CN1350778A - 利用家蚕生产非天然蚕丝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质工程和DNA重组技术领域,更具体地,本发明涉及用DNA重组技术和蛋白质工程技术对蚕丝(包括对丝素蛋白重链和轻链)进行改造的方法、由此获得的性能改进的蚕丝、以及产生所述蚕丝的家蚕,以及生产所述蚕丝的方法。

Description

利用家蚕生产非天然蚕丝的方法
本发明涉及蛋白质工程和DNA重组技术领域，更具体地，本发明涉及用DNA重组技术和蛋白质工程技术对蚕丝进行改造的方法、由此获得的性能改进的蚕丝、以及产生所述蚕丝的家蚕，以及生产所述蚕丝的方法。
发明背景
家蚕是一种能吐丝的经济昆虫，丝素蛋白基因可在五龄家蚕的后部丝腺中特异而高效表达，早就受到研究者的广泛注意。有关转基因家蚕的研究也受到国内外学者的重视。李振刚利用天蚕丝基因启动子与家蚕丝素蛋白启动子结构相似的特性，将完整的天蚕丝基因导入家蚕内，试图使它得到表达(李振刚，周从照，唐恒立，等.YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移及其在F2代中的表达.科学通报，1995，40(24)：2267～2269)。Marshall直接地提出将外源基因置于丝素蛋白启动子的调控下，利用家蚕丝腺做为表达外源基因的生物反应器(Marshall，A.Nature Biotechnology，1998，16：530-533)。
蜘蛛丝质地轻、富有弹性、强度高，具有广泛应用前景。例如，可用作光学显微镜上的指示针、外科手术缝合线和制作降落伞、防弹衣等；可作为保护层包裹在航天器表面以防流星或陨石的碰撞。长期以来，各国科学家对蜘蛛丝的研究一直很有兴趣，试图大量获取和利用蜘蛛丝。
以园蛛属蜘蛛为例，它有7种不同的丝腺分泌丝，其中以大囊状腺分泌的拖牵丝性能最优。其独特的强度和弹性的结合使得它的断裂能远高于其他的天然纤维和人工纤维。1960年，Warwicker利用X-ray研究N.madagascarensis的拖牵丝时发现结晶区由反平行的皱褶状的β-折叠组成，晶体与无规区相比是占多数的(Warwicker J O..J MolBiol，1960，2：350)。Lewis等最先根据拖牵丝部分水解获取的短肽序列设计寡核苷酸探针筛选大囊状腺(major ampullate gland)cDNA文库获得成功(Xu M，Lewis R V..Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87(18)：7120～7124)。在最近的几篇综述(Hinman MB，JonesJA，Lewis RV.Trends Biotechnol.2000，18(9)：374-379；Hayashi CY，Lewis RV.Science，287：1477-1479.；Gosline JM，Guerette PA Ortlepp CS，et al.The Journal of ExperimentalBiology，1999，202(23)：3295-3303)详细地叙述了多种蜘蛛丝蛋白的研究进展，并且对它们的蛋白质一级结构进行了比较和分析，有一些肽序列多次出现，被认为是蜘蛛丝蛋白的基本单元，即GPGXX，GGX，聚丙氨酸，GPX和间隔区(spacer)。
有关拖牵丝结构的研究中，最有说服力的是Simmons等的研究，他们的研究表明，90％的Ala在折叠结构中，而70％的Gly在无定型区内。使用固相2H-NMR研究未定向、定向和压缩状态的纤维。结果表明拖牵丝纤维的结晶区中有两类丙氨酸富集区，一类是高度定向的；而另一类是定向较差的，并且也不是紧密堆积的(Simmons AH，Michal CA，Jelinski LW.，Science，1996，271：84-87.)。总之，现在关于蜘蛛丝强度及弹性的认识是：强度来自于结晶区，在一级结构上讲是“聚丙氨酸”这样的序列；而弹性与β-转角是相关的，而在一级结构上讲是GPGXX这样的序列。
有关拖牵丝的表达工作已在大肠杆菌和酵母中进行。由于拖牵丝基因中含有大量的重复序列，PCR克隆有困难，研究者们多倾向于采用人工合成、逐步加倍的方式获得基因。在人工合成时还兼顾了表达宿主的密码子偏好性。另外，由于大囊状腺蛋白中究竟有几种蛋白及它们之间的比例如何仍未知，所以研究者倾向于同时表达已知的两种蛋白，并将这两种蛋白按一定的比例进行组合。在对表达的产物研究中，多采用了固定金属亲和层析的方法纯化蛋白。对蛋白产物的鉴定中也多集中于Western检测、氨基酸组成分析和N-端测序的方法，也有人采用了MS的方法。对于产物二级结构的分析则仅限于CD分析。在表达研究中遇到的困难，特别突出的是表达蛋白的成纤维化问题(Prince JT，McGrath KP，DiGrolano CM，etal.，Biochemistry，1995，10879-10885；Fahnestock SR，Bedzyk LA.，Appl Microbiol Biotechnol，1997，47，33-39)。
鉴于家蚕是一种能吐丝的经济昆虫，人们自然地关注能否用转基因的手段在家蚕中表达蜘蛛拖牵丝。转基因蚕研究已具有较高的水准，它的主要研究内容有3个方面：1)将外源基因导入蚕卵的方法。人们可以将外源DNA重组到NPV(核多角体病毒)中，利用NPV将外源基因导入家蚕细胞、幼虫中。其中AcNPV虽可在家蚕中复制，但受感染的幼虫不表现出核多角体的症状，因而也不失为一种有效的方法。其他方法中，起初人们使用得较多的是显微注射的方法。近年来，基因枪、电穿孔都获得了发展。电穿孔、基因枪都在不同的实验室中采用，证明是有效的(Zhang F，Zhao Y，Chen X，et al.，Acta Biochimica et Biophysica Sinica，1999，31(2)：119～123；Moto K，Abdel Salam SE，Sakurai S，Iwami M.，Dev Genes Evol，1999，209(7)：447～450)。2)报告基因的选择和后代的筛选方法。CAT基因、GFP(绿色荧光蛋白)基因和neoR(新霉素抗性基因)等都已成功地应用于转基因蚕的研究(Tamura T，Kanda T，Takiya S，Okano K，Maekawa H.，Jpn JGenet，1990，65：401～410；赵昀，张峰，陈秀，等.用绿色荧光蛋白进行转基因蚕研究.高技术通讯，1999，9(6)：16～19；陈秀，赵昀，张峰，等.新霉素抗性基因在家蚕中的插入和表达.生物化学和生物物理学报，1999，31(1)：90～92；Komoto N，Thibert C，Boulo V，et al.，J Seric Sci Jpn，2000，69(1)：55～61)。3)将外源基因携带入基因组的方式。早期的研究中多使用了随机重组的方式。使用转座子也是一种重要的方法(Toshiki T，Chantal T，Corinne R，et al.，Nat.Biotechnology，2000，18：81-84)。然而，现在越来越多的研究者关注外源基因在基因组中的重组位置。一则，担心外源基因的随机重组导致功能基因的失活，二则，认为重组的位置同外源基因的表达效率有关。关于这一点，近年来张峰和Yamao都取得了一定的进展。张峰等利用家蚕丝素蛋白的重链基因的5＇-和3＇-端序列为同源片段，介导IE启动子调控下的GFP基因对重链基因的剔除。Southern杂交结果表明了同源重组事件的发生，即利用同源重组定向改进蚕丝性能是可能的。Yamao等则针对丝素蛋白的轻链进行同源重组的尝试，在轻链中融合入GFP基因，在基因、蛋白水平上都找到了相应的证据(Yamao M，Katayama N，Nakazawa H，et al.Gene &Development，1999，13(5)：511～516)。
由于蚕丝是一种重要的织物原料，因此本领域迫切需要开发新性能的蚕丝，及其生产方法。
在本发明的第一方面，提供了一种蚕丝，它基本上由重组的家蚕丝素蛋白构成，所述的重组的家蚕丝素蛋白具有修饰或改变的重链和/或轻链，
其中所述的修饰或改变的重链在重组家蚕丝素蛋白的重链的N端非结晶区和C端非结晶区中保留天然家蚕丝素蛋白中相应的天然序列，并且在重组家蚕丝素蛋白的中间结晶区中插入了选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白，
和/或重组家蚕丝素蛋白的部分或全部的中间结晶区被选自下组的外源蛋白或其片段置换：蜘蛛拖牵丝蛋白、修饰的蚕丝素蛋白结晶区、蜘蛛丝-蚕丝混合丝蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白；
其中所述的修饰或改变的轻链包括在轻链的外显子中插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白。
较佳地，所述的重组家蚕丝素蛋白的全部的中间结晶区被蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白所置换。
在本发明的一个实施例中，所述的蜘蛛拖牵丝蛋白的长度为800氨基酸或更多，并且具有8个重复单元或更多。
在本发明的另一实施例中，所述的蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白融合蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在本发明的另一实施例中，所述的重组家蚕丝素蛋白的轻链具有选自下组的修饰：
(1)在外显子2和3之间插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白；
(2)在外显子6和7之间插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白；
在本发明的第二方面，提供了一种家蚕丝素蛋白，所述的家蚕丝素蛋白具有修饰或改变的重链和/或轻链，
其中所述的修饰或改变的重链是在重组家蚕丝素蛋白的重链的N端非结晶区和C端非结晶区中保留天然家蚕丝素蛋白中相应的天然序列，并且在重组家蚕丝素蛋白的中间结晶区中插入了选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白，蜘蛛拖牵丝蛋白，
和/或重组家蚕丝素蛋白的部分或全部的中间结晶区被选自下组的外源蛋白或其片段置换：蜘蛛拖牵丝蛋白、修饰的蚕丝素蛋白结晶区、蜘蛛丝-蚕丝混合丝蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白；
其中所述的修饰或改变的轻链包括在轻链的外显子中插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白。
在本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，它编码本发明上述的家蚕丝素蛋白的修饰或改变的重链和/或轻链。此外，还提供了一种载体，它含有本发明上述的核酸分子。还提供了一种宿主细胞，还宿主细胞含有所述的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种转基因家蚕，它合成、分泌、吐出本发明上述的蚕丝。
在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明蚕丝的方法，培养权利要求10所述的转基因家蚕使其分泌蚕丝，以获得蚕丝。
在本发明第六方面，提供了一种产生转基因家蚕的方法，包括步骤：
(a)提供一融合基因，该基因含有融合的蜘蛛拖牵丝基因和报告基因，并且在融合基因的5＇端和3＇端侧分别接家蚕丝素蛋白重链5＇端和3＇端序列，
(b)将步骤(a)中的融合基因导入家蚕的蚕卵；
(c)使步骤(b)中的蚕卵孵化、发育和结茧；
(d)鉴别基因组中整合有融合基因的家蚕，从而获得转基因家蚕。
较佳地，所述的报告基因是绿色荧光蛋白；在步骤(b)中通过电穿孔法将融合基因导入家蚕的蚕卵；和步骤(d)中鉴别的进行是通过在紫外光下筛选亮茧。
附图中，图1显示了人工合成的蜘蛛拖牵丝基因单元。
图2显示了GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白原核表达质粒pEGS1000。
图3显示了原核表达质粒中GFP-拖牵丝融合基因的序列。其中，T7启动子、SD序列用下划线标记；翻译起始密码子ATG和终止密码子TAA阴影标记。GFP基因的序列以斜体标记，GFP基因前后两端的PstI(CTGCAG)方框标记；拖牵丝基因中含有4个合成的基因单元，BglII(AGATCT)，BamHI(GGATCC)，HindIII(AAGCTT)，NheI(GCTAGC)及BglII和BamHI连接形成的GGATCT以下划线标记。
图4显示了GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白真核表达质粒。
图5显示了融合蛋白的氨基酸序列。其中，阴影部分表示拖牵丝序列，其中的多聚丙氨酸序列黑体和下划线标记。
图6显示了对大肠杆菌表达的GFP-拖牵丝融合蛋白的SDS-PAGE和Western杂交分析。其中各泳道分别是：M，蛋白分子量标记；1，诱导后8h；2，诱导后4h；3，诱导后2h；4，诱导后1h；C，BL21(DE3)空菌。
图7显示了对质粒pEGS1000在BL21(DE3)中受IPTG诱导后不同时间的荧光强度分析结果。
图8显示了融合蛋白荧光性质的分析结果。其中图8A为激发光谱，图8B为发射光谱。
图9是质粒p53GS的核心部分的示意图。其中，GFP-拖牵丝融合基因和重链基因的接合处对应的氨基酸序列在图中标记出。融合基因编码的序列由斜体表示，重链基因编码的序列由黑体表示。
图10是显示了重链修饰的转基因家蚕的＂亮茧＂和对照蚕茧。其中，T，＂亮茧＂；C，对照。
图11对基因组家蚕中同源重组事件的PCR鉴定示意图。其中，PCR产物(11，12)的出现表示同源重组事件的发生，PCR产物(11，13)的出现则表示未被改变的家蚕丝素蛋白重链基因仍存在。
图12是同源重组事件的PCR鉴定电泳图谱。图12A中，各泳道是：M，DNA分子量标记；1，GFP基因的PCR产物；2，11-13 PCR产物；3，11-12 PCR产物。图12B中，各泳道是：M，DNA分子量标记；1，11-13 PCR产物；2，11-12 PCR产物。
图13是同源重组事件的Southern杂交鉴定示意图。其中，GFP基因约0.7Kb，拖牵丝基因约2.4Kb.家蚕基因组DNA经HindIII酶解后与两种探针进行杂交。探针1是重链基因上游HindIII--XhoI约1.3Kb的序列，探针2是GFP基因。
图14是同源重组事件的Southern杂交鉴定结果。其中图14A为重链探针杂交结果，图14B图为GFP探针杂交结果。泳道C为对照的54A家蚕；泳道T为转基因家蚕。
图15显示了与拖牵丝基因的点杂交结果。其中点C为对照的54A家蚕；点1，2为转基因家蚕。
图16显示了家蚕丝素蛋白轻链基因的部分序列。图中，标明了用于扩增L2的引物1、2的位置，L2的扩增产物约为950bp；扩增L3的引物3、4的位置，L3的扩增产物约为770bp；在转基因家蚕的鉴定中，设计了一对引物(引物7、8)用于鉴定未重组事件的存在，它们的位置标在其中，扩增产物约为400bp。引物上的限制性内切位点HindIII(AAGCTT)、PstI(CTGCAG)、BglII(AGATCT)和EcoRI(GAATTC)用黑体标记。
图17显示了GFP基因与轻链基因外显子2、3融合之后的部分基因序列。图中GFP基因及其编码的氨基酸为黑体部分，GFP基因两端的PstI(CTGCAG)和BglII(AGATCT)用方框标出。转基因家蚕鉴定中用于检测同源重组事件的引物位置用下划线标记。
图18为质粒p23G的组装示意图。
图19为质粒p23G的酶解鉴定图谱。图中，各泳道分别为：M，分子量标准；1，BglII/EcoRI；2，BglII/PstI；3，PstI/HindIII；4，EcoRI/HindIII；5，EcoRI；6，BglII；7，PstI；8，HindIII。
图20显示了在轻链外显子2和3之间插入GFP的转基因家蚕的＂亮茧＂和对照蚕茧。其中，T，＂亮茧＂；C，对照。
图21是对转基因蚕GFP-L23进行PCR鉴定示意图。
图22显示了家蚕丝素蛋白轻链基因的部分序列。图中标明了用于扩增L6的引物1、2的位置，L6的扩增产物约为1200bp；扩增L7的引物3、4的位置，L7的扩增产物约为490bp；在转基因家蚕的鉴定中，设计了一对引物(引物7、8)用于鉴定未重组事件的存在，它们的位置标在图中，扩增产物约为500bp。引物上的限制性内切位点HindIII(AAGCTT)、PstI(CTGCAG)、BglII(AGATCT)和EcoRI(GAATTC)用黑体标记。
图23显示了GFP基因与轻链基因外显子6、7融合之后的部分基因序列。图中GFP基因及其编码的氨基酸为黑体部分，GFP基因两端的PstI(CTGCAG)和BglII(AGATCT)用方框标出。用于检测同源重组事件的引物(引物9和引物10)位置为下划线标记。
图24为质粒p67G的组装示意图。
图25为质粒p67G的酶解鉴定图谱。图中，各泳道分别为：M，分子量标准；1，BglII/EcoRI；2，BglII/PstI；3，PstI/HindIII；4，EcoRI/HindIII；5，EcoRI；6，BglII；7，PstI；8，HindIII。
图26是对转基因蚕GFP-L67进行PCR鉴定示意图。
图27是对转基因蚕GFP-L67进行PCR鉴定的电泳图谱。图中，各泳道分别为：M，DNA分子量标记；1，GFP基因；2，5＇未重组事件；3，5＇同源重组事件。
图28是质粒p53GS的构建示意图。
定义
如本文所用，术语“蚕丝”指家蚕吐出的丝。蚕丝的化学组成主要有丝素和丝胶两种蛋白质成份，还含有极少量的蜡物质、碳水化合物、色素和无机物。一根茧丝由两根平行的单丝组成它们借丝胶粘合而成。每根单丝中轴为丝素，外覆一层胶质称为丝胶。
如本文所用，术语“丝素蛋白”是蚕丝的主要组成成份，丝素蛋白聚集成为丝纤维的骨架。
如本文所用，术语“拖牵丝”指蜘蛛大囊状腺分泌的丝，是一种性能优良的蛋白纤维，具有良好的强度和伸度。蜘蛛利用拖牵丝做为固定蜘蛛网的骨架。
如本文所用，术语“拖牵丝的基本结构单元”指拖牵丝中一段肽的特异的氨基酸序列，它通常包括GPGXX，GGX，聚丙氨酸(区)，GPX和间隔区等。其中聚丙氨酸区起结晶作用；GPGXX、GGX和GPX属于起转折作用的区域；而间隔区在聚丙氨酸区和转折区之间起过渡作用。拖牵丝的基本结构单元可以是天然的或人工合成的，通常具有至少1个，较佳地2-100个聚丙氨酸区，至少1个(较佳地2-100个)选自GPGXX、GGX和GPX的转折区，以及至少1个(较佳地2-100个)间隔区。其长度通常为200-6400个氨基酸或更长，较佳地为400-3200个氨基酸。
如本文所用，术语“报告基因”指一种基因，它所编码的蛋白产物便于检测，在转基因研究中用于筛选和检测转基因个体。
如本文所用，术语“绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)”指从多管水母(Aequorea victoria)中发现的，蓝光的激发可使其产生绿色荧光的蛋白。基于GFP的发光特性，它在转基因动物研究中已被广泛使用。GFP已在昆虫细胞中得到表达，而拖牵丝在昆虫细胞中的表达尚未见报道。天然的或改造过的GFP都可用于本发明。
如本文所用，术语“亮蚕”指在紫外线照射下，会发出荧光的蚕茧。在本发明中，因为转基因家蚕所分泌的蚕丝中含有GFP，因此紫外线照射下会发出荧光。利用这一性状可以快速筛选出转基因家蚕。
发明详述
蜘蛛有多种腺体可分泌丝，其中以大囊状腺(major ampullate gland)分泌的拖牵丝(dragline)性能最优。拖牵丝中至少存在两种蛋白，被分别称为MaSp1和MaSp2，Lewis等克隆了编码这两种拖牵丝蛋白的cDNA，提供了研究拖牵丝结构和功能的模型(1 XuM，Lewis R V.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87(18)：7120～7124；Hinman M B，LewisR V.J Biol Chem，1992，267(27)：19320～19324)。MaSp1中具有典型的多聚丙氨酸序列，Jelinski等研究了拖牵丝蛋白的结构，结果表明90％的丙氨酸残基在折叠结构中，而70％的甘氨酸残基在无定型区内；拖牵丝纤维的结晶区中有两个丙氨酸富集区，一个是高度定向的，而另一个是定向较差的，并且也不是紧密堆积的。拖牵丝蛋白中的多聚丙氨酸对拖牵丝具有良好强度具有重要作用(Simmons A H，Michal C A，Jelinski L W.Science，1996，271(5245)：84～87)。后来的研究中也认为多聚丙氨酸和拖牵丝的强度有关(HayashiC Y，Lewis R V.J Mol Biol，1998，275(5)：773～784；Gosline J M，Guerette P A，Ortlepp C S，et al.The Journal of Experimental Biology，1999，202(23)：3295～3303)。关于蜘蛛丝的异源表达已经有了很多报道，拖牵丝蛋白在大肠杆菌(E.coli)和甲醇酵母(Pichia pastoris)中都已获得表达，表达产物经圆二色性(CD)检测表明具有β-折叠结构，和天然的拖牵丝蛋白一致(Prince J T，McCrath K P，DiGrolano C M，et al.Biochemistry，1995，34(34)：10879～10885；Fahnestock S R，Irwin S L. Appl Microbiol Biotechnol，1997，47(1)：23～32；Fahnestock S R，Bedzyk L A.Appl Microbiol Biotechnol，1997，47(1)：33～39)。
在本发明的一个实施例中，合成了编码蜘蛛拖牵丝蛋白部分序列的基因单元片段，加倍至1200bp后与GFP基因融合，在大肠杆菌和昆虫细胞中表达，表达产物具有同GFP一样的荧光性质。而后，将长度为2400bp的人工拖牵丝基因和GFP基因融合，两侧装配家蚕丝素蛋白重链基因5＇和3＇端序列，用电穿孔方法导入蚕卵。蚕卵孵化、发育和结茧后，紫外灯下筛选到了“亮茧”。对“亮茧”蚕的后代进行鉴定，结果表明GFP基因和蜘蛛拖牵丝基因存在于家蚕基因组中并可遗传；PCR和Southern杂交证明转基因蚕的同源染色体中一条发生了预期的同源重组事件；“亮茧”的丝蛋白在ELISA实验中可以与GFP多克隆抗体反应；对蚕丝的性能也进行了测定，其强度和伸度都比对照组家蚕有所降低。由此，得到了GFP-蜘蛛拖牵丝融合基因转基因蚕，它能作为进一步用蛋白质工程改造蚕丝性能的中间体。
在本发明另一实施例中，分别将GFP基因插入在家蚕丝素蛋白轻链基因外显子2、3之间，和外显子6、7之间，其后代中都可观察到“亮茧”的出现。基因鉴定说明GFP基因存在于家蚕基因组中并可遗传；PCR证实存在预期的同源重组事件。实现了对丝素蛋白轻链基因进行的基因改造。分别得到了杂合体的转基因家蚕GFP-L23和GFP-L67。
适用于本发明的外源蛋白(或其片段)可以来自不同的物种(如各种蜘蛛)，也可以来自同一物种的不同品系，可以是天然的，也可以是人工合成的。代表性的外源蛋白(或其片段)包括(但并不限于)：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白、修饰的蚕丝素蛋白结晶区、蜘蛛丝-蚕丝混合丝蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白。一种特别优选的外源蛋白是由人工合成的DNA序列所编码的拖牵丝。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1
GFP-蜘蛛拖牵丝蛋白基因在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达
在本实施例中，根据蜘蛛(Nephila clavipes)拖牵丝(dragline)蛋白一级结构，人工合成编码蜘蛛拖牵丝蛋白部分序列的基因单元片段，此单元片段中含有的基本结构单元有：3个聚丙氨酸，2个GPGXX，14个GGX，和间隔区。并利用两端的BamHI和BglII加倍至1200bp，与GFP基因融合后，在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达。融合蛋白的分子量经Western检测确证为60KD，与预测值相符。对融合蛋白的荧光性质进行了分析，结果表明它的荧光性质与GFP一致，即激发峰为490nm，发射峰为510nm。同时研究了变性剂、加热等条件下融合蛋白荧光性质的稳定性。
实施例1A
人工蜘蛛拖牵丝基因的合成及表达质粒的构建
1.人工合成蜘蛛拖牵丝基因单元及GFP基因的克隆
蜘蛛拖牵丝基因单元采用了全合成的方式，共合成了8条寡核苷酸片段，两两配对形成双链，每一对双链片段两端各有6核苷酸的粘性末端互连后，连接入pUC19的PstI和SacI之间，其序列经测序确证与设计相符合。基因单元内含有编码聚丙氨酸、GGX和GPGXX等几种拖牵丝蛋白基本结构单元(module)。在基因单元的5＇-端还设计了BglII，与3＇-端的BamHI可用于基因单元的加倍(见图1)。在基因单元的最前端设计了PstI位点，这个PstI位点用于与GFP基因融合。
根据pGreen Lantern中GFP基因的序列设计并合成了一对PCR引物(引物A和引物B)用于扩增GFP基因，其中，划线部分为EcoRI(GAATTC)和PstI(CTGCAG)：
引物A：5＇-ATA GAATTCCTGCAGGCGGCATGAGCAAGGGCGAGGAA-3＇
引物B：5＇-AAA CTGCAGGAATTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3＇
在引物设计时，使得拖牵丝基因的序列能够与GFP基因的阅读框架相吻合。pGreenLantern中的GFP基因是经过改造的，将65位的Ser定点突变为Thr使得它的激发峰为490nm，发射峰为510nm；而有别于野生型的GFP(激发峰为395nm，发射峰为510nm)，且荧光强度增加(Heim R，Cubitt A B，Tsien R Y.Nature，1995，373(6516)：663～664)。
2.GFP-蜘蛛拖牵丝基因原核表达质粒的构建
对pUC19进行了改造，去除了EcoRI和NarI之间的一段序列，包括其中的一个PvuII位点，然后又去除了HindIII和剩余的一个PvuII之间的LacZ启动子的序列。在此基础上继续构建表达质粒。引入了T7启动子的序列，下游又引入了SD序列，在HindIII之后加入了翻译起始密码子ATG；为了方便纯化，融合基因的3＇端的翻译终止密码子TAA前还加入了编码6个连续的His的序列，TAA后侧引入了一个位点NheI。最后根据的文献报道(Brosius J，Dull T J，Sleeter D，et al.，J Mol Biol，1981，148(2)：107～127)，利用PCR扩增了大肠杆菌rrnB基因的终止子序列置于质粒中。将GFP-拖牵丝融合基因克隆入质粒，最终形成原核表达质粒pEGS1000(见图2.)。其中从T7启动子到终止密码子TAA的DNA序列见图3。此外，因为拖牵丝基因中有多个PstI位点，为了克隆的方便，在质粒构建中可使用合成的蚕丝基因做为过渡。
合成片段引入T7启动子的接头：划线部分为T7启动子
5＇- TAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCGAGACTTCCCTA-3＇3′-ACGT ATTATGCTGAGTGATATCCCTTCAGAGCTCTGAAGGGATTCGA-5＇
合成片段引入SD序列的接头：划线部分为SD序列
5＇-AGCTTTATATTT GGAGGTAATCATATGGCTGCA-3＇
      3-＇AATATAAA CCTCCATTAGTATACCG-5＇
合成片段在表达载体的末端引入TAA的接头：划线部分为TAA，它的前面是编码6个连续His的序列
5＇-CATCACCATCACCATCAC TAATGCTAGCG-3＇3＇-TCGAGTAGTGGTAGTGGTAGTG ATTACGATCGCTTAA-5＇
克隆rrnB终止子序列的PCR引物：划线部分为EcoRI和AatII位点引物C：5＇-TA GAATTCAGAAGTGAAACGCCG-3＇引物D：5＇-TAA GACGTCGATGGCTTGTAGATATGAC-3＇
3.GFP-蜘蛛拖牵丝基因真核表达质粒的构建
在质粒pGL3(Promega公司)的多克隆位点的BglII和HindIII之间克隆入家蚕核多角体病毒即刻早期蛋白基因(IE)启动子pIE，而后将pEGS1000中的HindIII和NheI之间的GFP-拖牵丝融合基因克隆入HindIII和XbaI位点之间，形成真核表达质粒pIEGS(见图4.)。
从GFP-拖牵丝原核、真核表达质粒的构建来看，两者所表达的基因是完全一致的，DNA序列见图3。表达产物为661个氨基酸残基组成的蛋白质，理论分子量经DNastar软件计算约为60KD，其序列如图5所示。
实施例1B
GFP-拖牵丝融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定
将实施例1A中构建的原核表达质粒pEGS1000，转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。在诱导后的1、2、4、8小时之后，取一定体积的菌液离心，进行SDS-PAGE(10％)分离和Western检测。
通过Western检测，表明融合蛋白的分子量为60KD，与预期值的相符；同时用Western检测的结果也可看出表达产物随时间的增加在积累(见图6)。
荧光强度分析时，收集各个时间的相同数量的菌体，离心，经液氮反复冻融后用1ml水悬浮，再离心后取上清进行测定。将激发光定在470nm，扫描不同时期菌体内容物的发射光谱。荧光强度的测定分析与Western分析的结果是一致的(见图7)。上述两项实验中，测定各个时期菌液的OD600，调整所分析菌液的体积，使得分析的菌体量一致。
GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白的荧光性质分析
取IPTG诱导后8h的菌液，进行融合蛋白的荧光性质分析。将发射光定在510nm，进行扫描发现激发峰位于490nm；将激发光定在470nm，进行扫描发现发射峰位于510nm。在分析发射光谱时，因激发峰(490nm)与发射峰(510nm)相差小，为避免干扰将激发光设定在470nm。这个结果与实验中使用的GFP的荧光性质是相同的，说明融合蛋白未影响GFP的荧光性质，融合蛋白具有同GFP一致的荧光性质。
GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白的存在形式分析
取IPTG诱导后8h的菌液，10,000转/分离心，取上清为A；菌体经液氮裂解之后，再经10,000转/分离心，上清为B；剩余的部分经水重悬为C。这三个部分经荧光光谱分析后发现，有荧光的为B。这表明：融合表达产物存在于胞内且是可溶性的。
GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白的荧光性质的热稳定性分析
用水加热的方式溶解丝胶，是各种从蚕茧中去除丝胶的方法中较温和的一种方法。取大肠杆菌经IPTG诱导8h后的表达产物进行融合蛋白荧光性质的热稳定性分析。先获取若干菌液，离心后用液氮破裂，用100μl水溶解，离心，取上清。另取几只离心管加入1ml水，预先放置在所需温度的水浴中10min。待测定时，再将裂解菌液各20μl加入各个离心管中，放置一定时间进行测定。其中放置在室温中的一只做实验对照。分别在100℃加热5min、10min和20min，结果发现融合产物的发光特性在5min时就开始丧失。降低温度，50℃加热30min，表达产物的荧光性质仍存在，但荧光强度有所减弱(未示出)。
实施例1C
GFP-蜘蛛拖牵丝融合基因在BmN细胞中的瞬时表达
(1)用lipofectin转染BmN细胞
在35mm直径的培养皿中，加入Bm-N细胞(Grace，T.D.C.，Nature，1967，216：613)1ml(2.0×105个/ml)，再加3ml含10％的FBS的TC-100细胞培养液，27℃培养12～24h至细胞达50～80％的贴壁率。取2～25μl的lipfectin溶液(GIBCO BRL公司)加入100μl的无血清培养基中，另取1～2μg要转化的DNA加入100μl的无血清培养基中，放30min；再将两溶液混合继续放置10～15min。同时将培养板中的细胞培养基去除，用无血清培养基清洗2次。加人无血清培养基800μl，并加入上述用lipfectin处理的DNA混合液。27℃培养6h后，移去培养基，换10％FBS以及含抗生素的TC-100培养基。继续培养24～96h观察或检测外源基因的表达。
结果：用lipofectin将实施例1A中构建的pIEGS转导入BmN细胞，并在转导后的不同时间将细胞置于荧光显微镜下观察。发现带有绿色荧光的细胞从转染后24小时出现，36小时后数目逐渐增加，荧光强度也随之增强，直至90小时仍有大量的荧光细胞存在。收集破碎细胞后，测定荧光的激发峰、发射峰与GFP一致(结果与图8类似)。证明GFP在与拖牵丝蛋白融合后能在家蚕细胞中表达且荧光性质没有改变。为继续研究GFP-拖牵丝的转基因蚕和使用GFP筛选转基因蚕提供了依据。
实施例2
GFP-蜘蛛拖牵丝基因转基因家蚕
在本实施例中，根据蜘蛛(Nephila clavipes)拖牵丝(dragline)蛋白结构，人工合成编码蜘蛛拖牵丝蛋白部分序列的基因片段单元，并利用两端的BamHI和BglII加倍至约2400bp和GFP基因融合，融合基因的两侧装配家蚕丝素蛋白重链基因5＇和3＇端序列之后，利用电穿孔方法导入蚕卵中。蚕卵孵化、发育和结茧后，用紫外灯检查，在约5400个茧中有73个“亮茧”，对其后代进行基因和蛋白质水平上的鉴定。PCR和Southern杂交的结果表明，GFP基因存在于家蚕基因组DNA中，发生了预期的同源重组事件；点杂交表明人工合成的拖牵丝基因存在于家蚕基因组中；茧蛋白在ELISA反应中可以与GFP的多克隆抗体反应。上述结果说明GFP-拖牵丝融合基因已通过同源重组整合入家蚕基因组，表达产物能参与泌丝，＂亮茧＂这一表型能用于筛选转基因蚕。
材料：
用于引入XHoI位点的接头I：划线部分为XhoI
5＇-AGCTT CTCGAGCTGCA-3＇
      3＇-A GAGCTCG-5＇
用于引入MluI位点的接头II：划线部分为MluI
      5＇-C ACGCGTG-3＇
3＇TCGAG TGCGCACTTAA-5＇
用于扩增重链基因5＇-端序列的PCR引物：划线部分为XhoI(CTCGAG)和PstI(CTGCAG)
引物5：5＇-ATTTTCATAACC CTCGAG-3＇
引物6：5-ACCGA CTGCAGCACTAG-3＇
用于扩增重链基因3＇-端序列的PCR引物：划线部分为MluI(ACGCGT)和EcoRI(GAATTC)
引物7：5＇-TAA ACGCGTGACTTTGAAACTGGAAG-3＇
引物8：5＇-TTGTCTTCTAG GAATTC-3＇
鉴定同源重组事件的引物：
引物11：5＇-TTTTCATAACCTCGAGGTAGC-3＇
引物12：5＇-CATGGCACAGGGAGCTTTC-3＇
鉴定未重组事件的引物：
引物11：5＇-TTTTCATAACCTCGAGGTAGC-3＇
引物13：5＇-CTCCTGCACCGACTGCAG-3＇
GFP基因鉴定引物
引物14：5＇-ATGAGCAAGGGCGAGGA-3＇
引物15：5＇-TTGTACAGCTCGTCCATG-3＇
扩增重链基因探针的PCR引物：
引物16：5＇-TATAAGCTTGTTGTACAAAACTG-3＇
引物17：5＇-TGCTACCTCGAGGTTATG-3＇
扩增丝素蛋白重链基因3＇端非翻译区的PCR引物：
引物18：5＇-GCCAGTGAATTCCTAGAAGA-3＇
引物19：5＇-CCAGGACGAAGTAAGAAAC-3＇
方法
1.外源基因转导入蚕卵的方法
p53GS经ScaI酶解、线性化处理后，酚/氯仿(1∶1)、氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于双蒸水中。将刚产下的家蚕受精卵，放入电穿孔杯中(400～500粒/杯)，加线性化DNA的溶液(0.2mg/ml)混匀，冰浴5分钟。在电穿孔仪(BIO-RAD gene pluser II)中，以500V、25pF和200Ω的条件下电击，取出蚕卵，晾干，浸酸处理。
2.PCR反应条件
使用GIBCO BRL公司的快速抽提试剂DNAzolTM从蚕蛾及蚁蚕中抽提基因组DNA。操作方法参照商品说明书改进如下：样品在玻璃均浆器中反复碾磨，15,000转/分离心，等体积酚∶氯仿抽提，15,000转/分离心，水相加1/2体积乙醇沉淀，95％乙醇洗涤沉淀，凉干后，用水溶解，供PCR反应使用。
PCR反应的反应体系为：模板为100ng家蚕DNA；引物为20pmol，总反应体积为50μl。反应程序基本上为94.0℃变性7min；94.0℃变性30s，52.0℃退火30s，72.0℃延伸30s，共35个循环；72.0℃延伸7min；4.0℃保温。
3.Southern分析
3.1家蚕Bombyx mori基因组DNA的抽提
在家蚕五龄的第三天，解剖取出后部丝腺体约1g，放入研钵中加入液氮，待其完全蒸发后，用力碾碎，最后加入3～4ml DNA抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.5％SDS)，碾均匀。然后加入RNase至终浓度20μg/ml，37℃，1h。再加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml，边加边打匀，50℃，3h。用等体积酚抽提3次。最后，加入1/10体积NaAc(3mol/L，pH5.2)，2体积乙醇沉淀，4℃放置过夜，挑取絮状沉淀(由于丝腺中有较多的丝蛋白存在，沉淀时会与DNA一同沉淀下来，使用较长的时间沉淀后，DNA的絮状沉淀会漂浮在溶液上层，而蛋白形成的颗粒状沉淀处于溶液的下方，进一步起到分离的作用)，70％乙醇洗涤。风干，水或TE溶解。
3.2基因组DNA的酶解和电泳
用限制性内切酶HindIII酶解，37℃2小时。酶解处理后的DNA经等体积酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀后，加水溶解，50℃处理5min，然后加上样缓冲液上样，待DNA样品静置5min后，进行电泳。电泳时，前5min使用较高电压，使DNA样品快速进胶，而后在不超过1V/cm条件下进行电泳。
3.3杂交
转膜后，在预杂交液(6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液，100μg/ml鲑精DNA)中于68℃预杂交2h，加入热变性处理的探针于68℃杂交8h。
室温条件下于2×SSC、0.5％SDS及2×SSC、0.1％SDS中依次漂洗5min，0.1×SSC 0.1％SDS中于68℃漂洗30min。放入X-光片夹内，进行放射自显影。
4.丝蛋白的溶解及ELISA实验
蚕茧放入清水中煮沸30min，3次，清水中的成份为丝胶蛋白。留下的蚕丝放入6mol/L LiBr中溶解，65℃过夜，其后对水透析，而透析后的产品主要为丝素蛋白，可能会含有少量丝胶成份。
4.1试剂
包被液(pH9.5)：Na2CO3 0.8g，NaHCO3 1.46g，蒸馏水500ml溶解
洗涤液(pH7.4)：Tris 6g，1mol/L HCl 37ml，25％Tween-20 5ml，蒸馏水2500ml溶解
底物缓冲液：Na2HPO4.12H2O 8.72g，柠檬酸2.72g，蒸馏水500ml溶解
抗体稀释液(pH7.5)：NaCl 4g，KH2PO4 0.1g，KCl 0.1g，Na2HPO4.12H2O 1.45g，25％Tween-20 2ml，蒸馏水500ml溶解
封板液：PBS配制的15％的小牛血清溶液
4.2操作
Figure A0012585900171
用包被液将抗原稀释成5μg/ml，在酶标板中每孔加入100μl上述抗原溶液，37℃，1h
Figure A0012585900172
除去酶标板内的包被液。用洗涤液洗涤3次，每次5min
每孔加入封板液100μl，37℃，1h
Figure A0012585900174
除去封板液。用洗涤液洗涤3次，每次5min
用抗体稀释液(含有1％的小牛血清)适当稀释一抗，每孔加入100μl，37℃，1h
Figure A0012585900176
弃去抗体溶液，用洗涤液洗涤3次，每次5min
Figure A0012585900177
用抗体稀释液(含有1％的小牛血清)适当稀释二抗，每孔加入100μl，37℃，1h
Figure A0012585900178
弃去抗体溶液，用洗涤液洗涤3次，每次5min
Figure A0012585900179
加入底物(四甲基联苯胺2mg溶于5ml底物buffer)10μl，5μl H2O2，每孔50μl。37℃反应适当时间，2mol/L H2SO4 50μl终止反应
测定OD450
实施例2A
同源重组质粒的构建
1.人工合成蜘蛛拖牵丝基因单元
蜘蛛拖牵丝采用了全合成的方式，共合成了8条寡核苷酸片段，两两配对形成双链，每一对双链片段两端各有6核苷酸的粘性末端互连后，连接入pUC19的PstI和SacI之间。在基因单元的5’-端还设计了BglII，与3＇-端的BamHI可用于基因单元的加倍。基因单元序列见第一部分，在基因单元的最前端有PstI位点可用于GFP基因的融合，使得拖牵丝基因与GFP基因的阅读框架吻合。天然的蚕丝是对光不稳定的，原因在于丝蛋白中含有不少的Tyr。因此在人工合成的蜘蛛拖牵丝基因中，有意将Tyr改换为Thr。
2.对家蚕进行成体实验的质粒p53GS的构建
蚕丝素蛋白H链基因由两个外显子和一个内含子组成。外显子I所编码的序列中有典型的信号肽序列，可使得后部丝腺中合成的丝蛋白分泌出去。外显子II则编码丝素蛋白重链的重复区，在蛋白的C-端存在3个Cys残基，其中两个形成链间二硫键，另一个与轻链形成链间二硫键。设计了一对引物扩增基因5＇端XhoI至PstI间的约950bp的序列。XhoI位于内含子中，而PstI位于外显子II的前端，其后的序列是丝素蛋白重链基因的重复区域。为了克隆的方便使用了其中PvuII至PstI的约700bp的序列充当同源区。如果发生正确的同源重组，GFP-拖牵丝基因将在丝素蛋白重链基因的启动子调控下表达，并且使用丝素蛋白重链的N-端信号肽序列分泌。用于扩增家蚕丝素蛋白重链基因3＇端下游同源序列的引物序列为：正向引物5＇-TAA ACGCGTGACTTTGAAACTGGAAG-3＇(引物7)，其中划线部分为引入的MluI位点，反向引物5＇-TTGTCTTCTAGGAATTC-3＇(引物8)，正向引物中的MluI是为了克隆的便利而在引物中引入的。这一段基因在丝素蛋白重链基因重复序列之后，发生同源重组之后不改变原基因的末端序列，GFP-拖牵丝基因只是替代丝素蛋白重链基因的重复序列，这样基因产物的C-端的3个Cys残基将不受影响，可与轻链共价结合。由于基因的下游不受改变，基因转录后的后加工(如，加polyA等)应不受影响。
分别改造pUC19，使其原有的SphI被替代为XhoI，称pUX；在SacI和EcoRI之间加入位点MluI，称pUM。丝素蛋白重链5＇端序列克隆于pUX的XhoI和PstI之间，以后截去XhoI至PvuII的序列，仅保留PvuII至PstI约700 bp的序列，丝素蛋白重链3＇端序列克隆于pUM的MluI和EcoRI之间，5＇端序列和3＇端序列拼接在一起形成过渡质粒p52。丝素蛋白重链3＇端非翻译区的序列克隆在pUC18中，称为pUC100。p52和pUC100经AatII和EcoRI酶解后，将丝素蛋白重链3＇端非翻译区的序列也插入p52中，形成过渡质粒p53。拖牵丝基因单元以BglII和BamHI加倍后直至2.4Kb后，克隆于p53的PstI和SacI之间。从pGreen Lantern质粒中扩增的GFP基因插入在PstI位点，利用GFP基因中的EcoRI位点确定插入的方向。最后构成了p53GS质粒(详细的质粒构建过程见附图28)。如实施例1中提及，GFP基因与拖牵丝基因的融合具有共同的阅读框架，在本实施例中，GFP-拖牵丝融合基因与克隆的两段重链基因也是融合的，其接头部位的融合设计如图9所示。
实施例2B
GFP-蜘蛛拖牵丝融合基因转基因家蚕的筛选
1.转基因处理的蚕当代(G0)性状表现
用ScaI酶解质粒p53GS，使其线性化，用电穿孔方法处理了约一万颗蚕卵，分5天收蚁6700头左右，孵化率为67％，而一般没有经过处理的蚕卵，二日孵化率都达90％z以上。蚕饲养到上簇、结茧后第五天，用紫外灯观察蚕茧，结果在转基因处理的5436个蚕茧中，有73个亮茧，而在对照组中没有“亮茧”出现(见图10)。
2.家蚕基因组DNA的PCR检测(G0、G1和G2)
对G0、G1代中＂亮茧＂中的蚕蛾进行PCR检测，都检出了GFP基因，并依据PCR实验的结果保留检出明显PCR产物的蛾区。G2代中共获得35个蛾区，抽提蚕蛾的DNA，用PCR检测出10对含有GFP基因。35个蛾区的蚕卵待孵化后取出约1/4的蚁蚕抽提DNA，用PCR又检测出13个蛾区中含有GFP基因。鉴定到的阳性蛾区内进行“亮茧”蚕的交配、制种。
实施例2C
转基因家蚕的基因和蛋白质分析
1.同源重组事件的PCR检测
根据Tsujimoto和Suzuki(1979)提供的家蚕丝素蛋白重链基因的5＇-端序列信息，设计了3条PCR引物用于检测转基因家蚕。设计了引物11为公用的上游引物5＇-TTTTCATAAC CTCGAGGTAGC-3＇，它含盖了XhoI酶切位点，位于5＇同源重组片段(PvuII--PstI)的外侧。下游引物则设计了两条，引物12：5＇-CATGGCACAGGGAGCTTTC-3＇，这条引物位于GFP基因内侧，只有发生了同源重组事件后，才可能出现这个PCR产物(1.1Kb)；有时同源重组事件仅在一对同源染色体中的一条发生，为了区别同源重组事件是在一条染色体上发生还是在一对染色体上发生，设计了引物13：5＇-CTCCTGCACCGA CTGCAG-3＇，这条引物含盖了一个PstI位点，其余序列代表的是丝素蛋白重链基因的序列，只要家蚕的一条染色体未发生改变，那么这一PCR产物(0.95Kb)就会出现。
针对GFP基因检测呈阳性的转基因家蚕的后代，又进行了进一步的同源重组事件的PCR鉴定。结果如图12A所示，外源基因GFP是存在的，因为表明发生同源重组事件的PCR产物(11，12)也出现了。在图12B中看得更清楚，它比PCR产物(11，13)大一些。PCR产物(11，13)的出现，说明仍然有未被改变的染色体存在，那么鉴定到的是杂合体。
2.同源重组事件的Southern杂交鉴定
在有了上述同源重组事件PCR的鉴定结果后，进一步进行了杂交鉴定。根据丝素蛋白重链基因的序列，进行HindIII的酶解，用家蚕丝素蛋白重链基因和GFP基因两种探针进行杂交。其中重链基因探针是基因上游调控区中的HindIII-XhoI的1.3Kb的序列(见图13)。
杂交结果如图14所示。结果表明，GFP基因确实存在和重链基因上游调控区的连锁关系(两种探针杂交都出现了5.8Kb的条带)。GFP探针杂交还出现的4Kb片段，与重链基因上游调控区是不连锁的，应当属随机的同源重组。关于它的来源，也可能是转基因家蚕间杂交育种而获得的。
3.拖牵丝基因的点杂交实验
在尼龙膜上分别点上了54A家蚕的基因组DNA和两个转基因家蚕(GFP基因PCR检测呈阳性)的基因组DNA样品。利用人工合成的拖牵丝基因片段(约1.2Kb)为模板合成探针，进行杂交。这两个样品相对于54A是呈阳性的(图15)。
4.对“亮茧”丝蛋白的分析
用50℃加热的条件，获取了一些“亮茧”的丝胶成份，测定荧光，结果荧光不存在。接着，利用GFP多克隆抗体(Santa Cruz公司)进行ELISA实验。在紫外灯下挑选一些“亮茧”，用6mol/L LiBr溶解、透析后进行ELISA实验，发现其中的一些可以明显地与GFP多克隆抗体反应。见表1。
                    表1.“亮茧”丝蛋白进行的ELISA分析
样品 对照茧 1裹“亮茧” 2#“亮茧” 3#“亮茧” 4#“亮茧”
OD450  0.13  0.33  0.28  0.35  0.27
与对照茧的比值 1.00 2.55 2.17 2.72 2.13
从表1数据分析表明茧丝蛋白可以与GFP抗体反应，但其中丝胶、丝素的成份还未得到分离。因此，进一步分离丝胶、丝素进行分析。用清水煮沸，水中可以溶解丝胶。剩余的成份用6mol/L LiBr溶解、透析，其中主要是丝素成份，但含有少量丝胶。简单分离后的样品进行ELISA分析，发现丝胶不与抗体反应，而丝素(混有少量丝胶)可以与抗体反应。这表明，可以与GFP抗体反应的是丝素的成份，见表2。
                     表2.“亮茧”丝胶、丝素的ELISA分析
    样品   空白   54A丝胶   54A丝素   “亮茧”丝胶   “亮茧”丝素
    OD450   0.25     0.32   0.33     0.31      0.57
与空白的比值   1.00     1.29   1.36     1.27      2.32
茧中的丝蛋白可以与GFP抗体反应说明存在GFP的特异序列，由于翻译、泌丝是同源重组、转录和表达的下游事件，可以认为这项结果是对同源重组的有力支持，同时也说明同源重组的正确性。
5.蚕丝机械强度的测定
蚕丝经脱胶处理后，在紫外灯下不再发亮。这与实施例1表达研究中发现融合蛋白的荧光性质在现有的脱胶方法中会淬灭的结果(未给出具体数据)是相吻合的。脱胶后的蚕丝用来测定了单丝强度，结果如表3所示。与54A家蚕相比，强度有所减弱。
对于这样的结果，我们认为，丝纤维是一种蛋白纤维，蛋白单体间的组合方式对纤维的性质有影响。GFP-拖牵丝融合蛋白与丝素蛋白的相互作用如何(多数为杂合体)，很难预测。杂交结果表明发生同源重组的一条染色体HindIII酶解片段变小了许多，仅6Kb。可见GFP-蜘蛛拖牵丝融合蛋白的分子量较小，而且其中还有一段GFP(约230氨基酸残基)，因此结晶区更短，推测强度会降低。其次GFP可能不与蚕丝、蜘蛛丝形成好的结晶，也能使丝的强度降低。
  表3.转基因家蚕单丝断裂强度、伸度的测定
名称 断裂强度(厘牛顿) 断裂伸长度(％)
对照组 14.5  32.2
 A 11.5  24.4
 B 11.0  28.0
 C 11.5  24.3
 D 10.8  22.7
 E 11.6  27.6
 F 11.8  25.0
 G 8.7  20.6
 H 9.7  24.0
 I 10.5  24.5
 J 10.9  19.5
注：从每个蛾区中取10颗蚕茧，每颗蚕茧抽出的丝分为50cm长取50段进行测定，取其平均值代表每颗茧的强度及伸度。再将每个蛾区内的10颗茧平均，代表蛾区内的强度、伸度。本实验中采用的是较低温度的缫丝方法，使得茧中的蛹得以存活，可继续发育为蚕蛾完成交配、产卵。
实施例3
GFP-家蚕丝素蛋白轻链融合基因转基因蚕GFP-L23
在本实施例中，利用PCR扩增了家蚕丝素蛋白轻链基因的2个片段L2和L3，GFP基因同L2中的轻链基因外显子2和L3中的外显子3融合在一起，用电穿孔方法将这样的基因片段导入蚕卵中。家蚕经孵化、发育和结茧后，用紫外灯检察，在约8000颗蚕茧发现有280颗“亮茧”出现。选取G3代中一个蛾区内的20头家蚕，取血并进行PCR鉴定，其中有6个家蚕个体的基因组DNA中同时含有GFP基因和预想中的同源重组事件。对相应蚕茧中的蛋白质成份进行分析发现：其中3个蚕茧的丝素蛋白可与GFP多克隆抗体反应。
材料
用于扩增L2片段的PCR引物：
引物1：5＇-ATTAAGCTTCAAATTCTCTAGAAAAACATT-3＇
引物2：5＇-TTACTGCAGATCACTGTATTGATTGATGG-3＇
用于扩增L3片段的PCR引物：
引物3：5＇-TCAACGTTCAAGAGATCTTG-3＇
引物4：5＇-TAGAATTCGGTAATATTGGATGTTTAAGG-3＇
用于扩增GFP基因的引物
引物5：5＇-ATACTGCAGAGCAAGGGCGAGGAACT-3＇
引物6：5＇-ATTAGATCTCCTTGTACAGCTCGTCCAT-3＇
鉴定未重组事件的引物
引物7：5＇-CGTCACAGTGCATCTAGTG-3＇
引物8：5＇-GCACAGGCATCACCGGG-3＇
鉴定同源重组事件3＇-端引物
引物9：5＇-CCTGCTGGAGTTTGTGACC-3＇
引物10：5＇-CAGGGTTGATGACGAGT-3＇
鉴定同源重组事件5＇-端引物
引物11：5＇-GTTTTCGTGAACACGGACGA-3＇
引物12：5＇-CATGGCACAGGGAGCTTTC-3＇
鉴定GFP基因的引物
引物13：5＇-ATGAGCAAGGGCGAGGA-3＇
引物14：5＇-TTGTACAGCTCGTCCATG-3＇
实施例3A
同源重组质粒的构建
1.两个L-chain基因片段及GFP基因的克隆设计
依据Kikuchi和Yamaguchi等文献报道(Kikuchi Y，Mori K，Suzuki S，et al.Gene，1992，110(2)：151～158；Yamaguchi K，Kikuchi Y，Takagi T，et al.J Mol Biol，1989，210(1)：127～139)，家蚕丝素蛋白轻链基因共约14Kb，有7个外显子和6个内含子；编码262氨基酸残基，轻链蛋白的分子量约25Kd。外显子3、5、6上各有一个Cys，其中外显子3和外显子5上的Cys形成链内二硫键，而外显子6上的Cys则与重链上的一个Cys形成链间二硫键。设计了两对PCR引物扩增了两个L-chain的基因片段，分别称为L2、L3；L2起始于内含子1中，终止于外显子2，两条PCR引物上分别引入了HindIII和PstI位点，用于基因片段的克隆，PstI还兼顾与GFP基因的融合。L3起始于外显子3中，终止与内含子3(见图1)；上游引物中有BglII的位点，下游引物中引入了EcoRI的位点，便于克隆。L2长约950bp，L3长约770bp，在L2、L3之间会在同源重组中被替代的序列有约1300bp，包括外显子2、3中的一部分和整个内含子2。以pGreen Lantern质粒为模板扩增GFP基因，引物上分别设计了PstI和BglII酶切位点，便于产物的克隆并使GFP基因于L2和L3基因片段融合。
按照上述的设计，外显子2编码的28个氨基酸残基去除了后端的13个，外显子3编码的65个氨基酸残基中只去除了前端的19个残基。在发生同源重组之后的重组的GFP-轻链融合基因的部分序列在图2中显示。GFP基因两端的PstI和BglI用方框标记出，在这两个位点附近的氨基酸序也在图中显示。
2.质粒p23G的组装
以100ng家蚕基因组DNA为模板，通过PCR，扩增出L2和L3。以pGreen Lantern为模板，扩增了GFP基因。L2的PCR产物两端有HindIII、PstI位点，克隆于pUC19中，为pL2；GFP基因的两端有PstI和BglII，但pUC19中没有BglII，克隆于PstI和SmaI之间，为pGFP；L3两端有BglII和EcoRI，克隆于SmaI和EcoRI之间，为pL3。而后，按图18流程，将L2、L3和GFP基因拼接起来组装成p23G供成体实验使用。p23G经酶解鉴定正确(图19)。
实施例3B
外源基因的导入和转基因家蚕的初步筛选
1.外源基因的导入
利用电穿孔处理了约12500颗家蚕受精卵，其中有约8000颗孵化(孵化率为65％)，待家蚕发育、结茧后在紫外灯下进行观察，发现了一些“亮茧”的出现(见图20)，约有280颗这样的“亮茧”，占孵化卵的3.5％。
2.初步基因鉴定及交配、育种
选取了23个“亮茧”，取出蚕蛾与54A蚕蛾进行交配，其中包括了正交(雌性54A蚕蛾×雄性“亮茧”蚕蛾)12对和反交(雌性“亮茧”蚕蛾×雄性54A蚕蛾)11对。产下的卵孵化后，每个蛾区内取约1/4的蚁蚕抽提DNA进行GFP基因的PCR检测。约有一半的蛾区显示出阳性，其中正交中的4/12显阳性，反交中的6/11显阳性。显示阳性的蛾区内进行了自交。以GFP基因为标志进行的第一次基因鉴定，结果表明：在进行转基因处理的当代，观察到“亮茧”的出现，提示GFP基因可能已进入了当代家蚕的染色体中，但这并不意味着GFP基因一定进入生殖细胞并可以遗传，只有通过检测后代才能筛选到GFP基因可遗传的蛾区。检测第2代蚁蚕时，仅1/2蛾区可检出GFP基因。由于可能存在一些假阴性，实际可遗传的比例应还高一些，但是在第二代进行蛾区的可遗传分析是必要的。在蚁蚕GFP基因PCR检测阳性的蛾区中进行自交、育种，其后代将按孟得尔规律遗传。
实施例3C
转基因家蚕的基因及蛋白质分析
1.基因鉴定
对初步筛选到得转基因家蚕进行进一步的PCR鉴定：以确定GFP基因是否正确地插入在外显子2和外显子3中，同源重组事件发生在同源染色体的一条上还是两条上，因而进一步基因鉴定的内容包括5＇、3＇的同源重组事件，GFP基因和3＇未重组事件。3＇未重组鉴定中，上游引物设计在内含子2中(引物7)，而下游引物设计在L3中(引物8)，这两个引物完全是轻链基因中的，如果PCR反应呈阳性则表明所鉴定到的个体中仍有未改变的轻链基因。进行重组鉴定的两组PCR实验中。5＇端的融合PCR鉴定中，一条引物设计在GFP基因中(引物12)，而另一条引物则设计在L2片段的上游(引物11)这样的PCR产物的出现可以说明5＇端的同源重组事件的发生。3＇端的融合PCR鉴定中，一条引物设计在GFP基因中(引物9)，而另一条引物则设计在L3片段的下游(引物10)这样的PCR产物的出现可以说明3＇端的同源重组事件的发生。发生了同源重组的轻链的部分序列已列出(见图17)，5＇同源重组事件PCR产物约1150bp，3＇同源重组事件PCR产物约1000bp，GFP基因PCR产物为700bp，未重组事件的PCR产物为400bp(在图16中有说明)。
上一代中GFP基因检测为阳性的家蚕自交后，其后代中选取一些蛾区，用约1/4的蚁蚕抽提DNA进行PCR鉴定。这里进行的是同源重组事件的基因鉴定，发现了一些阳性蛾区。对于来自于正交的后代，检测了17个蛾区，共检测出阳性蛾区7个；反交蛾区10个，检测出阳性蛾区1个。阳性蛾区继续饲养，而阴性蛾区则放弃饲养。
待五龄后，从阳性蛾区23N-2(23N表示其亲本交配的方式为雄性GFP基因阳性蚕蛾与雌性54A蚕蛾交配，2表示实验中的检测编号)内取了二十头家蚕取血进行了完整的PCR基因鉴定，结果见表4。首先所有的3＇未重组事件都检测到了阳性，说明这些个体中都有未发生改变的染色体存在。另外，这项PCR鉴定的结果也表明从蚕血抽提的DNA可以进行PCR反应。从鉴定结果中，可发现外源基因的重组情况是复杂的，有6个家蚕个体同时检出了5＇和3＇同源重组事件和GFP基因，由于前面提到的3＇未重组事件的出现可判定为杂合体，表中为加阴影的个体，其中A1的PCR鉴定电泳图谱见图8。有仅检出3＇同源重组事件的(如A3，A6)，也有仅检出5＇同源重组事件的(如A15，A16)。特别提出的是A18和A20，两侧的同源重组事件都检出了，而GFP基因却没有检出。依据PCR引物的设计来看，3＇和5＇同源重组事件的PCR鉴定中，各有一条引物设计在GFP基因内，因此若同源重组事件检测为阳性，GFP基因的检测也应为阳性。GFP基因的PCR阴性可能为假阴性。对于它们的后代还会继续关注、鉴定。以蚕血中抽提的DNA进行的PCR使得基因鉴定的结果不再是粗略的蛾区，而是家蚕个体。A1至A10为雌性家蚕，A11至A20为雄性家蚕。根据PCR检测的结果A17同A1、A17同A9进行了交配、制种。
                     表4.23N-2蛾区的个体PCR检测结果
编号 3＇-同源重组事件 3＇-未重组事件 GFP基因 5＇-同源重组事件
A1 + + + +
A2 + + + -
A3 + + - -
A4 + + + +
A5 + + + +
A6 + + - -
A7 + + + +
A8 - + - -
A9 + + + +
A10 + + - -
A11 + + - -
A13 + + - -
A14 + + - -
A15 - + - +
A16 - + - +
A17 + + + +
A18 + + - +
A19 - + - -
A20 + + - +
注：选取雌蚕(A1～A10)、雄蚕(A11～A20)各10头，在五龄时从尾角放血，利用血中抽提的DNA进行PCR鉴定。
2.蛋白质的ELISA鉴定
按实施例2中相同的方法，对上述进行PCR鉴定的这二十头家蚕相对应的部分蚕茧也进行了ELISA分析，结果见表5。A1、A4和A17在基因鉴定中被确定为杂合体，茧丝蛋白的用GFP抗体检测均为阳性。A7的家蚕经取血后，未能存活结茧，无法鉴定。A5和A9却未能检测出ELISA的阳性。虽然基因鉴定它们显示阳性，但由于GFP的表达是基因同源重组的下游事件，可能由于重组并不十分精确而导致GFP基因未能正确表达。对于A20，GFP基因鉴定中为阴性，但它的茧丝蛋白能与GFP抗体反应，证实了GFP基因PCR检测结果有假阴性的猜想。
               表5.23N-2蛾区中的蚕茧的ELISA鉴定结果
 样品 对照茧 A1  A4  A17  A20
 OD450  0.13  0.34  0.39  0.46  0.37
与对照茧的比值  1.00  2.63  3.04  3.63  2.86
上述分析中，丝胶、丝素的成份未得到分离。因此，按实施例2中相同的方法，进一步分离丝胶、丝素后进行分析。即用清水煮沸可以溶解丝胶，剩余的成份用6mol/LLiBr溶解、透析，其中主要是丝素成份但含有少量丝胶。这样简单分离后的样品进行ELISA分析，发现丝胶是不与抗体反应的，而丝素(混有少量丝胶)可以与抗体反应，那么可以与GFP抗体反应的是丝素的成份(见表6)。
           表6.蚕茧的丝胶、丝素蛋白成份进行ELISA鉴定结果
    样品     空白    54A丝胶   54A丝素    A1丝胶    A1丝素
    OD450     0.25     0.32     0.33     0.35     0.59
与空白的比值     1.00     1.29     1.36     1.44     2.39
从蛾区23N-2中选取一部分五龄家蚕，解剖获得中部丝腺，从中获取蛋白质进行了分析，其ELISA结果见表7。说明融合蛋白在后部丝腺中合成后，进入中部丝腺并参与泌丝最终出现在蚕茧中，与轻链蛋白经过了一样的生理过程。
  表7.五龄家蚕中部丝腺蛋白进行ELISA鉴定结果
样品 对照丝腺 丝腺1 丝腺2
 OD450  0.17  0.82  0.66
与对照丝腺的比值  1.00  4.94  3.99
实施例4
GFP-家蚕丝素蛋白轻链融合基因转基因蚕GFP-L67
在本实施例中，利用PCR扩增了轻链基因的2个片段L6和L7，GFP基因与L6中的外显子6和L7中的外显子7融合在一起，用电穿孔方法将这样的基因片段导入蚕卵中。家蚕经孵化、发育和结茧后，用紫外灯检察，在约9600颗茧中有260颗“亮茧”的出现。在G3代进行的基因鉴定中发现了5个阳性蛾区，证明了GFP基因的存在和证实了预想中的同源重组事件。
材料
用于扩增L6片段的PCR引物：
引物1：5＇-AAT CTGCAGTGATCCAGCTGATTGGTG-3＇(划线为PstI位点)
引物2：5＇-ATT AAGCTTTCCAAATAAGAATGTAA-3＇(划线为HindIII位点)
用于扩增L7片段的PCR引物：
引物3：5＇- AGATCTATATTGCACAAGCAGCCA-3＇(划线为BglII位点)
引物4：5＇-AT GAATTCCAACAGTACCGAAATCCAT-3＇(划线为EcoRI位点)
用于扩增GFP基因的PCR引物：
引物5：5＇-ATA CTGCAGAGCAAGGGCGAGGAACT-3＇(划线为PstI位点)
引物6：5＇-ATT AGATCTCCTTGTACAGCTCGTCCAT-3＇(划线为BglII位点)
鉴定未重组事件的引物：
引物7：5＇-CAGTCAACAGATATCGCC-3＇
引物8：5＇-GATAAGCTCATCTGTCCAA-3＇
鉴定同源重组事件5＇-端引物：
引物9：5＇-GCCAGCAGTGACTCTAGG-3＇
引物10：5＇-CATGGCACAGGGAGCTTTC-3＇
鉴定GFP基因的引物：
引物11：5＇-ATGAGCAAGGGCGAGGA-3＇
引物12：5＇-TTGTACAGCTCGTCCATG-3＇
实施例4A
同源重组质粒的构建
1.两个L-chain基因片段及GFP基因的克隆设计
依据Kikuchi等文献报道，家蚕丝素蛋白轻链基因共约14Kb，有7个外显子和6个内含子；编码262氨基酸残基，轻链蛋白的分子量约25KD。外显子3，5，6上个有一个Cys，其中外显子3和外显子5上的Cys形成链内二硫键，而外显子6上的Cys则与重链上的一个Cys形成链间二硫键。由于二硫键对于蛋白质空间结构的重要性，设计同源重组方案时，都避免改变它的二硫键。
设计了两对PCR引物扩增了两个L-chain的基因片段，分别称为L6、L7；L6起始于内含子5中，终止于外显子6，两条PCR引物上分别引入了HindIII和PstI位点，用于基因片段的克隆，PstI还兼顾与GFP基因的融合。L7起始于外显子7中，终止于3＇-非翻译区(见图22)；上游引物中有BglII的位点，下游引物中引入了EcoRI的位点，便于克隆。L6长约1200 bp，L7长约490 bp，在L6、L7之间会在同源重组中被替代的序列有约650bp，包括外显子6、7中的一部分和整个内含子6。以pGreen Lantern质粒为模板扩增GFP基因，引物上分别设计了PstI和BglII酶切位点，便于产物的克隆、与L6、L7基因片段融合。
按照上述的设计，外显子6编码的48个氨基酸残基保留了前端的45个，外显子7编码的31个氨基酸残基中保留了后端的11个残基。在发生同源重组之后的重组的GFP-轻链融合基因的部分序列在图23中显示。GFP基因两端的PstI和BglII用方框标记，在这两个位点附近的氨基酸序列也在图中显示。
2.质粒p67G的组装
以100ng家蚕基因组DNA为模板，通过PCR条件，扩增了L6和L7，以pGreenLantern为模板，扩增了GFP基因。L6的PCR产物两端有HindIII、PstI位点，克隆于pUC19中，为pL6；GFP基因的两端有PstI和BglII，但pUC19中没有BglII，克隆于PstI和SmaI之间，为pGFP；L7两端有BglII和EcoRI，克隆于SmaI和EcoRI之间，为pL7。而后，按图24所示程序，将L6、L7和GFP基因拼接起来组装成p67G供实施例4B使用。p67G经酶解鉴定正确(图25)。
实施例4B
外源基因的导入和转基因家蚕的初步筛选
利用电穿孔处理了约14600颗家蚕受精卵，其中有约9600颗孵化(孵化率为66％)，待家蚕发育、结茧后在紫外灯下进行观察，发现了一些“亮茧”的出现，约有260颗这样的“亮茧”，占孵化卵的3.0％。
实施例4C
转基因家蚕的基因鉴定
选取了22个“亮茧”，取出蚕蛾与54A家蚕进行交配，其中包括了正交(雌性54A蚕蛾×雄性“亮茧”蚕蛾)10对和反交(雌性“亮茧”蚕蛾×雄性54A蚕蛾)12对。待它们产下卵、孵化后，取约1/4的蚁蚕抽提DNA进行GFP基因的检测。约有一半的蛾区显示出阳性。其中正交中的6/10显阳性，反交中的5/12显阳性。显示阳性的蛾区内进行了自交，以GFP基因为标志进行了第一次基因鉴定。
在进行转基因处理的当代，观察到了“亮茧”的存在，这提示GFP基因可能进入了当代家蚕的染色体中，但这并不意味着GFP基因一定可以遗传，只有通过检测后代才能筛选到GFP基因可遗传的蛾区。检测后代蚁蚕时，仅1/2蛾区可检出GFP基因。
对于GFP基因PCR检测呈阳性的家蚕后代，希望能进一步检测GFP基因是否正确地整合于轻链基因外显子6和7之间。设计了引物9和10，引物10位于GFP基因内侧，引物9位于片段L6的外侧，这个PCR产物用于说明5＇同源重组事件的发生。另外，引物7位于L6片段内，而引物8位于被预想剔除的内含子6之中，这个PCR产物的出现将说明存在未被改变的同源染色体(见图26.)。
从GFP基因PCR检测呈阳性的蛾区内取约1/4的蚁蚕进行3＇-端同源重组事件的基因鉴定，发现了一些蛾区内的蚁蚕DNA可扩增出代表同源重组事件的PCR产物。亲本为正交的鉴定了12个蛾区，仅一个蛾区呈阳性；反交鉴定了14个蛾区，4个蛾区呈阳性。预想中发生了同源重组的轻链的部分序列已列出(见图23)，从中可以计算出5＇-同源重组事件PCR产物为1400bp。PCR鉴定的电泳图谱见图27。
讨论
本发明与Yamao的工作都是针对家蚕丝素蛋白轻链基因进行基因打靶。Yamao等解剖五龄家蚕观察到了能发绿色荧光的丝腺，利用PCR和Southern杂交证明了同源重组事件的发生，同时在分析茧蛋白时发现了与GFP抗体反应的52KD的蛋白质。但不能观察到茧的任何变化。
本发明同Yamao的相比较有所不同：1)使用了不同的同源重组和融合的方式。在本工作中GFP融合于外显子2、3中(去除外显子2中的13个氨基酸残基、去除外显子3的19个氨基酸残基和内含子2)，或外显子6、7中(去除外显子6中的3个氨基酸残基、去除外显子7的20个氨基酸残基和整个内含子6；)，融合蛋白都利用轻链基因自身的翻译终止密码子TAA。Yamao等用重组AcNPV攻击幼虫，重组AcNPV中的GFP基因放置于轻链基因外显子7中，5＇-端与外显子7融合，3＇-端利用GFP基因自身的TGA为翻译的终止密码子，融合蛋白将丢掉外显子7末端的19个氨基酸残基。2)本发明中使用电穿孔的基因转移方式，外源基因经过酶解处理。受精初期的蚕卵为单细胞，在单细胞时发生同源重组才可得到能遗传的转基因蚕，即丝腺细胞和生殖细胞具有相同的基因组。Yamao的实验则使用NPV介导的方式。在五龄的第一天攻击家蚕，NPV能进入生殖细胞且发生同源重组并遗传给后代。3)不同的筛选方式。本发明依据出现的新表型“亮茧”进行，而他们直接对下一代家蚕进行PCR鉴定，工作量大。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息：(i)申请人：中国科学院上海生物化学研究所(ii)发明名称：利用家蚕生产非天然蚕丝的方法(iii)序列数目：1(2)SEQ ID N0.1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：655个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO.4

Claims (13)

1.一种蚕丝，其特征在于，它基本上由重组的家蚕丝素蛋白构成，所述的重组的家蚕丝素蛋白具有修饰或改变的重链和/或轻链，
其中所述的修饰或改变的重链在重组家蚕丝素蛋白的重链的N端非结晶区和C端非结晶区中保留天然家蚕丝素蛋白中相应的天然序列，并且在重组家蚕丝素蛋白的中间结晶区中插入了选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白，
和/或重组家蚕丝素蛋白的部分或全部的中间结晶区被选自下组的外源蛋白或其片段置换：蜘蛛拖牵丝蛋白、修饰的蚕丝素蛋白结晶区、蜘蛛丝-蚕丝混合丝蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白；
其中所述的修饰或改变的轻链包括在轻链的外显子中插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白。
2.如权利要求1所述的蚕丝，其特征在于，所述的重组家蚕丝素蛋白的全部的中间结晶区被蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白所置换。
3.如权利要求1或2所述的蚕丝，其特征在于，所述的蜘蛛拖牵丝蛋白的长度为800氨基酸或更多，并且具有8个重复单元或更多。
4.如权利要求2所述的蚕丝，其特征在于，所述的蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白融合蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的蚕丝，其特征在于，其中所述的重组家蚕丝素蛋白的轻链具有选自下组的修饰：
(1)在外显子2和3之间插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白；
(2)在外显子6和7之间插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白；
6.一种家蚕丝素蛋白，其特征在于，所述的家蚕丝素蛋白具有修饰或改变的重链和/或轻链，
其中所述的修饰或改变的重链是在重组家蚕丝素蛋白的重链的N端非结晶区和C端非结晶区中保留天然家蚕丝素蛋白中相应的天然序列，并且在重组家蚕丝素蛋白的中间结晶区中插入了选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白，蜘蛛拖牵丝蛋白，
和/或重组家蚕丝素蛋白的部分或全部的中间结晶区被选自下组的外源蛋白或其片段置换：蜘蛛拖牵丝蛋白、修饰的蚕丝素蛋白结晶区、蜘蛛丝-蚕丝混合丝蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白-绿色荧光蛋白的融合蛋白；
其中所述的修饰或改变的轻链包括在轻链的外显子中插入选自下组的外源蛋白或其片段：绿色荧光蛋白、蜘蛛拖牵丝蛋白。
7.一种核酸分子，其特征在于，它编码权利要求6中所述的家蚕丝素蛋白的修饰或改变的重链和/或轻链。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体。
10.一种转基因家蚕，其特征在于，它合成、分泌、吐出权利要求1所述的蚕丝。
11.一种产生权利要求1所述蚕丝的方法，其特征在于，培养权利要求10所述的转基因家蚕使其分泌蚕丝，以获得蚕丝。
12.一种产生转基因家蚕的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一融合基因，该基因含有融合的蜘蛛拖牵丝基因和报告基因，并且在融合基因的5＇端和3＇端侧分别接家蚕丝素蛋白重链5＇端和3＇端序列，
(b)将步骤(a)中的融合基因导入家蚕的蚕卵；
(c)使步骤(b)中的蚕卵孵化、发育和结茧；
(d)鉴别基因组中整合有融合基因的家蚕，从而获得转基因家蚕。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的报告基因是绿色荧光蛋白；在步骤(b)中通过电穿孔法将融合基因导入家蚕的蚕卵；和步骤(d)中鉴别的进行是通过在紫外光下筛选亮茧。
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