JP5691052B2 - 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 - Google Patents
組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5691052B2 JP5691052B2 JP2010203558A JP2010203558A JP5691052B2 JP 5691052 B2 JP5691052 B2 JP 5691052B2 JP 2010203558 A JP2010203558 A JP 2010203558A JP 2010203558 A JP2010203558 A JP 2010203558A JP 5691052 B2 JP5691052 B2 JP 5691052B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silkworm
- nucleic acid
- protein
- recombinant
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 40
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 39
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 18
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 10
- 108010064995 silkworm fibroin Proteins 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 102000004528 Mannose-Binding Protein-Associated Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010042484 Mannose-Binding Protein-Associated Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 3
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 108010000241 Arthropod Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256019 Antheraea yamamai Species 0.000 description 1
- 241000356504 Argiope Species 0.000 description 1
- 241000255783 Bombycidae Species 0.000 description 1
- 241000255794 Bombyx mandarina Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 108010028210 spidroin 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
- A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
- A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/70—Invertebrates
- A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質に関する。
優れた強度を有する天然繊維として、クモの糸が注目されている。しかし、クモは、共食いをするため集団飼育には適さず、１匹のクモから得られる糸の量はわずかである。しかも、クモは目的に応じて多種類の糸を使い分けるため、クモ糸の大量生産は困難である。
そこで、遺伝子組み換え技術を用いて、クモ以外の生物に、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クモ糸を作らせる試みがなされている。例えば、遺伝子組換えヤギにクモ糸タンパク質を作らせ、ヤギの乳中からクモ糸タンパク質を得る方法が開示されている（特許文献１）。しかし、上記方法による場合、クモ糸タンパク質を抽出、精製し、人工的に紡糸する必要があり、手間やコスト、溶媒による環境への負荷等の点で問題がある。
上記問題を解決するため、カイコに、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クモ糸タンパク質を作らせる試みがなされている（特許文献２）。組換えカイコによれば、クモ糸タンパク質が絹糸として吐糸されるため、上記抽出、精製、紡糸等の処理が不要となる。
しかしながら、従来の組換えカイコにより作られる絹糸の物性は、本来のクモ糸の物性には遠く及ばず、強度が不十分なものであった。
そこで、本発明は、優れた物性を有するタンパク質を作る組換え生物、及びその組換え生物により作られる物性の優れたタンパク質を提供することを目的とする。また、十分に優れた強度を有する絹糸を作る組換えカイコ、及びその組換えカイコにより作られる、十分に優れた強度を有する絹糸を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、被組換え生物にナガコガネグモの遺伝子を導入した場合に、得られるタンパク質の物性が優れることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換え生物、及び、上記組換え生物により作られるタンパク質に関する。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
上記特定の核酸を導入することにより、組換え生物が作るタンパク質は、クモタンパク質を多く含むものとなり、その結果、強度などの物性が優れたものとなる。
特に、本発明は、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換えカイコ、及び、上記組換えカイコにより作られる絹糸に関する。上記特定の核酸をカイコに導入することにより、組換えカイコが作る絹糸は、クモタンパク質を多く含むものとなり、その結果、十分な強度を有するものとなる。
本発明によれば、優れた物性を有するタンパク質を作る組換え生物、及びその組換え生物により作られる物性の優れたタンパク質を提供することが可能となる。また、十分に優れた強度を有する絹糸を作る組換えカイコ、及びその組換えカイコにより作られる、十分に優れた強度を有する絹糸を提供することが可能となる。
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換え生物、及び、上記組換え生物により作られるタンパク質に関する。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
特に、本発明は、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換えカイコ、及び、上記組換えカイコにより作られる絹糸に関する。
配列番号１の塩基配列を有する核酸は、コガネグモ属ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）において、牽引糸（又は縦糸）タンパク質の主成分であるＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）タンパク質をコードする核酸であるが、配列番号１の塩基配列を有するものであれば、人工合成により得たものでもよく、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから得たものでもよく、これらのものをＰＣＲで増幅したものや制限酵素で切り出したものでもよい。
配列番号２のアミノ酸配列は、ナガコガネグモのＭａＳｐ１タンパク質が有するアミノ酸配列である。
カイコに導入する核酸は、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸（ｉｉｉ）であってもよい。上記配列同一性は９０％以上であればよいが、９５％以上であることが好ましく、９８％以上であることがより好ましい。
また、カイコに導入する核酸は、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｉｖ）であってもよい。ここで、核酸の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。また、「ハイブリダイズ」とは、上記相補鎖間で起こる相補的結合、又は一本鎖核酸分子間の塩基対相互作用の形成を意味する。
上記「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「組換え生物」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子が染色体に導入され、形質転換された生物を示す。形質転換される対象となる被組換え生物としては、特に制限はなく、昆虫、動物、植物、微生物等を用いることができるが、昆虫を用いることが好ましい。好適な昆虫としては、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（てんさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（さくさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）等が挙げられる。なかでも、カイコガ科に属するカイコ、クワコ等が好適に用いられ、特に、カイコを用いることが好ましい。
本明細書において、「カイコ」とは、カイコガ属カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）をいう。カイコは、実験用の品種であっても、実用商品化された実用品種であってもよい。また、「組換えカイコ」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子がカイコ染色体に導入され、形質転換されたカイコを示す。本実施形態において、遺伝子組み換えはトランスポゾンを用いる方法により行うが、外来遺伝子をカイコに導入できる方法であれば制限はなく、エレクトロポレーション等の他の方法によって遺伝子組み換えを行ってもよい。
本明細書において、「絹糸」とは、カイコ、クワコ、天蚕、柞蚕等により吐糸される繊維であり、繭を構成し、フィブロインタンパク質を主成分とするものである。フィブロインタンパク質は、大小２つのサブユニット（Ｈ鎖及びＬ鎖）からなる。
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（クモ遺伝子）
配列番号１の塩基配列を有する核酸を含むベクターを利用し、上記核酸の両端にマッチするプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりクモ遺伝子を取得した。プライマーには、次の遺伝子操作をするために、あらかじめ適当な制限酵素サイトを設けた。具体的には、フォワードプライマーとしてＭａＳｐ１ＦＷ（５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣ−３’）（配列番号３）を用い、リバースプライマーとしてＭａＳｐ１ＲＶ（５’−ＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’）（配列番号４）を用いた。
配列番号１の塩基配列を有する核酸を含むベクターを利用し、上記核酸の両端にマッチするプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりクモ遺伝子を取得した。プライマーには、次の遺伝子操作をするために、あらかじめ適当な制限酵素サイトを設けた。具体的には、フォワードプライマーとしてＭａＳｐ１ＦＷ（５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣ−３’）（配列番号３）を用い、リバースプライマーとしてＭａＳｐ１ＲＶ（５’−ＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’）（配列番号４）を用いた。
（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むＰｆｉｂＨ５’（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号５）を用い、リバースプライマーとしてＳｐｅＩサイトを含むＰｆｉｂＨ３’（５’−ＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴ−３’）（配列番号６）を用いた。
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むＰｆｉｂＨ５’（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号５）を用い、リバースプライマーとしてＳｐｅＩサイトを含むＰｆｉｂＨ３’（５’−ＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴ−３’）（配列番号６）を用いた。
（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして、ＮｈｅＩサイトを含むＬＢＳ−ＦＷ（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧ−３’）（配列番号７）を用い、リバースプライマーとして、ＢａｍＨＩサイトを含むＬＢＳ−ＲＶ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’）（配列番号８）を用いた。
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして、ＮｈｅＩサイトを含むＬＢＳ−ＦＷ（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧ−３’）（配列番号７）を用い、リバースプライマーとして、ＢａｍＨＩサイトを含むＬＢＳ−ＲＶ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’）（配列番号８）を用いた。
（遺伝子組換用ベクタープラスミドの作製）
上記カイコフィブロインＨ鎖プロモーター配列（ＦＰ）、クモ遺伝子配列（ＭＡＳＰ）及びカイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列（ＦＣ）を順に連結し、クモ遺伝子発現カセットとした。このクモ遺伝子発現カセットを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むベクタープラスミドに導入し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドとした。図１は、遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。図１中の記号は以下のものを意味する。
上記カイコフィブロインＨ鎖プロモーター配列（ＦＰ）、クモ遺伝子配列（ＭＡＳＰ）及びカイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列（ＦＣ）を順に連結し、クモ遺伝子発現カセットとした。このクモ遺伝子発現カセットを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むベクタープラスミドに導入し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドとした。図１は、遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。図１中の記号は以下のものを意味する。
ＦＰ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列
ＭＡＳＰ：クモ遺伝子配列
ＦＣ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列
ＭＫ：マーカー遺伝子配列
Ｌ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＬハンド
Ｒ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＲハンド
ＭＡＳＰ：クモ遺伝子配列
ＦＣ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列
ＭＫ：マーカー遺伝子配列
Ｌ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＬハンド
Ｒ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＲハンド
（組み換えカイコの作製）
上記遺伝子組換用ベクタープラスミドを、大腸菌で増殖させ、「ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ」（（株）キアゲン社製）を用い、キットに添付したマニュアルに従って精製した。トランスポゼースタンパク質遺伝子を含むヘルパープラスミドも上記の方法で精製した。精製した上記のプラスミドＤＮＡをＴＥバッファーで溶解し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドＤＮＡとヘルパープラスミドＤＮＡを１対１の比で混和し、エタノール沈殿を行った。最後に、この混和ＤＮＡを４００ｎｇ／ｕｌの濃度になるように、５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ７のリン酸バッファーで調製した。これを産後３〜６時間のカイコ卵に顕微鏡の下で注射した。
上記遺伝子組換用ベクタープラスミドを、大腸菌で増殖させ、「ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ」（（株）キアゲン社製）を用い、キットに添付したマニュアルに従って精製した。トランスポゼースタンパク質遺伝子を含むヘルパープラスミドも上記の方法で精製した。精製した上記のプラスミドＤＮＡをＴＥバッファーで溶解し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドＤＮＡとヘルパープラスミドＤＮＡを１対１の比で混和し、エタノール沈殿を行った。最後に、この混和ＤＮＡを４００ｎｇ／ｕｌの濃度になるように、５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ７のリン酸バッファーで調製した。これを産後３〜６時間のカイコ卵に顕微鏡の下で注射した。
注射した卵をＧ０世代とし、Ｇ０世代が成長したガはＧ０ガと呼び、Ｇ０ガを親として産まれる卵はＧ１卵とする。Ｇ０ガを未注射のガと交尾させ、Ｇ１卵を採取し、催青期のＧ１卵について、蛍光顕微鏡の下で蛍光の発する個体（ポジティブ卵）をスクリーニングした。１匹の親ガ（Ｇ０ガ）が産む卵集団を１集団とし、１粒以上のポジティブ卵が検出された集団の数を、「ポジティブＧ１数」として計上した。結果を表１に示す。
（インバースＰＣＲによるクモ遺伝子の挿入及びその位置の確認）
カイコのゲノムＤＮＡは、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）で抽出した。ゲノムＤＮＡは制限酵素ＨａｅＩＩＩにより切断した後、セルフライゲーションされた。これをテンプレートとし、ｐｉｇｇｙＢａｃの左右ハンドにそれぞれマッチする２ぺアのプライマーを用い、挿入位置のカイコゲノム配列を含む断片を送付し、配列を同定した。具体的には、レフトハンドフォワードプライマーとしてＢａｃＬＦ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号９）を用い、レフトハンドリバースプライマーとしてＢａｃＬＲ（５’−ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号１０）を用い、ライトハンドフォワードプライマーとして（５’−ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列番号１１）を用い、ライトハンドリバースプライマーとして（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号１２）を用いた。図２は、クモ遺伝子発現カセットが挿入された位置の右側のカイコゲノム配列（配列番号１３）を示す。
カイコのゲノムＤＮＡは、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）で抽出した。ゲノムＤＮＡは制限酵素ＨａｅＩＩＩにより切断した後、セルフライゲーションされた。これをテンプレートとし、ｐｉｇｇｙＢａｃの左右ハンドにそれぞれマッチする２ぺアのプライマーを用い、挿入位置のカイコゲノム配列を含む断片を送付し、配列を同定した。具体的には、レフトハンドフォワードプライマーとしてＢａｃＬＦ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号９）を用い、レフトハンドリバースプライマーとしてＢａｃＬＲ（５’−ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号１０）を用い、ライトハンドフォワードプライマーとして（５’−ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列番号１１）を用い、ライトハンドリバースプライマーとして（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号１２）を用いた。図２は、クモ遺伝子発現カセットが挿入された位置の右側のカイコゲノム配列（配列番号１３）を示す。
（絹糸のタンパク質分析）
遺伝子組み換えカイコが作製した繭を切取り、１ｍｇの繭片に対して５０μｌの６０％ＬｉＳＣＮを加えて振動させ、室温下で２時間静置し、タンパク質を可溶化した。その後、１５０００ｒｐｍで遠心して不溶部分を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上層の溶液中のクモ糸タンパク質とカイコのフィブロインとを分離した。図３は、遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。図３中、ＦＨはカイコフィブロインＨ鎖を意味し、ＭＡＳＰはクモ糸タンパク質を意味する。また、図３のレーン１にはＨＭＷ分子量マーカーを流し、レーン２には組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質を含む上記上層の溶液を流し、レーン３にはレーン２の５倍のタンパク質を含む溶液を流した。分離結果から、絹糸タンパク質中のクモ糸タンパク質の含有率を計算したところ、２２．５％と、従来の組換えカイコにおける上記含有率よりも顕著に高い数値を示した。
遺伝子組み換えカイコが作製した繭を切取り、１ｍｇの繭片に対して５０μｌの６０％ＬｉＳＣＮを加えて振動させ、室温下で２時間静置し、タンパク質を可溶化した。その後、１５０００ｒｐｍで遠心して不溶部分を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上層の溶液中のクモ糸タンパク質とカイコのフィブロインとを分離した。図３は、遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。図３中、ＦＨはカイコフィブロインＨ鎖を意味し、ＭＡＳＰはクモ糸タンパク質を意味する。また、図３のレーン１にはＨＭＷ分子量マーカーを流し、レーン２には組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質を含む上記上層の溶液を流し、レーン３にはレーン２の５倍のタンパク質を含む溶液を流した。分離結果から、絹糸タンパク質中のクモ糸タンパク質の含有率を計算したところ、２２．５％と、従来の組換えカイコにおける上記含有率よりも顕著に高い数値を示した。
（絹糸の走査電子顕微鏡観察による繊度推算）
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）Ｓ−２３８０Ｎ（日立製作所製）を用い、１０ｋＶ電圧で観察及び撮影を行った。これをもとに、糸の直径と断面積を推算し、その断面積をもとに糸の強度を計算した。コントロールとして、遺伝子組み換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）の繭についても同様の処理を行った。図４は、組換えカイコ（Ａ）と非組換えカイコ（Ｂ）の絹糸の走査電子顕微鏡写真である。
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）Ｓ−２３８０Ｎ（日立製作所製）を用い、１０ｋＶ電圧で観察及び撮影を行った。これをもとに、糸の直径と断面積を推算し、その断面積をもとに糸の強度を計算した。コントロールとして、遺伝子組み換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）の繭についても同様の処理を行った。図４は、組換えカイコ（Ａ）と非組換えカイコ（Ｂ）の絹糸の走査電子顕微鏡写真である。
（絹糸の物性解析）
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、「ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ ＡＧＳ−Ｊ」（島津製作所製）を用いて、２０℃、６５％ＲＨの標準条件下で引っ張り試験を行った。コントロールとして、遺伝子組換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）が作製した絹糸についても、同様に引っ張り試験を行った。その結果、コントロール（非組換えカイコ）の絹糸の強度が３９７．０ＭＰａ（３．４９ｇ／ｄ）であったのに対して、組換えカイコが作製した絹糸の強度は４８９．２ＭＰａ（４．２７ｇ／ｄ）と、２２．３５％も増強していた。
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、「ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ ＡＧＳ−Ｊ」（島津製作所製）を用いて、２０℃、６５％ＲＨの標準条件下で引っ張り試験を行った。コントロールとして、遺伝子組換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）が作製した絹糸についても、同様に引っ張り試験を行った。その結果、コントロール（非組換えカイコ）の絹糸の強度が３９７．０ＭＰａ（３．４９ｇ／ｄ）であったのに対して、組換えカイコが作製した絹糸の強度は４８９．２ＭＰａ（４．２７ｇ／ｄ）と、２２．３５％も増強していた。
一方、特許文献２に記載のオニグモ等の遺伝子を用いた従来の組換えカイコにおいては、コントロールの絹糸の強度３．７８ｇ／ｄに対して、組換えカイコの絹糸の強度は３．９３ｇ／ｄと、３．９６％しか増強していない（特許文献２の第２９頁表３参照）。
以上のことから、本発明の特定の核酸を用いた場合には、従来のオニグモ等の遺伝子を用いた場合よりも、組換えカイコが作製する絹糸の強度が高まることが明らかとなった。表２に、本発明の絹糸と特許文献２の絹糸との物性比較を示す。
本発明の組換え生物により作られるタンパク質は、優れた物性を有する天然素材として有用である。特に、本発明の組換えカイコにより作られる絹糸は、十分に優れた強度を有する天然素材であるため、手術縫合糸などの医療用品をはじめ、航空機材、衣料品、化粧品など、さまざまな用途に好適に用いられる。
Claims (3)
- 以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された非ヒト組換え生物。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）前記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸 - 組換えカイコである、請求項１に記載の組換え生物。
- 請求項２に記載の組換えカイコにより作られる絹糸。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010203558A JP5691052B2 (ja) | 2010-09-10 | 2010-09-10 | 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 |
| EP11179742A EP2428115A1 (en) | 2010-09-10 | 2011-09-01 | Genetically modified silkworm for producing recombinant spider dragline protein |
| US13/226,964 US8222479B2 (en) | 2010-09-10 | 2011-09-07 | Recombinant organism and protein produced by the recombinant organism |
| CN2011102681920A CN102428897A (zh) | 2010-09-10 | 2011-09-09 | 重组生物及由重组生物制作的蛋白质 |
| US13/524,120 US8394942B2 (en) | 2010-09-10 | 2012-06-15 | Nucleic acid encoding a silk protein and a method of producing a silk thread using same |
| US13/764,124 US8519101B2 (en) | 2010-09-10 | 2013-02-11 | Nucleic acid encoding a silk protein and a method of producing a silk thread using same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010203558A JP5691052B2 (ja) | 2010-09-10 | 2010-09-10 | 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012055270A JP2012055270A (ja) | 2012-03-22 |
| JP5691052B2 true JP5691052B2 (ja) | 2015-04-01 |
Family
ID=44653188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010203558A Expired - Fee Related JP5691052B2 (ja) | 2010-09-10 | 2010-09-10 | 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8222479B2 (ja) |
| EP (1) | EP2428115A1 (ja) |
| JP (1) | JP5691052B2 (ja) |
| CN (1) | CN102428897A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014198715A (ja) * | 2013-03-15 | 2014-10-23 | 岡本株式会社 | タンパク質繊維 |
| CN105400815B (zh) * | 2015-10-23 | 2019-01-25 | 杭州超丝生物科技有限公司 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法 |
| CN105400817B (zh) * | 2015-10-23 | 2019-01-18 | 杭州超丝生物科技有限公司 | 利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法 |
| CN105463022B (zh) * | 2015-10-23 | 2019-01-25 | 杭州超丝生物科技有限公司 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 |
| EP4375403A3 (en) | 2016-02-11 | 2024-08-28 | Seevix Material Sciences Ltd. | Composite materials comprising synthetic dragline spider silk |
| CN109844112B (zh) * | 2016-10-18 | 2023-06-09 | 国立研究开发法人农业·食品产业技术综合研究机构 | 基因重组蓑蛾虫丝 |
| WO2018183946A1 (en) * | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Utah State University | Transgenic silkworms expressing spider silk |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989894A (en) * | 1990-04-20 | 1999-11-23 | University Of Wyoming | Isolated DNA coding for spider silk protein, a replicable vector and a transformed cell containing the DNA |
| JPH08511426A (ja) * | 1993-06-15 | 1996-12-03 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 新規の組換え産生性クモシルクアナログ |
| EP0848754A1 (en) * | 1995-08-22 | 1998-06-24 | Richard M. Basel | Cloning methods for high strength spider silk proteins |
| US5994099A (en) * | 1997-12-31 | 1999-11-30 | The University Of Wyoming | Extremely elastic spider silk protein and DNA coding therefor |
| US7157615B2 (en) | 1998-03-17 | 2007-01-02 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Production of biofilaments in transgenic animals |
| US6608242B1 (en) * | 2000-05-25 | 2003-08-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of silk-like proteins in plants |
| CN1350778A (zh) * | 2000-10-26 | 2002-05-29 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 利用家蚕生产非天然蚕丝的方法 |
| CN1362520A (zh) * | 2001-01-02 | 2002-08-07 | 成都天友发展有限公司 | 蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法 |
| AU2002312426A1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-16 | University Of Wyoming | Expression of spider silk proteins in higher plants |
| EP1427742A1 (en) * | 2001-08-29 | 2004-06-16 | University of Wyoming | Spider silk protein encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and method of use thereof |
| CN101712955B (zh) * | 2002-03-06 | 2013-06-05 | 东丽株式会社 | 利用基因重组蚕生产生理活性蛋白质的方法 |
| JP2004016144A (ja) * | 2002-06-18 | 2004-01-22 | Japan Science & Technology Corp | ヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコ |
| JP4431739B2 (ja) * | 2003-11-18 | 2010-03-17 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | カイコのキヌレニン酸化酵素遺伝子をコードするｄｎａの利用 |
| JP2005168460A (ja) * | 2003-12-15 | 2005-06-30 | Kyoto Institute Of Technology | 形質転換カイコの作製方法、カイコ卵に組み換えウイルスを接種する方法 |
| CN1910196A (zh) * | 2004-01-13 | 2007-02-07 | 东丽株式会社 | 含有蜘蛛丝蛋白质的丝线以及产生该丝线的蚕 |
| CN1283661C (zh) * | 2004-03-26 | 2006-11-08 | 南京师范大学 | 重组悦目金蛛大壶状腺丝蛋白及其制备方法 |
| RU2415938C2 (ru) * | 2004-07-22 | 2011-04-10 | АЭмЗильк ГмбХ | Рекомбинантный белок шелка пауков, кодирующая его нуклеиновая кислота, вектор и клетка-хозяин, подходящие для его экспрессии, способ его агрегации, способ получения материала из него, содержащий его продукт и применение |
| KR101323563B1 (ko) * | 2005-10-18 | 2013-10-29 | 니토 보세키 가부시기가이샤 | 항체를 생산하는 트랜스제닉 누에와 그의 제조방법 |
| JP5240699B2 (ja) * | 2006-03-29 | 2013-07-17 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 効率的なトランスジェニックカイコの作出方法 |
| JP5030610B2 (ja) * | 2007-02-02 | 2012-09-19 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 抗ウイルスタンパク質遺伝子ノックダウンによる有用タンパク質高発現カイコおよびその利用 |
| US9051383B2 (en) * | 2007-06-11 | 2015-06-09 | The Regents Of The University Of California | Spider silk dragline polynucleotides, polypeptides and methods of use thereof |
| WO2009097540A1 (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Entogenetics, Inc. | Methods, compositions, and systems for production of recombinant spider silk polypeptides |
-
2010
- 2010-09-10 JP JP2010203558A patent/JP5691052B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-09-01 EP EP11179742A patent/EP2428115A1/en not_active Withdrawn
- 2011-09-07 US US13/226,964 patent/US8222479B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-09 CN CN2011102681920A patent/CN102428897A/zh active Pending
-
2012
- 2012-06-15 US US13/524,120 patent/US8394942B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-02-11 US US13/764,124 patent/US8519101B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8394942B2 (en) | 2013-03-12 |
| US8222479B2 (en) | 2012-07-17 |
| US20120276590A1 (en) | 2012-11-01 |
| EP2428115A1 (en) | 2012-03-14 |
| US20130178602A1 (en) | 2013-07-11 |
| US20120065375A1 (en) | 2012-03-15 |
| CN102428897A (zh) | 2012-05-02 |
| JP2012055270A (ja) | 2012-03-22 |
| US8519101B2 (en) | 2013-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5691052B2 (ja) | 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 | |
| JP7544348B2 (ja) | 改良シルク繊維を合成するための方法および組成物 | |
| US20080287651A1 (en) | Silk Thread Containing Spider Thread Protein and Silk Worm Producing the Silk Thread | |
| US20210400936A1 (en) | Methods, compositions and systems for production of recombinant spider silk polypeptides | |
| CN110719732B (zh) | 表达蜘蛛丝的转基因蚕 | |
| JP2014198715A (ja) | タンパク質繊維 | |
| JP5771833B2 (ja) | 核酸、核酸によりコードされるタンパク質、核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により作られるタンパク質 | |
| JP5098039B2 (ja) | 化合物の結合効率が向上した絹糸 | |
| JP5997772B2 (ja) | カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 | |
| Lu et al. | Combined CRISPR toolkits reveal the domestication landscape and function of the ultra-long and highly repetitive silk genes | |
| JP2011103816A (ja) | トランスジェニックカイコ | |
| JP6300302B2 (ja) | カイコのセリシン１変異系統 | |
| WO2002000016A1 (en) | Altered wool and hair fibres | |
| WO2017067423A1 (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白的方法 | |
| Ji | Characterisation of Subdivision 19E3 of Chromosome X Housing the shaking-B Gene of Drosophila melanogaster | |
| AU2001267154A1 (en) | Altered wool and hair fibres |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20111207 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20111207 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130619 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141028 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141212 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150106 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150108 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5691052 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |