CN102066418A - 抗hiv单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

根据本发明，提供选自以下任一种抗体的、识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体。(a)抗体，该抗体具有SEQ IDNO：1记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列。

Description

抗HIV单克隆抗体

技术领域

本发明涉及具有中和人免疫缺陷病毒(HIV)的活性的单克隆抗体。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome；AIDS)是由名为人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus；HIV)的慢病毒的慢性感染引起的病态。近年来，人们开发了抑制HIV增殖的抗病毒药，可以阻止AIDS发病。但是，即使使用强效的抗病毒药，也难以驱逐HIV，抗病毒治疗必须持续一生。另一方面，因长期使用抗病毒药而出现的耐药性病毒或慢性毒性等问题也已明确，目前的抗病毒疗法依然处于不充分的状态。另外，抗病毒药昂贵，在发展中国家实质上不可能长期使用。鉴于上述情况，开发阻止感染的疫苗是世界性课题，而且人们还要求开发无副作用的新的治疗药。

关于中和HIV感染的单克隆抗体，有人报道了各种抗体(Burton，DR.等人，Nat.Immunol.5，第233-236页，2004；Zolla-Pazner，S.等人，Nat.Rev.Immunol.4，第199-210页，2004；Eda，Y.等人，J.Virol.80：5552-5562，2006)。这些靶分子大致分为：抗外被膜蛋白gp120的V1/V2、V3等可变区的抗体；抗CD4结合位点(CD4bs)的抗体；抗CD4i(CD4-gp120结合后出现的表位)的抗体。另一方面，有人还发表了与跨膜蛋白、gp41的MPR(membrane proximal region，近膜区)反应的抗体的中和活性。其中，显示交叉反应的抗体有：V3抗体中的447-52D和KD-247；CD4bs抗体中的b12；gp41-MPR抗体中的2F5和4E10；作为抗糖链抗体的2G12。在V3抗体中虽然确认到交叉反应性，但能够反应的病毒株受限，这是问题之所在。另一方面，gp41-MPR抗体在多个临床分离株中确认到交叉反应，因此近年来受到关注，但最近发现：它们与宿主细胞的淋巴脂质进行交叉反应，实际上是自身抗体与HIV的gp41进行交叉反应。此外，b12的CD3也长达18个氨基酸，暗示其与自身抗原的交叉反应性(Haynes，BF等人，Science 308，第1906-1908页，2005)。

非专利文献1：Burton，DR.等人，Nat.Immunol.5，第233-236页，2004

非专利文献2：Zolla-Pazner，S.等人，Nat.Rev.Immunol.4，第199-210页，2004

非专利文献3：Eda，Y.等人，J.Virol.80：5552-5562，2006

非专利文献4：Haynes，BF等人，Science 308，第1906-1908页，2005

发明内容

发明所要解决的课题

本发明应解决的课题在于：提供对广范围的HIV株具有中和活性的单克隆抗体。

解决课题的方法

尚未开发出阻止HIV感染的疫苗的原因之一在于：尚未明确有效的中和抗体。另一方面，在虽然感染HIV但长期未见进展的长期非进展病例中，存在对广范围的病毒株显示出中和活性、控制病毒增殖的病例。本发明人等为了研究在感染HIV但长期未见进展的长期非进展病例中是哪一种中和抗体在起作用，将末消血的B细胞用EB病毒进行无限增殖，通过克隆制成单克隆抗体产生株。根据对所得单克隆抗体的性质进行研究，不仅可以明确该单克隆抗体在长期非进展病例中的有效的抗病毒反应，还可以将其用于开发疫苗或新的治疗药。

即，根据本发明，提供以下发明。

(1)单克隆抗体，其是选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体。

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列。

(2)单克隆抗体，其是选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体。

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(c)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列。

(3)单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体是具有保藏号FERMBP-11021或保藏号FERM BP-11060的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体。

(4)单克隆抗体，该单克隆抗体是具有保藏号FERM BP-11020、保藏号FERM BP-11022或保藏号FERM BP-11023的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体。

(5)(1)～(4)中任一项所述的抗体，该抗体是由下述细胞产生的：所述细胞由根据与gp120的结合性筛选长期非进展病例的HIV感染患者的B细胞，并选择产生gp120结合抗体的B细胞而来。

(6)(1)～(5)中任一项所述的抗体的制造方法，该方法包括以下步骤：根据与gp120的结合性筛选长期非进展病例的HIV感染患者的B细胞，并选择产生gp120结合抗体的B细胞，之后采集所选择的B细胞产生的抗体。

(7)细胞，其是具有保藏号FERM BP-11021或保藏号FERMBP-11060的产生(1)所述的抗体的细胞。

(8)细胞，其是具有保藏号FERM BP-11020、保藏号FERMBP-11022或保藏号FERM BP-11023的产生(2)所述的抗体的细胞。

(9)HIV感染症的预防和/或治疗药，其中含有(1)～(5)所述的至少一种以上的单克隆抗体。

(10)HIV感染症的预防和/或治疗药，其中含有(1)或(3)所述的单克隆抗体与(2)或(4)所述的单克隆抗体的组合。

发明效果

本发明的单克隆抗体可用作AIDS/HIV-1感染症的预防、治疗药。此外，本发明的单克隆抗体还可用作开发中和抗体诱导型HIV疫苗的研究试剂。

附图说明

图1显示通过gp120-捕捉ELISA进行的单克隆抗体的反应性的分析。

图2显示与HIV-1JR-FL慢性感染细胞(PM1/JR-FL)表面的结合活性的FACS分析。

图3显示中和单克隆抗体对4种包膜假病毒的交叉中和活性。

图4显示0.5d(3D6)显著增强V3抗体与gp120的反应性。

图5显示0.5g(1C10)与0.5d(3D6)的组合对抑制HIV-1JR-FL的协同效果。

图6显示本发明的单克隆抗体0.5γ(1C10)的抗原结合位点的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

图7显示本发明的单克隆抗体5G2的抗原结合位点的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

图8显示本发明的单克隆抗体0.5δ(3D6)的抗原结合位点的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

图9显示本发明的单克隆抗体42F9的抗原结合位点的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

图10显示本发明的单克隆抗体49G2的抗原结合位点的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

图11显示本发明的抗体对各种病毒株的中和活性。

图12显示CCR5抑制剂与本发明的抗体结合使用时的协同抑制效果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式和实施方法进行说明。

1.本发明的单克隆抗体

本发明的单克隆抗体的第一例为：选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体。

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列。

上述抗体的具体例子有：具有保藏号FERM BP-11021或保藏号FERM BP-11060的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体或其片段。

本发明的单克隆抗体的第二例为：选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体。

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列；

(c)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列作为H链可变区(VH)的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列作为L链可变区(VL)的氨基酸序列。

上述抗体的具体例子有：具有保藏号FERM BP-11020、保藏号FERM BP-11022或保藏号FERM BP-11023的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体。

本说明书的实施例中记载的产生单克隆抗体3D6(0.5δ)、5G2、42F9和49G2的细胞分别以保藏号FERM BP-11020、保藏号FERMBP-11021、保藏号FERM BP-11022和保藏号FERM BP-11023于2008年(平成20年)9月17日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所 专利生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)，本说明书的实施例中记载的产生单克隆抗体1C10(0.5γ)的细胞以保藏号FERM BP-11060(认收号FERM ABP-11060)于2008年(平成20年)11月7日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)。

在本说明书中，当谈及抗体时，以不仅包含全长抗体还包含抗体片段的含义使用。抗体片段优选为功能性的片段，例如F(ab’)₂、Fab’等。F(ab’)₂、Fab’是指用蛋白分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)处理免疫球蛋白而制得的、在存在于铰链区中的2条H链间的二硫键的前后消化而生成的抗体片段。并且，当谈及抗体片段时，还包含含有来自编码该抗体的基因的抗原结合位点的蛋白。

例如，用木瓜蛋白酶处理IgG1时，在存在于铰链区中的2条H链间的二硫键的上游将其切断，可以制造由VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)形成的L链、以及由VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区)形成的H链片段在C末端区通过二硫键结合的相同的两个抗体片段。这两个相同的抗体片段分别称作Fab’。另外，用胃蛋白酶处理IgG时，在存在于铰链区中的2条H链间的二硫键的下游将其切断，可以制造比上述两个Fab’通过铰链区连接而成的片段稍大的抗体片段。该抗体片段称作F(ab’)₂。

本发明的单克隆抗体，可以以固定在固相载体等不溶性载体上的固定化抗体的形式使用、或者以用标记物标记的标记抗体的形式使用。这样的固定化抗体或标记抗体均包括在本发明范围内。

固定化抗体是指处于通过物理吸附或化学结合等担载在不溶性载体上的状态的抗体。这些固定化抗体可用于检测、定量、分离或纯化试样(例如血浆等体液试样、培养上清或离心上清等)中所含的抗原。作为可用于固定抗体的不溶性载体，例如有：(1)由包含聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、硅酮树脂或尼龙树脂等的塑料或玻璃等所代表的不溶于水的物质形成的板、试管或管等具有内容积的载体、珠粒、球、滤纸或膜等；以及(2)纤维素系载体、琼脂糖系载体、聚丙烯酰胺系载体、葡聚糖系载体、聚苯乙烯系载体、聚乙烯醇系载体、聚氨基酸系载体或多孔性二氧化硅系载体等用于亲和层析的不溶性载体。

标记抗体是指用标记物标记的抗体，这些标记抗体可用于检测或定量试样(例如血浆等体液试样、培养上清或离心上清等)中所含的抗原。对本发明中可以使用的标记物没有特别限定，只要是通过物理结合或化学结合等与抗体结合，从而可以检测它们的存在的标记物即可。标记物的具体例子有：酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白或放射性同位素等，更具体有：过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、脱辅基葡糖氧化酶、脲酶、萤光素酶或乙酰胆碱酯酶等酶；异硫氰酸荧光素、藻胆蛋白、稀土金属螯合物、丹磺酰氯或四甲基异硫氰酸罗达明等荧光物质；³H、¹⁴C、¹²⁵I或¹³¹I等放射性同位素；生物素、抗生物素蛋白或化学发光物质。标记物与抗体的结合方法可以采用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法或过碘酸法等公知的方法。

其中，放射性同位素和荧光物质可以单独产生能够检测的信号，而酶、化学发光物质、生物素和抗生物素蛋白则无法单独产生能够检测的信号，所以通过进一步与1种以上的其他物质反应而产生能够检测的信号。例如，当为酶时，至少需要底物，根据测定酶活性的方法(比色法、荧光法、生物发光法或化学发光法等)而使用各种底物。当为生物素时，通常至少与抗生物素蛋白或酶修饰抗生物素蛋白反应。根据需要，进一步使用依赖于该底物的各种显色物质。

2.产生本发明的单克隆抗体的细胞

本发明还涉及产生上述本发明的单克隆抗体的细胞。本发明的单克隆抗体可以使用该细胞来制造。以下，说明产生本发明的单克隆抗体的细胞的取得方法。

利用通常的比重离心法等，从HIV患者的末梢血液中回收含有B淋巴细胞的淋巴细胞，之后利用EBV进行转化，以从该淋巴细胞中得到安定地产生抗体、且持续进行无限增殖的细胞株。EBV是使人正常B淋巴细胞转化成增殖型细胞株的病毒(Nature，第269卷，第410页(1973))。作为含有EBV的材料，可以使用狨细胞B95-8株(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第87卷，第3333～3337页(1990))。首先，从对广泛的HIV株具有中和活性的长期非进展病例患者中采集末梢血到含有肝素的采血管内，利用比重离心法等采集末梢血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)部分。利用Dynabeads、免疫磁体(イムノマグネツト)从所得的PBMC中除去CD8阳性细胞。将CD8-缺失的PBMC悬浮于含有50％EB病毒产生株B95-8(ATCC)的培养上清的培养基(15％胎牛血清；含FCS的RPMI1640)中，移至24孔培养皿(Linbro，ICN)中，在37℃、含5％CO₂的培养箱内培养12～18小时左右。在此期间，用EB病毒感染末梢血中的B细胞，可以以该10⁴个细胞中得到1株的比例得到无限增殖细胞。回收增殖的细胞的培养上清，通过gp120-捕捉试验进行筛选，对于通过反复筛选判断为阳性的克隆，以对正常人的PBMC照射X射线而得到的细胞作为饲养细胞，利用极限稀释法进行克隆，可以分离具有抗gp120活性的抗体产生细胞。根据需要，重复进行筛选的程序。

通过培养上述得到的EBV转化细胞株，可以产生本发明的目标单克隆抗体。培养液中的抗体的纯化，例如根据需要，可以通过适当组合DEAE阴离子交换层析、亲和层析、硫酸铵分馏法、PEG分馏法、乙醇分馏法等公知的方法来进行。

3.本发明抗体的基因

编码本发明抗体的基因可如下获得：使用来源于产生上述本发明的单克隆抗体的EBV转化人细胞的mRNA制作cDNA文库，从中分离含有编码本发明单克隆抗体的cDNA的质粒，即可获得基因。mRNA可以通过培养EBV转化细胞，之后用异硫氰酸胍溶液溶解细胞后进行提取来制备。以所得的mRNA为模板制作cDNA，将其整合到载体中，由此制作cDNA文库。使用该cDNA文库，可以获得编码本发明单克隆抗体的基因。

此外，关于本发明抗体的基因，它们的核苷酸序列和氨基酸序列均通过以下实施例而明确，所以还可以按照本领域技术人员所公知的基因化学合成法来制造。例如，对于分别含有编码SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的适当的核苷酸序列以及与其互补的核苷酸序列的基因，将它们的基因分成若干个寡核苷酸后进行化学合成，再将每个嵌段依次适当连接，即可制作。

将编码本发明的单克隆抗体的基因插入表达载体中，可以构建重组表达载体。表达载体通常在翻译起始密码子(ATG)的上游具有启动子区，在翻译终止密码子(TAA、TGA或TAG)的下游具有polyA信号区。可以通过公知方法将重组表达载体导入宿主细胞中，培养该转化的宿主细胞，从而可以使本发明的单克隆抗体表达。作为宿主细胞，可以使用大肠杆菌、酵母或动物细胞等。通过培养被转化的宿主细胞，可以在培养物中产生本发明的单克隆抗体。

4.使用本发明的单克隆抗体的药物

本发明的单克隆抗体以及根据需要使用药学上可接受的适当的载体、赋形剂、稀释剂等，可以用作HIV感染症的预防和/或治疗药。作为HIV感染症的预防和/或治疗药，例如可以制成注射剂。HIV感染症的预防和/或治疗药的给药量取决于患者的症状程度、年龄和体重、给药方法等，以作为有效成分的抗体的重量计算，通常为约10ng～约100mg/kg体重的范围。

5.使用本发明的单克隆抗体的HIV病毒的表位的检测

本发明中，通过使用本发明的单克隆抗体或其片段进行免疫测定，还可以检测HIV病毒。该方法优选至少包括下述步骤(a)和(b)。

(a)使本发明的单克隆抗体或其片段与试样反应的步骤；以及

(b)使步骤(a)中形成的抗原抗体复合物与用于检测的标记抗体反应的步骤；

本发明的检测和/或定量方法只要是使用抗体进行的测定、即免疫测定即可，可以是任一种方法，例如酶免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、酶抗体法、荧光抗体法、免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红细胞凝集反应、颗粒凝集反应或蛋白质印迹法等。

当利用酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或发光免疫测定法等使用标记抗体的免疫测定法来实施本发明的检测方法时，还可以通过夹层法或竞争法来进行，采用夹层法时，只要固化抗体和标记抗体中的至少一种是本发明的单克隆抗体即可。

使抗体致敏固相载体后再使用时，作为固相载体，可以使用：由聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯类聚合物、胶乳、明胶、脂质体、微囊、红细胞、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性体等材质制成的颗粒。

作为该致敏方法，可以采用物理吸附法、化学结合法或将这些方法结合使用等公知的方法。测定的操作方法可以利用公知的方法来进行，例如，利用光学方法进行测定时，使试样与抗体、或者使试样与致敏固相载体的抗体反应，利用终点法或速率法测定透过光或散射光。

目视测定时，使试样与致敏固相载体的抗体在板或微量滴定板等容器中反应，目视判定凝集状态。需要说明的是，也可以使用酶标仪(microplate reader)等仪器进行测定，以代替目视测定。

利用以下实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。

实施例

实施例1：中和单克隆抗体的制作

使EB病毒感染末梢血B细胞，并反复进行克隆，分离具抗gp120活性的抗体产生细胞。制作方法基本上采用我们以前对人T细胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1；HTLV-1)感染病例进行的方法(Matsushita S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)83：3672-3676，1986)。从对广泛的病毒株具有中和活性的一例长期非进展病例采集末梢血到含有肝素的采血管内(20～30ml)，利用Ficoll-Hypaque的比重离心法采集末梢血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)部分。利用Dynabeads、免疫磁体从所得的PBMC中除去CD8阳性细胞。具体如下：将PBMC和DynabeadsCD8在4℃下培养1小时，利用磁性器具除去磁性珠粒，得到除去了CD8的PBMC(CD8-缺失的PBMC)。将1～10×10⁶个CD8-缺失的PBMC，悬浮于2～5ml含有50％EB病毒产生株B95-8(ATCC)的培养上清的培养基(15％胎牛血清；含FCS的RPMI1640)中，之后移入24孔培养皿(Linbro，ICN)中，在37℃、含5％CO₂的培养箱内培养12～18小时。在此期间，使EB病毒感染末梢血中的B细胞，考虑可以以该10⁴个细胞中产生1株的比例得到无限增殖细胞。收集培养的细胞，离心，舍弃旧培养基，分注到96孔平底培养板(Falcon)中，使新培养基中CD8-缺失的PBMC的密度达到1×10⁴个/孔以下，进一步在37℃、5％CO₂培养箱内培养7～10天，其间每天将一半培养基换成新的培养基，同时等待B细胞株的增殖。将已增殖的细胞在48孔或24孔培养皿(Linbro，ICN)中扩增(Expand)，回收进行增殖的细胞的培养上清，通过后述的“gp120-捕捉试验”进行筛选。对于通过反复筛选判断为阳性的克隆，以对正常人的PBMC照射了X射线而得到的细胞作为饲养细胞，利用极限稀释法进行克隆，分离具抗gp120活性的抗体产生细胞。根据需要，重复克隆的程序。

实施例2：gp120-捕捉ELISA

在具抗gp120活性的抗体产生细胞的筛选中，使用“gp120-捕捉ELISA”(J.P.Moore等人，J.Virol.67，第6136-6151页，1993)。即，在实验前1天向96孔聚丙烯板(Falcon)中加入50μl用CC缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)调整至13.3μg/ml的抗gp120-C5绵羊抗体(D7324，Aalto Bioreagents，Dublin，Ireland)，在4℃下静置一夜。除去上清后，加入175μl封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白；BSA、0.1％叠氮化物、PBS、pH7.2)，在室温下静置30分钟。用ELISA清洗缓冲液(0.15％Tween20、PBS pH7.2)清洗孔3次，之后每孔中加入50μl单体gp120(gp120-SF2；Austral Biologicals、San Ramon，California)。在室温下静置2小时，之后用ELISA清洗缓冲液清洗3次，制成“gp120-捕捉板”。向该板中加入B细胞培养上清，使之在室温下反应2小时。用ELISA清洗缓冲液清洗3次，加入100μl用ELISA缓冲液稀释了1000倍的抗人IgG-ALP，在室温下静置1小时。用ELISA清洗缓冲液清洗3次，之后将磷酸酶底物(SIGMA)溶于底物缓冲液(二乙醇胺缓冲液pH9.85)中，向每孔中分别加入100μl，在室温下静置10～30分钟，之后用酶标仪测定吸光度(405nm)。如此操作，得到20种产生gp120结合抗体的B细胞克隆(表1)。

[表1]

由长期“非进展HIV-1感染病例”得到的中和单克隆抗体的列表

实施例3：单克隆抗体的分类

根据反应表位将与gp120反应的抗体分为以下4类。即，CD4结合位点(CD4binding site；CD4bs)、CD4诱导表位(CD4induced epitope；CD4i)、第3可变区(V3loop；V3L)、以及不能分入上述3类的表位(其他表位)。是否是与V3L结合的抗体，这通过使用了具有V3L的氨基酸序列的合成肽的ELISA(V3-肽ELISA)来判定。此次使用与抗体所来自的病例的病毒的V3序列最近的JR-FL株的V3序列(NNT20；NNTRISIHIGPGRAFVTIGK)。即，在实验的前1天，向96孔聚丙烯板的各孔中加入100μl用PBS稀释至5μg/ml的肽(NNT20)，在4℃下静置一夜。除去上清后，加入175μl封闭缓冲液，在室温下静置30分钟。用ELISA清洗缓冲液清洗3次，之后加入B细胞培养上清，使之在室温下反应2小时。用ELISA清洗缓冲液清洗3次，使之与100μl的抗人IgG-ALP反应1小时，清洗后使用ALP底物进行显色，测定吸光度(405nm)。对得到的20种抗体进行V3-肽ELISA时，有6种是与V3反应的抗体。

另一方面，在gp120-捕捉ELISA中，可溶性CD4{soluble CD4(sCD4)：R&D Systems，Inc.Minneapolis，MN}对CD4bs抗体和CD4i抗体的影响是完全相反的。即，在sCD4存在下，CD4bs抗体的反应被抑制。相反，在sCD4存在下，CD4i抗体与gp120的反应性被增强。利用该性质进行单克隆抗体的分类。按照与上述gp120-捕捉ELISA的程序相同的程序制成“gp120-捕捉板”，使阶段性稀释的单克隆抗体在0.5μg/ml sCD4的存在或未存在下反应2小时，之后用ELISA清洗缓冲液清洗3次，使之与100μl抗人IgG-ALP反应1小时，清洗后使用ALP-底物进行显色，测定吸光度(405nm)。如图1所示，V3抗体以及包括用作对照的KD-247在内，并不受sCD4的影响。在sCD4存在下结合活性被抑制的克隆有0.5δ(3D6)、42F9、49G2、4E3、7B5这5种(使用b12作为对照)。反之，在sCD4存在下反应增强的抗体有4C11、4E9B、5D6S和7F11这4种(使用17b作为对照)。在V3-肽ELIA中未见反应、而且也未见sCD4的影响的抗体有5种，无法确认它们的表位特异性(其他表位)。

实施例4：与功能性包膜的结合活性

已知HIV-1在病毒粒子上和慢性感染细胞表面具有与靶细胞进行膜融合的功能性包膜。为了研究制成的抗体能否识别该功能性包膜，利用流式细胞仪研究抗体与HIV-1_JR-FL株慢性感染细胞(PM1/JR-FL)的细胞表面的结合活性。另外，研究sCD4对该反应性是否有影响。取2×10⁵个PM1/JR-FL到试管中，之后仅加入50μl用FACS缓冲液(2％BSA、0.02％叠氮化物的PBS溶液；pH7.23)稀释调整至1μg/ml的sCD4或FACS缓冲液。使之反应15分钟，加入50μl用FACS缓冲液稀释至1～3μg/ml的单克隆抗体，使之在室温下反应45分钟。用FACS缓冲液清洗2次，之后加入50μl用FACS缓冲液稀释至1∶200倍的FITC结合抗人IgG抗体(Sigma)，在4℃的暗室中保温30分钟。之后，用FACS缓冲液清洗2次，用0.5ml固定液{2％(w/v)多聚甲醛的PBS溶液}固定。固定的样品用FACSCalibur(Beckton-Dickinson)进行分析。得到的数据用Cell Quest(Beckton-Dickinson)进行分析。如图2所示，5种V3L抗体均确认到明确的与感染细胞表面的结合活性。而且，在sCD4存在下该活性增强。在sCD4未存在下，与1D9、2F8、3E4、3G8这4种克隆相比，在1C10(0.5γ)和5G2中确认到强反应。分类为CD4bs的抗体中，在3D6(0.5δ)、42F9、49G2中确认到与感染细胞表面的结合活性，但在4E3和7B5中则没有确认到上述结合活性。与在gp120单体中的反应不同，在由三聚体形成的功能性包膜中没有确认到sCD4产生的CD4bs抗体的结合阻碍。另一方面，关于CD4i抗体，4种抗体在sCD4未存在下均仅确认到弱的反应，但在sCD4存在下确认到反应性的增强程度与V3抗体相媲美。至于无法确定表位的5种抗体，均未确认到与感染细胞表面的结合活性。

实施例5：中和抗体的纯化和中和活性的研究

考虑20种抗体中与细胞表面的结合活性和抗体产生量等，对其中15种抗体，进行细胞增殖，收集培养上清并过滤，用蛋白A柱或蛋白G柱(GE Healthcare)纯化单克隆抗体。使用纯化的单克隆抗体，在抗体浓度10μg/ml和2μg/ml下研究其与假型病毒(pseudotype，假模标本)的中和活性，所述假型病毒使用了实验室中常用的4种HIV-1株的包膜(图3)。假病毒的制作如下：在转染前1天，将293T细胞接种在100mm的胶原包被的板(IWAKI)中使达到4×10⁶个细胞，在37℃下培养一夜，之后通过Effectene(QIAGEN)导入5μg pNL4-3-Luc-E^-R^-或5μg pSG3ΔEnv(Li M.等人，J.Virol.79，第10108-10125页，2005)、4.5μg包膜表达载体和0.5μg pRSV-REV载体，在37℃、5％CO₂中培养。24小时后回收上清，通过0.2μm滤器，分注后，在-80℃下保存。使用p24抗原ELISA试剂盒(ZeptoMetrix Co.)测定所得假病毒的p24的抗原量。使用假病毒的Single Round中和实验如下进行。在实验前1天，将GHOST-hi5细胞或TZM-bl细胞接种在96孔平底细胞培养用板(Falcon)中，使达到2×10⁴个细胞/200μl。增殖至70％左右会合，之后将200-500TCID₅₀的假型病毒和各浓度的抗体与含有10％胎牛血清(FCS)、0.1mg/ml G418、0.05mg/ml潮霉素-B、5μg/ml嘌呤霉素、20μg/ml Polybrane(GHOST-hi5的情形)或10％FCS、10μg/mlDEAE-葡聚糖(Pharmacia Biotech，TZM-bl的情形)的DMEM混合，在冰上静置15分钟。向除去了培养液的靶细胞中加入100μl抗体/病毒混合溶液，在37℃、5％CO₂中培养2小时，使病毒吸附在靶细胞上。之后，再加入100μl含有上述抗生素等的DMEM，在37℃、5％CO₂中培养2天。除去上清，用PBS(pH7.4)清洗3次，加入30μl用PBS稀释了5倍的裂解缓冲液(lysing buffer)(Luc PGC50；东洋油墨、GHOST-hi5的情形)或裂解溶液(Applied Biosystems、TZM-bl的情形)，振荡15分钟。将其中的20μl移入发光测定用板(Coster 3912)中，加入100μl萤光素酶底物(ピツカジ一ン、东洋油墨)，10秒后用TR477微板光度计(Applied Biosystems)测定荧光强度(GHOST-hi5的情形)。当为TZM-bl细胞时，移至发光测定用板中后，加入100μl用反应缓冲液稀释剂稀释了50倍的Galacto-Star(Applied Biosystems)，在暗室中静置1小时。之后，用TR477微板光度计测定β-半乳糖苷酶活性。通过算式{1-(t-c)/(n-c)}×100(式中，t：样品的荧光强度；c：仅有细胞的背景荧光强度；n：无抗体的样品的荧光强度)计算中和活性。相同抗体浓度按3个孔进行实验，独立的实验各进行2-3次。

所得结果见图3。关于作为中和感受性高的株而已知的SF162株，在几乎所有进行试验的单克隆抗体中均确认到中和活性。另一方面，虽然作为比较的中和抵抗性的89.6和JR-FL在V3抗体{特别是0.5γ(IC10)和5G2}中确认到中和活性，但CD4bs抗体、CD4i抗体则只确认到弱的中和活性。另一方面，关于V3-tip的氨基酸序列不同于其他病毒的IIIB，虽然V3抗体无效，但在CD4bs抗体和CD4i抗体的一部分中确认到中和活性。这些数据暗示：在具有这些抗体的病例中，对HIV-1的各种株的交叉中和活性主要是由V3抗体与CD4bs抗体的互补性中和产生的。这些单克隆抗体中，在V3抗体的0.5γ(IC10)和5G2、CD4bs的0.5δ(3D6)、49G2、42F9中也确认到强的中和活性，进一步进行了中和实验。

实施例6：对含有临床分离株的17种病毒株的中和活性的研究

研究对含有临床分离株的17种病毒株的中和活性(表2)。中和实验使用下述的MTT测定。方法如下：使用96孔圆底微量培养板，在各浓度的抗体存在下使100TCID50的病毒感染2×10³的PM1/CCR5，在37℃下培养7天。从各孔中除去100μl培养液，加入10μl溶于磷酸缓冲盐(PBS)中的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(7.5mg/ml)，在37℃下培养3小时。向各孔中加入100μl含有4％Triton X-100(vol/vol)的酸化异丙醇，使甲

晶体游离出来。用酶标仪测定吸光度(570nm)，算出细胞的存活率。实验重复2～3次。算出阻止50％病毒感染的抗体浓度(IC₅₀)，达到IC₅₀的抗体浓度用色彩区别显示。

对含有临床分离株的各种HIV-1株的中和抗体活性见表2。虽然克隆5G2与作为现有技术的KD-247抗体同等，但抗V3抗体的0.5γ(1C10)和CD4bs抗体的0.5δ(3D6)、49G2对亚型B(欧米型)的HIV-1显示出广泛而强效的中和活性。应注意的是，V3抗体的0.5γ(IC10)没有进行中和的株显示出CD4bs抗体的0.5δ(3D6)或49G2进行中和的这种互补性中和。

实施例7：由CD4bs抗体0.5δ引起的V3抗体的反应性的增强

已知gp120与CD4分子结合后发生构象改变。而CD4bs抗体是否会发生构象改变则几乎没有研究。我们考虑到：CD4bs抗体与gp120结合后可能引起gp120的构象改变、并使其他抗体的反应性发生变化。按照上述gp120-捕捉ELISA的方法制成“gp120-捕捉板”，使作为CD4bs抗体之一的0.5δ(3D6)或对照抗体(8D11)以5μg/ml的浓度与其反应15分钟，然后使结合有生物素(Pierce，Rockford IL)的抗体1C10、3E4、3D6、4C11以各浓度与其反应2小时。用ELISA清洗缓冲液清洗后，使抗生物素蛋白-ALP(Zymed)与其反应1小时，加入底物使之显色。结果见图4。在0.5δ存在下，生物素化的0.5γ(1C10)或3E4的V3抗体与gp120的反应性明显增强。而生物素化的0.5δ(3D6)或4C11的反应性在0.5δ存在下被抑制。由此可知：CD4bs抗体的0.5δ单独引起gp120的构象改变，并使V3抗体(特别是0.5γ)的反应性显著扩大。

实施例8：0.5δ与0.5γ结合使用所产生的协同中和效果

如上所述，由于0.5δ使0.5γ的反应性增强，所以研究0.5δ和0.5γ在中和活性中的组合效果。使用各浓度的0.5δ与0.5γ的组合，利用MTT测定研究对JR-FL株的中和活性。如图5所示，通过将两种抗体结合使用，观察到中和活性协同增强。协同效果的分析采用Chow/Talaley等人的分析方法和三维分析法。根据这些体外的观察，推测在体内V3抗体与CD4bs抗体相互作用，引起更强效的中和反应。根据这些数据，认为在广范围且强效的中和抗体反应中，与广范围的株反应的V3抗体和CD4bs抗体两者必不可少。

实施例9：对国际标准病毒代表株(Standard Virus Panel)的中和活性

为了评价国际上AIDS疫苗开发的数据，作为标准的病毒由美国机构(NIAID ARRP)供应。使用的包含12种假病毒的亚型(分化体，clade)B病毒的代表株(标准病毒代表株B；SVPB)的中和数据见表3。如表3所示，0.5γ(IC10)以50μg/ml的浓度可以使7/12的病毒的50％以上的增殖被抑制，以直至150μg/ml的浓度可以使10/12的病毒的50％以上的增殖被抑制。而作为现有技术的抗体的b12得到8/12的结果，2G12得到6/12的结果，447-52D得到1/12的结果，KD247得到3/12的结果。作为现有技术的b12、2G12、447-52D(447D)的数据从论文中引用(Li M.等人，J.Virol.79，第10108-10125页，2005)。b12和2G12是直至50μg/ml的数据，而447-52D(447D)只得到了直至25μg/ml的数据，因此未必能够进行比较，但与上述现有技术明显不同的是，0.5γ(1C10)显示出广泛的中和活性。作为CD4bs抗体的b12也具有广泛的中和活性，但它是一种在自身抗体中常见的重链CDR3长达18个氨基酸的特殊抗体(Saphire EO.等人，Science239，第1155-1159页)。而0.5γ(1C10)的CDR3包含11个氨基酸。

实施例10：单克隆抗体的抗原结合位点的基因序列的确定

我们确定了各代表性中和单克隆抗体、抗V3：0.5γ(1C10)、5G2、CD4bs：0.5δ(3D6)、42F9、49G2的抗原结合位点的基因序列。结果见图6～图10和序列表的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20。方法如下：从各细胞株中提取RNA，按照Marks等人的方法通过PCR扩增VH和VL，确定基因序列(Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991)。

SEQ ID NO：1是0.5γ(1C10)的H链可变区(VH)的氨基酸序列

SEQ ID NO：2是0.5γ(1C10)的L链可变区(VL)的氨基酸序列

SEQ ID NO：3是5G2的H链可变区(VH)的氨基酸序列

SEQ ID NO：4是5G2的L链可变区(VL)的氨基酸序列

SEQ ID NO：5是0.5δ(3D6)的H链可变区(VH)的氨基酸序列

SEQ ID NO：6是0.5δ(3D6)的L链可变区(VL)的氨基酸序列

SEQ ID NO：7是42F9的H链可变区(VH)的氨基酸序列

SEQ ID NO：8是42F9的L链可变区(VL)的氨基酸序列

SEQ ID NO：9是49G2的H链可变区(VH)的氨基酸序列

SEQ ID NO：10是49G2的L链可变区(VL)的氨基酸序列

SEQ ID NO：11是0.5γ(1C10)的H链可变区(VH)的核苷酸序列

SEQ ID NO：12是0.5γ(1C10)的L链可变区(VL)的核苷酸序列

SEQ ID NO：13是5G2的H链可变区(VH)的核苷酸序列

SEQ ID NO：14是5G2的L链可变区(VL)的核苷酸序列

SEQ ID NO：15是0.5δ(3D6)的H链可变区(VH)的核苷酸序列

SEQ ID NO：16是0.5δ(3D6)的L链可变区(VL)的核苷酸序列

SEQ ID NO：17是42F9的H链可变区(VH)的核苷酸序列

SEQ ID NO：18是42F9的L链可变区(VL)的核苷酸序列

SEQ ID NO：19是49G2的H链可变区(VH)的核苷酸序列

SEQ ID NO：20是49G2的L链可变区(VL)的核苷酸序列

(考察)

这些新型单克隆抗体对分化体(クレイド，clade)B的病毒显示出广泛而强效的中和活性。特别是0.5γ(IC10)被认为是目前能够使用的抗体的最高水准。这些抗体不仅在疫苗开发中发挥重要作用，而且根据抗体本身或其片段、或其基因制作的分子还有可能用于AIDS/HIV感染的预防和治疗。

实施例11：对各种病毒株的中和活性的研究

和亚型(分化体)B病毒代表株(SVPB)一样，还供给亚型C病毒的代表株。如图11所示，与对照抗体相比，CD4bs抗体的0.5δ(3D6)、49G2和42F9对亚型C代表株中的两种(SVPC13和SVPC15)病毒显示出明确的中和活性。此外，这些CD4bs抗体对作为亚型AE病毒的93TH976.17和93TH966.8也显示出中和活性。这3种CD4bs抗体对亚型B以外的病毒也显示出中和活性，由此认为：它们在由抗体产生的交叉-分化体中和研究上也是重要的。

结果见图11。本发明的抗体0.5δ(3D6)、49G2和42F9对研究的SVPC13、SVPC15、93TH976.17和93TH966.8显示出抑制活性。

实施例12：CCR5抑制剂与本发明抗体的结合使用

在gp120与CD4结合后，V3与共同受体(CCR5或CXCR4)结合，病毒侵入细胞内。从临床应用的角度考虑，认为作为0.5γ或5G2的表位的V3与作为结合负体的CCR5的抑制剂(maraviroc、MVC)也是重要的组合。于是，利用MTT测定研究V3抗体与CCR5抑制剂(MVC)的组合对JR-FL株的中和活性。如图12所示，通过V3抗体与MVC的结合使用，观察到中和活性协同增强。协同效果的分析采用三维分析法。根据这些体外的观察，推测V3抗体与CCR5抑制剂相互作用，产生更强效的病毒抑制效果。根据这些数据，认为在临床给药中，V3抗体与CCR5抑制剂联用能够增强治疗效果。

结果见图12。通过将本发明的抗体0.5γ(1C10)或5G2与CCR5抑制剂结合使用，确认到对HIV-1JRFL的协同抑制效果。

产业实用性

利用目前的HIV疗法(即抗病毒药的多剂联用疗法；HAART疗法)虽然可以抑制病毒的增殖，但不能完全治愈，一旦开始治疗，则HAART的持续不可缺少。由于抗病毒药是化学物质，在长期持续的过程中出现各种长期毒性，因此不得不中断治疗的病例正在增加。相对于此，本发明的抗体能够成为无副作用的新型疗法(联用疗法)的一个支柱。此外，本发明的抗体还可用作针刺事故时的抗血清，还可用作开发更有效的疫苗所必需的试剂。

Claims (10)

1.单克隆抗体，其为选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体，

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列作为H链可变区VH的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列作为L链可变区VL的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列作为H链可变区VH的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列作为L链可变区VL的氨基酸序列。

2.单克隆抗体，其为选自以下任一种抗体的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体，

(a)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列作为H链可变区VH的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列作为L链可变区VL的氨基酸序列；

(b)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列作为H链可变区VH的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列作为L链可变区VL的氨基酸序列；

(c)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列作为H链可变区VH的氨基酸序列和具有SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列作为L链可变区VL的氨基酸序列。

3.单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体是具有保藏号FERMBP-11021或保藏号FERM BP-11060的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的V3环的单克隆抗体。

4.单克隆抗体，该单克隆抗体是具有保藏号FERM BP-11020、保藏号FERM BP-11022或保藏号FERM BP-11023的细胞产生的识别AIDS病毒的包膜糖蛋白gp120的CD4结合位点的单克隆抗体。

5.权利要求1～4中任一项所述的抗体，该抗体是由下述细胞产生的：所述细胞由根据与gp120的结合性筛选长期非进展病例的HIV感染患者的B细胞，并选择产生gp120结合抗体的B细胞而来。

6.权利要求1～5中任一项所述的抗体的制造方法，该方法包括以下步骤：根据与gp120的结合性筛选长期非进展病例的HIV感染患者的B细胞，并选择产生gp120结合抗体的B细胞，之后采集所选择的B细胞产生的抗体。

7.细胞，其是具有保藏号FERM BP-11021或保藏号FERMBP-11060的产生权利要求1所述的抗体的细胞。

8.细胞，其是具有保藏号FERM BP-11020、保藏号FERMBP-11022或保藏号FERM BP-11023的产生权利要求2所述的抗体的细胞。

9.HIV感染症的预防和/或治疗药，其中含有权利要求1～5所述的至少一种以上的单克隆抗体。

10.HIV感染症的预防和/或治疗药，其中含有权利要求1或3所述的单克隆抗体与权利要求2或4所述的单克隆抗体的组合。

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