CN101384902A - 与使用病毒载体控制的基因表达相关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与病毒载体相关的方法和组合物。本发明还提供了有效转染宿主（例如通过高效慢病毒送递载体）的方法和组合物，以及通过单纯地将调节物给予携带被转移的目的序列的宿主来灵敏控制所述被转移的目的序列的表达时机和水平。本发明还公开了制备转基因小鼠的方法以及使用与病毒载体相关的组合物和方法制备得到的转基因小鼠。

Description

与使用病毒载体控制的基因表达相关的组合物和方法
相关专利申请的交互引用
本申请要求2005年12月16日提交的流水号为60/751,407的美国临时申请和2005年12月16日提交的流水号为60/751,117的美国临时申请的权益。2005年12月16日提交的流水号为60/751,407的美国临时申请和2005年12月16日提交的流水号为60/751,117的美国临时申请的全文均通过引用的方式纳入本文。
致谢
本发明在美国国立变态反应和传染病研究所和国立卫生研究所的编号为R01 AI47717和R01 AI48852的政府拨款资助下完成。政府对本发明具有某些权利。
背景技术
经常需要在细胞或活体中转移和调控目的序列的表达，无论受试者是培养物中的细胞，还是活体例如动物模型或者是需要接受治疗基因的人类受试者。当使用基于HIV的慢病毒载体作为转移和/或表达目的序列的模式时，就会产生关于其使用安全性的忧虑，因为该病毒是AIDS的病原。其他的忧虑包括细胞的癌基因插入激活的可能性，该载体或构建体成功地和有效地与核糖体关联的能力，以及该载体或构建体成功地传导入核转运信号的能力。迄今为止，尚未产生可安全有效地用于在哺乳动物宿主或细胞内转移和/或表达目的序列、并且可以提供可诱导和可逆地表达所述被转移的目的基因或序列这两种重要能力的慢病毒载体。
慢病毒是复杂的反转录病毒，这些慢病毒——基于其较高的复杂度——可以整合到非增殖性细胞的基因组中并调整其生命周期，同感染潜伏期中的情况一样。这些病毒包括HIV-1、HIV-2和SIV。同其他的反转录病毒一样，慢病毒具有gag、pol和env基因，所述基因侧翼接有两个长末端重复(LTR)序列。每个上述基因均编码多种蛋白，初始时均表达为一种前体多聚蛋白。所述gag基因编码内部结构(基质衣壳和核衣壳)蛋白。pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(反转录酶、整合酶和蛋白酶)。env基因编码病毒包膜糖蛋白并且还含有负责病毒RNA的出核转运的顺式作用元件(RRE)。所述5’和3’LTR可起到促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化的作用。所述LTR含有病毒复制所必需的全部其他顺式作用序列。邻近所述5’LTR的是反转录所述基因组所必需的序列(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效地壳体化为颗粒所必需的序列(Psi位点)。如果将壳体化(即将反转录病毒RNA包装为感染性病毒体)所必需的序列从所述病毒基因组上缺失，则会产生可阻止基因组RNA壳体化的顺式缺陷。然而，所得突变体仍旧能够指导所有病毒体蛋白的合成。例如Field′s Virology(Raven Publishers)，eds.B.N.Fields etal.，(1996)中提供了关于慢病毒(例如HIV)的全面综述。
尽管慢病毒载体可用于许多用途，但是通过遗传重组产生有复制能力的反转录病毒(RCR)的可能性导致了关于安全性的忧虑。研究人员试图克服该问题的一个途径是构建基于HIV的包装系统(反式-慢病毒)，所述包装系统将gag/gag-pol分为两部分：一部分表达gag/gag-pro，而另一部分以病毒蛋白R(Vpr)的融合伴侣的形式表达反转录酶和整合酶。然而，该方法被发现具有许多缺陷，如生产感染性病毒载体颗粒的效率远低于理想的效率。
其他用于生产不产生重组反转录病毒的、有效的反转录病毒包装细胞系(特别是慢病毒包装细胞系)的方法和系统将具有很高价值。
发明内容
本发明通过将基因转移构建体或其他表达系统与基因调节系统结合起来，以便有效地将基因送递到细胞和活体中并控制其表达，提供了一种针对上述问题的解决方案。因此，本发明可(例如通过高效慢病毒载体送递系统)保证有效转染宿主，并通过单纯地将调节物(例如，抗生素如四环素)给予携带被转移的目的序列的宿主，来灵敏地控制所述被转移的目的序列的表达时机和水平。本发明所提供的额外好处是可在数种物种(例如啮齿动物、灵长类动物和犬类)宿主的非分裂细胞中实现该有效的转染和调节。
本发明提供了基因转移构建体和表达系统。本发明的基因转移构建体和表达系统可以是慢病毒载体。上述构建体包括多种组件，所述组件可使得所述构建体可安全有效地将目的序列转移到哺乳动物宿主细胞中；本发明还通过给予细胞或受试者合适的调节物，提供了在所述哺乳动物宿主细胞内显著调控所述被转移目的序列的表达的极其重要的能力，所述细胞或受试者含有所述可诱导并且可逆转的基因转移构建体。本发明的基因转移构建体可包括下列组件的一种或多种：自我失活的5’LTR、调节子应答性启动子、入核转运信号、与编码调节子应答性受体的核酸有效连接的启动子、RNA稳定元件或自我失活的3’LTR。所公开的基因转移构建体可用于包装DNA并将其送递至分裂和非分裂细胞中。本发明公开的包装和转移构建体可以彼此结合使用，也可以与本领域已知的其他包装和基因转移构建体、系统和方法以及本文所公开的系统和方法结合使用。
本发明还提供了特异性基因转移构建体和使用所述构建体在靶细胞中诱导性地并且可逆转地表达目的序列的方法。本发明还提供了使用所述公开的基因转移构建体作为用于处理哺乳动物受试者的表达系统的活体外方法。本发明还提供了制备用于表达目的序列的动物模型的方法。此外，本发明提供了并入了或含有本文所公开的基因转移构建体或表达系统的细胞。因此，所公开的基因转移构建体有助于构建稳定的、可诱导/可逆转的细胞系，因为所述假型慢病毒载体可转导许多不适用标准DNA转染技术的细胞类型。
本发明还提供了双向启动子，所述双向启动子可在相反的两个方向上驱动至少两个单独的序列表达。所公开的双向启动子还可与本文公开的包装和基因转移构建体共同使用。
本发明还提供了含有本文所述各种基因转移构建体的细胞系。
本发明还公开了基因转移构建体，其中所述构建体能够产生无复制能力的重组体。
本发明还提供了含有本文所述的各种基因转移构建体的表达系统。本发明还提供了含有本文所述的基因转移构建体或表达系统的细胞系，以及按照本文所述方法制备的细胞。
本发明还提供了选择性调节目的基因表达的方法，包括将本文所公开的基因转移构建体引入靶细胞中。
本发明还提供了制备重组蛋白、抗体和转基因动物的方法。
本发明还提供了含有编码Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列的包装构建体。上述构建体都是安全的，而且与在本发明之前可获得的构建体相比，本发明的构建体具有提高的包装效率。本发明还提供了含有编码Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列的包装构建体，所述构建体还包括一个或多个位于所述编码Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列内的突变，所述突变可减少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol多聚蛋白所需的移码或翻译连读(read-through)。
本发明还提供了一种包装构建体，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
本发明还提供了包括第一、第二和第三核酸序列的包装构建体，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第三核酸序列编码Vpr-反转录酶-整合酶蛋白。
本发明还提供了包装构建体，其中Gag和Gag-Pol为反式(in
trans)，其中所述编码Gag多聚蛋白的核酸序列和编码Gag-Pro多聚蛋白的核酸序列含有一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且所述编码Gag多聚蛋白的核酸序列和编码Gag-Pro多聚蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
本发明还提供了含有各种本文所述包装构建体的细胞系、包装系统和表达系统。本发明还提供了含有本文所述表达系统的细胞系。
任选地，本文所述包装构建体能够产生无复制能力的重组体。
本发明还提供了制备病毒样颗粒的方法。
本发明还提供了制备和使用本文所述细胞系、包装构建体、基因转移构建体、包装系统和表达系统的方法。
本发明还提供了筛选可调节病毒颗粒形成的药剂(agent)的方法。
本发明还提供了含有本文所公开的基因转移构建体的疫苗，以及在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括给予受试者本文所公开的疫苗。
因此，本发明成功地将有效的目的序列送递系统与紧密调节的目的序列表达系统结合起来，并且具有在目的序列的送递和表达技术上的显著进步。
附图说明
附图图示说明了下文所述的几个方面，所述附图被编入本说明书中并构成其一部分。
图1示出了含有点突变的移码所需的突变gag序列与野生型gag序列之间的比较。
图2示出了含有点突变的移码所需的突变gag-pol序列与野生型gag-pol序列之间的比较。
图3示出了移码所需的HIV gag和HIV gag-pol中的环结构。
图4示出了移码所需的HIV gag和HIV gag-pol中环结构的改变的序列，所述改变的序列导致移码所需的环结构被破坏。
图5示出了在给小鼠喂食DOX之前和18天后对转基因CAG建立者(founder)的血细胞中GFP表达的FACS分析的结果。
图6示出了转基因CAG建立者的血细胞中GFP表达的诱导动力学。
图7示出了人和小鼠H1启动子均能表达设计用于靶向eGFP的shRNA，这本身又可以有效地沉默Hela细胞中的eGFP表达。
图8示出了人和小鼠H1启动子均能表达设计用于靶向eGFP的shRNA，这本身又可以有效地沉默人T细胞中的eGFP表达。
图9示出了含有靶向小鼠CXCR4的shRNA的诱导型单慢病毒载体可诱导性地降低小鼠内源CXCR4蛋白的表达。
图10示出了多个拷贝的整合的诱导型单慢病毒载体可诱发高水平的基因沉默，所述慢病毒载体含有靶向小鼠CXCR4的shRNA。
图11示出了利用DOX在转基因小鼠血细胞内诱导siRNA表达以减少GFP。
图12示出了利用DOX在转基因小鼠血细胞内诱导siRNA表达以减少GFP。
图13示出了在给小鼠喂食DOX之前，非转基因小鼠以及转基因CAG-建立者F1-6#和F1-9#的血细胞中GFP的表达水平。
图14示出了在给小鼠喂食DOX后第10、17、27天时，非转基因小鼠以及转基因CAG-建立者F1-4#和F1-11#的血细胞中GFP的表达水平。
图15示出了本文所公开的基因转移构建体的实例。
图16示出了A)基于HIV的含有hCCR1-m的慢病毒载体，所述慢病毒载体可用于产生诱导性地并可逆地表达人CCR1基因的细胞系。B)示出了CCR1-m的C末端氨基酸序列。所述CCR1的终止密码子被突变并且被置换为TEV蛋白酶位点(ENLYFQG)。在TEV和10个组氨酸之间插入M2标签以便分析所述蛋白(CCR1-m)的表达和纯化。所述10个His标签起到使用Ni-NTA柱来纯化CCR1-m的作用。
图17示出了A)基于HIV的含有hEP2R的慢病毒载体，所述慢病毒载体可用于产生诱导性地并可逆地表达人EP2基因的细胞系。B)示出了hEP2R-m的C末端氨基酸序列。其终止密码子被突变并且被置换为TEV蛋白酶位点(ENLYFQG)。在TEV和10个组氨酸之间插入M2标签以便分析所述蛋白(hEP2R-m)的表达和纯化。所述10个His标签起到使用Ni-NTA柱来纯化hEP2R-m的作用。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、设备和/或方法之前，应该理解的是下文所述的各方面不限于特定的合成方法或特定的给药方法，下文所述的各方面本身当然是可以变化的。还应该理解的是本文所用的术语仅是为了描述具体的方面而并非意在进行限制。
必须注意到除非上下文中另外明确指出，本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代对象。
本说明书全文中所用的“受试者”是指个体。因此，所述“受试者”可以包括驯养的动物(例如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验用动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和禽类。在一个方面中，所述受试者为哺乳动物，例如灵长类或人。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况可能发生，也可能不发生，并且这样的描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。例如，短语“所述组合物任选地可以包括一种组合”是指该组合物可以包括不同分子的一种组合，也可以不包括这一组合，使得该描述同时包括存在所述组合和不存在所述组合的情况(即组合的各个成员)。
短语“包装细胞系”或“包装细胞”是指含有生产病毒颗粒或病毒样颗粒所需编码序列的细胞(通常是哺乳动物细胞系)，所述细胞在包装病毒RNA和生产有复制能力的辅助病毒的能力上存在缺陷。当所述细胞内提供了包装功能时，该包装细胞系或包装细胞会产生重组的反转录病毒，因此成为“反转录病毒生产细胞系”或“反转录病毒生产细胞”。
术语“反转录病毒”是指任何已知的反转录病毒(例如c型反转录病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))。本发明的“反转录病毒”还包括人T细胞白血病病毒(HTLV-1和HTLV-2)和反转录病毒的慢病毒家族，例如人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)和其他反转录病毒类别。
术语“Gag多聚蛋白”或“Gag蛋白”、“Pro多聚蛋白”或“Pro蛋白”以及“Pol多聚蛋白”或“Pol蛋白”是指由反转录病毒gag、pro和pol基因编码的多种蛋白，所述蛋白通常被表达为单一的前体“多聚蛋白”。例如，HIV gag编码p17、p24、p7和p6等蛋白。HIV pro编码病毒蛋白酶。HIV pol编码蛋白酶(PR)、反转录酶(RT)和整合酶(IN)等蛋白。本文所用术语“多聚蛋白”应包括gag、pro或pol多聚蛋白的全部或其任何部分。
术语“载体”或“构建体”是指能够将与所述载体序列相连接的另一核酸转运到细胞内的核酸序列。术语“表达载体”包括以适合于被细胞表达的形式(例如与转录调控元件相连)含有基因构建体的任何载体(例如质粒、粘粒或噬菌体染色体)。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的一种常用形式。此外，本发明意在包括其他可发挥同样功能的载体。
术语“目的序列”或“目的基因”可以指这样一种核酸序列(例如治疗基因)，所述核酸序列对于被引入该序列的细胞来说部分或全部异源，即外来的。
术语“目的序列”或“目的基因”还可以指这样一种核酸序列，所述核酸序列对于被引入该序列的细胞的内源基因来说部分或全部同源，但是所述核酸序列被设计用于插入到该细胞的基因组中以改变该基因组(例如该序列被插入到与天然基因所处位置不同的位置上或者其插入导致“敲除”)。例如，目的序列可以是cDNA、DNA或mRNA。
术语“目的序列”或“目的基因”还可以指这样一种核酸序列，所述核酸序列与被引入该序列的细胞的内源基因部分或完全互补。例如，所述目的序列可以是微小RNA、shRNA或siRNA。
“目的序列”或“目的基因”还可以包括一种或多种转录调节序列以及优化表达选定核酸所需的任何其他核酸，例如内含子。“目的蛋白”是指由目的序列或目的基因表达的肽或多肽序列(例如治疗蛋白)。
“基因转移构建体”是指这样一种核酸序列，所述核酸序列通常与其他慢病毒或反式慢病毒载体系统的载体共同使用来生产病毒颗粒，例如，使得所述病毒颗粒可转导目的靶细胞。
术语“有效连接”是指一种核酸与另一种核酸序列之间的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列是与其他序列有效连接的核酸序列的实例。例如，DNA与转录调控元件之间的有效连接是指所述DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得可利用RNA聚合酶、由所述启动子启动这类DNA的转录，所述RNA聚合酶特异性识别、结合并转录所述DNA。
术语“转化”和“转染”是指将核酸(例如表达载体)引入接收者细胞，包括将核酸引入所述细胞的染色体DNA中。
术语“RNA外排元件(export element)”是指顺式作用转录后调节元件，所述元件可调节RNA转录物由细胞的细胞核至细胞质的转运。RNA外排元件的实例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Cullen et al.(1991)J.Virol.65：1053；和Cullenet al.(1991)Cell 58：423-426)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)(参见例如，Huang et al.(1995)Molec.and Cell.Biol.15(7)：3864-3869；Huang et al.(1994)J.Virol.68(5)：3193-3199；Huang etal.(1993)Molec.and Cell.Biol13(12)：7476-7486)，以及美国专利NO.5,744,326，上述所有文献关于RNA外排元件的内容通过引用的方式全部纳入本文)。通常，所述RNA外排元件位于基因的3’UTR内，并且可以一个或多个拷贝插入。RNA外排元件可以插入至产生本发明的包装细胞系的任何或全部的独立载体中。
本文中范围可以表示为从“大约”一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从所述的一个具体的数值和/或至所述的另一个具体的数值。类似地，当通过使用前面的“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是本文公开了许多数值，并且除所述数值本身外每一个数值在此还以“大约”该具体数值公开。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“大约10”。还应当理解的是，当公开一个数值时，也公开了“小于或等于”该数值、“大于或等于该数值”以及数值间的可能范围，这正如本领域技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解的是，在本申请全文中，数据以多种不同格式给出，并且该数据代表了端点和起点以及这些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”，那么应该理解的是，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10和15之间的数值也被认为已经公开。
“病毒样颗粒”或“病毒颗粒”是指蛋白性壳体样病毒体，所述病毒体是通过在宿主细胞内表达至少一种下列病毒基因来生产的：gag、pro、rt、in和env。所产生的颗粒优选地含有所述基因转移构建体的mRNA等价物，并且对所要转导的给定细胞类型具有感染性，或者可被加工成对所要转导的给定细胞类型具有感染性。
组合物
1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的gag和pol基因最初被表达为前体多聚蛋白Gag和Gag-Pro-Pol。在出芽过程中或之后，利用病毒蛋白酶(PR)将上述前体加工成为其成熟的产物。55kDa的Gag前体生成基质(MA)、壳体(CA)、间隔肽p2、核壳体(NC)、间隔肽p1和p6。160kDa的Gag-Pro-Pol多聚蛋白生成MA、CA、p2、NC、p6、PR、反转录酶(RT)和整合酶(IN)。Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白由同一mRNA编码但合成速率不同。罕见的核糖体移码事件会使Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的生成比例约为20:1。维持该比例对于病毒颗粒的形成和感染性至关重要。
单独在胞内表达Gag已足以生产病毒样颗粒(VLP)。此外，在装配过程中Gag和病毒基因组RNA相互作用起到重要作用，且基因组RNA的包装和二聚主要通过RNA-Gag相互作用发生。Gag的NC结构域与病毒RNA结合并且已经被证明可促进所述RNA包装过程和二聚化过程。基因组RNA和HIV-1Gag之间的初始相互作用似乎是通过Gag前体中的NC序列发生的，因为具有缺陷型病毒PR的HIV-1仍旧可以包装RNA。此外，对野生型(WT)病毒体和PR-缺陷型(PR-)病毒体的分析显示HIV-1中基因组RNA的二聚化开始于蛋白酶解加工之前，表明Gag和Gag-Pro-Pol前体蛋白在未进行蛋白加工的情况下亦可支持RNA二聚化。
与其他反转录病毒不同，慢病毒除gag、pol和env外还具有数种具有调节和结构性功能的“附属”基因。具体而言，HIV具有至少六种这类基因，包括Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef。密切相关的HIV-2不编码Vpu，但可编码另一种不存在于HIV-1中的无关蛋白Vpx。
HIV-1Vpr基因编码一14kD的蛋白(96个氨基酸)(Myers et al.(1993)Human Retroviruses and AIDS，Los Alamos NationalLaboratory，N.M.)。所述Vpr开放读码框还存在于大多数HIV-2和SIV病毒中。HIV-2Vpr和Vpx之间的氨基酸比较显示存在高度同源性区域，表明Vpx可能是由Vpr基因的复制产生的。成熟病毒颗粒中存在多个拷贝的Vpr和Vpx，并且已经证明Vpr和Vpx可结合p6蛋白，所述p6蛋白是与病毒装配有关的gag编码的前体多聚蛋白的一部分(WO96/07741；WO96/32494)。因此，Vpr和Vpx通过与p6之间的相互作用被引入到病毒颗粒中(Lavallee et al.(1994)J.Virol.68：1926-1934；和Wu etal.(1994)J.Virol.68：6161)。还已经证明Vpr具体是与p6的羧基末端区域相关联。已经证明Vpr和Vpx——以相对于HIV基因组的反式表达方式表达——可被用于将异源蛋白靶向HIV病毒(WO 96/07741；WO96/32494)。下列文件给出了对Vpr和Vpx的结构和功能的描述，包括这些蛋白及其结合结构域的全长核苷酸和氨基酸序列，所述文件包括：WO96/07741和Zhao et al.(1994)J.Biol Chem.269(22)：1577(Vpr)；Mahalingham et al.(91995)Virology 207：297(Vpr)；和Hu etal.(1989)Virology 173：624)(Vpx).其他与Vpr相关的参考文献包括，例如Kondo et al.(1995)J.Virol69：2759；Lavallee et al.(1994)J.Virol.68：1926；和Levy et al.(1993)Cell72：541.其他与Vpx相关的参考文献包括，例如Wu et al.(1994)J.Virol.68：6161。上述参考文献关于Vpr和Vpx结构和功能的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
这些反转录病毒整合酶(IN)蛋白可催化前病毒的整合并且是在体内维持所述感染状态所必需的。对这种关键性酶，特别是它的蛋白质结构和所述催化整合反应的生物化学机理的认识已经取得了显著进步(Brown，P.1997.Integration，p.161-204.In J.M.Coffin，S.H.Hughes和H.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Dyda，F.，A.B.Hickman，T.M.Jenkins，A.Engelman，R.Craigie和D.R.Davies.1994.Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1integrase：similarity to other polynucleotidyl transferases.Science 266：1981-1986；Katz，R.A.，和A.M.Skalka.1994.Theretroviral enzymes.Annu.Rev.Biochem.63：133-173。所有上述参考文献关于IN蛋白结构和所述催化整合反应的生物化学机理的教导全部均通过引用的方式纳入本说明书)。HIV-1IN被表达为一个较大的160-kDa Gag-Pol前体多聚蛋白(Prl60GagPol)的一部分并且装配进所述病毒颗粒中，所述Gag-Pol前体多聚蛋白含有其他Gag(基质、壳体、核壳体和p6)和Pol(蛋白酶、反转录酶[RT]和IN)组件。装配之后，利用所述病毒蛋白酶对Prl60GagPol进行蛋白酶解加工以便释放所述各个Gag和Pol组件，包括所述32-kDa IN蛋白。使用复制型病毒进行的IN功能研究已经证实，除催化所述病毒cDNA的整合外，IN还对病毒复制具有其他影响(Gallay，P.，S.Swingler，J.Song，F.Bushman和D.Trono.1995.HIV nuclear import is governed by thephosphotyrosine-mediated binding of matrix to the core domain ofintegrase.Cell 83：569-576；Leavitt，A.D.，G.Robles，N.Alesandro和H.E.Varmus.1996.Human immunodeficiency virus typel integrase mutants retain in vitro integrase activity yet failto integrate viral DNA efficiently during infection.J.Virol.70：721-728；Masuda，T.，V.Planelles，P.Krogstad和I.S.Y.Chen.1995.Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1integrase and the U3 att site：unusual phenotype of mutants in thezinc finger-like domain.J.Virol.69：6687-6696。所有上述参考文献关于IN蛋白结构和所述催化整合反应的生物化学机理的教导全部均通过引用的方式纳入本说明书)。在使用前病毒克隆进行的研究中，已经证明IN基因突变可在多个水平上影响病毒复制。IN基因中的突变可以影响Gag-Pol前体蛋白并且改变装配、成熟和其他后续病毒事件。IN基因突变还可以影响成熟IN蛋白以及其在病毒颗粒和核蛋白整合前复合体内的组构。因此，这类突变是多效的并且可以通过多种机制在病毒生活周期的不同阶段改变病毒复制。
反转录可被RT催化，并且尽管反转录可以在体外使用重组RT、模板和引物来进行，但是在体内该过程更加复杂。在病毒复制的过程中，病毒cDNA的完全合成并不只是简单地将不同的蛋白和核酸放在一起；相反，病毒复制是一个复杂的多步过程，包括许多过渡结构。在被感染的细胞中，反转录在核酸-蛋白(核蛋白)复合体中进行，所述复合体含有其他病毒因子和细胞因子。此外，所述病毒cDNA的合成在很大程度上取决于在反转录之前进行的多个分子事件的正确执行。
本发明公开了包装和基因转移构建体。用于生产重组反转录病毒载体和用于转化包装细胞系的方案在本领域中是已知的(CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)GreenePublishing Associates，(1989)，Sections9.10-9.14和其他标准的实验室手册；Eglitis，et al.(1985)Science 230：1395-1398；Danosand Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-8043；Ferryet al.(1991)Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury etal.(1991)Science 254：1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：7640-7644；Kay et al.(1992)Human GeneTherapy 3：641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad Sci USA89：10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150：4104-4115；U.S.Pat.No.4,868,116；U.S.Pat.No.4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573。所有上述参考文献关于生产重组反转录病毒构建体和载体以及将其用于转化细胞系的方案的教导全部均通过引用的方式纳入本说明书)。此外，适合用于本发明的反转录病毒序列可从商业来源获得。例如，购得的这类序列可以是反转录病毒质粒形式，例如pLJ、pZIP、pWE和pEM。本发明载体中所采用的合适的包装序列也可以是市售的，包括例如质粒Crip、
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Cre、
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2和Am。因此，当使用具体实施方案(例如具体的慢病毒载体)描述本发明时，其他可用于本发明的反转录病毒载体也可以按照本文所述的指南进行制备。此外，本文所公开的基因转移载体可以与本文所公开的包装和表达系统共同使用。
具体而言，本发明公开了含有编码Gag和Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列的包装构建体。任选地，所述包装构建体包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码Gag蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro-Pol蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
本发明还公开了一种含有第一和第二核酸序列的包装构建体，其中所述第一核酸序列编码Gag蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。在该构建体中，所述通常编码多聚RT和IN的核酸序列被移除或被突变，使得所述Pol或RT-IN蛋白无法表达。移除或突变所述编码Pol蛋白的核酸序列还会降低通过遗传重组生成有复制能力的反转录病毒(RCR)的可能性。然后，RT和IN可由单独的构建体(反式)表达。例如，反转录酶和整合酶可以以病毒蛋白R(Vpr)的融合伴侣的形式被表达。
本发明还公开了含有第一、第二和第三核酸序列的包装构建体，其中所述第一核酸序列编码Gag蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro蛋白，并且其中所述第三核酸序列编码Vpr-反转录酶-整合酶蛋白。此外，所述第一和第二核酸序列可以包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一、第二以及第三核酸序列由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一、第二和第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。在该构建体中，所述能够编码Pol蛋白的核酸序列可以被移除或被突变，使得所述Pol蛋白无法表达。所述反转录酶和整合酶可由编码Vpr-反转录酶-整合酶蛋白的核酸序列以反式提供。
本发明还公开了位于更下游的IRES或IRES样元件以便调控Vpr-RT-IN。下文描述了IRES和IRES样元件。例如，本发明公开了一种包装构建体，所述包装构建体还包括一个位于所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之间，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间产生差异表达。上述的实例包括内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。本发明公开了可用于该方法的IRES和IRES样元件。所述IRES可以是，例如EMC-病毒IRES、HCV-病毒IRES或不同来源的IRES。其他可以使用的IRES实例包括但不限于http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/的IRES数据库中存在的IRES。
本发明还公开了包装构建体，所述包装构建体还包括含有rev应答元件的核酸序列。
实际上，Gag和Gag-Pol蛋白可由部分重叠的开放读码框编码。Gag具有其自身的起始和终止密码子，而HIV-1Gag-Pol前体的合成会引起移码事件，所述移码事件的发生频率为Gag翻译时移码事件的发生频率的约5-10％。其他反转录病毒也使用类似的移码机制或连读抑制机制来调节Gag-Pol或Gag-Pro蛋白的表达。因此，在所有的反转录病毒复制过程中，胞内Gag/Gag-Pol比例都受到调节。已发现HIV移码位点(富含AU的七核苷酸序列)位于核壳体(NC)编码序列的3’末端。在合成Gag的过程中，该位点和下游紧邻的茎结构会停住所述核糖体，使得所述核糖体滑回一个核苷酸以使得罕见(相对于Gag)的Gag-Pol融合蛋白合成得以进行。
Gag蛋白的多聚化会产生病毒颗粒，同时Gag-Pol前体蛋白的表达会确保在病毒装配过程中病毒酶被整合到病毒颗粒内。在细胞释放病毒体的过程中以及释放之后，Gag前体蛋白被病毒蛋白酶(PR)切割成为成熟蛋白：基质、壳体(CA)、NC、p6和两种间隔肽p2和p1。切割Gag-Pol融合体以产生基质、CA、p2和NC，以及跨读框蛋白、PR、反转录酶(RT)和整合酶(IN)。
已经报道了单独合成Gag前体蛋白已足以进行病毒样颗粒的装配和释放。将Gag-Pol或其成熟产物并入到病毒体中是实现感染性所必需的，因为它们可介导被感染细胞内的病毒cDNA的合成和整合。此外，利用PR切割所述前体蛋白是所述病毒体核的形态成熟和感染性病毒颗粒的形成所必需的。在装配过程中，病毒基因组RNA也被包装进病毒体内，所述包装过程由位于所述基因组5’端附近的基因组RNA包装序列以及与Gag的NC结构域之间的相互作用驱动。
与其他反转录病毒类似，例如HIV-1具有二聚的RNA基因组。对HIV-1病毒RNA进行的体外二聚分析已经定位了(mapped)一种含50-60个核苷酸的序列(称为二聚体起始序列)，该序列对于所述二聚RNA复合体的形成很重要。二聚体起始序列中的突变会妨碍基因组RNA的二聚化以及病毒体RNA的包装，并且导致产生无感染性的病毒颗粒。一般认为RNA的二聚化是HIV-1中RNA包装的先决条件，并且在其他反转录病毒中，基因组RNA的病毒体包装和RNA的二聚化也是相关的。来源于PR缺陷型HIV-1病毒体的RNA二聚体的热稳定性低于来源于野生型成熟HIV-1的二聚体。在莫洛尼鼠白血病病毒中也观察到了类似的现象。
尽管单独表达Gag-Pol前体并不足以生产感染性反转录病毒颗粒，但是Gag/Gag-Pol比例对于所述病毒复制周期和RNA二聚化的影响是一个关键性因素。已经证明在生产病毒体的细胞内，Gag/Gag-Pol比例对于感染性病毒颗粒的形成和所述病毒体RNA二聚体的稳定性都很重要(Xhilaga et al.Journal of Virology，February 2001，p.1834-1841，Vol.75，No.4)。
本发明公开了包装系统，其中所述Gag和Gag-Pol蛋白的比例为约99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40或任一介于其间的比例。
此外，基于慢病毒的包装构建体可以任选地包括能够表达Vpr-反转录病酶-整合酶蛋白(顺式)的核酸序列，所述包装构建体缺乏能够表达Pol蛋白的核酸序列。或者，基于慢病毒的包装系统还可以包括能够表达Vpr-反转录病酶-整合酶蛋白(反式)的单独的核酸构建体，所述包装系统包括缺乏能够表达Pol蛋白的核酸序列的包装构建体。
本发明所公开的基因转移构建体可以包括目的序列。所述基因转移构建体还可以包括标记编码序列。例如，所述目的序列和标记编码序列可以与至少一个转录调控元件有效连接。任选地，所述基因转移构建体可以含有两、三、四、五个或更多个目的序列。所述目的序列可以是相同的或不同的，并且可以与单独的转录调控元件有效连接，或者可以与同另一目的序列、标记编码序列或调节序列有效连接的转录调控元件有效连接。例如，在本发明所公开的表达系统中，所述基因转移构建体可以包括第七、第八、第九或更高编号(ordered)的核酸序列，其中所述第七核酸序列编码第三、第四、第五或更高编号的选定的目的蛋白。
所述基因转移构建体还可以包括位于所述目的序列3’端的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。所述基因转移构建体还可以包括一个或多个长末端重复(LTR)序列，本文的其他部分对该序列进行了讨论。
所述基因转移构建体以及本文所公开的其他构建体还可以是自我失活型(SIN)构建体。SIN载体是新一代的反转录病毒载体，所述载体利用所述病毒反转录酶的独特性质使整合的转移载体前病毒DNA的顺式作用序列失活。上述序列可以包括存在于所述LTR中的病毒启动子以及存在于整合的载体前病毒DNA中的任何包装序列。几种制备SIN载体的策略是可以获得的并且在本领域中是公知的例如，可以使用Tahir A Rizvi在Non-Human Primate Lentiviral Vectors for HumanGene Therapy，Genetic Disorders in the Arab World United Arab Emirates(获自网址http://www.cags.org.ae/cbc101v.pdf)中所述的“断裂内含子”策略，所述文献关于断裂内含子策略的教导全部通过引用的方式纳入本文。所述“断裂内含子”策略利用有效真核剪接位点的并入来从整合载体前病毒DNA上缺失所述包装序列，使得它不能形成可以被所述病毒蛋白进一步包装和增殖的RNA。这消除了所述载体RNA与任何内源或外源病毒的RNA发生潜在重组的可能性，所述病毒可以是偶然地或因其他原因存在于经反转录载体转导的细胞内。另外，所述基因转移构建体还可以任选地在3’长末端重复序列中含有突变。还可以用启动子序列来取代5’或3’长末端重复序列。
此外，本发明所公开的表达系统可以包括含有目的序列和标记编码序列的基因转移构建体，且在所述目的序列和标记编码序列之间具有一元件，其中所述元件可使所述目的序列和标记编码序列产生差异表达。目的序列和标记编码序列之间的元件可以是内部核糖体进入位点(IRES)或内部核糖体进入位点样元件(IRES样)。本文的其他部分中讨论了IRES和IRES样元件。所述基因转移构建体还可以包括至少一个转录调控元件，本文的其他部分中对其进行了讨论。如本文其他部分所述，所述存在于基因转移构建体中的一个或多个转录调控元件还可以是可调节的。所述基因转移构建体还可以包含一个调节子序列(regulatorsequence)，或者所述调节子序列可由本文所述的单独的调节子构建体(regulator construct)提供。
此外，所述基因转移构建体可以包括标记编码序列和目的序列，其中所述标记编码序列和目的序列与相同或不同的转录调控元件(TCE)有效连接。例如，本发明公开了这样的基因转移构建体，其中所述目的序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述标记编码序列与第二转录调控元件有效连接。在一个实例中，所述第一转录调控元件可以强于所述第二转录调控元件。在这种情况下，所述与第一TCE有效连接的标记编码序列的表达应高于所述与第二TCE有效连接的目的序列。例如，所述与第一TCE有效连接的标记编码序列与所述与第二TCE有效连接的目的序列的表达比例可以为99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39或60:40。
此外，本发明公开了含有两个方向相反的启动子以及双向启动子的基因转移构建体。例如，所述目的序列和标记编码序列可以按相反方向表达。在另一个实例中，所述目的序列和标记编码序列可以按相反方向表达。此外，所述目的序列可以与第一转录调控元件有效连接，并且所述标记编码序列可以与第二转录调控元件有效连接。所述第一和第二转录调控元件可以是相同的或不同的。此外，至少一个所述转录调控元件是可调节的。同时，所述目的序列和标记编码序列还可以与一单转录调控元件有效连接，所述转录调控元件是可调节的。所述单转录调控元件可以是可调节的双向启动子。
本发明具体地公开了包括载体的基因转移构建体，其中所述载体包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列包括与第一转录调控元件有效连接的目的序列，其中所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接，并且编码调控所述第一核酸序列表达的多肽，其中所述第三核酸序列包括与第一转录调控元件有效连接的调节子靶序列，并且其中所述第一和第二转录调控元件取向相反。
本发明还公开了包括载体的基因转移构建体，其中所述载体包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列与一单转录调控元件有效连接，其中所述第一核酸序列包括目的序列，其中所述第二核酸序列编码可调控所述第一核酸序列表达的多肽，其中所述第三核酸序列包括与所述第一转录调控元件有效连接的调节子序列，并且其中所述转录调控元件能够驱动所述第一和第二核酸序列的表达。
所述基因转移构建体的载体可以是病毒载体，并且所述病毒载体可以任选地为自我失活型的。此外，所述基因转移载体的第一核酸序列的表达可以是可调节的。
本发明还公开了包含本文所公开的基因转移构建体的细胞和细胞系。
本发明还公开了任选地包含RNA外排元件的构建体。术语“RNA外排元件”是指顺式作用转录后调节元件，所述元件可调节RNA转录物由细胞的细胞核至细胞质的转运。RNA外排元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Cullen et al.(1991)J.Virol.65：1053；和Cullen et al.(1991)Cell 58：423-426)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)(参见例如，Huang et al.(1995)Molec.and Cell.Biol.15(7)：3864-3869；Huang et al.(1994)J.Virol68(5)：3193-3199；Huang et al.(1993)Molec.and Cell.Biol13(12)：7476-7486)，和美国专利No.5,744,326。这些参考文献关于RNA外排元件的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。通常，所述RNA外排元件位于基因的3’UTR，并且可以一个或多个拷贝插入。RNA外排元件可以插入形成本发明的包装细胞系的任一或全部独立的载体中。
本发明公开的构建体可以任选地包括编码Tat的核酸序列。本发明还公开了可以任选地包括编码Rev的核酸序列的构建体。所述编码Tat和Rev的核酸序列可以为所述编码Gag或Gag-Pol的核酸序列的一部分或者是与所述编码Gag或Gag-Pol的核酸序列相分离。所述Tat和Rev蛋白分别在转录水平和转录后水平调节HIV基因的表达水平。例如，由于HIV长末端重复(LTR)的弱基础转录活性，前病毒的表达最初会产生少量的编码Tat、Rev和Nef蛋白的多剪接转录物。Tat通过结合新生RNA中的茎环结构(反式作用应答元件[TAR])显著地增加了HIV转录，从而募集细胞周期蛋白-激酶复合体，所述复合体可以利用聚合酶II复合体激发转录延伸。
具体而言，Rev是可直接与其Rev应答元件(RRE)RNA靶序列结合的核质穿梭蛋白，所述RNA靶序列是所有未剪接和不完全剪接的病毒mRNA的一部分。当发生多聚化并且随后与细胞辅因子相互作用时，Rev促进上述mRNA跨核膜易位，导致产生晚期病毒蛋白。
Rev通过起到RNA基序(RRE，天然存在于HIV转录物的被膜编码区中)和所述细胞核外排机制的组件之间的连接物作用来实现这一作用。Rev结合序列是这样的核酸：它会在体外或体内特异性地与Rev结合(通常是RNA)，或者会与编码在体外或体内与Rev结合的核酸的核酸特异性地结合(即RNA或DNA)。几篇论文描述了用于监测Rev结合的体外结合测定法，包括Wong-Staal et al.(1991)Viral And CellularFactors that Bind to the Rev Response Element in Genetic Structureand Regulation of HIV(Haseltine and Wong-Staal eds.；HarvardAIDS Institute Series on Gene Regulation of Human Retroviruses第一卷的一部分)，311-322页和其中所引用的参考文献，所述参考文献描述了凝胶迁移率变换测定法和用于检测生物样本(包括人血液)中Rev的足迹测定法。这些参考文献关于监测RNA结合的结合分析的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本发明所公开的构建体可以任选地包括含有RRE的核酸序列。RRE通常存在于HIV转录物的被膜编码区以及细胞核外排机制的组件中。如上所述，当RRE与Rev发生多聚化，并且随后与多个细胞辅因子相互作用时，上述病毒mRNA就会跨核膜易位。
本发明还公开了内部核糖体进入位点(IRES)和内部核糖体进入位点样元件。内部核糖体进入位点(IRES)为能够介导40S核糖体亚基进入内部的顺式作用RNA序列，所述40S核糖体亚基位于一些真核生物和病毒的信使RNA的翻译起始密码子的上游。虽然IRES序列极其多样，并且存在于越来越多的mRNA中，但是IRES元件含有保守的Yn-Xm-AUG单元(Y：嘧啶；X：核苷酸)，该单元似乎是IRES发挥功能所必需的。每年都有新的IRES序列不断被添加到公共数据库中，且未知IRES序列的数量肯定仍然很多。
IRES样元件也是能够介导40S核糖体亚基进入内部的顺式作用序列，所述核糖体亚基位于一些真核生物和病毒信使RNA的翻译起始密码子的上游。与IRES元件不同，在IRES样元件中，Yn-Xm-AUG单元(Y：嘧啶；X：核苷酸)不是必需的，该单元似乎是IRES发挥功能所必需的。
本发明所公开的构建体可以任选地包括IRES或IRES样元件。例如，本发明公开的包装构建体还可以包括位于所述第一和第二核酸序列之间的元件，其中所述元件可使所述第一与第二核酸序列之间产生差异表达。在另一个实例中，所述位于第一和第二核酸序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。在另一个实例中，本发明所公开的包装构建体还可以包括位于所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之间，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间产生差异表达。
所述IRES或IRES样元件可以是天然存在的或非天然存在的。IRES的实例包括但不限于http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/的IRES数据库中存在的IRES。IRES的实例还可以包括但不限于EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。此外，所述IRES或IRES样元件可以是突变过的，其中所述IRES或IRES样元件的功能得到了保持。
本发明还公开了转录调控元件(TCE)。TCE是能够驱动与其有效连接的核酸序列表达的元件。本发明所公开的构建体包括至少一个TCE。TCE可以任选地为组成型的或可调节的。
本发明还公开了含有取向相反的第一和第二转录调控元件的构建体，其中一个所述转录调控元件的活性可影响另一个转录调控元件的活性。任选地，所述两个转录调控元件可以是并置的或者在所述第一和第二转录调控元件之间存在一个接头序列。例如，所述接头序列可以是一种染色体隔离子。
可调节的TCE可以包含这样一种核酸序列，所述核酸序列能够结合由调节子构建体表达的融合蛋白的结合结构域，从而使得所述转录抑制结构域起到抑制所述可调节TCE中所含核酸序列转录的作用。
本发明还公开了调节子构建体和调节子序列。调节子构建体可以是含有调节子序列的构建体。调节子序列可以是能够调控与调节子靶序列有效连接的序列表达的序列。例如，调节子序列可以是能够编码多肽的序列，所述多肽可调控与本文其他部分所述的核酸构建体中调节子靶序列有效连接的核酸序列的表达。例如，调节子构建体可以是含有能够编码可药物调控的(例如药物诱导的)阻遏融合蛋白的构建体，所述融合蛋白含有DNA结合结构域和转录抑制结构域。或者，所述构建体除含有可调节TCE之外还含有能够编码可药物调控的(例如药物诱导的)阻遏融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有DNA结合结构域和转录抑制结构域。在这种情况下，能够编码可药物调控的(例如药物诱导的)阻遏融合蛋白的核酸序列与所述可调节TCE位于相同的构建体上，所述阻遏融合蛋白会与所述可调节TCE结合。例如，所述包装构建体和基因转移构建体可以包括能够编码可药物调控的(例如药物诱导的)阻遏融合蛋白和与所述阻遏融合蛋白结合的可调节TCE两者的核酸序列。
如本说明书通篇所述，本发明所公开的构建体可以含有调节子序列或含有调节子靶序列的可调节TCE或者同时含有两者。所述调控构建体可以含有能够编码四环素抑制子(tetR)或四环素激活子(tetA)(或者被称为反向tetR-VP16)蛋白的调节子序列，所述蛋白可以结合tet0序列。所述tet0序列可以位于TCE中。所述调节子构建体可以任选地包括编码核定位信号的核酸序列，例如SV40核定位信号。例如，所述调节子构建体可以包括SEQ ID NO：1的序列。此外，所述调节子构建体还可以任选地包括一个或多个VP16最小反式激活结构域。例如，所述调节子构建体可以包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列。TetR-VP16还可以被称为“tet-off”。反向tetR-VP16还可以被称为“tet-on”。
所述调节子构建体可以任选地包括改变形式的tetR和tetA，以防止在所述tetR和tetA蛋白之间形成异源二聚体。所述改变形式的tetR和tetA可以包括彼此独立或相结合的E和B tet操纵子DNA结合结构域。例如，所述调节子构建体可以包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的序列。
可调节的TCE可以任选地包括调节子靶序列。可调节的TCE可以包含这样一种核酸序列，所述核酸序列能够结合由调节子构建体表达的融合蛋白的结合结构域，从而使得转录抑制结构域起到抑制所述可调节TCE中所含核酸序列转录的作用。调节子靶序列可以包括一个或多个tet操纵子序列(tet0)。所述调节子靶序列可以与其他序列有效连接，所述其他序列包括但不限于TATA框或编码GAL-4的核酸序列。
本发明所描述的基因转移构建体可以任选地包括第二调节子序列。例如，本文所述的基因转移构建体可以任选地包括与第二调节子序列有效连接的第二GAL-4编码核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列与第三转录调控元件有效连接，其中所述第二目的序列选自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二调节子序列位于所述第二GAL-4编码核酸序列和所述第二目的序列之间。
当存在可调节TCE和调节子序列时，无论它们是否位于相同或不同的构建体上，都使得可以诱导性且可逆转地表达所述与可调节TCE有效连接的序列。这样一来，所述可调节TCE就可以提供一种用于选择性地可诱导和可逆转地表达目的序列的方法。
例如，可调节TCE可以由四环素或多西环素调节。此外，所述TCE可以任选地包括至少一个tet操纵子序列。在一个实例中，至少一个tet操纵子序列可以与TATA框有效连接。
此外，如本文其他部分所述，所述TCE可以是启动子。本说明书的全文给出了可用于本文公开的包装构建体的启动子的实例。例如，启动子可以包括但不限于基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、热休克蛋白启动子、mH1启动子、hH1启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、U6启动子、泛素C启动子或EF-1α的启动子。
此外，本文所公开的TCE还可以包括彼此有效连接的一个或多个启动子、启动子的一部分或者彼此有效连接的启动子的一部分。例如，转录调控元件可以包括但不限于CMV启动子的3’部分、CMV启动子的5’部分、β-肌动蛋白启动子的一部分或者与CAG启动子有效连接的3’CMV启动子。
调控哺乳动物宿主细胞中载体转录的优选启动子可以获取自不同的来源例如病毒基因组，或者获取自异源哺乳动物例如β-肌动蛋白启动子，所述病毒例如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒并且最优选巨细胞病毒。可以很方便地以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，所述限制性片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers et al.，Nature，273：113(1978)，所述文献关于病毒启动子的部分全部通过引用的方式纳入本文)。可以很方便地以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子(Greenway，P.J.et al.，Gene 18：355 360(1982)，所述文献关于病毒启动子的部分全部通过引用的方式纳入本文)。当然，本发明还可以使用来自宿主细胞或相关物种的启动子，且所述启动子可以被用于进行组织特异性基因表达或组织特异性调节的基因表达。所引用的参考文献关于启动子的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
“增强子”通常是指在与所述转录起始位点的距离不固定的地方发挥作用的DNA序列，并且可以位于所述转录单元的5’方向(Laimins，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：993(1981))或3’方向(Lusky，M.L.，et al.，Mol.Cell Bio.3：1108(1983))。所引用的各参考文献关于增强子的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。此外，增强子可以位于内含子中(Banerji，J.L.et al.，Cell 33：729(1983))以及所述编码序列本身中(Osborne，T.F.，et al.，Mol.Cell Bio.4：1293(1984))。所引用的各参考文献关于增强子可能位置的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。它们的长度通常在10至300bp之间，并且它们以顺式发挥作用。增强子起到增加由邻近启动子起始的转录的作用。增强子还常常含有介导转录调节的应答元件。启动子也可以含有介导转录调节的应答元件。增强子常常可以决定对基因表达的调节。虽然目前已知许多来源于哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、胎球蛋白和胰岛素)的增强子序列，但是研究人员通常使用来源于真核细胞病毒的增强子来进行一般性表达。优选的实例为位于复制起点(bp 100 270)晚期侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
所述启动子和/或增强子可以通过可触发其功能的特定化学事件或光而被特异性地激活。可以使用例如四环素和地塞米松等试剂来调节系统。还存在通过暴露于辐照(例如γ辐照)或烷化化学治疗药物来增强病毒载体基因表达的方式。
在某些实施方案中，所述启动子和/或增强子区域可以起到组成型启动子和/或增强子的作用，以使所要转录的转录单元区域的表达最大化。在某些构建体中，所述启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中都具有活性，尽管所述启动子和/或增强子区域只能在特定的时间在特定的细胞类型中表达。一种优选的这类启动子为CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子为SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和反转录病毒载体LTR。
本发明还公开了双向转录调控元件。例如，本发明公开了一种双向转录调控元件，它包含与CAG启动子的5’端融合的CMV启动子的3’端。本发明还公开了一种双向转录调控元件，它包含与人EF-1α启动子的5’端融合的CMV启动子的3’端。本发明还公开了一种双向转录调控元件，它包含与CAG启动子的5’端融合的小鼠H1启动子的5’端。本发明还公开了一种双向转录调控元件，它包含与SV40启动子的5’端融合的CMV启动子的3’端。所述双向转录调控元件如本文其他部分所公开的转录调控元件一样，可以是可调节的或者是组成型的。本发明还公开了一种双向转录调控元件，它包含与eflα启动子的5’端融合的CMV启动子的5’端。
所述双向转录调控元件可以包括SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：51中列出的序列。双向转录调控元件还可以包括调节子靶序列，并且可以利用抗生素(例如四环素或多西环素)来对其进行调节。
已经证明，所有特异性调节元件都可被克隆并用于构建表达载体，所述表达载体可在特定细胞类型(例如黑色素瘤细胞)中被选择性表达。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已经被用于选择性表达胶质源性细胞内的基因。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中所用的表达载体还可以含有终止转录所必需的序列，所述序列可以影响mRNA的表达。上述区域被转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化区段。所述3’非翻译区还包括转录终止位点。优选地，所述转录单元还含有多腺苷酸化区域。该区域的一个好处是它可增加了所述被转录单元如mRNA那样被加工和转运的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴别和用途是公知的。优选地，在所述转基因构建体中使用同源多腺苷酸化信号。在某些转录单元中，所述多腺苷酸化区域来源于SV40早期多腺苷酸化信号，并且由大约400个碱基组成。还优选地，所述被转录单元仅含有其他标准序列或含有其他标准序列以及上述序列，以便促进所述构建体的表达或增加其稳定性。
Cre重组酶是一种来源于噬菌体P1的I型拓扑异构酶，它可催化位于loxP位点之间的DNA的位点特异性重组(Abremski，K.and Hoess，R.(1984)J.Biol.Chem.，259，1509-1514，所述文献关于Cre重组酶结构和功能的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。所述酶无需能量辅助因子，且Cre介导的重组可以迅速在底物和反应产物之间达到平衡(Abremski，K.et al.(1983)Cell，32，1301-1311，所述文献关于Cre重组酶作用机制的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。所述loxP识别元件是34碱基对(bp)的序列，包括位于一个起定向作用的8bp的间隔区两侧的两个13bp的反向重复序列(Metzger，D.and Feil，R.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.，10，470-476，所述文献关于loxP识别元件以及它们在Cre重组酶作用中的作用的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。重组产物依赖于loxP位点的位置和相对取向。两种含有单loxP位点的DNA可以融合。位于同向loxP位点之间的DNA将以环状形式被切除，而位于反向loxP位点之间的DNA将相对于外部序列而被翻转。
在本文所述基因转移构建体中，与转录调控元件有效连接的核酸序列的表达也可以被Cre重组酶调节。例如，一种基因构建体可以包括一种载体，其中所述载体包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和一种含有能够编码可筛选标记的核酸序列的调节子靶序列，其中所述第一核酸序列包括与第一转录调控元件有效连接的目的序列，其中所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接，并且编码可调控所述第一核酸序列表达的多肽，其中所述第三核酸序列包括与所述第一转录调控元件有效连接的调节子序列，并且其中所述调节子靶序列也与所述第一转录调控元件有效连接，且位于所述第一转录调控元件和所述第一核酸序列之间。在这种情况下，所述调节子靶序列的侧翼可以接有TATA序列，所述TATA序列还与至少一个tet操纵子序列连接。所述带有伴随序列的调节子靶序列的侧翼还可以接有loxP位点，使得当Cre介导重组时，所述调节子靶序列可被切除，并且所述目的序列可以与所述第一转录调控元件融合，从而表达所述目的序列。
本发明还公开了包装构建体，其中所述第一核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接。本发明还公开了包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第三核酸序列与第二转录调控元件有效连接。
任选地，所述第一转录调控元件可以强于所述第二转录调控元件。在这种情况下，所述与第一TCE有效连接的一个或多个序列的表达应高于所述与第二TCE有效连接的一个或多个序列。例如，所述与第一TCE有效连接的一个或多个序列与所述与第二TCE有效连接的一个或多个序列的表达比例可以为大约99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92：8、91：9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40或任一介于其间的比例。
本发明还公开了含有两种方向相反的启动子以及双向启动子的包装构建体。例如，所述第一和第二核酸序列可以按相反方向表达。在另一个实例中，所述第一和第二核酸序列相对于所述第三核酸序列可以按相反方向表达。任选地，所述标记编码序列和目的基因可以按相反方向表达。此外，所述第一核酸序列可以与第一转录调控元件有效连接，并且所述第二核酸序列可以与第二转录调控元件有效连接。此外，所述第一和第二核酸序列可以与第一转录调控元件有效连接，并且所述第三核酸序列可以与第二转录调控元件有效连接。所述第一和第二转录调控元件可以是相同的或不同的。此外，至少一个所述转录调控元件是可调节的。而且，所述第一和第二核酸序列还可以与一单转录调控元件有效连接，所述转录调控元件是可调节的。此外，所述第一、第二和第三核酸序列还可以与一单转录调控元件有效连接，所述单转录调控元件是可调节的。所述单转录调控元件是同样可调节的双向启动子。
典型的启动子由最小启动子和其他上游顺式元件组成。Lewin，B.Gene VI(Oxford University Press，Oxford，1997)、Odell，J.T.，Nagy，F.& Chua，N.-H.Nature 313，810-812(1990)，和Benfey，P.N.& Chua，N.-H.Science 250，959-966(1990)。所述最小启动子主要是其中RNA聚合酶与起始转录区结合的TATA框区，但是它本身不具有转录活性。Benfey，P.N.& Chua，N.-H.Science 250，959-966(1990)。当所述顺式元件一旦与特异性转录因子结合时，它单独地或共同地决定启动子的时空表达模式(Benfey，P.N.& Chua，N.-H.Science250，959-966(1990))。美国专利No.5,814,618公开了一种含有多个tet操纵子序列(在说明书中被定义为增强子或抑制子)并且侧翼接有最小启动子的双向启动子。美国专利No.5,955,646公开了双向异源构建体。美国专利No.5,368,855公开了一种天然存在的双向启动子。美国专利No.5,359,142公开了经过处理以使得在增强基因表达方面存在变化的构建体。美国专利No.5,627,046公开了一种天然存在的双向启动子。美国专利No.5,827,693公开了经修饰的血红蛋白启动子。所有上述参考文献关于双向启动子的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本发明还公开了含有一种或多种突变的包装构建体，所述突变位于编码Gag和Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列中，所述突变可减少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol蛋白所必需的移码或翻译连读。本发明还公开了含有一种或多种突变的包装构建体，所述突变可减少合成Gag-Pro和Gag-Pro蛋白所需的移码或翻译连读。
在I型HIV(HIV-1)和SIV-感染的细胞内，Gag和Gag-Pol天然地由相同的mRNA转录物制备，摩尔比例为约20：1。该比例可由gag和pol或gag和pro读码框之间重叠区中的核糖体移码或连读来实现(Swanstrom，R.，and J.W.Wills.1997.Synthesis，assembly，andprocessing of viral proteins，p.263-334.In J.M.Coffin，S.H.Hughes，and H.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，所述文献关于移码的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。作为成熟病毒体的催化亚基的前体，Pol是病毒体成熟和具备感染性所必需的，并且Pol是否能并入装配中的病毒颗粒中依赖于它与Gag的关联(Id.)。所述gag-pol移码位点由保守性的七核苷酸滑动序列(UUUUUUA)SEQ ID NO：7组成，所述序列下游紧邻一个RNA二级结构区域(Swanstrom，R.，and J.W.Wills.1997.Synthesis，assembly，and processing of viralproteins，p.263-334.In J.M.Coffin，S.H.Hughes，and H.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。当苯丙氨酸和亮氨酸的tRNA(密码子UUUUUA；SEQ ID NO：8)相对于所述gag框滑回一个核苷酸(-1)(UUU UUA；SEQ ID NO：8→UUU UUU；SEQ ID NO：9)并且在所述pol读码框内继续翻译时，就会在所述滑动序列内发生核糖体的物理移码(Jacks，T.，M.D.Power，F.R.Masiarz，P.A.Luciw，P.J.Barr，and H.E.Varmus.1988.Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1gag-pol expression.Nature 331：280-283，所述参考文献关于HIV-1中的核糖体移码的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。例如，所述突变可以破坏移码所必需的环结构。这可以通过改变或移除各个核苷酸以破坏环结构来实现。
例如，图3示出了HIV gag和HIV gag-pol中移码所必需的环结构。图4示出了HIV gag和HIV gag-pol中移码所必需的环结构的改变的序列，所述改变的序列导致移码所必需的环结构被破坏。本发明公开了包装构建体，其中所述第一核酸序列包括移码所必需的gag和gag-pol序列中的突变。任选地，移码所必需的gag序列可以包括点突变。例如，移码所需的所述gag序列可以包括图1中所示的点突变。任选地，所述第一核酸序列可以包括SEQ ID NO：10的核苷酸序列。例如，所述第二核酸序列可以包括单核苷酸插入以及图2中所示的几个点突变。任选地，所述第二核酸序列可以包括SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
不同物种之间的密码子偏好可能明显不同。为增强异种蛋白在特定表达系统(大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中的表达水平，调整所述异种蛋白的密码子频率以便与所述宿主表达系统的密码子频率匹配是十分重要的。这一过程被称为密码子优化。密码子优化是指改变基因序列以使得密码子选择与目的细胞/物种中的有效tRNA池相匹配。密码子优化是一种利用来自小RNA和DNA病毒的基因来增加蛋白表达的有力工具，所述病毒通常含有重叠的读码框以及嵌入编码区内的结构元件；这些特征在大DNA病毒中并不普遍。
使用密码子优化的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的env基因(Andre，S.，B.Seed，J.Eber le，W.Schraut，A.Bul tmann，and J.Haas.1998.Increased immune response elicited by DNA vaccination with asynthetic gp120 sequence with optimized codon usage.J.Virol.72：1497-1503)和gag基因(Deml，L.，A.Bojak，S.Steck，M.Graf，J.Wild，R.Schirmbeck，H.Wolf，and R.Wagner.2001.Multipleeffects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the humanimmunodeficiency virus type 1 Gag protein.J.Virol.75：10991-11001；zur Megede，J.，M.C.Chen，B.Doe，M.Schaefer，C.E.Greer，.M.Selby，G.R.Otten，and S.W.Bamett.2000.Increased expression and immunogenicity of sequence-modifiedhuman immunodeficiency virus type 1 gag gene.J.Virol.74：2628-2635)进行免疫导致所述基因表达增强和针对所述抗原的免疫应答加强。使用许多其他病原性生物进行的类似研究确认了密码子优化会增强DNA疫苗的效率的潜能，所述病原性生物例如李斯特菌属(Listeria)(Nagata，T.，M.Uchijima，A.Yoshida，M.Kawashima，andY.Koide.1999.Codon optimization effect on translationalefficiency of DNA vaccine in mammalian cells：analysis of plasmidDNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261：445-451)，产破伤风毒素细菌(Stratford，R.，G.Douce，L.Zhang-Barber，N.Fairweather，J.Eskola，and G.Dougan.2000.Inf luence of codon usage on the immunogenicity ofa DNA vaccine against tetanus.Vaccine 19：810-815)，原质团(Plasmodium)(Nagata，T.，M.Uchijima，A.Yoshida，M.Kawashima，and Y.Koide.1999.Codon optimization effect on translationalefficiency of DNA vaccine in mammalian cells：analysis of plasmidDNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261：445-451)，人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus)(Cid-Arregui，A.，V.Juarez，and H.zurHausen.2003.A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16that yields enhanced expression of the protein in mammalian cellsand is useful for DNA immunizations tudies.J.Virol.77：4928-4937；Liu，W.，F.Gao，K.Zhao，W.Zhao，G.Fernando，R.Thomas，and I.Frazer.2002.Codon modified human papillomavirustype 16 E7 DNA vaccine enhances cytotoxic T-lymphocyte inductionand anti-tumour activity.Virology 301：43-52)，以及其他病原性生物(Gurunathan，S.，D.M.Klinman，and R.A.Seder.2000.DNAvaccines：immunology，application，and optimization.Annu.Rev.Immunol.18：927-974)。可以使用各种本领域技术人员已知的技术进行密码子优化。例如，可以使用Ramakrishna L，Anand KK，MohankumarKM，Ranga U.J Virol.2004 Sep；78(17)：9174-89中所述的方法。所有引用的参考文献关于密码子优化的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本文还公开了已经进行了密码子优化的包装构建体。例如，可以修饰本文所述的包装构建体以使得所述第一核酸序列是经过密码子优化的。在另一个实施方案中，所述第二核酸序列可以经过密码子优化的。此外，所述第一和第二核酸都可以是经过密码子优化的。
本发明还公开了包装构建体，其中所述构建体能够产生无复制能力的重组体。本发明还公开了包装构建体，其中所述构建体不能产生有复制能力的重组体。如上所述，考虑到反转录载体(特别是能够感染不分裂细胞的慢病毒)的优势，许多研究的目标是获得用于生产纯净的重组病毒储液(不含有复制能力的辅助病毒)的改进方法。通常可以通过将合适的前病毒DNA载体引入哺乳动物细胞(“包装细胞”)中来生产重组反转录病毒，所述细胞可生产将所需重组RNA壳体化所必须的病毒蛋白，但是缺乏包装病毒RNA的信号(
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序列)。因此，虽然所需的反转录病毒的gag、pol和env基因是完整的，但是这些包装系不会释放野生型辅助病毒。然而，当使用含有包装所必需的
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序列的单独载体转染所述细胞时，就可以通过重组产生野生型反转录病毒(Mann et al.(1983)Cell 33：153)。对于所述载体的某些应用(例如基因疗法)来说，上述情况具有明显的安全隐患，特别是使用慢病毒(例如HIV)时。
目前避免由于重组导致产生有复制能力辅助病毒的危险的方法包括在所述用于产生包装系的病毒构建体中进行额外的突变(例如LTR缺失)和将产生病毒体所必需的病毒基因分开放到不同的质粒上。例如，最近已经证实，可以通过在包装细胞中将gag和pol基因与env基因分离开，来生产重组莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)(不含可检测的辅助病毒)(Markowitz et al.(1998)J.Virol.62(4)：1120)。在使用第三种含有
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包装信号的载体共转染上述包装细胞时，会获得含有两种共同编码病毒体生产所需病毒蛋白的不同质粒的包装细胞，这样降低了产生完整反转录病毒所必需的重组事件的发生机率。
本发明公开的构建体可以任选地包括编码核定位信号的核酸序列。此外，本发明所公开的构建体可以任选地包括与编码四环素反式作用子的核酸有效连接的编码核定位信号的核酸序列。例如，本发明所公开的构建体可以包括与编码四环素反式作用子(例如tet-on)的核酸有效连接的编码核定位信号的核酸序列。核定位序列是指导多肽从胞质穿过核膜进入细胞核的序列。所述编码核定位信号的核酸还可以包括转录调控元件。本文的其他部分公开了转录调控元件。所述编码核定位信号的核酸序列的侧翼还可以接有至少一个接头序列，所述接头序列可以编码例如SEQ ID NO：15(GGGGS)，它包括后面接有一个丝氨酸残基的四个甘氨酸残基。接头序列可以是染色体隔离子并且还可以是通用序列。通常，所述接头序列的作用是减少融合蛋白各功能结构域之间的干扰。例如，所述接头序列可以减少与tetR或tetA蛋白、SV40 NLS、VP16的干扰或与ZNF10沉默蛋白的干扰。作为染色体隔离子的接头可以减少本发明所公开的构建体中的可诱导型启动子与组成型启动子之间的干扰，从而减少所述诱导型启动子的渗漏。
本发明还公开了含有本文所公开的包装构建体的细胞系。本文的其他部分还描述了用于生产细胞系的方法。
上文和下文所述的实施方案适用于本文所公开的任何组合物和方法。
系统
本文还公开了使用上文所述的包装构建体的包装系统。例如，包装系统可以包括本发明的包装构建体和本文其他部分所述的表达包膜糖蛋白的核酸构建体。本发明还公开了包装细胞系。用于生产病毒样颗粒的包装细胞系包括靶细胞和本文所公开的包装构建体。包装细胞系还可以包括本文其他部分所述的表达包膜糖蛋白的核酸构建体。本文所用的包膜糖蛋白将可以使得由所述包装构建体产生的颗粒假型化。本文描述了含有能够表达包膜糖蛋白的核酸序列的构建体。例如，所述包膜构建体可以包括水泡性口膜炎病毒的G糖蛋白(VSV G)和莫洛尼氏白血病毒(MLV)的包膜。
本文还公开了包装和表达系统，其中所述包装构建体含有反式编码Gag和Gag-Pro-Pol的核酸。例如，本发明公开了含有第一、第二和第三包装构建体的表达系统。所述第一包装构建体包括含有编码Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸构建体，其中所述编码Gag的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接。所述第二包装构建体包括含有编码Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列的第二核酸构建体，其中所述编码Gag-Pro-Pol的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接。所述第三核酸构建体包括编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。所述含有上述构建体的包装和表达系统还可以包括含有至少一个目的基因的基因转移构建体。
本发明还公开了一种含有第一核酸构建体和第二核酸构建体的包装系统，所述第一核酸构建体包括编码Gag多聚蛋白的第一突变核酸，其中所述第一突变核酸与一个转录调控元件有效连接，所述第二核酸构建体包括编码Gag-Pol多聚蛋白的第二突变核酸，其中所述第二突变核酸与一个转录调控元件有效连接。所述第一和第二核酸构建体中的突变会使得所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表达比例可形成病毒颗粒。任选地，所述包装系统的第一突变核酸可以与最小CMV启动子有效连接，并且所述第二突变核酸可以与所述热休克蛋白启动子有效连接。本文其他部分描述了适用于所述包装系统的构建体的其他启动子。
可以在体外、在体内和活体外(exvivo)条件下使用本发明的构建体和病毒颗粒，以将目的序列引入靶细胞中(例如真核细胞)或哺乳动物体内(例如人或其他哺乳动物或脊椎动物)。所述细胞可通过商业途径获得或获取自保藏单位，或例如通过活组织检查而直接获自哺乳动物。所述细胞可以获取自其将返回的哺乳动物；或者所述细胞可以获取自相同或不同物种的另一/不同哺乳动物。例如，使用本发明的包装细胞系或病毒颗粒可以将目的DNA引入到非人细胞(例如猪细胞)中，然后再将所述细胞引入到人体内。或者，例如在需要将本发明的病毒颗粒送递到进行基因疗法的哺乳动物体内的情况下，可不必将所述细胞从哺乳动物体内分离出来。
例如在Kasid et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：473(1990)；Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.，323：570(1990)；Williams etal.，Nature，310：476(1984)；Dick et al.，Cell，42：71(1985)；Keller et al.，Nature，318：149(1985)；和Anderson et al.，U.S.Pat.No.5,399,346中描述了活体外疗法，上述文献关于活体外疗法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
用于将病毒颗粒直接给予(引入)哺乳动物的方法通常是本领域技术人员公知的。例如，给药模式包括肠胃外、注射、粘膜、全身、植入、腹膜内、口腔、皮内、经皮肤(例如以缓释聚合物形式)、肌内、静脉内(包括输注和/或快速浓注)、皮下、局部、硬膜外等。优选地，本发明的病毒颗粒可以通过可药用载体来给药，所述可药用载体例如盐水、无菌水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。
给予哺乳动物的本发明的病毒颗粒的剂量(包括给药频率)随各种因素而变，包括给药模式和给药途径；受体哺乳动物的体型、年龄、性别、健康状况、体重和饮食；所要治疗的疾病或障碍症状的性质和程度；同期治疗的种类、治疗频率和所期望的效果。
本发明公开了含有本文所述的包装构建体的表达系统，其中所述表达系统还包括含有编码包膜糖蛋白的核酸序列的包膜核酸构建体，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；并且所述表达系统还包括含有一个或多个目的序列的基因转移构建体。本发明还公开了表达系统，其中包膜糖蛋白有助于进入细胞。任选地，所述包膜糖蛋白可以是病毒包膜糖蛋白(例如水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G))或者是本领域已知可介导进入细胞的几种其它病毒糖蛋白之一。
任选地，所述表达系统还包括编码核定位信号的构建体，所述构建体含有与上文所述编码四环素反式作用子的核酸有效连接的核定位信号编码核酸序列。上文公开了核定位序列。例如，所述编码核定位信号的构建体从5’端至3’端还依次包括巨细胞病毒启动子、第一接头编码序列、第二核定位信号、第二接头序列和四环素反式作用子编码序列，其中所述被编码的接头为GGGGS(SEQ ID NO：15)。
本发明还公开了含有第一包装构建体并同时含有第二包装构建体的表达系统，其中所述第一包装构建体包括含有编码Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸构建体，其中所述编码Gag的核酸序列含有一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接；所述第二包装构建体包括含有编码Gag-Pol多聚蛋白的核酸序列的第二核酸构建体，其中所述编码Gag-Pol的核酸序列含有一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接。所述表达系统还包括第三核酸构建体，所述第三核酸构建体包括编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。所述表达系统还包括含有一个或多个目的序列的基因转移构建体。任选地，所述表达系统还可以包括编码核定位信号的构建体，所述构建体含有与编码四环素反式作用子的核酸有效连接的核定位信号编码核酸序列。核定位序列是指导多肽从胞质穿过核膜进入细胞核的序列。
上文公开的表达系统还可以包括含有编码核定位信号的第四核酸序列的第四核酸构建体，所述核定位信号与四环素反式作用子有效连接。所述第四核酸构建体还可以包括转录调控元件，例如启动子。所述核定位信号编码序列的侧翼还可以接有至少一个接头序列。所述第四核酸序列从5’端至3’端还可以依次包括巨细胞病毒启动子、编码SEQ IDNO：15(GGGGS)的核酸序列、编码核定位信号的核酸序列、编码SEQ IDNO：15(GGGGS)的核酸序列和编码四环素反式作用子的核酸序列。
本发明还公开了含有本文其他部分所公开的表达系统的细胞系。
本发明还公开了包膜核酸构建体，所述包膜核酸构建体包括编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。所述包膜糖蛋白可以有助于进入细胞。任选地，所述包膜糖蛋白可以是病毒的包膜糖蛋白。在一个实例中，所述包膜糖蛋白可以是水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。
本发明还公开了下述实施方案，其中顺式作用元件是进行壳体化、反转录和整合所必需的。所提供的顺式作用元件与本文所述构建体可以是反式或顺式(in cis)的。例如，缺乏能够表达Pol蛋白的核酸序列的包装构建体可以任选地包括能够表达Vpr-反转录病酶-整合酶蛋白的核酸序列(顺式)。或者，包装系统还可以包括能够表达Vpr-反转录病酶-整合酶蛋白的单独的核酸构建体(反式)，所述包装系统包括缺乏能够表达Pol蛋白的核酸序列的包装构建体。
本发明还公开了一种基因转移方法，包括将本文其他部分所述的包装核酸构建体引入细胞中，并且将含有编码包膜糖蛋白的核酸序列的包膜构建体引入所述细胞中，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接，并且将本文其他部分所述的含有一个或多个目的基因的基因转移构建体引入细胞；使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下，所述病毒样颗粒含有一个或多个目的基因或目的序列。
本发明还公开了含有外源目的序列的细胞，其中使用上文所述的基因转移方法将所述目的序列转移到细胞内。
本文所述构建体可以任选地包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物被用于确定所述基因是否已经被送递到细胞内，并且所述基因在被送递后是否立即表达。优选的标记基因为大肠杆菌lacZ基因(编码β半乳糖苷酶)和绿色荧光蛋白基因。
在一些实施方案中，所述标记可以是可筛选标记。适合用于哺乳动物细胞的可筛选标记的实例为二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸腺嘧啶核苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这类可筛选标记被成功地转移到哺乳动物宿主细胞内时，如果将细胞置于筛选压力下则被转化的哺乳动物宿主细胞可以存活下来。存在两类广泛应用的不同的筛选方法。第一类是基于细胞代谢并且使用突变细胞系，所述细胞系缺少不依赖于补充培养基独立生长的能力。两个实例是CHO DHFR细胞和小鼠LTK细胞。上述细胞缺少在不添加养分(例如胸腺嘧啶脱氧核苷或次黄嘌呤)的情况下生长的能力。因为上述细胞缺少完整的核苷酸合成途径中所必需的某些基因，所以它们在补充培养基中未提供所缺少的核苷酸的条件下无法存活。补充所述培养基的一种替代方法是将完整的DHFR或TK基因引入缺少对应基因的细胞内，由此改变其生长需求。未使用DHFR或TK基因转化的细胞个体将不能在非补充培养基中存活。
第二类方法是优势选择，这是指可用于任何细胞类型中且不需要使用突变细胞系的筛选方案。上述方案通常使用药物来阻碍宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞将会表达可赋予细胞抗药性的蛋白并且将会在筛选中存活下来。这种优势选择的实例使用药物新霉素(Southern P.and Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、麦考酚酸(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5：410 413(1985.These))。所引用的参考文献关于优势选择实例的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。上述三个实例采用受真核细胞调控的细菌基因来分别赋予细胞对适当的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(麦考酚酸)或潮霉素的抗性。其它的药物包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
本发明还公开了包膜核酸构建体，所述包膜核酸构建体包括编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。所述包膜糖蛋白可以有助于进入细胞。任选地，所述包膜糖蛋白可以是病毒的包膜糖蛋白。在一个实例中，所述包膜糖蛋白可以是水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。
方法
本文公开了制备病毒样颗粒的方法。例如，一种制备病毒样颗粒的方法包括使用本发明的包装构建体。本发明还公开了制备病毒样颗粒的方法，包括将任一种上文所述的包装核酸构建体引入细胞中；并且将包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；并且使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下。
本发明还公开了制备病毒样颗粒的方法，包括将任一种上文所述的包装核酸构建体引入细胞中；并且将包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；并且使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下。
可以通过将选定的慢病毒序列插入到合适的载体(例如，含有适合的调节元件(例如启动子和增强子)、限制性克隆位点、标记基因等的市售表达质粒)中来制备病毒样颗粒。这可以使用本领域公知的标准克隆技术来实现，包括PCR。所要克隆到这类载体中的慢病毒序列可以获取自任何已知来源，包括慢病毒基因组RNA或与病毒RNA对应的cDNA。适合的与慢病毒基因组RNA对应的cDNA是市售的，并且包括例如含有HIV基因组序列的pNLENV-1(Maldarelli et al.(1991)J.Virol.65：5732)，该文献关于适合的与慢病毒基因组RNA对应的cDNA的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。其他反转录病毒(例如慢病毒)cDNA克隆的来源包括位于马里兰州洛克威尔的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。上述参考文献关于目前可获得的与慢病毒基因组RNA对应的cDNA实例的教导全部通过引用的方式纳入本说明书，这些克隆全部通过引用的方式纳入本说明书，例如可用于本文所公开的组合物和方法中的反转录病毒cDNA克隆。
在反转录病毒序列(例如gag、pol、env、LTR和顺式作用序列)被克隆到适合的载体(例如表达载体)中之后，则可以按照本文所述对其进行修饰。在一个实施方案中，由质粒扩增的慢病毒序列(例如pNLENV-1)可以被克隆到适合的骨架载体中(例如pUC载体(例如pUC19)(University of California，San Francisco)、pBR322或pcDNA1(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California))，然后通过缺失(使用限制性内切酶)、置换(例如使用定向诱变)或其他(例如化学)修饰方法修饰来防止选定的慢病毒序列表达或发挥功能。如上所述，可以移除或突变gag、pol和env基因的一部分以及选定的附加基因。例如，在一个实施方案中，对编码Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列进行突变以减少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol多聚蛋白所必需的移码或翻译连读。
本发明的每种载体均可以含有编码所需慢病毒蛋白(例如gag、pol和env)或指导所需慢病毒功能(例如包装RNA)所必需的最小慢病毒序列。即优选地，所述载体其余部分为非病毒来源的或者来自于非慢病毒(例如HIV)的其他病毒。在一个实施方案中，对本发明的慢病毒载体中所含的慢病毒LTR进行修饰，所采用的方法是通过用来自另一种病毒的功能相似的序列置换所述LTR的一部分，从而产生杂合LTR。例如，起启动子作用的所述慢病毒5’LTR可以被CMV启动子或来自不同反转录病毒(例如MuLV或MuSV)的LTR部分地置换。替代地或额外地，所述慢病毒3’LTR可以被来自另一种基因或反转录病毒的多腺苷酸化序列部分地置换。任选地，所述HIV-1的3’LTR的一部分被兔β-珠蛋白基因的多腺苷酸化序列置换。通过以这种方式使本发明载体内的慢病毒序列总体上最少，载体之间发生重组的机率显著减少，所述重组会导致产生有复制能力的辅助慢病毒。
任何适合的表达载体均可用于本发明。如上所述，适合的表达构建体可以包括人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子构建体。所述巨细胞病毒启动子可以获自任何适合的来源。例如，完整的巨细胞病毒增强子-启动子可以来源于人巨细胞病毒(hCMV)。其他用于获得CMV启动子的适合来源包括商业来源，例如Clontech(Montain View，California)、Invitrogen(Carlsbad，California)和Stratagene(La Jolla，California)。本发明可以使用部分或全部的CMV启动子。其他可用于实施本发明的构建体的实例包括使用MuLV、SV40、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、疫苗P7.5、热休克蛋白和大鼠β-肌动蛋白启动子的构建体。在某些情况下，例如RSV和MuLV，上述启动子-增强子元件位于所述LTR序列内或者邻近所述LTR序列。
基因转录、翻译、加工和分泌所必需的适合的调节序列在本领域中是已知的，并且可被选择用于在合适的细胞内指导所需蛋白的表达。因此，本文所用的术语“调节序列”包括任何位于基因翻译区5’端(上游)或3’端(下游)并可调控或影响所述基因的表达的遗传元件，例如增强子和启动子序列。例如，Goeddel，Geneexpression Technology：Methodsin Enzymology，185页，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中讨论了这类调节序列，所述文献关于调节序列的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。本领域普通技术人员能够选择可用于本发明的调节序列。
在一个实施方案中，本发明在本文公开的构建体内使用了诱导型启动子，使得选定基因的转录可以被启动或关闭。这将由细胞毒性病毒蛋白的表达导致的细胞毒性减到最少，增加了含有所述载体的包装细胞的稳定性。例如，高水平表达的VSV-G(包膜蛋白)和Vpr可能是有细胞毒性的(Yee，J.-K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，91：9654-9568(1994)，并且因此可以利用诱导型启动子系统(例如诱导型Tet操纵子系统(GIBCO BRL，Carlsbad，California))来调控上述蛋白在本发明的包装细胞内的表达，使得可以利用所述培养基中的四环素浓度来精确调节基因的表达(即生成反转录病毒颗粒)。即在存在四环素的情况下使用Tet操纵子系统，四环素与Tet反式作用子融合蛋白(tTA)结合，防止tTA与所述Tet操纵子序列结合并且使得所述基因在Tet操纵子序列的调控下表达(Gossen et al.(1992)PNAS 89：5547-5551)，所述文献关于tTA和使得所述基因在Tet操纵子序列的调控下表达的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。在不存在四环素的情况下，tTA与Tet操纵子序列结合，防止所述基因在Tet操纵子的调控下表达。
其他可用于受控地表达所述蛋白的诱导型操纵子系统的实例——其中所述蛋白提供了假型包膜——为：1)响应于金属离子或糖皮质激素的诱导型真核启动子(例如金属硫蛋白启动子)；和2)大肠杆菌的LacSwitchTM诱导型哺乳动物表达系统(Stratagene)(La Jolla，California)。简言之，在所述大肠杆菌的乳糖操纵子中，所述Lac抑制子以同源四聚体的形式与lac操纵子结合，阻断所述lac2基因的转录。诱导剂(例如异乳糖(生理诱导剂)或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，合成诱导剂))与Lac抑制子结合，导致发生构象变化并且有效地降低所述抑制子对操纵子的亲和力。当将所述抑制子从操纵子中移出时，由所述乳糖操纵子调控的转录会继续进行。
本发明还公开了选择性调节目的序列表达的方法，包括在合适于调节目的序列的条件下将本文所述的基因转移构建体引入靶细胞内。本文公开的方法还可以被用于指导目的序列以组织特异性方式表达。例如，基因转移构建体可以包括组织特异性TCE，所述组织特异性TCE可以被用于驱动目的序列在特定组织中表达。这种基因转移载体可与包装构建体联合使用来制备本文所述的病毒颗粒。然后所述病毒颗粒可以被引入合子中。任选地，可以使用本文所公开的用于形成转基因动物的方法来实现组织特异性表达，其中所述目的序列的表达处于可诱导/可逆转的TCE的调控下。在这种动物中，所述目的序列的表达可以被限制于例如DOX的给药位点上。这样，目的序列的表达将仅发生在DOX给药位点上。
本发明还公开了将所述使用本发明方法形成的病毒颗粒给予受试者的方法。可以在体外、在体内和活体外使用本发明的构建体和病毒颗粒将目的序列引入靶细胞(例如哺乳动物细胞)中或哺乳动物(例如人)体内。所述细胞可通过商业途径获得或获取自保藏单位，或者例如通过活组织检查而直接获自哺乳动物。所述细胞可以获取自其将返回的哺乳动物；或者所述细胞可以获取自相同或不同物种的另一/不同哺乳动物。例如，使用本发明的包装细胞系或病毒颗粒可以将目的DNA引入到非人细胞(例如猪细胞)中，然后再将所述细胞引入到人体内。或者，例如在需要将本发明的病毒颗粒送递到进行基因疗法的哺乳动物体内的情况下，可不必将所述细胞从哺乳动物体内分离出来。
例如在Kasid et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：473(1990)；Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.，323：570(1990)；Williams etal.，Nature，310：476(1984)；Dick et al.，Cell，42：71(1985)；Keller et al.，Nature，318：149(1985)；和Anderson et al.，U.S.Pat.No.5,399,346中描述了活体外疗法，上述文献关于活体外疗法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本发明还公开了将所述使用本发明方法形成的病毒颗粒给予受试者的方法。通常，成功的抗病毒疫苗大多数依赖于减毒活病毒。候选HIV减毒活疫苗并不理想，因为它们具有逆转、重组或突变的危险。其他现有的候选HIV疫苗在形成针对原代HIV分离物的细胞毒性T细胞免疫应答和普遍有效的中和抗体方面存在困难。已经证明病毒样颗粒(VLP)可以被安全地给予动物和人类患者，并且是细胞和体液免疫应答的强有力的和有效的刺激物。因此，VLP可用作HIV疫苗。嵌合HIV-1VLP对早期VLP设计进一步作出改进，产生了得到增强的免疫刺激，所述嵌合HIV-1VLP是使用HIV或SIV衣壳蛋白加上HIV免疫表位和免疫刺激分子构建的。经由粘膜表面给予VLP疫苗也是一种极具前景的策略，使用该方法可诱发粘膜及全身的体液和细胞免疫应答。此外，关于抗原加工以及通过树突细胞(DC)呈递特定(particulate)抗原的新信息已形成用于改进的候选VLP疫苗的新策略。
用于将病毒颗粒直接给予(引入)哺乳动物的方法通常是本领域技术人员已知的。例如，给药模式包括肠胃外、注射、粘膜、全身、植入、腹膜内、口腔、皮内、经皮肤(例如以缓释聚合物形式)、肌内、静脉内(包括输注和/或快速浓注)、皮下、局部、硬膜外等。优选地，本发明的病毒颗粒可以通过可药用载体来给药，所述可药用载体例如盐水、无菌水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。
给予哺乳动物的本发明的病毒颗粒的剂量(包括给药频率)随各种因素而变，包括给药模式和给药途径；受体哺乳动物的体型、年龄、性别、健康状况、体重和饮食；所要治疗的疾病或障碍症状的性质和程度；同期治疗的种类、治疗频率和所期望的效果。
本发明公开了含有本文所述的包装构建体的表达系统，其中所述表达系统还包括含有编码包膜糖蛋白的核酸序列的包膜核酸构建体，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；并且所述表达系统还包括含有一个或多个目的序列的基因转移构建体。本发明还公开了表达系统，其中包膜糖蛋白有助于进入细胞。任选地，所述包膜糖蛋白可以是病毒包膜糖蛋白，例如水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。
任选地，所述表达系统还包括编码核定位信号的构建体，所述构建体含有与编码四环素反式作用子(例如tet-on)的核酸有效连接的核定位信号编码核酸序列。核定位序列是指导多肽从胞质穿过核膜进入细胞核的序列。所述编码核定位信号的核酸还可以包括转录调控元件。本文的其他部分公开了转录调控元件。所述编码核定位信号的核酸序列的侧翼还可以接有至少一个接头序列，所述接头序列可以编码例如SEQ ID NO：15(GGGGS)。接头序列还可以是通用序列。所述编码核定位信号的构建体从5’端至3’端还可以依次包括巨细胞病毒启动子、第一接头编码序列、第二核定位信号、第二接头序列和四环素反式作用子编码序列，其中所述被编码的接头为GGGGS(SEQ ID NO：15)。
本发明还公开了含有第一和第二包装构建体、第三核酸构建体和基因转移构建体的表达系统。所述第一包装构建体包括含有编码Gag蛋白的核酸序列的第一核酸构建体，其中所述编码Gag的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接。所述第二包装构建体包括含有编码Gag-Pol蛋白的核酸序列的第二核酸构建体，其中所述编码Gag-Pol的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接。所述表达系统还包括第三核酸构建体，所述第三核酸构建体包括编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。所述表达系统还包括含有一个或多个目的序列的基因转移构建体。任选地，所述表达系统还可以包括编码核定位信号的构建体，所述构建体含有与编码四环素反式作用子的核酸有效连接的上述核定位信号编码核酸序列。核定位序列是指导多肽从胞质穿过核膜进入细胞核的序列。
此外，所述编码核定位信号的核酸还可以包括转录调控元件。本文的其他部分公开了转录调控元件。所述编码核定位信号的核酸序列的侧翼还可以接有至少一个接头序列，所述接头序列可以编码例如SEQ ID NO：15(GGGGS)。所述编码核定位信号的构建体从5’端至3’端还依次包括巨细胞病毒启动子、第一接头编码序列、第二核定位信号、第二接头序列和四环素反式作用子编码序列，其中所述被编码的接头为GGGGS(SEQ IDNO：15)。
上文公开的表达系统还可以包括含有编码核定位信号的第四核酸序列的第四核酸构建体，所述核定位信号与四环素反式作用子有效连接。所述第四核酸构建体还可以包括转录调控元件，例如启动子。如上所述，所述核定位信号编码序列的侧翼还可以接有至少一个接头序列。所述第四核酸序列从5’端至3’端还可以依次包括巨细胞病毒启动子、编码SEQ ID NO：15(GGGGS)的核酸序列、编码核定位信号的核酸序列、编码SEQ ID NO：15(GGGGS)的核酸序列和编码四环素反式作用子的核酸序列。
本发明还公开了含有本文其他部分所公开的表达系统的细胞系。
本发明还公开了一种基因转移方法，包括将本文其他部分所述的包装核酸构建体引入细胞中，并且将包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接，并且将种本文其他部分所述的含有一个或多个目的基因的基因转移构建体引入细胞；使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下。所述病毒样颗粒含有一个或多个目的基因或目的序列。
本发明还公开了含有外源目的序列的细胞，其中使用上文所述的基因转移方法将所述目的序列转移到细胞内。
本发明还公开了由目的基因制备重组蛋白的方法，包括在合适于使细胞表达重组蛋白的条件下将靶细胞与病毒颗粒接触，所述病毒颗粒含有本文其他部分所公开的目的基因。例如，可以使所述靶细胞在体外或在体内与所述病毒颗粒接触。
本发明还公开了由目的基因或目的序列制备重组蛋白的方法，包括在合适于表达重组蛋白的条件下将本文所公开的基因转移构建体引入靶细胞中，其中所述目的序列为编码所述重组蛋白的核酸序列。如本文其他部分所公开的，所述重组蛋白的表达可以是可调节的。例如，所述重组蛋白的表达可以是可诱导的和可逆转的。
本发明还公开了制备重组蛋白的方法，包括在合适于使细胞表达所述重组蛋白的条件下将靶细胞与病毒颗粒接触，所述病毒颗粒含有一个或多个本文其他部分公开的编码所述重组蛋白的目的基因或序列。例如，可以使所述靶细胞在体外或在体内与所述病毒颗粒接触。
本发明还公开了制备重组蛋白的方法，包括将含有与调节子序列有效连接的启动子的第一核酸构建体引入靶细胞中，所述调节子序列与至少一个VP16序列有效连接；使所述靶细胞处于可使所述待整合的第一核酸序列整合至所述靶细胞基因组中并且形成经修饰的靶细胞的条件下；将第二核酸构建体引入步骤(b)的经修饰的靶细胞中，所述第二核酸构建体含有与目的序列有效连接的调节子靶序列；其中所述目的序列为编码重组蛋白的核酸序列；使所述经修饰的靶细胞处于可使所述重组蛋白表达的条件下。
本发明还公开了制备重组蛋白的方法，包括将含有与调节子序列有效连接的启动子的第一核酸构建体引入靶细胞中，所述调节子序列与至少一个VP16序列有效连接；将第二核酸构建体引入步骤(a)的同一靶细胞中，所述第二核酸构建体含有与目的序列有效连接的调节子靶序列，其中所述目的序列为能够编码重组蛋白的核酸序列；并且使所述靶细胞处于可使所述待整合的第一和第二核酸序列整合至所述靶细胞基因组中并且形成经修饰的靶细胞的条件下；并且使所述经修饰的靶细胞处于可使所述重组蛋白表达的条件下。
例如，所述第一核酸构建体可以包括SEQ ID NO：44的序列。所述第二核酸序列可以是任何本文其他部分所述的任一基因转移载体。例如，所述第二核酸可以包括与转录调控元件有效连接的目的序列，所述转录调控元件与调节子靶序列有效连接。所述第一核酸构建体还可以包括IRES或IRES样序列。例如，所述目的序列可以与IRES或IRES样序列有效连接，所述IRES或IRES样序列与可筛选标记有效连接。
所述制备重组蛋白的方法可以使用任何已知的细胞转染技术。本文其他部分公开了用于将细胞与病毒颗粒接触的其他方法。通常对于体外方法而言，在适合的转染条件下，将细胞与所述构建体或载体一起在适合的培养基中孵育(即培养)，这在本领域中是公知的。例如，可以使用例如电穿孔和磷酸钙沉淀的方法(O′Mahoney et al.(1994)DNA & CellBiol.13(12)：1227-1232)。
本发明还公开了含有本文公开的基因转移构建体的疫苗。本发明还公开了在受试者体内产生免疫应答的方法，包括给予所述受试者本文公开的基因转移构建体。
此外，本发明公开了在受试者体内产生免疫应答的方法，其中所述免疫应答为针对HIV的免疫应答，包括给予所述受试者本文公开的基因转移构建体，其中所述目的序列为能够表达HIV抗原的序列。
本文所用的特异性针对特定病原的“疫苗”或“用于接种受试者的组合物”是指这样一种制品，当将所述制品给予受试者时，会在受试者体内产生免疫原性应答。本文所用的“免疫原性”应答是指可赋予所述受试者针对所述病原的保护性免疫力的免疫应答。不希望受限于理论，人们认为免疫原性应答是由于产生中和抗体(即体液免疫应答)或由于免疫系统的细胞毒性细胞(即细胞免疫应答)或二者同时所导致的。本文所用的“免疫原性抗原”是指这样一种抗原，当将该抗原引入受试者体内时或者当在宿主或受试者细胞内合成该抗原时，它可以诱导免疫原性应答。本文所用的疫苗或免疫接种组合物的“有效量”是指这样一个量，当按照该量给予受试者所述疫苗或免疫接种组合物时，其足以赋予所述受试者保护性免疫力。历史上，人们已经了解到疫苗含有一种或多种特定分子组件或结构作为有效成分，所述特定分子组件或结构包含病原体，特别是病原体表面。这类结构可以包括表面组件例如通常存在于病原性生物中的蛋白、复合糖和/或复脂。
然而，应该强调的是本文所用的术语“疫苗”或“用于接种受试者的组合物”并不限于上述段落中所总结的一般含义。本文所用的这些术语还指本发明的目的序列或含有所述目的序列的组合物。所述目的序列促使在受试者细胞内生物合成一种或多种由所述目的序列编码的特定基因产物，其中所述基因产物是某种病原体的特异性抗原。然后所述生物合成的抗原起免疫原作用。已经注意到，所述目的序列以及由此而来的疫苗可以是任何编码所述特定免疫原性抗原的核酸。在本发明的一个优选实施方案中，所述疫苗的目的序列为DNA。为了分子生物学、细胞生物学和病毒免疫学领域技术人员的方便起见，所述目的序列可以包括并入有另外的基因或特定序列的质粒或载体(参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook，Fritsch andManiatis，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Current Protocols in Molecular Biology.Ausubel et al.，John Wiley and Sons，New York 1987(季刊)，上述文献关于质粒或载体的实例和用途的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
近年来已经设计了数种重组亚基和病毒疫苗。美国专利No.4,810,492描述了用作疫苗中的抗原的日本脑炎病毒(JEV)的E糖蛋白的生产，所述专利关于重组亚基和病毒疫苗的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。将对应的DNA克隆到表达系统中以便在适合的宿主细胞(例如大肠杆菌、酵母或高等动物细胞培养物)中表达所述抗原蛋白。美国专利5,229,293公开了含有JEV E蛋白基因的重组杆状病毒，所述专利关于将DNA克隆到表达系统中以表达抗原蛋白的方法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。所述病毒被用于感染培养物中的昆虫细胞使得可以生产并回收所述E蛋白用作疫苗。
美国专利5,021,347公开了一种重组痘苗病毒基因组，其中已经整合有JEV E蛋白基因。所述活重组痘苗病毒可被用作进行抗JEV免疫的疫苗。美国专利5,494,671公开了重组痘苗病毒和杆状病毒，其中所述病毒整合有编码登革血清型2(dengue serotype 2)、登革血清型4和JEV E蛋白C-末端截短的基因。美国专利5,514,375公开了各种表达一部分JEV开放读码框(从prM至NS2B)的重组痘苗病毒。这些pox病毒诱导形成含有所述经加工的M蛋白和所述E蛋白的胞外颗粒。两种编码上述JEV蛋白的重组病毒可在小鼠体内产生高效价的中和抗体和血凝素抑制抗体，以及保护性免疫力。两次免疫处理后这些效应的程度要大于一次免疫处理后这些效应的程度。将含有JEV prM/M和E蛋白编码基因的重组痘苗病毒给予小鼠时，其可赋予小鼠保护性免疫力(Konishi et al.，Virology 180：401-410(1991))。已经证明使用含有JEV prM和E基因的重组痘苗病毒感染的Hela细胞可产生亚病毒颗粒(Konishi et al.，Virology 188：714-720(1992))。Dmitriev等报导使用编码蜱传脑炎病毒的结构蛋白和某些非结构蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠(J.Biotechnology 44：97-103(1996))。上述每篇参考文献关于重组痘苗病毒的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
已经制备了重组病毒载体来作为登革热的病毒疫苗。Zhao等(J.Virol.61：4019-4022(1987))制备了含有登革血清型4的结构蛋白和NS1的重组痘苗病毒，并且在使用所述重组病毒感染哺乳动物细胞之后实现了表达。使用重组杆状病毒感染靶昆虫细胞获得了类似的表达(Zhang et al.，J.Virol.62：3027-3031(1988))。Bray等(J.Virol.63：2853-2856(1989))还报道了基于E蛋白基因的重组痘苗登革疫苗，当使用所述疫苗进行攻击时其可赋予小鼠抗登革脑炎的保护性免疫力。Falgout等(J.Virol 63：1852-1860(1989))和Falgout等(J.Virol.64：4356-4363(1990))报道了类似的结果。Zhang等(J.Virol62：3027-3031(1988))证明当使用编码登革E和NS1蛋白的重组杆状病毒进行攻击时，其同样会保护小鼠免遭登革脑炎的伤害。其中将结构基因和非结构基因并入重组病毒疫苗中的其他组合未能产生明显的免疫力(Bray et al.，J.Virol.63：2853-2856(1989))。同时，当使用表达所述E蛋白的重组杆状病毒进行免疫时，猴未能产生出针对登革病毒攻击的完全的保护性免疫力(Lai et al.(1990)pp 119-124 in F.Brown，R.M.Chancock，H.S.Ginsberg and R.Lerner(eds.)Vaccines：90Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。上述每篇参考文献关于将基因并入重组病毒疫苗中的方法以及将结构基因和非结构基因并入重组病毒疫苗中的实例的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
已经报道了使用断奶小鼠作为模型，使用重组DNA制品进行免疫来抵御SLEV和登革2病毒(Phillpotts et al.，Arch.Virol.141：743-749(1996)；Kochel et al.，Vaccine 15：547-552(1997))。编码SLEV的prM和E基因的质粒DNA可以通过单剂或双剂的DNA免疫来针对SLEV攻击提供部分保护。在这些实验中，对照小鼠的存活率为约25％，并且在所述DNA免疫小鼠体内未检测到保护性抗体(Phillpotts etal.，Arch.Virol.141：743-749(1996))。在接受了三次皮内注射含有prM的重组登革-2质粒DNA的小鼠中，全部小鼠均产生了抗登革-2中和抗体，并且接受了对应E基因的小鼠中有92％同样产生了中和抗体(Kochel et al.，Vaccine 15：547-552(1997))。然而，使用双剂方案进行的攻击实验未能保护小鼠免遭致命的登革2病毒攻击。仅使用某些虫媒病毒(例如JEV)的蛋白的重组疫苗不会导致高抗体滴度，所述重组疫苗是通过在细胞培养物中生物合成表达然后纯化或抗原处理来产生的。同时，与所述全病毒制品类似，这些疫苗也具有针对宿主抗原或所述载体产生有害变态反应的危险。抗登革病毒和WNV疫苗的开发水平比较落后，并且这类基于病毒或基于重组蛋白的疫苗面临着与上文提及的疫苗类似的问题。上述每篇参考文献关于将基因并入重组病毒疫苗中的方法、将结构基因和非结构基因并入重组病毒疫苗中的实例以及使用重组DNA制品进行免疫的方法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本发明还公开了制备抗体的方法。例如，本发明公开了一种通过在受试者体内诱发免疫应答来诱发生产抗体的体内方法。所述体外方法包括将按照本文其他部分公开的方法制备的重组蛋白引入受试者体内，其量足以诱发免疫应答。例如，可以在体外或体内将所述靶细胞与本文公开的基因转移构建体或病毒颗粒接触。
本发明还公开了生成抗目的蛋白的抗体的方法，包括：(a)将本文其他部分公开的基因转移构建体引入靶细胞中，其中所述基因转移构建体的转录调控元件为可调节或组成型的，其中所述目的序列能够编码目的蛋白；(b)使所述细胞处于可使步骤(a)中的核酸构建体整合到所述靶细胞的基因组中并且形成经修饰的靶细胞的条件下；(c)将步骤(b)的经修饰的靶细胞引入所述受试者体内；(d)给予所述受试者有效量的能够调节所述基因转移构建的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱导所述目的序列的表达，其中所述目的序列的表达量足以诱发免疫应答，并且其中所述免疫应答会生成针对所述目的蛋白的抗体。此外，可以分离由本文所述方法产生的抗体。
本发明还公开了鉴别可结合目的抗原的抗体的方法，所述方法包括：使疑似含有可结合目的抗原的抗体的样本与可表达所述目的抗原的靶细胞接触，并且确定样本中的抗体是否与所述由靶细胞表达的目的抗原结合，由此将所述结合目的抗原的抗体鉴别为可结合目的抗原的抗体。表达所述目的抗原的靶细胞可以是按照本文所述方法制成的靶细胞。所公开的鉴别可结合目的抗原的抗体的方法中所用的靶细胞可以是含有本文其他部分所述的基因转移构建体的靶细胞。例如，本发明还公开了鉴别可结合目的抗原的抗体的方法，所述方法包括：使疑似含有可结合目的抗原的抗体的样本与可表达所述目的抗原的靶细胞接触，其中所述靶细胞含有一种或多种权利要求1、55、208、247和286所述的核酸构建体；并且确定样本中的抗体是否与所述由靶细胞表达的目的抗原结合，由此将所述结合目的抗原的抗体鉴别为可结合目的抗原的抗体。
本发明还公开了生成抗目的蛋白的抗体的方法，包括：(a)将本文其他部分公开的基因转移构建体引入靶细胞中，其中所述基因转移构建体的转录调控元件为可调节或组成型的，其中所述目的序列能够编码目的蛋白；(b)使所述细胞处于可使步骤(a)中的核酸构建体整合到所述靶细胞的基因组中并且形成经修饰的靶细胞的条件下；(c)将步骤(b)的经修饰的靶细胞引入所述受试者体内；(d)给予所述受试者有效量的能够调节所述基因转移构建的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱发所述目的序列的表达，其中所述目的序列的表达量足以诱发免疫应答，并且其中所述免疫应答会生成针对所述目的蛋白的抗体。
此外，在该方法中可以使用不表达所述目的抗原的对照，使得疑似含有可结合目的抗原的抗体但实际不含可结合目的抗原的抗体的样本不会被鉴别为可结合所述目的抗原的抗体。所公开的鉴别可结合目的抗原的抗体的方法还可以被用于鉴别中和抗体。
本文所用术语“抗体”包括但不限于任何类的全免疫球蛋白(即完整的抗体)。天然抗体通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。通常，每条轻链均通过一个共价二硫键与一条重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间所述二硫键的数量是不相同的。每条重链和轻链还具有均匀分布的链内二硫键。每条重链均在一端具有一个可变区(V(H))，其后接有几个恒定区。每条轻链均在一端具有一个可变区(V(L))，并且在其另一端具有一个恒定区；所述轻链恒定区与所述重链第一恒定区并排，并且所述轻链可变区与所述重链可变区并排。人们认为特定的氨基酸残基在所述轻链和重链可变区之间形成了界面。根据其恒定区的氨基酸序列，来自任何脊椎动物的抗体的轻链均可被划为两种明显不同的类型，称为kappa(K)和lambda(λ)。根据其重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为不同的类型。存在五大类人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几类还可被分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将可识别小鼠中的对应类别。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
本文使用术语“可变”来描述抗体之间序列不同的可变区的某些部分，并且决定了每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，在抗体的整个可变区中变异性通常并非均匀地分布。在轻链和重链可变区中，变异性通常集中在三个被称为互补决定区(CDR)或高变区的区段中。可变区中保守度较高的部分被称为骨架(FR)。天然重链和轻链的可变区均包括四个FR区，主要采取β折叠构型、由三个CDR连接，这会形成连接所述β折叠结构的环(在某些情况下形成所述β折叠结构的一部分)。每条链中的CDR均被所述FR区紧密地结合在一起，并且与其它链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat E.A.et al.，＂Sequences of Proteins of Immunological Interest，＂NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
本文所述术语“抗体或其片段”包括具有两种或多种抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂交抗体和片段，例如F(ab’)2、Fab’和Fab等，包括杂交片段。因此，提供保持了与其特异性抗原结合的能力的抗体片段。例如，保持了目的蛋白结合活性的抗体片段均属于术语“抗体或其片段”的含义范围。这类抗体和片段可以利用本领域中已知的技术来制备，并且可以就特异性和活性按照实施例中给出的方法以及用于生产抗体并就特异性和活性筛选抗体的常规方法对其进行筛选(参见Harlow andLane.Antibodies，A Laboratory Manual.Cold Spring HarborPublications，New York，(1988)，所述文献涉及用于生产抗体并就特异性和活性对其进行筛选的常规方法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
例如，美国专利4,704,692中所述的抗体片段与抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物也属于“抗体或其片段”的含义范围，所述文献关于抗体片段与抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
任选地，在其他物种中制备所述抗体并且对其进行“人源化”以用于在人体内给药。人源化形式的非人(例如鼠类)抗体为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)，所述片段含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来源于接受者的互补决定区(CDR)的残基被来源于具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基(提供者抗体)所置换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架残基被对应的非人残基所置换。人源化抗体还可以包括既不存在于所述接受者抗体也不存在于输入的CDR或骨架序列中的残基。通常，所述人源化抗体将基本上包括至少一个——通常两个——可变区的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人免疫球蛋白的CDR区对应，并且全部或基本上全部的FR区为人免疫球蛋白的FR区。最佳地，所述人源化抗体还将包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的一部分(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)，所述文献关于人源化抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
用于人源化非人抗体的方法在本领域中是公知的。通常，人源化抗体具有一个或多个由非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常是被称为“输入”残基，这通常取自“输入”可变区。
基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988)，上述文献关于抗体人源化的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)，用一个或多个啮齿动物的CDR取代人抗体的对应序列来进行人源化。因此，这类“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利4,816,567，上述文献关于人源化抗体和嵌合抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)，其中一个基本上完整的人可变区已经被非人物种的对应序列所取代。事实上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基并且可能一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代。
为降低抗原性，用于制备人源化抗体的人可变区(轻链和重链)的选择非常重要。根据“最佳适配”法，用所述啮齿动物抗体的可变区序列在整个已知的人可变区序列文库中进行筛选。然后将与所述啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人骨架区(FR)(Sims et aL，J.Immunol.，151：2296(1993)和Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987)，上述文献关于使用与所述啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人骨架区(FR)的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。另一种方法使用了一种来源于所有人抗体的共有序列的特定骨架，所述人抗体具有特定亚型的轻链或重链。同一种骨架可以被用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，151：2623(1993)，上述文献关于使用与所述啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人骨架区(FR)的教导也全部通过引用的方式纳入本说明书)。
更加重要的是，将抗体人源化，并保持针对所述抗原的高亲和力以及其他有利的生物性质。为实现这一目标，根据一个优选的方法，利用一种使用亲代序列和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员所熟知的。计算机程序是可获得的，所述程序可举例说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对上述展示的检查使得可以分析所述残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能的过程中可能的作用，即对可影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。通过这种方式，可以从所述共有序列和输入序列中选择FR残基并加以组合以使得可以实现所需的抗体性质，例如对所述一种或多种靶抗原的亲和力增加。通常，所述CDR残基大多数会直接影响抗原结合(参见1994年3月3日公开的WO 94/04679，所述专利关于CDR残基以及其对抗原结合的影响的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
可以使用在进行免疫时能够生产人抗体的所有组成成分的转基因动物(例如小鼠)，所述转基因动物不能进行内源免疫球蛋白生产。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠体内进行的抗体重链结合区(J(H))基因的纯合缺失会导致对内源抗体生产的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因列转移到这类种系突变小鼠体内将会导致小鼠在受到抗原攻击时产生人抗体(例如参见Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-255(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.，7：33(1993)，上述文献关于在受到抗原攻击时产生人抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。还可以使用噬菌体展示文库生产人抗体(Hoogenboom etal.，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991)，上述文献关于使用噬菌体展示文库生产人抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。Cote等和Boerner等的用于制备人单克隆抗体的技术也是可以获得的(Cole et al.，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerneret al.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)，上述文献关于制备人单克隆抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
本发明还公开了可产生所述单克隆抗体的细胞。本文所用术语“单克隆抗体”是指获取自基本上同源的抗体群的抗体，即构成所述群的各个抗体除了可能存在少量的天然存在的突变之外都是相同的。本发明的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中所述重链和/或轻链的一部分与来源于特定的物种或者属于特定的抗体类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，同时所述链的其余部分与来源于另一物种或者属于另一抗体类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，所述术语“单克隆抗体”还包括这类抗体的具有所需活性的片段(参见美国专利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)，上述参考文献关于具体地包括嵌合抗体的单克隆抗体的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
还可以使用杂交瘤法制备单克隆抗体，例如Kohler and Milstein，Nature，256：495(1975)or Harlow and Lane.Antibodies，ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)所述的那些方法。在一种杂交瘤方法中，通常使用免疫剂免疫小鼠或其他适合的宿主动物，以诱发产生或能够产生特异性结合所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外对所述淋巴细胞进行免疫。优选地，所述免疫剂包括一种或多种存在于所述基因转移构建体中的目的序列。通常，单克隆抗体的生成依赖于是否可以获得纯化的蛋白或肽来用作免疫原。因此，本文所公开的方法提供了一种通过提供大量位于病毒颗粒内的目的蛋白来诱发强免疫应答并产生单克隆抗体的方法，所述病毒颗粒可以被注射到宿主动物体内。
该系统的优势包括容易生成、高水平表达和翻译后修饰与哺乳动物系统中所观察到的情况高度类似。该系统的用途包括以融合蛋白形式表达目的蛋白结构域的抗体。还可以通过将在信号序列和目的蛋白的成熟蛋白结构域的抗体核苷酸序列之间插入读框内基因片段来产生所述抗原。这会导致所述外源蛋白在病毒体表面上展示。该方法使得可以使用全病毒来进行免疫，不需要纯化靶抗原。
通常，当制备单克隆抗体时，如果需要人源的细胞则可以在生产单克隆抗体的方法中使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适合的融合剂(例如聚乙二醇)将所述淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，＂Monoclonal Antibodies：Principles and Practice＂Academic Press，(1986)pp 59-103)。永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，包括啮齿动物、牛、马和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。所述杂交瘤细胞可以在适合的培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种可抑制非融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核酸转移酶(HGPRT或HPRT)，则所述用于培养杂交瘤的培养基将通常含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(“HAT”培养基)，这些物质可防止HGPRT缺陷型细胞的生长。优选的永生化细胞系为具有下列特征的细胞：可有效融合、支持所选的产抗体细胞高水平的稳定表达抗体，以及对培养基(例如HAT培养基)敏感。更优选的永生化细胞系为鼠类骨髓瘤细胞系，所述细胞系可以获自，例如位于加利福尼亚州圣地亚哥的沙克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif)和位于马里兰州洛克威尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Md)。还已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，＂Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications＂Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp 51-63)。然后可以测定所述培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在抗所述目的蛋白的单克隆抗体。优选地，由所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。这类技术和测定在本领域中是已知的，并且本文和Harlow and Lane＂Antibodies，A Laboratory Manual＂ColdSpring Harbor Publications，New York，(1988)中有进一步表述。
在鉴别了所需的杂交瘤细胞之后，所述克隆可以通过有限稀释或FACS分选方法来亚克隆并且按照标准方法来培养。适合于该目的的培养基包括例如达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基和RPMI-1640培养基。或者，所述杂交瘤细胞可以在体内培养，例如在哺乳动物腹水中。
可以按照常规的免疫球蛋白纯化方法来从所述培养基或腹水液中分离或纯化由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，所述免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-琼脂糖、蛋白G、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域中已知的常规技术来消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶来进行消化。1994年12月22日公布的WO 94/29348、美国专利4,342,566和Harlow and Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)中描述了木瓜蛋白酶消化的实例。抗体的木瓜蛋白酶消化通常会产生两个相同的被称为Fab片段的抗原结合片段——每个片段均带有一个抗原结合位点——和一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理会产生一个被称为F(ab’)2片段的片段，所述片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
所述通过抗体消化产生的Fab片段还含有轻链恒定区和重链的第一恒定区。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链结构域的羧基末端多了几个残基，包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2片段是含有两个Fab’片段的二价片段，所述两个Fab’片段由一个二硫键在铰链区相连接。本文中所命名的Fab’-SH是指其中恒定区的一个或多个半胱氨酸残基带有一个自由巯基基团的Fab’。抗体片段最初是以Fab’片段对形式产生的，所述Fab’片段对之间带有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联形式也是已知的。
本发明还提供了一种分离的免疫原特异性的抗体互补位或片段。可以通过对分子进行化学性或机械性破坏来从整个抗体中分离出抗体特定的免疫原性表位。因此，可以按照本文中教导的方法对所获得的纯化片段进行测试以确定它们的免疫原性和特异性。任选地，所述抗体的免疫反应互补位是直接合成的。免疫反应片段被定义为至少含有大约2-5个来源于所述抗体氨基酸序列的连续氨基酸的氨基酸序列。
本发明还公开了具有生物活性的抗体片段。所述多肽片段可以是通过将编码该多肽的核酸克隆到能够产生该多肽片段的表达系统(例如本文所公开的表达系统)中获得的。例如，技术人员可以确定获自特定杂交瘤的抗体的活性域，所述活性域可以导致与抗体和目的蛋白之间的相互作用相关的生物效应。例如，可以将对所述抗体的活性或结合特异性或亲和力没有贡献的氨基酸缺失而不会导致各自活性的丧失。例如，可以将氨基或羧基末端的氨基酸从天然的或经修饰的非免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子上连续的移除，并且用许多可实现的测定方法之一来测定各自的活性。在另一个实例中，抗体片段包括经修饰的抗体，其中已经用至少一个氨基酸取代了位于特定位置的天然存在的氨基酸，并且氨基或羧基末端氨基酸的一部分甚至抗体的内部区域已经被多肽片段或其他部分(例如生物素)所置换，这有助于纯化所述经修饰的抗体。例如，可以下列方式将经修饰的抗体与麦芽糖结合蛋白融合：通过肽化学或将各种编码所述两个多肽片段的核酸克隆到表达载体中以使得所述编码区的表达可产生杂交多肽。可以通过将所述杂交多肽上样到淀粉酶亲和层析柱上来对其进行亲和纯化，然后可以通过用特异性蛋白酶因子Xa切割所述杂交多肽来从麦芽糖结合区分离所述经修饰的抗体受体(参见，例如New England Biolabs Product Catalog，1996，pg 164.)。类似的用于从真核细胞中分离杂交蛋白的纯化方法同样是可实现的。
所述片段——无论是否连接到其他序列上——包括对特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他所选的修饰，只要与未修饰的抗体或抗体片段相比，所述片段的活性没有被明显改变或削弱。这些修饰可以产生一些额外的性质，例如移除或增加能够形成二硫键的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特征等。在任何情况下，所述片段必须具有生物活性，例如结合活性、调节在结合结构域的结合等。可以通过诱变蛋白的特定区域然后表达并且测试所表达的多肽，从而鉴别所述抗体的功能或活性区域。这些方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以包括对编码所述抗原的核酸进行定点诱变(Zoller MJ et al.Nucl.Acids Res.10：6487-500(1982)。
可以使用各种免疫测定方法来选择可与特定蛋白、变体或片段选择性结合的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定来选择可选择性地与蛋白、蛋白变体或其片段发生免疫反应的抗体。关于可用于测定选择性结合的免疫测定方法和条件的描述请参见Harlow and Lane.Antibodies，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。例如，可以通过Munson et al.，Anal Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析法来确定单克隆抗体的结合亲和力。
本发明还提供了一种抗体试剂盒，包括装有单克隆抗体或其片段的容器以及一种或多种用于检测所述抗体或其片段与目的蛋白的结合的试剂。所述试剂可以包括，例如荧光标记、酶标记或其他标记。所述试剂还可以包括二抗或三抗或用于酶促反应的试剂，其中所述酶促反应会产生可视产物。
本发明还公开了在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括将按照本文其他部分公开的方法制备的重组蛋白引入受试者体内，所述重组蛋白的量足以诱导免疫应答。例如，可以使所述靶细胞在体外或在体内与所述病毒颗粒接触。
本发明还公开了在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括：(a)将基因转移构建体引入靶细胞中；(b)使所述细胞处于可使待整合的步骤(a)所述的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；和(c)将步骤(b)所述的靶细胞引入所述受试者体内，所述靶细胞的数量足以诱导免疫应答。例如，所述目的序列能够编码膜蛋白(例如HIV膜蛋白)。此外，所述目的序列的表达可以是可诱导的、可逆转的或可诱导且可逆转的。
本文所用的“免疫应答”是指身体作为整体对所存在的抗原的反应，所述反应包括产生抗体、产生免疫力、产生对所述抗原的超敏感性和产生耐受性。因此，对抗原的免疫应答还包括在受试者体内对所述目的抗原产生体液和/或细胞免疫应答。“体液免疫应答”通过由浆细胞产生的抗体来介导。“细胞免疫应答”通过T淋巴细胞和/或其他白细胞介导。
本文所用的术语“抗原”是指任何可被抗体识别和/或可在个体体内诱发免疫应答的药剂(例如，任何物质、化合物、分子、蛋白或其他部分)。
本文所公开的方法可以用于任何细胞类型。换言之，任何细胞类型均可用作本文所公开的方法的靶细胞。真核宿主细胞可以包括但不限于酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人和有核细胞。哺乳动物细胞也可被用于本文所述的方法中。靶细胞还可以含有任何本文所述的核酸构建体。例如，靶细胞可以含有一种或多种本文所述的基因转移构建体和/或一种或多种本文所述的包装构建体。
本文所用术语“哺乳动物”和“哺乳动物的”是指任何脊椎动物，包括单孔类动物、有袋类动物和胎盘类动物，所述脊椎动物会给其后代哺乳并且生育幼体(真哺乳亚纲哺乳动物或胎盘哺乳动物)或产卵(后兽亚纲哺乳动物或无胎盘哺乳动物)。哺乳动物物种的实例包括人和其他灵长类(例如猴、猩猩)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反刍动物(例如牛、猪、马)。
哺乳动物细胞的实例包括人(例如HeLa细胞、293T细胞、NIH 3T3细胞)、牛、羊、猪、鼠(例如胚胎干细胞)、兔和猴(例如COS1细胞)的细胞。所述细胞可以是非分裂细胞(包括肝细胞、肌纤维、造血干细胞、神经元)或分裂细胞。所述细胞可以是胚胎细胞、骨髓干细胞或其他祖细胞。当所述细胞为体细胞时，所述细胞可以是例如上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、血细胞(包括造血细胞、红细胞、T-细胞、B-细胞等)、肿瘤细胞、心肌细胞、巨噬细胞、树突细胞、神经元细胞(例如神经胶质细胞或星形胶质细胞)或病原体感染的细胞(例如那些被细菌、病毒、拟病毒、寄生虫或朊病毒感染的细胞)。
通常，分离自特定组织的细胞(例如上皮细胞、成纤维细胞或造血细胞)可被分类为一种“细胞型”。所述细胞可通过商业途径获得或获取自保藏单位或例如通过活组织检查而直接获自动物。或者，例如在需要将所述病毒送递到进行基因疗法的动物体内时，根本不必将所述细胞从动物身上分离出来。
尽管可以使用任何细胞类型来制备本文其他部分所述的重组蛋白或抗体，但是细胞表面存在的寡糖会给结晶和抗体的产生带来困难。本文公开了使用靶细胞制备重组蛋白和抗体的方法，所述靶细胞的一个或多个与蛋白糖基化有关的酶存在缺陷，这可以被用于刺激抗体生产。一种与蛋白糖基化有关的酶为UDP-GlcNAc：-D-甘露糖苷-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)。
许多分泌的蛋白以及所述分泌系统的膜整合蛋白为糖蛋白，即它们被聚糖(寡糖)所修饰，所述聚糖与天冬氨酸N-连接或与丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸O-连接。N-糖基化决定着蛋白的正确折叠和稳定性、防止蛋白降解、蛋白构象和识别、蛋白的可溶性、蛋白向胞外空间的分泌以及蛋白的生物活性。
GnTI是一种II型膜整合蛋白，定位到高尔基体中间膜囊，所述GnTI可催化由高麦芽糖N-聚糖转化为复合且混合的结构的第一步。复合N-聚糖对于发育中的胚胎的存活来说至关重要，因为缺少功能性GnTI基因的小鼠会在出生前死亡。然而，复合-N聚糖对于体外培养的细胞的存活来说并非至关重要，因为已经分离到许多缺少GnTI活性的突变体。
一个处理纯化的糖蛋白上的异源N-聚糖的实例是使用衣霉素处理来消除所有的糖基化。因此，已经使用衣霉素处理和四环素诱导的表达来纯化毫克量级的非糖基化视紫红质。然而，该方法并不理想，因为移除N-聚糖并不能了解使其在糖蛋白的结构和功能中所起的作用。例如，尽管没有完全了解糖基化在视紫红质结构和功能中的准确作用，但是它明显具有重要作用。先前已经报道了由于未对光感受器进行糖基化导致的信号转导性质的明显缺陷。此外，当在存在衣霉素的情况下进行表达时，具有三个氨基酸变化(E113Q/E134Q/M257Y)的视紫红质突变体不能被纯化。Puthalakath et al.，Glycosylation Defect in Lee！ChineseHamster Ovary Mutant is Due to a Point Mutation inN-Acetylglucosaminyltransferase I Gene，J.B.C.，271，27818-27822(1996)中描述了其他已经被突变的细胞系，所述文献关于缺少GnTI活性的细胞系的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
另一个处理异源N-聚糖的实例为在细胞内生产所述蛋白，所述细胞中各种与N-聚糖合成相关的酶(例如GlcNAc转移酶I)中的一种存在缺陷。该方法之前已经被用于分离中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的不同收集物，所述细胞系由于各种与N-聚糖合成有关的酶存在缺陷而导致对各种凝集素具有抗性。美国专利申请2004/0029229描述了已经经过突变以产生均一糖基化模式的细胞系，所述文献关于已经经过突变以确保N-聚糖均一的细胞系的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。Reeves等也描述了已经经过突变以产生均一糖基化模式的细胞系(Structureand function in rhodopsin：high-level expression of rhodopsinwith restricted and homogeneous N-glycosylation by atetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferaseI-negative HEK293S stable mammalian cell line；PNAS 2002 Oct15；99(21)：13419-24.Epub 2002 Oct 7)。如Koprivova et al.，N-Glycosylation in the Moss Physcomitrella patens is OrganizedSimilarly to that in Higher Plants，Plant Biology 5(2003)：582-591所述，还已经破坏了植物中的GnTI基因，所述文献关于已经经过突变以破坏所述gntI基因的细胞系的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
例如，本文所述靶细胞可以在糖蛋白上产生均一的糖基化模式。任选地，与对照细胞相比，所述靶细胞具有降低的GnTI活性。反义寡核苷酸、RNAi分子、核酶和siRNA分子可用于中断表达。反义寡核苷酸、RNAi分子、核酶和siRNA分子可以单独使用或者可以与其他治疗剂(例如抗病毒化合物)组合使用。这类方法还可以与本文公开的构建体和方法共同使用。例如，所述靶细胞还可以含有能够表达GnTI siRNA的基因转移构建体，其中GnTI siRNA的表达可以是组成型的或可调节的。
本发明还公开了一种使用选定的蛋白处理受试者的方法，包括给予所述受试者按照本文所公开的方法制备的蛋白。所选蛋白的给药方法包括但不限于，注射(皮下、表皮、皮内)、粘膜内(例如鼻、直肠和阴道)、腹膜内、静脉内、口腔或肌内。其他给药模式包括口腔和肺给药、栓剂和经皮施用。剂量处理可以是单次给药方案或多次给药方案。
在本文所述的方法中，所述方法包括将外源DNA给予到受试者细胞内并且被吸收(即基因转导或转染)，所公开的核酸可以是用于将所述核酸送递到细胞内的载体的形式，由此所述编码抗体的DNA片段受到启动子的转录调节，这是本领域普通技术人员所公知的。所述载体可以是本文所公开的任何载体。可以经由各种机制将所述核酸或载体送递到细胞内。作为一个实例，可以经由脂质体进行送递，使用市售的脂质体制品例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其他按照本领域中的标准方法制备的脂质体。此外，可以利用电穿孔将所公开的核酸或载体送递到体内，用于进行电穿孔的技术可获自Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)和利用SONOPORATION仪器(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)。
在一个实例中，本发明公开的重组反转录病毒可被用于进行感染并由此将编码广义中和抗体(或其活性片段)的核酸送递到被感染的细胞内。
如果需要的话，所述核酸或载体的肠胃外给药通常是通过注射进行的。可以将注射剂制成常规形式，以液体溶液或悬液形式、适合于在注射前溶于液体形成悬液的固体形式、或者以乳液形式。一种新近改良的用于肠胃外给药的方法包括使用缓释或持续释放系统以使得可维持恒定剂量。例如参见美国专利3,610,795，所述文献关于肠胃外给药的方法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。关于治疗化合物的适合制剂和各种给药途径的其他讨论，例如参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1995)，所述文献关于治疗化合物的适合制剂和各种给药途径的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
本文还公开了筛选可调整病毒颗粒形成的药剂的方法。例如，本发明公开了一种筛选可调整病毒颗粒形成的药剂的方法，包括将含有第一和第二核酸序列的包装核酸构建体引入细胞中，其中所述第一核酸序列编码Gag蛋白，并且其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro-Pol蛋白，并且其中所述第一和第二核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变。此外，所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且所述第一和第二核酸序列可以与所要筛选的药剂有效连接。接下来，可以将包膜构建体引入所述细胞中，并且所述包膜构建体可以含有编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。然后在适合于形成病毒颗粒的条件下培养所述细胞。然后可以对所述病毒颗粒进行检测；并且与对照相比，在存在所要筛选的药剂情况下，病毒颗粒数量的增加或减少表明所述药剂可调整病毒颗粒的形成。所述对照培养物可以是单独的培养物或者可以与给予所述药剂之前或之后的同一培养物。还可以将含有调节序列的调节子构建体引入所述细胞中，其中所述可调节元件与至少一个转录调控元件有效连接。本说明书通篇对各种可调节的转录调控元件和调节子序列进行了讨论。例如，所述转录调控元件可以是CMV启动子，并且所述可调节元件可以是tetR或tetA。
可以使用各种本领域中公知的筛选标记来筛选阳性包装细胞转化体(即已经接纳并整合了所述反转录病毒载体的细胞)。例如，所述构建体中可以包括下列标记基因：绿色荧光蛋白(GFP)基因、潮霉素抗性(Hyg)基因、新霉素抗性(Neo)基因和β-半乳糖苷酶(β-gal)基因；并且使用例如酶活性或药物抗性测定法来对上述基因进行测定。或者，可以就Goff et al.(1981)J.Virol.38：239所述的、作为病毒蛋白生产的量度的反转录酶(RT)活性对细胞进行测量。
可以使用类似的测定法来测试包装细胞所产生的不期望的、有复制能力的辅助病毒。例如，本文所述的构建体可以含有标记基因，例如本文所述的那些标记基因。在使用本文所述的包装构建体对靶细胞进行瞬时转染之后，将包装细胞(含有至少一种本文所公开的包装构建体的细胞)和其他非包装细胞共同传代培养。可以使用携带所述标记基因的本发明的重组的复制缺陷型构建体来感染这些非包装细胞。然而，由于上述非包装细胞不含产生病毒颗粒所必需的基因(例如gag、pol和env基因)，所以当与其他细胞共同传代培养时，上述非包装细胞应该不能感染所述其他细胞。当将上述其他细胞与所述非包装细胞共同传代培养时，如果所述其他细胞中的标记基因呈现阳性反应，则说明已经产生了不期望的、有复制能力的辅助病毒。
因此，为测试不期望的辅助病毒的产生情况，可以将本发明的包装细胞与第一细胞系(例如NIH3T3细胞)共同传代培养，再将所述第一细胞系与第二细胞系共同传代培养，测试所述第二细胞系中标记基因或RT活性的存在情况，所述标记基因或RT活性的存在情况表明了有复制能力的辅助反转录病毒的存在情况。可以使用例如FACS染色和酶活性测定法来测定标记基因，所述技术在本领域中是公知的。
本发明还公开了制备转基因动物的方法。具体而言，本发明公开了制备转基因动物的方法，包括：将按照本文所公开的方法制备的病毒颗粒引入合子中；允许所述合子发育至足月；获得一种其基因组中含有能够表达所述目的基因的核酸构建体的动物；将所述动物与非转基因动物杂交以获得F1子代，并且选择其基因组中含有所述能够表达目的序列或含有目的序列的核酸构建体的动物，其中所述动物可表达选定的目的序列或含有选定的目的序列。本发明还公开了按照本文所公开的方法制备的转基因动物。
可以将本发明的病毒颗粒引入到动物的基因组内，以产生转基因的非人动物来用于实施本发明所述的方法。可筛选标记还可以被用作鉴别那些含有目的序列的动物的报道分子。例如，发光蛋白可以被用作报道分子，通常使用完整的、活的、非人转基因动物例如活的转基因啮齿动物(例如小鼠或大鼠)来进行显像。可以使用任何可被用于将核酸引入所选的动物细胞内的技术(例如，＂Transgenic Animal Technology：ALaboratory Handbook，＂by Carl A.Pinkert，(Editor)First Edition，Academic Press；ISBN：0125571658；＂Manipulating the MouseEmbryo：A Laboratory Manual，＂Brigid Hogan，et al.，ISBN：0879693843，Publisher：ColdSpring Harbor Laboratory Press，Pub.Date：September 1999，Second Edition，上述参考文献关于可被用于将核酸引入动物细胞内的技术的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。各种转化技术在本领域中是公知的。可被用于将核酸引入所选的动物细胞内的方法包括但不限于以下方法：
(i)直接显微注射到细胞核中：可以使用微量吸管将病毒颗粒直接显微注射到动物细胞核内以机械地转移所述重组DNA。该方法的优势在于不会使所述DNA与除细胞核之外的细胞区室接触并且可以高频率地产生稳定的重组体。参见Capecchi，M.，Cell 22：479-488(1980)，所述参考文献关于直接显微注射到细胞核中的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
例如，在合子形成雄原核膜之后并且在雄原核膜被合子雌原核加工之前，尽快将所述病毒颗粒显微注射到合子的早期雄原核内。因此，应当在所述雄原核和雌原核被完全分开并且二者都位于距离细胞膜很近的位置上时，采用本方法的显微注射。参见，例如Wagner等的美国专利4,873,191(于1989年10月10日授权)；和Richa，J.，(2001)＂Production of Transgenic Mice，＂Mol.Biotech.，17：261-8，上述参考文献关于直接显微注射到合子的早期雄原核内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
(ii)ES细胞转染：本发明的病毒颗粒还可以被引入到胚胎干细胞(“ES”)内。鉴别与靶载体发生同源重组的ES细胞克隆，然后生产ES细胞-小鼠嵌合体。通过半合子嵌合动物交配来产生纯合动物。所述方法在例如Koller，B.H.and Smithies，O.，(1992)＂Altering genesin animals by gene targeting＂，Ann.R.Imm 10：705-30中有所描述。
(iii)电穿孔：还可以利用电穿孔将本发明的病毒颗粒引入到动物细胞内。在该技术中，在存在病毒颗粒的情况下对动物细胞进行电穿孔。高场强的电脉冲可逆地透化生物膜，使得可以引入所述核酸。在电穿孔过程中产生的孔使得可以摄取大分子，例如核酸。所述方法在例如Potter，H.，et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.81：7161-7165(1984)；和Sambrook，ch.16中有所描述，所述参考文献关于利用电穿孔将核酸或病毒颗粒引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
(iv)磷酸钙沉淀：还可以利用其它直接摄取方法(例如使用磷酸钙)将所述病毒颗粒转移到细胞内。参见，例如Graham，F.，and A.Van derEb，Virology 52：456-467(1973)；和Sambrook，ch.16，所述文献关于利用磷酸钙沉淀将核酸或病毒颗粒引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
(v)脂质体：还可以使用下述方法将核酸引入到动物细胞内：将核酸包装到人工膜囊(脂质体)中，然后将所述脂质体与所述靶细胞膜融合。参见Mannino，R.and S.Gould-Fogerite，BioTechniques，6：682(1988)，所述参考文献关于使用脂质体将核酸引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
(vi)使用聚凝胺(Polybrene)或DEAE-葡聚糖进行转染：这些技术在Sambrook，ch.16中有所描述，所述参考文献关于使用聚凝胺或DEAE-葡聚糖将核酸引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
(vii)原生质体融合：原生质体融合通常包括将携带有大量目的质粒的细菌原生质体与所培养的动物细胞融合，通常由使用聚乙二醇的处理来介导(Rassoulzadegan，M.，et al.，Nature，295：257(1982)，所述参考文献关于使用原生质体融合将核酸引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书)。
(iix)弹道侵入(Ballistic Penetration)：另一种引入核酸区段的方法是利用小颗粒进行高速弹道侵入，所述核酸位于小珠或小颗粒的基质内或位于其表面上，参见Klein，et al.，Nature，327，70-73，1987，所述参考文献关于利用弹道侵入将核酸引入到动物细胞内的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。
电穿孔的优势在于容易实施，并且已经得到了广泛的应用，但是在电穿孔过程中大部分靶细胞可能会被杀死。因此，对于敏感细胞或只能少量获得的细胞来说，优选直接显微注射到细胞内。此外，当高效率的核酸引入特别重要时，例如不使用可筛选标记的转化(如上所述)，直接显微注射到细胞核内就是一种有利的方法，因为通常5-25％的靶细胞将会具有稳定整合的经显微注射的核酸。
此外，本发明公开了含有目的序列的转基因动物。例如，本发明公开了表达KISS-1、FOX P3、NF κ β、微小RNA 223或Cre重组酶的转基因动物。
本发明还公开了含有本文所述的基因转移构建体的转基因动物。本发明还公开了按照本文所公开的方法制备的转基因动物。
在本申请通篇中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全部通过引用的方式纳入本申请，以便更全面地描述本文所述的化合物、组合物和方法。
可以对本文所述的化合物、组合物和方法进行各种修改和变化。考虑到对本文所公开的化合物、组合物和方法的说明和实践，本文所述的化合物、组合物和方法的其他方面将是显而易见的。所述说明和实例意在举例说明。
实施例
给出下列实施例以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备并评估本文所述和所要求保护的化合物、组合物、制品、设备和/或方法的完整公开和描述，并且意在纯粹地进行举例说明而并非意在对发明人所认为的本发明的范围进行限制。已经努力确保数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应该考虑到会存在一些错误和偏差。除非另有说明，份是指重量份、温度以为℃单位或指室温，压力是指大气压或接近大气压。存在许多的反应条件(例如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力以及其他反应范围和条件)的变化和组合，所述反应条件可被用于优化通过所述工艺获得的产物的纯度和产率。为优化这类工艺条件，仅需要进行合理的和常规的实验。
实施例1
构建基于四环素的可诱导和可逆转的单慢病毒载体
构建了基于四环素的可诱导和可逆转的单基因转移载体，以驱动目的序列eGFP的表达。首先，利用PCR由pEF4/His(Invitrogen)扩增1.2kb的人EF1-a启动子，并且使用EcoRI和BamHI限制性内切酶将其克隆到pHRCMVeGFP/blas中。将所得的载体命名为pHREFeGFP/blas。接下来，对一能够编码四环素抑制子的序列进行密码子优化并且将其与SV40核定位信号连接。然后使用NcoI和XhoI限制性内切酶将所述与SV40核定位信号连接的经过密码子优化的四环素抑制子的基因克隆到pHREFeGFP/blas中，用所述基因置换eGFP。将所得的载体命名为pHREFtet/blas。然后，利用PCR扩增500bp的人CMV启动子，将两条t et启动子序列引入到3’CMV启动子中。使用ClaI和EcoRI限制性内切酶将所述PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。将所得的载体命名为pHRCMVO2(R)EFtet/blas。这样所述CMV启动子的方向会被逆转。然后将含有牛生长激素多腺苷酸化信号的EGFP片段克隆到pHRCMVO2(R)EFtet/blas中，所述片段就会被CMV启动子所调控。将所得的载体命名为pHReGFPO2/EFtet/blas。接下来，利用PCR由pUB6/V5-His(Invitrogen)扩增1.2kb的人泛素6启动子并且使用EcoRI和NcoI限制性内切酶将其克隆到pHReGFPO2/EFtet/blas中。将所得的载体命名为pHReGFPO2/UB6tet/blas。该步骤之后，从pDRIVE-CAG(Invivogen)获得1.6kb的含有300bp的5’人CMV启动子序列的CAG启动子和1.2kb的鸡β-肌动蛋白启动子，并且将其克隆到pHReGFPO2/EFtet/blas中。利用SnaBI和NcoI限制性内切酶切割pHReGFPO2/EFtet/blas，将5’CMV序列和EF启动子移除并且替换为CAG启动子。将所得的载体命名为pHReGFPO2/CAGtet/blas。
实施例2
生成高效价的基于四环素的可诱导和可逆转的单病毒颗粒
用包装构建体、包膜构建体和不同基因转移构建体(包括pHReGFPO2/EFtet/blas、pHReGFPO2/CAGtet/blas；pHReGFPO2/UB6tet/blas和pHReGFPO2/CAGtet/blas)共转染293Y细胞以生产不同种类的诱导型病毒颗粒。使用荧光显微术测量由共转染得到的所述病毒颗粒的效价，以测定HeLa细胞内的eGFP表达。来自被转染的细胞的上清液的效价为1-4×106/ml，而浓缩的上清液的效价为2-10×108/ml(高了400倍)。
实施例3
紧密调节的诱导型单慢病毒载体
使用100μl源自pHReGFPO2/EFtet/blas(效价为2.5×106/ml)的病毒颗粒上清液感染小鼠T细胞系(4×104)。第二天，将感染的细胞分为以下两组：第一组，在含有0.1μg DOX/ml的培养基中培养；第二组，在不含DOX的培养基中培养。感染三天后，利用FACS分析对所述细胞进行分析以确定GFP的表达水平。对第一组的分析显示GFP表达信号的平均强度为16,195，与第二组的相比增加了44.2倍。
实施例4
单慢病毒载体对DOX高度敏感并且可迅速诱导基因表达
为测定诱导所述单载体系统内基因表达所需的DOX浓度，将不同浓度的DOX加入到被病毒颗粒感染的细胞内，所述病毒颗粒源自pHReGFPO2/EFtet/blas(效价为2.5×106/ml)。利用荧光显微术检测GFP表达。图4A示出了15ng的DOX足以在48小时内诱导GFP表达。
实施例5
组成型启动子活性会显著影响诱导型单慢病毒载体的诱导型启动子活性
为确定四环素抑制子的表达水平是否会影响基因转移载体的可诱导性，将不同启动子克隆到基因转移载体中以驱动四环素抑制子的表达。所用的启动子为人EF-1a启动子(pHReGFPO2/EF-1a/blas)、CAG启动子(pHReGFPO2/CAGtet/blas)和人泛素6启动子(pHReGFPO2/UB6tet/blas)。EF-1a为三种启动子中最强的启动子，而人泛素6启动子为最弱的。用来自所述293T细胞的病毒颗粒感染小鼠T细胞系。使用抗生素杀稻瘟素来筛选阳性感染细胞。经过3天的筛选之后，将被感染的细胞划分为以下两组：第一组，在含有DOX的培养基中培养；第二组，在不含DOX的培养基中培养。利用FACS分析对被感染的细胞进行分析以测量在存在或不存在DOX的情况下培养三天后的GFP表达。下表示出了使用不同载体诱导的GFP的表达水平。
                           表1
Figure A200680052999D01011
含有EF-1α启动子的构建体可产生最低的eGFP基础表达水平，然而，它也产生了最高的eGFP诱导表达水平。对于EF-1α启动子构建体来说，eGFP表达的诱导水平超过100倍。人泛素6启动子产生最高的eGFP基础表达水平和最低的eGFP诱导表达水平。对于人泛素6启动子构建体来说，eGFP表达的诱导水平约为17倍。
可以在两个水平上观察到组成型启动子的作用，首先该启动子会影响基础泄漏水平，其次所述组成型启动子会影响所述目的基因(本文中为eGFP)的最高表达水平。所述强的组成型启动子可以驱动高水平的四环素抑制子表达，在不存在DOX的情况下，所述高水平的四环素抑制子表达可以促进和调控基础泄漏水平。与其他类型细胞相比(例如HeLa细胞)，在T细胞中所述基于CMV启动子的诱导型启动子的活性较弱。
当将一种与调节子构建体相连的强组成型启动子(例如与tetR相连的EF-1α)应用于所述诱导型系统中时，这类强组成型启动子可以刺激基于CMV的诱导型启动子的活性。当将所述与目的基因有效连接的诱导型启动子再与一种可驱动调节子构建体表达的强组成型启动子有效连接时，所述目的基因的表达在T细胞中可变得非常活跃。
实施例6
使用诱导型单慢病毒载体来产生eGFP转基因小鼠
如前人所述，使用孕马血清和人体绒毛膜促性腺激素(HCG)的组合来使年龄在22-24天之间的雌性小鼠(B6株)超量排卵(B.Hogan，R.
Figure A200680052999D01021
F.
Figure A200680052999D01022
E.
Figure A200680052999D01023
Manipulating the MouseEmbryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1994)。然后，按照B.Hogan，R.Beddington，F.Costantini，E.Lacy，Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1994来所述收集提供者胚胎。在使用显微注射系统(CellTram，Eppendorf GmbH，Hamburg，Germany)收集的同一天，将使用上文所述方法制备的浓缩病毒颗粒(效价为大约2×108/ml)送递到单细胞期胚胎中。使用显微操作器来引导所述吸管，推动微量吸管穿过透明带进入卵黄周隙，并且将10pl-100pl的病毒储液送递到所述胚胎内。将所述被感染的胚胎在KSOM-AA中培养过夜并且按照B.Hogan，R.Beddington，F.Costantini，E.Lacy，Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，(1994)所述将这些二细胞期胚胎转移到假孕雌鼠(10周龄CD1)体内，所述参考文献关于制备转基因动物的方法的教导全部通过引用的方式纳入本说明书。鉴别了源自pHReGFPO2/EFtet的11个建立者(本文中称为EF-建立者)和源自pHReGFPO2/CAGtet的8个建立者(本文中称为CAG-建立者)。
通过移除杀稻瘟素基因来由pHReGFPO2/Eftet/blas和pHReGFPO2/CAGtet/blas制备两种形式的pHReGFPO2/EFtet和pHReGFPO2/CAGtet，以防止对所述转基因小鼠产生有害作用的可能性。从三周龄的建立者中提取基因组DNA并且利用PCR和RNA印迹进行分析，以确定是否存在阳性转基因小鼠和被整合的构建体的拷贝数量。表2示出了阳性转基因小鼠的数量。
                           表2
Figure A200680052999D01031
通过使用一对靶向四环素抑制子基因的引物—SEQ ID NO：16和SEQID NO：17的PCR分析来鉴别阳性转基因小鼠。这两种构建体可以产生相似阳性比例的转基因小鼠，因为这两种构建体的效价都大约为2×108/ml。RNA印迹显示在EF-建立者组中存在三种单拷贝建立者，而在CAG-建立者组中鉴别了两种单拷贝建立者。在这两组中，半数以上的阳性转基因小鼠具有两个或多个拷贝(范围为1-4)。与之前的报道相比，其他研究人员使用5倍高的效价(10×108/ml)来产生建立者小鼠，所述建立者小鼠在这两组中具有两个或多个拷贝(范围为1-20)。因此，本方法提供了一种更加有效的方法。
实施例7
使用含有DOX的饮用水在所述转基因小鼠体内诱导eGFP表达
为确定所述诱导型构建体是否可以在体内诱导eGFP表达，给所述转基因小鼠喂食含有100μg/ml DOX的饮用水。利用荧光显微术和FACS分析法来分析喂食DOX前后所述转基因小鼠体内(脚爪)和PBMC中的GFP表达。所有12只阳性小鼠均能在PBMC和体内(脚爪)诱导eGFP表达，但是这些小鼠的诱导水平之间存在差异。在喂食DOX之前，在所有转基因小鼠体内均检测到eGFP表达，但是这些小鼠的表达水平之间存在差异。在给所述转基因小鼠喂食DOX之后，eGFP表达显著升高。与使用源自含有EF-1α启动子的构建体的病毒颗粒感染的转基因小鼠相比，使用源自含有CAG启动子的构建体的病毒颗粒感染的转基因动物可产生最高水平的诱导。这些数据与上文所述的体外实验的结果不同。
实施例8
转基因小鼠体内(指)eGFP的可视表达是可诱导的和可逆转的
为确定所述基因转移构建体中含有的转基因是否会在全身表达，使用上述的含有由CAG启动子驱动的eGFP基因的基因转移构建体，如上所述地产生转基因动物。当eGFP处于CAG启动子的调控之下时，eGFP可能会在全身表达。为确定eGFP是否会在含有上述基因转移构建体的转基因动物全身表达，利用荧光显微术分析所述转基因动物的指。在本研究中，选择四只上文所述的CAG-建立者(分别命名为CAG-建立者1#、2#、6#和7#)来进行分析。在添加DOX之后，在CAG-建立者-2#和6#体内观察到eGFP表达，表明这两只小鼠体内的GFP表达可以受到DOX的紧密调控。添加DOX之后，在所测试的转基因建立者中，CAG-建立者-1#小鼠体内的eGFP表达的显像最亮，这说明该小鼠的指中表达的eGFP水平最低，并未受到DOX的诱导。CAG-建立者-7#在响应于DOX添加而表达eGFP时表现出某种延迟，并且与其他CAG-建立者的eGFP表达强度相比，CAG-建立者-7#的总表达强度较弱。
不再给予CAG-建立者DOX12天后，再次利用荧光显微术来分析所述小鼠的指。除CAG-建立者-1#外，所述指内GFP表达强度急剧下降到类似于诱导之前的表达水平。结果表明这些转基因小鼠体内的GFP表达是可诱导的和可逆转的，这取决于是否存在DOX。
实施例9
转基因小鼠血细胞内的GFP表达可被DOX诱导并且是可逆的
在下述4个不同时间点检测CAG-建立者小鼠血细胞内的GFP表达：(1)在给小鼠喂食含DOX(0.1mg/ml DOX)饮用水之前；(2)给小鼠喂食含DOX(0.1mg/ml DOX)饮用水12天后；(3)从时间点(2)开始从饮用水中移除DOX12天后，然后在再次给时间点(3)的小鼠喂食含DOX(0.1mg/mlDOX)饮用水1和2天后。CAG-建立者1#和CAG-建立者2#小鼠血细胞内的GFP表达受到DOX的紧密调控。此外，当停止给予DOX时，所述GFP表达可被逆转。此外，所测试的血细胞内的GFP表达水平可以回到本底水平(添加DOX之前的水平)。该数据表明单慢病毒载体系统可以诱导所述基因转移构建体内序列的表达并且可以使所述表达逆转。
实施例10
利用DOX诱导多种器官内的GFP表达
为确定上文所述慢病毒系统是否能够在动物全身表达目的序列，检测了GFP的表达。在生成CAG-建立者-2#后，将所述动物解剖并且使用荧光显微术逐个分析各器官。在所述Tg小鼠(CAG建立者2#)的骨骼和肌肉中观察到高GFP表达，但是在正常小鼠体内未观察到GFP表达。在所述Tg小鼠的心、肺、肝、肾、脾和肠内观察到高GFP表达，而所述Tg小鼠的脑内GFP表达较弱。该数据表明所述转基因小鼠全身的eGFP表达均可由DOX诱导，但是在对不同器官的诱导水平之间存在差异。
实施例11
确定饮用水中诱导GFP表达所需的DOX浓度
一项之前的研究报道称用于在含有tet调节系统的转基因小鼠体内进行诱导型基因表达所需的该小鼠饮用水中的DOX浓度为0.1-10mg/ml。为确定用于在上文所述的转基因小鼠体内进行GFP诱导型表达所需的DOX浓度，将源自CAG-建立者6#的F1小鼠分为四组，所述四组分别被喂食含有不同浓度DOX的饮用水，包括0μg/ml(第一组)、4μg/ml(第二组)、20μg/ml(第三组)和100μg/ml(第四组)。在喂食所述小鼠DOX 0、1、2、3、5和18天后，通过在UV光下使在所述转基因小鼠的指内表达的GFP显影来监测GFP表达。观察整个实验过程中所测试小鼠的指内的荧光信号强度。在DOX喂养1天后，第三组和第四组小鼠开始表达GFP，表明DOX会通过饮用水迅速诱导所述基因表达。在DOX喂养5天后，第三组和第四组的荧光信号强度表明其GFP表达水平达到最高。此外，给第二组的小鼠喂食4μg/ml DOX足以诱导GFP表达，然而，与第三组和第四组小鼠相比，诱导被延迟且强度较弱。还应该注意到，荧光信号强度表现为剂量依赖性方式。
使用FACS分离并且量化表达GFP的阳性血细胞。图5示出了在给小鼠喂食DOX之前和18天后对血细胞中GFP表达的FACS分析的结果。对第二组、第三组和第四组的所有小鼠而言，在给所述小鼠喂食DOX后，表达GFP的细胞的数量和强度均有所增加。
为确定DOX的药物代谢动力学，第四组小鼠43％的血细胞表达GFP(DOX喂养18天后)，使用该水平作为100％诱导的阈值。图6示出了第2、3和4组小鼠的血细胞中GFP表达的诱导动力学。该数据表明DOX可以诱导所公开转基因小鼠的血液和指内的GFP表达，并且所述诱导水平为剂量依赖性的。
实施例12
构建基于四环素的可诱导和可逆转的单慢病毒载体以表达shRNA
使用一条含有NotI的正义引物(5′-GCGGCCGCAATTCATATTTGCATGTCGCTATGT-3′)(SEQ ID NO：18)和一条反义引物(5′-GAATTCGCGGATCCTCTCTATCACTGATAGGGACTTATAAGTCTCTATCACTGATAG GGATTTCACGTTTATGGTGA-3′)(SEQ ID NO：19)，利用PCR从Hela细胞中扩增人H1启动子，其中所述反义引物含有位于TATA框上游的一个最小19bp的tetO序列和位于TATA框下游的另一个tetO序列。然后将含有人H1启动子的PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。所得的载体被命名为pHRhHltetOEFtet/blas。
使用一条含有NotI的正义引物(5′-GGCGGCCGCATATGACTAGTCATGCAAATTACGCGCT-3′)(SEQ ID NO：20)和一条反义引物(5′-GAATTCTGGATCCTCTCTATCACTGATAGGGATTATAAGTCTCTATCACTGATAGGG ATTTTACGTTTAGGGTGATTT-3′)(SEQ ID NO：21)利用PCR从3T3细胞系中扩增小鼠H1启动子，其中所述反义引物含有位于TATA框上游的一个最小19bp的tetO序列和位于TATA框下游的另一个tetO序列。然后将含有小鼠H1启动子的PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。所得的载体被命名为pHRmHltetOEFtet/blas。
用于上述实验的目的序列为设计用于靶向eGFP编码区(从nt126至144)的shRNA。使用正义引物(5′-GATCCAGCTGACCCTGAAGTTC ATCTTCAAGAGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTTTTGG-3′)(SEQ ID NO：22)和反义引物(5′-AATTCCAAAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCTCTTGAAGATGAACTTCA GGGTCAGCTG-3′)(SEQ ID NO：23)来生成shRNA，所述shRNA彼此退火并被克隆至pHRhHltetOEFtet/blas和pHRmHltetOEFtet/blas中，所述载体之前已经用BamHI和EcoRI限制性内切酶消化过。将所得载体分别命名为pHRhHlGFPi(126)EFtet/blas和pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas。
实施例13
利用小鼠H1诱导型启动子有效沉默基因表达
使用源自pHRhHlGFPi(126)EFtet/blas和pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的病毒颗粒感染能够表达eGFP的不同细胞系[HeLa细胞、CEM-SS细胞(人T细胞系)和小鼠T细胞系]。感染2天后，通过使细胞与杀稻瘟素接触3天来使用抗生素(10μg/ml杀稻瘟素)筛选含有慢病毒载体的细胞。将阳性细胞分为两组：第一组，在含有0.5μg/ml DOX的培养基中培养；第二组，在不含DOX的培养基中培养。在DOX诱导7天后，使用FACS分析第一组和第二组的细胞。图7示出了人和小鼠H1启动子均能表达shRNA，这本身又可以有效地沉默Hela细胞中的eGFP表达。eGFP表达的抑制最高可达50倍。
还应该注意到的是，人H1启动子在沉默人T细胞内的eGFP表达方面效率较低(1-2倍)，而小鼠H1启动子可将eGFP表达降低最高达10倍(图8)。在小鼠T细胞系内，利用小鼠H1启动子将eGFP表达降低至本底水平，而人H1启动子可将eGFP表达降低4倍。该数据表明使用上文所述病毒颗粒感染的细胞内的eGFP表达水平会受到DOX的紧密调控。
实施例14
利用单慢病毒载体可诱导地沉默内源蛋白CXCR4
为确定所述诱导型单慢病毒载体是否可以降低内源蛋白表达，构建一种含有靶向于小鼠CXCR4 mRNA的shRNA的单慢病毒载体。使用正义引物(5′-GATCCAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTTCAAGAGAGGA ATTGAAACACCACCATCCTTTTTGG-3′)(SEQ ID NO：24)和反义引物(5′-AATTCCAAAAAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTCTCTTGAAGGAATTGAAACACCAC CATCCTG-3′)(SEQ ID NO：25)来生成设计用于靶向CXCR4编码区(从nt652至702)的shRNA，所述shRNA彼此退火并被克隆至pHRmHOtetOEFtet/blas中，所述载体之前已经用BamHI和EcoRI限制性内切酶消化过，并且利用eGFP置换所述杀稻瘟素抗性标记。将所得载体命名为pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP。
使用源自pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP的病毒颗粒感染两组小鼠T细胞系。第一组使用效价为5×106IU/ml的病毒颗粒感染；第二组使用效价为5×107IU/ml的病毒颗粒感染。感染3天后，将每组细胞再分为两个亚组。将所述亚组分别在含有0.5μg/ml DOX的培养基(1a组和2a组)或者在不含DOX的培养基(1b组和2b组)中培养。培养5天后，使用与PE缀合的抗-CXCR4抗体(BD Pharmgen)将所有的细胞染色。然后，利用FACS分析上述被染色的细胞。使用5×106IU/ml的源自pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP的病毒颗粒感染的上述细胞中有85％会表达GFP，而使用5×107IU/ml的所述病毒颗粒感染的细胞中有98％会表达GFP(图9)。在存在DOX的情况下，1a组的细胞使CXCR4的强度降低60％，而2a组的细胞使CXCR4的强度降低85％。这些数据表明所述慢病毒载体可以诱导shRNA活性，所述shRNA又会降低内源蛋白表达。此外，上述数据表明多拷贝的所述整合载体可以诱发高水平的基因沉默。
实施例15
单慢病毒载体可以诱导性地表达shRNA以沉默转基因小鼠体内的基因表达。
为确定所述单慢病毒载体是否可以表达shRNA以降低动物体内的蛋白表达，选择来自Jackson实验室的eGFP转基因小鼠的纯合品系作为靶标。当使用eGFP转基因小鼠的纯合品系时，可以测量所述shRNA对eGFP蛋白表达的影响。为产生用于本实验的慢病毒载体，使用CAG启动子置换所述pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas质粒中的EF-1a启动子，以提高所述转基因小鼠体内单慢病毒载体的基因表达能力。将所得载体命名为pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas。在细胞培养物中，源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的载体与来源于pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的载体相似，均可表达能够诱导性地沉默GFP表达的shRNA。
使用微注射系统(上文所述)将2×108IU/ml的源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas构建体或pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas构建体的病毒颗粒送递到GFP小鼠纯合品系的单细胞期胚胎中。将这样获得的转基因小鼠命名为GFP/CAG-建立者小鼠。第二天，将双细胞期胚胎植入到CD1代孕母鼠(foster mother)体内。在11只使用源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的病毒颗粒感染的小鼠中，有5只为转基因阳性，这一点得到了PCR分析的确认；而在9只使用源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的慢病毒载体感染的小鼠中，有4只为转基因阳性，这一点得到了PCR分析的确认。因此，对于所述两种慢病毒载体的每一种来说，利用PCR分析推断出的转基因阳性小鼠的比例为大约40％。
将两只被鉴别为转基因表达阳性的小鼠——GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#饲养4周。然后收集取自4周龄转基因小鼠尾静脉的血液，并且利用FACS分析法分析所述血细胞中的GFP表达水平。然后通过饮用水给该小鼠喂食DOX以诱导所述shRNA的表达。在喂食DOX 5日和10日后，再次收集取自4周龄转基因小鼠尾静脉的血液。如上文所述地利用FACS分析法分析所述血细胞中的GFP表达水平。在被喂食DOX之后，四只源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的阳性转基因小鼠中有两只降低了GFP表达水平(参见图12中的GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#)。所述血细胞中GFP表达水平的降低并不一致，一些细胞中GFP表达水平降低最高达10倍，而一些细胞没有变化。此外，五只使用源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas构建体的病毒颗粒感染的阳性转基因小鼠的GFP表达水平全部没有发生变化。然而，诱导前GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#的GFP表达水平与非转基因小鼠(不含shRNA载体)相同，表明所述转基因动物体内的H1诱导型启动子会受到DOX的紧密调控(图11)。
实施例16
单慢病毒载体可以诱导性地表达shRNA以沉默转基因小鼠体内的基因表达。
为确定经过种系传递之后所述诱导型单慢病毒载体是否会保持功能，使两只阳性转基因小鼠——GFP/CAG-建立者6#(雌性)和GFP/CAG-建立者9#(雄性)交配。利用DNA印迹分析法分析所有F1小鼠以测定慢病毒载体的整合拷贝的数量。在11只F1小鼠中，有2只含有两个整合拷贝的慢病毒载体。其他F1小鼠含有一个整合拷贝(5只小鼠)或者为整合阴性小鼠(4只小鼠)。
为确定所述含有慢病毒载体的F1小鼠是否可以通过调节DOX来诱导性地降低GFP表达水平，分析所述含有两个整合拷贝的慢病毒载体的F1小鼠(F1-6#和F1-9#)。在给小鼠喂食DOX之前以及给小鼠喂食DOX10、17、27天后，收集取自4周龄F1-6#和F1-9#转基因小鼠的血液。利用FACS分析法分析所述血细胞中的GFP表达水平。图13示出了在给所述小鼠喂食DOX之前所述血细胞中的GFP表达水平。两只转基因小鼠(F1-6#和F1-9#)体内的GFP表达水平均类似于非转基因小鼠体内的GFP表达水平。图14示出了在给所述小鼠喂食DOX 10、17、27天后所述转基因小鼠体内的GFP表达水平。在给所述小鼠喂食DOX之后，所述血细胞中的GFP表达水平下降。所述血细胞中GFP表达水平的降低并不一致，一些细胞中GFP表达水平降低最高达30倍，而一些细胞中GFP表达水平维持不变。喂食DOX 17天后，75％的血细胞的GFP表达水平降低了20倍。喂食DOX 27天后，85％的血细胞的GFP表达水平降低了30倍。这些数据表明所述诱导型慢病毒载体可表达其数量足以沉默F1小鼠体内GFP表达的shRNA，表明经过种系传递之后所述诱导型单慢病毒载体为功能性的。
实施例17
经过种系传递之后表达shRNA的诱导型单慢病毒载体为功能性的
为确定经过种系传递之后所述诱导型单慢病毒载体是否为功能性的，使两只阳性转基因小鼠(GFP/CAG-建立者6#为雌性，GFP/CAG-建立者9#为雄性)交配。当使用两只建造者来彼此交配时，我们希望可增加shRNA表达以明显地抑制GFP水平。利用DNA印迹分析法分析所有F1小鼠以测定所述慢病毒载体整合拷贝的数量。在11只F1小鼠中，有2只含有两个整合拷贝的慢病毒载体。其他小鼠含有一个整合拷贝的慢病毒载体(5只小鼠)或者为整合阴性的(4只小鼠)。
为确定含有所述慢病毒载体的F1小鼠是否可以利用DOX降低GFP，分析了含有两个整合拷贝的载体的F1小鼠(F1-6#和F1-9#)。在给小鼠喂食DOX之前以及给小鼠喂食DOX 10、17、27天后，收集4周龄转基因小鼠的血液。利用FACS分析法分析所述血细胞中的GFP水平。图13示出了在喂食DOX前所述血细胞中的GFP水平。两只转基因小鼠(F1-6#和F1-9#)的GFP表达水平均类似于非转基因小鼠体内的GFP表达水平。图14示出了喂食DOX 10、17、27天后所述血细胞内的GFP水平。喂食DOX后，所述血细胞内的GFP水平降低。所述血细胞中GFP水平的降低并不一致，一些细胞中GFP表达降低最高达30倍，而其他细胞中GFP表达水平无变化。喂食DOX 17天后，75％的血细胞的GFP表达水平降低了20倍，而喂食DOX 27天后，85％的血细胞的GFP表达水平降低了30倍。这些数据表明所述诱导型慢病毒载体可表达其数量足以沉默F1小鼠体内GFP蛋白的shRNA，表明经过种系传递之后所述诱导型单慢病毒载体为功能性的。
实施例18
诱导型单慢病毒载体可利用II型聚合酶表达基于微小RNA的shRNA，以便沉默基因表达
之前，其他研究人员已经报道了使用由H.Bujard及其同事开发的使用四环素(Tet)-调节系统的诱导型单慢病毒载体。在单一载体中的四环素诱导型启动子和人CMV启动子的调控下，这种载体可表达GFP报道基因和四环素反式作用子。所述诱导型和组成型启动子排列反向相同，均从5’-LTR至3’-LTR。这类单一载体表达微小RNA或shRNA，所述微小RNA或shRNA可能会与非特异性RNA序列杂交。上述非特异性RNA序列可以降低微小RNA或shRNA的效率和功能。
为克服这类问题，制备含有双顺反子(bistronic)诱导型启动子和组成型启动子的诱导型单慢病毒载体，上述两种启动子取向相反。为减少所述诱导型启动子的启动子干扰和基础水平渗漏，将1.2kb的鸡隔离子插入到所述诱导型启动子和组成型启动子之间。选择CAG启动子来驱动所述四环素抑制子基因(tetR-VP16融合蛋白)的表达和提高所述可诱导的体内基因表达。此外，该载体使用改进的tet-on系统，包括被称为M2的突变体形式tet-on，并且用四拷贝的最小Vp16反式作用子结构域置换所述单一全长Vp16结构域。还将DsRed-exp基因插入到所述四环素激活子基因的下游，所述四环素激活子基因的表达由CAG启动子驱动并且由IRES表达。所述最终构建体被命名为pHRpATRE/CAGM2Red。
当使用Invitrogen miRNA试剂盒时，鉴别了一个21bp的miRNA靶向序列(从480至500为5’-CGGCATCAAGGTGAACTTCAA-3’)(SEQ ID NO：26)可以有效地沉默GFP蛋白表达。利用PCR扩增157个碱基对的miRNA-GFP(480)并且将其克隆到pHRpATRE/CAGM2Red中。此外，将DsRed-exp基因插入到所述四环素激活子基因的下游，所述四环素激活子基因的表达由CAG启动子驱动并且由IRES表达。为促进所述诱导型启动子中转录的终止，引入了两个pA信号元件(pA-BGH和pA-TK)。将所得的构建体命名为pHR miRNA-GFP(480)/CAGM2Red(SEQ ID NO：37)。使用源自构建体pHRmiRNA-GFP(480)/CAGM2Red的病毒颗粒来感染表达GFP的HeLa细胞。然后将被感染的表达GFP的HeLa细胞分为两组，第一组在含有0.5μg/ml DOX的培养基中培养，第二组在不含DOX的培养基中培养。感染7天后，利用荧光显微术分析所述细胞。该数据表明基于Pol II的单慢病毒载体可以表达功能性shRNA，所述shRNA能够以可诱导和可逆转的方式降低其靶蛋白的表达。
实施例19
基于Cre-loxP的有条件的、可诱导的、可逆转的慢病毒载体系统的开发
制备了基于Cre-loxP的有条件的、可诱导系统，并且将其应用到转基因动物内。为制备该系统，将Cre-loxP系统与一种四环素诱导的系统结合，以便以组织特异性、可诱导、可逆转的方式表达基因。按照下列方式制备构建体：将850bp的loxp-DsRed-loxp插入到pHRpATRE/CAGM2Red中所述M2基因的上游，并且将M2下游的IRES-DsRed片段删除。所得构建体为基于Cre-loxp的有条件的、可诱导、可逆转的慢病毒载体，命名为pHRpATRE/CAGloxRedM2。接下来，将获自pHR miRNA-GFP(480)/CAGM2Red的miRNA-GFP(480)片段克隆到pHRpATRE/CAGloxRedM2内，由此制备被命名为pHRmiRNA-GFP(480)/CAGloxRedM2的构建体。DsRed荧光蛋白提供了一种监测Cre-loxp功能的方法。
使用含有Bgl II限制性内切酶和SV40 NLS(用下划线标出)位点的正义引物(5’-GGA AGA TCT GAA TTC ACC ATG GAT CCC AAA AAG AAA AGA AAG GTA GCA TCC AAT TTA CTA ACC GTA CAC-3’)(SEQ ID NO：39)和含有Xhol I限制性内切酶位点的反义引物(5’-ATG CCG CTC GAG CTAATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG-3’)(SEQ ID NO：40)，利用PCR扩增所述Cre基因。利用Bgl II和Xhol I限制性内切酶消化所述PCR产物，并且使用BamHI和XhoI限制性内切酶将其克隆到pHREFGFPblas中，命名为pHREFla/CreNLS/blas。使用源自pHREFla/CreNLS/blas构建体的慢病毒载体颗粒感染表达GFP的HeLa细胞，以组成性地表达所述Cre酶。利用杀稻瘟素筛选所述被感染的细胞。筛选所得的细胞在本文中命名为GFP/Cre HeLa细胞。使用所述源自pHRmiRNA-GFP(480)/CAGloxRedM2的构建体病毒颗粒感染所述GFP或GFP/Cre HeLa细胞或者使所述病毒颗粒进入所述GFP或GFP/Cre HeLa细胞。感染三天后，将所述细胞分为两组。使第一组暴露于DOX(0.5μg/ml)，第二组不与DOX接触。感染7天后，利用荧光显微术分析所述细胞。与在不存在DOX的情况下培养的细胞相比，在所述暴露于DOX的GFP/Cre HeLa细胞内GFP表达水平显著下降。在所述GFP/Cre HeLa细胞内未检测到DsRed表达，因此，所述Cre酶可以移除所述Loxp-DsRed-Loxp片段，并且可以利用Cre酶有条件地表达M2。此外，上述结果表明M2可以诱导表达功能性shRNA以便以四环素调控方式减低所述靶蛋白表达。
实施例20
构建pTREGag-HCV-Gag-Pol包装构建体
如上文所述，利用PCR由pTRE质粒(购自Clontech)扩增所述四环素诱导型启动子片段。然后将所述PCR产物克隆到pcDNA 3.1中以置换CMV启动子，从而制备所述四环素诱导型质粒，所得的质粒在本文中被命名为pTRE-neo。
接下来，使用含有EcoRI限制性位点的正义引物(5’-CGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCGCGTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAG-3’)(SEQ ID NO：27)与含有MscI限制性位点和7碱基突变的反义引物(5’-CATGTTGGCCAAATTTTGCCCAGGAAATTAGCCTGTCTCTCAG-3’)(SEQ ID NO：28)利用PCR扩增一个1357bp的含有MA(这是什么)、CA和NC编码序列的HIV-1 gag片段。将所述7点突变引入到反义引物中是为了破坏所述PCR产物中移码所必需的二级结构(环结构)。所述突变不会改变gag氨基酸序列。
接下来，使用含有MscI限制性位点的正义引物(5’-TTTGGCCAAGTCACAAGGGAAGGCCAG-3’)(SEQ ID NO：29)与含有XhoI和MluI限制性位点和3个点突变的反义引物(5’-CTCGACATGACGCGTTATTGTGACGAGGGGTCGCTGCCAAA-3’)(SEQ ID NO：30)利用PCR扩增一个194bp的含有P2和P6编码序列的HIV-1 gag片段。将所述3个点突变引入到正义引物中是为了破坏所述PCR产物中移码所必需的二级结构(环结构)。所述突变不会改变gag氨基酸序列。使用EcoRI和MscI限制性内切酶消化所述1357bp的HIV-1 gag片段。此外，使用MscI和XhoI限制性内切酶消化所述194bp的HIV-1 gag片段。
还使用EcoRI和XhoI限制性内切酶消化所述pTRE-neo载体。然后将所述PCR产物的两个片段克隆到pTRE-neo内。将所得质粒命名为pTRE-Gag质粒。
接下来，使用含有EcoRI、MluI和BssH II限制性内切酶位点的正义引物(5’-GAATTCACGCGTATGGGCGCGCGTGCGTCAGTATTGAGCGGGGG-3’)(SEQID NO：31)与含有Bgl II限制性位点以及点突变和额外的碱基对插入的反义引物(5’-CGCAGATCTTCCCTGAAGAAGTTAGCCTGTCTCTCAGTACAATC-3’)(SEQ ID NO：32)，利用PCR扩增一个1313bp的含有MA、CA和NC编码序列的HIV-1 gag片段。将所述点突变和碱基对插入引入到正义引物中以破坏所述PCR产物的二级结构(环结构)，并且生成所述Gag-pol融合蛋白。
然后，使用含有Bgl II限制性位点的正义引物(5’-AGATCTGGCATTTCCGCAGGGTAAAGCGCGTGAATTTTCCTCAGAGCAGACCAGAGCCAACA-3’)(SEQ ID NO：33)和含有XhoI和Sal I限制性位点的反义引物(5’-GCCTCGAGCGATGTCGACACCCAATTCTGAAAAGAGTAAACAGCAG-3’)(SEQ IDNO：34)利用PCR扩增一个3695bp的含有P2、TF、蛋白酶、反转录酶、整合酶、vif和vpr的HIV-1 gag和Pol片段。使用EcoRI和Bgl II限制性内切酶消化所述1313bp的PCR产物，同时使用Bgl II和XhoI限制性内切酶消化所述3695bp的PCR产物。
然后使用EcoRI和XhoI限制性内切酶消化pTRE-neo。然后将两个PCR产物片段克隆到pTRE-neo内。将所得质粒命名为pTRE-Gag-Pol/dTat/dRev。
利用XhoI和SalI限制性内切酶消化pCMV-Gag-Pol，获得一个1710bp的含有vpr、Tat、Rev和RRE的片段。然后使用XhoI和Sal I限制性内切酶将该片段克隆到pTRE-Gag-Pol质粒中以制备被命名为pTRE-Gag-Pol的质粒。
使用含有MluI限制性内切酶位点的正义引物(5’-CTGACGACGCGTGCCAGCCCCCTGATGGGGCGAC-3’)(SEQ ID NO：35)和含有BssH II位点的反义引物(5’-CGCACGCGCGCCCATGGTGCGCTGTGTACGAGACCTCCCGGGGCA-3’)(SEQ ID NO：36)，利用PCR扩增一个340bp的HCV IRES片段。然后使用MluI和BssHII限制性内切酶消化所述PCR产物，并且使用MluI和BssH II限制性内切酶将其克隆到pTRE-Gag-Pol质粒内。将所得质粒命名为pTRE-HCV-Gag-Pol。
使用MluI和XhoI限制性内切酶消化pTRE Gag，获得了1646bp的Gag片段，并且使用MluI和XhoI限制性内切酶将其亚克隆到pTRE-HCV-Gag-Pol中。将最终的质粒命名为pTREGag-HCV-Gag-Pol。所得质粒缺少所述保守性移码环结构。其次，Gag-Pol融合蛋白的表达受到HCV IRES的调节。
实施例21
制备并分析KISS-1转基因小鼠
肿瘤迁移抑制素(Metastin)是一种由癌细胞中KiSS-1基因编码的抗迁移肽。最近的研究发现肿瘤迁移抑制素是孤儿G蛋白偶联受体GPR54的配体，所述GPR54在特定脑区域中(例如下丘脑和部分海马体)高水平表达。kisspeptins在调节促性腺激素释放激素(GnRH)分泌过程中起到了重要作用。新的证据证实了kisspeptin通过作用于GPR54来刺激GnRH分泌。Kisspeptins和GPR54对灵长类的青春期成熟至关重要。然而，目前尚未有关于KiSS-1转基因小鼠的报道。下文所述实验描述了基于诱导型单慢病毒载体的转基因小鼠的制备，所述转基因小鼠能够可诱导地和可逆转地表达人KiSS-1基因。
使用含有BamHI限制性内切酶位点的正义引物(5’-ATCGCGGATCCCTGCCTCTTCTCACCAAGATGAACTCACTGGT-3’)(SEQ ID NO：41)和含有XhoI限制性内切酶位点的反义引物(5’-TTTCTCGAGTCACTGCCCCGCACCTGCGCC-3’)(SEQ ID NO：42)，利用PCR扩增人KiSS-1基因。使用BamHI和XhoI限制性内切酶消化所述PCR产物，并且使用BamHI和XhoI限制性内切酶将其克隆到pHRpAtetOCMVCAGtetGFP中。将最终的构建体命名为pHRKiSSO2CAGtetGFP(SEQ ID NO：43)。
如上所述，使用源自pHRKiSSO2CAGtetGFP的高效价慢病毒载体的感染性颗粒感染单细胞期胚胎。使用荧光显微术通过GFP阳性细胞测定感染性颗粒的效价。在感染后的第二天，将所述双细胞期胚胎转移到代孕母鼠(CD1)体内。根据GFP表达情况筛选阳性转基因小鼠(具有绿色身体的小鼠)。所测试的11只小鼠中有7只阳性转基因小鼠。使用含有500μg/ml DOX的水喂养4只(2只雌性和2只雄性)4周龄的建立者转基因小鼠以诱导KiSS基因表达。为测量所述KiSS转基因小鼠的表型，监测雌性小鼠的阴道开口和雄性小鼠的阴茎。DOX诱导5天后，5周龄的雌性小鼠的阴道张开。此外，5周龄雄性小鼠的阴茎颜色和大小均有变化。与对照小鼠的阴茎相比，KiSS Tg雄性小鼠的阴茎较大并且发育更快。
实施例22
使用慢病毒载体制备表达M2反式活化蛋白的GNT1细胞系
使用BamHI和XhoI将经修饰的M2基因(含有与VP16有效连接的tetON)克隆到pHREF-lablas载体中(SEQ ID NO：52)。将所得载体命名为PS839pHREFM2blas(SEQ ID NO：44)。通过使用PS839pHREFM2blas(一种包装构建体(p8.91，Trono lab，Lausanne，Switzerland))和pCMV-VSV-G(pMD-G，Trono lab，Lausanne，Switzerland)共转染来制备含有PS839pHREFM2blas的感染性颗粒。使用所述感染性颗粒感染HEK293S细胞(GnTl+)和GnTl-HEK293S细胞(所述HEK293S细胞(GnTl+)和GnTl-HEK293S细胞由美国麻省理工学院(Massachusettes Instituteof Technology)提供)。将所述被转导的细胞用杀稻瘟素(20μg/ml)持续筛选一周。将抗性细胞系命名为GnTl+HEK293S W2细胞和GnTl-HEK293SW2细胞。上述细胞系含有上文所述的M2构建体。
制备表达CCR1的四环素诱导型细胞系
迄今为止，已经描述了至少10种CC趋化因子受体家族成员。根据IUIS/WHO小组委员会关于趋化因子命名的规定，将所述成员命名为CCR1至CCR10。CCR1是首个被鉴别出来的CC趋化因子受体，并且可结合多种炎症/诱导型CC趋化因子(例如CCL4-6和CCL14-16)。在人体内，该受体存在于外周血淋巴细胞和单核细胞上。该受体也被称为分化抗原簇标记CD191。
构建含有人CCR1的慢病毒载体
人CCR1 cDNA(GENBANK编号：BC051306)获自Open Biosystems(Huntsville，AL)，并且利用PCR对其进行扩增，并使用InvitrogenTA克隆试剂盒(Carlsbad，CA)将其克隆到pCR-2.1载体中。将所得的载体命名为pCR-hCCR1。对CCR1基因的终止密码子进行突变以便与Tag基因融合(TEV-Flag-10His)(参见图16B)。使用限制性内切酶消化hEP2R基因并且将其克隆到pHTRE-puro内(也被称为L494pHRTREpuro；SEQ ID NO：45)。将所得载体命名为pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His(也被称为PT834pHRTRE-hCCR1TEVpur；SEQ ID NO：46)。图16A示出了载体的示意图。如图16所示，驱动hCCR1表达的启动子为tet-调节元件(TRE)，其后紧邻hCCR1编码区。整合的载体转录双顺反子mRNA，使所述嘌呤霉素抗性基因与hCCR1为顺式。
构建表达hCCR1的四环素诱导型细胞系
为产生源自pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His的感染性颗粒，将所述pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His质粒与p8.91包装构建体(Trono lab，Lausanne，Switzerland)和pCMV-VSV-G(pMD-G；Trono lab，Lausanne，Switzerland)共转染到293T细胞内。使用所述含有pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His的病毒颗粒感染GnTl-HEK293S W2细胞，所述细胞具有降低的GnTI活性并且还表达四环素反式作用子。发现被感染的细胞可产生高水平的CFTR蛋白(3-5mg/109细胞)，这比其他已知被用于表达膜蛋白的系统高1个对数值。利用嘌呤霉素(从1.0至4.0μg/ml)筛选被转导的细胞，以建立被命名为hCCR1-m细胞的稳定细胞系。
分析四环素诱导型细胞系内的hCCR1表达
使hCCR1-m细胞(使用0、1、2和4μg嘌呤霉素/ml进行筛选)在6孔板中生长并且将1μg/ml DOX加入到培养基中。第二天，收集诱导的hCCR1-m细胞并且利用蛋白质印迹对其进行分析，所述蛋白质印迹方法使用了一抗(M2 flag抗体)和二抗(HRP缀合的抗-小鼠抗体)。还对所述印迹进行抗微管蛋白共染色作为对照。利用M2 flag抗体在hCCR1-m细胞内检测到一条52kDa的条带，而未在HERK细胞内检测到该条带，同时在所有细胞中均检测到一条55kDa的条带。
CCR1的高水平表面表达
为确定所述抗CCR1特异性抗体是否可以在hCCR1-m细胞中检测到CCR1的细胞表面表达，使用与Alexa 
Figure A200680052999D01181
 647缀合的小鼠抗人CCR1单克隆抗体(CAT#557914，BD Bioscience，San Jose，CA)对使用或未使用DOX诱导的hCCR1-m细胞进行染色(24小时)。使用未转导的293细胞作为对照。结果表明DOX诱导的细胞系所表达的CCR1的细胞表面水平非常高。与未诱导的hCCR1-m细胞相比，在诱导的hCCR1-m细胞内诱导水平为大约10倍。
诱导CCR1以阻止细胞生长和/或导致细胞凋亡
将所述hCCR1-m细胞在含有或不含有1μg/ml DOX的6孔板中培养。利用显微镜来监测细胞生长。在使用DOX诱导24小时之后，所述hCCR1-m细胞停止生长，同时大多数被诱导的hCCR1-m细胞会从板上脱附。数据表明高水平的hCCR1表达会导致hCCR1信号的激活，而不需要配体。
实施例23
制备表达CFTR(Cl-阴离子穿膜通道)的四环素诱导型细胞系
构建CFTR His(10x)慢病毒载体
使用BstXI和XhoI消化CFTR His(6x)慢病毒载体(又称为PT764pHRTRECFTR-His6puro；SEQ ID NO：47)DNA以移除含有6xHis的C末端DNA片段。使用野生型CFTR质粒DNA作为模板，利用PCR扩增含有10xHis的C末端CFTR BstXI/XhoI DNA片段。在使用BstXI和XhoI消化之后，克隆所述片段并且使用内切酶限制性分析和核苷酸序列分析进行确认。将所得载体命名为CFTR His(10x)(又称为PT823pHRTRECFTR-His10pur；SEQ ID NO：48)。
使用CFTR His(6x)和CFTR His(10x)慢病毒载体转导GnTl+和GnTl-HEK293S细胞。
如本文其他部分所述，包装每个慢病毒载体并且用其转导GnTl+HEK293S W2细胞和GnTl-HEK293S W2细胞。在给所述培养基添加25μg/ml嘌呤霉素两天后，筛选高度表达CFTR的细胞系。筛选四天后，在不含嘌呤霉素的培养基中放大培养存活的细胞。
免疫印迹分析
收集三百万个每种类型的细胞(转导的GnTl+HEK293S W2细胞和GnTl-HEK293S W2细胞)，并且制备膜组分以进行免疫印迹分析。此外还分析了CFTR+对照(CFTR-FLAG)。使用R1104抗-CFTR MAb检测被印迹的蛋白。结果表明转导的GnTl-HEK293S W2细胞表达了6x和10x标记的CFTR蛋白。观察到与转导的GnTl+HEK293S W2细胞中所表达的同一种蛋白的条带相比，转导的GnTl-HEK293S W2细胞中所表达的蛋白的条带在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的更快。
分析表达CFTR-His(10x)的GnTl-HEK293S细胞中的离子通道功能为确定所表达的CFTR-His-tag(10x)蛋白是否具有活性，使用卤化物淬灭染料6-甲氧基-N-3-(磺丙基)喹啉铵(SPQ，Molecular Probes)测量GnTl+和GnTl-细胞系中的卤化物外流。为进行比较，平行分析了表达野生型CFTR的GnTl+细胞。简言之，将转导的HEK293S wt-CFTR、HEK293S CFTR-His(10x)、HEK293S GnTl-CFTR-His(10x)细胞系在盖玻片上接种并且培养至约50％汇合度。然后将所述细胞用10mM SPQ低渗负载10分钟，并且置于淬灭NaI缓冲液中。使用Zeiss倒置显微镜、PTI成像系统和Hamamatsu照相机测量单细胞荧光。以340nm的波长激发，测量410nm波长的发射光。在实验开始时将细胞置于淬灭缓冲液中(NaI)，在建立了稳定的基线之后，在200秒时将细胞换到不含卤化物的去淬灭缓冲液中。在620秒时使用激动剂(20μM福斯高林)刺激细胞，然后将细胞放回到所述淬灭NaI缓冲液中。用其基线值将每个细胞的荧光标准化，并且将荧光变化表示为与基线荧光相比增加的百分数。将每个时间点所分析的细胞总数(至少30个)的平均值作图。所得结果证实每种细胞系的卤化物外流均被显著活化。与HEK293S wt-CFTR相比，所述HEK293S CFTR-His(10x)和GnTl-HEK293 CFTR-His(10x)细胞系的荧光均产生更大变化。
实施例24
制备表达人EP2R的四环素诱导型细胞系
构建含有EP2的慢病毒载体
hEP2 cDNA获自Schering Ag(Berlin，Germany)，并且利用PCR对其进行扩增，并使用Invitrogen TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA)将其克隆到pCR-2.1载体中。将所得构建体命名为pCR-hEP2R(SEQ ID NO：49)。对EP2基因的终止密码子进行突变以便与Tag基因融合(TEV-Flag-10His)(图17)。使用限制性内切酶消化hEP2R基因，并且将其克隆到pHTRE-puro(SEQ ID NO：45)内。将所得构建体命名为pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His(SEQ ID NO：50)。图17示出了载体的示意图。如图17所示，驱动hEP2R表达的启动子为tet-调节元件(TRE)，其后紧邻hEP2R编码区。所述整合的载体转录一种双顺反子mRNA，使所述嘌呤霉素抗性基因与hER2R同向。
构建表达hEP2R的四环素诱导型细胞系
为产生源自pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His(SEQ ID NO：50)的感染性颗粒，将所述pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His质粒(SEQ ID NO：50)与p8.91包装构建体(Trono lab，Lausanne，Switzerland)和pCMV-VSV-G(pMD-G；Trono lab，Lausanne，Switzerland)共转染到293T细胞内。使用所述含有pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His的病毒颗粒感染经过基因工程改造的细胞系，所述细胞系具有降低的GnTI活性(GnTl-HEK293S W2细胞)并且还表达四环素反式作用子。发现被感染的细胞可产生高水平的hEP2R蛋白(3-5mg/109细胞)，这比其他已知被用于表达膜蛋白的系统高1个对数值。利用嘌呤霉素(从1.0至4.0μg/ml)筛选被转导的细胞以建立被命名为hEP2R-m细胞的稳定细胞系。
分析四环素诱导型细胞系内的hEP2R表达
使hEP2R-m细胞(使用0μg或2μg/ml嘌呤霉素进行筛选)在6孔板中生长并且将1μg/ml DOX加入到培养基中。第二天，收集诱导的hEP2R-m细胞并且利用蛋白质印迹对其进行分析，所述蛋白质印迹方法使用了一抗(M2 flag抗体)和二抗(HRP缀合的抗-小鼠抗体)的。对所述印迹利用抗-微管蛋白共染色作为对照。利用M2 flag抗体在hEP2R-m细胞内检测到三条带，而在HERK细胞内未检测到所述条带。三条带的大小为45-53kDa，所述条带均小于微管蛋白的大小(55kDa)。hEP2R的期望大小为53kDa。
诱导hEP2R以阻止细胞生长和/或导致细胞凋亡
将所述hEP2R-m细胞在含有或不含有1μg/ml DOX的6孔板中培养。利用显微镜来监测细胞生长。在诱导24小时之后，所述hEP2R-m细胞停止生长，同时大多数被诱导的hEP2R-m细胞会从板上脱附。数据表明高水平的hEP2R表达会导致hEP2R信号的活化，而不需要配体。
序列表
<110>UAB研究基金会
<120>与使用病毒载体控制的基因表达相关的方法和组合物
<130>21085.0140P1
<150>60/751，407
<151>2005-12-16
<150>60/751，117
<151>2005-12-16
<160>52
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>654
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Claims (453)

1.一种核酸构建体，包括一种载体，其中所述载体包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列包括与第一转录调控元件有效连接的目的序列，其中所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接，并且编码可调控所述第一核酸序列表达的多肽，其中所述第三核酸序列包括与第一转录调控元件有效连接的调节子靶序列，并且其中所述第一和第二转录调控元件取向相反。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述载体为病毒载体。
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述病毒载体为自我失活型。
4.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一或第二转录调控元件影响所述其他转录调控元件的活性。
5.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一和第二转录调控元件并置。
6.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一和第二转录调控元件之间存在一个接头序列。
7.权利要求6的核酸构建体，其中所述接头序列为一种染色体隔离子。
8.一种含有权利要求1的核酸构建体的细胞系。
9.权利要求1的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括至少一个tet操纵子序列。
10.权利要求1的核酸构建体，其中所述调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
11.权利要求1的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
12.权利要求1的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括SEQ ID NO:6的序列。
13.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一核酸序列的表达依赖于Cre的存在。
14.权利要求13的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括一个侧翼接有TATA序列的可筛选标记，其中所述TATA序列与至少一个tet操纵子序列有效连接，其中所述可筛选标记的侧翼接有1oxP位点，并且其中所述调节子序列位于所述第一转录调控元件和所述第一核酸序列之间。
15.权利要求1的核酸构建体，其中所述目的序列编码一种目的蛋白。
16.权利要求15的核酸构建体，其中所述被编码的蛋白为一种DNA聚合酶III的转录因子。
17.权利要求1的核酸构建体，其中所述目的序列为微小RNA序列、shRNA序列、siRNA序列或mRNA序列。
18.权利要求1的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括一种编码四环素抑制子的核酸序列。
19.权利要求18的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括一种编码核定位信号的核酸序列。
20.权利要求19的核酸构建体，其中所述被编码的核定位信号为SV40核定位信号。
21.权利要求1的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:1的序列。
22.权利要求18的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括VP16。
23.权利要求22的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:2的序列。
24.权利要求1的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括一种编码四环素激活子的核酸序列。
25.权利要求24的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括一种编码核定位信号的核酸序列。
26.权利要求25的核酸构建体，其中所述被编码的核定位信号为SV40核定位信号。
27.权利要求1的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:2的序列。
28.权利要求24的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括VP16。
29.权利要求28的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:3的序列。
30.权利要求1的核酸构建体，还包括与第三转录调控元件有效连接的第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括第二目的序列。
31.权利要求30的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件为启动子。
32.权利要求31的核酸构建体，其中所述第二目的序列编码一种目的蛋白。
33.权利要求31的核酸构建体，其中所述第二目的序列为微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。
34.权利要求33的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件选自小鼠Hi启动子、人H1启动子或U6启动子。
35.权利要求1的核酸构建体，还包括第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括一种编码可筛选标记的序列。
36.权利要求35的核酸构建体，其中所述可筛选标记选自GFP或RFP。
37.权利要求35的核酸构建体，还包括一个内部核糖体进入位点。
38.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一核酸序列的表达是可调节的。
39.权利要求1的核酸构建体，其中所述转录调控元件选自启动子或增强子。
40.权利要求39的核酸构建体，其中所述启动子选自mH1启动子、hH1启动子、CAG启动子、CMV启动子、基于CMV的启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、泛素C启动子或EF-1α启动子。
41.权利要求40的核酸构建体，其中所述转录调控元件是可调节的。
42.权利要求16的核酸构建体，还包括一种与所述调节子靶序列有效连接的编码GAL-4的核酸序列。
43.权利要求42的核酸构建体，包括至少两个tet0序列。
44.权利要求42的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括至少一个tet调节子靶序列。
45.权利要求42的核酸构建体，其中所述调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
46.权利要求42的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
47.权利要求42的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括SEQ ID NO:6的序列。
48.权利要求42的核酸构建体，还包括与第二调节子序列有效连接的编码GAL-4的核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列与第三转录调控元件有效连接，其中所述第二目的序列选自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二调节子序列位于所述编码GAL-4的核酸序列和所述第二目的序列之间。
49.权利要求48的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括至少一个调节子靶序列。
50.权利要求48的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
51.权利要求48的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
52.权利要求48的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括SEQ IDNO:6的序列。
53.权利要求48的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件选自启动子或增强子。
54.权利要求53的核酸构建体，其中所述启动子选自mH1启动子、hH1启动子、泛素C启动子或EF-1α启动子。
55.一种核酸构建体，包括一种载体，其中所述载体包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列与一个转录调控元件有效连接，其中所述第一核酸序列包括一个目的序列，其中所述第二核酸序列编码一个可调控所述第一核酸序列表达的多肽，其中所述第三核酸序列包括一个与所述第一转录调控元件有效连接的调节子靶序列，并且其中所述第一转录调控元件能够驱动所述第一和第二核酸序列的表达。
56.权利要求55的核酸构建体，其中所述载体为病毒载体。
57.权利要求56的核酸构建体，其中所述病毒载体为自我失活型。
58.一种含有权利要求55的核酸构建体的细胞系。
59.权利要求55的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括至少一个tet操纵子序列。
60.权利要求55的核酸构建体，其中所述调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
61.权利要求55的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
62.权利要求55的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括SEQ ID NO:6的序列。
63.权利要求55的核酸构建体，其中所述第一核酸序列的表达依赖于Cre的存在。
64.权利要求63的核酸构建体，其中所述调节子序列包括一个侧翼接有TATA序列的可筛选标记，其中所述TATA序列与至少一个tet操纵子序列连接，其中所述调节子序列的侧翼还接有1ox P位点，并且其中所述调节子序列位于所述第一转录调控元件和所述第一核酸序列之间。
65.权利要求55的核酸构建体，其中所述目的序列编码一种目的蛋白；
66.权利要求65的核酸构建体，其中所述目的蛋白为一种DNA聚合酶III的转录因子。
67.权利要求55的核酸构建体，其中所述目的序列为微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。
68.权利要求55的核酸构建体，还包括一种与所述调节子靶序列有效连接的编码GAL-4的核酸序列。
69.权利要求68的核酸构建体，包括SEQ ID NO:6的序列。
70.权利要求68的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括至少一个tet调节子靶序列。
71.权利要求68的核酸构建体，其中所述调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
72.权利要求68的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
73.权利要求68的核酸构建体，其中所述调节子靶序列包括SEQ ID NO:6的序列。
74.权利要求55的核酸构建体，还包括一种与第二调节子靶序列有效连接的编码GAL-4的核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列与第三转录调控元件有效连接，其中所述第二目的序列选自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二调节子靶序列位于所述编码GAL-4的核酸序列和所述第二目的序列之间。
75.权利要求74的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括至少一个tet调节子靶序列。
76.权利要求74的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列与一个TATA框有效连接。
77.权利要求74的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括一个侧翼接有两个tet操纵子序列的TATA框。
78.权利要求74的核酸构建体，其中所述第二调节子靶序列包括SEQ IDNO:6的序列。
79.权利要求74的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件选自启动子或增强子。
80.权利要求79的核酸构建体，其中所述启动子选自mH1启动子或hH1启动子。
81.权利要求55的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括一种编码四环素抑制子的核酸序列。
82.权利要求81的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括一种编码核定位信号的核酸序列。
83.权利要求82的核酸构建体，其中所述被编码的核定位信号为SV40核定位信号。
84.权利要求55的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:1的序列。
85.权利要求81的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括VP16。
86.权利要求55的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:2的序列。
87.权利要求55的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括一种编码四环素激活子的核酸序列。
88.权利要求87的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括一种编码核定位信号的核酸序列。
89.权利要求88的核酸构建体，其中所述被编码的核定位信号序列为SV40核定位信号。
90.权利要求55的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:2的序列。
91.权利要求87的核酸构建体，其中所述第二核酸序列还包括VP16。
92.权利要求91的核酸构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQ ID NO:3的序列。
93.权利要求55的核酸构建体，还包括与第三转录调控元件有效连接的第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括第二目的序列。
94.权利要求93的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件为启动子。
95.权利要求93的核酸构建体，其中所述第二目的序列编码一种目的蛋白。
96.权利要求93的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件为启动子。
97.权利要求93的核酸构建体，其中所述第二目的序列为微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。
98.权利要求97的核酸构建体，其中所述第三转录调控元件选自小鼠Hi启动子、人H1启动子、U6启动子、泛素C启动子或EF-1α启动子。
99.权利要求55的核酸构建体，还包括第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括一种编码可筛选标记的序列。
100.权利要求99的核酸构建体，其中所述可筛选标记选自GFP或RFP。
权利要求99的核酸构建体，还包括一个内部核糖体进入位点。
权利要求55的核酸构建体，其中所述第一核酸序列的表达是可调节的。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件选自启动子或增强子。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件包括CMV启动子的3’部分。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件包括CMV启动子的5’部分。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件包括β-肌动蛋白启动子的一部分。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件包括CAG启动子。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件包括与CAG启动子有效连接的3’CMV启动子序列。
权利要求55的核酸构建体，其中所述转录调控元件序列包括SEQIDNO:12的序列。
110.权利要求67的核酸构建体，其中所述转录调控元件选自小鼠Hi启动子、人H1启动子、U6启动子、泛素C启动子或EF-1α启动子。
111.一种双向转录调控元件，包括与CAG启动子的5’端融合的CMV启动子的3’端。
112.权利要求111的双向转录调控元件，包括SEQIDNO:12中列出的序列。
113.权利要求111的双向转录调控元件，其中所述双向启动子是可调节的。
114.权利要求111的双向转录调控元件，其中所述双向启动子为组成型的。
115.一种双向转录调控元件，包括与EF-1α启动子的5’端融合的CMV启动子的3’端。
116.权利要求115的双向转录调控元件，包括SEQIDNO:13中列出的序列。
117.权利要求115的双向转录调控元件，其中所述双向启动子是可调节的。
118.权利要求115的双向转录调控元件，其中所述双向启动子为组成型的。
119.一种选择性调节目的序列表达的方法，包括在合适于调节目的序列的条件下将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞。
120.一种制备重组蛋白的方法，包括在合适于表达重组蛋白的条件下将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞，其中所述目的序列为编码所述重组蛋白的核酸序列。
121.权利要求120的方法，其中所述靶细胞产生均一糖基化模式的糖蛋白。
122.权利要求120的方法，其中与对照细胞相比，所述靶细胞具有降低的GnTI活性。
123.权利要求120的方法，其中通过在适合于调节所述目的序列的条件下将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞中来制备所述靶细胞。
124.权利要求120的方法，其中在体外将权利要求1所述的核酸构建体引入所述靶细胞中。
125.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括将按照权利要求120所述方法制备的重组蛋白引入受试者体内，所述重组蛋白的量足以诱导免疫应答。
126.权利要求120的方法，其中在体内将权利要求1所述的核酸构建体引入所述靶细胞中。
127.一种选择性调节目的序列表达的方法，包括在适合于调节所述目的序列的条件下将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞。
128.一种制备重组蛋白的方法，包括在合适于表达重组蛋白的条件下将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞，其中所述目的序列为编码所述重组蛋白的核酸序列。
129.权利要求128的方法，其中所述靶细胞产生均一糖基化模式的糖蛋白。
130.权利要求128的方法，其中与对照细胞相比，所述靶细胞具有降低的GnTI活性。
131.权利要求128的方法，其中所述靶细胞可使用权利要求331的方法来产生。
132.权利要求128的方法，其中在体外将所述核酸构建体引入所述靶细胞中。
133.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括将按照权利要求128所述方法制备的重组蛋白引入受试者体内，所述重组蛋白的量足以诱导免疫应答。
134.权利要求128的方法，其中在体内将所述核酸构建体引入所述靶细胞中。
135.一种制备转基因动物的方法，包括:
a)将权利要求1所述的核酸构建体引入合子中；
b)允许所述合子发育至足月；
c)获得基因组中含有所述核酸构建体的动物；
d)将所述动物与非转基因动物杂交以获得F1代；和
e)选择基因组中含有所述核酸构建体的动物。
136.一种基因组中含有转基因的转基因动物，其中所述转基因含有权利要求1所述的核酸构建体。
137.一种制备转基因动物的方法，包括:
a)将权利要求55所述的核酸构建体引入合子中；
b)允许所述合子发育至足月；
c)获得基因组中含有所述核酸构建体的动物；
d)将所述动物与非转基因动物杂交以获得F1代；和
e)选择基因组中含有所述核酸构建体的动物。
138.一种基因组中含有转基因的转基因动物，其中所述转基因含有权利要求55所述的核酸构建体。
139.一种表达Kiss-1的转基因动物。
140.权利要求139的转基因动物，其中所述Kiss-1的表达是可调节的。
141.一种使用权利要求135所述的方法产生的表达Kiss-1的转基因动物。
142.一种使用权利要求137所述的方法产生的表达Kiss-1的转基因动物。
143.一种表达Kiss-1的转基因动物，其中所述动物包括权利要求1所述的核酸构建体。
144.一种表达Kiss-1的转基因动物，其中所述动物包括权利要求55所述的核酸构建体。
145.一种表达FOXP3的转基因动物。
146.权利要求145的转基因动物，其中所述FOXP3的表达是可调节的。
147.一种使用权利要求135所述的方法产生的表达FOXP3的转基因动物。
148.一种使用权利要求137所述的方法产生的表达FOXP3的转基因动物。
149.一种表达FOXP3的转基因动物，其中所述动物包括权利要求1所述的核酸构建体。
150.一种表达FOXP3的转基因动物，其中所述动物包括权利要求55所述的核酸构建体。
151.一种表达NF κ β的转基因动物。
152.权利要求151的转基因动物，其中所述NFκβ的表达是可调节的。
153.一种使用权利要求135所述的方法产生的表达NFκβ的转基因动物。
154.一种使用权利要求137所述的方法产生的表达NFκβ的转基因动物。
155.一种表达NF κ β的转基因动物，其中所述动物包括权利要求1所述的核酸构建体。
156.一种表达NF κ β的转基因动物，其中所述动物包括权利要求55所述的核酸构建体。
157.一种表达微小RNA223的转基因动物。
158.权利要求157的转基因动物，其中所述微小RNA223的表达是可调节的。
159.一种使用权利要求135所述的方法产生的表达微小RNA223的转基因动物。
160.一种使用权利要求137所述的方法产生的表达微小RNA223的转基因动物。
161.一种表达微小RNA223的转基因动物，其中所述动物包括权利要求1所述的核酸构建体。
162.一种表达微小RNA223的转基因动物，其中所述动物包括权利要求55所述的核酸构建体。
163.一种表达Cre的转基因动物。
164.权利要求163的转基因动物，其中所述Cre的表达是可调节的。
165.一种使用权利要求447所述的方法产生的权利要求163所述的转基因动物。
166.一种使用权利要求448所述的方法产生的权利要求163所述的转基因动物。
167.一种表达Cre的转基因动物，其中所述动物包括权利要求1所述的核酸构建体。
168.一种表达Cre的转基因动物，其中所述动物包括权利要求55所述的核酸构建体。
169.一种含有权利要求1所述的核酸构建体的疫苗。
170.一种含有权利要求55所述的核酸构建体的疫苗。
171.一种使受试者体内产生免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求169所述的组合物。
172.一种使受试者体内产生免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求170所述的组合物。
173.一种使受试者体内产生免疫应答的方法，其中所述所述免疫应答为针对HIV的免疫应答，包括给予所述受试者权利要求169所述的组合物。
174.一种使受试者体内产生免疫应答的方法，其中所述所述免疫应答为针对HIV的免疫应答，包括给予所述受试者权利要求170所述的组合物。
175.一种制备重组蛋白的方法，包括:
a.将一种含有与调节子序列有效连接的启动子的第一核酸构建体引入靶细胞中，所述调节子序列与至少一个VP16序列有效连接；
b.使所述细胞处于可使所述待整合的第一核酸构建体整合至所述靶细胞基因组中的条件下；
c.将一种第二核酸构建体引入步骤(b)所述的细胞中，所述第二核酸构建体含有与目的序列有效连接的调节子靶序列；
其中所述目的序列为编码重组蛋白的核酸序列；并
d.使步骤(c)的细胞处于可使重组蛋白表达的条件下。
176.权利要求175的方法，其中所述第一核酸构建体包括SEQIDNO:44的序列。
177.权利要求175的方法，其中第二核酸构建体包括与转录调控元件有效连接的目的序列，所述转录调控元件与调节子靶序列有效连接。
178.权利要求175的方法，其中所述目的序列与IRES序列有效连接，所述IRES序列与可筛选标记有效连接。
178.权利要求175的方法，其中所述目的序列与IRES序列有效连接，所述IRES序列与可筛选标记有效连接。
179.权利要求175的方法，其中所述目的序列与IRES样序列有效连接，所述IRES样序列与可筛选标记有效连接。
180.一种制备重组蛋白的方法，包括:
a.将含有与调节子序列有效连接的启动子的第一核酸构建体引入靶细胞中，所述调节子序列与至少一个VP16序列有效连接；
b.将第二核酸构建体引入步骤(a)所述的同一靶细胞中，所述第二核酸构建体含有与目的序列有效连接的调节子靶序列；
其中所述目的序列为能够编码重组蛋白的核酸序列；并
c.使所述靶细胞处于可使所述待整合的第一和第二核酸序列整合至所述靶细胞基因组中的条件下；并
d.使步骤(c)的细胞处于可使所述重组蛋白表达的条件下。
181.权利要求180的方法，其中所述第一核酸构建体包括SEQIDNO:44的序列。
182.权利要求180的方法，其中第二核酸构建体包括与转录调控元件有效连接的目的序列，所述转录调控元件与调节子靶序列有效连接。
183.权利要求180的方法，其中所述目的序列与IRES序列有效连接，所述IRES序列与可筛选标记有效连接。
184.权利要求180的方法，其中所述目的序列与IRES样序列有效连接，所述IRES样序列与可筛选标记有效连接。
185.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括:
a.将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞中；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；并
c.将步骤(b)所述的靶细胞引入所述受试者体内，所述靶细胞的数量足以诱导免疫应答。
186.权利要求185的方法，其中所述权利要求1的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
187.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括:
a.将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞中；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；并
c.将步骤(b)所述的靶细胞引入所述受试者体内，所述靶细胞的数量足以诱导免疫应答。
188.权利要求187的方法，其中所述权利要求55的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
189.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括:
a.将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞中，
其中所述权利要求1的核酸构建体的转录调控元件为可调节的；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；并
c.将步骤(b)所述的靶细胞引入所述受试者体内；并
d.给予所述受试者有效量的能够调节权利要求1的核酸构建体的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱导所述目的序列的表达，
其中所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答。
190.权利要求189的方法，其中所述权利要求1的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
191.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括:
a.将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞中；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；并
c.将步骤(b)所述的靶细胞引入所述受试者体内；并
d.给予所述受试者有效量的能够调节权利要求55的核酸构建体的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱导所述目的序列的表达，
其中所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答。
192.权利要求191的方法，其中所述权利要求55的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
193.一种生产抗目的蛋白的抗体的方法，包括:
a.将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞中，
其中所述权利要求1的核酸构建体的转录调控元件为可调节的，
其中所述目的序列能够编码一种目的蛋白；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；
c.将步骤(b)所述的细胞引入所述受试者体内；
d.给予所述受试者有效量的能够调节权利要求1的核酸构建体的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱导所述目的序列的表达，
其中所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答，并且
其中所述免疫应答可产生抗所述目的蛋白的抗体。
194.权利要求193的方法，还包括分离通过所述方法产生的抗体。
195.权利要求193的方法，其中所述权利要求1的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
196.一种生产抗目的蛋白的抗体的方法，包括:
a.将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞中，
其中所述权利要求55的核酸构建体的转录调控元件为可调节的，
其中所述目的序列能够编码一种目的蛋白；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；
c.将步骤(b)所述的细胞引入所述受试者体内；
d.给予所述受试者有效量的一种能够调节权利要求55的核酸构建体的转录调控元件的物质，所述物质的量足以诱导所述目的序列的表达，
其中所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答，并且
其中所述免疫应答可产生抗所述目的蛋白的抗体。
197.权利要求196的方法，还包括分离通过所述方法产生的抗体。
198.权利要求196的方法，其中所述权利要求55的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
199.一种生产抗目的蛋白的抗体的方法，包括:
a.将权利要求1所述的核酸构建体引入靶细胞中，其中所述目的序列能够编码一种目的蛋白；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；并
c.将步骤(b)所述的细胞引入所述受试者体内，
其中所述细胞可表达目的序列，所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答，
其中所述免疫应答可产生抗所述目的蛋白的抗体。
200.权利要求199的方法，还包括分离通过所述方法产生的抗体。
权利要求199的方法，其中所述权利要求1的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
一种生产抗目的蛋白的抗体的方法，包括:
a.将权利要求55所述的核酸构建体引入靶细胞中，
其中所述权利要求55的核酸构建体的转录调控元件为可调节的，
其中所述目的序列能够编码一种目的蛋白；
b.使所述细胞处于可使步骤(a)所述待整合的核酸构建体整合到所述靶细胞基因组中的条件下；
c.将步骤(b)所述的细胞引入所述受试者体内，
其中所述细胞可表达目的序列，所述目的序列的表达量足以诱导免疫应答，
其中所述免疫应答可产生抗所述目的蛋白的抗体。
权利要求202的方法，还包括分离通过所述方法产生的抗体。
权利要求202的方法，其中所述权利要求55的核酸构建体的目的序列能够编码一种膜蛋白。
一种双向转录调控元件，包括与ef1α启动子的5’端融合的CMV启动子的5’端。
权利要求205的双向转录调控元件，还包括一种与所述CMV启动子的3’端有效连接的调节子靶序列。
权利要求205的双向转录调控元件，包括SEQIDNO:51中列出的序列。
一种包装构建体，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro-Pol多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
权利要求208的包装构建体，还包括一种含有rev应答元件的第三核酸序列。
210.一种含有权利要求208所述的包装构建体的细胞系。
211.权利要求208的包装构建体，还包括一种位于所述第一和第二核酸序列之间的元件，其中所述元件可使所述第一和第二核酸序列产生差异表达。
212.权利要求211的包装构建体，其中所述位于第一和第二核酸序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
213.权利要求212的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
214.权利要求212的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
215.权利要求212的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
216.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件是可调节的。
217.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
218.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
219.权利要求208的包装构建体，其中至少一个tet操纵子序列与一个TATA框有效连接。
220.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件序列包括SEQIDNO:6的序列。
221.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件为启动子。
222.权利要求221的包装构建体，其中所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
223.权利要求208的包装构建体，其中至少一个转录调控元件是组成型的。
224.权利要求223的包装构建体，其中至少一个所述组成型转录调控元件为启动子。
225.权利要求224的包装构建体，其中所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
226.权利要求208的包装构建体，其中所述第一核酸序列含有在gag序列内的移码所必需的至少一个点突变。
227.权利要求208的包装构建体，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。
228.权利要求208的包装构建体，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列内的移码所必需的一个单核苷酸插入和至少一个点突变。
229.权利要求208的包装构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:11的核苷酸序列。
230.权利要求208的包装构建体，其中一个或多个所述第一和第二核酸序列是密码子优化的。
231.权利要求208的包装构建体，还包括一个编码Tat的核酸序列。
232.权利要求208的包装构建体，还包括一个编码Rev的核酸序列。
233.权利要求208的包装构建体，其中所述构建体能够以约99:1至约80:20的比例表达Gag和Gag-Pol。
234.权利要求208的包装构建体，其中所述构建体能够产生无复制能力的重组体。
235.权利要求208的包装构建体，其中所述第一核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接。
236.权利要求235的包装构建体，其中所述第一转录调控元件强于所述第二转录调控元件。
237.权利要求208的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列的表达方向相反。
238.权利要求208的包装构建体，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
239.权利要求208的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列与一单转录调控元件有效连接。
240.权利要求239的包装构建体，其中所述单转录调控元件是可调节的。
241.权利要求239的包装构建体，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
242.权利要求241的包装构建体，其中所述双向启动子是可调节的。
243.一种包装系统，包括权利要求208所述的包装构建体和一种表达包膜糖蛋白的核酸构建体。
244.一种包装系统，包括权利要求209所述的包装构建体和一种表达包膜糖蛋白的核酸构建体。
245.一种使用权利要求243所述的包装系统制备病毒样颗粒的方法。
246.一种使用权利要求244所述的包装系统制备病毒样颗粒的方法。
247.一种包装构建体，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一个或多个能减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
248.权利要求247的包装构建体，还包括一种含有rev应答元件的第三核酸序列。
249.权利要求247的包装构建体，还包括一种位于所述第一和第二核酸序列之间的元件，其中所述元件可使所述两种核酸序列产生差异表达。
250.权利要求249的包装构建体，其中所述位于第一和第二核酸序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
251.权利要求250的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
252.权利要求250的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
253.权利要求250的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
254.权利要求247的包装构建体，其中至少一个转录调控元件是可调节的。
255.权利要求247的包装构建体，其中至少一个转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
256.权利要求247的包装构建体，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
257.权利要求256的包装构建体，其中至少一个tet操纵子序列与一个TATA框有效连接。
258.权利要求247的包装构建体，其中至少一个转录调控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。
259.权利要求247的包装构建体，其中至少一个转录调控元件为启动子。
260.权利要求259的包装构建体，其中所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
261.权利要求247的包装构建体，其中一种或多种所述转录调控元件是组成型的。
262.权利要求247的包装构建体，其中所述第一核酸序列含有在gag序列内的移码所必需的至少一个点突变。
263.权利要求247的包装构建体，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。
264.权利要求247的包装构建体，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列内的移码所必需的一个单核苷酸插入和至少一个点突变。
265.权利要求247的包装构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:20的核苷酸序列。
266.权利要求247的包装构建体，其中一个或多个所述第一和第二核酸序列是密码子优化的。
267.权利要求247的包装构建体，还包括一个编码Tat的核酸序列。
268.权利要求247的包装构建体，还包括一个编码Rev的核酸序列。
269.权利要求247的包装构建体，其中所述构建体能够以约99:1至约80:20的比例表达Gag和Gag-Pol。
270.权利要求247的包装构建体，其中所述构建体能够产生无复制能力的重组体。
271.权利要求247的包装构建体，其中所述第一核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第二核酸序列与第二转录调控元件有效连接。
272.权利要求271的包装构建体，其中所述第一转录调控元件强于所述第二转录调控元件。
273.权利要求271的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列的表达方向相反。
274.权利要求271的包装构建体，其中所述第一和第二转录调控元件是相同的。
275.权利要求271的包装构建体，其中所述第一和第二转录调控元件是不同的。
276.权利要求271的包装构建体，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
277.权利要求247的包装构建体，其中所述靶第一和第二核酸序列与一单转录调控元件有效连接。
278.权利要求277的包装构建体，其中所述单转录调控元件是可调节的。
279.权利要求277的包装构建体，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
280.权利要求279的包装构建体，其中所述双向启动子是可调节的。
281.一种包装系统，包括权利要求247所述的包装构建体和一种表达包膜糖蛋白的核酸构建体。
282.一种包装系统，包括权利要求248所述的包装构建体和一种表达包膜糖蛋白的核酸构建体。
283.一种使用权利要求281所述的包装系统制备病毒样颗粒的方法。
284.一种使用权利要求282所述的包装系统制备病毒样颗粒的方法。
285.一种含有权利要求247所述的靶包装构建体的细胞系。
286.一种包装构建体，包括第一、第二和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第三核酸序列编码Vpr-反转录酶-整合酶蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一个或多个能减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一、第二和第三核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，其中所述第一、第二和第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
287.权利要求286的包装构建体，还包括位于所述第一和第二核酸序列之间的元件，其中所述元件可使所述第一和第二核酸序列产生差异表达。
288.权利要求287的包装构建体，其中所述位于第一和第二核酸序列之间的可使二者产生差异表达的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
289.权利要求288的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
290.权利要求288的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
291.权利要求288的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
292.权利要求286的包装构建体，其中至少一个转录调控元件是可调节的。
293.权利要求286的包装构建体，其中至少一个转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
294.权利要求286的包装构建体，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
295.权利要求294的包装构建体，其中至少一个tet操纵子序列与一个TATA框有效连接。
296.权利要求286的包装构建体，其中至少一个转录调控元件含有SEQIDNO:6的序列。
297.权利要求286的包装构建体，其中至少一个转录调控元件为启动子。
298.权利要求297的包装构建体，其中所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
299.权利要求286的包装构建体，其中一种或多种所述转录调控元件是组成型的。
300.权利要求299的包装构建体，其中至少一个所述组成型转录调控元件为启动子。
权利要求300的包装构建体，其中所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
权利要求286的包装构建体，其中所述第一核酸序列含有在gag序列内的移码所必需的至少一个点突变。
权利要求286的包装构建体，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。
权利要求286的包装构建体，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列内的移码所必需的一个单核苷酸插入和至少一个点突变。
权利要求286的包装构建体，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:20的核苷酸序列。
权利要求286的包装构建体，其中一个或多个所述第一和第二核酸序列是密码子优化的。
权利要求286的包装构建体，还包括一个编码Tat的核酸序列。
权利要求286的包装构建体，还包括一个编码Rev的核酸序列。
权利要求286的包装构建体，其中所述构建体能够以约99:1至约80:20的比例表达Gag和Gag-Pro。
310.权利要求286的包装构建体，其中所述构建体能够产生无复制能力的重组体。
311.权利要求286的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第三核酸序列与第二转录调控元件有效连接。
312.权利要求311的包装构建体，其中所述第一转录调控元件强于所述第二转录调控元件。
313.权利要求286的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列或第三核酸序列的表达方向相反。
314.权利要求313的包装构建体，其中所述第一和第二核酸序列与第一转录调控元件有效连接，并且所述第三核酸序列与第二转录调控元件有效连接。
315.权利要求314的包装构建体，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
316.权利要求313的包装构建体，其中所述第一、第二和第三核酸序列与一单转录调控元件有效连接。
317.权利要求316的包装构建体，其中所述单转录调控元件是可调节的。
318.权利要求316的包装构建体，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
319.权利要求318的包装构建体，其中所述双向启动子是可调节的。
320.权利要求286的包装构建体，还包括一个位于所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之间，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列与所述第三核酸序列之间产生差异表达。
321.权利要求320的包装构建体，其中所述元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
322.权利要求321的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
323.权利要求321的包装构建体，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
324.权利要求321的包装构建体，其中内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
325.一种包装系统，包括权利要求286所述的包装构建体和一种表达包膜糖蛋白的核酸构建体。
326.一种使用权利要求325所述的包装系统制备病毒样颗粒的方法。
327.一种表达系统，包括:
a.权利要求208、247或286所述的包装构建体；
b.一种包膜核酸构建体，包括一种编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；和
c.一种含有一种或多种目的基因的基因转移构建体。
328.权利要求327的表达系统，还包括一种编码核定位信号的构建体，所述构建体含有与一种编码四环素反式作用子的核酸有效连接的编码核定位信号的核酸序列。
329.权利要求328的表达系统，其中所述编码核定位信号的构建体还包括一种转录调控元件。
330.权利要求329的表达系统，其中所述转录调控元件为启动子或增强子。
331.权利要求328的表达系统，其中所述编码核定位信号的核酸序列的侧翼接有至少一个接头序列。
332.权利要求331的表达系统，其中所述接头序列编码SEQIDNO:15。
333.权利要求328的表达系统，其中所述编码核定位信号的构建体从5’端至3’端依次包括巨细胞病毒启动子、第一接头编码序列、第二核定位信号、第二接头序列和四环素反式作用子编码序列，其中所述被编码的接头为SEQIDNO:15。
334.权利要求327的表达系统，其中所述包膜糖蛋白有助于进入细胞。
335.权利要求327的表达系统，其中所述包膜糖蛋白为病毒包膜糖蛋白。
336.权利要求335的表达系统，其中所述病毒包膜糖蛋白为囊泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。
337.权利要求327的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括一种标记编码序列，并且其中所述目的基因和标记编码序列与至少一个转录调控元件有效连接。
338.权利要求327的表达系统，其中所述基因转移构建体包括两种目的基因。
339.权利要求327的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括一个位于所述目的基因3’端的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
340.权利要求327的表达系统，其中所述基因转移构建体包括一个或多个长末端重复序列。
341.权利要求340的表达系统，其中所述基因转移构建体包括一个突变，所述突变位于3’长末端重复序列内。
342.权利要求340的表达系统，其中用一种启动子序列代替5’或3’长末端重复序列。
343.权利要求337的表达系统，其中所述基因转移构建体的至少一个转录调控元件为启动子。
344.权利要求337的表达系统，其中所述基因转移构建体的转录调控元件是可调节的。
345.权利要求344的表达系统，其中所述基因转移构建体的转录调控元件还包括一种调节子构建体，并且其中所述调节子构建体包括一种与至少一个转录调控元件有效连接的可调节元件。
346.权利要求337的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括一种位于所述目的基因和所述标记编码序列之间的元件，并且其中所述元件可使所述目的基因和所述标记编码序列产生差异表达。
347.权利要求346的表达系统，其中所述位于目的基因和标记编码序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
348.权利要求347的表达系统，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
349.权利要求347的表达系统，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
350.权利要求347的表达系统，其中内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
351.权利要求337的表达系统，其中所述基因转移构建体包括至少一个转录调控元件。
352.权利要求337的表达系统，其中所述转录调控元件是可调节的。
353.权利要求337的表达系统，其中所述转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
354.权利要求337的表达系统，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
355.权利要求337的表达系统，其中至少一个转录调控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。
356.权利要求351的表达系统，其中一种或多种所述转录调控元件为启动子。
357.权利要求356的表达系统，其中一种或多种所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
358.权利要求351的表达系统，其中所述基因转移构建体的至少一个转录调控元件为组成型的。
359.权利要求358的表达系统，其中一种或多种所述组成型转录调控元件为启动子。
360.权利要求359的表达系统，其中一种或多种所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
361.权利要求337的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因与不同的转录调控元件有效连接。
362.权利要求361的表达系统，其中所述与标记编码序列有效连接的转录调控元件强于所述与目的基因有效连接的转录调控元件。
363.权利要求337的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因的表达方向相反。
364.权利要求363的表达系统，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
365.权利要求363的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因与一单转录调控元件有效连接。
366.权利要求365的表达系统，其中所述单转录调控元件是可调节的。
367.权利要求366的表达系统，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
368.一种含有权利要求327所述的表达系统的细胞系。
369.一种表达系统，包括:
a.第一包装构建体，包括含有一种编码Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸构建体，其中所述编码Gag的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接；
b.第二包装构建体，包括含有一种编码Gag-Pol多聚蛋白的核酸序列的第一核酸构建体，其中所述编码Gag-Pol的核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，并且与至少一个转录调控元件有效连接；
c.第三核酸构建体，包括编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；和
d.一种含有至少一个目的基因的基因转移构建体。
370.一种含有权利要求369所述的表达系统的细胞系。
371.权利要求369的表达系统，还包括含有编码核定位信号的第四核酸序列的第四核酸构建体，所述核定位信号与四环素反式作用子编码序列有效连接。
372.权利要求371的表达系统，其中所述第四核酸构建体还包括一种转录调控元件。
373.权利要求371的表达系统，其中所述编码核定位信号的序列的侧翼接有至少一个接头序列。
374.权利要求373的表达系统，其中所述接头序列编码SEQIDNO:15。
375.权利要求371的表达系统，其中第四核酸序列从5’端至3’端依次包括巨细胞病毒启动子、编码SEQIDNO:15的核酸序列、编码核定位信号的核酸序列、编码SEQIDNO:15的核酸序列和编码四环素反式作用子的核酸序列。
376.权利要求371的表达系统，其中所述病毒包膜糖蛋白为囊泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。
377.权利要求369的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括一种标记编码序列，并且其中所述目的基因和标记编码序列与至少一个转录调控元件有效连接。
378.权利要求369的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括第二目的基因。
379.权利要求369的表达系统，其中所述基因转移构建体还包括一种位于所述目的基因和所述标记编码序列之间的元件，并且其中所述元件可使所述目的基因和所述标记编码序列产生差异表达。
380.权利要求379的表达系统，其中所述位于目的基因和标记编码序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
381.权利要求380的表达系统，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
382.权利要求380的表达系统，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
383.权利要求380的表达系统，其中内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
384.权利要求369的表达系统，其中所述基因转移构建体包括至少一个转录调控元件。
385.权利要求369的表达系统，其中所述转录调控元件是可调节的。
386.权利要求369的表达系统，其中所述转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
387.权利要求369的表达系统，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
388.权利要求369的表达系统，其中至少一个转录调控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。
389.权利要求369的表达系统，其中一种或多种所述转录调控元件为启动子。
390.权利要求389的表达系统，其中一种或多种所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
391.权利要求369的表达系统，其中至少一个转录调控元件是组成型的。
392.权利要求391的表达系统，其中一个或多个所述组成型转录调控元件为启动子。
393.权利要求392的表达系统，其中一个或多个所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
394.权利要求377的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因与不同的转录调控元件有效连接。
395.权利要求394的表达系统，其中所述与所述标记编码序列有效连接的转录调控元件强于所述与所述目的基因有效连接的转录调控元件。
396.权利要求377的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因的表达方向相反。
397.权利要求396的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因与两种不同的转录调控元件有效连接。
398.权利要求397的表达系统，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
399.权利要求396的表达系统，其中所述标记编码序列和所述目的基因与一单转录调控元件有效连接。
400.权利要求399的表达系统，其中所述单转录调控元件是可调节的。
权利要求399的表达系统，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
一种制备病毒样颗粒的方法，包括:
a.将权利要求208、247或286所述的包装核酸构建体引入细胞中；并
b.将一种包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有一种编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；并
c.使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下。
一种基因转移方法，包括:
a.将权利要求208、247或286所述的包装核酸构建体引入细胞中；并
b.将一种包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有一种编码包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述编码包膜糖蛋白的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；
c.将一种含有一种或多种目的基因的基因转移构建体引入细胞；并
d.使所述细胞处于可形成病毒样颗粒的条件下。
权利要求403的方法，其中所述基因转移构建体还包括一种编码标记的核酸序列，其中所述目的基因和编码标记的核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接。
权利要求404的方法，其中所述基因转移构建体还包括一个位于所述目的基因3’端的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
权利要求404的方法，其中所述基因转移构建体的转录调控元件为启动子。
权利要求404的方法，其中所述转录调控元件是可调节的。
权利要求404的方法，其中所述基因转移构建体还包括一种位于所述目的基因和所述标记编码序列之间的元件，其中所述元件可使所述目的基因和所述标记编码序列产生差异表达。
权利要求408的方法，其中所述位于目的基因和标记编码序列之间的元件为内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件。
410.权利要求409的方法，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
411.权利要求409的方法，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为非天然存在的。
412.权利要求409的方法，其中所述内部核糖体进入位点为EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。
413.权利要求409的方法，其中所述内部核糖体进入位点样元件为天然存在的。
414.权利要求409的基因转移构建体，其中所述内部核糖体进入位点或内部核糖体进入位点样元件为突变的。
415.权利要求403的方法，其中所述基因转移构建体包括至少一个转录调控元件。
416.权利要求415的方法，其中所述转录调控元件是可调节的。
417.权利要求415的方法，其中至少一个转录调控元件可由四环素或多西环素调节。
418.权利要求415的方法，其中至少一个转录调控元件含有至少一个tet操纵子序列。
419.权利要求415的方法，其中至少一个转录调控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。
420.权利要求415的方法，其中一个或多个所述转录调控元件为启动子。
421.权利要求420的方法，其中一个或多个所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
422.权利要求404的方法，其中至少一个转录调控元件是组成型的。
423.权利要求422的方法，其中一个或多个所述组成型转录调控元件为启动子。
424.权利要求423的方法，其中一个或多个所述启动子为基于CMV的启动子、CAG启动子、基于SV40的启动子、基于热休克蛋白的启动子、基于mH1的启动子、基于hH1的启动子、基于鸡β-肌动蛋白的启动子、基于U6的启动子、基于泛素C的启动子或基于EF-1α启动子。
425.权利要求404的方法，其中所述标记编码序列和所述目的基因与不同的转录调控元件有效连接。
426.权利要求425的方法，其中所述与所述目的基因有效连接的转录调控元件强于所述与所述编码标记的核酸序列有效连接的转录调控元件。
427.权利要求404的方法，其中所述标记编码序列和所述目的基因的表达方向相反。
428.权利要求427的方法，其中所述标记编码序列和所述目的基因与两种不同的转录调控元件有效连接。
429.权利要求428的方法，其中至少一个所述转录调控元件是可调节的。
430.权利要求427的方法，其中所述标记编码序列和所述目的基因与一单转录调控元件有效连接。
431.权利要求430的方法，其中所述单转录调控元件是可调节的。
432.权利要求427的方法，其中所述单转录调控元件为双向启动子。
433.权利要求430的方法，其中所述双向启动子是可调节的。
434.权利要求427的方法，还包括将一种编码核定位信号的构建体引入所述细胞中，所述构建体包括一种编码核定位信号的核酸序列，所述核定位信号与一种编码四环素反式作用子的核酸序列有效连接。
435.权利要求434的方法，其中所述编码核定位信号的构建体还包括一种转录调控元件。
436.权利要求435的方法，其中所述转录调控元件为启动子或增强子。
437.权利要求434的方法，其中所述编码核定位信号的序列的侧翼接有至少一个接头序列。
438.权利要求437的方法，其中所述接头序列编码SEQIDNO:15。
439.权利要求434的方法，其中所述编码核定位信号的构建体从5’端至3’端依次包括巨细胞病毒启动子、编码SEQIDNO:15的核酸序列、编码核定位信号的核酸序列、编码SEQIDNO:15的核酸序列和编码四环素反式作用子的核酸序列。
440.一种含有外源目的基因的细胞，其中按照权利要求403所述方法将所述目的基因转移到所述细胞内。
441.一种制备重组蛋白的方法，包括在适合于使靶细胞表达所述重组蛋白的条件下，使所述靶细胞与按照权利要求402所述方法制备的病毒颗粒接触。
442.一种在受试者体内诱导免疫应答的方法，包括将按照权利要求441所述方法制备的重组蛋白引入所述受试者体内，所述重组蛋白的量足以诱导免疫应答。
443.权利要求442的方法，其中所述靶细胞产生均一糖基化模式的糖蛋白。
444.权利要求443的方法，其中与对照细胞相比，所述靶细胞具有降低的GnTI活性。
445.一种使用选定的蛋白处理受试者的方法，包括给予所述受试者按照权利要求443所述方法制备的蛋白。
446.一种筛选可调整病毒颗粒形成的药剂的方法，包括
a.将一种含有第一和第二核酸序列的包装核酸构建体引入细胞中，其中所述第一核酸序列编码Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列编码Gag-Pro-Pol多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一个或多个可减少移码或翻译连读的突变，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同编码区表达，并且其中所述第一和第二核酸序列与所要筛选的药剂有效连接；
b.将一种包膜构建体引入所述细胞中，所述包膜构建体含有编码包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列与至少一个转录调控元件有效连接；
c.在适合于形成病毒颗粒的条件下培养所述细胞；
d.检测所述病毒颗粒；
e.与对照培养物相比，所要筛选的培养物中病毒颗粒数量的增加或减少表明所述药剂可调整病毒颗粒的形成。
447.一种制备转基因动物的方法，包括:
a.将按照权利要求402所述方法制备的病毒颗粒引入合子中；
b.允许所述合子发育至足月；
c.获得一种其基因组中含有能够表达所述目的基因的核酸构建体的动物；
d.将所述动物与非转基因动物杂交以获得F1代；并
e.选择一种其基因组中含有所述能够表达目的基因的核酸构建体的动物，其中所述动物可表达选定的目的基因。
448.一种按照权利要求447所述方法制备的转基因动物。
449.一种包装系统，包括:
a.第一核酸构建体，包括编码Gag多聚蛋白的第一突变核酸，其中所述第一突变核酸与一种转录调控元件有效连接；和
b.第二核酸构建体，包括编码Gag-Pol多聚蛋白的第二突变核酸，其中所述第二突变核酸与一种转录调控元件有效连接；
c.其中所述第一和第二核酸构建体中的突变会使得所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表达比例可形成病毒颗粒。
450.权利要求449的包装系统，其中所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表达比例为约99:1至约80:20。
451.权利要求449的包转系统，其中所述第一突变核酸与最小CMV启动子有效连接，并且所述第二突变核酸与所述热休克蛋白启动子有效连接。
452.一种鉴别可结合目的抗原的抗体的方法，包括:
a.使疑似含有可结合目的抗原的抗体的样本与可表达所述目的抗原的靶细胞接触，
其中所述靶细胞含有一种或多种权利要求1、55、208、247和286所述的核酸构建体；并
b.确定样本中的抗体是否与所述由靶细胞表达的目的抗原结合，由此将所述结合目的抗原的抗体鉴别为可结合目的抗原的抗体。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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