JP2014198715A - タンパク質繊維 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、遺伝子組換え技術を利用したタンパク質繊維の機能性の改良を目的とし、特に保水性に優れたタンパク質繊維を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、フィブロインからなるフィブロイン部と、該フィブロイン部の内部に存在し、水溶性タンパク質からなる水溶性タンパク質部とを有する、タンパク質繊維を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質繊維、特に組換えカイコによって作られたタンパク質繊維に関する。

近年、カイコにおける遺伝子組換え技術が注目されている。例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が導入されたカイコが報告されている（非特許文献１）。また、外来遺伝子をカイコにて発現させる発現用遺伝子カセットも報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらの技術はカイコが産生する天然タンパク質繊維の物性や機能性の改良を目的とするものではない。

ごく最近、カイコが産生する絹糸の強度を高める目的で、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子が導入された遺伝子組換えカイコが開示されている（特許文献２）。しかしながら、遺伝子組換えカイコによるタンパク質繊維の物性の改良は未だに限られており、遺伝子組換えによる様々な機能性が改良されたタンパク繊維が依然と望まれている。

一方、カイコが作る絹糸は、外側を構成するセリシンと内側（芯）を構成するフィブロインとからなり、それぞれ２５％と７５％を占める。絹糸を作る器官は絹糸腺といい、前部絹糸腺、中部絹糸腺及び後部絹糸腺を有する。セリシンは中部絹糸腺で作られ、フィブロインは後部絹糸腺で作られている。また、セリシンは、水溶性タンパク質であるため、繊維の精練処理によって容易に除去されてしまうゆえ、精練後の繊維はセリシンをほとんど含まない。

特開２００７−２２８８１４号公報 特開２０１２−５５２７０号公報

Ｍａｓａｆｕｍｉ Ｙａｍａｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． Ｍａｒｃｈ １，１９９９ １３：５１１−５１６

本発明は、遺伝子組換え技術を利用したタンパク質繊維の機能性の改良を目的とし、特に保水性に優れたタンパク質繊維を提供することを目的とする。

本発明は、フィブロインからなるフィブロイン部と、該フィブロイン部の内部に存在し、水溶性タンパク質からなる水溶性タンパク質部とを有する、タンパク質繊維を提供する。上記水溶性タンパク質が、セリシン１、セリシン２、セリシン３、フィブリノーゲン、及びコラーゲンからなる群から選択されることが好ましい。また、フィブロイン部の内部にクモ糸タンパク質がさらに存在することが好ましい。

本発明はまた、上記タンパク質繊維における上記水溶性タンパク質の少なくとも一部が除去された多孔質タンパク質繊維を提供する。水溶性タンパク質の除去は、上記タンパク質繊維を精練することにより行われることが好ましい。

本発明はまた、上記タンパク質繊維、又は上記多孔質タンパク質繊維から製造された繊維製品を提供する。

本発明はまた、水溶性タンパク質がフィブロインと共にカイコの後部絹糸腺において生成されるよう、該水溶性タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入された組換えカイコを提供する。上記組換えカイコは、クモ糸タンパク質がカイコの後部絹糸腺においてさらに生成されるよう、該クモ糸タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入された組換えカイコであることが好ましい。

本発明はさらに、上記組換えカイコにより作られた絹糸を提供する。

本発明のタンパク質繊維によれば、フィブロイン部の内部に存在する水溶性タンパク質部を有することにより、保水性（保湿性）に優れたタンパク質繊維を提供することが可能となる。また、一実施形態では、フィブロイン部の内部にクモ糸タンパク質がさらに存在することにより、強度がより高いタンパク質繊維を提供することが可能となる。

タンパク質繊維を例えば精練処理することにより、水溶性タンパク質の少なくとも一部が除去された場合、フィブロイン部の内部に空洞ができ、多孔質タンパク質繊維を得ることが可能となる。多孔質タンパク質繊維は、多孔質でないタンパク質繊維に比べてより軽量で、また空気をより多く含むことでより高い断熱性を有する。したがって、本発明のタンパク質繊維又は多孔質タンパク質繊維から製造された繊維製品は、保水性及び断熱性に優れており、例えば放射線を通しにくい宇宙服の素材や、シルクパウダー等の化粧品原料等に好適に用いられる。

本発明の水溶性タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入された組換えカイコによれば、水溶性タンパク質がフィブロインと共にカイコの後部絹糸腺において生成されることによって、フィブロインの内部にも水溶性タンパク質が含まれることとなり、保水性に優れたタンパク質繊維を提供することが可能となる。さらに、クモ糸タンパク質がカイコの後部絹糸腺においてさらに生成されるよう、クモ糸タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入されることにより、強度がより高いタンパク質繊維を提供することが可能となる。

上記組換えカイコにより作られた絹糸によれば、軽量で保水性及び断熱性に優れている繊維製品を製造することができる。

本発明のタンパク質繊維の断面を示す模式図である。 本発明の多孔性タンパク質繊維の断面を示す模式図である。 水溶性タンパク質が除去される前のタンパク質繊維（Ａ）及び除去後の多孔質タンパク質繊維（Ｂ）の表面を示す模式図である。 遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。 蛍光顕微鏡による遺伝子組換えカイコの観察結果を示す図である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質分析の結果を示す図である。 ウェスタンブロットによる遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質分析の結果を示す図である。 蛍光顕微鏡による本発明のタンパク質繊維の断面の観察結果を示す図である。 顕微鏡による本発明の多孔性タンパク質繊維の断面の観察結果を示す図である。

（タンパク質繊維）
本実施形態のタンパク質繊維は、フィブロインからなるフィブロイン部と、該フィブロイン部の内部に存在し、水溶性タンパク質からなる水溶性タンパク質部とを有する。タンパク質繊維の構造は特に限定されないが、例えば図１の模式図に示した構造を有し得る。

水溶性タンパク質が、セリシン１、セリシン２、セリシン３、フィブリノーゲン、及びコラーゲンからなる群から選択されることが好ましい。より具体的には、セリシン１（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）：ＮＭ＿００１０４４０４１．１、セリシン２（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）：ＮＭ＿００１１７２８１６１．１、セリシン３（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）：ＮＭ＿００１１１４６４４．１、フィブリノーゲン（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）：ＥＦ５９４０４７．１、フィブリノーゲン （Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）：Ｘ１５５５６．１、コラーゲン（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）：Ｘ５１６２３．１及びコラーゲンコラーゲン（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＮＭ＿１６４６１５．２からなる群から選択されることが好ましい。このうち、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリシン３が特に好ましい。また、水溶性タンパク質としては、ワイルドタイプのタンパク質であっても、突然変異のものであってもよい。このような突然変異の水溶性タンパク質は、好ましくはワイルドタイプのものとアミノ酸配列において９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する。

タンパク質繊維の作製方法は、特に限定されないが、遺伝子組換えカイコを用いた場合、タンパク質繊維を容易に作製できるため好ましい。このような遺伝子組換えカイコとしては後述のものが好ましい。遺伝子組換えカイコによって作られる絹糸は、外側が中部絹糸腺で作られたセリシンからなり、内側は後部絹糸腺で作られたフィブロイン部と水溶性タンパク質部とを有するタンパク質繊維からなる。なお本明細書において、水溶性タンパク質はセリシンであり得るため、外側のセリシンを「外側セリシン」といい、内側のセリシンを「内側セリシン」といい、区別する場合がある。

上記遺伝子組換えカイコによって作られる絹糸の構造は、これらに限定されないが、図１のＡ〜Ｃに示す断面の模式図を有することが好ましい。Ａは、水溶性タンパク質がフィブロインの内側に芯となって存在する構造を図示しており、Ｂは、水溶性タンパク質はフィブロインの内側に散在している構造を図示しており、Ｃは、水溶性タンパク質はフィブロインと混在している構造を図示している。Ｃの場合は、水溶性タンパク質はフィブロインの内側のみならず、表面にも存在する。同じカイコによって作られた絹糸であっても、Ａ〜Ｃの構造のうち２種以上の組み合わせが存在し得る。また、水溶性タンパク質は絹糸の長手方向において連続的であっても断続的であってもよい。さらに、遺伝子組換えカイコにおいて、水溶性タンパク質の発現量等を調節することで、タンパク質繊維の内部構造を変更し得る。

タンパク質繊維において、フィブロイン部と水溶性タンパク質部との重量比は、特に限定しないが、保水性及び強度維持の観点から、フィブロイン部と水溶性タンパク質部との合計重量を１００重量％とする場合、フィブロイン部が７０％〜９５％であることが好ましく、８０％〜９０％であることがより好ましい。この重量比は、例えば遺伝子組換えカイコにおける水溶性タンパク質の発現量によって調節することができる。

タンパク質繊維において、フィブロイン部の内部にクモ糸タンパク質がさらに存在することが好ましい。クモ糸タンパク質としては、所望の機能性によって選択し得る。例えば、牽引糸を構成する主要タンパク質である、大瓶状腺スピドロイン（Ｍａｊｏｒ Ａｍｐｕｌｌａｔｅ Ｓｐｉｄｒｏｉｎ：ＭａＳｐ）が存在する絹糸は、ＭａＳｐを含まない絹糸に比べてより高い強度を有し得る。これまでに、クロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）、北米ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）等、種々のクモのＭａＳｐタンパク質及びその遺伝子配列が知られているが、中でも特に配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、コガネグモ属ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）において、牽引糸（又は縦糸）タンパク質の主成分であるＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）タンパク質が、強度増強の観点から好ましく用いられる。

図１には、クモ糸タンパク質は、フィブロインの内側に散在する構造しか示していないが、クモ糸タンパク質も水溶性タンパク質と同様に、フィブロインの内側に芯となって存在してもよく、また、フィブロインの内側のみならず表面にも存在してよい。クモ糸タンパク質の含有量は、所望の性能（例えば、強度）を達成できる量であればよく、例えばＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）の場合、強度の観点から、フィブロイン部と水溶性タンパク質部との合計重量を１００重量％とする場合、ＭａＳｐ１が１０％〜５０％であることが好ましく、３０％〜５０％であることがより好ましい。この重量比は、遺伝子組換えカイコにおけるクモ糸タンパク質の発現量によって調節することができる。

タンパク質繊維は、保水性が高いため、従来品より保水性（保温性）に優れたシルクストッキングやシルク靴下、または肌着や着物等に応用することができる。タンパク質繊維は、さらにクモ糸タンパク質を含むことで強度も高い製品を作ることができる。また、タンパク質繊維を用いて、後述の多孔質タンパク質繊維を製造することができ、この多孔質タンパク質繊維は、保水性及び断熱性が求められる製品、例えば放射線を通しにくい宇宙服や、シルクパウダー等に好適に用いることができる。

タンパク質繊維から製造される繊維製品としては、例えば肌着、ストッキング、靴下、手袋、手術用縫合糸、さらにはシルクパウダーが挙げられる。

（多孔質タンパク質繊維）
本実施形態の多孔質タンパク質繊維は、上記タンパク質繊維における水溶性タンパク質の少なくとも一部が除去されたタンパク質繊維である。フィブロイン部の内部において、水溶性タンパク質が除去された部分において中空となり、多孔質のタンパク質繊維を形成することができる。

多孔質タンパク質繊維の構造は、水溶性タンパク質が除去される前のタンパク質繊維の構造又は水溶性タンパク質の除去程度によって様々な構造を有し得る。例えば、図１のＢに示すような水溶性タンパク質がフィブロインの内側に散在している構造を有する原料タンパク質繊維（図２のＡ及びＣ）の場合、図２のＢ及びＤに示す断面の模式図を有し得る。Ｂ及びＤから分かるように、一部の水溶性タンパク質が存在していた場所が空洞になっている。また、水溶性タンパク質が除去される前のタンパク質繊維（図３のＡ）及び除去後の多孔質タンパク質繊維（図３のＢ）の表面を示す模式図は図３に示している。凹みは表面に存在していた水溶性タンパク質が除去されたことによって形成されたものである。

水溶性タンパク質の除去は、特に限定されないが、例えばマルセル石鹸等の方法が挙げられるが、繊維の精練は通常に行われる工程であるため、タンパク質繊維を精練することにより水溶性タンパク質の除去を行われることが更なる工程を必要とせず好ましい。タンパク質繊維の精練の方法は、一般に行われている方法であればよく、例えば松本陽一・土屋幾雄・久間秀彦「絹紡複合糸における生糸の精練効果」日蚕雑５６（６），４８３−４８８（１９８７）に記載の方法が挙げられる。具体的な手順は、例えば、（１）沸騰したマルセル石鹸０．５％溶液中にて３０分間浸漬撹拌して煮る；（２）３０〜４０℃の０．０４％のＮａＨＣＯ_３溶液にて洗浄する；（３）３０〜４０℃の温水にて洗浄する；（４）手順１〜３をさらに２〜３回繰り返す（計３〜４回）；（５）最後に湿った繊維を３７℃で一晩乾燥させる、ことが挙げられる。

精練によって、タンパク質繊維における水溶性タンパク質の少なくとも一部が除去される。水溶性タンパク質の除去程度は、精練の条件によって調節し得る。また、一部フィブロインの表面に露出した水溶性タンパク質は容易に除去されるが、完全にフィブロインの内部に閉じ込められた等の存在状態によって、水溶性タンパク質は精練によっても除去されない場合がある。なお、カイコによって作られた外側セリシンを有する絹糸の場合は、精練によって外側セリシンは除去される。

図２のＢ及びＤに示すように、水溶性タンパク質の一部が除去された多孔質タンパク質繊維は、空洞を有することで、軽量で断熱性・保温性に優れる一方で、除去されずに残った水溶性タンパク質を含むことで保水性にも優れる。さらに、図２のＤに示すように、クモ糸タンパク質を含むことで、更なる機能性、例えば高い強度を備えることができる。このような多孔質タンパク質繊維は、例えば放射線を通しにくい宇宙服の素材や、シルクパウダー等の化粧品原料等に好適に用いられる。

多孔質タンパク質繊維から製造される繊維製品としては、例えば肌着、ストッキング、靴下、手袋、手術用縫合糸、さらにはシルクパウダーが挙げられる。

（組換えカイコ）
本実施形態の組換えカイコは、水溶性タンパク質がフィブロインと共にカイコの後部絹糸腺において生成されるよう、該水溶性タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入されたものである。なお、「カイコ」とは、カイコガ属カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）をいう。カイコは、実験用の品種であっても、実用商品化された実用品種であってもよい。また、「組換えカイコ」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子がカイコ染色体に導入され、形質転換されたカイコをいう。

遺伝子組換え用水溶性タンパク質及びこれらをコードする核酸は、上述のとおりである。使用される核酸は、上記の水溶性タンパク質の塩基配列を有するものであれば、人工合成により得たものでもよく、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから得たものでもよく、これらのものをＰＣＲで増幅したものや制限酵素で切り出したものでもよい。また、水溶性タンパク質をコードする核酸としては、ワイルドタイプの核酸であっても、突然変異のものであってもよい。このような突然変異の核酸は、好ましくはワイルドタイプのものと核酸配列において９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する。

遺伝子組換えカイコは、水溶性タンパク質がフィブロインと共にカイコの後部絹糸腺において生成できるものであれば、これらの水溶性タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入の形態は制限されない。ゲノムＤＮＡに組み込まれた安定的なものであってもよく、一過的な発現であってもよい。遺伝子組み換えはトランスポゾンを用いる方法により行うが、外来遺伝子をカイコに導入できる方法であれば制限はなく、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃等の他の方法によって遺伝子組み換えを行ってもよい。

ベクターやプラスミドによる形質転換の場合、使用されるベクターやプラスミドは特に限定されないが、導入効率の観点から、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましく用いられる。発現をコントロールするためのプロモーターも特に限定されないが、カイコ後部絹糸腺のみに発現させるために、カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター、カイコフィブロインＬ鎖遺伝子プロモーター、又はカイコフィブロインｐ２５遺伝子プロモーターが好ましく用いられる。また、スクリーニングを容易にするためにリポーター遺伝子、マーカー遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を用いてもよい。

遺伝子組換えカイコは、クモ糸タンパク質がカイコの後部絹糸腺においてさらに生成されるよう、該クモ糸タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入されたものであることが好ましい。クモ糸タンパク質は、上述のとおりである。そのうち、特に配列番号３に示す核酸配列を有する、ＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）タンパク質の遺伝子が、強度増強の観点から好ましく用いられる。

形質転換に使用するベクターにおいて、水溶性タンパク質遺伝子の長さを、例えば１〜４倍に変えてもよい。また、水溶性タンパク質遺伝子とクモ糸タンパク質遺伝子との導入比率は、５：１〜１：５であることが好ましく、２：１〜１：２であることがより好ましい。この導入比率を調節することによって、得られるタンパク質繊維における水溶性タンパク質とクモ糸タンパク質との発現量の比率、そして、タンパク質繊維の構造及び物性を調節し得る。

（絹糸及び繊維製品）
本実施形態の絹糸は、上記組換えカイコにより作られたものである。絹糸は、外側セリシンと、内側の、フィブロインからなるフィブロイン部と、該フィブロイン部の内部に存在し、水溶性タンパク質からなる水溶性タンパク質部とを有する、タンパク質繊維とからなる。内側のタンパク質繊維はクモ糸タンパク質も含み得る。

絹糸によって、保水性及び／又は断熱性・保温性に優れた繊維製品を製造することができる。なお、本明細書において、「繊維製品」とは、タンパク質繊維を利用して製造した製品をいい、シルクパウダーのような繊維の形を有さない製品であってもよい。繊維製品としては、例えば肌着、ストッキング、靴下、手袋、手術用縫合糸、さらにはシルクパウダーが挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ クモ糸タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入されたカイコの作製
（クモ遺伝子）
コガネグモ属ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）において、牽引糸（又は縦糸）タンパク質の主成分であるＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）タンパク質をコードする核酸（配列番号３）の塩基配列を有する核酸を含むベクターを利用し、上記核酸の両端にマッチするプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりクモ遺伝子を取得した。プライマーには、次の遺伝子操作をするために、あらかじめ適当な制限酵素サイトを設けた。具体的には、フォワードプライマーとしてＭａＳｐ１ＦＷ：５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号５）を用い、リバースプライマーとしてＭａＳｐ１ＲＶ：５’−ＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’（配列番号６）を用いた。

（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡ（ＢＡＣクローントータルゲノム）をテンプレートとし、ＰＣＲ法により増幅した。具体的には、フォワードプライマーとして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むＰｆｉｂＨ５’：５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号７）を用い、リバースプライマーとしてＳｐｅＩサイトを含むＰｆｉｂＨ３’：５’−ＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴ−３’（配列番号８）を用いた。

（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子にあるフィブロンＬ鎖結合サイト）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子にあるフィブロンＬ鎖結合サイト（ＬＢＳ）配列、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡ（ＢＡＣクローントータルゲノム）をテンプレートとし、ＰＣＲ法により増幅した。具体的には、フォワードプライマーとして、ＮｈｅＩサイトを含むＬＢＳ−ＦＷ：５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧ−３’（配列番号９）を用い、リバースプライマーとして、ＢａｍＨＩサイトを含むＬＢＳ−ＲＶ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１０）を用いた。

（遺伝子組換え用ベクタープラスミドの作製）
上記カイコフィブロインＨ鎖プロモーター配列（ＰＦｉｂＨ）、クモ遺伝子配列（ＭａＳｐ）及びカイコフィブロインＨ鎖遺伝子にあるフィブロンＬ鎖結合サイト（ＬＢＳ）を順に連結しクモ遺伝子発現カセットとした。ここで、ＰＦｉｂＨとＭａＳｐとをＳｐｅＩ制限酵素で連結し、ＭａＳｐとＬＢＳとをＮｈｅＩで連結した。このクモ遺伝子発現カセットを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むベクタープラスミドに挿入し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドとした（ｐＢａｃＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳと命名した）。

図４は、遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。Ａは、クモ糸タンパク質遺伝子組換え用ベクタープラスミド（ｐＢａｃＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳ）の構造を示す模式図である。図４中の記号は以下のものを意味する。なお、マーカー遺伝子として、カイコ細胞質アクチン遺伝子ＢｍＡ３のプロモーターによって制御された赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）遺伝子を用いた。
ＰＦｉｂＨ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列
Ｓｅｒ３：カイコセリシン３の遺伝子配列
ＭａＳｐ：クモ遺伝子配列
ＬＢＳ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子にあるフィブロンＬ鎖結合サイト配列
ＭＫ：マーカー遺伝子配列
Ｌ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＬハンド
Ｒ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＲハンド

（組換えカイコの作製）
上記遺伝子組換え用ベクタープラスミドを、大腸菌で増殖させ、「ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ」（（株）キアゲン社製）を用い、キットに添付したマニュアルに従って精製した。トランスポゼースタンパク質遺伝子を含むヘルパープラスミドも上記の方法で精製した。精製した上記のプラスミドＤＮＡをＴＥバッファーで溶解し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドＤＮＡとヘルパープラスミドＤＮＡを１対１の比で混和し、エタノール沈殿を行った。最後に、この混和ＤＮＡを４００ｎｇ／μｌの濃度になるように、５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ７のリン酸バッファーで調製した。これを産後３〜６時間のカイコ卵に顕微鏡の下で注射した。

注射した卵をＧ０世代とし、Ｇ０世代が成長したガはＧ０ガと呼び、Ｇ０ガを親として産まれる卵はＧ１卵とする。Ｇ０ガを未注射のガと交尾させ、Ｇ１卵を採取し、催青期のＧ１卵について、蛍光顕微鏡の下で蛍光の発する個体（ポジティブ卵）をスクリーニングした（図５）。図５中、Ａは卵、Ｂは幼虫、Ｃは蛹、Ｄ及びＥは成虫（カイコガ）である。遺伝子組換えカイコは目が光っていることが確認された。

（インバースＰＣＲによるクモ遺伝子の挿入及びその位置の確認）
カイコのゲノムＤＮＡは、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）で抽出した。ゲノムＤＮＡは制限酵素ＨａｅＩＩＩにより切断した後、セルフライゲーションされた。これをテンプレートとし、ｐｉｇｇｙＢａｃの左右ハンドにそれぞれマッチする２ペアのプライマーを用い、挿入位置のカイコゲノム配列を含む断片を送付し、配列を同定した。具体的には、レフトハンドフォワードプライマーとしてＢａｃＬＦ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号１１）を用い、レフトハンドリバースプライマーとしてＢａｃＬＲ（５’−ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号１２）を用い、ライトハンドフォワードプライマーとして（５’−ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列番号１３）を用い、ライトハンドリバースプライマーとして（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号１４）を用いた。配列番号１５は、クモ遺伝子発現カセットが挿入された位置の右側（下流側）のカイコゲノム配列を示す。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる絹糸のタンパク質分析）
遺伝子組換えカイコが作製した繭を切取り、１ｍｇの繭片に対して５０μｌの６０％ＬｉＳＣＮを加えて振動させ、室温下で２時間静置し、タンパク質を可溶化した。その後、１５０００ｒｐｍで遠心して不溶部分を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上層の溶液中の遺伝子組換えカイコが作製した絹糸における各種タンパク質を分離した。その結果を図６に示した。

図６中、ＴＧは組換えカイコを示し、ＷＴはワイルドタイプのカイコを示し、ＦｉｂＨはカイコフィブロインＨ鎖を示し、ＭａＳｐはクモ糸タンパク質を示し、ＦｉｂＬはカイコフィブロインＬ鎖を示す。左からレーン１にはＨＭＷ分子量マーカーを流し、レーン２〜レーン６には組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質を含む上記上層の溶液をそれぞれ２μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、及び２０μＬ流し、レーン７〜レーン１１にはコントロールとしてワイルドタイプが作製した絹糸のタンパク質を含む上層の溶液をそれぞれ２μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、及び２０μＬ流した。分離結果から、絹糸タンパク質中のクモ糸タンパク質の含有率を計算したところ、２２．５％であった。

（ウェスタンブロットによる絹糸のタンパク質分析）
ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）の大瓶状腺から抽出したタンパク質を用いて、ＭａＳｐタンパク質の検出用抗体を作製した（Ｋｉｔａｙａｍａ Ｌａｂｅｓ社）。

ＭａＳｐ遺伝子を導入した組換えカイコによって発現したＭａＳｐタンパク質の検出は、普通繭（ワイルドタイプ）をコントロールとし、組換えカイコの繭から溶かし出したタンパク質を用いて行った。繭をなるべく細かく切り、１０ｍｇの繭片に対して０．５ｍｌ６０％ＬｉＳＣＮ加え、１０分間激しく振動した。その後、室温で２時間ゆっくり混和しながら、可溶化し、１５０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心した。上清に四倍量の変性バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓＣｌ，ｐＨ８．０，２％ＳＤＳ，５％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙａｎｏｌ）で薄め、繭タンパク質サンプルとした。繭タンパク質サンプルに５×ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ，１％ＳＤＳ，５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙａｎｏｌ，少量なＢｒｏｍ Ｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ）を１×になるよう加え、１００℃５分間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルとした。

０．１％のＳＤＳを含むアクリルアミドゲルで絹のタンパク質を電気泳動した。電気泳動で分離したタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）に転写した。膜は、室温でタンパク質ブロッキング溶液（５％スキムミルク−ＰＢＳＴ（１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４，８．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，１％Ｔｗｅｅｎ−２０））を３０分間ブロックした。ＰＢＳＴで軽く２回リンスの後、ＰＢＳＴで５０００倍希釈したｒａｔ ａｎｉｔ−ＭａＳｐポリクローナル抗体と３０分反応させた。ＰＢＳＴで２回軽くリンスした後、１ｃｍ^２膜に４ｍｌのＰＢＳＴで１５分間一回、５分間３回洗浄した。ＰＢＳＴで５万倍希釈したＨＲＰ 標識ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｔ抗体（ＺＹＭＥＤ（登録商標）ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）と３０分間反応させ、ＰＢＳＴで２回軽くリンスした後、１ｃｍ^２膜に４ｍｌのＰＢＳＴで１５分間一回、５分間３回洗浄した。発光検出はＥＣＬ ＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って行った。その結果を図７に示した。

図７中、ＴＧは組換えカイコを示し、ＷＴはワイルドタイプのカイコを示す。図７から、ＭａＳｐ遺伝子を導入した繭からのみＭａＳｐタンパク質を特異的に検出したことが判明した。

（絹糸の物性解析）
遺伝子組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、「ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ ＡＧＳ−Ｊ」（島津製作所製）を用いて、２０℃、６５％ＲＨの標準条件下で引っ張り試験を行った。コントロールとして、遺伝子組換えを行っていないカイコ（ワイルドタイプカイコ）が作製した絹糸についても、同様に引っ張り試験を行った。その結果、コントロール（非組換えカイコ）の絹糸の強度が３９７．０ＭＰａ（３．４９ｇ／ｄ）であったのに対して、遺伝子組換えカイコが作製した絹糸の強度は４８９．２ＭＰａ（４．２７ｇ／ｄ）と、２２．３５％も増強していた。これは、遺伝子組換えカイコが作製したタンパク質繊維中にクモ糸タンパク質が含まれる結果であると考えられる。

実施例２ セリシン３遺伝子が挿入された遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構築
（カイコセリシン３遺伝子）
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｚｅｎ）を抽出し、ｃＤＮＡを合成した。Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋに記載されたカイコセリシン３遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿００１１１４６４４．１）（配列番号１）の配列を参考にし、制限酵素ＳｐｅＩサイトを含む上流プライマーＳｅｒ３（ＳｐｅＩ）：５’−ＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＣＣＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号１６）と、制限酵素ＮｈｅＩサイトを含む下流プライマーＳｅｒ３（ＮｈｅＩ）：５’−ＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号１７）とを設計した。上記ｃＤＮＡをテンプレートに上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、カイコセリシン３遺伝子を増幅した。

（遺伝子組換え用ベクタープラスミドの作製）
ベクターｐｉｇｇｙＢａｃ３×Ｐ３−ＤｓＲｅｄは使用された。ＤｓＲｅｄ遺伝子はカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）細胞質アクチン遺伝子ＢｍＡ３のプロモーターによって制御された。カイコフィブロンＨ鎖の遺伝子プロモーターを、実施例１と同様に、通常のカイコゲノムＤＮＡ（ＢＡＣクローントータルゲノム）をテンプレートとし、配列番号７と配列番号８のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで処理した後、同じ酵素で消化した通用クローニングシャトルベクターｐＳＬ１１８０ａｆに挿入した（ｐＳＬＰｆｉｂＨと命名した）。制限酵素ＳｐｅＩとＮｈｅＩで処理したカイコセリシン３遺伝子をｐＳＬＰｆｉｂＨベクターに挿入した（ｐＳＬＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３と命名した）。

フィブロインＨ鎖遺伝子にあるフィブロンＬ鎖結合サイト（ＬＢＳ）はＮｈｅＩサイトを持つプライマーＬＢＳ５’ＮｈｅＩ：５’−ＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴ−３’（配列番号１８）とＸｂａＩサイトを持つＬＢＳ３’ＸｂａＩ：５’−ＣＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１９）を用い、ＢＡＣクローントータルゲノムからＰＣＲで増幅され、ｐＳＬＦｉｂＳｅｒ３のＳｐｅＩサイトに挿入された（ｐＳＬＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳと命名した）。

次に、この発現セット（ＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳ）は、制限酵素ＦｓｅＩで切り出され、ｈｐＢａｃ３×Ｐ３−ＤｓＲｅｄのＦｓｅＩサイトに挿入された（ｐＢａｃＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳと命名した）。このセリシン３遺伝子組換え用ベクタープラスミドの模式図は図４のＢに示す。

最後に、実施例１のクモ糸タンパク質遺伝子組換え用ベクタープラスミドであるｐＢａｃＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳから、制限酵素ＡｓｃＩでＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳ発現カセットを切り出し、同じ酵素で処理されたｐＢａｃＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳに挿入した（ｐＢａｃＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳ―ＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳと命名した）。このセリシン３とクモ糸タンパク質遺伝子組換え用ベクタープラスミドの模式図は図４のＣに示す。

上記ｐＳＬＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳ及びｐＢａｃＰＦｉｂＨ−Ｓｅｒ３−ＬＢＳ―ＰＦｉｂＨ−ＭａＳｐ−ＬＢＳを実施例１と同様にカイコに導入すれば、セリシン３又はセリシンとクモ糸タンパク質を後部絹糸腺にて発現する遺伝子組み換えカイコを得ることができる。このような遺伝子組み換えカイコを用いれば、本発明のタンパク質繊維を得ることができる。

実施例３ セリシン３遺伝子及び緑色蛍光タンパク質遺伝子が挿入された遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構築
マーカー遺伝子として、カイコ細胞質アクチン遺伝子ＢｍＡ３のプロモーターによって制御された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法によって、セリシン３遺伝子及び緑色蛍光タンパク質遺伝子が挿入された遺伝子組換え用ベクタープラスミドを構築した。

実施例１の（組換えカイコの作製）と同様の方法によって、上述の遺伝子組換え用ベクタープラスミドを有する遺伝子組換えカイコを作製した。この遺伝子組換えカイコは、セリシンとＧＦＰを同時に発現するカイコである。そして、上記遺伝子組換えカイコが作製した繭から糸状のタンパク質繊維を取り出し、その断面を蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図８に示す。フィブロイン部の内部に対応する箇所においてＧＦＰに由来する緑色の蛍光が観察されていることから、上記遺伝子組換えカイコは、フィブロイン部の内部にセリシンを含むタンパク質繊維を生成することが確認された。

実施例４ 多孔質タンパク質繊維の作製
実施例３において得られたタンパク質繊維（以下、「タンパク質繊維３」という場合がある。）を以下の方法で精錬処理し、多孔質タンパク質繊維を作製した。
工程１：タンパク質繊維３を４０℃の温水に３０分間浸けた。
工程２：上記タンパク質繊維３の糸の質量に対して１００倍のマルセル石鹸液（濃度０．２質量％）で、上記タンパク質繊維３を更に２時間浸けた。（沸騰水浴、約９５℃）
工程３：上記タンパク質繊維３の糸の質量に対して１００倍の０．０１％炭酸ナトリウム液で、上記タンパク質繊維３を更に１５分間浸けた。（温水浴、約８０℃）
工程４：上記タンパク質繊維３の糸の質量に対して１００倍の０．００５％炭酸ナトリウム液で、上記タンパク質繊維３を更に１５分間浸けた。（温水浴、約５０℃）
工程５：上記タンパク質繊維３を大量の温水（約４０℃）ですすいだ。（約５分間）
工程６：上記タンパク質繊維３を大量の冷水（約２０℃）ですすいだ。（約５分間）
工程７：上記タンパク質繊維３を８０℃で１時間乾燥させることで（乾熱）、多孔質タンパク質繊維を得た。

上記多孔質タンパク質繊維の断面を顕微鏡によって観察したところ、フィブロイン部の内部に存在するセリシンが除去され、孔が形成されていることが確認できた（図９Ａ）。一方、対照としてワイルドタイプのカイコが作製した絹糸は、精錬処理を行ってもフィブロイン部において孔が形成されないことを確認した（図９Ｂ）。

タンパク質繊維３及び多孔質タンパク質繊維の保水性の評価
タンパク質繊維３及び多孔質タンパク質繊維の保水性を以下の方法によって評価した。なお、対照としてワイルドタイプのカイコが作製した絹糸（生糸、精錬糸）を用いた。
工程１：タンパク質繊維３、多孔質タンパク質繊維及び絹糸の各サンプルを、２０℃、６５％ＲＨの環境で２４時間以上放置し、それぞれの質量（Ｗ１）を測定した。測定には、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｂａｌａｎｃｅ（Ｓｈｉｍａｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて行った。
工程２：Ｗ１を測定した各サンプルを１４０℃で十分に乾燥させた後に、それぞれの質量重量（Ｗ２）を測定した。
工程３：各サンプルの含水率を以下の式によって算出した。
サンプルの含水率（質量％）＝１００×（Ｗ１−Ｗ２）／Ｗ２

各サンプルの含水率の結果を表１に示す。含水率の測定は３回行い、その平均値を比較した。タンパク質繊維３は、対照である精錬前の絹糸（生糸）に比べて含水率が高いことが分かった。さらに、タンパク質繊維３を精錬処理することで得られた多孔質タンパク質繊維は、対照である精錬後の絹糸（精錬糸）に比べて含水率が高いことが分かった。これらの結果から、上記タンパク質繊維３及び上記多孔質タンパク質繊維は保水性に優れることが分かった。

Claims (10)

1. フィブロインからなるフィブロイン部と、該フィブロイン部の内部に存在し、水溶性タンパク質からなる水溶性タンパク質部とを有する、タンパク質繊維。
2. 前記水溶性タンパク質が、セリシン１、セリシン２、セリシン３、フィブリノーゲン、及びコラーゲンからなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質繊維。
3. 前記フィブロイン部の内部にクモ糸タンパク質がさらに存在する、請求項１又は２に記載のタンパク質繊維。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質繊維における前記水溶性タンパク質の少なくとも一部が除去された、多孔質タンパク質繊維。
5. 前記水溶性タンパク質の除去は、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質繊維を精練することにより行われる、請求項４に記載の多孔質タンパク質繊維。
6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質繊維、或いは請求項４又は５に記載の多孔質タンパク質繊維から製造された、繊維製品。
7. 水溶性タンパク質がフィブロインと共にカイコの後部絹糸腺において生成されるよう、前記水溶性タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入された、組換えカイコ。
8. クモ糸タンパク質がカイコの後部絹糸腺においてさらに生成されるよう、前記クモ糸タンパク質をコードする核酸が遺伝子導入された、請求項７に記載の組換えカイコ。
9. 請求項７又は８に記載の組換えカイコにより作られた、絹糸。
10. 請求項９に記載の絹糸から製造された、繊維製品。