JP6326703B2 - 外因性遺伝子発現増強剤 - Google Patents
外因性遺伝子発現増強剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6326703B2 JP6326703B2 JP2015543802A JP2015543802A JP6326703B2 JP 6326703 B2 JP6326703 B2 JP 6326703B2 JP 2015543802 A JP2015543802 A JP 2015543802A JP 2015543802 A JP2015543802 A JP 2015543802A JP 6326703 B2 JP6326703 B2 JP 6326703B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silkworm
- asrna
- silk gland
- expression vector
- ser1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
- A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/70—Invertebrates
- A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
Description
1−1.概要
本発明の第1の態様は、外因性遺伝子発現増強剤である。本発明の外因性遺伝子発現増強剤は、カイコの絹糸腺で発現するセリシン遺伝子又はFib H鎖遺伝子を標的とするアンチセンスRNAの発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする。本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、カイコに投与することによって絹糸腺内でセリシン及び/又はFib H鎖の遺伝子発現を抑制することができる。
本明細書において使用する主要な用語について、以下で定義する。
本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、アンチセンスRNA発現ベクターを必須成分として含む他、担体を選択成分として必要に応じて含む。以下、各成分について説明をする。
「アンチセンスRNA発現ベクター」(本明細書では、しばしば「asRNA発現ベクター」と表記する)は、本態様の外因性遺伝子発現増強剤における有効成分である。asRNA発現ベクターの母核には、様々な遺伝子発現ベクターを利用することができる。例えば、プラスミド若しくはバクミド(Bacmid)のような自律複製可能な発現ベクター、ウイルスベクター、又は染色体中に相同又は非相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主の染色体中に挿入した染色体の一部が挙げられる。また、asRNA発現ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターとすることもできる。
asRNA発現ベクターは、カイコの絹糸腺内で標的遺伝子に対するasRNAを発現するように構成されている。発現ベクターの構成エレメントには、少なくとも一つのasRNAをコードするDNA、及び該asRNAの発現に必要なプロモーターを必須の構成エレメントとして含む。また、必要に応じて前記asRNAの発現に寄与し得る他の構成エレメントを含むことができる。ここで、他の構成エレメントとは、例えば、ターミネーター、標識遺伝子、エンハンサー、インスレーター、及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。さらに、asRNA発現ベクターが、後述する第1サブユニットと第2サブユニットの2つのユニットから構成される場合には、転写調節因子をコードするDNA及び該転写調節因子の標的プロモーターを必須の構成エレメントとして包含する。また、asRNAの発現に直接関与する構成エレメントではないが、外因性遺伝子を当該ベクターに含むこともできる。以下、各エレメントの構成について具体的に説明をする。
アンチセンスRNAをコードするDNA(本明細書では、しばしば「asRNAコードDNA」と略称する)は、カイコの中部絹糸腺で特異的に発現するセリシン1〜3又は後部絹糸腺で特異的に発現するフィブロインH鎖遺伝子を標的とし、その発現を抑制するasRNAをコードしている。
プロモーターは、asRNA発現ベクターのasRNAコードDNAに作用して、前記asRNAを発現する必須の構成エレメントである。
ターミネーターは、asRNA発現ベクターを導入する宿主の後部絹糸腺細胞内で、asRNAの転写を終結できる塩基配列で構成される。
標識遺伝子は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。標識タンパク質は、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。それ故、asRNA発現ベクターが標識遺伝子を含むことによって、asRNA発現ベクターを保有している遺伝子組換えカイコを標識タンパク質の活性に基づいて容易に判別することができる。ここで「活性に基づいて」とは「活性の検出結果に基づいて」という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出してもよいし、標識タンパク質の活性によって生成される色素のような代謝物を介して間接的に検出してもよい。検出は、化学的検出(酵素反応的検出を含む)、物理的検出(行動分析的検出を含む)、又は検出者の感覚的検出(視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む)のいずれであってもよい。
インスレーターは、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けずに安定的に制御できる配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
トランスポゾンの逆位末端反復配列(Inverted terminal repeat sequence)(Handler AM. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:7520-5)は、asRNA発現ベクターが組換え可能なasRNA発現ベクターの場合に含まれ得る。逆位末端反復配列は、asRNA発現ベクターの上流及び下流に配置される。トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる(Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281;Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9(2):145-55)。
「転写調節因子をコードするDNA」とは、後述する第1サブユニットの必須エレメントであって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第2サブユニットの必須エレメントであって、第1サブユニットにコードされた転写調節因子が結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS(Upstream Activating Sequence)が使用される。
外因性遺伝子は、前記定義で述べたように、絹糸腺内で発現可能な外来性の遺伝子であって、目的のペプチドをコードする。本態様の外因性遺伝子発現増強剤に含まれるasRNA発現ベクターの本来の機能は、Ser1〜Ser3やFib H鎖等の標的遺伝子の発現を抑制するasRNAを発現することである。したがって、目的のペプチドをコードする外因性遺伝子は、asRNA発現ベクターの構成には直接関連はしない。しかし、asRNAの目的は、前記標的遺伝子の発現を抑制することによって、間接的に外因性遺伝子の発現を増強し、目的のペプチドを効率的に生産することである。つまり、外因性遺伝子は、本態様の外因性遺伝子発現増強剤がその効果を発揮する上で必要となる対象物である。それ故、本態様の外因性遺伝子発現増強剤を投与する宿主昆虫が絹糸腺内で発現可能な外因性遺伝子を有さない場合には、本発明の目的を十分に達成し得ない。目的のペプチドをコードする外因性遺伝子は、通常、後述する他の遺伝子発現ベクター(外因性遺伝子発現ベクター)に含まれ、asRNA発現ベクターとは独立に、同一の宿主昆虫に導入される。しかし、その対象物たる外因性遺伝子を発現可能な状態でasRNA発現ベクターに含んでいてもよい。asRNA発現ベクターが外因性遺伝子を含む場合、外因性遺伝子が絹糸腺内で発現可能なように、その上流には前述した中部絹糸腺特異的プロモーター及び/又は後部絹糸腺特異的プロモーターを配置すればよい。
asRNA発現ベクターは、1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合と、2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
asRNA発現ベクターが1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、そのasRNA発現ベクターを含む外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与するだけで、カイコ細胞内で目的のasRNAを発現し得る。このようなasRNA発現ベクターは、asRNAを発現する上で必要な全ての構成エレメントを1つのユニット内に含む。すなわち、必須の構成エレメントであるプロモーター及びそのプロモーターの下流に機能的に結合したasRNAコードDNAからなる1組の発現システムを少なくとも1つ含む。この1組の発現システムは、1つのプロモーター制御下にasRNAコードDNAを1つ含む系であってもよいし、asRNAコードDNAを2以上含む系であってもよい。
asRNA発現ベクターが第1サブユニット及び第2サブユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、asRNAを発現する上で必須の構成エレメントは2つのユニットのそれぞれに分かれて存在している。それ故に、その2つがカイコ細胞内に存在してはじめて1つのasRNA発現ベクターとして機能し、目的のasRNAを発現し得る。各サブユニットは以下の構成を有する。
本発明の外因性遺伝子発現増強剤は、必要に応じて許容可能な担体を含むことができる。「許容可能な担体」とは、昆虫学分野において通常使用する溶媒や補助剤等が挙げられる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、遺伝子組換えカイコである。本態様の遺伝子組換えカイコは、前記第1態様に記載のasRNA発現ベクターを有することを特徴とする。本態様の遺伝子組換えカイコがさらに外因性遺伝子発現ベクターを有する場合には、asRNA発現ベクターから発現したasRNAがその標的となるセリシン又はFib H鎖等の内在性遺伝子の発現を抑制する。それによって、外因性遺伝子にコードされた目的のペプチドをカイコ絹糸腺内で効率的に生産することができる。
本発明の遺伝子組換えカイコは、前記第1態様に記載のasRNA発現ベクターを有する。asRNA発現ベクターの構成については、第1態様に記載のasRNA発現ベクターと同じであることからその説明を省略し、ここでは本態様の遺伝子組換えカイコに特有の構成について説明をする。
本態様の遺伝子組換えカイコの作出方法は、前記第1態様に記載の発現ベクターから目的のasRNAを発現できる組換えカイコを作成できる方法であれば、いかなる方法も採用可能であり、特に限定はしない。そのような組換えカイコを作出する方法として、例えば、前記第1態様の外因性遺伝子発現増強剤を宿主であるカイコに投与する方法や、第1態様に記載のasRNA発現ベクターの第1サブユニットと第2サブユニットを異なる染色体上に有する遺伝子組換えカイコを交配する方法が挙げられる。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、ペプチド製造方法である。本態様の製造方法によれば、遺伝子組換えカイコの絹糸腺で、セリシンやFib H鎖等の夾雑タンパク質の発現を抑制しながら、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドを効率的に製造することができる。
本態様のペプチド製造方法では、タンパク質の大量生産系として遺伝子組換えカイコを用いる。本態様で用いる遺伝子組換えカイコは、第1態様に記載のasRNA発現ベクター、及び外因性遺伝子発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコである。つまり、外因性遺伝子発現ベクターを有する前記第2態様の遺伝子組換えカイコと換言することができる。
本発明の製造方法は、飼育工程及び回収工程を含む。以下、各工程について説明をする。
「飼育工程」とは、遺伝子組換えカイコを飼育する工程である。遺伝子組換えカイコの飼育方法については、当該分野で公知のカイコの飼育技術に従って飼育すればよい。例えば、「蚕種総論;高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を参照するとよい。飼料には、クワ属(Morus)の葉のような食草樹種の天然葉を用いてもよいし、シルクメイトL4M若しくは原蚕種1−3齢用(日本農産工業)のような人工飼料を用いてもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できる点から、人工飼料が好ましい。以下、遺伝子組換えカイコの簡単な飼育方法について、一例を挙げて説明する。
「回収工程」とは、遺伝子組換えカイコの幼虫が絹糸腺内に蓄積した目的のペプチドを回収する工程である。
(目的)
中部絹糸腺特異的タンパク質であるセリシン1(Ser1)の遺伝子発現を、Ser1遺伝子に対するasRNAで抑制できることを立証する。
1.カイコ中部絹糸腺特異的発現ベクターの作製
カイコ中部絹糸腺特異的に発現可能な発現ベクターとして、Ser1遺伝子に対するasRNA(「Ser1 asRNA」と表記する)を発現するSer1 asRNA発現ベクター、及びSer1遺伝子に対するshRNA(「Ser1 shRNA」と表記する。なお、本明細書におけるshRNAは、ヘアピン構造を有するlong dsRNAも含むものとする。)を発現するSer1 shRNA発現ベクターを作製する。
pAmCyan1-N1(Takara)を鋳型として、AmCyankozakU(配列番号23)及びSV40PCRL(配列番号24)をプライマーペアに用いてPCR増幅し、pZErO-2ベクター(life technologies)へ挿入した。これをAmCyan/pZero2とする。
pBac[SerUAS/3xP3EGFP] (Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87)のNcoI-NotI部位へ挿入することによって、マーカー遺伝子をEGFPからAmCyan又はEYFPへ置換した。これらのプラスミドを、pBac[SerUAS/3xP3AmCyan]又はpBac[SerUAS/3xP3EYFP]とした。
カイコ白/C系統の5齢6日目の中部絹糸腺から総RNAを抽出した(Isogen ニッポンジーン)。総RNAをoligo dT primer(プロメガ)と逆転写酵素(ReverTra Ace TOYOBO)を用いて逆転写し、cDNAを得た。得られたcDNAを鋳型として、SpeSer1B130U23(配列番号26)及びBlnSer1B1636L23(配列番号27)、並びにBlnSer1B130U23(配列番号28)及びSpeSer1B1636L23(配列番号29)の2種類のプライマーペアを用いてPCRを行い、Ser1の5’側の断片を得た。これらの核酸断片を、5’Ser1SB及び5’Ser1BSとした。
shRNAのループ部分に相当するリンカーを作製した。カイコ白/C系統のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーペアにBlnA3intU(配列番号34)及びSpeA3IntL(配列番号35)を用いてアクチン3のイントロンをPCR増幅した。得られた核酸断片をリンカーA3intBSとした。
上記(1)で作製したpBac[SerUAS/3xP3AmCyan]のBlnI部位に5’Ser1SBをBlnIが5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan](図3A)とした。pBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan]は、反復配列領域を含まないSer1遺伝子の5’側領域を標的部位とする5’Ser1 asRNAを発現する5’Ser1 asRNA発現ベクターである。
5’Ser1 asRNA発現ベクターのBlnI部位にリンカーA3intBSをBlnI部位が5’側になるように挿入し、さらに5’Ser1BSをBlnI部位が5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan](図4A)とした。pBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan]は、Ser1遺伝子の5’側領域を標的部位とする5’Ser1 shRNAを発現する5’Ser1 shRNA発現ベクターである。
(1)発現ベクターの導入
上記「1.カイコ中部絹糸腺特異的発現ベクターの作製」で作製したSer1 asRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan]、pBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]及びSer1 shRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan]及びpBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]を、それぞれ別個にトランスポゾン転移酵素を発現するヘルパープラスミドpHA3PIG (Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84)と1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は、25〜27℃の飼育室で全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した(Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol, 75:89-97)。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1卵をそれぞれの選抜マーカーである3xP3EYFPマーカー又は3xP3AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。
上記「(1)発現ベクターの導入」で得られた各遺伝子組換えカイコ系統を3系統ずつ図5に示すpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2(Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87)を有する遺伝子組換えカイコ系統と交配した。ここで、pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2は、中部絹糸腺特異的にGAL4遺伝子を発現する中部絹糸腺GAL4発現ベクターで、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。F1個体において、Ser1 asRNA発現ベクター又はSer1 shRNA発現ベクター(第2サブユニット)、及びpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2(第1サブユニット)の両方を有する系統を、3xP3EYFPマーカー又は3xP3AmCyanマーカー、及び3xP3DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Ser1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを得た。第2サブユニットを有する遺伝子組換えカイコを3系統ずつ用いたことから、Ser1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコもそれぞれ3系統ずつ得た。
上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出したSer1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて、各遺伝子組換えカイコの中部絹糸腺におけるSer1遺伝子の発現抑制効果について検証した。
タンパク質レベルでもSer1タンパク質の合成が抑制されていることを、上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出したSer1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて確認した。各遺伝子組換えカイコを飼育して、繭を得た後、繭10 mgに対てし1 mLの50 mM Tris-HCl (PH8.0)/8 M 尿素/10 mM DTTを加え、80℃で5分間インキュベートすることにより、繭タンパク質を抽出した。繭タンパク質32.5μLに対し12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer(インビトロジェン)と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent(インビトロジェン)を加え、70℃で10分間加温してSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、EZ stain aqua(ATTO)で染色した。
上記「3.Ser1 mRNAの定量」の結果を図6に示す。この図は、陰性対照の遺伝子組換えカイコ(図6の第2サブユニットを「−」で示した系統)のSer1 mRNA転写量を1としたときの相対値を表す。5’Ser1 shRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、3’Ser1 shRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、5’Ser1 asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、及び3’Ser1 asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコのいずれの群もSer1遺伝子に対する発現抑制が確認された。各群における3系統(第2サブユニット1、2、3に相当)のSer1mRNA量の平均相対値を上部に示した。
(目的)
実施例1では、中部絹糸腺特異的なタンパク質Ser1の遺伝子に対するasRNAの発現抑制効果を立証した。そこで、本実施例では、後部絹糸腺特異的タンパク質であるフィブロインH(Fib H)鎖についても同様にFib H遺伝子の反復配列領域に対するasRNAでFib H遺伝子の発現を抑制できることを立証する。
1.カイコ後部絹糸腺特異的発現ベクターの作製
カイコ後部絹糸腺特異的に発現可能な発現ベクターとして、Fib H鎖遺伝子に対するasRNAを発現するFib-H asRNA発現ベクターを作製する。
BsmBIadapU(配列番号40)とBsmBIadapL(配列番号41)をアニーリングしてBsmBIアダプターを作製した。実施例1で作製したpBac[SerUAS/3xP3AmCyan]のBlnI部位にBsmBIアダプターを挿入した。得られたプラスミドをpBac[SerUAS-BsmBI/3xP3AmCyan]とした。
カイコ大造系統のゲノムDNAをFibHU(配列番号42)とFibHL(配列番号43)のプライマーペアでPCRし、Fib H鎖遺伝子の反復配列領域を増幅した。得られた複数種の断片より選択した2断片をそれぞれFibH1、FibH2とする。FibH1(1196bp)とFibH2(1433bp)をBsmBIで切断し、前記pBac[SerUAS-BsmBI/3xP3AmCyan]のBsmBI部位にアンチセンス鎖を発現する方向で挿入した。得られたプラスミドをそれぞれpBac[SerUAS-asFib1/3xP3AmCyan](図8A)及びpBac[SerUAS-asFib2/3xP3AmCyan](図8B)とした。これらは、いずれもFib H鎖遺伝子の反復配列領域に対するasRNA(「Fib-H asRNA」と表記する)コードDNAを含むFib-H asRNA発現ベクターであって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。
(1)発現ベクターの導入
pBac[SerUAS-asFib1/3xP3AmCyan]及びpBac[SerUAS- asFib2/3xP3AmCyan]をそれぞれ前記ヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は、25〜27℃の飼育室で全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1卵を3xP3 AmCyanによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。FibH1及びFibH2の2群の遺伝子組換えカイコについて、それぞれ2系統及び3系統選択し、次の後部絹糸腺GAL4系統との交配に用いた。
上で得られた遺伝子組換えカイコ系統をpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed](Sezutsu H. et al, 2009, Journal of Insect Biotechnology and sericology, 78,1-10)を有する遺伝子組換えカイコ系統と交配した。pBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed](図9)は、後部絹糸腺で活性を有するFib Hプロモーターの下流にGAL4遺伝子を連結した後部絹糸腺GAL4発現ベクターであって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。F1個体において、Fib-H asRNA発現ベクター(第2サブユニット)及びpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed](第1サブユニット)の両方を有する系統を、3xP3AmCyanマーカー及び3xP3DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Fib H鎖に対するasRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを得た。
上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出したFib-H asRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて、後部絹糸腺におけるFib H鎖遺伝子発現の抑制効果について検証した。
タンパク質レベルでもFib H鎖タンパク質の合成が抑制されていることを、上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出したFib-H asRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて確認した。各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、後部絹糸腺と中部絹糸腺に分離した。後部絹糸腺又は中部絹糸腺を1本あたり5 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8.0)/8 M 尿素/2% SDS/25 mM DTTに入れて、一晩、室温で振とうし、絹糸腺タンパク質を抽出した。Fib H鎖遺伝子が後部絹糸腺特異的に発現するにもかかわらず、中部絹糸腺のタンパク質についても検証する理由は、Fib H鎖タンパク質は、後部絹糸腺内で合成後に中部絹糸腺に移行するため、後部絹糸腺のみならず中部絹糸腺にも存在するからである。絹糸腺タンパク質5μLに対しH2O 27.5 μL、12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer(インビトロジェン)と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent(インビトロジェン)を加え、70℃で10分間加温しSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、EZ stain aqua(ATTO)で染色した。
上記「3.Fib H鎖 mRNAの定量」の結果を図10に示す。この図は、対照の遺伝子組換えカイコ(図10の第2サブユニットを「−」で示した系統)のFib H鎖 mRNA転写量を1としたときの相対値を表す。Fib-H asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコFibH1及びFibH2は、いずれもFib H鎖遺伝子の発現抑制が確認された。この結果は、カイコ絹糸腺タンパク質の反復配列領域に対するasRNAが中部絹糸腺特異的なタンパク質のみならず、後部絹糸腺特異的なタンパク質に対しても有効であることを示している。
(目的)
Ser1及びFib Hのそれぞれの遺伝子の反復配列領域に対するasRNAを組み合わせて、同時に発現した場合にもSer1遺伝子とFib H鎖遺伝子の発現を同時に抑制できることを立証する。
1.カイコ中部絹糸腺及び後部絹糸腺発現ベクターの作製
(1)Fib-H as RNA及びSer1 asRNAの同時発現UASベクター(UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクター)の作製
pBac[SerUAS-asFibH1/3xP3AmCyan]のBlnI部位に実施例1で調製した3’Ser1SBを挿入しpBac[SerUAS-3’asSer1_asFibH1/3xP3AmCyan](図12A)を作製した。このプラスミドはUASプロモーターの下流に3’Ser1 asRNAコードDNAとFib-H asRNAコードDNAをタンデムに配置した発現ベクター(UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクター)であって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第2サブユニットに相当する。
AscI.adU(配列番号46)とAscI.adL(配列番号47)をアニーリングして、AscIアダプターを作製した。図9に示したpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]のAscI部位にAscIアダプターを挿入し、pBacFibH-pro GAL4_AscI-BlnI/3xP3DsRed2を作製した。さらにこのプラスミドのAscI-BlnI部位にpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2のAscI-SpeI断片を挿入して中部及び後部絹糸腺の両方でGAL4遺伝子を発現する中部&後部絹糸腺GAL4発現ベクターであるpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2(図12B)を作製した。この発現ベクターは、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。
(1)発現ベクターの導入
中部&後部絹糸腺GAL4発現ベクターであるpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2とUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-3’asSer1_asFibH1/3xP3AmCyan]を、それぞれ別個に実施例1に記載のヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にそれぞれインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は25〜27℃の飼育室にて全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1から、中部&後部絹糸腺GAL4発現ベクターをインジェクションした中部&後部絹糸腺GAL4系統は3xP3 DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で、またUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクターをインジェクションしたUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統は3xP3 AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で、それぞれ選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。
中部&後部絹糸腺GAL4系統とUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統を交配した。また、対照用として、実施例1で用いた中部絹糸腺GAL4発現ベクターpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する遺伝子組換えカイコ系統、又は実施例2で用いた後部絹糸腺GAL4発現ベクターpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]を有する遺伝子組換えカイコ系統とSer1-FibH1 asRNA系統とを交配した。F1個体において、中部&後部絹糸腺GAL4系統及びUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統の両方を有する系統を3xP3DsRed2マーカー及び3xP3AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Fib-H asRNA及びSer1 asRNAを中部絹糸腺及び/又は後部絹糸腺で同時に発現する遺伝子組換えカイコを得た。
上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出した遺伝子組換えカイコを用いてSer1タンパク質量及びFib H鎖タンパク質量について検証した。各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、後部絹糸腺と中部絹糸腺に分離した。後部絹糸腺又は中部絹糸腺を1本あたり5 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8.0)/8 M 尿素/2% SDS/25 mM DTTに入れ、一晩、室温で振とうし、絹糸腺タンパク質を抽出した。絹糸腺タンパク質5μLにH2O 27.5 μL、12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer(インビトロジェン)と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent(インビトロジェン)を加え、70℃で10分間加温しSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、CBCで染色した。
図13に結果を示す。第1サブユニットに後部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、対照(UAS -;GAL4 +)と比較して中部絹糸腺におけるFib H鎖タンパク質量が減少した。これは、実施例2の結果と一致するまた、第1サブユニットに中部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、中部絹糸腺におけるSer1タンパク質がほとんど失われた。これは、中部絹糸腺発現用GAL4ベクターにより、中部絹糸腺でSer1 asRNAが発現し、Ser1遺伝子の発現を抑制したことを示している。一方、第1サブユニットに中部&後部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、中部及び後部絹糸腺の両方でFib-H asRNAとSer1 asRNAが発現する。それにより、Ser1遺伝子とFib H鎖遺伝子の両方が同時に、かつ効率的に発現抑制された。
(目的)
実施例1及び3から、Ser1 asRNAによりSer1遺伝子の発現が抑制されることが立証された。そこで、Ser1遺伝子の発現抑制により、外因性遺伝子の発現を増強できることを立証する。
1.外因性遺伝子発現ベクターの作製
実施例1で作製したUASバックボーンプラスミドAmCyan/pZero2をNcoI-NotIで切断し、AmCyan遺伝子断片を切り出した。得られた断片をpBac[SerUAS-ser_int-EGFP/3xP3EGFP] (図14A) (Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87)のNcoI-NotI部位へ挿入した。これによりpBac[SerUAS-ser_int-EGFP/3xP3EGFP]における標識遺伝子をEGFPからAmCyanに置換した。得られたUAS-EGFP発現ベクターをpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyan(図14B)とした。
(1)外因性遺伝子発現ベクターの導入
前記「1.外因性遺伝子発現ベクターの作製」で作製したUAS-EGFP発現ベクターpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyanを、実施例1に記載のヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は25〜27℃の飼育室にて全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1を3xP3 AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。この遺伝子組換えカイコ系統をUAS-EGFP系統とした。
中部絹糸腺発現用GAL4ベクターとしてpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する中部絹糸腺GAL4系統(第1サブユニット系統に相当)と、3’Ser1 asRNA発現ベクターpBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]を有するUAS-3’Ser asRNA系統(第2サブユニット系統に相当)、及び「(1)外因性遺伝子発現ベクターの導入」で得たpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyanを有するUAS-EGFP系統の交配を行った。比較用として、前記中部絹糸腺GAL4系統と、3’Ser1 shRNA発現ベクターpBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]を有するUAS-3’Ser shRNA系統、及び前記UAS-EGFP系統の交配を行った。また、陰性対照用として、前記中部絹糸腺GAL4系統と前記UAS-EGFP系統のみの交配を行った。一個体に3種類の遺伝子発現ベクターを有する系統、又は2種類の遺伝子発現ベクターを有する陰性対照用系統を、それぞれの発現ベクターのマーカーに基づいて眼の蛍光の有無により選抜した。これによって、中部絹糸腺特異的にEGFP遺伝子を発現し、かつSer1遺伝子の発現抑制を起こす系統と起こさない系統を得た。
上記「2.遺伝子組換えカイコの作出」で作出した各遺伝子組換えカイコを用いてEGFPタンパク質量について検証した。5齢6日目の幼虫から中部絹糸腺を摘出し、1本当たり10 mLのPBS(pH 7.2)/1%Tween20/0.05%アジ化ナトリウムに入れて、室温で24時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、2,000×g で10分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のEGFPタンパク質濃度をReacti-Bind Anti-GFP Coated Plates(PIERCE)で測定した。具体的にはReacti-Bind Anti-GFP Coated Platesに上清液を100 μL添加し、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)を添加して、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad)を用いて発色反応を行い、1N 硫酸を加えて反応を停止させた。発色をplate reader (SpectraMax 250; Molecular Devices)で定量した。リコンビナントGFPタンパク質(タカラバイオ; Z2373N)の系列希釈液(1-400pg/μL)を用いて標準曲線を作製した。
図15に各系統の1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す。3’Ser1 asRNAを発現する系統は、対照(図15の「−」)と比較して、約2倍のEGFPタンパク質量の上昇を示した。これは、中部絹糸腺でSer1遺伝子の反復配列領域に対する3’Ser1 asRNAが発現することによってSer1遺伝子の発現が抑制された結果、外因性遺伝子(ここではEGFP遺伝子)の発現が増強したことを示している。一方、3’Ser1 shRNAによるSer1遺伝子の発現抑制でもEGFPタンパク質量は増加したが、3’Ser1 asRNAと比較して、その増加量は低かった。
(目的)
Ser1 asRNA及びFib-H asRNAを組み合わせて発現し、Ser1遺伝子とFib H遺伝子の発現を同時に抑制することにより、外因性遺伝子の発現をより増強できることを検証した。
1.組換えカイコの作出
実施例3で調製した中部&後部絹糸腺GAL4発現ベクターpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する中部&後部絹糸腺GAL4系統、UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統及び実施例4で調製したUAS-EGFP系統を交配した。また、対照用として、中部&後部絹糸腺GAL4系統とUAS-EGFP系統のみを交配した。各発現ベクターのマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、絹糸腺特異的にEGFPを発現し、かつ、Fib-H asRNA及びSer1 asRNAを中部絹糸腺及び/又は後部絹糸腺で同時に発現する遺伝子組換えカイコをそれぞれ3系統得た。
上記「1.遺伝子組換えカイコの作出」で作出した各遺伝子組換えカイコを用いて、EGFPタンパク質量について検証した。5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、1本当たり20 mLのPBS(pH 7.2)/1%Tween20/0.05%アジ化ナトリウムに入れて、室温で24時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、2,000×g で10分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のEGFPタンパク質濃度をReacti-Bind Anti-GFP Coated Plates(PIERCE)で測定した。具体的にはReacti-Bind Anti-GFP Coated Platesに上清液を100 μL添加し、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)を添加して、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad)を用いて発色反応を行い、1N 硫酸を加えて反応を停止させた。発色をplate reader (SpectraMax 250; Molecular Devices)で定量した。リコンビナントGFPタンパク質(タカラバイオ; Z2373N)の系列希釈液(1-400pg/μL)を用いて標準曲線を作製した。
図16に各系統1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す。3’Ser1 asRNA及びFib-H asRNAを発現する系統では、それらの遺伝子の発現を抑制していない陰性対照(図17の「−」)と比較して、絹糸腺で高いEGFPタンパク質量が認められた。この結果は、中部絹糸腺及び後部絹糸腺の主要なタンパク質であるSer1及びFib H鎖の合成がそれぞれのasRNAによって抑制されることで、外因性遺伝子(ここではEGFP遺伝子)の発現が増強したことを示している。
(目的)
目的のペプチドの抽出を阻害するゲル状の夾雑タンパク質(主としてセリシンとフィブロインから構成される)がSer1 asRNA及びFib-H asRNAを発現することによって、減少することを確認した。
実施例5で作出した遺伝子組換えカイコと同じ系統の5令6日目の幼虫各3頭から中部及び後部絹糸腺を摘出した。1頭分の中部及び後部絹糸腺をまとめて4 mLのPBSに入れ、4℃で一晩転倒撹拌を行った。4℃、5,000 rpmで遠心し、得られた上清を15 mLチューブへ入れ、4℃で48時間静置した。チューブを上下転倒させ、落下した液量を計測し、元の液量に対して何%の液体が落下したかを計算した。
図17に結果を示す。Ser1及びFib H鎖遺伝子の発現を抑制していない陰性対照では上清がゲル化し、白濁した。その結果、チューブを上下転倒させても抽出液は全く落下してこなかった。一方、Ser1 as RNAとFib-H as RNAを発現する系統由来の試料では、上清はゲル化せず、液体のままであった。チューブを上下転倒させると、平均98%の抽出液が落下した。これらの結果は、Ser1 as RNA及びFib-H as RNAでSer1遺伝子及びFib H鎖遺伝子の発現をそれぞれ抑制することによって、絹糸腺抽出液のゲル化の原因となる夾雑タンパク質を効率的に除去できることが示された。
Claims (10)
- 配列番号1で示されるカイコセリシン1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域に含まれる配列番号2で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の開始位置をずらして位相を変えた派生配列からなる反復単位を少なくとも一つコードする塩基配列に対して相補的な配列を含むセリシン1アンチセンスRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター、及び/又は
配列番号12で示されるカイコフィブロインH鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域に含まれる配列番号13で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の開始位置をずらして位相を変えた派生配列からなる反復単位を少なくとも一つコードする塩基配列に対して相補的な配列を含むフィブロインH鎖アンチセンスRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター
を有効成分として含むカイコ絹糸腺における外因性遺伝子発現増強剤。 - セリシン1アンチセンスRNAが配列番号3で示される塩基配列からなり、又は
フィブロインH鎖アンチセンスRNAが配列番号14で示される塩基配列からなる、
請求項1に記載の外因性遺伝子発現増強剤。 - 前記アンチセンスRNA発現ベクターが第1及び第2サブユニットで構成される2つのサブユニットからなり、
前記第1サブユニットは後部絹糸腺プロモーター又は中部絹糸腺プロモーターの制御下に転写調節因子をコードするDNAを含み、
前記第2サブユニットは前記第1サブユニットに含まれる前記転写調節因子の標的プロモーターの制御下に前記アンチセンスRNAをコードするDNAを含む、
請求項1又は2に記載の外因性遺伝子発現増強剤。 - 配列番号1で示されるカイコセリシン1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域に含まれる配列番号2で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の開始位置をずらして位相を変えた派生配列からなる反復単位を少なくとも一つコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン1アンチセンスRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター、及び/又は
配列番号12で示されるカイコフィブロインH鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域に含まれる配列番号13で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の開始位置をずらして位相を変えた派生配列からなる反復単位を少なくとも一つコードする塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンスRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるフィブロインH鎖アンチセンスRNA発現ベクター
を有する遺伝子組換えカイコ。 - セリシン1アンチセンスRNAが配列番号3で示される塩基配列からなり、又は
フィブロインH鎖アンチセンスRNAが配列番号14で示される塩基配列からなる、
請求項4に記載の遺伝子組換えカイコ。 - 前記アンチセンスRNA発現ベクターが第1及び第2サブユニットで構成される2つのサブユニットからなり、
前記第1サブユニットは後部絹糸腺プロモーター又は中部絹糸腺プロモーターの制御下に転写調節因子をコードするDNAを含み、
前記第2サブユニットは前記第1サブユニットに含まれる前記転写調節因子の標的プロモーターの制御下に前記アンチセンスRNAをコードするDNAを含む、請求項4又は5に記載の遺伝子組換えカイコ。 - 前記2つのサブユニットが異なる染色体上に存在する、請求項6に記載の遺伝子組換えカイコ。
- 目的の外因性遺伝子を発現することのできる外因性遺伝子発現ベクターを有する、請求項6又は7に記載の遺伝子組換えカイコ。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与する工程を含む遺伝子組換えカイコの作出方法。
- 請求項8に記載の遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドを製造する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013222138 | 2013-10-25 | ||
JP2013222138 | 2013-10-25 | ||
PCT/JP2014/077316 WO2015060159A1 (ja) | 2013-10-25 | 2014-10-14 | 外因性遺伝子発現増強剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015060159A1 JPWO2015060159A1 (ja) | 2017-03-09 |
JP6326703B2 true JP6326703B2 (ja) | 2018-05-23 |
Family
ID=52992759
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015543802A Active JP6326703B2 (ja) | 2013-10-25 | 2014-10-14 | 外因性遺伝子発現増強剤 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6326703B2 (ja) |
CN (1) | CN105683373A (ja) |
WO (1) | WO2015060159A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020125274A (ja) * | 2019-02-06 | 2020-08-20 | 合同会社Tgs | 繭糸 |
CN111471714A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-07-31 | 西南大学 | Minos转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法 |
CN113773383B (zh) * | 2020-06-19 | 2024-02-06 | 西南大学 | 用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用 |
US20220017918A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Kraig Biocraft Laboratories, Inc. | Synthesis of Non-Native Proteins in Bombyx Mori by Modifying Sericin Expression |
CN112760324B (zh) * | 2021-01-18 | 2023-10-27 | 西南大学 | 一种提高家蚕产丝量的方法 |
US20220372078A1 (en) * | 2021-05-20 | 2022-11-24 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Polypetide, photoresist composition including the same, and method of forming pattern using the same |
CN114113376B (zh) * | 2021-11-10 | 2023-08-29 | 广东一方制药有限公司 | 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法 |
KR20230083100A (ko) * | 2021-12-02 | 2023-06-09 | 삼성전자주식회사 | 폴리펩티드, 이를 포함하는 포토레지스트 조성물 및 이를 이용한 패턴 형성 방법 |
CN115724937B (zh) * | 2022-08-26 | 2023-09-15 | 西南大学 | 具有抗菌活性的Sericin3蛋白的重复基序及其应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1482035A4 (en) * | 2002-03-06 | 2005-11-09 | Toray Industries | METHOD FOR THE PRODUCTION OF PHYSIOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN USING A GENETICALLY MODIFIED SILK ROBUST |
JP2004135528A (ja) * | 2002-10-16 | 2004-05-13 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコを利用したタンパク質の製造方法 |
FR2852325B1 (fr) * | 2003-03-13 | 2005-06-03 | Acide nucleique dirigeant l'expression d'un polypeptide d'interet dans les glandes sericigenes posterieures d'un lepidoptere, et ses applications | |
JP2008245623A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hiroshima Industrial Promotion Organization | 改変フィブロインを生産する遺伝子改変カイコ |
JP2011103816A (ja) * | 2009-11-18 | 2011-06-02 | Neosilk Co Ltd | トランスジェニックカイコ |
CN102358902B (zh) * | 2011-04-02 | 2013-01-02 | 西南大学 | 家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用 |
WO2014104269A1 (ja) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 |
-
2014
- 2014-10-14 JP JP2015543802A patent/JP6326703B2/ja active Active
- 2014-10-14 CN CN201480058676.4A patent/CN105683373A/zh active Pending
- 2014-10-14 WO PCT/JP2014/077316 patent/WO2015060159A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015060159A1 (ja) | 2015-04-30 |
CN105683373A (zh) | 2016-06-15 |
JPWO2015060159A1 (ja) | 2017-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6326703B2 (ja) | 外因性遺伝子発現増強剤 | |
JP6253109B2 (ja) | 後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 | |
Mori et al. | The functional domain of GCS1-based gamete fusion resides in the amino terminus in plant and parasite species | |
Heinrich et al. | Germ‐line transformation of the Australian sheep blowfly Lucilia cuprina | |
AU2007213444A1 (en) | Gene expression system using alternative splicing in insects | |
JP6497605B2 (ja) | 雌蚕致死カイコ系統 | |
CN112188834B (zh) | 自限性夜蛾 | |
WO2018074403A1 (ja) | 遺伝子組換えミノムシ絹糸 | |
Qian et al. | High-efficiency production of human serum albumin in the posterior silk glands of transgenic silkworms, Bombyx mori L | |
Zhao et al. | Expression of hIGF-I in the silk glands of transgenic silkworms and in transformed silkworm cells | |
JP6436908B2 (ja) | 外因性遺伝子発現ベクター、形質転換体判別マーカー及び形質転換体 | |
JP2011103816A (ja) | トランスジェニックカイコ | |
JP6964843B2 (ja) | バイナリー遺伝子発現システム | |
JP2006521802A (ja) | 鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用 | |
JP2015518366A (ja) | カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 | |
JP6541173B2 (ja) | 細胞死誘導ベクター及びそれを有する部位特異的細胞死誘導カイコ系統 | |
WO2017135452A1 (ja) | 哺乳動物型糖鎖付加遺伝子組換えカイコ | |
KR101811518B1 (ko) | 초파리의 산화 스트레스 저항성을 조절하는 방법 | |
JP6948064B2 (ja) | ミトコンドリア機能異常型遺伝子組換え絹糸虫 | |
JP4544834B2 (ja) | 外来遺伝子発現を促進するポリヌクレオチド | |
KR102114194B1 (ko) | 킬러레드 단백질을 발현하는 실크를 생산하는 형질전환 누에 | |
JP2004254681A (ja) | 昆虫への遺伝子導入ベクターおよび遺伝子産物製造法 | |
JP2023119400A (ja) | 休眠卵を用いた遺伝子組換えカイコの作製方法 | |
JP2023067775A (ja) | 不妊性チョウ目昆虫の生産方法及びチョウ目昆虫の不妊化組成物 | |
JP2014233223A (ja) | 転写制御ポリヌクレオチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180227 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180320 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180330 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6326703 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |