KR20210084488A

KR20210084488A - 항hiv항체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20210084488A
Application number: KR1020217013696A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 도미타; 마모루 시미즈; 슈조 마쓰시타; 다케오 구와타; 마사히로 미치시타; 야스히로 야스토미; 도모타카 오카무라
Original assignee: 가부시키가이샤 멘에키세이부츠 켄큐죠; 가부시키가이샤 큐어드; 고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼; 고꾸리쯔다이가꾸호오진 구마모또 다이가꾸
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-07-07
Also published as: US20220002389A1; JP2023002806A; TW202029981A; JP7551070B2; JPWO2020090747A1; CN113423731A; CN113423731B; JP7566257B2; WO2020090747A1; EP3875480A4; CA3118073A1; EP3875480A1

Abstract

본 발명자들은, 단회 또는 수회의 단독 투여에 의한 장기간의 HIV 바이러스 제어를 투여군에 고확률로 초래하는 항체에 대하여 예의(銳意) 검토한 결과, 놀랍게도, 1C10로서 보고된 항체유전자를 누에에서 생산시킴으로써 얻어진 SW-1C10 항체의 소수 회 단독 투여에 의해, 투여된 모든 개체에 있어서, 조기에 혈중 바이러스가 검출 한계 이하로 억제될 뿐만 아니라, 12주와 같은 장기간에 걸쳐 혈중 바이러스 RNA가 검출 한계 이하로 유지되는 것을 발견하였다. 또한, 지금까지, 누에에 의한 항체의 생산량은 고치 1개당 몇백 μg, 고치 1mg당 수 μg 정도이며, 더 이상의 생산성을 높이는 검토는 행해지지 않았다. 본 발명자들은, 다수의 항HIV항체 중에서, 견사충에서의 생산량이 더욱 높은 항체를 발견하기 위해 검토를 거듭한 결과, 항HIV항체인 1C10 항체 및 1D9항체가 견사충의 견사 중에 종래의 생산량보다 우수한 양으로 생산되는 것을 발견하였다.

Description

항HIV항체 및 그 제조 방법

본 국제출원은, 2018년 10월 29일에 일본특허청에 출원된 일본특허출원 제2018-203114호 및 2019년 9월 12일에 일본특허청에 출원된 일본특허출원 제2019-166040호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 일본특허출원 제2018-203114호 및 일본특허출원 제2019-166040호의 전체 내용을 본 국제출원에 참조에 의해 인용한다.

본 발명은 효율적인 항HIV항체의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 누에를 이용한 고효율로 항HIV항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

누에의 세리신 프로모터의 하류에 항체유전자를 배치하여, 항체분자를 고치에 발현시킴으로써, 치료용 항체를 누에에서 제조하는 시도가 행해지고 있다(비특허문헌 1 및 2 등). 특히, 누에의 고치에 발현시킨 항체는, 당쇄(糖鎖)에 코어푸코오스가 포함되지 않으므로, 우수한 ADCC 활성을 나타내는 것이 알려져 있다(특허문헌 1 및 2).

또한, HIV 치료 전략에 있어서, 단회 또는 수회의 항체투여에 의해, 그 후 장기간에 걸쳐 HIV를 컨트롤 가능한 항체가 기대되고 있다. 예를 들면, 비특허문헌 3에 있어서는, PGT121을 단회 투여한 4마리의 붉은 털 원숭이 중, 1마리에 있어서 바이러스RNA가 약 70일간에 걸쳐 검출 한계 이하로 억제할 수 있었던 것을 보고하고 있다.

또한, HIV의 엔벨로프(envelope) 단백질인 gp120의 V3루프를 인식하는 인간화 항체인 KD247이 개발되고, 임상시험도 실시되고 있다. KD247을 3회 투여한 환자에 있어서, 바이러스의 억제가 확인되었지만, 장기간 검출 한계 이하까지는 바이러스를 억제하기 위해서는 미흡했다. 이와 같이, 단제로 단회로부터 수회 투여함으로써, 높은 확률로 장기간 바이러스를 검출 한계 이하까지 억제할 수 있는 항체는, 아직 개발되어 있지 않다.

이에, KD247과 동일한 항원 인식 부위를 가지는 인간 항체인 1C10 항체의 개발이 진행되고 있다. 1C10 항체는, 폭넓은 HIV주에 대하여 중화 가능한 항체를 체내에 가지고, 25년 이상과 같은 장기간 미치료라도 증상을 억제하고 있는 환자로부터 단리된 항체이며, 항체의약품으로서 HIV감염 환자에 투여함으로써 높은 치료 효과를 발휘하는 것이 기대되고 있다(특허문헌 2 및 비특허문헌 4).

일본공개특허 제2014-12024호 국제공개 O2009/066702호

Masashi Iizuka, et al., FEBS Journal; 276: 5806-5820(2009) Minoru Toda, et al., mABs; 7(6): 1138-1150(2015) Dan H. arouch, et al., Nature; 503(7475): 224-228(2013) Kristel Paola Ramirez Valdez, et al., Virology; 475: 187-203(2015)

본 발명자들은, 단회 또는 수회의 단독 투여에 의한 장기간의 HIV 바이러스 제어를 투여군에 고확률로 초래하는 항체에 대하여 예의(銳意) 검토한 결과, 놀랍게도, 1C10로서 보고된 항체유전자를 누에에서 생산시키는 것에 의해 얻어진 SW-1C10 항체의 소수회 단독 투여에 의해, 투여된 모든 개체에 있어서, 조기에 혈중 바이러스가 검출 한계 이하로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 12주와 같은 장기간에 걸쳐 혈중 바이러스RNA가 검출 한계 이하로 유지되는 것을 발견하였다. 또한, 누에에서 생산된 항체와 CHO 세포에서 생산한 항체를 비교하여, 그 구조적인 차이가 당쇄 구조에 있는 것을 확인했다. 이로부터, 본 발명자들은, 푸코오스를 결락시키는 것이 1C10 항체에 투여 전체예에서의 장기간 바이러스 억제라는 극히 우수한 효과를 가져오는 것을 발견하기에 이르렀다. 이와 같은, 투여 전체예에서의 장기간의 바이러스 증식 제어가 가능한 것은 과거에 보고가 없으며, 본 발명자들은 처음으로 소수 회의 단독 투여에 의해 투여 대상에 대하여 넓게 안정적으로 바이러스 억제를 가져오는 항체를 발견하는 것에 성공했다.

또한, 지금까지, 누에에 의한 항체의 생산량은 고치 1개당 몇백 μg, 고치 1mg당 수 μg 정도이며, 더 이상의 생산성을 높이는 검토는 행해지지 않았다. 본 발명자들은, 다수의 항HIV항체 중에서, 견사충에서의 생산량이 더욱 높은 항체를 발견하기 위해 검토를 거듭한 결과, 항HIV항체인 1C10 항체 및 1D9항체가 견사충의 견사 중에 종래의 생산량보다 우수한 양으로 생산되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

따라서, 일태양에 있어서, 본 발명은, HIV로의 결합능을 가지고; 또한, 상기 항체에 결합하는 당쇄가 푸코오스를 포함하지 않고: 또한, HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는 항체에 관한 것이다. 어떤 항체가 HIV로의 결합능을 가지는 지의 여부를 조사하는 방법은, 본 기술 분야에 있어서 널리 알려져 있다. 예를 들면, HIV를 고상화(固相化)한 담체에 상기 항체를 접촉시켜, 상기 고상에 결합한 항체를 검출함으로써 확인할 수 있다.

일태양에 있어서, 본 발명은, IgG항체로서, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 혹은, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지고 ; HIV로의 결합능을 가지고; 또한, 상기 항체에 결합하는 당쇄가 푸코오스를 포함하지 않는 항체에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 항체는, 중쇄가 서열번호 7에 기재된 중쇄 아미노산 서열에서의 3개의 CDR서열을 가지고, 또한, 경쇄가 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열에서의 3개의 CDR서열을 가진다.

CDR서열의 결정의 방법은, Kabat 등의 넘버링 시스템(Kabat, E. 등, U.S. Department of Health and Human Services, (1983) 및 그 후속판), Chothia 등의 넘버링 시스템(Chothia 및 Lesk, J.Mol.Biol., 196: 901-917(1987)), Honegger 등의 넘버링 시스템(Honegger, A 등, J.Mol.Biol. 309: 657-670(2001)), contact 정의법(MacCallum et al., J Mol Biol, 262(5): 732-745(1996)), IMGT 데이터베이스(http://www.imgt.org/)에 의한 넘버링 시스템, 또는 기지(旣知)의 서열 데이터베이스로의 얼라인먼트에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 CDR서열은, CDRH1: GFMFSNYA(서열번호 14); CDRH2: ISNDGSDK(서열번호 15); CDRH3: CARDLDQTIPDLTAPAFEV(서열번호 16), 및 CDRL1: QSLLHSDGNN(서열번호 17); CDRL2: LTS(서열번호 18); CDRL3: MQSLQTWT(서열번호 19)일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 가진다.

본 발명의 항체는, 결합하는 당쇄에 푸코오스를 포함하지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, 이하로부터 선택되는 당쇄 구조를 가지고 있어도 된다.

일태양에 있어서, 본 발명은, 견사선(絹絲腺) 특이적 유전자 프로모터의 하류에 기능적으로 결합한, 하기 (i)∼(x)로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 카세트에 관한 것이다:

(i) 서열번호 6에 기재된 염기서열 및/또는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(ii) 서열번호 6에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열, 및/또는, 서열번호 8에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(iii) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(iv) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(v) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(vi) 서열번호 10에 기재된 염기서열 및/또는 서열번호 12에 기재된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(vii) 서열번호 10에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열, 및/또는, 서열번호 12에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;

(viii) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(ix) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(x) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

본 명세서에 있어서, 1C10 항체는, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 가지는 항체이다. 한편, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째로부터 19번째까지는 시그널 서열이다. 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는, 본원 명세서에 기재된 시그널 서열을 포함하고 있지 않아도 된다. 혹은, 본원 명세서에 기재된 시그널 서열 이외의 시그널 서열을 포함하고 있어도 된다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄」라는 말은, 적절하게, 「서열번호 7의 20번째로부터 474번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄」라는 말로 대체해도 된다. 동일하게, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째로부터 20번째까지는 시그널 서열이다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄」라는 말은, 적절하게, 「서열번호 9의 21번째로부터 238번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄」라는 말로 대체해도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 1D9항체는, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 가지는 항체이다. 한편, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째로부터 19번째까지는 시그널 서열이다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄」라는 말은, 적절하게, 「서열번호 11의 20번째로부터 472번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄」라는 말로 대체해도 된다. 동일하게, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째로부터 20번째까지는 시그널 서열이다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄」라는 말은, 적절하게, 「서열번호 9의 21번째로부터 238번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄」라는 말로 대체해도 된다.

1C10 항체를 코딩하는 DNA서열로서는, 예를 들면, 서열번호 6에 기재된 염기서열(중쇄) 및 서열번호 8에 기재된 염기서열(경쇄)을 들 수 있다. 전술한 바와 같이, 서열번호 6에 기재된 염기서열(중쇄) 중, 57base는 시그널 서열을 코딩하고 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 6에 기재된 염기서열」이라는 말은, 적절하게, 「서열번호 6에 기재된 염기서열 중, 58번째로부터 1425번째까지의 염기서열」이라는 말로 대체해도 된다. 동일하게, 서열번호 8에 기재된 염기서열(경쇄) 가운데, 60base는 시그널 서열을 코딩하고 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 8에 기재된 염기서열」이라는 말은, 적절하게, 「서열번호 8에 기재된 염기서열 중, 61번째로부터 717번째까지의 염기서열」이라는 말로 대체해도 된다. 또한, 1D9항체를 코딩하는 DNA서열로서는, 예를 들면, 서열번호 10에 기재된 염기서열(중쇄) 및 서열번호 12에 기재된 염기서열(경쇄)을 들 수 있다. 전술한 바와 같이, 서열번호 10에 기재된 염기서열(중쇄) 중, 57base는 시그널 서열을 코딩하고 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 10에 기재된 염기서열」이라는 말은, 적절하게, 「서열번호 10에 기재된 염기서열 중, 58번째로부터 1419번째까지의 염기서열」이라는 말로 대체해도 된다. 동일하게, 서열번호 12에 기재된 염기서열(경쇄) 중, 60base는 시그널 서열을 코딩하고 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「서열번호 12에 기재된 염기서열」이라는 말은, 적절하게, 「서열번호 12에 기재된 염기서열 중, 61번째로부터 717번째까지의 염기서열」이라고 말로 대체해도 된다.

본 명세서에 있어서, 「스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈한다」는, 당업자에게 통상 사용되는 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 예를 들면, Molecular Cloning, a Laboratory Mannual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012) 또는, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library 등에 기재된 방법에 의해 하이브리다이즈할 것인지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 하이브리다이즈의 조건은, 6×SSC (0.9M NaCl, 0.09M 시트르산 3나트륨) 또는 6×SSPE(3M NaCl, 0.2M NaH₂PO₄, 20mM EDTA·2Na, pH 7.4) 중 42℃로 하이브리다이즈시키고, 그 후 42℃로 0.5×SSC로 세정하는 조건이라도 된다.

일태양에 있어서, 본 발명은, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열, 또는, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열(본 단락에 있어서, 「서열번호 7에 기재된 아미노산 서열 등」이라고 함) 각각과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 아미노산 서열의 동일성은, 2종류의 단백질 사이에 있어서, 비교 대상으로 하는 아미노산 서열 범위에서의 종류가 동일한 아미노산수의 비율(%)을 의미하고, 예를 들면, BLAST, FASTA 등의 공지의 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 전술한 동일성으로서는, 80% 이상보다 높은 동일성이라도 되며, 예를 들면, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성이라도 된다. 혹은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열 등과 Blast에서의 상동성 스코어가 200 이상을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드라도 된다. 상동성 스코어는, 서열번호 7 등에 기재된 아미노산 서열과 목적 단백질의 아미노산 서열을 얼라인먼트하고, 비교 대상으로 하는 각 아미노산의 점수를 스코어 매트릭스로부터 구하고, 그 총계로서 계산할 수 있다(http://www.gsic.titech.ac.jp/supercon/supercon2004-e/alignmentE.html 참조). 예를 들면, 상동성 스코어는, 공지의 BLAST 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 스코어 매트릭스로서는, BLOSUM62나 PAM32 등이 알려져 있고, 본 명세서에 있어서 바람직하게는 BLOSUM62이다.

치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되는 아미노산의 수는, 상기 항체의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 수라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 1∼10 개, 1∼5 개, 1∼4 개, 또는 1∼3 개로 할 수 있다. 아미노산의 치환은, 바람직하게는 보존적 아미노산끼리의 치환(Molecular Biology of the Cell, Garland Science; 6판 참조)이다.

「견사선 특이적 유전자 프로모터」는, 견사충의 견사선에 있어서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터이다. 이와 같은 프로모터로서는, 견단백질 유전자 프로모터, 예를 들면, 후부(後部) 견사선 특이적 유전자 프로모터 및 중부 견사선 특이적 유전자 프로모터 등이 있고, 예를 들면, 세리신 유전자 프로모터(세리신1 유전자 프로모터, 세리신2 유전자 프로모터, 및 세리신3 유전자 프로모터) 또는 피브로인 유전자 프로모터(피브로인 중쇄 유전자 프로모터, 피브로인 경쇄 유전자 프로모터, 및 피브로헥사메린 프로모터)가 있다. 바람직하게는, 세리신1 유전자 프로모터, 세리신2 유전자 프로모터, 및 세리신3 유전자 프로모터이며, MSG 프로모터 및 PSG 프로모터(WO2017135452A1)를 포함한다. 프로모터의 하류에 기능적으로 결합한다는 것은, 프로모터의 활성화에 의해 결합된 유전자가 발현 가능하도록 결합되어 있는 것을 의미한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 함유하는, 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 플라스미드 벡터는, 견사충 세포에 도입하고, 유지할 수 있는 벡터라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, Trichoplusia ni에 유래하는 DNA형 트랜스포존 piggyBac를 도입한 플라스미드 벡터(Tamura, T 등, Nature Biotechnology, 18: 81-84(2000))가 있다. 예를 들면, 벡터로서, pPIGA3GFP(Tamura, T 등, Nature Biotechnology, 18: 81-84(2000))나 pBac[3xP3-DsRed/pA](NatureBiotechnology, 21: 52-56(2003))가 있다. 또한, 본 발명의 벡터는, 예를 들면, 미국특허 공개공보 2008/0301823에 기재된 방법에 의해 제작된 벡터(pMSG1.1MG)의 제한효소 절단 부위에 상기 발현 카세트를 삽입하는 것에 의해서도 제작할 수 있다. 혹은, 예를 들면, 벡터는, 견사충 형질전환용 벡터 pMSG 3.1MG(일본공개특허 제2012-182995)라도 된다.

일태양에 있어서, 본 발명은 상기 발현 카세트가 염색체에 도입된, 트랜스제닉 견사충에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서 「견사충」이란, 견사선을 가지고, 견사를 토사(吐絲)할 수 있는 곤충이라면 특별히 제한되지 않으며, 나비목 곤충, 벌목 곤충, 풀잠자리목 곤충, 날도래목 곤충 등에 있어서, 주로 유충기에 둥우리를 치고 , 고치를 형성하고 또는 이동을 위해서 토사하는 종류를 의미한다. 견사충로서는, 다량의 견사를 토사할 수 있는 나비목 곤충이 바람직하며, 누에나방과, 산누에나방과, 왕물결나방과, 띠나방과(Eupterotidae), 솔나방과, 주머니나방과, 불나방과, 또는 밤나방과 등에 속하는 종을 예로 들 수 있다. 또한, 견사충는, 누에, 상잠, 가중나무고치나방, 아주까리누에, 산누에나방, 안테레아 페른니(Antheraea pernyi), 작은산누에나방, 긴꼬리산누에나방 등을 포함한다. 본 발명의 트랜스제닉 견사충는, 상기 항체를 견사(고치)(바람직하게는, 세리신층) 중에 생산(분비)한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 상기 트랜스제닉 견사충에 의해 생산된 항체에 관한 것이다. 상기 항체는, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및/또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는 항체, 혹은, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및/또는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함해도 된다. 혹은, 상기 항체는, 서열번호 7 및/혹은 서열번호 9, 또는, 서열번호 11 및/혹은 서열번호 13의 각각 과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는, 각각, 중쇄 및/혹은 경쇄를 포함해도 된다. 혹은, 본 발명의 항체는, 서열번호 7 및/혹은 서열번호 9, 또는, 서열번호 11 및/혹은 서열번호 13 각각과 Blast에서의 상동성 스코어가 200 이상을 나타내는 아미노산 서열을 가지는, 각각, 중쇄 및/혹은 경쇄를 가지고 있어도 된다. 혹은, 본 발명의 항체는, 열번호 7 및/혹은 서열번호 9, 또는, 서열번호 11 및/혹은 서열번호 13의 각각에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는, 각각, 중쇄 및 경쇄를 가지고 있어도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「항체」의 용어는, Fc와 항원 결합 부위를 포함하는 한, 항체의 일부 또는 단편이나 개변체라도 되고, 예를 들면, 단일 가닥 항체(예를 들면, 중쇄 항체)이나 이중 특이성 항체라도 된다.

누에의 고치 중에 생산되는 항체는 당쇄로서 푸코오스가 결합하고 있지 않은 것이 알려져 있다. 또한, 푸코오스가 부가되어 있지 않은 항체는, ADCC 활성이 우수할 것이 이미 본 기술 분야에 있어서 널리 알려져 있다. ADCC 활성과 항체 투여에 의한 바이러스 억제에 대해서는 지금까지 보고가 없지만, 본 발명의 이와 같은 효과는 ADCC 활성에 의해 초래되고 있을 가능성이 있다. 따라서, 일태양에 있어서, 본 발명은, IgG항체이며, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 혹은, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지고; HIV로의 결합능을 가지고; 또한, ADCC 활성 향상을 위해 Fc 영역을 변형한 항체를 포함하는 조성물이며, ADCC 활성이 CHO 세포에 생산시킨 야생형 항체보다 높은 것을 특징으로 하고, HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는항HIV항체 조성물을 포함해도 된다.

또한, Fc와 FcγR의 관계가 ADCC 활성에 영향을 미치는 것이 나타나 있고, Fc영역의 아미노산 치환에 의해 FcγR과의 친화성을 높일 수 있는 것도 보고되어 있다.

특히, FcγRIIIa 등의 활성형 FcγR로의 결합이 높고, FcγRIIb 등의 저해형 FcγR로의 결합이 약한 Fc가 이펙터 기능이 우수한 것이 알려져 있다.

이와 같은 변이로서, F158V, A330L, S239D, 및 I332E(Greg ALazar 등, PNAS(2006) 103(11): 4005-4010)이나, F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, 및 P396L(Cancer Res(2007) 67(18): 8882-8890)이 보고되어 있다.

본 발명의 항체의 Fc영역은, 이와 같은 변이를 가지고 있어도 되고, 예를 들면, A330L, S239D, I332E, F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, 및 P396L로부터 선택되는 1∼10개의 변이를 가지고 있어도 된다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은, HIV로의 결합능을 가지는IgG항체를 포함하는 조성물이며, 상기 IgG항체의 80% 이상이 항체결합 당쇄중에 푸코오스를 포함하지 않는 항체인, 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물에 있어서, 반드시 모든 (100%의) 항HIV항체에 있어서 푸코오스가 포함되어 있지 않은 필요는 없고, 적어도, 80% 이상(바람직하게는, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 항HIV항체에 있어서 푸코오스가 포함되어 있지 않으면 된다. 바람직하게는, 상기 조성물은, HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가진다. 상기 조성물이 가지는 항HIV항체가 가지는 서열 등의 특징은, 상기 본 발명의 항HIV항체와 동일하다.

본 명세서에 있어서, 「HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상(바람직하게는, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%)의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는」 지의 여부는, 피험항체를 복수의 HIV감염자에 투여하고, 그 후의 혈중 HIV를 통상적인 방법, 예를 들면, PCR을 이용하는 방법에 따라 검출함으로써 확인할 수 있다. 피험항체를 투여한 HIV환자의 90% 이상에 있어서 혈중 HIV가 검출되지 않은 경우에는, HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는 것으로 판정할 수 있다. 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하고 있는지의 여부의 판정 시기는, 항체의 투여가 모두 종료한 후인 것이 바람직하고, 바람직하게는, 투여 완료 후 12주, 16주, 20주, 24주, 28주, 32주, 36주, 40주, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년의 시점으로 할 수 있다.

또 다른 태양에 있어서, 본 발명은, 상기 항체를 유효 성분으로서 함유하는, HIV감염증의 치료약 또는 예방약(의약조성물)에 관한 것이다. 본 발명의 의약조성물은, 환자에 투여할 수 있는 제제라면 경구 또는 비경구의 어떠한 제제를 채용해도 된다. 비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면, 주사제, 점비제, 좌제, 첩부제, 연고 등이 있다. 바람직하게는, 주사제이다. 본 발명의 의약조성물의 제형은, 예를 들면, 액제 또는 동결건조 제제를 들 수 있다. 본 발명의 의약조성물을 주사제로서 사용하는 경우, 필요에 따라, 프로필렌글리콜, 에틸렌디아민 등의 용해 보조제, 인산염 등의 완충재, 염화나트륨, 글리세린 등의 등장화제, 아황산염 등의 안정제, 페놀 등의 보존제, 리도카인 등의 무통화제 등의 첨가물(「의약품첨가물사전」약사일보사, 「Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition」APhA Publications사 참조)을 가할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약조성물을 주사제로서 사용하는 경우, 보존 용기로서는, 앰플, 바이알, 프리필드시린지, 펜형 주사기용 카트리지, 및 점적용 백 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 항체는, 누에에 의해 고효율로 생산할 수 있으므로, 보다 생산 코스트가 저렴한 HIV 감염증 치료용 항체를 제공할 수 있다.

도 1은 트랜스제닉 누에에 의한 발현량을 SDS-PAGE 후의 CBB 염색에 의해 비교한 사진이다. A: 전체 추출액; B: 중성완충액 추출액. 사진의 좌측의 수치는 분자량(kDa)을 나타내고, 사진의 상부는 사용한 항체의 종류를 나타낸다.
도 2는트랜스제닉 누에에 의해 생산된 각 항체의 HIV-1 BaL주에 대한 결합 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 평균형광강도(MFI), 가로축은 항체농도(μg/mL)를 나타낸다.
도 3은 유래가 상이한 각 항체의 HIV-1 BaL주에 대한 중화 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 저해 비율(%inhibition), 가로축은 항체의 Log농도(μg/mL)를 나타낸다. 아래의 표는 각 항체의 각 농도에서의 저해 비율(%inhibition)을 나타낸다.
도 4는 누에의 고치 중에 발현시킨 항체와 CHO 세포에 생산시킨 항체의 당쇄 구조를 매스 스펙트럼으로부터 추정한 결과를 나타낸다. 주요한 당쇄 구조와 그 존재 비율을 나타낸다.
도 5는 SW-1C10, 293A-1C10, CHO-1C10, 및 KD-247을 0.2, 2, 20 μg/mL로 HIV-1 BaL주에 첨가했을 때의 ADCC 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프(A) 및 표(B)이다. ADCC 활성은 SW-1C10이 가장 높고, 이어서 CHO-1C10이 높았다.
도 6은 급성 감염기에서의 SW-1C10의 효력에 대하여 평가하기 위하여, 강독성 SHIV 89.6P(Reimann K.A.et al., J.Virol. 70, 6922-6928.)을 접종한 게잡이원숭이에 SW-1C10을 투여한 결과를 나타낸 그래프이다. 좌측 그래프는 SW-1C10 투여군(n=3)을 나타내고, 우측 그래프는 무처치군(n=2)을 나타낸다. 위의 그래프의 세로축은 혈장 1ml 중의 바이러스RNA카피수(log₁₀ copies/mL)를 나타내고, 아래의 그래프의 세로축은 CD4＋T 세포수(count/μL)를 나타낸다. 전신감염을 성립시켰다. 모든 그래프의 가로축은, 바이러스 감염 후의 경과 기간(주)을 나타낸다. SW-1C10의 투여는, 바이러스 접종 후 3일째, 10일째, 17일째에 정맥 경유로 행하였다.

1. 항체

일태양에 있어서, 본 발명은 누에에 본 발명의 항체유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 본 발명의 항체의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 항체를 포함한다. 본 발명의 제조 방법은, 구체적으로는 하기 방법에 의해 실시할 수 있다.

(발현 카세트의 제작)

본 발명의 누에의 견사선세포에서 유전자발현을 일으키는 프로모터 영역과 기능적으로 연결된, 항체유전자를 포함하는 발현 카세트는, 누에의 견사선세포에서 유전자발현을 일으키는 프로모터 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와, 전술한 (i)∼(x)로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를, 당업자가 주지의 유전자재조합 기술에 의해 결합시켜 제작할 수 있다. 누에의 견사선세포에서 유전자발현을 일으키는 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 누에 세포로부터 추출한 게놈DNA를 템플릿으로 하여, 원하는 프로모터에 대응하는 프로모터를 사용하여 PCR을 행함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 세리신1 유전자 프로모터의 취득 방법이, 미국특허 공개공보 2008/0301823에 기재되어 있다.

본 발명의 발현 카세트가, 인핸서, 피브로인 중쇄 유전자의 -1860∼-1127의 영역, 및/또는, -5000∼-3848의 영역, 바큐로바이러스 homologous region을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바큐로바이러스·폴리헤드린의 5'비번역영역을 구성하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 바큐로바이러스 IE1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 포함하는 경우, 당업자 주지의 방법에 의해(예를 들면, 제한효소 절단 부위를 사용함으로써) 이들 폴리뉴클레오티드와 누에의 견사선세포에서 유전자발현을 일으키는 프로모터 영역과 기능적으로 연결된 항체유전자를 결합시킴으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 발현 카세트는, 일본공개특허 제2004-344123, 미국특허 공개공보 2008/0301823, 일본공개특허 제2008-125366 등에 기재된 방법에 따라, 제작할 수 있다.

(벡터의 제작)

상기 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 벡터는, 원하는 벡터에 상기 발현 카세트 또는 그 구성 성분을 도입하는 것에 의해 얻을 수 있다. 벡터는, 트랜스제닉 누에를 제작 가능한 플라스미드 벡터라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 전술한 벡터의 제한효소 절단 부위에 상기 발현 카세트를 삽입함으로써 제작할 수 있다.

(트랜스제닉 누에의 제작)

일태양에 있어서, 본 발명은, 상기 플라스미드 벡터를 견사충의 알에 삽입하는 것을 포함하는, 상기 항체를 견사(고치)(바람직하게는, 세리신층) 중에 생산(분비)하는 트랜스제닉 누에의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 트랜스제닉 누에의 제조 방법은, 상기 플라스미드 벡터를 산란 후 2∼8 시간의 누에 알(누에 배아)에 주입하고, 부화한 누에의 성충을 교배하여 G1 알덩어리를 얻고, 표지유전자의 발현 등을 지표로 본 발명의 발현 카세트가 도입된 트랜스제닉 누에를 스크리닝하는 것을 포함한다.

일례로서, 얻어진 플라스미드 벡터를 정제한 후, 헬퍼 플라스미드인 pHA3PIG(Nat.Biotechnol. 18, 81-84(2000))와 플라스미드량이 1:1로 되도록 혼합하고, 또한 에탄올 침전을 행한 후, DNA농도가 10∼1000 μg/ml되도록 인젝션 버퍼 (0.5mM 인산버퍼 pH 7.0, 5mM KCl)에 용해한다. 이 벡터 혼합액을, 산란 후 2∼8 시간의 전배반엽기의 누에 알(누에 배아)에, 1개의 알당 약 1∼200 nl의 액량으로 미량 주입한다. 벡터 DNA를 미량 주입한 알을 약 25℃로 인큐베이트하고, 부화한 누에를 사육하고, 얻어진 생식 가능한 성충을 교배하고, G1세대의 알덩어리를 얻는다. 산란일로부터 3∼10 일째의 G1알덩어리 중, 눈이나 신경계로부터 녹색형광을 발하는 트랜스제닉 누에의 알을 선택하고 부화시켜, 항체cDNA가 도입된 트랜스제닉 누에를 수립할 수 있다.

또한, 본 발명의 트랜스제닉 누에는, 본 발명의 발현 카세트와는 별도로, 상기 유전자발현을 증강시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 도입해도 된다. 예를 들면, 본 발명의 플라스미드 벡터와는 상이한 플라스미드 벡터에 유전자발현을 증강시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 이것을 본 발명의 플라스미드 벡터와 동시에 또는 따로따로 누에 알에 주입해도 된다. 혹은, 전술한 방법에 의해 얻어진 본 발명의 발현 카세트가 도입된 트랜스제닉 누에를, 유전자발현을 증강시키기 위한 폴리뉴클레오티드가 도입된 트랜스제닉 누에와 교배시킴으로써, 본 발명의 발현 카세트와, 상기 유전자발현을 증강시키기 위한 폴리뉴클레오티드가 도입된 트랜스제닉 누에를 얻을 수 있다. 예를 들면, 얻어진 트랜스제닉 누에를, BmNPV 유래의 트랜스 액티베이터인 ie1 유전자를 발현하는 누에(일본공개특허 제2012-182995)와 교배하여, 얻어진 G2세대의 누에로부터, 항체cDNA와 ie1 유전자의 양쪽을 가지는 누에를 선별할 수도 있다.

(항체의 제조 방법)

다른 태양에 있어서, 본 발명은, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는 항체, 혹은, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는 항체의 제조 방법으로서, 상기 트랜스제닉 견사충이 생산한 견사로부터 상기 항체를 추출하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

예를 들면, 항체의 제조는, 상기 누에를 사육하여 고치를 만들게 한다. 누에의 고치를, 추출 버퍼(PBS(최종농도 0.5M NaCl), 0.1% TritonX-100)에 침지하고, 1시간 실온에서 교반하여 고치추출액을 조제한다. 추출액을 0.45μm의 필터로 여과하고, 프로테인 G 컬럼(ProteinG Sepharose4 Fast Flow, GE헬스케어)에 제공한다. 0.1M 글리신(pH2.7)으로 용출시키고, 용액에 1M Tris-HCl(pH9.0)을 가하여 중화하고, 마지막으로 PBS에 대하여 투석함으로써 얻을 수 있다.

또한, 항체의 단편은, 당업자 주지의 다양한 방법으로 조제할 수 있고, 예를 들면, 전술한 방법에 의해 얻어진 항체를 파파인 처리함으로써, 얻을 수 있다.

또한, 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체는, 전술한 누에의 고치 중에 생산시키는 방법에 의한 것 외에, 약제로 처리한CHO 세포로부터 높은 푸코오스를 가지는 세포를 살상해서 선택된 푸코실화의 감소를 나타내는 세포를 사용하여 생산하는 방법(미국특허공개 2010/0081150호), Fx단백질의 돌연변이에 의한 것 및 푸코오스의 외부원의 공급력을 제어하는 것에 의한 푸코실화가 감소한 CHO 세포주를 사용하여 생산하는 방법(미국특허공개2010/0304436호), GMD엑손 5, 6 및 7 영역에 상당하는 게놈 결실을 가지는 GMD 녹아웃 세포 및 FUT8 녹아웃 숙주 세포주를 사용하여 생산하는 방법(KANDA, Y. 등 (2007)J.BIOTECHNOL; 130(3): 300-10), N-메틸-N-니트로소구아니딘과 인큐베이트하는 것에 의해 초래하는 4종의 렉틴 내성 CHO 변이 세포에 의해 제조하는 방법(RIPKA, J. 등 (1986)SOMAT CELL MOL GENET; 12(1): 51-62), Lec13(푸코오스 결손 CHO) 세포주에 의해 생산시키는 방법(SHIELDS, R.L. 등 (2002)J BIOL CHEM; 277(30): 26733-40), 메토트렉세이트(MTX) 처리 후 CHO 세포의 집단을 들주발버섯(aleuria aurantia) 렉틴(AAL) 또는 아스퍼질러스·오리자에(Aspergillus oryzae) 1-푸코오스 특이적 렉틴(AOL)의 비독성 푸코오스 결합제와 접촉시켜, 푸코오스 결합제에 결합한 세포를 제거하여 얻어진 세포를 사용하여 제조하는 방법(WO2012/120500), 항체로부터 당쇄를 한번 절단한 후, 푸코오스 비결합 당쇄를 항체에 재결합시키는 방법(일본공개특허 제2016-082962), 및 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제III를 발현하는 세포를 사용하여 제조하는 방법(미국특허 6,602,684)이 알려져 있다. 본 발명의 항체는, 이들 중 어떤 방법 또는 여기에 기재되어 있지 않은 것 외의 푸코오스 결합량이 감소하는 공지의 항체 생산 방법에 의해 제조되어도 된다.

2. 의약조성물

본 발명의 항체는, 경구 투여 형태, 또는 주사제, 점적제 등의 비경구 투여 형태의 의약조성물로서 사용할 수 있다. 포유동물 등에 투여할 경우, 의약조성물은, 정제, 산제, 과립제, 시럽제 등등의 경구 투여 형태라도 되고, 또는, 주사제, 점적제 등의 비경구적 투여 형태라도 된다.

본 발명의 의약조성물은, 통상의 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여, 통상적인 방법에 의해 제제화할 수 있다. 경구용 고형 제제를 조제하는 경우에는, 주약에 부형제, 또한 필요에 따라, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 부가한 후, 통상적인 방법에 의해 용제, 과립제, 산제, 캡슐제 등으로 만든다. 주사제를 조제할 경우에는, 주사약에 필요에 따라 pH조정제, 완충제, 안정화제, 가용화제 등을 첨가하고, 통상적인 방법에 의해 피하 또는 정맥내용 주사제로 만들 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은, 그것을 필요로 하는 환자에 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, HIV감염증의 치료 방법 또는 예방 방법에 관한 것이다. 혹은, 본 발명은, HIV감염증의 치료약 또는 예방약을 제조하기 위한, 본 발명의 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 포유동물 등에 투여할 경우의 투여량은, 증상, 연령, 성별, 체중, 투여 형태 등에 따라 다르지만, 예를 들면, 성인에 정맥내 투여할 경우에는, 통상 1회량은 0.1∼10000 mg으로 할 수 있다.

바람직하게는, 투여 후에도 장기간에 걸쳐(예를 들면, 12주 이상, 16주 이상, 20주 이상, 24주 이상, 28주 이상, 32주 이상, 36주 이상, 40주 이상, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상, 4년 이상, 또는 5년 이상) 혈중 HIV를 검출 한계 이하로 유지할 수 있는 투여 방법이다. 투여 후에 혈중 HIV를 검출 한계 이하로 유지할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 필요에 따라, 투여 기간 중 및 투여 기간 후에 혈중 HIV량(예를 들면, HIV RNA량)을 모니터링해도 된다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, HIV에 감염된 환자에 대하여, 전부 1∼10 회, 1∼8 회, 1∼5 회, 1∼4 회, 1∼3 회, 1∼2 회, 1회, 2회, 또는 3회 투여할 수 있다. 투여 간격은, 3∼30 일, 3∼15 일, 4∼10 일, 5∼9 일, 6∼8 일, 또는 7일으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위하여 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다. 한편, 본원 명세서 전체를 통하여 인용하는 문헌은, 참조에 의해 그 전체가 본원 명세서에 원용된다. 또한, 본원은 2018년 10월 29일자에 출원된 일본특허출원 제2018-203114호로부터의 우선권을 주장한다. 본원이 우선권을 주장하는 일본특허출원 제2018-203114호 기재된 내용은 모두 참조에 의해 그대로 본원에 원용된다.

[실시예]

(1) 벡터의 제작

1C10 항체의 중쇄(서열번호 6) 및 경쇄(서열번호 8)의 cDNA가 도입된 플라스미드(pMPE-1C10)를 주형으로 하고, 제한효소 NruI 인식 서열 및 BmNPV 폴리헤드린의 5' 비번역영역 서열(일본공개특허 제2008-125366)을 포함하는 프라이머(NruI-BmNPV-ATG), 및 1C10 중쇄 5' 말단측 서열로 이루어지는 프라이머(Hc-F)의 혼합액을 포워드 프라이머로 하고, 또한, 제한효소 NruI 및 XhoI 인식 서열을 부가한 중쇄 3' 말단측 서열로 이루어지는 프라이머(C-hIgG1-NruI-XhoI)를 리버스 프라이머로서 사용하여 PCR을 행함으로써, 1C10 중쇄의 cDNA를 증폭했다.

증폭된 프래그먼트를 XhoI으로 처리하고, EcoRV 및 XhoI으로 처리한 클로닝 벡터(pCR-MCS)에 도입했다. 동일하게 하여, 1C10 경쇄의 cDNA가 도입된 플라스미드(pKVA2-1C10)를 주형으로 하고, NruI-BmNPV-ATG, 및 경쇄 5' 말단측 서열로 이루어지는 프라이머(LcK-F)의 혼합액을 포워드 프라이머로서, 또한, 제한효소 NruI 및 XhoI 인식 서열을 부가한 경쇄 3' 말단측 서열로 이루어지는 프라이머(LcK-R)를 리버스 프라이머로서 사용하여 PCR을 행함으로써, 1C10 경쇄의 cDNA를 증폭하고, 얻어진 프래그먼트를 pCR-MCS에 삽입했다.

(포워드 프라이머)

NruI-BmNPV-ATG

5'-ATCGCGAAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATG-3'(서열번호 1)

Hc-F

5'-GTAATAAAAAAACCTATAAATATGGACTGGACCTGGAGGATC-3'(서열번호 2)

LcK-F

5'-GTAATAAAAAAACCTATAAATATGGTGTTGCAGACCCAGGTC-3(서열번호 4)

(리버스 프라이머)

C-hIgG1-NruI-XhoI

5'-CGCTCGAGTCGCGATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(서열번호 3)

LcK-R

5'-CGCTCGAGTCGCGATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3'(서열번호 5)

1C10 경쇄의 cDNA가 도입된 pCR-MCS를 NruI으로 절단하여 경쇄의 cDNA를 잘라내고, Aor51HI로 처리한 트랜스제닉 누에 제작용 벡터(pMSG 3.1MG, 일본공개특허 제2012-182995)에 도입했다. 다음으로, 이 벡터를 NruI으로 소화하고, 1C10 중쇄의 cDNA가 도입된 pCR-MCS로부터 NruI으로 잘라낸 중쇄 cDNA와 라이게이션했다. 얻어진 벡터(1C10/pMSG3.1MG)는, 1C10 중쇄 및 경쇄의 cDNA가, 각각 세리신1 프로모터의 하류에 도입되어 있다.

동일한 방법에 의해, 1C10이 단리된 동일한 환자 유래의 항HIV인간 항체인 1D9(중쇄의 cDNA 서열: 서열번호 10; 경쇄의 cDNA 서열: 서열번호 12) 및 49G2, 또한, 다른 HIV환자 유래의 인간 항체인 VRC01(Science. 329, 856-61(2010)) 및PGT121(Nature. 477, 466-470(2011))에 대해서도, 중쇄와 경쇄를 pMSG 3.1MG에 도입한 트랜스제닉 누에 제작용 벡터를 조제했다.

(2) 트랜스제닉 누에의 제작

1C10/pMSG 3.1MG를 Plasmid Midi Kit(QIAGEN)로 정제한 후, 헬퍼 플라스미드인 pHA3PIG(Nat.Biotechnol.; 18: 81-84(2000))과 플라스미드량이 1:1로 되도록 혼합하고, 또한 에탄올 침전을 행한 후, DNA 농도가 200μg/mL로 되도록 인젝션 버퍼(0.5mM 인산완충액 pH 7.0, 5mM KCl)에 용해했다. 이 벡터 혼합액을, 산란 후 2∼8 시간 전배반엽기의 누에 알(누에 배아) 383개에, 1개의 알당 약 15∼20 nL의 액량으로 미량 주입했다.

벡터 DNA를 미량 주입한 알을 25℃로 인큐베이트한 바, 85%의 알이 부화했다. 이들 누에 유충을 사육하고, 성장한 성충을 교배하여, 72구(자형(雌形) 성충이 낳은 알덩어리)의 G1세대의 알을 얻었다. 산란일부터 5∼6 일째의 G1 알덩어리를 형광실체현미경으로 관찰하고, 눈이나 신경계로부터 녹색형광을 발하는 트랜스제닉 누에의 알을 포함하는 31구의 알덩어리를 취득했다. 얻어진 알을 부화시키고 사육한 결과, 48마리의 트랜스제닉 누에를 수립할 수 있었기 때문에, 이들의 고치 단백질을 추출하여 SDS-PAGE에 의해 해석했다. 또한, 성충으로부터 게놈 DNA를 추출하여 서던블로팅를 행하였다. 이 해석에 의해, 고치에 1C10 항체가 발현되고 있고, 또한 게놈 중에 1카피의 재조합유전자를 가지는 6계통의 트랜스제닉 누에를 선발했다.

상기한 트랜스제닉 누에를, BmNPV 유래의 트랜스 액티베이터인 ie1 유전자를 발현하는 누에(일본공개특허 제2012-182995)와 교배했다. ie1 유전자로부터 합성되는 IE1 단백질은, pMSG 3.1MG에 포함되는 BmNPV 유래의 hr3 인핸서나, 세리신1 프로모터에게 작용하고, 중부 견사선에서의 재조합단백질의 발현량을 증가시키는 것이 알려져 있다(Biotechol. Bioeng.; 106: 860-870(2010)). 교배하여 얻어진 G2세대의 누에로부터, 1C10 cDNA와 ie1 유전자의 양쪽을 가지는 누에(이하 「1C10 생산용 계통」라고 함)를 선별하고, 이 누에를 사육하여 고치를 만들게 했다.

동일하게 하여, 1C10과 동일한 환자에 유래하는 1D9 및 49G2, 또한, 다른 환자 유래의 VRC01 및 PGT121의 cDNA를 도입한 벡터에 대해서도 누에 알에 미량 주입하여 트랜스제닉 누에를 제작했다. ie1 유전자를 발현하는 누에와 교배하여, 각각의 항체가 포함된 고치를 만들게 했다.

각각의 유전자를 도입한 누에 각 1계통에 대하여, 얻어진 고치의 고치층 중량을 기재하였다(표 1). 1C10, 1D9, VRC01, 및 PGT121에 대해서는, 평균적인 중량의 고치를 만들었지만, 49G2은 전혀 고치를 만들지 않았다.

[표 1]

(3) 발현량의 해석

고치를 얻어진 1C10, 1D9, VRC01, 및 PGT121에 대하여, 항체의 발현량을 조사했다. 각각의 누에의 고치 10mg을, 1mL의 8M 요소, 50mM 트리스염 완충액 pH 8.0, 0.1M DTT에 침지하고, 80℃에서 5분간 가온함으로써 견사 세리신층에 포함되는 단백질을 모두 가용화하고(전체 추출), 환원 조건에서 SDS-PAGE를 행한 후 CBB 염색을 행하여, 항체의 발현량을 비교했다.

결과를 도 1의 A에 나타내었다. 4종류의 유전자재조합 누에의 고치로부터 항체의 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)가 검출되었다. 발현량은, 1C10이 가장 높고, 1D9 및 PGT121도 비교적 고발현이었지만, 이들에 비해 VRC01의 발현량은 낮았다.

다음으로, 중성의 완충액에 대한 항체의 추출량에 대하여 해석했다. 10mg의 고치를 1mL의 PBS(최종농도 0.5M NaCl), 0.1% Triton X-100에 침지하고, 1시간 실온에서 교반한 후, 원심분리하여 상청액를 회수했다. SDS-PAGE에 의해 추출액 중의 단백질을 해석한 바, 항체의 추출량은 1C10이 가장 많고, 비교적 발현량이 높았던 1D9 및 PGT121의 추출율은, 1C10에 비교하여 상당히 낮았다. 추출액 중에 포함되는 항체량을, 프로테인 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe column(0.7×2.5cm; 1mL), GE헬스케어)을 장착한 HPLC 시스템(Alliance HPLC System, Waters)을 사용하여 정량(定量)했다. 각 누에의 고치로부터 조제한 추출액 300μL을, 프로테인 A 컬럼에 제공하고, PBS로 세정한 후, 100mM 시트르산 pH 3.0로 결합한 항체를 용출하여, 용출 피크의 면적으로부터 항체농도를 정량했다. 또한, 이 결과로부터, 고치 1개당으로부터 추출되는 항체량을 산출했다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 1C10의 고치 1개당으로부터 추출할 수 있는 항체량은 1.48mg이며, 동일한 HIV감염 환자 유래의 1D9의 약 3.2배의 항체량을 추출할 수 있는 것을 알았다.

(4) 1C10 항체의 정제

1C10 생산용 계통의 고치를, PBS(최종농도 0.5M NaCl), 0.1% Triton X-100에 침지하고, 1시간 실온에서 교반하여 고치 추출액을 조제했다. 추출액을 0.45μm의 필터로 여과하고, 프로테인 G 컬럼(Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE헬스케어)에 제공했다. 컬럼으로부터의 항체의 용출에는, 0.1M 글리신염산 완충액(pH2.7)을 사용했다. 용출된 항체 용액에 1M Tris-HCl(pH9.0)을 가하여 중화하고, 마지막으로 PBS에 대하여 투석했다. 정제한 항체를, SW-1C10로서, 하기 실험에 사용했다.

(5) 유래가 상이한 1C10 항체의 준비

항체의 유래에 의한 결합 활성 및 중화 활성의 차이를 조사하기 위하여, Bcell-1C10(Virology.; 475: 187-203(2015)), 293A-1C10(Virology.; 475: 187-203(2015)), 및 CHO-1C10가 상이한 유래의 1C10 항체를 제작했다.

CHO-1C10은 다음과 같이 제작했다.

ExpiCHO Expression System Kit(ThermoFisher Scientific)을 사용하여, ExpiCHO-S세포(키트에 부속)에 1C10의 cDNA가 도입된 플라스미드(pMPE-1C10)의 트랜스펙션을 행하였다. 트랜스펙션으로부터 12-14 일 후에 배양상청액를 회수하고, 0.2μm의 필터로 여과한 후, 프로테인 A 컬럼(HiTrap rProtein A FF, GE헬스케어)에 결합시켰다. 컬럼으로부터의 항체의 용출에는, 50mM 글리신염산 완충액(pH2.39)을 사용했다. 1M Tris-HCl(pH9.0)을 가하여 중화하고, PBS에 대하여 투석했다. PEG6,000(Wako)을 사용하여 항체 용액을 농축 후, 다시 PBS에 대하여 2회 투석을 행하였다.

(6) HIV-1 BaL주에 대한 결합 활성 측정

SW-1C10과 293A-1C10의 HIV-1 BaL주(Science.; 253: 71-4(1991))에 대한 결합 활성의 비교를 행하였다. 먼저 BaL 바이러스 감염 세포를 준비했다. CEM.NKR-CCR5(NKR24)세포(J Virol.; 86: 12039-52(2012) 현탁액(1×10⁶cells/50μL)과 BaL 바이러스 현탁액 50μL를 1.5mL 튜브 내에서 혼합하고, 1,200×g으로 2시간, 실온에서 원심분리했다. R10 medium(J Virol.; 86: 12039-52(2012))을 첨가하고, 24-well plate 상에서 37℃, 5% CO₂에서 배양을 개시했다. NKR24세포에는, HIV-1의 LTR 프로모터에 제어된 Luciferase 유전자가 도입되어 있다(J Virol.; 86: 12039-52(2012)). 이 NKR24세포에서 생산되는 Luciferase 활성을 neolite Reporter Gene Assay System(Perkin Elmer)로 측정하여, 바이러스 감염 상황을 적절하게 확인했다.

BaL 감염 NKR24세포 및 비감염(Normal) NKR24세포가 준비된 단계에서, FACS해석용 샘플을 조제하였다(반응액으로서 0.2% BSA/PBS를 사용). 반응액에 현탁하고, 2.5×10⁶cells/mL로 조정한 세포를 96-well 플레이트에 50μL 첨가하였다(25×10⁴cells/tube). 거기에 최종농도 0.032/0.16/0.8/4/20/100 μg/mL로 되도록 등량의 항체 용액(D-PBS(-)로 농도 조정)을 첨가했다. 30∼40 분간 실온에서 인큐베이트 후, 반응액으로 2회 세정하고, 반응액으로 200배 희석한 APC 표지 anti-human IgG(Jackson ImmunoResearch)를 50μL 첨가하였다(이후는 차광하면서 조작). 15분간 실온에서 인큐베이트 후, 반응액으로 2회 세정하고, 10% Formalin/PBS를 100μL 첨가했다. 15분간 얼음 위에서 인큐베이트 후, BD FACS Canto II(BD Biosciences)로 해석을 행하여, APC의 평균형광강도(MFI)로부터 결합 활성을 조사했다.

그 결과, SW-1C10, 293A-1C10 모두 BaL 감염 NKR24세포에 대하여 특이적으로 결합하고, 또한 항체 농도 의존적인 결합 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(표 2 및 도2).

[표 2]

(7) HIV-1 BaL주에 대한 중화 활성 측정

SW-1C10, Bcell-1C10, 293A-1C10, CHO-1C10에 대하여, HIV-1 BaL주에 대한 중화 활성의 비교를 행하였다. 4μg/mL를 최대농도로 하고 5배씩 8단계의 항체 희석 계열을 96-well플레이트 상에 제작(100μL/well)한 후, 4,000 TCID50/mL로 조정한 BaL 바이러스를 50μL 첨가(final 200 TCID50)했다. 37℃, 5% CO₂에서 1시간 인큐베이트 후, TZM-bl세포(AIDS; 23: 897-906(2009))를 1×10⁵cells/mL(＋37.5μg/mL DEAE dextran)로 조정하고, 100μL 첨가했다. 포지티브 컨트롤로서 VC(virus control; 바이러스와 세포만), 네가티브 컨트롤로서 CC(cell control; 세포만)의 웰도 동시에 준비했다. 37℃, 5% CO₂에서 2일간 배양 후, 세포를 PBS로 세정하고 각 웰에 Luciferase Cell Lysis Buffer(Promega)를 30μL 첨가 후, 15분 교반했다. Luciferase Assay Reagent를 검출용 white plate(Coster)에 50μL 첨가 후, 교반 종료 후의 cell lysate를 10μL 첨가하고, Luminometer에 의해 RLU(상대발광강도)를 측정했다. CC에서의 RLU를 백그라운드로 하여 감염 억제율(%inhibition)={(VC에서의 RLU)-(각 항체 농도에서의 RLU)}/(VC에서의 RLU)을 산출하고, IC50(50% inhibitory concentration)을 구했다.

표 3에 IC50, 도 3에 각 항체 농도에서의 감염 억제율을 나타낸다. 그 결과, SW-1C10을 포함하는 각종 항체가 대략 동등한 중화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[표 3]

(8) 당쇄 구조 해석

문헌(Mol.Cellular Proteom.; 6: 1437-1445(2007))에 따라, 이하의 조작에 의해, SW-1C10과 CHO-1C10의 당쇄 구조를 해석했다. 50μg의 정제 1C10을, 계면활성제 존재 하에서 환원알킬화, 트립신 소화의 후에, PNGaseA에 의한 효소 소화를 행함으로써, N-glycan을 유리(遊離)시켰다. 이어서, 50pmol의 내부표준물질을 가하고, 글리코블로팅법을 행하였다(이 공정에서, N-glycan의 포착, 카르복실기의 메틸화 및 BOA라벨화가 행해진다). 이것을 질량분석(MALDI-TOF-MS; Ultraflex III, 포지티브 모드)에 제공하여, 얻어진 스펙트럼을, GlycoMod Tool(http://web.expasy.org/glycomod/)에 대조하여, N-glycan의 구조를 추정했다. 또한, 미리 첨가한 내부표준물질의 피크 면적을 사용하여, 각각의 피크 면적을 규격화했다.

얻어진 매스 스펙트럼에 의해 추정되는 주요한 당쇄 구조와, 그 존재 비율을 도 4에 나타내었다. CHO-1C10에는, 약 70.3%의 코어 푸코오스 부가 당쇄가 인정된 것에 비해, SW-1C10로부터는, 코어 푸코오스 부가 당쇄가 전혀 검출되지 않았다. 또한, SW-1C10의 당쇄는, 시알산 부가나 바이섹팅 GlcNAc를 포함하는 당쇄가 존재하지 않는 점에서는, CHO-1C10의 당쇄 구조와 유사하다.

(9) ADCC 활성의 측정

SW-1C10, 293A-1C10, 및 CHO-1C10에 더하여, gp120의 V3루프를 인식하는 인간화 항체인 KD-247을 준비하고, HIV-1 BaL주에 대한 ADCC 활성의 비교를 행하였다.

결합 활성 측정의 경우와 동일한 방법에 의해, BaL 감염 NKR24세포를 조제했다. BaL 감염 NKR24세포 및 비감염(Normal) NKR24세포가 준비된 단계에서, ADCC 활성 측정용 샘플을 조제하였다(반응액 및 항체 희석액으로서 R10 medium 10U/ml IL-2을 사용). 반응액으로 3회 세정 후, 2.5×10⁵cells/mL로 조정한 NKR24세포를 96-well플레이트에 40μL 첨가하였다(1×10⁴cells/well). 반응액으로 1회 세정 후, 이펙터 세포로서 2.5×10⁶cells/mL로 조정한 내추럴 킬러 세포주인 human CD16＋ KHYG-1세포((N6세포; J Virol.; 86: 12039-52(2012))를 40μL 첨가하였다(10×10⁴cells/well). 그 후, 준비한 각 항체를 최종농도 0.2, 2, 또는 20 μg/mL로 되도록 20μL 첨가했다. 포지티브 컨트롤로서 VC(virus control; BaL 감염 NKR24세포와 N6세포만), 네가티브 컨트롤로서 CC(cell control; 비감염 NKR24세포와 N6세포만)의 웰도 동시에 준비하고, 37℃, 5% CO₂에서 6시간 인큐베이트를 행하였다.

ADCC 활성 측정에는 neolite Reporter Gene Assay System을 사용했다. neolite reagent를 검출용 white plate(Perkin Elmer)에 40μL 첨가 후, 인큐베이트 후의 반응액을 현탁하여 40μl 첨가하고, Luminometer에 의해 RLU(상대발광강도)를 측정했다. CC에서의 RLU를 백그라운드로 하여 바이러스 살상율(%killing; (VC에서의 RLU-각 항체 농도에서의 RLU)/VC에서의 RLU)을 산출하고, ADCC 활성으로 했다(도 5의 A 및 B). 그 결과, SW-1C10이 비교한 항체 중에서 가장 높은 ADCC 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

(10) 동물실험용 1C10의 대량생산

약 3만마리의 1C10 생산용 계통을 전연령에서 인공사료(니혼노산고교(日本農産工業)가부시키가이샤에서 제조한 실크메이트 원종용 1-3령용 S)를 제공하여 사육하고, 고치를 생산했다. 고치를 가위로 절개해서 번데기를 꺼내고, 약 1.1kg의 고치층을 얻었다. 이 중 1.0kg을 사용하여, SW-1C10의 추출 및 정제를 행하였다.

고치 1kg을 100L의 추출 버퍼(50mM 아세트산 완충액 pH 5.3, 30mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 0.01% 폴리디메틸실록산)에 침지하고, 25℃로 2시간 압착함으로써 단백질을 추출했다. 10μm 공업용필터(SMC)로 여과 후, 5L의 양이온 교환 담체(STREAMLINE SP(GE헬스케어))가 충전된 STREAMLINE 200 Column(GE헬스케어)에 제공하고, SP 세정 버퍼(50mM 아세트산 완충액 pH 5.3, 30mM NaCl, 0.2% Triton X-100)로 세정한 후, SP용출 버퍼(50mM 아세트산 완충액 pH 5.3, 300mM NaCl)로 용출하여 1C10 항체를 회수했다. 또한, 한외여과막(Biomax-100TF(밀리포어))을 사용하여 농축하고, 이어서 PBS에 용매 교환했다. 이것을, 프로테인 A 담체(MabSelect SuRe(GE헬스케어))를 충전한 컬럼에 제공하고, PBS로 세정한 후, 100mM 시트르산 완충액(pH3.0)으로 1C10 항체를 용출했다. 마지막으로, 한외여과막으로 농축하고, 보존 용액 (10mM 아세트산 완충액 pH 5.5, 50mM NaCl, 100mM 알기닌염산염)에 용매 치환했다. 이상의 조작에 의해, 순도 99.0% 이상의 정제 SW-1C10을 약 7.9g 조제했다.

(11) HIV 감염 게잡이원숭이로의 1C10의 투여

급성 감염기에서의 SW-1C10의 효력에 대하여 평가하기 위하여, 7마리의 게잡이원숭이의 직장에, 50,000 TCID50의, HIV 89.6주에 유래하는 Env를 SIV에 도입한 키메라 바이러스인 강독성 SHIV 89.6P(Reimann K.A.et al., J.Virol. 70, 6922-6928.)를 접종하여, 전신 감염을 성립시켰다. 게잡이원숭이의 군 구성은 대조군이 되는 무처치군을 4마리, SW-1C10 투여군을 3마리로 했다. SW-1C10의 투여는, 바이러스 접종 후 3일째, 10일째, 17일째에 정맥 경유하여 실시하고, 혈중 바이러스 억제 효과를 관찰했다.

바이러스 접종 시로부터 8주째까지는 통상 7일 간격으로, 그 이후는 4주에 1회의 빈도로, 마취한 원숭이로부터 경시적으로 말초혈(EDTA를 첨가)을 채취했다. 채취한 혈액은 원심분리에 의해 혈장을 회수하고, 다음으로, 혈구를 PBS에 희석 후, 비중 1.070의 Percoll에 중층(重層) 후, 원심분리하여 PBMCs(peripheral blood mononuclear cells, 말초혈 단핵구)를 분리했다. 혈장으로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 정량 RT-PCR에 의해 SIVmac239의 gag 영역을 증식하고, 그 생성물의 농도로부터 혈장 중의 바이러스 RNA 카피수를 산출했다. 혈장 중의 바이러스 RNA는 MagNA PureCompact Nucleic Acid isolation kit(Roche Diagnosticks)를 이용하여 추출·정제했다.

RNA량의 산출은, SIVmac239의 gag 영역을 표적으로 한 프라이머와 프로브를 설계하고, LightCycler 480 thermocycler(Roche Diagnostics)를 사용하여 행하였다. 바이러스 RNA는, QuantiTec Probe RT-PCR kit(Qiagen)를 사용하여, 증폭 및 검출을 행하였다. 프라이머 및 주형은 하기의 것을 설계했다. 즉, 포워드 프라이머로서, 「5'-GCAGAGGAGGAAATTACCCAGTAC-3'/서열번호 14」을, 리버스 프라이머로서 「5'-CAATTTTACCCAGGCATTTAATGTT-3'/서열번호 15」를, 프로브로서 「5'-FAM-TGTCCACCTGCCATTAAGTCCCGA-TAMRA-3'/서열번호 16」을 사용했다.

RT-PCR 산물은 LightCycler 480 thermocycler에 의해 형광의 검출을 행하고, 그 양을 결정했다. 혈장 중의 바이러스량은, Duplicate에서 2회의 측정을 하고, 바이러스량은 기지(旣知)의 농도의 SIV RNA를 단계 희석으로 작성한 검량선을 사용하여 환산하여 구하였다. 또한, 주형 DNA나 그 외의 혼입 DNA는 DNAaseI에서 처리했다. 이 측정계의 감도는, 100카피/ml였다.

대조가 되는 무처치의 원숭이에서는, 바이러스 접종 2주째에 혈장 1ml 중의 바이러스 RNA 카피수가 몇천만∼몇억 카피까지 상승한 이후, 8주째 이후에 바이러스학적 세트포인트로 불리우는 정상상태에 들어가고, 몇만∼몇십만 카피/ml로 전환했다. HIV의 감염 대상인 CD4＋T세포수는, 2∼4 주에 빠른 속도로 저하하고, 그 후 세포수는 낮은 레벨로 전환했다. 한편, SW-1C10 투여군에서는, 바이러스 접종 4주째의 10만∼100만 카피/ml를 피크로 바이러스량은 저감하고, 12주째 이후는 3마리 모두에, 바이러스가 검출되지 않았다. 또한, CD4＋T세포수는 크게 저하하지 않으며, 바이러스 투여 전의 레벨을 유지했다(도 6).

본 결과로부터, 놀랍게도, SW-1C10을 투여한 모든 개체에 있어서, 조기부터 바이러스가 검출 한계 이하로 되고, 12주와 같은 장기간에 걸쳐 바이러스 RNA를 검출 한계 이하로 제어했다. 이와 같은, 투여 전체예에서의 장기간의 바이러스 증식 제어가 가능한 것은 과거에 보고가 없었고, 본 발명자들은 처음으로 투여 대상에 대하여 넓게 안정적으로 바이러스 제어를 초래하는 항체를 발견하는 것에 성공했다.

SEQUENCE LISTING <110> Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KUMAMOTO UNIVERSITY CURED Inc. National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition <120> Anti HIV antibody and method to preparing thereof <130> IBL-3-PCT <150> JP2018-203114 <151> 2018-10-29 <150> JP2019-166040 <151> 2019-09-12 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atcgcgaaag tattttactg ttttcgtaac agttttgtaa taaaaaaacc tataaatatg 60 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtaataaaaa aacctataaa tatggactgg acctggagga tc 42 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgctcgagtc gcgattattt acccggagac agggagag 38 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtaataaaaa aacctataaa tatggtgttg cagacccagg tc 42 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgctcgagtc gcgattaaca ctctcccctg ttgaagctc 39 <210> 6 <211> 1425 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1425) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 6 atg gac tgg acc tgg agg atc ctc ctc ttg gtg gca gca gcc acc ggt 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 cct ggg agg tcc ctg aga gtc tcc tgt gta gcc tct gga ttc atg ttc 144 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Met Phe 35 40 45 agt aac tat gct atg cac tgg gtc cgc cag act gca ggc aag ggg ctg 192 Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Ala Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtg gct att att tca aat gat gga agc gat aaa tat tac gca 240 Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc gta tct aga gac aac tcc cag aac 288 Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn 85 90 95 aca ctg ttt ctg caa atg agt ggc ctc aga cct gag gat tcg ggt ctt 336 Thr Leu Phe Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Pro Glu Asp Ser Gly Leu 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gat ttg gac cag act att ccg gac ctg act gct 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala 115 120 125 ccc gct ttt gaa gtc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tct tca 432 Pro Ala Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 480 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 528 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 576 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 624 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 672 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 720 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 768 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 816 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 864 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 912 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 960 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1008 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1056 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1104 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1152 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375 380 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1200 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1248 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1296 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1344 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1392 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa 1425 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Met Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Ala Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Pro Glu Asp Ser Gly Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala 115 120 125 Pro Ala Phe Glu Val Trp 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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc 672 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 210 215 220 tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt 720 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240 gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 768 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 816 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 864 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 912 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 960 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 1008 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 1056 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 1104 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 1152 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 1200 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 1248 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 12 <211> 717 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <400> 12 atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc ata agc ttg ttg ctc tgg atc tct 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggt gcc tac ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtc aac cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc 144 Val Asn Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctc cta cat act aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac gtg cag aag 192 Leu Leu His Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys 50 55 60 cca ggg cag tct ccg cag ctc ctg atc ttt ttg ggt tct cat cgg gcc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser His Arg Ala 65 70 75 80 tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aaa atc agc aga gtg gag tct gag gat gtt ggc gtt tat tac 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc atg caa cct cta caa tcg tgg acg ttc ggc caa ggg acc agg gtg 384 Cys Met Gln Pro Leu Gln Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val 115 120 125 gaa atc aat cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 432 Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc 576 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 ctg agc ttg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 717 Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 13 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Asn Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu His Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser His Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Pro Leu Gln Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val 115 120 125 Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 14 Gly Phe Met Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 15 Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asp Lys 1 5 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 16 Cys Ala Arg Asp Leu Asp Gln Thr Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Ala 1 5 10 15 Phe Glu Val <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 17 Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 18 Leu Thr Ser 1 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 19 Met Gln Ser Leu Gln Thr Trp Thr 1 5

Claims

HIV로의 결합능을 가지고; 또한,
상기 항체에 결합하는 당쇄(糖鎖)가 푸코오스를 포함하지 않고: 또한,
HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는, 항체.
IgG항체로서,
서열번호 7에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 혹은, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열, 그것과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는, 그 아미노산 서열 중 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지고;
HIV로의 결합능을 가지고; 또한,
상기 항체에 결합하는 당쇄가 푸코오스를 포함하지 않는, 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
중쇄가 서열번호 7에 기재된 중쇄 아미노산 서열에서의 3개의 CDR서열을 가지고, 또한, 경쇄가 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열에서의 3개의 CDR서열을 가지는, 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
HIV감염자에 대한 단회 투여 또는 수회 투여에 의해, 90% 이상의 확률로 상기 HIV감염자의 혈중의 HIV를 검출 한계 이하로 억제하는 작용을 가지는, 항체.
제1항에 있어서,
서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 가지는, 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
하기로부터 선택되는 당쇄 구조를 가지는, 항체:
[화1]

.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
트랜스제닉 견사충에 의해 생산된, 항체.
HIV로의 결합능을 가지는 IgG항체를 포함하는 조성물로서,
상기 IgG항체의 80% 이상이 제1항 내지 제7항 또는 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항체인, 조성물.
견사선 특이적 유전자 프로모터의 하류에 기능적으로 결합한, 하기 (i)∼(x)로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 카세트:
(i) 서열번호 6에 기재된 염기서열 및/또는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(ii) 서열번호 6에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열, 및/또는, 서열번호 8에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(iii) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(iv) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(v) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(vi) 서열번호 10에 기재된 염기서열 및/또는 서열번호 12에 기재된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(vii) 서열번호 10에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열, 및/또는, 서열번호 12에 기재된 염기서열과 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(viii) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(ix) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(x) 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 또는, 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 삽입된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서,
상기 프로모터 영역이, 세리신1 프로모터, 세리신2 프로모터, 또는 세리신3 프로모터인, 발현 카세트.
제9항 또는 제10항에 기재된 발현 카세트를 함유하는, 플라스미드 벡터.
제11항에 기재된 플라스미드 벡터를 견사충의 알에 삽입하는 공정을 포함하는, 트랜스제닉 견사충의 제조 방법.
제10항에 기재된 발현 카세트가 염색체에 도입된, 트랜스제닉 견사충.
항체의 제조 방법으로서,
제13항에 기재된 트랜스제닉 견사충이 생산한 견사로부터 상기 항체를 추출하는 공정을 포함하는, 방법.
트랜스제닉 견사충에 의해 생산된, 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는, 항체.
제1항 내지 제7항 또는 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 혹은 제8항에 기재된 조성물을 유효 성분으로서 함유하는, HIV 치료용 약 또는 예방용 의약조성물.
제16항에 있어서,
HIV감염 후, 1∼5 회 투여되기 위한, 의약조성물.
제65항에 있어서,
2회 이상 투여되고, 또한, 2회째 이후의 투여가 전회(前回)의 투여의 3∼30 일 후에 행해지기 위한, 의약조성물.