JPWO2018074403A1 - 遺伝子組換えミノムシ絹糸 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が配列番号5で示すアミノ酸配列、配列番号5で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は配列番号5で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかを含む、(1)に記載の遺伝子。
(3)前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が配列番号7で示すアミノ酸配列、配列番号7で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は配列番号7で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかを含む、(2)に記載の遺伝子。
(4)カイコフィブロインH鎖をコードする遺伝子の一部を含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子。
(5)前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が配列番号9で示すアミノ酸配列、配列番号9で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は配列番号9で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかをコードする、(4)に記載の遺伝子。
(6)絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター、及び(1)〜(5)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子をカイコ細胞内で発現可能な状態で含み、前記改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子は、前記後部絹糸腺発現プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(7)絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター及び該プロモーターの下流制御下に配置された(1)〜(5)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子を含む、(6)に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(8)絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター及び該プロモーターの下流制御下に配置された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第1発現ユニット、及び該転写調節因子の標的プロモーター及び該標的プロモーターの下流制御下に配置された改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子を含む第2発現ユニットから構成される、(6)に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(9)前記転写調節因子をコードする遺伝子がGAL4遺伝子であり、該転写調節因子の標的プロモーターがUASプロモーターである、(8)に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(10)前記後部絹糸腺発現プロモーターが後部絹糸腺特異的プロモーターである、(6)〜(9)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(11)前記後部絹糸腺特異的プロモーターがフィブロインH鎖、フィブロインL鎖、又はp25のいずれかのプロモーターである、(10)に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(12)前記絹糸虫がカイコである、(6)〜(11)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
(13)(6)〜(12)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコ。
(14)(6)又は(7)、又はそれに従属する(10)〜(12)のいずれかに記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクターを宿主であるカイコに導入する工程、前記発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを選択する工程を含む改変型ミノムシ絹糸を吐糸する遺伝子組換えカイコの作出方法。
(15)(8)又は(9)、又はそれに従属する(10)〜(12)のいずれかに記載の第1発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコと(8)又は(9)、又はそれに従属する(10)〜(12)のいずれかに記載の第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコを交配させる工程、及び前記交配後の後代から前記第1及び第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコを選択する工程を含む改変型ミノムシ絹糸を吐糸する遺伝子組換えカイコの作出方法。
(16)(13)に記載の遺伝子組換えカイコに営繭させる工程、繭を回収する工程、及び回収した繭から改変型ミノムシ絹糸を繰糸する工程を含む改変型ミノムシ絹糸を生産する方法。
(17)(13)に記載の遺伝子組換えカイコが吐糸した改変型ミノムシ絹糸。
1−1.概要
本発明の第1の態様は、オオミノガ由来のミノムシ絹糸におけるフィブロインH鎖(Fib H)のアミノ酸の一部を有する改変型ミノムシFib Hをコードする遺伝子(改変型ミノムシFib H遺伝子)である。本発明の遺伝子をカイコに導入し、後部絹糸腺内で発現させることによって、その遺伝子組換えカイコからオオミノガ由来のミノムシ絹糸の物性を有するハイブリッド絹糸、すなわち改変型ミノムシ絹糸を吐糸させることができる。
本明細書で頻用する以下の用語について、以下の通り定義する。
一般にFib Hは、そのアミノ酸配列内に繰り返し単位を1個又は複数個含む。本明細書において「繰り返し単位」とは、グリシン残基(G)及びアラニン残基(A)を多数包含し、Fib Hのアミノ酸配列内で1回又は複数回出現するアミノ酸配列である。本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子がコードする改変型ミノムシFib Hも、そのアミノ酸配列内に繰り返し単位を1個又は複数個含んでいる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターである。本発明の発現ベクターは、第1態様に記載の改変型ミノムシFib H遺伝子をカイコの後部絹糸腺内において発現可能な状態で含んでいる。本発明の発現ベクターをカイコに導入することによって、遺伝子組換えカイコから改変型ミノムシ絹糸を得ることができる。
2−2−1.改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターの構成要素
本明細書で「発現ベクター」とは、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含み、その遺伝子の発現を制御できる発現単位をいう。
「後部絹糸腺発現プロモーター」とは、本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを宿主であるカイコに導入したときに、カイコの後部絹糸腺において、下流に配置された遺伝子の発現を制御することのできるプロモーターである。
改変型ミノムシFib H遺伝子は、本発明における改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターにおいて、発現すべき目的のタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の詳細については、第1態様に記載したことから、ここでの具体的な説明は省略する。
「標識遺伝子」は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。「標識タンパク質」とは、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。標識遺伝子は、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを保有する宿主、すなわち形質転換体を判別する目的、及び/又は改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターから発現した目的のタンパク質をモニタリングする目的で用いられる。いずれの目的の場合にも、標識タンパク質の活性に基づいて形質転換体の判別や改変型ミノムシFib Hの発現量をモニタリングすることができる。ここで「活性に基づいて」とは、活性の検出結果に基づいて、という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、生物学的検出(抗体、アプタマー等のペプチドや核酸の結合による検出を含む)、化学的検出(酵素反応的検出を含む)、物理的検出(行動分析的検出を含む)、又は検出者の感覚的検出(視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む)のいずれであってもよい。
「トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs:inverted terminal repeat sequence)」は、本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターをゲノムDNAに相同組換え可能な発現ベクターとする場合に含まれ得る選択構成要素である。逆位末端反復配列は、通常は2個1組で使用され、トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる(Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281;Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9(2):145-55)。
「5’UTR(5’untranslated region)及び3’UTR(3’untranslated region)」は、いずれもそれ自身がタンパク質やその断片、又は機能性核酸をコードしない非翻訳領域からなるポリヌクレオチドである。各UTRを構成する塩基配列は、限定はしないがFib H遺伝子に由来する5’UTR及び3’UTRであることが好ましい。改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターにおいて5’UTRは、前記Fib H遺伝子の開始コドンの上流(5’末端側)に配置され、3’UTRは、Fib H遺伝子の終止コドンの下流(3’末端側)に配置される。なお、3’UTRは、ポリAシグナルを含むことができる。
「ターミネーター」は、本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターにおいて、改変型ミノムシFib H遺伝子の3’末端側、好ましくは終止コドンの下流に配置される塩基配列で、改変型ミノムシFib H遺伝子の転写を終結できる塩基配列で構成されている。例えば、配列番号22で示す塩基配列からなるhsp70ターミネーターや配列番号23で示す塩基配列からなるSV40ターミネーターが挙げられる。
「エンハンサー」は、本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターにおいて、部位特異的プロモーターの制御による改変型ミノムシFib H遺伝子の発現をさらに増強することができる塩基配列からなる。
「インスレーター」は、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
「転写調節因子の遺伝子」は、後述する第1発現ユニットの必須構成要素である。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述の標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第2発現ユニットの必須要素であって、第1発現ユニットにコードされた転写調節因子が結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常は、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS(Upstream Activating Sequence)が使用される。
本発明の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターは、1つの発現ユニットで構成される場合と、2つの発現ユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
1つの発現ユニットで構成される場合、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターは、カイコ細胞内で改変型ミノムシFib H遺伝子を発現させる上で必要な全ての構成要素を1つのベクター内に含んでいる。具体的には、必須の構成要素である後部絹糸腺発現プロモーター及びそのプロモーターの制御下に配置された改変型ミノムシFib H遺伝子を含む。
改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターが第1発現ユニット及び第2発現ユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、改変型ミノムシFib H遺伝子の発現に必須の構成要素は各ユニットに分割されている。本構成では、第1及び第2発現ユニットが宿主細胞内に併存してはじめて1つの改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターとして機能する。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、遺伝子組換えカイコである。本態様の遺伝子組換えカイコは、前記第2態様の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを含む形質転換体である。本発明の遺伝子組換えカイコが吐糸する絹糸は、カイコ絹糸をベースとして改変型ミノムシFib Hを含む改変型ミノムシ絹糸である。したがって、本発明の遺伝子組換えカイコに営繭させることで、改変型ミノムシ絹糸を量産することが可能となる。
本発明の遺伝子組換えカイコは、前記第2態様に記載の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを細胞内に含む。改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターの構成については、第2態様で詳述したことから、その説明を省略し、ここでは本態様の遺伝子組換えカイコに特有の構成について説明をする。
本態様の遺伝子組換えカイコの作出方法は、公知のいかなる方法も採用可能であり、特に限定はしない。組換えカイコを作出する方法として、例えば、前記第2態様の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを宿主であるカイコに直接導入する方法や、第2態様に記載の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターの第1発現ユニットと第2発現ユニットをそれぞれ異なる染色体上に有する雌雄の遺伝子組換えカイコを交配する方法が挙げられる。
本方法は、主として第2態様の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターが1つの発現ユニットで構成される場合に採用する遺伝子組換えカイコの作出方法である。この方法では、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを宿主のカイコ内に導入し、その発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを選択することで目的を達成し得る。本作出方法は、導入工程及び選択工程を必須の工程として含む。
「導入工程」とは、第2態様に記載の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを宿主であるカイコに導入する工程である。発現ベクターをカイコに導入する方法は、当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、カイコ卵に導入する場合には、Tamuraらの方法(Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84)を利用することができる。具体的には、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターが適当な濃度となるように改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを水やバッファー等の溶媒によって希釈し、投与溶液を調製する。ここで、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列を有する場合には、投与溶液にトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを含んだヘルパーベクターを加えてカイコの発生初期卵にコインジェクションすればよい。この時に用いる宿主カイコは、特に限定はしない。野生型若しくは変異型カイコであってもよいし、遺伝子組換えカイコであってもよい。また宿主カイコがヘルパーベクターを既に含んでいる場合には、ヘルパーベクターを加えない、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターのみを含む投与溶液をカイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。
選択工程は、導入工程後のカイコから、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを選択する工程である。選択方法は、当該分野に公知の方法であれば限定はしない。通常は、改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクター(ヘルパーベクターを導入した場合にはヘルパーベクターも同様)に含まれる標識遺伝子の発現によって生じた選抜マーカーの有無に基づいて、形質転換体を選択することで、目的の遺伝子組換えカイコを得ることができる。
本方法は、主として第2態様の改変型ミノムシFib H遺伝子発現ベクターが2つの発現ユニットで構成される場合に採用する遺伝子組換えカイコの作出方法である。この方法では、第1発現ユニット及び第2発現ユニットのそれぞれを異なる染色体上に有する雌雄の遺伝子組換えカイコを交配し、F1又はF2で2つの発現ユニットを有する遺伝子組み換えを選択することで目的を達成し得る。本作出方法は、交配工程及び選択工程を必須の工程として含む。
「交配工程」とは、第1発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ(第1遺伝子組換えカイコ)と第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコと(第2遺伝子組換えカイコ)を交配させる工程である。交配は、二つのカイコ系統を常法に基づいて交配させればよい。
「選択工程」とは、前記第1及び第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコ系統を選択する工程である。本工程では、交配工程後に得られるF1個体又はF1どうしの交配によって得られるF2個体から、第1及び第2発現ユニットのそれぞれにコードされた選抜マーカーの活性に基づいて、両遺伝子発現ユニットを有する個体を選択することによって達成し得る。なお、第1及び第2遺伝子組換えカイコの作出は、前記直接導入方法を用いて、カイコにそれぞれ第1発現ユニット又は第2発現ユニットを導入することで作出できる。
4−1.概要
本発明の第4の態様は、改変型ミノムシ絹糸の生産方法である。本発明の生産方法では、タンパク質の大量生産系の遺伝子組換えカイコを用いる。本態様で用いる遺伝子組換えカイコは、第3態様の遺伝子組換えカイコである。そのカイコに営繭させ、繭から改変型ミノムシ絹糸を得る。本発明の生産方法によれば、カイコ絹糸の生産設備等を用いて、ミノムシ絹糸の物性を有するミノムシ絹糸とカイコ絹糸のハイブリッド絹糸、すなわち改変型ミノムシ絹糸を量産することができる。
本発明の改変型ミノムシ絹糸の生産方法は、飼育工程を選択工程として、また営繭工程、収繭工程、繰糸工程を必須の工程として含む。
(1)飼育工程
「飼育工程」とは、第3態様の遺伝子組換えカイコを飼育する工程である。遺伝子組換えカイコの飼育方法については、当該分野で公知のカイコの飼育技術に従って飼育すればよい。例えば、「蚕種総論;高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を参照するとよい。飼料には、クワ属(Morus)の葉のような食草樹種の天然葉を用いてもよいし、シルクメイトL4M若しくは原蚕種1−3齢用(日本農産工業)のような人工飼料を用いてもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できる点から、人工飼料が好ましい。以下、遺伝子組換えカイコの簡単な飼育方法について、一例を挙げて説明する。
「営繭工程」は、第3態様の遺伝子組換えカイコに営繭させる工程である。「営繭(えいけん)」とは、終齢(5齢)カイコが繭を蛹化のために繭を形成することをいう。
「収繭(しゅうけん)工程」は、営繭工程後、蔟から繭を掻き取り、回収する工程である。本工程は繭周辺に付着した毛羽の除去までを包含する。収繭は、上蔟後6〜8日目に行えばよい。収繭は、手作業で行うこともできるが、収繭専用装置を用いると便利である。毛羽のみを除去する毛羽取機の他、蔟からの繭の掻き取り及び毛羽の除去までを行う全自動収繭毛羽取機を利用することができる。
「繰糸工程」は、収繭工程で回収した繭から改変型ミノムシ絹糸を繰糸する工程である。「繰糸」とは、繭から生糸を作ることをいう。回収された繭は、80〜85℃の熱湯に水没させて繭をほぐれやすくする「煮繭」を行った後、索緒箒を用いて繭の表層部を剥取する「索緒」を行う。その後、繭から糸口を取り出す「抄緒」を行い、操糸を行う。これらの工程は、手作業で行うこともできるが、繰糸専用装置である自動繰糸機を用いることが好ましい。以上の工程によって、改変型ミノムシ絹糸を生糸として生産することができる。
(目的)
未知のミノムシFib H遺伝子をクローニングする。
(方法)
千葉県我孫子市(日本)で野外採取したオオミノガの幼虫を解剖して、絹糸腺を摘出した。RNA抽出試薬であるISOGEN(ニッポンジーン社)中において摘出した絹糸腺をすりつぶし、SV Total RNA Isolation system(プロメガ社)を用いて総RNAの抽出を行った。抽出した総RNAを鋳型に、TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (イルミナ社)を用いてcDNAライブラリーを作製した。次世代シーケンサーHiseq2500を用いてRNAseq解析に供した。得られた101bp×2のペアエンド配列リードデータを用いて、blast検索及びtrinityを用いたde novo assemble解析を行った。
de novo assemble解析によりオオミノガFib HのN末端領域をコードする配列番号24で示す約750bpの塩基配列、中央領域の繰り返し配列をコードする配列番号25で示す約1020bpの塩基配列、及びC末端領域をコードする配列番号26で示す約300bpの塩基配列の同定に成功した。
(目的)
実施例1で得られたオオミノガのミノムシFib H遺伝子の部分配列情報とカイコFib H遺伝子情報に基づいて全長キメラFib H遺伝子の発現ベクターを構築する。
実施例1で得られた塩基配列情報は、オオミノガ由来のミノムシFib H遺伝子における一部領域(N末端領域、中央領域、C末端領域)であった。オオミノガFib H遺伝子の転写産物は、全長が約10kbpと推定される。そこで、ミノムシFib H遺伝子を遺伝子組換えコンストラクトとして利用可能な形態にするため、実施例1で得たオオミノガのFib H遺伝子断片の塩基配列情報とカイコFib H遺伝子情報に基づいて、以下の操作によりミノムシ及びカイコのキメラFib H遺伝子からなる改変型ミノムシFib H遺伝子を構築した。
(目的)
実施例2で構築した発現ベクターを導入した遺伝子組換えカイコを作出する。
実施例2で構築した改変型ミノムシFibH遺伝子発現ベクター(pBac3xP3eGFP-BmEv01HFB-F31/R31)を定法(Tamura T. et al., 2000, Nat Biotechnol, 18: 81-84)に従い、カイコw1pnd系統の卵288個に注射し、生じた成虫のsib交配(G0交配)により38蛾区を得た。その内の8蛾区から92個体の遺伝子組換え体(G1卵)がスクリーニングされた。G1卵より56個体が孵化し、34個体の改変型ミノムシFib H遺伝子組換えカイコの成虫を得た。
Claims (17)
- 配列番号1で示すアミノ酸配列を複数個含む改変型ミノムシフィブロインH鎖をコードする遺伝子。
- 前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が
配列番号5で示すアミノ酸配列、
配列番号5で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は
配列番号5で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかを含む、請求項1に記載の遺伝子。 - 前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が
配列番号7で示すアミノ酸配列、
配列番号7で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は
配列番号7で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかを含む、請求項2に記載の遺伝子。 - カイコフィブロインH鎖をコードする遺伝子の一部を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子。
- 前記改変型ミノムシフィブロインH鎖が
配列番号9で示すアミノ酸配列、
配列番号9で示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換したアミノ酸配列、又は
配列番号9で示すアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかをコードする、請求項4に記載の遺伝子。 - 絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター、及び請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子をカイコ細胞内で発現可能な状態で含み、
前記改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子は、前記後部絹糸腺発現プロモーターによる直接的又は間接的な発現制御を受けるように配置されている改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。 - 絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター及び該プロモーターの下流制御下に配置された請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子を含む、請求項6に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
- 絹糸虫由来の後部絹糸腺発現プロモーター及び該プロモーターの下流制御下に配置された転写調節因子をコードする遺伝子を含む第1発現ユニット、及び
該転写調節因子の標的プロモーター及び該標的プロモーターの下流制御下に配置された改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子を含む第2発現ユニット
から構成される、請求項6に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。 - 前記転写調節因子をコードする遺伝子がGAL4遺伝子であり、該転写調節因子の標的プロモーターがUASプロモーターである、請求項8に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
- 前記後部絹糸腺発現プロモーターが後部絹糸腺特異的プロモーターである、請求項6〜9のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
- 前記後部絹糸腺特異的プロモーターがフィブロインH鎖、フィブロインL鎖、又はp25のいずれかのプロモーターである、請求項10に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
- 前記絹糸虫がカイコである、請求項6〜11のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクター。
- 請求項6〜12のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコ。
- 請求項6又は7、又はそれに従属する請求項10〜12のいずれか一項に記載の改変型ミノムシフィブロインH鎖遺伝子発現ベクターを宿主であるカイコに導入する工程、
前記発現ベクターを含む遺伝子組換えカイコを選択する工程
を含む改変型ミノムシ絹糸を吐糸する遺伝子組換えカイコの作出方法。 - 請求項8又は9、又はそれに従属する請求項10〜12のいずれか一項に記載の第1発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコと請求項8又は9、又はそれに従属する請求項10〜12のいずれか一項に記載の第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコを交配させる工程、及び
前記交配後の後代から前記第1及び第2発現ユニットを有する遺伝子組換えカイコを選択する工程
を含む改変型ミノムシ絹糸を吐糸する遺伝子組換えカイコの作出方法。 - 請求項13に記載の遺伝子組換えカイコに営繭させる工程、
繭を回収する工程、及び
回収した繭から改変型ミノムシ絹糸を繰糸する工程
を含む改変型ミノムシ絹糸を生産する方法。 - 請求項13に記載の遺伝子組換えカイコが吐糸した改変型ミノムシ絹糸。
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