JP6840323B2 - 哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ - Google Patents
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(2)前記ガラクトース転移酵素がGalT2である、(1)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(3)前記中部絹糸腺プロモーターがセリシン1遺伝子、セリシン2遺伝子、又はセリシン3遺伝子のプロモーターである、(1)又は(2)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(4)前記後部絹糸腺プロモーターがフィブロインH鎖遺伝子、フィブロインL鎖遺伝子、又はp25遺伝子のプロモーターである、(1)又は(2)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(5)前記選択される3以上のタンパク質がGNE、CAMS、及びST6GAL1を含む3以上のタンパク質である、(1)〜(4)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(6)前記発現ベクターが(c)CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター(SLC35A1)をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
をさらに含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(7)前記発現ベクターが前記(a)に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第1発現ベクター、及び前記(b)に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第2発現ベクターからなる、(1)〜(6)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(8)前記(c)に記載の遺伝子又はヌクレオチドが第2発現ベクターに含まれる、(7)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(9)前記タンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドが前記MSG又はPSGプロモーターの下流に機能的に連結している、(1)〜(6)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(10)前記発現ベクターが(i)前記MSG又はPSGプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第1サブユニットと、(ii)前記転写調節因子の標的プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された前記(a)〜(c)に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む一以上の第2サブユニット
から構成される、(1)〜(8)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(11)前記転写因子が酵母由来のGAL4タンパク質であり、その標的プロモーターがUAS(Upstream Activating Sequence)である、(10)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(12)前記絹糸虫がカイコである、(1)〜(11)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(13)哺乳動物型がヒト型である、(1)〜(12)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
(15)(10)又は(11)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
(16)前記第1サブユニットと前記第2サブユニットとが異なる染色体上に存在する、(15)に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
(17)前記絹糸虫がカイコである、(14)〜(16)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
(18)哺乳動物型がヒト型である、(14)〜(17)のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
(19)(10)又は(11)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第2サブユニットのみを含む、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統。
(20)哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を作製する方法であって、(19)に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統、及びそれと同種の(10)又は(11)に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第1サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫作出系統を交配する交配工程、及び交配第1世代(F1)から第1サブユニット及び第2サブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫として選抜する選抜工程を含む前記方法。
1−1.概要
本発明の第の態様は、哺乳動物型糖鎖付加剤である。本発明の糖鎖付加剤は、独立した1〜3つの発現ベクターで構成される。本発明の糖鎖付加剤をカイコ等の絹糸虫内に導入することで哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を容易に作製することができる。
本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
本明細書において「哺乳動物型糖鎖付加剤」とは、後述する構成を有する絹糸虫に適用する薬剤をいう。
本明細書において「絹糸虫(silk-spinning worm)」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。具体的には、チョウ目昆虫、ハチ目昆虫、アミメカゲロウ目昆虫、トビケラ目昆虫等において、主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。ここで、チョウ目昆虫は、分類学上のチョウ目(鱗翅目:Lepidoptera)に属する昆虫で、各種チョウ又はガが該当する。ハチ目昆虫は、分類学上のハチ目(膜翅目:Hymenoptera)に属する昆虫で、各種ハチ又はアリが該当する。アミメカゲロウ目昆虫は、アミメカゲロウ目(脈翅目:Neuroptera)に属する昆虫で、ヘビトンボ、ツノトンボ、ウスバカゲロウ等が該当する。トビケラ目昆虫は、トビケラ目(毛翅目:Trichoptera)に属する昆虫で、各種トビケラが該当する。本発明における絹糸虫には、大型の絹糸腺を有し、多量の絹糸を吐糸できるチョウ目昆虫が好ましく、中でもカイコガ科(Bombycidae)、ヤママユガ科(Saturniidae)、イボタガ科(Brahmaeidae)、オビガ科(Eupterotidae)、カレハガ科(Lasiocampidae)、ミノガ科(Psychidae)、ヒトリガ科(Archtiidae)、ヤガ科(Noctuidae)等に属する種が好適であり、Bombyx属、Samia属、Antheraea属、Saturnia属、Attacus属、Rhodinia属に属する種、具体的には、カイコの他、クワコ(Bombyx mandarina)、シンジュサン(Samia cynthia;エリサンSamia cynthia ricini及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む)、ヤママユガ(Antheraea yamamai)、サクサン(Antheraea pernyi)、ヒメヤママユ(Saturnia japonica)、オオミズアオ(Actias gnoma)等の野蚕と呼ばれるグループに属する種は特に好適である。最も好ましい絹糸虫は、カイコである。
カイコをはじめとする多くの絹糸虫において、中部絹糸腺(middle silk gland:本明細書では、しばしば「MSG」と表記する)細胞内では、絹糸の被覆成分である水溶性のゼラチン様タンパク質、セリシンが合成され、中部絹糸腺内腔中に分泌される。また、後部絹糸腺(posterior silk gland:本明細書では、しばしば「PSG」と表記する)細胞内では、絹糸の繊維成分を構成する3つの主要なタンパク質フィブロインH鎖(本明細書では、しばしば「Fib H」と表記する)、フィブロインL鎖(本明細書では、しばしば「Fib L」と表記する)、及びp25/FHX(以下、「p25」と表記する)が合成されている。これら3つのタンパク質は、Fib H:Fib L:p25=6:6:1の比率でSFEU(silk fibroin elementary unit)複合体を形成し、後部絹糸腺内腔中に分泌される。その後、SFEU複合体は中部絹糸腺内腔に移行し、セリシンで被覆され、絹糸として前部絹糸腺から吐糸される。したがって、絹糸虫をタンパク質発現系として利用する場合、中部又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子発現系を利用すればよい。
1−3−1.構成要素
本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤は、糖鎖付加剤発現ベクターで構成される。糖鎖付加剤発現ベクターは、(1)絹糸虫由来の中部及び/又は後部絹糸腺プロモーター、(2)糖鎖付加関連遺伝子又はそのタンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド(本明細書では、しばしば「糖鎖付加関連遺伝子等」と表記する)を必須の構成要素として含む。また、糖鎖付加剤発現ベクターが、後述する第1サブユニットと第2サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合には、(3)転写調節因子をコードする遺伝子及び(4)該転写調節因子の標的プロモーターを必須の構成要素として包含する。その他、糖鎖付加剤発現ベクターは、前記糖鎖付加関連遺伝子等の発現に寄与し得る他の構成要素を含むことができる。他の構成要素とは、例えば、(5)ターミネーター、(6)標識遺伝子、(7)エンハンサー、(8)インスレーター、及び(9)トランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。以下、各構成要素について、具体的に説明をする。
本明細書において「中部又は後部絹糸腺プロモーター(MSG又はPSGプロモーター)」とは、糖鎖付加剤発現ベクターの必須構成要素であり、絹糸虫の中部又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子の発現を制御する部位特異的プロモーターをいう。
糖鎖付加関連遺伝子又はその遺伝子がコードするタンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド(糖鎖付加関連遺伝子等)は、前述のMSG又はPSGプロモーターと共に糖鎖付加剤発現ベクターにおける中心的な構成要素である。
「ガラクトース転移酵素(β1,4-galactosyltransferase:本明細書ではしばしば「GalT」と表記する)」は、ドナー基質であるUDPガラクトース(UDP-Gal)から糖タンパク質のGlcNAcβ1-2Manにガラクトースを転移する反応を触媒する酵素である。本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤においては、絹糸虫の絹糸腺由来タンパク質でN型糖鎖のGlcNAc非還元末端にガラクトースを付加する機能を有する。GalTは、複数のアイソザイムの存在が知られている。例えばマウスでは7種類のアイソザイムが同定されている。そのうち糖タンパク質に関与するのはGalT1、GalT2、GalT3、及びGalT4の4種であるが本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤としての活性を有するのはGalT1、GalT2、及びGalT3の3種であり、中でもGalT2が特に好ましい。したがって、本明細書でGalTと表記する場合、特に断りのない限り、GalT1、GalT2、及びGalT3のいずれかを意味するものとする。
「6種のシアル酸関連タンパク質」とは、絹糸虫の絹糸腺細胞内においてN型糖鎖のガラクトース非還元末端にシアル酸を付加する上で必要な一連のタンパク質であり、シアル酸転移酵素の基質合成関連酵素4種、シアル酸転移酵素、及び糖ヌクレオチドトランスポーターからなる。
本明細書において「転写調節因子をコードする遺伝子」とは、後述する第1サブユニットの必須構成要素であって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
本明細書において「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第2サブユニットの必須構成要素であって、第1サブユニットにコードされた転写調節因子が結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS(Upstream Activating Sequence)が使用される。
本明細書において「ターミネーター」は、本態様の糖鎖付加剤発現ベクターにおいて遺伝子等の発現時にその転写を終結できる塩基配列で構成される選択構成要素である。
本明細書において「標識遺伝子」は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。標識タンパク質は、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。それ故、糖鎖付加剤発現ベクターが標識遺伝子を含むことによって、糖鎖付加剤発現ベクターを保有している遺伝子組換え絹糸虫を標識タンパク質の活性に基づいて容易に判別することができる。ここで「活性に基づいて」とは「活性の検出結果に基づいて」という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出してもよいし、標識タンパク質の活性によって生成される色素のような代謝物を介して間接的に検出してもよい。検出は、化学的検出(酵素反応的検出を含む)、物理的検出(行動分析的検出を含む)、又は検出者の感覚的検出(視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む)のいずれであってもよい。
「エンハンサー」は、プロモーターと協調して標的遺伝子の転写量を増大させることのできる遺伝子発現活性化領域で、特定のDNA配列で構成される。プロモーターと異なり、標的遺伝子の上流域(5’末端側)のみならず、下流域(3’末端側)や標的遺伝子内に配置され、標的遺伝子の転写を調節する。
本明細書において「インスレーター」とは、糖鎖付加剤発現ベクターの選択構成要素であり、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
本明細書において「トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRS:Inverted terminal repeat sequence)」は、糖鎖付加剤発現ベクターが相同組換え可能な発現ベクターの場合に含まれ得る選択構成要素である。逆位末端反復配列は、通常は2個1組で使用され、トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる(Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281;Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9(2):145-55)。
本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する糖鎖付加剤発現ベクターは、糖鎖付加関連遺伝子等をMSG又はPSGプロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置している。ここで「直接的又は間接的な発現制御」とは、糖鎖付加剤発現ベクターにおけるMSG又はPSGプロモーターと糖鎖付加関連遺伝子等の配置関係を意味するものであり、これは、糖鎖付加剤発現ベクターのユニット構成に依存する。糖鎖付加剤発現ベクターは、1つのユニットで構成される場合と、2つのサブユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
糖鎖付加剤発現ベクターは、絹糸虫細胞内で糖鎖付加関連遺伝子等を発現させる上で必要な全ての構成要素を1つの糖鎖付加剤発現ベクター内に含む。具体的には、必須の構成要素であるMSG又はPSGプロモーター及びそのプロモーターの下流に機能的に連結された糖鎖付加関連遺伝子等を含む。
糖鎖付加剤発現ベクターが第1サブユニット及び第2サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合、糖鎖付加関連遺伝子等の発現に必須の構成要素は各サブユニットに分割されて存在する。したがって、本構成では、第1及び第2サブユニットが宿主の絹糸虫細胞内に併存してはじめて1つの糖鎖付加剤発現ベクターとして機能する。具体的には、同一細胞内で第1サブユニットに含まれるプロモーターの活性化により第1サブユニットから転写調節因子が発現し、それが第2サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的の糖鎖付加関連遺伝子等を発現することができる。したがって、2つのサブユニットで構成される場合、糖鎖付加関連遺伝子等はMSG又はPSGプロモーターによる間接的な発現制御を受けることになる。第1及び第2サブユニットは、以下の構成を有する。
本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤は、独立した1〜3つの糖鎖付加剤発現ベクターからなる。本明細書において「独立した」とは、1つの糖鎖付加剤発現ベクターのみで糖鎖付加関連遺伝子等を少なくとも1種発現することのできる1つの発現単位として機能し得ることを意味する。したがって、前述した2つのサブユニットで構成される糖鎖付加剤発現ベクターの場合、それぞれのサブユニットは「独立」しているとは言わず、複数のサブユニットをまとめて「独立」していると解する。一方、1つのユニットで構成される場合、そのユニットは「独立」していると解することができる。
本態様の哺乳動物型糖鎖付加剤を宿主に適用し、宿主細胞内に糖鎖付加剤発現ベクターを導入する方法について、説明をする。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫である。本発明の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫は、前記第1態様の糖鎖付加剤発現ベクターを有し、MSG及び/又はPSGにおいて生産させる組換えタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加できることを特徴とする。
本明細書において「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫(本明細書では、しばしば「糖鎖付加絹糸虫」と略称する)」とは、第1態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターを有する遺伝子組換え絹糸虫をいう。宿主である絹糸虫は、前述したいずれの絹糸虫であってもよい。飼育方法や人工試料が確立しており、多頭飼育が可能なカイコ、エリサン及びサクサンは特に好ましい。宿主がカイコの場合、本態様の「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫」を「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ(本明細書では、しばしば「糖鎖付加カイコ」と略称する)」と称する。また、哺乳動物型糖鎖は、ヒト型糖鎖であることが好ましい。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統である。本発明の組換え絹糸虫作出系統は、第1態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターの一部を有する遺伝子組換え絹糸虫及びその後代である。本系統を用いることで、糖鎖付加絹糸虫を自在に、かつ容易に作出することができる。
本明細書で「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統(本明細書では、しばしば「糖鎖付加絹糸虫作出系統」と略称する)」とは、絹糸腺内で生産されるタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加する潜在性を有した継代可能な遺伝子組換え絹糸虫又はその後代をいう。宿主である絹糸虫は、いずれの絹糸虫であってもよいが、第2態様の糖鎖付加絹糸虫と同様の理由からカイコ、エリサン及びサクサンが好ましい。宿主がカイコの場合、本態様の「糖鎖付加絹糸虫作出系統」は「糖鎖付加カイコ作出系統」と称する。また、哺乳動物型糖鎖は、ヒト型糖鎖であることが好ましい。
4−1.概要
本発明の第4の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫(糖鎖付加絹糸虫)を作出する方法である。本発明は、絹糸腺で発現させる目的の組換えタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加できる糖鎖付加絹糸虫を作出できることを特徴とする。
本発明の遺伝子組換え絹糸虫の作出方法は、交配工程と選抜工程を含む。以下、各工程について説明をする。
「交配工程」とは、第3態様に記載の第2サブユニットを有する糖鎖付加絹糸虫作出系統と第1サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫系統を交配する必須の工程である。宿主である絹糸虫は、いずれの絹糸虫であってもよいが、第2態様の糖鎖付加絹糸虫と同様の理由からカイコ、エリサン及びサクサンが好ましい。交配は、前記2つの絹糸虫系統を常法に基づいて行えばよい。原則として同種の雌雄間で行う。
「選抜工程」とは、F1個体から2つのサブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を糖鎖付加絹糸虫として選抜する工程である。本工程では、交配工程後に得られるF1個体から、それぞれのサブユニットにコードされた標識タンパク質の活性に基づいて両者の標識タンパク質活性を有する個体を目的の糖鎖付加絹糸虫として選抜すればよい。
(目的)
本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する糖鎖付加剤発現ベクター及び目的の組換えタンパク質を含む発現ベクターを構築する。
1.第1発現ユニットの構築
(1)中部絹糸腺発現用第1サブユニットの構築
中部絹糸腺(MSG)での遺伝子発現を誘導する第1サブユニットとして、MSGで特異的に発現するセリシン1遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子GAL4遺伝子、さらにその下流に結合したhsp70 polyA付加配列を有するpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を構築した。
(1)基本ベクターの構築
pBac[SerUAS-hr5/3xP3-EGFPinv](Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150)を鋳型として、プライマーペアSerTATA-U(配列番号65)及びBlnBsmSerK-L(配列番号66)を用いてPCRを行い増幅産物SnaBI-BsmBI断片を得た。次に、pBac[SerUAS_Ser1intron_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla](Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150)をSnaBI及びBsmBIで切断して短断片を除き、SnaBI-BsmBIサイトに前記SnaBI-BsmBI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]とした。続いて、pHC-EGFPを鋳型として、プライマーペアFibHsig-U(配列番号67)及びFibHsig-L(配列番号68)を用いてPCRを行い増幅産物BspH-BlnI断片を得た。前述のpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]をBsmBI及びBlnIで切断して短断片を除き、BsmBI-BlnIサイトに、前記BspH-BlnI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]とし、発現ベクターにおける第2発現ユニットの基本発現ベクターとした。
A.GalT発現ベクターの構築
(従来型GalT2発現ベクターの構築)
セリシン1遺伝子のプロモーター領域と3’UTR領域を、それぞれカイコゲノムDNAを鋳型として増幅した後、両増幅断片をoverlap-extension PCRにより連結した。この際、プロモーター領域と3’UTRの境界にBlnIサイトを挿入した。この連結断片をpTAベクター(TOYOBO社)に挿入したものをpTA2[Ser-UTR]とした。pTA2[Ser-UTR]のBlnIサイトにGAL4Δ断片(Kobayashi I., et al., 2011, Arch Insect Biochem Physiol, 76:195-210)を挿入したものをpTA2[Ser-GAL4Δ]とした。pTA2[Ser-GAL4Δ]のAscI断片をpBac[A3KMO, UAS](Kobayashi I., et al., 2007, J. Insect Biotechnol Sericol, 76:145-48)のAscIサイトに挿入したものをpBac[A3KMO, UAS, Ser-GAL4Δ]とした。
上記(1)で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]をAscI及びXhoIで切断して短断片を除き、AscI-XhoIサイトにAscI-NheI-XhoI-U(配列番号69)及びAscI-NheI-XhoI-L(配列番号70)をアニーリングして作製したアダプターを挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/NheIad_A3-Bla]とした。このプラスミドのNheIサイトにpBac[A3KMO, UAS, Ser-GAL4Δ]のNheI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/A3-KMO_A3-Bla]とした。
マウス由来のGalT1〜GalT4遺伝子を、マウスGalT1用プライマーペアBspHI-mGalT1 U(配列番号71)及びマウスBlnI-mGalT1 L(配列番号72)、GalT2用BsmBI-GalT2-U(配列番号73)及びBsmBI-GalT2-L(配列番号74)、マウスGalT3用BsmBI-mGalT3 U(配列番号75)及びマウスBsmBI-mGalT3 L(配列番号76)、及びマウスGalT4用NcoI-mGalT4 U(配列番号77)及びマウスBlnI-mGalT4 L(配列番号78)を用いてPCRを行った。それぞれの増幅産物を各プライマー名に記載の制限酵素で切断処理した後、上記改良型GalTベクターの基本ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/A3-KMO_A3-Bla]のBsmBIサイトに挿入した。得られた改良型GalT発現ベクターのそれぞれをpBac[SerUAS-GalT1/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT2i/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT3/A3-KMO_A3-Bla]、及びpBac[SerUAS-GalT4/A3-KMO_A3-Bla]とした。なお、GalT2pは従来型GalT2を、GalT2iは改良型GalT2を示す。
(UASユニットベクターの構築)
前記(1)で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]を鋳型としてプライマーペアserUASUNhe(配列番号79)及びserPolyALSpe(配列番号80)でPCRを行った。得られた増幅産物をpZErO2(Thermo Fisher Scientific社)のEcoRVサイトに挿入した。これをUASユニットベクターSerUAS_unit/pZErO2とした。
シアル酸関連遺伝子(GNE、NANS、NANP、CMAS、ST6GAL1、及びSLC35A1の各遺伝子)は、各遺伝子のORFを以下のプライマーペアを用いたPCRにより増幅し、各シアル酸関連遺伝子断片を得た。GNE遺伝子用プライマーペアにはr2epiU(配列番号81)及びr2epiL(配列番号82)を、NANS遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_NANS_U(配列番号83)及びBsmBI_NANS_L(配列番号84)を、NANP遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_NANP_U(配列番号85)及びBsmBI_NANP_L(配列番号86)を、CMAS遺伝子用プライマーペアにはhCSSU(配列番号87)及びhCSSL(配列番号88)を、SLC35A1遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_hCST_U(配列番号89)及びBsmBI_hCST_L(配列番号90)を、そしてST6GAL1遺伝子用プライマーペアにはhSTU(配列番号91)及びhSTL(配列番号92)を用いた。各シアル酸関連遺伝子断片をBsmBIで切断した後、前述のUASユニットベクターSerUAS_unit/pZErO2のBsmBIサイトへ挿入した。完成した各シアル酸関連遺伝子を含むUASユニットベクターをUAS-GNE/pZErO2(GNE発現用)、UAS-NANS/pZErO2(NANS発現用)、UAS-NANP/pZErO2(NANP発現用)、UAS-CMAS/pZErO2(CMAS発現用)、UAS-ST6GAL1/pZErO2(ST6GAL1発現用)、及びUAS-SLC35A1/pZErO2(SLC35A1発現用)とした。
配列番号93で示す塩基配列からなるHS4インスレーター配列をGenscript社で委託合成し、NheI及びSpeIで切り出し、元のHS4インスレーターが入っているベクターのSpeIサイトへ挿入した。これを繰り返し、HS4インスレーターが4回繰り返しになったプラスミドを構築した。これをHS4x4/pUCとした。
pBac[SerUAS/3xP3EGFP](Tatematsu K, et al., 2010, Transgenic Res. 19(3):473-87)のEcoRV-PstIサイトにSpeIadaptU(配列番号94)及びSpeIadaptL(配列番号95)をアニーリングして作製したアダプターを挿入した。これをpBac[3xP3EGFP]とした。pBac[3xP3EGFP]のEcoRIサイトにpBac[SerUAS_Ser1intron_hr5/3xP3-AmCyan_A3-Bla] (Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150)のEcoRI断片を挿入した。これをpBac[3xP3AmCyan]とした。
各シアル酸関連遺伝子を含む前述のUASユニットベクターUAS-GNE/pZErO2(GNE発現用)、UAS-NANS/pZErO2(NANS発現用)、UAS-NANP/pZErO2(NANP発現用)、UAS-CMAS/pZErO2(CMAS発現用)、UAS-ST6GAL1/pZErO2(ST6GAL1発現用)、及びUAS-SLC35A1/pZErO2(SLC35A1発現用)と、HS4インスレーターユニットベクターHS4x4/pUCをそれぞれNheI及びSpeIで切断した。続いて、UAS-GNE/pZErO2、UAS-CMAS/pZErO2及びUAS-ST6GAL1/pZErO2の3種のNheI-SpeI断片とHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片をpiggyBac/3xP3AmCyanのSpeIサイトへ、各UASシアル酸ユニットとHS4インスレーターが交互に連結された状態となるように挿入した。これをpBac[HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした(以下、pBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]と略記する)。次に、このpBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]に、UAS-NANS/pZErO2及びUAS-NANP/pZErO2で示す2種のNheI-SpeI断片がHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片に挟み込まれた状態となるように再度挿入した。これをpBac[HS4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-GNE-HS4- UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした(以下、pBac[UAS-NANS/NANP/ GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]と略記する)。また、pBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]に、UAS-NANS/pZErO2、UAS-NANP/pZErO2及びUAS-SLC35A1/pZErO2で示す3種のNheI-SpeI断片がHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片に挟み込まれた状態となるように挿入した。これをpBac[HS4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-SLC35A1-HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした(以下、pBac[UAS-NANS/NANP/SLC35A1/GNE/CAMS/ST6GAL1/ 3xP3AmCyan]と略記する)。上記の結果、UASシアル酸ユニットを3種(GNE/CAMS/ST6GAL1)、5種(NANS/NANP/GNE/CAMS/ST6GAL1)、そして6種(NANS/NANP/ SLC35A1/GNE/CAMS/ST6GAL1)含むシアル酸関連遺伝子発現ベクターが得えられた。
(ヒトアンチトロンビンIII発現ベクターの構築)
ヒトアンチトロンビンIII(hATIII)遺伝子のORFを含むベクターFlexi ORFクローンFHC11758(プロメガ)を鋳型としてプライマーペアBsmBI_AT_FibHsig_U40(配列番号96)及びHisタグを含むAT_C-6His_L45(配列番号97)でPCRを行い、得られた増幅産物のBsmBI断片を(1)で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]のBsmBIサイトへ挿入した。これをUAS-rATIII/pZErO2とした。
ヒトインターフェロンγ(hIFNγ)遺伝子のORFを含むFlexi ORFクローンORH24802(プロメガ社)を鋳型としてプライマーペアhIFNg_FibHsig_U40(配列番号98)及びHisタグを含むhIFNg_C-6His_L45(配列番号99)でPCRを行い、得られた増幅産物のBsmBI断片を(1)で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]のBsmBIサイトへ挿入した。これをUAS-hIFNg/pZErO2とした。
(目的)
実施例1で構築した各発現ベクターを用いて各種遺伝子組換えカイコを作出した。
(1)カイコ系統
国立研究開発法人農業生物資源研究所で維持されている白眼・白卵・非休眠系統のw1-pnd系統を宿主系統として用いた。
25〜27℃の飼育室で、幼虫の全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した(Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol, 75:89-97)。
遺伝子組換えカイコは、Tamuraらの方法(Tamura T. et al., 2000, , Nature Biotechnology, 18, 81-84)に従って作出した。実施例1で構築した第1サブユニット及び第2サブユニットをそれぞれ別個にトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドpHA3PIG(Tamura T. et al., 2000, , Nature Biotechnology, 18, 81-84)と1:1 の割合で混合し、産卵後2〜8時間のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫を上記の方法で飼育した。
第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統の作出は、前記インジェクションにおいてMSG発現用第1サブユニットpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3 DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で第1サブユニットを含むF1個体を選抜し、本発明の遺伝子組換えカイコの第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統をそれぞれ得た。
第2サブユニットを含むGalT糖鎖付加カイコ作出系統は、前記インジェクションにおいて、GalT2p発現ベクター、及び各改良型GalT発現ベクター(pBac[SerUAS-GalT1/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT2i/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT3/A3-KMO_A3-Bla]、及びpBac[SerUAS-GalT4/A3-KMO_A3-Bla])のそれぞれを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、A3-KMOマーカーによる1齢幼虫の体表の着色で各改良型GalT発現ベクターを含むF1個体を選抜し、GalT糖鎖付加カイコ作出系統をそれぞれ得た。
第2サブユニットを含むシアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統は、前記インジェクションにおいて、上述の各シアル酸関連遺伝子発現ベクターを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3-AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で各発現ベクターを含むF1個体を選抜し、シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統をそれぞれ得た。
第2サブユニットを含む目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統は、前記インジェクションにおいて、上述のアンチトロンビンIII発現ベクター又はインターフェロンγ発現ベクターを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3-EYFPマーカーによる眼の蛍光の有無で各発現ベクターを含むF1個体を選抜し、ATIII発現用遺伝子組換えカイコ系統及びINFγ発現用遺伝子組換えカイコ系統をそれぞれ得た。その後、F1個体の兄妹交配を行い、ホモ接合体を得た。
第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統と第2サブユニットをそれぞれ含む系統(GalT糖鎖付加カイコ作出系統、各シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統、及び目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統)を交配した。
(目的)
実施例2で作出したATIII糖鎖付加カイコ、IFNγ糖鎖付加カイコ、及び対照用のATIII、IFNγ非発現カイコのMSG内腔から組換えタンパク質を含む内腔タンパク質を抽出する。
実施例2で作出した各糖鎖付加カイコを実施例2と同様の方法で飼育し、5齢6日目の幼虫を吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットでMSGを傷つけないように摘出した(森靖編,カイコによる新生物学実験,三省堂, 1970,pp.249-255参照)。続いて、摘出したMSGをエタノールで固定し、ピンセットで内腔タンパク質と細胞に分離した。ATIII糖鎖付加カイコ及びIFNγ糖鎖付加カイコのそれぞれから得られた内腔タンパク質をLiBrで溶解し、MSG抽出液として調製した。又は、摘出したMSGを1本当たり1mLの100 mMリン酸バッファー(pH 7.2)に入れて、4℃で2時間振とうすることにより水溶性タンパク質を抽出した後、2000×gで10分間遠心した後の上清を回収した。
(目的)
実施例3で得た目的の組換えタンパク質を分離・精製し、糖鎖構造分析のための調製を行う。
(方法)
(1)タンパク質濃度の測定
MSG抽出液中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により測定した。標準タンパク質にはBSAを用いた。Bradford試薬(ナカライテスク)を用いて作成した希釈系列(BSA濃度:0〜1.0 mg/Ml)についてOD595の吸光度を測定し、検量線を作成した。各MSG抽出液についても同様にOD595を測定し、検量線との比較によりタンパク質濃度を決定した。
(ヒトアンチトロンビンIII精製)
Niレジン(profanity IMAC Ni-charged resin)500μLをカラムに詰め、平衡化液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl)で平衡化した。500μLのMSG抽出液を積載し、1.5mLの洗浄液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/10mM イミダゾール)で洗浄した。続いて、300μLの溶出液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/200mM イミダゾール)で目的のタンパク質を溶出し、溶出液をAmicon Ultra-0.5mL (30K)を用いて、50mMリン酸ナトリウムバッファーにより濃縮し、タンパク質濃度を測定した。その後1μgに4×sample buffer(glycerol 4.0mL/1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL)を加え、100℃で3分間変性処理し、SDS-PAGEで分離した。
Niレジン(profanity IMAC Ni-charged resin)50μLをカラムに詰め、平衡化液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl)で平衡化した。続いて、MSG抽出液500μLを積載し、1.5mLの洗浄液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/20mM イミダゾール)で洗浄した。続いて、300μLの溶出液(50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/200mM イミダゾール)で目的タンパク質を溶出し、溶出液をAmicon Ultra-0.5mL (10K)を用い、50mMリン酸ナトリウムバッファーにより濃縮し、タンパク質濃度を測定した。その後1μgに4×sample buffer(glycerol 4.0mL/1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL)を加え、100℃で3分間変性処理し、SDS-PAGEで分離した。
(ヒトアンチトロンビンIIIサンプル調製)
Niカラムの各溶出液10μLに4×sample buffer(glycerol 4.0mL/ 1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/ 10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL)3.3μLを加え、100℃で3分間変性処理をした。遠心後、上清を回収し、MSG抽出液1.1μL、回収上清10μLをSDS-PAGEで分離した。泳動後のゲルをCBB染色してhATIII精製の確認を行った。
結果を図3に示す。精製画分にhATIIIのバンドをすることができた。
Niカラムの各溶出液をアセトンで1.2 mLにメスアップし、-20℃で3日間静置させた。その後、上清を除去し、遠心乾燥した。1×sample buffer 20μLを加えて沈殿を溶解し、100℃で3分間変性処理をした。遠心後、上清を回収し、MSG抽出液11.25μL、回収上清10μLをSDS-PAGEで分離した。泳動後のゲルをCBB染色してhIFNγ精製の確認を行った。
(ヒトインターフェロンγのゲル内消化)
SDS-PAGEで分離したタンパク質(hIFNγ)のバンド(図4の*及び**で示す糖鎖が付加した2本のバンド)を切り抜き、50mM NH4HCO3/50%MeCN(アセトニトリル)で15分×2回ボルテクッスにかけて脱染色を行った。その後、100% MeCNで5分間ボルテックスにかけ、再度50mM NH4HCO3/50%MeCNで一晩ボルテックスにかけた。翌朝、100% MeCNで15分×2回ボルテックスを行い、遠心乾燥でMeCNを除去した。
SDS-PAGEで分離した目的タンパク質(hATIII)のバンドを切り抜き、50mM NH4HCO3/50%MeCN(アセトニトリル)で15分×2回ボルテクッスにかけて脱染色を行った。その後、100% MeCNで5分間ボルテックスにかけ、再度50mM NH4HCO3/50%MeCNで一晩ボルテックスにかけた。翌朝、100% MeCNで15分×2回ボルテックスを行い、遠心乾燥でMeCNを除去した。
(目的)
実施例4で得られた消化ペプチドに付加した糖鎖構造をnanoLC-MS/MSを用いて分析する。
実施例4で得られた酵素処理液6μL又は8μLを以下の解析条件でnanoLC-MS/MSに供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。
・使用機器:Agilent Technologies 1200 series
・溶離液A:0.1% HCOOH/milliQ
・溶離液B:0.1% HCOOH/MeCN
・カラム:ZORBAX300SB-C18(Agilent Technologies) 150 mm x 100μm 粒子3.5μm
・流速:0.6μL/min
・時間連続濃度勾配(分)0→5→65→66→71→72→90
B(%)2→8→50→95→95→2→2
・使用機器:micrOTOF-Q Bruker
・Mass range: 50 - 4,500 m/z
・イオン化方法:ESI
・スキャン速度:5KHz
・解析ソフトウェア:Hystar
nanoLC-MS/MSの結果から糖鎖付加ペプチドを同定し、そのペプチドに付加した糖鎖構造を推定した。
(1)ヒトアンチトロンビンIIIの糖鎖構造解析
ヒトアンチトロンビンIIIには、糖鎖付加される4か所のアスパラギン残基(N128、N167、N87、及びN224:開始メチオニンをM1とする。以下、同様。)が知られている(Zhou Z. & Smith D.L., 1990, siomedical and environmental mass spectrometry, 19: 782-786)。
GalTの各アイソザイム遺伝子を導入した組換えカイコの絹糸腺より調製したタンパク質の糖鎖構造を解析した。その糖鎖構造のプロファイルを表2に示す。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合(%)である。
シアル酸関連遺伝子の導入数とシアル酸付加の有無を検証するため、GalT遺伝子組換えカイコ、及び各種シアル酸関連遺伝子組換えカイコ(3種、5種、及び6種)を交配して得た各糖鎖付加カイコの絹糸腺より調製したタンパク質の糖鎖構造を解析した。その糖鎖構造のプロファイルを表3に示す。GalT遺伝子には、ガラクトースの付加効率が高かったGalT2iを使用した。結果を表3に示す。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合(%)である。表中、例えばMan5は、糖鎖末端に5個のマンノースを含む構造を、Man3Fは3個のマンノースとフコース修飾を1個含む構造を示す。
GalT遺伝子組換えカイコ(GalT1、GalT2p、又はGalT2i)、シアル酸関連遺伝子組換えカイコ(5種又は6種)、及びhATIII遺伝子組換えカイコを交配して得た糖鎖付加カイコが生産する組換えhATIIIタンパク質のN187及びN224の2か所の糖鎖付加部位における糖鎖構造の関係を表4に示す。表中、Man0-4は、糖鎖末端に0〜4個のマンノースを含む構造を、Man2-3Fは2〜3個のマンノースとフコース修飾を1個含む構造を示す。また、非還元末端にGlcNAcをもつ糖鎖をまとめてGlcNAc構造として、非還元末端にGalをもつ糖鎖をまとめてGal構造として、そして非還元末端にSiaをもつ糖鎖をまとめてSia構造として示す。a及びbはカイコ系統(line)を示している。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合(%)である。表中、ATIII/GalT/シアル酸関連遺伝子の表記に関して、(+/-/-)はhATIII遺伝子組換えカイコを、また(+/-/5種)はGalT遺伝子組換えカイコを交配せず、hATIII遺伝子組換えカイコと5種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。同様に、(+/GalT2p/-)はシアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配せず、hATIII遺伝子組換えカイコとGalT2p遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを、また(+/GalT2p/5種)は、hATIII遺伝子組換えカイコ、GalT2p遺伝子組換えカイコ及び5種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。他の表記についても同様とする。
ヒトインターフェロンγ(hIFNγ)は、図4において*で示す中央のバンドを第1分子種、**で示す最も移動度の遅いバンドを第2分子種とした。
Claims (20)
- 昆虫又は昆虫細胞を宿主として使用する哺乳動物型糖鎖付加剤であって、
絹糸虫由来の中部及び/又は後部絹糸腺プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に連結された
ガラクトース転移酵素、
シアル酸転移酵素、
UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、及び
Neu5Ac9-リン酸合成酵素及び/又はNeu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素
をコードする遺伝子、又は
該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
を含む独立した1〜3つの発現ベクターからなり、
前記酵素をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドは、前記中部及び/又は後部絹糸腺プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている前記哺乳動物型糖鎖付加剤。 - 前記ガラクトース転移酵素がGalT2である、請求項1に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 前記中部絹糸腺プロモーターがセリシン1遺伝子、セリシン2遺伝子、又はセリシン3遺伝子のプロモーターである、請求項1又は2に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 前記後部絹糸腺プロモーターがフィブロインH鎖遺伝子、フィブロインL鎖遺伝子、又はp25遺伝子のプロモーターである、請求項1又は2に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 前記発現ベクターが
CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター、CMP-Neu5Ac合成酵素、又はその両方をコードする遺伝子、又は
該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。 - 絹糸虫由来の中部及び/又は後部絹糸腺プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に連結された
ガラクトース転移酵素、
シアル酸転移酵素、
UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、
Neu5Ac9-リン酸合成酵素、
Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素、
CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター、及び
CMP-Neu5Ac合成酵素
をコードする遺伝子、又は
該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
を含む独立した1〜3つの発現ベクターからなり、
前記酵素をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドは、前記中部及び/又は後部絹糸腺プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている哺乳動物型糖鎖付加剤。 - 前記発現ベクターが
ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子、又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドを含む第1発現ベクター、及び
UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、シアル酸転移酵素、及びNeu5Ac9-リン酸合成酵素及び/又はNeu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素の遺伝子、又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドを含む第2発現ベクター
からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。 - CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター、CMP-Neu5Ac合成酵素、又はその両方をコードする遺伝子、又は
該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
が第2発現ベクターに含まれる、請求項7に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。 - 前記酵素をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドが前記中部及び/又は後部絹糸腺プロモーターの下流に機能的に連結している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 前記発現ベクターが
(i)前記中部及び/又は後部絹糸腺プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第1サブユニットと、
(ii)前記転写調節因子の標的プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結されたガラクトース転移酵素、UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、シアル酸転移酵素、Neu5Ac9-リン酸合成酵素、Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素、CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター、及びCMP-Neu5Ac合成酵素からなる群から選択される一以上の酵素をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドを含む一以上の第2サブユニット
から構成される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。 - 前記転写調節因子が酵母由来のGAL4タンパク質であり、その標的プロモーターがUAS(Upstream Activating Sequence)である、請求項10に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 前記絹糸虫がカイコである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 哺乳動物型がヒト型である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
- 請求項10又は11に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
- 前記第1サブユニットと前記第2サブユニットとが異なる染色体上に存在する、請求項15に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
- 前記絹糸虫がカイコである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
- 哺乳動物型がヒト型である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
- 請求項10又は11に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第2サブユニットのみを含む、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統。
- 哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を作製する方法であって、
請求項19に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統、及びそれと同種の請求項10又は11に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第1サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫作出系統を交配する交配工程、及び
交配第1世代(F1)から第1サブユニット及び第2サブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫として選抜する選抜工程
を含む前記方法。
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