WO2014104269A1 - 後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 - Google Patents

後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 Download PDF

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gene expression
silkworm
expression unit
subunit
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謙一郎 立松
秀樹 瀬筒
恵郎 内野
飯塚　哲也
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独立行政法人農業生物資源研究所
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    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated

Definitions

  • the present invention relates to a posterior silk gland gene expression unit capable of expressing a target peptide in a large amount in the posterior silk gland of a silkworm such as a silkworm, and a genetically modified silkworm having the same.
  • Silkworm glands of Bombyx mori have the ability to synthesize large amounts of protein in a short time.
  • silkworm silk glands are large organs, so that they can be easily removed, and the synthesized protein is stored in the lumen of the silk gland and thus has an advantage that it can be easily recovered.
  • transgenic silkworms that express the target protein in the silk gland are promising as a mass production system for proteins.
  • the silkworm silk gland is morphologically a pair of left and right organs as shown in FIG. 1, each composed of three regions: an anterior silk gland, a middle silk gland, and a posterior silk gland. .
  • Fib H fibroin H chain
  • Fib L fibroin L chain
  • p25 p25 / FHX
  • sericin is secreted into the middle silk gland lumen after expression.
  • the fibroin secreted into the posterior silk gland lumen then moves to the middle silk gland lumen, is coated with sericin, and spun out as silk thread (FIG. 1: Non-Patent Document 1). Therefore, when the silkworm silk gland is used as a protein expression system, a gene expression system that is specifically expressed in the middle silk gland or the posterior silk gland may be used.
  • Non-patent Document 2 When the silkworm silk gland is used as a protein expression system, the GAL4 / UAS system (Non-patent Document 2) or a system combining a sericin 1 promoter and an Hr3 enhancer as a recombinant protein expression system using the middle silk gland so far A mass expression method (Non-patent Document 3) has been established.
  • the protein synthesis ability in the posterior silk gland is about three times that of the middle silk gland (Non-patent Document 4). Therefore, judging from the production aspect, the posterior silk gland is more preferable as the protein expression system than the middle silk gland.
  • Non-patent Document 5 since the recombinant protein produced in the posterior silk gland is secreted together with the silk thread, it is suitable for use as silk fiber (Non-patent Document 5).
  • Nd strain Fib L silkworm mutant strains is abnormal (Nd-s strain and Nd-s D strain), the other fibroin structure It is known that the protein can hardly be spun even though the protein is normally expressed (Non-patent Document 6).
  • analysis of these mutant strains revealed that the formation of the SFEU complex is important for efficient secretion of Fib H, Fib L, and / or p25 into the posterior silk gland lumen. (Non-Patent Documents 7 and 8).
  • Non-patent Document 9 Non-patent Document 9
  • proteins expressed in the posterior silk gland cells are efficiently secreted extracellularly only when they constitute the SFEU complex. Therefore, in order to use the posterior silk gland as a protein expression system, in order to use a secretory system specific to the posterior silk gland, it is necessary to devise such as expressing the target recombinant protein as part of the SFEU complex. I must.
  • the recombinant protein As a specific method for expressing and secreting the recombinant protein as part of the SFEU complex in the posterior silk gland, the recombinant protein is combined with all or part of Fib H or Fib L downstream of the promoter of Fib H gene or Fib L gene.
  • a method of expressing as a fusion protein (chimeric protein) bound to a replacement protein is known (FIGS. 2a and b) (Non-patent Documents 10 and 11). Since such a chimeric protein is incorporated as part of the SFEU complex, secretion into the lumen of the posterior silk gland is performed efficiently.
  • the solubilized SFEU complex since it becomes insoluble when incorporated into the SFEU complex, the solubilized SFEU complex must be solubilized to recover the recombinant protein.
  • Treatment with a strong denaturing agent is indispensable for solubilization, and in addition, in order to express physiological activity, it may be necessary to cleave the fibroin-constituting protein portion in the chimeric protein. Therefore, the recombinant protein expressed in the posterior silk gland has a big problem that it is difficult to recover and has a risk of losing its activity.
  • a method is also known in which a recombinant protein is expressed and secreted in the posterior silk gland as a water-soluble protein, not as a constituent component of an insoluble SFEU complex.
  • Non-patent Document 12 a method of adding DNA encoding the signal peptide of p25 upstream of DNA encoding the target recombinant protein (FIG. 2c) (Non-patent Document 12) can be mentioned.
  • the target protein can be expressed as a water-soluble protein, but there is a big problem that the expression level and secretion efficiency are low (Non-patent Document 12).
  • the signal peptide of the target recombinant protein itself is contained in a state containing the signal peptide of the target recombinant protein, as in the method for expressing defensins of Thai beetle described in Patent Document 1.
  • an object of the present invention is to develop a posterior silk gland gene expression unit capable of expressing and secreting a large amount of a water-soluble recombinant peptide in the posterior silk gland of silkworms including silkworms. It is to provide genetically modified silkworms into which it has been introduced.
  • the present inventors have made extensive studies, and a gene encoding a chimeric peptide in which a foreign water-soluble peptide is linked to a signal peptide derived from a protein that is specifically expressed in the middle silk gland cells is posterior silk thread.
  • a gene encoding a chimeric peptide in which a foreign water-soluble peptide is linked to a signal peptide derived from a protein that is specifically expressed in the middle silk gland cells is posterior silk thread.
  • the target water-soluble peptide can be expressed and secreted at an efficiency 10 to 50 times that of the conventional posterior silk gland gene expression system.
  • the present invention is based on the novel findings, and specifically provides the following inventions.
  • a promoter of a gene encoding a protein expressed specifically in the posterior silk gland and a DNA encoding a signal peptide derived from a protein expressed specifically in the middle silk gland that is functionally linked to the downstream of the promoter and its downstream
  • a posterior silk gland gene expression unit comprising DNA encoding a peptide that does not contain a fibroin-constituting protein linked to.
  • the posterior silk gland gene expression unit according to (1) or (2), wherein the protein expressed specifically in the posterior silk gland is Fib H, Fib L, or p25.
  • a first subunit comprising a promoter of a gene encoding a protein expressed specifically in the posterior silk gland, and a gene encoding a transcriptional regulatory factor operably linked downstream of the promoter;
  • a posterior silk gland gene expression unit composed of a second subunit containing DNA encoding a peptide.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of silkworm silk glands and the fibroin-constituting proteins and silk thread expressed at each site until silkworms are spun.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a conventional recombinant protein expression unit in the posterior silk gland.
  • This recombinant protein expression unit is obtained by linking a gene (Gene X) encoding the target recombinant protein X between the gene regions encoding the N-terminal region and C-terminal region of Fib H, respectively. It has a structure in which the fusion gene is linked downstream of the Fib H gene promoter in an expressible state.
  • This recombinant protein expression unit comprises a fusion gene obtained by binding a gene (Gene X) encoding the target recombinant protein X downstream of the gene region encoding the full length of Fib L, and the Fib L gene. It has a structure that is linked downstream of the promoter in an expressible state.
  • This recombinant protein expression unit has a fusion gene obtained by joining a gene region encoding a signal peptide of p25 and a gene (Gene X) encoding the target recombinant protein X downstream of the p25 gene promoter. It has a structure linked in an expressible state.
  • FIG. 3 shows a structural example of the posterior silk gland gene expression unit of the present invention.
  • A It is a structural example in case the rear silk gland gene expression unit of this invention is comprised by one gene expression unit.
  • B It is a structural example of the 1st subunit in case the rear silk gland gene expression unit of this invention is comprised by two subunits.
  • C It is a structural example of the 2nd subunit in case the rear silk gland gene expression unit of this invention is comprised by two subunits.
  • the white box on the 3 ′ end side of (a) to (c) indicates the 3 ′ UTR containing the poly A signal.
  • FIG. 4 shows the expression vector constructed in Example 1.
  • A The 1st subunit for middle silk gland gene expression units is shown.
  • B shows the first subunit for the posterior silk gland gene expression unit.
  • C shows the second subunit.
  • FIG. 5 is a diagram showing the expression of EGFP in the middle silk gland and the rear silk gland in transgenic silkworms into which the conventional middle silk gland gene expression unit and the rear silk gland gene expression unit of the present invention have been introduced, respectively.
  • FIG. 6 is a diagram showing the amount of EGFP in the middle silk gland or the rear silk gland in the transgenic silkworms into which the conventional middle silk gland gene expression unit and the rear silk gland gene expression unit of the present invention were introduced, respectively.
  • FIG. 5 is a diagram showing the expression of EGFP in the middle silk gland and the rear silk gland in transgenic silkworms into which the conventional middle silk gland gene expression unit and the rear silk gland gene expression unit of the present invention were introduced, respectively.
  • FIG. 7 is a view showing the presence of EGFP in the silkworm of transgenic silkworms into which the conventional middle silk gland gene expression unit and the rear silk gland gene expression unit of the present invention were respectively introduced.
  • A is a conceptual diagram showing one structure of the second subunit used in Example 6.
  • B is a first subunit for the posterior silk gland gene expression unit and either a signal peptide derived from the protein sericin 1 that is specifically expressed in the middle silk gland or a signal peptide derived from the protein p25 that is specifically expressed in the posterior silk gland. It is a figure which shows the amount of EGFP in the posterior silk gland in the transgenic silkworm which introduce
  • A is a conceptual diagram showing the structure of the second subunit used in Example 7.
  • B is the result of Western blotting in which porcine IL-2 was detected from the silk gland extract of silkworm strains having each posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 7.
  • C is the result of Western blotting in which porcine IL-2 was detected from an extract of each silk gland of a silkworm strain having each middle silk gland gene expression unit constructed in Example 7.
  • FIG. In FIG. 10, A is a conceptual diagram showing the structure of the second subunit used in Example 8.
  • B shows the result of Western blotting in which bovine IFN- ⁇ was detected from the silk gland extract of silkworm strains having each posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 7.
  • C is the result of Western blotting in which bovine IFN- ⁇ was detected from an extract of each silk gland of a silkworm strain having each middle silk gland gene expression unit constructed in Example 7.
  • Posterior silk gland gene expression unit 1-1 Overview and definition
  • the first aspect of the present invention is a posterior silk gland gene expression unit.
  • the rear silk gland gene expression unit of the present invention introduces this into a silkworm, so that in the rear silk gland of the silkworm, the target recombinant peptide is not a part of the fibroin component, but a water-soluble peptide. Can be expressed and secreted in large quantities.
  • the “posterior silk gland gene expression unit” refers to a set of gene expression systems capable of expressing and secreting a large amount of the recombinant peptide in the posterior silk gland of the silkworm.
  • the term “silkworm” refers to a general term for insects that have a silk gland and can spout silk thread. Specifically, among lepidoptera, hymenoptera, pulmonids, trichomes, etc., it refers to the type that can be spun for nesting, nesting or moving mainly during the larval stage. In the case of Lepidoptera, a large amount of silk thread can be spun, Bombycidae, Saturniidae, Brahmaeidae, Eupterotaidae, Lasiocampidae, Triggeriopidae, The family (Archtiidae), the family Noctuidae, etc.
  • silkworm of this specification.
  • a “silk gland” is an altered tubular organ of the salivary gland that has the function of producing, accumulating and secreting liquid silk.
  • the silk gland exists in a pair of left and right along the digestive tract of the silkworm, mainly the larvae, and each silk gland is composed of three regions, an anterior portion, a middle portion, and a posterior silk gland.
  • the posterior silk gland produces and secretes fibroin, the fiber component of silk.
  • the middle silk gland produces and secretes sericin, which is a coating component, and accumulates in the lumen together with fibroin that has migrated from the posterior silk gland.
  • the posterior silk gland gene expression unit includes DNA encoding a peptide that does not contain fibroin constituent protein, posterior silk gland expression promoter necessary for expression of the peptide, and elements such as DNA encoding a signal peptide necessary for secretion, etc.
  • the term “peptide” refers to a molecule in which two or more amino acids are linked by an amide bond.
  • Peptides include oligopeptides and polypeptides such as proteins.
  • the peptide may be derived from one gene or a gene fragment thereof, or may be derived from a chimeric gene in which a part of a plurality of genes is linked.
  • the amino acid length of the peptide is not particularly limited. For example, the number of amino acid residues may be 10 to 10,000.
  • the “peptide not containing fibroin component protein” means a target peptide to be expressed and secreted in large quantities by the rear silk gland gene expression unit of the present invention (hereinafter often referred to as “target peptide”). It is a chimeric peptide that does not contain all or part of the fibroin constituent protein and peptides other than the fibroin constituent protein and fragments thereof.
  • the fibroin constituent protein corresponds to Fib H, Fib L, p25 or the like constituting the SFEU complex.
  • Peptides that do not contain fibroin-constituting proteins are not expressed as part of the SFEU complex or the like, and therefore do not become part of the fiber component of the silk thread after being secreted from the posterior silk gland cells. Therefore, as a target peptide, for example, when a water-soluble peptide is expressed and secreted in the rear silk gland gene expression unit of this embodiment, the water-soluble peptide is removed from the rear silk gland lumen or silk thread to water, or a protein. It can be easily separated and recovered using a neutral extraction buffer containing no denaturant.
  • water-soluble peptides include peptide hormones such as insulin, calcitonin, paratolumon and growth hormone, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), interleukin (IL), interferon (IFN). ), Cytokines such as tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ) and transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ), immunoglobulins, serum albumin, enzymes, or collagen, or fragments thereof (including chimeric peptides). It is done.
  • the posterior silk gland expression promoter in the posterior silk gland gene expression unit of the present invention may be a promoter of any gene as long as it can operate in the posterior silk gland of the silkworm.
  • an overexpression promoter that can be expressed ubiquitously a constitutively active promoter or a time-specific active promoter, or an expression-inducible promoter can be used.
  • a posterior silk gland specific promoter is preferred.
  • the promoter of a gene encoding a protein that is specifically and highly expressed in the posterior silk gland of the silkworm is preferable, and the late silk gland that is specifically activated in the posterior silk gland from the late stage to the anterior stage of the late stage.
  • Specific active promoters are particularly preferred.
  • Fib H, Fib L, or p25 gene promoters that are fibroin constituent proteins (referred to herein as “Fib H promoter”, “Fib L promoter”, or “p25 promoter”, respectively) Is mentioned.
  • the biological species derived from the posterior silk gland expression promoter is not particularly limited as long as it operates in the silkworm insect cell into which the posterior silk gland gene expression unit of the present invention is introduced.
  • each promoter of Fib H, Fib L, or p25 it may be derived from any silkworm.
  • the base sequences of these promoters are evolutionarily very conserved among silkworms, and the silkworms from which the rear silk gland expression promoter is derived and the types of silkworms into which the rear silk gland gene expression unit of the present invention is introduced Because the promoter can operate in the posterior silk gland of host silkworms (Setsutsu H., et al., 2009, Journal of Insect Biotechnology and Seriology, 78: 1-10).
  • a posterior silk gland expression promoter in the posterior silk gland gene expression unit of the present invention preferably the same as that of the host silkworm that introduces the posterior silk gland gene expression unit of the present invention, more preferably from the same family, Preferred are promoters from the same genus, most preferably from the same species.
  • Fib H promoter examples include a silkworm-derived Fib H promoter including the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a saxan-derived Fib H promoter including the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
  • Fib L promoter examples include a silkworm-derived Fib L promoter including the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, a sakusan-derived Fib L promoter including the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the like.
  • specific examples of the p25 promoter include a silkworm-derived p25 promoter containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the rear silk gland gene expression unit of the present invention includes a DNA encoding a signal peptide (hereinafter referred to as “signal peptide DNA”).
  • This signal peptide is a peptide necessary for secreting the target peptide expressed in the silk gland cells into the silk gland lumen.
  • the signal peptide is arranged on the N-terminal side of the secretory protein, and is cleaved and removed by a signal peptidase before secretion.
  • the signal peptide DNA is linked to the 5 ′ end of the DNA encoding the target peptide.
  • the rear silk gland gene expression unit of the present invention encodes an extracellular secreted chimeric protein in which the signal peptide and the target peptide are linked (hereinafter, the DNA encoding this chimeric protein is referred to as “chimeric gene”). ”).
  • the signal peptide DNA in the rear silk gland gene expression unit of the present invention is a signal peptide DNA derived from a protein that is expressed specifically in the middle silk gland of the silkworm, the type of the extracellular secretory protein derived from it is not particularly limited. Any signal peptide DNA can be used.
  • the amino acid length of the signal peptide is not particularly limited as long as it can function as a signal peptide. Usually, it may be in the range of 3 to 60 amino acids.
  • the base length of the signal peptide DNA may be 9 to 180 bases.
  • a preferred example of signal peptide DNA in the rear silk gland gene expression unit of the present invention is signal peptide DNA derived from sericin 1-3.
  • Specific examples of signal peptide DNA derived from sericin 1 to 3 include a signal peptide DNA encoding a silkworm sericin 1 signal peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (for example, including the base sequence represented by SEQ ID NO: 7).
  • the posterior silk gland gene expression unit of the present invention can contain, in addition to the above elements, an element that can function for the expression and secretion of the target peptide, if necessary.
  • an enhancer, 5′UTR, signal sequence post-insertion sequence, signal peptidase recognition site, 3′UTR, terminator, selection marker, insulator, transposon inverted terminal repeat sequence, and the like can be mentioned.
  • the “post-signal sequence insertion sequence” is composed of a base sequence encoding an amino acid sequence that promotes cleavage and secretion of the signal peptide in an extracellular secreted chimeric peptide in which the signal peptide and the target peptide are linked.
  • the “signal peptidase recognition site” is composed of a base sequence encoding an amino acid sequence necessary for signal peptidase to recognize and cleave a signal peptide from the chimeric peptide.
  • the “terminator” is composed of a base sequence capable of terminating transcription of DNA encoding the fusion protein in the rear silk gland cells of the host into which the rear silk gland gene expression unit of the present invention is introduced.
  • “5′UTR” and “3′UTR” are nucleotide sequences arranged upstream of the start codon (5 ′ end side) and downstream of the stop codon (3 ′ end side), respectively, in the mRNA coding region of the chimeric gene. Consists of.
  • the 3 ′ UTR can contain a poly A signal.
  • the “selection marker” can function as a marker when confirming that the recombinant silkworm of the present invention described later has the posterior silk gland gene expression unit of the present invention.
  • a compound eye fluorescent marker 3xP3-EGFP or 3xP3-DsRed including a fluorescent gene such as EGFP or DsRed, and a drug resistance gene such as a blasticidin resistance gene can be used.
  • An “insulator” is a sequence that can stably control transcription of a gene sandwiched between the sequences without being affected by chromatin of surrounding chromosomes. Examples include the chicken cHS4 sequence and the Drosophila gypsy sequence.
  • An “inverted terminal repeat sequence of a transposon” can be included in the case of an expression vector in which the rear silk gland gene expression unit of the present invention can homologously recombine.
  • Inverted terminal repeats are located upstream and downstream of the posterior silk gland gene expression unit of the present invention.
  • piggyBac, mariner, minos, etc. can be used (Shimizu, K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281; Wang W. et al., 2000, Insect Mol Biol. 9 (2): 145-55).
  • the rear silk gland gene expression unit of the present invention is composed of two units, a first subunit and a second subunit, which will be described later, a DNA encoding a transcriptional regulatory factor and a target of the transcriptional regulatory factor Includes a promoter.
  • DNA encoding a transcriptional regulatory factor refers to a gene of a transcriptional regulatory factor that is an essential element of the first subunit.
  • transcriptional regulatory factor refers to a protein factor that can recognize and / or bind to a target promoter described below and activate the target promoter. Examples include GAL4 protein, which is a galactose metabolic activation protein of yeast, tTA, which is a tetracycline-regulated transactivator, and variants thereof.
  • GAL4 protein which is a galactose metabolic activation protein of yeast
  • tTA which is a tetracycline-regulated transactivator
  • the “target promoter of a transcriptional regulatory factor” is an essential element of the second subunit, and the transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit recognizes and / or binds to it.
  • the transcriptional regulatory factor and its target promoter are in a corresponding relationship with the transcriptional regulatory factor. Normally, when a transcriptional regulatory factor is determined, the target promoter is inevitably determined.
  • the transcriptional regulatory factor is a GAL4 protein
  • UAS Upstream Activation Sequence
  • the rear silk gland gene expression unit of the present invention is an autonomously replicable expression vector such as a plasmid or a bacmid, or an expression vector capable of homologous recombination in a chromosome or inserted into the host genome. It may be part of the genome.
  • the expression vector can also be a shuttle vector that can replicate in other bacteria such as E.
  • the posterior silk gland gene expression unit is composed of (1) one gene expression unit, which can function in the host cell alone, and (2) two subunits, two of which are contained in the host cell. It may function only when it exists.
  • (1) When composed of one gene expression unit When the posterior silk gland gene expression unit is composed of one gene expression unit, the gene expression unit corresponds to the posterior silk gland expression promoter as shown in FIG. 3 (a) (in FIG. 3 (a), the Fib H promoter corresponds).
  • a gene expression system comprising a signal peptide DNA (corresponding to sericin 1 signal peptide DNA in FIG. 3 (a)) and a DNA encoding the target peptide (corresponding to the EGFP gene in FIG. 3 (a)) At least one.
  • the posterior silk gland expression promoter of this configuration is a gene encoding a protein that is specifically and highly expressed in the posterior silk gland like the promoter of a fibroin component protein, for example, a gene encoding Fib H, Fib L, or p25. A promoter is preferred.
  • the rear silk gland gene expression unit of this configuration includes a signal peptide DNA derived from a protein that is specifically expressed in the middle silk gland, and a chimeric gene in which a DNA encoding a target peptide is linked downstream thereof. Between the signal peptide DNA and the DNA encoding the peptide of interest, an insertion sequence after the signal sequence and / or a signal peptidase recognition site may be included.
  • 5′UTR can be included upstream of the signal peptide DNA
  • 3′UTR can be included downstream of the DNA encoding the target peptide.
  • a terminator may be further arranged downstream of the DNA encoding the peptide of interest or downstream of the 3′UTR.
  • the rear silk gland gene expression unit of this configuration may be a monocistronic system containing one chimeric gene under the control of one rear silk gland expression promoter, or a polycistronic system containing two or more chimeric genes. It may be.
  • the chimeric gene is operably linked downstream of the posterior silk gland expression promoter.
  • “functionally linked downstream of the posterior silk gland expression promoter” means that a gene such as a chimeric gene is placed downstream of the posterior silk gland expression promoter at a position where expression control by the promoter is performed, It means joining.
  • the posterior silk gland gene expression unit is composed of a first subunit and a second subunit, each subunit has the following configuration. As shown in FIG. 3 (b), the first subunit consists of a posterior silk gland expression promoter (in FIG. 3 (b), the Fib H promoter), and a transcriptional regulator functionally linked downstream of the promoter. (See GAL4 gene in FIG. 3B).
  • a 5 ′ UTR may be included upstream of the DNA encoding the transcriptional regulatory factor, and a 3 ′ UTR may be included downstream thereof.
  • the posterior silk gland expression promoter of the first subunit encodes a protein that is specifically and abundantly expressed in the posterior silk gland, such as the promoter of genes encoding fibroin constituent proteins, eg, Fib H, Fib L, or p25. A gene promoter is preferred.
  • the second subunit functions as a target promoter of the transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit (UAS corresponds to FIG. 3C), and functions downstream of the target promoter.
  • Peptide-derived signal peptide DNA specifically, sericin 1 signal peptide DNA corresponds in FIG.
  • the second subunit may be a monocistronic system containing one chimeric gene under the control of one posterior silk gland expression promoter, or a polycistronic system containing two or more chimeric genes. .
  • the rear silk gland gene expression unit of this configuration functions in one set of first and second subunits.
  • a transcriptional regulatory factor expressed from the first subunit by activating the posterior silk gland expression promoter activates the target promoter of the second subunit to express a chimeric peptide containing the target peptide.
  • the second subunit may be two or more subunits containing different chimeric genes.
  • the transcriptional regulatory factor expressed from the first subunit can express the target peptide encoded by each second subunit by activating the target promoter of each second subunit.
  • the rear silk gland gene expression unit of this configuration can amplify the expression of the peptide of interest encoded by the second subunit via the transcriptional regulatory factor encoded by the first subunit. Therefore, it is suitable when the gene expression ability of the posterior silk gland expression promoter is not high.
  • the gene described below can be used in constructing the rear silk gland gene expression unit of the present invention. It is also useful for producing recombinant silkworms. 1-3. effect According to the rear silk gland gene expression unit of the present invention, a large amount of the peptide can be synthesized in the rear silk gland of a silkworm that has been conventionally unsuitable as a water-soluble peptide production system in this field. In addition, by using the rear silk gland gene expression unit of the present invention, it is possible to produce a transgenic silkworm with higher production efficiency than a genetically modified silkworm as a conventional protein production system using the middle silk gland. It becomes. 2.
  • the second aspect of the present invention is a genetically modified silkworm.
  • the genetically modified silkworm of the present invention has the posterior silk gland gene expression unit of the first aspect, and is characterized by being able to express and secrete a target peptide in large quantities in the posterior silk gland.
  • the “genetically modified silkworm” of the present invention refers to a silkworm or its progeny obtained by introducing the rear silk gland gene expression unit of the first aspect into a host silkworm.
  • the host silkworm may be any silkworm described above. Silkworms, erisan and sakusan, which have been established as breeding methods and artificial samples and can be cultivated in multiple heads, are particularly preferred as host silkworms.
  • the genetically engineered silkworm of the present invention may have the posterior silk gland gene expression unit of the first aspect transiently in the cell, or may be stably present when introduced into the genome. You may do it. It is preferable to have it stably.
  • the genetically modified silkworm of the present invention can have two or more posterior silk gland gene expression units different from each other in the first aspect.
  • a transgenic silkworm can have both a posterior silk gland gene expression unit composed of one gene expression unit and a posterior silk gland gene expression unit composed of two subunits. When the posterior silk gland gene expression unit is composed of two subunits, the first subunit and the second subunit, and each is inserted into the silkworm chromosome, each subunit is present on the same chromosome.
  • each subunit may exist on different chromosomes. If each subunit is present on a different chromosome, it has a line of transgenic silkworms having only the first subunit (preferably in a homozygote) and only the second subunit (preferably in a homozygote).
  • the genetically modified silkworm of the present invention having the first subunit and the second subunit at F1 can be easily obtained.
  • the transgenic silkworm strain having only the first subunit can be used for mating with the genetically modified silkworm strain having only the various second subunits.
  • the rear silk gland expression type recombinant silkworm can be used as a water-soluble peptide production system.
  • the third aspect of the present invention is a method for producing a transgenic silkworm.
  • the present invention is characterized by producing a transgenic silkworm capable of expressing a target peptide in the posterior silk gland of the silkworm. 3-2.
  • the method for producing a transgenic silkworm of the present invention is a method of introducing the posterior silk gland gene expression unit described in the first aspect into a silkworm that is a host, or the first of the posterior silk gland gene expression unit of the present invention. Examples include a method of mating silkworms having a subunit and the second subunit on different chromosomes.
  • the posterior silk gland gene expression unit described in the first aspect may be introduced into a silkworm, which is a host, by a method known in the art.
  • a silkworm egg such as a silkworm egg
  • Tamura T Tamura T.
  • transposon inverted terminal repeat sequence (Handler AM. Et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7520-5) is provided at both ends.
  • a helper vector having DNA encoding transposon transferase may be injected into an early egg of silkworm, together with an expression vector containing the described rear silk gland gene expression unit.
  • An example of the helper vector is pHA3PIG.
  • the obtained transformant is selected based on a selection marker. If necessary, sibling or inbred mating may be performed to obtain a homozygote of the posterior silk gland gene expression unit inserted in the genome.
  • each gene expression unit The method for introducing the worm into silkworms may be performed by the same method as described above, for example, the method of Tamura et al.
  • a method for producing transgenic silkworms having two gene expression units by mating transgenic silkworms having respective gene expression units on different chromosomes can also be obtained by a hybridization method known in the art. .
  • silkworms having respective gene expression units may be crossed and individuals having selection markers for two gene expression units may be selected for F1 individuals.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a method for producing a target peptide.
  • the target peptide particularly a water-soluble peptide
  • the production method of the present invention includes a breeding process and a recovery process. Hereinafter, each step will be described.
  • the “breeding process” is a process of breeding the genetically modified silkworm of the second aspect.
  • each silkworm may be raised by a technique known in the art. For example, if the silkworm is a silkworm, see “Introduction to Species; Takeo Takami, published by the National Species Association”, and if it is Elysan, see “Erisan Artificial Feed and Breeding Method; Good.
  • the feed is, for example, leaves of the genus Morus for silkworms or mulberry, leaves of Ricinus communis or licorice for Erysan, and leaves of Fagusaeae for sacs.
  • It may be a natural leaf of a herbaceous tree species such as, or may be an artificial feed such as for silk mate L4M or for raw silkworm species 1-3 years old (Nippon Agricultural Industry). Artificial feed is preferable in view of the fact that it is possible to suppress the occurrence of illness, provide stable quality and quantity, and can be sterilized aseptically as necessary.
  • a simple breeding method will be described using a silkworm as an example. Sweeping is carried out with eggs laid by females of a similar transgenic silkworm of an appropriate number (for example, 4 to 10).
  • the hatched larvae are transferred from the egg mount into a container laid with dry paper (paraffin processed paper), which is a scorpio, and artificial feed such as silk mate is arranged on the dry paper and fed.
  • dry paper paraffin processed paper
  • artificial feed such as silk mate is arranged on the dry paper and fed.
  • the bait is exchanged once every 1 to 2 years and once to 3 times at 3 years. Old bait is removed to prevent corruption if left over.
  • the container may be provided with a lid made of dry paper, acrylic, or mesh.
  • the breeding temperature is raised at 25 to 28 ° C. throughout the entire age.
  • the “recovery step” is a step of recovering the target peptide accumulated in the lumen of the silk gland after the larva of the transgenic silkworm of the second aspect is expressed and secreted in the posterior silk gland cells.
  • the genetically modified silkworm of the second aspect mainly expresses the target peptide contained in the posterior silk gland gene expression unit in the posterior silk gland cells as a chimeric peptide with a signal peptide from the late ages of larvae.
  • the chimeric peptide is transported to the endoplasmic reticulum by the action of the signal peptide, and the signal peptide is cleaved by an enzymatic action such as peptidase in the endoplasmic reticulum and then secreted into the posterior silk gland lumen.
  • the target peptide migrates and accumulates in the middle silk gland, and is secreted and spun out of the individual together with sericin and fibroin from the anterior silk gland during the hatching period. Therefore, the method for recovering the target peptide includes a method for recovering from the cocoon, or a method for extracting and directly recovering the silk gland from the worm body from the late-early to early-early stages.
  • the method of recovering from sputum is excellent in that the target peptide can be easily recovered.
  • the method of recovering the target peptide from the pupa first, the late-stage larvae are put into the upper cocoon (the larvae are transferred to the pupa “Mabushi”) and then managed. Next, the target peptide is extracted from the straw.
  • the extraction method is not particularly limited.
  • sputum in a suitable neutral extraction buffer without water or protein denaturant eg phosphate-buffered saline with or without 1% Tween-20 and 0.05% sodium azide, pH 7.2
  • the target peptide can be recovered simply by soaking. In order to enhance the extraction effect, the wrinkles may be cut or crushed before immersion.
  • the extraction temperature is 0 to 10 ° C., preferably 0 to 5 ° C., in order to prevent thermal denaturation of the target protein. However, if the target peptide is not a heat-sensitive peptide, it can also be carried out at 10 to 40 ° C.
  • the extract may be stirred as necessary.
  • the extraction time varies depending on the extraction conditions such as the state of the soot (for example, whether it is an uncut state or a powder state), the amount of the extraction liquid, the extraction temperature, and the presence or absence of stirring, and may be determined appropriately according to the conditions. Insoluble components such as fibroin can be removed from the extract by centrifugation or filtration as necessary.
  • the method of extracting the silk gland from the larvae of the late stage of life to the pre-dance stage and recovering the target peptide can be achieved by methods known in the art.
  • silkworms just before sprout on the 6th day of final age (5 years old) should be anesthetized on ice, and the dorsal side should be incised and removed with tweezers so as not to damage the silk gland (Mori Akira, neoplasm by silkworms) Science Experiment, Sanseido, 1970, pp. 249-255).
  • the extracted silk gland can be gently shaken in the extraction buffer at a temperature of 0 to 10 ° C., preferably 0 to 5 ° C., to elute the target peptide into the buffer.
  • the target peptide is not a heat-sensitive peptide, it may be carried out at a temperature of 10 to 40 ° C. Thereafter, contaminants such as tissue fragments may be removed by centrifugation or filtration, and the supernatant containing the target peptide may be collected. 4-3. effect
  • the target peptide by using the genetically modified silkworm larvae of the second aspect as a protein production system, the target peptide, In particular, a large amount of a water-soluble peptide can be produced and easily recovered.
  • embodiments of the present invention will be described with reference to specific examples. However, the present examples are only one concept of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • silkworms that are most commonly used in this field were used as host silkworms.
  • Example 1 Construction of posterior silk gland gene expression unit> Various expression vectors containing the rear silk gland gene expression unit of the present invention were constructed. In this example, an expression vector such as a posterior silk gland gene expression unit composed of first and second subunits was constructed. (Method) 1. Construction of expression vector (1) First subunit for the middle silk gland gene expression unit: pBacSer-pro GAL4 / 3xP3DsRed2 (FIG.
  • the sericin 1 gene promoter is a sericin 1 gene (GenBank Accession No. NM_001044041) represented by SEQ ID NO: 14 using a primer represented by SEQ ID NO: 12 containing a restriction enzyme AscI site and a primer represented by SEQ ID NO: 13 containing a BamHI site.
  • the promoter region from 666 to +40 was prepared by PCR amplification from the genomic DNA of the silkworm strain.
  • the amplified fragment was inserted into pCR-Blunt II-TOPO vector (life technologies).
  • the obtained plasmid was treated with AscI and BamHI, and the isolated AscI-BamHI amplified fragment was isolated from AscI-BamHI upstream of the GAL4 gene of pBacA3dGAL4 (Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75: 89-97). Inserted into the site.
  • a 3xP3-DsRed cassette excised by BglII from pBacA3GAL4 / 3xP3DsRed2 (Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75: 89-97) was inserted into this plasmid as a selection marker for the middle silk gland gene expression unit The first subunit was constructed.
  • the Fib H gene promoter specifically expressed in the posterior silk gland, the transcriptional regulatory factor GAL4 gene functionally linked downstream thereof, and further bound downstream thereof PBacFibH1-pro GAL4 / 3xP3DsRed2 having the hsp70polyA addition sequence was constructed.
  • the Fib H gene promoter uses the primer shown in SEQ ID NO: 15 containing the restriction enzyme AscI site and the primer shown in SEQ ID NO: 16 containing the BamHI site, and the ⁇ of the Fib H gene shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. AF226688).
  • a region of about 870 bp from 858 to +11 was prepared from the genomic DNA of the silkworm strain by PCR amplification.
  • the amplified fragment was inserted into pCR-Blunt II-TOPO vector (life technologies).
  • the obtained plasmid was treated with AscI and BamHI, and the isolated AscI-BamHI amplified fragment was isolated from AscI-BamHI upstream of the GAL4 gene of pBacA3dGAL4 (Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75: 89-97). Inserted into the site.
  • a 3xP3-DsRed cassette excised by BglII from pBacA3GAL4 / 3xP3DsRed2 (Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol 75: 89-97) was inserted into this plasmid as a selection marker and used for the posterior silk gland gene expression unit The first subunit was constructed.
  • a base sequence (SEQ ID NO: 7) encoding a secretion signal (SEQ ID NO: 6) of the sericin 1 gene downstream of the UAS sequence, and a 3 ′ terminal side thereof PBacSerUAS in which the added base sequence for cloning (SEQ ID NO: 17) and the EGFP gene (SEQ ID NO: 18) as the target water-soluble peptide DNA are linked, and the 3′UTR of sericin 1 (SEQ ID NO: 19) is linked downstream thereof.
  • -Ser_sigEGFP / 3xP3EGFP was constructed.
  • Example 2 Production of transgenic silkworm> Various transgenic silkworms were produced using each expression vector constructed in Example 1. (Materials and methods) (1) Silkworm strain The white-eye / white egg / non-dormant w1-pnd strain maintained at the National Institute of Agrobiological Sciences was used as the host strain.
  • a strain having both the first subunit and the second subunit is crossed, and a strain having both gene expression units in one individual is selected according to the presence or absence of eye fluorescence by the 3xP3EGFP marker and the 3xP3DsRed2 marker in the same manner as above, and the middle silk thread
  • a transgenic silkworm that expresses gland-specific expression and a recombinant silkworm that expresses the silkworm gland-specific expression that is the recombinant silkworm of the present invention were obtained.
  • Example 3 Expression of recombinant protein in silk gland> (Method)
  • Each genetically engineered silkworm produced in Example 2 was raised in the same manner as in Example 2, and anesthetized on ice immediately before the 5th-day, 6th-day sprout. The dorsal side was incised, and the middle and rear silk with tweezers. The gland was removed without damaging the gland (see Mori Kaoru, New Biological Experiment with Silkworm, Sanseido, 1970, pp. 249-255). This was not fixed and observed with a fluorescence microscope (Olympus SZX16, GFP filter). (result) The results are shown in FIG.
  • Example 4 Expression level of recombinant protein in silk gland> (Method)
  • Each genetically engineered silkworm produced in Example 2 is bred in the same manner as in Example 2, and anesthetized on ice immediately before the 5th, 6th day spun, and the dorsal side is opened with tweezers as described above. The silk gland was removed without damaging it. From the results of Example 3, the silk gland was obtained from only the middle silk gland from the recombinant silkworm having the middle silk gland gene expression unit, and from the recombinant silkworm having the rear silk gland gene expression unit, the middle silk gland and the rear silk gland. Was extracted respectively.
  • the results are shown in FIG.
  • the EGFP expression level of the water-soluble protein recovered from the middle silk gland of the recombinant silkworm having the middle silk gland gene expression unit was 1000 ⁇ g per head, whereas the recombinant silkworm having the rear silk gland gene expression unit.
  • the expression levels of EGFP recovered from the posterior silk gland and middle silk gland were 750 ⁇ g and 1600 ⁇ g, respectively.
  • EGFP in the middle silk gland is a transition of EGFP expressed in the posterior silk gland
  • 2350 ⁇ g of EGFP was expressed in the posterior silk gland.
  • This expression level is 10 to 50 times the expression level of the conventional posterior silk gland gene expression system shown in FIG. 2 (c) (Royer C.
  • EGFP is contained in recombinant silkworm cocoons having middle and posterior silk gland gene expression units. This result suggests that EGFP, which is a water-soluble peptide expressed from the posterior silk gland gene expression unit, can be recovered from the cocoon.
  • ⁇ Example 6 Effect of signal peptide in posterior silk gland> The expression and secretion amount of EGFP in the posterior silk gland by the signal peptide derived from the protein expressed specifically in the posterior silk gland or the middle silk gland was examined. (Method) (1) Construction of expression vector A second subunit for comparison, pBacSerUAS-p25_sigEGFP / 3xP3EGFP (FIG. 8A) was constructed.
  • This subunit has the same basic structure as the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 1, but only the signal peptide is a signal peptide derived from p25 that is expressed specifically in the posterior silk gland. ing.
  • the p25 signal peptide DNA uses the genomic sequence from exon 1 to the first amino acid of exon 2 (SEQ ID NO: 20), and cytosine in the p25 signal peptide is substituted with isoleucine (SEQ ID NO: 20). 21) (The signal peptide of the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit is derived from sericin 1). The exon-intron sequence (Royer C.
  • the obtained plasmid was treated with SmaI and BspHI, and the isolated SmaI-BspHI fragment was transferred to the HincII-NcoI site of pEGFP_NcoI_NheI plasmid (Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19 (3): 473-87). Inserted.
  • the resulting plasmid was partially digested with NheI to isolate an approximately 1.3 kb NheI fragment. This NheI fragment was inserted into the BlnI site of the pBac [SerUAS / 3xP3EGFP] plasmid (Tatematsu K.
  • Lines each having the second subunit for use were mated, and a line having both gene expression units in one individual was selected in the same manner as in Example 2 based on the presence or absence of eye fluorescence by the 3xP3EGFP marker and the 3xP3DsRed marker.
  • the method of creating a system having the second subunit for comparison and the method of mating the systems each having the first subunit and the second subunit for comparison were performed according to the method described in Example 2. (3) Breeding conditions The method described in Example 2 was followed.
  • the expression level of EGFP was measured in a line having a first subunit of the posterior silk gland gene expression unit and a second subunit containing a signal peptide of sericin 1 or a line having a comparative second subunit containing a signal peptide of p25. .
  • the method was according to the method described in Example 4. (result) The results are shown in FIG. 8B. Since both strains have the first subunit of the posterior silk gland gene expression unit, the EGFP proteins detected here are all expressed in the posterior silk gland, and the EGFP proteins detected in the middle silk gland are The posterior silk gland shows a transition after expression.
  • the actual expression level of the EGFP protein expressed in the posterior silk gland is the sum of the EGFP protein amounts of the middle silk gland and the posterior silk gland.
  • the middle silk gland It was found that that of the strain having the second subunit containing a signal peptide derived from the specifically expressed protein sericin 1 (sericin 1 in FIG. 8B) is about 10 times as many.
  • the signal peptide in the rear silk gland gene expression unit of the present invention is suitably a signal peptide derived from a protein expressed specifically in the middle silk gland.
  • the line having the second subunit containing the signal peptide derived from sericin 1 90% or more of the expressed EGFP protein was transferred to the middle silk gland, so that the target peptide expressed in the posterior silk gland was more There is also an advantage that it is easy to collect.
  • Example 7 Influence of signal peptide derived from mammal and target peptide (1)> The expression and secretion amount of the target peptide in the silk gland by the gene expression unit containing a signal peptide derived from a mammal and / or the target peptide was verified.
  • Method (1) Construction of expression vector Second subunit I for first verification: pBacSerUAS-ser_sigpoIL2 / 3xP3EGFP (FIG. 9A: when signal peptide is sericin 1) was constructed. This subunit has the same basic structure as the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 1, but only the target peptide is derived from porcine interleukin 2 (IL-2).
  • IL-2 porcine interleukin 2
  • the amplified fragment was inserted into the pZErO-2 vector (invitrogen).
  • the obtained plasmid was treated with BlnI, and the isolated BlnI fragment was inserted into the BlnI site of the pBac [SerUAS / 3xP3EGFP] plasmid to construct the second subunit I for verification: pBacSerUAS-ser_sigpoIL2 / 3xP3EGFP.
  • Second subunit for verification I pBacSerUAS-poIL2 / 3xP3EGFP (FIG. 9A: when the signal peptide is porcine IL-2) was constructed.
  • This subunit has the same basic structure as the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 1, but the signal peptide and the target peptide are both derived from porcine IL-2. It is different.
  • a DNA fragment encoding the peptide of porcine IL-2 was prepared by PCR amplification from pAcPIL2 using the primer shown in SEQ ID NO: 30 containing the restriction enzyme BlnI site and the primer shown in SEQ ID NO: 31. The amplified fragment was inserted into the pZErO-2 vector (invitrogen).
  • a system having both the first subunit of the posterior or middle silk gland gene expression unit and the first or second verification second subunit I is the first or second verification second subunit.
  • a system having a first or a second subunit is prepared by crossing a system having a first subunit and a system having each verification second subunit I. In the same manner as in No.
  • Example 4 Western blotting According to the method described in Example 4, the middle silk gland and the posterior silk gland were extracted from each strain, and the protein in each silk gland was extracted. Subsequently, the silk gland extract was mixed with an equal amount of EZ apply (AE-1430, ATTO) and heated at 95 ° C. for 5 minutes to form SDS. The SDS-converted sample was electrophoresed at a constant current of 20 mA for about 90 minutes using a 9 cm ⁇ 8 cm 13% SDS-PAGE gel. The gel was transferred to a PVDF membrane (RPN303F, GE Healthcare) using a semi-dry transfer device (NA-1512S, Nippon Aido) at 120 mA for 60 minutes.
  • PVDF membrane RPN303F, GE Healthcare
  • the membrane was lightly shaken with EZ wash (AE-1480, ATTO) for 5 minutes, and then the primary antibody (anti-IL-2 rabbit serum, diluted 2,000 times) was reacted at 4 ° C. overnight.
  • the membrane was washed 3 times for 10 minutes with EZ wash, and then a secondary antibody (NA934-100UL, GE healthcare, diluted 50,000 times) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was washed 3 times for 10 minutes with EZ wash, then reacted with ECL prime (RPN2232, GE Healthcare) for 5 minutes, and a signal was detected with LAS3000 (Fuji film). (result)
  • FIGS. 9B and 9C The results are shown in FIGS. 9B and 9C.
  • the desired water-soluble peptide can be produced in large quantities in the posterior silk gland of the silkworm by expressing it as a chimeric protein.
  • the signal peptide and the target peptide are both gene expression units having the second subunit for verification derived from porcine IL-2, they were efficiently expressed and secreted in the middle silk gland gene expression unit (FIG. 9C).
  • the posterior silk gland gene expression unit FIG. 9B
  • both the expression level and the transition from the posterior silk gland to the middle silk gland were very low in efficiency. This result is consistent with the result of defensin described in Patent Document 1.
  • Example 8 Effect of signal peptide derived from mammal and target peptide (2)> Using a gene expression unit containing a signal peptide derived from a mammal different from that in Example 7 and / or the target peptide, the expression and secretion amount of the target peptide in each silk gland was verified again.
  • Method (1) Construction of expression vector Second subunit II for first verification: pBacSerUAS-ser_sigboIFN ⁇ / 3xP3EGFP (FIG. 10A: when signal peptide is sericin 1) was constructed.
  • This subunit has the same basic structure as the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 1, but only the target peptide is derived from bovine interferon ⁇ (IFN- ⁇ ). It is different in point.
  • a fragment in which IFN ⁇ (excluding the signal peptide originally possessed by IFN ⁇ ) is connected downstream of the signal peptide sequence of sericin 1 is represented by the primer shown in SEQ ID NO: 32 containing the restriction enzyme BlnI site and SEQ ID NO: 33 containing the restriction enzyme BlnI site.
  • SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 having the sequence of the sericin 1 signal peptide and IFN ⁇ .
  • Second subunit II for second verification pBacSerUAS-boIFN ⁇ / 3xP3EGFP (FIG. 10A: when the signal peptide is bovine IFN- ⁇ ) was constructed.
  • This subunit has the same basic structure as the second subunit for the posterior silk gland gene expression unit constructed in Example 1, but the signal peptide and the target peptide are both derived from bovine IFN- ⁇ . It is different.
  • a DNA fragment encoding the amino acid of bovine IFN ⁇ (SEQ ID NO: 36, except for the signal peptide DNA shown by SEQ ID NO: 37 inherent in bovine IFN- ⁇ ) is a primer and a restriction enzyme shown in SEQ ID NO: 38 containing the restriction enzyme BlnI site It was prepared by PCR amplification from pBIFN- ⁇ using the primer shown in SEQ ID NO: 39 containing the BlnI site. The amplified fragment was inserted into the pZErO-2 vector (invitrogen).
  • Example 4 (a) for the middle silk gland gene expression unit constructed in Example 1 and the second subunit II for verification described above were used.
  • a line having the same structure as in Example 7 was prepared.
  • (3) Breeding conditions The method described in Example 2 was followed.
  • (4) Western blotting According to the method described in Example 4, the middle silk gland and the posterior silk gland were extracted from each strain, and the protein in each silk gland was extracted. Subsequently, the silk gland extract was mixed with an equal amount of EZ apply (AE-1430, ATTO) and heated at 95 ° C. for 5 minutes to form SDS.
  • the SDS-converted sample was electrophoresed at a constant current of 20 mA for about 90 minutes using a 9 cm ⁇ 8 cm 13% SDS-PAGE gel.
  • the gel was transferred to a PVDF membrane (RPN303F, GE Healthcare) using a semi-dry transfer device (NA-1512S, Nippon Aido) at 120 mA for 60 minutes. After the transfer, the membrane was lightly shaken with EZ wash (AE-1480, ATTO) for 5 minutes, and then the primary antibody (anti-IFN ⁇ antibody: AS1019.2, Cosmo Bio, diluted 2000 times) was overnight at 4 ° C. Reacted. The membrane was washed 3 times for 10 minutes with EZ wash, and then a secondary antibody (NA934-100UL, GE healthcare, diluted 50,000 times) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • NA934-100UL GE healthcare, diluted 50,000 times
  • the posterior silk gland gene expression unit of the present invention by introducing the posterior silk gland gene expression unit into a silkworm, a large amount of recombinant peptides and the like can be expressed and secreted and easily recovered.
  • a mass production system silkworm of the recombinant peptide can be provided.
  • the method for producing a recombinant genetic silkworm of the present invention by introducing the rear silk gland gene expression unit of the present invention into a silkworm, a mass production organism of the recombinant peptide can be easily produced. .
  • a water-soluble peptide can be easily produced.

Abstract

　カイコをはじめとする絹糸虫の後部絹糸腺において組換えペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に発現することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及びその遺伝子発現ユニット及びそれを導入した遺伝子組換え絹糸虫の提供を課題とする。　後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチド、及びその下流に連結されたフィブロインの構成成分として分泌されるタンパク質を含まない目的のペプチドをコードするDNAを含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを提供する。

Description

後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫
　本発明は、カイコのような絹糸虫の後部絹糸腺において目的のペプチドを大量に発現することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫に関する。
　カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）の絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成できる能力を有している。また、カイコの絹糸腺は大型器官であるため摘出が容易であり、また合成されたタンパク質は絹糸腺内腔に貯蔵されることから回収しやすいという利点もある。そのため、絹糸腺で目的のタンパク質を発現する遺伝子組換えカイコは、タンパク質の大量生産系として有望視されている。
　カイコの絹糸腺は、形態学的には図１で示すような左右１対の器官であり、それぞれは、前部絹糸腺、中部絹糸腺、及び後部絹糸腺の３つの領域で構成されている。後部絹糸腺細胞内では、絹糸の繊維成分であるフィブロインを構成する３つの主要なタンパク質、フィブロインＨ鎖（以下、しばしば「Ｆｉｂ　Ｈ」と略称する）、フィブロインＬ鎖（以下、しばしば「Ｆｉｂ　Ｌ」と略称する）、及びｐ２５／ＦＨＸ（以下、「ｐ２５」とする）が発現している。また中部絹糸腺細胞内では絹糸の被覆成分であるゼラチン様タンパク質、セリシンが発現している（図１）。後部絹糸腺細胞内で発現した前記３つのタンパク質は、Ｆｉｂ　Ｈ：Ｆｉｂ　Ｌ：ｐ２５＝６：６：１の比率で複合体（ｓｉｌｋ　ｆｉｂｒｏｉｎ　ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｕｎｉｔ；本明細書では、以下「ＳＦＥＵ複合体」と称する。）を形成し、後部絹糸腺内腔中に分泌される。これに対して、セリシンは、発現後に中部絹糸腺内腔中に分泌される。後部絹糸腺内腔中に分泌されたフィブロインは、その後、中部絹糸腺内腔に移行し、セリシンで被覆されて絹糸として吐糸される（図１：非特許文献１）。したがって、カイコ絹糸腺をタンパク質発現系として利用する場合、中部絹糸腺又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子発現系を利用すればよい。
　カイコ絹糸腺をタンパク質発現系として利用する場合、これまでに中部絹糸腺を用いた組換えタンパク質発現システムとしてＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（非特許文献２）、又はセリシン１プロモーター及びＨｒ３エンハンサーを組み合わせた系による大量発現方法（非特許文献３）が確立している。
　一方、後部絹糸腺におけるタンパク質合成能力は、中部絹糸腺のそれの約３倍であることが知られている（非特許文献４）。それ故、生産面から判断すれば、中部絹糸腺よりも後部絹糸腺の方がタンパク質発現系としては、より好ましい。また、後部絹糸腺で生産された組換えタンパク質は、繭糸と共に分泌されるため絹繊維として利用するのにも適している（非特許文献５）。
　ところで、これまでの研究からＦｉｂ　Ｈに異常があるカイコの変異系統（Ｎｄ系統）やＦｉｂ　Ｌに異常があるカイコの変異系統（Ｎｄ−ｓ系統及びＮｄ−ｓＤ系統）は、他のフィブロイン構成タンパク質が正常に発現しているにもかかわらず、ほとんど吐糸できないことが知られている（非特許文献６）。また、これらの変異系統の解析から、後部絹糸腺内腔へのＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、及び／又はｐ２５の効率的な分泌には、前記ＳＦＥＵ複合体の形成が重要であることが判明している（非特許文献７及び８）。したがって、前記変異系統が吐糸できない理由は、いずれかの構成タンパク質に異常があるためにＳＦＥＵ複合体を形成できず、その結果、ＦｉｂＨ、ＦｉｂＬ、及びｐ２５のいずれも後部絹糸腺細胞から内腔中へ分泌されないためと考えられている（非特許文献９）。このような知見から、後部絹糸腺細胞内で発現したタンパク質は、ＳＦＥＵ複合体を構成したときにのみ効率的に細胞外に分泌されるというのが当該分野の通説である。したがって、後部絹糸腺をタンパク質発現系として利用するには、後部絹糸腺に特異的な分泌システムを利用するために目的の組換えタンパク質をＳＦＥＵ複合体の一部として発現させる等の工夫をしなければならない。
　後部絹糸腺で組換えタンパク質をＳＦＥＵ複合体の一部として発現・分泌させる具体的な方法としては、Ｆｉｂ　Ｈ遺伝子又はＦｉｂ　Ｌ遺伝子のプロモーターの下流にＦｉｂ　Ｈ又はＦｉｂ　Ｌの全部又は一部と組換えタンパク質とを結合した融合タンパク質（キメラタンパク質）として発現させる方法が知られている（図２ａ及びｂ）（非特許文献１０、１１）。そのようなキメラタンパク質は、ＳＦＥＵ複合体の一部として組み込まれるため後部絹糸腺の内腔への分泌は効率的に行われる。しかし、ＳＦＥＵ複合体に組み込まれることによって不溶性となってしまうため、組換えタンパク質を回収するには分泌されたＳＦＥＵ複合体の可溶化処理を行わなければならない。可溶化には強い変性剤による処理が必須であり、さらに、生理活性を発現させるためには、キメラタンパク質中のフィブロイン構成タンパク質部分の切断も必要となる場合がある。そのため後部絹糸腺で発現させた組換えタンパク質は、回収が困難な上に、その活性を失うリスクを伴うという大きな問題があった。
　一方、組換えタンパク質を不溶性のＳＦＥＵ複合体の構成成分としてではなく、水溶性タンパク質として後部絹糸腺にて発現・分泌させる方法も知られている。例えば、目的の組換えタンパク質をコードするＤＮＡの上流にｐ２５のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加する方法（図２ｃ）（非特許文献１２）が挙げられる。この方法では目的とするタンパク質は水溶性タンパク質として発現され得るが、発現量及び分泌効率が低いという大きな問題があった（非特許文献１２）。また、後部絹糸腺特異的なタンパク質のシグナルペプチドを用いるのではなく、特許文献１に記載されたタイワンカブトムシのディフェンシンの発現方法のように、目的の組換えタンパク質自身のシグナルペプチドを含む状態で該組換えタンパク質を後部絹糸腺にて可溶化した状態で発現させる方法も試みられている。しかしながら、この方法も前記方法と同様に目的とするタンパク質は発現され得るものの、発現量及び分泌効率が低いという問題があった。
　以上の理由より、当該分野では、遺伝子組換えカイコの絹糸腺発現系を用いて、タンパク質を水溶性の状態で簡便にかつ多量に生産する場合には、後部絹糸腺は不適とされてきた。
特開２００５−９５０６３
Ｉｎｏｕｅ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（５１）：４０５１７−４０５２８． Ｔａｔｅｍａｔｓｕ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７． Ｔｏｍｉｔａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（４）：４４９−４６５． Ｍ．Ｍｏｎｄａｌ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｃａｓｐｉａｎ　Ｊ．Ｅｎｖ．Ｓｃｉ　５（２）：６３−７． 田村俊樹　他，２００８，農業技術，６３巻第７号：３２０−２３６． Ｇａｍｏ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，１９８５，Ｊ．ｓｅｒｉｃ．Ｓｃｉ．Ｊｐｎ，５４，４１２−４１９． Ｔａｋｅｉ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，１９８４，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，９９：２００５−２０１０． Ｔａｋｅｉ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０５：１７５−１８０． Ｉｎｏｕｅ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：３５６−３６６． Ｋｏｊｉｍａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，７１：２９４３−２９５１． Ｔｏｍｉｔａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，２００３，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１：５２−５６． Ｒｏｙｅｒ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２．
　しかしながら、もしも組換えペプチドをフィブロインの構成成分としてではなく、水溶性ペプチドとして後部絹糸腺で簡便にかつ多量に発現及び分泌させることができれば、その高いタンパク質合成能力により遺伝子組換えカイコを用いた有用ペプチドの生産効率を向上させることができ、また、それによって製造コストを低減することも可能となる。
　そこで、本発明の目的は、カイコをはじめとする絹糸虫の後部絹糸腺において水溶性組換えペプチドを大量に発現・分泌することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを開発し、その遺伝子発現ユニット及びそれを導入した遺伝子組換え絹糸虫を提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、中部絹糸腺細胞で特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドに外来の水溶性ペプチドを連結したキメラペプチドをコードする遺伝子を後部絹糸腺で発現させたところ、驚くべきことに従来の後部絹糸腺遺伝子発現系と比較して１０~５０倍もの効率で目的の水溶性ペプチドを発現及び分泌させることができることを見出した。本願発明は、当該新規知見に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡを含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（２）前記シグナルペプチドがセリシン１~３のいずれか一のシグナルペプチドである、（１）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（３）前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ又はｐ２５である、（１）又は（２）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（４）（ａ）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、（ｂ）該転写調節因子の標的プロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡを含む第２サブユニットから構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（５）前記シグナルペプチドがセリシン１~３のいずれか一のシグナルペプチドである、（４）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（６）前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ又はｐ２５である、（４）又は（５）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（７）（１）~（３）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
（８）（４）~（６）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
（９）前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、（８）に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１０）前記第１サブユニットを有する系統と前記第２サブユニットを有する系統とを交配して得られる、（８）又は（９）に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１１）絹糸虫がカイコ、エリサン、又はサクサンである、（７）~（１０）のいずれかに記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１２）（１）~（６）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入して、後部絹糸腺において目的のペプチドを発現する遺伝子組換え絹糸虫の作出方法。
（１３）（７）~（１１）のいずれかに記載の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチドを製造する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−２８１３３０号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　図１は、カイコの絹糸腺及びその各部位で発現するフィブロイン構成タンパク質と絹糸が吐糸されるまでの概念図である。
　図２は、従来の後部絹糸腺での組換えタンパク質発現ユニットの構成を示す図である。（ａ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、Ｆｉｂ　ＨのＮ末端領域及びＣ末端領域をそれぞれコードする遺伝子領域の間に目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ　Ｘ）を結合してなる融合遺伝子を、Ｆｉｂ　Ｈ遺伝子プロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。（ｂ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、Ｆｉｂ　Ｌの全長をコードする遺伝子領域の下流に目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ　Ｘ）を結合してなる融合遺伝子を、Ｆｉｂ　Ｌ遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。（ｃ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、ｐ２５のシグナルペプチドをコードする遺伝子領域と目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ　Ｘ）を結合してなる融合遺伝子をｐ２５遺伝子プロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。なお、（ａ）~（ｃ）の３’末端側の白箱は、ポリＡシグナルを含む３’ＵＴＲを示す。
　図３は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構成例を示す。（ａ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合の構成例である。（ｂ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが２つのサブユニットで構成される場合の第１サブユニットの構成例である。（ｃ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが２つのサブユニットで構成される場合の第２サブユニットの構成例である。なお、（ａ）~（ｃ）の３’末端側の白箱は、ポリＡシグナルを含む３’ＵＴＲを示す。
　図４は、実施例１で構築した発現ベクターを示す。（ａ）中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用の第１サブユニットを示す。（ｂ）後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用の第１サブユニットを示す。（ｃ）第２サブユニットを示す。
　図５は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコにおける中部絹糸腺及び後部絹糸腺でのＥＧＦＰの発現を示す図である。
　図６は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコにおける中部絹糸腺又は後部絹糸腺におけるＥＧＦＰ量を示す図である。
　図７は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコの繭におけるＥＧＦＰの存在を示す図である。
　図８において、Ａは、実施例６で用いた第２サブユニットの一つの構造を示す概念図である。Ｂは、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットと、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質セリシン１由来のシグナルペプチド又は後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質ｐ２５由来のシグナルペプチドのいずれかを有する第２サブユニット（それぞれ図４（ｃ）と図８Ａで示す）を導入した遺伝子組換えカイコにおける後部絹糸腺でのＥＧＦＰ量を示す図である。
　図９において、Ａは、実施例７で用いた第２サブユニットの構造を示す概念図である。シグナルペプチドは、ブタＩＬ−２由来のものとセリシン１由来のものの２種を構築している。Ｂは実施例７で構築した各後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からブタＩＬ−２を検出したウエスタンブロッティングの結果である。Ｃは実施例７で構築した各中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からブタＩＬ−２を検出したウエスタンブロッティングの結果である。
　図１０において、Ａは、実施例８で用いた第２サブユニットの構造を示す概念図である。シグナルペプチドは、ウシＩＦＮ−γ由来のものとセリシン１由来のものの２種を構築している。Ｂは実施例７で構築した各後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からウシＩＦＮ−γを検出したウエスタンブロッティングの結果である。Ｃは実施例７で構築した各中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からウシＩＦＮ−γを検出したウエスタンブロッティングの結果である。
１．後部絹糸腺遺伝子発現ユニット
１−１．概要及び定義
　本発明の第１の態様は、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットである。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、これを絹糸虫に導入することで、その絹糸虫の後部絹糸腺において、目的とする組換えペプチドをフィブロイン構成成分の一部としてではなく、水溶性ペプチドとして大量に発現及び分泌させることができる。
　本明細書において「後部絹糸腺遺伝子発現ユニット」とは、絹糸虫の後部絹糸腺において前記組換えペプチドを大量に発現し、分泌することのできる一組の遺伝子発現システムをいう。
　本明細書において「絹糸虫」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。具体的には、鱗翅目、膜翅目、脈翅目、毛翅目等のうち主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。鱗翅目であれば、多量の絹糸を吐糸できるカイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、イボタガ科（Ｂｒａｈｍａｅｉｄａｅ）、オビガ科（Ｅｕｐｔｅｒｏｔｉｄａｅ）、カレハガ科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、ミノガ科（Ｐｓｙｃｈｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｈｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）等は本明細書の絹糸虫として好ましい。Ｂｏｍｂｙｘ属、Ｓａｍｉａ属、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｓａｔｕｒｎｉａ属、Ａｔｔａｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｉｎｉａ属に属する種、具体的には、カイコ、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ；エリサンＳａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、ヒメヤママユ（Ｓａｔｕｒｎｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、オオミズアオ（Ａｃｔｉａｓ　ｇｎｏｍａ）等が好適な例として挙げられる。
　「絹糸腺」とは、液状絹を産生し、蓄積し、また分泌する機能を有する唾液腺の変化した管状器官である。絹糸腺は、前記絹糸虫の、主として幼虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の３領域で構成されている。前述のように、後部絹糸腺は、絹糸の繊維成分であるフィブロインを産生及び分泌する。また、中部絹糸腺は、被覆成分であるセリシンを産生及び分泌し、後部絹糸腺より移行してきたフィブロインと共にその内腔に蓄積する。
１−２．構成
１−２−１．エレメントの構成
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡの他、該ペプチドの発現に必要な後部絹糸腺発現プロモーター、及び分泌に必要なシグナルペプチドをコードするＤＮＡ等のエレメント等を包含する。以下、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの各エレメントの構成について具体的に説明をする。
（１）フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
　本明細書において「ペプチド」と表記する場合には、２個以上のアミノ酸がアミド結合によって連結した分子をいう。ペプチドは、オリゴペプチド、及びタンパク質のようなポリペプチドを含む。ペプチドは、１遺伝子由来又はその遺伝子断片由来であってもよいし、複数の遺伝子の一部を連結したキメラ遺伝子由来であってもよい。また、ペプチドのアミノ酸長は、特に限定はしない。例えば、アミノ酸残基数が１０~１０，０００個であってもよい。
　本明細書において、「フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチド」とは、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにより大量に発現及び分泌させるべき目的のペプチド（以下、しばしば「目的のペプチド」と略称する）であって、フィブロイン構成タンパク質及びその断片以外のペプチド、及びフィブロイン構成タンパク質の全部又は一部を含まないキメラペプチドをいう。フィブロイン構成タンパク質には、ＳＦＥＵ複合体を構成するＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、又はｐ２５等が該当する。フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドは、ＳＦＥＵ複合体の一部等として発現することはなく、したがって、後部絹糸腺細胞から分泌された後も繭糸の繊維成分の一部となることはない。それ故、目的のペプチドとして、例えば、水溶性ペプチドを本態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットで発現及び分泌させた場合には、該水溶性ペプチドは後部絹糸腺内腔又は繭糸から水、又はタンパク質変性剤を含まない中性の抽出バッファーを用いて容易に分離、回収することができる。このような水溶性ペプチドの例としては、インスリン、カルシトニン、パラトルモン及び成長ホルモンのようなペプチドホルモン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のようなサイトカイン、免疫グロブリン、血清アルブミン、酵素、又はコラーゲン、あるいはそれらの断片（キメラペプチドを含む）が挙げられる。
（２）後部絹糸腺発現プロモーター
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおける後部絹糸腺発現プロモーターは、絹糸虫の後部絹糸腺で作動可能なプロモーターであれば、いずれの遺伝子のプロモーターであってもよい。例えば、後部絹糸腺特異的プロモーターの他、ユビキタスに発現可能な過剰発現型プロモーター、構成的活性型プロモーター若しくは時期特異的活性型プロモーター、又は発現誘導型プロモーター等が挙げられる。好ましくは後部絹糸腺特異的プロモーターである。中でも絹糸虫の後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは好ましく、さらに終齢後期から前蛹期に後部絹糸腺で特異的に活性化する終齢後期後部絹糸腺特異的活性型プロモーターは特に好ましい。具体的には、例えば、フィブロイン構成タンパク質であるＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、又はｐ２５の遺伝子プロモーター（本明細書では、それぞれ「Ｆｉｂ　Ｈプロモーター」、「Ｆｉｂ　Ｌプロモーター」、又は「ｐ２５プロモーター」と称する）が挙げられる。
　後部絹糸腺発現プロモーターの由来生物種は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する絹糸虫の細胞内で作動する限り特に限定はしない。特にＦｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、又はｐ２５の各プロモーターを用いる場合には、いずれの絹糸虫由来であってもよい。これらのプロモーターの塩基配列は、絹糸虫間で進化的に非常によく保存されており、後部絹糸腺発現プロモーターの由来する絹糸虫と本願発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する絹糸虫の種類が異なる場合であっても、そのプロモーターは宿主絹糸虫の後部絹糸腺で作動し得るからである（Ｓｅｚｕｔｓｕ　Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｙ，７８：１−１０）。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおける後部絹糸腺発現プロモーターとして、好ましくは本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する宿主絹糸虫と分類学上同じ目由来、より好ましくは同じ科由来、さらに好ましくは同じ属由来、最も好ましくは同一種由来のプロモーターである。
　Ｆｉｂ　Ｈプロモーターの具体例としては、配列番号１で示される塩基配列を含むカイコ由来のＦｉｂ　Ｈプロモーター、配列番号２で示される塩基配列を含むサクサン由来のＦｉｂ　Ｈプロモーター等が挙げられる。また、Ｆｉｂ　Ｌプロモーターの具体例としては、配列番号３で示される塩基配列を含むカイコ由来のＦｉｂ　Ｌプロモーター、配列番号４で示される塩基配列を含むサクサン由来のＦｉｂ　Ｌプロモーター等が挙げられる。さらに、ｐ２５プロモーターの具体例としては、配列番号５で示される塩基配列を含むカイコ由来のｐ２５プロモーター等が挙げられる。
（３）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（以下「シグナルペプチドＤＮＡ」とする）を含む。このシグナルペプチドは、絹糸腺細胞内で発現した目的のペプチドを絹糸腺内腔内に分泌する上で必要なペプチドである。通常、シグナルペプチドは、分泌性タンパク質のＮ末端側に配置されており、分泌前にシグナルペプチダーゼによって切断除去される。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットでもシグナルペプチドＤＮＡは、目的のペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に連結されている。したがって、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、シグナルペプチドと目的のペプチドを連結した細胞外分泌性のキメラタンパク質をコードしていることになる（以下、このキメラタンパク質をコードするＤＮＡを「キメラ遺伝子」とする）。
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドＤＮＡは、絹糸虫の中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡであれば、由来する細胞外分泌性タンパク質の種類については特に限定はせず、あらゆるシグナルペプチドＤＮＡを利用することができる。シグナルペプチドのアミノ酸長は、シグナルペプチドとして機能し得る限り、特に限定はしない。通常は、３~６０アミノ酸の範囲内にあればよい。したがって、シグナルペプチドＤＮＡの塩基長も９~１８０塩基あればよい。
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドＤＮＡとして好適な例は、セリシン１~３由来のシグナルペプチドＤＮＡである。セリシン１~３由来のシグナルペプチドＤＮＡの具体例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン１シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン２シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号９で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン３シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号１１で示される塩基配列を含むＤＮＡ）が挙げられる。
（４）その他のエレメント
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、上記エレメント以外にも、必要に応じて目的のペプチドの発現及び分泌に機能し得るエレメントを含むことができる。例えば、エンハンサー、５’ＵＴＲ、シグナル配列後挿入配列、シグナルペプチダーゼ認識部位、３’ＵＴＲ、ターミネーター、選抜マーカー、インスレーター、及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。
　「シグナル配列後挿入配列」は、前記シグナルペプチドと目的のペプチドが連結した細胞外分泌性のキメラペプチドにおいて、シグナルペプチドの切断と分泌を促進するアミノ酸配列をコードする塩基配列で構成される。
　「シグナルペプチダーゼ認識部位」は、シグナルペプチダーゼが前記キメラペプチドからシグナルペプチドを認識し、切断するのに必要なアミノ酸配列をコードする塩基配列で構成される。
　「ターミネーター」は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する宿主の後部絹糸腺細胞内で、融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写を終結できる塩基配列で構成される。
　「５’ＵＴＲ」及び「３’ＵＴＲ」は、前記キメラ遺伝子のｍＲＮＡコード領域において、それぞれ開始コドンの上流（５’末端側）及び終止コドンの下流（３’末端側）に配置される塩基配列で構成される。３’ＵＴＲは、ポリＡシグナルを含むことができる。
　「選抜マーカー」は、後述する本発明の遺伝子組換え絹糸虫が本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有していることを確認する時のマーカーとして機能し得る。例えば、ＥＧＦＰやＤｓＲｅｄのような蛍光遺伝子を含む複眼の蛍光マーカー３ｘＰ３−ＥＧＦＰや３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ、及びブラストサイジン耐性遺伝子のような薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
　「インスレーター」は、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けずに安定的に制御できる配列である。例えば、ニワトリのｃＨＳ４配列やショウジョウバエのｇｙｐｓｙ配列などが挙げられる。
　「トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが相同組換え可能な発現ベクターの場合に含まれ得る。逆位末端反復配列は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの上流及び下流に配置される。トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓ等を用いることができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９，２７７−２８１；Ｗａｎｇ　Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　９（２）：１４５−５５）。
　また、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが、後述する第１サブユニット及び第２サブユニットの２つのユニットで構成される場合には、転写調節因子をコードするＤＮＡ及び該転写調節因子の標的プロモーターを包含する。
　本明細書において「転写調節因子をコードするＤＮＡ」とは、第１サブユニットの必須エレメントであって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターを認識及び／又はそれに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるＧＡＬ４タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるｔＴＡ及びその変異体等が挙げられる。
　本明細書において「転写調節因子の標的プロモーター」とは、第２サブユニットの必須エレメントであって、前記第１サブユニットにコードされた転写調節因子が認識及び／又はそれに結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がＧＡＬ４タンパク質の場合には、ＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が使用される。
１−２−２．後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構成
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、例えば、プラスミド若しくはバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）のような自律複製可能な発現ベクター、又は染色体中に相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主のゲノム中に挿入したゲノムの一部であってもよい。発現ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターとすることもできる。
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、（１）１つの遺伝子発現ユニットで構成され、単体で宿主細胞内において機能し得る場合と、（２）２つのサブユニットで構成され、その２つが宿主細胞内に存在してはじめて機能し得る場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
（１）１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、当該遺伝子発現ユニットは、図３（ａ）で示すような後部絹糸腺発現プロモーター（図３（ａ）ではＦｉｂ　Ｈプロモーターが該当する）、シグナルペプチドＤＮＡ（図３（ａ）ではセリシン１シグナルペプチドＤＮＡが該当する）及び目的のペプチドをコードするＤＮＡ（図３（ａ）ではＥＧＦＰ遺伝子が該当する）を含んでなる遺伝子発現システムを少なくとも１つ含む。
　本構成の後部絹糸腺発現プロモーターは、フィブロイン構成タンパク質、例えば、Ｆｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、又はｐ２５をコードする遺伝子のプロモーターのように後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。
　本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡ、及びその下流に目的のペプチドをコードするＤＮＡが連結されてなるキメラ遺伝子を含む。シグナルペプチドＤＮＡと目的のペプチドをコードするＤＮＡの間には、シグナル配列後挿入配列及び／又はシグナルペプチダーゼ認識部位を含んでいてもよい。また、シグナルペプチドＤＮＡの上流には５’ＵＴＲを、目的のペプチドをコードするＤＮＡの下流には３’ＵＴＲを含むことができる。目的のペプチドをコードするＤＮＡの下流又は３’ＵＴＲの下流には、さらにターミネーターを配置してもよい。本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、１つの後部絹糸腺発現プロモーター制御下にキメラ遺伝子を１つ含むモノシストロニックな系であってもよいし、キメラ遺伝子を２以上含むポリシストロニックな系であってもよい。
　前記キメラ遺伝子は、後部絹糸腺発現プロモーターの下流に機能的に結合されている。本明細書において「後部絹糸腺発現プロモーターの下流に機能的に結合」するとは、後部絹糸腺発現プロモーターの下流で、そのプロモーターによる発現制御を受ける位置にキメラ遺伝子等の遺伝子を配置し、それらを結合することをいう。
（２）２つのサブユニットで構成される場合
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが第１サブユニット及び第２サブユニットで構成される場合、各サブユニットは以下の構成を有する。
　第１サブユニットは、図３（ｂ）で示すように、後部絹糸腺発現プロモーター（図３（ｂ）ではＦｉｂ　Ｈプロモーターが該当する）、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードするＤＮＡ（図３（ｂ）ではＧＡＬ４遺伝子が該当する）を含んでなる。転写調節因子をコードするＤＮＡの上流には５’ＵＴＲを、またその下流には３’ＵＴＲを含んでいてもよい。
　第１サブユニットの後部絹糸腺発現プロモーターは、フィブロイン構成タンパク質、例えば、Ｆｉｂ　Ｈ、Ｆｉｂ　Ｌ、又はｐ２５をコードする遺伝子のプロモーターのように後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。
　第２サブユニットは、図３（ｃ）で示すように、前記第１サブユニットにコードされた転写調節因子の標的プロモーター（図３（ｃ）ではＵＡＳが該当する）、標的プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡ（図３（ｃ）ではセリシン１シグナルペプチドＤＮＡが該当する）と目的のペプチドをコードするＤＮＡ（図３（ｃ）ではＥＧＦＰ遺伝子が該当する）が連結されてなるキメラ遺伝子を含んでなる。シグナルペプチドＤＮＡと目的のペプチドＤＮＡの間には、シグナル配列後挿入配列及び／又はシグナルペプチダーゼ認識部位を含んでいてもよい。また、キメラ遺伝子の上流には５’ＵＴＲを、その下流には３’ＵＴＲを含んでいてもよい。第２サブユニットは、１つの後部絹糸腺発現プロモーター制御下にキメラ遺伝子を１つ含むモノシストロニックな系であってもよいし、キメラ遺伝子を２以上含むポリシストロニックな系であってもよい。
　本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、第１及び第２のサブユニットの１組で機能する。後部絹糸腺発現プロモーターの活性化により第１サブユニットから発現した転写調節因子が第２サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的のペプチドを含むキメラペプチドを発現する。第２サブユニットは異なるキメラ遺伝子を含む２以上のサブユニットであってもよい。この場合、第１サブユニットから発現した転写調節因子は、各第２サブユニットの標的プロモーターを活性化することで、それぞれの第２サブユニットにコードされた目的のペプチドを発現することができる。
　本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは第１サブユニットにコードされた転写調節因子を介して第２サブユニットにコードされた目的のペプチドの発現を増幅することができる。したがって、後部絹糸腺発現プロモーターの遺伝子発現能が高くない場合に好適である。また、第２サブユニットにおける目的のペプチドＤＮＡを交換するだけで、第１サブユニットは共通使用が可能であることから、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを構築する上でも、また後述の遺伝子組換え絹糸虫を作出する上でも便利である。
１−３．効果
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、従来当該分野において水溶性ペプチドの生産系としては不適とされてきた絹糸虫の後部絹糸腺で該ペプチドを大量に合成することができる。また、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを用いれば、中部絹糸腺を用いた従来のタンパク質生産系としての遺伝子組換え絹糸虫よりも生産効率の高い遺伝子組換え絹糸虫を作出することが可能となる。
２．遺伝子組換え絹糸虫
２−１．概要
　本発明の第２の態様は、遺伝子組換え絹糸虫である。本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有し、後部絹糸腺において目的のペプチドを大量に発現及び分泌できることを特徴とする。
２−２．構成
　本発明の「遺伝子組換え絹糸虫」とは、宿主絹糸虫に前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入した絹糸虫又はその後代をいう。宿主絹糸虫は、前述したいずれの絹糸虫であってもよい。飼育方法や人工試料が確立しており、多頭飼育が可能なカイコ、エリサン及びサクサンは、宿主絹糸虫として特に好ましい。
　本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを細胞内に一過的に有していてもよいし、ゲノム中に導入された状態等で安定的に有していてもよい。安定的に有することが好ましい。
　本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、異なる前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを２以上有することができる。例えば、遺伝子組換え絹糸虫は、１つの遺伝子発現ユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニットと、２つのサブユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの両方を有することができる。
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが第１サブユニット及び第２サブユニットの２つのサブユニットで構成され、それぞれが絹糸虫の染色体に挿入されている場合、各サブユニットは同一染色体上に存在していてもよいし、異なる染色体上に存在していてもよい。各サブユニットが異なる染色体上に存在する場合、第１サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換え絹糸虫の系統と第２サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換え絹糸虫の系統とを交配すれば、Ｆ１で第１サブユニットと第２サブユニットを有する本発明の遺伝子組換え絹糸虫を容易に得ることができる。この場合、前記第１サブユニットのみを有する遺伝子組換え絹糸虫の系統は、様々な第２サブユニットのみを有する遺伝子組換え絹糸虫の系統との交配に使用することができる。一方、第１サブユニット及び第２サブユニットが同一染色体上に存在する場合には、継代過程で組換えのよってそれぞれが分離しないように、サブユニット間の距離が近く、互いに連鎖している方が好ましい。
２−３．効果
　本発明の遺伝子組換え絹糸虫によれば、後部絹糸腺発現型の遺伝子組換え絹糸虫を水溶性ペプチドの生産系として利用することができる。
３．遺伝子組換え絹糸虫の作出方法
３−１．概要
　本発明の第３の態様は、遺伝子組換え絹糸虫を作出する方法である。本発明は、絹糸虫の後部絹糸腺において目的のペプチドを発現することのできる遺伝子組換え絹糸虫を作出することを特徴とする。
３−２．作出方法
　本発明の遺伝子組換え絹糸虫の作出方法は、前記第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入する方法、又は本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと前記第２サブユニットを異なる染色体上に有する絹糸虫を交配する方法が挙げられる。
　前記第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの宿主である絹糸虫への導入は、当該分野で公知の方法によって行えばよい。絹糸虫卵、例えば、カイコ卵に第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する場合、例えば、Ｔａｍｕｒａらの方法（Ｔａｍｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）を利用することができる。具体的には、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ　ＡＭ．ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７５２０−５）を両端に有する第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを含む発現ベクターと共に、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するヘルパーベクターを絹糸虫の発生初期卵にインジェクションすればよい。ヘルパーベクターとしては、例えば、ｐＨＡ３ＰＩＧが挙げられる。得られた形質転換体は、選抜マーカーに基づいて選抜する。必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、ゲノムに挿入された後部絹糸腺遺伝子発現ユニットのホモ接合体を得てもよい。
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと前記第２サブユニットを異なる染色体上に有する絹糸虫を交配して本発明の遺伝子組換え絹糸虫を作出する場合、それぞれの遺伝子発現ユニットを絹糸虫へ導入する方法は、前記と同様の方法、例えば、Ｔａｍｕｒａらの方法によって行えばよい。それぞれの遺伝子発現ユニットを異なる染色体上に有する遺伝子組換え絹糸虫を交配して２つの遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫を作出する方法も、当該分野で公知の交配方法によって得ることができる。例えば、それぞれの遺伝子発現ユニットを有する絹糸虫を交配し、Ｆ１個体について２つの遺伝子発現ユニットの選抜マーカーを有する個体を選抜すればよい。必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、ゲノムに挿入された後部絹糸腺遺伝子発現ユニットのホモ接合体を得てもよい。
４．ペプチドを製造する方法
４−１．概要
　本発明の第４の態様は、目的のペプチドを製造する方法に関する。本発明によれば、前記第２態様の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に製造することができる。
４−２．製造方法
　本発明の製造方法は、飼育工程及び回収工程を含む。以下、各工程について説明をする。
（１）飼育工程
　「飼育工程」とは、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫を飼育する工程である。遺伝子組換え絹糸虫の飼育方法については、それぞれの絹糸虫について当該分野で公知の技術によって飼育すればよい。例えば、絹糸虫がカイコであれば、「蚕種総論；高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を、またエリサンであれば、「エリサンの人工飼料と飼育法；２０００、野蚕３９　７−８」を参照するとよい。飼料は、例えば、カイコやクワコであればクワ属（Ｍｏｒｕｓ）の葉、エリサンであればトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の葉若しくはシンジュ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ　ａｌｔｉｓｓｉｍａ）の葉、サクサンであればブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）の葉のような食草樹種の天然葉であってもよいし、シルクメイトＬ４Ｍ若しくは原蚕種１−３齢用（日本農産工業）のような人工飼料であってもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できることを鑑みれば、人工飼料が好ましい。以下、簡単な飼育方法についてカイコを例に挙げて説明する。
　掃立ては、適当な頭数（例えば、４~１０頭）の同系の遺伝子組換え絹糸虫の雌が産卵した卵で行う。孵化した幼虫は、卵台紙から蚕座である防乾紙（パラフィン加工紙）を敷いた容器内に移し、シルクメイト等の人工飼料を防乾紙上に並べて給餌する。餌の交換は、原則として１~２齢では各１回、３齢では１~３回行う。古い餌は食べ残しが多い場合には腐敗防止のため除去する。４~５齢の壮カイコ幼虫時の飼育には、大型容器に移し、容器あたりの頭数を適宜調整する。湿度や容器内の状態により、容器に防乾紙、アクリル、又はメッシュ製のフタをしてもよい。飼育温度は、全齢を通して２５~２８℃で飼育する。
（２）回収工程
　「回収工程」とは、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫の幼虫が後部絹糸腺細胞内で発現し、分泌した後、絹糸腺内腔内に蓄積した目的のペプチドを回収する工程である。
　第２態様の遺伝子組換え絹糸虫は、主に幼虫の終齢後期から後部絹糸腺遺伝子発現ユニットに含まれる目的のペプチドをシグナルペプチドとのキメラペプチドとして後部絹糸腺細胞内で発現する。キメラペプチドは、シグナルペプチドの作用によって小胞体へ輸送され、そのシグナルペプチドが小胞体内のペプチダーゼ等の酵素作用によって切断された後、後部絹糸腺内腔へ分泌される。目的のペプチドは、中部絹糸腺に移行、蓄積され、蛹化期に前部絹糸腺からセリシンやフィブロインと共に個体外に分泌、吐糸される。したがって、目的のペプチドの回収方法には、繭から回収する方法、又は終齢後期から前蛹期に虫体から絹糸腺を摘出して直接回収する方法が挙げられる。特に繭から回収する方法は、目的のペプチドを簡便に回収できる点で優れている。
　繭から目的のペプチドを回収する方法は、まず、終齢後期の幼虫を上蔟（じょうぞく：幼虫を蔟「まぶし」に移すこと）して、営繭させる。次に、繭から目的のペプチドを抽出する。抽出方法は、特に限定はしない。例えば、水又はタンパク質変性剤を含まない適当な中性の抽出バッファー（例えば、１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０５％ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅを含む又は含まないｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．２）中に繭を浸漬するだけで目的のペプチドを回収することができる。抽出効果を高めるため浸漬前に繭を裁断又は粉砕してもよい。抽出温度は、目的のタンパク質の熱変性を防ぐため、０~１０℃、好ましくは０~５℃の低温で行う。ただし、目的のペプチドが熱感受性ペプチドでなければ、１０~４０℃でも行うこともできる。抽出液は、必要に応じて撹拌してもよい。抽出時間は、繭の状態（例えば、未裁断状態か、粉末状態か）、抽出液の量、抽出温度、撹拌の有無等の抽出条件によって異なることから、条件に応じて適宜定めればよい。フィブロイン等の不溶性成分は、抽出液から必要に応じて遠心又は濾過によって除去することができる。
　終齢後期~前踊期の虫体より絹糸腺を摘出して目的のペプチドを回収する方法は、当該分野で公知の方法によって達成することができる。例えば、終齢（５齢）６日目の吐糸直前カイコを氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで絹糸腺を傷つけないように摘出すればよい（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂，１９７０，ｐｐ．２４９−２５５参照）。摘出した絹糸腺を、例えば、前記抽出バッファー中で０~１０℃、好ましくは０~５℃の温度下にて緩やかに振盪させて、目的のペプチドをバッファー中に溶出させることができる。目的のペプチドが熱感受性ペプチドでなければ、１０~４０℃の温度下で行ってもよい。その後、遠心又は濾過によって組織片等の夾雑物を除去し、目的のペプチドを含む上清を回収すればよい。
４−３．効果
　本発明のペプチド製造方法によれば、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫の幼虫をタンパク質生産系として用いることで、従来の遺伝子組換え絹糸虫を用いた場合と比較して、目的のペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に製造し、また容易に回収することが可能である。
　以下に本発明の態様について、具体的な実施例を挙げて説明をするが、本実施例は本発明の一概念に過ぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
　なお、本実施例では、宿主絹糸虫として、当該分野で最も一般的に利用されているカイコを用いた。
＜実施例１：後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構築＞
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを含む、各種発現ベクターを構築した。本実施例では、第１及び第２サブユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット等の発現ベクターを構築した。
（方法）
１．発現ベクターの構築
（１）中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット：ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（図４（ａ））
　対照用の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットとして、中部絹糸腺で特異的に発現するセリシン１遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子ＧＡＬ４遺伝子、さらにその下流に結合したｈｓｐ７０ｐｏｌｙＡ付加配列を有するｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２を構築した。
　セリシン１遺伝子プロモーターは、制限酵素ＡｓｃＩサイトを含む配列番号１２で示すプライマーとＢａｍＨＩサイトを含む配列番号１３で示すプライマーを用いて、配列番号１４で示すセリシン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１０４４０４１）の−６６６から＋４０まで（転写開始点を０位とする。以下同様）のプロモーター領域を、カイコ大造系統のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。得られたプラスミドをＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩで処理し、分離されたＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩ増幅断片をｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４（Ｕｃｈｉｎｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｓｅｒｉｃｏｌ　７５：８９−９７）のＧＡＬ４遺伝子上流のＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドに、ｐＢａｃＡ３ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（Ｕｃｈｉｎｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｓｅｒｉｃｏｌ　７５：８９−９７）からＢｇｌＩＩにより切り出した３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄカセットを選抜マーカーとして挿入し、中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットを構築した。
（２）後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット：ｐＢａｃＦｉｂＨ−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（図４（ｂ））
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットとして、後部絹糸腺で特異的に発現するＦｉｂ　Ｈ遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子ＧＡＬ４遺伝子、さらにその下流に結合したｈｓｐ７０ｐｏｌｙＡ付加配列を有するｐＢａｃＦｉｂＨ１−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２を構築した。
　Ｆｉｂ　Ｈ遺伝子プロモーターは、制限酵素ＡｓｃＩサイトを含む配列番号１５で示すプライマーとＢａｍＨＩサイトを含む配列番号１６で示すプライマーを用いて、配列番号１で示すＦｉｂ　Ｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２２６６８８）の−８５８から＋１１の約８７０ｂｐの領域をカイコ大造系統のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。得られたプラスミドをＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩで処理し、分離されたＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩ増幅断片をｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４（Ｕｃｈｉｎｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｓｅｒｉｃｏｌ　７５：８９−９７）のＧＡＬ４遺伝子上流のＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドに、ｐＢａｃＡ３ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（Ｕｃｈｉｎｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｓｅｒｉｃｏｌ　７５：８９−９７）からＢｇｌＩＩにより切り出した３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄカセットを選抜マーカーとして挿入し、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットを構築した。
（３）第２サブユニット：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図４（ｃ））
　中部及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニット兼用の第２サブユニットとして、ＵＡＳ配列の下流にセリシン１遺伝子の分泌シグナル（配列番号６）をコードする塩基配列（配列番号７）と、その３’末端側に付加したクローニング用付加塩基配列（配列番号１７）と目的の水溶性ペプチドＤＮＡとしてのＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１８）を結合し、その下流にセリシン１の３’ＵＴＲ（配列番号１９）を連結したｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
２．発現ベクターの精製
　構築した上記各発現ベクターは、ＨｉＳｐｅｅｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。さらに、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、０．５ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／５ｍＭ　ＫＣｌバッファーに溶解した。
＜実施例２：遺伝子組換えカイコの作出＞
　実施例１で構築した各発現ベクターを用いて各種遺伝子組換えカイコを作出した。
（材料と方法）
（１）カイコ系統
　農業生物資源研究所で維持されている白眼・白卵・非休眠系統のｗ１−ｐｎｄ系統を宿主系統として用いた。
（２）飼育条件
　２５~２７℃の飼育室で、幼虫の全齢を人工飼料（シルクメイト原種１−３齢Ｓ、日本農産工）で飼育した。人工飼料は２~３日毎に交換した（Ｕｃｈｉｎｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｓｅｒｉｃｏｌ，７５：８９−９７）。
（３）遺伝子組換えカイコの作出
　遺伝子組換えカイコは、Ｔａｍｕｒａらの方法（Ｔａｍｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）に従って作出した。
　実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットを、それぞれ別個にトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）と１：１の割合で混合し、産卵後２~８時間のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態、２５℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、兄妹交配を行った。得られた卵を第１サブユニットについては３ｘＰ３　ＤｓＲｅｄ２マーカー、また第２サブユニットについては３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、本発明の遺伝子組換えカイコの第１及び第２サブユニットを有する系統をそれぞれ得た。第１サブユニットと第２サブユニットをそれぞれ有する系統を交配し、一個体に両方の遺伝子発現ユニットを有する系統を上記と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、中部絹糸腺特異的発現をする遺伝子組換えカイコと本発明の遺伝子組換え絹糸虫である後部絹糸腺特異的発現をする遺伝子組換えカイコをそれぞれ得た。
＜実施例３：絹糸腺における組換えタンパク質の発現＞
（方法）
　実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育し、５齢６日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで中部及び後部絹糸腺を傷つけないように摘出した（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂，１９７０，ｐｐ．２４９−２５５参照）。これを固定せずに蛍光顕微鏡（オリンパスＳＺＸ１６、ＧＦＰフィルター）で観察した。
（結果）
　図５に結果を示す。中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの絹糸腺は、中部絹糸腺のみで蛍光が観察された。一方、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの絹糸腺は、後部及び中部絹糸腺の両方で蛍光が観察された。この結果は、ＥＧＦＰが後部絹糸腺細胞内で発現した後に、後部絹糸腺内腔に分泌され、その後中部絹糸腺に移行したことを示している。
＜実施例４：絹糸腺における組換えタンパク質の発現量＞
（方法）
　実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育し、５齢６日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、前述のように背側を切開してピンセットで絹糸腺を傷つけないように摘出した。絹糸腺は、実施例３の結果から、中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコからは中部絹糸腺のみを、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコからは中部絹糸腺及び後部絹糸腺をそれぞれ摘出した。これらをそれぞれ１本当たり１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）／１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０５％アジ化ナトリウムに入れて、室温で２４時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、２，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のＥＧＦＰタンパク質濃度をＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ　Ａｎｔｉ−ＧＦＰ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ）で測定した。具体的にはＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ　Ａｎｔｉ−ＧＦＰ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｐｌａｔｅｓに上清液を１００μＬ添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ＧＦＰ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加して、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ＥＩＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色反応を行い、１Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。発色をｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で定量した。リコンビナントＧＦＰタンパク質（タカラバイオ；Ｚ２３７３Ｎ）の系列希釈液（１−４００ｐｇ／μＬ）を用いて標準曲線を作製した。
（結果）
　図６に結果を示す。中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの中部絹糸腺から回収された水溶性タンパク質のＥＧＦＰ発現量は、１頭あたり１０００μｇであったの対して、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの後部絹糸腺及び中部絹糸腺から回収されたＥＧＦＰ発現量は、それぞれ７５０μｇ及び１６００μｇであった。この場合の中部絹糸腺内のＥＧＦＰは、後部絹糸腺で発現したＥＧＦＰが移行したものであるため、後部絹糸腺では２３５０μｇのＥＧＦＰが発現したことになる。この発現量は、図２（ｃ）で示す従来の後部絹糸腺遺伝子発現系の発現量（Ｒｏｙｅｒ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２）と比較して１０~５０倍多い。
　これらの結果は、本発明の遺伝子組換えカイコにおいて後部絹糸腺で発現した組換え水溶性タンパク質であるＥＧＦＰが細胞外に効率的に、かつ中部絹糸腺での発現量よりも高い量で分泌されていることを示している。
＜実施例５：繭中の組換えタンパク質＞
（方法）
　実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育して営繭させた後、その繭を固定せずに蛍光顕微鏡（オリンパスＳＺＸ１６、ＧＦＰフィルター）で観察した。
（結果）
　図７に結果を示す。中部及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの繭にはＥＧＦＰが含まれることが確認された。この結果は、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットから発現した水溶性ペプチドであるＥＧＦＰを繭から回収できることを示唆している。
＜実施例６：後部絹糸腺におけるシグナルペプチドの効果＞
　後部絹糸腺又は中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドによる後部絹糸腺でのＥＧＦＰの発現及び分泌量について検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
　比較用第２サブユニットｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐ２５＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図８Ａ）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチドのみが後部絹糸腺特異的に発現するｐ２５由来のシグナルペプチドとなっている。なお、ｐ２５のシグナルペプチドＤＮＡには、エクソン１からエクソン２の第１アミノ酸までのゲノム配列を用い（配列番号２０）、さらに、ｐ２５のシグナルペプチド中のシトシンをイソロイシンに置換している（配列番号２１）（後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットのシグナルペプチドは、セリシン１由来）。ｐ２５のシグナルペプチドＤＮＡのエクソン−イントロン配列（Ｒｏｙｅｒ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２）は、制限酵素ＮｈｅＩサイトを含む配列番号２２で示すプライマーとＢｓｐＨＩサイトを含む配列番号２３で示すプライマーを用いてカイコ大造系統のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（アジレント・テクノロジー）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドをＳｍａＩとＢｓｐＨＩで処理し、分離されたＳｍａＩ−ＢｓｐＨＩ断片をｐＥＧＦＰ＿ＮｃｏＩ＿ＮｈｅＩプラスミド（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７）のＨｉｎｃＩＩ−ＮｃｏＩサイトへ挿入した。得られたプラスミドをＮｈｅＩで部分消化し、約１．３ｋｂのＮｈｅＩ断片を分離した。このＮｈｅＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミド（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７）のＢｌｎＩサイトへ挿入し、比較用第２サブユニットｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐ２５＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと第２サブユニットの両方を有する系統は、実施例２で作成した系統を用いた。
　一方、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと比較用第２サブユニットの両方を有する系統は、まず、比較用第２サブユニットを有する系統を作成し、その後、第１サブユニットと比較用第２サブユニットのそれぞれ有する系統を交配して、一個体に両方の遺伝子発現ユニットを有する系統を実施例２と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜して得た。比較用第２サブユニットを有する系統を作成する方法及び第１サブユニットと比較用第２サブユニットのそれぞれ有する系統を交配する方法は、実施例２に記載の方法に準じて行った。
（３）飼育条件
　実施例２に記載の方法に準じた。
（４）絹糸腺におけるＥＧＦＰの発現量
　後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと、セリシン１のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統又はｐ２５のシグナルペプチドを含む比較第２サブユニットを有する系統におけるＥＧＦＰの発現量を測定した。方法は、実施例４に記載の方法に準じた。
（結果）
　図８Ｂに結果を示す。いずれの系統も後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットを有することから、ここで検出されたＥＧＦＰタンパク質は、全て後部絹糸腺で発現したものであり、中部絹糸腺で検出されたＥＧＦＰタンパク質は、後部絹糸腺で発現後に移行したものを示す。したがって、後部絹糸腺で発現したＥＧＦＰタンパク質の実際の発現量は、中部絹糸腺と後部絹糸腺のＥＧＦＰタンパク質量の和となる。
　この図で示すように、後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質であるｐ２５由来のシグナルペプチドを含む比較第２サブユニットを有する系統（図８Ｂのｐ２５）のＥＧＦＰタンパク質量に対して、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質セリシン１由来のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統（図８Ｂのセリシン１）のそれは約１０倍もあることが明らかとなった。この結果は、セリシン１由来のシグナルペプチドと結合したＥＧＦＰが後部絹糸腺細胞から効率的に分泌されるのに対し、ｐ２５由来のシグナルペプチドと結合したＥＧＦＰは後部絹糸腺細胞から効率的に分泌されないことを示している。これらの結果から本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドは、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドが適当であることが示された。
　また、セリシン１由来のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統では、発現したＥＧＦＰタンパク質の９０％以上が中部絹糸腺に移行していたことから、後部絹糸腺で発現した目的のペプチドがより回収しやすいという利点もある。
＜実施例７：哺乳動物由来のシグナルペプチドと目的のペプチドの影響（１）＞
　哺乳動物由来のシグナルペプチド及び／又は目的のペプチドを含む遺伝子発現ユニットによる絹糸腺での目的のペプチドの発現及び分泌量について検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
　第１検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図９Ａ：シグナルペプチドがセリシン１の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、目的のペプチドのみがブタのインターロイキン２（ＩＬ−２）由来となっている点で異なる。セリシン１のシグナルペプチドＤＮＡ配列の下流に配列番号２４で示すブタＩＬ−２をコードする遺伝子（ただし、ブタＩＬ−２が本来持つ配列番号２５で示すシグナルペプチドＤＮＡを除く）を連結した断片は、制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号２６で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号２７で示すプライマー、及びセリシン１のシグナルペプチドとＩＬ−２の接続部分の配列を持つプライマー配列番号２８、と配列番号２９を用い、ｐＡｃＰＩＬ２（Ｉｎｕｍａｒｕ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，２０００　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇ．５：１４６−１４９）とｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第１検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
　第２検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図９Ａ：シグナルペプチドがブタＩＬ−２の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチド及び目的のペプチドがいずれもブタＩＬ−２由来となっている点で異なる。ブタＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡ断片は制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３０で示すプライマーと配列番号３１で示すプライマーを用い、ｐＡｃＰＩＬ２からＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第２検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
　後部又は中部絹糸腺遺伝子発現ユニットのそれぞれの第１サブユニットと、上記第１又は第２検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統は、まず、第１又は第２検証用第２サブユニットＩをそれぞれ有する系統を作成し、その後、第１サブユニットと、各検証用第２サブユニットＩを有する系統を交配して、一個体に第１又は第２のサブユニットを有する系統を実施例２と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜して得た。第１又は第２検証用第２サブユニットＩを有する系統を作成する方法、及び第１サブユニットと、第１又は第２検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統を交配する方法は、実施例２に記載の方法に準じて行った。
　また、比較用として、実施例１で構築した中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット（ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２）（図４（ａ））と上記検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統も上記と同様に作成した。
（３）飼育条件
　実施例２に記載の方法に準じた。
（４）ウエスタンブロッティング
　実施例４に記載の方法に準じて、それぞれの系統から中部絹糸腺及び後部絹糸腺を摘出し、各絹糸腺中のタンパク質を抽出した。続いて、絹糸腺抽出液を等量のＥＺアプライ（ＡＥ−１４３０、ＡＴＴＯ）と混合し、９５℃で５分間加温することによりＳＤＳ化した。ＳＤＳ化したサンプルを９ｃｍ×８ｃｍの１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、２０ｍＡ定電流で約９０分間泳動した。ゲルはセミドライ転写装置（ＮＡ−１５１２Ｓ、日本エイドー）を用いて、１２０ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥヘルスケア）に転写した。転写後のメンブレンをＥＺ　ｗａｓｈ（ＡＥ−１４８０、ＡＴＴＯ）で５分間軽く振とうした後、１次抗体（抗ＩＬ−２ウサギ血清、２，０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた。メンブレンをＥＺ　ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、２次抗体（ＮＡ９３４−１００ＵＬ、ＧＥヘルスケア、５０，０００倍希釈）を室温で１時間反応させた。メンブレンをＥＺ　ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア）を５分間反応させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉフィルム）でシグナルを検出した。
（結果）
　図９Ｂ、Ｃに結果を示す。
　まず、第１検証用第２サブユニットのセリシン１由来のシグナルペプチドとブタＩＬ−２のキメラ遺伝子を含む遺伝子発現ユニットの場合、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｂ）及び中部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｃ）のいずれも効率よく発現、分泌されることが明らかとなった。特に後部絹糸腺遺伝子発現ユニットでは、非常に多くのブタＩＬ−２が発現、分泌されている。これは、本願発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、目的のペプチドが絹糸虫以外の他生物種由来の水溶性ペプチドであっても中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドとのキメラタンパク質として発現させることによって、目的の水溶性ペプチドを絹糸虫の後部絹糸腺内で大量に製造することができることを示唆している。
　一方、シグナルペプチドと目的のペプチドが共にブタＩＬ−２由来の第２検証用第２サブユニットを有する遺伝子発現ユニットの場合、中部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｃ）では効率よく発現、分泌されたが、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｂ）では、発現量及び後部絹糸腺から中部絹糸腺への移行共に効率が非常に低かった。この結果は、特許文献１に記載のディフェンシンの結果と矛盾しない。つまり、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質及びフィブロイン構成タンパク質のいずれかに由来するシグナルペプチド以外のシグナルペプチドが結合したタンパク質は、後部絹糸腺細胞からの分泌が抑制されてしまうことが明らかになった。
　以上より、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドは、絹糸虫の後部絹糸腺での水溶性ペプチドの大量発現、分泌、及び中部絹糸腺への移行に好適であることが立証された。
＜実施例８：哺乳動物由来のシグナルペプチドと目的のペプチドの影響（２）＞
　実施例７とは異なる哺乳動物由来のシグナルペプチド及び／又は目的のペプチドを含む遺伝子発現ユニットを用いて、各絹糸腺での目的のペプチドの発現及び分泌量について再度検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
　第１検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図１０Ａ：シグナルペプチドがセリシン１の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、目的のペプチドのみがウシのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）由来となっている点で異なる。セリシン１のシグナルペプチド配列の下流にＩＦＮγ（ＩＦＮγが本来持つシグナルペプチドを除く）をつないだ断片は、制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３２で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３３で示すプライマー、及び、セリシン１のシグナルペプチドとＩＦＮγの接続部分の配列を持つプライマー配列番号３４、と配列番号３５を用い、ｐＢＩＦＮ−γ（Ｍｕｒａｋａｍｉ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，２００１　ＣＹＴＯＫＩＮＥ．１３（１）１８−２４）とｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第１検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
　第２検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図１０Ａ：シグナルペプチドがウシＩＦＮ−γの場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチド及び目的のペプチドがいずれもウシＩＦＮ−γ由来となっている点で異なる。ウシＩＦＮγのアミノ酸をコードするＤＮＡ断片（配列番号３６：ただし、ウシＩＦＮ−γが本来持つ配列番号３７で示すシグナルペプチドＤＮＡを除く）は制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３８で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３９で示すプライマーを用い、ｐＢＩＦＮ−γからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第２検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
　後部又は中部絹糸腺遺伝子発現ユニットのそれぞれの第１サブユニットと、上記第１又は第２検証用第２サブユニットＩＩの両方を有する系統は、実施例２及び７に記載の方法に準じて行った。
　また、比較用として、実施例１で構築した中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット（ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ　ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２）（図４（ａ））と上記検証用第２サブユニットＩＩの両方を有する系統も実施例７と同様に作成した。
（３）飼育条件
　実施例２に記載の方法に準じた。
（４）ウエスタンブロッティング
　実施例４に記載の方法に準じて、それぞれの系統から中部絹糸腺及び後部絹糸腺を摘出し、各絹糸腺中のタンパク質を抽出した。続いて、絹糸腺抽出液を等量のＥＺアプライ（ＡＥ−１４３０、ＡＴＴＯ）と混合し、９５℃で５分間加温することによりＳＤＳ化した。ＳＤＳ化したサンプルを９ｃｍ×８ｃｍの１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、２０ｍＡ定電流で約９０分間泳動した。ゲルはセミドライ転写装置（ＮＡ−１５１２Ｓ、日本エイドー）を用いて、１２０ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥヘルスケア）に転写した。転写後のメンブレンをＥＺ　ｗａｓｈ（ＡＥ−１４８０、ＡＴＴＯ）で５分間軽く振とうした後、１次抗体（抗ＩＦＮγ抗体：ＡＳ１０１９．２、コスモバイオ、２，０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた。メンブレンをＥＺ　ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、２次抗体（ＮＡ９３４−１００ＵＬ、ＧＥヘルスケア、５０，０００倍希釈）を室温で１時間反応させた。メンブレンをＥＺ　ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア）を５分間反応させ、ＬＡＳ３０００でシグナルを検出した。
（結果）
　図１０Ｂ、Ｃに示すように、実施例７とは異なる哺乳動物由来の水溶性タンパク質及びシグナルペプチドに変えた場合でも、結果は実施例７とほとんど同じ傾向を示した。
　以上の結果から、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドが結合したキメラタンパク質であれば、水溶性ペプチドであっても後部絹糸腺で抑制されることなく効率的に発現及び分泌されることが確認された。
　本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを絹糸虫に導入することで、組換えペプチド等の大量発現及び分泌、かつ簡便な回収が可能となる。
　本発明の組換え遺伝子絹糸虫によれば、前記組換えペプチドの大量生産系絹糸虫を提供することができる。
　本発明の組換え遺伝絹糸虫の作出方法によれば、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを絹糸虫に導入することで、前記組換えペプチドの大量生産系生物を容易に作出することができる。
　本発明の組換えペプチドを製造する方法によれば、水溶性ペプチドを容易に製造することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. 　後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び
    　該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
    を含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  2. 　前記シグナルペプチドがセリシン１~３のいずれか一のシグナルペプチドである、請求項１に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  3. 　前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖又はｐ２５である、請求項１又は２に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  4. （ａ）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、
    （ｂ）該転写調節因子の標的プロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
    を含む第２サブユニット
    から構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  5. 　前記シグナルペプチドがセリシン１~３のいずれか一のシグナルペプチドである、請求項４に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  6. 　前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖又はｐ２５である、請求項４又は５に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
  7. 　請求項１~３のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
  8. 　請求項４~６のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
  9. 　前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、請求項８に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
  10. 　前記第１サブユニットを有する系統と前記第２サブユニットを有する系統とを交配して得られる、請求項８又は９に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
  11. 　絹糸虫がカイコ、エリサン又はサクサンである、請求項７~１０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
  12. 　請求項１~６のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入して、後部絹糸腺において目的のペプチドを発現する遺伝子組換え絹糸虫の作出方法。
  13. 　請求項７~１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチドを製造する方法。
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