CN108659110B - 一种改进的红色荧光蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改进的红色荧光蛋白及其应用，属于蛋白质工程领域。本发明通过对来自奶嘴海葵红色荧光蛋白的eqFP578氨基酸序列的改造，获得一种改进的红色荧光蛋白RFPSpark，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，该蛋白与野生型具有明显不同的激发和发射光谱，具有荧光强度更强、成熟更快、稳定性更好和波长更长的特点，与另一个eqFP578的改造蛋白FP650相比，在同等测试条件下，本发明的红色荧光蛋白的荧光亮度比FP650高3倍。本发明还提供了改进的红色荧光蛋白的应用，适用于细胞标记、动物深组织和活体动物成像及多色应用等分析，具有广阔的应用前景。

Description

一种改进的红色荧光蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及一种改进的红色荧光蛋白及应用。

背景技术

荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像方面，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签的选择主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；4)可多通道检测，不相互干扰的荧光蛋白。针对动物体内成像，红色荧光蛋白是最好的选择，因为1)：红色荧光蛋白的激发和发射波长相对其他颜色的荧光蛋白更长，在动物体内的穿透性最强；2)：红光区的自发荧光和光吸收都很低，因此荧光背景最低，可以更清晰的显示红色荧光蛋白的荧光。

eqFP578是从奶嘴海葵Entacmaea quadricolor中分离出来的一种新型红色荧光蛋白，亮度约为DsRed2的1.5倍，为二聚体红色荧光蛋白，其激发和发射波长分别为552nm和578nm(Merzlyak E M.Nat Methods,2007,4(7):555～557)。但野生型eqFP578在使用上仍不是很理想，包括：1)：在成熟速度、荧光强度、波长等方面不适于厚标本和活体动物成像实验；2)：且在高浓度下易形成四聚体，对细胞或组织具有一定的毒性，其应用受到限制。3)：波长仍然偏短。因为在可见光谱的远红外部分，自体荧光和动物组织的光吸收都是最小，并且在远红外区的长波范围的光具有组织穿透力强、对动物组织损伤小、组织背景低、光漂白作用低等优点，更适用于深层组织器官的活体荧光成像。因此，远红荧光蛋白(Shaner NC.JCellSci.2007,120(Pt24):4247-4260)，即最大发射波长>600nm的红色荧光蛋白，在活体荧光成像方面具有巨大的应用潜力。于是，荧光蛋白的改造慢慢向远红色偏移。

进一步优化红色荧光蛋白对于活体动物成像和厚样本检测非常重要，在野生型eqFP578红色荧光蛋白的基础上已有成功的优化的红色荧光蛋白。Merzlyak等采用随机突变的方法，对eqFP578进行突变，得到一个成熟时间短，亮度比DsRed2亮1.7倍的二聚体突变体，命名为TurboRFP(Merzlyak E M.Nat Methods,2007,4(7):555～557)。Shcherbo等对TurboRFP进行一系列定点和随机突变，获得二聚体红色荧光蛋白FP650，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其激发和发射波长分别为592nm和650nm，且具有很好的亮度和光稳定性(Shcherbo D,Nat Methods.2010Oct；7(10):827-9.)。进一步优化红色荧光蛋白的亮度对提高活体成像的质量尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光强度高、稳定性好、能用于动物深组织和活体影像的红色荧光蛋白及其应用。

本发明通过对来自奶嘴海葵(Entacmaea quadricolor)红色荧光蛋白的eqFP578氨基酸序列进行改造，以eqFP578的序列为模板，从发光团结构上或邻近区域来设计荧光蛋白的突变位点，筛选荧光强度、成熟速率、pH值耐受性和光稳定性等特点优化的红色荧光蛋白。具体步骤包括针对功能区的目标氨基酸进行饱和突变和对其他非关键氨基酸进行随机突变并采用DNA重排来构建大容量高突变率的荧光蛋白库，然后筛选高荧光强度、更好光稳定性以及发射波段处于远红外区的红色荧光蛋白，并获得了1株高亮度、长波长和稳定性好的红色荧光蛋白。

本发明提供的一种改进的红色荧光蛋白RFPSpark，其氨基酸序列为如下：

i)Seq ID No.7所示的氨基酸序列；或

ii)Seq ID No.7所示的氨基酸序列中，I93V,N112D,M133V,A142C,S158G任一或多个位点突变的氨基酸序列；或

iii)Seq ID No.7所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

本发明提供了编码上述红色荧光蛋白RFPSpark的基因，其核苷酸序列为如下：

i)Seq ID No.6所示的核苷酸序列；或

ii)Seq ID No.6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

本发明提供了含有上述编码红色荧光蛋白RFPSpark基因的生物材料。

所述生物材料为载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌、昆虫或酵母。

本发明提供了上述红色荧光蛋白RFPSpark或其编码基因或含有该基因的生物材料在细胞标记中的应用。

所述的细胞为植物细胞或动物细胞。

本发明提供了上述红色荧光蛋白RFPSpark或其编码基因或含有该基因的生物材料在哺乳动物组织成像中的应用。

本发明提供了上述红色荧光蛋白RFPSpark或其编码基因或含有该基因的生物材料在基因表达中的应用。

本发明提供了上述红色荧光蛋白RFPSpark或其编码基因或含有该基因的生物材料在基因工程技术领域中的应用。

含有本发明所述红色荧光蛋白RFPSpark的显色剂属于本发明的保护范围。

本发明提供的改进的红色荧光蛋白RFPSpark是由eqFP578红色荧光蛋白突变而来，由SEQ.ID.NO:7所示氨基酸序列中包含了I93V,N112D,M133V,A142C,S158G,H230R位置上由相应的氨基酸替换。本发明红色荧光蛋白RFPSpark激发峰是580nm，发射峰是620nm，呈红色。与亲本蛋白相比(其亲本蛋白eqFP578的激发峰为552nm，发射峰为578nm)。激发光和发射光波长越长，在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，更适宜于动物活体组织的深层成像，是深层成像更为理想的荧光标记分子，并且有很强的红色偏移，因而在动物体内获得了清晰的显色影像，适用于动物深组织和活体动物成像等分析。本发明的红色荧光蛋白推测为二聚体形式，具有很强的荧光亮度和很好的稳定性。

附图说明

图1为本发明的高纯度的RFPSpark红色荧光蛋白溶液。

图2为红色荧光突变蛋白的荧光光谱测定图，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，结果显示RFPSpark的最大激发波长580nm，最佳发射波长620nm。

图3为pCMV3-RFPSpark和pCMV3-FP650在293H细胞中表达荧光蛋白强度图，左图为RFPSpark在293H细胞中表达，右图为FP650在293H细胞中表达，比较显示RFPSpark比FP650的亮度明显增强。

图4为pCMV3-RFPSpark和pCMV3-FP650在CHO细胞中表达荧光蛋白强度图，左图为RFPSpark在CHO细胞中表达，右图为FP650在CHO细胞中表达，比较显示RFPSpark比FP650的亮度明显增强。

图5为pCMV3-RFPSpark和pCMV3-FP650在B16细胞中表达荧光蛋白强度图，左图为RFPSpark在B16细胞中表达，右图为FP650在B16细胞中表达，比较显示RFPSpark比FP650的亮度明显增强。

图6为pCMV3-RFPSpark和pCMV3-FP650在Hela细胞中表达荧光蛋白强度图，左图为RFPSpark在Hela细胞中表达，右图为FP650在Hela细胞中表达，比较显示RFPSpark比FP650的亮度明显增强。

图7为RFPSpark和FP650的SDS-PAGE和PAGE蛋白质凝胶电泳检测图。

图8A和图8B分别为RFPSpark和FP650的SEC-HPLC检测图。

图9为RFPSpark和FP650的pH稳定性测定图，RFPSpark在低pH条件下稳定性优于FP650。

图10A和图10B分别为RFPSpark和FP650的荧光消光系数检测图，RFPSpark蛋白的荧光消光系数为25000M^-1cm^-1，FP650蛋白的荧光消光系数为30000M^-1cm^-1。

图11为RFPSpark和FP650的发射光波谱图，在相同的蛋白浓度下，RFPSpark的发射光的波谱面积为32688，FP650的发射光的波谱面积为12068。

图12为RFPSpark和FP650蛋白的光稳定特性检测图，显示RFPSpark在较强激光漂白下的荧光稳定性优于FP650。

图13A为RFPSpark在293H细胞中表达荧光蛋白强度图，图13B为RFPSpark蛋白活体动物成像图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1红色荧光蛋白eqFP578突变文库的构建

通过Discovery studio4.0软件对奶嘴海葵(Entacmaea quadricolor)红色荧光蛋白eqFP578(氨基酸序列见SEQ ID NO.1)蛋白结构的分析，找出可能影响eqFP578结构的32个位点，这32个位点是：L4，K6，N21，G30，P52，L58，M63，H72，L79，E86，I93，L102，T103，F110，N112，I115，V124，N129，M133，A142，N143，G152，S158，G166，H171，F174，K181，H193，R198，M216，K220，H230，将这32个点错开分成8组(表1)，分别对每组每个位点的氨基酸做饱和突变，这样得到了8组饱和突变的基因库；另外用易错PCR方法对eqFP578基因进行随机突变，得到一组突变基因库；用易错PCR方法对mOrange2基因进行随机突变，得到一组突变基因库；将这10组突变基因应用DNA Shuffling的方法进行随机重组，插入pQE30载体，建立pQE30-eqFP578-DS文库，以获得荧光强度高的突变型。

表1 10组eqFP578的突变库

突变库名	突变方法	突变位点
			eqFP578-m1	定点饱和突变	L4，L79,V124，H171
eqFP578-m2	定点饱和突变	K6,E86，N129，F174
			eqFP578-m3	定点饱和突变	N21，I93，M133，K181
eqFP578-m4	定点饱和突变	G30，L102，A142，H193
			eqFP578-m5	定点饱和突变	P52，T103，N143，R198
eqFP578-m6	定点饱和突变	L58，F110，G152，M216
			eqFP578-m7	定点饱和突变	M63，N112，S158，K220
eqFP578-m8	定点饱和突变	H72，I115,G166，H230
			eqFP578-m9	易错PCR突变	随机
mOrange2-m10	易错PCR突变	随机

分别在eqFP578基因的首尾设计引物，并加入可以连接进入载体的BamHI和PstI位点，上游引物序列是RFP-Bam-F：5’GGAGGATCCATGAGTGAACTGATCAAAGAAAAC 3’(SEQ IDNO.2)，下游引物序列为RFP-Pst-R：5’GGACTGCAGCTAACGATGTCCCAGTTTGGAT 3’(SEQ IDNO.3)。中间突变点处正向饱和引物设计是“NNK”，反向饱和引物设计是“NNM”，这样每组基因需要设计4对突变引物，以质粒pcDNA3-eqFP578为模板分段扩增，然后用重叠PCR法以首尾引物组合成完整的eqFP578-m1～eqFP578-m8突变基因库。

同样用RFP-Bam-F/RFP-Pst-R引物以质粒pcDNA3-eqFP578为模板进行易错PCR扩增全长eqFP578随机突变基因库，随机引入突变位点，易错PCR条件为：6mM MgCl₂和5mMMnCl₂存在下，将dATP,dGTP,dCTP,dTTP按不同比例混合，进行易错PCR，PCR循环条件为：94℃，5min；94℃30s,60℃30s,72℃50s,35个循环；72℃，5min，形成eqFP578-m9突变库。

分别在mOrange2基因的首尾设计引物，并加入可以连接进入载体的BamHI和PstI位点，上游引物序列是mOrange2-Bam-F：5’GGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG 3’(SEQ IDNO.4)，下游引物序列为mOrange2-Pst-R：5’GGACTGCAGTCACTTGTACAGCTCGTC 3’(SEQ IDNO.5)。以质粒pcDNA3-mOrange2为模板进行易错PCR扩增全长mOrange2随机突变基因库，随机引入突变位点，易错PCR条件为：6mM MgCl₂和5mM MnCl₂存在下，将dATP,dGTP,dCTP,dTTP按不同比例混合，进行易错PCR，PCR循环条件为：94℃，5min；94℃30s,60℃30s,72℃50s,35个循环；72℃，5min，形成mOrange2-m10突变库。

分别取10ug eqFP578-m1～eqFP578-m8、10μg易错PCR产物eqFP578-m9和10μg易错PCR产物mOrange2-m10混合后用DNaseI完全消化成小于300bp的条带，琼脂糖凝胶回收50-200bp间的条带。取200ng胶回收纯化的50-200bp的DNA混合物，加入5ul 10xTaq buffer,2μl dNTP,0.5μl taq酶，进行拼接，循环条件为：94℃5min；94℃30s,50℃30s,72℃50s,25个循环；72℃，5min。取10μl上面的PCR产物，其为模板，加入10μl 10xTaq buffer,4μl dNTP,1μl taq酶和首尾引物2μl 10μM RFP-Bam-F/RFP-Pst-R或者mOrange2-Bam-F/mOrange2-Pst-R至进行扩增，循环条件为：94℃，5min；94℃30s,60℃30s,72℃50s,30个循环；72℃，5min。扩增完成后，胶回收纯化680bp条带，经BamHI+PstI双酶切后与经同样双酶切的pQE30载体进行连接反应，电转XL1-Blue细胞，加入1ml SOC培养基于37℃，180rmp培养40min复苏细胞，取500ul涂LB-AT(Amp与Tet抗性)平皿，平均5μl涂一块平皿，37℃培养14h拿出平皿，放室温观察。剩余部分菌液加入甘油于-20℃保存，eqFP578-DS文库制备完成。

实施例2红色荧光蛋白eqFP578突变克隆的筛选

将eqFP578-DS文库均匀的涂板于ZYM-AT自诱导培养基平板(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，25mM Na₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％a-乳糖，2mM MgSO₄，0.2x微量元素，1％琼脂，50μg/mL Amp和10μg/mL Tet)上，30℃培养过夜，eqFP578-DS文库中的单克隆表达突变荧光蛋白，呈现不同亮度和颜色。观察平皿，将较亮的红色菌落用记号笔圈出来。下步配制ZYM-AT自诱导液体培养基，于96孔深孔板中每孔加入200μl ZYM-AT液体培养基中。然后将这些较亮的红色菌落挑出来接种至96孔板中，共挑1820个克隆，所有深孔板放入30℃，200rpm摇床培养16h进行荧光蛋白表达。将过夜表达菌液用PBS稀释5倍(20μl菌液+80μl PBS)，用微孔板检测系统SpectraMax M5进行检测，先用波长扫描对96孔板样品进行粗略扫描，扫描结果显示，所有突变体的激发峰在560-600之间，发射峰在590-650之间，记下每孔的激发峰和发射峰值，每个孔用相应的激发峰和发射峰进行检测，测定每个样品的荧光值。经过大量筛选，挑选了1株高荧光强度的红色荧光蛋白的克隆，命名为RFPSpark，序列见表2。

挑pQE30-RFPSpark单克隆挑于LB细菌培养基中37℃，200rpm培养过夜，按0.5％接种于200ml ZYM-AT自诱导液体培养基中，37℃，240rpm摇床培养20h后，离心收获菌液，收获菌体(BECKMAN COULTER Avanti@J-26XPI，6500RPM/15min)，按菌体:缓冲液1:20加入裂解缓冲液Buffer A(50Mm Tris，pH8.0，500mM NaCl)，搅拌混匀，高压均质机破碎(ATS，200Pa两次，800pa每次)，离心收集上清(BECKMAN COULTER AllegraTM 64R Centrifuge，12000RPM/30min)，0.45μm滤膜过滤，得到澄清的上清液，将样品用恒流泵上Ni柱，(提前用buffer A，3柱体积平衡)，同时打开UV灯，在线监测，样品上完后，用buffer A将UV平衡至基线，分步阶段洗脱，10％buffer B,15％buffer B,20％buffer B,50％buffer B,100％buffer B(buffer B:50mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，500mM咪唑)，分别收集各个洗脱峰。变性电泳监测纯度，将纯度合格的组分过Sephadex G-25Fine柱脱盐至PBS。图1显示RFPSpark蛋白为红色。

检测蛋白的发射峰和激发峰：具体方式为：1)发射波长设为0，扫描激发光谱A(设激发波长扫描范围为200～700nm)；2)荧光发射光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为激发波长，扫描发射光谱(设发射波长扫描范围为激发波长+5nm～700nm)；3)荧光激发光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为发射波长，扫描激发光谱。图2显示RFPSpark的荧光光谱，最大激发波长580nm，最佳发射波长620nm(见表2)。

表2突变红色克隆的特性及序列

实施例3RFPSpark突变型荧光蛋白和FP650荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

用引物RFP-inf-F:5’GGTACCGCTAGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3’(SEQ IDNO.8)和RFP-inf-R：5’GGCCGCTCTAGACTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCAT 3’(SEQ ID NO.9)以筛选的突变型为模板扩增RFPSpark基因，经infusion酶连入到真核表达载体pCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-RFPSpark。纯化获得转染级纯度的pCMV3-RFPSpark质粒转染293H细胞。

具体步骤为：293H细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基,在37℃及5％二氧化碳条件下培养。转染前,将细胞按1*10⁵细胞/孔的密度接种于24孔板中,培养24h后用于转染,细胞密度为70％～90％。2μg DNA与一定量PEI(按PEI:DNA＝5:1的比例添加)各用50μL稀释缓冲液(25mmol/L Hepes,150mmol/L NaCl,pH 7.1)稀释到终浓度。将稀释后的PEI溶液逐滴加入DNA溶液中,立即振荡混匀，室温静置30min后,将混合液加到铺有细胞的24孔板中,摇动混匀后于5％二氧化碳的培养箱中37℃培养。分别于24h、48h、72h用荧光显微镜观察荧光，挑选最亮的时间段拍摄照片(图3)。

用引物FP650-inf-F:5’GGTACCGCTAGCGGATCCATGGGAGAGGATAGCGAGCT 3’(SEQ IDNO.10)和FP650-inf-R：5’GGCCGCTCTAGACTCGAG TCAGCTGTGCCCCAGTTTGC 3’(SEQ IDNO.11)扩增获得FP650的核苷酸序列。经infusion酶连入到真核表达载体pCMV3中，鉴定得到正确的质粒pCMV3-FP650(SEQ ID NO.12)。提取获得pCMV3-FP650和pCMV3-RFPSpark的转染级质粒，转染293H、CHO、B16和Hela细胞。具体步骤同前文，挑选最亮的时间段拍摄照片(图3-6)。其结果显示，RFPSpark在4种细胞中的表达明显强于FP650。

实施例4红色荧光蛋白RFPSpark性质的测定

1.RFPSpark和FP650荧光蛋白的生产

具体方法同前，采用pQE30-RFPSpark、pQE30-FP650两种表达质粒培养1L表达产物，离心破菌得到澄清的上清液，Ni柱纯化获得高纯度的荧光蛋白，脱盐至PBS。RFPSpark和FP650蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图7，蛋白条带结果显示RFPSpark比FP650分子量略大，均在26～28kD，与其理论分子量相吻合。纯化蛋白采用SEC-HPLC分析蛋白的分子量大小，采用SEC-HPLC分析荧光蛋白的颗粒大小，分子量略大的RFPSpark的HPLC的出峰时间为16.274分钟，分子量略小的FP650的HPLC的出峰时间为16.896分钟(图8A和图8B)。

2.RFPSpark pH值稳定性测定

pH值稳定性测定方法为：配置pH＝3-12的缓冲液备用，用配置好的缓冲液将荧光蛋白稀释至20μg/ml，用荧光蛋白的最大激发波长激发，用最大发射波长检测荧光信号。记录相应pH值下的荧光信号值，将荧光信号最强的值定义为100％，计算出相应pH值下的荧光强度百分比，将50％荧光强度下的pH值定义为pKa。图9显示FP650的pKa为6.7,RFPSpark的pKa为6.0。RFPSpark的pH耐受能力要略好于FP650。pH值稳定性越低，表明蛋白可以更好的适应多环境系统的表达，保证其应用范围不受限制。

3.RFPSpark消光系数的测定

依据消光系数的计算公式：e＝A/bc其中e为消光系数；A为吸光度；c为溶液中物质的浓度；b光在溶液中的光程。利用BCA法检测生产的荧光蛋白的浓度，依据测定的浓度，将样品用pH8.0的缓冲液稀释至10ug/ml，20ug/ml，40ug/ml，80ug/ml和160ug/ml在1cm光程比色皿中检测吸光值；依据检测的吸光值和对应荧光蛋白的摩尔浓度作图，拟合直线，从计算公式中读取消光系数值。图10A和图10B显示FP650的消光系数为30000，RFPpark的消光系数为25000。

4.RFPSpark量子产率测定

荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。本实施例通过参比法检测荧光蛋白量子产率，依据公式：Yu＝Ys×Fu/Fs×As/Au；Yu、Ys为待测物质和参比物质的量子产率；Fu、Fs为待测物质和参比物质的积分荧光强度；As，Au为待测物质和参比物质在选定激发波长下的吸光值(A＝ebc)。

荧光样品用pH8.0的缓冲液稀释至20μg/ml在选定的激发波长条件下，用1cm光程比色皿中检测吸光值；同时将该样品在选定波长条件下，进行波谱扫描，导出实验数值，整理后作图，进行波谱积分。将检测获得的吸光值，积分荧光强度，参比物的量子产率值带入公式计算获得待测物质的量子产率。分析获得的荧光发射光谱面积见图11，根据图谱计算得到RFPSpark的量子产率为：0.89，该量子产率明显高于FP650的0.24。

5.RFPSpark亮度检测

荧光亮度为蛋白的消光系数与量子产率的乘积，即荧光蛋白的光能量吸收转换为发射光的能量强度。根据该公式计算，RFPSpark的荧光亮度为22.4，而FP650的荧光亮度为7.7。RFPSpark的亮度比FP650高2.9倍。该结果也与这两种荧光蛋白在细胞中的表达水平的差异结果相吻合。

6.RFPSpark光漂白检测

提取获得pCMV3-FP650和pCMV3-RFPSpark的转染级质粒，转染Hela细胞。具体步骤同前文，挑选最亮细胞用于光漂白检测。

本实施例使用Nikon A1激光扫描共聚焦显微镜进行荧光蛋白光漂白试验。物镜为CFI Apo TIRF 60x，数值孔径(N.A.)为1.49；激光选用561nm通道；光电倍增光(photomultiplier)电压为80V；读值区域面积(ROI)为15600μm²(130μm×120μm)。漂白过程中每隔1.55s读取一次荧光值，共读取25次。以荧光漂白时间为横坐标和荧光强度为纵坐标作图，分析FP650和RFPSpark的荧光强度随漂白时间的变化。图12显示RFPSpark在较强激光漂白下的荧光稳定性优于FP650。

实施例5红色荧光蛋白RFPSpark活体动物实验

提取获得pCMV3-RFPSpark的转染级质粒，转染293H细胞，转染方法同上。表达48h后荧光显微镜观察荧光拍照。收集细胞注射小鼠皮下组织，注射1h后用动物活体成像仪器(IVIS Lumina II)拍照，如图13B，从图中可以看出红色荧光信号很强，说明RFPSpark适于动物活体组织的深层成像。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京义翘神州科技有限公司

<120> 一种改进的红色荧光蛋白及其应用

<130> KHP171110077.5TQ

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 231

<212> PRT

<213> 红色荧光蛋白eqFP578

<400> 1

Met Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu

1 5 10 15

Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Arg

20 25 30

Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Lys Ile Lys Val Val Glu Gly

35 40 45

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr

50 55 60

Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Leu Phe

65 70 75 80

Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Ile Thr Thr Tyr

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asn

100 105 110

Gly Cys Ile Ile Tyr Asn Val Lys Ile Asn Gly Val Asn Phe Pro Ser

115 120 125

Asn Gly Ser Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Asn Thr

130 135 140

Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly His Ser Gln Met

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly Tyr Leu His Cys Ser Phe Lys Thr

165 170 175

Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Phe

180 185 190

His Phe Val Asp His Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu

195 200 205

Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Met Ala Val Ala Lys Tyr Cys Asp Leu

210 215 220

Pro Ser Lys Leu Gly His Arg

225 230

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaggatcca tgagtgaact gatcaaagaa aac 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggactgcagc taacgatgtc ccagtttgga t 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaggatcca tggtgagcaa gggcgag 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggactgcagt cacttgtaca gctcgtc 27

<210> 6

<211> 750

<212> DNA

<213> 从Entacmaea quadricolor的eqFP578突变获得的RFPSpark

<400> 6

atggtgagca agggcgagga ggatagcact agcgagccga tctccgagaa catgcacatg 60

aaactgtaca tggagggcac cgtgaacggt catcatttta aatgtactag tgaaggtgag 120

ggtaaaccct acgagggcac ccagaccatg aagatcaagg tggtcgaggg cggccctctc 180

cccttcgcct tcgacatcct ggctaccagc ttcatgtacg gcagcaaaac ctttatcaac 240

cacacccagg gcatccccga cttctttaag cagtccttcc ctgagggctt cacatgggag 300

agggtgacca catacgaaga tggcggggtc ttaacggcaa cgcaagatac gagtctccag 360

gacggctgcc tcatctacaa cgtcaagatc aacggggtga acttcccatc caacggccct 420

gtggtgcaga agaaaacact cggctgggag tgtagcaccg agatgctgta ccccgctgac 480

agcggcctga gaggccatgg gcagatggcc ctgaaattgg ttggtggagg gtatttacat 540

tgtagtttaa agaccacata cagatccaag aaacccgcta agaacctcaa gatgcccggc 600

ttctacttcg tggacaggaa actggaaaga atcaaggaag cggataagga aacgtatgtg 660

gaacaacatg aaatggctgt ggccaggtac tgcgacctgc ctagcaaact ggggcgcagc 720

accggcggca tggacgagct gtacaagtga 750

<210> 7

<211> 249

<212> PRT

<213> 从Entacmaea quadricolor的eqFP578突变获得的RFPSpark

<400> 7

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Ser Thr Ser Glu Pro Ile Ser Glu

1 5 10 15

Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His His

20 25 30

Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln

35 40 45

Thr Met Lys Ile Lys Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe

50 55 60

Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn

65 70 75 80

His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly

85 90 95

Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr

100 105 110

Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val

115 120 125

Lys Ile Asn Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Val Gln Lys

130 135 140

Lys Thr Leu Gly Trp Glu Cys Ser Thr Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp

145 150 155 160

Ser Gly Leu Arg Gly His Gly Gln Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly

165 170 175

Gly Tyr Leu His Cys Ser Leu Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro

180 185 190

Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Phe Tyr Phe Val Asp Arg Lys Leu

195 200 205

Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu

210 215 220

Met Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly Arg Ser

225 230 235 240

Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

245

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtaccgcta gcggatccat ggtgagcaag ggcgaggag 39

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggccgctcta gactcgagtc acttgtacag ctcgtccat 39

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtaccgcta gcggatccat gggagaggat agcgagct 38

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggccgctcta gactcgagtc agctgtgccc cagtttgc 38

<210> 12

<211> 705

<212> DNA

<213> 从Entacmaea quadricolor的eqFP578突变获得的FP650

<400> 12

atgggagagg atagcgagct gatctccgag aacatgcaca tgaaactgta catggagggc 60

accgtgaacg gccaccactt caagtgcaca tccgagggcg aaggcaagcc ctacgagggc 120

acccagaccg ctaagatcaa ggtggtcgag ggcggccctc tccccttcgc cttcgacatc 180

ctggctacca gcttcatgta cggcagcaaa acctttatca accacaccca gggcatcccc 240

gacttcttta agcagtcctt ccctgagggc ttcacatggg agaggatcac cacatacgaa 300

gacgggggcg tgctgaccgc tacccaggac accagcctcc agaacggctg cctcatctac 360

aacgtcaaga tcaacggggt gaacttccca tccaacggcc ctgtgatgca gaagaaaaca 420

ctcggctggg aggccagcac cgagatgctg taccccgctg acagcggcct gagaggccat 480

agtcagatgg ccctgaagct cgtgggcggg ggctacctgc actgctccct caagaccaca 540

tacagatcca agaaacccgc taagaacctc aagatgcccg gcttctactt cgtggacagg 600

aaactggaaa gaatcaagga ggccgacaaa gagacctacg tcgagcagca cgagatggct 660

gtggccaggt actgcgacct gcctagcaaa ctggggcaca gctga 705

Claims (9)

1.一种改进的红色荧光蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为如Seq ID No.7所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述红色荧光蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列为如Seq IDNo.6所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌、昆虫或酵母。

4.权利要求1所述红色荧光蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在细胞标记中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，所述的细胞为植物细胞或动物细胞。

6.权利要求1所述红色荧光蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在哺乳动物组织成像中的应用。

7.权利要求1所述红色荧光蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在基因表达中的应用。

8.权利要求1所述红色荧光蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在基因工程技术领域中的应用。

9.含有权利要求1所述红色荧光蛋白的显色剂。

Images