CN105463022A - 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 - Google Patents
利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105463022A CN105463022A CN201510697644.5A CN201510697644A CN105463022A CN 105463022 A CN105463022 A CN 105463022A CN 201510697644 A CN201510697644 A CN 201510697644A CN 105463022 A CN105463022 A CN 105463022A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- silkworm
- gene
- traction fiber
- masp2
- silk
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
本发明公开了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法。先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的载体pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，蚕蛾自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，育成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法。
背景技术
蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性，其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型，分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺(Majorampullategland)分泌的主牵引丝(draglinesilk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的强度是钢的5倍，因而拥有“生物钢”之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白1(MaSp1)和牵引丝蛋白2(MaSp2)2种蛋白组成。
黑寡妇蜘蛛(Latrodectushesperus)牵引丝蛋白2(MaSp2)基因具有一个单一外显子，全长11340bp，编码3779个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每一个重复单元主要由2种初级类型重复序列以Type1-Type1-Type4串联而成，而每一种初级类型重复序列都包含了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。碱基和蛋白序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。MaSp2被认为是牵引丝具有很强韧性的主要分子基础。
由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表达系统包括大肠杆菌、酵母(Pichiapastoris)、昆虫细胞(sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。
但是，至今为止使用的各种异源表达系统都没有表达过蜘蛛牵引丝蛋白2，现有技术缺少了一种方法能分泌出尽可能长的、单一蜘蛛牵引丝蛋白2分子的蜘蛛丝。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，利用转基因家蚕技术将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单一的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒(如图1所示)以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；
(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp2-FibroinHchainPolyA。
所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因是包含3倍到24倍的MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4(如图1所示)。
所述步骤(7)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
本发明是先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因的载体pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(如图2所示)一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕，自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，育成能分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2。
本发明具有的有益效果是：
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2具有功能活性。本发明开发了一种新型的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2生产工艺，为大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2奠定了基础，同时也为提高蚕丝的机械性能奠定了基础。
附图说明
图1是家蚕后部丝腺细胞合成分泌重组黑寡妇牵引丝蛋白2的pBac[3×P3-DsRed]-MaSp2×24质粒结构图。
图2是能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
本发明的五个实施例中的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒采用以下方式制备合成：
A)先将家蚕丝素重链蛋白基因启动子(Fib-H-P)连到pMD18-Tsimple(Takara)载体，并和基本的含有A3启动子和绿色荧光蛋白表达框的piggyBac质粒piggy6212载体分别经过XhoI/NcoI双酶切，胶回收重链启动子序列部分与piggyBac载体骨架连接，获得piggy6609载体。
B)pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒构建方法和步骤如下：
根据已经报导的全长黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因(MaSp2)序列特征设计质粒，并根据家蚕的密码子偏好性作了碱基优化，详细信息如下。
人工合成家蚕丝素重链蛋白基因的信号肽、3倍的MaSp2基因重复单元序列(其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)、MaSp2分子的C末端(其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)、家蚕丝素重链蛋白基因的C末端及其PolyA的序列、以及后续载体构建所需的酶切位点序列，将这些序列连接到pUC57载体上，命名为pUC4301质粒，该质粒含3倍MaSp2基因重复单元序列。
将pUC4301质粒分别利用2个同尾酶SpeI和NheI酶切，依次将不同倍数的重复单元序列连接起来，其叠加过程的具体操作步骤如下：
pUC4301质粒用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为1629bp含3倍MaSp2基因的片段，pUC4301用NheI/HindШ双酶切，回收长度为3326bp含3倍MaSp2基因重复单元的片段，连接上述1629bp片段和3326bp片段，获得pUC4955质粒(含6倍MaSp2基因重复单元)；
pUC4955质粒作为载体用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为2283bp含6倍MaSp2基因的片段，pUC4955用NheI/HindШ双酶切，回收长度为3980bp含6倍MaSp2基因重复单元的片段，连接上述2283bp片段和3980bp片段，获得pUC6263质粒(含12倍MaSp2基因重复单元,其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)；
pUC6263质粒用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为3591bp含12倍MaSp2基因重复单元的片段，pUC6263用NheI/HindШ双酶切，回收长度为5288bp含12倍MaSp2基因重复单元的片段，连接上述3591bp片段和5288bp片段，获得pUC8879质粒(含24倍MaSp2基因重复单元，其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10)；
将2283bp大小的片段(含6倍的MaSp2片段)与5288bp大小的片段(含12倍的MaSp2片段)连接，获得pUC7571质粒(含18倍MaSp2基因重复单元，其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12)
将上述获得的含有不同倍数的MaSp2基因重复单元序列的质粒用NcoI/MunI双酶切，回收含有重复片段以及组成元件的序列片段，将A)步骤已经构建好的包含重链启动子和piggyBac骨架的载体Piggy6609用同样的限制性内切酶酶切，回收包含piggyBac载体骨架及重链启动子序列元件的目的片段，分别与上述不同长度重复单元片段连接，获得piggy7471、piggy9433、piggy10741和piggy12049载体。piggy7471载体包含有3倍MaSp2基因重复单元序列，piggy9433载体包含有12倍MaSp2基因重复单元序列，piggy10741载体包含有18倍MaSp2基因重复单元序列，piggy12049载体包含有24倍MaSp2基因重复单元序列。
将piggy7471、piggy9433、piggy10741和piggy12049载体分别用BglII/AflII双酶切，分别回收包含有不同长度MaSp2基因重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，对含有3×P3启动子-红眼基因表达框和A3启动子-绿色荧光蛋白表达框的载体piggy7785(其碱基序列如SEQIDNO.13)用同样的酶切，回收1230bp含有3×P3启动子和标记基因DsRed编码框的目的片段，分别连接两目的片段以加上DsRed标记基因。具体的操作步骤如下：
piggy7785载体用AflⅢ/BglⅡ双酶切，回收1230bp的片段。
piggy7471载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收7129bp含有MaSp2重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，并与1230bp的片段连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×3载体(含3倍MaSp2基因重复单元，其3倍MaSp2基因的重复单元如SEQIDNO.3，其表达的蛋白序列如SEQIDNO.4)；
piggy9433载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收9091bp含有MaSp2重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，并与1230bp大小片段连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×12载体(含12倍MaSp2基因重复单元，其12倍MaSp2的重复碱基如SEQIDNO.7，其表达的蛋白序列如SEQIDNO.8)；
piggy10741载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收10399bp含有MaSp2重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，并与1230bp大小的连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×18载体(含18倍MaSp2基因重复单元，其18倍MaSp2的重复碱基如SEQIDNO.11，其表达的蛋白序列如SEQIDNO.12)；
piggy12049载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收11707bp含有MaSp2重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，并与1230bp大小的连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24载体(含24倍MaSp2基因重复单元，其24倍MaSp2的重复碱基如SEQIDNO.9，其表达的蛋白序列如SEQIDNO.10)(图1)。
实施例1：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，取1条5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示这个蛾区的后代插入位点都是在第22号染色体2966967位点处，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，定名为MASP2-24-1。
提取MASP2-24-1家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP2-24-1蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.5％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了64.5％，最大应变提高31.4％，杨氏模量提高29.0％，韧性提高108.3％。
研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到转基因家蚕新品种MASP2-24-1基因组的第22染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例2：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕2蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，随机取1个蛾区的5龄第3天家蚕1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP2-24-3这个蛾区的后代插入位点是在第11号染色体2512160位点处，证明转座子已经插入到每一个转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，定名为MASP2-24-3。
提取上述测定插入位点的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP2-24-3蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量最高达1.3％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高55.5％，最大应变提高21.2％，杨氏模量提高49.3％，韧性提高86.4％。
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到转基因家蚕家系MASP2-24-3基因组的11号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例3：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，取5龄第3天家蚕1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP2-24-4这个蛾区的后代插入位点是在第26号染色体7476231位点处，证明转座子已经插入到转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，定名为MASP2-24-4。
提取上述家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP2-24-4蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量最高达2.2％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高50.3％，最大应变提高19.9％，杨氏模量提高48.9％，韧性提高76.0％。
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到转基因家蚕家系MASP2-24-4基因组的26号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例4：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕2蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，随机取1个蛾区的5龄第3天家蚕1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP2-24-5这个蛾区的后代插入位点是在第22号染色体2966967位点处，证明转座子已经插入到转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，定名为MASP2-24-5。
提取上述测定插入位点的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP2-24-5蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量最高达1.9％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高51.2％，最大应变提高31.8％，杨氏模量提高36.2％，韧性提高94.3％。
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到转基因家蚕家系MASP2-24-5基因组的22号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例5：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×3质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，随机取5龄第3天家蚕1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP2-3-1这个蛾区的后代插入位点是在第25号染色体2869975位点处，证明转座子已经插入到转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，定名为MASP2-3-1。
提取上述测定插入位点的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP2-3-1蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量最高达2.2％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高18.4％，最大应变提高9.2％，杨氏模量提高13.2％，韧性提高31.8％。
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到转基因家蚕家系MASP2-3-1基因组的25号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
综合从上述5个实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕丝腺细胞高效合成黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2可以像蚕丝一样由丝腺分泌进入腺腔，并进一步吐出蚕体。该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，能够提高蚕丝机械性能，能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒以piggyBac转座子为基础包含有作为外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；
(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
2.根据权利要求1所述的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，其特征在于：所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp2-FibroinHchainPolyA。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，其特征在于：所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因是包含3倍到24倍MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4。
4.根据权利要求1所述的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法，其特征在于：所述步骤(7)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510697644.5A CN105463022B (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 |
| PCT/CN2016/102266 WO2017067423A1 (zh) | 2015-10-23 | 2016-10-17 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510697644.5A CN105463022B (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105463022A true CN105463022A (zh) | 2016-04-06 |
| CN105463022B CN105463022B (zh) | 2019-01-25 |
Family
ID=55601178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510697644.5A Active CN105463022B (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105463022B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017067423A1 (zh) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | 浙江大学 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白的方法 |
| CN113181432A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-30 | 复旦大学附属中山医院 | 一种人工蚕丝瓣膜及其制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1362520A (zh) * | 2001-01-02 | 2002-08-07 | 成都天友发展有限公司 | 蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法 |
| WO2006083514A2 (en) * | 2005-01-14 | 2006-08-10 | The Florida International University Board Of Trustees | Transgenic production of spider silk |
| CN102428897A (zh) * | 2010-09-10 | 2012-05-02 | 冈本株式会社 | 重组生物及由重组生物制作的蛋白质 |
| CN103261231A (zh) * | 2010-09-28 | 2013-08-21 | 圣母大学 | 嵌合蜘蛛丝及其用途 |
| CN104846011A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-08-19 | 浙江大学 | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 |
-
2015
- 2015-10-23 CN CN201510697644.5A patent/CN105463022B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1362520A (zh) * | 2001-01-02 | 2002-08-07 | 成都天友发展有限公司 | 蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法 |
| WO2006083514A2 (en) * | 2005-01-14 | 2006-08-10 | The Florida International University Board Of Trustees | Transgenic production of spider silk |
| CN102428897A (zh) * | 2010-09-10 | 2012-05-02 | 冈本株式会社 | 重组生物及由重组生物制作的蛋白质 |
| CN103261231A (zh) * | 2010-09-28 | 2013-08-21 | 圣母大学 | 嵌合蜘蛛丝及其用途 |
| CN104846011A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-08-19 | 浙江大学 | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| HONGXIU WEN ET AL: "Transgenic silkworms (Bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons", 《MOLECULAR BIOLOGY REPORTS》 * |
| YOSHIHIKO KUWANA ET AL: "High-Toughness Silk Produced by a Transgenic Silkworm Expressing Spider (Araneus ventricosus) Dragline Silk Protein", 《PLOS ONE》 * |
| YOSHIMI KIKUCHI ET AL: "Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene: upstream sequence elements common to the light and heavy chain", 《GENE》 * |
| 张袁松等: "转基因家蚕生产含蜘蛛丝蛋白的新型复合茧丝纤维", 《纺织学报》 * |
| 郑青亮等: "蜘蛛丝的结构性能及表达策略研究进展", 《蚕业科学》 * |
| 钟伯雄等: "piggyBac 转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展", 《中国农业科学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017067423A1 (zh) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | 浙江大学 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白的方法 |
| CN113181432A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-30 | 复旦大学附属中山医院 | 一种人工蚕丝瓣膜及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105463022B (zh) | 2019-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105400815A (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法 | |
| US11089767B2 (en) | Transgenic silkworms expressing spider silk | |
| CN104673815B (zh) | 复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用 | |
| CN111518831B (zh) | 蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| CN1362520A (zh) | 蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法 | |
| CN104846011A (zh) | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 | |
| CN104903445A (zh) | 后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫 | |
| Li et al. | Construction of transgenic silkworm spinning antibacterial silk with fluorescence | |
| CN111793643A (zh) | 表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重链表达系统及制备方法和应用 | |
| CN102604953B (zh) | 家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其重组表达载体和应用 | |
| CN105400817B (zh) | 利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法 | |
| CN111793644A (zh) | 家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 | |
| CN111850039A (zh) | 表达蛋白分布于家蚕丝胶层的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 | |
| CN111518832B (zh) | 蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| CN105331632A (zh) | 利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法 | |
| CN111500591B (zh) | 蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| CN105463022A (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 | |
| Zhao et al. | Expression of hIGF-I in the silk glands of transgenic silkworms and in transformed silkworm cells | |
| CN105969801A (zh) | 用于表达t4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法 | |
| JP2011103816A (ja) | トランスジェニックカイコ | |
| CN105907786B (zh) | 用于表达t4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法 | |
| CN113563446A (zh) | 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 | |
| CN102286529B (zh) | 家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法 | |
| CN102604954B (zh) | 家蚕表皮蛋白BmCP231启动子及其重组表达载体和应用 | |
| CN105907784B (zh) | 用于表达t4连接酶的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170126 Address after: Hangzhou City, Zhejiang province 310051 Binjiang District River Street No. 1180 Building No. 7 Waterfront Road 5 building 518 room Applicant after: Hangzhou super silk Biotechnology Co., Ltd. Address before: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Applicant before: Zhejiang University |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 314000 room a301-2, building 1, Jiaxin West Electric Industrial Park, 1355 Yunhe Road, Gaozhao street, Xiuzhou District, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: Zhejiang Chaosi Biotechnology Co., Ltd Address before: Hangzhou City, Zhejiang province 310051 Binjiang District River Street No. 1180 Building No. 7 Waterfront Road 5 building 518 room Patentee before: Hangzhou super silk Biotechnology Co.,Ltd. |