CN113423731A - 抗hiv抗体及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明人对通过单次或多次单独给药可以高概率地向给药组提供长期的HIV病毒控制的抗体进行了努力研究，结果惊奇地发现，通过少次单独施用由家蚕生产作为1C10报告的抗体基因而得到的SW‑1C10抗体，被施用的全部个体中，不仅在早期血液中病毒被抑制在检测极限以下，而且经过12周的长时间血液中的病毒RNA依然被维持在检测极限以下。进一步地，到目前为止，家蚕的抗体产量为每个茧数百μg，1mg茧数μg的水平，没有进行进一步提高产量的研究。本发明的发明人为了从多种抗HIV抗体中发现绢丝昆虫的产量更高的抗体进行了反复研究，发现作为抗HIV抗体的1C10抗体和1D9抗体在绢丝昆虫的丝中以比以往更优异的产量生产。

Description

抗HIV抗体及其制造方法
关联申请的相互参照
本国际申请是主张基于2018年10月29日在日本专利厅所申请的日本专利申请第2018-203114号及2019年9月12日在日本专利厅所申请的日本专利申请第2019-166040号的优先权的申请，日本专利申请第2018-203114号及日本专利申请第2019-166040号的全部内容通过参照引入本国际申请。
技术领域
本发明是涉及有效的抗HIV抗体的制造方法的发明。更具体地，本发明涉及利用家蚕高效地制造抗HIV抗体的方法。
背景技术
通过在家蚕的丝胶蛋白启动子(Sericin promoter)的下游配置抗体基因，并在茧中表达抗体分子，用家蚕进行了制造治疗用抗体的尝试(非专利文献1及2等)。尤其是，已知在家蚕的茧中所表达的抗体在糖链中不含核心岩藻糖(core fucose)，因此表现出优异的ADCC活性(专利文献1和2)。
另外，在HIV治疗计划中，期望有通过单次或多次施用抗体之后能够长期控制HIV的抗体。例如，在非专利文献3中报告了在单次施用PGT121的四只恒河猴(Macaca mulatta)之中，一只中的病毒RNA被抑制到检测极限以下持续约70天。
另外，已经开发出识别HIV的包膜(envelope)蛋白gp120的V3环的人源化抗体KD247，并且正在进行临床试验。在三次施用KD247的患者中，虽然确认了病毒的抑制作用，但不能将病毒长期抑制到检测极限以下。如此，以单剂施用单次至多次而能够高概率、长期将病毒抑制到检测极限以下的抗体尚未被开发出来。
因此，具有与KD247相同的抗原识别位点的人抗体1C10抗体的开发正在推进。1C10抗体在体内保持能够对广泛的HIV株中和的作用，是从即使25年以上长期不治疗仍然能够抑制症状的患者分离出的抗体，将之作为抗体医药品施用给HIV感染患者有望发挥高的治疗效果(专利文献2和非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2014-12024号
专利文件2:国际公开WO2009/066702号
非专利文献
非专利文献1:Masashi Iizuka等，FEBS Journal；276：5806-5820(2009)
非专利文献2:Minoru Toda等，mABs；7(6)：1138-1150(2015)
非专利文献3:Dan H.Barouch等，Nature；503(7475)：224-228(2013)
非专利文献4:Kristel Paola Ramirez Valdez等，Virology；475：187-203(2015)
发明内容
本发明的发明人对通过单次或多次单独给药高概率为给药组带来长期的HIV病毒控制的抗体进行努力研究，结果惊奇地发现，通过由家蚕生产作为1C10报告的抗体基因而得到的SW-1C10抗体的少次单独施用，被施用的全部个体中，不仅在早期血液中病毒被抑制在检测极限以下，经过12周的较长时间血中病毒RNA依然被维持在检测极限以下。此外，比较使用家蚕所生产的抗体与使用CHO细胞所生产的抗体，确认其结构差异在于糖链的结构。据此，本发明的发明人发现缺少岩藻糖(fucose)带来了施用了1C10抗体的全部病例长期抑制病毒的非常优异的效果。如此的在所有施用病例中能够长期抑制病毒增殖在以前没有报告，本发明的发明人首次成功地发现通过少次的单独施用对给药对象带来广泛的、稳定的病毒抑制效果的抗体。
另外，到目前为止，家蚕的抗体产量为每个茧数百μg、1mg茧数μg的水平，没有进行进一步提高生产率的研究。本发明的发明人经过反复研究，发现作为抗HIV抗体的1C10抗体和1D9抗体在绢丝昆虫的丝中以比以往更好的产量生产，从而完成了本发明。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种抗体，其具有对HIV的结合能力；并且，结合于该抗体的糖链不含岩藻糖(fucose)：并且，具有通过向HIV感染者单次施用或多次施用，以90％以上的概率将该HIV感染者血液中的HIV抑制在检测极限以下的作用。检测某种抗体是否具有对HIV的结合能力的方法在本技术领域广为知晓的。例如，可以通过使该抗体接触固相化有HIV的载体，检测与该固相结合的抗体来确认。
在一个实施方式中，本发明涉及一种IgG抗体，其具有：含有序列号7中记载的的氨基酸序列、与其具有80％以上同一性的氨基酸序列、或者其氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的重链，以及，含有序列号9中记载的氨基酸序列、与其具有80％以上同一性的氨基酸序列、或者其氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的轻链；该抗体具有对HIV的结合能力；并且，结合于该抗体的糖链不含岩藻糖(fucose)。
优选地，本发明的抗体中，重链具有序列号7中记载的重链氨基酸序列中的3个CDR序列，并且，轻链具有序列号9中记载的氨基酸序列中的3个CDR序列。确定CDR序列的方法能够根据Kabat等的编号系统(Kabat，E.等，U.S.Department of Health and HumanServices，(1983)及其后续版)、Chothia等的编号系统(Chothia以及Lesk，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987))、Honegger等的编号系统(Honegger，A等，J.Mol.Biol.309:657-670(2001))、contact定义法(MacCallumetal，JMol Biol，262(5)：732-745(1996))的编号系统，或者通过已知的序列数据库的比对来确定。例如，本发明的抗体的CDR序列可以为CDRH1:GFMFSNYA(序列号14)；CDRH2:ISNDGSDK(序列号15)；CDRH3：CARDLDQTIPDLTAPAFEV(序列号16)，以及CDRL1:QSLLHSDGNN(序列号17)；CDRL2:LTS(序列号18)；CDRL3:MQSLQTWT(序列号19)。更优选的是，本发明的抗体具有由序列号7中记载的氨基酸序列组成的重链，以及由序列号9中记载的氨基酸序列组成的轻链。
本发明的抗体在结合的糖链中不含岩藻糖(fucose)。例如，本发明的抗体可以具有从以下所选择的糖链结构。
Figure BDA0003046236690000041
在一个实施方式中，本发明涉及一种表达盒，功能地结合在绢丝腺特异性基因启动子的下游，含有从以下(i)～(x)中所选择的任意一个多核苷酸(polynucleotide)：
(i)具有序列号6中记载的碱基序列和/或序列号8中记载的碱基序列的多核苷酸；
(ii)具有在严格条件下与序列号6中记载的碱基序列杂交的碱基序列和/或在严格条件下与序列号8中记载的碱基序列杂交的碱基序列的多核苷酸；
(iii)编码序列号7中记载的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号9中记载的氨基酸序列的多核苷酸；
(iv)编码与序列号7中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码与序列号9中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸；
(v)编码序列号7中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号9中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加、插入的氨基酸排列的多核苷酸；
(vi)具有序列号10中记载的碱基序列和/或序列号12中记载的碱基序列的多核苷酸；
(vii)具有在严格条件下与序列号10中记载的碱基序列杂交的碱基序列和/或在严格条件下与序列号12中记载的碱基序列杂交的碱基序列的多核苷酸；
(viii)编码序列号11中记载的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号13中记载的氨基酸序列的多核苷酸；
(ix)编码与序列号11中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码与序列号13中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸；以及，
(x)编码序列号11中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加、插入的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号13中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多核苷酸。
本说明书中，1C10抗体是指具有由序列号7中记载的氨基酸序列组成的重链和由序列号9中记载的氨基酸序列组成的轻链的抗体。其中，序列号7中记载的氨基酸序列中，从第1位至第19位是信号序列。本说明书中所记载的抗体的重链和/或轻链可以不包括本申请说明书中记载的信号序列。或者，也可以含有本申请说明书中所记载的信号序列以外的信号序列。因此，在本说明书中，“由序列号7中记载的氨基酸序列组成的重链”可以适当地被替换为“由序列号7的第20位至第474位的氨基酸序列组成的重链”。同样地，序列号9中记载的氨基酸序列中，从第1位至第20位是信号序列。因此，在本说明书中，“由序列号9中记载的氨基酸序列组成的轻链”可以适当地被替换为“由序列号9的第21位至第238位的氨基酸序列组成的轻链”。另外，在本说明书中，1D9抗体是指具有由序列号11中记载的氨基酸序列组成的重链和由序列号13中记载的氨基酸序列组成的轻链的抗体。其中，序列号11中记载的氨基酸序列中，从第1位至第19位是信号排列。因此，在本说明书中，“由序列号11中记载的氨基酸序列组成的重链”可以适当地被替换为“由序列号11的第20位至第472位的氨基酸序列组成的重链”。同样地，序列号13中记载的氨基酸序列中，从第1位至第20位是信号序列。因此，在本说明书中，“由序列号13中记载的氨基酸序列组成的轻链”可以适当地被替换为“由序列号13的第21位至第238位的氨基酸序列组成的轻链”。
作为编码1C10抗体的DNA序列，例如可以举出序列号6中记载的碱基序列(重链)和序列号8中记载的碱基序列(轻链)。如上所述，序列号6中记载的碱基序列(重链)中，57base编码信号序列。因此，在本说明书中，“序列号6中记载的碱基序列”可以适当地被替换为“序列号6中记载的碱基序列中的第58位至第1425位的碱基序列”。同样地，在序列号8中记载的碱基序列(轻链)中，60base编码信号序列。因此，在本说明书中，“序列号8中记载的碱基序列”可以适当地替换为“序列号8中记载的碱基序列中从第61位到第717位的碱基序列”。另外，作为编码1D9抗体的DNA序列，例如可以举出序列号10中记载的碱基序列(重链)和序列号12中记载的碱基序列(轻链)。如上所述，在序列号10中记载的碱基序列(重链)中，57base编码信号序列。因此，在本说明书中，“序列号10中记载的碱基序列”可以适当地被替换为“序列号10中记载的碱基序列中从第58位至第1419位的碱基序列”。同样地，序列号12中记载的碱基序列(轻链)中，60base编码信号序列。因此，在本说明书中，“序列号12中记载的碱基序列”可以适当地被替换为“序列号12中记载的碱基序列中从第61位到第717位的碱基序列”。
在本说明书中，“在严格条件下杂交”是指本领域技术人员通常所使用的杂交条件下进行杂交。例如，可以通过Molecular Cloning，a Laboratory Mannual，FourthEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)或者Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Online Library等中记载的方法来确定是否杂交。例如，杂交的条件可以为在6×SSC(0.9M NaCl、0.09M柠檬酸三钠)或者6×SSPE(3M NaCl、0.2MNaH2PO4、20mM EDTA·2Na、pH 7.4)中在42℃下杂交，之后42℃下用0.5×SSC进行清洗的条件。
在一个实施方式中，本发明涉及一种多核苷酸，其编码分别与序列号7中记载的氨基酸序列以及序列号9中记载的氨基酸序列，或者序列号11中记载的氨基酸序列以及序列号13中记载的氨基酸序列(本段中，称为“序列号7中记载的氨基酸序列等”)具有80％以上同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性是指在两种蛋白质之间，作为比较对象的氨基酸序列范围中的种类是相同的氨基酸数的比例(％)，例如，可以使用BLAST、FASTA等公知的程序来确定。作为上述的同一性，可以是比80％以上更高的同一性，例如可以是85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或者99％以上的同一性。或者，本发明的多核苷酸可以是编码在Blast中显示与序列号7所记载的氨基酸序列等的相同性得分在200以上的氨基酸序列。相同性得分可以通过比对序列号7等中记载的氨基酸序列和目标蛋白质的氨基酸序列，通过打分矩阵得出作为比较对象的各氨基酸的分数，并作为其总和进行计算(参照http://www.gsic.titech.ac.jp/supercon/supercon2004-e/alignmentE.html)。例如，相同性得分可以使用公知的BLAST程序来确定。作为打分矩阵，已知有BLOSUM62和PAM 32等，在本说明书中优选为BLOSUM62。
被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸数量没有特别限制，只要不影响抗体的生物学活性即可，例如可以为1～10个、1～5个氨基酸、1～4个或1～3个。氨基酸的取代优选为保守氨基酸(conserved amino acids)的取代(参照Molecular Biology of the Cell，Garland Science第6版)。
“绢丝腺特异性基因启动子”是指在绢丝昆虫的绢丝腺中特异性表达的基因的启动子。这种启动子可以举出丝蛋白(silk protein)基因启动子，例如后部绢丝腺特异性基因启动子和中部绢丝腺特异性基因启动子等，例如，丝胶基因启动子(丝胶1基因启动子、丝胶2基因启动子和丝胶3基因启动子)或蚕丝蛋白(Fibroin)基因启动子(蚕丝蛋白重链基因启动子、蚕丝蛋白轻链基因启动子和纤维六聚素(fibrohexamerin，fhx)启动子)。优选为丝胶1基因启动子、丝胶2基因启动子和丝胶3基因启动子，并且含有MSG启动子和PSG启动子(WO2017135452A1)。在启动子下游的功能性结合是指通过启动子的活化以使所结合的基因能够表达的结合。
在另一实施方式中，本发明涉及含有上述表达盒的质粒载体(Plasmid vector)。质粒载体没有特别限制，只要能够导入绢丝昆虫细胞并维持即可。例如，可以列举出导入有粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的DNA型转座子(transposon)piggyBac的质粒载体(Tamura，T等，Nature Biotechnology，18：81-84(2000))。例如，作为载体可以举出pPIGA3GFP(Tamura，T等人，Nature Biotechnology，18：81-84(2000)和pBac[3xP3-DsRed/pA](Nature Biotechnology，21：52-56(2003))。另外，本发明的载体，例如，也可以通过将上述表达盒插入通过美国专利公开公报2008/0301823中所记载的方法制备的载体(pMSG1.1MG)的限制性酶切位点中来制备。或者，例如，载体可以是绢丝昆虫转化(Transformation)载体pMSG3.1MG(日本特开2012-182995号)。
在某个实施方式中，本发明涉及一种转基因绢丝昆虫，其中，表达盒被整合到染色体中。本说明书中，“绢丝昆虫”没有特别限制，只要它是具有绢丝腺并且能够吐丝的昆虫即可，鳞翅目昆虫(Lepidoptera insects)、膜翅目昆虫(Hymenoptera insects)、脉翅目昆虫(Neuroptera)、毛翅目昆虫(Trichoptera)等中，主要在幼虫期为了筑巢、筑茧或移动而吐丝的物种。作为绢丝昆虫，优选为能够大量吐丝的鳞翅目昆虫，可以列举出属于蚕蛾科(Bombycidae)、大蚕蛾科(Saturniidae)，箩纹蛾科(Brahmaeidae)，带蛾科(Eupterotidae)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)、蓑蛾科(Psychidae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)等的物种。另外，绢丝昆虫包括家蚕、野桑蚕(Bombyx mandarina)、日樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Eri-silkworm)、半目大蚕蛾(Antheraea yamamai)、柞蚕、绿目天蚕蛾(Caligula boisduvalii jonasii)和曲缘尾大蚕蛾(Actias Aliana)等。本发明的转基因绢丝昆虫在丝(茧)(优选为丝胶(Sericin)层)中产生(分泌)上述抗体。
在另一实施方式中，本发明涉及一种由上述转基因绢丝昆虫所产生的抗体。该抗体为含有具有序列号7中记载的氨基酸序列的重链和/或具有序列号9中记载的氨基酸序列的轻链的抗体，或者，也可以含有具有序列号11中记载的氨基酸序列的重链和/或具有序列号13中记载的氨基酸序列的轻链。或者，该抗体也可以含有分别具有与序列号7和/或序列号9、或者序列号11和/或序列号13各自80％以上同一性的氨基酸序列的重链和/或轻链。或者，本发明的抗体也可以含有分别具有与序列号7和/或序列号9、或者序列号11和/或序列号13各自在Blast中显示相同性得分为200以上的氨基酸序列的重链和/或轻链。或者，本发明的抗体也可以含有分别由序列号7和/或序列号9、或者序列号11和/或序列号13各自中的数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列组成的重链和轻链。另外，在本说明书中，“抗体”这一术语只要含有与Fc的抗原结合位点即可，可以是抗体的一部分或片段或变体，例如，可以是单链抗体(例如重链抗体)或双特异性抗体。
已知在家蚕的茧中产生的抗体作为糖链没有结合岩藻糖(fucose)。此外，在本领域中已经广为人知的是，没有添加岩藻糖(fucose)的抗体的ADCC活性优异。尽管没有关于ADCC活性和通过抗体施用抑制病毒的报道，但是本发明的这种效果有可能通过ADCC活性来实现。因此，在一个实施方式中，本发明为一种IgG抗体，其具有重链和轻链，该重链含有序列号7记载的氨基酸序列、与该氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、或者该氨基酸序列中的数个氨基酸序列被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，该轻链含有序列号9记载的氨基酸序列、与该氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列、或者该氨基酸序列中的数个氨基酸序列被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；该抗体具有对HIV结合的能力；并且本发明可以包含抗HIV抗体组合物，其为含有为了提高ADCC活性而改变了Fc区域的抗体的组合物，其特征在于，ADCC活性高于CHO细胞中产生的野生型抗体，具有通过向HIV感染者单次施用或多次施用以90％以上概率将该HIV病毒感染者的血中HIV抑制到检测极限以下的作用。
另外，还报道有，Fc和FcγR之间的关系显示出影响ADCC活性，通过取代Fc区域中的氨基酸能够提高与FcγR的亲和力。特别地，已知与FcγRIIIa等激活型FcγR具有高结合而与FcγRIIb等抑制型FcγR具有弱结合的Fc具有优异的效应子功能。作为此类变异报道有F158V、A330L、S239D和I332E(Greg ALazar等，PNAS(2006)103(11)：4005-4010)和F243L、D270E、R292P、S298N、Y300L、V305I、A330V和P396L(Cancer Res(2007)67(18)：8882-8890)。本发明的抗体的Fc区域也可以具有这样的突变，例如可以具有选自例如A330L、S239D、I332E、F243L、D270E、R292P、S298N、Y300L、V305I、A330V和P396L中的1～10个变异。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种含有具有对HIV结合能力的IgG抗体的组合物，该IgG抗体的80％以上是在抗体结合糖链中不含岩藻糖的抗体。即，在本发明的组合物中，没有必要全部的(100％)抗HIV抗体中都不含岩藻糖，而是至少80％以上(优选85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)的抗HIV抗体中不含岩藻糖即可。优选地，该组合物具有通过向HIV感染者单次或多次施用，以90％以上概率将HIV感染者的血液中的HIV抑制到检测极限以下的作用。该组合物具有的抗HIV抗体所具有的序列等特征与上述本发明的抗HIV抗体相同。
在本说明书中，是否“具有通过向HIV感染者单次施用或多次施用，以90％以上(优选为92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％)的概率将HIV感染者血液中的HIV抑制到检测限以下的作用”，能够通过向两个以上HIV感染者施用被检测抗体，之后通过根据常规方法(例如，利用PCR的方法)进行检测来确认。在施用了被检测抗体的HIV患者的90％以上未检测到血液中HIV时，能够判定具有通过向HIV感染者单次施用或者多次施用而以90％以上概率将该HIV感染者的血液中的HIV抑制到检测极限以下的作用。判断是否将血液中的HIV抑制到检测极限以下的时间最好是在抗体的施用完全结束之后，优选为在完成施用之后12周、16周，20周、24周、28周、32周、36周、40周、1年、2年、3年、4年或5年的时候。
再一个实施方式中，本发明涉及HIV感染病的治疗药物或预防药物(医药组合物)，其含有上述抗体作为有效成分。本发明的医药组合物，只要是能够向患者施用的制剂即可，可以采用口服或非口服的任何制剂。作为非口服给药的组合物，例如，可以举出注射剂、滴鼻剂(nasal drops)、栓剂(suppository)、贴剂、软膏等。优选为注射剂。本发明医药组合物的剂型可以举出液体制剂和冷冻干燥制剂。当将本发明的医药组合物作为注射剂使用时，根据需要，可以加入丙二醇和乙二胺等助溶剂(solubilizing agent)、磷酸盐等缓冲材料、氯化钠和甘油的等渗剂、亚硫酸盐等稳定剂、苯酚(phenol)等防腐剂(preservatives)、利多卡因等止痛剂等添加剂(请参阅“药事日报社”的《医药品添加物事典》、APhAPublications公司的《Handbook of Physical Excipients Fifth Edition》)。另外，本发明的医药组合物作为注射剂使用时，作为储存容器可以举出安瓿(ampoule)、小瓶(vial)、预充式注射器(Prefilled syringe)、笔式注射器筒(Pen-type syringe cartridge)和输液袋等。
发明效果
本发明的抗体能够使用蚕更高效地生产，因此能够提供一种生产成本更低的HIV感染症(Infectious disease)治疗用抗体。
附图说明
图1：是通过SDS-PAGE后的CBB染色来比较转基因家蚕的表达量的照片。A：总提取液；B：中性缓冲液提取液。照片左侧的数值表示分子量(kDa)，照片上部显示所用抗体的种类。
图2：是表示测量由转基因家蚕所生产的各抗体对HIV-1BaL株的结合活性的结果的曲线图。纵轴表示平均荧光强度(MFI)，横轴表示抗体浓度(μg/mL)。
图3：是表示测量不同来源的各抗体对HIV-1BaL株的中和活性的结果的曲线图。纵轴表示抑制率(％抑制)，横轴表示抗体的Log浓度(μg/mL)。下表显示了各抗体在各浓度下的抑制率(％抑制)。
图4：是显示由质谱推断在家蚕的茧中所表达的抗体和CHO细胞中产生的抗体的糖链结构的结果。显示了主要的糖链结构及其存在比例。
图5：是表示以0.2、2、20μg/mL将SW-1C10、293A-1C10、CHO-1C10和KD-247添加到HIV-1BaL株中时测量ADCC活性的结果的图(A)和表(B)。ADCC活性为SW-1C10最高，其次是CHO-1C10较高。
图6：是显示对接种了高毒性SHIV89.6P(Reimann K.A等，J.Virol.70，6922-6928)的食蟹猴(Macaca fascicularis)施用SW-1C10的结果的曲线图，来评价在急性感染期的SW-1C10的效果。左侧图表示SW-1C10给药组(n＝3)，右侧图表示未处理组(n＝2)。上侧图的纵轴表示1ml血浆中病毒RNA的拷贝数(log10拷贝/mL)，下侧图的纵轴表示CD4+T细胞数(数量/μL)。建立了全身性感染。所有图的横轴表示病毒感染后经过的时间(周)。SW-1C10的施用是在病毒接种后的第3天、第10天、第17天通过静脉进行。
具体实施方式
1.抗体
在一个实施方式中，本发明包括使家蚕表达本发明的抗体基因的本发明抗体的方法、以及通过该方法制造得到的抗体。本发明的制造方法具体能够通过下述方法实施。
(表达盒的制备)
本发明的与家蚕的绢丝腺细胞中引起基因表达的启动子区域功能连接的含有抗体遗传因子的表达盒，是能够通过本领域技术人员公知的基因重组技术，将编码家蚕绢丝腺细胞中引起基因表达的启动子区域的多核苷酸和选自上述的(i)～(x)中的任意一个多核苷酸结合来制作的。家蚕绢丝腺细胞中引起基因表达的启动子区域的多核苷酸，例如可以通过由家蚕细胞提取的基因组DNA(genomic DNA)作为模板，使用与目标启动子对应的启动子进行PCR而得到。例如，在美国专利公开公报2008/0301823中有记载有丝胶1基因启动子(sericin-1gene promoter)的获取方法。
本发明的表达盒在含有编码增强子(enhancer)、蚕丝蛋白重链基因的-1860至-1127的区域和/或-5000至-3884的区域、杆状病毒(baculovirus)同源区(homologousregion)的多核苷酸、构成杆状病毒多角体蛋白(polyhedra)的5′非翻译区(UTR)的多核苷酸、和/或编码杆状病毒IE1的多核苷酸等时，可以通过本领域技术人员公知的方法(例如，通过限制酶切割位点)将这些多核苷酸与抗体基因结合来得到，其中抗体基因为与家蚕的绢丝腺细胞中引起基因表达的启动子区域功能地连接的抗体基因。例如，本发明的表达盒可以根据日本特开2004-344123、美国专利公开公报2008/0301823、日本特开2008-125366等中记载的方法来制备。
(载体的制备)
含有上述表达盒的质粒载体能够通过将上述表达盒或其构成成分导入所需载体中而得到。载体没有特别限制，只要它是能够产生转基因家蚕的质粒载体即可，例如能够通过将上述表达盒插入上述载体的限制酶切割位点来制备。
(转基因家蚕的制备)
在一个实施方式中，本发明涉及一种转基因家蚕的制造方法，包括将上述质粒载体导入绢丝昆虫的卵中的步骤，在丝(茧)(优选为丝胶层)中产生(分泌)上述抗体。具体地，本发明的转基因家蚕的制造方法包括将上述质粒载体注入产卵后2～8小时的家蚕卵(家蚕胚胎)中，孵化的家蚕的成虫交配得到G1卵块，将标记基因的表达等作为指标来筛选导入有本发明的表达盒的转基因家蚕。
作为一个例子，在纯化所得到的质粒载体之后，以作为辅助质粒(help plasmid)的pHA3PIG(Nat.Biotechnol.18，81-84(2000))与质粒载体量为1：1混合，进一步进行醇沉(ethanol precipitation)之后，将其以DNA浓度为10～1000μg/ml的方式溶于注射缓冲液(Injection buffer)(0.5mM磷酸缓冲液、pH7.0、5mM KCl)。以每个卵约1～200nl的液量向产卵后2～8小时的胚泡期的家蚕卵(家蚕胚胎)中显微注射(microinjection)该载体混合液。将显微注射有载体DNA的卵在约25℃下孵育，并饲养孵化出的蚕蛾，使所得到的能够生殖的成虫交配，以得到G1代卵块。从产卵起第3～10天的G1卵块中，选择从眼睛和神经系统发出绿色荧光的转基因家蚕的卵并进行孵化，能够建立其中整合有抗体cDNA的转基因家蚕。
另外，除了本发明的表达盒之外，本发明的转基因家蚕也可以导入用于增强上述基因表达的多核苷酸。例如，可以将用于增强基因表达的多核苷酸导入与本发明的质粒载体不同的质粒载体中，将其与本发明的质粒载体同时或分开注入到家蚕卵中。或者，通过上述方法得到的整合有本发明的表达盒的转基因家蚕，使之与导入了用于增强基因表达的多核苷酸的转基因蚕交配，从而也可以得到导入了本发明表达盒和用于增强基因表达的多核苷酸的转基因家蚕。例如，也可以将得到的转基因家蚕与表达BmNPV来源的反式激活蛋白(transactivator,Tat)的ie1基因的家蚕(日本专利特开2012-182995)交配，从得到G2代家蚕中筛选出同时具有抗体cDNA和ie1基因的家蚕。
(抗体的制造方法)
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗体的制造方法，该抗体含有具有序列号7记载的氨基酸序列的重链和具有序列号9记载的氨基酸序列的轻链，或者具有序列号11中记载的氨基酸序列的重链和具有序列号13中记载的氨基酸序列的轻链，该方法包括从上述转基因绢丝昆虫生产的丝中提取该抗体的步骤。
例如，抗体的制备中饲养上述家蚕并结茧。将家蚕的茧浸入提取缓冲液(PBS(终浓度0.5M NaCl)，0.1％Triton X-100)中，并在室温下搅拌1小时以制备茧提取液。使用0.45μm过滤器过滤提取液，并过蛋白G柱(Protein G Sepharose 4Fast Flow，GE Healthcare)。可以通过用0.1M甘氨酸(glycine)(pH 2.7)洗脱，在溶液中添加1M Tris-HCl(pH 9.0)中和，最后相对于PBS进行透析而能够得到抗体。
另外，抗体片段可以通过本领域技术人员众所周知的各种方法来制备，例如可以通过用木瓜蛋白酶(papain)处理通过上述方法得到的抗体来获得。
另外，没有结合岩藻糖的抗体通过上述在家蚕的茧中产生的方法之外，还已知有以下方法：使用从药物处理过的CHO细胞中杀死具有高岩藻糖的细胞所选择的岩藻糖基化(Fucosylation)降低的细胞来进行生产的方法(美国专利公开2010/0081150号)；使用通过Fx蛋白质的突变和通过控制岩藻糖外部来源的供应能力而岩藻糖基化降低的CHO细胞来进行生产的方法(美国专利公开2010/0304436号)；使用具有对应于GMD外显子(exon)5、6和7区的基因组缺失的GMD敲除(knockout)细胞和FUT8敲除宿主细胞系来生产的方法(KANDA，Y.等(2007)J.BIOTECHNOL；130(3)：300-10)；通过与N-甲基-N-亚硝基胍孵育产生的4种类型的抗凝集素的CHO突变体细胞来生产的方法(RIPKA，J.等(1986)SOMAT CELL MOL GENET；12(1)：51-62)；通过Lec13(岩藻糖缺损CHO)细胞系生产的方法(SHIELDS，R.L.等(2002)JBIOL CHEM；277(30)：26733-40)；通过使甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)处理后CHO细胞群与橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)凝集素(AAL)或米曲霉(Aspergillus Oryzae)1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)的无毒性岩藻糖结合剂接触，使用去除与岩藻糖结合剂结合的细胞后得到的细胞的生产方法(WO2012/120500)；从抗体上暂时切割糖链，然后使不与岩藻糖结合的糖链再结合至抗体的方法(日本特开2016-082962)；以及，使用表达乙酰氨基葡萄糖转移酶III的细胞生产的方法(美国专利6,602,684)。本发明的抗体可以通过这些任意方法或此处没有记载的其他的减少岩藻糖结合量的公知的抗体生产方法来制备。
2.医药组合物
本发明的抗体可以以口服给药形式或者注射剂、输液剂等非口服给药形式的医药组合物使用。当施用于哺乳动物等时，医药组合物可以是片剂(tablets)、粉剂、颗粒剂(Granule)、糖浆剂(syrupus)等口服给药形式，也可以是注射剂、输液剂等非口服给药形式。
本发明的医药组合物可以使用通常的药学上可接受的载体通过常规方法制剂化。当制备口服固体制剂时，在主药中添加赋形剂，根据需要添加粘合剂、崩解剂、润滑剂等，然后使用常规方法制成溶剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂等。制备注射剂时，可以根据需要向主药中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂等，通过常规方法制备皮下或静脉用注射剂。
在另一实施方式中，本发明涉及一种治疗或预防HIV感染症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量(effective dose)的本发明的抗体的步骤。或者，本发明涉及本发明的抗体在制造HIV感染症的治疗药物或预防药物中的用途。向哺乳动物等施用本发明的抗体时的给药量根据症状、年龄、性别、体重、给药形式的不同而不同，例如当向成人静脉内给药时，一次剂量通常可以为0.1～10000mg。优选地，能够在给药后长时间(例如，12周以上、16周以上、20周以上、24周以上、28周以上、32周以上、36周以上、40周以上、1年以上、2年以上、3年以上、4年以上或5年以上)维持血液中的HIV在检测极限以下的给药方法。根据需要，可以在给药期间和给药后监测血液中的HIV的量(例如，HIV RNA的量)，用以确认给药后是否将血液中的HIV维持在检测极限以下。例如对于感染了HIV的患者，本发明的抗体可以一共施用1～10次、1～8次、1～5次、1～4次、1～3次、1～2次、1次、两次或三次。施用间隔可以是3～30天、3～15天、4～10天、5～9天、6～8天或7天。
在下文中，将示出实施例以更详细地说明本发明，但是本发明不限于此。另外，本申请说明书全文中引用的文献通过引用而被整体并入本申请说明书。此外，本申请还主张平成30年10月29日(2018年10月29日)申请的日本专利申请第2018-203114号的优先权。本申请主张优先权的日本专利申请第2018203114号记载的内容都通过引用并入本申请。
实施例
(1)载体的制作
将导入了1C10抗体的重链(序列号6)和轻链(序列号8)的cDNA的质粒(pMPE-1C10)作为模板，将含有限制酶(restriction enzyme)NruI识别序列和BmNPV多角体蛋白的5'非翻译区序列(日本特开2008-125366)的引物(NruI-BmNPV-ATG)和由1C10重链5'末端序列组成的引物(Hc-F)的混合液用作正向引物(forward primer)，另外，将由添加了限制酶NruI和XhoI识别序列的3'末端序列组成的引物(C-hIgG1-NruI-XhoI)用作反向引物(reverseprimer)，来进行PCR，从而扩增1C10重链的cDNA。
使用XhoI处理扩增得到的片段(fragment)，并且导入用EcoRV和XhoI处理后的克隆载体(pCR-MCS)中。同样地，以导入了1C10轻链的cDNA的质粒(pKVA2-1C10)作为模板，将由NruI-BmNPV-ATG和轻链5'末端序列组成的引物(LcK-F)的混合溶液用作正向引物，另外，将添加了限制酶NruI和XhoI识别序列的3'末端序列组成的引物(LcK-R)用作反向引物，进行PCR，由此来扩增1C10轻链的cDNA，将得到的片段插入到pCR-MCS中。
(正向引物)
NruI-BmNPV-ATG
5'-ATCGCGAAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATG-3'(序列号1)
Hc-F
5'-GTAATAAAAAAACCTATAAATATGGACTGGACCTGGAGGATC-3'(序列号2)
LcK-F
5'-GTAATAAAAAAACCTATAAATATGGTGTTGCAGACCCAGGTC-3(序列号4)
(反向引物)
C-hIgG1-NruI-XhoI
5'-CGCTCGAGTCGCGATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(序列号3)
LcK-R
5'-CGCTCGAGTCGCGATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3'(序列号5)
用NruI切断导入了1C10轻链的cDNA的pCR-MCS以切出轻链的cDNA，导入用Aor51HI处理后的转基因家蚕制备载体(pMSG3.1MG，日本特开2012-182995)。之后，用NruI消化该载体，与使用NruI从导入了1C10重链cDNA的pCR-MCS中切出的重链cDNA连接(Ligation)。得到的载体(1C10/pMSG3.1MG)中，1C10重链和轻链的cDNA分别被导入丝胶-1(sericin-1)启动子的下游。
关于分离了1C10的同一患者来源的抗HIV人源化抗体1D9(重链的cDNA序列：序列号10；轻链的cDNA序列：序列号12)和49G2，以及其他的HIV患者来源的人源化抗体VRC01(Science.329，856-61(2010))和PGT121(Nature.477，466-470(2011))，也通过同样的方法，制备将重链和轻链导入pMSG3.1的转基因家蚕制作用载体。
(2)转基因家蚕的制作
用质粒中量提取试剂盒(Plasmid Midi Kit)(QIAGEN)纯化1C10/pMSG3.1MG之后，将辅助质粒pHA3PIG(Nat.Biotechnology.；18：81-84(2000))与质粒的量以1：1混合，进一步进行醇沉之后，溶解在注射缓冲液(0.5mM磷酸缓冲液，pH 7.0，5mM KCl)中，使DNA浓度为200μg/mL。以每个卵约15～20nL的液量，向产卵后2～8小时的胚泡期的383个家蚕的卵(家蚕胚胎)显微注射该载体混合液。
将显微注射有载体DNA的卵在25℃孵育，结果85％的卵被孵化。饲养这些家蚕幼虫，使生长得到的成虫交配，得到72组(雌成虫产下的卵块)G1代卵。用荧光体视显微镜(fluorescence stereomicroscope)观察产卵日起第5～6天的G1卵块，得到含有从眼睛和/或神经系统发出绿色荧光的转基因家蚕卵的31组的卵块。通过使获得的卵孵化并进行饲养，结果构建了48只转基因家蚕，提取这些茧蛋白质并通过SDS-PAGE分析。另外，从成虫提取基因组DNA并进行DNA印迹法(Southern Blot)。通过这些分析，筛选出茧表达1C10抗体并且在基因组中具有1个拷贝重组基因的6个系统的转基因家蚕。
将上述转基因家蚕与表达作为BmNPV来源的反式激活因子的ie1基因的蚕蛾(日本特开2012-182995)交配。已知，从ie1基因所合成的IE1蛋白质可作用于pMSG3.1MG中所含的BmNPV来源的hr3增强子和丝胶1启动子，使中部绢丝腺中重组蛋白的表达量提高(Biotechol.Bioeng.；106：860-870(2010))。从通过交配获得的G2代家蚕中，筛选同时具有1C10 cDNA和ie1基因的家蚕(以下称为“1C10生产用系统”)，并饲养这些家蚕结茧。
同样地，对于导入了与1C10来自同一患者的1D9和49G2的载体，以及导入了来自其他患者的VRC01和PGT121的cDNA的载体，也显微注射到家蚕卵中来制备转基因家蚕。与表达ie1基因的家蚕交配，制作含有各个抗体的茧。
对于导入了各个基因的家蚕各一个系统，记载获得的茧的茧层重量(表1)。对于1C10、1D9、VRC01和PGT121而言，结了平均重量的茧，但49G2没有结任何茧。
[表1]
Figure BDA0003046236690000171
(3)表达量的分析
调查了获得茧的1C10、1D9、VRC01和PGT121的抗体表达量。通过分别将10mg家蚕的茧浸入1mL的8M尿素、50mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0、0.1M DTT中，并在80℃加热5分钟，而全部溶解(全部提取)丝的丝胶层中所含的蛋白质，在还原条件下进行SDS-PAGE，然后进行CBB染色，比较抗体的表达量。
在图1的A中显示结果。在4种类型的基因重组家蚕的茧中检测到抗体的重链(H链)和轻链(L链)。1C10的表达量最高，1D9和PGT121的表达量也比较高，与之相比，VRC01的表达量低。
接下来，分析对于中性缓冲液提取的抗体的量。将10mg茧浸入1mL PBS(终浓度0.5M NaCl)、0.1％Triton X-100中，在室温下搅拌1小时，然后离心分离，收集上清液。当通过SDS-PAGE分析提取液中的蛋白质时，抗体的提取量为1C10最大，表达量较高的1D9和PGT121的提取率远低于1C10。使用安装有蛋白A柱(HiTrap MabSelect SuRe colimn(0.7×2.5cm；1mL)，GE Healthcare)的HPLC系统(Alliance HPLC System，Waters)对提取液中所含的抗体量进行定量。将从各家蚕的茧中制备的提取液300μL过蛋白A柱，用PBS洗涤，然后用100mM柠檬酸(citric acid)pH 3.0洗脱结合的抗体，由洗脱峰(elution peak)定量抗体的浓度。另外，由该结果计算出从1个茧中所提取的抗体量。如表1所示，从1C10的每1个茧中能够提取的抗体量为1.48mg，可以判断能够提取同一HIV感染患者来源的1D9的抗体量的约3.2倍。
(4)1C10抗体的纯化
将1C10生产用系统的茧浸入PBS(终浓度0.5M NaCl)、0.1％Triton X-100中，并在室温下搅拌1小时，制备茧提取液。用0.45μm过滤器过滤提取液，并过蛋白G柱(蛋白G琼脂糖凝胶4FF(Protein G Sepharose 4Fast Flow)，GE Healthcare)。使用0.1M甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH 2.7)从柱上洗脱抗体。在洗脱的抗体溶液中加入1M Tris-HCl(pH 9.0)进行中和，最后用PBS透析。在以下实验中将纯化的抗体作为SW-1C10使用。
(5)准备不同来源的1C10抗体
为了研究抗体来源造成的结合活性和中和活性的差异，制备Bcell-1C10(Virology.；475：187-203(2015))、293A-1C10(Virology；475：187-203(2015))和CHO-1C10这些来源不同的1C10抗体。
如下制备CHO-1C10。使用ExpiCHO表达系统试剂盒(Expression System Kit)(Thermo Fisher Scientific)，向ExpiCHO-S细胞(包含在试剂盒中)转染(transfection)导入了1C10的cDNA的质粒。转染后12～14天后收集培养上清液，使用0.2μm过滤器过滤，然后使其结合至蛋白A柱(HiTrap rProtein A FF，GE Healthcare)。使用50mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.39)从柱上洗脱抗体。加入1M Tris-HCl(pH 9.0)进行中和，并使用PBS进行透析。用PEG 6,000(Wako)浓缩抗体溶液后，再对PBS透析两次。
(6)检测对HIV-1BaL株的结合活性
比较了SW-1C10和293A-1C10对HIV-1BaL株的结合活性(Science.；253：71-4(1991))。首先，准备BaL病毒感染细胞。将CEM.NKR-CCR5(NKR24)细胞(J Virus.；86:12039-52(2012)悬浮液(1×106细胞/50μL)和50μL BaL病毒悬浮液在1.5mL离心管中混合，以1,200×g在室温下离心2小时。添加R10培养基(J Virol.；86：12039-52(2012))，并在37℃和5％CO2下在24孔板上开始培养。NKR24细胞中，导入了由HIV-1的LTR启动子控制的荧光素酶(Luciferase)基因(J Virus.；86：12039-52(2012))。使用neolite报告基因检测系统(neolite Reporter Gene Assay System)(Perkin Elmer)测定了该NKR24细胞所产生的荧光素酶活性，适当确认病毒的感染状况。
在准备好感染BaL的NKR24细胞和未感染(正常)的NKR24细胞的阶段，制备用于FACS分析的样品(使用0.2％BSA/PBS作为反应液)。向96孔板添加50μL悬浮在反应液中并调整为2.5×106细胞/mL的细胞(25×104细胞/管)。向其中添加等量的抗体溶液(用D-PBS(-)调节浓度)，使最终浓度为0.032/0.16/0.8/4/20/100μg/mL。在室温下孵育30～40分钟后，用反应液清洗2次，并添加50μL用反应液稀释200倍的APC标记抗人IgG(anti-human IgG)(Jackson ImmunoResearch)(之后遮光操作)。在室温下孵育15分钟后，用反应液清洗2次，并添加100μL的10％福尔马林(Formalin)/PBS。在冰上孵育15分钟后，用BD FACS Canto II(BD Biosciences)进行分析，由APC的平均荧光强度(MFI)调查结合活性。
其结果确认了SW-1C10和293A-1C10均特异性结合感染BaL的NKR24细胞，并进一步显示出抗体浓度依赖性的结合活性(表2和图2)。
[表2]
Figure BDA0003046236690000201
(7)测定对HIV-1BaL株的中和活性
对于SW-1C10、Bcell-1C10、293A-1C10和CHO-1C10对HIV-1BaL株的中和活性进行了比较。在96孔板上制备8级抗体稀释系列(100μL/孔)，每级5倍，最大浓度为4μg/mL，然后添加50μL调整为4,000TCID50/mL的BaL病毒(最终为200TCID50)。在37℃、5％CO2下孵育1小时后，将TZM-bl细胞(AIDS；23：897-906(2009))调整为1×105细胞/mL(+37.5μg/mL DEAE葡聚糖(DEAE dextran))，添加100μL。同时准备VC(病毒对照；仅病毒和细胞)作为阳性对照(Positive control)、CC(细胞对照；仅细胞)作为阴性对照(Negative control)。在37C、5％CO2下培养2天后，将细胞用PBS清洗，在每个孔中添加30μL荧光素酶细胞裂解缓冲液(Luciferase Cell Lysis Buffer)(Promega)，搅拌15分钟。将50μL荧光素酶测定试剂(Luciferase Assay Reagent)添加到检测白板(Coster)后，添加10μL搅拌结束后的细胞裂解液(Cell lysate)，通过光度计(Luminometer)测定RLU(相对发光强度)。以CC中的RLU为背景，计算出感染抑制率(％抑制)＝{(VC的RLU)-(各抗体浓度下的RLU)}/(VC的RLU)，求出IC50(50％抑制浓度)。
表3示出了IC 50，图3示出了在各抗体浓度下的感染抑制率。其结果证实了含有SW-1C10的各种抗体显示出几乎相同的中和活性。
[表3]
SW B细胞 293A CHO
Y＝50时的剂量 0.1084 0.09697 0.1326 0.07808
(8)糖链结构分析
根据文献(Mol.Cellular Proteome.；6：1437-1445(2007))，通过以下操作来分析SW-1C10和CHO-1C10的糖链结构。通过在表面活性剂存在下将50μg纯化的1C10还原烷基化，用胰蛋白酶(trypsin)消化，然后用PNGaseA进行酶消化，使N-聚糖(N-glycan)游离。接着，添加50pmol内标物，并进行糖印迹(Glycoblotting)法(在此步骤中，进行N-聚糖的捕集、羧基的甲基化和BOA标记化)。对其进行质谱分析(Mass spectrometry)(MALDI-TOF-MS；Ultraflex III，正模式)，使用GlycoMod tool(http://web.expasy.org/gycomod/)对照所得到的光谱，推断出N-聚糖的结构。另外，使用与预先添加的内标物的峰面积，将每个峰面积标准化。
根据获得的质谱谱图(Mass Spectrum,MS)所推断的主要糖链结构及其存在比例示于图4。相对于在CHO-1C10中观察到大约70.3％的核心岩藻糖(core fucose)添加糖链，在SW-1C10中未检测到核心岩藻糖(core fucose)添加糖链。另外，SW-1C10的糖链不存在含有添加唾液酸(sialic acid)和等分GlcNAc的糖链，这点与CHO-1C10的糖链结构类似。
(9)检测ADCC活性
除了SW-1C10、293A-1C10和CHO-1C10之外，还制备了识别gp120的V3环的人源化抗体KD-247，并比较了对HIV-1BaL株的ADCC活性。
通过与检测结合活性相同的方法，制备感染BaL的NKR24细胞。在准备好感染BaL的NKR24细胞和未感染(正常)的NKR24细胞的阶段，制备ADCC活性测定用样品(使用R10培养基10U/ml IL-2作为反应液和抗体稀释液)。用反应液清洗3次后，将调整为2.5×105细胞/mL的NKR24细胞40μL添加到96孔板(1×104细胞/孔)中。用反应液清洗1次后，添加调整为2.5×106细胞/mL的自然杀伤细胞(natural killer cell)系即人CD16+KHYG-1细胞((N6细胞；J Virol.；86：12039-52(2012))40μL(1×104细胞/孔)作为效应细胞(effector cell)。然后添加20μL制备的各抗体，使其终浓度为0.2、2或20μg/mL。还同时准备了作为阳性对照的VC(病毒对照(virus control)；只有感染BaL的NKR24细胞和N6细胞)和作为阴性对照的CC(细胞对照(cell control)；仅有未感染的NKR24细胞和N6细胞)的孔；在37℃、5％CO 2下孵育6小时。
在ADCC活性检测中使用neolite报告基因检测系统(neolite Reporter GeneAssay System)。向检测用白板(PerkinElmer)中添加40μLneolite试剂后，将孵育后的反应液悬浮，添加40μl，并通过光度计测定RLU(相对发光强度)。使用CC中的RLU作为背景计算病毒杀伤率(％杀伤率；(VC的RLU-各抗体浓度的RLU)/VC的RLU)，作为ADCC活性(图5的A和B)。其结果确认了在比较的抗体中SW-1C10显示出最高的ADCC活性。
(10)大量生产用于动物实验的1C10
对大约1～3万只1C10生产用系统全龄投喂人工饲料(日本农业工业株式会社Silkmate原种用1-3龄用S)进行饲养，来产茧。用剪刀切开茧以取出蛹，得到约1.1kg的茧层。使用其中1.0kg来提取和纯化SW-1C10。
将1kg茧浸入100L提取缓冲液(50mM醋酸缓冲液pH 5.3、30mM NaCl、0.2％TritonX-100、0.01％聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane))中，并在25℃下压榨2小时来提取蛋白质。用10μm工业用过滤器(SMC)过滤后，通过5L填充了阳离子交换载体(STREAMLINE SP(GE Healthcare))的STREAMLINE 200Column(GE Healthcare)，用SP清洗缓冲液(50mM醋酸缓冲液pH 5.3,30mM NaCl、0.2％Triton X-100)清洗后，用SP洗脱缓冲液(50mM醋酸缓冲液pH 5.3、300mM NaCl)洗脱回收1C10抗体。此外，使用超滤膜(ultrafiltration membrane)(Biomax-100TF(Millipore株式会社))浓缩，然后将溶剂更换为PBS。将其通过填充有蛋白A载体(MabSelect SuRe(GE Healthcare))的柱，用PBS清洗，然后用100mM柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱1C10抗体。最后，将其用超滤膜浓缩，并将溶剂更换为存储溶液(pH 5.5的10mM醋酸缓冲液、50mM NaCl、100mM精氨酸盐酸盐)。通过以上操作，制备了约7.9g纯度为99.0％以上的纯化SW-1C10。
(11)对感染HIV的食蟹猴施用1C10
为了评价SW-1C10在急性感染期的效果，将在SIV中导入了HIV89.6株来源的Env得到的嵌合病毒强毒性SHIV89.6P(Reimann K.A.等，J.Virus.70，6922-66928.)50000TCID50接种到7只食蟹猴的直肠，建立全身感染。食蟹猴组的组成为：作为对照的无处理组为4只，SW-1C10给药组为3只。病毒接种后第3天、第10天和第17天通过静脉实施SW-1C10的给药，观察到了抑制血液中病毒的效果。
从接种病毒后到第8周通常每隔7天，之后每4周1次的频率，从麻醉的猴子经时地采集外周血(添加EDTA)。通过离心分离开收集所采集的血液，然后用PBS稀释血细胞，之后在比重1.070的Percoll中分层，然后离心分离以分离出PBMCs(Peripheral bloodmononuclear cell，外周血单核细胞)。从血浆中提取病毒RNA，通过定量RT-PCR扩增SIVmac239的gag区域，并根据产物的浓度计算出血浆中病毒RNA的拷贝数。使用MagNAPureCompact核酸分离试剂盒(Roche Diagnostics)提取并纯化血浆中的病毒RNA。
设计以SIVmac239的gag区域作为靶标的引物和探针，并使用LightCycler 480热循环仪(Roche Diagnostics)计算RNA的量。使用QuantiTec Probe RT-PCR试剂盒(Qiagen)扩增和检测病毒RNA。设计了以下引物和模板。即，使用了作为正向引物的“5'-GCAGAGGAGGAAATTACCCAGTAC-3'/序列号14”、作为反向引物的“5'-CAATTTTACCCAGGCATTTAATTTAATGTT-3'/序列号15”和作为探针的“5'-FAM-TGTCCACCTGCCATTAAGTCCCGA-TAMRA-3'/序列号16”。
通过Light Cycler 480热循环仪进行荧光检测，确定RT-PCR产物的量。血浆中的病毒量以Duplicate测量两次，病毒量使用校正曲线(calibration curve)进行换算来求得，该校准曲线是已知浓度的SIV RNA梯度稀释制备的。另外，用DNAase I来处理模板DNA和其他混入的DNA。该检测系统的灵敏度为100拷贝/ml。
在作为对照的未处理的猴子中，在病毒接种的第二周，1ml血浆中病毒RNA的拷贝数增加到数千万至数亿拷贝，然后在第8周后达到称为病毒学(virology)设定值的稳定状态(steady state)，以数万～数十万拷贝/ml变化。在2至4周内，作为HIV感染对象的CD4+T细胞数量迅速减少，此后细胞数量在较低水平变化。另一方面，在SW-1C10给药组中，在病毒接种的第4周的病毒量达到10万～100万拷贝/ml的峰值时病毒量减少，并且在第12周后3只中均未检测到病毒。此外，CD4+T细胞的数量没有显著降低，保持了病毒投予前的水平。(图6)。
从该结果令人惊讶的地方在于，在所有施用SW-1C10的个体中，病毒从早期就处于检测极限以下，并且在经过12周的长时间内病毒RNA被控制在检测极限以下。在过去，像这样能够长期控制全部病例的病毒增殖的情况还没有被报道过，本申请发明人首次成功发现了能够为施用对象提供广泛而稳定的病毒控制的抗体。
序列表
<110> 株式会社免疫生物研究所
国立大学法人熊本大学
株式会社丘阿德
国立研究开发法人医药基盘.健康.营养研究所
<120> 抗HIV抗体及其制造方法
<130> IBL-3-PCT
<150> JP2018-203114
<151> 2018-10-29
<150> JP2019-166040
<151> 2019-09-12
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer
<400> 1
atcgcgaaag tattttactg ttttcgtaac agttttgtaa taaaaaaacc tataaatatg 60
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtaataaaaa aacctataaa tatggactgg acctggagga tc 42
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cgctcgagtc gcgattattt acccggagac agggagag 38
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gtaataaaaa aacctataaa tatggtgttg cagacccagg tc 42
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cgctcgagtc gcgattaaca ctctcccctg ttgaagctc 39
<210> 6
<211> 1425
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1425)
<220>
<221> sig_肽
<222> (1)..(57)
<400> 6
atg gac tgg acc tgg agg atc ctc ctc ttg gtg gca gca gcc acc ggt 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
cct ggg agg tcc ctg aga gtc tcc tgt gta gcc tct gga ttc atg ttc 144
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Met Phe
35 40 45
agt aac tat gct atg cac tgg gtc cgc cag act gca ggc aag ggg ctg 192
Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Ala Gly Lys Gly Leu
50 55 60
gag tgg gtg gct att att tca aat gat gga agc gat aaa tat tac gca 240
Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc gta tct aga gac aac tcc cag aac 288
Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn
85 90 95
aca ctg ttt ctg caa atg agt ggc ctc aga cct gag gat tcg ggt ctt 336
Thr Leu Phe Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Pro Glu Asp Ser Gly Leu
100 105 110
tat tac tgt gcg aga gat ttg gac cag act att ccg gac ctg act gct 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala
115 120 125
ccc gct ttt gaa gtc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tct tca 432
Pro Ala Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 480
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 528
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 576
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 624
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 672
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 720
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 768
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 816
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 864
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 912
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 960
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1008
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1056
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1104
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1152
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1200
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1248
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1296
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1344
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1392
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa 1425
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 7
<211> 474
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Met Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Ala Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn
85 90 95
Thr Leu Phe Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Pro Glu Asp Ser Gly Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala
115 120 125
Pro Ala Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 8
<211> 717
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(717)
<220>
<221> sig_肽
<222> (1)..(60)
<400> 8
atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc ata agc ttg ttg ctc tgg atc tct 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
ggt gcc tac ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg gcc 96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala
20 25 30
gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc 144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
ctc ctg cat agt gat gga aac aat tac ttg gat tgg tat ttg cag aag 192
Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat ttg act tct aat cgg gcc 240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala
65 70 75 80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtc tat ttc 336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe
100 105 110
tgc atg caa tct cta caa acc tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg 384
Cys Met Gln Ser Leu Gln Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
gaa atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 432
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
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Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
ctg agc ttg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 717
Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 9
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe
100 105 110
Cys Met Gln Ser Leu Gln Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 10
<211> 1419
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1419)
<220>
<221> sig_肽
<222> (1)..(57)
<400> 10
atg gac tgg acc tgg agg atc ctc ctc ttg gtg gca gca gcc acc ggt 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cac ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96
Val Gln Cys Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gaa gtc tct gga gtc acc ttc 144
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Phe
35 40 45
act gag tct att atg cat tgg ctc cgc cag gct cca ggc aag ggg ccg 192
Thr Glu Ser Ile Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
gag tgg ctg gca att att tca caa gat gga gcc act aaa ttc tat gca 240
Glu Trp Leu Ala Ile Ile Ser Gln Asp Gly Ala Thr Lys Phe Tyr Ala
65 70 75 80
gac tcc gtg aag ggc cga ttc gcc atc tcc aga gac aat tcc aag aat 288
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
acg gtg tat ttg gaa atg aac agc ctg aga att gag gac tcg ggt acc 336
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ile Glu Asp Ser Gly Thr
100 105 110
tat tac tgt gcg aaa gac ggg gca gat gtg gac aat tta ggt ccc gcc 384
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ala Asp Val Asp Asn Leu Gly Pro Ala
115 120 125
ttt gac tac tgg ggc cgg gga acc ctg gtc acc gtc tct tca gct agc 432
Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc 480
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc 528
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg 576
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc 624
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc 672
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt 720
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225 230 235 240
gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 768
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 816
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 864
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 912
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 960
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 1008
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 1056
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 1104
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 1152
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 1200
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 1248
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 1296
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 1344
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 1392
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa 1419
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 11
<211> 472
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Ser Ile Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Glu Trp Leu Ala Ile Ile Ser Gln Asp Gly Ala Thr Lys Phe Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ile Glu Asp Ser Gly Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ala Asp Val Asp Asn Leu Gly Pro Ala
115 120 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 12
<211> 717
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(717)
<220>
<221> sig_肽
<222> (1)..(60)
<400> 12
atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc ata agc ttg ttg ctc tgg atc tct 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
ggt gcc tac ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc 96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
20 25 30
gtc aac cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc 144
Val Asn Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
ctc cta cat act aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac gtg cag aag 192
Leu Leu His Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys
50 55 60
cca ggg cag tct ccg cag ctc ctg atc ttt ttg ggt tct cat cgg gcc 240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser His Arg Ala
65 70 75 80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag tct gag gat gtt ggc gtt tat tac 336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
tgc atg caa cct cta caa tcg tgg acg ttc ggc caa ggg acc agg gtg 384
Cys Met Gln Pro Leu Gln Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val
115 120 125
gaa atc aat cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 432
Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc 576
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
ctg agc ttg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 717
Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 13
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
20 25 30
Val Asn Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu His Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser His Arg Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Pro Leu Gln Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val
115 120 125
Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 14
Gly Phe Met Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 15
Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys
1 5
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 16
Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Ala
1 5 10 15
Phe Glu Val
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 17
Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 18
Leu Thr Ser
1
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 19
Met Gln Ser Leu Gln Thr Trp Thr
1 5

Claims (18)

1.一种抗体，其具有对HIV的结合能力；并且，
结合于该抗体的糖链不含岩藻糖；并且，
该抗体具有通过向HIV感染者单次给药或多次给药，以90％以上的概率将该HIV感染者血液中的HIV控制在检测极限以下的作用。
2.一种IgG抗体，其具有：含有序列号7中记载的氨基酸序列、与其具有80％以上同一性的氨基酸序列、或者其氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的重链，以及含有序列号9中记载的氨基酸序列、与其具有80％以上同一性的氨基酸序列、或者其氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的轻链；
该抗体具有对HIV的结合能力；并且，
结合于该抗体的糖链不含岩藻糖。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中重链具有序列号7中记载的重链氨基酸序列中的3个CDR序列；并且，轻链具有序列号9中记载的氨基酸序列中的3个CDR序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体，其具有通过向HIV感染者单次给药或多次给药，以90％以上的概率将该HIV感染者血液中的HIV控制在检测极限以下的作用。
5.根据权利要求1所述的抗体，其具有由序列号7中记载的氨基酸序列组成的重链以及由序列号9中记载的氨基酸序列组成的轻链。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗体，其具有从以下所选择的糖链结构，
Figure FDA0003046236680000021
7.根据权利要求1～6中任一项所述的抗体，其特征在于，其是通过转基因绢丝昆虫产生的。
8.一种组合物，其为一种含有具有对HIV的结合能力的IgG抗体的组合物；该IgG抗体的80％以上为权利要求1～7或权利要求14所述的抗体。
9.一种表达盒，其功能地结合在绢丝腺特异性基因启动子的下游，且含有选自以下(i)～(x)中的任意一个多核苷酸：
(i)具有序列号6中记载的碱基序列和/或序列号8中记载的碱基序列的多核苷酸；
(ii)具有在严格条件下与序列号6中记载的碱基序列杂交的碱基序列和/或在严格条件下与序列号8中记载的碱基序列杂交的碱基序列的多核苷酸；
(iii)编码序列号7中记载的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号9中记载的氨基酸序列的多核苷酸；
(iv)编码与序列号7中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码与序列号9中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸；
(v)编码序列号7中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号9中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加、插入的氨基酸排列的多核苷酸；
(vi)具有序列号10中记载的碱基序列和/或序列号12中记载的碱基序列的多核苷酸；
(vii)具有在严格条件下与序列号10中记载的碱基序列杂交的碱基序列和/或在严格条件下与序列号12中记载的碱基序列杂交的碱基序列的多核苷酸；
(viii)编码序列号11中记载的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号13中记载的氨基酸序列的多核苷酸；
(ix)编码与序列号11中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码与序列号13中记载的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列的多核苷酸；以及，
(x)编码序列号11中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加、插入的氨基酸序列的多核苷酸和/或编码序列号13中记载的氨基酸序列中数个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述启动子区域为丝胶1启动子、丝胶2启动子或丝胶3启动子。
11.一种质粒载体，其含有权利要求9或权利要求10所述的表达盒。
12.一种转基因绢丝昆虫的制造方法，其包括将权利要求11所述的质粒载体导入绢丝昆虫的卵中的步骤。
13.一种转基因绢丝昆虫，其中权利要求10所述的表达盒被整合到染色体中。
14.一种抗体的制造方法，其包括从权利要求13所述的转基因绢丝昆虫产生的丝中提取该抗体的步骤。
15.一种抗体，其是由转移因绢丝昆虫所产生的，含有具有序列号11中记载的氨基酸序列的重链和具有序列号13中记载的氨基酸序列的轻链。
16.一种治疗或预防HIV的医药组合物，其含有权利要求1～权利要求7或权利要求15所述的抗体或权利要求8所述的组合物作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的医药组合物，其用于在HIV感染后被施用1～5次。
18.根据权利要求65所述的医药组合物，其被施用2次以上，且第2次以后的施用在前次施用3～30天后进行。
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