JP4459944B2 - 新規蛍光タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、親タンパク質(すなわち、GFP)と比較して、37℃で発現するとき、および450から500nmで励起するとき、細胞蛍光性をはるかに超える細胞蛍光性を生ずる、F64L−E222G−GFPのような新規蛍光タンパク質、青色変異体Y66H−GFP、S65T−GFP変異体およびF64L−GFPを提供する。これは、生存細胞中の細胞性機能を研究する上で蛍光タンパク質の有用性を相当改善する。
本発明の1つの態様は、緑色蛍光タンパク質(GFP)または任意の機能性GFP類似体から得られる蛍光タンパク質に関連する。この場合、クロモホア前の1位のアミノ酸が変異し、222位のグルタミン酸が変異し、当該変異GFPがF64L−GFPと比べてより高い波長で最大励起を有し、当該蛍光は、変異したGFPが30℃または野生型GFPと比較して高い温度でインキュベートされる細胞中で発現するときに増大する。
PSコードは表2に解説している。
PS1189(最大励起492nm)、PS1191(最大励起468nm)、PS1185(最大励起490nm)およびPS1186(最大励起473nm)の励起スペクトル。放射は560nmで記録した。PS1189およびPS1191のサンプルは2倍希釈し、PS1185およびPS1186のサンプルは10倍希釈した。
PS1189(最大放射509nm)、PS1191(最大放射505nm)、PS1185(最大放射510nm)およびPS1186(最大放射506nm)の放射スペクトル。励起は430nmであった。PS1189、PS1191、およびPS1185のサンプルは2倍希釈し、PS1186のサンプルは10倍希釈した。PS1189およびPS1191のカーブは、第一のy軸に関連し、その一方、PS1185およびPS1186のカーブは、第二のy軸に関連する。
PS1189(パネルA)、PS1191(パネルB)、PS1185(パネルC)、およびPS1186(パネルD)の励起(Ex)および放射(Em)スペクトルのオーバーラッピング。左側の励起カーブおよび右側の励起カーブは、それぞれ、第一のおよび第二のy軸に関連する。
この図は、リポフェクタミン2000トランスフェクション後に回収したイメージを示す。eF64L、E222G(PS699)は、E222Gとして称する右側カラムの上である。eF64L、S65T−GFP(PS279)は、EGFPとして称する左側カラムの上である。
EGFP(PS279)とeF64L、E222G−GFP(PS699)とのpH感受性の比較。
プラスミドpEGFP−N1(GenBnak accession number U55762)およびpEGFP−C1(GenBank accession number U55763)、両方は、GFPの誘導体を含み、その誘導体には、2位に別のアミノ酸が付加されて、よりよい翻訳開始配列が提供され(Kozak配列)、アミノ酸の総計は、野生型GFPの238から239に1増える。そのため、これらプラスミドのGFP中の変異の決定は、例えば、F64LよりもF65Lのように称するべきである。しかし、混乱を避けるため、およびGFPコミュニティーが、そのコミュニケーションに野生型GFPのナンバリングシステムを採用しているため、ここで使用するナンバーは、野生型GFP中の変異の通常の命名に合わせている。この点の関連変異は、F64L、S65TおよびE222Gである。
プラスミドpEGFP−N1(またPS279とも称する)由来のEGFPを発現するプラスミド、およびプラスミドPS699由来のeF64L、E222Gを発現するプラスミドを、製造者推奨に従い、リポフェクタミン2000(Life Technologiesより)を用い、E. coliTOP10細胞(Invitrogen)にトランスフェクトした。5日後、細胞を回収し、1mM DTTを有する抽出緩衝液
50mM TRIS(pH8.0)中に再懸濁した。3回、凍結−融解を繰り返し、細胞を溶解させた。細胞の残骸を、冷却遠心分離で10000gで遠心分離した。NaClを100mMとなるまで加えた。
励起350−525nm(スリット幅5nm) 放射560nm(スリット幅10nm)
図1にデータを示した。
励起430nm(スリット幅10nm) 放射450−550nm(スリット幅5nm)
図2にデータを示した。
CHOhIR細胞を有する3つの2ウェルチャンバーを、リポフェクタミントランスフェクション法を用い、EGFPを発現するプラスミドPS279およびeF64L、E222Gを発現するプラスミドPS699でトランスフェクトした。
COS7細胞発現で産生する、幾分精製した(semi-purified)、PS279由来EGFPタンパク質およびPS699由来eF64L、E222Gタンパク質のサンプルを、0.5ポイントインターバルで、pH4.0からpH12.5の範囲においてpH感受性を試験した。励起および放射スキャンを、pH4.0、8.0および12.5で各タンパク質で行った。そのスキャン結果から、EGFPは最大励起490nmおよび最大放射は510nmであり、eF64L、E222Gの最大励起は475nmおよび最大放射は504nmであることがわかった。pH値の相違は、最大励起または最大放射に影響を与えなかった。シングルリードは、励起470nmおよび放射510nmで生じ、10nmスリットで生じる。結果では、pH感受性に関してEGFPとeF64L、E222Gとの間に明白な相違はない。但し、ランダムな変動の原因となるものは除かれる(図5)。この実験は、繰り返しても実質的に同じ結果を生ずる。
10プラスミドを、以下の特徴のうちの幾つかを組合せるように構成した:
64位でのFまたはL
65位でのSまたはT
222位でのEまたはG
「クラゲ」または「ヒトに適応させ、促進させた」GFPバックボーン。
Claims (6)
- 緑色蛍光タンパク質(GFP)から得られ、配列番号4で示される蛍光タンパク質であって、クロモホア前の1位のアミノ酸FがLで置換されており、GFPの223位のグルタミン酸がGで置換されている、蛍光タンパク質。
- 配列番号4に開示のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の蛍光タンパク質。
- 請求項1または2の何れかの蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド。
- 配列番号3で示される、請求項3に記載のヌクレオチド。
- 請求項3または4の何れかに記載のヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3または4の何れかに記載のヌクレオチドを含むDNA構築体または請求項5に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
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