CN111850039B - 表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 - Google Patents

表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了表达于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用，家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子3信号肽序列；3’端为重链基因poly(A)序列；使用该系统表达目的蛋白发现仅存在于丝胶层，丝素层未见目的蛋白表达，因此可用于在丝胶层表达目的蛋白，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展；也为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础。

Description

表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表 达系统，还涉及表达系统的制备方法和应用。
背景技术
家蚕茧丝的主要组成是丝素(fibroin)和丝胶(sericin)两种蛋白，其中丝素是茧丝的主 要成分，约占茧丝重的82％。丝素由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺(MSG) 细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺(ASG)被榨丝后而吐丝结茧。丝素 由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例(H-chain：L-chain：fhx＝6：6：1)形成丝素基本单元，然后丝素基本单位被分泌到丝腺腔。 其中丝素基本单位由6个通过二硫键结合的重链、轻链(H-L)二聚体和1个P25糖蛋白分子组成。H-L二聚体在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之间形成二硫键。一个P25糖蛋 白和六个H-L二聚体通过与重链的N端结构域(NTD)的非共价相互作用在内质网上形成丝素基本单元。在丝素基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92％，并且是茧丝具有优良机 械性能的原因所在，而轻链蛋白只占约7％，fhx约占1％。而丝素重链是由中间的12个结晶 区域、11个非结晶区域和两端保守亲水的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)组成。
自从家蚕基因组框架图由中国家蚕基因组计划研究小组领导的率先完成后，它不但确立 了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的 契机。功能基因组时期的主要工作包括：主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕的丝腺能 在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白 一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。而目前对于成丝机理的研究仍有很多细节 需要科研工作者去解析，特别是在茧丝中占比最大且主要负责蚕丝机械性能的丝素重链其各元件在丝形成过程中发挥着怎样的作用更加需要进一步探究。
利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成 功，而经过科研工作者的努力，也建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术，为本 研究的工作开展打下了良好的基础。在利用转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术 的研究报道中，有关利用家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，无C端)表达外源蛋白 的方法未见报道，这也将进一步探究了丝素重链元件N、C端的作用，为蚕丝成丝机理的研 究提供实验及理论基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白 重链表达系统；本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体； 本发明的目的之三在于提供所述重组载体的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝胶层表达目的蛋白中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、家蚕丝胶层表达的家蚕丝心蛋白重链表达系统，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有 基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)；3’端为重链基 因poly(A)序列；所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述重 链基因poly(A)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。
优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由基因表达框连入pSLfa1180fa载体的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点处而得。
优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体AscⅠ和FseⅠ酶切位点。
3、所述重组载体的制备方法，所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载 体的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点处而得。
优选的，所述重组载体的制备方法如下：先将重链基因poly(A)序列通过BamHI和SalI 酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-poly(A)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连 入pSL-poly(A)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子信号肽序列 Fib-H P(s)通过BamHI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统 pSL-poly(A)-目的基因-Fib-H P(s)。
优选的，所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4 为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
优选的，所述poly(A)序列由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，含有家蚕品 种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
优选的，所述重组载体的制备方法如下：将所获得的重组载体利用限制性酶AscⅠ和Fse Ⅰ插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。
4、所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝胶层表达目的蛋白中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了表达于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统， 通过在表达框5’端设计仅含信号肽序列，3’端不含轻链结合位点(N端仅含信号肽，无C端)，表达目的蛋白发现仅存在于丝胶层，丝素层未见目的蛋白表达，因此可用于在丝胶层表达目 的蛋白，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国 蚕学和昆虫学科的长远发展；也为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为转基因载体结构图(A：含有多克隆位点的穿梭载体pSLfa1180fa；B：piggyBac 衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]；C：获得的最终注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-poly(A)-EGFP-Fib-H P(s)])
图2为获得的转基因家蚕荧光筛选(A：野生型和转基因家蚕复眼在白光和红色荧光下 观察结果，a为野生型白光，b为野生型红色荧光，c为转基因家蚕白光，d为转基因家蚕红 光；B：野生型和转基因家蚕蚕茧在白光和绿色荧光下观察，a为野生型白光，b为转基因家 蚕白光，c为野生型绿色荧光，d为转基因家蚕绿色荧光；WT：野生型；TS-H-G：转基因家蚕；White light：白光；RFP-fluorescent：红色荧光；GFP-fluorescent：绿色荧光；GFPstd： 绿色荧光蛋白标品)。
图3为目的基因EGFP的SDS-PAGE电泳图及Western blotting图(A：SDS-PAGE电泳；B：Western blotting图)。
图4为五龄家蚕2天丝腺整体荧光图(a：野生型丝腺白光图；b：转基因丝腺白光图；c： 野生型丝腺绿色荧光图；d：转基因丝腺绿色荧光图；e：转基因丝腺绿色荧光放大图)。
图5为五龄五天丝腺及茧丝冷冻切片图(A：丝腺冷冻切片图，a为野生型丝腺白光图， b为转基因丝腺白光图，c为野生型丝腺绿色荧光图，d为转基因丝腺绿色荧光图；B：茧丝 冷冻切片图，a为野生型丝腺白光图，b为转基因丝腺白光图，c为野生型丝腺绿色荧光图，d 为转基因丝腺绿色荧光图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明将家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，构建了一个在 家蚕丝腺中特异表达的家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，无C端)，N端序列长序列 长度为1929bp，其核酸序列是：aagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatatt ttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaag tattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatc acgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatga tcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaagatgagagtcaa aacctttgtgatcttgtgctgcgctctgcaggtgagttaattattttactattatttcagaaggtggccagacgatatcacgggccacctgataataagtggtcgccaaaacgcacagatatcgtaaattgtgccatttgatttgtcacgcccgggggggctacggaataaactacatttatttatttaaaaaatgaaccttagattatgtaacttgtgatttatttgcgtcaaaagtaggcaagatgaatctatgtaaatacctgggcagacttgcaatatcctatttcaccggtaaatcagcattgcaatatgcaatgcatattcaacaatatgtaaaacaattcgtaaagcatcattagaaaatagacgaaagaaattgcataaaattataa ccgcattattaatttattatgatatctattaacaattgctattgcctttttttcgcaaattataatcattttcataacctcgaggtagcattctgttacattttaatacattggtatgtgattataacacgagctgcccactgagtttctcgccagatcttctcagtgggtcgcgttaccgatcacgtgatagattctatgaagc actgctcttgttagggctagtgttagcaaattctttcaggttgagtctgagagctcacctacccatcggagcgtagctggaataggctaccagctaataggtagggaaaacaaagctcgaaacaagctcaagtaataacaacataatgtgaccataaaatctcgtggtgtatgagatacaattatgtactttcc cacaaatgtttacataattagaatgttgttcaacttgcctaacgccccagctagaacattcaattattactattaccactactaaggcagtatgtcctaactcgttccagatcagcgctaacttcgattgaatgtgcgaaatttatagctcaatattttagcacttatcgtattgatttaagaaaaaattgttaacattttgt ttcagtatgtcgcttatacaaatgca(SEQ IDNO.1)
poly(A)序列长度159bp，其核酸序列是：
tttttaatataaaataacccttgtttcttacttcgtcctggatacatctatgttttttttttcgttaataaatgagagcatttaagttattgtttttaattact tttttttagaaaacagatttcggattttttgtatgcattttatttgaatgtacta(SEQ ID NO.2)
本发明利用家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，无C端)表达外源蛋白的方法， 具体方法见实施例。
实施例1、载体的构建
利用前期获得的piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]作为注射转座子载体，重组 pBac[3×P3DsRedaf]注射转座子载体是利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建 的，首先，复杂的构建都在含有所有可能识别6个碱基的限制性内切酶的多克隆位点的 pSLfa1180fa克隆穿梭载体中完成，然后，构建好的重组pSLfa1180fa克隆穿梭载体用识别10 个碱基的限制性内切酶AscI和FseI消化，得到的重组目的基因部分最后被克隆到piggyBac 衍生载体pBac[3×P3-DsRedaf](通过限制性酶切位点AscⅠ和FseⅠ插入)形成目的重组注射载体。
启动子元件的PCR扩增是用含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体(BAC)克隆 (下面简称H-chain BAC)为模板(DDBJ/EMBL/GenBank的序列号为：AF226688)，EGFP基因是从pBS-A3EGFP质粒的中扩增得到，具体构建如下：
首先是不同元件片段的获得：包含仅含信号肽N端的丝素重链启动子(简称为Fib-H P(s))， 由丝素重链基因5’-上游序列，外显子1，内含子1和外显子2的部分5’端非重复序列组成， 它是用Fib-H-P(s)-f(61547-61564)：5'-aagcttgttgtacaaaactgcc-3'(SEQ IDNO.3)和 Fib-H-P(s)-r(63449-63471)：5'-gctatctagatgcatttgtataagcgacatact-3'(SEQID NO.4)引物对从 H-chain BAC扩增获得；重链基因多聚腺嘌呤化信号序列(poly(A))，它是用含有一个BamHI 位点的poly(A)-f(79200-79219)：5'-gtacggatccatttttaatataaaataaccc-3'(SEQ ID NO.5)和含有一 个SalI位点的poly(A)-r(79359-79335)：5'-gcgcgtcgactagtacattcaaataaaatgcatac-3'(SEQ ID NO.6) 从H-chain BAC扩增获得；EGFP基因是用含有一个XbaI位点的EGFP-f：5'-ctagtctagaatggtgagcaagggcgagg-3'(SEQ ID NO.7)和含有一个BamHI位点的EGFP-r (5'-cagtggatccttgtacagctcgtccatgccg-3'(SEQ ID NO.8)从pBS-A3EGFP质粒扩增获得，上面的 PCR扩增条件是94℃预变性5分钟，5个94℃变性1分钟，50℃退火1分钟和72℃延伸1 分30秒的循环，然后是25个94℃变性1分钟，55℃退火1分钟；和72℃延伸1分30秒的 循环，接下来是72℃延伸7分钟和4℃保存。
然后是将扩增元件按照下面的方法克隆到pSLfa1180fa(下面简称为pSL)穿梭载体(图1， A)：①克隆poly(A)片段通过BamHI和SalI连入进pSL穿梭载体获得pSL-poly(A)质粒；② 克隆EGFP片段通过XbaI和BamHI连入pSL-poly(A)质粒获得pSL-poly(A)-EGFP质粒；③克 隆Fib-H P(s)片段通过XbaI和HindⅢ连入进pSL-poly(A)-EGFP质粒获得 pSL-poly(A)-EGFP-Fib-H P(s)质粒。
最后，把获得的pSL-poly(A)-EGFP-Fib-H P(s)质粒的重组目的基因表达框克隆进pBac[3 ×P3DsRedaf]载体(图1，B)，获得重组注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-poly(A)-EGFP-Fib-H P(s)](图1，C)。
(2)转基因家蚕的获得(转基因家蚕命名为TS-H-G)：
pHA3PIG(Tamura et al.,2000)被用作辅助质粒产生转位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit (Qiagen)试剂盒纯化注射质粒DNA，参照Kanda&Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显 微注射，注射后的蚕卵用无毒胶封口，在25℃条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的 蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因 个体；最后，获得的转基因个体饲养、传代，并进行EGFP表达的检测和荧光观察，结果如图2所示。结果显示，TS-H-G的蚕蛾在红色荧光下眼睛显示红色，蚕茧在绿色荧光条件下显 示绿色。结果表明，转基因阳性家蚕TS-H-G成功获得。
启动子特异表达的检测和外源蛋白存在部位的观察如下：
获得的转基因家蚕进行基因组PCR、反向PCR、Western blotting以及荧光观察分析。
①基因组PCR分析：用酚-氯仿法从G1代的蛾或G2代7天的蛹抽提转基因家蚕及野生型的基因组DNA。利用引物对EGFP-f和EGFP-r对其进行PCR分析，后进行琼脂糖凝胶电泳分析检测。结果显示，TS-H-G相对于对照野生型有清晰单一的条带。
②反向PCR分析：利用逆转录聚合酶链反应(reverse PCR)技术测定了piggyBac载体在 染色体上的插入位点。10μg基因组DNA经HaeIII在37℃消化过夜，16℃过夜连接环状。以转座子特异性引物PLF/PLR(piggyBac左臂)和PRF/PRR(piggyBac右臂)扩增连接产物。PCR 片段克隆并测序。利用SilkMap应用程序(www.silkdb.org/silksoft/silkmap.html)完成了piggyBac载体的蚕基因组插入位点的定位。结果显示，转基因成功插入到家蚕基因组内且拷贝数单一。
③Western blotting分析：去掉乱丝的茧碎片溶解于60％的LiSCN溶液中(按照约0.025g 的茧片/1ml的60％LiSCN比例进行溶解和处理)，然后离心取上清液，并用Tris缓冲液(10 mM Tris-HCl pH＝7.0,2％SDS,5％β-巯基乙醇)稀释5倍后作为实验分析的样品。这些样品与 5×加样缓冲液混合并在100℃变性5分钟后上样于12％SDS-聚丙稀酰胺胶并进行Western blotting分析。Western blotting分析的抗体是GFP Rabbit MonoclonalAntibody(Beyotime, C.H.N.)，GFP的标准样品是Recombinant A.Victoria GFP protein(abcam,U.K.)，结果如图3所 示。结果显示，转基因家蚕有GFP目的蛋白表达。
④将G2代5龄幼虫第2天的转基因家蚕丝腺解剖，置于载玻片上，使用OlympusMacroViewMVX10-AUTO荧光立体显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)，检测并观察EGFP表达及存在位置，结果如图4所示。结果显示，转基因家蚕丝腺内能观察到绿色荧光。
⑤冷冻切片的组织学检查：取G2代五龄五天的丝腺放于10vol.％福尔马林中固定，后 与茧丝分别包埋于Tissue-Tek O.C.T.化合物(Sakura Finetechnical Co.,Ltd.)中并切成10μm厚 薄片，利用荧光立体显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM或LSCM)对蚕丝和蚕丝单丝的冷 冻切片进行EGFF的检测及存在位置的观察，结果如图5所示。结果显示，丝腺内丝胶及丝 素层均能检测到EGFP，而茧丝内仅在丝胶层有EGFP，丝素层没有，表明利用家蚕丝素重链 表达系统(N端仅含信号肽，无C端)表达的亲水性外源蛋白最后仅存在于丝胶层。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学；重庆西蚕生物技术研究院有限公司
<120> 表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1929
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)
<400> 1
aagcttgttg tacaaaactg ccacacgcat ttttttctcc actgtaggtt gtagttacgc 60
gaaaacaaaa tcgttctgtg aaaattcaaa caaaaatatt ttttcgtaaa aacacttatc 120
aatgagtaaa gtaacaattc atgaataatt tcatgtaaaa aaaaaatact agaaaaggaa 180
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aaattttgta aaactgtaaa tccgtaaaat tttgctaaac atatattgtg ttgttttggt 300
aagtattgac ccaagctatc acctcctgca gtatgtcgtg ctaattactg gacacattgt 360
ataacagttc cactgtattg acaataataa aacctcttca ttgacttgag aatgtctgga 420
cagatttggc tttgtatttt tgatttacaa atgttttttt ggtgatttac ccatccaagg 480
cattctccag gatggttgtg gcatcacgcc gattggcaaa caaaaactaa aatgaaacta 540
aaaagaaaca gtttccgctg tcccgttcct ctagtgggag aaagcatgaa gtaagttctt 600
taaatattac aaaaaaattg aacgatatta taaaattctt taaaatatta aaagtaagaa 660
caataagatc aattaaatca taattaatca cattgttcat gatcacaatt taatttactt 720
catacgttgt attgttatgt taaataaaaa gattaatttc tatgtaattg tatctgtaca 780
atacaatgtg tagatgttta ttctatcgaa agtaaatacg tcaaaactcg aaaattttca 840
gtataaaaag gttcaacttt ttcaaatcag catcagttcg gttccaactc tcaagatgag 900
agtcaaaacc tttgtgatct tgtgctgcgc tctgcaggtg agttaattat tttactatta 960
tttcagaagg tggccagacg atatcacggg ccacctgata ataagtggtc gccaaaacgc 1020
acagatatcg taaattgtgc catttgattt gtcacgcccg ggggggctac ggaataaact 1080
acatttattt atttaaaaaa tgaaccttag attatgtaac ttgtgattta tttgcgtcaa 1140
aagtaggcaa gatgaatcta tgtaaatacc tgggcagact tgcaatatcc tatttcaccg 1200
gtaaatcagc attgcaatat gcaatgcata ttcaacaata tgtaaaacaa ttcgtaaagc 1260
atcattagaa aatagacgaa agaaattgca taaaattata accgcattat taatttatta 1320
tgatatctat taacaattgc tattgccttt ttttcgcaaa ttataatcat tttcataacc 1380
tcgaggtagc attctgttac attttaatac attggtatgt gattataaca cgagctgccc 1440
actgagtttc tcgccagatc ttctcagtgg gtcgcgttac cgatcacgtg atagattcta 1500
tgaagcactg ctcttgttag ggctagtgtt agcaaattct ttcaggttga gtctgagagc 1560
tcacctaccc atcggagcgt agctggaata ggctaccagc taataggtag ggaaaacaaa 1620
gctcgaaaca agctcaagta ataacaacat aatgtgacca taaaatctcg tggtgtatga 1680
gatacaatta tgtactttcc cacaaatgtt tacataatta gaatgttgtt caacttgcct 1740
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ctcgttccag atcagcgcta acttcgattg aatgtgcgaa atttatagct caatatttta 1860
gcacttatcg tattgattta agaaaaaatt gttaacattt tgtttcagta tgtcgcttat 1920
acaaatgca 1929
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)
<400> 2
tttttaatat aaaataaccc ttgtttctta cttcgtcctg gatacatcta tgtttttttt 60
ttcgttaata aatgagagca tttaagttat tgtttttaat tacttttttt tagaaaacag 120
atttcggatt ttttgtatgc attttatttg aatgtacta 159
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcttgttg tacaaaactg cc 22
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctatctaga tgcatttgta taagcgacat act 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtacggatcc atttttaata taaaataacc c 31
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcgtcgac tagtacattc aaataaaatg catac 35
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagtctaga atggtgagca agggcgagg 29
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtggatcc ttgtacagct cgtccatgcc g 31

Claims (10)

1.表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)；3’端为重链基因poly(A)序列；所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述重链基因poly(A)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的SalI和HindⅢ酶切位点处而得。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体AscⅠ和FseⅠ酶切位点而得。
5.权利要求3所述重组载体的制备方法，其特征在于：所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的SalI和HindⅢ酶切位点处而得。
6.根据权利要求5所述重组载体的制备方法，其特征在于，制备方法如下：先将重链基因poly(A)序列通过BamHI和SalI酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-poly(A)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连入pSL-poly(A)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)通过XbaI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统pSL-poly(A)-目的基因-Fib-H P(s)。
7.根据权利要求6所述重组载体的制备方法，其特征在于：所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
8.根据权利要求6所述重组载体的制备方法，其特征在于：所述poly(A)序列由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
9.根据权利要求4所述重组载体的制备方法，其特征在于，制备方法如下：将权利要求3所获得的重组载体利用限制性酶AscⅠ和FseⅠ插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。
10.权利要求1所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或权利要求2～5任一项所述重组载体在丝胶层表达目的蛋白中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111793644B (zh) * 2020-07-17 2023-10-20 西南大学 家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用
CN112852876B (zh) * 2021-03-04 2022-11-29 西南大学 一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用
CN113621650B (zh) * 2021-03-24 2023-05-26 西南大学 一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104903445A (zh) * 2012-12-25 2015-09-09 国立研究开发法人农业生物资源研究所 后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫
CN105400815A (zh) * 2015-10-23 2016-03-16 浙江大学 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003211765B2 (en) * 2002-03-06 2007-11-01 National Institute Of Agrobiological Sciences Process for producing physiologically active protein using genetically modified silkworm

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104903445A (zh) * 2012-12-25 2015-09-09 国立研究开发法人农业生物资源研究所 后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫
CN105400815A (zh) * 2015-10-23 2016-03-16 浙江大学 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法
CN106011172A (zh) * 2016-05-24 2016-10-12 苏州大学 后部丝腺可合成和分泌亲水性丝胶蛋白的家蚕的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dingpei Long等.New insight into the mechanism underlying fibroin secretion in silkworm, Bombyx mori.《FEBS Journal》.2015,第282卷第89-101页. *
Zhanzhang Hao等.New insight into the mechanism of in vivo fibroin self-assembly and secretion in the silkworm, Bombyx mori.《International Journal of Biological Macromolecules》.2020,第169卷第473-479页. *
潘兴亮等.家蚕丝素重链启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达.生物工程学报.2009,第25卷(第05期),第761-766页. *
陆威健.hEGF生物活性新型蚕材料的创制与研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》.2016,(第02期),第E080-47页. *

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