TWI779550B - 鉛離子的偵測方法及生物感應器 - Google Patents

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邱泰裕
鍾敏玟
張郁芬
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昱星生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種鉛離子的偵測方法及生物感應器。偵測方法包括下列步驟：於一細胞樣本內表現用於偵測鉛離子的一融合蛋白，其包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域；對細胞樣本施以一特定波長範圍內的一光刺激；以及分析施體螢光蛋白及受體螢光蛋白回應光刺激所分別產生的一光學訊號。施體螢光蛋白可被該特定波長範圍的光所激發。施體螢光蛋白的發射光譜與受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊。鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間。生物感應器包括一載體及前述融合蛋白。融合蛋白設置於載體。

Description

鉛離子的偵測方法及生物感應器
本發明關於一種鉛離子的偵測方法及生物感應器，特別關於一種利用光學技術的偵測鉛離子的方法及生物感應器。
重金屬「鉛（Pb）」被廣泛地應用在工業、建築材料中，且隨著科技的發展，逐漸提升鉛的使用量，進而造成鉛被散佈於地球環境。直到近代，人們才了解到重金屬鉛毒害的嚴重性。由於鉛中毒的過程中並沒有明顯的徵兆或跡象（即無症狀）可作為警訊，待發現症狀時，病情已經相當嚴重，增加治療上的難度。
關於鉛暴露的程度、或鉛中毒的評估，是依據現行臨床檢驗的參考值規定。常規診斷方法是量測血鉛濃度（blood lead level, BLL），成人會出現病徵之血鉛濃度的臨界數值定為10 μg/dL（相當於500 nM），孩童的血鉛濃度的安全數值為2 μg/dL（相當於100 nΜ）。然而，血鉛濃度必須由受試者到醫院抽血，並經過繁複的化學分析程序才能得知，這也使得鉛暴露的評估變得更加的困難與不容易隨時監測。另外，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）定義自來水溶出的鉛含量標準為低於10 ppb（相當於50 nM）。
事實上，無論是環境水、食物源、或是血鉛濃度，皆必須先經過採樣（且血液還要再經過繁複的化學處理），再以精密的化學分析儀器進行檢測。例如以石墨烯原子吸收光譜（graphite furnace atomic absorption spectroscopy，GFAAS）、或電感耦合電漿體質譜儀（Inductively Coupled Plasma-Mass spectroscopy，ICP-MS）等精密儀器進行檢測。前述精密儀器的操作程序繁瑣、價格昂貴、且維修保養不易。
為解決前述問題，近年來也有不少實驗室開發出以光學技術取代儀器的簡易偵測方式，例如，以石墨烯搭配DNA酶（DNAzyme）、或利用遠紅外光螢光探針等。但前述偵測方式的靈敏度差，且仍在基礎研究階段，無法直接應用在現有的儀器。又，不論是化學分析儀器或是前述以光學技術取代儀器的偵測方式，皆無法應用在活細胞的即時偵測。
又，一般採用生物感應器（biosensor）偵測活細胞內的特定物質。具體而言，生物感應器的基本材料通常為小分子，例如典型的核糖核酸（RNA）或蛋白質（protein）。隨著科技的進步，目前已發展出多種的生物感應器以即時偵測與定量微小的分子或離子的變化。其中，多種遺傳編碼的螢光感應偵測器（genetically encoded fluorescent sensors）更被廣泛的應用在生物感應器。例如，以偵測螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）為策略的遺傳編碼鈣離子生物感應器。
螢光能量共振轉移（FRET）是早先發展起來的一門技術，其是以綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，GFP）技術搭配螢光即時影像感應系統。現今雖有許多類型的遺傳編碼螢光感應偵測器，以因應不同重要生物分子的活細胞動態感測。然而，目前仍沒有能偵測重金屬鉛的基因編碼融合蛋白被建構出來。
有鑑於上述課題，本發明之主要目的係在提供一種鉛離子的偵測方法及生物感應器，藉由偵測鉛離子的一融合蛋白的設計，以解決習知以精密儀器偵測鉛離子的操作程序繁瑣且維修保養不易等問題，且解決目前以光學技術取代儀器的偵測方式，無法應用在細胞內或活體內偵測的問題。
為達成上述之目的，本發明提供一種鉛離子的偵測方法。該方法包括下列步驟：於一細胞樣本內表現用於偵測鉛離子的一融合蛋白，其包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域，施體螢光蛋白可被一特定波長範圍的光所激發，施體螢光蛋白的發射光譜與受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊，鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間；對細胞樣本施以特定波長範圍內的一光刺激；以及分析施體螢光蛋白及受體螢光蛋白回應光刺激所分別產生的一光學訊號。
為達成上述之目的，本發明又提供一種鉛離子的偵測方法。該方法包括下列步驟：提供一生物感應器，包括用於偵測鉛離子的一融合蛋白，融合蛋白包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域，施體螢光蛋白可被一特定波長範圍的光所激發，施體螢光蛋白的發射光譜與受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊，鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間；提供一待測樣本，並置入生物感應器；對待側樣本施以特定波長範圍內的一光刺激；以及分析施體螢光蛋白及受體螢光蛋白回應光刺激所分別產生的一光學訊號。
為達成上述之目的，本發明更提供一種生物感應器，用於偵測鉛離子。生物感應器包括一載體以及一融合蛋白，融合蛋白設置於載體。融合蛋白包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域。施體螢光蛋白可被一特定波長範圍的光所激發。施體螢光蛋白的發射光譜與受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊。鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間。
根據本發明之一實施例，當鉛離子結合結構域與鉛離子結合時，施體螢光蛋白與受體螢光蛋白相互接近，且施以特定波長範圍內的光刺激時，施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間產生螢光能量共振轉移。
根據本發明之一實施例，鉛離子結合結構域的氨基酸序列與一鉛結合蛋白的胺基酸序列具有至少80%的相似度。
根據本發明之一實施例，鉛離子結合結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3。
根據本發明之一實施例，鉛離子結合結構域更包括一連接子，連接子插入鉛結合蛋白的第五個α螺旋結構。
根據本發明之一實施例，連接子的胺基酸序列為SEQ ID NO：4。
根據本發明之一實施例，鉛離子結合結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7。
根據本發明之一實施例，施體螢光蛋白為青色螢光蛋白，受體螢光蛋白為黃色螢光蛋白。
承上所述，依據本發明之鉛離子的偵測方法及生物感應器，藉由用於偵測鉛離子的一融合蛋白，可偵測細胞樣本或待測樣本的鉛離子，進而可應用在細胞內（in-cell）及活體內（ in vivo），並可應用在實體的生物感應器。具體而言，融合蛋白包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域，鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間。鉛離子結合結構域可與鉛離子結合，以作為偵測鉛離子的工具。又，當鉛離子結合結構域與鉛離子結合時，施體螢光蛋白與受體螢光蛋白相互靠近而產生螢光能量共振轉移（FRET），進而可以光學的方式偵測，以取代習知儀器的偵測方式。
本說明書中對「一實施例」、「在一實施例中」等引用是表示所述的實施例可包括特定的外觀、特徵、結構或特性，但非限制每一個實施例都必須包含該特定的外觀、特徵、結構或特性。而且，此用語可以但非必須指說明書中其他部分所提到的相同實施例。又，當描述一特定的模組、外觀、特徵、結構或特性且結合成一實施例時，不論說明書中是否有明確描述，在本技術領域界具有通常知識者仍可將該模組、外觀、特徵、結構或特性結合至其他實施例。換言之，任何模組、元件或特徵可以結合不同實施例中的其他元件或特徵，除非具有明顯或固有不相容特性者，或是特別被排除者。
首先，本發明所提供之鉛離子的偵測方法及生物感測器，是組合遺傳學及光學方法，以遺傳編碼的螢光感應偵測器（genetically encoded fluorescent sensors）為策略的遺傳編碼鉛離子生物感測器。在一些實施例中，鉛離子的偵測方法可應用在培養之細胞、細胞胞器、活組織及行為動物的特定細胞中，其可在前述細胞中表現一融合蛋白（fusion protein），作為用於偵測細胞中鉛離子的生物感測器（biosensor）。在另一實施例中，鉛離子的偵測方法也可直接應用在具有實體裝置的生物感測器，例如生物晶片（biochip）。將純化後的融合蛋白塗布（coating）在生物晶片上，用以偵測待測樣本（例如環境水或檢體）中的鉛離子。
圖1為本發明之一實施例之鉛離子的偵測方法的流程圖，圖2為本發明之一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的方塊示意圖，請同時參考圖1及圖2所示。本實施例之鉛離子的偵測方法包括下列步驟：於一細胞樣本內表現用於偵測鉛離子的一融合蛋白（步驟S10）；對細胞樣本施以特定波長範圍內的一光刺激（步驟S20）；以及分析施體螢光蛋白及受體螢光蛋白回應光刺激所分別產生的一光學訊號（步驟S30）。
在步驟S10中，於一細胞樣本內表現用於偵測鉛離子的融合蛋白（Fusion Protein），於後續實驗例中稱為融合蛋白Met-lead。其中，細胞樣本是指受測試的細胞、或細胞胞器。另外，可依據所需測試的樣本選擇培養不同的細胞，例如植物細胞或動物細胞。於後續的實驗例中，分別以人胚胎腎細胞（HEK 293）、阿拉伯芥（植物）及果蠅（昆蟲）中表現前述的融合蛋白Met-lead為例說明。
本實施例是利用螢光能量共振轉移（fluorescence resonance energy transfer，以下簡稱FRET）的方式，建構用於偵測鉛離子的融合蛋白Met-lead。如圖2所示，用於偵測鉛離子的融合蛋白Met-lead包括一施體螢光蛋白D、一受體螢光蛋白A以及一鉛離子結合結構域（Pb 2+binding domain）PbBD。其中，鉛離子結合結構域PbBD位於施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間。
首先，施體螢光蛋白D及受體螢光蛋白A分別為可產生螢光能量共振轉移（FRET）的施體（donor）螢光分子與受體（acceptor）螢光分子。具體而言，施體螢光蛋白D的發射光譜（emission spectrum）與受體螢光蛋白A的吸收光譜（absorption spectrum）部分重疊，例如重疊至少30%，使得施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間的距離小於10 nm時，可產生螢光能量共振轉移（FRET）的現象。
常見應用於螢光能量共振轉移（FRET）的配對螢光分子包括藍色螢光蛋白（bule fluorescent protein，BFP）及綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，GFP），較佳的可以為增強型藍色螢光蛋白（enhanced BFP，或稱EBFP）及增強型綠色螢光蛋白（enhanced GFP，或稱EGFP）。常見的螢光能量共振轉移（FRET）的配對螢光分子還包括青色螢光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）及黃色螢光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP），本實施例即是以次類型的配對螢光分子為例。意即，施體螢光蛋白D為青色螢光蛋白（CFP），而受體螢光蛋白A為黃色螢光蛋白（YFP）。較佳的，施體螢光蛋白D可以是增強型青色螢光蛋白（enhanced CFP，或稱ECFP），而受體螢光蛋白A可以是改良型的黃色螢光蛋白Venus。關於施體螢光蛋白D及受體螢光蛋白A的胺基酸序列於實驗例的段落中一併說明。
另外，鉛離子結合結構域PbBD為可與鉛離子結合（binding）的胜肽（peptide），用以偵測細胞樣本或其他待測樣本中的鉛離子。細菌中有許多特化的鉛結合蛋白，而研究發現在一種重金屬耐受性細菌 Cupriavidus metallidurans（ C. metallidurans）CH34中帶有抗鉛操控子（lead resistance operon, pbr），以調控鉛離子的吸收與排出。其中，抗鉛操控子具有三段基因可表現為鉛離子的結合蛋白，分別為鉛結合蛋白PbrA、PbrD及PbrR。在本實施例中，鉛離子結合結構域PbBD是以鉛結合蛋白PbrR（SEQ ID NO：1）作為設計的模板，且鉛離子結合結構域PbBD的氨基酸序列與鉛結合蛋白PbrR的胺基酸序列具有至少80%的相似度。在其他實施例中，鉛離子結合結構域PbBD亦可以鉛結合蛋白PbrA、PbrD作為設計的模板。換言之，鉛離子結合結構域PbBD的氨基酸序列可與鉛結合蛋白PbrA、或PbrD的胺基酸序列具有至少80%的相似度，同樣可以達到結合並偵測鉛離子的功能。又，本發明提出六種不同的鉛離子結合結構域PbBD，其細節於實驗例的段落中一併說明。
於步驟S20中，對表現有用於偵測鉛離子的融合蛋白（Met-lead）的細胞樣本施以特定波長範圍內的一光刺激。
施體螢光蛋白D可被一特定波長範圍的光所激發，該特定波長範圍視施體螢光蛋白D的類型而定。例如，本實施例之施體螢光蛋白D為增強型青色螢光蛋白（ECFP），其可被波長為430 nm至440 nm的光源所激發。當鉛離子結合結構域PbBD與鉛離子（Pb 2+）結合時，鉛離子結合結構域PbBD的蛋白質結構發生改變，進而可拉近二端之施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間的距離。當施以特定波長範圍（例如430 nm至440 nm）內的光刺激，且施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A相互接近至10 nm以內的距離時，施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間即可產生螢光能量共振轉移（FRET），並產生不同的光學訊號，以於步驟S30中進行分析。
於步驟S30中，分析施體螢光蛋白D及受體螢光蛋白A回應光刺激所分別產生的一光學訊號。
具體而言，當鉛離子結合結構域PbBD與鉛離子（Pb 2+）結合並發生結構上的改變後，會拉近施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間的距離，並增加螢光能量共振轉移（FRET）的程度。其中，可偵測到施體螢光蛋白D的螢光降低，而受體螢光蛋白A的螢光增加，故可以施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A的螢光值比（emission ratio）表示細胞樣本中的鉛離子（Pb 2+）濃度。
反之，若細胞樣本鉛離子、或鉛離子的濃度太低，使得鉛離子結合結構域PbBD未與鉛離子結合，則僅能偵測到施體螢光蛋白D回應前述特定波長範圍的光刺激的螢光（光學訊號），無法偵測到施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A有螢光消長的光學訊號。
由上述可知，本實施例之融合蛋白Met-lead因具有施體螢光蛋白D、受體螢光蛋白A以及鉛離子結合結構域PbBD，且鉛離子結合結構域PbBD位於施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間，進而可作為用於偵測鉛離子的一種生物感測器。其中，本實施例是於細胞樣本中表現融合蛋白Met-lead，進而可偵測細胞樣本中的鉛離子。
圖3為本發明之另一實施例之鉛離子的偵測方法的流程圖，圖4為本發明之一實施例之生物感應器的方塊示意圖，請參考圖3及圖4所示。在本實施例中，可將融合蛋白Met-lead應用在具有實體裝置的生物感測器，例如生物晶片，用以偵測待測樣本（例如環境水或檢體）中的鉛離子。本實施例之鉛離子的偵測方法包括下列步驟：提供一生物感應器1，其包括用於偵測鉛離子的一融合蛋白Met-lead（步驟S11）；提供一待測樣本，並置入生物感應器（步驟S12）；對待側樣本施以特定波長範圍內的一光刺激（步驟S21）；以及分析施體螢光蛋白及受體螢光蛋白回應光刺激所分別產生的一光學訊號（步驟S30）。
於步驟S11中，生物感應器1包括一載體10以及一融合蛋白Met-lead，且融合蛋白Met-lead設置於載體10。具體而言，生物感應器1可以為生物晶片（biochip），而載體10可以為生物晶片所使用的基材。融合蛋白Met-lead經表現純化後，例如以塗布（coating）的方式將融合蛋白Met-lead設置在載體10上，用以偵測待測樣本中的鉛離子（於步驟S12）。在本實施例中，生物感應器1可具有至少一凹槽11，載體10（基材）位於凹槽11的底部，而融合蛋白Met-lead塗布於載體10。其中，融合蛋白Met-lead的細節可參考前述實施例，其同樣包括施體螢光蛋白D、受體螢光蛋白A以及鉛離子結合結構域PbBD，且鉛離子結合結構域PbBD位於施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A之間。
於步驟S12中，提供一待測樣本，並置入生物感應器10。具體而言，待測樣本可以是血清、尿液等檢體、或是環境中的水樣本。待測樣本（液體）可注入凹槽11內，藉此將待測樣本置入生物感應器10。
本實施例之步驟S21與前述實施例之步驟S20大致相同，差異僅在於本實施例是對設置於生物感應器10的待測樣本施以特定波長範圍內的一光刺激。本實施例之施體螢光蛋白D同樣以增強型青色螢光蛋白（ECFP），故可被波長為430 nm至440 nm的光源所激發。若待測樣本中具有鉛離子（Pb 2+），其可與與塗布在凹槽11內之融合蛋白Met-lead的鉛離子結合結構域PbBD結合。同樣的，結合後會使施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A相互靠近，並產生螢光能量共振轉移（FRET）。此時，於步驟S30中分析施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A所產生的不同光學訊號。本實施例之步驟S30與前述實施例相同，可直接參考前述說明，於此不再贅述。
實驗例1：建構用於偵測鉛離子的融合蛋白Met-lead。
圖5A為本發明之一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的示意圖，請參考圖5A所示。利用聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）從細菌 C. metalliduransCH34放大鉛結合蛋白PbrR的基因片段，並以作為鉛離子結合結構域PbBD的設計模板。本實施例之離子結合結構域PbBD的胺基酸序列與鉛結合蛋白PbrR的胺基酸序列具有至少80%的相似度。其中，鉛結合蛋白PbrR具有131個胺基酸，其胺基酸序列可參考SEQ ID NO：1。
以蛋白質結構模擬的方式預測鉛結合蛋白PbrR的二級結構，鉛結合蛋白PbrR具有六個α螺旋結構（α-helix）。第一及第二個α螺旋結構為DNA結合結構域，第三至第六個α螺旋結構可形成鉛離子結合結構域PbBD。在本實施例中，提出三種胺基酸長度不同的鉛離子結合結構域PbBD，其所對應的融合蛋白Met-lead分別以數字1.01、1.44及1.59表示。
其中，融合蛋白Met-lead 1.01直接選用全長的鉛結合蛋白PbrR（胺基酸序列1～131）作為鉛離子結合結構域PbBD（SEQ ID NO：1），故其包含所有（第一至第六）的α螺旋結構。融合蛋白Met-lead 1.44選用鉛結合蛋白PbrR之胺基酸序列44～131作為鉛離子結合結構域PbBD（SEQ ID NO：2），其包含第三至第六個α螺旋結構。融合蛋白Met-lead 1.59則是選用鉛結合蛋白PbrR胺基酸序列59～131作為鉛離子結合結構域PbBD（SEQ ID NO：3），其包含第四至第六個α螺旋結構。於後續實驗例中所使用的融合蛋白Met-lead依據胺基酸序列長度的不同分別命名為融合蛋白Met-lead 1.01、融合蛋白Met-lead 1.44及融合蛋白Met-lead 1.59。
另外，鉛結合蛋白PbrR的第五個α螺旋結構可形成二聚體（dimer）。較佳的，本實施例更於第五個α螺旋結構處設計一個連接子（linker），以防止融合蛋白Met-lead形成多聚體（multimer），並提升偵測鉛離子的效果。換言之，鉛離子結合結構域PbBD更可包括一個連接子，且連接子插入鉛結合蛋白PbrR的第五個α螺旋結構。圖5B為本發明之另一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的示意圖，請參考圖5B所示。在本實施例中，將連接子命名為M1，具體的胺基酸序列為SEQ ID NO：4。
另外，具有連接子M1的融合蛋白Met-lead，同樣依據胺基酸序列長度的不同，分別命名為融合蛋白Met-lead 1.01 M1、融合蛋白Met-lead 1.44 M1及融合蛋白Met-lead 1.59 M1。其中，融合蛋白Met-lead 1.01 M1之鉛離子結合結構域PbBD的胺基酸序列為SEQ ID NO：5。具體而言，融合蛋白Met-lead 1.01 M1是選用全長的鉛結合蛋白PbrR（胺基酸序列1～131）作為鉛離子結合結構域PbBD，並於第98及99胺基酸的位置之間插入連接子M1，於此稱為鉛結合蛋白PbrR M1。其中，鉛結合蛋白PbrR M1的總長為138個胺基酸。
融合蛋白Met-lead 1.44 M1是選用鉛結合蛋白PbrR M1之胺基酸序列44～138作為鉛離子結合結構域PbBD，其胺基酸序列為SEQ ID NO：6。同樣的，融合蛋白Met-lead 1.59則是選用鉛結合蛋白PbrR胺基酸序列59～138作為鉛離子結合結構域PbBD，其胺基酸序列為SEQ ID NO：7。因此，融合蛋白Met-lead 1.44 M1、1.59 M1之鉛離子結合結構域PbBD皆具有連接子M1（SEQ ID NO：4）。
選擇合適的蛋白質片段作為鉛離子結合結構域PbBD（即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、及SEQ ID NO：7）。利用限制酶KpnI及BamHI切點，將鉛離子結合結構域PbBD的DNA片段接在施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A的基因片段之間。如前述，施體螢光蛋白D可以是增強型青色螢光蛋白（ECFP），而受體螢光蛋白A可以是改良型的黃色螢光蛋白Venus。在本實施例中，施體螢光蛋白D為ECFP(∆C11)，其胺基酸序列為SEQ ID NO：8。受體螢光蛋白A為cp173Venus，其胺基酸序列為SEQ ID NO：9。
最後，依據需求將融合蛋白Met-lead（1.01、1.44、1.59、1.01 M1、1.44 M1、1.59 M1）的DNA片段接在不同表現系統的載體（vector）上，以作為用於後續轉染的質體DNA。例如，將 pcDNA3載體用於人胚胎腎細胞（Human Embryonic Kidney Cells 293，以下稱HEK 293）的表現、pUAST載體則用於果蠅細胞的表現。另外，pUC19載體用於大腸桿菌的表現，以表現及純化大量的融合蛋白Met-lead，進而可應用在生物感應器1。
實驗例2：人類細胞培養及轉染
本實驗例所使用的人類細胞是HEK 293，其培養在37°C、5% 二氧化碳（CO 2）的培養箱中。細胞培養基為MEM（minimal essential medium）培養基，且包含濃度為1.5 g/L的碳酸氫鈉（NaHCO 3）、10%胎牛血清、1%抗生素（如Penicillin - Streptomycin）及5 mM HEPES緩衝液，酸鹼值為7.4。
鉛離子（Pb 2+）處理實驗的細胞準備：分拆3x10 5的細胞至24 mm蓋玻片上（放置在35 mm培養皿中）。其中，24 mm蓋玻片事先以poly-L-lysine處理，可使細胞更容易貼附於玻片。隔天（第二天）將質體DNA、轉染試劑polyJet（比例為1 μg質體DNA：3 μl polyJet）與MEM培養基混合（不含血清）。具體而言，質體DNA包括pcDNA3-Met-lead 1.01、pcDNA3-Met-lead 1.44、pcDNA3-Met-lead 1.59、pcDNA3-Met-lead 1.01 M1、pcDNA3-Met-lead 1.44 M1、pcDNA3-Met-lead 1.59 M1。15分鐘後，加入35 mm培養皿中進行細胞轉染，讓細胞表現融合蛋白Met-lead（1.01、1.44、1.59、1.01 M1、1.44 M1、1.59 M1）。其中，拆分的細胞數量與設置的玻片可依據鉛離子（Pb 2+）處理的時間進行調整。第四天，細胞以緩衝液清洗後，浸泡於不含鈣離子的緩衝液，並置於顯微鏡下以進行螢光能量共振轉移（FRET）成像（細節可參考實驗例5）。其中，實驗組的細胞，分別注入固定濃度的氯化鉛（PbCl 2）溶液（如0.5 μM或50 μM）。
圖6A及圖6B為HEK 293細胞進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。圖6A所測試HEK 293細胞為表現融合蛋白Met-lead 1.01、1.44、1.59的細胞；圖6B所測試HEK 293細胞為表現融合蛋白Met-lead 1.01 M1、1.44 M1、1.59 M1的細胞。又，圖6A及圖6B的橫軸為施體螢光蛋白D與受體螢光蛋白A（ECFP(∆C11)/ cp173Venus）的螢光比值（emission ratio）。由圖6A及圖6B可知，六種融合蛋白Met-lead （1.01、1.44、1.59、1.01 M1、1.44 M1、1.59 M1）在有鉛離子（Pb 2+）的環境中，其螢光比值相較於控制組具有顯著的差異。因此，六種融合蛋白Met-lead（1.01、1.44、1.59、1.01 M1、1.44 M1、1.59 M1）皆可用於偵測鉛離子，並可應用在用於偵測鉛離子的生物感應器。另外，圖6A及圖6B更顯示融合蛋白Met-lead 1.44、1.44 M1偵測鉛離子的效果最佳（即實驗組與控制組的差異最大），其次為融合蛋白Met-lead 1.01、1.01 M1。又，融合蛋白Met-lead 1.01 M1的效果優於融合蛋白Met-lead 1.01；融合蛋白Met-lead 1.44 M1的效果優於融合蛋白Met-lead 1.44；且融合蛋白Met-lead 1.59 M1的效果優於融合蛋白Met-lead 1.59。換言之，於鉛結合蛋白PbrR的第五個α螺旋結構具有連接子（linker）M1的設計，提升偵測鉛離子的效果。
實驗例3：阿拉伯芥（植物）的培養及轉染
本實驗例是使用Columbia（Col-0）品系的阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）。藉由AGROBEST方法，將具有融合蛋白Met-lead（1.44 M1）基因的質體送入農桿菌（ Agrobacterium tumefaciens）中，並感染阿拉伯芥幼苗的子葉組織（cotyledon tissues），以進行基因轉殖。具體而言，將阿拉伯芥幼苗與具有pUC19-Met-lead 1.44 M1建構體（construct）的農桿菌液共同培養2天。接著，清洗以去除農桿菌，使幼苗再生長2～3天。最後，將子葉切下並分別於含有10 μM鉛離子緩衝液（實驗組）或純水（控制組）浸泡隔夜，即可進行螢光能量共振轉移（FRET）成像（細節請參考實驗例5）。
圖7為以阿拉伯芥進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。如圖7所示，當環境中有鉛離子存在（實驗組），其所測得ECFP(∆C11)/ cp173Venus的螢光比值明顯大於控制組。因此，融合蛋白Met-lead也可應用在活體植物中，用以偵測環境中的鉛離子。
實驗例4：果蠅品系及轉殖基因建構體（transgene constructs）
本實驗例的果蠅（ Drosophila melanogaster）是以標準玉米粉（cornmeal）作為飼料，並以12小時光照及黑暗交替培養在25°C、70%濕度的培養箱中。
關於果蠅的品系，本實驗例是使用GAL4/UAS系統，並自Bloomington Drosophila Stock Center（BDSC, University of Indiana, IN, USA）購買Elav- gal4 (#458)轉殖基因系（transgenic fly lines），自行製備UAS-Met-lead 1.44 M1轉殖基因系。關於UAS-Met-lead 1.44 M1轉殖基因系果蠅的製備，可先建構質體pUAST-Met-lead 1.44 M1，將其注射至果蠅的胚胎中。其中，依據phiC31定點插入的標準步驟，將質體pUAST-Met-lead 1.44 M1插入2號染色體attP40位點或2號染色體attP2位點。
接著，將帶有 Elav- gal4 (#458) 或 R13F02- gal4轉殖基因的果蠅及帶有 UAS- Met-lead 1044 M1轉殖基因）的果蠅雜交後，對雜交後代進行腦部的螢光能量共振轉移（FRET）成像（細節請參考實驗例5）。例如，將活體果蠅浸置於含有鉛離子的溶液後，進行成像（如圖8A）。或例如，於成像前，實驗組的果蠅，以含有1 mM鉛離子（Pb 2+）的飼料培養3天（如圖8B）。
圖8A及圖8B為以果蠅進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。其中，如圖8A所示活體果蠅以含有10 μM鉛離子及離子黴素（ionmycin）的溶液浸置後，其腦部所測得cp173Venus/ ECFP(∆C11)的螢光比值明顯上升，處理鉛離子螯合劑（TPEN）後螢光比值下降，確認可從果蠅腦部取得鉛離子感應訊號。如圖8B所示，當果蠅以含有鉛離子的飼料餵食後（實驗組），其腦部所測得cp173Venus/ ECFP(∆C11)的螢光比值明顯大於控制組。因此，飲食中含有鉛離子，確實會累積在果蠅體內（腦部），且融合蛋白Met-lead也可被應用在活體昆蟲中，用以偵測體內鉛離子的累積。
實驗例5：螢光能量共振轉移比例（FRET-ratio）成像
本實驗例所使用的螢光能量共振轉移比例（FRET-ratio）成像系統包括使用倒立式顯微鏡的系統（用於活細胞）、及使用正立式顯微鏡（用於活體內（ in vivo）試驗）的系統。具體而言，融合蛋白Met-lead表現的細胞（HEK 293）或組織（阿拉伯芥的子葉及果蠅的腦）分別在倒立式或正立式顯微鏡上成像。其中，倒立式顯微鏡（Axiovert 200 M）配合使用20倍物鏡（NA=0.8, Zeiss）；正立式顯微鏡（BX-53, Olympus, Japan）配合使用10倍或20倍物鏡（NA=0.75 or 0.8, Olympus, Japan）。
為了從融合蛋白Met-lead表現的樣本中獲得受體螢光蛋白cp173Venus和施體螢光蛋白ECFP（ΔC11）的細胞內（in-cell）或原位（ in situ）落射螢光訊號（epi-fluorescent signals），前述二種類型的FRET-ratio成像系統（倒立式及正立式）必須配置一雙波長影像分光模組（W-View module）及一CMOS相機（ORCA-Flash 4.0 LT, Hamamatsu, Japan）。雙波長影像分光模組（Gemini, Hamamatsu, Japan）具有2個放射螢光濾鏡（emission filter），分別為542/27 nm（用於黃色螢光蛋白YFP）及432/32 nm（用於青色螢光蛋白CFP）。另外，可以利用軟體HCImage來控制施體螢光蛋白ECFP(∆C11)及受體螢光蛋白cp173Venus的螢光影像。將施體螢光蛋白ECFP(∆C11)和受體螢光蛋白cp173Venus的螢光扣除背景值後，分析出螢光強度的平均及和螢光比值。
關於果蠅腦部的三維FRET-ratio成像，是使用雷射掃描共軛顯微鏡（laser scanning confocal microscope）。以440 nm雷射作為共軛系統（例如Olympus FV1000（20倍物鏡、NA=0.75）、或Zeiss LSM 880（20倍物鏡、NA=0.8））的激發源（excitation source）。
綜上所述，依據本發明之鉛離子的偵測方法及生物感應器，藉由用於偵測鉛離子的一融合蛋白，可偵測細胞樣本或待測樣本的鉛離子，進而可應用在活細胞內（in-cell）及活體內（ in vivo），並可應用在實體的生物感應器。具體而言，融合蛋白包括一施體螢光蛋白、一受體螢光蛋白以及一鉛離子結合結構域，鉛離子結合結構域位於施體螢光蛋白與受體螢光蛋白之間。鉛離子結合結構域可與鉛離子結合，以作為偵測鉛離子的工具。又，當鉛離子結合結構域與鉛離子結合時，施體螢光蛋白與受體螢光蛋白相互靠近而產生螢光能量共振轉移（FRET），進而可以光學的方式偵測，以取代習知儀器的偵測方式。
應注意的是，上述諸多實施例係為了便於說明而舉例，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
1:生物感應器 10:載體 11:凹槽 A:受體螢光蛋白 D:施體螢光蛋白 Met-lead:融合蛋白 M1:連接子 PbBD:鉛離子結合結構域 S10~30:步驟
圖1為本發明之一實施例之鉛離子的偵測方法的流程圖。 圖2為本發明之一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的方塊示意圖。 圖3為本發明之另一實施例之鉛離子的偵測方法的流程圖。 圖4為本發明之一實施例之生物感應器的方塊示意圖。 圖5A為本發明之一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的示意圖。 圖5B為本發明之另一實施例之用於偵測鉛離子的融合蛋白的示意圖。 圖6A及圖6B為HEK 293細胞進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。 圖7為以阿拉伯芥進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。 圖8A及圖8B為以果蠅進行螢光能量共振轉移成像的結果圖。 
<![CDATA[ <110> 昱星生物科技股份有限公司 、台北榮民總醫院]]>
					<![CDATA[ <120> 鉛離子的偵測方法及生物感應器]]>
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					<![CDATA[ <213> 重金屬耐受性細菌屬 （Cupriavidus metallidurans ）]]>
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					<![CDATA[ <223> 鉛結合蛋白 PbrR ，作為融合蛋白 Met -lead 1.01 的鉛離子結合結構域 。]]>
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					 Met Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val
					 Val Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly
					 Arg Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg
					 Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp
					 Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly
					 Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg
					 Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu
					 Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly
					 Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <223> 選用鉛結合蛋白 PbrR 胺基酸序列 44 ～131 ，作為融合蛋白 Met -lead 1.44 的鉛離子結合結構域 。]]>
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					 Glu His Val Glu Arg Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp
					 Met Pro Leu Ser Asp Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro
					 Asp Gln Asp Cys Gly Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg
					 Gln Val Glu Ser Arg Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu
					 Val Glu Leu Arg Glu Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys
					 Gly Ile Leu Gln Gly Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <213> 重金屬耐受性細菌屬 （Cupriavidus metallidurans ）]]>
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					<![CDATA[ <223> 選用鉛結合蛋白 PbrR 胺基酸序列 59 ～131 ，作為融合蛋白 Met -lead 1.59 的鉛離子結合結構域 。]]>
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					 Asp Met Pro Leu Ser Asp Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg
					 Pro Asp Gln Asp Cys Gly Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile
					 Arg Gln Val Glu Ser Arg Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His
					 Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser
					 Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <213> 人工序列]]>
					<![CDATA[ <220>]]>
					<![CDATA[ <223> 鉛結合蛋白 PbrR M1 ，其是在鉛結合蛋白 PbrR 第五個螺旋結構插入連接子 ，以作為融合蛋白 Met -lead 1.01 M1 的鉛離子結合結構域 。]]>
					<![CDATA[ <400>]]>
					 Met Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val
					 Val Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly
					 Arg Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg
					 Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp
					 Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly
					 Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg
					 Ile Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His
					 His Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln
					 Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <223> 選用鉛結合蛋白 PbrR M1 (SEQ ID NO:5)胺基酸序列 44 ～138 ，作為融合蛋白 Met -lead 1.44 M1 的鉛離子結合結構域 。]]>
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					 Glu His Val Glu Arg Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp
					 Met Pro Leu Ser Asp Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro
					 Asp Gln Asp Cys Gly Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg
					 Gln Val Glu Ser Arg Ile Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Leu
					 Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala Cys Ser Gly
					 Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <223> 選用鉛結合蛋白 PbrR M1 (SEQ ID NO:5)胺基酸序列 59 ～138 ，作為融合蛋白 Met -lead 1.59 M1 的鉛離子結合結構域 。]]>
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					 Asp Met Pro Leu Ser Asp Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg
					 Pro Asp Gln Asp Cys Gly Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile
					 Arg Gln Val Glu Ser Arg Ile Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala
					 Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala Cys Ser
					 Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu Ser Asp
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					<![CDATA[ <223> 增強型青色螢光蛋白 ECFP(∆C11) 。]]>
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					 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
					 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly
					 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
					 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
					 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
					 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
					 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
					 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
					 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
					 Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
					 Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
					 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
					 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
					 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
					 Val Thr Ala Ala Arg Met His Gly Thr
					<![CDATA[ <210> 9]]>
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					<![CDATA[ <213> 人工序列]]>
					<![CDATA[ <220>]]>
					<![CDATA[ <223>改良型的黃色螢光蛋白 cp173Venus 。]]>
					<![CDATA[ <400>]]>
					 Gly Ser Glu Leu Met Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
					 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
					 Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
					 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu
					 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
					 Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp
					 Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
					 Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly
					 Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly
					 Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
					 Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe
					 Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
					 Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
					 Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser
					 His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala
					 Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu
A:受體螢光蛋白
D:施體螢光蛋白
Met-lead:融合蛋白
PbBD:鉛離子結合結構域

Claims (7)

  1. 一種鉛離子的偵測方法，該方法包括下列步驟：於一細胞樣本內表現用於偵測鉛離子的一融合蛋白，其包括：一施體螢光蛋白，其可被一特定波長範圍的光所激發；一受體螢光蛋白，該施體螢光蛋白的發射光譜與該受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊；以及一鉛離子結合結構域，位於該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白之間，該鉛離子結合結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7；對該細胞樣本施以該特定波長範圍內的一光刺激；以及分析該施體螢光蛋白及該受體螢光蛋白回應該光刺激所分別產生的一光學訊號。
  2. 一種鉛離子的偵測方法，該方法包括下列步驟：提供一生物感應器，包括用於偵測鉛離子的一融合蛋白，其包括：一施體螢光蛋白，其可被一特定波長範圍的光所激發；一受體螢光蛋白，該施體螢光蛋白的發射光譜與該受體螢光蛋白的吸收光譜部分重疊；以及一鉛離子結合結構域，位於該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白之間，該鉛離子結合結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7； 提供一待測樣本，並置入該生物感應器；對該待側樣本施以該特定波長範圍內的一光刺激；以及分析該施體螢光蛋白及該受體螢光蛋白回應該光刺激所分別產生的一光學訊號。
  3. 如請求項1或2所述之偵測鉛離子的方法，其中當該鉛離子結合結構域與鉛離子結合時，該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白相互接近，且施以該特定波長範圍內的光刺激時，該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白之間產生螢光能量共振轉移。
  4. 如請求項1或2所述之鉛離子的偵測方法，其中該施體螢光蛋白為青色螢光蛋白，該受體螢光蛋白為黃色螢光蛋白。
  5. 一種生物感應器，用於偵測鉛離子，該生物感應器包括：一載體；以及一融合蛋白，其設置於該載體，該融合蛋白包括：一施體螢光蛋白，其可被一特定波長範圍的光所激發；一受體螢光蛋白，其與該施體螢光蛋白之間可產生螢光能量共振轉移；及一鉛離子結合結構域，位於該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白之間，該鉛離子結合結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7。
  6. 如請求項5所述之生物感應器，其中當該鉛離子結合結構域與鉛離子結合時，該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白相互接近，且施以該特定波長範圍內的光刺激時，該施體螢光蛋白與該受體螢光蛋白之間產生螢光能量共振轉移。
  7. 如請求項5所述之生物感應器，其中該施體螢光蛋白為青色螢光蛋白，該受體螢光蛋白為黃色螢光蛋白。
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Non-Patent Citations (2)

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Title
期刊 Chiu et al., "Intracellular Pb2+ content monitoring using a protein-based Pb2+ indicator", Toxicological Sciences, Vol. 126, Issue 2, 2012, p. 436-445.; *
期刊 Rhys et al., "Maintaining and breaking symmetry in homomeric coiled-coil assemblies", Nat Commun 9:4132, 08 October 2018. Pages 1-12 *

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