DE19500030A1

DE19500030A1 - Thrombopoietin

Info

Publication number: DE19500030A1
Application number: DE1995100030
Authority: DE
Inventors: Dan L Eaton; Frederic J De Sauvage
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1995-01-02
Publication date: 1995-07-06

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, Reinigung und rekombinante oder chemische Synthese von Proteinen, die das Überleben, die Proliferation, die Differenzierung oder Reifung von hämatopoetischen Zellen, insbesondere von Plätt chenvorläuferzellen, beeinflussen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Klonieren und die Expression von Nukleinsäuren, die einen Proteinliganden kodieren, der an mpl, ein Mitglied der Zytokinrezeptorsuperfamilie, binden und diesen aktivieren kann. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser Proteine alleine oder in Kombination mit anderen Zytokinen zum Behandeln von immunologischen oder hämatopoetischen Beeinträchtigungen, einschließlich Thrombo zytopenie.

I. Das hämatopoetische System

Das hämatopoetische System erzeugt die reifen hochspeziali sierten Blutzellen, von denen bekannt ist, daß sie für das Überleben von allen Säugern notwendig sind. Diese reifen Zellen umfassen Erythrozyten, spezialisiert für den Trans port von Sauerstoff und Kohlendioxyd, T- und B-Lymphozyten, verantwortlich für Zell- und Antikörper-vermittelte Im munantworten, Plättchen oder Thrombozyten, spezialisiert zum Bilden von Blutpfropfen, und Granulozyten und Makrophagen, spezialisiert als Freßzellen und akzessorische Zellen zur Bekämpfung von Infektionen. Granulozyten werden weiter un terteilt in Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Mastzel len, wobei spezialisierte Zelltypen bestimmte Funktionen ausüben. Bemerkenswerterweise stammen alle diese speziali sierten reifen Blutzellen aus einer einzigen gemeinsamen primitiven Zellart, bezeichnet als die pluripotente (oder totipotente) Stammzelle, die primär in Knochenmark gefunden wird (Dexer et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3 : 423-441 [1987]).

Die reifen hochspezialisierten Blutzellen müssen in großen Zahlen kontinuierlich über das ganze Leben eines Säugers hergestellt werden. Die ganz große Mehrzahl dieser speziali sierten Blutzellen sind dazu bestimmt, nur für einige wenige Stunden bis Wochen funktionell aktiv zu sein (Cronkite et al., Blood Cells, 2 : 263-284 [1976]). Somit ist eine kontinu ierliche Erneuerung der reifen Blutzellen, der primitiven Stammzellen selbst wie auch jeder intermediären oder zu einer Abstammungslinie gehörende Vorläuferzellinien, die zwischen den primitiven und den reifen Zellen angesiedelt sind, notwendig, um den normalen Steady-State-Bedarf des Säugers an Blutzellen aufrechtzuerhalten.

Dem Kern des hämatopoetischen Systems liegt die pluripotente Stammzelle bzw. -zellen zugrunde. Diese Zellen kommen in re lativ geringer Zahl vor, und sie durchlaufen eine Selbster neuerung durch Proliferation, um Tochterstammzellen zu er zeugen, oder sie werden transformiert, in einer Serie von Differenzierungsschritten, zu zunehmend reifen auf eine be stimmte Abstammungslinie beschränkte Vorläuferzellen, wobei sie letztendlich die hochspezialisierten reifen Blutzellen bzw. -zelle bilden.

Zum Beispiel durchlaufen bestimmte multipotente Vorläufer zellen, als CFC-Mix bezeichnet, die von Stammzellen abstam men, eine Proliferation (Selbsterneuerung) und Entwicklung, um Kolonien zu bilden, die alle die verschiedenen Mye loidzellen, Erythrozyten, Neutrophile, Megakaryozyten (Vorläufer der Plättchen), Makrophagen, Basophile, Eosino phile und Mastzellen, enthalten. Andere Vorläuferzellen der lymphoiden Abstammungslinie durchlaufen Proliferation und Entwicklung zu T-Zellen und B-Zellen.

Weiterhin liegt zwischen den CFC-Mix-Vorläuferzellen und Myeloidzellen ein weiterer Rang an Vorläuferzellen von in termediärer Festlegung auf ihre Nachkommen. Diese auf eine Abstammungslinie festgelegten Vorläuferzellen werden klassi fiziert auf der Grundlage der Nachfolger, die sie erzeugen. Somit sind die unmittelbaren bekannten Vorläufer der myeloi den Zellen: Erythroide-Kolonie-bildende Einheiten (CFU-E) für Erythrozyten, Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-bildende Zellen (GM-CFC) für Neutrophile und Makrophagen, Megakaryo zyten-Kolonie-bildende Zellen (Meg-CFC) für Megakaryozyten, Eosinophile-Kolonie-bildende Zellen (Eos-CFC) für Eosino phile, und Basophile-Kolonie-bildende Zellen (Bas-CFC) für Mastzellen. Andere intermediäre Vorläuferzellen zwischen den pluripotenten Stammzellen und den reifen Blutzellen sind be kannt (siehe unten) oder werden wahrscheinlich aufgefunden werden, wobei sie variierende Grade der Festlegung auf eine Abstammungslinie und der Fähigkeit zur Selbsterneuerung ha ben.

Daß dem normalen hämatopoetischen Zellsystem zugrundelie gende Prinzip scheint zu sein eine verringerte Fähigkeit zur Selbsterneuerung sowie die Multipotenz verlorengeht und die Festlegung auf eine Abstammungslinie erfolgt und der Reife grad erworben wird. Somit liegt an einem Ende des hämatopoe tischen Zellspektrums die pluripotente Stammzelle, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung zu all den verschiedenen Vorläuferzellen, die auf eine spezielle Abstammungslinie festgelegt sind, besitzt. Diese Fähigkeit bildet die Grundlage der Knochenmarkstransplantationsthera pie, wo primitive Stammzellen das gesamte hämatopoetische Zellsystem wieder aufbauen. An dem anderen Ende des Spek trums liegen die stark auf eine Abstammungslinie festgeleg ten Vorläufer und deren Nachkommen, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren haben aber eine reife funktionelle Aktivität erworben haben.

Die Proliferation und Entwicklung von Stammzellen und auf eine Abstammungslinie festgelegten Vorläuferzellen wird sorgfältig kontrolliert durch eine Vielzahl von hämatopoeti schen Wachstumsfaktoren oder Zytokinen. Die Rolle dieser Wachstumsfaktoren in vivio ist komplex und unvollständig verstanden. Einige Wachstumsfaktoren, wie Interleukin-3 (IL- 3), können sowohl multipotente Stammzellen stimulieren wie auch festgelegte Vorläuferzellen für verschiedene Abstam mungslinien, einschließlich z. B. Megakaryozyten. Von anderen Faktoren, wie dem Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulie renden Faktor (GM-CSF) wurde ursprünglich angenommen, daß er hinsichtlich seiner Wirkung auf GM-CFC′s beschränkt sei. Später wurde jedoch gefunden, daß GM-CSF auch die Prolifera tion und Entwicklung von unter anderem Megakaryozyten beein flußt. Somit ist von IL-3 und GM-CSF gefunden worden, daß sie überlappende biologische Aktivitäten besitzen jedoch mit verschiedener Potenz. Erst in jüngerer Zeit wurde gefunden, daß Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-11 (IL-11), obwohl sie keinen offensichtlichen Einfluß auf die meg-Koloniebil dung alleine besitzen, synergistisch mit IL-3 wirken, um die Reifung von Megakaryozyten zu stimulieren (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20 : 1011-1016 [1992]).

Somit können hämatopoetische Wachstumsfaktoren das Wachstum und die Differenzierung von einer oder mehrerer Abstammungs linien beeinflussen, sie können anderen Wachstumsfaktoren bei der Beeinflussung einer einzigen Vorläuferzellinie über lappen, oder sie können mit anderen Faktoren synergistisch wirken.

Es scheint auch, daß hämatopoetische Wachstumsfaktoren ihre Wirkung zu verschiedenen Stadien der Zellentwicklung von der totipotenten Stammzelle bis zu verschiedenen auf Abstam mungslinien festgelegte Vorläuferzellen bis zu der reifen Blutzelle ausüben können. Zum Beispiel scheint Erythropoien tin (epo) die Proliferation nur von reifen erythroiden Vor läuferzellen zu fördern. IL-3 scheint seine Wirkung früher auszuüben, indem es primitive Stammzellen und intermediäre auf Abstammungslinien festgelegte Vorläuferzellen beein trächtigen.

Es ist aus dem zuvor genannten ersichtlich, daß neue hämato poetische Wachstumsfaktoren, die das Überleben, die Prolife ration, die Differenzierung oder Reifung von einer beliebi gen Blutzelle oder deren Vorläufer beeinflussen, nützlich wären, insbesondere um bei dem erneuten Aufbau eines zer störten hämatopoetischen Systems, hervorgerufen durch Krank heit oder nach einer Bestrahlung- oder Chemotherapie, zu helfen.

II. Megakaryozytopoese - Plättchenherstellung

Die Regulation der Megakaryozytopoese und der Plättchenher stellung ist in einem Übersichtsartikel dargestellt: Mazur, Exp. Hematol., 15 : 248 [1987] und Hoffman, Blood, 74 : 1196- 1212 [1989]. Kurz ausgeführt, pluripotente Knochenmarks stammzellen differenzieren zu megakaryozytartigen, erythro zytartigen und myelozytartigen Zellinien. Es wird angenom men, daß es eine Hierarchie von festgelegten megakaryozytar tigen Vorläuferzellen zwischen den Stammzellen und den Mega karyozyten gibt. Es sind mindestens drei Klassen an mega karyozytartigen Vorläuferzellen identifiziert worden, näm lich Burst-Forming-Unit-Megakaryozyten (BFU-MK), Kolonie- Forming-Unit-Megakaryozyten (CFU-MK) und Light-Density-Mega karyozyten-Vorläuferzellen (LD-CFU-MK). Die Megakaryozyten- Reifung selbst ist ein Kontinuum der Entwicklung, das in Stadien aufgelöst worden ist, basierend auf morphologischen Standardkriterien. Das früheste erkennbare Mitglied der Me gakaryozyten(MK oder meg)-Familie sind die Megakaryoblasten. Diese Zellen besitzen anfänglich einen Durchmesser von 20 bis 30 µm mit einem basophilen Zytoplasma und einem leicht unregelmäßigen Kern, lockerem, etwas retikulärem Chromatin und mehreren Nukleoli. Später können Megakaryoblasten bis zu 32 Kerne (polyploid) enthalten, aber das Zytoplasma bleibt spärlich und unreif. Sowie der Reifungsprozeß fortschreitet wird der Kern mehr lobulär und pyknotisch, das Zytoplasma nimmt in der Menge zu und wirkt stärker acidophil und granu lär. Die reifesten Zellen dieser Familien können das Er scheinungsbild des Freisetzens von Plättchen in ihre Umge bung annehmen. Normalerweise sind weniger als 10% der Mega karyozyten in dem Blasten-Stadium und mehr als 50% sind reif. Die willkürliche morphologische Klassifikation, die üblicherweise angewendet wird auf die megakaryozytenartigen Reihen, gibt an den Megakaryoblasten als die früheste Form; Promegakaryozyt oder basophiler Megakaryozyt für die inter mediäre Form; und reifer (acidophile, granuläre oder plätt chenerzeugende) Megakaryozyt für die späte Form. Der reife Megakaryozyt erstreckt Filamente des Zytoplasmas in sinusoi dale Räume, wo sie sich ablösen und zu einzelnen Plättchen fragmentieren (Williams et al., Hematology, 1972).

Von der Megakaryozytopoese wird angenommen, daß sie mehrere regulierende Faktoren umfaßt (Williams et al., Br. J. Haematol., 52 : 173 [1982] und Williams et al., J. Cell Physiol., 110 : 101 [1982]). Der frühe Spiegel der Megakaryo zytopoese wird als mitotisch postuliert und betrifft die Zellproliferation und die Initiation der Koloniebildung durch CFU-MK, aber sie ist nicht beeinflußt von der Plätt chenzahl (Burstein et al., J. Cell Physiol., 109 : 333 [1981] und Kimura et al., Exp. Hematol., 13 : 1048 [1985]). Das späte Stadium der Reifung ist nicht-mitotisch, umfaßt die Kern polyploidisierung und zytoplasmatische Reifung und ist ver mutlich reguliert durch einen Rückkopplungsmechanismus durch die periphere Plättchenzahl (Odell et al., Blood, 48 : 765 [1976] und Ebbe et al., Blood, 32 : 787 [1968]).

Die Existenz eines bestimmten und spezifischen Megakaryo zyten-koloniestimulierenden Faktors (MK-CSF) ist kontrovers diskutiert worden (Mazur, Exp. Hematol., 15 : 340-350 [1987]). Doch nehmen die meisten Autoren an, daß ein solch vitaler Vorgang für das Überleben, wie die Plättchenproduktion, von einem bzw. mehreren Zytokinen reguliert wird, die aus schließlich für diesen Vorgang verantwortlich sind. Die Hy pothese, daß Megakaryozyt/Plättchen-spezifische Zytokine bzw. Zytokin existiert, war die Grundlage für mehr als 30 Jahre Forschung - aber bis heute ist ein solches Zytokin nicht gereinigt, sequenziert oder durch einen Assay als ein einzigartiger MK-CSF (TPO) nachgewiesen worden.

Obwohl berichtet worden ist, daß MK-CSF′s teilweise gerei nigt worden sind aus experimentell erzeugter Thrombozytope nie (Hill et al., Exp. Hematol., 14 : 752 [1986] und humanem konditioniertem embryonalem Nierenmedium [CM) (Mc Donald et al., J. Lab. Clin. Med., 85 : 59 [1975] und aus Mensch von Pa tienten mit plastischer Anämie und mit idiopathischer throm bozytopenieartiger Purpura aus Harnextrakten (Kawakita et al., Blood, 6 : 556 [1983] und aus Plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75 : 11174 [1985]), ist deren physiologische Funktion bisher in den meisten Fällen noch unbekannt.

Das konditionierte Medium von mit Kermesbeerenmitogen-akti vierten Milzzellen (pokeweed mitogen; PWM-SpCM) und die Mäuse-Myelomonozytenzellinie WEHI-3 (WEHI-3CM) sind als Me gakaryozytenverstärker verwendet worden. PWM-SpCM enthält Faktoren, die das CFU-MK-Wachstum verstärken (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72 : 1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65 : 214 [1985]; und Iscove, N.N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 10, Golde et al., eds. (New York, Academy Press) Seiten 37-52 [1978], von denen eins In terleukin-3 (IL-3) ist, ein koloniestimulierender Faktor für mehrere Abstammungslinien (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11 : 469 [1986]). Die anderen Faktoren in diesem Medium sind noch nicht identifiziert und isoliert worden. WEHI-3 ist eine mäusemyelomonozytäre Zellinie, die relativ große Mengen an IL-3 und kleinere Mengen an GM-CSF ausscheidet. Von IL-3 ist gefunden worden, daß es das Wachstum einer großen Viel zahl von hämatopoetischen Zellen verstärkt (Ihle et al., J. Immunol. 13 : 282 [1983]). Von IL-3 ist auch gefunden worden, daß es mit vielen der bekannten hämatopoetischen Hormone oder Wachstumsfaktoren synergistisch zusammenwirkt (Bartelmez et al., J. Cell Physiol., 122 : 362-369 [1985] und Warren et al., Cell, 36 : 667-674 [1988]) einschließlich mit Erythropoietin (EPO) und Interleukin-1 (IL-1) bei der Induk tion von sehr frühen multipotenten Vorläufern und der Bil dung von sehr großen gemischten hämatopoetischen Kolonien.

Andere Quellen für Megakaryozytenverstärker sind aufgefunden worden in den konditionierten Medien von Lunge, Knochen, ma krophagen Zellinien, in Zellen des Bauchhöhlenexudats bei der Maus und in humanen embryonalen Nierenzellen. Trotz ei niger widersprüchlicher Daten (Mazur, Exp. Hematol., 15 : 340- 350 [1987]) gibt es einige Hinweise (Geissler et al., Br. J. Haematol., 60 : 233-238 [1985]), daß eher aktivierte T-Lympho zyten als Monozyten eine verstärkende Rolle bei der Mega karyozytopese spielen. Diese Befunde legen nahe, daß Aus scheidungen aktivierter T-Lymphozyten, wie Interleukine, re gulatorische Faktoren bei der MK-Entwicklung sein können (Geissler et al., Exp. Hematol., 15 : 845-853 [1987]). Eine An zahl an Untersuchungen über die Megakaryozytopoese mit ge reinigtem Erythropoietin EPO (Vainchenker et al., Blood, 54 : 940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261 : 492-4 [1976]; und Williams et al., Exp. Hematol., 12 : 734 [1984]) weisen darauf hin, daß dieses Hormon eine verstärkende Wirkung auf die MK- Koloniebildung besitzt. Dieses ist auch gezeigt worden in serumfreien und serumhaltigen Kulturen und in der Abwesen heit von akzessorischen Zellen (Williams et al., Exp. Hematol., 12 : 734 [1984]). Von EPO ist behauptet worden, daß es mehr in die Aspekte des Einzell- und Zweizellstadiums der Megakaryozytopoese verwickelt ist, im Gegensatz zu der Wir kung von PWM-SpCM, das in dem Vierzellstadium der Megakaryo zytenentwicklung beteiligt ist. Die Wechselwirkung all die ser Faktoren in der frühen und späten Phase der Megakaryo zytenentwicklung bleibt noch aufzuklären.

Von verschiedenen Labors erzeugte Daten legen nahe, daß die einzigen mehrere Abstammungslinien beeinflussende Faktoren die individuell MK-Kolonie-stimulierende Aktivität besitzen, GM-CSF und IL-3 sind und zu einem geringeren Maß der B-Zell- stimulierende Faktor IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 9035 [1987]). Kürzlich haben mehrere Au toren berichtet, daß IL-11 und Leukämie-inhibierender-Fak tor(LIF) synergistisch mit IL-3 wirken, um die Megakaryo zytengröße und Ploidie zu steigern (Yonemura et al., Britisch Journal of Hematology, 84 : 16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153 : 305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76 : 50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77 : 2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19 : 378-381 [1991]; und Yonemura et al., Exp. Hematol., 20 : 1011-1016 [1992]).

Weiter Dokumente von Bedeutung umfassen: US-Patent Nr. 4,962,091; Chong, US-Patent Nr. 4,879,111; Fernandes et al., US-Patent Nr. 4,604,377; Wissler et al., US-Patent Nr. 4,512,971; Gottlieb, US-Patent Nr. 4,468,379; Bennett et al., US-Patent Nr. 5,215,895; Kogan et al., US-Patent Nr. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5):1545- 1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73(7):1828-1835 [1989]; und Clutterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512 [1989].

III. Thrombozytopenie

Plättchen sind kritische Elemente in dem Blutgerinnungsme chanismus. Das Verarmen des zirkulierenden Plättchenspie gels, Thrombozytopenie genannt, erfolgt unter verschiedenen klinischen Bedingungen und Störungen. Thrombozytopenie wird üblicherweise definiert als eine Plättchenzahl unter 150 × 10⁹ pro Liter. Hauptursachen für Thrombozytopenie können grob eingeteilt werden in drei Kategorien auf der Grundlage der Plättchenlebensdauer, nämlich: (1) beeinträchtigte Produktion von Plättchen durch das Knochenmark, (2) Plätt chensequestration in der Milz (Splenomegalie) oder (3) ge steigerte Zerstörung von Plättchen in der peripheren Zirku lation (z. B. Autoimmunthrombozytopenie oder Chemo- und Strahlentherapie). Weiterhin können Patienten, die große Vo lumina an rasch verabreichten blutplättchenarmen Blutpro dukten erhalten, Thrombozytopenie entwickeln, aufgrund der Verdünnung.

Die klinischen Blutungsmanifestationen bei Thrombozytopenie hängen von der Schwere der Thrombozytopenie, ihrer Ursache und möglicherweise von damit zusammenhängenden Gerinnungsde fekten ab. Im allgemeinen haben Patienten mit Plättchenzah len zwischen 20 und 100 × 10⁹ pro Liter das Risiko von ex zessiven posttraumatischen Blutungen, während solche, mit Plättchenzahlen unterhalb von 20 × 10⁹ pro Liter spontane Blutungen haben können. Letztere Patienten sind Kandidaten für eine Plättchentransfusion mit damit zusammenhängendem immunologischem und viralem Risiko. Für jeden gegebenen Grad an Thrombozytopenie scheint die Blutung schlimmer zu sein, wenn die Ursache eher eine verringerte Produktion ist als die gesteigerte Zerstörung von Plättchen. Bei der letzten Situation führt der beschleunigte Plättchen-Turnover zu der Zirkulation von jüngeren, größeren und hämostatisch wirksa meren Plättchen. Thrombozytopenie kann von einer Vielzahl von Störungen, wie unten kurz beschrieben, herrühren. Eine ausführlichere Beschreibung kann gefunden werden in Schaf ner, A. I., "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function", Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].

(a) Thrombozytopenie aufgrund einer beeinträchtigten Plätt chenproduktion

Ursachen von kongenitaler Thrombozytopenie umfassen konsti tutionelle aplastische Anämie (Fanconi-Syndrom) und kongeni tale amegakaryozytäre Thrombozytopenie, die mit Skelettmiß bildungen assoziiert sein kann. Erworbene Störungen der Plättchenproduktion werden verursacht entweder durch Hypo plasie von Megakaryozyten oder ineffektive Thrombopoese. Me gakaryozytäre Hypoplasie kann von einer Vielzahl von Bedin gungen herrühren, einschließlich Knochenmarkaplasie (einschließlich idiopathische Formen oder Myelosuppression durch chemotherapeutische Mittel oder Strahlentherapie), Myelfibrose, Leukämie und Invasion des Knochenmarks durch metastatische Tumore oder Granulomas. In einigen Situationen können Toxine, infektiöse Mittel oder Medikamente relativ selektiv mit der Thrombopoese wechselwirken; Beispiele um fassen transiente Thrombozytopenien, verursacht durch Alko hol und bestimmte virale Infektionen, und milde Thrombo zytopenie, assoziiert mit der Verabreichung von Thiaziddi uretika. Schließlich kann eine ineffektive Thrombopoese als eine Sekundärfolge von megaloplastischen Vorgängen (Folat- oder B₁₂-Mangel) auch Thrombozytopenie verursachen, übli cherweise mit koexistierender Anämie und Leukopenie.

Die gegenwärtige Behandlung von Thrombozytopenie aufgrund einer erniedrigten Plättchenproduktion hängt ab von der Identifizierung und Umkehrung der zugrundeliegenden Ursache des Knochenmarkversagens. Plättchentransfusionen sind übli cherweise reserviert für Patienten mit ernsthaften Blutungs komplikationen oder zur Absicherung während chirurgischen Eingriffen, da die Isoimmunisierung einer weiteren Plätt chentransfusion erhöhten Widerstand leisten kann. Mukosablu tung, die das Ergebnis starker Thrombozytopenie ist, kann abgeschwächt werden durch die orale oder intravenöse Verab reichung von antifibrinolytischen Mitteln. Thrombotische Komplikationen können sich jedoch entwickeln, wenn antifi brinolytische Mittel in Patienten mit ausgebreiteter intra vaskulärer Gerinnung (DIC) verwendet werden.

(b) Thrombozytopenie aufgrund der Milzsequestration

Splenomegalie aufgrund einer beliebigen Ursache kann mit milder bis moderater Thrombozytopenie assoziiert sein. Dies ist ein im wesentlichen passiver Vorgang (Hypersplenie) der Milzplättchensequestration, im Gegensatz zu der aktiven Zer störung der Plättchen durch die Milz in Fällen der unten diskutierten immunvermittelten Thrombozytopenie. Obwohl die häufigste Ursache von Hypersplenie Stauungssplenomegalie durch portalen Hochdruck aufgrund von alkoholischer Zirrhose ist, sind andere Formen der Stauungs-, infiltrativen oder lymphoproliferativen Splenomegalie ebenfalls mit Thrombo zytopenie assoziiert. Die Plättchenzahlen fallen üblicher weise nicht unter 50 × 10⁹ pro Liter als ein Ergebnis von Hypersplenie alleine.

(c) Thrombozytopenie aufgrund nichtimmunologisch vermittel ter Plättchenzerstörung

Thrombozytopenie kann Folge der beschleunigten Zerstörung von Plättchen bei verschiedenen nicht immunologischen Vorgän gen sein. Störungen dieses Typs umfassen ausgebreitete in travaskuläre Gerinnung, intravaskuläre Prothesegegenstände, extrakoporale Zirkulation des Bluts und thrombotische Mikro angiophatien, wie thrombotische thrombozytäre Purpura. Bei all diesen Situationen werden zirkulierende Plättchen, die entweder den künstlichen Oberflächen oder einer abnormalen vaskulären Intima ausgesetzt werden, an diesen Stellen ver braucht oder geschädigt und dann vor der Reifung durch das retikuloendotheliale System entfernt. Krankheitsstadien oder Störungen, bei denen ausgebreitete intravaskuläre Gerinnung (DIC) auftreten können, sind ausführlich erläutert in Braun wald et al. (Herausgeber), Harrison′s Principles of Internal Medicine, 11. Ausgabe, Seite 1478, McGraw Hill [1987]. In travaskuläre prothetische Gegenstände, einschließlich Herz klappen und Intraaortaballons, können eine milde bis mode rate destruktive Thrombozytopenie und transiente Thrombo zytopenie in Patienten hervorrufen, die sich einer kardio pulmonaren Beipaßbehandlung oder Hämodialyse unterziehen, wobei sie aus dem Verbrauch oder der Schädigung von Plätt chen in dem extrakorporalen Kreislauf resultiert.

(d) Wirkstoffinduzierte Immunthrombozytopenie

Mehr als 100 Wirkstoffe sind mit immunologisch vermittelter Thrombozytopenie in Zusammenhang gebracht worden. Jedoch sind nur Chinidin, Chinin, Gold, Sulfonamide, Cephalothin und Heparin gut charakterisiert worden. Wirkstoffinduzierte Thrombozytopenie tritt regelmäßig sehr gravierend und tritt üblicherweise jäh innerhalb von Tagen auf, während die Pati enten die sensibilisierende Medikation einnehmen.

(e) Immunologische (autoimmunologische) thrombozytopenäre Purpura (ITP)

ITP in Erwachsenen ist eine chronische Erkrankung, die ge kennzeichnet ist durch autoimmunologische Plättchenzerstö rung. Der Autoantikörper ist typischerweise IgG, obwohl dies auch von anderen Immunglobulinen berichtet worden ist. Ob wohl von dem Autoantikörper für ITP gefunden worden ist, daß er mit dem GPII_bIII_a der Plättchenmembran assoziiert ist, ist die Plättchenantigenspezifität in den meisten Fällen noch nicht identifiziert worden. Extravaskuläre Zerstörung von sensibilisierten Plättchen tritt in dem retikuloendothe lialen System der Milz und der Leber auf. Obwohl mehr als die Hälfte aller Fälle von ITP idiopathisch sind, haben viele Patienten zugrundeliegende rheumatische oder autoim mune Erkrankungen (z. B. Systemischer Lupus Erythematosus) oder lymphoproliferative Störungen (z. B. chronische lympho zytäre Leukämie).

(f) HIV-induzierte ITP

ITP ist eine zunehmend übliche Komplikation bei HIV-Infek tion (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96 : 714-717 [1982]) und kann in jedem Stadium des Fortschreitens der Krankheit auftreten, sowohl in Patienten, bei denen das erworbene Im munschwächesyndrom (AIDS) diagnostiziert worden ist, wie auch bei solchen mit dem AIDS-related Complex, und solchen mit einer HIV-Infektion aber ohne AIDS-Symptome. Die HIV-In fektion ist eine übertragbare Krankheit, die im Endstadium gekennzeichnet ist durch einen starken Mangel der zellulären Immunfunktion wie auch dem Auftreten von opportunistischen Infektionen und Krebs. Die primäre immunologische Abnormali tät, die das Ergebnis einer Infektion mit HIV ist, ist die progressive Verarmung und funktionelle Beeinträchtigung von T-Lymphozyten, die das CD4-Oberflächenglycoprotein exprimie ren (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3 : 477 [1985]). Der Verlust an CD4-Helfer-/T-Zellinduktorfunktion liegt vermut lich den starken Defekten bei der zellulären und humoralen Immunität zugrunde, wobei dies zu den opportunistischen In fektionen und den malignen Erscheinungen führt, die charak teristisch für AIDS sind (H. Lane, siehe oben).

Obwohl der Mechanismus der HIV-assoziierten ITP unbekannt ist, wird angenommen, daß er verschieden ist von dem Mecha nismus von ITP, der nicht mit einer HIV-Infektion assoziiert ist (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311 : 635-639 [1984]; und Ratner, Am. J. Med., 86 : 194-198 [1989]).

IV. Gegenwärtige Therapie der Thrombozytopenie

Der therapeutische Ansatz für die Behandlung von Patienten mit Thrombozytopenie wird diktiert durch die Schwere und die Dringlichkeit der klinischen Situation. Die Behandlung ist ähnlich für die HIV-assoziierte und die nicht-HIV-assozi ierte Thrombozytopenie, und obwohl eine Anzahl an verschie denen therapeutischen Ansätzen verwendet worden ist, bleibt die Therapie umstritten.

Die Plättchenzahl ist in Patienten, bei denen Thrombozytope nie diagnostiziert wurde, erfolgreich gesteigert worden durch eine Glucokortikoid- (z. B. Prednisolon) Therapie, je doch ist in den meisten Patienten die Antwort unvollständig oder ein Rückfall erfolgt, wenn die Glucokortikoiddosis ver ringert wird oder die Verabreichung unterbrochen wird. Ba sierend auf Studien mit Patienten mit HIV-assoziierter ITP haben einige Forscher vorgeschlagen, daß die Glucokortikoid- Therapie zu einer Prädisposition für AIDS führen kann. Glucokortikoide werden üblicherweise verabreicht, falls die Plättchenzahl unter 20 × 10⁹ pro Liter fällt oder wenn spontan eine Blutung auftritt.

Für Patienten die auf Glucokortikoide nicht ansprechen, ist die Verbindung:
4-(2-Chlorphenyl)-9-methyl-2-[3-(4-morpholinyl)-3-propanon- 1-yl]6H-thieno[3,2,f][1,2,4]triazolo[4,3,a,][1,4]diazepin (WEB 2086)
erfolgreich verwendet worden, um einen schweren Fall von nicht-HIV-assoziierter ITP zu behandeln. Ein Patient mit einer Plättchenzahl von 37 000-58 000/µl wurde behandelt mit WEB 2086, und nach 1-2 Wochen der Behandlung stieg die Plättchenzahl auf 140 000-190 000/µl (EP 361,077 und Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Obwohl die optimale Behandlung für erworbene amegakaryo zytäre Thrombozytopenie Purpura (AATP) unsicher ist, ist von Antithymozytenglobulin (ATG), einem Pferdeantiserum gegen humanes Thymusgewebe, gezeigt worden, daß es eine verlän gerte vollständige Remission erzeugt (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37 : 126-127 [1991]). Ein jüngster Bericht jedoch legt nahe, daß der hämatopoetische Effekt von ATG auf Thio mersal zurückzuführen ist, wo vermutlich das Protein als ein Quecksilberträger wirkt (Panelle et al., Cancer Research, 50 : 4429-4435 [1990]).

Gute Ergebnisse sind berichtet worden bei Splenektomie. Splenektomie entfernt die hauptsächliche Stelle der Plätt chenzerstörung und eine Hauptquelle der Autoantikörperpro duktion bei vielen Patienten. Dieses Verfahren führt zu einer verlängerten behandlungsfreien Remission in einer Vielzahl von Patienten. Da jedoch chirurgische Verfahren im allgemeinen in einem immunkompromitierten Patienten zu ver meiden sind, wird Splenektomie nur empfohlen in schlimmen Fällen von Thrombozytopenie (z. B. schlimmer HIV-assoziierter ITP), und in Patienten, denen es nicht gelingt, auf eine 2- bis 3-wöchige Glucokortikoidbehandlung anzusprechen oder de nen es nicht gelingt, eine anhaltende Antwort nach Abbrechen der Glucokortikoidverabreichung zu erzielen. Basierend auf gegenwärtigem wissenschaftlichem Wissen ist es unklar, ob Splenektomie Patienten für AIDS prädisponiert.

Zusätzlich zur Prädnisolontherapie und Splenektomie verspre chen bestimmte zytotoxische Mittel, z. B. Vincristin und Azidothymidin (AZT, Zidovudin) Vorteile bei der Behandlung von HIV-induzierter ITP; jedoch sind die Ergebnisse noch vorläufig.

Es ist aus dem zuvor genannten ersichtlich, daß ein Weg zum Behandeln von Thrombozytopenie ist, ein Mittel zu erhalten, das die Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten oder Vorläufern davon zu der Plättchen-produzierenden Form be schleunigen kann. Beträchtliche Anstrengungen sind daraufhin gerichtet worden, solche Mittel zu identifizieren, im allge meinen bezeichnet als "Thrombopoietin" (TPO). Andere Namen für TPO, die im allgemeinen in der Literatur gefunden wer den, umfassen Thrombozytopoese-stimulierender Faktor (TSF), Megakaryozyten-koloniestimulierender Faktor (MK-CSF), Mega karyozyten-stimulierender Faktor und Megakryozytenverstär ker. TPO-Aktivität wurde bereits 1959 beobachtet (Rak et al., Med. Exp., 1 : 125), und die Versuche, dieses Mittel zu charakterisieren und zu reinigen, sind bis zum heutigen Tag fortgesetzt worden. Während Berichte über die partielle Rei nigung von TPO-aktiven Polypeptiden existieren (siehe z. B. Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262 : 3262 [1987] und Hoffmann et al., J. Clin. Invest. 75 : 1174 [1985]) haben andere postu liert, daß TPO nicht eine bestimmte Einheit selbst ist son dern vielmehr einfach die polyfunktionelle Manifestation eines bekannten Hormons (IL-3, Sparrow et al., Prog. Clin. Bio. Res., 215 : 123 [1986]). Unabhängig von seiner Form oder seinem Ursprung wäre ein Molekül mit thrombopoetischer Akti vität von beträchtlichem therapeutischem Wert. Obwohl noch kein Protein zweifelsfrei als TPO identifiziert worden ist, ist die kürzliche Entdeckung, daß mpl, ein vermeintlicher Zytokinrezeptor, ein thrombopoetisches Signal erzeugen bzw. weiterleiten (transduce) könnte, von großem Interesse.

V. Mpl ist ein megakaryozytopoetischer Zytokinrezeptor

Es wird angenommen, daß die Proliferation und Reifung von hämatopoetischen Zellen strikt reguliert wird durch Fakto ren, die positiv oder negativ die Proliferation der pluripo tenten Stammzelle und Differenzierung zu mehreren Abstam mungslinien moduliert. Diese Effekte werden vermittelt durch die Bindung von extrazellulären Proteinfaktoren mit hoher Affinität an spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Diese Zelloberflächenrezeptoren teilen eine beträchtliche Homolo gie und werden im allgemeinen klassifiziert als die Mitglie der der Zytokinrezeptorsuperfamilie. Mitglieder dieser Su perfamilie umfassen Rezeptoren für: IL-2 (β- und γ-Ketten) (Hatakeyama et al., Science, 244 : 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257 : 379-382 [1991]), IL-3 (Itoh et al., Science, 247 : 324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66 : 1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59 : 335-348 [1989]), IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9 : 4367- 4374 [1990]; Tavernier et al., Cell, 66 : 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241 : 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63 : 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60 : 941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5690-5694 [1992], Granulocyten-Makrophagen-Ko lonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8 : 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244 : 9655-9659 [1990], Granulocyten-Kolonie-stimu lierender Faktor (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61 : 341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172 : 1559- 1570 [1990]), EPO (D′Andrea et al., Cell, 57 : 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76 : 31-35 [1990], Leukämie-inhibierender Faktor (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10 : 2839-2848 [1991]), Oncostatin M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 8641-8645 [1991]) und auch Rezeptoren für Prolactin (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 2112- 2116 [1989]), Wachstumshormon (GH) (Leung et al., Nature, 330 : 537-543 [1987]) und Zilliar-Neurotropher-Faktor (CNTF) (Davis et al., Science, 253 : 59-63 [1991]).

Mitglieder der Zytokinrezeptorsuperfamilie können in drei funktionelle Kategorien eingruppiert werden (zur Übersicht siehe Nicola et al., Cell, 67 : 1-4 [1991]). Die erste Klasse umfaßt Rezeptoren mit einer Kette, wie der Erythropoietin rezeptor (EPO-R) oder der Rezeptor für den Granulozyten-Ko lonie-stimulierenden Faktor (G-CSF-R), die einen Liganden mit hoher Affinität über die extrazelluläre Domäne binden und auch ein intrazelluäres Signal erzeugen. Eine zweite Klasse an Rezeptoren, sogenannte α-Untereinheiten, umfassen Interleukin-6-Rezeptor (IL6-R), Rezeptor für den Granulo zyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF-R), Interleukin-3-Rezeptor (IL3-Ra) und andere Mitglieder der Zytokinrezeptorsuperfamilie. Diese α-Untereinheiten binden Liganden mit niedriger Affinität, aber sie können kein in trazelluläres Signal erzeugen. Ein Rezeptor mit hoher Affi nität, der zur Signalübertragung fähig ist, wird erzeugt durch ein Heterodimer zwischen einer α-Untereinheit und einem Mitglied einer dritten Klasse an Zytokinrezeptoren, besser β-Untereinheiten genannt, z. B. β_c, die gemeinsame β- Untereinheit für die drei α-Untereinheiten IL3-Ra und GM- CSF-R.

Ein Hinweis darauf, daß mpl ein Mitglied der Zytokinrezep torsuperfamilie ist, kommt aus der Sequenzhomologie (Gearing, EMBO J., 8 : 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253 : 59-63 [1991] und Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5640-5644 [1992]) und seine Fähigkeit, proliferative Signale zu erzeugen.

Die aus der molekularen Klonierung des Mäuse-c-mpl geschlos sene Proteinsequenz zeigt, daß dieses Protein homolog zu an deren Zytokinrezeptoren ist. Die extrazelluläre Domäne ent hält 465 Aminosäurereste und setzt sich aus zwei Unterdomä nen zusammen mit jeweils vier hochkonservierten Cysteinen und einem speziellen Motiv in der N-terminalen Unterdomäne und in der C-terminalen Unterdomäne. Die den Liganden bin denden extrazellulären Domänen haben vermutlich ähnliche Doppelte-β-Faltblattstrukturgeometrien. Diese duplizierte extrazelluläre Domäne ist hochhomolog mit der Signalübertra gungskette, die IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptoren wie auch der Bindungsdomäne mit geringer Affinität von LIF gemein ist (Vigon et al., Oncogene, 8 : 2607-2615 [1993]). Somit kann mpl zu der Klasse an Zytokinrezeptoren mit niedriger Affinität für die Ligandenbindung gehören.

Ein Vergleich von Mäuse-mpl und reifem humanem mpl P zeigt, daß diese zwei Proteine 81% Sequenzidentität zeigen. Insbe sondere zeigen die N-terminalen und C-terminalen extrazellu lären Subdomänen 75% bzw. 80% Sequenzidentität. Die am mei sten konservierte mpl-Region ist die zytoplasmatische Do mäne, die 91% Aminosäureidentität zeigt, wobei eine Sequenz von 37 Resten nahe der Transmembrandomäne in beiden Spezies identisch ist. Demzufolge wird von mpl berichtet, daß es eine der am meisten konservierten Mitglieder der Zytokinre zeptorsuperfamilie ist (Vigon, siehe oben).

Beweis dafür, daß mpl ein funktioneller Rezeptor ist, der ein proliferatives Signal weiterleiten kann, kommt von der Konstruktion von chimären Rezeptoren, die eine extrazellu läre Domäne von einem Zytokinrezeptor mit hoher Affinität für ein bekanntes Zytokin enthalten und die mpl-zytoplasma tische Domäne. Da noch kein bekannter Ligand für mpl berich tet worden ist, war es notwendig, die chimäre extrazelluläre Domäne mit hoher Affinität für die Ligandenbindung aus der ersten Klasse eines Zytokinrezeptors, wie IL-4R oder G-CSFR, zu konstruieren. Vigon et al., siehe oben, fusionierte die extrazelluläre Domäne von G-CSFR mit der Transmembran- und zytoplasmatischen Domäne von c-mpl. Eine IL-3 abhängige Zel linie, BAF/BO3 (Ba/F3) wurde transfektiert mit der G- CSFR/mpl-Chimäre zusammen mit einer vollständigen (full length) G-CSFR-Kontrolle. Die mit der Chimäre transfektier ten Zellen wuchsen gleich gut in der Anwesenheit von Zytokin IL-3 oder G-CSF. Ähnlich wuchsen auch Zellen, die mit G-CSRF transfektiert waren, gut in jeweils IL-3 oder G-CSF. Alle Zellen starben in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt von Skoda et al., EMBO J., 12(7):2645-2653 [1993], bei dem die extrazellulären und Transmembrandomänen von humanem IL-4-Rezeptor (IL-4-R) mit der Mäuse-mpl-zytoplasmatischen Domäne fusioniert wur den, und dieses Konstrukt wurde in eine IL-3 abhängige Mäu sezellinie BA/F3 transfektiert. Mit dem Wildtyp hIL-4-R transfektierte Ba/F3-Zellen vermehrten sich normal in der Anwesenheit von jedem der Spezies-spezifischen IL-4 oder IL- 3. Mit hIL-4R/mpl transfektierte Ba/F3-Zellen vermehrten sich normal in der Anwesenheit von hIL-4 (in der Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-3), wobei dies zeigt, daß in Ba/F3- Zellen die mpl-zytoplasmatische Domäne alle die Elemente enthält, die notwendig sind ein proliferatives Signal zu erzeugen.

Diese Chimären-Experimente zeigen die Fähigkeit zum Erzeugen von proliferationsfördernden Signalen durch die mpl-zyto plasmatische Domäne, aber sie sagen nichts darüber aus, ob die mpl-extrazelluläre Domäne einen Liganden binden kann. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit mindestens zwei Möglichkeiten, nämlich mpl ist ein Rezeptor mit einer einzi gen Kette (Klasse eins), wie EPO-R oder G-CSFR, oder er ist eine signalweiterleitende β-Untereinheit (Klasse drei), die eine α-Untereinheit benötigt, wie IL-3 (Skoda et al. siehe oben).

VI. Der mpl-Ligand ist ein Thrombopoietin (TPO)

Wie oben beschrieben, ist vorgeschlagen worden, daß das Se rum einen einzigartigen Faktor enthält, der manchmal als Thrombopoientin (TPO) bezeichnet wird, der synergistisch mit verschiedenen anderen Zytokinen wirkt, um das Wachsen und Reifen von Megakaryozyten zu fördern. Kein solcher natürli cher Faktor ist jemals isoliert worden aus Serum oder einem anderen Ausgangsmaterial, obwohl von zahlreichen Gruppen be trächtlicher Aufwand in dieser Richtung betrieben worden ist. Obwohl es nicht bekannt ist, ob mpl direkt einen Mega karyozyten-stimulierenden Faktor binden kann, zeigen jüngste Experimente, daß mpl in die Weiterleitung eines proliferati ven Signals von einem Faktor oder von Faktoren verwickelt ist, die in dem Serum von Patienten mit aplastischem Kno chenmark gefunden werden (Methia et al., Blood, 82(5):1395- 1401 [1993]).

Ein Hinweis darauf, daß ein einzigartiger koloniestimulie render Faktor aus Serum, der sich von IL-1α, IL-33, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF und GM-CSF unterscheidet, ein proliferatives Signal durch mpl erzeugt, kommt aus der Un tersuchung der Verteilung der c-mpl-Expression in primitiven und festgelegten hämatopoetischen Zellinien und aus mpl- Antisense-Untersuchungen in einer dieser Zellinien.

Unter Verwendung von reverser Transkriptase (RT)-PCR in im munologisch gereinigten humanen hämatopoetischen Zellen zeigten Methia et al., siehe oben, daß starke mpl-mRNA- Messages nur gefunden wurden in CD34⁺ gereinigten Zellen, Megakaryozyten und Plättchen. CD34⁺-Zellen, gereinigt aus Knochenmark (BM), repräsentieren ungefähr 1% aller BM-Zellen und sind angereichert mit primitiven und festgelegten Vor läuferzellen für alle Abstammungslinien (z. B. erythroidar tig, granulomakrophagenartig und megakaryozytenartig).

Von mpl-Antisense-Oligodesoxynukleotiden wurde gezeigt, daß sie die Megakaryozyten-Koloniebildung aus der pluripotenten CD34⁺-Zelle, kultiviert in Serum von Patienten mit aplasti schem Knochenmark (einer reichen Quelle für Megakaryozyten- Kolonie-stimulierende Aktivität [MK-CSA]) unterdrücken. Diese gleiche Antisense-Oligodesoxynukleotide hatten keinen Effekt auf die Erythroid- oder Granulomakrophagen-Kolonie bildung.

Ob mpl direkt einen Liganden band und ob der Serumfaktor, von dem gezeigt wurde, daß er Megakaryozytopoese hervorruft, über mpl wirkte, war noch unbekannt. Es ist jedoch vorge schlagen worden, daß, falls mpl direkt einen Liganden band, seine Aminosäuresequenz wahrscheinlich hochkonserviert war und Kreuzreaktivität zwischen Spezies zeigt, aufgrund der beträchtlichen Sequenzidentität zwischen humanen und mpl-ex trazellulären Domänen der Maus (Vigon et al., siehe oben [1993]).

VII. Aufgaben

Angesichts des Zuvorgenannten ist es offensichtlich, daß ein gegenwärtiger und fortwährender Bedarf besteht, Moleküle zu isolieren und identifizieren, die die Proliferation, Diffe renzierung und Reifung von hämatopoetischen Zellen stimulie ren können, insbesondere von Megakaryozyten oder deren Vor läufern, für die therapeutische Verwendung bei der Behand lung von Thrombozytopenie. Es wird angenommen, daß ein sol ches Molekül ein mpl-Ligand ist, und deshalb besteht ein weiterer Bedarf zum Isolieren eines solchen Liganden bzw. solcher Liganden, um deren Rolle(n) beim Zellwachstum und der Differenzierung aufzuklären.

Demzufolge ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein pharmazeutisch reines Molekül zu erhalten, das die Prolife ration, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten zu der reifen Plättchen-produzierenden Form stimulieren kann.

Eine weitere Aufgabe ist es, ein Molekül in einer Form be reitzustellen, die für die therapeutische Verwendung bei der Behandlung von einer hämatopoetischen Störung, insbesondere von Thrombozytopenie, geeignet ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pro teinliganden zu isolieren, zu reinigen und insbesondere zu identifizieren, die in vivo an einen Rezeptor der Zytokin superfamilie, bekannt als mpl, binden können, um ein proli feratives Signal zu erzeugen.

Es ist eine weitere Aufgabe, Nukleinsäuremoleküle bereitzu stellen, die für einen solchen Proteinliganden kodieren, und diese Nukleinsäuremoleküle zu verwenden, um mpl-bindende Li ganden in rekombinanter Zellkultur für diagnostische und therapeutische Zwecke herzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe, Derivate und modifizierte For men des Proteinliganden bereitzustellen, einschließlich Ami nosäuresequenzvarianten, variante Glycoproteinformen und ko valente Derivate davon.

Eine weitere Aufgabe, Fusionpolypeptidformen bereitzustel len, die einen mpl-Liganden und ein heterologes Protein kom binieren, sowie kovalente Derivate davon.

Es ist eine weitere Aufgabe, variante Polypeptidformen be reitzustellen, die einen mpl-Liganden kombinieren mit Ami nosäureanfügungen und -substitutionen aus der EPO-Sequenz, um ein Protein zu erzeugen, das die Proliferation und das Wachstum sowohl von Plättchen als auch von roten Blutzell vorläufern regulieren kann.

Es ist eine weitere Aufgabe, Immunogene herzustellen zum Er zeugen von Antikörpern gegen mpl-Liganden oder Fusionsformen davon, wie auch Antikörper zu erhalten, die solche Liganden binden können.

Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden deutlich an hand der folgenden Beschreibung.

Die der Erfindung zugrundeliegenden Aufgaben werden gelöst durch Bereitstellen eines isolierten Proteins aus Säugern, das die megakaryozytopoetische Proliferation und Reifung fördert, bezeichnet als der mpl-Ligand" (ML) oder "Thrombopoietin" (TPO), das die Proliferation, Reifung und/oder Differenzierung von Megakaryozyten zu der reifen Plättchen-produzierenden Form stimulieren kann.

Das im wesentlichen homogene Protein kann gereinigt werden aus einem natürlichen Ausgangsmaterial nach einem Verfahren umfassend: (1) Inkontaktbringen eines Plasma-Ausgangsmateri als enthaltend die zu reinigenden mpl-Ligandenmoleküle mit einem immobilisierten Rezeptorpolypeptid, insbesondere mpl oder einem mpl-Fusionspolypeptid, immobilisiert auf einem Träger, unter Bedingungen, bei denen die zu reinigenden mpl- Ligandenmoleküle selektiv an das immobilisierte Rezeptor polypeptid adsorbiert werden, (2) Waschen des immobilisier ten Rezeptorpolypeptids und dessen Träger, um nichtadsor biertes Material zu entfernen und (3) Eluieren der mpl-Li gandenmoleküle von dem immobilisierten Rezeptorpolypeptid, an die sie adsorbiert sind, mit einem Elutionspuffer. Vor zugsweise ist das natürliche Ausgangsmaterial ein Säuger plasma oder Urin enthaltend den mpl-Liganden. Gegebenenfalls ist der Säurer aplastisch und der immobilisierte Rezeptor ist eine mpl-IgG-Fusion.

Gegebenenfalls ist das bevorzugte, die megakaryozytopoeti sche Proliferation und Reifung fördernde Protein ein iso liertes, im wesentliches homogenes mpl-Ligandenpolypeptid, hergestellt durch synthetische oder rekombinante Mittel.

Das "mpl-Liganden"-Polypeptid oder "TPO" dieser Erfindung besitzt vorzugsweise zumindestens 70% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des hochgereinigten, im wesentli chen homogenen mpl-Ligandenpolypeptids aus Schwein und min destens 80% Sequenzidentität mit der "EPO-Domäne" des mpl- Ligandenpolypeptids aus Schwein. Gegebenenfalls ist der er findungsgemäße mpl-Ligand ein reifer humaner mpl-Ligand (hML), mit der reifen Aminosäuresequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), oder eine Variante oder posttranskriptional modifizierte Form davon oder ein Protein mit ungefähr 80% Sequenzidentität mit reifem humanem mpl-Ligand. Gegebenen falls ist die mpl-Ligandenvariante ein Fragment, insbeson dere ein Aminoterminus- oder "EPO-Domäne"-Fragment des rei fen humanen mpl-Liganden (hML). Vorzugsweise enthält das aminoterminale Fragment im wesentlichen die gesamte humane ML-Sequenz zwischen dem ersten und vierten Cysteinrest, aber es kann beträchtliche Hinzufügungen, Deletionen oder Substi tutionen außerhalb dieser Region enthalten. Gemäß dieser Ausführungsform kann das Polypeptidfragment dargestellt wer den durch die Formel:

X-hML(7-151)-Y

worin hML(7-151) darstellt die humane TOP (hML)-Aminosäure sequenz von Cys⁷ bis Cys¹⁵¹ einschließlich; X stellt dar die Aminogruppe von Cys⁷ oder einen oder mehrere der aminotermi nalen Aminosäurereste des reifen hML oder Aminosäurerestver längerungen davon wie Met, Tyr oder Leadersequenzen, enthal tend z. B. proteolytische Spaltstellen (z. B. Faktor Xa oder Thrombin); und Y stellt dar die carboxyterminale Gruppe Cys¹⁵¹ oder eine oder mehrere carboxyterminale Aminosäure reste des reifen hML oder Extensionen daran.

Gegebenenfalls kann das mpl-Ligandenpolypeptid oder ein Fragment davon fusioniert werden an heterologes Polypeptid (Chimäre). Ein bevorzugtes heterologes Polypeptid ist ein Zytokin, Kolonie-stimulierender Faktor oder Interleukin oder ein Fragment davon, insbesondere kit-Ligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF oder LIF. Ein gegebenenfalls be vorzugtes heterologes Polypeptid ist eine Immunglobulin kette, insbesondere humanes IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM oder ein Fragment davon, insbesondere umfas send die konstante Domäne einer IgG-schweren Kette.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen iso lierten mpl-Agonisten, der biologisch aktiv ist und der vor zugsweise in der Lage ist, den Einbau von markierten Nukleo tiden (z. B. ³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, transfektiert mit humanem mpl, zu stimulieren. Gegebenenfalls ist der mpl-Agonist ein biologisch aktiver mpl-Ligand und ist vorzugsweise in der Lage, den Einbau von ³⁵S in zirkulierende Plättchen in einem Maus-Plättchen- Rebound-Assay zu stimulieren. Ein geeigneter mpl-Agonist um faßt hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mM1, mML2, mML3, pML und pML2 oder Fragmente davon.

Bei einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein isolierter Antikörper bereitgestellt, der an den mpl-Ligan den binden kann. Der isolierte Antikörper, der an den mpl- Liganden binden kann, kann gegebenenfalls fusioniert sein mit einem zweiten Polypeptid, und der Antikörper oder die Fusion davon kann verwendet werden zum Isolieren und Reini gen des mpl-Liganden aus einem Ausgangsmaterial, wie oben beschrieben für immobilisierten mpl. In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Nachweis des mpl-Liganden in vitro oder in vivo umfassend Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer Analy senprobe, vorzugsweise einer Serumanalysenprobe, von der an genommen wird, daß sie den Liganden enthält, und dessen Nachweis, wenn die Bindung erfolgt ist.

Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das für den mpl-Li ganden oder Fragmente davon kodiert, wobei das Nukleinsäure molekül gegebenenfalls mit einem nachweisbaren Rest markiert sein kann, und es wird ein Nukleinsäuremolekül bereitge stellt mit einer Sequenz, die komplementär ist zu oder unter moderaten oder stark stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die für einen mpl-Li ganden kodiert, hybridisiert. Bevorzugte Nukleinsäuremole küle sind solche, die einen humanen mpl-Liganden oder aus Schwein oder Maus kodiert, und sie umfassen RNA und DNA so wie genomische und cDNA. Bei einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül eine DNA, die den mpl-Liganden kodiert, und die weiterhin umfaßt einen re plizierbaren Vektor, in den die DNA funktionsfähig unter die Kontrollsequenzen gebracht wird, die von einem Wirt erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert wird. Gegebenen falls ist die DNA eine cDNA mit der Sequenz, wie in Fig. 1 gezeigt, 5′-3′ (SEQ ID NO: 2), 3′-5′ oder ein Fragment da von. Dieser Aspekt umfaßt weiterhin Wirtszellen, vorzugs weise CHO-Zellen, die mit dem Vektor transformiert sind, und ein Verfahren unter Verwendung der DNA zum Bewirken der Her stellung eines mpl-Liganden, vorzugsweise umfassend Expri mieren der cDNA, die den mpl-Liganden kodiert, in einer Kul tur der transformierten Wirtszellen und Gewinnen des mpl-Li ganden aus den Wirtszellen oder der Wirtszellkultur. Der auf diese Weise hergestellte mpl-Ligand ist vorzugsweise ein hu maner mpl-Ligand.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Behandeln eines Säugers mit einer hämatopoetischen Störung, insbeson dere mit Thrombozytopenie, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines mpl-Liganden an den Säu ger. Gegebenenfalls wird der mpl-Ligand verabreicht in Kom bination mit einem Zytokin, insbesondere einem Kolonie-sti mulierenden Faktor oder Interleukin. Bevorzugte Kolonie-sti mulierende Faktoren oder Interleukine umfassen kit-Ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 und IL-11.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von TPO (ML) aus einem TPO-produzierenden Mi kroorganismus, umfassend:

(1) Aufbrechen oder Lysieren von Zellen enthaltend TPO,
(2) gegebenenfalls Abtrennen von löslichem Material von un löslichem Material enthaltend TPO,
(3) Solubilisieren von TPO in dem unlöslichen Material mit einem Solubilisierungspuffer,
(4) Abtrennen von solubilisiertem TPO von anderem löslichem oder unlöslichem Material,
(5) Zurückfalten von TPO in einem Redoxpuffer, und
(6) Abtrennen von richtig gefaltetem TPO von falsch gefalte tem TPO.

Das Verfahren stellt zum Solubilisieren des unlöslichen Ma terials, enthaltend TPO, ein chaotropes Mittel bereit, wobei das chaotrope Mittel ausgewählt wird aus einem Salz von Guanidin, Natriumthiocyanat oder Harnstoff. Das Verfahren stellt weiterhin bereit, daß solubilisiertes TPO von anderem löslichem oder unlöslichem Material getrennt wird durch einen oder mehrere Schritte ausgewählt aus Zentrifugation, Gelfiltration und Umkehrphasenchromatographie. Der Rückfal tungsschritt des Verfahrens stellt einen Redoxpuffer bereit, enthaltend ein oxidierendes und reduzierendes Mittel. Übli cherweise ist das oxidierende Mittel Sauerstoff oder eine Verbindung enthaltend zumindest eine Disulfidbindung, und das reduzierende Mittel ist eine Verbindung enthaltend zu mindestens eine freie Sulfhydrylgruppe. Vorzugsweise wird das oxidierende Mittel ausgewählt aus oxidiertem Glutathion (GSSG) und Cystin, das reduzierende Mittel wird ausgewählt aus reduziertem Glutathion (GSH) und Cystein. Besonders be vorzugt als oxidierendes Mittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG) und das reduzierende Mittel ist reduziertes Glutathion (GSH). Es ist auch bevorzugt, daß das molare Ver hältnis des oxidierenden Mittels gleich oder größer ist als das des reduzierenden Mittels. Der Redoxpuffer enthält zu sätzlich ein Detergens, vorzugsweise ausgewählt aus CHAPS und CHAPSO, das in einer Menge von mindestens 1% vorliegt. Der Redoxpuffer enthält zusätzlich NaCl, vorzugsweise mit einer Konzentration in dem Bereich von ungefähr 0,1-0,5 M, und Glycerol, vorzugsweise bei einer Konzentration von grö ßer als 15%. Der pH des Redoxpuffers liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr pH 7,5-pH 9,0, und der Rückfal tungsschritt wird durchgeführt in 4 Stufen für 12-48 Stun den. Der Rückfaltungsschritt erzeugt biologisch aktives TPO, in dem eine Disulfidbindung ausgebildet wird zwischen dem Cystein, das dem Aminoterminus am nächsten ist, mit dem Cystein, das dem Carboxyterminus der EPO-Domäne am nächsten ist.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Reinigen von biologisch aktivem TPO aus einem Mikroorganismus umfas send:

(1) Lysieren von zumindest der extrazellulären Membran des Mikroorganismus,
(2) Behandeln des Lysats enthaltend TPO mit einem chaotropen Agenz
(3) Rückfalten des TPO, und
(4) Abtrennen von Verunreinigungen und falsch gefaltetem TPO von richtig gefaltetem TPO.

Fig. 1 zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) aus der humanen mpl-Liganden-(hML)-cDNA und der kodierenden Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2). Die Nukleotide sind am Be ginn einer jeden Zeile numeriert. Die nichttranslatierten 5′- und 3′-Bereiche sind durch Kleinbuchstaben angegeben. Die Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, be ginnend bei Ser 1 der Proteinsequenz des reifen mpl-Liganden (ML). Die Grenzen des vermuteten Exon 3 sind gekennzeichnet durch die Pfeile, und die potentiellen N-Glycosylierungs stellen sind durch Rechtecke eingerahmt. Cysteinreste sind durch einen Punkt oberhalb der Sequenz gekennzeichnet. Die unterstrichene Sequenz entspricht der N-terminalen Sequenz, die für den mpl-Liganden ermittelt wurde, der aus Schweine plasma isoliert wurde.

Fig. 2 zeigt das Verfahren, das verwendet wurde für den Assay zum Nachweis des ³H-Thymidineinbaus durch den mpl-Li ganden. Zum Bestimmen der Anwesenheit des mpl-Liganden in verschiedenen Quellen wurde den mpl P-haltigen Ba/F3-Zellen IL-3 für 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂ und Luft entzogen. Auf den IL-3-Entzug folgend wurden die Zellen ausplattiert in 96-Lochplatten mit oder ohne verdünnten Analysenproben und für 24 Stunden in einem Zellkulturinkubator kultiviert. 20 µl serumfreie RPMI-Me dien, enthaltend 1 µCi ³H-Thymidin, wurden jedem Loch für mindestens 6-8 Stunden zugesetzt. Dann wurden die Zellen auf 96-Lochfilterplatten geerntet und mit Wasser gewaschen. Die Filter wurden ausgezählt.

Fig. 3 zeigt den Effekt von Pronase, DTT und Wärme auf die Fähigkeit von APP, die Ba/F3-mpl-Zellproliferation zu stimu lieren. Für den Pronaseabbau von APP wurde Pronase (Boehringer Mannheim) oder Rinderserumalbumin gekoppelt an Affi-Gel 10 (Biorad) und jeweils inkubiert mit APP für 18 h bei 37°C. Anschließend wurden die Harze entfernt durch Zen trifugation, und die Überstände wurden getestet. APP wurde auch erwärmt auf 80°C für 4 min oder auf 100 µM DTT einge stellt, gefolgt von der Dialyse gegen PBS.

Fig. 4 zeigt die Elution der mpl-Ligandenaktivität von Phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose und Ultralink-mpl-Säulen. Fraktionen 4-8 von der mpl-Affinitätssäule waren die Frak tionen mit der Spitzenaktivität, die von der Säule eluiert wurden.

Fig. 5 zeigt die SDS-PAGE von eluierten Ultralink-mpl-Frak tionen. Zu 200 µl einer jeden Fraktion 2-8 wurde 1 ml Aceton zugesetzt enthaltend 1 mM HCl bei -20°C. Nach 3 h bei -20°C wurden die Analysenproben zentrifugiert, und die erhaltenen Pellets wurden zweimal mit Aceton bei -20°C gewaschen. Die Acetonpellets wurden anschließend aufgelöst in 30 µl SDS-So lubilisierungspuffer, auf 100 µM DTT eingestellt und erwärmt bei 90°C für 5 min. Die Analysenproben wurden dann aufge trennt auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamidgel, und die Pro teine wurden sichtbar gemacht durch Silberfärbung.

Fig. 6 zeigt die Elution von mpl-Ligandenaktivität aus SDS- PAGE. Fraktion 6 von der mpl-Affinitätssäule wurde aufge trennt auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamidgel unter nichtredu zierenden Bedingungen. Auf die Elektrophorese folgend wurde das Gel in 12 gleiche Streifen geschnitten und elektroelu iert, wie beschrieben in den Beispielen. Die elektroeluierte Analysenprobe wurde dialysiert in PBS und analysiert bei einer 1/20 Verdünnung. Die Mr-Standards, die zum Kalibrieren des Gels verwendet wurden, waren Novex Mark 12-Standards.

Fig. 7 zeigt die Wirkung von APP, verarmt an mpl-Ligand, auf humane Megakaryozytopoese. Das an mpl-Ligand verarmte APP wurde hergestellt durch Durchleiten von 1 ml über eine 1 mpl-Affinitätssäule (700 µg mpl-IgG/ml NHS-Superose, Phar macia). Humane periphere Stammzellkulturen wurden auf 10% APP oder 10% mpl-ligandenverarmtes APP eingestellt und für 12 Tage kultiviert. Die Megakaryozytopoese wurde quantifi ziert, wie beschrieben in den Beispielen.

Fig. 8 zeigt die Wirkung von mpl-IgG auf die Stimulierung der humanen Megakaryozytopoese durch APP. Humane periphere Stammzellkulturen wurden auf 10% APP eingestellt und für 12 Tage kultiviert. Am Tag 0, 2 und 4 wurde mpl-IgG (0,5 µg) oder ANP-R-IgG (0,5 µg) zugesetzt. Nach 12 Tagen wurde die Megakaryozytopoese quantifiziert, wie in den Beispielen be schrieben. Der Mittelwert von zweifachen Analysenproben ist graphisch dargestellt, mit den tatsächlichen zweifachen Da ten in Klammern.

Fig. 9 zeigt beide Stränge eines 390 bp-Fragments von huma ner genomischer DNA, die den mpl-Liganden kodiert. Die ge folgerte Aminosäuresequenz für "Exon 3" (SEQ ID NO: 3), die kodierende Sequenz (SEQ ID NO: 4) und deren komplementäre Sequenz (SEQ ID NO: 5) sind gezeigt.

Fig. 10 zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz des reifen humanen mpl-Liganden (hML) (SEQ ID NO: 6) und von reifem hu manem Erythropoietin (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Die vorherge sagte Aminosäuresequenz für den humanen mpl-Liganden ist ausgerichtet (aligned) mit der humanen Erythropoietin sequenz. Identische Aminosäuren sind eingerahmt und Lücken, die zur optimalen Ausrichtung eingeführt sind, sind durch Striche gekennzeichnet. Potentielle N-Glycosylierungsstellen sind unterstrichen mit einer durchgezogenen Linie für das hML und mit einer unterbrochenen Linie für hEPO. Die zwei für die Erythropoietinaktivität wichtigen Cysteine sind durch einen großen Punkt gekennzeichnet.

Fig. 11 zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz von reifen humanen mpl-Ligandenisoformen hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) und hML4 (SEQ ID NO: 10).

Identische Aminosäuren sind eingerahmt und Lücken, die zur optimalen Ausrichtung eingeführt wurden, sind durch Striche gekennzeichnet.

Fig. 12A, 12B und 12C zeigen die Wirkung von humanen mpl- Liganden auf die Ba/F3-mpl-Zellproliferation (A), die humane Megakaryozytopoese in vitro, quantifiziert unter Verwendung eines radiomarkierten IgG monoklonalen Mäuseantikörpers, der spezifisch ist für das Megakaryozyten-Glycoprotein GPII_bIII_a (B), und die Thrombopoese in Maus, gemessen in einem Plätt chen-Rebound-Assay (C).

293-Zellen wurden transfektiert durch das CaPO₄-Verfahren (Gorman, C in DNA Cloning: A New Approach 2 : 143-190 [1985]) mit pRK5-Vektor alleine, pRK5-hML oder mit pRK5-ML₁₅₃ über Nacht (pRK5-ML₁₅₃ wurde erzeugt durch Einführen eines Stopp codons nach dem Rest 153 von hML durch PCR). Die Medien wur den für 36 h konditioniert und getestet auf die Stimulation der Zellproliferation von Ba/F3-mpl, wie beschrieben in Bei spiel 1 (A), oder auf humane Megakaryozytopoese in vitro (B). Die Megakaryozytopoese wurde quantifiziert mit Hilfe eines ¹²⁵I radiomarkierten IgG-monoklonalen Mäuseantikörpers (HP1-1D) gegen das Megakaryozyten-spezifische Glycoprotein GPII_bIII_a, wie beschrieben (Grant et al., Blood 69 : 1334-1339 [1987]). Der Effekt von teilsweise gereinigtem rekombinanten ML (rML) auf die in vivo Plättchenproduktion (C) wurde er mittelt mit Hilfe des Rebound-Thrombozytose-Assays, wie be schrieben von McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144 : 1006-10012 [1973]. Teilweise gereinigtes rML wurde her gestellt aus 200 ml konditioniertem Medium enthaltend das rekombinate ML. Das Medium wurde über eine 2 ml Blue-Sepa rose-Säule geleitet, die equilibriert war in PBS, und die Säule wurde gewaschen mit PBS und eluiert mit PBS enthaltend jeweils 2M Harnstoff und NaCl. Die aktive Fraktion wurde dialysiert in PBS und auf 1 mg/ml mit Endotoxin-freiem BSA eingestellt. Die Analysenprobe enthielt weniger als eine Einheit Endotoxin/ml. Mäuse wurden injiziert mit jeweils 64 000, 32 000 oder 16 000 Einheiten rML oder dem Hilfsstoff alleine. Jede Gruppe bestand aus sechs Mäusen. Der Mittel wert und die Standardabweichung einer jeden Gruppe ist ge zeigt. p-Werte wurden ermittelt mit Hilfe eines 2-Tailed-T- Tests unter Vergleich der in der Mitte liegenden Werte (medians).

Fig. 13 vergleicht die Wirkung von humanen mpl-Ligandeniso firmen und Varianten in dem Ba/F3-mpl-Zellproliferations assay. hML, Mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) und hML₁₅₃ wurden getestet unter verschiedenen Verdünnungen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Fig. 14A, 14B und 14C zeigen die gefolgerte Aminosäure sequenz (SEQ ID NO: 1) von humanen mpl-Liganden (hML) oder humanem TPO (hTPO) und der humanen genomischen DNA-kodieren den Sequenz (SEQ ID NO: 11). Nukleotide und Aminosäurereste sind am Anfang einer jeden Zeile numeriert.

Fig. 15 zeigt eine SDS-PAGE von gereinigtem 293-rhML₃₃₂ und gereinigtem 293-rhML₁₅₃.

Fig. 16 zeigt die Nukleotidsequenz: cDNA-kodierende Sequenz (SEQ ID NO: 12) und gefolgerte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 13) des offenen Leserasters einer ML-Isoform der Maus. Diese reife mpl-Ligandenisoform der Maus enthält 331 Aminosäure reste, vier weniger als der mutmaßliche vollständige mML, und er wird deshalb als mML2 bezeichnet. Die Nukleotide sind am Beginn einer jeden Zeile numeriert. Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1. Die po tentiellen N-Glycosylierungsstellen sind unterstrichen. Cysteinreste sind gekennzeichnet durch einen Punkt oberhalb der Sequenz.

Fig. 17 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 14) und die ge folgerte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 15) dieser ML-Mäuseiso form (mML). Die Nukleotide sind numeriert an dem Beginn einer jeden Zeile. Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1. Diese reife mpl-Ligandeniso form der Maus enthält 335 Aminosäurereste, und ist vermut lich der vollständige mpl-Ligand, bezeichnet mML. Die Signalsequenz ist gekennzeichnet durch eine unterbrochene Unterstreichung, und der wahrscheinliche Punkt der Spaltung ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die nichttranslatierten 5′- und 3′-Regionen sind durch Kleinbuchstaben gekennzeich net. Die Deletionen, die aufgefunden wurden als das Ergebnis von alternativem Spleißen (mML2 und mML3), sind unterstri chen. Die vier Cysteinreste sind durch einen Punkt gekenn zeichnet. Die sieben potentiellen N-Glycosylierungsstellen sind eingerahmt.

Fig. 18 vergleicht die gefolgerte Aminosäuresequenz der hu manen ML-Isoform hML3 (SEQ ID NO: 9) und einer Mäuse-ML-Iso form, als mML3 (SEQ ID NO: 16) bezeichnet. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für den humanen mpl-Liganden ist mit der mpl-Ligandensequenz der Maus ausgerichtet. Identische Ami nosäuren sind eingerahmt und Lücken, die eingeführt wurden für die optimale Ausrichtung, sind durch Striche gekenn zeichnet. Aminosäuren sind am Beginn einer jeden Zeile nume riert.

Fig. 19 vergleicht die vorhergesagte Aminosäuresequenzen von reifen ML-Isoformen aus Mäuse-ML (SEQ ID NO: 17), Schweine- ML (SEQ ID NO: 18) und humanem ML (SEQ ID NO: 6). Die Ami nosäuresequenzen sind mit Lücken ausgerichtet, die durch Striche gekennzeichnet sind, die eingeführt wurden zur opti malen Ausrichtung. Aminosäurereste sind an dem Beginn einer jeden Zeile numeriert, wobei identische Reste eingerahmt sind. Potentielle N-Glycosylierungsstellen sind durch eine schraffierte Box gekennzeichnet, und die Cysteinreste sind mit einem Punkt gekennzeichnet. Das konservierte dibasische Aminosäuremotiv, das eine potentielle Proteasespaltstelle darstellt, ist unterstrichen. Die vier Aminosäurenlange De letion, die in allen drei Spezies (ML2) vorkommt, ist durch eine fett gedruckte Box gekennzeichnet.

Fig. 20 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 19) und die vor hergesagte reife Proteinsequenz (SEQ ID NO: 18) einer Schweine-ML-Isoform (pML). Diese mpl-Ligandenisoform aus Schwein enthält 332 Aminosäurereste und ist vermutlich der vollständige mpl-Ligand aus Schwein, bezeichnet als pML. Die Nukleotide sind am Anfang einer jeden Zeile numeriert. Die Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, begin nend mit Ser 1.

Fig. 21 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 20) und vorherge sagte reife Proteinsequenz (SEQ ID NO: 21) einer Schweine- ML-Isoform (pML2). Diese mpl-Ligandenisoform aus Schwein enthält 328 Aminosäurereste und stellt eine Form mit einer Deletion von vier Resten des vollständigen mpl-Liganden aus Schwein dar, bezeichnet als pML2. Die Nukleotide sind an dem Beginn einer jeden Zeile numeriert. Die Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1.

Fig. 22 vergleicht die gefolgerte Aminosäuresequenz für die vollständige ML-Isoform aus Schwein pML (SEQ ID NO: 18) und eine ML-Isoform aus Schwein, bezeichnet als pML2 (SEQ ID NO: 21). Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für das pML ist ausgerichtet mit der pML2-Sequenz. Identische Aminosäuren -sind eingerahmt und Lücken, die für die optimale Ausrichtung eingeführt wurden, sind durch Striche gekennzeichnet. Die Aminosäuren sind am Beginn einer jeden Zeile numeriert.

Fig. 23 zeigt die relevanten Merkmale von Plasmid pSVI5.ID.LL.MLORF ("vollständig" ("full length") oder TPO₃₃₂), das verwendet wurde zum Transfektieren der CHO-DP12- Wirtszellen zum Herstellen von CHO-rhTPO₃₃₂.

Fig. 24 zeigt die relevanten Merkmale von Plasmid pSVI5.ID.LL.MLEPO-D ("verkürzt" oder TPO₁₅₃), das verwendet wurde zum Transfektieren der CHO-DP12-Wirtszellen zum Her stellen von CHO-rhTPO₁₅₃.

Fig. 25A, 25B und 25C zeigen den Effekt von E. Coli-rhTPO (_Met ^-1 _{, 153}) auf Plättchen (A), rote Blutzellen (B) und (C) weiße Blutzellen in normalen Mäusen. Zwei Gruppen von je weils 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 0,3 g E. Coli-rhTPO(_Met ^-1 _{, 153}) (100 µl sc.). Am Tag 0 und am Tag 3-7 wurden 40 µl Blut aus dem Orbitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort verdünnt in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels, und die Ge samtblutauszählung wurde erhalten mittels eines Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Die Daten sind als Mittel werte ± der Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Fig. 26A, 26B und 26C zeigen den Effekt von E. Coli rhTPO(_Met ^-1 _{, 153}) auf Plättchen (A), rote Blutzellen (B) und (C) weiße Blutzellen in sublethal bestrahlten Mäusen. Zwei Gruppen von 10 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden sublethal be strahlt mit 750 cGy einer Gammastrahlung aus einer ¹³⁷Cs- Quelle und täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 3,0 g E. Coli-rhTPO(_Met ^-1 _{, 153}) (100 µl sc.). Am Tag 0 und an anschließenden Zeitpunkten wurden 40 µl Blut aus dem Or bitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels verdünnt, und die Gesamt blutauszählung wurde erhalten auf einem Serrono Baker Hema tology Analyzer 9018. Die Daten sind als Mittelwerte ± Stan dardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Fig. 27A, 27B und 27C zeigen den Effekt von CHO-rhTPO₃₃₂ auf (A) Plättchen (Thrombozyten), (B) rote Blutzellen (Erythrozyten) und (C) weiße Blutzellen (Leukozyten) in nor malen Mäusen. Zwei Gruppen von 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 0,3 µg CHO-rhTPO₃₃₂ (100 µl sc.). Am Tag 0 und an Tagen 3-7 wurden 40 µl Blut aus dem Orbitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels ver dünnt, und die Gesamtblutauszählung wurde erhalten mit einem Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Fig. 28 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve für verschiedene For men von rhTPO, erhalten aus verschiedenen Zellinien. Die Do sis-Antwort-Kurven wurden für rhTPO aus den folgenden Zelli nien erstellt: hTPO₃₃₂ aus CHO (vollständig, aus Ovarienzel len des chinesischen Hamsters); hTPO_Met ^-1 _{, 153} (von E. Coli- stammende verkürzte Form mit einem N-terminalen Methionin); hTPO₃₃₂ (vollständiges TPO aus humanen 293-Zellen); Met freies 155 E-Coli (die verkürzte Form [rhTPO₁₅₅] ohne das N- terminale Methionin von E. Coli). Gruppen von 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich für 7 Tage injiziert mit rhTPO, abhängig von der Gruppe. An jedem Tag wurden 40 µl Blut aus dem Orbitalsinus für die Gesamtblutauszählung entnommen. Die oben gezeigten Daten stellen die maximale Wirkung dar, die mit den verschiedenen Behandlungen beobachtet wurden, und mit der Ausnahme von (Met 153 E-Coli) folgte dies am Tag 7 der Behandlung. In der zuvorerwähnten "Met 153 E-Coli"- Gruppe wurde der maximale Effekt am Tag 5 beobachtet. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittel werts angegeben.

Fig. 29 zeigt die Dosis-Antwort-Kurven, bei denen die Aktivi tät von vollständigen und "gestutzten" ("cliped") Formen von rhTPO, hergestellt in CHO-Zellen, mit der verkürzten Form aus E. Coli verglichen wird. Gruppen von 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich injiziert mit 0,3 µg rhTPO von ver schiedenen Typen. An Tagen 2-7 wurden 40 µl Blut aus dem Or bitalsinus für die Gesamtblutauszählung entnommen. Behand lungsgruppen waren TPO₁₅₃, der verkürzten Form von TPO aus E. Coli; TPO₃₃₂ (gemischte Fraktion) vollständiges TPO enthal tend ungefähr 80-90% vollständiges und 10-20% gestutzte For men; TPO₃₃₂ (30K-Fraktion) = gereinigte, gestutzte Fraktion aus der ursprünglichen "Mix"-Präparation; TPO₃₃₂ (70K-Frak tion) = gereinigte Fraktion mit vollständigem TPO aus der ursprünglichen "Mix"-Präparation. Die Daten sind als Mittel werte ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Fig. 30 ist ein Kartoon, der den KIRA-ELISA-Assay zum Messen von TPO zeigt. Die Figur zeigt die MPL/Rse.gD-Chimäre und relevante Teile des Ausgangsrezeptors wie auch das endgül tige Konstrukt (rechter Teil der Figur) und ein Fließdia gramm (linker Teil der Figur), das die relevanten Schritte des Assays zeigt.

Fig. 31 ist ein Fließdiagramm für den KIRA-ELISA-Assay, das jeden Schritt des Verfahrens zeigt.

Fig. 32A-32L geben die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 22) des pSVI17.ID.LL Expressionsvektors an, der zur Expression von Rse.gD in Beispiel 17 verwendet wurde.

Fig. 33 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP1.

Fig. 34 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP21.

Fig. 35 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP151.

Fig. 36 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP202.

Fig. 37 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP172.

Fig. 38 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP210.

Fig. 39 zeigt eine Tabelle der fünf besten TPO-exprimieren den Klone aus der pMP210-Plasmidbank (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 und 28).

Fig. 40 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP41.

Fig. 41 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP57.

Fig. 42 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP251.

I. Definitionen

Im allgemeinen besitzen die folgenden Worte und Ausdrücke die angegebene Bedeutung, wenn sie in der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen verwendet werden.

"Chaotropes Mittel" bedeutet eine Verbindung, die in einer wäßrigen Lösung und in einer geeigneten Konzentration eine Änderung in der räumlichen Konfiguration oder Konformation eines Proteins hervorrufen kann durch zumindest teilweise Zerstörung der Kräfte, die verantwortlich sind zum Aufrecht erhalten der normalen sekundären und tertiären Struktur des Proteins. Solche Verbindungen umfassen z. B. Harnstoff, Gua nidin-HCl und Natriumthiocyanat. Hohe Konzentrationen, übli cherweise 4-9 M, dieser Verbindungen sind normalerweise er forderlich, um den Einfluß auf die Konformation des Proteins auszuüben.

"Zytokin" ist ein allgemeiner Begriff für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als interzelluläre Mediatoren wirken. Beispiele für solche Zytokine sind Lymphokine, Monokine und traditionelle Polypeptidhormone. Eingeschlossen unter den Zytokinen werden Wachstumshormon, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon, humanes N-Methionyl-Wachstumshormon, Rin derwachstumshormon, Parathyroidhormon, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glycoproteinhormone wie Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH), hämatopoeti scher Wachstumsfaktor, hepatischer Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Prolaktin, Plazentalaktogen, Tumornekrosisfaktor-α (TNF-α und TNF-β) Mullerian-inhibie rende Substanz, Gonadotropin-assoziiertes Peptid der Maus, Inhibin, Aktivin, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, Integrin, Nervenwachstumsfaktoren wie NGF-β, Plättchenwachs tumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs) wie TGF-α und TGF-β, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II, Erythropoietin (EPO), osteoinduktive Faktoren, Interferone wie Interferon-α, -β, -γ, koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulozyten-Makropha gen-CSF (GM-CSF) und Granulozyten-CSF (G-CSF), Interleukine (IL′s) wie IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 und andere Polypeptidfaktoren ein schließlich LIF, SCF und kit-Ligand. Wie hierin verwendet bedeuten die zuvorgenannten Ausdrücke, daß sie Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Zellkulturen um fassen. Ähnlich sollen die Begriffe auch biologisch aktive Äquivalente umfassen; z. B. die sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren oder in der Art oder dem Ausmaß der Glycosylierung unterscheiden.

"mpl-Ligand", "mpl-Ligandenpolypeptid", "ML", "Thrombopoietin" oder "TPO" werden austauschbar hierin ver wendet und umfassen ein beliebiges Polypeptid, das die Ei genschaft zur Bindung an mpl, ein Mitglied der Zytokinrezep torsuperfamilie, besitzt, und das eine biologische Eigen schaft des ML, wie oben definiert, besitzt. Eine beispiel hafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, den Einbau von markierten Nukleotiden (z. B.³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, transfektiert mit humanem mpl P, zu stimulieren. Eine weitere beispielhafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, den Einbau von ³⁵S in zirku lierende Plättchen in einem Mäuse-Plättchen-Rebound-Assay zu stimulieren. Diese Definition umfaßt das Polypeptid, iso liert aus einer mpl-Ligandenquelle, wie aus einem hierin be schriebenen aplastischen Schweineplasma, oder aus einer an deren Quelle (Ausgangsmaterial), wie einer anderen Tierart, einschließlich Mensch, oder hergestellt durch rekombinante oder synthetische Verfahren, und es umfaßt variante Formen einschließlich funktionelle Derivate, Fragmente, Allele, Isoformen und Analoga davon.

Ein "mpl-Ligandenfragment" oder "TPO-Fragment" ist ein Teil eines natürlich vorkommenden reifen vollständigen mpl-Ligan den oder einer TPO-Sequenz, wobei eine oder mehrere Ami nosäurereste oder Kohlenhydrateinheiten deletiert sind. Die deletierten Aminosäurereste bzw. -rest können an beliebiger Stelle in dem Peptid vorkommen, einschließlich entweder an dem N-terminalen Ende oder dem C-terminalen Ende oder inner halb der Sequenz. Das Fragment teilt zumindestens eine bio logische Eigenschaft gemeinsam mit dem mpl-Liganden. Mpl- Ligandenfragmente haben eine fortlaufende Sequenz von minde stens 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, die iden tisch sind zu der Sequenz des mpl-Liganden, isoliert aus einem Säuger einschließlich dem Liganden isoliert von apla stischem Schweineplasma oder dem humanen oder Mäuseliganden, insbesondere der EPO-Domäne davon. Repräsentative Beispiele des N-terminalen Fragments sind hML₁₅₃ oder TPO (Met^-1 1- 153).

"Mpl-Ligandenvarianten" oder "mpl-Ligandensequenzvarianten" wie hierin definiert, bedeuten einen biologisch aktiven mpl- Liganden, wie unten definiert, mit weniger als 100% Sequenz identität mit dem mpl-Liganden, isoliert aus rekombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma oder dem humanen Liganden mit der gefolgerten Sequenz, wie beschrieben in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1). Üblicherweise besitzt eine biologisch aktive mpl-Ligandenvariante eine Aminosäuresequenz mit min destens ungefähr 70% Aminosäuresequenzidentität mit dem mpl- Liganden isoliert aus aplastischem Schweineplasma oder dem reifen Mäuse- oder humanen Liganden oder Fragmenten davon (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), vorzugsweise mindestens unge fähr 75%, ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr 80%, noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 85% und noch mehr bevorzugt sind mindestens ungefähr 90% und am bevorzugtesten sind mindestens ungefähr 95% Identität.

Ein "chimärer mpl-Ligand" ist ein Polypeptid umfassend den vollständigen mpl-Liganden oder eines oder mehrere Fragmente davon, die fusioniert oder gebunden sind an ein zweites he terologes Polypeptid oder ein oder mehrere Fragmente davon. Die Chimäre hat mindestens eine biologische Eigenschaft ge meinsam mit dem mpl-Liganden. Das zweite Polypeptid wird ty pischerweise ein Zytokin, Immunglobulin oder Fragmente davon sein.

"Isolierter mpl-Ligand", "hochgereinigter mpl-Ligand" und "im wesentlicher homogener mpl-Ligand" sind austauschbar und bedeuten einen mpl-Liganden, der gereinigt worden ist aus einer mpl-Ligandenquelle oder der hergestellt worden ist durch rekombinante oder synthetische Verfahren, und der aus reichend frei ist von anderen Peptiden oder Proteinen, (1) um zumindestens 15 und vorzugsweise 20 Aminosäurereste an dem N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Spinnung-Cup-Sequenzautomaten oder des be sten gewerblich erhältlichen Aminosäuresequenzierautomaten auf dem Markt oder nach modifizierten, am Einreichungstag der vorliegenden Erfindung veröffentlichten Verfahren, zu erhalten, oder (2) der bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen un ter Verwendung von Coomassie Blue oder vorzugsweise von Sil berfärbung gereinigt ist. Homogenität hier bedeutet eine Verunreinigung von weniger als 5% mit anderen Proteinen des Ausgangsmaterials.

"Biologische Eigenschaft", wenn verwendet in Verbindung mit entweder dem "mpl-Liganden" oder "isoliertem mpl-Liganden", bedeutet, daß er thrombopoetische Aktivität besitzt oder eine in vivo Effektor- oder Antigenfunktion oder Aktivität, die direkt oder indirekt verursacht oder ausgeübt wird durch einen mpl-Liganden (entweder in seiner nativen oder denatu rierten Konformation) oder von einem Fragment davon. Effek torfunktionen umfassen mpl-Bindung und jede Trägerbindungs aktivität, Agonismus oder Antagonismus von mpl, insbesondere die Erzeugung (Transduktion) eines proliferativen Signals, einschließlich Replikation, DNA-regulierende Funktion, Modu lation der biologischen Aktivität von anderen Zytokinen, Re zeptor(insbesondere Zytokin)-Aktivierung, Deaktivierung, Hoch- und Runterregulierung, Zellwachstum oder Differenzie rung und ähnliches. Eine antigene Funktion bedeutet besitzen eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die in der Lage ist, mit Antikörpern kreuzzureagieren, die gegen den nativen mpl-Liganden gerichtet sind. Die grundlegende antigene Funk tion eines mpl-Ligandenpolypeptids liegt darin, daß es mit einer Affinität von mindestens ungefähr 10⁶ l/Mol an einen Antikörper bindet, der gegen den mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma, hergestellt ist. Üblicherweise bindet das Polypeptid mit einer Affinität von mindestens un gefähr 10⁷ l/Mol. Besonders bevorzugt ist das antigenisch aktive mpl-Ligandenpolypeptid, das an einen Antikörper bin det, der gegen den mpl-Liganden mit einer der oben beschrie benen Effektorfunktionen gerichtet ist. Die Antikörper, die verwendet wurden zum Definieren von "biologischer Aktivi tät", sind polyklonale Kaninchenantikörper, die erhalten wurden durch Formulieren des mpl-Liganden, isoliert aus re kombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma, in Freund′s vollständigem Adjuvants, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperito neale Injektion der Formulierung, bis der Titer des mpl- Ligandenantikörpers ein Plateau erreicht.

"Biologisch aktiv", wenn verwendet in Verbindungen mit ent weder dem "mpl-Liganden" oder "isoliertem mpl-Ligand" bedeu tet ein mpl-Ligand oder Polypeptid, der bzw. das thrombopoe tische Aktivität zeigt oder eine Effektorfunktion mit dem mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma oder exprimiert in rekombinanter Zellkultur, wie hierin beschrie ben, teilt. Eine prinzipiell bekannte Effektorfunktion des mpl-Liganden oder des Polypeptids ist hierin die Bindung an mpl und die Stimulierung des Einbaus von markierten Nukleo tiden (³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3- Zellen, transfektiert mit humanem mpl P. Eine weitere be kannte Effektorfunktion des mpl-Liganden oder des Polypep tids hierin ist die Fähigkeit zum Stimulieren des Einbaus von ³⁵S in zirkulierende Plättchen in einem Mäuse-Plättchen- Rebound-Assay. Eine weitere bekannte Effektorfunktion des mpl-Liganden ist die Fähigkeit, in vitro die humane Mega karyozytopoese zu stimulieren, die quantifiziert werden kann unter Verwendung eines radiomarkierten monoklonalen Antikör pers, der spezifisch ist für das Megakaryozytenglycoprotein GPII_bIII_a.

"Prozent Aminosäuresequenzidentität" hinsichtlich der mpl- Ligandensequenz ist hierin definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in der fraglichen Sequenz, die identisch sind mit den Resten in der mpl-Ligandensequenz, isoliert aus aplastischem Scheineplasma oder dem Mäuse- oder humanen Li ganden mit der gefolgerten Aminosäuresequenz, wie beschrie ben in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), nach Ausrichten der Sequenzen und Einführen von Lücken, falls erforderlich, um die maxi male prozentuale Sequenzidentität zu erzielen, und wobei konservative Austausche nicht als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die mpl-Ligandensequenz werden als die Sequenzidentität oder Ho mologie beeinflussend angesehen. Somit umfassen beispiel hafte biologisch aktive mpl-Ligandenpolypeptide, von denen eine identische Sequenz angenommen wird, Präpro-mpl-Ligand, Pro-mpl-Ligand und reifer mpl-Ligand.

"Mpl-Ligandenmikrosequenzierung" kann durchgeführt werden durch ein jedes geeignetes Standardverfahren, vorausgesetzt das Verfahren ist sensitiv genug. Bei einem solchen Verfah ren wird hochgereinigtes Polypeptid, erhalten von SDS-Gelen oder einem abschließenden HPLC-Schritt, direkt sequenziert durch einen automatisierten Edman (Phenylisothiocyanat)-Ab bau unter Verwendung eines Modells 470A Applied Biosystems Gasphasensequenzierautomaten, ausgestattet mit einem 120A Phenylthiohydantion (PTH)-Aminosäureanalysator. Weiterhin können mpl-Ligandenfragmente, hergestellt durch chemischen (z. B. CNBr, Hydroxylamin, 2-Nitro-5-thiocyanobenzoat) oder enzymatischen (z. B. Trypsin, Clostripain, Staphylokokkuspro tease) Verdau, gefolgt von der Fragmentreinigung (z. B. HPLC), auf ähnliche Weise sequenziert werden. PTH-Aminosäu ren werden analysiert mit Hilfe des ChromPerfect-Daten systems (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Die Sequenz interpretation wird durchgeführt auf einer VAX 11/785 Digi tal Dquipment Co. Computer, wie beschrieben bei Henzel et al., J. Chromatography, 404 : 41-52 [1987]. Gegebenenfalls können Aliquots der HPLC-Fraktionen einer Elektrophorese un terzogen werden auf 5-20% SDS-PAGE, elektrotransferiert wer den auf eine PVDF-Membran (ProBlott, AIB, Foster City, CA) und gefärbt werden mit Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262 : 10 035-10 038 [1987]). Ein durch die Färbung identifiziertes spezielles Protein wird aus dem Blot ausgeschnitten und die N-terminale Sequenzie rung wird durchgeführt mit dem oben beschriebenen Gasphasen sequenzierautomaten. Für interne Proteinsequenzen werden HPLC-Fraktionen unter Vakuum (SpeedVAC) getrocknet, resus pendiert in geeignetem Puffer und verdaut mit Cyanbromid, dem Lys-spezifischen Enzym Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) oder Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Nach Verdauung werden die erhaltenen Peptide sequenziert als eine Mischung oder nach HPLC-Auftrennung auf einer C4-Säule, die mit einem Propanolgradienten in 0,1% TFA vor dem Gasphasen sequenzieren entwickelt wird.

"Thrombozytopenie" wird definiert als Plättchenzahl unter 150×10⁹ pro Liter Blut.

"Thrombopoetische Aktivität" wird definiert als biologische Aktivität, die besteht aus dem Beschleunigen der Prolifera tion, der Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryo zyten oder Megakaryozytenvorläufern zu den Plättchen-produ zierenden Formen dieser Zellen. Diese Aktivität kann gemes sen werden in verschiedenen Assays, einschließlich einem in vivo-Mäuse-Plättchen-Rebound-Synthese-Assay, durch Induktion eines Plättchen-Oberflächenantigen-Assays, wie gemessen durch einen Anti-Plättchen-Immuno-Assay (anti-GPII_bIII_a) für eine humane megakaryoplastische Leukämiezellinie (CMK), und Induktion der Polyploidisierung in einer megakaryoplasti schen Zellinie (DAMI).

"Thrombopoientin" (TPO) wird defin 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019500030 00004 99880iert als eine Verbindung mit thrombopoetischer Affinität oder die die Serumplättchen zahl in einem Säuger steigern kann. TPO ist vorzugsweise in der Lage, die endogenen Plättchenzahlen um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 50%, zu steigern, und ganz besonders bevorzugt kann es die Plättchenzahl in einem Menschen auf mehr als 150×10⁹ pro Liter Blut steigern.

"Isolierte mpl-Ligandennukleinsäure" ist RNA oder DNA ent haltend mehr als 16 und vorzugsweise 20 oder mehr Nukleotid basen in Abfolge, die einen biologisch aktiven mpl-Liganden oder ein Fragment davon kodieren, sie ist komplementär zu der RNA oder DNA oder hybridisiert zu der RNA oder DNA und verbleibt stabil gebunden unter moderaten bis stringenten Bedingungen. Diese RNA oder DNA ist frei von mindestens einer kontaminierenden Nukleinsäure des Ausgangsmaterials, mit der sie normalerweise in dem natürlichen Ausgangsmate rial assoziiert ist, und sie ist vorzugsweise im wesentli chen frei von jeder anderen Säuger-RNA oder -DNA. Der Aus druck "frei von mindestens einer kontaminierenden Nuklein säure des Ausgangsmaterials, mit der sie normalerweise asso ziiert ist" umfaßt den Fall, wo die Nukleinsäure in dem Aus gangsmaterial oder der natürlichen Zelle vorhanden ist, sie sich aber an einer anderen chromosomalen Stelle befindet oder von anderen Nukleinsäuresequenzen flankiert wird, die normalerweise nicht in der Ausgangsmaterialzelle gefunden werden. Ein Beispiel für isolierte mpl-Ligandennukleinsäure ist RNA oder DNA, die einen biologisch aktiven mpl-Liganden kodiert, der mindestens 75% Sequenzidentität, mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 85% und noch mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Sequenziden tität mit den humanen, dem Mäuse- oder Schweine-mpl-Liganden aufweist.

"Kontrollsequenzen", wenn auf die Expression Bezug genommen wird, bedeutet DNA-Sequenzen, die notwendig sind zur Expres sion einer funktionsfähig damit verknüpften kodierenden Se quenz in einem speziellen Wirtsorganismus. Die Kontrollse quenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise weitere bisher noch wenig verstandene Sequenzen. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.

"Funktionsfähig verknüpft", wenn auf Nukleinsäure Bezug ge nommen wird, bedeutet, daß die Nukleinsäuren in einer funk tionellen Beziehung mit anderen Nukleinsäuresequenzen ste hen. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader funktionsfähig verknüpft mit DNA für ein Polypeptid, wenn dieses als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer kodierenden Sequenz funktionsfähig verknüpft, wenn er die Transkription der Se quenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionsfähig verknüpft mit einer kodierenden Sequenz, wenn sie so angeordnet ist, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet "funktionsfähig verknüpft", daß die DNA-Sequenzen fortlaufend und in dem Fall eines sekretori schen Leaders, fortlaufend und im Leseraster verknüpft sind. Jedoch müssen Enhancer nicht fortlaufend angeordnet sein. Das Verknüpfen wird bewirkt durch Ligation an geeigneten Re striktionsschnittstellen. Falls solche Stellen nicht exi stieren werden synthetische Oligonukleotidadaptoren oder Linker nach herkömmlichen Verfahren verwendet.

"Exogen", wenn auf ein Element Bezug genommen wird, bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die für die Zelle fremd ist oder für die Zelle homolog ist, aber in einer Position in der Wirtszellnukleinsäure gelegen ist, in der das Element übli cherweise nicht gefunden wird.

"Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" werden austauschbar hierin verwendet, und solche Bezeichnungen umfassen alle Nachkommen einer Zelle oder Zellinie. Somit umfassen bei spielsweise Begriffe wie "Transformanden" und "transformierte Zellen" die primäre Zelle und davon abstam mende Kulturen, ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Auch wird davon ausgegangen, daß nicht alle Nachkommen genau identisch in dem DNA-Gehalt sein müssen, aufgrund von bewuß ten oder unvermeidbaren Mutationen. Mutante Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität besitzen, nach der die ursprünglich transformierte Zelle abgesucht wurde, sind eingeschlossen. Wo verschiedene Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird dies aus dem Zusammenhang klar.

"Plasmide" sind autonom replizierende ringförmige DNA-Mole küle, die unabhängige Replikationsursprünge besitzen, und sie werden hierin durch einen Kleinbuchstaben "p" bezeich net, der Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangestellt ist.

Die Ausgangsplasmide sind entweder gewerblich erhältlich, öffentlich erhältlich in nichtbeschränkter Weise, oder sie können aus solchen erhältlichen Plasmiden gemäß veröffent lichten Verfahren hergestellt werden. Weiterhin sind andere äquivalente Plasmide in dem Stand der Technik bekannt und sind dem Durchschnittsfachmann geläufig.

"Restriktionsenzymverdau(-spaltung)", wenn auf DNA Bezug ge nommen wird, bedeutet die katalytische Spaltung von internen Phosphodiester-Bindungen von DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Positionen und Stellen in der DNA-Sequenz wirkt. Solche Enzyme werden "Restriktionsendonukleasen" genannt. Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA- Sequenz, "Restriktionsschnittstelle(-spaltstelle)" genannt, die eine zweifache Symmetrie zeigt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind gewerblich erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfor dernisse, wie durch den Enzymhersteller angegeben, werden verwendet. Restriktionsenzyme werden üblicherweise bezeich net durch Abkürzungen, die sich zusammensetzen aus einem Großbuchstaben gefolgt von anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem das einzelne Restrikti onsenzym ursprünglich erhalten worden ist, und dann folgt eine Nummer, die das spezielle Enzym angibt. Im allgemeinen wird 1 µg Plasmid oder DNA mit ungefähr 1-2 Einheiten Enzym in ungefähr 20 µl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller spezifiziert. Typischerweise wird eine Inkubation für ungefähr 1 Stunde bei 37°C verwendet, aber sie kann variieren in Übereinstimmung mit den Herstelleran gaben. Nach Inkubation wird Protein oder Polypeptid entfernt durch Extraktion mit Phenol und Chloroform, und die gespal tene Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion gewonnen durch Präzipitation mit Ethanol. Der Spaltung mit einem Re striktionsenzym kann die Hydrolyse der terminalen 5′-Phos phate mit bakterieller alkalischer Phosphatase folgen, um zu vermeiden, daß die zwei Enden der restriktionsgespaltenen DNA eines DNA-Fragments "zirkularisieren" oder eine ge schlossene Schleife bilden, was das Einfügen eines anderen DNA-Fragments in die Restriktionsschnittstelle erschweren würde. Sofern nicht anders angegeben, folgt der Spaltung der Plasmide keine 5′-terminale Dephosphorylierung. Die Verfah ren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind die herkömm lichen, wie beschrieben in Abschnitten 1.56-1.61 von Sam brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989].

"Gewinnen" oder "Isolieren" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsspaltansatz bedeutet Auftrennen des Spaltansatzes auf einem Polyacrylamid oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifizieren des Fragments von Interesse durch Vergleich von dessen Mobilität mit der von Marker DNA- Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernen des Gelabschnitts, enthaltend das gewünschte Fragment, und Ab trennen des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist allgemein be kannt. Zum Beispiel siehe Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9 : 6103-6114 [1981], und Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8 : 4057 [1980].

"Southern-Analyse" oder "Southern-Blotten" ist ein Verfah ren, bei dem die Anwesenheit von DNA-Sequenzen in einem Re striktionsendonukleasespaltansatz von DNA oder DNA-enthal tender Zusammensetzung bestätigt wird durch Hybridisieren an ein bekanntes markiertes Oligonukleotid oder DNA-Fragment. Southern-Analyse umfaßt typischerweise die elektrophoreti sche Auftrennung eines DNA-Spaltansatzes auf Agarosegelen, Denaturieren der DNA nach der elektrophoretischen Auftren nung und Transfer der DNA auf Nitrocellulose, Nylon oder an dere geeignete Membranträger zur Analyse mit einer radiomar kierten, biotinylierten oder enzymmarkierten Probe, wie be schrieben in Abschnitten 9.37-9.52 von Sambrook et al., siehe oben.

"Northern-Analyse" oder "Northern-Blotten" ist ein Verfah ren, das verwendet wird zum Identifizieren von RNA-Sequen zen, die an eine bekannte Probe, wie ein Oligonukleotid, ein DNA-Fragment, cDNA oder ein Fragment davon, oder an ein RNA- Fragment hybridisieren. Die Probe ist mit einem Radioisotop, ³²P, oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym mar kiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektro phoretisch aufgetrennt auf einem Agarose- oder Polyacryl amidgel, auf Nitrocellulose, Nylon oder eine andere geeig nete Membran transferiert und mit der Probe hybridisiert un ter Verwendung von Standardtechniken, die im Stand der Tech nik gut gekannt sind, wie diejenigen, beschrieben in Ab schnitten 7.39-7.52 von Sambrook et al., siehe oben.

"Ligation" ist das Verfahren zum Bilden von Phosphodiester bindungen zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten. Zur Ligation dieser zwei Fragmente müssen die Enden der Fragmente mitein ander kompatibel sein. In einigen Fällen können die Enden direkt kompatibel sein nach der Endonukleasespaltung. Jedoch kann es zunächst erforderlich sein, die typischerweise nach Endonukleasespaltung erzeugten überhängenden Enden zu stump fen Enden umzuwandeln, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Zum Erzeugen glatter (stumpfer) Enden wird die DNA in einem geeigneten Puffer für mindestens 15 Minuten bei 15°C mit ungefähr 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase I oder T4 DNA-Polymerase in der Anwesenheit der vier Desoxyribonukleotidtriphosphate behandelt. Die DNA wird dann gereinigt durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation. Die miteinander zu ligierenden DNA- Fragmente werden in eine Lösung eingebracht in ungefähr äquimolaren Mengen. Die Lösung enthält auch ATP, Ligasepuf fer und eine Ligase, wie T4 DNA-Ligase, mit ungefähr 10 Ein heiten pro 0,5 µg pro DNA. Wenn die DNA in einen Vektor li giert werden soll, wird der Vektor zunächst linearisiert durch Spaltung mit dem bzw. den geeigneten Restriktionsendo nuklease(n). Das linearisierte Fragment wird dann mit bakte rieller alkalischer Phosphatase oder intestinaler Kalbsphos phatase behandelt, um die Selbstligation während des Ligati onsschritts zu verhindern.

"Herstellen (Präparation)" von DNA aus Zellen bedeutet Iso lieren der Plasmid-DNA aus einer Kultur der Wirtszellen. Ty pischerweise verwendete Verfahren zum DNA-Herstellen sind die Plasmidherstellverfahren im großen und kleinen Maßstab, wie beschrieben in Abschnitten 1.25-1.33 von Sambrook et al., siehe oben. Nach dem Herstellen der DNA kann sie gerei nigt werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie demjenigen beschrieben in Abschnitt 1.40 von Sambrook et al., siehe oben.

"Oligonukleotide" sind kurzkettige, einzel- oder doppel strängige Polydesoxynukleotide, die chemisch synthetisiert werden mit bekannten Verfahren, wie einer Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditchemie unter Verwendung von Festphasentechniken, wie beschrieben in EP 266,032, veröf fentlicht 4. Mai 1988, oder über Desoxynuklosid-H-Phos phonat-Zwischenprodukte, wie beschrieben durch Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14 : 5399-5407 [1986]. Weitere Verfah ren umfassen die Polymerasekettenreaktion, wie unten be schrieben, und andere selbstprimende (autoprimer) Verfahren und Oligonukleotidsynthesen auf festen Trägern. Alle diese Verfahren sind beschrieben in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28 : 716-734 [1989]. Diese Verfahren werden verwendet, wenn die vollständige Nukleinsäuresequenz des Gens bekannt ist oder die zu dem kodierenden Strang komple mentäre Nukleinsäuresequenz verfügbar ist. Alternativ, falls die Ziel-Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man auf poten tielle Nukleinsäuresequenzen schließen, unter Verwendung von bekannten und bevorzugten kodierenden Resten für jeden Ami nosäurerest. Die Oligonukleotide werden dann auf Polyacryl amidgelen gereinigt.

"Polymerasekettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich auf ein Verfahren oder eine Technik, bei der winzige Mengen eines spezifischen Stücks einer Nukleinsäure, RNA und/oder DNA, vervielfacht werden, wie beschrieben in US-Patent Nr. 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987. Im allgemeinen muß Se quenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder der darüber hinausgehenden Region verfügbar sein, so daß Oligonukleotidprimer entworfen werden können. Diese Primer sind identisch oder ähnlich in ihrer Sequenz zu den Ge gensträngen der zu vervielfachenden Matrize. Die 5′-termina len Nukleotide der zwei Primer können übereinstimmen mit den Enden des zu vervielfachenden Materials. PCR kann verwendet werden zum Vervielfachen von spezifischen RNA-Sequenzen, spezifischen DNA-Sequenzen aus gesamter genomischer DNA und cDNA, transkribiert aus gesamter zellulärer RNA, Baktriopha gen- oder Plasmidsequenzen usw . . Siehe allgemein Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51 : 263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Wie hierin verwendet, wird PCR als ein aber nicht als einziges Beispiel für ein Nukleinsäurepolymerasekettenreaktionsver fahren zum Vervielfachen einer Nukleinsäuretestanalysenprobe angesehen, das die Verwendung einer bekannten Nukleinsäure als Primer und einer Nukleinsäurepolymerase zum Vervielfäl tigen oder Erzeugen eines spezifischen Stücks an Nuklein säure umfaßt.

"Stringente Bedingungen" sind solche, die (1) zum Waschen eine niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur einsetzen, z. B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodSO₄(SDS) bei 50°C, oder (2) die während dem Hybridisieren ein denatu rierendes Mittel, wie Formamid, verwenden, z. B. 50% (Vol/Vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natrium phosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt′s Lösung, beschallte Lachsspermien DNA (50 µg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschvorgängen bei 42°C in 0,2×SSC und 0,1% SDS.

"Moderat stringente Bedingungen" sind beschrieben in Sam brook et al., siehe oben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und %SDS), die weniger stringent sind als oben beschrieben. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen sind Bedingungen, wie die über Nacht Inkubation bei 37°C in einer Lösung umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt′s Lösung, 10% Dextransulfat und 20 µl/ml denatu rierte gescherte Lachsspermien DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei ungefähr 37-50°C. Der Durchschnitts fachmann wird erkennen, wie die Temperatur, Ionenstärke usw. einzustellen ist, um sie auf Faktoren, wie die Probenlänge und ähnliches, einzustellen.

"Antikörper" (Abs) und "Immunglobuline" (Igs) sind Glycopro teine mit den gleichen strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper wie auch andere antikörperähnliche Moleküle, die keine Antigenspezi fität haben. Polypeptide des letzteren Typs werden z. B. in geringen Spiegeln durch das Lymphsystem hergestellt und mit gesteigerten Spiegeln durch Myelomas.

"Native Antikörper und Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glycoproteine von ungefähr 150 000 Daltons, die sich zusammensetzen aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten. Jede leichte Kette ist mit einer schweren Kette verknüpft über eine kovalente Disulfidbindung, während die Anzahl der Di sulfidverknüpfungen variiert zwischen den schweren Ketten für verschiedene Immunglobulinisotypen. Jede schwere und leichte Kette besitzt auch gleichmäßig angeordnete Disulfid brücken innerhalb der Kette. Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne (V_H) gefolgt von einer An zahl von konstanten Domänen. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne an einem Ende (V_L) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende; die konstante Domäne der leichten Kette ist ausgerichtet zu der ersten konstanten Domäne der schweren Kette, und die variable Domäne der leichten Kette ist ausgerichtet mit der variablen Domäne der schweren Kette. Spezielle Aminosäurereste bilden vermutlich die Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette (Clothia et al., J. Mol. Biol., 1986 : 651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 4592-4596 [1985]).

Der Begriff "variabel" bezieht sich auf den Umstand, daß be stimmte Anteile der variablen Domäne sich ausgiebig in der Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden, und sie sind an der Bindung und der Spezifität eines jeden speziellen Anti körpers für sein spezielles Antigen beteiligt. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig verteilt über die varia blen Domänen von Antikörpern. Sie ist konzentriert in drei Segmenten, sogenannte die Komplementarität bestimmende Re gionen (CDRs) oder hypervariable Regionen, die sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette und der schweren Kette vorkommen. Die stärker konservierten Anteile der variablen Domänen werden als sogenanntes "Framework" (FR) bezeichnet. Die variablen Domänen der nativen schweren und leichten Ket ten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die im wesentlichen eine β-Faltblattkonfiguration annehmen, verbunden mit drei CDRs, die Schleifen bilden, die mit der β-Faltblattstruktur verbunden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden in enger Nachbarschaft zusammen gehalten durch die FR-Regionen, und mit den CDRs der anderen Kette tragen sie zu der Bildung der Antigenbindungsstelle des Antikörpers bei (siehe Kabat et al., Sequences of Pro teins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Die konstanten Domänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen einbezogen, aber sie zeigen verschiedene Effektorfunktionen, wie die Teilnahme des Antikörpers in der antikörperabhängi gen zellulären Toxizität.

Papainspaltung von Antikörpern erzeugt zwei identische Anti gen-bindende Fragmente, genannt "Fab"-Fragmente, wobei jedes eine einzelne Antigenbindungsstelle besitzt, und ein restli ches "Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit wiedergibt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung erzeugt ein F(ab′)₂-Fragment, das zwei Antigenbindungsstellen enthält, und das noch Antigen vernetzen kann.

"Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollstän dige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Domäne einer schweren und einer leichten Kette in enger, nichtkova lenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt Wechsel wirkung der CDRs einer jeden variablen Domäne miteinander, um eine Antigenbindungsstelle auf der Oberfläche des V_H-V_L-Di meren zu definieren. In kollektiver Weise verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigenbindungsspezifität. Je doch besitzt selbst eine einzige variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, umfassend nur drei CDRs, die spezifisch für ein Antigen sind), die Fähigkeit, ein Antigen zu erkennen und zu binden, obwohl nur mit geringerer Affinität als die vollständige Bindungsstelle.

Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab′-Fragmente unterscheiden sich von Fab- Fragmenten durch den Zusatz von einigen wenigen Resten an den Carboxyterminus der CHI-Domäne der schweren Kette, ein schließlich ein oder mehrere Cysteine der Hinge-Region des Antikörpers. Fab′-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab′, bei dem der bzw. die Cysteinrest(e) der konstanten Domäne eine freie Thiolgruppe trägt. F(ab′)₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich hergestellt als Paare von Fab′-Fragmen ten, die Hinge-Cysteine zwischen sich haben. Andere chemi sche Kupplungsvarianten von Antikörperfragmenten sind eben falls bekannt.

Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) von einer beliebigen Vertebratenart können einer von-zwei deut lich unterschiedlichen Arten, genannt Kappa und Lambda (λ), zugewiesen werden, basierend auf den Aminosäuresequenzen der konstanten Domänen.

Abhängig von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ih rer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen an Im munglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und einige davon können weiter unterteilt werden in Subklassen (Isotypen), z. B. IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Domänen der schweren Kette, die den verschiedenen Klassen der Immunglobuline entsprechen, werden α, Delta, Epsilon, γ und µ genannt. Die Untereinheitsstrukturen und die dreidimensionalen Konfigurationen der verschiedenen Klassen der Immunglobuline sind gut bekannt.

Der Begriff "Antikörper" wird in dem breitesten Sinn verwen det und betrifft insbesondere einzelne monoklonale Antikör per (einschließlich Agonist- und Antagonistantikörper), An tikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, wie auch Antikörperfragmente (z. B. Fab, F(ab′)₂ und Fv), so lange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.

"Monoklonaler Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, erhalten aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern, d. h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfaßt, sind identisch außer für möglicherweise auftretende natürliche Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikör per sind hochspezifisch und gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet. Weiterhin, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparationen, die typischerweise verschiedene Antikörper enthalten, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, ist jeder monoklo nale Antikörper gegen eine einzige Determinante auf dem An tigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft insofern als sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden und nicht durch an dere Immunglobuline kontaminiert sind. Der modifizierende Begriff "monoklonal" deutet den Charakter des Antikörpers an, daß dieser aus einer im wesentlichen homogenen Popula tion von Antikörpern erhalten ist, und es bedeutet nicht, daß die Herstellung des Antikörpers ein spezielles Verfahren verlangt. Zum Beispiel können die gemäß der vorliegenden Er findung zu verwendenden monoklonalen Antikörper hergestellt werden nach dem Hybridomaverfahren, das zuerst beschrieben wurde von Kohler & Milstein, Nature, 256 : 495 (1975), oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wer den (siehe z. B. US-Patent Nr. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch ist mit oder ho molog ist zu den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer speziellen Art oder zu einer speziellen Anti körperklasse oder Subklasse gehören, während der Rest der Kette(n) identisch ist oder homolog ist zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von anderen Arten erhalten oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Subklasse gehö ren, wie auch Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 4,816,567 (Cabilly et a.); und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 [1984].

"Humanisierte" Formen von nichthumanen (z. B. Mäuse) Antikör pern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie Fv, Fab, Fab′, F(ab′)₂ oder andere An tigen-bindende Subsequenzen der Antikörper), die eine mini male Sequenz enthalten, die von einem nichthumanen Immunglo bulin stammt. Meistens sind humanisierte Antikörper humane Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste einer die Komplementarität bestimmenden Region (CDR) des Empfän gers ersetzt sind durch Reste einer CDR aus einer nichthuma nen Spezies (Donorantikörper) wie einer Maus, Ratte oder Kanninchen, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Ka pazität besitzt. In einigen Fällen werden Fv-Framework-Reste des humanen Immunglobulins ersetzt durch entsprechende nichthumane Reste. Weiterhin kann ein humanisierter Antikör per Reste umfassen, die weder in dem Empfängerantikörper noch in dem eingebrachten CDR oder der Framework-Sequenzen vorkommen. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im allgemeinen wird der humanisierte Antikör per im wesentlichen den gesamten Anteil mindestens einer und typischerweise von zwei variablen Domänen umfassen, in denen die gesamte oder im wesentlichen die gesamten CDR-Regionen denen eines nichthumanen Immunglobulins entsprechen, und die vollständige oder im wesentlichen vollständige FR-Regionen sind die aus einer humanen Immunglobulinkonsensussequenz. Der humanisierte Antikörper wird optimalerweise mindestens auch einen Anteil einer konstanten Region eines Immunglobu lins (Fc) umfassen, typischerweise den eines humanen Immun globulins. Für weitere Einzelheiten siehe: Jones et al., Nature, 321 : 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332 : 323-329 [1988] und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 : 593-596 [1992]).

"Nicht-immunogen im Menschen" bedeutet, daß beim Inkontakt bringen des Polypeptids in einem pharmazeutisch verträgli chen Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen kein Zustand der Sensi bilisierung oder Resistenz gegen das Polypeptid bei der zweiten Verabreichung des Polypeptids nach einer geeigneten Latenzperiode (z. B. 8 bis 14 Tage) nachweisbar ist.

II. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind im wesentlichen ein homogenes Polypeptid bzw. Polypeptide, bezeichnet als mpl-Ligand(en) oder Thrombopoietin (TPO), die die Eigen schaft des Bindens an mpl, einem Mitglied der Rezeptorzyto kinsuperfamilie, besitzen, und die die biologische Eigen schaft des Stimulierens des Einbaus von markierten Nukleoti den (³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zel len, transfektiert mit humanem mpl P, besitzen. Bevorzugtere mpl-Ligand(en) sind isolierte Säugerprotein(e) mit hämato poetischer, insbesondere megakaryozytopoetischer oder throm bozytopoetischer Aktivität - nämlich sie können die Prolife ration, Reifung und/oder Differenzierung von unreifen Mega karyozyten oder deren Vorläufer in die reife Plättchen-pro duzierende Form stimulieren. Am meisten bevorzugte erfin dungsgemäße Polypeptide sind humane mpl-Ligand(en) ein schließlich Fragmente davon mit hämatopoetischer, megakaryo zytopoetischer oder thrombopoetischer Aktivität. Gegebenen falls können diese humane mpl-Ligand(en) keine Glycosylie rung aufweisen. Andere bevorzugte humane mpl-Liganden sind die "EPO-Domäne" von hML, bezeichnet als hML₁₅₃ oder hTOP₁₅₃, eine verkürzte Form von hML, bezeichnet als hML₂₄₅ oder hTPO₂₄₅, und das reife vollständige Polypeptid mit der Ami nosäuresequenz, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), be zeichnet als hML, hML₃₃₂ oder hTPO_332, und die biologisch ak tive substituierte Variante hML(R153A, R154A).

Gegebenenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind biologisch oder immunologisch aktive mpl-Ligandenvarianten ausgewählt aus hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML und pML2.

Gegebenenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind biologisch aktive mpl-Ligandenvariante(n), die eine Ami nosäuresequenz besitzen mit mindestens 70% Aminosäurese quenzidentität mit dem humanen mpl-Liganden (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), dem Mäuse-mpl-Liganden (siehe Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), dem rekombinanten Schweine-mpl-Liganden (siehe Fig. 19 [SEQ ID NO: 18]) oder dem Schweine-mpl-Ligan den isoliert aus aplastischem Schweineplasma, vorzugsweise mindestens 75%, noch bevorzugter mindestens 80%, noch bevor zugter mindestens 85%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Identität.

Der aus aplastischem Schweineplasma isolierte mpl-Ligand be sitzt die folgenden Eigenschaften:

(1) der teilweise gereinigte Ligand eluiert von einem Gel filtrationssäulenlauf entweder in PBS, PBS enthaltend 0,1% SDS oder PBS enthaltend 4M MgCl₂ mit Mr von 60 000-70 000;
(2) die Ligandenaktivität wird zerstört durch Pronase;
(3) der Ligand ist stabil bis zu dem niedrigen pH (2,5), SDS bis zu 0,1% und 2M Harnstoff;
(4) der Ligand ist ein Glycoprotein, basierend auf seiner Bindung an verschiedene Lectinsäulen;
(5) der hochgereinigte Ligand eluiert aus nichtreduzierender SDS-PAGE mit einem Molekulargewicht von 25 000-35 000. Ge ringere Mengen an Aktivität eluieren auch mit Molekular gewicht von 18 000-22 000 und 60 000;
(6) der hochgereinigte Ligand wird auf reduzierender SDS- PAGE als ein Doublet aufgetrennt mit Mr von 28 000 und 31 000;
(7) die aminoterminale Sequenz der 18 000-22 000, 28 000 und 31 000-Banden ist die gleiche - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); und
(8) der Ligand bindet an und eluiert von den folgenden Affi nitätssäulen Blue-Sepharose,
CM Blue-Sepharose,
MONO-Q,
MONO-S,
Lentil-Lectin-Sepharose,
WGA-Sepharose,
Con A-Sepharose,
Ether-650m-Toyopearl,
Butyl-650m-Toyopearl,
Phenyl-650m-Toyopearl und
Phenyl-Sepharose.

Bevorzugtere mpl-Ligandenpolypeptide sind solche, die ko diert werden durch die humane genomische oder cDNA, mit einer Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 beschrieben (SEQ ID NO: 1).

Weitere bevorzugte natürlich vorkommende biologisch aktive mpl-Ligandenpolypeptide gemäß der Erfindung umfassen Präpro- mpl-Ligand, Pro-mpl-Ligand, reifer mpl-Ligand, mpl-Liganden fragmente und Glycosylierungsvarianten davon.

Noch weitere bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide umfas sen mpl-Ligandensequenzvarianten und Chimären. Üblicherweise sind bevorzugte mpl-Ligandensequenzvarianten und Chimären biologisch aktive mpl-Ligandenvarianten, die eine Aminosäu resequenz besitzen mit mindestens 70% Aminosäuresequenziden tität mit dem humanen mpl-Liganden oder dem mpl-Liganden isoliert aus aplastischem Schweineplasma, vorzugsweise mit mindestens 75%, bevorzugter mit mindestens 80%, noch bevor zugter mit mindestens 85%, noch bevorzugter mit mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mit mindestens 95% Identi tät. Eine beispielhaft bevorzugte mpl-Ligandenvariante ist eine N-terminale-Domäne-hML-Variante (bezeichnet als die "EPO-Domäne" wegen ihrer Sequenzhomologie zu Erythropoie tin). Die bevorzugte hML EPO-Domäne umfaßt ungefähr die er sten 153 Aminosäurereste von reifem hML und wird als hML₁₅₃ bezeichnet. Eine gegebenenfalls bevorzugte hML-Sequenzvari ante umfaßt eine, bei der einer oder mehrere der basischen oder dibasischen Aminosäurerest(e) in der C-terminalen Do mäne substituiert ist mit einem nichtbasischen Aminosäure rest(en) (z. B. hydrophobe, neutrale, saure, aromatische, Gly, Pro und ähnliche). Eine bevorzugte hML-C-terminale-Do mäne-Sequenzvariante umfaßt eine, bei der Arg-Reste 153 und 154 ersetzt sind mit Ala-Resten. Diese Variante wird be zeichnet als hML₃₃₂(R153A, R154A). Eine alternativ bevorzugte hML-Variante umfaßt entweder hML₃₃₂ oder hML₁₅₃, bei der die Aminosäurereste 111-114 (QLPP oder LPPQ) deletiert sind oder ersetzt sind mit einer unterschiedlichen Tetrapeptidsequenz (z. B. AGAG oder ähnliches). Die zuvorerwähnten Deletionsmu tanten werden als Δ4hML₃₃₂ oder Δ4hML₁₅₃ bezeichnet.

Eine bevorzugte Chimäre ist eine Fusion zwischen dem mpl-Li ganden oder einem Fragment (unten definiert) davon mit einem heterologen Polypeptid oder einem Fragment davon. Zum Bei spiel kann hML₁₅₃ fusioniert werden an ein IgG-Fragment, um dessen Serum-Halbwertszeit zu verbessern oder an IL-3, G-CSF oder EPO, um ein Molekül zu erzeugen mit gesteigerter throm bopoetischer oder chimärer hämatopoetischer Aktivität.

Eine alternative bevorzugte humane mpl-Ligandenchimäre ist eine "ML-EPO-Domäne-Chimäre", die besteht aus den N-termina len 153 bis 157 hML-Resten, substituiert mit einem oder meh reren, aber nicht allen, Resten von humanem EPO, ungefähr ausgerichtet wie in Fig. 10 (SEQ ID NO: 7). Bei dieser Aus führungsform ist die hML-Chimäre ungefähr 153-166 Reste lang, in der einzelne oder Blöcke von Resten aus der humanen EPO-Sequenz zugefügt oder Reste in der hML-Sequenz substitu ieren an Positionen entsprechend der Ausrichtung, wie in Fig. 10 (SEQ ID NO: 6) gezeigt. Beispielhafte, blockartige Sequenzeinschübe in den N-terminalen Anteil von hML umfassen eine oder mehrere der N-Glycosylierungsstellen an Positionen (EPO) 24-27, 38-40 und 83-85; eine oder mehrere der vier vorhergesagten amphipatischen α-helikalen Bündel an Positio nen (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 und 132-152; und andere stark konservierte Regionen einschließlich die N-terminalen und C-terminalen Regionen und Restepositionen (EPO) 44-52 (siehe z. B. Wen et al., Blood, 82 : 1507-1516 [1993] und Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Es ist of fensichtlich, daß diese "ML-EPO-Domäne-Chimäre" gemischte thrombopoetische, erythropoetische (TEPO) biologische Akti vität besitzt.

Andere bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide umfassen mpl- Ligandenfragmente mit einer zusammenhängenden Sequenz von mindestens 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, die identisch sind zu den Sequenzen des mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma, oder dem humanen mpl-Ligan den, wie hierin beschrieben (siehe Tabelle 14, Beispiel 24). Ein bevorzugtes mpl-Ligandenfragment ist humanes ML[1-X], worin X ist 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 oder 245 (siehe Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) für die Sequenz der Reste 1-X). Andere bevorzugte mpl-Ligandenfragmente umfassen solche, die hergestellt werden als das Ergebnis einer chemischen oder enzymatischen Hydrolyse oder einer Spaltung des gereinigten Liganden.

Andere bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung sind ein Verfahren zum Reinigen von mpl-Ligandenmolekülen, umfas send das Inkontaktbringen eines mpl-Ligandenausgangsmateri als enthaltend die mpl-Ligandenmoleküle mit einem immobili sierten Rezeptorpolypeptid, insbesondere mit mpl oder einem mpl-Fusionspolypeptid, unter Bedingungen, unter denen die zu reinigenden mpl-Ligandenmoleküle selektiv an das immobili sierte Rezeptorpolypeptid adsorbiert werden, Waschen des im mobilisierten Trägers, um nicht-adsorbiertes Material zu entfernen, und Eluieren des zu reinigenden Moleküls von dem immobilisierten Rezeptorpolypeptid mit einem Elutionspuffer. Das Ausgangsmaterial, enthaltend den mpl-Liganden, kann ein Plasma sein, wobei der immobilisierte Rezeptor vorzugsweise eine mpl-IgG-Fusion darstellt.

Als Alternative ist das Ausgangsmaterial, enthaltend den mpl-Liganden, eine rekombinante Zellkultur, wobei die Kon zentration an mpl-Ligand sowohl in dem Kulturmedium wie auch in den Zellysaten im allgemeinen höher ist als im Plasma oder anderen natürlichen Ausgangsmaterialien. In diesem Fall wird die oben beschriebene mpl-IgG-Immunaffinitätsmethode immer noch nützlich sein, aber sie ist normalerweise nicht erforderlich, und traditionellere Proteinreinigungsverfah ren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, können an gewendet werden. Kurz ausgeführt, das bevorzugte Reinigungs verfahren zum Bereitstellen von im wesentlichen homogenen mpl-Liganden umfaßt: Entfernen von partikulären Trümmern, entweder Wirtszellen oder lysierten Fragmenten, durch z. B. Zentrifugation oder Ultrafiltration; gegebenenfalls kann das Protein konzentriert werden mit einem gewerblich erhältli chen Proteinkonzentrierungsfilter; gefolgt von Abtrennen des Liganden von anderen Verunreinigungen durch einen oder meh rere Schritte ausgewählt aus: Immunaffinität, Ionenaustausch (z. B. DEAE oder Materialien enthaltend Carboxymethyl- oder Sulfopropylgruppen), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil-Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether-Toypearl, Butyl-Toypearl, Phenyl- Toypearl, Protein-A-Sepharose, SDS-PAGE, Umkehrphasen-HPLC (z. B. Silicagel mit anhängigen aliphatischen Gruppen) oder Sephadex-Molekularsieb- oder Größenausschlußchromatographie und Ethanol- oder Ammoniumsulfatfällung. Ein Proteatinhibi tor, wie Methylsulfonylfluorid (PMSF), kann in jedem der zu vorgenannten Schritte enthalten sein, um die Proteolyse zu hemmen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Antikörper bereit, der an den mpl-Liganden binden kann. Ein bevorzugter Anti mpl-Ligandenantikörper ist monoklonal (Kohler and Milstein, Nature, 256 : 495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Band 13, Elsevier Science Publisrers, Amsterdam [1985]; und Huse et al., Science, 246 : 1275-1281 [1989]). Ein bevorzugter isolierter Anti-mpl-Liganden-Antikörper ist einer, der an den mpl-Liganden mit einer Affinität von mindestens unge fähr 10⁶ l/Mol bindet. Bevorzugter bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens ungefähr 10⁷ l/Mol. Am bevor zugtesten ist ein Antikörper gegen den mpl-Liganden, der eine der oben beschriebenen Effektorfunktionen besitzt. Der isolierte Antikörper, der an den mpl-Liganden binden kann, kann gegebenenfalls an ein zweites Polypeptid fusioniert werden, und der Antikörper oder das Fusionsprodukt kann ver wendet werden zum Isolieren und Reinigen von mpl-Ligand aus einem Ausgangsmaterial, wie oben beschrieben, zum Immobili sieren von mpl-Polypeptid. Bei einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Nachweisen des mpl-Liganden in vitro oder in vivo, um fassend Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer Analysen probe, insbesondere einer Serumanalysenprobe, von der ange nommen wird, daß sie den Liganden enthält, und dessen Nach weis, falls eine Bindung erfolgt ist.

Bei einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das den mpl-Liganden oder Fragmente davon kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül markiert sein kann oder nicht markiert ist mit einem nachweisbaren Rest, und es wird ein Nuklein säuremolekül bereitgestellt mit einer Sequenz, die komple mentär ist zu oder unter stringenten Bedingungen oder mode rat stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Sequenz besitzt, die für einen mpl-Li ganden kodiert. Eine bevorzugte mpl-Ligandennukleinsäure ist RNA oder DNA, die einen biologisch aktiven mpl-Liganden ko diert, der mindestens 75% Sequenzidentität, bevorzugter min destens 80%, noch bevorzugter mindestens 85% und noch mehr bevorzugt 90% und ganz besonders bevorzugt 95% Sequenziden tität mit dem humanen mpl-Liganden zeigt. Stärker bevorzugte isolierte Nukleinsäuremoleküle sind DNA-Sequenzen, die bio logisch aktiven mpl-Liganden kodieren, ausgewählt aus: (a) DNA, basierend auf der kodierenden Region eines Säuger-mpl- Ligandengens (z. B. DNA umfassend die Nukleotidsequenz, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), oder ein Fragment davon); (b) DNA, die an eine DNA aus (a) hybridisieren kann unter zumindest moderat stringenten Bedingungen; und (c) DNA, die gegenüber einer DNA wie definiert in (a) oder (b) degene riert ist, wobei dies aus der Degeneration des genetischen Codes herrührt. Es wird hier davon ausgegangen, daß die hierin beschriebenen neuen mpl-Liganden Mitglieder einer Fa milie von Liganden oder Zytokinen sind, die eine geeignete Sequenzidentität aufweisen, so daß ihre DNA mit der DNA aus Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) (oder der komplementären Sequenz oder Fragmenten davon) unter geringen bis moderat stringenten Be dingungen hybridisieren kann. Somit umfaßt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung DNA, die unter geringen bis moderat stringenten Bedingungen mit DNA hybridisiert, die die mpl-Ligandenpolypeptide kodiert.

Bei einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausfüh rungsform ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA, die den mpl-Liganden kodiert und die weiterhin einen replizierbaren Vektor umfaßt, in dem die cDNA funktionsfähig verknüpft ist mit Kontrollsequenzen, die von einem Wirt erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert ist. Dieser Aspekt umfaßt weiterhin Wirtszellen, die mit dem Vektor transformiert sind, und ein Verfahren unter Verwendung der cDNA zum Bewir ken der Herstellung eines mpl-Liganden, umfassend Exprimie ren der cDNA, die den mpl-Liganden kodiert, in einer Kultur der transformierten Wirtszellen und Gewinnen des mpl-Ligan den aus der Wirtszellkultur. Der auf diese Weise herge stellte mpl-Ligand ist vorzugsweise im wesentlichen ein ho mogener humaner mpl-Ligand. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Herstellen des mpl-Liganden sind Ovarienzellen des chinesi schen Hamsters (CHO).

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes Verfahren zum Behandeln eines Säugers mit einer immunologischen oder häma topoetischen Störung, insbesondere von Thrombozytopenie, um fassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines mpl-Liganden an den Säuger. Gegebenenfalls wird der mpl-Ligand verabreicht in Kombination mit einem Zytokin, insbesondere einem Kolonie-stimulierenden Faktor oder Inter leukin. Bevorzugte Kolonie-stimulierende Faktoren oder In terleukine umfassen: kit-Ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 oder IL- 11.

III. Herstellungsverfahren

Von der Plättchenproduktion ist lange Zeit durch viele Auto ren angenommen worden, daß sie durch mehrere Abstammungsli nien-spezifische humorale Faktoren kontrolliert wird. Es ist postuliert worden, daß zwei bestimmte Zytokinaktivitäten, bezeichnet als Megakaryozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (meg-CSF) und Thrombopoietin, die Megakaryozytopoese und Thrombopoese regulieren (Williams et al., J. Cell Physiol., 110 : 101-104 [1982]; Williams et al., Blood Cells, 15 : 123-133 [1989]; und Gordon et al., Blood, 80 : 302-307 [1992]). Nach dieser Hypothese stimuliert meg-CSF die Proliferation von Vorläufermegakaryozyten, während Thrombopoietin primär die Reifung von differenzierteren Zellen und schließlich die Plättchenfreisetzung beeinflußt. Seit den 60er Jahren ist die Induktion und das Auftreten von meg-CSF- und Thrombo poietinaktivitäten in dem Plasma, Serum und Harn von Tieren und Menschen, folgend thrombocytopenieartigen Episoden, gut dokumentiert worden (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108 : 428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54 : 340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108 : 146- 149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49 : 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44 : 605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engl. J. Med., 305 : 533 [1981]; Straneva et al., Exp. Hema tol., 17 : 1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13 : 1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68 : 733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56 : 183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20 : 354-360 [1922]; und Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning, 8 : 236-244 [1990]). Von diesen Aktivi täten ist berichtet worden, daß sie spezifisch sind für eine Abstammungslinie und sich von bekannten Zytokinen unter scheiden (Hill R.J. et al., Blood 80 : 346 [1992]; Erickson- Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84 : 197-203 [1993]; Straneva J.E. et al., Exp. Hematol. 20 : 4750 [1992]; und Tsukada J. et al., Blood 81 : 866-867 [1993]). Versuche zum Reinigen von meg-CSF oder Thrombopoietin aus Thrombozyto penieplasma oder -harn sind bisher nicht erfolgreich gewe sen.

In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Beobachtungen betreffend Thrombozytopenieplasma haben wir gefunden, daß aplastisches Schweineplasma (APP), erhalten von bestrahlten Schweinen, die humane Megakaryozytopoese in vitro stimu liert. Wir haben gefunden, daß diese stimulierende Aktivität unterdrückt wird durch die lösliche extrazelluläre Domäne von c-mpl, wobei dies APP als ein mögliches Ausgangsmaterial für den vermeintlichen mpl-Liganden (ML) bestätigt. Wir ha ben jetzt erfolgreich den mpl-Liganden aus APP isoliert, und die Aminosäuresequenzinformation wurde verwendet zum Isolie ren von Mäuse-, Schweine- und humaner ML-cDNA. Diese MLs be sitzen eine Sequenzhomologie zu Erythropoietin und besitzen meg-CSF- und Thrombopoietin-ähnliche Aktivitäten.

1. Reinigung und Identifizierung des mpl-Liganden aus Plasma

Wie oben ausgeführt, ist von aplastischem Plasma aus einer Vielzahl von Arten berichtet worden, daß es Aktivitäten ent hält, die die Hämatopoese in vivo stimuliert, jedoch ist zu vor kein hämatopoetisch stimulierender Faktor, isoliert aus Plasma, berichtet worden. Ein Ausgangsmaterial für aplasti sches Plasma ist das, erhalten aus bestrahlten Schweinen. Das aplastische Schweineplasma (APP) stimuliert die Human hämatopoese in vitro. Um zu ermitteln, ob APP den mpl-Ligan den enthält, wurde dessen Effekt untersucht durch Messen des ³H-Thymidin-Einbaus in Ba/F3-Zellen, transfektiert mit huma nem mpl P (Ba/F3-mpl), gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Verfah ren. APP stimulierte den ³H-Thymidin-Einbau in Ba/F3-mpl- Zellen, aber nicht in Ba/F3-Kontrollzellen (d. h., nicht mit humanem mpl P transfektierte Zellen). Weiterhin wurde eine solche Aktivität nicht beobachtet in normalem Schweine plasma. Diese Ergebnisse deuten an, daß APP einen Faktor oder Faktoren enthält, die ein proliferatives Signal über den mpl-Rezeptor erzeugen, und der bzw. die deshalb den na türlichen Liganden für diesen Rezeptor darstellen könnten. Dies wurde weiter bestätigt durch den Befund, daß die Be handlung von APP mit löslichem mpl-IgG die stimulierenden Effekte von APP auf Ba/F3-mpl-Zellen blockierte.

Die Aktivität in APP schien ein Protein zu sein, da Pronase, DTT oder Wärme die Aktivität in APP zerstört (Fig. 3). Die Aktivität war auch nicht dialysierbar. Die Aktivität war je doch stabil bei niedrigem pH (pH 2,5 für 2 Std.) und band an und eluierte von mehreren Lektin-Affinitätssäulen, wobei dies anzeigt, daß es ein Glycoprotein ist. Um weiterhin die Struktur und Identität dieser Aktivität aufzuklären wurde es affinitätsgereinigt aus APP unter Verwendung einer mpl-IgG- Chimären.

APP wurde gemäß dem Protokoll, wie in Beispielen 1 und 2 ausgeführt, behandelt. Kurz ausgeführt, der mpl-Ligand wurde gereinigt unter Verwendung von hydrophober Wechselwirkungs chromatographie (HIC), immobilisierter-Farbstoff-Chromato graphie und mpl-Affinitätschromatographie. Das Gewinnen der Aktivität aus jedem Schritt ist in Fig. 4 gezeigt, und der Aufreinigungsfaktor ist in Tabelle 1 angegeben. Die gesamte Ausbeute an Aktivität über die mpl-Affinitätssäule betrug ungefähr 10%. Die Fraktion mit dem Aktivitätsgipfel (F6) von der mpl-Affinitätssäule besitzt eine abgeschätzte spezifi sche Aktivität von 9,8 × 10⁶ Einheiten/mg. Die Gesamtaufrei nigung aus 5 Litern APP betrug ungefähr das 4 × 10⁶-fache (0,8 Einheiten/mg auf 3,3 × 10⁶ Einheiten/mg) mit einer 83 × 10⁶-fachen Verringerung an Protein (250 g auf 3 µg). Wir be rechneten die spezifische Aktivität des Liganden, eluiert von der mpl-Affinitätssäule, als rund 3 × 10⁶ Einheiten/mg.

Tabelle 1

Reinigung von mpl-Ligand

Protein wurde ermittelt mit dem Bradford-Assay. Die Pro teinkonzentration der eluierten mpl-Fraktionen 5-7 wurde berechnet basierend auf der Färbeintensität eines sil bergefärbten SDS-Gels. Eine Einheit wird definiert als diejenige, die 50% der maximalen Stimulierung der Ba/F3- mpl-Zellproliferation hervorruft.

Die Analyse der eluierten Fraktionen von der mpl-Affinitäts säule durch SDS-PAGE (4-20%, Novex-Gel) durchgeführt unter reduzierenden Bedingungen, zeigte die Anwesenheit von mehre ren Proteinen (Fig. 5). Proteine, die nach Silberfärbung die stärkste Intensität ergaben, wurden aufgelöst mit einem apparenten Molekulargewicht (Mr) von 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 und 18 000-22 000. Zum Ermitteln, welches dieser Pro teine die Proliferation von Ba/F3-mpl-Zellkulturen stimu lierte, wurden die Proteine aus dem Gel eluiert, wie be schrieben in Beispiel 2.

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, daß die meiste Aktivität aus einem Gelstreifen eluiert wurde, der Proteine mit Mr 28 000-32 000 enthielt, wobei geringere Aktivität von der 18 000-22 000-Region des Gels eluierte (Fig. 6). Die ein zigen sichtbaren Proteine in diesen Regionen besaßen Mr von 30 000, 28 000 und 18 000 bis 22 000. Zum Identifizieren und zum Erhalten der Proteinsequenz dieser Proteine, die in diesem Bereich des Gels aufgetrennt wurden (d. h., Banden bei 30, 28 und 18-22 kDa), wurden diese drei Proteine nach einem Elek troblot-Verfahren auf PVDF übertragen und sequenziert wie in Beispiel 3 beschrieben. Die erhaltenen aminoterminalen Se quenzen sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Aminoterminale Sequenzen des mpl-Liganden

Computergestützte Analysen zeigten, daß diese Aminosäure sequenzen neu waren. Da alle drei Sequenzen gleich waren, wurde angenommen, daß die 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa- Proteine verwandt waren und möglicherweise verschiedene For men des gleichen Proteins darstellten. Weiterhin war dieses Protein bzw. Proteine ein wahrscheinlicher Kandidat für den natürlichen mpl-Liganden, da die Aktivität in der gleichen Region (28 000-32 000) auf einem 4-20%-Gel der SDS-PAGE aufge trennt wurde. Weiterhin wanderte der teilweise gereinigte Ligand mit einem Mr von 17 000 bis 30 000, wenn er einer Gel filtrationschromatographie unter Verwendung einer Superose 12 (Pharmacia)-Säule unterzogen wurde. Es wird angenommen, daß die verschiedenen Mr-Formen des Liganden das Ergebnis einer Proteolyse oder von Glycosylierungsunterschieden oder von anderen post- oder prätranslationalen Modifikationen sind.

Wie früher beschrieben unterdrückte humane Antisense-mpl-RNA die Megakaryozytopoese in humanen Knochenmarkskulturen, die angereichert waren mit CD 34⁺-Vorläuferzellen, ohne die Dif ferenzierung von anderen hämatopoetischen Abstammungszelli nien zu beeinflussen (Methia et al., siehe oben). Dieses Ergebnis legt nahe, daß der mpl-Rezeptor eine Rolle spielen könnte bei der Differenzierung und Proliferation von Mega karyozyten in vitro. Um die Rolle des mpl-Liganden bei der Megakaryozytopoese weiter aufzuklären, wurden die Effekte von APP und an mpl-Ligand verarmtem APP auf die humane in vitro-Megakaryozytopoese verglichen. Der Effekt von APP auf die humane Megakaryozytopoese wurde ermittelt mit Hilfe einer Modifikation des Flüssigsuspension-Megakaryozytopoese- Assays, beschrieben in Beispiel 4. Bei diesem Assay wurden humane periphere Stammzellen (PSC) mit APP vor und nach mpl- IgG-Affinitätschromatographie behandelt. Die GPII_bIII_a-Sti mulierung der Megakaryozytopoese wurde quantifiziert mit einem ¹²⁵J-Anti-II_bIII_a-Antikörper (Fig. 7). Fig. 7 zeigt, daß 10% APP eine ungefähr dreifache Stimulierung hervorrief, während APP, das an mpl-Ligand verarmt war, keinen Effekt besaß. Signifikanterweise induzierte das an mpl-Ligand ver armte APP nicht die Proliferation der Ba/F3-mpl-Zellen.

Bei einem weiteren Experiment neutralisierte lösliches huma nes mpl-IgG, zugesetzt an Tagen 0, 2 und 4, zu Kulturen ent haltend 10% APP, die stimulierenden Effekte von APP auf die humane Megakaryozytopoese (Fig. 8). Diese Ergebnisse zeigen an, daß der mpl-Ligand eine Rolle bei der Regulierung von humaner Megakaryozytopoese spielt, und deshalb kann er nütz lich sein bei der Behandlung von Thrombozytopenie.

2. Molekulares Klonieren des mpl-Liganden

Basierend auf den aminoterminalen Aminosäuresequenzen, er halten von den 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteinen (siehe Tabelle 2 oben), wurden zwei degenerierte Oligo nukleotid-Primer-Pools entworfen und verwendet zum Vermehren der genomischen Schweine-DNA durch PCR. Es wurde davon aus gegangen, daß, falls die aminoterminale Aminosäuresequenz durch ein einziges Exon kodiert wird, dann das richtige PCR- Produkt als 69 Basenpaar lang zu erwarten ist. Ein DNA-Frag ment dieser Größe wurde gefunden und subkloniert in pGEMT. Die Sequenzen der Oligonukleotid-PCR-Primer und der drei er haltenen Klone sind in Beispiel 5 gegeben. Die Aminosäure sequenz (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) des zwischen den PCR- Primern kodierten Peptids war identisch zu der durch das aminoterminale-Protein-Sequenzieren des Schweineliganden er haltenen Sequenz (siehe Reste 9-17 für die 28- und 30 kDa- Schweineproteinsequenzen oben).

Ein synthetisches Oligonukleotid, basierend auf der Sequenz des PCR-Fragments, wurde verwendet, um eine humane genomi sche DNA-Bank abzusuchen. Ein 45-mer-Oligonukleotid, be zeichnet pR45, wurde entworfen und synthetisiert basierend auf der Sequenz des PCR-Fragments. Dieses Oligonukleotid be saß die folgende Sequenz:
5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG- TCG3′
(SEQ ID NO:34)

Das Desoxyoligonukleotid wurde zum Absuchen einer humanen genomischen DNA-Bank in λgem12 unter niedrig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet, gemäß Bei spiel 6. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt und durch Restriktionskartierung und Southern-Blotten analy siert. Ein 390 bp EcoRI-XbaI-Fragment, das an das 45-mer hy bridisierte, wurde subkloniert in pBluescript SK-. DNA-Se quenzierung dieses Klons bestätigte, daß DNA isoliert worden war, die das humane Homologe zu dem Schweine-mpl-Liganden kodierte. Die humane DNA-Sequenz und die gefolgerte Amino säuresequenz sind in Fig. 9 gezeigt (SEQ ID NO: 3 & 4). Die vorhergesagten Positionen der Introns in der genomischen Se quenz sind ebenfalls durch Pfeile angegeben, und sie defi nieren ein vermutetes Exon ("Exon 3").

Basierend auf der humanen "Exon 3"-Sequenz (Beispiel 6) wur den Oligonukleotide synthetisiert, die den 3′- und 5′-Enden der Exon-Sequenz entsprechen. Diese zwei Primer wurden ver wendet in PCR-Reaktionen unter Verwendung einer Matrizen- cDNA, hergestellt aus verschiedenen humanen Geweben. Die er wartete Größe des richtigen PCR-Produkts betrug 140 bp. Nach Analyse der PCR-Produkte auf einem 12%-Polyacrylamidgel wurde ein DNA-Fragment der erwarteten Größe in cDNA-Banken nachgewiesen, die hergestellt worden waren aus humaner Niere von Erwachsenen, fötalen 293-Nierenzellen und cDNA, herge stellt aus humaner fötaler Leber.

Eine cDNA-Bank aus fötaler Leber (7 × 10⁶ Klone) in Lambda- DR2 wurde als nächstes abgesucht mit dem gleichen 45-mer- Oligonukleotid, das verwendet wurde zum Absuchen der humanen genomischen Bank, und die cDNA-Bank aus fötaler Leber wurde unter niedrig stringenten Hybridisierungsbedingungen abge sucht. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt, und die Insertgröße wurde ermittelt durch PCR. Ein Klon mit einem 1,8 kb-Insert wurde ausgewählt für die weitere Ana lyse. Unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Ver fahrens wurde die Nukleotid- und die gefolgerte Aminosäure sequenz des humanen mpl-Liganden (hML) erhalten. Diese Se quenzen sind in Fig. 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1 & 2).

3. Struktur des humanen mpl-Liganden (hML)

Die humane mpl-Liganden (hML)-cDNA-Sequenz (Fig. 1 [SEQ ID NO: 2]) umfaßt 1774 Nukleotide gefolgt von einem Poly(A)- Schwanz. Sie enthält 215 Nukleotide von 5′-nicht-transla tierter Sequenz und eine 3′-nicht translatierte Region von 498 Nukleotiden. Das angenommene Startcodon bei Nukleotidpo sition (216-218) liegt innerhalb einer Konsensussequenz, die für die Initiation der eukaryotischen Translation bevorzugt ist. Der offene Leseraster ist 1059 Nukleotide lang und ko diert für ein 353 Aminosäurereste langes Polypeptid, begin nend an Nukleotidposition 220. Der N-terminus der vorherge sagten Aminosäuresequenz ist stark hydrophob und entspricht vermutlich einem Signalpeptid. Die Computeranalyse der vor hergesagten Aminosäuresequenz (von Heÿne et al., Eur. J. Biochem., 133 : 17-21 [1983]) weist auf eine potentielle Spaltstelle für die Signalpeptidase zwischen Resten 21 und 22 hin. Die Spaltung an dieser Position würde ein reifes Polypeptid von 332 Aminosäureresten erzeugen, beginnend mit der aminoterminalen Sequenz, erhalten von dem mpl-Liganden, gereinigt aus Schweineplasma. Das vorhergesagte nicht glyco sylierte Molekulargewicht des 332 Aminosäurereste langen Li ganden beträgt ungefähr 38 kDa. Es gibt 6 potentielle N- Glycosylierungsstellen und 4 Cysteinreste.

Ein Vergleich der mpl-Ligandensequenzen mit der Sequenz datenbank Genbank ergab 23% Identität zwischen den aminoter minalen 153 Resten von reifem humanem mpl-Liganden und huma nem Erythropoietin (Fig. 10 [SEQ ID NO: 6 & 7]). Wenn kon servative Substitutionen mit berücksichtigt werden, zeigt diese Region von hML 50% Ähnlichkeit zu humanem Erythropoie tin (hEPO). hEPO und das hML enthalten vier Cysteine. Drei der vier Cysteine sind konserviert in hML, einschließlich das erste und das letzte Cystein. Sequenzspezifische (site- directed) Mutageneseexperimente haben gezeigt, daß das erste und letzte Cystein von Erythropoietin eine Disulfidbindung ausbilden, die für die Funktion erforderlich ist (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116 : 2286-2292 [1983]). In analoger Weise können das erste und letzte Cystein von hML ebenfalls eine kritische Disulfidbindung ausbilden. Keine der Glycosy lierungsstellen sind in hML konserviert. Alle potentiellen N-abhängigen Glycosylierungsstellen in hML sind in der carboxyterminalen Hälfte des hML-Polypeptids gelegen.

Ähnlich zu hEPO enthält die mRNA von hML nicht die Konsen sus-Polyadenylierungssequenz AAUAAA, auch nicht das regulie rende Element AUUUA, das in der 3′-nicht-translatierten Re gion von vielen Zytokinen vorhanden ist, und von dem man an nimmt, daß es die mRNA-Stabilität beeinflußt (Shaw et al., Cell, 46 : 659-667 [1986]). Die Northern Blot-Analyse zeigt geringe Spiegel eines einzigen 1,8 kb hML RNA-Transkripts in fötaler und erwachsener Leber. Nach längerer Exposition konnte eine schwächere Bande der gleichen Größe in der er wachsenen Niere nachgewiesen werden. Im Vergleich wird huma nes Erythropoietin in fötaler Leber exprimiert und, als Ant wort auf Hypoxie, in der erwachsenen Niere und der Leber (Jacobs et al., Nature, 313 : 804-809 [1985] und Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6 : 2731-2733 [1986]).

Die Bedeutung der C-terminalen Region des hML ist noch auf zuklären. Basierend auf der Anwesenheit der sechs potentiel len Stellen für die N-abhängige Glycosylierung und der Fä higkeit des Liganden, an Lektin-Affinitätssäulen zu binden, ist diese Region des hML vermutlich glycosyliert. In einigen Gelelutionsexperimenten beobachteten wir eine Aktivität, die aufgetrennt wurde mit einem M_r von ungefähr 60 000, die das vollständige glycosylierte Molekül darstellen kann. Die C- terminale Region kann deshalb zum Stabilisieren und Verlän gern der Halbwertszeit des zirkulierenden hML dienen. In dem Fall des Erythropoietin besitzt die nicht glycosylierte Form die volle in vitro-biologische Aktivität, aber sie besitzt in signifikanter Weise verringerte Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu glycosyliertem Erythropoietin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265 : 12 127-12 130 [1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266 : 23 022-23 026 [1991] und Spivack et al., Blood, 7 : 90-99 [1986]). Die C-terminale Domäne von hML ent hält zwei dibasische Aminosäuresequenzen (Arg-Arg-Motive an Positionen 153-154 und 245-246), die als potentielle Prozes sierungsstellen dienen können. Die Spaltung an diesen Stel len kann verantwortlich sein für das Erzeugen der 30-, 28- und 18-22 kDa-Formen des ML, isoliert aus APP. Signifikan terweise folgt die Arg₁₅₃-Arg₁₅₄-Sequenz unmittelbar auf die Erythropoietin-ähnliche Domäne des ML. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß das vollständige ML ein Vorläuferpro tein darstellen kann, das eine begrenzte Proteolyse durch läuft, um den reifen Liganden zu bilden.

4. Isoformen und Varianten des humanen mpl-Liganden

Isoformen und alternativ gespleißte Formen von humanem mpl- Liganden wurden nachgewiesen durch PCR in humaner Erwachse nenleber. Kurz gesagt, Primer wurden synthetisiert, die je dem Ende wie auch ausgewählten internen Regionen der kodie renden Sequenz von hML entsprachen. Diese Primer wurden in RT-PCR verwendet, um humane Erwachsenenleber-RNA zu vermeh ren, wie beschrieben in Beispiel 10. Zusätzlich zu der voll ständigen Form, bezeichnet hML, wurden drei andere Formen, bezeichnet hML2, hML3 und hML4, beobachtet oder gefolgert. Die reife gefolgerte Aminosäuresequenz aller vier Isoformen ist dargestellt in Fig. 11 (SEQ ID NO: 6, 8, 9 & 10). hML3 besitzt eine 116 Nukleotide umfassende Deletion an Position 700, die sowohl zu einer Aminosäuredeletion wie auch zu einer Rasterverschiebung führt. Die cDNA kodiert nun ein reifes Polypeptid, das 265 Aminosäuren lang ist und bei dem der Aminosäurerest 139 von der hML-Sequenz divergiert. Schließlich besitzt hML4 eine 12 Nukleotide umfassende Dele tion folgend auf Nukleotidposition 618 (auch gefunden in der Mäuse- und der Schweinesequenz (siehe unten)) und besitzt die 116 bp-Deletion, die in hML3 gefunden wird. Obwohl keine Klone mit lediglich der 12 bp-Deletion (folgend Nukleotid 619) isoliert worden sind in dem Menschen (bezeichnet hML2), besteht diese Form vermutlich, da solche Isoformen identifi ziert worden sind in der Maus und im Schwein (siehe unten), und weil sie identifiziert worden ist in Verbindung mit der 116-Nukleotid-Deletion in hML4.

Eine Substitutionsvariante von hML, in der die dibasische Arg₁₅₃-Arg₁₅₄-Sequenz ersetzt worden war durch zwei Alanin reste, und eine "EPO-Domäne"-verkürzte Form von hML wurden konstruiert, um zu bestimmen, ob das vollständige ML erfor derlich ist für die biologische Aktivität. Die substituierte dibasische Arg₁₅₃-Arg₁₅₄-Sequenzvariante, bezeichnet als hML(R153A, R154A), wurde konstruiert mit Hilfe von PCR, wie beschrieben in Beispiel 10. Die "EPO-Domäne"-verkürzte Form, hML₁₅₃, wurde ebenfalls hergestellt mit Hilfe von PCR durch Einführen eines Stopcodons folgend auf Arg153.

5. Expression von rekombinantem humanem mpl-Liganden (rhML) in transient transfektierten humanen Embryo-Nieren (293)- Zellen

Um zu bestätigen, daß die klonierte humane cDNA einen Ligan den für mpl kodiert, wurde der Ligand exprimiert in 293-Säu gerzellen unter der Kontrolle des Zytomegalovirus-Immediate- Early-Promotors unter Verwendung der Expressionsvektoren pRK5-hML oder pRK5-hML₁₅₃. Von Überständen der transient transfektierten humanen Embryonalnieren-239-Zellen wurde ge funden, daß sie den ³H-Thymidineinbau in Ba/F3-mpl-Zellen stimulieren, aber nicht in die parentalen Ba/F3-Zellen (Fig. 12A). Medien von den 293-Zellen, die nur mit dem pRK-Vektor alleine transfektiert waren, zeigten diese Aktivität nicht. Zusatz von mpl-IgG zu den Medien zerstörte die Stimulierung (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, daß die klo nierte cDNA ein funktionelles humanes ML (hML) kodiert.

Um zu bestimmen, ob die "EPO-Domäne" alleine an mpl binden und diesen aktivieren könnte, wurde die verkürzte Form von hML, rhML₁₅₃, in 293-Zellen exprimiert. Von Überständen aus transfektierten Zellen wurde gefunden, daß sie eine ähnliche Aktivität zu derjenigen haben, die in Überständen von Zellen gefunden wird, die das vollständige hML exprimieren (Fig. 12A), wobei dies anzeigt, daß die C-terminale Domäne von ML nicht erforderlich ist für die Bindung und Aktivierung von c-mpl.

6. Der mpl-Ligand stimuliert die Megakaryozytopoese und Thrombopoese

Der vollständige rhML und die verkürzte rhML₁₅₃-Form von re kombinantem hML stimulierte die humane Megakaryozytopoese in vitro (Fig. 12B). Dieser Effekt wurde beobachtet in der An wesenheit von anderen exogen zugesetzten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren. Mit der Ausnahme von IL-3 war ML der ein zige getestete hämatopoetische Wachstumsfaktor, der diese Aktivität zeigte. IL-11, IL-6, IL-1, Erythropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit-Ligand (KL), M-CSF, OSM und GM-CSF hatten keinen Effekt auf die Megakaryozytopoese, wenn sie in unse rem Assay getrennt getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt, daß ML Megakaryozyten-stimulierende Aktivität besitzt, und sie zeigen die Rolle von ML bei der Regulierung der Megakaryozytopoese.

Von thrombopoetischen Aktivitäten, die in dem Plasma von Thrombozytopenie-Tieren vorhanden sind, ist gezeigt worden, daß sie die Plättchenproduktion in einem Mäuse-Rebound- Thrombozytose-Assay stimulieren (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14 : 1006-1001 [1973] und McDonald et al., Scand. J. Haematol., 16 : 326-334 [1976). In diesem Modell wird bei Mäusen eine akute Thrombozytopenie hervorgerufen unter Ver wendung eines spezifischen Anti-Plättchen-Serums, wobei dies zu einer vorhersehbaren Rebound-Thrombozytose führt. Solche immuno-thrombozythemischen Mäuse antworten besser auf exo gene Thrombopoetin-ähnliche Aktivitäten als normale Mäuse (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14 : 1006-1001 [1973]), genau wie exhypoxische Mäuse sensitiver gegen Erythropoietin sind als normale Mäuse (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 77 : 134-143 [1971]). Um zu bestimmen, ob der rML die Plätt chenproduktion in vivo stimuliert, wurden Mäuse mit Rebound- Thrombocytose injiziert mit teilweise gereinigtem rhML. Die Plättchenzahl und der Einbau von ³⁵S in Plättchen wurde dann quantifiziert. Die Injektion von Mäusen mit 64 000 und 32 000 Einheiten von rML steigerte signifikant die Plättchenproduk tion, wie belegt wird durch einen rund 20%-Anstieg der Plättchenzahl (p=0,0005 und 0,0001) und eine rund 40%-Zu nahme im ³⁵S-Einbau in Plättchen (p=0,003) in den behandel ten Mäusen gegenüber den Kontrollmäusen, die mit dem Hilfs stoff alleine injiziert wurden (Fig. 12C). Dieser Spiegel der Stimulation ist vergleichbar mit dem Ergebnis, das wir beobachtet haben mit IL-6 in diesem Modell (Daten nicht ge zeigt). Die Behandlung mit 16 000 Einheiten von rML zeigte keine signifikante Stimulierung der Plättchenproduktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß ML die Plättchenproduktion in einer dosisabhängigen Weise stimuliert und deshalb Thrombo poietin-ähnliche Aktivität besitzt.

293-Zellen wurden ebenfalls transfektiert mit den anderen hML-Isoformkonstrukten, oben beschrieben, und die Überstände wurden getestet unter Verwendung des Ba/F3-mpl-Proliferati onsassays (siehe Fig. 13). hML2 und hML3 zeigten keine nach weisbare Aktivität in diesem Assay, jedoch war die Aktivität von hML(R153A, R154A) ähnlich zu hML und hML₁₅₃, wobei dies zeigt, daß der Besitz der Arg₁₅₃-Arg₁₅₄-dibasischen Stelle für die Aktivität weder erforderlich noch schädlich ist.

7. Megakaryozytopoese und der mpl-Ligand

Es ist vorgeschlagen worden, daß die Megakaryozytopoese re guliert wird auf einer Vielzahl von zellulären Ebenen (Williams et al., J. Cell Physiol., 110 : 101-104 [1982] und Williams et al., Blood Cells, 15 : 123-133 [1989]). Dies ba siert im wesentlichen auf der Beobachtung, daß bestimmte hämatopoetische Wachstumsfaktoren die Proliferation von Megakaryozytenvorläufern stimulieren, während andere primär die Reifung zu beeinflussen scheinen. Die hier dargestellten Ergebnisse legen nahe, daß ML sowohl als proliferativer wie auch als Reifungsfaktor wirkt. Der Befund, daß ML die Proli feration der Megakaryozytenvorläufer stimuliert, wird ge stützt durch mehrere Hinweise. Erstens, APP stimuliert so wohl die Proliferation wie auch die Reifung von humanen Megakaryozyten in vitro, und diese Stimulation wird voll ständig gehemmt durch mpl-IgG (Fig. 7 und 8). Weiterhin zei gen auch die Hemmung der Megakaryozytenkoloniebildung durch c-mpl-Antisense-Oligonukleotide (Methia et al., Blood, 82 : 1395-1401 [1993]) und der Befund, daß c-mpl ein prolife ratives Signal in Zellen erzeugen kann, in die es transfek tiert wird (Skoda et al., EMBO, 12 : 2645-2653 [1993] und Vigon et al., Oncogene, 8 : 2607-2615 [1993]), daß ML die Proliferation stimuliert. Die offensichtliche Expression von c-mpl während allen Phasen der Megakaryozytendifferenzierung (Methia et al., Blood, 82 : 1395-1401 [1993]) und die Fähigkeit von rekombinantem ML, die Plättchenproduktion in vivo rasch zu stimulieren, zeigen, daß ML auch die Reifung beeinflußt. Die Verfügbarkeit von rekombinantem ML ermög licht es, eine sorgfältige Ermittlung seiner Rolle bei der Regulierung der Megakaryozytopoese und Thrombopoese wie auch sein Potential zum Beeinflussen anderer hämatopoetischer Abstammungslinien zu untersuchen.

8. Isolierung des Gens für den humanen mpl-Liganden (TPO)

Humane genomische DNA-Klone des TPO-Gens wurden isoliert durch Absuchen einer humanen genomischen Bank in λ-Gem12 mit pR45 unter niedrig stringenten- Bedingungen oder unter hoch stringenten Bedingungen mit einem Fragment, das der 3′- Hälfte der humanen cDNA entsprach, die für den humanen mpl- Liganden kodiert. Zwei überlappende Lambda-Klone, die 35 kb umfassen, wurden isoliert. Zwei überlappende Fragmente (BamH1 und EcoRI), die das vollständige TPO-Gen enthalten, wurden subkloniert und sequenziert (Fig. 14A, 14B und 14C).

Die Struktur des humanen Gens setzt sich zusammen aus sechs Exons innerhalb von 7 kb der genomischen DNA. Die Grenzen aller Exon/Intron-Verbindungen stimmen überein mit dem Kon sensusmotiv, das für Säugergene etabliert worden ist (Shapiro, M.B. et al., Nucl. Acids Res. 15 : 7155 [1987]). Exon 1 und Exon 2 enthalten 5′-nicht-translatierte Sequenz und die anfänglichen vier Aminosäuren des Signalpeptids. Der Rest des sekretorischen Signals und die ersten 26 Aminosäu ren des reifen Proteins werden durch Exon 3 kodiert. Die vollständige Carboxyldomäne und der 3′-nicht-translatierte Bereich wie auch rund 50 Aminosäuren der Erythropoietin-ähn lichen Domäne werden durch Exon 6 kodiert. Die vier Ami nosäuren, die an der Deletion beteiligt sind, die in hML-2 beobachtet werden (hTPO-2), werden durch das 5′-Ende des Exons 6 kodiert.

Die Analyse von humaner genomischer DNA durch einen Southern Blot zeigte, daß das Gen für TPO in einer einzigen Kopie vorliegt. Die chromosomale Lage des Gens wurde ermittelt durch fluoreszierende in situ-Hybridisierung (FISH), die dem Chromosom 3q27-28 zugeordnet wurde.

9. Expression und Reinigung von TPO aus 293-Zellen

Herstellen und Reinigen von ML oder TPO aus 293-Zellen ist ausführlich beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgeführt, cDNA, die dem vollständigen offenen Leseraster von TPO ent spricht, wurde erhalten durch PCR mit Hilfe von pRK5-hmplI. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restrik tionsspaltstellen ClaI und XbaI des Plasmids pRK5tkneo (ein von pRK5 stammender Vektor, der modifiziert war zum Expri mieren eines Neomycinresistenzgens unter der Kontrolle des Thymidinkinasepromotors), kloniert, um den Vektor pRK5tkneo.ORF (ein Vektor, der für den vollständigen offenen Leseraster kodiert) zu erhalten.

Ein zweiter Vektor, der die EPO-homologe Domäne kodiert, wurde auf die gleiche Weise erzeugt, aber unter Verwendung verschiedener PCR-Primer, um das endgültige Konstrukt, pRK5- tkneoEPO-D genannt, zu erhalten.

Diese beiden Konstrukte wurden in humane Embryonennierenzel len durch das Kalziumphosphatverfahren transfektiert, und Neomycin-resistente Klone wurden ausgewählt und bis zu kon fluenter Dichte kultiviert. Die Expression von ML₁₅₃ oder ML₃₃₂ in den konditionierten Medien dieser Klone wurde gemes sen mit Hilfe des Ba/F3-mpl-Proliferationsassays.

Die Reinigung von rhML₃₃₂ wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgeführt, 293-rhML₃₃₂-konditionierte Medien wurden auf eine Blue-Sepharose (Pharmacia)-Säule ge geben, die anschließend gewaschen wurde mit einem Puffer enthaltend 2M Harnstoff. Die Säule wurde eluiert mit einem Puffer enthaltend 2M Harnstoff und 1M NaCl. Der Blue-Sepha rose-Elutionspool wurde dann direkt auf eine WGA-Sepharose- Säule gegeben, gewaschen mit 10 Säulenvolumina Puffer ent haltend 2M Harnstoff und 1M NaCl, und eluiert mit dem glei chen Puffer, enthaltend 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin. Das WGA- Sepharose-Eluat wurde auf eine C4-HPLC-Säule (Synchrom, Inc.) gegeben und eluiert mit einem diskontinuierlichen Pro panolgradienten. In SDS-PAGE wandert das gereinigte 293- rhML₃₃₂ als eine breite Bande in dem Bereich 68-80 kDa des Gels (siehe Fig. 15).

Die Reinigung von rhML₁₅₃ wurde ebenfalls durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgeführt, 293-rhML₁₅₃-kon ditionierte Medien wurden aufgetrennt auf Blue-Sepharose, wie beschrieben für rhML₃₃₂. Das Blue-Sepharose-Eluat wurde direkt auf eine mpl-Affinitätssäule gegeben, wie oben be schrieben. Von der mpl-Affinitätssäule eluiertes rhML₁₅₃ wurde bis zur Homogenität gereinigt mit Hilfe eines C4-HPLC- Säulenlaufs unter den gleichen Bedingungen wie für rhML₃₃₂ verwendet. In SDS-PAGE trennt sich das gereinigte rhML₁₅₃ in zwei Haupt- und zwei Nebenbanden mit Mr von rund 18 000-22 000 (siehe Fig. 15).

10. Der mpl-Ligand aus Maus

Ein DNA-Fragment entsprechend der kodierenden Region des hu manen mpl-Liganden wurde erhalten durch PCR, gelgereinigt und markiert in der Anwesenheit von ³²P-dATP und ³²P-dCTP. Diese Probe wurde verwendet zum Absuchen von 10⁶ Klonen einer Mausleber-cDNA-Bank in λGT10. Ein Mäuseklon (Fig. 16 [SEQ ID NO: 12 & 13)), enthaltend ein 1443 Basenpaar-Insert, wurde isoliert und sequenziert. Das vermutete Startcodon an Nukleotidposition 138-141 lag innerhalb einer Konsensusse quenz, die für die eukaryotische Translationsinitiation vor teilhaft ist (Kozak, M., J. Cell Biol., 108 : 229-241 [1989]). Diese Sequenz definiert einen offenen Leseraster von 1056 Nukleotiden, der ein primäres Translationsprodukt von 352 Aminosäuren vorhersagt. Diesen offenen Leseraster flankieren 137 Nukleotide 5′- und 247 Nukleotide einer 3′-nicht-trans latierten Sequenz. Es gibt keinen Poly(A)-Schwanz, der auf die 3′-nicht-translatierte Region folgt, wobei dies anzeigt, daß der Klon vermutlich nicht vollständig ist. Der N-Termi nus der vorhergesagten Aminosäuresequenz ist stark hydrophob und stellt vermutlich ein Signalpeptid dar. Die Compu teranalyse (von Heÿne, G., Eur. J. Biochem. 133 : 17-21 (1983)) zeigt eine potentielle Spaltstelle für die Signal peptidase zwischen Resten 21 und 22. Die Spaltung an dieser Position würde ein reifes Polypeptid von 331 Aminosäuren (35 kDa) ergeben, das als mML₃₃₁ identifiziert wird (oder mML2, aus den Gründen, wie unten angegeben). Die Sequenz enthält vier Cysteine, die in der humanen Sequenz alle konserviert sind, und sieben potentielle N-Glykosylierungsstellen, von denen fünf in der humanen Sequenz konserviert sind. Wie derum, wie bei hML, sind die sieben potentiellen N-Glykosy lierungsstellen in der C-terminalen Hälfte des Proteins lo kalisiert.

Wenn verglichen mit dem humanen ML, wird beträchtliche Iden tität für die Nukleotid- und die gefolgerten Aminosäurense quenzen beobachtet in den "EPO-Domänen" dieser ML′s. Jedoch wenn die gefolgerten Aminosäurensequenzen von humanem und Mäuse-ML′s ausgerichtet werden, scheint die Maussequenz eine Tetrapeptiddeletion zwischen Resten 111-114 zu tragen, die der 12 Nukleotid-Deletion entspricht, die der Nukleotidpo sition 618 folgt, wie beobachtet in der humanen (siehe oben) und der Schweine- (siehe unten) cDNA. Demzufolge wurden wei tere Klone untersucht, um mögliche Mäuse-ML-Isoformen zu identifizieren. Ein Klon kodierte für eine gefolgerte 335 Aminosäure lange Polypeptidsequenz enthaltend das "fehlende" Tetrapeptid LPLQ. Von dieser Form wird angenommen, daß sie den vollständigen ML der Maus darstellt, und sie wird be zeichnet als mML oder mML₃₃₅. Die Nukleotid- und die gefol gerte Aminosäuresequenz für mML sind in Fig. 17 angegeben (SEQ ID NO: 14 & 15). Diese cDNA-Klone bestehen aus 1443 Basenpaaren gefolgt von einem Poly(A)-Schwanz. Sie besitzt einen offenen Leseraster von 1068 bp, flankiert von 134 Ba sen einer 5′- und 241 Basen einer 3′-nicht-translatierten Sequenz. Das vermutete Startcodon liegt an der Nukleotidpo sition 138-140. Der offene Leseraster kodiert ein vorherge sagtes Protein von 356 Aminosäuren, die ersten 21 davon sind stark hydrophob und fungieren wahrscheinlich als Sekretions signal.

Schließlich wurde ein dritter Mäuseklon isoliert, sequen ziert, und es wurde gefunden, daß er die 116 Nukleotid-Dele tion, die hML3 entspricht, enthält. Diese Mäuse-Isoform wird deshalb mML3 bezeichnet. Ein Vergleich der gefolgerten Ami nosäuresequenzen dieser zwei Isoformen ist in Fig. 18 ge zeigt (SEQ ID NO: 9 & 16).

Die gesamte Aminosäuresequenzidentität zwischen humanem und Mäuse-ML (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6 & 17]) beträgt 72%, aber diese Homologie ist nicht gleichmäßig verteilt. Die als die "EPO-Domäne" bezeichnete Region (Aminosäuren 1-153 für die humane Sequenz und 1-149 für die Maus) ist stärker konser viert (86% Homologie) als die carboxyterminale Region des Proteins (62% Homologie). Dies mag weiterhin darauf hindeu ten, daß nur die "EPO-Domäne" wichtig ist für die biologi sche Aktivität des Proteins. Interessanterweise ist von den zwei dibasischen Aminosäuremotiven, die in hML gefunden wer den, nur das dibasische Motiv, das unmittelbar der "EPO-Do mäne" (Resteposition 153-154) in der humanen Sequenz folgt in der Maussequenz vorhanden. Dies ist in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, daß der vollständige ML ein Vorläufer protein darstellen kann, das eine begrenzte Proteolyse durchläuft, um den reifen Liganden zu erzeugen. Alternativ kann die Proteolyse zwischen Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ die Clearance von hML erleichtern.

Ein Expressionsvektor, enthaltend die vollständige kodie rende Sequenz für mML, wurde transient transfektiert in 293- Zellen, wie beschrieben in Beispiel 1. Konditionierte Medien von diesen Zellen stimulierten ³H-Thymidin-Einbau in Ba/F3- Zellen, die entweder den Mäuse- oder humanen mpl exprimier ten, aber sie hatten keinen Effekt auf die Eltern (mpl- frei)-Zellinie. Dies zeigt, daß die klonierte ML-cDNA der Maus einen funktionellen Liganden kodiert, der in der Lage ist, sowohl den Mäuse- wie auch den humanen ML-Rezeptor (mpl) zu aktivieren.

11. Der mpl-Ligand aus Schwein

Schweine-ML (pML) cDNA wurde isoliert durch RACE-PCR, wie beschrieben in Beispiel 13. Ein PCR-cDNA-Produkt aus 1342 bp wurde in Niere aufgefunden und subkloniert. Mehrere Klone wurden sequenziert, und von diesen wurde gefunden, daß sie einen Schweine-mpl-Liganden von 332 Aminosäureresten, be zeichnet als pML (oder pML₃₃₂), kodiert, der die Nukleotid- und gefolgerte Aminosäuresequenz, wie in Fig. 20 (SEQ ID NO: 18 & 19) gezeigt, besitzt.

Wiederum wurde eine zweite Form, als pML2 bezeichnet, die ein Protein mit einer 4 Aminosäure-Deletion kodiert (228 Aminosäurereste), identifiziert (siehe Fig. 21 [SEQ ID NO: 21)). Ein Vergleich der pML- und pML2-Aminosäuresequenzen zeigt, daß die letztere Form identisch ist, mit der Aus nahme, daß das Tetrapeptid QLPP, entsprechend den Resten 111-114 einschließlich, deletiert worden vier Aminosäuren lange Deletionen ist (siehe Fig. 22 [SEQ ID NO: 18 & 21]).

Die vier Aminosäuren lange Deletionen, die in Mäuse- und Schweine-ML-cDNA beobachtet werden, treten exakt an der gleichen Position innerhalb des vorhergesagten Proteins auf.

Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen der reifen ML-Form aus Mensch, Maus und Schwein (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 & 18]) zeigt, daß die Gesamtsequenzidentität 72% beträgt zwischen Maus und Mensch, 68% zwischen Maus und Schwein und 73% zwischen Schwein und Mensch. Die Homologie ist beträchtlich größer in der aminoterminalen Hälfte des ML (der EPO-homologen Domäne). Diese Domäne ist zu 80-84% iden tisch zwischen zwei Arten, wohingegen die carboxyterminale Hälfte (Kohlenhydratdomäne) zu nur 57 bis 67% identisch ist. Ein dibasisches Aminosäuremotiv, das eine Protease spaltstelle repräsentieren könnte, ist an dem Carboxyende der Erythropoietin-Homologiedomäne vorhanden. Dieses Motiv ist konserviert zwischen den drei Arten an dieser Position (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 & 18]). Eine zweite dibasische Stelle, die an Position 245 und 246 in der humanen Sequenz vorhanden ist, ist nicht vorhanden in der Mäuse- oder Schweinesequenz. Die Mäuse- und die Schweine-ML-Sequenz ent hält 4 Cysteine, die alle konserviert sind in der humanen Sequenz. Es gibt sieben potentielle N-Glycosylierungsstellen innerhalb des Maus-Liganden und sechs innerhalb des Schweine-ML, von denen fünf innerhalb der humanen Sequenz konserviert sind. Wiederum sind alle potentiellen N-Glycosy lierungsstellen in der C-terminalen Hälfte des Proteins vor handen.

12. Expression und Reinigung von TPO aus Zellen des chinesi schen Hamsters (CHO)

Die zum Transfektieren der CHO-Zellen verwendeten Expressi onsvektoren werden wie folgt bezeichnet: pSV15.ID.LL.MLORF (vollständig oder TPO₃₃₂), und pSV15.ID.LL.MLEPO-D (verkürzt oder TPO₁₅₃). Die wesentlichen Merkmale dieser Plasmide sind in Fig. 23 und 24 gezeigt.

Die Transfektionsverfahren sind in Beispiel 20 beschrieben. Kurz ausgeführt, cDNA, die dem vollständigen offenen Lese raster von TPO entspricht, wurde durch PCR erhalten. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und kloniert zwischen die Re striktionsspaltstellen (ClaI und SalI) des Plasmids pSV15.ID.LL, um den Vektor pSVl5.ID.LL.MLORF zu erhalten. Ein zweites Konstrukt, entsprechend der EPO-homologen Do mäne, wurde auf die gleiche Weise erzeugt, aber unter Ver wendung eines verschiedenen reversen Primers (EPOD.Sal). Das endgültige Konstrukt für den Vektor, der für die EPO-homo loge Domäne von TPO kodiert, wird pSV15.ID.LL.MLEPO-D ge nannt.

Diese zwei Konstrukte wurden linearisiert mit NotI und transfektiert in Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO-DP12-Zellen, EP 307,247, veröffentlicht am 15. März 1989) durch Elektroporation. 10⁷ Zellen wurden einer Elek troporation unterzogen in einem BRL-Elektroporationsapparat (350 Volt, 330 mF, geringe Kapazitanz) in der Anwesenheit von 10, 25 oder 50 mg DNA, wie beschrieben (Andreason, G.L., J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). Am auf die Transfektion folgenden Tag wurden die Zellen aufgeteilt auf DHFR-selek tive Medien (Hoch-Glukose-DMEM-F12 50 : 50 ohne Glyzin, 2 mM Glutamin, 2-5% dialysiertes fötales Kälberserum). 10 bis 15 Tage später wurden einzelne Kolonien in 96-Loch-Platten überführt und bis zur Konfluenz kultiviert. Die Expression von ML₁₅₃ oder ML₃₃₂ in den konditionierten Medien dieser Klone wurde gemessen mit Hilfe des Ba/F3-mpl-Prolifera tionsassays (beschrieben in Beispiel 1).

Das Verfahren zum Reinigen und Isolieren von TPO aus geern teter CHO-Zellkulturflüssigkeit ist in Beispiel 20 beschrie ben. Kurz ausgeführt, geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF) wird auf eine Blue-Sepharose-Säule (Pharmacia) mit einem Verhältnis von ungefähr 100 l des HCCF pro Liter Harz gege ben. Die Säule wird dann mit dem 3- bis 5-fachen Säulenvo lumen an Puffer gewaschen, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolu mina eines Puffers enthaltend 2,0 M Harnstoff. TPO wird dann eluiert mit 3 bis 5 Säulenvolumen an Puffer enthaltend 2,0M Harnstoff und 1,0M NaCl.

Der eluierte Blue-Sepharose-Pool enthaltend TPO wird dann auf eine Weizenkeimlectin-Sepharosesäule (Pharmacia), equi libriert in dem Blue-Sepharose-Elutionspuffer, in einem Ver hältnis von 8 bis 16 ml an Blue-Sepharose-Eluat pro ml Harz gegeben. Die Säule wird dann mit 2 bis 3 Säulenvolumen an Equilibrierungspuffer gewaschen. TPO wird dann eluiert mit 2 bis 5 Säulenvolumen eines Puffers enthaltend 2,0M Harnstoff und 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin.

Das Weizenkeimlektineluat enthaltend TPO wird dann angesäu ert, und C₁₂E₈ wird zugesetzt auf eine Endkonzentration von 0,04%. Der erhaltene Pool wird auf eine C4-Umkehrphasen säule, equilibriert in 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈, mit einer Bela dung von ungefähr 0,2 bis 0,5 mg Protein pro ml Harz gege ben.

Das Protein wird eluiert mit einem zweiphasigen linearen Gradienten aus Acetonitril enthaltend 0,1% TFA und 0,04% C₁₂E₈, und ein Pool wird hergestellt auf der Basis von SDS- PAGE.

Der C4-Pool wird dann verdünnt und einer Diafiltration gegen ungefähr 6 Volumen an Puffer auf einer Amicon YM oder ähnli chen Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-off des Moleku largewichts bei 10 000 bis 30 000 unterzogen. Das erhaltene Diafiltrat kann dann direkt weiterverarbeitet werden oder weiter konzentriert werden durch Ultrafiltration. Das Dia filtrat/Konzentrat wird üblicherweise auf eine Endkonzentra tion von 0,01% Tween-80 eingestellt.

Das vollständige oder ein Teil des Diafiltrats/Konzentrats, das äquivalent ist zu 2 bis 5% des berechneten Säulenvolu mens, wird dann auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia) gegeben, die equilibriert ist in einem Puffer enthaltend 0,01% Tween-80, und wurde dann chromatographiert. Die TPO enthaltenden Fraktionen, die frei sind von Aggrega ten und proteolytischen Abbauprodukten, werden dann verei nigt auf der Basis von SDS-PAGE. Der erhaltene Pool wird filtriert und bei 2-8°C gelagert.

13. Verfahren zum Transformieren und Induzieren der TPO-Syn these in einem Mikroorganismus und Isolieren, Reinigen und Zurückfalten des darin hergestellten TPO

Die Konstruktion der E. Coli-TPO-Expressionsvektoren ist ausführlich beschrieben in Beispiel 21. Kurz ausgeführt, Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 wurden alle so entworfen, daß sie die ersten 155 Aminosäuren von TPO stromabwärts eines kleinen Leaders exprimieren, der zwischen den verschiedenen Konstrukten variiert. Die Leader dienen primär einem hohen Spiegel der Translationsinitiation und der raschen Reinigung. Die Plasmide pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 sind entworfen zum Exprimieren der ersten 153 Ami nosäuren des TPO stromabwärts von einem Initiations-Methio nin, und sie unterscheiden sich nur in der Codon-Usage für die ersten sechs Aminosäuren des TPO, während das Plasmid pMP251 ein Derivat von pMP210-1 ist, in dem das carboxyter minale Ende von TPO um zwei Aminosäuren verlängert ist. Alle obigen Plasmide erzeugen hohe Spiegel an intrazellulärer Ex pression von TPO in E. Coli durch die Induktion des Trypto phanpromotors (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Hrsg.) 185 : 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Die Plasmide pMP1 und pMP172 sind Zwischenprodukte bei der Konstruktion der obigen Plasmide zur intrazellulären TPO-Expression.

Die obigen TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet zum Transformieren von E. Coli mit Hilfe des CaCl₂-Hitzeschock verfahrens (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53 : 159-162, [1970]) und anderer Verfahren, wie in Beispiel 21 beschrie ben. Kurz ausgeführt, die transformierten Zellen wurden zu nächst bei 37°C kultiviert, bis die optische Dichte (600 nm) der Kultur ungefähr 2-3 erreichte. Die Kultur wurde dann verdünnt, und nach Kultivieren unter Belüftung wurde Säure zugesetzt. Die Kultur wurde dann unter Belüftung für weitere 15 Std. kultiviert, und nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.

Die unten angegebenen Isolier-, Reinigungs- und Zurückfal tungsverfahren zur Herstellung von biologisch aktivem, zu rückgefaltetem humanem TPO oder Fragmenten davon werden in Beispielen 22 und 23 beschrieben und können für die Gewin nung einer beliebigen TPO-Variante verwendet werden, ein schließlich N- und C-terminal verlängerter Formen. Andere geeignete Verfahren zum Zurückfalten von rekombinantem oder synthetischem TPO können auch in den folgenden Patenten ge funden werden: Builder et al., U.S.-Patent 4,511,502, Jones et al., U.S.-Patent 4,512,922, Olson U.S.-Patent 4,518,526 und Builder et al., U.S.-Patent 4,620,948; für eine allge meine Beschreibung der Gewinnung und Zurückfaltungsverfahren für eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen, die in einer unlöslichen Form in E. Coli exprimiert wurden.

A. Gewinnen von unlöslichem TPO

Ein Mikroorganismus, wie E. Coli, der durch ein beliebiges Plasmid kodiertes TPO exprimiert, wird unter Bedingungen fermentiert, unter denen TPO als unlösliche "brechende Kör per (refractile bodies)" abgelagert werden. Gegebenenfalls werden die Zellen zunächst gewaschen in einem die Zelle auf brechenden Puffer. Typischerweise werden ungefähr 100 g Zel len in ungefähr 10 Volumen eines die Zellen aufbrechenden Puffers resuspendiert (z. B. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) mit z. B. einem Polytronhomogenisator, und die Zellen werden zen trifugiert bei 5000 × g für 30 min. Die Zellen werden dann lysiert unter Verwendung einer herkömmlichen Technik, wie einem tonischen Schock, Beschallung, Druckaufschluß (pressure cycling), chemischen oder enzymatischen Verfahren. Zum Beispiel kann das obige gewaschene Zellpellet resuspen diert werden in weiteren 10 Volumen eines die Zellen aufbre chenden Puffers mit einem Homogenisator, und die Zellsuspen sion wird durch einen LH-Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc.) oder durch einen Microfluidizer (Microfluidics Interntatio nal) gemäß den Herstellerangaben durchgeleitet. Das partiku läre Material enthaltend TPO wird dann von der Flüssigphase abgetrennt und gegebenenfalls mit einer geeigneten Flüssig keit gewaschen. Zum Beispiel kann eine Suspension des Zell lysats bei 5000 × g für 30 min zentrifugiert werden, resus pendiert werden und gegebenenfalls ein zweites Mal zentri fugiert werden, um ein gewaschenes Pellet aus brechenden Körpern zu ergeben. Das gewaschene Pellet kann sofort ver wendet werden oder gegebenenfalls eingefroren gelagert wer den (z. B. bei -70°C).

B. Solubilisierung und Reinigung von monomerem TPO

Unlösliches TPO in dem Pellet der brechenden Körper wird dann solubilisiert mit einem Solubilisierungspuffer. Der So lubilisierungspuffer enthält ein chaotropes Mittel und wird üblicherweise bei einem basischen pH gepuffert und enthält ein Reduktionsmittel, um die Ausbeute an monomerem TPO zu verbessern. Repräsentative chaotrope Mittel umfassen Harn stoff, Guanidin-HCl und Natriumthiocyanat. Ein bevorzugtes chaotropes Mittel ist Guanidin-HCl. Die Konzentration des chaotropen Mittels beträgt üblicherweise 4-9M, vorzugsweise 6-8M. Der pH des Solubilisierungspuffers wird bei einem ge eigneten pH in einem pH-Bereich von ungefähr 7,5-9,5, vor zugsweise von 8,0-9,0 und ganz besonders bevorzugt bei 8,0, gehalten. Vorzugsweise enthält der Solubilisierungspuffer auch ein Reduktionsmittel, um der Bildung der monomeren Form von TPO zu helfen. Geeignete Reduktionsmittel umfassen orga nische Verbindungen enthaltend eine freie Thiolgruppe (RSH). Repräsentative Reduktionsmittel umfassen Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), Mercaptoethanol, Glutathion (GSH), Cysteamin und Cystein. Ein bevorzugtes Reduktionsmit tel ist Dithiothreitol (DTT). Gegebenenfalls kann der Solu bilisierungspuffer ein mildes Oxidationsmittel enthalten (z. B. molekularen Sauerstoff) und ein Sulfitsalz, um monome res TPO über Sulfitolyse zu bilden. Bei dieser Ausführungs form wird das erhaltene TPO-S-Sulfonat später zurückgefaltet in der Anwesenheit des Redoxpuffers (z. B. GSH/GSSG), um das geeignet gefaltete TPO zu ergeben.

Das TPO-Protein wird üblicherweise weiter gereinigt mit Hilfe von beispielsweise Zentrifugation, Gelfiltrationschro matographie und Umkehrphasensäulenchromatographie.

Zur Erläuterung, das folgende Verfahren erzielte geeignete Ausbeuten an monomerem TPO. Das Pellet der brechenden Körper wird resuspendiert in ungefähr 5 Volumen bezogen auf das Ge wicht in dem Solubilisierungspuffer (20 mM Tris, pH8, mit 6- 8 M Guanidin und 25 mM DTT) und für 1-3 Std. oder über Nacht gerührt bei 4°C, um die Solubilisierung des TPO-Proteins zu erzielen. Hohe Konzentrationen an Harnstoff (6-8M) sind ebenfalls nützlich, aber sie führen üblicherweise zu einer etwas erniedrigten Ausbeute im Vergleich zu Guanidin. Nach dem Solubilisieren wird die Lösung zentrifugiert bei 30 000 × g für 30 min, um einen klaren Überstand zu erzeugen, enthal tend denaturiertes, monomeres TPO-Protein. Der Überstand wird dann chromatographiert auf einer Superdex 200-Gelfil trationssäule (Pharmacia, 2,6 × 60 cm) bei einer Flußrate von 2 ml/min, und das Protein wird eluiert mit 20 mM Natri umphosphat, pH 6,0, mit 10 mM DTT. Fraktion mit monomerem denaturiertem TPO-Protein, die zwischen 160 und 200 ml elu ieren, werden vereinigt. Das TPO-Protein wird weiter gerei nigt auf einer semipräparativen C4-Umkehrphasensäule (2 × 20 cm VYDAC). Die Analysenprobe wird mit 5 ml/min auf eine Säule gegeben, die equilibriert ist in 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) mit 30% Acetonitril. Das Protein wird eluiert mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril (30- 60% in 60 min). Das gereinigte reduzierte Protein eluiert bei ungefähr 50% Acetonitril. Dieses Material wird zum Zu rückfalten verwendet, um biologisch aktive TPO-Variante zu erhalten.

C. Zurückfalten von TPO erzeugt die biologisch aktive Form

Folgend auf die Solubilisierung und die weitere Reinigung von TPO wird die biologisch aktive Form erhalten durch Zu rückfalten der denaturierten monomeren TPO-Form in einem Re doxpuffer. Wegen der hohen Potenz von TPO (die halbmaximale Stimulierung in dem Ba/F3-Assay wird erzielt bei ungefähr 3 pg/ml) ist es möglich, biologisch aktives Material unter Verwendung vieler verschiedener Puffer, Detergentien und Re doxbedingungen zu erhalten. Jedoch wird unter den meisten Bedingungen nur eine kleine Menge von richtig gefaltetem Ma terial (< 10%) erhalten. Für kommerzielle Herstellungsver fahren ist es wünschenswert, Ausbeuten der Rückfaltung von mindestens 10%, stärker bevorzugt von 30-50% und ganz beson ders bevorzugt < 50% zu erhalten. Viele verschiedene Deter gentien, einschließlich Triton X-100, Dodecyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, Sarkosyl, Tween 20 und Tween 80, Zwittergent 3-14 und andere sind geeignet zum Herstellen von zumindest etwas richtig gefaltetem Material. Von diesen je doch waren die am meisten bevorzugten Detergentien diejeni gen der CHAPS-Familie (CHAPS und CHAPSO), von denen gefunden wurde, daß sie am besten bei der Zurückfaltungsreaktion wir ken, und daß sie die Proteinaggregation und ungeeignete Di sulfidbildung begrenzen. Spiegel an CHAPS von mehr als unge fähr 1% waren besonders bevorzugt. Natriumchlorid war für die besten Ausbeuten erforderlich, wobei die optimalen Spie gel zwischen 0,1 M und 0,5 M lagen. Die Anwesenheit von EDTA (1-5 mM) in dem Redoxpuffer war bevorzugt, um die Menge an metallkatalysierter Oxidation (und Aggregation) zu begren zen, die beobachtet wurde bei einigen Präparationen. Gly cerolkonzentrationen von mehr als 15% erzeugten die optima len Zurückfaltungsbedingungen. Für maximale Ausbeuten war es erforderlich, ein Redoxpaar in dem Redoxpuffer zu haben, be stehend aus einem oxidierten und reduzierten organischen Thiol (RSH). Geeignete Redoxpaare umfassen Mercaptoethanol, Glutathion (GSH), Cysteamin, Cystein und ihre entsprechenden oxidierten Formen. Bevorzugte Redoxpaare waren Glutathion (GSH):oxidiertes Glutathion (GSSG) oder Cystein:Cystin. Das am meisten bevorzugte Redoxpaar war Glutathion (GSH):oxidiertes Glutath 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019500030 00004 99880ion (GSSG). Im allgemeinen wurden höhere Ausbeuten beobachtet, wenn das Molverhältnis von oxi diertem Bestandteil des Redoxpaars gleich oder größer war gegenüber dem reduzierten Bestandteil des Redoxpaars. pH- Werte zwischen 7,5 und ungefähr 9 waren optimal für die Zu rückfaltung dieser TPO-Varianten. Organische Lösungsmittel (z. B. Ethanol, Acetonitril, Methanol) wurden toleriert bei Konzentrationen von 10-15% oder weniger. Hohe Spiegel an or ganischen Lösungsmitteln steigerten die Menge an unrichtig gefalteten Formen. Tris- und Phosphatpuffer waren im allge meinen nützlich. Die Inkubation bei 4°C erzeugte höhere Spiegel an richtig gefaltetem TPO.

Rückfaltungsausbeuten von 40-60% (basierend auf der Menge an reduziertem und denaturiertem TPO, das in der Rückfaltungs reaktion eingesetzt wurde) sind typisch für Präparationen von TPO, die durch den ersten C4-Schritt gereinigt worden sind. Aktives Material kann erhalten werden, wenn weniger reine Präparationen verwendet werden (z. B. direkt nach der Superdex 200-Säule oder nach der anfänglichen Extraktion der brechenden Körper), obwohl die Ausbeuten geringer sind wegen der extensiven Präzipitation und der Wechselwirkung mit nicht-TPO-Proteinen während dem TPO-Rückfaltungsvorgang.

Da TPO vier Cysteinreste enthält, ist es möglich, drei ver schiedene Disulfidversionen dieses Proteins zu erzeugen:
Version 1: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-4 und 2-3
Version 2: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-2 und 3-4
Version 3: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-3 und 2-4.

Während der anfänglichen Untersuchung bei der Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen wurden mehrere verschiedene Peaks, enthaltend das TPO-Protein, aufgetrennt durch C4-Umkehrpha senchromatographie. Nur einer dieser Peaks besaß signifi kante biologische Aktivität, wie ermittelt mit Hilfe des Ba/F3-Assays. Anschließend wurden die Rückfaltungsbedingun gen optimiert, um vorzugsweise diese Version zu erhalten. Unter diesen Bedingungen betrugen die falsch gefalteten Ver sionen weniger als 10-20% des gesamten monomeren TPO, erhal ten aus dem Solubilisierungsschritt.

Das Disulfidmuster für das biologisch aktive TPO ist ermit telt worden als 1-4 und 2-3 mit Hilfe der Spektrometrie und Proteinsequenzierung, wobei die Cysteine von dem Aminotermi nus her nacheinander numeriert sind. Dieses Cysteinvernet zungsmuster steht in Einklang mit dem bekannten Disulfidbin dungsmuster des verwandten Moleküls Erythropoietin.

D. Biologische Aktivität von rekombinantem, rückgefaltetem TPO

Rückgefaltetes und gereinigtes TPO besitzt Aktivität in den in vitro- und in vivo-Assays. Zum Beispiel wurde in dem Ba/F3-Assay die halbmaximale Stimulierung des Thymidinein baus in die Ba/F3-Zellen durch TPO (Met^-1 1-153) erzielt bei 3,3 pg/ml (0,3 pM). In dem mpl-Rezeptor-basierenden ELISA trat die halbmaximale Aktivität bei 1,9 ng/ml (120 pM) auf. In normalen und myelosuprimierten Tieren, erzeugt durch na hezu letale Röntgenbestrahlung, war rückgefaltetes TPO (Met^-1 1-153) hochpotent (eine Aktivität wurde bei so geringen Dosen wie 30 ng/Maus beobachtet) zum Stimulieren der Produk tion von neuen Plättchen. Ähnliche biologische Aktivität wurde für andere Formen von TPO beobachtet, das gemäß den oben beschriebenen Verfahren zurückgefaltet worden war (siehe Fig. 25, 26 und 28).

14. Verfahren zum Messen der thrombopoetischen Aktivität

Die thrombopoetische Aktivität kann in verschiedenen Assays gemessen werden, einschließlich dem Ba/F3-mpl-Ligandenassay, beschrieben in Beispiel 1, einem in vivo-Mäuse-Plättchen-Re bound-Syntheseassay, einem Assay der Induktion des Plätt chen-Oberflächenantigens, gemessen durch einen anti-Plätt chen-Immunoassay (anti-GPII_bIII_a) für eine humane mega karyoblastische Leukämiezellinie (CMK) (siehe Sato et al., Brit. J. Haematol., 72 : 184-190 [1989] (siehe auch den Flüs sigsuspensions-Megakaryozytopoese-Assay beschrieben in Bei spiel 4) und durch Induktion der Polyploidisierung in einer magakaryoblastischen Zellinie (DAMI) (siehe Ogura et al., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Die Reifung von Megakaryozyten aus unreifen, im wesentlichen nicht DNA synthetisierenden Zellen zu morphologisch identifizierbaren Megakaryozyten um faßt einen Prozeß, der einschließt das Auftreten von zyto plasmatischen Organellen, den Erwerb von Membranantigenen (GPII_bIII_a), Endoreplikation und Freisetzen von Plättchen, wie in der Einleitung beschrieben. Von einem abstammungsli nienspezifischen Promotor (d. h., der mpl-Ligand) der Mega karyozytenreifung wäre zu erwarten, daß er mindestens einige dieser Änderungen in unreifen Megakaryozyten induziert, wo bei dies zu Plättchenfreisetzung und Minderung der Thrombo zytopenie führt. Somit wurden Assays entworfen, um das Auf treten dieser Parameter in unreifen Megakaryozytenzellinien, d. h., CMK- und DAMI-Zellen, zu messen. Der CMK-Assay (Beispiel 4) mißt das Auftreten eines spezifischen Plätt chenmarkers, GPII_bIII_a, und die Plättchenformbildung. Der DAMI-Assay (Beispiel 15) mißt die Endoreplikation, da die Zunahme in der Ploidie ein Kennzeichen für reife Megakaryo zyten ist. Erkennbare Megakaryozyten besitzen Ploidiewerte von 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, usw. Schließlich ist der in vivo- Mäuse-Plättchen-Rebound-Assay (Beispiel 16) nützlich zum De monstrieren, daß die Verabreichung der Testverbindung (hier des mpl-Liganden) zu einer Erhöhung der Plättchenzahl führt.

Zwei weitere in vitro-Assays sind entwickelt worden, um die TPO-Aktivität zu messen. Der erste ist ein Kinaserezeptorak tivierungs- (KIRA) -ELISA, bei dem CHO-Zellen mit einer mpl- Rse-Chimäre transfektiert werden, und die Tyrosinphosphory lierung von Rse wird gemessen durch den ELISA, nachdem der mpl-Teil der Chimäre dem mpl-Liganden ausgesetzt worden ist (siehe Beispiel 17). Der zweite ist ein auf einem Rezeptor basierender Elisa, bei dem eine ELISA-Platte, beschichtet mit Kaninchen-anti-Mensch-IgG, den humanen chimären Rezeptor mpl-IgG einfängt, der wiederum den zu testenden mpl-Liganden bindet. Ein biotinylierter polyklonaler Kaninchenantikörper gegen den mpl-Liganden (TPO₁₅₅) wird verwendet zum Nachweis von gebundenem mpl-Liganden, der gemessen wird unter Verwen dung von Streptavidin-Peroxidase, wie beschrieben in Bei spiel 18.

15. Biologische Antwort in vivo von normalen und subletal bestrahlten, mit TPO behandelten Mäusen

Normale und subletal bestrahlte Mäuse wurden mit verkürztem und vollständigem TPO, isoliert aus Ovarienzellen des chine sischen Hamsters (CHO), E. Coli und humanen embryonalen Nie ren- (293)-Zellen, behandelt. Beide Formen von TPO, erzeugt in diesen drei Wirten, stimulierten die Plättchenproduktion in Mäusen, jedoch schien das vollständige TPO, isoliert aus CHO, eine größere in vivo-Antwort hervorzurufen. Die Ergeb nisse zeigen, daß die richtige Glycosylierung der car boxyterminalen Domäne erforderlich sein kann für die opti male in vivo-Aktivität.

a) E. Coli-rhTPO(Met^-1,153)

Die "Met"-Form der EPO-Domäne (Met in der -1-Position plus die ersten 153 Reste von humanem TPO), hergestellt in E. Coli (siehe Beispiel 23), wurde täglich in normale weibliche C57 B6-Mäuse injiziert, wie beschrieben in den Legenden zu Fig. 25 A, B und C. Diese Figuren zeigten, daß die nicht glycosylierte, verkürzte Form von TPO, hergestellt in E. Coli, und zurückgefaltet, wie oben beschrieben, in der Lage ist, eine ungefähr zweifache Zunahme der Plättchenproduktion in normalen Mäusen zu stimulieren, ohne die rote oder weiße Blutkörperchenpopulation zu beeinflussen.

Das gleiche Molekül, täglich injiziert in subletal be strahlte (¹³⁷Cs) weibliche C57 B6-Mäuse, wie beschrieben in den Legenden zu Fig. 26A, B und C, stimulierte die Plätt chenerzeugung und verringerte den Tiefstpunkt, aber hatte keinen Effekt auf Erythrozyten oder Leukozyten.

(b) CHO-rhTPO₃₃₂

Die vollständige Form von in CHO produziertem TPO, das täg lich in normale weibliche C57 B6-Mäuse injiziert wurde, wie beschrieben in den Legenden zu Fig. 27A, B und C, erzeugte einen ungefähr fünffachen Anstieg in der Plättchenproduktion in normalen Mäusen, ohne die Erythrozyten- oder Leukozyten population zu beeinflussen.

(c) CHO-rhTPO₃₃₂; E. Coli-rhTPO(Met^-1,153); 293-rhTPO₃₃₂ und E. Coli-rhTPO₁₅₅

Dosis-Antwort-Kurven wurden erstellt für die Behandlung von normalen Mäusen mit rhTPO von verschiedenen Zellinien (CHO- rhTPO₃₃₂; E. Coli-rhTPO(Met^-1,153); 293-rhTPO₃₃₂ und E. Coli- rhTPO₁₅₅), wie beschrieben in der Legende zu Fig. 28. Diese Figur zeigt, daß alle getesteten Formen des Moleküls die Plättchenproduktion stimulierten, jedoch besitzt die voll ständige in CHO hergestellte Form die größte in vivo-Aktivi tät.

(d) CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO "gestutzt" und CHO-rhTPO₃₃₂

Dosis-Antwort-Kurven wurden auch erstellt für die Behandlung von normalen Mäusen mit verschiedenen Formen von rhTPO, her gestellt in CHO (CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO "gestutzt" und CHO- rhTPO₃₃₂), wie beschrieben in der Legende zu Fig. 29. Diese Figur zeigt, daß alle getesteten CHO-Formen des Moleküls die Plättchenproduktion stimulierten, aber daß die vollständige 70 Kda-Form die größte in vivo-Aktivität besitzt.

16. Allgemeine rekombinante Herstellung von mpl-Ligand und Varianten

Vorzugsweise wird mpl-Ligand hergestellt durch rekombinante Standardverfahren, die umfassen das Herstellen des mpl-Li ganden-Polypeptids durch Kultivieren von transfektierten Zellen, um mpl-Liganden-Nukleinsäure zu exprimieren (typischerweise durch Transformieren der Zelle mit einem Ex pressionsvektor), und Gewinnen des Polypeptids aus den Zel len. Jedoch kommt auch in Betracht, daß der mpl-Ligand durch homologe Rekombination hergestellt werden kann, oder mit re kombinanten Produktionsverfahren unter Verwendung von Kon trollelementen, die in Zellen eingebracht werden, die be reits DNA enthalten, die für den mpl-Liganden kodiert. Zum Beispiel kann ein wirkungsvolles Promotor/Enhancer-Element, ein Suppressor oder ein exogenes, die Transkription modulie rendes Element in das Genom der beabsichtigten Wirtszelle in Nachbarschaft und einer Orientierung eingebracht werden, die ausreichen, die Transkription der DNA zu beeinflussen, die das gewünschte mpl-Ligandenpolypeptid kodiert. Das Kontrol lelement kodiert nicht den mpl-Liganden, sondern vielmehr ist die DNA dem Wirtszellgenom eigen. Als nächstes sucht man nach Zellen, die das erfindungsgemäße Rezeptorpolypeptid herstellen, oder man sucht nach gesteigerten oder verringer ten Spiegeln der Expression, falls gewünscht.

Somit umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines mpl-Liganden umfassend Einbringen eines die Transkrip tion modulierenden Elements in das Genom einer Zelle, ent haltend das mpl-Ligandennukleinsäuremolekül, in ausreichen der Nähe und Orientierung zu dem Nukleinsäuremolekül, um dessen Transkription zu beeinflussen, mit einem gegebenen falls weiteren Schritt, der umfaßt Kultivieren der Zelle enthaltend das die Transkription modulierende Element und das Nukleinsäuremolekül. Die Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle enthaltend das eigene mpl-Liganden-Nukleinsäure molekül funktionsfähig verknüpft mit exogenen Kontrollse quenzen, die von der Wirtszelle erkannt werden.

A. Isolieren von DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert

Die DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, kann erhal ten werden aus einer beliebigen cDNA-Bank, hergestellt aus Gewebe, von dem angenommen wird, daß es die mpl-Liganden- mRNA enthält und diese in einem nachweisbaren Spiegel expri miert. Das mpl-Ligandengen kann auch erhalten werden aus einer genomischen DNA-Bank oder durch in vitro-Oligonukleo tidsynthese der vollständigen Nukleotid- oder Aminosäure sequenz.

Die Banken werden abgesucht mit Proben, die entworfen wur den, um das Gen von Interesse oder das von diesem kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbanken umfas sen geeignete Proben monoklonale oder polyklonale Antikör per, die den mpl-Liganden erkennen und spezifisch daran bin den. Für cDNA-Banken geeignete Proben umfassen Oligonukleo tide von ungefähr 20 bis 80 Basen in Länge, die bekannte oder angenommene Teile der mpl-Liganden-cDNA aus der glei chen oder einer verschiedenen Art kodieren; und/oder komple mentäre oder homologe c-DNAs oder Fragmente davon, die das gleiche oder ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Proben zum Absuchen genomischer DNA-Banken umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Oligonukleotide, cDNAs oder Fragmente davon, die das gleiche oder ein ähnliches Gen kodieren, und/oder homologe genomische DNAs oder Fragmente davon. Das Absuchen der cDNA- oder genomischen Bank mit der ausgewähl ten Probe kann durchgeführt werden unter Verwendung von Standardverfahren, wie beschrieben in Kapiteln 10-12 von Sambrook et al., siehe oben.

Ein alternatives Mittel zum Isolieren des Gens, das für den mpl-Liganden kodiert, ist die Verwendung der PCR-Technik, wie beschrieben in Abschnitt 14 von Sambrook et al., siehe oben. Dieses Verfahren verlangt die Verwendung von Oligo nukleotidproben, die an DNA hybridisieren, die den mpl-Li ganden kodiert. Strategien zur Auswahl der Oligonukleotide sind unten beschrieben.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Ausüben der Erfindung besteht in der Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonukleo tidsequenzen zum Absuchen von cDNA-Banken von verschiedenen Geweben, vorzugsweise von humanen oder Schweineniere- (erwachsen oder fötal) oder Leberzellinien. Zum Beispiel werden cDNA-Banken einer humanen fötalen Leberzellinie abge sucht mit den Oligonukleotidproben. Alternativ können humane genomische Banken abgesucht werden mit den Oligonukleo tidproben. Die als Probe ausgewählten Oligonukleotidsequen zen sollten ausreichend lang und ausreichend spezifisch sein, um falsch positive Ergebnisse zu minimieren. Die tat sächliche Nukleotidsequenz(en) wird üblicherweise entworfen auf der Basis von Regionen des mpl-Liganden, die die gering ste Codonredundanz aufweisen. Die Oligonukleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwen dung von degenerierten Oligonukleotiden ist von besonderer Bedeutung, wenn eine Bank abgesucht wird von einer Art, von der die bevorzugte Codon-Usage nicht bekannt ist.

Das Oligonukleotid muß markiert sein, so daß es durch die Hybridisierung an DNA in der abzusuchenden Bank nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Verfahren zum Markieren ist die Verwendung von ATP (z. B. γ³²P) und Polynukleotidkinase, um das 5′-Ende des Oligonukleotids radioaktiv zu markieren. Je doch können andere Verfahren zum Markieren der Oligonukleo tide verwendet werden, einschließlich, ohne darauf be schränkt zu sein, Biotinylierung und Enzymmarkierung.

Von besonderem Interesse ist die mpl-Liganden-Nukleinsäure, die das vollständige mpl-Ligandenpolypeptid kodiert. Bei ei nigen bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Nukleinsäure sequenz die Signalsequenz des nativen mpl-Liganden. Eine Nukleinsäure umfassend die vollständige proteinkodierende Sequenz wird erhalten durch Absuchen ausgewählter cDNA- oder genomischer Banken mit Hilfe der gefolgerten Aminosäure sequenz.

B. Aminosäuresequenzvarianten von nativem mpl-Ligand

Aminosäuresequenzvarianten von mpl-Ligand werden hergestellt durch Einführen geeigneter Nukleotidänderungen in die mpl- Liganden-DNA oder durch in vitro-Synthese des gewünschten mpl-Ligandenpolypeptids. Solche Varianten umfassen z. B. Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz für den Schweine-mpl-Ligan den. Zum Beispiel können carboxyterminale Anteile des reifen vollständigen mpl-Liganden entfernt werden durch proteolyti sche Spaltung, entweder in vivo oder in vitro, oder durch Klonieren und Exprimieren eines Fragments oder der DNA, die den vollständigen mpl-Liganden kodiert, um eine biologisch aktive Variante zu erzeugen. Eine beliebige Kombination an Deletion, Insertion und Substitution wird ausgeführt, um zu dem endgültigen Konstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, daß das endgültige Konstrukt die gewünschte biologische Aktivi tät aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch die post translationalen Vorgänge an dem mpl-Liganden ändern, wie die Änderung der Anzahl oder Position der Glykosylierungsstel len. Für den Entwurf einer Aminosäuresequenzvariante des mpl-Liganden hängt die Lage der Mutationsstelle und die Art der Mutation ab von der zu verändernden mpl-Liganden-Eigen schaft(en). Die Stellen für die Mutation können einzeln oder in Serie modifiziert werden, z. B. durch (1) zunächst Substi tuieren mit einer Wahl konservativer Aminosäuren und dann mit radikaleren Selektionen abhängig von dem zu erzielenden Ergebnis, (2) Deletieren des Zielrests, oder (3) Einfügen von Resten der gleichen oder einer verschiedenen Klasse in Nachbarschaft zu der lokalisierten Stelle, oder Kombinatio nen der Möglichkeiten 1-3.

Ein nützliches Verfahren zum Identifizieren von bestimmten Resten oder Regionen des mpl-Ligandenpolypeptids, die bevor zugte Stellen für die Mutagenese sind, wird "Alanin-Scan ning-Mutagenese" genannt, wie beschrieben von Cunningham und Wells, Science, 244 : 1081-1085 [1989]. Hierbei wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z. B. geladene Reste wie arg, asp, his, lys und glu) und ersetzt durch eine beliebige, aber vorzugsweise eine neutrale oder negativ ge ladene Aminosäure (am meisten bevorzugt sind Alanin oder Polyalanin), um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässerigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Diese Domänen, die sich gegenüber den Substitutionen als funktional sensitiv erweisen, werden dann weiter aufgeklärt durch Einfügen von weiteren oder anderen Varianten an den oder für die zu sie substituierenden Stel len. Während somit die Stelle für das Einfügen einer Ami nosäuresequenzvariation vorab bestimmt ist, muß die Natur der Mutation per se nicht vorab bestimmt sein. Zum Beispiel wird zum Optimieren der Leistungsstärke einer Mutation an einer gegebenen Stelle ala-Scanning oder zufällige Mutage nese an dem Zielcodon oder -region durchgeführt, und die ex primierten mpl-Ligandenvarianten werden nach der optimalen Kombination von gewünschter Aktivität abgesucht.

Es gibt zwei prinzipielle Variablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: die Lage der Mutationsstelle und die Natur der Mutation. Zum Beispiel umfassen mpl-Liganden polypeptidvarianten solche Varianten der mpl-Ligandense quenz, welche natürlich vorkommende Allele darstellen können (wobei dies nicht die Manipulation der mpl-Liganden-DNA ver langt) oder vorab bestimmte Mutantenformen werden erzeugt durch Mutieren der DNA, um entweder bei einem Allel oder einer Variante anzugelangen, die nicht in der Natur vor kommt. Im allgemeinen wird die Lage und die Natur der ge wählten Mutation abhängen von der zu verändernden mpl-Ligan deneigenschaft.

Aminosäuresequenzdeletionen liegen üblicherweise in dem Be reich von ungefähr 1-30 Resten, vorzugsweise bei ungefähr 1- 10 Resten, und sind üblicherweise zusammenhängend. Alterna tiv können die Aminosäuresequenzdeletionen für den mpl-Li ganden einen Teil von oder die vollständige carboxyterminale Glycoproteindomäne erfassen. Aminosäuresequenzdeletionen können auch eine oder mehrere der ersten sechs aminotermi nalen Reste des reifen Proteins umfassen. Gegebenenfalls um fassen Aminosäuresequenzdeletionen einen oder mehrere Reste in einer oder mehreren der Loop-Regionen, die zwischen den "helikalen Bündeln (helical bundels)" existieren. Zusammen hängende Deletionen betreffen üblicherweise eine geradzah lige Anzahl an Resten, aber einzelne oder ungeradzahlige De letionen werden ebenfalls hiervon umfaßt. Deletionen können in Regionen mit niedriger Homologie unter den mpl-Liganden eingeführt werden, die die größte Sequenzidentität teilen, um die Aktivität des mpl-Liganden zu modifizieren. Oder Deletionen können in Regionen mit niedriger Homologie zwi schen humanen mpl-Liganden- und anderen Säuger-mpl-Liganden polypeptiden eingeführt werden, die die größte Sequenziden tität zu dem humanen mpl-Liganden aufweisen. Deletionen aus einem Säuger-mpl-Ligandenpolypeptid in Bereichen von be trächtlicher Homologie mit anderen Säuger-mpl-Liganden wer den eher die biologische Aktivität des mpl-Liganden in si gnifikanter Weise ändern. Die Anzahl der zusammenhängenden Deletionen wird so ausgewählt, daß die Tertiärstruktur der mpl-Liganden in der betroffenen Domäne beibehalten wird, z. B. ein Beta-Faltblatt oder eine Alphahelix.

Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder car boxyterminale Fusionen, die hinsichtlich der Länge in dem Bereich liegen von einem Rest bis zu Polypeptiden enthaltend 100 oder mehr Reste, wie auch Insertionen innerhalb der Sequenz aus einem oder mehreren Aminosäureresten. Insertio nen innerhalb der Sequenz (Intrasequenzinsertionen) (d. h., Insertionen innerhalb der reifen mpl-Liganden-Sequenz) kön nen üblicherweise ungefähr 1-10 Reste umfassen, vorzugsweise 1-5, ganz bevorzugt 1-3. Eine beispielhafte bevorzugte Fu sion ist die des mpl-Liganden oder Fragments davon mit einem anderen Zytokin oder Fragment davon. Beispiele für terminale Insertionen umfassen den reifen mpl-Liganden mit einem N- terminalen Methionylrest, einem Artefakt der direkten Expression des reifen mpl-Liganden in rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des reifen mpl-Ligandenmole küls, um die Sekretion des reifen mpl-Liganden aus rekombi nanten Wirten zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im allgemeinen erhalten aus, und sind somit homolog zu, der beabsichtigten Wirtszellart. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. Coli, Alphafaktor für Hefe, und virale Sequenzen, wie Herpes gD für Säugerzellen.

Andere Insertionsvarianten des mpl-Ligandenmoleküls umfassen die Fusion an den N- oder C-Terminus des mpl-Liganden von immunogenen Polypeptiden (d. h., sie sind nicht endogen für den Wirt, an den die Fusion verabreicht wird), z. B. bakteri elle Polypeptide wie Beta-Lactamase oder ein Enzym, das von dem E. Coli-trp-Lokus kodiert wird, oder Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteinen mit einer langen Halb wertszeit, wie den konstanten Regionen von Immunglobulinen (oder andere Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie beschrieben in WO 89/02922, veröffentlicht am 6. April 1989.

Eine dritte Gruppe an Varianten sind Aminosäuresubstituti onsvarianten. Bei diesen Varianten ist mindestens ein Ami nosäurerest in dem mpl-Ligandenmolekül entfernt worden, und ein verschiedener Rest ist an dessen Stelle eingefügt wor den. Die Stellen, die von größtem Interesse für die substi tutionelle Mutagenese sind, umfassen Stellen, die als die aktive Stelle(n) des mpl-Liganden identifiziert worden sind, und Stellen, wo die Aminosäuren, die in anderen Analoga ge funden werden, beträchtlich verschieden sind hinsichtlich des Umfangs der Seitenkette, der Ladung oder der Hydrophobi zität, aber auch wo ein hoher Grad an Sequenzidentität an der ausgewählten Stelle zwischen verschiedenen mpl-Ligan denarten und/oder zwischen den verschiedenen Tieranaloga eines mpl-Ligandenmitglieds besteht.

Andere Stellen von Interesse sind solche, an denen spezielle Reste des mpl-Liganden, erhalten aus verschiedenen Familien mitgliedern und/oder Tierarten für ein Mitglied identisch sind. Diese Stellen, insbesondere solche, die innerhalb einer Sequenz von mindestens drei weiteren identischen kon servierten Stellen liegen, werden auf relativ konservative Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle 3 unter der Überschrift der bevorzugten Substitu tionen aufgeführt. Wenn solche Substitutionen zu einer Ver änderung der biologischen Aktivität führen, dann werden deutlichere Änderungen, bezeichnet als beispielhafte Substi tutionen in Tabelle 3 oder wie unten weiter beschrieben in Bezugnahme auf Aminosäureklassen, eingeführt und die Pro dukte untersucht.

Tabelle 3

Beträchtliche Modifikationen der Funktion oder der immunolo gischen Identität des mpl-Liganden werden bewirkt durch Aus wählen von Substitutionen, die sich deutlich unterscheiden hinsichtlich ihres Effekts auf das Beibehalten von (a) der Struktur des Polypeptid-Backbones in dem Bereich der Substi tution, z. B. als Faltblatt oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder der Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle, oder (c) dem Umfang der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden in Gruppen eingeteilt, basierend auf den gemeinsamen Seitenketteneigenschaften:

(1) Hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Neutral, hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) Sauer: Asp, Glu;
(4) Basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, die die Kettenanordnung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) Aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht konservative Substitutionen machen einen Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen durch ein Mitglied einer anderen Klasse erforderlich. Solche substituierten Reste können auch in die konservative Substitutionen tragen den Stellen eingeführt werden, aber mehr bevorzugt in die restlichen (nicht konservierten) Stellen.

Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es wün schenswert, eine oder mehrere Proteasespaltstellen, die in dem Molekül vorhanden sind, zu inaktivieren. Diese Stellen werden identifiziert durch Absuchen der kodierten Amino säuresequenz, in dem Falle von Trypsin, z. B. nach einem Arginyl- oder Lysinylrest. Wenn Proteasespaltstellen identi fiziert sind, werden diese inaktiv gemacht gegenüber proteo lytischer Spaltung durch Substituieren des Zielrests mit einem anderen Rest, vorzugsweise einem basischen Rest wie Glutamin oder einem hydrophoben Rest wie Serin; durch Dele tieren des Rests; oder durch Einfügen eines Prolylrests un mittelbar nach dem Rest.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird jeder Methionylrest, der nicht der Startmethionylrest der Signalsequenz ist, oder jeder Rest, der innerhalb von ungefähr 3 Resten N- oder C- terminal zu einem solchen Methionylrest liegt, substituiert durch einen anderen Rest (vorzugsweise in Übereinstimmung mit Tabelle 3) oder deletiert. Alternativ werden ungefähr 1-3 Reste benachbart zu solchen Stellen eingefügt.

Jeder Cysteinrest, der nicht an der Aufrechterhaltung der richtigen Konformation des mpl-Liganden beteiligt ist, kann auch ersetzt werden, im allgemeinen mit Serin, um die Oxida tionsstabilität des Moleküls und zufällige Vernetzung zu verhindern. Es ist gefunden worden, daß das erste und vierte Cystein in der EPO-Domäne, numeriert von dem Aminoterminus, notwendig sind zum Aufrechterhalten der richtigen Konforma tion, aber daß das zweite und dritte nicht erforderlich ist. Demzufolge kann das zweite und dritte Cystein der EPO-Domäne ersetzt werden.

Nukleinsäuremoleküle, die Aminosäuresequenzvarianten des mpl-Liganden kodieren, werden hergestellt durch eine Viel zahl aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren. Diese Verfahren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Iso lierung aus einem natürlichen Ausgangsmaterial (in dem Fall von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) oder die Herstellung durch Oligonukleotid-vermittelte (oder site- directed) Mutagenese, PCR-Mutagenese oder Kassetten-muta genese einer früher hergestellten Variante oder einer Nicht- Varianten-Version des mpl-Ligandenpolypeptids.

Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zum Erzeugen von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von mpl-Liganden-DNA. Diese Technik ist in dem Stand der Technik bekannt, wie beschrieben von Adelman et al., DNA, 2 : 183 [1983]. Kurz ausgeführt, mpl- Liganden-DNA wird verändert durch Hybridisieren eines Oligo nukleotids, das die gewünschte Mutation kodiert, an eine DNA-Matrize, wobei die Matrize die Einzelstrangform eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, enthaltend die nicht ver änderte oder native DNA-Sequenz des mpl-Liganden. Nach Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet zum Syn thetisieren eines vollständigen zweiten komplementären Strangs der Matrize, der somit den Oligonukleotidprimer ein gebaut enthält und der für die gewählte Veränderung in der mpl-Liganden-DNA kodiert.

Im allgemeinen werden Oligonukleotide von mindestens 25 Nukleotiden Länge verwendet. Ein optimales Oligonukleotid besitzt zwölf bis 15 Nukleotide, die vollständig komplemen tär zu der Matrize auf jeder Seite des bzw. der Nukleotide sind, das bzw. die für die Mutation kodieren. Dieses stellt sicher, daß das Oligonukleotid richtig an das einzelsträn gige DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonukleotide können leicht synthetisiert werden mit Hilfe von Techniken, die in dem Stand der Technik bekannt sind, wie beschrieben von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 5765 [1978].

Die DNA-Matrize kann von solchen Vektoren erzeugt werden, die entweder von Bakteriophagen M13-Vektoren (die gewerblich erhältlichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet) oder von solchen Vektoren erhalten werden, die einen einzel strängigen Phagenreplikationsursprung enthalten, wie be schrieben von Viera et al., Meth. Enzymol., 153 : 3 (1987). Somit kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren eingefügt werden, um eine einzelsträngige Matrize zu erzeu gen. Das Herstellen der einzelsträngigen Matrize ist be schrieben in Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Alternativ kann eine einzelsträngige DNA-Matrize erzeugt werden durch Denaturieren eines doppelsträngigen Plasmids (oder anderer) DNA mit Hilfe von Standardtechniken.

Zum Verändern der nativen DNA-Sequenz (um z. B. Aminosäure sequenzvarianten zu erzeugen) wird das Oligonukleotid an die einzelsträngige Matrize unter geeigneten Hybridisierungs bedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, normalerweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dazugesetzt, um den komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren unter Verwendung des Oligonukleotids als einem Primer für die Synthese. Ein Heteroduplex wird somit derart gebildet, daß ein Strang der DNA die mutierte Form des mpl-Liganden kodiert, und der andere Strang (die ur sprüngliche Matrize) kodiert die native, unveränderte Sequenz des mpl-Liganden. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, üblicher weise einen Prokaryonten wie E. Coli JM101. Nachdem die Zel len kultiviert wurden, werden sie auf Agaroseplatten aus plattiert und abgesucht unter Verwendung des mit 32-Phosphor markierten Oligonukleotidprimers, um die Bakterienkolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mu tierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion eingebracht, üblicherweise in einen Expressionsvektor des Typs, der üblicherweise verwen det wird zur Transformation eines geeigneten Wirts.

Das oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein Homoduplexmolekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthält. Die Modifikationen sind wie folgt. Das einzelsträngige Oligonukleotid wird an die doppelsträngige Matrize hybridisiert (annealed), wie oben beschrieben. Eine Mischung aus drei Desoxyribonukleoti den, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wird mit einem modifizierten Thio-desoxyribocytosin, dCTP-(aS) genannt (das erhalten wer den kann von Amersham Corporation), kombiniert. Diese Mi schung wird zu dem Matrizen-Oligonukleotid-Komplex zuge setzt. Bei Zusatz von DNA-Polymerase zu dieser Mischung wird ein zu der Matrize identischer DNA-Strang, außer der mutier ten Base, erzeugt. Weiterhin enthält dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP, was dazu dient, ihn vor der Restriktionsendonukleasespaltung zu schützen.

Nachdem der Matrizenstrang des doppelsträngigen Heteroduple xes mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten (nicked) worden ist, kann der Matrizenstrang abgebaut werden mit ExoIII-Nuklease oder einer anderen geeigneten Nuklease, entlang der Region, die die zu mutagenisierende Stelle(n) enthält. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekül zu rückzulassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann ge bildet mit Hilfe von DNA-Polymerase in der Anwesenheit aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase. Dieses Homoduplexmolekül kann in eine geeignete Wirtszelle, wie E. Coli JM101, transformiert werden, wie oben beschrie ben.

DNA, die mpl-Ligandenmutanten mit mehr als einer zu erset zenden Aminosäure kodiert, kann auf mehreren Wegen herge stellt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander lokalisiert sind, können sie gleichzeitig mutiert werden unter Verwendung eines Oligonukleotids, das für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Falls jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander (durch mehr als zehn Aminosäurereste getrennt) vorliegen, ist es schwieriger, ein einziges Oligonukleotid zu erzeugen, das alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren angewendet werden.

Bei dem ersten Verfahren wird ein separates Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligo nukleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Matrizen-DNA hybridisiert, und der zweite DNA-Strang, der von der Matrize synthetisiert wird, kodiert für alle ge wünschten Aminosäuresubstitutionen.

Das alternative Verfahren umfaßt zwei oder mehrere Runden der Mutagenese zum Erzeugen der gewünschten Mutante. Die erste Runde entspricht der für die einzige Mutation be schriebenen: Wildtyp-DNA wird als Matrize verwendet, ein Oligonukleotid, das die erste gewünschte Aminosäuresubstitu tion(en) kodiert, wird an die Matrize hybridisiert, und das Heteroduplexmolekül wird dann erzeugt. Die zweite Runde der Mutagenese verwendet das mutierte DNA-Produkt aus der ersten Runde der Mutagenese als die Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligo nukleotid, das die zusätzlich gewünschte Aminosäuresubstitu tion(en) kodiert, wird dann an die Matrize hybridisiert, und der erhaltene DNA-Strang kodiert jetzt für Mutationen aus der ersten und zweiten Runde der Mutagenese. Diese erhaltene DNA kann als eine Matrize in einer dritten Runde der Muta genese verwendet werden, usw.

PCR-Mutagenese ist ebenfalls geeignet zum Herstellen von Aminosäurevarianten des mpl-Ligandenpolypeptids. Während sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, ist es selbst verständlich, daß die Technik auch auf RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich im allgemeinen auf folgendes Verfahren (siehe Ehrlich, siehe oben, das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70): Wenn kleine Mengen an Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich leicht in der Sequenz von der entsprechen den Region in einer Matrizen-DNA unterscheiden, verwendet werden zum Erzeugen von relativ großen Mengen eines spezifi schen DNA-Fragments, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen sich der Primer von der Matrize unterscheidet. Zum Einführen einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so entworfen, daß er mit der Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muß identisch sein mit einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs des Plasmids, aber diese Sequenz kann an beliebiger Stelle entlang der Plasmid-DNA lokalisiert sein. Es wird jedoch bevorzugt, daß die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nukleo tiden von der des ersten Primers lokalisiert ist, so daß am Ende die vollständige vermehrte Region der durch die Primer begrenzten DNA leicht sequenziert werden kann. Die Vermeh rung durch PCR mit Hilfe eines Primerpaars, wie dem gerade beschriebenen, führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der durch den Primer festgelegten Stelle der Mutation unterscheidet und möglicherweise an anderen Posi tionen, da das Kopieren der Matrize etwas fehleranfällig ist.

Wenn das Verhältnis von Matrize zu Produktmaterial extrem niedrig ist, enthält die große Mehrzahl der Produkt-DNA- Fragmente die gewünschte Mutation(en). Das Produktmaterial wird verwendet zum Ersetzen der entsprechenden Region in dem Plasmid, die als PCR-Matrize diente, unter Verwendung von DNA-Standardtechniken. Mutationen an getrennten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden entweder mit Hilfe eines mutierten zweiten Primers oder Durchführen einer zwei ten PCR mit verschiedenen Mutantenprimern und gleichzeitiges Ligieren der zwei erhaltenen PCR-Fragmente an das Vektor fragment in einer drei (oder mehr) Teile umfassenden Liga tion.

Bei einem speziellen Beispiel einer PCR-Mutagenese wird Matrizen-Plasmid-DNA (1 µg) linearisiert durch Spaltung mit einer Restriktionsendonuklease, die eine einzige Erkennungs stelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu vermehrenden Region besitzt. Von diesem Material werden 100 ng zu einer PCR-Mischung zugesetzt enthaltend PCR-Puffer, der die vier Desoxynukleotidtriphosphate enthält, und der in den GeneAmp®-Kits (erhalten von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) enthalten ist, und der 25 pMol eines je den Oligonukleotidprimers enthält, und auf ein Endvolumen von 50 µl eingestellt. Die Reaktionsmischung wird mit 35 µl Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsmischung wird für 5 min bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gebracht, und dann wird 1 µl Thermus aquaticus (Taq)-DNA-Polymerase (5 Einhei ten/µl, bezogen von Perkin-Elmer Cetus) unterhalb der Mine ralölschicht zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird dann in einen DNA Thermal Cycler (bezogen von Perkin-Elmer Cetus) eingeführt, der wie folgt programmiert ist:
2 min 55°C,
30 s 72°C, dann 19 Zyklen wie folgt:
30 s 94°C
30 s 55°C und
30 s 72°C.

Am Ende des Programms wird das Reaktionsgefäß aus dem Thermal Cycler entfernt, und die wässerige Phase wird in ein neues Gefäß überführt, mit Phenol/Chloroform (50/50 Volumen) extrahiert, und mit Ethanol präzipitiert, und die DNA wird nach Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird an schließend den geeigneten Behandlungen zum Einfügen in einen Vektor unterzogen.

Ein anderes Verfahren zum Herstellen von Varianten, Kasset tenmutagenese, basiert auf der Technik, wie beschrieben von Wells et al., Gene, 34 : 315 [1985]. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor) enthalten die zu mutierende mpl-Liganden-DNA. Das bzw. die zu mutierenden Codon(s) in der mpl-Liganden-DNA werden identifiziert. Es muß eine nur einmal vorkommende Restriktionsendonuklease spaltstelle auf jeder Seite der identifizierten Mutations- Stelle(n) vorhanden sein. Falls solche Restriktionsspalt stellen nicht vorkommen, können sie erzeugt werden mit Hilfe der oben beschriebenen Oligonukleotid-vermittelten Mutagene semethode, um sie an geeigneten Stellen in die mpl-Liganden- DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsspaltstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppel strängiges Oligonukleotid, das die DNA-Sequenz zwischen den Restriktionsspaltstellen kodiert, aber die gewünschte Muta tion(en) enthält, wird synthetisiert mit Hilfe von Standard verfahren. Die zwei Stränge werden separat synthetisiert und dann miteinander hybridisiert unter Verwendung von Standard techniken. Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so ausgestaltet, daß es 3′- und 5′-Enden besitzt, die mit den Enden des line arisierten Plasmids kompatibel sind, so daß sie direkt mit dem Plasmid ligiert werden können. Dieses Plasmid enthält jetzt die mutierte mpl-Liganden-DNA-Sequenz.

C. Einfügen einer Nukleinsäure in einen replizierbaren Vek tor

Die Nukleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die ein natives oder verändertes mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Vermehrung (Amplifikation) der DNA) oder zur Expression eingeführt. Viele Vektoren sind verfügbar, und die Auswahl des geeigneten Vektors hängt ab von (1) ob er verwendet wer den soll zur DNA-Vermehrung oder zur DNA-Expression, (2) der Größe der in den Vektor einzuführenden Nukleinsäure und (3) der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Bestandteile, abhängig von sei ner Funktion (Vermehrung von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. Die Vektor bestandteile umfassen im allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein, eines oder mehrere der folgenden Elemente: Eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.

(i) Signalsequenzbestandteil

Der erfindungsgemäße mpl-Ligand kann nicht nur direkt expri miert werden, sondern auch als Fusion mit einem heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem an deren Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle an dem N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids. Im allge meinen kann die Signalsequenz einen Bestandteil des Vektors bilden, oder sie kann einen Teil der mpl-Liganden-DNA dar stellen, die in den Vektor eingeführt wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz sollte eine Sequenz sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h., durch die Signalpeptidase abgespalten) wird. Für prokaryontische Wirtszellen, die die native mpl-Liganden-Signalsequenz nicht erkennen und nicht prozessieren, wird die Signalsequenz er setzt durch eine prokaryontische Signalsequenz, ausgewählt aus z. B. der Gruppe der Leader der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder des wärmebeständigen Enterotoxins II. Für die Hefesekretion kann die native Signalsequenz er setzt werden durch z. B. die Leader der Hefeinvertase, des Alphafaktors oder der sauren Phosphatase, den C. albicans- Glucoamylaseleader (EP 362,179, veröffentlicht am 4. April 1990) oder das Signal, wie beschrieben in WO 90/13646, ver öffentlicht am 15. November 1990. Bei der Expression in Säu gerzellen ist die native Signalsequenz (d. h., die mpl-Ligan den-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion des mpl- Liganden aus seinen natürlichen Säugerzellen in vivo steu ert) zufriedenstellend, obwohl andere Säugersignalsequenzen geeignet sein können, wie Signalsequenzen von anderen mpl- Ligandenpolypeptiden oder von dem gleichen mpl-Liganden aus einer verschiedenen Tierart, Signalsequenzen von einem mpl- Liganden, und Signalsequenzen von sezernierten Polypeptiden der gleichen oder verwandten Art, wie auch virale sekretori sche Leader, z. B. das Herpes Simplex gD-Signal.

(ii) Replikationsursprungsbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nuklein säuresequenz, die es dem Vektor erlaubt, in einer oder meh reren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemei nen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine Sequenz, die es dem Vektor erlaubt, sich unabhängig von der chromoso malen Wirts-DNA zu replizieren, und umfaßt Replikations ursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der Replikationsursprung des 2 µ-Plasmids ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Replikationsursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind brauchbar für Klo nierungsvektoren in Säugerzellen. Im allgemeinen wird der Replikationsursprungsbestandteil nicht benötigt für Säu gerexpressionsvektoren (der SV40-Replikationsursprung wird üblicherweise nur verwendet, weil er den Early-Promotor ent hält).

Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"-Vektoren, d. h., sie sind mindestens in einer Klasse an Organismen fä hig zur Replikation, aber sie können in einen anderen Orga nismus für die Expression transfektiert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor in E. Coli kloniert, und dann wird der glei che Vektor in Hefe oder Säugerzellen zur Expression trans fektiert, obwohl er nicht in der Lage ist, sich unabhängig von dem Wirtszellchromosom zu replizieren.

DNA kann auch vermehrt werden durch Einfügen in das Wirts genom. Dies wird leicht erzielt unter Verwendung von Bacil lus-Arten als Wirt, z. B. durch Einbringen einer DNA-Sequenz in den Vektor, die komplementär ist zu einer Sequenz, die in genomischer DNA von Bacillus vorkommt. Die Transfektion von Bacillus mit dem Vektor führt zu homologer Rekombination mit dem Genom und dem Einbau der mpl-Liganden-DNA. Jedoch ist das Gewinnen von genomischer DNA, die den mpl-Liganden ko diert, komplexer als die Gewinnung eines exogen replizieren den Vektors, da Restriktionsenzymspaltung erforderlich ist, um die mpl-Liganden-DNA auszuschneiden.

(iii) Selektionsgenbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektions gen, auch Selektionsmarker genannt, enthalten. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das notwendig ist für das Überleben oder Wachstum der transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium kultiviert werden. Wirtszellen, die mit dem Vektor, enthaltend das Selektionsgen, nicht trans formiert sind, werden in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verlei hen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetra cyclin, oder (b) auxotrophe Mängel komplementieren, oder (c) kritische Nahrungsmittel bereitstellen, die in komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen kodierend für D- Alanin-Racemase für Bacilli.

Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet einen Wirk stoff, um das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Solche Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transfor miert sind, exprimieren ein Protein, das eine Wirkstoff resistenz verleiht, und diese überleben somit das Selekti onsverfahren. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1 : 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science, 209 : 1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5 : 410-413 [1985]). Die drei oben gegebenen Beispiele verwenden bakterielle Gene un ter eukaryontischer Kontrolle, um die Resistenz zu verleihen gegen den geeigneten Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin.

Beispiele für andere geeignete selektierbare Marker für Säu gerzellen sind solche, die die Identifizierung von Zellen erlauben, die die mpl-Liganden-Nukleinsäure aufnehmen kön nen, wie Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Die transformierten Säugerzellen werden derart unter Selek tionsdruck gebracht, daß nur die Transformanden in einzig artiger Weise an das Überleben angepaßt sind, indem sie den Marker aufgenommen haben. Selektionsdruck wird auferlegt durch Kultivieren der Transformanden unter Bedingungen, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels in dem Medium sukzessiv geändert wird, wobei dadurch die Amplifikation von sowohl dem Selektionsgen wie auch der DNA, die das mpl- Ligandenpolypeptid kodiert, erfolgt. Amplifikation ist der Vorgang, bei dem Gene, nach denen ein größerer Bedarf für die Produktion eines für das Wachstum kritischen Proteins besteht, in Tandem nacheinander wiederholt werden in den Chromosomen von nachfolgenden Generationen der rekombinanten Zellen. Gesteigerte Mengen an mpl-Ligand werden von der amplifizierten DNA synthetisiert.

Zum Beispiel werden mit dem DHFR-Selektionsgen transfor mierte Zellen zunächst identifiziert durch Kultivieren aller Transformanden in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx) enthält, einen kompetitiven Antagonisten von DHFR. Eine ge eignete Wirtszelle, falls Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die Ovarienzellinie des chinesischen Hamsters (CHO), die einen Mangel der DHFR-Aktivität aufweist, hergestellt und kultiviert, wie beschrieben von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4216 [1980]. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Spiegeln an Mtx ausgesetzt. Dies führt zu der Synthese von multiplen Kopien an dem DHFR-Gen und gleichzeitig zu multiplen Kopien an anderer DNA, die die Expressionsvektoren umfassen, wie die DNA, die den mpl- Liganden kodiert. Diese Amplifikationstechnik kann in belie bigen anderen geeigneten Wirten verwendet werden, zum Bei spiel ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Anwesenheit von endogenem DHFR, falls z. B. ein mutiertes DHFR-Gen verwendet wird, das gegenüber Mtx hochresistent ist (EP 117,060). Alternativ können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogenes DHFR enthalten) transformiert oder cotransfor miert mit DNA-Sequenzen, die den mpl-Liganden, Wildtyp-DHFR- Protein und andere selektierbare Marker, wie Aminoglycosid- 3′-phosphotransferase (APH) kodieren, selektiert werden über das Zellwachstum in Medium enthaltend ein Selektionsmittel für den Selektionsmarker, wie ein Aminoglycosid-Antibioti kum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418. Siehe auch U.S.-PS 4,965,199.

Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das in dem Hefeplasmid YRp7 vorkommt (Stinchcomb et al., Nature, 282 : 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7 : 141 [1979] oder Tschemper et al., Gene, 10 : 157 [1980]). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutanten stamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit zum Wachsen in Tryptophan fehlt, z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 : 12 [1977]). Die Anwesenheit der trp1-Läsion in dem Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in der Abwe senheit von Tryptophan dar. Ähnlich werden Hefestämme mit einem Leu2-Mangel (ATCC Nr. 20,622 oder 38,626) komplemen tiert durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen enthalten.

(iv) Promotorbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und der funktionsfähig verknüpft ist mit der mpl-Liganden- Nukleinsäure. Promotoren sind nicht-translatierte Sequenzen, die stromaufwärts (5′) von dem Startcodon eines Strukturgens gelegen sind (im allgemeinen innerhalb von ungefähr 100 bis 1000 bp), die die Transkription und Translation von einer speziellen Nukleinsäuresequenz, wie der mpl-Liganden- Nukleinsäuresequenz, mit der sie funktionsfähig verknüpft sind, kontrollieren. Solche Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die die gesteigerten Spiegel der Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle in Antwort auf eine Änderung in den Kulturbedingungen initiieren, z. B. der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder einer Än derung der Temperatur. Zum jetzigen Zeitpunkt sind eine große Anzahl an Promotoren bekannt, die von einer Vielzahl von potentiellen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promoto ren werden funktionsfähig mit einer den mpl-Liganden kodie renden DNA verknüpft durch Entfernen des Promotors aus der Ausgangsmaterial-DNA durch Restriktionsenzymspaltung und Einfügen der isolierten Promotorsequenz in den Vektor. So wohl die native mpl-Liganden-Promotorsequenz wie auch viele heterologe Promotoren können verwendet werden zum Steuern der Amplifikation und/oder Expression der mpl-Liganden-DNA. Jedoch sind heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im all gemeinen eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten mpl-Liganden liefern, im Vergleich zu dem nativen mpl-Liganden-Promotor.

Für die Verwendung in prokaryontischen Wirten geeignete Pro motoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotor systeme (Chang et al., Nature, 275 : 615 [1978]; und Goeddel et al., Nature, 281 : 544 [1979]), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8 : 4057 [1980] und EP 36,776) und hybride Promotoren, wie der tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 21-25 [1983]). Jedoch sind andere bekannte bakteri elle Promotoren geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen sind ver öffentlicht worden, wodurch der Durchschnittsfachmann in die Lage versetzt wird, sie funktionsfähig mit der DNA zu ligie ren, die den mpl-Liganden kodiert (Siebenlist et al., Cell, 20 : 269 [1980]), bei Verwendung von Linkern und Adaptoren, um erforderliche Restriktionsspaltstellen bereitzustellen. Pro motoren für die Verwendung in bakteriellen Systemen enthal ten auch eine Shine-Dalgarno (S.D.)-Sequenz, die funktions fähig verknüpft ist mit der DNA, die das mpl-Ligandenpoly peptid kodiert.

Promotorsequenzen sind für Eukaryonten bekannt. Praktisch alle eukaryontischen Gene besitzen eine AT-reiche Region, die ungefähr 25 bis 30 Basen stromaufwärts von der Stelle, an der die Transkription eingeleitet wird, lokalisiert ist. Eine andere Sequenz, die 70-80 Basen stromaufwärts von dem Start der Transkriptionen bei vielen Genen gefunden wird, ist die CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nukleotid sein kann. An dem 3′-Ende der meisten eukaryontischen Gene befin det sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für das Anfügen des Poly-A-Schwanzes an das 3′-Ende der kodierenden Sequenz darstellen kann. Alle diese Sequenzen befinden sich in ge eigneter Weise in eukaryontischen Expressionsvektoren.

Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 : 2073 [1980]) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. En zyme Reg., 7 : 149 [1968] und Holland, Biochemistry, 17 : 4900 [1978]), wie von Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydroge nase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyru vatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.

Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind mit dem weiteren Vorteil der durch die Kultivierbedingungen kon trollierten Transkription, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assozi iert sind, Metallothionin, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydro genase, und Enzyme für die Maltose- und Galactoseverwertung. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Ex pression in Hefe sind weiterhin beschrieben bei Hitzeman et al., EP 73,657A. Hefe-Enhancer werden ebenfalls in vorteil hafter Weise verwendet mit Hefepromotoren.

Die mpl-Liganden-Transkription von Vektoren in Säugerwirts zellen wird beispielsweise kontrolliert von Promotoren er halten aus den Genomen von Viren, wie Polyomavirus, Hühner pockenvirus (UK 2,211,504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinderpapillomvirus, Vögel sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis- B-Virus und besonders bevorzugt Simian Virus 40 (SV40), von heterologen Säugerpromotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, von Heat-Shock-Promotoren und von dem Promotor, der normalerweise assoziiert ist mit der mpl-Ligandensequenz, vorausgesetzt, daß solche Promotoren mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.

Die frühen und späten Promotoren (early und late) des SV40- Virus werden leicht erhalten als ein SV40-Restriktionsfrag ment, das auch den SV40-viralen Replikationsursprung ent hält. Fiers et al., Nature, 273 : 113 [1978], Mulligan und Berg, Science, 209 : 1422-1427 [1980]; Pavlakis et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 78 : 7398-7402 [1981]. Der Immediate- Early-Promotor des humanen Zytomegalovirus wird geeigneter weise erhalten als ein HindIII-E-Restriktionsfragment. Greenaway et al., Gene, 18 : 355-360 [1982]. Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugerwirten unter Verwendung des Rinderpapillomvirus als Vektor ist offenbart in U.S.-PS 4,419,446. Eine Modifikation dieses Systems ist beschrieben in U.S.-PS 4,601,978. Siehe auch Gray et al., Nature, 295 : 503-508 [1982] zum Exprimieren von Immuninterferon-ko dierender cDNA in Affenzellen; Reyes et al., Nature, 297 : 598-601 [1982] zum Exprimieren von humaner β-Interferon- cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thymidin kinasepromotors vom Herpes Simplex Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 5166-5170 [1982] zur Expres sion des humanen Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 6777-6781 [1982] zur Expression von bakteriel len CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo fibroblasten, Ovarzellen des chinesischen Hamsters, HeLa- Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung des langen endständigen Repeats (LTR) von Rous-Sarcoma-Virus als einem Promotor.

(v) Enhancerelementbestandteil

Die Transkription einer DNA, die den erfindungsgemäßen mpl- Liganden kodiert, wird in höheren Eukaryonten oftmals ge steigert durch Einfügen einer Enhancersequenz in den Vektor. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise ungefähr 10-300 bp lang, die einen Promotor beeinflussen, um dessen Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ un abhängig von der Orientierung und der Position, und sie sind 5′(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 993 [1981]) und 3′ (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3 : 1108 [1983]) von der Transkriptionseinheit, innerhalb von Introns (Banerji et al., Cell, 33 : 729 [1983]) wie auch innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4 : 1293 [1984]) gefunden worden. Viele Enhancersequenzen sind von Säugergenen her bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α- Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer von einem eukaryontischen Zellvirus verwen den. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite (late side) des Replikationsursprungs (bp 100-270), den Cytomegalovirus-Early-Promotor-Enhancer, den Polyoma-En hancer auf der späten Seite (late side) des Replikations ursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature, 297 : 17-18 [1982] über Enhancerelemente zum Aktivieren von eukaryontischen Promotoren. Der Enhancer kann in einen Vek tor eingefügt werden in einer Position 5′ oder 3′ zu der mpl-Liganden-kodierenden Sequenz, aber er wird vorzugsweise an einer Stelle 5′ von dem Promotor angebracht.

(vi) Transkriptionsterminationsbestandteil

Expressionsvektoren zur Verwendung in eukaryontischen Wirts zellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch, oder kernhaltige Zellen von anderen multizellulären Organismen) enthalten auch Sequenzen, die notwendig sind zur Termination der Transkription und der Stabilisierung der mRNA. Solche Sequenzen sind üblicherweise erhältlich von den 5′- und manchmal von den 3′- nicht-translatierten Regionen von eukaryontischen oder viralen DNAs oder cDNAs. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Frag mente in dem nicht-translatierten Anteil der mRNA, die den mpl-Liganden kodiert, transkribiert werden.

(vii) Konstruktion und Analyse der Vektoren

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, enthaltend einen oder mehrere der oben aufgelisteten Bestandteile, verwendet Standardligationstechniken. Isolierte Plasmid- oder DNA- Fragmente werden gespalten, am Ende verlängert (tailored) und erneut in der gewünschten Form ligiert, um das erforder liche Plasmid zu erzeugen.

Als Analyse zum Bestätigen der richtigen Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen ver wendet zum Transformieren von E. Coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31,446), und erfolgreiche Transformanden werden durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, wo dies geeignet er scheint, selektiert. Plasmide aus den Transformanden werden hergestellt, analysiert durch Restriktionsendonukleasespal tung und/oder Sequenzieren nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 : 309 [1981] oder nach dem Verfah ren von Maxam et al., Methods in Enzymology, 65 : 499 [1980].

(viii) Transiente Expressionsvektoren

Besonders nützlich bei der Ausübung der vorliegenden Erfin dung sind Expressionsvektoren, die die transiente Expression in Säugerzellen von DNA bereitstellen, die das mpl-Liganden polypeptid kodieren. Im allgemeinen umfaßt die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle wirksam zu replizieren, so daß die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akku muliert und deshalb hohe Spiegel an einem gewünschten Poly peptid, kodiert durch den Expressionsvektor, synthetisiert. Sambrook et al., siehe oben, S. 16.17-16.22. Transiente Expressionssysteme, umfassend einen geeigneten Expressions vektor und eine Wirtszelle, erlauben sowohl die leichte positive Identifizierung von Polypeptiden, kodiert durch die klonierten DNAs, wie auch das rasche Absuchen solcher Poly peptide nach der gewünschten biologischen oder physiologi schen Eigenschaft. Somit sind transiente Expressionssysteme besonders nützlich bei der vorliegenden Erfindung für die Zwecke des Identifizierens von Analoga und Varianten des mpl-Ligandenpolypeptids, die die biologische Aktivität des mpl-Ligandenpolypeptids besitzen.

(ix) Geeignete beispielhafte Vektoren für Vertebratzellen

Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die geeignet sind zur Anpassung an die Synthese des mpl-Liganden in re kombinanten Vertebratzellkulturen, sind beschrieben in Gething et al., Nature, 293 : 620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281 : 40-46 [1979]; Levinson et al.; EP 117,060; und EP 117,058. Ein besonders nützliches Plasmid für die Expres sion von mpl-Ligand in Säugerzellkultur ist pRK5 (EP 307,247, U.S.-PS 5,258,287) oder pSV16B (PCT-Veröffentli chung WO 91/08291).

D. Selektion und Transformation von Wirtszellen

Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der Vek toren hierin sind die prokaryontischen, Hefe- oder höheren eukaryontischen Zellen, wie oben beschrieben. Geeignete Pro karyonten umfassen Eubakterien, wie Gram-negative oder Gram positive Organismen, z. B. E. Coli, Bacilli wie B. Subtilis, Pseudomonas-Arten wie P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans. Ein bevorzugter E. Coli-Klonie rungswirt ist E. Coli 294 (ATCC Nr. 31,446), obwohl andere Stämme, wie E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC Nr. 31,537) und E. Coli W3110 (ATCC Nr. 27325) geeignet sind. Diese Bei spiele sind vielmehr erläuternd als beschränkend. Vorzugs weise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolyti schen Enzymen sezernieren. Alternativ sind auch in vitro- Verfahren zum Klonieren, z. B. PCR oder andere Nukleinsäure polymerasereaktionen, geeignet.

Zusätzlich zu Prokaryonten sind eukaryontische Mikroben, wie filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Wirte für die mpl- Liganden-kodierenden Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder die herkömmliche Bäckerhefe sind die am meisten verwendeten Organismen unter den niederen eukaryontischen Wirtsmikro organismen. Jedoch sind eine Vielzahl an anderen Gattungen, Arten und Stämmen allgemein erhältlich und hierin brauchbar, wie Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290 : 140 [1981]; EP 139,383, veröffentlicht 2. Mai 1985), Kluyveromyces-Wirte (US-PS 4,943,529) wie z. B. K. lactis (Louvenourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans und K. marxianus, yarrowia (EP 402,226), Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28 : 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 5259-5263 [1979]), und filamentöse Pilze wie z. B. Neurospora, Penicillium, Toly pocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991), und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112 : 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26 : 205-221 [1983], Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4 : 475-479 [1985]).

Geeignete Wirtszellen für die Expression von glycosyliertem mpl-Ligand werden von multizellulären Organismen erhalten. Solche Wirtszellen sind zum komplexen Prozessieren in der Lage und besitzen Glycosylierungsaktivitäten. Grundsätzlich ist jede beliebige höhere eukaryontische Zellkultur einsetz bar, ob von einer Vertebraten- oder Invertebratenkultur. Beispiele für Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und korrespondierende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melano gaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori sind identifiziert worden. Siehe z. B. Luckow et al., Bio/Technology, 6 : 47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277-279; und Maeda et al., Nature, 315 : 592-594 [1985]. Eine Vielzahl von viralen Stämmen zur Transfektion sind öffentlich erhältlich, z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als das Virus gemäß der Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen.

Pflanzenzellkulturen aus Baumwolle, Getreide, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte ver wendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen trans fektiert durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakte riums Agrobacterium tumefaciens, das zuvor manipuliert wor den ist, um die mpl-Liganden-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, kodierend den mpl-Liganden, in die Pflanzenwirts zelle übertragen, so daß diese transfektiert wird, und sie wird unter geeigneten Bedingungen die mpl-Liganden-DNA ex primieren. Weiterhin sind regulatorische und Signalsequen zen, die mit den Pflanzenzellen kompatibel sind, verfügbar, wie der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignal sequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1 : 561 [1982]. Weiterhin können DNA-Segmente, isoliert aus der stromaufwärts gelegenen Region des T-DNA-780-Gens, die Transkriptionsspiegel von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinantem DNA-haltigem Pflanzengewebe aktivieren oder steigern. EP 321,196, veröffentlicht am 21. Juni 1989.

Jedoch war das Interesse an Vertebratenzellen am größten, und die Vermehrung von Vertebratzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in letzten Jahren ein Routineverfah ren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. [1973]). Beispiele für nützliche Säuger wirtszellinien sind die Affennierenlinie CV1, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), die humane embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol., 36 : 59 [1977]); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ova rienzellen des chinesischen Hamsters/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4216 [1980]); Maus- Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23 : 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); Hundenieren zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Leberzellen der Buffaloratte (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383 : 44-68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zel len; und humane Hepatomazellinie (Hep G2).

Die Wirtszellen werden transfektiert und vorzugsweise trans formiert mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klo nierungsvektoren gemäß der Erfindung und kultiviert in her kömmlichen Nährmedien, in geeigneter Weise modifiziert zum Induzieren der Promotoren, dem Selektieren der Transforman den oder dem Amplifizieren der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren.

Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressi onsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob ko dierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden. Zahlreiche Verfahren zur Transfektion sind dem Fachmann bekannt, z. B. CaPO₄ und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen angenommen, wenn innerhalb der Wirts zelle ein Hinweis auf das Funktionieren des Vektors auf tritt.

Transformation bedeutet Eindringen einer DNA in einen Orga nismus, so daß die DNA replizierbar ist, entweder als ex trachromosomales Element oder durch chromosomale Integra tion. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation durchgeführt unter Verwendung von Standard techniken, die für diese Zellen geeignet sind. Die Calcium behandlung, bei der Calciumchlorid verwendet wird, wie be schrieben in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben, wird üblicherweise verwendet für Prokaryonten oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die In fektion mit Agrobacterium tumefaciens wird verwendet zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen, wie beschrie ben von Shaw et al., Gene, 23 : 315 [1983] und WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989. Weiterhin können Pflanzen transfektiert werden mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung, wie beschrieben in WO 91/00358, veröffentlicht am 10. Januar 1991. Für Säugerzellen ohne Zellwände ist die Calciumphos phatpräzipitationsmethode von Graham und van der Eb, Virology, 52 : 456-457 [1978] bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Transformationen von Säugerwirtszellsystemen sind be schrieben von Axel in U.S.-PS 4,399,216, herausgegeben am 16. August 1983. Transformationen in Hefe werden typischer weise ausgeführt gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact., 130 : 946 [1977] und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 : 3829 [1979]. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen, wie die Injek tion in Kerne, Elektroporation oder Protoplastenfusion ver wendet werden.

E. Kultivieren der Wirtszellen

Prokaryontische Zellen, die verwendet werden zum Herstellen des erfindungsgemäßen mpl-Ligandenpolypeptids, werden in ge eigneten Medien kultiviert, wie allgemein beschrieben in Sambrook et al., siehe oben.

Die Säugerwirtszellen, die verwendet werden zum Herstellen des erfindungsgemäßen mpl-Liganden, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Gewerblich erhältliche Medien, wie Ham′s F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium ((DMEM), Sigma) sind geeignet zum Kultivieren der Wirtszellen. Weiterhin kann ein beliebiges Medium, wie be schrieben in Ham und Wallace, Meth. Enz., 58 : 44 [1979], Barnes und Sato, Anal. Biochem., 102 : 255 [1980], U.S.-PS 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; oder 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S.-PS 30,985 (Reissue), oder das ebenfalls anhängige U.S.S.N. 07/592,107 oder 07/592,141, beide eingereicht am 3. Oktober 1990, als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie gefordert ergänzt werden mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Ma gnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nukleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin^TM-Wirk stoff), Spurenelemente (definiert als anorganische Verbin dungen, die üblicherweise in einer Endkonzentration in dem mikromolaren Bereich vorhanden sind), und Glucose oder eine äquivalente Energiequelle. Jede andere notwendige Ergänzung kann ebenfalls mit geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die dem Fachmann geläufig sind. Die Kultivierbedingun gen, wie Temperatur, pH und ähnliches, sind diejenigen, wie zuvor verwendet für die zur Expression ausgewählte Wirts zelle, und sie sind dem Fachmann geläufig.

Die Wirtszellen, auf die in der vorliegenden Offenbarung Be zug genommen wird, umfassen Zellen in in vitro-Kultur wie auch Zellen, die in einem Wirtstier vorliegen.

F. Nachweis der Genamplifikation/Expression

Genamplifikation und/oder Expression kann in einer Analysen probe direkt gemessen werden, z. B. durch herkömmliches Southern-Blotten, Northern-Blotten, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 5201-5205 [1980]), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder durch in situ-Hybridisierung mit Hilfe einer geeigneten markierten Probe, basierend auf den direkt bereitgestellten Sequenzen. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am üb lichsten sind Radioisotope, insbesondere ³³P. Jedoch können auch andere Techniken verwendet werden, wie die Verwendung von Biotin-modifizierten Nukleotiden zum Einbau in ein Polynukleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl an Markierungen markiert sein können, wie Radionukliden, Fluo reszenzstoffen, Enzymen oder ähnliches. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexstruktu ren erkennen, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe oder DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikör per wiederum können markiert sein, und der Assay kann ausge führt werden, wobei der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so daß durch die Bildung eines Duplex auf der Oberflä che die Anwesenheit eines Antikörpers, gebunden an den Duplex, nachgewiesen werden kann.

Die Genexpression kann alternativ gemessen werden mit immu nologischen Verfahren, wie einem immunhistochemischen Färben von Gewebeschnitten, und einem Assay mit der Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts di rekt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbetech niken wird eine Zellanalysenprobe hergestellt, typischer weise durch Dehydratisierung und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die spezifisch für das Genprodukt sind, wobei die Markierungen üblicherweise durch Betrachtung nachweisbar sind, wie enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und ähnli che. Eine besonders sensitive Färbetechnik, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist be schrieben von Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75 : 734-738 [1980].

Antikörper, die für die immunhistochemische Färbung und/oder den Assay mit Analysenprobeflüssigkeiten brauchbar sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein, und sie können in einem beliebigen Säuger hergestellt werden. Geeig neterweise können die Antikörper hergestellt werden gegen ein natives mpl-Ligandenpolypeptid oder gegen ein syntheti sches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA- Sequenzen, wie unten weiter beschrieben.

G. Reinigung von mpl-Ligandenpolypeptid

Mpl-Ligand wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium gewonnen als ein sezerniertes Polypeptid, obwohl es auch aus Wirts zellysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt exprimiert wird ohne sekretorisches Signal.

Wenn mpl-Ligand exprimiert wird in einer anderen rekombinan ten Zelle als der des humanen Ursprungs, ist der mpl-Ligand vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ur sprungs. Jedoch ist es üblicherweise immer noch notwendig, den mpl-Liganden von anderen rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu befreien, um Präparationen zu erhalten, die im wesentlichen homogen sind hinsichtlich des mpl-Ligan den per se. Als ein erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu ent fernen. Die Membran- und löslichen Proteinfraktionen werden dann getrennt. Alternativ kann ein gewerblich erhältlicher Filter zur Proteinkonzentrierung (z. B. Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheiten) verwendet werden. Der mpl-Ligand kann dann aus der löslichen Proteinfraktion und der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden, ab hängig davon, ob der mpl-Ligand membrangebunden ist. Danach wird der mpl-Ligand von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt durch Aussalzen und Austausch oder durch chromatographische Verfahren unter Verwendung verschiedener Gelmatrixmaterialien. Diese Matrixmaterialien umfassen Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose und andere übliche Materialien zur Proteinreinigung. Beispielhafte chromatographische Verfahren, die zur Proteinreinigung ge eignet sind, umfassen Immunaffinität (z. B. anti-hmpl-Ligand Mab), Rezeptoraffinität (z. B. mpl-IgG oder Protein-A-Sepha rose), hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) (z. B. Ether-, Butyl- oder Phenyl-Toyopearl), Lectinchromatographie (z. B. Con A-Sepharose, Lentil-Lectin-Sepharose), Größenaus schluß (z. B. Sephadex G-75), Kationen- und Anionenaus tauschersäulen (z. B. DEAE oder Carboxymethyl- und Sulfo propylcellulose), und Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit Umkehrphase (RP-HPLC) (siehe z. B. Urdal et al., J. Chromatog., 296 : 171 [1984], wo zwei nacheinander folgende RP-HPLC-Schritte verwendet werden zum Reinigen von rekombi nantem humanem IL-2). Andere Reinigungsschritte umfassen ge gebenenfalls Ethanolpräzipitation, Ammoniumsulfatpräzipita tion, Chromatofokussierung, präparative SDS-PAGE und ähnli ches.

Mpl-Liganden-Varianten, bei denen Reste deletiert, eingefügt oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche Weise wie nativer mpl-Ligand gewonnen, wobei ihre wesentliche Än derung in den Eigenschaften, hervorgerufen durch die Varia tion, berücksichtigt wird. Zum Beispiel erleichtert Herstel len einer mpl-Liganden-Fusion mit anderem Protein oder Poly peptid, z. B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Immunaffinitätssäule, enthaltend Antikörper gegen das Antigen, kann verwendet werden zum Adsorbieren des Fusionspolypeptids. Immunaffinitätssäulen, wie eine Säule enthaltend polyklonales Kaninchen-Anti-mpl-Ligandenserum, kann verwendet werden zum Adsorbieren der mpl-Liganden-Vari ante durch Binden an mindestens ein verbleibendes Immunepi top. Alternativ kann der mpl-Ligand gereinigt werden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von gereinigtem mpl-IgG, gekoppelt an (vorzugsweise) immobilisiertes Harz, wie Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) oder ähnliches, durch im Stand der Technik bekannte Mittel. Ein Protease inhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann eben falls nützlich sein zum Hemmen von proteolytischem Abbau während der Reinigung, und Antibiotika können eingesetzt werden, um das Wachstum von zufälligen kontaminierenden Organismen zu verhindern. Der Fachmann wird erkennen, daß die Reinigungsverfahren, die geeignet sind für nativen mpl- Ligand, einer Modifikation bedürfen können, um den Änderun gen der Eigenschaft von mpl-Ligand oder seiner Varianten durch die Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.

H. Kovalente Modifikationen von mpl-Ligandenpolypeptid

Kovalente Modifikationen des mpl-Ligandenpolypeptids werden von der vorliegenden Erfindung mit erfaßt. Sowohl nativer mpl-Ligand wie auch Aminosäuresequenzvarianten des mpl- Liganden können kovalent modifiziert werden. Eine Art der kovalenten Modifikation, die von der vorliegenden Erfindung mit erfaßt wird, ist ein mpl-Liganden-Fragment. Variante mpl-Liganden-Fragmente mit bis zu ungefähr 40 Aminosäure resten können einfach hergestellt werden durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des vollständigen oder eines varianten mpl-Ligandenpolypeptids. Andere Arten der kovalenten Modifikationen des mpl-Liganden oder der Fragmente davon werden in das Molekül eingeführt durch Umsetzen der fraglichen Aminosäurereste des mpl-Ligan den oder der Fragmente davon mit einem organischen derivati sierenden Mittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten reagieren kann.

Cysteinylreste werden üblicherweise umgesetzt mit α-Haloace taten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch derivati siert durch die Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β- (5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkyl maleimide, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisul fid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Histidylreste werden derivatisiert durch die Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0, weil dieses Mittel rela tiv spezifisch ist für die Histidyl-Seitenkette. Parabrom phenacylbromid ist ebenfalls brauchbar; die Reaktion wird vorzugsweise durchgeführt in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0.

Lysinyl- und aminoterminale Reste werden umgesetzt mit Suc cinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden. Die Derivati sierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von aminohaltigen Resten umfassen Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharn stoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reak tion mit Glyoxylat.

Arginylreste werden modifiziert durch die Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Mittel, darunter sind Phenyl glyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Re aktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, we gen dem hohen pK_A-Wert der funktionellen Guanidingruppe. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen des Lysins wie auch der Epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.

Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann durchge führt werden, wobei das Einführen von spektralen Markierun gen in die Tyrosylreste von besonderem Interesse ist, durch die Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Meistens wird N-Acetylimidazol und Tetra nitromethan verwendet zum Bilden von O-Acetyltyrosylvarian ten bzw. 3-Nitroderivaten. Tyrosylreste werden iodiert mit Hilfe von ¹²⁵J oder ¹³¹J, um markierte Proteine herzustellen zur Verwendung in einem Radioimmunoassay, wobei die oben be schriebene Chloramin-T-Methode geeignet ist.

Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selek tiv modifiziert durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R- N=C=N-R′), worin R und R′ verschiedene Alkylgruppen darstel len, wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Weiterhin werden Aspartyl- und Glutamylreste zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt durch die Reaktion mit Ammoniumionen.

Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich für das Vernetzen des mpl-Liganden mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder einer Oberfläche zum Verwenden in dem Ver fahren zur Reinigung von Anti-mpl-Ligand-Antikörpern und um gekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Acidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimi dylester, wie 3,3′-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatisierende Mittel wie Methyl-3-[(p-azido phenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwi schenprodukte, die vernetzende Strukturen ausbilden können in der Anwesenheit von Licht. Alternativ können reaktive wasserunlösliche Matrixmaterialien, wie Cyanogenbromid-akti vierte Kohlenhydrate, und die reaktiven Substrate, beschrie ben in U.S.-PS 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 zur Proteinimmobilisierung verwendet werden.

Glutaminyl- und Asparaginylreste werden regelmäßig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingun gen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste fällt in den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Andere Modifikation umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppe von Lysin, Arginin und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 [1983]), Acetylierung des N- terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-termina len Carboxylgruppe.

Andere Arten der kovalenten Modifikation des mpl-Liganden polypeptids, die von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt sind, umfassen das Verändern des nativen Glycosylierungs musters des Polypeptids. Mit Ändern ist gemeint, Deletieren von einem oder mehreren Kohlehydratresten, die in dem nati ven mpl-Liganden vorgefunden werden, und/oder Zufügen von einem oder mehreren Glycosylierungsstellen, die in dem nati ven mpl-Liganden nicht vorhanden sind.

Die Glycosylierung von Polypeptiden erfolgt typischerweise entweder über eine N-Anbindung oder O-Anbindung. N-angebun den bezieht sich auf das Anfügen des Kohlenhydratrests an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine be liebige Aminosäure darstellt außer Prolin, sind die Erken nungssequenzen für die enzymatische Anfügung des Kohlenhy dratrests an die Asparaginseitenkette. Somit erzeugt die An wesenheit einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypep tid eine potentielle Glycosylierungsstelle. O-angebundene Glycosylierung bedeutet das Anfügen von einem der Zucker N- Acetylgalactosamin, Galacctose oder Xylose an eine Hydroxy aminosäure, meistens Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxy prolin oder 5-Hydroxylysin auch verwendet werden können.

Das Zufügen von Glycosylierungsstellen zu dem mpl-Liganden polypeptid wird leicht erreicht durch Ändern der Aminosäure sequenz derart, daß es eine oder mehrere der oben beschrie benen Tripeptidsequenzen (für N-angebundene Glycosylierungs stellen) enthält. Die Änderung kann ebenfalls erfolgen durch das Anfügen von oder den Ersatz von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an die native mpl-Ligandensequenz (für O-angebundene Glycosylierungsstellen). Aus Gründen der Einfachheit wird die mpl-Liganden-Aminosäuresequenz vorzugs weise geändert durch Änderungen auf der DNA-Ebene, insbeson dere durch Mutieren der DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, an vorher ausgewählten Basen, so daß Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert wer den. Die DNA-Mutation(en) können erzeugt werden mit Hilfe von Verfahren, wie oben beschrieben unter der Überschrift "Aminosäuresequenzvarianten des mpl-Liganden".

Eine andere Möglichkeit zum Steigern der Anzahl der Kohlen hydratreste an dem mpl-Liganden ist die chemische oder enzymatische Kupplung von Glycosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie nicht das Herstellen des Polypeptids in einer Wirtszelle verlangen, die Glycosylierungsfähigkeiten für die N- oder O-angebundene Glycosylierung besitzt. Abhängig von dem verwendeten Kupp lungsverfahren kann der bzw. die Zucker angefügt werden an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie die von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie die von Serin, Threonin oder Hydroxy prolin, (e) aromatische Reste, wie die von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin. Diese Verfahren sind beschrieben in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 [1981].

Entfernen der Kohlenhydratreste, die auf dem mpl -Liganden polypeptid vorkommen, kann bewirkt werden chemisch oder enzymatisch. Die chemische Deglycosylierung verlangt das Aussetzen des Polypeptids der Verbindung Trifluormethan sulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Be handlung führt zur Abspaltung der meisten oder aller Zucker, außer dem anbindenden Zucker (N-Acetylglucosamin oder N-Ace tylgalactosamin), während das Polypeptid intakt gelassen wird. Die chemische Deglycosylierung ist beschrieben bei Hadimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys., 259 : 52 [1987] und bei Edge et al., Anal. Bochem., 118 : 131 [1981]. Die enzymatische Abspaltung von Kohlenhydratresten von Polypep tiden kann erzielt werden durch die Verwendung von einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen, wie beschrieben von Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138 : 350 [1987].

Die Glycosylierung an potentiellen Glycosylierungsstellen kann verhindert werden durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin, wie beschrieben von Duskin et al., J. Biol. Chem., 257 : 3105 [1982]. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-glycosidbindungen.

Eine weitere Art der kovalenten Modifikation des mpl-Ligan den umfaßt das Anfügen des mpl-Ligandenpolypeptids an eine Vielzahl von nicht proteinartigen Polymeren, z. B. Poly ethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylene, auf die Weise, wie ausgeführt in U.S.-PS 4,640,835; 4,496,689; 4301,144; 4,670,417; 4,791,192 oder 4,179,337.

Es ist ersichtlich, daß ein Absuchen der gewonnenen mpl- Liganden-Varianten erforderlich ist dahingehend, die opti male Variante zum Binden an einen mpl auszusuchen und die die oben definierte immunologische und/oder biologische Ak tivität aufweist. Man kann absuchen nach der Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder in Plasma (z. B. gegen proteo lytische Spaltung), hoher Affinität für ein mpl-Mitglied, oxidativer Stabilität, Fähigkeit zum Sezernieren in erhöhten Ausbeuten und ähnliches. Zum Beispiel wird eine Änderung in der immunologischen Eigenschaft des mpl-Ligandenpolypeptids, wie die Affinität für einen gegebenen Antikörper, gemessen durch einen Immunoassay vom kompetitiven Typ. Andere poten tielle Modifikationen der Protein- oder Polypeptideigen schaften, wie die Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobizi tät oder Empfindlichkeit gegenüber dem proteolytischen Ab bau, können anhand von bekannten Verfahren getestet werden.

17. Allgemeine Verfahren zum Herstellen von Antikörpern ge gen den mpl-Liganden Antikörperherstellung (i) Polyklonale Antikörper

Polyklonale Antikörper gegen mpl-Ligandenpolypeptide oder Fragmente werden üblicherweise erzeugt in Tieren durch meh rere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des mpl-Liganden und einem Adjuvans. Es kann auch nützlich sein, den mpl-Liganden oder ein Fragment, enthaltend die Zielaminosäuresequenz, an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Art immunogen ist, z. B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabonentrypsininhibitor, unter Verwendung von bifunk tionellen oder derivatisierenden Reagenzien, z. B. Maleimido benzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Suc cinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, worin R und R¹ ver schiedene Alkylgruppen darstellen.

Die Tiere werden immunisiert gegen das mpl-Ligandenpolypep tid oder ein Fragment, immunogene Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg bzw. 1 µg des Peptids oder Konju gats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumen Freunds voll ständigem Adjuvans, und Injizieren der Lösung intradermal an mehreren Stellen. Einen Monat später werden die Tiere geboo stet mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Peptid oder Konjugat in Freunds vollständigem Adjuvans durch subku tane Injektion an mehreren Stellen. Sieben bis vierzehn Tage später wird den Tieren Blut entnommen, und das Serum wird auf einen mpl-Liganden-Antikörpertiter hin getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise werden die Tiere geboostet mit dem Konjugat aus dem gleichen mpl-Liganden, aber konjugiert an ein verschie denes Protein und/oder über ein verschiedenes Vernetzungs mittel damit verbunden. Konjugate können ebenfalls in rekom binanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch werden aggregierende Mittel, wie Alum, verwendet zum Steigern der Immunantwort.

(ii) Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d. h., die ein zelnen Antikörper, die die Population bilden, sind identisch außer möglichen, natürlicherweise auftretenden Mutationen, die in geringeren Mengen vorhanden sein können. Somit bedeu tet der modifizierende Begriff "monoklonal", daß der Anti körper nicht eine Mischung aus einzelnen Antikörpern dar stellt.

Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper gegen mpl- Ligand gemäß der Erfindung hergestellt werden unter Verwen dung des Hybridoma-Verfahrens, das zuerst beschrieben wurde von Kohler & Milstein, Nature, 256 : 495 [1975], oder sie kön nen durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden (U.S.-PS 4,816,567 (Cabilly et al.)).

Bei dem Hybridoma-Verfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie ein Hamster, immunisiert wie zuvor beschrieben, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder produzieren können, die spezifisch gegen das zur Immunisierung verwendete Protein gerichtet sind. Alternativ können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomazellen fusioniert un ter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie Poly ethylenglykol, um eine Hybridomzellinie zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Die so hergestellten Hybridomazellen werden in ein geeigne tes Kulturmedium ausgebracht und kultiviert, das vorzugs weise enthält eine oder mehrere Substanzen, die das Wachstum oder das Überleben der nicht fusionierten Elternmyelomzellen hemmen. Zum Beispiel, falls der Elternmyelomzelle das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, enthält das Kulturmedium für die Hybridomas typi scherweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Me dium), wobei diese Substanzen das Wachstum von Zellen ver hindern, denen HGPRT fehlt.

Bevorzugte Myelomazellen sind solche, die effizient fusio nieren, einen hohen Spiegel der Expression des Antikörpers durch die ausgewählte Antikörper-produzierende Zelle unter stützten und die sensitiv sind gegenüber einem Medium, wie HAT-Medium. Unter diesen sind bevorzugte Myelomazellinien die Mäusemyelomalinien, wie solche, die erhalten werden von MOPC-21 und MPC-11-Mäusetumoren, erhältlich vom Salk Insti tute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, und SP-2-Zellen, erhältlich von American Type Culture Col lection, Rockville, Maryland, USA. Humane Myeloma- und Maus- Mensch-Heteromyelomazellinien sind ebenfalls beschrieben worden für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikör pern (Kozbor, J. Immunol., 133 : 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Das Kulturmedium, in dem Hybridomazellen kultiviert werden, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die gegen den mpl-Liganden gerichtet sind, getestet. Vorzugs weise wird die Bindungsspezifität der durch die Hybrido mazellen erzeugten monoklonalen Antikörper ermittelt durch Immunpräzipitation oder durch einen in vitro-Bindungsassay, wie einen Radioimmunoassay (RIA) oder einen enzymgekoppelten Immunoabsorbentassay (ELISA).

Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z. B. ermittelt werden anhand der Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107 : 220 [1980].

Nachdem Hybridomazellen identifiziert worden sind, die Anti körper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität herstellen, können die Klone subkloniert werden durch begrenzte Verdünnungsverfahren (limiting dilution) und kultiviert werden unter Standardverfahren (Goding, siehe oben). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z. B. Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium oder RPMI-1640-Medium. Weiterhin können die Hybridomazellinien kultiviert werden in vivo, als Ascitestumore in einem Tier.

Die von den Subklonen ausgeschiedenen monoklonalen Antikör per werden geeigneterweise von dem Kulturmedium, der Asci tesflüssigkeit oder dem Serum abgetrennt durch herkömmliche Reinigungsverfahren für Immunglobuline, wie z. B. Protein A- Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.

DNA, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ko diert, kann leicht isoliert und sequenz 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019500030 00004 99880iert werden mit Hilfe herkömmlicher Verfahren (z. B. unter Verwendung von Oligo nukleotidproben, die spezifisch an Gene binden können, die die leichte und schwere Kette von Mäuseantikörpern kodie ren). Die erfindungsgemäßen Hybridomazellen dienen als be vorzugtes Ausgangsmaterial für diese DNA. Ist die DNA einmal isoliert, kann sie in Expressionsvektoren eingefügt werden, die dann in Wirtszellen transfektiert werden, wie Affen-COS- Zellen, Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder Myelomazellen, die nicht auf andere Weise Immunglobulinpro tein erzeugen, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch modifiziert werden, z. B. durch Einsetzen der kodieren den Sequenz für die konstanten Domänen der humanen leichten und schweren Kette an die Stelle der homologen Mäusesequen zen (Cabilly et al., siehe oben; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81 : 6851 [1984]), oder durch kovalente Verknüp fung der immunglobulinkodierenden Sequenz mit einem Teil oder der vollständigen kodierenden Sequenz für ein Nicht- Immunglobulin-Polypeptid.

Typischerweise ersetzen solche Nicht-Immunglobulin-Polypep tide die konstanten Domänen der erfindungsgemäßen Antikör per, oder sie ersetzen die variable Domäne einer Antigenbin dungsstelle des erfindungsgemäßen Körpers, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen, umfassend eine Antigen- Bindungsstelle mit der Spezifität für einen mpl-Liganden und eine andere Antigen-Bindungsstelle mit der Spezifität für ein anderes Antigen.

Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro herge stellt werden unter Verwendung bekannter Verfahren auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie, einschließlich sol cher, die Vernetzungsmittel verwenden. Zum Beispiel können Immuntoxine hergestellt werden unter Verwendung einer Disul fidaustauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbin dung. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.

Für diagnostische Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Antikörper typischerweise markiert mit einem nachweisbaren Rest. Der nachweisbare Rest kann ein beliebiger Rest sein, der in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein nach weisbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel kann der nach weisbare Rest sein ein Radioisotop, wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵J, oder eine fluoreszierende oder chemilumineszie rende Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; radioaktive Isotopenmarkierungen, wie z. B. ¹²⁵J, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder ein Enzym, wie alkalische Phos phatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.

Ein beliebiges Verfahren aus dem Stand der Technik zum sepa raten Konjugieren des Antikörpers mit dem nachweisbaren Rest kann verwendet werden, einschließlich der Verfahren, wie be schrieben von Hunter et al., Nature, 144 : 945 [1962]; David et al., Biochemistry, 13 : 1014 [1974]; Pain et al., J. Immunol. Meth., 40 : 219 [1981] und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30 : 407 [1982].

Die erfindungsgemäßen Antikörper können in jedem bekannten Assayverfahren verwendet werden, wie einem kompetitiven Bin dungsassay, einem direkten oder indirekten Sandwichassay und einem Immunpräzipitationsassay. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Kompetitive Bindungsassays beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein mpl-Ligand oder ein immunolo gisch reaktiver Teil davon sein kann) mit dem Analyt (mpl- Ligand) der Testanalysenprobe um die Bindung mit einer be grenzten Menge an Antikörpern zu konkurrieren. Die Menge an mpl-Ligand in der Testanalysenprobe ist umgekehrt proportio nal zu der Menge des Standards, der an die Antikörper gebun den wird. Um die Bestimmung der Menge an gebundenem Standard zu erleichtern, werden die Antikörper im allgemeinen insolu bilisiert, vor oder nach der Kompetition, so daß der Stan dard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht von dem Standard und Analyt, die nicht gebunden sind, abgetrennt werden können.

Sandwichassays umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder in der Lage ist, an einen verschiedenen immuno genen Teil oder Epitop des nachzuweisenden Proteins (mpl- Ligand) zu binden. In einem Sandwichassay wird der Analyt der Testanalysenprobe durch einen ersten Antikörper gebun den, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und da nach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, um somit einen unlöslichen dreiteiligen Komplex zu bilden. David & Greene, U.S.-PS 4,376,110. Der zweite Antikörper selbst kann mit einem nachweisbaren Rest markiert sein (direkter Sand wichassay), oder er kann gemessen werden mit Hilfe eines anti-Immunglobulin-Antikörpers, der markiert ist mit einem nachweisbaren Rest (indirekter Sandwichassay). Zum Beispiel ist ein Typ des Sandwichassays ein ELISA-Assay, wobei in diesem Fall der nachweisbare Rest ein Enzym ist (z. B. Meer rettichperoxidase).

(iii) Humanisierte und humane Antikörper

Verfahren zum Humanisieren von nicht humanen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Im allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäure reste, die in ihn eingeführt wurden aus einer Quelle, die nicht humanen Ursprungs ist. Diese nicht humanen Aminosäure reste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typi scherweise aus einer variablen "Import"-Domäne stammen. Die Humanisierung kann im wesentlichen durchgeführt werden fol gend dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature, 321 : 522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536 [1988]), durch Ersetzen der CDRs oder CDR-Sequenzen eines Nagers durch die entsprechenden Sequenzen eines humanen An tikörpers. Demzufolge sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al., siehe oben), worin be trächtlich weniger als eine vollständige humane variable Do mäne ersetzt worden ist durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht humanen Art. In der Praxis sind humanisierte An tikörper typischerweise humane Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste substituiert sind durch Reste aus analogen Stellen von Antikörpern aus Nagern.

Die Wahl der humanen variablen Domänen, sowohl der leichten wie auch der schweren Kette, die für das Herstellen der hu manisierten Antikörper zu verwenden sind, ist sehr wichtig, um die Antigenizität zu verringern. Nach der sogenannten "best-fit"-Methode wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagerantikörpers abgesucht gegen eine vollständige Bank bekannter humaner variabler Domänensequenzen. Die hu mane Sequenz, die der Nagersequenz am nächsten kommt, wird dann als das humane Framework (FR) für den humanisierten An tikörper verwendet (Sims et al., J. Immunol., 151 : 2296 [1993]; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., 196 : 901 [1987]). Ein anderes Verfahren benutzt ein spezielles Framework, das sich von der Konsensussequenz aller humanen Antikörper einer speziellen Subgruppe von leichten oder schweren Ketten ab leitet. Das gleiche Framework kann verwendet werden für meh rere verschiedene humanisierte Antikörper (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 151 : 2623 [1993]).

Es ist weiterhin wichtig, daß die Antikörper humanisiert werden unter dem Beibehalten einer hohen Affinität für das Antigen oder anderen vorteilhaften biologischen Eigenschaf ten. Zum Erreichen dieses Ziels wird gemäß eines bevorzugten Verfahrens ein humanisierter Antikörper hergestellt durch ein Analyseverfahren der parentalen Sequenzen und verschie dener konzeptioneller humanisierter Produkte unter Verwen dung von dreidimensionalen Modellen der Parental- und huma nisierten Sequenzen. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann geläufig. Compu terprogramme sind erhältlich, die die möglichen dreidimen sionalen Konformationsstrukturen von ausgewählten Immunglo bulinsequenzkandidaten erläutern und grafisch zeigen. Das Untersuchen dieser Darstellungen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktion der ge wünschten Immunglobulinsequenz, d. h., die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des gewünschten Immunglobulins be einflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise kön nen FR-Reste aus der Konsensussequenz ausgewählt und mit der Importsequenz kombiniert werden, so daß die gewünschte Anti körpereigenschaft, wie eine gesteigerte Affinität für das bzw. die Zielantigen(e), erzielt wird. Im allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und am stärksten an dem Einfluß auf die Antigenbindung beteiligt. Für weitere Einzelheiten siehe U.S.-Anmeldung, Seriennummer 07/934,373, eingereicht am 21. August 1992, die eine continuation-in-part-Anmeldung der Se riennummer 07/715,271, eingereicht am 14. Juni 1991, ist.

Alternativ ist es jetzt möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) herzustellen, die nach Immunisierung in der Lage sind, ein vollständiges Repertoire an humanen Antikörpern in der Abwesenheit von endogener Immunglobulinproduktion herzu stellen. Zum Beispiel ist beschrieben worden, daß die homo zygote Deletion des Gens für die Antikörper-schwere-Kette joining-Region (J_H), in chimären und Keimbahn-mutierten Mäu sen zu einer vollständigen Hemmung der endogenen Antikörper produktion führt. Die Übertragung der Immunglobulingenanord nung aus humaner Keimbahn in solche keimbahnmutierten Mäuse führt zur Produktion von humanen Antikörpern bei der Kon frontation mit Antigen. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 2551-255 [1993]; Jakobovits et al., Nature, 362 : 255-258 [1993]; Bruggerman et al., Year in Immuno., 7 : 33 [1993]. Humane Antikörper können auch herge stellt werden in Phagenbanken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]).

(iv) Bispezifische Antikörper

Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise hu mane oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifität für mindestens zwei verschiedene Antigene aufweisen. Verfah ren zum Herstellen bispezifischer Antikörper sind in dem Stand der Technik bekannt.

Traditionellerweise basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Coexpression von zwei Paaren von Immunglobulin-schweren-Ketten und -leichten-Ket ten, wobei die zwei schweren Ketten verschiedene Spezifitä ten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature, 305 : 537-539 [1983]). Wegen der zufälligen Paarung von leichten und schweren Immunglobulinketten erzeugen diese Hybridomas (Quadromas) eine potentielle Mischung aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die richtige bispe zifische Struktur aufweist. Die Reinigung des richtigen Mo leküls, die normalerweise durch Affinitätschromatographie schritte erfolgt, ist recht mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind offenbart in der PCT- Veröffentlichung WO 93/08829 (veröffentlicht 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO, 10 : 3655-3659 [1991].

Gemäß einem anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an Immunglobulinsequen zen für die konstante Domäne fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise innerhalb einer konstanten Domäne der Immunglo bulin-schweren-Kette, umfassend mindestens einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen. Es ist bevorzugt, daß die er ste konstante Region der schweren Kette (CH1), die die für die Bindung der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in mindestens einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die die Fusionen der Immunglobulin-schweren-Kette und, falls ge wünscht, der Immunglobulin-leichten-Kette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren eingefügt und kotransfek tiert in einen geeigneten Wirtsorganismus. Dies gestattet eine große Flexibilität hinsichtlich des Einstellens der einzelnen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausfüh rungsformen, wenn das ungleiche Verhältnis der zur Konstruk tion verwendeten drei Polypeptidketten die optimalen Ausbeu ten ermöglicht. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Se quenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor einzufügen, wenn die Expression von minde stens zwei Polypeptidketten im gleichen Verhältnis zu hohen Ausbeuten führt, oder wenn die Verhältnisse von keiner be sonderen Bedeutung sind. Bei einer bevorzugten Ausführungs form dieses Ansatzes setzen sich die bispezifischen Antikör per zusammen aus einer hybriden Immunglobulin-schweren-Kette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm, und einem hybriden Immunglobulin-schwere-Kette-leichte-Kette-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) in dem anderen Arm. Es wurde gefunden, daß diese asymmetrische Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von den unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Anwesenheit von nur einer Immunglobulin-leichten- Kette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls einen erleichterten Weg für die Trennung bereitstellt. Dieser An satz ist offenbart in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/931,811, eingereicht am 17. August 1992.

Weitere Einzelheiten zum Erzeugen bispezifischer Antikörper sind offenbar z. B. in Suresh et al., Methods in Enzymology, 121 : 210 [1986].

(v) Heterokonjugat-Antikörper

Heterokonjugat-Antikörper werden ebenfalls von der vorlie genden Erfindung mit erfaßt. Heterokonjugat-Antikörper set zen sich zusammen aus zwei kovalent verknüpften Antikörpern. Von solchen Antikörpern ist z. B. behauptet worden, daß sie die Immunsystemzellen auf nicht-erwünschte Zellen richten (U.S.-PS 4,676,980) und für die Behandlung von HIV-Infektio nen geeignet sind (PCT-Veröffentlichung WO 91/00360 und WO 92/00373, EP 03089). Heterokonjugat-Antikörper können herge stellt werden unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Vernetzungsmethode. Geeignete Vernetzungsmittel sind in dem Stand der Technik bekannt und offenbart in U.S.-PS 4,676,980, zusammen mit einer Vielzahl von Vernetzungstech niken.

IV. Therapeutische Verwendung des megakaryozytopoetischen Proteins mpl-Ligand

Der biologisch aktive mpl-Ligand mit hämatopoetischer Effek torfunktion und der hierin als megakaryozytopoetisches oder thrombozytopoetisches Protein (TPO) bezeichnet wird, kann in einer sterilen pharmazeutischen Präparation oder Formulie rung verwendet werden zum Stimulieren der megakaryozytopoe tischen oder thrombopoetischen Aktivität in Patienten, die an Thrombozytopenie leiden aufgrund einer beeinträchtigten Produktion, Sequestration oder gesteigerter Zerstörung von Plättchen. Thrombozytopenie-assoziierte Knochenmarkhyplasie (z. B. aplastische Anämie folgend auf Chemotherapie oder Kno chenmarktransplantation) kann wirksam behandelt werden mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, wie auch Störungen, wie die ausgebreitete intravaskuläre Gerinnung (DIC), Immunthrombozytopenie (einschließlich HIV-induzierter ITP oder nicht HIV-induzierter ITP), chronische idiopathische Thrombozytopenie, kongenitale Thrombozytopenie, Myelodyspla sie und thrombotische Thrombozytopenie. Weiterhin können diese megakaryozytopoetischen Proteine nützlich sein zur Be handlung von myeloproliferativen thrombozytotischen Erkran kungen wie auch von Thrombozytose als Folge entzündlicher Be dingungen und Eisenmangel.

Bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen megakaryozyto poetischen oder thrombozytopoetischen Proteins (TPO) sind in Verbindung mit myelotoxischer Chemotherapie, myeloablativer Chemotherapie und Thrombozytopenie aufgrund des Knochenmark versagens.

Weitere Störungen, die in nützlicher Weise mit den erfin dungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteinen behandelt werden können, umfassen Defekte oder Schäden an Plättchen, die herrühren von Wirkstoffen, Vergiftung oder Aktivierung auf künstlichen Oberflächen. In diesen Fällen können die Verbindungen verwendet werden, um den "Ausstoß (shedding)" von neuen "unbeschädigten" Plättchen zu stimulieren. Für eine vollständigere Liste nützlicher Anwendungen, siehe die "Einleitung" oben, insbesondere die Abschnitte (a)-(f) und die darin angegebenen Literaturstellen.

Die erfindungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteine kön nen einzeln verwendet werden oder in Kombination mit anderen Zytokinen, Hämatopoetinen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern zu der Behandlung der oben identifizierten Störungen und Bedingungen. Somit können die vorliegenden Verbindungen verwendet werden in Kombination mit anderen Proteinen oder Peptiden mit thrombopoetischer Aktivität ein schließlich: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, Erythro poietin (EPO), kit-Ligand, IL-6 und IL-11.

Die erfindungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteine wer den in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zubereitet. Diese therapeutische Zusammensetzung kann intravenös oder über die Nase oder Lunge verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann auch parenteral oder subkutan, falls gewünscht, verabreicht werden. Wenn die therapeutische Zusammensetzung systemisch verabreicht wird, sollte sie pyrogenfrei sein und in einer parenteral verträglichen Lö sung vorliegen, wobei der pH, die Isotonizität und die Sta bilität zu berücksichtigen ist. Diese Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. Kurz ausgeführt, Dosisformulierungen aus den erfindungsgemäßen Verbindungen werden hergestellt zur Lagerung und Verabreichung durch Mischen der Verbindung mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträgli chen Trägern, Hilfsstoffen und Stabilisatoren. Solche Mate rialien sind für den Empfänger nicht toxisch in den verwen deten Dosen und Konzentrationen, und sie umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat, Acetat und andere organische Säuresalze; Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Peptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als 10 Reste), wie Polyarginin, Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosac charide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließ lich Zellulose oder dessen Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Manni tol oder Sorbitol; Gegenionen wie Natrium- und/oder nichtio nische oberflächenaktive Mittel wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol.

Ungefähr 0,5 bis 500 mg einer Verbindung oder Mischung des megakaryozytopoetischen Proteins in Form der freien Säure oder Base oder als pharmazeutisch verträgliches Salz wird verarbeitet mit einem physiologisch verträglichem Vehikel, Träger, Hilfsstoff, Bindemittel, Konservierungsmittel, Sta bilisator, Aromastoff, usw., je nachdem, wie es die pharma zeutische Praxis verlangt. Die Menge an aktivem Bestandteil in diesen Zusammensetzungen wird so gewählt, daß eine geeig nete Dosierung in dem angezeigten Bereich erhalten wird.

Sterile Zusammensetzungen für die Injektion können formu liert werden gemäß der üblichen pharmazeutischen Praxis. Zum Beispiel kann das Auflösen oder Suspendieren der aktiven Verbindung in einem Vehikel wie Wasser, oder natürlich vor kommenden Pflanzenölen, wie Sesam-, Erdnuß- oder Baumwoll samenöl, oder einem synthetischen Fettvehikel, wie Ethylo leat oder ähnliches, gewünscht sein. Puffer, Konservierungs mittel, Antioxidantien und ähnliches kann gemäß der zulässi gen pharmazeutischen Praxis eingebracht werden.

Geeignete Beispiele für Präparationen mit verzögerter Frei setzung umfassen semipermeable Matrixmaterialien aus festen hydrophoben Polymeren enthaltend das Polypeptid, wobei die Matrixmaterialien in der Form von geformten Körpern vorlie gen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Matrix materialien mit verzögerter Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie be schrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167- 277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12 : 98-105 [1982] oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (U.S.-PS 3,773,919, EP 58,481), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaethyl-L- glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22 : 547-556 [1983]), nicht abbaubare Ethylen-Vinylacetate (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere, wie das Lupron-Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die sich zusam mensetzen aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer und Leupro lidacetat), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133,988).

Während Polymere, wie Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure- Glycolsäure die Freisetzung von Molekülen über einen Zeit raum von mehr als 100 Tagen erlauben, setzen bestimmte Hydrogele Proteine in einer kürzeren Zeitspanne frei. Wenn die Proteine eingekapselt werden, verbleiben sie für eine längere Zeit in dem Körper, aber sie können denaturieren oder aggregieren als das Ergebnis des Aussetzens von Feuch tigkeit bei 37°C, wobei dies zu einem Verlust der biologi schen Aktivität und möglicherweise zu Änderungen in der Immunogenität führt. Rationale Strategien können entworfen werden für die Proteinstabilisierung, abhängig von dem be teiligten Mechanismus. Zum Beispiel, wenn gefunden wird, daß der Aggregationsmechanismus auf der intermolekularen S-S- Bindungsbildung aufgrund von Disulfidaustausch beruht, kann die Stabilisierung erzielt werden durch Modifizieren der Sulfhydrylreste, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kon trollieren des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrixzusammen setzungen.

Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung des megakaryo zytopoetischen Proteins umfassen auch in Liposomen verpackte megakaryozytopoetisches Protein. Liposomen enthaltend mega karyozytopoetisches Protein werden in an sich bekannter Weise hergestellt: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4030-4034 [1980]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; JP-A-83-118008; U.-S.-PS 4,485,045 und 4,544,545; und EP 102,324. Normaler weise sind die Liposomen von dem kleinen (ungefähr 200-800 Angström) unilamellaren Typus, in dem der Lipidgehalt größer ist als ungefähr 30 Mol% Cholesterol, wobei der optimale An teil so eingestellt wird, daß er für die megakaryozytopoeti sche Proteintherapie optimal ist.

Die Dosierung wird von dem begleitenden Arzt ermittelt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, von denen bekannt ist, daß sie die Wirkung von Wirkstoffen beeinflussen, ein schließlich die Schwere und Art der Erkrankung, das Körper gewicht, das Geschlecht, die Diät, die Zeit und der Weg der Verabreichung, andere Medikationen und andere relevante kli nische Faktoren. Typischerweise liegt das tägliche Therapie schema in dem Bereich von 0,1 bis 100 µg/kg Körpergewicht. Vorzugsweise liegt die Dosierung in dem Bereich von 0,1-50 µg/kg Körpergewicht. Besonders bevorzugt liegt die Dosierung in dem Bereich von 1-5 µg/kg/Tag. Gegebenenfalls kann der Bereich der Dosierung der gleiche sein wie für andere Zyto kine, insbesondere G-CSF, GM-CSF und EPO. Therapeutisch wirksame Dosierungen können ermittelt werden entweder mit Hilfe von in vitro- oder in vivo-Verfahren.

Beispiele

Es wird angenommen, daß ohne eine weitere Beschreibung der Durchschnittsfachmann unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung und der erläuternden Beispiele die Erfindung in vollem Umfang ausüben und verwenden kann. Die folgenden Aus führungsbeispiele erläutern deshalb spezifische erfindungs gemäße Ausführungsformen, und sie sind nicht gedacht, die Offenbarung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiel 1 Partielle Reinigung des Schweine-mpl-Liganden

Plättchenarmes Plasma wurde gesammelt aus normalen und apla stisch anämischen Schweinen. Die Schweine wurden aplastisch gemacht durch Bestrahlung mit 900 cGY für die gesamte Kör perbestrahlung mit Hilfe eines 4mEV linearen Beschleunigers. Die bestrahlten Schweine wurden für 6 bis 8 Tage mit intra muskulären Injektionen von Cefazolin unterstützt. Anschlie ßend wurde das gesamte Blutvolumen entfernt unter allgemei ner Betäubung, heparinisiert und zentrifugiert bei 1800 × g für 30 min, um plättchenarmes Plasma herzustellen. Die Mega karyozyten-stimulierende Aktivität gipfelte sechs Tage nach der Bestrahlung.

Aplastisches Schweineplasma, erhalten aus den bestrahlten Schweinen, wird auf 4M mit NaCl eingestellt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Präzipität wird durch Zentrifugation bei 3800 Upm in einer Sorvall RC3B ent fernt, und der Überstand wird auf eine Phenyl-Toyopearl- Säule (220 ml), equilibriert in 10 mM NaPO₄ enthaltend 4M NaCl, geladen. Die Säule wird mit diesem Puffer gewaschen, bis eine A₂₈₀ von <0,05 erreicht wird, und es wird eluiert mit dH₂O. Der eluierte Proteinpeak wird verdünnt mit dH₂O zu einer Leitfähigkeit von 15 mS und auf eine Blue-Sepharose- Säule, equilibriert (240 ml) in PBS, geladen. Anschließend wird die Säule mit 5 Säulenvolumen von jeweils PBS und 10 mM NaPO₄ (pH 7,4), enthaltend 2M Harnstoff, gewaschen. Die Pro teine werden von der Säule eluiert mit 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4) enthaltend 2M Harnstoff und 1M NaCl. Der eluierte Proteinpeak wird auf 0,01% Octylglucosid (n-octyl-β-D-gluco pyranosid) und jeweils 1 mM EDTA und Pefabloc (Boehringer Mannheim) eingestellt und direkt auf tandemverbundene CD4- IgG-(Capon, D.J. et al., Nature 337 : 525-531 (1989)) und mpl- IgG-Ultralink (Pierce)-Säulen (siehe unten) geladen. Die CD4-IgG (2 ml)-Säule wird entfernt, nachdem die Analysen probe aufgeladen ist, und die mpl-IgG (4 ml)-Säule wird ge waschen mit 10 Säulenvolumen von jeweils PBS und PBS enthal tend 2 M NaCl und eluiert mit 0,1M Glycin-HCl pH 2,25. Die Fraktionen werden gesammelt in 1/10-Volumen 1 M Tris-HCl (pH 8,0).

Die Analyse der eluierten Fraktionen von der mpl-Affinitäts säule durch SDS-PAGE (4-20%, Novex-Gel), Lauf unter reduzie renden Bedingungen, zeigte die Anwesenheit von mehreren Pro teinen (Fig. 5). Proteine, die mit der Silberfärbung die stärkste Intensität zeigen, trennen sich auf mit einem appa renten Mr von 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 und 14 000. Zum Be stimmen, welches dieser Proteine die Proliferation von Ba/F3-mpl-Zellkulturen stimuliert, wurden diese Proteine aus dem Gel eluiert, wie in Beispiel 2 unten beschrieben.

Ultralink-Affinitätssäulen

10-20 mg mpl-IgG oder CD4-IgG in PBS werden gekoppelt an 0,5 g Ultralink-Harz (Pierce), wie in den Herstellerangaben be schrieben.

Konstruktion und Expression von mpl-IgG

Ein chimäres Molekül umfassend die vollständige extrazellu läre Domäne von humanem mpl (Aminosäuren 1-491) und die Fc- Region von einem humanen IgG1-Molekül wurde in 293-Zellen exprimiert. Ein cDNA-Fragment, das die Aminosäuren 1-491 des humanen mpl kodiert, wurde durch PCR aus einer humanen mega karyozytischen CMK-Zell-cDNA-Bank erhalten und sequenziert.

Eine ClaI-Stelle wurde an dem 5′-Ende, und eine BstEII- Stelle an dem 3′-Ende eingefügt. Dieses Fragment wurde stromaufwärts von der IgG1-Fc-kodierenden Region in einem Bluescript-Vektor zwischen der ClaI- und der BstEII-Stelle eingebaut nach Partialspaltung des PCR-Produkts mit BstEII, weil zwei weitere BstEII-Stellen in der DNA, die die extra zelluläre Domäne von mpl kodiert, vorhanden waren. Die BstEII-Stelle, die an dem 3′-Ende des mpl-PCR-Produkts ein geführt worden war, war so entworfen, daß die Fc-Region im Raster mit der mpl-extrazellulären Domäne war. Das Konstrukt wurde subkloniert in den pRK5-tkneo-Vektor zwischen die ClaI- und XbaI-Stellen und transfektiert in humane embryo nale 293-Nierenzellen durch das Kalziumphosphatverfahren. Diese Zellen wurden selektiert in 0,4 mg/ml G418, und indi viduelle Klone wurden isoliert. Die mpl-IgG-Expression von isolierten Klonen wurde bestimmt mit Hilfe eines für den hu manen Fc spezifischen ELISA. Der beste Expressionsklon besaß einen Expressionsspiegel von 1-2 mg/ml an mpl-IgG.

Mpl P exprimierende Ba/F3-Zellen

Eine cDNA, die der vollständigen kodierenden Region von hu manem mpl P entsprach, wurde in pRK5-tkneo kloniert, der an schließend linearisiert wurde mit NotI und transfektiert wurde in die IL-3-abhängige Zellinie Ba/F3 durch Elektro poration (1 × 10⁷ Zellen, 9605 F, 250 Volt). Drei Tage spä ter wurde die Selektion begonnen in der Anwesenheit von 2 mg/ml G418. Die Zellen wurden als Pools selektiert oder ein zelne Klone wurden erhalten durch begrenzte Verdünnung in 96-Loch-Platten. Ausgewählte Zellen wurden in RPMI gehalten, enthaltend 15% FBS, 1 mg/ml G418, 20 mM Glutamin, 10 mM HEPES und 100 µg/ml Pen-Strep. Die Expression von mpl P in den selektierten Klonen wurde ermittelt durch FACS-Analyse mit Hilfe eines polyklonalen anti-mpl P-Kaninchenantikör pers.

Ba/F3-mpl-Ligadenassay

Der mpl-Ligandenassay wurde durchgeführt, wie in Fig. 2 ge zeigt. Zum Ermitteln der Anwesenheit von mpl-Liganden in verschiedenen Ausgangsmaterialien wurden die mpl P Ba/F3- Zellen ausgehungert an IL-3 für 24 Std. bei einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml in einem feuchten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂ und Luft. Folgend auf das IL-3-Aushungern wurden die Zellen in 96-Loch-Kulturplatten bei einer Dichte von 50 000 Zellen in 200 µl Medium mit oder ohne verdünnte Analy senprobe ausplattiert und kultiviert für 24 Stunden in einem Zellkulturinkubator. 20 µl serumfreie RPMI-Medien, enthal tend 1 µCi ³H-Thymidin, wurde zu jedem Loch für mindestens 6 bis 8 Stunden zugesetzt. Die Zellen wurden dann geerntet auf 96-Loch-GF/C-Filterplatten und fünfmal mit Wasser gewaschen. Die Filter wurden ausgezählt in der Anwesenheit von 40 µl einer Scintillationsflüssigkeit (Microscint 20) in einem Packard Top Count Zähler.

Beispiel 2 Hoch gereinigter mpl-Ligand aus Schwein Gelelutionsprotokoll

Gleiche Mengen des affinitätsgereinigten mpl-Liganden (von der mpl-IgG-Säule eluierte Fraktion 6) und 2X Laemmli-Pro benpuffer wurden bei Raumtemperatur ohne reduzierendes Agens gemischt und so schnell wie möglich auf ein Novex 4-20% Polyacrylamidgel geladen. Die Probe wurde nicht erhitzt. Als Kontrolle wurde Probenpuffer ohne Ligand in einer benachbar ten Spur laufen gelassen. Das Gel wurde für ungefähr 2 1/4 Std. bei 4-6°C bei 135 Volt laufen gelassen. Der Laufpuffer hatte anfänglich Raumtemperatur. Das Gel wurde danach aus dem Gelkasten und die Platte auf einer Seite des Gels ent fernt.

Ein Replika des Gels wurde wie folgt auf Nitrocellulose her gestellt: Ein Stück der Nitrocellulose wurde mit destillier tem Wasser angefeuchtet und sorgfältig auf die Oberfläche des exponierten Gels derart gelegt, daß Luftblasen ausge schlossen wurden. Vergleichsmarkierungen wurden auf der Nitrocellulose und der Gelplatte angebracht, so daß das Replika-Filter nach dem Färben wieder genau in die gleiche Stellung gebracht werden konnte. Nach ungefähr 2 min wurde die Nitrocellulose sorgfältig entfernt, und das Gel wurde in eine Plastikhülle eingepackt und in den Kühlschrank ge stellt. Die Nitrocellulose wurde mit Gold-Gesamtproteinfär bemittel von Biorad dadurch gefärbt, daß es zuerst in 3 × 10 ml 0,1% Tween 20 + 0,5 M NaCl + 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 für ungefähr 45 min und danach in 3 × 10 ml gereinigtem Wasser für 5 min bewegt wurde. Das Goldfärbemittel wurde danach zu gefügt und solange zum Entwickeln stehen gelassen, bis die Banden in den Standardmarkierungen sichtbar wurden. Das Replika-Filter wurde danach mit Wasser gespült, über der Plastikhülle auf das Gel gelegt und sorgfältig an den Ver gleichsmarkierungen ausgerichtet. Die Positionen der Novex- Standardmarker wurden auf der Gelplatte markiert und Linien gezogen, um die Schneidepositionen anzudeuten. Die Nitrocel lulose und die Plastikhülle wurden danach entfernt und das Gel entlang der angezeigten Linien mit einer scharfen Ra sierklinge geschnitten. Die Schnitte wurden über die Proben spuren hinaus verlängert, so daß sie verwendet werden konn ten, um die Positionen der Stückchen zu bestimmen, nachdem das Gel gefärbt wurde. Nachdem die Stückchen entfernt worden waren, wurde das restliche Gel silbergefärbt und die Posi tionen der Standardmarker und die Schnittmarkierungen gemes sen. Die den Schnittpositionen entsprechenden Molekular gewichte wurden ausgehend von den Novex-Standardmarkern be stimmt.

Die zwölf Gelstückchen wurden in die Zellen zweier Biorad Modell 422-Elektroelutionsgeräte eingebracht. 12-14 K Mole kulargewichtsausschlußmembrandeckel wurden in den Zellen verwendet. 50 mM Ammoniumbicarbonat + 0,05% SDS (ungefähr pH 7,8) war der Elutionspuffer. 1 l des Puffers wurde ungefähr 1 Std. in einem 4-6°C-Kühlraum vor der Verwendung gekühlt. Die Gelstückchen wurden bei 10 mA/Zelle (anfangs 40 V) in einem 4-6°C-Kühlraum eluiert. Die Elution dauerte ungefähr 4 Stunden. Die Zellen wurden danach sorgfältig entfernt, und die Flüssigkeit über der Fritte mit einer Pipette abgenom men. Die Elutionskammer wurde entfernt, und jegliche Flüs sigkeit über dem Membrandeckel mit einer Pipette abgenommen. Die Flüssigkeit in dem Membrandeckel wurde mit einer Pipet tierhilfe (Pipetman) entfernt und aufbewahrt. 50 µl-Aliquots gereinigten Wassers wurden danach in den Deckel gegeben, be wegt und solange entfernt, bis alle SDS-Kristalle gelöst wa ren. Diese Waschschritte wurden mit der vorstehend erwähnten aufbewahrten Flüssigkeit vereinigt. Das Gesamtelutionspro benvolumen betrug 300-500 µl pro Gelstückchen. Die Proben wurden in 10 mm Spectrapor 4 12-14 K Ausschluß-Dialyse röhrchen, die mehrere Stunden in gereinigtem Wasser benetzt worden waren, gefüllt. Sie wurden über Nacht bei 4-6°C gegen 600 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS ist ungefähr 4 mM hinsichtlich Kalium) pro 6 Proben dialysiert. Der Puf fer wurde am nächsten Morgen erneuert, und die Dialyse für 2,5 Std. fortgesetzt. Die Proben wurden danach aus den Dia lysetaschen entfernt und in Mikrozentrifugenröhrchen ge füllt. Die Röhrchen wurden für 1 Std. auf Eis gestellt, bei 14K Upm für 3 min mikrozentrifugiert, und die Überstände sorgfältig von dem präzipitierten SDS entfernt. Die Über stände wurden danach für ungefähr eine weitere Stunde auf Eis gestellt und nochmals für 4 min mikrozentrifugiert. Die Überstände wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verdünnt und für den Aktivitätsassay bereitgestellt. Die restlichen Proben wurden bei -70°C eingefroren.

Beispiel 3 Mikrosequenzierung des mpl-Liganden aus Schwein

Die Fraktion 6 (2,6 ml) von der mpl-IgG-Affinitätssäule wurde in einem Microcon-10 (Amicon) konzentriert. Um zu ver hindern, daß der mpl-Ligand an dem Mikrocon absorbiert, wurde die Membran mit 1% SDS gespült, und 5 µl 10% SDS wur den zu der Fraktion 6 zugegeben. Probenpuffer (20 µl) von 2X wurde zu der Fraktion #6 nach der Microcon-Konzentrierung (20 µl) zugegeben, und das gesamte Volumen (40 µl) wurde auf eine einzige Spur eines 4-20%-Gradienten-Acrylamidgel (Novex) geladen. Das Gel wurde gemäß dem Novex-Protokoll laufen gelassen. Das Gel wurde danach vor dem Elektroblotten in 10 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS)-Puf fer, pH 11,0, enthaltend 10% Methanol, für 5 min equili briert. Das Elektroblotten auf Immobilon-PSQ-Membranen (Millipore) wurde für 45 min bei 250 mA konstanter Strom stärke in einer BioRad Trans-Blot-Transferzelle (32) durch geführt. Die PVDF-Membran wurde mit 0,1% Coomassie Blau R- 250 in 40% Methanol, 0,1% Essigsäure für 1 min gefärbt und für 2-3 min mit 10% Essigsäure in 50% Methanol entfärbt. Die einzigen Proteine, die in der 18 000-35 000-Molekulargewichts region des Blots sichtbar wurden, hatten MG von 30 000, 28 000 und 22 000.

Die Banden bei 30, 28 und 22 kDa wurden einer Proteinsequen zierung ausgesetzt. Automatisierte Proteinsequenzierung wurde mit einem Modell 470A Applied Biosystem-Sequenzierge rät, das mit einem on-line PTH-Analysator ausgestattet war, durchgeführt. Das Sequenziergerät wurde so modifiziert, daß 80-90% der Probe injiziert werden konnte (Rodriguez, J. Chromatogr., 350 : 217-225 [1985]). Aceton (ungefähr 12 µl/l) wurde zum Lösungsmittel A zugegeben, um die UV-Absorption auszugleichen. Die elektrogeblotteten Proteine wurden in der Blott-Patrone sequenziert. Die Peaks wurden mit einer Justice Innovation-Software unter Verwendung von Nelson Ana lytical 970 Interfaces integriert. Die Sequenzinterpretation wurde an einer VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404 : 41-52 [1987]) durchgeführt. N-terminale Sequenzen (unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes mit unsicheren Resten in Klammern) und die Menge des erhaltenen Materials (in Klam mern) ist in Tabelle 2′ dargestellt.

Tabelle 2′

Sequenzen des Amino-Terminus vom mpl-Ligand

Beispiel 4 Flüssigsuspensions-Megakaryozytopoese-Assay

Humane periphere Stammzellen (PSC) (von Patienten mit Zu stimmung erhalten) wurden 5-fach mit IMDM-Medium (Gibco) verdünnt und für 15 min bei Raumtemperatur bei 800 × g zen trifugiert. Die Zellpellets wurden in IMDM resuspendiert, auf 60% Percoll (Dichte 1,077 g/ml) (Pharmacia) geschichtet und für 30 min bei 800 × g zentrifugiert. Die mononukleären Zellen niedriger Dichte wurden an der Zwischenphase abge saugt, 2× mit IMDM gewaschen und zu 1-2 × 10⁶ Zellen/ml in IMDM, enthaltend 30% FBS (1 ml Endvolumen) in Gewebekultur schalen mit 24 Vertiefungen (Costar) ausgesät. APP oder vom mpl-Liganden befreites APP wurde zu 10% zugegeben, und die Kulturen wurden für 12-14 Tage in einem befeuchteten Inkuba tor bei 37°C in 5% CO₂ und Luft wachsen gelassen. Die Kultu ren wurden ebenso in der Gegenwart von 10% APP mit 0,5 µg mpl-IgG, zugegeben an den Tagen 0, 2 und 4, wachsen gelas sen. APP wurde vom mpl-Liganden dadurch befreit, daß APP durch eine mpl-IgG-Affinitätssäule geschickt wurde.

Um die Megakaryozytopoese in diesen Flüssigsuspensionskultu ren zu quantifizieren, wurde eine Modifizierung von Solberg et al. verwendet, welche einen radioaktiv markierten Maus- IgG monoklonalen Antikörper (HP1-1D) gegen GPIIbIIIa (zur Verfügung gestellt von Dr. Nichols, Mayo Clinic) benutzt. 100 µg HP1-1D (siehe Grant, B. et al., Blood 69 : 1334-1339 [1987]) wurden mit 1 mCi Na¹²⁵I unter Verwendung von Enzymo beads (Biorad, Richmond, Ca) radioaktiv markiert, wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben. Radioaktiv mar kierter HP1-1D wurde bei -70°C in PBS, enthaltend 0,01% Octyl-Glucosid, gelagert. Typische spezifische Aktivitäten betrugen 1-2 × 10⁶ cpm/µg (<95% durch 12,5% Trichloressig säure präzipitiert).

Die Flüssigsuspensionskulturen wurden dreifach für jeden ex perimentellen Punkt erstellt. Nach 12-14 Tagen in Kultur wurden 1 ml-Kulturen in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen überführt und bei 800 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die resultierenden Zellpellets wurden in 100 µl PBS, enthaltend 0,02% EDTA und 20% Kälberserum, resuspendiert. 10 ng ¹²⁵J-HP1-1D in 50 µl Assaypuffer wurden zu den resuspen dierten Kulturen zugefügt und für 60 min bei Raumtemperatur (RT) bei gelegentlichem Schütteln inkubiert. Daraufhin wur den die Zellen durch Zentrifugation bei 800 × g für 10 min bei Raumtemperatur gesammelt und 2× mit Assaypuffer gewa schen. Die Pellets wurden für 1 min in einem Gammazähler (Packard) gezählt. Nicht-spezifisches Binden wurde dadurch bestimmt, daß 1 µg unmarkierter HP1-1D für 60 min vor der Zugabe des markierten HP1-1D zugegeben wurde. Spezifisches Binden wurde bestimmt als der Wert, der sich dadurch ergibt, daß gesamter ¹²⁵J-HP1-1D gebunden ist, minus dem Wert, der sich dadurch ergibt, daß ¹²⁵J-HP1-1D in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem HP1-1D bindet.

Beispiel 5 Oligonukleotid-PCR-Primer

Auf der Grundlage der von den 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteinen erhaltenen amino-terminalen Aminosäuresequenz wurden degenerierte Oligonukleotide für die Verwendung als Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer (siehe Tabelle 4) entworfen. Zwei Primer-Pools wurden synthetisiert, ein Sinnstrang-20-mer-Pool kodierend für die Aminosäurereste 2-8 (mpl 1) und ein Antisinnstrang-21-mer-Pool, komplementär zu den Sequenzen, die für die Aminosäuren 18-24 (mpl 2) kodie ren.

Tabelle 4

Degenerierte Oligonukleotid-Primer-Pools

Genomische DNA aus Schwein, isoliert aus peripheren Blutlym phozyten des Schweins, wurden als Matrize für die PCR ver wendet. Die 50 µl-Reaktion enthielt: 0,8 µg genomische DNA aus Schwein in 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 100 µg/ml BSA, 400 µM dNTPs, 1 µM von jedem Primer- Pool und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase. Die anfängliche Matrizendenaturierung wurde für 8 min bei 94°C ausgeführt, gefolgt von 35 Zyklen à 45 s bei 94°C, 1 min bei 55°C und 1 min bei 72°C. Den letzten Zyklus ließ man für 10 min bei 72°C extendieren. Die PCR-Produkte wurden durch Elektropho rese in einem 12%-Polyacrylamidgel getrennt und durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Es wurde geschlossen, daß, wenn die aminoterminale Aminosäuresequenz von einem einzelnen Exon kodiert war, das korrekte PCR-Produkte ver mutlich 69 bp lang ist. Ein DNA-Fragment dieser Größe wurde aus dem Gel eluiert und in pGEMT (Promega) subkloniert. Se quenzen von drei Klonen sind nachstehend in der Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

69 bp genomische DNA-Fragmente aus Schwein

Die Position der PCR-Primer ist durch die unterstrichenen Basen angedeutet. Diese Ergebnisse verifizieren die N-termi nale Sequenz, die für die Aminosäuren 9-17 für die 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteine erhalten wurde und zeigten, daß diese Sequenz durch ein einzelnes Exon der Schweine-DNA kodiert ist.

Beispiel 6 Humane mpl-Liganden-Gene

Auf der Grundlage der Ergebnisse von Beispiel 5 wurde ein 45-mer-Desoxyoligonukleotid, genannt pR45, entworfen und synthetisiert, um eine genomische Bank zu durchmustern. Das 45-mer hatte die folgende Sequenz:

5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3′
(SEQ ID NO: 28)

Dieses Oligonukleotid wurde mit (γ³²P)-ATP und T4-Kinase ³²P- markiert und verwendet, um eine humane, genomische DNA-Bank in λgem12 unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen nied riger Stringenz (siehe Beispiel 7) zu durchmustern. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt und durch Restrik tionskartierung und Southern-Blotting analysiert. Klon #4 wurde für eine zusätzliche Analyse ausgewählt.

Ein 2,8 kb BamHI-XbaI-Fragment, das an das 45-mer hybridi sierte, wurde in pBlueskript SK- subkloniert. Teilweise DNA- Sequenzierung dieses Klons wurde unter Verwendung von Oligo nukleotiden, die spezifisch für die Schweine-mpl-Ligand-DNA- Sequenz sind, als Primer durchgeführt. Die erhaltene Sequenz bestätigte, daß DNA, die für den humanen homologen mpl- Liganden des mpl-Liganden aus Schwein kodiert, isoliert wor den ist. Eine EcoRI-Restriktionsstelle wurde in der Sequenz entdeckt, die uns erlaubte, ein 390 bp EcoRI-XbaI-Fragment von dem 2,8 kb BamHI-XbaI zu isolieren und dieses in pBlues kript SK- subzuklonieren.

Beide Stränge dieses Fragments wurden sequenziert. Die hu mane DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 9 gezeigt (SEQ ID NO: 3 & 4). Die vorausgesagten Po sitionen von Introns in der genomischen Sequenz sind durch Pfeile angedeutet und definieren ein mutmaßliches Exon ("Exon 3").

Das Studium der vorausgesagten Aminosäuresequenz bestätigt, daß ein Serinrest die erste Aminosäure des reifen mpl-Ligan den ist, wie durch direkte Aminosäureanalyse bestimmt wurde. Unmittelbar stromaufwärts von diesem Codon läßt die voraus gesagte Aminosäuresequenz stark eine Signalsequenz vermuten, die bei der Sezernierung des reifen mpl-Liganden eine Rolle spielt. Diese für eine Signalsequenz kodierende Region ist wahrscheinlich an der Nukleotidposition 68 durch ein Intron unterbrochen.

In der 3′-Richtung scheint das Exon am Nukleotid 196 zu en den. Dieses Exon kodiert daher für eine Sequenz von 42 Ami nosäuren, wovon 16 wahrscheinlich Teil einer Signalsequenz und 26 Teil des reifen humanen mpl-Liganden sind.

Beispiel 7 Humane mpl-Ligand-cDNA voller Länge

Auf der Grundlage der humanen "Exon 3"-Sequenz (Beispiel 6) wurden zwei nicht-degenerierte Oligonukleotide, die den 3′- und 5′-Enden der "Exon 3"-Sequenz entsprechen, synthetisiert (Tabelle 6).

Tabelle 6

Nicht-degenerierte PCR-Oligonukleotid-Primer für humane cDNA

Diese zwei Primer wurden in PCR-Reaktionen verwendet, worin als Matrize DNA von verschiedenen humanen cDNA-Banken oder 1 ng Quick Clone cDNA (Clonetech) von verschiedenen Geweben unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen verwendet wurde. Die erwartete Größe des korrekten PCR-Pro dukts war 140 bp. Nach der Analyse der PCR-Produkte in einem 12% Polyacrylamidgel wurde ein DNA-Fragment der erwarteten Größe in cDNA-Banken entdeckt, die ausgehend von adulter Niere und 293-fötale Nierenzellen hergestellt worden war und cDNA, die ausgehend von humaner fötaler Leben (Clonetech Ka talog-Nr. 7171-1) hergestellt worden war.

Eine cDNA-Bank aus fötaler Leber in λ DR2 (Clonetech Kata log-Nr. HL1151x) wurde mit demselben 45-mer Oligonukleotid durchmustert, welches verwendet worden war, um die humane genomische Bank zu durchmustern. Das Oligonukleotid wurde mit (γ³²P)-ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase markiert. Die Bank wurde unter Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchmustert. Die Filter wurden für 2 Std. vorhybridisiert, danach mit der Probe über Nacht bei 42°C in 20% Formamid, 5×SSC, 10×Denhardt′s, 0,05M Natrium phosphat (pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 µg/ml be schallte Lachsspermien-DNA für 16 Std. hybridisiert. Die Filter wurden danach in 2×SSC gespült und daraufhin einmal in 0,5×SSC, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Die Filter wurden über Nacht einem Kodak Röntgenfilm exponiert. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt, und die Insert-Größe wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die die BamHI-XbaI-Klonierungsstelle in λ DR2 (Clonetech Katalog Nr. 6475-1) flankieren, bestimmt. 5 µl Phagen-Stammlösung wurden als Matrizenquelle verwendet. Die anfängliche Denatu rierung wurde für 7 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen (1 min bei 94°C, 1 min bei 52°C und 1,5 min bei 72°C). Die letzte Extension wurde für 15 min bei 72°C durchgeführt. Klon Nr. FL2b besaß ein 1,8 kb-Insert und wurde für die weitere Analyse ausgewählt.

Das Plasmid pDR2 (Clonetech, λDR2 & pDR2 Cloning and Expres sion System Library Protocol Handbook, S. 42), enthalten in nerhalb der λDR2-Phagenarme, wurde gewonnen (rescued) wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben ist (Clonetech, λDR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, S. 29-30). Die Restriktionsana lyse des Plasmids pDR2-FL2b mit BamHI und XbaI wies auf die Gegenwart einer internen BamHI-Restriktionsstelle ungefähr an der Position 650 in dem Insert hin. Der Verdau des Plas mids mit BamHI-XbaI schnitt das Insert in zwei Fragmente, eines von 0,65 kb und eines von 1,15 kb. Die DNA-Sequenz wurde mit drei verschiedenen Klassen an Matrizen bestimmt, die von dem Plasmid pDR2-FL2b stammten. Die DNA-Sequenzie rung der doppelsträngigen Plasmid-DNA wurde ausgeführt mit dem ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, California) au tomatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät unter Verwen dung des Standardprotokolls für Farbstoff-markierte Di desoxynukleosidtriphosphat-Terminatoren (Farbstoff-Termina toren) und üblichen synthetisierten walking-Primer (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature, 321 : 674-679 [1986]). Direkte Sequen zierung der ausgehend von dem Plasmid amplifizierten Frag mente der Polymerasekettenreaktion wurden mittels des ABI373-Sequenziergeräts unter Verwendung von üblichen Pri mern und Farbstoff-Terminatorreaktionen durchgeführt. Die einzelsträngige Matrize wurde mit dem M13-Janus-Vektor (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21 : 3385-3390 [1993]). BamHI-XbaI (1,15 kb) und BamHI (0,65 kb)-Fragmente wurden ausgehend vom Plasmid pDR2- FL2b isoliert, die Enden mit T4-DNA-Polymerase in der Gegen wart von Desoxynukleotiden aufgefüllt und danach in die SmaI-Stelle des M13-Janus subkloniert. Die Sequenzierung wurde mittels Standardprotokolle für Farbstoff-markierte M13 Universal- und reverse Primer oder walking-Primer und Farb stoff-Terminatoren ausgeführt. Manuelle Sequenzierungsreak tionen wurden an Einzelstrang-M13-DNA unter Verwendung von walking-Primer und Standard-Didesoxy-Abbruchchemie (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (1977)), ³³P-markiertem α-dATP und Sequenase (United States Biochemi cal Corp., Cleveland, Ohio) durchgeführt. Der DNA-Sequenz zusammenbau wurde durchgeführt mittels Sequencher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Die Nukleo tid- und abgeleiteten Sequenzen des hML sind in Fig. 1 be reitgestellt (SEQ ID NO: 1).

Beispiel 8 Isolierung des humanen mpl-Ligand (TPO)-Gens

Humane genomische DNA-Klone des TPO-Gens wurden durch Durch mustern einer humanen genomischen Bank in λ-Gem12 mit pR45, einer vorstehend beschriebenen Oligonukleotid-Probe, unter Bedingungen niedriger Stringenz (siehe Beispiel 7) oder un ter Bedingungen hoher Stringenz mit einem Fragment, welches der 3′-Hälfte der für den mpl-Liganden (von der BamHI-Stelle zum 3′-Ende) kodierenden humanen cDNA isoliert. Zwei über lappende λ-Klone, die 35 kb überspannen, wurden isoliert. Zwei überlappende Fragmente (BamHI und EcoRI), die das ge samte TPO-Gen enthalten, wurden subkloniert und sequenziert. Die Struktur des humanen Gens ist aufgebaut aus 6 Exons in nerhalb von 7 kb genomischer DNA (Fig. 14A, B und C). Die Umgebungen aller Exon/Intron-Verknüpfungen sind vereinbar mit dem für Säuger-Gene aufgestellten Konsensusmotiv (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15 : 7155 (1987)). Das Exon 1 und Exon 2 enthalten eine 5′-nicht-translatierte Sequenz und die ersten vier Aminosäuren des Signalpeptids. Der Rest des Sezernierungssignals und die ersten 26 Ami nosäuren des reifen Proteins sind innerhalb des Exons 3 ko diert. Die gesamte Carboxyl-Domäne und sowohl die 3′-nicht translatierte als auch ungefähr 50 Aminosäuren der Erythro poietin-ähnlichen Domäne sind innerhalb des Exons 6 kodiert. Die vier Aminosäuren, die in die Deletion verwickelt sind, welche innerhalb des hML-2 (hTPO-2) beobachtet wurde, sind am 5′-Ende des Exons 6 kodiert.

Beispiel 9 Transiente Expression des humanen mpl-Liganden (hML)

Um das Insert der vollen Länge, das in pDR2-FL2b enthalten ist, subzuklonieren, wurde das Plasmid vollständig mit XbaI, danach partiell mit BamHI verdaut. Ein DNA-Fragment, welches dem 1,8 kb-Insert entspricht, wurde Gel-gereinigt und in pRK5 (pRK5-hmpl I) (siehe U.S.-PS 5,258,287 hinsichtlich der Konstruktion von pRK5) unter der Kontrolle des immediate early-Promotors des Zytomegalovirus subkloniert. DNA des Konstrukts pRK5-hmpl I wurde mittels der PEG-Methode herge stellt und in humane embryonale Nieren-293-Zellen, die in Dulbecco′s modifiziertem Eagle′s-Medium (DMEM), ergänzt mit F-12 Nährstoffmischung, 20 mM Hepes (pH 7,4) und 10% fötalem Rinderserum, gehalten wurden, transfiziert. Die Zellen wur den durch die Calciumphosphat-Methode wie beschrieben trans fiziert (Gorman, C. (1985) in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., Hrsg.) Bd. II, S. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). 36 Std. nach der Transfektion wurde der Überstand der transfizierten Zellen auf die Akti vität in dem Proliferationsassay (siehe Beispiel 1) gete stet. Der Überstand der nur mit dem pRK-Vektor transfizier ten 293-Zellen ergab keine Stimulierung der Ba/F3- oder Ba/F3-mpl-Zellen (Fig. 12A). Der Überstand der mit dem pRK5- hmpl I transfizierten Zellen hatte keine Wirkung auf die Ba/F3-Zellen, stimuliert jedoch dramatisch die Proliferation der Ba/F3-mpl-Zellen (Fig. 12A), was zeigt, daß diese cDNA für einen funktionell aktiven humanen mpl-Liganden kodiert.

Beispiel 10 Humane mpl-Ligand-Isoformen hML2, hML3 und hML4

Um alternativ gespleißte Formen des hML zu identifizieren, wurden Primer synthetisiert, die jedem Ende der kodierenden Sequenz von hML entsprechen. Diese Primer wurden in der RT- PCR verwendet, um humane RNA aus adulter Leber zu amplifi zieren. Zusätzlich wurden interne Primer, die ausgewählte Bereiche von Interesse (siehe nachstehend) flankieren, kon struiert und ähnlich verwendet. Die direkte Sequenzierung der Enden des PCR-Produkts ließ eine einzige Sequenz erken nen, die exakt derjenigen Sequenz der cDNA, die aus der hu manen Bank aus fötaler Leber isoliert worden war, entsprach (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). Jedoch wies eine Region in der Nähe des C-Terminus der EPO-Domäne (in der Mitte des PCR-Produkts) ein komplexes Sequenzmuster auf, was die Exi stenz von möglichen Spleißvarianten in dieser Region andeu tet. Um diese Spleißvarianten zu isolieren, wurden die Pri mer, die in Tabelle 7 bereitgestellt sind und den interes sierenden Bereich flankieren, in einer PCR als Matrizen für humane cDNA aus adulter Leber verwendet.

Tabelle 7

PCR-Primer für humane ML-Isoform

Die PCR-Produkte wurden mit glatten Enden in M13 subklo niert. Die Sequenzierung von einzelnen Subklonen eröffnete die Existenz von wenigstens drei ML-Isoformen. Eine von die sen, hML (auch bezeichnet als hML₃₃₂), ist die längste Form und entspricht exakt der Sequenz, die aus der Bank der föta len Leber isoliert worden ist. Die Sequenzen der vier huma nen mpl-Ligand-Isoformen, aufgelistet ausgehend von der längsten (hML) zur kürzesten (hML-4) Isoform, sind in Fig. 11 bereitgestellt (Fig. 11 [SEQ ID NO: 6, 8, 9 & 10]).

Beispiel 11 Konstruktion und transiente Expression der humanen mpl- Ligand-Isoformen und Substitutions-Varianten hML2, hML3 und hML(R153A, R154A)

Die Isoformen hML2 und hML3 und die Substitutions-Variante hML(R153A, R154A) wurden ausgehend von hML unter Verwendung der von Russell Higuchi, in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Hrsg. beschriebenen re kombinanten PCR-Technik rekonstitioniert.

In allen Konstrukten sind die verwendeten "outside"-Primer in Tabelle 8 und die "überlappenden" Primer in Tabelle 9 ge zeigt.

Tabelle 8

Outside-Primer

Tabelle 9

Überlappende Primer

Alle PCR-Amplifikationen wurden mit klonierter Pfu-DNA-Poly merase (Stratagene) unter Verwendung der folgenden Bedingun gen durchgeführt: Die anfängliche Matrizendenaturierung wurde für 7 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 1,5 min bei 72°C. Den letzten Zyklus ließ man für 10 min bei 72°C extendieren. Das letztendliche PCR-Produkt wurde mit ClaI-XbaI verdaut, Gel gereinigt und in pRK5tkneo kloniert. 293-Zellen wurden mit den verschiedenen Konstrukten wie vorstehend beschrieben transfiziert, und der Überstand wurde unter Anwendung des Ba7F3-mpl-Proliferationsassays untersucht. hML-2 und hML-3 zeigten keine nachweisbare Aktivität in diesem Assay, jedoch war die Aktivität von hML(R153A, R154A) ähnlich zu hML, was zeigt, daß die Prozessierung an dieser di-basischen Stelle nicht für die Aktivität benötigt wird (siehe Fig. 13).

Beispiel 12 Maus-mpl-Ligand-cDNA mML, mML-2 und mML-3 Isolierung der mML-cDNA

Ein DNA-Fragment, das der gesamten kodierenden Region des humanen mpl-Liganden entspricht, wurde durch PCR erhalten, Gel-gereinigt und durch "random priming" in der Gegenwart von ³²P-dATP und ³²P-dCTP markiert. Diese Probe wurde verwen det, um 10⁶ Klone einer cDNA-Bank aus Mäuseleber in λGT10 (Clontech Katalog-Nr. ML3001a) zu durchmustern. Filterdupli kate wurden in 35% Formamid, 5×SSC, 10×Denhardt′s, 0,1% SDS, 0,05M Natriumphosphat (pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 100 µg/ml beschallte Lachsspermien-DNA über Nacht in der Ge genwart der Probe hybridisiert. Die Filter wurden in 2×SSC gespült und danach einmal in 0,5×SSC, 0,1% SDS bei 42°C ge waschen. Der hybridisierende Phage wurde Plaque-gereinigt, und die cDNA-Inserts wurden in die EcoR1-Stelle des Bluescript SK- Plasmids subkloniert. Der Klon "LD" mit einem 1,5 kb Insert wurde für die weitere Analyse gewählt, und beide Stränge wurden wie vorstehend für die humane ML-cDNA beschrieben sequenziert. Die Nukleotid- und abgeleitete Ami nosäuresequenz von Klon LD sind in Fig. 14 (SEQ ID NO: 1 & 11) bereitgestellt. Die abgeleitete reife ML-Sequenz von diesem Klon war 331 Aminosäurereste lang und wurde als mML₃₃₁ (oder aus den nachstehend beschriebenen Gründen mML-2) be zeichnet. Beträchtliche Identität sowohl hinsichtlich der Nukleotid- als auch der abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden in den EPO-ähnlichen Domänen dieser ML′s beobachtet. Nachdem jedoch die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der hu manen und Maus-ML′s zueinander ausgerichtet worden waren, schien die Maussequenz eine Tetrapeptid-Deletion zwischen den humanen Resten 111 bis 114 zu besitzen, die der 12 Nukleotide langen Deletion entspricht, die auf die Nukleo tidposition 618 folgt und in sowohl den humanen (siehe oben) und Schwein (siehe unten)-cDNA′s gesehen wurde. Dementspre chend wurden zusätzliche Klone untersucht, um mögliche Maus- ML-Isoformen zu entdecken. Ein Klon, "L7", besaß ein 1,4 kb- Insert mit einer abgeleiteten Sequenz von 335 Aminosäuren, welche das "fehlende" Tetrapeptid LPLQ enthält. Diese Form ist vermutlich der Maus-ML voller Länge und wird als mML oder mML₃₃₅ bezeichnet. Die Nukleotid- und abgeleitete Ami nosäuresequenz für mML sind in Fig. 16 (SEQ ID NO: 12 & 13) bereitgestellt. Letztendlich wurde der Klon "L2" isoliert und sequenziert. Dieser Klon besaß die dem hML3 entspre chende 116 Nukleotide lange Deletion und wird daher mML-3 genannt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser zwei Isoformen ist in Fig. 16 gezeigt.

Expression des rekombinanten mML

Expressionsvektoren für Maus-ML wurden im wesentlichen wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Für mML und mML-2 ko dierende Klone wurden in pRK5tkneo, einem Säuger-Expressi onsvektor, der eine Expression unter der Kontrolle des CMV- Promotors und einem SV40-Polyadenylierungssignal ermöglicht, subkloniert. Die resultierenden Expressionsvektoren, mMLpRKtkneo und mML2pRKtkneo, wurden unter Anwendung der Calciumphosphat-Methode transient in 293-Zellen transfi ziert. Nach der transienten Transfektion wurde das Medium für 5 Tage konditioniert. Die Zellen wurden in DMEM-Medien mit hoher Glukosekonzentration, ergänzt mit 10% fötalem Käl berserum, gehalten.

Expression von Maus-mpl (mmpl) in Ba/F3-Zellen

Stabile c-mpl exprimierende Zellinien wurden durch Transfek tion von mmpl pRKtkneo erhalten, im wesentlichen wie für hu manen mpl in Beispiel 1 beschrieben. Ein die gesamte kodie rende Sequenz des Maus-mpl (Skoda, R.C., et al., EMBO J. 12 : 2645-2653 (1993)) enthaltender Expressionsvektor (20 µg; linearisiert) wurde durch Elektroporation (5 × 10⁶ Zellen, 250 Volt, 960 µF) in Ba/F3-Zellen transfiziert, worauf eine Selektion auf Neomycinresistenz mit 2 mg/ml G418 folgte. Die Expression von mpl wurde durch Durchflußzytometrie-Analyse unter Verwendung von Kaninchen-anti-Maus-mpl-IgG-Antiseren bestimmt. Die Ba/F3-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium von WEHI -3B-Zellen als Quelle für IL-3 gehalten. Die Überstände von mit sowohl mML als auch mML-2 transient transfizierten 293-Zellen wurden in mit sowohl mmpl als auch hmpl transfi zierten BaF3-Zellen untersucht, wie in Beispiel 1 beschrie ben.

Beispiel 13 mpl-Ligand-cDNA vom Schwein pML und pML-2

Schweine-ML (pML)-cDNA wurde durch RACE PCR isoliert. Ein Oligo-dT-Primer und zwei spezifische Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz des Exons des für den Amino-Terminus des vom aplastischen Schweineserum isolierten ML kodierenden Schweine-ML-Gens entworfen. Ausgehend von verschiedenen aplastischen Schweinegeweben hergestellte cDNA wurde erhal ten und amplifiziert. Ein PCR-cDNA-Produkt von 1342 bp wurde in Niere gefunden und subkloniert. Mehrere Klone wurden se quenziert, und es wurde gefunden, daß diese für den reifen Schweine-mpl-Liganden (nicht ein vollständiges Sezernie rungssignal umfassend) kodieren. Es wurde gefunden, daß die cDNA für ein reifes Protein aus 332 Aminosäuren (pML₃₃₂) mit der in Fig. 18 (SEQ ID NO: 9 & 16) gezeigten Sequenz ko diert.

Verfahren Isolierung des pML-Gens und cDNA

Genomische Klone des Schweine-ML-Gens wurden dadurch iso liert, daß eine genomische Bank vom Schwein in EMBL3 (Clontech Inc.) mit pR 45 durchmustert wurde. Die Bank wurde im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben durchmustert. Mehrere Klone wurden isoliert, und das Exon, welches für die Aminosäuresequenz kodiert, die identisch zu derjenigen ist, die ausgehend von gereinigtem ML erhalten wurde, sequen ziert. Schweine-ML-cDNA wurde unter Anwendung einer Modifi zierung des RACE PCR-Protokolls erhalten. Zwei spezifische ML-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz des Schweine- ML-Gens entworfen. Polyadenylierte mRNA wurde aus der Niere aplastischer Schweine im wesentlichen wie vorstehend be schrieben isoliert. Die cDNA wurde durch reverse Transkrip tion mit dem BamdT-Primer

(BamdT: 5′GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3′)
(SEQ ID NO: 55)

der gegen den Polyadenosin-Schwanz der mRNA gerichtet ist, hergestellt. Eine anfängliche Runde der PCR-Amplifikation (28 Zyklen von 95°C für 60 Sekunden, 58°C für 60 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden) wurde unter Verwendung des ML-spe zifischen h-Vorwärts-1-Primers

(h-forward-1: 5′GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3′)
(SEQ ID NO: 43)

und dem BAMAD-Primer

(BAMAD: 5′GACTCGAGGATCCATCG3′)
(SEQ ID NO: 56)

in einer 100 ml-Reaktion (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl, 10 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM dNTPs mit 0,05 U/ml Amplitaq-Polymerase [Perkin Elmer Inc.]) durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde da nach mit Cla1 verdaut, mit Phenol-Chloroform (1 : 1) extra hiert, Ethanol-präzipitiert und zu 0,1 mg Bluescript SK- Vektor (Stratagene Inc.), der mit Cla1 und Kpn1 geschnitten worden war, ligiert. Nach zweistündiger Inkubation bei Raum temperatur wurde ein Viertel der Ligierungsmischung direkt zu einer zweiten PCR-Runde (22 Zyklen, wie vorstehend be schrieben) unter Verwendung eines zweiten ML-spezifischen Vorwärts-1-Primers

(forward-1: 5′GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG3′)
(SEQ ID NO: 57)

und T3-21 (ein Oligonukleotid, das an eine Sequenz bindet, die benachbart zu der multiplen Klonierungsregion innerhalb des Bluescript SK-Vektors liegt)

(5′CGAAATTAACCCTCACTAAAG3′)
(SEQ ID NO: 58).

zugefügt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Xba1 und Cla1 verdaut und in Bluescript SK- subkloniert. Mehrere Klone aus unabhängigen PCR-Reaktionen wurden sequenziert.

Wiederum wurde ein zweite Form, die pML-2 bezeichnet wurde, identifiziert, welche für ein Protein mit einer 4 Aminosäu rereste langen Deletion (328 Aminosäurereste) kodiert (siehe Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). Ein Vergleich der pML- und pML-2- Aminosäuresequenzen zeigt, daß die letztere Form identisch ist, mit der Ausnahme, daß das Tetrapeptid QLPP, welches den Resten 111-114 einschließlich entspricht, deletiert worden ist (siehe Fig. 22 [SEQ ID NO: 18 & 21]). Die vier Aminosäu ren lange Deletion, die in Maus-, humaner und Schweine-ML- cDNA beobachtet wurde, kommt an genau derselben Position in nerhalb der vorausgesagten Proteine vor.

Beispiel 14 CMK-Assay für Thrombopoietin (TPO)-Induktion von Blutplätt chen-Antigen GPII_bIII_a Expression

Die CMK-Zellen werden in RMPI 1640-Medium (Sigma), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 10 mM Glutamin, gehalten. Zur Vorbereitung des Assays werden die Zellen geerntet, ge waschen und zu 5×10⁵ Zellen/ml in Serum-freien GIF-Medium, ergänzt mit 5 mg/l Rinderinsulin, 10 mg/l Apo-Transferrin, 1 X Spurenelemente, resuspendiert. In eine Gewebekulturplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen werden die TPO-Stan dard- oder Experiment-Proben in geeigneten Verdünnungen in 100 µl-Volumina in jede Vertiefung zugefügt. 100 µl der CMK- Zellsuspension wird in jede Vertiefung zugefügt, und die Ge webekulturplatten werden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator für 48 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten bei 1000 Upm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, und 100 µl des FITC-konju gierten GPIIbIIIa-monoklonalen 2D2-Antikörpers werden in jede Vertiefung zugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei 4°C werden die Platten wiederum bei 1000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Die nicht-gebundene Antikörper enthaltenden Überstände werden verworfen, und 200 µl 0,1% BSA-PBS- Waschlösung wird zu jeder Vertiefung zugefügt. Der Wasch schritt mit 0,1% BSA-PBS wird dreimal wiederholt. Die Zellen werden danach in einem FASCAN unter Anwendung einer Stan dard-Ein-Parameter-Analyse analysiert, wobei die relative Fluoreszenzintensität gemessen wird.

Beispiel 15 DAMI-Assay für Thrombopoietin (TPO) durch Messen der endo mitotischen Aktivität von DAMI-Zellen in 96-Loch-Mikrotiter platten

DAMI-Zellen werden in IMDM + 10% Pferdeserum (Gibco), er gänzt mit 10 mM Glutamin, 100 ng/ml Penicillin G und 50 µg/ml Streptomycin, gehalten. Zur Vorbereitung des Assays werden die Zellen geerntet, gewaschen und zu 1×10⁶ Zellen/ml in IMDM + 1% Pferdeserum resuspendiert. In einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Rundböden werden 100 µl der TPO-Stan dard- oder Experiment-Proben zu der DAMI-Zellsuspension zu gefügt. Die Zellen werden danach für 48 Stunden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten in einer Sorvall 6000B-Zentrifuge bei 1000 Upm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, und der Waschschritt mit 200 µl PBS-0,1% BSA wird wiederholt. Die Zellen werden durch die Zugabe von 200 µl eiskaltem 70% Ethanol-PBS fixiert und durch Saugen resuspen diert. Nach 15-minütiger Inkubation bei 4°C werden die Plat ten bei 2000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert und 150 µl 1 mg/ml RNAse, enthalten 0,1 mg/ml Propidiumiodid und 0,05% Tween-20, werden in jede Vertiefung zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C werden die Veränderungen hinsichtlich des DNA-Gehalts durch Durchflußzytometrie ge messen. Polyploidie wird wie folgt gemessen und quantifi ziert:

Beispiel 16 Thrombopoietin (TPO) in vivo-Assay (Maus-Blutplättchen-Rebound-Assay) In vivo-Assay für ³⁵S-Bestimmung der Blutplättchenproduktion

C57BL6-Mäuse (erhalten von Charles River) werden intraperi toneal (IP) mit 1 ml Ziege-Anti-Maus-Blutplättchen-Serum (6 amps) am Tag 1 injiziert, um Thrombozytopenie zu erzeugen. An den Tagen 5 und 6 werden den Mäusen zwei IP-Injektionen des Faktors oder PBS als Kontrolle verabreicht. Am Tag 7 werden 30 µCi Na₂³⁵SO₄ in 0,1 ml Kochsalzlösung intravenös injiziert, und der Prozentsatz des ³⁵S-Einbaus der injizier ten Dosis in zirkulierende Blutplättchen wird in den von den behandelten und Kontrollmäusen erhaltenen Blutproben gemes sen. Die Blutplättchenzählungen und Leukozytenzählungen wer den zur selben Zeit in Blut durchgeführt, das von dem retro orbitalen Sinus erhalten wurde.

Beispiel 17 KIRA ELISA für Thrombopoietin (TPO) durch Messen der Phos phorylierung des chimären mpl-Rse.gD-Rezeptors

Der humane mpl-Rezeptor ist von Vigon et al., PNAS, USA 89 : 5640-5644 (1992) beschrieben worden. Ein chimärer Rezep tor, der die extrazelluläre Domäne (ECD) des mpl-Rezeptors und die Transmembran (TM)- und intrazelluläre Domäne (ICD) des Rse (Mark et al, J. of Biol. Chem. 269(14):10 720-10 728 [1994]) mit einem Carboxyl-terminalen Polypeptidanhang (flag polypeptide) (d. h. Rse.gD) umfaßt, wurde für eine Verwendung in dem hierin beschriebenen KIRA ELISA hergestellt. Siehe Fig. 30 und 31 hinsichtlich einer diagrammartigen Beschrei bung des Assays.

(a) Präparation des Abfang-Agens

Monoklonaler Anti-gD (Klon 5B6) wurde gegen ein Peptid des Glycoproteins D von Herpes simplex-Virus (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553[1990]) hergestellt. Die ge reinigte Stammpräparation wurde auf 3,0 mg/ml in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 eingestellt, und 1,0 ml-Aliquots wurden bei -20°C gelagert.

(b) Präparation des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers

Monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Klon 4G10, wurde von UBI (Lake Placid, NY) bezogen und unter Verwendung von langarmigem Biotin-N-Hydroxysuccinamid (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH) biotinyliert.

(c) Ligand

Der mpl-Ligand wurde durch die hierin beschriebenen rekombi nanten Techniken hergestellt. Der gereinigte mpl-Ligand wurde bei 4°C als Stammlösung gelagert.

(d) Präparation der Rse.gD-Nukleinsäure

Synthetische doppelsträngige Oligonukleotide wurden verwen det, um die kodierende Sequenz für die C-terminalen 10 Ami nosäuren (880-890) des humanen Rse zu rekonstitutionieren und zusätzliche 21 Aminosäuren, die ein Epitop für den Anti körper 5B6 und ein Stopcodon enthalten, zuzufügen. Die Ta belle 10 stellt die Endsequenz des synthetischen Teils des Fusiongens dar.

Tabelle 10

Synthetischer doppelsträngiger Teil des humanen Rse-Fusion- Gens

Die synthetische DNA wurde ligiert mit der für die Aminosäu ren 1-880 des humanen Rse kodierenden cDNA an der Pst1- Stelle, beginnend am Nukleotid 2644 der publizierten cDNA- Sequenz des humanen Rse (Mark et al, Journal of Biological Chemistry 269(14):10 720-10 728 [1994]), und den HindIII-Stel len in dem Polylinker des Expressionsvektors pSV17.ID.LL (siehe Fig. 32A-L; SEQ ID NO:22), um das Expressionsplasmid pSV.ID.Rse.gD zu erzeugen. Das Expressionsplasmid umfaßt ein dicistronisches primäres Transkript, welches die für den DHFR kodierende Sequenz enthält, die von 5′-Spleißdonor- und 3′-Spleißakzeptor-Intronspleißstellen umgeben ist, gefolgt von der Sequenz, die für den Rse.gD kodiert. Die Boten-RNA der vollen Länge (nicht gespleißt), enthält DHFR als erstes offenes Leseraster und erzeugt daher ein DHFR-Protein, wo durch stabile Transformanten selektiert werden können.

(e) Präparation der mpl-Rse.gD-Nukleinsäure

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Expressionsplas mid pSV.ID.Rse.gD wurde modifiziert, um das Plasmid pSV.ID.M.tmRd6 herzustellen, das die kodierende Sequenz der ECD des humanen mpl (Aminosäuren 1-491) fusioniert an die Transmembrandomäne und die intrazelluläre Domäne des Rse.gD (Aminosäuren 429-911), enthielt. Synthetische Oligonukleo tide wurden verwendet, um die kodierende Sequenz eines Teils der extrazellulären Domäne des humanen mpl an einen Teil der für Rse kodierenden Sequenz in einer zweistufigen PCR-Klo nierungsreaktion zu knüpfen, wie beschrieben von Mark et.al., J.Biol. Chem. 267 : 26 166-26 171 (1992). Die für die erste PCR-Reaktion verwendeten Primer waren M1

(5′-TCTCGCTACCGTTTACAG-3′)
(SEQ ID NO: 61)

und M2

(5′-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3′)
(SEQ ID NO: 62)

mit einer mpl-cDNA-Matrize und R1

(5′-GGGCCATGACACTGTCAA-3′)
(SEQ ID NO: 63)

und R2

(5′-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3′)
(SEQ ID NO: 64)

mit einer Rse-cDNA-Matrize. Der PvuII-SmaI-Teil dieser Fusi onsverbindung wurde für die Konstruktion des chimären Rezep tors voller Länge verwendet.

(f) Zelltransformation

DP12.CHO-Zellen (EP 307247, veröffentlicht am 15. März 1989) wurden durch Elektroporation mit pSV.ID.M.tmRd6, welcher an einer einzigen NotI-Stelle in dem Plasmidteil linearisiert worden war, transformiert. Die DNA wurde nach einer Phe nol/Chloroform-Extraktion Ethanol-präzipitiert und in 20 µl 1/10 Tris EDTA resuspendiert. Danach wurden 10 µg DNA mit 10⁷ CHO DP12-Zellen in 1 ml PBS vor der Elektroporation bei 400 Volt und 330 µf für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden für 10 Minuten zurück zum Eis gebracht, bevor sie in nicht-selektives Medium ausgesät wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in Nukleosid-freiem Medium inku biert, um auf stabile DHFR+ Klone zu selektieren.

(g) Selektion der transformierten Zellen für die Verwendung in dem KIRA ELISA

Mpl/Rse.gD exprimierende Klone wurden durch Western-Blotting der Gesamtzellysate nach Fraktionierung durch SDS-PAGE unter Verwendung des Antikörpers 5B6, welcher das gD-Epitop-tag erkennt, identifiziert.

(h) Medien

Die Zellen wurden in F12/DMEM 50 : 50 (Gibco/BRL, Life Techno logies, Grand Island, NY) kultiviert. Die Medien wurden er gänzt mit 10% diafiltiertem FBS (HyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin.

(i) KIRA ELISA

Mit mpl-Rse.gD transformierte DP12CHO-Zellen wurden in den Vertiefungen einer Kulturplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen in 100 µl Medium ausgesät (3×10⁴ pro Vertie fung) und über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Am fol genden Morgen wurden die Überstände in den Vertiefungen de kantiert, und die Platten leicht auf einem Papierhandtuch abgeklopft. 50 µl Medium, enthaltend entweder die Experi mentproben oder 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 oder 0 ng/ml mpl-Ligand, wurden danach zu jeder Vertiefung zuge geben. Die Zellen wurden bei 37°C für 30 Minuten stimuliert, die Überstände in den Vertiefungen wurden dekantiert und die Platten noch einmal leicht auf einem Papierhandtuch abge klopft. Um die Zellen zu lysieren und die chimären Rezepto ren in Lösung zu bringen, wurden 100 µl Lysepuffer zu jeder Vertiefung zugefügt. Der Lysepuffer bestand aus 150 mM NaCl, enthaltend 50 mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% Thimerosal, 30 KIU/ml Aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid hydrochlorid (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 µM Leupeptin (ICN Biochemicals) und 2 mM Natrium Orthovanadat (Na₃VO₄; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. Die Platte wurde danach auf einem Plattenschüttler (Bellco Instruments, Vineland, NJ) für 60 Minuten bei Raumtemperatur sanft bewegt.

Während die Zellen in Lösung gingen, wurde eine ELISA-Mikro titerplatte (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dänemark), die über Nacht bei 4°C mit dem monoklonalen Anti-gD-Antikörper 5B6 (5,0 µg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, 100 µl/Vertiefung) beschichtet worden war, dekantiert, auf einem Papierhandtuch abgeklopft und mit 150 µl/Vertiefung Blockie rungspuffer [PBS, enthaltend 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) und 0,01% Thimerosal] für 60 Minuten bei Raum temperatur mit sanfter Bewegung abgesättigt (blockiert). Nach 60 Minuten wurde die mit Anti-gD 5B6 beschichtete Platte 6mal mit Waschpuffer (PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 und 0,01% Thimerosal) unter Verwendung eines automatisierten Plattenwaschgeräts (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA) gewaschen.

Das Lysat, welches solubilisierten MPL/Rse.gD von den Zell kultur-Mikrotitervertiefungen enthielt, wurde in mit Anti-gD 5B6 beschichtete und abgesättigte ELISA-Vertiefungen trans feriert (85 µl/Vertiefung) und für 2 Stunden bei Raumtempe ratur mit sanfter Bewegung inkubiert. Ungebundener mpl- Rse.gD wurde durch Waschen mit Waschpuffer entfernt, und 100 µl biotinylierter 4G10 (Anti-Phosphotyrosin), 1 : 18 000 in Verdünnungspuffer (PBS, enthaltend 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA und 0,01% Thimerosal) verdünnt, d. h. 56 ng/ml wur den in jede Vertiefung zugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte gewaschen, und 100 µl Meerrettichperoxidase (HRPO)-konjugiertes Streptavidin (Zymed Laboratories, S.San Francisco, CA), 1 : 60 000 in Ver dünnungspuffer verdünnt, wurden zu jeder Vertiefung zuge fügt. Die Platte wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanfter Bewegung inkubiert. Das freie Avidin-Konjugat wurde weggewaschen, und 100 µl frisch hergestellte Substratlösung (Tetramethylbenzidin [TMB]; 2-Komponenten-Substratkit, Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) wurden zu jeder Ver tiefung hinzugefügt. Man ließ die Reaktion 10 Minuten lang fortschreiten, wonach die Farbentwicklung durch die Zugabe von 100 µl/Vertiefung 1,0 M H₃PO₄ gestoppt wurde. Die Ab sorption bei 450 nm wurde bei einer Bezugswellenlänge von 650 nm (ABS_450/650) unter Verwendung eines vmax Platten-Lese geräts (Molecular Devices, Palo Alto, CA), das durch einen Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) und DeltaSoft Software (BioMetallics, Inc. Princeton, NJ) kon trolliert wurde, gelesen.

Die Standardkurve wurde durch Stimulieren von dp12.trkA,B- oder C.gD-Zellen mit 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 oder 0 ng/ml mpl-Ligand erzeugt und als ng/ml TPO versus Mittelwert ABS_450/650 ± sd unter Anwendung des DeltaSoft-Pro gramms präsentiert. Die Probenkonzentrationen wurden durch Interpolation ihrer Absorption an der Standardkurve erhalten und sind als ng/ml TPO-Aktivität ausgedrückt.

Es wurde gefunden, daß der mpl-Ligand den chimären mpl- Rse.gD-Rezeptor in einer konzentrationsabhängigen und Li gand-spezifischen Weise aktivieren kann. Weiterhin wurde ge funden, daß der mpl-Rse.gD KIRA-ELISA bis zu 100% humanes Serum (gezeigt) oder 100% Plasma (nicht gezeigt) toleriert, was die Verwendung des Assays erlaubt, um schnell Patienten- und pK-Proben zu durchmustern.

Zusammenfassung der TPO EC50′s

Beispiel 18 Rezeptor-vermittelter ELISA für Thrombopoietin (TPO)

ELISA-Platten wurden mit Kaninchen F(ab′)₂-Anti-human IgG (Fc) in Carbonatpuffer, pH 9,6, bei 4°C über Nacht beschich tet. Die Platten wurden mit 0,5% Rinderserumalbumin in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur abgesättigt. Die Fermen terernte, enthaltend den chimären Rezeptor, mpl-IgG, wurde zu den Platten zugefügt und für 2 Stunden inkubiert. Zwei fach-Reihenverdünnungen (0,39-25 ng/ml) des Standards (TPO₃₃₂, hergestellt in 293-Zellen mit der mittels quantita tiver Aminosäureanalyse bestimmten Konzentration) und rei henverdünnte Proben in 0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Twen- 20 wurden zu den Platten zugefügt und für 2 Stunden inku biert. Gebundenes TPO wurde mit gereinigtem Protein A, bio tinylierten Kaninchen-Antikörpern gegen TPO₁₅₅, welches in E.coli (1 Stunde Inkubation) hergestellt wurde, gefolgt von Streptavidin-Peroxidase (30 Minuten Inkubation) und 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin als Substrat detektiert. Die Absorption wurde bei 450 nm abgelesen. Die Platten wurden zwischen den Schritten gewaschen. Zur Datenanalyse wird die Standardkurve unter Anwendung eines Vier-Parameter-Kurvenan passungsprogramms von Kaleidagraph angepaßt. Die Probenkon zentrationen wurden ausgehend von der Standardkurve berech net.

Beispiel 19 Expression und Reinigung des TPO von 293-Zellen 1. Präparation der Expressionsvektoren für 293-Zellen

Eine dem gesamten offenen Leseraster für TPO entsprechende cDNA wurde unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide als Primer durch PCR erhalten:

Tabelle 11

293 PCR-Primer

PRK5-hmpl I (beschrieben in Beispiel 9) wurde als Matrize für die Reaktion in der Gegenwart der pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denaturierung er folgte für 7 Minuten bei 94°C, worauf 25 Amplifikationszy klen (1 Minute bei 94°, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C) folgten. Die letzte Extension erfolgte für 15 Minuten bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restriktionsstellen ClaI und XbaI des Plasmids pRK5tkneo, einem vom pRK5 abstammenden Vektor, der derart modifiziert wurde, daß ein Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Thymidinkinase-Promotors exprimiert wird, kloniert, um den Vektor pRK5tkneo.ORF zu erhalten. Ein zweites Konstrukt, das der epo-homologen Domäne entspricht, wurde auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung des Cla.FL.F als Vorwärts- Primer und des folgenden reversen Primers erzeugt:

Arg.STOP.Xba: 5′TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC3′
(SEQ ID NO: 66)

Das letztendliche Konstrukt wird pRK5-tkneoEPO-D genannt. Die Sequenz beider Konstrukte wurde wie in Beispiel 7 be schrieben verifiziert.

2. Transfektion humaner embryonaler Nieren-Zellen

Diese zwei Konstrukte wurden in humane embryonale Nierenzel len mittels der CaPO₄-Methode, wie in Beispiel 9 beschrie ben, transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Selektion Neomycin-resistenter Klone in der Gegenwart von 0,4 mg/ml G418 gestartet. 10 bis 15 Tage später wurden Einzelkolonien in Platten mit 96 Vertiefungen überführt und bis zur Konfluenz wachsengelassen. Die Expression von ML₁₅₃ oder ML₃₃₂ in den konditionierten Medien von diesen Klonen wurde mittels des Ba/F3-mpl-Proliferationsassays (beschrieben in Beispiel 1) bestimmt.

3. Reinigung von rhML₃₃₂

Durch 293-rhML₃₃₂ konditioniertes Medium wurde auf eine Blue- Sepharose(Pharmacia)-Säule, die in 10 mM Natriumphosphat pH 7,4 (Puffer A) equilibriert wurde, appliziert. Die Säule wurde nachfolgend mit 10 Säulenvolumina jeweils des Puffer A und Puffer A, enthaltend 2M Harnstoff, gewaschen. Die Säule wurde danach mit Puffer A, enthaltend 2M Harnstoff und 1 M NaCl, eluiert. Der Blue-Sepharose-Elutionspool wurde danach direkt auf eine im Puffer A equilibrierte WGA-Sepharose- Säule appliziert. Die WGA-Sepharose-Säule wurde danach mit 10 Säulenvolumina des Puffers A, enthaltend 2M Harnstoff und 1 M NaCl, gewaschen und mit demselben Puffer, enthaltend 0,5 M N-Acetyl-D-glucosamin eluiert. Das WGA-Sepharose-Eluat wurde auf eine in 0,1% TFA equilibrierte C4-HPLC-Säule (Synchrom, Inc.) appliziert. Die C4-HPLC-Säule wurde mit einem diskontinuierlichen Propanol-Gradienten (0-25%, 25-35%, 35-70%) eluiert. Es wurde gefunden, daß rhML₃₃₂ in dem 28-30% Propanolbereich des Gradienten eluiert. In der SDS- PAGE wandert der gereinigte rhML₃₃₂ als eine breite Bande im 68-80 kDa-Bereich des Gels (siehe Fig. 15).

4. Reinigung des rhML₁₅₃

Durch 293-rhML₁₅₃ konditioniertes Medium wurde an Blue-Sepha rose, wie für rhML₃₃₂ beschrieben, aufgetrennt. Das Blue- Sepharose-Eluat wurde direkt auf eine mpl-Affinitätssäule, wie vorstehend beschrieben, appliziert. Von der mpl-Affini tätssäule eluierter rhML₁₅₃ wurde zur Homogenität unter Ver wendung einer C4-HPLC-Säule, die unter denselben Bedingungen wie für rhML₃₃₂ beschrieben laufengelassen wurde, gereinigt. In der SDS-PAGE trennt sich der gereinigte rhML₁₅₃ in zwei größere und zwei kleinere Banden mit MG von ungefähr 18 000-21 000 (siehe Fig. 15).

Beispiel 20 Expression und Reinigung des TPO von CHO 1. Beschreibung der CHO-Expressionsvektoren

Die in den nachstehend beschriebenen Elektroporationsproto kollen verwendeten Expressionsvektoren sind folgendermaßen bezeichnet worden:

pSVI5.ID.LL.MLORF (volle Länge oder hTPO₃₃₂) und
pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (verkürzt oder hTPO₁₅₃).

Die einschlägigen Merkmale dieser Plasmide sind in den Fig. 23 und 24 dargestellt.

2. Präparation der CHO-Expressionsvektoren

Eine cDNA, die dem gesamten offenen Leseraster vom hTPO ent spricht, wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer der Tabelle 12 durch PCR erhalten.

Tabelle 12

CHO-Expressionsvektor PCR-Primer

PRK5-hmpl I (beschrieben in den Beispielen 7 und 9) wurde als Matrize für die Reaktion in der Gegenwart der pfu-DNA- Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denatu rierung erfolgte für 7 Minuten bei 94°C, worauf 25 Amplifi kationszyklen (1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C) folgten. Die letzte Extension erfolgte für 15 Minuten bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restriktionsstellen ClaI und SalI des Plasmids pSVI5.ID.LL kloniert, um den Vektor pSVI5.ID.LL.MLORF zu er halten. Ein zweites Konstrukt, das der EPO-homologen Domäne entspricht, wurde auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwen dung des Cla.FL.2 als Vorwärts-Primer und den folgenden re versen Primer erzeugt:

EPOD.Sal 5′AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC3′
(SEQ ID NO: 68)

Das letztendliche Konstrukt wird pSVI5.ID.LL.MLEPO-D ge nannt. Die Sequenz beider Konstrukte wurde, wie in den Bei spielen 7 und 9 beschrieben, verifiziert.

Im wesentlichen wurden die kodierenden Sequenzen für den Li ganden der vollen Länge und den verkürzten Liganden in die multiple Klonierungsstelle des CHO-Expressionsvektors pSVI5.ID.LL eingebracht. Dieser Vektor enthält die frühe Promotor/Enhancer-Region des SV40, eine die Maus-DHFR-cDNA enthaltende modifizierte Spleiß-Einheit, eine multiple Klo nierungsstelle für das Einbringen des interessierenden Gens (in diesem Fall die beschriebenen TPO-Sequenzen), ein Poly adenylierungssignal von SV40 und einen Replikationsursprung und das Beta-Lactamase-Gen für die Plasmidselektion und -amplifikation in Bakterien.

3. Methodik zum Etablieren stabiler CHO-Zellinien, die re kombinantes humanes TPO₃₃₂ und TPO₁₅₃ exprimieren a. Beschreibung der CHO-Elternzellinie

Die CHO (chinesische Hamsterovarien) Wirtszell-Linie, die für die Expression der hierin beschriebenen TPO-Moleküle verwendet wurde, ist bekannt als CHO-DP12 (siehe EP 307 247, veröffentlicht am 15. März 1989). Diese Säuger-Zellinie wurde ausgehend von einer Transfektion der Elternlinie (CHO- K1 DUX-B11(DHFR-)-, erhalten von Dr. Frank Lee von der Standford Universität mit der Erlaubnis von Dr.L.Chasin), mit einem Präproinsulin exprimierenden Vektor klonal selek tiert, um Klone mit reduzierten Insulinbedürfnissen zu er halten. Diese Zellen sind auch DHFR minus, und Klone können auf das Vorhandensein von DHFR cDNA-Vektorsequenzen durch Wachstum auf Medium, dem Nukleosidzusätze (Glycin, Hypo xanthin und Thymidin) fehlen, selektiert werden. Dieses Se lektionssystem auf stabil exprimierende CHO-Zellinien wird allgemein verwendet.

b. Transfektionsmethode (Elektroporation)

TPO₃₃₂ und TPO₁₅₃ exprimierende Zellinien wurden durch Trans fektion von DP12-Zellen mittels Elektroporation (siehe z. B. Andreason, G.L. J.Tiss. Cult. Meth., 15,56 [1993]) mit line arisierten pSVI5.ID.LL.MLORF- bzw. pSVI5.ID.LL.MLEPO-D-Plas miden erzeugt. Drei (3) Restriktionsenzym-Reaktionsmischun gen wurden zum jeweiligen Schneiden der Plasmide herge stellt; 10 µg, 25 µg und 50 µg des Vektors mit dem Enzym NotI durch Standardverfahren der Molekularbiologie. Diese Restriktionsstelle wird nur einmal in dem Vektor in der Li nearisierungsregion 3′ und außerhalb der TPO-Ligand-Trans kriptionseinheiten (siehe Fig. 23) gefunden. Die 100 µl-Re aktionen wurden für eine Inkubation über Nacht bei 37°C be reitet. Am nächsten Tag wurden die Mischungen mit Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol (50 : 49 : 1) einmal extrahiert und für ungefähr eine Stunde auf Trockeneis Ethanol-präzipi tiert. Das Präzipitat wurde danach durch eine 15 minütige Mikrozentrifugation gesammelt und getrocknet. Die lineari sierte DNA wurde in 50 µl Ham′s DMEM-F12 1 : 1 Medium, ergänzt mit Standard-Antibiotika und 2 mM Glutamin, resuspendiert.

In Suspensionskultur wachsende DP12-Zellen wurden gesammelt, einmal in dem für das Resuspendieren der DNA beschriebene Medium gewaschen und letztendlich in demselben Medium zu einer Konzentration von 107 Zellen pro 750 µl resuspendiert. Aliquots der Zellen (750 µl) und jede Mischung der lineari sierten DNA wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur zusam men inkubiert und danach in eine BRL-Elektroporationskammer transferiert. Jede Reaktionsmischung wurde dann in einem Standard-BRL-Elektroporationsapparat bei 350 Volt, festge legt bei 330 µF, und niedriger Kapazitanz elektroporiert. Nach der Elektroporation ließ man die Zellen in dem Apparat für 5 Minuten und danach für eine zusätzliche 10-minütige Inkubationszeitdauer auf Eis sich absetzen. Die elektro porierten Zellen wurden in 60 mm-Zellkulturschalen, enthal tend 5 ml komplettes Standard-Wachstumsmedium für CHO-Zellen (DMEM-F12 50 : 50 mit hoher Glucosekonzentration ohne Glycin, ergänzt mit 1X GHT, 2 mM Glutamin und 5% fötalem Kälberse rum) überführt und über Nacht in einem 5% CO₂-Zellkulturin kubator wachsen gelassen.

c. Selektions- und Durchmusterungs-Methode

Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Standardverfahren von den Platten mit Trypsin abgelöst und in 150 mm Gewebe kulturschalen, enthaltend selektives DHFR-Medium (vorstehend beschriebenes Ham′s DMEM-F12, 1 : 1-Medium, ergänzt mit entwe der 2% oder 5% dialysiertem fötalen Kälberserum, jedoch frei von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; dies ist das DHFR- Standard-Selektionsmedium, das wir verwenden) überführt. Die Zelle von jeder 60 mm-Schale wurden nachfolgend nochmals in 5/150 mm-Schalen ausgesät. Die Zellen wurden danach für 10-15 Tage (mit einem Mediumwechsel) bei 37°C/5% CO₂ inkubiert, bis Klone anfingen zu erscheinen und Größen erreichten, die für einen Transfer in Schalen mit 96 Vertiefungen geeignet waren. Über eine Zeitdauer von 4-5 Tagen hinweg wurden die Zellinien unter Verwendung steriler gelber Spitzen auf einer auf 50 ml eingestellten Pipettierhilfe in Schalen mit 96 Vertiefungen überführt. Die Zellen ließ man bis zur Konflu enz (gewöhnlich 3-5 Tage) wachsen, und danach wurden die Schalen trypsinisiert und zwei Kopien der ursprünglichen Schale reproduziert. Zwei dieser Kopien wurden im Gefrier schrank mit Zellen in jeder Vertiefung, verdünnt in 50 µl 10% FCS in DMSO kurzzeitig gelagert. 5 Tage lang konditio nierte, serumfreie Mediumproben wurden von konfluent bewach senen Vertiefungen in der dritten Schale auf TPO-Expression mittels des auf Ba/F-Zellen basierenden Aktivitätsassays un tersucht. Die auf der Grundlage dieses Assays am höchsten exprimierenden Klone wurden von der Aufbewahrung reaktiviert und zu zwei konfluenten 250 mm T-Flaschen hochgezogen für den Transfer zu der Zellkulturgruppe für eine Suspensionsan passung, Kontrolle und Konservierung.

d. Amplifikaktionsprotokoll

Mehrere Zellinien mit den höchsten Titern aus der vorstehend beschriebenen Selektion wurden nachfolgend durch eine Stan dard-Methotrexat-Amplifikationsbehandlung geführt, um Klone mit hohen Titern zu erzeugen. CHO-Zellklone werden expan diert und in 10 cm-Schalen mit 4 Methotrexat-Konzentrationen (d. h. 50 nM, 100 nM, 200 nM und 400 nM) zu zwei oder drei Zellzahlen (105, 5×105 und 106 Zellen pro Schale) ausgesät. Diese Kulturen werden danach bei 37°C/5% CO₂ inkubiert, bis Klone etabliert und geeignet zum Transfer in Schalen mit 96 Vertiefungen für den weiteren Assay sind. Mehrere Klone mit hohen Titern von dieser Selektion wurden nochmals größeren Methotrexat-Konzentrationen (d. h. 600 nM, 800 nM, 1000 nM und 1200 nM) ausgesetzt, und wie vorstehend beschrieben ließ man die resistenten Klone sich etablieren, worauf diese in Schalen mit 96 Vertiefungen überführt und untersucht wurden.

4. Kultivieren stabiler CHO-Zellinien, die rekombinanten hu manen TPO₃₃₂ und TPO₁₅₃ exprimieren

Aufbewahrte Zellen werden aufgetaut, und die Zellpopulation wird durch Standard-Zellwachstumsverfahren in entweder serumfreiem oder Serum-enthaltendem Medium expandiert. Nach der Expansion zu einer ausreichenden Zelldichte werden die Zellen gewaschen, um verbrauchtes Zellkulturmedium zu ent fernen. Die Zellen werden danach durch irgendein Standard verfahren kultiviert, umfassend Chargen (batch)-, gefütterte Chargen (fed-batch)- oder kontinuierliche Kultur bei 25- 40°C, neutralem pH, mit einem Gehalt an gelöstem O₂ von min destens 5% bis das konstitutiv sezernierte TPO angehäuft ist. Die Zellkulturflüssigkeit wird dann von den Zellen durch mechanische Mittel, wie Zentrifugation, abgetrennt.

5. Reinigung des rekombinanten humanen TPO von CHO-Kultur flüssigkeiten

Geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF) wird direkt auf eine Blue-Sepharose 6 Schnelldurchflußsäule (Fast Flow column; Pharmacia), die in 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl zu einer Rate von ungefähr 100 l HCCF pro Liter Harz und zu einer linearen Fließrate von ungefähr 300 ml/h/cm² appli ziert. Die Säule wird danach mit 3 bis 5 Säulenvolumina des Equilibrierungspuffers, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0M Harnstoff, gewaschen. Das TPO wird danach mit 3 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na- Phosphat pH 7,4, 2,0M Harnstoff, 1,0M NaCl eluiert.

Der TPO enthaltende Blue-Sepharose-Pool wird danach auf eine Weizenkeimlektin-Sepharose 6MB-Säule (Pharmacia) appliziert, die in 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0M Harnstoff und 1,0M NaCl zu einer Rate von 8 bis 16 ml des Blue-Sepharose-Pools pro ml Harz bei einer Fließrate von ungefähr 50 ml/h/cm² appliziert. Die Säule wird danach mit 2 bis 3 Säulenvolumina des Equilibrierungspuffers gewaschen. Das TPO wird danach bis 2 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,0M Harnstoff, 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin eluiert.

Der Weizenkeimlektin-Pool wird danach zu einer Endkonzentra tion von 0,04% C₁₂E₈ und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) einge stellt. Der resultierende Pool wird auf eine C4-Umkehrpha sensäule (Vydac 214TP1022) appliziert, die in 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈ zu einer Beladung von ungefähr 0,2 bis 0,5 mg Protein pro ml Harz bei einer Fließrate von 157 ml/h/cm² equilibriert wurde.

Das Protein wird in einem zweiphasigen linearen Acetonitril- Gradienten, enthaltend 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈ eluiert. Die er ste Phase besteht aus einem linearen Gradienten von 0 bis 30% Acetonitril in 15 Minuten. Die zweite Phase besteht aus einem linearen Gradienten von 30 bis 60% Acetonitril in 60 Minuten. Das TPO eluiert bei ungefähr 50% Acetonitril. Ein Pool wird auf der Grundlage von SDS-PAGE hergestellt.

Der C4-Pool wird danach mit 2 Volumina an 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl verdünnt und gegen ungefähr 6 Volumina von 0,01M NA-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl an einem Amicon YM oder einer ähnlichen Ultrafiltrationsmembran mit einer Mole kulargewichtsausschlußgröße von 10 000 bis 30 000 Dalton dia filtriert. Das resultierende Diafiltrat kann danach direkt weiterverarbeitet oder durch Ultrafiltration weiter konzen triert werden. Das Diafiltrat/Konzentrat wird auf eine End konzentration von 0,01% Tween-80 eingestellt.

Das gesamte oder ein Teil des Diafiltrat/Konzentrats, das äquivalent zu 2 bis 5% des berechneten Säulenvolumens ist, wird danach auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia) appliziert, die in 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,1% Tween-80 equilibriert wurde, und bei einer Fließrate von ungefähr 17 ml/h/cm² chromatographiert. Die TPO-enthal tenden Fraktionen, die frei von Aggregaten und proteolyti schen Abbauprodukten sind, werden auf der Grundlage der SDS- PAGE gesammelt. 42787 00070 552 001000280000000200012000285914267600040 0002019500030 00004 42668 Der resultierende Pool wird durch ein 0,22 µ-Filter, Millex-GV oder ähnliches, filtriert und bei 2-8°C gelagert.

Beispiel 21 Transformation und Induktion der TPO-Proteinsynthese in E.coli 1. Konstruktion von E. coli TPO-Expresssionsvektoren

Die Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 sind alle für die Expression der ersten 155 Aminosäuren des TPO stromabwärts von einem kleinen Leader, der unter den ver schiedenen Konstrukten variiert, entworfen. Die Leader er möglichen primär eine starke Translationsinitiation und schnelle Reinigung. Die Plasmide pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 sind für die Expression der ersten 153 Aminosäuren des TPO stromabwärts von einem Initiations-Methionin entwor fen und unterscheiden sich nur in dem Codongebrauch für die ersten Aminosäuren des TPO, während das Plasmid pMP251 ein Abkömmling von pMP210-1 ist, in welchem das Carboxy-termi nale Ende des TPO durch zwei Aminosäuren verlängert ist. Alle der vorstehenden Plasmide werden große Raten einer in trazellulären TPO-Expression in E.coli nach Induktion des Tryptophan-Promotors produzieren (Yansura, D.G. et al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Hog.) 185 : 54-60 Acade mic Press, San Diego [1990]). Die Plasmide pMP1 und pMP172 sind Zwischenprodukte bei der Konstruktion der vorstehenden Plasmide für intrazelluläre Expression des TPO.

(a) Plasmid pMP1

Das Plasmid pMP1 ist ein Sezernierungsvektor für die ersten 155 Aminosäuren des TPO und wurde dadurch konstruiert, daß 5 DNA-Fragmente, wie in Fig. 33 gezeigt, zusammenligiert wur den. Das erste davon war der Vektor pPho21, in welchem das kleine MluI-BamHI-Fragment entfernt worden war. pPho21 ist ein Abkömmling von phGH1 (Chang, C.N. et. al., Gene 55 : 189-196 [1987]), in welchem das Gen für das humane Wachstumshor mon durch das E.coli phoA-Gen ersetzt worden ist und eine MluI-Restriktionsstelle in die kodierende Sequenz für die STII-Signalsequenz bei den Aminosäuren 20-21 eingebaut wor den ist.

Die zwei nächsten Fragmente, ein 258 Basenpaar HinfI-PstI- DNA-Stück von dem für die TPO-Aminosäuren 19-103 kodierenden pRK5-hmplI (Beispiel 9), und die folgende synthetische für die Aminosäuren 1-18 kodierende DNA.

5′-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG TG
ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC ACTGA-5′
(SEQ ID NO: 69)
(SEQ ID NO: 70)

wurden mittels T4-DNA-Ligase vorligiert und danach mit PstI geschnitten. Das vierte war ein 152 Basenpaar PstI-HaeIII- Fragment vom für die Aminosäuren 104-155 des TPO kodierenden pRK5hmpII. Das letzte war ein 412 Basenpaar StuI-BamHI-Frag ment vom pdh108, welcher den lambda-Transkriptionsterminator enthält, wie früher beschrieben (Scholtissek, S. et.al., NAR 15 : 3185 [1987]).

(b) Plasmid pMP21

Das Plasmid pMP21 ist für die Expression der ersten 155 Ami nosäuren des TPO mit der Hilfe eines 13 Aminosäuren langen Leaders, welcher einen Teil der SII-Signalsequenz umfaßt, entworfen. Es wurde dadurch konstruiert, daß drei (3) DNA- Fragmente, wie in Fig. 34 gezeigt, zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der Vektor pVEG31 ist, in welchem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden war. Der Vek tor pVEG31 ist ein Abkömmling vom pHGH207-1 (de Boer, H.A. et. al., in Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L. und Chamberlain, M.J., Hrg.) 462, Praeger, New York [1982]), in welchem das Gen für das humane Wachstumshormon durch das Gen für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (dieses identische Vektorfragment kann von diesem letzteren Plasmid erhalten werden) ersetzt worden ist.

Das zweite Teil in der Ligierung war ein synthetischer DNA- Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:

5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5′
(SEQ ID NO: 71)
(SEQ ID NO: 72)

Das letzte Stück war ein 1072 Basenpaar MluI-SphI-Fragment vom für 155 Aminosäuren des TPO kodierenden pMP1.

(c) Plasmid pMP151

Das Plasmid pMP151 ist für die Expression der ersten 155 Aminosäuren des TPO stromabwärts von einem Leader, welcher 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, 8 Histidine und eine Faktor Xa-Schnittstelle umfaßt, entworfen. Wie in Fig. 35 gezeigt, wurde pMP151 dadurch konstruiert, daß drei DNA- Fragmente zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der vorstehend beschriebene Vektor pVEG31 ist, von welchem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang mit der fol genden Sequenz:

5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG
GTCGTAGCC
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5′
(SEQ ID NO: 73)
(SEQ ID NO: 74)

Das letzte war ein 1064 Basenpaar BglI-SphI-Fragment vom für 154 Aminosäuren des TPO kodierenden pMP11. Das Plasmid pMP11 ist identisch zu pMP1 mit der Ausnahme einiger weniger Codon-Veränderungen in der STlI-Signalsequenz (dieses Frag ment kann vom pMP1 erhalten werden).

(d) Plasmid pMP202

Das Plasmid pMP202 ist dem Expressionsvektor pMP151 sehr ähnlich mit der Ausnahme, daß die Faktor Xa-Schnittstelle in dem Leader durch eine Thrombin-Schnittstelle ersetzt worden ist. Wie in Fig. 36 gezeigt, wurde der pMP202 dadurch kon struiert, daß drei DNA-Fragmente zusammenligiert wurden. Das erste von diesen war der vorstehend beschriebene pVEG31, in welchem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:

5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA
CCACGTAGCC
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT GGTGCAT-5′
(SEQ ID NO: 75)
(SEQ ID NO: 76)

Das letzte Stück war ein 1064 Basenpaar BglI-SphI-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMP11.

(e) Plasmid pMP172

Das Plasmid pMP172 ist ein Sezernierungsvektor für die er sten 153 Aminosäuren des TPO und ein Zwischenprodukt für die Konstruktion des pMP210. Wie in Fig. 37 gezeigt, wurde der pMP172 dadurch hergestellt, daß drei DNA-Fragmente zusammen ligiert wurden, wobei das erste von diesen der Vektor pLS32lamB war, in welchem das kleine EcoRI-HindIII-Segment entfernt worden war. Das zweite war ein 946 Basenpaar EcoRI- HgaI-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMP11. Das letzte Stück war ein synthetischer DNA-Doppel strang mit der folgenden Frequenz:

5′-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77)
GGAGACGCAGTCCATCGA-5′ (SEQ ID NO: 78)

(f) Plasmid pMP210

Das Plasmid pMP210 ist für eine Expression der ersten 153 Aminosäuren des TPO nach einem Translationsinitiations- Methionin entworfen. Dieses Plasmid wurde tatsächlich als eine Plasmidbank hergestellt, in welcher die ersten 6 Codons des TPO in der dritten Position eines jeden Codons zufalls mäßig verändert wurden, und wurde, wie in der Fig. 38 ge zeigt, durch die Ligierung von drei DNA-Fragmenten konstru iert. Das erste von diesen war der vorstehend beschriebene Vektor pVEG31, in welchem das kleine XbaI-SphI-Fragment ent fernt worden war. Das zweite war ein synthetischer DNA-Dop pelstrang, nachstehend gezeigt, der zuerst mit DNA-Polyme raseI (Klenow) behandelt wurde, gefolgt von einem Verdau mit XbaI und HinfI, und der für das Initiations-Methionin und die zufallsmäßig veränderten ersten 6 Codons des TPO ko diert.

5′-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA ACACTGGAGGCT
GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79)
CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5′ (SEQ ID NO: 80)

Das dritte war ein 890 Basenpaar HinfI-SphI-Fragment vom für die Aminosäure 19-153 des TPO kodierenden pMP172.

Die pMP210-Plasmidbank aus ungefähr 3700 Klonen wurde auf LB-Platten mit hoher Tetracyclin-Konzentration (50 µg/ml) retransformiert, um Klone mit einer hohen Translations initiationsrate zu selektieren (Yansura, D.G. et. al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4 : 151-158 [1992]). Von den 8 Kolonien, die auf den Platten mit hoher Tetracyclinkonzentration hervorkamen, wurden 5 der hinsicht lich der TPO-Expression besten Klone einer DNA-Sequenzierung ausgesetzt, und die Ergebnisse sind in Fig. 39 gezeigt (SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 und 28).

(g) Plasmid pMP41

Das Plasmid pMP41 ist für eine Expression der ersten 155 Aminosäuren des TPO, fusioniert an einen Leader, der aus 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, gefolgt von einer Faktor Xa-Schnittstelle, besteht, entworfen. Das Plasmid wurde, wie in Fig. 40 gezeigt, dadurch kontruiert, daß drei DNA-Stücke zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der vor stehend beschriebene Vektor pVEG31 war, in welchem das kleine XBaI-SphI-Fragment entfernt worden war. Das zweite war der folgende synthetische DNA-Doppelstrang:

5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81)
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5′ (SEQ ID NO: 82)

Das letzte Stück der Ligierung war das 1064 Basenpaar BgII- SphI-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMP11.

(h) Plasmid pMP57

Das Plasmid pMP57 exprimiert die ersten 155 Aminosäuren des TPO stromabwärts von einem Leader, der aus 9 Aminosäuren der STII-Signalsequenz und der dibasischen Stelle Lys-Arg be steht. Diese dibasische Stelle stellt die Möglichkeit zur Verfügung, den Leader mit der Potease ArgC zu entfernen. Dieses Plasmid wurde, wie in Fig. 41 gezeigt, dadurch kon struiert, daß drei DNA-Stücke zusammenligiert wurden. Das erste von diesen war der vorstehend beschriebene Vektor pVEG31, in welchem das kleine XbaI-SphI-Fragment entfernt worden war. Das zweite war der folgende synthetische DNA- Doppelstrang:

5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83)
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5′ (SEQ ID NO: 84)

Das letzte Teil der Ligierung war das 1064 Basenpaar BgII- SphI-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMP11.

(i) Plasmid pMP251

Das Plasmid 251 ist ein Abkömmling von pMP210-1, in welchem zwei zusätzliche Aminosäuren des TPO an dem Carboxy-termina len Ende umfaßt sind. Wie in Fig. 42 gezeigt, wurde das Plasmid dadurch konstruiert, daß zwei DNA-Stücke zusammenli giert wurden, wobei das erste von diesen der vorstehend be schriebene pMP21 ist, in welchem das kleine XbaI-ApaI-Frag ment entfernt worden war. Das zweite Teil der Ligierung war ein 316 Basenpaar XbaI-ApaI-Fragment vom pMP210-1.

2. Transformation und Induktion von E.coli mit TPO-Expressi onsvektoren

Die vorstehenden TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet, um den E.coli-Stamm 44C6 (w3110 tonA_Δ rpoH_ts Ion_Δ clpP_Δ galE). unter Anwendung der CaCl₂-Hitzeschockmethode zu transformie ren (Mandel, M. et al., J.Mol.Biol., 53 : 159-162, [1970]). Die transformierten Zellen wurden zuerst bei 37°C in LB-Me dium, enthaltend 50 µg/ml Carbenicillin solange kultiviert, bis die optische Dichte (600 nm) der Kultur ungefähr 2-3 er reichte. Die LB-Kultur wurde danach 20× in M9-Medium, ent haltend 0,49% Casaminosäuren (Gew./Vol.) und 50 µg/ml Carbe nicillin, verdünnt. Nach Kultivierung bei 30°C für eine Stunde mit Belüftung, wurde Indol-3-acrylsäure zu einer End konzentration von 50 µg/ml zugefügt. Danach ließ man die Kultur bei 30°C mit Belüftung für weitere 15 Stunden weiter wachsen, wonach die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden.

Beispiel 22 Produktion von biologisch aktivem TPO (Met-¹ 1-153) in E.coli

Die nachstehend beschriebenen Verfahren für eine Produktion von biologisch aktivem, rückgefaltetem TPO (Met-¹ 1-153) kann in analoger Weise für die Gewinnung weiterer TPO-Vari anten, einschließlich N und C-terminal verlängerter Formen (siehe Beispiel 23) angewendet werden.

A. Gewinnung von nicht-löslichem TPO (Met-¹ 1-153)

E.coli-Zellen, die durch das Plasmid pMP210-1 kodiertes TPO (Met-¹ 1-153) exprimieren, wurden wie vorstehend beschrieben fermentiert. Typischerweise werden ungefähr 100 g Zellen in 1 l (10 Volumina) Zelldisruptionspuffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH8) mit einem Polytron-Homogenisiergerät resuspen diert und die Zellen bei 5000 × g für 30 Minuten zentrifu giert. Das gewaschene Zellpellet wird nochmals in 1 l Zell disruptionspuffer mit dem Polytron-Homogenisiergerät resus pendiert und die Zellsuspension wird durch einen LH-Zell- Disrupter (LH Inceltech, Inc.) oder durch einen Microfluidi zer (Microfluidics International) gemäß den Anweisungen des Herstellers geschickt. Die Suspension wird bei 5000 g für 30 Minuten zentrifugiert, resuspendiert und ein zweites Mal zentrifugiert, um ein gewaschenes Pellet aus brechenden Kör pern herzustellen. Das gewaschene Pellet wird unmittelbar verwendet oder bei -70°C gefroren gelagert.

B. Solubilisierung und Reinigung von monomerem TPO (Met-¹ 1- 153)

Das vorstehend erwähnte Pellet wird in 5 Gewichtsvolumina von 20 mM Tris, pH 8, mit 6-8 M Guanidin und 25 mM DTT (Dithiothreitol) resuspendiert und für 1-3 h oder über Nacht bei 4°C gerührt, um die Solubilisierung des TPO-Proteins zu bewirken. Hohe Harnstoffkonzentrationen (6-8M) sind ebenso geeignet, ergeben jedoch gewöhnlich, verglichen mit Guani din, geringere Ausbeuten. Nach der Solubilisierung wird die Lösung bei 30 000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um einen klaren, das denaturierte, monomere TPO-Protein enthaltenden Überstand herzustellen. Der Überstand wird danach über eine Superdex 200 Gel-Filtrationssäule (Pharmacia, 2,6 × 60 cm) bei einer Fließrate von 2 ml/min chromatographiert und das Protein mit 20 mM Na-Phosphat, pH 6,0, mit 10 mM DTT elu iert. Die monomeres, denaturiertes TPO-Protein enthaltenden Fraktionen, die zwischen 160 und 200 ml eluieren, werden vereinigt. Das TPO-Protein wird über eine semi-präparative C4-Umkehrphasen-Säule (2 × 20 cm VYDAC) weiter gereinigt. Die Probe wird zu 5 ml/min auf eine Säule appliziert, die in 0,1% HTFA (Trifluoressigsäure) mit 30% Acetonitril equili briert wurde. Das Protein wird mit einem linearen Acetoni tril-Gradienten (30-60% in 60 min) eluiert. Das gereinigte, reduzierte Protein eluiert bei ungefähr 50% Acetonitril. Dieses Material wird für das Rückfalten verwendet, um eine biologisch aktive TPO-Variante zu erhalten.

C. Erzeugung von biologisch aktivem TPO (Met-¹ 1-153)

Ungefähr 20 mg des monomeren, reduzierten und denaturierten TPO-Proteins in 40 ml 0,1% TFA/50% Acetonitril wird in 360 ml des Rückfaltungspuffers verdünnt, welcher optimal die folgenden Reagenzien enthält:

50 mM Tris
0,3 M NaCl
5 mM EDTA
2% CHAPS-Detergenz
25% Glycerin
5 mM oxidiertes Glutathion
1 mM reduziertes Glutathion
pH eingestellt auf 8,3

Nach dem Mischen wird der Rückfaltungspuffer sanft bei 4°C für 12-48 h gerührt, um maximale Rückfaltungsausbeuten der TPO-Form mit korrekten Disulfidbindungen zu bewirken (siehe nachstehend). Die Lösung wird danach mit TFA zu einer End konzentration von 0,2% angesäuert, durch ein 0,45 oder 0,22 µ-Filter filtriert und 1/10 Volumen Acetonitril zugeführt. Die Lösung wird danach direkt auf eine C4-Umkehrphasen-Säule gepumpt und das gereinigte, rückgefaltete TPO (Met-¹ 1-153) mit demselben Gradienten-Programm, wie vorstehend beschrie ben, eluiert. Rückgefaltetes, biologisch aktives TPO wird bei ungefähr 45% Acetonitril unter diesen Bedingungen elu iert. TPO-Versionen mit falschen Disulfidbindungen werden früher eluiert. Das endgereinigte TPO (Met-¹ 1-153) ist mehr als 95% rein, wie durch SDS-Gele und analytische C4-Um kehrphasen-Chromatographie bestimmt wurde. Für die Tierver suche wurde das C4-gereinigte Material in physiologisch ver träglichen Puffern dialysiert. Isotonische Puffer (10 mM Na- Acetat, pH 5,5, 10 mM Na-Succinat, pH 5,5 oder 10 mM Na- Phosphat, pH 7,4), enthaltend 150 mM NaCl und 0,01% Tween-80 wurden verwendet.

Aufgrund der hohen Wirksamkeit des TPO im Ba/F3-Assay (halbmaximale Stimulation wird bei ungefähr 3 pg/ml er reicht), ist es möglich, biologisch aktives Material unter Verwendung vieler verschiedener Puffer, Detergentien und Redox-Bedingungen zu erhalten. Jedoch wird unter den meisten Bedingungen nur eine geringe Menge an genau gefaltetem Mate rial (<10%) erhalten. Für gewerbliche Herstellungsverfahren ist es wünschenswert, Rückfaltungsraten von mindestens 10%, vorzugsweise 30-50% und am meisten bevorzugt <50% zu errei chen. Viele verschiedene Detergenzien (Triton X-100, Dode cyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, Salkosyl, Tween-20 und Tween-80, Zwittergent 3-14 und andere) wurden auf ihre Effizienz untersucht, hohe Rückfaltungsausbeuten zu gewähr leisten. Es wurde gefunden, daß unter diesen Detergenzien nur die CHAPS-Familie (CHAPS und CHAPSO) allgemein geeignet für die Rückfaltungsreaktion sind, um eine Proteinaggrega tion und falsche Disulfid-Bildung zu begrenzen. Mengen an CHAPS größer als 1% waren am geeignetsten. Natriumchlorid wurde für die besten Ausbeuten benötigt, mit den optimalen Mengen zwischen 0,1 M und 0,5 M. Die Gegenwart von EDTA (1-5 mM) begrenzte die Höhe der Metall-katalysierten Oxidation (und Aggregation), die mit einigen Präparationen beobachtet wurde. Größere Glycerinkonzentrationen als 15% ergaben die optimalen Rückfaltungsbedingungen. Für maximale Ausbeuten war es wichtig, sowohl oxidiertes als auch reduziertes Glutathion oder oxidiertes und reduziertes Cystein als Redox-Reagenzpaar zu verwenden. Gewöhnlich werden höhere Ausbeuten beobachtet, wenn das Mol-Verhältnis des oxidierten Reagenz gleich zu oder im Überschuß über dem reduzierten Reagenzmitglied des Redoxpaars ist. pH-Werte zwischen 7,5 und ungefähr 9 waren optimal für das Rückfalten dieser TPO- Varianten. Organische Lösungsmittel, (z. B. Ethanol, Acetoni tril, Methanol) wurden in Konzentrationen von 10-15% oder niedriger toleriert. Hohe Mengen an organischen Lösungsmit teln erhöhte die Menge an falsch gefalteten Formen. Tris und Phosphat-Puffer waren gewöhnlich geeignet. Die Inkubation bei 4°C führte ebenso zu höheren Mengen an richtig gefalte tem TPO.

Rückfaltungsausbeuten von 40-60% (auf der Grundlage der Menge des in der Rückfaltungsreaktion verwendeten reduzier ten und denaturierten TPO) sind typisch für TPO-Präparatio nen, die durch die erste C4-Stufe gereinigt worden sind. Ak tives Material kann erhalten werden, wenn weniger reine Prä parationen (z. B. direkt nach der Superdex 200-Säule oder nach der anfänglichen Extraktion von brechenden Körpern) verwendet werden, obwohl die Ausbeuten aufgrund einer exten siven Präzipitation und Interferenz der Nicht-TPO-Proteine während des TPO-Rückfaltungs-Prozesses geringer sind.

Da TPO (Met-¹ 1-153) 4 Cysteinreste enthält, ist es möglich, drei verschiedene Disulfidversionen dieses Proteins zu er zeugen:

Version 1: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-4 und 2-3
Version 2: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-2 und 3-4
Version 3: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-3 und 2-4

Während der anfänglichen Untersuchung zur Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen, wurden mehrere verschiedene, TPO- Protein enthaltende Peaks durch C4-Umkehrphasen-Chromatogra phie getrennt. Nur einer dieser Peaks besaß eine signifi kante biologische Aktivität, wie unter Verwendung des Ba/F3- Assays bestimmt wurde. Nachfolgend wurden die Rückfaltungs bedingungen optimiert, um vorzugsweise diese Version zu er halten. Unter diesen Bedingungen machen die falsch gefalte ten Versionen weniger als 10-20% des gesamten erhaltenen mo nomeren TPO aus.

Es ist durch Massenspektrometrie und Proteinsequenzierung bestimmt worden, daß das Disulfidmuster für das biologisch aktive TPO 1-4 und 2-3 (d. h. Version 1) ist. Aliquots der verschiedenen C4-aufgelösten Peaks (5-10 nmol) wurden mit Trypsin verdaut (1 : 25 Mol-Verhältnis von Trypsin zu Pro tein). Die Verdaumischung wurde durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspektrometrie vor und nach der Reduk tion mit DTT analysiert. Nach der Reduktion wurden Massen, die den meisten der größeren, tryptischen Peptide des TPO entsprechen, detektiert. In den nicht-reduzierten Proben fehlten einige dieser Massen und neue Massen wurden beobach tet. Die Masse der neuen Peaks entsprach grundlegend der Summe der einzelnen tryptischen Peptiden, die bei der Disul fidbindung eine Rolle spielen. Folglich war es möglich, das Disulfidmuster des rückgefalteten, rekombinanten, biologisch aktiven TPO unzweideutig als 1-4 und 2-3 zu bestimmen. Dies ist vereinbar mit dem bekannten Disulfidmuster des verwand ten Moleküls Erythropoietin.

D. Biologische Aktivität des rekombinanten, rückgefalteten TPO (Met 1-153)

Rückgefaltetes und gereinigtes TPO (Met^-1 1-153) besaß so wohl in vitro- als auch in vivo-Assay-Aktivität. In dem Ba/F3-Assay wurde eine halbmaximale Stimulierung des Thymi din-Einbaus in die Ba/F3-Zellen bei 3,3 pg/ml (0,3 pM) er reicht. In dem mpl-Rezeptor-vermittelten ELISA wurde halb maximale Aktivität bei 1,9 ng/ml (120 pM) gefunden. In nor malen und myelo-supprimierten Tieren, die durch fast-letale Röntgenbestrahlung produziert wurden, war TPO (Met-¹ 1-153) hoch wirksam (Aktivität wurde bei so niedrigen Dosen wie 30 ng/Maus beobachtet), die Produktion von neuen Blutplättchen zu stimulieren.

Beispiel 23 Produktion von weiteren biologisch aktiven TPO-Varianten in E.coli

Drei weitere TPO-Varianten, die in E.coli hergestellt, ge reinigt und in biologisch aktive Formen rückgefaltet wurden, werden nachstehend bereitgestellt.

(1) MLF - 13 Reste von der bakteriell abgeleiteten Signalse quenz STII werden an die N-terminale Domäne des TPO (Reste 1-155) fusioniert. Die resultierende Sequenz ist MKKNIAFLLNAYASPAPPAC . . . . . CVRRA (SEQ ID NO: 85)worin die Leader-Sequenz unterstrichen ist und C . . . . . . C Cys⁷ bis Cys¹⁵¹ darstellt. Diese Variante wurde konstruiert, um ein Tyrosin für die Radio-Iodierung des TPO für Rezeptor- und biologische Untersuchungen bereitzustellen.
(2) H8MLF - 7 Reste von der STII-Sequenz, 8 Histidinreste und die Enzym-Schnittsequenz IEGR des Faktors Xa werden an die N-terminale Domäne (Reste 1-155) des TPO fusioniert. Die Sequenz ist MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC . . . . . CVRRA (SEQ ID NO: 86)worin die Leader-Sequenz unterstrichen ist und C . . . . . C Cys⁷ bis Cys¹⁵¹ darstellt. Diese Variante kann, wenn sie gereinigt und rückgefaltet ist, mit dem Enzym Faktor Xa behandelt werden, das hinter dem Argininrest der Sequenz IEGR schnei den wird, wodurch sich eine 155 Reste lange TPO-Variante mit einem natürlichen Serin als N-terminale Aminosäure ergibt.
(3) T-H8MLF - wird wie vorstehend für die Variante (2) be schrieben, hergestellt, außer daß eine Thrombin-sensitive Sequenz IEPR an die N-terminale Domäne des TPO fusioniert wird. Die resultierende Sequenz ist MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC . . . . . CVRRA (SEQ ID NO: 87)worin die Leader-Sequenz unterstrichen ist und C . . . . . C Cys⁷ bis Cys¹⁵¹ darstellt. Diese Variante kann nach Reinigung und Rückfaltung mit dem Enzym Thrombin behandelt werden, um eine 155 Reste lange Variante des TPO mit einem natürlichen N- Terminus zu erzeugen.

A. Gewinnung, Solubilisierung und Reinigung der monomeren, biologisch aktiven TPO-Varianten (1), (2) und (3)

Alle Varianten wurden in E.coli exprimiert. Die Mehrzahl der Varianten wurden in brechenden Körpern gefunden, wie in Bei spiel 22 für TPO (Met^-1 1-153) beobachtet wurde. Identische Verfahren für die Gewinnung, Solubilisierung und Reinigung der monomeren TPO-Varianten, wie in Beispiel 22 beschrieben, wurden angewendet. Rückfaltungsbedingungen, die zu denjeni gen identisch sind, die für TPO (Met^-1 1-153) verwendet wor den sind, wurden mit Gesamtausbeuten von 30-50% verwendet. Nach dem Rückfalten wurden die TPO-Varianten durch C4-Um kehrphasen-Chromatographie in 0,1% TFA gereinigt, wobei ein Acetonitril-Gradient, wie vorstehend beschrieben, verwendet wurde. Alle TPO-Varianten (in ihren nicht-proteolysierten Formen) besaßen biologische Aktivität, wie durch den Ba/F3- Assay bestimmt wurde, mit halbmaximalen Aktivitäten von 2-5 pM.

B. Proteolytische Prozessierung der Varianten (2) und (3) zur Erzeugung von authentischem, N-terminalen TPO (1-155)

Die vorstehend beschriebenen TPO-Varianten (2) und (3) wur den mit einem enzymatisch schneidbaren Leader-Peptid vor dem normalen N-terminalen Aminosäurerest des TPO entworfen. Nach Rückfaltung und Reinigung der Varianten (2) und (3), wie vorstehend beschrieben, wurde jede einem Verdau mit dem ge eigneten Enzym ausgesetzt. Für jede Variante wurde das Ace tonitril aus dem C4-Umkehrphasenschritt dadurch entfernt, daß ein sanfter Stickstoffstrom auf die Lösung geblasen wurde. Danach wurden die zwei Varianten mit entweder Faktor Xa oder Thrombin, wie nachstehend beschrieben, behandelt.

Für die TPO-Variante (2) wurde 1 M Tris-Puffer, pH 8, zu einer Endkonzentration von 50 mM zu der Acetonitril-freien Lösung zugegeben und der pH wurde, falls notwendig, auf 8 eingestellt. NaCl und CaCl₂ wurden zu 0,1 M bzw. 2 mM zuge fügt. Faktor Xa (New England Biolabs) wurde so zugegeben, daß ungefähr ein Molverhältnis von Enzym zu Variante von 1 : 25 bis 1 : 100 erreicht wurde. Die Probe wurde bei Raumtem peratur für 1-2 h inkubiert, um eine maximale Spaltung zu er reichen, wie durch eine Veränderung hinsichtlich der Wande rung in SDS-Gelen bestimmt wurde, was den Verlust der Leader-Sequenz anzeigt. Danach wurde die Reaktionsmischung durch C4-Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung des selben Gradienten und derselben Bedingungen, wie sie vorste hend für die Reinigung der richtig gefalteten Varianten be schrieben wurden, gereinigt. Nicht-geschnittene Variante B wurde von der geschnittenen Variante (2) durch diese Bedin gungen abgetrennt. Es wurde gezeigt, daß die N-terminalen Aminosäuren SPAPP sind, was anzeigt, daß die Entfernung der N-terminalen Leader-Sequenz erfolgreich war. Der Faktor Xa erzeugte auch variable Mengen einer internen Spaltung inner halb der TPO-Domäne; die Spaltung wurde hinter dem Agenin rest bei der Positionsnummer 118 beobachtet, wodurch eine zusätzliche N-terminale Sequenz von TTAHKDP (SEQ ID NO: 88) erzeugt wurde. In nicht-reduzierenden SDS-Gelen wurde eine einzelne Bande bei ungefähr 17 000 Dalton für die Faktor Xa geschnittene Variante beobachtet; in reduzierenden Gelen wurden zwei Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 12 000 und 5000 Dalton gesehen, was vereinbar mit einer Spal tung am Arginin 118 ist. Diese Beobachtung bestätigte auch, daß die zwei Molekülteile durch eine Disulfidbindung zwi schen dem ersten und vierten Cysteinrest zusammengehalten werden, wie aus den vorstehend beschriebenen tryptischen Verdauexperimenten geschlossen wurde. In dem biologischen Ba/F3-Assay besaß die gereinigte TPO (1-155)-Variante nach Entfernung der N-terminalen Leader-Sequenz und mit der in ternen Spaltung eine halbmaximale Aktivität von 0,2 bis 0,3 Picomolar. Die intakte Variante mit der Leader-Sequenz besaß eine halbmaximale Aktivität von 2-4 Picomolar.

Für die Variante (3) war der Spaltungspuffer zusammengesetzt aus 50 mM Tris, pH 8,2% CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA und hu manem oder Rinder-Thrombin (Calbiochem) zu 1 : 25 bis 1 : 50 von Enzym zu TPO-Variantenprotein auf der Grundlage des Ge wichts. Die Spaltung wurde bei Raumtemperatur für 2-6 Stun den durchgeführt. Das Fortschreiten der Spaltung wurde durch SDS-Gele bestimmt, wie vorstehend für die Faktor Xa-Spal tungsreaktion beschrieben wurde. Gewöhnlich wurde mehr als 90% Spaltung der Leader-Sequenz erreicht. Das resultierende TPO wurde über C4-Umkehrphasen-Säulen gereinigt, wie vorste hend beschrieben wurde, und es wurde durch Aminosäure-Se quenzierung gezeigt, daß dieses den gewünschten N-Terminus besitzt. Nur ein geringer (<5%) Anteil einer internen Spal tung an derselben Arginin-Threonin-Bindung, wie sie vorste hend mit Faktor Xa beobachtet worden ist, wurde erhalten. Das resultierende TPO-Protein besaß eine hohe biologische Aktivität mit halbmaximalen Antworten in dem Ba/F3-Assay bei 0,2-0,4 Picomolar Protein. In dem mpl-Rezeptor-vermittelten ELISA bewirkte dieses Protein eine halbmaximale Antwort bei 2-4 ng/ml gereinigtem Protein (120-240 Picomolar), während die die Leader-Sequenz enthaltende intakte Variante in bei den Assays 5-10fach weniger wirksam war. Für die Tierversu che wurde das HPLC-gereinigte, geschnittene Protein in phy siologisch annehmbaren Puffern, mit 150 mM NaCl, 0,01% Tween-80 und 10 mM Natriumsuccinat, pH 5,5 oder 10 mM Natri umacetat, pH 5,5 oder 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 dialy siert. Durch HPLC und SDS-Gele wurde das gereinigte Protein für mehrere Wochen stabil, wenn es bei 4°C gelagert wurde. In normalen und myelo-supprimierten Mäusen war dieses gerei nigte TPO mit der authentischen N-terminalen Sequenz hoch wirksam, wobei die Produktion von Blutplättchen bei so nied rigen Dosen wie 30 ng/Maus stimuliert wurde.

Beispiel 24 Synthetischer mpl-Ligand

Obwohl der humane mpl-Ligand (hML) gewöhnlich unter Verwen dung von rekombinanten Verfahren hergestellt wird, kann er ebenso durch enzymatisches Ligieren synthetischer Peptid fragmente unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Ver fahren synthetisiert werden. Eine synthetische Produktion von hML erlaubt den Einbau unnatürlicher Aminosäuren oder synthetischer funktioneller Gruppen, wie Polyethylenglykol. Früher wurde eine Mutante der Serinprotease BPN, Subtiligase (S221C/P225A) entworfen und hergestellt, um Peptidester in wäßriger Lösung effizient zu ligieren (Abrahmsen et al., Bioch., 30 : 4151-4159 [1991]). Es ist jetzt gezeigt worden, daß synthetische Peptide in einer sequentiellen Weise en zymatisch ligiert werden können, um enzymatisch aktive, lange Peptide und Proteine, wie Ribonuclease A (Jackson et al., Science [1994]) herzustellen. Diese nachstehend genau beschriebene Technologie hat es uns ermöglicht, lange Pro teine chemisch zu synthetisieren, die früher nur mit rekom binanter DNA-Technologie hergestellt werden konnten.

Die allgemeine Strategie für eine hML₁₅₃-Synthese unter Ver wendung von Subtiligase ist gezeigt (Schema 1). Beginnend mit einem Peptid, dessen Schutzgruppen vollständig entfernt sind und das dem C-terminalen Fragment des Proteins ent spricht, wird ein N-terminal geschützter, C-terminal akti vierter Peptidester, zusammen mit Subtiligase zugegeben. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, wird das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und die Schutz gruppe vom N-Terminus entfernt. Das nächste Peptidfragment wird ligiert, die Schutzgruppen werden abgespalten und der Prozeß wird unter Verwendung der aufeinanderfolgenden Pep tide solange wiederholt, bis das Protein der vollen Länge erhalten wird. Das Verfahren ist ähnlich zur Festphasen- Methodik, in der ein N-terminal geschütztes, C-terminal ak tiviertes Peptid an den N-Terminus eines vorhergehenden Pep tids ligiert wird und das Protein in einer C-<N-Richtung synthetisiert wird. Da jedoch jede Verknüpfung zusätzlich bis zu 50 Reste ergibt, und die Produkte nach jeder Ligie rung isoliert werden, können viel längere, hochreine Pro teine in angemessenen Ausbeuten synthetisiert werden.

Schema 1. Strategie für die Synthese von hML unter Verwen dung von Subtiligase

Nach unseren Kenntnissen sowohl der Sequenzspezifität der Subtiligase als auch der Aminosäure-Sequenz der biologisch aktiven "Epo-Domäne" des hML, teilten wir hML₁₅₃in sieben 18-25 Reste lange Fragmente. Testligierungs-Tetrapeptide wurden synthetisiert, um geeignete Ligierungs-Verknüpfungen für die 18-25-mere zu bestimmen. Die Tabelle 13 zeigt die Ergebnisse dieser Testligierungen.

Tabelle 13

hML-Testligierungen. Donor- und nukleophile Peptide wurden gelöst zu 10 mM in 100 mM Tricin (pH 7,8) bei 22°C. Die Li gase wurde zu einer Endkonzentration von 10 µM, ausgehend von einer 1,6 mg/ml Stammlösung (ungefähr 70 µM) zugefügt, und die Ligierung ließ man über Nacht fortschreiten. Die Ausbeuten sind ausgedrückt als % Ligierung vs. Hydrolyse der Donorpeptide.

Auf der Grundlage dieser Experimente sollten die in Tabelle 14 gezeigten Ligierungspeptide durch die Subtilidase effizi ent ligiert werden. Eine geeignete Schutzgruppe für den N- Terminus jedes Donor-Peptidesters wurde benötigt, um Selbst ligierung zu verhindern. Wir wählten eine Isonicotinyl (iNOC)-Schutzgruppe (Veber et al., J. Org. Chem., 42 : 3286-3289 [1977]), weil diese wasserlöslich ist, in der letzten Stufe der Festphasen-Peptidsynthese eingebaut und gegenüber wasserfreier HF stabil ist, die verwendet wird, um die Schutzgruppen zu entfernen und die Peptide von dem Festpha senharz abzuspalten. Zusätzlich kann sie von dem Peptid nach jeder Ligierung unter milden, reduzierenden Bedingungen (Zn/CH₃CO₂H) entfernt werden, um einen freien N-Terminus für die nachfolgenden Ligierungen bereitzustellen. Ein Glykolat lysyl-amid (glc-K-NH₂)-ester wurde für die C-terminale Akti vierung basierend auf frühere Experimente verwendet, die zeigten, daß dieser durch Subtiligase effizient acyliert wird. (Abrahmsen et al., Biochem., 30 : 4151-4159 [1991]). Die iNOC-geschützten glc-K-Amid-aktivierten Peptide können unter Anwendung von Standard-Festphasenverfahren, wie ausgeführt (Schema 2), synthetisiert werden. Die Peptide werden danach sequentiell ligiert, bis das vollständige Protein herge stellt ist, und das Endprodukt wird in vitro rückgefaltet. Auf der Grundlage der Homologie mit EPO wird vermutet, daß die Disulfidpaare zwischen den Cysteinresten 7 und 151 und zwischen 28 und 85 gebildet werden. Die Oxidation der Disul fide kann dadurch erreicht werden, daß das reduzierte Mate rial unter einer Sauerstoffatmosphäre für mehrere Stunden einfach gerührt wird. Das rückgefaltete Material kann danach durch HPLC gereinigt, und die das aktive Protein enthalten den Fraktionen vereinigt und lyophilisiert werden. Als eine Alternative können die Disulfide differenziell geschützt werden, um eine sequenzielle Oxidation zwischen spezifischen Disulfidpaaren zu kontrollieren. Ein Schutz der Cystein 7 und 151 mit Acetamidomethyl (acm)-Gruppen würde die Oxida tion von 28 und 85 gewährleisten. Die acm-Gruppen könnten danach entfernt und die Reste 7 und 151 oxidiert werden. Um gekehrt könnten die Reste 28 und 85 acm-geschützt und oxi diert werden, wenn eine sequentielle Oxidation für das kor rekte Falten benötigt wird. Wahlweise können die Cystein 28 und 85 durch einen natürlichen oder unnatürlichen Rest, der von Cys verschieden ist, substituiert werden, um eine kor rekte Oxidation der Cysteine 7 und 151 zu gewährleisten.

Tabelle 14 Peptidfragmente, die für die Gesamtsynthese des h-ML unter Verwendung der Subtiligase verwendet werden Fragment Sequenz

1 (SEQ ID NO: 110)
iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH₂ (1-22)
2 (SEQ ID NO: 111)
iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH₂ (23-46)
3 (SEQ ID NO: 112)
iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH₂ (47-69)
4 (SEQ ID NO: 113)
iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH₂ (70-90)
5 (SEQ ID NO: 114)
iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH₂ (90-106)
6 (SEQ ID NO: 115)
iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH₂ (107-128)
7 (SEQ ID NO: 116)
H₂N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO₂ (129-153)

Die Peptidligierungen werden bei 25°C in 100 mM Tricin, pH 8 (frisch hergestellt und durch Vakuumfiltration durch ein 5 µm-Filter entgast) durchgeführt. Typischerweise wird das C- terminale Fragment in Puffer (2-5 mM Peptid) gelöst und eine 10× Stammlösung der Subtiligase (1 mg/ml in 100 mM Tricin, pH 8) zugefügt, um die Enzymendkonzentration auf ungefähr 5 µm zu bringen. Ein 3-5 molarer Überschuß des glc-K-NH₂-akti vierten Donorpeptids wird danach als Feststoff zugegeben, gelöst, und die Mischung bei 25°C stehengelassen. Die Ligie rungen wurden durch analytische Umkehrphasen-C18 HPLC (CH₃CN/H₂O-Gradient mit 0,1% TFA) überwacht. Die Ligierungs produkte werden durch präparative HPLC gereinigt und lyophi lisiert. Die Abspaltung der Isonicotinyl (iNOC)-Gruppen wurde dadurch durchgeführt, daß HCl-aktivierter Zinkstaub mit dem geschützten Peptid in Essigsäure gerührt wurde. Der Zinkstaub wird durch Filtration entfernt und die Essigsäure unter Vakuum abgezogen. Das resultierende Peptid kann direkt in der nächsten Ligierung verwendet werden, und das Verfah ren wird wiederholt. Synthetischer hML₁₅₃ kann durch Verfah ren, die analog zu denjenigen sind, die vorstehend beschrie ben wurden, an den synthetischen oder rekombinanten hML_154-332) ligiert werden, um synthetischen oder halbsynthetischen hML voller Länge herzustellen.

Synthetischer hML besitzt viele Vorteile gegenüber rekombi nantem. Unnatürliche Seitenketten können eingeführt werden, um die Wirksamkeit oder Spezifität zu verbessern. Funktio nelle Polymergruppen, wie Polyethylenglycol, können einge baut werden, um die Wirkungsdauer zu verbessern. Zum Bei spiel kann Polyethylenglycol an Lysinreste der einzelnen Fragmente (Tabelle 14) angehängt werden, bevor oder nachdem ein Ligierungsschritt oder mehrere durchgeführt worden sind. Protease-sensitive Peptidbindungen können entfernt oder ver ändert werden, um die Stabilität in vivo zu verbessern. Zu sätzlich können Schweratomderivate als Hilfe bei der Struk turbestimmung synthetisiert werden.

Schema 2. Festphasensynthese der Peptidfragmente für die Segment-Ligierung

a) Lysyl-paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz 1 (0,63 meq./g. Advanced ChemTech) wird für ein Stunde bei 25°C mit Bromessigsäure (5 eq.) und Diisopropylcarbodiimid (5 eq.) in Dimethylacetamid (DMA) gerührt, um das Bromacetyl-Derivat 2 herzustellen. b) Das Harz wird gründlich mit DMA gewaschen, und die einzelnen Boc-geschützten Aminosäuren (3 eq., Bachem) werden durch Rühren mit Natriumbicarbonat (6 eq.) in Dimethylformamid (DMF) für 24 h bei 50°C esterifiziert, um das entsprechende Glykolat-phenylalanyl-amid-Harz 3 herzu stellen. Das Amino-acetylierte Harz 3 wird mit DMF (3×) und Dichlormethan (CH₂Cl₂) (3×) gewaschen und kann bei Raumtem peratur mehrere Monate lang gelagert werden. Das Harz 3 kann danach in ein automatisiertes Peptid-Synthesegerät (Applied Biosystems 430A) eingebracht und die Peptide unter Verwen dung von Standard-Festphasenverfahren (5) elongiert werden. c) Die N-α-Boc-Gruppe wird mit einer Lösung von 45% Tri fluoressigsäure in CH₂Cl₂ entfernt. d) Nachfolgende Boc-ge schützte Aminosäuren (5 eq.) werden unter Verwendung von Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)phosphonium hexafluorphosphat (BOP, 4 eq.) und N-Methylmorpholin (NMM, 10 eq.) in DMA voraktiviert und für 1-2 h verknüpft. e) Die letzte N-α-Boc-Gruppe wird entfernt (TFA/CH₂Cl₂), um 4 her zustellen und die Isonicotinyl (iNOC)-Schutzgruppe wird wie vorstehend (4) beschrieben durch Rühren mit 4-Isonicotinyl2- 4-dinitrophenylcarbonat (3 eq.) und NMM (6 eq.) in DMA bei 25°C für 24 h eingeführt. f) Die Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen des Peptids durch Behandlung mit wasserfreier HF (5% Anisol/5% Ethylmethylsulfid) bei 0°C für eine Stunde ergibt das iNOC-geschützte, Glycolat-lys-amid-aktivierte Peptid 5, welches durch Umkehrphasen-18-HPLC (CH₃CN/H₂O-Gra dient, 0,1% TFA) gereinigt wird. Die Identität aller Sub trate wird durch Massenspektrometrie bestätigt.

Die Erfindung, wie sie beansprucht wird, ist in Übereinstim mung mit der vorstehenden Beschreibung und den leicht er hältlichen Referenzen und Ausgangsmaterialien durchführbar. Trotzdem haben die Anmelder die nachstehend aufgelistete Zellinie bei der American Type Culture Collection, Rock ville, Md., USA (ATCC) hinterlegt:
Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmpl I 1,8, ATCC-Hinterlegungs- Nr.CRL 69575, hinterlegt am 24. Februar 1994.
Plasmid, pSVI5. ID.LL.MLORF, ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL 75958, hinterlegt am 2. Dezember 1994 und
CHO DP-12-Zellen, ML 1/50 MCB (markiert # 1594), ATCC-Hin terlegungs-Nr. CRL 11770, hinterlegt am 6. Dezember 1994.

Diese Hinterlegung wurde nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung, der Hinterlegung von Mikro organismen für die Zwecke von Patentverfahren und den be treffenden Vorschriften (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies gewährleistet die Zugänglichkeit einer lebenden Kultur für 30 Jahre nach dem Hinterlegungstag. Der Organismus wird durch die ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Ver trags zugänglich gemacht.

Claims

1. Isoliertes, im wesentlichen homogenes mpl-Ligandenpoly peptid.

2. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) einem Polypeptidfragment;
(b) einer Polypeptidvariante; und
(c) einem chimären Polypeptid.

3. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) dem Polypeptid, das aus einem Säuger isoliert wird;
(b) dem Polypeptid, das mit rekombinanten Mitteln her gestellt wird; und
(c) dem Polypeptid, das mit synthetischen Mitteln her gestellt wird.

4. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) dem Polypeptid, das menschlich ist; und
(b) dem Polypeptid, das in einem Menschen nicht immuno gen ist.

5. Isolierter, im wesentlichen homogener mpl-Agonist, dadurch gekennzeichnet, daß:

(a) der Agonist den Einbau von markierten Nukleotiden (³H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3- Zellen, die mit humanem mpl P transfektiert sind, stimuliert; oder
(b) der Agonist den ³⁵S-Einbau in zirkulierende Plätt chen in einem Plättchen-Rebound-Assay stimuliert.

6. Polypeptidfragment nach Anspruch 2, dargestellt durch X-hTPO(7-151)-Yworin
hTPO(7-151) darstellt die humane TPO (hML)-Aminosäure sequenz von einschließlich Cys⁷ bis Cys¹⁵¹
X darstellt eine Aminogruppe aus Cys⁷ oder einem amino terminalen Aminosäurerest(en) ausgewählt aus der Gruppe Y stellt dar die carboxyterminale Gruppe von Cys¹⁵¹ oder carboxyterminaler bzw. carboxyterminale Aminosäure rest(e) ausgewählt aus der Gruppe und aminoterminaler bzw. aminoterminale Aminosäure rest(e)-Verlängerungen umfassend eine oder mehrere Reste 176-332 von humanem ML, wie dargestellt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

7. Ein Polypeptidfragment nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe TPO(1-153) und TPO(1-245).

8. Ein Polypeptidfragment nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptidfragments umfaßt SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL
(SEQ ID NO: 110)
HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF,
(SEQ ID NO: 111)
SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL,
(SEQ ID NO: 112)
LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL.
(SEQ ID NO: 113)
GQLSGQVRLLLGALQS
(SEQ ID NO: 114)
LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF
(SEQ ID NO: 115)
LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR,
(SEQ ID NO: 116)und Kombinationen davon.

9. Polypeptid nach Anspruch 6, das nicht glycosyliert ist.

10. Isoliertes Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die unter moderat stringenten Bedin gungen hybridisiert an das Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleinsäuresequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

11. Polypeptid nach Anspruch 11, das biologisch aktiv ist.

12. Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe hML, hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mMl, mML2, mML3, pML und pML2.

13. Polypeptid nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfaßt Aminosäurereste 1 bis X aus Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), worin X ausgewählt ist aus der Gruppe 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 und 332.

14. Isoliertes, im wesentliches homogenes mpl-Ligandenpoly peptid, das mindestens 80% Sequenzidentität mit dem Polypeptid nach Anspruch 13 teilt.

15. Polypeptid nach Anspruch 13, worin X 153 ist.

16. Die Chimäre, umfassend den mpl-Liganden aus Anspruch 13, fusioniert an ein heterologes Polypeptid.

17. Die Chimäre nach Anspruch 16, worin das heterologe Polypeptid ein Immunglobulinpolypeptid ist.

18. Die Chimäre nach Anspruch 16, worin das heterologe Polypeptid ein Interleukinpolypeptid ist.

19. Eine Chimäre umfassend die N-terminalen Reste 1 bis ungefähr 153 bis 157 von hML, substituiert mit einem oder mehreren, aber nicht allen, der humanen EPO-Reste, angefügt oder substituiert in den N-terminalen Resten von hML an Positionen, die der Ausrichtung (alignment), wie in Fig. 10 gezeigt, entsprechen.

20. Ein Antikörper, der das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 13 binden kann.

21. Eine Hybridomzellinie, die den Antikörper nach Anspruch 20 herstellt.

22. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das das mpl-Ligan denpolypeptid von Anspruch 1 kodiert.

23. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das das mpl-Ligan denpolypeptid nach Anspruch 13 kodiert.

24. Isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend die Nuklein säuresequenz mit dem offenen Leseraster, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

25. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, das kodiert ein mpl-Ligandenpolypeptid, ausgewählt aus der Gruppe hML, hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mMl, mML2, mML3, pML und pML2.

26. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) einem cDNA-Klon, umfassend die Nukleotidsequenz der kodierenden Region des mpl-Ligandengens;
(b) einer DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingun gen an einen Klon aus (a) hybridisieren kann; und
(c) einer genetischen Variante von einer der DNA- Sequenzen aus (a) und (b), die für ein Polypeptid kodiert, das eine biologische Eigenschaft eines natürlich vorkommenden mpl-Ligandenpolypeptids besitzt.

27. Ein isoliertes DNA-Molekül mit einer Sequenz, die an eine DNA-Sequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), unter moderat stringenten Bedingungen hybridisieren kann, worin das DNA-Molekül ein biologisch aktives mpl- Ligandenpolypeptid kodiert.

28. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 25, das weiterhin umfaßt einen Promotor, der funktionsfähig mit dem Nukleinsäuremolekül verknüpft ist.

29. Expressionsvektor umfassend die Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 25, funktionsfähig verknüpft mit Kontroll sequenzen, die von einer Wirtszelle erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert ist.

30. Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 29.

31. Ein Verfahren unter Verwendung eines Nukleinsäuremole küls, das für das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, um die Herstellung des mpl-Ligandenpolypeptids zu bewir ken, umfassend Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 30.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin das mpl-Ligandenpoly peptid aus der Wirtszelle gewonnen wird.

33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das mpl-Ligandenpoly peptid aus dem Wirtszellkulturmedium gewonnen wird.

34. Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von mpl- Ligandenpolypeptid, umfassend Hybridisieren von DNA, die für das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäureanalysenprobe und Bestimmen der Anwesenheit von DNA für das mpl-Ligandenpolypeptid.

35. Ein Verfahren zum Vermehren einer Nukleinsäureanalysen probe umfassend Starten (priming) einer Nukleinsäure polymerasereaktion mit Nukleinsäure, die für ein mpl- Ligandenpolypeptid kodiert.

36. Zusammensetzung umfassend das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

37. Verwendung eines mpl-Ligandenpolypeptids nach Anspruch 1 zum Behandeln eines Säugers mit oder mit einem Risiko für Thrombozytopenie.

38. Zusammensetzung nach Anspruch 36, die weiterhin umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge eines Agenzes ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Zytokin, Kolonie stimulierender Faktor und Interleukin.

39. Zusammensetzung nach Anspruch 38, worin das Agenz aus gewählt ist aus KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 und IL-11.