WO2017135452A1 - 哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ - Google Patents

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silkworm
mammalian
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promoter
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和仁 藤山
亮 三▲崎▼
謙一郎 立松
秀樹 瀬筒
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国立大学法人大阪大学
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C12Y204/99003—Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase (2.4.99.3)

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified silkworm that can add a mammalian sugar chain to a target recombinant protein, in particular a genetically modified silkworm, and an expression vector for producing the genetically modified organism.
  • Non-patent Document 1 Recombinant protein production using genetic recombination technology is extremely important in the development of new materials and high value-added materials, and in the production industry such as pharmaceuticals and cosmetics. For example, the share of medical proteins in the top 10 global pharmaceutical sales in 2010 reached 45.9% (Non-patent Document 1) and is expected to continue growing in the future.
  • microorganisms such as Escherichia coli and yeast, and cultured cells such as insect cells and animal cells have been used as hosts.
  • the host is selected according to the structure and use of the protein to be produced.
  • protein production systems using microorganisms can be produced at low cost and high efficiency, but are not suitable for mass production and production of recombinant proteins with complex structures.
  • a protein production system using cultured cells such as mammalian cultured cells can produce a recombinant protein having a complex structure. Therefore, it has been mainly used in the production of biopharmaceuticals.
  • a protein production system using cultured cells cannot avoid high-cost production due to huge capital investment and expensive culture solution.
  • the continuous use of biopharmaceuticals has a great economic burden on patients, and therefore, there has been a demand for the development of a protein production system capable of producing a recombinant protein having a complex structure at a low cost.
  • Silkworm (Bombyx mori) has attracted attention as a new protein production host that can solve the above problems.
  • Silkworms belonging to the order Lepidoptera have long been industrially useful insects responsible for silk production, but with the advance of genetic recombination technology, expectations for useful protein production systems have increased in recent years.
  • Silk glands, which silkworms produce and secrete silk during the larval stage are known to be able to synthesize large amounts of protein in a short period of time. Therefore, by utilizing the protein synthesis ability of the silk gland, it becomes possible to produce a large amount of the target protein in the silk gland.
  • a silkworm When a silkworm is used as a protein production system, a genetic recombination technique for introducing a foreign gene encoding the target protein into a silkworm cell to produce a transformant, that is, a transgenic silkworm (transgenic silkworm) is essential. It becomes. Fortunately, silkworms have established a technique for stably maintaining foreign genes in the genome using transposon piggyBac (Non-patent Document 2).
  • the protein production system using silkworms is that the amount of protein production can be easily controlled by the number of silkworms bred, that even tens of thousands of animals can be kept in a space-saving manner, and the period from hatching to the late stage of 5th instar larvae or pupae is 1
  • a protein production system using other hosts in terms of a relatively short period of time, a relatively short period of time, that can be reared throughout the year by artificial hatching technology and artificial feed, and that the produced protein can be easily recovered from straw. Compared with.
  • proteins produced in silkworms are different from mammals including humans in the structure of added sugar chains.
  • the protein produced in silkworm cocoons, midgut, fat pad, etc. is mainly a high mannose end with mannose added to the non-reducing end. It has a structure (B).
  • the silk gland protein produced in silkworm silk gland has a GlcNAc terminal structure in which N-acetylglucosamine (often referred to as “GlcNAc” in this specification) is added to the terminal mannose at the non-reducing end.
  • Has (C) sugar chains mainly found in mammals have a non-reducing end sialic acid terminal structure in which galactose and sialic acid are added to the above GlcNAc (A).
  • Protein sugar chains are added as one of post-translational modifications and are present in more than 50% of proteins in vivo.
  • Sugar chains play an important role in imparting various functions to proteins such as protein stabilization, protection, physiological activity, antigen-antibody reaction, viral infection and pharmacokinetics.
  • the difference in the sugar chain structure between silkworms and mammals is concerned about the possibility of exhibiting immunogenicity, and may cause allergic reactions. Therefore, when producing a pharmaceutical protein using a silkworm as a host, a difference in sugar chain structure involves a risk of affecting the activity and stability of the pharmaceutical protein. Therefore, there has been a demand for a technique for modifying a sugar chain of a recombinant protein produced by a transgenic silkworm into a mammalian sugar chain.
  • Non-patent Document 3 In research using insect cultured cells, it has been reported that cultured cells that have been capable of mammalian glycosylation by adding a sialic acid to the non-reducing end of a recombinant protein by introducing a human glycosylation pathway.
  • Non-Patent Document 4 a hexosaminidase inhibitor that degrades N-acetylhexosamine in the glycoprotein sugar chain was added to the medium, and as a result, sialic acid was added to the non-reducing end of the sugar chain of the recombinant protein produced by baculovirus.
  • Patent Document 1 discloses that a galactose transferase gene was introduced into a silkworm and galactose could be added to the non-reducing end of an N-type sugar chain at the individual level.
  • a genetically modified silkworm that has a function of adding sialic acid to the non-reducing end of the galactose is not known.
  • Non-Patent Document 5 succeeded in modifying sugar chains by expressing human-derived N-acetylglucosaminyltransferase ⁇ 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 in silkworms. However, no mammalian-type sialic acid is added to the non-reducing end.
  • sialic acid was successfully added to the non-reducing end of the recombinant protein by a combination of transgenic silkworm and baculovirus expression system, and oral or transdermal administration of sialic acid.
  • a simpler method that is, a technique for introducing a sialic acid addition function with a transgenic silkworm alone has been desired.
  • human sugar chains to which sialic acid has been added are harmful to silkworm individuals, and normal gene expression systems have a problem of inhibiting silkworm development.
  • the present inventors have developed an expression vector that can induce the expression of glycosylation-related genes derived from mammals such as humans only in silkworm silk glands.
  • Genetically modified silkworms that have introduced it efficiently add galactose and sialic acid to the N-type sugar chain ends of the target recombinant protein produced in the silk gland without being adversely affected by development. I was able to.
  • galactose transferase and three or more genes selected from the enzyme gene group related to the sialic acid synthesis system to add the mammalian sugar chain, and the sialic acid transporter gene can be used in silkworms.
  • the present invention is based on the above results and findings, and specifically provides the following inventions (1) to (20).
  • a silkworm-derived middle and / or posterior silk gland promoter (MSG or PSG promoter) and a gene operably linked to the downstream of the promoter (a) a gene encoding galactose transferase (GalT) or the enzyme Nucleotides encoding active fragments, and (b) UDP-GlcNAc2 epimerase / ManNAc kinase (GNE), Neu5Ac9-phosphate synthase (NANS), Neu5Ac9-phosphate phosphatase (NANP), CMP-Neu5Ac synthase ( CAMS), and independent 1 to 3 expression vectors comprising nucleotides encoding genes encoding three or more proteins selected from the group consisting of sialyltransferase (ST6GAL1) or active fragments of the proteins,
  • the gene encoding the protein or the nucleotide encoding the active fragment of the protein is directly or directly by the MSG or PSG promoter.
  • the expression vector further comprises (c) a nucleotide encoding a gene encoding the CMP-Neu5Ac sialic acid transporter (SLC35A1) or an active fragment of the enzyme.
  • SLC35A1 CMP-Neu5Ac sialic acid transporter
  • the expression vector comprises a first expression vector comprising the gene or nucleotide described in (a) above, and a second expression vector comprising the gene or nucleotide described in (b) above (1) to (6 )
  • the mammalian type glycosylation agent according to any one of 1).
  • the expression vector comprises (i) a first subunit comprising a gene encoding the MSG or PSG promoter and a transcriptional regulatory factor operably linked downstream of the promoter; and (ii) the transcriptional regulatory factor (1) to (8) comprising the target promoter of (1) and one or more second subunits comprising the gene or nucleotide described in (a) to (c) operably linked downstream of the promoter.
  • the mammalian type glycosylation agent according to any one of 1).
  • the said method including the selection process which selects the genetically modified silkworm containing a unit and a 2nd subunit as a mammalian type glycosylation genetically modified silkworm.
  • the silkworm when introduced into a silkworm, preferably a silkworm, the silkworm can be easily modified into a mammalian glycosylation gene recombinant silkworm.
  • a mammalian N-type sugar chain is added to the target recombinant protein or peptide produced in the silk gland of the transgenic silkworm. be able to.
  • the mammalian glycosylation agent is constituted by administering the mammalian glycosylation agent of the present invention to the host silkworm.
  • An expression vector can be introduced into a silkworm to obtain the desired mammalian glycosylated silkworm.
  • N-type sugar chains of mammals and silkworm silk gland proteins A is an N-type sugar chain structure of a mammal, B is a protein present in silkworm cocoons, midgut, fat pad, etc., and C is a protein present in a silk gland.
  • A is an N-type sugar chain structure of a mammal
  • B is a protein present in silkworm cocoons, midgut, fat pad, etc.
  • C is a protein present in a silk gland.
  • a route indicated by a broken line is a conceptual diagram of a reaction route generated in the present invention.
  • the result of SDS-PAGE of purified ATIII is shown.
  • Lane 1 shows the middle silk gland (MSG) extract
  • lanes 2-7 show the eluate of Ni column purification.
  • the arrow indicates the position of ATIII.
  • the inside of the frame is a region cut out for in-gel digestion.
  • the result of SDS-PAGE of purified IFN ⁇ is shown.
  • Lane 1 shows the MSG extract
  • Lane 2 shows the flow-through fraction for Ni column purification
  • Lanes 3 and 4 show the washing solution
  • Lanes 5 and 6 show the eluate. Arrows indicate the three detected bands.
  • * And ** are bands cut out for in-gel digestion.
  • the 1st aspect of this invention is a mammal type
  • the glycosylation agent of the present invention is composed of 1 to 3 independent expression vectors.
  • mammal-type glycosylation agent refers to a drug applied to silkworms having the structure described below.
  • the “mammalian sugar chain” is an N-type sugar chain that is added to an asparagine residue of a protein.
  • galactose is added to the non-reducing end of GlcNAc
  • It is a sugar chain having a sialic acid non-reducing terminal sugar chain structure in which sialic acid is added to galactose.
  • Si n Gal n GlcNAc n Man m -Asn Sia is sialic acid, especially N acetylneuraminic acid
  • Gal is galactose
  • Man mannose
  • m is independently an integer greater than 1
  • n is Independently represents an integer of 1 or more).
  • “mammal” is not particularly limited, but preferably includes human, chimpanzee, rat, mouse, dog, cat, cow, pig, horse, goat, sheep and the like. Preferably it is a human. That is, “human-type sugar chain” is preferable.
  • “Silk” refers to animal fibers that are biosynthesized mainly within the silk glands of silkworms.
  • the term “silk-spinning worm” refers to a general term for insects having a silk gland and capable of spitting a silk thread. Specifically, it refers to a species that can be spun for nesting, nesting, or moving mainly in the larval stage in Lepidopterous insects, Bee-flying insects, Aphididae insects, Trichomycetes insects, and the like.
  • Lepidoptera insect belongs to the taxonomic Lepidoptera (Lepidoptera) and corresponds to various butterflies or moths.
  • Bee insects belong to taxonomic bees (Hymenoptera), and are various bees or ants.
  • the Aphididae is an insect belonging to the Aphididae (Neuroptera) and includes, for example, snake dragonflies, horned dragonflies, and dipterans.
  • the genus Coleoptera is an insect belonging to the order Cleoptera (Trichoptera) and corresponds to various species.
  • the silkworm in the present invention is preferably a lepidopterous insect having a large silk gland and capable of spitting a large amount of silk thread.
  • the most preferred silkworm is a silkworm.
  • the “silk gland” is a tubular organ in which the salivary glands of silkworms have changed, and has the function of producing, accumulating and secreting liquid silk.
  • Silk glands exist mainly in a pair of left and right along the digestive tract of silkworm larvae, and each silk gland is composed of three regions, an anterior, middle and posterior silk glands.
  • a water-soluble gelatin-like protein, sericin which is a coating component of silk Is synthesized and secreted into the lumen of the middle silk gland.
  • PSG posterior silk gland
  • three major protein fibroin heavy chains (often referred to herein as “PSG”) Fib H ”), fibroin L chain (herein often referred to as“ Fib L ”), and p25 / FHX (hereinafter referred to as“ p25 ”) have been synthesized.
  • the SFEU complex migrates to the middle silk gland lumen, is coated with sericin, and spun out from the anterior silk gland as silk. Therefore, when using silkworm as a protein expression system, a gene expression system that specifically expresses in the middle or posterior silk gland may be used.
  • the term “expression vector” refers to an expression unit that contains a recombinant gene encoding a recombinant protein or a nucleotide encoding an active fragment thereof in an expressible state and can control the expression of the recombinant gene and the like.
  • the expression vector of the present invention can utilize various expression units that can replicate in the host cell. For example, an autonomously replicable plasmid vector, a Bacmid vector, a viral vector and the like can be mentioned. In the present specification, a plasmid vector is mainly used.
  • glycosylation agent expression vector The expression vector constituting the mammalian glycosylation agent of the present invention (hereinafter often referred to as “glycosylation agent expression vector”) is composed of two or more independent subunits. Also good. In this case, the whole subunit is regarded as one expression vector. The configuration of each subunit will be described later.
  • the “target recombinant protein” refers to a protein encoded by a target recombinant gene and to be produced in a silk gland in a protein production system using silkworms. In this specification, it is a recombinant protein to which a mammalian sugar chain is added in a mammalian sugar chain-added gene recombinant silkworm.
  • the target recombinant protein may be derived from one gene or a gene fragment thereof, or may be derived from a chimeric gene obtained by linking a part of a plurality of genes.
  • the amino acid length of the target recombinant protein is not particularly limited. The number of amino acid residues may be 8 to 10,000.
  • a peptide hormone consisting of only 9 amino acids such as oxytocin is also included.
  • the kind of target recombinant protein in this specification is not specifically limited, Protein with a high added value is suitable.
  • peptide hormones such as insulin, calcitonin, paratormon and growth hormone, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), interleukin (IL), interferon (IFN), tumor necrosis factor ⁇ (TNF- and cytokines such as ⁇ ) and transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ), immunoglobulins, antithrombin III, serum albumin, hemoglobin, various enzymes, or collagen, or fragments thereof (including chimeric peptides).
  • the “target recombinant gene” means a gene exogenous in principle that encodes the target recombinant protein.
  • the target recombinant gene is operably linked to the middle and / or posterior silk gland promoter in an expression vector.
  • This expression vector may be a glycosylated agent expression vector.
  • the mammalian glycosylation agent of the present invention is composed of a glycosylation agent expression vector.
  • Glycosylation agent expression vectors consist of (1) a silkworm-derived middle and / or posterior silk gland promoter, (2) a nucleotide encoding a glycosylation-related gene or an active fragment thereof (referred to herein as “ "Glycosylation-related genes etc.") is included as an essential component.
  • the glycosylation agent expression vector is composed of two subunits, a first subunit and a second subunit described later, (3) a gene encoding a transcriptional regulatory factor and (4) the transcription
  • the target promoter of the regulator is included as an essential component.
  • the glycosylation agent expression vector can include other components that can contribute to the expression of the glycosylation-related gene and the like.
  • the other components include (5) terminator, (6) marker gene, (7) enhancer, (8) insulator, and (9) inverted terminal repeat of transposon.
  • each component will be specifically described.
  • Middle or posterior silk gland promoter is an essential component of the glycosylation agent expression vector, and the middle or posterior silk thread of the silkworm A site-specific promoter that controls the expression of a gene that is specifically expressed in the gland.
  • genes that are specifically expressed in the middle silk gland (MSG) of silkworms include, for example, the sericin 1 (often referred to herein as “Ser1”) gene, sericin 2 (often referred to as “Ser2” herein). And a sericin 3 (often referred to as “Ser3” in this specification) gene. Therefore, promoters that control the expression of Ser1 to Ser3 genes (referred to herein as Ser1 promoter, Ser2 promoter, and Ser3 promoter, respectively) are suitable as silkworm-derived MSG promoters of glycosylation agent expression vectors.
  • these promoters include the Ser1 promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the Ser2 promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the Ser3 promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 derived from silkworm. It is done.
  • Fib H promoter examples include the Fib H gene, the Fib L gene, and the p25 gene. Therefore, promoters that control the expression of these genes (referred to herein as Fib H promoter, Fib L promoter, and p25 promoter, respectively) are suitable as silkworm-derived PSG promoters for glycosylation agent expression vectors.
  • Specific examples of these promoters include the Fib H promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, the Fib L promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the p25 promoter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Fib H promoter consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 derived from sakusan
  • Fib L promoter consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • the base sequence of the MSG or PSG promoter is evolutionarily very conserved among silkworms.
  • the PSG promoter has a high probability of being able to operate in PSG of different silkworm species (Sezutsu H., et al., 2009, Journal of Insect Biotechnology and Sericology, ology78: 1-10). Therefore, the biological species derived from the MSG or PSG promoter and the biological species of the silkworm into which the glycosylated agent expression vector is introduced are not necessarily the same species.
  • a species belonging to the same eye more preferably a species belonging to the same family, further preferably a species belonging to the same genus, most preferably a promoter derived from the same species.
  • the glycosylation agent expression vector may contain either MSG or PSG promoter. As will be described later, when the glycosylated agent expression vector is composed of two independent expression vectors, each expression vector can also contain different silk gland promoters. In addition, the expression of a plurality of glycosylation-related genes described later contained in one expression vector may be controlled by different silk gland promoters. Usually, it only needs to contain either the MSG or PSG promoter. The MSG promoter is preferable.
  • the MSG or PSG promoter is configured so that a glycosylation-related gene or the like described later or a gene encoding a transcriptional regulatory factor can be placed within the control region in the downstream region (3 ′ end side). Has been.
  • Glycosylation-related genes etc.
  • Nucleotide glycosylation-related genes or nucleotides (glycosylation-related genes, etc.) encoding active fragments of the proteins encoded by these genes are expressed together with the aforementioned MSG or PSG promoter It is a central component in the vector.
  • the “glycosylation-related gene” refers to a gene encoding a galactosyltransferase related to mammalian glycosylation and six sialic acid-related proteins.
  • “Nucleotide encoding an active fragment of a protein encoded by the gene” is a partial peptide of a protein encoded by a glycosylation-related gene and encodes an amino acid sequence of a peptide having a physiological activity equal to or higher than that protein. Refers to a nucleotide.
  • a nucleotide encoding a functional domain of a protein is applicable.
  • the amino acid length of the partial peptide is not particularly limited as long as it has activity. It may be 40 amino acids or more, 50 amino acids or more, 60 amino acids or more, 70 amino acids or more, and less than the full length.
  • each glycosylation-related gene will be specifically described.
  • GalT Galactose transferase “Galactose transferase ( ⁇ 1,4-galactosyltransferase: often referred to as“ GalT ”in this specification)” is used to transfer galactose from the donor substrate UDP galactose (UDP-Gal) to the glycoprotein GlcNAc ⁇ 1-2Man. It is an enzyme that catalyzes a transfer reaction.
  • the mammalian glycosylation agent of the present invention has a function of adding galactose to the GlcNAc non-reducing end of the N-type sugar chain in a silkworm gland-derived protein. GalT is known to have multiple isozymes. For example, seven types of isozymes have been identified in mice.
  • GalT1 there are 4 types of GalT1, GalT2, GalT3, and GalT4 that are involved in glycoproteins, but 3 types of GalT1, GalT2, and GalT3 have activity as mammalian type glycosylation agents of the present invention.
  • GalT2 is particularly preferred. Therefore, when expressed as GalT in this specification, it means any of GalT1, GalT2, and GalT3 unless otherwise specified.
  • the GalT gene is an essential component in the glycosylation agent expression vector.
  • the species of the GalT gene derived in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited.
  • a GalT gene derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fishes, amphibians, reptiles, birds and vertebrates such as mammals can be used.
  • it is a GalT gene derived from mammals such as human, rat and mouse.
  • the human GalT1 gene encoding the human GalT1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 for example, the human GalT1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • the rat GalT1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 Gene for example, rat GalT1 gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • mouse GalT1 gene comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 for example, mouse GalT1 gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14
  • SEQ ID NO: 15 A human GalT2 gene encoding the human GalT2 consisting of the amino acid sequence shown in (for example, a human GalT2 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16), a rat GalT2 gene consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 (eg, in SEQ ID NO: 18)
  • sialic acid-related proteins Six types of sialic acid-related proteins The six types of sialic acid-related proteins are a series of proteins necessary for adding sialic acid to the non-reducing galactose end of N-type sugar chains in silkworm silk gland cells. , Consisting of 4 types of sialyltransferase substrate synthesis-related enzymes, sialyltransferase, and sugar nucleotide transporter.
  • the four types of sialyltransferase substrate synthesis-related enzymes are GlcNAc-1-P (N-acetylglucosamine-1-phosphate) and CMP-Neu5Ac (CMP-N-acetylneuraminic acid: CMP-sialic acid).
  • GlcNAc-1-P N-acetylglucosamine-1-phosphate
  • CMP-Neu5Ac CMP-N-acetylneuraminic acid: CMP-sialic acid.
  • sialic acid-related gene a gene encoding a sialic acid-related protein is often referred to as “sialic acid-related gene”.
  • sialic acid-related gene six types of sialic acid-related proteins will be described.
  • UDP-GlcNAc2 epimerase / ManNAc kinase UDP-acetylglucosamine 2-epimerase / N-acetylmannosamine kinase: often referred to herein as“ GNE ” refers to GlcNAc-1-P as UDP-GlcNAc (Uridine diphosphate N- acetylglucosamine) and also has a catalytic action to convert UDP-GlcNAc to ManNac-6-P (N-acetylmannosamine-6-phosphate).
  • GNE gene a gene encoding GNE is referred to as a “GNE gene”.
  • the species from which the GNE gene is derived in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited.
  • GEN genes derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fish, amphibians, reptiles, birds and vertebrates such as mammals can be used.
  • it is a GNE gene derived from mammals such as humans, rats and mice.
  • it encodes a gene encoding human GNE having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (for example, human GNE gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28) and rat GNE comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • Rat GNE gene for example, rat GNE gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • mouse GNE gene encoding mouse GNE comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 for example, from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32
  • Mouse GNE gene for example, rat GNE gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • mouse GNE gene encoding mouse GNE comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 for example, from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32
  • NeuronalAc9-phosphate synthase (Neu5Ac9-phosphate synthase: often referred to as“ NANS ”in this specification)” refers to ManNac-6-P produced by the catalytic action of GNE as Neu5Ac-9-P (N-acetylneuraminic acid-9-phosphate).
  • NANS gene a gene encoding NANS is referred to as “NANS gene”.
  • the biological species derived from the NANS gene in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited. NANS genes derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fishes, amphibians, reptiles, birds and vertebrates such as mammals can be used.
  • a NANS gene derived from mammals such as humans, rats and mice is a NANS gene derived from mammals such as humans, rats and mice.
  • a human NANS gene encoding human NANS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 (eg, human NANS gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34), rat NANS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35
  • Rat NANS gene eg, rat NANS gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36
  • mouse NANS gene eg, nucleotide shown in SEQ ID NO: 38
  • NANP Neuronal neuropeptide phosphatase
  • NANS N-acetylneuraminic acid
  • a gene encoding NANP is referred to as “NANP gene”.
  • the biological species from which the NANP gene is derived in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited. NANP genes derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fishes, amphibians, reptiles, birds and vertebrates such as mammals can be used.
  • a NANP gene derived from mammals such as humans, rats and mice is a NANP gene derived from mammals such as humans, rats and mice.
  • a human NANP gene encoding the human NANP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 for example, a human NANP gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40
  • a rat NANP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 A rat NANP gene encoding a mouse NANP gene (for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 44) and a mouse NANP gene encoding the mouse NANP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43 (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 44)
  • Mouse NANP gene comprising a sequence).
  • CMAS CMP-Neu5Ac synthase (CMP-Neu5Acynthase: often referred to herein as“ CMAS ”)” has a catalytic action to convert Neu5Ac produced by the catalytic action of NANP to CMP-Neu5Ac.
  • CMAS gene a gene encoding CMAS is referred to as “CMAS gene”.
  • the species of the CMAS gene derived in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited.
  • CMAS genes derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fish, amphibians, reptiles, vertebrates such as birds and mammals can be used.
  • it is a CMAS gene derived from mammals such as humans, rats and mice.
  • a human CMAS gene encoding human CMAS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 (for example, a human CMAS gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46), rat CMAS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47
  • a rat CMAS gene for example, the rat CMAS gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48
  • a mouse CMAS gene for example, the nucleotide represented by SEQ ID NO: 50
  • “Sialyltransferase ( ⁇ 2,6-sialyltransferase: often referred to as“ ST6GAL1 ”in the present specification)” is a kind of glycosyltransferase, which is synthesized by the above-mentioned sialic acid synthesis pathway and is Golgi apparatus by the action of SLC35A1. It catalyzes the reaction of transferring a sialic acid residue from the donor substrate CMP-Neu5Ac transported into the glycoprotein and glycolipid structure of the acceptor substrate.
  • ST6GAL1 gene a gene encoding ST6GAL1 is referred to as “ST6GAL1 gene”.
  • the species from which the ST6GAL1 gene is derived in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited.
  • the ST6GAL1 gene derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, chordates, fishes, amphibians, reptiles, birds and vertebrates such as mammals can be used.
  • it is ST6GAL1 gene derived from mammals such as human, rat and mouse.
  • a human ST6GAL1 gene encoding human ST6GAL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51 for example, a human ST6GAL1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 52
  • rat ST6GAL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 53
  • mouse ST6GAL1 gene encoding mouse ST6GAL1 gene for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 54
  • mouse ST6GAL1 gene encoding mouse ST6GAL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 55 for example, base shown in SEQ ID NO: 56
  • Mouse ST6GAL1 gene comprising a sequence).
  • sugar nucleotide transporter refers to a transporter protein having the ability to transport sialic acid to the Golgi apparatus.
  • a sialic acid transporter is applicable.
  • SLC35A1 sialic acid transporter (CMP-Neu5Ac transporter: often referred to herein as“ SLC35A1 ”)” is a type of membrane transport protein that is present on the membrane of the Golgi apparatus, and is synthesized through the sialic acid synthesis pathway. It has the effect of transporting CMP-Neu5Ac into the Golgi apparatus.
  • a gene encoding SLC35A1 is referred to as “SLC35A1 gene”.
  • the species of origin of the SLC35A1 gene in the glycosylation agent expression vector is not particularly limited.
  • the SLC35A1 gene derived from any organism such as invertebrates such as nematodes and insects, vertebrates such as chordates, fishes, amphibians and mammals can be used.
  • SLC35A1 gene derived from mammals such as human, rat and mouse is preferable.
  • a human SLC35A1 gene encoding human SLC35A1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 57 (for example, human SLC35A1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58), rat SLC35A1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59
  • Rat SLC35A1 gene eg, the rat SLC35A1 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60
  • the mouse SLC35A1 gene eg, the base shown in SEQ ID NO: 62
  • mouse SLC35A1 gene encoding the mouse SLC35A1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61
  • Mouse SLC35A1 gene comprising the sequence
  • Glycosylation agent expression vectors include three types selected from the group consisting of five types of GNE gene, NANS gene, NANP gene, CMAS gene and ST6GAL1 gene, excluding the SLC35A1 gene, among the six types of sialic acid-related genes.
  • the above genes are included as essential components.
  • a combination of GNE gene, CMAS gene and ST6GAL1 gene can be mentioned for three types.
  • a combination of GNE gene, NANP gene, CMAS gene and ST6GAL1 gene can be mentioned for four types.
  • all five types are selected.
  • the SLC35A1 gene is a selective component in the glycosylation agent expression vector. Since the effect of the invention is enhanced by adding the SLC35A1 gene, it is particularly preferable to include all six types.
  • Each gene is preferably a wild type gene, but may be a mutant gene as long as the activity of the protein encoded by each gene is maintained.
  • a mutant gene due to genetic polymorphism such as SNPs can be mentioned.
  • Such mutant genes include a gene consisting of a base acid sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of the wild type gene, or more than 70% of the base sequence of the wild type gene. 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher, preferably 95% or higher, more preferably 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher. It is done.
  • the term “plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • Base identity means that two base sequences are aligned (aligned), and a gap is introduced into one of the base sequences as necessary, so that the base coincidence between the two is the highest. The ratio (%) of the same base to the total number of base residues of the wild type gene.
  • the “gene encoding a transcriptional regulatory factor” refers to a gene of a transcriptional regulatory factor that is an essential component of the first subunit described later.
  • transcriptional regulatory factor refers to a protein factor that can bind to a target promoter described later and activate the target promoter. Examples thereof include GAL4 protein, which is a galactose metabolic activation protein of yeast, tTA, which is a tetracycline-regulated transactivator, and mutants thereof.
  • the “target promoter of the transcription regulator” is an essential component of the second subunit described later, and is a transcription regulator encoded by the first subunit. Refers to a promoter that can activate the expression of a gene under its control by binding.
  • the transcriptional regulatory factor and its target promoter are in a corresponding relationship with the transcriptional regulatory factor. Normally, when a transcriptional regulatory factor is determined, the target promoter is inevitably determined. For example, when the transcriptional regulatory factor is GAL4 protein, UAS (Upstream Activating Sequence) is used.
  • the target promoter of the transcriptional regulatory factor is configured such that the aforementioned glycosylation-related gene or the like can be placed within the control region in the downstream region.
  • Terminator is a selective component composed of a base sequence capable of terminating transcription when a gene or the like is expressed in the glycosylated agent expression vector of this embodiment.
  • labeling gene is a gene encoding a labeling protein, also called a selection marker.
  • a labeled protein refers to a polypeptide that can determine the presence or absence of expression of a labeled gene based on its activity. Therefore, when the glycosylation agent expression vector contains a labeling gene, it is possible to easily discriminate a genetically modified silkworm carrying the glycosylation agent expression vector based on the activity of the labeling protein.
  • “based on activity” means “based on the detection result of activity”.
  • the detection of the activity may be performed by directly detecting the activity of the labeled protein itself or indirectly through a metabolite such as a dye generated by the activity of the labeled protein. Detection can be chemical detection (including enzymatic reaction detection), physical detection (including behavioral analysis detection), or sensory detection of the detector (including visual, tactile, olfactory, auditory, taste detection) Either may be sufficient.
  • the kind of the labeled protein is not particularly limited as long as its activity can be detected by a method known in the art.
  • it is a labeled protein that has low invasiveness to transgenic silkworms during detection.
  • fluorescent proteins, chromogenic proteins, photoproteins, external secreted proteins, proteins that control external morphology, and the like can be mentioned.
  • Fluorescent proteins, chromogenic proteins, photoproteins, and exogenously secreted proteins can be visually detected under certain conditions, so they are very less invasive to transgenic silkworms and are easy to identify and select Particularly preferred.
  • the fluorescent protein refers to a protein that emits fluorescence of a specific wavelength when the transgenic silkworm is irradiated with excitation light of a specific wavelength. Either a natural type or a non-natural type may be used. Further, the excitation wavelength and the fluorescence wavelength are not particularly limited. Specific examples include CFP, AmCyan, RFP, DsRed (including derivatives such as DsRedsmonomer and DsRed2), YFP, GFP (including derivatives such as EGFP and EYFP), and the like.
  • the pigment synthesis protein is a protein involved in pigment biosynthesis, and is usually an enzyme.
  • the “dye” here is a low molecular compound or peptide capable of imparting a dye to a transformant, and the kind thereof is not limited.
  • a pigment that appears as an external color of an individual is preferable. Examples include melanin pigments (including dopamine melanin), omochrome pigments, and pteridine pigments.
  • the photoprotein refers to a substrate protein that can emit light without the need for excitation light or an enzyme that catalyzes the light emission of the substrate protein. Examples include aequorin and luciferase as an enzyme.
  • an exocrine secreted protein is a protein secreted extracellularly or externally, and corresponds to exocrine enzymes and the like.
  • Exocrine enzymes include digestive enzymes in addition to enzymes that contribute to the degradation or inactivation of drugs such as blasticidin and impart drug resistance to the host.
  • the marker gene is placed in a state capable of being expressed downstream of the promoter in the glycosylated agent expression vector.
  • the promoter used may be the same as or different from the middle or posterior silk gland.
  • Enhancer “Enhancer” is a gene expression activation region that can increase the transcription amount of a target gene in cooperation with a promoter, and is composed of a specific DNA sequence. Unlike promoters, they are located not only in the upstream region (5 ′ end side) of the target gene but also in the downstream region (3 ′ end side) and within the target gene, and regulate transcription of the target gene.
  • an “insulator” is a selective component of a glycosylation agent expression vector, and transcription of a gene sandwiched between sequences without being affected by chromatin of surrounding chromosomes. Is a base sequence that can be stably controlled. Examples include the cHS4 sequence of chicken and the gypsy sequence of Drosophila.
  • inverted terminal repeat sequence refers to an expression vector in which the glycosylated agent expression vector is capable of homologous recombination. Optional components that may be included.
  • the inverted terminal repeats are usually used in pairs, and piggyBac, mariner, minos, etc. can be used as transposons (Shimizu, K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9 , 277-281; Wang W. et al., 2000, Insect Mol Biol 9 (2): 145-55).
  • Glycosylation agent expression vector constituting the mammalian glycosylation agent of the present invention is a direct or indirect expression control of glycosylation-related genes and the like by MSG or PSG promoter Is arranged to receive.
  • direct or indirect expression control means a positional relationship between a MSG or PSG promoter and a glycosylation-related gene in a glycosylation agent expression vector, which is a glycosylation agent.
  • the glycosylation agent expression vector may be composed of one unit or may be composed of two subunits.
  • a glycosylation agent expression vector is a glycosylation agent expression vector that contains all the necessary components for expressing glycosylation-related genes in silkworm cells. Include in. Specifically, the MSG or PSG promoter, which is an essential component, and a glycosylation-related gene operably linked downstream of the promoter are included.
  • “functionally linked” means that each glycosylation-related gene or the like is incorporated into a glycosylated agent expression vector in a state where it can be expressed. Specifically, it means that the respective glycosylation-related genes and the like are arranged downstream under the control of the MSG or PSG promoter in the glycosylation agent expression vector. Therefore, when it is composed of one unit, the glycosylation-related gene and the like are subjected to direct expression control by the MSG or PSG promoter.
  • glycosylation agent expression vector is composed of a single unit
  • genetically modified silkworms with the glycosylation agent expression vector always add a mammalian sugar chain to the recombinant protein produced in the silk gland. can do.
  • the glycosylation agent expression vector When composed of two subunits, the first subunit and the second subunit, it is essential for the expression of glycosylation-related genes, etc.
  • the component exists divided into each subunit. Therefore, in this configuration, the first and second subunits function as one glycosylated agent expression vector only after coexisting in the host silkworm cell. Specifically, a transcriptional regulatory factor is expressed from the first subunit by the activation of the promoter contained in the first subunit in the same cell, which activates the target promoter of the second subunit. Glycosylation-related genes and the like can be expressed. Therefore, when composed of two subunits, the glycosylation-related gene and the like are subjected to indirect expression control by the MSG or PSG promoter.
  • the first and second subunits have the following configuration.
  • the “first subunit” comprises the MSG or PSG promoter and a transcription regulatory factor gene linked in an expressible state downstream of the promoter.
  • two or more transcriptional regulatory factors may be linked under the control of one MSG or PSG promoter.
  • the first subunit may have two or more pairs of MSG or PSG promoters and a transcription regulatory factor gene under the control.
  • each set may be the same set or different sets.
  • the case where the first subunit includes a pair consisting of the MSG promoter and the GAL4 gene and a pair consisting of the posterior silk gland promoter and the GAL4 gene can be mentioned.
  • the promoter included in the first subunit can use a known MSG or PSG promoter
  • an existing gene expression vector having an MSG or PSG promoter prepared for silkworms such as silkworms may be used. it can.
  • the “second subunit” includes a target promoter of a transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit and a glycosylation-related gene operably linked downstream of the target promoter.
  • the target promoter contained in the second subunit is a promoter activated by a transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit. Accordingly, in principle, the target promoter contained in the second subunit is uniquely determined by the transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit. For example, if the transcriptional regulatory factor gene contained in the target promoter first subunit is a GAL4 gene, UAS is used for the GAL4 target promoter in the second subunit.
  • the second subunit may contain two or more identical or different glycosylation-related genes and the like under the control of one target promoter.
  • the second subunit contains three genes consisting of the GNE gene, CMAS gene, and ST6GAL1 gene under the control of one UAS, four genes consisting of the GNE gene, CMAS gene, ST6GAL1 gene, and NANP gene
  • 5 genes consisting of GNE gene, CMAS gene, ST6GAL1 gene, NANS gene and NANP gene are arranged, GNE gene, CMAS gene, ST6GAL1 gene, NANS gene, NANP gene and SLC35A1 gene
  • the second subunit may have two or more sets of a target promoter and a glycosylation-related gene under the control of the target promoter.
  • each set may be the same set or different sets.
  • the second subunit contains two UASs, and under the control of one UAS, six genes consisting of the GNE gene, CMAS gene, ST6GAL1 gene, NANS gene, NANP gene, and SLC35A1 gene are placed, and the other This applies to the case where the GalT gene is placed under the control of UAS.
  • the second subunit may be composed of two or more identical or different units including a glycosylation-related gene.
  • a transcriptional regulatory factor expressed from one first subunit expresses a glycosylation-related gene and the like contained in each second subunit by activating target promoters of a plurality of second subunits. can do.
  • the 6th gene consisting of the GNE gene, CMAS gene, ST6GAL1 gene, NANS gene, NANP gene, and SLC35A1 gene is placed under the control of the UAS, and the GalT gene under the control of the 2nd B subunit UAS. This applies to the case where the
  • the first subunit may be a known or existing middle or posterior silk gland specific gene expression vector, and thus includes such a gene expression vector.
  • Existing genetically modified silkworm strains can be used.
  • the glycosylation agent expression vector of this configuration can amplify the expression of the second subunit glycosylation-related gene and the like via the transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit. Therefore, it is suitable for overexpressing a glycosylation-related gene or the like in a host cell.
  • the mammalian glycosylation agent of the present invention comprises 1 to 3 independent glycosylation agent expression vectors.
  • “independent” means that only one glycosylation agent expression vector can function as one expression unit capable of expressing at least one glycosylation-related gene or the like. Therefore, in the case of the glycosylated agent expression vector composed of the above-mentioned two subunits, each subunit is not said to be “independent”, but a plurality of subunits are collectively “independent”. I understand. On the other hand, when it is composed of one unit, it can be understood that the unit is “independent”.
  • the mammalian glycosylation agent of the present invention is composed of a plurality of independent glycosylation agent expression vectors
  • combinations of glycosylation-related genes and the like included in each glycosylation agent expression vector are not particularly limited.
  • the first glycosylation agent expression vector contains only the GalT gene
  • the second glycosylation agent expression vector contains three or more sialic acid-related genes. May be.
  • the first expression vector contains only the GalT gene
  • the second expression vector contains three or more sialic acid-related genes excluding the SLC35A1 gene
  • the third glycosylation agent expression vector (third expression vector) contains the SLC35A1 gene. May be included.
  • the host into which the glycosylation agent expression vector is introduced may be a silkworm individual, a silkworm-derived cell (including cell lines), or a silkworm-derived tissue.
  • the generation stage of the individual is not limited. Any stage of embryo, larva, pupa, or adult may be used. Preferably, it is an embryonic time when a high effect can be expected.
  • the sex of a host is not ask
  • the stage of development of the individual from which it was collected or from which it originates is irrelevant.
  • the introduction method may be performed by a method known in the field according to the introduction situation.
  • a plasmid in which the host to be introduced is silkworm and the exogenous gene expression vector has a transposon inverted terminal repeat (Handler (AM. Et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7520-5)
  • Handler AM. Et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7520-5
  • Tamura et al. Tropura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84
  • a helper vector having DNA encoding a transposon transferase may be injected into the silkworm early embryo together with the glycosylation agent expression vector.
  • An example of the helper vector is pHA3PIG.
  • the glycosylated agent expression vector of this embodiment contains a marker gene
  • a transformant can be easily selected based on the expression of the gene or the like.
  • the glycosylation agent expression vector is incorporated into the chromosome via the transposon inverted terminal repeat sequence.
  • the obtained transgenic silkworm may be sibling or inbred as necessary to obtain a homozygote of the expression vector inserted into the chromosome.
  • the second aspect of the present invention is a mammalian glycosylated silkworm.
  • the mammalian glycosylated silkworm of the present invention has the glycosylation agent expression vector of the first aspect, and adds a mammalian sugar chain to a recombinant protein produced in MSG and / or PSG. It is possible to do.
  • “mammalian glycosylated silkworm (often referred to herein as“ glycosylated silkworm ”)” expresses the glycosylated agent according to the first aspect.
  • the silkworm that is the host may be any silkworm described above.
  • Silkworms, erisans and saxants are particularly preferred since breeding methods and artificial samples have been established and multi-head breeding is possible.
  • the “mammalian glycosylated recombinant silkworm” of this embodiment is referred to as “mammal glycosylated genetically modified silkworm (often referred to herein as“ glycosylated silkworm ”). ) ".
  • the mammalian sugar chain is preferably a human sugar chain.
  • the glycosylated silkworm of the present invention may have the glycosylation agent expression vector of the first aspect transiently in a cell or stably in a state of being introduced into the genome. It may be. It is preferable to have it stably.
  • the glycosylated silkworm of the present invention can have two or more different glycosylation agent expression vectors of the first aspect.
  • the case where it has the 1st expression vector and 2nd expression vector which were described in the 1st aspect corresponds.
  • the first expression vector and the second expression vector divide and include a glycosylation-related gene essential for achieving mammalian-type glycosylation
  • the sugar having both the first expression vector and the second expression vector Chain-added silkworms can achieve the effects of the present invention.
  • the glycosylation agent expression vector is composed of two subunits, the first subunit and the second subunit, the glycosylated silkworm having both subunits can exert the effects of the present invention.
  • each expression vector is the same chromosome They may be present on different chromosomes.
  • each expression vector is present on a different chromosome, if a transgenic silkworm strain having only the first expression vector and a recombinant silkworm strain having only the second expression vector are crossed, In F1), the glycosylated silkworm of the present invention having the first expression vector and the second expression vector can be easily obtained.
  • the subunits are close to each other and linked to each other so that they are not separated by recombination during the passage. Is preferred.
  • the glycosylation agent expression vector is composed of two subunits, the first and second subunits.
  • the first and second subunits are present on different chromosomes, a recombinant silkworm strain having only the first expression vector, and a mammalian glycosylation gene set described below having only the second expression vector
  • the glycosylated silkworm of the present invention having the first and second subunits at F1 can be easily obtained.
  • the 3rd aspect of this invention is a mammalian-type glycosylated gene recombinant silkworm production line.
  • the recombinant silkworm production line of the present invention is a genetically modified silkworm having a part of the glycosylated agent expression vector according to the first aspect and its progeny. By using this strain, sugar chain-added silkworms can be produced freely and easily.
  • “mammalian glycosylated gene recombinant silkworm-producing line” is produced in the silk gland.
  • the silkworm that is the host may be any silkworm, but silkworm, erysan, and sakusan are preferred for the same reason as the glycosylated silkworm of the second aspect.
  • the “sugar chain-added silkworm-producing line” of this embodiment is referred to as a “sugar chain-added silkworm-producing line”.
  • the mammalian sugar chain is preferably a human sugar chain.
  • the glycosylated silkworm production line has a part of the glycosylated agent expression vector described in the first aspect.
  • Part of the glycosylation agent expression vector means that when the glycosylation agent expression vector is composed of two or three expression vectors, only a part of the expression vector or a glycosylation agent When the expression vector is composed of two subunits, this corresponds to the case of having only the second subunit. That is, the glycosylation silkworm production line has the potential to add a mammalian sugar chain to a protein produced in the silk gland by having a part of the glycosylation agent expression vector according to the first aspect.
  • the 4th aspect of this invention is a method of producing the mammalian type glycosylation gene recombinant silkworm (sugar chain addition silkworm).
  • the present invention is characterized in that a glycosylated silkworm capable of adding a mammalian sugar chain to a target recombinant protein to be expressed in the silk gland can be produced.
  • the method for producing a transgenic silkworm of the present invention includes a mating step and a selection step.
  • Mating step is an essential step of mating a glycosylated silkworm-producing strain having the second subunit described in the third aspect with a genetically modified silkworm strain having the first subunit. It is.
  • the silkworm that is the host may be any silkworm, but silkworm, erysan, and sakusan are preferred for the same reason as the glycosylated silkworm of the second aspect.
  • the mating may be performed based on the conventional method using the two silkworm strains. As a rule, it is performed between males and females of the same species.
  • Each of the subunits is a genetically modified silkworm inserted into the genome, and the glycosylated silkworm producing line used for mating and the silkworm of the transgenic silkworm line are sibling or inbred. It is preferable that the unit is preliminarily homozygous. As a result, all crossed first generation (F1) individuals become glycosylated silkworms having both subunits. In this case, the next selection process is not an essential process, but is a selection process performed as necessary for confirmation.
  • selection process is a process of selecting a genetically modified silkworm containing two subunits from F1 individuals as a glycosylated silkworm.
  • an individual having both labeled protein activities may be selected from the F1 individuals obtained after the mating step as the target glycosylated silkworm based on the activities of the labeled proteins encoded by the respective subunits.
  • Example 1 Construction of each expression vector> (the purpose) A glycosylation agent expression vector constituting the mammalian glycosylation agent of the present invention and an expression vector containing the target recombinant protein are constructed.
  • an expression vector composed of two subunits, a first subunit and a second subunit was employed for each expression vector. That is, the expression vector used in the examples of the present specification includes a MSG promoter and a first subunit containing a GAL4 gene operably linked downstream thereof, and sugars operably linked downstream of the UAS promoter. It is composed of a second subunit containing a chain-related gene and a gene encoding the target recombinant protein.
  • Method 1 Construction of the first expression unit (1) Construction of the first subunit for expression of the middle silk gland As the first subunit that induces gene expression in the middle silk gland (MSG), the sericin 1 gene that is specifically expressed in MSG A pBacSer-pro GAL4 / 3xP3DsRed2 having a promoter and a transcriptional regulatory factor GAL4 gene operably linked downstream thereof and an hsp70 polyA addition sequence conjugated downstream thereof was constructed.
  • the sericin 1 gene promoter is a promoter-containing region represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to the silkworm sericin 1 gene from ⁇ 666 to +40 (the transcription start point is O-position, the same applies hereinafter), and a silkworm strain genomic DNA is used as a template.
  • SEQ ID NO: 1 a promoter-containing region represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to the silkworm sericin 1 gene from ⁇ 666 to +40 (the transcription start point is O-position, the same applies hereinafter), and a silkworm strain genomic DNA is used as a template.
  • As a primer pair it was prepared by PCR amplification using a primer containing the AscI site shown by the primer pair SEQ ID NO: 63 and a primer containing the BamHI site shown by SEQ ID NO: 64.
  • the amplified fragment was inserted into pCR-Blunt II-TOPO vector (Thermo Fisher Scientific), cut with AscI and BamHI, and then the AscI-BamHI amplified fragment containing the promoter region was pBacA3dGAL4 (Uchino K. et al., 2006, J Insect BiotechnolericSericol 75: 89-97) was inserted into the AscI-BamHI site upstream of the GAL4 gene.
  • the 3xP3-DsRed cassette excised by BglII from pBacA3GAL4 / 3xP3DsRed2 (Uchino K.
  • pBac The aforementioned pBac [SerUAS_Ser1kozak_hr5 / 3xP3-EYFP_A3-Bla] was cut with BsmBI and BlnI to remove the short fragment, and the BspH-BlnI fragment was inserted into the BsmBI-BlnI site. This was designated as pBac [SerUAS_FibHsigint_hr5 / 3xP3-EYFP_A3-Bla] and used as the basic expression vector of the second expression unit in the expression vector.
  • GalT expression vector Construction of glycosylation agent expression vector Construction of GalT expression vector (Construction of conventional GalT2 expression vector)
  • the promoter region and 3′UTR region of the sericin 1 gene were each amplified using silkworm genomic DNA as a template, and then both amplified fragments were ligated by overlap-extension PCR. At this time, a BlnI site was inserted at the boundary between the promoter region and 3 ′ UTR.
  • PTA2 [Ser-UTR] was obtained by inserting this ligated fragment into a pTA vector (TOYOBO).
  • pTA2 [Ser-GAL4 ⁇ ] was obtained by inserting a GAL4 ⁇ fragment (Kobayashi I., et al., 2011, Arch Insect Biochem Physiol, 76: 195-210) into the BlnI site of pTA2 [Ser-UTR].
  • pBac [A3KMO was obtained by inserting the AscI fragment of pTA2 [Ser-GAL4 ⁇ ] into the AscI site of pBac [A3KMO, UAS] (Kobayashi I., et al., 2007, J. Insect Biotechnol Sericol, 76: 145-48). , UAS, Ser-GAL4 ⁇ ].
  • the mouse-derived GalT2 open-reading frame was amplified by PCR so that a BlnI site was added to the end. This fragment was inserted into the BlnI site of pBac [A3KMO, UAS, Ser-GAL4 ⁇ ] to obtain pBac [SerUAS-GalT2p / A3-KMO_A3-Bla], a conventional GalT2 expression vector.
  • pBac SerUAS_Ser1kozak_hr5 / NheIad_A3-Bla.
  • the NheI fragment of pBac [A3KMO, UAS, Ser-GAL4 ⁇ ] was inserted into the NheI site of this plasmid. This was designated as pBac [SerUAS_Ser1kozak_hr5 / A3-KMO_A3-Bla].
  • mice-derived GalT1 to GalT4 genes were converted into mouse GalT1 primer pair BspHI-mGalT1 U (SEQ ID NO: 71) and mouse BlnI-mGalT1 L (SEQ ID NO: 72), GalT2 BsmBI-GalT2-U (SEQ ID NO: 73) and BsmBI- GalT2-L (SEQ ID NO: 74), BsmBI-mGalT3 U (SEQ ID NO: 75) and mouse BsmBI-mGalT3 L (SEQ ID NO: 76) for mouse GalT3, and NcoI-mGalT4 U (SEQ ID NO: 77) and mouse BlnI- for mouse GalT4 PCR was performed using mGalT4 L (SEQ ID NO: 78).
  • Each amplification product was cleaved with the restriction enzyme described in each primer name, and then inserted into the BsmBI site of the basic vector pBac [SerUAS_Ser1kozak_hr5 / A3-KMO_A3-Bla] of the improved GalT vector.
  • Each of the obtained improved GalT expression vectors is pBac [SerUAS-GalT1 / A3-KMO_A3-Bla], pBac [SerUAS-GalT2i / A3-KMO_A3-Bla], pBac [SerUAS-GalT3 / A3-KMO_A3-Bla], And pBac [SerUAS-GalT4 / A3-KMO_A3-Bla].
  • GalT2p represents conventional GalT2
  • GalT2i represents improved GalT2.
  • sialic acid-related gene expression vector (Construction of UAS unit vector) PCR was performed with the primer pair serUASUNhe (SEQ ID NO: 79) and serPolyALSpe (SEQ ID NO: 80) using the basic expression vector pBac [SerUAS_Ser1kozak_hr5 / 3xP3-EYFP_A3-Bla] constructed in (1) above as a template.
  • the obtained amplification product was inserted into the EcoRV site of pZErO2 (Thermo Fisher Scientific). This was designated as a UAS unit vector SerUAS_unit / pZErO2.
  • Sialic acid-related genes (GNE, NANS, NANP, CMAS, ST6GAL1, and SLC35A1 genes) were amplified by PCR using the following primer pairs to obtain each sialic acid-related gene fragment.
  • R2epiU (SEQ ID NO: 81) and r2epiL (SEQ ID NO: 82) for the GNE gene primer pair
  • BsmBI_NANS_U (SEQ ID NO: 83) and BsmBI_NANS_L (SEQ ID NO: 84) for the NANS gene primer pair
  • NANP gene primer pair Are BsmBI_NANP_U (SEQ ID NO: 85) and BsmBI_NANP_L (SEQ ID NO: 86), hCSSU (SEQ ID NO: 87) and hCSSL (SEQ ID NO: 88) for the CMAS gene primer pair, and BsmBI_hCST_U (SEQ ID NO: 89) for the SLC35A1 gene primer pair.
  • BsmBI_hCST_L SEQ ID NO: 90
  • hSTU SEQ ID NO: 91
  • hSTL SEQ ID NO: 92
  • UAS-GNE / pZErO2 (for GNE expression), UAS-NANS / pZErO2 (for NANS expression), UAS-NANP / pZErO2 (for NANP expression), UAS-CMAS / pZErO2 (for CMAS expression), UAS-ST6GAL1 / pZErO2 (for ST6GAL1 expression), and UAS-SLC35A1 / pZErO2 (for SLC35A1 expression).
  • UAS unit vectors UAS-GNE / pZErO2 for GNE expression
  • UAS-NANS / pZErO2 for NANS expression
  • UAS-NANP / pZErO2 for NANP expression
  • UAS-CMAS / pZErO2 containing each sialic acid-related gene for CMAS expression
  • UAS-ST6GAL1 / pZErO2 for ST6GAL1 expression
  • UAS-SLC35A1 / pZErO2 for SLC35A1 expression
  • HS4 insulator unit vector HS4x4 / pUC were cut with NheI and SpeI, respectively.
  • NheI-SpeI fragments including UAS-GNE / pZErO2, UAS-CMAS / pZErO2 and UAS-ST6GAL1 / pZErO2 and NheI-SpeI fragments containing HS4 insulators are transferred to the SpeI site of piggyBac / 3xP3AmCyan.
  • the acid unit and the HS4 insulator were inserted so as to be alternately connected.
  • pBac H4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4 / 3xP3AmCyan
  • pBac UAS-GNE / CAMS / ST6GAL1 / 3xP3AmCyan
  • pBac H4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4 / 3xP3AmCyan
  • pBac UAS-NANS / NANP / GNE / CAMS / ST6GAL1 / 3xP3AmCyan
  • pBac H4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-SLC35A1-HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4 / 3xP3AmCyan
  • pBac Abbreviated as UAS-NANS / NANP / SLC35A1 / GNE / CAMS / ST6GAL1 / 3xP3AmCyan.
  • GNE / CAMS / ST6GAL1 3 types of UAS sialic acid units (GNE / CAMS / ST6GAL1), 5 types (NANS / NANP / GNE / CAMS / ST6GAL1), and 6 types (NANS / NANP / SLC35A1 / GNE / CAMS / ST6GAL1) are included.
  • a sialic acid-related gene expression vector was obtained.
  • PCR is performed using the primer pair hIFNg_FibHsig_U40 (SEQ ID NO: 98) and the hIFNg_C-6His_L45 (SEQ ID NO: 99) containing the His tag using the Flexi ORF clone ORH24802 (Promega) containing the ORF of the human interferon ⁇ (hIFN ⁇ ) gene as a template.
  • the BsmBI fragment of the amplified product was inserted into the BsmBI site of the basic expression vector pBac [SerUAS_FibHsigint_hr5 / 3xP3-EYFP_A3-Bla] constructed in (1). This was designated as UAS-hIFNg / pZErO2.
  • Example 2 Production of transgenic silkworm> (the purpose) Various transgenic silkworms were produced using each expression vector constructed in Example 1. (Materials and methods) (1) Silkworm strain The w1-pnd strain of white-eye, white egg, and non-dormant strain maintained at the National Institute of Agrobiological Sciences was used as the host strain.
  • the first subunit for expressing MSG pBacSer-pro GAL4 / 3xP3DsRed2 was used in the injection.
  • the hatched larvae are bred by the above method, and F1 individuals containing the first subunit are selected based on the presence or absence of eye fluorescence by the 3xP3 DsRed2 marker, and contain the first subunit of the transgenic silkworm of the present invention.
  • Recombinant silkworm lines for GAL4 expression were obtained.
  • the GalT glycosylated silkworm-producing strain containing the second subunit is a GalT2p expression vector, and each improved GalT expression vector (pBac [SerUAS-GalT1 / A3-KMO_A3-Bla], pBac [SerUAS-GalT2i / A3-KMO_A3-Bla], pBac [SerUAS-GalT3 / A3-KMO_A3-Bla], and pBac [SerUAS-GalT4 / A3-KMO_A3-Bla]) were used.
  • the hatched larvae are reared by the above method, and F1 individuals containing each improved GalT expression vector are selected by coloring the body surface of the 1st instar larvae with the A3-KMO marker. I got each.
  • sialic acid-related protein sugar chain-added silkworm production line containing the second subunit used the above-described sialic acid-related gene expression vectors in the injection.
  • the hatched larvae were bred by the above method, and F1 individuals containing each expression vector were selected by the presence or absence of eye fluorescence by 3xP3-AmCyan marker, and sialic acid-related protein glycosylated silkworm production lines were obtained respectively. .
  • a GAL4 expression recombinant silkworm strain containing the first subunit and a target recombinant protein expression recombinant silkworm strain (ATIII or IFN ⁇ ) containing the second subunit are first crossed.
  • Crossing between a GAL4 expressing transgenic silkworm strain containing a subunit and a GalT glycosylated silkworm producing strain containing a second subunit, and a GAL4 expressing transgenic silkworm strain containing a first subunit and a second subunit Each of the sialic acid-related protein sugar chain-added silkworm-producing strains was crossed to confirm the expression of each gene and extract the protein.
  • Table 1 shows combinations of transgenic silkworms containing GalT expression vectors (GalT genetically modified silkworms) and recombinant silkworms containing various sialic acid-related gene expression vectors (sialic acid-related genetically modified silkworms). After the mating, F1 individuals were selected based on the markers and lines having each subunit.
  • “-” indicates that a transgenic silkworm containing a GalT expression vector or a sialic acid-related gene expression vector is not used for mating.
  • “ ⁇ ” indicates that the mating was performed to obtain transgenic silkworms having the respective expression vectors, and “x” indicates that no mating was performed.
  • sialic acid-related gene expression vector (3, 5, or 6) only, target recombinant protein expression vector / GalT gene expression vector, target recombinant protein expression vector / sialic acid-related gene expression vector ( 3, 5, and 6), GalT gene expression vector / sialic acid related gene expression vector (3, 5, and 6), and target recombinant protein expression vector / GalT gene expression vector / sialic acid
  • target recombinant protein expression vector / GalT gene expression vector / sialic acid 3, 5, and 6
  • target recombinant protein expression vector / GalT gene expression vector / sialic acid A transgenic silkworm containing the relevant gene expression vector was created.
  • Example 3 Extraction of lumen protein in MSG of glycosylated silkworm> (the purpose) Luminous proteins including recombinant proteins are extracted from the MSG lumens of ATIII glycosylated silkworms, IFN ⁇ glycosylated silkworms, and control ATIII, IFN ⁇ non-expressing silkworms produced in Example 2.
  • Example 2 Each glycosylated silkworm produced in Example 2 is bred in the same manner as in Example 2. The larvae at age 5 and 6 are anesthetized on ice immediately before spitting, and the back side is incised. Extracted so as not to hurt (see Mori Kaede, New Biology Experiment with Silkworm, Sanseido, 1970, pp. 249-255). Subsequently, the excised MSG was fixed with ethanol and separated into lumen protein and cells with tweezers. Lumen proteins obtained from each of ATIII glycosylated silkworms and IFN ⁇ glycosylated silkworms were dissolved in LiBr to prepare MSG extract.
  • the extracted MSG was placed in 1 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.2) per bottle, and the water-soluble protein was extracted by shaking at 4 ° C. for 2 hours, and then centrifuged at 2000 ⁇ g for 10 minutes. The later supernatant was collected.
  • Example 4 Purification and preparation of recombinant protein from MSG extract> (the purpose) The target recombinant protein obtained in Example 3 is separated and purified and prepared for sugar chain structure analysis.
  • Method 1 Measurement of protein concentration The protein concentration in the MSG extract was measured by the Bradford method. BSA was used as the standard protein. The absorbance of OD 595 was measured for a dilution series (BSA concentration: 0 to 1.0 mg / Ml) prepared using Bradford reagent (Nacalai Tesque), and a calibration curve was prepared. Similarly, OD 595 was measured for each MSG extract, and the protein concentration was determined by comparison with a calibration curve.
  • the protein of interest is eluted with 300 ⁇ L of eluate (50 mM sodium phosphate buffer / 0.3 M NaCl / 200 mM imidazole), and the eluate is eluted with 50 mM sodium phosphate buffer using Amicon Ultra-0.5 mL (30 K). Concentrate and measure protein concentration. Then add 4 ⁇ sample buffer (glycerol 4.0mL / 1.5M Tris-HCl buffer (pH6.8) 1.67mL / 10% SDS solution 1.0mL / ⁇ -mercaptoethanol 400 ⁇ L) to 1 ⁇ g, denature at 100 °C for 3 minutes, Separated by SDS-PAGE.
  • sample buffer glycerol 4.0mL / 1.5M Tris-HCl buffer (pH6.8) 1.67mL / 10% SDS solution 1.0mL / ⁇ -mercaptoethanol 400 ⁇ L
  • the target protein is eluted with 300 ⁇ L of eluate (50 mM sodium phosphate buffer / 0.3 M NaCl / 200 mM imidazole), and the eluate is concentrated with 50 mM sodium phosphate buffer using Amicon Ultra-0.5 mL (10 K). The protein concentration was measured. Then add 4 ⁇ sample buffer (glycerol 4.0mL / 1.5M Tris-HCl buffer (pH6.8) 1.67mL / 10% SDS solution 1.0mL / ⁇ -mercaptoethanol 400 ⁇ L) to 1 ⁇ g, denature at 100 °C for 3 minutes, Separated by SDS-PAGE.
  • Example 5 Analysis of sugar chain structure of recombinant protein> (the purpose) The sugar chain structure added to the digested peptide obtained in Example 4 is analyzed using nanoLC-MS / MS. (Method) 6 ⁇ L or 8 ⁇ L of the enzyme-treated solution obtained in Example 4 was subjected to nanoLC-MS / MS under the following analysis conditions. About the specific analysis method, the instruction manual attached to each equipment used was followed.
  • the sugar chain structure of a protein prepared from the silk gland of a recombinant silkworm into which each GalT isozyme gene was introduced was analyzed.
  • the sugar chain structure profile is shown in Table 2.
  • the numerical value in the table is the ratio (%) of the sugar chain when the entire detected sugar chain is defined as 100%.
  • the sialic acid terminal structure was confirmed in the glycoprotein even when the sialic acid-related transgenic silkworm contained any of 3, 5, or 6 sialic acid-related genes. Based on this result, the number of sialic acid-related genes required to add sialic acid to the non-reducing galactose end should be at least three selected from the GNE, NANS, NANP, CMAS, and ST6GAL1 genes. Became clear. In addition, the sialic acid addition efficiency was significantly increased when the number of sialic acids was 6 compared to the case of 3 or 5.
  • sialic acid-related gene expression vectors Between 5 types (NANS / NANP / GNE / CAMS / ST6GAL1) sialic acid-related gene expression vectors and 6 types (NANS / NANP / SLC35A1 / GNE / CAMS / ST6GAL1) sialic acid-related gene expression vectors prepared in Example 1
  • the different sialic acid-related gene is the SLC35A1 gene. Therefore, it was revealed that the SLC35A1 gene is not essential for adding sialic acid to the non-reducing end of galactose, but has a function of enhancing the addition efficiency.
  • sugar chains with GlcNAc at the non-reducing end are combined as a GlcNAc structure
  • sugar chains with Gal at the non-reducing end are combined as a Gal structure
  • sugar chains with Sia at the non-reducing end are combined as a Sia structure.
  • Show. a and b indicate silkworm lines.
  • the numerical value in the table is the ratio (%) of the sugar chain when the entire detected sugar chain is defined as 100%.
  • (+ / GalT2p /-) does not cross sialic acid-related transgenic silkworms, but crosses the hATIII transgenic silkworms with GalT2p transgenic silkworms, and (+ / GalT2p / 5 species) indicates a genetically modified silkworm obtained by crossing hATIII transgenic silkworm, GalT2p transgenic silkworm and 5 sialic acid-related transgenic silkworms. The same applies to other notations.
  • the N187 and N224 glycosylated asparagine residues are all genetically modified silkworms containing a GalT (GalT2p, GalT2i or GalT1) expression vector and 5 or 6 sialic acid-related gene expression vectors. The same sialic acid was added to the non-reducing end. The efficiency was higher when using GalT2p or GalT2i than when using GalT1.
  • hIFN ⁇ proteins obtained from a glycosylated silkworm obtained by crossing GalT2p transgenic silkworm, sialic acid-related transgenic silkworm (5 or 6), and hIFN ⁇ transgenic silkworm
  • Table 5 shows the sugar chain structures of the N48 and N120 sugar chain addition sites in the two molecular species. The numerical values in the table indicate the ratio (%) of the sugar chain when the entire detected sugar chain is 100%, and a and b indicate the silkworm line.
  • (+ / + /-) does not cross the sialic acid-related transgenic silkworm, but crosses the hIFN ⁇ transgenic silkworm with the GalT2p transgenic silkworm, and (+ / + / 5 species or 6 species) shows transgenic silkworms obtained by mating GalT2p transgenic silkworms, hIFN ⁇ transgenic silkworms and 5 or 6 sialic acid-related transgenic silkworms.
  • Table 6 is an excerpt of the sugar chain structure directly related to the present invention and the ratio (%) from Table 5.
  • Table 7 shows the sugar chain structures detected in each molecular species in the highest order from the highest abundance.
  • the control transgenic silkworm in this table is a hIFN ⁇ transgenic silkworm that does not cross the GalT transgenic silkworm and the sialic acid-related transgenic silkworm. Therefore, the wild-type sugar chain of the silkworm is substantially added to the control transgenic silkworm.
  • N48 and N120 glycosylated asparagine residues in hIFN ⁇ also have a sialic acid at the non-reducing end in transgenic silkworms containing both the GalT2 expression vector and the sialic acid-related gene expression vector.
  • Animal-type sugar chains were added. Therefore, if the glycosylated silkworm of the present invention is used, a mammalian sugar chain can be added to the target protein produced in the silk gland of the silkworm.

Abstract

遺伝子組換えカイコに哺乳動物型糖鎖であるシアル酸が付加された組換えタンパク質をバキュロウイルス発現系やシアル酸の経口及び経皮投与を行うことなく単独、かつ個体レベルで簡便に生産させる技術を開発し、提供する。　哺乳動物型糖鎖修飾された組換えタンパク質がカイコ自身に有害とならないように絹糸腺内のみで哺乳動物型糖鎖付加関連遺伝子群の発現を誘導できる発現ベクターを開発し、それを導入した遺伝子組換えカイコを作製した。

Description

哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ
　本発明は、目的の組換えタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加することのできる遺伝子組換え絹糸虫、特に遺伝子組換えカイコ、及びその遺伝子組換え体を作出するための発現ベクターに関する。
　遺伝子組換え技術を用いた組換えタンパク質の生産は、新素材や高付加価値素材の開発、医薬品、化粧品等の生産産業上極めて重要である。例えば、2010年の世界医薬品売上高上位10品目における医療用タンパク質の占有率は45.9％にのぼり(非特許文献１)、今後もさらに成長を続けることが予想されている。
　組換えタンパク質の生産では、従来、大腸菌や酵母等の微生物、昆虫細胞や動物細胞等の培養細胞が宿主として利用されてきた。宿主は生産するタンパク質の構造や用途等に応じて選択される。一般に、微生物を用いたタンパク質生産系は、低コストで高効率な生産が可能であるが、大量生産や複雑な構造の組換えタンパク質の生産には適さない。一方、哺乳類培養細胞等の培養細胞を用いたタンパク質生産系は、複雑な構造の組換えタンパク質の生産が可能である。それ故、従来はバイオ医薬品の生産で主に利用されてきた。しかし、培養細胞によるタンパク質生産系は、巨額な設備投資、高価な培養液等による高コスト生産を避けることができない。バイオ医薬品の継続的な使用は患者に対する経済的負担を大きく、そのため複雑な構造を有する組換えタンパク質を低コストで生産できるタンパク質生産系の開発が求められていた。
　上記問題を解決し得る新たなタンパク質生産系宿主として、近年、カイコ（silkworm: Bombyx mori）が注目を集めている。チョウ目昆虫に属するカイコは、古くから絹糸生産を担う産業上有用な昆虫であったが、遺伝子組換え技術の躍進から、近年では有用タンパク質生産系としての期待が高まっている。カイコが幼虫期に絹糸を生産、分泌する絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成できることが知られている。そこで、この絹糸腺のタンパク質合成能を利用することで、絹糸腺内で目的のタンパク質を大量に生産させることが可能となる。カイコをタンパク質生産系とする場合には、目的のタンパク質をコードした外来遺伝子をカイコ細胞内に導入して形質転換体、すなわち遺伝子組換えカイコ（トランスジェニックカイコ）を作製する遺伝子組換え技術が必須となる。幸い、カイコではトランスポゾンpiggyBacを用いて外来遺伝子をゲノム内で安定に維持させる技術が確立している（非特許文献２）。カイコを用いたタンパク質生産系は、タンパク質生産量をカイコの飼育頭数によって容易に制御できる点、数万匹レベルでも省スペースで飼育できる点、孵化から5齢幼虫後期又は蛹までの期間が1か月弱と比較的短期間である点、人工孵化技術及び人工飼料により一年を通して飼育可能である点、生産されたタンパク質を繭として回収容易な点等においても他の宿主を用いたタンパク質生産系と比較して優れている。
　一方、カイコで生産されるタンパク質は、付加される糖鎖の構造がヒトをはじめとする哺乳動物とは異なる。図１に示すようにタンパク質のアスパラギン残基に結合するN型糖鎖において、カイコの蛹、中腸、脂肪体等で生産されるタンパク質は、主として非還元末端にマンノースが付加した高マンノース型末端構造を有している（B）。さらに、カイコの絹糸腺で生産される絹糸腺タンパク質は、非還元末端において前記末端マンノースにさらにN－アセチルグルコサミン（本明細書では、しばしば「GlcNAc」と表記する）が付加されたGlcNAc末端構造を有している（C）。これに対して、哺乳動物で主としてみられる糖鎖は非還元末端が上記GlcNAcにさらにガラクトースとシアル酸が付加されたシアル酸末端構造となっている（A）。
　タンパク質の糖鎖は、翻訳後修飾の一つとして付加され、生体内のタンパク質の50%以上に存在する。糖鎖は、タンパク質の安定化、保護、生理活性、抗原抗体反応、ウイルス感染及び体内動態等に関与する等、様々な機能をタンパク質に付与する重要な役割を担う。しかし、カイコと哺乳動物の糖鎖構造の差異は、免疫原性を示す可能性が懸念され、アレルギー反応の発症原因となり得る。したがって、カイコを宿主として医薬品タンパク質を生産する場合、糖鎖構造の差異が医薬品タンパク質の活性や安定性に影響を与えるリスクを伴う。それ故、遺伝子組換えカイコで生産される組換えタンパク質の糖鎖を哺乳動物型糖鎖に改変する技術が求められていた。
　昆虫培養細胞を用いた研究では、ヒト型糖鎖修飾経路を導入することで、組換えタンパク質の非還元末端にシアル酸を付加する哺乳動物型糖鎖修飾が可能となった培養細胞が報告されている（非特許文献３）。
　また、糖タンパク質糖鎖のN-アセチルヘキソサミンを分解するヘキソサミニダ―ゼの阻害剤を培地に添加したところ、バキュロウイルスによって生産された組換えタンパク質の糖鎖非還元末端にシアル酸が付加したという報告もある（非特許文献４）。
　さらに、特許文献１は、カイコにガラクトース転移酵素遺伝子を導入して、個体レベルでN型糖鎖の非還元末端にガラクトースを付加できたことを開示している。しかしながら、そのガラクトースの非還元末端にシアル酸を付加する機能を付与した遺伝子組換えカイコは知られていない。
　非特許文献５は、ヒト由来Nアセチルグルコサミン転移酵素β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2をカイコで発現させて、糖鎖を改変することに成功している。しかし、哺乳動物型のシアル酸を非還元末端には付加させていない。
特開2014-012024
日本政策投資銀行　関西支店資料(2012) Tamura T. et al., 2000, Nat Biotechnol, 18: 81-84. Jarivis DL et al., Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):528-533 Watanabae et al., J Biol Chem. 2002 Feb 15;277(7):5090-5093 Dojima et al., J2009, Biotechnol. 143(1):27-33
　従来の発明では、遺伝子組換えカイコとバキュロウイルス発現系、及びシアル酸の経口や経皮投与の組み合わせによって、組換えタンパク質の非還元末端にシアル酸を付加させることに成功はしていたが、より簡便な方法、つまり遺伝子組換えカイコ単独でシアル酸付加機能を導入する技術が望まれていた。しかし、シアル酸が付加されたヒト型糖鎖はカイコ個体に有害であり、通常の遺伝子発現システムではカイコの発生を阻害する問題があった。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、カイコの絹糸腺内のみでヒト等の哺乳動物に由来する糖鎖付加関連遺伝子群の発現を誘導できる発現ベクターを開発した。それを導入した遺伝子組換えカイコは、発生上、有害な影響を受けることなく、絹糸腺内で生産された目的の組換えタンパク質のN型糖鎖末端に効率的にガラクトース及びシアル酸を付加することができた。また、哺乳動物型糖鎖の付加にはガラクトース転移酵素と、シアル酸合成系に関連する酵素遺伝子群から選択される3種以上の遺伝子を導入すれば足りること、シアル酸トランスポーター遺伝子をカイコに導入することで糖鎖付加効率が著しく増大すること、そしてガラクトース転移酵素のアイソザイムがこれまで一般的に使用されていたGalT1よりもGalT2の方が転移効率が高いことを見出した。本発明は、上記結果と知見に基づくもので、具体的には以下の（１）～（２０）で示す発明を提供する。
　（１）絹糸虫由来の中部及び／又は後部絹糸腺プロモーター（MSG又はPSGプロモーター）及び該プロモーターの下流に機能的に連結された（ａ）ガラクトース転移酵素（GalT）をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド、及び（ｂ）UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ（GNE）、Neu5Ac9-リン酸合成酵素（NANS）、Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素（NANP）、CMP-Neu5Ac合成酵素（CAMS）、及びシアル酸転移酵素（ST6GAL1）からなる群から選択される3以上のタンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドを含む独立した１～３つの発現ベクターからなり、前記タンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドは、前記MSG又はPSGプロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（２）前記ガラクトース転移酵素がGalT2である、（１）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（３）前記中部絹糸腺プロモーターがセリシン１遺伝子、セリシン２遺伝子、又はセリシン３遺伝子のプロモーターである、（１）又は（２）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（４）前記後部絹糸腺プロモーターがフィブロインH鎖遺伝子、フィブロインL鎖遺伝子、又はp25遺伝子のプロモーターである、（１）又は（２）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（５）前記選択される3以上のタンパク質がGNE、CAMS、及びST6GAL1を含む3以上のタンパク質である、（１）～（４）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（６）前記発現ベクターが（ｃ）CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーター（SLC35A1）をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチドをさらに含む、（１）～（５）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（７）前記発現ベクターが前記（ａ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第１発現ベクター、及び前記（ｂ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第２発現ベクターからなる、（１）～（６）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（８）前記（ｃ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドが第２発現ベクターに含まれる、（７）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（９）前記タンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドが前記MSG又はPSGプロモーターの下流に機能的に連結している、（１）～（６）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（１０）前記発現ベクターが（i）前記MSG又はPSGプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、（ii）前記転写調節因子の標的プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された前記（ａ）～（ｃ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む一以上の第２サブユニットから構成される、（１）～（８）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（１１）前記転写因子が酵母由来のGAL4タンパク質であり、その標的プロモーターがUAS（Upstream Activating Sequence）である、（１０）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（１２）前記絹糸虫がカイコである、（１）～（１１）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（１３）哺乳動物型がヒト型である、（１）～（１２）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
　（１４）（１）～（９）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
　（１５）（１０）又は（１１）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
　（１６）前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、（１５）に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
　（１７）前記絹糸虫がカイコである、（１４）～（１６）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
　（１８）哺乳動物型がヒト型である、（１４）～（１７）のいずれかに記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
　（１９）（１０）又は（１１）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第２サブユニットのみを含む、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統。
　（２０）哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を作製する方法であって、（１９）に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統、及びそれと同種の（１０）又は（１１）に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第１サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫作出系統を交配する交配工程、及び交配第１世代（F1）から第１サブユニット及び第２サブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫として選抜する選抜工程を含む前記方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-21352号の開示内容を包含する。
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤によれば、絹糸虫、好ましくはカイコに導入することで、その絹糸虫を容易に哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫に改変することができる。
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫によれば、その遺伝子組換え絹糸虫の絹糸腺内で生産される目的の組換えタンパク質又はペプチドに哺乳動物型N型糖鎖を付加することができる。
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出方法によれば、宿主絹糸虫に本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を投与することで、哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを絹糸虫に導入して目的の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を得ることができる。
哺乳動物及びカイコ絹糸腺タンパク質のN型糖鎖の概念図である。Aは哺乳動物の、Bはカイコの蛹、中腸、脂肪体等に存在するタンパク質の、Cは絹糸腺に存在するタンパク質のN型糖鎖構造である。 ゴルジ装置内における哺乳動物型及び昆虫型のN型糖鎖合成経路とヒトシアル酸合成経路の概念図である。図中、斜体で示す7種のタンパク質（ガラクトース転移酵素GalTと6種のシアル酸関連タンパク質GNE、NANS、NANP、CMAS、ST6GAL1及びSLC35A1）をコードする遺伝子が本発明において、カイコ個体内で強制発現させる遺伝子群である。破線で示す経路は、本発明で生じる反応経路の概念図である。 精製したATIIIのSDS-PAGEの結果を示す。レーン１は中部絹糸腺（MSG）抽出液、及びレーン２～７はNiカラム精製の溶出液を示す。矢印はATIIIの位置を示している。枠内は、ゲル内消化のために切り出した領域である。 精製したIFNγのSDS-PAGEの結果を示す。レーン１はMSG抽出液、レーン２はNiカラム精製の素通り画分、レーン３及び４は洗浄液、及びレーン５及び６は溶出液を示す。矢印は、検出された3本のバンドを示している。*及び**はゲル内消化用に切り出したバンドである。
１．哺乳動物型糖鎖付加剤
１－１．概要
　本発明の第の態様は、哺乳動物型糖鎖付加剤である。本発明の糖鎖付加剤は、独立した１～３つの発現ベクターで構成される。本発明の糖鎖付加剤をカイコ等の絹糸虫内に導入することで哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を容易に作製することができる。
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「哺乳動物型糖鎖付加剤」とは、後述する構成を有する絹糸虫に適用する薬剤をいう。
　本明細書において「哺乳動物型糖鎖」とは、タンパク質のアスパラギン残基に付加されるN型糖鎖で、図１のAで示すように、GlcNAc非還元末端にガラクトースが付加され、さらにそのガラクトースにシアル酸が付加したシアル酸非還元末端糖鎖構造を有する糖鎖である。一般にはSianGalnGlcNAcnManｍ-Asn（Siaはシアル酸、特にNアセチルノイラミン酸を、Galはガラクトースを、Manはマンノースを、そしてmは独立に2以上の整数を、またnは独立に1以上の整数を表す）で表される構造を有する。
　本発明において「哺乳動物」は、特に限定はしないが、好ましくはヒト、チンパンジー、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等が該当する。好ましくはヒトである。つまり、「ヒト型糖鎖」が好ましい。
　「絹糸」とは、主として絹糸虫の絹糸腺内で生合成される動物繊維をいう。
　本明細書において「絹糸虫（silk-spinning worm）」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。具体的には、チョウ目昆虫、ハチ目昆虫、アミメカゲロウ目昆虫、トビケラ目昆虫等において、主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。ここで、チョウ目昆虫は、分類学上のチョウ目（鱗翅目：Lepidoptera）に属する昆虫で、各種チョウ又はガが該当する。ハチ目昆虫は、分類学上のハチ目（膜翅目：Hymenoptera）に属する昆虫で、各種ハチ又はアリが該当する。アミメカゲロウ目昆虫は、アミメカゲロウ目（脈翅目：Neuroptera）に属する昆虫で、ヘビトンボ、ツノトンボ、ウスバカゲロウ等が該当する。トビケラ目昆虫は、トビケラ目（毛翅目：Trichoptera）に属する昆虫で、各種トビケラが該当する。本発明における絹糸虫には、大型の絹糸腺を有し、多量の絹糸を吐糸できるチョウ目昆虫が好ましく、中でもカイコガ科(Bombycidae)、ヤママユガ科（Saturniidae）、イボタガ科(Brahmaeidae)、オビガ科(Eupterotidae)、カレハガ科（Lasiocampidae）、ミノガ科（Psychidae）、ヒトリガ科（Archtiidae）、ヤガ科（Noctuidae）等に属する種が好適であり、Bombyx属、Samia属、Antheraea属、Saturnia属、Attacus属、Rhodinia属に属する種、具体的には、カイコの他、クワコ（Bombyx mandarina）、シンジュサン（Samia cynthia；エリサンSamia cynthia ricini及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Antheraea yamamai）、サクサン（Antheraea pernyi）、ヒメヤママユ（Saturnia japonica）、オオミズアオ（Actias gnoma）等の野蚕と呼ばれるグループに属する種は特に好適である。最も好ましい絹糸虫は、カイコである。
　「絹糸腺」とは、絹糸虫が有する唾液腺の変化した管状器官であって、液状絹を産生、蓄積し、また分泌する機能を有する。絹糸腺は、主として絹糸虫の幼虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の3領域で構成されている。カイコをはじめとする多くの絹糸虫において、中部絹糸腺（middle silk gland：本明細書では、しばしば「MSG」と表記する）細胞内では、絹糸の被覆成分である水溶性のゼラチン様タンパク質、セリシンが合成され、中部絹糸腺内腔中に分泌される。また、後部絹糸腺（posterior silk gland：本明細書では、しばしば「PSG」と表記する）細胞内では、絹糸の繊維成分を構成する3つの主要なタンパク質フィブロインH鎖（本明細書では、しばしば「Fib H」と表記する）、フィブロインL鎖（本明細書では、しばしば「Fib L」と表記する）、及びp25/FHX(以下、「p25」と表記する)が合成されている。これら3つのタンパク質は、Fib H：Fib L：p25＝6:6:1の比率でSFEU（silk fibroin elementary unit）複合体を形成し、後部絹糸腺内腔中に分泌される。その後、SFEU複合体は中部絹糸腺内腔に移行し、セリシンで被覆され、絹糸として前部絹糸腺から吐糸される。したがって、絹糸虫をタンパク質発現系として利用する場合、中部又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子発現系を利用すればよい。
　本明細書において「発現ベクター」とは、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子又はその活性断片をコードするヌクレオチドを発現可能な状態で含み、その組換え遺伝子等の発現を制御できる発現単位をいう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能な様々な発現単位を利用することができる。例えば、自律複製可能なプラスミドベクター若しくはバクミド（Bacmid）ベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。本明細書では主にプラスミドベクターを使用する。本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクター（以下、本明細書ではしばしば「糖鎖付加剤発現ベクター」と表記する）は、2つ以上の独立したサブユニットで構成されていてもよい。この場合、サブユニット全体で1つの発現ベクターと解する。各サブユニットの構成については、後述する。
　本明細書において「目的の組換えタンパク質」とは、目的の組換え遺伝子にコードされたタンパク質であって、絹糸虫を用いたタンパク質生産系において絹糸腺内で生産すべき組換えタンパク質をいう。本明細書では、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫において、哺乳動物型糖鎖が付加される対象となる組換えタンパク質である。目的の組換えタンパク質は、1遺伝子由来又はその遺伝子断片由来の他、複数の遺伝子の一部を連結したキメラ遺伝子由来のいずれであってもよい。目的の組換えタンパク質のアミノ酸長は、特に限定はしない。アミノ酸残基数が8～10,000個であってもよい。例えば、オキシトシンのように僅か9アミノ酸からなるペプチドホルモンも包含する。本明細書における目的の組換えタンパク質の種類は特に限定はしないが、付加価値の高いタンパク質が好適である。例えば、インスリン、カルシトニン、パラトルモン及び成長ホルモンのようなペプチドホルモン、上皮成長因子（EGF）、繊維芽細胞成長因子（FGF）、インターロイキン（IL）、インターフェロン（IFN）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）及びトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）のようなサイトカイン、免疫グロブリン、アンチトロンビンIII、血清アルブミン、ヘモグロビン、各種酵素、又はコラーゲン、あるいはそれらの断片（キメラペプチドを含む）が挙げられる。
　本明細書において「目的の組換え遺伝子」とは、前記目的の組換えタンパク質をコードする原則として外来性の遺伝子をいう。本明細書において目的の組換え遺伝子は、発現ベクター内で中部及び／又は後部絹糸腺プロモーターに機能的に連結されて存在する。この発現ベクターは、糖鎖付加剤発現ベクターであってもよい。
１－３．構成
１－３－１．構成要素
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤は、糖鎖付加剤発現ベクターで構成される。糖鎖付加剤発現ベクターは、（１）絹糸虫由来の中部及び／又は後部絹糸腺プロモーター、（２）糖鎖付加関連遺伝子又はそのタンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド（本明細書では、しばしば「糖鎖付加関連遺伝子等」と表記する）を必須の構成要素として含む。また、糖鎖付加剤発現ベクターが、後述する第１サブユニットと第２サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合には、（３）転写調節因子をコードする遺伝子及び（４）該転写調節因子の標的プロモーターを必須の構成要素として包含する。その他、糖鎖付加剤発現ベクターは、前記糖鎖付加関連遺伝子等の発現に寄与し得る他の構成要素を含むことができる。他の構成要素とは、例えば、（５）ターミネーター、（６）標識遺伝子、（７）エンハンサー、（８）インスレーター、及び（９）トランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。以下、各構成要素について、具体的に説明をする。
（１）中部又は後部絹糸腺プロモーター
　本明細書において「中部又は後部絹糸腺プロモーター(MSG又はPSGプロモーター)」とは、糖鎖付加剤発現ベクターの必須構成要素であり、絹糸虫の中部又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子の発現を制御する部位特異的プロモーターをいう。
　絹糸虫の中部絹糸腺（MSG）で特異的に発現する遺伝子には、例えば、セリシン1（本明細書では、しばしば「Ser1」と表記する）遺伝子、セリシン2（本明細書では、しばしば「Ser2」と表記する）遺伝子、及びセリシン3（本明細書では、しばしば「Ser3」と表記する）遺伝子等が挙げられる。したがってSer1～Ser3遺伝子の発現を制御するプロモーター（本明細書では、それぞれSer1プロモーター、Ser2プロモーター、及びSer3プロモーターと称する）は、糖鎖付加剤発現ベクターの絹糸虫由来のMSGプロモーターとして好適である。これらのプロモーターの具体例として、カイコ由来の、配列番号１で示す塩基配列からなるSer1プロモーター、配列番号２で示す塩基配列からなるSer2プロモーター、及び配列番号３で示す塩基配列からなるSer3プロモーターが挙げられる。
　絹糸虫の後部絹糸腺（PSG）で特異的に発現する遺伝子には、例えば、Fib H遺伝子、Fib L遺伝子、又はp25遺伝子が挙げられる。したがってこれらの遺伝子の発現を制御するプロモーター（本明細書では、それぞれFib Hプロモーター、Fib Lプロモーター、及びp25プロモーターと称する）は、糖鎖付加剤発現ベクターの絹糸虫由来のPSGプロモーターとして好適である。これらのプロモーターの具体例として、カイコ由来の、配列番号４で示す塩基配列からなるFib Hプロモーター、配列番号５で示す塩基配列からなるFib Lプロモーター、及び配列番号６で示す塩基配列からなるp25プロモーターが、またサクサン由来の配列番号７で示す塩基配列からなるFib Hプロモーター及び配列番号８で示す塩基配列からなるFib Lプロモーターが、挙げられる。
　なお、MSG又はPSGプロモーターの塩基配列は、絹糸虫間で進化的に非常によく保存されている。したがって、例えば、PSGプロモーターは異なる絹糸虫種のPSGにおいても作動し得る蓋然性が高い（Sezutsu H., et al., 2009, Journal of Insect Biotechnology and Sericology, 78 :1-10）。よって、MSG又はPSGプロモーターの由来生物種と糖鎖付加剤発現ベクターを導入する絹糸虫の生物種は必ずしも同一種でなくてもよい。好ましくは同じ目に属する種、より好ましくは同じ科に属する種、さらに好ましくは同じ属に属する種、最も好ましいのは同種由来のプロモーターである。
　糖鎖付加剤発現ベクターは、MSG又はPSGプロモーターのどちらを含んでいてもよい。後述するように、糖鎖付加剤発現ベクターが2つの独立した発現ベクターで構成される場合、それぞれの発現ベクターは異なる絹糸腺プロモーターを含むこともできる。また1つの発現ベクター内に含まれる後述する複数の糖鎖付加関連遺伝子の発現を異なる絹糸腺プロモーターで制御してもよい。通常は、MSG又はPSGプロモーターのどちらか一方を含んでいれば足りる。好ましくはMSGプロモーターである。
　糖鎖付加剤発現ベクターにおいてMSG又はPSGプロモーターは、その下流域（3’末端側）の制御領域範囲内に後述する糖鎖付加関連遺伝子等又は転写調節因子をコードする遺伝子を配置できるように構成されている。
（２）糖鎖付加関連遺伝子等
　糖鎖付加関連遺伝子又はその遺伝子がコードするタンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド（糖鎖付加関連遺伝子等）は、前述のMSG又はPSGプロモーターと共に糖鎖付加剤発現ベクターにおける中心的な構成要素である。
　本明細書において「糖鎖付加関連遺伝子」とは、哺乳動物型糖鎖付加に関連するガラクト―ス転移酵素及び6種のシアル酸関連タンパク質をコードする遺伝子をいう。「その遺伝子がコードするタンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド」とは、糖鎖付加関連遺伝子がコードするタンパク質の部分ペプチドであって、そのタンパク質と同等以上の生理活性を有するペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドをいう。例えば、タンパク質の機能ドメインをコードするヌクレオチドが該当する。前記部分ペプチドのアミノ酸の長さは活性を有する限り特に限定しない。40アミノ酸以上、50アミノ酸以上、60アミノ酸以上、70アミノ酸以上、全長未満であればよい。以下、各糖鎖付加関連遺伝子について具体的に説明をする。
　Ａ．ガラクトース転移酵素
　「ガラクトース転移酵素（β1,4-galactosyltransferase：本明細書ではしばしば「GalT」と表記する）」は、ドナー基質であるUDPガラクトース（UDP-Gal）から糖タンパク質のGlcNAcβ1-2Manにガラクトースを転移する反応を触媒する酵素である。本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤においては、絹糸虫の絹糸腺由来タンパク質でN型糖鎖のGlcNAc非還元末端にガラクトースを付加する機能を有する。GalTは、複数のアイソザイムの存在が知られている。例えばマウスでは7種類のアイソザイムが同定されている。そのうち糖タンパク質に関与するのはGalT1、GalT2、GalT3、及びGalT4の4種であるが本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤としての活性を有するのはGalT1、GalT2、及びGalT3の3種であり、中でもGalT2が特に好ましい。したがって、本明細書でGalTと表記する場合、特に断りのない限り、GalT1、GalT2、及びGalT3のいずれかを意味するものとする。
　GalT遺伝子は、糖鎖付加剤発現ベクターにおいて必須の構成要素である。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるGalT遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。例えば、線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のGalT遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のGalT遺伝子である。具体的には、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるヒトGalT1をコードするヒトGalT1遺伝子（例えば、配列番号１０で示す塩基配列からなるヒトGalT1遺伝子）、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるラットGalT1遺伝子（例えば、配列番号１２で示す塩基配列からなるラットGalT1遺伝子）、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるマウスGalT1遺伝子（例えば、配列番号１４で示す塩基配列からなるマウスGalT1遺伝子）、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるヒトGalT2をコードするヒトGalT2遺伝子（例えば、配列番号１６で示す塩基配列からなるヒトGalT2遺伝子）、配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるラットGalT2遺伝子（例えば、配列番号１８で示す塩基配列からなるラットGalT1遺伝子）、配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるマウスGalT2遺伝子（例えば、配列番号２０で示す塩基配列からなるマウスGalT2遺伝子）、及び配列番号２１で示すアミノ酸配列からなるヒトGalT3をコードするヒトGalT3遺伝子（例えば、配列番号２２で示す塩基配列からなるヒトGalT3遺伝子）配列番号２３で示すアミノ酸配列からなるラットGalT3遺伝子（例えば、配列番号２４で示す塩基配列からなるラットGalT3遺伝子）、配列番号２５で示すアミノ酸配列からなるマウスGalT3遺伝子（例えば、配列番号２６で示す塩基配列からなるマウスGalT3遺伝子）が挙げられる。
　Ｂ．6種のシアル酸関連タンパク質
　「6種のシアル酸関連タンパク質」とは、絹糸虫の絹糸腺細胞内においてN型糖鎖のガラクトース非還元末端にシアル酸を付加する上で必要な一連のタンパク質であり、シアル酸転移酵素の基質合成関連酵素4種、シアル酸転移酵素、及び糖ヌクレオチドトランスポーターからなる。
　シアル酸転移酵素の基質合成関連酵素4種は、図２に示すようにGlcNAc-1-P（N-acetylglucosamine-1-phosphate）をCMP-Neu5Ac（CMP-N-acetylneuraminic acid：CMP-シアル酸）に変換するシアル酸合成経路において機能する酵素群であり、UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、Neu5Ac9-リン酸合成酵素、Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素、CMP-Neu5Ac合成酵素からなる。
　なお、本明細書ではシアル酸関連タンパク質をコードする遺伝子をしばしば「シアル酸関連遺伝子」と表記する。以下、6種のシアル酸関連タンパク質について説明する。
　「UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ（UDP-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase：本明細書ではしばしば「GNE」と表記する）」は、GlcNAc-1-PをUDP-GlcNAc（Uridine diphosphate N-acetylglucosamine）に、またUDP-GlcNAcをさらにManNac-6-P（N-acetylmannosamine-6-phosphate）に変換する触媒作用を有する。本明細書ではGNEをコードする遺伝子を「GNE遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるGNE遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のGEN遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のGNE遺伝子である。具体的には、配列番号２７で示すアミノ酸配列からなるヒトGNEをコードする遺伝子（例えば、配列番号２８で示す塩基配列からなるヒトGNE遺伝子）、配列番号２９で示すアミノ酸配列からなるラットGNEをコードするラットGNE遺伝子（例えば、配列番号３０で示す塩基配列からなるラットGNE遺伝子）、及び配列番号３１で示すアミノ酸配列からなるマウスGNEをコードするマウスGNE遺伝子（例えば、配列番号３２で示す塩基配列からなるマウスGNE遺伝子）が挙げられる。
　「Neu5Ac9-リン酸合成酵素（Neu5Ac9-phosphate synthase：本明細書ではしばしば「NANS」と表記する）」は、GNEの触媒作用によって生じたManNac-6-PをNeu5Ac-9-P（N-acetylneuraminic acid-9-phosphate）に変換する触媒作用を有する。本明細書ではNANSをコードする遺伝子を「NANS遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるNANS遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のNANS遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のNANS遺伝子である。具体的には、配列番号３３で示すアミノ酸配列からなるヒトNANSをコードするヒトNANS遺伝子（例えば、配列番号３４で示す塩基配列からなるヒトNANS遺伝子）、配列番号３５で示すアミノ酸配列からなるラットNANSをコードするラットNANS遺伝子（例えば、配列番号３６で示す塩基配列からなるラットNANS遺伝子）、及び配列番号３７で示すアミノ酸配列からなるマウスNANSをコードするマウスNANS遺伝子（例えば、配列番号３８で示す塩基配列からなるマウスNANS遺伝子）が挙げられる。
　「Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素（Neu5Ac9-phosphate phosphatase：本明細書ではしばしば「NANP」と表記する）」は、NANSの触媒作用によって生じたNeu5Ac-9-Pからリン酸を除去しNeu5Ac（N-acetylneuraminic acid）に変換する触媒作用を有する。本明細書ではNANPをコードする遺伝子を「NANP遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるNANP遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のNANP遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のNANP遺伝子である。具体的には、配列番号３９で示すアミノ酸配列からなるヒトNANPをコードするヒトNANP遺伝子（例えば、配列番号４０で示す塩基配列からなるヒトNANP遺伝子）、配列番号４１で示すアミノ酸配列からなるラットNANPをコードするラットNANP遺伝子（例えば、配列番号４２で示す塩基配列からなるラットNANP遺伝子）、及び配列番号４３で示すアミノ酸配列からなるマウスNANPをコードするマウスNANP遺伝子（例えば、配列番号４４で示す塩基配列からなるマウスNANP遺伝子）が挙げられる。
　「CMP-Neu5Ac合成酵素（CMP-Neu5Ac synthase：本明細書ではしばしば「CMAS」と表記する）」は、NANPの触媒作用によって生じたNeu5AcをCMP-Neu5Acに変換する触媒作用を有する。本明細書ではCMASをコードする遺伝子を「CMAS遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるCMAS遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のCMAS遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のCMAS遺伝子である。具体的には、配列番号４５で示すアミノ酸配列からなるヒトCMASをコードするヒトCMAS遺伝子（例えば、配列番号４６で示す塩基配列からなるヒトCMAS遺伝子）、配列番号４７で示すアミノ酸配列からなるラットCMASをコードするラットCMAS遺伝子（例えば、配列番号４８で示す塩基配列からなるラットCMAS遺伝子）、及び配列番号４９で示すアミノ酸配列からなるマウスCMASをコードするマウスCMAS遺伝子（例えば、配列番号５０で示す塩基配列からなるマウスCMAS遺伝子）が挙げられる。
　「シアル酸転移酵素（α2,6-sialyltransferase：本明細書ではしばしば「ST6GAL1」と表記する）」は、糖転移酵素の一種であり、前記シアル酸合成経路で合成され、SLC35A1の作用によりゴルジ装置内に輸送されたドナー基質CMP-Neu5Acから受容体基質である糖タンパク質及び糖脂質中の糖鎖構造にシアル酸残基を転移する反応を触媒する。本明細書ではST6GAL1をコードする遺伝子を「ST6GAL1遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるST6GAL1遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のST6GAL1遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のST6GAL1遺伝子である。具体的には、配列番号５１で示すアミノ酸配列からなるヒトST6GAL1をコードするヒトST6GAL1遺伝子（例えば、配列番号５２で示す塩基配列からなるヒトST6GAL1遺伝子）、配列番号５３で示すアミノ酸配列からなるラットST6GAL1をコードするラットST6GAL1遺伝子（例えば、配列番号５４で示す塩基配列からなるラットST6GAL1遺伝子）、及び配列番号５５で示すアミノ酸配列からなるマウスST6GAL1をコードするマウスST6GAL1遺伝子（例えば、配列番号５６で示す塩基配列からなるマウスST6GAL1遺伝子）が挙げられる。
　本明細書において「糖ヌクレオチドトランスポーター」とは、ゴルジ装置へのシアル酸輸送能を有するトランスポータータンパク質をいう。例えば、シアル酸トランスポーターが該当する。
　「シアル酸トランスポーター（CMP-Neu5Ac transporter：本明細書ではしばしば「SLC35A1」と表記する）」は、ゴルジ装置の膜上に存在する膜輸送タンパク質の一種であり、前記シアル酸合成経路で合成されたCMP-Neu5Acをゴルジ装置内に輸送する作用を有する。本明細書ではSLC35A1をコードする遺伝子を「SLC35A1遺伝子」と表記する。糖鎖付加剤発現ベクターにおけるSLC35A1遺伝子の由来生物種は、特に限定はしない。線虫や昆虫等の無脊椎動物、脊索動物、魚類、両生類及び哺乳動物等の脊椎動物等、いずれの生物由来のSLC35A1遺伝子も使用することができる。好ましくは、ヒト、ラット、マウス等の哺乳動物由来のSLC35A1遺伝子である。具体的には、配列番号５７で示すアミノ酸配列からなるヒトSLC35A1をコードするヒトSLC35A1遺伝子（例えば、配列番号５８で示す塩基配列からなるヒトSLC35A1遺伝子）、配列番号５９で示すアミノ酸配列からなるラットSLC35A1をコードするラットSLC35A1遺伝子（例えば、配列番号６０で示す塩基配列からなるラットSLC35A1遺伝子）、及び配列番号６１で示すアミノ酸配列からなるマウスSLC35A1をコードするマウスSLC35A1遺伝子（例えば、配列番号６２で示す塩基配列からなるマウスSLC35A1遺伝子）が挙げられる。
　糖鎖付加剤発現ベクターには、前記6種のシアル酸関連遺伝子のうち、SLC35A1遺伝子を除くGNE遺伝子、NANS遺伝子、NANP遺伝子、CMAS遺伝子及びST6GAL1遺伝子の5種からなる群から選択される3種以上の遺伝子が必須の構成要素として含まれる。例えば、3種であれば、GNE遺伝子、CMAS遺伝子及びST6GAL1遺伝子の組が挙げられる。また、4種であればGNE遺伝子、NANP遺伝子、CMAS遺伝子及びST6GAL1遺伝子の組が挙げられる。好ましくは5種全ての選択である。一方、SLC35A1遺伝子は、糖鎖付加剤発現ベクターにおいて選択構成要素である。SLC35A1遺伝子を加えることで発明の効果が増強されることから、6種全てを含む場合が特に好ましい。
　前記各遺伝子は、野生型遺伝子が好ましいが、各遺伝子がコードするタンパク質の活性を維持する限り変異型遺伝子であってもよい。例えば、SNPsのような遺伝子多型による変異型遺伝子が挙げられる。このような変異型遺伝子には、野生型遺伝子の塩基配列において1～複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基酸配列からなる遺伝子、野生型遺伝子の塩基配列に対して70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の塩基同一性を有する塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。本明細書において「複数個」とは、例えば、2～20個、2～15個、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個をいう。「塩基同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じていずれかの塩基配列にギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、野生型遺伝子の全塩基残基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
（３）転写調節因子をコードする遺伝子
　本明細書において「転写調節因子をコードする遺伝子」とは、後述する第1サブユニットの必須構成要素であって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
（４）該転写調節因子の標的プロモーター
　本明細書において「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第2サブユニットの必須構成要素であって、第1サブユニットにコードされた転写調節因子が結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS（Upstream Activating Sequence）が使用される。
　糖鎖付加剤発現ベクターにおいて転写調節因子の標的プロモーターは、その下流域の制御領域範囲内に前述の糖鎖付加関連遺伝子等を配置できるように構成されている。
（５）ターミネーター
　本明細書において「ターミネーター」は、本態様の糖鎖付加剤発現ベクターにおいて遺伝子等の発現時にその転写を終結できる塩基配列で構成される選択構成要素である。
（６）標識遺伝子
　本明細書において「標識遺伝子」は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。標識タンパク質は、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。それ故、糖鎖付加剤発現ベクターが標識遺伝子を含むことによって、糖鎖付加剤発現ベクターを保有している遺伝子組換え絹糸虫を標識タンパク質の活性に基づいて容易に判別することができる。ここで「活性に基づいて」とは「活性の検出結果に基づいて」という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出してもよいし、標識タンパク質の活性によって生成される色素のような代謝物を介して間接的に検出してもよい。検出は、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
　標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によってその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。好ましくは検出に際して遺伝子組換えカイコに対する侵襲性が低い標識タンパク質である。例えば、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質、外部形態を制御するタンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、及び外部分泌タンパク質は、特定の条件下で視覚的に検出可能なことから、遺伝子組換えカイコに対する侵襲性が非常に低く、判別及び選抜が容易なことから特に好適である。
　前記蛍光タンパク質は、特定波長の励起光を遺伝子組換えカイコに照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、AmCyan、RFP、DsRed（DsRed monomer、DsRed2のような派生物を含む）、YFP、GFP（EGFP、EYFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
　前記色素合成タンパク質は、色素の生合成に関与するタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。好ましくは個体の外部色彩として表れる色素である。例えば、メラニン系色素（ドーパミンメラニンを含む）、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
　前記発光タンパク質は、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、イクオリン、酵素としてのルシフェラーゼが挙げられる。
　本明細書において外部分泌タンパク質とは、細胞外又は体外に分泌されるタンパク質であり、外分泌性酵素等が該当する。外分泌性酵素には、ブラストサイジンのような薬剤の分解又は不活化に寄与し、宿主に薬剤耐性を付与する酵素の他、消化酵素が該当する。
　標識遺伝子は、糖鎖付加剤発現ベクターにおいて、プロモーターの下流に発現可能な状態で配置される。使用するプロモーターは、中部又は後部絹糸腺と同一であってもよいし、異なっていてもよい。
（７）エンハンサー
　「エンハンサー」は、プロモーターと協調して標的遺伝子の転写量を増大させることのできる遺伝子発現活性化領域で、特定のDNA配列で構成される。プロモーターと異なり、標的遺伝子の上流域（5’末端側）のみならず、下流域（3’末端側）や標的遺伝子内に配置され、標的遺伝子の転写を調節する。
（８）インスレーター
　本明細書において「インスレーター」とは、糖鎖付加剤発現ベクターの選択構成要素であり、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
（９）トランスポゾンの逆位末端反復配列
　本明細書において「トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRS:Inverted terminal repeat sequence)」は、糖鎖付加剤発現ベクターが相同組換え可能な発現ベクターの場合に含まれ得る選択構成要素である。逆位末端反復配列は、通常は2個1組で使用され、トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる（Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281；Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9（2）:145-55）。
１－３－２．糖鎖付加剤発現ベクターのユニット構成
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する糖鎖付加剤発現ベクターは、糖鎖付加関連遺伝子等をMSG又はPSGプロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置している。ここで「直接的又は間接的な発現制御」とは、糖鎖付加剤発現ベクターにおけるMSG又はPSGプロモーターと糖鎖付加関連遺伝子等の配置関係を意味するものであり、これは、糖鎖付加剤発現ベクターのユニット構成に依存する。糖鎖付加剤発現ベクターは、1つのユニットで構成される場合と、2つのサブユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
（１）1つのユニットで構成される場合
　糖鎖付加剤発現ベクターは、絹糸虫細胞内で糖鎖付加関連遺伝子等を発現させる上で必要な全ての構成要素を1つの糖鎖付加剤発現ベクター内に含む。具体的には、必須の構成要素であるMSG又はPSGプロモーター及びそのプロモーターの下流に機能的に連結された糖鎖付加関連遺伝子等を含む。
　本明細書で「機能的に連結」とは、各糖鎖付加関連遺伝子等が発現可能な状態で糖鎖付加剤発現ベクター内に組み込まれていることを意味する。具体的には、前記各糖鎖付加関連遺伝子等が糖鎖付加剤発現ベクター内のMSG又はPSGプロモーター制御下である下流に配置されていることをいう。したがって、1つのユニットで構成される場合、糖鎖付加関連遺伝子等はMSG又はPSGプロモーターによる直接的な発現制御を受けることになる。
　糖鎖付加剤発現ベクターが1つのユニットで構成される場合、その糖鎖付加剤発現ベクターを有する遺伝子組換え絹糸虫は、絹糸腺内で生産する組換えタンパク質に常に哺乳動物型糖鎖を付加することができる。
（２）2つのサブユニットで構成される場合
　糖鎖付加剤発現ベクターが第１サブユニット及び第２サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合、糖鎖付加関連遺伝子等の発現に必須の構成要素は各サブユニットに分割されて存在する。したがって、本構成では、第１及び第２サブユニットが宿主の絹糸虫細胞内に併存してはじめて1つの糖鎖付加剤発現ベクターとして機能する。具体的には、同一細胞内で第１サブユニットに含まれるプロモーターの活性化により第１サブユニットから転写調節因子が発現し、それが第２サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的の糖鎖付加関連遺伝子等を発現することができる。したがって、2つのサブユニットで構成される場合、糖鎖付加関連遺伝子等はMSG又はPSGプロモーターによる間接的な発現制御を受けることになる。第１及び第２サブユニットは、以下の構成を有する。
　「第１サブユニット」は、前記MSG又はPSGプロモーターとそのプロモーターの下流に発現可能な状態で連結された転写調節因子の遺伝子を含んでなる。このとき、1つのMSG又はPSGプロモーター制御下に2以上の転写調節因子を連結していてもよい。例えば、MSGプロモーター制御下にGAL4及びtTAが連結される場合が挙げられる。また、第１サブユニットは、MSG又はPSGプロモーターとその制御下にある転写調節因子の遺伝子からなる組を2組以上有することもできる。この場合、各組は同一の組であっても、又は異なる組であってもよい。例えば、第1サブユニットがMSGプロモーターとGAL4遺伝子からなる組、及び後部絹糸腺プロモーターとGAL4遺伝子からなる組を含む場合が挙げられる。
　なお、第１サブユニットに包含されるプロモーターは、既知のMSG又はPSGプロモーターを利用できることから、カイコ等の絹糸虫用に作製されたMSG又はPSGプロモーターを有する既存の遺伝子発現ベクターを利用することもできる。
　「第２サブユニット」は、前記第１サブユニットにコードされた転写調節因子の標的プロモーターとその標的プロモーターの下流に機能的に連結された糖鎖付加関連遺伝子等を含んでなる。第2サブユニットに含まれる標的プロモーターは、第1サブユニットにコードされる転写調節因子によって活性化されるプロモーターである。したがって、第1サブユニットにコードされる転写調節因子によって第２サブユニットに含まれる標的プロモーターは、原則として一義的に決定される。例えば、標的プロモーター第1サブユニットに含まれる転写調節因子の遺伝子がGAL4遺伝子であれば、第２サブユニットのGAL4標的プロモーターにはUASが使用される。第２サブユニットは、1つの標的プロモーター制御下に同一の又は異なる糖鎖付加関連遺伝子等を2以上含んでいてもよい。例えば、第２サブユニットが1つのUASの制御下にGNE遺伝子、CMAS遺伝子及びST6GAL1遺伝子からなる3つの遺伝子を配置している場合、GNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子及びNANP遺伝子からなる4つの遺伝子を配置している場合、GNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子、NANS遺伝子及びNANP遺伝子からなる5つの遺伝子を配置している場合、GNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子、NANS遺伝子、NANP遺伝子及びSLC35A1遺伝子からなる6つの遺伝子を配置している場合、そしてGNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子、NANS遺伝子、NANP遺伝子、SLC35A1遺伝子、及びGalT遺伝子からなる7つの遺伝子を配置している場合が該当する。
　また、第２サブユニットは、標的プロモーターとその制御下にある糖鎖付加関連遺伝子等からなる組を2組以上有していてもよい。この場合、各組は同一の組であっても、又は異なる組であってもよい。例えば、第２サブユニットが2つのUASを含み、1つのUASの制御下に、GNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子、NANS遺伝子、NANP遺伝子、及びSLC35A1遺伝子からなる6つの遺伝子を配置し、他のUASの制御下にGalT遺伝子を配置している場合が該当する。
　さらに、第２サブユニットは、糖鎖付加関連遺伝子等を含む同一の又は異なる2以上のユニットで構成されていてもよい。この場合、1つの第1サブユニットから発現した転写調節因子は、複数の第2サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって、それぞれの第２サブユニットに含まれる糖鎖付加関連遺伝子等を発現することができる。例えば、第２AサブユニットがUASの制御下にGNE遺伝子、CMAS遺伝子、ST6GAL1遺伝子、NANS遺伝子、NANP遺伝子、及びSLC35A1遺伝子からなる6つの遺伝子を配置し、第２BサブユニットUASの制御下にGalT遺伝子を配置している場合が該当する。
　糖鎖付加剤発現ベクターが2つのサブユニットで構成される場合、第１サブユニットは公知又は既存の中部又は後部絹糸腺特異的な遺伝子発現ベクターを利用できることから、そのような遺伝子発現ベクターを含む既存の遺伝子組換え絹糸虫系統を利用できる。
　本構成の糖鎖付加剤発現ベクターは、第１サブユニットにコードされた転写調節因子を介して第２サブユニットの糖鎖付加関連遺伝子等の発現を増幅させることができる。したがって、糖鎖付加関連遺伝子等を宿主細胞内で過剰発現させる上で好適である。
１－３－３．哺乳動物型糖鎖付加剤の構成
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤は、独立した1～3つの糖鎖付加剤発現ベクターからなる。本明細書において「独立した」とは、1つの糖鎖付加剤発現ベクターのみで糖鎖付加関連遺伝子等を少なくとも1種発現することのできる1つの発現単位として機能し得ることを意味する。したがって、前述した2つのサブユニットで構成される糖鎖付加剤発現ベクターの場合、それぞれのサブユニットは「独立」しているとは言わず、複数のサブユニットをまとめて「独立」していると解する。一方、1つのユニットで構成される場合、そのユニットは「独立」していると解することができる。
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤が独立した複数の糖鎖付加剤発現ベクターで構成される場合、各糖鎖付加剤発現ベクターが包含する糖鎖付加関連遺伝子等の組み合わせは特に限定はしない。例えば、第１の糖鎖付加剤発現ベクター（第１発現ベクター）にGalT遺伝子のみを含み、第２の糖鎖付加剤発現ベクター（第２発現ベクター）にシアル酸関連遺伝子を3種以上含んでいてもよい。また第１発現ベクターにGalT遺伝子のみを含み、第２発現ベクターにSLC35A1遺伝子を除くシアル酸関連遺伝子を3種以上含み、そして第３の糖鎖付加剤発現ベクター（第３発現ベクター）にSLC35A1遺伝子のみを含んでいてもよい。
１－４．導入方法
　本態様の哺乳動物型糖鎖付加剤を宿主に適用し、宿主細胞内に糖鎖付加剤発現ベクターを導入する方法について、説明をする。
　糖鎖付加剤発現ベクターを導入する宿主は、絹糸虫個体、絹糸虫由来の細胞（株化細胞を含む）、又は、絹糸虫由来の組織のいずれであってもよい。個体の場合にはその個体の発生ステージは問わない。胚、幼虫、蛹、又は成虫のいずれのステージであってもよい。好ましくは、高い効果が期待できる胚時期である。また、宿主の雌雄も問わない。同様に、細胞若しくは組織の場合にはそれが採取された又はそれが由来する個体の発生ステージは問わない。
　導入方法は、導入状況に応じて当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、導入する宿主がカイコで、外因性遺伝子発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列（Handler AM. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:7520-5）を有するプラスミドの場合であれば、Tamuraらの方法（Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）を利用して導入できる。簡単に説明すると、前記糖鎖付加剤発現ベクターと共にトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するヘルパーベクターをカイコの初期胚にインジェクションすればよい。前記ヘルパーベクターとしては、例えば、pHA3PIGが挙げられる。本態様の糖鎖付加剤発現ベクターが標識遺伝子を含む場合には、その遺伝子等の発現に基づいて形質転換体を容易に選抜することができる。なお、この方法で得られた遺伝子組換えカイコは、糖鎖付加剤発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列を介して染色体中に組み込まれている。得られた遺伝子組換えカイコを必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、染色体に挿入された発現ベクターのホモ接合体を得てもよい。
２．哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫である。本発明の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫は、前記第１態様の糖鎖付加剤発現ベクターを有し、MSG及び／又はPSGにおいて生産させる組換えタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加できることを特徴とする。
２－２．構成
　本明細書において「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫（本明細書では、しばしば「糖鎖付加絹糸虫」と略称する）」とは、第１態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターを有する遺伝子組換え絹糸虫をいう。宿主である絹糸虫は、前述したいずれの絹糸虫であってもよい。飼育方法や人工試料が確立しており、多頭飼育が可能なカイコ、エリサン及びサクサンは特に好ましい。宿主がカイコの場合、本態様の「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫」を「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ（本明細書では、しばしば「糖鎖付加カイコ」と略称する）」と称する。また、哺乳動物型糖鎖は、ヒト型糖鎖であることが好ましい。
　本発明の糖鎖付加絹糸虫は、第１態様の糖鎖付加剤発現ベクターを細胞内に一過的に有していてもよいし、ゲノム中に導入された状態等で安定的に有していてもよい。安定的に有することが好ましい。
　本発明の糖鎖付加絹糸虫は、第１態様の異なる糖鎖付加剤発現ベクターを2以上有することができる。例えば、第１態様に記載した第１発現ベクターと第２発現ベクターを有する場合が該当する。哺乳動物型糖鎖付加を達成する上で必須の糖鎖付加関連遺伝子等を第１発現ベクターと第２発現ベクターが分割して含む場合、第１発現ベクターと第２発現ベクターの両方を有する糖鎖付加絹糸虫が本発明の効果を奏し得る。また、糖鎖付加剤発現ベクターが第1サブユニット及び第２サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合も両方のサブユニットを有する糖鎖付加絹糸虫が本発明の効果を奏し得る。
　糖鎖付加剤発現ベクターが異なる2つ又は3つの発現ベクター（第１～第３発現ベクター）を有し、それぞれが遺伝子組換え絹糸虫の染色体に挿入されている場合、各発現ベクターは同一染色体上に存在していてもよいし、異なる染色体上に存在していてもよい。各発現ベクターが異なる染色体上に存在する場合、第１発現ベクターのみを有する遺伝子組換え絹糸虫系統と、第２発現ベクターのみを有する遺伝子組換え絹糸虫系統を交配すれば、交配第１世代（F1）で第1発現ベクターと第２発現ベクターを有する本発明の糖鎖付加絹糸虫を容易に入手できる。一方、第1発現ベクター及び第２発現ベクターが同一染色体上に存在する場合には、継代過程で組換えによってそれぞれが分離しないように、サブユニット間の距離が近く、互いに連鎖している方が好ましい。
　糖鎖付加剤発現ベクターが第１及び第２サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合も同様である。例えば、第１及び第２サブユニットが異なる染色体上に存在する場合、第１発現ベクターのみを有する遺伝子組換え絹糸虫系統と、第２発現ベクターのみを有する後述の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統を交配すれば、F1で第1及び第２サブユニットを有する本発明の糖鎖付加絹糸虫を容易に入手できる。
３．哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統である。本発明の組換え絹糸虫作出系統は、第１態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターの一部を有する遺伝子組換え絹糸虫及びその後代である。本系統を用いることで、糖鎖付加絹糸虫を自在に、かつ容易に作出することができる。
３－２．構成
　本明細書で「哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統（本明細書では、しばしば「糖鎖付加絹糸虫作出系統」と略称する）」とは、絹糸腺内で生産されるタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加する潜在性を有した継代可能な遺伝子組換え絹糸虫又はその後代をいう。宿主である絹糸虫は、いずれの絹糸虫であってもよいが、第２態様の糖鎖付加絹糸虫と同様の理由からカイコ、エリサン及びサクサンが好ましい。宿主がカイコの場合、本態様の「糖鎖付加絹糸虫作出系統」は「糖鎖付加カイコ作出系統」と称する。また、哺乳動物型糖鎖は、ヒト型糖鎖であることが好ましい。
　糖鎖付加絹糸虫作出系統は、第１態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターの一部を有する。「糖鎖付加剤発現ベクターの一部」とは、糖鎖付加剤発現ベクターが2つ又は3つの発現ベクターで構成されるときに、その一部の発現ベクターのみを有する場合や糖鎖付加剤発現ベクターが2つのサブユニットで構成されるときに、第２サブユニットのみを有する場合が該当する。つまり、糖鎖付加絹糸虫作出系統は、第１態様に記載の糖鎖付加剤発現ベクターの一部を有することにより、絹糸腺内で生産されるタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加する潜在性を有するものの、糖鎖付加に必要な最低限の糖鎖付加関連遺伝子等を含まないことから単独では哺乳動物型糖鎖を付加することができない。一方、他の糖鎖付加絹糸虫作出系統と交配して必要な最低限の糖鎖付加関連遺伝子等を一個体内に充足させることによって、又は第１サブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫と交配して第２サブユニットが含む必要な最低限の糖鎖付加関連遺伝子等の発現を誘導することによって、目的の糖鎖付加絹糸虫を必要な時に、容易に作出することができる。なお、第１サブユニットのみを有する遺伝子組換え絹糸虫系統は、哺乳動物型糖鎖を付加する直接的な潜在性はないことから、本発明の糖鎖付加絹糸虫作出系統には該当しない。
４．哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出方法
４－１．概要
　本発明の第４の態様は、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫（糖鎖付加絹糸虫）を作出する方法である。本発明は、絹糸腺で発現させる目的の組換えタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加できる糖鎖付加絹糸虫を作出できることを特徴とする。
４－２．方法
　本発明の遺伝子組換え絹糸虫の作出方法は、交配工程と選抜工程を含む。以下、各工程について説明をする。
（１）交配工程
　「交配工程」とは、第３態様に記載の第２サブユニットを有する糖鎖付加絹糸虫作出系統と第１サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫系統を交配する必須の工程である。宿主である絹糸虫は、いずれの絹糸虫であってもよいが、第２態様の糖鎖付加絹糸虫と同様の理由からカイコ、エリサン及びサクサンが好ましい。交配は、前記2つの絹糸虫系統を常法に基づいて行えばよい。原則として同種の雌雄間で行う。
　それぞれのサブユニットがゲノム内に挿入された遺伝子組換え絹糸虫で、交配に用いる糖鎖付加絹糸虫作出系統及び遺伝子組換え絹糸虫系統の絹糸虫は、兄妹交配又は同系交配を行い、各サブユニットに関して予めホモ接合体にしておくことが好ましい。これによって、全ての交配第１世代（F1）個体は両サブユニットを有する糖鎖付加絹糸虫となる。この場合、次の選抜工程は必須工程ではなくなり、確認のために必要に応じて行う選択工程となる。
（２）選抜工程
　「選抜工程」とは、F1個体から2つのサブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を糖鎖付加絹糸虫として選抜する工程である。本工程では、交配工程後に得られるF1個体から、それぞれのサブユニットにコードされた標識タンパク質の活性に基づいて両者の標識タンパク質活性を有する個体を目的の糖鎖付加絹糸虫として選抜すればよい。
　以下で本発明の実施形態について例を挙げて説明する。ただし、ここに記載した実施形態は、本発明を実施するための形態を具体的に説明するための一例に過ぎず、本発明の範囲が以下の実施例範囲に限定されることを示すものではない。
＜実施例１：各発現ベクターの構築＞
（目的）
　本発明の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する糖鎖付加剤発現ベクター及び目的の組換えタンパク質を含む発現ベクターを構築する。
　本明細書の実施例では、各発現ベクターに第１サブユニットと第２サブユニットの2つのサブユニットからなる発現ベクターを採用した。すなわち、本明細書の実施例で使用する発現ベクターは、MSGプロモーター及びその下流に機能的に連結されたGAL4遺伝子を含む第１サブユニットと、UASプロモーターの下流に機能的に連結された各糖鎖関連遺伝子及び各目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む第２サブユニットで構成されている。
（方法）
１．第１発現ユニットの構築
　（１）中部絹糸腺発現用第１サブユニットの構築
　中部絹糸腺（MSG）での遺伝子発現を誘導する第１サブユニットとして、MSGで特異的に発現するセリシン１遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子GAL4遺伝子、さらにその下流に結合したhsp70 polyA付加配列を有するpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を構築した。
　セリシン1遺伝子プロモーターは、カイコセリシン１遺伝子の-666から+40（転写開始点をO位とする。以下同様）に相当する配列番号１で示すプロモーター包含領域を、カイコ大造系統のゲノムDNAを鋳型として、プライマーペア配列番号６３で示すAscIサイトを含むプライマーと配列番号６４で示すBamHIサイトを含むプライマーを用いてPCRで増幅して調製した。増幅断片をpCR-Blunt II-TOPOベクター（Thermo Fisher Scientific社）に挿入し、AscI及びBamHIで切断した後、プロモーター領域を含むAscI-BamHI増幅断片をpBacA3dGAL4（Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75:89-97）におけるGAL4遺伝子上流のAscI-BamHIサイトに挿入した。このプラスミドに、pBacA3GAL4/3xP3DsRed2（Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75:89-97）からBglIIにより切り出した3xP3-DsRedカセットを選抜マーカーとして挿入し、MSG発現用第１サブユニットpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を構築した。
２．第２発現ユニットの構築
　（１）基本ベクターの構築
　pBac[SerUAS-hr5/3xP3-EGFPinv]（Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150）を鋳型として、プライマーペアSerTATA-U（配列番号６５）及びBlnBsmSerK-L（配列番号６６）を用いてPCRを行い増幅産物SnaBI-BsmBI断片を得た。次に、pBac[SerUAS_Ser1intron_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]（Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150）をSnaBI及びBsmBIで切断して短断片を除き、SnaBI-BsmBIサイトに前記SnaBI-BsmBI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]とした。続いて、pHC-EGFPを鋳型として、プライマーペアFibHsig-U（配列番号６７）及びFibHsig-L（配列番号６８）を用いてPCRを行い増幅産物BspH-BlnI断片を得た。前述のpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]をBsmBI及びBlnIで切断して短断片を除き、BsmBI-BlnIサイトに、前記BspH-BlnI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]とし、発現ベクターにおける第２発現ユニットの基本発現ベクターとした。
　（２）糖鎖付加剤発現ベクターの構築
　　Ａ．GalT発現ベクターの構築
　（従来型GalT2発現ベクターの構築）
　セリシン1遺伝子のプロモーター領域と3’UTR領域を、それぞれカイコゲノムDNAを鋳型として増幅した後、両増幅断片をoverlap-extension PCRにより連結した。この際、プロモーター領域と3’UTRの境界にBlnIサイトを挿入した。この連結断片をpTAベクター（TOYOBO社）に挿入したものをpTA2[Ser-UTR]とした。pTA2[Ser-UTR]のBlnIサイトにGAL4Δ断片（Kobayashi I., et al., 2011, Arch Insect Biochem Physiol, 76:195-210）を挿入したものをpTA2[Ser-GAL4Δ]とした。pTA2[Ser-GAL4Δ]のAscI断片をpBac[A3KMO, UAS]（Kobayashi I., et al., 2007, J. Insect Biotechnol Sericol, 76:145-48）のAscIサイトに挿入したものをpBac[A3KMO, UAS, Ser-GAL4Δ]とした。
　マウス由来GalT2のopen reading frameをPCRで末端にBlnIサイトが付加するように増幅した。この断片をpBac[A3KMO, UAS, Ser-GAL4Δ]のBlnIサイトに挿入したものを従来型GalT2発現ベクターであるpBac[SerUAS-GalT2p/A3-KMO_A3-Bla]とした。
　（改良型発現GalTベクターの基本ベクターの構築）
　上記（１）で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]をAscI及びXhoIで切断して短断片を除き、AscI-XhoIサイトにAscI-NheI-XhoI-U（配列番号６９）及びAscI-NheI-XhoI-L（配列番号７０）をアニーリングして作製したアダプターを挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/NheIad_A3-Bla]とした。このプラスミドのNheIサイトにpBac[A3KMO, UAS, Ser-GAL4Δ]のNheI断片を挿入した。これをpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/A3-KMO_A3-Bla]とした。
（各改良型GalT発現ベクターの構築）
　マウス由来のGalT1～GalT4遺伝子を、マウスGalT1用プライマーペアBspHI-mGalT1 U（配列番号７１）及びマウスBlnI-mGalT1 L（配列番号７２）、GalT2用BsmBI-GalT2-U（配列番号７３）及びBsmBI-GalT2-L（配列番号７４）、マウスGalT3用BsmBI-mGalT3 U（配列番号７５）及びマウスBsmBI-mGalT3 L（配列番号７６）、及びマウスGalT4用NcoI-mGalT4 U（配列番号７７）及びマウスBlnI-mGalT4 L（配列番号７８）を用いてPCRを行った。それぞれの増幅産物を各プライマー名に記載の制限酵素で切断処理した後、上記改良型GalTベクターの基本ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/A3-KMO_A3-Bla]のBsmBIサイトに挿入した。得られた改良型GalT発現ベクターのそれぞれをpBac[SerUAS-GalT1/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT2i/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT3/A3-KMO_A3-Bla]、及びpBac[SerUAS-GalT4/A3-KMO_A3-Bla]とした。なお、GalT2pは従来型GalT2を、GalT2iは改良型GalT2を示す。
　　Ｂ．シアル酸関連遺伝子発現ベクターの構築
　（UASユニットベクターの構築）
　前記（１）で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_Ser1kozak_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]を鋳型としてプライマーペアserUASUNhe（配列番号７９）及びserPolyALSpe（配列番号８０）でPCRを行った。得られた増幅産物をpZErO2（Thermo Fisher Scientific社）のEcoRVサイトに挿入した。これをUASユニットベクターSerUAS_unit/pZErO2とした。
　（シアル酸関連遺伝子断片のUASユニットベクターへの挿入）
　シアル酸関連遺伝子（GNE、NANS、NANP、CMAS、ST6GAL1、及びSLC35A1の各遺伝子）は、各遺伝子のORFを以下のプライマーペアを用いたPCRにより増幅し、各シアル酸関連遺伝子断片を得た。GNE遺伝子用プライマーペアにはr2epiU（配列番号８１）及びr2epiL（配列番号８２）を、NANS遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_NANS_U（配列番号８３）及びBsmBI_NANS_L（配列番号８４）を、NANP遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_NANP_U（配列番号８５）及びBsmBI_NANP_L（配列番号８６）を、CMAS遺伝子用プライマーペアにはhCSSU（配列番号８７）及びhCSSL（配列番号８８）を、SLC35A1遺伝子用プライマーペアにはBsmBI_hCST_U（配列番号８９）及びBsmBI_hCST_L（配列番号９０）を、そしてST6GAL1遺伝子用プライマーペアにはhSTU（配列番号９１）及びhSTL（配列番号９２）を用いた。各シアル酸関連遺伝子断片をBsmBIで切断した後、前述のUASユニットベクターSerUAS_unit/pZErO2のBsmBIサイトへ挿入した。完成した各シアル酸関連遺伝子を含むUASユニットベクターをUAS-GNE/pZErO2（GNE発現用）、UAS-NANS/pZErO2（NANS発現用）、UAS-NANP/pZErO2（NANP発現用）、UAS-CMAS/pZErO2（CMAS発現用）、UAS-ST6GAL1/pZErO2（ST6GAL1発現用）、及びUAS-SLC35A1/pZErO2（SLC35A1発現用）とした。
　（HS4インスレーターユニットベクターの構築）
　配列番号９３で示す塩基配列からなるHS4インスレーター配列をGenscript社で委託合成し、NheI及びSpeIで切り出し、元のHS4インスレーターが入っているベクターのSpeIサイトへ挿入した。これを繰り返し、HS4インスレーターが4回繰り返しになったプラスミドを構築した。これをHS4x4/pUCとした。
　（piggyBac/3xP3AmCyanベクターの構築）
　pBac[SerUAS/3xP3EGFP]（Tatematsu K, et al., 2010, Transgenic Res. 19(3):473-87)のEcoRV-PstIサイトにSpeIadaptU（配列番号９４）及びSpeIadaptL（配列番号９５）をアニーリングして作製したアダプターを挿入した。これをpBac[3xP3EGFP]とした。pBac[3xP3EGFP]のEcoRIサイトにpBac[SerUAS_Ser1intron_hr5/3xP3-AmCyan_A3-Bla] (Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150)のEcoRI断片を挿入した。これをpBac[3xP3AmCyan]とした。
　（piggyBac/3xP3AmCyanへのUASシアル酸ユニット及びHS4インスレーターの挿入）
　各シアル酸関連遺伝子を含む前述のUASユニットベクターUAS-GNE/pZErO2（GNE発現用）、UAS-NANS/pZErO2（NANS発現用）、UAS-NANP/pZErO2（NANP発現用）、UAS-CMAS/pZErO2（CMAS発現用）、UAS-ST6GAL1/pZErO2（ST6GAL1発現用）、及びUAS-SLC35A1/pZErO2（SLC35A1発現用）と、HS4インスレーターユニットベクターHS4x4/pUCをそれぞれNheI及びSpeIで切断した。続いて、UAS-GNE/pZErO2、UAS-CMAS/pZErO2及びUAS-ST6GAL1/pZErO2の3種のNheI-SpeI断片とHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片をpiggyBac/3xP3AmCyanのSpeIサイトへ、各UASシアル酸ユニットとHS4インスレーターが交互に連結された状態となるように挿入した。これをpBac[HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした（以下、pBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]と略記する）。次に、このpBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]に、UAS-NANS/pZErO2及びUAS-NANP/pZErO2で示す2種のNheI-SpeI断片がHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片に挟み込まれた状態となるように再度挿入した。これをpBac[HS4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-GNE-HS4- UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした（以下、pBac[UAS-NANS/NANP/ GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]と略記する）。また、pBac[UAS-GNE/CAMS/ST6GAL1/3xP3AmCyan]に、UAS-NANS/pZErO2、UAS-NANP/pZErO2及びUAS-SLC35A1/pZErO2で示す3種のNheI-SpeI断片がHS4インスレーターを含むNheI-SpeI断片に挟み込まれた状態となるように挿入した。これをpBac[HS4-UAS-NANS-HS4-UAS-NANP-HS4-UAS-SLC35A1-HS4-UAS-GNE-HS4-UAS-CMAS-HS4-UAS-ST6GAL1-HS4/3xP3AmCyan]とした（以下、pBac[UAS-NANS/NANP/SLC35A1/GNE/CAMS/ST6GAL1/ 3xP3AmCyan]と略記する）。上記の結果、UASシアル酸ユニットを3種（GNE/CAMS/ST6GAL1）、5種（NANS/NANP/GNE/CAMS/ST6GAL1）、そして6種（NANS/NANP/ SLC35A1/GNE/CAMS/ST6GAL1）含むシアル酸関連遺伝子発現ベクターが得えられた。
　（３）目的の組換えタンパク質発現ベクターの構築
　　（ヒトアンチトロンビンIII発現ベクターの構築）
　ヒトアンチトロンビンIII（hATIII）遺伝子のORFを含むベクターFlexi ORFクローンFHC11758（プロメガ）を鋳型としてプライマーペアBsmBI_AT_FibHsig_U40（配列番号９６）及びHisタグを含むAT_C-6His_L45（配列番号９７）でPCRを行い、得られた増幅産物のBsmBI断片を（１）で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]のBsmBIサイトへ挿入した。これをUAS-rATIII/pZErO2とした。
　　（ヒトインターフェロンγ発現ベクターの構築）
　ヒトインターフェロンγ（hIFNγ）遺伝子のORFを含むFlexi ORFクローンORH24802（プロメガ社）を鋳型としてプライマーペアhIFNg_FibHsig_U40（配列番号９８）及びHisタグを含むhIFNg_C-6His_L45（配列番号９９）でPCRを行い、得られた増幅産物のBsmBI断片を（１）で構築した基本発現ベクターpBac[SerUAS_FibHsigint_hr5/3xP3-EYFP_A3-Bla]のBsmBIサイトへ挿入した。これをUAS-hIFNg/pZErO2とした。
＜実施例２：遺伝子組換えカイコの作出＞
（目的）
　実施例１で構築した各発現ベクターを用いて各種遺伝子組換えカイコを作出した。
（材料と方法）
　（１）カイコ系統
　国立研究開発法人農業生物資源研究所で維持されている白眼・白卵・非休眠系統のw1-pnd系統を宿主系統として用いた。
　（２）飼育条件
　25～27℃の飼育室で、幼虫の全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2～3日毎に交換した（Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol, 75:89-97）。
　（３）遺伝子組換えカイコの作出
　遺伝子組換えカイコは、Tamuraらの方法（Tamura T. et al., 2000, , Nature Biotechnology, 18, 81-84）に従って作出した。実施例１で構築した第１サブユニット及び第２サブユニットをそれぞれ別個にトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドpHA3PIG（Tamura T. et al., 2000, , Nature Biotechnology, 18, 81-84）と1:1 の割合で混合し、産卵後2～8時間のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫を上記の方法で飼育した。
　（GAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統の作出）
　第１サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統の作出は、前記インジェクションにおいてMSG発現用第１サブユニットpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3 DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で第１サブユニットを含むF1個体を選抜し、本発明の遺伝子組換えカイコの第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統をそれぞれ得た。
　（GalT糖鎖付加カイコ作出系統の作出）
　第２サブユニットを含むGalT糖鎖付加カイコ作出系統は、前記インジェクションにおいて、GalT2p発現ベクター、及び各改良型GalT発現ベクター（pBac[SerUAS-GalT1/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT2i/A3-KMO_A3-Bla]、pBac[SerUAS-GalT3/A3-KMO_A3-Bla]、及びpBac[SerUAS-GalT4/A3-KMO_A3-Bla]）のそれぞれを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、A3-KMOマーカーによる1齢幼虫の体表の着色で各改良型GalT発現ベクターを含むF1個体を選抜し、GalT糖鎖付加カイコ作出系統をそれぞれ得た。
　（シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統の作出）
　第２サブユニットを含むシアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統は、前記インジェクションにおいて、上述の各シアル酸関連遺伝子発現ベクターを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3-AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で各発現ベクターを含むF1個体を選抜し、シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統をそれぞれ得た。
　（目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統の作出）
　第２サブユニットを含む目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統は、前記インジェクションにおいて、上述のアンチトロンビンIII発現ベクター又はインターフェロンγ発現ベクターを用いた。インジェクション後、孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、3xP3-EYFPマーカーによる眼の蛍光の有無で各発現ベクターを含むF1個体を選抜し、ATIII発現用遺伝子組換えカイコ系統及びINFγ発現用遺伝子組換えカイコ系統をそれぞれ得た。その後、F1個体の兄妹交配を行い、ホモ接合体を得た。
　（４）第１及び第２サブユニットを含む系統の交配
　第１サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統と第２サブユニットをそれぞれ含む系統（GalT糖鎖付加カイコ作出系統、各シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統、及び目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統）を交配した。
　具体的には、まず、第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統と第２サブユニットを含む目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコ系統（ATIII又はIFNγ）の交配、第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統と第２サブユニットを含むGalT糖鎖付加カイコ作出系統の交配、そして第1サブユニットを含むGAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統と第２サブユニットを含む各シアル酸関連タンパク質糖鎖付加カイコ作出系統の交配を行い、各遺伝子の発現確認、及びタンパク質抽出を行った。第１及び第２サブユニットを含む各交配第1世代（F1）を選択し、[GAL4×ATIII又はIFNγ]F1カイコと[GAL4×GalT] F1カイコの交配、及び[GAL4×ATIII又はIFNγ]F1カイコと[GAL4×シアル酸関連タンパク質] F1カイコの交配を行い、各遺伝子の発現確認、及びタンパク質抽出を行った。第１及び2種の第２サブユニットを含む各交配第２世代（F2）を選択し、最後に[GAL4×ATIII又はIFNγ/GalT] F2カイコと[GAL4×ATIII又はIFNγ/シアル酸関連タンパク質] F2カイコの交配を行い、各遺伝子の発現確認、及びタンパク質抽出を行った。その結果、4種のサブユニット（第１サブユニット、及び3種の第２サブユニット）を含むF3カイコを作出した。この他、同様の手順により[GAL4×GalT]F1カイコと[GAL4×シアル酸カイコ] F1カイコの交配も行い[GAL4×GalT/シアル酸関連タンパク質] F2カイコも作出した。GAL4発現用遺伝子組換えカイコ系統、シアル酸関連遺伝子組換えカイコ系統及びGalT遺伝子組換えカイコ系統、及び目的の組換えタンパク質発現用遺伝子組換えカイコは、いずれも異なる選抜マーカーを有しているので、交配順序は特に問わない。
　GalT発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコ（GalT遺伝子組換えカイコ）と各種シアル酸関連遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコ(シアル酸関連遺伝子組換えカイコ)の組み合わせを表１に示す。交配後F1個体でマーカーに基づき、各サブユニットを有する系統を選抜した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表中「-」は、GalT発現ベクター又はシアル酸関連遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを交配に使用していないことを示す。表中、「○」は交配を行い、それぞれの発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコが得られたことを、また「×」は交配を行っていないことを示す。
　本実施例では、共通するMSG発現用第１サブユニットとしてのpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2に加えて、第２サブユニットとしての目的の組換えタンパク質（ATIII、又はIFNγ）発現ベクターのみ、GalT遺伝子発現ベクターのみ、シアル酸関連遺伝子発現ベクター(3種、5種、又は6種)のみ、目的の組換えタンパク質発現ベクター／GalT遺伝子発現ベクター、目的の組換えタンパク質発現ベクター／シアル酸関連遺伝子発現ベクター(3種、5種、及び6種)、GalT遺伝子発現ベクター／シアル酸関連遺伝子発現ベクター(3種、5種、及び6種)、そして目的の組換えタンパク質発現ベクター／GalT遺伝子発現ベクター／シアル酸関連遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを作出した。
＜実施例３：糖鎖付加カイコのMSGにおける内腔タンパク質の抽出＞
（目的）
　実施例２で作出したATIII糖鎖付加カイコ、IFNγ糖鎖付加カイコ、及び対照用のATIII、IFNγ非発現カイコのMSG内腔から組換えタンパク質を含む内腔タンパク質を抽出する。
（方法）
　実施例２で作出した各糖鎖付加カイコを実施例２と同様の方法で飼育し、5齢6日目の幼虫を吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットでMSGを傷つけないように摘出した（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂, 1970，pp．249-255参照）。続いて、摘出したMSGをエタノールで固定し、ピンセットで内腔タンパク質と細胞に分離した。ATIII糖鎖付加カイコ及びIFNγ糖鎖付加カイコのそれぞれから得られた内腔タンパク質をLiBrで溶解し、MSG抽出液として調製した。又は、摘出したMSGを1本当たり1mLの100 mMリン酸バッファー(pH 7.2)に入れて、4℃で2時間振とうすることにより水溶性タンパク質を抽出した後、2000×gで10分間遠心した後の上清を回収した。
＜実施例４：MSG抽出液からの組換えタンパク質の精製及び調製＞
（目的）
　実施例３で得た目的の組換えタンパク質を分離・精製し、糖鎖構造分析のための調製を行う。
（方法）
　（１）タンパク質濃度の測定
　MSG抽出液中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により測定した。標準タンパク質にはBSAを用いた。Bradford試薬(ナカライテスク)を用いて作成した希釈系列（BSA濃度：0～1.0 mg/Ml）についてOD595の吸光度を測定し、検量線を作成した。各MSG抽出液についても同様にOD595を測定し、検量線との比較によりタンパク質濃度を決定した。
　（２）タンパク質精製
　（ヒトアンチトロンビンIII精製）
　Niレジン（profanity IMAC Ni-charged resin）500μLをカラムに詰め、平衡化液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl）で平衡化した。500μLのMSG抽出液を積載し、1.5mLの洗浄液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/10mM イミダゾール）で洗浄した。続いて、300μLの溶出液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/200mM イミダゾール）で目的のタンパク質を溶出し、溶出液をAmicon Ultra-0.5mL (30K)を用いて、50mMリン酸ナトリウムバッファーにより濃縮し、タンパク質濃度を測定した。その後1μgに4×sample buffer（glycerol 4.0mL/1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL）を加え、100℃で3分間変性処理し、SDS-PAGEで分離した。
　（ヒトインターフェロンγ精製）
　Niレジン（profanity IMAC Ni-charged resin）50μLをカラムに詰め、平衡化液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl）で平衡化した。続いて、MSG抽出液500μLを積載し、1.5mLの洗浄液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/20mM イミダゾール）で洗浄した。続いて、300μLの溶出液（50mMリン酸ナトリウムバッファー/0.3M NaCl/200mM イミダゾール）で目的タンパク質を溶出し、溶出液をAmicon Ultra-0.5mL (10K)を用い、50mMリン酸ナトリウムバッファーにより濃縮し、タンパク質濃度を測定した。その後1μgに4×sample buffer（glycerol 4.0mL/1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL）を加え、100℃で3分間変性処理し、SDS-PAGEで分離した。
　（３）タンパク質分離
　（ヒトアンチトロンビンIIIサンプル調製）
　Niカラムの各溶出液10μLに4×sample buffer（glycerol 4.0mL/ 1.5M Tris-HCl buffer(pH6.8) 1.67mL/ 10% SDS solution 1.0mL/β-mercaptoethanol 400μL）3.3μLを加え、100℃で3分間変性処理をした。遠心後、上清を回収し、MSG抽出液1.1μL、回収上清10μLをSDS-PAGEで分離した。泳動後のゲルをCBB染色してhATIII精製の確認を行った。
　結果を図３に示す。精製画分にhATIIIのバンドをすることができた。
　（ヒトインターフェロンγサンプル調製）
　Niカラムの各溶出液をアセトンで1.2 mLにメスアップし、-20℃で3日間静置させた。その後、上清を除去し、遠心乾燥した。1×sample buffer 20μLを加えて沈殿を溶解し、100℃で3分間変性処理をした。遠心後、上清を回収し、MSG抽出液11.25μL、回収上清10μLをSDS-PAGEで分離した。泳動後のゲルをCBB染色してhIFNγ精製の確認を行った。
　結果を図４に示す。精製画分に3本のバンドが確認されたため、3000倍希釈したマウス由来抗His抗体でウェスタンブロットを行い、hIFNγを検出した。上述のようにクローニングの際に使用したプライマーにより、hIFNγ遺伝子断片は末端に6Hisタグを含んでいる。二次抗体には10000倍希釈したHRP抗マウスIgG抗体を用いた。その結果、3本のバンドは全てhIFNγであることが確認された。PNGaseFを用いて脱糖鎖を行ったhIFNγをウェスタンブロットで検出したところ、3本のバンドは最も分子量の小さい1本のバンドに収束した。この結果から、hIFNγの2ヶ所の糖鎖付加部位における糖鎖付加の有無によって3本のバンドに分かれて検出されたことが推測された。
　（４）ゲル内消化
　（ヒトインターフェロンγのゲル内消化）
　SDS-PAGEで分離したタンパク質（hIFNγ）のバンド（図４の*及び**で示す糖鎖が付加した2本のバンド）を切り抜き、50mM NH4HCO3/50%MeCN（アセトニトリル）で15分×2回ボルテクッスにかけて脱染色を行った。その後、100% MeCNで5分間ボルテックスにかけ、再度50mM NH4HCO3/50%MeCNで一晩ボルテックスにかけた。翌朝、100% MeCNで15分×2回ボルテックスを行い、遠心乾燥でMeCNを除去した。
　（ヒトアンチトロンビンIIIのゲル内消化）
　SDS-PAGEで分離した目的タンパク質（hATIII）のバンドを切り抜き、50mM NH4HCO3/50%MeCN（アセトニトリル）で15分×2回ボルテクッスにかけて脱染色を行った。その後、100% MeCNで5分間ボルテックスにかけ、再度50mM NH4HCO3/50%MeCNで一晩ボルテックスにかけた。翌朝、100% MeCNで15分×2回ボルテックスを行い、遠心乾燥でMeCNを除去した。
　25mM DDTを含む50mM NH4HCO3を加えて、56℃で20分間還元反応を行った。その後、上清のDTT溶液を除去し、同量の50mMヨードアセトアミドを含む50mM NH4HCO3を加え、20分間暗所で時々振とうを行った。精製水を加えボルテックスし、その後、MeCNを加えて10分間ボルテックスを2回繰り返した。50mM NH4HCO3を加えて15分間膨潤させた後、MeCNで脱水後、遠心乾燥でMeCNを除去した。
　氷上でトリプシン溶液を20μL加え、30分間静置し、膨潤させた。その後、0.01% ProteaseMAXTM（プロメガ社）を含む50mM NH4HCO3をゲルが浸る程度加え、50℃で1時間インキュベートした。なお、プロテアーゼ処理は、キモトリプシンでもよい。この場合、25℃で2～18時間インキュベートする。酵素処理液を15000×gで10分間遠心して回収した。トリプシンを不活化するためにTFAを0.5%となるように添加した。
＜実施例５：組換えタンパク質の糖鎖構造解析＞
（目的）
　実施例４で得られた消化ペプチドに付加した糖鎖構造をnanoLC-MS/MSを用いて分析する。
（方法）
　実施例４で得られた酵素処理液6μL又は8μLを以下の解析条件でnanoLC-MS/MSに供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。
　（液体クロマトグラフィー（LC）条件）
　　　・使用機器：Agilent Technologies 1200 series
　　　・溶離液A:0.1% HCOOH/milliQ
　　　・溶離液B:0.1% HCOOH/MeCN 
　　　・カラム：ZORBAX300SB-C18(Agilent Technologies) 150 mm x 100μm 粒子3.5μm
　　　・流速：0.6μL/min
　　　・時間連続濃度勾配（分）0→5→65→66→71→72→90
 　　　　　　　　　　　B（％）2→8→50→95→95→2→2
　（MS/MS条件）
　　　・使用機器：micrOTOF-Q Bruker
　　　・Mass range: 50 - 4,500 m/z
　　　・イオン化方法：ESI
　　　・スキャン速度：5KHz
　　　・解析ソフトウェア：Hystar
　nanoLC-MS/MSの結果から糖鎖付加ペプチドを同定し、そのペプチドに付加した糖鎖構造を推定した。
（結果）
（１）ヒトアンチトロンビンIIIの糖鎖構造解析
　ヒトアンチトロンビンIIIには、糖鎖付加される4か所のアスパラギン残基（N128、N167、N87、及びN224：開始メチオニンをM1とする。以下、同様。）が知られている（Zhou Z. & Smith D.L., 1990, siomedical and environmental mass spectrometry, 19: 782-786）。
（GalTアイソザイムのガラクトース付加効率の比較）
　GalTの各アイソザイム遺伝子を導入した組換えカイコの絹糸腺より調製したタンパク質の糖鎖構造を解析した。その糖鎖構造のプロファイルを表２に示す。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合（％）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、GalTアイソザイムの中で、ガラクトース付加効率が最も高いのは従来型GalT2のGalT2pであり、次いで改良型GalT2のGalT2iであった。そして、従来の研究においてガラクトース付加で最も一般的に使用されてきたGalT1と、GalT3が同程度の付加効率を有し、GalT4の付加効率が最も低いことが明らかとなった。よって、以降は、GalT2p、GalT2i、及びGalT1遺伝子組換えカイコを用いたデータを示す。
　（シアル酸関連遺伝子の導入数と糖鎖構造の関係）
　シアル酸関連遺伝子の導入数とシアル酸付加の有無を検証するため、GalT遺伝子組換えカイコ、及び各種シアル酸関連遺伝子組換えカイコ（3種、5種、及び6種）を交配して得た各糖鎖付加カイコの絹糸腺より調製したタンパク質の糖鎖構造を解析した。その糖鎖構造のプロファイルを表３に示す。GalT遺伝子には、ガラクトースの付加効率が高かったGalT2iを使用した。結果を表３に示す。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合（％）である。表中、例えばMan5は、糖鎖末端に5個のマンノースを含む構造を、Man3Fは3個のマンノースとフコース修飾を1個含む構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　シアル酸関連遺伝子組換えカイコがシアル酸関連遺伝子を3種、5種又は6種のいずれを含む場合にも、糖タンパク質にシアル酸末端構造が確認された。この結果から、ガラクトース非還元末端にシアル酸を付加する上で必要なシアル酸関連遺伝子の導入数は、GNE、NANS、NANP、CMAS、及びST6GAL1の各遺伝子から選択される少なくとも3つで足りることが明らかとなった。また、3種や5種のときよりも6種のときにシアル酸付加効率が著しく上昇した。実施例１において作製した5種（NANS/NANP/GNE/CAMS/ST6GAL1）のシアル酸関連遺伝子発現ベクターと6種（NANS/NANP/SLC35A1/GNE/CAMS/ST6GAL1）のシアル酸関連遺伝子発現ベクター間で異なるシアル酸関連遺伝子はSLC35A1遺伝子である。したがって、SLC35A1遺伝子は、ガラクトース非還元末端にシアル酸を付加する上で必須ではないが、その付加効率を増強させる機能を有することが明らかとなった。
　（糖鎖付加部位における糖鎖構造の解析）
　GalT遺伝子組換えカイコ（GalT1、GalT2p、又はGalT2i）、シアル酸関連遺伝子組換えカイコ（5種又は6種）、及びhATIII遺伝子組換えカイコを交配して得た糖鎖付加カイコが生産する組換えhATIIIタンパク質のN187及びN224の2か所の糖鎖付加部位における糖鎖構造の関係を表４に示す。表中、Man0-4は、糖鎖末端に0～4個のマンノースを含む構造を、Man2-3Fは2～3個のマンノースとフコース修飾を1個含む構造を示す。また、非還元末端にGlcNAcをもつ糖鎖をまとめてGlcNAc構造として、非還元末端にGalをもつ糖鎖をまとめてGal構造として、そして非還元末端にSiaをもつ糖鎖をまとめてSia構造として示す。a及びbはカイコ系統（line）を示している。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合（％）である。表中、ATIII/GalT/シアル酸関連遺伝子の表記に関して、（+/-/-）はhATIII遺伝子組換えカイコを、また（+/-/5種）はGalT遺伝子組換えカイコを交配せず、hATIII遺伝子組換えカイコと5種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。同様に、（+/GalT2p/-）はシアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配せず、hATIII遺伝子組換えカイコとGalT2p遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを、また（+/GalT2p/5種）は、hATIII遺伝子組換えカイコ、GalT2p遺伝子組換えカイコ及び5種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。他の表記についても同様とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　N187及びN224の糖鎖付加アスパラギン残基は、いずれもGalT（GalT2p、GalT2i又はGalT1）発現ベクター、及び5種又は6種のシアル酸関連遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコのみで、哺乳動物と同じシアル酸が非還元末端に付加されていた。その効率は、GalT1を使用したときよりもGalT2p又はGalT2iを使用した時の方が高かった。
（２）ヒトインターフェロンγの糖鎖構造解析
　ヒトインターフェロンγ（hIFNγ）は、図４において*で示す中央のバンドを第１分子種、**で示す最も移動度の遅いバンドを第２分子種とした。
　ヒトインターフェロンγには、糖鎖付加される2か所のアスパラギン残基（N48、及びN120）が知られている。GalT2p遺伝子組換えカイコ、シアル酸関連遺伝子組換えカイコ（5種又は6種）、及びhIFNγ遺伝子組換えカイコを交配して得た糖鎖付加カイコから得られた組換えhIFNγタンパク質の第１及び第２分子種におけるN48及びN120の糖鎖付加部位の糖鎖構造を表５に示す。表中の数値は、検出された糖鎖全体を100%としたときのその糖鎖の割合（％）を、またa及びbはカイコ系統（line）を示している。表中、IFNγ/GalT2p/シアル酸関連遺伝子の表記に関して、（+/-/-）はhIFNγ遺伝子組換えカイコを、また（+/-/5種）はGalT2p遺伝子組換えカイコを交配せず、hIFNγ遺伝子組換えカイコと5種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。同様に、（+/+/-）はシアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配せず、hIFNγ遺伝子組換えカイコとGalT2p遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを、また（+/+/5種or6種）はGalT2p遺伝子組換えカイコ、hIFNγ遺伝子組換えカイコ及び5種又は6種シアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配して得た遺伝子組換えカイコを示す。
　表６は、表５から本発明と直接関係のある糖鎖構造とその割合（％）を抜粋したものである。
　さらに、各分子種において検出された糖鎖構造を存在率の高い順から上位4位を表７に示した。この表における対照用遺伝子組換えカイコは、GalT遺伝子組換えカイコ及びシアル酸関連遺伝子組換えカイコを交配しないhIFNγ遺伝子組換えカイコである。したがって、対照用遺伝子組換えカイコでは、実質的にカイコの野生型の糖鎖が付加されることになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以上の結果からhIFNγにおけるN48及びN120の糖鎖付加アスパラギン残基にも、GalT2発現ベクター及びシアル酸関連遺伝子発現ベクターの両発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコにおいて、非還元末端にシアル酸を有する哺乳動物型糖鎖が付加されていた。したがって、本発明の糖鎖付加カイコを用いれば、そのカイコの絹糸腺内で生産される目的のタンパク質に哺乳動物型糖鎖を付加することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (20)

  1. 　絹糸虫由来の中部及び／又は後部絹糸腺プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に連結された
    　　（ａ）ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド、及び
    　　（ｂ）UDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、
    　　　　　Neu5Ac9-リン酸合成酵素、
    　　　　　Neu5Ac9-リン酸脱リン酸化酵素、
    　　　　　CMP-Neu5Ac合成酵素、及び
    　　　　　シアル酸転移酵素、
    　　　からなる群から選択される3以上のタンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチド
    を含む独立した１～３つの発現ベクターからなり、
    　前記タンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドは、前記中部及び／又は後部絹糸腺プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている
    哺乳動物型糖鎖付加剤。
  2. 　前記ガラクトース転移酵素がGalT2である、請求項１に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  3. 　前記中部絹糸腺プロモーターがセリシン１遺伝子、セリシン２遺伝子、又はセリシン３遺伝子のプロモーターである、請求項１又は２に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  4. 　前記後部絹糸腺プロモーターがフィブロインH鎖遺伝子、フィブロインL鎖遺伝子、又はp25遺伝子のプロモーターである、請求項１又は２に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  5. 　前記選択される3以上のタンパク質がUDP-GlcNAc2エピメラーゼ/ManNAcキナーゼ、CMP-Neu5Ac合成酵素、及びシアル酸転移酵素を含む3以上のタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  6. 　前記発現ベクターが
    　　（ｃ）CMP-Neu5Acシアル酸トランスポーターをコードする遺伝子又は該酵素の活性断片をコードするヌクレオチド
    をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  7. 　前記発現ベクターが
    　　前記（ａ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第１発現ベクター、及び
    　　前記（ｂ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む第２発現ベクター
    　からなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  8. 　前記（ｃ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドが第２発現ベクターに含まれる、請求項７に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  9. 　前記タンパク質をコードする遺伝子又は該タンパク質の活性断片をコードするヌクレオチドが前記中部及び／又は後部絹糸腺プロモーターの下流に機能的に連結している、請求項１～６のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  10. 　前記発現ベクターが
    　　（i）前記中部及び／又は後部絹糸腺プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、
    　　（ii）前記転写調節因子の標的プロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に連結された前記（ａ）～（ｃ）に記載の遺伝子又はヌクレオチドを含む一以上の第２サブユニット
    から構成される、請求項１～８のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  11. 　前記転写調節因子が酵母由来のGAL4タンパク質であり、その標的プロモーターがUAS（Upstream Activating Sequence）である、請求項１０に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  12. 　前記絹糸虫がカイコである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  13. 　哺乳動物型がヒト型である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤。
  14. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
  15. 　請求項１０又は１１に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターを含む哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
  16. 　前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、請求項１５に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
  17. 　前記絹糸虫がカイコである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
  18. 　哺乳動物型がヒト型である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫。
  19. 　請求項１０又は１１に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第２サブユニットのみを含む、哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統。
  20. 　哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫を作製する方法であって、
    　請求項１９に記載の哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫作出系統、及びそれと同種の請求項１０又は１１に記載の哺乳動物型糖鎖付加剤を構成する発現ベクターの第１サブユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫作出系統を交配する交配工程、及び
    　交配第１世代（F1）から第１サブユニット及び第２サブユニットを含む遺伝子組換え絹糸虫を哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換え絹糸虫として選抜する選抜工程
    を含む前記方法。
PCT/JP2017/004105 2016-02-05 2017-02-03 哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ WO2017135452A1 (ja)

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