JPH09508262A

JPH09508262A - トロンボポエチン

Info

Publication number: JPH09508262A
Application number: JP7518499A
Authority: JP
Inventors: イートン，ダン・エル; ドゥ・ソバージュ，フレドリック・ジ
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 1997-08-26
Also published as: AU1514695A; CA2178482C; PT101627B; IE72517B1; JPH10113186A; FI962723A; CZ192296A3; AU704266B2; SG47030A1; LU88573A1; FI121573B; HRP941020A2; GB9425831D0; NO962783D0; NO962783L; HU9601805D0; LV11632A; SK87596A3; ITTO950002A0; ES2114786B1

Abstract

(57)【要約】分離されたトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＴＰＯをコードしている分離されたＤＮＡ、およびＴＰＯを製造し精製する組換えまたは合成法が開示される。ＴＰＯの種々の型が、血液細胞、特に巨核球および巨核球祖先細胞の増幅、分化または成熟に影響を及ぼすことが示される。したがって、これらの化合物は血小板減少症の処置に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】トロンボポエチン発明の分野本発明は、造血細胞、特に血小板祖先細胞の生存、増殖、分化または成熟に影響する蛋白の分離、精製および組換えまたは化学合成に関するものである。特に本発明は、サイトカインレセプタースーパーファミリーの一員であるｍｐｌに結合しこれを活性化できる蛋白リガンドをコードしている核酸のクローニングおよび発現に関するものである。本発明はさらに、血小板減少症を包含する免疫または造血疾患を処置するための、単独でのまたは他のサイトカインと組み合わせたこれらの蛋白の用途に関するものである。発明の背景Ｉ．造血系造血系は、全ての哺乳動物の生存に必要であることが知られている、高度に専門化した成熟血液細胞を産生する。これらの成熟細胞は、酸素および二酸化炭素を輸送するために専門化した赤血球、細胞および抗体仲介免疫反応を司るＴおよびＢリンパ球、血餅の形成のために専門化した血小板または栓球、ならびに清掃屋としておよび感染と戦うための補助細胞として専門化した顆粒球およびマクロファージを包含する。顆粒球はさらに、別個の機能を有する専門化した細胞型である、好中球、好酸球、好塩基球および肥満細胞に細分化される。驚くべき事に、これらの専門化した成熟血液細胞は全て、主として骨髄に見いだされる多能性（または全能性）幹細胞と呼ばれる一つの共通する原始細胞型から誘導される（デクスター等、Ann.Rev.Cell Biol.、３巻４２３−４４１頁［１９８７］）。高度に専門化した成熟血液細胞は、哺乳動物の生涯を通じて絶えず大量に生産されねばならない。これら専門化した血液細胞の大半は、わずか数時間ないし数週間しか機能的に活性であり続けない運命にある（クロンカイト等、Blood Cell s、２巻２６３−２８４頁［１９７６］）。したがって、哺乳動物の正常で安定した状態の血液細胞の要求を支えるためには、成熟血液細胞、原始幹細胞自身、ならびに原始および成熟細胞の間にある全ての中間体または系統が決定付けられている祖先セルラインの連続的再生が必要である。造血系の核心には多能性幹細胞がある。これらの細胞は比較的少数であって、増殖により自己再生を受け娘幹細胞を産生し、または一連の分化工程においてだんだん成熟する系統制限された祖先細胞へと変換され、最終的には高度に専門化した成熟血液細胞を形成する。例えば、幹細胞から誘導されＣＦＣ−Ｍｉｘと呼称される或る種の多能性祖先細胞は、増殖（自己再生）および発達を受け、異なった骨髄細胞の全て：赤血球、好中球、巨核球（血小板の先祖）、マクロファージ、好塩基球、好酸球、および肥満細胞、を含むコロニーを作る。リンパ系統の別の祖先細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞への増殖および発達を受ける。さらに、ＣＦＣ−Ｍｉｘ祖先細胞および骨髄細胞の間には、それらの子孫への中間体になることが決定付けられている別の列の祖先細胞が存在する。系統に制限されるこれらの祖先細胞は、それらの生成する子孫を基に分類される。即ち、知られている骨髄性細胞の直接の先祖は、赤血球に対しては赤血球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、好中球およびマクロファージに対しては顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＧＭ−ＣＦＣ）、巨核球に対しては巨核球コロニー形成細胞（Ｍｅｇ−ＣＦＣ）、好酸球に対しては好酸球コロニー形成細胞（Ｅｏｓ −ＣＦＣ）、そして肥満細胞に対しては好塩基球コロニー形成細胞（Ｂａｓ−ＣＦＣ）である。多能性幹細胞および成熟血液細胞の間のその他の中間体の先祖は既知である（下記を参照されたい）か、または異なった程度の系統制限および自己再生能を持つことが発見される可能性があろう。正常な造血細胞系の根底にある原則は、多能性が失われ系統制限および成熟が獲得されるにつれて自己再生能が低下する事のようである。したがって、造血細胞スペクトルの一端には、自己再生する能力、および様々な系統特異的な、分化方向の決定付けられている祖先細胞の全てに分化する能力を有する多能性幹細胞が存在する。この能力は、原始幹細胞が造血細胞系全体に再度位置を占める骨髄移植治療の基礎である。該スペクトルの他端には、高度に系統制限された祖先と、自己再生能は喪失したが成熟した機能的活性を獲得したそれらの子孫とが存在する。幹細胞および系統制限された祖先細胞の増殖および発達は、様々な造血成長因子またはサイトカインにより注意深く調節されている。これらの成長因子のインビボでの役割は複雑であり、完全には理解されていない。インターロイキン３（ＩＬ−３）のような幾つかの成長因子は、多能性幹細胞と、例えば巨核球を包含する、分化方向を決定付けられた幾つかの系統の祖先細胞の両方を刺激することができる。顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような別の因子は、最初、その作用がＧＭ−ＣＦＣに限定されていると考えられていた。しかしながら後に、ＧＭ−ＣＳＦは、とりわけ巨核球の増殖および発達にも影響を及ぼしていることが発見された。即ち、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦは、その強さは異なっているものの、部分重複する生物活性を有することが判明した。より近年になり、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン１１（ＩＬ−１１）はいずれも単独ではｍｅｇコロニー形成に明らかな影響力を持たないが、ＩＬ−３と相乗的に作用して巨核球の成熟を刺激する（ヨネムラ等、Ex p.Hematol.、２０巻１０１１−１０１６頁［１９９２］）。このように、造血成長因子は１またはそれ以上の系統の成長および分化に影響するかも知れず、単一の祖先細胞セルラインへの影響において他の成長因子と部分重複するかも知れず、または他の因子と相乗的に作用するかも知れない。さらに造血成長因子は、全能性幹細胞から、分化方向の決定付けられている系統制限された様々な祖先を経て成熟血液細胞に至る細胞発達の異なった段階でそれらの作用を表すことができるようである。例えば、エリスロポエチン（ｅｐｏ）は成熟赤血球の祖先細胞の増殖をのみ亢進するように見える。ＩＬ−３はその作用をより早く行使し、原始幹細胞および中間体系統制限祖先細胞に影響を及ぼすように見える。幹細胞因子（ＳＣＦ）のような他の成長因子はさらにより原始的な細胞の発達に影響を及ぼし得る。任意の血液細胞またはそれらの祖先の生存、増殖、分化または成熟に影響する新規な造血成長因子は、特に、疾病により惹起されたまたは照射もしくは化学療法後の減衰した造血系の再確立を援助するために役立つという事が、前記の事から理解されるであろう。 II．巨核球形成 − 血小板の産生巨核球形成および血小板産生の調節は、マズーア、Exp.Hematol.、１５巻２４８頁［１９８７］およびホフマン、Blood、７４巻１１９６−１２１２頁［１９８９］により総説されている。簡潔に述べると、骨髄多能性幹細胞が巨核球の、赤血球の、そして骨髄球のセルラインに分化する。幹細胞と巨核球の間には、分化方向の決定された巨核球祖先細胞の階層があると信じられている。少なくとも三つのクラスの巨核球祖先細胞、即ち、バースト形成単位巨核球（ＢＦＵ−ＭＫ）、コロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）、および軽密度巨核球祖先細胞（ＬＤ−ＣＦＵ−ＭＫ）が同定されている。巨核球の成熟それ自体は、標準的形態学上の判断基準に基づく段階に分離された発達の連続体である。巨核球（ＭＫまたはｍｅｇ）ファミリーの最も早期に認識できる成員は巨核芽球である。この細胞は、最初、好塩基性細胞質と、緩い、幾分網状のクロマチンおよび数個の仁を伴う僅かに不規則な核とを有する直径２０ないし３０μｍのものである。後に巨核芽球は３２個までの核を含み得る（プロイプロイド）が、細胞質は依然としてまばらで未熟なままである。成熟が進むにつれて、核はより分葉および濃縮し、細胞質はその量を増加させそしてより好酸性且つ顆粒性となる。このファミリーの最も成熟した細胞は、その辺縁に血小板を放出する外観を与えるかも知れない。正常では、巨核球の１０％未満が芽球段階であり、５０％以上が成熟している。巨核球系列に一般に適用される自由裁量による形態学的分類は、最も初期の型に対して巨核芽球；中間の形に対して前巨核球または好塩基性巨核球；そして後期の型に対して成熟（好酸性、顆粒、または血小板産生性）巨核球である。成熟巨核球では、細胞質の線維が類洞空間へと伸張し、そこでこれらは分離して個々の血小板へと破片化している（ウィリアムズ等、Hematology、１９７２）。巨核球形成は幾つかの調節因子を含むと信じられている（ウィリアムズ等、Br .J.Haematol.、５２巻１７３頁［１９８２］およびウィリアムズ等、J.Cell Phy s iol.１１０巻１０１頁［１９８２］）。巨核球形成の初期の段階は、有糸分裂性であり、ＣＦＵ−ＭＫからの細胞増殖およびコロニー形成開始と関わっているとされているが、血小板の数による影響は受けない（バースタイン等、J.Cell Phy siol.、１０９巻３３３頁［１９８１］およびキムラ等、Exp.Hematol.、１３巻１０４８頁［１９８５］）。成熟の後期段階は、非有糸分裂性であり、核の倍数体化および細胞質成熟と関連があり、そして恐らくは末梢の血小板数によるフィードバック機構で調節されている（オデル等、Blood、４８巻７６５頁［１９７６］およびエブ等、Blood、３２巻７８７頁［１９６８］）。明確なそして特異的な巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ−ＣＳＦ）の存在が論じられてきた（マズーア、Exp.Hematol.、１５巻３４０−３５０頁［１９８７］）。しかしながら、殆どの論者は、血小板産生のように生存にとって極めて重大な過程は、この過程を独占的に司るサイトカインによって調節されているであろうと信じている。巨核球／血小板特異的サイトカインが存在するという仮説は３０年以上もの間、研究の根拠を提供してきた。しかしながら、現在のところそのようなサイトカインは、特異なＭＫ−ＣＳＦ（ＴＰＯ）として精製され、配列決定されそして検定により確立されていない。実験的に作り出された血小板減少症（ヒル等、Exp.Hematol.、１４巻７５２頁［１９８６］）およびヒト胚腎臓条件培地［ＣＭ］（マクドナルド等、J.Lab.Cl in.Med.、８５巻５９頁［１９７５］）から、ならびに人間の増殖性貧血および特発性血小板減少性紫斑病の尿抽出物（カワキタ等、Blood、６巻５５６頁［１９８３］）および血漿（ホフマン等、J.Clin.Invest.、７５巻１１７４頁［１９８５］）から、ＭＫ−ＣＳＦが部分精製されたと報告されてはいるが、それらの生理機能は殆どの場合なお知られていない。アメリカヤマゴボウ分裂促進因子により活性化された脾臓細胞（ＰＷＭ−ＳｐＣＭ）およびマウス骨髄単球セルラインＷＥＨＩ−３（ＷＥＨＩ−３ＣＭ）の条件培地を巨核球増強物質として使用した。ＰＷＭ−ＳｐＣＭはＣＦＵ−ＭＫの増殖を亢進する因子を含み（メトカーフ等、Pro.Natl.Acad.Sci.USA、７２巻１７４４−１７４８頁［１９７５］；ケセンベリー等、Blood、６５巻２１４頁［１９８５］；およびＮ．Ｎ．イスコーヴ、ヘマトポエティック・セル・ディファレンシエーション、分子および細胞生物学に関するＩＣＮ−ＵＣＬＡシンポジウム、１０巻、ゴールド等編［ニューヨーク、アカデミー・プレス］３７−５２頁［１９７８］）、それらの一つがインターロイキン３（ＩＬ−３）、多系統コロニー刺激因子である（マルチＣＳＦ［バースタイン、Blood Cells、１１巻４６９頁［１９８６］）。この培地中のその他の因子はまだ同定および分離されていない。ＷＥＨＩ−３は、比較的大量のＩＬ−３およびより少量のＧＭ−ＣＳＦを分泌するマウス骨髄単球セルラインである。ＩＬ−３は、広範囲の造血細胞の成長を強化することが見いだされている（イール等、J.Immunol.、１３巻２８２頁［１９８３］）。ＩＬ−３は、ごく初期の多能性前駆体の誘導および極めて大きな混合造血コロニーの形成において、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）の両者を包含する既知の造血ホルモンまたは成長因子の多くと相乗作用することが見いだされている（バーテルメッツ等、J.Cell Physi ol.、１２２巻３６２−３６９頁［１９８５］およびワレン等、Cell、４６巻６６７−６７４頁［１９８８］）。巨核球強化物質のその他の供給源は、マウス肺、骨、マクロファージセルライン、腹膜滲出液細胞およびヒト胚腎臓細胞の条件培地に見いだされている。幾つかの相反するデータ（マズーア、Exp.Hematol.、１５巻３４０−３５０頁［１９８７］）にも拘わらず、単球ではなく活性化Ｔリンパ球が巨核球形成を増強する役割を果たしているという幾つかの証拠がある（ガイスラー等、Br.J.Haematol. 、６０巻２３３−２３８頁［１９８５］）。これらの発見は、インターロイキンのような活性化Ｔリンパ球分泌物がＭＫの発達の調節因子であるかも知れないということを示唆している（ガイスラー等、Exp.Hematol.、１５巻８４５−８５３頁［１９８７］）。精製エリスロポエチンＥＰＯを用いた巨核球形成に関する幾つかの研究（ヴァインチェンカー等、Blood、５４巻９４０頁［１９７９］；マクレオド等、Nature、２６１巻４９２−４頁［１９７６］；およびウィリアムズ等、Exp.Hematol.、１２巻７３４頁［１９８４］）は、このホルモンがＭＫコロニー形成において増強効果を有することを示している。この事は、無血清および血清含有培養においてそしてアクセサリー細胞不在下でも証明された（ウィリアムズ等、Exp.Hematol.、１２巻７３４頁［１９８４］）。巨核球発達の四細胞段階で関与するＰＷＭ−ＳｐＣＭの効果に反して、ＥＰＯは、巨核球形成の一および二細胞段階でより関与が大きいとされた。巨核球発達の初期および後期の両者に及ぼすこれらの因子の相互作用は、なお解明されねばならない。幾つかの研究室から導き出されたデータは、個別的にＭＫコロニー刺激活性を有する唯一の多系統因子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３ならびに、より程度は低いがＢ細胞刺激因子ＩＬ−６であることを示唆している（イケブチ等、Proc.N atl.Acad.Sci.USA、８４巻９０３５頁［１９８７］）。より近年になって、幾人かの著者が、ＩＬ−１１および白血病阻害因子（ＬＩＦ）はＩＬ−３と相乗的に作用して巨核球の大きさと倍数性を増大させると報告した（ヨネムラ等、Britis h Journal of Hematology、８４巻１６−２３頁［１９８３］；バースタイン等、J.Cell.Physiol.、１５３巻３０５−３１２頁［１９９２］；メトカーフ等、B lood、７６巻５０−５６頁［１９９０］；メトカーフ等、Blood、７７巻２１５０−２１５３頁［１９９１］；ブルーノ等、Exp.Hematol.、１９巻３７８−３８１頁［１９９１］；およびヨネムラ等、Exp.Hematol.、２０巻１０１１−１０１６頁［１９９２］）。その他の興味深い文献は、エプスタイン等、米国特許第４９６２０９１号；チョング、米国特許第４８７９１１１号；フェルナンデス等、米国特許第４６０４３７７号；ウィスラー等、米国特許第４５１２９７１号；ゴットリープ、米国特許第４４６８３７９号；ベネット等、米国特許第５２１５８９５号；コーガン等、米国特許第５２５０７３２号；キムラ等、Eur.J.Immunol.、２０（９）巻１９２７−１９３１頁［１９９０］；シーコー等、J.of Immunol.、１４４（４）巻１４８４−１４８９頁［１９９０］；ワレン等、J.of Immunol.、１４０（１）巻９４−９９頁［１９８８］；ワレン等、Exp.Hematol.、１７（１１）巻１０９５−１０９９頁［１９８９］；ブルーノ等、Exp.Hematol.、１７（１０）巻１０３８−１０４３頁［１９８９］；タニカワ等、Exp.Hematol.、１７（８）巻８８３−８８８頁［１９８９］；コイケ等、Blood、７５（１２）巻２２８６−２２９１頁［１９９０］；ローテム、Blood、７５（５）巻１５４５−１５５１頁［１９８９］；レニック等、Blood、７３（７）巻１８２８−１８３５頁［１９８９］；およびクルターバック等、Blood、７３（６）巻１５０４−１５１２頁［１９８９］を包含する。 III．血小板減少症血小板は血液凝固機構の決定的要素である。血小板減少症と呼ばれる循環レベルの血小板の涸渇は、様々な臨床状態および疾病を引き起こす。血小板減少症は一般に、リットル当たり１５０ｘ１０⁹以下の血小板数として定義される。血小板減少症の主たる原因は、血小板の寿命に基づいて大きく三つの範疇に分けることができる。即ち、（１）骨髄による血小板の産生障害、（２）脾臓での血小板の破壊（脾腫）、または、（３）末梢循環における血小板の破壊の増加（例えば自己免疫血小板減少症または化学および照射療法）である。加えて、血小板の少ない大量の血液製剤を迅速に投与された患者においては、希釈による血小板減少症を発症するかも知れない。血小板減少症の臨床的な出血の発現は、血小板減少症の重篤度、その原因、および起こり得る随伴凝固障害に依存する。一般に、血小板数が１リットル当たり２０および１００ｘ１０⁹の間の患者は、外傷後過度の出血の危険性があり、血小板数が１リットル当たり２０ｘ１０⁹以下の患者は自然出血し得る。この後者の患者は、免疫およびウイルスの危険を随伴する血小板輸血の候補者である。いかなる血小板減少症の程度についても、その原因が血小板生産の低下である場合の出血傾向は、血小板破壊の増加の場合よりも重篤である。後者の状況においては、血小板の代謝回転を加速すれば、若齢の、大きな、そして止血の点でより有効な血小板の循環がもたらされる。血小板減少症は、下に簡潔に記載される様々な疾患からもたらされ得る。より詳細な説明は、Ａ．Ｉ．シャフナー、「血小板減少症および血小板機能の疾患」、インターナル・メディスン、３版、ジョン・Ｊ．ハットン等編、リトル・ブラウン・アンド・Ｃｏ．、ボストン／トロント／ロンドン［１９９０］に見いだすことができる。（ａ）血小板産生障害による血小板減少症先天性血小板減少症の原因には、体質性再生不良性貧血（ファンコニ症候群）および、骨格奇形を随伴し得る先天性無巨核球性血小板減少症が包含される。血小板産生の後天性疾患は、巨核球の過形成または無効な血小板形成のいずれかによって引き起こされる。巨核球過形成は、骨髄無形成（特発型または化学療法剤もしくは照射療法による骨髄抑制を包含する）、骨髄線維症、白血病、および転移腫瘍または肉芽腫による骨髄の侵襲を包含する様々な状態からもたらされ得る。幾つかの状況においては、毒素、感染性物質、または薬物が比較的選択的に血小板形成を妨害する。例には、アルコールおよび或る種のウイルス感染により引き起こされる一過性血小板減少症ならびにサイアザイド利尿剤の投与に随伴する緩和な血小板減少症が包含される。最後に、巨赤芽球の工程に二次的な無効血小板形成（葉酸またはＢ₁₂欠乏）もまた、通常共存する貧血および白血球減少症と共に血小板減少症を引き起こし得る。血小板産生低下に起因する血小板減少症の現行の処置は、骨髄の機能不全の根底にある原因の同定と逆転に依っている。同種免疫はさらなる血小板輸注への不応性を導くかも知れないため、血小板輸注は、通常、重篤な出血合併症を持つ患者のために、または外科処置の間に適用するためにとっておかれる。重篤な血小板減少症が原因の粘膜出血は、抗フィブリン溶解剤の経口または静脈内投与によって緩和され得る。しかしながら、もし抗フィブリン溶解剤が播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の患者に用いられると、血栓症の合併症が発症するかも知れない。（ｂ）脾臓による血小板の破壊に起因する血小板減少症いかなる原因による脾腫も、緩和なないし中等度の血小板減少症を随伴し得る。これは、下に論じられる免疫仲介血小板減少症の場合の脾臓による血小板の積極的な破壊とは対照的に、主として脾臓の血小板破壊の受動的工程（脾機能亢進症）である。脾機能亢進症の最も一般的な原因はアルコール性硬変による門脈高血圧からのうっ血性脾腫であるが、他の型のうっ血性、浸潤性、またはリンパ球増殖性脾腫もまた血小板減少症を随伴する。脾機能亢進症単独の結果としては、血小板数は一般に１リットル当たり５０ｘ１０⁹を下回ることはない。（ｃ）非免疫仲介性血小板破壊による血小板減少症血小板減少症は、種々の非免疫学的過程による血小板破壊の加速から起こり得る。この型の疾患は、播種性血管内凝固、静脈内補綴器具、血液の過度の身体循環、および血栓症性栓球紫斑病のような血栓症性微小血管障害を包含する。これら全ての状況において、人工的表面または異常な脈管内膜に暴露された循環血小板は、これらの部位で消費されるかまたは損傷を受け、次いで網内系により早々と一掃される。播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の起こる病的状態または異常は、ブラウンワルド等（編）、ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナル・メディスン、１１版、１４７８頁、マクグロウ・ヒル［１９８７］に極めて詳細に開示されている。心臓弁および大動脈内バルーンを包含する静脈内補綴器具は緩和なないし中等度の破壊的血小板減少症を引き起こし得、心肺バイパスまたは血液透析を受けている患者における一過性血小板減少症は、過度の身体循環における血小板の消耗または損傷から引き起こされ得る。（ｄ）薬物誘発性免疫血小板減少症１００以上の薬物が免疫学的に仲介される血小板減少症に関わっている。しかしながら、キニジン、キニン、金、スルホンアミド類、セファロチン、およびヘパリンのみが良く性格決定されているに過ぎない。薬物誘発性血小板減少症は極めて重篤であることが多く、そして典型的には、患者が感作薬物療法を受けている最中に、数日のうちに急激に起こる。（ｅ）免疫（自己免疫）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）成人のＩＴＰは、自己免疫血小板破壊を特徴とする慢性疾患である。自己抗体は通常ＩｇＧであるが、他の免疫グロブリンもまた報告されている。ＩＴＰの自己抗体は血小板の膜ＧＰII_bIII_aに付随していることが判明しているが、血小板抗原の特異性は殆どの場合同定されていない。感作された血小板の血管外破壊は脾臓および肝臓の網内系で起こる。ＩＴＰの全症例の半数以上は特発性であるが、多くの患者は、基礎となるリウマチ性もしくは自己免疫疾患（例えば、全身性紅斑性狼瘡）またはリンパ球増殖性疾患（例えば慢性リンパ球性白血病）を有する。（ｆ）ＨＩＶ誘発ＩＴＰＩＴＰはますますＨＩＶ感染の一般的合併症となっており（モリス等、Ann.In tern.Med.、９６巻７１４−７１７頁［１９８２］）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と診断された患者、ＡＩＤＳ関連複合体を有する患者、およびＡＩＤＳの徴候は無いがＨＩＶに感染している患者のいずれにおいても、疾病の進行の任意の段階で起こり得る。ＨＩＶ感染は、細胞性免疫機能の深刻な不全ならびに日和見感染および悪性腫瘍の発生によって最終的に特徴付けられる、伝染性疾患である。ＨＩＶによる感染が招く主たる免疫学的異常は、ＣＤ４細胞表面糖蛋白を発現するＴリンパ球の進行性涸渇および機能不全である（レイン等、Ann.Rev. Immunol.、３巻４７７頁［１９８５］）。恐らくＣＤ４ヘルパー／インデューサーＴ細胞機能の喪失が、細胞性および液性免疫の深刻な不全の根底にあり、これが、ＡＩＤＳの特徴である日和見感染および悪性腫瘍につながるのであろう（Ｈ．レイン、上記）。ＨＩＶに随伴するＩＴＰの機構は未知であるが、これは、ＨＩＶに随伴しないＩＴＰの機構とは相違すると信じられている（ワルシュ等、N.Eng.J.Med.、３１１巻６３５−６３９頁［１９８４］；およびラトナー、Am.J.Med.、８６巻１９４−１９８頁［１９８９］）。 IV．血小板減少症のための現行の治療血小板減少症の患者の処置に対する治療的アプローチは、臨床状況の重篤度および緊急性に支配される。その処置はＨＩＶ付随性と非ＨＩＶ関連性血小板減少症について似通っており、幾つかの異なった治療的アプローチが用いられてはいるが、その治療にはなお論争がある。血小板減少症と診断された患者の血小板数は、グルココルチコイド（例えばプレドニソロン）療法によってうまく増加したが、殆どの患者においてその反応は不完全であるか、またはグルココルチコイドの用量が減らされもしくはその投与が中断されると再発が起こる。ＨＩＶ付随性ＩＴＰを有する患者での研究に基づき、幾人かの研究者は、グルココルチコイド療法がＡＩＤＳの素因を招くかも知れないと示唆している。グルココルチコイドは通常、血小板数が２０ｘ１０⁹／リットル未満に下がった時、または自然出血が起こる時に投与される。グルココルチコイドに対し不応性の患者に対しては、化合物：４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−２−［３−（４−モルホリニル） −３−プロパノン−１−イル］６Ｈ−チエノ［３，２，ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３，ａ］［１，４］ジアゼピン（ＷＥＢ２０８６）を使用して非ＨＩＶ付随性ＩＴＰの重篤な症例が首尾良く処置された。血小板数３７０００−５８０００／μｌの患者をＷＥＢ２０８６で処置し、１−２週間の処置の後、血小板数は１４００００−１９００００／μｌに増加した（ＥＰ３６１０７７およびローマン等、Lancet、１１４７［１９８８］）。後天性無巨核球性血小板減少症紫斑病（ＡＡＴＰ）のための最適な処置は不確定であるが、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、ヒト胸腺組織に対するウマ抗血清が、長期の完全な寛解を産むことが示された（トリンブル等、Am.J.Hematol. 、３７巻１２６−１２７頁［１９９１］）。しかしながら、最近の報告は、ＡＴＧの造血効果はチメロサルに帰することができ、ここでこの蛋白は恐らく水銀担体として作用していると指摘している（パネラ等、Cancer Research、５０巻４４２９−４４３５頁［１９９０］）。脾臓切除術で良好な結果が報告されている。脾臓切除術は、多くの患者において血小板破壊の主たる部位および自己抗体産生の主たる源を除去する。この手法は、多数の患者において長期の無処置寛解をもたらす。しかしながら、一般に、免疫が傷つけられている患者では外科的手法は回避すべきであるから、脾臓切除術は、血小板減少症の重篤な症例（例えば、重篤なＨＩＶ付随ＩＴＰ）、２ないし３週間のグルココルチコイド処置に応答しない患者、またはグルココルチコイド投与の中断後に応答の持続が達成されない患者にのみ推奨される。現在の科学知識に基づいた時、脾臓切除術が患者をＡＩＤＳに罹患させ易くするかどうかは明らかでない。プレドニソロン療法および脾臓切除術に加えて、或る種の細胞毒性物質、例えばビンクリスチン、およびアジドチミジン（ＡＺＴ）ジドブジン）もまたＨＩＶ誘発ＩＴＰを処置する見込みがある。しかしながらその結果は予備的なものである。前記のことから、血小板減少症を処置する一つの方法は、巨核球またはその前駆体の血小板産生型への分化および成熟を加速することのできる物質を得ることであるという事が理解できるであろう。一般に「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）と呼ばれるこのような物質の同定に、かなりの努力が費やされてきた。文献中に一般的に見いだされるＴＰＯの別名は、血小板形成刺激因子（ＴＳＦ）、巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ−ＣＳＦ）、巨核球刺激因子および巨核球強化物質を包含する。ＴＰＯの活性は、古く１９５９年に観察されており（ラック等、Med.Ex p.、１巻１２５頁）、この物質を特性決定し精製する試みが今日まで続けられてきた。ＴＰＯ活性ポリペプチドの部分的精製の報告が存在するものの（例えば、タイリーン等、J.Biol.Chem.、２６２巻３２６２［１９８７］およびホフマン等、J.Clin.Invest.、７５巻１１７４頁［１９８５］）、他は、ＴＰＯはそれ自身独立した実体ではなく、単に既知ホルモンの多機能の具現であるとしている（ＩＬ−３、スパロウ等、Prog.Clin.Biol.Res.、２１５巻１２３頁［１９８６］）。その形態または起源に拘わらず、血小板形成活性を有する分子には有意な治療的価値があろう。ＴＰＯとして明確に同定された蛋白は無いが、推定的サイトカインレセプターであるｍｐｌが血小板形成シグナルを変換し得るという最近の発見には、かなりの関心が集まっている。Ｖ．ｍｐｌは巨核球形成サイトカインレセプターである。造血細胞の増殖および成熟は、多能性幹細胞の増殖および多系統分化を正にまたは負に調節する因子により緊密に調節されていると信じられている。これらの作用は、特異的細胞表面レセプターに対する細胞外蛋白因子の高親和性結合を介して仲介される。これらの細胞表面レセプターは、かなりの相同性を共有し、そして一般にサイトカインレセプタースーパーファミリーの成員として分類される。このスーパーファミリーの成員は、ＩＬ−２（βおよびγ鎖）（ハタケヤマ等、Science、２４４巻５５１−５５６頁［１９８９］；タケシタ等、Science、２５７巻３７９−３８２頁［１９９１］）；ＩＬ−３（イトウ等、Science、２４７巻３２４−３２８頁［１９９０］；ゴーマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻５４５９−５４６３頁［１９９０］；キタムラ等、Cell、６６巻１１６５− １１７４頁［１９９１ａ］；キタムラ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻５０８２−５０８６頁［１９９１ｂ］）、ＩＬ−４（モスレイ等、Cell、５９巻３３５ −３４８頁［１９８９］、ＩＬ−５（タカキ等、EMBO J.、９巻４３６７−４３７４頁［１９９０］；タヴァーニア等、Cell、６６巻１１７５−１１８４頁［１９９１］、ＩＬ−６（ヤマサキ等、Science、２４１巻８２５−８２８頁［１９８８］；ヒビ等、Cell、６３巻１１４９−１１５７頁［１９９０］）、ＩＬ−７（グッドウィン等、Cell、６０巻９４１−９５１頁［１９９０］）、ＩＬ−９（ルノー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻５６９０−５６９４頁［１９９２］）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ギアリング等、EMBO J.、８巻３６６７−３６７６頁［１９９１］；ハヤシダ等、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA、２４４巻９６５５−９６５９頁［１９９０］）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フクナガ等、Cell、６１巻３４１−３５０頁［１９９０ａ］；フクナガ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻８７０２−８７０６頁［１９９０ｂ］；ラーセン等、J.Exp.Med.、１７２巻１５５９−１５７０頁［１９９０］）、ＥＰＯ（ドゥアンドレア等、Cell、５７巻２７７−２８５頁［１９８９］；ジョーンズ等、Blood、７６巻３１−３５頁［１９９０］）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）（キアリング等、EMBO J.、１０巻２８３９−２８４８頁［１９９１］）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（ローズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻８６４１−８６４５頁［１９９１］）のためのレセプター、そしてさらにプロラクチン（ブーティン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻７７４４−７７４８頁［１９８８］：エダリー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８６巻２１１２−２１１６頁［１９８９］）、成長ホルモン（ＧＨ）（リュング等、Nature、３３０巻５３７−５４３頁［１９８７］）および繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（デイヴィス等、Science、２５３巻５９−６３頁[１９９１]のためのレセプターをも包含する。サイトカインレセプタースーパーファミリーの成員は三つの機能的範疇に分けることができる（総説についてはニコラ等、Cell、６７巻１−４頁［１９９１］を参照されたい）。第一のクラスは、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）または顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）のような一本鎖レセプターを含み、これらは細胞外ドメインを介してリガンドと高い親和性で結合し、さらに細胞内シグナルを作り出す。第二のクラスのレセプター、いわゆるα サブユニットは、インターロイキン６レセプター（ＩＬ６−Ｒ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子レセプター（ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）、インターロイキン３レセプター（ＩＬ３−Ｒα）およびサイトカインレセプタースーパーファミリーのその他の成員を包含する。これらのαサブユニットは、リガンドを低い親和性で結合させるが、細胞内シグナルを変換することはできない。シグナルを送ることのできる高親和性レセプターは、αサブユニットと、βサブユニットと呼ばれるサイトカインレセプターの第三のクラスの成員、例えば三つのαサブユニットＩＬ３−ＲαおよびＧＭ−ＣＳＦ−Ｒに対する共通のβサブユニット、βｃ、との間のヘテロ二量体によって生成される。ｍｐｌがサイトカインレセプタースーパーファミリーの一員であるという証拠は、配列の相同性（ギアリング、EMBO J、８巻３６６７−３６７６頁［１９８８］；バザン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻６８３４−６９３８頁［１９９０］；デイヴィス等、Science、２５３巻５９−６３頁［１９９１］およびヴィゴン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻５６４０−５６４４頁［１９９２］）および増殖のシグナルを変換するその能力に由来する。マウスｃ−ｍｐｌの分子クローニングから導き出された蛋白配列は、この蛋白が他のサイトカインレセプターと相同性であることを明らかにしている。細胞外ドメインは４６５アミノ酸残基を含んでおり、二つのサブドメインで構成され、その各々は４個の高度に保存されたシステイン、ならびにＮ末端サブドメインおよびＣ末端サブドメインに特別なモチーフを持っている。リガンド結合細胞外ドメインは、類似の二重βバレル折り畳み構造形態を有すると予想される。この二重の細胞外ドメインは、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターに共通するシグナル変換鎖ならびにＬＩＦの低親和性結合ドメインと極めて相同的である（ヴィゴン等、Oncogene、８巻２６０７−２６１５頁［１９８３］）。したがって、ｍｐｌはサイトカインレセプターの低親和性リガンド結合クラスに属しているかも知れない。マウスｍｐｌと成熟ヒトｍｐｌＰとの比較は、これら二つの蛋白が８１％の配列一致を示すことを明らかにしている。より詳細には、Ｎ末端およびＣ末端細胞外サブドメインは、各々７５％および８０％の配列一致を共有している。最も保存されたｍｐｌ領域は、９１％のアミノ酸一致を示す細胞質ドメインであり、貫膜ドメイン付近の３７残基から成る配列が、両方の種で一致している。したがって、ｍｐｌは、サイトカインレセプタースーパーファミリーの最も保存された成員の一つであると報告されている（ヴィゴン、上記）。ｍｐｌが増殖シグナルを変換できる機能的レセプターであるという証拠は、ｍｐｌ細胞質ドメインを持つ既知のサイトカインに対して高親和性を有するサイトカインレセプター由来の細胞外ドメインを含むキメラレセプターの組み立てに依っている。ｍｐｌに対する既知のリガンドは報告されていないことから、ＩＬ− ４ＲまたはＧ−ＣＳＦＲのようなクラス１サイトカインレセプター由来の細胞外ドメインを結合させるキメラ高親和性リガンドを組み立てる必要があった。ヴィゴン等、上記、は、Ｇ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインをｃ−ｍｐｌの貫膜および細胞質ドメインの両者と融合させた。ＩＬ−３依存性セルライン、ＢＡＦ／Ｂ０３（Ｂａ／Ｆ３）を、全長のＧ−ＣＳＦＲ対照と共にＧ−ＣＳＦＲ／ｍｐｌキメラによりトランスフェクトさせた。このキメラによりトランスフェクトさせた細胞は、サイトカインＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦの存在下で等しく良好に生育した。同様に、Ｇ−ＣＳＦＲでトランスフェクトさせた細胞もまた、ＩＬ−３またはＧ −ＣＳＦいずれかの中で良好に生育した。成長因子の不在下では全ての細胞が死滅した。同様の実験が、スコダ等、EMBO J．、１２（７）巻２６４５−２６５３頁［１９９３］によって行われたが、ここでは、ヒトＩＬ−４レセプター（ｈＩＬ−４−Ｒ）の細胞外および貫膜ドメインの両方をマウスｍｐｌ細胞質ドメインに融合させ、マウスＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３セルライン中にトランスフェクトさせた。野生型ｈＩＬ−４−ＲでトランスフェクトさせたＢａ／Ｆ３細胞は、種特異的ＩＬ−４またはＩＬ−３のいずれかの存在下で正常に増殖した。ｈＩＬ−４Ｒ／ｍｐｌでトランスフェクトさせたＢａ／Ｆ３細胞はｈＩＬ−４の存在下で（ＩＬ−３の存在下または不在下で）正常に増殖し、Ｂａ／Ｆ３細胞においてｍｐｌ細胞質ドメインが増殖シグナルを変換するために必要な全ての要素を含んでいることを立証した。これらのキメラ実験は、ｍｐｌ細胞質ドメインの増殖シグナル伝達能を証明しているが、ｍｐｌ細胞外ドメインがリガンドを結合できるかどうかに関してはわからない。これらの結果は、少なくとも二つの可能性、即ち、ｍｐｌはＥＰＯ− ＲまたはＧ−ＣＳＦＲのような一本鎖（クラス１）レセプターであるか、またはこれはＩＬ−３のようなα−サブユニットを要するシグナル変換β−サブユニット（クラス３）であるという可能性に合致する（スコダ等、上記）。 VI．ｍｐｌリガンドはトロンボポエチン（ＴＰＯ）である。上に記載のように、血清は、様々な他のサイトカインと相乗的に作用して巨核球の成長および成熟を促進する、時にはトロンボポエチン（ＴＰＯ）と呼ばれる特異な因子を含むことが示唆された。多数のグループによりかなりの努力が費やされてきたにも拘わらず、このような天然の因子は血清または他のいかなる供給源からも分離されたことはなかった。ｍｐｌが巨核球刺激因子を直接結合させることができるかどうかは未知であるとしても、最近の実験は、ｍｐｌが、無形成性骨髄の患者の血清に見いだされる因子または因子群からの増殖シグナルの変換に関わっていることを証明している（メシア等、Blood、８２（５）巻１３９５ −１４０１頁［１９９３］）。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦとは別個の特異な血清コロニー形成因子がｍｐｌを介して増殖シグナルを変換するという証拠は、原始および分化方向が決定付けられた造血セルラインにおけるｃ−ｍｐｌ発現の分布の調査ならびにこれらセルラインの一つにおけるｍｐｌアンチセンスの研究に由来する。免疫精製されたヒト造血細胞での逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを使用して、メシア等、上記、は、強いｍｐｌｍＲＮＡメッセージはＣＤ３４⁺精製された細胞、巨核球および血小板にのみ見いだされることを証明した。骨髄（ＢＭ）から精製されたＣＤ３４⁺細胞は、全ＢＭ細胞の約１％をなし、全系統の原始および分化方向を決定付けられた祖先細胞に富んでいる（例えば、赤血球、顆粒球マクロファージ、および巨核球）。ｍｐｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、無形成性骨髄の患者由来の血清（巨核球コロニー刺激活性［ＭＫ−ＣＳＡ］の豊富な供給源）で培養された多能性ＣＤ３４⁺細胞からの巨核球コロニー形成を抑制することが示された。この同じアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、赤血球または顆粒球マクロファージコロニー形成には影響を及ぼさなかった。ｍｐｌがリガンドを直接結合させるかどうか、そして巨核球形成を引き起こすことが示された血清因子がｍｐｌを介して働いているかどうかは未だ不明であった。しかしながら、もしｍｐｌが事実リガンドと直接結合するならば、そのアミノ酸配列は、高度に保存され、そしてヒトおよびマウスのｍｐｌ細胞外ドメインの間のかなりの配列一致のために、種交差反応性を有すると思われるという事が示唆された（ヴィゴン等、上記［１９９３］）。 VII．目的前記の事柄に鑑み、当分野では、血小板減少症の処置における治療用途のための、造血細胞、特に巨核球またはその先祖の増殖、分化および成熟を刺激できる分子を分離および同定する必要性が、現在、そして継続して、あることが理解されるであろう。このような分子はｍｐｌリガンドであり、したがって、細胞の成長および分化におけるそれらの役割を評価するため、係るリガンドを分離するさらなる必要性が存在すると信じられる。従って、巨核球の成熟血小板産生型への増殖、分化および／または成熟を刺激することのできる薬学上純粋な分子を得ることが本発明の一つの目的である。造血疾患、特に血小板減少症の処置における治療用途のための型で当該分子を提供することが、もう一つの目的である。ｍｐｌとして知られるサイトカインスーパーファミリーレセプターをインビボで結合することのできる蛋白リガンドを分離、精製および特異的に同定し、増殖シグナルを変換することが、本発明のさらなる目的である。係る蛋白リガンドをコードしている核酸分子を提供し、そして、これらの核酸分子を用いて診断および治療用途のために組換え細胞培養中でｍｐｌ結合リガンドを生成させることが、また別の目的である。それらのアミノ酸配列変異体、変異体糖蛋白型および共有結合誘導体を包含する、該蛋白リガンドの誘導体および修飾された型を提供することがさらに別の目的である。ｍｐｌリガンドおよびヘテロローガスな蛋白を結びつけた融合ポリペプチド型およびそれらの共有結合誘導体を提供することが、さらなる目的である。血小板および赤血球祖先細胞の両方の増殖および成長を調節することのできる蛋白を産生させるための、ｍｐｌリガンドをＥＰＯ配列からのアミノ酸付加および置換と結びつけた変異体ポリペプチド型を提供することが、さらなる目的である。ｍｐｌリガンドまたはその融合型に対する抗体を作製するための免疫原を製造すること、および係るリガンドを結合することのできる抗体を取得することが、さらに別の目的である。本発明のこれらのおよびその他の目的は、本明細書を全体として考える時、当業者には明らかであろう。発明の要約本発明の目的は、巨核球の成熟血小板産生型への増殖、成熟および／または分化を刺激することのできる、「ｍｐｌリガンド」（ＭＬ）または「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）と呼ばれる、分離された哺乳動物の巨核球形成性増殖および成熟促進蛋白を提供することによって達成される。この実質上均質な蛋白は、（１）精製すべきｍｐｌリガンド分子を含有する供給源の血漿を、固定されたレセプターポリペプチド、特に、支持体上に固定されたｍｐｌまたはｍｐｌ融合ポリペプチドと、精製すべきｍｐｌリガンド分子が固定されたレセプターポリペプチド上に選択的に吸着されるような条件下で、接触させ、（２）この固定されたレセプターポリペプチドおよびその支持体を洗浄して、非吸着物質を除去し、そして、（３）ｍｐｌリガンド分子を、それらが吸着されている固定されたレセプターポリペプチドから、溶離緩衝液によって溶出する、ことからなる方法によって、天然供給源から精製することができる。好ましくは、この天然供給源は、ｍｐｌリガンドを含有する哺乳動物の血漿または尿である。所望によりこの哺乳動物は再生不良性であり、固定されたレセプターはｍｐｌ−ＩｇＧ融合物である。所望により、好ましい巨核球形成性増殖および成熟促進蛋白は、合成または組換え手段により作成された、分離された実質上均質なｍｐｌリガンドポリペプチドである。本発明に係る「ｍｐｌリガンド」ポリペプチドまたは「ＴＰＯ」は、好ましくは、高度に精製された実質上均質なブタｍｐｌリガンドポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも通算７０％の配列一致、そしてこのブタｍｐｌリガンドポリペプチドの「ＥＰＯドメイン」と少なくとも８０％の配列一致を有する。所望により、本発明に係るｍｐｌリガンドは、図１（配列番号１）に供される成熟アミノ酸配列を有する成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはその変異体もしくは転写後修飾された型であるか、または、成熟ヒトｍｐｌリガンドと約８０％の配列一致を有する蛋白である。所望により、ｍｐｌリガンド変異体は、成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）のフラグメント、特にアミノ末端または「ＥＰＯドメイン」フラグメントである。好ましくは、このアミノ末端フラグメントは、第一および第四のシステイン残基の間のヒトＭＬ配列の実質上全てを保持しているが、その領域外の実質的な付加、除去または置換を含むこともある。この態様に従うと、当該フラグメントポリペプチドは、式：Ｘ−ｈＭＬ（７−１５１）−Ｙ［式中、ｈＭＬ（７−１５１）はＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹（両端の番号を含む）までのヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミノ酸配列を表し；Ｘは、Ｃｙｓ⁷のアミノ基または成熟ｈＭＬもしくはそのアミノ酸残基伸長物の１もしくはそれ以上のアミノ末端アミノ酸残基、例えばＭｅｔ、Ｔｙｒまたは、蛋白分解的開裂部位（例えば因子Ｘａまたはトロンビン）を含むリーダー配列を表し；そしてＹは、Ｃｙｓ¹⁵¹ のカルボキシ末端基または成熟ｈＭＬもしくはその伸長物の１もしくはそれ以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を表す］によって表すことができる。所望により、ｍｐｌリガンドポリペプチドまたはそのフラグメントは、ヘテロローガスなポリペプチドと融合させることができる（キメラ）。好ましいヘテロローガスなポリペプチドは、サイトカイン、コロニー刺激因子またはインターロイキンもしくはそのフラグメント、特にｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＬＩＦである。所望による好ましいヘテロローガスポリペプチドは、免疫グロブリン鎖、特にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはそれらのフラグメント、特にＩｇＧ重鎖の不変ドメインを含むものである。本発明の別の態様は、生物学的に活性であり、且つ好ましくはヒトｍｐｌでトランスフェクトされたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡ中への標識されたヌクレオチド（例えば、³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激することのできる、分離されたｍｐｌアゴニストを含む組成物を提供する。所望によりこのｍｐｌアゴニストは生物活性なｍｐｌリガンドであり、そして好ましくはマウス血小板リバウンド検定において循環血小板への³⁵Ｓの取り込みを刺激することができる。好適なｍｐｌアゴニストは、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬ、およびｐＭＬ２またはそれらのフラグメントを包含する。別の態様において、本発明はｍｐｌリガンドに結合することのできる分離された抗体を提供する。ｍｐｌリガンドに結合できる分離された抗体は、所望により第二のポリペプチドと融合していてよく、該抗体またはその融合物は、固定されたｍｐｌについて上に記載されたような供給源からｍｐｌリガンドを分離および精製するために使用することができる。この態様のさらなる側面において、本発明は、該抗体を、リガンドの含有が疑われる試料、特に血清試料と接触させ、結合が起こっているか否かを検出することからなる、インビトロまたはインビボでｍｐｌリガンドを検出する方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、ｍｐｌリガンドまたはそのフラグメントをコードしている核酸分子であって、その核酸分子が所望により検出し得る原子団で標識されていてよい、分離された核酸分子、および、ｍｐｌリガンドをコードしている配列を有する核酸分子に対し相補的であるか、または中等度ないし高度緊縮条件下でこれとハイブリダイズする配列を有する核酸分子を提供する。好ましい核酸分子は、ヒト、ブタ、およびマウスｍｐｌリガンドをコードしているものであり、ＲＮＡおよびＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両者を包含する。この態様のさらなる側面において、該核酸分子はｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡであり、さらに、複製可能なベクターを含んでおり、ここで該ＤＮＡはベクターにより形質転換された宿主により認識される調節配列と機能的に結合している。所望により、このＤＮＡは、図１の５'−３'（配列番号２）、３'−５'に供される配列を有するｃＤＮＡまたはそれらのフラグメントである。この側面はさらに、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、および、該ＤＮＡを用いてｍｐｌリガンドの生産をさせる方法であって、好ましくは該ｍｐｌリガンドをコードしているｃＤＮＡを形質転換させた宿主細胞の培養で発現させ、このｍｐｌリガンドを宿主細胞または宿主細胞培養から回収することからなる方法を包含する。この方法により製造されたｍｐｌリガンドは、好ましくはヒトｍｐｌリガンドである。本発明はさらに、治療上有効な量のｍｐｌリガンドを哺乳動物に投与することからなる、造血疾患、とりわけ血小板減少症を有する哺乳動物を処置する方法を包含する。所望によりこのｍｐｌリガンドは、サイトカイン、とりわけコロニー刺激因子またはインターロイキンと組み合わせて投与されてよい。好ましいコロニー刺激因子またはインターロイキンは、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＬＩＦ、Ｇ −ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１を包含する。本発明はさらに、（１）ＴＰＯを含有する細胞を破壊または溶菌し、（２）所望により、可溶性物質をＴＰＯを含有する不溶性物質から分離し、（３）不溶性物質中のＴＰＯを可溶化緩衝剤で可溶化し、（４）可溶化されたＴＰＯを他の可溶性および不溶性物質から分離し、（５）酸化還元緩衝液中でＴＰＯを再折り畳みし、そして、（６）正しく折り畳まれたＴＰＯを誤折り畳みされたＴＰＯから分離する、ことからなる、ＴＰＯ産生微生物からＴＰＯ（ＭＬ）を分離および精製するための方法を包含する。この方法は、ＴＰＯを含有する不溶性物質を、カオトロピック剤で可溶化することを提供しており、ここでこのカオトロピック剤は、グアニジンの塩、チオシアン酸ナトリウム、または尿素から選択される。この方法はさらに、可溶化されたＴＰＯを、遠心、ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーから選ばれる１またはそれ以上の工程によって他の可溶性および不溶性物質から分離することを提供している。この方法の再折り畳み工程は、酸化および還元剤の両者を含む酸化還元緩衝液を提供している。一般に、酸化剤は酸素または少なくとも１個のジスルフィド結合を含む化合物であり、還元剤は少なくとも１個の遊離スルフヒドリルを含む化合物である。好ましくは、酸化剤は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）およびシスチンから選ばれ、還元剤は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびシステインから選ばれる。最も好ましくは、酸化剤は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）であり、還元剤は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）である。酸化剤のモル比は還元剤のモル比と等しいかまたはより大であることもまた好ましい。酸化還元緩衝液はさらに、好ましくはＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯから選ばれ少なくとも１％のレベルで存在する洗浄剤を含有する。酸化還元緩衝液はさらに、好ましくは約０．１−０．５Ｍの濃度範囲のＮａＣｌ、および好ましくは１５％以上の濃度のグリセロールを含有する。酸化還元緩衝液のｐＨは、好ましくは約ｐＨ７．５− ｐＨ９．０の範囲であり、再折り畳み工程は４度で１２−４８時間実施する。再折り畳み工程は、ＥＰＯドメインのアミノ末端に最も近いＣｙｓとカルボキシ末端に最も近いＣｙｓの間にジスルフィド結合が形成された、生物活性なＴＰＯを生成する。本発明はさらに、（１）微生物の少なくとも細胞外膜を溶菌し、（２）ＴＰＯを含有する溶菌液をカオトロピック剤で処理し、（３）このＴＰＯを再折り畳みし、そして、（４）不純物および誤折り畳みされたＴＰＯを正しく折り畳まれたＴＰＯから分離する、ことからなる、生物活性なＴＰＯを微生物から精製するための方法を包含する。図面の簡単な説明図１は、ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）ｃＤＮＡの導き出されたアミノ酸配列（配列番号１）およびコード化ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付してある。５'および３'非翻訳領域を小文字で示す。アミノ酸残基は配列上部に、成熟ｍｐｌリガンド（ＭＬ）蛋白配列のＳｅｒ１で始まる番号を付してある。推定のエクソン３の境界を矢印で示し、可能性あるＮグリコシル化部位に囲みを付す。システイン残基を配列上部の点により示す。下線を付した配列は、ブタ血漿から精製されたｍｐｌリガンドから決定されたＮ末端配列に対応する。図２は、ｍｐｌリガンド³Ｈ−チミジン取り込み検定に用いられる手順を示す図である。様々な供給源由来のｍｐｌリガンドの存在を決定するために、５％ＣＯ₂および空気中３７℃の加湿インキュベーター中でｍｐｌＰＢａ／Ｆ３細胞を２４時間ＩＬ−３を欠乏させた。ＩＬ−３欠乏後、この細胞を、希釈試料有りまたは無しの９６ウェル培養皿に蒔き、細胞培養インキュベーター中で２４時間培養した。最後の６−８時間は³Ｈ−チミジン１μＣｉを含有する無血清ＲＰＭＩ培地２０μｌを各ウェルに加えた。次にこの細胞を９６ウェルフィルター板に収穫し、水で洗浄した。次いでこのフィルターを計数した。図３は、ＡＰＰのＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖の刺激に及ぼすプロナーゼ、ＤＴＴおよび熱の影響を示す図である。ＡＰＰのプロナーゼ消化については、プロナーゼ（ベーリンガー・マンハイム）または牛血清アルブミンをＡｆｆｉ−ゲル１０（バイオラド）と結合させ、ＡＰＰと共に１８時間３７℃で個別にインキュベートした。続いて樹脂を遠心により除去し、上清を検定した。ＡＰＰはまた、８０℃に４分間加熱し、または１００μＭＤＴＴとしその後ＰＢＳに対して透析した。図４は、フェニル−トヨパール、ブルー−セファロースおよびウルトラリンク −ｍｐｌカラムからのｍｐｌリガンド活性の溶出を示す図である。ｍｐｌ親和カラムからの画分４−８は、このカラムから溶離されたピーク活性画分であった。図５は、溶離されたウルトラリンク−ｍｐｌ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。画分２−８それぞれ２００μｌに、−２０℃の１ｍＭＨＣｌを含有するアセトン１ｍｌを加えた。３時間後、−２０℃の試料を遠心し、得られたペレットを−２０℃のアセトンで２ｘ洗浄した。このアセトンペレットを引き続きＳＤＳ−可溶化緩衝液３０μｌに溶解し、１００μＭＤＴＴとし、９０℃に５分間加熱した。次にこの試料を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、蛋白を銀染色によって可視化した。図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのｍｐｌリガンド活性の溶離を示す図である。ｍｐｌ−親和カラムからの画分６を、非還元条件下で４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、このゲルを１２の等しい領域に薄く切り、実施例に記載のように電気溶出した。電気溶出された試料をＰＢＳ中に透析し、１／２０希釈で検定した。ゲルの標定に用いられたＭｒ標準はノヴェックス・マーク１２標準であった。図７は、ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰがヒト巨核球形成に及ぼす効果を示す図である。ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰは、１ｍｌを１ｍｌのｍｐｌ−親和カラム（７００μｇｍｐｌ−ＩｇＧ／ｍｌＮＨＳ−スーパーロース、ファルマシア）に通すことにより作成した。ヒト末梢幹細胞培養を１０％ＡＰＰまたは１０％ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰとし、１２日間培養した。巨核球形成を実施例に記載のように定量した。図８は、ｍｐｌ−ＩｇＧがＡＰＰによるヒト巨核球形成の刺激に及ぼす効果を示す図である。ヒト末梢幹細胞培養をＡＰＰで１０％とし、１２日間培養した。０、２および４日目にｍｐｌ−ＩｇＧ（０．５μｇ）またはＡＮＰ−Ｒ−ＩｇＧ（０．５μｇ）を加えた。１２日後、巨核球形成を実施例に記載のように定量した。二重の試料の平均をグラフ化し、実際の二重のデータを括弧に入れて付記する。図９は、ｍｐｌリガンドをコードしているヒトゲノムＤＮＡの３９０ｂｐフラグメントの両方の鎖を示す図である。「エクソン３」（配列番号３）の導き出されたアミノ酸配列、コード化配列（配列番号４）、およびその相補体（配列番号５）を示す。図１０は、成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）（配列番号６）および成熟ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）（配列番号７）の導き出されたアミノ酸配列を示す図である。ヒトｍｐｌリガンドについて予想されるアミノ酸配列をヒトエリスロポエチン配列と並べる。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適の並置のために導入された間隙をダッシュにより示す。可能性あるＮグリコシル化部位に、ｈＭＬについては実線で、ｈＥＰＯについては破線で下線を付す。エリスロポエチン活性にとって重要な二つのシステインを大きな点により示す。図１１は、成熟ヒトｍｐｌリガンドイソ型ｈＭＬ（配列番号６）、ｈＭＬ２（配列番号８）、ｈＭＬ３（配列番号９）、およびｈＭＬ４（配列番号１０）の導き出されたアミノ酸配列を示す図である。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適の並置のために導入された間隙をダッシュにより示す。図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖（Ａ）、巨核球糖蛋白ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識されたマウスＩｇＧモノクローナル抗体を用いて定量されたインビトロヒト巨核球形成（Ｂ）、および血小板リバウンド検定において測定されたマウス栓球形成（Ｃ）に及ぼすヒトｍｐｌリガンドの効果を示す図である。２９３細胞をＣａＰＯ₄法（Ｃ．ゴーマン、DNA Cloning:A New Approach、２巻１４３−１９０頁［１９８５］）により、ｐＲＫ５ベクター単独、ｐＲＫ５− ｈＭＬまたはｐＲＫ５−ＭＬ₁₅₃を用いて一夜トランスフェクトさせた（ｐＲＫ５−ＭＬ₁₅₃は、ｈＭＬの残基１５３の後にＰＣＲによって停止コドンを導入することにより作成された）。次に培地を３６時間条件設定し、実施例１に記載のようにＢａ／Ｆ３−ｍｐｌの細胞増殖について（Ａ）またはインビトロヒト巨核球形成について（Ｂ）検定した。巨核球形成は、巨核球特異的糖蛋白ＧＰII_bIII_a に対する¹²⁵Ｉ放射標識されたマウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＨＰ１−ＩＤ）を用いて記載のように定量した（グラント等、Blood、６９巻１３３４−１３３９頁［１９８７］）。インビボ血小板産生に及ぼす部分精製された組換えＭＬ（ｒＭＬ）の効果（Ｃ）は、Ｔ．Ｐ．マクドナルド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４４巻１００６−１００１２頁（１９７３）に記載のリバウンド栓球増加検定を用いて決定した。部分精製されたｒＭＬは、組換えＭＬを含有する条件培地２００ｍｌから調製した。この培地をＰＢＳで平衡化した２ｍｌブルー−セファロースカラムに通し、このカラムをＰＢＳで洗浄し、尿素およびＮａＣｌ各２Ｍを含有するＰＢＳで溶出した。活性画分をＰＢＳ中に透析し、エントドキシンを含まないＢＳＡで１ｍｇ／ｍｌとした。この試料は１単位／ｍｌ未満のエンドトキシンを含んでいた。マウスに、６４０００、３２０００または１６０００単位のｒＭＬまたは賦形剤のみを注射した。各群は６匹のマウスで構成されていた。各群の平均および標準偏差を示す。メジアンを比較する二端Ｔ検定によりｐ値を決定した。図１３は、ヒトｍｐｌリガンドイソ型および変異体の効果をＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖検定で比較する図である。ｈＭＬ、偽似、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、およびｈＭＬ₁₅₃を実施例１に記載のように様々な希釈で検定した。図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒトＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸残基は各列の始まりに番号を付す。図１５は、精製された２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂および精製された２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。図１６は、ヌクレオチド配列：マウスＭＬイソ型のオープンリーディングフレームのｃＤＮＡコード化（配列番号１２）および導き出されたアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。この成熟マウスｍｐｌリガンドイソ型は、推定の全長ｍＭＬより４個少ない３３１のアミノ酸残基を含んでおり、よってｍＭＬ２と命名する。ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。可能性あるＮグリコシル化部位に下線を付す。システイン残基は配列上部の点により示す。図１７は、このマウスＭＬイソ型（ｍＭＬ）のｃＤＮＡ配列（配列番号１４）および予想蛋白配列（配列番号１５）を示す図である。ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。この成熟マウスｍｐｌリガンドイソ型は３３５のアミノ酸残基を含むので、ｍＭＬと命名される全長のｍｐｌリガンドであると信じられる。シグナル配列を破線の下線で示し、開裂されそうな点を矢印で示す。５'および３'非翻訳領域を小文字で示す。択一的スプライシングの結果として見いだされる２個の除去（ｍＭＬ２およびｍＭＬ３）に下線を付す。４個のシステイン残基を点により示す。７個の可能性あるＮグリコシル化部位に囲みを付す。図１８は、ヒトＮＬイソ型ｈＭＬ３の導き出されたアミノ酸配列（配列番号９）およびｍＭＬ３と命名されたマウスＭＬイソ型（配列番号１６）を比較する図である。ヒトｍｐｌリガンドの予想アミノ酸配列をマウスｍｐｌリガンド配列と並べる。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適な並置のために導入された間隙をダッシュで示す。アミノ酸は各列の始まりに番号を付す。図１９は、マウスＭＬ（配列番号１７）、ブタＭＬ（配列番号１８）およびヒトＭＬ（配列番号６）由来の成熟ＭＬイソ型の予想アミノ酸配列を比較する図である。アミノ酸は、最適な並置のために導入されたダッシュで示される間隙を入れて並べる。アミノ酸は各列の始まりに番号を付し、同一の残基に囲みを付す。可能性あるＮグリコシル化部位を陰付きの囲みで表し、システイン残基を点で示す。可能性あるプロテアーゼ開裂部位である保存された二塩基アミノ酸モチーフに下線を付す。三つの種（ＭＬ２）全てに存在することが判明した４個のアミノ酸除去に太線の囲みで輪郭を付す。図２０は、ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ）のｃＤＮＡ配列（配列番号１９）および予想される蛋白配列（配列番号１８）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型は３３２アミノ酸残基を含み、ｐＭＬと命名される全長のブタｍｐｌリガンドであると信じられる。ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。図２１は、ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ２）のｃＤＮＡ配列（配列番号２０）および予想成熟蛋白配列（配列番号２１）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型は３２８のアミノ酸残基を含み、ｐＭＬ２と命名される全長ブタｍｐｌリガンドの４残基除去型である。ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。図２２は、全長ブタＭＬイソ型ｐＭＬ（配列番号１８）およびｐＭＬ２と命名されたブタＭＬイソ型（配列番号２１）の導き出されたアミノ酸配列を比較する図である。ｐＭＬの予想アミノ酸配列をｐＭＬ２配列と並置する。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適の並置のために導入された間隙をダッシュで示す。アミノ酸は各列の始まりに番号を付す。図２３は、ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂の産生のための宿主ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞のトランスフェクトに使用されるプラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ（「全長」またはＴＰＯ₃₃₂）の適切な特徴を示す図である。図２４は、ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃の産生のための宿主ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞のトランスフェクトに使用されるプラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ −Ｄ（「末端切除された」またはＴＰＯ₁₅₃）の適切な特徴を示す図である。図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃは、正常なマウスの血小板（Ａ）、赤血球（Ｂ）、および白血球（Ｃ）に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液またはＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）０．３μｇのいずれか（１００μｌ皮下）を毎日注射した。０日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差として表す。図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃは、近致死量を照射されたマウスの血小板（Ａ）、赤血球（Ｂ）および（Ｃ）白血球に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示す図である。１０匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群に¹³ ⁷ Ｃｓ線源からの７５０ｃＧｙガンマ線で近致死量の照射を行い、ＰＢＳ緩衝液またはＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）３．０μｇのいずれか（１００μｌ皮下）を毎日注射した。０日目およびその後の中間時点で４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差として表す。図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃは、正常なマウスの（Ａ）血小板（栓球）、（Ｂ）赤血球、および（Ｃ）白血球に及ぼすＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂の効果を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液またはＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂０．３μｇのいずれか(１００μｌ皮下)を毎日注射した。０日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差として表す。図２８は、様々なセルラインから得られたｒｈＴＰＯの様々な型に対する用量反応曲線を示す図である。用量反応曲線は、以下のセルライン由来のｒｈＴＰＯに対して組み立てられた：ＣＨＯからのｈＴＰＯ₃₃₂（チャイニーズハムスター卵巣細胞からの全長）；ｈＴＰＯ_Met ^-1 ₁₅₃（Ｎ末端メチオニンを有するＥ．ｃｏｌｉから誘導された末端切除型）；ｈＴＰＯ₃₃₂（ヒト２９３細胞からの全長ＴＰＯ）；Ｍｅｔ無し１５５Ｅ−Ｃｏｌｉ（大腸菌由来の末端メチオニン無しの末端切除型［ｒｈＴＰＯ₁₅₅］）。６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウスの群に、群に応じてｒｈＴＰＯを毎日７日間注射した。完全血球数測定のため、４０μｌの血液を毎日眼窩より採取した。上に示したデータは種々の処置について見られた最大効果であり、（ｍｅｔ１５３Ｅ−Ｃｏｌｉ）を除き、これは処置の７日目に起こった。上記の「ｍｅｔ１５３Ｅ−Ｃｏｌｉ」群では、最大効果は５日目に見られた。データを平均値±平均値の標準誤差として表す。図２９は、ＣＨＯ細胞で産生された全長および「切り取られた」型のｒｈＴＰＯの活性を、大腸菌からの末端切除型と比較する用量反応曲線を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウスの群に、種々の型のｒｈＴＰＯ０．３μｇを毎日注射した。２−７日目に、完全血球数測定のため、４０μｌの血液を眼窩より採取した。処置群は、大腸菌由来のＴＰＯの末端切除型ＴＰＯ₁₅₃；およそ８０− ９０％の全長および１０−２０％の切り取られた型を含む全長ＴＰＯ、ＴＰＯ₃₃ ₂ （混合画分）：ＴＰＯ３３２（３０Ｋ画分）＝元の「混合」調製物からの精製された切り取られた画分；ＴＰＯ３３２（７０Ｋ画分）＝元の「混合」調製物からの精製全長ＴＰＯ画分。データを平均値±平均値の標準誤差として表す。図３０は、ＴＰＯを測定するためのＫＩＲＡＥＬＩＳＡ検定を示す図である。この図は、ＭＰＬ／Ｒｓｅ.ｇＤキメラおよび親レセプターの関連部分ならびに最終組み立て物（図の右部分）、ならびにこの検定の関連工程を示す流れ図（図の左部分）を示す。図３１は、操作の各工程を示すＫＩＲＡＥＬＩＳＡ検定のためのフローチャートである。図３２Ａ−３２Ｌは、実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用されるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す図である。図３３は、プラスミドｐＭＰ１の製造の模式的表現である。図３４は、プラスミドｐＭＰ２１の製造の模式的表現である。図３５は、プラスミドｐＭＰ１５１の製造の模式的表現である。図３６は、プラスミドｐＭＰ２０２の製造の模式的表現である。図３７は、プラスミドｐＭＰ１７２の製造の模式的表現である。図３８は、プラスミドｐＭＰ２１０の製造の模式的表現である。図３９は、ｐＭＰ２１０プラスミドバンクからの五つの最良のＴＰＯクローンの表である（配列番号２３、２４、２５、２６、２７および２８）。図４０は、プラスミドｐＭＰ４１の製造の模式的表現である。図４１は、プラスミドｐＭＰ５７の製造の模式的表現である。図４２は、プラスミドｐＭＰ２５１の製造の模式的表現である。発明の詳細な説明Ｉ．定義一般に以下の語または句は、説明、実施例、および請求の範囲に使用される場合、示される定義を有する。「カオトロピック剤」とは、水溶液および適当な濃度において、蛋白の正常な二次および三次構造の維持を司る力を少なくとも部分的に破壊することにより、該蛋白の空間的コンフィギュレーションまたはコンホメーションに変化を起こすことのできる化合物を指す。このような化合物は、例えば、尿素、グアニジンＨＣｌ、およびチオシアン酸ナトリウムを包含する。蛋白にコンホメーションの作用を及ぼすには、高濃度、通常４−９Ｍのこれらの化合物が必要である。「サイトカイン」とは、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する、一つの細胞集団により放出される蛋白の総称である。係るサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。成長ホルモン、インシュリン様成長因子、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、牛成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インシュリン、プロイインシュリン、リラキシン、プロリラキシン、糖蛋白ホルモン類、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体化ホルモン（ＬＨ）、造血成長因子、肝細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、ミュレリアン阻害物質、マウスゴナドトロピン付随ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞成長因子、インテグリン、神経成長因子、例えばＮＧＦ−β、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、インシュリン様成長因子−Ｉおよび−II、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、および−γ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ− ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α 、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２ならびにＬＩＦ、ＳＣＦ、およびｋｉｔ−リガンドを包含するその他のポリペプチド因子である。本明細書中使用される前記の語は、天然供給源からのまたは組換え細胞培養からの蛋白の包含を意味する。同様に、これらの語は、生物活性な等価物、例えば１またはそれ以上のアミノ酸によってアミノ酸配列が相違、またはグリコシル化の型もしくは程度が相違している等価物を包含することを意図している。「ｍｐｌリガンド」、「ｍｐｌリガンドポリペプチド」、「ＭＬ」、「トロンボポエチン」または「ＴＰＯ」は本明細書中、互換的に使用され、ｍｐｌ、サイトカインレセプタースーパーファミリーの一員に結合する特性を持ち、そして下に定義されるようなＭＬの生物学的性質を有する任意のポリペプチドを含む。生物学的性質の例は、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトさせたＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識されたヌクレオチド（例えば³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激する能力である。生物学的性質のもう一つの例は、マウス血小板リバウンド検定において循環血小板中への³⁵Ｓの取り込みを刺激する能力である。この定義は、本明細書に記載の再生不良性ブタ血漿のようなｍｐｌリガンド供給源から、またはヒトを包含する他の動物種のような別の供給源から分離された、または、組換えもしくは合成法により製造された該ポリペプチドを包含し、また、その機能的誘導体、フラグメント、対立遺伝子、イソ型および類似体を含む変異体型を包含する。「ｍｐｌリガンドフラグメント」または「ＴＰＯフラグメント」は、１またはそれ以上のアミノ酸残基または炭水化物単位が除去された、天然に存在する成熟全長ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯ配列の一部分である。除去されるアミノ酸残基は、Ｎ末端もしくはＣ末端または内部を包含する該ペプチドのどこにあってもよい。このフラグメントは、ｍｐｌリガンドに共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有するであろう。ｍｐｌリガンドフラグメントは典型的には、再生不良性ブタ血漿またはヒトもしくはマウスリガンドから分離されるリガンドを包含する哺乳動物から分離されたｍｐｌリガンド、とりわけそのＥＰＯドメインの配列と同一の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０アミノ酸残基の連続する配列を有するであろう。Ｎ末端フラグメントの代表例はｈＭＬ₁₅₃またはＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）である。本明細書に定義される「ｍｐｌリガンド変異体」または「ｍｐｌリガンド配列変異体」とは、組換え細胞培養または再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドまたは図１に記載の導き出された配列（配列番号１）を有するヒトリガンドと１００％未満の配列一致を有する、下に定義される生物活性ｍｐｌリガンドを意味する。通常、生物活性なｍｐｌリガンド変異体は、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドまたは成熟マウスもしくはヒトリガンドまたはそのフラグメントと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列一致を有するアミノ酸配列を有するであろう（図１［配列番号１］を参照されたい）。「キメラｍｐｌリガンド」は、全長のｍｐｌリガンドを含むポリペプチド、または第二のヘテロローガスポリペプチドと融合または結合したその１もしくはそれ以上のフラグメント、またはそれらの１もしくはそれ以上のフラグメントである。このキメラは、ｍｐｌリガンドに共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有するであろう。第二のポリペプチドは典型的にはサイトカイン、免疫グロブリンまたはそのフラグメントであろう。「分離されたｍｐｌリガンド」、「高度に精製されたｍｐｌリガンド」および「実質上均質なｍｐｌリガンド」は互換的に使用され、ｍｐｌリガンド供給源から精製され、または組換えもしくは合成法により製造され、（１）スピニングカップシークエネーターまたは入手し得る最良の市販アミノ酸シークエネーターを使用することにより、または本出願の出願日現在公表されている方法により修飾された、少なくとも１５および好ましくは２０アミノ酸残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を取得するに十分な程、または、（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質に至るに十分な程、他のペプチドもしくは蛋白を実質上含まない、ｍｐｌリガンドを意味する。本明細書における均質性とは、他の供給源蛋白による、約５％未満の汚染を意味する。「ｍｐｌリガンド」または「分離されたｍｐｌリガンド」のいずれかと共に使用される場合、「生物学的性質」とは、血小板形成活性を有すること、または、ｍｐｌリガンド（天然または変性コンホメーションの如何に拘わらず）もしくはそのフラグメントにより直接的または間接的に惹起または遂行されるインビボエフェクターもしくは抗原機能もしくは活性を意味する。エフェクター機能とは、ｍｐｌ結合および任意の担体結合活性、ｍｐｌのアゴニズムまたはアンタゴニズム、特に複製を包含する増殖シグナルの変換、ＤＮＡ調節機能、他のサイトカインの生物活性の調節、レセプター（特にサイトカイン）活性化、不活性化、上方または下方調節、細胞の成長または分化等を包含する。抗原機能とは、天然ｍｐｌリガンドに対して作製された抗体と交差反応できるエピトープまたは抗原部位の所有を意味する。ｍｐｌリガンドポリペプチドの主要な抗原機能は、それが、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドに対して作製された抗体と、少なくとも約１０⁶ｌ／ｍｏｌｅの親和性で結合することである。普通、該ポリペプチドは、少なくとも約１０⁷ｌ／ｍｏｌｅの親和性で結合する。最も好ましくは、抗原的に活性なｍｐｌリガンドポリペプチドは、上記エフェクター機能のうち一つを有するｍｐｌリガンドに対して作製された抗体と結合するポリペプチドである。「生物活性」を定義するために使用される抗体は、組換え細胞培養または再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドを完全フロイントアジュバント中に調合し、この調合物を皮下注射し、そしてｍｐｌリガンド抗体の力価がプラトーに達するまでこの調合物の腹腔内注射により免疫反応を追加免疫することによって作成されるウサギポリクローナル抗体である。「ｍｐｌリガンド」または「分離されたｍｐｌリガンド」のいずれかと共に使用される場合、「生物活性な」とは、血小板形成活性を示す、または再生不良性ブタ血漿から分離される、もしくは本明細書に記載の組換え細胞培養中で発現される、ｍｐｌリガンドのエフェクター機能を共有する、ｍｐｌリガンドまたはポリペプチドを意味する。本発明に係るｍｐｌリガンドまたはポリペプチドの主要な既知のエフェクター機能は、ｍｐｌへの結合、および、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトさせたＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識ヌクレオチド（³ Ｈ−チミジン）の取り込みの刺激である。本発明に係るｍｐｌリガンドまたはポリペプチドのもう一つの既知のエフェクター機能は、マウス血小板リバウンド検定における循環血小板への³⁵Ｓの取り込みを刺激する能力である。さらに別の知られているｍｐｌリガンドのエフェクター機能は、巨核球糖蛋白ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識されたモノクローナル抗体を用いることにより定量され得る、インビトロヒト巨核球形成の刺激能力である。ｍｐｌリガンド配列に関する「パーセントアミノ酸配列一致」とは、本明細書において、同類置換は配列一致の一部とは考えずに、最大の配列一致パーセントを達成するために、必要ならば間隙を導入して配列を並べた後の、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンド配列、または、図１に記載される導き出されたアミノ酸配列(配列番号１)を有するマウスもしくはヒトのリガンド中の残基と一致する、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ｍｐｌリガンド配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、除去または挿入は配列一致または相同性に影響を及ぼすとはみなさない。したがって、同一の配列を有すると考えられる生物活性なｍｐｌリガンドポリペプチドの例は、プレプロ−ｍｐｌリガンド、プロ−ｍｐｌリガンド、および成熟ｍｐｌリガンドを包含する。「ｍｐｌリガンド微細配列決定」は、その方法が十分感受性である限り、任意の適当な標準法によって達成することができる。一つのこのような方法においては、ＳＤＳゲルまたは最終的ＨＰＬＣ工程から得られた高度に精製されたポリペプチドを、１２０Ａフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析機を備えたモデル４７０Ａアプライド・バイオシステムズ・気相シークエンサーを用いて自動化エドマン（フェニルイソチオシアナート）分解により直接配列決定する。さらに、化学的（例えばＣＮＢｒ、ヒドロキシアミン、２−ニトロ−５−チオシアノベンゾアート）または酵素的（例えばトリプシン、クロストリパイン、スタフィロコッカスプロテアーゼ）消化とその後のフラグメント精製（例えばＨＰＬＣ）によって製造されたｍｐｌリガンドフラグメントを同様に配列決定することができる。ＰＴＨアミノ酸はクロムパーフェクトデータシステム（ジャスティス・イノヴェーションズ、パロ・アルト、ＣＡ）を用いて分析する。配列の解釈を、ヘンゼル等、J.Chromatograthy、４０４巻４１−５２頁［１９８７］に記載のようにＶＡＸ１１／７８５ディジタル・イクイップメント・Ｃｏ．コンピューター上で実施する。所望により、ＨＰＬＣ画分のアリコートを５−２０％ＳＤＳ− ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（プロブロット、ＡＩＢ、フォスターシティー、ＣＡ）に電気的に転移させ、クマシーブリリアントブルーで染色することもできる（マトゥサーディアラ、J.Biol.Chem.、２６２巻１００３５−１００３８頁［１９８７］。染色により同定された特異蛋白をブロットから切り取り、Ｎ末端配列決定を上記の気相シークエネーターで実施する。内部蛋白配列については、ＨＰＬＣ画分を減圧下に乾燥し（スピードヴァク）、適当な緩衝液に再懸濁し、臭化シアン、Ｌｙｓ特異的酵素Ｌｙｓ−Ｃ（ワコー・ケミカルズ、リッチモンド、ＶＡ）、またはＡｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）で消化する。消化後、得られたペプチドを、混合物として配列決定するか、または、０．１％ＴＦＡ中のプロパノール勾配で展開するＣ４カラム上でのＨＰＬＣ分解後に気相配列決定する。「血小板減少症」とは、血液１リットルにつき１５０ｘ１０⁹未満の血小板数として定義される。「血小板形成活性」とは、巨核球または巨核球前駆体がこれらの細胞の血小板産生型へと増殖、分化および／または成熟する事を加速することを構成する生物活性として定義される。この活性は、インビボマウス血小板リバウンド合成検定、ヒト白血病巨核芽球セルライン（ＣＭＫ）のための抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰII_bIII_a）により測定される血小板細胞表面抗原検定の誘導、および巨核芽球セルライン（ＤＡＭＩ）における多能化の誘導を包含する様々な検定で測定することができる。「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）とは、血小板形成活性を有する、または哺乳動物において血清の血小板数を増加させることのできる化合物として定義される。ＴＰＯは好ましくは、内因性血小板数を少なくとも１０％、より好ましくは５０％増加させることができ、最も好ましくは人間の血小板数を血液１リットル当たり１５０ｘ１０⁹以上に上昇させることができる。「分離されたｍｐｌリガンド核酸」とは、生物活性なｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントをコードしている１６好ましくは２０またはそれ以上の連続したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡもしくはＤＮＡであるか、該ＲＮＡもしくはＤＮＡに相補的であるか、または該ＲＮＡもしくはＤＮＡとハイブリダイズして中等度ないし緊縮条件下で安定に結合し続ける。このＲＮＡまたはＤＮＡは、普通天然供給源に付随している少なくとも一つの汚染源核酸を含まず、好ましくは他のいかなる哺乳動物のＲＮＡまたはＤＮＡをも実質上含まない。「普通付随している少なくとも一つの汚染源核酸を含まない」という句は、該核酸がその供給源または天然細胞中に存在してはいるが、異なった染色体位置にある、またはその他の状態でその供給源細胞に正常では見いだされない核酸配列と隣接している場合を包含する。分離されたｍｐｌリガンド核酸の例は、ヒト、マウスまたはブタｍｐｌリガンドと少なくとも７５％の配列一致、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列一致を共有する生物活性なｍｐｌリガンドをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。発現に言及する場合の「調節配列」とは、特定の宿主生物における機能的に結合したコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適な調節配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、そして恐らくはまだあまり理解されていない配列を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。核酸に言及する場合の「機能的に結合した」とは、当該核酸が別の核酸配列と機能的な関係に位置することを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば、そのポリペプチドのためのＤＮＡと機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード化配列の転写に影響するならば、その配列と機能的に結合しており；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置しているならば、コード化配列と機能的に結合している。一般に、「機能的に結合した」とは、結合しているＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合には、隣接し且つ読み取り枠内にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。もしそのような部位が存在しない場合、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。要素に言及する場合の「外因性」とは、その細胞にとって外来性であるか、またはその細胞にとってホモローガスではあるがその要素が通常見いだされない宿主細胞核酸内の位置にある、核酸を意味する。「細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」は本明細書中、互換的に用いられ、係る表現は或る細胞またはセルラインの子孫全てを包含する。したがって、例えば、「形質転換体」および「形質転換された細胞」というような語は、第一番目の対象細胞および、転移の回数に拘わらずそれから誘導された培養を包含する。全ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含有量が厳密に同一ではないかも知れないということもまた理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が包含される。明確な表記が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。「プラスミド」は、独立した複製起点を有する自立的に複製する環状ＤＮＡ分子であり、本明細書では、大文字および／または数字の前および／または後の小文字「ｐ」によって表記される。本発明における出発プラスミドは、市販品を入手できるか、無制限に一般に入手できるか、または公表されている方法に従って係る入手可能なプラスミドから組み立てることができる。加えて、その他の等価なプラスミドが当分野で知られており、当業者には明らかであろう。ＤＮＡに言及する場合の「制限酵素消化」とは、ＤＮＡ配列の或る位置または部位にのみ作用する酵素でそのＤＮＡの内部ホスホジエステル結合を触媒的に開裂することを意味する。このような酵素は「制限エンドヌクレアーゼ」と呼ばれる。それぞれの制限エンドヌクレアーゼは、二倍対称を示す「制限部位」と呼ばれる特異的ＤＮＡ配列を認識する。本発明において使用される種々の制限酵素は市販品が入手でき、酵素供給者により確立されたそれらの反応条件、補助因子、およびその他の要件が用いられる。制限酵素は一般に、それぞれの制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字とその後の他の文字、そして次に特定の酵素を指定する数字から成る略語によって表記される。一般に、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約１μｇが、緩衝溶液約２０μｌ中約１−２単位の酵素と共に使用される。特定の制限酵素のための適当な緩衝液および基質量は、製造者により明記されている。３７℃で約１時間のインキュベーションが普通用いられるが、供給者の指示によって変わり得る。インキュベーションの後、蛋白またはポリペプチドをフェノールおよびクロロホルムでの抽出により除去し、消化された核酸をエタノールによる沈澱化により水性画分から回収する。制限酵素による消化の後に、末端５'ホスファートの細菌アルカリホスファターゼ加水分解を行い、ＤＮＡフラグメントの二つの制限開裂端の「環化」、または制限部位への別のＤＮＡフラグメントの挿入を妨害する閉鎖ループの形成、を防止する。別途記載の無い限り、プラスミドの消化の後の５'末端脱燐酸化は行われない。脱燐酸化のための手法および試薬は、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル［ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９］の１．５６−１．６１項に記載のように常套的である。制限消化物からのＤＮＡの所定のフラグメントの「回収」または「分離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上での消化物の分離、その移動度を既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度に対して比較することによる目的フラグメントの同定、所望フラグメントを含有するゲル切片の切り取り、およびＤＮＡからのそのゲルの分離を意味する。この方法は一般に知られている。例えば、ローン等、Nucleic Acids Res.、９巻６１０３−６１１４頁［１９８１］、およびゲッデル等、Nucleic Acids Res.、８巻４０５７頁［１９８０］を参照されたい。「サザン分析」または「サザンブロッティング」は、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーションによって確認する方法である。サザン分析は典型的には、アガロースゲル上でのＤＮＡ消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの変性、および、サムブルック等、上記、の９．３７−９．５２項に記載のような放射標識された、ビオチニル化された、または酵素標識されたプローブによる分析のための、ニトロセルロース、ナイロン、またはその他の適当な膜支持体へのＤＮＡの転移を含む。「ノーザン分析」または「ノーザンブロッティング」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡもしくはそのフラグメント、またはＲＮＡフラグメントのような既知のプローブとハイブリダイズするＲＮＡ配列を同定するために用いられる方法である。プローブは³²Ｐのような放射性同位元素で、またはビオチニル化により、または酵素によって標識する。分析すべきＲＮＡは、通常、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分離し、ニトロセルロース、ナイロン、またはその他の適当な膜に転移させ、そして、サムブルック等、上記、の７．３９−７．５２項に記載のような当分野で良く知られる標準技術を用いてプローブとハイブリダイズさせる。「ライゲーション」は、二つの核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成させる工程である。二つのフラグメントのライゲーションのためには、そのフラグメントの末端は互いに適合性でなければならない。幾つかの場合においては、末端はエンドヌクレアーゼ消化の後、直ちに適合性となろう。しかしながら、まず、エンドヌクレアーゼ消化の後に普通生成される互い違いに切断された末端を、ライゲーションに適合性とするため、平滑末端に変換する必要があるかも知れない。末端を平滑化するためには、そのＤＮＡを、約１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共に、４種のデオキシリボヌクレオチド三燐酸の存在下で、適当な緩衝液中で、少なくとも１５分間１５℃で処理する。次いでこのＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱化により精製する。ライゲーションすべきＤＮＡフラグメントをほぼ当モル量で溶液中に入れる。この溶液はさらにＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびＤＮＡ０．５μｇに付き約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを含む。このＤＮＡをベクター中にライゲーションしたい場合は、ベクターをまず適当なエンドヌクレアーゼで消化することにより線状化する。次にこの線状化されたフラグメントを細菌アルカリホスファターゼまたは子牛腸ホスファターゼで処理してライゲーション工程中の自己ライゲーションを防止する。細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養からプラスミドＤＮＡを分離することを意味する。ＤＮＡの調製に一般的に用いられる方法は、サムブルック等、上記、の１．２５−１．３３項に記載の大規模および小規模プラスミド製造である。ＤＮＡの調製後、これは、サムブルック等、上記、の１．４０項に記載のような当分野で良く知られる方法によって精製することができる。「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法（例えば、１９８８年５月４日公開のＥＰ２６６０３２に記載の固相技術を使用する、または、フレーラー等、Nucl .Acids Res.、１４巻５３９９−５４０７頁［１９８６］に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスホナート中間体を経た、ホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイト化学）によって化学合成される、短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法には、下に定義されるポリメラーゼ連鎖反応およびその他の自己プライマー法および固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成が包含される。これらの方法は全てエンゲルス等、Agnew.Ch em.Int.Ed.Engl.、２８巻７１６−７３４頁（１９８９）に記載されている。当該遺伝子の全核酸配列が知られている場合、またはコーディング鎖に対し相補的な核酸の配列が知られている場合、これらの方法を用いる。別法として、もし標的アミノ酸配列が既知であるならば、各アミノ酸残基に対する既知のそして好ましいコーディング残基を用いて、可能性ある核酸配列を推論することができる。次いでそのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル上で精製する。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、わずかな量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特異的断片を、１９８７年７月２８日登録の米国特許第４６８３１９５号に記載のように増幅させる方法または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーが設計されるよう、目的の領域の末端またはそれ以上からの配列情報が得られる必要があり；これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の反対の鎖と同一または類似の配列であろう。二つのプライマーの５'末端ヌクレオチドは、増幅されたものの末端と一致するかも知れない。ＰＣＲは、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等の増幅に使用することができる。一般に、ミュリス等、Cold Spring Harbor Symp.Quan t.Biol.、５１巻２６３頁［１９８７］；アーリッヒ編、ＰＣＲテクノロジー（ストックトン・プレス、ＮＹ、１９８９）を参照されたい。本明細書中使用されるＰＣＲは、プライマーとしての既知の核酸および核酸の特異的断片を増幅または生成させるための核酸ポリメラーゼを使用することからなる、核酸被験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一つの例であって、唯一の例ではないと考えられる。「緊縮条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば５０℃で０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄（ＳＤＳ）を使用し、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％牛血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と共に５０％（容量／容量）ホルムアミドを４２℃で使用する条件である。別の例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃で洗浄するものである。「中等度の緊縮条件」は、サムブルック等、上記、に記載されており、上の記載より緊縮性の低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度の緊縮条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｌ／ｍｌ変性剪断鮭精子ＤＮＡからなる溶液中３７℃で一夜インキュベートし、その後フィルターを１ｘＳＳＣ中約３７−５０ ℃で洗浄するような条件である。当業者は、プローブの長さ等のような因子に適合させるのに必要な温度、イオン強度等をいかにして調節するかがわかるであろう。「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖蛋白である。抗体は特異抗原に対する結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルが、そして骨髄腫によって高レベルが産生される。「天然の抗体および免疫グロブリン」は、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖および二つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ三量体糖蛋白である。それぞれの軽鎖は一つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結しているが、但しジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で異なっている。各々の重および軽鎖はさらに、規則的に間隔のあいた鎖間ジスルフィド橋を有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（Ｖ_H）、その後に幾つかの不変ドメインを持っている。それぞれの軽鎖は一方の端に可変ドメイン（Ｖ_L）、そして他方の端に不変ドメインを持っている。軽鎖の不変ドメインは重鎖の最初の不変ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸が軽および重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると信じられている（クロチア等、J.Mol.Biol.、１８６巻６５１−６６３頁［１９８５］；ノヴォトニーおよびヘイバー、Proc.Natl.Acad.Sci .USA、８２巻４５９２−４５９６頁［１９８５］）。「可変」という語は、可変ドメインの或る部分が配列の上で抗体間で甚だしく異なっている事実を指し、特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性に用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインに平均して分布してはいない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ四つのＦＲ領域を含んでおり、これらは大抵βシートコンフィギュレーションを採用しており、三つのＣＤＲによって連結しているが、それらはこのβシート構造につながるループを形成するか、幾つかの場合にはそのβシート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（カバット等、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ［１９８７］を参照されたい）。不変ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与している訳ではないが、抗体の抗体依存細胞毒性への参加といったような様々なエフェクター機能を示す。抗体のパパイン消化は、それぞれが１個の抗原結合部位を伴う「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる二つの等しい抗原結合フラグメント、および、その名称が容易に結晶化する能力を反映している、残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差反応できるＦ(ａｂ')₂フラグメントを生成する。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に非共有結合している１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体で構成されている。各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶ_H−Ｖ_L二量体表面の抗原結合部位を規定しているのはこのコンフィギュレーションにおいてである。まとめると、６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、ただ一つの可変ドメイン（または、或る抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を持っている。Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ドメインおよび重鎖の最初の不変ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１またはそれ以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に加わっている点でＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ'− ＳＨは本明細書において、不変ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持っているＦａｂ'の表記である。Ｆ(ａｂ')₂抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを持っているＦａｂ'フラグメントの対として生成された。別の、抗体フラグメントの化学的結合もまた知られている。任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダ（λ）と呼ばれる極めて明瞭な二つのタイプの一つに割り当てることができる。重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。五つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、があり、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２、に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖不変ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは良く知られている。「抗体」という語は最も広い意味で用いられ、詳細には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を包含する）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、そして、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')₂およびＦｖ）を包含する。本明細書中使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質上均質な抗体の集団から得られた抗体、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して作製される異なった抗体を含む常套的（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の一つの決定基に対して作製されたものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されないハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質上均質な抗体の集団から得られる抗体の性格を示すものであり、特定の方法によりその抗体を産生することを要求すると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができ、または、組換えＤＮＡ法により作製することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号[キャビリー等]を参照されたい）。本明細書に記載のモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスである、「キメラ」抗体および係る抗体のフラグメントを特に包含する（米国特許第４８１６５６７号（キャビリー等）；およびモリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻６８５１−６８５５頁［１９８４］）。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂またはその他の抗体の抗原結合サブ配列）である。大抵は、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも取り入れられたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の挙動をさらに洗練および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質上全てを含み、ここで、全てまたは実質上全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質上全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部をも含むであろう。さらなる詳細については、ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁［１９８６］；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２９頁［１９８８］；およびプレスタ、Curr.Op.Struct.Biol.、２巻５９３−５９６頁［１９９２］）を参照されたい。「人間において非免疫原性」とは、薬学上許容し得る担体中の治療的有効量の当該ポリペプチドを人間の適当な組織に接触させ、適当な潜伏期（例えば８ないし１４日間）の後に該ポリペプチドの二回目の投与を行う時、そのポリペプチドに対する過敏性または耐性の状態が立証され得ない事を意味する。 II．発明の好ましい態様本発明の好ましいポリペプチドは、ｍｐｌ、レセプターサイトカインスーパーファミリーの一員に結合する性質を持ち、そして、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトさせたＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡ中への標識されたヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激する生物学的性質を有する、ｍｐｌリガンドまたはトロンボポエチン（ＴＰＯ）と呼ばれる実質上均質なポリペプチドである。より好ましいｍｐｌリガンドは、造血、特に巨核球形成または血小板形成活性を有する、即ち、未熟な巨核球またはその祖先の、成熟血小板産生型への増殖、成熟および／または分化を刺激することのできる、分離された哺乳動物の蛋白である。本発明に係る最も好ましいポリペプチドは、造血、巨核球形成または血小板形成活性を有する、フラグメントを包含するヒトｍｐｌリガンドである。所望により、これらのヒトｍｐｌリガンドはグリコシル化を欠く。その他の好ましいヒトｍｐｌリガンドは、ｈＭＬ₁₅₃またはｈＴＰＯ₁₅₃と呼ばれるｈＭＬの「ＥＰＯドメイン」、ｈＭＬ₂₄₅またはｈＴＰＯ₂₄₅と呼ばれるｈＭＬの末端切除型、および、ｈＭＬ、ｈＭＬ₃₃₂またはｈＴＰＯ₃₃₂と呼ばれる、図１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列を有する成熟全長ポリペプチド、ならびに生物活性な置換変異体ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）である。所望による好ましい本発明に係るポリペプチドは、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬおよびｐＭＬ２から選ばれる生物学的にまたは免疫学的に活性なｍｐｌリガンド変異体である。所望による好ましい本発明に係るポリペプチドは、ヒトｍｐｌリガンド（図１［配列番号１］を参照されたい）、マウスｍｐｌリガンド（図１６［配列番号１２および１３］を参照されたい）、組換えブタｍｐｌリガンド（図１９［配列番号１８］を参照されたい）、または再生不良性ブタ血漿から分離されたブタｍｐｌリガンドと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列一致を有する生物活性なｍｐｌリガンド変異体である。再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドは以下の性格を持っている：（１）部分精製されたリガンドは、ＰＢＳ、０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ、または４ＭＭｇＣｌ₂を含有するＰＢＳのいずれかで溶離されるゲル濾過カラムからＭｒ６００００−７００００で溶出し；（２）このリガンドの活性はプロナーゼにより破壊され；（３）このリガンドは、低いｐＨ（２．５）、０．１％までのＳＤＳ、および２Ｍ尿素に対して安定であり；（４）このリガンドは、様々なレクチンカラムへの結合に基づき、糖蛋白であり；（５）高度に精製されたリガンドは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＭｒ２５０００−３５０００で溶出する。より少量の活性もまたＭｒ〜１８０００−２２０００および６００００で溶出し；（６）高度に精製されたリガンドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＭｒ２８０００および３１０００のダブレットとして分離され；（７）１８０００−２２０００、２８０００および３１０００のハンドのアミノ末端配列は同じＳＰＡＰＰＡＣＤＰＲＬＬＮＫＬＬＲＤＤＨＶＬＨＧＲ（配列番号２９）であり；そして、（８）このリガンドは、以下の親和カラム：ブルー−セファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンズマメレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテル６５０ｍトヨパール、ブチル６５０ｍトヨパール、フェニル６５０ｍトヨパール、および、フェニル−セファロース、に結合し、それらから溶出する。より好ましいｍｐｌリガンドポリペプチドは、図１（配列番号１）に記載のアミノ酸配列を有するヒトゲノムまたはｃＤＮＡによりコードされているものである。その他の好ましい本発明に係る天然に存在する生物活性ｍｐｌリガンドポリペプチドは、プレプロ−ｍｐｌリガンド、プロ−ｍｐｌリガンド、成熟ｍｐｌリガンド、ｍｐｌリガンドフラグメントおよびそれらのグリコシル化変異体を包含する。さらに別の本発明に係る好ましいポリペプチドは、ｍｐｌリガンド配列変異体およびキメラを包含する。通常、好ましいｍｐｌリガンド配列変異体およびキメラは、ヒトｍｐｌリガンドまたは再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列一致を有するアミノ酸配列を持つ生物活性なｍｐｌリガンド変異体である。好ましいｍｐｌリガンド変異体の例は、Ｎ末端ドメインｈＭＬ変異体（エリスロポエチンに対するその配列相同性の故に「ＥＰＯ−ドメイン」と呼ばれる）である。好ましいｈＭＬＥＰＯ−ドメインは、成熟ｈＭＬの最初の約１５３のアミノ酸残基を含み、ｈＭＬ₁₅₃と呼ばれる。所望により好ましいｈＭＬ配列変異体は、Ｃ末端ドメイン中の１またはそれ以上の塩基性または二塩基性アミノ酸残基が非塩基性アミノ酸残基（例えば、疎水性、中性、酸性、芳香族、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ等）で置換されているものを含む。好ましいｈＭＬＣ末端ドメイン配列変異体は、Ａｒｇ残基１５３および１５４がＡｌａ残基に置き換わっているものを含む。この変異体はｈＭＬ₃₃₂（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）と呼ばれる。これに代わる好ましいｈＭＬ変異体は、アミノ残基１１１−１１４（ＱＬＰＰまたはＬＰＰＱ）が除去されまたは異なるテトラペプチド配列（例えばＡＧＡＧ等）に置き換わっているｈＭＬ₃₃₂またはｈＭＬ₁₅₃のいずれかを含む。前記の除去突然変異体は、△４ｈＭＬ₃₃₂ または△４ｈＭＬ₁₅₃と呼ばれる。好ましいキメラは、ｍｐｌリガンドまたはそのフラグメント（下記に定義される）とヘテロローガスなポリペプチドまたはそのフラグメントとの間の融合である。例えば、ｈＭＬ₁₅₃はＩｇＧフラグメントと融合させて血清半減期を改善し、または、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦまたはＥＰＯと融合させて血小板形成活性またはキメラ造血活性を向上させた分子を生成させることができる。これに代わる好ましいヒトｍｐｌリガンドキメラは、図１０（配列番号７）に示されるようにおおよそ並べられたヒトＥＰＯ残基の１またはそれ以上（但し全てではない）で置換されたＮ末端１５３ないし１５７ｈＭＬ残基で構成される「ＭＬ−ＥＰＯドメインキメラ」である。この態様において、ｈＭＬキメラは約１５３−１６６残基の長さであり、ヒトＥＰＯ配列由来の個々のまたはひとかたまりの残基が、図１０（配列番号６）に示される並置に対応する位置でｈＭＬ中に付加または置換されている。ｈＭＬのＮ末端部分へのブロック配列挿入物の例は、２４−２７、３８−４０、および８３−８５位（ＥＰＯ）のＮグリコシル化部位の１またはそれ以上；９−２２、５９−７６、９０−１０７、および１３２− １５２位（ＥＰＯ）の４個の予想される両親媒性αヘリックスの束の１またはそれ以上；ならびにＮ末端およびＣ末端領域および残基位置（ｅｐｏ）４４−５２を包含するその他の高度に保存された領域、を包含する（例えば、ウェン等、Bloo d、８２巻１５０７−１５１６頁［１９９３］およびボイセル等、J.Biol.Chem. 、２６８（２１）巻１５９８３−１５９９３頁［１９９３］を参照されたい）。この「ＭＬ−ＥＰＯドメインキメラ」は、混成の血小板形成−赤血球形成（ＴＥＰＯ）生物活性を有するであろうと考えられる。その他の本発明に係る好ましいポリペプチドは、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドまたは本明細書に記載のヒトｍｐｌリガンドの配列に等しい少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０アミノ酸残基の連続配列を有するｍｐｌリガンドフラグメントを包含する（例えば、第１４表、実施例２４を参照されたい）。好ましいｍｐｌリガンドフラグメントは、Ｘが１５３、１６４、１９１、２０５、２０７、２１７、２２９、または２４５であるヒトＭＬ［１−Ｘ］である（残基１−Ｘの配列については図１［配列番号１］を参照されたい）。その他の好ましいｍｐｌリガンドフラグメントは、精製されたこのリガンドの化学的または酵素的加水分解または消化の結果として生成されるものを包含する。本発明のもう一つの好ましい態様は、ｍｐｌリガンド分子を精製する方法であって、この方法は、ｍｐｌリガンド分子を含有するｍｐｌリガンド供給源を、精製すべきｍｐｌリガンド分子が、固定されたレセプターポリペプチドに選択的に吸着される条件下で、固定されたレセプターポリペプチド、特にｍｐｌまたはｍｐｌ融合ポリペプチトと接触させ、この固定された支持体を洗浄して非吸着物質を除去し、そして精製すべき分子を、固定されたレセプターポリペプチドから溶離緩衝液で溶出することからなる。ｍｐｌリガンドを含有する供給源は血漿であってよく、その場合固定されたレセプターは好ましくはｍｐｌ−ＩｇＧ融合物である。別法として、ｍｐｌリガンドを含有する供給源は組換え細胞培養であり、その場合、培地または細胞溶菌液中のｍｐｌリガンドの濃度は一般に、血漿またはその他の天然供給源中の濃度より高い。この場合、上記のｍｐｌ−ＩｇＧ免疫親和法は、尚有用ではあるが通常必要なく、より伝統的な当分野で知られる蛋白精製法を適用することができる。簡潔に述べると、実質上均質なｍｐｌリガンドを提供するための好ましい精製法は、粒状の断片、宿主細胞または溶菌されたフラグメントを、例えば遠心または限外濾過によって除去し；所望により、入手し得る市販の蛋白濃縮フィルターで蛋白を濃縮し；その後、免疫親和、イオン交換（例えばＤＥＡＥまたはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックス）、ブルー−セファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンズマメレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテル・トイパール、ブチル・トイパール、フェニル −トイパール、プロテインＡセファロース、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基を付けたシリカゲル）またはセファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈澱化から選ばれる１またはそれ以上の工程によって、その他の不純物から当該リガンドを分離することを含む。メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターを前記の工程のいずれかに加えて蛋白分解を阻害することができる。もう一つの好ましい態様において、本発明は、ｍｐｌリガンドに結合することのできる分離された抗体を提供する。好ましいｍｐｌリガンドの分離された抗体はモノクローナルである（コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５−４９７頁［１９７５］；キャンベル、ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー、バードン等編、１３巻、エルセヴィア・サイエンス・パブリスラーズ、アムステルダム［１９８５］；およびヒューズ等、Science、２４６巻１２７５−１２８１頁［１９８９］）。好ましいｍｐｌリガンドの分離された抗体は、少なくとも約１０⁶ｌ／ｍｏｌｅの親和性でｍｐｌリガンドに結合するものである。より好ましくは、この抗体は少なくとも約１０⁷ｌ／ｍｏｌｅの親和性で結合する。最も好ましくは、この抗体は上記のエフェクター機能のうち一つを有するｍｐｌリガンドに対して作製される。ｍｐｌリガンドに結合することのできる分離された抗体は、所望により第二のポリペプチドと融合させてもよく、該抗体またはその融合物は、固定されたｍｐｌポリペプチドについて上に記載されたように、ｍｐｌリガンドを供給源から分離および精製するために使用することができる。この態様のさらなる好ましい側面において、本発明は、抗体を、該リガンドの含有が疑われる試料、特に血清試料と接触させ、そして結合が起こったか否かを検出することからなる、インビトロまたはインビボでｍｐｌリガンドを検出する方法を提供する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、ｍｐｌリガンドまたはそのフラグメントをコードしている分離された核酸分子（この核酸分子は検出し得る原子団によって標識されていてもいなくてもよい）、および、ｍｐｌリガンドをコードしている配列を有する核酸分子に対し相補的、または緊縮もしくは中等度緊縮条件下でこれとハイブリダイズする配列を有する核酸分子を提供する。好ましいｍｐｌリガンド核酸は、ヒトｍｐｌリガンドと、少なくとも７５％の配列一致、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％の配列一致を共有する生物活性なｍｐｌリガンドをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。より好ましい分離された核酸分子は、（ａ）哺乳動物ｍｐｌリガンド遺伝子のコード化領域に基づくＤＮＡ（例えば、図１（配列番号２）に供されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはそのフラグメント）；（ｂ）少なくとも中等度緊縮条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡ；、および、（ｃ）遺伝コードの縮重からもたらされる（ａ）または（ｂ）に定義のＤＮＡに対して縮重しているＤＮＡ、から選ばれる、生物活性なｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡ配列である。本明細書に記載される新規なｍｐｌリガンドは、それらのＤＮＡが、低ないし中等度緊縮条件下で図１（配列番号２）のＤＮＡ（またはその相補物もしくはフラグメント）とハイブリダイズできるという適当な配列同一性を有するリガンドまたはサイトカインのファミリーの成員であり得るということが意図される。したがって、本発明のさらなる側面は、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡと低ないし中等度緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。本発明のさらなる好ましい態様において、該核酸分子はｍｐｌリガンドをコードしているｃＤＮＡであり、そしてさらに複製可能なベクターを含み、ここで該ｃＤＮＡは、該ベクターにより形質転換された宿主により認識される調節配列と機能的に結合している。この側面はさらに、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、および、該ｃＤＮＡを使用してｍｐｌリガンドの生産を行う方法であって、ｍｐｌリガンドをコードしているｃＤＮＡを、形質転換された宿主細胞の培養中で発現させ、この宿主細胞培養からｍｐｌリガンドを回収することからなる方法を包含する。このやり方で製造されたｍｐｌリガンドは、好ましくは実質上均質なヒトｍｐｌリガンドである。ｍｐｌリガンドの生産にとって好ましい宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本発明はさらに、哺乳動物に治療的有効量のｍｐｌリガンドを投与することからなる、免疫学的または造血疾患、特に血小板減少症を有する哺乳動物を処置する好ましい方法を包含する。所望により、ｍｐｌリガンドは、サイトカイン、特にコロニー刺激因子またはインターロイキンと組み合わせて投与してよい。好ましいコロニー刺激因子またはインターロイキンは、ｋｉｔ−リガンド、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ− ３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９またはＩＬ−１１を包含する。 III．作成の方法血小板の産生は、長い間幾人かの著者によって、複数の系統特異的液性因子により調節されると考えられてきた。巨核球コロニー刺激因子（ｍｅｇ−ＣＳＦ）およびトロンボポエチンと称される二つの明確なサイトカイン活性が、巨核球形成および血小板形成を調節するとされてきた（ウィリアムズ等、J.Cell Physiol .、１１０巻１０１−１０４頁［１９８２］；ウィリアムズ等、Blood Cells、１５巻１２３−１３３頁［１９８９；およびゴードン等、Blood、８０巻３０２− ３０７頁［１９９２］）。この仮説によれば、ｍｅｇ−ＣＳＦは祖先巨核球の増殖を刺激し、一方トロンボポエチンは主として、より分化した細胞の成熟に、そして最終的に血小板放出に影響する。１９６０年代以来、血小板減少症の症状発現後の、動物および人間の血漿、血清および尿におけるｍｅｇ−ＣＳＦおよびトロンボポエチン活性の誘導および出現は、詳細に証明されてきた（オーデル等、 Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１０８巻４２８−４３１頁［１９６１］；ネイケフ等、Acta Haematol.、５４巻３４０−３４４頁［１９７５］；スペクター、Proc.S oc.Exp.Biol.、１０８巻１４６−１４９頁［１９６１］；シュライナー等、J.Cl in.Invest.、４９巻１７０９−１７１３頁［１９７０］；エブ、Blood、４４巻６０５−６０８頁［１９７４］；ホフマン等、N.Engl.J.Med.、３０５巻５３３頁［１９８１］；ストラニーヴァ等、Exp.Hematol.、１７巻１１２２−１１２７頁［１９８８］；マズーア等、Exp.Hematol.、１３巻１１６４頁［１９８５］；マズーア等、J.Clin.Invest.、６８巻７３３−７４１頁［１９８１］；シャイナー等、Blood、５６巻１８３−１８８頁［１９８０］；ヒル等、Exp.Hematol.、２０巻３５４−３６０頁［１９９２］；およびヘギー等、Int.J.Cell Cloning、８巻２３６−２４４頁［１９９０］）。これらの活性は、系統特異的であり、既知のサイトカインから識別できると報告された（Ｒ．Ｊ．ヒル等、Blood、８０巻３４６頁（１９９２）；Ｃ．Ｌ．エリクソン−ミラー等、Brit.J.Haematol.、８４巻１９７−２０３頁（１９９３）；Ｊ．Ｅ．ストラニーヴァ等、Exp.Hemato l.、２０巻４７５０頁（１９９２）；およびＪ．ツカダ等、Blood、８１巻８６６−８６７頁［１９９３］）。今まで、ｍｅｇ−ＣＳＦまたはトロンボポエチンを血小板減少症の血漿または尿から精製する試みは成功していない。血小板減少症の血漿を説明している上記の観察と一致して、本発明者等は、照射されたブタから得られた再生不良性ブタ血漿（ＡＰＰ）がヒトの巨核球形成をインビトロで刺激することを見いだした。本発明者等は、この刺激活性が、ｃ− ｍｐｌの可溶性細胞外ドメインによって破壊されることを見いだし、ＡＰＰが推定のｍｐｌリガンド（ＭＬ）の可能性ある供給源であることを確認した。現在本発明者等は、ＡＰＰからｍｐｌリガンドをうまく精製しており、そして、アミノ酸配列情報を用いてマウス、ブタおよびヒトＭＬｃＤＮＡを分離した。これらのＭＬはエリスロポエチンと配列相同性があり、ｍｅｇ−ＣＳＦおよびトロンボポエチン様活性の両方を持っている。１．血漿からのｍｐｌリガンドの精製および同定上に開示されるように、様々な種由来の再生不良性血漿はインビトロで造血を刺激する活性を含むと報告されているが、但し、造血刺激因子が血漿から分離されたという報告はかつて無い。再生不良性血漿の一つの供給源は、照射されたブタから得られる。この再生不良性ブタ血漿（ＡＰＰ）はヒトの造血をインビトロで刺激する。ＡＰＰがｍｐｌリガンドを含むかどうかを決定するため、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ）中への³ Ｈ−チミジンの取り込みを図２に示される手法によって測定することにより、その効果を検定した。ＡＰＰはＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞への³Ｈ−チミジンの取り込みを刺激したが、Ｂａ／Ｆ３対照細胞（即ち、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトされていない）への取り込みは刺激しなかった。加えて、正常なブタ血漿では係る活性は観察されなかった。これらの結果は、ＡＰＰが、ｍｐｌレセプターを介して増殖シグナルを変換する因子（群）を含み、故にこのレセプターの天然リガンドであるかも知れないということを示した。この事はさらに、可溶性ｍｐｌ −ＩｇＧでＡＰＰを処理するとＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞に対するＡＰＰの刺激効果が遮断されるという発見によって支持された。プロナーゼ、ＤＴＴ、または熱がＡＰＰ中の活性を破壊することから、ＡＰＰ中の活性は蛋白であるらしい（図３）。さらにこの活性は透析され得ない。しかしながらこの活性は、低いｐＨ（ｐＨ２．５で２時間）に対して安定であり、幾つかのレクチン親和カラムに結合し且つそこから溶出されることが示され、この事はこれが糖蛋白であることを示した。この活性の構造および実体をさらに解明するために、ｍｐｌ−ＩｇＧキメラを用いてこれをＡＰＰから親和精製した。実施例１および２に開示されるプロトコルに従ってＡＰＰを処理した。簡潔に述べると、ｍｐｌリガンドを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、固定された色素クロマトグラフィー、およびｍｐｌ−親和クロマトグラフィーを用いて精製した。各工程からの活性の回収を図４に示し、比純度を第１表に供する。ｍｐｌ−親和カラムからの活性の通算回収はおよそ１０％であった。ｍｐｌ− 親和カラムからのピーク活性画分（Ｆ６）は、９．８ｘ１０⁶単位／ｍｇの推定比活性を有する。ＡＰＰ５リットルからの通算の精製は、およそ４ｘ１０⁶倍（０．８単位／ｍｇから３．３ｘ１０⁶単位／ｍｇに）で、８３ｘ１０⁶倍の蛋白の減少（２５０ｇから３μｇに）を伴った。本発明者等は、ｍｐｌ−親和カラムから溶離されたリガンドの比活性を〜３ｘ１０⁶単位／ｍｇであると評価した。還元条件下で実施するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％、ノヴェックス・ゲル）によりｍｐｌ親和カラムから溶離された画分の分析は、幾つかの蛋白の存在を明らかにした（図５）。最も強い強度で銀染色された蛋白は、見掛けのＭｒ６６０００、５５０００、３００００、２８０００および１８０００−２２０００に分離した。これらの蛋白のうちのどれがＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞培養の増殖を刺激したかを決定するために、蛋白を実施例２に記載のようにゲルから溶出した。この実験の結果は、Ｍｒ２８０００−３２０００の蛋白を含むゲル切片から殆どの活性が溶出し、ゲルの１８０００−２２０００領域に、より低い活性が溶出することを示した（図６）。これらの領域内で可視的な唯一の蛋白は、３００００、２８０００および１８０００−２２０００のＭｒを持っていた。ゲルのこの領域に分離する蛋白（即ち、３０、２８および１８−２２ｋＤａのバンド）の蛋白配列を同定し取得するために、これら三つの蛋白をＰＶＤＦに電気ブロットし、実施例３に記載のように配列決定した。得られたアミノ末端配列を第２表に供する。コンピューター援用分析により、これらのアミノ酸配列は新規であることが明らかとなった。三つの配列は全て同じであったため、３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａの蛋白は関連しており、同じ新規な蛋白の異なる型であろうと信じられた。さらに、活性がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４−２０％ゲルの同じ領域（２８０００−３２０００）に分離されることから、この蛋白は天然ｍｐｌリガンドの有望な候補物質であった。加えて、部分的に精製されたリガンドは、スーパーロース１２（ファルマシア）カラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーに付す時、Ｍｒ１７０００−３００００で移動した。このリガンドの異なったＭｒ型は、蛋白分解またはグリコシル化の相違またはその他の翻訳前もしくは翻訳後修飾の所産であると信じられる。先に記載されたように、アンチセンスヒトｍｐｌＲＮＡは、他の造血細胞系統の分化に影響を及ぼすことなく、ＣＤ３４⁺祖先細胞に富ませたヒト骨髄培養の巨核球形成を破壊した（メシア等、上記）。この結果は、ｍｐｌレセプターがインビトロの巨核球の分化および増殖で役割を果たしているかも知れないということを示唆した。巨核球形成におけるｍｐｌリガンドの役割をさらに解明するために、インビトロのヒト巨核球形成に及ぼすＡＰＰおよびｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰの効果を比較した。ヒト巨核球形成に及ぼすＡＰＰの効果は、実施例４に記載の液体懸濁巨核球形成検定の変法を用いて測定した。この検定において、ヒト末梢幹細胞（ＰＳＣ）を、ｍｐｌ−ＩｇＧ親和クロマトグラフィーの前および後にＡＰＰで処理した。巨核球形成のＧＰII_bIII_a刺激を¹²⁵Ｉ−抗II_bIII_a抗体で定量した（図７）。図７に示されるように、１０％ＡＰＰはおよそ３倍の刺激を惹起したが、ｍｐｌリガンドを涸渇させたＡＰＰは効果が無かった。重要なことに、ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰはＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の増殖を誘導しなかった。別の実験において、１０％ＡＰＰを含有する培養に０、２および４日目に添加された可溶性ヒトｍｐｌ−ＩｇＧは、ヒト巨核球形成に及ぼすＡＰＰの刺激効果を中和した（図８）。これらの結果は、ｍｐｌリガンドはヒト巨核球形成を調節する役割を果たし、故に血小板減少症の処置に有用であり得ることを示すものである。２．ｍｐｌリガンドの分子クローニング３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白から得られたアミノ末端アミノ酸配列に基づき（上記第２表を参照されたい）、二つの縮重したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを設計し、ＰＣＲによってブタゲノムＤＮＡの増幅に使用した。もしこのアミノ末端アミノ酸配列が単一のエクソンによってコードされているのならば、正しいＰＣＲ産物は６９ｂｐ長であると予想されるという事が推論された。この大きさの一つのＤＮＡフラグメントが発見されｐＧＥＭＴ中にサブクローニングされた。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーおよび得られた３個のクローンの配列を実施例５に示す。ＰＣＲプライマー間にコードされているペプチドのアミノ酸配列（ＰＲＬＬＮＫＬＬＲ［配列番号３３］）は、ブタリガンドのアミノ末端蛋白配列決定により得られたものと同一であった（上記の２８および３０ｋＤａブタ蛋白配列の残基９−１７を参照されたい）。ＰＣＲフラグメントの配列に基づいた合成オリゴヌクレオチドを用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｐＲ４５と命名された４５量体のオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＣＲフラグメントの配列に基づいて合成した。このオリゴヌクレオチドは以下の配列：を持っていた。このデオキシオリゴヌクレオチドを、実施例６に従い、低緊縮のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下でλｇｅｍ１２中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。陽性クローンを選び、プラークを精製し、制限地図作成およびサザンブロッティングにより分析した。４５量体とハイブリダイズした３９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ−中にサブクローニングした。このクローンのＤＮＡ配列決定は、ブタｍｐｌリガンドのヒト同族体をコードしているＤＮＡが分離されたことを確認した。このヒトＤＮＡ配列および導き出されたアミノ酸配列を図９（配列番号３および４）に示す。ゲノム配列中のイントロンの予想位置を矢印で示し、推定のエクソンを規定する（「エクソン３」）。ヒト「エクソン３」配列（実施例６）に基づき、このエクソン配列の３'および５'末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。これらの二つのプライマーを、様々なヒト組織から調製されるｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ反応に使用した。予想される正しいＰＣＲ生成物の大きさは１４０ｂｐであった。ＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した後、予想された大きさのＤＮＡフラグメントが、ヒト成人腎臓から調製されたｃＤＮＡライブラリー、２９３胎児腎臓細胞およびヒト胎児肝臓から調製されたｃＤＮＡに検出された。次に、λＤＲ２中の胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（７ｘ１０⁶クローン）を、低緊縮ハイブリダイゼーション条件下でヒトゲノムライブラリーおよび胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いられた同じ４５量体オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。陽性クローンを選び、プラークを精製し、挿入物の大きさをＰＣＲにより決定した。１．８ｋｂ挿入物を伴う１個のクローンを、さらなる分析のために選択した。実施例７に記載の方法を用いて、ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）のヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸の配列を得た。これらの配列を図１（配列番号１および２）に示す。３．ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）の構造ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）ｃＤＮＡ配列（図１［配列番号２］）は、１７７４ヌクレオチドとその後のポリ（Ａ）尾を含んでいる。これは２１５ヌクレオチドの５'非翻訳配列および４９８ヌクレオチドの３'非翻訳領域を含んでいる。ヌクレオチド位置（２１６−２１８）の仮定の開始コドンは、真核生物の翻訳開始にとって好適な共通配列内にある。オープンリーディングフレームは１０５９ヌクレオチド長であり、ヌクレオチド位置２２０で始まる３５３アミノ酸残基のポリペプチドをコードしている。予想アミノ酸配列のＮ末端は極めて疎水性であり、恐らくシグナルペプチドに対応しているであろう。予想アミノ酸配列のコンピューター分析（フォン・ヘイジュヌ等、Eur.J.Biochem.、１３３巻１７−２１頁［１９８３］）は、シグナルペプチダーゼのための可能性ある開裂部位が残基２１および２２の間であることを示している。その位置での開裂は、ブタ血漿から精製されたｍｐｌリガンドから得られたアミノ末端配列で始まる３３２アミノ酸残基の成熟ポリペプチドを生成するであろう。この３３２アミノ酸残基のリガンドの、グリコシル化されていない予想分子量は、約３８ｋＤａである。６個の可能性あるＮ−グリコシル化部位および４個のシステイン残基がある。ｍｐｌリガンド配列とジーンバンク配列データベースとの比較は、成熟ヒトｍｐｌリガンドのアミノ末端１５３残基とヒトエリスロポエチンとの間の２３％の一致を明らかにした（図１０［配列番号６および７］）。同類置換を考慮に入れると、ｈＭＬのこの領域はヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）と５０％の類似性を示す。ｈＥＰＯおよびｈＭＬはいずれも４個のシステインを含む。４個のシステインのうち最初と最後のシステインを含む３個がｈＭＬで保存されている。位置指定突然変異生成実験は、エリスロポエチンの最初と最後のシステインが、機能に必要なジスルフィド結合を形成することを示した（Ｆ．Ｆ．ワング等、Endoc rinology、１１６巻２２８６−２２９２頁［１９８３］）。類推により、ｈＭＬの最初と最後のシステインもまた重要なジスルフィド結合を形成しているかも知れない。グリコシル化部位のどれもｈＭＬで保存されてはいない。可能性あるｈＭＬのＮ結合グリコシル化部位は全てｈＭＬポリペプチドのカルボキシ末端側の半分に位置している。ｈＥＰＯと同様に、ｈＭＬｍＲＮＡは共通ポリアデニル化配列ＡＡＵＡＡＡを含まず、また、多くのサイトカインの３'非翻訳領域に存在しｍＲＮＡの安定性に影響していると考えられる調節要素ＡＵＵＵＡもまた含まない（シャウ等、Ce ll、４６巻６５９−６６７頁［１９８６］）。ノーザンブロット分析では、胎児および成人いずれの肝臓にも、低レベルの単一の１．８ｋｂｈＭＬＲＮＡ転写物が現れている。より長く露光した後に、同じ大きさのより弱いバンドを、成人の腎臓で検出することができた。比較すると、ヒトエリスロポエチンは、胎児肝臓に、そして低酸素症に応答して成人の腎臓および肝臓に発現される（ジェイコブズ等、Nature、３１３巻８０４−８０９頁［１９８５］およびボンデュラント等、Molec.Cell.Biol.、６巻２７３１−２７３３頁［１９８６］）。ｈＭＬのＣ末端領域の重要性は尚、解明される必要がある。Ｎ結合グリコシル化のための６個の可能性ある部位の存在およびレクチン親和カラムと結合するこのリガンドの能力に基づくと、ｈＭＬのこの領域はグリコシル化されそうである。幾つかのゲル溶離実験において、本発明者等は、Ｍｒ６００００前後で活性が分離することを観察したが、これは全長のグリコシル化された分子を表しているかも知れない。故に、Ｃ末端領域は、循環するｈＭＬを安定化しその半減期を増大させるような作用をするのかも知れない。エリスロポエチンの場合、非グリコシル化型は完全なインビトロ生物活性を持つが、グリコシル化されたエリスロポエチンと比較して有意に短縮した血漿半減期を有する（タケウチ等、J.Biol.Che m.、２６５巻１２１２７−１２１３０頁［１９９０］；ナーヒ等、J.Biol.Chem. 、２６６巻２３０２２−２３０２６頁［１９９１］およびスピヴァック等、Bloo d、７巻９０−９９頁［１９８９］）。ｈＭＬのＣ末端ドメインは、可能性あるプロセシング部位として働き得る２個の二塩基性アミノ酸配列［１５３−１５４および２４５−２４６位のＡｒｇ−Ａｒｇモチーフ］を含んでいる。これらの部位での開裂が、ＡＰＰから分離されるＭＬの３０、２８および１８−２２ｋＤａ型の生成を司っているのかも知れない。重要なことに、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄配列は、ＭＬのエリスロポエチン様ドメインの直後に存在する。これらの観察は、全長のＭＬは、成熟リガンドを生成するための限定された蛋白分解を受ける前駆体蛋白であり得るという事を示している。４．ヒトｍｐｌリガンドのイソ型および変異体成人肝臓でのＰＣＲにより、ヒトｍｐｌリガンドのイソ型または択一的スプライス型が検出された。簡潔に述べると、ｈＭＬのコード化配列の各末端および選ばれた内部領域に対応するプライマーが合成された。これらのプライマーをＲＴ −ＰＣＲに使用して実施例１０に記載のように成人肝臓ＲＮＡを増幅した。ｈＭＬと命名された全長型に加えて、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３およびｈＭＬ４と命名される他の三つの型が観察されまたは導き出された。４個のイソ型全てについての導き出された成熟アミノ酸配列を図１１（配列番号６、８、９および１０）に示す。ｈＭＬ３は７００位に１１６のヌクレオチド除去があり、これはアミノ酸の除去およびフレームシフトの両方をもたらしている。このｃＤＮＡは、今や、２６５アミノ酸長でアミノ酸残基１３９でｈＭＬから分岐する成熟ポリペプチドをコードしている。最後に、ｈＭＬ４はヌクレオチド位置６１８の後の１２ヌクレオチドの除去（マウスおよびブタの配列にも見いだされる［下記参照］）およびｈＭＬ３に見いだされる１１６ｂｐ除去を有している。１２ｂｐ除去（ヌクレオチド６１９の後に）のみを有するクローンはヒトにおいて分離されていないが（ｈＭＬ２と命名される）、係るイソ型がマウスおよびブタの両者で同定されている事（下記参照）、そしてそれはｈＭＬ４の１１６ヌクレオチド除去に関連して同定されている事から、この型は存在しそうである。二塩基性Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄配列が２個のアラニン残基に置き換えられたｈＭＬの置換変異体およびｈＭＬの「ＥＰＯ−ドメイン」末端切除型の両方を組み立てて、全長ＭＬが生物活性にとって必要であるか否かを決定した。ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）と呼ばれるＡｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄二塩基性配列置換変異体は実施例１０に記載のようにＰＣＲを用いて組み立てた。「ＥＰＯ−ドメイン」末端切除型、ｈＭＬ１５３もまたＰＣＲを使用し、Ａｒｇ１５３の後に停止コドンを導入することによって作成した。５．一過性トランスフェクトされたヒト胚腎（２９３）細胞における組換えヒトｍｐｌリガンド（ｒｈＭＬ）の発現クローニングされたヒトｃＤＮＡがｍｐｌのためのリガンドをコードしていることを確認するため、このリガンドを、発現ベクターｐＲＫ５−ｈＭＬまたはｐＲＫ５−ｈＭＬ₁₅₃を用いてサイトメガロウイルス即時初期プロモーターの調節下に、哺乳動物２９３細胞で発現させた。一過性トランスフェクトさせたヒト胚腎２９３細胞からの上清は、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞における³Ｈ−チミジン取り込みを刺激するが、親のＢａ／Ｆ３細胞では刺激しないことが判明した（図１２Ａ）。ｐＲＫベクター単独でトランスフェクトさせた２９３細胞からの培地はこの活性を含まなかった。この培地へのｍｐｌ−ＩｇＧの添加は、この刺激を破壊した（データは示されていない）。これらの結果は、クローニングされたｃＤＮＡは機能的ヒトＭＬ（ｈＭＬ）をコードしていることを示している。「ＥＰＯ−ドメイン」単独がｍｐｌに結合しこれを活性化できるかどうかを決定するため、ｈＭＬの末端切除型、ｒｈＭＬ₁₅₃を２９３細胞で発現させた。トランスフェクトさせた細胞からの上清は、全長ｈＭＬを発現する細胞からの上清に存在するものと類似の活性を有することが判明し（図１２Ａ）、この事により、ＭＬのＣ末端ドメインはｃ−ｍｐｌの結合および活性化に必要ないことが示された。６．ｍｐｌリガンドは巨核球形成および血小板形成を刺激する組換えｈＭＬの全長ｒｈＭＬおよび末端切除されたｒｈＭＬ₁₅₃型はいずれもインビトロでヒト巨核球形成を刺激した（図１２Ｂ）。この効果は、他の、外から加えられた造血成長因子の不在下で観察された。ＩＬ−３を除いて、ＭＬは、この活性を表す試験された唯一の造血成長因子であった。ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−１、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−９、ＬＩＦ、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＯＳＭおよびＧＭ−ＣＳＦは、本発明者等の検定で個別に試験する時、巨核球形成への影響が無かった（データは示されていない）。この結果はＭＬが巨核球刺激活性を有することを立証し、巨核球形成の調節におけるＭＬの役割を示すものである。血小板減少症の動物の血漿に存在する血小板形成活性は、マウスリバウンド血小板増加検定において血小板の産生を刺激することが示された（マクドナルド、 Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４巻１００６−１００１頁［１９７３］およびマクドナルド等、Scand.J.Haematol.、１６巻３２６−３３４頁［１９７６］）。このモデルにおいて、特異的抗血小板血清を用いてマウスを急性血小板減少症とし、予言可能なリバウンド血小板増加症を引き起こさせる。ちょうど低酸素症のマウスが正常マウスよりエリスロポエチンに対してより感受性である（マクドナルド等、J.Lab.Clin.Med.、７７巻１３４−１４３頁［１９７１］）ように、係る免疫血小板血症マウスは正常マウスより、外来性のトロンボポエチン様活性に、より応答性が高い（マクドナルド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４巻１００６− １００１頁［１９７３］）。ｒＭＬがインビボで血小板産生を刺激するかどうかを決定するため、リバウンド血小板増加症のマウスに部分精製されたｒｈＭＬを注射した。次いで、血小板数および血小板への³⁵Ｓの取り込みを定量した。処置されたマウスにおいて、賦形剤のみを注射された対照マウスに対して血小板数で〜２０％の増加（それそれｐ＝０．０００５および０．０００１）、そして血小板への³⁵Ｓ取り込み〜で４０％の増加（ｐ＝０．００３）があったことで証明されるように、マウスへの６４０００または３２０００単位のｒＭＬの注射は、血小板の産生を有意に増加させた（図１２Ｃ）。このレベルの刺激は、本発明者等がＩＬ−６によってこのモデルで観察したものに匹敵する（データは示されていない）。１６０００単位のｒＭＬでの処置は血小板産生を有意に刺激しなかった。これらの結果は、ＭＬが血小板産生を用量依存的に刺激し、故にトロンボポエチン様活性を有していることを示すものである。さらに、２９３細胞を上記の別なｈＭＬイソ型組み立て物でトランスフェクトさせ、上清をＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて検定した（図１３を参照されたい）。ｈＭＬ２およびｈＭＬ３はこの検定で検出し得る活性を示さなかったが、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）の活性はｈＭＬおよびｈＭＬ₁₅₃と似通っており、この事は、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄二塩基部位でのプロセシングは活性にとって必要でもなければ有害でもないことを示すものである。７．巨核球形成とｍｐｌリガンド巨核球形成は複数の細胞レベルで調節されているという事が提唱されている（ウィリアムズ等、J.Cell Physiol.、１１０巻１０１−１０４頁［１９８２］およびウィリアムズ等、Blood Cells、１５巻１２３−１３３頁［１９８９］）。これは概して、或る造血成長因子は巨核球祖先の増殖を刺激し、一方別のものは主として成熟に影響するという観察に基づいている。本明細書に提示された結果は、ＭＬは増殖および成熟因子の両方として作用するという事を示唆している。ＭＬが巨核球祖先の増殖を刺激するという事は、幾つかの方面の証拠によって支持される。第一に、ＡＰＰはインビトロでヒト巨核球の増殖および成熟の両方を刺激し、この刺激はｍｐｌ−ＩｇＧにより完全に阻害される（図７および８）。さらに、ｃ−ｍｐｌアンチセンスオリゴヌクレオチドによる巨核球コロニー形成の阻害（メシア等、Blood、８２巻１３９５−１４０１頁［１９９３］）および、ｃ−ｍｐｌが、それがトランスフェクトされる細胞において増殖シグナルを変換できるという発見（スコダ等、EMBO、１２巻２６４５−２６５３頁［１９９３］およびヴィゴン等、Oncogene、８巻２６０７−２６１５頁［１９９３］）もまた、ＭＬが増殖を刺激するという事を示している。巨核球分化の全ての段階で明らかにｃ−ｍｐｌが発現されること（メシア等、Blood、８２巻１３９５−１４０１頁［１９９３］）、そしてインビボで血小板産生を迅速に刺激する組換えＭＬの能力は、ＭＬが成熟にも影響することを示している。組換えＭＬが利用できることにより、巨核球形成および血小板形成の調節におけるその役割ならびに他の造血系統にそれが影響している可能性を注意深く評価することが可能になる。８．ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子の分離ｐＲ４５を伴うλ−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラリーを、低緊縮条件下または高緊縮条件下で、ｍｐｌリガンドをコードしているヒトｃＤＮＡの３'側半分に対応するフラグメントでスクリーニングすることにより、ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを分離した。３５ｋｂの２個の部分重複するλクローンが分離された。ＴＰＯ遺伝子全体を含む２個の部分重複するフラグメント（ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩ）をサブクローニングし配列決定した（図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃを参照されたい）。このヒト遺伝子の構造は、７ｋｂのゲノムＤＮＡ内の６個のエクソンで構成されている。全エクソン／イントロン接合部の境界は、哺乳動物遺伝子のために確立された共通モチーフと一致する（Ｍ．Ｂ．シャピロ等、Nucl.Acids Res.、１５巻７１５５頁［１９８７］）。エクソン１およびエクソン２は、５'非翻訳配列およびシグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸を含む。分泌シグナルの残部および成熟蛋白の最初の２６アミノ酸は、エクソン３内部にコードされている。全カルボキシドメインおよび３'非翻訳ならびにエリスロポエチン様ドメインの〜５０アミノ酸は、エクソン６内部にコードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ −２）内部に観察される除去に含まれる４個のアミノ酸は、エクソン６の５'末端にコードされている。サザンブロットによるヒトゲノムＤＮＡの分析は、ＴＰＯのための遺伝子が単一のコピーで存在することを示した。この遺伝子の染色体上の位置が蛍光インサイトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により決定され、これは染色体３ｑ２７−２８に位置付けられた。９．２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製２９３細胞からのＭＬまたはＴＰＯの製造および精製を実施例１９に詳細に記載する。簡潔に述べると、ＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを、ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩを用いるＰＣＲによって取得した。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ（チミジンキナーゼプロモーターの調節の下にネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう修飾したｐＲＫ５から誘導されたベクター）の制限部位ＣｌａＩおよびＸｂａｌの間にクローニングして、ベクターｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ.ＯＲＦ（全オープンリーディングフレームをコードしているベクター）を得た。ＥＰＯホモローガスドメインをコードしている第二のベクターを、異なるＰＣＲプライマーを使用する外は同様にして生成し、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏＥＰＯ− Ｄと呼ばれる最終組み立て物を得た。これら二つの組み立て物をＣａＰＯ₄法によりヒト胚腎臓細胞中にトランスフェクトさせ、ネオマイシン耐性クローンを選択し、密集成長させた。条件培地でのこれらのクローンからのＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて評価した。ｒｈＭＬ₃₃₂の精製を実施例１９に記載のように実施した。簡潔に述べると、２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂条件培地をブルー−セファロース（ファルマシア）カラムに適用し、その後２Ｍ尿素を含有する緩衝液で洗浄した。このカラムを２Ｍ尿素および１ＭＮａＣｌを含有する緩衝液で溶離した。次に、このブルー−セファロース溶出プールをＷＧＡ−セファロースカラムに直接適用し、２Ｍ尿素および１ＭＮａＣｌを含有する１０カラム容量の緩衝液で洗浄し、０．５ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。ＷＧＡ−セファロース溶出液をＣ４−ＨＰＬＣカラム（シンクロム、Ｉｎｃ．）に適用し、不連続プロパノール勾配で溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製された２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂は、ゲルの６８−８０ｋＤａ領域の幅広いバンドとして移動した（図１５を参照されたい）。ｒｈＭＬ₁₅₃の精製もまた実施例１９に記載のように実施した。簡潔に述べると、２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃条件培地をｒｈＭＬ３３２について記載されたようにブルー−セファロース上で分離した。このブルー−セファロース溶出液を上記のようにｍｐｌ−親和カラムに直接適用した。ｍｐｌ−親和カラムから溶出したｒｈＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂に用いたのと同じ条件下で稼働させるＣ４−ＨＰＬＣカラムを用いて、均質となるまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この精製されたｒｈＭＬ１５３は、Ｍｒ〜１８０００−２２０００の２個の主要なそして２個の重要性の低いバンドに分離する（図１５を参照されたい）。１０．マウスｍｐｌリガンドヒトｍｐｌリガンドのコード化領域に対応するＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって取得し、ゲル精製し、そして³²Ｐ−ｄＡＴＰおよび³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で標識した。このプローブを用いてλＧＴ１０中のマウス肝ｃＤＮＡライブラリーの１０⁶のクローンをスクリーニングした。１４４３塩基対の挿入物を含むマウスクローン（図１６［配列番号１２および１３］）を分離し配列決定した。ヌクレオチド位置１３８−１４１の仮定開始コドンは、真核生物の翻訳開始にとって望ましい共通配列内部にあった（Ｍ．コザック、J.Cell Biol.、１０８巻２２９−２４１頁［１９８９］）。この配列は、３５２アミノ酸の一次翻訳産物が予想される１０５６ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを規定する。このオープンリーディングフレームには、５'の１３７ヌクレオチドおよび３'非翻訳配列の２４７ヌクレオチドが隣接する。３'非翻訳領域に続くポリ（Ａ）尾は無く、この事は、このクローンが恐らく完全ではないことを示している。予想されるアミノ酸配列のＮ末端は極めて疎水性であり、恐らくはシグナルペプチドを表しているであろう。コンピューター分析（Ｇ．フォン・ヘイジュヌ、Eur.J. Biochem.、１３３巻１７−２１頁［１９８３］）は、残基２１および２２の間のシグナルペプチダーゼのための可能性ある開裂部位を示した。その位置での開裂は、ｍＭＬ₃₃₁（または下記の理由でｍＭＬ２）として同定される３３１アミノ酸の成熟ポリペプチド（３５ｋＤａ）を産むであろう。この配列は、ヒトの配列で全てが保存されている４個のシステイン、および、ヒトの配列でそのうち５個が保存されている７個の可能性あるＮグリコシル化部位を含んでいる。さらに、ｈＭＬと同様に、７個の可能性あるＮグリコシル化部位は全てこの蛋白のＣ末端側の半分に位置している。ヒトＭＬと比較した時、これらのＭＬの「ＥＰＯドメイン」には、ヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列の両方にかなりの一致が観察された。しかしながら、ヒトおよびマウスＭＬの導き出されたアミノ酸配列を並べた場合、マウスの配列は、ヒト（上記参照）およびブタ（下記参照）ｃＤＮＡの両者に見られるヌクレオチド位置６１８に続く１２ヌクレオチドの除去に対応する残基１１１ −１１４の間のテトラペプチドの除去を有するようであった。したがって、可能性あるマウスＭＬイソ型を検出するため、さらなるクローンを調べた。１個のクローンが、「失われている」テトラペプチドＬＰＬＱを含む３３５アミノ酸の導き出される配列のポリペプチドをコードしていた。この型は全長のマウスＭＬであると信じられ、ｍＭＬまたはｍＭＬ₃₃₅と呼ばれる。ｍＭＬに対するヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列を図１７（配列番号１４および１５）に提供する。このｃＤＮＡクローンは、１４４３塩基対とこれに続くポリ（Ａ）尾で構成される。これは、５'の１３４塩基および３'非翻訳配列の２４１塩基が隣接する１０６８ｂｐのオープンリーディングフレームを有している。仮定された開始コドンはヌクレオチド位置１３８−１４０にある。このオープンリーディングフレームは３５６アミノ酸の予想蛋白をコードしており、その最初の２１個は極めて疎水性で、分泌シグナルとして機能していそうである。最後に、第三のマウスクローンを分離し、配列決定し、ｈＭＬ３に対応する１１６のヌクレオチド除去を含むことが見いだされた。このマウスイソ型は、故にｍＭＬ３と命名する。これら２個のイソ型の導き出されたアミノ酸配列の比較を図１８（配列番号９および１６）に示す。ヒトおよびマウスＭＬ（図１９［配列番号６および１７］）の間の通算のアミノ酸配列一致は７２％であるが、この相同性は均一に分布してはいない。「ＥＰＯドメイン」として定義される領域（ヒト配列についてはアミノ酸１−１５３、マウスについては１−１４９）は、該蛋白のカルボキシ末端領域（６２％相同性）より良好に保存されている（８６％相同性）。この事はさらに、「ＥＰＯドメイン」のみが該蛋白の生物活性にとって重要であるという事を示し得る。興味深いことに、ｈＭＬに見いだされる２個の二塩基性アミノ酸モチーフのうち、ヒト配列中「ＥＰＯドメイン」の直後の二塩基性モチーフ（残基位置１５３−１５４）のみがマウス配列に存在する。この事は、全長ＭＬが、成熟リガンドを生成するために限定的蛋白分解を受ける前駆体蛋白であるかも知れないという可能性と一致する。これとは別に、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄の間の蛋白分解はｈＭＬのクリアランスを促進し得る。ｍＭＬの全コード化配列を含む発現ベクターを、実施例１に記載のように２９３細胞中に一過性トランスフェクトした。これらの細胞からの条件培地は、マウスまたはヒトｍｐｌのいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞中への³Ｈ−チミジン取り込みを刺激したが、親（ｍｐｌ無し）のセルラインには影響を及ぼさなかった。この事は、クローニングされたマウスＭＬｃＤＮＡは、マウスおよびヒトＭＬレセプター（ｍｐｌ）の両者を活性化することのできる機能的リガンドをコードしているという事を示している。１１．ブタｍｐｌリガンドブタＭＬ（ｐＭＬ）ｃＤＮＡを実施例１３に記載のようにＲＡＣＥＰＣＲによって分離した。１３４２ｂｐのＰＣＲｃＤＮＡ生成物が腎臓に見いだされ、サブクローニングされた。幾つかのクローンが配列決定され、図２０（配列番号１８および１９）に示されるヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列を有する、ｐＭＬ（またはｐＭＬ３３２）と呼ばれる３３２アミノ酸残基のブタｍｐｌリガンドをコードしていることが判明した。さらに、４個のアミノ酸残基除去を有する蛋白（２２８アミノ酸残基）をコードしているｐＭＬ２と命名された第二の型が同定された（図２１［配列番号２１］を参照されたい）。ｐＭＬおよびｐＭＬ２アミノ酸配列の比較は、後者の型は、残基１１１−１１４（両端を含む）に対応するテトラペプチドＱＬＰＰが除去されている外は同一であることを示す（図２２［配列番号１８および２１］を参照されたい）。マウスおよびブタＭＬｃＤＮＡの両者で観察される４アミノ酸の除去は、予想された蛋白の正確に同じ位置で起こっている。ヒト、マウス、およびブタからの成熟ＭＬの予想アミノ酸配列の比較（図１９［配列番号６、１７および１８］）は、全体の配列一致が、マウスおよびヒト間で７２％、マウスおよびブタ間で６８％、そしてブタおよびヒト間で７３％であることを示す。相同性は、実質上、ＭＬのアミノ末端側の半分（ＥＰＯホモローガスドメイン）で、より大きい。このドメインはどの二つの種間でも８０ないし８４％が同一であるが、カルボキシ末端側の半分（炭水化物ドメイン）は５７ないし６７パーセントが一致するに過ぎない。プロテアーゼ開裂部位を表し得る二塩基性アミノ酸モチーフは、エリスロポエチン相同性ドメインのカルボキシ末端に存在する。このモチーフは、三つの種の間でこの位置に保存されている（図１９［配列番号６、１７および１８］）。ヒトの配列の２４５および２４６位に存在する第二の二塩基性部位はマウスまたはブタ配列には存在しない。マウスおよびブタＭＬ配列は４個のシステインを含み、全てがヒト配列で保存されている。７個の可能性あるＮグリコシル化部位がマウスリガンド内に、そして６個がブタＭＬ内にあり、そのうち５個がヒト配列内で保存されている。さらに、可能性あるＮグリコシル化部位は全てこの蛋白のＣ末端側の半分に位置している。１２．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からのＴＰＯの発現および精製ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするのに用いられる発現ベクターを指定する：ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ（全長またはＴＰＯ₃₃₂）、およびｐＳＶＩ５ .ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄ（末端切除されたまたはＴＰＯ₁₅₃）。これらのプラスミドの関連する特徴を図２３および２４に示す。トランスフェクトの方法は実施例２０で説明する。簡潔に述べると、ＴＰＯのオープンリーディングフレーム全体に対応するｃＤＮＡをＰＣＲにより取得した。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬの２個の制限部位（ＣｌａＩおよびＳａｌＩ）の間にクローニングして、ベクターｐＳＶＩ５. ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦを得た。ＥＰＯホモローガスドメインに対応する第二の組み立て物を、異なる逆プライマー（ＥＰＯＤ.Ｓａｌ）を使用する外は同じやり方で作成した。ＴＰＯのＥＰＯホモローガスドメインをコードしているベクターのための最終組み立て物はｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄと呼ぶ。これら二つの組み立て物をＮｏｔＩで線状化し、電気穿孔によってチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞、１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７２４７）中にトランスフェクトした。１０⁷の細胞を、記載のように（Ｇ．Ｌ．アンドレアソン、J.Tissue Cult.Meth.、１５，５６［１９９３］）１０、２５または５０ｍｇのＤＮＡの存在下でＢＲＬ電気穿孔装置で電気穿孔した（３５０ボルト、３３０ｍＦ、低キャパシタンス）。トランスフェクションの翌日、細胞をＤＨＦＲ選択培地（グリシン無しの高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１２５０：５０、２ｍＭグルタミン、２−５％透析牛胎児血清）で分裂させた。１０ないし１５日後、個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、密集成長させた。これらのクローンからの条件培地中のＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて評価した（実施例１に記載）。収穫されたＣＨＯ細胞培養の液体からのＴＰＯの精製および分離の方法は実施例２０に記載する。簡潔に述べると、収穫された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、樹脂１リットルにつきおよそ１００ＬのＨＣＣＦの比率でブルーセファロースカラム（ファルマシア）に適用する。次にこのカラムを３ないし５カラム容量の緩衝液、続いて２．０Ｍ尿素を含有する３ないし５カラム容量の緩衝液で洗浄する。次いで２．０Ｍ尿素および１．０ＭＮａＣｌの両方を含有する緩衝液３ないし５カラム容量でＴＰＯを溶離する。次に、ＴＰＯを含有するブルーセファロース溶出液のプールを、樹脂１ｍｌに付き８ないし１６ｍｌのブルーセファロース溶出液の比率で、ブルーセファロース溶離緩衝液中で平衡化した小麦胚芽レクチンセファロースカラム（ファルマシア）に適用する。次にこのカラムを２ないし３カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄する。次いでＴＰＯを、２．０Ｍ尿素および０．５ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する緩衝液２ないし５カラム容量で溶離する。次に、ＴＰＯを含有する小麦胚芽レクチン溶出液を酸性化し、Ｃ₁₂Ｅ₈を最終濃度０．０４％まで加える。得られたプールを、樹脂１ｍｌに付きおよそ０．２ないし０．５ｍｇ蛋白のロードで、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラムに適用する。蛋白を、０．１％ＴＦＡおよび０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈を含有するアセトニトリルの二相直線勾配で溶離し、プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥを基礎に作成する。次にＣ４プールを、１００００ないし３００００ダルトン分子量カットオフを有するアミコンＹＭ等のような限外濾過膜上で、およそ６容量の緩衝液に対して希釈およびダイアフィルトレーションする。次いで、得られたダイアフィルトレートを直接処理しても、または限外濾過によってさらに濃縮してもよい。ダイアフィルトレート／濃縮液は通常、０．０１％トゥイーン−８０の最終濃度に調節する。次に、算出されたカラム容量の２ないし５％に相当するダイアフィルトレート／濃縮液の全量または一部を、０．０１％トゥイーン−８０を含有する緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（ファルマシア）に適用し、クロマトグラフィーに付す。次いで、凝集物および蛋白分解産物を含まないＴＰＯ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを基礎にプールする。得られたプールを濾過し、２ −８℃で保存する。１３．微生物における形質転換およびＴＰＯ合成の誘導ならびにそこで生成されたＴＰＯの分離、精製、および再折り畳みの方法Ｅ．ｃｏｌｉＴＰＯ発現ベクターの組み立ては実施例２１に詳細に記載されている。簡潔に述べると、プラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２を、全て、異なった組み立て物間で相違する小さなリーダーの下流のＴＰＯの１５５アミノ酸を発現するよう設計した。このリーダーは主に高レベルの翻訳開始および迅速な精製を提供する。プラスミドｐＭＰ２１０−１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流のＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計し、ＴＰＯの最初の６アミノ酸に対するコドン使用法のみが相違するが、一方プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端が２アミノ酸だけ伸長しているｐＭＰ２１０−１の誘導体である。上のプラスミドは全てトリプトファンプロモーターの誘導時に大腸菌においてＴＰＯの高レベルの細胞内発現を産むであろう（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Methods in Enzymology（Ｄ．Ｖ．ゲッデル編）、１８５巻５４−６０頁、アカデミック・プレス、サンディエゴ[１９９０]）。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの組み立ての際の中間体である。上のＴＰＯ発現プラスミドは、ＣａＣｌ₂熱衝撃法（Ｍ．マンデル等、J.Mol.B iol.、５３巻１５９−１６２頁［１９７０］）および実施例２１に記載されるその他の方法を用いて大腸菌の形質転換に使用された。簡潔に述べると、形質転換された細胞は、まず、培養の光学密度（６００ｎｍ）がおよそ２−３に達するまで３７℃で増殖させた。次にこの培養を希釈し、そして通気しつつ増殖させた後、酸を添加した。次いで培養を通気しながら１５時間増殖を続けさせ、その後細胞を遠心により収穫した。生物活性な、再折り畳みされたヒトＴＰＯまたはそのフラグメントの生産のために下記に供される分離、精製および再折り畳み法は実施例２２に説明されており、そして、２３は、ＮおよびＣ末端伸長型を包含する任意のＴＰＯ変異体の回収のために適用することができる。組換えまたは合成ＴＰＯの再折り畳みに好適なその他の方法は、大腸菌において不溶性型で発現される様々な組換え蛋白のための回収および再折り畳み過程の一般的記載に関する以下の特許；ビルダー等、米国特許４５１１５０２；ジョーンズ等、米国特許４５１２９２２；オルソン、米国特許４５１８５２６およびビルダー等、米国特許４６２０９４８に見いだすことができる。Ａ．非可溶性ＴＰＯの回収任意の適当なプラスミドによりコードされているＴＰＯを発現する大腸菌のような微生物は、ＴＰＯが不溶性「屈折体」に蓄積される条件の下で発酵させる。所望により、細胞を最初に細胞破壊緩衝液で洗浄してもよい。典型的には、例えばポリトロンホモジナイザーを用いて、細胞約１００ｇを細胞破壊緩衝液約１０容量（例えば、１０ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸濁し、細胞を５０００ｘｇで３０分間遠心する。次に細胞を、浸透圧衝撃、超音波処理、圧力サイクル、化学的または酵素的方法のような任意の常套的技術を用いて溶菌する。例えば、上記の洗浄した細胞ペレットは、ホモジナイザーを用いてさらに１０容量の細胞破壊緩衝液に再懸濁することができ、この細胞懸濁液を、製造者の指示に従って、ＬＨ細胞破砕機（ＬＨインセルテク、Ｉｎｃ．）またはマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス・インターナショナル）に通す。次に、ＴＰＯを含有する粒状物質を液相から分離し、所望により適当な液体で洗浄する。例えば、細胞溶菌液の懸濁液を５０００ｘｇで３０分間遠心し、再懸濁し、所望により二回目の遠心を行い、洗浄された屈折体ペレットを作成することができる。洗浄されたペレットは直ちに使用することができ、または所望により凍結保存することもできる（例えば−７０℃）。Ｂ．単量体ＴＰＯの可溶化および精製次いで、屈折体ペレット中の不溶性ＴＰＯを可溶化緩衝液で可溶化する。可溶化緩衝液はカオトロピック剤を含有し、通常、塩基性ｐＨに緩衝化されており、そして単量体ＴＰＯの収量を改善するために還元剤を含有している。代表的カオトロピック剤は、尿素、グアニジンＨＣｌ、およびチオシアン酸ナトリウムが包含される。好ましいカオトロピック剤はグアニジンＨＣｌである。カオトロピック剤の濃度は通常４−９Ｍ、好ましくは６−８Ｍである。可溶化緩衝液のｐＨは、任意の適当な緩衝剤により、ｐＨ範囲約７．５−９．５、好ましくは８．０− ９．０、そして最も好ましくは８．０に維持する。好ましくは、可溶化緩衝液は、単量体型ＴＰＯの形成を助けるために還元剤をも含有する。好適な還元剤は、遊離チオールを含む有機化合物（ＲＳＨ）を包含する。代表的還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、メルカプトエタノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、システアミンおよびシステインを包含する。好ましい還元剤はジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。所望により、可溶化緩衝液は、緩和な酸化剤（例えば分子酸素）および亜硫酸分解を介して単量体ＴＰＯを形成させるための亜硫酸塩を含有させることができる。この態様においては、得られたＴＰＯ−Ｓ−スルホナートを後で酸化還元緩衝液（例えばＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の存在下で再折り畳みして、正しく折り畳まれたＴＰＯを形成させる。通常ＴＰＯ蛋白は、例えば遠心、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製する。例示のために、以下の方法で適当な収量の単量体ＴＰＯを生成した。屈折体ペレットを約５容量／重量の可溶化緩衝液（６−８Ｍグアニジンおよび２５ｍＭＤＴＴを伴う２０ｍＭトリス、ｐＨ８）に再懸濁し、１−３時間、または一夜攪拌して、ＴＰＯ蛋白の可溶化を起こさせる。高濃度の尿素（６−８Ｍ）もまた有用であるが、一般にグアニジンと比べて幾分低い収量をもたらす。可溶化の後、この溶液を３００００ｘｇで３０分間遠心し、変性した単量体ＴＰＯ蛋白を含有する透明な上清を生成させる。次に上清を、流速２ｍｌ／分でスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア、２．６ｘ６０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、１０ｍＭＤＴＴを伴う２０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６．０で蛋白を溶出する。１６０および２００ｍｌの間に溶出する単量体の変性ＴＰＯ蛋白を含有する画分をプールする。このＴＰＯ蛋白を半調製用Ｃ４逆相カラム（２ｘ２０ｃｍＶＹＤＡＣ）上でさらに精製する。３０％アセトニトリルを伴う０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したカラムに試料を５ｍｌ／分で適用する。蛋白をアセトニトリルの直線勾配（６０分間で３０−６０％）で溶出する。精製された還元された蛋白はおよそ５０％アセトニトリルの時点で溶出する。この物質を再折り畳みに使用して生物活性なＴＰＯ変異体を得る。Ｃ．生物活性型を生成させるためのＴＰＯの再折り畳みＴＰＯの可溶化およびさらなる精製の後、変性した単量体ＴＰＯを酸化還元緩衝液中で再折り畳みすることにより、生物活性型を取得する。ＴＰＯの力価が高い（Ｂａ／Ｆ３検定における半最大刺激はおよそ３ｐｇ／ｍｌで達成される）ため、多くの異なる緩衝液、洗浄剤および酸化還元条件を利用して生物活性物質を取得することが可能である。しかしながら、殆どの条件の下では、正しく折り畳まれた物質は少量（＜１０％）得られるに過ぎない。商業的製造工程のためには、少なくとも１０％、より好ましくは３０−５０％、そして最も好ましくは＞５０％の再折り畳み収率であることが望ましい。トリトンＸ−１００、ドデシル− β−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、サルコシル、トゥイーン２０およびトゥイーン８０、ツヴィッタージェント３−１４およびその他を包含する多くの異なる洗浄剤が、少なくとも幾らかの正しく折り畳まれた物質を生成するのに好適であることが見いだされた。しかしながらこれらのうち、最も好ましい洗浄剤はＣＨＡＰＳファミリー（ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）のものであって、これらは再折り畳み反応で最も良好に働き、蛋白凝集および不適正なジスルフィド形成を制限するとわかった。約１％より高いレベルのＣＨＡＰＳが最も好ましかった。最良の収率には塩化ナトリウムが必要であり、最適レベルは０．１Ｍおよび０．５Ｍの間であった。幾つかの調製物で観察される、金属で触媒される酸化（および凝集）の量を制限するため、酸化還元緩衝液中にＥＤＴＡ（１−５ｍＭ）を存在させることが好ましかった。１５％より高いグリセロール濃度は最適の再折り畳み条件を産んだ。最大収率のためには、酸化されたそして還元された有機チオール（ＲＳＨ）の両方で構成される酸化還元緩衝液中の酸化還元対があることが必須であった。好適な酸化還元対には、メルカプトエタノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、システアミン、システインおよびそれらの対応する酸化型が包含される。好ましい酸化還元対はグルタチオン（ＧＳＨ）：酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）またはシステイン：シスチンであった。最も好ましい酸化還元対はグルタチオン（ＧＳＨ）：酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）であった。一般に、酸化還元対の酸化型のモル比が酸化還元対の還元型と等しいかまたは過剰である時に高い収率が観察された。７．５および約９の間のｐＨ値がこれらのＴＰＯ変異体の再折り畳みにとって最適であった。有機溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール）は１０−１５％またはこれ以下の濃度では寛容された。より高い濃度の有機溶媒は、不適切に折り畳まれた型の量を増加させた。トリスおよび燐酸緩衝液が一般に有用であった。４℃でのインキュベーションもまた高レベルの正しく折り畳まれたＴＰＯを生産した。最初のＣ４工程で精製されたＴＰＯの製造では、４０−６０％（再折り畳み反応に用いられた還元および変性されたＴＰＯの量に基づく）の再折り畳み収率が典型的である。活性物質は純度の低い調製物からも得られるが（例えば、スーパーデックス２００カラム後または最初の屈折体抽出後に直ちに）、長時間の沈澱化およびＴＰＯ再折り畳み工程中の非ＴＰＯ蛋白の妨害のため、収率は、より低い。ＴＰＯは４個のシステイン残基を含むため、この蛋白では３個の異なったジスルフィド型の生成が可能である：第一の型：システイン残基１−４および２−３の間のジスルフィド、第二の型：システイン残基１−２および３−４の間のジスルフィド、第三の型：システイン残基１−３および２−４の間のジスルフィド。再折り畳み条件を決定する際の初期の探究中に、ＴＰＯ蛋白を含有する幾つかの異なったピークがＣ４逆相クロマトグラフィーにより分離された。これらのピークのうちただ一つが、Ｂａ／Ｆ３検定を用いて測定したところ有意な生物活性を持っていた。続いて、再折り畳み条件を、専らその型が生成するように最適化した。これらの条件の下で、誤って折り畳まれた型は、可溶化工程から得られた総単量体ＴＰＯの１０−２０％未満であった。生物活性なＴＰＯのジスルフィドパターンは、質量分析および蛋白配列決定により１−４および２−３であると決定された（ここでシステインはアミノ末端から順に番号を付す）。このシステイン架橋パターンは、関連分子エリスロポエチンの既知のジスルフィド結合パターンと一致している。Ｄ．組換え再折り畳みＴＰＯの生物活性再折り畳みされ精製されたＴＰＯはインビトロおよびインビボ検定の両方で活性を持っている。例えばＢａ／Ｆ３検定において、ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の、Ｂａ／Ｆ３細胞中へのチミジン取り込みの半最大刺激は３．３ｐｇ／ｍｌ（０．３ｐＭ）で達成された。ｍｐｌレセプターに基づくＥＬＩＳＡにおいては、半最大活性は１．９ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）で出現した。正常のおよび近致死Ｘ線照射により作り出された骨髄抑制動物では、再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、極めて強力に（わずか３０ｎｇ／マウスの用量で活性が見られた）新しい血小板の産生を刺激した。上に記載の方法に従って再折り畳みされたＴＰＯの他の型についても、同様の生物活性が観察された（図２５、２６および２８を参照されたい）。１４．血小板形成活性の測定方法血小板形成活性は、実施例１に記載のＢａ／Ｆ３ｍｐｌリガンド検定、インビボマウス血小板リバウンド合成検定、ヒト白血病巨核芽球セルライン（ＣＭＫ）のための抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰII_bIII_a）により測定される血小板細胞表面抗原の誘導検定（サトー等、Brit.J.Heamatol.、７２巻１８４−１９０頁［１９８９］）（実施例４に記載の液体懸濁巨核球形成検定をも参照されたい）、および巨核芽球セルライン（ＤＡＭＩ）における多能化の誘導（オグラ等、 Blood、７２（１）巻４９−６０頁［１９８８］を参照されたい）を包含する様々な検定で測定することができる。未熟な、大抵は非ＤＮＡ合成細胞から形態学的に同定し得る巨核球への巨核球の成熟は、細胞質小器官の出現、膜抗原（ＧＰ II_bIII_a）の獲得、背景に記載のような血小板の細胞内複製および放出を包含する工程を含む。巨核球成熟の系統特異的プロモーター（即ち、ｍｐｌリガンド）は、未熟な巨核球におけるこれらの変化のうち少なくとも幾つかを誘発し、血小板放出および血小板減少症の寛解に導くと予想される。したがって、未熟な巨核球セルライン、即ちＣＭＫおよびＤＡＭＩ細胞でこれらのパラメータの出現を測定するような検定を設計した。ＣＭＫ検定（実施例４）は、特異的血小板マーカー、ＧＰII_bIII_aの出現および血小板放散を測定する。ＤＡＭＩ検定（実施例１５）は、倍数性の増加が成熟巨核球の証拠であることから、細胞内複製を測定するものである。認識し得る巨核球は、倍数値が２Ｎ、４Ｎ、８Ｎ、１６Ｎ、３２Ｎ等である。最後に、インビボマウス血小板リバウンド検定（実施例１６）は、被験化合物（本明細書ではｍｐｌリガンド）の投与が血小板数の上昇を招くことを立証するのに有用である。ＴＰＯ活性を測定するために、さらに二つのインビトロ検定が開発されている。第一はキナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡであって、ここでは、ＣＨＯ細胞をｍｐｌ−Ｒｓｅキメラでトランスフェクトさせ、このキメラのｍｐｌ部分をｍｐｌリガンドに暴露させた後、ＥＬＩＳＡによってＲｓｅのチロシン燐酸化を測定するものである（実施例１７を参照されたい）。第二はレセプターに基づくＥＬＩＳＡであって、ここでは、ウサギ抗ヒトＩｇＧで被覆したＥＬＩＳＡプレートが、検定されるｍｐｌリガンドを結合させるヒトキメラレセプターｍｐｌ−ＩｇＧを捕捉する。ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ₁₅₅）に対するビオチニル化ウサギポリクローナル抗体を用いて、結合したｍｐｌリガンドを検出し、これを実施例１８に記載のようにストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて測定する。１５．ＴＰＯで処置された正常のおよび近致死量を照射されたマウスのインビボ生物学的反応正常のおよび近致死量を照射されたマウスを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌、およびヒト胚腎臓（２９３）細胞から分離された、末端切除および全長ＴＰＯで処置した。これら三つの宿主で産生されたＴＰＯのいずれの型も、マウスで血小板産生を刺激したが、ＣＨＯから分離された全長ＴＰＯが最も大きいインビボ反応をもたらしたようであった。これらの結果は、カルボキシ末端ドメインの適正なグリコシル化が、最適なインビボ活性にとって必要であるかも知れないことを示している。（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1，１５３）大腸菌で産生された（実施例２３を参照されたい）ＥＰＯドメインの「Ｍｅｔ」型（−１位のＭｅｔにヒトＴＰＯの最初の１５３残基を加えたもの）を、図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃに対する凡例に記載のように、正常な雌性Ｃ５７Ｂ６マウスに毎日注射した。これらの図は、大腸菌で産生され上記のように再折り畳みされたＴＰＯの非グリコシル化末端切除型は、赤血球または白血球数に影響を及ぼすことなく、正常マウスにおいて血小板産生の約２倍の増加を刺激できることを示している。同じ分子を、図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃに対する凡例に記載のように、近致死量を照射された（¹³⁷Ｃｓ）雌性Ｃ５７Ｂ６マウスに毎日注射すると、血小板の回復を刺激し、最下点を緩和したが、赤血球または白血球には影響しなかった。（ｂ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂ ＣＨＯで産生され、図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃに対する凡例に記載のように正常な雌性Ｃ５７Ｂ６マウスに毎日注射された全長型ＴＰＯは、正常マウスにおいて赤血球または白血球の数に影響することなく血小板産生に約５倍の増加をもたらした。（ｃ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂；Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1，１５３）；２９３−ｒｈＴＰＯ₃₃₂；およびＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ₁₅₅ 図２８に対する凡例に記載のように種々のセルライン由来のｒｈＴＰＯ（ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂；Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1，１５３）；２９３ −ｒｈＴＰＯ₃₃₂；およびＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ₁₅₅）による正常マウスの処置に対して用量反応曲線を組み立てた。この図は、試験された全ての型の分子が血小板産生を刺激するが、ＣＨＯで産生された全長型が最も高いインビボ活性を有することを示している。（ｄ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃、ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ「切り取り」およびＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂ 図２９に対する凡例に記載のようにＣＨＯで産生された様々な型のｒｈＴＰＯ（ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃、ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ「切り取り」およびＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂）による正常マウスの処置に対して、やはり用量反応曲線を組み立てた。この図は、試験された全てのＣＨＯ型が血小板産生を刺激するが、全長の７０Ｋｄａ型が最も高いインビボ活性を有することを示している。１６．ｍｐｌリガンドおよび変異体の一般的組換え製造好ましくはｍｐｌリガンドは、（典型的には細胞を発現ベクターで形質転換することにより）ｍｐｌリガンド核酸を発現するようトランスフェクトさせた細胞を培養し、この細胞から該ポリペプチドを回収することによってｍｐｌリガンドポリペプチドを産生させることを含む、標準的組換え法によって製造する。しかしながら、所望により、ｍｐｌリガンドをホモローガスな組換えによって、またはｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡを既に含んでいる細胞中に導入された調節要素を利用する組換え生産を用いてｍｐｌリガンドを産生できるという事もまた考えられる。例えば、強力なプロモーター／エンハンサー要素、サプレッサー、または外因性転写調節要素を、所望のｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近さおよび方向で、意図される宿主細胞のゲノムに挿入することができる。調節要素はｍｐｌリガンドをコードせず、むしろこのＤＮＡは宿主細胞ゲノムに固有のものである。次いで、本発明に係るレセプターポリペプチドを作る細胞について、または増強または低減したレベルの発現について希望に応じてスクリーニングする。したがって、本発明は、ｍｐｌリガンド核酸分子を含有する細胞のゲノム中に、転写調節要素を、その転写に影響を与えるに十分な、該核酸分子に対する近さおよび方向で挿入することからなる、そして転写調節要素および該核酸分子を含む細胞を培養することからなる所望によるさらなる工程を伴う、ｍｐｌリガンドを生産するための方法を意図するものである。本発明はさらに、宿主細胞により認識される外因性調節配列と機能的に結合した固有のｍｐｌリガンド核酸分子を含む宿主細胞を意図するものである。Ａ．ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡの分離ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ｍｐｌリガンドｍＲＮＡを持ち、それを検出し得るレベルで発現すると信じられる組織から調製される任意のｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。ｍｐｌリガンド遺伝子はさらに、ゲノムＤＮＡライブラリーから、または完全なヌクレオチドまたはアミノ酸配列からインビトロオリゴヌクレオチド合成によって取得することもできる。ライブラリーを、目的とする遺伝子またはそれによりコードされている蛋白を同定するよう設計されたプローブでスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのためには、好適なプローブは、ｍｐｌリガンドを認識し且つこれに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を包含する。ｃＤＮＡライブラリーのためには、好適なプローブは、同じまたは異なる種由来のｍｐｌリガンドｃＤＮＡの既知のまたはそれが疑われる部分をコードしている約２０−８０塩基長のオリゴヌクレオチド；および／または同じまたは類似の遺伝子をコードしている相補的もしくはホモローガスｃＤＮＡまたはそのフラグメントを包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための適当なプローブは、同じもしくは類似の遺伝子をコードしているオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはそれらのフラグメント、および／またはホモローガスなゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを包含するが、これらに限定される訳ではない。選ばれたプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、サムブルック等、上記、の１０−１２章に記載のような標準法を用いて実施することができる。ｍｐｌリガンドをコードしている遺伝子を分離する代替手段は、サムブルック等、上記、の１４項に記載のＰＣＲ法を使用することである。この方法は、ｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略を下に述べる。本発明を実施する好ましい方法は、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、様々な組織、好ましくはヒトまたはブタの腎臓（成体または胎児）または肝臓セルラインからのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、ヒト胎児肝臓セルラインｃＤＮＡライブラリーをこのオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。別法として、ヒトゲノムライブラリーをこのオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さがあり、且つ偽陽性を最小とするに十分明確であるべきである。実際のヌクレオチド配列は通常、コドンの重複が最小であるｍｐｌリガンドの領域を元に設計される。このオリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、或るライブラリーが、優先的コドンの使用が知られていない種からスクリーニングされる場合、特に重要である。このオリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリダイズする時に検出できるよう、標識しなければならない。好ましい標識方法は、ＡＴＰ（例えば、γ³²Ｐ）およびポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの５'末端を放射標識することである。しかしながら、ビオチニル化または酵素標識化を包含するその他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識することもできるが、これらに限定される訳ではない。全長ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているｍｐｌリガンド核酸は特に興味深い。幾つかの好ましい態様において、この核酸配列は天然ｍｐｌリガンドシグナル配列を含む。全ての蛋白コード化配列を有する核酸は、導き出されたアミノ酸配列を用いて、選ばれたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。Ｂ．天然ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体は、ｍｐｌリガンドＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、または、所望ｍｐｌリガンドポリペプチドのインビトロ合成により、製造される。係る変異体は、例えば、ブタｍｐｌリガンドのためのアミノ酸配列中の残基を除去、または挿入もしくは置換することを包含する。例えば、成熟全長ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端部分は、インビボまたはインビトロいずれかの蛋白分解的開裂によって、または、フラグメントまたは全長ｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡをクローニングおよび発現させることによって、除去し、生物活性な変異体を生成させることができる。最終組み立て物が所望の生物活性を有する限り、最終組み立て物に到達するために除去、挿入、および置換の任意の組み合わせが施される。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変更といったような、ｍｐｌリガンドの翻訳後処理を変化させ得る。ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体の設計のためには、突然変異部位の位置および突然変異の性格は、修飾されるべきｍｐｌリガンドの特性に依存するであろう。突然変異のための部位は、例えば（１）最初に同類アミノ酸選択肢で、次いで、達成される結果に応じて、より過激な選択で置換することにより、(２)標的残基を除去することにより、または、(３)存在する部位に隣接して、同じまたは異なるクラスの残基を挿入することにより、または選択肢１−３の組み合わせにより、個別に、または連続して修飾することができる。突然変異生成にとって好ましい位置であるｍｐｌリガンドポリペプチドの或る残基または領域を特定する有用な方法は、カニングハムおよびウェルズ、Scienc e、２４４巻１０８１−１０８５頁［１９８９］に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。ここでは、或る残基または標的残基群を特定し（例えば、ａｒｇ、asp、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびＧｌｕのような荷電残基）、任意の、但し好ましくは中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置き換え、細胞内外を取り巻く水性環境と該アミノ酸との相互作用を起こさせる。次に、この置換に対する機能的感受性を示すドメインを、置換部位にまたは置換部位のためのさらなるまたはその他の変異体を導入することによってさらに改良する。このように、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決められているが、突然変異自体の性質は予め決めておく必要がない。例えば、与えられた部位での突然変異の挙動を最適化するため、標的コドンまたは領域でａｌａスキャニングまたは無作為突然変異生成を実施し、発現されたｍｐｌリガンド変異体を、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。アミノ酸配列変異体の組み立てには二つの主要な変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質がある。例えば、ｍｐｌリガンドポリペプチドの変異体はｍｐｌリガンド配列からの変異体を包含し、天然に存在する対立遺伝子（これはｍｐｌリガンドＤＮＡの操作を必要としないであろう）、または、天然に見いだされない対立遺伝子または変異体に到達するためにＤＮＡを突然変異させることにより作成される前もって決定されている突然変異体型を表し得る。一般に、選ばれた突然変異の位置および性質は、修飾されるべきｍｐｌリガンドの性格に依存するであろう。アミノ酸配列の除去は一般に約１から３０残基まで、より好ましくは約１ないし１０残基の範囲であり、典型的には隣接している。別法として、ｍｐｌリガンドのためのアミノ酸配列除去は、カルボキシ末端糖蛋白ドメインの一部または全体を含み得る。アミノ酸配列除去は、成熟蛋白の最初の６個のアミノ末端残基のうち１またはそれ以上を含むこともできる。所望によるアミノ酸配列除去は、「ヘリックス束」の間に存在するループ領域のうち１またはそれ以上にある１またはそれ以上の残基を含む。隣接する除去は、通常偶数の残基に施されるが、１個のまたは奇数の除去もまた本発明の範囲内にある。殆どの配列一致を共有するｍｐｌリガンド間で相同性が低い領域に除去を導入して、ｍｐｌリガンドの活性を修飾することができる。または、ヒトｍｐｌリガンドに対して殆どの配列一致を共有する他の哺乳動物ｍｐｌリガンドポリペプチドとヒトｍｐｌリガンド間で相同性の低い領域に除去を導入することができる。他の哺乳動物ｍｐｌリガンドと実質的な相同性を有する領域での哺乳動物ｍｐｌリガンドポリペプチドからの除去は、ｍｐｌリガンドの生物活性をより有意に修飾する可能性が高い。連続した除去の数は、影響を受けるドメインにおけるｍｐｌリガンドの三次構造、例えばβプリーツシートまたはαヘリックスを保存するように選択されるであろう。アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（即ち、成熟ｍｐｌリガンド配列内部への挿入）は一般に、約１ないし１０残基、より好ましくは１ないし５、最も好ましくは１ないし３残基の範囲であり得る。好ましい融合の例は、ｍｐｌリガンドまたはそのフラグメントと、他のサイトカインまたはそのフラグメントとの融合である。末端挿入の例には、組換え細胞培養中での成熟ｍｐｌリガンドの直接発現の所産である、Ｎ末端メチオニン残基を有する成熟ｍｐｌリガンド、および、組換え宿主からの成熟ｍｐｌリガンドの分泌を促進させるための、成熟ｍｐｌリガンド分子のＮ末端へのヘテロローガスなＮ末端シグナル配列の融合が包含される。このようなシグナル配列は一般に、意図される宿主細胞の種から得られ、従ってこれとホモローガスであろう。好適な配列には、大腸菌のためのＳＴIIまたはｌｐｐ、酵母のためのα因子、および哺乳動物細胞のためのヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルが包含される。ｍｐｌリガンド分子のその他の挿入変異体は、ｍｐｌリガンドのＮまたはＣ末端への、免疫原性ポリペプチド（即ち、融合が施される宿主にとって内因性でない）、例えば細菌性ポリペプチド、例えばβラクタマーゼまたはＥ．ｃｏｌｉｔｒｐ遺伝子座によりコードされている酵素、または酵母蛋白の融合、および、１９８９年４月６日公開のＷＯ８９／０２９２２に記載の、半減期の長い蛋白、例えば免疫グロブリン不変領域（または他の免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチンを用いたＣ末端融合を包含する。変異体の第三の群はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ｍｐｌリガンド分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異生成のための最も興味深い部位は、ｍｐｌリガンドの活性部位として同定される部位、および、他の類似体中に見いだされるアミノ酸が側鎖のかさ、電荷、または疎水性の点で実質上異なっており、それでいて種々のmplリガンド種および／または一つのmplリガンド成員の種々の動物類似体の中の選ばれた部位に高度の配列一致もまた存在する部位を包含する。他の重要な部位は、様々なファミリー成員から、そして／または一つの成員の中の様々な動物種から得られるｍｐｌリガンドの特定の残基が一致している部位である。これらの部位、特に、少なくともあと３個、完全に保存されている部位を持つ配列の内部にある部位は、比較的保守的なやり方で置換される。このような同類置換は、第３表で、好ましい置換という項の下に示されている。もしこのような置換が生物活性の変化をもたらすならば、第３表中、例示的置換と称されている、またはアミノ酸クラスに関する下のさらなる記載のような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングする。ｍｐｌリガンドの機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチドバックボーンの構造、例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または、（ｃ）側鎖のかさ、の維持に及ぼすそれらの影響が有意に相違する置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づく群に分けられる： (1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr； (3)酸性：Asp、Glu； (4)塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg； (5)鎖の向きに影響する残基：Gly、Pro；および、 (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非同類置換は、これらのクラスのうち或るものの成員を別のものに交換することを必要とする。このような置換された残基もまた同類置換部位に導入することができ、または、より好ましくは、残っている（非保存的）部位に導入することができる。本発明の一つの態様において、当該分子に存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を不活性化することが望ましい。これらの部位は、例えばトリプシンの場合にはアルギニンまたはリジン残基について、コードされているアミノ酸配列を調べることによって特定される。プロテアーゼ開裂部位が特定されたならば、標的とされる残基を別の残基、好ましくはグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような疎水性残基で置換することにより；当該残基を除去することにより；または当該残基の直後にプロリン残基を挿入することにより、それらを蛋白分解的開裂に対して不活性となるようにする。別の態様においては、シグナル配列の開始メチオニン残基以外のメチオニン残基、または係る各メチオニン残基に対するＮまたはＣ末端の約３残基以内に位置する残基を、別の残基（好ましくは第３表に従う）により置換、または除去する。別法として、このような部位に隣接して約１−３の残基を挿入する。ｍｐｌリガンドの適正なコンホメーションの維持に関わっていないシステイン残基もまた、一般にセリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改善し且つ異常な交差反応を防止することができる。ｅｐｏドメイン中、アミノ末端から数えて第一および第四のシステインは適正なコンホメーションの維持に必要であるが、第二および第三のシステインは必要でないことが判明している。したがって、 eｐｏドメインの第二および第三のシステインは置換することができる。ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当分野で知られる様々な方法によって製造される。これらの方法には、天然の供給源からの分離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド仲介（または位置指定）突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、および、先に製造されたｍｐｌリガンドポリペプチドの変異体または非変異体のカセット突然変異生成による製造が包含されるが、これらに限定される訳ではない。オリゴヌクレオチド仲介突然変異生成は、ｍｐｌリガンドＤＮＡの置換、除去および挿入変異体の製造のための好ましい方法である。この技術は、アーデルマン等、ＤＮＡ、２巻１８３頁［１９８３］に記載されるように、当分野で良く知られている。簡潔に述べると、ｍｐｌリガンドＤＮＡを、所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型に対してハイブリダイズすることによって変化させるのであるが、ここでこの鋳型は、変化していないまたは天然のｍｐｌリガンドのＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖型である。ハイブリダイズの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の第二相補鎖全体を合成し、これは該オリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、選択された変化をｍｐｌリガンドＤＮＡにコードするであろう。一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側に、鋳型と完全に相補的な１２ないし１５のヌクレオチドを有するであろう。この事により、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子と正しくハイブリダイズすることが保証される。このオリゴヌクレオチドは、クレア等、Proc.Natl.Acad.S ci.USA、７５巻５７６５頁［１９７８］に記載のような当分野で知られる技術を用いて容易に合成される。ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（入手し得る市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当である）から誘導されるベクター、またはヴィエラ等、Meth.Enzymol.、１５３巻３頁［１９８７］に記載のような一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって作り出すことができる。即ち、突然変異させようとするＤＮＡをこれらのベクターの一つに挿入して一本鎖鋳型を作成する。一本鎖鋳型の製造は、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ＮＹ、１９８９）の４．２１−４．４１項に記載されている。別法として、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、標準技術を用いて二本鎖プラスミド（またはその他の）ＤＮＡを変性させることによって作成することもできる。天然ＤＮＡ配列を変化させるため（例えばアミノ酸配列変異体を作成するために）、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型とハイブリダイズさせる。次に、ＤＮＡ重合酵素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを加えて、合成のためのプライマーとして該オリゴヌクレオチドを用いて鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖はｍｐｌリガンドの突然変異型をコードし、他の鎖（元の鋳型）は天然の変化していないｍｐｌリガンドの配列をコードしているようなヘテロ二本鎖分子が形成される。次いでこのヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞、通常Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１のような原核生物中に導入する。細胞が増殖した後、これらをアガロース平板上に蒔き、３２−ホスファートで放射標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定する。次いで、突然変異している領域を取り、蛋白産生のための適当なベクター、一般に適当な宿主の形質転換のために典型的に使用される型の発現ベクターに入れる。直前に記載した方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含む、ホモ二本鎖分子が作り出されるように改変することができる。この改変は以下の通りである：一本鎖オリゴヌクレオチドを上記のように一本鎖鋳型とアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオ−デオキシリボシトシン（これはアマーシャム・コーポレーションから入手することができる）と合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基の外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。加えて、この新たなＤＮＡの鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これは制限エンドヌクレアーゼ消化から防護する役割を有する。ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で切り目を入れた後、鋳型鎖をＥｘｏ IIIヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼを用いて、突然変異させようとする部位を含む領域を超えて消化することができる。そして、この反応を、分子が部分的にしか一本鎖になっていないまま停止させる。次いで、４種全てのデオキシリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全な二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。次にこのホモ二本鎖分子を、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１のような適当な宿主細胞中に導入することができる。１以上のアミノ酸が置換されているｍｐｌリガンド突然変異体をコードしているＤＮＡは、幾つかの方法のうち一つで生成させることができる。アミノ酸がポリペプチド鎖中接近して位置している場合は、所望のアミノ酸置換の全てをコードしている一つのオリゴヌクレオチドを用いてこれらを同時に突然変異させることができる。しかしながら、もしそのアミノ酸が互いに幾らかの距離をおいて位置している（約１０アミノ酸以上離れている）と、所望の変化の全てをコードしている１個のオリゴヌクレオチドを作成することは、より困難である。その代わりに、二つの別法のうち一つを利用することができる。第一の方法では、置換しようとする各アミノ酸のための別々のオリゴヌクレオチドを作成する。次いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすると、その鋳型から合成される第二のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードしているであろう。これに代わる方法は、所望の突然変異を産むための２回またはそれ以上の突然変異生成を含むものである。第一回目は単一突然変異体について記載された通りである：野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所望アミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、するとヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。第二回目の突然変異生成は、第一回目の突然変異生成で作成された突然変異したＤＮＡを鋳型として利用する。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。そこで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、得られたＤＮＡの鎖はその結果、第一および第二回目両方の突然変異生成由来の突然変異をコードしていることになる。この得られたＤＮＡは第三回目の突然変異生成で鋳型として使用することができ、以下同様である。ＰＣＲ突然変異生成もまたｍｐｌリガンドポリペプチドのアミノ酸変異体の作成に好適である。以下の記述はＤＮＡに関するものであるが、この技術はＲＮＡにも適用されることが理解できる。ＰＣＲ技術は一般に以下の方法を指す（アーリッヒ、上記、Ｒ．ヒグチによる章、６１−７０頁を参照されたい）：少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲでの出発物質として使用する時、鋳型ＤＮＡの対応領域と僅かに異なる配列のプライマーを用いて、そのプライマーが鋳型と相違している位置でのみ鋳型配列と異なっている比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、一方のプライマーは突然変異の位置に一部重複し且つその突然変異を含むように設計し；他方のプライマーの配列は、プラスミドの反対の鎖の配列一つながりと一致させねばならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は、プライマーにより境界を与えられるＤＮＡの増幅された領域全体が最終的に容易に配列決定されるよう、第一プライマーの配列の２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好ましい。今記載したようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そして鋳型の複製は多少誤りが起こり易いのであるいはその他の位置で相違するＤＮＡフラグメントの集団を生成する。生成物に対する鋳型の比が極端に低い場合、生成物のＤＮＡフラグメントの大多数に所望の突然変異（群）が組み込まれる。この生成物は、標準的ＤＮＡ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応領域を置き換えるのに使用される。別々の位置にある突然変異は、突然変異体第二プライマーを使用することにより、または、異なる突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを行い、得られた二つのＰＣＲフラグメントを三部（またはそれ以上の）ライゲーションでベクターフラグメントに同時にライゲーションすることによって同時に導入することができる。ＰＣＲ突然変異生成の特別な例においては、プラスミドＤＮＡの増幅される領域の外に特異な認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を線状化する。この物質から１００ｎｇを、４種のデオキシヌクレオチド三燐酸を含有しジーンアンプ（商標）キット（パーキン−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴおよびエメリーヴィル、ＣＡ、より入手）に含まれるＰＣＲ緩衝液、および各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌｅを含有するＰＣＲ混合物に加え、最終容量５０μｌとする。この反応混合物を鉱油３５μｌに積層する。反応混合物を１００℃で５分間変性させ、短時間氷上に置き、次いで鉱油層の下にサーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（５単位／μｌ、パーキン−エルマー・シータスより購入）を添加する。次いでこの反応混合物を、以下のようにプログラムしたＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン−エルマー・シータスより購入）中に入れる：５５℃２分間、７２℃３０秒間、次いで以下を１９サイクル：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、そして７２℃３０秒間。このプログラムの終了時に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容量）で抽出し、そしてエタノール沈澱させ、ＤＮＡを標準法により回収する。この物質を、続いてベクターへの挿入のための適当な処理に付す。変異体を製造するためのもう一つの方法、カセット突然変異生成は、ウェルズ等、Gene、３４巻３１５頁（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物質は、突然変異させようとするｍｐｌリガンドＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。突然変異させるｍｐｌリガンドＤＮＡ中のコドンを特定する。特定された突然変異部位の両側には特異な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合は、それらをｍｐｌリガンドＤＮＡの適当な位置に導入するための上記オリゴヌクレオチド仲介突然変異生成法を用いてそれらを作り出すことができる。制限部位がプラスミド中に導入された後、このプラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードしており所望の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、次いで標準技術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションできるよう、線状化されたプラスミドの末端と適合する３'および５'末端を有するよう設計される。その結果このプラスミドは突然変異したｍｐｌリガンドＤＮＡ配列を含むことになる。Ｃ．複製可能なベクターへの核酸の挿入天然または変異体ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター中に挿入する。多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、（１）それがＤＮＡ増幅に使用されるのかまたはＤＮＡ発現に使用されるのか、（２）ベクター中に挿入される核酸の大きさ、および、（３）ベクターにより形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各々のベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に応じて様々な構成成分を含んでいる。ベクターの構成成分は一般に、１またはそれ以上の以下のもの：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終止配列を含むが、これらに限定される訳ではない。 (i)シグナル配列成分本発明に係るｍｐｌリガンドは、直接的のみならず、ヘテロローガスなポリペプチド（これは好ましくはシグナル配列、または成熟蛋白もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとしても発現され得る。一般に、シグナル配列はベクターの構成成分であってよく、またはこれは、ベクター中に挿入されるｍｐｌリガンドＤＮＡの一部であってよい。選ばれたヘテロローガスなシグナル配列は、宿主細胞によって認識され且つ処理される（即ち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものでなければならない。天然ｍｐｌリガンドシグナル配列を認識および処理しない原核生物宿主細胞のためには、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選ばれる原核生物シグナル配列によって置換する。酵母の分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２１７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルによって置換することができる。哺乳動物細胞の発現においては天然のシグナル配列（即ち、天然の哺乳動物細胞からインビボでｍｐｌリガンドの分泌を正常に指令するｍｐｌリガンドプレ配列）でよいが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば他のｍｐｌリガンドポリペプチド由来のまたは異なる動物種からの同じｍｐｌリガンド由来のシグナル配列、ｍｐｌリガンド由来のシグナル配列、および同じまたは関連する種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルもまた好適である。 (ii)複製起点成分発現およびクローニングベクターの両者は、そのベクターを１またはそれ以上の選ばれた宿主細胞で複製できるようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、そのベクターを宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製できるようにする配列であって、複製起点または自立的複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は殆どのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物の発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むという理由でのみ典型的に使用され得る）。殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ちこれらは少なくとも一つのクラスの生物で複製可能であるが、発現のため別の生物中にトランスフェクトすることができる。例えば、或るベクターは大腸菌中でクローニングされ、次いでその同じベクターが、たとえそれが宿主細胞染色体と独立して複製できなくても、発現のため酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によって増幅することもできる。これは、バシルス種を宿主に用いて、例えば、バシルスゲノムＤＮＡ中に見いだされる配列に相補的なＤＮＡ配列を該ベクターに含ませることによって容易に達成される。このベクターによるバシルスのトランスフェクションは、ゲノムによるホモローガスな組換えおよびｍｐｌリガンドＤＮＡの挿入をもたらす。しかしながら、ｍｐｌリガンドをコードしているゲノムＤＮＡの回収は、mplリガンドＤＮＡの切除に制限酵素消化を必要とするため、外因性複製ベクターの回収より複雑である。 (iii)選択遺伝子成分発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいなければならない。この遺伝子は、選択培養基中で生育する形質転換された宿主細胞の生存または生育に必要な蛋白をコードしている。選択遺伝子を含むベクターにより形質転換されなかった宿主細胞は、その培養基中で生き残らないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性突然変異体の欠失を補完し、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する、蛋白をコードしている（例えばバシルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。選択計画の一例は、宿主細胞の生育を停止させる薬物を利用する。ヘテロローガスな遺伝子によってうまく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与する蛋白を発現し、よって選択処方中で生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（サザン等、J.Molec.Appl.Genet.、１巻３２７頁［１９８２］）、ミコフェノール酸（ミュリガン等、Science、２０９巻１４２２頁［１９８０］）またはハイグロマイシン（サグデン等、Mol.Cell.Biol.、５巻４１０−４１３頁［１９８５］）を使用する。上に挙げた３つの例は、細菌遺伝子を真核生物の調節の下で使用して、それぞれ適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。哺乳動物細胞のためのその他の好適な選択マーカーの例は、ｍｐｌリガンド核酸の取り込みに対してコンピテントな細胞の同定を可能にするマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。哺乳動物細胞形質転換体を、マーカーを取り込んだために形質転換体のみが特異に適合して生き残るという選択圧の下に置く。培地中の選択薬物の濃度を連続的に変化させる条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧を課し、それにより選択遺伝子およびｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡの両者の増幅を導く。増幅は、それによって、生育に必須の蛋白の産生にとって極めて重要な遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内部で縦に反復される工程である。増幅されたＤＮＡから、増加した量のｍｐｌリガンドが合成される。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメソトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全形質転換体を培養することによってまず同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁［１９８０］による記載のように製造され増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。次にこの形質転換された細胞を、増強したレベルのＭｔｘに暴露する。これにより多数のＤＨＦＲ遺伝子のコピーの合成が導かれ、そして同時に、該発現ベクターを含む他のＤＮＡ、例えばｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡのコピーが多数合成される。この増幅技術は、他の点で好適な任意の宿主、例えばＭｔｘに対し高度に耐性な突然変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されるならば、内因性ＤＨＦＲの存在にも拘わらず、例えばＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１と共に利用することができる（ＥＰ１１７０６０）。別法として、ｍｐｌリガンド、野生型ＤＨＦＲ蛋白、およびアミノグリコシド３'ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択マーカーをコードしているＤＮＡ配列により形質転換または同時形質転換された宿主細胞［特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主］を、その選択マーカーに対する選択薬剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照されたい。酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（スティンチコウム等、Nature、２８２巻３９頁［１９７９］；キングズマン等、Gene、７巻１４１頁［１９７９］；またはチェンパー等、 Gene、１０巻１５７頁［１９８０］）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する（ジョーンズ、Genetics、８５巻１２頁［１９７７］）。そうすると、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファンの不在下で増殖させることによる形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣＮｏ．２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。 (iv)プロモーター成分発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され且つｍｐｌリガンド核酸と機能的に結合しているプロモーターを含んでいる。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５'）に位置する（一般に約１００ないし１０００ｂｐ以内）翻訳されない配列であって、それらが機能的に結合している特定の核酸配列、例えばｍｐｌリガンド核酸配列の転写および翻訳を調節する。このようなプロモーターは、典型的には二つのクラス、誘導性および構成性に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば或る栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答したそれらの調節の下で、ＤＮＡからの増強されたレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点において、可能性ある様々な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが良く知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によりそのプロモーターを供給源のＤＮＡから取り出し、この分離されたプロモーター配列をベクター中に挿入することにより、ｍｐｌリガンドコード化ＤＮＡと機能的に結合する。天然ｍｐｌリガンドプロモーター配列および多くのヘテロローガスなプロモーターはいずれもｍｐｌリガンドＤＮＡの直接的増幅および／または発現に使用することができる。しかしながら、ヘテロローガスなプロモーターは、天然ｍｐｌリガンドプロモーターと比較して一般により大量の転写および高収量のｍｐｌリガンドの発現を可能にするため、これが好ましい。原核生物宿主と共に使用するのに好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チャング等、Nature、２７５巻６１５頁［１９７８］；およびゲッデル等、Nature、２８１巻５４４頁［１９７９］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲッデル、Nu cleic Acids Res.、８巻４０５７頁［１９８０］およびＥＰ３６７７６）およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（デボーア等、Proc.Nat l.Acad.Sci.USA、８０巻２１−２５頁［１９８３］）が包含される。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターもまた好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって当業者は、必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、それらをｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡに機能的にライゲーションすることができる（ジーベンリスト等、Cell、２０巻２６９頁［１９８０］）。細菌系に使用するためのプロモーターはさらに、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡに機能的に結合したシャイン− ダルガルノ（S.D.）配列をも含んでいるであろう。真核生物のためのプロモーター配列が知られている。実際全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見いだされるもう一つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域（ここでＸは任意のヌクレオチドであってよい）である。殆どの真核生物遺伝子の３'末端には、コーディング配列の３'末端にポリＡ尾を付加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクター中に適当に挿入される。酵母宿主と共に使用するための好適なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセラートキナーゼ（ヒッツェマン等、J.Biol.Chem.、２５５巻２０７３頁［１９８０］）またはその他の解糖酵素（ヘス等、J.Adv.Enzyme Reg.、７巻１４９頁［１９６８］；およびホランド、Biochemistry、１７巻４９００頁［１９７８］）、例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスファートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。増殖条件により転写が調節されるというさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、その他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセロアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を司る酵素のプロモーター領域である。酵母の発現で用いられる好適なベクターおよびプロモーターは、ヒッツェマン等、ＥＰ７３６５７Ａにさらに記載されている。酵母のエンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのｍｐｌリガンド転写は、プロモーターが宿主細胞系と共存し得る限り、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、ヘテロローガスな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱衝撃プロモーターから、そしてｍｐｌリガンド配列に通常付随するプロモーターから得られるプロモーターによって調節される。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる。フィアズ等、Natu re、２７３巻１１３頁［１９７８］；ミュリガンおよびバーグ、Science、２０９巻１４２２−１４２７頁［１９８０］；パヴラキス等、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA、７８巻７３９８−７４０２頁［１９８１］。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄIII Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる。クリーナウェイ等、Gene、１８巻３５５−３６０頁［１９８２］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でのＤＮＡを発現する系が米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載されている。さらに、サルの細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現に関するグレイ等、Nature、２９５巻５０３−５０８頁［１９８２］；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するレイエス等、Nature、２９７巻５９８−６０１頁［１９８２］；培養されたマウスおよびウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するキャナーニおよびバーグ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻５１６６−５１７０頁［１９８２］；ならびに、プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、鶏の胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現に関するゴーマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻６７７７ −６７８１頁［１９８２］を参照されたい。 (v)エンハンサー要素成分本発明に係るｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡの、高等真核生物による転写は、しばしばベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約１０ないし３００ｂｐの、ｃｉｓ作動要素のＤＮＡである。エンハンサーは相対的に、方向および位置に独立しており、転写ユニットの５'（ライミンズ等、Pro c.Natl.Acad.Sci.USA、７８巻９９３頁［１９８１］）および３'（ラスキー等、 Mol.Cell Bio.、３巻１１０８頁［１９８３］）、イントロン内部（バネルジ等、Cell、３３巻７２９頁［１９８３］）、およびコーティング配列自身の内部（オスボーン等、Mol.Cell Bio.、４巻１２９３頁［１９８４］）に、見いだされている。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素についてのヤニヴ、Na ture、２９７巻１７−１８頁［１９８２］もまた参照されたい。エンハンサーはｍｐｌリガンドコード化配列の５'または３'位でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５'部位に位置する。 (vi)転写終止成分真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、人間、または他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターはさらに、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むであろう。このような配列は普通、真核生物のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'および時には３'非翻訳領域から取得することができる。これらの領域は、ｍｐｌリガンドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含んでいる。 (vii)ベクターの組み立ておよび分析上に列挙された構成成分の１またはそれ以上を含む適当なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂させ、整え、そして必要なプラスミドの生成のために望まれる型に再ライゲーションする。組み立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いてＥ．coli Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、そして／またはメシング等、Nucleic Acid s Res.、９巻３０９頁［１９８１］の方法によって、またはマクサム等、Method s in Enzymology、６５巻４９９頁［１９８０］の方法によって配列決定する。 (viii)一過性発現ベクター哺乳動物細胞においてｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施において特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、その発現ベクターによりコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。サムブルック等、上記、１６．１７−１６．２２頁。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。よって、一過性発現系は、ｍｐｌリガンドポリペプチドの生物活性を有するｍｐｌリガンドポリペプチドの類似体および変異体を同定する目的のために本発明において特に有用である。 (ix)好適な例示的脊椎動物細胞ベクター組換え脊椎動物細胞培養でのｍｐｌリガンドの合成に当てはめるのに好適なその他の方法、ベクター、および宿主細胞は、ゲシング等、Nature、２９３巻６２０−６２５頁［１９８１］；マンテイ等、Nature、２８１巻４０−４６頁［１９７９］；レヴィンソン等；ＥＰ１１７０６０；およびＥＰ１１７０５８に記載されている。ｍｐｌリガンドの哺乳動物細胞培養発現にとって特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７米国特許第５２５８２８７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０８２９１号）である。Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換本明細書に記載のベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または上記の高等真核生物細胞である。適当な原核生物は、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性菌、例えば大腸菌、Ｂ．サブティリスのようなバシルス、Ｐ．アエルギノーサのようなシュードモナス種、サルモネラ・ティフィムリウム、またはセラティア・マルセスキャンスを包含する。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）のようなその他の菌株もまた適当である。これらの例は限定的ではなく例示的なものである。好ましくは、宿主細胞は最少量の蛋白分解酵素を分泌すべきである。別法として、インビトロのクローニング方法、例えばＰＣＲまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応もまた好適である。原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、ｍｐｌリガンドをコードしているベクターのための好適な宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、幾つかのその他の属、種、および菌株、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（ビーチおよびナース、Nature、２９０巻１４０頁［１９８１］；１９８５年５月２日公開のＥＰ１３９３８３）、クルイヴェロミセス宿主（米国特許第４９４３５２９号）、例えばＫ．ラクティス（ルーヴェンコート等、J. Bacteriol.、７３７頁［１９８３］）、Ｋ．フラギリス、Ｋ．ブルガリクス、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルクシアヌス、ヤロウィア［ＥＰ４０２２２６］、ピチア・パストリス（ＥＰ１８３０７０；スリークリシュナ等、J.Basic Microbiol.、２８巻２６５−２７８頁［１９８８］）；カンディダ、トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）、ニューロスポラ・クラッサ（ケイス等、Pr oc.Nat l.Acad.Sci.USA、７６巻５２５９−５２６３頁［１９７９］）、および糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７）、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデュランス（バランス等、Biochem.Biophys.Res.Commun.、１１２巻２８４−２８９頁［１９８３］；ティルバーン等、Gene、２６巻２０５−２２１頁［１９８３］；イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻１４７０−１４７４頁［１９８４］）およびＡ．ニガー（ケリーおよびハインズ、EMBO J.、４巻４７５ −４７９頁[１９８５]）もまた一般的に利用でき且つ本発明において有用である。グリコシル化ｍｐｌリガンドの発現のための好適な宿主細胞が、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑な処理およびグリコシル化活動が可能である。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養由来の如何に拘わらず、任意の高等真核生物細胞培養が使用可能である。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が包含される。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリのような宿主からの対応する受容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。例えば、ラッコウ等、Bio/Technology、６巻４７− ５５頁［１９８８］；ミラー等、Genetic Engineering、セットロウ等編、８巻（プレナム・パブリッシング、１９８６）、２７７−２７９頁；およびマエダ等、Nature、３１５巻５９２−５９４頁［１９８５］を参照されたい。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株が広く入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に従い本明細書に記載のウイルスとして、特にスポドブテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用することができる。綿花、トウモロコシ、馬鈴薯、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコといった植物細胞培養を宿主として利用できる。典型的には、ｍｐｌリガンドＤＮＡを含むよう前もって操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共にインキュベートすることにより、植物細胞をトランスフェクトする。Ａ．トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡがその植物細胞宿主に移され、これがトランスフェクトされ、そして適当な条件の下でｍｐｌリガンドＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と共存し得る調節およびシグナル配列が利用できる。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻５６１頁［１９８２］。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または増強することができる。１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６。しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、近年常套的手法となっている（ティシュー・カルチャー、アカデミック・プレス、クルースおよびパターソン編［１９７３］）。有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓ライン（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞。グラハム等、 J.Gen Virol.、３６巻５９頁［１９７７］。）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁［１９８０］）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー、Biol.Reprod.、２３巻２４３−２５１頁［１９８０］）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス胸部腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（マザー等、Annals.N.Y.Acad.Sci.、３８３巻４４−６８頁［１９８２］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌ライン（ＨｅｐＧ２）である。宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは本発明に係る上記の発現またはクローニングベクターにより形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望配列をコードしている遺伝子の増幅のために適宜修飾した常套的栄養培地で培養する。トランスフェクションとは、コーディング配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。多数のトランスフェクションの方法、例えばＣａＰＯ₄および電気穿孔が当業者に知られている。一般に、宿主細胞内にこのベクターの作用の何らかの徴候が存在した時、トランスフェクションの成功が認められる。形質転換とは、ＤＮＡが生物中に導入されその結果そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体構成要素により複製可能となることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、係る細胞にとって適当な標準技術を用いて行われる。サムブルック等、上記、の１．８２項に記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、原核生物または実質的な細胞壁障壁を含むその他の細胞に対して一般的に使用される。シャウ等、Gene、２３巻３１５頁［１９８３］および１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されるように、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、或る植物細胞の形質転換に使用される。さらに、１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５８に記載のように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクトすることができる。このような細胞壁の無い哺乳動物細胞に対しては、グラハムおよびヴァン・デル・エプ、Virology、５２巻４５６−４５７頁［１９７８］の燐酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的側面は、アクセルにより１９８３年８月１６日登録の米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、ヴァン・ゾーリンゲン等、J.Bact.、１３０巻９４６頁［１９７７］およびシャオ等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、７６巻３８２９頁［１９７９］の方法に従って実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入するその他の方法、例えば、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合もまた使用できる。Ｅ．宿主細胞の培養本発明に係るｍｐｌリガンドポリペプチドの産生に使用される原核細胞は、サムブルック等、上記、に一般的に記載される適当な培地で培養される。本発明に係るｍｐｌリガンドの産生に使用される哺乳動物宿主細胞は様々な培地で培養することができる。ハムのＦ１０（シグマ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコの改良イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、シグマ）のような市販品が入手できる培地が、当該宿主細胞の培養に適している。さらに、ハムおよびワレス、Meth.Enz.、５８巻４４頁［１９７９］、バーンズおよびサトー、Anal.Biochem.、１０２巻２５５頁［１９８０］、米国特許第４７６７７０４号；４６５７８６６号；４９２７７６２号；もしくは４５６０６５５号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；米国特許Ｒｅ．３０９８５；または同時係属のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／５９２１０７または０７／５９２１４１（共に１９９０年１０月３日出願）に記載される任意の培地を当該宿主細胞のための培養基として使用することができ、これらの内容は全て引用して本明細書の一部とする。これらの培地はいずれも、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（通常最終濃度がマイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて添加することができる。他の必要な添加物もまた、当業者により知られる適当な濃度で含有させることができる。温度、ｐＨ等といった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞についてかつて用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。本明細書中で言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞および宿主動物内にある細胞を包含する。Ｆ．遺伝子の増幅／発現の検出遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、本明細書中に供される配列に基づき、適当に標識されたプローブを用いて、常套的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング（トマス、Proc.Natl.Acad .Sci.USA、７７巻５２０１−５２０５頁［１９８０］）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイトゥハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。様々な標識、最も一般的には放射性同位元素、特に³² Ｐが使用できる。しかしながら、ポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドの使用といったようなその他の技術を利用することもできる。次いでこのビオチンは、広範囲の標識、例えば放射性核種、蛍光剤、酵素等で標識することのできるアビジンまたは抗体への結合部位として働く。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−蛋白二本鎖を包含する特異的二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。次いで、抗体を標識し、二本鎖が表面に結合しているところで検定を実施し、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在が検出できる。別法として、遺伝子の発現を、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定といった免疫学的方法により測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することもできる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成し、その後、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常、酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等のような視覚的に検出できるものである。本発明における使用に好適な特に鋭敏な染色技術は、シュー等、Am.J.Clin.Path.、７５巻７３４−７３８頁［１９８０］に記載されている。試料液の免疫組織化学的染色および／または検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってよく、任意の哺乳動物で作成することができる。簡便には、この抗体は、下にさらに記載されるように、天然ｍｐｌリガンドポリペプチドに対して、または本明細書に供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。Ｇ．ｍｐｌリガンドポリペプチドの精製ｍｐｌリガンドは、好ましくは分泌されたポリペプチドとして培地から回収されるが、分泌シグナル無しで直接発現される場合は、宿主細胞溶菌液から回収することもできる。ｍｐｌリガンドがヒト起源以外の組換え細胞で発現される場合、このｍｐｌリガンドは、ヒト起源の蛋白またはポリペプチドを全く含んでいない。しかしながら、ｍｐｌリガンド自体に関して実質上均質な製品を得るためには、通常、ｍｐｌリガンドを他の組換え細胞蛋白またはポリペプチドから精製することがやはり必要である。第一段階として、培地または溶菌液を遠心して粒状の細胞破片を除去する。次に、膜および可溶性蛋白画分を分離する。別法として、市販品を入手し得る蛋白濃縮フィルター（例えば、アミコンまたはミリポア・ペリコン限外濾過ユニット）を使用することもできる。次いで、ｍｐｌリガンドが膜に結合しているかどうかに応じて、可溶性蛋白画分および培養溶菌液の膜画分からｍｐｌリガンドを精製することができる。その後ｍｐｌリガンドを、塩析および種々のゲルマトリックスを用いる交換またはクロマトグラフィー法により、混在する可溶性蛋白およびポリペプチドから精製する。これらのマトリックスは、蛋白精製のために一般的な、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースおよびその他を包含する。蛋白精製に好適なクロマトグラフィー法の例は、免疫親和（例えば、抗ｈｍｐｌリガンドＭａｂ）、レセプター親和（例えば、ｍｐｌ−ＩｇＧまたはプロテインＡセファロース）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（例えば、エーテル、ブチル、またはフェニルトヨパール）、レクチンクロマトグラフィー（例えば、ＣｏｎＡ−セファロース、レンズマメレクチン− セファロース）、サイズ排除（例えば、セファデックスＧ−７５）、陽イオン− および陰イオン−交換カラム（例えば、ＤＥＡＥまたはカルボキシメチル−およびスルホプロピル−セルロース）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ −ＨＰＬＣ）（例えば、二つの連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて組み換えヒトＩＬ−２を精製している、アーダル等、J.Chromatog.、２９６巻１７１頁［１９８４］を参照されたい）を包含する。その他の精製工程は、所望により、エタノール沈澱化；硫酸アンモニウム沈澱化；クロマトフォーカシング；調製用ＳＤＳ −ＰＡＧＥ等を包含する。残基が除去され、挿入され、または置換されたｍｐｌリガンド変異体は、その変異により惹起された実質的な性質の変化を考慮に入れて、天然ｍｐｌリガンドと同じ様式で回収される。例えば、別の蛋白またはポリペプチド、例えば細菌またはウイルス抗原とのｍｐｌリガンド融合物の製造は、精製を促進し；当該抗原に対する抗体を含む免疫親和カラムを用いて該融合ポリペプチドを吸着することができる。ウサギポリクローナル抗ｍｐｌリガンドカラムのような免疫親和カラムを使用して、少なくとも１個の残存している免疫エピトープとｍｐｌリガンド変異体を結合させることにより、ｍｐｌリガンド変異体を吸収することができる。別法として、ｍｐｌリガンドは、アフイーゲル１０（バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ）等のような固定された樹脂に（好ましくは）結合させた精製ｍｐｌ −ＩｇＧを使用する親和クロマトブラフィーにより、当分野で良く知られる手段によって精製することができる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターもまた、精製中の蛋白分解的減成を阻害するのに有用であり、また、偶発的汚染物質の成長を防止するため、抗生物質を含有させることができる。当業者には、天然ｍｐｌリガンドに好適な精製法は、組換え細胞培養中での発現時のｍｐｌリガンドまたはその変異体の性質の変化を説明できる修飾が必要となり得るという事が理解できるであろう。Ｈ．ｍｐｌリガンドポリペプチドの共有結合的修飾ｍｐｌリガンドポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。天然ｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体の両者は共有結合的に修飾することができる。本発明の範囲内に包含される共有結合的修飾の一つの型は、ｍｐｌリガンドフラグメントである。約４０までのアミノ酸残基を有する変異体ｍｐｌリガンドフラグメントは、化学合成または全長のもしくは変異体のｍｐｌリガンドポリペプチドの酵素的または化学的開裂によって簡便に製造することができる。ｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントの共有結合的修飾の別の型は、ｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントの標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬と反応させることによって、当該分子中に導入される。システイン残基は、最も一般的にはα−ハロアセタート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により、誘導体化される。ヒスチジン残基はｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジン側鎖に対し相対的に特異的であるためである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６．０で実施する。リジンおよびアミノ末端残基は無水琥珀酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬は、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミダート；燐酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応を包含する。アルギニン残基は１または数種の常套的試薬との反応により修飾され、それらの中にはフェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫ_aのため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同時にリジンの基とも反応するかも知れない。チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入に特段の興味を伴って行われる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシン残基は、ラジオイムノアッセイに使用するための標識化蛋白を製造するために¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が適当である。カルボキシ側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ− Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）［式中、ＲおよびＲ'は異なるアルキル基である］、例えば１ −シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。二価の試薬による誘導体形成は、抗ｍｐｌリガンド抗体の精製のための方法で使用するための、水不溶性支持体マトリックスまたは表面へのｍｐｌリガンドの架橋にとって有用であり、逆もまた同様である。一般的に用いられる架橋剤は、例えば１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３,３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステル類を包含するホモ二価イミドエステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタンのような二価マレイミド類を包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体形成試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成する。別法として、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび米国特許第３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号；および４３３０４４０号に記載の反応性基質を、蛋白の固定に使用する。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば、各々対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は本発明の範囲内にある。その他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・Ｃｏ．、サンフランシスコ、７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシ基のアミド化が包含される。本発明の範囲に包含されるｍｐｌリガンドポリペプチドのもう一つの型の共有結合的修飾は、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。変更とは、天然ｍｐｌリガンド中に見いだされる１またはそれ以上の炭水化物部分を除去し、そして／または天然ｍｐｌリガンドに存在しない１またはそれ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン［ここでＸは、プロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、可能性あるグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使われることもある。ｍｐｌリガンドポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が、上記トリペプチド配列の１またはそれ以上を含むよう、該アミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。この変化は、天然ｍｐｌリガンド配列への１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によっても行うことができる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするためには、ｍｐｌリガンドアミノ酸配列は、好ましくはＤＮＤレベルでの変化によって、特に、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡを、所望アミノ酸に翻訳されるようなコドンが生成するように、前もって選択された塩基の位置で突然変異させることによって変化させる。このＤＮＡ突然変異は、「ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体」という表題の下に上で記載された方法を用いて行うことができる。ｍｐｌリガンド上の炭水化物部分の数を増す、もう一つの手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである。これらの方法は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中で該ポリペプチドを産生させる必要が無いという点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシ基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシ基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、およびアプリンおよびリストン、CRC Crit.Rev.Biochem.、２５９−３０６頁［１９８１］に記載されている。ｍｐｌリガンドポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成できる。化学的脱グリコシル化は、該ポリペプチドを、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に暴露させる必要がある。この処理は、該ポリペプチドを無傷のまま残しつつ、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どまたは全ての糖の開裂をもたらす。化学的脱グリコシル化は、ハキムディン等、Arch.Biochem.Biophys. 、２５９巻５２頁［１９８７］およびエッジ等、Anal.Biochem.、１１８巻１３１頁［１９８１］に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、ソタクラ等、Meth.Enzymol.，１３８巻３５０頁［１９８７］に記載のような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。可能性あるグリコシル化部位でのグリコシル化は、ダスキン等、J.Biol.Chem. 、２５７巻３１０５頁［１９８２］に記載されるように化合物ツニカマイシンの使用によって防止することができる。ツニカマイシンは、蛋白−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。ｍｐｌリガンドの共有結合的修飾のもう一つの型は、米国特許第４６４０８３５号；４４９６６８９号；４３０１１４４号；４６７０４１７号；４７９１１９２号または４１７９３３７号に開示される方法で、ｍｐｌリガンドポリペプチドを、様々な非蛋白性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類のうちの一つに結合させることを含む。前記のポリマーと共有結合したｍｐｌリガンドポリペプチドを、本明細書中、ペギレイティドｍｐｌリガンドポリペプチドと称する。ｍｐｌへの結合および上に定義された免疫学的および／または生物学的活性の所有について最適な変異体を選択するため、回収されたｍｐｌリガンド変異体の何らかのスクリーニングが必要であることは理解されるであろう。組換え細胞培養中または血漿中での安定性（例えば、蛋白分解的開裂に対する）、ｍｐｌ成員に対する高親和性、酸化的安定性、高収量で分泌される能力等についてスクリーニングすることができる。例えば、与えられた抗体に対する親和性といったようなｍｐｌリガンドポリペプチドの免疫学的性格の変化は、競合型イムノアッセイにより測定される。酸化還元または熱安定性、疎水性、または蛋白分解的減成の受け易さといったようなその他の可能性ある蛋白またはポリペプチドの性質の修飾は、当分野で良く知られる方法によって検定される。１７．ｍｐｌリガンドに対する抗体製造のための一般的方法抗体の製造（ｉ）ポリクローナル抗体ｍｐｌリガンドポリペプチドまたはフラグメントに対するポリクローナル抗体は一般に、ｍｐｌリガンドおよびアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物において作製される。ｍｐｌリガンドまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である］を用いて、免疫される種において免疫原性である蛋白、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターとコンジュゲートさせることが有用であるかも知れない。動物は、ペプチドまたはコンジュゲート１ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と合し、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、ｍｐｌリガンドポリペプチドもしくはフラグメント、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、ｍｐｌリガンド抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じｍｐｌリガンドのコンジュゲートで、但し異なった蛋白にコンジュゲートさせた、そして／または異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、蛋白融合として組換え細胞培養中で製造することができる。さらに、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために使用される。（ii）モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、実質上均質な抗体の集団、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在するかも知れない天然に起こる可能性のある突然変異を除いて同一であるような集団から取得される。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、別々の抗体の混合物ではないという、抗体の性格を示している。例えば、本発明に係るｍｐｌリガンドモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁［１９７５］により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号［キャビリー等］）によって作製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫に用いられた蛋白と特異的に結合する抗体を産生する、または産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９−１０３頁［アカデミック・プレス、１９８６］）。このようにして製造されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を好ましくは含有する適当な培養基に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養基は、典型的には、ＨＧＰＲＴ −欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫セルラインは、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ−２細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルラインもまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（コズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁［１９８４］；ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディー・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁、マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）。ハイブリドーマ細胞が生育している培養基を、ｍｐｌリガンドに対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、マンソンおよびポラード、Anal .Biochem.、１０７巻２２０頁［１９８０］のスキャッチャード分析により測定することができる。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生することが確定された後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により増殖させることができる（ゴディング、上記）。この目的にとって好適な培養基は、例えば、ダルベッコの改良イーグル培地またはＲＰＭＩ１６４０培地を包含する。加えて、このハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ− セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和クロマトグラフィーのような常套的免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清から好適に分離される。本発明に係るモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に分離および配列決定される。本発明に係るハイブリドーマ細胞は、係るＤＮＡの好ましい供給源として働く。分離されたならば、このＤＮＡは発現ベクター中に入れ、次にこれを、この状況以外では免疫グロブリン蛋白を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。このＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖不変ドメインのコード化配列を、ホモローガスなマウス配列の代わりに置換することにより（キャビリー等、上記；モリソン等、Proc.Nat.Acad.Sci.、８１巻６８５１頁［１９８４］）、または、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部または全てを共有結合させることにより、修飾することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明に係る抗体の不変ドメインを置換し、または本発明に係る抗体の１個の抗原結合部位の可変ドメインを置換して、ｍｐｌリガンドに対する特異性を有する１個の抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を包含する、合成蛋白化学において既知の方法を用いてインビトロで製造することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエステル結合を形成することにより、組み立てることができる。この目的のための好適な試薬は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートを包含する。診断への適用のため、本発明に係る抗体は、典型的には検出し得る原子団で標識されるであろう。検出し得る原子団は、検出し得るシグナルを直接的または間接的に生成することのできる任意のものとすることができる。例えば、検出し得る原子団は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉのような放射性同位元素、蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリン；放射性同位元素標識、例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹ ⁴ Ｃ、または³Ｈ、または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであってよい。ハンター等、Nature、４４巻９４５頁［１９６２］；デイヴィッド等、Bioche mistry、１３巻１０１４頁［１９７４］；ペイン等、J.Immunol.Meth.、４０巻２１９頁［１９８１］；およびニグレン、J.Histochem.and Cytochem.、３０巻４０７頁［１９８２］に記載の方法を包含する、検出し得る原子団と抗体を個別にコンジュゲートするための当分野で知られる任意の方法を使用することができる。本発明に係る抗体は、競合的結合検定、直接および間接サンドイッチ検定、および免疫沈降検定といったような任意の既知の検定法に使用することができる。ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・マニュアル・オブ・テクニークス、１４７−１５８頁（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．、１９８７）。競合的結合検定は、標識された標準（これはｍｐｌリガンドまたはその免疫学的に活性な部分であってよい）が限られた量の抗体との結合について被験試料検体（ｍｐｌリガンド）と競合する能力に依るものである。被験試料中のｍｐｌリガンドの量は、抗体と結合するようになる標準の量と逆比例する。結合するようになる標準の量の測定を容易にするため、抗体は一般に競合の前または後で不溶化し、その結果抗体に結合する標準および検体が、未結合のままである標準および検体から簡便に分離され得るようにする。サンドイッチ検定は二つの抗体の使用を含み、各々が、検出すべき蛋白（ｍｐｌリガンド）の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合することができる。サンドイッチ検定においては、被験試料検体は、固体支持体上に固定された第一の抗体と結合し、その後第二の抗体が検体と結合し、こうして不溶性三部複合体が形成される。デイヴィッドおよびグリーン、米国特許第４３７６１１０号。第二の抗体は、自身検出し得る原子団で標識されていてよく（直接サンドイッチ検定）、または検出し得る原子団で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することもできる（間接サンドイッチ検定）。例えば、サンドイッチ検定の一つの型はＥＬＩＳＡ検定であり、この場合検出し得る原子団は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）である。（iii）ヒト化およびヒト抗体非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターおよび共同研究者の方法（ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁［１９８６］；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２７頁［１９８８］；ベルホーエン等、Science、２３９巻１５３４−１５３６頁［１９８８］）に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である（キャビリー等、上記）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基およびことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従うと、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、その齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（シムズ等、J.Immunol.、１５１巻２２９６頁［１９９３］；チョシアおよびレスク、J.Mol.Biol.、１９６巻９０１頁［１９８７］）。もう一つの方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグループにある、全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター等、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA、８９巻４２８５頁［１９９２］；プレスタ等、J.Immunol.、１５１巻２６２３頁［１９９３］）。さらに、抗体は、抗原に対する高親和性およびその他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい態様によれば、親配列および様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における当該残基の可能な役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析、が可能となる。このようにして共通および移入配列からのＦＲ残基を選択しそして、結びつけることができ、その結果、所望の抗体の性格、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接且つ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。さらなる詳細については、１９９１年６月１４日出願の出願番号第０７／７１５２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日出願の米国出願第０７／９３４３７３号を参照されたい。別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできる、形質転換動物（例えば、マウス）を作ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA、９０巻２５５１−２５５頁［１９９３］；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５−２５８頁［１９９３］；ブラガーマン等、Year in Immuno.、７巻３３頁［１９９３］を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーで産生させることもできる（フーゲンブームおよびウィンター、J.Mol. Biol.、２２７、３８１［１９９１］；マークス等、J.Mol.Biol.、２２２、５８１［１９９１］）。（iv）二重特異性抗体二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当分野において既知である。常套的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの二つの重鎖は異なる特異性を持っている（ミルシュタインおよびキュエロ、Nature、３０５巻５３７−５３９頁［１９８３］）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、親和クロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、そして生成物の収率は低い。同様の方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０８８２９号（１９９３年５月１３日公開）およびトラウネッカー等、EMBO、１０巻３６５５− ３６５９頁［１９９１］に開示されている。異なったそしてより好ましいアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。この融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、および、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。この事により、組み立てに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適の収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらす時、または、その比率が特に重要性を持たない時は、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。その二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にするとわかった。このアプローチは、１９９２年８月１７日出願の同時係属出願第０７／９３１８１１号に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えばスレッシュ等、Me thods in Enzymology、１２１巻２１０頁［１９８６］を参照されたい。（ｖ）ヘテロコンジュゲート抗体ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結した二つの抗体で構成される。このような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため（米国特許第４６７６９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置のため（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）に提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。 IV．巨核球形成蛋白ｍｐｌリガンドの治療用途造血エフェクター機能を持ち本明細書中巨核球形成または血小板形成蛋白（ＴＰＯ）と称される生物活性ｍｐｌリガンドは、無菌薬用調製物または製剤に使用され、血小板の産生障害、破壊、または破壊の増加による血小板減少症に罹患している患者において巨核球形成または血小板形成活性を刺激することができる。血小板減少症に随伴する骨髄形成不全（例えば、化学療法または骨髄移植後の再生不良性貧血）は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫血小板減少症（ＨＩＶ誘発性ＩＴＰおよび非ＨＩＶ誘発性ＩＴＰを包含する）、慢性特発性血小板減少症、先天性血小板減少症、脊髄異形成、および血栓性血小板減少症と同様、本発明に係る化合物を用いて有効に処置することができる。さらに、これらの巨核球形成蛋白は、骨髄増殖性血小板増加疾患および炎症状態からの血小板増加症の処置ならびに鉄欠乏症に有用であり得る。本発明に係る巨核球形成または血小板形成蛋白（ＴＰＯ）の好ましい用途は、白血病または充実性腫瘍の処置のための骨髄毒性化学療法、オートロガスなまたは同種内の骨髄移植のための骨髄切除化学療法、脊髄異形成、特発性再生不良性貧血、先天性血小板減少症、および免疫血小板減少症への用途である。本発明に係る巨核球形成蛋白により有効に処置されるさらに別の疾患は、薬物、人工的表面上での毒作用または活性化からもたらされる血小板の欠損または損傷を包含する。これらの場合、本化合物を使用して、新たな「損傷を受けていない」血小板の「放散」を刺激することができる。有用な適用のさらに完全な一覧については、上記「背景」、特に（ａ）−（ｆ）項およびそこに引用されている文献を参照されたい。本発明に係る巨核球形成蛋白は、単独で、または他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、成長因子、または抗体と組み合わせて、上に定義された疾患および状態の処置に使用することができる。よって本化合物は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｋｉｔリガンド、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１を包含する、血小板形成活性を有する他の蛋白またはペプチドと組み合わせて使用できる。本発明に係る巨核球形成蛋白は、薬学上許容し得る担体と混合して製造される。この治療用組成物は、静脈内または鼻もしくは肺を介して投与することができる。さらにこの組成物は、所望により非経口的または皮下投与することもできる。全身的に投与される場合、この治療用組成物は発熱性物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に十分配慮した非経口投与のために許容し得る溶液中にあるべきである。これらの条件は当業者には知られている。簡潔に述べると、本発明に係る化合物の投薬用製剤は、所望の純度を有する本化合物を、生理学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって貯蔵用または投与用に製造される。係る材料は、用いられる用量および濃度において受容者にとって非毒性であり、燐酸、クエン酸、酢酸およびその他の有機酸塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；ポリアルギニンのような低分子量（約１０残基未満）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピロリジノンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオンおよび／またはトゥイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤を包含する。遊離の酸もしくは塩基型または薬学上許容し得る塩としての巨核球形成蛋白の一つの化合物または混合物約０．５ないし５００ｍｇを、容認されている薬学上の実務が要求するように、生理学上許容し得る媒質、担体、賦形剤、結合材、保存剤、安定剤、香料等と混合する。これらの組成物中の活性成分の量は、指示された範囲内の適切な用量が得られるような量である。注射用無菌組成物は、常套的薬学実務に従って調合することができる。例えば、水、またはゴマ、落花生もしくは綿実油のような天然に存在する植物油のような媒質、またはオレイン酸エチル等のような合成脂肪媒質への活性化合物の溶解または懸濁が望ましいかも知れない。容認されている薬学実務に従って、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤などを加えることができる。徐放製剤の適当な例は、当該ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、このマトリックスが、成型された物体、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである、マトリックスを包含する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル類、ヒドロゲル類［例えば、ランガー等、J.Biomed .Mater.Res.、１５巻１６７−２７７頁［１９８１］およびランガー、Chem.Tech .、１２巻９８−１０５頁［１９８２］に記載のポリ（２−ヒドロキシエチル− メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリアクチド類（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル− Ｌ−グルタマートのコポリマー（シドマン等、Biopolymers、２２巻５４７−５５６頁［１９８３］）、非分解性エチレン−ビニルアセタート（ランガー等、上記）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばルプロン・デポ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）を包含する。エチレン−ビニルアセタートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間にわたり分子を放出できるが、或るヒドロゲルは蛋白をより短時間放出する。カプセル化された蛋白が長時間体内にとどまる時、３７℃で水分にさらされる結果としてそれらは変性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の変化が起こり得る。関係する機構に応じた蛋白の安定化のために、合理的な戦略を考え出すことができる。例えば、凝集の機構が、ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されたなら、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の調節、適当な添加剤の使用、および特異的ポリマーマトリックス組成物の開発により、達成することができる。徐放性巨核球形成蛋白組成物は、リポソームに捕捉された巨核球形成蛋白をも包含する。巨核球形成蛋白を含有するリポソームは、自体既知の方法によって製造される：ＤＥ３２１８１２１；エプシュタイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻３６８８−３６９２頁［１９８５］；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA、７７巻４０３０−４０３４頁［１９８０］；ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４４８５０４５および４５４４５４５；ならびにＥＰ１０２３２４。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ．％コレステロール以上である、小さな（約２００−８００オングストローム）単層型のものであり、選択される比率は最適な巨核球形成蛋白治療法のために調節される。用量は、疾患の重篤度および型、体重、性別、食餌、投与の時間および経路、他の薬物療法ならびにその他の関連する臨床上の因子を包含する、薬物の作用を修飾することが知られている様々な因子を考慮に入れて、処置に臨む医師により決定されるてあろう。典型的には、日用量は０．１−１００μｇ／ｋｇ体重の範囲であろう。好ましくは、用量は０．１−５０μｇ／ｋｇ体重の範囲であろう。より好ましくは、初期用量は１ないし５μｇ／ｋｇ／日となるであろう。所望により、この用量範囲は、他のサイトカイン、特にＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥＰＯの用量範囲と同じになるであろう。治療上の有効用量はインビトロまたはインビボいずれかの方法によって決定することができる。実施例当業者の一人は、これ以上の説明が無くとも、上の記載および例示的実施例を用いて本発明を完全に実施および利用できると信じられる。故に、以下の実用的実施例は、本発明の好ましい態様を特に指摘するものであり、いかなるやり方によっても、開示の残りの部分を限定するものと解してはならない。実施例１ブタｍｐｌリガンドの部分的精製正常なまたは再生不良性貧血のブタから血小板の僅少な血漿を集めた。ブタは、４ｍＥＶ線形加速器を用いて９００ｃＧｙの全身照射で照射することにより再生不良性とした。照射されたブタは６−８日間、セファゾリンの筋肉内注射で支援した。続いて、その全血容量を全身麻酔下に採取し、ヘパリン処理し、そして１８００ｘｇで３０分間遠心して血小板僅少血漿を作成した。巨核球刺激活性は照射の６日後にピークとなることがわかった。照射されたブタから得られた再生不良性ブタ血漿をＮａＣｌで４Ｍとし、室温で３０分間攪拌する。得られた沈澱をソルヴォールＲＣ３Ｂ中３８００ｒｐｍで遠心することにより除去し、上清を、４ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭＮａＰＯ₄で平衡化したフェニル−トヨパールカラム（２２０ｍｌ）にロードする。Ａ₂ ₈₀ が＜０．０５となるまでカラムをこの緩衝液で洗浄し、ｄＨ₂Ｏで溶離する。溶出した蛋白のピークをｄＨ₂Ｏで１５ｍＳの伝導度まで希釈し、ＰＢＳで平衡化した（２４０ｍｌ）ブルー−セファロースカラムにロードする。続いてこのカラムを、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）およびＰＢＳ各々５カラム容量で洗浄する。蛋白を、２Ｍ尿素および１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）でカラムから溶離する。溶出した蛋白のピークを０．０１％オクチルグルコシド（ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド）ならびにＥＤＴＡおよぴペファブロック（ベーリンガー・マンハイム）各１ｍＭとし、縦に連結させたＣＤ４−ＩｇＧ（Ｄ．Ｊ．カポン等、Nature、３３７巻５２５−５３１頁［１９８９］）およびｍｐｌ−ＩｇＧウルトラリンク（ピアス）カラムに直接ロードする（下記参照）。試料をロードした後ＣＤ４−ＩｇＧ（２ｍｌ）カラムをはずし、ｍｐｌ−ＩｇＧ（４ｍｌ）カラムを、各１０カラム容量のＰＢＳおよび２ＭＮａＣｌを含有するＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン− ＨＣｌ（ｐＨ２．２５）で溶離する。画分は１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に集める。ｍｐｌ−親和カラムから溶出した画分を還元条件下で実施するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％、ノヴェックスゲル）により分析すると、幾つかの蛋白の存在が明らかとなった（図５）。銀染色の強度が最も強い蛋白は、見掛けのＭｒ６６０００、５５０００、３００００、２８０００および１４０００で分離する。これらの蛋白のうちいずれがＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞培養の増殖を刺激するかを決定するため、これらの蛋白を下記実施例２に記載のようにゲルから溶離した。ウルトラリンク親和カラムＰＢＳ中のｍｐｌ−ＩｇＧまたはＣＤ４−ＩｇＧ１０−２０ｍｇを製造者の指示に記載のようにウルトラリンク樹脂（ピアス）０．５ｇと結合させる。ｍｐｌ−ＩｇＧの組み立ておよび発現ヒトｍｐｌの細胞外ドメイン全体（アミノ酸１−４９１）およびヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域からなるキメラ分子を２９３細胞で発現させた。ヒトｍｐｌのアミノ酸１−４９１をコードしているｃＤＮＡフラグメントをヒト巨核球ＣＭＫ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって取得し、配列決定した。ＣｌａＩ部位を５'末端に、そしてＢｓｔＥII部位を３'末端に挿入した。このフラグメントをブルースクリプトベクターのＩｇＧＩＦｃコード化領域の上流のＣｌａＩおよびＢｓｔＥII部位の間に、ＰＣＲ生成物をＢｓｔＥIIで部分消化した後、クローニングした。何故ならあと２個のＢｓｔＥII部位がｍｐｌの細胞外ドメインをコードしているＤＮＡに存在しているからである。ｍｐｌＰＣＲ生成物の３'末端に導入されたＢｓｔＥII部位は、ｍｐｌ細胞外ドメインを伴うフレーム内Ｆｃ領域を有するよう設計された。この組み立て物をｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏベクター中に、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ部位の間にサブクローニングし、燐酸カルシウム法によって２９３ヒト胚腎細胞中にトランスフェクトした。細胞を０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、個々のクローンを分離した。分離されたクローンからのｍｐｌ−ＩｇＧ発現をヒトＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。最良の発現クローンは１−２ｍｇ／ｍｌのｍｐｌ−ＩｇＧの発現レベルを有していた。Ｂａ／Ｆ３ｍｐｌＰ発現細胞ヒトｍｐｌＰのコード化領域全体に対応するｃＤＮＡをｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ中にクローニングし、これを引き続きＮｏｔＩで線状化し、ＩＬ−３依存セルラインＢａ／Ｆ３に電気穿孔によってトランスフェクトした（１ｘ１０⁷細胞、９６０５Ｆ、２５０ボルト）。３日後、２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択を開始した。プールまたは個々のクローンとして選択された細胞を、９６ウェルプレートでの限界希釈により取得した。選択された細胞を、１５％ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８、２０ｍＭグルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１００μ ｇ／ｍｌＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ中に維持した。選択されたクローンでのｍｐｌＰの発現を、抗ｍｐｌＰウサギポリクローナル抗体を用いるＦＡＣＳ分析により測定した。Ｂａ／Ｆ３ｍｐｌリガンド検定図２に示されるようにｍｐｌリガンド検定を実施した。種々の供給源からのｍｐｌリガンドの存在を決定するため、ｍｐｌＰＢａ／Ｆ３細胞を、３７℃の５％ＣＯ₂および空気中の加湿インキュベーター中、細胞密度５ｘ１０⁵細胞／ｍｌで２４時間ＩＬ−３を欠乏させた。ＩＬ−３欠乏に続いてこの細胞を、培地２００μｌ中、希釈試料有りまたは無しで、５００００細胞の密度で９６ウェル培養皿に蒔き、細胞培養インキュベーター中２４時間培養した。１μＣｉの³Ｈ−チミジンを含有する無血清ＲＰＭＩ培地２０μｌを最後の６−８時間の間、各々のウェルに添加した。次にこの細胞を９６ウェルＧＦ／Ｃフィルター板に収穫し、水で５回洗浄した。フィルターを、シンチレーション液（マイクロシント２０）４０μｌの存在下にパッカード・トップ・カウント計数器で係数した。実施例２高精製ブタｍｐｌリガンドゲル溶出プロトコル親和精製されたｍｐｌリガンド（ｍｐｌ−ＩｇＧカラムから溶出した画分６）および２Ｘレムリ試料緩衝液の等量を還元剤の不在下で室温で混合し、できるだけ速やかにノヴェックス４−２０％ポリアクリルアミドゲル上にロードした。試料は加熱しなかった。対照として、リガンド無しの試料緩衝液を隣接する列で移動させた。このゲルを４−６℃、１３５ボルトでおよそ２と４／１時間稼働させた。流す緩衝液は最初室温とした。次いでこのゲルをゲル箱から取り除き、ゲルの片側の平板を除去した。ゲルのレプリカをニトロセルロース上で以下のように作成した：一片のニトロセルロースを蒸留水で湿し、気泡が入らないよう、露出したゲル表面の上に注意深く積層した。ニトロセルロースおよびゲル平板上に基準線の印を付け、レプリカが染色後に正確に復位されるようにした。およそ２分後、ニトロセルロースを注意深く除去し、ゲルをラップで包み冷蔵庫に入れた。このニトロセルロースを、３ｘ１０ｍｌの０．１％トゥイーン２０＋０．５ＭＮａＣｌ＋０．１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ７．５中でおよそ４５分間、引き続き３ｘ１０ｍｌ精製水中で５分間振盪することにより、バイオラドの金総蛋白染色剤で染色した。次に金染色剤を加え、標準のバンドが見えるようになるまで発色させた。次いでレプリカを水ですすぎ、ゲル上のラップに重ね、基準線の印と注意深く並べた。ノヴェックス標準の位置をゲル平板に記録し、切断位置を示す線を引いた。次にニトロセルロースおよびラップを取り除き、ゲルを示された線に沿って鋭利な剃刀の刃で切った。切断線は試料列を越えて伸ばし、ゲルを染色した時にこれらを切片の位置の決定に使用できるようにした。切片を取り除いた後、残りのゲルを銀染色し、標準および切断の印の位置を測定した。切断位置に対応する分子量をノヴェックス標準から決定した。１２のゲル切片を、二つのバイオラドモデル４２２電気泳動機中のセルに入れた。１２−１４Ｋ分子量カットオフ膜のキャップをこれらのセルに使用した。５０ｍＭ重炭酸アンモニウム＋０．０５％ＳＤＳ（およそｐＨ７．８）が溶離緩衝液であった。緩衝液１リットルを使用前におよそ１時間４−６℃の冷室で冷却した。ゲル切片を４−６℃の冷室内で１０ｍａ／セル（最初４０Ｖ）で溶離した。溶出にはほぼ４時間かかった。次にセルを注意深くはずし、フリット上部の液体をピペットで除去した。溶離チェインバーをはずし、膜キャップ上に液体があればこれをピペットで除去した。膜キャップ中の液体をピペットマンで取り、保存した。次に精製水５０μｌアリコートをキャップ内に入れ、ＳＤＳ結晶が全て溶解するまで攪拌し除去した。これらの洗液を、保存しておいた上の液体と合した。溶出試料の全容量はゲル切片当たり３００−５００μｌであった。試料を、精製水に数時間浸漬しておいた１０ｍｍスペクトレイパー４１２−１４Ｋカットオフ透析管に入れた。これらを試料６個につき６００ｍｌの燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳはカリウムがおよそ４ｍＭである）に対して４−６℃で一夜透析した。緩衝液を翌朝交換し、透析を２．５時間継続した。次いで試料を透析バッグから取り、遠心管に入れた。管を１時間氷上に置き、１４Ｋｒｐｍで３分間遠心し、上清を沈澱化したＳＤＳから注意深く取った。次にこの上清をさらにおよそ１時間氷上に置き、再度４分間遠心した。上清を燐酸緩衝化食塩水で希釈し、活性検定に付した。残りの試料は−７０℃で凍結した。実施例３ブタｍｐｌリガンド微細配列決定ｍｐｌ−ＩｇＧ親和カラム由来の画分６（２．６ｍｌ）をマイクロコン−１０（アミコン）で濃縮した。ｍｐｌリガンドがマイクロコンに吸収されるのを防ぐため、膜を１％ＳＤＳですすぎ、１０％ＳＤＳ５μｌを画分６に加えた。２Ｘの試料緩衝液（２０μｌ）をマイクロコン濃縮後の画分＃６（２０μｌ）に加え、全容量（４０μｌ）を４−２０％勾配のアクリルアミドゲル（ノヴェックス）の一つの列にロードした。このゲルはノヴェックスのプロトコルに従って稼働させた。次にこのゲルを５分間平衡化し、その後１０％メタノールを含有する１０ｍＭ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液、ｐＨ１１．０中で電気ブロッティングした。イモビロン−ＰＳＱ膜（ミリポア）上での電気ブロッティングを、バイオラドトランス−ブロット転移セル（３２）中、２５０ｍＡ定電流で４５分間実施した。ＰＶＤＦ膜を４０％メタノール、０．１％酢酸中０．１％クマシーブルーＲ−２５０で１分間染色し、５０％メタノール中１０％酢酸で２−３分間脱染した。このブロットのＭｒ１８０００−３５０００領域で見られた唯一の蛋白は、Ｍｒ３００００、２８０００および２２０００を有していた。３０、２８および２２ｋＤａのバンドを蛋白配列決定に付した。自動蛋白配列決定を、オンラインＰＴＨ分析機を備えたモデル４７０Ａアプライドバイオシステムシークエンサーで実施した。シークエンサーは、試料の８０−９０％を注入するよう改変した（ロドリゲス、J.Chromatogr.、３５０巻２１７−２２５頁［１９８５］）。ＵＶ吸収の平衡を保たせるため、アセトン（〜１２μｌ／ｌ）を溶媒Ａに添加した。電気ブロッティングされた蛋白をブロットカートリッジ内で配列決定した。ピークを、ネルソンアナリティカル９７０インターフェイスを用い、ジャスティスイノヴェーションのソフトウェアで統合した。配列の解釈をＶＡＸ５９００で実施した（ヘンツェル等、J.Chromatogr.、４０４巻４１−５２頁［１９８７］）。Ｎ末端配列（一文字コードを使用し、不確実な残基を括弧に入れる）および得られた物質の量（角括弧に入れる）を第２'表に示す。実施例４液体懸濁巨核球形成検定ヒト末梢幹細胞（ＰＳＣ）（同意を得た患者より取得）をＩＭＤＭ培地（ジブコ）で５倍に希釈し、室温、８００ｘｇで１５分間遠心した。細胞ペレットをＩＭＤＭに再懸濁し、６０％パーコル（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）（ファルマシア）上に積層し、８００ｘｇで３０分間遠心した。界面の低密度単核細胞を吸引し、ＩＭＤＭで２ｘ洗浄し、２４ウェル組織培養クラスター（コスター）中の３０％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ（１ｍｌ最終容量）に１−２ｘ１０⁶細胞／ｍｌで蒔いた。ＡＰＰまたはｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰを１０％まで加え、５％ＣＯ₂ および空気中３７℃の加湿インキュベーター中で培養を１２−１４日間増殖させた。培養は、０、２および４日目に添加されるｍｐｌ−ＩｇＧ０．５μｇを伴う１０％ＡＰＰの存在下でも増殖させた。ＡＰＰは、ｍｐｌ−ＩｇＧ親和カラムを通過させることによりｍｐｌリガンドを涸渇させた。これらの液体懸濁培養の巨核球形成を定量するため、ソルバーグ等の修飾を用い、ＧＰIIbIIIaに対する放射標識マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＨＰ１− １Ｄ）を使用する（ニコルズ博士、メイヨー・クリニック、により提供された）。製造者の指示に従い、ＨＰ１−１Ｄ（Ｂ．グラント等、Blood、６９巻１３３４−１３３９頁［１９８７］）１００μｇをエンザイモビーズ（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）を用いてＮａ¹²⁵Ｉ１ｍＣｉで放射標識した。放射標識されたＨＰ１−１Ｄは０．０１％オクチル−グルコシドを含有するＰＢＳ中、−７０ ℃で保存した。典型的な比活性は１−２ｘ１０⁶ｃｐｍ／μｇ（１２．５％トリクロロ酢酸により＞９５％が沈澱化）であった。液体懸濁培養を各実験点につき三重に準備した。培養して１２−１４日後に１ｍｌの培養を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、室温、８００ｘｇで１０分間遠心し、得られた細胞ペレットを０．０２％ＥＤＴＡおよび２０％子牛血清を含有するＰＢＳ１００μｌに再懸濁した。検定緩衝液５０μｌ中１０ｎｇの¹²⁵Ｉ −ＨＰ１−１Ｄをこの再懸濁された培養に加え、時々振盪しながら室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。続いてＲＴで８００ｘｇで１０分間遠心することにより細胞を集め、検定緩衝液で２ｘ洗浄した。このペレットをガンマカウンター（パッカード）で１分間計数した。標識されたＨＰ１−１Ｄの添加の６０分前に非標識ＨＰ１−１Ｄ１μｇを添加することにより、非特異結合を測定した。特異的結合を、結合した全¹²⁵Ｉ−ＨＰ１−１Ｄから、過剰の非標識ＨＰ１−１Ｄの存在下でのそれを差し引いたものとして決定した。実施例５オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白から得られるアミノ末端アミノ酸配列に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するための縮重オリゴヌクレオチドを設計した（第４表を参照されたい）。アミノ酸残基２−８をコードしている正のセンス２０量体プール（ｍｐｌ１）およびアミノ酸１８−２４をコードしている配列に相補的なアンチセンス２１量体プール（ｍｐｌ２）という二つのプライマープールを合成した。ブタ末梢血リンパ球から分離されたブタゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。５０μｌの反応は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、４００μＭｄＮＴＰ、１μＭの各プライマープールおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼに入れたブタゲノムＤＮＡ０．８μｇを含んでいた。最初の鋳型変性は９４℃で８分間、その後、９４℃で４５秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を３５サイクル行った。最終サイクルは、７２℃で１０分間延長させた。ＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分離し、エチジウムブロミドで染色することにより可視化した。アミノ末端アミノ酸配列が単一のエクソンによりコードされているならば、正しいＰＣＲ生成物は６９ｂｐであると予想されるということが推理された。この大きさのＤＮＡフラグメントがゲルから溶離し、ｐＧＥＭＴ（プロメガ）中にサブクローニングされた。３個のクローンの配列を下の第５表に示す。ＰＣＲプライマーの位置は下線を付した塩基によって示す。これらの結果は、３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白のアミノ酸９−１７について得られたＮ末端配列を立証し、この配列がブタＤＮＡの単一のエクソンによってコードされていることを示した。実施例６ヒトｍｐｌリガンド遺伝子実施例５の結果に基づき、ｐＲ４５と呼ばれる４５量体デオキシリボヌクレオチドを設計し合成してゲノムライブラリーをスクリーニングした。この４５量体は以下の配列を持っていた：このオリゴヌクレオチドを（γ³²Ｐ）−ＡＴＰおよびＴ４キナーゼで³²Ｐ−標識し、低緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でλｇｅｍ１２中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。（実施例７を参照されたい）。陽性クローンを選び、プラークを精製し制限地図作成およびサザンブロッティングにより分析した。さらなる分析用にクローン＃４を選択した。４５量体とハイブリダイズした２．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ−中にサブクローニングした。ブタｍｐｌリガンドＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーに使用して、このクローンの部分的ＤＮＡ配列決定を実施した。得られた配列により、ブタｍｐｌリガンドのヒト類似体をコードしているＤＮＡが分離されたことが確認された。この配列中にＥｃｏＲＩ制限部位が検出されたことにより、本発明者等は、２．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｂａＩから３９０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを分離しそしてこれをｐBluescriptＳＫ−にサブクローニングすることができた。このフラグメントの両方の鎖を配列決定した。このヒトＤＮＡ配列および導き出されたアミノ酸配列を図９に示す（配列番号３および４）。さらにゲノム配列中のイントロンの予想位置を矢印により示し、推定のエクソンを規定する（「エクソン３」）。この予想アミノ酸配列の調査により、直接アミノ酸配列分析から決定されるように、セリン残基が、成熟ｍｐｌリガンドの最初のアミノ酸であることが確認される。このコドンのすぐ上流には、成熟ｍｐｌリガンドの分泌に関わるシグナル配列であるという示唆に富む予想アミノ酸配列がある。このシグナル配列コード化領域は恐らくイントロンによりヌクレオチド位置６８で中断している。３'方向では、エクソンはヌクレオチド１９６で終止しているようである。故にこのエクソンは４２アミノ酸の配列をコードしており、うち１６はシグナル配列の一部であり、２６は成熟ヒトｍｐｌリガンドの一部であるらしい。実施例７全長ヒトｍｐｌリガンドｃＤＮＡヒト「エクソン３」配列（実施例６）に基づき、「エクソン３」配列の３'および５'末端に対応する２個の非縮重オリゴヌクレオチドを合成した(第６表)。これら二つのプライマーは、種々のヒトｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡまたは種々の組織由来の１ｎｇのクイッククローンｃＤＮＡ（クロンテク）を鋳型に使用するＰＣＲ反応で、実施例５に記載の条件を用いて使用された。正しいＰＣＲ生成物の予想される大きさは１４０ｂｐであった。１２％ポリアクリルアミドゲル上でこのＰＣＲ生成物を分析した後、成人腎臓、２９３胎児腎細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーおよびヒト胎児肝から調製されたｃＤＮＡに、予想された大きさのＤＮＡフラグメントが検出された（クロンテクカタログ＃７１７１−１）。 λＤＲ２中の胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（クロンテクカタログ＃ＨＬ１１５１ｘ）を、ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したものと同じ４５量体オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。このオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて（γ³²Ｐ）−ＡＴＰで標識した。ライブラリーは低緊縮ハイブリダイゼーション条件下にスクリーニングした。フィルターを２時間プレハイブリダイゼーションし、次いで１６時間、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハート、０．０５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌの超音波処理鮭精子ＤＮＡ中で４２ ℃で一夜プローブとハイブリダイズさせた。次にフィルターを２ｘＳＳＣですすぎ、次いで４２℃の０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。フィルターをコダックＸ線フィルムに一夜暴露させた。陽性クローンを選び、プラークを精製し、挿入物の大きさを、λＤＲ２にクローニングしているＢａｍＨＩ−ＸｂａＩに隣接するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって決定した（クロンテクカタログ＃６４７５−１）。ファージストック５μｇを鋳型供給源として使用した。最初の変性は９４℃で７分間、引き続き３０サイクルの増幅（９４℃１分間、５２℃１分間および７２℃１．５分間）を実施した。最後の伸長は７２℃で１５分間とした。クローン＃ＦＬ２ｂは１．８ｋｂ挿入物を持っており、これをさらなる分析のために選択した。 λＤＲ２ファージのアーム内に入っているプラスミドｐＤＲ２（クロンテク、 λＤＲ２およびｐＤＲ２クローニングおよび発現系ライブラリープロトコルハンドブック、４２頁）を、製造者の指示（クロンテク、λＤＲ２およびｐＤＲ２クローニングおよび発現系ライブラリープロトコルハンドブック、２９−３０頁）に記載のようにして回収した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによるプラスミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂの制限分析は、挿入物中およそ６５０位に内部ＢａｍＨＩ制限部位が存在することを示した。ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによるこのプラスミドの消化は、この挿入物を、一方は０．６５ｋｂであり他方は１．１５ｋｂである２個のフラグメントに切断した。プラスミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂから誘導された三つの異なるクラスの鋳型によりＤＮＡ配列を決定した。二本鎖プラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定を、色素標識ジデオキシヌクレオシド三燐酸ターミネーター（色素ターミネーター）および特別に合成した歩行プライマーのための標準プロトコルを用いるＡＢＩ３７３（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）自動蛍光ＤＮＡシークエンサーで実施した（サンガー等、Proc .Natl.Acad.Sci.USA、７４巻５４６３−５４６７頁［１９７７］；スミス等、Na ture、３２１巻６７４−６７９頁［１９８６］）。ポリメラーゼ連鎖反応で増幅させたプラスミドからのフラグメントの直接配列決定を、特別製プライマーおよび色素ターミネーター反応を用いてＡＢＩ３７３シークエンサーで行った。一本鎖鋳型をＭ１３ジェイナスベクター（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン）を用いて作成した（バーランド等、Nucl.Acids Res.、２１巻３３８５−３３９０頁［１９９３］）。プラスミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ（１．１５ｋｂ）およびＢａｍＨＩ（０．６５ｋｂ）フラグメントを分離し、デオキシヌクレオチドの存在下で末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで満たし、次いでＭ１３ジェイナスのＳｍａＩ部位にサブクローニングした。配列決定を、色素標識Ｍ１３普遍および逆プライマー、または歩行プライマーおよび色素ターミネーターについての標準プロトコルで実施した。歩行プライマーおよび標準ジデオキシターミネーター化学（サンガー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 、７４巻５４６３−５４６７頁［１９７７］）、³³Ｐ−標識されたα−ｄＡＴＰおよびシークエナーゼ（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・Ｃｏｒｐ．、クリーヴランド、オハイオ）を用いて一本鎖Ｍ１３ＤＮＡについての手動配列決定反応を実施した。ＤＮＡ配列の集成をシークエンチャーＶ２．１ｂ１２（ジーン・コーズ・コーポレーション、アンアーバー、ミシガン）によって実施した。ｈＭＬのヌクレオチトおよび導き出された配列を図１（配列番号１）に供する。実施例８ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子の分離 λ−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラリーを、先に記載のオリゴヌクレオチドプローブｐＲ４５を用いて低緊縮条件下で（実施例７を参照されたい）、またはｍｐｌリガンドをコードしているヒトｃＤＮＡの３'側半分に対応するフラグメント（ＢａｍＨＩ部位から３'末端まで）を用いて高緊縮条件下でスクリーニングすることにより、ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを分離した。３５ｋｂの長さの２個の部分重複したλクローンが分離された。ＴＰＯ遺伝子の全体を含む２個の部分重複フラグメント（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）をサブクローニングし配列決定した。このヒト遺伝子の構造は、ゲノムＤＮＡの７ｋｂ以内の６個のエクソンで構成されている（図１４Ａ、ＢおよびＣ）。全てのエクソン／イントロン接合部の境界は、哺乳動物遺伝子について確立された共通モチーフと一致している（Ｍ．Ｂ．シャピロ等、Nucl.Acids Res.、１５巻７１５５頁［１９８７］）。エクソン１およびエクソン２は、５'非翻訳配列およびシグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸を含んでいる。分泌シグナルの残部および成熟蛋白の最初の２６アミノ酸はエクソン３の中にコードされている。カルボキシドメインの全体、ならびにエリスロポエチン様ドメインの３'非翻訳および〜５０アミノ酸はエクソン６の中にコードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ−２）内部に見られる除去に含まれる４個のアミノ酸はエクソン６の５'末端にコードされている。実施例９ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）の一過性発現ｐＤＲ２−ＦＬ２ｂに含まれる全長挿入物をサブクローニングするため、このプラスミドを、ＸｂａＩで完全に、次にＢａｍＨＩで部分的に消化した。１．８ｋｂ挿入物に対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、サイトメガロウイルス即時初期プロモーターの調節の下にｐＲＫ５にサブクローニングした（ｐＲＫ５ −ｈｍｐｌＩ）（ｐＲＫ５の組み立てについては米国特許第５２５８２８７号を参照されたい）。組み立て物ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩからのＤＮＡをＰＥＧ法により調製し、Ｆ−１２栄養混合物、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）および１０％牛胎児血清を添加したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持したヒト胚腎臓２９３細胞にトランスフェクトした。細胞は、記載のように燐酸カルシウム法によりトランスフェクトさせた（Ｃ．ゴーマン［１９８５］、ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｄ．Ｍ．グローヴァー編）、II巻１４３−１９０頁、ＩＲＬプレス、ワシントンＤ．Ｃ．）。トランスフェクションの３６時間後、トランスフェクトされた細胞の上清を、増殖検定で活性について検定した（実施例１を参照されたい）。ｐＲＫベクターでトランスフェクトされた２９３細胞の上清のみは、Ｂａ／Ｆ３またはＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の刺激を与えなかった（図１２Ａ）。ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩでトランスフェクトされた細胞の上清はＢａ／Ｆ３細胞には効果が無かったが、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の増殖を劇的に刺激し（図１２Ａ）、この事は、このｃＤＮＡが機能的に活性なヒトｍｐｌリガンドをコードしていることを示すものである。実施例１０ヒトｍｐｌリガンドイソ型ｈＭＬ２、ｈＭＬ３およびｈＭＬ４択一的にスプライスされた型のｈＭＬを同定するため、ｈＭＬのコード化配列のそれぞれの末端に対応するプライマーを合成した。これらのプライマーをＲＴ −ＰＣＲに使用してヒト成人肝ＲＮＡを増幅した。加えて、目的とする選択された領域に隣接する内部プライマー（下記参照）を組み立て、同様に使用した。ＰＣＲ生成物の末端の直接配列決定は、ヒト胎児肝ライブラリーから分離されたｃＤＮＡの配列と正確に対応する一つの配列を明らかにした（図１［配列番号１］を参照されたい）。しかしながら、ＥＰＯドメインのＣ末端付近の領域（ＰＣＲ生成物の中程）は複雑な配列パターンを示し、その領域でスプライス変異体の存在する可能性を示唆した。これらのスプライス変異体を分離するため、目的領域に隣接する第７表に供されるプライマーをヒト成人肝ｃＤＮＡのための鋳型としてＰＣＲに使用した。ＰＣＲ生成物をＭ１３にブラントでサブクローニングした。個々のサブクローンの配列決定は、少なくとも３個のＭＬイソ型の存在を明らかにした。そのうちの一つであるｈＭＬ（ｈＭＬ₃₃₂とも呼ばれる）は最も長い型であり、胎児肝ライブラリーから分離された配列に正確に対応する。最長（ｈＭＬ）から最短（ｈＭＬ−４）までを列挙した４個のヒトｍｐｌリガンドイソ型の配列を（図１１［配列番号６、８、９および１０］）に供する。実施例１１ヒトｍｐｌリガンドイソ型および置換変異体の組み立ておよび一過性発現ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、およびｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）イソ型ｈＭＬ２およびｈＭＬ３ならびに置換変異体ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）を、ラッセル・ヒグチ、ＰＣＲプロトコルズ、ア・ガイド・トゥー・メソッズ・アンド・アプリケーションズ、アカデミック・プレス、Ｍ．Ａ．イニス、Ｄ．Ｈ．ゲルファンド、Ｊ．Ｊ．スニンスキーおよびＴ．Ｊ．ホワイト編、に記載の組換えＰＣＲ技術を用いてｈＭＬから再構成した。全組み立て物において、使用された「外部」プライマーを第８表に、そして「一部重複」プライマーを第９表に示す。全てのＰＣＲ増幅は、クローニングされたＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）で、以下の条件を用いて実施した：最初の鋳型変性は９４℃で７分間、その後９４℃１分間、５５℃１分間、および７２℃１．５分間を３０サイクル。最後のサイクルは７２℃で１０分間延長した。最終的ＰＣＲ生成物をＣｌａＩ −ＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏにクローニングした。２９３細胞を上記のように種々の組み立て物でトランスフェクトし、上清をＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて検定した。ｈＭＬ−２およびｈＭＬ−３はこの検定で検出し得る活性を示さなかったが、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）の活性はｈＭＬと同様で、この事は、この二塩基部位でのプロセシングが活性に必要ないことを示すものである（図１３を参照されたい）。実施例１２マウスｍｐｌリガンドｃＤＮＡｍＭＬ、ｍＭＬ−２およびｍＭＬ−３ｍＭＬｃＤＮＡの分離ヒトｍｐｌリガンドの全コード化領域に対応するＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって取得し、ゲル精製し、³²Ｐ−ｄＡＴＰおよび³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下でランダムプライミングにより標識した。このプローブを用いてλＧＴ１０（クロンテクカタログ＃ＭＬ３００１ａ）中のマウス肝ｃＤＮＡライブラリー１０⁶クローンをスクリーニングした。３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハート、０．１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌの超音波処理鮭精子ＤＮＡ中、プローブの存在下で二重のフィルターを一夜ハイブリダイズさせた。フィルターを２ｘＳＳＣですすぎ、次いで４２℃の０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで一回洗浄した。ハイブリダイズしているファージをプラーク精製し、ｃＤＮＡ挿入物をブルースクリプトＳＫ−プラスミドのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。１．５ｋｂ挿入物を伴うクローン「ＬＤ」をさらなる分析のために選択し、両方の鎖をヒトＭＬｃＤＮＡについて上に記載したように配列決定した。クローンＬＤからのヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列を図１４（配列番号１および１１）に供する。このクローンから導き出された成熟ＭＬ配列は３３１アミノ酸残基の長さであり、ｍＭＬ₃₃₁（または下記の理由でｍＭＬ−２）と同定された。これらのＭＬのＥＰＯ様ドメインには、ヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列の両方についてかなりの一致が観察された。しかし、ヒトおよびマウスＭＬの導き出されたアミノ酸配列を並べる時、マウス配列は、ヒト（上記参照）およびブタ（下記参照）ｃＤＮＡの両方に見られる、ヌクレオチド位置６１８の後の１２ヌクレオチド除去に対応するヒト残基１１１−１１４の間のテトラペプチドの除去を有するようであった。そこで、可能性あるマウスＭＬイソ型を検出するため、さらなるクローンを調べた。一つのクローン「Ｌ７」は、「失われている」テトラペプチドＬＰＬＱを含む３３５アミノ酸の導き出された配列を有する１．４ｋｂ挿入物を持っていた。この型は全長のマウスＭＬであると信じられ、ｍＭＬまたはｍＭＬ³³⁵と呼ばれる。ｍＭＬについてのヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列を図１６（配列番号１２および１３）に供する。最後に、クローン「Ｌ２」を分離し配列決定した。このクローンはｈＭＬ３に対応する１１６ヌクレオチド除去を持っており、故にｍＭＬ−３と命名される。これら二つのイソ型の導き出されたアミノ酸配列の比較を図１６に示す。組換えｍＭＬの発現。マウスＭＬのための発現ベクターを、本質的には実施例８に記載のように製造した。ｍＭＬおよびｍＭＬ−２をコードしているクローンを、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの調節下での発現を提供する哺乳動物発現ベクターである、ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏにサブクローニングした。得られる発現ベクターｍＭＬｐＲＫｔｋｎｅｏおよびｍＭＬ２ｐＲＫｔｋｎｅｏを燐酸カルシウム法を用いて２９３細胞中に一過性トランスフェクトさせた。一過性トランスフェクションの後、培地を５日間条件付けた。この細胞は、１０％牛胎児血清を添加した高グルコースＤＭＥＭ培地中に維持した。Ｂａ／Ｆ３細胞におけるマウス−ｍｐｌ（ｍｍｐｌ）の発現。ｃ−ｍｐｌを発現する安定なセルラインを、本質的には実施例１でヒトｍｐｌについて記載したようにｍｍｐｌｐＲＫｔｋｎｅｏのトランスフェクションによって取得した。簡潔に述べると、マウスｍｐｌの全コード化配列（Ｒ．Ｃ．スコダ等、EMBO J．、１２巻２６４５−２６５３頁［１９９３］）を含む発現ベクター（２０μｇ；線状化）を電気穿孔（５ｘ１０⁶細胞、２５０ボルト、９６０μＦ）によりＢａ／Ｆ３細胞中にトランスフェクトし、続いて２ｍｇ／ｍｌＧ４１８によりネオマイシン耐性について選択した。ｍｐｌの発現を、ウサギ抗マウスｍｐｌ−ＩｇＧ抗血清を用いるフローサイトメトリー分析により評価した。Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３の供給源としてのＷＥＨＩ−３Ｂ細胞からのＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ｍＭＬおよびｍＭＬ−２の両者で一過性トランスフェクトさせた２９３細胞からの上清を、実施例１に記載のようにｍｍｐｌおよびｈｍｐｌでトランスフェクトさせたＢａＦ３細胞で検定した。実施例１３ブタｍｐｌリガンドｃＤＮＡｐＭＬおよびｐＭＬ−２ブタＭＬ（ｐＭＬ）ｃＤＮＡをＲＡＣＥＰＣＲにより分離した。簡潔に述べると、再生不良性ブタ血清から精製されたＭＬのアミノ末端をコードしているブタＭＬ遺伝子のエクソンの配列に基づき、オリゴｄＴプライマーおよび２個の特異的プライマーを設計した。様々な再生不良性ブタの組織から調製されたｃＤＮＡを得、増幅させた。１３４２ｂｐのＰＣＲｃＤＮＡ生成物が腎臓に見いだされ、これをサブクローニングした。幾つかのクローンを配列決定すると、成熟ブタｍｐｌリガンド（完全な分泌シグナルを含まない）をコードしていることが判明した。このｃＤＮＡは、図１８（配列番号９および１６）に示される配列を有する３３２アミノ酸の成熟蛋白(ｐＭＬ₃₃₂)をコードしていることが見いだされた。方法：ｐＭＬ遺伝子およびｃＤＮＡの分離。ＥＭＢＬ３（クロンテクＩｎｃ．）中のブタゲノムライブラリーをｐＲ４５でスクリーニングすることにより、ブタＭＬ遺伝子のゲノムクローンを分離した。このライブラリーは、本質的には実施例７に記載のようにスクリーニングした。幾つかのクローンを分離し、精製されたＭＬから得られたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードしているエクソンを配列決定した。ブタＭＬｃＤＮＡは、ＲＡＣＥＰＣＲプロトコルの変法を用いて取得した。２個の特異的ＭＬプライマーを、ブタＭＬ遺伝子の配列に基づいて設計した。ポリアデニル化ｍＲＮＡは、本質的には前記のようにして再生不良性ブタの腎臓から分離した。ｍＲＮＡのポリアデノシン尾に対して作成されたＢａｍｄＴプライマーによる逆転写によってｃＤＮＡを製造した。ＰＣＲ増幅の最初のラウンド（９５ ℃６０秒間、５８℃６０秒間、および７２℃９０秒間を２８サイクル）を、１００ｍｌの反応（５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．２ｍＭｄＮＴＰを０．０５Ｕ／ｍｌアンプリタクポリメラーゼ［パーキン・エルマーＩｎｃ．］と共に）中で、ＭＬ特異的ｈ−前進−１プライマーおよびＢＡＭＡＤプライマーを用いて実施した。次にこのＰＣＲ生成物をＣｌａＩで消化し、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱させ、Ｃｌａ１およびＫｐｎ１で切断しておいたブルースクリプトＳＫ−ベクター（ストラタジーンｉｎｃ．）０．１ｍｇにライゲーションした。室温で２時間インキュベートした後、ライゲーション混合物の四分の一を、第二のＭＬ特異的前進−１プライマーおよびＴ３−２１（ブルースクリプトＳＫ−ベクター内の多クローニング領域に隣接する配列に結合するオリゴヌクレオチド）：を用いるＰＣＲの第二ラウンド（上記のような２２サイクル）に直接加えた。得られたＰＣＲ生成物をＸｂａ１およびＣｌａ１で消化し、ブルースクリプトＳＫ −中にサブクローニングした。独立したＰＣＲ反応からのクローンを幾つか配列決定した。さらに、４アミノ酸残基の除去を有する蛋白（３２８アミノ酸残基）をコードしているｐＭＬ−２と命名された第二の型を同定した（図２１［配列番号２１］を参照されたい）。ｐＭＬとｐＭＬ−２アミノ酸配列の比較は、後者では残基１１１−１１４（両端を含む）に対応するテトラペプチドＱＬＰＰが除去されている外は同一であることを示す（図２２［配列番号１８および２１］を参照されたい）。マウス、ヒトおよびブタＭＬｃＤＮＡで観察される４個のアミノ酸の除去は、導き出された蛋白内の正確に同じ位置で起こっている。実施例１４トロンボポエチン（ＴＰＯ）による血小板抗原ＧＰII_bIII_a発現の誘導のためのＣＭＫ検定ＣＭＫ細胞を、１０％牛胎児血清および１０ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭ１１６４０培地（シグマ）中に維持する。検定用の調製において、細胞を収穫し、洗浄し、５ｍｇ／ｌ牛インシュリン、１０ｍｇ／ｌアポートランスフェリン、１ｘ微量元素を添加した無血清ＧＩＦ培地中に５ｘ１０⁵細胞／ｍｌで再懸濁する。９６ウェル平底プレートにおいて、ＴＰＯ標準または実験試料を１００μｌ容量中適当な希釈で各ウェルに加える。ＣＭＫ細胞懸濁液１００μｌを各ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を捨て、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせたＧＰII_bIII_aモノクローナル２Ｄ２抗体１００μｌを各ウェルに加える。４℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを再度１０００ｒｐｍで５分間遠心する。結合していない抗体を含有する上清を捨て、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ洗液２００μｌを各ウェルに加える。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ洗浄工程を３回反復する。次いで細胞を、相対蛍光強度を測定する標準的１パラメータ分析を用いるＦＡＳＣＡＮで分析する。実施例１５９６ウェル微量定量プレート上でのＤＡＭＩ細胞の核内有糸分裂活性を測定することによるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のためのＤＡＭＩ検定ＤＡＭＩ細胞は、１０ｍＭグルタミン、１００ｎｇ／ｍｌペニシリンＧ、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ＋１０％ウマ血清（ジブコ）中に維持する。検定用の調製において、細胞を収穫し、洗浄し、そしてＩＭＤＭ＋１％ウマ血清中に１ｘ１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁する。９６ウェル丸底プレート中で、ＴＰＯ標準または実験試料１００μｌをＤＡＭＩ細胞懸濁液に加える。次いで細胞を５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートをソルヴォール６０００Ｂ遠心機中で、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を捨て、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ２００μｌの洗浄工程を反復する。氷冷７０％エタノール−ＰＢＳ２００ μｌの添加により細胞を固定し、吸引により再懸濁する。４℃１５分間のインキュベーションの後、プレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心し、０．１ｍｇ／ｍｌ沃化プロピジウムおよび０．０５％トゥイーン−２０を含有する１ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼ１５０μｌを各ウェルに加える。３７℃で１時間のインキュベーション後、ＤＮＡ含有量の変化をフローサイトメトリーにより測定する。多能性を測定し以下のように定量化する：実施例１６インビボ検定でのトロンボポエチン（ＴＰＯ）（マウス血小板リバウンド検定）血小板産生の³⁵Ｓ測定のためのインビボ検定血小板減少症を誘発するため、Ｃ５７ＢＬ６マウス（チャールズ・リヴァーより入手）にヤギ抗マウス血小板血清（６ａｍｐ）１ｍｌを第１日目に腹腔内（ＩＰ）注射する。５および６日目に、該因子または対照としてのＰＢＳをマウスに２回ＩＰ注射する。７日目に、０．１ｍｌ食塩水中のＮａ₂ ³⁵ＳＯ₄３０μＣｉを静脈内注射し、注射された用量の、循環血小板中への³⁵Ｓ取り込みパーセントを、処置および対照マウスから得られた血液試料で測定する。血小板計数および白血球計数を、後眼窩洞から得られた血液で同時に行う。実施例１７ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤキメラレセプターの燐酸化を測定することによるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のためのＫＩＲＡＥＬＩＳＡヒトｍｐｌレセプターがヴィゴン等、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８９巻５６４０−５６４４頁（１９９２）により開示されている。ｍｐｌレセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ならびにカルボキシ末端フラッグポリペプチドを伴うＲｓｅ（マーク等、J.of Biol.Chem.、２６９（１４）巻１０７２０−１０７２８頁［１９９４］）の貫膜（ＴＭ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）（即ち、Ｒｓｅ.ｇＤ）からなるキメラレセプターを、本明細書に記載のＫＩＲＡＥＬＩＳＡへの使用のために作成した。この検定の図式的説明については、図３０および３１を参照されたい。（ａ）捕捉物質の調製モノクローナル抗ｇＤ（クローン５Ｂ６）を、単純ヘルペス糖蛋白Ｄ由来のペプチドに対して生成させた（パボルスキー等、Protein Engineering、３（６）巻５４７−５５３頁［１９９０］）。精製された保存調製物を燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で３．０ｍｇ／ｍｌに調節し、１．０ｍｌアリコートを −２０℃で保存した。（ｂ）抗ホスホチロシン抗体の調製モノクローナル抗ホスホチロシン、クローン４Ｇ１０をＵＢＩ（レイク・プラシッド、ＮＹ）から購入し、長腕ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ、リサーチ・オーガニクス、クリーヴランド、ＯＨ）を用いてビオチニル化した。（ｃ）リガンドｍｐｌリガンドは本明細書に記載の組換え技術により調製した。精製されたｍｐｌリガンドを保存溶液として４℃で保存した。（ｄ）Ｒｓｅ.ｇＤ核酸の調製合成二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトＲｓｅのＣ末端の１０アミノ酸（８８０−８９０）のためのコード化配列を再構成し、抗体５Ｂ６に対するエピトープおよび停止コドンを含むさらなる２１のアミノ酸を付け加えた。第１０表は、この融合遺伝子の合成部分の最終的な配列を示す。この合成ＤＮＡを、公表されているヒトＲｓｅｃＤＮＡ配列（マーク等、Jou rnal of Biological Chemistry、２６９（１４）巻１０７２０−１０７２８頁［１９９４］）のヌクレオチド２６４４で始まるＰｓｔＩ部位および発現ベクターｐＳＶＩ７.ＩＤ.ＬＬのポリリンカー中のＨｉｎｄIII部位でヒトＲｓｅのアミノ酸１−８８０をコードしているｃＤＮＡとライゲーションし（図３２Ａ−Ｌ；配列番号２２を参照されたい）、発現プラスミドｐＳＶ．ＩＤ.Ｒｓｅ.ｇＤを作り出した。簡潔に述べると、この発現プラスミドは、５'スプライスドナーおよび３'スプライスアクセプターイントロンスプライス部位を境界とするＤＨＦＲをコードしている配列とその後のＲｓｅ.ｇＤをコードしている配列を含む二シストロン性一次転写物からなる。全長の（スプライスされていない）メッセージは、第一のオープンリーディングフレームとしてＤＨＦＲを含み、故に安定な形質転換体の選択を可能とするためのＤＨＦＲ蛋白を生成する。（ｅ）ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤ核酸の調製上記のようにして生産された発現プラスミドｐＳＶ.ＩＤ.Ｒｓｅ.ｇＤを修飾して、Ｒｓｅ.ｇＤの貫膜ドメインおよび細胞内ドメイン（アミノ酸４２９−９１１）と融合したヒトｍｐｌのＥＣＤ（アミノ酸１−４９１）のコード化配列を含むプラスミドｐＳＶ.ＩＤ.Ｍ.ｔｍＲｄ６を生成させた。合成オリゴヌクレオチドを使用して、マーク等、J.Biol.Chem.、２６７巻２６１６６−２６１７１頁 (１９９２)に記載のような二段階ＰＣＲクローニング反応で、ヒトｍｐｌの細胞外ドメインの一部のコード化配列をＲｓｅコード化配列の一部と結合させた。第一のＰＣＲ反応に使用されたプライマーは、ｍｐｌｃＤＮＡ鋳型と共に、Ｍ１およびＭ２ならびにＲｓｅｃＤＮＡ鋳型と共に、Ｒ１およびＲ２であった。この融合接合部のＰｖｕII−ＳｍａＩ部分を使用して全長のキメラレセプターの組み立てを行った。（ｆ）細胞の形質転換プラスミドバックボーン中の特異なＮｏｔＩ部位で線状化しておいたｐＳＶ．ＩＤ.Ｍ.ｔｍＲｄ６により、ＤＰ１２.ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７２４７）を電気穿孔した。フェノール／クロロホルム抽出の後ＤＮＡをエタノール沈澱させ、１／１０トリスＥＤＴＡ２０μｌに再懸濁した。次に、ＤＮＡ１０μｇをＰＢＳ１ｍｌ中で１０⁷のＣＨＯＤＰ１２細胞と氷上で１０分間インキュベートし、その後４００ボルトおよび３３０μｆで電気穿孔した。細胞を氷に１０分間戻し、その後非選択培地に蒔いた。２４時間後、細胞に無ヌクレオシド培地を与え、安定なＤＨＦＲ＋クローンを選択した。（ｇ）ＫＩＲＡＥＬＩＳＡへの使用のための形質転換細胞の選択ＭＰＬ／Ｒｓｅ.ｇＤを発現するクローンを、ｇＤエピトープ標識を検出する抗体５Ｂ６を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画後の全細胞溶菌液のウェスタンブロッティングにより同定した。（ｈ）培地細胞はＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０（ジブコ／ＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ、グランド・アイランド、ＮＹ）中で増殖させた。この培地に１０％ダイアフィルトレーションＦＢＳ（ハイクローン、ローガン、ユタ）、２５ｍＭＨＥＰＥＳおよび２ｍＭＬ−グルタミンを添加した。（ｉ）ＫＩＲＡＥＬＩＳＡｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤで形質転換されたＤＰ１２.ＣＨＯ細胞を平底９６ウェル培養プレートのウェル中の培地１００μｌに蒔き（ウェル当たり３ｘ１０⁴）、５％ＣＯ₂中３７℃で一夜培養した。翌朝、ウェルの上清をデカンテーションし、プレートをペーパータオル上で軽く突き固めた。次に、被験試料または２００、５０、１２．５、３．１２、０．７８、０．１９、０．０４８、もしくは０ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガンドのいずれかを含有する培地５０μｌを各ウェルに加えた。細胞を３７℃で３０分間刺激し、ウェルの上清をデカンテーションし、そしてプレートを再度ペーパータオル上で軽く突き固めた。細胞を溶菌しキメラレセプターを可溶化するため、溶菌緩衝液１００μｌを各ウェルに加えた。溶菌緩衝液は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ジブコ）を含有する１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％トリトン−Ｘ１００（ジブコ）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン（ＩＣＮバイオケミカルズ、オーロラ、ＯＨ）、１ｍＭ４−（２− アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ；ＩＣＮバイオケミカルズ）、５０μＭロイペプチン（ＩＣＮバイオケミカルズ）、および２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄；シグマ・ケミカル・Ｃｏ．、セントルイス、ＭＯ）、ｐＨ７．５、で構成されていた。次いでこのプレートをプレート振盪機（ベルコ・インストルメンツ、ヴァインランド、ＮＪ）上で、室温で６０分間穏やかに攪拌した。細胞を可溶化している間に、５Ｂ６モノクローナル抗ｇＤ抗体により４℃で一夜被覆（５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中５．０μｇ／ｍｌ。１００μｌ／ウェル。）したＥＬＩＳＡ微量定量プレート（ナンク・マキシソープ、インター・メド、デンマーク）をデカンテーションし、ペーパータオル上で突き固め、１５０μｌ／ウェルのブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（インタージェン・カンパニー、パーチェス、ＮＹ）および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ］で、穏やかに攪拌しながら室温で６０分間ブロックした。６０分後、この抗ｇＤ５Ｂ６被覆プレートを、自動プレート洗浄器（スキャンウォッシャー３００、スカトロン・インストルメンツ、Ｉｎｃ．、スターリング、ＶＡ）を用いて６回洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン−２０および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ）で洗浄した。細胞培養微量定量ウェルからの可溶化ＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤを含有する溶菌液を、抗ｇＤ５Ｂ６で被覆されそして遮断されたＥＬＩＳＡウェルに移し（８５ μｌ／ウェル）、穏やかに攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。結合していないｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤを洗浄緩衝液で洗浄することにより除去し、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ）で１：１８０００に希釈した、即ち５６ｎｇ／ｍｌのビオチニル化４Ｇ１０（抗ホスホチロシン）１００μｌを各ウェルに加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：６００００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）にコンジュゲートさせたストレプトアビジン（ザイムド・ラボラトリーズ、Ｓ．サンフランシスコ、ＣＡ）１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを穏やかに攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。遊離のアビジンコンジュゲートを洗浄除去し、新たに調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］；２成分基質キット；カークガード・アンド・ペリー、ガイザーズバーグ、ＭＤ）１００μｌを各ウェルに加えた。反応を１０分間進行させ、その後１００μ ｌ／ウェルの１．０ＭＨ₃ＰＯ₄の添加により発色を止めた。マッキントッシュ・セントリス６５０（アップル・コンピューターズ、クパティーノ、ＣＡ）およびデルタソフトのソフトウェア（バイオメタリクス、Ｉｎｃ．、プリンストン、ＮＪ）で制御されるｖｍａｘプレート読み取り機（モレキュラー・ディヴァイシズ、パロアルト、ＣＡ）を使用して、６５０ｎｍの対照波長で４５０ｎｍの吸収を読み取った（ＡＢＳ_450/650）。ｄｐ１２.ｔｒｋＡ、ＢまたはＣ.ｇＤ細胞を２００、５０、１２．５、３．１２、０．７８、０．１９、０．０４８もしくは０ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガンドで刺激することにより標準曲線を作成し、デルタソフトのプログラムを用いて平均ＡＢＳ_450/650±ｓｄに対するｎｇ／ｍｌＴＰＯとして表した。試料濃度を標準曲線にそれらの吸収を内挿することにより得、ｎｇ／ｍｌＴＰＯ活性として表した。ｍｐｌリガンドは、濃度依存的且つリガンド特異的にｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤキメラレセプターを活性化できることが判明した。さらに、ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡは、１００％ヒト血清（示されている）または１００％血漿（示されていない）まで寛容されることが見いだされ、この事は、この検定を患者およびｐＫ試料の容易なスクリーニングに使用することを可能にする。実施例１８トロンボポエチン（ＴＰＯ）のための、レセプターに基づくＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中のウサギＦ(ａｂ')₂抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）により４℃で一夜被覆した。プレートを、ＰＢＳ中の０．５％牛血清アルブミンにより室温で１時間ブロックした。キメラレセプター、ｍｐｌ− ＩｇＧを含有する発酵収穫物をこのプレートに加え、２時間インキュベートした。０．５％牛血清アルブミン、０．０５％トゥイーン２０に入れた標準（定量的アミノ酸分析により決定された濃度の、２９３細胞中で産生されたＴＰＯ₃₃₂）の二倍連続希釈液（０．３９−２５ｎｇ／ｍｌ）および連続希釈試料をプレートに加え、２時間インキュベートした。大腸菌で産生されたＴＰＯ₁₅₅に対するプロテインＡ精製されたビオチニル化ウサギ抗体（１時間のインキュベーション）、その後ストレブトアビジン−ペルオキシダーゼ（３０分間のインキュベーション）および基質としての３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンによって、結合したＴＰＯを検出した。吸収を４５０ｎｍで読み取った。プレートは工程の間に洗浄した。データ分析のため、カレイダグラフによる４パラメータ曲線当てはめプログラムを用いて標準曲線を当てはめた。試料の濃度を標準曲線から算出した。実施例１９２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製１．２９３細胞発現ベクターの調製ＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＰＣＲによって取得した：ＰＲＫ５−ｈｍｐｌＩ（実施例９に記載）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）の存在下での反応の鋳型として使用した。最初の変性は９４℃ で７分間、続いて２５サイクルの増幅（９４℃１分間、５５℃１分間、および７２℃１分間）を行った。最後の伸長は７２℃で１５分間であった。このＰＣＲ生成物を精製し、チミジンキナーゼプロモーターの調節下にネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう修飾したｐＲＫ５から誘導されるベクターであるプラスミドｐＲＫ５ｔｋｎｅｏの制限部位ＣｌａＩおよびＸｂａＩの間にクローニングして、ベクターｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ.ＯＲＦを得た。ｅｐｏホモローガスドメインに対応する第二の組み立て物は、前進プライマーとしてのＣｌａ.ＦＬ.Ｆおよび以下の逆プライマー：を使用する外は同じ方法で作成した。最終組み立て物はｐＲＫ５−tkneoＥＰＯ −Ｄと呼ばれる。両組み立て物の配列は実施例７に記載のように確認された。２．ヒト胚腎細胞のトランスフェクションこれらの２組み立て物を、実施例９に記載のようにＣａＰＯ₄法によりヒト胚腎細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、０．４ｍｇ／ｍｌＧ４１８．１０の存在下にネオマイシン耐性クローンの選択を開始し、１５日後に個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、密集するまで増殖させた。条件培地におけるこれらのクローンからのＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定（実施例１に記載）を用いて評価した。３．ｒｈＭＬ₃₃₂の精製２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂条件培地を、１０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７．４（緩衝液Ａ）で平衡化したブルー−セファロース（ファルマシア）カラムに適用した。続いてこのカラムを、緩衝液Ａおよび２Ｍ尿素を含有する緩衝液Ａ各々１０カラム容量で洗浄した。次にカラムを２Ｍ尿素および１ＭＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで溶出した。次いでこのブルー−セファロース溶出プールを、緩衝液Ａで平衡化したＷＧＡ−セファロースカラムに直接適用した。次にＷＧＡ−セファロースカラムを、２Ｍ尿素および１ＭＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ１０カラム容量で洗浄し、０．５ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。ＷＧＡ−セファロース溶出液を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４− ＨＰＬＣカラム（シンクロム、Ｉｎｃ．）に適用した。Ｃ４−ＨＰＬＣカラムを不連続プロパノール勾配（０−２５％、２５−３５％、３５−７０％）で溶出した。ｒｈＭＬ₃₃₂は、この勾配の２８−３０％プロパノール領域で溶出することが判明した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、精製されたｒｈＭＬ₃₃₂は、ゲルの６８−８０ｋＤａ領域の幅広いバンドとして移動する（図１５を参照されたい）。４．ｒｈＭＬ₁₅₃の精製２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃条件培地をｒｈＭＬ₃₃₂について記載されたようにブルー −セファロースで分離した。このブルー−セファロース溶出液を上記のようにｍｐｌ親和カラムに直接適用した。ｍｐｌ親和カラムから溶出したｒｈＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂について記載されたものと同じ条件で稼働させるＣ４−ＨＰＬＣカラムを用いて均質となるまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製されたｒｈＭＬ₁₅₃はＭｒ〜１８０００−２１０００の２個の主要なおよび２個の重要性の低いバンドに分離する（図１５を参照されたい）。実施例２０ＣＨＯからのＴＰＯの発現および精製１．ＣＨＯ発現ベクターの説明下記の電気穿孔プロトコルで使用される発現ベクターは、ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ（全長またはｈＴＰＯ₃₃₂）、および、ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄ（末端切除されたまたはｈＴＰＯ₁₅₃）と命名された。これらのプラスミドの関連する特徴を図２３および２４に示す。２．ＣＨＯ発現ベクターの調製ｈＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡは、第１２表のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって取得した。ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩ（実施例７および９に記載）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）の存在下でこの反応のための鋳型として使用した。最初の変性は９４℃で７分間、引き続き２５サイクルの増幅（９４℃１分間、５５℃ １分間および７２℃１分間）を行った。最後の伸長は７２℃で１５分間であった。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬの制限部位ＣｌａＩおよびＳａｌＩの間にクローニングして、ベクターｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ. ＭＬＯＲＦを得た。ＥＰＯホモローガスドメインに対応する第二の組み立て物は、前進プライマーとしてのＣｌａ.ＦＬ.Ｆ２および以下の逆プライマー：を使用する外は同じ方法で作成した。最終組み立て物はｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ. ＭＬＥＰＯ−Ｄと呼ばれる。両組み立て物の配列は実施例７および９に記載のように確認された。本質において、全長のおよび末端切除されたリガンドのためのコード化配列が、ＣＨＯ発現ベクターｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬの多クローニング部位に導入された。このベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー領域、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含む修飾されたスプライス単位、目的遺伝子（この場合、記載のＴＰＯ配列）の導入のための多クローニング部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび複製起点ならびに細菌中でのプラスミドの選択および増幅のための β−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいる。３．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃を発現する安定なＣＨＯセルラインを確立するための方法論ａ．ＣＨＯ親セルラインの説明本明細書に記載のＴＰＯ分子の発現に使用されるための宿主ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）セルラインは、ＣＨＯ−ＤＰ１２（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７２４７を参照されたい）として知られている。この哺乳動物セルラインは、インシュリン要求性の低いクローンを得るためのプレプロインシュリンを発現するベクターでトランスフェクトされた親ライン（スタンフォード大学のフランク・リー博士からＬ．チェイシン博士の許諾によって入手したＣＨＯ −Ｋ１ＤＵＸ−Ｂ１１（ＤＨＦＲ−）−）からクローン選択された。これらの細胞はまたＤＨＦＲが無く、クローンは、ヌクレオチド補充（グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン）の無い培地上で増殖させることにより、ＤＨＦＲｃＤＮＡベクター配列の存在について選択することができる。安定に発現するＣＨＯセルラインのための選択系は一般に使用されている。ｂ．トランスフェクション方法（電気穿孔）ＤＰ１２細胞を、電気穿孔（例えばＧ．Ｌ．アンドルアソン、J.Tiss.Cult.Me th.、１５，５６［１９９３］を参照されたい）により、線状化したｐＳＶＩ５. ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦまたはｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄプラスミドでそれぞれトランスフェクトすることにより、ＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃発現セルラインを作成した。三つ（３）の制限酵素反応混合物を、各々のプラスミドの切断のために準備した；標準的分子生物学の方法による、酵素ＮＯＴＩを伴う１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇのベクター。この制限部位は、ベクターの線状化領域３'で且つＴＰＯリガンド転写ユニットの外に、ただ一度見いだされる（図２３を参照されたい）。１００μｌの反応を、３７度で一夜インキュベートするために準備した。翌日、混合物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、およそ１時間、ドライアイス上でエタノール沈澱化させた。次にこの沈澱を１５分間微量遠心することにより集め、乾燥した。線状化したＤＮＡを、標準抗生物質および２ｍＭグルタミンを添加したハムのＤＭＥＭ−Ｆ１２１：１培地５０μｌ中に再懸濁した。ＤＰ１２細胞の生育している懸濁液を集め、ＤＮＡの再懸濁について記載した培地中で１回洗浄し、最後に、７５０μｌにつき１０⁷細胞の濃度で同じ培地に再懸濁した。細胞のアリコート（７５０μｌ）およびそれぞれの線状化ＤＮＡ混合物を室温で１時間一緒にインキュベートし、次いでＢＲＬ電気穿孔チェインバーに移した。次に、各反応混合物を、標準的ＢＲＬ電気穿孔装置中、３３０μＦおよび低キャパシタンスに設定し３５０ボルトで電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞をこの装置内に５分間放置し、次いでさらなる１０分間のインキュベーション時間の間氷上に置いた。電気穿孔された細胞を、ＣＨＯ細胞用の標準的な完全増殖培地（１ＸＧＨＴ、２ｍＭグルタミン、および５％牛胎児血清を添加したグリシン無しの高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１２５０：５０）５ｍｌを入れた６０ｍｍの細胞培養皿に移し、５％ＣＯ₂細胞培養インキュベーター中で一夜増殖させた。ｃ．選択およびスクリーニング方法翌日、細胞を標準法によりトリプシン処理して、プレートから、ＤＨＦＲ選択培地（２％または５％いずれかの透析牛胎児血清を添加しグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く上記のハムのＤＭＥＭ−Ｆ１２、１：１の培地であり、これは本発明者等の使用する標準的ＤＨＦＲ選択培地である）を入れた１５０ｍｍ組織培養皿に移した。それぞれの６０ｍｍの皿からの細胞を、続いて５個の１５０ｍｍの皿に再度蒔いた。次に細胞を、クローンが現れ始め、９６ウェルの皿に移すのに適当な大きさに達するまで、３７度／５％ＣＯ₂で１０ないし１５日間（培地を１回交換）インキュベートした。４−５日の期間にわたり、セルラインを、５０ｍｌに設定したピペットマンの滅菌した黄色の先端部を用いて９６ウェルの皿に移した。細胞を密集成長まで増殖させ（通常３−５日間）、次いでトレーをトリプシン処理し、元のトレーのコピーを２個再生産した。これらのコピーのうち２個は、各ウェルの細胞をＤＭＳＯ中１０％ＦＣＳ５０μｌで希釈し、冷凍庫に短期間保存した。５日間の無血清条件培地試料を、Ｂａ／Ｆ細胞に基づく活性検定により、第三のトレーの密集成長しているウェルから、ＴＰＯ発現について検定した。この検定に基づいて最も良く発現しているクローンを保存から回復させ、懸濁適応、再検定および預託用の細胞培養群に移すため、２個の密集成長１５０ｍｍＴフラスコにスケールアップした。ｄ．増幅プロトコル上記の選択からの最高力価のセルラインの幾つかを引き続き標準メソトレキサート増幅処方に付し、より高い力価のクローンを生成させた。ＣＨＯ細胞のクローンを拡大し、４種のメソトレキサート濃度（即ち、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭおよび４００ｎＭ）の１０ｃｍ皿に、２または３種の細胞数（皿当たり１０５、５ｘ１０５、および１０６細胞）で蒔く。次にこれらの培養を、クローンが確立され、さらなる検定用の９６ウェル皿に移すのに適当となるまで、３７度／５％ＣＯ₂でインキュベートする。この選択からの幾つかの高力価クローンを再度より高濃度のメソトレキサート（即ち、６００ｎＭ、８００ｎＭ、１０００ｎＭおよび１２００ｎＭ）に付し、前と同じように耐性クローンを確立させ、次いで９６ウェル皿に移して検定した。４．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃を発現する安定なＣＨＯセルラインの培養預託しておいた細胞を融解し、無血清または血清含有培地中、標準的な細胞増殖法によって細胞数を拡大する。十分な細胞密度まで拡大した後、細胞を洗浄して、成分の無くなった細胞培養基を除去する。次いで細胞を、バッチ、給餌バッチまたは連続培養を包含する任意の標準法により、２５−４０℃、中性ｐＨ、少なくとも５％の溶存Ｏ₂含有量で、構成的に分泌されたＴＰＯが蓄積されるまで培養する。次いで細胞培養液を遠心のような機械的手段で細胞から分離する。５．ＣＨＯ培養液からの組換えヒトＴＰＯの精製収穫した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭＮａＣｌで平衡化したブルーセファロース６ファスト・フロー・カラム（ファルマシア）に、樹脂１リットル当たりＨＣＣＦおよそ１００Ｌの比率、およびおよそ３００ｍｌ／時／ｃｍ²の線流速で直接適用する。次にこのカラムを、３ないし５カラム容量の平衡化緩衝液、続いて３ないし５カラム容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿素で洗浄する。次いでＴＰＯを、３ないし５カラム容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿素、１．０ＭＮａＣｌで溶出する。次に、ＴＰＯを含有するブルーセファロースプールを、０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿素、および１．０ＭＮａＣｌで平衡化した小麦胚芽レクチンセファロース６ＭＢカラム（ファルマシア）に、樹脂１ｍｌあたり８ないし１６ｍｌのブルーセファロースプールの比率で、およそ５０ｍｌ／時／ｃｍ² の流速で適用する。次いでカラムを２ないし３カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄する。次いでＴＰＯを、２ないし５カラム容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿素、０．５ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで溶出する。次に、小麦胚芽レクチンプールを０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の最終濃度に調節する。得られたプールを、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラム（ヴィダック２１４ＴＰ１０２２）に、樹脂１ｍｌ当たりおよそ０．２ないし０．５ｍｇ蛋白のロードで、１５７ｍｌ／時／ｃｍ²の流速で適用する。蛋白を、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈を含有するアセトニトリルの二相直線勾配で溶出する。第一の相は１５分間の０から３０％のアセトニトリル直線勾配で構成され、第二の相は６０分間の３０から６０％のアセトニトリル直線勾配で構成されている。ＴＰＯはおよそ５０％アセトニトリルで溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づきプールを作成する。次にこのＣ４プールを２容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭＮａＣｌで希釈し、１００００ないし３００００ダルトン分子量カットオフの、アミコンＹＭ等のような限外濾過膜で、およそ６容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションする。次に、得られたダイアフィルトレート液を直ちに処理するか、またはさらに限外濾過により濃縮することができる。このダイアフィルトレート液／濃縮液を、０．０１％トゥイーン８０の最終濃度に調節する。計算されたカラム容量の２ないし５％に相当するダイアフィルトレート液／濃縮液の全量または一部を、０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン８０で平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（ファルマシア）に適用し、およそ１７ｍｌ／時／ｃｍ²の流速でクロマトグラフィーに付す。凝集物および蛋白分解産物を含まないＴＰＯ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールする。得られたプールを０．２２μフィルター、ミレックス−ＧＸ等で濾過し、２−８℃で保存する。実施例２１大腸菌での形質転換およびＴＰＯ蛋白合成の誘導１．大腸菌ＴＰＯ発現ベクターの組み立てプラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２は全て、異なる組み立て物の間で相違する小さなリーダーの下流にある、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。リーダーは主として高レベルの翻訳開始および迅速な精製を提供する。プラスミドｐＭＰ２１０ −１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流にあるＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計されており、ＴＰＯの最初の６アミノ酸に対するコドンの使用のみが相違しているが、一方、プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端が２アミノ酸だけ伸長しているｐＭＰ２１０−１の誘導体である。上記のプラスミドは全て、トリプトファンプロモーターの誘導時に、大腸菌において高レベルのＴＰＯの細胞内発現を産むであろう（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Methods in Enzymology（Ｄ．Ｖ．ゲッデル編）、１８５巻５４−６０頁、アカデミック・プレス、サンディエゴ［１９９０］）。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの組み立ての際の中間体である。（ａ）プラスミドｐＭＰ１プラスミドｐＭＰ１はＴＰＯの最初の１５５アミノ酸のための分泌ベクターであり、図３３に示されるように、５個のＤＮＡのフラグメントをライゲーションすることにより組み立てられた。これらの第一は、小さなＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントがはずされたベクターｐＰｈｏ２１であった。ｐＰｈｏ２１は、ヒト成長ホルモン遺伝子が大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子に置き換わっており、ＭｌｕＩ制限部位がアミノ酸２０−２１のＳＴＩＩシグナル配列のためのコード化配列中に入れられたｐｈＧＨ１の誘導体である（Ｃ．Ｎ．チャング等、Gene、５５巻１８９−１９６頁［１９８７］）。次の二つのフラグメント、即ちＴＰＯアミノ酸１９−１０３をコードしているｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩの２５８塩基対ＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片（実施例９）、および、アミノ酸１−１８をコードしている以下の合成ＤＮＡ：をＴ４−ＤＮＡリガーゼでプレライゲーションし、次にＰｓｔＩで切断した。第四番目は、ＴＰＯのアミノ酸１０４−１５５をコードしているｐＲＫ５ｈｍｐｌＩからの１５２塩基対ＰｓｔＩ−ＨａｅIIIフラグメントであった。最後は、先に記載されたλｔｏ転写ターミネーターを含むｐｄｈ１０８からの４１２塩基対ＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントであった（Ｓ．ショルティセク等、NAR、１５巻３１８５頁［１９８７］）。（ｂ）プラスミドｐＭＰ２１プラスミドｐＭＰ２１を、ＳＴＩＩシグナル配列の一部を含む１３アミノ酸リーダーの助けを受けてＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計する。これは、図３４に示されるように３個（３）のＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより組み立てられ、その最初のものは、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントがはずされたベクターｐＶＥＧ３１であった。このベクターｐＶＥＧ３１は、ヒト成長ホルモン遺伝子が血管内皮細胞成長因子のための遺伝子により置き換えられているｐＨＧＨ２０７−１（Ｈ．Ａ．デボーア等、プロモーター・ストラクチャー・アンド・ファンクション（Ｒ．Ｌ．ロドリゲスおよびＭ．Ｊ．チェンバレン編）、４６２、プレーガー、ニューヨーク［１９８２］）の誘導体である（この同一のベクターフラグメントが、この後者のプラスミドから得ることができる）。ライゲーションの第二の部分は、以下の配列：を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後の断片は、ＴＰＯの１５５アミノ酸をコードしているｐＭＰ１からの１０７２塩基対ＭｌｕＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。（ｃ）プラスミドｐＭＰ１５１プラスミドｐＭＰ１５１は、ＳＴIIシグナル配列の７アミノ酸、８ヒスチジン、および因子Ｘａ開裂部位を含むリーダーの下流にあるＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。図３５に示されるように、ｐＭＰ１５１は３個のＤＮＡフラグメントをライゲーションすることによって組み立てられ、それらの第一のものは、前記のベクターｐＶＥＧ３１であって、ここから小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去された。二番目は、以下の配列：を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後は、ＴＰＯの１５４アミノ酸をコードしているｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢglＩ−SphＩフラグメントであった。プラスミドｐＭＰ１１は、ＳＴIIシグナル配列中の数個のコドンの変化を除くとｐＭＰ１と同一である（このフラグメントはｐＭＰ１から得ることができる）。（ｄ）プラスミドｐＭＰ２０２プラスミドｐＭＰ２０２は、リーダー中の因子Ｘａ開裂部位がトロンビン開裂部位に置き換わっていることを除けば、発現ベクターｐＭＰ１５１と極めて似通っている。図３６に示されるように、ｐＭＰ２０２は３個のＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより組み立てられた。これらのうち第一番目は、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントがはずされた前記のｐＶＥＧ３１であった。第二番目は、以下の配列：を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後の断片は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢｇｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。（ｅ）プラスミドｐＭＰ１７２プラスミドｐＭＰ１７２はＴＰＯの最初の１５３アミノ酸のための分泌ベクターであり、ｐＭＰ２１０の組み立てのための中間体である。図３７に示されるように、ｐＭＰ１７２は３個のＤＮＡフラグメントをライゲーションすることによって製造され、その第一番目は、小さなＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII部分が除去されたベクターｐＬＳ３２１ａｍＢであった。第二番目は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの９４６塩基対ＥｃｏＲＩ−ＨｇａＩフラグメントであった。最後の断片は、以下の配列：を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。（ｆ）プラスミドｐＭＰ２１０プラスミドｐＭＰ２１０は、翻訳開始メチオニンの後のＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計されている。このプラスミドは実際には、ＴＰＯの最初の６個のコドンが各コドンの３位で無作為化されているプラスミドの群として作成され、図３８に示されるように３個のＤＮＡフラグメントのライゲーションによって組み立てられた。これらの第一番目は、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去された前記ベクターｐＶＥＧ３１であった。第二番目は、まずＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で処理し、その後ＸｂａＩおよびＨｉｎｆＩで消化された下記の合成ＤＮＡ二本鎖であって、開始メチオニンおよびＴＰＯの無作為化された最初の６個のコドンをコードしていた：第三番目は、ＴＰＯのアミノ酸１９−１５３をコードしているｐＭＰ１７２からの８９０塩基対ＨｉｎｆＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。およそ３７００クローンのプラスミドｐＭＰ２１０群を、高翻訳開始クローンを選択するための高テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ平板上で再トランスフォームした（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Methods:A Companion to Methods in En zymology、４巻１５１−１５８頁［１９９２］）。高テトラサイクリン平板上に出現した８個のコロニーから、ＴＰＯ発現の点で最良のもの５個をＤＮＡ配列決定に付し、その結果を図３９（配列番号２３、２４、２５、２６、２７および２８）に示す。（ｇ）プラスミドｐＭＰ４１プラスミドｐＭＰ４１は、ＳＴIIシグナル配列の７アミノ酸からなるリーダーとこれに続く因子Ｘａ開裂部位に融合させたＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。このプラスミドは図４０に示されるように、３個のＤＮＡ断片をライゲーションすることにより組み立てられ、その第一番目は、先に記載された小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去されたベクターｐＶＥＧ３１であった。第二番目は以下の合成ＤＮＡ二本鎖：であった。ライゲーションの最後の断片は、先に記載のプラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢｇｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。（ｈ）プラスミドｐＭＰ５７プラスミドｐＭＰ５７は、ＳＴIIシグナル配列の９アミノ酸および二塩基性部位Ｌｙｓ−Ａｒｇよりなるリーダーの下流にあるＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現する。この二塩基性部位は、プロテアーゼＡｒｇＣによりリーダーを除去する手段を提供する。このプラスミドは図４１に示されるように、３個のＤＮＡ断片をライゲーションすることにより組み立てられた。これらの第一番目は、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去された先に記載のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二番目は以下の合成ＤＮＡ二本鎖：であった。ライゲーションの最後の部分は、先に記載のプラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢｇｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。（ｉ）プラスミドｐＭＰ２５１プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端にさらに２個のアミノ酸が加わっているｐＭＰ２１０−１の誘導体である。図４２に示されるように、このプラスミドは２個のＤＮＡ断片をライゲーションすることにより組み立てられ、その第一番目は、小さなＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメントが除去された先に記載のｐＭＰ２１であった。ライゲーションの第二の部分はｐＭＰ２１０−１からの３１６塩基対ＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメントであった。２．ＴＰＯ発現ベクターによる大腸菌の形質転換および誘導上のＴＰＯ発現プラスミドを、ＣａＣｌ₂熱衝撃法（Ｍ．マンデル等、J.Mol.B iol.、５３巻１５９−１６２頁［１９７０］）を用いる大腸菌菌株４４Ｃ６（ｗ３１１０ｔｏｎＡ△ｒｐｏＨ_tsｌｏｎ△ｃｌｐＰ△ｇａｌＥ）の形質転換に使用した。形質転換された細胞を最初にカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中３７℃で、培養の光学密度（６００ｎｍ）がおよそ２−３に達するまで増殖させた。次いでこのＬＢ培地を０．４９％カザアミノ酸（ｗ／ｖ）および５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＭ９培地で２０ｘに希釈した。３０℃ で通気しながら１時間増殖させた後、インドール−３−アクリル酸を最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるまで加えた。次いで、３０℃で通気しながらさらに１５時間培養を継続し、この時点で細胞を遠心により収穫した。実施例２２大腸菌における生物活性なＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の産生生物活性な再折り畳みされたＴＰＯ（ｍｅｔ^-1１−１５３）の産生のための以下に示す方法は、ＮおよびＣ末端伸長型を包含する他のＴＰＯ変異体の回収に同様に適用することができる（実施例２３を参照されたい）。Ａ．不溶性ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の回収プラスミドｐＭＰ２１０−１によりコードされているＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）を発現する大腸菌細胞を上記のように発酵させる。典型的には、細胞約１００ｇをポリトロンホモジナイザーを用いて細胞破壊緩衝液（１０ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）１Ｌ（１０容量）に再懸濁し、細胞を５０００ｘｇで３０分間遠心する。洗浄した細胞ペレットをポリトロンホモジナイザーで再度細胞破壊緩衝液１Ｌに再懸濁し、この細胞懸濁液を、製造者の指示に従ってＬＨセルディスラプター（ＬＨインセルテク、Ｉｎｃ．）またはマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス・インターナショナル）を通過させる。懸濁液を５０００ｇで３０分間遠心し、再懸濁し、二度目の遠心を行って、洗浄された屈折体ペレットを作成する。洗浄されたペレットを直ちに使用するか、または−７０℃で保存する。Ｂ．単量体ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の可溶化および精製上で得たペレットを、５容量／重量で、６−８Ｍグアニジンおよび２５ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）を伴う２０ｍＭトリス、ｐＨ８に再懸濁し、４℃ で１−３時間または一夜攪拌してＴＰＯ蛋白の可溶化を起こさせる。高濃度の尿素（６−８Ｍ）もまた有用であるが、一般にグアニジンと比較して低収率をもたらす。可溶化の後、この溶液を３００００ｘｇで３０分間遠心して、変性した単量体ＴＰＯ蛋白を含有する透明な上清を生成させる。次にこの上清を、流速２ｍｌ／分でスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア、２．６ｘ６０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、蛋白を、１０ｍＭＤＴＴを伴う２０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６．０で溶出させる。１６０および２００ｍｌの間で溶出する、単量体の、変性したＴＰＯ蛋白を含有する画分をプールする。このＴＰＯ蛋白を半調製用Ｃ４逆相カラム（２ｘ２０ｃｍＶＹＤＡＣ）でさらに精製する。試料を３０％アセトニトリルを加えた０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したカラムに５ｍｌ／分で適用する。蛋白をアセトニトリルの直線勾配（６０分間で３０−６０％）で溶離する。精製された還元された蛋白はおよそ５０％アセトニトリルの時点で溶出する。この物質を、生物活性ＴＰＯ変異体を得るための再折り畳みに使用する。Ｃ．生物活性ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の生成０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル４０ｍｌに入れた単量体の、還元され変性されたＴＰＯ蛋白およそ２０ｍｇを、最適には以下の試薬：５０ｍＭトリス、０．３ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２％ＣＨＡＰＳ洗浄剤、２５％グリセロール、５ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨを８．３に調節、を含有する再折り畳み緩衝液３６０ｍｌ中に希釈する。混合後、再折り畳み緩衝液を４℃で１２−４８時間穏やかに攪拌して、正しいジスルフィド結合型のＴＰＯの再折り畳み収率が最大となるようにする（下記参照）。次にこの溶液をＴＦＡで酸性化して最終濃度０．２％とし、０．４５または０．２２ミクロンフィルターで濾過し、１／１０容量のアセトニトリルを加える。次いでこの溶液をＣ４逆相カラムに直接ポンプで送り込み、精製された、再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）を上記と同じ勾配プログラムで溶離する。再折り畳みされた、生物活性なＴＰＯが、これらの条件下でおよそ４５％アセトニトリルの時点で溶出する。ＴＰＯの正しくないジスルフィド結合型は、より早く溶出する。最終的な精製されたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、ＳＤＳゲルおよび分析用Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより評価したところ、９５％以上純粋である。動物での研究用に、Ｃ４精製した物質を生理学的に適合し得る緩衝液中に透析した。１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．０１％トゥイーン８０を含有する等張緩衝液（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５、１０ｍＭ琥珀酸Ｎａ、ｐＨ５．５または１０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ７．４）を利用した。Ｂａ／Ｆ３検定でのＴＰＯの高い力価（半最大刺激はおよそ３ｐｇ／ｍｌで達成される）の故に、多くの異なる緩衝液、洗浄剤および酸化還元条件を利用して生物活性物質を得ることが可能である。しかしながら、殆どの条件においては、正しく折り畳まれた物質は少量（＜１０％）得られるに過ぎない。商業的な製造工程のためには、再折り畳み収率が少なくとも１０％、より好ましくは３０−５０％、そして最も好ましくは＞５０％であることが望ましい。多くの異なった洗浄剤（トリトンＸ−１００、ドデシル−β−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、サルコシル、トゥイーン２０およびトゥイーン８０、ツヴィッタージェント３−１４およびその他）が、高い再折り畳み収率を支持する有効性について評価された。これらの洗浄剤のうち、ＣＨＡＰＳファミリー（ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）のみが、一般に、再折り畳み反応において蛋白凝集および正しくないジスルフィド形成を制限するのに有用であることが見いだされた。１％以上のレベルのＣＨＡＰＳが最も有用であった。最良の収率には塩化ナトリウムが必要であり、その最適レベルは０．１Ｍおよび０．５Ｍの間であった。ＥＤＴＡ（１−５ｍＭ）の存在は、幾つかの製品で観察される金属により触媒される酸化（および凝集）の量を制限した。１５％以上のグリセロール濃度は最適な再折り畳み条件をもたらした。最大収率のためには、酸化還元試薬対として、酸化型および還元型両方のグルタチオンまたは酸化型および還元型システインのあることが必須であった。一般に、酸化還元対の酸化型試薬のモル比が還元型試薬と等しいかまたは過剰である時、より高い収率が観察された。７．５および約９の間のｐＨ値がこれらのＴＰＯ変異体の再折り畳みにとって最適であった。有機溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール）は１０−１５％またはこれ以下の濃度では寛容された。より高レベルの有機溶媒は、不適正に折り畳まれた型の量を増加させた。トリスおよび燐酸緩衝液が一般に有用であった。４℃ でのインキュベーションもまた、より高レベルの正しく折り畳まれたＴＰＯを生成させた。第一のＣ４工程で精製されたＴＰＯの製造については、４０−６０％の再折り畳み収率（再折り畳み反応に使用された還元され変性されたＴＰＯの量に基づく）が典型的である。甚だしい沈澱化およびＴＰＯ再折り畳み工程中の非ＴＰＯ蛋白の妨害のため、収率はより低いものの、より不純な調製物から活性物質を得ることができる（例えば、スーパーデックス２００カラムの後または最初の屈折体抽出の後直ちに）。ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は４個のシステイン残基を含むため、この蛋白から３個の異なるジスルフィド型を生成することが可能である：第一の型：システイン残基１−４および２−３の間のジスルフィド、第二の型：システイン残基１−２および３−４の間のジスルフィド第三の型：システイン残基１−３および２−４の間のジスルフィド。再折り畳み条件の決定の際の最初の探査中に、ＴＰＯ蛋白を含有する幾つかの異なるピークがＣ４逆相クロマトグラフィーによって分離された。これらのうちただ一つがＢａ／Ｆ３検定を用いて測定される有意な生物活性を有していた。続いて、再折り畳み条件を、専らその型を生成するように最適化させた。これらの条件の下で、誤って折り畳まれた型は、得られた総単量体ＴＰＯの１０−２０％未満である。生物活性なＴＰＯのジスルフィドパターンは、質量分析および蛋白配列決定により、１−４および２−３であると決定された（即ち、第一の型）。種々のＣ４分離されたピークのアリコート（５−１０ｎｍｏｌｅ）をトリプシンで消化した（蛋白に対するトリプシンのモル比は１：２５）。消化混合物をマトリックス支援レーザー脱着質量分析により、ＤＴＴによる還元の前後で分析した。還元後、ＴＰＯの大きなトリプシン分解ペプチドの殆どに対応する質量が検出された。非還元試料においてはこれらの質量のうち幾つかが無く、新たな質量が観察された。この新たなピークの質量は基本的に、ジスルフィド対に含まれる個々のトリプシン分解ペプチドの合計に対応していた。したがって、再折り畳みされた組換えの生物活性ＴＰＯのジスルフィドパターンを、無条件に１−４および２−３に割り当てることが可能である。これは、関連分子エリスロポエチンの既知のジスルフィドパターンと一致する。Ｄ．組換えの再折り畳みされたＴＰＯ（ｍｅｔ１−１５３）の生物活性再折り畳みされ精製されたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、インビトロおよびインビボの両方の検定で活性を持っている。Ｂａ／Ｆ３検定において、Ｂａ／Ｆ３細胞へのチミジン取り込みの半最大刺激は３．３ｐｇ／ｍｌ（０．３ｐＭ）で達成された。ｍｐｌレセプターに基づくＥＬＩＳＡにおいては、半最大活性は１．９ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）で出現した。正常のおよび近致死Ｘ線照射により作り出された骨髄抑制動物において、ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は極めて強力に（わずか３０ｎｇ／マウスの用量で活性が見られた）新たな血小板の産生を刺激した。実施例２３大腸菌におけるその他の生物活性ＴＰＯ変異体のの生成大腸菌において生産され、精製され生物活性型に再折り畳みされた三つの異なるＴＰＯ変異体を下に示す。（１）ＭＬＦ − 細菌由来シグナル配列ＳＴIIからの１３残基をＴＰＯのＮ末端ドメイン（残基１−１５５）と融合させる。得られる配列は、［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… ＣはＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体は、レセプターおよび生物学的研究のためのＴＰＯの放射性沃素化のためのチロシンを提供するために組み立てられた。（２）Ｈ８ＭＬＦ − ＳＴII配列からの７残基、８個のヒスチジン残基および因子Ｘａ酵素的開裂配列ＩＥＧＲをＴＰＯのＮ末端ドメイン（残基１−１５５）と融合させる。この配列は、［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… ＣはＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体は、精製され再折り畳みされる時、配列ＩＥＧＲのアルギニン残基の後で開裂して天然セリンＮ末端アミノ酸を有する長さ１５５残基のＴＰＯ変異体を生成する酵素、因子Ｘａで処理することができる。（３）Ｔ−Ｈ８ＭＬＦ − は、トロンビン感受性配列ＩＥＰＲをＴＰＯのＮ末端ドメインと融合させる外は変異体（２）について上に記載されるようにして製造する。得られる配列は、［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… ＣはＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体は、精製および再折り畳みの後、酵素トロンビンで処理して、長さ１５５残基のＴＰＯの天然Ｎ末端変異体を生成することができる。Ａ．単量体の生物活性ＴＰＯ変異体（１）、（２）、および（３）の回収、可溶化および精製全ての当該変異体は大腸菌において発現された。この変異体の大部分はＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）に関して実施例２２で観察されたように、屈折体中に見いだされた。単量体ＴＰＯ変異体の回収、可溶化および精製のための同じ方法が実施例２２に記載されるように達成された。ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）に用いられたのと同一の再折り畳み条件を用いて、通算収率は３０−５０％であった。再折り畳みの後、このＴＰＯ変異体を、前記のようにアセトニトリル勾配を利用する０．１％ＴＦＡ中のＣ４逆相クロマトグラフィーにより精製した。全てのＴＰＯ変異体（非蛋白分解型において）はＢａ／Ｆ３検定により評価したところ半最大活性２−５ｐＭの生物活性を有していた。Ｂ．真性のＮ末端ＴＰＯ（１−１５５）を生成させるための変異体（２）および（３）の蛋白分解的処理上のＴＰＯ変異体（２）および（３）を、ＴＰＯの正常なＮ末端アミノ酸残基の前に、酵素的に開裂し得るリーダーペプチドを有するように設計した。上記のように変異体（２）および（３）の再折り畳みおよび精製を行った後、各々を適当な酵素での消化に付した。各変異体について、Ｃ４逆相工程からのアセトニトリルを、溶液上に穏やかな窒素気流を通気することにより除去した。その後二つの変異体を下記のように因子Ｘａまたはトロンビンのいずれかで処理した。ＴＰＯ変異体（２）については、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）を、アセトニトリルを含まないこの溶液に最終濃度５０ｍＭとなるまで加え、必要ならばｐＨを８に調節した。ＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂をそれぞれ０．１Ｍおよび２ｍＭとなるまで加えた。因子Ｘａ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を加えて変異体に対する酵素のモル比約１：２５ないし１：１００を達成した。この試料を室温で１−２時間インキュベートして、リーダー配列の喪失を表すＳＤＳゲル上の移動の変化により評価される最大の開裂を達成した。その後、反応混合物を、正しく折り畳まれた変異体の精製について上に記載されたものと同じ勾配および条件を用いるＣ４逆相クロマトグラフィーによって精製した。開裂しなかった変異体Ｂは、これらの条件により開裂した変異体（２）から分離された。Ｎ末端アミノ酸はＳＰＡＰＰであることが示され、これはＮ末端リーダー配列の除去が成功したことを示すものである。因子ＸａはまたＴＰＯドメイン内の変化し得る量の内部開裂を産み；開裂は位置番号１１８のアルギニン残基の後に観察され、これはさらなるＮ末端配列ＴＴＡＨＫＤＰ（配列番号８８）を生成した。非還元ＳＤＳゲル上で、因子Ｘａ開裂変異体についてはおよそ１７０００ダルトンに単一のバンドが観察され；還元ゲル上では、アルギニン１１８での開裂に合致するおよそ１２０００および５０００ダルトンの分子量である二つのバンドが見られた。この観察はまた、上記のトリプシン消化実験から導き出されたように、分子の二つの部分が１番目および４番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合により結合していることを確かにした。Ｂａ／Ｆ３生物検定において、Ｎ末端リーダー配列の除去後の内部開裂を伴う精製ＴＰＯ（１−１５５）変異体は、０．２ないし０．３ピコモルの半最大活性を有していた。リーダー配列を有する無傷の変異体は２−４ピコモルの半最大活性を有していた。変異体（３）のためには、消化緩衝液は、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、２％ＣＨＡＰＳ、０．３ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡおよびＴＰＯ変異体蛋白に対する酵素が１：２５ないし１：５０（重量）のヒトまたは牛トロンビン（カルビオケム）で構成されていた。消化は室温で２−６時間実施した。消化の進行を、因子Ｘａ開裂反応について上に記載されたようにＳＤＳゲルにより評価した。一般に、この時点でリーダー配列の９０％以上の開裂が達成された。得られたＴＰＯを上記のようにＣ４逆相カラム上で精製し、アミノ酸配列決定により所望のＮ末端を有することが示された。因子Ｘａに関して上で観察されたのと同じアルギニン−スレオニン結合において、極めて少量（＜５％）の内部開裂が得られただけであった。得られたＴＰＯ蛋白は、Ｂａ／Ｆ３検定において０．２−０．４ピコモル蛋白での半最大反応を有する高い生物活性を持っていた。ｍｐｌレセプターに基づくＥＬＩＳＡにおいて、この蛋白は２−４ｎｇ／ｍｌ精製蛋白（１２０− ２４０ピコモル）で半最大反応があったが、一方、リーダー配列を含む無傷の変異体は両方の検定で５−１０倍力価が低かった。動物研究のために、ＨＰＬＣ精製された開裂蛋白を、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン８０および１０ｍＭ琥珀酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、または１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、または１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を伴う生理学上許容し得る緩衝液中に透析した。ＨＰＬＣおよびＳＤＳゲルにより、この精製された蛋白は４℃で保存した場合、数週間安定であった。正常のおよび骨髄抑制マウスにおいて、真性のＮ末端配列を有するこの精製ＴＰＯは高度に活性であり、３０ｎｇ／マウスという低い用量で血小板の産生を刺激した。実施例２４合成ｍｐｌリガンドヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）は通常組換え法を用いて作成されるが、これは、下記の方法を用いて、合成ペプチドフラグメントの酵素的ライゲーションで合成することもできる。ｈＭＬの合成による生産は、非天然アミノ酸またはポリエチレングリコールのような合成官能基の取り込みを可能にする。かつてセリンプロテアーゼズブチリシンＢＰＮの突然変異体、ズブチリガーゼ（Ｓ２２１Ｃ／Ｐ２２５Ａ）が、ペプチドエステルを水性溶液中で有効にライゲーションするように組み立てられた（アブラームセン等、Biochem.、３０巻４１５１−４１５９頁［１９９１］）。現在では、合成ペプチドを連続して酵素的にライゲーションして、酵素的に活性な長いペプチドおよびリボヌクレアーゼＡのような蛋白を生成させることができるということが知られている（ジャクソン等、Science、［１９９４］）。より詳細に下に記載されるこの技術によって、本発明者等は、かつて組み換えＤＮＡ技術でしか製造できなかった長い蛋白を化学合成することができるようになった。ｈＭＬ₁₅₃合成のための一般的方法を示す（図式１）。当該蛋白のＣ末端フラグメントに対応する完全に脱保護されたペプチドで始まり、Ｎ末端保護されＣ末端活性化されたエステルペプチドをズブチリガーゼと共に加える。反応が完結したならば、生成物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、保護基をＮ末端から除去する。次のペプチドフラグメントをライゲーションし、脱保護し、そしてこの工程を、次々とペプチドを用いて全長の蛋白が得られるまで反復する。この方法は、Ｎ末端保護されＣ末端活性化されたペプチドが、先行するペプチドのＮ末端にライゲーションされ、蛋白がＣ→Ｎ方向に合成されるという点において固相法に類似している。しかし、各合成が５０残基までの付加を産み、そして生成物が各ライゲーション後に分離されるため、ずっと長い、高度に純粋な蛋白を妥当な収率で合成することができる。ズブチリガーゼの配列特異性およびｈＭＬの生物活性「ｅｐｏドメイン」のアミノ酸配列についての知識に基づき、本発明者等はｈＭＬ₁₅₃を長さ１８−２５残基の７個のフラグメントに分割した。この１８−２５量体のための適当なライゲーション接合部を決定するため、試験ライゲーションテトラペプチドを合成した。第１３表はこれらの試験ライゲーションの結果を示すものである。これらの実験に基づき、第１４表に示されるライゲーションペプチドはズブチリガーゼにより有効にライゲーションされるに違いない。自己ライゲーションを防止するため、各ドナーエステルペプチドのＮ末端のための適当な保護基が必要であった。本発明者等はイソニコチニル（ｉＮＯＣ）保護基（ヴィーバー等、J. Org.Chem.、４２巻３２８６−３２８９頁［１９７７］）を選択する。何故ならこれは水溶性であり、固相ペプチド合成の最終段階で加えることができ、そしてペプチドを固相樹脂から脱保護および開裂するために用いられる無水ＨＦに対して安定であるためである。さらにこれは、各ライゲーションの後、緩和な還元条件下で（Ｚｎ／ＣＨ₃ＣＯ₂Ｈ）ペプチドから除去され、次のライゲーションのための遊離Ｎ末端を与えることができる。グリコラート−リジル−アミド（ｇｌｃ −Ｋ−ＮＨ₂）エステルがズブチリガーゼにより効果的にアシル化されることを示した先の実験（アブラームセン等、Biochem.、３０巻４１５１−４１５９頁［１９９１］）に基づき、これをＣ末端活性化に使用した。ｉＮＯＣ−保護されｇｌｃ−Ｋ−アミド活性化されたペプチドは、概説されるような標準的固相法を用いて合成することができる（図式２）。次にこのペプチドを、完全な蛋白が生成されるまで連続的にライゲーションし、最終生成物をインビトロで再折り畳みする。ＥＰＯとの相同性に基づき、ジスルフィド対はシステイン残基７および１５１ならびに２８および８５の間に形成されると信じられる。ジスルフィドの酸化は、還元された物質を単に酸素雰囲気下で数時間攪拌することによって達成することができる。次いで再折り畳みされた物質をＨＰＬＣにより精製し、活性蛋白を含有する画分をプールし凍結乾燥することができる。別法として、特定のジスルフィド対間の連続酸化を調節するため、ジスルフィドを区別を付けて保護することもできる。アセトアミドメチル（ａｃｍ）基によるシステイン７および１５１の保護は２８および８５の酸化を確実にするであろう。次いでこのａｃｍ基を除去して残基７および１５１を酸化することができる。逆に、残基２８および８５をａｃｍ保護し、連続的酸化が正しい折り畳みにとって必要とされる場合に酸化することができる。所望により、システイン２８および８５をＣｙｓ以外の別の天然または非天然残基に置換して、システイン７および１５１の適正な酸化を保証することもできる。ペプチドライゲーションを１００ｍＭトリシン（ｐＨ８）（新たに調製し、５ μＭフィルターで真空濾過することにより脱気する）中２５℃で実施する。典型的にはＣ末端フラグメントを緩衝液に溶解し（２−５ｍＭペプチド）、ズブチリガーゼの１０ｘ保存溶液（１００ｍＭトリシン、ｐＨ８中１ｍｇ／ｍｌ）を加えて最終的な酵素濃度を〜５μＭとする。次に、３−５モル過剰のｇｌｃ−Ｋ−ＮＨ₂活性化されたドナーペプチドを固体で加え、溶解し、混合物を２５℃に放置する。ライゲーションは分析用逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを伴うＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ勾配）により監視する。ライゲーション生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製し凍結乾燥する。ＨＣｌ活性化された亜鉛末を酢酸中の保護ペプチドと共に攪拌することにより、イソニコチニル（ｉＮＯＣ）脱保護を遂行した。亜鉛末を濾過により除き、酢酸を減圧下に蒸発させる。得られたペプチドを次のライゲーションに直接使用し、この工程を反復する。合成ｈＭＬ₁₅₃を、上記の方法と類似の方法により合成または組換えｈＭＬ_154-332とライゲーションして、合成または半合成全長ｈＭＬを生成させることができる合成ｈＭＬは組換えに優る多くの利点を有する。力価または特異性を改善するため、非天然側鎖を導入することができる。活性の持続性を改善するため、ポリエチレングリコールのようなポリマー官能基を組み入れることができる。例えば、１またはそれ以上のライゲーション工程の実施の前または後に、ポリエチレングリコールを個々のフラグメント（第１４表）のリジン残基に結合させることができる。インビボ安定性を改善するため、プロテアーゼ感受性ペプチド結合を除去しまたは変更することができる。加えて、構造決定の助けとするため重原子誘導体を合成することもできる。ａ）リジル−パラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂１（０．６３ｍｅｑ／ｇ、アドヴァンスト・ケムテク）を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中でブロモ酢酸（５ｅｑ）およびジイソプロピルカルボジイミド（５ｅｑ）と共に２５℃で１時間攪拌してブロモアセチル誘導体２を得る。ｂ）樹脂をＤＭＡで良く洗浄し、個々のＢｏｃ−保護されたアミノ酸（３ｅｑ、バッチェム）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で重炭酸ナトリウム（６ｅｑ）と共に５０℃で２４時間攪拌することによりエステル化して、対応するグリコラート−フェニルアラニル−アミド−樹脂３を得る。このアミノアセチル化された樹脂３をＤＭＦ（３ｘ）およびジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）（３ｘ）で洗浄し、室温で数ヶ月保存することができる。次に樹脂３を自動ペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ４３０Ａ）にロードし、標準的固相法を用いてペプチドを伸長することができる（５）。ｃ）Ｎ−α−Ｂｏｃ基をＣＨ₂Ｃｌ₂中の４５％トリフルオロ酢酸の溶液で除去する。ｄ）次のＢｏｃ−保護アミノ酸（５ｅｑ）を、ＤＭＡ中のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ、４ｅｑ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１０ｅｑ）を用いて前活性化し、１−２時間結合させる。ｅ）最後のＮ−α−Ｂｏｃ基を除去して（ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）４を得、前記（４）に記載のように、ＤＭＡ中の４−イソニコチニル−２−４−ジニトロフェニルカルボナート（３ｅｑ）およびＮＭＭ（６ｅｑ）と共に２５℃で２４時間攪拌することにより、イソニコチニル（ｉＮＯＣ）保護基を導入する。ｆ）無水ＨＦ（５％アニソール／５％エチルメチルスルフィド）を用いる０℃で１時間の処理によるペプチドの開裂および脱保護は、ｉＮＯＣ−保護された、グリコラート−ｌｙｓ−アミド活性化されたペプチド５を与え、これを逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ（ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ勾配、０．１％ＴＦＡ）により精製する。全ての基質の同定は質量分析により確認する。補足的許諾特許請求されている本発明は、上記の明細書および容易に入手し得る参考文献および出発物質にしたがって実施可能である。にもかかわらず、本出願人等は、以下に列挙されるセルラインをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、Ｍｄ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：エシェリチア・コリ、ＤＨ１０Ｂ−ｐＢＳＫ−ｈｍｐｌＩ１．８、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ６９５７５、１９９４年２月２４日寄託、プラスミド、ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ７５９５８、１９９４年１２月２日寄託；および、ＣＨＯＤＰ−１２細胞、ＭＬ１／５０ＭＣＢ（標識＃１５９４）、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ１１７７０、１９９４年１２月６日寄託。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則の規定の下になされた（ブダペスト条約）。これは、生存培養を寄託の日から３０年間維持することを保証するものである。当該生物は、ブダペスト条約の下にＡＴＣＣによって入手可能とされ、そして、関連する米国特許の登録時における無制限の入手可能性を保証する、出願人およびＡＴＣＣ間の合意の下にあるであろう。寄託された菌株の入手可能性は、任意の政府当局がその特許法に従って付与した権利に違反して本発明を実施する許諾と解してはならない。本発明を必然的に好ましい態様および個々の実用的実施例と結びつけて説明してきたが、当業者は、前述の明細書を読んだ後に、本発明の精神および範囲から乖離せずに、種々の変更、等価物による置き換え、および本明細書に開示される主題内容への改変を加えることができるであろう。したがって本発明は、本明細書に個別的に記載される以外の方法で実施することができる。故に、本発明に関する特許証により付与された保護は、付記される請求の範囲およびその等価物によってのみ制限されることが意図されている。本明細書に引用される全ての参考文献は、説明的に引用されて本明細書の一部とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ 37/24 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０８／１９６，６８９ (32)優先日 1994年２月15日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２２３，２６３ (32)優先日 1994年４月４日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２４９，３７６ (32)優先日 1994年５月25日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／３４８，６５７ (32)優先日 1994年12月２日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／３４８，６５８ (32)優先日 1994年12月２日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．分離された実質上均質なｍｐｌリガンドポリペプチド。２．（ａ）フラグメントポリペプチド；（ｂ）変異体ポリペプチド；および、（ｃ）キメラポリペプチド、より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリペプチド。３．（ａ）哺乳動物から分離された該ポリペプチド；（ｂ）組換え手段により作成された該ポリペプチド；および、（ｃ）合成手段により作成された該ポリペプチド、より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリペプチド。４．（ａ）人間のポリペプチド；および、（ｂ）人間において非免疫原性であるポリペプチド、より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリペプチド。５．（ａ）該アゴニストが、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトされたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞中への標識されたヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激し；または、（ｂ）該アゴニストが、血小板リバウンド検定において循環血小板中への³⁵ Ｓ取り込みを刺激する、ことを特徴とする、分離された実質上均質なｍｐｌアゴニスト。６．Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ［式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）は、Ｃｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹まで（両端を含む）のヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミノ酸配列を表し；Ｘは、Ｃｙｓ⁷のアミノ基または群：から選ばれるアミノ末端アミノ酸残基を表し、Ｙは、Ｃｙｓ¹⁵¹のカルボキシ末端基または群：から選ばれるカルボキシ末端アミノ酸残基を表す］で表される請求項２に記載のフラグメントポリペプチドであって、アミノ末端アミノ酸残基の伸長が図１（配列番号１）に供されるヒトＭＬの残基１７６−３３２の１またはそれ以上を含むフラグメントポリペプチドおよびそのペギレイティド型。７．群ＴＰＯ（１−１５３）およびＴＰＯ（１−２４５）から選ばれる請求項６に記載のフラグメントポリペプチド。８．該フラグメントポリペプチドのアミノ酸配列が、およびその組み合わせからなる、請求項２に記載のフラグメントポリペプチド。９．グリコシル化されていない請求項６に記載のポリペプチド。１０．図１（配列番号２）に示される核酸配列を有する核酸分子と中等度の緊縮条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸によりコードされている、分離されたポリペプチド。１１．生物活性である請求項１１に記載のポリペプチド。１２．群ｈＭＬ、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬ、およびｐＭＬ２から選ばれる請求項１に記載のポリペプチド。１３．ポリペプチドのアミノ酸配列が、図１（配列番号１）のアミノ酸残基１ないしＸ［ここでＸは、群１５３、１５５、１６４、１７４、１９１、２０５、２０７、２１７、２２９、２４５および３３２から選ばれる］を含む、請求項２に記載のポリペプチド。１４．請求項１３に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列一致を共有する、分離された実質上均質なｍｐｌリガンドポリペプチド。１５．Ｘが１５３である、請求項１３に記載のポリペプチド。１６．ヘテロローガスなポリペプチドと融合した請求項１３に記載のｍｐｌリガンドを含むキメラ。１７．ヘテロローガスなポリペプチドが免疫グロブリンポリペプチドである、請求項１６に記載のポリペプチド。１８．ヘテロローガスなポリペプチドがインターロイキンポリペプチドである、請求項１６に記載のキメラ。１９．図１０に示される整列に対応する位置でｈＭＬのＮ末端残基中に加えられまたはそこに置換されているヒトＥＰＯ残基の１またはそれ以上（但し全てではない）により置換されている、ｈＭＬのＮ末端残基１ないし約１５３ないし１５７を含むキメラ。２０．請求項１３に記載のｍｐｌリガンドポリペプチドを結合することのできる抗体。２１．請求項２０に記載の抗体を産生するハイブリドーマセルライン。２２．請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている、分離された核酸分子。２３．請求項１３に記載のｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている、分離された核酸分子。２４．図１（配列番号２）に示されるオープンリーディングフレーム核酸配列を含む、分離された核酸分子。２５．群ｈＭＬ、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬおよびｐＭＬ２から選ばれるｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている、請求項２４に記載の分離された核酸分子。２６．（ａ）ｍｐｌリガンド遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン；（ｂ）緊縮条件下で（ａ）のクローンとハイブリダイズすることのできるＤＮＡ配列；および、（ｃ）天然に存在するｍｐｌリガンドポリペプチドの生物活性を有するポリペプチドをコードしている、（ａ）および（ｂ）のＤＮＡ配列のいずれかの遺伝的変異体、より成る群から選ばれる、分離された核酸分子。２７．中等度の緊縮条件下で図１（配列番号２）に供されるＤＮＡ配列とハイブリダイズすることのできる配列を有する、分離されたＤＮＡ分子であって、生物活性なｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子。２８．当該核酸分子に機能的に結合したプロモーターをさらに含む、請求項２５に記載の核酸分子。２９．当該ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列と機能的に結合している請求項２５に記載の核酸配列を含む発現ベクター。３０．請求項２９に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。３１．請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを含む、ｍｐｌリガンドポリペプチドの産生をもたらすための、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている核酸分子を使用する方法。３２．ｍｐｌリガンドポリペプチドが宿主細胞から回収される、請求項３１に記載の方法。３３．ｍｐｌリガンドポリペプチドが宿主細胞培養基から回収される、請求項３１に記載の方法。３４．ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡを被験試料の核酸とハイブリダイズさせ、ｍｐｌリガンドポリペプチドＤＮＡの存在を決定することからなる、ｍｐｌリガンドポリペプチドの存在を決定する方法。３５．核酸ポリメラーゼ反応をｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている核酸で開始することを含む、核酸被験試料を増幅する方法。３６．請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリペプチドおよび薬学上許容し得る担体からなる組成物。３７．請求項３６に記載の組成物の治療的有効量を、処置を必要とする哺乳動物に投与することからなる、血小板減少症に罹患しているまたはその危険性のある哺乳動物を処置するための方法。３８．サイトカイン、コロニー刺激因子、およびインターロイキンより成る群から選ばれる物質の治療的有効量をさらに含む、請求項３６に記載の組成物。３９．該物質が、ＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ −ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ −７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１１から選ばれる、請求項３８に記載の組成物。４０．（ａ）ヒトｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡ分離物を含む宿主細胞培養を生育させ、（ｂ）この培養からヒトｍｐｌリガンドポリペプチドを回収し、そして、（ｃ）実質上均質な生物活性ヒトｍｐｌリガンドポリペプチドを得るためにこのｍｐｌリガンドポリペプチドを精製する、ことからなる、一つのヒトｍｐｌリガンドポリペプチドのアミノ酸配列、例えば図１（配列番号１）に開示される配列を特徴とするヒトｍｐｌリガンドポリペプチドの生合成のための方法。