CN109897093A - 多种改进型橙/红色荧光蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多种改进型橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed氨基酸序列的改造，获得的新型荧光蛋白与野生型具有不同的特点。本发明获得了一种与mOrange2类似但更亮的单体结构橙色荧光蛋白，其荧光亮度比mOrange2高2.0倍。本发明还获得了一种新型的紫红色荧光蛋白，该荧光蛋白具有特异性的最大激发波长和最大发射波长。本发明还涉及将改进型的荧光蛋白用于多领域的研究，采用将荧光蛋白融合在靶标蛋白N端或C端，在细胞系或活体动物中表达该融合蛋白，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等多种进行分析。

Description

多种改进型橙/红色荧光蛋白

本申请是申请号为201510003374.3、申请日为2015年01月06日、发明名称为“多种改进型橙/红色荧光蛋白”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一些改进型的橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed序列的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的颜色(激发光谱和发射光谱)、荧光强度等特点。本发明还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及其可与蛋白在N端或在C端融合，在细胞系或活体动物中表达，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等进行多种分析。

背景技术

荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签众多，如何选择荧光蛋白更好的显示靶标蛋白的示踪和功能，主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)不能选择多聚体的荧光蛋白；4)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；5)要有多通道，不相互干扰的荧光蛋白。

红色荧光蛋白drFP583(DsRed)是从Discosoma sp.分离得到的(Matz et al.,Nature Biotech.17:969-973(1999),Gross et al.,Proc.Nat'LAcad.Sci.USA97:11990-11995(2000))，其优点显而易见：可与GFP系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，能够与现有的共聚焦和宽视场显微镜滤光片等具有很好的包容性，红光的穿透性尤其适用于对活体动物组织的成像，因而红色荧光蛋白显得尤为重要。在哺乳动物细胞中，无论是自发荧光还是对红光区的光吸收都大为减少，因此红色荧光探针的发展对于检测厚标本和活体动物成像都是非常重要的。在后续的荧光使用中，逐渐在荧光蛋白的单体化，适应多细胞区域表达，荧光稳定性等多方面对红色荧光蛋白有了更多的需求，而DsRed为4聚体蛋白，高度聚集的形式不利于与蛋白融合表达来观察蛋白的表达定位，功能等的能力，因此开展了更大规模的红色荧光蛋白突变体筛选工作。但将DsRed突变为单体后，其光稳定性大大缩短，无法满足共聚焦的成像要求，并且由于改变了发光体的结构，容易形成更多不同颜色差异的红色荧光蛋白。因此，目前红色荧光蛋白进化的焦点集中在两个目标上，第一完善当前己有的单体红色荧光蛋白，使得它们的荧光特性或稳定性等特征进一步优化；第二是开发能发红光的荧光蛋白，甚至是发射波段处于远红外区的荧光蛋白。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。

mOrange2为从DsRed蛋白基础上突变获得橙红色的荧光突变体，其激发光谱为549nm，发射光谱为565nm。既可在红色荧光下发红光，也可以在橙色荧光下发橙色的光。相对于DsRed红色荧光蛋白，mOrange2形成了更有利于蛋白融合表达的单体形式，并且蛋白成熟速度快，但荧光强度虽略有下降，其光稳定性虽比DsRed四聚体差，但相对于大多数单体红色荧光蛋白，其光稳定性完全可以保证共聚焦的成像要求(表1)。由于mOrange2明显的光稳定优势，与其融合表达的蛋白可以在高强度的共聚焦显微镜下清晰的显示蛋白在细胞内或组织内表达的荧光图像(Nathan C.Shaner等，Improving the photostability ofbright monomeric orange and red fluorescent proteins.Nat Methods.2008；5(6):545–551)。

表1：红色荧光蛋白的荧光特性

本发明欲以DsRed的序列为模板，对其荧光结构的构建位点进行饱和突变，并且增加了随机突变的文库来筛选单体结构，荧光强度高，光稳定性强等特性的红色荧光蛋白，即在保证单体结构适于与靶标蛋白融合表达的基础上，重点优化其亮度和光稳定性。本发明获得了3株突变为不同颜色的高亮度荧光蛋白，其中一株橙红色荧光蛋白OFPSpark(sRFP10)的亮度明显增强，可以更好的增强蛋白融合后的荧光蛋白亮度。另一株sRFP2蛋白为一新激发波长的荧光蛋白，相对于常见的红色荧光蛋白，该荧光蛋白的激发和发射波长更长，具有一定的特色。

发明内容

本发明的一个方面，提供了一种新的荧光蛋白OFPSpark(sRFP10)，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其特征在于由SEQ.ID.NO:7所示氨基酸序列中包含了E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q位置上由相应的氨基酸替换。所述荧光蛋白激发峰是549nm，发射峰是566nm，呈橙红色，可以分别在橙色和红色激发光谱下反射荧光。与亲本蛋白相比(DsRed的激发峰为558nm，发射峰为583nm)，所述荧光蛋白为单体形式，并且保留了很强的荧光亮度，可在多种哺乳动物细胞中能获得良好表达，激发出明显的荧光。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列的荧光蛋白sRFP2，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换:E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q,A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q。与亲本蛋白比，其光谱范围红移，所述荧光蛋白激发峰是577nm，发射峰是602nm，呈一种很漂亮的紫红色。

本发明的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO:9所示氨基酸序列的荧光蛋白sRFP12，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换:E10P，R17H，E32V，R36K，K47Q，K83C，L85A，I210Y，L225Q。与亲本蛋白比，所述荧光蛋白激发峰是547nm，发射峰是565nm，呈一种很漂亮的玫红色。

本发明的又一方面，还提供了OFPSpark和sRFP2荧光蛋白与表达于多种细胞器中靶标蛋白进行融合表达，可检测细胞内靶标蛋白的表达、定位，及标记相互作用蛋白等多种用途。即将OFPSpark荧光蛋白基因序列放在靶标蛋白的N端或C端融合在一起后，装载到哺乳动物细胞的表达载体中，将表达载体采用不同的方式转染细胞或活体组织，转染24～120小时后，可在专业荧光成像设备下观察荧光图像。

附图说明

图1：高纯度的3株红色突变克隆蛋白溶液，sRFP2，OFPSpark(sRFP10)和sRFP12的颜色分别为紫红，橙红色和玫红；

图2：红色荧光突变蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，结果显示sRFP2的最大激发波长578nm，最佳发射波长602nm；OFPSpark(sRFP10)的最大激发波长549nm，最佳发射波长566nm；sRFP12的最大激发波长548nm，最佳发射波长565nm；

图3：pCMV3-sRFP2，pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12在293H细胞中表达荧光蛋白强度，在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下出红色荧光，sRFP10的荧光强度最亮，sRFP12的荧光强度次之，sRFP2的荧光强度最弱；

图4：pCMV3-OFPSpark(sRFP10)和pCMV3-mOrange2在293H细胞和Hela细胞中表达荧光蛋白强度，在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下出红色荧光，在2种细胞中，OFPSpark比mOrange2的亮度明显增强；在范围为503.5～547.5nm波长通道激发光下出橙色荧光；在293H细胞中，OFPSpark比mOrange2的亮度明显增强。

图5：mOrange2和OFPSpark的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测；

图6：mOrange2(图A)和OFPSpark(图B)的SEC-HPLC检测；

图7：mOrange2和OFPSpark的pH稳定性测定，OFPSpark的pH稳定性略优于mOrange2；

图8:mOrange2(上图)和OFPSpark(下图)的荧光消光系数检测，mOrange2蛋白的荧光消光系数为50000M^-1cm^-1，OFPSpark蛋白的荧光消光系数为84000M^-1cm^-1；

图9:mOrange2和OFPSpark的发射光波谱，在相同的蛋白浓度下，mOrange2的发射光的波谱面积为122736，OFPSpark的发射光的波谱面积为216142，其发射光光谱比mOrange2强1.8倍；

图10A：OFPSpark和mOrange2蛋白在紫外强光下的光稳定特性检测，其结果类似；图10B为在共聚焦显微镜下，561nm红光光谱的高强度光刺激下OFPSpark和mOrange2的光稳定性检测，其结果也显示类似；

图11：OFPSpark与目的基因融合表达载体示意图，图A为OFPSpark放在目的基因N端表达的载体示意图，图B为OFPSpark放在目的基因C端表达的载体示意图；

图12：pCMV-TUBB-OFPSpark微管蛋白TUBB融合蛋白在Hela细胞中表达图，激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光；

图13：pCMV-GOLM1-OFPSpark高尔基体蛋白GOLM1融合蛋白在Hela细胞中表达，激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光；

图14：pCMV-ACTB-OFPSpark胞质骨架蛋白ACTB融合蛋白在Hela细胞中表达，激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光；

图15：pCMV-LAMP1-OFPSpark溶酶体蛋白LAMP1融合蛋白在Hela细胞中表达，激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光；

图16：pCMV-CCNE1-sRFP2细胞核蛋白CCNE1融合蛋白在Hela细胞中表达，激发光为561nm波长通道激发光下出红色荧光。

具体实施方式

实施例1.DsRed突变文库的构建：

通过Discovery studio4.0软件对DsRed(氨基酸序列见SEQ.ID.NO:1)蛋白结构的分析，找出可能影响DsRed结构的48个位点，这48个位点是：R2,S4,K5,E10,V16,R17,T21,E32,R36,H41,N42,V44,K47,Q64,F65,Q66,V71,V73,K83,L85,F91,E 99,C117,F118,F124,I125,V127,T147,L150,R153,V156,E160,I161,H162,K163,A164,L174,V175,F177,S179,I180,Y192,Y194,S197,I210,T217,G219,L225，将这48个点错开分成12组(表2)，分别对每组每个位点的氨基酸做饱和突变，这样得到了12组饱和突变的基因库；另外用易错PCR方法对DsRed基因进行随机突变，得到一组突变基因库；将这13组突变基因应用DNA Shuffling的方法进行随机重组，插入pQE30载体，建立pQE30-DsRed-DS文库，以期获得荧光光谱变异的突变型。

表2：13组DsRed的突变库

突变库名	突变方法	突变位点
			DsRed-m1	定点饱和突变	R2，K47,F124,L174
DsRed-m2	定点饱和突变	S4,Q64,I125,V175
			DsRed-m3	定点饱和突变	K5,F65,V127,F177
DsRed-m4	定点饱和突变	E10,Q66,T147,S179
			DsRed-m5	定点饱和突变	V16,V71,L150,I180
DsRed-m6	定点饱和突变	R17,V73,R153,Y192
			DsRed-m7	定点饱和突变	T21,K83,V156,Y194
DsRed-m8	定点饱和突变	E32,L85,E160,S197
			DsRed-m9	定点饱和突变	R36,F91,I161,I210
DsRed-m10	定点饱和突变	H41,E99,H162,T217
			DsRed-m11	定点饱和突变	N42,C117,K163,G219
DsRed-m12	定点饱和突变	V44,F118,A164,L225
			DsRed-m13	易错PCR突变	随机

分别在DsRed基因的首尾设计引物，并加入可以连接进入载体的BamHI和PstI位点，上游引物序列是RFP-Bam-F：5’GGAGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA3’(SEQ.ID.NO:2)，下游引物序列为RFP-Pst-R：5’GGACTGCAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3’(SEQ.ID.NO:3)。中间突变点处正向饱和引物设计是“NNK”，反向饱和引物设计是“NNM”，这样每组基因需要设计4对突变引物，以质粒pcDNA3-DsRed为模板分段扩增，然后用重叠PCR法以首尾引物组合成完整的DsRed-m1～DsRed-m12突变基因库。

同样用RFP-Bam-F/RFP-Pst-R引物以质粒pcDNA3-DsRed为模板进行易错PCR扩增全长DsRed随机突变基因库，随机引入突变位点，易错PCR条件为：6mM MgCl₂和5mM MnCl₂存在下，将dATP,dGTP,dCTP,dTTP按不同比例混合，进行易错PCR，PCR循环条件为：94℃，5min；94℃30s,55℃30s,72℃50s,30个循环；72℃5min，形成DsRed-m13突变库。

分别取10μg DsRed-m1～DsRed-m12和10μg易错PCR产物DsRed-m13混合后用DNaseI完全消化成小于300bp的条带，琼脂糖凝胶回收50-200bp间的条带。取200ng胶回收纯化的50-200bp的DNA混合物，加入5μl 10xTaq buffer,2μl dNTP,0.5μl taq酶，进行拼接，循环条件为：94℃5min；94℃30s,50℃30s,72℃50s,25个循环；72℃，5min。取10μl上面的PCR产物，其为模板，加入10μl 10xTaq buffer,4μl dNTP,1μl taq酶和首尾引物2μl 10μM RFP-Bam-F/RFP-Pst-R，进行PCR扩增，循环条件为：94℃，5min；94℃30s,60℃30s,72℃50s,30个循环；72℃，5min。扩增完成后，胶回收纯化680bp条带，经BamHI+PstI双酶切后与经同样双酶切的pQE30载体进行连接反应，电转XL1-Blue细胞，加入1ml SOC培养基于37℃，180rmp培养40min复苏细胞，取500μl涂LB-AT(Amp与Tet抗性)平皿，平均5μl涂一块平皿，37℃培养14h拿出平皿，放室温观察。剩余部分菌液加入甘油于-20℃保存，DsRed-DS文库制备完成。

实施例2.DsRed突变克隆的筛选：

将DsRed-DS文库均匀的涂板于ZYM-AT自诱导培养基平板(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，25mM Na₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％a-乳糖，2mM MgSO₄，0.2x微量元素，1％琼脂和50μg/mL Amp)上，30℃培养过夜，DsRed-DS文库中的单克隆表达突变荧光蛋白，呈现不同亮度和颜色。观察平皿，将较亮的红色菌落用记号笔圈出来。下步配制ZYM-AT自诱导液体培养基，于96孔深孔板中每孔加入200μlZYM-AT液体培养基中。然后将这些较亮的红色菌落挑出来接种至96孔板中，共挑1820个克隆，所有深孔板放入30℃，200rpm摇床培养16h进行荧光蛋白表达。将过夜表达菌液用PBS稀释5倍(20μl菌液+80μl PBS)，用微孔板检测系统SpectraMax M5进行检测，先用波长扫描对96孔板样品进行粗略扫描，扫描结果显示，所有突变体的激发峰在530-590nm之间，发射峰在550-610nm之间，记下每孔的激发峰和发射峰值，每个孔用相应的激发峰和发射峰进行检测，测定每个样品的荧光值。经过大量筛选，挑选了3株可稳定激发不同颜色的高荧光值红色荧光蛋白的克隆，分别命名为sRFP2、sRFP10、sRFP12，序列见表3。

将pQE30-sRFP2、pQE30-sRFP10、pQE30-sRFP12单克隆挑于LB细菌培养基中37℃，200rpm培养过夜，按0.5％接种于200ml ZYM-AT自诱导液体培养基中，37℃，240rpm摇床培养20h后，离心收获菌液，收获菌体(BECKMAN COULTER Avanti@J-26XPI，6500RPM/15min)，按菌体:缓冲液1:20加入裂解缓冲液Buffer A(50Mm Tris，pH8.0，500mM NaCl)，搅拌混匀，高压均质机破碎(ATS，200Pa两次，800pa每次)，离心收集上清(BECKMAN COULTERAllegraTM 64R Centrifuge，12000RPM/30min)，0.45μm滤膜过滤，得到澄清的上清液，将样品用恒流泵上Ni柱，(提前用buffer A，3柱体积平衡)，同时打开UV灯，在线监测，样品上完后，用buffer A将UV平衡至基线，分步阶段洗脱，10％B,15％B,20％B,50％B,100％B(buffer B:50mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，500mM Imidazole)，分别收集各个洗脱峰。变性电泳监测纯度，将纯度合格的组分过Sephadex G-25Fine柱脱盐至PBS。图1显示3种突变RFP蛋白的肉眼观察颜色，其中sRFP2为紫红色，sRPF10为橙红色，sRPF12为玫红色。检测这三种蛋白的发射峰和激发峰：具体方式为：1)发射波长设为0，扫描激发光谱A(设激发波长扫描范围为200～700nm)；2)荧光发射光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为激发波长，扫描发射光谱(设发射波长扫描范围为激发波长+5nm～700nm)；3)荧光激发光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为发射波长，扫描激发光谱。图2显示sRFP2、sRFP10、sRFP12的荧光光谱，其中sRFP2的最大激发波长577nm，最佳发射波长602nm；sRFP10的最大激发波长549nm，最佳发射波长566nm；sRFP12的最大激发波长547nm，最佳发射波长565nm(见表3)。

表3：突变红色克隆的特性及序列

实施例3.sRFP突变型荧光蛋白和mOrange2荧光蛋白真核表达载体的构建和表达：

用引物sRFP-inf-F:5’GGTACCGCTAGCGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA 3’(SEQ.ID.NO:10)和sRFP-inf-R：5’GGCCGCTCTAGACTCGAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3’(SEQ.ID.NO:11)分别以这3株突变型为模板扩增sRFP2，sRFP10和sRFP12基因，经infusion酶连入到真核表达载体pCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-sRFP2，pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12。纯化获得转染级纯度的pCMV3-sRFP2，pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12质粒转染293H细胞。具体步骤为：293H细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基,在37℃及5％二氧化碳条件下培养.转染前,将细胞按1×10⁵细胞/孔的密度接种于24孔板中,培养24h后用于转染,细胞密度为70％～90％。2μg DNA与一定量PEI(按PEI:DNA＝5:1的比例添加)各用50μL稀释缓冲液(25mmol/L Hepes,150mmol/L NaCl,pH 7.1)稀释到终浓度。将稀释后的PEI溶液逐滴加入DNA溶液中,立即振荡混匀，室温静置30min后,将混合液加到铺有细胞的24孔板中,摇动混匀后于5％二氧化碳的培养箱中37℃培养。分别于24h、48h、72h用荧光显微镜观察荧光，挑选最亮的时间段拍摄照片(图3)。其结果显示，在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下，sRFP10的表达最亮，该蛋白的颜色为橙红色，并且其荧光光谱也与mOrange2一致，因此将该蛋白命名为OFPSpark。

用引物mOrange2-inf-F:5’GGTACCGCTAGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3’(SEQ.ID.NO:12)和mOrange2-inf-R：5’GGCCGCTCTAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC 3’(SEQ.ID.NO:13)扩增获得mOrange2的核苷酸序列。经infusion酶连入到真核表达载体pCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-mOrange2(SEQ.ID.NO:14)。提取获得pCMV3-mOrange2和pCMV3-sRFP10(OFPSpark)的转染级质粒，转染293H和Hela细胞。具体步骤同前文，挑选最亮的时间段拍摄照片(图4)。其结果显示，在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下为高亮度的红色荧光，OFPSpark在2种细胞中的表达明显强于mOrange2，在范围为503.5～547.5nm波长通道激发光下为橙色荧光，OFPSpark表达也强于mOrange2。

实施例4.OFPSpark荧光蛋白性质的测定：

1.OFPSpark和mOrange2荧光蛋白的生产：

具体方法同前，采用pQE30-sRFP10(OFPSpark)、pQE30-mOrange2两种表达质粒培养1L表达产物，离心破菌得到澄清的上清液，Ni柱纯化获得高纯度的荧光蛋白，脱盐至PBS。OFPSpark和mOrange2蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图5，蛋白条带结果显示mOrange2比OFPSpark分子量略大，均在28～30kD，与其理论分子量相吻合。纯化蛋白采用SDS-PAGE分析蛋白的分子量大小，采用SEC-HPLC分析荧光蛋白的颗粒大小，分子量略大的mOrange2的HPLC出峰时间为17.768分钟，分子量略小的OFPSpark的HPLC的出峰时间为18.468分钟(图6)。该结果显示OFPSpark蛋白和mOrange2蛋白一样，均为单体的结构。

2.OFPSpark pH值稳定性测定

pH值稳定性测定方法为：配置pH3至pH12的缓冲液备用，用配置好的缓冲液将荧光蛋白稀释至20μg/ml，用荧光蛋白的最大激发波长激发，用最大发射波长检测荧光信号；记录相应pH值下的荧光信号值，将荧光信号最强的值定义为100％，计算出相应pH值下的荧光强度百分比，将50％荧光强度下的pH值定义为pKa。图7显示mOrange2的pKa为6.8,OFPSpark的pKa为6.2。OFPSpark的pH耐受能力要略好于mOrange2。pH值稳定性越低，表明蛋白可以更好的适应多环境系统的表达，保证其应用范围不受限制。

3.OFPSpark消光系数的测定

依据消光系数的计算公式：e＝A/bc其中e为消光系数；A为吸光度；c为溶液中物质的浓度；b为光在溶液中的光程。利用BCA法检测生产的荧光蛋白的浓度，依据测定的浓度，将样品用pH8.0的缓冲液稀释至10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml和160μg/ml在1cm光程比色皿中检测吸光值；依据检测的吸光值和对应荧光蛋白的摩尔浓度作图，拟合直线，从计算公式中读取消光系数值。图8显示mOrange2的消光系数为50000M^-1cm^-1，OFPSpark的消光系数为84000M^-1cm^-1。该结果表明OFPSpark的光吸收性能是mOrange2的1.7倍。

4.OFPSpark量子产率测定

本研究通过参比法检测荧光蛋白量子产率，依据公式：Yu＝Ys*Fu/Fs*As/Au；Yu、Ys为待测物质和参比物质的量子产率；Fu、Fs为待测物质和参比物质的积分荧光强度；Au，As为待测物质和参比物质在选定激发波长下(为548nm)的吸光值(A＝ebc)。荧光样品用pH8.0的缓冲液稀释至20μg/ml在选定的激发波长条件下，用1cm光程比色皿中检测吸光值，其中OFPSpark在548nm激发波长下的吸光值为0.035，mOrange2在548nm激发波长下的吸光值为0.023；同时将该样品在选定波长条件下，进行波谱扫描，导出实验数值，整理后作图，进行波谱积分。将检测获得的吸光值，积分荧光强度，参比物的量子产率值带入公式计算获得待测物质的量子产率。分析获得的荧光发射光谱面积见图9，OFPSpark(光谱面积为216142)的激发光谱强度比mOrange2(光谱面积为122736)强1.8倍。根据量子产率计算公式，参考文献中的mOrange2的量子产率，计算得到OFPSpark的量子产率为0.69，略高于mOrange2为0.60的量子产率(Nathan C.Shaner等，Improving the photostability ofbright monomeric orange and red fluorescent proteins.Nat Methods.2008；5(6):545–551)。

5.OFPSpark亮度检测

荧光亮度为蛋白的消光系数与量子产率的乘积，即荧光蛋白的光能量吸收转换为发射光的能量强度。根据该公式计算，OFPSpark的荧光亮度为58，而mOrange2的荧光亮度为29.4。OFPSpark的亮度比mOrange2高2.0倍。该结果也与这两种荧光细胞在细胞中的表达水平的差异结果相吻合。

6.OFPSpark光稳定性检测

本研究将50μg/ml的mOrange2和OFPSpark同时放置于紫外强光条件下照射，不同时间点取样检测荧光强度；以最初的荧光强度为100％，计算不同时间的荧光强度百分比，以时间和荧光强度百分比作图分析荧光蛋白的失活速率。图10A显示mOrange2和OFPSpark的光稳定性质相似，都保留了相对较好的光稳定性。

将pCMV3-mOrange2和pCMV3-OFPSpark(sRFP10)的转染级质粒转染HeLa细胞。具体步骤同前文，转染48h挑选最亮细胞用于光漂白检测。使用Nikon A1激光扫描共聚焦显微镜进行荧光蛋白光漂白检测。物镜为CFI Apo TIRF 60x，数值孔径(N.A.)为1.49；激光选用561nm通道(红光光谱)，光电倍增光(photomultiplier)电压为80V；读值区域面积(ROI)为15600μm2(130μm*120μm)。漂白过程中每隔1.55s读取一次荧光值，共读取25次。以荧光漂白时间为横坐标和荧光强度为纵坐标作图，分析mOrange2和OFPSpark的荧光强度随漂白时间的变化。图10B显示OFPSpark和mOrange2的在较强激光漂白下的荧光强度变化趋势相似，显示OFPSpark与mOrange2有相近的光稳定特性。

实施例5.OFPSpark荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建和表达：

将微管蛋白TUBB，胞质骨架蛋白ATCB，溶酶体蛋白LAMP1和高尔基体蛋白GOLM1的ORF(无终止密码子)基因序列用各自的特异引物扩增出来，并在上下游引物上分别引入HindIII和NheI位点，TUBB-F，5'GGCCGCCACCAAGCTTATGAGGGAAATCGTGCACAT 3'(SEQ.ID.NO:15),TUBB-R,5'ACCATGGATCCGCTAGCGGCCTCCTCTTCGGCCT 3'(SEQ.ID.NO:16)，GOLM1-F,5'GGCCGCCACCAAGCTTATGGTGGACCTCCAGACACGG 3'(SEQ.ID.NO:17)，GOLM1-R,5'ACCATGGATCCGCTAGCGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG 3'(SEQ.ID.NO:18)，LAMP1-F,5'GGCCGCCACCAAGCTTATGGCTGCCCCCGGCAG 3'(SEQ.ID.NO:19)，LAMP1-R,5'CCATGGATCCGCTAGCCATGCTGTTCTCGTCCAGCAGACA 3'(SEQ.ID.NO:20)，ActB-F,5'GGCCGCCACCAAGCTTATGGATGATGATATCGCCGC 3'(SEQ.ID.NO:21)，ActB-R,5'CCATGGATCCGCTAGCGAAGCATTTGCGGTGGACG 3'(SEQ.ID.NO:22)。通过PCR获得4条基因需要表达的基因序列。通过HindIII+NheI双酶切构建到pCMV3-N-OFPSpark或pCMV3-C-OFPSpark载体中(图11)，使之与OFPSpark形成融合表达形式，获得pCMV3-LAMP1-OFPSpark，pCMV3-ACTB-OFPSpark，pCMV3-GOLM1-OFPSpark，pCMV3-TUBB-OFPSpark表达载体(见表4)。将这些融合质粒转染Hela细胞，转染方法同上。表达48h后检测，用Confocal共聚焦荧光显微镜观察荧光，激发光为561nm(红光范围)，并拍摄照片。试验显示：OFPSpark能够与这些基因融合表达，能应用于真核细胞的定位，而且对融合表达目的基因的折叠没有影响(图12，13，14，15)。

表4：OFPSpark融合蛋白序列

sRFP2荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建和表达：将核蛋白CCNE1的ORF(无终止密码子)基因序列用各自的特异引物扩增出来，并在上下游引物上分别引入HindIII和NheI位点，CCNE1-F,5'GGCCGCCACCAAGCTTATGCCGAGGGAGCGCAGG 3'(SEQ.ID.NO:31)，CCNE1-R,5'CCATGGATCCGCTAGCCGCCATTTCCGGCCCGC 3'(SEQ.ID.NO:32)。通过PCR获得CCNE1条基因需要表达的基因序列。通过HindIII+NheI双酶切构建到pCMV3-C-sRFP2载体中，使之与OFPSpark形成融合表达形式，获得pCMV3-CCNE1-sRFP2表达载体(见表5)。将该融合质粒转染Hela细胞，转染方法同上。表达48h后检测，用Confocal共聚焦荧光显微镜观察荧光，激发光为561nm(红光范围)，并拍摄照片。试验显示：sRFP2能够与CCNE1基因融合表达能发出漂亮的红色荧光，可应用于细胞核的定位，而且对融合表达目的基因的折叠没有影响(图16)。

表5：sRFP2融合蛋白序列

克隆	核苷酸序列	氨基酸序列
			pCMV3-CCNE1-sRFP2	SEQ.ID.NO:33	SEQ.ID.NO:34

序列表

<110> 北京义翘神州科技有限公司

<120> 多种改进型橙/红色荧光蛋白

<130> 1

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> Discosoma sp. (Sea anemone)

<400> 1

Met Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 2

ggaggatcca tggatagcac tgagaacgtc a 31

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 3

ggactgcagc tactggaaca ggtggtggc 29

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP2)

<400> 4

atggatagca ctgagaacgt catcaagcag ttcatgcgct tcaagattta tatggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgtgggcg agggcaagcc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgca agtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc atttcaccta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttca agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctac aggacggcac cctcatctac 360

cacgtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagact 420

ctgggctggg agccctccac tgagcgcaac tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

aaccacatgg cgctgaagct gaagggcggc ggccactacc tgtgtgagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gaagctcccc ggctaccact acgtggacta caagctcgac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccgtg gtggagcagt acgagcgcgc cgaggcccgc 660

caccacctgt tccagtag 678

<210> 5

<211> 225

<212> PRT

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP2)

<400> 5

Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Gln Phe Met Arg Phe Lys Ile

1 5 10 15

Tyr Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His

50 55 60

Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr His Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu

130 135 140

Pro Ser Thr Glu Arg Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Asn His Met Ala Leu Lys Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Leu Cys Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Lys Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

His Tyr Val Asp Tyr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Ala Arg His His Leu Phe

210 215 220

Gln

225

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP10)

<400> 6

atggatagca ctgagaacgt catcaagccc ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgtgggcg agggccgccc ctacgagggc 120

tttcagaccg ctaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc atttcaccta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaactacgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctac aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggtgccct gaagggcaag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactaca cctccgaggt caagaccacc 540

tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca tcgtcgacat caagttggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc 660

caccacctgt tccagtag 678

<210> 7

<211> 225

<212> PRT

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP10)

<400> 7

Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Pro Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His

50 55 60

Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Lys

145 150 155 160

Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Ser Glu

165 170 175

Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala

180 185 190

Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Gln

225

<210> 8

<211> 678

<212> DNA

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP12)

<400> 8

atggatagca ctgagaacgt catcaagccc ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgtgggcg agggcaagcc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgca agtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtctcctc atttcaccta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactactgta aggcttcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctac aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggtgccct gaagggcaag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactaca cctccgaggt caagaccacc 540

tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca tcgtcgacat caagttggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacacctat gtggagcagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

caccacctgt tccagtag 678

<210> 9

<211> 225

<212> PRT

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP12)

<400> 9

Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Pro Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His

50 55 60

Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Cys Lys Ala Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Lys

145 150 155 160

Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Ser Glu

165 170 175

Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala

180 185 190

Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Tyr Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Gln

225

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 10

ggtaccgcta gcggatccat ggatagcact gagaacgtca 40

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 11

ggccgctcta gactcgagct actggaacag gtggtggc 38

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 12

ggtaccgcta gcggatccat ggtgagcaag ggcgagg 37

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 13

ggccgctcta gactcgagtt acttgtacag ctcgtccatg c 41

<210> 14

<211> 711

<212> DNA

<213> 从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的mOrange2)

<400> 14

atggtgagca agggcgagga gaataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggctttca gaccgctaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcatttc acctacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttcaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact acgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctacaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgtg 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggt 480

gccctgaagg gcaagatcaa gatgaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacacctcc 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacatcgtc 600

gacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 15

ggccgccacc aagcttatga gggaaatcgt gcacat 36

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 16

accatggatc cgctagcggc ctcctcttcg gcct 34

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 17

ggccgccacc aagcttatgg tggacctcca gacacgg 37

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 18

accatggatc cgctagcgag tgtatgattc cgcttttcac g 41

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 19

ggccgccacc aagcttatgg ctgcccccgg cag 33

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 20

ccatggatcc gctagccatg ctgttctcgt ccagcagaca 40

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 21

ggccgccacc aagcttatgg atgatgatat cgccgc 36

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 22

ccatggatcc gctagcgaag catttgcggt ggacg 35

<210> 23

<211> 1836

<212> DNA

<213> homo sapiens的LAMP1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 23

atggctgccc ccggcagcgc ccggcgaccc ctgctgctgc tactgctgtt gctgctgctc 60

ggcctcatgc attgtgcgtc agcagcaatg tttatggtga aaaatggcaa cgggaccgcg 120

tgcataatgg ccaacttctc tgctgccttc tcagtgaact acgacaccaa gagtggccct 180

aagaacatga cctttgacct gccatcagat gccacagtgg tgctcaaccg cagctcctgt 240

ggaaaagaga acacttctga ccccagtctc gtgattgctt ttggaagagg acatacactc 300

actctcaatt tcacgagaaa tgcaacacgt tacagcgtcc agctcatgag ttttgtttat 360

aacttgtcag acacacacct tttccccaat gcgagctcca aagaaatcaa gactgtggaa 420

tctataactg acatcagggc agatatagat aaaaaataca gatgtgttag tggcacccag 480

gtccacatga acaacgtgac cgtaacgctc catgatgcca ccatccaggc gtacctttcc 540

aacagcagct tcagcagggg agagacacgc tgtgaacaag acaggccttc cccaaccaca 600

gcgccccctg cgccacccag cccctcgccc tcacccgtgc ccaagagccc ctctgtggac 660

aagtacaacg tgagcggcac caacgggacc tgcctgctgg ccagcatggg gctgcagctg 720

aacctcacct atgagaggaa ggacaacacg acggtgacaa ggcttctcaa catcaacccc 780

aacaagacct cggccagcgg gagctgcggc gcccacctgg tgactctgga gctgcacagc 840

gagggcacca ccgtcctgct cttccagttc gggatgaatg caagttctag ccggtttttc 900

ctacaaggaa tccagttgaa tacaattctt cctgacgcca gagaccctgc ctttaaagct 960

gccaacggct ccctgcgagc gctgcaggcc acagtcggca attcctacaa gtgcaacgcg 1020

gaggagcacg tccgtgtcac gaaggcgttt tcagtcaata tattcaaagt gtgggtccag 1080

gctttcaagg tggaaggtgg ccagtttggc tctgtggagg agtgtctgct ggacgagaac 1140

agcatggcta gcggatccat ggatagcact gagaacgtca tcaagccctt catgcgcttc 1200

aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgtgggcgag 1260

ggccgcccct acgagggctt tcagaccgct aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg 1320

cccttcgcct gggacatcct gtcccctcat ttcacctacg gctccaaggc ctacgtgaag 1380

caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag 1440

cgcgtgatga actacgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctacag 1500

gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc cgacggcccc 1560

gtgatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac 1620

ggtgccctga agggcaagat caagatgagg ctgaagctga aggacggcgg ccactacacc 1680

tccgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacatc 1740

gtcgacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac 1800

gaacgcgccg agggccgcca ccacctgttc cagtag 1836

<210> 24

<211> 611

<212> PRT

<213> homo sapiens的LAMP1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 24

Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Ala Met Phe Met

20 25 30

Val Lys Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala

35 40 45

Ala Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr

50 55 60

Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys

65 70 75 80

Gly Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg

85 90 95

Gly His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser

100 105 110

Val Gln Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Ser Asp Thr His Leu Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Ser Ser Lys Glu Ile Lys Thr Val Glu Ser Ile Thr Asp

130 135 140

Ile Arg Ala Asp Ile Asp Lys Lys Tyr Arg Cys Val Ser Gly Thr Gln

145 150 155 160

Val His Met Asn Asn Val Thr Val Thr Leu His Asp Ala Thr Ile Gln

165 170 175

Ala Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Arg Gly Glu Thr Arg Cys Glu

180 185 190

Gln Asp Arg Pro Ser Pro Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ser Pro

195 200 205

Ser Pro Ser Pro Val Pro Lys Ser Pro Ser Val Asp Lys Tyr Asn Val

210 215 220

Ser Gly Thr Asn Gly Thr Cys Leu Leu Ala Ser Met Gly Leu Gln Leu

225 230 235 240

Asn Leu Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Asn Thr Thr Val Thr Arg Leu Leu

245 250 255

Asn Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His

260 265 270

Leu Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe

275 280 285

Gln Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile

290 295 300

Gln Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr

325 330 335

Lys Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val

340 345 350

Asn Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln

355 360 365

Phe Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser Met Ala Ser

370 375 380

Gly Ser Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Pro Phe Met Arg Phe

385 390 395 400

Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu

405 410 415

Gly Val Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Phe Gln Thr Ala Lys Leu

420 425 430

Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser

435 440 445

Pro His Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp

450 455 460

Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu

465 470 475 480

Arg Val Met Asn Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp

485 490 495

Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly

500 505 510

Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly

515 520 525

Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys

530 535 540

Gly Lys Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr

545 550 555 560

Ser Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro

565 570 575

Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu

580 585 590

Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His

595 600 605

Leu Phe Gln

610

<210> 25

<211> 1815

<212> DNA

<213> homo sapiens的ACTB和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 25

atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc 60

ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac 120

cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc 180

aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac 240

gacatggaga aaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag 300

caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc 360

cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta 420

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cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg 540

gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc 600

accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc 660

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gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca 780

ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac 840

tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct 900

ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg 960

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atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag 1080

gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttcgctag cggatccatg 1140

gatagcactg agaacgtcat caagcccttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc 1200

gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc gtgggcgagg gccgccccta cgagggcttt 1260

cagaccgcta agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg 1320

tcccctcatt tcacctacgg ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac 1380

tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa ctacgaggac 1440

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cacctgttcc agtag 1815

<210> 26

<211> 604

<212> PRT

<213> homo sapiens的ACTB和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 26

Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met

1 5 10 15

Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro

20 25 30

Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly

35 40 45

Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile

50 55 60

Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp

65 70 75 80

Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val

85 90 95

Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro

100 105 110

Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn

115 120 125

Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala

130 135 140

Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr

145 150 155 160

His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu

165 170 175

Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile

180 185 190

Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile

195 200 205

Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu

210 215 220

Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr

225 230 235 240

Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg

245 250 255

Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys

260 265 270

Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp

275 280 285

Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr

290 295 300

Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu

305 310 315 320

Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe

340 345 350

Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser

355 360 365

Ile Val His Arg Lys Cys Phe Ala Ser Gly Ser Met Asp Ser Thr Glu

370 375 380

Asn Val Ile Lys Pro Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser

385 390 395 400

Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val Gly Glu Gly Arg Pro

405 410 415

Tyr Glu Gly Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro

420 425 430

Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His Phe Thr Tyr Gly Ser

435 440 445

Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu

450 455 460

Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Tyr Glu Asp

465 470 475 480

Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu

485 490 495

Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly

500 505 510

Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg

515 520 525

Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Lys Ile Lys Met Arg Leu

530 535 540

Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Ser Glu Val Lys Thr Thr Tyr

545 550 555 560

Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile

565 570 575

Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln

580 585 590

Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His Leu Phe Gln

595 600

<210> 27

<211> 1755

<212> DNA

<213> homo sapiens的GOLM1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 27

atggagctgg aaggcagggt ccgcagggcg gctgcagaga gaggcgccgt ggagctgaag 60

aagaacgagt tccagggaga gctggagaag cagcgggagc agcttgacaa aatccagtcc 120

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gatagcactg agaacgtcat caagcccttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc 1140

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cagaccgcta agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg 1260

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tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa ctacgaggac 1380

ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc tccctacagg acggcgagtt catctacaag 1440

gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc gacggccccg tgatgcagaa gaagaccatg 1500

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cacctgttcc agtag 1755

<210> 28

<211> 584

<212> PRT

<213> homo sapiens的GOLM1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 28

Met Glu Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala

1 5 10 15

Val Glu Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg

20 25 30

Glu Gln Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser

35 40 45

Val Asn Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile

50 55 60

Thr Thr Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr

65 70 75 80

Leu Gln Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln

85 90 95

Lys Asn Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln

100 105 110

Cys Ile Asn Gln Met Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile

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Glu Glu Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu

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Ser Glu Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro

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165 170 175

Gly Lys Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro

180 185 190

Ser Ser Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu

195 200 205

Thr Asn Glu Ile Gln Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu

210 215 220

Pro Gln Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly

225 230 235 240

Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val

245 250 255

Gln Ala Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro

260 265 270

Glu Arg Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu

275 280 285

Ala Ala Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp

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Ala Leu Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp

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Gln Lys Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn

340 345 350

His Thr Leu Ala Ser Gly Ser Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys

355 360 365

Pro Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His

370 375 380

Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Phe

385 390 395 400

Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala

405 410 415

Trp Asp Ile Leu Ser Pro His Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val

420 425 430

Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu

435 440 445

Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val

450 455 460

Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys

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Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln

485 490 495

Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu

500 505 510

Asp Gly Ala Leu Lys Gly Lys Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp

515 520 525

Gly Gly His Tyr Thr Ser Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile

545 550 555 560

Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala

565 570 575

Glu Gly Arg His His Leu Phe Gln

580

<210> 29

<211> 2022

<212> DNA

<213> homo sapiens的TUBB和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 29

atgagggaaa tcgtgcacat ccaggctggt cagtgtggca accagatcgg tgccaagttc 60

tgggaggtga tcagtgatga acatggcatc gaccccaccg gcacctacca cggggacagc 120

gacctgcagc tggaccgcat ctctgtgtac tacaatgaag ccacaggtgg caaatatgtt 180

cctcgtgcca tcctggtgga tctagaacct gggaccatgg actctgttcg ctcaggtcct 240

tttggccaga tctttagacc agacaacttt gtatttggtc agtctggggc aggtaacaac 300

tgggccaaag gccactacac agagggcgcc gagctggttg attctgtcct ggatgtggta 360

cggaaggagg cagagagctg tgactgcctg cagggcttcc agctgaccca ctcactgggc 420

gggggcacag gctctggaat gggcactctc cttatcagca agatccgaga agaataccct 480

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gagccctaca atgccaccct ctccgtccat cagttggtag agaatactga tgagacctat 600

tgcattgaca acgaggccct ctatgatatc tgcttccgca ctctgaagct gaccacacca 660

acctacgggg atctgaacca ccttgtctca gccaccatga gtggtgtcac cacctgcctc 720

cgtttccctg gccagctcaa tgctgacctc cgcaagttgg cagtcaacat ggtccccttc 780

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tatcgagctc tcacagtgcc ggaactcacc cagcaggtct tcgatgccaa gaacatgatg 900

gctgcctgtg acccccgcca cggccgatac ctcaccgtgg ctgctgtctt ccgtggtcgg 960

atgtccatga aggaggtcga tgagcagatg cttaacgtgc agaacaagaa cagcagctac 1020

tttgtggaat ggatccccaa caatgtcaag acagccgtct gtgacatccc acctcgtggc 1080

ctcaagatgg cagtcacctt cattggcaat agcacagcca tccaggagct cttcaagcgc 1140

atctcggagc agttcactgc catgttccgc cggaaggcct tcctccactg gtacacaggc 1200

gagggcatgg acgagatgga gttcaccgag gctgagagca acatgaacga cctcgtctct 1260

gagtatcagc agtaccagga tgccaccgca gaagaggagg aggatttcgg tgaggaggcc 1320

gaagaggagg ccgctagcgg atccatggat agcactgaga acgtcatcaa gcccttcatg 1380

cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgtg 1440

ggcgagggcc gcccctacga gggctttcag accgctaagc tgaaggtgac caagggtggc 1500

cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcatttca cctacggctc caaggcctac 1560

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tgggagcgcg tgatgaacta cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc 1680

ctacaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac 1740

ggccccgtga tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc 1800

gaggacggtg ccctgaaggg caagatcaag atgaggctga agctgaagga cggcggccac 1860

tacacctccg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc 1920

tacatcgtcg acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 1980

cagtacgaac gcgccgaggg ccgccaccac ctgttccagt ag 2022

<210> 30

<211> 673

<212> PRT

<213> homo sapiens的TUBB和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的OFPSpark的融合蛋白)

<400> 30

Met Arg Glu Ile Val His Ile Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln Ile

1 5 10 15

Gly Ala Lys Phe Trp Glu Val Ile Ser Asp Glu His Gly Ile Asp Pro

20 25 30

Thr Gly Thr Tyr His Gly Asp Ser Asp Leu Gln Leu Asp Arg Ile Ser

35 40 45

Val Tyr Tyr Asn Glu Ala Thr Gly Gly Lys Tyr Val Pro Arg Ala Ile

50 55 60

Leu Val Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ser Val Arg Ser Gly Pro

65 70 75 80

Phe Gly Gln Ile Phe Arg Pro Asp Asn Phe Val Phe Gly Gln Ser Gly

85 90 95

Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys Gly His Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu

100 105 110

Val Asp Ser Val Leu Asp Val Val Arg Lys Glu Ala Glu Ser Cys Asp

115 120 125

Cys Leu Gln Gly Phe Gln Leu Thr His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly

130 135 140

Ser Gly Met Gly Thr Leu Leu Ile Ser Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro

145 150 155 160

Asp Arg Ile Met Asn Thr Phe Ser Val Val Pro Ser Pro Lys Val Ser

165 170 175

Asp Thr Val Val Glu Pro Tyr Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln Leu

180 185 190

Val Glu Asn Thr Asp Glu Thr Tyr Cys Ile Asp Asn Glu Ala Leu Tyr

195 200 205

Asp Ile Cys Phe Arg Thr Leu Lys Leu Thr Thr Pro Thr Tyr Gly Asp

210 215 220

Leu Asn His Leu Val Ser Ala Thr Met Ser Gly Val Thr Thr Cys Leu

225 230 235 240

Arg Phe Pro Gly Gln Leu Asn Ala Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val Asn

245 250 255

Met Val Pro Phe Pro Arg Leu His Phe Phe Met Pro Gly Phe Ala Pro

260 265 270

Leu Thr Ser Arg Gly Ser Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Thr Val Pro Glu

275 280 285

Leu Thr Gln Gln Val Phe Asp Ala Lys Asn Met Met Ala Ala Cys Asp

290 295 300

Pro Arg His Gly Arg Tyr Leu Thr Val Ala Ala Val Phe Arg Gly Arg

305 310 315 320

Met Ser Met Lys Glu Val Asp Glu Gln Met Leu Asn Val Gln Asn Lys

325 330 335

Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Pro Asn Asn Val Lys Thr Ala

340 345 350

Val Cys Asp Ile Pro Pro Arg Gly Leu Lys Met Ala Val Thr Phe Ile

355 360 365

Gly Asn Ser Thr Ala Ile Gln Glu Leu Phe Lys Arg Ile Ser Glu Gln

370 375 380

Phe Thr Ala Met Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly

385 390 395 400

Glu Gly Met Asp Glu Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn

405 410 415

Asp Leu Val Ser Glu Tyr Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Thr Ala Glu Glu

420 425 430

Glu Glu Asp Phe Gly Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Ala Ser Gly Ser

435 440 445

Met Asp Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Pro Phe Met Arg Phe Lys Val

450 455 460

His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val

465 470 475 480

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val

485 490 495

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His

500 505 510

Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

515 520 525

Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

530 535 540

Met Asn Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

545 550 555 560

Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn

565 570 575

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

580 585 590

Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Lys

595 600 605

Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Ser Glu

610 615 620

Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala

625 630 635 640

Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

645 650 655

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His Leu Phe

660 665 670

Gln

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 31

ggccgccacc aagcttatgc cgagggagcg cagg 34

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 合成序列(引物)

<400> 32

ccatggatcc gctagccgcc atttccggcc cgc 33

<210> 33

<211> 1920

<212> DNA

<213> homo sapiens的CCNE1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP2的融合蛋白)

<400> 33

atgccgaggg agcgcaggga gcgggatgcg aaggagcggg acaccatgaa ggaggacggc 60

ggcgcggagt tctcggctcg ctccaggaag aggaaggcaa acgtgaccgt ttttttgcag 120

gatccagatg aagaaatggc caaaatcgac aggacggcga gggaccagtg tgggagccag 180

ccttgggaca ataatgcagt ctgtgcagac ccctgctccc tgatccccac acctgacaaa 240

gaagatgatg accgggttta cccaaactca acgtgcaagc ctcggattat tgcaccatcc 300

agaggctccc cgctgcctgt actgagctgg gcaaatagag aggaagtctg gaaaatcatg 360

ttaaacaagg aaaagacata cttaagggat cagcactttc ttgagcaaca ccctcttctg 420

cagccaaaaa tgcgagcaat tcttctggat tggttaatgg aggtgtgtga agtctataaa 480

cttcacaggg agacctttta cttggcacaa gatttctttg accggtatat ggcgacacaa 540

gaaaatgttg taaaaactct tttacagctt attgggattt catctttatt tattgcagcc 600

aaacttgagg aaatctatcc tccaaagttg caccagtttg cgtatgtgac agatggagct 660

tgttcaggag atgaaattct caccatggaa ttaatgatta tgaaggccct taagtggcgt 720

ttaagtcccc tgactattgt gtcctggctg aatgtataca tgcaggttgc atatctaaat 780

gacttacatg aagtgctact gccgcagtat ccccagcaaa tctttataca gattgcagag 840

ctgttggatc tctgtgtcct ggatgttgac tgccttgaat ttccttatgg tatacttgct 900

gcttcggcct tgtatcattt ctcgtcatct gaattgatgc aaaaggtttc agggtatcag 960

tggtgcgaca tagagaactg tgtcaagtgg atggttccat ttgccatggt tataagggag 1020

acggggagct caaaactgaa gcacttcagg ggcgtcgctg atgaagatgc acacaacata 1080

cagacccaca gagacagctt ggatttgctg gacaaagccc gagcaaagaa agccatgttg 1140

tctgaacaaa atagggcttc tcctctcccc agtgggctcc tcaccccgcc acagagcggt 1200

aagaagcaga gcagcgggcc ggaaatggcg gctagcggat ccatggatag cactgagaac 1260

gtcatcaagc agttcatgcg cttcaagatt tatatggagg gctccgtgaa cggccacgag 1320

ttcgagatcg agggcgtggg cgagggcaag ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg 1380

caagtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcatttcacc 1440

tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt caagctgtcc 1500

ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc 1560

gtgacccagg actcctccct acaggacggc accctcatct accacgtgaa gttcatcggc 1620

gtgaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ctctgggctg ggagccctcc 1680

actgagcgca actacccccg cgacggcgtg ctgaagggcg agaaccacat ggcgctgaag 1740

ctgaagggcg gcggccacta cctgtgtgag ttcaagtcca tctacatggc caagaagccc 1800

gtgaagctcc ccggctacca ctacgtggac tacaagctcg acatcacctc ccacaacgag 1860

gactacaccg tggtggagca gtacgagcgc gccgaggccc gccaccacct gttccagtag 1920

<210> 34

<211> 639

<212> PRT

<213> homo sapiens的CCNE1和从Discosoma sp. (Sea anemone的DsRed突变获得的sRFP2的融合蛋白)

<400> 34

Met Pro Arg Glu Arg Arg Glu Arg Asp Ala Lys Glu Arg Asp Thr Met

1 5 10 15

Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg Lys

20 25 30

Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp Glu Glu Met Ala Lys

35 40 45

Ile Asp Arg Thr Ala Arg Asp Gln Cys Gly Ser Gln Pro Trp Asp Asn

50 55 60

Asn Ala Val Cys Ala Asp Pro Cys Ser Leu Ile Pro Thr Pro Asp Lys

65 70 75 80

Glu Asp Asp Asp Arg Val Tyr Pro Asn Ser Thr Cys Lys Pro Arg Ile

85 90 95

Ile Ala Pro Ser Arg Gly Ser Pro Leu Pro Val Leu Ser Trp Ala Asn

100 105 110

Arg Glu Glu Val Trp Lys Ile Met Leu Asn Lys Glu Lys Thr Tyr Leu

115 120 125

Arg Asp Gln His Phe Leu Glu Gln His Pro Leu Leu Gln Pro Lys Met

130 135 140

Arg Ala Ile Leu Leu Asp Trp Leu Met Glu Val Cys Glu Val Tyr Lys

145 150 155 160

Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg Tyr

165 170 175

Met Ala Thr Gln Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ile Gly

180 185 190

Ile Ser Ser Leu Phe Ile Ala Ala Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Pro Pro

195 200 205

Lys Leu His Gln Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asp

210 215 220

Glu Ile Leu Thr Met Glu Leu Met Ile Met Lys Ala Leu Lys Trp Arg

225 230 235 240

Leu Ser Pro Leu Thr Ile Val Ser Trp Leu Asn Val Tyr Met Gln Val

245 250 255

Ala Tyr Leu Asn Asp Leu His Glu Val Leu Leu Pro Gln Tyr Pro Gln

260 265 270

Gln Ile Phe Ile Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asp Leu Cys Val Leu Asp

275 280 285

Val Asp Cys Leu Glu Phe Pro Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu

290 295 300

Tyr His Phe Ser Ser Ser Glu Leu Met Gln Lys Val Ser Gly Tyr Gln

305 310 315 320

Trp Cys Asp Ile Glu Asn Cys Val Lys Trp Met Val Pro Phe Ala Met

325 330 335

Val Ile Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Leu Lys His Phe Arg Gly Val

340 345 350

Ala Asp Glu Asp Ala His Asn Ile Gln Thr His Arg Asp Ser Leu Asp

355 360 365

Leu Leu Asp Lys Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Leu Ser Glu Gln Asn

370 375 380

Arg Ala Ser Pro Leu Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Pro Gln Ser Gly

385 390 395 400

Lys Lys Gln Ser Ser Gly Pro Glu Met Ala Ala Ser Gly Ser Met Asp

405 410 415

Ser Thr Glu Asn Val Ile Lys Gln Phe Met Arg Phe Lys Ile Tyr Met

420 425 430

Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Val Gly Glu

435 440 445

Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val Thr Lys

450 455 460

Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro His Phe Thr

465 470 475 480

Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr

485 490 495

Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn

500 505 510

Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln

515 520 525

Asp Gly Thr Leu Ile Tyr His Val Lys Phe Ile Gly Val Asn Phe Pro

530 535 540

Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Pro Ser

545 550 555 560

Thr Glu Arg Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Asn His

565 570 575

Met Ala Leu Lys Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Leu Cys Glu Phe Lys

580 585 590

Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Lys Leu Pro Gly Tyr His Tyr

595 600 605

Val Asp Tyr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Val

610 615 620

Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Ala Arg His His Leu Phe Gln

625 630 635

Claims (2)

1.一种新型红色荧光蛋白，其特征在于：

a)为珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed的突变体；

b)其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:5,包含了氨基酸替换E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q；编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ.ID.NO:4；且

c)该荧光蛋白在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下为红色荧光。

2.一种定位目的蛋白在细胞、动物活体表达的方法，该方法包括：

a)采用基因工程技术将SEQ.ID.NO:4与目的蛋白基因的3’端或5’端融合；

b)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

c)将融合蛋白表达载体转染细胞或动物活体，并在上述细胞和活体的培养条件下培养合适的时间，获得包含SEQ.ID.NO:5氨基酸序列的红色荧光蛋白融合蛋白的表达；

d)在532.5～587.5nm波长通道激发光谱范围下观察目的蛋白在细胞、动物活体中的表达定位。