SA95150635B1 - ثرومبوبواييتين thrombopoietin (عامل مولد للصفائح الدموية ) - Google Patents

Abstract

الملخص: يتعلق الاختراع الحالي بالكشف عن طرق لعزل عامل التخثر (thrombopoietin (TPO والحامض النووي DNA الذي يحمل المورث encoding لل TPO وطرق لتحضير وتنقية TPO إما بطريقة ال DNA المأشوب recombinant أو البناء الاصطناعي synthetic . وأيضا تم إيضاح أن هناك بأشكال مختلفة من ال TPO تؤثر في عملية بناء ال DAN replication وتؤثر في التميز differentiation ونضوج خلايا الدم وخاصة ال megakaryocytes والخلايا المنتجة لها megakaryocyte progenitor. وعليه فإن هذه المركبات يمكن استخدامها لمعالجة مرضى نقص صفائح الدم thrombocytopenia.

Description

‎Y —‏ _— ثرومبوبوايتين ‎Jule) thrombopoietin‏ مولد للصفائح الدموية) الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق هذا الاختراع بعزل وتنقية المأشوب والبناء بطريقة ال ‎recombinant DNA‏ أو البناء الكيميائي للبروتينات ‎chemical synthesis of proteins‏ التي تؤثر على استمرارية ‎survival‏ أو تكاثر أو تميز أو نضج الخلايا المكونة للدم ‎hematopoietic cells‏ ؛ وبصفة خاصة الخلايا ° المولدة للصفائح الدموية ‎platelet progenitor cells‏ . يتعلق هذا الاختراع بصفة خاصة بالتنسيل ‎cloning‏ والتعبير الجيني ‎expression‏ لمركب ‎protein ligand‏ بروتيني قادر على الارتباط مع وتنشيط ‎empl‏ وهو أحد أعضاء الفصيلة الواسعة لمستقبل السيتوكين ‎cytokine receptor‏ ‎superfamily‏ يتعلق هذا الاختراع علاوة على ذلك باستخدام هذه البروتينات بمفردها أو في توليفة مع سيتوكينات ‎cytokines‏ أخرى لعلاج الاضطرابات المناعية ‎immune‏ أو إضرابات ‎٠‏ تكون خلايا الدم والصفائح الدموية ‎Lay‏ في ذلك نقص الصفائح الدموية ‎-thrombocytopenia‏ ‎١‏ - نظام تكوين الخلايا والصفائح الدموية ‎Hematopoietic System‏ : ينتج نظام تكوين خلايا الدم ‎LAY‏ الناضجة عالية التخصصية المعروفة بأنها ضرورية لبقاء كل الثدييات على قيد الحياة. تشتمل هذه الخلايا الناضجة على: الخلايا الحمراء ‎erythrocytes‏ ؛ وهي متخصصة لنقل ‎oxygen‏ و ‎carbon dioxide‏ ؛ والخلايا اللمفية ‎lymphocytes‏ 1 و5 ¢ وهي ‎Vo‏ مسئولة عن الاستجابات المناعية المحدثة بواسطة الخلية والجسم المضاد ‎antibody-mediated‏ ‎immune responses‏ » والصفائح الدموية ‎platelets‏ أو خلايا التجلط ‎thrombocytes‏ ؛ وهي مخصصة لتكوين جلطات دموية ‎blood clots‏ ؛ والخلايا المحببة ‎granulocytes‏ والخلايا الأكلة

دسم الضخمة ‎macrophages‏ ¢ وهي متخصصة ‎LAS‏ خاطفة ‎scavengers‏ وخلايا مساعدة لمكافحة العدوى. يتم علاوة على ذلك تقسيم ‎LAN‏ المحببة إلى: ‎LIA‏ بيضاء متعادلة ‎neutrophilis‏ وخلايا ‎eosinophils‏ وخلايا محبة للقاعدية ‎basophils‏ وخلايا بدنيةٍ ‎mast cells‏ « وهي أنواع خلايا متخصصة ذات وظائف منفصلة. بصورة ملحوظة؛ يتم اشتقاق كل ‎LDA‏ الدم الناضجة المتخصصة هذه من نوع خلية أولية مفردة عادية يشار إليها ‎a uly‏ الخلية الجذعية ‎stem cell‏ متعددة ‎pluripotent‏ (أو ذات تناسل شامل ‎«(totipotent‏ موجودة أساسا في نخاع العظام ‎bone‏ ‎(Dexter et al, Ann.

Rev.

Cell Biol,, 3: 423-441 [1 987]) marrow‏ . يجب أن يتم إنتاج خلايا الدم عالية التخصص الناضجة بأعداد كبيرة وبصورة مستمرة على مدى حياة الكائن الثديي. ومن المقدر أن تظل الغالبية العظمى من خلايا الدم المتخصصة هذه فعالة في تأدية وظيفتها لساعات ‎٠‏ قليلة فقط. أو إلى أسابيع )]1976[ 263-284 :2 ‎(Cronkite et al., Blood Cells‏ بذلك؛ يكون التجديد المستمر لخلايا الدم الناضجة والخلايا الجذعية الأولية نفسها؛ وأيضاً أي سلالات خلايا وسيطة أو سلفية لسلالة واقعة بين الخلايا الأولية والناضجة ‎lineage-committed progenitor cell‏ ‎٠‏ ضرورياً من أجل الحفاظ على احتياجات خلايا الدم للحالة المستقرة الطبيعية للكائن الثديي. في قلب نظام تكوين الدم تقع الخلية أو الخلايا الجذعية متعددة التناسلية. تكون هذه الخلايا ‎ALE‏ ‎١‏ في العدد نسبياً وتخضع لتجديد ذاتي بواسطة التكاثر لإنتاج خلايا جذعية وليدة أو يتم تحويلهاء في سلسلة من خطوات تميزية ‎differentiation‏ ¢ إلى خلايا سلفية ناضجة مقيدة السلالة بصورة تزايدية؛ مكونة في النهاية خلية أو خلايا دم ناضجة عالية التخصص. على سبيل ‎Jha‏ تخضع ‎LWA‏ سلفية ‎progenitor cells‏ متعددة السلالة ؛ يشار إليها باسم خليط ‎CFC-Mix‏ ؛ مشتقة من الخلايا جذعية للتكاثر (تجديد ذاتي) والتطوير لإنتاج مستعمرات ‎colonies ٠‏ محتوية على كل أنواع الخلايا التخاعية ‎myeloid cells‏ ؛ والخلايا الحمراء

م ‎«erythrocytes‏ و ‎neutrophils‏ وخلايا نقيية كبيرة ‎megakaryocytes‏ (جدود الصفائح) وخلايا أكلة ضخمة ‎basophils WA macrophages‏ محبة للقاعدية وخلايا ‎eosinophils‏ وخلايا بدنية ‎mast‏ ‎cells‏ تخضع خلايا سلفية أخرى من السلالة اللمفية ‎lymphoid lineage‏ للتكاثر والتطور إلى خلايا ‎T‏ وخلايا — 3 ‎-T-cells and B-cells‏ © بصورة إضافية؛ بين الخلايا السلفية لخليط ‎CFC-Mix‏ والخلايا النخاعية تقع رتبة أخرى من الخلايا السلفية ذات إلتزام وسيط لذرياتها. يتم تصنيف خلايا السلفية المقيدة للسلالة هذه على أساس الذرية التي تنتجها. بذلك؛ تكون الأسلاف الوسيطة المعروفة للخلايا النخاعية هي: وحدات تكوين مستعمرة حمراء ‎LAY‏ الحمراء ‎erythroid colony-forming units (CFU-E)‏ وخلايا تكوين مستعمرة خلايا محببة / خلايا أكلة ضخمة ‎granulocytelmacrophage colonyforming‏ ‎cells (GM-CFC) ٠‏ للخلايا ال ‎eosinophils‏ والخلايا ‎megakaryocyte‏ ؛ وخلايا تكوين مستعمرة خلايا نقيية كبيرة ‎megakaryocyte colonyforming cells (Meg-CFC)‏ وخلايا تكوين مستعمرة خلايا سهلة الاصطباغ بالأيرسين ‎eosinophil coiony-forming cells (EosCFC)‏ للخلايا سهلة الاصطباغ بالأيوسين وخلايا تكوين مستعمرة ‎LA‏ محبة للقاعدية ‎basophil colony-torming‏ ‎(Bas-CFC)‏ وااهعلخلايا البدن ‎mast cells‏ والخلايا السلفية الوسيطة ‎intermediate predecessor‏ ‎cells ١‏ الأخرى بين الخلايا الجذعية متعددة السلالة وخلايا الدم الناضجة معروفة (راجع ما يلي) أو من المحتمل أن يتم اكتشاف أن لها درجات متعددة من تقييد السلالة بالخط السلالي ‎lineage-‏ ‎restnctlon‏ وقدرة التجديد الذاتي. يبدو أن المبدأ الأساسي لنظام خلايا تكوين الدم الطبيعي هو تقليل القدرة على التجديد الذاتي وفقدان التعدد السلالي وتحديد الخط السلالي عند إكتساب النضج. بذلك؛ في أحد أطياف خلايا © تكوين الدم تقع خلايا جذعية متعددة السلالة التي تمتلك القدرة على التجديد الذاتي والتمايز لتعطي

Ce —

كل الخلايا السلفية المختلفة الخاصة بسلالة محددة. تعتبر هذه القدرة هي أساس علاج زرع نخاع العظم ‎bone marrow transplant‏ حيث تعيد الخلايا الجذعية الأولية إنتاج نظام خلايا تكوين الدم الكلية. يقع عند الطرف الآخر للطيف أسلاف السلالة المقيدة بشدة وذريتها التي فقدت القدرة على التجديد الذاتي ولكن تكتسب نشاطاً وظيفياً ناضجاً.

© يتم بعناية التحكم في تكاثر وتطور الخلايا الجذعية وخلايا أسلاف السلالات المقيدة وذلك بواسطة تشكيلة من عوامل أو سيتوكينات نمو تكوين الدم ‎-hematopoietic growth factors or cytokines‏ ودور عوامل النمو هذه في الكائن الحي ‎chine‏ وغير مفهوم بصورة كاملة: تكون بعض عوامل النموء مثل ‎interleukin-3 (IL-3)‏ ¢ قادرة على تحفيز كل من الخلايا الجذعية متعددة السلالة وأيضاً الخلايا السلفية الخاصة بسلالات متعددة؛ ‎Ly‏ في ذلك على سبيل المثال؛ خلايا كبيرة

‎megakaryocytes ٠‏ . ثم في البداية الاعتقاد أن عوامل أخرى مثل عامل تحفيز مستعمرة خلايا حبيبية / خلايا أكلة ضخمة ‎granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CS F)‏ هي عوامل يقصر تأثيرها على 60-0709 فقط . بعد ذلك؛ على أي حال تم اكتشفاف أن ‎GM-‏ ‎CSF‏ مؤثرة أيضاً على تكاثر وتطور خلايا نقيية كبيرة ضمن خلايا أخرى ‎interalia‏ ‎.megakaryocytes‏ بذلك؛ تم اكتشاف أن ل 11-3 ‎GM-CSF‏ أنشطة حيوية مترادفة ؛ بالرغم من

‎¢ interleukin-1 1 (IL-11) interleukin-6 (IL-6) ‏أنها ذات فعالية مختلفة. حالياً؛ يعمل كل من‎ yo ‏إلا أنها تعمل‎ cmeg-colony ‏بينما لا يكون لأي منهما تأثير بمفرده على تكوين مستعمرة ضخمة‎ (Yonemura et megakaryocytes ‏الكبيرة‎ ddl) ‏بصورة تعاونية مع 11-3 لتحفيز نضج الخلايا‎ -al., Exp.

Hematol., 20: 1011-1016 [1992])

بذلك قد تؤثر عوامل نمو تكوين الدم على نمو وتميز سلالة واحدة أو أكثرء وقد تترادف مع عوامل نمو أخرى في التأثير على سلالة خلية سلفية مفردة؛ أو قد تعمل بصورة تعاونية مع عوامل أخرى. يبدو ‎Lad‏ أن عوامل نمو تكوين الدم يمكن أن تبدى تأثيرها في مراحل مختلفة من تطور خلية من م الخلايا الجذعية متعددة السلالة من الخلايا سلفية ذات خط محدد إلى خلية الدم الناضصجة. على سبيل المثال؛ يبدو أن ‎erythropoietin (epo)‏ يحفز التكاثر فقط لأسلاف الخلايا الحمراء الناضجة ‎mature erythroid progenitor cells‏ يبدو أن 3 يعطي تأثيره مبكراً ومؤثراً بذلك على ‎Lol‏ ‏الجذعية الأولية وخلايا أسلاف وسيطة مقيدة السلالة. قد تؤثر عوامل نمو أخرى مثل عامل الخلية الجذعية ‎(SCF)‏ على التطور الأولى للخلية أيضاً. 1 مما سبق سيتم إدراك أن عوامل نمو تكوين الدم المنفردة التي تؤثر على البقاء على الاستمرارية أو تكاثر أو النضج لأي من خلايا الدم أو أسلافها تكون ‎ade‏ وبصفة خاصة للمساعدة في إعادة إنشاء نظام تكوين الدم الذي قد سبق وتأثر سلباً بسبب مرض معين أو بعد علاج بالإشعاع أو علاج كيميائي ‎-chemo-therapy‏ ‏" - تكوين الخلايا النقيية الكبيرة - إنتاج صفائح دموية ‎Megakaryocytopoiesis - Platelet‏

Production Vo ‏وإنتاج الصفائح الدموية‎ megakaryocytopoiesis ‏تم استعراض تنظيم تكوين الخلايا النقيية الكبيرة‎ : ‏بواسطة‎ ‎Mazur, Exp. Hematol, 15: 248 [1987] and Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1 989]‏ بإيجاز؛ تتقسم الخلايا الجذعية متعددة ‎ADL‏ لنخاع العظام إلى سلالات ‎megakaryocytopoiesis‏

‎vy —‏ وخلايا حمراء وخلايا نخاعية. يعتقد وجود سلسلة من ‎LA‏ أسلاف ‎megakaryocytopoiesis‏ ‏المودعة بين الخلايا الجذعية و ‎-megakaryocytopoiesis‏ يتم تعيين ثلاث فئات على الأقل من خلايا أسلاف ‎megakaryocytopoiesis‏ « أي وحدة إنفجار ‎megakaryocytes (BFU-MK)‏ وخلايا نقبية كبيرة لتكوين مستعمرة ‎(CFU-MK)‏ وخلايا أسلاف ‎megakaryocytes‏ خفيفة ‎(LD-CFU-‏ ‏ل ‏مراحل على أساس معايير شكلية قياسية. يكون العضو الذي يمكن ملاحظته مبكراً من فصيلة ‎MK)‏ أى ‎(meg‏ هو الخلايا ‎megakaryocytes‏ تكون هذه الخلايا في البداية بقطر ‎Ye‏ إلى ‎٠١‏ ‏ميكرومتر ‎pm‏ ذات ‎cytoplasm‏ قاعدية وأنوية يشوبها قليلاً من عدم النظام بكروماتين ؛ وشبكي ‎reticular‏ بعض الشئ وعدة نويات :0021601 . بعد ذلك قد تحتوي > الكبيرة على حتى ‎VY‏ ‎٠‏ ثواة ‎(Sls «(ployploid)‏ يظل ‎cytoplasm‏ غير كثيف وغير ناضج. عندما يستمر النضج؛ تصبح النواة ذات فصوص ‎lobulate‏ أكثر ومكثفة ‎pyknotic‏ « ويزيد ال ‎cytoplasm‏ في الكمية ويصبح ‎ji]‏ ألفة ‎acidophilic‏ للحمض ومحبب ‎granular‏ قد تعطي الخلايا الأكثر ‎Laas‏ لهذه الفصيلة مظهر إطلاق ‎platelet release‏ الصفائح الدموية عند محيطها . بصورة معتادة؛ يكون أقل من ‎٠‏ من 1416 في مرحلة التجذع ‎blast‏ ويكون أكثر من 750 منها ناضجاً والتصنيفات الشكلية ‎ve‏ الاختيارية المطبقة بصورة شائعة على سلسلة ‎MK WA‏ هي: ‎megakaryoblast‏ للأولية منها ‎promegakaryocyte Lek‏ أو القاعدة للوسيطة ثم الشكل الناضج أو الحمضي المحبب المنتج للصفائح ‎(acidophilic, granular, or platelet-producing)‏ للأشكال الأخيرة من 1 11. تمد الخلايا ‎MK‏ فتائل من ‎cytoplasm‏ في الحيزات الحبيبية حيث تنفصل وتتكسر إلى صفائح دموية كل على حدة )972 1 ‎.(Williams et al., Hematology,‏

‎A —_‏ _ يعتقد أن تولد الخلايا ‎MK‏ يتضمن عوامل تنظيمية متعددة ل : ‎Williams et al., Br.

J.

Haematol., 52: 173 ] 1982 [ and Williams et al., J. cell Physiol.‏ ( )]1982[ 101 :110. يثم افتراض المستوى المبكر من تولد الخلايا ‎MK‏ على أنه يكون انقسامياً مهتماً بتكاثر الخلية © وتكوين المستعمرات من ‎CFUMK‏ ولكنه لا يتأثر بعدد الصفائح الدموية ل : ‎(Burstein et al, J.

Cell Physiol., 109: 333 [1981] and Kimura et al., Exp Hematol, 13:‏ )]1985[ 1048. إن المرحلة الأخيرة من النضج غير إنقسامية ‎mitotic‏ متضمنة مع زيادة تعدد المجموعة النووية ‎polyploidization‏ :01 والنضج السيتوبلازمي ‎cytoplasmic maturation‏ ومن المحتمل أن يتم ‎٠‏ تنظيمها في آلية عكسيةة ‎feedback mechanism‏ بواسطة عدد الصفائح الدموية في الدم ‎(Odell et al, Blood, 48: 765 [1976] and Ebbe et al, Blood. 32: 787 [1981 1‏ ان وجود عامل محدد للتحضير نمو مستعمرات خلايا ‎(MK.

CSF)‏ مشكوك فيه ‎(Mazur, Exp, Hematol, 15: 340-350 [1987])‏ من ناحية ثانية يعتقد معظم المؤلفين ان تنظيم عملية حيوية للبقاء كإنتاج صفائح دموية يكون بواسطة ‎cytokine(s)‏ والمسسئول على وجه ‎yo‏ الحصر عن هذه العملية. ‎dpa jill‏ بوجود ‎cytokines cytokine‏ محددة) خاصة ب خلايا ‎li‏ ‏كبيرة/ صفائح دموية ‎MK/platelet‏ وفرت الأساس لأكثر من ثلاثين عاما من البحث - ولكن لم يتم حتى الآن تنقية0م0:0م تحديد تسلسل الأحماض الأمينية ‎Jia‏ هذا ‎cytokine‏ ولم يحقق بالتجربة العملية على أنه المحفز ‎(TPO) MK-CSF‏ المنفرد.

بالرغم من أنه قد تم جزئيا تنقية 16-0575 من نقص مرض الصفائح الدموية ‎thrombocytopenia‏ المحدث تجريبياً )]1986[ 752 :14 ‎(Hill et al., Exp.

Hematol.,‏ من وسط مكيف بكلية جنين بشري ‎(McDonald et al., J.

Lab.

Ctin.

Med. 85: 59 [1975]) [CM]‏ ومن بول إنسان يشكو من أنيميا ‎plastic anemia‏ مشكلة ومن بول ومصل الدم عند مرضى مصابون ‎aly oo‏ الصفائح الدموية المتصف ببقع الجلد )]1983[ 556 :6 ‎(Kawakita et al, Blood,‏ ‎(Hoffman et al., J.

Clin.

Invest., 75: 1174 [1985],‏ ووظائفها الفسيولوجية لازالت غير معروفة حتى الآن في معظم الحالات. يتم استخدام الوسط المكيف لخلايا طحال منشطة بواسطة المسرطن المعروف ‎pokeweed‏ ‎(PWMSpCM)‏ وسلالة خلية نخاع أحادية فأرية ‎(WEHI-3CM) murine myelomonocyte‏ ‎٠‏ 17121113 كمقويات ‎MK WIA‏ يحتوي ‎PWM-SpCM‏ على عوامل معززة لنمو ‎CFU-MK‏ ‎(Metcalf et al, Pro.

Natl.

Acad Sci, USA, 72: 1744-1748 [1975], Quesenberry et al,‏ ‎Blood, 65: 214 [1985]; and Iscove, N,N, in Hemato poietic cell Differentiation, ICN-‏ ‎UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, vol. 10, Golde et al., eds, [New‏ ‎York, Academy press] pp 37-52 [1978])‏ ‎ o‏ أحدها هو ‎Jule 5 ¢ interleukin-3 (IL-3)‏ تحفيز مستعمرة متعددة السلالات ‎(Muli-CSF‏ ‎[Burstein, Blood Cells, 11: 469 [1986])‏ لم يتم حتى الآن تعيين وعزل العوامل الأخرى من هذا الوسط. ‎WEHL3‏ عبارة عن سلالة خلية نخاع أحادية فأرية تفرز كميات كبيرة نسياً من ‎IL-3‏ وكميات أصغر من ‎GM-CSF‏ ووجد أن 11-3 يقوى النمو لمدى واسع من خلايا تكوين الدم ‎(Thle et al, J.

Immunol, 13: 282 [1983])‏ تم أيضاً اكتشاف تعاون 11-3 مع الكثير من ‎٠‏ هرمونات ‎hormones‏ تكوين الدم المعروفة أو عوامل النمو ‎(Barteimez et al., J. growth factors‏

- ١. ‏بما في‎ Cell Physiol., 122: 362-369 [1985] and Warren et al., Cell, 46: 667-674 [1988]) ‏في‎ ¢ interleukin-1 (IL-1) s erythropoietin (EPO) ‏ذلك كلا من تكوين الخلايا الحمراء‎ ‏مبكرة ومتعددة المقدرة وتكوين مستعمرات كبيرة لمخاليط‎ precursors ‏إستحثات مواد تمهيدية‎ . ‏خلايا تكوين الدم‎ conditioned ‏في الأوساط المكيفة‎ MK ‏خلايا‎ potentiators ‏ولقد وجدت مصادر أخرى لدافعان‎ © ‏وخلايا إفراز‎ macrophage cell lines ‏ضخمة‎ 4ST ‏وسلالات خلايا‎ murine lung ‏لخلايا لرئة فأرية‎ -human embryonic kidney cells ‏وخلايا كلية جنينية بشرية‎ peritoneal exudate cells ‏بريتوني‎ ‏توجد‎ (Mazur, Exp. Hematol, 15: 340-350 [1987]) ‏وبالرغم من البيانات المتباينة المعينة‎

T ‏أن الخلايا اللمفية‎ (Geissier et al., Br. J. Haematol, 60: 233-238 [1985]) ‏بعض الأدلة‎ ‏توحى‎ ‘monocytes ‏الأحادية‎ LIAN ‏وليس‎ MK ‏المنشطة تلعب دوراً تعزيزياً في تكوين الخلايا‎ ٠ ‏إفرازات و100د108:016 قد تكون‎ Jia ‏المنشطة‎ T ‏هذه الإكتشافات أن إفرازات الخلايا اللمفية‎ ‏يبين‎ (Geissler et al, Exp. Hematol, 15: 845-853 ]1987[( MK ‏عوامل تنظيمية في تطوير‎ (Vainchemker et al., « erythropoietin EPO ‏التي تشمل‎ MK LDA ‏عدد من الدراسات في تشوه‎

Blood, 54: 940 [1979]; McLead et al., Nature, 261 492-4[1976]; and Williams et al , ‏تم‎ "MK ‏أن هذا الهرمون له تأثير محفز لتكوين مستعمرة‎ Exp. Hematol, 12: 734 [1984]) ٠ ‏والمحتوية على مصل الدم وفي‎ SERUM ‏توضيح هذا أيضاً باستخدام المزارع الخالية من المصل‎ ٠ LSHUM(Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]) ‏إضافية‎ WA ‏غياب‎ ‏أكثر في سمات مرحلة الخلية المفردة والمرحلة من خليتين من‎ EPO ‏يفترض أن يتم تضمن‎ four- ‏الذي يؤثر في المرحلة من أربع خلايا‎ PWMSpCM ‏مقارنة بتأثير ال‎ MK ‏مراحل الخلايا‎

- ١١ - ‏يظل تداخل كل هذه العوامل وتأثيرها على المراحل المبكرة والمتأخرة‎ MK ‏الخلايا‎ gail cell ‏في حوجة إلى إيضاحه.‎ MK ‏لنمو الخلايا‎ ‏والتى‎ multi-lineage factors ‏توحي البيانات الناتجة من معامل متعددة أن عوامل السلالة المتعددة‎ ‏و11-3 وإلى مدى أقل عامل تحفيز‎ GM-CSF ‏بصورة فردية هي‎ MK ‏لها نشاط تحفيز مستعمرة‎ ‏حديثاً ؛‎ . (Ikebuchi et ‏مله‎ Proc. Natl. Acad Sci USA, 84: 9035 [1987]) IL-6 8 - ‏خلايا‎ ٠ ‏يعمل بصورة تعاونية مع 11-3 لزيادة‎ (LIF) ‏قرر عدة مؤلفين أن 11-11 وعامل تثبيط ليوكيميا‎ (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84: 16-23 MK ‏حجم وإزدواجية الخلايا‎

[1993]: Burstein ‏مل‎ J. Cell. Physial., 153: 305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 6 50-56 [1990]; Metcalf et al, Blood, 77:2150-2153 {1991]; Burno et al, Exp. Hematol. , ‏و‎ 19: 378-381 [1991]; and Yonemura et al, Exp. Hematol, 20: 1011-1016 [1992]). ٠ : ‏وثائق أخرى موضع الاهتمام هي‎ ‏البراءة الأمريكية رقم‎ «Chong 5 11701 ‏البراءة الأمريكية رقم‎ (0 AT, Eppstein ‏وآخرين. البراءة الأمريكية رقم 5707/7 5738 و11715516 وآخرين؛‎ Fernandes 5 879111

Bennelt 5 6 £1A 74 ‏البراءة الأمريكية رقم‎ «Gottlieb 5 £01 Ya VY ‏والبراءة الأمريكية رقم‎

VEY ‏وآخرين؛ البراءة الأمريكية رقم‎ Kogan g <0Y 1 0Ad0 ‏وآخرينء البراءة الأمريكية رقم‎ yo ‏و‎ «© You

Kimura et al, Eur. J. Immunol, 20(9): 1927-1931 [1990]; Secor et al, J. of Immunol. , 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al, J. of Immunol., 140(1): 94-49 [1988]; Warren et al, Exp. Hematol, 17(11): 1095-1099 [1989], Bruno et al. Exp. Hematol., 17(10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al, Exp. Hematol, 1 7(8): 883-888 [1989]; Koike et al, vy.

‎١١7 -‏ - ‎Blood, 75 )12(: 2286-2291 [1990], Lotem, Blood, 75(5): 1545-1551 [1989]; Rennuck et‏ ‎Blood, 73(6): 1504-1512‏ .له ‎al., Blood, 73(7): 1826-1835 [1989]; and Cluterbuck et‏ ]1989[ ¥ — نقص الصفائح ‎Thrombocytopenia 43 yell‏ : ‎٠‏ تعتبر الصفائح الدموية عناصر حاسمة لآلية تجلط الدم. يحدث استنفاد مستوى الصفائح الدموية الدورة الدموية ؛ والمسمى نقص الصفائح الدموية ‎thrombocytopenia‏ « في حالات واضطرابات سريرية ‎cilnical‏ مختلفة. يتم بصورة شائعة تحديد نقص الصفائح الدموية إذا كان تعدادها أقل من ‎٠١ x ٠‏ لكل لتر. يمكن أن يتم بصورة موسعة تقسيم الأسباب الرئيسية لنقص الصفائح الدموية إلى ثلاث تصنيفات على أساس فترة حياة ‎life span‏ الصفيحة الدموية: ‎)١(‏ إنتاج صفائح ‎٠‏ دموية ضعيف بواسطة نخاع العظم؛ أو ‎(Y)‏ حجز الصفائح ‎sequestration‏ الدموية في الطحال (تضخم الطحال ‎«(splenomegaly‏ أو (©) تدمير زائد للصفائح الدموية في الدورة الدموية ‎Je) circulation‏ سبيل ‎(JE)‏ نقص الصفائح الدموية نتيجة المانعة ذاتية أو علاج كيماوي واشعاعي ‎(autoimmune thrombocytopenia or chemo- and radiation-therapy‏ وبالإضافة إلى ذلك؛ هناك مرضى يتلقون أحجام كبيرة من منتجات دم فقيرة في الصفائح الدموية معطاة بسرعة؛ ‎yo‏ 38 يظهر نقص في الصفائح الدموية بسبب التخفيف ‎dilution‏ ‏ان النزف السريري ودلالات نقص الصفائح الدموية المصاحبة له يعتمد على حدة نقص الصفائح الدموية وسببهاء وعيوب التجلط الممكنة والمتعلقة به .بصفة عامة؛ يكون المرضى بتعداد صفائح دموية بين ‎٠١ x ٠٠0١و 7١‏ لكل لتر في ‎pha‏ نزف مفرط بعد الجروح ‎«traumatic‏ بينما قد ينزف المرضى بتعداد صفائح دموية أقل من ‎٠١ XY‏ لكل لتر بصورة تلقائية. يعتبر المرضى ‎ov.‏ المذكورين أخيراً مرشحين لنقل صفائح دموية ‎platelet transfusion‏ مع وجود خطر المناعة

- س١‏ والفيروسات. بالنسبة لأي درجة معلومة من نقص الصفائح الدموية؛ يميل النزف إلى أن يكون أكثر خطورة عندما يكون السبب هو ‎Gali‏ الإنتاج بدلا من التدمير الزائد للصفائح الدموية. في ‎Ala‏ الأخيرة؛ يتسبب دورة إنتاج ‎tumove‏ الصفيحة الدموية ‎day jus‏ والصفائح الدموية تكون يافعة وبحجم اكبر وذات فعالية اكبر لمنع النزف . قد يتسبب نقص الصفائح الدموية من تشكيلة ‎٠‏ من الاضطرابات المشروحة باختصار أدناه . قد يوجد شرح أكثر تفضيلا في ‎Schafner, A.

I., “Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function”. Internal‏ ‎Medicine, 3" Ed., John J.

Hutton et al, Eds., Little Brown and Co., Boston /Toronto/‏ ‎London [1990].‏ 0 نقص الصفائح الدموية بسبب ضعف إنتاج الصفائح الدموية ‎Thrombocytopenia due to‏ ‎‘impaired platelet 0100000002 ٠‏ تشتمل أسباب نقص الصفائح الدموية الخلقي ‎congenital‏ على فقر الدم اللاتتنسجي التركيبي ‎constitutional aplastic anemia‏ (متلازمة فانكوني ‎(Fanconi syndrome‏ ونقص الصفائح الدموية الخلقي للخلايا ‎MK‏ ؛ والذي قد يتم ارتباطه مع عيوب تكوين الهيكل العظمي. يتم إحداث الاضطرابات المكتسبة لإنتاج الصفائح الدموية بواسطة إما نقص تنسج الخلايا ‎hypoplasia‏ أو ‎١‏ تكون صفائح دموية غير فعالة. يمكن أن يتسبب نقص تنسج الخلايا النقيية الكبيرة من تشكيلة مي الظروف؛ بما في ذلك تعطل النخاع ‎Ly) bone marrow aplasia‏ في ذلك أشكال تلقائية ‎idiopathic‏ ‏أو كبت النخاع بواسطة عوامل علاجية كيميائية أو علاج إشعاعي ‎myelosuppression by‏ ‎(chemotherapeutic agents or radiation therapy‏ وتليف النخاع ‎myelfibrosis‏ و ‎leukemia‏ « وغزو نخاع العظم بواسطة ورم انتقالي ‎sf metastatic‏ الأورام الحبيبية ‎granulomas‏ في بمعض ‎vy.‏ الحالات؛ قد تتداخل السموم ‎toxins‏ » أو العوامل المسببة للعدوى؛ أو عقاقير ‎drugs‏ مع تكوين

م١‏ - الصفائح الدموية بصورة اختيارية نسبياً؛ تتضمن أمثلة حالات نقص صفائح دموية عرضية 1 مسببة بواسطة ال ‎alcohol‏ وإصابات عدوى فيروسية ‎viral infections‏ معينة ونقسص صفائح دموية بسيطة متعلقة بإعطاء مدرات البول ثيازيد ‎diuretics‏ ©02:0ن:0. أخيراً؛ فإن عمليات بناء الصفائح ‎thrombopoiesis‏ الغير فاعلة المصاحبة الثانوية لعمليات تضخم كرات الدم الحمواء ‎gl folate ) megaloblastic processes ©‏ قصور 12 ‎(B‏ يمكن أن تسبب نقص الصفائح الدموية» عادة مع الوجود المشترك لفقر الدم ونقص الكرات البيضاء ‎-leukopenla‏ ‏يعتمد العلاج الحالي لحالات نقص الصفائح الدموية بسبب نقص إنتاج الصفائح الدموية على تعيين وعكس السبب الأساسي لإخفاق نخاع العظم. يحتفظ في العادة لنقل الصفائح الدموية للمرضى في حالات النزف الخطيرة أو للتغطية أثناء الإجراءات الجراحية.حيث قد يؤدي تساوي التمنيع ‎isoimmunizatio ٠‏ إلى عدم الاستجابة لنقل الصفائح الدموية الإضافي. قد يتم تخفيف نزيف الغشاء المخاطي الناتج من نقص الصفائح الدموية الخطير بواسطة الإعطاء عن طريق الفم أو في الوريد ‎(Jal gal‏ مضادة لحل الليفين ‎antifibrinolytic agents‏ . قد تتطور مضاعفات تجلطية ‎Thrombotic‏ ‎٠‏ على أي حال إذا تم استخدام عوامل مضادة لحل الليفين في المرضى المصابون بالتخثر المنتشر ‎Jala‏ الأوعية الدموية ‎٠ intravascular coagulation (DIC)‏ ‎١‏ (ب) نقص الصفائح الدموية بسبب ‎J je‏ الطحال ‎splenic sequestration‏ قد يتم ارتباط تضخم الطحال لأي سبب من الأسباب بنقص صفائح دموية بسيط إلى متوسط. تكون هذه العملية ( تضخم الطحال ‎(hypersplenism‏ غير فعالة نسبياً لعزل الصفائح الدموية في الطحال ؛ إذا ما قورنت بالتدمير الفعال للصفائح الدموية بواسطة الطحال في حالات ‎pais‏ ‏الصفائح الدموية المناعي ‎immunomediated thrombocytopenia‏ المشروحة أدناه. بالرغم أن ‎٠‏ -_ السبب الأكثر شيوعاً لفرط الطحالية ‎hypersplenism‏ هو تضخم الطحال ‎splenomegaly‏ الاحتقلني

- ١و‎ alcoholic ‏بسبب تليف الكبد الكحولي‎ portal hypertension ‏بسبب ضغط الدم البابي‎ congestive

05 + ويتم أيضاً ارتباط أشكال أخرى لتضخم الطحال الاحتقاني ‎congestive‏ أو المرتفح lymphoproliferative ‏أو ذو التكاثر اللميفاوي‎ infiltrative

جميعها ذات علاقة بنقص الصفائح الدموية. لا تهبط أعداد الصفائح الدموية بصفة عامة أقل من م ١ه ‎٠١ x‏ لكل لتر كنتيجة لفرط الطحالية فقط.

(ج) نقص الصفائح الدموية بسبب تدمير الصفائح الدموية بأسباب غير مناعية ‎nonimmune-‏

‘mediated

يمكن أن يحدث نقص الصفائح الدموية بالتدمير المتسارع للصفائح الدموية بواسطة عمليات

مختلفة غير مناعية. تشتمل اضطرابات من هذا النوع على تحثوات منتشرة داخل الأوعية الدموية ‎٠‏ ووسائل بدلية ‎prosthetic devices‏ داخل الوعاء ودوران الدم الإضافي الجسماني ‎corporeal‏

008 واعتلال الأوعية الشعرية التجلطي ‎Jie thrombotic microangiopathies‏ فرفرية

اللويحة التجلطية ‎thrombotic thrombocytic purpura‏ في كل هذه الحالات؛ فإن الصفائح الدموية

الدائرة التى يتم تعرضها إلى أسطح صناعية ‎artificial surfaces‏ أو باطن وعائي غير عادي

‎abnormal vascular intima‏ إما يتم استهلاكها عند هذه المواقع أو يتم اتلافها وإزالتها عندئذ ‎Vo‏ بصورة مبكرة بواسطة النظام الشبكي البطاني ‎reticuloendothelial system‏ . إن الحالات مرضية

‏أو الاضطرابات التي قد تبرز فيها التخثرات المنتشرة داخل الأوعية الدموية ‎(DIC)‏ توجد بتفصيل

‏أكثر في :

‎Braunwald et al, (eds), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 11" Ed., P. 1478.

‎McGraw Hill [1987].

‎١١ -‏ - يمكن أن تسبب الوسائل البديلة داخل الأوعية الدموية ‎Lay‏ في ذلك الصمامات القلبية والبالونات داخل الأورطى نقص الصفائح الدموية البسيط إلى المتوسط ونقص صفائح دموية تحويلية في مرضى خاضعين التحويلة القلبية الرئوية ‎cardiopulmonary bypass‏ أو ديلزه الدم قد تستهلك أو تتلف الصفائح الدموية بفعل الدائرة الدموية الزائدة للعملية ‎extra corporeal circuit‏ . ‎٠‏ (د) ‎aii‏ الصفائح الدموية المناعي المحدث بواسطة العقار ‎Drug-induced immune‏ ‎thrombocytopenia‏ : ‎ad‏ تم تضمين أكثر من ‎٠٠١‏ عقار من التي تسبب نقص الصفائح الدموية المحدثة مناعياً. على أي حال؛ لقد تم التمييز الجيد لتورط كينيدين ‎quinidine‏ وكينين ‎quinine‏ والذهب ‎gold‏ ومركبات ‎sulfonamides‏ و ‎cephalothin‏ و ‎hepann‏ فقط. وكثيرا ما يكون نقص الصفائح الدموية المسسبب 1 بواسطة العقار خطيراً ‎lan‏ ويحدث نمطياً وبإندفاع خلال أيام أثناء تتاول المرضى الدواء المسبب لتلك الحساسية. (ه) فرفرية تكوين ‎WA‏ دموية مناعية (ذاتية المتاعة) ‎Immune (autoimmune) (ITP)‏ ‎thrombocytopenic purpura (ITP)‏ يعتبر 170 في الكبار مرض مزمن يتميز بالتدمير الذاتي المناعي للصفائح الدموية. يكون الجسم ‎١‏ المضاد الذاتي في العادة هو ‎IgG‏ بالرغم من أن جلوبيولينات مناعية ‎immunoglobulins‏ أخرى قد ذكرت . بالرغم من الجسم المضاد الذاتي يرتبط مع غشاء الصفيحة الدموية ,11,111م0؛ فإنه لم يتم تعيين ‎antigen‏ للصفيحة الدموية في معظم الحالات. يحدث التدمير للصفائح الدموية المحسية ‎idiopathic‏ خارج الأوعية الدموية في النظام الشبكي البطاني للطحال والكبد ‎reticuloendothelial‏ ‎-system of the spleen and liver‏ من أن نصف حالات ‎ITP‏ مجهولة السبب.؛ فإن الككير من © المرضى يصابون من أمراض روماتيزمية ‎rheumatic‏ أو ذاتية المناعة ‎autoimmune‏ أساساً

‎١١7 -‏ - (على سبيل المثال ذأب حمامي جهازي ‎(systemic lupus erythematosus‏ أو اضطرابات منشطة لتكاثر النسيج الليمفاوي ‎Iymphoproliferative‏ (على سبيل المثال؛ اللوكيميا المزمنة للخلايا الليمفية ‎lymphocytic leukemia‏ عتمتطه). (و) ‎ITP‏ المحدث بواسطة ‎HIV-Induced ITP‏ 6 يعثخبر 11 أحد المضاعفات الشضائعة المتتامية عند الاصابة ببس ‎(Morris et al., Ann Intern. 1160., 96: 714-717 [1982]; HIV‏ ويمكن أن يحدث في أي مرحلة مع تقدم المرض سواء في مرضى مشخصين بمتلازمة قصور المناعة المكتسبة ‎Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)‏ ؛ إن ظهرت عليهم تعقيدات المرض أو فقط حاملون لفيروس ‎HIV‏ وبدون أعراض . ان ‎HIV‏ هو مرض معدي يتميز في النهاية 1 بقصور العمل الخلوي المناعي تصاحبه الالتهابات الانتهازية والسرطان . ان الاختلال الاساسي في المناعة الناتج عن الإصابة ب ‎HIV‏ هو الاستنفاد المتنامي والإضعاف الوظيفي للخلايا ‎T lymphocytes‏ المنتجة لل ‎cell surface glycoprotein‏ 00104 ‎(Lane et al, Ann.

Rev.

Immunal,, 3: 477 [1985]).‏ من المحتمل أن فقدان ‎CD4‏ المساعدة / المحثة لعمل ‎Tell WDA‏ الخلل الكبير في المناعة الخلوية والدموية ‎cellular and humoral‏ ‎immunity ١٠‏ ولذلك يعود إلى الإلتهابات الانتهازية ‎opportunistic infections‏ والسرطان التي همي ال ‎HLane) AIDS‏ عالية). على الرغم من أن آلية التداخل بين ‎HIV‏ و ‎ITP‏ غير معروفة ولكن من المعتقد أنها مختلفة من ‎ITP‏ الغير متعلقة بالإصابة ب ‎HIV‏

‎A _‏ \ — ‎(Walsh et al, N.

Eng.

J.

Med., 311: 635-639 [1 984]; and Ratner, Am.

J.

Med., 86: 194-‏ .)]1989[ 198 ؛ - العلاج الحالي لنقص الصفائح ‎*Current Therapy for Thrombocytopenia 4; geal}‏ إن المنحنى العلاجي للمرضى بنقص الصفائح الدموية تمليه خطورة والحاح الحالة المرضة. ‎٠‏ المعالجة مشابهة لتلك المتعلقة بنقص الصفائح الدموية بسبب ‎HIV‏ أو غير المتعلق ب ‎HIV‏ ‏وبالرغم من أنه يتم استخدام عدد من المحاولات العلاجية المختلفة إلا أن العلاج يظل العلاج مثير للجدل والخلاف. ثم بنجاح زيادة تعداد الصفائح الدموية في مرضى مشخصين بنقص الصفائح الدموية بواسطة علاج بال ‎glucocorticoid‏ (على سبيل المثال» ‎«(prednisolone‏ وفي ‎plaza‏ المرضى على أي حال تكون الاستجابة غير كاملة؛ أو يحدث إخفاق عندما يتم خفض جرعة ال ‎glucocorticoid‏ أو يتم إيقاف إعطائه. على أساس الدراسات مع مرضى لديهم ‎ITP‏ مرتبط ب ‎HIV‏ يقترح بعصض الباحثين أن علاج ‎glucocorticoid‏ قد يتسبب في جعله عرضة ل ‎AIDS‏ يتم في العادة إعطاء مركبات ‎glucocorticoid‏ إذا هبط تعداد الصفائح الدموية إلى اقل من ‎٠١ x 7١‏ / لتر أو عندما يحدث نزف تلقائي ‎-spontaneous bleeding‏

‎١‏ بالنسبة للمرضى غير المستجيبين لمركبات ‎glucocorticoid‏ ؛ فقد تم بنجاح استخدام المركب ‎4-(2-chlorphenyl)-9-methyl-2-13- ) 4-morpholinyl)-3- propanon-1-ylil6H-thienol‏ ‎3,2,f][1,2,4ltriazolol4,3,a,][ 1,4]diazepin (WEB 2086)‏ لعلاج حالة خطيرة ل ‎ITP‏ غير مرتبطة ب ‎HIV‏ تمت معالجة مريض لدية تعداد صفائح دموية بالق - ‎[OA‏ ميكرولتر ب ‎WEB2086‏ وبعد العلاج لمدة ‎١‏ - 7 أسبوع زاد التعداد

‎١ -‏ - إلى ‎١500080 - ١45066868‏ / ميكرولتر. (البراءة ‎EP‏ رقم ‎(Lohman et al., Lancet, s YY «VV‏ ]1988[ 1147. بالرغم أن العلاج المثالي لفرفرية نقص الصفائح الدموية للخلايا ‎amegakaryocytic‏ ‎thrombocytopenia purpura (AATP)‏ غير مؤكدة؛ فقد أظهر الجلوبيولين المضاد للخلية © التيموسية ‎antithymocyte globulin (ATG)‏ ¢ وهو مصل من مضاد لأنسجة الغدة التيموسية البشرية ‎human thymus tissue‏ « أنه يحدث إستعفاء ‎J sha remission‏ كامل ‎-(Trimble et al., Am.

J.

Hematol., 37: 126-127 [1991])‏ يبين تقرير حديث من ناحية ثانية أن التأثيرات على تكوين الدم بال ‎ATG‏ مسببة مع ‎thimerosal‏ ‎٠»‏ حيث يعمل هذا البروتين بصورة مفترضة كحامل زئبق ‎(Panella et al., mercury carrier‏ ‎.Cancer Research, 50: 4429-4435 ]1990[( ٠‏ يتم تدوين نتائج جيدة باستئصال الطحال ‎splenectomy‏ استئصال الطحال ‎splenectomy‏ يزيل الموقع الرئيسي لتدمير الصفائح الدموية ومصدر رئيسي لإنتاج الأجسام المضادة الذاتية ‎autoantibody‏ في الكثير من المرضى. يتسبب هذا الإجراء في استعفاء من المرض ممتد وخالي من العلاج في عدد كبير من المرضى. ومع ان الإجراءات الجراحية يجب تجنبها بصفة عامة في المرضى المشكوك فيهم ‎autoantibody‏ مناعيلٌ ‎Yo‏ فعليه ينصح باستئصال الطحال فقط في الحالات الخطيرة من نقص الصفائح الدموية (على سبيل ‎TTP‏ العنيف المتعلق ‎HIV‏ وفي المرضى الذين فشلوا في الاستجابة من بعد ؟ إلى ‎٠“‏ ‏أسبوع من المعالجة بال ‎glucocorticoid‏ “أو لم يحققوا استجابة متواصلة بعد انقطاع إعطاء 41 . على أساس المعارف العلمية المعاصرة ؛ فإنه من غير الواضح ما إذا كان استئصال الطحال يعرض المرضى للإيدز.

—Y.- ‏واستئصال الطحال؛ هناك عوامل معينة سامة‎ prednisolone ‏بالإضافة إلى العلاج بال‎

AZT )azidothimidine vincristine ‏المثال‎ Jy ‏للخلايا أيضاء على‎ cytotoxic agents ‏ومن ناحية أخرى؛ فإن النتائج أولية.‎ (HIV ‏سببه‎ ITP ‏وهو هقار واعد في علاج‎ (Zidovudine نقدر مما سبق ذكره أن الطرق لعلاج نقص الصفائح الدموية هي الحصول على عامل قادر على © لتصبح منتجة للصفائح الدموية. لقد تم ‎ol precursors‏ اسلافها 11اتعجيل تميز ونضج ‎Lal‏ ‏بذل جهود كبيرة في التعرف على مثل هذا العامل الذي يشار إليه بصورة شائعة باسم الموجودة بصورة شائعة في ‎TPOg sans‏ . تشتمل الأسماء الأخرى ل ‎thrombopoietin (TPO)‏ ‎Lthrombocytopoiesls stimulating factor (TSF)‏ كتب على على: عامل تحفير ‎Ag‏ اللويحلت ‎Jule smegakaryocyte colony-stimulating factor (MK-‏ تحفيز مستعمرة خلايا نقيية كبيرة ‎٠‏ ا ومقوى ‎LA‏ نقبية ‎megakaryocytestimulating factor‏ وعامل تحفيز خلايا نقيية كبيرة57 ‎(Rak et‏ مبكرا في عام 404 ‎.TPO Y‏ تمت ملاحظة نشاط ‎3_+——Smegakaryocyte potentialor‏ واستمرت محاولات لتمييز وتنقية هذا العامل إلى ‎Lia gy‏ هذا. بينما توجد(125 :1 ‎al, Med. Exp,‏ ‎(Tayrien et al,‏ نشط؛ راجع على سبيل المثال : ‎pn polypeptides TPO‏ عن تتقية جزئية ل ‎J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985]).‏ ملة ‎J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] and Hoffman et‏ ‎١‏ وافتقرض آخرون أن ‎TPO‏ ليس موجودا منفمسسلا بحسد ذاتقه ولكن يكون على الأسح ببساطة ظاهرة الهرمون متعددة الوظائف معروف ‎(IL-3, Sparrow et al, Prog. Clin. Biol. Res, 215: 123 [1986])‏ بغض ‎py hill‏ عن شكله ومنشأة ؛ فالجزي الذي يمتلك نشاطا محفزا لبناء الصفيحات الدموية يكن ذو قيمة علاجية هامة. بالرغم من عدم تعيين بروتين بصورة لا شك فيها على أنه ‎(TPO‏ فإنه يحيط اهتمام كبير

ال١‎ - ‏قد يمد‎ » putative cytokine recepts ‏وهو مستقبل سيتوكين مفترض‎ cmpl ‏بالاكتشاف الجديد أن‎ ‏إشارة تكوين صفيحات دموية.‎

MP is a ‏عبارة عن مستقبل سيتوكين تكوين خلايا نقيية كبيرة‎ mpl ‏يكون‎ - © :Megakaryocytopoietic cytokinereceptor ‏يعتقد أن تكاثر ونضج خلايا تكوين الدم يتم تنظيمه بصورة دقيقة بواسطة عوامل تحور‎ ٠ . ‏بصورة إيجابية أو سلبية تكاثر وتمييز لخلايا جذعية متعددة السلالة ومتعددة أنسال‎ modulate ‏هذه التأثيرات تصل من خلال ربط عالي الألفة لعوامل بروتينية خارج الخلية مع مستقبلات‎ ‏محددة على سطح الخلايا. مستقبلات سطح الخلية هذه لها شبه تكوين مشترك وتصنف بصفة‎ ‏عامة كأحد أعضاء مجموعة العائلة الكبيرة لمستقبل السيتوكين. تشتمل مجموعة العائلة الكبيرة‎ ‏(سلاسل 8 و/)‎ IL-2 ‏على مستقبلات ل‎ ٠ (Hatakeyama et al., Science, 244:551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257:379-382

[1991]), IL-3 (Itoh et al., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 87:5459-5463 [1990]; Kitamura et al.. Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura et al, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al.,

Cell, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takaki et al, EMBO j, 9:4367-4374 [1990]; ٠

Tavernier et al., Cell, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241:825- 828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60:941- 951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-5694 [1992]) granulocyte-macrophage (GM-CSF) ‏تحفيز مستعمرة لخلايا محببة أكلة ضخمة‎ ale (Gearing et ‏ملة‎ EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et colony-stimulating factor ٠

—_ Y Y —_ ‏وعامل تحفيز مستعمرة خلايا‎ al, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), ٠ granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) ‏محببة‎ ‎(Fukunaga et al, Cell 61:341-350 [1990a]: Fukunaga et al, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 [1990b], Larsen et al, J. Exp. Med., 172:15591570

[1990]), EPO (D'Andrea et al. Cell, 57:277-285 [1989]; Jones et al, Blood. ٠ 76:31-35 [1990]) prolactin ‏وأيضا مستقبلات لل‎ Leukemia inhibitory tactor (LIF) ‏تثبيطي للوكيميا‎ Jule (Boutin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116 [1989]), ‏وعامل تحفيز للاهداب‎ (Leung et al., Nature, 330: 537-543 [1987]) (GH) ‏وهرمون نمو‎ 3. + ciliary neurotrophic factor (CNTF) ‏العصبية‎ ‏قد يتم تجميع أعضاء مجموعة العائلة الكبرى‎ (Davis et al, Science, 253: 59-63 ]1991[( ‏السى ثلاث فقات وظييسة (للأاطلاع راجبع‎ cytokine ‏لمستقبل‎ ‎-(Nicola et al., Cell, 67: 1-4 ]1991[( ‏مثل مستقبل‎ ¢ single chain receptors ‏تحتوي الفئة الأولى على مستقبلات ذات سلسلة فردية‎ ١ ‏الذي يربط‎ ((G-CSF-R) ‏أو مستقبل عامل تحفيز مستعمرة خلايا محببة‎ erythropoietin (EPO-R) ‏الذي يقع خارج الخلية ويولد أيضا‎ domain ‏بألفة عالية عن طريق حيزه‎ ligand ‏عامله الترابطي‎ «QL -subunits ‏داخل الخلية. تشتمل فئة ثائية من المستقبلات؛ تسمى الوحدة الفرعية‎ signal ‏إشارة‎ ‏؛ ومستقبل عامل تحفيز مستعمرة خلايا محببة أكلة كبيرة‎ interleukin-6 (IL6-R) ‏على مستقبل‎

‎yy —‏ — ‎«(GM-CSF-R)‏ ومستقبل ‎interleukin-3 (IL3-Rot)‏ وأعضاء أخرى من مجموعة العائلة الكبرى لمستقبل ‎cytokine‏ . تربط هذه الوحدات الفرعية - 0 مع عاملها الترابطي بألفة منخفضة ولكن لا ترسل إشارة داخل الخلية. هناك مستقبل عالي الألفة قادر على إرسال إشارة يتكون من ديمر :006 غير متجانس بين وحدة فرعية ‎-subunit‏ 0 وعضو من فئة ثالثة لمستقبلات ‎cytokine ٠‏ ؛ تسمى وحدات ‎«B= cytokine de jb‏ على سبيل المثال ‎Por‏ وهي الوحدة الفرعحية 8 المشتركة للثلاث وحدات فرعية ‎IL3-Ro‏ 5 +011-051-1. ويأتي الدليل أن ‎mpl‏ يكون عضو من ‎de gana‏ العائلة الكبرى لمستقبل ‎cytokine‏ التشابه تسلسل ‎sequence homology‏ الأحماض الأمينية . ‎(Gearing, EMBO J, 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 87: 6834-‏ ‎Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991] and Vigon et al, Proc.

Natl Acad. \ .‏ ,]1990[ 6938 ‎Sci.

USA, 89: 5640-5644 [1992])‏ وقدرته على تحويل طاقة إشارة تكاثرية ‎-transduce proliferative signals‏ يكشف التسلسل البروتيني المستنتج من الاستنساخ الجزيئي ل ‎C.mpl‏ الفأري ‎murine‏ بأن هذا البروتين مشابه لمستقبلات ‎cytokine‏ الأخرى. يحتوي فيه المجال خارج الخلية على £10 حمض ‎Vo‏ أميني ويتكون من مجالين فرعيين كل منهما بأربعة ‎cysteines‏ عالية الحفظ ‎highly conserved‏ ومتكرر ‎motif‏ خاص في المجال الفرعي للطرفية - ‎N‏ وفي المجال الفرعي للطرفية - ©. يتوقع أن يكون لمجالات ربط العامل الترابطي ‎ligand-binding domains‏ خارج الخلية أشكال هندسية متاشبه لطية مزدوجة أسطوانية - 8. يكون هذا المجال الخارج الخلية المتكرر مشابه بدرجة ‎dle‏ لسلسلة نقل الاشارة ‎signal transducing‏ المشتركة لمستقبلات 11-3 و11-5 و ‎GM-CSF‏ ‎vo‏ وأيضا شبه من مجال الربط منخفض الألفة ل ‎(Vigon et al., Opcogene, 6: 2607-2615 LIF‏

م ([19985) بذلك؛ قد ينتمي ‎mpl‏ الفئة منخفضة الألفة مع عاملها الترابطي من مستقبلات ‎-cytokine‏ ‏تكشف مقارنة ل ‎mpl‏ الفأرى و« ‎mpl‏ بشري ناضج أن هذين البروتينين يظهران نسبة ‎TAY‏ من التماثل التسلسلي. وأكثر تحديداء تساهم المجالات الفرعية للطرفية - 17 والطرفية - © خارج م الخلية ب 7720 و 780 من نسبة التماثل التسلسلي على الترتيب. تكون منطقة ‎mpl‏ الأكثر ‎dais‏ ‏هي المجال ‎cytoplasmic domain‏ المتميز بنسبة 7951 من ‎PLS‏ ترتيب الأحماص؛ بتسلسل من ‎١‏ حمض اميني بالقرب من الحيز العابر للغشاء ويكون مطابقا في كلا النوعين. تبعا لذلك؛ فإن ‎mpl‏ هو أحد الأعضاء الأكثر محافظة من العائلة الكبرى لمستقبل ‎Vigon) cytokine‏ السابق). إن البرهان على أن 201 هو مستقبل فعال ‎receptor‏ قادر على إرسال إشارة للتكاثر يأتي بإنشاء ‎٠‏ توليفة مركبة ‎chimera‏ لمستقبل يحتوي على الحيز الخارج - خلوي ‎extracellular domain‏ من مستقبل ‎cytokine‏ له ألفة عالية ل ‎cytokine‏ معروف بالمجال ال ‎cytoplasmic‏ لل ‎Less mpl‏ أنه لا توجد ربيطة معروفة لل ‎empl‏ فإنه كان من الضروري أن تشمل التوليفة الحيز ‎OA‏ ‏- للخلية عالي الألفة من فئة أحد مستقبلات ‎cytokine‏ من ذات المرتبة الأولى مثل ‎IL-4R‏ أو ‎Vigon + G-CSFR‏ وآخرين ( أعلاه ) قد دمجوا الحيز الخارج - خلوي ل ‎G-CSFR ٠‏ مع كلا الحيزين العابر للغشاء ‎cytoplasmic transmembrane‏ من ‎-C-mpl‏ تم زرع المستقبل المولف داخل خلية من سلالة خلايا معتمدة ‎IL-3. le‏ و (:038/2 31/303 كما زرع معه ‎G-CSFR/mpl‏ وزرع ‎G-CSFR‏ بكامل طوله للمقارنة ل00008. نمت الخلايا المعدلة بالتوليفة المذكورة جيدا بصورة متساوية في وجود ‎IL-5 cytokine‏ أو 0-087. بالمثل؛ نمت الخلايا المعدلة ب 6-0877 جيدا أيضا إن كان في ‎Wa‏ 11-3 أو ‎eile .G-CSF‏ كل الخلايا في ‎lev.‏ عوامل ‎-growth factors sail!‏ تم تنفيذ تجربة مشابهة بواسطة ‎Skoda et al, EMBO J,‏

ده [993 1[ 2645-2653 :)12(7 تم فيها دمج كلا الحيزين الخارج - خلوي والعابر للغشاء لمستقبل ‎IL-4‏ البشري ‎(hIL-4R)‏ إلى المجال ‎cytoplasmic mpl‏ الفأري ‎murine‏ وزرع التوليفة إلى سلالة خلية ‎Ba/F3‏ معتمدة على ‎IL-3‏ فأري ‎murine‏ تكاثرت خلايا ‎Ba/F3‏ المولفة والتي تحوي النوع الطبيعي ‎type‏ 1 ل ‎hIL-4-R‏ بصورة طبيعية في وجود أي من الأنواع المحددة ‎specific‏ ‎o‏ 4لا أو ‎IL-3‏ تكاثرت خلايا ‎Ba/F3‏ المصابة بالعدوى بواسطة 1م111-48/0 بصورة طبيعية في وجود 11-4 (في وجود أو غياب ‎(IL-3‏ موضحة أنه في ‎Ba/F3 WMA‏ فإن الحيز ‎domain‏ ال ‎cytoplasmic‏ لل ‎mpl‏ يحتوي على كل العناصر الضرورية لإرسال الإشارة التكاثرية. توضح هذه التجارب التوليفة التركيبية قدرة تكوين إشارة التكاثر للحيز ‎cytoplasmic‏ لل امه ولكن تكون صامتة معتمدة على إمكانية الحيز الخارج خلوي لل ‎mpl‏ بالارتباط مع الربيطة . ‎yy‏ تكون هذه النتائج متمشية مع احتمالين على الأقل؛ أي يكون ‎mpl‏ مستقبل ذو سلسلة فردية ‎single‏ ‎chain‏ (فئة واحد) مثل ‎EPO-R‏ أو 0-0578 أو يكون وحدة فرعيةانه:انه - 8 ناقلة للإشارة (فئة ثلاثة) تتطلب وحدة فرعية ‎Skoda) 11-3 Jie » - subunit‏ وآخرين السابق). + - إن الربطية لل ‎mpl‏ هي ‎Thrombopoietin (TPO)‏ كما وصف من ‎(JE‏ فإنه قد اقترح بأن مصل ‎serum‏ الدم يحتوي على عامل فريد؛ يشار إليه في ‎١‏ بعض الأحيان باسم ثرومبوبوايتين» والذي يعمل تعاونيا مع السيتوكينات المختلفة الأخرى لتحسين نمو ونضج الخلايا ‎MK‏ . لم يتم ابدا عزل مثل هذا العامل الطبيعي من مصل الدم أو أي مصدر آخر برغم الجهد الكبير بواسطة مجموعات عديدة. ومع انه لا يعرف ما إذا كان ‎mpl‏ قادرا على الارتباط مباشرة مع عامل تحفيز خلية 106 ؛ إلا أن تجاربا حديثة اظهرت ‎mpl‏ له علاقة بارسال إشارة تكاثرية في وجود عامل أو عوامل موجودة في مصل ‎serum ©‏ المرضى بنخاع عظم لا تنسجي ([1993] 1395-1401 :)5( 82 ‎Blood,‏ مله ‎(Methia et‏

- ٠*١ ‏يأتي دليل بأن هناك عامل فريد في مصل لدم لتكوين مستعمرة مختلفا عن 11-16 و11-4 و6-]1آ‎ ‏قد تم من‎ mpl ‏بإمكانه إرسال إشارة تكاثرية خلال‎ GM-CSF 5 G-CSF 3 EPO 3 ‏و5807‎ IL-11 5 ‏أو‎ primitive ‏ل 6.001 في سلالات خلايا تكويمن دم أولية‎ expression ‏فحص توزيع التعبير‎ ‏في أحد سلالات هذه الخلايا.‎ autisense ‏قابل للاستنساخ‎ mpl ‏متخصصة ومن دراسات استخدام‎

‎٠‏ باستخدام إنزيم الانتساخ العكسي ‎reverse transcriptase (RT)-PCR‏ في خلايا تكوين دم بشري منقاة ‎Lelia‏ وضحت ‎Methia‏ وآخرين أعلاه أنه تم فقط وجود إشارات قوية لل ‎mpl Mrna‏ في خلايا +0034 النقية فقط وخلايا ‎MK‏ وصفائح دموية. تمثل خلايا +0034 المنقاة من نخاع عظم ‎(BM)‏ حوالي ‎7١‏ من كل خلايا 314 تكن غزيرة في خلايا سلفية أولية أو ملتزمة لكل السلالات (على سبيل المثال؛ خلايا حمراء ‎erythroid cells‏ وخلايا ‎AT‏ محببة كبيرة وخلايا ‎(MK‏

‎٠‏ ثم بيان أن أوليجو ديوكسي نيو كلويتيدات ‎antisense oligodeoxynucleotides‏ في ‎mpl‏ قادرة على أن تكبت تكوين مستعمرة ‎MK LA‏ من ‎LDA‏ +0034 متعددة ‎ADL‏ مستنبتة في مصسل من مرضى بنخاع لا تنسجي (مصدر غني بنشاط محفز مستعمرة خلايا نقيية كبيرة [016-05/8]). ليس لهذه أوليجو ديوكسي نيوكليوتيدات القابلة للاستنساخ تأثير على تكوين مستعمرة خلايا حمراء أو آكلة حبيبية كبيرة.

‎Lyi ‏مباشرة مع ربطية وسواء أظهر عامل المصل قدرة تحضير تكوين خلايا‎ mpl ‏سواء ارتبط‎ yo ‏مباشرة‎ mpl ‏وقد اقترح انه إذا ما ارتبط‎ mpl ‏كبيرة فما زال غير معروفا أن هذا قد تم من خلال‎

‏مع ربيطة ؛ فإن تتابع احماضه الامينية يكون محافظا في كل الاجناس وله معها تقاطعات مناعية بسبب عذا التشابه كما في الحيز الخارج خلوي للإنسان والموردين ‎Vigon) maurine‏ وآخرين السابقة ‎YAY]‏ [(

: Objects ‏الأهداف‎ - Vv ‏في نظرة إلى ما سبق يمكن تقدير وجود حاجة ماسة حالية ومستمرة في الفن لعزل وتعيين‎ ‏جزيئات قادرة على تحفيز تكاثر وتمييز ونضج خلايا تكوين الدم؛ وبصفة خاصة خلإيا 116 أو‎ ‏لاستخدام علاجي في علاج نقص الصفائح الدموية. يعتقد أن مثل جزئ هو‎ theraputic ‏أسلافها‎ ‏امم وبذلك توجد حاجة ماسة لعزل مثل هذه الربطية او الربيطات (المركبات‎ ligand ‏ربيطة‎ ٠

الترابطية) لتقييم دورة (أدوارها) في نمو وتميز الخلايا.

‎Lag‏ لذلك؛ فإنه من أهداف هذا الاختراع هو الحصول على جزئ نقي صيدلانيا قادر على تحفيز

‏تكاثر و/أو تمييز و/أو نضج الخلايا النقيية الكبيرة في شكل منتج للصفائح الناضجة.

‏ويعتبر هدف آخر هو توفير الجزئ في شكل للاستخدام العلدجي في علاج اضطراب تكوين الدم؛ ‎١‏ وبصفة خاصة نقص الصفائح الدموية.

‏ومن الأهداف الإضافية للاختراع الحالي عزل وتنقية وتحديدا تعيين مركبات ترابطية بروتينية

‏قادرة على الارتباط بمستقبل من فصيلة عائلة سيتوكين الكبرى في الكائن الحي المعروف باسم

‎mpl‏ وإرسال إشارة تكاثرية.

‏ولا يزال هدف آخر هو توفير جزئيات حمض نووي ‎nucleic acid‏ تحمل جينات مثل هذه ‎١‏ _المركبات الترابطية البروتينية واستخدام جزيئات الحمض النووي هذه لإنتاج مركبات ترابطية

‏ترتبط ب ‎mpl‏ في خلايا مستنبتة تحمل ‎DNA‏ مأشوب وتستخدم تشخيصيا أو علاجيا .

‏يكون هدف آخر أيضا هو توفير مشتقات وأشكال معدلة للمركبات الترابطية البروتينية بما في ذلك

‏أشكال مختلفة ‎Ge variants‏ تسلسل الاحماض الامينية وأشكال ‎glgloprotein‏ متنوعة ومشضتقات

‏تساهمية ‎covalent‏ مكافئة منها.

يكون هدف إضافي هو توفير أشكال إندماجية ‎fusion polypeptide‏ تدمج فيها ربيطة ‎mpl‏

وبروتين غير متجانس ‎heterologous‏ ومشتقات مكافئة منها.

لا يزال هدف إضافي هو توفير أشكال 6م مختلفة تدمج ربيطة ان مع إضافات

واستبدالات أحماض أمينية من التسلسل ‎EPO‏ لإنتاج بروتين قادر على تنظيم تكاثر ونمو أسلاف 0 كل من الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء .

لا يزال هدف إضافي أيضا هو تحضير مولدات مناعية ‎immunogens‏ لإنشساء أجسام مضادة

‎antibodies‏ ضد ربيطة ‎mpl‏ أو أشكال مدمجة منها؛ وأيضا الحصول على أجسام مضادة قادرة

‏على ربط مثل هذه المركبات الترابطية.

‏ستكون هذه الأهداف وأهداف أخرى للاختراع واضحة إلى ذوى الخبرة العادية في الفن عند تأمل ‎٠‏ المواصفة ككل.

‏وصف عام للاختراع

‏كما هو مبين في عناصر الحماية المصاحبة؛ يوفر الاختراع الحالي؛ من بين أشياء ‎Al‏ 5« عزل

‏بروتين لتكاثر وتعزيز نضج وتكوين خلايا ‎MK‏ للثدييات.

‏تعيين بروتين بحث على تكاثرو نضج تكوين خلايا ‎MK‏ "الربيطة ‎(ML) "mpl‏ أو " ‎thrombopoietin® (TPO) ٠‏ ؛ قادر على تحفيز تكاثر و/أو نضج ‎Ss‏ تمييز خلايا ‎MK‏ ووصولها

‏إلى الشكل المنتج للصفائح الدموية الناضجة.

‏قد تتم تنقية هذا البروتين المتجانس تماما من مصدر طبيعي بواسطة طريقة تحتوي على: ‎)١(‏

‏ملامسة مصدر بلازما محتوى على جزئيات الربيطة الل ‎mpl‏ المراد تنقيتها ‎ih ug‏

‎vq -‏ - ‎polypeptide‏ مستقبل مثبت ‎immobilized receptor polypeptide‏ » وبالتحديد ‎mpl‏ أو ‎polypeptide‏ ‏مدمج مع ‎mpl‏ ومثبت على دعامة ‎support‏ تحت ظروف حيث يتم 5 ‎JS‏ انتقائي ‎adsorbed‏ ‏امتزاز جزئيات الربيطة لل ‎mpl‏ المراد تنقيتها على ‎polypeptide‏ المستقبل المثبت؛ و(؟) غسل ‎polypeptide‏ المستقبل المثبت ودعامته لإزالة المادة غير الممتزة؛ )¥( شطف ‎eluting‏ جزئيات © الربيطة لل ‎mpl‏ من ‎polypeptide‏ المستقبل المثبت التي تم إمتزازها إليه بواسطة مادة شطف محلول منظم ‎elution buffer‏ بصورة مفضلة يكون المصدر الطبيعي هو بلازما من كائنات ثديية أو بول ‎urine‏ محتوى على ربيطة ‎mpl‏ بصورة اختيارية يكون الكائن الثديي ثابت التركيبة الجينية ‎aplastic‏ ويكون المستقبل المثبت عبارة عن توليفة مدمجة من ‎mpl-IgG‏ ‏بصورة اختيارية؛ يكون البروتين المفضل لاستحثات وتعزيز نضج مكون الخلايا ‎MK‏ هو ‎polypeptide ٠‏ ربيطة ‎mpl‏ متجانس تماما مصنوع بوسائل صناعية ‎synthetic‏ أو بالهندسة الوراثيةٍ ‎recombinant‏ . يكون ‎"mpl La polypeptide‏ أو "100 ' لهذا الاختراع بصورة مفضلة شبه تسلسل كلية تصل إلى ‎7١‏ 7 على الأقل من تسلسل الأحماض الامينية ل ‎polypeptide‏ ربيط 01 للخنزير ‎porcine‏ والمتجانس تماما وعالي النقاوة وهوية تسلسل 7/80 على الأقل مع "حيز ‎EPO-domain‏ " ‎Vo‏ لع00م©0170م ربيطة ‎mpl‏ للخنزير. بصورة اختيارية؛ يكون ربيطة ‎mpl‏ لهذا الاختراع هو ربيطة ‎mpl‏ بشري ناضج ‎o(Hml)‏ له تسلسل الحمض الأميني للربيطة الناضجة المزودة في شكل رقم ‎)١(‏ (هوية تسلسل رقم ‎((SEOID 100: 1 ١‏ أو شكل مختلف ‎variant‏ أو شكل معدل بعد الانتساخ ‎posttranscriptionally modified‏ منها أو بروتين له هوية تسلسل حوالي 7860 مع ربيطة ‎mpl‏ بشري ناضج. بصورة اختيارية يكون الشكل المختلف للربيطة ‎mpl‏ هو جزء ‎fragment‏ ¢ ‎٠‏ وبصفة خاصة الطرف الاميني ‎amino-terminus‏ للربويتين أو جزء "حيز ‎EPO-domain‏ " لربيطة

ل ‎mpl‏ البشري الناضج ‎(AML)‏ بصورة مفضلة يحتجز جزء طرفية الأمينو كل تسلسل ‎ML‏ ‏البشري ‎Lila‏ بين حمض ‎cysteine‏ الأول والرابع ولكن قد يحتوي على إضافات00:6008ة أو محذوفات ‎deletions‏ أو استبدالات ‎substitutions‏ خارج هذه المنطقة. طبقا لهذا النموذج؛ يشل جزء ‎fragment polypeptide‏ بالصيغة: ‎X-hML(7-151)-Y ;‏ حيث تمثل ‎hML(7-151)‏ تسلسل الحمض الأميني لل ‎(Hm)TPO‏ البشري من ‎Cys’‏ عبر اكور على وجه الشمول؛ 5 ‎X‏ تمثل الحمض الاميني ‎Cys’‏ أو أحد الاحماض الامينية للمجموعة الطرفية لل ‎AML‏ الناضج أو امتدادات احماض امينية له مثل ‎Mel‏ أو ‎Tyr‏ أو تسلسلات دليلية ‎leader sequences‏ محتوية؛ على سبيل المثال؛ على مواقع لتحلل البروتين (على ‎dw‏ المثقال ‎٠‏ عامل ‎«(thrombin 4 Xa‏ و7 تمثل مجموعة كربوكسي الطرفية ‎carboxy terminal‏ ل ‎Cys!‏ أو أي حمض أميني طرفي واحد أو أكثر من التي تتواجد في ال ‎KML‏ الناضج أو امتدادات له. بصورة اختيارية قد يتم دمج ‎mpl day J) polypeptide‏ 0 جزء منه مع ‎polypeptide‏ غير متجانس ‎heterocyclic‏ (تركيبية). يكون ‎polypeptide‏ غير المتجانس المفضل هو عامل تحفيز مستعمرة ‎cytokine « colony stimulating factor‏ أو ‎interleukin‏ أو جزء منه؛ وبصفة ‎dials‏ ‎yo‏ الربيطة المنشطة ‎(KL) Kit‏ أو ‎(IL-1‏ أو ‎(IL-3‏ أو ‎IL-6‏ أو ‎(IL-11‏ أو ‎(EPO‏ أو ‎«GM-CSF‏ أو ‎LIF‏ ويكون ‎polypeptide Lad‏ غير المتجانس الاختياري المفضل هو سلسلة جلوبين مناعي ‎immunoglobin chain‏ ¢ وبصفة خاصة 1561 أو 1802 أو 1503 أو 1504 ‎IgA J‏ أو ‎IgE‏ أو ‎IgD‏ أو ‎IgM‏ بشرية أو جزء منهاء وبصفة خاصة المحتوى على الحيز الثابت ‎constant domain‏ من سلسلة ثقيلة ‎-1gG heavy chain‏

“py ‏يكون فعال حيويا ويكون‎ mpl agonist ‏قادرة على تزويد محفز‎ mpl ‏الربيطة‎ polypeptide ‏تكون‎ ‎=H ‏المرقمة (على سبيل المثال‎ labeled nucleotiaes ‏بصورة مفضلة قادرا على تحفيز استيعاب‎ ‏لخلايا 3 المعتمدة على 11-3 المزروع فيها‎ DNA ‏في ال‎ (thymidine ‏في الصفائح الدموية الدائرة‎ FF ‏بشرى و/أو يكون قادرا بصورة مفضلة على تحفيز دمج‎ mpl mpl ‏تشتمل محفزات‎ platelet rebound assay ‏في دم الفأر في تجربة لإرتداد الصفائح الدموية‎ ٠ mML2 5 mML s hML4 5 hML3 5 AML2 3 1101/8153, RIS44) ‏المناسبة على ويمتتلط ى‎ ‏أو أجزاء منها.‎ pML2 ‏و‎ PML 5 mML3 ‏و‎ ‏قادر على الارتباط‎ 1 antibody ‏يوفر هذا الاختراع جسم مضاد معزول‎ al ‏في نموذج‎ ‏قد يتم بصورة اختيارية دمج الجسم المضاد المعزول القادر على الارتباط مع‎ mpl ‏مع ربيطة‎ ‏ثان وقد يتم استخدام الجسم المضاد أو مدموجة لعزل وتنقية ربيطة‎ polypeptide ‏ربيطة ام« مع‎ ٠ ‏من مصدرها كما هو موصوف من قبل ل ام« مثبت. في سمة إضافية لهذا النموذج» يوفو‎ mpl ‏محتوية‎ alin vivo ‏أو في الكائن‎ 10 vitro ‏في المعمل‎ mpl ‏الاختراع طريقة لاكتشاف ربيطة‎ ‏على ملامسة الجسم المضاد مع عينة؛ وبصفة خاصة عينة مصل 800001؛ متوقع احتوائها على‎ binding ‏الربيطة واكتشاف ما )13 حدث ربط‎ ‏معزول؛ يحمل مورث‎ DNA ‏يوفر الاختراع جزيئ حمض نووي‎ clad ‏في نماذج إضافية‎ ٠ ‏أو أجزاء منه؛ حيث قد يتم اختياريا ترقيم جزيئ الحمض النووي بواسطة‎ mpl day encoding complementary ‏وجزئ حمض نووي له تسلسل يكون تكميليا‎ ¢ detectable ‏للتحسس‎ LE ‏شق‎ ‏إلى؛ أو يتهجن تحت ظروف حاسمة معتدلة إلى شديدة مع؛ جزيئ حمض نووي له تسلسل يحمل‎ ‏تكون جزيئات الحمض النووي المفضلة هي تلك التي تحمل مورث ربيطة‎ mpl ‏مورث ربيطة‎ ‏كلاهما‎ DNA RNA ‏والفأري 06 وتشتمل على‎ porcine ‏ام_البشري والخنزيري‎ vy.

—- yy -

الجنومي ‎cDNA genomic‏ في سمة إضافية لهذا النموذج؛ يكون جزيئ الحمض النووي هو

‎DNA‏ يحمل مورث ربيطة ‎mpl‏ ويحتوي علاوة على ذلك على ناقل ‎vector‏ قابل للمضاعفة

‎control sequences ‏إلى تسلسلات تحكم‎ DNA ‏فيه بصورة ممكنة توصيل ال‎ a3 replicable

‏يمكن أن يستخدمها العائل المعدل بالناقل عائل محول بواسطة الناقل. بصورة اختيارية يكون — ‎DNA ©‏ عبارة عن ‎Cdna‏ له التسلسل المزود في شكل رقم ‎Y (SEQ ID NO: 2) ¥ - 5# ١‏ -

‏° أو جزء منه.

‏تشتمل هذه السمة علاوة على ذلك على خلايا عائلة ‎host cells‏ ¢ ومن المفضل خلايا ‎«CHO‏

‏معدلة بواسطة الناقل وطريقة لاستخدام ال ‎DNA‏ لإحداث إنتاج ربيطة ‎empl‏ ومن المفضل

‏متضمنة التعبير عن ‎Jala cDNA‏ مورث ربيطة ‎mpl‏ في مزرعة خلايا العائل المعدلة واستعادة ‎٠‏ ربيطة ام« من الخلايا العائلة أو مزرعة الخلايا العائلة. تكون الربيطة ‎mpl‏ المحضرة بهذه

‏الطريقة بصورة مفضلة ربيطة ‎mpl‏ بشري.

‏يتيح الاختراع طريقة لمعالجة كائن ثديي لدية اضطراب مولدات ‎hematopoietic disorder pall‏ «

‏وبصفة خاصة نقص الصفائح الدموية ‎thrombocytopenia‏ ؛ تتضمن إعطاء كمية فعالة علاجيا

‏من ربيطة ‎mpl‏ إلى الكائن الثديي. بصورة اختيارية يتم إعطاء ربيطة 01 في توليفة مع ‎Vo‏ سيتوكين»؛ وبصفة خاصة عامل تحفيز مستعمرة ‎colony‏ أو ‎interleukin‏ تشتمل عوامل تحفيز

‎M- 3 GM-CSF 5 G-CSF 5 LIF ‏و‎ (KL) Kit- ‏المفضلة على ربيطة‎ interleukins ‏المستعمرة أو‎

‎JL-11 9 IL-6 3 IL-3 5 IL-1 s EPO 3 CSF

‏قد يتضمن الاختراع عملية ‎J jal‏ وتنقية ‎(ML) TPO‏ من كائن دقيق ‎microorganism‏ ينتج ‎TPO‏

‏تحتوي على:

‎(١)‏ تمزيق ‎disrupting‏ أو تحليل ‎WIA lysing‏ محتوية على ‎(TPO‏ و ) ¥ ( الفصل الاختياري لمادة قابلة للذوبان من مادة غير ‎ALE‏ للذوبان محتوية على ‎TPO‏ ؛ و )¥( إذابة ‎TPO‏ في المادة غير الذائبة ‎insoluble‏ بواسطة مذيب في محلول منظم ‎buffer‏ ؛ ‎o‏ 5 (؟) فصل ‎TPO‏ المذاب من المواد الأخرى الذائبة والغير ذائبة 6+ و ‎sole) (0)‏ طي ‎TPO refolding‏ في محلول منظم مختزل مؤكسد ‎redox buffer‏ ؛ و (7) .فصل ‎TPO‏ المطوي بصورة صحيحة من ‎TPO‏ غير المطوية ‎.misfolded‏ ‏تقوم العملية بإذابة المادة غير القابلة للذوبان المحتوية على ‎TPO‏ بواسطة تقليل الارتباط ‎chaotropic agent ٠‏ حيث يتم اختيار عامل تقليل الارتباط منئلقة ‎guanidine‏ أن ‎sodium‏ أو ‎thiocyanate‏ أو 8©. تشترط العملية علاوة على ذلك أن يتم فصل ‎TPO‏ الذائب من المواد الأخرى الذائبة وغير الذائبة بواسطة خطوة واحدة أو أكثر مختارة من الطرد المركزي ‎centrafugation‏ والترشيح بواسطة الهلام ‎gel filtration‏ وكروماتوجراف الطور العكسي ‎reverse‏ ‎.phase chromotography‏ توفر خطوة ‎sale)‏ الطي ‎refolding‏ للعملية محلول منظم مخزل ‎٠‏ مؤكسد محتوية على عامل أكسدة ‎oxidizing agent‏ واختزال ‎reducing‏ بصفة عامة؛ يكون ‎dale‏ ‏الأكسدة هو ‎oxygen‏ أو مركب محتوي على رابطة ‎disulfide bond‏ واحدة على الأقل. بصسورة مفضلة؛ يتم اختيار عامل الأكسدة من جلوتائثيون مؤكسد ‎oxidized glutathione(GSSG)‏ و ‎cysleine‏ ويتم اختيار عامل الاختزال من جلوتانيون مختزل ‎oxidized glutathione(GSSG)‏ و عدنعاوين. والأكثر تفضيلا يكون عامل الأكسدة ‎glutathione‏ مؤكسد ‎(GSSG)‏ ويكون عامل

الاختزال ‎glutathione‏ مختزل ‎(GSH)‏ من المفضل أيضا أن تكون النسبة الجزيئية لعامل الأكسدة مساوية أو أكبر من تلك لعامل الاختزال. يحتوي المحلول المنظم المؤكسد / المختزل إضافيا على منظف ‎detergent‏ « مختار بصورة مفضلة من ‎«SHAPSD y CHAPS‏ موجود في مستوى مقداره ‎١‏ على الأقل. يحتوي المحلول المنظم المؤكسد / المختزل إضافيا على ‎NaCl‏ ومن المفضل في م مدى تركيز حوالي )= ‎١6‏ مولار» و ‎glycerol‏ بصورة مفضلة بتركيز أكثر من ‎INO‏ ‏يتراوح الأس الهيدروجيني ‎pH‏ للمحلول المنظم المؤكسد / المختزل من حوالي أس هيدروجيني ‎V,0 pH‏ إلى أس هيدروجيني ‎pH‏ 9؛ ويتم تنفيذ خطوة إعادة الطي في ؛ درجات مئوية لمدة ‎EA -١‏ ساعة. تنتج خطوة ‎sale)‏ طي ‎TPO‏ فعال بيولوجيا ‎biologically active‏ يتم فيه تكوين رابطة ‎disulfide bond‏ بين ال ‎Cys‏ الأقرب لطرفية الأمينو ‎amino-terminus‏ مع ال ‎Cys‏ ‎٠‏ الأقرب لطرفية الكربوكسي ‎carboxy-terminus‏ لحيز ال ‎‘EPO‏ ‏قد يتضمن الاختراع علاوة على ذلك عملية لتنقية ‎TPO‏ فعال بيولوجيا من ‎GIS‏ دقيق تحتوي على: ‎١ )‏ ( على الأقل تحليل الغشاء الخارجي للخلية ‎extracellular membrane‏ للكائن الدقيق؛ و ‎(Y)‏ معالجة ناتج التحلل ‎lysate‏ المحتوي على ‎TPO‏ بواسطة عامل تفكيك الارتباط ‎chaotropic \o‏ » و ‎(V)‏ إعادة طي ‎refolding‏ ال ‎«TPO‏ و (؟) فصل الشوائب ‎TPO impurities‏ غير المطوي 10 من ‎TPO‏ مطوي بصورة صحيحة.

دوس شرح مختصر للرسومات: شكل رقم ‎:)١(‏ يبين تسلسل الأحماض الامينية المستنتج )1 ‎(SEQ ID NO:‏ لربيطة ‎mpl‏ بشسري ‎cDNA (hML)‏ وتسلسل النيوكليوتيد حاملة المورث 200160006 ‎coding‏ ‎.(SEQ ID NO: 2) sequence‏ يتم ترقيم ‎Nucleotides‏ في بداية كل سطر. يتم ° بيان المناطق غير المترجمة 5 و“ بالأحرف الصغيرة. يتم ترقيم المكوفئات من الأحماض الامينية أعلى التسلسل بادئا بالسرين ‎١-‏ 1 - :»5من تسلسل بروتين ربيطة ‎(ML) mpl‏ الناضج. يتم بيان حدود ‎exon‏ ¥ المفترضة بواسطة الأسهم ويتم وضع مواقع إدخال مجموعة 7-1:0087180000المحتملة في مربعات. يتم بيان مواقع ‎Cysteine‏ بواسطة نقطة أعلى التسلسل. يناظر التسلسل ‎٠١‏ الموضوع تحته خط هو تسلسل النهاية الامينية ‎N-terminal‏ المحدد من ربيطة ‎mpl‏ منقى من بلازما خنزير ‎٠‏ ‏شكل رقم ‎:)١(‏ يبين خطوات لتجربة لادخال 317 - ‎thymidine‏ في ‎mpl day‏ لتحديد وجود ‎mpl day‏ من مصادر مختلفة؛ تم حرمان ‎mpl P Ba/F3 WAY‏ من ‎IL-3‏ لمدة ‎Y¢‏ ساعة في حضانة مرطبة ‎humidified incubator‏ في درجة 7١م‏ في ‎CO;‏ ‎\o‏ 70 وهواء. بعد الحرمان من 11-3 مع الخلايا على أطباق إستنبات سعة 16 عين مع أو بدون عينات مخففة وزراعتها لمدة ‎YE‏ ساعة في حضانة إستنبات. تمت إضافة ‎٠١‏ ميكرولتر أوساط ‎RPMI‏ خالية من المصل محتوية على ‎١‏ ‏ميكروكوري 0م من 311 - ‎thymidine‏ إلى كل عين لمدة 6 - 4 ساعات الأخيرة. تم عندئذ حصدت الخلايا على أطباق ترشيح سعة 17 عين وغسلها 7 بواسطة الماء. تم عندئذ عد المرشحات ‎filters‏ ( عد الاشعاع ) ‎٠‏

١م‏ شكل رقم (9): يبين تأثير إنزيم ‎pronase‏ و1011 والحرارة على قدرة ‎APP‏ على تحفيز تكائثر خلايا ‎.Ba/F3-mpl‏ لهضم ‎«pronase APP‏ تم إقران برونيز ‎(Boehringer Mannheim)‏ أو ألبومين مصل بقري ‎bovine serum albumin‏ إلى ‎Affi.gel10 (Biorad)‏ وتحضينها كل على حدة مع ‎APP‏ لمدة ‎YA‏ ساعة في 0 درجة ‎LTV‏ نتيجة ‎(lla‏ تمت إزالة الراتنجات ‎resins‏ بواسطة الطرد المركزي واختبار ‎of gall‏ الطافية ‎supernatants‏ . تم أيضا تسخين ‎APP‏ إلى ‎a Avian‏ لمدة ؛ دقائق أو جعلها في ‎٠٠١‏ ميكرومولار ‎DTT‏ متبوعا بديلزة ‎dialyzed‏ ‏مقابل ‎PBS‏ ‏شكل رقم (؛): يبين النشاط الإشعاعي ‎activity‏ لربيطة ‎mpl‏ المشطوفة ‎elution‏ من أعمدة ‎Blue-Sepharose™ ys Phaenyl.

Toyopeat™ ٠١‏ وأطزدص-عاصئله1710. كانت الجزيئات ‎A — 4 Fractions‏ من عمود ألفة ‎mpl affinity column‏ تحتوي على أعلى النشاط الإشعاعي. شكل رقم ( ): يبين ال ‎SDS-PAGE‏ تجزيئات ‎Ultralink mpl fractions‏ المشطوفة : إلى ‎٠٠١‏ ‏ميكرولتر من كل جزء ¥ = ‎oA‏ تمت إضافة ‎acetone (Ja ١(‏ يحتوي على ‎١‏ ‎yo‏ ميكرومولار [110 في درجة - ١٠أم.‏ بعد ‎Y‏ ساعات؛ في درجة - ١٠م‏ تم الطرد ‎(53S yall‏ للعينات وتم غسل الحبات ‎pellets‏ الناتجة مرتين بواسطة أسيتون في درجة - ‎TY ١0‏ تمت بصورة تعاقبية إذابة الحبات الناتجبة عن ال ‎acetone‏ في ‎١‏ ميكرولتر من مادة إذابة ‎SDS-solubilization buffer‏ في المحلول المنظم؛ كملت إلى ‎٠٠١‏ ميكرومولار ‎DTT‏ وتم تسخينها في ‎Lay‏ ‏7 ٠م‏ لمدة © دقائق. تمت عندئذ فصل العينات على ‎SDS-polyacrylamide gel‏

الاسم - 70 وتم الفحص النظري ‎visualized‏ للبروتينات بواسطة صبغ فضي ‎-silver staining‏ شكل رقم (+): تبين ربيطة ‎mpl‏ المشطوف من ‎SDS-PAGE‏ تمت إذابة الجزء 6 من عمود ألفة ال ‎mpl-affinity column mpl‏ على ‎SDS-polyacrylamide gel‏ تحث ظروف ° غير مختزلة ‎non - reducing‏ بعد الترحيل الكهربي ‎electrophoresis‏ تم تشريح ‎dal‏ إلى ‎١١‏ منطقة متساوية شطفت كهربائيا كما هو مشروح في الأمثلة. تمت ديلزة ‎dialyzed‏ العينات المشطوفة كهربيا في ‎PBS‏ وفحصها عند تخفيف ‎/١‏ ‎.٠‏ كانت المعايير بالأوزان الجزئية ‎Mr‏ المستخدمة لمعايرة الجل هي معايير ‎-Novex Mark 12‏ ‎٠‏ شكل رقم (7): تبين تأثير ‎mpl‏ المستنفذ الربيطة في ‎APP‏ على تكون الخلايا النقيية ‎megakaryocytopoiesis‏ تم صنعه بواسطة تمرير ‎(Jo ١(‏ فوق عمود ألفة ‎mpl-‏ ‎Vaffinity column‏ مل )+ ‎V+‏ ميكرو جرام ‎mplIgG‏ / مل ‎NHS-‏ ‎.(Superpose™, Pharmacia‏ تم عمل مزارع خلايا جذعية طرفية بشرية ‎Human peripheral stem cell cultures‏ في ‎APP ٠١‏ أو ‎APP ٠‏ بدون ‎\o‏ ربيطة ‎mpl‏ وزراعتها لمدة ‎١١‏ يوما. تم التقييم الكمي لتكون الخلايا ‎MK‏ كما هو مشروح في الأمثلة. شكل رقم (4): يبين تأثير ‎mpl-IgG‏ على تحفيز تكون خلايا ‎MK‏ بشرية بواسطة ‎APP‏ تم عمل مزارع ‎LDA‏ جذعية طرفية بشرية في ‎APP 7٠١‏ وزراعتها لمدة ‎VY‏ يوما. في اليوم صفر و7 و4؛ تمت إضافة )0,+ ميكرو جرام) ‎mpl-IgG‏ أر )1,0 7 ميكروجرام) ‎LANP-RIGG‏ بعد ‎VY‏ يوما تم التقييم الكمي لتكون الخلايا ‎MK‏

الم كما هو مشروح في الأمثلة. يتم رسم متوسط العينات المتمائلة بينما بيانات المضاعفات الفعلية بين الأقواس. شكل رقم (9): يبين كلا الشريطين ل 90 ما ل ‎DNA‏ جينومي ‎genomic‏ يحمل مورث الربيطة ل ‎mpl‏ يتم بيان تسلسل الأحماض الامينية ‎exon‏ 7 (هوية تسلسل

° رقم *: 3 ‎«(SEQ ID NO:‏ وتسلسل ترميز (هوية تسلسل رقم:؛ :10170 ‎SEQ‏

4( وتكملته (هوية تسلسل ) 0:8 5 ‎(SEQID NO:‏ شكل رقم ‎:)٠١(‏ يبين تسلسل الأحماض الامينية المستنتج لربيطة ‎mpl‏ بشري ناضج ‎(AML)‏ (هوية تسلسل رقم: 7). تتم محاذاة ‎aligned‏ تسلسل الحمض الأميني المتوقع لربيطة ‎mpl‏ البشري مع تسلسل تكون ‎erythropoietin‏ البشري. يتم

‎١‏ وضع الأحماض الأمينية المتطابقة داخل مربعات ويتم ترك فواصسل لمحاذاة مثالية موضحة بخطوط متقطعة. يتم وضع خط تحت مواقع محتملة لإدخال مجموعة ‎N-glycosylation‏ بخط سليم لل ‎Hml‏ وبخط متقطع ل ‎-hEPO‏ يتم بيان ‎two cysteines‏ الهامين لنشاط تكوين ‎erythropoietin‏ بواسطة نقطة كبيرة.

‎mpl ‏من ربيطة‎ isoforms ‏يبين تسلسل الأحماض الامينية المستنتجة لأشكال‎ :)١١( ‏شكل رقم‎ ١ ‏و13012 (هوية تسلسل‎ )١ ‏البشري الناضج ,11:0 (هوية تسلسل رقم:‎ ‏(هوية تسلسل رقم: 4) و11014 (هوية تسلسل‎ hML3 5 (A ‏رقم:‎ ‏ترك‎ ayy ‏يتم وضع الأحماض الأمينية المتطابقة داخل مربعات‎ .)٠١ ‏رقم:‎ ‎. ‏فواصل مدخلة لمحاذاة مثالية موضحة بخطوط متقطعة‎

وس الأشكال ‎Y)‏ 11( و(7١ب)‏ و(٠١ج):‏ تبين تأثير الربيطة ‎mpl‏ البشري على تكاثر خلايا ‎Ba/F3-‏ ‎mpl‏ (أ)؛ وتكون الخلايا ‎MK‏ البشرية في المعمل ‎in vitro‏ مقيمة كميا بامستخدام جسم مضاد أحادي الانتساخ من نوع ‎murine IgG IgG‏

GPILII, ‏فأري موشوم إشعاعيا محدد ل-‎ monoclonal antibody ‎glycoprotein 0‏ للخلايا ‎MK‏ ( ب ) ؛ وتولد الصفائح الدموية الفأرية ‎munne‏ ‎thrombopoiesis‏ مقاسة معايرة إرتداد الصفائح دموية (ج). تم نقل المعلومة ‏إلى داخل مائتين وثلاثة وتسعين خلية بواسطة طريقة ال ,0طع0 .0 ‎(German.‏ ‎PrkS ‏بواسطة ناقل‎ in DNA Cloning: A New Appraach 2: 143-190 [1985]) ‏فقط أو ‎Prks-Hml‏ أو بواسطة ‎Prks-MLys;‏ طوال الليل (تم توليد ‎Prks-MLys;‏ ‎٠١‏ بواسطة إدخال ‎codon‏ الإيقاف بعد حمض 153 ل ‎Hml‏ بواسطة ‎.(PCR‏ تم عندئذ تكييف الأوساط لمدة 1“ ساعة وفحصها بالنسبة لتحفيز تكائثر خلايا ‎Ba/F3-mpl‏ كما هو مشروح في مثال رقم ‎١‏ (أ) أو في ‎a dg‏ الخلايا ‎MK‏ ‏البشرية في المعمل (ب). تم التقدير الكمي لتولد الخلايا ‎MK‏ باستخدام جسم مضاد أحادي من نوع ‎IgG‏ فأري المستنسخ والموشوم ‎Lele)‏ بواسطة ‎PT‏ ‎(Grant et ‏كما هو مشروح في‎ MK ‏لل ,611,111 المحدد للخلايا‎ (HP1-1D) Vo ‏تم تحديد تأثير ناتج الربيطة المصنعة‎ al, Blood 69: 1334-1339 [1987]) ‏والمنقاة جزئيا على إنتاج الصفائح الدموية في‎ (ML) ML ‏بالهندسة الوراثية‎ ‏الكائن الحي (ج) باستخدام تجربة تكاثر الصفائح الدموية المرتدة ‎rebound‏ ‎McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. ‏المشروحة بواسطة‎ thrombocytosis (do You) ‏منقى جزئيا من‎ IML ‏تم تحضير‎ Med. 144: 1006-10012 (1973) ‏أ‎ ‏مصنع بالهندسة الوراثية . تم تمرير الوسط خلال‎ ML ‏على‎ gine ‏وسط مكيف‎

4.0 - عمود ‎(Ja Y) Blue - Separos'e‏ مشبع ب ‎PBS‏ وتم غسل العمود بواسطة 58 وشطفه بواسطة ‎PBS‏ محتوي على ¥ مولار من كل من ‎‘NaCl urea‏ تمت ديلزة الجزء الفعال ‎fraction‏ 00006 في ‎PBS‏ ركز إلى ‎١‏ ملي ‎fala‏ مل في ‎BSA‏ خالي من السمية الداخلية ‎endotoxin‏ احتوت العينة على ‎J‏ من ° وحدة واحدة من سم داخلي ‎endo toxia‏ لكل مل. تم حقن الفثران بواسطة أما أو ‎©٠٠٠١‏ أو ‎11٠١‏ وحدة من ‎IML‏ أو سواغ فقط ‎excipient‏ ‏كونت كل مجموعة من ستة فئران. يتم بيان المتوسط ‎mean‏ والانحراف المعياري ‎standaud deriation‏ تم تحديد قيمة ‎da ul gy P‏ تحليل اختبار 1 لمقارنة ‎tailed 1 - test‏ - 2 نهايتين. ‎٠‏ شكل رقم ‎(VF)‏ يقارن تأثير الأشكال المتساوية والأشكال المختلفة لربيطة ‎mpl‏ البشري في تجربة تكاثر الخلايا ‎.Ba/F3-mpl‏ تم تقييم لالط 3 ‎mock‏ و2تالط و ‎hML 5 hML3‏ لذذ3كل 8154)؛ و1141,153 عند تخفيفات مختلفة كما هو مشروح في مثال رقم ‎.)١(‏ ‏الأشكال )1( 5 )28( 5 )£ ١ج):‏ تبين تسلسل الأحماض الامينية المستنتج (هوية تسلسل رقم: ‎)١‏ ‎Ve‏ لربيطة ‎mpl‏ البشري ‎(AML)‏ أو ‎TPO‏ البشري (0170) وتسلسل المورث في ‎DNA‏ البشري (هوية تسلسل رقم: ‎.)١١‏ يتم ترقيم ‎Nucleotides‏ ومكونات الأحماض الامينية في بداية كل خط. شكل رقم ( ‎:)٠‏ يبين ‎SDS-PAGE‏ ل ‎th ML332‏ 293 منقى 5 ‎thMLiss‏ 293 منقى. شكل رقم ‎(V7)‏ : يبين تسلسل ‎Nucleotides‏ : ترميز ‎cDNA‏ (هوية تسلسل رقم: ‎(VY‏ وتسلسل أ الأحماض الأمينية المستنجة (هوية تسلسل رقم: ‎(VY‏ لإطار القراءة المفتقوح

‎sy -‏ - ‎ML —! open reading frame‏ ايزو فأري ‎murine ML isoform‏ يحتوي هذا الشكل ‎isoform‏ للربيطة ‎mpl‏ الفأري الناضج على ‎“7١‏ حمض أميني؛ أقل من الطول الكامل المفترض ل .017 ويتم ‎dW‏ تسميته 140012. يتم ترقيم ‎Nucleotides‏ في بداية كل خط. يتم ترقيم مكونات الأحماض الأمينية أعلى ه التسلسل بداية بحمض مسلسل ‎١‏ 1 56. يتم وضع خط تحت المواقع الممكن إدخال مجموعة ‎N-glycosylation‏ . يتم توضيح أحماض ‎Cysteine‏ بوضع نقطة أعلى التسلسل. شكل رقم ‎(VY)‏ : يبين تسلسل ال ‎cDNA‏ (هوية تسلسل رقم: ؟٠١)‏ وتسلسل البروتين المتوقع (هوية ‎J ula‏ رقم: ‎(Yo‏ لهذا الشكل ‎ML — isoform‏ الفأري ‎٠١‏ (241). يتم ترقيم ‎nucleotides‏ في بداية كل خط. يتم ترقيم مكونات الأحماض الأمينية أعلى التسلسل بداية بمسلسل رقم 1 561. يحتوي هذا الشكل ‎isoform‏ ‏لربيطة ‎mp]‏ الفأري الناضج على 75 مكون حمض أميني ويعتقد أنه يكون ربيطة ‎mpl‏ بالطول الكامل» والمسمى ‎ML‏ يتم توضيح تسلسل الإشارة ‎signal‏ ‏6 بواسطة خط تحتي متقطع وتتم الإشارة إلى نقطة الإنشطار المحتملة ‎Vo‏ بواسطة سهم. يتم توضيح المناطق © و“ غير المترجمة بواسطة حروف تحتية صغيرة ‎lower case letters‏ يتم وضع خط تحث الإلغائين ‎deleations‏ ‏الموجودين كنتيجة للقطع واللزق البديل ‎mML2)‏ و ‎mML3‏ ). يتم توضيح احماض ‎day Ylcysteine‏ بواسطة نقطة. يتم وضع المواقع السبعة المحتملة لإدخال مجموعة ‎N-glycosylation‏ في مربعات.

‎gy -‏ - شكل رقم (18): يقارن تسلسل الأحماض الأمينية المستنتجة للشكل ‎ML isoform‏ البشسري 3 (هوية تسلسل رقم:9) والشكل ‎ML isoform‏ فأري المسمى ‎MML3‏ ‏(هوية تسلسل رقم: ‎.)١١‏ تتم محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية المتوقعة للمركب لربيطة ‎ML‏ البشري مع تسلسل ربيطة ‎mpl‏ الفأري. يتم وضع الأحماض هه الأمينية المتطابقة في مربعات ويتم وضع فواصل ‎dashes‏ لمحاذاة مثالية. يتم ترقيم الأحماض الأمينية في بداية كل خط. شكل رقم ‎:)١9(‏ يقارن تسلسلات الأحماض الأمينية المتوقعة للأشكال ‎isoform‏ من ‎ML‏ ‏الناضجة من ‎ML‏ لفأر ‎mouse‏ (هوية تسلسل رقم: ‎ML y (VV‏ لخنزير ‎porcine‏ ‏(هوية تسلسل رقم: ‎ML (VA‏ - لانسان (هوية تسلسل رقم : 6). تتم محاذاة ‎Ve‏ تسلسلات أحماض أمينية مع فواصل موضحة بواسطة ‎dashes‏ ؛ مدخلة لمحاذاة مثالية. يتم ترقيم أحماض أمينية في بداية كل خط مع وضع الأحماض الأمينية المتطابقة في مربعات. يتم توضيح المواقع المحتملة لإدخال مجموعة ‎N-‏ ‏70 بواسطة مربع مظلل ويتم تعيين بقايا — ‎cysteine‏ بواسطة نقطة. يتم وضع خط تحت ‎de sens‏ الأحماض الأمينية ثنائية القاعدية عليها ‎\o‏ وإلى تمتل موقع عمل انزيم ‎protease‏ محتمل لشطر البروتين. يتم تحديد الأربعة حذوفات للأحماض الأمينية التى ثبت حدوثها في كل الأنواع الثلاثة ‎(ML2)‏ بواسطة مربع أسود. شكل رقم ‎:)٠١(‏ يبين تسلسل ال ‎cDNA‏ (هوية تسلسل رقم: ‎(V4‏ وتسلسل بروتين ناضج مستنتج (هوية تسلسل رقم: ‎(VA‏ للشكل ‎ML isoform‏ لخنزير (0141). يحتوي هذا 2 الشكل ‎mpl Alay isoform‏ الخنزير على 777 متبقى حمض أميني ويعتقد أن

Cosy ‏يتم ترقيم ال‎ PML ‏الخنزير الكامل؛ المسمى‎ mpl ‏يكون هذا هو طول ربيطة‎ ‏في بداية كل خط. يتم ترقيم بقايا الحمض الأميني أعلى التسلسل بداية‎ nucleotides

Ser1 )١( ‏رقم‎ شكل رقم ‎:)7١(‏ يبين تسلسل ال ‎cDNA‏ (هوية تسلسل رقم: ‎(Yo‏ وتسلسل البروتين الناضج ° المتوقع (هوية تسلسل رقم: ‎(Y)‏ للشكل ‎ML isoform‏ للخنزير ‎(pML2)‏ ‏يحتوي هذا الشكل ‎isoform‏ _لربيطة ‎mpl‏ الخنزير على ‎YYA‏ حمض أميني ناقصة أربعة أحماض أمينية من الطول الكامل لربيطة ‎mpl‏ الخنزير؛ المعينة 2. يتم ترقيم ‎nucleotides‏ في بداية كل خط. يتم ترقيم بقايا حمض أميني أعلى التسلسل بداية ب 1 ‎Ser‏ رقم ‎.)١(‏ ‎٠‏ شكل رقم (77): يقارن تسلسل الأحماض الأمينية المستنتجة للشسكل ‎ML isoform‏ الخنزير بالطول الكامل ‎pML‏ (هوية تسلسل رقم: ‎(VA‏ والشكل ‎ML isoform‏ الخنزير المسمى 0112 (هوية تسلسل رقم: ‎.)7١‏ تتم محاذاة تسلسل الحمض الأميني المتوقع لل ‎PML‏ مع تسلسل ‎pML2‏ يتم وضع الأحماض الأمينية المتطابقة في مربع ويتم إدخال فواصل مدخلة لمحاذاة مثالية بواسطة شرطة ‎dashes‏ . يتم ‎vo‏ ترقيم أحماض أمينية في بداية كل خط. ‏شكل رقم ("7): يبين ميزات وثيقة الصلة بال ‎J ska')plasmid pSVIS.ID.LLMLORF‏ كامل" ‏أو ‎(TPOs3,‏ المستخدم لنقل المورث لخلايا عائل 0110-0012 لإنتاج ‎CHO-‏ ‎.th TPO33,‏ ‏شكل رقم (؛ 7): يبين ميزات وثيقة الصلة ب ‎truncated ")plasmid pSV15.ID.LL.MLEPO-D‏ ‎CHO- ‏لإنتاج‎ CHO-DP/2 ‏أو 10,5) المستخدم لنقل المورث لخلايا عائل‎ ' Y. .th ‏و10‎

م - الأشكال ‎(Yo) (iro)‏ و(© 7"ج): تبين تأثير )153 ‎E.coli-rh TPO (Met,‏ على الصفائح الدموية (أ) وخلايا الدم الحمراء (ب) و(ج) خلايا الدم البيضاء في ‎OA‏ ‏العادية. تم حقن مجموعتين من ستة إناث فئران 05786 يوميا بواسطة إما محلول منظم ‎PBS‏ أو ‎١7‏ ميكروجرام )153 ,046 ‎٠٠١( Ecoli-th TPO‏ ° ميكرولتر تحت الجلد). في اليوم صفر وفي الأيام ‎=v‏ تم أخذ (0؛ ميكرولتر) دم من الجيب العيني ‎orbital sinus‏ . تم تخفيف هذا الدم مباشرة في (١٠مل)‏ من ‎sale‏ تخفيف تجارية وتم الحصول على تعداد دم كامل على ‎.Serrono Baker Hematology Analyzer 9018‏ يتم تقديم البيانات على هيئة متوسط + ‎Uns‏ معياري للمتوسط ‎-Standard error‏ ‎٠‏ الأشكال ‎(IY)‏ ,)1 ¥@( و(77ج): تبين تأثير )153 ‎E.coli-rh TPO (Met,‏ على الصفائح الدموية )1( وخلايا الدم الحمراء )2( و(ج) خلايا الدم البيضاء في فئران معالجة بالإشعاع دون الفناء ‎sublethally irradiated‏ ثم عولجت أيضا بالإشعاع ودون الفناء مجموعتين من ‎٠١‏ فثران 05736 إناث بواسطة ‎cGy Vor‏ من إشعاع جاما من مصدر ‎Cs‏ وحقنها يوميا بواسطة ‎Lf‏ محلول منظم ‎PBS‏ أو © ‎Vo‏ ميكروجرام )153 ‎E.coli-th TPO (Met,‏ . في اليوم صفر والنقط الزمتية الوسيطة المتتالية تم أخذ )£4 ميكرولتر) من الدم من جيب العين. تم تخفيف هذا الدم مباشرة في ( ٠مل)‏ من ‎sala‏ تخفيف تجارية وتم الحصول على تعداد دم كامل على 9018 ‎Baker Hematology Analyzer‏ 560000. يتم تقديم البيانات على هيئة متوسط + ‎Tha‏ معياري للمتوسط.

— fo ‏على (أ) الصفاح الدموية‎ CHO-th TPO; ‏و(ااب) و(١7ج): تبين تأثير‎ (fry) ‏الأشكال‎ ‏و(ب) خلايا الدم الحمراء (كريات الدم الحمراء)‎ ¢(thrombocytes ‏(خلايا التجلط‎ ‏و(ج) خلايا الدم البيضاء (كريات الدم البيضاء) في فئران طبيعية. تم حقن‎ ‏أو‎ PBS ‏يوميا بواسطة إما محلول منظم‎ C57 6 ‏إناث فئران‎ ١ ‏مجموعتين من‎

‎٠ ) CHO-th TPO, alas See oY °‏ ميكرو لتر تحت الجلد). في اليوم

‏صفر وفي الأيام © - 7 تم أخذ )£0 ميكرولتر) دم من جيب العين. تم تخقيف هذا الدم مباشرة في (١٠مل)‏ من مادة تخفيف تجارية وتم الحصول على تعداد دم كامل على 9018 ‎Serrono Baker Hematology Analyzer‏ .24 تقديم البيانات على هيئة متوسط + ‎Wad‏ معياري للمتوسط.

‎٠‏ شكل رقم ‎(YA)‏ : يبين منحنيات استجابة جرعة أشكال مختلفة من 00770 تم الحصول عليها من سلالات خلايا مختلفة. تم إنشاء منحنيات استجابة الجرعة ل ‎thTPO‏ من سلالات الخلايا التالية: ,0770 من ‎CHO‏ (طول كامل من خلايا مبيض همستر صيني ‎Chinese hamster ovary cells‏ « و 153 ,»110014 (شكل مبتور موصول ب ‎E.coli‏ بطرفية = ‎N‏ ميثونين منها ‎«(N-terminal methionine‏

‎hTPO;, Vo‏ (طول كامل ‎TPO‏ من خلايا ‎YAY‏ بشرية)؛ ‎met E.coli‏ ناقصة

‎methionine ‏بدون‎ [th TPOjs5] ‏(الشكل المقطوع‎ Met-less 155 methionine ‏إناث فئران 05786 يوميا لمدة‎ ١ ‏تم حقن مجموعات من‎ (E.coli ‏الطرفي من‎ ‏حسب المجموعة. كل يوم تؤخذ )£4 ميكرولتر) دم من‎ th TPO ‏أيام بواسطة‎ ١ ‏جيب العين لتعداد دم كامل. تكون البيانات المقدمة سابقا هي أقصى تأثيرات‎ ‏حدث هذا في‎ (Met 153 E.coli) ‏تمت رؤيتها مع المعالجات المختلفة باستثناء‎ Y. ‏المشار إليها من قبل تمت‎ "146: 153 E.coli ‏من المعالجة. في مجموعة‎ ١ ‏اليوم‎

- رؤية التأثير الأقصى في اليوم 5.0 تقديم البيانات على هيئة متوسطات + الخطأً المعياري للمتوسط. شكل رقم ( 4 يبين منحنيات الاستجابة للجرعة مقارنة نشاط الأشكال طول كاملة الطول و"المقصوص ‎cliped‏ " ل ‎th TPO‏ منتج في ‎CHO LA‏ بشكل مبتور من ‎E.coli °‏ تم حقن مجموعات من ‎١‏ إناث فئران 05786 يوميا بواسطة ‎٠,(‏ ‏ميكروجرام) ‎th TPO‏ بانواعه المختلفة. في ‎N= XY asl)‏ تم أخذ )£0 ميكرولتر) دم من جيب العين لتعداد دم كامل. كانت مجموعات المعالجة همي ‎TPO,‏ الجزء المبتور من ‎TPO‏ ¢ د::7100 ‎Ecoli‏ (جزء مخلوط). طول كامل ‎TPO‏ محتوى على أشكال 860- 460 تقريبا طول كامل و١٠- ‎1٠0‏ ‎٠١‏ مقصوصة؛ :100 (جزء ‎7١‏ 30165800001 ) = جزء مقصوص منقى من مستحضر الخليط الأصلي ‎TPOss, 5 » original "mix" preparation‏ (جزء ‎٠١‏ ‎(k‏ طول كامل منقى لجزء ‎TPO‏ من مستحضر الخليط الأصلي. يتم تقديم البيانات على هيئة متوسطات + الخطأ المعياري للمتوسط. شكل رقم ‎(Yh)‏ عبارة عن رسم كريكاتوري ‎cartoon‏ يبين تجربة ‎KIRA ELISA‏ لقياس ‎‘TPO‏ ‎\o‏ يبين الشكل المخلوط ‎MPL/Rse.gD chimera‏ وأجزاء ملائمة للمستقبلات الأساسية وأيضا التركيبة النهائية ‎all)‏ اليمين من الشكل) وسجل سير عمليلت (الجزء اليسار من الشكل ) مبينا خطوات مرتبطة بالتجربة. شكل رقم ‎:)7١(‏ عبارة عن خريطة تسلسل عمليات لتجربة ‎KIRA ELISA‏ تبين كل خطوة في الإجراء.

الأشكال ‎(IVY)‏ - (7*ل): توفر تسلسل النيوكليوتيد ‎nucleotide‏ (هوية التسلسل رقم: ‎(YY‏ للناقل المعبر ‎LL expression vector‏ .17.112 051771 المستخدم للتعبير 10 في المثال رقم )09( شكل رقم ‎(v7)‏ : عبارة عن تمثيل تخطيطي ‎schematic representation‏ لتحضير ال ‎plasmid‏ ‏هت 1 ‎pMP‏ " شكل رقم ‎(V4)‏ عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎.pPMP,; plasmid‏ شكل رقم ) ‎(vo‏ عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎.pMPs; plasmid‏ شكل رقم ) ): عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎.pMP», plasmid‏ شكل رقم ‎(PV)‏ عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎plasmid‏ :0110 ‎٠‏ شكل رقم ‎(YA)‏ عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎PMP; plasmid‏ شكل رقم (39): عبارة عن جدول لأفضل خمس نسائل ‎TPO clones‏ معبرة عن ‎TPO‏ من بنك ال ‎plasmid‏ ,10م (هويات تسلسل أرقام: ‎Yo YE YY‏ واولا و8١).‏ شكل رقم ) $ ( : عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎.pMP,; plasmid‏ شكل رقم ) ‎١‏ ( : عبارة عن ته ‎Lh‏ ( تخطيطي لتحضير الل ‎-pMPs; plasmid‏ ‎٠‏ شكل رقم ) ‎$Y‏ ( : عبارة عن تمثيل تخطيطي لتحضير ال ‎-pMP5;5; plasmid‏

الوصف التفصيلىي ‎١‏ - تعريفات: بصفة عامة؛ يكون للكلمات أو التعبيرات التالية المعاني المبينة عند استخدامها في الوصف ‎description‏ والأمظة ‎examples‏ وعناصر الحماية ‎.claims‏ ‏© يشير التعبير "عامل تفكيك الارتباط ‎Chaotropic agent‏ " إلى مركب يمكنه؛ في محلول مائي وبتركيزات مناسبة؛ إحداث تغير في الهيئة الفراغية ‎spatial configuration‏ أو تطابق بروتين ‎conformation of a protein‏ بواسطة خلخلة ‎disrupting‏ جزئيا على الأقل للقوى المسئولة على الحفاظ على البنية الثنائية ‎secondary‏ والثلاثية العادية :8 للبروتين. تشتمل مثل هذه المركبات؛ على سبيل المثال» ‎urea‏ ؛ و ‎guanidine HCI‏ ¢ و ‎sodium thiocyanate‏ . يتم ‎٠‏ بصورة طبيعية الاحتياج إلى تركيزات عالية؛ في العادة ؛ - 4 مولار؛ من هذه المركبات لاحداث تأثير انطباقي على هيكلة البروتينات. ‎Cytokine”‏ " هو تعبير عام للبروتينات المنطلقة بواسطة نوع واحد من الخلايا يعمل على خلية أخرى كوسائط بين الخلايا. من ‎A Bd‏ هذه ‎cytokines‏ مركبات ليمفية ‎lymphokines‏ و ‎monokines‏ وهرمونات ‎polypeptide‏ تقليدية. وتشمل ال ‎cytokines‏ هرمون النمو ‎growth‏ ‎hormone | ١٠‏ وعوامل نمو شبيهة بالانسولين ‎insulin-like growth factors‏ وهرمون نمو بشري ‎human growth hormone‏ وهرمون نمو بشري ‎—=N‏ مثيو تيل ‎N-methionyl human growth‏ ‎(saa 9 hormone‏ نمو بقري ‎ys wa 5bovine growth hormone‏ الغدة جار درقية ‎parathyroid hormone‏ وخلاصة ‎thyroxine‏ و ‎insulin‏ وأنسولين مبكر ‎proinsulin‏ و ‎relaxin‏ ‏مبكر وهرمونات ‎Jie glycoprotein‏ هرمون تحفيز جرابات المبيض ‎(FSH)‏ وهرمون تحفيز ‎٠‏ الغدة الدرقية ‎thyroid stimulating hormone (TSH)‏ وهرمون ‎(LH) leutinizing‏ وعامل نمو

مولد للدم ‎hematopoietic growth factor‏ وعامل نمو كبدي ‎hepatic growth factor‏ وعامل نمو تليفي ‎fibroblast growth factor‏ و 2018000 و لاكتوجين مشيمي ‎placental lactogen‏ وعامل موت الوزم ‎(TNF-Bs TNF-0) « tumor necrosis‏ ومادة ‎Ja afi‏ ميوليريان ‎mullerian-‏ ‎inhibiting substance‏ و ببتيد متعلق بجونادوكتروبين فأري ‎mouse gonadotropin-associated‏ ‎peptide ٠ :‏ و مثشبطين ‎inhibin‏ ومنشطين ‎activin‏ وعامل نمو بطاني وعائي ‎vascular endothelial‏ ‎growth factor‏ و ‎integnn‏ وعوامل نمو العصب ‎nerve growth factors‏ مقلى ‎TNF-B 5s TNF-a‏ وعامل نمو شبيه بالأتسولين ‎١‏ و7 11- ‎insulin-like growth factor 1 and‏ و ‎erythropoietin‏ ‎(EPO)‏ وعوامل مؤثزة على العظام ‎interferon-a Ju interferons s osteoinductive factors‏ و8 و7 وعوامل تحفيز مستعمرة ‎colony stimulating factors (CSFs)‏ مثل خلايا أكلة كبيرة ‎macrophage-CSF (M-CSF) ٠‏ وخلايا أكلة كبيرة حبيبية ‎granulocyte. macrophage-CSF‏ ‎WA 5 (GM-CSF)‏ حبيبية ‎IL- 5 IL-1 Jie interleukins (IL's) 5 granulocyte-CSF (G-CSF)‏ ‎IL-2 5 la‏ و ‎IL-3‏ و ‎IL-6 § IL-5 s IL-4‏ و ‎IL-7‏ و ‎IL-8‏ و ‎IL-9‏ و ‎J deg IL-12 5 IL-11‏ ‎polypeptide‏ أخرى بما في ذلك ‎LIF‏ و5017 ومجموعة ربيطة. كما هو مستخدم في هذه المواصفة تقصد التعبيرات السابقة الاشتمال على بروتينات من مصادر طبيعية أو من مزرعة ‎ve‏ خلايا ناتج هندسة وراثية ‎recombinant cell culture‏ . بالمثل؛ يقصد أن تشتمل التعبيرات على مكافئات فعالة حيوياً ‎biologically active equivalents‏ ؛ على سبيل المثال؛ مختلفة في تسلسسل

الحمض الأميني بحمض أميني واحد أو أكثر أو في ‎gol‏ أى مدى إدخال ‎glycosylation‏ . يتم استخدام "ربيطة ‎"mpl‏ و" ‎polypeptide‏ لربيطة ‎thrombopoietin"s "ML" s "mpl‏ " أو ‎"TPO"‏ ‏بصورة تبادلية في هذه المواصفة وتتضمن أي ‎polypeptide‏ يمتلك خاصية الربط مع ‎mpl‏ عضو ‎v.‏ العائلة الكبرى لمستقبل ال ‎coytokine‏ وله خاصية حيوية لل ‎ML‏ كما هو معين فيما يلي. تكون خاصية حيوية مثالية هي القدرة على تحفيز دمج ‎nucleotides‏ المشعة (على سبيل المثال- ‎thymidine‏ 311 ) في ال ‎Ba/F3 LAI DNA‏ المعتمدة على 11-3 المنقول إليها المورث

‎Co. =‏ بواسطة ‎mplP‏ بشري. خاصية حيوية مثالية أخرى هي القدرة على تحفيز دمج ‎33S‏ صفائح دموية دوارة ‎peripheral‏ في تحليل إرتداد ‎rebound assay‏ صفائح دموية فأرية. يشضتمل هذا التعريف على ‎polypeptide‏ المعزولة من مصدر ربيطة ‎Jie mpl‏ بلازما خنزير ثابت ‎aplastic‏ ‏لاتنسجية المشروحة في هذه البراءة أو من مصدر آخر؛ مثل أنواع حيوانات ‎sal‏ بما في ذلك م الإنسان أو محضرة بواسطة ناتج الهندسة الوراثية ‎recombinant‏ أو طرق تخليقية ‎synthetic‏ ‏وتشتمل على أشكال متنوعة بما في ذلك ‎clin da‏ وظيفية ‎functional derivatives‏ وأجزاء ‎fragments‏ وسلالات ‎alleles‏ وأشكال ‎isoforms‏ ونظائر ‎analogues‏ منها. يعني "'جزء ربيطة ‎mpl ligand fragment‏ " أو "جزء ‎(TPO‏ جزء من ربيطة ‎mpl‏ طبيعية بطول كامل ناضج أو تسلسل ‎TPO‏ ناقص واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية أو وحدات ‎carbohydrate ٠‏ قد يحدث نقص الحمض الأميني أو الأحماض في أي مكان في الببتيد بما في ذلك ‎Lyf‏ في النهاية الطرفية ‎N-terminal‏ أو النهاية الطرفية ‎C-terminal‏ أو داخلياً. يلتقى الجزء في خاصية حيوية واحدة على الأقل مع ربيطة ‎mpl‏ سيكون لأجزاء ربيطة ‎mpl‏ بصورة نمطية ‎typically‏ تسلسل متتالي بمقدار ‎٠١‏ أو ‎١‏ أو 70 أو 78 أو ‎٠‏ أو 46 من مكوناته من الأحماض الأمينية على الأقل والتي تكون متطابقة مع تسلسلات ربيطة ‎mpl‏ المعزولة من كائن ‎١‏ يي بما في ذلك الربيطة المعزولة من بلازما خنزير لاتتسجية ‎aplastic porcine plasma‏ أو ربيطة لانسان أو الفأر وبصفة خاصة حيز ‎domain‏ ال 800 لها. تعتبر أ نموذج ممثل لأجزاء طرفية = ‎N‏ هي وملالط أر )1.153 ‎TPO(Met!‏ ‏يعني التعبير "أنواع مختلفة لربيطة ‎Mpl ligand variants‏ " أو "أنواع مختلفة لتسلسل ربيطة ‎mpl‏ ‎ligand sequence variants‏ " كما هي معينة في هذه البراءة ربيطة ‎mpl‏ فعالة حيويا كما هو © - معين فيما يلي له أقل من هوية تسلسل ‎٠٠١‏ بربيطة ‎mpl‏ معزول من مزرعة خلايا ناتجة عن هندسة وراثية أو بلازما خنزيرية لاتنسجية أو ربيطة بشرية لها التسلسل المستنتج المشروح في شكل رقم ‎)١(‏ (هوية تسلسل رقم: ‎.)١‏ طبيعياً ؛ سيكون لأنواع مختلفة من ربيطة ‎mpl‏ فعال

١ه‏ - حيوياً تسلسل أحماض أمينية بحوالي 770 على الأقل هوية تسلسل حمض أميني مع ربيطة ‎mpl‏ ‏معزول من بلازما خنزيرية لاتنسجية أو ربيطة كاملة من الفأر أو البشر أو أجزاء منه (إراجع شكل رقم [هوية تسلسل رقم:١])؛‏ ومن المفضل حوالي 775 على الأقل؛ وأكثر تفضيلاً حوالي ‎٠‏ على الأقل وأكثر تفضيلا لا يزال حوالي 788 على الأقل وأكثر تفضيلا ‎Lad‏ حوالي 140 ‎٠‏ على الأقل؛ والأكثر تفضيلا حوالي ‎ve‏ على الأقل. يكون "ربيطة ‎mpl‏ مركبة ‎"chimeric‏ هو ‎polypeptide‏ محتوى على ربيطة ‎mpl‏ بطول كامل أو جزء واحد أو أكثر منه مدمج 0 أو مربوط ‎bonded‏ مع ‎polypeptide‏ ثان غير متجانس ‎heterologous‏ أو جزء واحد أو أكثر منه. ستساهم الخيميرية بخاصية حيوية واحدة على الأق-ل بالاشتراك مع ربيطة ‎mpl‏ سيكون ‎polypeptide‏ الثاني بصورة نمطية ‎cytokine‏ أو جلوبين ‎٠‏ مناعي ‎immunoglobin‏ أو جزء منهما. يتم استخدام التعبيرات "ربيطة ‎mpl‏ معزول ‎highly purified mpl ligand‏ " و"ربيطة ‎l= mpl‏ النقاوة ‎mpl ddan y's" homogeneous mpl ligand‏ عالي التجانس ‎substantially‏ تستخدم هذه المسميات بصورة تبادلية وتعني ربيطة ‎mpl‏ تمت تنقيته من مصدر ربيطة ‎mpl‏ أو تم تحضيره بواسطة هندسة ورائية أو طرق تخليقية ‎synthetic‏ ويكون خاليا بدرجة كافية من ‎peptides‏ أو ‎proteins vo‏ الأخرى ‎)١(‏ للحصول على الأقل على ‎Ve‏ ومن المفضل ‎٠١‏ حمض أميني للطرفيةٍ - أو تسلسل حمض أميني داخلي باستخدام وسيلة قراءة تسلسل على هيئة كأس دوار ‎spinning‏ ‎cup sequenator‏ أفضل وسيلة قراءة تسلسل متاحة تجاريا مباعة في السوق أو معدلة بواسطة طرق منشورة من تاريخ إيداع هذه ‎Adal gall‏ أو (؟) تجانسية ‎homogeneity‏ بواسطة ‎SDS-‏ ‏08 تحت ظروف غير مختزلة أو مختزلة باستخدام أزرق كوماسي ‎Coomassie blue‏ 5 « ‎٠‏ بصورة مفضلة صبغ فضي ‎stain‏ :51176. تعني التجانسية هنا أقل من حوالي 5# تلوث ببروتينات من مصدر آخر.

الاج يعني التعبير "خاصية حيوية ‎Biological property‏ " عند استخدامه في ‎Ale‏ إما مع ‎Adan)‏ ‎"mpl‏ أو 'ربيطة ‎mpl‏ معزول ‎"isolated‏ الحصسول على نشاط لمولد للصفائح الدموية ‎thrombopoietic activity‏ أو الحصول على مؤثر في الكائن الحي ‎vivo‏ 10 أو وظيفة مولد الضد ‎antigenic function‏ أو نشاط يتم إحداثه بصورة مباشرة أو غير مباشرة أو أدائه بواسطة ربيطة denatured ‏أو غير الطبيعية‎ native conformation ‏(سواء في هيكلته الطبيعية‎ mpl ٠ ‏أو ربط أي مادة حاملة‎ mpl ‏ربط‎ Effector ‏أو جزء منه. تشتمل وظائف المؤثر‎ (conformation ‏وبصفة خاصة إرسال إشارة تكاثرية بما في ذلك‎ empl ‏أو محفزة أو مثبطة ل‎ carrier ‏مساعدة‎ ‎cytokines ‏وتعديل النشاط الحيوي الل‎ DNA ‏والوظيفة التنظيمية لل‎ replication ‏التضاعف‎ ‏التشيط‎ ¢(cytokine ‏(وبصفة خاصة‎ receptor activation ‏الأخرى؛ وتنشيط المستقبل‎ ‏ونمو أو تمييز الخلايا وما‎ ¢ up- or down regulation ‏وزيادة أو خفض التتظيم‎ deactivation ٠ ‏أو موقع مولد ضد‎ epitope ‏وظيفة توليد ضد امتلاك قمة لاصقة‎ antigenic ‏شابه ذلك. تعني‎ antibodies ‏مع أجسام مضادة‎ crossreacting ‏يكون قادرا على التفاعل التبادلي‎ antigenic site polypeptide — ‏توليد الضد الأساسية‎ antigenic ‏الطبيعي . تعتبر وظيفة‎ mpl ‏منشأة ضد ربيطة‎ antibody ‏مول على الأقل لجسم مضلا‎ /١ ٠٠١ ‏هي أنه يرتبط بألفة مقدارها حوالي‎ mpl ‏ربيطة‎ ‏المعزول من بلازما خنزيرية لا تنسجية. بصورة عادية؛ يرتبط‎ mpl ‏ضد ربيطة‎ las ve gvfd'm polypeptide ‏مول على الأقل. الأكثر تفضيلاً يكون‎ /1 *٠١ ‏ألفة مقدارها‎ polypeptide ‏ضد ربيطة‎ (AU ‏يرتبط مع الجسم المضاد‎ polypeptide ‏فعالة هو‎ antigenically ‏بصورة‎ mpl ‏له أحد وظائف المؤثر المشروحة من قبل. تكون الأجسام المضادة المستخدمة لتعييين‎ mpl rabbit polyclonal ‏هي أجسام مضادة عديدة الانتساخ‎ " 'biologleally activity ‏"النشاط الحيوي‎ ‏المعزول من مزرعة خلايا ناتج من‎ mpl ‏لأرانب منشأة بواسطة صياغة ربيطة‎ antibodies ٠

Freund's ‏خنزيرية لا تتنسجية في المساعد الكامل‎ Le 320 ‏أو‎ recombinant ‏الهندسة الوراثية‎ ‏الاستجابة‎ boosting ‏الجلد للصيغة؛ زيادة‎ Caan ‏والحقن‎ (Freund ‏ل‎ complete adjuvant

‎ov —‏ — المناعية بواسطة حقن التركيبة داخل التجويف البريتوني ‎intraperitoneal‏ حتى يستوي ‎plateaus‏ ‏عيار الجسم المضاد لربيطة ‎mpl‏ ‏يعني التعبير ‎Jad’‏ حيوياً ‎Biologically active‏ " عند استخدامه في ارتباط إما مع 'ربيطة ‎"mpl‏ ‏أو ‎mpl Alay;‏ المعزول"؛ ربيطة ‎mpl‏ أو ‎polypeptide‏ يمتلك نشاط توليد صفائح دموية ‎thrombopoietic ٠‏ أو يساهم في وظيفة مؤثر ‎effector‏ لربيطة ‎mpl‏ المعزول من بلازما خنزيرية لا تتسجية أو معبر عنها في مزرعة خلايا هندسة وراثية المشروحة في هذه المواصفة. ترتبط وظيفة مؤثر أساسي معروف لربيطة ‎mpl‏ أو ‎polypeptide‏ في هذه المواصفة مع ‎mpl‏ وتحفز دمج ال ‎nucleotides‏ المشعة ‎(*H - thymidine)‏ في ال ‎DNA‏ لخلايا ‎Ba/F3‏ ‏معتمدة على 11-3 مزروع فيها ‎mpl P transfected‏ بشري. تكون وظيفة المؤثفر الأخرى ‎٠‏ المعروفة لربيطة ‎mpl‏ أو 0017060808 في هذه المواصفة هي القدرة على تحفيز دمج 58 في صفائح دموية دائرة في تجربة إرتداد صفائح دموية لفأر. وطيفه مؤثر معروفة أخرى لربيطة ‎mpl‏ هي القدرة على تحفيز توليد ‎MK WA‏ بشرية في المعمل ‎in vitro‏ قد يتم تقييم كميتها باستخدام جسم مضاد أحادي الانتساخ ‎monoclonal antibody‏ مرقم إشعاعياً خاصة لجليكوبروتين الخلايا ‎dual‏ الكبيرة ‎megakaryocyte glycoprotein GPIIpIII,‏ ‎١‏ _ يتم تعيين "النسبة المئوية للحمض الأميني" بالنسبة لتسلسل ربيطة ‎mpl‏ في هذه المواصفة بالنسبة المئوية لمكونات البروتين من الأحماض الأمينية في تسلسل مختار يكون متطابقاً مع البقايا في تسلسل ربيطة ‎mpl‏ المعزول من بلازما خنزيرية لا تنسخية أو ربيطة فأر أو بشرية له تسلسل الأحماض الأمينية المستنتج المشروح في شكل رقم ‎)١(‏ (هوية التسلسل رقم: ‎of)‏ بعد محاذاة التسلسلات وإدخال الفواصل؛ إن كان ضرورياً؛ لتحقيق هوية التسلسل بأقصى نسبة مئوية؛ وعدم ‎oy.‏ اعتبار أي استبدالات ثابتة ‎conservative substitutions‏ لجزء من هوية التسلسل. لا توجد حزفيات ‎deletions‏ أو إدخالات ‎insertions‏ للطرفية ‎N-‏ أو الطرفية ‎C=‏ أو الامتدادات الداخلية ‎internal extensions‏ 4 تسلسل ربيطة ‎mpl‏ سيتم تفسيرها كمؤثر على نوعية التسلسل أو

مج - التشابه. بذلك تشتمل ‎polypeptides‏ ربيطة ‎mpl‏ فعالة حيويا مثالية تعخبر أن لها تسلسلات متطابقة على: ربيطة ‎mpl‏ - قبلي ‎ligand‏ اصسدم«م6م وربيطة ‎mpl‏ قبني ‎pro-mpl ligand‏ وربيطة ‎mpl‏ ناضجة ‎mature mpl ligand‏ . قد يتم تحقيق معرفة "التسلسل الدقيق ‎microsequencing‏ لربيطة ‎"mpl‏ بواسطة أي إجراء قياس ‎٠‏ ملائم بشرط أن يكون الإجراء حساس بدرجة كافية. في أحد ‎Jie‏ هذه الطرق؛ يتم سلسلة ‎Je polypeptide‏ النقاوة تم الحصول عليه بواسطة ‎SDS gels‏ أو من خطوة ‎A fli HPLC‏ مباشسرة بواسطة تحلل ‎Edman‏ الذاتي ‎phenyl) automated Edman degradation‏ ‎(isothiocyanate‏ باستخدام وسيلة سلسلة طراز 4708 للأنظمة الحيوية المستخدمة طور غازي ‎Applied Biosystems gas phase sequencer‏ مجهزة بواسطة ‎als wg‏ تحليل حمض أميني ‎120A phenylthiohydantion (PTH) amino acid analyzer | ٠‏ بالإضافة إلى ذلك؛ قد يتم ‎Jilly‏ سلسلة أجزاء ربيطة ‎mpl‏ المحضرة بالتحلل الكيميائي (على سبيل المثال ‎(hydroxylamine. 2-nitro-5-thiocyanobenzoate «CNBr‏ أو إتزيمي (على سبيل المثالء؛ ‎(staphylococcal protease «¢ clostripain « trypsin‏ متبوعا بواسطة تتقية الأجزاء (ب ‎HPLC‏ ‏على سبيل المثال). يتم تحليل أحماض أمينية 1 باستخدام نظام بيانلت ‎(Justic innovations,‏ ‎(Palo Alto, CA) Chrom Perfect ٠‏ يتم إجراء توضيح لتسلسل على جهاز حاسب ‎VAX™‏ ‎Digital Equipment Co.‏ 11/785 كما هو مشروح بواسطة ‎Henzel et al., J.

Chromatography,‏ ]1987[ 41-52 :404 بصورة اختيارية؛ قد يتم التحليل ‎ectrophoresis‏ لعينات مفصولة على ‎HPLC‏ على © — + ‎SDS-PAGE 7Y‏ ثم نقلها كهربيا إلى غشاء ‎(Pro Blott, AIB, PVDF‏ ‎Foster City, CA)‏ صبغها بواسطة ‎Coomassie™ Brilliant Blue (Matsurdiara, J.

Biol.‏ ‎Chem, 262: 10035-10038 [1987]) ©‏ 3 استئصال بروتين محدد قد تم تعيينه بواسطة الصبغ من البقعة ويتم تنفيذ دراسة تسلسل سلسلة الطرفية ‎Ne‏ بواسطة وسيلة السلسلة طور غازي المشروحة من قبل. بالنسبة لتسلسلات البروتين الداخلية؛ يتم تجفيف أجزاء ‎HPLC‏ تحت تفريغ ‎«(Speed Vac ™)‏ وإعادة تعليقها في محاليل ملائمة منظمة للأس الهيدروجيني؛ وهضمها

- 00 —

Wako Chemicals, Richmond,) Lys-c ‏أو الإنزيم المتخصص‎ » cyanogen bromide ‏بواسطة‎ ‎(va‏ أو ‎(Boehringer Mannhein, Indianapolis, IN) Asp-N‏ بعد الهضم ؛ تتم سلسلة ‏الببتيدات الناتجة لخليط أو بعد فصلها ب ‎HPLC‏ على عمود ‎C4‏ مشبع ‎propanol‏ متدرج ‎gradient‏ في ‎TAF 70.1١‏ قبل السلسلة بالطور الغازي. يتم تعريف "نقص الصفائح الدموية ‎Thrombocytopenia ٠‏ " كتعداد صفائح دموية أقل من ‎١١ ١٠١‏ لكل لتر من الدم. ‏يتم تعريف "نشاط مولد للصفائح الدموية ‎BLAS" Thrombopoietic activity‏ حيوي يتكون من ‏تعجيل تكاثر و/أو تمييز و/أو تنضيج للخلايا ‎MK‏ أو المواد التمهيدية ‎precursors‏ للخلايا ‎MK‏ ‏إلى شكل منتج للصفائح الدموية لهذه الخلايا. قد يتم قياس هذا النشاط في تجارب مختلفة بما في ‏ذلك تجربة تخليق ‎synthesis‏ ارتداد الصفائح الدموية الفأرية في الكائن الحي؛ وتجربة حث ‎antigen ٠‏ سطح ‎LDA‏ الصفائح الدموية كما هو مقاس بواسطة تجربة مناعية مضادة للصفائح ‏الدموية ‎anti-platelet immunoassay (Anti GPILIIL,)‏ لسلالة خلايا بدائية ‎MK‏ للوكيميا بشوية ‎human leukemia megakaryoolastic cell line (CMK)‏ « وحث التزاوج المتعدد في سلالة ‎. megakaryoblastic cell line (DAMI) ‏خلايا بدائية نقيية كبيرة‎ ‏يتم تعريف ‎Thrombopoietin” (TPO)‏ على أنه مركب له نشاط مولد للصفائح الدموية أو يكون ‎١‏ قادرا على زيادة تعداد الصفائح الدموية لمصل الدم ‎serum‏ في ‎AS‏ ثديي. يكون 170 قادر ‏بصورة مفضلة على زيادة تعداد الصفائح الدموية النامية من الداخل بواسطة ‎7٠١‏ على الأقلء ‏وأكثر تفضيلا بواسطة ‎٠‏ 5 والأكثر تفضيلا قادر على رفع تعداد الصفائح الدموية في الإنسان ‏إلى أكثر من ‎٠١ x ١٠١‏ لكل لتر من الدم. ‏يكون "الحمض النووي لربيطة ‎mpl‏ المعزول ‎'Tsolated mpl ligand nucleic acid‏ هو ‎RNA‏ أو ‎٠‏ 0 لاط محتوى على أكثر من ‎١١‏ ومن المفضل ‎٠١‏ أو أكثر قاعدة نيوكليوتيد تسلسلية ‎sequential‏ ‎nucleotide bases‏ تشفر ‎encoding‏ ربيطة ‎mpl‏ أو جزء منه فعال حيوياء يكون تكميليا ‎complementary‏ لل ‎RNA‏ أو ‎«DNA‏ أو يهجن ‎RNA hybndizes‏ أو ‎DNA‏ ويظل مرتبط

‎ov —‏ - بصورة ثابتة تحت ظروف معتدلة إلى شديدة ‎stnngent‏ . يكون هذا ال ‎RNA‏ أو ‎DNA‏ خالي من حمض نووي لمصدر ملوث واحد على الأقل يتم ارتباطه به بصورة طبيعية في المصدر الطبيعي ومن المفضل خالي تماما من أي ‎RNA‏ أو 0718 لكائن ثديي. يشتمل التعبير "خالي من حمض نووي لمصدر ملوث واحد على الأقل يتم ارتباطه به بصورة طبيعية ‎free from at‏ ‎"least one contaminating source nucleic acid with which it is normally associated °‏ على الحالة حيث يكون الحمض النووي موجودا في المصدر أو الخلية الطبيعية ولكن يكون في موضع كروموسومي ‎chromosomal location‏ مختلف أو يتم إحاطته ‎flanked‏ بطريقة أخرى بواسطة تسلسلات حمض نووي غير موجود بصورة طبيعية في خلايا المصدر. يكون أحد أمثلة الحمض النووي لربيطة ‎mpl‏ المعزول هو ‎RNA‏ أو ‎DNA‏ الذي يشفر ربيطة ‎mpl‏ فعال حيويا ‎٠‏ مساهم ب ‎Ve‏ هوية تسلسل على الأقل؛ وأكثر تفضيلا ‎yA‏ على الأقل؛ ولازال أكثر تفضيلا على الأقل؛ وأكثر تفضيلا أيضا 90 والأكثر تفضيلا 796 هوية تسلسل مع المركب الترابطي ‎mpl‏ البشري أو الفأري أو الخنتزيري. يعني التعبير "تسلسلات مقارنة ‎Control sequences‏ " عند الإشارة إلى التعبيرء فهو يعني تسلسلات ‎DNA‏ ضرورية للتعبير عن جزء جيني فعال في كائن معين. تشتمل تسلسلات التحكم ‎١‏ المناسبة في البروكاريوت ‎prokaryotes‏ ¢ على سبيل ‎«Jha‏ على معزز ‎promoter‏ « وبصورة اختيارية تسلسل عامل؛ وموقع ربط ريبوسوم ‎ribosome binding site‏ ومن الممكن تسلسلات أخرى مفهومة بصورة ضعيفة. يعرف أن ‎WIA‏ ذات نواة طبيعية ‎Eukaryotic‏ تستخدم معوزات ‎promoters‏ وإشارات مجموعة ‎polyadenylation signals‏ ومحثاث ‎-enhancers‏ ‏يعني التعبير 'موصل بصورة عملية ‎Operably linked‏ " عند الإشارة إلى الأحماض النووية يتم © فيها وضع الأحماض النووية في علاقة وظيفية مع تسلسل حمض نووي آخر. على سبيل ‎J‏ ‏يتم بصورة طيعة توصيل ‎DNA‏ لتسلسل سابق أو دليل إفرازي ‎secretory‏ إلى ‎DNA‏ ل ‎polypeptide‏ إذا تم بناءه ‎expressed‏ على أنه بروتين سابق يساهم في إفراز ‎polypeptide‏ : يتم

لان - بصورة عملية توصيل معزز 0802© أو مقوى ‎promoter‏ إلى تسلسل جيني ‎coding sequence‏ إذا كان يؤثر على استنساخ التسلسل؛ أو يتم بصورة عملية توصيل موقع ربط 110080016 إلى تسلسل جيني إذا تم وضعه بطريقة تسهل ‎translation ely‏ البروتينات. بصفة عامة؛ يعني التعبير ‎Joa ga"‏ بصورة عملية ‎"operably linked‏ أن تكون تسلسلات ال ‎DNA‏ التى يتم توصيلها reading ‏متواصلة المعنى ؛ وفي حالة الدليل الإفرازي؛ متواصلة المعنى وفي طور قراءة‎ ٠ ‏متواصلة. يتم تنفيذ التوصيل‎ enhancers ‏من ناحية ثانية؛ لا يجب أن تكون المستحثات‎ phase ‏عند مواقع قطع ملائمة. إذا لم توجد مثل هذه المواقع؛ يتم استخدام‎ ligation ‏بواسطة الربط‎ ‏طبقا‎ synthetic ‏الصناعية‎ oligonucleotide ‏ل‎ linkers ‏أو الموصلات‎ adaptors ‏المهايئات‎ ‏لممارسة تقليدية.‎

‎٠‏ يعني التعبير "خارج المنشاً ‎Exogenous‏ " عند الإشارة إلى عنصر ‎element‏ يعني ؛ سلسل حمض نووي يكون غريبا على الخلية ‎homologous‏ أو مشابه للخلية ولكن في موضع داخل الحمض النووي للخلية العائلة لا يوجد فيه العنصر بصورة عادية. يتم استخدام التعبيرات "خلية ‎Cell‏ " و'سلالة ‎cell line Aa‏ " و”مزرعة ‎"WA‏ بصورة تبادلية في هذه البراءة وتشتمل مثل هذه التسميات على كل نسل ‎progeny‏ خلايا أو ‎ADL‏ خلايا. بنلك؛

‎vo‏ وعلى سبيل ‎(JB‏ تشتمل تعبيرات ‎Jue‏ "الاضطراب التبادلي ‎"transformants‏ و"خلايا محولة ‎"transformed cells‏ على الخلايا الأولى ومزارع مشتقة منها بغض النظر عن عدد التحويلات. يتم الفهم أيضا أن كل النسل قد لا يكون متطابق بدقة في محتوى ال ‎(DNA‏ بسبب التحويرات المتعمدة أو عن غير قصد. يتم ضم ذرية متحورة لها نفس الوظيفة أو النشاط الحيوي الذي جرى البحث عنه في الخلايا متحولة أصلا. حيث تقصد تسميات منفصلة؛ سيكون ذلك واضحا

‎Gey‏ السياق. تكون ‎"Plasmids‏ عبارة عن جزيئات ‎DNA‏ دائرية متضاعفة بصورة ‎autonomously 4&1 wwe‏ ‎replicating‏ تمتلك أصول ‎Independent ongins‏ مستقلة للتضاعف وتسمى في هذه البراءة

مه - بواسطة أحرف صغيرة "م" مسبوقة و/أو متبوعة بواسطة حروف كبيرة و/أو أرقام. تكون 05 البداية في هذه البراءة إما متاحة تجاريا؛ أو متاحة للجميع على أساس غير مقيد؛ أو يمكن انشاؤها من ‎Jie‏ هذه ‎Plasmids‏ المتاحة طبقا لإجراءات منشورة. بالإضافة إلى ذلك؛ تعرف ‎Plasmids‏ أخرى مكافئة في الفن وستكون واضحة للعاملين العاديين في الفن.

‎٠‏ يعني التعبير ‎pad‏ أنزيمي مقيد ‎Restriction enzyme digestion‏ " عند الإشارة إلى ‎(DNA‏ قطع تحفيزي لروابط فوسفو داي إستر ‎internal phosphodiester bonds‏ داخلية ل ‎DNA‏ بواسطة إنزيم يعمل فقط في مواضع معينة أو مواقع معينة في تسلسل ال ‎DNA‏ تسمى مثل هذه الإنزيمات "إندونيوكلييز مقيدة ‎restriction endonucleases‏ ". يدرك كل إتنزيم ‎endonucleases‏ ‏مقيد تسلسل ‎DNA‏ محدد يسمى ‎ad sa’‏ مقيد" يبدى ‎JIG‏ ضعفين ‎two-fold sy letter‏ تكون

‎٠‏ الإنزيمات المقيدة المختلفة المستخدمة في هذه البراءة متاحة تجاريا ويتم استخدام ظروف تفاعلهاء وعواملها المشتركة؛ ومطالب أخرى كما هي منشأة بواسطة اختصارات مكونة من حرف كبير متبوعا بواسطة حروف أخرى تمثل الكائن الدقيق الذي تم الحصول منه على كل إنزيم مقيد أصلا ثم الرقم المعين للانزيم الخاص. بصفة عامة؛ يتم استخدام حوالي ‎١‏ ميكروجرام

‏0 أو جزء ‎DNA‏ مع حوالي ‎١‏ - ؟ وحدة إنزيم في حوالي ‎Yo‏ ميكرولتر من محلول

‎١‏ منظم. يتم تحديد كميات محاليل منظمة ومادة أساس ‎substrate‏ لإنزيمات مقيدة خاصة بواسطة القائم بالتصنيع. يتم في ‎salad‏ استخدام تحضين حوالي ساعة واحدة في درجة ‎a VY‏ ولكن قد يتغير ذلك طبقا لتعليمات المورد. بعد التحضين؛ تتم إزالة البروتين أو ‎polypeptide‏ بواسطة استخلاص ب ‎phenol‏ و ‎chloroform‏ وتتم استعادة الحمض النووي المهضوم من الجزء الملائي بواسطة الترسيب ب ‎ethanol‏ قد يتم إتباع الهضم بواسطة إنزيم تقييد بتحليل مائي فوسفاتيز

‎٠‏ قلوي بكتيري ‎bacterial alkaline phosphatase‏ ل ‎phosphates‏ النهاية © لمنع طرفي الثقييد

‏المنشطرين لجزء ‎DNA‏ من "التكوين الحلقي ‎circularizing‏ " أو تكون حلقة مغلقة ‎closed loop‏ التى سوف تعوق إدخال جزء ‎DNA‏ آخر في موقع التقييد. إذا لم يذكر خلاف ذلك؛ لا يتم إتباع هضم ‎plasmids‏ بواسطة نزع ‎de gana‏ فوسفوريل من الطرفية ‎dephosphorylation‏ © . تكون

‎oq —‏ - إجراءات ومواد تفاعل نزع تقليدية كما هو مشروح في الأقسام ‎Oma) =) mo - ١‏ ‎Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring‏ ‎Hrbor Laboratory Press, 1989]‏ تعني "إستعادة ‎Recovery‏ " أو "عزل" جزء ‎DNA‏ معلوم من هضم مقيد؛ فصل الهضم ‎digest‏ على ‎polyacrylamide‏ أو ‎agarose gel‏ بواسطة الفصل ‎٠‏ الكهربي ‎Gaal 5 celectrophoresis‏ الجزء موضع الاهتمام بواسطة مقارنة هجرته مقابل تلك لأجزاء ال ‎DNA‏ المميزة لوزن جزيئي معلوم؛ وإزالة جزء الجل المحتوي على الجزء المرغوب؛ وفصل الجل من ال ‎DNA‏ يكون هذا الإجراء معروفا بصفة عامة. على سبيل المثال راجع ‎Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981], and Goeddel et al.,‏ ‎Jala? Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980]‏ سوثرن ‎Southern analysis‏ " أو 'تلطيخ سوثرن ‎Southern blotting ٠‏ " عبارة عن طريقة بواسطتها يتم تأكيد وجود تسلسلات ‎DNA‏ في هضم ‎DNA‏ لإنزيم ‎endonuclease‏ تقييد أو ‎DNA‏ _محتوي على تركيبة ثبت وجودها بواسطة التهجين ‎hybridization‏ ب ‎oligonucleotide‏ مشع ‎labeled‏ أو جزء ‎DNA‏ مشضع. يتضمن تحليل ‎Southern‏ نمطيا فصل مهضومات ‎DNA‏ بالفصل الكهربي على مواد ‎agarose gels‏ ونزع الطبيعية 0 من ال- ‎DNA‏ بعد فصل بالاستشراد الكهربي؛ ونقل ال ‎DNA‏ إلى ‎nitrocellulose ٠٠‏ أو ‎nylon‏ أو غشاء دعامة آخر مناسب للتحليل بواسطة ترقيم بالإشعاع أو إدخال مجموعة ‎biotinylated‏ حيوية أو مسبار مرقم بالإنزيم ‎enzyme-labeled‏ كما هو مشروح في الأقسام 4 — ‎©Y — 4 - YV‏ من ‎Sambrook‏ وآخرين السابقة. ‎Jala’‏ سوثرن ‎Southern analysis‏ " أو 'تلطيخ سوثرن ‎or'Southern blotting‏ " هي طريقة مستخدمة لتعيين تسلسلات ‎RNA‏ التى تهجن إلى مسبار معروف مثل ‎oligonucleotide‏ « أو ‎Y.‏ جزء ‎DNA‏ أو ‎cDNA‏ أو جزء منه؛ أو جزء ‎RNA‏ يتم ترقيم المسبار بواسطة نظير مشع ‎FP Jie‏ أو بواسطة إدخال مجموعة ‎biotinylation‏ حيوية؛ أو بواسطة إنزيم. يتم في العادة فصل ‎RNA‏ المراد تحليله بالفصل الكهربائي على ‎agarose gel‏ أو ‎polyacrylamide gel‏ « ونقله إلى ‎«nitrocellulose‏ أو ‎nylon‏ ¢ أو غشاء مناسب؛ وتهجينه بواسطة المسبار؛ باستخدام

تقنيات قياسية معروفة جيدا في الفن ‎Jue‏ تلك المشروحة في الأقسام ‎OF = V = FA = ١‏ من ‎Sambrook‏ وأخرين السابقة. يكون "الربط ‎Ligation‏ " هو عملية تكوين روابط ‎phosphodiester bonds‏ بين جزئشي حمض نووي. بالنسبة لربط الجزئين؛ يجب أن تكون أطراف الجزئين متوافقة مع بعضهما ‎aed‏ ‏٠ه ‎compatible‏ . في بعض الحالات؛ ستكون الأطراف متوافقة مباشرة بعد ‎endonuclease aad‏ انزيم . من ناحية ثانية؛ قد يكون من الضروري أولا تحويل الأطراف المتخالفة المنتجة بصورة شائعة بعد هضم إنزيم ‎endonuclease‏ إلى أطراف متبلدة لجعلها متوافقة للربط. لجعل الأطراف متبلدة؛ تتم معالجة ال ‎DNA‏ في محلول منظم مناسب لمدة 10 دقيقة على الأقل في درجة ١١م‏ مع حوالي ‎٠١‏ وحدات من ‎T4 DNA § Klenow fragment of DNA polymerase 1 & j=‏ ‎polymerase ٠‏ في وجود الأربع ‎.deoxyribonucleotide tnphosphates‏ يتم وضع أجزاء ال ‎DNA‏ المراد أن يتم ربطها سويا في محلول بكميات متساوية المولارية ‎equimolar‏ تقريبا. سيحتوي المحلول أيضا على ‎ATP‏ ومحلول ‎ligase‏ منظم وإنزيم ربط ليجيز مثل ‎DNA ligase‏ 14 في حوالي ‎٠١‏ وحدات لكل ‎١,5‏ ميكروجرام ‎DNA‏ . إذا كان ال ‎DNA‏ يواد ربطه في ناقل ‎vector‏ ؛ يتم أولا جعل الناقل مستقيما بواسطة الهضم بواسطة ‎endonuclease(s)‏ ‎ve‏ المقيد. تتم عندئذ معالجة الجزء المستقيم بواسطة إنزيم فوساتيز بكتيري قلوي ‎bacterial‏ ‎alkaline phosphatase‏ أو فوسفاتيز ‎phosphatase‏ أمعاء 1 عجل لمنع الربط الذاتي ‎self-ligation‏ أثناء خطوة الربط. يعني '"تحضير ‎DNA "Preparation’‏ من ‎«LAY‏ عزل ‎DNA plasmid‏ من مزرعة خلايا عائلة لل ‎plasmid‏ . تكون طرق شائعة الاستخدام لتحضير ‎DNA‏ هي مستحضرات ‎plasmid‏ على © النطاق الكبير والصغير المشروحة في الأقسام ‎FY - ١ - Yo - ١‏ من ‎Sambrook‏ وآخرين السابقة. بعد تحضير ال 0178 ؛ يمكن تنقيته بواسطة طرق معروفة جيدا في الفن مثل تلك المشروحة في ‎١ aud‏ - 40 من ‎Sambrook‏ وآخرين السابقة.

‎+١ -‏ - يكون " ‎Oligonucleotides‏ ' هو ‎polydeoxynucleotides‏ قصير الطول مفرد الجديلة ‎single‏ ‏مزدوج الجديلة ‎double-stranded‏ والذي يتم بناءه كيميائياً بواسطة طرق معروفة (مثل كيمياء ‎phosphotriester‏ أو ‎phosphite‏ أو ‎phosphoramidite‏ ¢ باستخدام تقنيات ‎Alla‏ صلبة ‎soiid-phase‏ ‏مثل المشروح في البراءة الأوروبية رقم 15077 المنشورة في ؛ مايو ‎VAAN‏ أو عن طريق © وسائط ‎deoxynucleoside H-phosphonate‏ كما هو مشروح بواسطة ‎Frochler et al., Nucl.)‏ ‎Acids Res., 14: 5399-5407 [1986]‏ تشتمل طرق إضافية على تفاعل سلسلة البوليمريز ‎polymerase chain reaction‏ المعينة فيما يلي وطرق أخرى ذاتية البدء ‎autopnmer‏ وتخليق ‎oligonucleotide syntheses‏ على مواد حاملة صلبة. يتم شرح كل .يتم استخدام هذه الطرق إذا تمت معرفة تسلسل الحمض النووي بالكامل للجين 8600؛ أو يكون تسلسل الحمض النووي ‎٠‏ التكميلي ‎complementary to the coding strand‏ لجديلة التشفير متاحاً . بصورة بديلة؛ إذا تمت معرفة تسلسل الحمض الأميني المستهدف؛ قد يخمن شخص ما تسلسلات حمض نووي ممكنة باستخدام رجوات تشفير معروفة ومفضلة لكل رجوة حمض أميني. يتم عندئذ تنقية ‎oligonucieotides‏ على مواد ‎٠ polyacrylamide gels‏ ويشير الاصطلاح "تفاعل البوليميريز المتسليل ‎Polymerase chain reaction‏ " أو ‎"PCR"‏ إلى ‎١‏ الإجراء أو الطريقة التي يتم فيها تزويد 8001002008 كميات صغيرة من حامض نووي مثل ‎RNA‏ و/ أو ‎DNA‏ كما جاء وصف ذلك في براءة الاختراع الأمريكية رقم 4687190 الصادرة في ‎YA‏ يولية عام ‎TAY‏ وبصفة عامة فإن معلومات التتالي ‎sequence‏ من النهايات الطرفية للمنطقة ‎origion‏ قيد الاهتمام يجب أن تتوافر حتى يمكن بذلك تصميم البادثات ال ‎oligonucleotide‏ والتي تتطابق مع متواليات أو تتشابه مع الجدائل العكسية للنموذج ‎sequence to‏ ‎opposite strands of the template to be amplified ٠‏ المراد تكبيره. وقد تتطابق ال ‎nucleotides‏

— أ“ _—

عند النهاية الطرفية © لاثنين من البادئات مع النهايات الطرفية للمادة المراد تزويدها. ويمكن استخدام ‎PCR‏ لتزويد متواليات نوعية محددة من الحامض النووى ‎RNA‏ أو ‎DNA‏ وذلك من مجموع ‎DNA‏ الوارثى ‎genomic‏ أو ‎cDNA‏ المستنسخ من مجموعة ‎RNA‏ الخلوى. أو من فيروسات بكتيريا ‎bacteriophage‏ « أو من متواليات ‎«plasmid‏ إلخ كما في المرجع العامة الآتية ‎Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp.

Quant.

Biol., 51:263 [1987]: Erlich. ed.. PCR °‏ ‎Technology, (Stockton Press, NY. 1989).‏

وكما هو مستخدم في هذا النص فإن ‎PCR‏ يعد واحداً ولكن ليس الوحيد من الأمثلة على طرق

‎Jel‏ البوليميريز للحامض النووىء والخاصة بتزويد عينة اختبار من حامض نووى» وهى طريقة تشتمل على استخدام حامض نووى معروف كمادة بادئة ‎primer‏ ؛ مع بوليميريز الحامض

‎٠‏ النووى لتزويد أو بناء قطعة محددة من الحامض النووى.

‏وتعنى "الظروف الصارمة ‎Stringent conditions‏ " تلك الظطروف التي ‎)١(‏ - تستخدم فيها تركيزات أيونية منخفضة ودرجات حرارة عالية في عملية الغسيل» أي مثلاً محلول من ‎sodium‏ ‎(M ٠.١ ©) sodium citrate / (M ++) ©) chloride‏ / )7 من ,11200050 ‎(SDS)‏ تحت

‏درجة حرارة ‎٠٠‏ م؛ أو ‎(Y)‏ — تستخدم فيها أثناء التهجين مادة مفيدة للطبيعة مل ‎formamide‏ ؛

‎٠,١ ‏مصل الدم في الأبقار/‎ aibumin ‏من‎ 0.١ ‏مع‎ formamide ‏(حجم / حجم) من‎ ٠ Se ‏أى‎ ve sodium ‏ميكرومولار محلو منظم من‎ 0+ [polyvinylpyrrolidone ‏من‎ 7 | Ficoll ‏من‎ 7. ‏مل مولار‎ VO 5 ¢ sodium chloride ‏مل مولار من‎ YOu ‏قدره 1,0 درجة؛ مع‎ (pH)phosphate

‏من 017016 ‎sodium‏ تحت درجة حرارة قدرها 247م. وهناك مثال آأخر وهو استخدام ‎5٠‏ ‎formamide‏ « وه ‎sodium chloride) SSC X‏ #ا» ‎sodium citrate «(M‏ ١ار؛‏ آل 5 +0 مل

‎X ‏وه‎ sodium pyrophosphate ‏من‎ 7+.) 5 ¢(1,A = pH)sodium phosphate ‏..مولار من‎ ٠

محلول ‎<Denhard‏ وحامض نووى ‎DNA‏ من نطفة السلمون ‎sonicated salmon sperm DNA‏ المعالجة بالموجات الصوتية )04 ميكروجرام/مل)؛ 5 ).+ 7 ‎dextran sulfate 7 ٠١و SDS‏ تحث درجة حرارة قدرها 8.080( 7 ‎X‏ 550 وفي ‎١.١‏ من 505. وقد جاء وصف "الظروف متوسطة الصرامة ‎Moderately stringent conditions‏ " وذلك في مرجع ‎Sambrook et al‏ أعلاه؛ ويشتمل ذلك على استخدام محلول غسيل وحالات التهجين (كالحرارة؛ والتركيز الأيونى؛ والنسبة ‎dy sal‏ ل ‎(SDS‏ وهى ظروف وحالات أقل شدة عما ‎sla‏ وصفه أعلاه. وهناك مثال على الحالات متوسطة الشدة يتمتل في إجراء عملية تحضين طوال فترة الليل تحت درجة حرارة قدرها 7١م‏ في محلول يحتوى على + ‎formamide 7Y‏ « © ‎VO) SSC X‏ مل مولار من ‎sodium chloride‏ » و١١‏ مل مولار من ‎«(trisodium citrate‏ و٠٠‏ .1 مل مولار من ‎pH) sodium phosphate‏ = 1,6)؛ وه ‎X‏ محلول ‎dextran 7} + 5 «Denhard‏ ‎sulfate‏ ¢ و١٠‏ ميكرولتر/مل من ‎DNA‏ من نطفة السلامون والمغيرة طبيعتها؛ ويتبع ذلك غسل المرشحات ‎filters‏ في ‎SSC 7١‏ تحت درجة حرارة تتراوح تقريباً ما بين ‎TV‏ = 200 وبدرك الشخص المتمرس في هذا المجال كيف يتم ضبط درجة الحرارة؛ والتركيز ‎ionic‏ إلخ؛ باعتبارها ضرورية لاستيعاب ‎Jie dal so‏ طول المسبار ‎probe‏ وما شابه ذلك. ‎ve‏ وبالنسبة ل "الأجسام المضادة ‎(Abs)‏ 00000:66م'والأجسام المناعية ‎immunoglobulins (Igs)‏ " فهى عبارة عن ‎glycoproteins‏ لها نفس الخصائص الهيكلية. ومع أن الأجسام ‎Balad‏ تبدى خصوصية ‎specificity‏ من الترابط مع ‎antigen‏ نوعى؛ إلا أن الأجسام المناعية تضم كل من الأجسام المضادة والجزيئات الأخرى التي تشبه الجسم المضاد؛ ولكنها تقتصر على التخصسص النوعى تجاه ال ‎antigen‏ . ويتم إنتاج ‎Polypeptides‏ من النوع الأخير وذلك بمستويات منخفضةٍ

— > -_ عن طريق نظام الليمف ‎lymph‏ « وبمستويات عالية عن طريق أورام الخلايا النخاعية ‎myelomas‏ . ‎sale‏ ما تكون "الأجسام المضادة والأجسام المناعية الطبيعية ‎Native antibodies and‏ ‎immunoglobulins‏ " عبارة عن ‎glycoproteins‏ رباعية الوحدات وغير متجانسة ‎heterotetrameric glycoproteins ©‏ وذات وزن جزيئي قدره حوالى ‎١5٠١00٠0١٠‏ دالتون» ‎Jag‏ ‏على اثنتين من السلاسل الخفيفة المتطابقة ‎identical light (L) chains‏ واثنتين من السلاسل ‎ALAN‏ ‏المتطابقة ‎heavy (H)‏ . وترتبط كل من السلاسل الخفيفة مع سلسلة ثقيلة وذلك برابطة تساهمية من ‎disulfide‏ بينما تتفاوت عدد روابط ‎disulfide‏ بين السلاسل الثقيلة لمختلف أنواع الأجسام المناعية المتماثلة. وتشتمل أيضا كل سلسلة ثقيلة وسلسلة خفيفة على قناطر ‎bridges‏ من ‎disulfide‏ ‎٠‏ تقع على مسافات متساوية في السلسلة. وتحتوى كل سلسلة ثقيلة عند ‎san)‏ نهاياتها الطرفية على حيز متفاوت ‎variable domain (VH)‏ يتبعه عدد من المجالات الثابتة. كما تحتوى كل سلسلة خفيفة على حيز متفاوت عند إحدى نهاياتها الطرفية ‎(VL)‏ وعلى حيز ثابت عند النهاية الطرفية الأخرى. يصطف ‎align‏ المجال الثابت للسلسلة الخفيفة مع المجال الثابت الأول للسلسلة ‎A LEN‏ كما يصطف المجال المتفاوت في السلسلة الخفيفة مع المجال المتفاوت للسلسلة الثقيلة. ويعتقد أن ‎٠‏ هناك وحدات بنائية معينة من الأحماض الأمينية تتكون عنها وصلة بينية ‎interface‏ تربط بين المجالات المتفاوتة للسلسلة الخفيفة والسلسلة الثقيلة. ‎(Clothia et al., J.

Mol.

Biol.. 186:651-663 [1985]: Novotny and Haber, Proc.

Natl Acad‏ ‎Sci.

USA. 82:4592-4596 [1985]).‏ ويشير الاصطلاح "متفاوت ‎variable‏ " إلى الحقيقة التي مفادها أن بعض أجزاء المجالات © المتفاوتة تختلف بشكل واسع من حيث توالي الأحماض الأمينية بين الأجسام المضادة؛ وتستخدم

‎Ho —‏ -_ في ترابط جسم مضاد معين وفي تحديد تخصصه بالنسبة ‎antigen‏ معين. ومع ذلك فإن التفاوت هنا لا يتوزع بشكل منتظم بين المجالات المختلفة للأجسام المضادة؛ وإنما يتركز في “ أجزاء تسمى مناطق تحديد التكاملية ‎(CDRs) complementanty‏ أو مناطق التباين المفرط ‎hypervariable‏ ‏في كل من المجالات المتفاوتة للسلسلة الخفيفة والسلسلة الثقيلة. وتسمى الأجزاء الأكثر تحفظاً للمجالات المتباينة بالإطار ‎framework (FR)‏ . وتشتمل كل من المجالات المتباينة للسلسلة الثقيلة المحلية والسلسلة الخفيفة المحلية على ؛ مناطق للإطار ‎FR)‏ وهذه تأخذ إلى حد كبير شكل رقيقة بيتا ‎B - sheet‏ متصلة بواسطة “ مناطق لتحديد التكاملية ‎(CDR)‏ لتتكون عن ذلك حلقة تتصل مع أو تكون جزءاً من هيكل رقيقة ‎sheet Uy‏ - 8 . وفي كل سلسلة تتجمع مناطق ‎CDR‏ ‏من سلسلة أخرى لتسهم بذلك في تشكيل موضع ارتباط ‎antigen‏ للأجسام المضادة: ‎(see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Vo‏ ‎Institute of Health, Bethesda, MD [1987])‏ هذا ولا تدخل المجالات الثابتة بشكل مباشر في عملية الترابط بين الجسم المضاد و ‎antigen‏ ‏ولكنها تبدى هنا وظائف مختلفة مؤثرة ‎Jia‏ مشاركة الجسم المضاد في سمية الخلية المعتمدة على الجسم المضاد ‎-antibody-dependent cellular toxicity‏ ‎١‏ ويؤدى هضم الأجسام المضادة بواسطة خميرة ‎Papain‏ إلى إنتاج أجزاء متمائلة رابطة ل ‎antigen‏ تسمى أجزاء "785 يقع كل منها ضمن موضع واحد لارتباط ‎cantigen‏ مع جزء متبقى من ‎(Fc)‏ الذى يعكس اسمه قدرة هذا الجزء على التبلر ‎crystallize‏ سريعاً. وتؤدى المعالجة بانزيم ‎Pepsin‏ إلى إنتاج جزء من ‎F(ab)‏ اثنين من مواضع الارتباط مع ‎antigen‏ مع احتفاظه بقدرته على الترابط التقاطعي ‎cross-linking‏ مع ‎-antigen‏

‎١ -‏ - وتمثل ‎FY‏ الحد الأدنى لجزء الجسم المضاد الذى يحتوى على موضع لتمييز وربط ‎antigen‏ ‏وتشتمل هذه المنطقة على مركب مزدوج الوحدات ‎dimer‏ به مجال متفاوت لسلسلة ‎ALE‏ وآخر لسلسلة خفيفة في وضع متلاصق من خلال رابطة غير تساهمية. وفي هذا التشكيل تتفاعل المناطق الثلاث لتحديد التكاملية ‎(CDR)‏ في كل من المجالات المتفاوتة وذلك لتمييز موضع ربط

‎antigen ٠‏ على سطح المركب .17-17 ذو الوحدات المزدوجة. وبشكل شامل تقوم المناطق الست الخاصة بتحديد التكاملية ‎(CDR)‏ باضفاء التخصص النوعى لربط ‎antigen‏ مع الجسم المضاد. ومع ذلك فإنه حتى مع الحيز المتفاوت الواحد ‎gf)‏ نصف ‎Fy‏ المشتمل فقط على ثلاث مناطق لتحديد التكاملية ‎CDR‏ ذات التخصص النوعى ل ‎(antigen‏ يكون لهذا الحيز الواحد القدرة على تمييز وربط ‎antigen‏ ولكن عند درجة أقل من الألفة مقارنة بموضع الترابط بأكمله.

‎٠‏ ويحتوى أيضاً جزء ‎Fab‏ على مجال ثابت للسلسلة الخفيفة ومجال ثابت أول ‎CHI‏ للسلسلة الثقيلة. وتختلف أجزاء ‎Fab‏ عن أجزاء ‎Fab‏ من حيث إضافة وحدات بنائية قليلة من النهايات الطرفية للمجال ‎CHI‏ في السلسلة الثفيلة ‎Loy‏ في ذلك واحد أو أكثر من أحماض ‎cysteines‏ من منطقة التصاق الجسم المضاد. ويمثل ‎Fab-SH‏ جزء ‎Fab'‏ الذى تحمل فيه وحدات بنائية ال ‎cysteines‏ ‏في المجالات الثابتة ‎de sane‏ ثيول حرة ‎free thiol group‏ وفي الأصل تم إنتاج أجزاء الجسم

‎١‏ المضاد ‎F(ab)2‏ في شكل أزواج من أجزاء ‎Fab’‏ تقع بينها أحماض ال ‎cysteine‏ الملاصقة. وهناك حالات أخرى معروفة في مجال الاقتران الكيميائي ‎chemical couplings‏ بين أجزاء الجسم المضاد. ويمكن تصنيف " السلاسل الخفيفة ‎light chains‏ " للأجسام المضادة (الأجسام المناعية) من أي من أنواع الفقاريات ‎vertebrates‏ ضمن واحد من نوعين مميزين بوضوح هما نوع ‎Kappa‏ ونوع

‎Lambda ©‏ وذلك على أساس تتابع الأحماض الأمينية الموجودة في مجالاتها الثابتة.

‎Vv —‏ — واعتماداً على تتابع الأحماض الأمينية في المجال الثابت في السلاسل الثقيلة يمكن هنا تصنيف الأجسام ‎Lelia‏ إلى فئات مختلفة. وهناك 0 فئات أساسية من الأجسام المناعية» وهى ] ‎IgA‏ ‎IgM «IgG IgE <IgD‏ ويمكن تقسيم العديد منها إلى فئات فرعية (أنواع متماثلة) مقل 180-1؛ 2 ؛ ‎IgG-2 <IgA-1 4 IgG-4 dgG-3‏ وتسمى المجالات الثابتة للسلاسل الثقيلة المناظرة - © للفئات المختلفة من الأجسام المناعية ب ‎poy » epsilon ¢ delta «a‏ على التوالي. وبالنسبة لهياكل الوحدات الفرعية والأشكال المجسمة ذات الأبعاد الثلاثية في الفئات المختلفة من الأجسام المناعية فهي معروفة جيداً. ويستخدم الاصطلاح "جسم مضاد ‎antibody‏ " في مفهومه الواسع ليغطى بشكل محدد أجساماً مضادة أحادية الاستنساخ ‎monoclonal antibodies‏ (بما في ذلك الأجسام المضادة المؤازرة ‎agonist ٠‏ وغير المؤازرة ‎«(antagonist‏ وتركيبات الأجسام المضادة ذات التخصص النوعى ‎pail‏ ‏اللاصقة العديدة ‎polyepitopic‏ ل ‎«antigen‏ وأيضاً أجزاء الجسم المضاد مثل ‎F(ab"), 5 Fab‏ 7 ما دام لهذه الأجزاء نشاط بيولوجى مرغوب. ويشير الاصطلاح "جسم مضاد أحادى الاستتساخ ‎monoclonal antibody‏ " كما ورد في هذا النص إلى جسم مضاد يتم الحصول عليه من مجموعة أجسام مضادة متجانسة ‎homogeneous‏ « ‎١‏ أى أجسام مضادة فردية تحتوى على مجموعة متماثلة فيما عدا الطفرات المحتملة التي قد توجد بكميات قليلة. وتعتبر الأجسام المضادة أحادية الاستنساخ أجسام شديدة التخصص النوعى ويتم توجيهها نحو موضع واحد ل ‎antigen‏ وفضلاً عن ذلك؛ وخلافاً لمستحضرات الجسم المضاد التقليدى عديد الاستنساخ ‎Jl polyclonal‏ تشتمل بشكل نمطى على أجسام مضادة مختلفة موجهة نحو قمم لاصقة ‎epitopes‏ مختلفة؛ يتم هنا توجيه كل جسم مضاد نحو قمة لاصقة واحدة على ‎antigen ©‏ وإضافة على التخصص النوعى فإن للأجسام المضادة أحادية الاستنساخ ميزة تتمثل في

إمكانية تخليق تلك الأجسام في وسط ورمى هجين ‎hybridoma culture‏ دون التلوث بأجسام مناعية أخرى. ويشير البادئة ‎eal"‏ الاستنساخ ‎"monoclonal‏ إلى خاصية للجسم المضاد تتمثل في الحصول عليه من مجموعة متجانسة إلى حد كبير من الأجسام المضادة دون الحاجة إلى إنتاج الجسم المضاد بأية طريقة معينة. وعلى سبيل المثال فإن الأجسام المضادة أحادية الاستتساخ hybridoma method ‏يمكن تحضيرها بطريقة الأورام الهجينية‎ al ‏المستخدمة وفق الاختراع‎ ٠

التي جاء وصفها لأول مرة في المرجع:

‎Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)‏ أو بطريقة ‎DNA‏ المهجنة بالهندسة الوراثية 024 0 » كما جاء وصفها براءة الاختراع الأمريكية رقم 5/1601 للمخترع " ‎Cabilly‏ ' وآخرين.

‎٠‏ وبشكل محدد فإن الأجسام المضادة أحادية الاستنساخ تضم أجساماً مضادة محضرة بالتخليط ‎chimeric‏ الوراثى (أجسام مناعية ‎«(immunoglobulins‏ وفيها يكون جزء من السلسلة التقيلة و/أو السلسلة الخفيفة متماثلاً أو متجانسة مع المتتاليات المناظرة في الأجسام المضادة المشتقة من أنواع محددة أو تنتمى إلى فئة رئيسية أو فئة فرعية معينة من الأجسام المضادة؛ بينما يكون الجزء الباقى من السلسلة (أو السلاسل) متطابقاً أو متجانساً مع المتتاليات المناظرة في الأجسام المضادة

‏_ المشتقة من أنواع أخرى أو تنتمى إلى فئة رئيسية أو إلى فئة فرعية أخرى من الجسم المضاد؛ وأيضاً على أجزاء من مثل تلك الأجسام المضادة ما دامت تبدى نشاطاً بيولوجياً مرغوباً.

‎The monoclonal antibodies herein specifically include "" antibodies () in (U.S.

Patent No. 4,816,567 (Cabilly et al.); and Morrison et al.. Proc.

Natl.

014 والأجسام المضادة غير البشرية ‎Jia‏ تلك الموجودة في الفئران والتي تم تمثيلها بشرياً ‎Humanized‏ ‏هى عبارة عن أجسام مناعية تم تحضيرها بطريقة التخليط ‎chimeric‏ الوراثى؛ أو سلاسل من الأجسام المناعية؛ أو أجزاء من تلك السلاسل (مثل ‎FV‏ أو ‎Fab‏ أو ‎Fab‏ أو ‎Fab),‏ أو ‎LJ‏ ‏متتاليات أخرى من الأجسام المضادة رابطة — 60ع8008؛ وهى تحتوى على حد أدنى من ‎٠‏ المتتاليات المشتقة من أجسام مناعية غير بشرية. وبالنسبة للجزء الأكبر فإن الأجسام المضادة الممثلة في صورة بشرية هى عبارة عن أجسام مناعية بشرية (جسم مضاد ‎recipient Jie‏ ‎¢(antibody‏ وفيها يتم استبدال مكان حمض أميني محددة للتكاملية ‎(CDR)‏ على الجسم المضاد المستقبل ‎recipient‏ بأخرى من أنواع غير بشرية على الجسم المضاد المعطى ‎donor antibody‏ « وهى أنواع تضم الفئران ‎mouse‏ والجرذان ‎rat‏ والأرانب ‎rabbit‏ التي بها درجة مرغوبة من ‎٠‏ التخصص النوعى والألفة والسعة. ‎dy‏ بعض الحالات يتم استبدال وحدات بنائية إطار ‎FV‏ ‏للجسم المناعى البشرى بوحدات بنائية أخرى مناظرة غير بشرية. وفضلاً عن ذلك يمكن أن يشتمل الجسم المضاد الممثل في صورة بشرية على وحدات بنائية لا توجد في أى من متتاليات الجسم المضاد المستقبل؛ أو في منطقة تحديد التكاملية ‎(CDR)‏ المستوردة؛ أو في متتاليات الإطار. وتهدف تلك التعديلات إلى المزيد من التنقية والوصول بأداء الجسم المضاد إلى الحد الأمثل. ‎vo‏ وبصفة عامة يشتمل الجسم المضاد الممثتل في صورة بشرية بشكل أساسى؛ على مجال واحد على الأقل وبصورة نمطية على مجالين متفاوتين تكون فيهما مناطق تحديد التكاملية ‎(CDR)‏ متناظرة مع تلك الموجودة في الجسم المناعى غير البشرى؛ وتكون مناطق ‎FR‏ عبارة عن متتالية للجبم المناعى البشرى ‎Lede pane‏ 5ن0005©08. وبشكل مثالى أيضاً فإن الجسم المضادة الممثل في صورة بشرية يحتوى أيضاً على جزء واحد على الأقل من منطقة ثابتة في الجسم المناعى ‎(FX)‏ ‏© ونمطياً ذلك الجزء في جسم مناعى بشرى. وللمزيد من التفاصيل يمكن الإطلاع على المراجع الأتية:

‎Ya -—‏ — ‎Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]. Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988];‏ ‎and Presta, Curr.

Op.

Struck.

Biol, 2:593-596 [1992]).‏ ويعنى الاصطلاح "غير مناعى في الإنسان ‎namuhNon-immunogenicina‏ " أنه عند تلامس كمية فعالة علاجياً من ‎polypeptide‏ في مادة ناقلة ‎carrier‏ مقبولة من الناحية الصيدلانية مع ‎٠‏ الأنسجة الملائمة في الإنسان لا تظهر هنا حالة من الحساسية ‎sensitivity‏ أو المقاومة لل ‎polypeptide‏ عند التناول الثانى لل ‎polypeptide‏ بعد فترة كامنة ‎latent period‏ مناسبة تتراوح ‎Nia‏ ما بين ‎en YEA‏ ثانياً: النماذج المفضلة من هذا الاختراع ‎Preferred Embodiments of the Invention‏ : إن ‎polypeptide‏ المفضلة في هذا الاختراع هى بشكل أساسى عبارة عن ‎polypeptide‏ متجانسة ‎٠‏ تعرف بمجموعة أو مجموعات ربيطة 001 ؛ أو ‎thrombopoietin (TPO)‏ التي تتميز بخاصية الترباط مع امه أحد أعضاء العائلة الكبرى لل ‎cytokine‏ المستقبل؛ والتي تتميز أيضاً بخاصية بيولوجية وهى تحفيز اندماج ‎nucleotides‏ المميزة ‎(*H-Thymidine) labeled‏ على الحامض النووى ‎DNA‏ في خلايا ‎Ba [ F3‏ المعتمدة على 11-3 والتي نقلت إليها معلومة ‎mpl P‏ البشرية. وبالنسبة لمجموعة أو مجموعات ربيطة ‎mpl‏ الأكثر تفصيلاً فهى عبارة عن تلك التي تم عزلها ‎٠‏ .من بروتين (أو بروتينات) ثديية ذات نشاط مكون للدم وتحديدا نشاط ‎megakaryocytopoietic‏ أو نشاط ‎Thrombocutopoietic‏ الذى تستطيع من خلاله تلك البروتينات أن تحفز نمو و/أو نضج و/أو تمييز خلايا ‎MEGAKARYO‏ أو طلائع تلك الخلايا وتحويلها إلى شكل ناضج منتج للصفائح الدموية. أما ‎polypeptide‏ الأكثر تفضيلاً في هذا الاختراع فهى عبارة عن مجموعة أو مجموعات ربيطة ‎mpl‏ البشرية أو أجزاء من تلك المجموعات التي تتميز بنشاط مكون للدم مل ‎٠‏ شاط ‎megakaryocytopietic‏ أو نشاط ‎Thrombocutopoietic‏ واختيارياً فإن تلك المجموعات

— إلا — البشرية الربيطة ‎mpl‏ تفتقر إلى حدوث عملية تكون ‎glycosylation‏ . وهناك مجموعات ترابطية أخرى مفضلة ل ‎mpl‏ البشري؛ وهى عبارة عن حيز ‎EPO‏ في ‎¢hML‏ وتمثل الشكل المتبلمر من ‎IML‏ المعروف ب 107-248 أو من 11000-248 مع البولى ببتييد الناضج ذو الطول الكامل والذى يحتوى على متتالية الأحماض الأمينية الموضحة في شكل ‎١-‏ (المتوالية رقم ‎)١-‏ والمشار © إليها ب ‎BML‏ أو 241-332 أو 700-332 والمغاير الاستبدالى النشط من الناحية البيولوجية ‎(R153A, R154A biolocically active substitutional variant‏ لالط وهناك ‎polypeptide‏ اختيارية مفضلة في هذا الاختراع» وهى عبارة عن نظائر ‎variant‏ من مجموعات ربيطة ‎mpl‏ النشطة بيولوجياً أو مناعياً والتي يتم اختيارها من 2تاط 5 ‎¢hML3‏ ‎«mML 5 <hML4 5‏ لالس وقلالس 3 ‎.PML2 5 «PML‏ ‎٠‏ وهناك أيضاً ‎polypeptide‏ )4,483 مفضلة في هذا الاختراع» وهى عبارة عن نظائر ‎variant‏ من مجموعات ربيطة ‎mpl‏ النشطة بيولوجياً والتي تحتوى على مثالية أحماضة أمينية بها ‎Ve‏ على الأقل من هوية مثالية أحماض أمينية مع المجموعة لربيطة ‎mpl‏ البشرية كما في شكل ‎Y=‏ ‏(المتتالية رقم -١)؛‏ المجموعة لربيطة ‎mpl‏ الفأرية كما في شكل ‎١١-‏ (المتتالية رقم ‎(VF Y=‏ ‎de sane‏ ربيطة ‎mpl‏ الترابطية الناتجة عن الهندسة الوراثية في الخنازير كما في شكل ‎١9-‏ ‎١٠‏ (المتوالية رقم -8١)؛‏ أو المجموعة ‎MPL‏ الترابطية في الخنازير والتي تم عزلها عن بلازما لا نموية ‎aplastic‏ في ‎«jy Jal‏ وذلك بنسبة مفضلة قدرها ©7/ على الأقل؛ الأفضل 80 على الأقل؛ والأكثر تفضيلاً ‎AG‏ على الأقل؛ والمفضل أكثر نسبة قدرها 78 على الأقل؛ والأفضل على وجه التحديد نسبة قدرها 4905 على الأقل. وفيما يلى خصائص مجموعة ربيطة ‎mpl‏ التي تم عزلها من بلازما لا نموية ‎aplastic‏ في - الخنازير.:

(١)_الربيطة‏ المنقاة جزئيا يمكن أن يتم فصلها تتابعيا من عمود لترشيح الجل في أى من المحتوى على ).+7 805 أو في ‎PBS‏ المحتوى على محلول من ‎MgCl,‏ ‎(4M)‏ مع وزن جزيثي تتراوح ما بين م مره كر رما ‎(Y)‏ يتحطم نشاط الربيطة أنزيم ‎٠ pronase‏ ‎(YF) 0‏ الربيطة تكون مستقرة عند رقم هيدروجينى ‎(pH)‏ منخفض قدره 3,5 درجة؛ ونسبة من ‎SDS‏ تصل إلى 50.1 مع يوريا ‎(2M)‏ ‏)4( الربيطة هي عبارة عن ‎glycoprotein‏ يعتمد في ترابطه على أعمدة ‎lectin‏ مختلفة. ‎aay i (0)‏ المنقاة بدرجة عالية يتم فصلها تتابعياً من ‎SDS-PAGE‏ غير مختزل بنسبة جزيئية تتراوح ما بين 00 ‎To, 00 - Yo,‏ ويمكن أيضا أن يجرى الفصل التتابعي ‎Ve |‏ بكميات أقل من النشاط بنسب جزئية قدرها صخلت واكك ريات )1( تنفصل ‎resolves‏ الربيطة المنقاة بدرجة عالية في ‎SDS-PAGE‏ المختزل على هيئة مزدوج ‎doublet‏ وذلك بنسب جزيئية قدرها ‎FV eg YA ee‏ ‎(V)‏ أن ‎Amd)‏ الأمينية الطرفية التي تتراوح نسبها الجزيئية ما بين 180000 - ‎٠‏ و10 - 1,3 كدي ‎PE‏ المتثالميسسة ‎SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR‏ (المتتالية رقم - ‎.)١9‏ ‎(A)‏ ترتبط المجموعات الترابطية ويتم فصلها تتابعياً من أعمدة التجاذب الآتية:

‎vy -—‏ _ ‎Blue-Sepharose.‏ ‎CM Blue-Sepharose MONO,‏ ‎MONO-S.‏ ‎Lentil lectin-Sepharose.‏ ‎WGA-Sepharose. °‏ ‎Con A-Sepharose.‏ ‎Ether 650m Toyopearl,‏ ‎Butyl 650 m Toyopearl.‏ ‎Phenyl 650m Toyopearl, and‏ ‎Phenyl-Sepharose. \‏ إن ‎mpl vid'm polypeptide‏ الأكثر تفضيلاً هي تلك الموجودة بالحامض النووي ‎10s‏ ‎genomic‏ البشري ‎cDNA‏ المميز بمتتاليات الأحماض الأمينية التي تم وصفها في شكل رقم ‎)١(‏ ‏(المتوالية رقم - ‎.)١‏ ‏وهناك في هذا الاختراع ‎polypeptide‏ أخرى مفضلة لربيطة ‎mpl‏ الحادثة طبيعياً والنشطة من ‎yo‏ الناحية البيولوجية؛ وهذه تشتمل على مجموعة ربيطة ‎mpl‏ قبل الأولية ‎«prepro-mpl ligand‏ و ربيطة ‎mpl‏ الأولية ‎prepro-mpl ligand‏ ؛» وربيطة ‎prepro-mpl ligand mpl‏ الناضجة؛ وأجزاء من ربيطة ‎mpl‏ ومتغيرات تلك المجموعات المرتبطة بال ‎glycosylation‏ ‏وهناك ‎La‏ في هذا الاختراع ‎polypeptide‏ أخرى مفضلة لربيطة ‎anpl‏ وهذه تشتمل على اختلافات ‎variants‏ مخاليط وراثية لمتتالية ربيطة ‎mpl‏ وبشكل معتاد تكون تلك الاختلافات و © مخاليط الوراثية عبارة عن اختلافات نشطة بيولوجيا لربيطة ‎mpl‏ التي تحتوي على متتالية

أحماض أمينية تكون بها 70/ على الأقل من تلك الأحماض عبارة عن ربيطة ‎mpl‏ التي يتم عزلها من بلازما لا نموية ‎aplastic‏ في الخنازير؛ والأفضل أن تكون هذه النسبة 70 على الأقل؛ والأكثر تفضيلا أن تكون النسبة 7850 على الأقل؛ والمفضل تحديداً أن تكون النسبة 785 على الأقل؛ والمفضل أكثر أن تكون النسبة 796 وبشكل خاص يفضل أن تكون النسبة المذكورة 0 ©25. ومن النماذج المفضلة لربيطة ‎mpl‏ نذكر هنا المتغير ,0341 لحيز النهاية الطرفية ‎N‏ والذي يشار إليه بحيز ‎(EPO‏ وذلك نظراً لتجانس متتالية مع ‎erythropoietin‏ . ويشستمل حيز ‎EPO‏ ‏للمتغير .]11 على حوالي ‎VOY‏ من ‎clang‏ بنائية الأحماض الأمينية الأولى في .11 الناضج؛ ويعرف هنا باسم ‎hML-153‏ وهناك متغير مفضل لمتتالية ‎hML‏ وفيه يكون واحد أو أكثر مسن الأحماض الأمينية القاعدية ‎basic‏ أو ثنائية القاعدة ‎dibasic‏ في مجال النهاية الطرفية © مستبدل ‎٠‏ بوحدات بنائية حامض أميني غير قاعدية مثل الوحدات البنائية التي لا تألف الماء ‎hydrophobic‏ ؛ والوحدات البنائية المتعادلة ‎neutral‏ ؛ والوحدات البنائية الحامضية ‎«acidic‏ والوحدات البنائية العطرية ‎aromatic‏ » و ‎glycine‏ و عدناه«م» وما شابه ذلك. ويشتمل متغير متتالية النهاية الطرفية ‎C‏ المفضلة ل ‎hML‏ على حيز تستبدل فيه وحدات بنائية الحامض الأميني ‎(Vo argonone‏ ‎Vo 8‏ بوحدات بنائية الحامض الأميني ‎alanine‏ ويشار هنا إلى هذا المتغير ب ‎hML332‏ ‎R154A) ٠‏ ,61538. وهناك متغير بديل مفضل ل ,131 يشتمل إما على 111.153 أو على 3م حيث يتم حذف ‎Asli cla a gl)‏ الأمينية ‎QLPP) ١١4 — ١١١‏ أو ‎(LPPQ‏ أو استبدالها بمتتالية ‎tetrapeptide‏ مختلفة ‎AGAG ie‏ أو ما شابه ذلك. ويشار إلى طفرات الحذف

السابقة ب ‎A4 hML153‏ أو ‎.A4 hML153‏ وبالنسبة ‎of gall‏ المفضلة المحضرة بالتخليط الوراثي فهي عبارة عن ناتج لإندماج ربيطة ‎mpl‏ أو ‎٠‏ جزء منها كما سيأتي تعريفه لاحقاً مع ‎polypeptide‏ غير متجانس أو مع جزء منه. وعلى سبيل المثال يمكن دمج 141,153 مع جزء الجسم المناعي ‎IgG‏ لتحسين فترة نصف العمر لمصل الدم

‎Vo -‏ - ‎half-life‏ ؛ أو لتحفيز أي من ‎IL-3‏ أو 6-057 أو ‎EPO‏ لإنتاج جزئ يتميز بزيادة نشاط تكوين ‎hematopoietic all‏ أو تكوين ‎.thrombopoietic‏ ‏وهناك تخليط ‎chimera‏ وراثي بديلة مفضلة تحتوي على ربيطة ‎mpl‏ الترابطية البشرية؛ وهي عبارة عن تخليط وراثي في مجال ‎¢ML-EPO‏ وتتكون من النهاية الطرفية 17 لوحدات بنائية ‎Ad‏ ‎AML ©‏ من ‎١١7-١١7‏ المستبدلة بواحدة أو أكثر - ولكن ليس كلياً - من وحدات ‎EPO Aly‏ البشرية المتراصفة ‎dligne‏ بشكل تقريبي كما هو موضح في شكل - ‎٠١‏ (المتتالية رقم ‎.)٠‏ وفي هذا النموذج يتراوح طول مواد التخليط الوراثي ‎BML‏ ما بين ‎١15 -١"“‏ من الوحدات البنائية؛ وفيها تتم إضافة أو استبدال وحدات بنائية فردية أو مجموعات من الوحدات البنائية في متتالية 0 البشرية وذلك بالمتتالية ,11 عند مواضع تتوافق مع حالة التراصف الموضحة في شكل ‎٠‏ رقم ‎)٠١(‏ (المتتالية رقم 7). وهناك ولائج مثالية لمتتالية ‎Exemplary block sequence inserts‏ المجموعات في ‎Ja‏ النهاية الطرفية ‎N‏ ل ‎(ML‏ وهذه تضم واحد أو أكثر من مواضع المعالجة ب ‎N-glycosylation‏ وذلك عند مواضع ‎EPO‏ من 4 7- ‎YY‏ ومن 0-748 ‎cde‏ ومن ‎AO =AY‏ وقد تضم الولائج ‎inserts‏ أيضاً واحد أو أكثر من الجدائل الحلزونية ‎helical‏ - » مزدوجة الذوبانية ‎amphipathic‏ عند مواضع ‎EPO‏ من 4 - ‎YY‏ ومن 09= ‎VU‏ ومن ‎eV oY -45٠0‏ ومن ‎(1OY 137 1‏ مع مناطق أخرى ذات درجة تحفظ ‎dle‏ تشتمل على مناطق النهاية ‎N'A hall‏ ومناطق النهاية الطرفية "©" ومواضع لوحدات بنائية ‎EPO‏ من 44 - ‎OY‏ ‏ومن المتوقع هنا أن يكون لمواد التخليط الوراثي المحتوية على حيز ‎ML-EPO‏ مخلوط نشاطا بيولوجياً مختلطاً يتعلق بتكوين ‎thrombopoietic-erythropoietic (TEPO)‏ . وهناك ‎polypeptide‏ أخرى مفضلة في هذا الاختراع؛ وهي تشتمل على أجزاء من المجموعة ‎٠‏ ربيطة ‎mpl‏ بها ‎Ll‏ تتابعية تحتوي على ‎٠١‏ أو ‎١١‏ أو ‎SY‏ ©؟ أو 0 أو 6؛ من وحدات

بنائية الأحماض الأمينية المطابقة لتلك في متتاليات ربيطة ‎mpl‏ التي تم عزلها من بلازما لا نموية 6 في الخنازير» أو من ربيطة ‎mpl‏ البشرية التي ‎ela‏ وصفها في هذا النص (راجع على سبيل المثال جدول رقم ‎VE‏ ومثال رقم ‎(YE‏

SATE aor gl EX Cua ML[1-X] ‏مفضلة وهي عبارة عن‎ mpl ‏وهناك ربيطة من‎ ١4اء‏ أو ‎٠١#‏ أو ‎١١7‏ أو ‎١١‏ أو 79 أو ‎YEO‏ (راجع شكل رقم ‎١‏ المتتالية رقم ١؛‏ بالنسبة لمتتاليات الوحدات البنائية 1-7). ومن الإجزاء الأخرى المفضلة لربيطة ‎mpl‏ تلك التي تضم الإجزاء الناتجة عن التحلل الإنزيمي ‎ol enzymatic‏ التحلل الكيميائي ‎chemical‏ أو عن هضم ‎digestion‏ الربيطة المنقاة. ومن الجوانب الأخرى المفضلة في هذا الاختراع طريقة لتنقية ‎purifying‏ جزيئات ربيطة ‎٠‏ ل©؛ وتشتمل هذه الطريقة على تلامس مصدر لربيطة ‎mpl‏ يحتوي على جزيئات ربيطة ‎mpl‏ مع 6 لمستقبل ‎receptor‏ غير ‎«immobilized fie‏ وتحديداً ‎mpl sa polypeptide‏ أو ‎polypeptide‏ الخاصة بترابط ‎empl‏ وذلك تحت ظروف يتم فيها امتزاز ‎adsoption‏ جزيئات ربيطة ‎mpl‏ المراد تنقيتها وارتباطها مع ‎polypeptide‏ المستقبل غير المثبت؛ ويجرى بعد ذلك غسل ‏الدعامة ‎support‏ المثبتة لإزالة المادة غير الممتزة؛ ثم تتم عملية الفصل التتابعي للجزيئات المواد ‎١‏ تنقيتها من ‎polypeptide‏ المستقبل المثبت؛ وذلك باستخدام محلول منظم ‎buffer‏ يختص بعمليات ‏الفصل التتابعي. وقد يكون المصدر المحتوى على ربيطة ‎mpl‏ عبارة عن بلازماً؛ وفيها يفضل أن ‏يكون المستقبل المثبت عبارة عن ناتج لاتدماج ‎mpl fusion‏ مع الجسم المناعي ‎IgG‏ ‏وكبديل عن ذلك ‎old‏ المصدر المحتوى على ربيطة ‎mpl‏ يكون عبارة عن وسط ‎alia‏ خلايا ‏ناتجة عن هندسة وراثية ‎recombinant‏ ؛ ويكون تركيز ربيطة ا« في أي من وسط الاستنبات ستنتلع» ‎culture‏ أو في المواد الناتجة عن تحلل الخلية ‎cell lysates‏ أكثر منه في البلازما أو في

- لا غيرها من المصادر الطبيعية الأخرى. وفي هذه الحالة فإن الطريقة السابق ذكرها بشأن التآلف المناعي بين ‎mpl‏ و186 رغم كونها طريقة مفيدة إلا أنها ليست ضرورية؛ ويمكن هنا استخدام الطرق التقليدية لتنقية البروتين والمعروفة في هذا المجال. وباختصار فإن طريقة التتقية المفضلة للحصول على ربيطة ‎mpl‏ المتجانسة إلى حد كبير تشتمل على: إزالة أجزاء النفايات ممثلة في ‎٠‏ خلايا العائل أو في الأجزاء الخلوية ‎debris‏ المتحللة؛ ويتم ذلك - مثلاً - عن طريق الطرد المركزي ‎centrifugation‏ أو الترشيح الفائق ‎-ultrotilteration‏ ويمكن ‎JS‏ اختياري تركيز البروتين باستخدام أحد المرشحات ‎tslters‏ المتاحة تجارياً لهذا الغرضء ويتبع ذلك فصل الربيطة عن الشوائب الأخرى بواحدة أو بأكثر من الخطوات المختارة من: التآلف المناعي ‎immunoaffinity‏ ¢ أو التبادل ‎jonic exchange‏ (باستخدام ‎DEAE‏ أو قاعدة نسيجية ‎matrices‏ ‎٠‏ تحتوي على مجموعات ‎methyl carboxymethy‏ أو ‎«(sulfopropyl‏ أو السيفاروز الأزرق - ‎blue‏ ‎«sepharoce‏ أو السيفاروز الأزرق ‎«CM - blue sepharore‏ أو ‎(MONO-Q‏ أو ‎(MONO-S‏ أو ‎lectin sepharose 0 ¢ lentil‏ ¢ أو ‎«Con-A sepharose 0 «WGA sepharose‏ أو ‎ether‏ ‎ctoyopearl‏ أو ‎cbuty toyopead‏ أو ‎«phenyl toyopearl‏ أو ‎<A — protein asepherose‏ أو كروماتوجراف ‎HPLC‏ ذو الطور المنعكس ‎revese phase HPLC‏ على طبقة من ‎Silica gel‏ مع ‎١‏ مجموعات اليفاتية ملحقة؛ أو منخل جزيئي ‎moleculor sieve‏ من طراز ‎Sephadex”‏ أو كهروماتوجرافياً فرز الجسيمات حسب الحجم؛ أو الترسيب باستخدام ‎ethanol‏ و ‎ammonium‏ ‎sulfate‏ وفي أي من الخطوات السابقة يمكن استخدام متبط لانزيم البروتياز ‎protease inhibitor‏ ‎(PMSF) methylsulfonyl fluoride Jie‏ وذلك لمنع تحلل البروتين ‎proteolysis‏ ‏وفي نموذج آخر مفضل في هذا الاختراع نقدم هنا جسماً مضاداً معزولاً له القدرة على الارتباط ‎٠‏ بربيطة ‎empl‏ ويفضل أن يكون هذا الجسم المضاد أحادي الاستنساخ ‎.monoclonal‏

‎YA -‏ - ‎(kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 [1975] : Campbell Laboratory Techniquse in‏ ‎Biochemistry and Molecutar Biology, Burdon et.

At., Eds, Volume 13,. Elsevier Science‏ ‎Publisrers, Amsterdam [1985]; and Huse., Science. 246 : 1275 - 1281 [1989)).‏ والجسم المضاد المفضل الذي يتم عزله عن المجموعة بريسطة ‎mpl‏ هو ذلك الجسم الذي يرتبط م مع ‎mpl day‏ بدرجة من التجاذب ‎attinity‏ والألفة قدرها على الأقل ‎٠١‏ لتر/ مول ‎٠‏ والأفضل أن تصل هذه الدرجة إلى ‎"٠١‏ لتر / مول على الأقل؛ والأكثر تفضيلاً أن يتم إنماء الجسم المضاد ضد ربيطة ‎mpl‏ تتميز بواحدة من الوظائف المؤثرة السابق ذكرها. وبشكل اختياري يمكن دمج الجسم المضاد المعزول والقادر على الترابط مع ربيطة ‎mpl‏ وذلك مع ‎polypeptide‏ ثاني؛ وأن يتم استخدام الجسم المضاد أو ناتج إندماج هذا الجسم وذلك لتقييد المجموعة الترابطية ‎mpl‏ وعزلها ‎٠‏ عن المصدر السابق وصفه بالنسبة ل ‎mpl polypeptide‏ غير المتنقل. وفي جانب آخر مفضل في هذا النموذج يقدم الاختراع طريقة للكشف عن مجموعة ‎mpl‏ الترابطية في جسم ‎in ad) Gl‏ ‎vivo‏ أو في المختبر ‎din vitro‏ وتشتمل هذه الطريقة على تلامس الجسم المضاد مع ‎die‏ وخاصة عينة من مصل الدم يشتبه في احتوائها على الربيطة؛ مع الكشف عما إذا كان الارتباط قد حدث. وفي نماذج أخرى مفضلة يقدم الاختراع جزيئي حامض نووي معزول يحمل مورث ‎encoding‏ ‎ve‏ ربيطة ‎mpl‏ أجزاء من تلك المجموعة. وقد يتم وشم ‎labeled‏ جزيئ الحامض النووي أو عدم وشمه ‎unlabeled‏ بشق محسوس ‎detectable moiety‏ يمكن اكتشافه؛ ويكون لهذا الجزيئ متتالية تتكامل ‎complementary‏ أو تتهجن ‎hybridizes‏ في ظروف شديدة أو متوسطة الشدة مع جزيئ لحامض نووي يحتوي على متتالية تحمل مورث ربيطة ‎mpl‏ ومن الأحماض النووية المفضلة المحتوية على مجموعات ‎mpl‏ الترابطية حامض ‎RNA‏ أو حامض ‎DNA‏ الذي يشفر ربيطة من © 1ج من ذوات النشاط البيولوجي بالتشارك بنسبة ‎yo‏ على الأقل من متتاليات مع ربيطة ‎mpl‏

‎ve -‏ — البشرية؛ والأفضل أن تكون هذه النسبة 780 على الأقل؛ والأكثر تفضيلاً أن تكون 785 على الأقل؛ والمفضل على وجه التحديد أن تكون هذه النسبة 790 على الأقل؛ والمفضل أكثر أن تكون النسبة 740 على الأقل. وهناك جزيئات أكثر تفضيلا لحامض نووي معزول» وهي عبارة عن متتاليات ‎DNA‏ التي تحمل مورث ربيطة ‎mpl‏ النشطة بيولوجياً والمختارة من: ‎)١( °‏ الحامض النووي ‎DNA‏ اعتماداً على موروث أو جين ربيطة ‎mpl‏ للثدييات؛ أي الحامض النووي ‎DNA‏ المحتوي على متتالية ‎nucleotide‏ الموضحة في شكل رقم ‎)١(‏ (المتتالية رقم ‎(Y‏ أو على أجزاء منها. ‎ (Y)‏ الحامض النووي ‎DNA‏ القادر على التهجين ‎hybridizing‏ مع الحامض النووي ‎DNA‏ ‏في 0( على الأقل تحت ظروف متوسطة الشدة ‎.moderately stnngent‏ ‎١‏ (©)_ الحامض النووي ‎DNA‏ الإنحلالي ‎degenerate‏ الذي يعطي الحمض النووي المعورف في 0 أو (ب) نتيجة لإنحلالية ‎degenerate‏ الشفرة الوراثية ‎٠ genetic code‏ ومن المتصور أن تكون ‎mpl Sle gana‏ الجديدة التي جاء وصفها هنا أعضاء في طائفة الربيطات ‎cytokines sf ligands‏ التي تحتوي على هوية مناسبة من المتتاليات تجعل الحامض النووي ‎DNA‏ فيها قابل للتهجين مع الحامض النووي ‎DNA‏ في شكل رقم ‎١‏ (المتثالية رقم ‎Y‏ ( أو مع ‎١‏ مكملات أو أجزاء ‎dia‏ وذلك تحت ظروف منخفضة إلى متوسطة الشدة. وعلى ذلك يضم جانب آخر في هذا الاختراع الحامض النووي ‎DNA‏ الذي يتهجن تحت ظروف منخفضة إلى متوسطة الشدة مع الحامض النووي ‎DNA‏ الذي يشفر ‎polypeptide‏ ربيطة ‎.mpl‏ ‏وفي نموذج آخر مفضل في هذا الاختراع يكون جزيئ الحامض النووي عبارة عن ‎cDNA‏ حامل مورث ربيطة ‎mpl‏ والذي يشتمل ‎La‏ على ناقل وراثي قابل للتكرار ‎replicable vector‏ ويتم فيه

‎Ar —‏ — ‎JSS‏ عملي ‎transformed‏ وصل ‎CDNA‏ مع متتاليات التحكم التي تم التعرف عليها بواسطة عائل متغيرة ‎host‏ مع الناقل الوراثي. ويشتمل هذا الجانب أيضاً على خلايا للعائل متغيرة بواسطة الناقل الوراثي؛ وعلى طريقة لاستخدام ‎cDNA‏ لتفعيل إنتاج ربيطة ‎mpl‏ ؛ وهي طريقة تقوم على تعبير 8 الصيغة الوراثية للحامض النووي ‎DNA‏ حامل مورث ربيطة ‎mpl‏ في وسط ‎٠‏ ا لاستتبات ‎culture‏ خلايا العائل المتغيرة ؛ مع استخراج ربيطة 1 من وسط استتبات ‎Lo‏ ‏العائل. ومن المفضل أن تكون ربيطة ‎mpl‏ المحضرة بهذه الطريقة عبارة عن ربيطة بشرية متجائسة إلى حد كبيرء كما يفضل أن تكون خلايا العائل المستخدمة لإنتاج ربيطة ‎mpl‏ عبارة عن خلايا من مبيض ‎Ovary‏ مستخرج من جرذان صينية ‎.(CHO)Chinese hamster‏ ويشتمل الاختراع أيضاً على طريقة مفضلة لعلاج كائن ثديي يعاني من اضطرابات مناعية أو ‎٠‏ اضطرابات في تكوين الدم؛ وتحديداً نقص تكوين الصفيحات الدموية. وتشتمل الطريقة على إعطاء الكائن الثديي كمية فعالة علاجياً من ربيطة ‎«mpl‏ ويتم ذلك - اختيارياً - بالترافق مع واحد من ‎cytokine‏ ؛ وتحديداً ‎interleukins‏ العامل المنشط لتكوين المستعمرات؛ وتشتمل العوامل المفضلة المنشطة لتكوين المستعمرات على: مجموعة ربيطة - ‎Kit‏ ¢ أو تنك أو ‎G-‏ ‎«CSF‏ أو ‎«GM-CSF‏ أو ‎(M-CSF‏ أو ‎EPO‏ أو 1سلاء أو ‎IL-2‏ أو ‎IL-3‏ أو 5سلاء أو ‎IL-6‏ ‎٠‏ 7سلاء أو ‎«IL-8‏ أو ‎dL-9‏ أو 11-11. طرق التحضير ‎Methods of Making‏ : ‎ie‏ بعض المؤلفين ولفترة طويلة أن التحكم في إنتاج الصفائح الدموية يتم بواسطة عوامل في الدم ‎humoral‏ متعددة ذات تخصص نوعي تجاه السلالة ‎multiple lineage‏ وقد كان من المتصور أن هناك أثنين من الأنشطة المميزة — ‎cytokine‏ يشار إليهما باسم عامل ‎megakaryocyte‏ ‏المحفز لتكوين المستعمرات ‎«(meg-CSF) megakaryocyte colony-stimulating factor‏ وعامل

- AY - megakaryocytopoiesis ‏ويقوم هذان العاملان بتنظيم عملتي‎ ¢ thrombopoietin ‏تكوين‎ ‎.Thrombopoiesis s (Williams et al., J. Cell Physiol. 110:101-109 11982]; Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; and Gordon et al., Blood. 80:302-307 [1992]). ‏بينما‎ « progenitor megakaryocytes ‏بتحفيز خلايا السفلية‎ meg-CSF ‏ووفقاً لهذه النظرية يقوم‎ ° ‏أساساً على نمو المزيد من الخلايا المتميزة؛ ومن ثم يعمل‎ thrombopoietin ‏يؤثر العامل المكون‎ ‏على انطلاق وتحرر الصفائح الدموية. ومنذ أعوام الستينات تم بشكل جيد توثيق عمليات حث‎ ‏في بلازما ومصل بول‎ thrombopoietin ‏والعامل المكون لل‎ meg-CSF ‏وظهور أنشطة كل من‎ ‏البشر والحيوانات بعد تكوين الثرومبين بشكل عارض؛ وذلك في المراجع الآتية:‎ (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol Med.. 108.428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Vo

Haematol, 54:340-344 [1975]; Specter, Proc Soc. Exp. Biol., 108:146- 149 119611;

Schreiner et al, J.Clin.invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974l;

Hoffman et al., N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et al, Exp. HematoL, Ye. 17:1122-1127 [19881, Mazur et al., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur et aL, J.Clin.

Invest, 68:733-741 119811, Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et ‏مله‎ Exp.

Hematol, 20:354-360 [1992]; and Hegyi et al, Int. J. Cell Cloning, 8:236-244 [ 1990]). ‏وقد أفيد بأن تلك الأنشطة تتميز بتخصص نوعي تجاه السلالة وتختلف عن السيتوكينات المعروفة.‎

‎AY —‏ — ‎(Hill RJ. et al., Blood 80 346 (1992); Erickson-Miller CL. et al, Brit.

J.

Haematol,‏ ‎Straneva JE. et al., Exp.

Hematol. 20:4750(1992); and Tsukada J. et‏ ;)1993( 84:197-203 ‎al., Blood 81:866-867 [1993]).‏ ومن هنا لم ‎madi‏ المحاولات التي بذلت من أجل ‎meg-CSF ian‏ أو عامل تكوين ‎thrombopoietin ٠‏ من البلازما أو من البول الذي يقل فيه تكوين ‎.thrombopoietin LS‏ وتماشياً مع المشاهدات المذكورة أعلاه والتي تصف بلازما تقل فيها خلايا ‎thrombopoietin‏ فقد وجدنا أن البلازما اللانموية ‎J aplastic‏ الخنازير ‎(APP)‏ والمتحصل عليها من خنازير معرضة للاشعاع 0 تعمل على تحفيز تكوين خلايا ‎megakaryo‏ البشرية في المختبر. وقد وجدنا ‎La‏ أن هذا النشاط التحفيزي يمكن إلغاء؛ بواسطة الحيز ‎domain‏ ذائب وخارج الخلية في ‎(Compl‏ مما ‎٠‏ يؤكد على أن ‎APP‏ هو مصدر ‎(Sas‏ ربيطة ‎(ML) mpl‏ ولقد نجحنا الآن في تنقية ربيطة ‎mpl‏ ‏من ‎(APP‏ وتم استخدام معلومات متتالية الأحماض الأمينية لعزل ‎ML cDNA‏ في كل من الفئران : والخنازير والبشر ‎٠‏ وتحتوي ‎ML's‏ على متتالية نتجانس مع عامل ‎thrombopoietin‏ « ولها أنشطة تشبه تلك في كل من ‎meg-CSF‏ وعامل تكوين ‎.thrombopoietin‏ ‎١‏ - تنقية وتمييز ربيطة ‎mpl Ligand‏ الترابطية من البلازما:

‎lS ‏من أنواع مختلفة من‎ aplastic ‏كما ذكرنا عاليه فإن المراجع تفيد بأن البلازما اللإنموية‎ ٠ ‏في المختبر 100 0 ؛ غير أنه لم ترد إفادة‎ hematopoiesis ‏تتميز بأنشطة محفزة لتكوين الدم‎ ‏تلك‎ aplastic ‏حول عزل عامل محفز لتكوين الدم من البلازما. ومن مصادر البلازما اللانمرية‎ ‏تقوم هذه البلازما بتحفيز تكوين‎ (APP) ‏التي تم الحصول عليها من خنازير معرضة للاشعاع‎ ‏موجودة في ربيطة ا(« فقد تم‎ APP ‏ولتحديد ما إذا كانت‎ . 0 vitro ‏الدم في الانسان مختبرياً‎

‎ve‏ اختبار تأثيرها عن طريق قياس درجة إندماج ‎SH-Thymidine‏ مع ‎Ba/F3 WIA‏ التي طعمت أو

‎AY ---‏ — نقل إليها ‎mpl P transfected‏ البشري ‎«(Ba/F3- mpl)‏ وتم هذا الاختبار وفق الإجراءات الموضحة في شكل رقم ". وتعمل ‎Je APP‏ تحفيز إندماج ‎*H-Thymidine‏ في خلايا ‎Ba/F3-‏ ‎mpl‏ ولكن ليس في خلايا التحكم أو المقارنة ‎Ba/F3‏ التي لم تطعم ‎mpl-P‏ البشري. وإضافة إلى ذلك لم يشاهد مثل هذا النشاط في بلازما الخنازير العادية. وتشير تلك النتائج إلى أن ‎APP‏ يحتوي

‏هه على عامل أو عوامل قامت بتحويل ‎transduced‏ إشارة التكاثر ‎proliferative signal‏ والاستشراء

‏خلال مستقبل ‎empl‏ ومن ثم فإنها تمثل ربيطة طبيعية بالنسبة لهذا المستقبل. وقد تم تأييد ذلك

‏بالنتائج التي أفادت بأن معالجة ‎APP‏ باستخدام خليط ذواب يحتوي على ‎mpl‏ والجسم المناعي

‏6 قد أدت إلى إعاقة تأثير ‎APP‏ المحفز على خلايا ‎Ba/F3-mpl‏

‏ويبدو أن نشاط ‎APP‏ أساسه البروتين؛ ذلك لأن هذا النشاط يتوقف بتأثير انزيم ال ‎pronase‏ ؛

‎non-dialyzable ‏إضافة إلى كون هذا النشاط غير قابل للديلزة‎ oF ‏أو277 أو بالحرارة (شكل رقم‎ ٠

‎٠‏ ومع ذلك كان النشاط ثابتاً عن رقم هيدروجيني ‎(PH)‏ قدرة ‎Y,0‏ درجة لمدة ساعتين؛ وأبدى ارتباطاً وفصلاً تتابعياً من العديد من الأعمدة التي تألف ‎lectin-affinity‏ ؛ مما يشير إلى أن هذا النشاط ناتج عن ‎glycoprotein‏ ولتوضيح هذا الهيكل وللتعرف على المزيد من التفاصيل على هذا النشاط ققد تمت 455 من ‎APP‏ باستخدام خلائط 001-180 المحضرة بالخلائط الجينية ‎٠‏

‏10 وقد تمت معالجة ‎APP‏ وفق البروتوكول الذي جاء وصفه في الأمثلة ‎Yo)‏ وباختصارء تمت 45 ربيطة ‎mpl‏ باستخدام كروماتوجرافيا التفاعل الذي لا يألف الماء ‎hydrophobic Interaction‏ ‎chromatography (HIC)‏ ؛ وكروماتوجرافيا آلفة القالب القابت ‎immobilized dye‏ ‎«chromatography‏ وكروماتوجرافيا الألفة تجاه ‎-mpl-affinity‏ ويوضح شكل رقم ؛ استرداد ‎recovery‏ النشاط من كل خطوة؛ ويوضح جدول رقم ‎١‏ عدد مرات التنقية ‎fold purification‏ وقد

‎vy.‏ كانت النسبة المئوية لمجموع النشاط المسترد خلال الألفة تجاه عمود ‎mpl‏ حوالي ‎7٠0‏ وكان

-_ عم -_ للجزء ذو النشاط القمي ‎(F6)‏ الناتج عن عمود الألفة تجاه ‎mpl‏ نشاطاً نوعياً ‎specific activity‏ مقدراً عند القيمة 9,4 ‎"٠١ X‏ وحدة/ملجم. وبالنسبة للتنقية الكلية من © لتر من ‎APP‏ فكانت حوالي ¢ ‎٠١‏ 1 ضعفاً ‎٠ A)‏ وحدة/ ملجم إلى ‎YY‏ ل وحدة/ مجم)؛ مع انخفاض قدره ‎AY‏ ‎Nox‏ ضعف في البروتين ‎YOu)‏ جرام إلى ؟ ميكرجرام). وقد قدرنا النشاط النوعي ‎hay ll‏ © التي تم فصلها تتابعيا عن عمود يألف ‎activity‏ ‎mpl‏ وذلك عند قيمة قدرها - ‎"٠١ XY‏ وحدة/ مجم. جدول رقم ‎)١(‏ ‏تنقية مجموعة ‎mpl‏ الترابطية ‎Purification of mpl Ligand‏ بروتين وحدات/ عدد مرات الحجم النشاط | المنتج العينة ملجم/مل ‎Glad ١ de ١‏ التنقية (مل) النوعي ‎Yield‏ ‎Purificatio Units Units/ | Protein Sample‏ ‎mls‏ (وحدة/مجم) )7( ‎n mg mg/ml‏ ‎Ce freee ee am‏ ‎Cw ele ree Le ey‏ يه ‎ee Lo | [ome | oe [oe‏ مجموعة ‎FY xo ١١ ١ mpl‏ | 16ح | ‎Yoon‏ الور ‎Ye‏ مجر قارع الترابطية (ميكرولتر ‎(Wl‏ — الأمثلة ه ل وقد تم تحديد البروتين بواسطة اختبار ‎Bradford‏ ويتم تقدير تركيز البروتين في أجزاء ‎mpl‏ ‏المفصولة تتابعياً © - ‎١‏ وذلك على أساس شدة التصبغ في جل ‎SDS‏ المصبوغ بالفضة ‎silver‏

فم - 0 . الوحدة الواحدة يتم تعريفها على أنها الوحدة التي تسبب ‎٠‏ 75 من الحد الأقصى لتحفيز ‎ISS‏ خاديا ‎Ba/F3-mpl‏ ‏وقد تمت الإفادة عن وجود بروتينات متعددة (شكل رقم 0( وذلك من خلال تحليل الأجزاء التي تم فصلها تتابعياً من عمود ألفة ‎mpl‏ باأستخدام ‎71٠0 - £) SDS-PAGE‏ جل ‎(Novex®‏ في ‎١‏ ظروف اختزالية. وقد كانت البروتينات التي اصتبغت بالفضة بدرجة عالية وبشكل واضح ‎alc resolved‏ نسب جزيئية ‎Mr‏ قدرها ‎٠‏ تت روت رقم نك ‎YA, vee‏ ‎YY, 000 VA eg‏ ولتحديد أي من تلك البروتينات يحفز تكاثر وسط استنبات خلإيا ‎Ba/F3-‏ ‎mpl‏ فقد تم فصل البروتينات تتابعياً من الجل كما جاء وصف ذلك في مثال رقم ‎.)١(‏ ‏وقد أظهرت نتائج هذه التجربة أن أغلب النشاط الذي تم فصله تتابعياً كان لشريحة الجل المحتوية ‎٠‏ على بروتينات بنسبة جزيئية ‎Mr‏ تتراوح ما بين 78.0060 - ‎FY, nee‏ مع نشاط ‎J‏ يتم فصله تتابعياً في منطقة يتراوح فيها النسبة الجزيئية ما بين 18,0050 = 77,000 في الجل (شكل رقم لقد كانت البروتينات الوحيدة التي شوهدت في تلك المناطق هي تلك التي تبلغ نسبتها الجزيئية ره لاء ود درا ‎YY ve - VA eg‏ ولكي يتم تعريف هوية متتاليات البروتين والحصول على البروتينات في هذه المنطقة من الجل (حزم جزيئية عند ‎YA‏ و8١-‏ ؟؟ كيلو ‎٠‏ دالتون ‎(kDa‏ فقد أجرى تمثيل خطوط تلك البروتينات الثلاثة كهربائيا في ‎PVDF‏ ثم حلل تتابع الاحماض ‎Aad)‏ فيها كما جاء وصفها في مثال رقم ‎oF‏ ويوضح جدول رقم ؟ متتاليات النهاية الطرفية "أمينو" ‎Amino-terminus‏ المتحصل عليها.

— م - جدول رقم ‎(Y)‏ ‏متواليات النهاية الطرفية ‎ginal’‏ " لمجموعة ‎mpl‏ الترابطية ‎Ligand Amino-Terminus‏ 1م11 ‎Sequences‏ ‏( متتالية رقم : ‎kDa‏ 30 ‎(ve‏ 25 20 15 10 5 1 ‎(S)PAPPA(CDPRLLNKLLRDD (H/S)VLH (G)R‏ ( متتالية رقم : ‎kDa‏ 28 1( 25 20 15 10 5 1 ‎SYPAPPAXDPRLLNKLLRDDH)VLHGR‏ ‏( متتالية رقم : ‎kDa‏ 18-22 ‎(YY‏ 10 5 1 ‎SEQ ID NO: 32‏ م مم أت م هعتم ممح م«

‎AY —‏ - وقد أفاد التحليل الذي أجرى بمساعدة الحاسوب بحداثة تلك المتتاليات الخاصة بالأحماض الأمينية. ونظراً لتمائل جميع المتتاليات الثلاث فقد كان الاعتقاد هنا أن بروتينات ذات الأوزان الجزيئية ‎KDa‏ 30؛ ‎kDa 28 kDa‏ 18-22 هي بروتينات متشابهة أو أشكال مختلفة لنفس البروتين الجديد ‎novel‏ وفضلاً عن ذلك فإن هذا البروتين (البروتينات) كان من الممكن ‎mpl Hk dk vim‏ ‎٠‏ الطبيعية نظراً للنشاط الحيوي للبروتينات المفصولة على ‎SDS-PAGE‏ في نفس المنطقة ‎(vv pre =YA van )‏ للجل ؟ - 7460. وإضافة إلى ذلك فإن الربيطة المنقاة جزئيا يتم هنا ارتحالها بنسبة جزيئية تتراوح ما بين 17,006 = 0.000 وذلك بعد أن تتعرض لعملية كروماتوجرافية لترشيح الجل باستخدام عمود ‎٠ (Pharmacia) Superose-12‏ ويعتقد أن الأشكال المختلفة للنسب الجزيئية هي نتيجة للاختلافات الحادثة في التحلل البروتيني أو المعالجبة بال ‎٠ glycosylation ٠ |‏ أو نتيجة لتعديلات تحويلية سابقة أو لاحقة للبناء البروتيني ‎post or pre-‏ ‎translational modifications‏ . ‎LS‏ جاء وصفه سابقاً فإن ‎mpl-RNA‏ البشري الغير مشفر ‎antisense‏ قد أوقف عملية تكوين خلايا ‎megakaryocytes‏ في أوساط لاستزراع نخاع العظام البشري مشبعة بخلايا ‎CD34"‏ السلفية ‎progenitor‏ دون التأثير على سلالات الخلايا الأخرى المكونة للدم (راجع سالفة أبحاث ‎supra‏ ‎٠‏ .ال ‎Methia‏ وآخرين ). وتقترح هذه النتيجة أن مستقبل ‎mpl‏ قد يلعب دوراً في تمييز وتكائثر خلايا ‎megakaryocytes‏ في المختبر ‎Lin vitro‏ وللتأكيد أكثر على دور ‎day‏ ام(« في عملية تكون خلايا ‎megakaryocytes‏ تمت هنا مقارنة تأثير ‎APP APP‏ الخالي من مجموعات ‎mpl‏ الترابطية على التكوين - في المختبر ‎in vitro‏ - لخلايا ‎megakaryocytes‏ البشرية. وقد تم تحديد تأتثير ‎APP‏ على تكوين خلايا ‎megakaryocytes‏ في الإنسان وذلك بتعديل اختبار تكوين تلك الخلايا باستخدام معلق سائل ‎suspension megakaryocytopoiesis‏ 110010 وهو الاختبار التي جاء وصفه في مثال رقم 4. في هذا الاختبار تمت معالجة خلايا جذعية سطحية ‎human peripherald; 3—s‏

‎AM _‏ - ‎CAPP—_stem cells (PSC)‏ وذلك قبل وبعد المعالجة الكروماتوجرافية الخاصة بتحديد درجة الألفة مع خليط ‎mpl‏ والجسم المناعي ‎TG‏ وقد تم التقدير الكمي لتحفيز عملية تكوين خلايا ‎megakaryocytes‏ بواسطة ‎(GPILIII,‏ وذلك باستخدام الجسم المضاد ‎"L-anti-IL III, antibody‏ (شكل رقم 7). ويوضح الشكل رقم ‎٠‏ أن ‎7٠‏ 07م قد أدى إلى ¥ أضعاف التحفيز؛ بينما ‎APP‏ ‏ف الخالي من ربيطة ‎mpl‏ لم يكن له أي تأثير. وبشكل أساسي فإن ‎APP‏ الخالي من ربيطة ‎empl‏ ‏يؤدي إلى حث تكاثر ‎-Ba/F3-mpl A‏ ‎i‏ تجربة أخرى فإن إضافة ‎mpl-IgG‏ البشري المذاب ‎soluble‏ في اليوم صفرء؛ ‎EY‏ إلى أوساط استنبات تحتوي على ‎APP ٠‏ قد أدت إلى معادلة التأثيرات الحفزية ل ‎APP‏ على عملية تكوين ‎megakaryocytes LDA‏ البشرية؛ كما يتضح ذلك في شكل رقم 8. وتشير تلك ‎٠‏ النتائج إلى أن ربيطة ‎mpl‏ تلعب دوراً في تنظيم عملية تكوين ‎megakaryocytes LDA‏ البشرية؛ ومن ثم يمكن الاستفادة منها في علاج حالات نقص تكون خلايا الصفائح الدموية ‎٠ thrombocytopenia‏ — الاستنساخ الجزيئي لربيطة ‎Molecular Cloning of the mpl Ligand mpl‏ : استناداً إلى متتالية الأحماض الأمينية في النهاية الطرفية "أمين و" ‎amino-terminal‏ والمتحصسل ‎vo‏ عليها من بروتينات ‎kDa s 28 kDa s <30 kDa‏ 18-22 (جدول رقم ¥ ‎(Def‏ فقد تم تصميم اثنين من ‎Ale gana‏ البادائات ‎oligonucleotide primers‏ الإنحلالية ‎degenerate oligonucleotide‏ ‎٠ primer pools‏ واستخدمت لتكثير الحامض النووي ‎DNA Jill‏ في الخنازير وذلك بواسطة ‎PCR‏ وقد أعزى ذلك إلى أنه وإذا كانت معلومة متتالية الأحماض الأمينية ذات النهاية الطرفية "أمينو" مشفرة بواسطة أكسون ‎exon‏ مفرد يتوقع عندئذ أن يكون طول منتج ‎PCR‏ الصحيح هو ‎yy.‏ 14 جوز قاعدة ‎bp‏ لقد تم إيجاد مثل هذا الحجم من جزء ‎DNA‏ وتم استنساخه ‎subcloned‏ شكل

— قم - فرعي إلى ‎.pGEMT‏ ويوضح مثال رقم 0 متتاليات البادثات ‎oligonucleotide primers‏ المستخدمة ‎PCR‏ مع ¥ مستنسخات منه تم الحصول عليها. وقد كانت متتالية الحامض الأميني ‎(PRLLNKLLR)‏ المتتالية رقم ‎(YY‏ للببتيد المشفر ‎peptide encoded‏ بين مواد ‎PCR‏ 4534 مطابقة لتلك المتحصل عليها بعمل متوالية من بروتين به نهايقطرفية "أمينو" ‎amino-‏ ‏م ‎terminal‏ لربيطة في الخنازير (راجع الوحدات البنائية 4 ‎١7-‏ بالنسبة لمتتاليات بروتين الخنازير ‎kDa‏ 28 و1002 30 أعلاه).

وقد تم استخدام ‎oligonucleotide‏ مصنع ‎synthetic‏ البسيط الذي يتكون أساساً من متتالية الجبزء المستخدم ‎PCR‏ وذلك لمسح مجموعة ‎DNA‏ الورائية ‎screen a human genomic DNA library‏ في الإنسان. وقد تم تصميم وبناء ‎45-mer oligonucleotide‏ المعبر عنه ب ‎Pra5‏ وذلك على

‎٠‏ أساس متتالية الجزء المستخدم ‎(PCR‏ ويأخذ هذا ‎oligonucleotide‏ شكل المتتالية رقم ؛ ‏ الآتية: ‎GCC-GTG-MG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-MG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3‏ '5 ‎(SEQ ID NO: 34)‏ وقد استخدم هذا ‎deoxyollgonucleotide‏ لمسح مجموعة ال ‎DNA‏ البشرية الوراثيةٍ ‎screen a‏ ‎human genomic DNA‏ في 12 ‎Agem‏ في ظروف من التهجين والغسل ذات شدة ‎stringency‏ ‎Vo‏ منخفضة وفق مثال رقم +. وقد تم التقاط النسخ الإيجابية وتنقيتها وتحليلها لعن طريق عمل خرائط التقييد ‎restriction mapping‏ وعن طريق عمل بقع ‎blotting‏ . 500118:0. كما تم عمل إعادة نسخ ‎subcloned‏ من جزء مقطوع بواسطة ‎EcoRI-Xbal‏ طوله )+ ¥4 ‎(bp‏ الذي تهجن مع ‎45-mer‏ ليتحول بذلك إلى ‎pBluescript SK‏ وقد أكدث متتاليات الحامض النووي ‎DNA‏ لهذه النسخة على أن الحامض ‎DNA‏ المشفر لربيطة ‎mpl‏ البشرية المتجانسة ‎homolog‏ مع ربيطة ‎mpl‏ ‏© _ الترابطية في الخنازير قد تم عزلها ‎٠‏ ويوضح شكل رقم 4 متوالية ‎DNA‏ في الانسان ومتوالية

الأحماض الأمينية المختزلة (المتواليات رقم ‎(oF‏ ويشار أيضاً بالأسهم إلى المواضع المحددة لل ‎A introns‏ المتوالية الوراثية؛ وهي تميز كذلك 0 التصوري ) ‎AY - exon‏ واستناداً إلى متتالية " ‎exon‏ — ©" البشرية (مثال ‎("A‏ تم تصنيع ‎oligonucleotides‏ تتناظر مع النهايات الطرفية 7 © - متتالية ال ‎cexon‏ وقد استخدمت هاتين المادتين الأوليتين في ‎٠‏ تفاعلات ‎PCR‏ المستخدمة ل ‎Cdna‏ كقاعدة بيانات ‎una template‏ 3 من أنسجة بشرية متنوعة؛ وكان الحجم المتوقع لمنتج ‎٠ bp Yé+ sa PCR‏ وبعد دراسة ناتج ‎PCR‏ على ‎JAX‏ ‎polyacrylamide gel‏ تم اكتشاف جزء ‎DNA‏ بالحجم المتوقع في مجموعات ‎cDNA‏ المحضرة من ‎Kidney‏ إنسان بالغ؛ وأيضاً ‎TAT‏ خلية كلوية جنينية ‎CDNA fetal‏ محضر من كبد بشري جنيني ‎.human fetal liver‏ ‎٠‏ وقد ثم بعد ذلك مسح مجموعة ‎cDNA‏ لكبد جنيني (لا ‎Ye X‏ نسخة ‎(clones‏ في ‎lambda DR2‏ مع نفس ‎45-mer oligonucleotide‏ الذي استخدم في مسح المجموعة البشرية ‎human A ysl‏ ‎genomic library‏ ومجموعة ‎cDNA‏ الكبدية الجنينية تحت ظروف تهجين منخفضة الشدة. كما تم التقاط النسخ ‎Aum gal)‏ وتنقيتهاء تم تحديد ‎ans‏ الوليجة 7 بواسطة ‎(PCR‏ مع اختيار نسخة واحدة ذات وليجة ‎٠ A‏ ا لإجراء تحليل إضافي. وباستخدام الإجراءات التي جاء وصفها في ‎١‏ _مثال رقم 7 تم الحصول على 06 ومتتالية الحامض الأميني ‎dati al‏ تربيطة ‎mpl‏ ‏البشرية (.1)؛ ويعرض شكل رقم ‎١‏ تلك المتتاليات (المتتاليات رقم © ‎.)١‏ ‏¥ شكل ربيطة ‎mpl‏ البشرية (17): تشتمل ‎cDNA Ale‏ لربيطة ‎mpl‏ الترابطية البشرية ‎(hML)‏ (المتتالية رقم - ؛ شكل رقم - ‎(Y‏ ‏على ؛ 179 ‎nucleotide‏ متبوعة بذيل ‎Poly (A)‏ عديد . وتحتوي ‎A Jul‏ على ١٠7من‏ ‎٠‏ 06600088 التي بها © متتاليات غير مترجمة ‎untranslated‏ و 7 منطقة غير مترجمة لها

‎4١ -‏ 4 وعل0معاهيه. ويعتبر الكودون ‎initiation codon sal‏ عند موضع ‎Y11) nucleotide‏ = 1( ضمن المتتاليات المجمع عليها ‎consensus‏ المفيدة لبدء الترجمة ‎translation‏ في ‎٠ eukaryotic‏ ويبلغ طول إطار القراءة المكشوفة ‎٠١59‏ من ‎nucleotides‏ ؛ وهو يشفر ‎YOY ha polypeptide‏ وحدة حمض اميني بدءاً بال ‎nucleotides‏ عند الموضع ‎YY‏ وتعتبر ‎Lalo‏ الطرفية ‎No‏ لمتتالية الأحماض الأمينية المتوقعة أن تكن من التي لا تألف الماء وبدرجة ‎dle‏ ربما تك ببتيد منظم ‎signal peptide‏ . وتشير تحليلات الحاسب الآلي لمتتالية الحامض الأميني المحدد إلى موضع محتمل لعمل ‎signal peptidase‏ بين الوحدات البنائية ‎YY 7١‏ (راجع ‎Von Heijne et al, Eur.

J.

Biochem. 133: 17-21 (1983)‏ ) ويؤدي الإنشطار عند هذا الموضع إلى توليد ‎polypeptide‏ ناضج يحتوي على 77 من وحدات بنائية الأحماض الأمينية بدءاً من ‎ddl. - ٠‏ النهاية الطرفية ‎"ginal"‏ المتحصل عليها من ربيطة ‎mpl‏ المنتقاة من بلازما الخنازير. ‎dug‏ ‏الوزن الجزيئي غير المشتمل على ‎glycosylated‏ في الربيطة الباقية المحتوية على ١؟*‏ حامض أميني حوالي ‎FA‏ كيلو دالتون؛ وهناك 1 مواضع ممكنة لإدخال مجموعة ‎N-glycosylation‏ ؛ مع ؛ وحدات بنائية محتملة للحامض الأميني ‎.cysteine‏ ‏وبمقارنة متتالية ربيطة ‎mpl‏ مع قاعدة بيانات ‎database‏ متتالية ‎Genbank‏ أوضحت بأن هناك ‎١‏ تطابق بنسبة 777 بين ‎VOT‏ من الوحدات البنائية المحتوية على نهاية طرفية "أمينو" لربيطة ‎mpl‏ ‏البشرية وبين ‎erythropoietin‏ البشري (شكل رقم ‎٠١‏ المتتاليات رقم 6 ‎.)١‏ وعند الأخذ في الاعتبار الاستبدال ‎conservative substitutions‏ التحفظي تبدى منطقة .1/11 درجة قدرما +70 من التشابه مع ‎erythropoietin‏ البشري (02500). ويحتوي كل من ‎hML 5 hEPO‏ على أربعة من أحماض ‎cysteines‏ تحفظ “ منها ثابتة في ‎hML‏ بما في ذلك الحامض الأميبني ‎cysteines‏ الأول © والحامض الأميني ‎cysteines‏ الأخير. وقد أظهرت تجارب تكوين الطفرات حسب توجيه الموضع ‎mutagenesis‏ 1 أن حامض ‎cysteines‏ الأول والأخير يقومان بتكوين رابطة من ‎bond‏

‎ay -‏ _ 6 المطلوبة لأداء هذا الدور 2286-2292 :116 ‎(Wange, EF. et al, Endocrinology‏ ((1983) وبالمثل فإن حامض ‎cysteines‏ الأول والأخير في .1245 قد يقومان ‎Lad‏ بتكوين رابطة مهمة من ‎disulfide‏ لا يحتفظ بأي من مواضع المعالجة بال ‎-hML (siglycosylation‏ وتقع جميع المواضع الممكنة للمعالجة بالجليكوسيل والمرتبطة ب ‎linked‏ - 17 في ‎Hmin‏ في منتصف النهاية ‎oo‏ الطرفية ’ ‎"carboxy-terminal‏ لل ‎Hm! polypeptide‏ . وبالتشابه مع ‎hEPO‏ فإن ‎mRNA‏ 1101 لا تحتوي على المتتالية المجمع عليها ‎bs‏ مجموعة + وهي المتتالية ‎(AAUAAA‏ كما لا تحتوي أيضاً على العنصر التتظيمسي ‎AUUUA‏ الموجود في المناطق ¥ غير المترجمة لكثير من ‎«cytokines‏ ويعتقد أنه ‎i‏ على ثبات ‎(Shaw et al, Cell, 46: 659-667 (1986)) mRNA‏ ويشير تحليل ‎Northern blot dad;‏ إلى ‎٠‏ وجود مستويات منخفضة من نسخة ‎kb hML RNA‏ 1-8 الموجودة في كبد كل من الجنين والإنسان البالغ. وبعد التعرض ‎exposure‏ لفترة طويلة يمكن اكتشاف حزمة ‎band‏ أضعف ذات حجم ‎Silas‏ في كلى الإنسان البالغ. وبالمقارنة فإن عملية تكوين ‎erythropoietin‏ في الإنسان تظهر في كبد الجنين كاستجابة لنقص ‎hypoxia‏ في الدورة الدموية؛وأيضاً في كلى وكبد الإنسان البالغ. ‎(Jacobs et al., Nature, 313: 804-809 [1985] and Bondurant et al, Molec.

Cell.

Biol.

Vo‏ )]1986[ 6:2731-2733 ولا تزال أهمية منطقة النهاية الطرفية "©" في ‎BML‏ في حاجة إلى الشرح والتوضيح. واستناداً إلى وجود ‎١‏ مواضع محتملة لإدخال مجموعة ‎glycosylation‏ مرتبطة ب ‎(N‏ وقدرة المجموعة الربيطة على الارتباط بالأعمدة التي تألف اللكتين ‎lectin-affinity columns‏ ؛ فإنه يحتمل أن يتم ‎JY.‏ مجموعة ‎J glycosylation‏ منطقة ‎AML‏ وفي بعض تجارب الغسل 0 التتابعي

‎ay —‏ - ‎Jal‏ لاحظنا أن النشاط ينفصل عند نسبة جزيئية قدرها حوالي ‎Tose‏ وهي قيمة تمثل الطول الكامل للجزئ المحتوي على ‎glycosylation‏ . لذلك فإن منطقة النهاية الطرفية "©" يمكن أن تعمل هنا على تثبيت وزيادة فترة نصف العمر ل ‎BML‏ السابح في تيار الدم. وفي حالة تكوين ‎li erythropoietin‏ الشكل غير المحتوي على 0 0 يكون له نشاط بيولوجي كامل في ‎٠‏ المختبرء ولكن تقل فيه وبشكل ملحوظ فترة نصف العمر في البلازما بالمقارنة إلى ال ‎erythropoietin‏ المعالج بال ‎glycosylation‏ ‎(Takeuchi et al.. J.

Blol.

Chem., 265:12127-12130 [1990], Narhi et al, J.

Biol.

Chem,‏ ‎and Spivack et al., Blood. 7:90-g9 [19891).‏ ]1991[ 266:23022-23026 ويحتوي مجال النهاية الطرفية "©" ل ‎AML‏ على أثنين من متتاليات الأحماض الأمينية ثنائية ‎٠‏ القاعدية ‎di-basic‏ (شقوق ‎Arg-Arg‏ عند المواضع ‎Not ١0‏ والمواضع 40 7- ‎(YEN‏ وهي المواضع التي تعمل كمواضع محتملة للمعالجة ‎processing sites‏ وقد يكون القطع في تلك المواضع مسئولاً عن توليد أشكال ‎ML‏ ذات الوزن الجزيئي ‎YY -١8 YA Fy‏ كيلودالتون؛ والتي تم عزلها من ‎LAPP‏ وبشكل أساسي تقع متتاليات 54 ‎Argl153-Argl‏ مباشرة بعد المجال الشبيه بال ‎erythropoietin‏ بالنسبة ل ‎ML‏ وتشير تلك المشاهدات إلى أن الطول الكامل — ‎Vo‏ .111 قد يمثل ‎proteolysis‏ يخضع لدرجة محددة من التحلل البروتيني لتوليد ربيطة ناضجة. ؛ - الأشكال التناظرية والمتعددة من ربيطة ‎mpl‏ البشرية: تم الكشف عن الأشكال التناظرية أو - كبديل عن ذلك - الأشكال المتحورة ‎spliced‏ لربيطة ‎mpl‏ ‏البشرية؛ وذلك بواسطة 00 في كبد إنسان بالغ. وباختصار تم ‎ely‏ البادئات ‎primers‏ لكل من النهايات الطرفية وأيضاً المناطق الداخلية المختارة لتشفير متتالية ‎ML‏ وقد استخدمت تلك البادئات في 87-00 وذلك لتزويد ‎amplify‏ الحامض النووي ‎RNA‏ في كبد إنسان بالغ كما ‎sla‏

‎a8 -‏ _ وصف ذلك في مثال رقم ‎.٠١‏ وإضافة إلى الشكل ذو الطول الكامل ‎AML‏ فهناك © أشكال أخروى تمت مشاهدتها أو أستتتجث 40 وهي ‎hML2‏ و ‎¢hML3‏ و14لط. ويوضح شكل رقم ‎١١‏ ‏متتاليات الأحماض الأمينية الناضجة المستنتجة لكافة الأشكال التناظرية (المتتاليات رقم 3 ‎AA‏ ‎(Ve‏ وتحتوي ‎hML3‏ على الموضع ‎7٠١‏ الخاص بحذف ‎١76 nucleotide‏ ويؤدي ذلك إلى ‎٠‏ حذف حامض أميني و تحول في الإطار ‎frameshift‏ . ويقوم ‎cDNA‏ الآن بتشفير ‎polypeptide‏ ‏ناضج طوله 365 حامض أميني ويتفرغ ‎diverges‏ من متتالية ‎hML‏ عند الحمض الأميني ‎Ava‏ ‏وأخيراً يحتوي 1114 على كل من موضع حذف ‎١١ nucleotide‏ بعد ال ‎١8 nucleotide‏ (موجود أيضاً في متتاليات في الفئران والخنازير - راجع الجزء أدناه)؛ مع موضع لحذف القاعدة رقم ‎BP ١١١‏ الموجود في 11.3 ورغم أنه لم يتم عزل نسخ بها موضع حذف ‎bp ١١‏ فقط ( ‎nucleotide ٠‏ يلي 119) في الإنسان (03072)إلا أنه من الممكن أن يوجد هذا الشكل التناظري بعد أن تم تمييزه والتعرف عليه في كل من الفئران والخنازير (أنظر الجبزء ‎(plaid‏ ‏ونظراً أيضاً إلى أنه قدتم تمييز هذا الشكل التناظري والتعرف عليه بالترافق مع منطقة حذف ‎١١١ nucleotide‏ في ‎-hML4‏ ‏وقد تم عمل كل من هيكل مختلف استبدالي ل .13401 الذي تستبدل فيه المتتالية ثنائية القاعدة ‎Argl53-Argls4 | ٠‏ باثنين من وحدات بنائية ‎calanine‏ ومجال ‎EPO‏ المقطوع من ,1لا وذلك لتحديد ما إذا كان الطول الكامل ل ‎ML‏ ضرورياً لأداء النشاط البيولوجي. وقد تم عمل هيكل مختلفة إستبدالي لمتتالية 54 ‎Arg]53-Argl‏ ثنائية القاعدة والمشار ‎hML (R153A-R154A leu)‏ وذلك باستخدام ‎PCR‏ كما جاء وصفه في مثال رقم ‎.٠١‏ كما تم أيضاً عمل حيز ‎EPO‏ المقطوع من ‎¢hMLIS3‏ وذلك باستخدام ‎PCR‏ وعن طريق إدخال ‎codon‏ الإيقاف بعد الحمض ‎Argl53‏

0° - التعبير عن الصيغة الوراثية لربيطة ‎mpl‏ البشرية ‎(rhML)‏ الناتجة عن الهندسسة الوراثية

‎Recombinant‏ خلايا من كلى جنينية بشرية ‎(YAY)‏ أودعت فيها المعلومة بشكل انتقالي:

‏للتأكد من أن ‎cDNA‏ البتشري المستنسخ قد قام حمل مورث ‎de sans day) encoded‏ ترابطية ل

‎control ‏فقد تم أظهار الصيغة الوراثية لتلك المجموعة في خلايا 203 الثديية تحت سمسيطرة‎ mpl

‏© محفز ‎promoter‏ فيروس ‎cytomegalovirus‏ المبكر باستخدام أي من ناقلات ‎vectors‏ الصيغة

‏الوراثية ‎pRKS-hML‏ أو ‎.pRKS-hML-153‏ وقد وجد أن المواد الطافية ‎Supernatants‏ من خلايا

‎YAY‏ الكلوية الجنينية البشرية التي أحدثت بها العدوى بشكل عرضي ‎transiently‏ تعمل هنا على

‏تحفيز إندماج ‎°H-Thymidine‏ في ‎Ba/F3-mpl WA‏ ولكن ليس في الخلايا الأبوية ‎Ba/F3‏ (شكل

‏رقم ١١أ) ‎٠‏ ولم يظهر هذا النشاط البيولوجي في الأوساط الناتجة عن خلايا ‎YAY‏ التي أودعت ‎led‏ ‎٠‏ المعلومة بواسطة الناقل الوراثي ‎pRK‏ بمفرده؛ وأدى إضافة 1180م« إلى تلك الأوساط إلى

‏مورث (207-0247 البشرية الوظيفية.

‏ولتحديد ما إذا كان مجال ‎EPO‏ بمفرده يستطيع أن يرتبط مع وأن ينشط ام« فقد تم هنا إظهار

‏الصيغة الوراثية للشكل المقطوع من ‎(hML‏ وهو الشكل 153 ‎orhML‏ وذلك في ‎YAY‏ خلية. وقد ‎vo‏ وجد أن المواد الطافية من الخلايا التي أودعت فيها المعلومة لها نشاط ‎Silas‏ لتلك الناتجة عن

‏خلايا تظهر الطول الكامل ل ‎AML‏ (شكل رقم ١١أ)؛‏ مما يشير إلى أن حيز النهاية الطرفية "0"

‏ل ‎ML‏ ليس مطلوباً لارتباط أو لتنشيط ‎compl‏

‏1 - تقوم ربيطة ‎mpl‏ بتحفيز تكون خاديا ‎Megakaryocytopoiesis‏ وتكوين ‎Thrombopoiesis‏ :

‏تقوم كل من شكلي ‎AML‏ بطولها الكامل أو 153 ‎thML‏ المتشطرة ‎truncated‏ بتكوين خلايا ‎meghakaryocytes ٠‏ البشرية التي يحفزها ‎AML‏ الناتج عن الهندسة الوراثية في المختبر ‎in vitro‏

- 0410 (شكل رقم ١١ب).‏ وقد لوحظ هذا التأثير في غياب عوامل نمو أخرى مكونة للدم تمت إضافقها خارجياً. وباستثناء 11-3 فقد كان ‎ML‏ هو عامل النمو الوحيد المكون للدم الذي تم اختباره والذي ثبت أنه يبدى هذا التشاط. ‎(IL-6g IL-11 Lal‏ و11 و ‎(IL-9 5 «G-CSF 3 «erythropoietin‏ ‎LIF 5‏ و ربيطة ‎GM-CSF 5 «OSM.

M-CSF 5 (KL) Kit‏ فلم تؤثر أي منها على تكوين الدم © عند اختبارها بشكل منفصل في الاختبار الذي أجريناه (البيانات غير موضحة). وتبرهن هذه النتيجة على أن ‎ML‏ كان له نشاط محفز لخلايا ‎Megakaryocytes‏ وهي تشير أيضاً إلى دور ‎ML‏ في تنظيم عملية تكوين ‎.Megakaryocytopoiesis WIS‏ لقد تبين أن الأنشطة المكونة لل ‎Thrombopoietic‏ والموجودة في البلازما في الحيوانات العاجزة عن صنع الصفائح الدموية تقوم بتحفيز إنتاج الصفائح الدموية في اختبارات ‎mouse rebound‏ ‎٠‏ 50110007109818 . ‎(McDonald, Proc.

Soc.

Exp.

Biol Meo 14: 1006-1001 [1973] and McDonald et al,‏ ‎Scand J.

HaematoL, 16:326-334 11976]).‏ وفي هذا النموذج جعلت الفئران عاجزة عن تكوين الصفائح ‎seal)‏ 4 باستخدام مصل نوعي مضلاد ‎antlplatelet serum‏ لتكوين الصفائح الدموية؛ وأدى ذلك إلى معاودة تكوين الصفائح الدموية بشكل ‎Vo‏ يمكن تحديده. وتعتبر تلك الفئثران المكونة ‎immuno-thrombocythemic‏ المعزز بالحفز المناعي أكثر استجابة للانشطة الخارجية الشبيهة بنشاط ‎thrombopoletin‏ مقارنة بالفئران العادية. ‎(McDonald.

Proc.

Soc.

Exp.

Biol.

Med., 14:1006-1001 [1973])‏ ذلك كمثل الفئران التي تعاني نقصاً في الأكسجين الخارجي؛ حيث تكون أكثر استجابة الل ‎thrombopoletin‏ مقارنة بالفئران العادية.

‎Vy —‏ — ‎(McDonald. et al., J.

Lab.

Clin.

Med, 77:134143 [1971]).‏ ولتحديد ما )13 كان ‎IML‏ يحفر إنتاج الصفائح الدموية في جسم الكائن الحي فقد تم حقن الفتران التي أعيد فيها تكوين الصفائح الدموية؛ وذلك ب ‎TAMIL‏ المتقى جزئياً؛ ثم أجرى بعد ذلك حساب كمي لعدد الصفائح الدموية ولإندماج 3*8 في الصفائح. وقد أدى حقن بالفئران ب ‎IML‏ بوحدات م قدرها 14,0660 و٠0 ‎FY,‏ إلى زيادة مقدرة ‎significantly‏ في إنتاج الصفائح الدموية؛ ويتضسح ذلك بالزيادة التي قدرها حوالي ‎/7٠0‏ في تعداد الصفائح الدموية (احتمالات الصدفة "7 - ‎nnee‏ و٠١‏ على التوالي)؛ وبالزيادة التي قدرها حوالي 7468 من إندماج ‎PS‏ ‏الصفائح الدموية (احتمال الصدفة "0" - 0,007) في الفئران المعالجة مقارنة بفئران مجموعة المستوى المقارن والتي حقنت فقط بالمادة السواغة ‎excipient‏ (شكل رقم ‎(VY‏ هذا المستوى من ‎٠‏ التحفيز يتقارب مع المستوى الذي شاهدناه في 11-6 في هذا النموذج (البيانات غير موضحة). هذا ولم تؤدي المعالجة ب ‎٠6.000‏ وحدة من ‎IML‏ تحفيز مقدر لإنتاج الصفائح الدموية. وتشير هذه النتائج إلى أن ‎ML‏ يقوم بتحفيز إنتاج الصفائح الدموية وفق نمط يعتمد على الجرعة؛ ومن ثم فهو يتميز بنشاط يشبه النشاط المكون لل ‎-thrombopoletin‏ ‏وقد أودع الشكل الآخر من ‎AML‏ الذي تم وصفه عاليه في 797 ؛ وتم اختبار المواد الطافية ‎١‏ باستخدام اختبار تكاثر ‎Ba/F3-mpl‏ (راجع شكل رقم ‎(VV‏ ولم تظهر أي من 2 ‎hML‏ و 1141.3 أي نشاط ملحوظ في هذا الاختبار» ومع ذلك فإن نشاط ‎R154A)‏ ,114108153 كان مماثلاً له في ‎¢hML153 5 hML‏ مما يشير إلى أن المعالجة عند موضع ‎Arg153-Argl54‏ ثنائي القاعدية ليس مطلوباً لأداء النشاط كما أنه ليس ضاراً به.

‎4A —‏ - ‎١‏ - تكرين خلايا ‎Megakaryocytes‏ وربيطة ‎Megakaryocytopoiesis and the mpl mpl‏ ‎Ligand‏ ‏لقد أقترح أنه يتم تنظيم تكوين خلايا ‎Megakaryocytes‏ عند مستويات خلوية متعددة. ‎(Williams et al., J.Cell Physiol. 110:101-104 [1982] and Williams et al., Blood Cells,‏ 5 .)]1989[ 133- 15:123 ويقوم هذا الاقتراح على المشاهدات التي أفادت بأن بعض عوامل النمو الخاصة بتكوين الدم تقوم بتحفيز تكاثر ‎Megakaryocytes LWIA‏ السلفية ‎cprogenitors‏ بينما تقوم أخرى بالتأثير على النضج بشكل أساسي. وتقترح النتائج التي نعرضها هنا أن ‎ML‏ يعمل بمثابة عامل ‎All‏ ‎proliferative‏ وأيضاً كعامل للنضج ‎maturation‏ . ويعتبر تحفيز .101 لتكائر ‎Dla‏ ‎Megakaryocytes ٠‏ السلفية من العمليات التي تدعمها عدة اتجاهات من القرائن ‎ali‏ أولها أن ‎APP‏ يقوم بتحفيز تكاثر ونضج خلايا ‎Megakaryooytes‏ البشرية في المختبرء ويتم بشكل كامل تثبيط هذا التحفيز عن طريق ‎USE) mplIgG‏ رقم ‎(AY‏ وفضلاً عن ذلك فإن تثبيط تكون مستعمرات من ‎Megakaryocytes WIA‏ بواسطة ‎oligonucleotides‏ المضادة للمعلومة ‎antisense‏ ‏والتي تحتوي على ربيطة ‎Compl‏ كما جاء ذلك في: 1392-1401 :82 ‎Blood‏ .له ‎(Methia et‏ ‎١٠‏ ((1993). واستنادا إلى النتائج التي تفيد ‎Compl ols‏ يمكن أن ترسل ‎transduce‏ الإشارة التكاثرية في الخلايا التي نقلت اليها ‎transfected‏ ‎(Skoda et al., EMBO. 12:2645-2653 [1993] and Vigon et al, Oncogene. 8:2607- 2615‏

‎a9 _‏ - فإن ذلك يشير أيضاً إلى دور .147 في تحفيز عملية التكاثر. كذلك فإن التعبير الواضح عن الصيغة الوراثية ل ‎Compl‏ أثناء مراحل تميز خلايا ‎Methia et al, Blood,) Megakaryocytes‏ )1993( 1395-1401 :82؛ إضافة إلى قدرة ‎ML‏ على التحفيز السريع لإنتاج الصفائح الدموية في جسم الكائن ‎pall‏ ليشير إلى أن ‎ML‏ يؤثر أيضاً على النضج. ويمكن من خلال توفر ‎ML‏ الناتج م من الهندسة الوراثية أن يكون هناك تقييم دقيق لدوره. في تنظيم عمليات تكوين خلايا ‎Megakaryocytes‏ وتكوين ‎thrombopoiesis‏ وأيضاً دوره الكامن في التأثير على سلالات أخرى مكونة للدم. ‎A‏ - عزل جين ‎(TPO)‏ لربيطة ‎mpl‏ البشرية ‎Isolation of the Human mpl Ligand (TPO)‏ ‎Gene‏ : ‎٠‏ تم عزل نسخ ‎DNA‏ الوراثي البشري ‎genomic DNA clones‏ التي تحمل مورث ‎TPO‏ عن طريق مسح ‎de sans‏ وراثية بشرية ‎human genomic library‏ في ‎A-Gem12‏ بواسطة 1645م في ظووف منخفضة الشدة أو عالية الشدة؛ مع قطعة ‎sragment‏ مناظر للنصف 7 في ‎CDNA‏ البشري حامل مورث لربيطة ‎mpl‏ وقد تم عزل اثنين من نسخ المتراكبة ‎overlapping lambda‏ ذات النطاق ‎kb YO‏ وتم عمل سخ فرعية من الجزئين المتراكبين ‎BamHI)‏ ‎(EcoRls ٠‏ المتضمين جين ‎TPO‏ بأكمله؛ وقد تم اعادة نسخها ومعرفة تتاليها ‎subcloned and‏ 0 (راجع شكل - ‎Zz) Ee 4 ١‏ ويتكون هيكل الجين البشري من ‎exons ١‏ ضمن ‎kbY‏ من ‎DNA‏ الوراثئي ‎genomic‏ . وتعتبر حدود جميع نقاط اتصال ‎exon/intron‏ متماشية مع ما هو مقبول للجينات الثديية. ‎(Shapiro.

M.

B.. et al., Nucl.

Acids Res. 15:7155 [1987)).‏

‎٠.١. -‏ ‎exon 5) exon sinus‏ ¥ على © متتاليات غير مترجمة مع ال ؛ أحماض أمينية البادة ‎ad‏ الإشاري ‎signal peptide‏ . ويتم تشفير باقي الإشارة الإفرازية والأحماض الأمينية الستة والعشرون الأولى للبروتين الناضج؛ وذلك ضمن ال ‎exon‏ ©. أما حيز ‎Jal) carboxyl‏ وأيضاً الأحماض الأمينية + غير المترجمة والأحماض الأمينية ال ‎٠٠‏ المكونة لحيز يشبه ‎SS erythropoietin ©‏ تشفيرها ضمن ال ‎exon‏ ويتم تشفير الأحماض الأمينية الأربعة الداخلة في الحذف ‎deletion‏ الملاحظ ضمن ‎(HTPO-2)‏ 1141-2 وذلك عند النهاية الطرفية © في ‎.١ exon‏ وقد إشار تحليل ‎DNA‏ الوراثي البشري بواسطة بقعة ‎Southern blot‏ إلى أن جين ‎TPO‏ موجود في نسخة ‎single copy‏ فردية وقد تم تحديد الموضع الكروموسومي ‎chromosomal location‏ ‎٠‏ للجين بواسطة التهجين الوميضي في الموضع ‎fluorescent in situ hybridization (FiSH)‏ والذي تم عمل خريطة له إلى ‎chromosome‏ 3027-28. 4 - التعبير الوراثي ل ‎TPO‏ وتنقيته من خلايا ‎Expression and Purification of TPO YAY‏ ‎from 293 Cells‏ : في مثال رقم ‎١9‏ جاء بالتفصيل وصف لعملية تحضير وتتقية ‎ML‏ أو ‎TPO‏ من خلايا ‎YAY‏ ‎١٠‏ وباختصار فإن ‎cDNA‏ الذي يعادل إطار القراءة المكشوفة بالكامل ل ‎TPO‏ قد تم الححسول عليه بواسطة ‎PCR‏ وباستخدام 00011 -وءعل00. وقد تمت تنقية منتج ‎PCR‏ واستنساخه بين مواضع الحصر ‎xbal 5 Clal‏ في بلازميد ‎pRKStkneo‏ (وهو عبارة عن ناقل وراثي متشتق من ‎PRKS‏ ‏ومعدل للتعبير ‎BY‏ عن الجين ‎a glial‏ للنيوميسين ‎neomycin resistaut gene‏ تحت ‎Lill‏ ‏المحفز لانزيم ثيميدين كيناز ‎(thymidine kinase promote‏ للحصول بذلك على الناقل الوراتفي ‎pRKStkneo ORF #٠‏ (الناقل الوراثي المشفر لإطار القراءة المكشوفة الكاملة).

‎٠١١٠ -‏ - وقد تم إحداث ناقل وراثي ثاني مشفر لمجال ‎EPO‏ المشابه؛ وذلك بنفس الطريقة؛ ولكن مع استخدام بادئات ‎PCR‏ مختلفة للحصول بذلك على هيكل نهائي يسمى ‎.pRKS5-tkneoEPO-D‏ وقد تم إحداث العدوى بهذين الهيكلين في خلايا كلوية جنينية في الإنسانء وذلك بواسطة طريقة ب0طع0؛ وتم اختيار النسخ المقاومة لل ‎neomycin‏ وسمح لها بالنمو. كما تم تقييم التعبير الوراثي ف ل 101153 أو 101332 في الأوساط المهيأة من تلك ‎etl‏ وذلك باستخدام اختبار ‎SL‏ ‎-Ba/F3-mpl‏ ‏وقد تمت تنقية ‎thML332‏ وفق الطريقة التي جاء وصفها في مثال رقم ‎V4‏ وباختصار فإن الأوساط المهيأة التي تحتوي على ‎393-rhML332‏ قد استعملت على عمود ‎Blue-Sepharose‏ ‎(Pharmacia)‏ ؛ والذي غسل لاحقاً بمحلول منظم يحتوي على ‎urea‏ (234). وقد تم الغسل التتابعي ‎elution ٠‏ باستخدام محلول منظم يحتوي على ‎(2M) urea‏ مع ‎sodium chloride‏ (114). وبعد ذلك تم وضع مصب الفصل التتابعي بواسطة ‎Blue-Sepharose‏ مباشرة على عمود ‎WGA-‏ ‎Sepharose‏ وغسل بمحلول منظم ذو حجم يعادل ‎٠١‏ أمثال حجم العمود ويحتوي على يوريا ‎(2M)‏ و ‎sodium chloride‏ (134)؛ ثم أجرى الفصل التتابعي بنفس المحلول المنظم الذي يحتوي على ‎N-acetyl-D-glucosamine‏ (0.524). وقد وضعت المادة الناتجة عن الفصل التتابعي ب ‎WGA-Sepharose ٠‏ على عمود ‎C4-HPLC‏ (من شركة ‎(Synchrom, Inc‏ وتم الفصل التتابعي بنسبة تدريجية ‎gradient‏ من ‎propanol‏ وبشكل غير متصل. ومن خلال ‎SDS-PAGE‏ تم إرتحال 299-72 في شكل نطاق واسع ‎broad band‏ في منطقة ‎68-80kDa‏ للجل (راجع شكل رقم ‎(Ve‏ ‏وقد تمت أيضاً تتقية ‎thML332153‏ وفق الطريقة التي جاء وصفها في مثال رقم ‎.٠9‏ وباختصار ‎Av.‏ هنا فرز الأوساط المهيأة المحتوية على ‎293-thML153‏ وذلك في ‎Blue-Sepharose‏ كما جاء

‎١٠١١ _‏ - وصف ذلك بالنسبة ل 21101332 وقد وضع ناتج الفصل التتابعي بواسطة ‎Blue-Sepharose‏ ‏مباشرة على عمود يألف ‎mpl‏ وفق ما جاء وصفه أعلاه؛ وتم إلى حد التجانس تتقية 20141153 ‎BIN‏ تتابعياً عن عمود الألفة تجاه ‎emp]‏ وذلك باستخدام عمود ‎C4-HPLC‏ تحت نفس ‎ag hall‏ المستخدمة بالنسبة ل 2011.332 ومن خلال ‎SDS-PAGE‏ ينفصل 3 المنقى في اثنين ‎٠‏ من النطاقات ‎bands‏ الأساسية ‎major‏ واثنين من النطاقات غير الأساسية +0100 وذلك بنسبة جزيئية تتراوح ما بين 6 - ‎17,٠٠١‏ (شكل رقم ‎(Yo‏ ‎mpl day, -٠‏ في الفئران ‎‘The Murine mplLigand‏ تم الحصول على قطعة من ‎DNA‏ تعادل منطقة التشفير ربيطة ‎mpl‏ البشرية؛ وذلك بواسطة ‎(PCR‏ كما تمت تنقية ‎gel‏ وتمييزه ‎labeled‏ في وجود كل من ‎2p-dATP‏ و٠0-007.‏ وقد ‎٠‏ استخدم هذا المسبار ‎probe‏ في مسح نسخ عددها ‎"٠١‏ من مجموعة ‎cDNA library‏ داخل كبد فأر في ‎AGT10‏ وقد تم عزل النسخة الفأرية (شكل رقم ‎oy‏ المتتاليات رقم ‎(VW OY‏ المحتوية على ‎٠‏ وليجة ‎Led sha insert‏ زوج قاعدي؛ وتم بعد ذلك تشكيلها في صورة متتالية؛ وكان ‎codon‏ ‏البادئ المفترض عند موضع ‎1١ = PA nucleotide‏ ضمن متتالية ملائمة ‎consensus sequence‏ لبدء الترجمة في الخلايا ال ‎٠ eukaryotic‏ ‎(Kozak, M.

J.Cell Biol., 108:229-241 [1989] Vo‏ وتقوم هذه المتتالية بتمييز إطار القراءة المكشوفة ‎open reading frame‏ ل ‎nucleotides ٠١١‏ ؛ مما يحدد منتج الترجمة ‎translation‏ الأولى ل ‎Yo‏ حامض أميني. وعلى جانب هذا الإطار الخاص بالقراءة المكشوفة يوجد ‎nucleotides ٠١‏ عند الموضع 0 4 ‎nucleotides Y£V‏ عند الموضع ‏ من لمتتالية غير المترجمة . وليس هناك نهاية طرفية ل ‎poly (A)‏ بعد المنطقة ؟ ‎+٠.‏ غير المترجمة ؛ مما يشير إلى احتمال عدم اكتمال النسخة ‎is not complete‏ 0006. وتعتبر النهاية

— ٠١“ - الطرفية "7 لمتتالية الأحماض الأمينية التي تم تحديدها منطقة عالية التتافر ‎hydrophobic‏ مع ‎cell)‏ ويحتمل أنها تمثل ببتيد إشاري ‎signal peptide‏ . ويشير تحليل الحاسب الآلي إلى موضع

NYY) ‏بين الوحدات البنائية‎ signal peptidase ‏للقطع بالببتيديز الإشاري‎ (Sas (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) ‏حامض أميني‎ 7١ ‏ناضح يتكون من‎ polypeptide ‏ويؤدي القطع عند هذا الموضع إلى توليد‎ © ‏لأسباب سيأتي وصفها فيما بعد).‎ mML2 ‏(أو‎ mML331 ‏تم التعرف عليها في صورة‎ ¢(35kDa)

V ‏محفوظة جميعها في متتالية بشرية؛ مع‎ cysteines ‏وتحتوي المتتالية على ؛ أحماض من‎ ‏منها © مواضع محفوظة في المتتالية البشرية.‎ N-glycosylation ‏مواضع محتملة لإدخال مجموعة‎ de sane ‏فإن جميع المواضع الممكن عندها إدخال‎ AML ‏ومرة أخرى» وكما هو الحال بالنسبة ل‎ ‎N-glycosylation ٠‏ تقع هنا عند منتصف النهاية الطرفية "©" للبروتين. ‏وبالمقارنة مع ‎ML‏ البشري كانت هناك هوية واضحة لكل من متتاليات ‎nucleotide‏ والأحماض الأمينية المستنتجة؛ وهذه الهوية تمت ملاحظتها في حيز ‎LalAlIEPO-domains‏ ب ‎ML‏ ومع ذلك فإنه عند ‎aligned‏ متتاليات الأحماض الأمينية المستنتجة في الإنسان مع ,11 في الفئران تكون ‎AME al‏ الفأرية منطقة لحذف ‎tetrapeptide deletion‏ بين الوحدات البنائية ‎١١١‏ ‎١‏ و4١٠١‏ وهذه تتعادل مع منطقة لحذف ‎nucleotide VY‏ بعد ‎٠١8 aia gall‏ لل ‎nucleotide‏ الذي يُرى في كل من ‎cDNA‏ في الانسان (انظر الجزء عاليه) والخنازير (أنظر الجزء أدناه). وبناء على ذلك تم فحص نسخ إضافية تكشف عن احتمال وجود أشكال متناظرة من .10 في الفتئران. وقد كانت هناك نسخة واحدة حملت مورث ‎FO‏ متتالية ‎polypeptide‏ أستنتج منها أحماض أمينية تحتوي على ‎LPLQ tetrapeptide‏ المفقود. ويعتقد أن هذا الشكل يمثل الطول الكامل ل ‎ML‏ في © الفئران؛ ويشار إليه هنا ب ‎mML‏ أو ‎-mML332‏ ويوضح شكل رقم ‎AE VV‏ ال ‎nucleotide‏

١١ ‏وتتكون نسخة‎ (V0 VE ‏(المتتاليات رقم‎ mML ‏والأحماض الأمينية المستنتجة بالنسبة ل‎ ‏وتحتوي على‎ Poly (A) ‏من الإزواج القاعدية تتبعها نهاية طرفية من‎ ٠47 ‏هذه من‎ cDNA © ‏قاعدة عند الطرف‎ ١74 ‏مط وعلى جوانبه 180160 توجد‎ ٠٠١168 ‏إطار للقراءة المكشوفة به‎ ‏غير مترجمة؛ و41 7 قاعدة عند الطرف “7 غير مترجمة. ويقع الكودون البادئ المفترض عند‎ ‏من النكليوتيد؛ ويقوم إطار القراءة المكشوفة يجمل مورث البروتين المحدد ل‎ ١50 -١ ‏الموضع‎ ٠ ‏حامض أميني وتمثل الأحماض الأحدى والعشرون الأولى منها أحماضاً تتتافر‎ Fo . secretion signal ‏بدرجة عالية مع الماء وتعمل بشكل محتمل كاشارة للإفراز‎ hydrophobic ‏وأخيراً تم عزل نسخة فأرية ثالثة وتشكيلها في صورة متتالية؛ ووجد أنها تحتوي على منطقة‎ isoform ‏ولذلك يقوم هذا الشكل الفأري المتتاظر‎ hML3 ‏المعادل ل‎ ١١١ ‏لحذف النكليوتيد‎ ‏مقارنة بين متتاليات الحامض الأميني المستنتج‎ (VA) ‏بالسيطرة على 003413 ويوضح شكل رقم‎ ٠

VA ‏لهذين الشكلين المتناظرين (المتتاليات رقم‎ ‏الفئران (إشكل‎ (AML ‏البشري‎ ML ‏ويقدر مجموع تطابق هوية متتالية الأحماض الأمينية بين‎ ‏بنحو 777 ؛ غير أن هذا التجانس غير موزع بانتظام. وتعتبر‎ (VY 6 ‏المتتاليات رقم‎ ٠9 ‏رقم‎ ‎VER - ١و ‏للمتتالية البشرية؛‎ Vor - ١ ‏(الأحماض الأمينية‎ EPO ‏المنطقة التي تميز حيز‎ (7A ‏(درجة تجانس قدرها‎ better conserved ‏الحفظ‎ Cua ‏الفأرية) هي الأفضل من‎ Adal ٠ ‏وقد تكون في‎ (homology ‏مقارنة بمنطقة النهاية الطرفية "كربوكسي" للبروتين (777 تجانس‎ ‏هو فقط الحيز المهم في النشاط البيولوجي للبروتين. ومما‎ EPO ‏ذلك أيضاً إشارة إلى أن حيز‎ ‏الحامض الأميني ثنائي القاعدة الموجودتان في‎ motifs ‏يدعو إلى الاهتمام أن من بين متوالتي‎ —VoY ‏(الموضع الباقي‎ EPO ‏مباشرة بعد حيز‎ ad ‏هناك فقط متوالية واحدة ثنائية القاعدة‎ 7 ‏في المتوالية البشرية؛ وأيضاً توجد في المتوالية الفأرية. ويتماشي ذلك مع الامكانية بأن‎ )١٠٠؛‎ ©

٠١# ‏بروتين أولى يخضع لعمليات تحلل بروتيني محدودة لتوليد ربيطة‎ ML ‏يمثل الطول الكامل‎ ‏قد يساعد في التخلص من‎ Arg-153-Arg154 ‏عن ذلك فإن التحلل البروتيني بين‎ Jay ‏ناضجة.‎ ‎-hML clearance coding ‏الصيغة الوراثية المحتوى على المتوالية الكاملة‎ Jil ‏وقد تم بشكل عرضي إيداع‎ ‏وقد أدت‎ .)١( ‏خلية كما جاء وصف ذلك في مثال رقم‎ YAY ‏إلى‎ mML ‏المشفرة ل‎ sequence ©

Ba/F3 ‏مع خلايا‎ *H-Thymidine ‏الأوساط المهيأة من تلك الخلايا إلى تحفيز وحث إندماج‎ mpl) ‏الفأرية أو البشرية؛ ولكنها لم تؤثر على سلالة الخلية الأبوية‎ mpl ‏والمعبرة وراثياً عن‎ ‏الفأرية المستنسخة تقوم بحمل مورث الربيطة الوظيفية التي‎ ML cDNA ‏ويشير هذا إلى أن‎ (less (mpl) ‏الفأري والبشري‎ ML ‏يمكنها تتشيط كل من مستقبل‎ : The Porcine mpl Ligan ‏في الخنازير‎ mpl ‏ربيطة‎ -١١ vy. ‏كما جاء وصف ذلك في مثال‎ RACE PCR ‏الخنازير بواسطة‎ AML (pML) cDNA J je ‏تم‎ ‏في الكلى وتم إعادة استتساخه‎ 5( ١47 ‏ل‎ 008 cDNA ‏وتم الحصول على ناتج‎ .)١“( ‏رقم‎ ‏في الخنازير‎ mpl ‏كما تم عمل متتاليات لعدة نسخ؛ ووجد أنها تحمل مورث ربيطة‎ © subcloned ‏(أو‎ PML ‏والتي تحتوي على 377 من وحدات الأحماض الأمينية المكونة ويشار إليها ب‎ ‏وهي التي تحتوي على نكليوتيد متتالية الأحماض الأمينية المستنتجة الموضحة في شكل‎ (PMLsy, ٠ .)١9 OA ‏(المتتاليات رقم‎ )٠١( ‏رقم‎ ‏يشفر بروتين به منطقة حذف من ؛ وحدات‎ PML2 ‏ومرة أخرى تم التعرف على شكل ثان وهو‎ ‏(المتتالية رقم‎ (YV) ‏وحدة حمض أميني ككل)؛ ويظهر ذلك في شكل رقم‎ YYA) ‏أحماض أمينية‎ ‏حذف‎ elit ‏أن الشكل الأخير مطابق ولكن‎ PML2 5 PML ‏وتظهر المقارنة بين متتالية‎ .)7١ (YY) ‏كما يظهر ذلك في شكل رقم‎ VE - ١١١ ‏المقابل للوحدات‎ QLPP ‏الببتيد الرباعي‎ ©

‎٠١١ =‏ — (المتتاليات رقم ‎(YY VA‏ وتقع مناطق حذف الأحماض الأمينية الأربعة المشاهدة في كل من ‎MLCDNA‏ الفأري والبشري في نفس الموضع الدقيق ضمن البروتينات التي تم تحديدها. وتشير المقارنة بين متتاليات الأحماض الأمينية المحددة ل ‎ML‏ الناضج في الإنسان والفئران والخنازير (شكل رقم ‎١4‏ متتاليات رقم ‎)٠8 OY ١‏ إلى أن نسبة التشابه هو ‎٠‏ 7727 بين الفأر والإنسان» و7768 بين ‎SU‏ والخنزير؛ و7779 بين الخنزير والإنسان. وهناك درجة من التجانس أكبر بكثير في منتصف النهاية الطرفية "أمينو" ل ‎ML‏ (مجال ‎EPO‏ المتجانس). وتتراوح نسبة تطابق هذا الحيز ما بين 88- 7484 بين أي نوعين؛ بينما بالنسبة لمنتصف النهاية الطرفية ‎carboxy”‏ " (حيز الكربوهيدرات ‎(carbohydrate domain‏ تتراوح نسبة التطابق ما ‎O—‏ ‎—0V‏ 717 فقط. وتمثل متتالية الأحماض الأمينية ثنائية القاعدة موضعاً للقطع البروتياز ‎protease‏ ‎cleavage ٠‏ ¢ وهذه موجودة عند النهاية الطرفية " ‎carboxyl‏ " لمجال تطابق ‎erythropoeitin‏ . ويتم حفظ تلك المتتالية بين ¥ أنواع عند هذا الموضع؛ كما يبدو ذلك في شكل رقم )14( (المتتاليات رقم 7 ‎(VA OY‏ وبالنسبة للموضع الثاني ثنائي القاعدة والموجود عند المواضع 745 و16 في المتتاليات البشرية فهو غير موجود في متتاليات الفئران أو الخنازير. وتحتوي متوالية ‎ML‏ ‏الفأرية وفي الخنازير على ؛ من أحماض ‎cysteines‏ ؛ وجميعها محفوظة في المتتالية البشضرية. ‎١‏ وهناك ‎١‏ مواضع ممكنة لإدخال مجموعة «11-817005718000 ضمن ربيطة في الفثران؛ و١‏ ضمن ‎ML‏ في الخنازير؛ منها © محفوظة في المتتالية البشرية. ومرة أخرى فإن جميع المواضع الممكنة لإدخال مجموعة ‎N-glycosylation‏ تقع هنا في منتصف النهاية الطرفية "©" للبروتين. ‎-٠‏ التعبير الوراثي ‎Expression‏ ل ‎TPO‏ وتتقيته من خلايا مبيض هامستر ‎Hamster‏ ‎:(CHO)‏

‎١١ -—‏ — تعرف الناقلات الوراثية المستخدمة في إدخال المعلومة الوراثية ‎CHO‏ بأسماء ‎pSV15.ID LL.

MLORF‏ (الطول الكامل أو ‎Js— ll) pSV15.ID.MLEPO-D 5 ¢(TPOs3,‏ المنشطر ‎truncated‏ أو ‎(TPOuss‏ ويوضح ‎JSS‏ رقم ‎(YY)‏ وشكل رقم ‎(Y£)‏ السمات المميزة لتلك ‎-plasmids‏ ‏© وقد تم وصف الإجراءات المتبعة في نقل المعلومة الوراثية وذلك في مثال رقم ‎L(Y)‏ وباختصار تم هنا الحصول على ‎cDNA‏ المقابل للإطار الكامل ‎TPO‏ الخاص بالقراءة المكشضوفة ‎open‏ ‎reading frame‏ ؛ وذلك بواسطة ‎«PCR‏ وتثمت أيضاً تتقية المنتج واستنساخه بين اثنين من مواضع القطع ‎Clal «Sall) restriction sites‏ ) في بلازميد ‎pSVISID.LL‏ للحصول على الناقل الوراتفي ‎.pSV15.ID.LL.MLORF‏ وهناك هيكل آخر مناظر لحيز ‎EPO‏ المتجانس؛ وهذا تم تحضيره ‎٠‏ - بنفس الطريقة باستخدام ‎sale‏ أولية عكسية (ل2001.58). وبالنسبة للهيكل النهائي للناقل المتشفر لحيز ‎EPO‏ المتجانس في ‎TPO‏ فيسمى بهيكل ‎.pSV15.ID.LL MLEPO-D‏ وقد تم تشكيل هذين الهيكلين في سلالة بواسطة 0008 وتم إدخال المعلومة في خلايا من مبيبض هامستر صيني ‎(CHO-DP12)‏ (راجع براءة الاختراع الأوروبية رقم 07747 المنشورة في ‎١١‏ ‏مارس عام 989١)؛‏ وذلك بطريقة الاستشراد الكهربائي ‎electroporation‏ . وقد أجريت تلك ‎١‏ _العملية على ‎"٠١‏ خلية في جهاز ‎Yo) BRL‏ فولت ‎7١ «Volts‏ ميللي فاراد 007 ؛ سعة منخفضة ‎(low capacitance‏ وذلك في وجود ‎٠١‏ أو ‎Yo‏ أو 00 ملجم من 0178 كما جاء وصفه في: ‎Andreason, G.L.

J.

Tissue Cult.

Meth. 15, 56 (1993).‏ وبعد يوم من نقل العدوى تم تقسيم الخلايا في أوساط ‎DHFR‏ الانتقائية (نسبة عالية من الجلوكوز ‎DMEM-F12 & ٠‏ بنسبة ‎tO‏ +0 بدون ‎Y 5 ¢ glycine‏ ميللي مولار من ‎Y 5 ¢ glutamine‏ = 70

‎٠١# =‏ — مصل دم من عجول في مراحلها الجنينية بعد تعرض المصل لعملية ديلزة)؛ وبعد ‎-٠١‏ 0 يوم تم نقل مستعمرات فردية إلى أطباق سعة 976 تجويف وسمح لها بالنمو إلى حد الإلتقاء ‎confluency‏ نقطة واحدة. وقد تم تقييم الصيغة الوراثية ل ‎MLys3;‏ أو دما في الأوساط المهيأة من تلك النسخ؛ وذلك باستخدام اختبار تكاثر ‎Ba/F3-mpl‏ الذي جاء وصفه في مثال رقم ‎.)١( ٠‏ ويصف مثال رقم ‎)٠١(‏ عملية لتنقية وعزل ‎TPO‏ من وسط استزراع خلايا ‎CHO‏ المحصدة ‎harvested‏ وباختصار يتم وضع سائل ‎fluid‏ وسط استزراع الخلايا المحصدة ‎(HCCF)‏ على عمود ‎(Phamacia) Blue Sepharose‏ بنسبة قدرها حوالي ‎٠٠١‏ مل من 11007 لكل لتر من الراتنج ‎resin‏ وبعد ذلك يتم غسل العمود بكمية من محلول منظم تعادل ‎=F‏ ه مرات قدر حجمه؛ ويتبع ذلك غسل بمحلول منظم بكمية من المحلول تعادل ‎=F‏ 0 مرات قدر حجم العمودء ويحتوي هذا المحلول المنظم على ‎urea‏ (2.014). ويجرى الغسل ‎elution‏ التتابعي ل ‎TPO‏ ‏بكمية من المحلول المنظم تعادل © = © مرات قدر حجم العمود؛ ويحتوي المحلول المنظم هنا على ‎urea‏ (2.014) و ‎NaCI‏ (1.014). وتوضع مصب المادة الناتجة عن الغسل التتابعي من ‎Blue Sepharose‏ والمحتوى على ‎TPO‏ على ‎١‏ عمود ‎Sepharose‏ يحتوي على لكتين جنين التقمسح ‎Wheat Germ‏ ‎(Pharmacia) Lectin‏ وهذا تتم معادلته في محلول منظم للغسل التتابعي يحتوي على ‎Blue‏ ‎Sepharose‏ بنسبة تتراوح ما بين ‎٠١ = A‏ مل من ‎Blue Sepharose‏ لكل ‎١‏ مل من الراتنج ‎resin‏ ‏وبعد ذلك يتم غسل العمود بكمية من محلول منظم ‎١‏ - “ مرات قدر حجم العمود لمعادلته» م يجرى الغسل التتابعي ب ‎TPO‏ بكمية من محلول منظم تعادل ¥ - 0 مرات قدر حجم العمود؛ ‎٠‏ وهذا المحلول يحتوي على ‎M) Nacetyl-D-glucosamine 5 (2.0 M)urea‏ 0.5).

‎٠١١ -‏ — ويتم بعد ذلك تحميض ‎acidified‏ 30 الفصل التتابعي لمادة لكتين جنين القمح والمحتوى على ‎(TPO‏ وتضاف إليه ‎Cis‏ وصولاً إلى تركيز نهائي قدره 4 ‎est‏ ويوضع مجموع ‎pool‏ الناتج على عمود الطور المنعكس ‎reversed phase‏ ,© الموازن في ‎TFA 700١‏ مع 0.654 مظيرن بتحميل 1000 يتراوح تقريباً ما بين ‎pale ١.5 - ١,"‏ بروتين لكل مل من الراتنج ‎resin‏ ‏© ويتم فصل البروثين تتابعياً على مرحلتين في ‎acetonitrile‏ ذو تدرج خطي ‎linear gradient‏ يحتوي على 70.1 ‎TFA‏ و05 7 ‎«CoE‏ ويتم عمل مجموع ‎pool‏ على أساس ‎SDS-PAGE‏ ‏ويتم بعد ذلك فصل مجموع ‎Cs pool‏ تتابعياً وترشيحه مرتين ‎diafilitered‏ مقابل حوالي > أحجام من محلول منظم على غشاء فائق الترشيح ‎ultrafiltration‏ من نوع ‎AmiconYM®‏ أو ما شابه ذلك ذو وزن جزيئي يتراوح ما بين ‎٠٠٠٠١‏ = 0.0060" دالتون ‎Dalton‏ . وقد تتم بعد ذلك مباشرة ‎٠‏ معالجة المادة الناتجة عن الترشيح الثنائي؛ أو تركيزها بواسطة الترشيح الفائق. وعادة ما يتم ضبط وتعديل الراشح الثنائي/ المركز إلى تركيز نهائي قدره 0.01 ,7 من ‎Tween-80"‏ ‏وتوضع جميع أو جزء من المواد الناتجة عن الترشيح الثنائي/ التركيز والمكافئة ل ¥ = 70 من الحجم المحسوب للعمود على عمود من نوع ‎(Pharmacia) Sephacryl®S-300HR‏ موزون في محلول منظم يحتوي على 780.01 ‎(Tween-80‏ وأجريت بعد ذلك تنقية بالكروماتوجراف. ويتم ‎١‏ بعد ذلك دمج ‎TPO‏ المحتوي على الأجزاء الخالية من التجمعات ‎aggregates‏ ومنتجات التحلل البروتيني ‎proteolytic degradation‏ ؛ وذلك في مجموع ‎pool‏ على أساس ‎«SDS-PAGE‏ مع ترشيح هذا ‎hglfLu‏ وتخزينه تحت درجة ؟ ‎A=‏

‎١٠١ -‏ ‎١‏ - طرق تحويل 28 وحث تخليق ‎TPO Inducing‏ كائن ديق ‎Microorganism‏ وعزل وتنقية وتكرار طي ‎Refolding‏ 0 المتكون في هذا الكائن: جاء في مثال رقم ‎(YV)‏ وصف تفصيلي لبناء الناقلات ‎vectors‏ الورائية ل ‎TPO‏ في بكتيريا ‎E-‏ ‎coli‏ وباختصان فقد تم تصميم جميع ‎«pMP57 3 11041 cpMP151 5 «(pMP21 5 plasmids‏ ‎pMP2025 ٠‏ وذلك للتعبير وراثياً عن ال ‎٠٠96‏ حامض أميني الأولى إلى اليمين ‎down‏ ‏0 لقائد ‎leader‏ صغير تتفاوت بين الهياكل المختلفة. وتعمل القيادة 35 هذه على توفير مستوى عال من بدء الترجمة والتتقية السريعة. ويتم تصميم ‎«pMP210-1 plasmids‏ 3-8 21- 2+ 24 © 25- وذلك لإظهار الصيغة الوراثية ل ‎Vor‏ حامض أميني الأولى في ‎TPO‏ إلى اليمين ‎methionine — downstream‏ البادئ» وهذه تختلف فقط من حيث استخدام ‎codon ٠‏ للأحماض الأمينية الستة الأولى في ‎«TPO‏ بينما يكون ‎pMP251 plasmid‏ عبارة عن مشتق ل ‎pMP210-1‏ يتم فيه تمديد النهاية الطرفية ‎TPO __ carboxy‏ بواسطة اثنين من الأحماض الأمينية. وتقوم جميع ‎plasmids‏ أعلاه بإنتاج مستويات عالية من التعبير ‎expression‏ ‏الوراثي ل ‎Jala TPO‏ خلايا ‎E.Coli‏ وذلك عند إدخال محفز الثربتوفان ‎.tryptophan promoter‏ ‎(Yansura, D.

G. et.

AL Methods in Enzymology ( Goeddel, D.

V., Ed.) 185:54-60,‏ ‎Academic Press, San Diego [1990]). Vo‏ وبالنسبة لل ‎pMP172 «pMP1 plasmids‏ فهي عبارة عن مواد وسيطة لعمل ‎plasmids‏ ‏المذكورة اعلاه والخاصة بإظهار الصيغة الوراثية ل ‎TPO‏ داخل الخلايا. وقد استخدمت ‎plasmids‏ عاليه والخاصة بالتعبير عن الصيغة الوراثية ل ‎TPO‏ وذلك لترجمة ‎E.Coli transform‏ بطريقة الصدمة الحرارية ‎cheat shock‏ وبغير ذلك من الطرق التي جاء ‎lena ©‏ في مثال رقم ‎(YY)‏

‎١١١ -‏ - ‎(Mandel.

M. et al.

J.

Mol 3101., 53:159-162, [1970])‏ وباختصار فإن الخلايا المتحولة قد تم إنمائها أولاً تحت درجة حرارة ”م إلى أن وصلت الكثافة الضوئية ‎Teo ) optical density‏ نانومتر ‎(nm‏ لوسط الاستنبات إلى حوالي ‎٠ 7-١7‏ وبعد ذلك تم تخفيف وسط الاستنبات. وبعد النمو مع التهوية تمت إضافة الحامض؛ ثم سمح لوسط الاستنبات © باستمرار النمو مع التهوية ‎aeration‏ لمدة ‎١١‏ ساعة أخرى؛ وبعدها تم حصد الخلايا بطريقة الطرد المركزي. وفي الأمثلة ‎(YY‏ 77 تم وصف إجراءات الفصل والتنقية والطي المتكرر ع601410: لإنتاج ‎TPO‏ ‏البشري النشط من الناحية البيولوجية أو أجزاء منه؛ وقد استخدم هنا في استرجاع أي من متغيرات ‎TPO‏ بما في ذلك الأشكال المتمددة ذات النهاية الطرفية "7" أو '"©". وهناك ‎Sled yal‏ ‎٠١‏ أخرى مناسبة لإجراء الطي المتكرر ل ‎TPO‏ الناتج عن الهندسة الوراثية ‎recombinant‏ أو ‎TPO‏ ‏البنائي ‎synthetic‏ « وهذه الإجراءات جاء وصفها في براءات الاختراع الآتية التي تصف بشكل عام عملية الاسترجاع والطي المتكرر لبروتينات مختلفة ناتجة عن الهندسة الوراثية ومعبر عنها ‎i‏ شكل غير ذائب في ‎E.Coli‏ ‎Builder et at., U.S Patent 4.511,502; Jones et al., U.S.

Patent 4,512.922; Olson U.S.‏ ‎Patent 4.518,526 and Builder ef al.. U.S.

Patent 4,620,948; Vo‏ أ- استرجاع ‎TPO‏ غير الذائب ‎Recovery of non-soluble TPO‏ : يتم زراعة ‎fermented‏ كائن دقيق ‎E-Coli Jie‏ المعبر وراثياً عن ‎TPO‏ والمشفر بأي ‎plasmid‏ ‏مناسب»؛ وذلك في ظروف يتم فيها وضع ‎TPO‏ في أجسام غير ذائبة وقابلة للانكسار ‎refractile‏ ‎bodies‏ . ويتم بشكل اختياري ‎LAY Jue‏ أولا في محلول منظم ‎disruption buffer‏

‎١١١ -‏ - لتكسير الخلايا ؛ وبصفة نمطية يتم إعادة تعليق ‎٠٠١‏ جرام من الخلايا في محلول ذو حجم يعادل حوالي ‎٠١‏ أحجام المحلول المنظم (أي ‎٠١‏ ميللي مولار تريس ‎Tris‏ ؛ 05 ‎a‏ مولار = ‎EDTA‏ ورقم هيدروجيني ‎pH‏ قدره ‎A‏ )؛ وذلك بواسطة مجانس ‎homogenizer‏ من نوع ‎Polytron”‏ مع إجراء طرد مركزي للخلايا بسرعة ‎٠٠٠١‏ لمدة ‎Yr‏ دقيقة. ويتم بعد ذلك حل ‎lysed ©‏ الخلايا باستخدام أي من الطرق ‎Jie Lali)‏ صدمة الاحتلال التركيزي ‎tonic shock‏ ؛ أو المعالجة بالموجات الصوتية ‎sonication‏ ؛ أو التدوير بالضغط ‎pressure cycling‏ ؛ أو بطرق المعالجة الكيميائية أو الإنزيمية. ‎Jey‏ سبيل المثال يمكن ‎sale)‏ تعليق حبيبات ‎Uy ural WAN‏ المذكورة عاليه وذلك في ‎٠١‏ أحجام أخرى من المحلول المنظم ‎padi wal)‏ لتحليل ‎disruption‏ ‏الخلايا بواسطة مجانس؛ ثم يمر بعد ذلك معلق ‎LAN‏ خلال محلل ‎Disrupter‏ خلايا ‎LH‏ (من ‎٠‏ شركة ‎«(LH Inceltech‏ أو خلال مميع دقيق ‎Microfluidizer‏ (من شركة ‎Micofluidics)‏ ‎«(International‏ وفق توجيهات الشركة المصنعة. ويتم بعد ذلك فصل المادة الجسيمية المحتوية على ‎TPO‏ عن الطور السائل؛ ثم تغسل اختيارياً بسائل مناسب. وعلى سبيل المثال يمكن إجراء عملية طرد مركزي على المادة الناتجة عن حل الخلايا وذلك بسرعة 500860 ‎X‏ ع لمدة ‎Ye‏ دقيقة؛ ثم يعاد تعليقها وتخضع اختيارياً لعملية طرد مركزي مرة ثانية لعمل قرص ‎pellet‏ من جسم 1 مغسول قابل للانكسار ‎body‏ 76586016 ؛ وهذا القرص يمكن أن يستخدم مباشرة أو يخزن اختيارياً في حالة تجمد تحت درجة - ‎Ve‏ م ‎Sia‏ ‏ب - إذابة وتنقية ‎TPO‏ أحادي الوحدات ‎Monomeric‏ : تتم بعد ذلك إذابة ‎TPO‏ غير المذاب في قرص الجسم قابل للانكسار ‎refractile body‏ ؛ وذلك باستخدام محلول منظم للإذابة يحتوي على مادة مسببة للتفكك ‎cchaotropic‏ ويتم ضبطه عند رقم ‎٠‏ هيدروجيني ‎(PH)‏ قاعدي؛ ويحتوي مادة مختزلة لزيادة منتج ‎TPO‏ أحادي الوحدات. ومن مواد

‎١١٠١“ -‏ - التفكك القياسية تلك التي تضم ‎guanidine-HCI urea‏ ¢ و ‎sodium thiocyanate‏ ¢ ويفضل من تلك المواد ‎guanidine HCI‏ . وعادة ما تتراوح مادة التفكك ما بين ؛ - 9 مولار ويفضل ما بين ‎alg.

Yea 6 - >‏ الحفاظ على الرقم الهيدروجيني ‎(pH)‏ لمحلول الإذابة المنظم وذلك عند مستوى يتراوح ما بين ‎vo‏ 4,5 درج والأفضل ما بين ‎A‏ -1 درجة؛ والأكثر تفضيلاً 4 مه درجات. كما يفضل أيضاً أن يحتوي محلول الإذابة المنظم على مادة للاختزال تساعد في تكوين الشكل أحادي الوحدات من ‎TPO‏ والمواد المختزلة المناسبة هي تلك الي تضم مركبات تحتوي على ‎free thiol (RSH)‏ » ومن الأمثلة ‎Lull‏ على ذلك ‎dithiothreitol (DTT)‏ « و ‎dithioerythritol (DTE)‏ + و ‎mercaptoethanol‏ « و ‎glutathione (GSH)‏ » و ‎cysteamine‏ + و ‎cysteine‏ ¢ ويفضل من هذه المواد ‎dithiothreitol (DTT)‏ . وقد يحتوي محلول الإذابة ‎a—aiall‏ ‎٠‏ وبشكل اختياري على مادة مؤكسدة بدرجة طفيفة (مثل الأكسجين الجزيئي ‎molecular oxygen‏ ( مع ‎salt‏ 5021016 لتكوين ‎TPO‏ أحادي الوحدات عن طريق تحلل 90106. وفي هذا النموذج فإنه يتم مؤخراً إعادة طي 700 ‎sulfitolysis‏ الناتج من وجود محلول أكسدة واختزال منظم ‎Ue‏ ‎GSH/GSSG‏ لتكوين ‎TPO‏ مطوي بشكل ملائم. وعادة ما تجرى عملية تنقية أخرى على بروتين ‎TPO‏ باستخدام الطرد المركزي - مثلاً = ‎١‏ وكروماتوجراف ترشيح الجل؛ والكروماتوجراف العمودي ذو الطور المتعكس ‎reversed phase‏ ‎-column chromatography‏ وعلى سبيل الإيضاح فإن الإجراءات الآتية قد أدت إلى إنتاج محصول مناسب من ‎TPO‏ أحادي الوحدات. يتم هنا إعادة تعليق قرص الجسم القابل للانكسار في حوالي © أحجام بالوزن من محلول إذابة منظم ‎٠١(‏ ميللي مولار تريس ‎(Tris‏ رقم هيدروجيني ‎A= pH‏ مع 4 - ‎١‏ مولار ‎٠‏ من الجوانيدين؛ ‎You‏ ميللي مولار من ‎(DTT‏ ويتم التقليب لمدة ‎١‏ - “ ساعات أو طوال فترة

- ١١٠4 -

الليل تحت درجة حرارة قدرها ؛ "م لتفعيل إذابة بروتين ‎TPO‏ ويمكن أيضاً الاستفادة من تركيزات عالية من اليوريا )1 - ‎A‏ مولار)؛ ولكنها تؤدي بصفة عامة إلى إنتاج أقل نوعاً ما مقارناً به في ‎Alla‏ الجوانيدين. وبعد الإذابة تجرى عملية طرد مركزي للمحلول بسرعة ‎٠2000‏ ‏" ع ‎Vo Saal‏ دقيقة لإنتاج مادة طافية رائقة ‎superuatent‏ تحتوي على بروتين ‎TPO‏ مفكك ‎denatuned‏ أحادي الوحدات. وبعد ذلك تجرى معالجة كروماتوجرافية على المادة الطافية باستخدام عمود لترشيح الجل من طراز 5006:0200 ‎X 7,١ Pharmacia)‏ ١٠سم)‏ بمعدل تدفق ‎flow‏ قدره 7 مل/ دقيقة؛ مع غسل ‎elution‏ البروتين تتابعياً بواسطة ‎Yo‏ ميللي مولار من ‎Na phosphate‏ تحت رقم هيدروجيني قدره > درجات باستخدام ‎٠١‏ ميللي مولار من ‎DTT‏ ‏ويجرى عمل تجميع ‎pool‏ من أجزاء تحتوي على بروتين ‎TPO‏ المفكك أحادي الوحدات والذي ‎٠‏ يفصل تتابعياً بكمية تتراوح ما بين ‎Yor ١٠١‏ مل. وتتم 4 بروتين 170 في عمود ,© ذو طور منعكس ‎C4 reversed phase column‏ شبه تحضيري ‎٠١ XY)‏ سم ‎((VYDAC‏ وتوضع العينة ‎Janay‏ © مل/ دقيقة على عمود معاير في 7001 ‎(trifluoroacetic acid) TFA‏ مع ‎1٠١‏ ‎acetonitrile‏ .ويتم فصل البروتين تتابعياً بمستوى خطي متدرج من ‎acetonitrile‏ (0 10-7 في ‎٠‏ دقيقة)ء بينما البروتين المختزل المنتقى يتم فصله بشكل تتابعي عند نسبة من ‎acetonitrile‏ ‎yo‏ قدرها ‎75٠‏ تقريباً. وتستخدم هذا المادة في عملية ‎sale)‏ الطي ‎refolding‏ المتكرر للحصول على

شكل مختلف من ‎TPO‏ النشط من الناحية البيولوجية.

ج- إعادة الطي ‎TPO refolding‏ لتوليد الشكل النشط من الناحية البيولوجية:

بعد الإذابة والتنقية الإضافية ل ‎TPO‏ يتم الحصول على الشكل النشط بيولوجياً عن طريق إعادة الطي ل ‎TPO‏ المتفكك أحادي الوحدات؛ وذلك في محلول أكسدة واختزال منظم. ونظراً للقوة © العالية ل ‎TPO‏ (يحدث تحفيز نصف أقصى في اختيار ‎Ba/F3‏ عند حوالي ¥ بيكوجرام / مل

— ١٠# -

‎«(pg/ml‏ فإنه من غير الممكن هنا الحصول على مادة نشطة بيولوجياً باستخدام العديد من حالات المحاليل المنظمة أو المنظف ‎detergents‏ أو حالات الأكسدة والاختزال ‎redox conditions‏ المختلفة. ومع ذلك فإنه في معظم الحالات يتم الحصول على كمية صغيرة من المادة التي أخضعت لطي ملائم (أقل من + )1( وبالنسبة لعمليات التصنيع التجارية يفضل أن يكون ناتج م إعادة الطي ‎7٠١‏ على الأقل؛ والأكثر تفصيلاً أن تتراوح تلك النسبة ما بين +7*- 050 والمفضل بشكل خاص أن تزيد تلك النسبة عن ‎٠‏ 75. وهناك العديد من المنظفات المختلفة التي وجد أنها

‏مناسبة لإنتاج على الأقل بعض من المادة المطواة بشكل ملائم؛ وهذه المنظفات تشتمل على: ‎Triton X-100 (Trade Mark) dodecyl-beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosyl‏ ‎(Trade Mark) Tween 20 and Tween 80, Ziwittergent 3014 .‏ ‎٠‏ ومن بين هذه ‎of gall‏ يفضل بشكل خاص طائفة ‎(CHAPSO 5 CHAPS) CHAPS‏ التي وجد أنها تؤدي أفضل أداء في تفاعل ‎Bale)‏ الطي وتحد من تكتل البروتين أو تكون ‎disulfide‏ غير المرغوب. ويفضل وبشكل خاص استخدام مستويات من ‎CHAPS‏ تزيد عن ‎ad.)‏ كان ‎sodium chloride‏ مطلوباً ‎J peas‏ على ‎lef‏ ناتج؛ وذلك بمستويات مثالية تتراوح ما بين ‎0,١‏ - 1. ويفضل وجود ‎١( EDTA‏ - © ميللي مولار) في محلول الأكسدة والاختزال المنظم؛ ‎١‏ وذلك للحد من التأكسد والتكتل المحفز بواسطة الفلزات المعدنية ‎metal-catalyzed‏ والقي تمت مشاهدتها في بعض المستحضرات. وقد أدى استخدام ‎Glycerol‏ بتركيزات تزيد عن 219 إلى إنتاج حالات مثلى لإعادة للطي. وللحصول على الحد الأقصى من المنتج كان من الضروري توافر أزواج من مواد الأكسدة والاختزال في محلول منظم يحتوي على كل من ‎thiol‏ العمخوي المتأكسد و ‎thiol‏ العضوي المختزل (8517). وتشتمل أزواج الأكسدة والاختزال المناسبة على : ‎glutathione (GSH) 5 « mercaptoethanol ٠٠‏ ¢ و ‎cysteamine‏ » و ‎cysteine‏ وأشكال تلك المواد

‎١١٠١ -‏ - المتأكسدة المناظرة. وبالنسبة لأزواج التأكسد والاختزال المفضلة فهي ‎glutathione(GSH)‏ « ‎oxidized glutathione(GSSG)‏ أو ‎Ll .cysteine - cystine‏ أزواج التأكسد والاختزال الأكثر تفضيلاً فهي ‎oxidized glutathione(GSSG) « glutathione(GSH)‏ وبصفة عامة تم الحصسول على كمية أكبر من النواتج عندما كانت النسبة المولارية للعضو المتأكسد في زوج الأكسدة ‎٠‏ والاختزال مساوياً أو يزيد عن العضو المختزل في هذا الزوج. وقد كان الرقم الهيدروجيني ‎(PH)‏ ‏الأمثل لعملية ‎ale]‏ الطي لمتغيرات ‎TPO‏ يتراوح هنا ما بين 7,5- 4 درجات. كما تم تحمل المذيبات العضوية ‎ethanol Jia‏ و ‎methanol acetonitrile‏ عند تركيزات تتراوح ما بين ‎١٠ -٠١‏ أو أقل؛ بينما أدت زيادة مستويات المذيبات العضوية إلى أشكال مطواة بشكل غير ملائم. وتعتبر المحاليل المنظمة 5 و ‎phosphate‏ مفيدة بوجه عام؛ كما أدى التحضين تحت ‎٠‏ درجة حرارة قدرها ؛ "م إلى إنتاج مستويات أعلى من ‎TPO‏ المطوي بشكل ملائم. وقد أدت عملية إعادة الطي إلى إنتاج ‎4٠0‏ - 710 (على أساس كمية ‎TPO‏ المختزلة والمتحللة والتي تم استخدامها في تفاعل إعادة الطي)؛ وهذه النسبة تعد نمطية بالنسبة لمستحضرات ‎TPO‏ ‏التي ثمت تتقيتها خلال ‎Aa je‏ ,© الأولى. ويمكن الحصول على مادة نشطة عندما تكون هناك مستحضرات أقل من حيث النقاء (أي تستخدم مباشرة بعد الفصل التتابعي على عمود ‎Superdex‏ ‎٠‏ 200 أو بعد الاستخلاص الأولى للجسم القابل للانكسار)؛ رغم أن المنتج يكون أقل عند مستويات أقل تركيزاً من حيث الترسيب والتداخل مع بروتينات غير ‎TPO‏ أثناء عملية ‎sale]‏ ل ‎.TPO‏ ‏وحيث أن ‎TPO‏ يحتوي على؛ وحدات بنائية من ‎cysteine‏ فإنه يمكن هنا توليد ' صور مختلفة من ‎disulfides‏ لهذا البروتين: ‎٠‏ - الصورة رقم ‎disulfide :)١(‏ بين وحدات بنائية ‎١ cysteine‏ - ؛ و7 - 2

‎١١٠١7 -‏ الصورة رقم (7): ‎disulfide‏ بين وحدات بنائية ‎YX - ١ cysteine‏ - 4 الصورة رقم (7): ‎ediflusid‏ بين وحدات بنائية ‎١ cysteine‏ - و7١‏ - 4. وأثناء الكشف الأولى لتحديد حالات إعادة الطي تم فصل العديد من القمم المختلفة المحتوية على بروثين ‎TPO‏ وذلك بواسطة كروماتوجراف ‎Cs‏ ذو الطور المنعكس . وقد كانت هناك قمة واحدة هه فقط ذات نشاط بيولوجي جوهري حسب ‎sald)‏ اختبار ‎Ba/F3‏ وبالتالي فإن حالات إعادة الطي قد ‎clea‏ مثالية لإنتاج هذا الشكل بالصورة الأفضل ؛ وفي هذه الظروف والحالات كانت الصور ذات الطي المشوه تمثل نسبة أقل من ‎7/7١ -٠١‏ من مجموع ‎TPO‏ أحادي الوحدات والمتحصسل عليه في خطوة الإذابة. وقد تم تحديد نمط ‎disulfide‏ بالنسبة ل ‎TPO‏ النشط من الناحية البيولوجية؛ وذلك عند قيمة ‎٠‏ تتراوح ما بين ‎١‏ - ؛ و؟ - ¥ عن طريق مطياف الكتلة ‎mass spectrometry‏ وتوالي البروتين ‎protein sequencing‏ » وهنا تم ترقيم ال ‎cysteine‏ بشكل تتابعي بدءاً من النهاية الطرفية "أمينو". وقد كان نمط الترابط التقاطعي ‎cross-linking pattern‏ لل ‎cysteine‏ متماشياً مع نمط الترابط المعروف في ‎disulfide‏ بالنسبة لجزء ‎wrythropietin‏ ذو العلاقة. د - النشاط البيولوجي ل ‎TPO‏ المصنوع بالهندسة الوراثية ‎recombinant‏ 53 تم إخضاعه ‎١٠‏ لعملية إعادة الطي : ثبت أن ل ‎TPO‏ المعاد طيه والمنقي نشاط في الاختبارات التي أجريت على جسم الكائن الحسي وفي المختبر ‎In vitro‏ وعلى سبيل المثال فإنه في اختبار ‎Ba-F3‏ فإن التحفيز نصف ‎١‏ لأقصسى لاندماج الثيميدين مع خلايا ‎Ba/F3‏ بالنسبة ل ‎(Met-1 1-153) TPO‏ قد تم الحصول عليه عد قيمة قدرها 7,7 بيكوجرام / مل )¥ بيكومولار) ‎٠‏ وفي ‎ELISA‏ الذي أساسه مستقبل ‎receptor‏

- اا - ‎mpl‏ حدث النشاط نصف الأقصى عند قيمة قدرها ‎٠,9‏ نانوجرام/ مل )0 ‎VY‏ بيكومولار). وفي الحيوانات العادية وتلك التي تم فيها كبح النخاع الشوكي عن طريق اشعاع - ‎near - lethal x‏ ‎radiation‏ شبه مميت بأشعة ‎"x"‏ فإن ‎TPO‏ المعاد طيه )1-153 ‎(Met-1‏ كان له نشاط عال (لوحظ النشاط عند جرعات قليلة تصل فقط إلى ‎٠0‏ نانوجرام/ فأر) لتحفيز إنتاج صفائح دموية جديدة. ‎٠‏ وقد لوحظ أن هناك نشاط بيولوجي مماثل لأشكال أخرى من ‎TPO‏ بعد إعادة طيها ‎Gis‏ ‏الإجراءات التي جاء وصفها عاليه (أنظر الأشكال رقم 076 ‎(YA YT‏ 6- طرق قياس نشاط تكوين الثرومبين ‎‘thrombopoietic actity‏ يمكن قياس إنتاج الصفاءح الدموية وذلك في اختبارات مختلفة تشتمل على اختيار الربيطة 3 الذي جاء وصفه في مثال رقم (١)؛‏ واختبار تكوين الصفائح الدموية في الفثران؛ واختبار ‎٠‏ حث ‎antigen‏ على سطح خلايا الصفائح الدموية مقاساً بالاختبار المناعي لمضاد الصفائح الدموية ‎alias) antiplatelet inmunoassay‏ ملتتمتآم6) بالنسبة لسلالة خلايا ‎megakaryoblastic‏ الخاصة بسرطان الدم في الإنسان ‎(CMK)‏ (راجع 184-190-1989 :72 ‎Sato et al, Brit.

J.

Heamatol.‏ وأيضاً اختبار تكوين خلايا ‎CMK‏ في معلق سائل؛ وهو الاختبار المذكور في مثال رقم ؛)؛ واختبار حث ‎polyploidization‏ في ‎LA‏ من ‎(DAM) megakaryocytes {Dw‏ (راجع ‎Ogura et‏ ‎al, Blood 72 (1): 49-60-1988 ٠‏ ). إن نضج خلايا ‎megakaryocytes‏ من ‎WA‏ غير ناضجبة وغير مولدة للحامض النووي ‎DNA‏ وصولاً إلى خلايا يمكن تمييزها من الناحية المورفولوجية ‎morphologically‏ هي عملية تشتمل على ظهور ‎antigen‏ على غشاء سينوبلازمي عضوي ‎(GPILIIL)‏ وتحرر الصفائح الدموية حسب ما جاء وصفه في خلفية هذا الاختراع. ويتوقع أن يقوم المحفز النوعي ‎ADL‏ (مثل ربيطة ‎(mpl‏ والخاصة بنضج خلايا ‎megakaryocytes‏ بحث ‎x.‏ البعض على الأقل من تلك المتغيرات في خلايا غير ناضجة؛ مما يؤدي بالتالي إلى تحرير

- ١١١ -

الصفائح الدموية والتخفيف من ‎Alla‏ نقص الصفائح الدموية. وهكذا تم تصميم اختبارات لقياس انبثاق تلك المتغيرات في سلالات غير ناضجة من خلايا ‎megakaryocytes‏ مقل خلايا ‎CMK‏ ‎-DAMI‏ ويقيس اختبار ‎CMK‏ (مثال رقم ؛) ظهور الدليل النوعي ‎marker‏ للصفائح الدموية م1 واختفاء الصفائح الدموية. أما اختبار ‎DAMI‏ (مثال رقم 10( فهو يقيس تضاعف © غلا ‎endoreplication‏ الداخلي؛ ذلك لأن زيادة درجة التكرار الكروموسومي تعد ‎Ma‏ على وجود خلايا ‎megakaryocytes‏ الناضجة. لقد كان لخلايا ‎megakaryocytes‏ التي تم التعرف عليها قيم للتكرار الكروموسوي قدرها ‎32N 167 SN AN 2N‏ الخ. وأخيراً كان اختبار الصفائح الدموية في جسم الفئران (مثال رقم ‎(V1‏ مفيداً في إثبات أن تناول مركب الاختبار (ربيطة ‎(mpl‏

يؤدي إلى زيادة أعداد الصفائح الدموية.

‎٠‏ وقد أجرى أثنان من الاختبارات الإضافية في المختبر لقياس نشاط ‎TPO‏ كان الاختبار الأول هو تنشيط مستقبل الكيناز ‎(KIRA) ELISA‏ وفيه تم إبخال معلومة ‎mpl-Rse‏ الهجينة الجينية ‎chimera‏ خلايا ‎CHO‏ ؛ وتم قياس ‎phosphorylatlon Rse‏ بواسطة فسفرة التيروسين ‎tyrosine‏ ‎phosphorylation‏ وذلك باستخدام ‎ELISA‏ بعد تعرض الجزء ‎mpl‏ من مركبات الهجينة الوراتية ‎chimera‏ ربيطة ‎mpl‏ (أنظر مثال رقم ‎(VV‏ وفي الاختبار الثاني المؤوسس على 21158 والذي

‎١‏ فيه تحتوي شرائح ‎ELISA‏ على طبقة من اجسام مضادة من الآرانب من النوع المضاد لل ‎mpl-IgG‏ البشري والذي يرتبط بدوره بالمستقبل البشري المهجن ورائياً ‎mpl-lgG‏ والذي يرتبط بدوره بربيطة ‎mpl‏ المراد قياسها . وقد استخدم الجسم المضاد عديد الانتساخ ‎polyclonal‏ ‎antibody‏ في الأرانب بعد معالجته بال ‎biotinylated‏ والمهياً ضد ربيطة ‎(TPO 155) mpl‏ وذلك للكشف عن ربيطة ‎mpl‏ ؛ وتم القياس هنا باستخدام ‎streptavidin-peroxidase‏ كما جاء

‎AA ‏وصف ذلك في مثال رقم‎ ٠

‎AY. -—‏ — ‎Yo‏ الاستجابة البيولوجية في جسم الكائن الحي ‎J‏ عادية وأخرى تعرضت لإشعاع ‎X irradiated‏ بجرعة شبه مميتة ‎sublethally‏ وتمت معالجتها ب ‎"TPO‏

‏تمت معالجة الطبيعية والمعالجة إشعاعيا ب ‎TPO‏ منشطر وذو طول كامل بعد عزله من خلايا مبيض جرذان صينية ‎(CHO)‏ ومن خلايا بكتيريا ‎«E.Coli‏ ومن خلايا كلوية بشرية في م٠‏ المرحلة ‎embryonic‏ (293). وقد أدى كل من الشكلين ‎TPO‏ الناتجين في هذه العوامل الثلاثة إلى تحفيز إنتاج الصفائح الدموية في الفئران» ولكن بدى أن 0 ذو الطول الكامل والذي تم عزله من ‎CHO‏ قد أدى إلى إنتاج أكبر استجابة في جسم الكائن الحي. وتشير تلك النتائج إلى أن إدخال مجموعة 0 في مجال النهاية ‎carboxy'ds shall‏ 'قد يكون ضروريا

‏لحدوث النشاط الأمتل في جسم الكائن الحي.

‎E.coli-thTPO(Met 153) = ‏أ‎ ٠ ‏إضافة إلى‎ ١ - ‏من الوضع‎ Met) "Met" ‏من نوع‎ EPO ‏في حيز‎ "Met" ‏تم يوميا حقن الشكل‎ ‏وذلك في‎ (YY ‏(مثال رقم‎ E-Coli ‏البشري)؛ والناتج عن‎ TPO ‏الأولى في‎ Yor ‏الوحدات البنائية‎ ‏وتوضح تلك‎ zl ‏ب‎ (IYO ‏وصف ذلك في حاشية الأشكال‎ ela ‏كما‎ 057 86 Ale ‏أناث فثران‎ ‏والذي نتج‎ TPO ‏بال‎ non-glycosylated ‏الأشكال إن الشكل المنشطر 410 غير المعالج‎ ‏وتم إعادة طيه كما جاء وصف ذلك عاليه قد أدى إلى التحفيز بزيادة قدرها ضعفين‎ E.Coli ‏عن‎ Vo

‏في إنتاج الصفائح الدموية في الفئران العادية دون التأثير على تعداد الكريات الدموية الحمراء أو

‏البيضاء ‎٠‏ وعند حقن نفس هذا الجزئ يوميا في أناث فثران تعرضت لإشعاع 72" بجرعات شبه

‏مميته ‎(137CS)‏ 6 كما ‎ela‏ وصف ذلك في حاشية الأشكال 776؟أ ‎em‏ ج؛ أدى ذلك إلى

‏زيادة مقدارها ضعفين في إنتاج الصفائح الدموية ذدن التأثير على تعداد خلايا الدم الحمراء ‎٠‏ والخلايا البيضاء.

CHO-rh TPOs3, =

إن الطول الكامل ل ‎TPO‏ المنتج في ‎CHO‏ والذي تم حقنه يومياً في أناث فئران 057186 الذي

جاء وصفه في حاشية الأشكال ‎ze Jyv‏ قد أدى هنا إلى زيادة قدرها ضعفيسن في إنتاج

الصفائح الدموية في الفئران العادية دون التأثير على أعداد خلايا الدم الحمراء والخلايا البيضاء. © ج- ‎E. coh-thTPO(Met™, 53); 203-thTP0332; and E. coli-thTPOyss‏ ددد0 0110-11

تم عمل منحنيات الاستجابة للجرعة لمعالجة الفئران العادية بشكل ‎thTPO‏ من سلالات خلايا

مختلفة كما جاء وصف ذلك في حاشية الشكل رقم ‎(YA)‏

‎E. coli-thTPO(Met ; 153); 293thTPOs3,; and E. col,-thTPO ss)‏ بددد10ط:-01010)

‏ويوضح هذا الشكل أن جميع الجزيئات التي تمت معالجتها قد أدت إلى تحفيز إنتاج الصفائح ‎٠‏ الدموية؛ ولكن كان للشكل ذو الطول الكامل والمنتج في ‎CHO‏ أكبر نشاط في جسم الكائن الحي.

‎CHO-rhTPO0;s3. CHO-rhTPO cllpped and CHo-rhTPO33; - ‏د‎

‏تم أيضاً عمل منحنيات الاستجابة للجرعة لمعالجة الفئران العادية بأشكال مختلفة من ‎thTPO‏

‏الناتجة في كل من ‎«CHO(CHO-thTPO153‏ و مقصوص ‎CHO- 5 «CHO-thTPO clipped‏

‏2 كما جاء وصف ذلك في حاشية شكل رقم (79). ويوضح هذا الشكل أن جميع ‎١‏ ا صور ‎CHO‏ للجزئ الذي تم اختباره قد أدت إلى تحفيز إنتاج الصفائح الدموية؛ ولكن كان للشكل

‏ذو الطول الكامل والمنتج في ‎CHO‏ أكبر نشاط في جسم الكائن الحي.

‎١"١ -‏ -— - الطريقة العامة لتحضير نواتج ربيطة ‎mpl‏ وأشكالها المختلفة بالهندسة الوراتية ‎Recombinant‏ وللمتغيرات : يفضل تحضير ربيطة ‎mpl‏ باستخدام الهندسة الوراثية بالطرق المعروفة التي تشتمل على ‎A‏ ‏6 ربيطة ‎mpl‏ عن طريق استنبات الخلايا التي أودعت فيها المعلومة الوراثية. وذلك ‎٠‏ من أجل التعبير وراثياً عن الحامض النووي التابع لربيطة ‎mpl‏ (وبشكل نمطي عن طريق تحويل ‎WIAD transforming‏ بواسطة ناقل للصيغة الوراثية ‎¢(vector‏ مع استرداد ‎polypeptide‏ من الخلايا. ومع ذلك فإنه من المتصور بشكل اختياري أن ربيطة ‎mpl‏ يمكن أن تنتج عن طريق الهندسة الوراثية للمتماثلات ‎homologous‏ ؛ أو بطرق هندسة وراثية تستخدم فيها عناصر تحكم يتم إدخالها في الخلايا المحتوية على ‎DNA‏ المشفر لربيطة ‎mpl‏ وعلى سبيل المثال فإن أي من ‎٠‏ عنصر التحفيز/ التعزيز ‎«promoter/enhancer‏ أو الكابح ‎suppressor‏ ؛ أو عنصر خارجي تنظيم الانتساخ يمكن أن تُدخل في البنية ‎genome‏ الوراثية لخلايا العائل المستهدف بدرجة من التجاور ‎proximity‏ والتكيف ‎orientation‏ تكفي للتأثير على إنتساخ ‎DNA‏ المشفر ل ‎polypeptide‏ ‏ربيطة ‎mpl‏ المرغوبة. ولا يقوم عنصر التحكم بتشفير ربيطة ‎mpl‏ ؛ وبالأحرى فإن 0348 هو عبارة عن حامض نووي داخلي ‎Jd indigenous‏ البنية الوراثية لخلية العائل. ويلي ذلك البحث عن ‎ve‏ الخلايا المكونة لل 6 في المستقبل وفق هذا الاختراع؛ أو للمستويات الزائدة أو المتناقصة الخاصة بالتعبير عن الصيغة الوراثية كما هو مطلوب . وهكذا ينطوي الاختراع الحالي على طريقة لإنتاج ربيطة ‎mpl‏ الترابطية؛ وتشتمل الطريقة علي إدخال 48 عنصر منظم للانتساخ ‎A transcription‏ بنية ورائية ‎Adal genome‏ تحتوي على جزئ حامض نووي لربيطة ‎mpl‏ الترابطية؛ وذلك بدرجة من التقارب ‎proximity‏ والتكيف ‎orientation ٠٠‏ تكفي لأن يؤثر جزئ الحامض النووي على عملية الإنتساخ» مع خطوة اختيارية

‎NYY -‏ إضافية تشتمل على استنبات خلية تحتوي على العنصر المنظم للانتساخ» وجزئ الحامض النووي. كما ينطوي الاختراع أيضاً على خلية عائل تحتوي على جزئ الحامض النووي لربيطة ‎mpl‏ يتصل بشكل فعلي مع متتاليات التحكم الخارجية و ‎recognized‏ التي تميزها خلية العائل.

‎: mpl ‏ربيطة‎ Polypeptide ‏ل‎ Encoding ‏المشفر‎ DNA ‏عزل‎ - i ‏مجموعة من‎ Af ‏وذلك من‎ mpl Aan Polypeptide ‏المشفر ل‎ DNA ‏يمكن الحصول على‎ © ‏وتعبر عنها وراثياً‎ mpl ‏لربيطة‎ mRNA ‏المحضر من خلايا يعتقد أنها تحتوي على‎ cDNA ‏من مجموعة‎ mpl ‏مورث_ربيطة‎ gene ‏بمستوى يمكن اكتشافه. كما يمكن أيضاً الحصول على‎ ‏البسيطة من‎ nucleotide ‏أو عن طريق البناء في المختبر لل‎ + genomic library ‏الوراثية‎ DNA

‏1056 كامل أو من متتاليات الأحماض الأمينية.

‎٠‏ وتتم استعراض المجموعات بواسطة مسبار ‎probe‏ معين تم تصميمه للتعرف على الجين قيد الاهتمام أو على البروتين المشفر بواسطة هذا الجين. وبالنسبة لمجموعات التعبير ‎ol‏ في ‎cDNA‏ فإن المسبار المناسب لها يشتمل على أجسام مضادة أحادية الانتساخ أو عديدة الاسنتساخ يمكنها أن تميز وترتبط بشكل نوعي محدد مع ربيطة ‎Ul mpl‏ بالنسبة لمجموعات ‎CDNA‏ فإن المسبار المناسب لها يشتمل هنا على ‎oligonucleotides‏ يتراوح طولها ما بين ‎A -7١‏ قاعدة

‎١٠‏ وتقوم بتشفير أجزاء معلومة أو مشتبه فيها من حامض 0118 الخاص بربيطة ‎mpl‏ ؛ وذلك من نفس النوع أو من الأنواع المختلفة من المخلوقات ‎species‏ ؛ و/أو قد يكون المسبار هنا عبارة عن ‎complementary cDNA‏ أو مجانس ‎chomologous‏ أو عبارة عن أجزاء من هذا الحامض النووي تقوم بتشفير جين مماثل. وبالنسبة للمسبار المناسب لمجموعات ‎DNAs‏ الوراثية فهو يشتمل - دون حصر - على ‎«oligonucleotides‏ أو ‎«cDNAs‏ أو أجزاء منها تشفر جين مماثل أو

‎Screening ‏وراثي مجانس أو أجزاء منه. وقد تجرى عملية استعراض‎ DNAs ‏مشابه؛ و/أو على‎ x.

— ١714 -

المجموعة الوراثية أو ‎cDNA‏ بواسطة مسبار مختار؛ وذلك باستخدام الإجراءات القياسية التي

جاء وصفها في الفصول ‎١١ -٠١‏ في مرجع ل ‎Sambrook‏ وآخرين المذكور أعلاه .

وهناك طريقة بديلة لعزل الجين المشفر لربيطة ‎mpl‏ الترابطية؛ وهي استخدام ‎PCR‏ وفق الطريقة

التي جاء وصفها في مرجع ‎Sambrook © al.‏ أعلاه. وتحتاج هذه الطريقة إلى استخدام مسبار من ‎oligonucleotides ©‏ بسيط يقوم بتهجين ‎DNA‏ المشفر لربيطة ‎.mpl‏ وهناك طرق لاختبار تلك

‎oligonucleotides‏ « سيأتي وصفها فيما بعد.

‏ومن الطرق المفضلة في ممارسة هذا الاختراع استخدام متتاليات مختارة بدقة من

‎oligonucleotides‏ ؛ وذلك لاستعراض مجموعات ‎CDNA‏ من انسجة مختلفة؛ ويفضل أن تكون

‏تلك الأنسجة من كلى في انسان أو في خنزير (سواء كان هذا الكائن بالغاً أو في مرحلته ‎٠‏ الجنينية)؛ أو تكون تلك الأنسجة من سلالات خلوية في الكبد. وعلى سبيل المثال يتم استعراض

‏خلايا كبدية بشرية في المرحلة الجنينية تحتوي على مجموعات ‎(cDNA‏ وذلك باستخدام مسبار

‏من ‎oligonucleotides‏ البسيطة. وكبديل عن ذلك يمكن تصفية مجموعات ورائية بشرية بواسطة

‏مسبار من ‎oligonucleotides‏ البسيطة.

‏وبالنسبة لمتتاليات ‎oligonucleotides‏ المختارة كمسبار فيجب أن تكون ذات طول ‎AK‏ وبعيدة عن ‎١٠‏ الغموض حتى تقل الإيجابية الخاطئة ‎false positives‏ وتصل إلى حدها الأدنى ‎٠‏ ويتم تصميم

‏متتاليات — ‎nucleotide‏ الفعلية وذلك على أساس مناطق ربيطة 1( التي تحتوي على أقل

‏قدر ممكن من تكرار الكودون ‎codon redundancy‏ . وقد يحدث تحلل لل ‎oligonucleotides‏

‏البسيطة عند م وضع واحد أو أكثرء ويعتبر استخدام تلك ‎oligonucleotides‏ الإنحلالية من الأمور

‏ذات الأهمية الخاصة في حالة عدم المعرفة بالمجموعة التي يتم استعراضها من الأنواع التي لا ‎٠‏ تفرق استخدام ‎codon‏ مفضلة .

‎١١٠ -‏ - ويجب تمييز ‎oligonucleotide‏ بحيث يمكن اكتشافه عند تهجنة ‎hybridization‏ مع ‎DNA‏ في المجموعة التي يتم إستعراضها. ومن طرق التمييز المفضلة استخدام ‎ATP‏ مثل ‎(Y3P)‏ و ‎polynucleoticie kinase‏ لتمييز النهاية الطرفية © لل ‎oligonucleotide‏ المشع. ومع ذلك فهناك طرق أخرى يمكن استخدامها لتمييز ‎oligonucleotide‏ ؛» وهذه تشتمل - دون حصر - على © التمييز بواسطة إدخال مجموعة ‎biotinylation‏ أو باستخدام الإنزيمات ‎-enzyme labeling‏ ومن الأحماض ذات الأهمية الخاصة الحامض النووي لربيطة ‎mpl‏ الذي يشر ‎polypeptide‏ ‏الربيطة ذات الطول الكامل. وفي بعض النماذج المفضلة تشتمل متتالية الحامض النووي على متتالية إشارية محلية لربيطة ‎mpl‏ ويتم الحصول على الحامض النووي المحتوي على ‎AS‏ ‏المتتاليات المشفرة وذلك عن طريق استعراض ‎CDNA‏ مختار أو ‎cle gana‏ وراثية باستخدام - متتالية أحماض أمينية مستنتجة ‎deduced‏ + ب- أنواع متتاليات الحامض الأميني في ربيطة ‎mpl‏ الطبيعي ‎Native‏ : يتم تحضير تلك الأنواع بإدخال تعديلات مناسبة لل ‎nucleotide‏ في ‎DNA‏ ربيطة ‎empl‏ أو عن طريق البناء معملياً ل ‎polypeptide‏ ربيطة ‎mpl‏ المرغوبة. وعلى سبيل المثال يمكن هنا ‎A)‏ ‏أجزاء النهاية الطرفية " ‎"carboxy‏ المشكلة للطول الكامل لربيطة ‎mpl‏ عن طريق التحلل _ البروتيني؛ سواء كان ذلك في جسم الكائن الحي أو في المختبرء أو عن طريق الانتساخ أو التعبير وراثياً عن جزء أو عن ‎DNA‏ يشفر الطول الكامل لربيطة ‎mpl‏ لإنتاج نوع نشط من الناحية البيولوجية. ويمكن عمل أي توليفة من الحذف والإدخال والاستبدال؛ للوصول بذلك إلى البنية الوراثية النهائية» شريطة أن يكون لهذه البنية نشاطاً بيولوجياً مرغوباً. ويمكن أيضاً أن يعمل الحامض الأميني على تغيير عمليات بتاء بروتين 005078051810081 ربيطة ‎mpl‏ « كأن يحدث ‎Me vy.‏ تغيير في عدد أو موضع الأماكن التي تدخل فيها مجموعة ‎glycosylation‏ . ولتصميم أنواع

‎١١١ -‏ - متتالية الحامض أ لأميني في ربيطة ‎mpl‏ فإن موضع وطبيعة الطفرة ‎aay mutation‏ أن يعتمد هنا على خصائص ربيطة ‎mpl‏ المراد تعديلها. ويمكن تعديل موضع حدوث الطفرة فردياً أو ‎Liles‏ ‏ويكون ذلك ‎Sa‏ عن طريق: = إستبدال حامض أميني ثابت ‎conservative‏ ¢ ثم باختيارات أكثر جذرية ‎radical‏ اعتماداً على ‎٠‏ النتائج التي تم الحصول عليها. " - حذف الوحدات البنائية المستهدفة ‎٠ target residue‏ 7 -إيلاج وحدات بنائية لنفس الفئة أو لفئة أخرى مختلفة مجاورة للموضع؛ أو بواسطة خليط من الخيارات ) ‎١‏ ). وهناك طريقة مفيدة لتمييز وحدات بنائية أو مناطق معينة في ‎polypeptide‏ ربيطة ‎«mpl‏ وهي ‎٠‏ المواضع المفضلة لإحداث الطفرة وتسمى "إحداث الطفرة عن طريق إستعراض الألانين ‎alanine‏ ‎scanning mutagenesis‏ " وجاء وصفها في المرجع ‎Cunningham and Wells; Science J]‏ )1989( 1081-1085 :244- وفي هذه الحالة يتم تمييز واحدة أو مجموعة من الوحدات البنائية المستهدفة (الوحدات البنائية المشحونة ‎Jie‏ وعة؛ ‎casp‏ قثا دنر ‎«(glu‏ ثم تستبدل بعد ذلك بأي من الأحماض الأمينية التي ‎١‏ يفضل أن تكون ذات شحنة متعادلة أو سالبة (وا لأكثر تفضيلاً أحماض ‎alanine‏ أو ‎polyalanine‏ ( وذلك للتأثير على التفاعل بين الأحماض الأمينية والبيئة المائية المحيطة خارج الخلية. وهذه المجالات التي تبدى حساسية وظيفية للاستبدالات ‎substitutions‏ يتم بعد ذلك تكريرها عن طريق إدخال متغيرات إضافية أو متغيرات أخرى عند مواضع الاستبدال. وهكذا فإنه مع التحديد المسبق لموضع إدخال متوالية الحامض الأميني إلا أن طبيعة الطفرة في حد ذاتها لا تحتاج إلى تحديدما

‎١" -‏ - مسبقاً. وعلى سبيل المثال فإنه للوصول بأداء الطفرة إلى حده الأمثتل عند موضع معلوم يجرى هنا استعراض ‎alanine‏ أو الطفرة العشوائية عند ‎codon‏ أو منطقة مستهدفة؛ ثم يتم بعد ذلك فصل أنواع ربيطة ‎mpl‏ الترابطية للوصول إلى التوليفة المثلى ذات النشاط المطلوب. وهناك اثنين من الأنواع الأساسية في البنية الوراثية لمتتالية الأحماض الأمينية؛ وهي: موضع ‎٠‏ الطفرة؛ وطبيعة الطفرة. وعلى سبيل المثال فإن أنواع ‎polypeptide‏ ربيطة ‎mpl‏ تشتمل هنا على أنواع من متتالية ربيطة ام« وقد تمثل متغيرات حادثة طبيعياً لا يحتاج الأمر فيها إلى تطويع الحامض النووي ‎DNA‏ لربيطة ‎mpl‏ » أو قد تمثتل أشكالاً محددة مسبقاً من الطفرة تنتج عن إحداث الطفرة في ‎DNA‏ للوصول إلى متغير غير ربيطة في الطبيعة. وبصفة عامة فإن موضع وطبيعة الطفرة المختارة يعتمد هنا على خصائص مجموعة ‎mpl‏ المراد تعديلها.

‎- ١ ‏ويتراوح عدد الوحدات البنائية التي يتم حذفها من متتالية الأحماض الأمينية ما بين حوالي‎ ٠ ‏وبصفة نمطية يكون هذا العدد متقارب.‎ ؛٠١‎ - ١ ‏ويفضل أن يتراوح هذا العدد ما بين‎ ٠ ‏قد‎ mpl ‏الأحماض الأمينية لربيطة‎ Lime ‏وكبديل عن ذلك فإن الوحدات البنائية التي يتم حذفها من‎ ‏وقد تشتمل‎ ." carboxy” ‏ذو النهاية الطرفية‎ glycoprotein ‏تشتمل على جزء من الحيز الكامل لل‎ ‏تلك الوحدات البنائية أيضاً على واحدة أو أكثر من الوحدات البنائية الستة الأولى المحتوية على‎

‎yo‏ النهاية الطرفية "أمينو" في البروتين الناضج. وهناك وحدات بنائية اختيارية في متتالية الأحماض الأمينية تشتمل على واحدة أو أكثر من الوحدات البنائية في واحدة أو أكثر من المناطق الحلقية ‎loops‏ الموجودة بين الحزم الحلزونية ‎٠ helical bundels‏ ويحدث الحذف المتقارب عادة بإعداد متساوية من الوحدات البنائية ولكن الحذف بإعداد فردية أو بإعداد غير صحيحة يدخل أيضاً ضمن نطاق هذه العملية. وقد يتم عمل حذف في مناطق قليلة التجانس بين ربيطة ام التي

‏© - تتشارك في معظم هوية المتوالية لتعديل نشاط تلك المجموعة. وقد يتم أيضاً إجراء عمليات

‎١7# -—‏ - الحذف في مناطق قليلة التجانس بين ربيطة ‎mpl‏ الترابطية البشرية أو في كائنات ثديية أخرى تتشارك في معظم هوية ربيطة ‎mpl‏ البشرية. وتعتبر عمليات الحذف من ‎polypeptides‏ ربيطة ‎mpl‏ في الثدييات في المناطق المميزة بدرجة عالية من التجانس مع مجموعات ‎mpl‏ في ‎Aldi‏ ‏أخرى من العوامل التي ‎dating‏ أن تؤدي إلى تعديل وتغيير أكبر في النشاط البيولوجي ربيطة ‎mpl ٠‏ ويتم اختيار عدد عمليات الحذف المتتالية بحيث يتم بذلك الحفاظ على الهيكل الثلاثي لربيطة ‎mpl‏ في المجال الخاضع للتأثير إي في مجال بيتا الرقائقي ‎beta-pleated sheet‏ أو مجال ‎Lill‏ ‏الحلقي ‎-alpha helix‏ وتشتمل ولائج ‎insertions‏ متتالية الحامض الأميني على إندماجات ذات نهاية طرفية "أمينو" و/أو ‎carboxyl”‏ " يتراوح ‎Led sha‏ ما بين واحدة من الوحدات البنائية إلى ‎polypeptides‏ يحتوي على ‎٠‏ _مائة أو أكثر من الوحدات البنائية؛ ‎Lady‏ ولائج ‎din‏ بها حامض أميني واحد أو عدة وحدات بنائية من الحامض الأميني. وبصفة عامة يتراوح عدد الوحدات البنائية في ولائج المتتالية البينية (ولائج ضمن متتالية ناضجة تتكون من ربيطة ‎(mpl‏ وذلك ما بين حوالي ‎٠١ - ١‏ من الوحدات البنائية» ويفضل أن يتراوح هذا العدد ما بين ‎١‏ - 0 والأكثر تفضيلاً أن يتراوح هذا العدد ما بين ‎-١‏ “. ويفضل بشكل قياسي أن يكون الإندماج بين ربيطة ‎mpl‏ أو جزء ‎lea‏ مع ‎cytokine‏ آخو ‎١‏ أو مع جزء منه. ومن الأمثلة على الولائج الطرفية تلك التي تضم ربيطة ‎mpl‏ مع وحدة من ‎methionyl‏ ذات نهاية طرفية 77 مع عامل للتعبير المباشر عن الصيغة الوراثية في ربيطة ‎mpl‏ ‏الناضجة في وسط لاستزراع الخلية يعتمد على الهندسة الوراثية؛ ومع إندماج يحدث بين متتالية إشارية غير متجانسة تحتوي على النهاية الطرفية "77" وبين النهاية الطرفية 7" في جزء لربيطة ‎mpl‏ ناضجة؛ وذلك لتسهيل إفراز ربيطة 1م« الترابطية من العوائل التي تمت فيه الهندسة © الوراثية . وبصفة عامة يتم الحصول على مثل تلك المتتاليات الإشارية من أنواع خلايا العائل

‎١" -‏ - المستهدف ؛ وتشتمل المتتاليات المناسبة على 7 أو ‎Ipp‏ بالنسبة لبكتيريا :8-001 ؛ والعامل ألفا في الخمائر ‎yeast‏ ؛ والإشارات الفيروسية مثل فيروس الحلا ‎herpes gD‏ في خلايا الثدييات. وهناك متغيرات إيلاجية أخرى لجزئ ربيطة ‎mpl‏ ؛ وهذه تشتمل على إندماج مع النهاية الطرفية ‎"C"‏ ربيطة ‎mpl‏ في ‎polypeptides‏ المكونة للمناعة (والتي لا تفرز داخلياً في جسم العائل وإنما ه تعطى له ‎Leia dala‏ البكتيرية ‎bacterial polypeptides‏ مثل ‎beta - lactamase‏ أو الإنزيمات المشفرة بواسطة ‎E.Coli trplocas‏ أو بروتين الخمائر)؛ و إندماج ‎lal‏ الطرفية "©" مع بروتينات ذات فترة نصف عمر طويلة مثل مناطق الأجسام المناعية الثابتة ‎constant‏ (أو أية مناطق أخرى للاجسام المناعية)؛ و ‎albumin‏ أو 0 كما جاء وصفها في طلب البراءة الدولية رقم 777 المنشور في ‎١‏ أبريل عام ‎AAA‏ ‎٠‏ أما المجموعة الثالثة من المتغيرات فهي عبارة عن متغيرات لاستبدال الحامض الأميني؛ وهذه تحتوي على واحد على الأقل من وحدات مكونات الأحماض الأمينية في جزئ ربيطة ‎mpl‏ ‏المزالة والتي إدخلت مكانها واحدة أخرى من الوحدات البنائية. وبالنسبة للمواضع ذات الاهتمام الأكبر للطفرات الاستبدالية فهي تشتمل على المواضع التي تعرف بأنها مواضع نشطة لربيطة ‎mpl‏ والتي توجد فيها الأحماض الأمينية في مشابهات أخرى وتكون مختلفة إلى حد كبير من حيث ‎١‏ حجم السلسلة الجانبية ‎sidechain bulk‏ « أو القحنة ‎charge‏ » أو درجة التنافر مع الماء ‎hydrophobicity‏ ؛ ولكن مع درجة ‎dle‏ من تمييز المتتالية عند موضع مختار بين أنواع مختلفة من ربيطة ‎mpl‏ او/أو ضمن مشابهات حيوانية مختلفة في عضو واحد من المجموعة الربيطة ‎-mpl‏ ‏وهناك مواضع أخرى مهمة وهي تلك التي تتشابه فيها وحدات بنائية معينة من ربيطة ‎mpl‏ التي ‎٠‏ تم الحصول عليها من أعضاء طائفة مختلفة و/أو أنواع حيوانية ضمن عضو واحد.

‎AY. —‏ — جدول رقم )¥( الاستبدالات الاستبدالات المثالية الوحدات البنائية الأصلية المفضلة | ‎Original Residue‏ ‎Preferred‏ ‎Substitutions‏ ‎Ala (A) Val; Leu; lie Val

Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N) Gln; His, Lys; Arg Gln

Asp (D) Glu Glu

Cys (C) Ser Ser

Gln (Q) Asn Asn

Glu (E) Asp Asp

Gly (G) Pro Pro ‎His (H) Asn, Gln; Lys; Arg Arg ‎lle (I) Leu, Val; Met, Ala; Phe; norleucine Leu

Leu (L) norleucine, ile, val, Met: Ala. Phe Lle ‎Lys (K) Arg, Gln. Asn Arg

Met (M) Leu; Phe; lie Leu

Phe (F) Leu: Val; lle; Ala Leu

Pro (P) Gly Gly

Ser (S) Thr Thr

Thr (T) Ser Ser

Trp (W) Tyr Tyr

Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V) lle; Leu; Met; Phe; Ala; norleucine Leu

‎١١١ -‏ وهناك تعديلات جوهرية في الوظيفة أو في الهوية المناعية لربيطة ‎mpl‏ ؛ وهذه تتحقق عن طريق اختيار استبدالات تختلف بشكل أساسي في تأثيرها على الحفاظ على: ‎i‏ - هيكل ‎polypeptide‏ في منطقة الاستبدال؛ سواء كان -مثلا - هيكل تولينة ‎conformation‏ ‏رقائقية أو حلزونية ‎sheet or helical‏ . م ب - شحنة الجزئ أو درجة تنافره مع الماء ‎hydrophobicity‏ عند الموضع المستهدف. ج-حجم السلسلة الجانبية ‎side chain‏ وخصائصها التي تحدد تقسيم الوحدات البنائية الحادقة طبيعياً إلى مجموعات. )( مواد طاردة للماء ‎norleucine, Met.

Ala.

Val, Leu.lle; : hydrophobic‏ ¥( مواد متعادلة محبة للماء ‎Cys.Ser.

Thr; : neutral hydrophilic‏ ‎(v ٠١‏ مواد حمضية ‎Asp, Glu; : acidic‏ ¢( مواد قاعدية: ‎Asn, Gln, His, Lys, Arg;‏ م( الوحدات البنائية التي تؤثر على توجيه السلسلة ‎ly, Pro; : chain orientation‏ ( مركب عطري ‎Trp, Tyr, Phe : aromatic‏ ستستلزم المستبدلات غير الاحتفاظية ‎Non-conservative substitutions‏ تغيير عضو من إحدى ‎vo‏ هذه الفئات بالآخر. كما يمكن أن يتم أيضاً إدخال مثل هذه الوحدات البنائية بداخل مواقع استبدال إحتفاظية؛ أو بصورة أكثر تفضيلاً بداخل المواقع (غير الاحتفاظية).

‎١١١ -‏ في أحد نماذج الاختراع؛ يكون من المرغوب فيه أن تتم إزالة نشاط أو أن يتم إخماد فعالية موقع واحد أو أكثر من مواقع كسر الرابطة بفعل إنزيم ' ‎protease‏ " والتي تكون موجودة في الجزيئ. تحدد هذه المواقع ويتم التعرف عليها بواسطة فحص متتالية الحمض الأميني ‎iid)‏ في حالة ال " ‎"trypsin‏ (خميرة في عصارة البنكرياس)؛ على سبيل المثال بالنسبة لوحدة بنائيةٍ ‎arginyl‏ أو © 78071ا. وعندما يتم التعرف على مواقع أو مواضع كسر الرابطة بفعل إتزيم ‎protease’‏ " وتحديدها؛ يتم جعلها خاملة بالنسبة لكسر الرابطة للتحلل البروتينيّ بواسطة استبدال الوحدة البنائية المستهدفة بوحدة ‎Aly‏ آخرى ¢ ومن المفضل أن يكون وحدة بنائية قاعدية مثل ‎glutamine‏ أو وحدة بنائية طاردة للماء مثل ‎serine”‏ ؛ بواسطة إلغاء الوحدة ‎Ald)‏ أو بواسطة إدخال وحدة بنائية ‎prolyl‏ في الحال بعد الوحدة البنائية. ‎٠‏ وفي نموذج آخرء فإن أى وحدة بنائية من الوحدات البنائية " ‎methionyl‏ " بخلاف وحدة ال " ابدمنطاع«"_البدايةللسلسلة الفردية أو أى وحدة بنائية موجودة بداخل حوالي ثلاثة وحدات بنائية عند النهايات الطرفية - 17 أو كربون - © لكل وحدة بنائية من مثل هذه الوحدات البنائية لل " 6001" فإنه يتم إستبدالها بوحدة بنائية أخرى (من المفضل أن يكون ‎lay‏ لما تم ذكره في جدول رقم "") أو إلغائها. وبطريقة بديلة؛ يتم إدخال ما يتراوح من حوالي ‎)١(‏ إلى حوالي (©) ‎١‏ وحدات بنائية لتكون قريبة أو مجاورة ‎iad‏ هذه المواقع. قد يتم أيضاً استبدال أية وحدات بنائية " ‎"cysteine‏ لم يتم تضمينها في المحافظة على شكل البنية المناسب لربيطة ال ‎mpl’‏ وبصفة عامة مع ال ‎serine’‏ وذلك لتحسين الثبات ضد أكسدة الجزئ ومنع الترابط المستعرض الشاذ ‎aberrant crosslinking‏ . لقد وجد أن مركبات ال " ‎cysteine‏ الأول منها والرابع الموجودة في حيز "إيبو" (800)؛ والتي قد تم ترقيمها بداية من ‎٠‏ _نهايات مجموعات الأمينو؛ تكون ضرورية للمحافظة على شكل البنية المناسبء ولكن وجد أن

‎١١# -‏ الثاني والثالث منها ليسا ضروريان. ووفقاً لذلك؛ فقد يتم استبدال مركبات ال "سيستين" الثاني منها والثالث والموجودين في المجال "إيبو" (وم»). يتم تحضير جزيئات الحمض النووي المشفر أنواع متتالية الحمض الأميني للربيطة وذلك بواسطة طرق متنوعة ومختلفة معروفة في مثل هذا المجال من هذا الفن. تشتمل هذه الطرق على سبيل © المثال لا على سبيل الحصر على إجراء الفصل من مصدر طبيعي (في حالة أنواع متتالية الحمض الأميني الموجودة بصورة طبيعية) أو أن يتم تحضيرها بواسطة الطفرة التي تحدث عن طريق ال " ‎"oligonucleotide‏ (أو الموقع الموجبه ‎«site-directed‏ وطفرات ‎PCR mutagenesis‏ « ومجموعة طفرات متغير مُحضضّر بصورة مبكرة أو تحويل غير متغير ل ‎polypeptide”‏ " المجموعة ربيطة ‎.mpl‏ ‎٠‏ وطريقة الطفرة عن طريق ال ‎Oligonucleotide’‏ " هي الطريقة المفضلة لتحضير متغيرات الاستبدال ‎substitution‏ + والإلغاء ‎deletion‏ « والإدخال ‎insertion‏ لل ‎(DNA)‏ لربيطة ‎"mpl"‏ ‏لقد عرفت هذه التقنية الفنية في هذا الفن حسبما تم وصفها في [183 :2 ‎Adelman et al, DNA,‏ (1983)]. وباختصان يغير ال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏ بواسطة تهجين ‎Oligonucleotide”‏ "مشفر للطفرة المطلوبة والمرغوب فيها ليصبح قالب ‎template‏ أو نموذج ‎Cus (DNA)‏ يكون القالب ‎ve‏ المذكور هو الصورة ذات الجديلة المفردة ل " ‎"plasmid‏ أو ‎bacteriophage‏ محتوية على ‎ie‏ ‎(DNA)‏ غير المتغيرة أو طبيعية ‎native‏ للربيطة ‎(mpl)‏ وبعد أن يتم التهجين؛ يتم استخدام إنزيم ال " ‎polymerase‏ " لل ‎DNA‏ ليتم تصنيع جديلة تامة من الجدائل التامة بمسورة كاملة للنموذج الذي سيقوم بدمج ال * ‎"oligonucleotide‏ البادئ؛ والذي سيقوم بتشفير التغير أو التعديلى ‎alteration‏ الثاني الذي يحدث في ال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏

‎١74 -‏ وبصفة ‎dale‏ يتم استخدام ال " ‎"oligonucleotides‏ بعدد ‎(YO)‏ نيكليوتيا على الأقل طولا. سيكون لل ' ‎oligonucleotide‏ " المثالي ما يتراوح من ‎(VY)‏ إلى )10( ‎nucleotides‏ التي تكون مكملة ‎complementary‏ بصفة كاملة مع النموذج على أى جانب من ال ‎nucleotide(s)’‏ " المشفرة للطفرة. إن هذا يضمن أن ال " ‎"oligonucleotide‏ سيقوم بالتهجين بصورة مناسبة لجزيئ ‎DNA‏ ‏© ذى الجديلة المفردة. تكون ال " ‎oligonucleotides‏ " معدة وجاهزة ‎pin oY‏ باستخدام التقنيات الفنية المعروفة في مثل هذا الفن حسبما تم وصفها في ‎Crea et al, Proc.

Natl Acad.

Sci]‏ )1978( 5765 :75 بذ5تا]. يمكن أن يتم توليد وإنتاج نموذج ال ‎(DNA)‏ بواسطة النواقل ‎vectors‏ التي ‎Ld)‏ أن تكون مشتقة من نواقل ‎(M13) bacteriophage‏ [تكون النواقل ‎(M13mp19) «(M13mp18)‏ المتوفرة ‎١‏ تجارياً هى النواقل المناسبة]؛ أو أن تكون مشتقة من تلك النواقل التي مصدرها ‎bacteriophage‏ ‏ذو جديلة مفردة وله موقع ‎ongin‏ واحد التضاعف 0ح حسبما تم وصفه في ‎[Viera et al., Meth.

Enzymol, 153:3 (1987)]‏ لذلك؛ قد يتم إدخال ال ‎DNA‏ المراد لجبراء تعديله وإجراء طفرة له بداخل أحد هذه النواقل لإنتاج نموذج ذى جديلة مفردة ‎single-stranded‏ ‎template‏ لقد تم وصف إنتاج النموذج ذى الجديلة المفردة في الأقسام من رقم (١7,؛)‏ إلى رقم ‎Sambrook "Alia (£,£1) ٠‏ وآخرين" ‎Sambrook et al, Molecular Cloning; A Laboratory]‏ ‎.[Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)‏ وبطريقة ‎Alyy‏ قد يتم إنتاج نموذج ‎DNA‏ ذى جديلة ‎jie‏ 33 بواسطة تغيير طبيعة ‎denatunng‏ ‏الحمض النووي ‎(DNA)‏ ل ‎plasmid‏ مزدوج ‎double-stranded‏ (أو آخر) وذلك باستخدام التقنيات الفنية القياسية.

‎\Yo -‏ — لتغيير أو لتعديل متثالية ال ‎(DNA)‏ الطبيعي ‎native‏ (لإنتاج متغيرات ‎variants‏ متتاليات الحمض الأميني؛ على سبيل المثال)؛ يتم حينئذ تهجين ال " ‎oligonucleotide‏ " إلى حيث النموذج ذى الجديلة المفردة في ظروف التهجين المناسبة. من المعتاد؛ أن تتم حينئذ إضافة إنزيم بلمرة ال ‎DNA‏ « وهو عبارة عن جزء ‎fragment‏ ال ‎"Klenow"‏ لإنزيم " 1 ‎DNA polymerase‏ « ‎٠‏ وذلك لتصنيع جديلة متتامة ومتكاملة للنموذج باستخدام ال " ‎oligonucleotide‏ " كمادة أولية لعملية التصنيع. وبذلك يتكون جزيئ ‎heteroduplex‏ غير متجانس بحيث تقوم جديلة واحدة مسن جدائل ال ‎DNA‏ بتشفير الصورة المعدلة لربيطة ‎(mpl)‏ التي حدثت لها طفرة؛ وتقوم الجديلة الأخرى (النموذج ‎(lal)‏ بتشفير المتتالية الطبيعية غير المعدلة لربيطة ‎(mpl)‏ حينئذ؛ يتم تحؤّل 40 هذا الجزئ المزدوج غير المتجانس إلى خلية عائل مناسبة؛ من المعتاد أن تكون ‎prokaryote ٠‏ مثل ) 01 1 ‎(E.coli‏ وبعد أن تنمو ‎(LOAN‏ يتم بسطها ‎plated‏ ووضعها فوق أطباق "06 " ثم فصلها باستخدام بادئ ‎oligonucleotide " primer‏ " موشوم إشعاعياً ب ‎7١‏ - فوسفات ‎(32-phosphate)‏ لتحديد المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على ال ‎DNA‏ المعدل الذي حدثت له الطفرة. حينئذ؛ تتم إزالة المنطقة المعدلة التي حدثت بها الطفرة ويتم وضعها في ناقل مناسب لإنتاج البروتين» وبصفة عامة؛ يتم بصورة نموذجية استخدام ناقل ‎١‏ الصفة الوراثية من النوع الذي يقوم بتحويل العائل المناسب . قد يتم تعديل الطريقة الموصوفة تواً بحيث يتم بناء أو تكوين جزيئ مزدوج متجانس حيث تكون فيه كلتا الجديلتين للبلازميد تحتويان على الطفرة ‎mutation‏ (الطفرات ‎(mutations‏ تكون التعديلات كما يلي: " ‎“oligonucleotide‏ ذو الجديلة المفردة يتم تراصفها أو تكاملها إلى نموذج ذى جديلة مفردة حسبما تم وصف ذلك. تم عمل لخليط لثلاثقة من مركبات ال " ‎"deoxyribonucleotides ٠‏ وهي المركبات ‎deoxyriboguanosine 3 « deoxyriboadenosine (Datp)‏ ‎Sl deoxyribothymidine (dTTP) 5 ¢ (dGTP)‏ مع ‎thio-deoxyribocytosine‏ يسمى ‎dCTP-)‏

‎١7 -‏ 5) (والذي يمكن الحصول عليه من مؤسسة ال ‎"Amersham Corporation"‏ ثم تمت إضافة هذا الخليط إلى المركب المعقد للنموذج - ‎٠ oligonucleotide‏ وعند إضافة ‎polymerase‏ ال ‎(DNA)‏ لهذا الخليط؛ يتم تكوين جديلة لل ‎(DNA)‏ مماثلة للنموذج. فيما عدا القواعد المعدلة (التي تم فيها طفرة). بالإضافة إلى ذلك؛ ستحتوي الجديلة الجديدة ‎(DNA)‏ على ‎Yay dCTP-(0S)‏ © .من ‎«dCTP‏ التي تعمل على حمايتها من الهضم الجزء بواسطة فعل وتأثير إتنزيم ‎restriction‏ ‎endonuclease‏ . وبعد أن تم قطع جديلة النموذج للجزئي المزدوج غير المتجانس ذى الجديلة المزدوجة بانزيم هضم حاز ¢ أصبح من الممكن هضم جديلة النموذج بانزيم " ‎ExollI "nuclease‏ أو بإنزيم " ‎"nuclease‏ مناسب آخر يسبق المنطقة التي تحتوي على الموضع (المواضم) المراد تعديلها ‎٠‏ ولإحداث طفرة فيها. بعد ذلك؛ تم إيقاف التفاعل لترك الجزئ الذي يكون عبارة عن جديلة مفردة بصورة جزئية ‎«partially single-stranded‏ بعدهاء؛ تم تكوين جزيئ مزدوج متجانس لل ‎DNA‏ ‏ذى جديلة مزدوجة كاملة باستخدام إتزيم ‎polymerase‏ ال ‎DNA‏ في وجود جميع ال ‎ATP" deoxynbonucleotlde” I triphosphates‏ وإنزيم الربط للديوون1 ‎fim.

DNA‏ 3( يمكن أن ‎Ji‏ هذا الجزئي المزدوج إلى خلية عائل مناسب وذلك على سبيل المقال ‎٠‏ (8601114101). حسبما تم وصف ذلك ‎Lash‏ سبق. قد يتم إنتاج ‎(DNA)‏ المشفر لطفرات ‎sly‏ من حمض أميني واحد يراد إستبدالها في ربيطة ‎(mpl)‏ بطريقة واحدة من الطرق العديدة. إذا تم وضع الأحماض الأمينية كلها مقاربة بعضها لبعض في سلسلة ال " ‎"polypeptide‏ فقد يتم تعديلها وإحداث طفرة فيها في أن واحد باستخدام " ‎"oligonucleotide‏ واحد وهو الذي يقوم بتشفير جميع مستبدلات الحمض الأميني المطلوب ‎٠‏ والمرغوب فيه. وعلى أية حال إذا كانت الأحماض الأمينية موجودة على مسافة ما كل منها عن

‎١١١7 -‏ الأخرى (مفصولة بواسطة أكثر من حوالي عشرة أحماض أمينية)؛ فإنه من الصعوبة أن يتم إنتاج ‎oligonucleotide '‏ " مفرد يُشفر جميع التغيرات المطلوبة المرغوب فيها. وبدلاً من ذلك؛ قد يتم استخدام طريقة واحدة من الطريقتين البديلتين. في الطريقة الأولى؛ يتم توليد أو إنتاج " ‎oligonucleotide‏ " منفصل لكل حمض أميني يراد ‎oo‏ استبداله. بعدهاء تتم في نفس الوقت إعادة البنية المزدوجة لل " ‎"oligonucleotide‏ إلى نموذج ‎DNA‏ ذى الجديلة المفردة؛ وستقوم الجديلة الثانية لل ‎DNA‏ التي تم تصنيعها من النموذج بتشفير جميع مستبدلات الحمض الأميني المطلوب المرغوب فيها. تشتمل الطريقة البديلة على دورتين أو أكثر من دورات تكوين الطفرة لإنتاج الطفرة المطلوبة المرغوب فيها. تتمثل الدورة الأولى حسبما تم وصفه بالنسبة للطفرات الفرادى في: أنه يتم ‎٠‏ استخدام ‎DNA‏ _من النوع - الطبيعي ‎wild-type‏ الخاص بالنموذج؛ وتتم ‎sale)‏ البنية المزدوجة لل " ‎oligonucleotide‏ " المشفر لمستبدل (لمستبدلات) الحمض الأميني الأول المطلوب وتحويلها إلى هذا النموذج؛ حينئذ؛ يتم توليد وإنتاج الجزئي المزدوج غير المتجانس لل ‎DNA‏ .تقوم الدورة الثانية ‎A gl‏ الطفرة باستخدام ال ‎DNA‏ الذي تم تعديله بالطفرة والمنتج في الدورة الأولى من دورات تولد أو تكوّن الطفرة في صورة النموذج. وبذلك؛ يكون هذا النموذج معدا وجاهزا ‎daily Yo‏ لأن يحتوي على طفرة واحدة أو أكثر من الطفرات. حينتذ؛ تتم إعادة البنية المزدوجة لل " ‎"oligonucleotide‏ المشفر لمستبدل (لمستبدلات) الحمض الأميني الإضافي المطلوب وتحويلها إلى هذا ‎rd gall‏ وتقوم الجديلة الناتجة لل ‎DNA‏ حينئذ بتشفير الطفرات من خلال الدورتين الأولى والثانية من دورات تولد أو تكؤن الطفرات. يمكن أن يتم استخدام هذا ‎(DNA)—‏ الناتج في صورة نموذج في الدورة الثالثة لتكوين الطفرات؛ وهلم جرا.

‎١7 -‏ — كما أن تكوين الطفرة بال ‎PCR‏ يكون مناسباً ‎La‏ لعمل تغيرات في الأحماض الأمينية ل " ‎polypeptide‏ " ربيطة ‎(mpl)‏ وبالرغم من أن الشرح التالي يشير إلى ال ‎DNA‏ ؛ إلا أنه يُفهم أن التكنيك (الطريقة الفنية) تجعل التطبيق يتوافق أيضاً مع — ‎(RNA)‏ وبصفة عامة يشير تكنيك ال ‎PCR‏ إلى الإجراء التالي ‎٠‏ [أنظر )61-70( .م ‎:[Erlich. supra, the chapter by R.

Higuchi,‏ عندما يتم استخدام كميات ضئيلة من قالب ‎DNA‏ كمادة لبدء التفاعل في ‎(PCR‏ فإن البادئات ‎primers‏ التي تختلف بدرجة طفيفة في المتتالية عن المنطقة المقابلة الموجودة في قالب ‎DNA‏ يمكن أن تستخدم لتوليد وإنتاج كميات كبيرة نسبياً من ‎po si DNA‏ والذي يختلف عن متتالية النموذج فقط عند المواضع التي تختل ف فيها البادئات ‎primers‏ عن النموذج. لإدخال طفرة في ‎DNA‏ البلازميد؛ يتم تحديد خواص أحد ‎٠‏ البادئات ‎primers‏ ليتداخل ويتراكب مع موضع الطفرة وليحوي الطفرة؛ ويجب أن تكون سلسلة البادئ الآخر مماثلة لإمتداد سلسلة الجديلة المقابلة لل ‎plasmid‏ ؛ ولكن يمكن أن يتم وضع هذه السلسلة في ‎sl‏ موضع على طول امتداد ‎DNA‏ ال ‎plasmid‏ إنه لمن المفضل على أية حلل؛ أن يتم وضع سلسلة البادئ الثاني بعد ‎nucleotides 7٠١‏ بداية من الأول منهاء بحيث تكون المنطقة المطولة أو المضخمة كلها بالكامل من ال ‎(DNA)‏ الموجود في الطرف مربوطة بواسطة ‎vo‏ البوادي التي يمكن أن يتم تسلسلها (وضعها في صورة سلسلة) بسهولة. يتم تضخيم أو تطويل ال ‎(PCR)‏ باستخدام زوج بادئ مثل ذلك البادئ الواحد الذي تم وصفه تواً ونتج ‎dic‏ أعداد لمجموعة أجزاء ال ‎(DNA)‏ التي تختلف عند موضع الطفرة المصنفة بواسطة البادئ؛ ومن الممكن عند المواضع الأخرى؛ أن تكون كنموذج نسخ يكون معرضاً للخطأ إلى حد ما. إذا كانت نسبة القاعدة ‎template‏ إلى مادة المنتج منخفضة بصورة مفرطة؛ فإن الأغلبية العظلمى © الضخمة من منتج أجزاء ال ‎DNA‏ تقوم بدمج الطفرة (الطفرات) المطلوبة المرغوب فيها. تستخدم هذه المادة للمنتج لإحلال المنطقة المتوافقة في ال ‎plasmid‏ التي عملت كنموذج ‎PCR‏

‎vq -‏ - باستخدام تقنية ‎DNA‏ قياسية. يمكن أن يتم في نفس الوقت إدخال طفرات في المواضع المنفصلة سواء كان ذلك بواسطة استخدام بادئ طفرة ثاني؛ أو بواسطة إجراء 7018 ثاني مع بادئات طفرة مختلفة وإجراء ربط ‎ligating‏ "إنزيمي” للجزئين عن الناتج ال ‎PCR‏ في آن واحد مع جزء الناقل ‎ga gall vector‏ 3 يربط لثلاثة أجزاء (أو أكثر). م في مثال ذو نوعية خاصة لتولد وتكوّن الطفرة بواسطة ‎PCR‏ يتم وضع قالب ‎DNA‏ البلازميد ‎"١ ")‏ ميكرو ‎(ng alsa‏ بشريط منفرد بالهضم بإنزيم الهضم ‎restriction endonuclease‏ الجزئشي الذي يكون ذى موقع متميز فريد في ‎plasmid DNA‏ وخارج المنطقة المراد تضخيمها. ومن هذه المادة» تتم إضافة ‎)٠٠١(‏ نانوجرام ‎ng‏ إلى خليط ال ‎PCR‏ المحتوي على محلول منظم لل ‎PCR‏ ؛ والذي يحتوي على المركبات الأربعة لل ‎deoxynucleotide triphosphates‏ «¢ وقد تم ‎٠‏ تضمينها في الأطقم التي تحمل العلامة التجارية (© ‎(GeneAmp‏ (يتم الحصول عليها من ‎Perkin-‏ ‎(Y©) Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA)‏ بيكومول عم من كل بادئ ‎primer‏ ‏من بادئات ‎oligonucleotide‏ ؛ إلى أن يصل الحجم النهائي ل )+0( ميكرولتر ‎ul‏ تتم تغطية 0 خليط التفاعل باستخدام ‎(Vo)‏ ميكرولتر من الزيت المعدني ‎mineral oil‏ . يتم تغيير طبيعة ‎denatured‏ خليط التفاعل لمدة )0( دقائق في درجة حرارة (١٠٠"م)؛‏ ثم يتم وضعه 16 بصورة نهائية فوق ثلج؛ ثم تتم إضافة ‎)١(‏ ميكرولتر من إنزيم ‎polymerase‏ ال ‎(DNA)‏ من نوع ‎Thermus aquaticus (Taq)‏ بمقدار )0 وحدات / ميكرولتر)؛ يمكن أن يتم شرائه من ‎Perkin-)‏ ‎«(Elmer Cetus‏ حيث تتم الإضافة بأسفل طبقة الزيت المعدني. ثم يتم حينئذ إدخال طبقة خليط التفاعل في جهاز تدوير حراري ‎Thermal Cycler‏ لل ‎DNA‏ (يمكن أن يتم شراؤه من مؤسسة "وا ‎«Perkin-Elmer‏ ومبرمج على النحو التالي:

‎a 003) a daa ‏دقيقة في‎ | ٠

‎١5٠١ —‏ — ‎"٠‏ ثانية في درجة حرارة ‎a YY‏ ثم 9 دورة تكون على النحو التالي: ‎ae‏ ثانية في درجة حرارة ¢ م ¢ ‎Ya‏ ثانية في ‎ap‏ حرارة 00 ‎a‏ ¢ ‎bv.‏ في درجة حرارة ‎a VY‏ ¢ هت في نهاية التفاعل؛ يتم رفع قارورة التفاعل من جهاز التدوير الحراري؛ ثم يثم نقل الطور المائي إلى قارورة جديدة؛ ثم يتم إجراء الاستخلاص من " ‎"phenol/chloroform‏ (بنسبة حجمية ‎(‘or ion"‏ ويرسب ال ‎ethanol precipitated‏ ؛ ثم تتم استعادة ال ‎DNA‏ بواسطة تتفيذ إجراءات قياسية. بعدهاء يتم بالتالي تعريض هذه المادة إلى المعالجات المناسبة لإجراء الإدخال في ناقل من النواقل. ‎٠‏ هناك طريقة أخرى لتحضير الأنواع ‎variants‏ ؛ ومجموعة تولد وتكون ‎ikl)‏ موضوعة على أساس طريقة طفرات الكاسيت ‎cassette mutagenesis‏ الموصوفة بواسطة ‎Wells et al, Gene,]‏ (1985) 315 :34]. تكون مادة البداية عبارة عن البلازميد (أو ناقل آخر) يكون مشتملاً على الل ‎DNA‏ ربيطة ‎of yall (mpl)‏ إحداث طفرة فيها. لقد تم تحديد ‎(codons) codon‏ الموجودة في ال ‎(mpl) Alan) (DNA)‏ المراد إحداث طفرة لها. يجب أن يكون هناك موقعاً فريداً لإنزيم الهضم ‎Ve‏ الجزء ‎endonuclease‏ على كل ‎ils‏ من موقع (مواقع) الطفرة التي تم التعرف عليها وتمييزها. إذا لم توجد مثل هذه المواقع للهضم الحدي ؛ فقد يتم إنتاجها وتوليدها بامستخدام طريقة توليد وتكوين الطفرة التي تحدث عن طريق ال ‎oligonucleotide-mediated mutagenesis‏ لإدخالها في مواقع مناسبة في ال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏ وبعد أن يتم ‎JAY‏ مواقع الهضم الجزئيٌ في ؛ يتم ‎plasmid aa‏ عند هذه المواقع لجعله خطياً. ‎ais‏ تصنيع " ‎oligonucleotide‏ " ذو الجديلة

‎١6١ -‏ المزدوجة المشفر لمتتاليات ال ‎Led DNA‏ بين مواقع الهضم الجزئي ولكنه يكون محتوياً على الطفرة (الطفرات) المطلوبة المرغوب فيها وذلك باستخدام الإجراءات القياسية. ويتم تصنيع الجديلتين بصورة منفصلة كل منها على حدة ثم يتم تهجينهما (خلطهما) معاً ‎pani uly‏ التقنيات القياسية. يشار هذا ال " ‎oligonucleotide‏ " المزدوج الجديلة إلى أنه الكاسيت ‎cassette‏ . ويتم 0 تصميم المجموعة لتكون ذات أطراف 7؛ 0 وهي الأطراف التي تتوافق مع ‎plasmids af‏

‏الذي تم جعله خطياً؛ بحيث يمكن أن يتم ربطه بصورة مباشرة مع ‎plasmid‏ يحتوي هذا ‎plasmid‏ ‏الآن على متتالية ال ‎(DNA)‏ لربيطة ‎(mpl)‏ الذي تم إحداث طفرة له. ج. إدخال حمض نووي في ناقل قابل للتضاعف ‎Insertion of Nucleic Acid into a Replicable‏ ‎Vector‏ :

‎polypeptide” ‏وراتي) مشر ل‎ DNA ‏أو‎ cDNA ‏“يتم إدخال الحمض النووي (على سبيل المثال‎ ٠ ‏للتضاعف لإجراء المزيد من الاستنساخ الإضاف‎ Jil ‏الربيطة المعدلة أو الطبيعية وذلك في ناقل‎ ‏عن الصيغة الوراثية. إن هناك الكثير‎ expression ‏(تضاعف للحمض النوويٌ "10708 أو للتعبير‎ ‏ما إذا كان المراد أن يتم استخدامه‎ )١( ‏من النواقل المتوفرة؛ وسيعتمد اختيار الناقل المناسب على:‎ ‏للتعبير عن الصيغة الوراثية؛ (7) حجم الحمض النووي‎ (DNA) ‏لتضاعف أو لتضخيم ال‎

‎١‏ _ المراد إدخاله في الناقل؛ (7) خلية العائل المراد تحويلها 0 بالناقل. يحتوي كل ناقل على وحدات عديدة وفقاً لوظيفته (مضاعفة ال ‎"DNA"‏ أو للتعبير عن الصيغة الوراثية لل ‎('DNA"‏ وخلية العائل التي تكون متوافقة معه. وبصفة عامة؛ تشتمل مكونات الناقل على سبيل المثال لا على سبيل الحصر وذلك على واحد أو أكثر من كل مما يأتي: متتالية إشارة ‎signal‏ ‎sequence‏ » مكان بدء التضاعف ‎origin of replication‏ ؛ وواحد أو أكثر من الجينات ‎hh‏

- 7؟١ ‏ ‎¢marker genes‏ وعنصر معزز ‎enhancer‏ ¢ محفز ‎promoter‏ « ومتتالية إنهاء ‎Flay‏ ‎transcription termination‏ . )1( مكون مثتالية الإشارة ‎Signal Sequence Component‏ : قد يتم التعبير عن الصيغة الوراثية لربيطة ‎(mpl)‏ ليس فقط بصورة مباشرة» ولكن أيضاً في ‎٠‏ صورة إندماج مع ببتيد مختلف التركيب أو الشكل؛ والمفضل في صورة متتالية إشارة أو ‎polypeptide‏ آخر له موضع قطع ‎cleavage site‏ رابطة ذى نوعية خاصة عند النهاية الطرفية المنتهية بذرة - ‎N‏ أو ‎protein‏ أو 58م الناضج. وبصفة عامة؛ قد تكون مثتالية الإشارة عبارة عن مُكوّن ‎(Jill‏ أو قد يكون جزءاً من ال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏ التي تم إدخالها في الناقل. يجب أن يتم اختيار متتالية الإشارة المختلفة التركيب أو الشكل لتكون واحدة من تلك ‎٠‏ المتتاليات التي تم تمييزها والتعرف عليها ومعالجتها بواسطة خلية العائل ‎(sf)‏ تم كسر رابطتها بواسطة ‎(signal peptidase‏ وبالنسبة للخلايا ‎Ally prokaryotic‏ لا تقوم بتمييز أو معالجة متتالية إشارة ربيطة ‎(mpl)‏ فإنه يتم استبدال ممتالية الإشارة بواسطة متتالية إشارة 06 + يتم اختيارهاء على سبيل ‎JE‏ من المجموعة المكونة من ال ‎alkaline phosphatase‏ « أو ‎penicillinase‏ « أو ‎spp‏ موجهات (إنتروتوكسين "!1) المقاوم الحرارة ‎heat-stable‏ ‎enterotoxin IT leaders ١٠‏ . وبالنسبة لإفراز الخميرة ‎cyeast‏ 26 يتم استبدال متتالية الإشارة الطبيعية» على سبيل المثال؛ بإنزيم انفرتاز للخميرة ‎yeast invertase‏ ؛ أو عامل ‎alpha factor Wl‏ ‎Se‏ موجهات إنزيم فوسفتاز الحمض ‎acid phosphatase leaders‏ ؛ لقد تم وصف موجه ال ‎C.albicans glucoamylase‏ في [البراءة الأوروبية رقم (79 1 ‎(EP‏ والتي ثم نشرها في ؛ أريل (1940م) أو متتالية الإأشضارة التي تم وصفها في طلب البراءة الدولية رقم ‎(WO 1 3646( ٠‏ نشرها في ‎١١‏ نوفمبر ( ‎٠‏ ام). وفي الصيغة الوراثية ‎LIAN‏ الثديية؛ فإن

‎١2“ -‏ متتالية الإشارة الطبيعية [أى متتاليقت ربيطة ‎(mpl)‏ التي تقوم بصورة عادية بتوجيه ‎JA‏ ربيطة ‎(mpl)‏ من الخلايا الثديية الطبيعية في أنابيب الاختبار] فإنها تكون مقبولة؛ هذا بالرغم من أن هناك متتاليات إشارة ثديية قد تكون مناسبة؛ مثل متتاليات الإشارة المأخوذة من ‎Aas" polypeptide’‏ ‎(mpl)‏ أخرى أو من نفس ربيطة ‎(mpl)‏ المأخوذة من أنواع حيوانات مختلفة؛ متتاليات الإشارة ‎٠‏ المأخوذة من ربيطة ‎(mpl)‏ ومتتاليات الإشارة المأخوذة من ‎polypeptide”‏ " مفرزة لنفس الأنواع أو لأنواع أخرى ‎same or related species‏ وثيقة الصلة؛ وكذلك أيضاً موجهات إفرازية فيروسية ‎viral secretory leaders‏ ؛ على سبيل المثال؛ الإشارة ‎"gD"‏ لهربس سمبلكس ‎٠ herpes simplex‏ ‎(ii)‏ مكان بدء التضاعف ‎Origin of Replication Component‏ + يحتوي كل من التعبير عن الصيغة الوراثية وناقلات الاستنساخ على متتالية الحمض النووي التي تُمكنٌ الناقل من أن يقوم بالتضاعف في خلية واحدة أو أكثر من خلايا العائل التي تم اختيارها. وبصفة عامة؛ فإنه في ناقلات الاستنساخ, فإن هذه المتتالية تكون عبارة عن إحدى المتتاليات التي تمكن الناقل من أن يقوم بصورة مستقلة قائمة بذاتها يتضاعف ‎DNA‏ ال ‎chromosomal‏ مع تضمين أصول بدء مكان لتضاعف أو تضاعف متتاليات بصورة مستقلة وظيفياً بصورة ذاتية ‎ail . autonomously replicating‏ عرفت مثل هذه المتتاليات معرفة جيدة بالنسبة لبكتريا مختلفة؛ ‎١‏ والخميرة ‎yeast‏ والفيروسات ‎viruses‏ يكون مكان بدء التضاعف المأخوذ من البلازميد ‎(Pbr322)‏ ‏مناسباً بالنسبة لمعظم البكتيريا السالبة تجاه صبغة جرام ‎(Gram-negative)‏ ويكون أصل البلازميد (م2) مناسباً للخميرة؛ وتكون الأصول الفيروسية العديدة ‎(SV40 Jia)‏ أر ‎polyoma’‏ ‏أو فيروسات الغدد ‎adenovirus‏ أو ‎«VSV‏ أو ‎(BPV‏ مفيدة بالنسبة لناقلات الاستنساخ الموجودة في خلايا ثديية. وبصفة عامة؛ لا تكون هناك حاجة لمكان بدء التضاعف بالنسبة لناقلات التعبير

‎١544 —‏ - عن الصيغة الوراثية الثديية (قد يتم بصورة نموذجية استخدام أصل ال "5740" فقط نظراً لأنه يحتوي على المحفز). تكون معظم ناقلات التعبير عن الصيغة الوراثية عبارة عن ناقلات مكوكية ‎shuttle’‏ أى أنها تكون قادرة على التضاعف في فئة واحدة على الأقل من الكائنات الحية الدقيقة ولكن يمكن أن م تنقل ‎transfected‏ إلى كائن دقيق آخر بغرض التعبير عن الصيغة الوراثية. على سبيل المثال؛ يتم استنساخ ناقل في 085.001 ثم ينقل إلى خميرة أو إلى خلايا ثديية ‎ll‏ عن الصيغة الوراثية حتى و إذا لم يكن قادراً على التضاعف بمعزل عن ‎chromosome‏ خلية العائل بصورة مستقلة قائمة بذاتها. كما يمكن أن يتم أيضاً زيادة نسخ ‎amplifiecation‏ ال ‎DNA‏ بواسطة الإدخال في مجموعة ‎٠‏ العوامل الوراثية للعائل. يمكن أن يتم إتمام ذلك بالفعل باستخدام أنواع باسيلية "عصية" ‎(Bacillus)‏ ‏كعوائل؛ على سبيل المثال؛ بواسطة تضمينها في متتالية ال ‎DNA‏ لل ‎Bacillus‏ بهذا الناقل إلى معاودة الترابط الجينيً بمجموعة العوامل الوراثية وإدخال ال ‎Aa} DNA‏ ‎(mpl)‏ وعلى أية حال؛ فإن استعادة ال ‎DNA‏ لمجموعة العوامل الوراثية المشفرة لربيطة ‎(mpl)‏ ‏تكون في غاية التعقيد أكثر من الناقل خارجي التضاعف ‎exogenously replicated‏ أو التكون ‎ve‏ نظراً لأن إنزيم الهضم الحدي يكون مطلوباً ليستأصل أو لقطعال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏ ‏0 اختيار مُكوّن ال "جين" ‎Selection Gene Component‏ : الصيغة الوراثية وناقلات الاستتساخ يجب أن تحتوي جنباً للاختيار + على اختيار الجين؛ كما أنه يصطلح على أنها مادة ‎selectable marker‏ للاختيار. يقوم هذا الجين بتشفير البروتين الضخروري للإبقاء على الحياة ‎survival‏ أو الضروري ‎LIA gail‏ العائل المحولة ‎transformed‏ والتي تنمو في © وسط إستنبات منتقى. لا تستطيع خلايا العائل المحولة بالناقل المحتوي على جين الاختيار

- ١50 -

بالاستمرار في الحياة في الوسط الاستنباتيّ . تقوم جينات الاختيار النموذجية بتشفير البروتينات

حيث أنها 0( تمنح مقاومة للمضادات الحيوية ‎resistance to antiblotics‏ أر السميات ‎toxins‏

‎ampicillin «Jie cs AY!‏ » أو ‎neomycin‏ ¢ أو ‎methotrexate‏ » أو ‎tetracycline‏ أو

‏(ب) متممات أوجه القصور في التغذية ‎«complement auxotrophic deficiencies‏ أو (ج) تقوم

‏© بالامداد بمواد التغذية الحرجة ‎critical‏ غير المتوفرة في الأوساط المعقدة ‎complex media‏ ¢ على

‏سبيل المثال؛ الجين المشفر لانزيم راسيماز ©- آلانين ‎(D-alanine racemase)‏ للباسيليات

‎. Bacilli ‏"للعصيات"‎

‏تقوم أحد أمثلة مخطط الاختيار بامستخدام عقار لوقف 8::688 نمو خلية العائل. تقوم

‏الخلايا التي تتحول بنجاح بتضمين مع جين مختلف التركيب أو الشكل بالتعبير عن ‎٠‏ الصيغة الوراثية للبروتين المانح مقاومة لعقار وبالتالي البقاء في البيئة المختارة. تقوم ‎Jie AB‏

‎Southern et al, J.

Molec.

Appl] neomycin ‏هذا الاختيار السائد أو المهيمن باستخدام عقار‎

‎Mulligan et al., Science, 209: 1422] mycophenolic acid ‏أو‎ «[Genet., 1: 327 (1982)

‏)1980([< أو ‎[Sugden et al., Mol.

Cell.

Biol, 5: 410-413 (1985)] hygromycin‏ تقوم الأمثلة

‏الثلاث السابق طرحها باستخدام جينات بكتيرية تحت سيطرة موجهات ‎eukaryotic‏ لنقل المقاومة ‎١‏ ا للعقار المناسب ‎((G418)‏ أو إلى ‎«neomycin (geneticin)‏ أى ‎«xgpt (mycophenolic acid)‏ أو

‎hygromycin‏ ¢ على الترتيب.

‏هناك أمثلة ‎of gall‏ الدالة الأخرى المناسبة المختارة أو القابلة للاختيار والخاصة بخلايا اللدذيييات؛

‏وهى عبارة عن تلك المواد التي تكون قادرة على التعرف على خلايا مؤهلة مقتدرة على إستعياب

‏الحمض النووي لربيطة ‎Jie (mpl)‏ اتنزيم ‎thymidine sf dihydrofolate reductase (DHFR)‏ ‎kinase ٠‏ يتم وضع الثديية المتغيرة تحت ضغط اختياري بحيث تتم التهيئة بصورة فريدة لتبقى

‎١٠67 -‏ - المتغيرات فقط على قيد الحياة لأن لها خاصية إستعياب المادة الدالة. يتم فرض الضغط الاختياري بواسطة استتبات المتغيرات في وسط استتبات في الظروف التي يتغير فيها تركيز عامل الدالة في الوسط بصورة متعاقبة؛ وبالتالي يؤدي ذلك إلى زيادة تضاعف كل من جين الدالة وال ‎DNA‏ ‏الذي يشفر ‎polypeptide‏ ربيطة (ام). إن زيادة التضاعف عبارة عن العملية التي بواسطتها ‎٠‏ _يكون الطلب على الجينات بصورة متزايدة تلك التي تعني بإنتاج البروتينات الهامة للنمو وتك ون موجودة بصورة متكررة متعاقبة ‎in tandem‏ بداخل ‎chromosomes‏ الأجيال المتتالية للخلايا الناتجة عن الهندسة الوراثية. لقد تم تصنيع كميات متزايدة من ربيطة ‎(mpl)‏ وذلك من ال ‎DNA‏ ‏الذي تكررت مضاعفته . على سييل المثال؛ يتم أولاً التعرف على الخلايا المحولة بجين الدالة ‎(DHFR)‏ ‎٠‏ وتمييزها بواسطة الاستنبات في وسط إستنبات لجميع المتغيرات الموجودة في وسط الاستنبات الذي تحتوي على ‎methotrexate (Mix)‏ ¢ وعامل مضاد تنافسمي ‎competitive‏ ‎antagonist‏ لل ‎٠ (DHFR)‏ عندما يتم استخدام ‎(DHFR)‏ من النوع - الطبيعي ‎wild-type‏ ¢ تكون خلية العائل المناسبة عبارة عن خط خلية لمبيض همستر صيني "الهمستر ‎Chinese hamster‏ ‎ovary (CHO)‏ ¢ ضعيف ‎deficient‏ من حيث نشاط ‎«(DHFR)‏ ويتم تحضيره وتكثيره حسبما تم ‎٠‏ وصفه بواسطة [(1980) 4216 :77 ‎[Chasin.

Proc.

Natl.

Acad.

Sci., USA,‏ بعدهاء يتم تعريض الخلايا المحّولة لمستويات متزايدة من ‎(Mix)‏ يؤدي هذا إلى تصنيع النسخ المتعددة من جين ال ‎(DHFR)‏ وبصورة ملازمة؛ يؤدي ذلك أيضاً إلى أن يتم تصنيع نسخ متعددة من أحماض نووية ‎DNA‏ أخرى تكون مشتملة على النواقل المعبرة عن الصيغة الوراتية قل الل ‎DNA‏ المشفر لربيطة ‎(mpl)‏ يمكن أن يقم استخدام التكننيك ‎٠‏ (الطريقة ‎(Agi)‏ لهذه المضاعفة مع أى عائل مناسب من نوع آخر على سبيل المقال ‎((ATCC No.

CCL 61 0160-1 )‏ بدون مقاومة وجود ال ‎(DHFR)‏ الداخلي المنشأ والنموء

‎١49 -‏ على سبيل المثال ؛ استخدام جين ال ‎(DHFR)‏ المتحول الذي حدثت له طفرة ويكون مقاوماً بدرجة عالية لل ‎(Mix)‏ (البراءة الأوروبية رقم '060 ,117 ‎("EP‏ وبطريقة بديلة؛ فإن خلايا العائل [وبصفة خاصة خلايا العوائل التي تكون من النوع الطبيعي والتي تحتوي على ‎DHFR"‏ ‏داخلئ المنشاً والنمو] المحولة أو المحولة بصورة مشتركة مع متتاليات ‎(DNA) ٠‏ المشفرة لربيطة ‎o(mpl)‏ وبروتين ‎(DHFR)‏ من النوع الطبيعي؛ ومادة ‎Alla‏ أخرى قابلة للاختيار مثل ‎aminoglycoside 3' phosphotransferase (APH)‏ 43 يمكن اختيار هذه الخلايا بواسطة نمو الخلية في وسط يكون محتوياً على عامل اختيار للمادة الدالة القابلة للاختيار مل المضاد الحيوي ‎aminoglycosidic antibiotic‏ « على سبيل المثال؛ ‎neomycin sl « kanamycin‏ « أو 8م [أنظر البراءة الأمريكية رقم )199 ,965 ,4 ‎.[(US Patent No.‏ ‎٠‏ ومن جينات الاختيار المناسبة للاستخدام في الخميرة الجين (01) الموجود في ‎plasmid‏ الخميرة ‎Kingsman et al., Gene, 7, 141] ol ¢[Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979))(Yrp7)‏ (1979)]؛ أو ])1980( 57 1 :15 ‎-[Tschemper et al., Gene,‏ يقوم الجين ‎(trpl)‏ بتوفير ‎sale‏ اختيار دالة لسلالة محولة ومُحدث بها طفرة لخميرة وتفتقر القدرة على النمو في ‎tryptophan"‏ "¢ على سبيل المثالء 44076 ‎ATCC No.‏ أو 4-1 ‎-[Jones, Genetics, 85: 12 (1977)] PEP‏ إن وجود ‎Ne‏ موضع ‎(1rpl) cesion‏ في مجموعة ‎Jal gall‏ الوراثية لخلية خميرة العائل ستوفر حينئذ ‎Af‏ ‏فعالة ومؤثرة في الكشف عن وتحديد التحول بواسطة ‎sell‏ في غياب ‎tryptophan’‏ وعلى نفس المنوال؛ يتم استكمال سلالات الخميرة المفتقرة للجين ‎ATCC No. 20, 622) "Leu2"‏ أو ‎ATCC‏ ‎(No. 38, 626‏ وذلك بواسطة ‎4d y yealplasmids‏ الحاملة للجين "2 ‎Leu‏

١؛8‎ -

‘Promoter Component ‏مكون المادة المحفزة‎ (iv) ‏من المعتاد؛ أن تحتوي النواقل المعبرة عن الصيغة الوراثية ونواقل الاستنساخ على مادة محفزة‎ ‏يتم التعرف عليها وتمييزها بواسطة كائن حىّ دقيق للعائل ويكون مرتبطاً بصورة تشغيلية مع‎ ‏تكون المواد المحفزة عبارة عن متتاليات غير مترجمة موجودة‎ (mpl) ‏الحمض النووي لربيطة‎ ‏(بصفة عامة يكون فيما بين من‎ upstream ‏للجين البنائي‎ start codon ‏فيما بعد )0( كودون البداية‎ © ‏وترجمة‎ control the transcription ‏والتقي تتحكم في نسخ‎ (bp "٠٠٠١" Mbp ٠ ١ ‏التي ترتبط‎ (mpl) ‏متتالية الحمض النووي لربيطة‎ Jia ‏متتالية حمض نووي خاصة؛‎ 0108 ‏حاثة‎ A ‏هذه المواد المحفزة بداخل فئتين؛‎ Jie ‏بصورة تشغيلية. وبصورة نموذجية؛ تقع‎

‎inducible‏ (مؤثرة) وفئة بنائية ‎constitutive‏ وتكون المواد المحفزة الحاثة أو المؤثرة عبارة عن ‎٠‏ المواد المحفزة التي تقوم بحث بداية ‎tate‏ لنسخ من ال ‎(DNA)‏ وتحت سيطرتها واستجابة لبعض التغيرات في ظروف وحالات الاستنبات ‎culture conditions‏ ؛ على سبيل المثال» وجود أو

‏عدم وجود مادة غذائية أو حدوث تغير في درجة الحرارة. في هذا الوقت؛ يتم التعرف على عدد

‏كبير من المواد المحفزة وتمييزها بواسطة عدد متنوع من خلايا العائل المحتملة المعروفة معرفة

‏جيدة. يتم ربط هذه المواد المحفزة بصورة تشغيلية بربيطة ‎(mpl)‏ في ‎DNA‏ بواسطة إزالة المادة

‎٠‏ المحفزة من مصدر ال ‎(DNA)‏ بواسطة إنزيم الهضم ‎restriction enzyme‏ الحدي وإدخال متتالية المادة المحفزة المفصولة إلى الناقل. قد تستخدم كل من متتالية المادة المحفزة لربيطة

‎(mpl)‏ والكثير من المواد المحفزة المختلفة التركيب أو الشكل وذلك لتوجيه تكرار التضاعف و/أو التعبير ‎expression‏ عن الصيغة الوراثية للحمض النووي ‎DNA‏ لربيطة ‎Jes (mpl)‏ أية ‎(Js‏

‏فإن المواد المحفزة المختلفة التركيب أو الشكل هي المفضلة؛ نظراً لأنها بصفة عامة تسمح بنسخ

‎٠‏ أكبر وبحصيلة نواتج أعلى من ربيطة ‎(mpl)‏ المعبرة عن الصيغة الوراثية مقارنة بالمادة المحفزة

‏لربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية .

‎٠49 -‏ — تشتمل المواد المحفزة المناسبة للاستخدام مع ‎prokaryotic‏ العائلة وذلك على إنزيم ‎lactamase‏ — 8 وأنظمة لاكتوز محسنة ‎Nature] lactose promoter systems‏ ملة ‎Chang et‏ )1978( 615 :275]؛ ])1979( 544 :281 ‎{{Goeddel et al, Nature,‏ و ‎alkaline phosphatase‏ النظام المحسن لل ‎{[Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)] tryptophan (trp)‏ ‎٠‏ والبراءة الأوروبية رقم )36776 88)؛ والمواد المحفزة المهجنة مثل المادة المحفزة "تاك" ‎(tac)‏ ‎i Jes [de Boer et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 80: (21-25) (1983)]‏ حال؛ فإن هناك بعض المواد المحفزة البكترية المعروفة الأخرى المناسبة. لقد تم نشر متتالياتها الل ‎nucleotide‏ ‏الخاصة بهاء وبالتالي» فإن هذا مكن العاملين المهرة في مثل هذا المجال من أن يقوموا بصسورة تشغيلية بربططها ‎linking‏ بالحمض النووي ‎(DNA)‏ المشفر لربيطة ‎(mpl)‏ ‎[Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)] ٠‏ وذلك باستخدام وسائل ربط ‎linkers‏ أو مهيئات 359 لامداد بأية مواقع هضم حزي مطلوبة. كما أن المواد المحفزة التي تكون بغرض الاستخدام في الأنظمة البكتيرية ستحتوي أيضاً على متتالية ‎Shine - Dalgamo (S.D.)‏ التي يتم ربطها بصورة تشغيلية مع ال ‎(DNA)‏ المشفر ل ‎polypeptide’‏ " ربيطة ‎(mpl)‏ ض لقد ‎ci jo‏ متتالية المحفزة بالنسبة لل 98 . وبصورة واقعية؛ فإن جميع جنات ال ‎eukaryotes ٠‏ لها منطقة غنية ب قواعد 7م موجودة فيما بين قواعد تتراوح من حوالي ‎(Yo)‏ ‏إلى ‎)“١(‏ تقريباً قبل ‎upstream‏ الموقع الذي عنده يبدا النسخ. لقد وجدت ‎Ale‏ أخرى فيما بين قواعد تتراوح من ‎(V1)‏ إلى ‎(A+)‏ قبل نقطة من بداية النسخ للكثير من الجينات وهي عبارة عن المنطقة 607" حيث من الممكن أن تكون ‎X‏ عبارة عن أى " بولي ببتيد". وعند النهابة الطرفية ‎Cy‏ لمعظم ‎eukarvotic‏ تكون المتتالية ‎AATAAA‏ التي قد تكون إشارة ‎signal‏ لإضافة ‎Ye‏ ثيل البولى م إلى النهاية الطرفية "م للمتالية المشفرة. كل هذه المتتاليات يتم إدخالها بصورة مناسبة المتتاليات في النواقل المستخدمة في التعبير الوراتي لل ‎eukaryotic‏ .

وتشتمل أمثلة المتتاليات المحفزة المناسبة بغرض الاستخدام مع الخميرة العائلة تشمل المحسنات لل ‎[Hitzeman et al, J.

Bio.Chem. 255: 2073 (1980)] 3-phosphoglycerate kinase‏ أو ‎glycolytic enzymes‏ أخرى ])1968( 149 :7 ‎[Hess et al, J.

Adv.

Enzyme Reg,‏ ‎[Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)]‏ مثل إنزيمات ‎glyceraldehyde-3- ¢ enolase‏ ‎phosphofructokinase ¢ pyruvate decarboxylase « hexokinase ¢« phosphate dehydrogenase ©‏ ‎pyruvate kinase ¢ 3-phosphoglycerate mutase ¢ glucose-6-phosphate isomerase ¢‏ ¢ ‎glucokinase « phosphoglucose isomerase > triosephosphate isomerase‏ . وتكون محفزات الخميرة الأخرى التي تكون عبارة عن محفزات حاثة وذات الميزة أو الفائدة الإضافية في النسخ المسيطر عليه بواسطة ظروف النمو ‎growth conditions‏ ؛ تكون هذه ‎٠‏ المحسنات المحفزة لإنزيمات 2 ‎alcohol dehydrogenase‏ و © ‎isocytochrome‏ « و ‎acid‏ ‎phosphatase‏ » وانزيمات التحلل المتعلقة.؛ بأيض ‎¢nitrogen‏ و ‎metallothionein‏ « و ‎glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase‏ » وكذلك أيضاً الانزيمات المسئولة عن ايض 6 و ‎galactose‏ كما أنه تم أيضاً بالإضافة لما تقدم وصف نواقل ومواد محفزة مناسبة للاستخدام في التعبير عن الصيغة الوراثية للخميرة وذلك في البراءة الأوروبية رقم ‎EP)‏ ‎ve‏ 736578) ل ‎Hitzeman‏ وآخرين . كما يتم أيضاً بصورة مفيدة استخدام معززات ‎enhancers‏ ‏الخميرة مع محفزات ‎promoters‏ الخميرة . تتم السيطرة على نسخ ربيطة ‎(mpl)‏ من النواقل الموجودة في خلايا عائل من الثدييات؛ كأن تتم السيطرة على سبيل ‎(JE‏ بواسطة المواد المحفزة التي يتم الحصول عليها من مجموعة العوامل الوراثية للفيروسات مثل فيروس بوليوما ‎«(polyoma)‏ وفيروس فولبوكس ‎(fowlpox)‏ [براءة 3 المملكة المتحدة رقم )504 ,211 ,2 ‎(UK‏ التي تم نشرها في 0 يوليو ‎(a) AA)‏ وفيروس.

‎١١١٠ -‏ - ‎¢("adenovirus 2" Ji) adenovirus‏ وفيروس "بابيللوم" البقري ‎bovine papilloma virus‏ « وفيروس "ساركوما" الطائري ‎avian sarcoma virus‏ ¢ و فيروس ‎cytomegalovirus‏ « والفيروس الارتجاعي ‎retrovirus’‏ " وفيروس إلتهاب الكبد الوبائي - ‎B‏ "قبعب ‎hepatitis-B‏ "» والأكثر تفضيلاً منها فيروس سيماين "+" )40 ‎of Simian Virus‏ من المواد المحفزة الثديية المختلفة ‎oo‏ التركيب أو التشكيل» مثل مادة ال ' ‎"actin promoter‏ المحفزة أو المادة المحفزة ل جلوبيلين (بروتين) المناعة ‎immunoglobulin‏ ؛ من المواد المحفزة لضربة الشمس ‎heat-shock promoters‏ ؛» ومن المادة المحفزة التي تكون في المعتاد مصحوبة بمتتالية ربيطة ‎(mpl)‏ شريطة أن مثل هذه المواد المحفزة تكون متوافقة ‎compatible with‏ مع أنظمة خلايا العائل. بصورة ملائمة؛ يتم الحصول على المواد المحفزة للفيروس ‎(SVA40)‏ وهي المبكرة والمتأخرة ‎٠‏ وذلك في صورة جزء لإنزيم هضم حزي ‎(SVA0)‏ والذي يحتوي أيضاً على مكان إيتداء التضاعف الفيروسي لل ‎Mulligan and]¢[Fiers et al, Nature, 273: 3 (1978)] « (SVA40)‏ ‎Acad., Sci, USA] «[Berg.

Science, 209: (1422-1427) (1980)‏ انهل ‎Pavlakis et al., Proc.‏ )1981( 7398-7402 :18]. وبصورة ملائمة؛ يتم الحصول على محفز المرحلة المبكرة المباشر لفيروس البشري ‎cytomegalovirus‏ 0 في صورة جزء لإنزيم الهضم الحزي المسمى ‎(Hindill "E") ٠‏ كما تم وصف ذلك في ‎Gene]‏ ملة ‎Hindill E restriction fragment Greenway et‏ (1982) 355-360 :18]. لقد تم كشف النقاب عن نظام للتعبير عن الصيغة الوراثية لل ‎(DNA)‏ ‏في عوائل ‎Audi‏ باستخدام فيروس " ‎"papilloma‏ البقري ‎JS‏ وذلك في البراءة الأمريكية رقم ‎(U.S.

Pat.

No. 4, 419, 446(‏ كما تم وصف تعديل هذا النظام في البراءة الأمريكية رقم ‎.(U.S.Pat.

No. 4, 601, 978)‏ أنظر أيضاً ])1982( 503-508 :295 ‎[Gray et al, Nature,‏ فيما ‎٠‏ يتعلق بالتعبير عن الصيغة الوراثية ‎jis) (cDNA)‏ ل ‎deli interferon‏ في خلايا قرد؛ وأنظر أيضاً [(1982) 598-601 :297 ‎[Reyes et al, Nature,‏ فيما يتعلق بالتعبير عن الصيغة

‎١١7 -‏ الوراثية ل ‎p-interferon‏ لل ‎(cDNA)‏ في خلايا فأر من الفئران تحت سيطرة المادة المحفزة "ليميدين كيناز" المأخوذ من فيروس هيربس سملبكس ‎Canaani and] » herpes simplex virus‏ ‎[Berg, Proc.

Natl, Acad.

Sci.

USA, 79: 5166-5170 (1982)‏ فيما يتعلق بجين ‎B, -interferon‏ البشري في خلايا فأر وأرنب مستنبتة في وسط إستباتي ؛ وأنظر أيضاً [ملة ‎Gorman et‏ ‎Led [Proc Natl.

Acad.

Sci., USA, 79: 6777-6781 (1982) ٠‏ يتعلق بالتعبير عن الصيغة الوراثية للمتتاليات البكترية ‎CAT‏ في ‎LDA‏ كلية قرد 017-1؛ وفي ‎WIA‏ الأنسجة الليفية الجينية للدجاج ‎chicken embryo fibroblasts‏ ؛ وفي ‎WIA‏ مبيض الهمستر الصيني ‎Chinese hamster ovary‏ ‎cells‏ ؛ وفي الخلايا ‎Hela!‏ وفي الخلايا ‎lll 'NTH-3T3"‏ وذلك باستخدام فيروس ال " ‎"sarcoma‏ الجزء المعروف ب ‎(LTR) longterminal repcat‏ كمحفز . ‎(v) ٠‏ مكون عنصر المادة المعززة ‎Enhancer Element Component‏ : في الغالب؛ يتزايد نسخ ‎DNA‏ المشفر لربيطة ‎(mpl)‏ في هذا الاختراع بواسطة ‎eukaryotes‏ ‏وذلك بواسطة إدخال متتالية لمادة معززة في ناقل . تكون المواد المعززة عبارة عن عناصر تعمل بصورة سيز ‎Tais™‏ (على جانب من جوانب) ال ‎DNA‏ من المعتاد أن يتراوح من حوالي ‎)٠١(‏ ‎bp )٠٠١( Sop‏ تقريباًء والتي تعمل على المادة المحفزة بزيادة نسخها. ومن المعتاد. أن تكون ‎٠‏ المواد المعززة ذات توجيه نسبي ومستقلة الموضع وموجودة في الموضع 0 ‎([Laimins et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 78: 993 (1981)]‏ وفي الموضع ‎v‏ ا ‎Cell Bio., 3: 1108 (1 983)]‏ ,اما ‎[Lusky et al,‏ إلى حيث وحدة النسخ ¢ بداخل ‎intron‏ ‎[Banerji et al., Cell, 33 729 (1983)]‏ وكذلك أيضاً بداخل المتتاليات حاملة المعلومة ‎Osborne]‏ ‎ail [et al., Mol.

Cell Bio., 4: 1293 (1984)‏ عرفت الكثير من متتاليات المادة المعززة وذلك من ‎Bla ٠‏ الجينات الثديية [ومنها المأخوذ من ‎albumin ¢ elastase ¢ globin‏ "البروتين الدهني-أ"

‎Voy —‏ _ ‎le [insulin ¢ a-fetoprotein‏ أية حال ؛ وبصورة نموذجية؛ سيقوم أحد الأشخاص المتخصصين باستخدام مادة معززة مأخوذة من فيروس خلية ‎eukaryotic‏ . تشتمل أمثلة المواد المعززة على المادة المعززة ال ‎(SVA0)‏ الموجودة على الجانب المتأخر من مكان بدء التضاعف ‎¢(bp 770 — ٠٠١( origin‏ والمادة المعززة للمادة المحفزة في المرحلة المبكرة لفيروس ‎cytomegalovirus ©‏ ؛ والمادة المعززة لفيبروس ‎le polyoma‏ الجانب المتأخر من مكان بدء التضاعف؛ والمواد المعززة لفيروس ‎adenovirus‏ أنظر أيضاً ]18 -17 :297 ‎Yaniv, Nature,‏ ‎Lad [(1982)‏ يتعلق بتعزيز العناصر لتتشيط المواد المنشطة بمحفزات ال ‎eukaryotic‏ ‎promoters‏ . قد توصل أو تقرن المادة المعززة بداخل الناقل عند الموضع 5 أو '3 مع ربيطة ‎(mpl)‏ المشفرة للمتتالية؛ ولكن من المفضل أن تكون موجودة عند الموقع 5 من المادة المحفزة. ‎(vi) | ٠‏ مكون نهاية طرف النسخ ‎Transcription Termmaflon Component‏ ستحتوي أيضاً نواقل التعبير عن الصيغة الوراثية المستخدمة في خلايا — ‎Je) eukaryotic‏ الخميرة ‎yeast‏ ؛ أو الفطيرات ‎tungi‏ ؛ أو النبات ‎«plant‏ أو الحيوان ‎animal‏ ¢ أو الخلايا ذات الأنوية من الكائنات الحية الأخرى عديدة الخلايا وذلك بأنها تحتوين متتاليات ضرورية لإنياء النسخ ولتثبيت ‎(mRNA) stabilizing‏ ومن المألوف والشائع أن تكون ‎ia‏ هذه المتتاليات ‎٠١‏ _متوفرة في المناطق غير المترجمة '5 وبمحض الصدفة من المناطق غير المترجمة '3 لكل من ‎(DNAs)‏ أو ‎(cDNAs)‏ ال ‎eukaryotic‏ أو الفيروسية. تحتوي هذه المناطق على أجزاء 56 منسوخة في صورة أجزاء ‎polyadenylated‏ في الجزء غير المترجم ‎untranslated‏ ‏لل ‎(mRNA)‏ المشفر لربيطة ‎(mpl)‏

‎ot —‏ _ ‎(vii)‏ بناء وتحليل ‎Construction ana Analysis of Vectors J8 sill‏ : يقوم بناء وتكوين نواقل محتوية على مكون واحد أو أكثر من المكونات السابق ذكرها باستخدام تقنيات أو طرق ربط فنية قياسية؛ أو بلازميدات منفصلة ‎«Isolated plasmids‏ أو أجزاء ‎DNA‏ ‏5 تكون محاكة ‎tailored‏ « ومكيفة 385( حاجة أو ‎ima le‏ ومعادة الربط ‎religated‏ ‎٠‏ وذلك في الصورة المرغوب فيها لكى يتم إنتاج ‎plasmids‏ المطلوبة. لأغراض إجراء التحليل لتأكيد متتاليات صحيحة في ‎plasmids‏ التي تم تكوينها وبناها؛ يتم استخدام مخاليط ربط لتحويل السلالة 204 لل 1612 ‎(ATCC No. 31, 446( E.coli‏ والمتحولات الناجحة المختارة من مقاومة ‎ampicillin‏ أو ‎tetracycline resistance‏ أيهما يكون ‎Labia‏ يتم تحضير ال 5 من المتحولات»؛ ثم يتم تحليلها بواسطة إنزيم الهضم الحزي " ‎"endonuclease ٠‏ و/أو وضعها في صورة متتالية بواسطة طريقة ‎Messing et al., Nucleic Acids]‏ ‎[Res., 9:309 (1981)‏ أو بواسطة طريقة ]499 :65 ‎Maxam et al, Methods in Enzymology‏ )1980([. ‎(viii)‏ نواقل التعبير ‎Transient Expression Vectors‏ : تتمثل الأمور المفيدة بصفة خاصة في ممارسة وتنفيذ هذا الاختراع في نواقل التعيير عن الصيغة ‎٠‏ _الوراثية التي يتم توفيرها للتعبير العرضي عن الصيغة الوراثية في الخلايا الشيية لل ‎DNA‏ ‏المشفر ل ‎polypeptide‏ ربيطة (ام«). وبصفة ‎dale‏ يشتمل التعبير العرضي عن الصيغة الوراثقية على استخدام ناقل معبر عن الصيغة الوراثية يكون قادراً على أن يقوم بإجراء التضاعف 0 بكفاءة في خلية ‎(Jile‏ بحيث تقوم خلية العائل بعمل تراكم للكثير من نسخ الناقل المعبر عن الصيغة الوراثية؛ وبدور» يقوم بتصنيع مستويات ‎Ble‏ من " ‎"polypeptide‏ مرغوب فيه مشفر بواسطة ناقل التعبير عن الصيغة الوراثية

— ١950 ‏تسمح أنظمة التعبير العورضي عن الصيغة‎ [Sambrook et al., supra, pp (16. 17 -16.22)] ‏الوراثية ؛ المشتملة على ناقل مناسب للتعبير عن الصيغة الوراثية وخلية عائل بتحقيق التعرف‎ ‏مُستنسخة؛ وكذلك أيضاً بإجراء‎ (DNAs) ‏المشفرة بواسطة‎ " polypeptide” ‏الإيجاب' الملاثم لل‎ ‏فيما يتعلق بالخواص البيولوجية أو الفسيولوجية‎ polypeptide’ ‏التصنيف السريع لمثل هذه ال‎ ‏المطلوبة والمرغوب فيها. لذلك؛ تكون أنظمة التعبير العرضي عن الصيغة الوراثية مفيدة بصفة‎ ٠ ‏ربيطة‎ " polypeptide’ ‏خاصة في الاختراع لأغراض التعرف على مماثلات (نظائر) ومتغيرات‎ (mpl) ‏ربيطة‎ " polypeptide’ ‏التي تكون ذات نشاط بيولوجيّ ل‎ (mp1)

Suitable Exemplary Vertebrate ‏نواقل نموذجية مناسبة لخلية فقارية (من خلايا الفقاريات)‎ (ix) :Cell Vectors (mpl) ‏لقد تم وصف طرقاً أخرى» ونواقل؛ وخلايا عائل مناسبة للتكيف والتهيئة مع تصنيع ربيطة‎ ٠

Gething et al., Nature] ‏وذلك في مقالات كل من‎ BY ‏في وسط إستنبات خلية فقارية مهندسة‎

Mantel et al, Nature, 281: 40-46 (1979)] ¢[293: 620-623 (1981) ‏ويكون‎ (EP 117, 058) (EP 117, 060) ‏وفي البراءتين الأوروبيتين رقمى‎ Levinson et al.” ‏بصفة خاصة للتعبير عن الصيغة الوراثية لوسط استنبات خلية ثديية للمجموعة‎ ial) plasmid ‏والبراءة الأمريكية‎ (EP 307, 247) ‏[البراءة الأوروبية رقم‎ pRKS ‏عبارة عن‎ (mpl) ‏الترابطية‎ ve

PCT ‏[طلب البراءة الدولية رقم‎ pSVI6B ‏أو عبارة عن‎ [(US. Patent No. 5, 258, 287(( ‏رقم‎ ‎[Publication No. WO (91/08291) : Selection and Transformation of Host Cells ‏د. اختيار وتحويل خلايا العائل‎ ‏تكون خلايا العائل المناسبة هنا للاستنساخ أو للتعبير عن الصيغة الوراثية للنواقل عبارة عن خلايا‎ ‏ذات أنوية طبيعية عالية من خلايا العائل والتي تم‎ DA ‏؛ أو‎ yeast ‏أو خلايا خميرة‎ prokaryote ٠

‎Yo —‏ — وصفها من قبل. تشتمل الخلايا التي ال ‎eukaryotic‏ المناسبة على ‎eubacteria‏ مثل الكائنات الحية الدقيقة السلبية لصبغة جرام "01800-06880376" أو الإيجابية لصبغة جرام ‎"Gram-positive"‏ على سبيل المثال» ‎E.coli.‏ و ‎Bacilli‏ مقل أنواع ‎B. subtilis‏ «¢ وأنواع 5 مقل ‎(P. aeruginosa‏ أو ‎«Salmonella typhimurium‏ أو ‎Serratia marcescans‏ العائل المفضل من ‎E.coli ©‏ هو السلالة )446 .31 ‎E.coli 294 (ATCC No.‏ هذا بالرغم من أن هناك سلالات أخرى تكون مناسبة لهذا الغفرض ‎W «E.coli x 1776 (ATCC No. 31, 537) «E.coli B Jia‏ تامع ‎(ATCC No. 27, 325)‏ 3110. وهذه الأمثلة مطروحة بغرض التوضيح فقط لا بغرض الحصر والتحديد. ومن المفضل؛ أن تقوم خلية العائل بافراز الكميات الأدنى من إنزيمات التحلل البروتيني. وبطريقة بديلة؛ فإن طرق التجارب المعملية لإجراء الاستتساخ على سبيل المشال ‎PCR)‏ أو تفاعلات إنزيم 'بوليميراز" الحمض النووي ‎os SAY) DNA‏ فإنها تكون هي المناسبة في هذا المجال. وبالإضافة لل 8 » فإن الميكروبات ‎Jie eukaryotic‏ الفطريات الخيطية ‎filamentous‏ ‎fungi‏ أو الخميرة تكون عبارة عن عوائل مناسبة لنواقل ‎pi‏ ربيطة ‎.(mpl)‏ إن خميرة ال ‎Saccharomyces cerevisiae‏ أو خميرة الخبز ‎baker's yeast‏ المألوفة هي الأكثر شيوعاً في الاستخدام من بين الكائنات الدقيقة لعائل ‎eukaryotic‏ الأدنى وعلى أية ‎Ja‏ فإن هناك عدداً آخر من أجناس » وأنواع؛ وسلالات أخرى متوفرة بصورة مألوفة ومفيدة هنا ‎Jie‏ ‎{[Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981)] Schizosaccharomycespombe‏ والبراءة الأوروبية رقم )383 ,139 ‎(EP‏ التي تم نشرها في ¥ مايو ‎AAC)‏ )4 والعوائل من النوع ‎Kluyveromyces hosts‏ التي نشرت في البراءة الأمريكية رقم )529 ,943 ,4 ‎«(U.S.

Paten No.‏ ‎٠‏ على سبيل المثال :

١7 -

K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 11983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, and K. marxianus, yarrowia [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070;

Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1 988]). Candida.

Trichoderma reesia (EP 244,234). Neurospora crassa (Case et awl., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]) ° : ‏والفطريات الخيطية كأن يكون ذلك على سبيل المثال‎

Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 9 1/00357 published 10 January 1991), and

Aspergillus hosts such as A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun.. 112:284-289 [1983); Tilburn er a!., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et aL,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:1470-1474 [1984]) and A. niger (Kelly and ٠١

Hynes, EMBO j, 4:475-479 ]1985[( ‏وذلك مسن‎ glycosylated (mpl) ‏تشتق خلايا العائل المناسبة للتعيير عن الصيغة الوراثية لربيطة‎ ‏العائل قادرة على إجراء معالجة‎ LIA ‏الكائنات الدقيقة المتعددة الخلايا. تكون مثل هذه الخلايا من‎ ‏ومن المبادئ الأساسية؛ فإن‎ .) glycosylation ‏معقدة والقيام بأنشطة جلوكوسيلاتية (إنتاج مركب‎ ‏للعمل وللتشغيل سواء كان هذا‎ SHB ‏عالية فإنه يكون‎ eukaryotic ‏أى وسط استنبات لمزرعة خلية‎ 10 ‏"من الفقاريات" أو لافقاري. وتشتمل أمثلة الخلايب‎ vertebrate ‏الوسط الاستباتي للمزرعة فقاري‎ ‏لقد تم التعرف على سلالات فيروسية‎ insect ‏أو خلايا حشرات‎ plants ‏اللأققرية على خلايا‎ permissive ‏الشكل عديدة ومتغيرات وخلايا العائل الحشري المباح المستقل‎ baculoviral ‏عصوية‎ ‎Aedes aegypti «Spodoptera frungiperda (caterpillar) ‏المقابل المأخوذة من عوائل مقثل‎

- ١١8 -

Bombyx «Drosophila 116180025161 (fruitifly) «Aedes albopictus (mosquito) ¢«(mosquito) : ‏تم تمييزها. أنظر على سبيل المثال‎ S85 cmori

Neurospora crassa ( Case et.al,. Proc. . Natl. Acad. Sci USA, 76 : 5259 - 5263 [1979], and Filamentous Fungi such as, e.g. Neurospora Luckow et al.. Bio/Technology, 6:47-55

[1988]. Miller et al., Genetic Engineermg, Setlow et al., eds. Vol. 8 (Plenum Publishing ° 1986), pp. 277-279; and Maeda et al, Nature, 315:592-594 [1985 وهناك تنوع من السلالات الفيروسية لنقل ‎da slaall transfection‏ الوراثية متوفرة بصورة شائعة على سبيل المثال المتغير ‎(L-1)‏ لل ‎"Autographa califonica NPV"‏ والساالة ‎(Bm-5)‏ لل ‎"Bombyx mori NPV"‏ وقد تستخدم ‎Jia‏ هذه الفيروسات في صورة الفيروس المستخدم هنا وفقاً ‎Spodoptera frugiperda’ ‏ا للاختراع الحالي وبصفة خاصة لنقل المعلومة الوراثية لخلايا‎ ٠ ‏يمكن أن يتم استخدام أوساط إستنبات لمزرعة خلية نباتية لكل من القطن ‎«cotton‏ والذرة ‎corn‏ ‏والبطاطس ‎potato‏ ؛ وفول الصويا ‎soybean‏ ؛ والبطونية ‎petunia‏ "نبات أمريكي من الفصيلة الباذنجانية"؛ والطاطم ‎tomato‏ ؛ والتبغ "التوباكو ‎"tobacco‏ وذلك في صورة عوائل ‎‘hosts‏ ‏وبصورة نموذجية؛ يتم نقل المعلومة الوراثية لخلايا النبات بالتحضين مع سلالات معينة مأخوذة ‎٠‏ من ال ‎"Agrobacterium tumefaciens’‏ البكترية؛ التي قد تمت معالجتها مُسبقاً لتحتوي على ال ‎cl .(mpl) Atay (DNA)‏ تحضين الوسط الاستتباتي لخلية ‎ell‏ مع ‎«A. tumefaciens)‏ ينتقل ال ‎DNA‏ لربيطة ‎(mpl)‏ إلى عائل خلية النبات بحيث أنه ينتقل 0 باستعياب المعلومة في الخلية النباتية؛ وفي ظروف ملائمة؛ فإنه يعبر عن الصيغة الوراثية لل ‎(DNA)‏ لربيطة (ام(م). بالإضافة إلى ذلك؛ فإن المتتاليات التنظيمية والإشارية ‎٠‏ المتوافقة مع خلايا النبات تكون متوفرة؛ مثل المادة المحفزة كمحفز ‎nopaline synthase‏

‎١٠١8! —‏ - والمتتاليات من نوع ‎polyadenylation‏ الإشارية ‎Depicker et al., J.

Mol.

Appl.

Gen.) . signal‏ )1982( 561 :1]. بالإضافة إلى ذلك؛ فإن أجزاء ‎J) DNA‏ يتم فصلها من المنطقة التي ثلي الجين ‎(T-DNA 780 gene)‏ تكون قادرة على تنشيط أو زيادة مستويات النسخ للجينات القابلةٍ لأن تعبر عن الصيغة الوراثية للنبات المهندس ورائياً ‎DNA‏ « البراءة الأوروبية رقم (196 ,321 ‎(EP‏ ‎٠‏ التي تم نشرها في ‎1١‏ يونيو (1989م). على أية حال؛ فإن الاهتمام قد بلغ أقصاه في خلايا الفقاريات» وأصبح انتشار خلايا الفقاريات في مزرعة النسيج (في الوسط الاستنباتي للنسيج) إجراءاً روتينياً في السنوات الحالية ‎Tissue]‏ ‎.[Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)‏ أمثلة على سلالات خلايا العائل الثديي المفيدة خلايا 0171 لكلية قرد ‎monkey kidney‏ تحول بواسسطة ‎COS-7, ATCC)‏ ‎«SV40 (CRL 1651 ٠‏ وسلالة لكلية جنينية بشرية ‎human embryonic kidney‏ (خلايا 293 أو 3و2 مستنسخة تعاقبياً بالتتمية لنمو في مزرعة أو وسط إستنباتي كمعلق ‎Graham et al.,] «suspension‏ ‎(J.

Gen Virol, 36: 59 (1977)‏ وخلايا كلية لهمستر وليد ‎BHK, ATCC) baby hamster‏ ‎¢(CCLI1O‏ وخلايا مبيض لهمستر صيني ‎DHFR (CHO, [3 Chinese hamster ovary cells‏ ‎¢Urlauband Chasin, Proc.

Natl, Acad.

Sci.

USA, 77: 4216 (1980)‏ وخلايا ‎sertoli cells‏ ‎٠‏ لفأر ))1980( 243-251 :23 ‎¢(TM4, Mather, Biol.

Reprod.,‏ وخلايا كلية قرد ‎monkey‏ ‎¢(CV1 ATCC CCL 70) Kidney cells‏ وخلايا كلية قرد أخضر أفريقي ‎Affican green monkey‏ ‎DA ¢(VERO-76, ATCC CRL-1 587) kidney cells‏ سرطانية عنقية بشرية ‎human cervical‏ ‎¢(HELA, ATCC CCL2) carcinoma cells‏ وخلايا كلية كلابية ‎MDOK,) canine kidney cells‏ ‎(ATCC CCL 34‏ وخلايا ‎aS‏ جرذ جاموسي ‎BRL 3A, ATCC CRL) buffalo rat liver cells‏ ‎٠‏ 1442( وخلايا رئية بشرية ‎«(W 138, ATCC CCL 75) human lung cells‏ وخلايا ‎2S‏ بشري ‎«(Hep G2, HB 8065) human liver cells‏ وورم ثديي لفأر ‎MMT) mouse mammary tumor‏

— ١١١ -

Mather et ‏لد‎ Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68] TR1 ‏وخلايا‎ ¢(060562, ATCC CCL 51 )1982([¢ وخلايا "5 ‎(FS4 Wa MRC‏ وسلالة خلايا ورم كبدي بشري ‎human hepatoma‏ . (Hep G2) line من المفضل أن تنقل المعلومة الوراثية للخلايا المضيفة وتحور ‎transformed‏ بواسطة النواقل ‎٠‏ المذكورة اعره في هذا الاختراع وأن يتم استنباتها في وسط إستنبات غذائي تقليدي عادي يتم تعديله ليكون في صورة ملائمة لحث وإستثارة المواد المحفزة ‎«inducing promoters‏ أو مناسباً لاختيار المواد المُحولة ‎selecting transformants‏ + أو لتكرار مضاعفة ‎amplifying‏ الجينات المشفرة للمتتاليات المطلوبة المرغوب فيها.

La ‏الصيغة الوراثية بواسطة‎ vector ‏إلى إستعياب الناقل حامل‎ Transfection ‏مصطلح‎ yu) ‎٠‏ العائل سواء استطاع العائب أو لم يستطع التعبير عن أي معلومة مشفرة في هذا الناقل . لقد عرفت طرقاً عديدة ‎Jil‏ ولتحويل المعلومة الوراثية كما يعرفها الفنيين المهرة العاديين على سبيل المثال بواسطة +0؛ وعملية تكوين المسام كهربياً ‎electroporation‏ وبصفة ‎dale‏ يمكن تمييز الانتقال والتحول الوراثي الناجح يعرف عندما تكون هناك دلالات للتعبير عن الناقل بداخل خلية العائل. ‎Jl ‏قابلاً‎ DNA ‏حيث لكى يكون ال‎ organism ‏في كائن دقيق‎ DNA ‏يعني التحول إدخال‎ ١ ‏خارجي أو عنصسر‎ extrachromosomal ‏سواء كان في صورة عنصر كروموزومي‎ replicable el a) ‏ووفقاً لخلية العائل المستخدمة؛ يتم عمل‎ .chromosomal integrant ‏مضمن كروموزومياً‎ ‏التحول باستخدام تقنيات قياسية مناسبة لمثل هذه الخلايا. تستخدم بصفة عامة المعالجة بال‎

Sambrook — (1.82) ‏؛ حسبما تم وصف ذلك في القسم‎ calcium chloride ‏بواسطة‎ calcium ‎٠‏ وآخرين؛ وذلك عند ال ‎prokaryotes‏ أو ‎WAL‏ الأخرى التي تحتوي على حواجبز لجدران

‎1١١ -‏ — خلوية ‎cell-wall‏ . تستخدم الإصابة بالعدوى ب ‎Agrobacterium tumfaciens‏ لتحويل خلايا نبلت معينة؛ حسبما تم وصف ذلك بمعرفة ])1983( 315 :23 ‎[Show et al., Gene,‏ وطلب البراءة الدولية رقم )89/05859 ‎(WO‏ الذي تم نشره في ‎YA‏ يونيو ‎(a) AAR)‏ بالإضافة إلى ذلك يمكن تحويل النبات بالإصابة بالعدوى باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية 10850000«حسبما تم 0 وصف ذلك في طلب البراءة الدولية رقم (91/00358 ‎(WO‏ الذي نشره في ‎٠١‏ يناير (1991م). وبالنسبة للخلايا الثديية وهي لا تحتوي مثل هذه الجدران الخلوية؛ فإن طريقة الترسيب ب ‎calcium phosphate‏ ل ])978 1( 456-457 :52 ‎[Graham van der Eb, Virology,‏ هي الطريقة المفضلة. لقد تم وصف سمات عامة لتحولات نظام عائل لخلية ثديية وذلك بواسطة ‎Axel‏ في البراءة الأمريكية رقم 216 ,399 ,4 الصادرة في ‎١١6‏ أغسطس (1987م). وبصورة ‎٠‏ نموذجية؛ يتم تنفيذ التحولات إلى خميرة وفقاً لطريقة ]946 :130 ‎Van Solingen et al, J.

Bact.‏ ‎Jey [Hsiao et al, Proc.

Natl, Acad.

Sci (USA), 76: 3829 (1 979)] ¢[(1977)‏ أية ‎«Ja‏ ‏فإن هناك طرقاً أخرى قد يتم استخدامها لإدخال ال ‎(DNA)‏ في الخلايا كأن يتم ذلك على سبيل المثال بواسطة الحقن النووي ‎nuclear injection‏ » أو تكوين المسام كهرياً ‎electroporation‏ أو الدمج البروتوبلاستا ‎protoplast fusion‏ "الدمج بمحتوى الخلية البروتوبلازميٌ كوحدة حيوية ‎٠‏ أصلية". ه. إستتبات ‎LDA‏ العائل ‎Culturing the Host Cells‏ : لقد تم استنبات الخلايا ‎Prokaryotic‏ المستخدمة لإنتاج ‎(mpl) 4a, polypeptide‏ لهذا الاختراع في أوساط إستنبات مناسبة حسبما تم وصف ذلك بصفة عامة في ‎Sumbrook‏ وآخرين . قد يتم إستنبات خلايا العائل الثديي المستخدمة لإنتاج وتكوين ربيطة ‎(mpl)‏ لهذا الاختراع وذلك ‎ve‏ في أوساط إستتبات (مزارع) متنوعة. إن أوساط الاستنبات المتوفرة تجارياً لهذا العفرض مثل

‎AY -‏ - ‎¢Ham's Flo (Sigma)‏ والوسط الأدننى الأساسئي الضروري ‎Minimal Essential Medium‏ ‎(RPMI-1640 (Sigma) « ([MEM]. Sigma)‏ ووسط ‎Dulbeco’s Modified Eagles Medium‏ ‎((DMEM] Sigma)‏ هي أوساط الاستنبات المناسبة في مثل هذا المجال لاستتبات خلايا العائل. بالإضافة إلى ذلك فإن أية أوساط إستنبات ثم وصفها في كل من : ٠ه‏ 102;255 ‎Ham and Wallace, Meth.

Enz 58.44 [1979], Bames and Sato . Anal Biochem.‏ ‎U.S.

Patent No; 4.767.704 ; 4,657,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; wo‏ ,]1980[ ‎wo 87/00195; U.S.

Patent Re. 30,995; or copending U.S.S.N. 07/592 OR‏ :90/034430 07/592,141 والتي تم إيداع كلتيهما في “ أكتوبر )+39 )2( 07/592,141 والتى تم الإفصاح عنها جميعها ‎٠‏ ودمجها هنا بالإشارة إليها والاستعانة بهاء قد يتم استخدامها كأوساط إستنبات (مزارع) لخلايا العائل. يمكن أن يتم استكمال أى وسط إستنبات (مزرعة) من هذه الأوساط إذا دعت الضرورة بواسطة هرمونات ‎hormones‏ و/أو بواسطة عوامل نمو ‎growth factors‏ أخرى (مثل ‎insulin‏ « أو ‎transferrin‏ ¢ أو عامل نمو بشريعم61 ‎epidermal growth‏ ) و/أو أملاح (مثل ‎sodium‏ ‎chloride‏ و ‎magnesium calcium‏ و ‎«(phosphate‏ و/أر المحاليل المنظمة ‎buffers‏ (مثل ‎"HEPES" ٠‏ و/أو ال ‎(thymidine « adenosine J—is) nucleosides‏ والمضادات الحيوية ‎Ji) antibiotics‏ عقار ‎((Gentamycinw‏ وعناصر مطلوبة بكميات قليلة ‎trace elements aa‏ (يتم تحديدها في صورة مركبات غير عضوية ‎inorganic‏ من المعتاد أن تكون موجودة بتركيزات نهائية في حدود المدى الميكرومولاري) و ‎glucose‏ أو مصدر طاقة مكافئ. كما أنه يمكن أن يتم أيضاً تضمين مواد مكملة ضرورية أخرى بتركيزات ملائمة والتى ستكون معروفة معرفة جيدة ‎٠‏ ا ‎dy‏ المهرة في مثل هذا المجال من هذا الفن. وتكون ظروف وسط الاستنبات (المزرعة) مل

‎١17 -‏ درجة ‎pall‏ الأس الهيدروجيني ‎¢(Ph)‏ وما شابه ذلك مماثئلة لتلك الظروف التى سبق إستخدامها مع خلية العائل المختارة للتعبير عن الصفة الوراثية وستكون ‎Jie‏ هذه الظطروف واضحة تماماً لأولئك الفنيين من المهرة العاديين في مثل هذا المجال. إن خلايا العائل المشار إليها هنا في هذا النص تتضمن الخلايا الموجودة في وسط الاستتبات 0 لمزرعة إجراء التجارب ‎Led Ws in vitro‏ تتضمن أيضاً الخلايا الموجودة بداخل حيوان ‎dle‏ من حيوانات العائل. و. الكشف عن تكرار تضاعف الجين/ التعبير عن الصفة الوراثية للجين ‎Detecting Gene‏ ‎Amplification/Expression‏ : قد يتم قياس تكرار تضاعف و/أو التعبير عن الصفة الوراثية للجين في عينة من العينات بصورة - مباشرة؛ على سبيل ‎WJ‏ بواسطة ‎Southern blotting‏ وشمالية لتحديد ‎northern blotting‏ كمية نسخ ال ‎"mRNA"‏ وقياسها ‎[Thomas, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 77: 5201-5205 (1980), dot blotting (DNA‏ ‎analysis)]‏ ‏مع تحليل ال ‎«(DNA)‏ أو إجراء التهجين في الموقع؛ باستخدام مجس ‎probe‏ ‎No‏ معنون ببطاقة معينة بصورة ملائمة؛ على أساس المتتاليات التي يتم التزويد بها وتوفيرها هنا. قد يتم استخدام مسابير ‎labels‏ عديدة؛ تكون في معظمها بصورة عادية شائعة عبارة عن نظائر إشعاعية ‎radioisotopes‏ وبصفة خاصة ‎P‏ وعلى أية ‎(Ja‏ فقد يتم ‎La‏ استخدام تقنيات أخرى. كأن يتم على سبيل المثال استخدام معدلة ‎biotin-modified nucleotides‏ ليتم إدخالها في ‎polynucleotide‏ حينئذ؛ يعمل ال ‎A biotin‏ صورة الموقع لكى يتم الارتباط بال ‎avidin‏ أو

‎١١6 -‏ — بالأجسام المضادة؛ والتي قد يتم وشمها بمسايير عديدة ذات تنوع واسع من ؛ مثل عناصر ‎aia‏ ‏أو مواد إحداث ‎fluorescers‏ اللاصقة أو ‎enzymes‏ » أو ما شابه ذلك. وبطريقة ‎(Alay‏ فقد يتم استخدام الأجسام المضادة التى يمكن أن تميز المزدوجات ‎duplexes‏ ذات النوعية الخاصة؛ شاملة ‎DNA-RNA hybrid duplexes « RNA duplexes « DNA duplexes‏ « أ ‎DNA-protein‏ ‎duplexes ©‏ . قد يتم أيضاً تحديد الأجسام المضادة بدورها وذلك بتمييزها بمسبار و يتم ربط المزدوج بسطح من الأسطح؛ عندما يتم تكوين المزدوج على السطح؛ يمكن حينئذ الكشف عن وجود الجسم المضاد المرتبط بالمزدوج وتحديده. وبطريقة بديلة؛ فقد يتم قياس التعبير عن الصفة الوراثية للجين بواسطة طرق دراسة المناعة ‎J— immunological methods‏ دراسة الصبغ الكيميائي للمتحد النسيجي المناعي ‎immunohistochemical staining ٠‏ أو الصابغ لقطاعات النسيج المختلفة واختبار جميع أوساط إستنبات الخلية أو موائع الجسم؛ وذلك لكى يتم تحديد كمية التعبير عن الصيغة الوراثية لمنتج الجين بصورة مباشرة. وباستخدام الطرق الفنية لهذه الصيغة الكيميائية النسيجية المناعية؛ يتم تحضير عينة خلية؛ ويكون ذلك بصورة نموذجية بواسطة نزع الماء (التجفيف ‎(dehydration‏ ‏والتثبيت ‎fixation‏ ؛ يتبعه التفاعل مع أجسام مضادة مميزة ‎labeled‏ وذات نوعية خاصة لمنتج ‎١‏ الجين المقترن؛ حيث من المعتاد أن تكون المسابير ‎labels‏ مرئية بصورة قابلة ‎lic ci SKU‏ وتحديدهاء مثل المسايير الإنزيمية؛ المتفلورة ‎fluorescent‏ اللاصقة ؛ والبطاقات المتلألئة أو المتألقة ‎luminescent labels‏ ؛ وما شابه ذلك. لقد تم وصف تقنية الصبغ أو التلوين والمناسبة للاستخدام في الاختراع الحالي وذلك في ‎[Hsu et al, Am, J.

Clin.

Path,‏ ])1980( 734-738 :75.

‎١١# —‏ - قد تكون الأجسام المضادة المفيدة في الصيغة الكيميائية النسيجية المناعية و/أو اختبار موائع العينة ‎sample fluids‏ إما أحادية الاستتنساخ ‎monoclonal‏ أو عديدة الاستنساخ ‎polyclonal‏ ؛ وقد يتم تحضيرها في أى حيوان من الحيوانات الثديية. ومن ‎aD‏ أن يتم تحضير الأجسام المضادة مقابل ‎polypeptide‏ مجموعة ربيطة ‎(mpl)‏ طبيعية أو في مقابل ‎{clin peptide‏ وذلك على ‎٠‏ أساس متتاليات ال ‎DNA‏ التي تم توفيرها هنا والآتي وصفها أدناه . ز. تنقية بولى ببتيد ربيطة ‎Purification of mpl ligand Polypeptide (mpl)‏ : من المفضل أن تتم استعادة ربيطة ‎(mpl)‏ من وسط الاستنبات (المزرعة) ك ‎polypeptide‏ مفرز ‎secreted‏ « بالرغم من أنه يمكن استعادتها من نواتج وتحلل خلايا 1,588 عائل عندما يتم التعبير عن الصيغة الوراثية بصورة مباشرة بدون إشارة إفرازية ‎secretory signal‏ .

‎٠‏ عندما يتم التعبير عن الصيغة الوراثية لربيطة ‎(mpl)‏ في خلية مهندسة وراثياً بخلاف تلك التى تكون من أصل بشريء فإن ربيطة ‎(mpl)‏ تكون نظيفة تماماً من البروتينات أو ال ‎polypeptide‏ ‏التى من أصل بشري. وعلى أية حال؛ وكالمعتاد فهناك ضرورة لتنقية ربيطة ‎(mpl)‏ من بروتينات أو ‎polypeptide‏ الخلية المهندسة وراثياً للحصول على مستحضر ربيطة ‎mpl‏ متجانس في ذاته. وكخطوة أولى, يتم تشكيل وسط الاستتبات (المزرعة) أو نواتج ذوبان وتحلل الخلية لإزالة بقايا

‎٠‏ مخلفات الخلية ‎debris‏ 0611. ثم يتم حينئذ فصل أجزاء الغشاء وأجزاء البروتين القابلة للذوبان. وبطريقة بديلة؛ قد يتم استخدام مرشح تركيز ‎concentration filter‏ البروتين المتوفر تجارياً (على سبيل ‎(JU)‏ وحدات الترشيح الفائقة الدقة التى تحمل العلامة التجارية ‎“Amicon™‏ أو ‎“Millipore™"”‏ أو ‎(“Pellicon™”‏ بعدهاء؛ قد تتم تنقية ربيطة ‎(mpl)‏ من جزء البروتين ‎GLE‏ ‏للذوبان ومن جزء الغشاء لناتج ذوبان وتحلل الخلية؛ وهذا يتوقف على ما إذا كانت ربيطة ‎(mpl)‏

‎٠‏ عبارة عن غشاء مرتبط من عدمه. بعد ذلك؛ تتم تنقية ربيطة ‎(mpl)‏ من ملوثات البروتينلت وال

‎١١7 -‏ - ‎ALN polypeptide‏ للذوبان وذلك بواسطة فصل الملح أو إجبراء التبادل ‎exchange‏ أو تتفيذ العمليات الكروماتوجرافية التى تستخدم هلامات نسيجية عديدة. تشتمل هذه المواد النسيجية على ‎cellulose » dextran » agarose ¢ acrylamide‏ ومواد أخرى شائعة ومألوفة في مجال تنقية البروتين. وتشتمل الإجراءات الكروماتوجرافية المثالية المناسبة لتتقية البروتين على: الألفة ‎٠‏ المناعية ‎immunoaffinity‏ (على سبيل المثال لجسم لربيطة ‎¢((Mab) anti-hmpl ligand mpl‏ الألفة الاستقبالية ‎receptoraffinity‏ (على سبيل المثالة:ةتقطم5 ‎mpl-IgG or protein A‏ )؛ كروماتوجرافية التجاذب الكاره للماء ‎Je) (HIC)‏ سبيل المثال؛ ‎butyl sf cether‏ ¢ أى ‎phenyl‏ ‎«(Toyopearl‏ كروماتوجرافية لكتين ‎lectin chromatography‏ (على ‎Jiu‏ المثال ‎Con A-‏ ‎(lentil-lectin-Sepharose) (Sepharose‏ استبعاد الحجم (على سبيل المثال؛ 6-75 ‎«(Sephadex‏ ‎٠‏ وأعمدة التبادل الأيوني ‎exchange columns‏ لكل من ‎anion cation‏ (على سبيل ‎(DEAE «JL‏ ‎«carboxymethyl sf‏ أو ‎¢(sulfopropyl-cellulose‏ وكروماتوجرافية السائل العالية الأداء للطور ‎reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), Sl)‏ [أنظر على سبيل المثال؛ )1984( 171 :296 ‎[Urdal et al, J.

Chromatog.,‏ حيث يتم استخدام خطوتين أساسيتين متتاليتين من خطوات ‎(RP-HPLC)‏ لتنقية ‎(IL-2)‏ بشرية مهندسة. وتشتمل خطوات ‎١‏ إجراء التنقية الاختيارية الأخرى على: ترسيب ال ‎ethanol‏ ؛ وترسيب ‎ammonium sulfate‏ . والتركيز الكروماتوجرافي ‎SDS-PAGE » chromatofocusing‏ التحضيري ‎«preparative‏ وما شابه ذلك. وتتم استعادة متغيرات ربيطة ‎(mpl)‏ التى تم فيها إلغاء الوحدات البنائية المتخلفة ‎«deleted‏ أو تم إدخالها ‎inserted‏ ¢ أو تم استبدالها ‎substituted‏ وذلك بنفس الأسلوب المتبع في حالة ربيطة ‎٠‏ (ام)_الطبيعية مع الأخذ بعين الاعتبار أية تغيرات أساسية في الخواص التى تحدث بصورة عرضية بواسطة التغير. على سبيل المثال» تحضير إندماج لربيطة ‎(mpl)‏ مع بروتين آخر أو مع

‎١١7 -‏ — . بولى ببتيد ‎AT‏ على سبيل ‎antigen ie (JE‏ بكتيري أو فيروسي؛ تسهل التنقية؛ عمود ألفة مناعية ‎immunoaffinity column‏ يكون محتوياً على جسم ‎alias‏ لل ‎antigen‏ وذلك لكى يتم إمتزاز ‎adsorb polypeptide‏ المتحدد . يمكن أن يتم استخدام أعمدة ألفة المناعة ‎Jie‏ عمود جسم مضاد لربيطة ‎(anti-mpl) mpl‏ العديدة الاستنساخ ‎polyclonal‏ لأرنب وذلك لامتصاص متغير ‎٠‏ ربيطة ‎Aad (mpl)‏ ربطة مع وحدة الجسم المضاد المتبقية . وبطريقة ‎Aly‏ قد تتم تنقية ربيطة ‎(mpl)‏ بواسطة ألفة الكروماتوجرافية باستخدام ‎(mpl-IgG)‏ مُقترنة (ومن المفضل) براتتج ‎«(Bio-Rad., Richmond CA) Affi —Gel 10 immobilized‏ أو ما شابه ذلك؛ وذلك بواسطة وسائل معروفة جيداً في ‎Jie‏ هذا المجال من هذا الفن. قد يكون ‎protease inhibitor a— 3) Jails‏ ‎asia phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) Jie‏ أيضاً في تثبيط التحلل البروتيني أثناء إجراء ‎٠‏ - التنقية؛ وقد يتم تضمين المضادات الحيوية لمنع نمو الملوثات العرضية الطارئة. سؤدرك أحد المهرة في مثل هذا المجال من هذا الفن أن طرق التنقية المناسبة لربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية قد تتطلب تعديلاً ليُحسب لصالح التغيرات التى تحدث في الخاصية المميزة لربيطة ‎(mpl)‏ أو متغيراتها وفقاً للتعبير عن الصيغة الوراثية في وسط إستنبات خلية مهندسة ورائياً. ح. التعديلات التساهمية ل "بولى ببتيد" لربيطة ‎Covalent Modifications of mpl ligano (mpl)‏ ‎Polypeptide ٠‏ : لقد تم تضمين التعديلات التساهمية ل ‎polypeptide’‏ " ربيطة ‎(mpl)‏ في إطار مجال هذا الاختراع. قد يتم بصورة تساهمية تعديل كل من متغيرات ربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية ومتغيرات متتالية الأحماض الأمينية لربيطة ‎(mpl)‏ لقد كان أحد أنواع التعديل التساهمي الذي تم تضمينه في إطار مجال هذا الاختراع عبارة عن جزء من ربيطة ‎(mpl)‏ قد يتم بصورة ملائمة تحضير © أجزاء من متغير ربيطة ‎(mpl)‏ 1 تكون لديها ما يصل إلى )£1( وحدة بنائية من الأحماض

‎VIA -‏ - الأمينية المكونة وذلك بواسطة التصنيع الكيميائي أو بواسطة قطعة الإنزيميّ أو الكيسبائي من الطول الكامل لربيطة ‎mpl‏ متغيرات ‎Lie polypeptide‏ . لقد تم إدخال أنواعاً أخرى من التعديلات التساهمية لربيطة ‎(mpl)‏ أو لأجزاء منها وذلك بداخل الجزيئ بواسطة تفاعل الوحدات البنائية للأحماض الأمينية المستهدفة لربيطة ‎(mpl)‏ أو لأجزاء منها وذلك مع عامل اشتقاق ‎derivatizing agent ٠‏ عضوي يكون قادراً على التفاعل مع سلاسل جانبية ‎side chains‏ (فرعية) مختارة أو مع وحدات النهاية الطرفية الأمينية بذرة ‎(N-)‏ أو الكاربوكسيلية (-). وبصورة عادية مألوفة في معظم الأحيان ‎٠‏ تتفاعل وحدات بنائية " ‎Cysteinyl‏ " مع ‎haloacetates‏ - » (والأمينات المقابلة لها)؛ ‎chloroacetic acid Jie‏ أو ‎cchloroacetamide‏ لتعطي ‎carboxymethyl‏ ‏أو ‎carboxyamidomethyl‏ . كما أنه يمكن أن تشتق أيضاً وحدات بنائية " ‎cysteinyl‏ " بواسطة ‎٠‏ التفاعل مع ‎bromotrifluoroacetone‏ ¢ أو حمض ‎a-b romo- B- (5 - imidozoyl)propionic acid‏ » أو ‎chioroacetyl phosphate‏ « أو ‎N-alkylmaleimides‏ « أو ‎3-nitro-2pyridyl disulfide‏ « أو ‎2chioromercuri-4- gb ¢ p-chloromercuribenzoate ol « methyl 2-pyridyl disulfide‏ ‎nitrophenol‏ « أو ‎chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1‏ » أو ‎.3-diazole‏ ‏تشتق وحدات بنائية ‎Histidyl residues‏ بواسطة التفاعل مع ‎diethylpyrocarbonate‏ عند أس ‎٠‏ هيدروجيني "17م" يتراوح من )0.0( ‎(V0)‏ نظراً لأن هذا العامل يكون ذى نوعية خاصة نسبياً بالنسبة لسلسلة ال ‎histidyl‏ الفرعية. كما أن ‎Parabromophenacyl bromide‏ يكون مفيداً ‎Lad‏ ومن المفضل أن يتم تنفيذ التفاعل في ‎)٠.١(‏ مول ‎cacodylate‏ («1:ةه»وعند أس هيدروجينيٌ ‎(pH)‏ = )300( تتفاعل وحدات بنائية ‎Lysingl‏ والوحدات البنائية في النهاية الطرفية الأمينية وذلك مع ‎succinic‏ ‎anhydride ٠‏ أو مع ‎carboxylic acid anhydrides‏ آخر . إن الاشتقاق مع هذه العوامسل يكون ذى

‎١٠١9 -‏ — تأثير إنعكاس شحنة الوحدات البنائية ال ‎lysinyl‏ . تشتمل متفاعلات ‎reagents‏ مناسبة أخرى لإشتقاق الوحدات البنائية المحتوية على مجموعة أمينو على ‎imidoesters‏ مقل ‎methyl‏ ‎phosphate pyridoxal ¢ picolinimidate‏ ؛ ‎chloroborohydride ¢ pyridoxal‏ ¢ ‎4-pentanedione ¢ methylisourea -0 ¢ trinitrobenzenesulfonic acid‏ ,2 ؛ والتفاعل المحفز ° بإنزيم ‎4ll3 transaminase-catalyzed‏ مع ‎.glyoxylate‏ ‏يتم تعديل وحدات بنائية ‎Arginyl‏ بواسطة التفاعل مع متفاعل واحد ملام أو عدة متفاعلات ملاثمة» من بينها ‎.ninhydrin 1 ,2-cyclohexanedione ¢ 2,3-butanedione ¢«phenylglyoxal‏ يتطلب إشتقاق وحدات بنائية ‎arginine‏ أن يتم تنفيذ التفاعل في ظروف قلوية بسبب ال ‎“pKa”‏ ‏العالية للمجموعة الوظيفية لل ‎guanidine‏ . علاوة على ‎«ly‏ قد تتفاعل هذه المركبات مع ‎٠‏ مجموعات من ال ‎lysine‏ وكذلك أيضاً مجموعة ال ‎.arginine epsilon-amino group‏ قد يتم عمل التعديل النوعيً للوحدات البنائية ‎tyrosyl‏ باهتمام خاص في إدخال مشتقات طيفية ‎spectral labels‏ بداخل وحدات بنائية ‎tyrosyl‏ بواسطة التفاعل مع مركبات ديازونيومية عطرية ‎aromatic diazonium compounds‏ أو مع ‎-tetranitromethane‏ وبصورة عادية ومألوفة ‎Sis‏ ‘ فإنه يتم استخدام ‎٠ N-acetylimidizole‏ 20110061876 لتكوين أنواع من ‎O-acetyl tyrosyl‏ ‎٠١‏ | 806068؛ و ‎3-nitro derivatives‏ علىالترتيب ‎٠‏ ثم تتم معالجة وحدات بنائية ال ‎Tyrosyl‏ بال 0 باستخدام ‎PT PT‏ لتحضير بروتينات مشعة للاستخدام في اختبار المناعة الإشعاعي 1 » وتكون طريقة ال 1 ‎chloramine‏ السابق وصفها هي الطريقة المناسبة. ويتم تعديل مجموعات ال ‎Carboxyl‏ الجانبية ( لجف أو الإصتهاداع) بصورة إنتقائية بواسطة ‎٠‏ التفاعل مع ‎(R-N=C=N-R)‏ 5ق + حيث تكون فيها ‎RR‏ عبارة عن مجموعتى ‎alkyl‏

‎١١٠١ —‏ مختلفتين» ‎-cyclohexyl.3-(2-morpholinyl. 4-ethyl)carbodiimide Jie‏ 1 أى ‎lethyl-3-(4-azonia-‏ ‎4-dimethylpentyl)carbodiimide‏ 4 . علاوة على ‎J afi ld‏ وحدات بنائية ‎asparaginyl‏ « ‎glutaminyl‏ إلى وحدات بنائية ‎glutaminyl « asparaginyl‏ وذلك بالتفاعل مع ‎-ammonium ions‏ يكون الاشتقاق باستخدام ‎Jal go‏ ثنائية الوظيفية ‎bifunctional agents‏ مُفيداً لإجراء الترابط © التقاطعي ‎crosslinking‏ للربيطة ‎(mpl)‏ مع نسيج داعم غير قابل للذوبان في الماء ‎water-insoluble support matrix‏ أو مع سطح غير قابل للذوبان في الماء للاستخدام في الطريقة الخاصة بتنقية الأجسام المضادة لربيطة ‎(anti-mpl) mpl‏ والعكس بالعكس. وتشتمل ‎Jal gall‏ المستخدمة في إجراء الترابط التقاطعي بصورة مألوفة شائعة وذلك على سبيل المثال على: ‎N N-hydroxysuccinimide ¢« 1 .1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane, glutaraldehyde‏ ‎esters ٠‏ ؛ على سبيل المثال؛ ‎esters‏ مع حمض ‎4-azidosalicylic acid‏ ¢ إسترات إيميدو المتجانسة الثنائية الوظيفية ‎homobifunctional imidoesters‏ شاملة ‎disuccinimidyl esters‏ مثل -3,3 ‎dithiobis(succinimidylpropionate)‏ » و ‎maleimides‏ ثنائية الوظيفية ‎bifunctional‏ مقثل ‎bis-N-‏ ‎.maleimido-1 ,8-octane‏ تودي ‎methyl-3- J—— Je Bai IW J dle‏ ‎[(p.azidophenyl)dithio]propioimidate‏ إلى إنتاج مركبات وسيطة قابلة للتنشيط ‎yall‏ ‎photoactive Vo‏ والتى تكون قادرة على تكوين ترابط تقاطعي في وجود الضوء. وبطريقة بديلة؛ يتم استخدام مواد النسيج ‎matrices‏ غير القابلة للذوبان في الماء مثل الكربوهيدرات المنشطة ‎cyanogen bromide - activated carbohydrates‏ والمواد التفاعلية ‎Allg‏ تم وصفها في البراءات الأمريكية أرقام (287 ,969 ,3)» )016 ,691 ,3)» )128 ,195 ,4(« )642 ,247 ,4)» (537 ,229 ,4(« )440 ,330 ,4( مستخدمة البروتين.

‎١١١ -‏ ويتم نزع الأميدات بصورة متكررة من كل من وحدات بنائية ‎Glutamingl‏ ووحدة بنائية ‎asparaginyl‏ إلى حيث يتم تحويلها إلى وحدات بنائية ال ‎glutamyl‏ ووحدات بنائية — ‎aspartyl‏ المقابلة؛ على الترتيب. ويتم نزع ‎deamidated‏ من هذه الوحدات البنائية تحت ظروف متعادلة ‎include‏ أو قاعدية ‎basic‏ . وتقع الهيئة المنزوعة ‎deamidated‏ لهذه الوحدات البنائية في ‎٠‏ إطار مجال الاختراع الحالي. وتشتمل تعديلات أخرى على إدخال ‎de gene’‏ /مجموعات" ‎hydroxylation‏ (إجراء عملية ‎(hydroxylation‏ لل ‎lysine » proline‏ ¢ وإجراء المعالجة بال ‎phosphorylation‏ بإجراء عملية ‎phosphorylation‏ لمجموعات ‎hydroxyl‏ لكل من وحدات بنائية ‎seryl‏ أو وحدات بنائية ‎threonyl‏ ‏؛ ثم إجراء عملية ‎methylation‏ (إدخال مجموعة [ مجموعات ‎(methylation‏ لمجموعات -0 ‎amino ٠٠‏ لكل من ‎carginine » lysine‏ والسلاسل الجانبية (الفرعية) ‎histidine side [T-E.‏ ‎Creighton, Proteins, Structure and Molecular Properties, 11711. Freeman & Co.,‏ ‎«SanFrancisco pp. (79-86) (1983)]‏ ثم إجراء عملية أستلة ‎acetylation‏ للطرف الأميني ‎((N-)‏ ‏وإجراء عملية ‎amidation‏ (إدخال مجموعات ‎(amidation‏ للطرف ال ‎carboxyl‏ للبروتين ‎٠‏ ‏وهناك نوعاً آخر من التعديل التساهميًّ ل ‎polypeptide‏ ربيطة ‎(mpl)‏ تم تضمينه في إطار مجال ‎١‏ هذا الاختراع ويشتمل على تغيير نمط المعالجة ‎glycosylation‏ الطبيعية لل ‎-polypeptide‏ إن استخدام مصطلح "بواسطة تغيير ‎Lai) "by altering‏ يعني إلغاء شق واحد أو أكثر من شقوق الكربوهيدرات الموجودة في ربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية و/أو إضافة موقع واحد أو أكثر من مواقع ال ‎glycosylation‏ التى لا تكون موجودة في ربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية. إن إجراء المعالجة ‎glycosylation‏ لل ‎polypeptide‏ تكون بصورة نموذجية ‎Ul‏ مرتبطة بذرة © نيتروجين ‎(N-linked)‏ أو مرتبطة بذرة أكسيجين (0-0160). تشير المرتبطة بذرة النيتروجين

‎١7 —‏ ‎(N-linked)‏ إلى ارتباط شق الكربوهيدرات بالسلسلة الجانبية (الفرعية) للوحدة البنائية ‎asparagine‏ ‏تكون متتثاليات ال ‎asparagine-Xthreonine « asparagine-X-serine—-U tripeptide‏ ¢ حيث تكون ‎X‏ عبارة عن أى حمض أميني فيما عدا ال ‎proline‏ ؛ عبارة عن المتتاليات المميزة للارتباط الإنزيميّ لشق الكربوهيدرات مع السلسلة الفرعية لل ‎asparagine‏ لذلك؛ فإن وجود ‎Ld‏ ‏© من هذه السلاسل لل ‎tnpeptlde‏ يبرز موقعاً قابلاً لل ‎glycosylation‏ . تشير المعالجة ‎glycosylation‏ المرتبطة بذرة أكسيجين ‎(O-linked)‏ إلى الارتباط الخاص بسكر من السكريات ‎N-acetylgalactosamine‏ » أو ‎galactose‏ أو 6 مع ‎hydroxyamino acid‏ 6 من المألوف بصورة شائعة أن يكون عستدعوار ‎threonine‏ ؛ بالرغم من أنه يمكن استخدام ‎5-hydroxyproline‏ ‏أو ‎.5-hydroxylysine‏ ‏يمكن بصورة ملائمة تنفيذ إضافة مواقع ‎glycosylation‏ إلى ‎polypeptide‏ ربيطة ‎(mpl)‏ وذلك بواسطة تغيير متتاليات الأحماض الأمينية بحيث تحتوي على متتالية أو أكثر من متتاليات ال 6 السابق وصفها (بالنسبة لمواقع ‎glycosylation‏ المرتبطة بذرة النيتروجين ‎N-"‏ ‎(‘linked‏ قد يتم أيضاً إجراء التغيير بواسطة إجراء الإضافة أو الاستبدال بوحدة بنائية واحدة أو أكثر من الوحدات البنائية ‎serine‏ أو ‎threonine‏ لمتتالية ربيطة ‎(mpl)‏ الطبيعية ‎lal)‏ مواقع ‎glycosylation ٠‏ المرتبطة بذرة أكسيجين ‎.('O-linked"‏ وللسهولة؛ فمن المفضل أن يتم تغيير متتالية الأحماض الأمينية للربيطة ‎(mpl)‏ من خلال إجراء تغيرات عند مستوى ال ‎¢(DNA)‏ وبصفة خاصة بواسطة إحداث طفرة لل ‎(DNA)‏ المشفر ل ‎polypeptide‏ ربيطة ‎(mpl)‏ وفقاً للأسس السابق اختيارها بحيث يتم توليد ال ‎codons‏ التى ستترجم وتفسر بتحولها إلى الأحماض الأمينية المطلوبة المرغوب فيها. قد يتم إجراء طفرة (طفرات) لل ‎(DNA)‏ باستخدام الطرق السابق ‎Yo‏ وصفها تحت عنوان "متغيرات متتالية الأحماض الأمينية لربيطة ‎Amino Acid) (mpl)‏ ‎Sequence Variants of mpl Ligand‏ ( .

- ١١7 ‏تتمثل في أن يتم إجراء‎ (mpl) ‏على ربيطة‎ carbohydrate ‏وهناك وسيلة أخرى لزيادة عدد شقوق‎ ‏.تكون مثل هذه الإجراءات مفيدة‎ polypeptide ‏مع‎ glycosides ‏إقتران كيميائي أو إنزيمي لل‎ ‏في خلية العائل التى تكون ذات قدرات‎ polypeptide ‏ومميزة في أنها لا تحتاج إلى إنتاج ال‎

N-) ‏لل "0106000" المرتبطة بذرة نيتروجين‎ glycosylation ‏لإجراء معالجة‎ 0010 ‏أو المرتبطة بذرة أكسيجين (0-100100). وفقاً لنمط الاقتران المستخدم؛ فقد يرتبط السكر‎ (linked ‏ف‎ ‏حرة ؛‎ carboxyl ‏؛ أو (ب) مجموعات‎ histidine ‏أو‎ arginine ‏(ترتبط السكريات) ب()‎ ‏؛ أو (جب) مجموعات‎ cysteine ‏حرة مثل تلك المجموعات التى لل‎ sulfhydryl ‏مجموعات‎ ‏أو‎ « hydroxyproline ‏أو للمسدتدمغطة « أو‎ serine ‏حرة كتلك المجموعات التى لل‎ hydroxyl ‏أو‎ » tyrosine ‏أو‎ « phenylalanine ‏كتلك التى لل‎ aromatic residues ‏(د) وحدات بنائية عطرية‎ ‏لقد تم وصف هذه الطرق في طلب‎ . glutamine ‏لل‎ amide ‏؛ أو (ه) مجموعة‎ tryptophan ٠ ‏وفي‎ م)١947(‎ Dads ١١يف ‏التى تم النشر عنها‎ (WO 87/05330( ‏البراءة الدولية رقم‎ ٠ [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, pp. 259-306 [1981] ‏كيميائياً أو‎ (mpl) Atay polypeptide ‏الموجودة في‎ carbohydrate ‏قد يتم تنفيذ إزالة مشتقات‎ polypeptide ‏أن يتم تعريض ال‎ deglycosylation ‏إنزيمياً . تتطلب المعالجة الكيميائية لإزالة‎ ‏أو لمركب آخر مكافئ له. تؤدي هذه‎ ¢ trifluoromethanesulfonic acid ‏المركب حمض ال‎ ١

N=) ‏المعالجة إلى كسر روابط معظم أو كل السكريات وإتقسامها فيما عدا روابط إرتباط السكر‎ ‏سليماً . لقد‎ polypeptide ‏في حين يتم ترك ال‎ ¢(N-acetylgalactosamine ‏أو‎ acetylglucosamine ‏وآخرين‎ Hakimuddin ‏الكيميائية بواسطة‎ deglycosylation ‏نزع وإزالة‎ dae ‏تم وصف‎ [Edge et al, ‏وبواسطة‎ «[Hakimuddin et al, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)] carbohydrate ‏ويمكن تحقيق الإنقسام الإنزيمي لشقوق‎ Anal Biochim,, 118: 131 (1981)] ٠

١740 exo-glycosidases ‏؛ و‎ endo ‏بواسطة استخدام تنوع من إنزيمات‎ polypeptide ‏على ال‎ -[Thotakura et al., Meth.

Enzymol., 138: 350 )1987([ ‏حسبما تم وصف ذلك بواسطة‎ — ‏في مواقع 0 محتملة بواسطة استخدام مركب‎ glycosylation aie ‏قد يتم‎ [Duskin et al, J.

Biol.

Chem., 257: 3105 ‏حسبما ثم وصف ذلك بواسطة‎ tunicamycin + protein-N-glycoside linkages ‏بإعاقة تكوين روابط‎ tunicamycin ‏يقوم مركب‎ .)1982([[ © (mpl) ‏ربيطة‎ polypeptide ‏على ربط‎ (mpl) ‏ويشتمل نوع آخر من التعديل التساهميٌ لربيطة‎ ‏أو‎ «polyethylene glycol ‏بأحد أنواع البوليمرات غير البروتينية المتميزة. على سيل المثال‎ ‏؛ وذلك بالاسلوب السابق وصفه في البراءات‎ polyoxyalkylenes ‏أى‎ « polypropylene glycol «U.S.

Patent Nos. (4, 640, 835) ‏الأمريكية أرقام‎ (4,179,337) ‏أو )689 ,49 ,4(« أو )144 ,301 ,4(« أو )670,417 ,4(« أو )192 ,4,791« أو‎ ٠ ‏الرابط لل‎ JE ‏الذي تمت استعادته لاختيار المتغير‎ mpl ‏وتتطلب الحاجة لاستعراض ربيطة‎ ‏ويكون لها النشاط المناعي و/أو البيولوجي الذي تم تحديده وتعريفه من قبل. يمكن أن يتم‎ mpl ‏في وسط إستنبات (مزرعة) خلية مهندسة جينياً‎ stability ‏فصل متغير واحد بغرض تحقيق الثبات‎ ‏وتحقيق‎ «( proteolytic cleavage ‏أو في البلازما (على سبيل المثال؛ فيما يقابل التحلل البروتيني‎ oxidative stability ‏والثبات تجاه الأكسدة‎ « mpl ‏الألفة العالية أو الانجذاب العالي لنوع من أنواع‎ ١ ‏يتم قياس وتقدير التغير في‎ JU) ‏والقدرة على أن يفرز بتراكيز عالية؛ وما شابه ذلك. على سبيل‎ ‏مثل الألفة والإنجذاب تجاه‎ (mpl) ‏ربيطة‎ polypeptide ‏الخاصية أو الصفة المميزة المناعية ل‎ competitive ‏جسم مضاد معين؛ وذلك بواسطة إجراء تجارب اختبار المناعة من النوع التنافسئ‎ ‏كما يتم أيضاً إجراء تجارب اختبار على تعديلات محتملة أخرى للخواص‎ type immunoassay ‏مثل إجراء تجارب اختبار الثبات تجاه عمليات الأكسدة‎ polypeptide ‏المميزة للبروتين أو لل‎ ©

‎١78 -‏ ‎redox‏ والاختزال؛ أو الثبات الحراري ‎thermal stability‏ ¢ أو خاصية التفور من الماء ‎hydrophobicity‏ أو التحلل البروتيني؛ حيث يتم إجراء تجاب الاختبار السالفة الذكر باستخدام الطرق المعروفة معرفة جيدة في مثل هذا المجال من هذا الفن. ‎-١١7‏ الطرق العامة لتحضير الأجسام المضادة لربيطة ‎(mpl)‏ ‏تحضير الجسم المضاد : )1( الأجسام المضادة العديدة الاستتنساخ ‎Polyclonal antibodies‏ : بصفة عامة؛ تكوين الأجسام المضادة العديدة الاستتنساخ ضد ‎polypeptides‏ أجزاء ‎lk vd'm‏ ‎(mpl)‏ في الحيوانات بواسطة إجراء الحقن المتعدد تحت الجلد ‎subcutaneous (sc)‏ أو بداخل الغشاء البريتوني ‎(mpl) gvfd'm intraperitoneal (ip)‏ ولمادة إضافية ‎adjuvant‏ مساعدة. قد يكون ‎٠‏ من المفيد أن يتم إجراء إقتران ربيطة ‎(mpl)‏ أو جزء منها يكون محتوياً على متتالية الأحماض الأمينية المستهدفة مع بروتين يكون حاثاً للمناعة ‎immunogenic‏ في الكائنات المراد تمنيعها " تطعيمها " ؛ على سبيل المثال» ‎keyhole limpet hemocyanin —S‏ « أو ‎JY‏ مصل الدم ‎serum‏ ‎«albumin‏ أو ثيروجلوبيولين بقري ‎bovine thyroglobulin‏ ؛ أو متبط ترابسين فول صوياً ‎soybean trypsin inhibitor‏ وذلك باستخدام عامل ثنائي الوظيفية ‎bifunctional‏ أو عامل إشتقاق؛ ‎٠‏ على سبيل المثال ‎maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester‏ (ترابط من خلال وحدات ‎Aly‏ ‎N-hydroxysuccinimide sf «(cysteine‏ (من خلال وحدات بنائية ‎glytaraldehyde sf «(lysine‏ « أى ‎succinic anhydride‏ » أو ‎aR N=C=NR | «(SOCL,)‏ تكون ‏ ل عبارة عن مجموعتى الكيل مختلفتين.

— ١١7١ -

يتم تحصين ‎ill gall‏ ضد ‎polypeptide‏ ربيطة ‎(mpl)‏ أو جزء من ربيطة ‎(mpl)‏ أو إقترانات

مناعية أو مشتقات مناعية منها بواسطة خلط ‎١‏ مللىجرام؛ إلى ‎١‏ ميكروجرام من ‎peptide‏ أو

المقترن (للأرانب أو الفئران على الترتيب) مع ¥ أحجام من مادة إضافية مساعدة كاملة

‎Freund's — complete adjuvant‏ ثم حقن المحلول بداخل الجلد في عدة مواقع مختلفة. وبعد

‏© مضى شهرء تم تعزيز حقن الحيوانات وتقويتها بما يتراوح من ‎١‏ / إلى ‎٠١ / ١‏ الكمية الأصلية

‏من ‎peptide‏ في المادة الإضافية المساعدة الكاملة ل ‎Freund's‏ بواسطة إجراء الحقن تحت الجلد

‏في عدة مواضع مختلفة. وبعد مضى فترة تراوحت من ‎UV‏ إلى ‎VE‏ يوما؛ يتم سحب دم من

‏الحيوانات ثم فحص واختبار المصل لمستوى تراكيز الجسم المضاد لربيطة ‎(mpl)‏ يتم تعزيز

‏المناعة في الحيوانات إلى حيث الوصول إلى الحد الكافي لبلوغ مستوى ‎sh‏ الاستقرار ‎plateau‏

‎٠‏ . ومن ‎(Jaa)‏ أن تتم تقوية المناعة في الحيوان بالمقترن الخاص بنفس بربيطة ‎(mpl)‏ ولكن

‏بالاقتران مع بروتين مختلف و/أو من خلال استخدام مادة ربط تقاطعي مختلفة. يمكن أن يتم

‎Lia‏ عمل إقترانات في وسط استنبات خلية الهندسة الجينية في صورة إندماجات بروتين. كما أنه

‏يمكن أن يتم ‎Lad‏ استخدام ‎dal so‏ تجميع ‎aggregating agents‏ مثل الشب ‎alum‏ لتعزيز استنجابة المناعة.

‎: Monoclonal antibodies ‏الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ‎ Gi) ١٠ ‏يتم الحصول على الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ من أعداد كثيرة أو جمهرة من أجسام‎ ‏مضادة متجانسة بصفة أساسية؛ أىء أن الأجسام المضادة الفرادى المكونة لهذه الأعداد الخفيرة‎ ‏تكون متماثلة فيما عدا تلك المحتمل وجودها بصورة طبيعية الناتجة عن الطفرات التى قد توجبد‎ ‏بكميات ضئيلة. لذلك؛ فإن المُعدّل "الأحادي الاستنساخ” يُشير إلى الصفة المميزة للجسم المضاد‎

‏© ا لكونه لا يكون في صورة خليط من الأجسام المضادة المختلفة.

‎١77 —‏ ا على سبيل المثال؛ قد يتم عمل الأجسام المضادة الأحادية الاستتنساخ لربيطة ‎(mpl)‏ باستخدام طريقة التهجين الأوراميّ ‎hybridoma‏ أولاً ‎ll‏ وصفيها 495 :256 ‎[Kohler & Milstein, Nature,‏ [197) أو قد يتم عملها بواسطة طرق الهندسة الوراثية لل ‎(DNA)‏ [البراءة الأمريكية رقم ‎[U.S.

Patent (No. 4, 816, 567)‏ الصادرة لصالح ‎Cabilly‏ وآخرين . ‎٠‏ في طريقة التهجين الأوراميّ؛ يتم تطعيم ‎immunized‏ فأر أو أى حيوان ‎dile‏ مناسب مثل الهمستر وذلك حسبما تم وصف ذلك من قبل لإستحثات الخلايا الليمفاوية التى تنتج أو تكون قادرة على إنتاج الأجسام المضادة التى سترتبط بصورة نوعية بالبروتين المستخدم لإستحثات المناعة أو الحصانة اللازمة. وبطريقة بديلة؛ قد يتم تطعيم الخلايا الليمفاوية في أنابيب الاختبار المعملية. حينئذ؛ يتم دمج الخلايا الليمفاوية مع ‎WDA‏ ورم نخاعي ‎myeloma cells‏ باستخدام عامل دمج ‎٠‏ مناسب؛ ‎polyethylene glycol Jie‏ ؛ وذلك لتكوين خلية مهجنة ورمياً ‎hybridoma cell‏ . ‎[Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Proctice, pp. (59-103), Academic‏ ‎-Press, (1986)]‏ تتم زراعة الخلايا المهجنة بصورة ورمية وتهيئة نموها في وسط استنبات مناسب وهو الوسط الذي من المفضل أن يحتوي على مادة واحدة أو أكثر من المواد التى تثبّط نمو الخلايا غير ‎yo‏ المهجنة وغير المدمجة من ‎WA‏ ال ‎myeloma‏ الأصلية. على سبيل المثال؛ إذا كانت خلايا ‎myeloma‏ الأصلية المصدر تفتقر إلى الإتزيم ‎hypoxauthine guanine phosphoribosyl‏ ‎«(HPRT | HGPRT) trausferase‏ فإن وسط الاستتبات للتهجين الأوراميٌ سيتضمن بصورة نموذجية ‎caminopterin hypoxauthine‏ و ‎thymidine‏ (الوسط ‎«(HAT‏ والذي يكون عبارة عن مواد تمنع نمو الخلايا المفتقرة لل - ‎“HGPRT”‏

- YVA —

تكون خلايا الورم التنخاعي ‎myeloma‏ المفضلة عبارة عن تلك ‎(All WAY‏ تدمج ‎eli‏ وتدعم مستوى عالي من الشبات خاص بالتعبير عن الصيغة الوراثية للجسم المضاد بواسطة الخلايا المنتجة للجسم المضاد المختارة؛ وتكون حساسة للوسط مثل الوسط (0187. ومن بين هذه ‎(LDA‏ تكون سلالة خلية الورم النخاعي المفضلة عبارة عن سلالة ورم نخاعيّ فأري ‎marine‏ ؛

م كلك التى يتم اشتقاقها من الأورام الفأرية من النوع ‎((MPC-11) (MOPC-21)‏ والمتوفرة لدى مركز ‎the Salk Institute Cell Distribution Center‏ ب ‎San Digo‏ بولاية كاليفورنيا؛ بالولايات

المتحدة الأمريكية ‎¢(California, U.S.A.)‏ وكذلك الخلايا ‎(SP-2)‏ المتوفرة لدى ‎(the American‏ ‎Culture Collection Rockville, Marryland, U.S.A.)‏ ©170. كما تم وصف ‎ADL‏ خلية بتشرية ‎myeloma‏ وسلالة خلية ‎myeloma‏ غير متجانسة فأرية — بشرية ‎moace - human hetevomy‏

[Kozbor, J.

Immunol, 133: 3001 ‏عنما ليتم إنتاج أجسام مضادة بشرية أحادية الاستنساخ‎ ٠ (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,

‎-pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1 987]‏ يتم اختبار وسط الاستنبات الذي تنمو فيه الخلايا المهجنة تهجيناً أورامياً لصالح إنتاج الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ الموجهة ضد ربيطة ‎(mpl)‏ ومن المفضل؛ أن يتم تحديد نوعية ‎vo‏ ارتباط الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ التي أنتجتها الخلايا الورمية المهجنة وذلك بواسطة إجراء الترسيب المناعي ‎immunoprecipitation‏ أو بواسطة اختبار الارتباط في أنابيب الاختبلر المعملية ‎cin vitvo‏ مثل إجراء اختبار المناعة الإشعاعية ‎(RIA) radioimmunoassay‏ أو اختبار

‏ماص المناعة المرتبط بالإنزيم ‎-anzme - limked immunoabsorbenT Aassay (ELISA)‏ على سبيل ‎J‏ يمكن تحديد ألفة الارتباط للجسم المضاد الأحادي الاستنساخ بواسطة إجراء ‎v.‏ تحليل ال ‎“Scatchard”‏ ل ])1980( 220 :107 ‎[Munson & Pollard, Anal.

Biochem.,‏

‎١794 -‏ - وبعد أن يتم التعرف على الخلايا المهجنة تهجيناً أورامياً وتمييزها والتى تقوم بإنتاج الأجسام المضادة ذات النوعية الخاصة؛ و/أو ‎Ad)‏ و/أو النشاط و/أو الفعالية المطلوبة والمرغوب ‎Cele‏ ‏فإن المستنتجات قد يتم إستنساخها إستنساخاً مكرراً ‎subcloned‏ بواسطة تحديد إجراءات التخقفيف وتنميتها بواسطة الطرق القياسية ‎(Goding, supra)‏ تشتمل الأوساط الاستباتية المناسبة لهذا م الغرض على سبيل المثال على وسط ‎Dulbeceo’s Modified Eagle’s Medium‏ أو وسط ‎RPMI-‏ ‎medium‏ 1640. بالإضافة إلى ذلك؛ قد تنمو الخلايا المهجنة أورامياً في جسم الكائن الحي ‎Jie‏ ‏أورام الاستسقاء ‎ascite‏ في حيوان من الحيوانات. من المناسب؛ أن يتم فصل الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ المفرزة بواسطة الاستتساخات المكررة الاعادة ‎subclones‏ وذلك من وسط الاستنبات؛ أو من مائع ‎ascites fluid eli uu)‏ » أو من مصل من الأمصال وذلك بواسطة تنفيذ إجراءات تنقية جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ ‎«purification‏ كأن يكون على سبيل المثال ‎protein A-Sepharose‏ ؛ أو بواسطة ‎hydroxylapatite‏ ‎«chromatography‏ أو بواسطة الإشراء الكهربائي للجل ‎gel electrophoresis‏ « أو ‎dialysis‏ « أو كروماتوجرافية الألفة ‎affinity chromatography‏ يتم بسرعة فصل ال ‎DNA‏ المشفر للأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ للاختراع الحالي وتحدد ‎١‏ متتالياته وذلك باستخدام إجراءات تقليدية مألوفة (على سبيل المثال؛ بواسطة استخدام مجسات ‎oligonucleotide probes‏ التى تكون قادرة على إجراء الربط بصورة نوعية للجينات المشفرة للسلاسل الثقيلة والخفيفة الفأرية (الأجسام المضادة). الخلايا المهجنة ‎hybridoma‏ الاورامية تستخدم كمصدر مفضل لمثل هذا الحمض النووي ‎DNA‏ في هذا الاختراع. وبمجرد أن يتم إجراء الفصل؛ فقد يتم وضع ال ‎DNA‏ في نواقل تعبر عن الصيغة الوراثية؛ والتى يتم تحويلها ‎transfection ٠‏ خلايا عائل مثل خلايا قردية ‎simian COS cells‏ ؛ أو خلايا مبيض همستر

‎١86 =‏ - صيني ‎(CHO)‏ أو ‎IS‏ ورم ‎[elds‏ التى لا تنتج بطريقة أو بأخرى بروتين جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ للحصول على تصنيع الأجسام المضادة الأحادية الاستنساخ في خلايا عائل مهندسة وراثياً. قد يتم أيضاً تعديل ال ‎DNA‏ كأن يتم تعديله على سبيل المثال بواسطة إحلال المتتالية المشفرة لمجالات ثابتة لسلسلة ثفيلة وخفيفة بشرية بدلا من المتتاليات الفأرية المختلفة © الشكل أو التركيب 6851 :81 ‎Proc.

Nat.

Acad.

Sci.‏ مله ‎[Cabilly et al, supra; Marrison et‏ )1984( أو بواسطة الربط التساهميّ مع كل أو جزء من المتتالية المشفرة ل جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ وذلك لكل أو لجزء من المتتالية المشفرة ل ‎polypeptide‏ غير جلوبيلين المناعة ‎-immunoglobulin‏ ‏وبصورة نموذجية؛ يتم استبدال ‎Jia‏ هذه ال ‎polypeptide‏ غير جلوبيلين المناعة ‎non-‏ ‎immunoglobulin ٠‏ للمجالات الثابتة للجسم المضاد للاختراع أو يتم استبدالها للمجالات المتغيرة لموقع واحد متحد مع 0 للجسم المضاد للاختراع ليتم تخليق أو تكوين جسم مضاد ثنائي التكافؤ مخلوط ‎chimeric‏ (به إبدال وراثي ‎("chimeric"‏ يكون مشتملاً على موقع متحد مع ‎antigen‏ ‏ذى نوعية خاصة بالنسبة للمجموعة الترابطية ‎(mpl)‏ وموقع آخر متحد مع ‎antigen‏ ذى نوعية خاصية بالنسبة ل ‎.antigen‏ ‎ve‏ قد يتم ‎Lad‏ تحضير الأجسام المضادة الكيميرية أو المهجنة وذلك في أنابيب الاختبار المعملية باستخدام الطرق المعروفة في كيمياء تحضير البروتينات الصناعية ؛ شاملاً ذلك عوامل تحقيق الارتباط المتقاطع. على سبيل المثال؛ قد يتم بناء وتكوين سميات المناعية ‎immunotoxins‏ ‏باستخدام تفاعل تبادل ال ‎disulfide‏ أي ثاني الكبريتيد أو بواسطة تكوين رابطة ‎thioether bond‏ وتشتمل أمثلة الكيماويات المناسبة في هذا المقام لهذا الغرض على ‎methyl-4- ¢ iminothiolate‏ ‎-mercaptobutyrimidate ٠‏

— YAY - بالنسبة للتطبيقات التشخيصية؛ سيتم تحديد وتوشيم ‎labeling‏ الأجسام المضادة للاختراع بصسورة نموذجية بشق قابل للكشف عنه وتحديده. يمكن أن يكون الشق القابل للكشف عنه وتحديده عبارة عن أى شق يكون ‎SUE‏ لإنتاج إشارة قابلة للكشف عنها وتحديدها سواء كان ذلك بصورة مباشرة أو غير مباشرة. على سبيل المثال؛ قد يكون الشق القابل للكشف عنه وتحديده عبارة عن نظير ° إشعاعي ‎٠ radioisotope‏ مثل ‎CH‏ أو ‎SC‏ 0 أو 8 أو 1 أو أن يكون عبارة عن مادة قابلة للتفلور ‎fluorescent‏ أو عبارة عن مركب متلالئ كيميائياً ‎chemiluminescent‏ » مثل ‎rhodamine » fluorescein isothiocyanate‏ » أو ال ‎luciferin‏ والمسابير المميزة للنظائر ‎(da dial‏ كأن تكون على سبيل المثال ‎EP DT‏ أو ©*'؛ أو ‎CH‏ أو يكون عبارة عن إنزيم؛ كأن يكون على سبيل المثال ‎salkaline phosphatase‏ أى ‎beta-galactosidase‏ « أى ‎‘horseradish peroxidase‏ 0 ويمكن استخدام أية طريقة من الطرق المعروفة في مثل هذا المجال من هذا الفن لاقتران الجسم المضاد بصورة منفصلة مع شق قابل للكشف عنه وتحديده؛ شاملة بذلك الطرق التى تم وصفها بمعرفة كل من : [Hunter, et al., Nature, 144: 945 (1962)] ¢[David, et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974)] ¢[Pain, et al, J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981)] ¢[Nygren, J. Histochem. And

Cytochem. 30: 407 (1982)]. Vo ‏قد يتم استخدام الأجسام المضادة للاختراع الحالي في أية طريقة اختبار من الطرق‎ ‏طرق‎ « competitive binding assays ‏طرق اختبار الربط التنافسمئ‎ Jia ‏المعروفة؛‎ ‏المباشر‎ direct and indirect sandwich assays ‏الربط المتداخل في صورة سندوش‎

Zola, immunoprecipitation assays ‏وغير المباشرء. وطرق الاختبار بالترسسيب المناعي‎

‎١87 -‏ - ‎Mononclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. (147-158) (CRC Press, Inc.‏ )1987. تعتمد تجارب اختبار الربط التنافسي على قدرة معيار قياسي محدد ( والذي قد يكون عبارة عن ربيطة ‎(mpl)‏ أو عبارة عن ‎elie Ja‏ منه بصورة مناعية) لكى يتتافس مع ناتج تحليل عينة

‎٠‏ الاختبار (وهي ربيطة "1م" ) ‎Lad‏ يتعلق بالارتباط مع كمية محددة من الجسم المضاد. تتناسب كمية ربيطة ‎(mpl)‏ الموجودة في ‎die‏ الاختبار تناسباً عكسياً ‎inversely‏ مع كمية المعيار ‎bil)‏ ‏التى تصبح مرتبطة؛ وبصفة عامة تكون الأجسام المضادة غير قابلة للذوبان قبل وبعد المنافسة؛ وذلك لأنه قد يتم بصورة مناسبة إجراء فصل المعيار القياسيّ وناتج التحليل المرتبطين بالأجسام المضادة وذلك عن المعيار القياسي وناتج التحليل اللذين يظلان غير مرتبطين.

‎٠‏ يشتمل التحليل المشبه ‎Sandwich assays‏ على استخدام جسمين متضادين؛ كل منهما يكون قادراً على الارتباط بجزء مناعي مختلف؛ أو بحيز ‎epitope‏ أو الأنتيجين؛ أو البروتين (ربيطة "ام(«") المراد الكشف ‎die‏ وتحديده. في تحليل السندوتش؛ حيث يتم ربط عينة الاختبار بواسطة الجببم المضاد الأول الذي ‎i‏ فوق مادة صلبة داعمة ‎solid suppor‏ ؛ ثم يرتبط الجسم المضاد الثاني بناتج ‎dial‏ وبالتالي يُكوّن ثلاثة أجزاء معقدة غير قابلة للذوبان. ‎David & Greene US.

Patent‏

‎No 4,376,110 \e‏ قد يتم تمييز الجسم المضاد الثاني بمسبار وذلك باستخدام شق قابل للكشف عنه وتحديده (تجارب اختبار طريقة السندوتش المباشرة) أو قد يتم قياسه وتقديره باستخدام جسم مضاد ل "جلوبيلين" المناعة الذي يتم تمييزه بشق قابل للكشف عنه وتحديده (تجارب اختبار طريقة السندوتش غير المباشرة). على سبيل المثال؛ أحد أنواع طريقة السندوتش عبارة عن تحليل الاختبار ‎«(ELISA)‏ وهي الحالة التى يكون فيها الشق القابل للكشف عنه وتحديده عبارة عن إنزيم

‏على سبيل المثال إنزيم ‎-horseradish peroxidase‏

‎١8# -‏ - ض ‎(ii)‏ الأجسام المضادة البشرية والتى يتم جعلها بشرية ‎Humanized and human antibodies‏ لقد عُرفت في مثل هذا الفن ومعرفة جيدة الطرق التى يتم بها جعل الأجسام المضادة غير البشرية أجساماً مضادة بشرية. وبصفة عامة؛ فإن الجسم المضاد المراد جعله بشرياً تدخل عليه وحدة بنائية لحمض أميني واحد أو أكثر يتم إدخاله من غير بشري. وفي ‎lla)‏ يُشار إلى الوحدات م٠‏ البنائية للحمض الأميني غير - البشري هذه على أنها وحدات بنائية دخيلة "من مصدر خارجي" ‎(import)‏ والتى تؤخذ بصورة نموذجية بصورة نموذجية من مجال متغير "دخيل خارجي". يمكن أن يتم تنفيذ عملية التحويل إلى بشرية بصفة أساسية بإتباع طريقة وينتر ومساعدية ‎[Winter and‏ ‎[Riechmann et al, Nature, 322: ¢co-workers Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]‏ ‎[Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)] £323-327 (1988)]‏ وذلك باستبدال 1 متتاليتي القوارض ‎CDRs‏ أو ‎CDR‏ للمتاليات المقابلة لها للجسم المضاد البشري. ووفقاً لذلك؛ تكون مثل هذه الأجسام المضادة التى تم جعلها بشرية عبارة عن أجسام مضادة كيميرية "أى بها ‎Ja‏ وراثي" ‎et al, supra)‏ «الاطة0)؛ حيث يكون قد تم فيها بصفة أساسية تكوين أقل من مجال متغير ‎variable domain‏ بشري سليم مستبدل بواسطة المتتالية المقابلة من أنواع غير بشرية. وفي الممارسة العملية؛ تكون الأجسام المضادة التى تم جعلها بشرية بصورة نموذجية عبارة عن أجسام ‎١‏ مضادة بشرية والتي يتم فيها استبدال بعض الوحدات البنائية 001 ومن الممكن بعض الوحدات البنائية ‎FR‏ وذلك بواسطة وحدات بنائية من مواقع مماثلة موجودة في الأجسام المضادة للقارض. إن اختيار المجالات المتغيرة البشرية ‎human variable domains‏ ؛ كلا منها الخفيفة والثقيلة والمراد استخدامها في جعل الأجسام المضادة أجساماً مضادة بشرية يكون أمراً هاماً لتخفيض التضادية ‎٠ reduce antigenicity‏ ووفقاً لطريقة الأفضل - المضبوطة المناسبة 88-51"؛ يتم © عرض متتالية المجال المتغير للجسم المضاد للقارض مقابل المجموعة الكلية كلها بالكامل

‎١64 -‏ لمتتاليات المجال المتغير البشري المعروفة. ‎clin‏ يتم قبول المتتالية البشرية التى تكون أقرب ما يكون لمتتالية القارض وذلك في صورة الهيكل البشري ‎human framework (FR)‏ للجسم المضاد الذي تم جعله بشرياً ])19993( 2296 :151 ‎[Chothia and Lesk, J. ¢[Sims et al., J.

Immunol.,‏ ‎Mol.

Biol, 196:901 (1987)]‏ وهناك طريقة أخرى تقوم باستخدام هيكل لنظام خاص مشتق من ا الاحصائية الدقيقة الشاملة لجميع الأجسام المضادة البشرية لمجموعة فرعية خاصسة لسلاسل خفيفة أو سلاسل ثقيلة. قد يتم أيضاً استخدام نفس هيكل النظام لأجسام مضادة عديدة مختلفة تم جعلها أجساماً مضادة بشرية ‎[Carter et al, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 89: 4285 (1992)] ¢[Presta et al., Immnol.,‏ -])1993( 2623 :151 ‎٠‏ إنه لمن المهم بالإضافة لما تقدم أن يتم تحويل الأجسام المضادة المراد جعلها أجساماً ‎ine‏ ‏بشرية بحيث تحتفظ بألفة عالية ل 0 وبالخواص البيولوجية الأخرى المفضلة. لتعزيز هذا الهدف وفقاً لطريقة مفضلة؛ يتم تحضير الأجسام المضادة المحولة إلى بشرية بواسطة عملية تحليل المتتاليات الأصلية والنواتج المحولة بشرياً العديدة التصور ‎conceptual‏ باستخدام نماذج ثلاثية الأبعاد ‎Three dimensional models‏ متوفرة بصورة شائعة عادية وتكون مألوفة لدى ذوى ‎١‏ الخبرة والمهارة في ‎Jie‏ هذا الفن. إن برامج الكمبيوتر متوفرة والتى توضح وتعرض البنيات المشتركة الحدود الثلاثية الأبعاد المحتملة لمتتاليات جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ المرشحة المختارة. إن فحص ودراسة هذه العروض يسمح بتحليل الدور المتحمل للوحدات البنائية في الوظيفية الخاصة بمتتالية جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ المرشح لهذا العمل؛ أى تحليل الوحدات البنائية التى تؤثر على قدرة جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ المرضح في ربط ‎antigen ٠‏ الخاص به. وبهذه الطريقة؛ يمكن أن يتم اختيار وحدات بنائية ‎(FR)‏ وجعلها تتحد من

ا ‎YA‏ — المتتالية الإحصائية الدقيقة الشاملة الدخيلة (من مجال خارجي)؛ لكى يتم تحقيق الخواص المميزة المطلوبة للجسم المضاد والمرغوب فيها مثل الألفة المتزايدة لمولد (لمولدات) الضد المستهدف (المستهدفة) . وبصفة عامة؛ يتم تضمين الوحدات البنائية ‎(CDR)‏ بصورة مباشرة وبصفة أساسية في معظم الأحيان في التأثير على ربط ‎antigen‏ ولمزيد من التفاصيل الإضافية أنظر طلب © البراءة الأمريكية مسلسل رقم )373 ,07/934( المودع في ‎١‏ أغسطس عام (997١م)؛‏ الذي يشترك بصورة جزئية مع طلب البراءة الأمريكية مسلسل رقم (272 ,07/715) المودع في ‎VE‏ ‏يونيو عام (991١م).‏

وبطريقة بديلة؛ فإنه من الممكن الآن أن يتم إنتاج حيوانات متحولة ‎transgenic‏ جينياً (مثل ‎oo) iil‏ والتى تكون قادرة عند تطعيمها أن تقوم بإنتاج ذخيرة (مجموعة غفيرة) من الأجسام ‎٠‏ المضادة البشرية في حالة عدم وجود إنتاج جلوبيلين مناعة داخلي المنشاً والنمو. على سبيل ‎(Jal)‏ فقد تم وصف أن إلغاء الجينات ‎homozygous deletion‏ المتجانسة لسلسلة الجسم المضاد ‎ALE‏ الموصلة لجين ‎(J)‏ في سلالة فار به إيدال ‎chimeric {ys‏ تم به إحداث طفرة يؤدي إلى تثبيط تام وكامل لإنتاج جسم مضاد داخلي المنشاً والنمو. سيؤدي نقل نظام ترتيب جين جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ للسلالة البشرية في مثل هذه ‎ADL‏ الفأرية وذلك إلى إنتاج أجسام

‎Vo‏ مضادة بشرية عندما يتم إستفرازها بال ‎antigen‏ . أنظر على سبيل المثال؛ ‎Jakobovits et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA. 90:2551-255 [1993]; Jakobovits et al.,‏ ‎Nature, 362:255-258 [1993]; Bruggermann et al.. Year in Immuno., 7:33 [1993].‏

— ١7 -

يمكن أن يتم أيضاً إنتاج أجسام مضادة بشرية في مجموعات عرض مصنفة بلعمية ‎phage‏ ‏(ملتهمة أو أكالة) ‎(Hoogenboom and Winter, J.

Mol.

Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J.

Mol.

Biol. 222,‏

581 [1991]).

‎(iv) ©‏ أجسام مضادة ثنائية الخصوصية ‎Bispecific antibodies‏ :

‏تكون الأجسام المضادة الثنائية ‎bispecific‏ الخصوصية أحادية الاستنساخ ‎monoclonal‏ » ومن المفضل أن تكون أجسام مضادة بشرية أو تم جعلها بشرية ‎humanized‏ والتى تكون ذات نوعيلت إرتباط ل ‎antigens‏ مختلفين على الأقل. لقد عرفت طرق عمل الأجسام المضادة الثنائية الخصوصية في مثل هذا الفن.

‎٠‏ وبصورة تقليدية عادية؛ فإن إنتاج الهندسة الوراثية للأجسام الثنائية الخصوصية يتم على أساس التعبير عن الصيغة الوراثية المشتركة لأزواج سلسلة ‎ALE‏ سلسلة - خفيفة ل جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ ¢ حيث يكون للسلسلتين الثقيلتين نوعيات مختلفة ‎[Millstein and Cuello,‏ ‎.Nature, 305: 537-539 (1983)]‏ ونظراً للفرز والتصنيف العشوائي ‎random assortment‏ للسلاسل الثقيلة والخفيفة ل جلوبيلين المناعة ‎immunoglobulin‏ » فإن هذه الأورام المهجنة

‎hybridomas ٠‏ (الأورام الرباعية ‎(‘quadromas”‏ تقوم بإنتاج خليط محتمل من ‎(Vr)‏ جزيئات جسم مضاد مختلفة؛ والتى منها واحداً فقط يكون له البنية الثنائية الخصوصية الصحيحة. إن عملية تنقية الجزيئ الصحيح؛ والتي يتم إجراؤها من المعتاد بواسطة تنفيذ خطوات كروماتوجرافية التآلف والإنجذاب؛ فإنها تكون مزعجة ومرهقة إلى حد ‎cle‏ كما أن حصيلة الناتج تكون منخفضة. لقد تم كشف النقاب أيضاً عن إجراءات مماثلة في طلب البراءة الدولية ‎(PCT)‏ رقم (93/08829 ‎(Wo‏

‎YAY -‏ - (التي تم نشرها في ‎١“‏ مايو ‎١999‏ م)؛ كما تم الإفصاح عنها في ‎[Traunecker et al, EMBO,‏ ])1991( 3655-3659 :10. ووفقاً لطرق مختلفة ومفضلة بصورة ‎«JST‏ يتم دمج مجالات متغيرة للجسم المضاد مع نوعيات الربط المطلوبة المرغوب فيها (مواقع ربط "جسم مضاد - ‎antigen‏ ") وذلك مع متتاليات مجال م ثابت ل جلوبيولين المناعة ‎immunoglobulin‏ . ومن المفضل؛ أن يتم الدمج بمجال ثابت لسلسلة ‎ALE‏ ل جلوبيولين المناعة ‎immunoglobulin‏ ؛ يكون مشتملاً على جزء على الأقل من المفصسل (الجزء الرابط)؛ للمنطقتين (للمجموعتين) ‎(CH2‏ 0113. إنه لمن المفضل أن يكون ذا منطقة تابتة للسلسلة ‎ALE)‏ الأولى ‎(CHI)‏ المحتوية على الموقع الضروري لربط السلسلة الخفيفة؛ الموجودة في دمج واحد على الأقل من الاندماجات. يتم ‎Jay)‏ الأحماض النووية ‎(DNAs)‏ المشفرة ‎٠‏ الاندماجات السلسلة الثقيلة ل جلوبيولين المناعة ‎«immunoglobulin‏ وحسب الرغبة يمكن أن يتم ‎Lad‏ إدخال السلسلة الخفيفة ل جلوبيولين ‎immunoglobulinde lil‏ وذلك في نواقل منفصلة معبرة عن الصيغة الوراثية؛ ويتم إدخال الناقلين ‎vectors‏ ادخال ‎cotransfected into & yids‏ لكائن دقيق عائل مناسب. إن هذا يوفر أو يزود بمرونة كبيرة في تضبيط النسب المتبادلة للأجزاء ال ‎ADEN polypeptide‏ في النماذج عندما تكون هناك نسب غير متساوية لسلاسل الل ‎polypeptide ٠‏ الثلاثة المستخدمة في التكوين الذي يحقق حصيلات النواتج المثالية. إنه على أية حال؛ من الممكن أن يتم إدخال المتتاليات المشفرة لسلسلتين من الل ‎polypeptide‏ للثلاثة سلاسل من ال ‎polypeptide‏ جميعها وذلك في ناقل واحد معبر عن الصيغة الوراثية عندما يكون التعبير عن الصيغة الوراثية لسلسلتى ‎peptide‏ على الأقل مساوياً للنسب الناتجة عن حصيلات الناتج العالية أو عندما تكون هذه النسب ليست ذات أهمية خاصة. وفي نموذج مفضل لهذه الطريقة؛ تتكون الأجسام المضادة الثنائية التخصصية من سلسلة ثقيلة مهجنة ل جلوبيولين المناعة مع نوعية ربط أولى في ذراع واحد؛ وزوج مهجن لسلسلة ‎ALE‏ سلسلة - خفيفة ل

‎YAN —‏ — جلوبيولوجين المناعة (مع توفير نوعية ربط ثانية) في الذراع الآخر. لقد وجد أن هذه البنية غير المتماثلة ‎Jot‏ إنفصال المركب الثنائي النوعية المطلوب والمرغوب فيه من اتحادات سلسلة جلوبيولوجين مناعة غير مطلوبة؛ نظراً لوجود سلسلة خفيفة ل "جلوبيولين مناعة" في نصف واحد فقط من الجزئ الثنائي التخصصية يوفر طريقة تسهيل الفصل. لقد تم كشف النقاب عن هذه © الطريقة في طلب البراءة التى لم يتم البت فيها بعد وتحمل رقم مسلسل (811 ,07/931)؛ المودعة في ‎VV‏ أغسطس )39 ‎(a)‏ (البراءة الأوروبية رقم "656064 "). لمزيد من التفاصيل فيما يتعلق بإنتاج الأجسام الثنائية التخصصية؛ أنظر على سيل المثال؛ ‎-[Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]‏ ‎(v)‏ الأجسام المضادة ‎Heteroconjugate antibodies‏ المترافقة بصورة غير متجانسة .

‎٠‏ إن الأجسام المضادة المتراققة بصورة غير متجانسة تقع ‎Loaf‏ في إطار مجال الاختراع الحالي. تتكون الأجسام المضادة غير المتجانسة الترافق من جسمين مضادين مرتبطين بصورة تساهمية. لقد أقترح لهذه الأجسام المضادة على سبيل المثال أن تستهدف خلايا جهاز المناعة لتحول إلى ‎LA‏ غير مرغوب فيها (البراءة الأمريكية رقم 980 ,676 ,4 ‎(US.

Patent No.‏ ولعلاج الإصابة بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ‎"HIV"‏ [طلبات البراءات الدولية ‎(PCT)‏ أرقام

‎((WO 92/00373( WO 91/00360( ٠‏ والبراءة الأوروبية رقم )03089 ‎.[(EP‏ قد يتم عمل الأجسام المضادة المترافقة بصورة غير متجانسة باستخدام طرق ربط تقاطعية مناسبة. لقد عُرفت عوامل الربط المتقاطعة المناسبة معرفة جيدة في مثل هذا الفن؛ وقد تم كشف النقاب عنها في البراءة الأمريكية رقم )980 ,676 ,4 ‎(U.S.

Patent No.‏ على مدى إمتداد عدد من الطرق الفنية العديدة للربط المتسعرض (المتقاطع الروابط).

- ١/9 —

Therapeutic Use of the mpl ‏ربيطة‎ - MK WA ‏الاستخدام العلاجي للبروتين الدافع لبناء‎ (iv) : Megakaryocytopoietic Protein mpl Ligand hematopoietic ‏النشطة بيولوجياً ذات الفعالية الحاثة لمكونات الدم‎ (mpl) ‏قد يتم استخدام ربيطة‎ ‏أو بروتين حاث‎ megakaryocytopoietic ‏والذي يشار إليه هنا على أنه بروتين حاث لبناء خلايا‎ ‏وذلك في تحضير مستحضر صيدلاني (دوائي) معقم أو في تركيبة‎ (TPO) ‏لبناء صفائح الدموية‎ ٠ ‏أو تولد الصفائح الدموية في‎ MK LAN ‏صيدلانية معقمة لإستثارة وحث نشاط تولد كثرة‎ ‏الذي يُعزي إلى الإنتاج‎ thrombocytopenia ‏المرضى الذين يعانون من نقص الصفائح الدموية‎ ‏أو تلفها المتزايد. إن قلة أو نقص النمو‎ sequestration ‏الضعيف»؛ أو إلى إنفصال الصفائح الدموية‎ ‏لنخاع العظام المرتبط بنقص الصفائح الدموية (على سبيل المثال؛ فقر الدم‎ hypoplasia ‏النسيجي‎ ‏لبطئ النمو نتيجة العلاج الكيميائي أو بزرع نخاع عظام) فقد يتم علاجه بصورة‎ aplastic anemia) ie ‏يمكن استخدامها في علاج الاضطرابات؛‎ Loaf ‏فعالة باستخدام مركبات هذا الاختراع وكذلك‎ ‏ونقص الصفائح‎ disseminated intravascular coagulation (DIC) ‏الأوعية المنتشر‎ Jala ‏التجلط‎ ‏المستحثة ب (317)؛‎ (ITP) ‏(شاملة‎ immune tnrombocytopenia ‏الدموية الخاصة بالمناعة‎ chronic ‏ونقص الصفائح الدموية ذاتية الاعتلال المزمنة‎ ((HIV) ‏غير المستحثة ب‎ (ITP) ‎Idiopathic thrombocytopenia ٠‏ ¢ ونقص الصفائح الدموية الطبيعي ‎Jia congenital‏ الولادة؛ وسوء النمو ‎myelodysplasla eal‏ ونقص الصفائح الدموية التجلطية ‎thrombotic‏ ‎thrombocytopenia‏ بالإضافة إلى ذلك؛ فقد تكون مثل هذه البروتينات الحاثة للتكاثر لنمو ‎megakaryocytopoietic‏ مفيدة في علاج أمراض ‎HLS‏ الصفائح الدموية النخاعية ‎myeloproliferative‏ وكذلك أيضاً في علاج أمراض تكاثر الصفائح الدموية ‎thrombocytosis‏ ‏© الناتجة عن حالات الإلتهابات ونقص الحديد.

‎Yq. -‏ - وتكون الاستخدامات المفضلة للبروتين الحاثة لتكاثر ‎MK‏ أو للبروتين المكوّن للجلطة أو المولد للصفائح الدموية ‎(TPO)‏ لهذا الاختراع متمثلة في الاقتران بالعلاج الكيميائي السام ‎myelotoxic‏ ‎chemotherapy‏ للنخاع؛ والعلاج الكيميائي المستأصل للنخاع ‎myeloablative‏ ؛ حيث يكون ‎oat‏ ‏الصفائح الدموية يُعزى إلى حدوث إنهيار لنخاع العظام ‎-bone marrow failure‏ ‎٠‏ كما أنه مازالت هناك اضطرابات أخرى من المفيد أن يتم علاجها باستخدام البروتينات الحاثة للتكاثر خلايا ‎MK‏ لهذا الاختراع؛ حيث تشتمل مثل هذه الاضطرابات على حدوث نقص أو إتلاف في الصفائح الدموية ناتجة عن تناول عقاقير ‎drugs‏ ؛ أو حدوث تسمم ‎poisoning‏ أو تنشيط على أسطح صناعية. في هذه الحالات؛ قد يتم استخدام المركبات الحالية لحث واستثارة تحقيق العزل أو الفصل ‎shedding‏ للصفائح الدموية الجديدة التى لم يتم إتلافها ‎undamaged‏ بعد. لمزيد من ‎the ‏الحصول على قائمة كاملة أكبر فيما يتعلق بالتطبيقات المفيدة في هذا المجال؛ أنظر‎ ٠ ‏(0)؛ وكذلك المراجع التى تم‎ and ‏إلى‎ (2) and ‏وبصفة خاصة الأقسام من‎ “Background” supra

La la £3 ‏الخاصة بالاختراع الحالي وذلك في صورة‎ MK ‏قد يتم استخدام البروتينات الحاثة لتكاثر لخلايا‎ ‏أخرى للخلاياء؛ أو مع مولدات للدم؛ أومع‎ cytokines ‏منفردة أو في صورة إتحاد مع‎ ‎١‏ إنترليوكينات؛ أو مع عوامل ‎sai‏ أو مع أجسام مضادة؛ وذلك في علاج الاضطرابات والحالات ‏المرضية السابق ذكرها. لذلك؛ قد يتم استخدام المركبات الحالية في صورة إتحاد مع بروتين 351 أو مع ببتيد آخر له نشاط مكون للجلطة ‎thrombopoietic‏ أو مولد للصفائح الدموية شاملاً ذلك: ‎IL-1 1-087 «LIF «GM-CSF «G-CSF‏ 11-3؛ مُكون الكرت الدموية الحمراء ‎<erythropoietin (EPO)‏ ربيطة ‎kit‏ لتصمونا ‎kit‏ « 6مكل 11-11

‎١9١ -‏ - ويتم تحضير البروتينات الحاثة لتكاثر خلايا ‎MK‏ الخاصة بالاختراع الحالي وذلك في صورة خليط مع مادة حاملة مقبولة صيدلانياً. يمكن أن يتم تناول التركيبة العلاجية بالحقن بداخل الوريد أو تناولها من خلال الأنف أو من خلال الرئة. كما يمكن أن يتم تناول التركيبة بالحقن عن غير طريق القناة الهضمية ‎parenterally‏ أو بالحقن تحت الجلد إذا رغب في ذلك. وعندما يتم تناولها ‎٠‏ بانتظام؛ يجب أن تكون التركيبة العلاجية خالية من الممرضات ‎pyrogen-free‏ وفي صورة محلول مقبول للحقن ذى أس هيدروجيني ‎(Ph)‏ مناسب؛ بتركيز ‎«isotonic‏ وعلى درجة عالية من الثبات. إن مثل هذه الظروف معروفة لدى أولئك المهرة وذوى الخبرة في ‎Jie‏ هذا المجال من هذا الفن. وباختصار؛ يتم تحضير تركيبات الجرعة لمركبات الاختراع الحالي لأغراض التخزين أو التتلول وذلك بواسطة خلط المركب الذي له الدرجة المطلوبة من النقاء مع مواد حاملة؛ أو مواد مكسبة ‎٠‏ ا للاستساغة ‎excipients‏ أو مواد مثبتة ‎stabilizers‏ مقبولة كلها فسيولوجاً. تكون ‎Jia‏ هذه المواد غير سامة لمتلقيها من المرضى الخاضعين للعلاج وهذا بالنسبة للجرعات والتركيزات ‎A‏ يتم استخدامها؛ وتكون مشتملة على محاليل منظمة مثل أملاح الفوسفات ¢ و ‎citrate‏ )و ‎cacetate‏ ¢ وأملاح الأحماض العضوية الأخرى؛ ومشتملة أيضاً على مضادات للأكسدة ‎antioxidants‏ مثل ‎«ascorbic acid‏ و ‎peptides‏ ذات أوزان جزيئية منخفضة (تكون أقل من حوالي عشرة وحدات ‎eo‏ بنائية) مثل ‎cpolyarginine‏ وكذلك تكون مشتملة أيضاً على بروتينات؛ ألبومين مصل الدم ‎serum‏ ‎gelatin i « albumin‏ ؛ أو جلوبيولينات المناعة ‎immunoglobulins‏ ¢ وكذلك تكون مشتملة أيضاً على البوليمرات الماصة ‎hydrophilic polymers‏ للماء ‎polyvinylpyrrolidinone J—is‏ ¢ وأيضاً تكون مشتملة على أحماض أمينية متلى ‎glycine‏ « أو ‎glutamic acid‏ « أو ‎aspartic acid‏ ¢ أو ‎arginine‏ ؛ وكذلك تكون مشتملة أيضاً على ‎disaccharides « monosaccharides‏ ¢ وكذلك ‎La]‏ ‎carbohydrates Y.‏ أخرى شاملة ‎cellulose‏ أو ‎«ili a‏ أر ‎glucose‏ « أو ‎mannose‏ » أو ‎derivatives‏ » وكذلك أيضاً عوامل مخلبية ‎«(EDTA) Jia chelating agents‏ وأيضاً كحولات

‎Vay -‏ - سكرية ‎mannitol Jie sugar alcohols‏ أو ‎sobitol‏ ؛ وكذلك أيضاً أيونات مضادة ‎counterions‏ ‏أو عكسية مثل ‎ssodium‏ /أو المواد المخفضة للتوتر السطحي 5 غير الأيونية ‎Je‏ ‏المواد التى تحمل العلامة التجارية ‎.polyethyleneglycol si Pluronics™ «Tween™‏ يتم تكوين مركب ‎Lay‏ يتراوح من )10( مللىجرام إلى )004( مللىءجرام من مركب أو من خليط ه للبروتين الحاث لتكاثر خلايا ‎MK‏ وذلك على صورة الحمض الحر ‎free acid‏ أو القاعدة ‎sal‏ ‎free base‏ في صورة ملح مقبول صيدلانياً؛ وذلك مع ناقل؛ مادة حاملة؛ مادة مكسبة للاستساغة؛ مادة رابطة "تساعد على التماسك والإلتحام"؛ ‎sale‏ حافظة ‎068080٠78‏ مادة مثبتة؛ مادة مكسبة للنهكة ‎«flavor‏ الخ ومقبولة جميعها فسيولوجياء حسبما يقتضي أو يتطلب ذلك بواسطة الممارسة الصيدلانية المقبولة. ويتم الحصول على كمية المكون الفعال في هذه التركيبات بحيث ‎٠‏ تكون الجرعة المناسبة موجودة في حدود المدى الذي تم توضيحه. يمكن أن يتم تشكيل أو تكوين التركيبات المعقمة لأغراض الحقن ‎lig‏ للممارسات الصيدلانية التقليدية المألوفة. على سبيل المثال؛ قد يكون من المرغوب فيه أن تتم إذابة المركب الفعال أو عمل معلق له في ناقل مثل الماء أو في زيت نباتي ‎vegetable oil‏ موجود بصورة طبيعية (طبيعي) مثل زيت السمسم ‎sesame‏ ؛ أو زيت الفول السوداني ‎peanut‏ ؛ أو زيت بذرة القطن ‎cottonseed ٠‏ ؛ أو أن يتم ذلك في ‎Jil‏ دهني صناعي ‎ethyl oleate Jie‏ ؛ أو ما شابه ذلك. يمكن أن يتم دمج المحاليل المنظمة؛ والمواد الحافظة؛ والعوامل (المواد) المضادة للأكسدة وذلك ‎Ly‏ ‏للممارسات الصيدلانية (الدوائية) المقبولة. تشتمل الأمثلة المناسبة للمستحضرات التى تنطلق منها المادة الفعالة ببطء ‎sustained-release‏ على أنسجة بين نسيج شبه ‎semipermeable matrices dite‏ من بوليمرات مواد صلبة طاردة ‎solid‏ ‎hydrophobic polymers | 7٠‏ للماء محتوية على ال ‎polypeptide‏ + وهى الأنسجة التى تكون في

‎Yay -‏ - صورة مواد مشكلة بصورة معينة؛ مثل الشرائح ‎films‏ الرقيقة أو الكبسولات الدقيقة ‎microcapsules‏ . وتشتمل أمثلة الأنسجة بين الخلوية التى تنطلق منها المادة الفعالة ‎shy‏ على ‎hydrogels « polyesiers‏ لجبلات مائية) ‎WJ Ad Jw Le]‏ ‎(poly(2-hydroxyethylmethacrylate)‏ حسبما تم وصفها بواسطة ‎[Langer et al, J.

Biomed.‏ هه ])1981( )167-277( :15 ‎Mater.

Res.,‏ ¢ ])1982( )96-105( :12 مك1 ‎¢[Langer, Chem,‏ أو ‎[poly(vinylalcohol)‏ كما تشتمل على ‎se) je] polylactides‏ الأمريكية رقم ‎(US.

Patent No. 3, 773, 919)‏ والبراءة الأوروبية رقم )481 ,58 ‎(EP‏ ‏و ‎copolymers‏ لحمض ‎«L-glutamic‏ و ‎Sidman et al,] gamma ethyl-L-glutamate‏ ‎ethylene-vinyl acetate «[Biopolymers, 22: (547-556) (1983)‏ غير القابلة للإنحلال بيولوجياً ‎٠‏ أو كيميائياً ‎«(Langer et al, supra)‏ و ‎copolymers‏ لحمض ‎lactic‏ و ‎acidglycolic‏ القابلة للانحلال بيولوجياً أو كيميائياً مثل تلك التى تحمل العلامة التجارية ‎"Lupron Depot™"‏ (عبارة عن كريات دقيقة ‎microspheres‏ قابلة للحقن مكونة من ‎copolymers‏ لحمض ‎lactic‏ وحمض ‎«(leuprolide acetate « glycolic‏ ى ‎poly-D (-)-3-hydroxybutyric acid‏ (البراءة الأوروبية رقم 988 ,133(

‎١‏ وبالرغم من أن البوليمرات مثل ‎ethylene-vinyl acetate‏ و ‎copolymers‏ لحمض 80116لوحمض ‎glycolic‏ قادرة على إطلاق جزئيات على مدى إمتداد ‎class )٠٠١(‏ إلا أن هناك ‎hydrogels‏ تقوم بإطلاق بروتينات على مدى إمتداد فترات زمنية قصيرة وأكثر فصراً. وعند بقاء البروتينات المكبسلة ‎encapsulated‏ في الجسم لفترة ‎Alysha‏ من الزمنء فإنها قد تفقد طبيعتها أو قد تتراكم نتيجة لتعرضها لرطوبة في درجة حرارة (27"م)؛ ‎Lam‏ 5033( إلى ققدائها لفعاليتها البيولوجية مع

‎x.‏ إحتمال حدوث تغيرات محتملة في إنتاج مولدات المناعة. يمكن استحداث واستنباط استراتيجيات منطقية لتثبيت البروتين وهذا يعتمد على الميكانيكية (الآلية) التى يتم تضمينها على سبيل المثال؛

- Vag ‏تكون عبارة عن تكوين رابطة‎ aggregation ‏إذا تم اكتشاف أن ميكانيكية (آلية) التراكم أو التجميع‎ ‏بين جزيئية (58-9) من خلال تغير داخلي 01901506؛ فقد يتم تحقيق التثبيت بواسطة تعديل‎ ‏من محاليل‎ lyophilizing ‏والتجفيف بالتجميد‎ sulfhydryl residues ‏وحدات بنائية ال‎ 8 ‏حمضية؛ مع السيطرة على محتوى الرطوبة باستخدام مواد مساعدة إضافية مناسبة؛ مع تطوير‎ polymer matrix ‏تركيبات مادة النسيج لبوليمر نوعي‎ ‏المطلقة للمادة الفعالة ببطء وذلك على‎ MK WAY ‏تشتمل أيضاً تركيبات البروتين الحاث لتكاثر‎ ‏يتم تحضير‎ Liposomes ‏المحتجز في صورة جسم دهنئ‎ MK Wal ‏بروتين الحاث لتكاثر‎ ‏الأجسام الدهنية المحتوية على البروتين الحاث لتكاثر الخلايا 106 بواسطة الطرق المعروفة في‎ [Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. ¢(DE 3, 218, 121) ‏ذاتها: البراءة الألمانية رقم‎ aa [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030- ¢ USA, 82: 3688-3692 (1985)] ٠

EP) «(EP 88, 046) «(EP 36, 676) «(EP 52, 322) ‏والبراءت الأوروبية أرقام‎ (4034 (1980)]

Japanese patent application 83-) ‏وطلب البراءة اليابانية رقم‎ «(EP 142, 641) (143, 949 ‏والبراءتين الأمريكتين رقمى )045 ,485 ,4)؛ )545 ,544 ,4( والبراءة الأوروبية رقم‎ «(118008 unilamellar ‏وبصورة عادية؛ تكون الأجسام المدهنية من نوع وحيدة الطبقات‎ (EP 102, 324( ‏المحتوى‎ led ‏والتى يكون‎ ) 208870375 (Ar) ‏إلى‎ )٠٠١( ‏الرقيقة الصغيرة (يتراوح من حوالي‎ ys al aly ‏تضبيط الجزء المختار‎ pig ¢ cholestero ‏الدهني أكبر من حوالي (770) مول من‎ ‏المثالي.‎ MK ‏إجراء علاج البروتين حاث لتكاثر الخلايا‎ ‏سيتم تحديد الجرعة بواسطة الطبيب المختص في هذا الشأن مع الأخذ بعين الاعتبار عدة عوامل‎ ‏معروفة في أنها تقوم بتعديل فعل العقاقير وتأثيراتها وهذه العوامل تكون شاملة درجة شدة المرض‎ ‏الخاضع للعلاج ونوعيته؛ وزن ونوع جنس المريض الخاضع للعلاج ونظامه الغذائي والفترة‎ - ©

‎١٠١8 -‏ — الزمنية لتناول العقار ومسار تناوله ‎route of administration‏ ¢ والأدوية الأخرى التي يتم تناولها والعوامل الأكلينيكية (السريرية) الأخرى ذات العلاقة. وبصورة نموذجية؛ سيكون النظام اليومي لمعدل الجرعة المعطاة في حدود مدى يتراوح من ‎٠٠١ - ١,١‏ ميكروجرام / كجم من وزن الجسم. ومن المفضل أن تكون الجرعة في حدود مدى يتراوح من ‎١١‏ ميكروجرام/ كجم إلى ‎٠‏ )00( ميكروجرام/ كجم من وزن الجسم. ومن المفضل بصورة أكثر؛ أن تكون الجرعة في حدود مدى يتراوح من ‎)١(‏ ميكروجرام/ كجم إلى © ميكروجرام/ كجم/يوم. واختيارياً؛. سيكون مدى الجرعة هو نفسه بالنسبة لل ‎cytokines‏ الأخرى ؛ وبصفة خاصة ‎«(GM-CSF) (G-CSF)‏ ‎(EPO)‏ وقد يتم تعيين وتحديد الجرعات الفعالة ‎Uf Ladle‏ بالطرق التي يتم إجراؤها في التجارب المعملية في أنابيب الاختبار أو تلك التي يتم إجراؤها في جسم الكائن الحي.

‎٠‏ أمثلة بدون طرح المزيد من ‎(Coal‏ فإنه لمن المعتقد أنه بإمكان أى متمرس عادي وذو مهارة وخبرة في مثل هذا المجال من هذا الفن أن يقوم باستخدام الوصف السابق والأمثلة التلوضيحية؛ وأن يقوم بعمل الاختراع الحالي وتنفيذه واستخدامه على الوجه الأكمل إلى المدى الأقصى والتام له. ومن نم فإن أمثلة العمل التالية توضح بصورة نوعية النماذج المفضلة للاختراع الحالي؛ وأنه ليس من

‎yo‏ المقصود من طرحها أن تكون بطريقة أو بأخرى تحديدا للجزء المتبقي من الاختراع؛ بل أنه قد تم طرحها على سبيل المثال لا على سبيل الحصر.

‎Va —‏ - مثال رقم )1( التنقية الجزئية ‎Partial Purification‏ لربيطة ‎(mpl)‏ في الخنازير تم تجميع بلازما قليلة الصفائح الدموية من خنازير مصابة بففر الدم عادية أو عديمة النشاط 16 . لقد تم جعل الخنازير عديمة النشاط بتعريضها للإشعاع ‎irradiation‏ بمقدار 900( ‎cGy) ©‏ من إجمالي الإشعاع المعرض له الجسم وذلك باستخدام معجل خطي بطاقة )£( مليون إلكترون فولت ‎AMEV‏ لقد تم رعاية ‎supported‏ الخنازير التي تعرضت للإشعاع بحقنها في العضل بال ‎cefazolin‏ لمدة تتراوح من (6) إلى ‎(A)‏ أيام. ثم تمت إزالة دمها الإجمالي بعد إخضاعها لتخدير كلي مضافاً للدم ‎hepannized‏ ؛ ثم الإخضاع لقوة طرد مركزية بمعدل ‎١8060‏ ‏ع لمدة ‎cis )٠١(‏ للحصول على بلازما ضعيفة الصفائح الدموية. لقد وجد أن النشاط ‎٠‏ المستثير أو الحاث للخلية ‎MK‏ يبلغ الذروة بعد مضى (6) أيام من التعرض للإشعاع. تتم معالجة البلازما ‎Aplastic Zsa)‏ (عديمة النشاط) في الخنازير التي تم الحصول عليها من خنازير تعرضت للإشعاع وذلك باضافة ‎NaCl‏ بتركيز ؛ مولار ؛ ثم يتم التقليب لمدة 70 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعدهاء تتم إزالة الراسب قوة الطرد المركزية بسرعة دورانية 7800 لفة في الدقيقة في جهاز من النوع الذي يحمل العلامة التجارية ‎(Sorvall RC 3B™)‏ ثم يتم ‎٠‏ تحميل المادة الطافية ‎supernatant‏ فوق عمود ‎٠٠١ daw‏ مل من نوع ‎(Phenyl-Toyopearl)‏ تمت ومعادلته في ‎٠‏ مللى مولار من ,11800 المحتوي على ؛ مولار [2180). ثم تم غسل العمود بهذا المحلول المنظم إلى أن أصبح الامتصاص ‎Aggy‏ > 1,00( ثم تم إجراء الغسل ‎elution‏ ‏التتابعية ب 011:0. ثم تم تخفيف ذروة البروتين المصفى تصفية تتابعية ب 011:0 إلى حيث أصبحت الموصلية الكهربية ‎mS) conductivity‏ 15( ثم تم إجراء التحميل فوق عمود من نوع ‎(Blue- Sepharose) ٠٠‏ بسعة 7560 لتر تمت معادلته في ‎PBS‏ وبالتالي؛ تم غسل العمود بمقدار ©

‎vay -‏ - أحجام من حجم العمود بال ‎PBS‏ و ‎٠١‏ مللى مولار 108007 بأس هيدروجيني ‎pH)‏ = 4 محتوياً على ؟ مولار ‎urea‏ ثم تم إجراء تصفية تتابعية للبروتينات من العمود باستخدام ‎٠١‏ ‏مللى مولار ‎MNaPO,‏ بأس هيدروجيني ‎pH)‏ = 7,4) ومحتوية على ¥ مولار ‎Veurea‏ ‏مولار من ‎NaCl‏ لقد تمت معالجة ذروة البروتين المصفى تصفية تتابعية وذلك باستخدام ‎١ ¢ octyl glucoside(n-octyl -D-glucopyranoside) (7+, + ) ٠‏ مللي مولار ‎Mm‏ بكل من ‎EDTA‏ ‏و ‎Pefabloc‏ والعلامة التجارية )™ ‎((Bochinger Mannheim‏ ثم تم التحميل بصورة مباشرة فوق (مع,0) مرتبط بصورة تتابعية [(1989) 525-531 :337 ‎Capon DJ. et al, Nature‏ وأعمدة ‎(Pierce) mpl-lgG Ultralink‏ (أنظر ما يلي ‎Lad‏ بعد). ثم تم رفع عمود — (004-186) ذى سعة ال ؟ مل وإزالته بعد أن تم تحميل العينة؛ ثم تم غسل العمود ‎(mpl-IgG)‏ ذى السعة ؛ مل ‎٠‏ بمقدار ‎٠١‏ أحجام من حجم العمود من كل من ‎(PBS)‏ وكان كل من ‎(PBS)‏ محتوياً على ؟ مولار ‎«NaCl‏ ثم تم إجراء التصفية التتابعية باستخدام ‎١١‏ مولار من ‎glycine hydrochlorcle‏ « بأس هيدروجيني ‎pH)‏ = 1,75). لقد تم تجميع الأجزاء في عُشر حجم ‎١‏ مولار ‎Tris-HCl‏ بأس هيدروجيني "11م - 8.60" . ‎ad)‏ تم ‎ela)‏ تحليل الأجزاء المصفاة تصفية تتابعية ‎elution‏ من عمود تآلف ربيطة ‎mpl-affinity‏ ‎١‏ وذلك بواسطة استخدام ‎(Novex gel 77١ — £) SDS-PAGA‏ تحت ظروف مختزلة ؛ أو كف عن وجود بروتينات عديدة (شكل رقم (*)). لقد تم تحليل البروتينات التي إصطبغت بالفضة بدرجة شديدة أو بالكثافة العالية جداً بان لها الأوزان الجزيئية ‎Mr‏ بقيمة (15000)؛ (28000)؛ ‎(Faas)‏ (18000)؛ ‎(VE nn)‏ لتعيين ما هي هذه البروتينات؛ التس تستحث تكائثر لخلية ‎"Ba/F3-mpl"‏ المستنبتة تمت تصفية هذه البروتينات من الجل كما وصف في مثال رقم ‎)١(‏ أدناه .

‎١98 —‏ - أعمدة التآلف ‎Ultra link Affinity Columns‏ تم دمج ما يتراوح من ‎٠١‏ مللىجرام إلى ‎٠١‏ مللوجرام من ‎Simpl-IgG‏ 004-186 مع © جرامات ل ‎(Pierce) Ultralink resin‏ حسبما وصف ‎la‏ لتعليمات الصانع. التكوين والتعبير عن الصيغة الوراثية ل ‎Construction and Expression of mpl- (mpl-IgG)‏ ©1860 لقد تم التعبير عن الصيغة الوراثية للجزيئ المخلوط (الذي به إبدال وراثي) المشتمل على الحيز الخارج الخلوي بالكامل ل ‎mpl‏ البشرية (الأحماض الأمينية من ‎"٠"‏ إلى "491") والمنطقة ‎(Fc)‏ للجزئ "861 البشري وذلك في 797 خلية. لقد تم الحصول على جزء ‎cDNA‏ المشفر للأحماض الأمينية من ‎"٠"‏ إلى "91؟" لربيطة ‎mpl‏ البشرية وذلك بواسطة ‎(PCR)‏ المستمدة من مجموعة ‎(cDNA)‏ لخلية ‎(CMK)‏ من الخلايا النقية الكبيرة ‎Cua‏ تمت صياغتها في صورة ‎٠‏ -_متوالية. لقد تم إدخال الموقع ‎(Clal)‏ عند نهاية الطرف 5 وإدخال الموقع ‎(Bst Eli)‏ عند نهاية الطرف 3. بعدهاء تم استتساخ هذا الجزء ‎Lud‏ قبل المنطقة المشفرة ‎IgGl Fe‏ في ناقل من نوع ‎(Bluescript)‏ فيما بين الموقعين ‎(Bst Eli) ¢(Clal)‏ الموجود في ال ‎(DNA)‏ المشفر للمجال الخلوي الخارجيّ لربيطة ‎mpl‏ . لقد تم تحديد الموقع ‎(Bst El)‏ المدخل عند نهاية الطرف 3 للناتج ‎(PCR)‏ لربيطة ‎mpl‏ ليكون ذى المنطقة ‎(Fc)‏ إطار مع المجال الخلوي الخارجئ للربيطة عد ‎(mpl)‏ لقد تم إجراء استنساخ فرعي للبنية في ‎JU‏ مرتبط برابطة ‎Lad Pris-‏ بين الموقعين (لها©)؛ ‎(Xbal)‏ ثم نقل بالإصابة بالعدوى بداخل خلايا كلية جينية بشرية بواسطة طريقة ‎calcium‏ ‎phosphate‏ . لقد تم اختيار الخلايا في )+( مللىجرام/ مل (6418) وتم عزل أو فصل الاستنساخات الفرادى. لقد تم تعيين التعبير عن الصيغة الوراثية ‎(mpl-IgG)‏ من الاستتساخات التي تم ‎gl je‏ وذلك باستخدام طريقة ‎(ELISA)‏ النوعية ل ‎(Fc)‏ بشري. يكون للاستتساخ

‎١٠99 -‏ - الأفضل المعبر عن الصيغة الوراثية مستوى تعبير عن الصيغة الوراثية بمعدل من ‎)١(‏ إلى ‎(Y)‏ ‏مللىجرام / مل من ‎(mpl-IgG)‏ ‎LDA‏ التعبير عن الصيغة الوراثية لل ‎(Ba/F3 mpl P)‏ ‎ai)‏ تم استنساخ ‎(Cdna)‏ المتوافق مع المنطقة المشفرة بالكامل لربيطة ‎(mpl P)‏ البشرية وذلك في ‎٠‏ الرابطة ‎(PrkS-tkneo)‏ والتي بالتالي تم جعلها خطية مع ‎(Notl)‏ ثم نقلت بالإصابة بالعدوى بداخل خط الخلية ‎(IL-3)‏ التابع ل ‎(Ba/F3)‏ وذلك بواسطة تكوين المسامية الكهربية ‎TY ” ١(‏ خلية؛ 0 فرق جهد ‎YOu‏ فولت). وبعد مضى ثلاثة أيام؛ تم البدء في إجراء الاختبار في وجود ‎(Y)‏ ميكروجرام / مل من (6418). لقد تم اختيار الخلايا في صورة مجموعات من الاستنسلخات أو في صورة استنساخات فرادى تم الحصول عليها بواسطة تحديد أو تقييد التخفيف في أطباق ‎٠‏ - بكل منها ‎A‏ تجويف. لقد تم المحافظة على الخلايا المختارة أو المنتقاة وذلك في ‎RPMI‏ محتوى على )0 )1( ‎)١( FBS”‏ مللي جرام / مل من (6418)؛ ‎)٠١(‏ مللى مول من جليوتامين» ‎)٠١(‏ ‏مللي مول من ‎٠ ¢(HEPES)‏ ميكروجرام/ مل من (م060-508). لقد تم تعيين أو تحديد التعبيير عن الصيغة الوراثية لربيطة ‎(mpl P)‏ الموجودة في الاستنساخات المختارة وذلك ‎dal gy‏ تحليل ‎(FACS)‏ باستخدام جسم مضاد عديد الاستنساخ لمضاد الربيطة ‎(mpl P)‏ لأرنب.

‎(Ba/F3 mpl) ‏اختبار ربيطة‎ ٠ ‏من‎ (mpl) ‏لتعيين وجود الربيطة‎ L(Y) ‏كما هو موضح في شكل رقم‎ (mpl) ‏تم تنفيذ اختبار ربيطة‎ ‏لمدة 4 ساعة عند كثافة من الخلايا‎ IL-3 (mpl P Ba/F3) ‏مصادر عديدة؛ تمت إماتة الخلايا‎ ‏وفي جو من ثاني أكسيد‎ oP ‏مرطب عند درجة حرارة‎ land ‏خلية / مل في‎ )٠١ x 0) ‏تبلغ‎ ‏كربون بتركيز 5 والهواء. وعقب إماتة ال 1-3 ثم وضع الخلايا في أوساط إستنبات في‎ ‏ميكرولتر من وسط الاستنبات‎ ٠٠١ ‏خلية في‎ ٠0000 ‏تجويف بكثافة قدرها‎ AT ‏أطباق بكل منها‎ “2

_ You ‏وسط استنبات للخلية.‎ fash ‏ساعة في‎ YE ‏مع عينات مخففة أو بدونهاء حيث تم الاستنبات لمدة‎ ‏خالي من مصل الدم؛ ومحتوى‎ (RPMI) ‏ميكرولتر من وسط إستنبات‎ 7١ ‏بعدهاء تمت إضافة‎ ‏وذلك لكل تجويف من هذه التجاويف في الساعات من‎ (CH - ‏ميكرو © ل (ثيميدين‎ ١ ‏على‎ ‏الست الأخيرة إلى الثماني الأخيرة من عملية الاستنبات والتحضين. بعد ذلك؛ تم جمع حصيلة‎ ‏ثم تم غسلها © مرات بالماء. لقد تم عد‎ ((GF/C) ‏الخلايا لعدد 40 تجويف لأطباق مرشح‎ ٠ ‏وإحصاء المرشحات في وجود £4 ميكرولتر من مائع متلالئ يقوم بعمل وميض (من نوع‎ -(Packard Top Counter ™) ‏في عداد من النوع الذي يحمل العلامة التجارية‎ (Microscint 20 ‏مثال رقم (؟)‎ thigly purifed porcine mpl ligand ‏من الخنزير وذات نقاوة عالية‎ mpl ‏ربيطة‎ ‎Gel elution protocol ‏نظام جل للتصفية التتابعية‎ ٠ ‏المنقاة بالتآلفية (الجبزء‎ (mpl) vid'm ‏لقد تم خلط كميات متساوية من كل من‎ ‏وذلك في درجة‎ 2XLaemmli ‏والمحلول المنظم‎ " mpl-IgG" ‏المصفى تصفية تتابعية من العمود‎ "+" ‏حرارة الغرفة وبدون عامل مختزل؛ ثم بسرعة قدر الإمكان تحميل الخليط الناتج على جل‎ ‏من نوع *©07]. لم يتم تسخين العينة.‎ )77٠١( ‏بتركيز يتراوح من ( ؟)) إلى‎ polyacrylamide ‏للمقاومة؛ تم إمرار المحلول المنظم للعينة بدون ربيطة في مسار ممر مجاور. لقد تم إجراء الجلى‎ - ١ ‏ساعة_تقريباً. لقد كانت‎ (Y,Y0) ‏لمدة‎ volt ‏فولت‎ 1 Fo ‏إلى ١م عند‎ TE ‏في درجة حرارة من‎ all ‏عند درجة حرارة الغرفة. بعدهاء تمت إزالة‎ running bufher ‏حرارة المحلول المنظم الشغال‎ . ‏من صندوق الجل؛ ثم إزالة الطبق من جانب واحد للجل‎

‎١١ -‏ — ثم عمل نسخة مطابقة ‎replica‏ (طبعة) من الجل على ‎nitro cellulise‏ كما يلي: ثم تبليل قطعة من ال "نيترو سليلوز" بماء ‎hia‏ ¢ ثم وضعها بعناية من على واجهة الجل المكشوف لكى يتم إقصاء فقاعات الهواء المتصاعدة. ثم وضع علامات إسنادية على ال ‎nitro cellulise‏ وعلى طبق الجبل لكى تتم إعادة وضع النسخة المطابقة بصورة صحيحة بعد الصبغة وبعد مضى حوالي دقيقتين؛ ‎٠‏ تمت إزالة ال ‎nitro cellulise‏ بعناية؛ ثم تم لف الجل في غلاف مرن في صورة لفافة بلاستيكية ‎plastic wrap‏ ثم وضعها في ثلاجة أو مبرد. لقد تم صبغ ال ‎nitro cellulise‏ بصبغة ‎Biorad's‏ ‎gald total prorein stain‏ بواسطة رجه أولاً في (© * ‎)٠١‏ مل بتركيز (0.1/) من 20 ‎Tween‏ ‏+ 0,+ مولار ‎M Tris-HCI +,) + 0.5 M NaCl‏ 0.1 عند أس هيدروجيني ‎=pH‏ 7,9 وذلك على مدى فترة زمنية )£0( دقيقة؛ ثم أُستتبع ذلك بالغسيل بالماء النقي )¥( مرات بمقدار ‎)٠١(‏ ‎..٠‏ مل في كل مرة ( * ‎٠١‏ مل) وذلك على مدى )0( دقائق. بعدهاء تمت إضافة صبغات ‎cad‏ ‏ثم تُركت لتتطور إلى أن ظهرت النطاقات ‎bands‏ أو البقع الملونة ‎standard‏ في ‎Ase‏ المقارنة وأصبحت مرئية. بعد ذلك؛ تم شطف النسخة (الطبعة) المطابقة بالماء؛ ثم تم وضعها فوق الغلاف البلاستيكي فوق الجل وبعناية تامة تمت محاذاتها مع العلامات الاسنادية. لقد تم تعليم أوضاع عينة المقارنة من النوع ‎Novex‏ وذلك فوق طبق الجل؛ ثم وضع الخطوط لتوضح أماكن القطع. بعدهاء ‎Aes ١‏ ال ‎nitro cellulise‏ والغطاء البلاستيكي؛ ثم قطع الجل على طول امتداد الخطوط الموضحة وذلك بنصل شفرة حادة. ‎ail‏ إمتدت القطوعات إلى ما وراء ممرات العينة؛ لإستخدامها لتعيين مكان الشرائح عندما تتم سبغة الجل. وبعد أن تمت إزالة ‎etl pall‏ كان الجل المتبقي مصنوع بالفضة . وقيست أماكن العينة المقارنة والأماكن المقطوعة .لقد تم تحديد الأوزان الجزئيئة المتوافقة أو المقابلة لأوضاع القطع وذلك من خلال العينة المقارنة ال («08). لقد تم وضع شرائح الجل ال ‎(VY)‏ بداخل الخلايا في المصفيات الكهربيية للتصفية التتابعية ‎model 422 electroeluters‏ 510:80. لقد تم في الخلايا استخدام أغطية غشائية محددة للوزن على

- ١١7 -

ألا يتجاوز الجزيئي الخارج من ‎(K) 2) (12K)‏ [أى من ‎.])٠٠٠١( HOY)‏ لقد كلن محلول التصفية التتابعية المنظم عبارة عن )+0( مللى مولار ‎ammonium bicarbonate‏ +

9058 (تقريباً بأس هيدروجيني ‎pH)‏ = 7,8)). كما تم أيضاً تبريد ‎)١(‏ لتر من المحلول

المنظم في لمدة ساعة في حرارة غرفة باردة تتراوح درجة حرارتها من ؛ “م إلى ‎oT‏ قبل أن يتم

‎٠‏ الاستخدام. ثم أجريت التصفية التتابعية لشرائح الجل بمعدل ‎fma Vv‏ خلية )£0 فولت بصفة مبدئية) وفي غرفة باردة تتراوح درجة حرارتها من ؛"م إلى +"م . لقد إستغرقت التصفية التتابعية حوالي ؛ ساعات. بعدهاء؛ تمت بعناية إزالة الخلاياء ثم أزيل السائل الموجود فوق الفريتةٍ

‏+ وذلك باستخدام ماصة. بعد ذلك؛ تمت إزالة غرفة التصفية التتابعية وأى سائل آخر موجبود

‏فوق غطاء الغشاء وذلك باستخدام ماصة. ثم تمت ‎Aj)‏ السائل ‎as a pall‏ في غطاء الغشاء

‎٠‏ باستخدام ماصة أو أنبوبة من نوع ‎Pipetman‏ ثم تم الاحتفاظ به. بعدهاء تم وضع ‎5٠‏ ميكرولتر بكميات تامة ومتساوية من ماء نقي في الغطاء؛ ثم تم الرج؛ ثم أجريت إزالته إلى أن تم تذوريب بلورات ‎(SDS)‏ بالكامل. لقد تم جمع نواتج الغسيل مع السائل الذي تم الاحتفاظ به من قبل. لقد

‏كان حجم عينة التصفية التتابعية الإجمالية بما يتراوح من ‎(Fr)‏ )000( ميكرولتر لكل شريحة جل. لقد تم وضع العينات في أنبوب ديلزة عيار١٠‏ ملم :50600800 من نوع المحدود ب

‎١‏ 12-14 وهذه الأنابيب قد تم نقعها لعدة ساعات في ماء نقيّ. لقد استمرت الديلزة طوال الليل في درجة حرارة من 4 "م إلى 6م مقابل ‎Tov‏ مل من محلول ملحي مشبع من الفوسفات (يكون ‎"PBS"‏ بتركيز ؛ مللى مولار تقريباً في ‎potassium‏ ) لكل “ عينات. لقد تم استبدال المحلول المنظم في الصباح التالي؛ ثم إستمر إجراء عملية الديلزة لمدة )0,¥( ساعة. ‎(pany‏ تم رفع العينات وإزالتها من أكياس الديلزة ووضعها في أنابيب طرد صغيرة ‎.mlcrofuged‏ لقد تم وضع © الأنابيب فوق الثلج لمدة ‎)١(‏ ساعة؛ ثم أجرى طردها بفعل قوة طاردة مركزية عند سرعة دورانية ‎rpm”‏ 141" أى ‎)١٠٠٠١(‏ لفة في الدقيقة لمدة “ دقائق؛ ثم أزيلت بعناية تامة المواد الطافية من

‎١١7 -‏ - ال (505) الذي تم ترسيبه. بعد ذلك؛ تم وضعت المواد الطافية فوق ثلج لمدة أكثر من ساعة تقريباً ثم أجرى طردها مرة أخرى بتعريضها لقوة طاردة مركزية لمدة )£( دقائق. بعد ذلك» تم تخفيف المواد الطافية في محلول ملحي مشبع من الفوسفات؛ ثم استخدام الناتج لإجراء اختبار ض النشاط والفعالية. وجمدت العينات المتبقية عند درجة حرارة (- ‎(pV‏ ‏م _مثال رقم )¥( إجراء عملية تسلسل الدقيق ‎(mpl) gvfd'm‏ لخنزير ‎Porcine mpl Ligand Microsequencing‏ ثم تركيز ‎(Y,1)‏ مل من المتجزء ‎Fraction‏ رقم 1 المأخوذ من عمود التآلف ‎(mpl-IgG)‏ على في جهاز ميكروكون - ‎Microcon-10 ٠١‏ يحمل العلامة التجارية ‎.(Amicon™)‏ ولمنع ربيطة ‎(mpl)‏ من أن تمتص إلى الميكروكون؛ تم شطف ‎sl Gal)‏ بمقدار 80571 ؛ ثم أضيف © ‎٠‏ ميكرولتر من محلول ‎7٠١‏ 505 إلى المتجزء رقم ‎١‏ . بعدهاء أضيف إلأى المتجزء رقم 1 حجم ‎٠‏ ميكرو لتر مرتين من عينة المحلول المنظم ‎(do ٠١ XY)‏ بعد أن أصبح تركيز الميكروكون بحجم ‎Yo‏ ميكرولترء ثم تم تحميل الحجم ‎SH‏ £0 ميكرولتر على ممر مفرد بنسبة تتراوح من 4 إلى ‎77١‏ من ‎-(Novex) acrylamide gel‏ ثم تم إجراء عملية الجل بإتباع نظام ‎Novex‏ . بعدهاء تمت معادلة الجل لمدة )0( دقائق؛ قبل أن يتم إجراء للامتصاص الكهربائية ‎Eiectroblotting ٠‏ في ‎٠‏ مللى مول لمحلول منظم ل ‎3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic‏ ‎cacid (CAPS)‏ بأس هيدروجيني ‎Ph)‏ = ١٠١١)؛‏ ومحتوياً على + )7 ‎methanol‏ لقد تم الامتصاص الكهربائي على أغشية ‎(Millipore) Immobilon-PSQ‏ لمدة £0 دقيقة عند تيار كهربي ثابت شدته ‎You‏ مللى أمبير 148 في خلية (بطارية) من النوع ‎(Bio Rad Trans-Blot)‏ © . ثم صبغ الغشاء ‎(PVDF)‏ بمحلول 70,1 ‎Coomasie Blue R-250‏ مذاب في ‎t+‏ 1 ‎acetic acid 70٠ ١ methanol ٠٠‏ لمدة ‎١‏ دقيقة؛ ثم أزيلت الصبغة لمدة ¥ - ¥ دقيقة باستخدام

‎Yet _‏ — ‎٠‏ لنمه ‎acetic‏ مذاب في ‎methanol 79 ٠‏ لقد كانت البروتينات الوحيدة المرئية في نطاق الوزن الجزيئي ال :1" في منطقة تقع فيما بين ) ‎ga (Youve) (VA‏ البروتينات ذات ‎Mr‏ ‏بقيم تبلغ يكال نيلك ‎٠١١.‏ ‏لقد تم تعريض شرائح النطاقات ) ‎kDa (YY YA os‏ لعمل متتالية البروتين. لقد تم تنفيذ ‎sd oma)‏ أو عمل متتالية بصورة آلية على نموذج ‎(470A)‏ لجهاز ‎Applied Biosystem sequencer‏ مجهز بوحدة تحليل ‎"PTH"‏ على نفس خط التشغيل.لقد تم تعديل جهاز اعداد المتتاليات لحقن ما يتراوح من 7/80 إلى 790 من العينة ])1985( )17-225 2( :350 ‎.[Rodriguez, J.

Chromatogr,‏ لقد تمت إضافة ‎Acetone‏ (بمقدار - ‎VY‏ ميكرولتر / لتر) من المذيب ‎"A"‏ لتحقيق إتزان امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ‎UV absorbance‏ . لقد تم وضع البروتينات الممتصة كهربائيا خلال تتابعها في ‎٠‏ خرطوشة الطابعة ‎cartridge‏ 3101 ثم تم إجراء تكامل ‎integration‏ الذروات ‎Peaks‏ باستخدام ‎Justice Innovation software using Nelson Analytical 970 interfaces‏ . لقد تم تتنفيذ تفسير المتتالية على "5900 ‎[Henzel et al., J.

Chromatogr., 404: (4 1-52) (1987)] "VAX‏ المتتاليات في الطرف الأميني للبروتين ‎(N ~terminal)‏ (باستخدام حرف واحد للحمض الأميني مع وحدات بنائية غير مؤكدة بين قوسين) كما تم توضيح كمية المادة التي تم الحصول عليها (في أقواس) ‎١‏ _وذلك في جدول رقم ‎(Y)‏

‎7٠١5# _‏ — جدول رقم ‎(Y)‏ ‏متتاليات الطرف الأميني ‎N —terminal‏ لربيطة ‎mpl‏ ‎kDa 1.8 pmol (SEQIDNO:30)‏ 30 : ‎١ ° "١ Yo Yo Yo‏ ‎(SPAPPA(CDPRLLNKLLRDD (H/S)VLH (GR L‏ ‎kDa 0.5 pmol (SEQIDNO:31)‏ 28 ‎(S)PAPPAXDPRLLNKLLRDDHVLHGR‏ ‎kDa 0.5 pmol (SEQIDNO:32)‏ 18-22 ‎XPAPPAXDPRLX(N)(K)‏ ‏مثال رقم )2( اختبار معلق سائل تكاثر في خلايا ‎MK‏ المولدة ‎Liquid Suspension Megakaryocytopoiesis‏ ‎Assay‏ ‏م ثم تخفيف خلايا جذعية ‎stem cells‏ محيطية بشرية ‎(PSC)‏ (تم الحصول عليها موافقة المرضى) بمتدار )0( مرات لوسط من ‎(Gibeo) "IMDM‏ ثم تم تعريضها لقوة طاردة مركزية لمدة )10( دقيقة وفي درجة حرارة الغرفة عند قوة دوران ) ‎X Ava‏ 2( . ثم أعيد عمل معلق لراسب الخلديا في وسط ال ‎(IMDM)‏ 5 ووضعها كطبقة فوق ‎٠‏ من المركب ‎٠١/١7 GES, "Percoll™"‏ جم / لتر ‎(Pharmacia)‏ ثم ترضفها ب (800 8%( لمدة ‎٠‏ دقيقة. ثم سحب الخلايا الأحادية النواة أ الخفيفة الكثافة عند السطح البيني ثم غسلها ‎Ob ya‏ بالوسط ‎(IMDM)‏ ووضعها على أسطح أطباق بمعدل يتراوح من ‎(Ys XV)‏ إلى ‎)'٠١ xX)‏ خلية /مل في الوسط ‎(IMDM)‏ المحتوى على ‎"FBS" Ys‏ (إلى أن أصبح الحجم النهائي ‎"٠"‏ مل) في المجموعات وسط إستتبات ‎Vida wl‏ تجويفاً من التجاريف ‎(Costar)‏ لقد تمت إضافة ‎(APP)‏ أو ربيطة ‎(mpl)‏ المستنفذة ‎depletea‏ لل

‎١١ -‏ - ‎(APP)‏ إلى ‎٠١‏ ثم تركت أوساط الاستنبات (المزارع) لتنمو لمدة من ‎١١‏ يوماً إلى ‎Lap VE‏ في حضانة رطبة وذلك في درجة حرارة )77+( وفي جو من )70( ثاني أكسيد الكربون (:60) والهواء. كما تم أيضاً ترك أوساط الاستنبات لتنمو في وجود ‎(APP 7٠0(‏ مع ‎١6‏ ميكروجرام من ‎(mpl-IgG)‏ أضيفت في اليوم الأول منها والثاني والرابع. لقد استنفذت ال ‎APP‏ من ربيطة ‎mpl ٠‏ بواسطة ‎APP) je)‏ من خلال عمود الألفة ‎٠ mpl-IgG‏ لتحديد كمية خلايا ‎MK‏ المولدة للصفائح الدموية والموجودة في أوساط استنبات (مزارع) المعلق السائل؛ تم استخدام تعديل ‎(Solberg et al.)‏ مع استخدام جسم مضاد فأري موشوماً ‎radiolabeled‏ ‏إشعاعياً ‎(IgG)‏ أحادي الاستنساخ ‎(HP1-1D)‏ لل ‎pais) (GPILIIL)‏ من ‎Dr.

Nichols, Mayo"‏ ‎("Clinic‏ ثم الوشم الإشعاعي ل ‎٠٠١‏ ميكروجرام من ‎(HP1-1D)‏ [أنظر ‎Grant, B. et al,‏ ‎[Blood 69: (1334-1339) )1987( ٠‏ وذلك ب :10" من ‎Nal'™‏ المشبع وباستخدام خرزات إنزيمية ‎(Biorad, Richmond, CA) Enzymobeads‏ حسبما تم وصف ذلك وفقاً لتعليمات جهة التصنيع. لقد تم تخزين ‎(HPI-ID)‏ المشعة وذلك في درجة حرارة = ١7م‏ في ‎(PBS)‏ محتوياً على 0 7 ‎octyl-glucoside‏ . لقد كانت الأنشطة النوعية النموذجية ‎Le: specific activities‏ يتراوح من ‎)”٠١ XY)‏ إلى ‎(TV eX Y)‏ «م/ ميكروجرام (أكثر من 1425 ترسب بواسطة ‎trichloroacetic acid ٠‏ بتركيز ‎Y,0‏ )7( لقد تم اعداد وتجهيز أوساط إستنبات (مزارع) المعلق السائل في ثلاثات ‎triplicates‏ لكل نقطة تجريبية. وبعد مضئً ما يتراوح من ‎١١‏ يوماً إلى ‎VE‏ يوماً في وسط الأستنبات (المزرعة)»؛ تم ‎Js‏ مزارع ال ‎١‏ مل إلى أنابيب ‎(eppendorf)‏ سعة كل منها ‎da ٠,5‏ ثم طردها مركزيا ب ‎x Ae)‏ ع) لمدة ‎٠١‏ دقائق وفي درجة حرارة الغرفة؛ ثم تمت إعادة تكوين معلق لراسب الخلية © الصغير الناتج في ‎٠٠١‏ ميكرولتر من ‎PBS‏ محتوي على 70.07 ‎UY (EDTA‏ من مصل الدم

عجول ‎bovine calf serum LLY!‏ . ثم أضيفت ‎٠١‏ نانوجرام من (1]110110"!) مذابة في ‎ov‏ ‏ميكرولتر من المحلول المنظم إلى الخلايا المعلقة؛ ثم تحضينها لمدة ‎٠١‏ دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إجراء الرج والتقليب ما بين حين وآخر. بعدهاء تم تجميع الخلايا بواسطة التعريض لقوة طاردة مركزية تبلغ ‎(g X Ave)‏ لمدة ‎٠١‏ دقائق وفي درجة حرارة الغرفة؛ ثم غسلها ‎Ge‏ ‏باستخدام المحلول المنظم لإجراء الاختبار. لقد تم عد الإشعاع لمدة دقيقة واحدة في عداد لأشعة ‎gamma counter Lela‏ (من نوع ‎(Packard‏ لقد تم تحديد الإشعاع غير النوعي بواسطة إضافة ‎١‏ ‏ميكروجرام من ال ‎(HP1-1D)‏ غير المشعة ولمدة ‎٠١‏ 4883 قبل أن تتم إضافة ‎(HP1-1D)‏ ‏المشعة . ثم تم تعيين الربط الإشعاعي النوعي في صورة الربط الإجمالي (1101-10”*) مطروحاً منه ذلك الربط في حالة وجود زيادة ‎excess‏ من ‎(HP1-ID)‏ غير المشع. ‎٠‏ _مثال رقم (5) بادئات ‎Oligonucleotide PCR Primers Oligonucleotide PCR‏ على أساس متتاليات الحمض الأميني في الطرف الأميني للبروتين ‎amino-terminal‏ والقي تم الحصول عليها من البروتينات ذات ‎k Da 28 k Da 30 k Da‏ 18-22 تم تحديد ال ‎oligonucleotides‏ انحلالية ‎degenerate‏ للاستخدام كبادئات ‎primers‏ لتفاعل ‎(PCR)‏ (أنظر جدول ‎yo‏ رقم 4). لقد تم تصنيع مجموعتين من البادئات؛ إحداهما إيجابية المعنى ‎mer ٠١ positive sense‏ من المجموعة المشفرة للوحدات البنائية من الحمض الأميني ¥ - ‎mpl 1A‏ والثانية مضادة المعنى ‎mer 7١ antl-sense‏ لمجموعة مكملة للمتاليات المشفرة للأحماض الأمينية ‎(mpl 2) 7 4 -١8‏

‎YA -‏ - جدول رقم )2( مجموعات بادي أوليجونيكيوتيد منحل إنحلالية بمقدار ‎٠١448‏ مرة3 ‎mpl 1:5 CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA‏ إنحلالية بمقدار 44 ‎mp12:5' NCC RTG NAR NACRTGRTCRTC 3' 3 3a ٠١‏ تم استخدام ‎DNA‏ مجيني ‎genomic‏ خنزيري؛ معزول ‎isolated‏ من خلايا ليمفاوية دموية ‎blood lymphocytes‏ محيطية خنزيرية كقاعدة للبناء ال 008. احتوى التفاعل على ‎ov‏ ‏ميكرو لتر على ‎A‏ ,+ ميكرو جرام حمض ‎DNA‏ مجيني خنزيري في ‎٠‏ ملي مولار ‎—Tris‏ ‏م ‎HCL‏ (الأس الهيدروجيني ‎(AY‏ 005 ملي مولار 1601و ملي مولار :1480 و١٠٠‏ ميكرو جرام/ مل ‎BSA‏ 9 £44 ميكرو مولار ‎ANTP,‏ و١‏ ميكرو مولار من كل مجموعة بادئات ‎Vos‏ ‏وحدة من إنزيم ‎Taq polymerase‏ كان ‎fads‏ انحلال ‎denaturation‏ عند درجة 86 ‎Asada‏ ‏دقائق وتبع ذلك ‎Yo‏ دورة مدة كل منها £0 ثانية عند درجة 14م ودقيقة واحدة عند درجة 00 م ودقيقة واحدة عند ‎VY‏ م. وسمح بمد الدورة النهائية لمدة ‎٠١‏ دقائق عند درجة 7أم. تم فصك ‎٠‏ نواتج ‎PCR‏ بالاستشراد الكهربائي ‎electrophoresis‏ على ‎polyacrylamide gel ١١‏ وتم إظهارها للرؤية بصبغها بمادة ‎ethidium bromide‏ . ومن المقدر أنه لو تم تشفير متتالية الحمض الأميني على الطرف الأميني من البروتين عن طريق ‎exon‏ فردي فمن المتوقع أن يكون منتج ‎PCR‏ ‏الصحيح 14 زوج ‎bp sac ld‏ وثمث استخراج جزء ‎DNA‏ بهذا الحجم من الجل وثم استتنساخه في ‎-(promega) pGEMT‏ ثم توضيح ‎Vall,‏ نسائل في قائمة رقم ) ( .

)5( ‏جدول رقم‎ ‏مجيني خنزيري بطول 1 زوج قاعدة‎ DNA ‏تجزئات من‎

GemT3 S'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC

TGCCTCGTGA 3GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG

ACGGAGCACT TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 37)

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEQ ID NO: 38) gemT7 5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC

TGCTTCGTGA 30010010046 GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATRATTITG

ACGAAGCACT CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID NO: 40) gemT9P R LL NK L L R(SEQID NO: 32) 5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG 3'

GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC

ATCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41)

TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42)

‎7٠١ -‏ يتم توضيح موضع بادئات ‎POR‏ بالقواعد التى تحتها خط. وتحقق تلك النتائج المتتالية الطرفية ‎N-‏ ‎terminal‏ التي تم الحصول عليها للأحماض الأمينية 4 - ‎١7‏ بالنسبة للبروتينات ذات ‎٠١‏ ‏كيلودالتون و ‎YA‏ كيلودالتون و ‎YY -١8‏ كيلو دالتون وتوضح أن تلك المتتاليات يتم تشفيرها ‎exon‏ فردي ل- ‎DNA‏ خنزيري. 0 مثال رقم )1(:

‎Human mpl Ligand Gene ‏البشري‎ mpl ‏جين ربيطة‎

‏بناء على نتائج المثال )0(. تم تصميم بناء ‎deoxyoligonucleotide 45-mer‏ ¢ تسمى ‎PRY‏ ‏لاستعراض المجموعة المجينية ‎genomic library‏ . وكان ل«ع-45 المتتالية التالية:

‎5 GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3

‎(YA: ‏(رقم هوية المتتالية‎ ٠ ‏كيناز واستخدم لفحص‎ Ty ‏موشوماً ب م2 (صتم)-(م ) وإنزيم‎ oligonucleotide ‏هذا‎ ‏تحث ظروف تهجين متراخية الشدة‎ + gem 12 ‏في‎ human genomic ‏مجموعة مجينية بشرية‎ ‏وتحليلها بخرائط القطع مع‎ plaque ‏(أنظر مثال رقم ). تم التقاط النسائل الموجبة وتنقية اللويحة‎ ‏ثم اختيار النسيلة رقم ؛ لإجراء تحليل إضافي.‎ . southern blotting ‏تحليل‎

‎١‏ تتم استتساخ 7,4 ‎lf‏ قاعدة من أجزاء ‎BamHI-Xbal‏ والتى تم تهجينها إلى :45-006 وتحويلها إلى ‎.p.Bluescript SK‏ تم إجراء تحديد تسلسل ‎DNA‏ > لهذه النسيلة بامستخدام ‎oligonucleotide‏ ‎Lala‏ بمتتالية ‎DNA‏ لربيطة ‎mpl‏ لخنزير كبادئة. وقد أثبتت المتتالية التي تم الحصول عليها أن ‎DNA‏ المشفر للشبيه البشري لربيطة ‎mpl‏ الخنزيري قد ثم ‎led je‏ . وثم الكشف عن موضع قطع

‎7١١٠ -‏ - ب ل2003 في المتتالية مما يسمح لنا بعزل جزئية تبلغ 180 زوج ‎EcoRI-Xbal sxc‏ من ‎Y,A‏ ‏قاعدة من ‎Bamltl-Xbal‏ وكذلك بإعادة إستنساخها في ‎-pBluescript SK‏ تمت دراسة تسلسل السلسلتين لهذه الجزئية. تظهر مثتالية ‎DNA‏ البشري ومتتالية الأحماض الأمينية المستنتجة في شكل (4) (أرقام هوية المتتالية ' و4). وتم أيضاً توضيح الأماكن المتوقعة ‎٠‏ لل 1010008 في المتتالية المجينية بالأسهم؛ وتحدد ال ‎exon‏ المفترض ‎exon)‏ © ). ‎eu‏ اختبارات متتالية الأحماض الأمينية المتوقعة أن الحمض الأميني الأول لربيطة ‎mpl‏ الناضج هو ‎senne‏ ؛ كما تم تحديد ذلك من التحليل المباشر لمثتالية الأحماض الأمينية . وقبل هذا ‎codon‏ ‏مباشرة توحي متتالية الأحماض الأمينية المتوقعة وبشكل كبير بمتتالية تلعب دور إشاري ‎signal‏ ‏في إفراز ربيطة ‎mpl‏ الناضج. من المحتمل عدم تواصل منطقة تشفير متتالية الإشارة ب ‎intron‏ ‏عند موضع ‎A nucleotide‏ . يظهر ‎exon‏ وكأنه ينتهي عند ‎١97 nucleotide‏ . وبالتالي يشفر ذلك ‎exon‏ متتالية ؟؛ حمض أميني؛ 1% منها يحتمل أن تكون جزءاً من متتالية إشارة و 17 منها تكون جزءاً من ربيطة ‎mpl‏ ‏البشري الناضج . مثال رقم ‎(v)‏ : ‎cDNA ٠‏ لربيطة اه بشري بطول كامل ‎Full Length Human mpl Ligand cDNA‏ بناء على متتالية ‎exon‏ “ البشرية (مثال 1(« تم تخليق اثنين من ‎oligonucleotide‏ غير الانحلالية ‎non-degenerate‏ المناظرين للنهايات ‎v‏ و © ل ‎¥oexon‏ (جدول رقم + ( .

‎7١١ -‏ - جدول رقم )7( بادئات ‎Oligonucleotid‏ غير انحلالية ل 008 لل .في ‎cDNA‏ بشري ‎Human cDNA Non-degenerate PCR Oligonucleotid Primers‏ (رقم ‎ia‏ بادئة امامية: ‎GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG‏ "5 المتتالية : 5 ) | ‎TCATGC TTC T3'‏ (رقم هوية بادئة عكسية : '3 ‎CAG TCT GCC 616 AAG GAC ATG G‏ 5 المتتالية : 44 ) تم استخدمت هاتين البادئتين في تفاعلات ‎DNA— S308 wall PCR‏ كقاعدة معلومات من مجموعات ‎(DNA‏ بشرية مختلفة أو ‎١‏ نانوجرام من ‎cDNA‏ نسيلة سريعة ‎Quick Clone‏ ‎(Clonetech)‏ من أنسجة مختلفة باستخدام الحالات التى ثم وصفها في المثال ) 8 . وكان الحجبم 0 المتوقع لمنتج ‎PCR‏ الصحيح ‎Yeo‏ زوج ‎bp sac ld‏ وبعد تحليل منتجات ‎PCR‏ على ‎١١‏ 7 ‎polyacrylamide gel‏ ¢ تم كشف جزيئية ‎DNA‏ من الحجم المتوقع في مجموعات ‎cDNA‏ ‏المحضرة من كلية حيوان بالغ 797 خلية كلية جنينية ‎DNA y‏ تم تحضيره من كبد جنيني بشوي ‎-(Clonetech cat. # 7171-1)‏ تم استعراض ‎screening‏ مجموعة ‎cDNA‏ لكبد جنينى في ‎(Clonetech cat. # HL A DR;‏ ‎IX) - ٠‏ 5 بنفس ‎45mer oligonucleotide‏ المستخدم في اختبار المجموعة المجينية ‎genomic‏ ‏البشرية. وتم وشم ‎oligonucleotide‏ ب ‎(y?P)~ATP‏ باستخدام إنزيم ‎polynucleotide kinase Ty‏

‎7١٠“ -‏ ‎٠‏ وتم اختبار المجموعة تحت ظروف تهجين متراخية الشدة. وتم إجراء تهجين مسبق لنواتج الترشيح لمدة ساعتين ثم تهجينها باستخدام المسبار طوال ‎Jl‏ عند درجة ‎EY‏ م في ‎1٠0‏ ‎10xDenhardt’s y SXSSC 5 formamide‏ 5 0+ ,+ مولار ‎sodium phosphate‏ (أس هيدروجيني م( و )+ ‎sodium pyrophosphate‏ 5 + © ميكرو جم/ مل من ‎DNA‏ نطفة سلمون معالجة ‎Cla sally ©‏ الصوتية ‎sonicated salmon sperm‏ لمدة ‎١١‏ ساعة. وتم تعريض المرشحات لفيلم أشعة ‎X‏ من نوع ‎Kodak™‏ (علامة مسجلة) طوال الليل. وتم التقاط النسائل الموجبة ؛ وتنقية اللويحة ‎plaque‏ وتم تحديد الحجم وليجة ‎insert‏ عن طريق ‎PCR‏ باستخدام ‎oligonucleotide‏ لتطويق ‎flanking‏ استتساخ ‎BamH1-Xbal‏ في ‎cat. # 6475-1) A DR;‏ 010061600). تم استخدام © ميكوو لتر من مخزون فيروس ‎phage‏ كمصدر معلومات. وكان ‎sal‏ 0 الأولى لمدة ا ‎٠‏ دقائق عند 1م وتبعه ‎Vo‏ دورة من (دقيقة واحدة عند م ودقيقة واحدة عند ‎of‏ م و ‎٠,‏ ‏دقيقة عند ‎VY‏ م). وكان الامتداد النهائي لمدة ‎١١‏ دقيقة عند درجة 77م وكان للنسيلة رقم ‎FL2b‏ ‏وليجة ‎٠,8 insert‏ كيلو قاعدة وتم اختيارها للتحليل. ‎el‏ تثبيت ‎Clonetech.

ACDR; & pDR2 cloning and Expression System) pDR2 se Dll‏ 42 م ‎(Library Protocol Handbook,‏ المحتوى ‎Jala‏ أذرع فيروس ‎¢ACDR, phage‏ كما تم ‎Vo‏ وصف ذلك بواسطة تعليمات القائمين بالصناعة ‎Clonetech.

CDR, & pDR2 cloning and Expression)‏ ‎(System Library Protocol Handbook, p29-30‏ . وأوضحت التحاليل القاطعة ‎plasmid — restriction‏ ‎Pdr2-FL2b‏ باستخدام ‎BamHI‏ و ‎Xbal‏ أشارات إلى وجود موقع قطع 380111 داخلي في الوليجة عند موقع +0 أدى هضم ‎plasmid‏ ب 380111-58 إلى قطع الوليجة إلى جزئين تم تحديد واحدة ذات ‎M0‏ ,+ الف قاعدة وواحدة ذات ‎١,١٠‏ الف قاعدة . متتالية ‎DNA‏ حددت عن طريسق ‎v.‏ بثلاث فئات مختلفة لقواعد المعلومات ‎template‏ مشتق من عمل ال ‎.pDR2-FL2b plasmid‏ تمت دراسة تسلسل ‎DNA‏ بالنسبة ل ‎plasmid‏ مزدوج السلسلة ‎double-stranded‏ بامستخدام وسيلة

‎7١ -‏ - تسلسل ‎DNA‏ ومضية آلية ‎(Applied Biosystems, Foster AB1373 automated fluorescent‏ ‎City.

California)‏ باستخدام بروتوكولات قياسية لوسائل قطع ‎dideoxy nucleoside terminators‏ ‎triphosphate‏ موشومة بالصبغة (قطع بالصبغة) وبادئات متحركة ‎walking primers‏ مخلقة عادية ‎(Sanger et al, Proc.

Natl Acad.

Sci.

USA, 74:5463-5467 [1977]: smith et al., Nature,‏ ‎٠‏ )]1986[ 321:674-676). أجرى تسلسل مباشر للأجزاء التي إزدادت اعدادها بال ‎PCR‏ من 0 باستخدام وسيلة تسلسل 1373 ‎AB‏ باستخدام بادئات عادية وتفاعلات إنهاء بالصبغة. وتم إنتاج قاعدة معلومات بسلسلة فردية ‎Single stranded‏ باستخدام ‎the M13 Janus vector‏ ‎(DNASTAR.

Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl.

Acids Res. , 21:3385-3390‏ ‎BamH1-Xbal (1.15 kb) and BamHI (0.65kb)‏ )]1993[« تم ‎Le—1je‏ عن ‎pDR2- plasmid‏ ‎FL2b ٠‏ وتمت تعبئة الأطراف بإنزيم ‎polymerase 14 DNA‏ في وجود ‎deoxynucleotldes‏ ثم استنساخها داخل موضع ‎-MI13 Janus—! Smal‏ وتم إجراء الترتيب باستخدام بروتوكولات قياسية لبادئات 1,113 عامة وعكسية ‎of reverse primers‏ بادئات متحركة ووسائل إنهاء بالصبغة. وتم إجراء تفاعلات لمعرفة الترتيب يدوية على ‎M13 DNA‏ يسلسلة فردية باستخدام بادئات متحركة وكيمياء الإنهاء الطرفي ب ‎dideoxy-termlnator‏ قياسية ‎Proc.

Natl.

Acad.

Sci.‏ .له ‎(Sanger et‏ ‎(USA, 74:5463-5467 ]1977[ ٠‏ باستخدام 337 في موقع ‎a-dATP—‏ وإنزيم 86 (علامة تجارية لشركة الكيمياء الحيوية بالولايات المتحدة الأمريكية.؛ كليفلاند؛ أوهايو ‎United‏ ‎(States Biochemical Corp., Cleveland.

Ohio‏ وتم تجميع متتالية مجموعة متتالية ‎DNA‏ ‏باستخدام ‎-Sequencher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan)‏ وتم توفير ‎nucleotide‏ والمتتاليات المستنتجة ‎AML‏ مبينة في شكل ‎)١(‏ (رقم هوية المتتالية: ‎.)١‏

‎١# -‏ - مثال رقم ‎(A)‏ ‏عزل جين ربيطة ‎mpl‏ البشري ‎Isolation of the Human mpl Ligand (TPO) Gene (TPO)‏ تم ‎J je‏ نسائل ‎DNA‏ مجيني بشري لجين ‎TPO gene‏ باستعراض فحص مجموعة مجينية بشوية في 1-08012 مع 5 مسبار أوليجو نيكلوتيد الذى تم وصفه سابقا تحت ظروف متراخية © الشدة (أنظر مثال ‎oF‏ أو تحث ظروف بالغة الشدة مع جزيئية تناظر نصف الجهة 7 لشفرة ‎cDNA‏ البشرية لربيطة ‎mpl‏ (من موضع قطع ‎BamHI‏ إلى الطرف ‎٠ (v‏ وتم عزل نسياتين ‎A‏ ‏مترادفتين ‎overlapping‏ تمتد ‎Wo‏ ألف قاعدة. وتم استنساخ ودراسة تسلسل الجزئين المترادفين ‎(Eco R15 Bam Hi)‏ المحتوية على طول ‎TPO‏ . يشتمل هيكل الجين البشضري من ‎exons ١‏ داخل 7 الف قاعدة من ‎DNA‏ المجيني (شكل ؟١أ‏ وب وج). تتطابق الحدود الخارجية لوصلات ‎٠‏ كل «0/000»© مع الصيغة الرئيسية المجمع عليها التى تم إنشاؤها لجينات الثدييات. ‎(Shopiro,‏ ‎.M.

B.. Nucl.

Acids Res. 15:7155 [1987])‏ يحتوى ‎١ exon‏ و ‎Y exon‏ على المتتالية غير المترجمة ‎untranslated‏ في جهة © والأربعة أحماض الأمينية الأولى للببتيد الإشاري ‎signal‏ ‎peptide‏ . ويتم تشفير المتبقي من إشارة الإفراز والأحماض الأمينية ‎YI‏ الأولى للبروتين الناضج داخل ‎exon‏ “. ويتم تشفير المجال ال ‎)2٠ -( carboxyl‏ الكامل وكذلك الجزء من ¥ ‎١‏ غير المترجم بالإضافة إلى حوالي ‎٠‏ حمض أميني من الحيز الذي يسبق ‎erythropoietin‏ كلها تقع ‎.١ exon Jala‏ إن الأحماض الأمينية الأربعة ذات العلاقة بالحذف الملاحظ داخل ‎Hml-2‏ ‎(Htpo-2)‏ توجد عند النهاية © ل ‎exon‏ 1

‎7١١ -‏ - مثال رقم )3( التعبير الوراثي العرضي ‎Transient‏ لربيطة ‎mpl‏ بشري ‎(hML)‏ ‏لاستنساخ الوليجة ذات الطول الكامل المحتواة في 0012-1126 يتم هضم ‎plasmid‏ ب ‎Xbal‏ ‏حتى النهاية؛ ثم هضمة مع الجزئي ب ‎.BamH1‏ تم تنقية جزء ‎DNA‏ المعادل لوليجة 1,8 الف ‎٠‏ قاعدة بالجل واستنساخها في ‎(PrkS-hmpl1) PrkS‏ (إرجع إلى براءة الاختراع الأمريكية رقم 7 لتكوين ‎(PrkS‏ تحت تحكم المعزز ‎promoter‏ المبكر المباشر لفيروس ‎cytomegalovirus‏ . ثم تحضير ‎DNA‏ من ‎PrkS-hmpll‏ المتكون بطريقة ‎PEG‏ ونقل ‎transfected‏ ‏الجين إلى ‎YAY‏ خلية كلية جنين بشري تم وضعها في وسط ‎Dulbecco's modified Eagle's‏ ‎(DMEM)‏ مضاف إليه مخلوط مغذ 7-12 و70 ملي مولار ‎Hepes‏ (أس هيدروجيني ‎Ph‏ 7,4) ‎٠‏ و١٠72‏ مصل ‎dae‏ جنيني ‎fetal bovine serum‏ وتم نقل الجينات إلى الخلاآيا بطريقة ‎calcium‏ ‏6 ممما تم وصف ذلك في : ‎(Gorman, C. [1985] in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover.

D. 1 ed) Vol.

IL.‏ ‎pp. 143-190, IRL Press.

Washington, D. ©(‏ ‎٠‏ وبعد مرور “© ساعة من النقل الجيني؛ تم اختبار الجزء الطافي من الخلايا المصابة للوقوف ‎yo‏ على نشاط اختبار التكاثر (أنظر مثال رقم ‎.))١(‏ لم يعط الجزء الطافي من ‎YAY‏ خلية منقول إليها ‎pRK‏ فقط لم يستحث لم يستحث ‎Ba/F3 WIA‏ أو خلايا ‎Ba/F3-mpl‏ (شكل رقم ‎(WY‏ ولم يكن للجزء الطافي من الخلايا المصابة ب ‎pRKS-hmpll‏ أي تأثير على خلايا ‎Ba/F3‏ ولكنه قام بشكل مثير بحث تكاثر ‎Ba/F3-mpl WDA‏ (شكل رقم ‎(NY‏ مما يدل على أن ‎cDNA‏ المذكور ‎A‏ ‏ربيطة ‎mpl‏ البشري النشط وظيفياً.

‎7١١ -‏ مثال رقم ) ‎Yo‏ ): الأشكال المتماثلة لربيطة ‎mpl‏ البشري 63012 و 211.3 3 ‎-hML4‏ ‏لكي يتم تحديد الأشكال المقترنة بشكل تبادلي ‎alternatively spliced‏ والخاصة ب ,1141 تم بناء ‎primers ball‏ المناظرة لكل نهاية من متتالية تشفير ‎hML‏ تم استخدام تلك البادئات في ‎RT-‏ ‎PCR ٠‏ اتكرار زيادة ‎RNA‏ كبد بشري بالغ . وبشكل إضافي؛ تم إنشاء مناطق مختارة لأجناب ‎flankers‏ بادئات داخلية ذات أهمية (أنظر ما ‎(Gh‏ وبشكل ‎Silas‏ تم استخدامها. كشف الترتيب المباشر لأطراف منتج ‎POR‏ عن متتالية فردية تعادل تماماً متتالية ‎DNA‏ المعزولة من المجموعة الجينية لكبد جنين إنسان (أنظر شكل رقم ‎)١(‏ [رقم هوية متتالية: ‎.)]١‏ من ناحية ثانية؛ أظهرت منطقة قريبة من الطرف © للحيز - ‎EPO‏ (في وسط منتج ‎(PCR‏ نموذج متتالية معقد ‎٠‏ يوحي بوجود أشكال مختلفة مقترنة ممكنة في تلك المنطقة. ولعزل تلك الأشكال المقترنة المختلفة؛ تم استخدام البادئات المدرجة في جدول رقم (7) التي تطوق ‎flanking‏ المنطقة ذات الاهتمام في ‎PCR‏ كقاعدة بيانات ‎cDNA‏ من ‎AS‏ بالغ بشري . جدول رقم (7) بادئات ‎PCR‏ لأشكال متماثلة ‎ML isoform‏ بشرية (رقم هوية متتالية : £0( | ‎phmplicdna 361: STGTGGACTHAGCTTGGGAGAATGS'‏ (رقم هوية متتالية : £7( ‎pbx4.£2: SGGTCCAGGGACCTGGAQGTTTG3'‏ تم تكراراستنساخ منتجات ‎PCR‏ بشكل غير حاد ‎blunt‏ في 3. وكشف تسلسل النسائل الفرعية ‎ye‏ الفردية عن وجود ‏ أشكال متماثلة ل ‎ML‏ على الأقل. أحدهاء .1047 ‎Load)‏ يشار إليها ‎als‏

‎YYA -‏ - ‎(hMLs;,‏ تمثل الشكل الأطول وتناظر تماماً ‎Am)‏ التي تم عزلها من المجموعة الجينية للكبد الجنيني. ويتم إدراج متتاليات الأشكال المتماثلة الأربعة لربيطة ‎mpl‏ البشري والموضحة من الأطول ‎(hML)‏ إلى الأقصر ‎(hML-4)‏ في (شكل رقم ‎١١‏ [أرقام هوية المتتالية: > و4 و5 و١٠]).‏ 0 مثال رقم ) ‎١١‏ ( : الإنشاء والتعبير الوراثئي العرضي لأشكال متماثلة من ربيطة ‎mpl‏ البشري والأشكال المختلفة الفعلية ‎hML3 5 hML2‏ و(154 ‎-hML(R153A,‏ ‏تم ‎sale)‏ تركيب ‎reconstituted‏ الأشكال المتماثلة ‎hML2‏ و1113 والأشكال المختلفة المشتقة ‎hML(R153A, R154A) substitutional‏ من ‎hML‏ باستخدام تقنية ‎PCR‏ المهندسة وراثياً التي تم ‎Va‏ وصفها بواسطة: ‎Russell Higuchi, in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad.

Press,‏ ‎M.A Innis, D.H.

Gelfand, J.J Snmsky & T.J White Editors.‏ في كل التراكيب يتم البادئات "الخارجية" المستخدمة موضحة في جدول رقم ‎Sadly (A)‏ "المتراكبة ‎overlapping‏ " يتم توضيحها في جدول رقم )3(

‎1١4 -‏ - جدول رقم (4) البطانات الخارجية ‏(رقم هوية المتتالية : 597 ) 012 ‎5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3' ‏(رقم هوية المتتالية: ‎HMPLL-R: (8A‏ ‎500 AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ‎ATG AGA3' ‏جدول رقم )1( البطانات المتراكبة ‎hML-2: ‎MLd4.F: CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3 | (£9 ةيلاتنملا ‏(رقم هوية‎

MLa4.R 5001 CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3' | (0+ ٠ ‏(رقم هوية المتتالية‎ hML-3: (0) : ‏(رقم هوية المتتالية‎ hML#116+: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ‎ATT 3 (oF : ‏(رقم هوية المتتالية‎ ‏نضشتالط‎ 16-: SAAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG ‎GAG CAG 3' hML(R153A. R154A): (oF : ‏(رقم هوية المتتالية‎

RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC

OCA C 3' (of : ‏(رقم هوية المتتالية‎

RR-KO-R: 5010 GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG

AGG G 3'

‎YY. -‏ - تم إجراء كل عمليات التكرار بواسطة ‎PCR‏ باستخدام إنزيم ‎polymerase pfu DNA‏ مستنسخ ‎(Stratagene)‏ في الظروف التالية. تم تمسخ ‎denaturation‏ قاعدة المعلومات الأولي ‎Alta ic‏ لمدة ‎١‏ دقائق وتبع ذلك ‎“٠‏ دورة لمدة دقيقة واحدة عند 14م ودقيقة واحدة عند 1,052°00 دقيقة عند 77أم. وسمح بامتداد الدورة النهائية لمدة ‎٠١‏ دقائق عند درجة ‎a VY‏ وتم هضم منتج ‎PCR ٠‏ النهائي باستخدام جل ‎Clat-Xbal‏ ثم نقى بالجل وأستنسخ في ‎.pRKStkneo‏ وتم نقل الجينات إلى ‎YAY‏ خلية باستخدام تركيبات مختلفة كما تم وصف ذلك سابقاً وتم اختبار المادة الطافية باستخدام اختبار التكاثر ‎.Ba/F3-mpl proliferation assay‏ لم ‎hML-2 eds‏ و ‎hML-3‏ أي نشاط ملحوظ في هذا الاختبارء من ناحية ‎dls‏ كان نشاط ‎hML (R153A, R154A)‏ مشابها لنشاط ‎AML‏ مما يدل على أن المعالجة عند هذا الموقع موضع مزدوج القاعدة غير ضروري للنشاط ‎٠‏ (أنظر شكل رقم ‎.)١١‏ ‏مثال رقم ‎(VY)‏ ‎CDNA mML-3 3 mML-2 3 mML‏ لربيطة ‎mpl‏ فأري:- ‎~:icDNA mML J je‏ تم الحصول على ‎DNA 44 5a‏ مناظر لمنطقة التشفير الكاملة لربيطة ‎mpl‏ البشري بواسطة ‎PCR 40‏ وتمت تتقيته بالجل ووشمة ببادئ ‎random sic‏ في وجود 0-1877* و(0-001. تم استخدام ذلك المسبار لاختبار ‎٠١‏ نسيلة من مجموعة ‎cDNA‏ من كبد فأر من 1.6110 ‎(Clontech Cat # ML 3001 a)‏ تم تهجين مرشحات مضاعفة ‎Duplicate filters‏ في ‎7Yo‏ ‎SDS 70,1 5 Denhardt's X ٠١و SSC X © formamide‏ 3 0+,+ مولار ‎sodium phosphate‏ (أس هيدروجيني ‎sodium pyrophosphate 7١و (1,0 pH‏ و١٠٠‏ ميكروجرام / مل ‎DNA‏ ‏+ نطفة ‎salmon‏ معالجة بالموجات الصوتية طول الليل في وجود المسبار. وتم شطف ‎rinse‏

‎77١٠ -‏ -— المرشحات في ‎XY‏ 556 ثم غسلها مرة واحدة في 0,+ ‎X‏ 550 و1 ‎SDS X‏ عند درجة حرارة ‎"EY‏ وتمت تنقية لويحات ‎plaque‏ الفاج ‎phage‏ المهجنة وتم استنساخ ولاج ‎inserts‏ ‎cDNA‏ جزئيا في موضع قطع 1 لل ‎.Bluescript-SK plasmid‏ وتم اختيار النسيلة ‎"LD"‏ ‏مع وليجة ‎١,5‏ الف قاعدة لمزيد من التحليل وتم تحليل تسلسل كل من السلسلتين كما تم ‎Cag‏ ‎٠‏ ذلك سابقاً بالنسبة ل 0008 ‎ML‏ البشري. ويتم توضيح متتاليات ‎nucleotide‏ و متتاليات الأحماض الأمينية المستنتجة من النسيلة 110 في الشكل رقم ‎(VE)‏ (أرقام هوية متتالية ‎١‏ و١١).‏ كانت متتالية ‎ML‏ الناضج من تلك النسيلة بطول ‎7١‏ وحدة بنائية من الأحماض الأمينية ويتم تعريفها باسم ‎mML-2) mMLay,‏ للأسباب الموصوفة فيما يلي). وتمت ملاحظة يمكن أخذها في الاعتبار وهي تطابق متتاليات ‎nucleotide‏ ومتتاليات الحمض الأميني المستنتجة في حيز الشبيه ب ‎EPO‏ ‎٠‏ لثلك ال ‎JML's‏ من ناحية ثانية. عندما تمت مواءمة ‎aligned‏ متتاليات الحمض الأميني المستنتجة في 7 لكل من الإنسان والفأر ¢ اتضح أن ‎lla‏ الفأر تتميز بفقد ‎tetrapeptide deletion‏ بين الوحدات المكونة للأحماض الأمينية ‎-١١١‏ ؛ ‎١١‏ في الإنسان التي تناظر فقد ‎VY nucleotide‏ بعد موضع ‎nucleotide‏ 114 الذي يرى في ‎DNA‏ في كل من الإنسان (أنظر عالية) والخنزير (أنظر ما يلي). وبناء على ذلك؛ تم اختبار نسائل إضافية للكشف عن أي متماثلات ل ‎UML‏ ‎Vo‏ ممكنة. وكان لأحد النسائل "17" وليجة ‎٠,4‏ الف قاعدة بمتتالية مستنتجة ل ‎7١5‏ حمض أميني تحتوي على ‎LPLQ tetrapeptide‏ "المفقود". ويعتقد أن تكون تلك الهيئة هي ‎ML‏ فأري كامل الطول ويشار إليها بالاسم تلت أو ودملال0ه. ويتم توضيح ‎nucleotide‏ ومتتالية الأحماض الأمينية ل .20 في شكل رقم ‎(V1)‏ (أرقام هوية المتتالية: ‎١١‏ و7١).‏ وفي النهاية؛ تم عزل معرفة وتسلسل النسيلة "12". تتميز تلك النسيلة بحذف ال ‎١١١ nucleotide‏ تناظر ‎hML3‏ ‎٠٠‏ وبالتالي تسمى 0201-3 . مقارنة متتاليات الأحماض الأمينية المستنتجة لهاتين المتماثلتين موضحة في شكل رقم ‎.)١6(‏

‎77١7 -‏ - التعبير الوراثي عن .01/1 المهندس وراثياً ‎Expnession of recombinaut mML‏ :- ثم تحضير نواقل تعبيرية ‎expression vectors‏ ل ‎ML‏ فأري بشكل أساسي كما تم وصف ذلك في مثال رقم (4). وتم استنساخ النسائل المشفرة ل ‎mML-2.5 mML‏ جزئياً من ‎pRKStkeo‏ وناقل تعبيري ل حيوان ثديي يوفر التعبير تحت سيطرة معزز ‎promoter‏ 7 وإشارة عديدة الأدنلة ‎polyadenylation signal ٠‏ 9940 ل- ‎-SV40‏ وتم بشكل مؤقت تقل المعلومة الجينية إلى النواق _--ل التعبيرية الناتجة و ‎mMLpRK 5tkeo‏ و 101/12015051160 في ‎YAY‏ خلية باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم. وبعد نقل المعلومة الجينية العرضي ‎٠‏ تم تكييف الأوساط لمدة © أيام. وتمت المحافظة على بقاء الخلايا في أوساط ‎DMEM‏ جلوكوزية عالية ‎high glucoze‏ مضافاً إليها + )7 مصل ‎Jac‏ جينيني ‎٠ fetl calf serum‏ ‎٠‏ - التعبير ‎Gol‏ عن ‎mpl‏ فأري ‎(mmpl)‏ في خلايا ‎—:Ba/F3‏ ‏تم الحصول على سلالات خلايا ثابتة تعبر وراثياً عن ‎Compl‏ عن طريق ‎is‏ المعلومة الوراثية إلى ‎«mmpl pRKStkeo‏ كما تم وصف بشكل أساسي ل ‎mpl‏ بشري في المثال رقم ‎JS ago)‏ مختصر؛ تم نقل الناقل التعبيري 760107 600165100 ‎٠١(‏ ميكروجرام ؛ ‎(linearized jas‏ يحتوي على متتالية التشفير الكاملة ل ‎mpl‏ فأري ‎skoda, R.C. et., et at.,‏ ‎EMBO 1.12:2645-2653(1993) 1 o‏ إلى خلايا 80/3 بالاستشراد )0 ‎'٠١ x‏ خلية؛ ‎You‏ فولت؛ ‎(uF do.‏ وتبع ذلك اختيار ‎neomycin resistance polis‏ بقيمة ‎[ana Y‏ مل ‎.G418‏ تم تقييم التعبير الوراثي عن ‎mpl‏ بتحليل الخلايا المتدفققة ‎flow cytometry analysis‏ باستخدام مضاد أمصال ‎mp-1-1gG antisera‏ مضاد للفئران - أرنبي ‎rabbit antimurine‏ تمت المحافظطة على بقاء الخلايا ‎Ba/F3‏ في وسط 2014/1640 من خلايا ‎WEHI-3B‏ كمصدر ل ‎IL-3‏ تم تقييم + الأجزاء الطافية ‎supernatents‏ من 717 خلية نقلت اليها المعلومة الوراثية عرضياً من ‎mML‏

و ‎mML-2‏ في ‎Ba/F3 Wa‏ منقول إليها كل من ‎hmpl 9 mmpl‏ كما تم وصف ذلك في مثال رقم )( مثال رقم ‎(VF)‏ ‎cDNA‏ ل ‎pML-2 5 Pml‏ من ربيطة ‎mpl‏ خنزيري:- م ثم ‎ML cDNA Je‏ من نوع ‎(PML)‏ خنزيري عن طريق ‎.RACE PCR‏ وبشكل مختصر؛ ثم تصميم بادئ 07 قصير وإثنين من البادئات الأولية المتخصصة ‎specific‏ بناء على تسلسل ‎exon‏ ‏جين ‎ML‏ الخنزيري المشفر للنهايات الأمينية ل ‎ML‏ المنقى من مصل خنزيري لا تنسجي ‎aplastic‏ ثم الحصول على ‎cDNA‏ محضر من أنسجة خنزيرية لا تنسجية مختلفة زيدت بالتكرار. وجد منتج ‎cDNA‏ من تفاعل ‎PCR‏ بطول ‎IVEY‏ زوج قاعدة في الكلية وأعيد ‎٠‏ استتساخها 5900010060. ودرس تسلسل نسائل مختلفة ووجد أنها تشفر ربيطة ‎mpl‏ لخنزير نلضج (لا يحتوي على إشارة إفراز ‎secretion signal‏ كاملة) . وجد أن ال ‎cDNA‏ يشفر بروتين ناضج ب ‎“#١‏ حمض أميني (10:2م) له المتتالية الموضحة في شكل رقم ‎(VA)‏ (أرقام هوية المتتالية 115( الطريقة: - ‎٠‏ عزل جين اام وغخلان:- تم عزل نسائل مجينية لجين ‎ML‏ الخنزيري باستعراض ‎screening‏ مجموعة مجينية لخنزير في ‎(Clontech Inc) EMBL3‏ باستخدام 1845م. وتم الاستعراض بشكل أساسي كما تم وصسسف ذلك في مثال رقم (7). وتم عزل النسائل المختلفة ودراسة تسلسل ال ‎exon‏ المشفر لمتتالية الأحماض الأمينية المماثلة للتي تم الحصول عليها من ‎ML‏ منقى. وتم الحصول على 00178 من

‎ML‏ خنزيري باستخدام تعديل بروتوكول ‎RACE PCR‏ تم تصميم بادئتي ‎ML‏ محددين بناء على متتالية جين ‎ML‏ من خنزير. وتم عزل ‎Polyadenylated mRNA‏ من كلية الخنازير اللاتناسجية ‎aplastic‏ بشكل أساسي كما تم وصف ذلك في السابق. تم تحضير ‎cDNA‏ بالاستتنساخ العكسي ‎transcription‏ 6 باستخدام البادئ 38001. ‎(BamdT : 5 GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTITITTTTS 0 °‏ (رقم هوية المتتالية :00( الموجة ضد ذيل ‎polyadenosine‏ ل خانتد. تم تنفيذ دورة أولية لتكرار تضاعف ‎YA) PCR‏ دورة عند درجة 2°40 لمدة ‎٠١‏ ثانية؛ ‎OA‏ أم لمدة ‎١‏ ثانية و77”م لمدة 0 ثانية) باستخدام البادئ الخاص ‎h-forward-1‏ ل ‎—ML‏ ‎(h-forward-1: 5° GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGICATGCTTCT 3 0 ٠١‏ (رقم ‎La‏ المتتالية :1 ( والبادئ ‎BAMAD‏ ‎(BAMAD:5’GACTCGAGGATCCATCG3 0‏ (رقم هوية المتتالية ب" ( في ‎٠٠١ dels‏ مل ) 04 ملي مولار !160 ‎٠,59‏ ملي مولار ‎MgCl‏ و١٠‏ ملي ‎«Tris JY sa‏ أس هيدروجيني ‎ApH‏ و7١‏ ملي مولار ‎«NTPs‏ مع 00 وحدة/ مل إنزيم بوليمراز علامة تجارية ‎-([Perkin Elmer Inc.] Amplitaq‏ وتم بعد ذلك هضم منتج ‎PCR‏ باستخدام 1 واستخلاصه باستخدام ‎)١ :١( phenol-chloroform‏ وترسيبه بايثانول وربط ب ‎١1‏ مجم من ناقل ‎SK-‏

‎YYo -‏ — ‎(Stratagene Inc.) Bluescript vector‏ والذي تم قطعه باستخدام 1 ‎.Kpnl‏ وبعد الحضانة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ثمتث إضافة ربع الخليط المربوط مباشرة إلى دورة ثانية من ‎Yy ) PCR‏ دورة كما ثم وصف ذلك سابقاً) باستخدام بادئٌ ثاني خاص ب ‎forward-1 primer‏ ‎-ML‏ ‎(forward-I: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3") °‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(OV‏ ‏و ‎oligonucleotide ) Ts‏ يرتبط بمتتالية مجاورة لمنطقة استتساخ متعدد ‎mulliple cloning‏ ‎Jalanegion‏ الناقل ‎-(Bluescript SK oligonucleotide‏ ‎CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3 7‏ '5( ‎٠‏ (رقم هوية المتتالية ‎(0A:‏ ‏ثم هضم منتج ‎PCR‏ الذي تم الحصول عليه باستخدام 1 و11ه0 وتمت إعادة ‎subcloning‏ ‏استنساخة ‎Lf ja‏ في ‎-Bluescript SK‏ وتم درس تسلسل نسائل مختلفة ناتجة عن تفاعلات ‎PCR‏ ‏مستقلة . ومرة أخرى فإن هناك شكلاً ثانياً ‎Sand‏ 0141-2 يشفر بروتين فاقد ل ؛ وحدات بنائية للحمصض ‎٠‏ الأميني ‎A)‏ "© وحدة بنائية للأحماض الأمينية)» تم تعريفه (أنظر شكل ‎YY‏ [رقم هوية المتتالية:١7]).‏ وتبين المقارنة بين متتاليات الأحماض الأمينية ‎pML-2 5 pML‏ أن الصيغة الأخيرة تكون مماثلة ما عدا أنه قد تم إلغاء ‎tetrapeptide‏ 01.0 المناظر للوحدات البنائية ‎١١-١١١‏ ‏بشكل كامل (أنظر شكل رقم ‎YY‏ [أرقام هوية المتتالية ‎VA‏ و١‏ ؟]). حدثت الإلغاءات الأربعة

للحمض الأميني والتي تمت ملاحظتها في ‎cDNA‏ في ‎ML‏ فأري وبشري وخنزيري في نفس الموضع بالضبط داخل البروتينات المتوقعة. مثال رقم ) و" )- اختبار ‎CMK‏ لحث ‎induction‏ مكون ‎thrombopoietin (TPO)‏ للتعبير الوراني عن ‎antigen‏ ‏م الصفائح الدموية ‎.GPIIb Illa‏ تمت المحافظة على بقاء خلايا ‎CMK‏ في وسط 1640 ‎(Sigma) Rempl‏ مضافاً إليه )7 مصسل بقري جنيني و١٠‏ ملي مولار ‎glutamine‏ في التحضير للاختبار» يتم حصد الخلايا وغسلها وإعادة تعليقها عند © ‎”٠١ X‏ خلية/ مل في وسط ‎GIf‏ خالي من المصل مضافاً إليه © ملجم/ لتر ‎Insulin‏ بقري ‎bovine‏ و١١٠7‏ ملجم/ لتر ‎apo-transferrin‏ و١‏ ” معادن نذرة ‎trace elements‏ . في طبق مسطح القاع من 976 عين؛ تمت إضافة عينات ‎TPO‏ القياسية أو التجريبية لكل عين بتخفيف مناسب بأحجام ‎٠٠١‏ ميكرولتر وتمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر من معلق خلايا 016 لكلى عين وتمت حضانة الأطباق عند ‎"FV‏ في 70 ‎CO,‏ كوسط حضانة لمدة ‎fA‏ ساعة. وبعد الحضانة تم تدوير الأطباق بسرعة ‎٠٠٠١‏ لفة في الدقيقة عند درجة حرارة ؛أم لمدة خمس دقائق. وتم استبعاد الأجزاء ‎AUD‏ وتمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر من الجسم المضاد 212 وحيد ‎٠‏ النسيلة ‎Ia monoclonal‏ 00115 المترافق ‎conjugated‏ مع 7716 لكل عين. وبعد الحضانة وعند م لمدة ساعة تم إستبعاد الجسم المضاد غير المقيد ‎unbound‏ وتمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر من غسول ‎BSA-PBS 7 +, wash‏ لكل عين. وتم تكرار خطوة الغسول )7 358-085 ثلاث مرات. وتم بعد ذلك تحليل الخلايا على ‎FASCAN‏ باستخدام التحليل القياسي بمتغير واحد ‎one‏ ‎parameter analysis‏ _لقياس شدة الوميض النسبية ‎٠ relative fluorescence intensity‏

مثال رقم )10( اختبار 1 لل ‎(TPO) Thrombopoietin‏ بقياس نشاط الإنقسام الداخلي لخلايا ‎DAMI‏ في أطباق معايرة صغيرة من 976 عين. ثمت المحافظة على خلايا 111 في ‎7٠١ + IMDM‏ مصل حصان(ه:6:5) ‎horse serum‏ ه مضافا إليه ‎٠١‏ ملي مولار ‎glutamine‏ و١٠٠‏ نانوجرام/ مل 6 ‎Penicillin‏ و١‏ © ميكروجرام/ ملى ‎streptomycin‏ . في الإعداد للاختبار؛ يتم حصد الخلايا وغسلها وإعادة تعليقها في ايلا خلية / مل في ‎IMDM‏ + )7 مصل حصان. في طبق مستدير القاع به ‎AT‏ عين تتم إضافة ‎٠٠١‏ ‏ميكرولتر من عينات ‎TPO‏ قياسية ‎standard‏ أو تجريبية إلى معلق خلايا ‎DAME‏ وتمت بعد ذلك حضانة الخلايا لمدة ‎$A‏ ساعة عند درجة ‎sa YY‏ جهاز حضانة به 70 ‎.CO,‏ وبعد الحضانة؛ ‎٠‏ يتم تدوير الأطباق في جهاز الطرد المركزي ‎Sorvall 6000 B‏ بمعدل ‎٠٠٠١‏ لفة في الدقيقة لمدة ‎o‏ دقائق عند ؛ "م. ويتم استبعاد الأجزاء الطافية ويتم تكرار خطوة الغسيل ب ‎٠٠0١0‏ ميكرولتر من ‎alg .BSA 70,1 — PBS‏ تثبيت ‎LA fixed‏ بإضافة ‎٠٠‏ ميكرولتر ‎ice-cold ethanol‏ متلج ‎PBS - ٠‏ ويعاد تعليقها بالشفط ‎aspiration‏ . بعد الحضانة عند درجة ؛ م لمدة ‎١١‏ دقيقة؛ يتم تدوير الأطباق عند ‎700٠5‏ لفة في الدقيقة لمدة © دقائق وتتم إضافة ‎١٠١‏ ميكرولتر من إنزيم ‎RNAse ٠‏ بتركيز ‎١‏ مجم / مل تحتوي على ‎0.١‏ مجم/ مل ‎propidium iodide‏ ‎Tween -20 7+, 0‏ إلى كل عين. بعد مرور ساعة من الحضانة عند ‎YY‏ يتم قياس التغيرات في محتوى ‎DNA‏ عن طريق قياس الخلايا المتدفقة ‎flow cytometry‏ وتم حساب عدد الكروموزمات ‎Polyploldy‏ وتحديد كميتها كالتالي:-

‎YYA -‏ - نسبة عدد الكروموزمات ‎Polyploldy‏ الطبيعية ‎(NPR)‏ = ‎Da )‏ في >,6 + ‎/M‏ 96 خلايا في ‎(M + Go<‏ مع ‎TPO‏ ‏ا ‎Tre‏ ار اط )7 خلايا في >ي0 ‎M+‏ 7 خلايا في ‎(M+ Gx‏ في عينة المقارنة مثال رقم ) ‎٠١‏ ): اختبار ‎Thrombopoietin‏ في المعمل (اختبار الاستجابة العكسية ‎Rebound Assay‏ في صفائح 0 فأر): - اختبار معملي لتحديد ‎3g‏ كمعيار لإنتاج صفائح الدموية ا" تم حقن فئران 057816 (تم الحصول عليها من ‎(Charles River‏ داخل الغشاء البريتوني ‎intraperitoneally (IP)‏ ب ‎١‏ مل من مصل ماعز محتوى على مضاد صفائح للفأر )1 ‎(amps‏ في اليوم ‎١‏ لإحداث تقليل في الصفائح الدموية ‎-thrombocytopenia‏ في اليومين © و؛ تم إعطاء ‎٠‏ الفئران العامل أو ‎PBS‏ كعينة مقارنة بالحقن في الغشاء البريتوني مرتين. في اليوم 7؛ يتم حقن © ميكروكوري نعي من ,11827750 في ‎١‏ مل محلول ملحي ‎saline‏ في الوريد ويتم قياس نسبة تضمين 8" في الصفائح الدموية من الجرعة التي تم إعطاؤها بالحقن والدائرة في عينات دم تم أخذها من فئران مقارنة وأخرى معالجة. تم إجراء عملية عد الصفائح الدموية وكرات الدم البيضاء في نفس الوقت في دم تم أخذه من تجويف مداري عكسي ‎٠ retro-orbital sinus‏ ‎oe‏ مثال رقم (ل7 ‎١‏ ): ‎KIRA ELISA‏ لل ‎(TPO) Thrombopoietin‏ بقياس فسفرة مستقبل ‎mpl-Rse-gD receptor‏ به ‎chimeric Jada‏ وراثي. تم الكشف عن مستقبل ‎mpl‏ بشري ‎Vigenet al, PNAS, USA,—:4ddaul‏ )1992( 5640-5644 :89 تم عمل مستقبل به خليط وراثي يشتمل على الحيز خارج - خلوي

‎extracellular domain (ECD)‏ لمستقبل ‎mpl‏ وحيز عابر للغشاء ‎transmembrane domain‏ ™ وحيز داخل - خلوي ‎(ICD)‏ ل 10720-10728 :)14( 269 ‎Mark et al, J. of Biol. Chem:‏ ‎RSE‏ )]1994[ باستخدام ‎peptide‏ موشوم في ‎carboxyl-terminal flag «ih‏ (أي ‎(Rse. gD‏ للاستخدام في ‎KIRA ELISA‏ التي تم وصفها في هذه الوثيقة. أنظر شكل رقم )+7( و(١7)‏ 0 للوصف البياني للاختبار . 0 تحضير عامل النقاط ‎Capture agent preparation‏ :- تم إنتاج مضاد ‎anti-gD‏ وحيد النسيلة ‎monoclonal‏ (نسيلة 536) ضد ‎peptide‏ من ‎D glycoprotein‏ لفيروس ‎Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): ) Herpes simplex virus‏

[1990] 547-553) المخزون المنقى تم ظبطه ليكون ¥ ‎[alae‏ مل في ‎Js las‏ ملحي منظم ‎buffered saline ٠‏ ب ‎«(PBS) phosphate‏ أس هيدروجيني ‎pH‏ 7.4 وتم تخزين جزء يبلغ ‎١‏ مل عند درجة ‎١‏ 5 (ب) تحضير جسم مضاد لتيروسين مفسفر ‎Antl-phosphotyrosme antlboav preparation‏ * - تم شراء 4610 وحيدة النسيلة مضادة لتيروسين مفسفر ‎anti-phosphotyrosine‏ من ‎(Lake Placid, NY) UBL‏ وتمت معالجتها بال ‎blotinylated‏ باستخدام ‎biotin-N-‏ ‎hydroxysuccinamide ٠٠‏ طويل السلسلة ‎Biot in -X- NHS, Research Organics, Cleveland,)‏ ‎.(OH‏ ‏(ج) الربيطة ‎dnagil.‏ :- ثم تحضير ‎mpl day,‏ بالتقنيات الخاصة بالهندسة الوراثية التي ثم وصفها هنا في هذه الوثيقة. وتم تخزين ربيطة ‎mpl‏ المنقى عند درجة ؛ أم كمخزون ‎stock solution‏ +

- YY. -:186.81( ‏تحضير الحمض النووي‎ (4) ‏بناء متتالية التشفير‎ ole stranded ‏مزدوجة معيارية مصنعة‎ oligonucleotides ‏تم استخدام‎ ‏بشري وتمت‎ Rse — )640-- ( C - stranded ‏بالنسبة لعشرة أحماض أمينية عند الطرف‎ ‏للجسم المضاد 586 ورامزة‎ epitope ‏حمض أميني أخرى تحتوي على قمة لاصقة‎ YY ‏إضافة‎ ‏المتتالية النهائية للجزء البنائي للجين المدمج.‎ (V+) ‏يقدم جدول رقم‎ . stop signal ‏إيقاف‎ © )٠١( ‏جدول رقم‎ ‏بشري.‎ Rse ‏جزء تخليقي ذو سلسلة مزدوجة لجين إندماج‎ ‏(رقمهوية‎ coding strand ‏سلسلة التشفير‎ (0% : ‏المتتالية‎ | 51 1GCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAG

ATGCTAGCCTCAAGATGGCTG

ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTA

GAAGCT-3' ‏(رقمهوية‎ noncoding (anti-sense) strand ‏سلسلة عدم تشفير‎ (V+: HE ١ 5 A GCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAA

TCGATITrGGATCAGCCA

TCTTGAGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAG

CCCTTGCTGCA-3'

‎77١ -‏ - تم ربط ‎DNA‏ المصنع مع المشفر للأحماض الأمينية ل ‎١ cDNA‏ - 880 ل ‎Rse‏ بشري عند موضع ‎Pst]‏ بدءاً من النكليوتيد 744 لمتتالية ‎cDNA‏ ل ‎Rse‏ بشري منشورة في:- ‎(Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14):1072010728 [1994])‏ ومواضع ‎Hindill‏ في متعدد الروابط ‎polylinker‏ للناقل التعبيري ‎pSVI17.IDLL‏ (أنظر شكل رقم ‎:A-L 7 ٠‏ رقم هوية متتالية: ‎(YY‏ لإنتاج ‎plasmid‏ التعبيري ‎expression vector pSV17.1D.LL‏ ‎.pSV.ID Rse.qD‏ وبشكل مختصرء يشتمل ‎plasmid‏ التعبيري على نسخة أولية ‎dicistronic‏ ‏تحتوي على متتالية مشفرة ل ‎DHFR‏ يحدها من جهة © قطعة للمنح ومن جهة © مكان لاستقبال قطعة ممنوحة في اماكن قطع ولزق ‎cintron‏ ويلي ذلك متتالية تشفر ال ‎Rse.gD‏ ‏تحتوي الرسالة كاملة ‎J shall‏ (غير المقطعة ‎non-spliced‏ ) على ‎DHFR‏ كإطار قراءة مفتوح أول ‎٠١‏ وبالتالي تنتج ‎DHFR (yg‏ وتسمح باختيار متحولات ثابتة. (ه) تحضير الحمض النووي ‎‘mpl-Rse.gD‏ ‏تم تطوير ‎plasmid‏ التعبيري ‎pSV.ID.Rse.gD‏ الناتج كما تم وصفه عاليه لإنتاج ‎plasmid‏ ‏6 يحتوي على متتالية التشفير ل ‎ECD‏ الخاص ب ‎mpl‏ بشري (أحماض أمينية ‎-١‏ 491) مدمجة ‎fused‏ حيز عابر للغشاء ‎transmembrane‏ وحيز داخل - خلوي لل ‎Rse.gD‏ ‎vo‏ (أحماض أمينية 474 - 111). تم استخدام ‎oligonucleotides‏ صناعية لربط متتالية التشتير لبروتين لحيز خارج - خلوي ل ‎mpl‏ بشري مع بروتين متتالية التشفير 1856 في تفاعل استنساخ ‎PCR‏ من خطوتين كما تم وصف ذلك بواسطة 26166-26171 :267 ‎Market al, J.

Biol.

Chem‏ )1992( وكانت البادئات المستخدمة لتفاعل ‎PCR‏ الأول عبارة عن 141:- ‎(5-TCTCGCTACCGTTTACAG-3"‏

‎17١ -‏ - (رقم هوية المتتالية : ‎)6١‏ ‏و 102:- ‎(5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3 7‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(TY‏ ‏هت مع قاعدة معلومات ‎cDNA‏ ل ‎Ris mpl‏ ‎(5-GGGCCATGACACTGTCAA-3')‏ ‏(رقم هوية المتتالية : ؟ 1( و ‎Ry‏ ‎-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3 7‏ 5( ‎٠‏ (رقم هوية المتتالية ‎(V6:‏ ‏مع قاعدة بيانات ‎cDNA‏ ل ‎.Rse‏ وتم استخدام جزء ‎Pyyll-Smal‏ لتلك الوصلة المندمجة لتكوين مستقبل مجمع الأجزاء ‎chimeric‏ كامل الطول. )5( تحويل الخلية ‎Cell transformation‏ :- تم إجراء النفاذية الكهربائية ‎electroporation‏ لخلايا 00120110 (برا ءة الاختراع الأوروبية رقم ‎ye‏ 307247 المنشورة في ‎Vo‏ مارس ‎)١989‏ باستخدام 05171040846 والذي تم جعله خطياً عند موضع ‎Notl‏ فريد في الجزء الرئيسي من ال ‎plasmid‏ وتم ترسيب ‎ethanol‏ بعد استخلاص ‎phenol/chloroform‏ وأعيد تعليقه في ‎٠١‏ ميكرولتر ‎.EDTA - Tris ٠ / ١‏ وبالتالي؛ تمت

‎77٠ -‏ تحضين ‎٠١‏ ميكروجرام من ‎DNA‏ مع 3" خلية 0012 0110 في ‎١‏ مل من ‎PBS‏ مثلج لمدة ‎٠‏ دقائق قبل عملية النفاذ الكهربائي عند 50860 فولت و١“ ‎uf‏ وأعيدت الخلايا إلى الثلج لمدة ‎Yo.‏ دقائق قبل وضعها في أطباق في وسط غير انتقائي . وبعد مرور ‎Y¢‏ ساعة ثم ‎ol Ag‏ بوسط خالي من ال ‎nucleoside‏ لاختيار نسائل + ‎DHFR‏ ثابت. هت )2( اختيار خلايا محولة للاستخدام في ‎—:KIRA ELISA‏ تم تحديد النسائل المعبرة عن ‎MPL/Rse.gD‏ بطريقة ‎western-blotting‏ على مستخلص خلايا . . بكاملة بعد فصله ب ‎SDS-PAGE‏ باستخدام الجسم المضاد 5836 والذي يكشف وجود القمة اللاصقة ‎.gD‏ ‎fd)‏ الأوساط: - ‎٠‏ ثم إنماء خلايا ‎F12/DMEM‏ بنسبة +0: +© ‎Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island,)‏ ‎(NY‏ . تمت تزويد الوسط ب ‎FBS 7٠‏ مرشح مرتين ‎(Hyclone, Logan, Ulab) diafiltered‏ ‎You‏ ملي مولار ‎Y s HEPES‏ ملي مولار ‎‘L-glutamine‏ ‏(ط) ‎KIRA ELISA‏ :— تم استزراع خلايا ‎DP12CHO‏ محولة من ‎١ Y) mpl-Rse.gD‏ في كل عين) من عيون طبق ‎\o‏ الاستزراع ذى القعر المسطح المكون من ‎a‏ عين في وسط حجم ‎Yoo‏ ميكرولتر وتم استتباتها طول الليل عند درجة ١7م‏ في 786 ‎.CO,‏ وفي الصباح التالي؛ تمت تصفية الأجزاء الطافية في العيون وتم رص الأطباق بشكل خفيف على ورق نشاف. ثم تمت إضافة ‎5٠‏ ميكرولتر من أوساط تحتوي على ‎LJ‏ عينات تجريبية أو ‎You‏ أو 8 و,7١‏ أو ‎YY‏ أو ‎YA‏ ,+ أو 7,15" أو ‎٠,‏ أو صفر نانوجرام/ مل من ربيطة ‎mpl‏ إلى كل عين. وتم تحفيز الخلايا عند ‎"FY‏ لمدة ‎Y.‏ © دقيقة. وتمت تصفية الأجزاء الطافية ‎aly‏ مرةٌ أخرى رص الأطباق بشكل خفيف على ورقة

نشاف. لتحلل الخلايا وجعل المستقبلات التي بها إبدال وراثي ‎ALS‏ للذوبان. تمت إضافة ‎٠٠١‏ ‏ميكرولتر من مادة محللة إلى كل عين. تكونت المادة المنظمة المحللة من ‎Yor‏ ملي ‎NaCl JY ga‏ تحتوي على ‎59٠6‏ ملي مولار ‎(Gibco) HEPES‏ و0 ‎Triton-X 100 (Gibco)‏ و0 1 ‎[klu ٠١ thimerosal‏ ملى ‎Biochemicals, Aurora, OH) aprotinin‏ 1017 و١‏ ملي مولار ‎(AEBSF, ICN Biochemicals) 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride ٠‏ و50 ميكرو مولار ‎(ICN Biochemicals) leupeptin‏ و١‏ ملي مولار محلول ‎sodium‏ ‎«(Nazvo,, Sigma Chemicals Co, St Louismo) orthovanadate‏ أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,0. وتم بعد ذلك رج الأطباق بلطف على هزاز أطباق ‎(Bellco.

Instruments, Vineland.

NJ)‏ لمدة ‎٠١‏ ‏دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. ‎Lay.‏ كانت ‎A‏ تتعرض للتذوب ؛ فإن طبق ‎ELISA‏ للمعايرة الصغير ‎(Nunc Maxisorp, Inter‏ ‎Med, Denamark)‏ والذي يتم طلاؤه طول الليل عند درجة ؛ "م بالجسم المضاد وحيد النسيلة 6 المضاد ل ‎Gd‏ )0 ميكروجرام/ مل في © ملي مولار كربونات كمحلول منظم بأ هيدروجيني ‎٠٠١ (9,1) PH‏ ميكرولتر/ عين) تمت تصفيته ووضعه على ورق نشاف وسده ب ‎٠‏ ميكرولتر/ عين من مادة منظمة حاجزة ‎PBS] Block Buffer‏ تحتوي على ‎BSA 7 ٠.05‏ مد ‎(Intergen Company, Purchase, NY)‏ و70.01 ‎thimerosal‏ ] لمدة ‎٠١‏ دقيقة عند درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف. وبعد ‎٠١‏ دقيقة؛ تم غسل الطبق المطلي المضاد ل 60586 7 مرات باستخدام مادة غسيل منظمة ‎PBS) wash buffer‏ تحتوي على 10.06 ‎Tween-20‏ و1000 ‎thimerosal‏ ( باستخدام غسالة أطباق آلية ‎Scan Washer 300 Skatron Instruments.

Inc.)‏ ‎(Sterling, VA‏ تم نقل ناتج التحلل المحتوي على 80 1001/3886 من خلية الاستنبات ذات عيون © المعايرة الصغيرة ‎AO)‏ ميكرولتر/ عين) إلى ‎ELISA (pe‏ مطلية بمضادة ‎anti‏ ل ‎Gd5B6‏ ‏ومغلقة وتمت حضانتها لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف. تمت إزالة ‎mpl-‏ ‎Rse.gD‏ بالغسيل باستخدام مادة غسيل منظمة و١١٠٠‏ ميكرولتر من 4610 معالج ‎biotinylated‏ ‏(مضاد للتيروسين المفسفر ‎phosphotyrosine‏ ( مخففة بنسبة ‎:١‏ 1800060 في مادة مخففة

‎YYo _‏ — منظمة ‎PBS)‏ تحتوي على 750,5 ‎Tween-20 750.06 3 BSA‏ 5 © ملي مولار ‎+1*YSEDTA‏ 1 ‎thimerosal‏ (¢ يعني إضافة 0% نانوجرام/ مل لكل عين. وبعد الحضانة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة تم غسل الطبق وتمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر من إنزيم ‎horseradish peroxidase‏ ‎streptavidin - (HRPO)‏ مترافق ‎(Zymed Laboratories, 5. San Francisco, CA) conjugated‏ © مخفف بنسبة ‎٠0000 :١‏ بمادة مخففة منظمة إلى كل عين. تمت حضانة الطبق لمدة ‎١‏ دقيقة عند درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف. وتم غسل مترافق أفيدين الحر ‎free avidin-conjugate‏ وتمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر من محلول ‎substrate 5 33S)‏ ثم تحضيرها حديشاً ‎[TMB] tetramethyl benzidine)‏ مجموعة ركيزة من مكونين ‎2-component substrate kit‏ ¢ ‎Kirkegaard and Perry, Gaithersburg «MD‏ إلى كل عين. وتمت مواصلة التفاعل لمدة ‎٠١‏ ‎٠‏ دقائق؛ وبعدها تم إيقاف تطور اللون بإضافة ‎٠٠١‏ ميكرولتر/ عين من ,11:00 بتركيز ‎١‏ مولار. تمت قراءة الامتصاص عند £00 نانومتر مع طول موجه مرجعي يبلغ ‎١560‏ نانومتر ‎nm‏ ‎.(ABSusois0)‏ باستخدام قارئ أطباق ‎(Molecular Devices, Palo, Alto, CA) Vmax‏ يتم التحكم فيه باستخدام 650 ‎Macintoch Centris‏ (علامة تجارية ‎(Apple Computer, Cupertino, CA‏ وبرنامج حاسب من نوع ‎(BioMetallics, Inc, Princeton, NJ) Delta Soft‏ . ‎٠‏ تم رسم المنحنى القياسي بحث خلايا ‎dpl2.trkAB‏ أو خلايا ‎CD‏ باستخدام ‎٠٠١‏ أو ‎So‏ ‎١5‏ أو 17 أو ‎CVA‏ أو ‎١,19‏ أو ‎EA‏ ,+ أو صفر نانوجرام / مل من ربيطة از« وتم تقديمه في صورة ‎TPO‏ نانوجرام ‎ml /ng‏ مقابل متوسط ‎ABS,sosso t sd‏ باستخدام برنامج ‎Delta‏ ‎.Soft‏ تم الحصول على تركيزات العينات عن طريق استكمال امتصاصها ‎interpolation‏ على المنحنى القياسي وتم التعبير عنها بدلالة نشاط ‎TPO‏ بالوحدات نانوجرام/ ‎Jo‏ ‏وجد أن ربيطة ‎mpl‏ قادر على تنشيط مستقبل ‎mpl-Rse-gD‏ المركب وراثياً ‎chimeric‏ بطريقة تعتمد على التركيز ومحددة للربيطة. علاوة على ذلك؛ وجد أن ‎mpl-Rse-gDKIRA-ELISA‏ ‏تتحمل حتى ‎7٠٠١‏ مصل بشري (موضح) أو ‎7٠٠١‏ بلازما (غير موضحة)؛ مما يسمح بسهولة استخدامها لفحص المريض وعينات ‎ph‏ بسهولة.

‎7٠31 -‏ - منحنى قياسي ل ‎TPO;3;‏ منتج ب ‎Yay‏ ‏منحنى قياسي ‎TTPO, YT‏ اس ااا تت ب ‎٠,‏ ‏7 أوسا ‎A 8 b‏ 7 كلأ و | ‎Hu Ser‏ 10056 ل ‎٠, 2‏ ‎w v, o w‏ و ‎y‏ 1< 7 1 7 7 وٍِ* ‎gh }‏ ٍ اا ‎ER Ys vo 3 [a ١ * ١ ٠‏ تركيز ‎TPO‏ ‏(نانوجراع/مل) ‎EC50 EC50‏ صيغ ‎TPO‏ خلايا ) نسبة جزيئية مولارية ‎pM 4‏ 7 نانو جرام / مل )293( 332 ‎Hu TPO‏ ‎pM AY)‏ 4 نانو جرام / مل )293( 332 ‎Mu TPO‏ -٠؛‏ نانو جرام / مل )293( 153 ‎Hu TPO‏ 4 نانو جرام / مل ‎Hu TPO 155 (E. coli)‏ ‎sili «AYA pM Y),A‏ جرام / مل | ‎Hu TPO 153met E. coli)‏ مثال رقم ‎A)‏ \ ( : ‎ELISA‏ مبينة على مستقبل — ‎Receptor Based ELISA for (TPO) Thrombopoietin‏ ‎Thrombopoietin (TPO)‏ تم طلاء أطباق ‎ELISA‏ ب ‎F(ab),‏ من أرنب مضاد ل ‎(Fe)‏ 186 بشري في كربونات منظمة ثم ي في ل عند أس هيدرو 2 جيني ‎q 0 1 pH‏ وفي درجة حرارة $ م طوال الليل . وتم سد الأطباق باستخدام

‎YY -‏ — ‎٠‏ ألبومين مصل بقري ‎bovine serum albumin‏ في ‎PBS‏ عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. تمت إضافة ناتج حصيلة التخمر ‎Fermentertion‏ المحتوى على المستقبل المجمع جينياً؛ ‎mpl-lgG‏ إلى الإطباق وتم تحضينها لمدة ساعتين. وتمت إضافة ضعفين من المخففات (02,79 - ‎Yo‏ نانوجرام/ ‎(Ja‏ من العينات المخففة المتتالية ‎serial dilutions‏ القياسية (د:و100 تم إنتاجها في م 747 خلية بتركيز تم تحديده بالتحليل الكمي للحمض الأحماض الأمينية) في 74,0 ألبومين مصل بقري و 2070.05 - ‎tween‏ إلى الأطباق وتمت تحضينها لمدة ساعتين. وتم كشف عن ‎TPO‏ ‏المرتبط باستخدام بروتين ‎iia A‏ وأجسام مضادة ‎co JY‏ معالجة بال ‎biotinylated‏ ضد و10 تم إنتاجها في بكتيريا إشرشيا كولاي ‎E.coli‏ (حضانة لمدة ساعة)؛ وتبع ذلك ‎streptavidin-peroxidase‏ (حضانة لمدة ‎١‏ دقيقة) و ‎tetramethyl benzidine‏ 3,3,5,5 كركيزة ‎٠‏ #6 . وتمت قراءة ‎dad‏ الامتصاص عند طول موجه £04 نانومتر. تم غسل الأطباق بين الخطوات. ولتحليل البيانات؛ تمت مواءمة ‎fitted‏ المنحنيات باستخدام برنامج مواءمة منحنيات من ‎day‏ متغيرات ‎Kaleidagraph {aul 5; four-parameter curve fitting program‏ تم حساب تركيزات العينات من المنحنى القياسي. ‎Jha‏ رقم ) 4 1 ‎vo‏ _التعبير الوراثي والتنقية ل ‎TPO‏ من ‎YAY‏ خلية:- )1( تحضير ‎JIL YAY‏ تعبيري ‎Expression Vectors‏ خلوي:- ثم الحصول على ‎cDNA‏ مناظر لكل إطار القراءة المفتوحة ‎entire open reading frame‏ — لإطار قراءة مفتوح كلي ‎TPO‏ عن طريق ‎PCR‏ باستخدام ‎oligonucleotides‏ التالية ‎Labs‏ ‎Primers‏ :—

-0 77/8 جدول رقم ‎)١١(‏ ‏797 بادئ ‎PCR‏ ‎Clg FLF: 5 ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC‏ | (رقم هوية المتتالية ‎(to:‏ ‎CCG GCC AG 3‏ ‎AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG‏ 067 5 :لام | (رقم هوية المتتالية : ‎(EA‏ ‎CTG TAC ATG AGA 3'‏ ثم استخدام ‎PRKS5-hmpl1‏ (الذي ثم وصفه في مثال رقم 9 ( كنموذج للتفاعل في وجود إنزيم ‎polymerase‏ ل ‎(Stratagene) pfu DNA‏ وكان التمسخ ‎JY denaturation‏ لمدة ‎١7‏ دقائق عند درجة 3 5 وتبع ذلك ‎Yo‏ دورة من ‎sale)‏ البناء (دقيقة واحدة عند درجة ¢ ‎(a‏ دقيقة واحدة هم عند درجة 00 ‎a‏ ودقيقة واحدة عند درجة 777م). وكان التمديد النهائي لمدة ‎١١‏ دقيقة عند ‎a VY‏ وتمت تنقية منتج ‎PCR‏ واستنسخ 1 بين مواضع قطع ‎xbal 5 Clal restriction sites‏ لل ‎pRKS5tkneo plasmid‏ وهو ناقل مشتق ‎pRKS‏ معدل للتعبير الوراثي عن جين مقاومة 0 تحت سيطرة محفز إنزيم ‎thymidine kinase‏ للحصول على الناقل ‎-PRKS5tkneo.

ORF‏ تم تكوين تركيب ثان مناظر لحيز ‎epo‏ متجانس ‎homologous‏ بنفس الطريقة ولكن باستخدام ‎٠‏ .081 كبادئ أمامي والبادئ العكسي التالي:- ‎Arg STOP.Xba: 5 TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3‏ (رقم هوية المتتالية :1 %( يسمى التركيب النهائي ‎.pRKS-thnoeoEPO-D‏ وتم التحقق من متتالية كلا كل التركيبين كما تم وصف ذلك في مثال رقم ‎(VY)‏

‎Yrs -‏ - )¥( نقل المعلومة الوراثية لخلايا كلية جنينية بشرية بطريقة ,0800 كما تم وصف ذلك في مثال رقم (9):- وبعد نقل الإصابة ب 8 ¥ ساعة بدأ اختيار النسائل المقاومة للنيوميسين في وجود 4 مجم/ مل 8. وبعد ذلك بفترة تتراوح من ‎٠١‏ إلى ‎Vo‏ يوماً تم تقل نسائل فردية إلى أطباق ‎AT‏ عين مه وتركت لتنمو حتى الكمال ‎confluency‏ تم تقييم التعبير عن ‎ML153‏ أو 141,332 في الأوساط المكيفة ‎conditioned media‏ من تلك النسائل باستخدام اختبار التكاثر ‎LS) Ba/F3-mpl‏ تم وصف ذلك في مثال رقم ‎.)١‏ ‎(Y)‏ تنقية ‎—:thML332‏ ‏تم وضع ‎293-rthMI332‏ الوسط المكيف في عمود ‎(pharmacia) Blue- Sepharose‏ ثم تشبيعه ‎٠‏ ل01110:8160© في ‎٠‏ ملي مولار ‎sodium phosphate‏ عند أس هيدروجيني ‎sala) 2, 4 pH‏ منظمة أ ‎(buffer A‏ وتم بشكل متتالي غسل العمود بعشرة أحجام العمود؛ كل ‎pan‏ منها مكون من المادة المنظمة أ ومادة منظمة أ تحتوي على ‎urea‏ بتركيز ¥ مولار. وتم بعد ذلك غسل ‎aad)‏ ‏تتابعياً باستخدام المادة المنظمة (أ) التي تحتوي على هن بتركيز ‎١‏ مولار ‎NaCls‏ بتركيز ‎١‏ ‏مولار. وتم بعد ذلك مباشرة وضع مجموعة التصفية التتابعية من ‎Blue-Sepharose‏ في عمود ‎WGA-Sepharose ١٠‏ مشبع في مادة منظمة أ. ثم بعد ذلك غسل عمود ‎WGA- Sepharose‏ باستخدام عشرة أحجام العمود من مادة منظمة أ تحتوي على ‎urea‏ 7 مولار و11801 ‎١‏ مولار وتمت غسله تتابعياً بنفس المادة المنظمة المحتوية على ‎3S yu N-acetyl-D-glucosamine‏ 0,+ مولار. وتم وضع وسائل الغسيل التتابعية ‎WGA-Sepharose‏ في عمود ‎(Synchrom, Inc.) C4-HPLC‏ معادل في 1ر760 ‎TFA‏ ثمت غسل العمود ‎C-HPLC‏ باستخدام كميات متدرجة بشكل متقطع من ‎Yo (Yo — Jia) propanol #٠‏ مين ‎—¥o‏ 19). وجد أن ‎thMLy;,‏ تتم غسله في الحيز

‎YE. _‏ — ‎propanol 1 . —YA‏ أثناء التدرج. ينتقل ‎rhML;3,‏ المنقى بواسطة 01م 5105-0 كنطاق واسع في منطقة 8+- 80 كيلو دالتون و1022 للجل (أنظر شكل رقم ‎(Vo‏ ‏)£ ( تنقية وممتلاخط:- تمت تجزئة الوسط المكيف ب ‎293-thML,s; resolved‏ مكيف الوسط على ‎Blue -Sepharose‏ هه كما تم وصف ذلك في وومتال. وتم بشكل مباشر وضع سائل التصفية التتابعية الخارج من ‎Blue-Sepharose‏ في عمود ألفة ‎mpl-affinity column‏ كما تم وصف ذلك عالية. تمت تنقية و5 الخارج من عمود ألفة - ‎mpl‏ حتى التجانس ‎homogeneity‏ باستخدام دورة عمود ‎C4-‏ ‎HPLC‏ تحت نفس الظروف التي تم وصفها بالنسبة ل ‎.thMLys;‏ وبواسطة ‎SDS-PAGE‏ أظهر تحليل ‎thML ps;‏ رابطتين رئيسيتين ورابطتين ثانويتين ‎two major and two minor bands‏ ‎٠‏ بوزن جزيئي :14 في حدود ‎7٠٠٠١ - 1800١‏ (أنظر شكل رقم ‎(Yo‏ ‏مثال رقم ‎HY)‏ ‏التعبير الوراثي والتنقية ل ‎TPO‏ من ‎Expression and Purification of TPO from CHO‏ ‎—:CHO‏ ‎-١‏ وصف النواقل التعبيرية ل ‎CHO‏ ‎yo‏ تحمل النواقل التعبيرية المستخدمة في بروتوكولات النفاذ الإلكتروني ‎electroporation protocols‏ التي سيتم وصفها لاحقاً الأسماء التالية:- ‎pSV15.ID.

LL MLORF‏ (طول كامل أو ,ب8770)؛ 5 ‎pSV1S.ID.LLMLEPO-D‏ (مقطوع أو ‎-(hTPO,s;‏

‎١4١ -‏ - ويتم توضيح الخواص ذات الصلة بالموضوع بالنسبة لتلك ال ‎plasmids‏ في شكل رقم ‎(Y¥)‏ ‏و(؟1). ‎Y‏ - تحضير النواقل التعبيرية ل ‎CHO‏ :— تم الحصول على ‎cDNA‏ المناظر لإطار القراءة المفتوح الكلى ‎hTPO‏ بواسطة تفاعل ‎PCR‏ ‏0 باستخدام بادئات ‎oligonucleotide‏ الموضحة في جدول رقم ‎(VY)‏ ‏جدول رقم ‎(VY)‏ ‏بوادئ ‎PCR‏ للناقل التعبيري ‎CHO‏ ‎FL 2 S'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC‏ 014 | (رقم هوية المتتالية : ‎(8Y‏ ‎CGG CCA G 3'‏ ‎ORE S41 5 AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT‏ | (رقم هوية المتتالية : 67) ‎CTG AGA ACC 3'‏ ثم ‎al‏ ستخدام 1 ‎PRK S-hmpl‏ (الذي ثم وصفه في مثال رقم 7 و ‎q‏ ( كنموذج للتفاعل في وجود إنزيم بوليمراز ل ‎.(Stratagene) pfu DNA‏ واستمر التمسخ 0 الأولى لفترة ‎١‏ دقائق عند ‎a q¢‏ وتبع ذلك ‎Yo‏ دورة من التكرار (دقيقة واحدة عند درجة € 2° ودقيقة واحدة عند درجة #دام ودقيقة واحدة عند درجة 77أم). واستمر التمديد النهائي لمدة ‎١١‏ دقيقة عند درجة ‎VY‏ 2 وتمت تنقية منتج ‎PCR‏ واستنساخه بين مواضع قطع ‎sall 5 Clal‏ للبلازميد 05715.10 للحصول على الناقل ‎.pSVIS.ID.LLMLORF‏ تم إنشاء تركيب ثاني مناظر للمجال المتجانس ‎EPO‏ بنفس reverse ‏والبادئ العكسي‎ forward primer ‏الطريقة ولكن باستخدام 018.117 كبادئ أمامي‎ ‏التالي:-‎ primer

EPOD.Sal 5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3 )68 : ‏(رقم هوية المتتالية‎ ‎o‏ يسمى التركيب النهائي ‎pSVISID.LLMLEPO-D‏ وتم التحقق من متتالية كل من التركيبين كما تم وصف ذلك في مثال رقم ‎(V)‏ 5 )2( وبشكل أساسي؛ تم إدخال متتالية التشفير للربيطة ‎ld‏ ذى الطول الكامل والمقطوع ‎truncated‏ إلى موضع التشفير المتعدد ‎multiple cloning site‏ للناقل التعبيري ‎CHO‏ المتمثل في ‎.pSVISID.LL‏ يحتوي الناقل على المعزز ‎enhancer‏ / المحفز المبكر ‎early promoter‏ 51740 ووحدة الوصل ‎splice unit‏ التراكبي المعدلة المحتوية على ‎DHFR‏ ‎cDNA \‏ فأري ‎mouse‏ وموضع استتنساخ متعدد لإدخال الجين قيد الاهتمام (في هذه الحالة متتاليات ‎TPO‏ التي تم وصفها) وإشارة أدينين متعدد ‎polyadenylation signal‏ ل- ‎SV40‏ وأصسل للمضاعفة ‎origin of replication‏ وجين لإنزيم ‎B-lactamase gene‏ لاختيار ال ‎plasmid‏ والتكوار في البكتيريا. » — طريقة إنشاء سلالات خلية ‎CHO‏ ثابتة تعبر عن ‎TPOss‏ وه,100 بشرية بالهندسة الوراثية ا ‎.recombinant‏ ‏أ- وصف سلالة الخلية ‎١‏ لأم ‎parent cell line‏ 0110). تعرف سلالة الخلية ‎CHO‏ المضيفة (مبيض ‎fi wala‏ صيني ‎Chinese Hamster Ovary‏ ( المستخدمة للتعبير عن جزيئات ‎TPO‏ التي ثم وصفها هنا في هذه الوثيقة كك ‎CHO -DP12‏ (أنظر براءة الاختراع الأوروبية رقم 247 ‎EP307‏ المنشورة في ‎١١‏ مارس (آزار) 4 ‎١‏ ( وثم

اختيار سلالة الخلية ‎dal‏ كنسيلة ‎clonally selected‏ من خلايا السلالة الأم المنقول إليها ‎al)‏ ‎CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-))‏ - تم الحصول عليها من ‎Dr.

Frank Lee of Stanford‏ ‎University‏ بتصريح من ‎(Dr.L.Chasin‏ باستخدام ‎Jib‏ ل ‎preproinsulin‏ للحصول على نسائل بمتطلبات ‎insulin‏ منخفضة. وتكون تلك الخلايا أيضاً ناقصة ‎DHFR‏ ويمكن اختيار النسائل بوجود © مثثاليات الناقل ‎DHFR CDNA‏ بالتتمية في على وسط ‎MA‏ من إضافات نكليوسيد ‎nucleoside‏ ‎hypoxanthine « glycine) supplements‏ و ‎٠ (thymidine‏ وبشكل عام يستخدم نظام الاختيار المذكور للتعبير الثابت عن سلالات ‎CHO Wa‏ ب- طريقة القطع الجينية (النفاذ الإلكتروني) ‎Transfection method (electroporation)‏ :- تم إنتاج سلالات خلايا ‎Lisa‏ و10 و7100 بإدخال المعلومة الوراثية ‎transfecting‏ إلى خلايا ‎٠‏ 109012 عن طريق النفاذ الإلكتروني؛ أنظر على سبيل المثال ‎Andreason, G.L.J.

Tiss.

Cult)‏ ‎(Meth., 15.56 (1993)‏ باستخدام ‎pSV15.ID.LLMLEPO- si pSV15.ID.LLMLORF plasmids‏ 0 تم تحويله إلى الشكل الخطي على التوالي. وتم تكوين ¥ مخاليط تفاعل إنزيمية قاطعة ‎reaction‏ ‏لقطع 5 عند ‎٠١‏ ميكروجرام 5 ‎YO‏ ميكروجرام و١‏ © ميكروجرام من الناقل مع الإنزيم 1 بطرق بيولوجية جزيئية قياسية ‎molecular biology - methods‏ 10 . يوجد موضع ‎١‏ القطع المذكور مرة واحدة فقط في الناقل في منطقة التحويل الخطي ‎linearization‏ في جهة ‏ ¥ وخارج وحدات استتساخ ربيطة ‎TPO‏ (أنظر شكل رقم ‎(YY‏ وتم تجهيز التفاعلات بحجم ‎٠٠١‏ ‏ميكرولتر للحضانة طول الليل عند درجة "م ‎٠‏ وفي اليوم التالي» تم استخلاص مخاليط ‎phenol‏ ‎٠ ) - chloroform - isoamyl alcohol‏ ؟: ‎)١‏ مرة واحدة وتم وضع الراسب بال ‎ethnol‏ على ثلج جاف ‎dry ice‏ لمدة ساعة واحدة تقريباً. وتم بعد ذلك تجميع الراسب بعد الطرد المركزي لمدة ‎١‏ دقيقة ثم التجفيف. وأعيد تعليق ال ‎DNA‏ المحول إلى خطي في ‎٠٠‏ ميكرولتر من وسط

‎Ham's DMEM-F12‏ بنسبة ‎١ :١‏ مضافاً إليه مضادات حيوية ‎standord antibiotics‏ قياسية و؟ ملي مولار ‎glutamine‏ ‏تم تجميع ‎WA‏ 7012 النامية في المعلق وغسلها مرة واحدة في الوسط الذي تم وصفه لإعادة تعليق ال ‎DNA‏ يتم تعليق الخلايا فيه بشكل نهائي في نفس الوسط عند تركيز ‎"٠١‏ خلية في كل ‎Vou oo‏ ميكرولتر ‎٠‏ وتم تحضين كميات الخلايا ( ‎VO‏ ميكرو لتر) وكذلك كل خليط ‎DNA‏ المحول إلى خطي مع بعضها البعض عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ثم نقلها لحجرة إجراء النفاذية الكهربائية ‎BRL‏ ويتم بعد ذلك إخضاع كل خليط تفاعل لإجراء النفاذية الكهربائية في جهاز اختبار نفاذية كهربائية ‎BRL‏ قياسي عند ‎YOu‏ فولت مضبطة عند سعة مكف منخفضة ‎low‏ ‎YY capacitance‏ ميكروفاراد ‎(uF‏ وبعد إجراء النفاذية الكهربائية سمح للخلايا بالبقاء في الجهاز ‎Bad ٠‏ © دقائق ثم وضعت على ثلج لمدة ‎٠١‏ دقائق أخرى. وتم نقل الخلايا التي أجرى عليها لنفاذية الكهربائية إلى أطباق استنبات خلايا ‎٠١‏ مليمتر ‎mm‏ تحتوي على © مل من وسط نمو كامل قياسي لخلايا ‎CHO‏ (جلوكوز عالي 014534-12 بنسبة؛ 10 ‎٠٠‏ بدون جليسين مضافاً إليه ‎GHT 1‏ و؟ ملي مولار جلوتامين 5 70 مصل جنين عجل) وتم استنباتها طول الليل في جهاز حضانة لاستنبات خلايا في ‎CO;‏ 0 ‎٠‏ ج- طريقة الاستعراض والانتقاء والاختبار ‎—:salaction and screening‏ في اليوم ‎J‏ تمت ‎dallas‏ الخلايا بال ‎trypsin‏ لفصلها من الأطباق بطرق قياسية ونقلها إلى أطباق إستنبات نسيج ‎YOu‏ مليمتر ‎mm‏ تحتوي على وسط ‎DHFR‏ إنتقائي ‎Ham's S.DMEM-)‏ 2 الوسط ‎١ :١‏ الذي تم وصفه سابقاً مضافاً إليه إما 77 أو 16 مصل عجل جنيني مديلز 40 ولكنه خالي من ‎glycine‏ ال ‎htpoxauthine‏ و ال عصنةن”رط؛ ويعتبر ذلك هو وسط ‎DHFR ٠‏ الإنتفائي الذي نستخدمه). وتم فيما بعد وضع خلايا من كل طبق ‎Te‏ مليمتر 0 في

أطباق * / ‎٠‏ مليمتر ‎mm‏ وتمت بعد ذلك تحضين الخلايا لفترة تتراوح من ‎٠١‏ إلى ‎1١6‏ يوم (مع تغيير وسط واحد) عند 7ا7”م / 00,75 حتى بدا ظهور النسائل ووصلت لأحجام يمكن نقلها إلى أطباق ‎AT‏ عين. وفي خلال فترة من 4 إلى 0 أيام»؛ تم نقل سلالات خلايا إلى أطباق 16 عين باستخدام أطراف ‎tips‏ ماصات صفراء معقمة لماصة ثم ضبطها عند الحجم ‎5٠‏ مل. وتم السماح للخلايا بالنمو حتى الكمال ‎com‏ (عادة من ¥ - 0 أيام) ثم تمت معالجة الصواني بالتربسين وتمت إعادة إنتاج نسختين ‎repraduced‏ من الصينية الأصلية. وتم تخزين اثنين من تلك النسخ تخزينا قصير الأجل تحت التجميد مع تخفيف الخلايا ‎JS‏ عين في ‎٠٠‏ ميكرولتر من ‎٠١‏ ‏5 في ‎DMSO‏ تم تحليل عينات وسط مكيف لمدة 0 ‎ali‏ وخالي من المصل من عيون مجمعة في الصينية الثالثة للتعبير الوراثي عن ‎TPO‏ عن طريق اختبار نشاط مبنى على خلية ‎BaF‏ تم ‎٠‏ تنشيط النسائل ذات التعبير الأعلى بناء على ذلك الاختبار بعد تخزينها وتم وضعها في اثنتين من قوارير التجميع 7 ‎١٠١‏ مليمتر ‎mm‏ لنقلها لمجموعة استنبات الخلايا لتهيئتها للتعليق وإعادة الاختبار ‎re-assay‏ والتخزين ‎.banking‏ ‏د- بروتوكول التكبير ‎Amplification Protocol‏ :- تم بالتالي وضع مجموعات عديدة من سلالات خلايا ذات التراكيز الأعلى من المجموعة المنتقلة ‎١٠‏ التي تم وصفها سابقاً خلال نظام تكبير ‎methotrexate‏ لإنتاج نسائل ذات تركيز أعلى. وثم تمديد نسائل خلايا ‎CHO‏ وتم وضعها في أطباق ‎٠‏ سم بأربعة تراكيز من ‎methotrexate‏ (أي؛ 84 نانومولار و١٠٠‏ نانومولار و00٠٠‏ نانومولار و١0٠5‏ نانومولار) عند رقمين أو ثلاثة للخلايا ‎٠١(‏ و80 ‎٠١٠ x‏ و١٠‏ خلية / طبق). ‎fis‏ بعد ذلك حضانة الخلايا عند درجة 7م / 70 ‎CO,‏ حتى يتم تكوين النسائل وتصبح قادرة على النقل إلى أطباق ذات 476 عين للاختبار © - الإضافي.وتم مرة أخرى إخضاع نسائل ذات تراكيز عالية مختلفة من تلك المجموعة المنتقاة إلى

- +7147 تركيزات أعلى من ‎methotrexate‏ (أي؛ ‎٠‏ نانومولار و8060 نانومولار و١٠٠٠‏ نانومولار

و١١٠١‏ نانومولار) وكما سبق توضيحه فإن النسائل المقاومة ‎resistant clones‏ يُسْمَحَ لها بالتكوين

‎establish‏ ثم النقل إلى أطباق 976 عين ومن ثم اختبارها.

‏؛ - استنبات سلالات خلايا ‎CHO‏ 435 معبرة عن :170 و:170 بشرية هندسة وراثية

‎. recombinant ٠

‏يتم تنشيط خلايا بنكية ‎Banked cells‏ ويتم زيادة عدد الخلايا بطرق إنماء قياسية في وسط خالي

‏من المصل أو يحتوي على مصل. وبعد الزيادة إلى تركيز ‎WIA‏ كافي؛ يتم غسل الخلايا لإزالة

‏أوساط إستنبات الخلايا المتبقية. ويتم بعد ذلك استنبات خلايا بأي طريقة قياسية بما في ذلك:

‏الاستنبات المتقطع ‎batch‏ أو التغذية على دفعات ‎fed-batch‏ أو الاستتبات المتّصل ‎continuous‏ ‎culture ٠‏ عند درجة حرارة تتراوح من ‎NYO‏ 40 "م؛ أس هيدروجيني ‎pH‏ متعادل». مع وجود

‏محتوى ‎0p‏ مذاب لا يقل عن 70 حتى يتم تراكم ‎TPO‏ المفرز بشكل أساسي. ويتم بعد ذلك فصل

‏مائع استنبات الخلايا ‎Cell culture fluid‏ عن الخلايا بوسيلة ميكانيكية ‎Jie‏ الطرد المركزي.

‏© - تتقية ‎TPO‏ بشرى منتج بالهندسة الوراثية من موائع ‎Fluids‏ استنبات ‎~:CHO‏

‏يتم بشكل مباشر وضع مائع استنبات خلايا ثم تجميعة ‎(HCCF) Harvested cell culture fluid‏ في ‎٠‏ عمود ‎(pharmacia) Blue sepharose 6 Fast Flow‏ مشبع بس ‎Na Phosphate‏ بتركيز ‎٠,١١‏

‏مولارء أس هيدروجيني ‎NaCly oY, € Ph‏ بتركيز ‎١٠6‏ مولار بنسبة تبلغ حوالي ‎٠٠١‏ لتقرمن

‏107 لكل لتر من الراتنج ‎resin‏ وبمعدل تدفق خطي ‎linear flow rate‏ يبلغ حوالي ‎٠١‏ مسل/

‏ساعة/ سم'. وتم بعد ذلك غسل العمود بكمية تتراوح من “ إلى © من حجم العمود من مادة

‏منظمة معادلة ويلي ذلك غسله بكمية تتراوح من ©“ إلى © من حجم العمود من ‎Na Phosphate‏ © بتركيز ‎١0٠‏ مولار عند أس هيدروجيني 21 7.4 وأخيراً ‎urea‏ بتركيز ؟ مولار. ويتم بعد ذلك

‎54١ -‏ تصفية ‎Lal TPO‏ باستخدام كمية تتراوح من “ إلى © من حجم العمود من ‎Na Phosphate‏ بتركيز ‎١0٠‏ مولار؛ عند أس هيدروجيني ‎١,4 pH‏ و ‎3S urea‏ ¥ مولار ‎NaCly‏ بتركيز ‎١‏ ‏مولار. ‏ويتم بعد ذلك وضع كمية ‎Blue Sepharose‏ المحتوية على ‎TPO‏ في عمود ‎Wheat Germ Lectin‏ ‎(pharmacia) Sepharose 6MB ٠‏ مشبع في ‎Na Phosphate‏ بتركيز ‎80٠‏ مولارء عند أس هيدروجيني ‎pH‏ 4 و 8ن بتركيز ¥ مولارء ‎NaCly‏ بتركيز ‎١‏ مولار بنسبة من 8 إلى ‎١١‏ مل من 0001 ‎Blue Sepharose‏ لكل مل من الراتتج ‎resin‏ بمعدل تدفق يبلغ حوالي ‎5٠‏ مل/ ساعة/ ‎You‏ ويتم بعد ذلك غسل العمود بكمية تتراوح من * إلى ؟ من حجم العمود من مادة منظمة معادلة. وتم بعد ذلك تصفية ‎TPO‏ باستخدام كمية من ؟ إلى © من حجم العمود من فوسفات ‎٠‏ صوديوم بتركيز 00 مولار عند ‎of‏ هيدروجيني 4 .ا و 68 بتركيز ¥ مولار و ‎N-acetyl-D‏ ‎glucosamine‏ بتركيز ‎v,0‏ متر. ويتم ضبط المجموعة ‎Wheat Germ Lectin pool‏ إلى تركيز نهائي يبلغ 1004 يقر و١,16‏ ‎.(TFA) trifluroacetic acid‏ ويتم وضع المجموعة الناتجة في عمود طور عكسي ‎Jalas (Vydoc214TP1022)C4‏ في 70:1 ‎Cig 70.0 £5 TFA‏ عند تحميله ‎load‏ يتراوح ‎٠‏ _تقريباً من ‎١.7‏ إلى 10+ ملجم بروتين لكل مل من الراتنج عند معدل تدفق يبلغ ‎٠٠7‏ ‏مل/س/ سم '. وتتم تصفية البروتين تتابعياً بكميات متدرجة بشكل خطي في مرحلتين من 80010116»#يحتوي على 228-741 و7505 ‎Ci‏ تتكون المرحلة الأولى من كميات متدرجة خطية صفر إلى ‎٠‏ 2661001016 في ‎١١‏ دقيقة. وتتكون المرحلة الثانية من كميات متدرجة خطية من ‎Fr‏ إلى

‎YEA -‏ — ‎acetonitrile 11‏ في ‎٠‏ دقيقة. وتتم تصفية ‎TPO‏ تتابعياً باستخدام +70 تقريباً ‎acetonitrile‏ . ويتم تكوين المجموعة على أساس ‎SDS-PAGE‏ ‏ويثم بعد ذلك تخفيف المجموعة بع باستخدام حجم من فوسفات صوديوم بتركيز 8,61 مولار عند أس هيدروجيني 7.4 ‎NaCly‏ بتركيز 8 مولار على غشاء ‎AmiconYM‏ أو أي غشاء 0 متعدد الترشيح مشابه وله حد فصل ‎cut - Off‏ عند وزن جزيئي يتراوح من ‎٠٠٠٠١‏ إلى ‎va‏ *"دالتون . ‎alg‏ بعد ذلك مباشرة معالجة ناتج الترشيح الثنائي الذي ثم الحصول عليه أو يتم تركيزه أكثر عن طريق الترشيح المتعدد. ويتم ضبط الترشيح الثنائي ‎diafiltrate‏ التركيز إلى تركيز نهائي يبلغ 6201 ‎Tween-80‏ . ويتم بعد ذلك وضع كل أو جزء من ناتج الترشيح الثنائي / التركيز يعادل من ؟ إلى 70 من حجم ‎٠‏ العمود المحسوب في عمود ‎(pharmacia) Sephacryl 5-300 HR‏ المعادل في ‎Na Phosphate‏ بتركيز 6501 مولار عند أس هيدروجيني ‎NaCly .¢ pH‏ بتركيز ‎١216‏ مولار و 80 - ‎Tween‏ ‏بتركيز 10000 وتتم تنقيته كروماتوجرافيا عند معدل تدفق يبلغ ‎١١‏ مل/ س/سم” تقريباً. يتم تجميع الأجزاء المحتوية على ‎TPO‏ التي تكون خالية من التكتلات ومنتجات تحلل ‎Ala‏ للبروتين على أساس 505-5. ويتم ترشيح المجموعة الناتجة على مرشح ‎YY‏ ,+ ميكووء ‎Millex-Gv‏ ‎١٠‏ أو ما شابه ذلك؛ ويتم تخزينها عند درجة حرارة تتراوح من ؟ إلى ‎AA‏ ‏مثال رقم ) ‎١‏ "): تحويل وحث تخليق بروتين ‎TPO‏ في إشرشيا كولاي ‎Transformation and Induction of TPO‏ ‎Protein Synthesis in E. coli‏ : ‎-١‏ إنشاء نواقل تعبيرية 0 في إشرشيا كولاي ‎E. coli‏ :

يتم تصميم كل ‎pMP21 plasmids‏ و ‎pMP202 5 pMPS7 5 pMP4L pMP151‏ للتعبير عن الل ‎٠5‏ حمض أميني الأولى من ‎TPO‏ إلى اليمين ‎downstream‏ من دليل ‎leader‏ صغير والذي يتغير بين كل التركيبات. توفر الدالات ‎leader‏ أساساً مستوى عالي من بدايات الترجمة ‎translation initiation‏ والتنقية السريعة. ويتم تصميم ‎plasmids Pmp210-1‏ و18 و21 - و22 ~ © و24 - و25 - للتعبير عن ال ‎Yor‏ حمض أميني الأولى من ‎TPO‏ بعد بدء ‎initiation‏ ‎methionine‏ ويختلف فقط في الرامزة 0 المستخدمة لل + أحماض أمينية الأولى من ‎(TPO‏ ‏بينما يكون ‎pMP251 plasmid‏ عبارة عن مشتق من ‎pMP210-1‏ تكون فيه نياية ‎carboxy‏ ‏الطرفية ل 0 ممتدة بعدد ¥ حمض أميني. سوف تنتج ‎JS‏ تلك ‎plasmids‏ مستويات عالية من التعبير الداخل ‎intracellular‏ الخلوي ل ‎TPO‏ في إشريشيا كولاي ‎E coli‏ عند حث محفز ‎tryptophan).‏ : ‎(Yansura, 10. G. et. al Methods in Enzymology ( Goeddel, D.

V., Ed.) 185:54-60,‏ ‎Academic Press, San Diego [1990)).‏ وتمثل ‎pMP172 5 pMP1 plasmids‏ وسائط في تكوين ‎plasmids‏ التعبيرية ل ‎TPO‏ السابق ذكرها في داخل الخلايا. ‎—:pMP1 plasmids )( ٠‏ يعتبر ‎pMP1 plasmids‏ ناقل إفراز لل ‎Yoo‏ حمض أميني الأولي من ‎TPO‏ تم تكوينها بربط 6 جزيئات ‎DNA‏ مع بعضها البعض كما هو مبين في شكل رقم ‎(YT)‏ وكان أولها عبارة عن الناقل 1 تمت إزالة الجزء ‎Mlul-BamH1‏ الصغيرمنه ‎٠‏ ويعتبر 001021 مشتق من 1تتورم ‎C.

N. et.

Al, Gene 55:189196 [1987])‏ ,ع«هط©)_تم استبدال جين هرمون النمو البشري ‎human growth hormone gene ٠‏ فيه بجين ‎phoA‏ من إشرشيا كولاي ‎E.coli‏ وتم تضبيط

‎Yo. —‏ — موضع قطع 1001 هندسياً في متتالية التشفير بالنسبة للمتتالية الإشارة 8711 عند الأحماض الأمينية ١؟"- ‎XY‏ ‏ثم بشكل مسبق ربط الجزئين التاليين رم زوج قاعدة من مقطوعة ‎Hinti-Pstl‏ من ‎DNA‏ ‏الخاصة ب ‎pRKS-hmpl‏ (مثال رقم 3( التي تشفر الأحماض الأمينية في ‎TPO‏ من ‎١9‏ إلى ‎٠١“‏ ‎oo‏ و القطعة المصنعة من ‎DNA‏ التي تشفر الأحماض الأمينية ‎١8 - ١‏ : - ‎5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTA‏ ‎AACTGCTTCGTG‏ ‎ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCAITIGACG‏ ‎AAGC ACTGA-5'‏ (رقم هوية المتتالية ‎(V8:‏ ‎Y ٠‏ (رقم هوية المتتالية ‎(v ٠‏ باستخدام إنزيم ليجاز ‎ligase‏ 14-0118 وقطع ثاني باستخدام 0 وكان الرابع ‎١٠9١‏ زوج قاعدة من قطع ‎pstl-Haelll‏ من ‎PrkShmpll‏ مشفر للأحماض الأمينية ؛١٠- ‎١٠١‏ من ‎TPO‏ ‏وكان الأخير 7؛ زوج قاعدة من أجزاء قطع 5011-71 من ‎pdh108‏ يحتوي ‎lambda‏ ‎eo‏ الإنهاء الاستنساخ كما تم وصف ذلك سابقاً:- ‎(Scholtissek, 5. et al., NAR 15: 3185 [1987])‏

- ٠١ -

)2<( ال ‎Pmp21 Plasmid‏ يتم تصميم ‎pMP21 Plasmid‏ للتعبير عن ال ‎Yoo‏ حمض أميني الأولى من ‎TPO‏ بمساعدة قطعة قائدة ‎leader‏ من ‎١“‏ حمض أميني الذي يشتمل على جزء من متتالية الإشارة ‎STI‏ وتم تكوينه بربط ¥ أجزاء ‎DNA‏ مع بعضها البعض كما هو موضح في شكل رقم ‎(TE)‏ يكون الأول ‎ie oo‏ عبارة عن الناقل ‎pVEG31‏ تتم فيه إزالة الجزء ‎Xbal-Sphl‏ الصغير. ويكون الناقل

1 عبارة عن مشتق ‎pHGH207-1‏ ‎(de Boer, H.

A. et. al. in Promoter Structure and Function (Rodriguez.

R. 1. and‏ ‎Chamberlain, M.

J., Ed), 462, Praeger, New York [1982])‏ يتم فيه استبدال جين هرمون النمو البشري ‎human growth hormone gene‏ بالجين الخاص بعامل - النمو البطاني العرضي ‎vascular endothelial growth factor‏ (يمكن الحصول على جزء الناقل المماثل المذكور من ‎plasmid‏ الأخير). وكان الجزء الثاني في الربط عبارة عن ‎DNA‏ بنائي ‎synthetic‏ مزدوج له المثتالية التالية:- ‎CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA‏ .5 ‎TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-S'‏ ‎ve‏ (رقم هوية المتتالية ‎(VY:‏ ‏(رقم هوية المتتالية ‎(VY:‏ ‏كانت القطعة الأخيرة عبارة عن ‎٠ Y‏ زوج قاعدة ‎base pair‏ من أجزاء ‎Milul-Sphl‏ من ‎pMP1‏ ‏يشفر 100 حمض أميني من ‎TPO‏

‎750١7 -‏ ج) ‎Plasmid‏ 110151م:- يتم تصميم ‎plasmid‏ 0000151 للتعبير عن ال ‎Y00‏ حمض أميني الأولى من ‎TPO‏ بعد قائد :5 يحتوي على ‎١‏ أحماض أمينية لمتثالية الإشارة 9111 و ‎A‏ 85 وموضع قطع عامل ‎Xa‏ كما هو موضح في شكل رقم ) ‎«(Yo‏ وثم تركيب ‎pMP151‏ بربط ثلاثة أجزاء ‎DNA‏ مع © بعضها البعض» الأول منها عبارة عن الناقل ‎pVEG3T‏ الذي تم وصفه سابقاً والذي تم نزع جزء ‎Xbal-Sphl‏ الصغير منه والذي تم وصفه سابقاً. وكان الثاني عبارة عن ‎DNA‏ بنائي مزدوج له المتتالية التالية:- ‎٠. CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACAT‏ 5 ‎CGAAG 6106105‏ ‎TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC ٠١‏ ‎CAGCAT-5‏ ‏(رقم هوية المتتالية : ‎(vv‏ ‏(رقم هوية ‎(Ve: mall‏ وكان الأخير عبارة عن جزيئية ‎Bgll-Sphl‏ به ‎٠١74‏ زوج قاعدة من 0081011 مشفر ل ‎Voi‏ ‎١١‏ حمض أميني في ‎-TPO‏ ويكون ال ‎pMP11 plasmid‏ مطابقاً ‎identical‏ ل ‎pMP1‏ باستثناء قليل من التغيرات الكودونية 8 في متتالية إشارة 5111 (يمكن الحصول على ذلك الجزء من ‎(pMP 1‏ .

‎YoY -‏ — ‎pMP202 Plasmid (=)‏ ‎pMP202 plasmid 55:‏ مشابها جداً للناقل التعبيري 0000151 باستثناء أن موضع قطع العامل ‎Xa‏ في القائد ‎leader‏ قد تم استبداله بموضع قطع ‎thrombin‏ كما هو موضح في شكل رقم ‎oF)‏ ‏تم إنشاء ‎pMP202‏ بربط ثلاثة أجزاء ‎DNA‏ معاً. الأول ‎Leia‏ هو 01785031 الذي تم وصفه سلبقاً ‎o‏ والذي تم نزع جزيئية ‎Xbal-Sphl‏ منه. ويمثل الثاني ‎DNA‏ بنائي مزدوج له المتتالية التالية:- ‎CTAGAATTATGAAAAAGAATATCG CArrTCATCACCATCACCATCACCATCA‏ ."5 ‎CATCGAACCACGTAGCC‏ ‎TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGC‏ ‎TTGGTGCAT-5'‏ ‎٠‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(Vo‏ ‏(رقم هوية المتتالية : ‎)٠77‏ ‏وكانت القطعة الأخيرة عبارة عن جزيئية ‎Bgll-Shpl‏ به ‎٠١164‏ زوج قاعدة من ‎plasmid pMP11‏ الذي ثم وصفه سابقاً.

‏(ه) ‎—:Pmp172 plasmid‏ ‎vo‏ يكون ‎Pmpl72 plasmid‏ عبارة عن ناقل إفرازي ‎secretion vector‏ لل ‎YoY‏ حمض أميني الأولى من ‎TPO‏ ويعتبر وسيطا لإنشاء ‎pMP210‏ كما هو موضح في شكل رقم ‎(FV)‏ تم تحضير ‎pMP172‏ بربط ثلاثة أجزاء ‎clea DNA‏ الأول منها كان هوالناقل ‎pLS32lamB‏ والذي تم نزع قطاع 260621-71 منه. وكان الثاني عبارة عن جزء ‎EcoRI-Hagl‏ به 157 زوج قاعدة

‎Yo¢ —‏ — من ‎plasmid‏ 1م الذي سبق وصفه. وكانت القطعة الأخيرة عبارة عن ‎DNA‏ مزدوج له المتتالية التالية : - ‎SUTCCACCCTCTGCGTCAGGT‏ | (رقم هوية ‎(VY: Amal‏ ‎GGAGACGCAGTCCATCGA-S'‏ | (رقم هوية المنتالية : ‎(VA‏ ‏(ى) ‎Plasmid‏ 110210م:-

‏0 يتم تصميم ‎pMP210 plasmid‏ للتعبير عن ال ‎YoY‏ حمض أميني الأولى في ‎TPO‏ بعد ميثيونين بدء الترجمة ‎translational initiation methionine‏ . وتم بشكل أساسي عمل ذلك الل ‎plasmid‏ ‏كبنك ‎bank of plasmlds‏ تم وضع الست رامزات ‎codons‏ الأولى في 0 بشكل عشوائي في الموضع الثالث لكل رامزة ‎codon‏ وتم تركيبة كما هو موضح في شكل رقم ‎(VA)‏ عن طريق ربط ثلاثة جزيئيات ‎DNA‏ الأول منها هو الناقل 0115031 الذي تم وصفه سابقاً والذي تم نزع

‎٠‏ - الجزء ‎Xbal-Sphl‏ الصغير منه. وكان الثاني هو ‎DNA‏ البنائي المزدوج الموضح ‎Lid‏ يلي والمعالج ‎(Klenow) DNA polymerasel — Y‏ ويلي ذلك همضة باستخدام ‎Xbal‏ واأمنكتل وتشفير ‎methionine‏ البدء 0 والستة رامزات ‎codons‏ الأولى في ‎.TPO‏

‎GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGC‏ .5 (رقم هوية ‎١ NTGTGACCTCCGAACACTGGAGGCT‏ المتتالية : ‎(V4‏

‎ie ‏رقم‎ GTTCTCAGTAAACAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGA (A+: 45d | GGGTACAGGAAG-5

— Yoo -— وكان الثالث عبارة عن جزيئية ‎Hintl-Sphl‏ به + ‎A9‏ زوج قاعدة من ‎pMP172‏ مشفر للأحماض

TPO ‏في‎ ١٠7 -١9 ‏الأمينية من‎ وأعيد نقل بنك ‎pMP210 plasmid‏ ل 700 نسيلة ‎clones‏ تقريباً إلى أطباق ‎LB‏ بها ykdm ffh]zhj hgjv[lm ‏عالي التركيز )04 ميكروجرام/ مل) لانتقاء نسائل‎ tetracycline . translational initiation clones ٠ (Yansura, D. G. et. al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology4:151158

[1992]). من بين الثمان نسائل التي تمت في أطباق ‎tetracycline‏ ؛ تم إخضاع خمسة من المفشضل منها للتعبير عن ‎TPO‏ إلى إجراء فحص تسلسل ‎DNA‏ ويتم توضيح النتائج في شكل رقم (19) (أرقام ‎١‏ هوية المتتالية 77 و 7 ‎Cy‏ 7 و6 ‎XY‏ ولا 7 ‎Ag‏ ¥( pMP41 Plasmid ‏(ز)‎ يتم تصميم ‎pMP4 1 plasmid‏ للتعبير عن اهل ‎Yoo‏ حمض أميني الأولى في ‎TPO‏ المندمجة مع قائد ‎leader‏ يتكون من ‎١‏ أحماض أمينية من متتالية الإشارة 5111 ويلي ذلك موضع قطع عامل ‎.Xa‏ وثم إنشاء الل ‎plasmid‏ كما هو موضح في شكل رقم ) $ ( يربط ثلاث قطع من ‎DNA‏ مع 1 بعضها البعض» الأولى منها هي الناقل ‎pVEG3T‏ الذي تم وصفه سابقاً تم نزع الجزيئية ‎Xbal-‏ ‎Sphi‏ الصغيرة منه. ‏وكان الثاني عبارة عن ‎DNA‏ البنائي المزدوج التالي: -

‎5.CTAGAATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC‏ | (رقم هوية متوالية: ‎(AY‏ ‎TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-S'‏ | رقم هوية المتتالية ‎(A vl‏ كانت القطعة الأخيرة للربط عبارة عن جزيئية ‎Bgll-Sphl‏ بهما 1+ )53 > قاعدة من ‎plasmid‏ ‏1 الذي تم وصفه سابقا. (ح) ‎—:pMP57 plasmid‏ © يعبر ‎plasmid‏ 01057 عن ال ‎Yoo‏ حمض أميني الأولى في ‎TPO‏ بعد القائد المكون من أحماض أمينية لمتتالية الإشارة 5111 والموضع القاعدي المزدوج ‎.Lgs-Arg dibasic site‏ ويوفر الموضع القاعدي المزدوج المذكور وسيلة لنزع القائد بامستخدام إنزيم ‎protease‏ أعتط. وتم تركيب ذلك ال ‎plasmid‏ كما هو موضح في شكل رقم )£1( بربط ثلاث قطع ‎DNA‏ معاً. الأولى ‎Leia‏ عبارة عن الناقل 1031م الذي تم وصفه سابقاً تم نزع جزيئية ‎Xbal-Sphl‏ الصغيرة منه. أ وكان الثاني عبارة عن ‎DNA‏ البنائي المزدوج التالي. ‎CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTA‏ .5 | (رقم ‎Ls‏ ‎AACGTAGCC‏ | متوالية: ‎(AY‏ ‎TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5'‏ | رقم ‎i‏ ‏المتتالية ‎(Af:‏

‎58١ —‏ وكان الجزء الأخير من المربوط عبارة عن جزيئية ‎Ball-Sphl‏ به ‎٠١4‏ زوج قاعدة من ‎plasmid pMP11‏ الذي تم وصفه سابقاً . (ط) ‎—:plasmid pMP251‏ يعتبر ‎pMP251 plasmid‏ مشتقاً من ‎pMP210-1‏ يتضمن اثنين من الأحماض الأمينية الإضافية ‎٠‏ .من ‎TPO‏ على نهاية ‎carboxy‏ الطرفية ‎carboxy terminal end‏ . كما هو موضح في شكل رقم (7؛)؛ ثم تركيب ‎plasmid‏ بربط قطعتين من ‎(DNA‏ الأولى منها عبارة عن ‎pMP21‏ الذي تم وصفه سابقاً والذي تم نزع جزء ‎Xbal-Apal‏ منه. وكان الجزء الثاني من الربط عبارة عن جزء ‎Xbal-Apal‏ به ‎٠١‏ زوج قاعدة من 0100210-1. " - تحويل وحث إشريشيا كولاي بواسطة نواقل معلومة ‎Transformation and Induction of E.‏ ‎—:coli with TPO expression vectors TPO ٠‏ تم استخدام 805 التعبيرية ل ‎TPO‏ السابقة لتحويل ‏ سلالة شرشيا كولاي ‎E. coli‏ ‎44C6 (w3110 topaz rpoHts ion3 clpP galE) using the 06012 heat shock method‏ ‎(Mandel.

M. et al.. J.

Mol.

Biol., 53:159-162, [1970]).‏ تمت تنمية الخلايا المحولة أولا عند درجة حرارة تبلغ ‎"FY‏ أوساط 113 تحتوي على ‎Ov‏ ‎١‏ ميكرجرام/ مل ‎carbenicillin‏ حتى تصل الكثافة الضوئية ‎Tov)‏ نانومتر ‎(nm‏ للمزرعة إلى ؟ - ؟ تقريباً. وتم بعد ذلك تخفيف المزرعة ‎LB‏ إلى ‎7١‏ ضعف في أوساط ‎MO‏ تحتوي على 10,45 أحماض أمينية (وزن / ‎(ana‏ و١5‏ ميكروجرام/ مل ‎.carbenicillin‏ وبعد النمو مع التهوية عند درجة ١٠م‏ لمدة ساعة؛ تمت إضافة ‎indole-3-acrylic acid‏ إلى تركيز نهائي يبلغ ‎ov‏

— م0 — ميكروجرام/ ‎٠ Je‏ وتم بعد ذلك السماح بمواصلة نمو المزرعة عند درجة ‎a¥ ٠‏ مع التهوية لمدة ‎٠‏ ساعة أخرى وعندئذ تم حصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. مثال رقم ) ‎(Y X‏ : إنتاج ‎TPO‏ نشط بيولوجياً )1-153 ‎(Met‏ في إشريشيا كولاي ‎E.coli‏ - م يمكن استخدام الإجراءات المعطاة فيما يلي لإنتاج (1-153 ‎TPO (Met‏ نشط حيوياً أعيد طية 0 بطريقة مماثلة لمعالجة أشكال ‎TPO‏ الأخرى ‎Lay‏ في ذلك الصور الممتدة عند الطرف ‎N‏ ‎Cy‏ . (أنظر مثال رقم ‎(YY‏ ‎i‏ إستخلاص )1-153 ‎(Met‏ 0 غير قابل للذوبان ‎—:non-soluble‏ ‏تم تحضير خلايا اشريشيا كولاي ‎E. coli‏ معبرة عن )1-153 ‎TPO (Met‏ مشفر بال ‎plasmid‏ ‎Pmp210-1 ٠‏ كما تم وصف ذلك عاليه. وبشكل نمطي؛ أعيد تعليق حوالي ‎٠٠١‏ جم من الخلايا في لتر واحد ) ‎٠٠١‏ أحجام) من مادة منظمة ممزقة للخلايا ‎٠ ) cell disruption‏ ملي مولار تريس ‎Mm Tris‏ ؛ © ملي مولار ‎(EDTA‏ أس هيدروجيني ‎(A Ph‏ مع وسيلة تجانس بولي ترون وتم طرد ‎LAD‏ مركزياً عند ‎X ©٠08١‏ ع لمدة ‎“٠‏ دقيقة. وأعيد تعليق راسب ‎pellet‏ الخلية المغسولة مرة أخرى في ‎١‏ لتر مادة منظمة ممزقة ‎LOAN‏ مع وسيلة التجانس ‎Polytron homogenizer‏ ‎١‏ ويتم تمرير معلق الخلديا عبر ‎ad uy‏ تمزريق خلايا ‎LH Cell Disruption‏ ‎(Inc, LH-Inceitech)‏ أو عبر مميع صغير ‎Lik (Microfluidics International) Microfividizer‏ لتعليمات الصانع . ويثم إخضاع المعلق للطرد المركزي عند ‎g 5 0 ٠0٠٠١‏ لمدة 6 ؟ دقيقة؛ ثم أعيد تعليقه وطرده مركزياً مرة ثانية للحصول على راسب ذات هيكل هش. ويتم استخدام الراسب المغسول فوراً كما يمكن تخزينه مجمداً عند درجة - ‎a 7١‏

— 4ه - ب) ذوبانية وتنقية )1-153 ‎(Met‏ 0 مونومري ‎monomeric‏ :- تتم إعادة تعليق الكرية الناتجة عالية في © أحجام بالوزن من ‎Yo‏ ملي مولار تريس ‎«mM Tris‏ أس هيدروجيني ‎A pH‏ مع > - ‎A‏ مولار ‎YO 5 guanidine‏ ملي مولار ‎(dithiothreitol) DTT‏ ويتم تقليبه لفترة تتراوح من ‎١‏ إلى ¥ ساعات؛ أو طول ‎cll‏ عند درجة 78 لجعل بروتين ‎TPO‏ ‎٠‏ قابلاً للذوبان. وتكون ‎Lad‏ التركيزات العالية من ال ‎urea‏ مفيدة )1 - ‎A‏ مولار) ولكنها تؤدي بوجه عام إلى حصيلة إنتاج أقل مقارنة بال ‎guanidine‏ . وبعد التحويل إلى مادة قابلة ‎(Olas‏ ‏يتم إخضاع المحلول للطرد المركزي عند 00060 ‎X‏ ع لمدة ‎١‏ ؟ دقيقة لإنتاج ‎sale‏ طافية تحتوي على بروتين ‎Jaw TPO‏ 0 مونومري ‎monomeric‏ . وتتم بعد ذلك تنقية الجزء الطافي كروماتوجرافيا على عمود ترشيح من الجل من نوع 200 ‎X ١ Pharmacia) Superdex‏ +" ‎(pm ٠‏ عند معدل تدفق يبلغ ؟ مل/ ‎i‏ وتمت تصفية البروتين تتابعياً باستخدام ‎Yo‏ ملي مولار من ‎Na phosphate‏ « أس هيدروجيني ‎pH‏ باستخدام ‎٠١‏ ملي مولار من تجميع أجزاء ‎DTT‏ ‏تحتوي على بروتين ‎monomeric denaturedJie TPO‏ يخرج من عمود الفصل بين ‎٠٠١‏ ‏و60٠٠‏ مل. وتتم بعد ذلك تنقية البروتين ‎TPO‏ على عمود طور عكسي ‎Cy‏ شبه تحضيري ‎semi-‏ ‎٠١ XY) preparative Cy reversed phase column‏ سم ‎(VYDAC‏ ويتم وضع العينة عند 6 ‎Vo‏ مل/ دقيقة في عمود مشبع ب ),+7 ‎(trifluoroacetic acid) TFA‏ باستخدام ‎.acetonitrile 7 ١‏ وتتم تصفية البروتين تتابعياً باستخدام كميات متدرجة بشكل خطي ‎linear‏ ‎gradient‏ من ‎71١ -7١( acetonitrile‏ في ‎<١‏ دقيقة). وتتم تصفية البروتين المختزل ‎reduced‏ ‏المنقى تتابعياً عن ‎acetonitrile‏ + 7.0 تقريباً. ويتم استخدام تلك المادة لإعادة الطي ‎refolding‏ ‏للحصول على شكل مختلف من ‎TPO‏ الفعال بيولوجياً.

ج- إنتاج ‎TPO‏ نشط بيولوجياً )1-153 ‎—:(Met"‏ ‏يتم تحفيف ‎Yo‏ مجم تقريباً من بروتين ‎monomeric TPO‏ مبدّل ‎reduced‏ ومختزل في 560 مل )7 ‎acetonitrile 70+ / TFA‏ في ‎"٠١‏ مل من مادة إعادة طي منظمة تحتوي بشكل مثالي على الكواشف التالية:- م ‎١‏ ملي مولار تريس ‎Tris‏ ‏¥,¢ مولار ‎NaCl‏ ‏© ملي مولار ‎EDTA‏ ‏7 منظف ‎CHAPS detergent‏ ‎glycerol 7 Yo‏ ‎٠‏ © ملي مولار ‎glutathione‏ مؤكسد ‎oxidized glutathione‏ ‎١‏ ملي مولار ‎glutathione‏ مختزل ‎reduced glutathione‏ الأس الهيدروجيني ‎pH‏ مضبط عند القيمة ‎AY‏ ‏بعد الخلط؛ يتم بشكل خفيف تقليب ‎refolding (all sale) sale‏ المنظمة عند درجة ؛ أم لمدة ‎VY‏ ‎SA -‏ ساعة للحصول على نتائج إعادة طي ‎refolding‏ أعلى ما يمكن للصورة المرتبطة ‎١‏ بالكبريتيد ‎disulfide-bonded‏ السليمة من ‎TPO‏ (أنظر ما يلي). ويتم بعد ذلك تحميض ‎acidified‏ ‏المحلول باستخدام ‎TFA‏ تركيز نهائي يبلغ 7857 وترشيح الناتج خلال مرشح من 0.406 إلى 7 ميكرون نا ومن ثم ‎ali‏ إضافة ‎alg .acetonitrile aaa ٠١ / ١‏ بعد ذلك ضخ ذلك المحلول

‎717١١ -‏ - مباشرة إلى عمود طور عكسي وتتم تصفية ‎TPO elution‏ المنقى المعاد طيه )1-153 ‎(Met"‏ ‏باستخدام نفس برنامج التدرج كما سبق. وتتم تصفية ‎TPO‏ الفعال بيولوجيا المعاد طيه باأستخدام ‎acetonitrile‏ 50 تقريباً تحت هذه الظروف؛ وثتم تصفية الأشكال المختلفة المرتبطة ‎bonded‏ ب 6 غير الملائمة من ‎TPO‏ مسبقاً. ويكون ‎TPO‏ المنقى بشكل نهائي (1-153 ‎(Met!‏ بنقلوة ‎٠‏ تزيد على 790 عند تقييمه باستخدام ‎SDS gel‏ والتحليل باستخدام كروماتوجراف طور عكسي ب©. بالنسبة للدراسات الحيوانية ‎canimal studies‏ تمت ديلزة ‎dialyzed‏ المادة المنقاة ,© في مواد منظمة متوائمة ‎compatible‏ فسيولوجيا. وتم استخدام مواد منظمة ازوتونية التوتر ‎Isotonic‏ ‎٠١( buffers‏ ملي مولار أسيتات؛ أس هيدروجيني ‎pH‏ © أو ‎٠‏ ملي مولار ‎Na succinate‏ « أس هيدر وجيني ‎pH‏ 0,0 أو ‎٠‏ ملي مولار ‎phosphate‏ 118 أس هيدروجيني ‎)٠,4 pH‏ تحتوي ‎Tween -80 ‏ملي مولار 1180 و7001‎ ١5١ ‏على‎ ٠ half ‏في عينة 38/79 (يتم تنشيط عملية الحث نصسف القصوى‎ TPO ‏بسبب الفعالية العالية ل‎ dled ‏من الممكن الحصول على مادة‎ (pg/ml ‏عند حوالي ؟ بيكرجرام/مل‎ maximal stimulation detergents ‏والمواد المنظفة‎ buffer ‏بيولوجيا باستخدام ظروف مختلفة بالنسبة للمواد المنظمة‎ ‏في معظم الأحوال ؛ يتم‎ Aull ‏من ناحية‎ . redox conditions ‏والمواد المختزلة والمؤكسدة‎ ‏بالنسبة لعمليات التصنيع‎ .)0٠١ ‏الحصول على كمية صغيرة من مادة مطوية بشكل ملائم (أقل من‎ 15 ‏على الأقل» والأكثر‎ 7٠١ ‏التجارية؛ من المرغوب فيه الحصول على حصيلة إعادة طي تبلغ‎ ‏وتم تقييم العديد من‎ 70 ٠ ‏ومن المفضل أكثر من كل ما سبق أكبر من‎ 75٠ ‏تفضيلاً من © إلى‎

CHAPS 3 dodecyl-beta-maltoside ‏و‎ Triton X-100) ‏المختلفة‎ detergents ‏المواد المنظفة‎ )اهريغو١‎ — ١ Zwittergent ‏و‎ Tween - 80 ‏و‎ Tween - 20 ‏و‎ sarkosyl ‏و‎ SDS 3 CHAPSO ‏للوقوف على كفاءتها لدعم عملية إنتاج إعادة الطي العالية. من بين تلك المنظفات؛ وجد أن عائلة‎ © ‏مفيدة بشكل عام في تفاعل إعادة الطي لتحديد تكتل‎ (CHAPSO 5 CHAPS) ‏فقط‎ CHAPS

البروتين وتشكيل ‎disulfide‏ غير المرغوب فيه. وكانت مستويات ‎CHAPS‏ الأكبر من 71 أكثر فائدة. وتطلب الأمر وجود ‎Sodium chloride‏ للحصول على إنتاجية أفضل؛ بمستويات مثلى بين ‎١‏ مولار و5١‏ مولار. ويؤدي وجود ‎١( EDTA‏ - © ملي مولار) إلى تحديد كمية الأكسدة المحفزة بفلز ‎metal-catalyzed oxidation‏ ى ( التكتل ‎(aggregation‏ التي تمت ملاحظتها مع © بعض المستحضرات. وتؤدي تركيزات ‎Glycerol‏ الأكبر من ‎71١‏ إلى تحقيق ظروف ‎sale)‏ الطي المثتلى. وللحصول على إنتاجية قصوى؛ كان من الضروري وجود ‎glutathione‏ مؤكسد ومختزل ‎oxidized and reduced‏ أو ‎cysteine‏ مؤكسد ومختزل ‎oxidized and reduced‏ كزوج العوامل مختزلة مؤكسدة ‎redox reagent pair‏ وبشكل عام لوحظ وجود إنتاجية أعلى عندما تتساوى النسبة الجزيئية للكاشف المؤكسد أو تزيد عن عدد العوامل المختزلة لزوج المختزل والمؤكسد. ‎٠‏ وكانت ‎ad‏ الأس الهيدروجيني ‎pH‏ من 7,59 إلى 4 مثالية لإعادة طي تلك الأشكال المختلفة من ‎TPO‏ وتم تحمل المذيبات العضوية (على سبيل المثال ‎ethanol‏ و ‎acetonitrile‏ و ‎(methanol‏ ‏بتركيزات تبلغ ‎Sve -٠١‏ أقل. وأدت المستويات العالية من المذيبات العضوية إلى زيادة كمي الأشكال المعاد طيها بشكل غير ملائم. وكانت مركبات ‎Tris‏ و ‎phosphate‏ كمحاليل منظمة ‎buffers‏ المنظمة ‎ool‏ الهيدروجيني مفيدة ‎٠‏ بشكل عام للتحضين عند درجة ؛ "م وأيضاً تنتج مستويات أعلى من ‎TPO‏ المعاد طيه بشكل غير ملائم. تعتبر حصيلة إعادة الطي التي تتراوح من 46- 710 (بناء على كمية ‎TPO‏ المختزلة ‎A Tdi‏ 0 المستخدمة في تفاعل إعادة ‎(hl‏ حصيلة نمطية لتحضير ‎TPO‏ الذي تتم تنقيتقه خلال خطوة ,© الأولى. ويمكن الحصول على مادة فعالة في حالة المستحضرات الأقل نقاء (على ‎(Jal dpe ©‏ مباشرة بعد عمود 200 ‎Superdex‏ أو بعد إستخلاص الأجسام المنكسرة الأولية

‎refractile body extraction‏ ) برغم أن الحصيلة تكون أقل نتيجة للترسيب على نطاق واسع وتداخل البروتينات بخلاف ‎TPO‏ أثناء عملية ‎ale)‏ طي ‎‘TPO‏ ‎Cua‏ أن ‎(Met? 1-153 ( TPO‏ يحتوي على ؛ وحدات بنائية ‎cysteine‏ ¢ يكون من الممكن توليد ثلاثة أشكال مختلفة من ‎disulfide‏ لهذا البروتين. م ا نسخة رقم ‎:)١(‏ مركبات ‎disulfides‏ بين وحدات بنائية ‎cysteine‏ )= 4 و - ‎FV‏ ‏نسخة رقم (): مركبات ‎disulfides‏ بين وحدات بنائية ‎١ - cysteine‏ و5-7. نسخة رقم (7): مركبات ‎disulfides‏ بين وحدات بنائية ‎cysteine‏ - 7و7 -. أثناء الفحص الأول لتحديد حالات إعادة الطي؛ وحدت منفصلات ‎peaks‏ ومختلفة تحتوي على البروتين ‎TPO‏ عند التنقية الكروماتوجرافية بطور عكسي ‎revers phase‏ بن. أحتوت منفصلة ‎٠‏ واحدة فقط من تلك المنفصلات نشاطاً بيولوجياً ذات واضحاً عند دراسته باستخدام اختبار ‎BaF;‏ ‏وبالتالي؛ تم جعل ظروف إعادة الطي تتناسب مع تلك التي تعطي مثل تلك النسخة. وفي ظل تلك الظروف؛ تكون النسخ ذات الطي الخاطئ أقل من ‎-٠١‏ 70 من الناتج الكلي ل من الناتج الكلي ل ‎monomer TPO‏ - و ‎disulfide‏ في ال ‎TPO‏ نشط بيولوجياً هو — 8 و - ¥ بمقياس الطيف الكتلي ‎mass‏ ‎spectrometry ٠‏ وتسلسل البروتين ‎protein sequencing‏ (أي ‎.)١ das‏ وتم فضم أجزاء من مفضلات عمود - ,© المختلفة ( ‎٠١ - ٠‏ نانومول) باستخدام ‎trypsin‏ (نسبة جزيئية ‎YO :١‏ بين ‎trypsin‏ و بروتين) . وتم تحليل خليط الهضم باستخدام مقياس الطيف الكتلي بمساعدة نسيج شعاع ليزر ‎mixture was analyzed by matrixassisted laser desorption mass spectrometry‏ قبل وبعد الاختزال باستخدام ‎DTT‏ وبعد الاختزال؛ تم كشف الكتل المناظرة لمعظم الببتيدات التربسينية

‎1١4 -‏ - الكبيرة ‎tryptic peptides of TPO‏ وفي العينات غير المختزلة؛ غابت بعض تلك الكتل ولوح-ظ وجود البعض الآخر. وكانت الكتلة الخاصة بالقمم الجديدة المناظرة بشكل أساسي لمجموع ال ‎tryptic peptides‏ الفردية متضمنة في زوج ‎disulfide‏ وبالتالي كان من الممكن تحديد مكان ‎JS disulfide‏ جلي ل ‎TPO‏ الفعال بيولوجياً والمصنع بالهندسة الوراثية والمعاد طيه ليكون ‎١‏ ‏4-0-0 و - ؟. ويعد ذلك متسقاً مع نموذج ‎disulfide‏ المعروف لل ‎erythropoietin‏ ذو الصلة.

‏د النشاط البيولوجي ل ‎TPO‏ معاد طيه المنتج بالهندسة الوراثية )1-153 ‎—:(Met‏ ‏يكون ل ‎TPO‏ المعاد طيه والمنقى )1-153 ‎(Met‏ نشاطاً في كل من اختبارات المعمل ‎in vitro‏ والكائن الحي ‎in vivo‏ في اختبار 80/15 تم تحقيق نصف أقصى قيمة حث لتضمين ‎thymidine‏ ‎(J incorporation‏ خلايا و1/و80 عند ‎Su YF‏ جرام ‎pg‏ / مل (, ‎٠‏ بيكومولار). في ‎ELISA‏

‎٠‏ المبنية على مستقبل ‎ampl‏ يحدث نصف النشاط الأقصى عند ‎٠,9‏ نانوجرام/ مل ‎VY)‏ بيكو مولار) : وفي الحيوانات الطبيعية والتي تعاني من كبث نخاعي ‎myelosuppressed‏ ناتج عن أشعة ‎wal X‏ تقريباً ‎cnear-lethal X-radiation‏ كان ‎(Met! 1-153( TPO‏ أكثر فعالية (لوحظطت الفعالية عند جرعات منخفضة حتى ‎Yo‏ نانوجرام/ فأر) لحث إنتاج صفائح دموية جديدة. مثال رقم )¥ "):

‎-: 15. ‏نشطة بيولوجياً في إشريشيا كولاي ناه»‎ TPO ‏إنتاج أشكال مختلفة أخرى من‎ ١ ‏منقاة‎ 8. coli ‏ويتم فيما يلي توفير ثلاثة أشكال نشطة بيولوجياً تم إنتاجها في إشريشيا كولاي‎ ‏ومعاد طيها في صورة نشطة بيولوجيا.‎ ‏من متتالية الإشارة المشتقة من بكتيريا 5171 في المجال‎ MLF-13 ‏دمج وحدات بنائية‎ متي)١(‎

‏المنتهى ب ‎N-terminal‏ من ‎TPO‏ (الوحدات البنائية ‎(Yoo - ١‏

وتتمثل المتتالية الناتجة في:- حيث تم وضع خط تحت متثالية القائد ‎leader‏ وتمثل ‎C...C‏ من ‎Cys”‏ إلى ‎Cys!‏ وتم تركيب ذلك الشكل المختلف لتوفير ‎tyrosine‏ لإدخال يود مسسع ‎radio-iodination‏ إلى ‎TPO‏ بالنسبة م للمستقبل والدراسات البيولوجية. )¥( يتم دمج الوحدات البنائية ‎HSMLF-7‏ من المتثتالية ‎STII‏ و ‎A‏ وحدات بنائية ‎histidine‏ ؛ ويتم دمج المتتالية 1561 موقع القطع الإنزيمي بالعامل ‎Xa‏ مع حيز الطرف ‎N‏ (الوحدات البنائية ‎(Yeo -١(‏ ل ‎TPO‏ وتتمثل المتتالية في :- حيث تم وضع خط تحت متتالية القائد وتمثل ‎CnC‏ من ‎Cys‏ إلى ‎Cys"‏ ويمكن معالجة ذلك الشكل المختلف؛ عند تنقيته وإعادة طيه باستخدام عامل إنزيمي ‎Xa‏ والذي سوف يقطعه بعد الوحدة البنائية ‎arginine‏ للمتالية 1261 مما ينتج عنه ‎TPO‏ بشكل مختلف من ‎Yoo‏ وحدة بنائية في الطول مع حمض أميني ‎serine‏ طبيعي بالطرف ‎N-terminal‏ + (©) يتم تحضير ‎T-H8MLF‏ كما تم وصف ذلك عاليه للشكل المختلف ‎oY)‏ ماعدا دمج ‎Allie‏ ‎٠‏ 1508 الحساسة للثرومبين ‎thrombin sensitive‏ مع الحيز الطرفي ‎N‏ في ‎.TPO‏ وتتمثل المتتالية الناتجة في:

حيث تم وضع خط تحت متتالية القائد وتمثل ‎C...C‏ من ‎Cys’‏ إلى ‎Cys"!‏ ويمكن معالجة ذلك الشكل المختلف بعد التنقية وإعادة الطي بثرومبين إنزيمي ‎enzyme thrombin‏ لتوليد شكل مختلف من ‎TPO‏ له نهاية ‎N‏ طبيعي طوله ‎١٠5‏ وحدة بنائية. ‎(I‏ معالجة وإذابة وتنقية أشكال ‎TPO‏ مختلفة نشطة ‎١ ) monomeric La gl su‏ ( و ‎(Y‏ و():- ف ثم التعبير وراثياً عن كل الأشكال المختلفة في إشريشيا كولاي ‎E.coli‏ . وجدت معظم الأشكال المختلفة في أجسام ثابتة ‎refractile bodies‏ ؛ كما تمت ملاحظة ذلك في مثال ‎(YY)‏ بالنسبة ل ‎TPO‏ )1-153 ©146). وتم إجراء خطوات مماثلة للمعالجة والذوبانية والتنقية بالنسبة للأشكال المختلفة من ‎monomeric TPO‏ كما تم وصف ذلك في مثال رقم ‎(YY)‏ تم استخدام ظروف إعادة طي مماثلة لتلك التي تم استخدامها مع ‎(Met! 1-153) TPO‏ مع حصيلة ‎AS‏ تتراوح من ‎Tr‏ إلى ‎٠‏ 20 وبعد ‎sale)‏ الطي تمت تنقية الأشكال المختلفة من ‎TPO‏ باستخدام كروماتوجراف طور عكسي ,0 في 70,1 ‎TFA‏ باستخدام كميات متدرجة من ‎acetonitrile‏ كما تم وصف ذلك سابقاً : وكان لكل الأشكال المختلفة من ‎TPO‏ (في صورها غير ‎(unproteolyzed‏ نشاطاً بيولوجياً كما تم ‏تقييمه باختبار 138/7 بنصف نشاطات قصوى تبلغ ‎١‏ - 0 بيكومولار . (ب) معالجة البروتيني التحللي للأشك ال المختلفة (") ,)1( لتوليد ‎TPO‏ (1-155) بطرف - ‎N‏ ‎-: ‏حقيقي‎ terminal ٠ ‏قائد قابل للقطع إنزيميا قل‎ peptide ‏باستخدام‎ TPO ‏تم تصميم الأشكال المختلفة (7) و(©) من‎

Ally ‏بعد إعادة الطي‎ TPO ‏الخاص ب‎ N ‏الوحدة البنائية للحمض الأميني عند الطرف‎ ‏للأشكال المختلفة (7) و(©) كما تم وصف ذلك سابقاً؛ تم إخضاع كل منها للهضم باستخدام إنزيم‎ ‏من خطوة الطور العكسي ,© بتمرير تيار‎ acetonitrile ‏بالنسبة لكل شكل ؛ تمت إزالة ال‎ ake

‎7١١ -‏ - هادئ من ‎nitrogen‏ في المحلول. وبعد ذلك تمت معالجة الشكلين المختلفين بأي من العامل ‎Xa‏ أو ال ‎thrombin‏ كما يتم وصف ذلك لاحقاً. بالنسبة للشكل المختلف (7) ل ‎«TPO‏ تمت إضافة مادة منظمة تريس ‎Tns buffer‏ بتركيز ‎١‏ ‏مولارء؛ أس هيدروجيني ‎A pH‏ ؛ إلى محلول خالي من ‎acetonitrile‏ إلى تركيز نهائي ‎ov ily‏ ‎٠‏ ملي مولار وتم ضبط الأس الهيدروجيني11م عند القيمة ‎A‏ إذا كان ذلك ضرورياً؛ وتمت إضافة ‎NaCl‏ و ‎CaCl,‏ إلى ‎١١‏ مولار وأ ملي مولار على الترتيب. تمت إضافة العامل ‎Xa‏ ‎(New England Biolabs)‏ للحصول على نسبة جزيئية حوالي ‎:١‏ 5 إلى ‎٠٠١ :١‏ بين الإنزيم والشكل المراد من ‎TPO‏ ‏وتمت تحضين العينة عند درجة حرارة الغرفة لمدة ‎١‏ - 7 ساعة لتحقيق أقصى تقطيع ‎cleavage‏ ‎٠‏ كما تم تقييم ذلك من خلال تغير الفصل ب جلات ‎SDS‏ مبينة فقدان ‎AE‏ القائد. وبعد ذلك؛ تمت تنقية مخلوط التفاعل باستخدام كروماتوجراف طور عكسي ,© باستخدام نفس الكميات المتدرجبة والظروف التي تم وصفها في السابق بالنسبة لتنقية أشكال مختلفة مطوية ملائمة. وتم فصل الشكل المختلف غير المنشطر 8 عن الشكل المختلف المنشطر (7) تحت هذه الظطروف. واتضح أن الأحماض الأمينية عند الطرف 17 عبارة عن ‎«SPAPP‏ مما يدل على أن إزالة متتالية القائد عند ‎vo‏ الطرف ‎N‏ كانت ناجحة. ويولد العامل ‎Xa‏ أيضاً كميات متنوعة من متتالية الداخلي داخل حيز ‎TPO‏ وتمت ملاحظة التقطيع بعد الوحدة البنائية ‎arginine‏ عند الموضع رقم ‎(VIA)‏ مما يولد متتالية إضافية عند طرف ‎N‏ عبارة عن ‎TTAHKDP‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(AA‏ على لات غير مختزلة؛ تمت ملاحظة نطاق فردي ‎single band‏ عند ‎١١7٠٠١‏ دالتون تقريباً بالنسبة للشكل المنشطر للعامل ‎Xa‏ وعلى جلات مختزلة تمت ملاحظة رابطتين بوزن جزيئي تقريباً من ‎١7١١ >‏ إلى ‎٠٠١‏ دالتون» متسقة مع القطع عند ‎.١١١ arginine‏ وتؤكد تلك الملاحظة أيضاً أن

الجزئين الخاصين بالجزئ تم تثبيتهما معاً بواسطة رابطة ‎disulfide‏ بين الوحدات البنائية ‎cysteine‏ ‏الأولى والرابعة؛ كما تم استتتاج ذلك من تجارب هضم التربسين ‎tryptic digestion‏ التي تم وصفها سابقاً. في اختبار ‎BaF‏ البيولوجي؛ كان للشكل المختلف المتقى من 700( 100-1( بعد إزالة متتالية القائد عند الطرف 17 وبالتقطيع الداخلي؛ نصف النشاط الأقصى بقيمة تتراوح من ‎٠‏ 7 إلى ‎١7‏ بيكو مولار. وكان للشكل المختلف السليم بمتتالية القائد نصف أقصى نشاط يتراوح من ‎NY‏ ¢ بيكومولار ‎.picomolar‏ ‏بالنسبة للشكل المختلف ()؛ تكونت المادة المنظمة المستخدمة للهضم من ‎٠٠‏ ميكرومولار تريس؛ أس هيدروجيني ‎A pH‏ و77 ‎CHAPS‏ و7١‏ مولار ‎NaCl‏ , 5# ملي مولار ‎SEDTA‏ ‎thrombin‏ بشري أو بقري ‎(Calbiochem)‏ عند نسبة من ‎:١‏ 78 إلى ‎or :١‏ بالوزن بين الإنزيم ‎٠‏ وبروتين الشكل المختلف من ‎TPO‏ وتم تنفيذ عملية الهضم عند درجة حرارة الغرفة لمدة ؟ - ‎١‏ ساعات. وتم تقييم فعالية الهضم بواسطة جلات ‎SDS‏ كما تم وصف ذلك سابقاً لتفاعل القططع ‎Xa Jalal)‏ وبشكل عام؛ تم تحقيق أكثر من 7550 من التقطيع بالنسبة لمتتالية القائد في ذلك الوقت. تمت تنقية ‎TPO‏ الناتج على أعمدة الطور العكسي ‎Cy‏ كما تم وصف ذلك ‎Alle‏ وتبين أنه يحتوي ‎ve‏ على الطرف ‎N‏ المطلوب بدراسة تسلسل الأحماض الأمينية. تم الحصول فقط على كميات صغيرة جداً (أقل من 5/) من التقطيع الداخلي عند نفس ‎arginine-threonine day) y‏ كما تمت ملاحظة ذلك ‎lle‏ مع معامل ‎Xa‏ وكان لبروتين ‎TPO‏ الناتج نشاط بيولوجي عالي بنصف الإستجابات القصوى في اختبار ‎Ba/F‏ عند بروتين بتركيز 07 - 54 بيكومولار. في ‎ELISA‏ مبنية على المستقبل ‎mpl receptor‏ كان لهذا البروتين إستجابة نصف قصوى عند ‎١‏ - ‎Ye‏ ؟؛ نانوجرام/ مل بروتين منقى ‎-١7١(‏ 740 بيكومولار) بينما كان الشكل المختلف السليم المحتوي على ‎Allie‏ القائد هو البروتين الأقل في كل من الاختبارين بقيمة تتراوح من 0 إلى ‎٠١‏

‎1١95 -‏ - أضعاف مقارنة بالدراسات الحيوانية؛ وتمت ديلزة البروتين المقطع المنتقى بكروماتوجراف ‎HPLC‏ في مواد منظمة مقبولة فسيولوجياً باستخدام ‎NaCl‏ بتركيز ‎١٠١‏ ملي مولار وتوين 80 بتركيز 70.01 و ‎acetate‏ 00لانةه80 بتركيز ‎٠١‏ ملي مولار ‎٠‏ أس هيدرو جيني ‎pH‏ 0,0 أو ‎sodium phosphate‏ بتركيز ‎٠١‏ ملي مولار + أس هيدرو جيني ‎sodium phosphate § ©,0 pH‏ م بتركيز ‎٠١‏ ملي مولار؛ أس هيدروجيني11م 7,4. كان البروتين المنقى بواسطة ‎HPLC‏ وجلات ‎SDS‏ ثابتاً لعدة أسابيع أثناء تخزينه عند ؛"م؛ في فئران طبيعية وأخرى تعاني من كبت نخاعي ‎myelosuppressed mice‏ كان ‎TPO‏ المنقى المذكور بمتتالية ذات طرف ‎N‏ طبيعية متمازاً بالنشاط العالي؛ ويحث على إنتاج الصفائح الدموية عند جرعات قليلة تصل إلى ‎Fe‏ نانوجرام/ ‎Js‏ ‎٠‏ مثال رقم ‎(Ye)‏ ‏ربيطة ‎mpl‏ بنائية ‎Synthetic mpl Ligand‏ :- برغم أن ربيطة ‎mpl‏ البشري ‎(WML)‏ يتم في العادة تصنيعة باستخدام طرق الهندسة الوراثية فإنه يمكن ‎Lind‏ بناءه عن طريق الربط الإنزيمي ‎enzymatic ligation‏ لأجزاء ال ‎peptide‏ البنائية باستخدام طرق سيتم وصفها لاحقاً. يسمح الإنتاج البنائي ‎٠‏ ل ‎Hml‏ بتضمين الأحماض الأمينية المبّدلةٍ ‎unnatural amino acids‏ أو الوظائف التخليقية ‎synthetic functionalities‏ مثل ‎.polyethylene glycol‏ وسابقاً ‎+٠‏ تمت هندسة طاثر ‎mutant‏ ‎subtilisin BPN‏ إنزيم ‎(S22IC/P225A) subtiligase a2 3 « serine protease‏ حتى يتم ربط ‎peptide esters‏ بكفاءة في وسط مائي )1 1991[ 4151-4159 :30 ‎.(Abrahmsen et al., Biochem,‏ وقد تبين الآن أن ‎peptides‏ البنائية يمكن أن ترتبط إنزيمياً بطريقة متتالية ‎peptides Ly‏ طويلة فعالة إنزيمياً وبروتينات مثل إنزيم ‎(Jackson et al., Science ]1994[( ribonuclease A‏ . وتمكن تلك التقنية التي سيتم وصفها لاحقاً بمزيد من التفصيل من البناء الكيمسيائي لبروتينات طويلة كان في في السابق يمكن تصنيعها باستخدام تقنية ‎DNA‏ والهندسة الوراثية فقط. ويتم توضيح استراتيجية عامة لتخليق 1111.153 باستخدام إنزيم ‎subtiligase‏ (إمخطط ‎.)١‏

بد ‎peptide le‏ غير محمي 01 لكلية مناظر لجزئية الطرف ‎C-terminal‏ للبروتين» تضاف إليه ‎ester peptide‏ منشط الطرف ‎C-terminal activated‏ ومحمي عند الطرف = 17 إلى جانب إنزيم ‎subtiligase‏ . عند إكتمال التفاعل؛ يتم عزل المنتج باستخدام ‎HPLC‏ بطور ‎Se‏ ‏ويتم نزع المجموعة الحامية من الطرف ‎oN -terminal‏ ويتم ربط جزء ال ‎Jl peptide‏ ونزع 0 حمايته ويتم تكرار العملية باستخدام ‎peptides‏ متتالية حتى يتم الحصول على بروتين بالطول الكامل. وتكون العملية مشابهة لطريقة الطور الصلب ‎solid phase methodology‏ في أن ال ‎peptide‏ المنشط عند الطرف ‎C-terminal‏ والمحمي عند الطرف ‎N-terminal‏ يتم ربطه بالأطراف ‎N-terminal protected‏ من ال ‎peptide‏ السابق ويتم تخليق البروتين في اتجاه ازحن. من ناحية ثائية؛ فإنه نتيجة لأن كل إقران ‎coupling‏ يؤدي إلى إضافة تصل إلى ‎٠‏ © وحدة بنائية ‎0٠‏ ويتم عزل المنتجات بعد كل ‎day‏ فإنه يمكن بناء بروتينات أطول وذات درجة نقاء عالية بحصيلة معقولة. مخطط رقم ‎:)١(‏ طريقة بناء ‎hML‏ باستخدام إنزيم ‎subtiligase‏ ‏و00- 51-0601108 + ‎R-NH-Peptide,-CO-R'‏ ‎Subtiligase‏ )1 ‎R-NH-Peptide,-CO-NH-Peptide,-CO,‏ ‎Zn/CHZCO,H‏ )2 } ‎H.N-Peptide,-CO-NH-Peptide4-CO,‏ ‎3jrepeat 1 +2‏ ‎H N-Peptide;-CO-NH-Peptide,-CO-NH-Peptide,-CO,‏ 0 0 ‎NH‏ = — ‎I~ oY wh NH;‏ 8 ب 0 ‎CY‏ - 5 ‎N.# © (CH‏ ‎NH,‏

- ١لا‏ - بناء على معرفتنا بمكان تخصصية القطع بانزيم ‎subtiligase‏ للمتالية وبالإضافة بمعرفتنا بمتتالية الأحماض الأمينية ‎epo pad‏ النشط بيولوجيا ل 101 تم تقسيم 1101153 إلى سبعة ‎Stas‏ ‏بطول ‎Yo -١8‏ حمض أميني . تم بناء ‎peptides‏ رباعية لتحديد أماكن وصلات ربط ملائمة للأجزاء ‎Yo -١8‏ يبين الجدول ‎(VY)‏ نتائج تلك الروابط الاختبارية ‎test ligations‏ 0 جدول رقم ‎(VF)‏ ‏اختبار 3 5 ‎Test Ligationsdad‏ .01 تمت إذابة ببتيدات مانئحة ومحبة للنواة ‎Donor and‏ ‎nucleophile peptides‏ بتركيز ‎٠١‏ ملي مولار في ‎tricine‏ بتركيز ‎٠٠١‏ ملي مولار (أس هيدروجيني ‎(V,A pH‏ عند درجة ‎YY‏ 2 . تمت إضافة إنزيم ليجاز إلى تركيز نهائي يبلغ ‎٠١‏ ‎٠‏ ميكرومولار من خام تغذية بتركيز ‎٠,6‏ مجم/ مل (حوالي ‎Vo‏ ميكرومولار) واستمرت عملية الربط طول الليل. وتعتمد الحصيلة على النسبة المئوية للربط مقابل التحلل المائي لل ‎peptides‏ ‏المائنحة. ‏التحلل ‏الربط ‏المو 9 ‎glc-K-) Donor guild‏ محب للنواة المائي ضع 116 : _ ‎Ligation‏ ‎Hydroly NH; — Nucleophile (NH,‏ % ‎Yosis‏ ‎+A ay SRLS HVLH (Y £/vY) ١‏ (رقم هوية المتثالية : ‎(Ad‏ (رقم هوية المتتالية ‎“og‏ 4( ‎HSRL SHVL (YF /1Y)‏ 2 5 (رقم هوية المتتالية : )3( (رقم هوية المتتالية : ‎(AY‏ ‎VA YY SLGE AVDF (£V [£1) ¥‏ (رقم هوية المتتالية ‎(AY:‏ | (رقم هوية المتتالية ‎(V6:‏ ‎or LLEG AVIL (Ve 9) ¥‏ 7 (رقم هوية المتتالية :0 4( (رقم هوية المتتالية 1 2( ‎LGQL LSSL (3+ JA) ¢‏ م (رقم هوية المتتالية ‎(AY:‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(3A‏

‎YVY -‏ — ‎EE‏ ‏(رقم هوية المتتالية : 34) ‎١‏ (رقم هوية المتتالية : ‎(Vor‏ ‏ما اوت (رقم هوية المتتالية : ‎)٠١١‏ | (رقم هوية المتتالية ‎(Vo:‏ ‏(رقم هوية ‎١ )٠١7 : AJ‏ (رقم هوية ‎(Vers Amal‏ (رقم هوية المتتالية ‎١ (Vf:‏ (رقم هوية المتتالية ‎(Yeo:‏ ‏(رقم هوية المتتالية ‎(Ve:‏ | (رقم هوية المتتالية ‎(Voy:‏ ‏(رقم هوية المتتالية ‎(V0 A:‏ | (رقم هوية المتتالية : ‎)٠٠١6‏ ‏بناء على تلك التجارب؛ يجب أن ترتبط ببتيدات الربط الموضحة في جدول رقم ‎(VE)‏ عن طريق إنزيم سيبتلي جاز. وكانت هناك حاجة لمجموعة حامية مناسبة لأطراف 17 لكل ببتيد إستر مانح وذلك لمنع الربط الذاتي. يتم اختيار مجموعة حامية أيزونيكوتيثيل ‎isonicotinyl protecting‏ ‎—:(iNOC) group‏ ‎(Veber et al., J.

Org.

Chem., 42: 3286-3289 [1977]) °‏ لأنها قابلة للذوبان في الماء؛ يمكن تضمينها في الخطوة الأخيرة في بناء ببتيد بالطور الصلب ‎solid phase peptide synthesis‏ وتكون ثابتة تجاه ‎HF‏ اللدمائي ‎anhydrous‏ المستخدم لنزع الحماية وقطع الببتيدات من الراتنج ‎resin‏ في الطور الصلب. بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن نزعها من الببتيد بعد كل ربط في ظل ظروف اختزال معتدلة (20/011:00(217) لتوفير أطراف ‎N‏ ‎٠‏ حرة للربط التالي. تم استخدام ‎glycolate-lysyl-amide (gic-K-NH2) ester‏ لتنشيط الطرف ‎C‏ ‏بناء على التجارب السابقة التي أوضحت أسيلة ذلك بشكل فعال ‎efficiently acylated‏ باستخدام إنزيم سيبتلي جاز ([1991] ,4151-4159 :30 ‎.(Abrahmsen et al, Biochen,‏ ويمكن تخليق

‎peptides‏ المنشطة بأميد ‎activated‏ 81-1-2106 والمحمية ب ع110 باستخدام طرق طور صلب قياسية ‎standard solid phase methods‏ كما تم إيجاز ذلك في (مخطط ؟). ويتم ربط ال ‎peptides‏ بشكل متتالي حتى إنتاج البروتين الكامل وتتم إعادة طي المنتج النهائي في المعمل. بناء على التناظر مع ‎EPO‏ ؛ يعتقد أن أزواج ‎disulfide‏ تتشكل بين الوحدات البنائية من ال ‎(V) cysteine ٠‏ 5 )101( وبين ‎(YA)‏ و ‎-(0A)‏ ويمكن إجراء عملية أكسدة مركبات ‎disulfide‏ عن طريق تقليب ‎sald)‏ المختزلة بشكل بسيط تحت أكسجين الوسط الخارجي ‎oxygen atmosphere‏ لعدة ساعات. ويمكن بعد ذلك تنقية المادة المعاد طيها باستخدام ‎HPLC‏ والأجزاء التي تحتوي على بروتين فعال تجمع وتجفف بالتجميد. وكبديل يمكن حماية مركبات ‎disulfide‏ بشكل تفاضلي للتحكم في الأكسدة المتتالية بين أزواج ‎disulfide‏ محددة. وسوف تضمن حماية ‎cysteines‏ )¥( ‎(Yor) vs‏ باستخدام مجموعات ‎acetamidomethyl (acm)‏ أكسدة ‎(YA)‏ و(8/*). ويمكن بعد ذلك إزالة مجموعات ‎acm‏ وأكسدة الوحدات البنائية ‎(V0) 5 (V)‏ وعلى العكس من ذلك؛ يمكن حماية الوحدات البنائية ‎(0A) 5 (YA)‏ ب ‎acetamidomethyl (acm)‏ وأكسدتها في حالة الحاجة إلى الأكسدة المتتالية للطي الصحيح. وبشكل اختياري؛ يمكن استبدال ‎(YA) cysteines‏ و(4*) بوحدة بنائية أخرى طبيعية أو غير طبيعية بخلاف ‎Cys‏ لضمان أكسدة ملائمة لل ‎(V) cysteines‏

‏ا و(١١١).‏

‎١6 —‏ - جدول رقم ‎(V€)‏ ‏أجزاء ببتيد تستخدم للتخليق الكلي ل .1-141 باستخدام إنزيم سيبتلي جاز. جزء ‎Fragments‏ متتالية: ‎١‏ ( رقم هوية المتتالية : ‎)٠٠١١‏ ‎iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH, (1-22)‏ ¥ ( رقم هوية المتتالية : ‎)٠١١‏ ‎iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH, (23-46)‏ ‎Y‏ ( رقم هوية المتتالية : ‎)٠١١‏ ‎iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH, (47-69)‏ ¢ ) رقم هوية المتتالية : ‎)٠١١‏ ‎iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-gle-K-NH, (70-90)‏ © ( رقم هوية المتتالية : ‎)٠١١‏ ‎iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-gle-K-NH; (90-106)‏ ( رقم هوية المتتالية : ‎)٠٠١١‏ ‎iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH, (107-128)‏ ‎١‏ ( رقم هوية المتتالية : ‎(VY‏ ‎HoN-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO, (129-153‏ يتم تنفيذ ربط ‎peptides‏ عند درجة ‎tricine dp YO‏ بتركيز ‎٠٠١‏ ملي مولارء أس هيدروجيني ‎A pH‏ (محضر حديثاً ومنزوع الغاز ‎degassed‏ بالترشيح الفراغي خلال مرشح ‎#٠‏ ‏ميكرومولار). وبشكل نمطي تتم إذابة جزء الطرف © في ‎sale‏ منظمة ‎peptide)‏ بتركيز ¥ = © م ملي مولار) وتتم إضافة محلول خام تغذية ‎10x stock solution‏ من إنزيم ‎١( subtiligase‏ مجم/ مل في ‎٠٠١‏ ملي مولار ‎tricine‏ ؛ أس هيدروجيني ‎(A pH‏ للوصول إلى تركيز إنزيم نهائي يلغ © ميكرومولار. وتتم بعد ذلك إضافة كمية زائدة بتركيز ‎٠‏ - © مولار من ال ‎peptide‏ المانح المنشط ‎gle-K-NH,‏ كمادة صلبة مذابة ويسمح ببقاء المخلوط عند درجة 7#”م. وتتم مراقبة

‎YVo -‏ — تكوين الروابط عن طريق تحليل ‎HPLC‏ بعمود ‎Cig‏ بطور عكسي (كميات متدرجة من 0/007 مع ).+7 ‎(TFA‏ تتم تتقية منتجبات الربط عن طريق ‎HPLC‏ تحضيري ‎preparative‏ وتجفيفها بالتجميد ‎lyophilized‏ تم إجراء نزع حماية ‎(INOC)Isonicotinyl‏ بخلط 48 مسحوق زنك منشط ‎activated zinc dust‏ ب ‎HCI‏ مع ال 6م المحمي في ‎acetic‏ ‎.acid ©‏ تتم إزالة مسحوق ‎zine‏ بالترشيح ويتم تبخير ‎acetic acid‏ في وسط منوغ ‎.under vacuum‏ ويمكن استخدام ال ‎Sl) peptide‏ مباشرة في الربط التالي ويتم تكرار العملية. ويمكن ربط 1 بإجراءات مشابهة لتلك التي تم وصفها سابقاً بالنسبة لدوه:, 14 بنائي أو الهندسة الوراثية لإنتاج .10 كامل الطور بنائي أو شبه بنائي. ويكون ل 1101 البنائي كثير من المميزات مقارنة بناتج الهندسة الوراثية. يمكن إدخال سلاسل ‎٠‏ جانبية غير طبيعية لكي يتم تحسين الفعالية ‎potency‏ أو الخصوصية ‎specificity‏ . ويمكن تضمين وظائف بوليمرية ‎Polymer functionalities‏ مقل ‎polyethylene glycol‏ لتحسين فترة التأثير ‎duration‏ . على سبيل المثّال» ‎(Say‏ توصيل ‎polyethylene glycol‏ بالوحدات البنائية ‎lysine‏ ‏للجزئيات 58 الفردية (جدول رقم ؟٠)‏ قبل أو بعد إجراء خطوة ربط واحدة أو أكتر. ويمكن إزالة روابط ‎peptides‏ حساسة لإنزيم ‎Protease‏ أو تغيرها لتحسين الثبات في الكائن الحي ‎nvivo Vo‏ بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن تخليق مشتقات الذرات الثقيلة للمساعدة في تحديد الهيكل البنائي ‎.structure determination‏

‏بناء جزيئيات بالطور الصلب لربط القطع‎ : ( Y ) ‏مخطط رقم‎ -: Solid Phase Synthesis of Peptide Fragments for Segment Ligation

Ce LS 1

NE) a wy (i) a

R 0 R i 1 2 0 9 ‏بسر‎ ‏ل , ¢ اا ا ا‎ (automated synthesis)

R 0 R = 3 0 ©0 ‏سر‎ ‎: . ide. NH NH 1 e, f (cleavage) oe ‏تفاط‎ Hoy PE) c) 0 R 0 R 4 0 0 0

CY oA wy (Peptide) ~y NH A oy N he NH, 8! 5 0 ‏يليثك) 0 8خ‎ ْ NH, ‏لتثشبيا لبا‎

Isonicotiny! (iINOC) glycolate-lysyl-amide (gle-K-NH,) +,1Y) (MBHA) Lysyl-paramethylbenzhydrylamine (1) ‏يتم تحريك الراتنج‎ (0 ‏مكافئ) و‎ °) bromoacetic acid ‏باستخدام‎ (Advanced Chem Tech ‏/جم؛‎ 0 ° ‏مكافئ) لمدة ساعة عند درجة 7#م في‎ ©) diisopropyl carbodiimide .)١( bromoacetyl derivative ‏للحصول على مشتق‎ (DMA) dimethylacetamide ‏وتتم أسترة أحماض أمينية محمية بوك‎ DMA ‏(ب) يتم غسل الراتنج بشكل شامل باستخدام‎ sodium bicarbonate ‏بالتقليب مع‎ (Bachem « 3 eq ‏فردية )¥ مكافئ‎ Boc-protected ‏أم للحصول‎ #٠١ ‏ساعة عند درجة‎ Y¢ ‏لمدة‎ (DMF) dimethylformamide ‏مكافئ) في‎ 1) ٠١ ‏المناظر (7). ويتم غسل الراتتج المدخل‎ glycolate-phenylalanyl-amide-resin ‏على‎ ‎dichloromethane 5 ‏مسرات)‎ ¥) DMF ‏باستخدام‎ (Y) amino acetylated ‏عليه‎

‎YVYV -‏ -— ‎(CHLCL)‏ )¥ مرات) ويمكن تخزين الناتج عند درجة حرارة الغرفة لعدة شهور ‎٠‏ ويمكن بعد ذلك تعبئة الراتتج ‎(V)‏ في جهاز بناء ببتيدات ذاتي ‎automated peptide synthesizer‏ ‎(Applied Biosystems 430A)‏ ويتم تطويل الببتيدات ‎peptides elongated‏ باستخدام إجراءات طور صلب قياسي ‎standard solid phase‏ (*). © (ج) يتم نزع مجموعة 17-0-302 باستخدام محلول من حمض ‎trifluoroacetic acid‏ 40 في ‎.CH,(Cl,‏ ‏د يتم تنشيط الأحماض الأمينية بعد الحماية بال ‎benzotriazol-1 N-a-Boc‏ ‎-yl-oxy-tris-(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate‏ ‎Bop)‏ ¢ مكافئ) و ‎٠١ (NMM) N-methylmorpholine‏ مكافئ) في ‎DMA‏ ويتم ‎١‏ إقرائها ‎١ sad‏ - 7 ساعة. (ه) تتم إزالة ‎N-a-Boc Ae gana‏ النهائي ‎TFA)‏ /:011:01) للحصول على (؛) ويتم إدخال المجموعة الحامية ‎(INOC) isonicotinyl‏ كما تم وصف ذلك سابقاً (؟؛) عن طريق ‎Il‏ مع ‎4-isonicotinyl-2-4-dinitrophenyl carbonate‏ ( مكانئ) 5 ‎NMM‏ )1 مكافئ) في ‎DMA‏ عند درجة 75م لمدة 4 7 ساعة. ‎Vo‏ (و يعطي قطع ونزع حماية ‎deprotection‏ ال ‎atu peptide‏ عن طريق المعالجة ب ‎HF‏ ‏لا مائي ( 8 ‎(ethylmethyl sufide 70 [anisole‏ عند درجة صفرأم لمدة ساعة؛ يعطي ‎peptide‏ منشط ‎activated‏ ب ‎glycolate-lys-amide‏ ومحمي ب ‎INOC‏ )©( الذي تتم تنقيته بواسطة ‎HPLC‏ بعمود 018 ذى طور عكسي (كميات متدرجة من ‎CH3CN‏

‎YVA -‏ - ‎Alig .(TFA 7١,١ (HO‏ التحقق من هوية كل المواد بقياس الطيف الكتلي ‎mass‏ ‎-spectometry‏ ‏تمكين إضاف ‎SUPPLEMENTAL ENABLEMENT‏ يكون الاختراع الحالي قادراً على القيام بالهدف كما جاء في عناصر الحماية وطبقاً للوصسف الكامل السابق والمراجع المتاحة بشكل مبسط وكذلك مواد البدء ‎.starting matenals‏ برغم ذلك؛ قام مقدمو الاختراع بإيداع سلالة الخلية ‎cell line‏ المدرجة فيما يلي؛ مع مجموعة الاستتبات من النوع ‎١‏ لأمريكي ‎—:Rockville, Md., USA (ATCC) » American Type Culture Collection‏ ‎o‏ إشرشياكولاي ‎ATCC » Escherichia coli‏ ,1.1.8رسط-011103-0351؛ مجموعة رقم ‎(CRL 69575‏ المودعة في ‎YE‏ فبراير ‎(halal)‏ 1344 ‎ATCC ١ Plasmid ٠ ٠١‏ ,ل051715.10.11.11.01 مجموعة رقم 75958 ‎«CRL‏ المودعة في ‎Y‏ ديسمبر (كانون الأول)؛ 144¢ 6و ه خلايا ‎ML 1/50MCB «CHO DP-12‏ (مرقمة برقم 1594(¢ ‎(ATCC‏ مجموعة رقم ‎CRL‏ ‎deasall (11770‏ في + ديسمبر (كانون الأول)» ‎N98‏ ‏ويتم عمل ذلك الإيداع طبقاً لقوانين معاهدة ‎Budapest Treaty‏ بخصوص الإقرار الدولي ‎International Treaty ٠‏ بإيداع كائنات حية دقيقة ‎Deposit of Microorganisms‏ لأغراض إجراءات براءات الاختراع والأحكام المندرجة تحت هذه القوانين (معاهدة ‎(Budapest Treaty‏ ويضمن ذلك صيانة مزرعة حية ‎viable‏ لمدة ‎7١‏ سنة من تاريخ الإيداع. ويتم توفير الكائنات الحية بواسطة ‎ATCC‏ بموجب شروط معاهدة ‎Budapest Treaty‏ ويضمن موضوع الإتفاق بين ‎da‏ ‏الطلب 5 ‎ATCC‏ إتاحية غير مقيدة عند إصدار برارءة الاختراع الأمريكية ذات الصلة. لا تأول

- ١795 -

إتاحية السلالة المودعة كإجازة لممارسة الاختراع كإخلال بالحقوق المضمونة في ظل سلطة أي

حكومة طبقاً لقوانين براءات الاختراع الخاصة بها.

بينما تم وصف الاختراع بشكل ضروري بالنسبة لنماذج مفضلة وأمثلة تشغيل خاصة؛ فسوف

يصبح أي من الأشخاص ذوى الخبرة العادية وبعد الإطلاع على الوصف الكامل السابق؛ قادرا م على إحداث تغيرات مختلفة وكذلك استبدالات مكافئة وبدائل في موضوع البحث المذكور هنا في

هذه الوثيقة. وعليه؛ ‎(Say‏ ممارسة الاختراع بطرق مختلفة عن تلك التي تم وصفها بشكل محدد

هنا في هذه الوثيقة.

ويتم بشكل واضح تضمين كل المراجع التي ذكرت في هذه الوثيقة بالإشارة إليها.

Claims (1)

1. لم78

   عناصر_الحماية ‎١ ١‏ - ربيطة بولي ببتيديه ‎mpl ligand polypeptide‏ يتم الحصول ‎Ade‏ بعملية ‎Jari‏ ‎Y‏ على:- 3 0( اختبار مجموعة مجينية بشرية ‎screening a human genomic library‏ ع باستخدام ‎oligonucleotide‏ مبنى على المتتالية المجينية ‎based on the genomic‏ ‎sequence °‏ الموضحة في شكل رقم )8( لهذا الغرض لعزل ‎DNA‏ مجيني ‎genomic 1‏ يحتوي على متتالية ‎sequence‏ تشفير ‎exon‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ موضح في شكل رقم )3( لهذا الغرض مع ‎exons‏ المتبقية للجين ‎gene‏ +5 ‎A‏ (ب ) إدخال ‎inserting‏ ال ‎DNA‏ في ناقل مقروء ‎expression‏ و ‎q‏ (ج) إدخال الناقل ‎transfecting vector‏ لخلية حيوان شيي ‎mammalion cells‏ ‎Ye‏ والتعبير ‎expressing‏ عن الجين ‎gene‏ ¢ و ‎١١‏ )3( استخلاص ‎polypeptide recovering‏ لربيطة ‎ligand‏ 1(« من وسط ‎\Y‏ إستنبات الخلية ‎.cell culture medium‏ ‎polypeptide — ¥ ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ يتم الحصول عليه بعملية تشتمل على:- ‎genmic DNA Je { Y‏ من مجموعة مجينية ‎ganomic libray‏ وتهجينة ‎hybridises‏ ‏3 تحت ظروف منخفضة الشدة ‎low stringency‏ بمتتالية ال ‎DNA‏ التالية:- ‎GCCGTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTATTTAGGAGTCG 3' t‏ 5 ° والذي يحتوي على ‎exons‏ المخفرة ‎encoding‏ ل ‎polypeptide‏ ربيطة ‎«mpl ligand 1‏ 7 ب) إدخال ‎inserting‏ ال ‎DNA‏ في ناقل مقروء ‎expression vector‏ ¢ و ‎A‏ ج إدخال الناقل ‎transfecting vector‏ لخلية حيوان ثديي ‎mammalion cells‏

   - YAY -

   1 والتعبير ‎expressing‏ عن الجين ‎gene‏ ؛ و

   ‎Yo‏ د) استخلاص ‎polypeptide recovering‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ من وسط إستنبات ‎١١‏ الخلية ‎cell culture medium‏ .

   ‎polypeptide - ¥ ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ يتم الحصول عليه بعملية تشتمل على:-

   ‎Y‏ )( تحديد ‏ 060085 مصدر خلوي مناسب ل ‎RNA‏ خاص بمركب ترابطي ‎mpl v‏ بشري ‎human‏ وتحضير مجموعة ‎cDNA libraries‏ واحدة أو أكثر ¢ من ‎RNA‏ المذكورء و

   ‏8 )9( اختبار — تهجيني ‎hybridisation - screening‏ للمجموعة أو المجموعات 1 باستخدام ‎oligonucleotide‏ مبنى ‎based‏ على متتالية ‎sequence‏ التشفير 7 الموضحة في شكل رقم )4( بهذا الخصوص لتحديد ‎identify‏ وعزل ‎A‏ 6 نسيلة ‎clone‏ تحتوي على متتالية تشفير ‎day) coding sequence‏ ‎«mpl ligand 1‏ و

   ‎vector encoding ‏المشفر في ناقل تعبيري‎ DNA inserting ‏(ج) إدخال‎ ٠١ ‏في خلايا حيوان تثديي‎ expression ‏مناسب للتعبير‎ 0 ١١ ‏و‎ «mammalion cells 7

   ‏ا" (د) إدخال الناقل ‎transfecting vector‏ لخلية حيوان ثديي ‎mammalion cells‏ ¢\ والتعبير ‎expressing‏ عن الجين ‎gene‏ ؛ و

   ‎Yo‏ (ه) استخلاص ‎polypeptide recovering‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ من وسط ‎VY‏ إستنبات الخلية ‎.cell culture medium‏

   ‎١‏ ؛ - ‎polypeptide‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ كما تم الحصول عليه بعملية تشتمل على:-

   ‎mRNA ‏من‎ cDNA library or libraries ‏أو مجموعات‎ de gana ‏تحضير‎ (0 ¥

   ‎YAY -‏ — 3 مستخلص ‎eextracted‏ خلايا كلية بشرية ‎«human kiden cells‏ و (ب) إجراء اختبار - تهجيني ‎hybridisation - screening‏ المجموعة أو 8 المجموعات ‎library or libraries‏ باستخدام ‎oligonucleotide‏ مبنى على 1 متتالية التشفير ‎coding sequence‏ الموضحة في شكل رقم (1) باذا ل الخصوص لتحديد ‎identify‏ وعزل ‎isolate‏ نسيلة ‎clone‏ تحتوي على ‎A‏ متتالية تشفير ‎coding sequence‏ ربيطة ‎«mpl ligand‏ و 9 )©( إدخال ‎DNA transfecting‏ المشفر ‎coding‏ في ناقل تعبيري ‎vector‏ ‎Vo‏ 0 _مناسب للتعبير في ‎WIS‏ حيوان ثديي ‎mammalion cells‏ « و ‎١‏ (د نقل الإصابة لخلية حيوان ثديي ‎mammalion cells‏ بالناقل والتعبير عن لل الجين ‎expressing‏ عن الجين ‎gene‏ ¢ و ‎YY‏ (ه) ‎polypeptide recovering‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ من وسط إستنبات الخلية ‎-cell culture medium \¢‏ ‎١‏ - مركب ترابطي ‎mpl‏ معزول ومتجانس بشكل أساسي ‎substantially‏ ‎homogeneous isolated Y‏ يتميز بما يلي:- و 0 تستحث الربيطة ‎ligand‏ تضمين ‎nucleotides « incorporation‏ موشومة ‎(3H thymidine)labelled ¢‏ في ال ‎DNA‏ في خلايا 3/1 المعتمدة ‎dependent o‏ على ‎IL-3‏ والتي إدخل ‎transfected‏ فيها ‎mpl P‏ بشري ‎human‏ « 1 (ب) تستحث الربيطة ‎ligand‏ تضمين ‎4S incorporation‏ الصفائح الدموية ‎platelets 7‏ في الدم ‎circulating‏ في اختبار الاستجابة العكسية للصفائح ‎platelet‏ ‎rebound assay A‏ ؛ ‎(z) 9‏ تكون ربيطة ‎ligand‏ ثابتة عند أس هيدروجيني ‎SDS 7,5 pH‏ عند تركيز ‎Ye‏ 9660.1 و بتركيز ¥ مولار 21/100168

   — YAY - «glycoprotein ‏عبارة عن‎ ligand ‏تكون الربيطة‎ 8 ١١ polypeptide ‏لل‎ amino terminal saquence ‏تكون المتتالية الأمينية الطرفية‎ (0) \Y ‎VY‏ عبارة عن:- ‏ف" ‎SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR‏ او

   ‎. SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL Yo ‎polypeptide - 1 ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ بشري ‎human‏ معزول ‎isolated‏ يشتمل على ‎Y‏ متتالية الأحماض الأمينية ‎amino acid saquence‏ ويكون فعالاً من الناحية البيولوجيةٍ

   ل ‎.biologically active‏ ‎apkastic Lait ‏يتم الحصول عليه بالتتقية من بلازما لا‎ mpl ligand ‏ربيطة‎ - ١ ١ hydrophobic interaction ‏للماء‎ 4a ‏بكروماتوجرافياً ذات ألفة‎ plasma Y immobilised dye oa ‏وكروماتوجرافياً ذات الصبغ‎ « chromatography ¥ ‏وتكون‎ « mpl - affinity chromatography ‏وكروماتوجرافياً بألفة‎ chromatography ¢ «apparent molecular weight ‏المذكورة لها وزن جزيئي ظاهري‎ mpl ligand ‏ربيطة‎ 0 «reducing conditions ‏ظروف اختزال‎ Jb ‏في‎ SDS-PAGE ‏كما ثم الكشف بتحليل‎ 1 ‏كيلودالتون‎ ٠٠ ‏أو‎ kD ‏كيلودالتون‎ YA ‏أو‎ KD ‏كيلودالتون‎ YY TVA ‏في الحدود من‎ v kD A ‎polypeptide - A \‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ معزول مشفر بحمض نووي ‎encoded by a‏ ‎nucleic acid‏ له متتالية 6 تتهجن ‎hybridizes‏ في ظل ظروف معتدلة ‎3a all‏ ‎moderately 1‏ مع حمض نووي ‎uncleic acid‏ له مثتالية من ‎١١9 nucleotide‏ إلى 14% ؟ ‎JSAP‏ رقم )1( (رقم هوية المتتالية ‎sequence‏ : ؛ أو رقم هوية المتتالية

   ‎YAS —‏ -— ‎sequence 0‏ : *). ‎١‏ 4 - ربيطة ‎mpl ligand‏ معزول ‎Wh isolated‏ لأي من عناصر الحماية السابقة ‎preceding claims Y‏ يكون فعالاً من الناحية البيولوجية ‎-biologically active‏ ‎mpl ligand day polypeptide — ٠ ١‏ لها ما لا يقل عن ‎967٠0‏ نسبة مشبعة ‎shares‏ ‎identity Y‏ من هوية المثتالية ‎sequence‏ مع ال ‎polypeptide‏ طبقاً لأي من عناصر ‎v‏ الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى ‎(A)‏ ‎polypeptide - ١ ١‏ تربيطة ‎mpl ligand‏ يكون عبارة عن ‎allele‏ أو شكل مختلف ‎variant Y‏ لل ‎polypeptide‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى ‎(A)‏ أو و جزء من لربيطة ‎mpl ligand‏ المذكورة أو ‎allele‏ أو شكل مختلف ‎variant‏ ¢ يشترك ¢ في خاصية بيولوجية واحدة على الأقل مع ربيطة ‎-mpl ligand‏ ‎mpl ligand day - ١ ١‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم ) ‎AL Cua ( ١١‏ تعديل موضع ‎Y‏ محتمل أو أكثر للقطع بإنزيم ‎protease cleavage site‏ وذلك لجعله مقاوماً للقطع ‎-resistant to cleavage 1‏ ‎lish mpl ligand day - ١ ١‏ لعنصر الحماية رقم ) ‎١‏ ( ‘ حيث يكون موضع الإنشطار المحتمل المذكور عند موضع الحمض الأميني ‎١٠4-١١٠‏ و/أو ‎“Yo‏ ‏© 746 للمركب الترابطي ‎mpl‏ كما تم وصف ذلك في شكل رقم )16(

   —_ قم — ‎١‏ 4 - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(VF)‏ حيث يتم تعطيل ‎Y‏ 10 موقع القطع ‎cleavage site‏ عند الموضع ‎Jai YL ١٠4 YoY‏

   ‎.substitution 1‏ ‎١٠١ ١‏ - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم (4١)؛‏ حيث يتم استبدال ‎Y‏ الوحدات البنائية ‎Arg-Arg residues‏ عند ؟١-‏ ؛ ‎١٠‏ بوحدات بنائية ‎residues‏ علم. ‎١١٠‏ - شكل مختلف لربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم (١١)؛‏ يشتمل على ‎Y‏ الدمج 3 مع ‎polypeptide‏ غير متجانس ‎heterogeneous‏ . ‎١7 ١‏ - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم )1( أو عنصر الحماية رقم ‎(V1)‏ يشتمل على الدمج ‎fusion‏ مع وحدة بنائية ‎residues‏ لحمض أميني واحد أو ‎v‏ أكثر عند أطراف الأمينو و/أو الكربوكسيل ‎.amino - and/or carboxy terminus‏ ‎YA ١‏ - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقا لعنصر الحماية رقم ‎(VV)‏ يكون به ‎methionine‏ ‎Y‏ عند الطرف ‎N‏ ‎polypeptide — 3 ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم ‎)١( Y‏ إلى رقم (+) ومن ‎(A)‏ إلى ‎(VA)‏ حيث يتم استخلاص ربيطة ‎mpl ligand‏ من 1 سلالات بشرية ‎.human species‏ ‎polypeptide - ٠ ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ طبقا لأي من عناصر الحماية من رقم 0 (7) إلى رقم 0 ومن (7) إلى ‎٠» (YA)‏ حيث يتم استخلاص ربيطة ‎mpl ligand‏ من

   3 سلالات غير بشرية ‎.non -human species‏ ‎polypeptide - "١ ١‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية السابقة والذي 7 لم تدخل عليه مجموعة ‎.unglycosylated‏ ‎YY ١‏ - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية السابقة ‎Jas yall‏ ب ‎polymer‏ ‏غير بروتيني ‎-non - proteinaceous‏ ‎١‏ ©؟ - ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(YY)‏ حيث يكون البوليمر ‎Y‏ المذكور عبارة عن ‎polyethylene glycol‏ أو ‎polypropylene‏ أو ‎.polyoxyalkylene‏ ‎١‏ ؛ - جزيئ حمض نووي معزول ‎isolated nucleic acid molecule‏ يشتر ‎encoding‏ ‎polypeptide ¥‏ طبقا لأي من عناصر الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى رقم ‎(YY)‏ ‎YO ١‏ - جزيئ حمض نووي معزول ‎An isolated nucleic acid molecule‏ يتم اختياره ‎Y‏ من :- 7 0 نسيلة ‎cDNA clone‏ كما ثم الحصول عليها من ‎(ii) 3 hill‏ في عنصر ¢ الحماية رقم (©) أو الخطوة ‎(ii)‏ في عنصر الحماية رقم (؛)؛ و 0 (ب) متتالية ‎DNA sequence‏ قادر على التهجين ‎hybridizing‏ تحت ظروف قاسية ‎stringent conditions 1‏ إلى نسيلة ‎clone‏ من البند )7( و ‎(z) Y‏ شكل جيني مختلف لأي من متتاليات ‎sequences‏ الحمض النووي ‎DNA‏ 00( ‎A‏ و(ب) والذي يشفر ‎encodes a polypeptide‏ له خاصية بيولوجية مثل ‎polypeptide q‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ طبيعي.

   ‎YAY -‏ — ‎١‏ 1 - حمض نووي معرول ‎isolated nucleic acid‏ له متتالية ‎sequence‏ تتهجن ‎hybridizing‏ في ظل ظروف معتدلة الشدة ‎moderately stringent‏ إلى حمض نووي ل ‎nucleic acid‏ له متتالية ‎sequence‏ من ‎nucleotide‏ 1956-1194 كما في شكل رقم ¢ (5) (رقم هوية المتتالية ‎sequence‏ : 6 أو رقم هوية المتتالية ‎sequence‏ 01( ويشفر ‎encodes °‏ ربيطة ‎.mpl ligand‏ ‎VV ١‏ - حمض ‎S35‏ معزول ‎Gb isolated nucleic acid‏ لعنصر الحماية رقم ‎)١(‏ ‎Y‏ يتهجن ‎hybridizing‏ إلى ‎١١8 nucleotide‏ ثم إلى ‎١97 nucleotide‏ كما في فشكل ل رقم (5) (رقم هوية المتتالية ‎sequence‏ : ¢ أو رقم هوية المتتالية ‎sequence‏ : 0( ٌ ويشفر ‎encodes‏ ربيطة ‎mpl ligand‏ أو جزء ‎fragment‏ منه والذي يشارك في خاصية © بيولوجية واحدة على ‎BY‏ مع ربيطة ‎mpl ligand‏ ‎genomic DNA - YA ١‏ أو ‎cDNA‏ يعادل على الأقل لجزء من جين ‎gene‏ ربيطة ‎mpl ligand Y‏ والذي يتهجن ‎hybridizing‏ في ‎|b‏ ظروف عالية الشدة ‎highly stringent‏ 3 باستخدام ‎ror‏ حمض نووي طبيعي ‎nalural nucleic acid molecule‏ له متتالية ‎sequence ¢‏ يشفر ‎encoding‏ ربيطة ‎«mpl ligand‏ حيث يكون ربيطة ‎mpl ligand‏ كما ‎٠‏ § تحديده في أي من عناصر الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى ‎(MN)‏ ‎١‏ 4 — حمض $95( ‎Gb nucleic acid‏ لأي من عناصر الحماية من رقم ‎L(Y)‏ ‎(YA) Y‏ يرتبط بشكل فعال ‎operably linked‏ .معزز ‎.promoter‏

   ‎YAA —‏ - ‎٠ ١‏ - ناقل تعبيري ‎vector encoding‏ يشتمل على الحمض النووي ‎nucleic acid‏ ‎Y‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم ‎(YE)‏ إلى (79) يرتبط بشكل فعال مع متتاليات 3 تحكم مقبولة ‎control seauences recognised‏ الخلية الحاضنة ‎host cell‏ . ‎©١ ١‏ - خلية حاضنة محولة ‎host cell transformed‏ بالحمض النووي طبقاً لأي من ‎Y‏ عناصر الحماية من رقم ) ‎Y¢‏ ( إلى رقم ) ‎٠‏ *( لتكون قادرة على التعبير عن الحمض 7 النووي ‎mucleic acid‏ المذكور لإنتاج ‎polypeptide‏ لربيطة ‎.mpl ligand‏ ‎١‏ © - عملية تشتمل على التعبير عن حمض نووي مهندس ‎recombinant Ld,‏ ‎nucleic acid Y‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم ‎(YE)‏ رقم ‎(Ve)‏ خلية 1 حاضنة ‎host cell‏ مناسبة لإنتاج ‎polypeptide‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ . ‎١‏ *© - عملية طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(PY)‏ حيث يتم استخلاص ‎polypeptide‏ ‎Y‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ من الخلية الحاضنة ‎host cell‏ أو وسط استنبات الخلية الحاضنة ‎host cell culture medium 7‏ . ‎١‏ 0 ؛© - عملية طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(FY)‏ أو عنصر الحماية رقم ‎(FF)‏ تكون فيها 7 الخلية الحاضنة ‎host cell‏ عبارة عن سلالة ‎cell line‏ خلية ‎.CHO‏ ‎Yo ١‏ - عملية تشتمل على التعبير في خلية جين ‎expression in cell gene‏ لربيطة 40 1 طبيعي 100860005 تحت سيطرة عنصر معزز ‎[promoter‏ مُحسّن ‎enhancer 1‏ أو عنصر كابت ‎suppressor‏ أو عنصر تطبيع إستتساخ خارجيا ‎exogenous‏ ‎“transcription modulatory element ¢‏ والذي يتم إدخاله في جينوم الخلية ‎cell genome‏

   هه في مكان قريب وفي اتجاه ملائم للتأثير على استتساخ ‎DNA‏ الذي يشفر ‎encoding‏ ‎polypeptide 1‏ لربيطة ‎.mpl ligand‏ ‎١‏ “© - تركيبة تشتمل على ربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم ‎)١( Y‏ إلى ‎(YF)‏ أو وفقاً لما تم الحصول عليه بعملية طبقاً لأي من عناصر الحماية من ؟ رقم ‎(FY)‏ إلى ‎(YE)‏ ومادة حاملة مقبولة صيدلانياً ‎pharmaceutically acceptable‏ ‎carrier ¢‏ . ‎FV ١‏ - عملية تشتمل على استخدام ‎polypeptide‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ طبقاً لأي من ‎ "‏ عناصر الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى رقم )17( أو تم الحصول عليه بالعملية طبقاً لأي من 3 عناصر الحماية من رقم ‎(VE) (VY)‏ في تحضير ‎preparation of jlie‏ ‎٠ medicament ¢‏ ‎FA)‏ - تركيبة طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(M1)‏ يمكن الحصول عليها بالعملية طبقاً " - لعنصر الحماية رقم ‎(VV)‏ والتي تشتمل بالإضافة إلى ما سبق على كمية فعالة ‎Ladle‏ ‏و ‎effective‏ بللمعنان©116:20 من عامل ‎agent‏ يتم اختياره من ‎cytokines‏ وعوامل حث ¢ مستعمرة ‎colony stimulating factors‏ و ‎-interleukin‏ ‎FA‏ - تركيبة طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎o FA)‏ حيث يتم اختيار العامل ‎agent‏ من ‎LIF‏ ‎IL-25 IL-1 5 Epos M-CSF 5s GM-CSF y G-CSF5 "‏ و3س11ا ‎IL-55‏ و6سلآ ‎IL-75‏ ‎JL-115 IL-9 5 IL-8 5 Y‏

   — Yq. _ nucleic acid test sample ‏عينة اختبار حمض نووي‎ amlifying ‏طريقة لتزويد‎ - 6 ١ nucleic acid ‏تفاعل إنزيم بوليمراز لحمض نووي‎ priming ‏تشتمل على تنشيط‎ Y ‏مناظر على الأقل لجزء من‎ nucleic acid ‏باستخدام حمض نووي‎ polymerase ‏و‎ ‎(YA) ‏طبقاً لعنصر الحماية رقم‎ cDNA ‏أو‎ genomic ¢ ‎١‏ ١؛‏ - طريقة لتحديد وجود ‎polypeptide‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ تشتمل على تهجين ‎hybridizing‏ حمض نووي ‎nucleic acid‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎(YA)‏ إلى حمض ¥ نووي لعينة اختبار وتحديد وجود حمض نووي ‎nucleic acid‏ ل ‎polypeptide‏ لربيطة ‎-mpl ligand ¢‏ ‎١‏ "؛ — عملية تشتمل على استخدام ‎polypeptide‏ لربيطة ‎Lik mpl ligand‏ لأي من عناصر الحماية من رقم ‎)١(‏ إلى (7) أو يتم الحصول عليه بالعملية ‎lik‏ لأي من 7 عناصر الحماية من رقم ‎(YY)‏ إلى ‎(VE)‏ في تحضير جسم مضاد نوعي ‎specific‏ ‏¢ لربيطة ‎ligand mpl‏ ‎١‏ ؛ - عملية طبقاً لعنصر الحماية رقم ) ‎aly dua ¢ ( ey‏ تحضير جسم مضاد وحيد ‎-monoclonal antibody ‏النسيلة‎ Y ‎١‏ £4 - جسم مضاد ‎antibody‏ يتم الحصول عليه بالعملية طبقاً لعنصر الحماية رقم

   ‎.)47( ‏(7؛) أو عنصر الحماية رقم‎ Y ‎ligand ‏لربيطة‎ polypeptide binding ‏قادر على ربط‎ antibody ‏جسم مضاد‎ - £0 ١

   ‎.)17( ‏إلى رقم‎ )١( ‏ام« طبقاً لأي من عناصر الحماية من رقم‎ ٠"

   ‎Yay -‏ - ‎١‏ ؟؟ - جسم مضاد ‎antibody‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم )£0( والتي يكون عبارة عن ‎Y‏ جسم مضاد وحيد النسيلة ‎-monoclonal antibody‏ ‎tv ١‏ - سلالة خلايا مهجنة ‎hybridoma cell line‏ تنتج الجسم المضاد ‎antibody‏ طبقاً " - لعنصر الحماية رقم )££( أو عنصر الحماية رقم )81( ‎¢A ١‏ - ربيطة ‎mpl ligand‏ كما ثم وصفه في هذه الوثيقة بشكل أساسي . ‎١‏ 4 - جزيئ حمض نووي ‎isolated nucleic acid moleculed s ze‏ يشتر ‎encoding‏ ‏6 لربيطة ‎mpl ligand‏ أو من جين ‎gene‏ ربيطة ‎mpl ligand‏ كما تم وصف و ذلك في هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎٠ ١‏ - طريقة لتحديد وجود ‎polypeptide‏ لربيطة ‎mpl ligand‏ كما تم وصف ذلك في ‎Y‏ هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎١‏ ١ه‏ - ناقل تعبيري 766107 6001651017 يشتمل على حمض نووي طبقا لعنصسر " - الحماية رقم ) 4)؛ كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎duals 443 - oY ١‏ محولة ‎host cell transformed‏ بحمض نووي ‎nucleic acid‏ يشفر ‎polypeptide encoding Y‏ لربيطة ‎ligand‏ 01ت كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة بشكل ‎oy‏ أساسي.

   ‎yay —‏ - ‎oF ١‏ - عملية تشتمل على التعبير ‎expresion‏ عن حمض نووي ‎nucleic acid‏ مهندس ‎Y‏ وراثياً ‎recombinant‏ في خلية حاضنة ‎host cell‏ مناسبة لإنتاج ‎polypeptide‏ لربيطة ‎empl ligand ٍ‏ كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎of ١‏ - طريقة تزويد ‎amlifying‏ « باستخدام التفاعل التسلسلي لإنزيم بوليمراز ‎polymerase chain reaction 1‏ ¢ لعينة اختبار حمض نووي ‎nucleic acid‏ يظن أنها 1 تحتوي على حمض نووي ‎nucleic acid‏ يشفر ‎encoding‏ ربيطة ‎mpl ligand‏ 0 من 3 جين ‎gene‏ ربيطة ‎«mpl ligand‏ كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة بشكل أساسي . ‎١‏ 00 - تركيبة صيدلانية ‎pharmaceutical‏ تشتمل على ‎polypeptide‏ لربيطة ‎ligand‏ ‎«mpl Y‏ كما ثم ‎ag‏ ذلك في هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎١‏ 0% - جسم مضاد ‎spevific entibody‏ محدد لربيطة ‎empl ligand‏ كما تم وصف ذلك ‎٠‏ في هذه الوثيقة بشكل أساسي. ‎polypeptide - ov ١‏ يشتمل على متتالية الأحماض الأمينية ‎amino acid saquence‏ التالية: - ‎SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR v‏ او ‎SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRIL £‏ + ‎DNA - oA ١‏ معزول ‎Wh polypeptide encoding ily isolated‏ لعنصر الحماية ‎٠‏ رقم ‎(OV)‏