CN1438239A - 一种新型荧光蛋白,编码其的多核苷酸序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中I11、V14、I16、F64、S65、Y66、Q69、T203、和/或F220位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列。本发明的荧光蛋白来自对来自大型多管水母的野生型绿色荧光蛋白多肽的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的激发和发射光谱，即具有不同的颜色，可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。

Description

一种新型荧光蛋白，编码其的多核苷酸序列及其用途

发明领域

本发明提供了一种新的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中I11、V14、I16、F64、S65、Y66、Q69、T203、和/或F220位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列。本发明的荧光蛋白来自对来自大型多管水母的野生型绿色荧光蛋白多肽的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的激发和发射光谱，即具有不同的颜色，可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。

发明背景

发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)存在于发光水母体内，在紫外光或蓝光照射下会发出绿色荧光，是近年来出现的一种革命性的标记分子，已被大量应用于由病毒、细菌、真菌、植物、低等动物到哺乳动物等多种生命形式的多个领域的研究中。

1992年，Prasher等首先从美国西海岸附近水域的发光水母中克隆出gfp基因的全长cDNA及大部分基因组DNA[(Prasher，D.C.，Eckenrode，V.K.，Ward，W.W.，et al.，Gene，111：229-233(1992))。在Chalfie等首先异源表达出野生型gfp基因之后不久，美国Tsien研究小组就通过随机突变从表达gfp的大肠杆菌中筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的gfp变体，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有所改变的gfp变体，如荧光强度增强的GFP(EGFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP等[Heim，R.，Prasher，D.C.，and Tsien，R.Y.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12501-12504(1994)，Heim，R.，Cubitt，A.B.，Tsien，R.Y.，Nature，373：663-664(1995)]。Tsien研究小组还在用X-衍射分析了GFP的晶体结构后，预测出将第203位的苏氨酸替换为组氨酸、酪氨酸等极性芳香族氨基酸有可能改变GFP的发射峰，据此进行了定向突变，产生出发射峰移至527nm左右的黄色荧光蛋白(YFP)。这些变体GFP与野生型GFP都只有几个氨基酸的差别，而且许多位点的变异的效应可以叠加。

2000年，本发明人采用聚合酶链式反应(PCR)与Southern杂交相结合的方法，已经分离出大型多管水母的绿色荧光蛋白基因gfpxm的DNA序列(GenBan k：AY013821)和cDNA序列(GenBank：AY013824)，并由GFPxm基因的cDNA序列推测出氨基酸序列(分别见SEQ ID NO：1和2)。在此基础上，以序列SEQ ID NO：1为模板，采用设计了aa64-66的简并性引物，通过定点随机突变的方法来筛选荧光强度提高或光谱发生变化或可溶性提高的GFPxm变体，得到了分别命名为GFPxm16(GenBank：AY013825)、GFPxm18(GenBank：AY013826)、GFPxm19(GenBank：AY013827)的3种变体。

为了进一步获得新的具有不同荧光光谱或荧光强度增强的GFPxm变体，以用于诸如细胞生物学、发育生物学、免疫学等生命科学领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记，本发明人采用新型体外突变技术-DNA重排(DNA shuffling)技术结合基因突变技术，对现有的野生型GFP xm及其变体GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19进行改造，从而实现了本发明的目的。

发明概述

本发明的一个方面，提供了一种新的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中I11、V14、I16、F64、S65、Y66、Q69、T203、和/或F220位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。与亲本蛋白相比，所述荧光蛋白激发峰向长波长或短波长移动。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，Q69L，和T203C。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65A，T203H，F220L。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65A，T203H。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L，T203Y。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：7F64L，S65G，T203L。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65G，T203F。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65G，T203Y。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：S65G。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中65位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：S65G，S65T或S65A。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中65位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：T203L，T203C，T203F，T203Y，T203H或T203W。

此外，本发明还提供了编码根据上述任一项荧光蛋白之多核苷酸序列。

本发明的又一方面，还提供了上述任一项荧光蛋白用作检测细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化、发育的标记的用途。发明详述

基因突变技术是研究基因功能和改良蛋白质性能的一种重要手段，传统上应用于基因突变的方法主要有两种，一是致错PCR(error-pronePCR)技术，二是盒式突变(cassette mutation)技术，对克隆化的靶序列进行随机突变或定点突变。但这两种技术均存在不足之处：致错PCR所用的酶聚合能力差，利用该技术所产生的点突变并非完全随机，且中性突变多，此外致错PCR靶序列的长度有限，大都不超过0.5-1Kb；盒式突变的突变效能往往取决于寡核苷酸序列的数目及长短，而且还会出现统计学上的瓶颈效应。

近几年发展起来的新型体外突变技术DNA重排技术则是一种利用多次、反复选择和重组以获得具有预期性状的多聚核苷酸的方法。利用随机化片段的重新排列组合产生多样化的突变正是DNA重排技术的精髓所在，这一点类似拉链PCR(assembly PCR)。其优点是：可以实现同源序列间的重组，并可能实现那些对进化有利的点突变的优化组合，最终获得性状改良比较理想的突变体。

需要说明，在本发明的描述中，用单字母符号表示氨基酸，氨基酸单字符后具体的数字表示该氨基酸在序列中的相应位置，数字后的单字符表示替换数字前氨基酸的具体氨基酸。例如，F64L，表示该序列中第64位氨基酸F被氨基酸L替换。

本发明采用前面所述的基因突变技术，对已有的野生型GFPxm及三种变体GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19进行进一步改造，获得了大量具有不同荧光光谱或荧光强度增强的多种新的荧光蛋白。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种新的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中I11、V14、I16、F64、S65、Y66、Q69、T203、和/或F220位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。与亲本蛋白相比，所述新的荧光蛋白激发峰发生了向长波长或短波长的移动。本领域技术人员知晓，此处所述的荧光蛋白激发峰的变化相应于其荧光颜色。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，Q69L，和T203C。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65A，T203H，F220L。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65A，T203H。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L，T203Y。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：7F64L，S65G，T203L。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65G，T203F。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：F64L，S65G，T203Y。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：S65G。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中65位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：S65G，S65T或S65A。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中65位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成的荧光蛋白：T203L，T203C，T203F，T203Y，T203H或T203W。

表1中概述了本发明所述新的荧光蛋白的具体荧光特征。

           表1   GFPxm及其突变型的荧光特征

                                              λ_发射 量子  相对荧

突变                  通用名       λ_激发/nm

                                               /nm     产率  光强度^*F64L                   GFPxm19uv         393(476)    505            100F64L Q69L T203C        GFPxm191uv        498(394)    510             23F64L S65A T203H F220L  GFPxm181uv        398(500)    514I11V V14I I16V         ShG24               486       506             60F64L S65G Q69LF64L S65G T203L        GFPxm161            500       511             -F64L S65A T203H        GFPxm18uv           400       513F64L S65G T203F        GFPxm162            514       525             11F64L S65G T203Y        GFPxm163            520       530     1      100I11V V14I I16V         OFPxm               509       523    0.25    3.5F64L S65G Q69L T203Y

^*37℃表达的结果，以最高的荧光强度为100，不同的种类之间不能比较。第一类的荧光强度测定均以紫外光激发。“-”表示极低，其余相应参数未测。

此外，本发明所要求保护的范围还涉及编码根据上述任一项荧光蛋白之多核苷酸序列。本领域技术人员知晓，由于遗传密码的简并性，因此，根据上述氨基酸序列可以推导出一种以上的相应的多核苷酸序列，这些序列均包含在本发明的范围之内。此外，本领域技术人员知晓，在编码上述任一项荧光蛋白的氨基酸序列中，对本发明所特别指出的特定氨基酸位点之外的其他氨基酸序列可以进行保守性的氨基酸替换、添加或缺失，得到本发明所述荧光蛋白质的保守性变体，只要经修饰的氨基酸序列保持或基本上保持本发明蛋白的荧光性质。这些蛋白质保守性变体以及编码这些蛋白质变体的相应的多核苷酸序列均包含在本发明的范围之内。

在本发明的一个具体实施方案中，还提供了上述任一项荧光蛋白用作检测细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化、发育的标记的用途。

已知GFP荧光结构的形成是一个自催化的过程，仅由其一级结构决定，因此几乎可在所有生命形式中进行多种异源表达；众多研究都已表明GFP的表达对细胞的功能和生长、分化没有明显干扰，只有在表达量很大时少数细胞的生长会有所减缓；GFP的N端和C端都可以与其他蛋白进行嵌合表达而保留其荧光活性；许多重要的蛋白如P53、蛋白激酶C(PKC)、钙调素等与GFP融合表达后，蛋白的生物活性基本上不受影响；GFP的荧光很稳定，不易发生光漂白。这些特性使得GFP成为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。

Gfpxm的变体可作为细胞内基因表达的报告基因，研究基因表达的调控。GFPxm的检测极其方便，一旦正确折叠形成晶体，利用长波紫外光或蓝光激发就可以检测到它的表达，因此gpfxm及其变体作为报告基因体现出其他需要底物、辅助因子的报告基因所不具备的优越性。可以构建各种缺省了启动子或增强子序列的gfpxm载体，利用它们来测定组织特异性启动子和特殊的增强子。

利用已知技术易于将编码其他蛋白和合成多肽的核苷酸序列与gfpxm DNA突变体在氨基末端或羧基末端相连，从而制备融合蛋白。通过基因融合的荧光标记具有位点特异性，且不需在体外纯化和标记蛋白再注射至细胞中。GFPxm及其变体可作为其他蛋白的分子标记，与其他蛋白融合表达，进行细胞内定位，或观察蛋白在细胞内的动力学过程，亦可作为细胞标记，观察细胞的生长、分化和发育。作为遗传标记，用这种方式筛选标记的细胞或生物体，如荧光激活细胞的分选。

GFPxm及其变体作为蛋白标记，可用于体外蛋白质相互作用研究。GFPxm及其变体可应用于免疫荧光试验，荧光免疫检测技术在临床免疫学领域已成为取代放射免疫检测的另一种方法，具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点，可用来测量含量很低的生物活性化合物，如蛋白质(酶、接受体、抗体)、药物及微生物等。

GFPxm及其变体可应用于荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)技术，应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析等许多方面。通过定点突变或DNA重排等方式，得到了多种荧光光谱不同或量子产率更高的荧光蛋白，这样，就产生了许多新的FRET能量供受体对，它们适合于活体观察，通过基因工程的手段可以与各种感兴趣的蛋白融合表达，其特异性远远高于化学标记法。迄今为止，荧光蛋白是唯一的一种活体标记物，特别适用于观察活体内生物反应的动态变化；其融合蛋白用于体外研究，由于标记的特异性不需要高度纯化就能加以应用。FRET除了用于研究生物大分子的结构功能之外，还可能用于细胞器功能研究、细胞信号传导以至对在自然环境中的生活细胞进行分析。而在核酸检测、免疫测定、生物大分子相互作用的测定方面也会出现更多的实际应用价值，联系目前迅速发展的PCR-ELISA、生物芯片等技术，FRET将对生物检测的发展起到巨大的推动作用。

不同光谱特征的多种形式的GFPs的获得将易于同时研究不同基因的表达，进行两种或以上蛋白的示踪，应用于药物筛选、细胞信号传导、多种细胞因子的作用、发育生物学等多方面的研究。如欲筛选一种药物，这种药物只能特异性地激活基因A的表达而不激活基因B，则可将一种颜色的GFP cDNA融合于基因A启动子区域，融合另一种颜色GFPcDNA至基因B启动子区域。共转染至目的细胞，检测候选药物是否激活目的颜色，而不是另一种颜色。同理，可以通过两种颜色的同时出现来检测测A和B的同时表达。

测定重组蛋白C和D在细胞或机体的生成和定位的准确时间和空间关系，将不同颜色的GFPs融合于C和D蛋白，测定2种不同颜色荧光在同一细胞或机体中的出现，从而比较对照C、D的生成、定位，不受生物个体差异性影响因而更为准确。

附图说明：

图1：显示ShG24蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图1可看到，本发明ShG24蛋白的激发峰为485nm，发射峰为505nm。

图2：显示xm19uv蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图2可看到，本发明xm19uv蛋白的荧光光谱具有两个激发峰，主峰为393nm，次峰为476nm，发射峰为505nm。

图3：显示xm161蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图3可看到，本发明xm161蛋白的激发峰为500nm，发射峰为511nm。

图4：显示xm162蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图4可看到，本发明xm162蛋白的激发峰为513nm，发射峰为527nm。

图5：显示xm163蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图5可看到，本发明xm163蛋白的激发峰为520nm，发射峰为530nm。

图6：显示xm191uv蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图6可看到，本发明xm191uv蛋白具有两个激发峰，主峰为498nm，次峰为394nm，发射峰为510nm。

图7：显示OFPxm蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图7可看到，本发明OFPxm蛋白的激发峰为509nm，发射峰为523nm。

图8：显示GFPxm18uv蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图7可看到，本发明GFPxm18uv蛋白的激发峰为400nm，发射峰为513nm。

图9：显示GFPxm181uv蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图7可看到，本发明GFPxm181uv蛋白具有两个激发峰，主峰为398nm，次峰为500nm，发射峰为514nm。

图10：不同诱导温度下GFPxm突变型的相对荧光强度。

图11：表达时间对GFPxm突变型荧光强度的影响。

下面将结合附图及实施例对本发明进行进一步的例示性说明，而并非意在对本发明保护范围的限定。

实施例

除非特别指明，本发明中所进行的分子生物学操作，例如DNA的获取、转化、PCR扩增等基本上按照J.Sambrook，等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Frederick M.Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，3^rd，John Wiley & Sons，Inc.，1995。所述酶学以及其他相关操作，除非特别指明，均依照供应商指示进行。

实施例1

含有编码GFP突变型GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的多核苷酸序列之质粒pTO-T7GFPxm16、pTO-T7GFPxm18、pTO-T7GFPxm19的制备

设计aa64-66的兼并引物，用PCR方法对GFPxm进行定点突变，以期得到荧光性质或蛋白可溶性有所提高的变异型GFPxm。以质粒pTGFPxm为模板，利用aa64-66的兼并引物进行盒式PCR突变。用xyF1-fpR、fpF-xyR1两对引物分别PCR扩增出部分重叠的两个片段，xyF1的序列为5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’(SEQ ID NO 26)。xyR1的序列为5’-AAC AGC TAT GAC CAT G-3’(SEQ ID NO 27)，fpF的序列为5’-G CCA ACA CTT GTT ACT ACA(C/T)T(C/G)(G/A)(C/G)C(C/T)(G/A)(C/G)GGC ATC CAA TGT TTC GC-3’(SEQ IDNO 28)，fpR的序列为5’-TGT AGT AAC AAG TGT TGG C-3’(SEQID NO 29)。PCR反应条件为：94℃ 5min，94℃ 40”55℃ 40”72℃ 50”25个循环，72℃ 10min，4℃-。分别回收这两个片段，再直接以这两个片段为引物和模板，在重叠部分退火的基础上向两端延伸，PCR条件同上，循环数为15。由此获得引入了核苷酸位点突变的128种不同GFPxm的混合PCR产物，此混合PCR产物的序列两端还带有部分pMD18-T载体的序列。回收带有突变的混合PCR产物，再经BamH/HindIII双酶切，克隆至相同酶切的pTO-T7载体中。连接物转化至大肠杆菌中，挑取大量单菌落分别进行培养并在630℃诱导表达5小时后，用荧光全谱仪测定荧光光谱和荧光强度。从约5700个单菌落中筛选出了一些蛋白可溶性有所提高的GFPxm突变型，其中有3种突变型尤为为突出，分别命名为GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19。得到含有相应多核苷酸序列的质粒，分别命名为pTO-T7GFPxm16、pTO-T7GFPxm18、pTO-T7GFPxm19。

实施例2突变型ShG24的获得

应用DNA重排的方法对八种已知的GFP野生型和突变型进行突变，以期获得荧光光谱变异的突变型。

分别在上下游引物中设计BamHI、HindIII位点，以质粒pEGFP、pEYFP、pEGFPuV、pBFP为模板(购自CloneTech公司)，分别扩增出EGFP、YFP、GFPuv、BFP基因片段。5′端引物为5’-GGA TCC ATGGTG AGC AAG GGC GAG-3’(SEQ ID NO：12)，3′端引物为5’-AAGCTT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CA-3’(SEQ ID NO：13)。反应条件为94℃5′，94℃40″55℃35″72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。用DNA凝胶柱回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)分别回收4条DNA片段，再分别连接到pMD-18T(购自大连宝生物公司)载体。连接物转化市售的ER2566菌株，挑单菌落至4ml LB液体培养基中(含Kan100ug/ml)，37℃振荡培养过夜，菌液OD600值达0.8左右，0.2mmol/L的IPTG诱导，25℃表达8hr后即观察菌液颜色，EGFP、GFPuv在正向插入时能正确表达出绿色的荧光蛋白，YFP在正向插入时能正确表达出黄色荧光蛋白，从而使菌体呈现出相应的颜色。BFP的荧光较弱，因此用荧光全谱仪(Lumex，FLU-02型)检测其表达。各选择有表达的菌体提取质粒，分别得到pTEGFP、pTYFP、pTGFPuv、pTBFP正向插入质粒。

同理，分别以实施例1所述制备的质粒pTO-T7GFPxm16、pTO-T7GFPxm18、pTO-T7GFPxm19为模板扩增GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19片段，5′端引物为5′-GGA TCC ATG AGT AAA GGAGAA GAA C-3′(SEQ ID NO：14)，3′端引物为5′-GTG TCAATTGGA AGT CTG G-3′(SEQ ID NO：15)。反应条件同上。

同样分别回收并克隆至pMD-18 T载体，表达筛选正向插入克隆。

由此获得8种带有不同GFP基因的质粒pTYFP、pTEGFP、pTGFPuV、pTBFP、pTGFPxm、pTGFPxm16、pTGFPxm18、pTGFPxm19，取等量的8种质粒混匀，即为DNA重排的模板。以一对M13引物进行PCR扩增，得到8种基因的DNA混合物。5′端引物为5’-AAC AGC TAT GAC CAT G-3’(SEQ ID NO：16)，3′端引物为5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’(SEQ ID NO：17)。PCR扩增条件为94℃ 5′，94℃ 40″55℃ 35″72℃ 50″，35个循环，72℃延伸10′。PCR产物经凝胶电泳回收，去除引物及二聚体。回收DNA用DnaseI消化，条件为5ug以上的片段用0.15u DNaseI室温消化5分钟，立即凝胶电泳回收。

用低融点胶回收50-300bp片段，再取回收片段进行第一次PCR扩增，不加引物。PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″45℃50″72℃30″，40个循环，72℃延伸10′。然后取第一次PCR扩增产物为模板，以M13引物为引物进行第二次PCR扩增，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″57℃35″72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。回收约800bp片段，用BamHI/HindIII双酶切，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表达载体(购自Clonetech)，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3mlLB液培的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。经过大量筛选，获得了11株荧光光谱有所变异的突变型，对其中的6株突变型进行测序。

荧光蛋白EGFP、YFP、GFPuv、BFP均为野生型GFP的变体，相互之间只有几个氨基酸的差异，核苷酸序列同源性在95％以上。GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19则为GFPxm的突变型，核苷酸序列同源性在95％以上，而GFPxm与wtGFP的核苷酸序列同源性仅为82％左右。测序结果发现2类GFP的核苷酸序列之间没有进行同源重组。其中氨基酸组成变化相对较大的一种变体为ShG24(见SEQ IDNO：3)，相对于野生型GFPxm，其突变氨基酸有I11V、V14I、I16V、F64L、S65G、Q69L。其荧光光谱的激发峰为486nm，发射峰为506nm。实施例3突变型OFPxm的获得

采用盒式突变方法对如实施例2所得的ShG24的第203位氨基酸进行突变。这一突变型基因位于pTO-T7载体的BamHI/HindIII的位点上。设计并合成四条特异性引物203F 5’-CCA ATC AAT CAC TAC CTATCC(T/C)(A/G/T)(T/G)CAA ACA GCC-3’(SEQ ID No：18)，203R5’-GGA TAG GTA GTG ATT GAT TGG-3’(SEQ ID NO：19)。T7F5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’(SEQ ID NO：20)，T7T 5’-CTAGTT ATT GCT CAG CGG-3’(SEQ ID NO：21)。分别以2对引物对T7F/203R、203F/T7T扩增出基因的2个片段，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10’。分别凝胶电泳回收2片段。再取等量的两个片段在PCR标准体系中反应，不加引物，使2个片段重叠延伸成一条完整基因。反应条件为94℃3′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，30个循环，72℃延伸10′。再取其产物为模板进行PCR扩增，加入引物对T7F/T7T，反应条件为94℃3′，94℃40″，55℃35″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。凝胶电泳回收PCR产物，BamHI/HindIII双酶切的pTO-T7载体，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。

经盒式突变在203位氨基酸处引入了八种氨基酸替换方式，即T203Y、C、F、H、R、L、Q、或W。结果获得1种荧光光谱变异的突变型OFPxm(见SEQ ID NO：4)，测序并推测其氨基酸序列。突变型OFPxm相对于野生型GFPxm，其氨基酸突变有I11V、V14I、I16V、F64L、S65G、Q69L、T203Y，其荧光光谱的激发峰为509nm，发射峰为523nm。OFPxm的荧光颜色为明亮的橙色，明显不同于所有已知的GFP突变型。

实施例4突变型GFPxm161、GFPxm162、GFPxm163的获得

采用盒式突变方法对GFPxm16的第203位氨基酸进行突变，方法同

实施例3。

GFPxm突变型基因位于pTO-T7载体的BamHI/HindIII的位点上。分别以2对引物对T7F/203R、203F/T7T扩增出GFPxm的2个片段，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10’。分别凝胶电泳回收2片段。再取等量的两个片段在PCR标准体系中反应，不加引物，使2个片段重叠延伸成一条完整基因。反应条件为94℃3′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，30个循环，72℃延伸10′。再取其产物为模板进行PCR扩增，加入引物对T7F/T7T，反应条件为94℃3′，94℃40″，55℃35″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。凝胶电泳回收PCR产物，BamHI/HindIII双酶切的pTO-T7载体，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。

经盒式突变在203位氨基酸处引入了八种氨基酸替换方式，即T203Y、C、F、H、R、L、Q、或W。结果获得3种荧光光谱变异的突变型，测序并推测其氨基酸序列。由GFPxm16而获得三种突变型--GFPxm161(见SEQ ID NO：5)、GFPxm162(见SEQ ID NO：6)、GFPxm163(见SEQ ID NO：7)。GFPxm161相对于野生型GFPxm的氨基酸突变有F64L、S65G、T203L，其荧光光谱的激发峰为500nm，发射峰为511nm。GFPxm162相对于野生型GFPxm的氨基酸突变有F64L、S65G、T203F，其荧光光谱的激发峰为513nm，发射峰为527nm。GFPxm163相对于野生型GFPxm的氨基酸突变有F64L、S65G、T203Y，其荧光光谱的激发峰为520nm，发射峰为530nm。

实施例5突变型GFPxm19uv的获得

采用盒式突变方法对GFPxm19的第66和69位氨基酸进行突变。GFPxm19突变型基因位于pTO-T7载体的BamHI/HindIII的位点上。设计并合成四条特异性引物，66F 5’-CA CTT GTT ACT ACA TTC TCT(C/T)(A/G)(T/G)GGC ATC C(T/A)A TGT TTC GC-3’(SEQ ID NO：22)，66R 5’-AGA GAA TGT AGT AAC AAG TG-3’(SEQ ID NO：23)，T7F 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’(SEQ ID NO：24)，T7T5’-CTA GTT ATT GCT CAG CGG-3’(SEQ ID NO：25)。分别以2对引物对T7F/66R、66F/T7T扩增出基因的2个片段，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10’。分别凝胶电泳回收各片段。再取等量的两个片段在PCR标准体系中反应，不加引物，使2个片段重叠延伸成一条完整基因。反应条件为94℃3′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，30个循环，72℃延伸10′。再取其产物为模板进行PCR扩增，加入引物对T7F/T7T，反应条件为94℃3′，94℃40″，55℃35″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。凝胶电泳回收PCR产物，用BamHI/HindIII双酶切后连至相同酶切的pTO-T7载体，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。

经盒式突变在66位氨基酸处引入了五种氨基酸替换方式，即Y66H、W、C、Q、或R，在69位氨基酸处引入了一种氨基酸取代方式，即L69Q。结果从中筛选出1种荧光光谱变异的突变型GFPxm19uv(见SEQ IDNO：8)，测序并推测其氨基酸序列。相对于GFPxm的氨基酸序列，GFPxm19uv的氨基酸突变为F64L，其荧光光谱具有两个激发峰，主峰为393nm，次峰为476nm，发射峰为505nm。

实施例6突变型GFPxm191uv的获得

采用盒式突变方法对GFPxm19的第203位氨基酸进行突变。方法同

实施例3。

分别以2对引物对T7F/203R、203F/T7T扩增出基因的2个片段，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10’。分别凝胶电泳回收各片段。再取等量的两个片段在PCR标准体系中反应，不加引物，使2个片段重叠延伸成一条完整基因。反应条件为94℃3′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，30个循环，72℃延伸10′。再取其产物为模板进行PCR扩增，加入引物对T7F/T7T，反应条件为94℃3′，94℃40″，55℃35″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。凝胶电泳回收PCR产物，BamHI/HindIII双酶切的pTO-T7载体，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。

同样经盒式突变在203位氨基酸处引入了八种氨基酸替换方式，即T203Y、C、F、H、R、L、Q、或W。结果获得1种荧光光谱变异的突变型，测序并推测其氨基酸序列。由GFPxm19获得的突变型为GFPxm191uv(见SEQ ID NO：9)，相对于野生型GFPxm，氨基酸突变位点有F64L、Q69L、T203C，其荧光光谱的激发峰肩峰为394nm，主峰为498nm，发射峰为510nm。

实施例7突变型GFPxm18uv、GFPxm181uv的获得

采用盒式突变方法对GFPxm18的第203位氨基酸进行突变，方法同

实施例3。

GFPxm18突变型基因位于pTO-T7载体的BamHI/HindIII的位点上。分别以2对引物对T7F/203R、203F/T7T扩增出GFPxm的2个片段，PCR扩增条件为94℃5′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10’。分别凝胶电泳回收2片段。再取等量的两个片段在PCR标准体系中反应，不加引物，使2个片段重叠延伸成一条完整基因。反应条件为94℃3′，94℃40″，52℃40″，72℃50″，30个循环，72℃延伸10′。再取其产物为模板进行PCR扩增，加入引物对T7F/T7T，反应条件为94℃3′，94℃40″，55℃35″，72℃50″，35个循环，72℃延伸10′。凝胶电泳回收PCR产物，BamHI/HindIII双酶切的pTO-T7载体，连接物转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.8左右时，以IPTG诱导，室温诱导6小时以上，用荧光全谱仪直接测定菌株的荧光光谱。

经盒式突变在203位氨基酸处引入了八种氨基酸替换方式，即T203Y、C、F、H、R、L、Q、或W。结果获得2种荧光光谱变异的突变型，测序并推测其氨基酸序列。由GFPxm18而获得二种突变型--GFPxm18uv(见SEQ ID NO：10)、GFPxm181uv(见SEQ IDNO：11)。GFPxm18uv的氨基酸突变为F64L、S65A、T203H，其荧光光谱的激发峰为400nm，发射峰为513nm。GFPxm181uv的氨基酸突变为F64L、S65A、T203H、T220L，其荧光光谱的激发主峰为398nm，次峰为500nm，发射峰为514nm。T220L的突变估计由PCR错配而引起。

实施例8

表达温度GFPxm突变型的表达量和荧光强度的影响

将如前述实施例得到的各个表达质粒分别转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液培的试管中，37℃摇床培养到OD600为0.2-0.3左右时，以IPTG诱导，分别于25℃、32℃、37℃、42℃表达6小时。将所有样品的OD600调至0.225。用F-4500荧光光度计测定样品的荧光强度(激发和发射狭缝为5nm)。菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用UVIband进行蛋白含量分析(UVIBAND software for windows，V.99)，样品总蛋量以100计。样品的相对荧光强度是以样品荧光强度除以蛋白含量所得到的数值。

结果如下表2所示，除GFPxm163和EYFP的表达量偏低外，其余各类型在25℃的表达量在20左右，而在表达温度升高至32℃以上时，表达量相应升至30左右。表2 GFPxm及其突变型在不同温度条件下表达的荧光强度和蛋白含量

            25℃          32℃          37℃          42℃GFP及其突

         荧光   蛋白   荧光   蛋白   荧光   蛋白   荧光   蛋白变型

         强度   含量   强度   含量   强度   含量   强度   含量GFPxm      2161   24.2   236    32.5   157    31.5   62.8   32.6GFPxm16    13138  23.4   13170  28.3   8286   27.6   4809   28.9GFPxm18    16240  23.8   16038  31     12390  30.9   3109   33GFPxm19    11672  18.2   14818  24     7300   25     709    24.3GFPxm162   2857   23.4   4702   33.5   5247   31.7   3489   33.4GFPxm163   24388  11     25353  15.5   26488  18.1   15009  15.3OFPxm      1920   22.8   1646   30.4   1497   29.6   879    28.7GFPxm19uv  7626   22.9   5870   30     4032   31.9   565    26GFPuv      8615   20.2   8406   31.3   8944   34.7   4263   25.1EGFP       9104   16.3   7112   26.4   8175   25.9   2205   29.7EYFP       31940  12.7   32816  14.2   29821  13.8   25244  13.8

荧光强度与相应的蛋白含量相比得到相对荧光强度，可粗略地反映出各类型GFP在不同温度条件表达时的蛋白可溶性，即翻译后蛋白质正确折叠成具有荧光功能的形式的能力。结果如图10所示，除GFPxm162以外，几乎所有类型的GFP的相对荧光强度随温度的升高而下降。在25、32和37℃条件下，GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度高于EGFP，其中37℃条件下GFPxm18的相对荧光强度最高，是EGFP的1.5倍。当温度上升至42℃时，GFPxm16的相对荧光强度最强，是EGFP的2.3倍。而此时，GFPxm19的相对荧光强度只有37℃时的十分之一(图10-a)。

在所有GFPxm突变型中，除GFPxm161的荧光很弱外，GFPxm162和OFPxm的荧光强度也相对较低。随着表达温度的上升，OFPxm的相对荧光强度下降并不显著，但是是所测样品中最低的。在25、32和37℃条件下，GFPxm162的相对荧光强度意外地逐渐升高，到42℃时才下降到稍低于25℃时的水平(图10-b)。

在任何温度下，GFPxm163的相对荧光强度是所有GFPxm突变型中最强的，但是仍低于EYFP的水平(图10-c)。由图10-d可知，GFPxm19uv的相对荧光强度也低于GFPuv的水平。

实施例9

表达时间对GFPxm突变型的表达量和荧光强度的影响

将如前述所得各个表达质粒分别转化ER2566菌株，挑单个菌落于装有3ml LB液培的试管中，37℃摇床培养OD600为0.2-0.3左右时，以IPTG诱导，于37℃表达时每隔一小时取出部分样品。将所有样品的OD₆₀₀调至0.225。用F-4500荧光光度计测定样品的荧光强度(激发和发射狭缝为5nm)。菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用UVIband进行蛋白含量分析(UVIBAND software for windows，V.99)，样品总蛋量以100计。样品的相对荧光强度是以样品荧光强度除以蛋白含量所得到的数值。

在37℃条件下诱导，所有GFPxm突变型的荧光强度在6至7hrs后达到最高值。37℃诱导1/2hr后，GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19都显示高的荧光强度(图11-a)，其中表达GFPxm18的菌株可以用肉眼看到强的绿色荧光。GFPxm18的荧光强度是EGFP的1.6倍，而GFPxm16与EGFP相当，GFPxm19的荧光相对低一些。蛋白含量分析结果显示，这些样品中表达的蛋白在菌体总蛋白中的含量都在25％-28％之间，没有显著差别。图11-a中所有曲线的形状都类似，说明这些GFP的表达水平及折叠速度相近。因为荧光强度较低，在诱导4hrs后才能看到OFPxm的橙色荧光(图11-c)。

GFPxm163的荧光强度随着诱导时间的延长而迅速升高，速度与EYFP相似，但低于EYFP的荧光强度(图11-c)。在诱导表达1hr内，GFPuv与GFPxm19uv的荧光强度相近，但随着表达时间的延长，GFPxm19uv的荧光强度只达到GFPuv的1/2(图11-d)。

实施例10GFPxm突变型在哺乳动物细胞中的表达

用BamH I/XhoI双酶切分别从质粒pTO-T7GFPxm16、pTO-T7-GFPxm18、pTO-T7GFPxm19、pTO-T7GFPxm163、pTO-T7GFPxm19uv、pTO-T7OFPxm中切出GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19、GFPxm163、OFPxm基因片段，插入相同酶切的真核表达载体pCDNA3.1中，得到真核表达质粒  pCDGFPxm16、pCDGFPxm18、pCDGFPxm19、pCDGFPxm19uv、pCD-GFPxm163、pCDOFPxm，分别转染CHO、Hela和HepG2细胞，24hrs后观察细胞荧光。

结果表明6种GFPxm突变型中有4种，即GFPxm16、GFPxm18、GFPxm19、GFPxm163，在3种哺乳动物细胞中获得良好的表达，与对照GFP的表达类似结果。而GFPxm19uv的表达不大理想，OFPxm的检测需绿光激发，因为整个视野都呈现红色而难以区分。具体表达情况参见表3(+表示表达，重复数目随表达的强度增加而增加；-表示不表达)。表3 GFPxm突变型在哺乳动物细胞中的表达

GFPxm             哺乳动物细胞株

突变型      CHO      Hela      HepG2GFPxm16      +++      +++        ++GFPxm18      +++      +++        ++GFPxm19      +++      +++        ++GFPxm163     +++      +++        ++GFPxm19uv    ++       +          -OFPxm        -        -          -

                       SEQUENCE LISTING<110>厦门大学，养生堂有限公司<120>一种新型荧光蛋白，编码其的多核苷酸序列及其用途<130>idc020003<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>717<212>DNA<213>Aequorea macrodactyla<400>1atgagtaaag gagaagaact tttcactggg attgtcccag ttctcattga gttagacggt     60gatgtccatg gacataaatt ctctgtcaga ggagaagggg aaggcgatgc agattatgga    120aaacttgaaa tcaaattcat ttgcactact ggaaagctac cagttccatg gccaacactt    180gttactacat tctcttatgg catccaatgt ttcgcaagat acccagaaca catgaaaatg    240aatgacttct tcaagagtgc catgcctgag ggttacattc aagaaagaac catctttttc    300caagatgatg gaaaatacaa gacacgtggt gaagtcaagt ttgaaggtga tactcttgtt    360aacagaattg agctcaaagg tatggacttt aaagaagatg gcaatatcct tggacacaag    420ttggagtaca attttaactc acataatgta tacattatgc cggacaaagc caataatgga    480ctcaaagtca atttcaaaat tagacacaat atcgaaggtg gtggtgtcca acttgctgat    540cattaccaaa caaatgttcc ccttggagac ggtcctgtcc ttataccaat caatcactac    600ctatccacgc aaacagccat ttcaaaagat cgaaatgaga cgagagatca tatggtgttt    660ctggaatttt tctcagcttg tggacataca catggcatgg atgaactata caaataa       717<210>2<211>476<212>PRT<213>Aequorea macrodactyla<400>2Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1           5                       10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50                  55                  60Ser Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                   90                 95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

    100                     105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Met Ser225                 230                 235                 240Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile Glu Leu

            245                 250                 255Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu

        260                 265                 270Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys Thr Thr

    275                 280                 285Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ser Tyr

290                 295                 300Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met Asn Asp305                 310                 315                 320Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile

            325                 330                 335Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val Lys Phe

        340                 345                 350Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met Asp Phe

    355                 360                 365Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn

370                 375                 380Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly Leu Lys385                 390                 395                 400Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val Gln Leu

            405                 410                 415Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro Val Leu

        420                 425                 430Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ser Lys Asp

    435                 440                 445Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe Ser Ala

450                 455                 460Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys465                 470                 475<210>3<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>3Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1           5                       10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Gly Tyr Gly Ile Leu Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>4<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>4Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1                5                  10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Gly Tyr Gly Ile Leu Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>5<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>5Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20          25                          30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Gly Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Leu Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>6<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>6Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Gly Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>7<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>7Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Gly Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

    100                     105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>8<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>8Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Ser Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

    180                     185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>9<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>9Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Ser Tyr Gly Ile Leu Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170             175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Cys Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>10<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>10Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1               5                   10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Ala Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

            85                  90                  95Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

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    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>11<211>238<212>PRT<213>Artificial<400>11Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile1                5                  10                  15Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

        20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

    35                  40                  45Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50                  55                  60Ala Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met65                  70                  75                  80Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

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        100                 105                 110Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

    115                 120                 125Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130                 135                 140Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly145                 150                 155                 160Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

            165                 170                 175Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

        180                 185                 190Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser His Gln Thr Ala Ile Ser

    195                 200                 205Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Phe

210                 215                 220Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225                 230                 235<210>12<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>12ggatccatgg tgagcaaggg cgag                                           24<210>13<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>13aagcttttac ttgtacagct cgtcca                                         26<210>14<211>25<212>DNA<213>primer<400>14ggatccatga gtaaaggaga agaac                                          25<210>15<211>19<212>DNA<213>primer<400>15gtgtcaattg gaagtctgg                                                 19<210>16<211>16<212>DNA<213>primer<400>16aacagctatg accatg                                                    16<210>17<211>17<212>DNA<213>primer<400>17gtaaaacgac ggccagt                                                   17<210>18<211>33<212>DNA<213>primer<220><221>misc_feature<222>(22).. (22)<223>n＝t or c<220><221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>n＝a，g or t<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>n＝t or g<400>18ccaatcaatc actacctatc cnnncaaaca gcc                                         33<210>19<211>21<212>DNA<213>primer<400>19ggataggtag tgattgattg g                                                      21<210>20<211>19<212>DNA<213>primer<400>20taatacgact cactatagg                                                         19<210>21<211>18<212>DNA<213>primer<400>21ctagttattg ctcagcgg                                                          18<210>22<211>40<212>DNA<213>primer<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n＝c or t<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>n＝a or g<220><221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>n＝t or g<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>n＝t or a<400>22cacttgttac tacattctct nnnggcatcc natgtttcgc                               40<210>23<211>20<212>DNA<213>primer<400>23agagaatgta gtaacaagtg                                                     20<210>24<211>19<212>DNA<213>primer<400>24taatacgact cactatagg                                                          19<210>25<211>18<212>DNA<213>primer<400>25ctagttattg ctcagcgg                                                           18<210>26<211>17<212>DNA<213>primer<400>26gtaaaacgac ggccagt                                                            17<210>27<211>16<212>DNA<213>primer<400>27aacagctatg accatg                                                             16<210>28<211>45<212>DNA<213>primer<220><221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>n＝c or t<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>n＝c or g<220><221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>n＝a or g<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>n＝c or g<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>n＝c or t<220><221>misc_feature<222>(27)..(27)<223>n＝g or a<220><221>misc_feaure<222>(28)..(28)<223>n＝ c or g<400>28gccaacactt gttactacan tnnncnnngg catccaatgt ttcgc                          45<210>29<211>19<212>DNA<213>primer<400>29tgtagtaaca agtgttggc                                                      19

Claims (6)

1.一种新的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中I11、V14、I16、F64、S65、Y66、Q69、T203、和/或F220位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。

2.根据权利要求1所述的荧光蛋白，其特征在于分别由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中包含选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成：

1)F64L，Q69L，和T203C(SEQ ID No：9)；

2)F64L(SEQ ID No：8)；

3)F64L，S65A，T203H，F220L(SEQ ID No：11)；

4)F64L，S65A，T203H(SEQ ID NO：10)；

5)I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L(SEQ ID NO：3)；

6)I11V，V14I，I16V，F64L，S65G，Q69L，T203Y(SEQ ID NO：4)；

7)7F64L S65G，T203L(SEQ ID No：5)；

8)F64L，S65G，T203F(SEQ ID NO：6)；或

9)F64L，S65G，T203Y(SEQ ID NO：7)。

3.根据权利要求1所述的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中65位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成：S65G，S65T或S65A。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，其特征在于由SEQ.ID.NO：2所示氨基酸序列中203位氨基酸具有选自如下氨基酸替换的氨基酸序列所组成：T203L，T203C，T203F，T203Y，T203H或T203W。

5.编码根据权利要求1-4中任一项的荧光蛋白之多核苷酸序列。

6.根据权利要求1-4中任一项的荧光蛋白用作检测细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化、发育的标记的用途。

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