CN104220589B - 繁星蠕虫荧光素酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光素酶，所述荧光素酶源自属于多光点萤属的繁星蠕虫，所述荧光素酶诱导发光以使得在5.5～8.0的整个pH范围内最大发光波长都落入557nm～562nm的范围内，或所述荧光素酶诱导的发光的发光强度是北美萤火虫荧光素酶所诱导的发光的发光强度的1.5倍。

Description

繁星蠕虫荧光素酶

技术领域

本发明涉及发光昆虫繁星蠕虫(star-worm)的荧光素酶，繁星蠕虫属于节肢动物门、昆虫纲、鞘翅目。更具体而言，本发明涉及克隆自繁星蠕虫的荧光素酶及其突变酶，还涉及通过在细胞中表达所述荧光素酶的基因、并借助于成像检测发光来确定细胞功能的方法。

背景技术

为了确定诸如细胞内信号转导和基因表达等细胞功能，已经使用诸如荧光染料和荧光蛋白等荧光探针和利用荧光素-荧光素酶反应的发光探针。特别而言，为了分析基因表达的调节，使用发光测量，这不会引起由激发光造成的细胞损伤或自发光问题，并且在定量确定方面非常优异。例如，在观察已导入了荧光素酶基因的细胞时，可以通过测量由荧光素酶引起的所述细胞的发光来确定荧光素酶基因的表达强度(更具体而言，表达量)。通过下述步骤进行发光程度的测量：将荧光素和三磷酸腺苷(ATP)等添加至通过裂解细胞而制备的裂解物中，使用利用光电倍增器的光度计对所述裂解物进行定量确定。即，在裂解细胞后测量发光，因此将在特定时间点时荧光素酶基因的表达量确定为整个细胞的平均值。用于导入作为报道基因的发光基因(例如荧光素酶基因)的方法的实例是磷酸钙法、脂转染法和电穿孔法，这些方法中的每一种都根据目的和细胞类型来使用。当使用连接至待导入细胞中的荧光素酶基因上游或下游的目的DNA片段来分析荧光素酶的表达量时，能够研究该DNA片段对荧光素酶基因的转录的影响。此外，待导入细胞中的荧光素酶基因和目的基因的共表达使得能够研究基因产物对荧光素酶基因表达的影响。

为了对发光基因的表达量进行时程分析，需要测量活细胞随时间的发光程度。此类测量通过以下方式进行：在配备有光度计的温育器中进行细胞培养，并且以固定时间间隔定量确定整个细胞群的发光程度。因此，例如，可以分析具有特定周期的表达节律，并且可以获得整个细胞中发光基因的表达量的时间变化。

近年来，在生物学和医学领域中，使用图像对活样品中的动态交替变化进行时程观察的必要性越来越高。在利用荧光观察的领域中，已采用时滞拍摄或动态图像拍摄来动态地阐明蛋白分子的功能。在常规技术中，已利用荧光样品进行时程观察，例如，观察带有添加的荧光分子的蛋白的一个分子的运动图像。

相反，当使用发光样品进行时程观察时，需要使用配备有图像增强器的CCD相机，这是因为发光样品的发光强度极低。近来，已经开发出配备有用于观察发光样品的光学系统的显微镜(Jpn.Pat.Appln.KOKAI申请号2006-301599,国际公开号2006/088109)。

当对发光强度较小的发光样品进行图像拍摄时，应该曝光更长时间以获得清晰图像。此类发光样品仅用于有限的研究。例如，当因发光强度低而需要30分钟的曝光时，可以每30分钟拍摄时程图像，但是不能以更短的时间间隔进行，并且实时图像拍摄也是不可能的。在获得图像后，应该获得多幅图像并将其进行比较，以重点关注发光的细胞，因此，在因发光强度低而需要更长的曝光时间时，这非常耗时。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光素酶，所述荧光素酶与常规荧光素酶相比使得能够进行更容易的测量或观察。

根据本发明的第一方面，提供了一种荧光素酶，所述荧光素酶源自多光点萤属(Diplocladon)的繁星蠕虫。

根据本发明的第二方面，提供了一种荧光素酶，所述荧光素酶诱导发光，以使得在5.5～8.0的整个pH范围内最大发光波长都落入557nm～562nm的范围内。

根据本发明的第三方面，提供了一种荧光素酶，在哺乳动物细胞中，所述荧光素酶所诱导的发光的发光强度是来自北美萤火虫(Photinuspyralis)的已知荧光素酶所诱导的发光的发光强度的1.5倍。

根据本发明的第四方面，提供了一种荧光素酶，所述荧光素酶诱导发光以使得在pH变化时最大发光波长的变化较小，由此可以通过减少环境pH的影响来进行测量或观察。根据本发明的另一方面，提供了一种荧光素酶，所述荧光素酶所诱导的发光的发光强度是已知的萤火虫荧光素酶所诱导的发光的发光强度的1.5倍，由此减少了发光图像拍摄的曝光时间，并与常规技术相比能够以更高的时间分辨率进行时程观察。

附图说明

图1显示了繁星蠕虫荧光素酶在各种pH下的发射谱图。

图2图示了各种荧光素酶的Km值。

图3比较了在哺乳动物细胞中表达的繁星蠕虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度。

图4比较了在哺乳动物细胞中表达的繁星蠕虫野生型荧光素酶和繁星蠕虫突变荧光素酶的发光强度。

具体实施方式

本发明的实施方式涉及荧光素酶，所述荧光素酶源自属于多光点萤属的繁星蠕虫。

“荧光素酶”是催化发光化学反应的一类酶。该酶的底物称为荧光素。在ATP的存在下，在荧光素因荧光素酶的催化活性而发生化学反应时出现光发射。目前，已经获得源自萤火虫和细菌的荧光素酶。实施方式的荧光素酶也具有与上述相同的含义，但是因其首次从下述繁星蠕虫获得而是新颖的。此处，术语“源自”不仅包括来自繁星蠕虫的野生型荧光素酶，还包括其突变形式。

“繁星蠕虫”是属于节肢动物门、昆虫纲、鞘翅目、花萤科(Phengodidae)、多光点萤属的昆虫。已经确认，繁星蠕虫主要原生于南亚、东南亚和东亚。与多光点萤属密切相关的铁路蠕虫(railroadworm)属于花萤科、南美竖毛甲属(Phrixothrix)，原生于南美和中美。

本发明实施方式的荧光素酶是例如含有由SEQIDNO:1表示的氨基酸序列的荧光素酶。所述荧光素酶获自繁星蠕虫。在说明书和所附的权利要求中，所述荧光素酶也称为例如繁星蠕虫荧光素酶或源自繁星蠕虫的荧光素酶。

本发明实施方式的荧光素酶具有诱导发光以使得在pH变化时最大发光波长的变化较小的特性。此处，“最大发光波长”是指在荧光素酶参与的发光反应中在测量波长范围内发光强度最大的波长。使用所述荧光素酶，可以进行测量或观察，从而减少环境pH的影响。例如，对于由在不同pH环境中的荧光素酶诱导的发光，可以在利用显微镜成像时在单一波长下同时测量发光强度。对于本发明实施方式的荧光素酶，即使使用光电转换效率随测量波长变化的设备(例如CCD)，也能够进行更容易的定量测量。当使用常规荧光素酶进行测量时，需要针对每一pH调整测量波长，由于测量波长的差异，这使得难以进行定量比较。相比之下，当使用本发明实施方式的荧光素酶进行测量时，可以使用单一的测量波长，由此更容易进行定量比较。

本发明实施方式的荧光素酶的特征在于，诱导发光以使得在特定pH范围内最大发光波长都落入特定范围内。例如，本发明实施方式的荧光素酶诱导发光以使得在pH6.5～7.0、pH6.0～7.5、pH5.5～8.0、pH5.0～8.5或pH4.5～9.0的整个范围内最大发光波长总在520nm～600nm、530nm～590nm、540nm～580nm、545nm～575nm、550nm～570nm、555nm～565nm或557nm～562nm的范围内。

本发明实施方式的荧光素酶的特征在于，当pH在特定范围内变化时，最大发光波长的变化落入特定值内。例如，对于本发明实施方式的荧光素酶，当pH在pH6.5～7.0、pH6.0～7.5、pH5.5～8.0、pH5.0～8.5或pH4.5～9.0的范围内变化时，最大发光波长的变化总在80nm、60nm、40nm、30nm、20nm、10nm或5nm以内。

图1显示了本发明实施方式的荧光素酶所诱导的发光的发光谱图。如该图所示，在pH5.5～8.0的整个范围内，所述荧光素酶诱导的发光的最大发光波长落入557nm～562nm的范围内。在pH5.5～8.0的范围内，最大发光波长的变化在5nm以内。

本发明实施方式的荧光素酶所诱导的发光比已知荧光素酶所诱导的发光具有更高的强度。因此，实施方式的荧光素酶在用作使蛋白质成像的报告物(reporter)时展示出特别有利的效果。即，实施方式的荧光素酶即使在量小时也能提供高发光强度，由此能够对表达量小的蛋白实现优异的检测。此外，由于发光强度高，实施方式的荧光素酶能够缩短检测所需的曝光时间。因此，通过在时程观察中使用本发明实施方式的荧光素酶作为报告物，能够缩短图像拍摄的间隔，由此实现与实时观察更接近的观察。

图3中，对本发明实施方式的繁星蠕虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度进行了比较。如该图所示，繁星蠕虫荧光素酶能够诱导的发光的发光强度是北美萤火虫荧光素所酶诱导的发光的发光强度的1.5倍。

本发明实施方式的荧光素酶不仅包括源自繁星蠕虫的野生型荧光素酶，还包括使所述野生型荧光素酶的部分氨基酸序列发生突变而得到的突变荧光素酶。此类突变可以是提高其酶活性的突变。此类突变可以是改善其实验可操作性的突变。例如，当野生型荧光素酶在哺乳动物细胞中显示出低溶解度时，本发明实施方式的突变荧光素酶可以是在其中引入了增加溶解度的突变的突变荧光素酶。此处，突变荧光素酶可以是在氨基酸序列中含有突变(例如氨基酸的替换、缺失和/或添加)的那些荧光素酶，只要其展示出本发明实施方式的荧光素酶的特性(即，与常规荧光素酶相比具有更高的发光强度)即可。突变是指野生型荧光素酶的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的突变，优选是野生型荧光素酶的1～20个、1～15个、1～10个或1～5个氨基酸的突变。优选的是，突变荧光素酶的氨基酸序列与野生型荧光素酶的氨基酸序列的同源性为75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上。

此类突变繁星蠕虫荧光素酶的实例是具有由SEQIDNO:15表示的氨基酸序列的荧光素酶。该突变荧光素酶是将SEQIDNO:1的氨基酸序列中的第344位的半胱氨酸替换为丝氨酸而得到的荧光素酶。该突变荧光素酶所诱导的发光的发光强度比繁星蠕虫野生型荧光素酶的更高。图4比较了繁星蠕虫突变荧光素酶和繁星蠕虫野生型荧光素酶的发光强度。繁星蠕虫突变荧光素酶所诱导的发光的发光强度是繁星蠕虫野生型荧光素酶所诱导的发光的发光强度的4.9倍。

本发明涉及一种核酸，所述核酸含有编码本发明实施方式的荧光素酶的碱基序列。即，该核酸含有源自繁星蠕虫的荧光素酶基因。核酸是指例如DNA或RNA。荧光素酶的“基因”主要是指mRNA所转录的区域，即，其是指结构基因。

含有编码实施方式的荧光素酶的碱基序列的核酸是含有SEQIDNO:2表示的碱基序列的那些核酸。具有该序列的基因克隆自繁星蠕虫，并且编码繁星蠕虫野生型荧光素酶。

实施方式的核酸可以是含有野生型荧光素酶基因的碱基序列的那些核酸和包含具有突变的突变荧光素酶基因的碱基序列的那些核酸。此处，突变荧光素酶基因可以是下述基因：其中，只要其仍能展示一个实施方式的荧光素酶的特性，碱基序列中的特定碱基，例如数个碱基，可以被替换、缺失和/或添加。碱基序列的突变包括不引起所编码的氨基酸序列发生变异的那些突变。即，实施方式的核酸包括含有编码野生型荧光素酶的突变荧光素酶基因的那些核酸。

不会使所编码的氨基酸序列发生变异的突变的实例是消除了特异性限制性酶的识别序列的那些突变。由于该突变，含有该基因的核酸不会被限制性酶消化，但是该基因能够编码与突变前的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白。此类突变可以通过将构成限制性酶的识别序列的密码子转化成同义密码子来实现。当该基因中包含用于基因重组的限制性酶识别序列时，此类突变是有用的。在该情况下，通过事先消除该基因的识别序列，可以防止核酸在用限制性酶处理时发生片段化，由此便于进行基因重组。

不会使所编码的氨基酸发生变异的突变的另一实例是针对在特定有机体物种中的表达而对基因的密码子进行了优化的突变。此处，术语“优化”是指将包含在核酸中的基因密码子替换成在特定有机体物种中密码子频率高的密码子。如果进行优化，基因在特定有机体物种中的表达与不优化的情况相比得到增强。实施方式的荧光素酶基因源自繁星蠕虫，因此，在导入了该基因的有机体物种在分类学上与繁星蠕虫距离较远时，可以通过优化来获得较高的效果。特定的有机体物种为例如细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞为例如小鼠细胞、猴细胞和人类细胞。

含有密码子经过优化的编码荧光素酶的碱基序列的实施方式的核酸是例如含有由SEQIDNO:3表示的碱基序列的核酸。在所述核酸中，消除了BamHI和EcoRI的识别序列，并且针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了密码子。

本发明实施方式的核酸是例如包含带有Kozak序列的荧光素酶基因的核酸。Kozak序列是由起始密码子和位于起始密码子前后的多个碱基序列组成的序列。已经证明Kozak序列的存在会使基因的表达量增加。关于Kozak序列，在各有机体物种或生物群系中已经发现共有序列。实施方式的含有Kozak序列的核酸具有与其要被导入的有机体物种对应的Kozak序列。例如，在将核酸导入哺乳动物细胞的情况下，该核酸含有作为Kozak序列的SEQIDNO:4，其中r表示鸟嘌呤或腺嘌呤。起始密码子之后紧邻的氨基酸可以因Kozak序列的添加而改变。待添加Kozak序列的荧光素酶基因可以是野生型基因或以上述方式优化了密码子的突变基因。

本发明包括具有这些核酸的载体。除编码荧光素酶的核酸之外，所述载体可以包含含有表达调控序列和标志基因序列的核酸等。

本发明涉及利用实施方式的荧光素酶来分析细胞中的功能的方法。所述方法包括将实施方式的荧光素酶导入细胞中并用成像设备检测荧光素酶的发光。例如，可以将实施方式的荧光素酶基因引入DNA中的特定表达调控区的下游，并且基于是否存在发光来检测荧光素酶的表达，由此能够确定表达调控区的功能。

本发明涉及利用实施方式的荧光素酶来分析细胞内蛋白的方法。所述方法包括：导入由实施方式的荧光素酶和待分析蛋白组成的融合蛋白，并且使用成像设备检测所述荧光素酶的发光。

所述方法包括：观察待分析蛋白在细胞中的定位，并对定位进行时程观察(时滞)。所述方法不仅包括确认蛋白定位还包括确认单纯的表达。待使用的细胞是非唯一的，并且可以是细胞成像领域中能够常规使用的那些。此外，待分析蛋白也是非唯一的，可以根据研究目来选择。所述蛋白可以是基本上存在于待使用的细胞中的蛋白，或者可以是基本上不存在于细胞中的异源蛋白或经修饰的蛋白。

在将融合蛋白导入细胞时，可以应用已知的导入方法。其中之一是将体外纯化的融合蛋白直接导入细胞中的方法。例如，可以用显微注射法将融合蛋白直接注射到细胞中。或者，将细胞在含有融合蛋白的培养基中温育，由此通过胞吞作用将融合蛋白摄入细胞中。另一方法是将含有编码所述融合蛋白的碱基序列的核酸导入，以在细胞中表达所述融合蛋白。例如，用磷酸钙方法、脂转染和电穿孔法等将含有所述核酸的表达载体导入细胞，由此能够从表达载体表达融合蛋白。此处，融合蛋白的基因含有本发明实施方式的荧光素酶基因和待分析的蛋白的基因，其中，所述荧光素酶基因和所述蛋白的基因以使得它们各自都能够正常翻译的方式连接。

在使用成像设备检测荧光素酶的发光时，可以应用公知的检测方法。例如，通过将荧光素、ATP和Mg²⁺离子等适当地添加到表达含荧光素酶的融合蛋白的细胞中来引起荧光素酶的发光反应，并且通过成像设备可以检测发出的光。所述成像设备是例如配备有用于捕获发光的滤光器的显微镜。基于通过鉴定细胞中的发光位置而获得的信息，可以使用显微镜来具体说明蛋白的定位。作为成像设备，可以使用具有能够进行时程图像拍摄功能的显微镜，并且可以用所述显微镜实现时程观察。

[实施例1：荧光素酶基因的克隆]

1.材料

将在马来西亚霹雳州收集的雌性成虫繁星蠕虫用作材料。已证明繁星蠕虫属于多光点萤属，但是尚未给予其科学命名。在本说明书中，将该物种称为多光点萤属物种1。

2.总RNA的提取

使用剪刀从多光点萤属物种1雌性成虫的腹部周围剪下组织块。使用DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN)根据其手册从这些组织块中提取总DNA。对所获得的总DNA进行荧光素酶基因扩增实验，作为源自多光点萤属物种1的总DNA。

3.繁星蠕虫荧光素酶的鉴定

3-1.以总DNA为模板的PCR

设计了特定引物，从而以总DNA为模板进行PCR来扩增含有内含子的繁星蠕虫荧光素酶基因。所述引物是Home-Diplo(I)-BamHI-F(SEQIDNO:5)和Home-Diplo(I)-stop-EcoRI-R(SEQIDNO:6)。这些引物的合成委托给LifeTechnologies,Japan,Co.,Ltd.。

PCR反应液包含稀释10倍的10×ExTaq缓冲液(20mMMg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种碱基2.5mL)、终浓度为0.05U/μl的TaKaRaExTaq(5U/μL)和终浓度为0.3μM的引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，向19μl该PCR反应液中添加1.0μl繁星蠕虫总DNA溶液。此处，繁星蠕虫总DNA溶液的浓度未确定。在PCR反应中，将所获得的溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环35次，接着在72℃进行延伸反应5分钟。

3-2.以总DNA为模板进行PCR扩增得到的基因的碱基序列的确定

为了确定使用总DNA的PCR扩增的基因的碱基序列，对PCR产物进行纯化、亚克隆和直接测序。详细内容如下。

利用凝胶提取法来收集目的基因片段。使用WizardSVGelandPCRClean-UPSystem(PromegaKK)根据其手册进行凝胶提取。通过TA克隆对提取自凝胶的PCR产物进行亚克隆。使用pGEM-TEasyVectorSystem(PromegaKK)根据其手册进行TA克隆。

随后，将载体DNA转化至大肠杆菌(TOP10菌株或DH5α菌株)中，并且通过蓝-白筛选法来选择插入物阳性菌落。对选出的菌落进行直接菌落PCR，并且确认了目的基因的插入。在直接菌落PCR中，使用由M13-F(-29)引物(5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3':SEQIDNO:7)和M13反向引物(5'-GGATAACAATTTCACAGG-3':SEQIDNO:8)组成的引物对。PCR反应液包含稀释10倍的10×ExTaq缓冲液(20mMMg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种碱基2.5mL)、终浓度为0.05U/μl的TaKaRaExTaq(5U/μL)和终浓度为0.2μM的引物对，向10μl该PCR反应液中添加少量大肠杆菌菌落。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性1分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环25次，接着在72℃进行延伸反应2分钟。PCR反应后，取2μLPCR反应液进行1%tris乙酸缓冲液(TAE)琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。

对于已确认发生了扩增的PCR反应液，通过直接测序方法来确定基因的碱基序列。使用PCR产物纯化试剂盒EXoSAP-IT(GEHealthcareBioscience)，除去包含在PCR反应液中的额外dNTP和引物，制得用于PCR直接测序的模板。使用BigDyeTerminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，制备含有所述模板的测序反应液，并且使用热循环仪进行测序反应。PCR产物的纯化和测序分别根据其手册进行。测序反应后，如下所述对反应产物进行纯化。向反应液中添加2.5倍重量的100%乙醇，然后离心沉淀核酸。除去上清液后，添加70%乙醇来清洗沉淀物，然后用离心机进行沉淀。最后，在除去上清液后，使沉淀物干燥。向经纯化的沉淀物中添加15μL的Hi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)并使其溶解。在94℃下使溶液热变性2分钟，然后在冰上快速冷却，由此提供用于确定碱基序列的样品。对于该样品，使用AppliedBiosystems3130x1基因分析仪(AppliedBiosystems)确定碱基序列。根据手册来执行分析方法。

利用序列信息分析软件DNASISPro的“序列连接(sequencelinking)”功能对所获得的基因序列进行分析。对于所述序列，使用由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的blastx检索进行同源性研究，由此确认：所述序列与已知的萤火虫荧光素酶的碱基序列具有高同源性。所获得的碱基序列(SEQIDNO:9)含有5个内含子，将除去了这些内含子而得到的碱基序列(SEQIDNO:2)翻译成氨基酸序列。将翻译得到的氨基酸序列用作新型繁星蠕虫荧光素酶的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。将通过上述实验和分析获得的碱基序列确定为新型繁星蠕虫荧光素酶基因。

由NO:1、2和9表示的序列如下示出。

SEQIDNO:1

MPNEIVLHGAKPRDPLDLGTAGSQLFRSLTQFSYLREALVDAHTEQVVSYADILENSCRLAICFEKYGLRQNSVIAVCSENSAIFFYPVIAALYMGIITATVNDNYTERELFDTLNISKPELVFCSKKAIKNLTQLKNHIDFIKKLVVLDSDEDIGEVESLANFMKRYSESVIDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGTRTVPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVILLKRFEEEFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDVSSIREVATGGAPVGIEVAEAVAKRLKINGILQGYGLTETCCAVLITPHDHVKTGSTGKVAPYVQAKVVDLSTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNIKATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDEDGHFYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPAIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLEEGHSLTEQEVIEYVAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRRMLSQKKSKL

SEQIDNO:2

atgccgaatgaaatcgttttacatggagccaaaccgcgagatccattagacctgggaactgcaggaagtcaattatttaggtctttgacgcaattttcttatttaagagaagctctggtcgacgctcatactgagcaagtggtatcttacgcggatatcttagaaaacagttgccgtctagctatatgctttgagaaatatggattacgccaaaatagtgtcatagcagtatgcagcgaaaatagcgcgatctttttctaccccgtaatcgccgctttatatatgggtatcataacagcaacagtaaatgataactacaccgaaagggaattattcgacactttaaatatttcgaaacctgaactggtattctgttcgaagaaggcgattaaaaacttgacgcaattgaagaatcacatcgattttattaaaaagctcgtagttttggatagtgatgaagacataggtgaagtcgaatctcttgccaactttatgaaacgctattcagaatctgttattgatgtgagaaactttaagcctcgcgattttgatgctaaagaacaagttgccttaatcatgtcgtcatcaggaacaactggattacctaaaggagtcgttctaacccatagaaatttgagcgttcgctttgtacattgcaaggacccgttattcggcacaaggactgtcccttcaacttcaattttatctatcgttcctttccatcatgcgtttggaatgtttacgacgttgtcctattttatagtaggactcagagtcatactactaaaaagattcgaagaagaatttttcttaagcactattgaaaagtacagaattccaactatcgttcttgcaccacccgtaatggtattcctagccaagagtccgttagtcgatcagtacgatgtgtccagtattagagaagttgctaccggtggtgcacctgtcggcattgaagtggcagaagctgttgcgaaacggctaaaaattaatggaatacttcaaggatacggtctaacagagacatgttgcgccgtattaatcaccccacacgaccatgttaaaacaggttctactgggaaagtcgccccgtacgtgcaagcgaaagttgtagatcttagcaccggaaaatctctagggccaaataaaagaggagaactttgctttaaaagcgagataattatgaaaggttatttcaacaatataaaggctacggaagaggctatcgataaagaaggatggttacattctggagatgtcgggtattatgatgaagatggtcatttctacgtagtagatcgtttaaaagaacttatcaagtacaagggatatcaagttgcaccggctgaattggaatggttgcttttgcaacatccagctatcaaagacgccggtgttactggcgttcctgacgaagctgccggagaacttccgggtgcttgcatagtccttgaagaaggacatagtcttaccgaacaagaagttattgaatatgtagccgaacgtgtttctccaactaaacgtatacgtggtggagtagttttcgttgatgatatacccaaaggagcgactggaaaactcgtcagaagtgaattacggagaatgctttctcagaagaaatcgaaactataa

SEQIDNO:9

atgccgaatgaaatcgttttacatggagccaaaccgcgagatccattagacctgggaactgcaggaagtcaattatttaggtctttgacgcaattttcttatttaagagaagctctggtaagtgtttaacgaaaatagacaatgtacacatcatttgaaaatattgttgaaaaatgggtgtttttttataattttgtctaaagaaacttatatgcagtttcttaataatgataaagtgcaactctttggattacagtcttaaagcatataattattctgagttaattttaacatattttactgtaactataaaaaatcactagcatttgactggttactatatttgaagatacaatgctaaagttaggcaacccaaataacactttttctagtttggttcgacacaatattatttaaaagatcacctatatataccgatgatagaagagaaactatgatgtatgtattattacatgcaaaaataatgttcctcgttcgaattggaatttttataaaattaattaaaattccaattgatcatcatatccatcatatttgcaaaaatatcaacattaaaacattttaggtcgacgctcatactgagcaagtggtatcttacgcggatatcttagaaaacagttgccgtctagctatatgctttgagaaatatggattacgccaaaatagtgtcatagcagtatgcagcgaaaatagcgcgatctttttctaccccgtaatcgccgctttatatatgggtatcataacagcaacagtaaatgataactacaccgaaagtaagtggaaaacttacaaacattttttaatcctccatcatatcgatataatcttccaggggaattattcgacactttaaatatttcgaaacctgaactggtattctgttcgaagaaggcgattaaaaacttgacgcaattgaagaatcacatcgattttattaaaaagctcgtagttttggatagtgatgaagacataggtgaagtcgaatctcttgccaactttatgaaacgctattcagaatctgttattgatgtgagaaactttaagcctcgcgattttgatgctaaagaacaagttgccttaatcatgtcgtcatcaggaacaactggattacctaaaggagtcgttctaacccatagaaatttgagcgttcgctttgtacattgcaagtaggtaacaggaaaaaatttgttttgaaactatacctaagattgattgtacgttattaatcaaaaatccatgcgcctatattacatggtaaagtaggatgtgacacaactgtgtgaaacgtcatcatctactagctttttattgatgacgtacatgttgaaataaaatttgaatggcttataccttaccttagcccaccacattttacctccatttctttgcccctagctgacagatccacttccacatcgtttaatcctcttttcagccgatcctgaattcgaattcaaattcgaattctcttcttctagaagagaatttttctctctttccctcttttttctatcttctctagaaaagaattctagaattctaatcctcttttcagccgataggatgccctatcggctgccctatctgagtccatcatttcaacgatccctagtcatcttagagtgatgaagaatttctacgatttattgttctagtattgttcatttactacaaacaaacaatacaataataaagaatttgaactgtgaattagaaataattcgttcaattttgcacttagtcttaccagtcagtggagttaggttcttagccgtgtatttttaacctcctttaacaggtctgggtttttatatacattttctaacccaatccagacgtatattcgtgctcgttattcattattatcctgaccaagccaaatattatccacagttatggacaggacaggagtcctctcctcataaacttagtgtagtttaatttttcttagggccggtctcgccaccttttaataaatttatctgacaaataacgtacacaaccggcttctattgtaaaaaatatttaccaaataagtttgtcgctggaataactggtttttccggaagatttcaataattagattaatcttttagggacccgttattcggcacaaggactgtcccttcaacttcaattttatctatcgttcctttccatcatgcgtttggaatgtttacgacgttgtcctattttatagtaggactcagagtcatactactaaaaagattcgaagaagaatttttcttaagcactattgaaaagtacagaattccaactatcgttcttgcaccacccgtaatggtattcctagccaagagtccgttagtcgatcagtacgatgtgtccagtattagagaagttgctaccggtggtgcacctgtcggcattgaagtggcagaagctgttgcgaaacggtatttgttttttttttaattgttgaagtgttgttttataacagttaatgtacaggctaaaaattaatggaatacttcaaggatacggtctaacagagacatgttgcgccgtattaatcaccccacacgaccatgttaaaacaggttctactgggaaagtcgccccgtacgtgcaagcgaaagttgtagatcttagcaccggaaaatctctagggccaaataaaagaggagaactttgctttaaaagcgagataattatgaaaggttatttcaacaatataaaggctacggaagaggctatcgataaagaaggatggttacattctggagatgtcgggtattatgatgaagatggtcatttctacgtagtagatcgtttaaaagaacttatcaagtacaagggatatcaagtatgtcgatttttatttaagtgaacgtgtatgaatttaagaccctttatgtattttaggttgcaccggctgaattggaatggttgcttttgcaacatccagctatcaaagacgccggtgttactggcgttcctgacgaagctgccggagaacttccgggtgcttgcatagtccttgaagaaggacatagtcttaccgaacaagaagttattgaatatgtagccggtgagttttagtagcatttttagtttttaatcaattgcgcatttttttcgtagaacgtgtttctccaactaaacgtatacgtggtggagtagttttcgttgatgatatacccaaaggagcgactggaaaactcgtcagaagtgaattacggagaatgctttctcagaagaaatcgaaactataa

将相对于人类密码子进行了优化的SEQIDNO:1氨基酸序列在SEQIDNO:3中示出。基因合成委托给LifeTechnologies,Japan,Co.,Ltd.。由NO:3表示的序列如下示出。

SEQIDNO:3

atgcccaacgagattgtgctgcacggcgccaagcccagggaccctctggatctgggcacagccggcagccagctgttcagaagcctgacccagttcagctacctgcgcgaggccctggtggacgcccacaccgaacaggtggtgtcctacgccgacatcctggaaaacagctgcagactggccatctgcttcgagaagtacggcctgcggcagaacagcgtgatcgccgtgtgcagcgagaacagcgccatcttcttctaccctgtgatcgccgccctgtacatgggcatcatcaccgccaccgtgaacgacaactacaccgagagagagctgttcgacaccctgaacatcagcaagcccgagctggtgttctgcagcaagaaggccatcaagaatctgacccagctgaagaaccacatcgacttcatcaagaaactggtggtgctggacagcgacgaggacatcggcgaggtggaaagcctggccaacttcatgaagcggtacagcgagtccgtgatcgacgtgcggaacttcaagccccgggacttcgacgccaaagaacaggtggccctgatcatgagcagcagcggcaccaccggcctgcctaagggcgtggtgctgacccaccggaacctgagcgtgcgcttcgtgcactgcaaggaccctctgttcggcaccagaaccgtgcccagcaccagcatcctgagcatcgtgcccttccaccacgccttcggcatgttcaccaccctgagctacttcatcgtgggcctgagagtgatcctgctgaagagattcgaggaagagttcttcctgagcaccatcgagaagtatcgcatccccaccatcgtgctggcccctcccgtgatggtgttcctggccaagagccccctggtggatcagtacgacgtgtccagcatcagagaggtggccaccggcggagcccctgtgggaattgaagtggccgaggccgtggccaagcggctgaagatcaacggcatcctgcagggctacggcctgaccgagacatgctgcgccgtgctgatcaccccccacgaccacgtgaaaaccggcagcaccggcaaggtggccccctatgtgcaggccaaggtggtggacctgtccaccggcaagagcctgggccccaacaagcggggcgagctgtgcttcaagagcgagatcatcatgaagggctacttcaacaacatcaaggccaccgaggaagccatcgacaaagagggctggctgcacagcggcgacgtgggctactacgacgaggacggccacttctacgtggtggaccggctgaaagagctgatcaagtacaagggctaccaggtggcacctgccgagctggaatggctgctgctgcagcaccccgccatcaaggatgccggcgtgaccggcgtgccagatgaagctgctggcgagctgcctggcgcctgtatcgtgctggaagagggccactccctgaccgagcaggaagtgatcgagtacgtcgccgagcgggtgtcccccaccaagagaatcagaggcggcgtggtgttcgtggacgacatccctaagggcgccacaggcaagctggtgcgcagcgagctgcggcggatgctgagccagaaaaagtccaagctgtga

以下将该新型荧光素酶称为繁星蠕虫荧光素酶。

[实施例2：新型荧光素酶的酶学参数的确定]

1.新型繁星蠕虫荧光素酶基因的蛋白表达

为了在大肠杆菌中表达，将繁星蠕虫荧光素酶基因引入pRSET-B载体(Invitrogen)中。根据标准方法，通过下述实验来构建该基因表达载体。

1-1.将新型繁星蠕虫荧光素酶引入表达载体中

为了将编码氨基酸序列SEQIDNO:1的荧光素酶基因引入位于pRSET-B载体的BamHI位点和EcoRI位点之间的区域，制备了包含起始密码子及其前方的限制性酶BamHI的识别序列GGATCC的引物，和包含终止密码子及其后方的限制性酶EcoRI的识别序列GAATTC的引物。使用该引物对，对在荧光素酶基因的两端含有前述限制性酶识别位点的片段进行扩增。使用聚合酶KOD-Plus(ToyoboCo.,Ltd.)根据其手册进行PCR。

PCR反应液包含稀释10倍的10×PCR缓冲液、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种碱基2.5mM)、终浓度为1.0mM的MgSO₄、终浓度为0.02U/μl的ToyoboKOD-Plus(1U/μl)和终浓度为0.3μM的引物对，向20μl的该PCR反应液中添加0.4μl的作为模板的不含BamHI和EcoRI识别序列的荧光素酶基因的溶液。在PCR反应中，将反应液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在55℃下30秒和在68℃下2分钟组成的循环30次，接着在68℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μLPCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增基因的条带。确认了基因扩增，因此通过乙醇沉淀法对该PCR反应液进行沉淀浓缩，通过添加4μL用于进行限制性酶处理的10xΗBuffer、限制性酶BamHI(ToyoboCo.,Ltd.)和EcoRI(ToyoboCo.,Ltd.)各2μL、以及32μL无菌去离子水使其溶解，并用限制性酶进行处理，同时保持37℃的温度2小时。随后，通过乙醇沉淀法对反应液进行沉淀浓缩，并将其溶解于无菌去离子水中。取该溶液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色。在紫外照射下确认含有DNA条带的凝胶，用刀切下该凝胶。使用Wizard(R)SVGelandPCRClean-UPSystem(PromegaKK)从切下的凝胶中提取DNA。根据手册进行这些操作。随后，使用LigationPack(NipponGene)根据手册将所提取的DNA引入pRSET-B载体中，所述pRSET-B载体事先已经用BamHI和EcoRI用相同的方法处理过。将该载体DNA转化至大肠杆菌JM109(DE3)菌株中，并使菌落形成。

使用所获得菌落作为模板进行直接菌落PCR，并且对引入pRSET-B中的荧光素酶基因进行扩增。使用T7启动子引物(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3':SEQIDNO:10)和T7反向引物(5'-CTAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3':SEQIDNO:11)的引物对来进行直接菌落PCR。PCR反应液包含稀释10倍的10×ExTaq缓冲液(20mMMg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种碱基2.5mM)、终浓度为0.05U/μl的TaKaRaExTaq(5U/μL)和终浓度为0.2μM的引物，向10μl该PCR反应液中添加少量大肠杆菌菌落作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环25次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL的PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增基因的条带。

对于已确认发生了扩增的PCR反应液，通过直接测序方法来确定基因的碱基序列。使用PCR产物纯化试剂盒ExoSAP-IT，除去额外的dNTP和引物，由此制得用于PCR直接测序的模板。使用BigDyeTerminatorv3.1循环测序试剂盒，制备含有所述模板的测序反应液，并且使用热循环仪进行测序反应。将载体引物或基因特异性引物用于测序。PCR产物的纯化和测序根据手册来进行。测序反应后，如下所述对反应产物进行纯化。向反应液中添加2.5倍重量的100%乙醇，然后离心沉淀核酸。除去上清液后，添加70%乙醇来清洗沉淀物，并用离心机使核酸沉淀。除去上清液后，最后使沉淀物干燥。通过添加15μL的Hi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)使经纯化的沉淀物溶解。在94℃下使溶液热变性2分钟，在冰上冷却，并使用其作为用于确定碱基序列的样品。对于该样品，使用AppliedBiosystems3130xl基因分析仪确定碱基序列，并且确认了所述基因已被引入基因表达载体pRSET-B中。

2.发光蛋白的纯化

将0.5μL荧光素酶表达载体添加至50μL含有JM109(DE3)的大肠杆菌溶液中，将该溶液在冰上温育10分钟，然后在42℃温育1分钟，而后在冰上温育2分钟。随后，将50μL该大肠杆菌溶液添加至200μLSOC培养基中，在37℃下振荡温育20分钟。用100μL经温育的样品在LB培养基平板(含有100μg/mL的氨苄青霉素)上进行划线接种，并在37℃下温育过夜。第二天，将所获得的菌落在500mL规模的LB培养基中于37℃温育24小时，并于18℃温育24小时。温育共48小时后，用离心机收集菌块，将其再悬浮于0.1MTris-HCl溶液(pH8.0)中，并进行超声波破碎。对破碎处理后的菌块溶液进行离心分离(15,000rpm,10分钟)，除去沉淀物，并收集上清液。向床体积为2mL的柱中添加500μLNi-Agar悬浮液和2mL0.1MTris-HCl以使柱平衡。将收集的上清液添加至柱上并使其过柱。在使全部上清液过柱的同时，操作都在4℃下进行。用2mL的25mM咪唑/0.1MTris-HCl溶液洗柱。向洗过的柱上添加2mL的500mM咪唑/0.1MTris-HCl溶液以洗脱荧光素酶。用凝胶过滤柱PD-10(GEHealthcare)过滤经洗脱的样品，并除去矿物质。使用Vivaspin6(SartoriusK.K.)对除去了矿物质的样品进行超滤，并向浓缩样品中添加甘油以制备50%的甘油溶液。将该溶液保存在-20℃下。

3.发光谱图的测量

使用LumiFlSpectroCapture(ATTO)作为测量设备，向含有1mMD-荧光素、2mMATP和4mMMgCl₂的0.1M柠檬酸/0.1MNa₂HPO₄缓冲液(pH6.0～8.0)溶液中添加终浓度为1～10μg/mL的经纯化的酶，添加所述酶15秒后测量发光谱图。测量结果示于图1。

图1显示，所获得的荧光素酶诱导发光以使得在5.5～8.0的整个pH范围内最大发光波长都落入557nm～562nm范围内。更具体而言，其诱导发光以使得在pH8.0的环境下最大发光波长为约562nm。此外，其诱导发光以使得在pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0和pH5.5的环境下最大发光波长分别为约559nm、557nm、557nm、557nm、557nm。

4.动力学分析

4-1.D-荧光素和ATP浓度的确定

如下所述来确定D-荧光素在D-荧光素溶液中的浓度和ATP在ATP溶液中的浓度。

使用紫外光-可见光分光光度计(Hitachi)测量了D-荧光素溶液和ATP溶液的紫外线-可见光吸收光谱。基于测量结果和以下所示的ε值，计算这些溶液的浓度。

D-荧光素：λ_最大328nm,ε18200,pH5.0

ATP:λ_最大259nm,ε15400,pH7.0

对每个样品进行10次测量，并且使用吸光度的平均值进行计算。使用以上述方式确定了浓度的D-荧光素溶液和ATP溶液来计算Km值。

4-2.测量针对D-荧光素的Km值

在多种D-荧光素浓度下测量所获得的荧光素酶的发光强度。基于测量结果，计算针对D-荧光素的Km值。

通过向0.1MTris-HCl(pH8.0)中添加D-荧光素来制备8种不同浓度的D-荧光素溶液。这些溶液中D-荧光素的终浓度为0.625μΜ、1.25μΜ、2.5μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ和80μΜ。将这些D-荧光素溶液各自以50μL的量注入96孔微孔板中。将含有每种经纯化的荧光素酶、4mMATP和8mMMgSO₄的0.1MTris-HCl(pH8.0)溶液连接至光度计的标准泵，在向孔中添加50μL所述溶液的同时进行测量。使用Luminescensor(ATTO)进行测量。对于每种荧光素浓度重复测量3次。

将所获得的光子计数值的峰值强度对荧光素浓度S作图，将初始速率定义为V。对这些图进行Michaelis-Menten型曲线拟合，由此得出Km值。通过非线性最小二乘法进行曲线拟合，通过Newton法进行参数的检索。

4-3.测量针对ATP的Km值

在多种ATP浓度下测量所获得的荧光素酶的发光强度。基于所述结果，确定了针对ATP的Km值。

通过向0.1MTris-HCl(pH8.0)中添加ATP来制备8种不同浓度的ATP溶液。这些溶液中的ATP的终浓度为10μΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ、160μΜ、320μΜ、480μΜ或640μΜ。将这些ATP溶液各自以50μL的量注入96孔微孔板中。将含有每种经纯化的荧光素酶、1mMD-荧光素和8mMMgSO₄的0.1MTris-HCl(pH8.0)溶液连接至光度计的标准泵，在向孔中添加50μL所述溶液的同时进行测量。对于每种荧光素浓度重复测量3次。

将所获得的光子计数值的峰值强度对ATP浓度S作图，将初始速率定义为V。对这些图进行Michaelis-Menten型曲线拟合，由此得出Km值。通过非线性最小二乘法进行曲线拟合，通过Newton法进行参数的检索。

表1中，示出了上文确定的针对D-荧光素的Km值和针对ATP的Km值。表1还标出了以类似方式测量的已知的荧光素酶的Km值。GL3是源自北美萤火虫的荧光素酶。此外，ELuc、CBG和CBR是源自已知的叩头虫(clickbeetle)的荧光素酶。这些已知的荧光素酶是能够商购获得的。

表1.Km值的比较

图2示出了针对D-荧光素浓度和ATP浓度作图的这些Km值。

[实施例3：发光强度的测量]

对繁星蠕虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶在HeLa细胞中表达时的发光强度进行了比较。

对于繁星蠕虫荧光素酶，将Kozak序列添加至针对哺乳动物细胞中的表达而优化了的核酸中，然后插入到pF9ACMVhRLucneoFlexi载体(Promega)多克隆位点的SgfI位点和PmeI位点之间。由于添加了Kozak序列，由紧随起始密码子之后的密码子编码的氨基酸脯氨酸变成了丙氨酸。pF9A载体在载体序列中含有作为内部对照的源自海肾(seapansy)的荧光素酶基因，插入多克隆位点的发光基因的发光强度可以计算为相对于海肾荧光素酶的发光强度的比值。出于比较目的，将Kozak序列添加至已知的北美萤火虫核酸(其含有针对哺乳动物细胞中的表达而优化了的基因)中，然后以类似的方式插入apF9ACMVhRLucneoFlexi载体中。

通过脂转染法将以上述方式获得的两种质粒中的每一种都导入HeLa细胞中，24小时后，用PBS清洗所述细胞。向24孔板的每个孔中添加500μL的2mMD-荧光素/CO₂非依赖性培养基(Invitrogen)，使用Luminescensor(ATTO)在25℃和每孔1秒的条件下测量发光强度90分钟。将在经过90分钟后的时间点的发光强度用作繁星蠕虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度。从各个孔除去培养基后，用PBS将孔清洗三次。随后，向各个孔中添加500μL的10μM腔肠素/CO₂非依赖性培养基，使用Luminescensor在25℃和每孔1秒的条件下测量发光强度30分钟。添加腔肠素后，将在经过5分钟后的时间点的发光强度用作内部对照海肾荧光素酶的发光强度。用繁星蠕虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度各自除以海肾荧光素酶的发光强度，将所获得的值在图中标出作为各荧光素酶的发光强度。结果在图3中示出。根据该图，繁星蠕虫荧光素酶在HeLa细胞中诱导的发光的发光强度是北美萤火虫荧光素酶所诱导的发光强度的1.5倍。

[实施例4：繁星蠕虫荧光素酶的稳定化]

对繁星蠕虫突变荧光素酶和具有由SEQIDNO:1表示的氨基酸序列的繁星蠕虫野生型荧光素酶的发光强度进行了比较。

首先，制备繁星蠕虫突变荧光素酶。在实施例3中制备的含有密码子经过优化且添加有Kozak序列的繁星蠕虫野生型荧光素酶基因的载体中，使用突变引入引物(由SEQIDNO:12表示)来引入突变。由此获得的繁星蠕虫突变荧光素酶编码的是将第344位半胱氨酸替换为丝氨酸的荧光素酶。所述突变根据AsakoSawano和AtsushiMiyawaki,NuleicAcidsResearch,2000,第28卷,No.16,E78所述的方法引入。引入突变后，通过测序确定了序列，从而确认了目标突变的引入。所获得的突变形式的碱基序列及其氨基酸序列示于SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。在由SEQIDNO:14表示的氨基酸序列中，第二位的氨基酸是丙氨酸，其因Kozak序列的添加由脯氨酸变化而来。仅含有C344S突变而不具有Kozak序列的氨基酸序列由SEQIDNO:15表示。由NO:13和15表示的序列如下示出。

SEQIDNO:13

atggccaacgagattgtgctgcacggcgccaagcccagggaccctctggatctgggcacagccggcagccagctgttcagaagcctgacccagttcagctacctgcgcgaggccctggtggacgcccacaccgaacaggtggtgtcctacgccgacatcctggaaaacagctgcagactggccatctgcttcgagaagtacggcctgcggcagaacagcgtgatcgccgtgtgcagcgagaacagcgccatcttcttctaccctgtgatcgccgccctgtacatgggcatcatcaccgccaccgtgaacgacaactacaccgagagagagctgttcgacaccctgaacatcagcaagcccgagctggtgttctgcagcaagaaggccatcaagaatctgacccagctgaagaaccacatcgacttcatcaagaaactggtggtgctggacagcgacgaggacatcggcgaggtggaaagcctggccaacttcatgaagcggtacagcgagtccgtgatcgacgtgcggaacttcaagccccgggacttcgacgccaaagaacaggtggccctgatcatgagcagcagcggcaccaccggcctgcctaagggcgtggtgctgacccaccggaacctgagcgtgcgcttcgtgcactgcaaggaccctctgttcggcaccagaaccgtgcccagcaccagcatcctgagcatcgtgcccttccaccacgccttcggcatgttcaccaccctgagctacttcatcgtgggcctgagagtgatcctgctgaagagattcgaggaagagttcttcctgagcaccatcgagaagtatcgcatccccaccatcgtgctggcccctcccgtgatggtgttcctggccaagagccccctggtggatcagtacgacgtgtccagcatcagagaggtggccaccggcggagcccctgtgggaattgaagtggccgaggccgtggccaagcggctgaagatcaacggcatcctgcagggctacggcctgaccgagacatgcagcgccgtgctgatcaccccccacgaccacgtgaaaaccggcagcaccggcaaggtggccccctatgtgcaggccaaggtggtggacctgtccaccggcaagagcctgggccccaacaagcggggcgagctgtgcttcaagagcgagatcatcatgaagggctacttcaacaacatcaaggccaccgaggaagccatcgacaaagagggctggctgcacagcggcgacgtgggctactacgacgaggacggccacttctacgtggtggaccggctgaaagagctgatcaagtacaagggctaccaggtggcacctgccgagctggaatggctgctgctgcagcaccccgccatcaaggatgccggcgtgaccggcgtgccagatgaagctgctggcgagctgcctggcgcctgtatcgtgctggaagagggccactccctgaccgagcaggaagtgatcgagtacgtcgccgagcgggtgtcccccaccaagagaatcagaggcggcgtggtgttcgtggacgacatccctaagggcgccacaggcaagctggtgcgcagcgagctgcggcggatgctgagccagaaaaagtccaagctgtga

SEQIDNO:15

MPNEIVLHGAKPRDPLDLGTAGSQLFRSLTQFSYLREALVDAHTEQVVSYADILENSCRLAICFEKYGLRQNSVIAVCSENSAIFFYPVIAALYMGIITATVNDNYTERELFDTLNISKPELVFCSKKAIKNLTQLKNHIDFIKKLVVLDSDEDIGEVESLANFMKRYSESVIDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGTRTVPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVILLKRFEEEFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDVSSIREVATGGAPVGIEVAEAVAKRLKINGILQGYGLTETCSAVLITPHDHVKTGSTGKVAPYVQAKVVDLSTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNIKATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDEDGHFYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPAIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLEEGHSLTEQEVIEYVAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRRMLSQKKSKL

此处所用的pF9A载体在载体序列中含有作为内部对照的海肾荧光素酶基因，插入到多克隆位点中的发光基因的发光强度可以计算为相对于由海肾荧光素酶的发光强度的比值。

通过脂转染法将如上获得的繁星蠕虫突变荧光素酶的质粒和实施例3中获得的繁星蠕虫野生型荧光素酶的质粒(其中已优化了密码子并且添加了Kozak序列)各自导入HeLa细胞中，24小时后用PBS清洗细胞。向48孔板的每个孔中添加500μL的2mMD-荧光素/CO₂非依赖性培养基(Invitrogen)，使用Luminescensor在37℃和每孔1秒的测量条件下测量发光强度90分钟。将在经过90分钟后的时间点的发光强度用作各荧光素酶的发光强度。从各个孔除去培养基后，用PBS清洗各个孔三次。随后，向各个孔中添加500μL的10μM腔肠素/CO₂非依赖性培养基，在37℃和每孔1秒的条件下测量发光强度30分钟。添加腔肠素后，将在经过5分钟后的时间点获得的发光强度用作内部对照海肾荧光素酶的发光强度。用繁星蠕虫野生型荧光素酶和突变荧光素酶的发光强度各自除以海肾荧光素酶的发光强度，将所获得的值作为各荧光素酶的发光强度示于图中。结果在图4中示出。根据该图，在HeLa细胞中繁星蠕虫突变荧光素酶所诱导的发光的发光强度是繁星蠕虫野生型荧光素酶所诱导的发光强度的4.9倍。

对本领域技术人员而言可以容易地想到另外的优点和改进。因此，广义方面的本发明不受本文所示和所描述的具体细节和代表性实施方式的限制。因此，可以进行各种修改而不背离由所附权利要求及其等效方案所定义的总的创造性概念的主旨或范围。

Claims (6)

1.一种荧光素酶，所述荧光素酶源自属于多光点萤属(Diplocladon)的繁星蠕虫，所述荧光素酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1或SEQIDNO:15。

2.如权利要求1所述的荧光素酶，所述荧光素酶诱导发光以使得在5.5～8.0的整个pH范围内最大发光波长都落入557nm～562nm的范围内。

3.如权利要求1所述的荧光素酶，所述荧光素酶诱导的发光的发光强度是北美萤火虫荧光素酶所诱导的发光的发光强度的1.5倍。

4.一种核酸，所述核酸编码权利要求1～3中任一项所述的荧光素酶。

5.如权利要求4所述的核酸，其中，针对在哺乳动物细胞中的表达对编码所述荧光素酶的基因的密码子进行了优化。

6.如权利要求4所述的核酸，所述核酸的碱基序列为SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:13。