CN109844112B

CN109844112B - 基因重组蓑蛾虫丝

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Publication number: CN109844112B
Application number: CN201780064025.XA
Authority: CN
Inventors: 米村真之; 饭冢哲也; 中岛健一; 坪田拓也; 铃木誉保; 濑筒秀树; 龟田恒德; 吉冈太阳
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2037-10-16
Also published as: CN109844112A; JP6990413B2; CN116195554A; WO2018074403A1; KR102563658B1; US20190256565A1; EP3530735A1; US11220529B2; JPWO2018074403A1; EP3530735A4; KR20190065410A; IL266090A

Abstract

使用基因重组技术制成吐丝蓑蛾虫丝的基因重组蚕，开发、提供大量生产蓑蛾虫丝的方法。克隆编码包含蓑蛾虫Fib H的一部分氨基酸序列的蓑蛾虫Fib H样多肽的基因片段，提供使该基因片段与编码蚕来源的Fib H的基因片段融合而得的编码改变型蓑蛾虫Fib H的基因、和导入了该基因的基因重组蚕。

Description

基因重组蓑蛾虫丝

技术领域

本发明涉及利用基因重组技术制作的改变型蓑蛾虫丝和吐丝该改变型蓑蛾虫丝的基因重组蚕。

背景技术

构成昆虫的茧的丝、哺乳动物的毛自古以来作为动物纤维而在衣物等中被利用。特别作为蚕蛾(Bombyx mori)的幼虫的蚕来源的丝(本说明书中经常表述为“蚕丝”)，吸放湿性、保湿性和保温性优异，而且具有独特的光泽和润滑的肌肤触感，现在也作为高级天然材料而被重视。

但是，自然界存在具有与蚕丝匹敌、或其以上的特性的动物纤维。例如，由蓑蛾虫(Basket worm,别名“bag worm”)吐丝的丝(本说明书中经常表述为“蓑蛾虫丝”)就是其中之一。已知蓑蛾虫是属于鳞翅目(Lepidoptera)蓑蛾科(Psychidae)的蛾的幼虫的总称，通常潜伏在将叶片、枝片用丝捆束而成的纺锤形或圆筒形的巢(Bag nest)(图1)中，摄食时也连巢等移动，全幼虫期与巢共同生活。

该蓑蛾虫丝具有力学上比蚕丝更优异的特性。例如，关于弹性模量，茶大蓑蛾(Eumeta minuscula)的蓑蛾虫丝被夸耀为蚕丝的3.5倍，并且具有非常强的强度(非专利文献1、2)。另外，蓑蛾虫丝的单纤维的剖面积仅为蚕丝的单纤维的1/7，能够制作纹理细腻、具有润滑的肌肤触感、薄且轻的布。并且，蓑蛾虫丝具备与蚕丝同等或其以上的光泽和艳丽。因此，蓑蛾虫丝能够成为极有希望作为新的天然材料的动物纤维。

但是，为了将蓑蛾虫丝实用化，存在几个问题。其一为量产。提到利用了蓑蛾虫丝的制品，到目前为止不过是将从自然界采集的蓑蛾虫的巢缝在一起而制作的钱袋、草鞋这样的所谓手工的单品生产品。为了将蓑蛾虫丝实用化，成为材料的蓑蛾虫的巢的大量取得是不可或缺的。但是，蓑蛾虫的巢的野外采集量不足以满足量产，因此蓑蛾虫的大量饲养和蓑蛾虫丝的有效的采集方法的确立变得不可或缺。但是，蓑蛾虫丝产业刚刚迎来黎明期，饲养场地、食树栽培、和制丝工厂等用于量产蓑蛾虫丝的设备和体制尚不十分健全。现状是实现量产化还需很多时间。

在蓑蛾虫丝的实用化中，另一个大问题是在蓑蛾虫的巢的表面必须附着叶片、枝片等这一点。为了将蓑蛾虫丝制品化，必须完全除去这些夹杂物。但是，除去作业需要庞大的工夫和成本，结果产生了生产成本变高这样的新问题。另外，通过现有的技术完全除去夹杂物是困难的，不仅最终生产物中也混有少量的小叶片等，而且由于夹杂物来源的色素而丝被染成淡茶色等，变成低品质的产品。

但是，上述问题可以通过利用基因重组蚕的技术而完全解决。如果使用基因重组技术，则通过将克隆的外来基因导入宿主中，能够在宿主细胞内进行有用蛋白质的生产。一直以来，作为蛋白质生产系统的宿主主要利用大肠菌(Escherichia coli)、芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，但存在这些宿主不能大量生成目的蛋白质这样的问题。因此，近年来，以蚕作为宿主的蛋白质的大量生产系统受到瞩目。蚕(Bombyx mori)能够在丝腺内短时间合成大量的蛋白质。在基因重组技术中，需要将外来基因导入宿主细胞内的转化体的制作技术，但对于蚕，已经确立了通过使用转座子piggyBac使外来基因在基因组内稳定地维持来制作基因重组蚕(转基因蚕)的技术(非专利文献3)。

蚕的丝腺在形态学上由如图2所示的左右1对的器官构成，并且分别由前部丝腺、中部丝腺、和后部丝腺3个区域构成。在后部丝腺细胞内，构成作为丝的纤维成分的丝心蛋白的3种主要蛋白质、即丝心蛋白H链(本说明书中经常简称为“Fib H”)、丝心蛋白L链(本说明书中经常简称为“Fib L”)、和p25/FHX(以下称为“p25”)被合成。这3种蛋白质形成复合体(silk fibroin elementary unit(蚕丝丝心蛋白基本单元)；本说明书中以下表述为“SFEU复合体”)，被分泌到后部丝腺内腔中。另外，在中部丝腺细胞内，作为丝的被覆成分的水溶性的明胶样蛋白质丝胶蛋白被合成。它们在合成后被分泌到中部丝腺内腔中。被分泌到后部丝腺内腔中的SFEU复合体转移到中部丝腺内腔，在此被丝胶蛋白被覆，成为丝从前部丝腺被吐丝(非专利文献4)。

认为蓑蛾虫丝的基本结构也与蚕丝同样，由作为纤维成分的丝心蛋白与被覆其的丝胶蛋白构成。因此，如果利用蚕丝腺作为蓑蛾虫丝的表达系统，使蚕吐丝蓑蛾虫丝，则能够容易且大量地获得蓑蛾虫丝。另外，如果能够作为蚕茧回收蓑蛾虫丝，则也不会混入向蓑蛾虫的巢那样的夹杂物。进而，如果饲养对象是基因重组蚕，则可以直接利用现有的蚕的饲养设备、制丝工厂、和饲养技术，因此能够快速实用化。

但是，上述利用基因重组蚕的蓑蛾虫丝的生产法也存在阻碍实现的问题。为了利用基因重组蚕的技术，必须克隆编码蓑蛾虫丝的构成蛋白质的各基因、至少必须克隆构成作为蓑蛾虫丝中的丝心蛋白的主成分的Fib H的基因(Fib H基因)。但是，一般Fib H具有甘氨酸残基和丙氨酸残基的簇重复的氨基酸序列，因而通过通常的克隆技术难以分离、鉴定编码全长的蓑蛾虫Fib H的基因(以下在本说明书中经常表述为“蓑蛾虫Fib H基因”)。实际到现在为止，蓑蛾虫的丝心蛋白H链基因尚未被鉴定。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：大崎茂芳,2002,繊維学会誌(繊維と工業),58:74-78

非专利文献2：Gosline J.M.et al.,1999,202,3295-3303

非专利文献3：Tamura T.et al.,2000,Nat Biotechnol,18:81-84.

非专利文献4：Inoue S.et al.,2000,The Journal of Biological Chemistry,275(51):40517-40528.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是使用基因重组技术制作吐丝蓑蛾虫丝的基因重组蚕，提供大量生产蓑蛾虫丝的方法。

用于解决课题的手段

为了制成吐丝蓑蛾虫丝的基因重组蚕，编码蓑蛾虫丝的各构成成分的基因的鉴定和克隆是必需的，但在蓑蛾虫中，编码任一构成成分的基因均未被鉴定。另外，克隆作为蓑蛾虫丝的主成分的蓑蛾虫Fib H基因的全长如上所述在通常技术中是困难的。

因此，本发明者们通过使用大蓑蛾(Eumeta japonica)实施利用新一代DNA测序仪的转录物组分析，成功地克隆了编码包含蓑蛾虫Fib H的一部分氨基酸序列的蓑蛾虫Fib H样多肽的基因片段。使该基因片段与编码蚕来源的Fib H的基因片段融合，从而制作了编码全长化的改变型蓑蛾虫Fib H的基因(以下在本说明书中经常表述为“改变型蓑蛾虫Fib H基因”)。另外，将该基因导入蚕而制成基因重组蚕。该基因重组蚕吐丝包含在蚕Fib H中包含一部分改变型蓑蛾虫Fib H的Fib H、与蚕来源的Fib L、p25、和丝胶蛋白的改变型蓑蛾虫丝。改变型蓑蛾虫丝是对蚕丝付与了蓑蛾虫丝的物性的杂种丝。本发明基于上述研究成果，提供以下发明。

(1)编码改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链的基因，所述改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链包含多个序列号1所示的氨基酸序列。

(2)根据(1)所述的基因，所述改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链包含以下任一氨基酸序列：

序列号5所示的氨基酸序列、

在序列号5所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、和

与序列号5所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。

(3)根据(2)所述的基因，所述改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链包含以下任一氨基酸序列：

序列号7所示的氨基酸序列、

在序列号7所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、和

与序列号7所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的基因，包含编码蚕丝心蛋白H链的基因的一部分。

(5)根据(4)所述的基因，所述改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链包含以下任一氨基酸序列：

序列号9所示的氨基酸序列、

在序列号9所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、和

与序列号9所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。

(6)改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，以能够在蚕细胞内表达的状态包含泌丝昆虫来源的后部丝腺表达启动子和(1)～(5)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因，

所述改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因以受到所述后部丝腺表达启动子的直接或间接表达控制的方式配置。

(7)根据(6)所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，

包含泌丝昆虫来源的后部丝腺表达启动子和在该启动子的下游控制下配置的(1)～(5)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因。

(8)根据(6)所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，由第1表达单元和第2表达单元构成，

所述第1表达单元包含泌丝昆虫来源的后部丝腺表达启动子和在该启动子的下游控制下配置的编码转录调节因子的基因，

所述第2表达单元包含该转录调节因子的目标启动子和在该目标启动子的下游控制下配置的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因。

(9)根据(8)所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，编码所述转录调节因子的基因是GAL4基因，该转录调节因子的目标启动子是UAS启动子。

(10)根据(6)～(9)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，所述后部丝腺表达启动子是后部丝腺特异的启动子。

(11)根据(10)所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，所述后部丝腺特异的启动子是丝心蛋白H链、丝心蛋白L链和p25的任一者的启动子。

(12)根据(6)～(11)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体，所述泌丝昆虫是蚕。

(13)基因重组蚕，包含(6)～(12)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体。

(14)吐丝改变型蓑蛾虫丝的基因重组蚕的制成方法，包括：

将(6)或(7)、或从属于它们的(10)～(12)的任一项所述的改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因表达载体导入作为宿主的蚕中的工序，和

选择包含所述表达载体的基因重组蚕的工序。

(15)吐丝改变型蓑蛾虫丝的基因重组蚕的制成方法，包括：

使具有(8)或(9)、或从属于它们的(10)～(12)的任一项中所记载的第1表达单元的基因重组蚕与具有(8)或(9)、或从属于它们的(10)～(12)的任一项中所记载的第2表达单元的基因重组蚕交配的工序，和

从所述交配后的后代选择具有所述第1和第2表达单元的基因重组蚕的工序。

(16)生产改变型蓑蛾虫丝的方法，包括：

使(13)所述的基因重组蚕结茧的工序，

回收茧的工序，和

从回收的茧缫丝改变型蓑蛾虫丝的工序。

(17)由(13)所述的基因重组蚕吐丝的改变型蓑蛾虫丝。

本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-204592号的公开内容。

发明的效果

根据本发明的表达载体，能够通过将该表达载体导入蚕而制作吐丝改变型蓑蛾虫丝的基因重组蚕。

另外，通过使用本发明的基因重组蚕，能够生产对蚕丝人工付与了蓑蛾虫丝的物性的改变型蓑蛾虫丝。

附图说明

图1：A是大蓑蛾的蓑蛾虫(大蓑蛾蓑蛾虫)的巢的外观图。B是显示将大蓑蛾蓑蛾虫的巢沿长轴方向切开而分成两部分时的巢的内部的图。

图2是蚕的丝腺和在其各部位表达的丝心蛋白构成蛋白质和直到丝被吐丝的概念图。

具体实施方式

1.改变型蓑蛾虫丝心蛋白H链基因

1-1.概要

本发明的第1方式是编码具有大蓑蛾来源的蓑蛾虫丝中的丝心蛋白H链(Fib H)的氨基酸的一部分的改变型蓑蛾虫Fib H的基因(改变型蓑蛾虫Fib H基因)。通过将本发明的基因导入蚕，使其在后部丝腺内表达，能够使该基因重组蚕吐丝具有大蓑蛾来源的蓑蛾虫丝的物性的杂种丝、即改变型蓑蛾虫丝。

1-2.术语的定义

本说明书中频繁使用的以下术语如下定义。

“蓑蛾虫”如前所述，是指属于鳞翅目(Lepidoptera)蓑蛾科(Psychidae)的蛾的幼虫的总称。本说明书中的蓑蛾虫，只要其所吐丝的蓑蛾虫丝包含后述的序列号1所示的氨基酸序列，就对其种类不特别限定。本说明书中进行基因克隆的Fib H是大蓑蛾来源的Fib H，因此蓑蛾虫优选是大蓑蛾、茶大蓑蛾(Eumeta minuscula)的那样的窠蓑蛾(Eumeta)属的幼虫、更优选为大蓑蛾的幼虫。

本说明书中所谓“丝”，是昆虫来源的丝，是指昆虫的幼虫、成虫为了结巢、移动、固定、结茧、捕食等而吐丝的蛋白质制的丝。本说明书中，在仅表述为“丝”的情况下，原则上是不特定来源的昆虫名地广泛地指一般的丝，在表示特定的昆虫来源的丝的情况下，像蚕丝、蓑蛾虫丝这样，在丝之前附上其来源生物名。

“丝腺”是具有产生、蓄积、以及分泌液状丝的功能的由唾液腺变化而成的管状器官。丝腺通常沿着能够吐丝出丝的昆虫的、主要为幼虫的消化管左右一对地存在，各丝腺由前部、中部和后部丝腺的3个区域构成。图2图示了蚕的丝腺，但蓑蛾虫的丝腺也具有基本同样的形态。如前所述，后部丝腺产生和分泌作为丝的纤维成分的丝心蛋白。另外，中部丝腺产生和分泌作为被覆成分的丝胶蛋白，与从后部丝腺转移而来的丝心蛋白一起蓄积在其内腔。

“丝心蛋白H链(Fib H)”是构成丝中的纤维蛋白质成分丝心蛋白的蛋白质之一。如图2所示，例如，蚕的丝心蛋白主要由3种蛋白质、即Fib H、Fib L、和p25构成。其中Fib H是丝心蛋白中的主要构成蛋白质，丝的特性主要由Fib H带来。本说明书中，仅表述为“Fib H”的情况下，原则上对来源的昆虫不特别限定。另一方面，表示特定的昆虫来源的Fib H的情况下，像蚕Fib H、蓑蛾虫Fib H这样，在Fib H之前附上其来源生物名。

本说明书中“改变型Fib H”是人工改变的Fib H，由与野生型Fib H不同的氨基酸序列构成。改变型Fib H可列举例如，在Fib H的氨基酸序列中的导入了1个或多个氨基酸的添加、缺失、和/或替换的变异Fib H、2种以上不同昆虫来源的Fib H的氨基酸序列融合而成的嵌合Fib H。

本说明书的“改变型蓑蛾虫Fib H”是蓑蛾虫来源的Fib H中的改变型Fib H，相当于在野生型蓑蛾虫Fib H的氨基酸序列中导入了1个或多个氨基酸的添加、缺失、和/或替换的变异Fib H、和/或2种以上不同昆虫来源的Fib H的氨基酸序列融合而成的嵌合Fib H。

本说明书中“丝心蛋白H链(Fib H)基因”是指编码所述Fib H的基因。与Fib H同样地，在仅表述为“Fib H基因”的情况下，本说明书中原则上不限定来源的昆虫。另一方面，在表示特定的昆虫来源的Fib H基因时，像蚕Fib H基因、蓑蛾虫Fib H基因这样，在Fib H之前附上其来源生物名。

另外，本说明书中“改变型Fib H基因”是指编码所述改变型Fib H的基因。因此，“改变型蓑蛾虫Fib H基因”是编码蓑蛾虫来源的Fib H中的改变型Fib H的基因。本方式中，该改变型蓑蛾虫Fib H基因成为对象。

本说明书中“改变型蓑蛾虫丝”是指将所述改变型Fib H基因以能在蚕的后部丝腺表达的状态导入蚕中，由其结果而得的基因重组蚕所吐丝的丝。改变型蓑蛾虫丝除了Fib H以外，全部由蚕来源的丝成分构成。即改变型蓑蛾虫丝中的Fib H成为内源性蚕Fib H与改变型蓑蛾虫Fib H混在的杂种Fib H。因此，改变型蓑蛾虫丝是所谓蚕丝与改变型蓑蛾虫丝的杂种丝。杂种丝通过在蚕Fib H中混在改变型蓑蛾虫Fib H，而具有蓑蛾虫丝的物性。

1-3.构成

一般Fib H在其氨基酸序列内包含1个或多个重复单元。本说明书中“重复单元”包含多个甘氨酸残基(G)和丙氨酸残基(A)，是在Fib H的氨基酸序列内1次或多次出现的氨基酸序列。由本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因所编码的改变型蓑蛾虫Fib H也在其氨基酸序列内包含1个或多个重复单元。

改变型蓑蛾虫Fib H作为“重复单元”包含序列号5所示的氨基酸序列，在序列号5所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，或相对于序列号5所示的氨基酸序列有90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。序列号5所示的氨基酸序列是包含大蓑蛾的野生型蓑蛾虫FibH的一部分的氨基酸序列。本说明书中“多个”是指2～10个、2～8个、2～6个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，所述氨基酸的替换优选为保守氨基酸替换。这是因为，如果是保守氨基酸替换，则能够具有与野生型蛋白质实质上同等的结构或性质。保守氨基酸是指被分类于相同氨基酸组的氨基酸彼此的关系。所述氨基酸组已知非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸)、极性氨基酸组(非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸组(酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和碱性氨基酸组(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))、非带电氨基酸组(带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、以及脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。进而，本说明书中“氨基酸同一性”是指将两条多肽的氨基酸序列排列(对齐)，根据需要在任一氨基酸序列中导入间隙，当两者的氨基酸一致度最高时，相对于一条多肽的总氨基酸数另一条多肽相同的氨基酸的比例(％)。该氨基酸同一性的％可以通过使用同源性检索程序BLAST(Basic local alignmentsearch tool；Altschul,S.F.et al，J.Mol.Biol.,215,403-410,1990)检索等公知的程序容易地确定。

作为编码所述重复单元的多核苷酸的具体碱基序列，可列举例如，编码序列号5所示的氨基酸序列的序列号6所示的碱基序列。

本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因所编码的改变型蓑蛾虫Fib H在所述重复单元内包含多个、例如2个以上、优选为3个以上核心序列。本说明书中“核心序列”是指在重复单元内进一步多次重复出现的由十数个氨基酸组成的序列。

作为改变型蓑蛾虫Fib H中的“核心序列”，可列举例如，序列号1所示的由13个氨基酸构成的氨基酸序列(GAGAGAGSGAGAG)。该氨基酸序列是大蓑蛾的野生型蓑蛾虫Fib H中的部分氨基酸序列。前述的由序列号5所示的氨基酸序列组成的重复单元包含3个核心序列。

作为编码所述核心序列的多核苷酸的具体碱基序列，可列举例如，编码序列号1所示的氨基酸序列的序列号2、3、和4所示的碱基序列。

本发明的基因所编码的改变型蓑蛾虫Fib H进一步可以包含序列号7所示的氨基酸序列，在序列号7所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，或与序列号7所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。序列号7所示的氨基酸序列是包含大蓑蛾的野生型蓑蛾虫Fib H的一部分的氨基酸序列。此外，序列号7所示的氨基酸序列中包含1个所述重复单元，但该重复单元也可以根据需要增加至2个以上。作为编码序列号7所示的氨基酸序列的具体碱基序列，可列举例如，序列号8所示的碱基序列。

本发明的基因所编码的改变型蓑蛾虫Fib H也可以是与其他昆虫的Fib H的嵌合Fib H。例如，蓑蛾虫Fib H与蚕Fib H的嵌合Fib H等。作为具体例，可列举由序列号9所示的氨基酸序列组成的大蓑蛾的蓑蛾虫Fib H与蚕Fib H的嵌合Fib H。该嵌合Fib H的1位～153位、466位～524位是蚕Fib H来源的氨基酸序列，156位～463位包含大蓑蛾的蓑蛾虫Fib H来源的氨基酸序列。另外，也可以是由在序列号9所示的氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、或与序列号9所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列组成的Fib H。进而，序列号9所示的氨基酸序列中包含1个所述重复单元，但该重复单元也可以根据需要增加至2个以上。作为编码序列号9所示的氨基酸序列的具体碱基序列，可列举例如，序列号10所示的碱基序列。

此外，本发明的改变型蓑蛾虫Fib H可以根据需要在N末端侧具有外源性的信号肽。“信号肽”是使通过基因表达而生物合成的蛋白质分泌到细胞外时所需的细胞外转移信号。信号肽在翻译之后在分泌到细胞外之前被信号肽酶切断除去。信号肽在N末端侧配置有Lys、Arg这样的具有正电荷的氨基酸，接着它们配置有Ala、Leu、Val、Ile、Val、和Phe这样的疏水性高的氨基酸序列。分泌性蛋白质通常在其N末端侧具有内源性的信号肽。因此，本方式的外源性基因表达载体中在改变型蓑蛾虫Fib H在其N末端侧具有内源性信号肽的情况下，就不需要该外源性信号肽。例如，所述由序列号9所示的氨基酸序列构成的蓑蛾虫Fib H与蚕Fib H的嵌合Fib H中，1位～21位的氨基酸相当于蚕Fib H来源的内源性信号肽，因此不需要外源性信号肽。另一方面，在改变型蓑蛾虫Fib H不具有信号肽的情况下，可以在其N末端配置外源性信号肽。另外，信号肽的C末端侧也可以具有包含促进信号肽的切断和分泌的信号序列后插入序列和/或从融合蛋白质切断信号肽的信号肽酶识别部位的氨基酸序列。对信号肽的氨基酸序列不特别限定。通常可以在3～60个氨基酸的范围内。

对编码信号肽的信号肽DNA不限定，可列举编码包含序列号11所示的氨基酸序列的蚕的丝胶蛋白1信号肽的信号肽DNA(例如，包含序列号12所示的碱基序列的DNA)、编码包含序列号13所示的氨基酸序列的蚕的丝胶蛋白2信号肽的信号肽DNA(例如，包含序列号14所示的碱基序列的DNA)、编码包含序列号15所示的氨基酸序列的蚕的丝胶蛋白3信号肽的信号肽DNA(例如，包含序列号16所示的碱基序列的DNA)。

2.改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体

2-1.概要

本发明的第2方式是改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体。本发明的表达载体以能在蚕的后部丝腺内表达的状态包含第1方式所述的改变型蓑蛾虫Fib H基因。通过将本发明的表达载体导入蚕，能够从基因重组蚕获得改变型蓑蛾虫丝。

2-2.构成

2-2-1.改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的构成要素

本说明书中“表达载体”是指包含编码目的蛋白质的基因、能够控制该基因的表达的表达单元。

本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体以能够在作为宿主的蚕的后部丝腺内表达改变型蓑蛾虫Fib H基因的方式构成。

改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的母核载体可以利用各种载体。可列举例如，质粒或者杆状病毒质粒(Bacmid)这样能自主复制的表达载体、病毒载体、或能在染色体中同源或非同源重组的表达载体或者将它们插入宿主的染色体中而成的染色体的一部分。另外，也可以利用在大肠菌、枯草菌或酵母内都能复制的穿梭载体。

改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体包含后部丝腺表达启动子和改变型蓑蛾虫FibH基因作为必须构成要素。另外，包含标记基因、转座子的末端反向重复序列、5’UTR、3’UTR、终止子、增强子、和绝缘子等作为选择构成要素。进而，在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由后述的第1表达单元和第2表达单元的2个基因表达单元构成的情况下，包含转录调节因子的基因和该转录调节因子的目标启动子作为必须构成要素。以下对于本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中的各构成要素进行具体说明。

(1)后部丝腺表达启动子

“后部丝腺表达启动子”是在将本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体导入作为宿主的蚕时，能够在蚕的后部丝腺控制配置于下游的基因的表达的启动子。

后部丝腺表达启动子只要是在蚕的后部丝腺能够工作的启动子，就可以是任一基因的启动子。所谓“能够工作”是指能够控制在下游配置的基因的表达。后部丝腺表达启动子可列举例如，后部丝腺特异的启动子、能遍在地表达的全身性启动子、构成性活性型启动子或者时期特异的活性型启动子、或表达诱导型启动子等。优选为后部丝腺特异的启动子。其中,优选编码在泌丝昆虫的后部丝腺特异且大量表达的蛋白质的基因的启动子,进一步特别优选从终龄后期到前蛹期在后部丝腺中特异激活的终龄后期后部丝腺特异的活性型启动子。例如，作为丝心蛋白构成蛋白质的Fib H、Fib L、或p25的各基因启动子(本说明书中分别称为“Fib H启动子”、“Fib L启动子”、或“p25启动子”)作为本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中的后部丝腺表达启动子是合适的。

对于后部丝腺表达启动子的来源生物种、即启动子的供体，只要该启动子在作为宿主的蚕的细胞内能够工作就不特别限定。一般地，后部丝腺特异地表达的Fib H、Fib L、或p25的各启动子的碱基序列在泌丝昆虫之间进化上非常高地保守(Sezutsu H.,et al.,2009,Journal of Insect Biotechnology and Sericology,78:1-10)。因此，即使本申请发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中的后部丝腺表达启动子的供体不是蚕，其后部丝腺表达启动子在蚕的后部丝腺也能够工作。

此外，本说明书中“泌丝昆虫”是具有丝腺、能吐丝出丝的昆虫的总称。通常指在幼虫期为了结巢、结茧或移动而吐丝的种。具体是属于鳞翅目、膜翅目、脉翅目、毛翅目的种。优选为属于能够吐丝大量的丝的鳞翅目的种。属于蚕蛾科(Bombycidae)、大蚕蛾科(Saturniidae)、萝纹蛾科(Brahmaeidae)、带蛾科(Eupterotidae)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)、蓑蛾科(Psychidae)、灯蛾科(Archtiidae)、夜蛾科(Noctuidae)等的种作为本说明书的泌丝昆虫优选。属于蚕蛾属(Bombyx)、樗蚕蛾属(Samia)、柞蚕属(Antheraea)、大蚕蛾属(Saturnia)、皇蛾属(Attacus)、透目大蚕蛾属(Rhodinia)的种、具体为蚕、野桑蚕(Bombyx mandarina)、眉纹天蚕蛾(Samia cynthia；包含蓖麻蚕(Samiacynthia ricini)和眉纹天蚕蛾与蓖麻蚕的交配种)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、银杏美蛾(Saturnia japonica)、大目长尾水青蛾(Actias gnoma)等是特别优选的。因此，作为本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中的后部丝腺表达启动子的来源生物，优选为与成为宿主的蚕在分类学上同属于鳞翅目的种、更优选为同属于蚕蛾科的种、进一步优选为野桑蚕这样的属于相同属的种。最优选的来源生物是相同种、即蚕。

作为后部丝腺特异的启动子的具体例，可以利用包含序列号17所示的碱基序列的蚕Fib H启动子、包含序列号18所示的碱基序列的柞蚕Fib H启动子、包含序列号19所示的碱基序列的蚕Fib L启动子、包含序列号20所示的碱基序列的柞蚕Fib L启动子、和包含序列号21所示的碱基序列的蚕p25启动子等。

(2)改变型蓑蛾虫Fib H基因

改变型蓑蛾虫Fib H基因是编码本发明中的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中应表达的目的蛋白质的基因。关于该基因的详细在第1方式记载了，因此这里省略具体的说明。

本申请发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中，改变型蓑蛾虫Fib H基因被配置并连接在所述后部丝腺表达启动子的直接或间接控制下。这里所说的“直接控制下”是指在后部丝腺表达启动子的下游配置改变型蓑蛾虫Fib H基因，通过后部丝腺表达启动子直接控制其表达。另外“间接控制下”是指利用后部丝腺表达启动子的基因表达控制介由其他基因表达活性等而进行。例如，在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由后述的2个表达单元构成的情况下，利用后部丝腺表达启动子的改变型蓑蛾虫Fib H基因的表达控制介由编码转录调节因子的基因的表达和该转录调节因子的目标启动子的活性来进行。

(3)标记基因

“标记基因”是编码也被称为筛选标志物的标记蛋白质的基因。“标记蛋白质”是指能够基于其活性来判别标记基因的表达的有无的多肽。标记基因为了判别保持改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的宿主、即转化体的目的、和/或监测由改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体表达的目的蛋白质的目的而使用。在任一目的的情况下，都可以基于标记蛋白质的活性来判别转化体、监测改变型蓑蛾虫Fib H的表达量。这里“基于活性”是基于活性的检测结果这样的含义。活性的检测可以直接检测标记蛋白质的活性本身，也可以介由色素这样的通过标记蛋白质的活性而产生的代谢物而间接地检测。检测可以是生物学检测(包含抗体、适体(aptamer)等利用肽、核酸的结合的检测)、化学检测(包含酶反应的检测)、物理检测(包含行动分析的检测)、或检测者的感觉检测(包含利用视觉、触觉、嗅觉、听觉、味觉的检测)的任一者。

标记基因所编码的标记蛋白质的种类只要能够通过该领域公知的方法检测其活性，就不特别限定。优选为检测时对转化体的侵袭性低的标记蛋白质。可列举例如，标签肽、荧光蛋白质、色素合成蛋白质、发光蛋白质、外部分泌蛋白质、控制外部形态的蛋白质等。荧光蛋白质、色素合成蛋白质、发光蛋白质、外部分泌蛋白质能够不使转化体的外部形态变化地在特定的条件下视觉地检测，因而对转化体的侵袭性非常低，另外转化体的判别和筛选容易，因此特别适合。

“标签肽”是能够将蛋白质标记化的由十数个氨基酸～数十个氨基酸构成的短肽，作为蛋白质的检测用、纯化用而使用。通常在编码应标记的蛋白质的基因(本说明书中为改变型蓑蛾虫Fib H基因)的5’末端侧或3’末端侧连接编码标签肽的碱基序列，作为与标签肽的融合蛋白质使其表达，从而标记化。标签肽在该领域开发了各种种类，可以使用任一标签肽。作为标签肽的具体例，可列举FLAG、HA、His、和myc等。

“荧光蛋白质”是指在照射特定波长的激发光时发出特定波长的荧光的蛋白质。可以是天然型和非天然型的任一者。另外，对激发波长、荧光波长也不特别限定。具体可列举例如，CFP、RFP、DsRed(包含3xP3-DsRed这样的派生物)、YFP、PE、PerCP、APC、GFP(包含EGFP、3xP3-EGFP等派生物)等。

“色素合成蛋白质”是指参与色素的生物合成的蛋白质，通常为酶。这里所说的“色素”是能够对转化体付与色素的低分子化合物或肽，不限制其种类。优选为作为个体的外部色彩表现的色素。例如，黑色素系色素(包含多巴胺黑色素)、眼色素系色素、或蝶啶系色素。

本说明书中“发光蛋白质”是指不需要激发光就能够发光的底物蛋白质或催化该底物蛋白质的发光的酶。可列举例如，作为底物蛋白质的荧光素或水母素(aequorin)、作为酶的荧光素酶。

本说明书中“外部分泌蛋白质”是被分泌到细胞外或体外的蛋白质，有外分泌性酶等。外分泌性酶有助于杀稻瘟菌素(blasticidin)这样的药剂的分解或钝化，有对宿主付与耐药性的酶、以及消化酶。

标记基因在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中以与改变型蓑蛾虫Fib H基因连接的状态、或与改变型蓑蛾虫Fib H基因独立地，在启动子的下游以能表达的状态配置。

(4)转座子的末端反向重复序列

“转座子的末端反向重复序列(ITRs:inverted terminal repeat sequence)”是当本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体为能够同源重组到基因组DNA中的表达载体的情况下可以包含的选择构成要素。末端反向重复序列通常2个1组使用，作为转座子可以使用piggyBac、mariner、minos等(Shimizu,K.et al.,2000,Insect Mol.Biol.,9,277-281；Wang W.et al.,2000,Insect Mol Biol 9(2):145-55)。

(5)5’UTR和3’UTR

“5’UTR(5’untranslated region，5’非翻译区)和3’UTR(3’untranslatedregion，5’非翻译区)”均是由其自身不编码蛋白质或其片段、或功能性核酸的非翻译区域构成的多核苷酸。对构成各UTR的碱基序列不限定，优选为来源于Fib H基因的5’UTR和3’UTR。在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中，5’UTR配置在所述Fib H基因的起始密码子的上游(5’末端侧)，3’UTR配置在Fib H基因的终止密码子的下游(3’末端侧)。此外，3’UTR可以包含多聚A信号。

(6)终止子

“终止子”是在本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中配置在改变型蓑蛾虫Fib H基因的3’末端侧、优选为终止密码子的下游的碱基序列，由能够终结改变型蓑蛾虫Fib H基因的转录的碱基序列构成。可列举例如，由序列号22所示的碱基序列构成的hsp70终止子、由序列号23所示的碱基序列构成的SV40终止子。

(7)增强子

“增强子”由能够在本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体中进一步增强由部位特异的启动子的控制而进行的改变型蓑蛾虫Fib H基因的表达的碱基序列构成。

(8)绝缘子

“绝缘子”是不受周围的染色体的染色质影响地稳定控制其序列所夹的基因的转录的碱基序列。可列举例如，鸡的cHS4序列、果蝇的gypsy序列等。

(9)转录调节因子的基因

“转录调节因子的基因”是后述的第1表达单元的必须构成要素。本说明书所说的“转录调节因子”是指能够与后述的目标启动子结合，激活该目标启动子的蛋白质因子。可列举例如，作为酵母的半乳糖代谢激活蛋白质的GAL4蛋白质、和四环素控制性反式激活因子的tTA及其变异体等。

(10)转录调节因子的目标启动子

“转录调节因子的目标启动子”是后述的第2表达单元的必须要素，是指通过第1表达单元所编码的转录调节因子结合而能够激活在其控制下的基因表达的启动子。所述转录调节因子和其目标启动子，与所述转录调节因子是对应关系，通常如果转录调节因子确定，则其目标启动子也必然确定。例如，在转录调节因子是GAL4蛋白质的情况下，使用UAS(Upstream Activating Sequence，上游激活序列)。

2-2-2.改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的单元构成

本发明的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体有由1个表达单元构成的情况，和由2个表达单元构成的情况。以下，对于各个情况进行说明。

(1)由1个表达单元构成的情况

在由1个表达单元构成的情况下，改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体需要在1个载体内包含在蚕细胞内表达改变型蓑蛾虫Fib H基因所需的全部构成要素。具体地，包含作为必须构成要素的后部丝腺表达启动子和配置在该启动子的控制下的改变型蓑蛾虫Fib H基因。

改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体可以在1个启动子控制下包含2个以上改变型蓑蛾虫Fib H基因。

在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由1个基因表达单元构成的情况下，仅将改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体导入蚕中，就能够在蚕后部丝腺内表达改变型蓑蛾虫Fib H基因。

(2)由2个表达单元构成的情况

在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由第1表达单元和第2表达单元的2个基因表达单元构成的情况下，改变型蓑蛾虫Fib H基因的表达所需的构成要素被分割成各单元。本构成下，只有第1和第2表达单元在宿主细胞内并存，才能作为1个改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体发挥功能。

如果具体说明该机制，则第1和第2表达单元在宿主细胞内并存时，在相同细胞内通过第1表达单元所含的后部丝腺表达启动子的激活而由第1表达单元表达转录调节因子。该转录调节因子与第2表达单元的目标启动子结合，通过激活而能够表达目的改变型蓑蛾虫Fib H基因。第1和第2表达单元具有以下的构成。

“第1表达单元”包含后部丝腺表达启动子和配置在该启动子控制下的转录调节因子的基因。此时，在1个启动子控制下包含相同的或不同的2个以上的转录调节因子。

第1表达单元可以具有2组以上的由后部丝腺表达启动子和在其控制下的转录调节因子的基因组成的组。该情况下各组可以是相同的组，或不同的组。可列举例如，第1表达单元包含由Fib H启动子和GAL4基因组成的组、和由Fib L启动子和GAL4基因组成的组的情况。

第1表达单元所包含的启动子和转录调节因子可以利用已知的后部丝腺表达启动子、转录调节因子。因此，第1表达单元也可以再利用包含后部丝腺表达启动子和转录调节因子的现有的基因表达载体。

“第2表达单元”包含所述第1表达单元所编码的转录调节因子的目标启动子和配置在目标启动子的控制下的改变型蓑蛾虫Fib H基因。第2表达单元所含的目标启动子是通过第1表达单元所编码的转录调节因子激活的启动子。即，根据第1表达单元所编码的转录调节因子，第2表达单元所含的目标启动子原则上唯一确定。例如，如果目标启动子第1表达单元所含的转录调节因子的基因是GAL4基因，则第2表达单元的GAL4目标启动子是UAS。

第2表达单元也可以在1个目标启动子控制下包含2个以上相同的或序列不同的改变型蓑蛾虫Fib H基因。

另外，第2表达单元也可以具有2组以上由目标启动子和在其控制下的改变型蓑蛾虫Fib H基因组成的组。该情况下，各组可以是相同的组或不同的组。

进而第2表达单元可以由包含改变型蓑蛾虫Fib H基因的相同的或不同的2个以上单元构成。该情况下，由1个第1表达单元表达的转录调节因子可以通过激活多个第2表达单元的目标启动子，分别表达各个第2表达单元所含的改变型蓑蛾虫Fib H基因。

本构成的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体可以介由第1表达单元所编码的转录调节因子来使第2表达单元的改变型蓑蛾虫Fib H基因的表达扩增。因此，在使改变型蓑蛾虫Fib H基因在宿主细胞内过表达上是合适的。

3.基因重组蚕

3-1.概要

本发明的第3方式是基因重组蚕。本方式的基因重组蚕是包含所述第2方式的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的转化体。由本发明的基因重组蚕所吐丝的丝是以蚕丝为基础并包含改变型蓑蛾虫Fib H的改变型蓑蛾虫丝。因此，通过使本发明的基因重组蚕结茧，能够量产改变型蓑蛾虫丝。

3-2.构成

本发明的基因重组蚕在细胞内包含所述第2方式所述的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体。关于改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的构成在第2方式详述了，因而省略其说明，这里对于本方式的基因重组蚕所特有的构成进行说明。

基因重组蚕中，第2方式所述的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体可以在蚕细胞内暂时性存在，另外也可以以导入染色体中的状态等稳定且持续地存在。通常优选稳定且持续地存在。

基因重组蚕可以具有第2方式所述的不同的2种以上改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体。可列举例如，包含前述的由1个基因表达单元构成的表达载体、和由2个基因表达单元构成的表达载体的第1和第2单元的情况。该情况下，各个改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体可以包含相同的或不同的碱基序列的改变型蓑蛾虫Fib H基因。

改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由第1表达单元和第2表达单元的2个表达单元构成、各个表达单元存在于蚕的染色体上的情况下，各表达单元可以存在于相同染色体上，也可以存在于不同的染色体上。在各表达单元存在于不同的染色体上的情况下，通过使仅具有第1表达单元(优选为纯合子)的基因重组蚕的系统与仅具有第2表达单元(优选为纯合子)的基因重组蚕的系统交配，能够在F1容易地获得具有第1表达单元和第2表达单元的本发明的基因重组蚕。该情况下，仅具有所述第1表达单元的基因重组蚕的系统通用性高，因而可以再利用仅具有第1表达单元的现有的基因重组蚕的系统。

另一方面，在第1表达单元和第2表达单元存在于相同染色体上的情况下，为了在传代过程中不通过重组而各自分离，优选各表达单元之间的距离近、彼此连锁。

3-3.制成方法

本方式的基因重组蚕的制成方法可以采用公知的任何方法，不特别限定。作为制成重组蚕的方法，可列举例如，将所述第2方式的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体直接导入作为宿主的蚕中的方法，将分别在不同的染色体上具有第2方式所述的改变型蓑蛾虫FibH基因表达载体的第1表达单元和第2表达单元的雌雄基因重组蚕交配的方法。

(1)直接导入方法

本方法是主要在第2方式的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由1个表达单元构成的情况下采用的基因重组蚕的制成方法。该方法中，可以将改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体导入宿主的蚕内，通过选择包含表达载体的基因重组蚕，能够实现目的。本制成方法包含导入工序和选择工序作为必须工序。

(导入工序)

“导入工序”是将第2方式所述的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体导入作为宿主的蚕中的工序。将表达载体导入蚕的方法可以通过该领域公知的方法进行。例如，导入蚕卵的情况下，可以利用Tamura等的方法(Tamura T.et al.,2000,Nature Biotechnology,18,81-84)。具体地，将改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体用水、缓冲液等溶剂稀释使得改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体为适当浓度，制备施与溶液。这里，在改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体具有转座子的末端反向重复序列的情况下，可以在施与溶液中加入包含编码转座子转移酶的DNA的辅助载体对蚕的发生初期卵进行共注入。对此时使用的宿主蚕不特别限定。可以是野生型或者变异型蚕，也可以是基因重组蚕。另外在宿主蚕已经包含辅助载体的情况下，可以不加入辅助载体，将仅包含改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的施与溶液注入蚕的发生初期卵。

(选择工序)

选择工序是从导入工序后的蚕选择包含改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体的基因重组蚕的工序。选择方法只要是该领域公知的方法就不限定。通常基于通过改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体(在导入了辅助载体的情况下辅助载体也同样)所含的标记基因的表达而产生的筛选标志物的有无来选择转化体，从而可以得到目的的基因重组蚕。

此外，通过使用辅助载体的方法得到的基因重组蚕中，导入的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体介由转座子的末端反向重复序列而插入染色体中。因此，根据需要，其后也可以将所得的基因重组蚕经过同胞交配或同系交配的工序而获得插入染色体中的表达载体的纯合子。

(2)交配选择方法

本方法是主要在第2方式的改变型蓑蛾虫Fib H基因表达载体由2个表达单元构成的情况下采用的基因重组蚕的制成方法。该方法中，将分别在不同的染色体上具有第1表达单元和第2表达单元的雌雄基因重组蚕交配，在F1或F2选择具有2个表达单元的基因重组，从而可以实现目的。本制成方法包含交配工序和选择工序作为必须工序。

(交配工序)

“交配工序”是使具有第1表达单元的基因重组蚕(第1基因重组蚕)与具有第2表达单元的基因重组蚕(第2基因重组蚕)交配的工序。交配使二种蚕系统基于常规方法交配即可。

(选择工序)

“选择工序”是选择具有所述第1和第2表达单元的基因重组蚕系统的工序。本工序中，从交配工序后而得的F1个体或由F1彼此的交配而得的F2个体，基于第1和第2表达单元各自所编码的筛选标志物的活性选择具有两基因表达单元的个体，从而实现。此外，第1和第2基因重组蚕的制成可以通过使用所述直接导入方法，在蚕中分别导入第1表达单元或第2表达单元，从而制成。

4.改变型蓑蛾虫丝的生产方法

4-1.概要

本发明的第4方式是改变型蓑蛾虫丝的生产方法。本发明的生产方法中使用蛋白质的大量生产系统的基因重组蚕。本方式中使用的基因重组蚕是第3方式的基因重组蚕。使该蚕结茧，从茧获得改变型蓑蛾虫丝。根据本发明的生产方法，可以使用蚕丝的生产设备等，量产具有蓑蛾虫丝的物性的蓑蛾虫丝与蚕丝的杂种丝、即改变型蓑蛾虫丝。

4-2.方法

本发明的改变型蓑蛾虫丝的生产方法包含饲养工序作为选择工序，另外包含结茧工序、收茧工序、缫丝工序作为必须工序。

(1)饲养工序

“饲养工序”是饲养第3方式的基因重组蚕的工序。关于基因重组蚕的饲养方法，可以按照该领域公知的蚕的饲养技术饲养。例如，可以参照“蚕种总论；高见丈夫著、全国蚕种协会刊”。饲料可以使用桑属(Morus)的叶这样的食草树种的天然叶，也可以使用シルクメイトL4M或者原蚕种1-3龄用(日本农产工业)这样的人工饲料。从可以抑制病害发生、进行稳定的质和量的饲养、另外根据需要能够无菌饲养的方面考虑，优选人工饲料。以下，对于基因重组蚕的简单饲养方法举一例进行说明。

掃立て用适当只数(例如，4～10只)的雌性的同系的基因重组蚕产卵而得的卵进行。孵化后的幼虫从卵纸板移到铺有作为蚕箪的防干纸(石蜡加工纸)的容器内，将シルクメイト等人工饲料放在防干纸上进行饲养。饵食的交换原则上1～2龄各进行1次、3龄进行1～3次。在旧的饵食吃剩的多的情况下，为了防止腐败而除去。4～5龄的壮蚕幼虫时的饲养移入大型容器中，适宜调整每个容器的只数。根据湿度、容器内的状态，也可以在容器中加上防干纸、丙烯酸系物质、或网制的盖。饲养温度在全龄中在25～28℃饲养。

(2)结茧工序

“结茧工序”是使第3方式的基因重组蚕结茧的工序。“结茧”是指终龄(5龄)蚕为了蛹化而形成茧。

本工序基本可以进行对于蚕公知的结茧方法。例如，回收终龄第6～8天熟蚕，通过上蔟而可以完成本工序。“上蔟”是将蚕移至蔟上。结茧可以在25～28℃下进行。然后，第3方式的基因重组蚕在蔟中形成茧。

(3)收茧工序

“收茧工序”是在结茧工序后从蔟上收集茧而回收的工序。本工序也包含除去附着在茧周围的搭脚丝。收茧可以在上蔟后第6～8天进行。收茧也可以手工作业，但如果使用收茧专用装置则方便。可以利用仅除去搭脚丝的搭脚丝除去机、以及进行从蔟的茧收集以及直到搭脚丝的除去的全自动收茧搭脚丝除去机。

(4)缫丝工序

“缫丝工序”是从收茧工序中所回收的茧缫丝改变型蓑蛾虫丝的工序。“缫丝”是指从茧制作生丝。进行使回收的茧淹没在80～85℃的热水中使茧变得容易解开的“煮茧”之后，进行使用索绪帚剥取茧的表层部的“索绪”。然后，进行从茧取出丝口的“抄绪”，进行操丝。这些工序也可以手工作业，但优选使用作为缫丝专用装置的自动缫丝机。通过以上的工序，可以生产改变型蓑蛾虫丝制成生丝。

实施例

＜实施例1：蓑蛾虫Fib H基因的克隆＞

(目的)

克隆未知的蓑蛾虫Fib H基因。

(方法)

将在千叶县我孙子市(日本)野外采集的大蓑蛾的幼虫解剖，摘出丝腺。在RNA提取试剂ISOGEN(ニッポンジーン社)中将摘出的丝腺磨碎，使用SV Total RNA Isolationsystem(プロメガ社)进行总RNA的提取。以提取的总RNA为模板，使用TruSeq RNA SamplePreparation Kit v2(イルミナ社)制作cDNA文库。使用新一代测序仪Hiseq2500进行RNAseq分析。使用所得的101bp×2的双端序列阅读数据库，进行使用blast检索和trinity的全新装配(de novo assemble)分析。

(结果)

通过全新装配分析成功地坚定了编码大蓑蛾Fib H的N末端区域的序列号24所示的约750bp的碱基序列、编码中央区域的重复序列的序列号25所示的约1020bp的碱基序列、和编码C末端区域的序列号26所示的约300bp的碱基序列。

＜实施例2：改变型蓑蛾虫FibH表达载体的构建＞

(目的)

基于实施例1所得的大蓑蛾的蓑蛾虫Fib H基因的部分序列信息和蚕Fib H基因信息构建全长嵌合Fib H基因的表达载体。

(方法和结果)

实施例1所得的碱基序列信息是大蓑蛾来源的蓑蛾虫Fib H基因中的一部分区域(N末端区域、中央区域、C末端区域)。推定大蓑蛾Fib H基因的转录产物全长为约10kbp。于是，为了将蓑蛾虫Fib H基因制成能作为基因重组构建体利用的形态，基于实施例1中得到的大蓑蛾的Fib H基因片段的碱基序列信息和蚕Fib H基因信息，通过以下操作构建由蓑蛾虫和蚕的嵌合Fib H基因构成的改变型蓑蛾虫Fib H基因。

此外，在构建本实施例的改变型蓑蛾虫Fib H基因时，不利用实施例1中得到的N末端区域、和C末端区域的碱基序列信息。这是因为，考虑为了使该改变型蓑蛾虫Fib H基因在蚕的后部丝腺内适当表达，作为改变型蓑蛾虫丝正常分泌，优选N末端区域和C末端区域利用蚕的Fib H基因。另外因为，考虑一般各种丝特有的物性具有由重复序列构成的区域，因而为了对蚕丝付与蓑蛾虫丝的物性，仅利用编码重复序列的中央区域就足够了。

使用设计成分别扩增该基因的N末端区域和重复序列部分以及重复部分和C末端区域的基因区域的2组引物对、即序列号27和28所示的5’侧引物对(分别为EvHFB-F21&-R26)和序列号29和30所示的3’侧引物对(分别为EvHFB-F26&-R12)，分别实施PCR。接着，将包含各个PCR后的扩增产物(Ev01HFB-F21/R26和Ev01HFB-F26/R12)的反应液以1/50量稀释1000倍，以所得的溶液作为模板，利用序列号31所示的N末端引物(EvHFB-F12)和序列号30所示的C末端引物(EvHFB-R12)进行PCR，回收扩增片(Ev01HFB-F12/R12)。接着，仅将该扩增片的重复部分使用序列号32所示的正向引物(EvHFB-F31)和序列号33所示的反向引物(EvHFB-R31)进行PCR扩增，得到扩增片(Ev01HFB-F31/R31)。将其克隆到T载体pCR4TOPO(Thermo Fisher Scientific社)后，用BglII和SalI切下。另一方面，将蚕的绿色荧光FibH构建体“pHChis6-EGFP”(Kuwana Y.,et al.,2014,PLoS ONE 9(8):e105325)用BamHI和SalI切割，使得载体骨架和蚕FibH的N末端和C末端序列残留。在两者的连接反应液进行转化，构建改变型蓑蛾虫FibH“pHC.BmEv01HFB-F31/R31s”。将从中选择的“pHC.BmEv01HFB-F31/R31.03”克隆的AscI和FseI切片段、与背驮式载体“pBac3xP3eGFP”的AscI和FseI切片段在连接反应液进行转化，以能够在蚕丝腺中表达的方式进行杂种基因化，构建改变型蓑蛾虫FibH基因表达载体(pBac3xP3eGFP-BmEv01HFB-F31/R31)。

＜实施例3：基因重组蚕的制成＞

(目的)

制成导入了实施例2中构建的表达载体的基因重组蚕。

(方法和结果)

将实施例2中构建的改变型蓑蛾虫FibH基因表达载体(pBac3xP3eGFP-BmEv01HFB-F31/R31)按照常规方法(Tamura T.et al.,2000,Nat Biotechnol,18:81-84)注射到蚕w1pnd系统的卵288个中，通过生成的成虫的sib交配(G0交配)获得38个蛾区。从其中的8个蛾区筛选出92个体的基因重组体(G1卵)。从G1卵孵化56个体，获得34个体的改变型蓑蛾虫Fib H基因重组蚕的成虫。

用同样的方法再次进行改变型蓑蛾虫Fib H基因重组蚕的制成。将pBac3xP3eGFP-BmEv01HFB-F31/R31按照上述常规方法注射到蚕w1pnd系统的卵384个中。对孵化的120个体进行饲养后，用得到的G0成虫进行sib交配，在38个蛾区得到G1卵。孵卵后，基于胚的眼的GFP标志物进行筛选，结果在8个蛾区得到GFP阳性个体。GFP阳性个体是能够表达目的的改变型蓑蛾虫Fib H基因的基因重组蚕。将各蛾区按照阳性个体数多的顺序依次作为Y91.01～Y91.08。使用其中上位3个蛾区(Y91.01～Y91.03)的基因重组蚕进行以下实验。此外，该阶段得到的GFP阴性个体作为不保持改变型蓑蛾虫FibH基因表达载体的对照用个体(Y90.Cont.)使用。将上述3蛾区的G1个体和对照用G1个体分别sib交配，得到G2卵后，饲养其G2个体，再次进行sib交配，得到G3卵。将由该G3世代的幼虫得到的茧使用茧检定用自动缫丝机(日产自动车，CT-2型)以目的纤度27d、缫丝速度200m/min进行缫丝。对于得到的丝，目标设定温湿度20℃、65％中放置2小时以上之后，以试样长100mm、拉伸速度150mm/min测定其物性(断裂强度、断裂伸长率、和杨氏模量)。断裂强度是指直到就要断裂之前的应力。一般数值越大，意味着对象材料越能耐受更强的应力。断裂伸长率是指到达断裂的伸长率。一般数值越大，意味着对象材料越良好地伸长。并且，杨氏模量是在胡克定律成立的弹性范围中的、同轴方向的变形与应力的比例常数。一般数值越大，意味着对象材料刚性越高。

结果示于表1。

表1

基因重组蚕丝是由改变型蓑蛾虫Fib H基因重组蚕所吐丝的丝，相当于改变型蓑蛾虫丝与w1pnd系统来源的蚕丝的混合丝。另外对照用丝相当于w1pnd系统来源的蚕丝。

根据表1，基因重组蚕丝与对照用丝相比，任一系统来源的均伸长率和杨氏模量显著增加。这显示通过改变型蓑蛾虫丝，对蚕丝付与了伸长性和刚性。

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