SK282265B6 - Polypeptid mpl ligandu, jeho zodpovedajúca nukleová kyselina, expresný vektor a hostiteľská bunka, ktorá ho obsahuje, spôsob prípravy polypeptidu a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Je opísaný polypeptid mpl ligandu pripravený spôsobom, ktorý zahŕňa: (i) skríning humánnej genómovej knižnice s oligonukleotidom založeným na genómovej sekvencii znázornenej na obrázku 9 na izolovanie genómovej DNA, ktorá zahŕňa exón mpl ligandu kódujúci sekvenciu znázornenú na obrázku 9, spolu so zostávajúcimi exónmi génu, (ii) inzerciu DNA do expresného vektora, (iii) transfekciu cicavčej bunky génovým expresným vektorom a (iv) izoláciu polypeptidu mpl ligandu z bunkového kultivačného média, ako aj nukleová kyselina, expresný vektor a hostiteľská bunka a spôsob prípravy polypeptidu a jeho použitia.ŕ

Description

Vynález sa týka izolácie, čistenia, rekombinantnej alebo chemickej syntézy proteínov, ktoré ovplyvňujú prežitie, rýchle rozmnožovanie, delenie alebo dozrievanie krvotvorných buniek, najmä progenitómych buniek krvných doštičiek. Obzvlášť sa tento vynález týka klonovania a expresie nukleových kyselín, zakódovaním proteínového ligandu, ktorý je schopný viazať sa na a aktivovať mpl, člena zo superrodiny cytokínínových receptorov. Ďalej sa vynález týka použitia týchto proteínov samotných alebo v kombinácii s ďalšími cytokinínmi na liečenie imunitných ochorení alebo porúch krvotvorby, vrátane trombocytopénie.

Doterajší stav techniky

I. Krvotvomý systém

Krvotvomý systém produkuje zrelé, vysoko špecializované krvné bunky, ktoré sú potrebné na prežitie všetkých cicavcov. Medzi tieto zrelé bunky patria erytrocyty, špecializované na prenos kyslíka a oxidu uhličitého, T- a B-lymfocyty, zodpovedajúce za prenos bunkových a protilátkových reakcií imunologického systému, krvné doštičky alebo trombocyty, ktoré sú špecializované na tvorbu krvných zrazenín, granulocyty a makrofágy, ktoré sú špecializované ako odstraňovače a ako vedľajšie bunky na boj s infekciou. Granulocyty sa ďalej rozdeľujú na neutrofily, eozinofily, bazofily a tukové bunky, špecializované bunky s individuálnymi funkciami. Je pozoruhodné, že všetky tieto špecializované zrelé krvné bunky sú odvodené z jednoduchého bežného nediferencovaného typu bunky, ktorý sa označuje ako pluripotentný (alebo totipotentný) bunkový kmeň, pôvodne sa nachádzajúci v kostnej dreni (Dexter a kol.,riwi. Rev. CellBiol., 3:423-441 [1987]).

Zrelé, vysoko špecializované krvné bunky sa musia produkovať vo veľkých množstvách nepretržite počas celého života cicavca. Obrovská väčšina týchto špecializovaných krvných buniek si udržiava svoju funkčnú aktivitu iba počas niekoľkých hodín až týždňov (Cronkite a kol., Blood Cells, 2:263-284 [1976]). Teda, na udržanie normálneho ustáleného stavu potrieb krvných buniek cicavcov je nutné neustále obnovovanie zrelých krvných buniek, nediferencovaných kmeňových buniek a rovnako aj celých línií ľubovoľných prechodných buniek alebo progenitómych buniek, odovzdávajúcich si rodové vlastnosti, ktoré ležia medzi nediferencovanými a zrelými bunkami.

V ťažisku krvotvomého systému sa nachádzajú kmeňové pluripotentné bunky. Týchto buniek je čo do množstva pomerne málo. Obnovujú sa proliferáciou, pričom vznikajú dcérske kmeňové bunky alebo sa premieňajú v sérii rozličných krokov na viac a viac zrelé rodovo obmedzené progenitóme bunky, až konečne vznikajú vysokošpecializované zrelé krvné bunky.

Napríklad, niektoré multipotentné progenitóme bunky, označované ako CFC-Mix, odvodené z kmeňových buniek, proliferujú (samoobnovovanie) a vývojom vznikajú postupne celé skupiny buniek, obsahujúce všetky rozličné myeloidné bunky, ako sú erytrocyty, neutrofily, megakaryocyty (predchodcovia krvných doštičiek), makrofágy, bazofily, eozinofily a bunky prsných žliaz. Ďalšie progenitóme bunky lymfoidného rodu proliferujú (rýchlo sa množia) a vývojom vznikajú T-bunky a B-bunky.

Medzi CFC-Mix progenitómymi bunkami a myeloidnými bunkami sa nachádza ďalšia línia progenitómych buniek s prechodným spôsobom odovzdávania ďalšiemu potomstvu. Tieto rodovo obmedzené pregenitóme bunky sa klasifikujú na základe potomstva, ktoré produkujú. Teda, známymi bezprostrednými predchodcami myeloidných buniek sú: jednotky tvoriace erytroidné skupiny buniek (CFU-E) pre erytrocyty, bunky tvoriace granulocytové/makrofágové skupiny buniek (GM-CFC) pre neutrofily a makrofágy, bunky tvoriace megakaryocytové skupiny buniek (Meg-CFC) pre megakaryocyty, bunky tvoriace eozinofilné skupiny buniek (Eos-CFC) pre eozinofily a bunky tvoriace bazofilné skupiny buniek (Bas-CFC) pre tukové bunky. Aj ďalšie prechodné predchádzajúce bunky medzi pluripotentnými kmeňovými bunkami a zrelými krvnými bunkami sú známe (pozri nižšie) alebo budú pravdepodobne objavené, pričom majú rozličné stupne rodového obmedzenia a samoobnovovacej schopnosti.

Zásadný princíp pre normálnu činnosť krvotvomého bunkového systému spočíva v potláčaní znižovania schopnosti multipotentného samoobnovovania a v rozvíjaní rodového obmedzenia a zrelosti. Takto, na jednom konci spektra krvotvomých buniek leží kmeňová pluripotentná bunka, majúca schopnosť samoobnovovania a diferenciácie na všetky rozličné rodovo špecifické progenitóme bunky. Táto schopnosť je základom liečenia transplantáciou kostnej drene, keď nediferencované kmeňové bunky znovu osídlia celý krvotvomý bunkový systém. Na opačnom konci tohto spektra sa nachádzajú vysoko rodovo obmedzení predkovia a ich potomstvo, ktorí stratili schopnosť samoobnovovania, ale nadobudli zrelú funkčnú aktivitu.

Proliferácia a vývoj kmeňových buniek a rodovo obmedzených progenitómych buniek sa môže bezpečne regulovať rozličnými krvotvomými rastovými faktormi alebo cytokinínmi. V súčasnosti nepoznáme úplne komplexnú funkciu týchto rastových faktorov in vivo. Niektoré rastové faktory, ako interleukín-3 (IL-3), sú schopné stimulovať aj multipotentné kmeňové bunky a rovnako aj progenitóme bunky so zdedenými informáciami viacerých rodov, vrátane, napríklad, megakaryocytov. Spočiatku sa predpokladalo, že faktor (GM-CSF), stimulujúci granulocytovú/makrofágovú skupinu buniek sa obmedzuje v svojom účinku len voči GM-CFC. Neskôr sa zistilo, že GM-CSF tiež ovplyvňuje proliferáciu a vývoj, okrem iného, megakaryocytov. Takto sa zistilo, že IL-3 a GM-CSF majú širšie biologické aktivity, líšiace sa rozličnou intenzitou. Celkom nedávno sa zistilo, že aj interleukin-6 (IL-6) a interleukin11 (IL-11), hoci samotné nemajú významný vplyv na tvorbu skupiny meg-kolónií, synergicky pôsobia spolu s IL-3 a stimulujú dozrievanie megakaryocytov (Yonemura a kol., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Teda, krvotvomé rastové faktory môžu ovplyvňovať rast a diferenciáciu jedného alebo viacerých rodov, ich účinok sa môže prekrývať s ďalšími rastovými faktormi v ovplyvňovaní jednoduchého vývojového radu progenitórnych buniek alebo môžu pôsobiť synergicky s ďalšími faktormi.

Rovnako sa zdá, že krvotvomé rastové faktory môžu pôsobiť v rozličných stupňoch vývoja bunky a to od totipotentnej kmeňovej bunky cez rozličné rodovo obmedzené progenitóme bunky s prenosom dedičných informácií až po zrelé krvné bunky. Napríklad sa zistilo, že erytropoetín (EPO) urýchľuje proliferáciu len zrelých erytroidných progenitómych buniek. IL-3 pôsobí svojím účinkom skôr, ovplyvňuje už nediferencované kmeňové bunky a prechodné rodovo obmedzené progenitóme bunky. Ďalšie rastové faktory, ako je kmeňový bunkový’ faktor (SCF), môžu ovplyvňovať dokonca ešte nediferencovanejší bunkový vývoj.

Z uvedeného vyplýva, že také nové krvotvomé rastové faktory, ktoré ovplyvňujú prežitie, rýchle rozmnožovanie,

SK 282265 Β6 delenie alebo dozrievanie ľubovolných krvných buniek alebo ich predkov, z ktorých vznikli, budú užitočné, hlavne ak napomáhajú pri znovuobnovení zredukovaného krvotvorného systému, zapríčineného ochorením alebo v dôsledku rádio- alebo chemoterapie.

II. Megakaryocytopoéza - tvorba krvných doštičiek

Rozbor publikovaných údajov o regulácii megakaryocytopoézy (tvorby megakaryocytov) a tvorbe krvných doštičiek udávajú: Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] a Hoŕ'fman, Blood, 74: 1196-1212 [1989]. V skratke, pluripotentné kmeňové bunky kostnej drene sa rozdeľujú na megakaryocytové, erytrocytové a myelocytové línie buniek. Predpokladá sa, že existuje odstupňované usporiadanie megakaryocytových progenitómych buniek s dedičnými informáciami a to medzi kmeňovými bunkami a megakaryocytmi. Podarilo sa identifikovať minimálne tri triedy megakaryocytových progenitómych buniek a to: jednotku megakaryocytov spôsobujúcich pučanie (BFU-MK), jednotku megakaryocytov tvoriacich kolónie buniek (CFU-MK) a megakaryocytové progenitóme bunky s nízkou hustotou (LD-CFU-MK). Samotné megakaryocytové dozrievanie je pokračovaním vývoja, ktorý možno rozdeliť do viacerých stupňov, podľa štandardných morfologických kritérií. Najskôr rozlíšiteľným prvkom megakaryocytovej (MK alebo meg) rodiny sú megakaryoblasty. Tieto bunky s počiatočným priemerom 20 až 30 pm majú bazofilnú cytoplazmu a mierne nepravidelné voľné jadro, čiastočne retikulámy chromatín a viacero jadierok. Megakaryoblasty môžu obsahovať až 32 jadier (ployploid), ale cytoplazma zostáva riedka a nezrelá. Z dozrievaním sa jadro stáva viacej laločnaté a pyknotické, množstvo cytoplazmy rastie a táto sa stáva acidofilnejšia a zrnitá. Na okraji najzrelších buniek tejto rodiny sa môžu objaviť a uvoľňovať krvné doštičky. Bežne, 10 % megakaryocytov je v zárodkovom štádiu a viac než 50 % je zrelých. V ľubovoľných morfologických klasifikáciách bežne aplikovaných na série megakaryocytov sú najskoršou formou megakaryoblasty, prechodnou formou sú promegakaryocyty alebo bazofilné megakaryocyty a najneskoršou vývojovou formou sú zrelé (acidofilné, zrnité alebo produkujúce krvné doštičky) megakaryocyty. Zrelé megakaryocyty rozširujú vlákna cytoplazmy aj do zakrivených priestorov, kde sa oddeľujú a fragmentujú na jednotlivé krvné doštičky (Williams a kol., Hematology, 1972).

Predpokladá sa, že tvorba megakaryocytov zahrnuje niekoľko regulačných faktorov (Williams a kol., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] a Williams a kol., J. Celí Physiol., 110: 101 [1982]). Prvý stupeň tvorby megakaryocytov sa postuluje ako mitotický, týka sa proliferácie buniek a iniciácie kolónie (skupiny) buniek s CFU-MK, ale proces nie je ovplyvnený množstvom krvných doštičiek (Burstein a kol., J. CelíPhysiol., 109: 333 [1981] a Kimura a kol., Exp. Hematol., 13:1048 [1985]). Druhý stupeň dozrievania je nemitotický, zahrnuje jadrovú polyploidizáciu a dozrievanie cytoplazmy a pravdepodobne je riadený mechanizmom spätnej väzby pomocou množstva vzniknutých periférnych krvných doštičiek (Odeli a kol., Blood, 48:765 [1976] a Ebbe a kol., Blood, 32:787 [1968]).

Existenciu odlišného a špecifického faktora, stimulujúceho bunkové kolónie megakaryocytov (MK-CSF), diskutoval Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]. Avšak väčšina autorov predpokladá, že tak životne dôležitý proces ako je produkcia krvných doštičiek bude riadený cytokinínom(-nmi) výlučne pomocou odozvy na tento proces. Hypotézy o existencii špecifického cytokinínu(-ov) pre systém megakaryocyt/krvná doštička boli bázou výskumných prác počas viac ako 30 rokov - ale k dnešnému dňu sa nepodarilo žiadny takýto cytokinín vyčistiť, definovať jeho sekvenciu a pokusne pripraviť ako špecifický MK-CSF (TPO).

Hoci sa už v literatúre uvádzalo, že MK-CSF bol čiastočne vyčistený z experimentálne spôsobenej trombocytopénie (Hill a kol., Exp. Hematol,, 14: 752 [1986]) a z upraveného média ľudskej embryonálnej ľadviny [CM] (McDonald a kol., J. Lab. Clin. Med., 85: 59 [1975]) a z mužských močových extraktov u pacienta s aplastickou anémiou (chudokrvnosťou) a s idiopatickou trombocytopenickou purpurou (Kawakita a kol., Blood, 6: 556 [1983]) a z plazmy (Hofíman a kol., J. Clin. Invest., 75: 1174 [1985]), predsa len ich fyziologická funkcia bola vo väčšine prípadov neznáma.

Upravené médiá, z buniek sleziny, aktivovaných mitogénom z Phytolacca americana L. (PWM-SpCM) a myšia myelomonocytová bunková línia WEHI-3 (WEHI-3CM) sa použili ako megakaryocytové potenciátoiy. PWM-SpCM obsahuje faktory zvyšujúce rast CFU-MK (Metcalf a kol., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72: 1744-1748 [1975]; Quesenberry a kol., Blood, 65:214 [1985]; a Iscove, N.N., v Hematopoietic Celí Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde a kol., eds. [New York, Academy Press] s. 37-52 [1978]), jeden z nich je interleukín-3 (IL-3), stimulačný faktor kolónie buniek viacerých rodov (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11: 469 [1986]). Ostatné faktory v tomto médiu neboli identifikované a izolované. WEHI-3 je myšia myelomonocytová bunková línia, vylučujúca pomerne veľké množstvo IL-3 a menšie množstvo GM-CSF. Zistilo sa, že IL-3 posilňuje rast širokého spektra krvotvomých buniek (Ihle a kol., J. Immunol., 13: 282 [1983]). Rovnako sa zistilo, že IL-3 má synergický účinok s množstvom známych krvotvomých hormónov alebo rastových faktorov (Bartelmez a kol., J. Celí Physiol., 122: 362-369 [1985] a Warren a kol., Celí, 46: 667:674 [1988]), vrátane aj erytropoetínu (EPO) a interleukínu-1 (IL-1) a to pri zavádzaní počiatočných multipotentných prekurzorov a pri vytváraní veľmi veľkých zmiešaných skupín krvotvomých buniek.

Ďalšie zdroje megakaryocytových potenciátorov sa našli v upravených médiách myších pľúc, kostí, makrofágových bunkových línií, buniek peritoneálnych výpotkov a ľadvinových buniek humánnych (ľudských) embryí. Napriek určitým rozporuplným údajom (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]) existuje dôkaz (Geissler a kol., Br. J. Haematol., 60:233-238 [1985]), že väčší vplyv na tvorbu megakaryocytov majú aktivované T- lymfocyty než monocyty. Toto zistenie predpokladá, že aktivované T-lymfocytové výlučky, ako sú interleukíny, môžu byť regulačnými faktormi pri vývoji MK (Geissler a kol., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). Množstvo prác o príprave megakaryocytov s purifikovaným (vyčisteným) erytropoetinom (EPO) (Vainchenker a kol., Blood, 54:940 [1979]; McLeod a kol., Náture, 261:492-4 [1976]; a Williams a kol., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) indikuje, že tento hormón má zlepšujúci účinok na tvorbu skupiny buniek MK. Bolo to demonštrované v kultúrach aj s obsahom séra, aj bez jeho prítomnosti a v neprítomnosti sprievodných buniek (Williams a kol., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). EPO sa viacej používa v súvislosti s jednoduchým alebo dvojbunkovým stupňom tvorby megakaryocytov, zatiaľ čo PWM-SpCM sa využíva pri štvorbunkovom stupni vývoja megakaryocytov. Zostáva ešte objasniť pôsobenie všetkých týchto faktorov aj na prvú, aj na poslednú fázu vývoja megakaryocytov.

Podľa údajov pochádzajúcich z viacerých laboratórií sa predpokladá, že jedinými multirodovými faktormi, ktoré majú jednotlivo stimulačnú aktivitu voči skupine buniek

MK, sú GM-CSF a IL-3 a v menšej miere aj IL-6 ako stimulačný faktor B-buniek (Ikebuchi a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Prednedávnom publikovalo niekoľko autorov údaje o tom, že IL-11 a inhibičný faktor leukémie (LIF) pôsobia synergicky s IL-3, pričom sa zvyšuje veľkosť megakaryocytov a ploidita (Yonemura a kol., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein a kol., J. Celí. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf a kol., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf a kol., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno a kol., Exp. Hematol., 19: 378-381 [1991]; a Yonemura a kol., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Ďalšími prácami o tejto problematike sú: Eppstein a kol., U.S. Patent 4 962 091; Chong, U.S. Patent 4 879 111; Fernandes a kol., U.S. Patent 4 604 377; Wissler a kol., U.S. Patent 4 512 971; Gottlieb, U.S. Patent 4 468 379; Bennett a kol., U.S. Patent 5 215 895; Kogan a kol., U.S. Patent 5 250 732; Kimura a kol., Eur. J. Immunol., 20(9): 1927-1931 [1990]; Secor a kol., J. of Immunol., 144(4): 1484-1489 [1990]; Warren a kol., J. of Immunol., 140(1)94-99 [1988]; Warren a kol., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno a kol., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa a kol., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike a kol., Blood, 75(12):2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5):1545-1551 [1989]; Rennick a kol., Blood, 73(7):1828-1835 [1989]; a Clutterbuck a kol., Blood, 73(6):1504-1512 [1989],

III. Trombocytopénia

Krvné doštičky sú rozhodujúcimi prvkami mechanizmu zrážania krvi. Pri trombocytopénii, ktorá sa vyskytuje pri rozličných klinických podmienkach a ochoreniach, sa zníži hladina krvných doštičiek pod hodnotu 150 x 10⁹ na liter. Hlavné príčiny trombocytopénie možno rozdeliť do troch skupín, na základe rozpätia životnosti krvných doštičiek a to: (1) narušená tvorba krvných doštičiek v kostnej dreni, (2) vylučovanie krvných doštičiek v slezine (splenomegália) alebo (3) zvýšený rozklad krvných doštičiek v periférnom okruhu (to znamená, autoimunitná trombocytopénia alebo chemo- a rádioterapia). Tiež u pacientov, ktorí dostali pri rýchlej pomoci veľké objemy krvných produktov chudobných na krvné doštičky, sa môže vyvinúť trombocytopénia ako dôsledok zriedenia.

Klinické krvácanie ako prejav trombocytopénie závisí od vážnosti trombocytopénie, jej príčin a od pravdepodobných sprievodných porúch koagulácie. Vo všeobecnosti u pacientov, ktorí majú počet krvných doštičiek medzi 20 až 100x10’ na liter, je riziko význačného posttraumatického krvácania, zatiaľ čo pacienti, ktorí majú krvných doštičiek menej ako 20 x 10⁹ na liter, môžu krvácať spontánne. Títo poslední pacienti sú kandidátmi na transfúziu krvných doštičiek, pričom táto môže byť doprevádzaná imunologickými a vírusovými rizikami. V ľubovoľnom stupni trombocytopénie sa môže stať krvácanie intenzívnejším, ak príčinou je skôr pokles tvorby krvných doštičiek ako zvýšenie ich rozkladu. V poslednom prípade urýchlená premena krvných doštičiek vyplýva z obehu mladších, väčších a hemostaticky účinnejších krvných doštičiek. Trombocytopénia môže byť spôsobená množstvom ochorení, ktoré sú stručne opísané v ďalšom. Detailnejší opis možno nájsť v publikácii Schaíher, A.I., „Throbocytopenia and Disorders of Platelet Function,“ Internal Medicíne, 3rd Ed., John J.Hutton a kol., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].

a) Trombocytopénia spôsobená vznikom poškodených krvných doštičiek

Príčiny vrodenej trombocytopénie zahrnujú vrodenú aplastickú anémiu (Fanconiho syndróm) a vrodenú amegakaryotovú trombocytopéniu, ktorá môže byť spojená so znetvoreniami kostry. Druhotné ochorenia tvorby krvných doštičiek sú spôsobené buď hypopláziou megakaryocytov alebo neúčinnou tvorbou krvných doštičiek. Megakaryocytová hypoplázia môže byť spôsobená rozličnými podmienkami, vrátane aplázie kostnej drene (vrátane vrodených foriem alebo myelosupresie chemoterapeutickými látkami alebo rádioterapiou), myelofibrózou, leukémiou, a napadnutím kostnej drene metastatickým tumorom alebo granulómami. V niektorých prípadoch môžu toxíny, infekčné látky alebo liečivá pomerne selektívne narušovať trombopoézu; medzi takéto príklady patrí prechodná trombocytopénia zapríčinená alkoholom a niektorými vírusovými infekciami a stredná trombocytopénia spojená s podávaním tiazidových diuretík. Nakoniec, trombocytopéniu môže zapríčiniť tiež neúčinná trombopoéza ako následok megaloblastových procesov (nedostatok B₁₂ alebo derivátov kyseliny listovej), pričom priebeh býva doprevádzaný anémiou a leukopéniou.

Súčasné liečenie trombocytopénii v dôsledku zníženej tvorby krvných doštičiek závisí od identifikácie a vratnosti zásadnej príčiny, ktorá vyvolala poruchu v kostnej dreni. Transfúzie krvných doštičiek sa obvykle dávajú pacientom s vážnymi komplikáciami krvácania alebo počas chirurgických zákrokov, pretože izoimunizácia môže viesť k odolnosti voči ďalším transfúziám krvných doštičiek. Slizničné krvácanie vyplývajúce z intenzívnej trombocytopénie sa môže zlepšiť po ústnom alebo vnútrožilovom podaní antifibrinolytických látok. Ak sa antifibrinolytické látky podávajú pacientom s roztrúsenou intravaskulámou koaguláciou (DIC), môžu nastať trombotické komplikácie.

b) Trombocytopénia spôsobená oddeľovaním v slezine

Zväčšenie sleziny v dôsledku ľubovoľnej príčiny môže byť spojené s miernou až neveľkou trombocytopéniou. Toto je prevažne pasívny proces (hypersplenizmus) vylučovania krvných doštičiek slezinou, zatiaľ čo aktívny rozklad krvných doštičiek slezinou v prípadoch imunosprostredkovanej trombocytopénie bude diskutovaný ďalej. Hoci najbežnejšou príčinou hypersplenizmu je hromadenie krvi v zväčšenej slezine, vyvolané zvýšeným vrátnicovým tlakom v dôsledku alkoholickej cirhózy, ďalšie formy prekrvenej, infiltračnej alebo lymfoproliferačnej zväčšenej sleziny sú tiež spojené s trombocytopéniou. V dôsledku samotného hypersplenizmu nebýva počet krvných doštičiek menší ako 50 x 10⁹ na liter.

c) Trombocytopénia zapríčinená sprostredkovaným neimunitným rozkladom krvných doštičiek

Trombocytopénia môže byť zapríčinená urýchleným rozkladom krvných doštičiek, pomocou rozličných neimunologických procesov. Poruchy tohto typu zahrnujú roztrúsenú intravaskulámu koaguláciu, protetické intravaskuláme zariadenia, mimotelový krvný obeh a trombotické mikrocievne liečebné techniky ako je trombotická trombocytová purpura. Vo všetkých týchto prípadoch sú obiehajúce krvné doštičky namáhané a to buď kontaktom s umelými povrchmi alebo nenormálnymi vnútrožilovými podmienkami alebo sa spotrebovávajú v týchto miestach alebo sú poškodzované a potom predčasne odstraňované retikuloendotelovým systémom. Stavy ochorenia alebo porúch, z ktorých môže vzniknúť rozstrúsená intiavaskuláma koagulácia (DIC), sú detailne opísané v publikácii Braunwald a kol. (eds), Harrison ’s Principles of Internal Medicíne, 1 lth Ed., s. 1478, McGraw Hill [1987], Intravaskuláme protetické zariadenia, vrátane srdcových chlopní a vnútroaortových balónikov, môžu zapríčiňovať miernu až neveľkú deštruktívnu trombocytopéniu a na druhej strane, prechodná trombocytopénia môže nastať u tých pacientov, ktorí sú napojení na srdcovopľúcne premostenie („bypass“) alebo na hemodialýzu, pričom býva zapríčinená spotrebou alebo poškodením krvných doštičiek v mimotelovom okruhu.

d) Liekom indukovaná imunitná trombocytopénia

Viac ako 100 druhov liekov vyvoláva imunologický sprostredkovanú trombocytopéniu. Ale len účinky chinidínu, chinínu, zlata, sulfónamidov, cefalotínu a heparínu boli dobre charakterizované. Liekom indukovaná trombocytopénia je často veľmi intenzívna a má typicky prudký priebeh v tých dňoch, keď pacient užíva príslušné lieky.

e) Imunitná (autoimunitná) trombocytopenická purpura (ITP)

ITP je u dospelých chronické ochorenie charakterizované autoimunitným rozkladom krvných doštičiek. Vlastnou protilátkou je obvykle IgG, hoci sa uvádzajú aj ďalšie imunoglobulíny. Napriek tomu, že sa zistilo, že vlastná protilátka ITP je spojená s membránou GPiyiU krvných doštičiek, v mnohých prípadoch sa nepodarilo určiť špecifičnosť antigénu krvnej doštičky. Mimocievny rozklad senzibilných krvných doštičiek nastáva v retikuloendotelovom systéme sleziny a pečene. Hoci viac než polovica všetkých prípadov ITP sú vrodené, mnoho pacientov trpí na reumatické alebo autoimunitné ochorenia (to znamená, systémový lupus eiythematosus) alebo lymfoproliferatívne ochorenia (to znamená, chronická lymfocytová leukémia).

f) ITP indukované s HIV

ITP je bežnou významnou komplikáciou HIV infekcie (Morris a kol., Ann. Intern. Med., 96: 714-717 [1982]), a môže sa objaviť v ľubovoľnom štádiu tejto choroby a to aj u pacientov s diagnózou AIDS, tých, ktorí majú symptómy AIDS a rovnako aj u tých pacientov, ktorí sú transfekovaní s HIV, ale bez symptómov AIDS. HIV infekcia je prenosné ochorenie charakterizované závažnou stratou bunkovej imunity a rovnako tiež výskytom oportunistických infekcií a zhubnosťou. Prvotnou imunologickou abnormalitou, vyplývajúcou z infekcie s HIV, je progresívne vyčerpanie a narušenie funkčnosti T lymfocytov exprimujúcich glykoproteín CD4 na povrchu buniek (Lane a kol.., Ann. Rev. Immunol., 3:477 [1985]). Tým, že sa stráca glykoproteín CD4, ktorý napomáha resp. indukuje funkčnosť T buniek, pravdepodobne dochádza k závažným poruchám bunkovej a humorálnej imunity, ktoré vedú k oportunistickým infekciám a k zhubnému bujneniu, ktoré sú charakteristické pre AIDS (H. Lane, pozri vyššie).

Hoci je mechanizmus ITP súvisiacej s HIV neznámy, predpokladá sa, že je odlišný od mechanizmu ITP, ktorý nie je spojený s infekciou HIV (Walsh a kol., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; aRatner, Am. J. Med., 86: 194198 [1989]).

IV. Prehľad terapie trombocytopénie

Terapeutický prístup k liečeniu pacientov s trombocytopéniou určuje intenzita a naliehavosť klinickej situácie. Liečenie je podobné, keď je trombocytopénia spojená s HIV, ako keď nie je spojená s HIV a napriek tomu, že sa použili rozličné liečebné postupy, terapia je naďalej sporná

Počet krvných doštičiek u pacientov s diagnózou trombocytopénie sa významne zvýšil liečením s glukokortikoidmi (napríklad prednizolón), avšak u väčšiny pacientov nebola odozva úplná alebo sa vyskytli recidívy, keď sa dávka glukokortikoidu znížila alebo jeho podávanie sa prerušilo. Na základe štúdia prípadov pacientov, ktorí mali ITP spojené s HIV, niektorí autori predpokladali, že terapia glukokortikoidmi môže viesť k zvýšenej náchylnosti na AIDS. Glukokortikoidy sa obvykle podávajú vtedy, ak počet krvných platničiek klesne pod hodnotu 20 x 10⁹/liter alebo keď sa objaví spontánne krvácanie.

Pacientom, ktorým nezaberajú glukokortikoidy, sa úspešne podávala v ťažkých prípadoch ITP spojenej s HIV zlúčenina; 4-(2-chlórfenyl)-9-metyl-2-[3-(4-morfolinyl)-3-propanón-1 -yl]6H-tieno[3,2,f] [ 1,2,4]triazolo[4,3,a] [1,4]diazepín (WEB 2086).

Pacienti, ktorí mali počet krvných doštičiek 3700058000/pl, sa liečili preparátom WEB 2086 a po 1-2 týždňoch liečenia sa počet krvných doštičiek zvýšil na 140000-190000/μ1 (EP 361 077 a Lohman a kol., Lancet, 1147 [1988]).

Hoci presne nepoznáme optimálny spôsob liečenia získanej amegakaryocytovej trombocytopenickej purpury (AATP), zistilo sa (Trimble a kol., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]), že podávanie antitymocytového globulínu (ATG), čo je konské antisérum voči tkanivu ľudského týmusu, predĺžilo dobu úplného vymiznutia príznakov ochorenia. Podľa ďalších údajov sú krvotvomé účinky ATG spôsobené timerozalom, pretože pravdepodobne proteín pôsobí ako nosič ortuti (Panella a kol., Cancer Research, 50:4429-4435 [1990]).

V literatúre sú uvedené dobré výsledky po chirurgickom odstránení sleziny (splenektómia). Splenektómiou sa u mnohých pacientov zníži pravdepodobnosť rozkladu krvných doštičiek a odstráni sa hlavný zdroj produkujúci autoprotilátky. Použitím tohoto postupu sa u mnohých pacientov predĺži interval remisie aj bez podávania liekov. Ale, pretože vo všeobecnosti sa chirurgické postupy nepoužívajú pri pacientov s problémami imunity, splenektómia sa doporučuje len v ťažkých prípadoch trombocytopénie (to znamená, ťažké ITP spojené s HIV), u pacientov, u ktorých nedošlo k reakcii na 2-3 týždňové liečenie glukokortikoidmi alebo sa nedosiahla trvalá odozva po prerušení podávania glukokortikoidov. Na základe prehľadu vedeckých poznatkov nie je potvrdené, či splenektonómia zvyšuje náchylnosť pacientov na AIDS.

K uvedenej splenektonómii a liečeniu prednizolónom možno priradiť aj sľubné výsledky, ktoré sa dosiahli pri liečení ITP vyvolanom HIV a to pomocou niektorých cytotoxických látok, ako sú vinkristín a azidotimidín (AZT, zidovudín), avšak výsledky možno pokladať len za predbežné.

Ako z uvedeného vyplýva, jeden spôsob liečenia trombocytopénie spočíva v získaní látky schopnej urýchľovať diferenciáciu a dozrievanie megakaryocytov alebo ich prekurzorov do štádia produkujúceho krvné doštičky. V minulosti bolo vynaložené značné úsilie na identifikáciu takejto látky, ktorá sa bežne označuje ako „trombopoetin“ (TPO). TPO je z literatúry známy aj pod inými menami, ako sú: stimulačný faktor trombocytopoézy (TSF), stimulačný faktor skupiny megakaryocytov (MK-CSF), stimulačný faktor megakaryocytov a potenciátor megakaryocytov. Aktivita TPO sa pozorovala už v roku 1959 (Rak a kol., Med. Exp., 1:125) a pokusy charakterizovať a vyčistiť túto látku pokračujú až do súčasnosti. Na jednej strane existujú informácie o čiastočnom vyčistení TPO na báze aktívnych polypeptidov (pozri, napríklad, Tayrien a kol., J. Biol. Chem., 262:3262 [1987], ale na druhej strane sa udáva, že TPO nie je individuálnym jedincom, čo sa týka jeho pôsobenia, ale skôr pripomína polyfunkčné prejavy známeho hormónu (IL-3, Sparrow a kol., Prog. Clin. Biol. Res., 215:123 [1986]). Bez ohľadu na tvar alebo pôvod, bude mať molekula s krvotvomou aktivitou aj významnú liečebnú hodnotu. Hoci nebol žiaden proteín jednoznačne identifikovaný ako TPO, značný záujem spôsobil nedávny objav, že mpl, zdanlivý cytokinínový receptor, môže prenášať trombopoetický signál.

V. Mpľje megakaryocytopoetinový cytokinínový receptor

Predpokladá sa, že proliferácia a dozrievanie krvotvorných buniek sú celkom kontrolované faktormi, ktoré pozitívne alebo negatívne modulujú proliferáciu buniek pluripotentného kmeňa a viacrodovú diferenciáciu. Tieto účinky sú sprostredkované prostredníctvom vysokoúčinného viazania sa mimobunkových proteínových faktorov na špecifické bunkové povrchové receptory. Tieto bunkové povrchové receptory sú značne homologické a sú všeobecne klasifikované ako členy superrodiny cytokininových receptorov. Členy tejto superrodiny zahrnujú receptory pre: IL-2 (β a γ reťazce) (Hatakeyama a kol., Science, 244:551556 [1989]; Taheshita a kol., Science. 257:379-382 [1991]; IL-3 (Itoh a kol., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5459-5463 [1990]; Kitamura a kol., Celí, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086 [1991b], IL-4 (Mosley a kol., Celí, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takaki a kol., EMBO J., 9:4367-4374 [1990]; Tavemier a kol., Celí, 66:1175-1184 [1991], IL-6 (Yamasaki a kol, Science, 241:825-828 [1988]; Hibi a kol., Celí, 63:1149-1157 [1990], IL-7 (Goodwin a kol., Celí, 60:941-951 [1990], IL-9 (Renault a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:56905694 [1992]), stimulačný faktor pre skupinu granulocytov a makrofágov (GM-CSF) (Fukunaga a kol., Celí, 61:341-350 [1990a]; Fukunaga a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 [1990b]; Larsen a kol., J. Exp.

Med., 172:1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea a kol., Celí, 57:277-285 [1989]; Jones a kol., Blood, 76:31-35 [1990], inhibičný faktor leukémie (LIF) (Gearing a kol., EMBO J., 10:2839-2848 [1991], onkostatín M (OSM) (Rose a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645 [1991]) a tiež receptory pre prolaktín (Boutin a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748 [1988]; Edery a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116 [1989]), rastový hormón (GH) (Leung a kol., Náture, 330:537-543 [1987]) a ciliámy (riasinkový) neurotropický faktor (CNTF) (Davis a kol., Science, 253:59-63 [1991]).

Členovia superrodiny cytokininových receptorov sa rozdeľujú na tri funkčné kategórie (pozri prehľadný článok Nicola a kol., Celí, 67:1-4 [1991]). Prvá skupina zahrnuje receptory s jednoduchým reťazcom, ako sú erytropoetínový receptor (EPO-R) alebo receptor stimulačného faktora kolónie granulocytov (G-CSF-R), ktorý viaže ligand s vysokou afinitou, cestou extracelulámej domény (mimobunkovej oblasti) a tiež generuje vnútrobunkový signál. Druhá skupina receptorov, takzvané α-podjednotky („subunity“), zahrnuje receptor interleukínu-6 (IL6-R), receptor stimulačného faktora kolónie granulocytov a makrofágov (GMCSF-R), receptor interleukín-3 (IL3-Ra) a ďalšie členy superrodiny cytokininových receptorov. Tieto a-podjednotky viažu ligand s nízkou afinitou, ale nemôžu prenášať medzibunkový signál. Vysokoafinitný receptor schopný prenosu signálu je generovaný heterodimérom medzi a-podjednotkou a členom tretej skupiny cytokininových receptorov, označených ako β-podjednotky („subunit“), napríklad p_c, bežná β-podjednotka pre tri α-podjednotky IL3-Ra a GM-CSF-R.

Dôkaz, že mpl je členom superrodiny cytokininových receptorov, poskytuje homologická sekvencia (Gearing, EMBO, J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proc.Natl. Acad.

Sci. USA, 87:6834-6938 [1990]; Davis a kol., Science, 253:59-63 [1991] a Vigon a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 [1992]) a jeho schopnosť prenášať signály proliferácie.

Dedukovaná sekvencia proteínov z molekulového klonovania myšieho c-mpl ukazuje, že tento proteín je homológom ostatných cytokininových receptorov. Mimobunková doména obsahuje 465 zvyškov aminokyselín a skladá sa z dvoch subdomén, pričom každá obsahuje štyri silne chránené cysteíny a špecifický motív v N-koncovej subdoméne a v C-koncovej subdoméne. Predpokladá sa, že mimobunkové oblasti väzbových ligandov majú podobnú štrukturálnu geometriu dvojitého uzavretého β-valcovitého tvaru. Táto zdvojená mimobunková oblasť je silne homologická s reťazcom prenášajúcim signál spoločným pre receptory IL3, IL-5 a GM-CSF, rovnako ako LIF nízkoafinitná väzbová oblasť (Vigon a kol., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Teda mpl môže patriť do skupiny cytokininových receptorov viažucich ligand s nízkou afinitou.

Z porovnania myšieho mpl a zrelého ľudského mpl P vyplýva, že tieto dva proteíny sú z hľadiska sekvencie identické na 81 %. Konkrétnejšie, N-koncové a C-koncové mimobunkové subdomény sú z hľadiska sekvencie identické na 75 %, resp. na 80 %. Najviac konzervovanou mpl oblasťou je cytoplazmatická oblasť, ktorá má 91% identitu aminokyselinovej sekvencie, so sekvenciou 37 zvyškov v blízkosti transmembránovej domény, ktorá je identická v oboch druhoch. Z tohto dôvodu sa mpl uvádza ako jeden z najviac konzervovaných členov superrodiny cytokinínových receptorov (Vigon, pozri vyššie).

Dôkaz, že mpl je funkčný receptor schopný prenosu signálu proliferácie, poskytuje konštrukcia chimerických receptorov obsahujúcich extracelulámu doménu z cytokinínového receptora, ktorý má vysokú afinitu pre známy cytokinín s mpl cytoplazmatickou doménou. Pretože žiadny ligand pre mpl nebol v literatúre uvedený, bolo potrebné zostrojiť chimerický vysokoafinitný ligand, spájajúci mimobunkovú oblasť z prvej skupiny cytokinínového receptora, ako je IL-4R alebo G-CSFR. Vigon a kol., (pozri vyššie) spojili mimobunkovú oblasť G-CSFR s transmembránovou aj s c-mpl cytoplazmatickou doménou. Bunková línia závislá na IL-3, BAF/B03 (Ba/F3) bola transfekovaná chimérou G-CSFR/wp/ súčasne s G-CSFR kontrolou s úplnou dĺžkou. Bunky transfekované chimérou rástli rovnako dobre v prítomnosti cytokinínu IL-3 alebo G-CSF. Podobne bunky transfekované G-CSFR tiež rástli dobre buď v IL-3 alebo v G-CSF. Všetky bunky zahynuli v neprítomnosti rastových faktorov. Podobné experimenty vykonal Škoda a kol., EMBO J., 12(7):2645-2653 [1993], pričom mimobunkovú, ale aj transmembránovú oblasť ľudského receptora IL-4 (hIL-4-R) spojil s myšou cytoplazmatickou mpl doménou a transfekoval do myšej IL-3 závislej Ba/F3 bunkovej línie. Ba/F3 bunky transfekované divým druhom hlL4-R sa normálne množili v prítomnosti buď IL-4 alebo IL-3. Ba/F3 bunky transfekované hIL-4R/mp/ sa normálne množili v prítomnosti hIL-4 (v prítomnosti alebo v neprítomnosti IL-3), demonštrujúc tým, že v Ba/F3 bunkách mpl cytoplazmatická doména obsahuje všetky elementy potrebné na prenos signálu proliferácie.

Tieto chimérické experimenty poukazujú na to, že mpl cytoplazmatická doména má signalizačnú schopnosť proliferácie, ale nevyplýva z nich, či mpl cytoplazmatická doména môže viazať ligand. Tieto výsledky sú konzistentné minimálne s dvoma pravdepodobnými hypotézami, a to, mpl je receptor s jednoduchým reťazcom (prvá skupina), ako sú EPO-R alebo G-CSFR alebo je β-podjednotkou, ktorá prenáša signál (tretia skupina), vyžadujúci a-podjednotku, ako je IL-3 (Škoda a kol., pozri vyššie).

VI. Mpl ligand je trombopoctín (TPO)

Ako z uvedeného vyplýva, predpokladalo sa, že sérum obsahuje jedinečný faktor, ktorý býva niekedy označovaný ako trombopoetín (TPO) a ktorý synergický pôsobí s rozličnými cytokinínmi a urýchľuje rast a dozrievanie megakaryocytov. Žiadny takýto prirodzený faktor nebol zatiaľ izolovaný zo séra alebo z iného ľubovoľného zdroja a to napriek tomu, že početné vedecké tímy na to vynaložili značné úsilie. Dokonca, hoci nie je známe, či je mpl schopné priamo viazať stimulačný faktor megakaryocytu, nedávne experimenty ukázali, že mpl je obsiahnuté vo faktore alebo faktoroch, ktoré sa našli v sére pacientov s aplastickou kostnou dreňou a ktoré prenášajú signál proliferácie (Methiaakol.,BW, 82(5):1395-1401 [1993]).

Dôkaz toho, že jedinečný faktor, tvoriaci kolóniu buniek séra a odlišný od IL-Ια, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF, a GM-CSF, prenáša signál proliferácie pomocou mpl, poskytuje skúška rozdelenia ompl expresie v nediferencovaných a všeobecných hematopoetických bunkových líniách a výsledky mpl antisense prác v jednej z týchto bunkových línií.

Použitím reverznej transkriptázy (RT)-PCR v imunovyčistených ľudských krvotvomých bunkách, Methia a kol. (pozri vyššie) ukázal, že intenzívne mpl mRNA informácie sa zistili iba v CD34⁺ vyčistených bunkách, v megakaryocytoch a krvných doštičkách. CD34⁺ bunky vyčistené z kostnej drene (BM) predstavujú asi 1 % zo všetkých BM buniek a sú rozšírené v nediferencovaných a všeobecných progenitoroch všetkých rodov (to znamená, erytroid, granulomakrofág a megakaryocyt).

Antisense mpl oligodeoxynukleotidy potláčajú tvorbu megakaryocytových kolónií z pluripotentných CD34⁺ buniek kultivovaných v sére pacientov s aplastickou kostnou dreňou (bohatý zdroj aktívnych elementov stimulujúcich skupinu megakaryocytov [MK-CSA]). Tie isté antisense oligodeoxynukleotidy nemali vplyv na tvorbu skupiny erytroidov alebo granulomakrofágov.

Zatiaľ nie je známe, či mpl je priamo naviazaný na ligand a či sérový faktor poukazuje na to, že príčina megakaryocytopoézy pôsobí cez mpl. Predpokladalo sa, že ak mpl je priamo naviazaný na ligand, jeho aminokyselinová sekvencia bola pravdepodobne vysoko konzervovaná a má druhovú krížovú reaktivitu (cross-reaktivitu) v dôsledku význačnej sekvenčnej identity medzi ľudskými a myšími mpl extracelulámymi doménami (Vigon a kol., pozri vyššie).

VII. Predmety vynálezu

Ako z uvedeného vyplýva, existuje v súčasnosti pretrvávajúca potreba izolovať a identifikovať molekuly schopné stimulovať proliferáciu, diferenciáciu a dozrievanie krvotvomých buniek, najmä megakaryocyty alebo ich predkov na terapeutické použitie pri liečení trombocytopénie. Predpokladá sa, že takouto molekulou je mpl ligand a potom existuje ďalšia potreba izolovať takýto ligand(-y) a zhodnotiť jeho úlohu(-y) pri bunkovom raste a diferenciácii.

Vzhľadom na to, predmetom tohto vynálezu je získanie farmaceutický čistej molekuly schopnej stimulácie proliferácie, diferenciácie a/alebo dozrievania megakaryocytov na formu, produkujúcu zrelé krvné doštičky.

Ďalším predmetom je vybavenie molekuly do vhodného tvaru na terapeutické použitie pri liečení krvotvomých ochorení, najmä trombocytopénie.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je izolácia, čistenie a identifikácia proteínových ligandov schopných viazať in vivo receptor zo superrodiny cytokinínov, známy ako mpl a prenášať signál proliferácie.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnutie molekúl nukleových kyselín kódujúcich takéto proteínové ligandy a použitie týchto molekúl nukleových kyselín na prípravu ligandov viažucich mpl v rekombinantnej bunkovej kultúre na diagnostikovanie a terapeutické použitie.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnutie derivátov a modifikovaných foriem proteínových ligandov zahrnujúcich varianty aminokyselinových sekvencii, varianty glykoproteínových foriem a ich kovalentné deriváty.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnutie túzovaných polypeptidových foriem skombinovaním ligandu mpl a heterologického proteínu a ich kovalentných derivátov.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je zabezpečenie variantu polypeptidových foriem spájaním ligandu mpl s aminokyselinou adíciami a substitúciami z EPO sekvencie, pričom vzniká proteín schopný regulovať proliferáciu a rast aj krvných platničiek aj progenitorov buniek červených krviniek.

Ďalším predmetom tohto vynálezu je príprava imunogénov na získavanie protilátok proti mpl ligandom alebo ich fúzovaných foriem, rovnako, ako získanie protilátok schopných viazať takéto ligandy.

Tieto a ďalšie predmety tohto vynálezu budú zrejmé bežným odborníkom s prihliadnutím na celkovú špecifikáciu.

Podstata vynálezu

Podstaty vynálezu sa dosiahnu zabezpečením izolovaného proteínu cicavcov, ktorý urýchľuje megakaryocytopoetickú proliferáciu a dozrievanie, označeného ako „ligand mpl“ (ML) alebo trombopoetín (TPO) a schopného stimulovať proliferáciu, dozrievanie a/alebo diferenciáciu megakaryocytov na formu, produkujúcu zrelé krvné doštičky.

Tento skutočne homogénny proteín sa môže čistiť z prirodzených zdrojov metódou pozostávajúcou z; 1. kontaktu zdrojovej plazmy obsahujúcej molekuly ligandu mpl, ktoré sa majú čistiť, s imobilizovaným polypeptidovým receptorom, hlavne mpl alebo mpl fuzovaným polypeptidom imobilizovaným na nosiči, za podmienok, pri ktorých čistené molekuly ligandu mpl sa selektívne adsorbujú na imobilizovanom polypeptidovom receptore, 2. vypranie imobilizovaného polypeptidového receptora a jeho nosiča a odstránenie neadsorbovanej látky, a 3. eluovanie molekúl ligandu mpl z imobilizovaného polypeptidového receptora, na ktorom boli naadsorbované, pomocou elučného tlmivého roztoku. Je výhodné, keď prirodzeným zdrojom je plazma cicavcov alebo moč obsahujúci ligand mpl. Cicavec môže byť aplastický a imobilizovaným receptorom môže byť zmes mpl-lgG.

Preferovaný proteín, urýchľujúci megakaryocytopetickú proliferáciu a dozrievanie, môže byť jednotlivý, skutočne homogénny polypeptidový mpl ligand, pripravený syntetickou alebo rekombinantnou cestou.

Polypeptidový „ligand mpl“ alebo „TPO“, týkajúci sa tohto vynálezu, má minimálne celkovú 70% sekvenčnú identitu so sekvenciou aminokyselín vysoko čistého skutočne homogénneho prasačieho polypeptidového ligandu mpl a minimálne 80 % sekvenčnú identitu s „EPO-oblasťou“ prasačieho polypeptidového ligandu mpl. Ligand mpl podľa tohto vynálezu je zrelý ľudský ligand mpl (hML), ktorý má zrelú sekvenciu aminokyselín vyobrazenú na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1), alebo jej posttranskripčne modifikovaného variantu alebo je to proteín, ktorý má okolo 80 % sekvenčnú identitu so zrelým ľudským ligandom mpl. Voliteľne, môže byť variant ligandu mpl fragmentom, najmä aminoterminálnym alebo fragmentom „EPO-oblasti“ a to zo zrelého ľudského ligandu mpl (hML). Je výhodné, keď si aminoterminálny fragment zachová, v podstate všetko z ľudskej ML sekvencie medzi prvým a štvrtým zvyškom cysteínu, ale môže obsahovať podstatné pridané, odobraté alebo nahradené časti, ale mimo túto vymedzenú oblasť. Podľa uvedeného, fragment polypeptidu má nasledovný vzorec:

X-hML(7-151)-Y, kde hML (7-151) predstavuje ľudskú TPO (hML) sekvenciu aminokyselín od Cys⁷ po Cys'⁵¹ vrátane; X predstavuje amínoskupinu Cys⁷ alebo jeden alebo viac z aminoterminálnych zvyškov (zvyšok) aminokyselín zrelej hML alebo rozšírenie zvyškov aminokyselín navyše o Met, Tyr alebo hlavnú sekvenciu, obsahujúcu, napríklad, proteolyticky štiepené polohy (to znamená, Faktor Xa alebo trombín); a Y predstavuje karboxy-terminálnu skupinu Cys¹⁵¹ alebo jeden alebo viac karboxy-terminálnych zvyškov (zvyšok) aminokyselín zrelej hML alebo rozšírenia navyše. Polypeptidový ligand mpl alebo jeho fragment môže byť fuzovaný s heterologickým polypeptidom (chiméra). Preferovaný heterologický polypeptid je cytokinín, stimulačný faktor skupiny buniek alebo interleukín alebo jeho fragment, najmä kitligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF alebo LIF. Voliteľne preferovaný heterologický polypeptid je reťazec imunoglobínu, najmä ľudský IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM alebo ich fragmenty, obzvlášť obsahujúci konštantnú oblasť veľkého reťazca IgG.

Ďalší aspekt tohto vynálezu predstavuje zlúčenina obsahujúca jednotlivého agonistu mpl, ktorý je biologicky aktívny a je výhodne schopný stimulovať zavedenie značených nukleotidov (napr., ³H-tymidín) do DNA Ba/F3 - buniek závislých od IL-3 a transfekovaných s ľudským mpl. Agonista mpl môže byť biologicky aktívny ligand mpl a je výhodne schopný stimulácie zavedenia ³⁵S do obiehajúcich krvných doštičiek pri reakčnej skúške myších krvných doštičiek. Vhodný agonista mpl môže byť hML]₅3, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML a pML2 alebo ich fragmenty.

Ďalšou podstatou tohto vynálezu je zabezpečenie izolovanej protilátky schopnej viazať sa na ligand mpl. Izolovaná protilátka schopná viazať sa na ligand mpl môže byť voliteľne fúzovaná s druhým polypeptidom a protilátka alebo ich zmes sa môže použiť na izoláciu a čistenie ligandu mpl od počiatočných látok, ako to už bolo uvedené pre imobilizované mpl. V ďalšom aspekte tejto podstaty, tento vynález zabezpečuje metódu na detekciu ligandu mpl in vitro alebo in vivo zahrnujúcu kontakt protilátky so vzorkou, obzvlášť vzorkou séra, u ktorej predpokladáme, že obsahuje ligand a stanovenie, ak sa väzba s ligandom objaví.

V ďalších podstatách vynález zabezpečuje izolovanú molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu ligand mpl alebo jeho fragmenty, pričom táto molekula nukleovej kyseliny môže byť voliteľne značkovaná tak, že jej časť je detegovateľná a molekula nukleovej kyseliny má sekvenciu, ktorá je komplementárna k sekvencii molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ligand mpl, alebo hybridizuje za miernych až veľmi prísnych podmienok s tou istou molekulou nukleovej kyseliny. Preferované molekuly nukleových kyselín sú tie, ktoré kódujú ľudský, prasačí a myší ligand mpl a zahrnujú

RNA a DNA (obe genomické) a cDNA. V ďalších aspektoch tejto podstaty, molekula nukleovej kyseliny je DNA kódujúca ligand mpl a ďalej zahrnuje replikovateľný vektor, v ktorom je DNA operabilne pripojená na riadiace sekvencie rozoznávané hostiteľom, ktorý je transformovaný vektorom. DNA môže byť cDNA, ktorá má sekvenciu uvedenú na Obr. 1 5-3' (SEQ ID NO: 2), 3-5' alebo jej fragment. Tento aspekt ďalej zahrnuje hostiteľské bunky, najmä CHO bunky, transformované s vektorom a spôsob použitia DNA na účinnú produkciu ligandu mpl, výhodne zahrnuje expresiu cDNA kódujúcej ligand mpl v kultúre transformovaných hostiteľských buniek a znovuzískanie ligandu mpl z hostiteľských buniek alebo z hostiteľskej bunkovej kultúry. Týmto spôsobom pripravený ligand mpl je výhodne ľudský ligand mpl.

Vynález ďalej zahrnuje spôsob liečenia cicavcov, ktorí majú krvotvomé ochorenia, najmä trombocytopéniu, a to podávaním terapeuticky účinného množstva ligandu mpl cicavcom. Voliteľne môže byť ligand mpl podávaný s cytokinínom, najmä so stimulačným faktorom skupiny buniek alebo s interleukínom. Preferované stimulačné faktory skupiny buniek alebo interleukíny sú : kit-ligand (KL), LIF, GCSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 a IL-11. Vynález ďalej zahrnuje spôsob izolácie a čistenia TPO (ML) od mikroorganizmov, ktoré produkujú TPO, ktorý pozostáva z:

1. porušenia alebo lýzy buniek s obsahom TPO,

2. voliteľného separovania rozpustného materiálu od nerozpustného materiálu obsahujúceho TPO,

3. rozpustenia TPO z nerozpustného materiálu pomocou rozpúšťacieho tlmivého roztoku,

4. separácie rozpusteného TPO od ostatného rozpusteného a nerozpusteného materiálu,

5. refolding TPO v redox tlmivom roztoku, a

6. separácia vhodne preskladaného TPO od nepreskladaného TPO.

Proces zahrnuje pre rozpúšťanie nerozpustného materiálu s obsahom TPO použitie chaotropickej látky, pričom chaotropická látka sa vyberie zo soli guanidínu, tiokyanátu sodného alebo močoviny. Proces ďalej zahrnuje separáciu rozpusteného TPO od ostatných rozpustných a nerozpustných materiálov, ktorá môže prebiehať v jednom alebo vo viacerých stupňoch a môže to byť odstreďovanie, gélová filtrácia alebo reverzná fázová chromatografia. V stupni zahrnujúcom refolding TPO sa používa redox tlmivý roztok s obsahom oxidačného a redukčného činidla. Všeobecne, oxidačné činidlo je kyslík alebo zlúčenina obsahujúca minimálne disulfidickú väzbu a redukčné činidlo je zlúčenina, obsahujúca minimálne jeden voľný sulfhydryl. Výhodne sa oxidačné činidlo vyberie z oxidovaného glutatiónu (GSSG) a cystínu a redukčné činidlo sa vyberie z redukovaného glutatiónu (GSH) a cysteínu. Najlepším oxidačným činidlom je oxidovaný glutatión (GSSG) a redukčným činidlom je redukovaný glutatión (GSH). Je výhodné, keď je mólový pomer oxidačného činidla a redukčného činidla rovný alebo väčší ako 1. Redox tlmivý roztok obsahuje tiež detergent, výhodne vybraný z CHAPS a CHAPSO o koncentrácii maximálne 1 %. Redox tlmivý roztok obsahuje aj NaCl výhodne v koncentračnom rozsahu okolo 0,1-0,5 M a glycerín, výhodne s koncentráciou väčšou ako 15 %. pH redox tlmivého roztoku je okolo 7,5 - 9,0 a refoldingový krok sa vykonáva pri 4 stupňoch po dobu 12-48 hodín. V refoldingovom kroku sa produkuje biologicky aktívny TPO, v ktorom sa tvorí disulfidická väzba medzi Cys, ktorý je najbližšie k amino-terminálu, s Cys, ktorý je najbližšie ku karboxy-terminálu oblasti EPO.

Ďalej vynález zahrnuje spôsob čistenia biologicky aktívneho TPO od mikroorganizmov, ktorý pozostáva z:

1. uvoľnenia (rozpustenia) aspoň mimobunkovej membrány mikroorganiz-mov,

2. pôsobenia chaotropickým činidlom na lyzát obsahujúci TPO,

3. refoldingu TPO, a

4. separácie nečistôt a nepreskladaného TPO od vhodne preskladaného TPO.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje dedukovanú sekvenciu aminokyselín (SEQ ID NO: 1) ľudského ligandu mpl (hML) cDNA a kódujúcu nukleotidovú sekvenciu (SEQ ID NO: 2). Nukleotidy sú číslované na začiatku každého radu. Netranslatované oblasti 5' a 3' sú označené spodnými písmenami. Zvyšky aminokyselín sú číslované nad sekvenciou začínajúcou pri Ser 1 zo sekvencie zrelého mpl ligand (ML) proteínu. Hranice predpokladaného exón 3 sú označené šípkami a potenciálne N-glykozylačné polohy sú dané do rámčeku. Cysteínové zvyšky sú označené bodkou nad sekvenciou. Podčiarknuté sekvencie odpovedajú N-koncovej sekvencii určenej z ligandu mpl, vyčisteného z prasačej plazmy.

Obr. 2 ukazuje použitý postup zavedenia ligandu mpl ³H-tymidínu. Na určenie prítomnosti ligandu mpl z rozličných zdrojov sa mpl P Ba/F3 bunky udržiavali v hladnom stave (bez IL-3) počas 24 hodín vo vlhčenom inkubátore pri 37 °C v 5 % CO₂ a vzduchu. Vyhladované bunky sa umiestnili do 96-jamkových kultivačných misiek spolu alebo bez zriedených vzoriek a kultivovali sa 18 hodín v kultivačnom inkubátore buniek. 20 μί RPMI média bez séra obsahujúceho 1 pCi ³H-tymidínu sa pridalo do každej misky a vzorky sa ponechali v inkubátore 6-8 hodín. Bunky sa potom oddelili a nahromadili na 96-jamkových filtračných platniach a premyli vodou. Vzorky sa potom vyhodnotili.

Obr. 3 ukazuje vplyv pronázy, DTT a tepla na schopnosť APP stimulovať proliferáciu Ba/F3-w/>/ buniek. Na štiepenie APP pronázou, sa pronáza (Boehringer Mannheim) alebo albumín kravského séra spojili s Affi-gellO (Biorad) a jednotlivo inkubovali s APP počas 18 hodín pri 37°C. Potom sa oddelili odstreďovaním smoly a supematanty sa podrobili skúške. APP sa tiež ohrievalo na 80°C počas 4 min., alebo sa pripravilo 100 μΜ DTT a dialyzovalo sa oproti PBS.

Obr. 4 ukazuje elúciu aktivity ligandu mpl z PhenylToyopearl, Blue-Sepharose a Ultralink-iM^/ kolón. Frakcie 4-8 z kolóny afinity mpl boli frakcie aktivitných pikov eluovaných z kolóny.

Obr. 5 ukazuje SDS-PAGE eluované frakcie z Ultralink-mp/ kolóny. K 200 μί každej z frakcií 2-8 sa pridal pri -20°C 1 ml acetónu obsahujúci 1 mM HC1. Po troch hodinách pri -20°C sa vzorky odstredili a získané peletky sa premyli 2x s acetónom pri -20°C. Acetónové peletky sa potom rozpustili v 30 μί SDS-rozpúšťacieho tlmivého roztoku, vytvorilo sa 100 μΜ DTT a ohrievalo pri 90°C počas 5 minút. Vzorky boli potom rozpustené na 4-20 % SDSpolyakrylamidový gél a proteíny sa zviditeľnili zafarbením pomocou striebra.

Obr. 6 ukazuje elúciu aktivity ligandu mpl z SDSPAGE. Frakcia 6 z kolóny mp/-afinity sa rozdelila na 4-20 % SDS-polyakrylamidovom géle za neredukujúcich podmienok. Po elektroforéze bol gél rozdelený do 12 rovnakých častí a elektroeluovaný, ako je to uvedené v príkladoch. Elektroeluované vzorky sa dialyzovali do PBS a skúmali pri zriedení 1/20. Na kalibráciu gélu sa použilo 12 štandardov Novex Mark.

Obr. 7 ukazuje vplyv APP so spotrebovaným ligandom mpl na ľudskú megakaryocytopoézu. APP so spotrebovaným ligandom mpl sa pripravilo prechodom 1 ml cez 1 ml kolóny mpLafmity (700 pg mp/-IgG/ml NHS-superose, Pharmacia). Kultúry ľudských periférnych kmeňových buniek sa pripravili s 10 % APP alebo s 10 % APP so spotrebovaným ligandom mpl a kultivovali sa 12 dní. Megakaryocytopoéza sa zisťovala postupom uvedeným v príkladoch.

Obr. 8 ukazuje vplyv mpl-lgG na stimuláciu ľudskej megakaryocytopoézy pomocou APP. Kultúry ľudských periférnych kmeňových buniek sa pripravili v zriedení 10 % s APP a kultivovali sa 12 dní. V nultom, druhom a štvrtom dni sa pridalo mpl-IgG (0,5 pg) alebo ANP-R-IgG (0,5 pg). Po 12 dňoch bola vyhodnotená megakaryocytopoéza spôsobom uvedeným v príkladoch. V grafe sú vynesené priemerné hodnoty z dvojice vzoriek (namerané hodnoty sú uvedené v zátvorkách).

Obr. 9 ukazuje oba reťazce 390bp fragmentu ľudskej genomickej DNA kódujúcej ligand mpl. Ukázaná je dedukovaná sekvencia aminokyselín „exón 3“ (SEQ ID NO: 3), kódujúca sekvencia (SEQ ID NO:4) a jej komplement (SEQIDNO: 5).

Obr. 10 ukazuje dedukovanú sekvenciu aminokyselín zrelého ľudského ligandu mpl (hML) (SEQ ID NO: 6) a zrelého ľudského erytropoetínu (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Predpovedaná sekvencia aminokyselín pre ľudský ligand mpl je v jednom rade so sekvenciou ľudského erytropoetínu. Identické aminokyseliny sú orámčekované a pomlčkami sú označené zavedené medzery pre optimálne zoskupenia. Potenciálne polohy pre N-glykozyláciu sú podtrhnuté neprerušovanou čiarou pre hML a prerušovanou pre hEPO. Dva cysteíny, ktoré sú dôležité pre aktivitu erytropoetínu sú označené veľkou bodkou.

Obr. 11 ukazuje dedukované sekvencie aminokyselín izoforiem zrelého ľudského ligandu mpl hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) a hML4 (SEQ ID NO: 10). Identické aminokyseliny sú orámčekované a pomlčkami sú označené zavedené medzery pre optimálne zoskupenia.

Obr. 12A, 12B a 12C ukazujú vplyv ľudského ligandu mpl na proliferáciu buniek Ba/F3-wp/ (A), in vitro ľudskej megakaryocytopoézy meranej s použitím rádioznačenej myšej IgG monoklonálnej protilátky, špecifickej voči megakaryocytovému glykoproteínu GPIIbIII_a (B), a myšej trombopoézy, meranej v krvných platničkách reakčnou skúškou (C).

293 bunky boli počas noci transfekované metódou CaPO₄ (Gorman,C v DNA Cloning: A NewApproach 2:143-190 [1985]) so samotným vektorom pRK5, pRK5-hML alebo s pRK5-ML]₅3 (pRK5-ML]₅₃ sa generoval zavedením zastavovača kódu za zvyškom 153 z hML pomocou PCR). Kultúry sa kondiciovali počas 36 hodín a skúšali na stimuláciu proliferácie buniek Ba/F3-mp/ ako je uvedené v príklade 1 (A) alebo in vitro na ľudskú megakaryocytopoézu (B). Megakaryocytopoéza sa určila použitím ¹²⁵I rádioznačenej myšej IgG monoklonálnej protilátky (HP1-1D) na glykoproteín OPIIJIL špecifický voči megakaryocytom ako je uvedené (Grant a kol., Blood 69:1334-1339 [1987]). Vplyv čiastočne vyčisteného rekombinantu ML (rML) na in vivo tvorbu krvných doštičiek (C) sa určil s použitím reakčnej trombocytovej skúšky, uvedenej v McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-1012 (1973). Čiastočne vyčistený rML sa pripravil z 200 ml kondiciovanej kultúry obsahujúcej rekombinant ML. Kultúra prešla cez 2 ml kolónu Blue-Separose udržovanú v rovnováhe v PBS a kolóna sa premyla s PBS a eluovala s PBS, ktorý obsahoval 2M močoviny a 2M NaCl. Aktívne frakcie sa dialyzovali do PBS a pripravil sa 1 mg/ml s endotoxínom neobsahujúcim BSA. Vzorka obsahovala menej než jednu jednotku endotoxínu/ml. Myšiam sa injekčné podalo 64000, 32000 alebo 16000 jednotiek rML alebo samotný excipient. Každá skupina sa skladala zo 6 myší. Uvedená je stredná a štandartná odchýlka pre každú skupinu, p-hodnoty sa určili porovnaním mediánov 2 chvostového T-testu.

Obr. 13 porovnáva vplyv izoforiem a variant ľudského ligandu mpl v skúške proliferácie BaF3lmpl buniek. Skúšali sa hML, mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) a hML₁₅₃ pri rozličných riedeniach ako je uvedené v príklade 1.

Obr. 14A, 14B a 14C ukazujú dedukované sekvencie aminokyselín (SEQ ID NO: 1) ľudského ligandu mpl (hML) alebo ľudského TPO (hTPO) a kódujúcej sekvencie ľudskej genomickej DNA (SEQ ID NO: 11). Nukleotidy a zvyšky aminokyselín sú číslované na začiatku každého radu.

Obr. 15 ukazuje čistený 293-rhML₃₃₂ a čistený 293-rhML₁₅₃ pomocou SDS-PAGE.

Obr. 16 ukazuje sekvenciu nukleotidov: kódujúca cDNA (SEQ ID NO: 12) a dedukovaná sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 13) v otvorenom čítacom rámci pre izoformu myšej ML. Táto zrelá myšia izoforma ligandu mpl obsahuje 331 zvyškov aminokyselín, štyri sú menšie než zdanlivo celá dĺžka mML a preto je označená mML2. Nukleotidy sú číslované na začiatku každého radu. Zvyšky aminokyselín sú číslované nad sekvenciou počnúc Ser L Potenciálne vhodné polohy N-glykozylácie sú podčiarknuté. Zvyšky cysteínov sú označené bodkou nad sekvenciou.

Obr. 17 ukazuje sekvenciu cDNA (SEQ ID NO: 14) a predpovedanú proteínovú sekvenciu (SEQ ID NO: 15) izoformy tejto myšej ML (mML). Nukleotidy sú číslované na začiatku každého radu. Zvyšky aminokyselín sú číslované nad sekvenciou počnúc Ser L Zrelá myšia izoforma ligandu mpl obsahuje 335 zvyškov aminokyselín a predpokladá sa, že majú celú dĺžku ligandu mpl, označená je mML. Signálna sekvencia je označená prerušovaným podčiarknutím a pravdepodobný bod štiepenia je označený šípkou. Netranslatované oblasti 5' a 3' sú označené spodnými písmenami. Podčiarknuté sú dve miesta strát nukleotidov v dôsledku alternatívneho pozdĺžneho spájania (mML2 a mML3). Štyri cysteínové zvyšky sú označené bodkou. Sedem potenciálnych polôh N-glykozylácie je ohraničených rámčekom.

Obr. 18 porovnáva dedukovanú sekvenciu aminokyselín ľudskej ML izoformy hML3 (SEQ ID NO: 9) a myšiu ML izoformu označenú mML3 (SEQ ID NO: 16). Predpovedaná sekvencia aminokyselín pre ľudský ligand mpl je zoradená spolu so sekvenciou pre myší ligand mpl. Identické aminokyseliny sú v rámčekoch a pomlčkami sú označené zavedené medzery pre optimálne zoskupenie. Aminokyseliny sú číslované na začiatku každého radu.

Obr. 19 porovnáva predpovedané sekvencie aminokyselín zrelých ML izoforiem z myšieho ML (SEQ ID NO: 17), prasačieho ML (SEQ ID NO: 18) a ľudského ML (SEQ ID NO: 6). Sekvencie aminokyselín sú zoradené s medzerami indikovanými pomlčkami, zavedenými pre optimálne zoskupenie. Aminokyseliny sú číslované na začiatku každého radu, identické zvyšky sú ohraničené čiarou. Potenciálne polohy N-glykozylácie sú označené vytieňovaním a cysteínové zvyšky sú označené bodkou. Konzervovaný di-bázický aminokyselinový motív, ktorý predstavuje potenciálnu štiepnu polohu proteázy je podčiarknutý. Vynechanie štyroch aminokyselín vyskytujúce sa vo všetkých troch druhoch (ML2) je označené hrubým rámčekom.

Obr. 20 ukazuje sekvenciu cDNA (SEQ ID NO: 19) a predpovedanú sekvenciu zrelého proteínu (SEQ ID NO: 18) izoformy prasačieho ML (pML). Táto prasačia izoforma ligandu mpl, ktorá obsahuje 332 zvyškov aminokyselín a predpokladá sa, že majú celú dĺžku prasačieho ligandu mpl, je označená pML. Nukleotidy sú číslované na začiatku každého radu. Zvyšky aminokyselín sú číslované nad sekvenciou počnúc Ser 1.

Obr. 21 ukazuje sekvenciu cDNA (SEQ ID NO: 20) a predpovedanú sekvenciu zrelého proteínu (SEQ ID NO: 21) izoformy prasačieho ML (pML2). Táto prasačia izoforma ligandu mpl, ktorá obsahuje 328 zvyškov aminokyselín a je formou s vynechanými štyrmi zvyškami celodížkového prasačieho ligandu mpl, sa označuje ako pML2. Nukleotidy sú číslované na začiatku každého radu. Zvyšky aminokyselín sú číslované nad sekvenciou počnúc Ser L

Obr. 22 porovnáva dedukovanú sekvenciu aminokyselín celej dĺžky izoformy prasačej ML, označenej ako pML (SEQ ID NO: 18) a izoformy prasačej ML, označenej ako pML2 (SEQ ID NO: 21). Predpovedaná sekvencia aminokyselín pre pML je zoradená so sekvenciou pML2. Identické aminokyseliny sú zarámované a pomlčky indikujú zavedené medzery pre optimálne usporiadanie. Aminokyseliny sa číslujú na začiatku každého radu.

Obr. 23 ukazuje príslušné charakteristiky plazmidu pSVI5.ID.LL.MLORF („celá dĺžka“ alebo TPO₃₃₂) použitého na transfekovanie hostiteľských buniek CHO-DP12 pri príprave CHO-rhTPO₃₃₂.

Obr. 24 ukazuje príslušné charakteristiky plazmidu pSVI5.ID.LL.MLEPO-D („skrátený“ alebo TPO_I53) použitého na transfekovanie hostiteľských buniek CHO-DP12 pri príprave CHO-rhTPO₁₅₃.

Obr. 25A, 25B a 25C ukazuje na vplyv E. eo/í-rhTPO (Mef¹, 153) na krvné doštičky (A), bunky červených krviniek (B) a bunky bielych krviniek (C) pre obyčajné myši. Dvom skupinám 6 samičiek C57 B6 myší sa denne injekčné podával buď PBS tlmivý roztok alebo 0,3 pg E. colirhTPO (Met¹, 153) (100 μΐ sc.). V nultom dni a potom v 3.-7. dni sa im odobralo 40 μΐ krvi z očnicovej dutiny. Táto krv sa okamžite zriedila v 10 ml komerčným riedidlom a kompletná analýza krvi sa získala na prístroji Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Údaje sa uvádzajú ako stredné hodnoty + štandartná odchýlka od strednej hodnoty.

Obr. 26A, 26B a 26C ukazuje vplyv E. co/í-rhTPO (Met¹, 153) na krvné doštičky (A), na bunky červených krviniek (B) a bunky bielych krviniek (C) pre skoro smrteľne ožiarené myši. Dvom skupinám 10 myších samičiek C57 B6, ktoré boli skoro smrteľne ožiarené s 750 cGy gamma žiarenia zo zdroja ^l37Cs sa denne injekčné podával buď PBS tlmivý roztok alebo 0,3 pg E. coh-rhTPO (Mef¹, 153) (100 μΐ sc.). V nultom dni a v nasledujúcich odpovedajúcich dňoch sa odobralo 40 pl krvi z očnicovej dutiny. Táto krv sa okamžite zriedila v 10 ml komerčným riedidlom a na prístroji Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 sa získala kompletná analýza krvi. Údaje sa uvádzajú ako stredné hodnoty + štandartná odchýlka od stredných hodnôt.

Obr. 27A, 27B a 27C ukazujú vplyv CHO-rhTPO₃₃₂ na (A) krvné doštičky (trombocyty), (B) bunky červených krviniek (erytrocyty) a (C) bunky bielych krviniek (leukocyty) pre obyčajné myši. Dvom skupinám 6 myších samičiek C57 B6 sa denne injekčné podával buď PBS tlmivý roztok alebo 0,3 pg CHO-rhTPO₃₃₂ (100 μΐ sc.). V nultom a v 3.-7. dni sa odobralo 40 μΐ krvi z očnicových oblúkov. Táto krv sa okamžite zriedila v 10 ml komerčným riedidlom a na prístroji Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 sa zís kala kompletná analýza krvi. Údaje sa uvádzajú ako stredné hodnoty ± štandartná odchýlka od stredných hodnôt.

Obr. 28 ukazuje krivky dávkových odoziev pre rozličné formy rhTPO získané z rozličných radov buniek. Krivky dávkových odoziev sa zostrojili voči rhTPO z nasledujúcich bunkových radov: hTPO₃₃₂ z CHO (celá dĺžka z vaječníkových buniek čínskeho škrečka); hTPO_Mel-l ₁₅₃ (skrátená forma odvodená z E. coli s N-koncovým metionínom); hTPO₃₃₂ (celá dĺžka TPO z 293 ľudských buniek); 155 E.Coli bez metionínu (skrátená forma [rhTPO₁₅₅] bez terminálneho metioninu z E.coli). Skupinám 6 myších samičiek C57 B6 sa injekčné podávalo denne počas 7 dní rhTPO v závislosti na skupine. Každý deň sa odobralo z očnicovej dutiny 40 μΐ krvi a urobila sa kompletná analýza. Uvádzané údaje predstavujú maximálne pozorovateľné účinky pre rozličné spôsoby liečby, okrem (met 153 E.coli), ktoré sa pozorovali na 7. deň liečenia. Pre uvedenú „met 153 E.Colľ skupinu sa maximálny účinok pozoroval na 5. deň. Údaje sa uvádzajú ako stredné hodnoty ± štandartná odchýlka od stredných hodnôt.

Obr. 29 ukazuje krivky dávkových odoziev porovnávajúcich aktivitu celého reťazca a „oklieštených“ foriem produkovaného rhTPO v CHO bunkách so skrátenou formou z E.Coli. Skupinám 6 myších samičiek C57B6 sa denne injekčné podávalo 0,3 pg rhTPO rozličných typov. Na 2.-7. deň sa im odobralo 40 pl krvi z očnicových dutín a urobila sa kompletná analýza. Jednotlivé skupiny sa liečili s TPOi5₃, čo je skrátená forma TPO z E.Coli; TPO₃₃₂ (zmiešaná frakcia), čo je celodížkové TPO obsahujúce približne 80-90 % celých dĺžok a 10-20 % oklieštených foriem; TPO332(30K frakcia), čo je vyčistená oklieštená frakcia z pôvodnej zmiešanej frakcie; TPO332(70K frakcia), čo je vyčistená celodížková frakcia TPO z pôvodnej zmiešanej frakcie. Údaje sa uvádzajú ako stredné hodnoty ± štandartná odchýlka od stredných hodnôt.

Obr. 30 ukazuje mozaikovito priebeh K1RA ELISA skúšky pre meranie TPO. Obrázok ukazuje MPL/Rse.gD chiméru a podstatné časti rodičovských receptorov, rovnako ako konečný tvar (pravá časť obrázku) a prúdový diagram (ľavá časť obrázku) ukazujúci podstatné kroky pokusu.

Obr. 31 je prúdový záznam pre KIRA ELISA pokus ukazujúci každý krok postupu.

Obr. 32A-32L udávajú sekvencie nukleotidov (SEQ ID NO: 22) expresného vektora pSVI17.ID.LL použitý pri vytvorení Rse.gD v príklade 17.

Obr. 33 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMPl.

Obr. 34 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP21.

Obr. 35 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP151.

Obr. 36 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP202.

Obr. 37 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP 172.

Obr. 38 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP210.

Obr. 39 je tabuľka piatich najlepších vytvorených klonov TPO z pMP210 plazmidovej banky (SEQ ID NOS: 23, 24,25,26,27 a 28).

Obr. 40 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP41.

Obr. 41 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP57.

Obr. 42 predstavuje schematický postup prípravy plazmidu pMP251.

Podrobný opis vynálezu

I. Definície

Nasledujúce slová a slovné spojenia sa vzťahujú na definície, ktoré sú použité v opise, príkladoch a nárokoch.

„Chaotropická látka“ sa vzťahuje na zlúčeninu, ktorá vo vodných roztokoch, vo vhodných koncentráciách môže spôsobiť zmenu v priestorovej konfigurácii alebo tvaru proteínu aspoň čiastočným narušením síl potrebných na udržiavanie normálnej sekundárnej a terciámej štruktúry proteínu. Takéto zlúčeniny napríklad sú: močovina, guanidín.HCl a tiokyanát sodný. Aby sa uplatnil požadovaný účinok chaotropickej látky na proteín, je potrebné použiť vysoké koncentrácie, obvykle 4-9M, týchto zlúčenín.

„Cytokínín“ je generické označenie proteínov vznikajúcich z populácie jednej bunky, ktoré pôsobia na druhú bunku ako vnútrobunkové sprostredkovatele. Príkladmi takýchto cytokinínov sú lymfokiníny, monokiníny a známe polypeptidové hormóny. Medzi cytokiníny zahrnujeme rastový hormón, rastové faktory podobné inzulínu, ľudský rastový hormón, N-metionyl ľudský rastový hormón, kravský rastový hormón, paratyreoidný hormón, tyroxín, inzulín, proinzulín, relaxín, prorelaxín, glykoproteínové hormóny ako je folikulámy stimulačný hormón (FSH), tyroidný stimulačný hormón (TSH), leutinizačný hormón (LH), krvotvomý rastový faktor, hepatický rastový faktor, fibroblastový rastový faktor, prolaktín, placentámy laktogén, mullerian-inhibičná látka faktoru-α tumorovej nekrózy (TNF-a a TNF-β), myši s gonádotropínom spojený peptid, inhibín, aktivín, vaskulámy endotelový rastový faktor, integrín, nervové rastové faktory, ako je NGF-β, rastový faktor krvných doštičiek, transformujúce rastové faktory (TGFs), ako sú TGF-α a TGF-β, rastové faktory-I a -II podobné inzulínu, erytropoetín (EPO), osteoinduktívne faktory, interferóny ako sú interferón-α, -β a -γ, stimulačné faktory skupiny buniek (CSFs), ako sú CSF-makrofág (M-CSF), CSF-granulocyt-makrofág (GM-CSF) a CSF-granulocyt (G-CSF), interleukíny, ako sú IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 a ďalšie polypeptidové faktory zahrnujúce LIF, SCF a kitligand. Na potreby tohto vynálezu sa môžu použiť predchádzajúce zlúčeniny z prírodných zdrojov alebo z rekombinantných bunkových kultúr. Podobne, sem zahrnujeme aj ich biologické ekvivalenty, to znamená, líšiace sa v sekvencii aminokyselín o jednu alebo viac aminokyselín alebo v type alebo rozsahu glykozylácie.

„Ligand mpľ, „polypeptidový ligand mpľ, „ML“, „trombopoetín“ alebo „TPO“ sa v tomto vynáleze zameniteľné používajú a zahrnujú ľubovoľný polypeptid, ktorý má schopnosť viazať sa s mpl, členom superrodiny cytokinínových receptorov a má biologické vlastnosti ML ako je definované ďalej. Dôležitou biologickou vlastnosťou je schopnosť stimulovať zavedenie značkovaných nukleotidov (napr.: ³H-tymidínu) do DNA Ba/F3 buniek závislých na 1L-3 transfekovaných s ľudským mpl P. Ďalšou dôležitou biologickou vlastnosťou je schopnosť stimulovať zavedenie ³⁵S do obiehajúcich krvných doštičiek v reakčnej skúške s myšími krvnými doštičkami. Táto definícia zahrnuje polypeptid izolovaný zo zdroja ligandu mpl, ako je aplastická prasačia plazma opísaná v tomto vynáleze alebo z iného zdroja, ako sú iné živočíšne druhy, vrátane ľudí alebo pripravený rekombinantným alebo syntetickým spôsobom a vrátane variantných foriem, zahrnujúcich fiinkčné deriváty, fragmenty, alelomorfy, izoformy a ich analógy.

„Fragment ligandu mpľ alebo „TPO fragment“ je časť prirodzene sa vyskytujúceho zrelého celodížkového ligandu mpl alebo TPO sekvencia, ktorá má vynechaných jeden a

SK 282265 Β6 lebo viac zvyškov aminokyselín alebo karbohydrátových jednotiek. Vynechané zvyšky (zvyšok) aminokyselín sa môžu vyskytnúť v peptide na hociktorom mieste, vrátane buď v N-koncových alebo v C-koncových ukončeniach alebo vo vnútri. Fragment musí prebrať aspoň jednu biologickú vlastnosť z ligandu mpl. Fragmenty ligandov mpl majú typicky následnú sekvenciu minimálne 10,15, 20, 25, 30 alebo 40 zvyškov aminokyselín, ktoré sú identické sekvenciám ligandov mpl izolovaných z cicavcov a zahrnujúcich ligand, izolovaný z aplastickej prasačej plazmy alebo ľudský alebo myší ligand, najmä ich EPO-oblasť. Typické vzorky N-koncových fragmentov sú hML₁₅₃ alebo TPO(Meť' 1-153).

„Varianty ligandov mpľ alebo „sekvenčné varianty ligandov mpľ sú definované v tomto vynáleze tak, že predstavujú biologicky aktívny ligand mpl, definovaný nižšie, ktorý má menej než 100 % identitu sekvencie s ligandom mpl, izolovaným z rekombinantnej bunkovej kultúry alebo z aplastickej prasačej plazmy alebo s ľudským ligandom, ktorý má dedukovanú sekvenciu uvedenú na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1). Obvykle, biologicky aktívny variant ligandu mpl bude mať sekvenciu aminokyselín, ktorá má aspoň okolo 70 % identitu sekvencie aminokyselín s ligandom mpl izolovaným z aplastickej prasačej plazmy alebo so zrelým myším alebo ľudským ligandom alebo ich fragmentmi (pozri Obr. 1 [SEQ ID NO: 1 J), výhodne aspoň okolo 75 %, s väčšou výhodou aspoň okolo 80 %, s ešte väčšou výhodou aspoň okolo 85 %, ešte viac preferujúc hodnotu aspoň okolo 85 % a s najväčšou výhodou aspoň okolo 95 %.

„Chimerický ligand mpľ je polypeptid obsahujúci celodlžkový ligand mpl alebo jeden alebo viac jeho fragmentov, fúzovaný alebo pripojený k druhému heterologickému polypeptidu alebo k jednému alebo k viacerým jeho fragmentom. Chiméra prenáša aspoň jednu biologickú vlastnosť z ligandu mpl. Druhý polypeptid bude typicky cytokinín, imunoglobín alebo ich fragmenty.

Výrazy „izolovaný ligand mpľ, „vysokočistý ligand mpľ a „podstatne homogénny ligand mpľ sa používajú zameniteľné a znamenajú ligand mpl, ktorý bol vyčistený zo zdroja ligandu mpl alebo bol pripravený rekombinantným alebo syntetickým spôsobom a je bez ostatných peptidov alebo proteínov (1) získaním aspoň 15 a výhodne 20 zvyškov aminokyselín N-koncovej alebo vnútornej sekvencie aminokyselín s použitím spájajúceho sekvenátora alebo najlepšie zakúpeného obchodne dostupného sekvenátora aminokyselín alebo modifikovaného podľa publikovaných metód ku dňu prihlásenia tohto vynálezu, alebo (2) homogenizovaním pomocou SDS-PAGE za neredukujúcich alebo redukujúcich podmienok s použitím Coomassie blue alebo výhodne, striebornej farby. Homogenita tu znamená menej než okolo 5 % znečistenie inými zdrojovými proteínmi.

„Biologická vlastnosť“, keď je použitá v spojení s buď „ligand mpľ alebo „izolovaný ligand mpľ znamená buď trombopoetickú aktivitu alebo znamená in vivo efektorovú alebo antigénovú funkciu alebo aktivitu, ktorá je priamo alebo nepriamo zapríčinená alebo spôsobená ligandom mpl (či už v prirodzenom alebo v neprirodzenom tvare) alebo jeho fragmentom. Efektorové funkcie zahrnujú viazanie mpl a akúkoľvek nosičovu väzobnú aktivitu, agonizmus alebo antagonizmus mpl, hlavne prenos signálu proliferácie vrátane replikovania, regulačnú funkciu DNA, moduláciu biologickej aktivity ďalších cytokinínov, aktiváciu receptora (hlavne cytokinínu), deaktiváciu, reguláciu smerom nahor i nadol, rast alebo diferenciáciu buniek a podobne. Antigénová funkcia znamená zahrnutie epitopového alebo antigénového miesta, ktoré je schopné reakcie s protilátkou vyvinutou proti prirodzenému ligandu mpl. Hlavnou antigénovou funkciou polypeptidového ligandu mpl je, že sa viaže s afinitou aspoň okolo 10⁶1/mól s protilátkou, vyvinutou proti ligandu mpl a izolovanou z aplastickej prasačej plazmy. Obvykle, sa polypeptidy viažu s afinitou aspoň okolo 10⁷ 1/mól. Antigénovo aktívny polypeptidový ligand mpl je výhodne polypeptid, ktorý sa viaže s protilátkou, vzniktou voči ligandu mpl, ktorý má jednu z uvedených funkcií efektora. Protilátky, ktoré sa tu použili na definovanie „biologickej aktivity“ sú králičie polyklonálne protilátky, vznikajúce formulovaním ligandu mpl, izolovaného z rekombinantnej bunkovej kultúry alebo z aplastickej prasačej plazmy v kompletnom Freundovom adjuvans, pri podkožnom podaní formulácie injekciou a podporení imunoodozvy vnútroperitoneálnou injekciou formulácie až kým sa neustáli titer protilátky ligandu mpl.

„Biologicky aktívny“, keď sa použije v spojení buď s „ligandom mpľ alebo s „izolovaným ligandom mpľ, znamená ligand mpl, alebo polypeptid, ktorý vykazuje trombopoetickú aktivitu alebo podieľa sa na efektorovej funkcii ligandu mpl izolovaného z aplastickej prasačej plazmy alebo exprimovaného v rekombinantnej bunkovej kultúre opísanej v tomto vynáleze. Zásadná známa efektorová funkcia ligandu mpl alebo polypeptidu z hľadiska tohto vynálezu, je pripájanie sa k mpl a stimulácia zavedenia značených nukleotidov (³H-tymidín) do DNA buniek Ba/F3 závislých na IL-3 transfekovaných s ľudskou mpl P. Ďalšia známa efektorová funkcia ligandu mpl alebo polypeptidu z hľadiska tohto vynálezu je schopnosť stimulovať zavedenie ³⁵S do obiehajúcich krvných doštičiek v reakčnej skúške s myšími krvnými doštičkami. Ďalšia známa efektorová funkcia ligandu mpl je schopnosť stimulovať in vitro ľudskú megakaryocytopoézu, ktorá môže byť kvantifikovaná použitím rádioznačených monoklonálnych protilátok špecifických voči megakaryocytovému glykoproteínu GPII_bI II_a.

„Percento sekvenčnej identity aminokyselín“ s prihliadnutím k sekvencii ligandu mpl je v tomto vynáleze definované ako percento zvyškov aminokyselín v kandidátskej sekvencii, ktoré sú identické so zvyškami v sekvencii ligandu mpl izolovanom z aplastickej prasačej plazmy alebo myšieho alebo ľudského ligandu, ktorý má dedukovanú sekvenciu aminokyselín uvedenú na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) a to po zoradení sekvencii a zavedení medzier, ak je to potrebné, na dosiahnutie maximálnej sekvenčnej identity a bez nenásilných substitúcií ako časti sekvenčnej identity. Nesmú nastať žiadne N-koncové alebo C-koncové alebo vnútorné rozšírenia, vynechania alebo vkladania do sekvencie ligandu mpl, ktoré by ovplyvňovali sekvenčnú identitu alebo homológiu. Potom, typické biologicky aktívne polypeptidové ligandy mpl budú mať identické sekvencie, ktoré zahrnujú prepro-mp/ ligand, ρτο-mpl ligand a zrelý mpl ligand.

„Mikrosekvenovanie mpl ligandu“ sa môže vykonať ľubovoľným vhodným štandardným postupom, ktorý zabezpečuje dostatočnú citlivosť metódy. V jednom takomto spôsobe, sa veľmi vyčistené polypeptidy získané zo SDS gélov alebo z koncového stupňa HPLC, priamo sekvenovali automatizovanou Edmanovou (fenylizotiokyanát) degradáciou s použitím modelu 470A Applied Biosystems pre sekvenovanie v plynnej fáze, vybaveným so 120A fenyltiohydantoín (PTH) analyzátorom aminokyselín. Fragmenty ligandu mpl, pripravené chemickým (napr., CNBr, hydroxylamín, 2-nitro-5-tiokyanobenzoan) alebo enzymatickým (napr., trypsín, klostripaín, stafýlokoková proteáza) štiepením a potom čistením (HPLC) sa môžu sekvenovať podobným spôsobom. PTH aminokyseliny sa analyzovali s použitím ChromPerfect údajového systému (Justice Innova tions, Palo Alto, CA). Interpretácia sekvencie sa vykonala na počítači VAX 11/785 Digital Equipment Co., postupom, opísaným v Henzel a kol., J. Chromatography, 404:41-52 [1987]. Voliteľne, pomerné časti frakcií HPLC sa podrobili elektroforéze na 5-20 % SDS-PAGE, elektrotransféru na PVDF membráne (ProBlott, AIB, Foster City, CA) a vyfarbili s Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987], Špecifický proteín identifikovaný farebne sa odstránil z krvi a vykonalo sa Nkoncové sekvenovanie, uvedeným sekvenovaním v plynnej fáze. Pri vnútorných proteínových sekvenciách sa frakcie HPLC sušili za vákua (SpeedVac), resuspendovali vo vhodnom tlmivom roztoku a štiepili s brómkyánom, Lysšpecifickým enzýmom Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) alebo Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Po štiepení boli výsledné peptidy sekvenované ako zmes alebo po HPLC rozpustení na C4 kolóne vyvolané s gradientom propanolu v 0,1 % TFA prednostne voči sekvenovaniu v plynnej fáze.

„Trombocytopénia“ je definovaná počtom krvných platničiek nižších ako 150 x 10⁹ na liter krvi.

„Trombopoetická aktivita“ je definovaná ako biologická aktivita, ktorá zahrnuje urýchľovanie proliferácie, diferenciáciu a/alebo dozrievanie megakaryocytov alebo ich prekurzorov na takú formu týchto buniek, ktorá produkuje krvné doštičky. Táto aktivita sa môže merať rozličnými skúškami, ktoré zahrnujú in vivo skúšku reakčnej syntézy myších krvných doštičiek, skúšku indukcie povrchového antigénu bunky krvných doštičiek, meranú imuno-skúškou anti-krvných doštičiek (anti-GPIIJIL) pre bunkovú líniu megakaryoblastov (CMK) ľudskej leukémie a indukciu polyploidizácie v bunkovom rade megakaryoblastov (DAMI).

„Trombopoetín“ (TPO) je definovaný ako zlúčenina, ktorá má trombopoetickú aktivitu alebo je schopná zvyšovať u cicavcov počet sérových krvných doštičiek. TPO je výhodne schopné zvyšovania počtu endogénnych krvných doštičiek aspoň o 10 %, ešte s väčšou výhodou o 50 % a najvýhodnejšie je schopný zvyšovať počet krvných doštičiek u človeka na hodnotu väčšiu ako 150 x 10⁹ na liter krvi.

„Izolovaná mpl ligandová nukleová kyselina“ je RNA alebo DNA obsahujúca viac než 16, výhodne 20 alebo viac sekvenčných nukleových báz, ktorá kóduje biologicky aktívny ligand mpl alebo jeho fragment, je komplementárna k RNA alebo DNA alebo hybridizuje s RNA alebo DNA a zostáva stabilne viazaná za miernych až prísnych podmienok. Táto RNA alebo DNA neobsahuje aspoň jeden kontaminujúci zdroj nukleovej kyseliny, s ktorým sa normálne vyskytuje v prirodzených podmienkach a výhodne neobsahuje žiadnu RNA alebo DNA cicavcov. Výraz „neobsahuje aspoň jeden kontaminujúci zdroj nukleovej kyseliny, s ktorým sa normálne vyskytuje v prirodzených podmienkach“ zahrnuje prípad, keď je nukleová kyselina prítomná v zdrojovom materiáli alebo v prirodzených bunkách, aleje v rozličnej chromozómovej polohe alebo je inak obrátená vedľa sekvencie nukleových kyselín, nie tak, ako sa bežne nachádza v bunkách zdrojového materiálu. Príklad izolovanej mpl ligand nukleovej kyseliny je RNA alebo DNA, ktorá kóduje biologicky aktívny mpl ligand a ktorá má aspoň 75 % podiel sekvenčnej identity, preferovane aspoň 80 %, výhodne aspoň 85 %, s väčšou výhodou aspoň 90 % a najvýhodnejšie 95 % sekvenčnú identitu s ľudským, myším alebo prasačím mpl ligandom.

„Regulačné sekvencie“, keď sa vzťahuje na výraz, znamená DNA sekvencie potrebné na exprimovanie použiteľné spájanej kódujúcej sekvencie v jednotlivom hosti teľskom organizme. Regulačné sekvencie vhodné pre prokaryocyty, napríklad zahrnujú: promótorové, operátorove sekvencie, ribozóm viažuce miesto a pravdepodobne aj iné sekvencie, ktoré zatiaľ ešte nepoznáme. Je známe, že eukaryotické bunky využívajú promótory, polyadenylačné signály a zosilňovače.

„Operatívne spájaný“, keď sa vzťahuje na nukleové kyseliny znamená, že nukleové kyseliny sú dané do funkčného vzťahu sinou nukleokyselinovou sekvenciou. Napríklad, DNA presekvencie alebo sekrečnej vedúcej sekvencie je operatívne spojená s DNA polypeptidu, ak je exprimovaná ako preproteín, ktorý sa podieľa na sekrécii polypeptidu; promótor alebo zosilňovač je operabilne spojený s kódujúcou sekvenciou, ak ovplyvňuje transkripciu sekvencie; alebo ribozóm viažuce miesto je operabilne spojené s kódujúcou sekvenciou, ak je umiestnené tak, aby uľahčovalo transláciu. Vo všeobecnosti znamená „operatívne spojený“, že DNA sekvencie, ktoré sa majú spojiť sú v blízkosti, a v prípade sekrečnej vedúcej sekvencie blízko seba a v čítacom rámci. Avšak zosilňovače nemusia byť v blízkosti. Spojenie sa uskutočňuje ligáciou bežných reštrikčných miest. Ak takéto miesta neexistujú, použijú sa v súlade s bežnou praxou syntetické oligonukleotidové adaptory alebo linkery.

„Exogénny“, keď sa vzťahuje na element, znamená sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá je cudzia voči bunke alebo homologická voči bunke, ale v takej polohe v hostiteľskej bunkovej nukleovej kyseline, v ktorej sa element obvykle nenachádza.

„Bunka“, „bunková línia“ a „kultúra buniek“ sa používajú vzájomne zameniteľné, v tomto vynáleze, a také označenia zahrnujú všetkých potomkov buniek alebo línie buniek. Takto, napríklad, výrazy ako „transformanty“ a „transformované bunky“ zahrnujú predmetné primáme bunky a kultúry z nich odvodené, bez ohľadu na počet premien. Je tiež pochopiteľné, že všetky bunky z ďalších potomstiev nemusia byť presne identické, čo sa týka obsahu DNA a to v dôsledku zámerných alebo náhodných mutácií. Tiež sem patrí mutantné potomstvo, ktoré má rovnakú funkciu alebo biologickú aktivitu ako má pôvodná transformovaná bunka. V prípade, že dôjde k odlišným označeniam, bude to vyplývať z kontextu.

„Plazmidy“ sú autonómne rcplikovateľné kruhové molekuly DNA vlastniace nezávislý počiatok replikácie a v tomto vynáleze sú označené malým písmenom „p“, ktoré predchádzajú a/alebo za ním nasledujú veľké písmená a/alebo číslice. Podľa tohto patentu sú počiatočné plazmidy buď komerčne dostupné alebo verejne neobmedzene dostupné alebo sa môžu získať z takýchto dostupných plazmidov pomocou publikovaných postupov. Rovnako to môžu byť aj iné ekvivalenty plazmidov, ktoré sú známe priemerným odborníkom pracujúcim v tejto oblasti.

„Reštrikčné enzymatické štiepenie“, keď sa vzťahuje na DNA, znamená katalytické štiepenie vnútorných fosfodiesterických väzieb DNA s enzýmom, ktorý pôsobí iba v určitých polohách alebo miestach sekvencie DNA. Takéto enzýmy sa nazývajú „reštrikčné endonukleázy“. Každá reštrikčná endonukleáza rozlíši špecifickú DNA sekvenciu nazývanú „reštrikčné miesto“, ktoré vykazuje dvojitú symetriu. V tomto vynáleze použité rozličné reštrikčné enzýmy sú komerčne dostupné a ich reakčné podmienky, spolupôsobiace faktory a ďalšie požiadavky sa aplikovali tak, ako to určili dodávatelia týchto enzýmov. Bežné označenie reštrikčných enzýmov je pomocou skratiek, ktoré sa skladajú z veľkého písmena, nasledovaného ďalšími písmenami, ktoré reprezentujú mikroorganizmus, z ktorého bol každý reštrikčný enzým pôvodne získaný a potom číslicou, označujúcou špecifický enzým. Všeobecne, približne 1 pg plazmidu alebo fragmentu DNA sa použil s asi 1-2 jednotkami enzýmu v približne 20 pl tlmivého roztoku. Vhodné tlmivé roztoky a množstvá substrátov pre špecifické reštrikčné enzýmy špecifikuje výrobca. Obvykle sa používala inkubácia počas 1 hodiny pri 37 °C, ale môže sa prispôsobiť inštrukciám dodávateľov. Po inkubácii sa odstráni proteín alebo polypeptid extrakciou fenolom alebo chloroformom a štiepená nukleová kyselina sa separuje z vodnej fázy vyzrážaným etanolom. Po štiepení s reštrikčným enzýmom môže nasledovať hydrolýza terminálnych 5' fosfátov s bakteriálnou alkalickou fosfatázou, aby sa zabránilo spojeniu dvoch reštrikčné štiepených koncov fragmentu DNA a tým cyklizácii alebo vytvoreniu uzavretej slučky, ktorá by mohla prekážať zavedeniu ďalšieho fragmentu DNA na reštrikčné miesto. Pokiaľ nie je inak definované, po štiepení plazmidov nenasleduje 5' koncová defosforylácia. Postupy a reagenty pre defosforyláciu sú bežné, tak ako je uvedené v častiach 1.56-1.61 publikácie Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], „Získanie“ alebo „izolácia“ daného fragmentu DNA zo zmesi poštiepenej reštrikčnou endonukleázou znamená separáciu zmesi elektroforézou na polyakiylamide alebo na agare, identifikáciu požadovaného fragmentu porovnaním jeho pohyblivosti voči pohyblivosti označených fragmentov so známou molekulovou hmotnosťou, oddelenie gólovej časti obsahujúcej požadovaný fragment a separáciu gélu od DNA. Tento postup je všeobecne známy. Napríklad, udáva ho Lawn a kol., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981] aGoeddel akol., Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980].

„Southem analýza“ alebo „Southem bloting“ je metóda, ktorou sa potvrdzuje prítomnosť DNA sekvencií v zmesi DNA poštiepenej reštrikčnými endonukleázami alebo zloženie DNA a to hybridizáciou so známym označeným oligonukleotidom alebo fragmentom DNA. Typická Southem analýza zahrnuje separáciu zmesí poštiepenej DNA na agare elektroforézou, po nej nasleduje denaturácia DNA a prenos DNA na nitrocelulózu, nylon alebo iný vhodný membránový nosič pre analýzu rádioznačenou, biotinylovanou alebo enzymaticky značenou sondou ako je uvedené v častiach 9.37-9.52 uvedenej publikácie od Sambrooka a kol.

„Northem analýza“ alebo „Northem bloting“ je metóda, ktorá sa použila na identifikáciu RNA sekvencií, ktoré hybridizujú so známou sondou, ako je oligonukleotid, DNA fragment, cDNA alebo jej fragment alebo RNA fragment. Sonda je značená rádioizotopom ako je ³²P, alebo biotinyláciou alebo enzymaticky. Postup pri analýze RNA obvykle spočíva v jej separácii elektroforézou na agare alebo polyakrylamidovom géle, v prenose na nitrocelulózu, nylon alebo inú vhodnú membránu a v hybridizácií so sondou s použitím štandardných postupov, ktoré sú v tejto oblasti dobre známe, napríklad tých, ktoré sú uvedené v častiach 7.39-7.52 citovanej publikácie od Sambrooka a kol.

„Ligácia“ je proces tvorby fosfodiesterických väzieb medzi dvomi fragmentmi nukleových kyselín. Aby došlo k ligácii dvoch fragmentov, musia byť konce fragmentov vzájomne kompatibilné. V niektorých prípadoch, budú konce priamo kompatibilné po štiepení endonukleázou. Avšak, môže byť potrebné najprv premeniť kohézne konce, ktoré bežne vznikajú po štiepení endonukleázou, na otupené konce, ktoré sú vhodné na ligáciu. Proces otupenia koncov spočíva v spracovaní DNA vo vhodnom tlmivom roztoku po dobu aspoň 15 minút pri 15 °C približne s 10 jednotkami Klenowho fragmentu DNA polymerázy I alebo T4 DNA polymerázy v prítomnosti štyroch trifosfátov deoxy ribonukleotidu. DNA sa potom čistí fenol-chloroformovou extrakciou a vyzrážaním s etanolom. Fragmenty DNA, ktoré sú spolu ligované sa vložia do roztoku približne v ekvimolámych množstvách. Roztok ďalej obsahuje ATP, tlmivý prostriedok ligázy a ligázu ako je T4 DNA ligáza približne 10 jednotiek na 0,5 pg DNA. Ak je DNA vligovaná do nosiča, musí sa najprv nosič linearizovať štiepením s vhodnou reštrikčnou endonukleázou(ami). Potom sa linearizovaný fragment spracuje s bakteriálnou alkalickou fosfatázou alebo s črevnou teľacou fosfatázou, aby sa zabránilo samoligácii v priebehu tohto procesu.

„Príprava“ DNA z buniek, znamená izoláciu plazmidu DNA z kultúry hostiteľských buniek. Bežne používané metódy preparácie DNA sú široko a úzko rozsahové plazmidové preparácie uvedené v častiach 1.25-1.33 citovanej publikácie od Sambrooka a kol. Po preparácii sa DNA môže čistiť metódami dobre známymi v tomto obore, napríklad takými, ako sú uvedené v časti 1.40 citovanej publikácie od Sambrooka a kol.

„Oligonukleotidy“ sú krátko reťazcové, jednoducho alebo dvojito spletené polydeoxynukleotidy, ktoré sú chemicky syntetizované známymi metódami (ako sú známe z fosfotriesterovej, fosforitanovej alebo fosfoamiditovej chémie, s použitím postupov v tuhej fáze, ako sú uvedené v EP 266 032 zverejnenom 4. mája 1988 alebo postupom s využitím medziproduktov H-fosfonátu deoxynukleozidu ako to uvádza Froehler a kol., Nucl. Acids Res., 14:53995407 [1986]). Medzi ďalšie metódy patrí polymerázová reťazová reakcia, ktorá je definovaná v ďalšom a ďalšie samoiniciačné postupy a syntézy oligonukleotidov na tuhých nosičoch. Všetky tieto metódy sú uvedené v publikácii Engels a kol., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989). Tieto metódy sa používajú, ak je známa celá sekvencia nukleovej kyseliny génu alebo je dostupná sekvencia komplementárnej nukleovej kyseliny ku kódujúcemu reťazcu. Ak je teda známa cieľová sekvencia aminokyseliny, možno tiež usudzovať, že sú známe sekvencie potenciálnej nukleovej kyseliny a preferovaných kódujúcich zvyškov pre každý zvyšok aminokyseliny. Oligonukleotidy sa potom čistia na polyakrylamidových géloch.

„Polymerázová reťazová reakcia“ alebo „PCR“ sa vzťahuje na postup alebo metódu, v ktorej sa amplifikujú minimálne množstvá špecifických častí nukleovej kyseliny, RNA a/alebo DNA ako je uvedené v US Patente č. 4 683 195 vydanom 28. júla 1987. Všeobecne, je potrebné mať informáciu o koncoch (alebo ešte aj ďalej) oblasti, o ktorú sa zaujímame, takže tým môžu byť oligonukleotidové priméry určené; tieto priméry môžu byť identické alebo podobné, čo do sekvencie, so svojim párovým reťazcom, ktorý je amplifikovaný. 5' koncové nukleotidy dvoch primérov môžu koincidovať s koncami amplifikovaného templátu. PCR sa môže použiť na amplifikáciu špecifických RNA sekvencií, špecifických DNA sekvencií z celkovej genomickej DNA, a cDNA prepísanej z celkovej bunkovej RNA, bakteriofágových alebo plazmidových sekvencií a pod. (pozri : Mullis a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). V tomto vynáleze sa uvádza PCR ako jeden, ale nemusí to byť jediný príklad reakčnej metódy polymerázy nukleovej kyseliny na amplifikáciu pokusnej vzorky nukleovej kyseliny, ktorý zahrnuje použitie známej nukleovej kyseliny ako iniciátora a polymeráza nukleovej kyseliny amplifikuje alebo generuje špecifickú časť nukleovej kyseliny.

„Prísne podmienky“ sú také, pri ktorých sa 1. na vypieranie používa nízka iónová sila a vysoká teplota, napríklad, 0,015 M NaCl/0,0015 M citran sodný/0,1 %

NaDodSO₄ (SDS) pri 50 °C alebo 2. v priebehu hybridizácie sa používa denaturačné činidlo ako je formamid, napríklad, 50 % (obj./obj.) formamid s 0,1 % albumínom z kravského séra/0,1 % Ficoll/0,1 % polyvinalpyrolidón/50 mM fosforečnan sodný ako tlmivý prostriedok pri pH 6,5 s 750 mM NaCl, 75 mM citran sodný pri 42 °C. Iný príklad je použitie 50 % formamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citran sodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 6,8), 0,1 % pyrofosforečnan sodný, 5 x Denhardtov roztok, sonifikovaná DNA z lososích spermií (50 pg/ml), 0,1 % SDS a 10 % dextransulfát pri 42 °C, s premývaním pri 42 °C v 0,2 x SSC a 0,1 %SDS.

„Mierne prísne podmienky“ sú uvedené v Sambrook a kol., (vyššie citované) a zahrnujú použitie premývacieho roztoku a hybridizačných podmienok (teplota, iónová sila a % SDS) menej prísnejších ako bolo uvedené. Príklad mierne prísnych podmienok sú podmienky, ako sú inkubácia počas noci pri 37 °C v roztoku obsahujúcom : 20 % formamidu, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citran trojsodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtov roztok, 10 % dextransulfát a 20 μΐ/ml poštiepenej denaturovanej DNA z lososích spermií, a za tým premývanie filtrov s 1 x SSC pri teplote okolo 37-50 °C. Vyškolení odborníci vedia, ako nastavovať teplotu, iónovú silu a pod. a keď je potrebné aj prispôsobovať ďalšie faktory ako je dĺžka pokusu a pod.

„Protilátky“ (Abs) a „imunoglobulíny“ (Igs) sú glykoproteíny, ktoré majú rovnaké štrukturálne charakteristiky. Zatiaľ čo protilátky vykazujú väzbovú špecifičnosť proti špecifickým antigénom, imunoglobulíny zahrnujú aj protilátky a iné protilátkam podobné molekuly, ktoré nie sú špecifické voči antigénom. Napríklad, polypeptidy posledného druhu sú vytvárané v nízkych koncentráciách lymfatickým systémom a v zvýšených koncentráciách myelómami.

„Prirodzené protilátky a imunoglobulíny“ sú obvykle heterotetramerické glykoproteíny, ktoré majú okolo 150 000 daltonov, zložené z dvoch identických ľahkých (L) reťazcov a dvoch identických ťažkých (H) reťazcov. Každý ľahký reťazec je spojený s ťažkým reťazcom pomocou jednej kovalentnej disulfidickej väzby, zatiaľ čo medzi ťažkými reťazcami rozličných imunoglobulínových izotypov je rozličný počet disulfidických spojení. Každý ťažký a ľahký reťazec má tiež pravidelne umiestnené vnútroreťazcové disulfidické mostíky. Každý ťažký reťazec má na jednom konci variabilnú oblasť (V_H) a vedľa nej množstvo konštantných oblastí. Každý ľahký reťazec má variabilnú oblasť na jednom konci (V_L) a konštantnú oblasť na druhom konci; konštantná oblasť ľahkého reťazca je v jednom rade s prvou konštantnou oblasťou ťažkého reťazca a variabilná oblasť ľahkého reťazca je v jednom rade s variabilnou oblasťou ťažkého reťazca. Predpokladá sa, že rozhranie medzi variabilnými oblasťami ľahkého a ťažkého reťazca tvoria špecifické zvyšky aminokyseliny (Clothia a kol., J. Mol. Biol., 186:651-663 [1985]; Novotny a Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985]).

Výraz „variabilný“ sa vzťahuje na skutočnosť, že určité časti variabilných oblastí sa značne líšia v sekvencii medzi protilátkami a používajú sa pri viazaní a špecifičnosti každej jednotlivej protilátky s jej špecifickým antigénom. Avšak, variabilita nie je rovnako rozdelená do variabilných oblastí protilátok. Je koncentrovaná v troch segmentoch nazývaných oblasti determinujúce komplementaritu (CDRs) alebo hypervariabilné oblasti, obe sú vo variabilných oblastiach ľahkého a ťažkého reťazca. Najviac konzervované časti variabilných oblastí sa nazývajú kostra (FR). Všetky variabilné oblasti prirodzených ťažkých a ľahkých reťazcov zahrnujú štyri FR časti, prevažne prijímajúce konfiguráciu β-skladaného listu, spojené pomocou troch CDRs, ktoré tvoria slučkové spojenie a v niektorých prípadoch tvoria časť štruktúry β-skladaného listu. CDRs sa v každom reťazci držia pokope, v blízkosti vedľa FR častí a s CDRs z druhého reťazca prispievajú k vzniku antigénových väzbových miest protilátok (pozri Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institue of Health, Bethesda, MD [1987]). Konštantné oblasti sa priamo nezúčastňujú viazania sa protilátky na antigén, ale vykazujú rozličné efektorové funkcie, ako je participácia protilátky na bunkovej toxicite závislej od protilátky.

Štiepenie protilátok papaínom dáva dva identické fragmenty viažuce antigén, nazývané „Fab“ fragmenty, každý s jednoduchým miestom na viazanie antigénu a zvyškový „Fc“ fragment, ktorého názov odráža jeho schopnosť okamžitej kryštalizácie. Spracovanie s pcpsínom dáva F(ab')₂ fragment, ktorý má dve antigénové kombinované miesta a je ešte schopný viazať antigén krížovou väzbou.

„Fv“ je taký najmenší fragment protilátky, ktoiý v sebe zahrnuje celkovú schopnosť rozlíšenia antigénu a má väzbové miesto. Táto oblasť sa skladá z diméru variabilnej oblasti jedného ťažkého a jedného ľahkého reťazca v tesnom nekovalentnom spojení. Táto konfigurácia sa vyznačuje tým, že tri CDRs každej variabilnej oblasti dávajú interakciou antigénové väzbové miesto na povrchu V_H-V_L diméru. Šesť CDRs, spoločne, vytvára väzbovú antigénovú špecifičnosť protilátky. Avšak, dokonca jednoduchá variabilná oblasť (alebo polovica z Fv, ktorá obsahuje len tri CDRs špecifické voči antigénu) má rozlišovaciu a väzbovú schopnosť voči antigénu i keď s nižšou afinitou, než v prípade úplného väzbového miesta.

Fab fragment tiež obsahuje konštantnú oblasť ľahkého reťazca a prvú konštantnú oblasť (CH1) ťažkého reťazca. Fab' fragmenty sa líšia od Fab fragmentov pridaním niekoľkých zvyškov ku karboxylovému koncu CH1 oblasti ťažkého reťazca, ktoré obsahujú jeden alebo viac cysteínov z otočnej oblasti protilátky. Fab'SH je označenie, ktoré sa v tomto vynáleze používa pre Fab', v ktorom cysteínový zvyšok(ky) konštantných oblastí nesie voľnú tiolovú skupinu. Protilátkové fragmenty F(ab')₂ sa pôvodne pripravili ako párové fragmenty k Fab', ktoré majú medzi sebou otočné uchytené cysteíny. Chemické spájania protilátkových fragmentov sú tiež známe.

Výrazom „ľahké reťazce“ protilátok (imunoglobulínov) z ľubovoľných druhov stavovcov môžeme označiť jeden alebo dva zreteľne rozdielne typy nazývané kappa a lambda (λ), ktoré sú založené na sekvenciách aminokyselín a ich konštantných oblastiach.

V závislosti na sekvenciách aminokyselín konštantných oblastí ich ťažkých reťazcov rozdeľujeme imunoglobulíny do piatich skupín. Týchto päť hlavných skupín imunoglobulínov je; IgA, IgD, IgE, IgG a IgM a niektoré z nich možno deliť ďalej na podskupiny (izotypy), napr. IgG-1, IgG-2, IgG-3 a IgG-4; IgA-1 a IgA-2. Konštantné oblasti ťažkého reťazca, ktoré odpovedajú rozličným skupinám imunoglobulínov sa nazývajú a, delta, epsilon, γ a μ. Subunitové štruktúry a trojrozmerné konfigurácie rozličných skupín imunoglobulínov sú dobre známe.

Výraz „protilátka“ sa používa v najširšom zmysle a špecificky pokrýva jednoduché monoklonálne protilátky (zahrnujúc agonistické a antagonistické protilátky), protilátkové zlúčeniny s polyepitopickou špecifičnosťou a rovnako aj protilátkové fragmenty (napr. Fab, F(ab')₂ a Fv), pokiaľ vykazujú požadovanú biologickú aktivitu.

Výrazom „monokionálna protilátka“, ktorý sa používa v tomto vynáleze, pomenúvame protilátku, získanú z populácie skutočne homogénnych protilátok, to znamená,

SK 282265 Β6 jednotlivých protilátok, ktoré majú identickú populáciu, okrem pravdepodobne prirodzene sa vyskytujúcich mutácií, ktoré sa môžu nachádzať v minimálnych množstvách. Monoklonálne protilátky sú vysoko špecifické, pôsobia priamo voči jednoduchému antigénovému miestu. Ďalej, opačne voči prípravám konvenčnej (polyklonálnej) protilátky, ktoré typicky zahrnujú rozličné protilátky pôsobiace priamo proti rozličným činiteľom (epitopy), každá monoklonálna protilátka pôsobí priamo proti jednoduchému činiteľu na antigéne. Co sa týka ich špecifičnosti možno doplniť, že monoklonálne protilátky sú výhodné vtedy, keď sú syntetizované pomocou hybridnej kultúry nekontaminovanej inými imunoglobulínmi. Prívlastok „monoklonálny“ indikuje charakter takej protilátky, ktorá bola získaná zo skutočne homogénnej populácie protilátok a nie takej, ktorá bola pripravená ako vyžadovaná produkcia protilátky ľubovoľnou inou metódou. Napríklad, monoklonálne protilátky používané v súlade s týmto vynálezom možno pripraviť hybridnou metódou, ktorú prvýkrát opísal Kohler & Milstein, Náture, 256:495 (1975) alebo ich možno pripraviť metódami pomocou rekombinantnej DNA (pozri, napr., U.S. patent 4 816 567 [Cabilly a kol.]).

Monoklonálne protilátky, podľa tohto vynálezu, zahrnujú „chimerické“ protilátky (imunoglobulíny), v ktorých časť ťažkého a/alebo ľahkého reťazca je identická s (alebo homologická ku) odpovedajúcimi sekvenciami v protilátkach odvodených od daných druhov alebo patriaca k skupine alebo k podskupine jednotlivých protilátok, zatiaľ čo zvyšok reťazca (ov) je identický s (alebo homologický ku) odpovedajúcimi sekvenciami v protilátkach odvodených z iných druhov alebo patriacich k skupine alebo k podskupine iných protilátok, tiež aj k fragmentom takýchto protilátok, pokiaľ vykazujú požadovanú biologickú aktivitu (U.S. patent 4 816 567 (Cabilly a kol.); a Morrison a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

„Humanizované“ formy nehumánnych (napr. myších) protilátok sú chimerické imunoglobulíny, reťazce imunoglobulínov alebo ich fragmenty (ako je Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ alebo ďalšie antigén viažuce podsekvencie protilátok), ktoré obsahujú minimálnu sekvenciu odvodenú z nehumánneho imunoglobulínu. Väčšinou, humanizované protilátky sú ľudské imunoglobulíny (recipientné protilátky), v ktorých sú nahradené zvyšky z oblastí determinujúcich komplementaritu (CDR) recipientu zvyškami z CDR nehumánnych druhov (donorová protilátka) ako je myš, krysa alebo králik, ktoré majú požadovanú špecifičnosť, afinitu a kapacitu. V niektorých prípadoch môžu byť nahradené nosné zvyšky Fv ľudského imunoglobulínu odpovedajúcimi nehumánnymi zvyškami. Ďalej, humanizované protilátky môžu obsahovať zvyšky, ktoré sa nenachádzajú ani v protilátkovom rccipiente, ani v importovanom CDR alebo v hlavných (nosných) sekvenciách. Tieto modifikácie sa robia kvôli ďalšiemu prepracovaniu a optimalizácii prípravy protilátok. Humanizované protilátky budú teda obsahovať podstatne všetky z aspoň jednej alebo výhodne z dvoch variabilných domén, v ktorých všetky alebo podstatne všetky z CDR oblastí odpovedajú CDR oblastiam nehumánneho imunoglobulínu a všetky alebo podstatne všetky z FR oblastí sú FR oblasti zo zhodných sekvencií ľudského imunoglobulínu. Humanizovaná protilátka bude optimálne tiež obsahovať aspoň časť konštantnej oblasti (Fc) imunoglobulínu, výhodne ľudského imunoglobulínu. Doplňujúce informácie uvádzajú Jones a spol., Náture, 321: 522-525 (1986); Reichmann a spol., Náture, 332: 323-329 (1988); a Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

„Neimunogénny u človeka“ znamená, že pôsobením terapeuticky účinnej dávky polypeptidu vo farmaceutický vhodnom nosiči na príslušné ľudské tkanivo nedôjde k žiadnemu stavu senzitivity alebo rezistencie na polypeptid po druhom podaní polypeptidu po uplynutí príslušnej latentnej periódy (to znamená 8 až 14 dní).

II. Výhodné uskutočnenia vynálezu

Uprednostňovanými polypeptidmi tohto vynálezu sú najmä homogénny(e) polypeptid(y), vzťahujúci sa k mpl ligandu(om) alebo k trombopoetínu (TPO), ktoré sa dokážu viazať na mpl, člena superrodiny cytokínových receptorov a ktoré majú biologickú schopnosť stimulácie zavedenia rádionukleotidov (³H-tymidín) do DNA z Ba/F3 buniek závislých na IL-3 a transfekovaných ľudským mpl P. Viac preferovanými mpl ligandami sú izolované proteíny cicavcov, ktoré majú krvotvomú aktivitu, najmä sú aktívne pri tvorbe megakaryocytov a trombocytov, ďalej sú schopné stimulovať proliferáciu, dozrievanie a/alebo diferenciáciu nezrelých megakaryocytov alebo ich predchodcov, do zrelej formy produkujúcej krvné doštičky. Najviac preferovanými polypeptidmi podľa tohto vynálezu sú ľudský(é) mpl ligand(y) vrátane ich fragmentov, ktoré majú krvotvomú, megakaryocytotvomú alebo trombotvomú aktivitu. Týmto ľudským mpl ligandom môže chýbať glykozylácia. Ďalšie preferované ľudské mpl ligandy sú „EPO-doména“ hML, označovaná ako hMLi₅₃ alebo hTPO_IS3, skrátený tvar hML, označovaný ako hMI^₄₅ alebo hTPO₂₄₅ a zrelý polypeptid celej dĺžky, ktorý má sekvenciu aminokyselín uvedenú na Obr. 1 (SEQ ID NO; 1), označovaný ako hML, hML₃₃₂ alebo hTPO₃₃₂ a biologicky aktívny náhradný variant hML (R 153 A, R154A).

Voliteľnými preferovanými polypeptidmi podľa tohto vynálezu sú biologicky alebo imunologický aktívne varianty mpl ligandov vybrané z hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML a pML2.

Preferovanými polypeptidmi podľa tohto vynálezu sú biologicky aktívne varianty mpl ligandov, ktoré majú sekvenciu aminokyselín obsahujúcu aspoň 70 % rovnakej sekvencie aminokyseliny s ľudským mpl ligandom (pozri obr. 1 [SEQ ID NO: 1]), s myšacím mpl ligandom (pozri obr. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), s rekombinantným prasačím mpl ligandom (pozri Obr. 19 [SEQ ID NO: 18]) alebo s prasačím mpl ligandom izolovaným z aplastickej prasačej plazmy, výhodne aspoň 75 %, s väčšou výhodou aspoň 80 %, s ešte väčšou výhodou aspoň 85 %, ešte výhodnejšie je, keď je to aspoň 90 % a najvýhodnejšie, keď je to aspoň 95 %. Mpl ligand, izolovaný z aplastickej prasačej plazmy má nasledujúce charakteristiky:

1. Parciálne vyčistený ligand eluuje z gélovej filtračnej kolóny zaliatej buď s PBS, s PBS s obsahom 0,1 % SDS alebo s PBS s obsahom 4M MgCl₂ s Mr 60000 - 70000;

2. Aktivita ligandu sa ruší pronázou;

3. Ligand je stabilný pri nízkom pH (2,5), SDS do 0,1 % a 2M močovina;

4. Ligand je glykoproteín, s väzbou k rozličným lektínovým stĺpcovým kolónam;

5. Vysoko čistý ligand eluuje z neredukovaného SDSPAGE s Mr 25000 - 35000. Menšie množstvá tiež eluujú s Mr približne 18000 - 22000 a 60000;

6. Vysoko čistý ligand sa znovu rozpúšťa ako dublet s Mr 28000 a 31000;

7. Aminoterminálna sekvencia v pásmach 18000-22000, 28000 a 31000 je rovnaká ako - SPAPPACDPRLĽNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); a

8. Ligand sa viaže a eluuje z nasledujúcich afinitných stĺpcových kolón

Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether 650m Toyopearl, Butyl 650 m Toyopearl, Phenyl 650m Toyopearl a Phenyl-Sepharose

Najviac preferovanými polypeptidmi (mpl ligand) sú tie, ktoré sú kódované ľudskými génmi alebo cDNA so sekvenciou aminokyselín uvedenou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1).

Ďalšími preferovanými, v prírode sa vyskytujúcimi, biologicky aktívnymi polypeptidmi (mpl ligand), podľa tohto vynálezu, sú prepro-mpZ ligand, ρτο-mpl ligand, zrelý mpl ligand, mpl ligandové fragmenty a ich glykozylačné varianty.

Ďalšie preferované polypeptidy, podľa tohto vynálezu zahrnujú varianty a chiméry sekvencií mpl ligandu. Preferované varianty a chiméry sekvencií mpl ligandu sú biologicky aktívne varianty mpl ligandu, ktorých sekvencia aminokyselín je aspoň na 70 % identická so sekvenciou aminokyselín ľudského mpl ligandu alebo mpl ligandu izolovaného z aplastickej prasačej plazmy, výhodne aspoň 75 %, s väčšou výhodou aspoň 80 %, s ešte väčšou výhodou aspoň 85 %, ešte výhodnejšie je, keď je to aspoň 90 % a najvýhodnejšie, keď je to aspoň 95 %. Konkrétne preferovaným variantom mpl ligandu je variant N-koncovej domény hML (označený ako „EPO-doména“, kvôli jeho homologickej sekvencií s erytropoetínom). Preferovaná hML EPOdoména obsahuje asi prvých 153 zvyškov aminokyselín zrelej hML a označuje sa ako hMLi₅₃. Ľubovoľne preferovaný variant hML sekvencie obsahuje sekvenciu, v ktorej jeden alebo viac zvyškov jednobázickej alebo di-bázických aminokyselín v C-koncovej doméne je substituovaných s nebázickými zvyškami aminokyselín (napr. hydrofóbnymi, neutrálnymi, kyslými, aromatickými, Gly, Pro a pod.). Preferovaný variant hML sekvencie C-koncovej domény obsahuje sekvenciu, v ktorej Arg zvyšky 153 a 154 sú nahradené Ala zvyškami. Tento variant sa označuje ako hML₃₃₂(R153A, R154A). Alternatívne, preferovaný hML variant obsahuje buď hML₃₃₂ alebo hML|₅₃, v ktorých sú odstránené amino zvyšky 111-114 (QLPP alebo LPPQ) alebo sú nahradené rozličnými tetrapeptidovými sekvenciami (napr. AGAG a pod.). Predchádzajúce delečné mutanty sa označujú ako A4hML5₃₂ alebo A4hML₁₅₃.

Preferovaná chiméra vzniká spojením mpl ligandu alebo jeho fragmentu (definovaného ďalej) s heterologickým polypeptidom alebo s jeho fragmentom. Napríklad, hML₁₅₃ sa môže pripojiť k IgG fragmentu, čim sa zlepšia jeho sérové polčasy alebo k IL-3, G-CSF alebo EPO a vzniká molekula s vyššou trombotvomou alebo chimerickou krvotvornou aktivitou.

Alternatívne, preferovanou ľudskou mpl ligandovou chimérou je „chiméra ML-EPO domény“, ktorá obsahuje N-koncové 153 až 157 hML zvyšky, substituované jedným alebo viacerými (ale nie všetkými) zvyškami ľudskej EPO, ktoré sú približne zoradené na Obr. 10 (SEQ ID NO: 7). Konkrétna bloková sekvencia, ktorá sa vkladá do N-koncovej časti hML, môže obsahovať jedno alebo viac N-glykozylačných miest v polohách (EPO) 24-27, 38-40 a 83-85; jeden alebo viac zo štyroch predpokladaných amfipatických a-špirálových zväzkov v polohách (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 a 132-152; a ďalšie veľmi konzervované oblasti, vrátane N-koncových a C-koncových oblastí a polôh zvyškov (epo) 44-52 (pozri napr., Wen a spol., Blood, 82:1507-1516 [1993] a Boissel a spol., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Môžeme očakávať, že „chiméra ML-EPO domény“ bude mať zmiešanú trombotvomo-erytrotvomú (TEPO) biologickú aktivitu.

Ďalšie preferované polypeptidy, podľa tohto vynálezu zahrnujú fragmenty mpl ligandu, ktoré majú konzekutívnu sekvenciu aspoň 10, 15, 20, 25, 30 alebo 40 zvyškov aminokyselín, ktoré sú identické zo sekvenciami mpl ligandu izolovaného z aplastickej prasačej plazmy alebo ľudského mpl ligandu opísaného v tomto vynáleze (pozri Tabuľka 14, Príklad 24). Preferovaným fragmentom mpl ligandu je ľudský ML[1-X], kde X je 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 alebo 245 (pozri Obr. 1 [SEQ ID NO: 1] pre sekvencie zvyškov 1-X). Ďalšie preferované fragmenty mpl ligandu zahrnujú fragmenty, ktoré vznikajú v dôsledku chemickej alebo enzymatickej hydrolýzy alebo štiepenia čisteného ligandu.

Ďalším preferovaným aspektom tohto vynálezu je spôsob čistenia molekúl mpl ligandu, ktorý zahrnuje kontakt zdroja mpl ligandu, obsahujúceho molekuly mpl ligandu, s imobilizovaným polypeptidovým receptorom, najmä mpl alebo polypeptidom s pripojeným mpl, za podmienok, keď čistené molekuly mpl ligandu sa selektívne adsorbujú na imobilizovanom polypeptidovom receptore; premývanie imobilizovaného nosiča, aby sa odstránili neadsorbované látky a eluovanie čistených molekúl zo imobilizovaného polypeptidového receptora s elučným tlmivým roztokom. Zdrojom, ktorý obsahuje mpl ligand, môže byť plazma, pričom imobilizovaným receptorom je výhodne spojenie mplIgG.

Alternatívne, zdrojom obsahujúcim mpl ligand môže byť rekombinantná bunková kultúra, pričom koncentrácia mpl ligandu, buď v médiu kultúry alebo v bunkových lyzátoch, je vyššia než v plazme alebo v iných prírodných zdrojoch. V tomto prípade sa opísaná užitočná mpl-lgG imunoafinitná metóda obvykle nemusí používať, ale využívajú sa bežne známe spôsoby čistenia proteínov. Preferovaná čistiaca metóda, ktoré zabezpečí podstatne homogénny mpl ligand sa skladá z: odstránenia poškodených zvyškov buď hostiteľských buniek alebo rozložených fragmentov a to napríklad, odstreďovaním alebo ultrafiltráciou; koncentrovania proteínu pomocou komerčne dostupného koncentračného filtra proteínu; separácie ligandu od ostatných nečistôt v jednom alebo viacerých stupňoch, niektorou z nasledujúcich metód: imunoafinita, výmena iónov (napr. DEAE alebo náplne (lôžka) obsahujúce karboxymetyl alebo sulfopropylové skupiny), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectinSepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, HPLC s reverznou fázou (napr. silikagél s pripojenými alifatickými skupinami) alebo molekulové sitá Sephadex alebo separačná chromatografia na základe veľkostí molekúl; premývania etanolom alebo roztokom síranu amónneho. V ľubovoľnom z predchádzajúcich krokov sa môže použiť inhibítor proteázy, napríklad metylsulfonylfluorid (PMSF), na inhibíciu proteolýzy.

Ďalšou preferovanou podstatou tohto vynálezu je izolácia protilátky, schopnej sa viazať na mpl ligand. Preferovaná izolovaná protilátka mpl ligandu je monoklonálna protilátka (Kohler a Molstein, Náture, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboralory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon a spol., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; a Huse a spol., Science, 246:1275-1281 [1989]). Preferovanou izolovanou protilátkou mpl ligandu je protilátka, ktorá sa viaže s mpl ligandom s afinitou aspoň približne 10⁶1/mol. Viac preferovaná protilátka sa viaže s afinitou aspoň 10⁷1/mol. Najviac preferovanou protilátkou je taká protilátka, ktorá pôsobí proti mpl ligandu, ktorý má jednu z opísaných efektorových funkcií. Izolovaná protilátka, schopná viazať sa na mpl ligand, môže byť ľubovoľne pripojená k druhému polypeptidu a samotná protilátka alebo takáto jej zmes s polypeptidom sa môže použiť na izoláciu a čistenie mpl ligandu z jeho zdroja, ako už bolo opísané pre imobilizovaný mpl polypeptid. Z ďalších preferovaných aspektov tejto podstaty vynálezu, tento vynález zabezpečuje spôsob detekcie mpl ligandu in vitro alebo in vivo, ktorý zahrnuje kontakt protilátky so vzorkou, najmä so vzorkou séra, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje ligand a detekciu, pokiaľ dôjde k spojeniu ligandu s protilátkou.

V ďalších preferovaných príkladoch vynálezu, tento vynález zabezpečuje izoláciu molekuly nukleovej kyseliny, ktorá kóduje mpl ligand alebo jeho fragmenty, pričom molekula nukleovej kyseliny môže byť značená tak, aby bola detegovateľná alebo neznačená a molekula nukleovej kyseliny má sekvenciu, ktorá je komplementárna k molekule, alebo hybridizuje za silných alebo miernejších podmienok s molekulou nukleovej kyseliny, ktorá má sekvenciu kódujúcu mpl ligand. Preferovanou nukleovou kyselinou mpl ligandu je RNA alebo DNA, ktorá kóduje biologicky aktívny mpl ligand so 75% podielom sekvenčnej identity, výhodne aspoň s 80% podielom, výhodnejšie aspoň s 85% podielom, ešte výhodnejšie s 90 % podielom a najvýhodnejšie s 95% podielom sekvenčnej identity s ľudským mpl ligandom. Preferovanými izolovanými molekulami nukleovej kyseliny sú DNA sekvencie, kódujúce biologicky aktívny mpl ligand, vybrané z: a) DNA založenej na kódovaní oblasti génov mpl ligandu cicavcov (napr. DNA obsahujúca nekleotidovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) alebo jej fragmenty); b) DNA schopná hybridizácie s DNA podľa a) za, aspoň, miernejších podmienok; a c) degenerovaná DNA voči DNA podľa a) alebo b), pričom degenerácia sa týka genetického kódu. Dá sa očakávať, že nové mpl ligandy, tu opísané, môžu byť členmi rodiny ligandov alebo cytokínov, ktoré majú vhodnú sekvenčnú identitu, takže ich DNA môže hybridizovať s DNA na Obr. 1 (SEQ ID NO: 2) (alebo jej komplement alebo fragmenty) za slabých až stredne prísnych podmienok. Teda, ďalší aspekt tohto vynálezu zahrnuje DNA, ktorá hybridizuje za slabých až stredne prísnych podmienok s DNA, ktorá kóduje polypeptidy mpl ligandu.

V ďalšom preferovanom riešení tohto vynálezu je molekulou nukleovej kyseliny cDNA kódujúca mpl ligand a ďalej obsahujúca replikovateľný vektor, v ktorom je cDNA operabilne spojená s riadiacou sekvenciou rozoznávanou hostiteľom, ktorý je transformovaný vektorom. Tento aspekt ďalej obsahuje hostiteľské bunky transformované vektorom a spôsob použitia cDNA na ovplyvnenie prípravy mpl ligandu, ktorý sa skladá z expresie cDNA, kódujúcej mpl ligand v kultúre transformovaných hostiteľských buniek a oddelenia mpl ligandu od kultúry hostiteľských buniek. Týmto spôsobom pripravený mpl ligand je výhodne, v podstate homogénny ľudský mpl ligand. Preferované hostiteľské bunky na prípravu mpl ligandu sú bunky z vaječníkov čínskych škrečkov (CHO).

Tento vynález ďalej obsahuje preferovaný spôsob liečenia cicavcov, ktorí majú imunologické alebo krvotvomé ochorenia, najmä trombocytopéniu; ktorý zahrnuje podávanie terapeuticky účinného množstva mpl ligandu cicavcom. Mpl ligand sa môže podávať aj v kombinácii s cytokínom, najmä so stimulačným faktorom skupiny buniek alebo s interleukínom. Preferované stimulačné faktory skupiny buniek alebo interleukíny zahrnujú: kit-ligand, LIF, G-CSF,

GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7,

IL-8, IL-9 alebo IL-11.

III. Spôsoby prípravy

Dlhý čas viacerí autori predpokladali, že tvorba krvných doštičiek je regulovaná rozličnými dedičnými, špecifickými humorálnymi (telovými) faktormi. Zistilo sa, že dve rozličné cytokínové funkcie, označované ako megakaryocytový stimulačný faktor skupiny buniek (meg-CSF) a trombopoetín regulujú tvorbu megakaryocytov a trombocytov (Williams a spol., J. Celí Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams a spol., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; a Gordon a spol., Blood, 80:302-307 [1992]). Podľa tejto hypotézy meg-CSF stimuluje proliferáciu progenitómych megakaryocytov, zatiaľ čo trombopoetín primáme ovplyvňuje dozrievanie viac diferencovaných buniek a konečné uvoľňovanie krvných doštičiek. Indukcia a výskyt pôsobenia megCSF a trombopoetínu v plazme, v sére a v moči zvierat a ľudí, s pokračujúcimi trombocytopenickými príhodami, boli od roku 1960 dobre dokumentované v literatúre (Odeli a spol., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff a spol., Acta Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner a spol., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman a spol., N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva a spol., Exp. Hematol., 17:11221127 [1988]; Mazur a spol., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur a spol., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner a spol., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill a spol., Exp. Hematol., 20:354-360 [1992]; a Hegyi a spol., Int. J. Celí Cloning, 8:236-244 [1990]). Tieto pôsobenia sa označujú ako špecificky dedičné a odlišné od známych cytokínov (Hill R.J. a spol., Blood, 80:346 [1992]; EricksonMiller C.L. a spol., Brit. J. Haematol., 84:197-203 [1993]; Straneva a spol., Exp. Hematol. 20:4750 [1992]; a Tsukada J. a spol., Blood, 81:866-867 [1993]). Až dosiaľ neboli úspešné pokusy s vyčistením meg-CSF alebo trombopoetínu z trombocytopenickej plazmy alebo moču.

V súlade s uvedenými pozorovaniami, opisujúcimi trombocytopenickú plazmu, sa zistilo, že aplastická prasačia plazma (APP), získaná z ožiarených prasiat, stimuluje in vitro tvorbu ľudských megakaryocytov. Ďalej sa zistilo, že táto stimulačná aktivita sa dá zrušiť pomocou rozpustnej mimobunkovej c-mpl domény, čo potvrdzuje APP ako potenciálny zdroj predpokladaného mpl ligandu (ML). Ďalej bol úspešne vyčistený mpl ligand od APP a informácia o sekvencii aminokyselín sa použila na izoláciu myšacej, prasačej a ľudskej ML cDNA, ktoré sú sekvenčne homologické s erytropoetínom a pôsobia podobne ako meg-CSF a trombopoetín.

1. Čistenie a identifikácia mpl ligandu z plazmy

Ako už z predchádzajúceho vyplynulo, udáva sa, že aplastická plazma z rozličných biologických druhov obsahuje zložky, ktoré stimulujú in vitro krvotvorbu, avšak zatiaľ nebolo v literatúre uvedené, že by sa podarilo izolovať z plazmy nejaký krvotvomý stimulačný faktor. Jeden zdroj aplastickej plazmy pochádza z ožiarených prasiat. Táto aplastická prasačia plazma stimuluje in vitro ľudskú krvotvorbu. Aby sa určilo, či APP obsahovala mpl ligand, skúšal sa jej účinok meraním zavedenia ³H-tymidínu do Ba/F3 buniek transfekovaných ľudským mpl P (Ba/F3-mp/) a to postupom, uvedeným na Obr. 2. APP stimuluje zavedenie ³H-tymidínu do Ba/F3-mp/ buniek, ale nie do kontrolných Ba/F3 buniek (to znamená, netransfekovaných ľudským

SK 282265 Β6 mpl P). Nadväzne na to, sa nepozoroval žiadny účinok v normálnej prasačej plazme. Tieto výsledky ukazujú, že APP obsahovalo faktor alebo faktory, ktoré prenášajú proliferatívny signál pomocou mpl receptora a teda týmto receptorom musí byť prirodzený ligand. Tento záver bol ďalej podporený zistením, že pôsobením rozpustného mpl-lgG na APP sa blokujú stimulačné účinky APP na Ba/F3-m/>/ bunky.

Tento účinok APP sa zdá byť proteínového charakteru, pretože pronáza, DTT alebo teplo, pôsobia na tento účinok rozkladné (Obr. 3). Účinok APP bol tiež nedialyzovateľný. Účinok bol tiež stabilný pri nízkych hodnotách pH (pH 2,5 počas 2 hodín) a ukázalo sa, že sa viaže a eluuje z rozličných stĺpcových kolón s lcktínovou afinitou, čo indikuje, že ide o glykoproteín. Kvôli ďalšiemu objasneniu štruktúry a identity tohto účinku bolo potrebné ho oddeliť od APP s použitím mpl-IgG chiméry.

APP sa spracovalo postupom, uvedeným v príkladoch 1 a 2. Stručne, mpl ligand sa čistil pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie (HIC), imobilizovanej farebnej chromatografie a mpí-afinitnej chromatografie. Obnovenie účinku za každým stupňom je ukázané na obr. 4 a násobok čistenia je uvedený v Tabuľke 1. Celkové obnovenie účinku pomocou mp/-afinitnej stĺpcovej kolóny bolo približne 10 %. Frakcia s maximálnym účinkom (F6) z mpí-afinitnej stĺpcovej kolóny mala odhadnutý špecifický účinok 9,8 x x 10⁶ jednotiek/mg. Celkové čistenie z pôvodných 5 litrov APP bolo približne 4 x 10⁶-násobné (z 0,8 jednotky/mg po 3,3 x 10⁶ jednotiek/mg) s 83 x 10⁶-násobnou redukciou proteínu (z 250 g na 3 pg). Špecifický účinok ligandu eluovaného z mp/-afinitnej kolóny sa odhaduje na ~ 3 x 10⁶ jednotiek/mg.

Tabuľka 1

Purifikácia mpl ligandu

Vzoika	Objem mls	Proteín mg'ml	Jednotky nami	Jednotky	Špecif aktivita iednJmg	Výťažok	Násobok čistenia
APP	5000	50	40	200,000	0,8	-	1
Fenyl	4700	0,8	40	200,000	50	94	62
BlueSep.	640	0,93	400	256,000	430	128	538
Λ#>/(μ1) (Fxns 5-B	12	5 x 104	1666	20,000	3,300,000	10	4,100,000

Proteín sa určil Bradfordovou skúškou. Koncentrácia proteínu mp/-eluovaných frakcií 5-7 sa odhadla na základe intenzity sfarbenia SDS-gélu striebrom. Jedna jednotka je definovaná takým spôsobom, že spôsobí 50 % maximálnych stimulácií proliferácie Ba/F3 buniek.

Analýza eluovaných frakcií z mpl afinitnej stĺpcovej kolóny pomocou SDS-PAGE (4-20 %, Novex gél) prebiehala za redukujúcich podmienok, odkrývajúcich prítomnosť cf niekoľkých proteínov. Proteíny, ktoré spôsobujú najintenzívnejšie vyfarbenie striebrom, sa rozpúšťajú s hodnotami Mr 66000, 55000, 30000, 28000 a 18000-22000. Aby sa určilo, ktorý z týchto proteínov stimuluje proliferáciu Ba/F3-mpZ kultúr buniek, eluovali sa proteíny z gélu spôsobom, ako je opísané v príklade 2.

Výsledky tohto experimentu ukázali, že frakcia s vyšším účinkom eluovala z gélovej vrstvy, ktorá obsahovala proteíny s Mr 28000-32000, zatiaľ čo frakcia s nižším účinkom eluovala z gélovej vrstvy s hodnotou Mr 1800022000 (Obr. 6). Jediné viditeľné proteíny v týchto oblastiach mali Mr 30000, 28000 a 18000-22000. Na identifiká ciu a získanie proteínovej sekvencie pre rozpúšťané proteíny v tejto oblasti gélu (pásma 30, 28 a 18-22 kDA), boli tieto tri proteíny elektroblotované PVDF a sekvenované postupom, ako je uvedené v príklade 3. Získané aminoterminálne sekvencie sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Aminoterminálne sekvencie mpl ligandu

30 kOa 1 5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D PRLL.NKt.LRDD (H/5) V L H iG) R L	(SEQ ID NO; 30)
26 kDa 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLROD(H)VL(H)GR	(SED ID NO: 31)
18*22 kOl 1 5 10 X P A P P A X D P R ĽX (N) (KÍ	(SEQ 10 NO: 32)

Analýza pomocou počítača odhalila, že tieto sekvencie aminokyselín sú nové. Pretože všetky sekvencie boli rovnaké, možno predpokladať, že proteíny, zodpovedajúce 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa, sú len rozličnými formami toho istého nového proteínu. Ďalej, tento proteín mohol prichádzať do úvahy ako prírodný mpl ligand, pretože mal po rozpustení aktivitu v tej istej oblasti (28000-32000, SDS-PAGE, 4-20% gél). Navyše, čiastočne vyčistený ligand migroval s hodnotou Mr 17000-30000, keď sa podrobil gélovej filtračnej chromatografii s použitím kolóny Superose 12 (Pharmacia). Predpokladá sa, že rozličné Mr formy ligandu nastávajú v dôsledku rozdielov proteolýzy alebo glykozylácie alebo ďalších po- alebo predtranslačných modifikácií.

Ako už bolo skôr uvedené v literatúre, antimediátorová ľudská mpl RNA potlačila tvorbu megakaryocytov v kultúrach ľudskej kostnej drene obohatených s CD 34⁺ progenitórnymi bunkami a to bez ovplyvnenia diferenciácie ďalších krvotvomých bunkových rodových línií (Methia a spol., pozri vyššie). Z tohto výsledku vyplýva, že mpl receptor môže hrať úlohu pri ovplyvňovaní in vitro diferenciácie a proliferácie megakaryocytov. Aby sa ďalej objasnila úloha mpl ligandu pri tvorbe megakaryocytov, porovnal sa účinok APP a APP bez mpl ligandu in vitro na tvorbu ľudských megakaryocytov. Účinok APP na tvorbu ľudských megakaryocytov sa stanovil s použitím modifikácie testu tvorby megakaryocytov v kvapalnej suspenzii, opísanej v príklade 4. V tomto teste sa na ľudské periférne bunkové kmene (PSC) pôsobilo s APP a to pred a po mpZ-IgG afinitnej chromatografii. Pomocou '^I-anti-iyiIj protilátky (Obr.7) sa kvantifikovala βΡΠρΙΙΙ, stimulácia tvorby megakaryocytov. Ako vidieť z Obr. 7, 10 % APP spôsobila približne 3-násobnú stimuláciu, zatiaľ čo APP bez mpl ligandu nemala žiadny účinok. Jednoznačne, APP bez mpl ligandu nevyvoláva proliferáciu Ba/F3-mp/ buniek.

V ďalšom experimente rozpustný ľudský mpl-lgG po pridaní v nultom, druhom a v štvrtom dni ku kultúram obsahujúcim 10 % APP neutralizoval stimulačné účinky APP na tvorbu ľudských megakaryocytov (obr,8). Z týchto výsledkov vyplýva, že mpl ligand hrá úlohu pri regulácii tvorby ľudských megakaryocytov a teda môže byť užitočný pri liečení trombocytopénie.

2. Molekulárne klonovanie mpl ligandu

Vychádzajúc z aminoterminálnej sekvencie aminokyselín získanej z 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa proteínov (pozri tabuľku 2,), sa vytvorili zásoby dvoch degenerovaných oligonukleotidových primérov, ktoré sa použili na amplifikáciu prasačej genómovej DNA pomocou PCR. Je logické, že ak sa aminoterminálna sekvencia aminokyselín kódovala jednoduchým exónom, potom sa mohla očakávať dĺžka správneho PCR produktu 69 bp. Našiel sa fragment DNA s touto veľkosťou a klonoval sa do pGEMT. Na Obrázku 5 sú uvedené sekvencie oligonukleotidových PCR prímérov a tri klony. Sekvencia aminokyselín (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) peptidu, kódovaná medzi PCR primármi, bola rovnaká ako sekvencia, ktorá sa získala proteínovým aminoterminálnym sekvenovaním prasačieho ligandu (pozri zvyšky 9-17 pre 28 a 30 kDa sekvencie prasačieho proteínu).

Syntetický oligonukleotid, založený na sekvencii PCR fragmentu, sa použil na skríning, v knižnici ľudských genómových DNA. Na báze sekvencie PCR fragmentu sa navrhol a syntetizoval 45bp oligonukleotid, označený ako pR45. Tento oligonukleotid má nasledovnú sekvenciu: 5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQIDNO: 34)

Tento deoxyoligonukleotid sa použil na skríning v knižnici ľudských genómových DNA v Xgeml2 pri miernych podmienkach hybridizácie a premývania, podľa Príkladu 6. Pozitívne klony sa vybrali, plaky sa vyčistili a analyzovali sa reštrikčným mapovaním a Southemovým prenosom. Fragment 390 bp EcoRI-Xbal, ktorý hybridizoval na 45-mémy oligonukleotid, sa klonoval do pBluescript SK-. DNA sckvenovanie tohto klonu potvrdilo, že bola izolovaná DNA kódujúca ľudský homológ prasačieho mpl ligandu. Sekvencia ľudskej DNA a sekvencia dedukovanej aminokyseliny sú uvedené na Obr. 9 (SEQ ID NOS: 3 & 4). Predpovedané polohy intrónov v genómovej sekvencii sú indikované šípkami a definujú predpokladaný exón („exón 3“).

Na základe ľudskej „exón 3“ sekvencie (príklad 6) sa syntetizovali oligonukleotidy zodpovedajúce 3' a 5' koncom sekvencie exónu. Tieto dva priméry sa použili pri PCR reakciách s využitím chemického vzora cDNA, pripravenej z rozličných ľudských tkanív. Očakávaná veľkosť správneho PCR produktu bola 140 bp. Po analýze PCR produktov na 12% polyakrylamidovom géle, sa detegoval DNA fragment očakávanej veľkosti v knižniciach cDNA, ktoré boli pripravené z ľudských dospelých obličiek, 293 fetálnych obličkových buniek a cDNA pripravené z ľudskej fetálnej pečene.

Ďalej sa uskutočnil skríning vo fetálnej pečeňovej cDNA knižnici (7x10⁶ klonov) v lambda DR2 a to pomocou toho istého 45-členného oligonukleotidu, ktorý sa použil na rovnakú činnosť v ľudskej genómovej knižnici a fetálnej pečeňovej cDNA knižnici pri miernych podmienkach hybridizácie. Vybrali sa pozitívne klony, vyčistili sa plaky a veľkosť inzertu sa určila pomocou PCR. Jeden kloň s veľkosťou inzertu 1,8 kb sa vybral na ďalšiu analýzu. S použitím postupov opísaných v Príklade 7 sa získali nukleotidy a sekvencie dedukovanej aminokyseliny ľudského mpl ligandu (hML). Tieto sekvencie sú uvedené na Obr. 1 (SEQID NOS: 1 &2).

3. Štruktúra ľudského mpl ligandu (hML)

Sekvencia cDNA ľudského mpl ligandu (hML) (obr. 1 [SEQ ID NO: 2]) obsahuje 1774 nukleotidov, ukončených poly(A) koncom (chvostom). Tento obsahuje 215 nukleotidov z 5' netranslátovanej sekvencie a z 3' netranslátovanej oblasti 498 nukleotidov. Predpokladaný iniciačný kodón v nukleotidovej polohe (216-218) je so súhlasnou sekvenciou výhodný pre eukaryotickú translačnú iniciáciu. Základná štruktúra má dĺžku 1059 nukleotidov, kódovaných 353 polypeptidovými zvyškami aminokyselín, začínajúc od nukleotidovej polohy 220. N-koniec predpovedanej sekvencie aminokyselín je veľmi hydrofóbny a pravdepodobne zodpovedá signálnemu peptidu. Počítačová analýza predpovedanej sekvencie aminokyselín (von Heijne a spol., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) indikuje potenciálne štiepne, miesto na signálnu peptidázu medzi zvyškami 21 a 22. Štiepenie v tejto polohe by mohlo uvoľniť zrelý polypetid s 332 zvyškami aminokyselín začínajúci s aminoterminálnou sekvenciou, ktorá bola získaná z mpl ligandu, vyčisteného z prasačej plazmy. Predpovedaná neglykozylovaná molová hmotnosť ligandu z 332 zvyškov aminokyselín je okolo 38 kDa. Má 6 potenciálnych N-glykozylačných polôh a 4 cysteínové zvyšky.

Porovnanie sekvencie mpl ligandu so sekvenčnou databázou Genbank ukázalo 23% zhodnosť medzi 153 aminoterminálnymi zvyškami zrelého ľudského mpl ligandu a ľudského erytropoetínu (Obr. 10 [SEQ ID NOS: 6 & 7]). Keď zoberieme do úvahy konzervatívne substitúcie, potom táto oblasť hML má 50% podobnosť s ľudským erytropoetínom (hEPO). Aj hEPO, aj hML obsahujú štyri cysteiny. Tri zo štyroch cysteínov sú konzervované v hML, vrátane prvého a posledného cysteínu. Experimenty prostredníctvom miestne špecifickej mutagenézy ukázali, že prvý a posledný cysteín erytropoetínu tvorí disulfidovú väzbu, ktorá sa vyžaduje pre správnu funkčnosť (Wang, F.F. a spol., Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). Analogicky, prvý a posledný cysteín z hML môže tiež tvoriť kritickú disulfidovú väzbu. V hML nie je konzervovaná žiadna glykozylačná poloha. Všetky potenciálne N-väzbové glykozylačné polohy v hML sú umiestnené v karboxyterminálnej časti hML polypeptidu.

Podobne ako v hEPO, hML mRNA neobsahuje zhodnú polyadenylačnú sekvenciu AAUAAA, ani regulačný prvok AUUUA, ktorý je prítomný v 3' netranslátovaných oblastiach mnohých cytokínov a predpokladá sa, že ovplyvňuje stabilitu mRNA (Shawet a spol., Celí, 46:659-667 [1986]). Z analýzy northem blotingu vyplývajú nízke hladiny samotného 1,8 kb hML RNA prepisu, vo fetálnej a dospelej pečeni. Po dlhšej expozícii možno detegovať slabšie väzby tej istej veľkosti v dospelých obličkách. Na porovnanie, sa ľudský erytropoetín nachádza vo fetálnej pečeni a v odozve na hypoxiu aj v dospelých obličkách a pečeni (lacobs a spol., Náture, 313:804.809 [1985] a Bondurant a spol., Molec. Celí. Biol., 6:2731-2733 [1986]).

Je potrebné objasniť dôležitosť C-koncovej oblasti hML. Vychádzajúc z prítomnosti šiestich potenciálnych polôh pre N-väzbovú glykozyláciu a schopnosť ligandu viazať sa v kolóne s lektínovou afinitou, bude táto oblasť hML pravdepodobne glykozylovateľná. V niektorých experimentoch s gélovou elúciou sa pozorovalo účinné rozpúšťanie s Mr okolo 60000, ktoré môže reprezentovať celú dĺžku glykozylovanej molekuly. C-koncová oblasť môže potom pôsobiť na stabilizáciu a zvýšenie polčasu obehu hML. V prípade erytropoetínu má neglykozylovaná forma in vitro úplnú biologickú aktivitu, ale má významne redukovaný plazmový polčas voči glykozylovanému erytropoetinu (Takeuchi a spol., J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990]; Narhi a spol., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] a Spivack a spol., Blood, 7:90-99 [1989]). C-koncová doména hML obsahuje dve sekvencie dibázických aminokyselín [Arg-Arg spojenie v polohách 153-154 a 245-246], ktoré môžu slúžiť ako potenciálne polohy úpravy. Štiepenie v týchto polohách môže byť vhodné na uvoľnenie foriem 30, 28 a 18-22 kDa z ML izolovaného z APP. Je významné, že Arg^-Arg^ sekvencie nasledujú po doménach ML podobných erytropoetínu. Tieto pozorovania indikujú, že úplná dĺžka ML môže pred stavovať proteínový prekurzor, ktorý podlieha limitovanej proteolýze za uvoľňovania zrelého ligandu.

4. Izoformy a varianty ľudského mpl ligandu

Izoformy alebo alternatívne spojené formy ľudského mpl ligandu sa detegovali pomocou PCR v ľudskej dospelej pečeni. Stručne, priméry sa syntetizovali zodpovedajúco voči každému koncu, čo sa týka vybraných vnútorných oblastí kódujúcej sekvencie ML. Tieto priméry sa použili v RT-PCR na amplifikáciu RNA z ľudskej dospelej pečene, ako bolo uvedené v príklade 10. Okrem formy s úplnou dĺžkou, označenou ako hML, sa pozorovali alebo odvodili aj tri ďalšie formy, označené ako hML2, hML3 a hML4. Zrelé odvodené sekvencie aminokyseliny všetkých štyroch izoforiem sú uvedené na Obrázku 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10). V polohe 700 chýba v hML3 116 nukleotidov, čo vyplýva z chýbajúcich aminokyselín a z posunu. cDNA teraz kóduje zrelý polypeptid, ktorý má dĺžku 265 aminokyselín a odchyľuje sa od hML sekvencie pri aminokyselinovom zvyšku 139. Nakoniec, hML4 má odstránený nukleotid 12 po polohe nukleotidu 618 (tiež sa našla v myšacích a prasaČích sekvenciách [pozri ďalej]) a aj odstránenie 116 bp, ktoré sa našlo aj v hML3. Hoci žiadne klony, okrem odstránenia 12 bp (po nukleotide 619), neboli izolované u ľudí (označené ako hML2), táto forma pravdepodobne existuje, pretože takéto izoformy boli identifikované aj u myši, aj u prasaťa (pozri ďalej) a pretože boli identifikované v spojení s odstránením 116 nukleotidu v hML4.

Aj náhradný variant hML, v ktorom di-bázická Arg₁₅₃Arg₁₅₄ sekvencia sa nahradila dvoma alanínovými zvyškami a aj „EPO-doménová“ skrátená forma hML sa vytvorili, aby sa stanovilo, či pre biologickú aktivitu bola potrebná úplná dĺžka ML. Di-bázický sekvenčný náhradný variant Arg₁₅₃-Arg₁₅₄, označovaný ako hML(R153A, R154A), sa vytvoril s použitím PCR, ako je uvedené v Príklade 10. „EPO-doménová“ skrátená forma, hMLi₅₃, sa tiež vytvorila s použitím PCR pomocou zavedenia stop-kodónu po Argl53.

5. Expresia rekombinantného ľudského mpl ligandu (rhML) do prechodne transfekovaných ľudských embryonálnych obličkových (293) buniek

Aby sa potvrdilo, že klonovaná ľudská cDNA kódovala ligand pre mpl, exprimoval sa ligand v 293 bunkách cicavcov za regulácie pomocou bezprostredného cytomegalovírusového počiatočného promótora, s použitím vektorov expresie pRK5-hML alebo pRK5-hML₁₅₃. Zistilo sa, že supematanty z prechodne transfekovaných ľudských embryonálnych obličkových 293 buniek stimulujú zavedenie ³Htymidínu do Ba/F3-mp/ buniek, ale nie do rodičovských Ba/F3 buniek (obr. 12A). Médium z 293 buniek transfekované so samotným vektorom pRK nemalo tento účinok. Pridanie mpl-lgG k médiu ruší túto stimuláciu (výsledky nie sú doložené). Z týchto výsledkov vyplýva, že klonovaná cDNA kóduje funkčný ľudský ML (hML).

Aby sa určilo, či „EPO-doména“ mohla samotná viazať a aktivovať mpl, exprimovala sa v 293 bunkách skrátená forma hML, rhML₁₅₃. Zistilo sa, že supematanty z transfekovaných buniek mali aktivitu podobnú ako supematanty z buniek, exprimujúcich úplnú dĺžku hML (obr. 12A), čo indikuje, že C-koncová doména ML nie je potrebná na viazanie a aktiváciu c- mpl.

6. Mpl ligand stimuluje tvorbu megakaryocytov a trombocytov

Rovnako ako forma rekombinantnej hML s úplnou dĺžkou rhML aj forma so skrátenou rhML₁₃₃, stimulovali in vitro tvorbu ľudských megakaryocytov (obr. 12B). Tento účinok sa pozoroval v neprítomnosti iných exogénne pridaných krvotvomých rastových faktorov. Okrem IL-3, z testovaných krvotvomých rastových faktorov jedine ML mal tento účinok. IL-11, IL-6, IL-1, erytropoetín, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM a GM-CSF nemali účinok na tvorbu megakaryocytov, keď sa separátne testovali týmito skúškami (výsledky nie sú doložené). Tento výsledok ukazuje, že ML má megakaryocytovú stimulačnú aktivitu a určuje úlohu ML pri regulácii tvorby megakaryocytov.

Ukázalo sa, že tie účinky, ktoré vedú k tvorbe trombocytov a nachádzajú sa v plazme trombocytopenických živočíchov, stimulujú tvorbu krvných doštičiek v myšacej reakcii v teste trombocytózy (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1010 [1973] a McDonald a spol., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976]). Pri tomto pokuse majú myši akútnu trombocytopéniu, vyvolanú použitím špecifického séra, ktoré pôsobí proti krvným doštičkám, z čoho vyplýva predpovedateľná vyvolaná trombocytóza. Takéto imunotrombocytové myši sú odolnejšie voči vonkajším účinkom podobným trombopoetínu, než normálne myši (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:10061010 [1973]), rovnako ako exhypoxické myši sú citlivejšie na erytropoetín, než normálne myši (McDonald a spol., J. Lab. Clin. Med., 77:134-143 [1971]). Aby sa určilo, či rML stimuluje in vivo tvorbu krvných doštičiek, injekčné sa podal myšiam s vyvolanou trombocytózou čiastočne vyčistený rhML. Potom sa kvantifikoval počet krvných doštičiek a zavedenie ³⁵S do krvných doštičiek. Podanie injekcie s 64000 alebo 32000 jednotkami rML u myší významne zvýšilo počet krvných doštičiek, konkrétne, o ~20 % zvýšilo počet krvných doštičiek (p=0,0005, resp. 0,0001) a o ~40 % zvýšilo inkorporáciu ³⁵S do doštičiek (p=0,003) u liečených myší oproti kontrolným myšiam, ktoré dostali injekciu iba samotného excipientu (Obr. 12C). Táto hladina stimulácie je porovnateľná s hladinou, ktorá bola pozorovaná u IL-6 v rovnakom pokuse (výsledky nie sú doložené). Liečenie s 16000 jednotkami rML nepreukázalo významnú stimuláciu tvorby krvných doštičiek. Tieto výsledky ukazujú, že ML stimuluje tvorbu krvných doštičiek v závislosti od veľkosti dávky a teda má podobný účinok ako trombopoetin.

Ďalej sa tiež transfekovali 293 bunky s ďalšími pripravenými izoformami hML, ktoré už boli opísané vyššie a supematanty sa testovali s využitím Ba/F3-mp/ proliferačného testu (pozri Obr. 13). hML2 a hML3 nemali v tejto skúške detegovateľný účinok, avšak účinok hML(R153A, R154A) bol podobný účinku hML a hMLis₃ , čo ukazuje, že pôsobenie v di-bázických polohách Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ nie je ani potrebné, ale nie je ani škodlivé na sledovaný účinok.

7. Tvorba megakaryocytov a mpl ligand

Na základe literárnych údajov sa predpokladalo, že tvorba megakaryocytov je regulovaná na rozmanitých bunkových úrovniach (Williams a spol., J. Celí. Physiol., 110:101-104 [1982] a Williams a spol., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Tento poznatok je založený na pozorovaniach, že určité krvotvomé rastové faktory stimulujú proliferáciu predchodcov megakaryocytov, zatiaľ čo sa zdá, že iné faktory ovplyvňujú hlavne dozrievanie. Výsledky uvedené v tomto vynáleze ukazujú, že ML ovplyvňuje aj proliferatívny, aj dozrievací faktor. Skutočnosť, že ML stimuluje proliferáciu predchodcov megakaryocytov podporujú rozličné dôkazy. Po prvé, APP stimuluje aj proliferáciu, aj dozrievanie ľudských megakaryocytov in vitro a táto stimulácia je úplne inhibovaná pomocou mpl-lgG (obr. 7 a 8). Ďalej, inhibícia tvorenia kolónie megakaryocytov po mocou c-mpl antimediátorových oligonukleotidov (Methia a spol., Blood, 82:1395-1401 [1993]) a zistenie, že c-mpl môže transdukovať proliferatívny signál v bunkách, do ktorých bol transfekovaný (Škoda a spol., EMBO, 12:26452653 [1993] a Vigon a spol., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]) tiež indikuje, že ML stimuluje proliferáciu. Zdanlivá exprimácia c-mpl v priebehu všetkých stupňov diferenciácie megakaryocytov (Methia a spol., Blood, 82:1395-1401 [1993]) a schopnosť rekombinantného ML rýchlo stimulovať tvorbu krvných doštičiek in vivo ukazuje, že ML tiež ovplyvňuje dozrievanie. Dostupnosť rekombinantného ML umožňuje spoľahlivo vyhodnotiť jeho úlohu pri regulácii tvorby megakaryocytov a trombocytov a rovnako jeho potenciálny účinok na ďalšie krvotvomé línie.

8. Izolácia ľudského mpl ligandového (TPO) génu

Klony ľudskej genómovej DNA génu TPO sa izolovali skríningom ľudskej genómovej knižnice v 1-Geml2 s pR45 a to za pomerne prísnych podmienok alebo za veľmi prísnych podmienok s fragmentom zodpovedajúcim 3' polovici ľudskej cDNA, kódujúcej mpl ligand. Izolovali sa dva prekrývajúce sa lambda klony merajúce 35 kb. Dva prekrývajúce sa fragmenty (BamHl a EcoRI), obsahujúce úplný TPO gén, sa subklonovali a sekvenovali (pozri obr. 14A, 14B a 14C).

Štruktúra ľudského génu sa skladá zo 6 exónov so 7 kb genómovej DNA. Rozhrania všetkých spojení exón/intrón sú konzistentné so zhodným motívom, ktorý bol určený v génoch cicavcov (Shapiro, M. B., a spol., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). Exón 1 a exón 2 obsahujú 5' netranslátovanú sekvenciu a počiatočné štyri aminokyseliny signálneho peptidu. Zvyšok sekrečného signálu a prvých 26 aminokyselín zrelého proteínu sa kódujú v exóne 3. Celá karboxylová doména a netranslátovaná 3', rovnako ako ~50 aminokyselín domény podobnej erytropoetínu, sa kódujú v exóne 6. Štyri aminokyseliny, obsiahnuté v delécii pozorovanej v hML-2 (hTPO-2), sa kódujú na konci 5' exónu 6.

Analýza ľudskej genómovej DNA pomocou Southem blotu ukazuje, že gén pre TPO je prítomný v jednej kópii. Lokalizácia chromozómov v géne sa určila fluorescentnou in situ hybridizáciou (FISH), ktorou sa mapovali chromozómy 3q27-28. ⁹

9. Expresia a purifikácia TPO z 293 buniek

Príprava a purifikácia ML alebo TPO z 293 buniek je podrobne opísaná v Príklade 19. Stručne, cDNA zodpovedajúca celému otvorenému čítaciemu rámcu TPO sa získala pomocou PCR s použitím pRK5-hmp/ I. PCR produkt sa čistil a klonoval medzi reštrikčné polohy Clal a Xbal plazmidu pRK5tkneo (ide o odvodený vektor od pRK5, modifikovaný na exprimovanie génu, odolného voči neomycínu, reguláciou pomocou kinázy tymidínu), pričom sa získal vektor pRK.5tkneo.ORF (vektor kódujúci celý otvorený čítací rámec).

Druhý vektor kódujúci homologickú doménu EPO sa generoval rovnakým spôsobom, ale sa použili rozdielne priméry PCR, pričom sa získal konečný tvar označený ako pRK5-tkneoEPO-D.

Týmito dvoma vektormi sa transfekovali ľudské embryonálne obličkové bunky a to CaPO₄ metódou a selektovali sa odolné klony voči neomycínu, ktoré sa nechali rásť až do splynutia. Pomocou Ba/F3- mpl proliferačnej skúšky sa exprimovali z týchto klonov ML_15J alebo ML₃₃₂ v kondiciovaných médiách.

V príklade 19 je opísané čistenie rhML₃₃₂. Stručne, 293-rhML₃₃₂ kondiciované médium sa použilo v Blue-Sepharose (Pharmacia) kolóne, kde sa potom premylo tlmivým roztokom obsahujúcim 2 M močoviny. Kolóna sa eluovala tlmivým roztokom obsahujúcim 2 M močoviny a 1 M NaCl. Celý eluát zachytený z Blue-Sepharose kolóny sa potom priamo aplikoval do WGA-Sepharose kolóny, premyl 10-násobným objemovým množstvom tlmivého roztoku, než bol objem kolóny, ktorý obsahoval 2 M močoviny a IM NaCl a eluoval s tým istým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,5 M N-acetyl-D-glukozamín. Eluát z WGA-Sepharose kolóny sa aplikoval do C4-HPLC kolóny (Synchrom, Inc.) a diskontinuálne eluoval propanolom. Pomocou SDS-PAGE vyčistený 293-rhML₃₃₂ migruje ako široký pás v oblasti 68-80 kDa gélu (pozri obr. 15).

V príklade 19 je tiež opísané čistenie rhML₁₅₃. Stručne, 293-rhML₁₅₃ kondiciované médium sa rozpustilo na BlueSepharose kolóne rovnako, ako bolo opísané pre rhML₃₃₂. Eluát z Blue-Sepharose sa priamo aplikoval do mpl-afinitnej kolóny, spôsobom ako už bolo opísané. RhML₁₅₃, ktorý eluoval z mpZ-afinitnej kolóny, sa čistil a homogenizoval s použitím C4-HPLC kolóny za rovnakých podmienok ako sa použili pri rhML₃₃₂. RhML|₅₃ vyčistené pomocou SDS-PAGE sa rozdeľuje do dvoch hlavných a dvoch malých pásov s hodnotami Mr ~ 18000-22000 (pozri Obr. 15)·

10. Myšací mpl ligand

Pomocou PCR, gélovým čistením a rádioaktívnym značením v prítomnosti ³²P-dATP a ³²P-dCTP, sa získal DNA fragment, zodpovedajúci kódujúcej oblasti ľudského mpl ligandu. Táto sonda sa použila na skríning 10⁶ klonov myšacej pečeňovej cDNA knižnice v XGTIO. Myšací kloň (Obr. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]) obsahujúci 1443 základných párových inzertov sa izoloval a sekvenoval. Predpokladaný iniciačný kodón v nukleotidovej polohe 138-141 mal zhodnú sekvenciu so sekvenciou, ktorá je priaznivá pre eukaryotickú translačnú iniciáciu (Kozák, M. J. Celí Biol., 108:229-241 [1989]). Táto sekvenciu definuje otvorený čítací rámec 1056 nukleotidov, čo predpovedá primárny translačný produkt 352 aminokyselín. Tento otvorený čítací rámec je lemovaný 137 nukleotidmi na 5' konci a 247 nukleotidmi na 3' koncovej netranslátovanej sekvencie. Nenachádza sa tam žiadne poly(A) ukončenie (chvost) po netranslátovanej oblasti 3', čo indikuje, že kloň pravdepodobne nie je úplný. N-koniec predpovedanej sekvencie aminokyselín je veľmi hydrofóbny a pravdepodobne predstavuje signálny peptid. Počítačová analýza (von Heijne, G., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) indikuje potenciálnu štiepnu polohu pre signálnu peptidázu a to medzi zvyškami 21 a 22. Štiepenie v tejto polohe by mohlo uvoľniť zrelý polypeptid 331 aminokyselín (35 kDa), identifikovaný ako mML₃₃₁ (alebo mML2 kvôli potrebe, vyplývajúcej z ďalšieho textu). Sekvencia obsahuje 4 cysteíny, všetky konzervované v ľudskej sekvencii a sedem potenciálnych N-glykozylačných polôh, z ktorých 5 je konzervovaných v ľudskej sekvencii. Podobne ako pri hML, všetkých sedem potenciálnych N-glykozylačných polôh sa nachádza v C-koncovej časti proteínu.

Pri porovnaní s ľudským ML sa pozorovala významné zhoda aj nukleotidov, aj dedukovaných sekvencii aminokyselín v „EPO-doménach“ týchto ML. Avšak keď sa zoradili dedukované sekvencie aminokyselín ľudskej a myšacej ML, zistilo sa, že myšacia sekvencia má odstránený tetrapeptid medzi zvyškami 111-114, zodpovedajúci odstráneniu 12 nukleotidov po polohe nukleotidu 618, s ktorým sa môžeme stretnúť aj pri ľudskej (pozri vyššie), aj pri prasačej (pozri nižšie) cDNA. Preto sa odskúšali dodatkové klony na detegovanie pravdepodobných izoforiem myšacej ML. Jeden kloň kódoval polypeptid, pozostávajúci z dedu

SK 282265 Β6 kovanej sekvencie 335 aminokyselín, ktorý obsahoval „chýbajúci“ tetrapeptid LPLQ. Predpokladá sa, že táto forma je úplnou dĺžkou myšacej ML a označuje sa ako mML alebo mMLj₃5. Nukleotid a dedukovaná sekvencia aminokyselín pre mML sú uvedené na Obr. 17 (SEQ ID NOS: 14 & 15). Tento cDNA kloň pozostáva z 1443 základných párov, za ktorými sa nachádza poly(A) chvost. Jeho súčasťou je otvorený čítací rámec s veľkosťou 1068 bp, lemovaný 134 bázami 5' konca a 241 bázami 3' koncových netranslátovaných sekvencii. Očakávaný iniciačný kodón leží v nukleotidovej polohe 138-140. Otvorený čítací rámec kóduje predpovedaný proteín 356 aminokyselín, z ktorých prvých 21 sú veľmi hydrofóbne a pravdepodobne použiteľné ako sekrečný signál.

Nakoniec sa izoloval tretí myšací kloň, sekvenoval sa a zistilo sa, že obsahuje 116 nukleotidovú deléciu, čo zodpovedá hML3. Táto myšacia izoforma sa potom premenovala na mML3. Porovnanie dedukovaných sekvencii aminokyselín týchto dvoch izoforiem ukazuje Obr. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

Celková identita sekvencii aminokyselín medzi ľudskou a myšacou ML (Obr. 19 [SEQ ID NOS: 6 & 17]) je 72 %, ale táto homológia nie je rovnomerná. Oblasť definovaná ako „EPO-doména“ (aminokyseliny 1-153 ľudskej sekvencie a 1-149 myšacej sekvencie) je lepšie konzervovaná (86 % homológia), než karboxyterminálna oblasť proteínu (62 % homológia). Z toho môže ďalej vyplývať, že len „EPO-doména“ je dôležitá pre biologickú aktivitu proteínu. Pozoruhodné je, že z dvoch motívov di-bázických aminokyselín, ktoré sa našli v hML, je iba ten di-bázický motív, ktorý sa nachádza ihneď po „EPO-doméne“ (pozícia zvyšku 153-154) v ľudskej sekvencii, prítomný aj v myšacej sekvencii. Toto je v súlade s predpokladanou možnosťou, že úplná dĺžka ML môže reprezentovať proteínový prekurzor, ktorý podlieha limitovanej prateolýze za uvoľňovania zrelého ligandu. Podobne proteolýza medzi Arg₁₅₃-Arg₁5₄ môže uľahčiť vyčistenie hML.

Expresný vektor, obsahujúci celú kódujúcu sekvenciu mML, sa prechodne transfekoval do 293 buniek ako je opísané v príklade L Kondiciované médium z týchto buniek stimulovalo inkorporáciu ³H-tymidínu do Ba/F3 buniek exprimujúc buď myšací alebo ľudský mpl, ale nemalo žiaden účinok na rodičovskú bunkovú líniu (bez mpl). Z toho vyplýva, že klonovaná myšacia ML cDNA kóduje funkčný ligand, ktorý je schopný aktivovať aj myšací, aj ľudský ML receptor (mpl).

11. Prasačí mpl ligand

Prasačia ML (pML) cDNA sa izolovala pomocou RAČE PCR ako je opísané v Príklade 13. PCR cDNA produkt s veľkosťou 1342 bp sa našiel v obličkách a subklonoval. Niektoré klony sa sekvenovali a na kódovanie sa našiel prasačí mpl ligand 332 aminokyselinových zvyškov, označený ako pML (alebo pML₃₃₂), ktorého nukleotid a dedukovaná sekvencia aminokyselín je uvedená na obr. 20 (SEQ ID NOS: 18 & 19).

Druhá forma, označená ako pML2, kódujúca proteín s deléciou 4 aminokyselinového zvyšku (zvyšky 228 aminokyselín) bola tiež identifikovaná (pozri Obr. 21 [SEQ ID NO: 21]). Porovnanie sekvencii aminokyselín pre pML a pML2 ukazuje, že posledný tvar je zhodný, okrem toho, že má odstránený tetrapeptid QLPP zodpovedajúci zvyškom 111-114 vrátane (pozri Obr. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Delécia štyroch aminokyselín, pozorovaná aj pri myšacej aj pri prasačej ML cDNA, bola pozorovaná presne v tej istej polohe ako pri predpovedaných proteínoch.

Porovnanie predpovedaných sekvencii aminokyselín zrelého ML z človeka, myši a prasaťa (Obr. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]) ukazuje, že sekvenčná identita medzi myšou a človekom je 72 %, medzi myšou a prasaťom je 68 % a medzi prasaťom a človekom je 73 %. Homológia je podstatne väčšia v aminoterminálnej časti ML (EPO homologická doména). Táto doména má 80 až 84% identitu medzi ľubovoľnými dvoma druhmi, zatiaľ čo karboxyterminálna časť (karbohydrátová doména) je identická iba na 57 až 67 %. Motív di-bázických aminokyselín, ktorý môže predstavovať štiepnu polohu proteázy, sa nachádza v karboxylovom konci homologickej domény erytropoetinu. Tento motív je konzervovaný pri uvedených druhoch v polohách, ktoré sú zrejmé z Obr. 19 (SEQ ID NOS: 6, 17 & 18). Druhá dibázická poloha prítomná v pozícii 245 a 246 ľudskej sekvencie, sa nenachádza v sekvenciách myši a prasaťa. Myšacia a prasačia ML sekvencia obsahuje 4 cysteíny, všetky sú konzervované aj v ľudskej sekvencii. Ďalej sa v myšacom ligande nachádza sedem potenciálnych Nglykozylačných polôh a v prasačom ML šesť takýchto polôh, z nich je 5 polôh konzervovaných v ľudskej sekvencii. Všetky potenciálne N-glykozylačné polohy sú umiestnené v C-koncovej časti proteínu.

12. Expresia a purifikácia TPO z vaječníkových buniek čínskych škrečkov (CHO bunky)

Expresné vektory, použité na transfekovanie CHO buniek, sú označené takto: pSVI5.ID.LL.MLORF (úplná dĺžka TPO₃₃₂), a pSVI5.ID,LL.MLEPO-D (skrátená forma alebo TPO_15J). Vlastnosti týchto plazmidov sú uvedené na obr. 23 a 24.

Postupy transfekovania sú opísané v príklade 20. Stručne, pomocou PCR sa získala cDNA, ktorá zodpovedala celému otvorenému čítaciemu rámcu TPO. PCR produkt sa vyčistil a klonoval medzi dve reštrikčné polohy (Clal a Sali) plazmidu pSVI5.ID.LL, aby sa získal vektor pSVI5.ID.LL.MLORF. Druhý postup, zodpovedajúci EPO homologickej doméne, sa vykonal rovnakým spôsobom, ale s použitím odlišného reverzného priméru (EPOD.Sal). Konečné zloženie vektora kódujúceho EPO homologickú doménu TPO sa označuje pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.

Tieto dve konštrukcie sa linearizovali s Notl a transfekovali sa nimi vaječníkové bunky čínskych škrečkov (CHO-DP12 bunky, EP 307 247, zverejnený 15. marca 1989) a to elektroporáciou. V BRL elektroporačnom prístroji sa elektroporovalo 10⁷ buniek (350 Voltov, 330 mF, nízka kapacitancia) v prítomnosti 10, 25 alebo 50 mg DNA, ako je opísané v literatúre (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth. 15, 56 [1993]). Nasledujúci deň po infekcii, sa bunky rozštiepili v DHFR selektívnom médiu (vysoká glukóza DMEM-F12 50:50 bez glycínu, 2 mM glutamín, 2-5 % dialyzované teľacie sérum). O 10 až 15 dní neskôr sa jednotlivé kolónie preniesli na 96-jamkové platničky (mikroplatničky) a nechali sa rásť až do splynutia. Expresia ML₁₅₃ alebo ML₃₃₂ v kondiciovaných médiách z týchto klonov sa vykonalo pomocou Ba/F3-»ip/ proliferačnej skúšky (opísanej v príklade 1).

Proces čistenia a izolácie TPO z nazhromaždenej tekutiny CHO bunkovej kultúry je opísaný v príklade 20. Stručne, nazhromaždená tekutina bunkovej kultúry (HCCF) sa aplikuje do Blue Sepharose kolóny (Pharmacia) v pomere približne 100 1 HCCF na liter živice. Kolóna sa potom premyje pufrovacím roztokom, ktorý mal 3- až 5-násobný objem voči objemu kolóny a potom s rovnakým množstvom pufrovacieho roztoku, ktorý obsahoval 2,0M močovinu. Potom sa eluovalo TPO s 3- až 5-násobným množ23 stvom pufrovacieho roztoku voči objemu kolóny, ktorý obsahoval 2,0M močovinu a 1,OM NaCl.

Celé množstvo eluátu z Blue Sepharose kolóny, obsahujúce TPO, sa potom aplikovalo na Wheat Germ Lectin Sepharose kolónu (Pharmacia), ktorá sa uviedla do rovnováhy pomocou elučného tlmivého roztoku z Blue Sepharose a to v pomere 8 až 16 ml Blue Sepharose eluátu na 1 ml živice. Kolóna sa potom prepláchla s 2- až 3-násobným kolónovým objemom rovnovážneho tlmivého roztoku. TPO sa potom eluovalo pomocou 2- až 5-násobného kolónového objemu tlmivého roztoku, ktoiý obsahoval 2,0 M močoviny a 0,5 M N-acetyl-D-glukózaminu.

Eluát z Wheat Germ Lectin kolóny, obsahujúci TPO, sa potom okyslil a pridalo sa C_]2E₈ až po konečnú koncentráciu 0,04 %. Výsledná zásoba roztoku sa aplikovala na kolónu s C₄ reverznou fázou, ktorá bola uvedená do rovnováhy pomocou 0,1 % TFA; 0,04 % C₁₂E₈ bol vo vstupnom roztoku, ktorý obsahoval približne 0,2 až 0,5 mg proteínu na ml živice.

Proteín sa eluoval v dvojfázovom lineárnom gradiente acetonitrilu s obsahom 0,1 % TFA a 0,04 % C_!2E₈ a výsledný roztok sa získal pomocou SDS-PAGE.

Nahromadený roztok z C4 reverzne fázovej kolóny sa potom zriedil a diafiltroval oproti približne šiestim objemom tlmivého roztoku na Amicone YM alebo s použitím ekvivalentu ultrafiltračnej membrány, ktorý umožňuje urobiť rez 10000 až 30000 Da molekulovej hmotnosti. Výsledný diafiltrát sa potom môže priamo spracovať alebo ďalej koncentrovať ultrafiltráciou. Diafiltrát/koncentrát sa obvykle adjustuje na konečnú koncentráciu 0,01 % Tween80.

Celé množstvo, alebo len časť diafiltrát/koncentrátu zodpovedajúca 2 až 5 % vypočítaného objemu kolóny, sa potom aplikuje do Sephacryl S-300 HR kolóny (Pharmacia), ekvilibrovanej tlmivým roztokom obsahujúcim 0,01 % Tween-80 a podrobí sa chromatografii. Frakcie obsahujúce TPO, ktoré nemajú agregáty a produkty proteolytickej degradácie, sa potom spracujú a spoja pomocou SDS-PAGE. Výsledný roztok sa prefiltruje a skladuje pri 2-8 °C.

13. Spôsoby transformácie a indukovania syntézy TPO v mikroorganizme a jeho izolácia, čistenie a refolding

Konštrukcia expresných vektorov TPO pre E. coli je podrobne opísaná v Príklade 21. Stručne, všetky plazmidy pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 a pMP202 sa vytvoria, aby sa exprimovalo prvých 155 aminokyselín z TPO v smere expresie krátkeho fragmentu, ktorá sa môže meniť podľa rozličných konštrukcií. Krátke fragmenty zabezpečujú hlavne vysokú úroveň translačnej iniciácie a rýchly proces čistenia. Plazmidy pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 sú vytvorené na expresiu prvých 153 aminokyselín TPO v smere expresie iniciačného metionínu a líšia sa len v použití kodónu pre prvých 6 aminokyselín TPO, kým plazmid pMP251 je derivát pMP210-l, v ktorom karboxyterminálny koniec TPO je rozšírený o dve aminokyseliny. Všetky z uvedených plazmidov produkujú vysokú hladinu intracelulámej expresie TPO v E. coli za indukčného použitia tryptofánu ako promótora (Yansura, D.G. a spol., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidy pMPl a pMP172 sú medziproduktami pri konštrukcii uvedených intracelulárnych expresných plazmidov TPO.

Uvedené expresné plazmidy TPO sa použili na transformáciu E. coli s použitím CaCl₂ metódy tepelného šoku (Mandel, M. a spol. J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]) a ďalších postupov opísaných v Príklade 21. Stručne, trans formované bunky rástli najprv pri 37 °C, až kým optická hustota (600 nm) kultúry nedosiahla približne hodnotu 2-3. Kultúra sa potom zriedila a po rozrastení s prevzdušnením sa pridala kyselina. Potom sa kultúra nechala ďalších 15 hodín kontinuálne rásť s prevzdušnením a potom sa bunky oddelili odstredenim.

Postupy izolácie, čistenia a refoldingu, uvedené ďalej, na prípravu biologicky aktívneho, refoldovaného ľudského TPO alebo jeho fragmentov, sú opísané v Príkladoch 22 a 23 a môžu sa použiť na znovuzískanie ľubovoľného variantu TPO, vrátane N- a C-koncových amplifikovaných foriem. Ďalšie postupy vhodné pre refolding rekombinantného alebo syntetického TPO sú uvedené v patentoch : Builder a spol., U.S. patent 4 511 502; Jones a spol., U.S. patent 4512922; Olson U.S. patent 4 518 526 a Builder a spol., U.S. patent 4 620 948; pre všeobecný opis znovuziskania a refoldingu pre rozličné rekombinantné proteíny cxprimované v nerozpustnej forme do E. coli.

A. Znovuzískanie nerozpustného TPO

Mikroorganizmus, ako je E. coli, exprimujúci TPO kódované ľubovoľným vhodným plazmidom, sa fermentuje za podmienok, pri ktorých sa TPO uloží v nerozpustných „refraktilných telieskach“. Bunky sa najprv premyjú tlmivým roztokom, ktorý ich rozkladá. Konkrétne, asi 100 g buniek sa resuspenduje približne v 10 objemoch tlmivého roztoku rozkladajúceho bunky (napr. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) s homogenizérom (napríklad Polytron) a bunky sa odstreďujú pri 5000 x g počas 30 minút. Bunky sa potom lýzujú s použitím ľubovoľného konvenčného spôsobu, ako je tonický šok, ultrazvukové vibrácie, cyklovanie tlaku, chemické alebo enzymatické metódy. Napríklad uvedený premytý sediment buniek sa môže resuspendovať v ďalších 10 objemoch tlmivého roztoku rozkladajúceho bunky s homogenizérom a suspenzia buniek prejde cez LH Celí Disrupter (LH Inceltech, Inc.) alebo cez Microfluidizer (Microfluidics Intemational) v súlade s výrobnými inštrukciami. Hmota častíc, obsahujúca TPO, sa potom oddelí od kvapalnej fázy a premyje sa ľubovoľne vhodnou kvapalinou. Napríklad, suspenzia bunkového lyzátu sa môže odstrediť pri 5000 x g po dobu 30 minút, resuspendovať a druhýkrát ľubovoľne odstrediť, pričom sa získa premytý sediment refraktilných teliesok. Premyté peletky sa môžu ihneď použiť alebo ľubovoľne skladovať pri nízkej teplote (napr. pri -70 °C).

B. Solubilizácia a čistenie monomémeho TPO

Nerozpustný TPO v peletkách refraktilných teliesok sa potom solubilizuje so solubilizačným tlmivým roztokom. Solubilizačný tlmivý roztok obsahuje chaotropné činidlo a je obvykle tlmený pri zásaditých hodnotách pH a ďalej obsahuje redukčné činidlo na zlepšenie výťažku monomémeho TPO. Typickým chaotropným činidlom môže byť močovina, hydrochlorid guanidínu a tiokyanát sodný. Preferovaným chaotropným činidlom je hydrochlorid guanidínu. Koncentrácia chaotropného činidla obvykle býva 4-9 M, výhodne 6-8 M. Hodnota pH solubilizačného tlmivého roztoku sa udržiava pomocou ľubovoľne vhodného tlmivého roztoku v rozsahu pH približne 7,5-9,5, výhodne 8,0-9,0 a preferovane 8,0. Je výhodné, keď solubilizačný tlmivý roztok obsahuje tiež redukčné činidlo za účelom tvorby monomémej formy TPO. Vhodné redukčné činidlá zahrnujú organické zlúčeniny obsahujúce voľný tiol (RSH). Typické redukčné činidlá zahrnujú ditiotreitol (DTT), ditioeiytritol (DTE), merkaptoetanol, glutatión (GSH), cysteamín a cysteín. Preferovaným redukčným činidlom je ditiotreitol (DTT). Solubilizačný tlmivý roztok môže obsaho vať stredne oxidujúce činidlo (napr., molekulárny kyslík) a siričitany, pričom sa môže tvoriť sulfitolýzou monomémy TPO. V tomto riešení vynálezu je výsledný TPO-S-sulfonát neskôr refoldovaný v prítomnosti tlmivého redox roztoku (napr., GSH/GSSG), pričom vzniká vlastný refoldovaný TPO.

TPO proteín sa obvykle ďalej čistí s použitím, napríklad, odstreďovania, gélovej filtračnej chromatografie a reverznej fázovej stĺpcovej chromatografie.

Kvôli ilustrácii je uvádzaný nasledujúci postup, ktorý dáva vhodné výťažky monomémeho TPO. Sediment refraktilných teliesok sa resuspenduje asi v 5 objemoch (voči hmotnosti) solubilizačného tlmivého roztoku (20 mM Tris, pH 8, s 6-8 M guanidinu a 25 mM DTT) a mieša počas 1-3 hodín alebo počas noci, pri 4 °C na ovplyvnenie solubilizácie proteínu TPO. Použijú sa tiež vysoké koncentrácie močoviny (6-8 M), ale všeobecne sú výťažky pri použití guanidínu vyššie. Po solubilizácii sa roztok odstredí pri 30000 x g počas 30 min. a získa sa číry supematant, obsahujúci denaturovaný monomémy TPO. Supematant sa potom podrobí chromatografii na Superdex 200 gélovej filtračnej kolóne (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) pri rýchlosti toku 2 ml/min a proteín eluuje s 20 mM fosforečnanom sodným, pH 6,0, s 10 mM DTT. Zachytávajú sa frakcie, ktoré obsahujú monomémy denaturovaný TPO proteín, eluujúci medzi 160 a 200 ml. TPO proteín sa ďalej čistí na semipreparatívnej C4 reverznej fázovej kolóne (2 x 20 cm VYDAC). Vzorka sa dávkuje rýchlosťou 5 ml/min do kolóny, ktorá je uvedená do rovnováhy pomocou 0,1 % TFA (kyselina trifluóroctová) s 30% acetonitrilom. Proteín sa eluuje lineárnym gradientom acetonitrilu (30-60 % za 60 min.). Vyčistený a redukovaný proteín eluuje v približne 50% acetonitrile. Takáto látka sa použije na refolding, aby sa získal biologicky účinný variant TPO.

C. Refolding TPO za vzniku biologicky účinnej formy

Po solubilizácii a čistení TPO sa získa biologicky účinná forma pomocou refoldingu denaturovaného monomérneho TPO v tlmivom redoxovom roztoku. Kvôli vysokej potencii TPO (polovica maximálnej stimulácie v Ba/F3 teste sa dosiahne približne pri 3 pg/ml) je pravdepodobné, že biologicky účinný materiál sa podarí získať pomocou rozličných tlmivých, detergentných a redoxových podmienok. Avšak pri väčšine použitých podmienok sa získa iba malé množstvo (<10 %) vhodne refoldovaného materiálu. Pre komerčné výrobné postupy je výhodné, aby tieto výťažky boli aspoň 10 %, výhodnejšie, keď sú 30-50 % a najvýhodnejšie, keď sú >50 %. Ukázalo sa, že na produkciu aspoň určitého množstva vhodne refoldovaného materiálu možno použiť množstvo rozličných detergentov, zahrnujúcich Triton X-100, dodecyl-beta-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozyl, Tween 20 a Tween 80, Zwittergent 3-14 a ďalšie. Avšak z týchto boli najviac preferovanými detergentami tie, ktoré patria do skupiny CHAPS detergentov (CHAPS a CHAPSO), ktoré sa najlepšie hodia na refolding a limitujú agregáciu proteínu a nevhodnú tvorbu disulfidu. Preferované sú také koncentrácie CHAPS, ktoré sú väčšie ako 1 %. Najlepšie výťažky sa dosahujú, keď sa použije chlorid sodný pri optimálnych koncentráciách 0,1 M a 0,5 M. Uprednostňuje sa tiež pridanie EDTA (1-5 mM) do tlmivého redoxového roztoku, čím sa obmedzí kovom katalyzovaná oxidácia (a agregácia), ktorá sa pozoruje pri niektorých prípravách. Optimálne refoldingové podmienky zabezpečuje tiež prítomnosť glycerínu s koncentráciou vyššou ako 15 %. Maximálne výťažky sa dosiahnu vtedy, keď sa použije oxidovaný a redukovaný organický tiol (RSH) ako redoxová dvojica v tlmivom redoxovom roztoku.

Vhodné redoxové dvojice zahrnujú merkaptoetanol, glutatión (GSH), cysteamín, cystín s ich zodpovedajúcimi oxidovanými formami. Preferovanými redoxovými dvojicami sú glutatión(GSH): oxidovaný glutatión(GSSG) alebo cysteín:cystín. Najviac preferovanou redoxovou dvojicou je glutatión(GSH): oxidovaný glutatión(GSSG). Všeobecne vyššie výťažky sa pozorujú, keď počet molov oxidovaného člena redoxovej dvojice sa rovná alebo je vyšší ako počet molov redukovaného člena redoxovej dvojice. Optimálne hodnoty pH pre refolding týchto variantov TPO sú medzi 7,5 a 9. Môžu sa tiež použiť organické rozpúšťadlá (napr. etanol, acetonitril, metanol) v koncentráciách 10-15 % alebo nižších. Vyššie koncentrácie organických rozpúšťadiel zvyšujú množstvo nevhodných refoldingových foriem. Všeobecne sa používajú tris- a fosfátové tlmivé roztoky. Inkubácia pri 4 °C tiež prispieva k vysokým koncentráciám vhodne refoldovaného TPO ako produktu.

Typické výťažky refoldingu sa pohybujú medzi 40 % až 60 % TPO (počítané na množstvo redukovaného a denaturovaného TPO, použitého pre refolding), ktorý sa čistil v prvom C4 stupni. Aktívny materiál možno získať aj menej účinnými postupmi (napr. priamo z Superdex 200 kolóny alebo počiatočnou extrakciou refraktilných teliesok), lenže výťažky sú nižšie, v dôsledku značného zrážania a prekrytia iných ako TPO proteínov počas procesu refoldingu TPO.

Pretože TPO obsahuje 4 cysteínové zvyšky, možno rozlíšiť tri rozličné verzie disulfidu tohto proteínu: verzia 1: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-4 a 2-3 verzia 2: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-2 a 3-4 verzia 3: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-3 a 2-4.

V priebehu počiatočného prieskumu podmienok, ktoré ovplyvňujú refolding, sa pomocou C4 reverznej fázovej chromatografie separovalo viacero odlišných vrcholov, obsahujúcich TPO proteín. Iba jeden z týchto vrcholov mal významnú biologickú aktivitu, čo sa potvrdilo Ba/F3 testom. Nadväzne na to sa optimalizovali podmienky refoldingu, aby sa zvýšil výťažok tejto látky. Za týchto podmienok vznikali nevhodné verzie požadovaného produktu v množstve menšom ako 10-20 % z celkového množstva monomémeho TPO, ktoré sa získalo v solubilizačnom stupni.

Pomocou hmotnostnej spektrometrie a proteínovým sekvenovaním sa zistilo, že vhodným disulfidovým modelom z hľadiska biologickej aktivity TPO je model, ktorý má disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-4 a 2-3, pričom cysteíny sa počítajú postupne od aminoterminálnej časti. Tento cysteínový zosieťovaný model je konzistentný so známym modelom disulfidových väzieb, v zodpovedajúcej molekule erytropoetínu.

D. Biologický účinok rekombinantného, refoldovaného TPO

Refoldovaný a purifikovaný TPO má účinok aj v in vitro aj v in vivo testoch. Napríklad v Ba/F3 teste sa dosiahla pre TPO (Met^-1 1-153) polovica maximálnej stimulácie zavedenia tymidínu do Ba/F3 buniek, pri 3,3 pg/ml (0,3 pM). Pri skúške ELISA, založenej na mp/-receptore, sa dosiahla polovica maximálneho účinku pri 1,9 ng/ml (120 pM). Pri normálnych a myelosupresívnych živočíchoch, ktoré sa pripravili X-radiáciou v blízkosti smrteľných dávok, bol refoldovaný TPO (Meť¹ 1-153) vysoko účinný (účinok sa pozoroval už pri dávkach 30 ng/myš) pri stimulácii vzniku nových krvných doštičiek. Podobný biologický účinok sa pozoroval aj pre ďalšie formy TPO, získané refoldingom podľa opísaných postupov (pozri obr. 25,26 a 28).

14. Metódy merania trombopoetickej aktivity

Trombopoetická aktivita sa môže merať rozličnými skúškami, vrátane Ba/F3 mpl ligandovej skúšky opísanej v príklade 1, in vivo myšacím testom reakcie na syntézu krvných doštičiek, testom indukcie povrchového antigénu krvných doštičiek, meraným anti-doštičkovým imunologickým testom (anti-GPII_bIII_a) pre ľudské leukemické megakaryoblastové bunkové línie (CMK) (pozri Sato a spol., Brit. J. Heamatol., 72:184-190 [1989]) (pozri tiež test tvorby megakaryocytov v kvapalnej suspenzii opísanú v Príklade 4) a indukcie polyploidizácie v megakaryoblastovej bunkovej línii (DAMI) (pozri Ogura a spol., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Dozrievanie megakaryocytov z nezrelých buniek, prevažne takých, ktoré nesyntetizujú DNA, na morfologicky identifikovateľné megakaryocyty je proces, ktorý pozostáva zo vzniku cytoplazmových organel, zo získania membránových antigénov (GPIÍ_bIII_a), endoreplikácie a uvoľnenia krvných platničiek, ako bolo opísané v časti; Doterajší stav techniky. Predpokladá sa, že rodový špecifický promótor (to znamená mpl ligand) dozrievania megakaryocytov indukuje aspoň niektoré z týchto zmien v nezrelých megakaryocytoch, ktoré vedú k uvoľneniu krvných doštičiek a k zmierneniu trombocytopénie. Navrhli sa testy na zistenie prítomnosti týchto parametrov v nezrelých líniách megakaryocytových buniek, to znamená v CMK a DAMI bunkách. CMK testom (Príklad 4) sa zisťuje prítomnosť špecifického signálneho znaku krvnej doštičky, GPIIbIII_a, a ubúdania krvných doštičiek. Testom DAMI (príklad 15) sa meria endoreplikácia, pretože zvýšenie počtu chromozómov je znakom zrelých megakaryocytov. Rozlíšiteľné megakaryocyty majú hodnoty chromozómov 2N, 4N, 8N, 16N, 32N atď. Konečne, test reakcie myších krvných doštičiek in vivo (Príklad 16) sa používa ako dôkaz zvýšenia počtu krvných doštičiek pri aplikácii testovanej zlúčeniny (v tomto prípade mpl ligandu).

Na meranie TPO aktivity sa vyvinuli dve ďalšie skúšky in vitro. Prvou je aktivácia receptora kinázy (KIRA) ELISA, v ktorej sú CHO bunky transfekované s mpl-Rse chimérou a pomocou ELISA testu sa meria fosforylácia Rse tyrozínom, po pôsobení časti mpl chiméry na mpl ligand (pozri Príklad 17). Druhou je ELISA na báze receptora, v ktorej platnička ELISA pokrytá králičou inou ako ľudskou IgG zachytáva ľudský chimerický receptor wp/-IgG viažuci mpl ligand, ktorý sa týmto testom stanovuje. Biotinylovaná králičia polyklonálna protilátka do mpl ligandu (TPO₁₅₅) sa používa na detegovanie viazaného mpl ligandu, ktoré je merané pomocou streptavidín-peroxídázy, ako je opísané v príklade 18. ^{15 * * * * * * * * * * * * * * * * *}

15. Biologická odozva in vivo normálnej a subletálne ožiarenej myši, ošetrenej s TPO

Normálne aj subletálne ožiarené myši sa liečili pomocou TPO (so skrátenou a s úplnou dĺžkou), izolovaným z vaječníkových buniek čínskych škrečkov (CHO), E. coli, a z ľudských obličkových embryonálnych (293) buniek. Obe formy TPO, produkované v týchto troch hostiteľoch, stimulovali tvorbu krvných doštičiek u myší, avšak najvyšší účinok in vivo malo TPO s úplnou dĺžkou, izolované z

CHO. Tieto výsledky ukazujú, že samotná glykozylácia karboxyterminálnej domény je potrebná na optimálnu aktivitu in vivo.

a) E co/í-rhTPO_(Ma-l,i53) „Met“ forma EPO domény (Met v polohe -1 plus prvých 153 zvyškov ľudského TPO), produkovaná v E. coli (pozri Príklad 23), sa podávala injekčné denne samičkám

C57 B6 myši, ako je opísané v legendách k obr. 25A, 25B a

25C. Z týchto obrázkov vyplýva, že neglykozylovaná skrátená forma TPO, produkovaná v E. coli a refoldovaná spôsobom, ktorý už bol opísaný, je schopná stimulovať približne dvojnásobné zvýšenie vzniku krvných doštičiek u normálnych myší a to bez ovplyvnenia populácie buniek červených a bielych krviniek.

Tá istá molekula podávaná denne, injekčné subletálne ožiareným (¹³⁷Cs) samičkám C57 B6 myší, ako je opísané v legendách k Obr. 26A, 26B a 26C, stimulovala obnovenie krvných doštičiek a znížila nadir, ale nemala žiadny vplyv na erytrocyty a leukocyty.

b) CHO-rhTPO₃₃₂

Forma TPO s úplnou dĺžkou produkovaná v CHO a podávaná injekčné, denne, normálnym samičkám C57 B6 myší, ako je opísané v legendách Obr. 27Λ, 27B a 27C, vyvolala asi päťnásobné zvýšenie produkcie krvných doštičiek pri normálnych myšiach bez ovplyvnenia populácie erytrocytov alebo leukocytov.

c) CHO-rhTPO33₂; E. coli- rhTPO(Met-l, 153»; 293-rhTPO₃₃₂; a E. co/(-rhTPO|55

Krivky, ktoré predstavujú odozvu na jednotlivé dávky, sa zostrojili na základe liečenia normálnych myší s rhTPO s rozličnými líniami buniek (CHO-rhTPO₃₃₂; E. coli-rhTPO(Ma-l, i53)í 293-rhTPO₃₃₂; aE. co/z-rhTPO_l55), ako je opísané v legende k Obr.28. Tento obrázok ukazuje, že všetky testované formy molekuly stimulujú tvorbu krvných doštičiek, avšak najvyššiu aktivitu in vivo mala forma s úplnou dĺžkou produkovaná v CHO.

d) CHO-rhTPO|₅₃, CHO-rhTPO._skráleni. a CHO-rhTPO₃₃₂ Krivka, ktorá predstavuje odozvu na jednotlivé dávky, sa zostrojila na základe liečenia normálnych myší rozličnými formami rhTPO, produkovanými v CHO (CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO.._sWt_raá“ a CHO-rhTPO₃₃₂), ako je opísané v legende k Obr. 29. Tento obrázok ukazuje, že všetky testované CHO formy molekuly stimulujú tvorbu krvných doštičiek, pričom najvyššiu aktivitu in vivo mala forma s úplnou dĺžkou 70 Kda.

16. Všeobecná rekombinantné príprava mpl ligandu a variantov

Mpl ligand sa výhodne pripravuje štandardnými rekombinantnými postupmi, ktoré zahrnujú prípravu polypeptidu mpl ligandu, kultivovaním transfekovaných buniek na expresiu nukleovej kyseliny mpl ligandu (typicky transformáciou buniek pomocou expresného vektora) a oddelením polypeptidu z buniek. Avšak, počíta sa s tým, že mpl ligand sa môže produkovať homologickou rekombináciou alebo rekombinantnými produkčnými metódami, využívajúcimi regulačné elementy zavedené do buniek, ktoré už obsahujú DNA, kódujúcu mpl ligand. Napríklad, do genómu danej hostiteľskej bunky možno zaviesť silný promótor/zosilňovač, supresor alebo exogénny transkripčný modulačný element a to v takej vzdialenosti a v nasmerovaní, ktoré sú vhodné na ovplyvnenie transkripcie DNA kódujúcej požadovaný polypeptid mpl ligandu. Regulačný element nekóduje mpl ligand, skôr DNA je pôvodnou v genóme hostiteľskej bunky. Ďalej možno, podľa potreby, triediť bunky pri príprave polypeptidu receptora podľa tohto vynálezu alebo triediť zvýšené alebo znížené úrovne expresie.

Teda, vynález sa týka aj spôsobu prípravy mpl ligandu, zahrnujúci inzerciu transkripčného modulačného elementu do genómu bunky obsahujúcej molekulu nukleovej kyseliny mpl ligandu a to tak, že tento element je v takej vhodnej vzdialenosti a polohe voči molekule nukleovej kyseliny, aby mohol ovplyvniť jej transkripciu, pričom ďalší krok zahrnuje kultivovanie bunky, obsahujúcej transkripčný modulačný element a molekulu nukleovej kyseliny. Vynález sa taktiež týka hostiteľskej bunky, obsahujúcej pôvodnú molekulu nukleovej kyseliny mpl ligandu, schopnú pripojiť sa na exogénne regulačné sekvencie, ktoré sú rozlíšiteľné hostiteľskou bunkou.

A. Izolácia DNA, kódujúcej polypeptid mpl ligandu

DNA kódujúca polypeptid mpl ligandu sa môže získať z ľubovoľnej cDNA knižnice pripravenej z tkanív, o ktorých sa očakáva, že vlastnia mRNA mpl ligandu a že ju exprimujú detegovateľným spôsobom. Gén mpl ligandu sa tiež môže získať z genómovej DNA knižnice alebo pomocou oligonukleotidovej syntézy in vitro z úplnej nukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencie.

V knižniciach sa vykonáva skríning s označenými sondami na identifikáciu hľadaného génu alebo proteínu, ktorý je ním kódovaný. Pre knižnice expresie cDNA patria medzi vhodné sondy monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, ktoré rozlišujú a špecificky sa viažu na mpl ligand. Pre cDNA knižnice patria medzi vhodné sondy oligonukleotidy asi s 20-80 bázami v dlhom reťazci, ktoré kódujú známe alebo očakávané časti cDNA mpl ligandu z tých istých alebo rozličných druhov; a/alebo komplementárne alebo homologícké cDNA alebo ich fragmenty, ktoré kódujú ten istý alebo podobný gén. Medzi vhodné sondy na skríning genómovej DNA knižnice patria oligonukleotidy, cDNA alebo ich fragmenty, ktoré kódujú ten istý alebo podobný gén a/alebo homologické genómové DNA alebo ich fragmenty. Skríning cDNA alebo genómovej knižnice s vybranou sondou sa vykonáva štandardnými postupmi, ako je opísané v Kapitolách 10-12 publikácie Sambrook a spol. (pozri vyššie).

Alternatívou voči izolácii génu kódujúceho mpl ligand je použitie PCR metodológie, ako je to opísané v časti 14 publikácie Sambrook a spol. (pozri vyššie). Táto metóda si vyžaduje použitie oligonukleotidových sond, ktoré budú hybridizovať DNA kódujúcu mpl ligand. Postupy selekcie oligonukleotidov sú uvedené v ďalej.

Preferovaným postupom uskutočnenia tohto vynálezu je použitie spoľahlivo vybraných sekvencií oligonukleotidu na skríning cDNA knižníc a to z rozličných tkanív, výhodne z bunkových línií ľudskej alebo prasačej obličky (dospelej alebo zárodočnej) alebo pečene. Napríklad, cDNA knižnice bunkovej línie ľudskej zárodočnej pečene sú podrobené skríningu pomocou oligonukleotidových sond.

Oligonukleotidové sekvencie vybrané ako sondy majú byť vhodne dlhé a jednoznačné tak, aby sa minimalizoval účinok falošných pozitív. Skutočná nukleotidová sekvencia je obvykle konštruovaná na základe oblastí mpl ligandu, ktoré majú aspoň kódovú redundanciu. Oligonukleotidy môžu byť degenerované do jednej alebo viacerých polôh. Použitie degenerovaných oligonukleotidov má špeciálny význam tam, kde je knižnica podrobená skríningu z takých druhov, pri ktorých nie je známe použitie preferovaného kódu.

Oligonukleotidy musia byť označené, aby mohli byť detegované po hybridizácii k DNA počas skríningu v knižnici. Uprednostňovaná metóda značenia je použitie ATP (napr., /²P) a polynukleotidovej kinázy na rádioznačenie 5' konca oligonukleotidu. Použitie iných metód značenia nie je obmedzené, napríklad sa môže použiť biotinylácia alebo enzýmové značenie.

Špeciálny význam má kyselina nukleová mpl ligandu, ktorá kóduje celý reťazec polypeptidu mpl ligandu. V niektorých preferovaných začleneniach sekvencia nukleovej kyseliny zahŕňa prirodzenú signálnu sekvenciu mpl ligandu. Nukleová kyselina, ktorá má celú kódujúcu sekvenciu proteínu, sa získa skríningom vybraných cDNA alebo ge nómových knižníc pomocou dedukovanej sekvencie aminokyseliny.

B. Varianty sekvencie aminokyseliny prirodzeného mpl ligandu

Varianty sekvencie aminokyseliny mpl ligandu sa pripravia zavedením vhodných nukleotidových zmien do DNA mpl ligandu alebo pomocou syntézy in vitro požadovaného polypeptidu mpl ligandu. Takéto varianty zahrnujú, napríklad, deléciu alebo inzerciu alebo substitúciu zvyškov v sekvencií aminokyseliny v prasačom mpl ligande. Napríklad časti karboxy zakončenia zrelého úplného mpl ligandu sa môžu odstrániť proteolytickým štiepením a to buď in vivo alebo in vitro alebo klonovaním a expresiou fragmentu alebo DNA kódujúcou úplnú dĺžku mpl ligandu za vzniku biologicky aktívneho variantu. Môže sa urobiť akákoľvek kombinácia odstránenia, vsunutia a substitúcie, aby sa dosiahol taký konečný tvar, ktorý má požadovanú biologickú aktivitu. Zmeny aminokyselín môžu tiež meniť posttranslačné procesy mpl ligandu, ako je zmena počtu alebo polohy glykozyíačných miest. Pri konštrukcii variantov sekvencie aminokyseliny mpl ligandu bude závisieť umiestnenie mutačnej polohy a podstata mutácie od modifikovanej charakteristiky(ík) mpl ligandu. Polohy pre mutáciu môžu byť modifikované individuálne alebo v sériách, napríklad,

1. substitúciou prvej s výberom konzervovanej aminokyseliny a potom radikálnejšou selekciou až kým sa dosiahne výsledok, 2. odstránením (deléciou) cieľových zvyškov alebo 3. vsunutím (inzerciou) zvyškov tej istej alebo rozličnej triedy priľahlých k umiestnenej polohe alebo kombináciou bodov 1-3.

Metóda, použiteľná na identifikáciu určitých zvyškov alebo oblastí polypeptidu mpl ligandu s cieľom nájsť preferované polohy pre mutagenézu sa nazýva „alanine scanning mutagenesis“ a je opísaná Cunninghamom a Wellsom, Science, 244:1081-1085 (1989). V tejto metóde sa najprv identifikuje zvyšok alebo skupina cieľových zvyškov (napr. zvyšky s nábojom, ako sú arg, asp, his, lys, a glu) a nahradí sa ľubovoľným zvyškom, ale výhodne neutrálnou alebo negatívne nabitou aminokyselinou (výhodne alanín alebo polyalanín), aby sa ovplyvnila interakcia aminokyselín s okolitým vodným prostredím v bunke alebo mimo nej. Tieto domény, demonštrujúce funkčnú citlivosť k substitúciám, sa potom ďalej rozvíjajú zavedením ďalších alebo iných variant do (alebo pre) substitučných polôh. Takto, zatiaľ čo poloha na zavedenie variácie sekvencie aminokyseliny je predurčená, podstata mutácie per se nemusí byť predurčená. Napríklad pri optimalizácii vykonania mutácie v danej polohe sa uskutočnila ala snímacia alebo náhodná mutagenéza do konečného kódu alebo oblasti a exprimované varianty mpl ligandu sa podrobili skríningu za účelom získania optimálnej kombinácie požadovanej aktivity.

Pri konštrukcii variant sekvencie aminokyseliny existujú dve hlavné premenné; umiestnenie mutačnej polohy a podstata mutácie. Napríklad varianty polypeptidu mpl ligandu zahrnujú varianty zo sekvencie mpl ligandu a môžu reprezentovať prirodzene sa vyskytujúce alely (ktoré si nevyžadujú manipuláciu DNA mpl ligandu), buď predurčené mutantné formy pripravené mutáciou DNA alebo dosiahnuté v alelách alebo vo variante nenachádzajúcom sa v prírode. Všeobecne, umiestnenie a podstata vybranej mutácie bude závisieť na modifikácii charakteristík mpl ligandu.

Delécie sekvencie aminokyseliny bývajú všeobecne v rozsahu 1 až 30 zvyškov, výhodne 1 až 10 zvyškov a typicky ide o susediace zvyšky. Pri odstránení sekvencie aminokyselín pre mpl ligand môže isť tiež o časť alebo o celý karboxy-terminál glykoproteínovej domény. Delécie sek

SK 282265 Β6 vencie aminokyseliny môžu tiež zahrnovať jeden alebo viac z prvých 6 amino-terminálnych zvyškov zrelého proteínu. Ľubovoľné odstránenia sekvencie aminokyseliny zahrnujú jeden alebo viac zvyškov v jednej alebo viacerých slučkových oblastiach, ktoré existujú medzi „špirálovitými zväzkami“. Do rozsahu tohto vynálezu patria rovnako delécie susedných zvyškov ako aj jednotlivých alebo nepravidelne umiestnených zvyškov. Odstránenia sa môžu vykonať v oblastiach s nízkou homológiou medzi mpl ligandami, ktoré sa podieľajú najvyššou sekvenčnou identitou na modifikácii aktivity mpl ligandu. Alebo možno odstránenia vykonať v oblastiach nízkej homológie medzi ľudským mpl ligandom a druhými polypeptidmi mpl ligandov cicavcov, ktoré sa podieľajú najvyššou sekvenčnou identitou k ľudskému mpl ligandu. Odstránenia z polypeptidov mpl ligandu cicavcov v oblastiach podstatnej homológie s druhými mpl ligandami cicavcov budú vhodnejšie na modifikáciu biologickej aktivity mpl ligandu. Počet po sebe idúcich delécií sa stanoví tak, aby sa ochránila terciáma štruktúra mpl ligandu v ovplyvňovanej doméne, napr. štruktúra beta-skladaného listu alebo alfa-závitnica.

Vkladanie sekvencie aminokyseliny zahrnuje aminoa/alebo karboxy-terminálne fúzované rozsahy, pričom môže ísť o jeden zvyšok alebo až o polypeptidy obsahujúce sto alebo viac zvyškov, rovnako môže ísť o intrasekvenčné inzercie jednoduchých alebo násobných zvyškov aminokyseliny. Pri intrasekvenčných inzerciách (napr. vkladanie do zrelej sekvencie mpl ligandu) môže ísť o vkladanie 1 až 10 zvyškov, výhodne 1 až 5 zvyškov, ešte výhodnejšie 1 až 3 zvyšky. Príkladom preferovanej fúzie je fúzia mpl ligandu alebo jeho fragmentu s druhým cytokínom alebo jeho fragmentom. Príklady terminálnych inzercií zahrnujú spojenie zrelého mpl ligandu s N-koncovým metionylovým zvyškom, artifakt priamej expresie zrelého mpl ligandu v rekombinantnej bunkovej kultúre a fúziu heterogénnej N-koncovej signálnej sekvencie k N-koncu molekuly zrelého mpl ligandu na uľahčenie vylučovania zrelého mpl ligandu z rekombinantných hostiteľov. Takéto signálne sekvencie môžu byť všeobecne získané zo zamýšľaných druhov hostiteľských buniek a voči nim takto aj homologické. Vhodné sekvencie zahrnujú STU alebo Ipp pre E. coli, alfa faktor pre kvasinky a vírusové signály ako je herpes gD pre bunky cicavcov.

Ďalšie varianty vkladania do molekuly mpl ligandu zahrnujú pripájanie k N- alebo C-koncu mpl ligandu imunogénnych polypeptidov (napr. neendogénnych k hostiteľovi, v ktorom sa spájanie vykoná), napr. bakteriálne polypeptidy ako je beta-laktamáza alebo enzým kódovaný pomocou

E. coli v polohe trp alebo kvasinkový proteín a C-koncové spojenia s proteínmi majúcimi dlhý polčas životnosti, ako sú konštantné oblasti imunoglobulínu (alebo ďalšie imunoglobulínové oblasti), albumín alebo feritín, ako je opísané vo WO 89/02922 zverejnenom 6. apríla 1989.

Tretia skupina variantov sú substitučné varianty aminokyselín. Tieto varianty majú aspoň jeden zvyšok aminokyseliny v molekule mpl ligandu odstránený a na jeho miesto zavedený odlišný zvyšok. Najvýznamnejšie polohy pre substitučnú mutagenézu zahrnujú polohy identifikované ako aktívne polohy mpl ligandu a polohy, v ktorých nachádzajúce sa aminokyseliny v iných analógoch sa podstatne líšia v takých vlastnostiach, ako sú veľkosť bočného reťazca, náboj, hydrofóbnosť, ale kde je tiež vysoký stupeň sekvenčnej identity vo vybranej polohe medzi rozličnými druhmi mpl ligandov a/alebo v rozličných zvieracích analógoch jedného zástupcu mpl ligandu.

Ďalšie zaujímavé polohy sú také, v ktorých jednotlivé zvyšky mpl ligandu získané z rozličných zástupcov čeľade a/alebo zvieracích druhov sú identické v jednom zástupcovi. Tieto polohy, najmä tie, ktoré sú v súlade so sekvenciou posledných troch inak identicky konzervovaných polôh, sa substituujú pomerne konzervatívnym spôsobom. Takéto konzervatívne substitúcie sú uvedené v tabulke 3, pod hlavičkou preferovaných substitúcií. Ak takéto substitúcie spôsobujú zmenu biologickej aktivity, potom sa zavedú podstatnejšie zmeny, ktoré sú označené ukážkovými substitúciami v Tabulke 3 alebo, ako bude ďalej uvedené, v odkaze na triedy aminokyselín, a produkty sa podrobia skríningu.

Tabulka 3

Pôvodný	Ukážkové	Preferované
zvyšok	substitúcie	substitúcie
Ala (A)	Val; Leu; íle	Val
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucín	Leu
Leu (L)	norleucín; Íle; Val; Met; Ala; Phe	íle
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; íle	Leu
Phe (F)	Leu; Val; íle; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser(S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	íle; Leu; Met; Phe Ala; norleucín	Leu

Podstatné modifikácie vo funkčnosti alebo imunologickej identite mpl ligandu sú sprevádzané selektujúcimi substitúciami, ktoré sa významne líšia v svojom účinku na udržiavanie (a) štruktúry kostry polypeptidu v oblasti substitúcie, napríklad, ako je listové alebo špirálové usporiadanie, (b) náboja alebo hydrofóbnosti molekuly v cieľovej polohe alebo (c) velkosti bočného reťazca. Prírodné sa vyskytujúce zvyšky sa delia do skupín na základe všeobecných vlastností bočného reťazca:

1. hydrofóbne : norleucín, Met, Ala, Val, Leu, íle;

2. neutrálne hydrofilné : Cys, Ser, Thr;

3. kyslé : Asp, Glu;

4. zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5. zvyšky, ktoré ovplyvňujú orientáciu reťazca : Gly, Pro; a

6. aromatické : Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne substitúcie budú mať za následok výmenu zástupcu jednej z týchto skupín za druhého. Takéto substituované zvyšky sa môžu tiež zaviesť do polôh konzervatívnej substitúcie, výhodne do nezachovaných polôh.

V jednom z riešení, podľa tohto vynálezu, je vhodné inaktivovať jednu alebo viac štiepnych polôh proteázy, ktoré sa nachádzajú v molekule. Tieto polohy sa identifikujú kotrolou kódovanej aminokyselinovej sekvencie, v prípade tiypsinu je to, napríklad, pre arginylový alebo lyzinylový zvyšok. Keď sú štiepne polohy proteázy identifikované, stanú sa inaktívne voči proteolytickému štiepeniu substitúciou vybraného zvyšku iným zvyškom, výhodne zásaditým zvyškom ako je glutamín alebo hydrofóbnym zvyškom ako je serín; deléciou zvyšku; alebo inzerciou prolylového zvyšku ihneď za vybraný zvyšok.

Podľa ďalšieho riešenia každý jeden metionylový zvyšok, ktorý je iný ako počiatočný metionylový zvyšok signálnej sekvencie, alebo každý jeden zvyšok umiestnený v okruhu približne troch zvyškov N- alebo C-koncových ku každému takému metionylovému zvyšku, je substituovaný iným zvyškom (výhodne v súlade s Tabuľkou 3) alebo odstránený. Alternatívne, približne 1-3 zvyšky možno vsunúť tesne k takýmto polohám.

Tiež môžu byť substituované akékoľvek cysteínové zvyšky, neobsiahnuté pri udržovaní vlastnej konformácie mpl ligandu a to všeobecne so serínom, aby sa zlepšila oxidačná stabilita molekuly a zabránilo sa nenormálnemu zosieťovaniu. Zistilo sa, že prvý a štvrtý cysteín v epo doméne, počítané od amino-terminálu, je potrebný na udržovanie vlastnej konformácie, ale druhý a tretí cysteín nie je potrebný na tento účel. V dôsledku toho sa druhý a tretí cysteín v epo doméne môže substituovať.

Molekuly nukleovej kyseliny, kódujúce varianty sekvencie aminokyseliny mpl ligandu, sa môžu pripraviť rozličnými spôsobmi, ktoré sú známe v tejto odbornej oblasti. Medzi tieto metódy patria: izolácia z prírodných zdrojov (v prípade prírodné sa vyskytujúcich variant sekvencií aminokyselín) alebo príprava sprostredkovanou oligonukleotidovou (alebo riadenou do polôh) mutagenézou, PCR mutagenézou a kazetová mutagenéza predpripravených variantov alebo nevariantná verzia polypeptidu mpl ligandu. Rozsah použitých metód nie je limitovaný týmito vymenovanými metódami.

Oligonukleotidom sprostredkovaná mutagenéza je preferovaná metóda na prípravu, substitúciu, odstránenie a vkladanie variantov mpl ligandu. Táto technika je dobre známa v odbornej oblasti a bola opísaná Adelmanom a spol., DNA, 2:183 (1983). Stručne, DNA mpl ligandu sa pozmení hybridizáciou oligonukleotidom kódujúcim požadovanú mutáciu do templátu DNA, pričom templát je jednoreťazcovou formou plazmidu alebo bakteriofágu, obsahujúci nezmenenú alebo prirodzenú sekvenciu DNA mpl ligandu. Po hybridizácii sa použije DNA polymeráza na syntézu celého druhého komplementárneho reťazca templátu, ktorý bude takto zahrnovať oligonukleotidový primér a bude kódovať selekčnú zmenu v DNA mpl ligandu.

Všeobecne sa používajú oligonukleotidy, ktorých dĺžka pozostáva najmenej z 25 nukleotidov. Optimálny oligonukleotid bude mať 12 až 15 takých nukleotidov, ktoré sú úplne komplementárne s templátom na oboch stranách nukleotidu(ov), kódujúcich mutáciu. Toto zaisťuje, že oligonukleotid bude účinne hybridizovať jednoreťazcovú molekulu DNA templátu. Oligonukleotidy možno syntetizovať s použitím techník známych v tejto odbornej oblasti, ako ich opisuje Crea a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978).

Templátová DNA môže byť generovaná pomocou tých vektorov, ktoré sú buď odvodené od bakteriofágových M13 vektorov (vhodné sú komerčne dostupné M13mpl8 a M13mpl9 vektory) alebo tých vektorov, ktoré obsahujú jednoreťazcový fágový počiatok replikácie, ako opisuje Viera a spol., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Potom DNA, ktorá má byť mutovaná, sa môže vsunúť do jedného z týchto vektorov za účelom generovania jednoreťazcového templátu. Príprava jednoreťazcového templátu je opísaná v sekciách 4.21-4.41 publikácie Sambrook a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Alternatívne môže byť jednoreťazcová templátová DNA generovaná denaturáciou DNA dvojreťazcového plazmidu (alebo iného) s použitím štandardných postupov.

Pre alternatívu prirodzenej sekvencie DNA (napríklad na generovanie variantov sekvencie aminokyselín) možno hybridizovať oligonukleotid s jednoreťazcovým templátom za vhodných hybridizačných podmienok. DNA polymerizačný enzým, obvykle Klenowov fragment DNA polymerázy I, sa potom pridá za účelom syntézy komplementárneho reťazca templátu, s použitím oligonukleotidu ako priméru pre syntézu. Vytvorí sa heteroduplexná molekula a to takým spôsobom, že jeden reťazec DNA kóduje mutovanú formu mpl ligandu a druhý reťazec (pôvodný templát) kóduje prirodzenú nezmenenú sekvenciu mpl ligandu. Táto heteroduplexná molekula sa potom transformuje do vhodných hostiteľských buniek, obvykle sa použije prokaryot ako je E. coli JM101. Keď bunky narastú, umiestnia sa na agarové platne a podrobia sa skríningu s použitím oligonukleotidového priméru, ktorý je rádioznačený s ³²P za účelom identifikácie bakteriálnych kolónií, ktoré obsahujú mutovanú DNA. Mutovaná oblasť sa potom odstráni a umiestni do vhodného vektora na prípravu proteínu, vo všeobecnosti do expresného vektora a to takého typu, ktorý sa typicky používa na transformáciu vhodného hostiteľa.

Táto uvedená metóda sa môže modifikovať takým spôsobom, že sa vytvorí homoduplexná molekula, v ktorej oba reťazce plazmidu obsahujú mutáciu(ie). Modifikácie sú potom nasledovné: jednoreťazcový oligonukleotid sa naaneluje na jednoreťazcový templát postupom, ktorý už bol opísaný vyššie. Zmes troch deoxyribonukleotidov, deoxyriboadenozín (dATP), deoxyriboguanozin (dGTP) a deoxyribotymidín (dTTP) sa kombinuje s modifikovaným tiodeoxyribocytozínom, nazývaným tiež dCTP-(aS) (ktorý sa dá získať od Amersham Corporation). Táto zmes sa potom pridá ku komplexu templátoligonukleotid. Po pridaní DNA polymerázy do tejto zmesi sa generuje reťazec DNA identický s templátom, s výnimkou mutovanej bázy. Tento nový reťazec DNA bude obsahovať už dCTP-(aS) namiesto dCTP, čo poslúži na jeho ochranu proti štiepeniu reštrikčnými endonukleázami.

Potom, ako sa reťazec templátového dvojreťazcového heteroduplexu poštiepil vhodným reštrikčným enzýmom, reťazec templátu sa môže podrobiť štiepeniu s ExoIII nukleázou alebo s inou vhodnou nukleázou a to vedľa oblasti, obsahujúcej polohu(y), ktorá má byť mutagenovaná. Potom sa reakcia zastaví a zostane molekula, ktorá je len parciálne jednoreťazcová. Úplný dvojreťazcový DNA homoduplex sa potom vytvorí s použitím DNA polymerázy v prítomnosti všetkých štyroch deoxyribonukleotidových trifosfátov, ATP a ligázy DNA. Táto molekula homoduplexu sa potom môže transformovať do vhodných hostiteľských buniek ako je E. coli JM101, ako už bolo uvedené.

DNA kódujúca mutanty mpl ligandu s viac než jednou substituovateľnou aminokyselinou sa môže generovať jedným z viacerých spôsobov. Ak sú aminokyseliny umiestnené v polypeptidovom reťazci bližšie k sebe, potom môžu byť mutované súčasne s použitím jedného oligonukleotidu, ktorý kóduje všetky z požadovaných substitúcií aminokyselín. Na druhej strane, ak sú aminokyseliny umiestnené v určitých vzájomných vzdialenostiach (oddelené od seba viacerými ako desiatimi aminokyselinami), je ťažšie generovať jednoduchý oligonukleotid, ktorý by kódoval všetky

SK 282265 Β6 z požadovaných zmien. V takomto prípade sa použije jedna z dvoch nasledovných alternatívnych metód.

V prvej metóde sa generuje separátny oligonukleotid pre každú aminokyselinu, ktorá má byť substituovaná. Tieto oligonukleotidy sú potom súčasne naanelované na jednoreťazcové templátové DNA a druhý reťazec DNA, ktorý je syntetizovaný z templátu, bude kódovať všetky z požadovaných substitúcií aminokyselín.

Alternatívna metóda zahrnuje dva alebo viac krokov mutagenézy na prípravu požadovaného mutantu. Prvý krok je, ako je opísané, pre jednoduché mutanty: pre templát sa použije DNA divého typu, k tomuto templátu sa pridá oligonukleotid kódujúci prvú požadovanú substitúciu(ie) aminokyseliny a potom sa generuje heteroduplexná molekula DNA. V druhom kroku mutagenézy sa využíva ako templát mutovaná DNA pripravená v prvom kroku mutagenézy. Takto tento templát už obsahuje jednu alebo viac mutácií. Oligonukleotid kódujúci ďalšiu požadovanú substitúciu(ie) aminokyseliny sa potom pridá k tomuto templátu a výsledný reťazec DNA teraz kóduje mutácie z oboch prvých dvoch krokov mutagenézy atď.

Vhodná je tiež PCR mutagenéza na prípravu variant aminokyselín polypeptidu mpl ligandu. Nasledujúci postup sa síce týka DNA, aleje pochopiteľné, že sa môže využiť aj pre RNA. Pri PCR spôsobe sa všeobecne odkazuje na nasledovný postup (pozri, Erlich, kapitola od R. Higuchiho, str. 61-70): Ak sa v PCR postupe použije ako počiatočný materiál malé množstvo templátu DNA, potom také priméry, ktoré sa v sekvencii len málo líšia od zodpovedajúcej oblasti v templáte DNA, sa môžu použiť na generovanie pomerne veľkých množstiev špecifického fragmentu DNA, ktorý sa líši od sekvencie templátu len v tých polohách, v ktorých sa priméry líšia od templátu. Na zavedenie mutácie do plazmidu DNA sa jeden z primárov skonštruuje takým spôsobom, aby prekrýval polohu mutácie a obsahoval mutáciu; sekvencia druhého priméru musí byť identická s úsekom sekvencie opačného reťazca plazmidu, ale táto sekvencia môže byť umiestnená hocikde pozdĺž plazmidu DNA. Je výhodné, keď sekvencia druhého priméru je umiestnená vo vzdialenosti 200 nukleotidov od prvého, takže nakoniec celá amplifikovaná oblasť DNA, ohraničená primérmi, sa môže ľahko sekvenovať. PCR amplifikácia, pri ktorej sa použije podobným spôsobom pár primérov namiesto jedného priméru, vedie k takej populácii fragmentov DNA, ktorá sa líši v polohe mutácie špecifikovanej primérom a pravdepodobne v ďalších polohách, pretože kopírujúci templát je trochu nepresný.

Ak je pomer templátu k produkovanému materiálu extrémne nízky, obrovská prevaha produkčných fragmentov DNA zahrnuje požadovanú mutáciu(ie). Tento produkovaný materiál sa použije ako náhrada zodpovedajúcej oblasti v plazmide, ktorá slúži ako PCR templát s použitím štandardnej DNA technológie. Mutácie v oddelených polohách možno zaviesť súčasne a to buď pomocou mutantného druhého priméru alebo vytvorením druhého PCR s rozdielnymi mutantnými primérmi a ligáciou dvoch výsledných fragmentov PCR súčasne k vektorovému fragmentu v troch (alebo viacerých) častiach ligácie.

V špecifickom príklade PCR mutagenézy sa plazmidová templátová DNA (1 pg) linearizuje štiepením s reštrikčnou endonukleázou, ktorá má špecifickú poznávaciu polohu v plazmide DNA mimo oblasť amplifikácie. Z tohto materiálu sa pridá 100 ng do zmesi PCR, obsahujúcej PCR tímivý roztok, ktorý obsahuje štyri trifosfáty deoxynukleotidu a je obsiahnutý v súpravách GeneAmp® (získaných od Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA) a 25 pmolov každého priméru oligonukleotidu, až do koneč ného objemu 50 pl. Povrch reakčnej zmesi sa pokryje 35 pl minerálneho oleja. Potom sa reakčná zmes denaturuje 5 minút pri 100 °C, umiestni na chvíľu na ľad a potom sa 1 pl Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerázy (5 jednotiek/pl, kúpenej od Perkin-Elmer Cetus) pridá pod vrstvu minerálneho oleja. Reakčná zmes sa vloží do DNA Thermal Cycler (zakúpený od Perkin-Elmer Cetus), ktorý je takto naprogramovaný: 2 min 55 °C s 72 °C, potom 19 cyklov s nasledovným programom: 30s94°C s 55 °C a 30 s 72 °C.

Na konci programu sa reakčná ampulka vyberie z DNA Thermal Cycler a vodná fáza sa prenesie do novej ampulky, extrahuje sa zmesou fenol/chloroform (50:50 obj.), vyzráža etanolom a DNA sa separuje štandardným postupom. Tento materiál sa potom podrobí vhodnému spracovaniu na zavedenie do vektora.

Ďalší spôsob prípravy variantov, kazetová mutagenéza, je založený na postupe opísanom Wellsom a spol., Gene, 34:315 (1985). Počiatočným materiálom je plazmid (alebo iný vektor), obsahujúci DNA mpl ligandu, ktorá sa má mutovať. Identifikuje sa kód(y) DNA mpl ligandu, ktorá má byť mutovaná. Na každej strane identifikovanej mutačnej polohy(ôh) sa musí nachádzať poloha špecifickej reštrikčnej endonukleázy. Ak neexistujú takéto reštrikčné polohy, potom sa musia generovať s použitím opísanej mutagenovej metódy prostredníctvom oligonukleotidu, aby sa zaviedli vo vhodných polohách DNA mpl ligandu. Keď boli tieto reštrikčné polohy zavedené do plazmidu, plazmid sa reže v týchto polohách a linearizuje. S použitím štandardných postupov sa syntetizuje dvojreťazcový oligonukleotid kódujúci sekvenciu DNA medzi reštrikčnými polohami, ale obsahujúci požadovanú mutáciu(ie). Oddelene sa syntetizujú dva reťazce a potom spolu hybridizujú s použitím štandardných postupov. Takýto dvojreťazcový oligonukleotid sa označuje ako kazeta. Táto kazeta je skonštruovaná tak, aby mala 3' a 5' konce, ktoré sú kompatibilné s koncami linearizovaného plazmidu, takže môže byť priamo ligovaná na plazmid. Tento plazmid potom obsahuje mutovanú sekvenciu DNA mpl ligandu.

C. Inzercia nukleovej kyseliny do replikovateľného vektora

Nukleová kyselina (napr. cDNA alebo genómová DNA), kódujúca prirodzený alebo variantný polypeptid mpl ligandu, sa vloží do replikovateľného vektora na ďalšie klonovanie (amplifikáciu DNA) alebo na expresiu. Dostupných je veľa vektorov a výber vhodného z nich bude závisieť od toho, (1) či je použiteľný na amplifikáciu DNA alebo na expresiu DNA, (2) od veľkosti inzerovanej nukleovej kyseliny do vektora a (3) od hostiteľskej bunky, ktorá bude transformovaná vektorom. Každý vektor obsahuje rozličné zložky, závisiace od jeho funkcie (zdvojenie DNA alebo expresia DNA) a od hostiteľskej bunky, s ktorou je kompatibilný. Vektor všeobecne zahrnuje jeden alebo viac z nasledujúcich komponentov: signálnu sekvenciu, počiatok replikácie, jeden alebo viac značkovacích génov, zosilňovací prvok, promótor, transkripčnú terminačnú sekvenciu a ďalšie.

i) Komponent signálnej sekvencie

Mpl ligand podľa tohto vynálezu sa môže exprimovať nielen priamo, ale tiež spojením s heterologickým polypeptidom, výhodne signálnej sekvencie alebo iným polypeptidom, ktorý má špecifickú štiepnu polohu v N-konci zrelého proteínu alebo polypeptidu. Všeobecne, signálna sekvencia môže byť komponentom vektora alebo môže byť časťou DNA mpl ligandu, ktorá je vkladaná do vektora. Vybraná heterologická signálna sekvencia môže byť rozpoznaná a spracovaná (napr. štiepená signálnou peptidázou) hostiteľskou bunkou. Čo sa týka prokaryotických hostiteľských buniek, ktoré nerozpoznajú a nespracujú signálnu sekvenciu prirodzeného mpl ligandu, signálna sekvencia sa substituuje vybranou prokaryotickou signálnou sekvenciou, napríklad zo skupiny alkalickej fosfatázy, penicilinázy, Ipp alebo tepelne stabilných enterotoxinových II vodičov. V prípade sekrécie kvasiniek môže byť prirodzená signálna sekvencia substituovaná, napr. invertázou kvasiniek, alfa faktorom alebo vedúcimi sekvenciami kyslých fosfatáz, vedúcou sekvenciou glukoamylázy C. albicans (EP 362,179 zverejnený 4. apríla 1990) alebo signálom, opísaným v WO 90/13646, zverejneným 15. novembra 1990. Pri expresii buniek cicavcov je prirodzená signálna sekvencia (napr. presekvcencia mpl ligandu, ktorá normálne riadi sekréciu mpl ligandu z jeho prirodzených buniek cicavcov in vivo) vyh^ovujúca, hoci aj iné signálne sekvencie cicavcov môžu byť vhodné, ako sú signálne sekvencie z druhých polypeptidov mpl ligandu alebo z toho istého mpl ligandu z odlišných živočíšnych druhov, signálne sekvencie z mpl ligandu a signálne sekvencie zo sekretovaných polypeptidov tých istých alebo príbuzných druhov a rovnako aj vírusové sekrečné vodiče, napríklad, gD signál herpesu simplex.

ii) Počiatok replikácie

Aj expresný aj klonovací vektor obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá umožňuje replikovať vektor v jednej alebo viacerých vybraných hostiteľských bunkách. Všeobecne, pri klonovacích vektoroch táto sekvencia umožňuje replikovať vektor nezávisle od hostiteľskej chromozómovej DNA a zahrnuje počiatok replikácie alebo autonómne replikujúce sekvencie. Takéto sekvencie sú dobre známe pre množstvo baktérií, kvasiniek a vírusov. Počiatok replikácie z plazmidu pBR322 je vhodný pre väčšinu gram-negatívnych baktérií, počiatok replikácie 2 μ plazmidu je vhodný pre kvasinky a rozličné vírusové počiatky replikácie (SV40, polyoma, adenovírus, VSV alebo BPV) sa používajú pre klonovacie vektory v bunkách cicavcov. Vo všeobecnosti počiatok replikácie nie je potrebný pre expresné vektory cicavcov (počiatok SV40 sa môže typicky použiť len preto, lebo obsahuje počiatočný promótor).

Väčšina expresných vektorov sú „shuttle“ vektory, to znamená, že sú schopné replikácie aspoň v jednej skupine organizmov a môžu sa preniesť do iných organizmov kvôli expresii. Napríklad, vektor je klonovaný v E. coli a potom sa ten istý vektor prenesie do kvasiniek alebo do buniek cicavcov kvôli expresii, hoci dokonca nie je schopný replikácie nezávisle od chromozómov hostiteľskej bunky.

Aj DNA sa môže amplifíkovať inzerciou do hostiteľského genómu. Toto sa dosiahne pomocou druhov Bacillus ako hostiteľov, napríklad vložením do vektora sekvencie DNA, ktorá je komplementárna k sekvencií, nachádzajúcej sa v genómovej DNA príslušného druhu Bacillus. Transfekcia druhu Bacillus spolu s týmto vektorom vyvolá homologickú rekombináciu s genómom a vloženie DNA mpl ligandu. Avšak oddelenie genómovej DNA, kódujúcej mpl ligand, je zložitejšie ako jej oddelenie z exogénne replikovaného vektora, pretože je potrebné štiepenie reštrikčným enzýmom na odstránenie DNA mpl ligandu.

iii) Selekcia génovej z/ožky

Expresné a klonovacie vektory môžu obsahovať selekčný gén, tiež označovaný ako selekcieschopný signálny znak (marker). Tento gén kóduje taký proteín, ktorý je nutný na prežitie alebo rast transformovaných hostiteľských buniek rastúcich v selektívnej kultúre. Také hostiteľské bunky, ktoré neboli transformované s vektorom obsahujúcim selekčný gén v kultúre, neprežijú. Typické selekčné gény kódujú proteíny, ktoré (a) prepožičiavajú odolnosť voči antibiotikám alebo iným toxínom, napr. ampicilín, neomycín, metotrexát alebo tetracyklín, (b) dopĺňajú auxotrofické nedostatky alebo (c) dodávajú kritické živiny nedostupné z komplexného média, napr. gén kódujúci racemázu D-alanínu pre Bacilli.

Jeden príklad selekčnej schémy využíva liečivo na zastavenie rastu hostiteľskej bunky. Tieto bunky, ktoré sú úspešne transformované s hetero logickým génom, exprimujú proteín, vyvolávajú odolnosť voči liečivu a takto prežijú režim selekcie. Ako príklady takejto dominantnej selekcie možno uviesť: s použitím neomycínu ako liečiva (Southem a spol., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 [1982]), s použitím kyseliny mykofenolovej (Mulligan a spol., Science, 209:1422 [1980]) alebo hygromycínu (Sugden a spol., Mol. Celí. Biol. 5: 410-413 [1985]). V troch vyššie uvedených príkladoch sa používajú bakteriálne gény regulované eukaryoticky na prenesenie odolnosti voči vhodným liečivám, ako sú G418 alebo neomycín (geneticín), xgpl (kyselina mykofenolová) alebo hygromycín.

Ako príklady ďalších vhodných selekcie schopných markerov buniek cicavcov poslúžia také markery, ktoré sú schopné identifikovať bunky kompetentné na vyzdvihnutie mpl ligandu nukleovej kyseliny, ako sú reduktáza solí kyseliny dihydrolistovej (DHFR) alebo kináza tymidínu. Transformáty buniek cicavcov sa umiestnia pri vybranom tlaku tak, že len transformáty sú špecificky adaptované na prežitie v dôsledku účinku vyzdvihnutia pomocou signálneho znaku (markera). Vybraný tlak sa zavedie kultivovaním transformátov za podmienok, pri ktorých sa koncentrácia selekčného činidla v médiu postupne mení a tým vedie k amplifikácii aj selekčného génu, aj DNA, ktorá kóduje polypeptid mpl ligandu. Amplifikácia je proces, pomocou ktorého gény, vo väčšine požiadaviek na prípravu proteínu kriticky dôležitého pre rast, sú opakovane iterované (repetícia génov) v tandeme s chromozómami úspešných generácií rekombinantných buniek. Z amplifikovanej DNA sú potom syntetizované väčšie množstvá mpl ligandu.

Bunky, transformované s DHFR selekčným génom, sú napríklad najprv identifikované kultivovaním všetkých transformátov v kultúre, ktorá obsahuje metotrexát (Mtx) a konkurenčného antagonistu k DHFR. Vhodnou hostiteľskou bunkou, ak sa použije divý typ DHFR, je bunková línia z vaječníkov čínskych škrečkov (CHO), ktorá má nedostatočnú aktivitu DHFR, pripravená a rozmnožená ako opisujú Urlaub a Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Transformované bunky sú potom vystavené účinku zvýšenej koncentrácie Mtx. Toto vedie k syntéze viacnásobných kópií DHFR génu a následne viacnásobných kópií ďalšej DNA, obsahujúcej expresný vektor, ako je DNA kódujúca mpl ligand. Amplifikačné techniky sa môžu použiť s akýmkoľvek iným vhodným hostiteľom, napr. ATCC No. CCL61 CHO-K1, bez ohľadu na prítomnosť endogénnej DHFR, ak sa, napríklad, použije mutant DHFR génu, ktorý je vysoko odolný voči Mtx (EP 117,060). Hostiteľské bunky (najmä hostitelia divého typu, ktorí obsahujú endogénnu DHFR), transformované alebo ko-transformované so sekvenciou DNA kódujúcou mpl ligand, ďalej divý typ DHFR proteínu a ďalšie selekcie schopné signálne znaky, ako je aminoglykozid 3 fosfotransferáza (APH), môžu byť tiež selektované rastom buniek v médiu, ktoré obsahuje selekčné činidlo pre selekcie schopný marker, ako

SK 282265 Β6 je aminoglykozidové antibiotikum, napríklad kanamycín, neomycín alebo G418 (viď U.S. Patent 4 965 199).

Vhodným selekčným génom na použitie v kvasinkách je trpí gén, ktorý je prítomný v plazmide YRp7 kvasiniek (Stinchcomb a spol., Náture, 282:39 [1979]; Kingsman a spol., Gene, 7:141 [1979]; alebo Tschemper a spol., Gene, 10:157 [1980]). Gén trpí pôsobí ako selekčný marker mutantného kmeňa kvasiniek, ktoré stratili schopnosť rastu v tryptofáne, napríklad ATCC No. 44076 alebo PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Prítomnosť poškodenia trpí v genóme hostiteľskej bunky kvasiniek potom zabezpečí účinný rozvoj detekcie transformácie pomocou rastu v neprítomnosti tryptofánu. Podobne £eu2-deficitné kmene kvasiniek (ATCC No. 20,622 alebo 38,626) sa stanú komplementárne pomocou známych plazmidov nesúcich Leu2 gén.

iv) Promótorový komponent

Expresné a klonovacie vektory obvykle obsahujú promótor, ktorý hostiteľský organizmus dokáže rozpoznať a je použiteľné pripojený k mpl ligandu nukleovej kyseliny. Promótormi sú netranslátované (netranslátované) sekvencie umiestnené proti smeru expresie (5) voči počiatočnému kódu konštrukčného génu (všeobecne, vo vzdialenosti okolo 100 až 1000 bp), ktoré regulujú transkripciu a transláciu špeciálnej sekvencie nukleovej kyseliny ako je sekvencia nukleovej kyseliny mpl ligandu, ku ktorej sa použiteľné pripájajú. Takéto promótory obvykle delíme do dvoch skupín, na inducibilné a konštitutívne. Inducibilné promótory sú také, ktoré iniciujú zvýšenie úrovne transkripcie z DNA a regulujú túto činnosť v odozve na určité zmeny v podmienkach kultúry, napríklad prítomnosť alebo neprítomnosť výživných látok alebo zmena teploty. V súčasnosti je známe veľké množstvo promótorov rozpoznaných rozličnými potenciálnymi hostiteľskými bunkami. Tieto promótory sú použiteľné spájané s mpl ligandom, kódujúcim DNA a to vybraním promótora z pôvodnej DNA pomocou štiepenia reštrikčným enzýmom a vložením sekvencie izolovaného promótora do vektora. Aj sekvencia promótora prirodzeného mpl ligandu a aj množstvo heterologických promótorov sa môže použiť na priamu amplifíkáciu a/alebo expresiu DNA mpl ligandu. Avšak výhodné sú heterologické promótory, pretože vo všeobecnosti umožňujú väčšiu transkripciu a dávajú vyššie výťažky exprimovaného mpl ligandu v porovnaní s prirodzeným promótorom mpl ligandu.

Medzi promótory, ktoré sú vhodné na použitie s prokaryotickými hostiteľmi, patrí β-laktamázové a laktózové promótorové systémy (Chang a spol., Náture, 275:615 [1978]; a Goeddel a spol., Náture, 281:544 [1979]), promótor alkalickej fosfatázy a tryptofánový (trp) promótorový systém (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] a EP 36,776) a hybridné promótory ako je tac promótor (deBoer a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Vhodné sú aj ďalšie bakteriálne promótory. Ich sekvencie nukleotidov boli publikované, čo umožňuje skúsenému pracovníkovi operatívne ich pripojiť k DNA kódujúcej mpl ligand (Siebenlist a spol., Celí, 20:269 [1980]) s použitím linkerov alebo adaptérov na zabezpečenie ľubovoľných požadovaných reštrikčných polôh. Promótory na použitie v bakteriálnych systémoch budú tiež obsahovať ShineDalgamovu (S.D.) sekvenciu, operatívne pripojenú k DNA kódujúcej polypeptid mpl ligandu.

Sekvencie promótorov sú známe pre eukaryoty. V skutočnosti všetky eukaryotické gény majú AT-bohatú oblasť umiestnenú približne vo vzdialenosti 25 až 30 báz proti smeru expresie od polohy, v ktorej sa iniciuje transkripcia.

Ďalšia sekvencia, nájdená 70 až 80 báz proti smeru sekvencie od počiatku transkripcie väčšiny génov, je CXCAAT oblasť, kde X môže byť ľubovoľný nukleotid. Na 3' konci väčšiny eukaryotických génov je AATAAA sekvencia, ktorá môže byť signálom pre adíciu poly A konca k 3 koncu kódujúcej sekvencie. Všetky z týchto sekvencií sa vhodne vkladajú do eukaryotických expresných vektorov.

Príklady vhodných aktivačných sekvencií na použitie v kvasinkovom hostiteľovi zahrnujú promótory 3-fosfoglycerát kinázy (Hitzeman a spol., J. Biol. Chem., 255:2073 [1980]) alebo ďalších glykolytických enzýmov (Hees a spol., J. Adv. Enzýme Reg., 7:149 [1968]; a Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), ako sú enoláza, glyceraldehyd3-fosfátodehydrogenáza, hexokináza, pyrohroznandekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukózo-6-fosfátoizomeráza, 3-fosfoglycerátomutáza, pyrohroznankináza, triózofosfátoizomeráza, fosfoglukózoizomeráza a glukokináza.

Ďalšími kvasinkovými promótormi, ktoré sú promótormi schopnými indukcie a navyše majú výhodu transkripcie regulovanej pomocou rastových podmienok, sú promótorové oblasti alkoholdehydrogenázy 2, izocytochrómu C, kyslej fosfatázy, degradačných enzýmov spojených s metabolizmom dusíka, metalotioneínu, glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázy a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Ďalšie vhodné vektory a promótory na použitie pri expresii v kvasinkách sú ďalej opísané v Hitzeman a spol., EP 73,657A. Kvasinkové zosilňovače sa tiež výhodne používajú s kvasinkovými promótormi.

Transkripcia mpl ligandu z vektorov v hostiteľských bunkách cicavcov je regulovaná, napríklad, promótormi získanými z genómov vírusov, ako je pofyoma vírus, vírus kiahní hydiny (UK 2 211 504, zverejnený 5. júla 1989), adenovírus (ako je Adenovírus 2), vírus hovädzieho papilomu, vírus vtáčieho sarkómu, cytomegalovírus, retrovírus, vírus hepatitídy-B a výhodne Simian Virus 40 (SV40), z heterologických promótorov cicavcov, napríklad aktínový promótor alebo imunoglobulinový promótor, z tepelnošokových promótorov a z promótorov normálne spojených so sekvenciou mpl ligandu, aby sa zabezpečilo, že takéto promótory sú kompatibilné s hostiteľským bunkovým systémom.

Skoršie a neskoršie promótory vírusu SV40 sa vhodne získajú ako SV40 reštrikčné fragmenty, ktoré tiež obsahujú SV40 vírusový počiatok replikácie (Fiers a spol., Náture, 273:113 [1978]; Mulligan aBerg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 [1981]). Najskorší promótor ľudského cytomegalovirusu sa vhodne získa ako //indlll E reštrikčný fragment (Greenaway a spol., Gene, 18:355-360 [1982]). Systém na expresiu DNA v hostiteľoch (cicavce) s použitím vírusu hovädzieho papilomu ako vektora je opísaný v U.S. Patente 4 601 978. Odkázať možno tiež na Gray a spol., Náture, 295:503-508 [1982], čo sa týka expresie cDNA kódujúcej imunitný interťerón v bunkách opíc; na Reyes a spol., Náture, 297:598-601 [1982], čo sa týka expresie ľudského β-interferónu cDNA v bunkách myší reguláciou promótorom tymidín kinázou z vírusu herpes simplex; na Canaani a Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 [1982], čo sa týka expresie βΐ génu ľudského interferónu do kultivovaných buniek myší a králikov; a na Gorman a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:67776781 [1982], čo sa týka expresie bakteriálnych C AT sekvencií do CV-1 obličkových buniek opíc, fibroblastov embryí sliepok, vaječníkových buniek čínskych škrečkov, HeLa buniek a myších NIH-3T3 buniek, s použitím dlhých

SK 282265 Β6 terminálnych opakovaní vírusu Rousoveho sarkómu ako promótora.

(v) Zložka zosilňovacieho prvku

Transkripcia DNA kódujúcej mpl ligand podľa tohto vynálezu pre vyššie eukaiyoty sa často dá zvýšiť inzerciou zosilňovacej sekvencie do vektora. Zosilňovačmi sú cis-pôsobiace elementy DNA, obvykle okolo 10 až 300 bp, ktoré pôsobia na promótor a zosiľujú jeho transkripciu. Zosilňovače sú nezávislé od relatívnej orientácie a polohy a môžu mať, ako bolo zistené 5' (Laimins a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981]) a 3 (Lusky a spol., Mol. Celí Bio., 3:1108 [1983]) voči transkripčnej jednotke, vo vnútri intrónu (Banerji a spol., Celí, 33:729 [1983]), rovnako ako vo vnútri samotnej kódujúcej sekvencie (Osbome a spol., Mol. Celí Bio., 4:1293 [1984]). Je známych mnoho sekvencií zosilňovačov z génov cicavcov (globin, elastáza, albumín, a-fetoprotein a inzulín). Typicky sa však použije zosilňovač z eukaryotického bunkového vírusu. Príklady zahrnujú SV40 zosilňovač na predchádzajúcej strane počiatku replikácie (bp 100-270), zosilňovač počiatočného promótora cytomegalovírusu, polyoma zosilňovač na predchádzajúcej strane počiatku replikácie a zosilňovače adenovírusu. Pozri tiež Yaniv, Náture, 297:17-18 [1982], čo sa týka zosilňovacích prvkov na aktiváciu eukaryotických promótorov. Zosilňovče sa dajú pripojiť do vektora v polohe 5 alebo 3' k sekvencií kódujúcej mpl ligand, ale výhodne sa umiestňujú v polohe 5 od promótora.

vi) Komponent terminácie transkripcie

Expresné vektory používané v eukaryotických hostiteľských bunkách (kvasinky, huby, hmyz, rastliny, zvieratá, ľudia alebo nukleované bunky z ďalších mnohobunečných organizmov) budú tiež obsahovať sekvencie, ktoré sú potrebné na termináciu transkripcie a na stabilizáciu mRNA. Takéto sekvencie sú bežne dostupné z 5 a tiež z 3 netranslátovanej oblasti eukaryotických alebo vírusových DNA alebo cDNA. Tieto oblasti obsahujú segmenty nukleotidu, prepísané ako polyadenylované fragmenty v netranslátovaných častiach mRNA kódujúcej mpl ligand.

vii) Konštrukcia a analýza vektorov

Konštrukcia vhodných vektorov, obsahujúcich jednu alebo viac uvedených zložiek, využíva štandardné ligačné techniky. Izolované plazmidy alebo fragmenty DNA sa štiepia, strihajú a ligujú v tvare požadovanom na generovanie vyžadovaných plazmidov.

Na potvrdenie, či sa skonštruovali v plazmidoch správne sekvencie, sa vykonala analýza, pričom sa zmesi po ligovaní použili na transformáciu E. coli K12 kmeň 294 (ATCC No. 31,446) a úspešné transformáty sa selektovali na rezistenciu voči ampicilínu alebo tetracyklínu, podľa vhodnosti. Z transformátov sa pripravili plazmidy, analyzovali štiepením reštrikčnou endonukleázou a/alebo sa sekvenovali metódou Messinga a spol., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] alebo metódou Maxama a spol., Methods in Enzymology, 65:499 [1980], viii) Prechodné expresné vektory

Špeciálne užitočné v praktickom využití tohto vynálezu sú expresné vektory, ktoré zabezpečujú prechodnú expresiu v bunkách cicavcov DNA, ktorá kóduje polypeptid mpl ligandu. Vo všeobecnosti prechodná expresia zahrnuje použitie expresného vektora, ktorý je schopný účinne sa replikovať v hostiteľskej bunke tak, že hostiteľská bunka akumuluje množstvo kópií expresného vektora a na druhej strane syntetizuje vysoké koncentrácie požadovaného polypeptidu, kódovaného expresným vektorom, Sambrook a spol., pozri, str. 16.17 - 16.22. Prechodné expresné systémy, obsahujúce vhodný expresný vektor a hostiteľskú bunku, umožňujú vhodnú pozitívnu identifikáciu polypeptidov kódovaných klonovanými DNA, rovnako ako aj rýchly skríning takýchto polypeptidov na vyžadované biologické alebo fyziologické vlastnosti. Takto, prechodné expresné systémy sú špeciálne užitočné v zmysle tohto vynálezu na účely identifikácie analógov a variantov polypeptidu mpl ligandu, ktoré majú biologickú aktivitu polypeptidu mpl ligandu.

ix) Vhodné príklady vektorov buniek stavovcov

Ďalšie metódy, vektory a hostiteľské bunky vhodné na adaptáciu, na syntézu mpl ligandu v rekombinantnej bunkovej kultúre stavovcov opisujú Gething a spol., Náture, 293:620-625 [1981]; Mantei a spol., Náture, 281:40-46 [1979]; Levinson a spol.; EP 117,060; a EP 117,058. Špeciálne použiteľným plazmidom na expresiu bunkovej kultúry cicavcov mpl ligandu je pRK5 (EP 307,247; U.S. Patent 5 258 287) alebo pSV16B (PCT WO 91/08291).

D. Selekcia a transformácia hostiteľských buniek

Vhodnými hostiteľskými bunkami na klonovanie alebo expresiu vektorov, podľa tohto vynález, sú prokaryoty, kvasinky alebo vyššie eukaryotické bunky, ktoré už boli opisané. Vhodné prokaryoty zahrnujú eubaktérie, ako sú Gram-negatívne alebo Gram-pozitívne organizmy, napríklad, E. coli, Bacilli ako je B. subtilis, Pseudomonas sp. ako je P. aeruginosa, Salmonella typhimurium alebo Serratia marcescans. Jednou z preferovaných E. coli klonujúcich hostiteľských buniek je E. coli 294 (ATCC No. 31,446), hoci aj ďalšie kmene, ako sú E. coli B, E. coli X1776 (ATCC No. 31.537) a E. coli W3110 (ATCC No. 27.325) sú vhodné. Tieto príklady sú len ilustračné a nelimitujú rozsah použitia príslušných hostiteľských buniek. Preferovaná hostiteľská bunka má vylučovať minimálne množstvá proteolytických enzýmov. Podobne sú vhodné aj in vitro metódy klonovania, to znamená PCR alebo iné reakcie polymerázy nukleovej kyseliny.

Spolu s prokaryotmi sú vhodnými hostiteľmi pre vektory kódujúce mpl ligand aj eukaryotické mikróby, ako sú vláknité huby alebo kvasinky. Saccharomyces cerevisiae alebo bežné pekárske kvasnice sa najbežnejšie používajú medzi nižšími eukaryotickými hostiteľskými mikroorganizmami. Avšak v zmysle tohto vynálezu je použiteľných množstvo ďalších, bežne dostupných rodov, druhov a kmeňov, ako sú Schizosaccharomyces pombe (Beach a Nurse, Náture, 290:140 [1981]; EP 139,383 zverejnený 2. mája 1985), hostitelia z rodu Kluyveromyces (U.S. Patent 4 943 529), ako sú napríklad K. lactis (Louvencourt a spol., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fŕagilis, K. bulgarieus, K.thermotolerans a K. marxianus, yarrowia (EP 402,226), Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna a spol., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Čase a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]) a vláknité huby ako sú, napríklad, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 zverejnené 10. januára 1991) a hostitelia z rodu Aspergillus ako sú A. nidulans (Ballance a spol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilbum a Spol., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:147-1474 [1984]) a A. niger (Kelly a Hynes, EMBOJ., 4:475-479 [1985]).

Vhodné hostiteľské bunky na expresiu glykozylovaného mpl ligandu sa odvodili z mnohobunkových organizmov. Takéto hostiteľské bunky sú schopné komplexného spracovania a glykozylačných aktivít. V zásade každá vyš

SK 282265 Β6 šia eukaryotická bunková kultúra je spracovateľná, či už z kultúry stavovcov alebo bezstavovcov. Príklady buniek bezstavovcov zahrnujú bunky rastlín a hmyzu. Množstvo bakulovírusových kmeňov a variantov a zodpovedajúcich povolených hostiteľských buniek hmyzu sa identifikovalo z hostiteľov, ako sú Spodoptera frugiperda (húsenica), Aedes aegypti (moskyt), Aedes albopictus (moskyt), Drosophila melanogaster (octomilka) a Bombyx mori. Pozri, napríklad, Luckow a spol., Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller a spol., Genetic Engineering, Setlow a spol., eds., Vol. 8 (Plénum Publishing, 1986), str. 277-279; a Maeda a spol., Náture, 315:592-594 [1985], Množstvo vírusových kmeňov na transfekciu je publikačné dostupných, napríklad L-l variant z Autographa californica NPV a Bm-5 kmeň z Bombyx mori NPV a takéto vírusy sa môžu použiť ako vírusy podľa tohto vynálezu, najmä na transfekciu buniek Spodoptera frugiperda.

Kultúry buniek rastlín bavlny, pšenice, zemiakov, sóje, petúnie, paradajok a tabaku sa môžu použiť ako hostitelia. Typický postup zahrnuje transfekciu buniek rastlín pomocou inkubácie s určitými kmeňmi baktérie Agrobacterium tumefaciens, ktorá bola najprv upravená tak, aby obsahovala DNA mpl ligandu. V priebehu inkubácie bunkovej kultúry rastliny s A. tumefaciens sa DNA, kódujúca mpl ligand, prenesie do hostiteľskej bunky rastliny tak, že prebehne transfekovanie a hostiteľská bunka bude za vhodných podmienok exprimovať DNA mpl ligandu. Navyše sú dostupné regulačné a signálne sekvencie, kompatibilné s bunkami rastliny, ako sú promótor nopálovej syntézy a polyadenylačné signálne sekvencie, Depicker a spol., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982], DNA segmenty, izolované z oblasti proti smeru expresie T-DNA 780 génu, sú tiež schopné aktivácie a zvyšovania transkripčnej úrovne génov exprimujúcich rastlinu v rekombinantných rastlinných tkanivách, obsahujúcich DNA. EP 321,196 zverejnený 21. júna 1989.

Ale vyššia pozornosť sa venovala bunkám stavovcov a rozmnožovanie buniek stavovcov v kultúre (tkanivová kultúra) sa v posledných rokoch stalo rutinnou záležitosťou (Tissue Culture, Academic Press, Krase and Patterson, editors [1973]). Ako príklady užitočných hostiteľských bunkových línií cicavcov možno uviesť CV1 bunkovú líniu opičej obličky, transformovanú pomocou SV4O (COS-7, ATCC CRL 1651); líniu ľudskej embryonálnej obličky (293 alebo 293 bunky subklonované na rast v suspenznej kultúre, Graham a spol., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); bunky obličky mláďat škrečka (BHK, ATCC CCL 10); bunky vaječníkov čínskych škrečkov/-DHFR (CHO, Urlaub a Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); myšie „sertoli“ bunky (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243251 [1980]); bunky opičích obličiek (CV1 ATCC CCL 70); bunky obličiek „afrických zelených opíc“ (VERO-76, ATCC CRL-1587); ľudské cervikálne karcinómové bunky (HELA, ATCC CCL 2); psie obličkové bunky (MDCK, ATCC CCL 34); pečeňové bunky z „buffalo rat“ (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ľudské pľúcne bunky (W138, ATCC CCL 75); ľudské pečeňové bunky (Hep G2, HB 8065); myší prsný tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI bunky (Mather a spol., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); MRC 5 bunky; FS4 bunky; a línia ľudských hepatómových buniek (Hep G2).

Hostiteľské bunky sa transfekujú a výhodne transformujú s opísanými expresnými alebo klonovacími vektormi podľa tohto vynálezu a kultivujú sa v bežných živných médiách, modifikovaných podľa potreby na indukciu promótormi, selekciu transformátormi alebo na amplifikáciu génmi, kódujúcimi požadované sekvencie.

Transfekcia predstavuje proces, pri ktorom expresný vektor vnikne do hostiteľskej bunky, pričom sa v žiadnom prípade neexprimuje žiadna kódujúca sekvencia. Odborníci spôsobilí v danej oblasti poznajú množstvo spôsobov transfekovania, napríklad CaPO₄ a elektroporéza. Úspešnú transfekciu, všeobecne, poznáme podľa toho, keď sa indikuje akákoľvek činnosť tohto vektora vo vnútri hostiteľskej bunky.

Transformácia znamená zavedenie DNA do organizmu tak, že DNA sa replikuje a to buď ako extrachromozómový element alebo pomocou chromozómového integrantu. V závislosti od použitej hostiteľskej bunky sa transformácia vykoná s použitím štandardných techník, vhodných pre dané bunky. Pri prokaryotoch alebo ďalších bunkách obsahujúcich podstatné prekážky z bunečných stien sa všeobecne odporúča použiť spracovanie pomocou vápnika, s využitím chloridu vápenatého, ako je to opísané v časti 1.82 Sambrook a spol., pozri vyššie. Na transformáciu niektorých rastlinných buniek sa používa infekcia s Agrobacterium tumefaciens, ako to opisujú Shaw a spol., Gene, 23:315 (1983) a WO 89/05859, zverejnené 29. júna 1989. Naviac, rastliny sa môžu transfektovať pôsobením ultrazvuku, ako je to opísané vo WO 91/00358, zverejnené 10. januára 1991. V prípade, že steny buniek netvoria takéto prekážky ako je to, napríklad, pri bunkách cicavcov, odporúča sa zrážacia metóda s fosforečnanom vápenatým podľa Grahama a van der Eba, Virology, 52:456-457 (1978). Všeobecné aspekty transformácií bunkových hostiteľských systémov cicavcov opisuje Axel v U.S. Patent 4 399 216, udelenom 16. augusta 1983. Transformácie v kvasinkách sa typicky vykonávajú podľa metódy Van Solingena a spol., J. Bact., 130:946 (1977) a Hsiao a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Môžu sa tiež použiť aj ďalšie metódy na zavedenie DNA do buniek, ako sú nukleová injekcia, elektroporéza alebo protoplastové splynutie.

E. Kultivovanie hostiteľských buniek

Prokaryotické bunky, používané na prípravu polypeptidu mpl ligandu podľa tohto vynálezu, sa kultivujú vo vhodnom médiu, ako všeobecne opisujú Sambrook a spol., pozri vyššie.

Hostiteľské bunky cicavcov, používané na prípravu mpl ligandu podľa tohto vynálezu, sa môžu kultivovať v rozličných médiách. Komerčne dostupné médiá, ako sú Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Médium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Dulbecco's Modified Eagle's Médium ([DMEM], Sigma), sú vhodné na kultivovanie hostiteľských buniek. Navyše, ľubovoľné médium opísané v Ham a Wallace, Meth. Enz., 58: 44 [1979], Bames a Sato, Anál. Biochem., 102: 255 [1980], v U.S. Patentoch 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762 alebo 4 560 655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Patent Re. 30,985 alebo spolu prejednávané U.S.S.N. 07/592,107 alebo 07/592,141, oba prihlásené 3. októbra 1990, ktoré sú tu zahrnuté uvedenými odkazmi, sa môže použiť ako kultivačné médium pre hostiteľské bunky. Akékoľvek z týchto médií môže byť, ak je to potrebné, doplnené hormónmi a/alebo inými rastovými faktormi (ako sú inzulín, transferín alebo epidermálny rastový faktor), soľami (ako sú chlorid sodný, fosforečnan vápenatý a horečnatý), tlmivými roztokmi (ako je HEPES), nukleozidmi (ako sú adenozín a tymidfn), antibiotikami (ako je liek Gentamycin™), stopovými prvkami (definovanými ako anorganické zlúčeniny, ktoré sú obvykle prítomné pri konečných koncentráciách v rozsahu mikromólov) a glukózou alebo ekvivalentným zdrojom energie. Akékoľvek ďalšie potrebné prídavky sa môžu tiež doplniť vo vhodných koncentráciách, čo býva známe odborníkom v danej oblasti. Kultivačné podmienky, ako je teplota, pH a pod. sú také, ako sa použili v predchádzajúcom prípade pri selektovanej hostiteľskej bunke na expresiu a sú známe odborníkom v danom odbore.

Vo vzťahu k predchádzajúcemu textu zahrnujú hostiteľské bunky jednak bunky v in vitro kultúre a rovnako bunky, ktoré sú v hostiteľskom živočíchovi.

F. Detekcia amplifikácie/expresie génu

Ampliíikácia a/alebo expresia génu sa môže merať priamo vo vzorke, napríklad bežnými metódami ako sú Southem blotting, northem blotting, na kvantifikáciu transkripcie mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]), dot blotting (analýza DNA) alebo hybridizácia in situ, s použitím vhodne značenej sondy, založenej na tu uvedených sekvenciách. Na značenie sa môžu použiť rozličné látky, najvhodnejšie sú rádioizotopy, najmä ³²P. Ale sa dajú použiť aj iné spôsoby, ako sú biotínom modifikované nukleotidy na zavedenie do polynukleotidu. Biotín potom slúži ako poloha na viazanie k avidínu alebo k protilátkam, ktoré môžu byť značené širokým spektrom značkovacích látok, ako sú rádionukleotidy, enzýmy, fluoreskujúce látky a pod. Podobne sa môžu použiť protilátky, ktoré môžu rozpoznať špecifické duplexy alebo duplexy DNA-proteínu. Protilátky, naopak, môžu byť značené a skúškou sa môže zistiť, či je duplex viazaný na povrch, takže vlastne stanovením naviazania duplexu na povrch sa určí prítomnosť naviazanej protilátky k duplexu.

Expresia génu sa môže merať imunologickými metódami, ako je imunohistochemické sfarbenie tkanivových rezov a test kultúry buniek alebo telových tekutín za účelom priamej kvantifikácie expresie génového produktu. Technikou imunohistochemického sfarbenia sa pripraví vzorka bunky a to typickým postupom pomocou dehydratácie a fixácie a potom reakciou so značenými špecifickými protilátkami pre pripojený génový produkt; obvykle sa používajú vizuálne detegovateľné značenia, ako sú enzýmy, fluorescentné látky, luminiscentné látky a pod. Špeciálne citlivú techniku sfarbenia, vhodnú na použitie podľa tohto vynálezu, opisuje Hsu a spol., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 (1980).

Na imunohistochemické sfarbenie a/alebo test vzorky tekutín sa používajú monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, ktoré sa môžu pripraviť v ľubovoľných cicavcoch. Vhodné je, keď sa protilátky pripravia proti prirodzenému polypeptidu mpl ligandu alebo proti syntetickému peptidu založenému na sekvenciách DNA v zmysle tohto vynálezu, ako sú opísané ďalej.

G. Čistenie polypetidu mpl ligandu

Mpl ligand sa výhodne získava z kultivačného média ako vylúčený polypeptid, hoci sa môže získať aj z lyzátov hostiteľských buniek po priamej expresii bez použitia sekrečného signálu.

Keď sa mpl ligand exprimuje v inej rekombinantnej bunke ako je bunka ľudského pôvodu, potom je mpl ligand úplne zbavený proteínov alebo polypeptidov ľudského pôvodu. Avšak obvykle je potrebné čistiť mpl ligand od ostatných rekombinantných bunkových proteínov alebo polypeptidov, aby sa získali preparáty podstatne homogénne voči mpl ligandu per se. V prvom kroku sa kultivačné médium alebo lyzát odstreďuje, aby sa odstránili jednotlivé zvyšky buniek. Potom sa separuje membrána a vhodné proteínové frakcie. Alternatívne sa môže použiť komerčne dostupný filter (napr. Amicon alebo Milipore Pellicon ultrafiltračná jednotka) na zahustenie (zakoncentrovanie) proteínu. Ďalej sa mpl ligand purifikuje od rozpustných proteínových frakcií a od frakcií membrány kultivačného lyzátu v závislosti od toho, či je mpl ligand viazaný membránou. Potom sa mpl ligand čistí vysolením od znečisťujúcich rozpustných proteínov a polypeptidov a výmenou alebo chromatografickými postupmi s využitím rozličných gélových matríc. Tieto matrice zahrnujú: akrylamid, agarózu, dextran, celulózu a ďalšie bežne používané látky na čistenie proteínu. Ako príklady chromatografických postupov, vhodných na čistenie proteínu, sa dajú uviesť, imunoafinita (to znamená anti-lwipí ligand Mab), receptorafinita (to znamená »tp/-IgG alebo proteín A Sepharose), hydrofóbna interakčná chromatografia (HIC) (to znamená éter, butyl alebo fenyl Toyopearl), lektínová chromatografia (to znamená Con A-Sepharose, lentil-lektín-Sepharose), metóda rozlišovania na základe veľkosti (to znamená Sephadex G-75), ionomeniče (katex a anex) (to znamená DEAE alebo karboxymetyl- a sulfopropylcelulóza) a reverznofázová vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (RP-HPLC) (pozri napr. Urdal a spol, J. Chromatog., 296:171 (1984), kde sa použili dva sekvenčné kroky RP-HPLC na vyčistenie rekombinantného ľudského IL-2). Ďalšie čistiace kroky voliteľne zahrnujú: zrážanie etanolom, zrážanie síranom amónnym, chromatofokusáciu, preparačnú SDS-PAGE a pod.

Varianty mpl ligandu, v (resp. do) ktorých boli zvyšky odstránené, inzerované alebo substituované sa získajú rovnako ako prirodzený mpl ligand, berúc do úvahy akékoľvek podstatné zmeny vlastností v dôsledku variácie. Napríklad príprava fúzie mpl ligandu s iným proteínom alebo polypeptidom, napríklad bakteriálnym alebo vírusovým antigénom, uľahčí čistenie; imunoafinitná kolóna obsahujúca protilátku voči antigénu sa použije na adsorpciu naviazaného polypeptidu. Imunoafinitné kolóny, ako kolóna králičieho polyklonálneho anti-mp/ ligandu, sa môže využiť na absorbovanie variantu mpl ligandu jeho naviazaním aspoň k jednému zostávajúcemu imunitnému epitopu. Alternatívne sa mpl ligand môže čistiť afinitnou chromatografiou s použitím vyčisteného mpl-lgG v dvojici s (výhodne) imobilizovanou živicou, ako je Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) alebo podobne, spôsobom, ktorý je dobre známy odborníkom v danej oblasti. Inhibítor proteázy, ako je fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), sa tiež môže použiť na inhibovanie proteolytickej degradácie počas čistenia a tiež sa môžu použiť antibiotiká na zabránenie rastu cudzích náhodných nečistôt. Odborník v danej oblasti pozná, že čistiace metódy vhodné pre prirodzený mpl ligand si vyžadujú modifikáciu kvôli zmenám v charaktere mpl ligandu alebo jeho variantov na expresiu v rekombinantnej bunkovej kultúre.

H. Kovalentné modifikácie polypetidu mpl ligandu

Kovalentné modifikácie polypeptidu mpl ligandu sú zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu. Aj prirodzený mpl ligand a aj varianty sekvencie aminokyselín mpl ligandu sa môžu kovalentné modifikovať. Jedným druhom kovalentnej modifikácie, ktorý je zahrnutý do rozsahu tohto vynálezu, je napríklad fragment mpl ligandu. Fragmenty variantov mpl ligandu, ktoré majú až do 40 zvyškov aminokyselín, sa môžu vhodne pripraviť chemickou syntézou alebo enzymatickým alebo chemickým štiepením celej dĺžky alebo polypeptidu variantu mpl ligandu. Ďalšie typy kovalentných modifikácií mpl ligandu alebo ich fragmenty sa zaviedli do molekuly reakciou cieľových zvyškov mpl ligandu alebo jeho fragmentov s organickým derivatizačným činidlom, ktoré je schopné reakcie s vybranými bočnými reťazcami alebo s N- alebo C-koncovými zvyškami.

Cysteinylové zvyšky najbežnejšie reagujú s ahalogénacetátmi (a zodpovedajúcimi amínmi), ako je kyselina chlóroctová alebo chlóracetamid, za vzniku karboxy35

SK 282265 Β6 metyl alebo karboxyamidometyl derivátov. Cysteinylové zvyšky sa môžu tiež derivatizovať reakciou s brómtriíluóracetónom, kyselinou a-bróm-p-(5-imidazolyl) propiónovou, chlóracetylfosfátom, N-alkylmaleínimidmi, 3-nitro-2-pyridyldisulfidom, metyl 2-pyridyldisulfidom, p-chlór-merkuribenzoanom, 2-chlórmerkuri-4-nitrofenolom alebo chlór-7-nitrobenzo-2-oxo-1,3-diazolom.

Histidylové zvyšky sa derivatizujú reakciou s dietylpyrouhličitanom pri pH 5,5-7,0, pretože toto činidlo je relatívne špecifické voči bočnému reťazcu týchto zvyškov. Para-brómfenylacylbromid je tiež použiteľný; reakcia sa výhodne vykonáva v 0,1 M kakodylane sodnom pri pH 6,0.

Lyzylové a aminoterminálne zvyšky reagujú s anhydridmi karboxylových kyselín, napríklad butándiovej, ale aj s inými. Derivatizácia týmito činidlami ovplyvňuje zmenu náboja lyzylových zvyškov. Ďalšie vhodné reagenty na derivatizáciu zvyškov, obsahujúcich aminoskupinu, zahrnujú imidoestery ako je metylpikolínimidan, pyridoxálfosfát, pyridoxál, chlórbórhydrid, kyselina trinitrobenzénsulfónová, O-metyl-izomočovina, pentán-2,4-dión a transaminázou katalyzovaná reakcia s glyoxylátom.

Arginylové zvyšky sú modifikované reakciou s jedným alebo niekoľkými bežnými činidlami, napríklad fenylglyoxalom, bután-2,3-diónom, cyklohexán-l,2-diónom a ninhydrínom. Derivatizácia arginylových zvyškov si vyžaduje vykonanie reakcie v alkalickom prostredí, kvôli vysokej hodnote pK_a guanidínovej funkčnej skupiny. Ďalej tieto reagenty môžu reagovať so skupinou lyzínu a rovnako aj s epsilon-amino skupinou arginínu.

Špecifická modifikácia tyrozylových zvyškov sa môže vykonať s prihliadnutím k zavedeniu spektrálneho značenia do tyrozylových zvyškov reakciou s aromatickými diazóniovými zlúčeninami alebo s tetranitrometánom. Najbežnejšie sa môže použiť N-acetylimidazol a tetranitrometán, pričom vznikajú O-acetyl tyrozylové zlúčeniny a 3-nitroderiváty. Tyrozylové zvyšky sa iódujú s použitím ¹²⁵I alebo ¹³¹1 a pripravia sa značené proteíny na použitie v rádioimunologickom stanovení, vhodná je aj opísaná metóda pomocou chlóramínu T.

Bočné karboxylové skupiny (aspartyl alebo glutamyl) sa selektívne modifikujú reakciou s karbodiimidmi (R-N=C=N-R'), kde R a R' sú odlišné alkylové skupiny, ako l-cyklohexyl-3-(2-morfolíno-4-etyl)karbodiimid alebo l-etyl-3-(4-azo-4,4-dimetyl-pentyl)karbodiimid. Ďalej, aspartylové a glutamylové zvyšky sa premenili na asparaginylové a glutaminylové zvyšky reakciou s amóniovými iónmi.

Derivatizácia s bifunkčnými činidlami je vhodná na zosieťovanie mpl ligandu s matricou vodonerozpustného nosiča alebo povrchu na ďalšie použitie pri čistení protilátok anti-mpl ligandu a vice verša. Medzi bežne používané sieťujúce činidlá patria: l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenyletán, glutaraldehyd, estery imidu kyseliny N-hydroxybutándiovej, napríklad estery s kyselinou 4-azidosalicilovou, homobifunkčné imidoestery, vrátane esterov kyseliny dibutándiovej, ako je 3,3'-ditiobis(sukcín-imidylpropionát) a bifunkčné maleínimidy, ako je bis-N-maleínimido-l,8-oktán. Derivatizačné činidlá, ako je metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidan, poskytujú medziprodukty s fotoaktivačnou schopnosťou, ktoré sú schopné tvoriť zosietenia v prítomnosti svetla. Alternatívne, reaktívne vodonerozpustné matrice, ako sú brómkyánom aktivované uhľovodíky a reaktívne substráty opísané v U. S. patentoch 3 969 287, 3 691 016,4 195 128,4 247 642,4 229 537 a 4 330440, sa tiež môžu použiť na imobilizáciu proteínu.

Glutaminylové a asparaginylové zvyšky sa často deamidujú na zodpovedajúce glutamoylové a aspartylové zvyšky. Tieto zvyšky vznikajú deamidáciou za neutrálnych alebo zásaditých podmienok. Táto deamidovaná forma zvyškov patrí tiež do rozsahu tohto vynálezu.

Ďalšie modifikácie zahrnujú hydroxylácie prolínu a lyzínu, fosforylácie hydroxylových skupín serylových a treonylových zvyškov, metylácie α-amino skupín lyzínových, arginínových a histidínových bočných reťazcov (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetyláciu N-koncového aminu a amidáciu ľubovoľnej Ckoncovej karboxylovej skupiny.

Ďalšie typy kovalentných modifikácií polypeptidu mpl ligandu, zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu, obsahujú adaptáciu prirodzeného modelu glykozylácie polypeptidu. Adaptáciou sa myslí odstránenie jednej alebo viacerých uhľovodíkových časti, ktoré sa nachádzajú v prirodzenom mpl ligande a/alebo pridanie jednej alebo viacerých glykozylačných polôh, ktoré nie sú prítomné v prirodzenom mpl ligande.

Glykozylácia polypeptidov ide typicky buď do polohy N alebo O. Keď ide do polohy N, týka sa to pripojenia uhľovodíkovej časti k bočnému reťazcu asparagínového zvyšku. Tripeptidové sekvencie asparagín-X-serín a asparagín-X-treonín, kde X je ľubovoľná aminokyselina okrem prolínu, sú rozlišovacími sekvenciami pri enzymatickom pripojení uhľovodíkovej časti k asparagínovému bočnému reťazcu. Takto prítomnosť každej z týchto tripeptidových sekvencií v polypeptide tvorí potenciálnu glykozylačnú polohu. Glykozylácia do O-polohy sa vzťahuje na pripojenie jedného z cukrov - N-acetylgalaktózamín, galaktóza alebo xylóza - k hydroxyaminokyseline, najbežnejšie k serínu alebo treonínu, hoci sa môže použiť aj 5-hydroxyprolín alebo 5-hydroxylyzín.

Pridanie glykozylačných polôh k polypeptidu mpl ligandu je vhodne sprevádzané adaptáciou sekvencie aminokyseliny tak, že táto obsahuje jednu alebo viac opísaných tripeptidových sekvencií (pri glykozylácii do N-polôh). Adaptácia sa môže tiež vykonať pomocou pridania alebo substitúcie jedného alebo viacerých serínových alebo treonínových zvyškov k prirodzenej sekvencií mpl ligandu (pri glykozylácii do O-polôh). Kvôli jednoduchosti je sekvencia aminokyselín mpl ligandu výhodne adaptovaná zmenami na úrovni DNA, najmä mutáciou DNA kódujúcou polypeptid mpl ligandu v predurčených bázach tak, že kódy sa generujú na transláciu do požadovaných aminokyselín. DNA mutácia(ie) sa môžu vykonať s použitím už opísaných metód pod nadpisom „Varianty sekvencií aminokyselín mpl ligandu“.

Ďalšou metódou zvyšovania počtu uhľovodíkových častí v mpl ligande je chemické alebo enzymatické pripájanie glykozidov k polypeptidu. Tieto postupy majú výhodu v tom, že si nevyžadujú prípravu polypeptidu v hostiteľskej bunke, ktorý má glykozylačné schopnosti na glykozyláciu do N- alebo O-polôh. V závislosti na použitom spôsobe spájania cukotýry) sa dá pripojiť k (a) arginínu a histidínu, (b) voľným karboxylovým skupinám, (c) voľným sulfohydrylovým skupinám, napríklad v cysteíne, (d) k voľným hydroxylovým skupinám, napríklad v seríne, treoníne alebo hydroxyprolíne, (e) aromatickým zvyškom, napríklad vo fenylalaníne, tyrozíne alebo tryptofáne alebo (f) amidovým skupinám glutamínu. Tieto metódy sú opísané vo WO 87/05330 zverejnenom 11. septembra 1987 a v publikácii Aplin a Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., s. 259-306 (1981).

Odstránenie uhľovodíkových častí, prítomných v polypeptide mpl ligandu, sa môže uskutočniť chemicky alebo enzymaticky. Chemická deglykozylácia si vyžaduje pôso36

SK 282265 Β6 benie polypeptidu na kyselinu trifluórmetánsulfónovú alebo na podobnú ekvivalentnú zlúčeninu. Týmto dochádza k štiepeniu väčšiny alebo všetkých cukrov, okrem spájajúceho cukru (N-acetylglukozamín alebo N-acetylgalaktozamín), ktorý neporušený opúšťa polypeptid. Chemickú deglykozyláciu opisujú Hakimuddin a spol., Árch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) a Edge a spol., Anál. Biochem., 118:131 (1981). Enzymatické štiepenie uhľovodíkovej časti v polypeptide sa môže dosiahnuť pomocou rozličných endo- a exo-glykozidáz, ako opisujú Thotakura a spol., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Glykozylácii v potenciálnych glykozylačných polohách možno zabrániť použitím tunicamycínu, ako opisujú Duskin a spol., J. Biol. Chem., 257:3105 (1982). Tunicamycín blokuje vznik väzieb proteín - N-glykozid.

Ďalší typ kovalentnej modifikácie mpl ligandu obsahuje naviazanie polypeptidu mpl ligandu k jednému z viacerých neproteínových polymérov, napríklad k polyetylénglykolu, polypropylénglykolu alebo k polyoxyalkylénom, a to postupom uvedeným v U.S. patentoch 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144,4 670 417,4 791 192 alebo 4 179 337. Polypeptidy mpl ligandu, kovalentne pripojené k uvedeným polymérom, sú v tomto vynáleze označené ako „pegylované“ polypeptidy mpl ligandu.

Je potrebné si uvedomiť, že bude nutný skríning získaných variantov mpl ligandu, aby sa vyselektoval optimálny variant na naviazanie k mpl a majúci definovanú imunologickú a/alebo biologickú aktivitu. Skríning možno vykonať aj z hľadiska stability v rekombinantnej bunkovej kultúre alebo v plazme (to znamená, voči proteolytickému štiepeniu), z hľadiska vysokej afinity k mpl členovi, oxidačnej stability, schopnosti byť sekrétovaným vo zvýšených výťažkoch a pod. Napríklad, zmena imunologického charakteru polypeptidu mpl ligandu ako je afinita voči danej protilátke, sa meria vhodným druhom imunologickej skúšky. Ďalšie potenciálne modifikácie vlastností proteínu alebo polypeptidu ako je redox alebo termálna stabilita, hydrofóbnosť alebo citlivosť voči proteolytickej degradácii sú merané metódami, ktoré sú dobre známe v príslušnej odbornej oblasti.

17. Všeobecné metódy prípravy protilátok voči mpl ligandu Príprava protilátok (i) Polyklonálne protilátky

Polyklonálne protilátky k polypeptidom alebo fragmentom mpl ligandu všeobecne vznikajú v zvieratách po viacnásobných podkožných (sc) alebo intraperitoneálnych (ip) injekciách mpl ligandu a adjuvans. Môže byť užitočné konjugovať mpl ligand alebo fragment obsahujúci cieľovú sekvenciu aminokyseliny k proteínu, ktorý je imunogénny v tých druhoch, ktoré sa imunizujú, to znamená, „keyhole limpet“ hemokyanín, sérový albumín, hovädzí tyroglobulín alebo inhibítor sójového trypsínu, s použitím bifunkčného alebo derivatizujúceho činidla, napríklad esteru maleínimidobenzoylsulfosukcínimidu (konjugácia cez cysteínové zvyšky), N-hydroxysukcínimidu (cez lyzýnové zvyšky), glutaraldehydu, anhydridu kyseliny butándiovej, SOC1₂, alebo R*N=C=NR, kde R a R¹ sú odlišné alkylové skupiny.

Zvieratá sa imunizujú voči polypeptidu alebo fragmentu mpl ligandu imunogénovými konjugátmi alebo derivátmi a to kombinovaním 1 mg z 1 pg peptidu alebo konjugátu (pre králikov alebo myši) s 3 objemami kompletného Freundovho adjuvans a injekčným podaním roztoku intradermálne do viacerých miest. O mesiac neskôr sa zvieratám podkožné aplikujú injekcie na viacerých miestach, pričom sa použije iba 1/5 až 1/10 pôvodného množstva peptidu alebo konjugátu v kompletnom Freundovom adjuvans. O 7 až 14 dní neskôr sa zvieratám odoberie krv a sérum sa podrobí skúške na titer protilátky mpl ligandu. Zvieratám sa injekcie podávajú dovtedy, kým titer nedosiahne stabilizovanú úroveň. Výhodne sa zvieratám podávajú injekcie s konjugátom toho istého mpl ligandu, ale konjugovaného s odlišným proteínom a/alebo odlišným sieťujúcim činidlom. Konjugáty sa tiež môžu pripraviť v rekombinantnej bunkovej kultúre ako zmesi proteínov. Tiež sa používajú agregačné činidlá, ako je kamenec, na zvýšenie imunologickej odozvy.

(ii) Monoklonálne protilátky

Monoklonálne protilátky sa získajú z populácie podstatne homogénnych protilátok, to znamená, že individuálne protilátky zahrnujúce populáciu sú identické, okrem možných, prirodzene sa vyskytujúcich mutácií, ktoré môžu byť prítomné v minimálnych množstvách. Teda, prívlastok „monoklonálny“ indikuje charakter protilátky, ktorá nie je zmesou jednotlivých protilátok.

Napríklad, monoklonálne protilátky mpl ligandu podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť s použitím hybridómovej metódy, prvýkrát opísanej Kohlerom & Milsteinom, Náture, 256:495 (1975), alebo sa môžu pripraviť metódou rekombinantnej DNA (U.S. patent 4 816 567 [Cabilly a spol.]).

V hybridómovej metóde sa opísaným postupom imunizuje myš alebo iné vhodné hostiteľské zviera, ako je škrečok, aby sa vyvolala reakcia lymfocytov, ktoré produkujú alebo sú schopné produkovať protilátky, ktoré sa potom špecificky viažu na proteín použitý na imunizáciu. Alternatívne môžu byť lymfocyty imunizované in vitro. Lymfocyty sa potom zmiešajú s myelómovými bunkami s použitím vhodného íúzovacieho činidla, ako je polyetylénglykol, pričom vznikne hybridómová bunka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 [Academic Press, 1986]).

Takto pripravené hybridómové bunky sa očkujú a rastú vo vhodnom kultivačnom médiu, ktoré výhodne obsahuje jednu alebo viac zložiek inhibujúcich rast alebo prežitie nepripojených rodičovských myelómových buniek. Napríklad, ak rodičovské myelómové bunky nemajú guanínfosforibozylovú transferázu hypoxantínu (HGPRT alebo HPRT), kultivačné médium pre hybridómy bude typicky obsahovať hypoxantín, aminopterín a tymidín (HAT médium), ktoré zabraňujú rastu deficitných HGPRT buniek.

Preferované myelómové bunky sú také, ktoré sa účinne fúzujú, napomáhajú stabilizovať vysokú úroveň expresie protilátok pomocou vybraných buniek produkujúcich protilátky a sú citlivé na médium ako je HAT médium. Medzi nimi sú ďalej preferovanými myelómovými bunkovými líniami myšacie myelómové línie ako sú tie, ktoré boli odvodené od MOPC-21 a MPC-11 myších tumorov, dostupných z Salk Inštitúte Celí Distribution Center, San Diego, Califomia USA a SP-2 bunky, dostupné z Američan Type Culture Collection Rockville, Maryland USA. Ľudské myelómové bunkové línie a myšaco-ľudské heteromyelómové bunkové línie boli tiež opísané pri príprave ľudských monoklonálnych protilátok (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur a spol., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Kultivačné médium, v ktorom rastú hybridómové bunky, sa testuje na produkciu monoklonálnych protilátok pôsobiacich proti mpl ligandu. Výhodne sa väzbová špecifickosť monoklonálnych protilátok, produkovaných hybridómovými bunkami, stanoví imunozrážaním alebo pomocou in vitro väzbovej skúšky, ako je rádioimunologické stano venie (RIA) alebo imunoabsorpčná skúška väzbovým enzýmom (ELISA).

Väzbová afinita monoklonálnej protilátky sa môže určiť, napríklad, Scatchardovou analýzou podľa Munsona & Pollarda, Anál. Biochem., 107: 220 [1980].

Potom, ako sa stanoví, že hybridómové bunky produkujú protilátky požadovanej špecifickosti, afinity a/alebo aktivity, klony sa môžu ďalej subklonovať postupmi pri limitujúcom zriedení a zabezpečí sa ich rast štandardnými postupmi (Goding, pozri vyššie). Vhodné kultivačné médiá na tieto účely zahrnujú, napríklad, Dulbecco's Modified Eagle's Médium alebo RPMI-1640 médium. Okrem toho hybridómové bunky môžu rásť in vivo ako ascitické tumory v zvieratách.

Monoklonálne protilátky vylúčené subklonmi sa vhodne separujú z kultivačného média, ascitickej tekutiny alebo zo séra pomocou bežných imunoglobulínových čistiacich postupov ako sú, napríklad, proteínová A-Sepharóza, hydroxylapatitová chromatografia, gélová elektroforéza, dialýza alebo afmitná chromatografia.

DNA kódujúca monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa izoluje a sekvencuje s použitím bežných postupov (napríklad s použitím oligonukleotidových sond schopných špecifickej väzby ku génom kódujúcim ťažké a ľahké reťazce myšacích protilátok). Hybridómové bunky podľa tohto vynálezu slúžia ako výhodný zdroj takejto DNA. Po izolácii sa môže DNA umiestniť do expresných vektorov, ktoré sa potom transfektujú do hostiteľských buniek, ako sú: opičie COS bunky, bunky vaječníkov čínskych škrečkov (CHO) alebo myelómové bunky, ktoré inak neprodukujú proteín imunoglobulínu, aby prebehla syntéza monoklonálnych protilátok v rekombinantných hostiteľských bunkách. DNA sa môže tiež modifikovať, napríklad substitúciou kódujúcej sekvencie ľudských ťažkých a ľahkých reťazcov konštantných domén v miestach homologických myšacích sekvencii (Cabilly a spol., pozri vyššie; Morrison a spol., Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 6851 [1984]) alebo kovalentným pripojením všetkých alebo len časti kódujúcej sekvencie polypeptidu ne-imunoglobulínu ku kódujúcej sekvencii imunoglobulínu.

Takéto neimunoglobulínové polypeptidy sú typicky nahradené za konštantné domény protilátky podľa tohto vynálezu alebo sú nahradené za premenné domény takej polohy protilátky, ktorá viaže antigén podľa tohto vynálezu, aby sa vytvorila chimerická bivalentná protilátka, obsahujúca jednu polohu viažucu antigén, ktorá je špecifická voči mpl ligandu a ďalšiu polohu viažucu antigén špecifickú voči odlišnému antigénu.

Chimerické alebo hybridné protilátky sa môžu tiež pripraviť in vitro, s použitím metód známych v chémii syntézy proteínov, vrátane tých, ktoré zahrnujú sieťovacie činidlá. Imunotoxiny sa môžu napríklad pripraviť s použitím disulfidovej výmennej reakcie alebo vytvorením tioéterovej väzby. Príklady vhodných reagentov na tento účel zahrnujú iminotiolát a metyl-4-merkaptobutyrimidát.

Na diagnostické aplikácie sa protilátky podľa tohto vynálezu typicky značia detegovateľnou časťou. Detegovateľnou časťou môže byť akákoľvek časť, ktorá je schopná vyvolať, buď priamo alebo nepriamo, detegovateľný signál. Detegovateľnou časťou môže byť, napríklad, rádioizotop, ako je ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S alebo ¹²⁵I, fluorescentná alebo chemiluminiscentná zlúčenina ako je izotiokyanát fluoresceínu, rodamín alebo luciferin; rádioaktívne izotopové značkovače, ako sú napríklad, ¹²⁵1, ³²P, ¹⁴C alebo ³H alebo enzým ako je alkalická fosfatáza, beta-galaktozidáza alebo chrenová peroxidáza.

Na separátnu konjugáciu protilátky k detegovateľnej časti sa môže použiť hocijaká metóda, ktorá je známa v tejto oblasti, vrátane tých metód, ktoré opisujú Hunter a spol., Náture, 144:945 (1962); Dávid a spol., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain a spol., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); a Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu použiť v akejkoľvek známej testovacej metóde, ako sú kompetitívne väzbové skúšky, priame alebo nepriame sendvičové skúšky a imunoprecipitačné skúšky. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Kompetitívne väzbové testy vychádzajú zo schopnosti značeného štandardu (ktorým môže byť mpl ligand alebo jeho imunologický reaktívna časť) súťažiť s testovanou vzorkou (mpl ligand) vo vytvorení väzby s limitovaným množstvom protilátky. Množstvo mpl ligandu v testovanej vzorke je nepriamo úmerné množstvu štandardu, ktorý sa viaže s protilátkami. Na uľahčenie určenia množstva štandardu, ktorý sa má naviazať, sa protilátky všeobecne prevedú do nerozpustného stavu a to pred alebo po skúške tak, že štandard a testovaná vzorka, ktoré sa viažu na protilátky, sa môžu vhodne separovať od štandardu a testovanej zložky, ktoré zostávajú nenaviazané.

Nepriame sendvičové skúšky zahrnujú použitie dvoch protilátok, každá je schopná viazať sa s odlišnými imunogénovými časťami, alebo epitopu proteínu (mpl ligand), ktorý sa deteguje. V sendvičovej skúške sa testovaná vzorka viaže pomocou prvej protilátky, ktorá je imobilizovaná na pevnom nosiči a potom sa k nej naviaže druhá protilátka, pričom vzniká nerozpustný trojdielny komplex (Dávid & Greene, U.S. Patent 4 376 110). Samotná druhá protilátka môže byť značená detegovateľnou časťou (priama sendvičová skúška) alebo sa môže stanovovať s použitím antiimunoglobulínovej protilátky, ktorá je značená detegovateľnou časťou (nepriama sendvičová skúška). Jedným druhom sendvičovej skúšky je napríklad ELISA test, pri ktorom je detegovateľnou časťou enzým (to znamená chrenová peroxidáza).

iii) Humanizované a ľudské protilátky

Metódy na humanizáciu nehumánnych protilátok sú v tomto odbore dobre známe. Všeobecne, humanizovaná protilátka má jeden alebo viac zvyškov aminokyselín zavedených do protilátky a to zo zdroja, ktorý je iný ako ľudský. Tieto nehumánne zvyšky aminokyselín sa často vzťahujú na „importované“ zvyšky, ktoré sa typicky vyberajú z „importovanej“ variabilnej domény. Humanizácia sa môže, v podstate, vykonať podľa metódy Wintera a spol. (Jones a spol., Náture, 321:522-525 [1986]; Riechmann a spol., Náture, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen a spol., Science, 239:1534-1536 [1988]), nahradením CDRs a CDR sekvencií hlodavcov zodpovedajúcimi sekvenciami ľudskej protilátky. Takéto „humanizované“ protilátky sú chimerické protilátky (Cabilly a spol., pozri vyššie), v ktorých sa nahradilo podstatne menej, než je neporušená ľudská variabilná doména, zodpovedajúcimi sekvenciami z nehumánnych druhov. V praxi to znamená, že humanizované protilátky sú typicky ľudské protilátky, v ktorých sú nahradené niektoré CDR zvyšky a možno tiež niektoré FR zvyšky, zvyškami z analogických polôh v protilátkach hlodavcov.

Výber ľudských variabilných domén, a to ľahkej aj ťažkej, používaný na prípravu humanizovaných protilátok, je veľmi dôležitý na redukovanie antigenicity. Podľa tzv. „best-fit“ metódy sa sekvencia variabilnej domény protilát

SK 282265 Β6 ky hlodavca podrobí skríningu voči celej knižnici známych ľudských sekvencii variabilných domén. Ľudská sekvencia, ktorá je najbližšia k danej sekvencii hlodavca, sa potom akceptuje ako ľudský rámec (štruktúra) (FR) pre humanizovanú protilátku (Sims a spol., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia a Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). Ďalšia metóda využíva špeciálnu štruktúru, odvodenú od súhlasnej sekvencie všetkých ľudských protilátok špecifickej podskupiny ľahkých alebo ťažkých reťazcov. Ten istý rámec sa môže použiť pre niektoré odlišné humanizované protilátky (Carter a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta a spol., J. Immunol., 151: 2623 [1993]).

Ďalej je dôležité, že protilátky sú humanizované takým spôsobom, aby si zachovali vysokú afinitu voči antigénu a ďalšie potrebné biologické vlastnosti. Aby sa v súlade s preferovanou metódou dosiahol tento účinok humanizované protilátky sa pripravia procesom analýzy rodičovských sekvencii a rozličných koncepčných humanizovaných produktov a to s použitím trojrozmerných modelov rodičovských a humanizovaných sekvencii. Trojrozmerné modely imunoglobulínu sú bežne dostupné a sú známe osobám, ktoré sú odborníkmi v danej oblasti. Dostupné počítačové programy ilustrujú a vizuálne znázorňujú pravdepodobné trojrozmerné konformačné štruktúry vybraných kandidátov sekvencii imunoglobulínu. Kontrola týchto vyobrazení dovoľuje analyzovať pravdepodobnú úlohu zvyškov na funkčnosť kandidáta sekvencie imunoglobulinu, to znamená analyzovať zvyšky, ktoré ovplyvňujú schopnosť kandidáta imunoglobulinu viazať jeho antigén. Teda, FR zvyšky sa môžu selektovať a kombinovať zo súhlasnej a dôležitej sekvencie tak, že sa dosiahne požadovaná charakteristika protilátky, ako je zvýšená afinita pre cieľový (konečný) antigén(y). Všeobecne, CDR zvyšky priamo a podstatnejšie ovplyvňujú viazanie antigénu. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v U.S. prihláške 07/934 373 prihlásenej 21. augusta 1992, ktorá je pokračovaním prihlášky 07/715 272 prihlásenej 14. júna 1991.

Alternatívne je teraz možné pripravovať transgénových živočíchov (napríklad myši), ktoré sú schopné po imunizácii produkovať celé spektrum ľudských protilátok bez toho, aby vznikal endogénny imunoglobulín. Napríklad sa opisuje, že homzygotné odstraňovanie ťažkého reťazca protilátky spájajúceho génovú oblasť (J_H) do chimerickej a zárodočnej mutantnej myši spočíva v úplnej inhibícii produkcie endogénnej protilátky. Prenos skupiny ľudských zárodočných imunoglobulínových génov do takejto zárodočnej mutantnej myši spôsobí vznik ľudských protilátok, vyvolaných prítomnosťou antigénu. Pozri, napríklad, Jakobovits a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 [1993]; Jakobovits a spol., Náture, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann a spol., Year in Immuno., 7:33 [1993]. Ľudské protilátky sa môžu tiež produkovať vo fágových zobrazovacích knižniciach (Hoogenboom a Winter, J. Mol. Biol., 227, 381 [1991]; Marks a spol., J. Mol. Biol., 222,581 [1991]).

iv) Bišpecifické protilátky

Bišpecifické protilátky sú monoklonálne, výhodne ľudské alebo humanizované, protilátky, ktoré viažu špecifickosti aspoň dvoch odlišných antigénov. Spôsoby prípravy bišpecifických protilátok sú odborníkom v tejto oblasti známe.

Tradičná rekombinantná príprava bišpecifických protilátok je založená na koexpresii dvoch imunoglobulínových párov (ťažký reťazec-ľahký reťazec), kde dva ťažké reťazce majú odlišné špecifickosti (Millstein a Cuello, Náture, 305: 537-539 [1983]). Kvôli náhodnému rozloženiu imu noglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov tieto hybridómy (kvadrómy) dávajú potenciálnu zmes 10 odlišných molekúl protilátky, z ktorých iba jedna má správnu bišpecifickú štruktúru. Čistenie správnej molekuly, ktoré sa obvykle vykonáva viacerými krokmi afinitnej chromatografie, je dosť ťažkopádne a výťažky sú nízke. Podobné postupy sú uvedené v PCT prihláške WO 93/08829 (zverejnenej 13. mája 1993) a uvádzajú ich aj Traunecker a spol., EMBO, 10:3655-3659 [1991].

Podľa odlišného a výhodnejšieho postupu sú variabilné domény protilátky s vyžadovanými viažucimi sa špecifickosťami (polohy spájajúce protilátku a antigén) pripojené k sekvenciám konštantnej domény imunoglobulínu. Spojenie sa výhodne vykoná s konštantnou doménou ťažkého reťazca imunoglobulínu, obsahujúcou aspoň časť miesta pripojenia CH2 a CH3 oblastí. Je vhodné, keď konštantná oblasť prvého ťažkého reťazca (CH1) obsahuje polohu, ktorá je potrebná na naviazanie ľahkého reťazca, prítomnú aspoň v jednom produkte spojenia. Molekuly DNA, kódujúce produkty spojenia ťažkých reťazcov imunoglobulínu, sa zavedú do separátnych expresných vektorov a ko-transfektujú sa do vhodného hostiteľského organizmu. Toto zabezpečí väčšiu flexibilitu pri adjustovaní vzájomných proporcií troch polypeptidových fragmentov pri ich začlenení v príkladoch, keď sa použili na zhotovenie nerovnaké pomery troch polypeptidových reťazcov s cieľom získať optimálne výťažky. Je tiež možné vložiť kódujúce sekvencie pre dva alebo všetky tri polypeptidové reťazce do jedného expresného vektora a to v prípade, keď expresia aspoň dvoch polypeptidových reťazcov v rovnakých pomeroch dáva vysoké výťažky alebo keď pomery nemajú špecifický význam. V preferovanom spôsobe sa postupuje tak, že bišpecifické protilátky sa skladajú z hybridného imunoglobulínového ťažkého reťazca s prvou naviazanou špecificitou na jednej vetve a z hybridného imunoglobulínového páru ťažkého a ľahkého reťazca (zabezpečujúceho naviazanie druhej špecifícity) v druhej vetve. Zistilo sa, že táto asymetrická štruktúra uľahčuje separáciu požadovanej bišpecifickej zlúčeniny z neočakávaných kombinácií reťazcov imunoglobulínu, pretože prítomnosť ľahkého reťazca imunoglobulínu je len polovica bišpecifickej molekuly, uľahčujúcej separačnú cestu. Tento postup je uvedený v prihláške 07/931 811 prihlásenej 17. augusta 1992, ktorá je v konaní.

Ďalšie podrobnosti generovania bišpecifických protilátok sú uvedené, napríklad, v publikácii Suresh a spol., Methods in Enzymology, 121:210 [1986].

v) Heterokonjugované protilátky

Heterokonjugované protilátky patria tiež do rozsahu tohto vynálezu. Heterokonjugované protilátky sa skladajú z dvoch kovalentne spojených protilátok. Takéto protilátky sa predpokladali voči cieľovému imunitnému systému buniek, voči nechceným bunkám (U.S. patent 4 676 980) a na liečenie infekcie HIV (PCT WO 91/00360 a WO 92/00373; EP 03089). Heterokonjugované protilátky sa môžu zhotoviť s použitím akejkoľvek bežnej zosieťovacej metódy. Vhodné sieťovacie činidlá sú dobre známe odborníkom v tomto odvetví a sú uvedené v U.S. patente 4 676 980 spolu s množstvom sieťovacích postupov.

IV. Terapeutické využitie megakaiyocytopoetického proteínu mpl ligandu

Biologicky aktívny mpl ligand, ktorý má hematopoetickú výkonnú funkciu a v zmysle tohto vynálezu je to megakaryocytopoetický alebo trombocytopoetický proteín (TPO), sa používa v sterilnom farmaceutickom prostriedku alebo formulácii na stimuláciu megakaryocytopoetickej alebo trombocytopoetickej aktivity, u pacientov trpiacich na trombocytopéniu v dôsledku zhoršenej tvorby, sekvestrácie alebo zvýšeného rozpadu krvných doštičiek. Trombocytopénia spojená s hypopláziou kostnej drene (to znamená aplastická anémia s nasledujúcou chemoterapiou alebo transplantáciou kostnej drene) sa môže účinne liečiť zlúčeninami podľa tohto vynálezu, rovnako ako ďalšie ochorenia, ako sú diseminovaná intravaskuláma koagulácia (DIC), imunitná trombocytopénia (vrátane HIVindukované ITP a neHIV-indukované ITP), chronická idiopatická trombocytopénia, kongenitálna trombocytopénia, myelodysplázia a trombotická trombocytopénia. Navyše, tieto megakaryocytopoetické proteíny môžu byť užitočné pri liečení myeloproliferatívnych trombocytových ochorení, rovnako ako aj trombocytóz vyplývajúcich z nezápalových stavov a z deficitu železa.

Výhodné použitia megakaryocytopoetického a trombocytopoetického proteínu (TPO) podľa tohto vynálezu sú v: myelotoxickej chemoterapii pri liečení leukémií alebo tuhých tumorov, myeloablatívnej chemoterapii pri autológových a alogenetických transplantáciách kostnej drene, myelodisplázii, idiopatickej aplastickej anémii, kongenitálnej trombocytopénii a imunitnej trombocytopénii.

Ďalšie ochorenia, ktoré sa môžu účinne liečiť megakaryocytopoetickými proteinmi, podľa tohto vynálezu, zahrnujú vady a poškodenia krvných doštičiek spôsobené liekmi, otravu alebo aktiváciu na umelých povrchoch. V týchto prípadoch sa môžu použiť instantné zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ktoré stimulujú „uvoľňovanie“ nových „nepoškodených“ krvných doštičiek. Kompletnejší zoznam použiteľných aplikácií je uvedený v kapitole „Doterajší stav techniky“ (pozri vyššie), najmä v častiach (a)-(f) a v referenciách tam citovaných.

Megakaryocytopoetické proteíny na použitie, podľa tohto vynálezu, sa môžu využívať samotné alebo v kombinácii s ďalšími cytokínmi, hematopoetínmi, interleukínmi, rastovými faktormi alebo protilátkami pri liečení vyššie identifikovaných ochorení a stavov. Takto sa môžu použiť instantné zlúčeniny v kombinácii s ďalšími proteinmi alebo peptidmi, ktoré majú trombopoetickú aktivitu, zahŕňajúcimi: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, erytropoetín (EPO), kit ligand, IL-6 a IL-11.

Megakaryocytopoetické proteíny na instantné použitie podľa tohto vynálezu sa pripravujú v zmesi s farmaceutický akceptovateľným nosičom. Táto terapeutická kompozícia sa môže podávať vnútrožilovo alebo cez nos alebo pľúca. Kompozícia sa môže podávať tiež parenterálne alebo podkožné, ak je to potrebné. Keď sa podáva systémovo, terapeutická kompozícia musí byť apyrogénna a pri parenterálne akceptovateľných roztokoch musí mať vhodné pH, izotonicitu a stabilitu. Tieto podmienky sú odborníkom v danej oblasti známe. Stručne, dávky aplikačných foriem zlúčenín podľa tohto vynálezu sa pripravia do zásoby alebo na podávanie zmiešavaním zlúčeniny, majúcej požadovaný stupeň čistoty, s fyziologicky prijateľnými nosičmi, excipientami alebo stabilizátormi. Takéto materiály sú v používaných dávkach a koncentráciách pre príjemcov netoxické a zahrnujú ešte aj tlmivé roztoky, ako je fosforečnan, citrát, octan a soli ďalších organických kyselín; antioxidanty, ako je kyselina askorbová; peptidy s nízkou molovou hmotnosťou (menej než je približne desať zvyškov), ako je polyarginín, proteíny, ako je sérový albumín, gelatín alebo imunoglobulíny; hydrofilné polyméry, ako je polyvinylpyrolidón; aminokyseliny, ako je glycín, kyselina glutámová, kyselina asparágová alebo arginín; monosacharidy, disacharidy a iné uhľovodíky, zahrnujúce celulózu a jej deriváty, glukózu, manózu alebo dextríny; chelátové činidlá, ako je

EDTA; alkoholické cukry, ako je manitol alebo sorbitol;

protiiónové prostriedky, ako sú sodné a/alebo neiónové povrchovoaktívne látky ako Tween, Pluronics alebo polyetylénglykol.

Približne 0,5 až 500 mg zlúčeniny alebo zmesi megakaryocytopoetického proteínu vo forme voľnej kyseliny alebo zásady alebo farmaceutický akceptovateľnej soli sa zmieša s fyziologicky akceptovateľným vehikulom, nosičom, excipientom, väzbovým činidlom, ochrannou látkou, stabilizátorom, farbivom atď. podľa toho, ako si to vyžaduje akceptovaná farmaceutická prax. Množstvo aktívnej látky v týchto kompozíciách je také, aby sa získali vhodné dávky v indikovanom rozsahu.

Sterilná kompozícia pre injekcie sa môže formulovať v súlade s bežnou farmaceutickou praxou. Napríklad, vyžaduje sa rozpúšťanie alebo suspendovanie aktívnej zlúčeniny vo vehikule ako je voda alebo prírodný rastlinný olej ako je sézamový, podzemnicový alebo olej zo semien bavlníka alebo v syntetickom mastnom vehikule ako je etylolean a podobne. Aj tlmivé roztoky, ochranné látky, antioxidanty atď. sa môžu použiť v súlade s akceptovanou farmaceutickou praxou.

Vhodné príklady dlhodobo a rovnomerne sa uvoľňujúcich prípravkov zahrnujú semipermeabilné matrice tuhých hydrofóbnych polymérov, obsahujúce polypeptidy, pričom tieto matrice sú vo forme tvarovaných predmetov, napríklad, tenkých vrstiev alebo mikrokapsúl. Príklady dlhodobo a rovnomerne účinkujúcich matríc zahrnujú polyestery, hydrogély [napríklad, poly(2-hydroxyetylmetakrylát), ako je opísaný Langerom a spol., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] a Langerom, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] alebo polyvinylalkohol], polylaktidy (U.S. Patent 3 773 919, EP 58 481), kopolyméry kyseliny L-glutámovej a gama etyl-L-glutamanu (Sidman a spol., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), nedegradovateľné etylén-vinylacetáty (Langer a spol., pozri vyššie), degradovateľné kopolyméry kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej, ako je Lupron Depot™ (injektovateľné mikroguľôčky zložené z kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej a leukoprolidacetátu) a kyselina poly-D-(-)-3-hydroxybutyrová (EP 133 988).

Zatiaľ čo polyméry, ako je etylén-vinylacetát a kopolymér kyseliny maslovej a kyseliny glykolovej, umožňujú uvoľňovanie molekúl počas viac ako 100 dní, niektoré hydrogély uvoľňujú proteíny počas kratšiej doby. Keď opuzdrené proteíny zostávajú v tele po dlhý čas, môže sa deformovať alebo agregovať v dôsledku pôsobenie vlhkosti pri 37 °C, z čoho vyplýva strata biologickej aktivity a pravdepodobné zmeny imunogenicity. Na stabilizáciu proteínu sa môžu použiť rôzne postupy v závislosti od očakávaného mechanizmu straty jeho biologickej aktivity. Napríklad, ak sa očakáva agregačný mechanizmus vnútromolekulovými väzbami S-S v dôsledku disulfidickej výmeny, v takomto prípade sa dosiahne stabilizácia modifikáciou sulfohydrylových zvyškov, lyofilizáciou z kyslých roztokov, reguláciou obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditív a vývojom kompozície so špecifickou polymémou matricou.

Dlhodobo a rovnomerne účinkujúce kompozície megakaryocytopoetického proteínu tiež zahrnujú lipozómovo naviazaný megakaryocytopoetický proteín. Lipozómy obsahujúce megakaryocytopoézny proteín sa pripravia metódami uvedenými v: DE 3 218 121; Epstein a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; Hwang a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980]; EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; Japonský patent 83-118008; U. S. patent 4 485 045 a 4 544 545; a EP 102 324. Lipozómy sú malého (okolo 200-800

Angstromov) jednolamelového typu, v ktorých je obsah lipidov vyšší ako približne 30 mol. % cholesterolu, čo sa týka zvolenej dávky, tá sa upraví na optimálnu megakaryocytopoéznu proteínovú terapiu.

Dávku určí ošetrujúci lekár berúc do úvahy rozličné známe faktory, ktoré môžu ovplyvniť účinkovanie liekov, zahrnujúce prudkosť a druh ochorenia, hmotnosť pacienta, pohlavie, diétu, dobu a spôsob podávania, ďalšie lieky, ktoré užíva a iné relevantné klinické faktory. Typicky, denný režim zahrnuje dávku v rozsahu 0,1-100 pg/kg hmotnosti pacienta. Preferovaná dávka bude v rozsahu 0,1-50 pg/kg hmotnosti pacienta. Je výhodné, keď počiatočná dávka bude v rozsahu od 1 do 5 pg/kg/deň. Rozsah dávok bude taký istý ako pri iných cytokínoch, hlavne pri G-CSF, GM-CSF a EPO. Terapeuticky účinné dávky sa môžu určiť buď metódou in vitro alebo in vivo.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Bez ďalšieho opisovania sa rozumie, že odborník v odbore, využijúc predchádzajúci opis a ilustratívne príklady, vytvorí a využije predložený vynález v najširšom rozsahu. Nasledujúce pracovné príklady preto zdôrazňujú výhodné uskutočnenia predloženého vynálezu a v žiadnom prípade nie sú konštruované ako akýmkoľvek spôsobom ohraničujúce ostatné údaje.

Príklad 1

Čiastočná purifikácia prasačieho mpl ligandu

Plazma, ochudobnená o krvné doštičky, sa zhromaždila od normálnych ošípaných alebo od ošípaných s aplastickou anémiou. Aplastická anémia sa ošípaným vyvolala ožiarením 900 cGy celkovej telesnej radiácie, použitím 4 mEV lineárneho urýchľovača. Ožiareným ošípaným boli počas 68 dní intramuskuláme podávané injekcie eefazolínu. Následne, za celkovej anestézie, im bolo odobraté celé množstvo krvi, krv sa heparinizovala a centrifugovala pri 1800g počas 30 minút. Účinok stimulujúci megakaryocyty bol zistený ako vrchol (pík) 6 dni po ožiarení.

Aplastická prasačia plazma, získaná z ožiarených ošípaných, sa spracovala so 4M NaCl (chlorid sodný) a miešala 30 minút pri teplote miestnosti. Vzniknutá zrazenina sa odstránila centrifugáciou pri 3800 rpm v Sorvall RC3B a supematant sa vniesol do fenyl-toyopearl kolóny (220 ml) ekvilibrovanej 10 mM NaPO₄, obsahujúcim 4M NaCl. Kolóna sa premývala tlmivým roztokom až do hodnoty ^a280 < 0,05 a eluovala sa s dH₂O. Vypraná proteínová zóna sa rozriedila s dH₂O na hodnotu vodivosti 15 mS a vniesla sa na Blue-Sepharose kolónu (240 ml), ekvilibrovanú v PBS. Následne sa kolóna premyla 5-násobným (vztiahnuté na objem kolóny) objemom PBS aj NaPO₄ (pH 7,4) s obsahom 2 M močoviny. Proteíny sa z kolóny eluovali lOmM NaPO₄ (pH 7,4) s obsahom 2 M močoviny a 1 M NaCl. Eluát proteínov sa spracoval s 0,01% oktylglukozidom (n-oktyl-P-D-glukopyranozid), s lmM EDTA a lmM Pefabloc (Boehringer Mannheitn) a vniesla priamo na tandemovo viazané CD4-IgG (Capon, D.J. a ost., Náture 337: 525-531 [1989]) a mpl-lgG Ultralink (Pierce) kolóny (pozri nižšie). CD4-IgG (2 ml) kolóna sa odstránila potom ako sa vzorka naplnila a mpZ-IgG (4 ml) kolóna sa premyla 10-násobným množstvom PBS aj PBS s obsahom 2 M NaCl a eluovala sa s 0,lM glycín-HCl s pH 2,25. Frakcie sa zhromaždili v 0,1 objemu IM tris-HCl (pH 8,0).

Analýza frakcií, eluovaných z mp/-afinitnej kolóny prostredníctvom SDS-PAGE (4-20 %, Novex gél), meraná za podmienok redukcie, ukázala prítomnosť niekoľkých proteínov (obr. 5). Proteíny so strieborným farbivom s najsilnejšou intenzitou sa rozložili so zjavným Mr 66000, 55000, 30000, 28000 a 14000. Aby sa určilo, ktoré z týchto proteínov stimulujú proliferáciu Ba/F3-mpZ bunkových kultúr, eluovali sa tieto proteíny z gélu, ako je uvedené v príklade 2.

Kolóny ultraafinitné

10-20 mg mpl-lgG alebo CD4-IgG v PBS sa spojí s 0,5 g Ultralink živice (Pierce) spôsobom, ako je uvedené v inštrukciách výrobcu.

Konštrukcia a expresia mpl-lgG

Chiméma molekula, obsahujúca celú extracelulámu doménu humánneho mpl (aminokyseliny 1-491) a Fc oblasť humánnej IgGl molekuly, sa exprimovala do 293 buniek. cDNA fragment kódujúci aminokyseliny 1-491 humánnej mpl sa získal pomocou PCR z humánnej megakaryocytovej CMK bunkovej knižnice cDNA a sekvenoval sa. Clal poloha sa vložila na 5 - koniec a BstEII poloha na 3 - koniec. Tento fragment sa klonoval proti smeru IgGl Fc kódujúcej oblasti v Bluescript vektore medzi Clal a BstEII miestami po čiastočnom štiepení PCR produktu s BstEII pre dve ďalšie BstEII polohy, prítomné v DNA kódujúcej extracelulárnu doménu mpl. BstEII poloha zavedená na 3 koniec mpl PCR produktu sa označila, aby mala Fc oblasť v rámci s mpl extracelulámou doménou. Konštrukcia sa subklonovala do pRK5-tkneo vektora medzi Clal a Xbal miesta a transfekovala do 293 humánnych embryonálnych obličkových buniek kalcium-fosfátovou metódou. Bunky sa selektovali v 0,4 mg/ml G418 a izolovali sa jednotlivé klony. A/pZ-IgG expresia z izolovaných klonov sa stanovila použitím humánneho Fc špecifického ELISA testu. Najlepšie exprimovaný kloň mal úroveň expresie 1-2 mg/ml mpl-lgG.

Ba/F3 mpl P expresia buniek cDNA zodpovedajúca celej kódujúcej oblasti humánneho mpl P sa klonovala do pRK5-tkneo, ktorý sa následne linearizoval s Notl a transfektoval do IL-3 závislej Ba/F3 bunkovej línie Ba/F3 elektroporáciou (lxlO⁷ buniek, 9605 F, 250 voltov). Po troch dňoch sa začala selekcia v prítomnosti 2 mg/ml G418. Bunky sa selektovali ako celok alebo sa získali jednotlivé klony hraničným riedením v 96jamkových mikrotitračných doštičkách. Selektované bunky sa udržovali v RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 1 mg/ml G418,20 mM glutamínu, 10 mM HEPES a 100 pg/ml PenStrep. Expresia mpl P vo vybratých klonoch sa určila FACS analýzou s použitím anti-mpZ P králičej polyklonálnej protilátky.

Ba/F3 mpl ligand test mpl Ligand test bol vykonaný ako je znázornené na obr.2. Aby sa stanovila prítomnosť mpl ligandu z rôznych zdrojov, mpl P Ba/F3 sa vystavili na 24 hodín nedostatku IL-3 pri hustote buniek 5 x 10⁵ buniek/ml v zvlhčovanom inkubátore pri 37 °C, 5 % CO₂ a vzduchu. Po nedostatku IL-3 sa bunky naočkovali do 96-jamkových kultivačných mikroskúmaviek na hustotu 50,000 buniek v 200 μΐ média so zriedenými alebo neriedenými sondami a kultivovali sa 24 hodín v bunkovom kultivačnom inkubátore. 20 μΐ séra, bez RPMI média, obsahujúceho 1 μΰί ³H-tymidínu, sa pridalo do každej mikroskúmavky na posledných 6-8 hodín. Bunky sa potom zozbierali do 96-jamkových GF/C filtračných mikroplatničiek a 5x premyli vodou. Filtráty sa vyhodnotili v prítomnosti 40 μΐ scintilačného roztoku (Mikroscint 20) v počítači Packard Top Count.

SK 282265 Β6

Príklad 2

Vysoko purifikovaný prasačí mpl ligand

Protokol gélovej elúcie

Rovnaké množstvá afinitne purifikovaného mpl ligandu (frakcia 6 eluovaná z mpl-lgG kolóny) a 2X vzorka Laemmliho tlmivého roztoku sa zmiešali pri teplote miestnosti bez redukčného činidla a vniesli na 4-30% polyakrylamidový Novex gél tak rýchlo, ako to bolo možné. Vzorka sa nezohrievala. Ako kontrola sa na kraj naniesla vzorka tlmivého roztoku bez ligandu. Gél sa spracúval pri 4-6 °C pri 135 V približne 2 1/4 hodiny. Vytesňovaci tlmivý roztok bol pôvodne pri teplote miestnosti. Gél sa potom odobral z elektroforetickej komôrky (gélovej krabičky) a odstránila sa platnička z jednej strany gélu.

Kópia gélu sa urobila na nitrocelulóze nasledovným spôsobom: kus nitrocelulózy sa zvlhčil destilovanou vodou a opatrne uložil na vrch exponovanej gélovej strany tak, aby sa nevytvorili vzduchové bubliny. Základné značky sa umiestnili na nitrocelulózu a gélovú platňu, takže kópia môže byť po zafarbení presne uvedená do správnej polohy. Po približne 2 minútach sa nitrocelulóza opatrne oddelila a gél sa zabalil do plastového obalu a uložil do chladničky. Nitrocelulóza sa zafarbila s Bioradovým gold total proteín farbivom jeho prvým pretrepaním v 3x10 ml 0,1% Tween 20 + 0,5M NaCl + O,1M tris-HCl pH 7,5 počas približne 45 minút, nasledovaná po 5 minútach 3x10 ml purifikovanej vody. Potom sa pridalo zlaté farbivo a nechalo sa pôsobiť, až kým neboli viditeľné pásiky v štandardoch. Kópia sa potom opláchla vodou, uložila sa do plastového obalu na gél a opatrne sa priradila k základným značkám. Polohy Novex štandardov sa označili na gélovej platničke a nakreslili sa čiary, ktoré označili miesta rezov. Nitrocelulóza a plastový obal sa potom oddelili, gél sa ostrou žiletkou nakrájal po označených čiarach. Rezy sa pretiahli až za vzorky, takže sa môžu použiť na stanovenie polôh prúžkov, keď sa gél zafarbí. Po oddelení prúžkov sa zostávajúci gél zafarbí na strieborne a zmerajú sa miesta štandardov a značky rezu. Molekulové hmotnosti zodpovedajúce miestam rezu sa určili z Novex štandardov.

prúžkov gélu sa vložilo do kyviet v dvoch elektroelútoroch typu Biorad 422. V kyvetách sa použili upravené ultraflltračné membrány s molekulovou hmotnosťou 1214K. Elučným tlmivým roztokom bol 50mM hydrogénuhličitan amónny + 0,05% SDS (pH približne 7,8). Jeden liter tlmivého roztoku sa pred použitím chladil približne 1 hodinu v chladiacej komore s teplotou 4-6 °C. Prúžky gélu sa eluovali pri 10 ma/kyveta (pôvodný 40 v) v chladiacej komore s teplotou 4-6 °C. Elúcia trvala približne 4 hodiny. Kyvety sa potom opatrne oddelili a tekutina nad fritou sa odstránila pipetou. Elučná komôrka sa odňala a všetka tekutina nad membránou sa odstránila pipetou. Tekutina v membráne sa odstránila Pipetmanom a odložila. Po päťdesiat μΐ purifikovanej vody sa pridávalo do membrány, pretrepávalo a oddelilo až kým sa nerozpustili všetky kryštáliky SDS. Tieto premývacie roztoky sa spojili so spomenutou odloženou tekutinou. Celkový objem elúcie vzorky bol 300-500 μΐ na jeden prúžok gélu. Vzorky sa umiestnili do lOmm narezaných dialyzačných hadie Spectrapor 4 1214K, ktoré boli namočené niekoľko hodín v purifikovanej vode. Dialyzovali sa cez noc pri 4-6 °C proti 600 ml fosfátového fyziologického tlmivého roztoku (PBS obsahuje približne 4 mM draslíka) na 6 vzoriek. Tlmivý roztok sa vymenil nasledujúce ráno a dialýza pokračovala 2,5 hodiny. Vzorky sa oddelili od dialyzačných vakov a uložili do mikrocentrifugálnych skúmaviek. Skúmavky sa uložili na 1 hodinu na ľad, mikrocentrifugovali sa 3 minúty pri 14K rpm a supematanty sa opatrne oddelili od vyzrážaného

SDS. Supematanty sa potom uložili na ľad približne na ďalšiu 1 hodinu a opäť sa mikrocentrifugovali počas 4 minút. Supematanty sa zriedili vo fosfátovom fyziologickom tlmivom roztoku a použili na stanovenie účinnosti. Zostávajúce vzorky sa zmrazili pri -70 °C.

Príklad 3

Mikrosekvenovanie prasačieho mpl ligandu

Frakcia 6 (2,6 ml) z mpl-lgG afinitnej kolóny sa zahustila na MÍcrocone-10 (Amicon). Aby sa zabránilo absorbcii mpl ligandu na Microcon membrána sa prepláchla s 1% SDS a 5 μΐ 10% SDS sa pridalo k frakcii 6. Vzorka tlmivého roztoku (20 μΐ) 2X sa pridala k frakcii #6 po zahustení na Microcone (20 μΐ) a celkový objem (40 μΐ) sa vniesol na jednu chodbičku akrylamidového gélu (gradient 4-20%) Novex. Gél sa spracoval podľa Novex protokolu. Gél sa potom uviedol do rovnovážneho stavu počas 5 minút pred elektroblotáciou v lOmM tlmivom roztoku kyseliny 3-(cyklohexylamino)-l-propánsulfónovej (CAPS), pH 11,0, obsahujúcej 10 % metanolu. Elektroblotácia sa vykonávala na Immobilon-PSQ membránach (Millipore) počas 45 minút pri 250 mA konštantným prúdom v prenosnej BioRad Trans-Biot kyvete (32). PVDF membrána sa zafarbila s 0,1% Coomassie Blue R-250 v 40% metanole, 0,1% kyseline octovej počas 1 minúty a odfarbila počas 2-3 minút s 10% kyselinou octovou v 50% metanole. Len tie proteíny, ktoré boli viditeľné v škvrne v oblasti Mr 18,000-35,000, mali Mr 30,000,28,000 a 22,000.

Pásiky (prúžky) pri 30, 28 a 22 kDa boli spôsobené sekvenciou bielkovín. Automatické sekvenovanie bielkovín sa vykonalo na sekvenátore typ 470A Applied Biosystem, vybavenom s on-line PTH analyzátorom. Radič bol modifikovaný na injektovanie 80-90% vzorky (Rodriguez, J.: Chromatogr., 350: 217-225 [1985]). Acetón (~12 μΐ/ΐ) sa pridal k rozpúšťadlu a na vyrovnanie UV absorbancie. Elektroblotované proteíny bolí sekvenované v Blott kazete. Vrcholy boli integrované s Justice Innovation software s využitím Nelson Analytical 970 interfaces. Interpretácia sekvencie sa vykonala na VAX 5900 (Henzel, a ost.: J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). N-koncové sekvencie (využívajúc jednopísmenový kód s neurčitými zvyškami v zátvorkách) a množstvo získaného materiálu (v zátvorkách) sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Sekvencia amino-konca mpl ligandu

30 kDa [1.8 pmel] 1 5 10 15 20 2S (S) P A P P A(C)D P R L L N K t L R D D MS) V L H (G) R L	(SEO ID NO: 30)
28 kDa [0.5 pmol] 1 S 10 16 20 26 (S)PAPPAXDPRLINKLLRDD(H)VĽ[H)GR	(Sea ID NO: 31)
18*22 kDa [0.S pmol] 1 5 10 X P A P P AX O P RIX (N) (K)	(SEO ID NO: 32)

Príklad 4

Tekutý suspenzný test megakaryocytopoézy

Humánne periférne kmeňové bunky (PSC) (získané od dobrovoľných pacientov) sa zriedili 5 prehnutiami s IMDM médiom (Gibco) a centrifúgovali sa 15 minút pri teplote miestnosti a pri 800 x g. Bunkové peletky sa resuspendovali v IMDM a rozmnožili na 60% Percoll (hustota 1,077 gm/ml) (Pharmacia) a centrifúgovali pri 800 x g počas 30 minút. Svetelná hustota mononukleámych buniek sa odsala na rozhraní a premyla 2x s IMDM a naočkovala na 1-2x10⁶ buniek/ml v IMDM, obsahujúcom 30% FBS (1 ml koneč

SK 282265 Β6 ného objemu) v 24 šachtových zhlukoch tkanivových kultúr (Costar). APP alebo APP vyprázdnený mpl ligand sa pridal na 10 % a kultúry rástli počas 12-14 dní v zvlhčovanom inkubátore pri 37 °C v 5% CO₂ a vzduchu. Kultúry rástli tiež v prítomnosti 10% APP s 0,5 pg mpl-lgG, ktorý sa pridal v deň 0, 2 a 4. APP sa vyprázdnilo z mpl ligandu prejdením APP cez mpl-lgG afinitný stĺpec.

Na kvantifikáciu megakaryocytopoézy v týchto tekutých suspenzných kultúrach sa použila modifikácia podľa Solberga a ost. a používa sa rádioizotopom značená myšia IgG monoklonálna protilátka (HP1-1D) na GPIIblIIa (uskutočnené Dr. Nicholsom, Mayo Clinic). 100 pg HP11D (pozri Grant, B. a ost.: Blood 69: 1334-1339 [1987]) sa rádioaktívne označilo s 1 mCi Na¹²⁵I s využitím Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) ako je uvedené v návode výrobcu. Rádioaktívne označený HP1-1D sa uložil pri -70 °C v PBS s obsahom 0,01 % oktyl-glukozidu. Typické špecifické aktivity boli 1 -2xl0⁶ cpm/pg (>95 % zrážané 12,5% kyselinou trichlóroctovou).

Tekuté suspenzné kultúry sa vyhotovili trojmo pre každý experimentálny bod. Po 12-14 dňoch kultivácie 1 ml kultúr sa preniesol do l,5ml mikroskúmaviek („eppendorfky“) a centrifugovali sa pri 800 x g 10 minút pri teplote miestnosti a výsledné peletky buniek sa resuspendovali v 100 pl PBS, obsahujúcom 0,02 % EDTA a 20 % bovinného teľacieho séra. 10 ng ¹²⁵I-HP1-1D v 50 pl vzorky tlmivého roztoku sa pridalo k resuspendovaným kultúram a inkubovalo sa počas 60 minút pri teplote miestnosti (RT) za príležitostného pretrepania. Následne sa bunky zhromaždili centrifugáciou pri 800 x g počas 10 minút pri RT a 2x premyli tlmivým roztokom. Peletky sa v priebehu 1 minúty spočítali v gama počítači (Packard). Nešpecifická väzba sa určila pridaním 1 pg neznačeného HP1-1D počas 60 minút pred pridaním značeného HP1-1D. Špecifická väzba sa určila ako celkové viazanie sa ¹²⁵I-HP1-1D mínus viazanie sa v prítomnosti nadbytku neznačeného HP1-1D.

Príklad 5

Oligonukleotidavé PCR priméry

Na základe aminoterminálovej sekvencie aminokyseliny získanej z 30 kDA 28 kDa a 18-22 kDa proteínov sa určili degenerované oligonukleotidy na použitie ako primery polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) (pozri tabuľka 4). Syntetizovali sa dva primérové fondy: pozitívny 20 mer fond kódujúci zvyšky aminokyselín 2-8 (mpl 1) a anti- 21-mer fond doplňujúci sekvencie kódujúce aminokyseliny 18-24 (mpl 2).

Tabuľka 4

mpl 1:5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (2,048 x deger.)	(SEQ ID NO: 35)
mpl 2:5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3' (2,048 x deger.)	(SEQ ID NO: 36)

Bravčová genómová DNA, izolovaná z bravčových periférnych krvných lymfocytov, sa použila ako templát pre PCR. 50 pl reakcie obsahovalo: 0,8 pg bravčovej genómovej DNA v lOmM tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 3 mM MgCl₂,100 pg/ml BSA, 400 pM dNTPs, po 1 pM z každého primérového fondu a 2,5 jednotiek Taq polymerázy. Počiatočná templátová denaturácia bola pri 94 °C počas 8 miηύζ nasledovaná 35 - 45-sekundovými cyklami pri 94 °C, 1 min pri 55 °C a 1 min pri 72 °C. Konečný cyklus nasledoval po 10-minútovom predĺžení pri 72 °C. PCR produkty sa oddelili elektroforézou na 12% polyakrylamidovom géle a vizualizovali sa zafarbením s etidium bromidom. Zistilo sa, že ak aminoterminálová sekvencia aminokyseliny bola kódovaná jedným exónom, potom sa pre správny PCR produkt očakáva 69 bp. DNA fragment s touto veľkosťou sa eluoval z gélu a subklonoval do pGEMT (Promega). Sekvencie troch klonov sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 5 bp fragmenty bravčovej genómovej DNA g«mT3

S'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA

3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGQGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCAGI

TGACCACGTT CAGCACGGC [6S bp] (SEQ ID NO; 37) (SEQ 10 NO: 38) jernTľ

5'CCäGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCA2I

CGACCACGTC CATCACGGC (69 bp] (SEQ ID NO; 39) gamTS

P R L L N K L LR (SEQ ID

NO: 32)

5· pCAGCACCGCCGBCATGTGACCCCCGACTCCTAÄATAAACTGCTTCGTSACG 3* GGTCGTGGCGGCCôTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACIfii

ATCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41)

TABTACAGATAGTOCC« 5' (SEQ ID NO: <2)

Poloha PCR primárov je označená podčiarknutím báz. Tieto výsledky, potvrdené N-koncovou sekvcnciou, sa získali pre aminokyseliny 9-17 30kDa, 29kDa a 18-22kDa proteínov a preukázali, že táto sekvencia je kódovaná jediným exónom bravčovej DNA.

Príklad 6

Gén ľudského mpl ligandu

Na báze výsledkov z príkladu 5 45-mer deoxynukleotid, nazývaný pR45, sa určil a syntetizoval, aby sa preskúmala genómová knižnica. 45-mer mal nasledujúcu sekvenciu: 5 GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3 (SEQ ID č.: 28)

Tento oligonukleotid sa označil ³²P s (/²P)-ATP a T4 kinázou a použil na skrining humánnej genómovej DNA knižnice v ygem!2 pri nízkej ostrosti hybridizácie a prepieracích podmienkach (pozri príklad 7). Pozitívne klony sa pozbierali, povlaky sa prečistili a analyzovali reštrikčným mapovaním a southem blottingom. Kloň #4 sa vybral na dodatkovú analýzu.

2,8 kb BamHI-Xbal fragment, ktorý hybridizoval na 45-mer, sa subklonoval do pBluescript SK-. Parciálnou DNA sekvenciou tohto klonu sa predtvaroval na použitie ako oligonukleotidové priméry, špecifické na sekvenciu mpl ligandu bravčovej DNA. Získaná sekvencia potvrdila, že sa izolovala DNA kódujúca ľudský homológ bravčového mpl ligandu. EcoRI reštrikčné miesto sa zistilo v sekvencii, umožňujúcej izolovať 390 bp EcoRl-Xbal fragment z 2,8 kb BamHI-Xbal a subklonovať ho v pBluescript SK-.

Obidva reťazce tohto fragmentu sa sekvenovali. Sekvencia humánnej DNA a sekvencia odvodenej aminokyseliny sú ukázané na obr.9 (SEQ ID č. 3 a 4). Predpovedané polohy intrónov v genómovej sekvencii sú tiež označené šípkami a definované predpokladaným exónom („exón 3“).

Skúmanie sekvencie odvodenej aminokyseliny potvrdzuje, že serínový zvyšok je prvou aminokyselinou zrelého mpl ligandu, ako sa určilo z priamej sekvenčnej analýzy aminokyseliny. Hneď za kodónom odvodenej aminokyseliny sekvencia vysoko pripomína signálnu sekvenciu, obsiah43 nutú v sekréte zrelého mpl ligandu. Táto signálna sekvencia, kódujúca oblasť, je pravdepodobne prerušená v nukleotidovej polohe 68 intrónom.

Zdá sa, že v 3 smere exón končí pri nukleotide 196. Tento exón preto kóduje sekvenciu 42 aminokyselín, z ktorých 16 sa zdá byť časťou signálnej sekvencie a 26 je časťou zrelého humánneho mpl ligandu.

Príklad 7 cDNA ľudského mpl ligandu s úplnou dĺžkou

Na báze sekvencie humánneho „exónu 3“ (príklad 6) sa syntetizovali dva nedegenerované oligonukleotidy, zodpovedajúce 3 a 5 koncom sekvencie „exónu 3“ (tabuľka 6).

Tabuľka 6

Primery humánneho cDNA nedegenerovaného PCR oligonukleotidu

Fwd primér: 5' GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGGTCATGCTTCT3'	(SEQ ID NO: 4 3)
Rv: primér 5' CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3'	(SEQ ID NO: 4 4)

Tieto dva priméry sa použili v PCR reakciách, ktoré využívajú ako templátovú DNA z rôznych humánnych cDNA knižníc alebo 1 ng „Quick Clone“ cDNA (Clonetech) z rôznych tkanív, s využitím podmienok opísaných v príklade 5. Očakávaná veľkosť správneho PCR produktu bola 140 bp. Po analýzach PCR produktov na 12% polyakrylamidovom géle sa DNA fragment s očakávanou veľkosťou zistil v cDNA knižniciach pripravených z obličiek dospelých, z 293 fetálnych obličkových buniek a z cDNA pripravenej z humánnej fetálnej pečene (Clonetech cat. #7171-1).

Fetálna pečeňová cDNA knižnica v y DR2 (Clonetech cat. # HL1151x) sa skrínovala s rovnakým 45 mer oligonukleotidom a využila na skríning humánnej genómovej knižnice. Oligonukleotid sa označil s (y³²P)-ATP s využitím T4 polynukleotidovej kinázy. Knižnica sa skrínovala pri podmienkach málo prísnej hybridizácie. Filtráty sa predhybridizovali počas 2 hodín a potom hybridizovali so sondou cez noc pri 42 °C v 20% formamide, 5xSSC, lOx Denhardts, 0,05M fosforečnan sodný (ph 6,5), 0,1% pyrofosforečnan sodný, 50 pg/ml DNA ultrazvukom ošetrených lososích spermií počas 16 hodín. Filtre sa potom opláchli v 2xSSC a potom premyli v 0,5xSSC, 0,1% SDS pri 42 °C. Filtre sa potom exponovali cez noc na rádioaktívny film (Kodak X-Ray film). Pozitívne klony sa pozbierali, povlaky prečistili a veľkosť inzertu sa určila pomocou PCR, s použitím ohraničujúcich oligonukleotidov BamHI-Xbal kódujúcich v λ DR2 (Clonetech cat. #6475-1). 5 pl kultúry bakteriofágov sa použilo ako templátový zdroj. Počiatočná denaturácia sa robila 7 minút pri 94 °C, nasledovaná 30 cyklami amplifikácie (1 min pri 94 °C, 1 min pri 52 °C a 1,5 min pri 72 °C). Záverečné predĺženie bolo 15 min pri 72 °C. Kloň # FL2b mal 1,8 kb inzert a selektoval sa na ďalšiu analýzu.

Plazmid pDR2 (Clonetech, yDR2 & pDR2 cloning and Expression Systém Library Protocol Handbook, str.42), obsiahnutý v yDR2 baktériofágových ramenách, sa získal spôsobom, ako je opísaný v pokynoch výrobcu (Clonetech, Clonetech, yDR2 & pDR2 cloning and Expression Systém Library Protocol Handbook, str.29-32). Reštrikčná analýza plazmidu pDR2-F2b s BamHI a Xbal dokázala prítomnosť vnútorného BamHI reštrikčného miesta v inzerte približne v polohe 650. Štiepenie plazmidu s BamHI-Xbal rozstrihlo inzert na dva fragmenty: jeden 0,65 kb a druhý 1,15 kb. DNA sekvencia sa stanovila s tromi rôznymi triedami tem plátu, odvodeného od plazmidu pDR2-FL2b. Stanovenie DNA sekvencie dvojvláknového plazmidu DNA sa uskutočnilo s ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, Califomia) automatizovaným fluorescenčným sekvenátorom s využitím štandardného postupu, pre farbivom označené terminátory dideoxynukleozid trifosfátu (zafarbené terminátory) a na objednávku syntetizovanými primérmi (Sanger et all., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]; Smith et al., Náture, 321: 674-679 [1986]). Priame sekvenovanie fragmentov amplifikovaných reakciou polymerázového reťazca z plazmidu sa urobilo s ABI373 sekvenátorom, s využitím vybraných reakcií primérov a farbivom označených terminátorov. Jednovláknový templát sa vytvoril s M13 Janusovým vektorom (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21: 3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1,15 kb a BamHI (0,65 kb) fragmenty sa izolovali z plazmidu pDR2-FL2b, konce sa doplnili s T4 DNA polymerázou v prítomnosti deoxynukleotidov a potom subklonovali do Smal miesta Ml3 Janusa. Sekvenovanie sa uskutočnilo podľa štandardného postupu pre farbivom značené M13 univerzálne a reverzné priméry, alebo pohyblivými primérmi a farbivom označenými terminátormi. Manuálne sekvenčné reakcie sa uskutočnili na jednovláknovej M13 DNA s využitím pohyblivých primérov a chémie štandardného dideoxyterminátora (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467 [1977]), ³³P-značeného α-dATP a sekvenázy (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Súborná DNA sekvencia sa uskutočnila so Sequencher V2.1bl2 (gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Nukleotidové a odvodené sekvencie hML sú znázornené na obr. 1 (SEQ ID č. 1).

Príklad 8

Izolácia génu humánneho mpl ligandu (TPO)

Humánne genómové DNA klony TPO génu sa izolovali skríningom humánnej genómovej knižnice v γ-Gem 12 s pR45, už opísanou oligonukleotidovou sondou pri stredne prísnych podmienkach nízkej (pozri príklad 7) alebo pri veľmi prísnych podmienkach vysokej, s fragmentom zodpovedajúcim 3 polovici humánnej cDNA kódujúcej pre mp/-ligand (z BamHI miesta na 3 koniec). Izolovali sa dva prekrývajúce sa lambda klony merajúce 35 kb. Dva prekrývajúce sa fragmenty (BamHI a EcoRI), obsahujúce úplný TPO gén, sa subklonovali a sekvenovali. Štruktúra humánneho génu pozostáva zo 6 exónov v rozsahu 7 kb genómovej DNA (obr. 14 A, B a C). Hranice spojení všetkých exónov/intrónov sú zhodné s konvenčným motívom zavedeným pre gény cicavcov (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exón 1 a exón 2 obsahujú 5 netranslátovanú sekvenciu a začiatočné aminokyseliny signálneho peptidu. Zvyšok sekrečného signálu a prvých 26 aminokyselín zrelého proteínu sa kóduje v exóne 3. Celá karboxylová doména (oblasť) a 3 netranslátované ako aj asi 50 aminokyselín oblasti podobnej erytropoetínu sa kóduje v exóne 6. Štyri aminokyseliny zvinuté v delécii pozorované v rozsahu hML-2 (hTPO-2) sú kódované na 5 konci exónu 6.

Príklad 9

Prechodná expresia humánneho mpl ligandu (hML)

Aby sa klonovala celá dĺžka inzertu, obsiahnutého v pDR2-FL2b, plazmid sa štiepil s Xbal kvôli koncu, potom sa parciálne štiepil s BamHI. DNA fragment zodpovedajúci 1,8 kb inzertu sa gélovo purifikoval a subklonoval v pRK5 (pRK5-hw/>/1) (pozri US pat. č.5,258,287 na konštrukciu pRK5) pod kontrolou okamžitého počiatočného promótora cytomegalovírusu. DNA z konštrukcie pRK5-hmp/1 sa pripravila PEG metódou a transfektovala do 293 humánnych

Vo všetkých konštrukciách použité „vonkajšie“ priméry sú uvedené v tabuľke 8 a „prekrývajúce sa“ priméry sú uvedené v tabuľke 9.

zárodočných obličkových buniek, udržiavaných v modifikovanom Dulbecco s Eagle s médiu (DMEM), doplnenom s F-12 nutričnou zmesou, 20 mM Hepes a 10% fetálnym bovinným sérom. Bunky sa transfektovali kalciumfosfátovým spôsobom, ako je opísané (Gorman, C. [1985] v DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., ed) Vol. II, 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). 36 hodín po transfekcii sa v supematante transfektovaných buniek stanovila aktivita v proliferačnej skúške (pozri príklad 1). Supematant 293 buniek transfektovaných len s pRK vektorom neposkytol žiadnu stimuláciu Ba/F3 alebo Ba/F3-mp/ buniek (obr. 12A). Supematant buniek transfektovaných s pRK5-hmp/1 nemal žiadny účinok na Ba/F3 bunky, ale neuveriteľne stimuloval proliferáciu Ba/F3-mp/ buniek (obr. 12A), naznačujúc, že táto cDNA kóduje fiinkčne aktívny humánny mpl ligand.

Príklad 10

Izoformy hML2, hML3 a hML4 humánneho Mpl ligandu

Aby sa identifikovali alternatívne spojené formy hML, syntetizovali sa priméry zodpovedajúce každému koncu kódujúcej sekvencie hML. Tieto priméry sa použili v RTPCR na zosilnenie humánnej dospelej pečeňovej RNA. Dodatočne sa zostrojili vnútorné priméry, ohraničujúce oblasti záujmu (pozri nižšie) a použili sa podobne. Priame sekvenovanie koncov PCR produktu ukázalo samostatnú sekvenciu zodpovedajúcu presne sekvencií cDNA izolovanej z humánnej fetálnej pečeňovej knižnice (pozri obr.l [SEQ ID NO: 1]). Avšak oblasť blízko C-konca EPO-domény (v strede PCR produktu) ukázala komplexnú sekvenciu predlohy naznačujúcej existenciu možných spojených variantov v tejto oblasti. Aby sa izolovali tieto spojené varianty, priméry poskytnuté v tabuľke 7, ohraničujúce oblasť záujmu, sa použili v PCR ako templáty pre humánne dospelé pečeňové cDNA.

Tabuľka 7

Humánna ML izoforma PCR primérov

phmpl1cdna.3el: 5TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3'	(SEQ ID NO: 45)
pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3'	(SEQ ID NO: 46)

PCR produkty sa tupo subklonovali do M13. Sekvenovanie samostatných subklonov ukázalo existenciu najmenej 3 ML izoforiem. Jedna z nich, hML (tiež uvádzaná ako hML₃₃₂), je najdlhšou formou a presne zodpovedá sekvencii izolovanej z fetálnej pečeňovej knižnice. Sekvencie štyroch izoforiem humánneho mpl ligandu, vymenované od najdlhšej (hML) po najkratšiu (hML-4), sú uvedené na obr. 11 (SEQ ID č. 6,8,9 a 10).

Príkladll

Konštrukcia a prechodná expresia izoforiem humánneho Mpl ligandu a náhradných variantov hML2, hML3 a hML4 (R153A, R154A)

Izoformy hML2 a hML3 a náhradný variant hML (R153A, R154A) sa rekonštruovali z hML s využitím rekombinatnej PCR techniky, opísanej Russellom Higuchim v: PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J. J.Sninsky & T. J. White Editors.

Tabuľka 8

Vonkajšie priméry

CKFLF2: 5ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3’	(SEQ ID NO: 47)
HMPLL-R: 5GCT AGC TCT AGA CAG GG A AGG GAG CTG TAC ATG AGA3'	(SEQ ID NO. 48)

Tabuľka 9

Prekrývajúce sa priméry

hML-2: MLA4F: 5CTC CIT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3’ MLMR 5GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3'	(SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO: 50)
hML-3: hMU116+: 5CIG CTC CGA GGA AAG GAC TIC TGG ATT3' hMLAl 16-: 5ΆΑΤ CCA GAA GTC CIT TCC TCG GAG CAG 3'	(SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52)
hMLíR153AR154AI: RR-KO-F: 5CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' RR-KO-R: 5GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGGG3'	(SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 54)

Všetky PCR amplifikácie sa uskutočnili s klonovanou Píu DNA polymerázou (Stratagene) pri nasledujúcich podmienkach: začiatočná templátová denaturácia bola pri 94 °C počas 7 minút, nasledovaná 30 1-minútovými cyklami pri 94 °C, 1 minútu pri 55 °C a 1,5 min pri 72 °C. Konečný cyklus bol predĺžený na 10 minút pri 72 °C. Konečný PCR produkt sa štiepil s Clal-AbaZ, gélovo purifikoval a klonoval do pRK5tkneo. 293 buniek sa transfektovalo s rôznymi konštrukciami, ako je opísané, a aktivita supematantu sa stanovila s využitím Ba/F3-mp/ skúšky proliferácie. hML-2 a hML-3 nepreukázali žiadnu zistiteľnú aktivitu v tejto skúške, avšak aktivita hML(R153A, R154A) bola podobná ako hML, naznačujúc, že na dosiahnutie aktivity sa nevyžaduje spracovávanie na di-bázickej polohe (pozri obr. 13).

Príklad 12 cDNA myších mpl ligandov mML, mML-2 a mML-3

Izolácia mML cDNA

DNA fragment, zodpovedajúci celej kódujúcej oblasti humánneho mpl ligandu, sa získal prostredníctvom PCR, gélovou purifikáciou a označením náhodným nanášaním v prítomnosti ³²P-dATP a ³²P-dCTP. Táto skúška sa použila na skúmanie 10^s klonov myšej pečeňovej cDNA knižnice v yGTlO (Clontech cat# ML3001a). Dvojité filtráty sa hybridizovali v 35% formamide, 5x SSC, lOx Denhardt, 0,1% SDS, 0,05M fosforečnan sodný (pH 6,5), 0,1% pyrofosforečnan sodný, 100 pg/ml DNA z ultrazvukom ošetrených lososích spermií cez noc, v prítomnosti sondy. Filtráty sa prepláchli 2x SSC a potom sa jedenkrát premyli 0,5xSSC, 0,1% SDS pri 42 °C. Hybridizované fágy sa plakovo purifikovali a cDNA inzerty sa subklonovali do Eco R1 miesta Bluescript SK- plazmidu. Kloň LD s 1,5 kb inzertom sa vybral na ďalšiu analýzu a obidve vlákna sa sekvenovali ako je uvedené pri humánnej ML cDNA. Nukleotid a odvodené aminokyselinové sekvencie z klonu LD sú uvedené na obr. 14 (SEQ ID NOS: 1 & 11). Odvodenou sekvenciou zrelého ML z tohoto klonu boli zvyšky s 331 aminokyselinami a boli identifikované ako mML₃₃i (alebo mML-2 z u45 vedených dôvodov). V doménach týchto ML, podobných EPO, bola zistená identita obidvoch sekvencií - nukleotidovej aj aminokyselinovej. Avšak keď sa zoradili odvodené aminokyselinové sekvencie humánnych a myšacích ML, ukázalo sa, že myšacia sekvencia má deléciu tetrapeptidu medzi humánnymi zvyškami 111-114, zodpovedajúcu 12 nukleotidovej delécii nasledujúcej nukleotidovej pozície 618 zjavnej tak v humánnej (pozri vyššie) ako aj v prasačej (pozri nižšie) cDNA. Preto sa skúmali ďalšie klony na stanovenie možných myších ML izoforiem. Jeden kloň, L7, mal 1,4 kb inzert s odvodenou 335 aminokyselinovou kyselinou, obsahujúcou chýbajúci” tetrapeptid LPLQ. Táto forma je považovaná za formu s celou dĺžkou myšieho ML a je uvádzaná ako mML alebo mML_JJS. Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia pre mML sú uvedené na obr. 16 (SEQ ID NOS: 12 & 13). Nakoniec sa izoloval a sekvenoval kloň L2”. Tento kloň má 116 nukleotidovú deléciu zodpovedajúcu hML3 a preto je označovaná mML-

3. Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií týchto dvoch izoforiem ukazuje obr. 16.

Expresia rekombinantnej mML

Expresné vektory myšej ML sa pripravili v podstate spôsobom, opísaným v príklade 8. Klony kódujúce mML a mML-2 sa subklonovali do pRK5tkneo, cicavčieho expresného vektora, ktorý umožňuje expresiu za riadenia CMW promótora a SV40 polyadenylačného signálu. Výsledné expresné vektory, mMLpRKtkneo a mML2pRKtkneo boli prechodne transfekované do 293 buniek s použitím kalcium fosforečnanovej metódy. Po prechodnej transfekcii sa médium upravovalo 5 dní. Bunky sa udržovali vo vysokom DMEM glukózovom médiu doplnenom 10% teľacím sérom.

Expresia myšieho-mpl (mmpl) v Ba/F3 bunkách

Stabilné expresné c-mpl bunkové línie sa získali transfekovaním mmpl pRKtkneo, na báze opísanej pre humánny mpl v príklade L V krátkosti, expresný vektor (20 gg; linearizovaný) obsahujúci úplnú kódujúcu sekvenciu myšieho mpl (Škoda, R.C., et al., EMBO J. 12: 2645-2653 [1993]), sa transfektoval do Ba/F3 buniek elektroporáciou (5 x 10⁶ buniek, 250 voltov, 960 gF), nasledovala selekcia na neomycínovu rezistenciu s 2 mg/ml G418. Expresia mpl stanovená prietokovou cytometrickou analýzou s použitím králičieho anti-myšacieho mpl-lgG antiséra. Ba/F3 bunky sa udržovali v RPMI médiu z WEHI-3B buniek ako zdroji IL3. Supematanty z 293 buniek, prechodne transfekovaných s mML aj mML-2, sa testovali v Ba/F3 bunkách transfekovaných s mmpl aj s hmpl, ako je opísané v príklade 1.

Príklad 13

CDNA prasačích mpl ligandov pML a pML-2

Prasačia ML (pML) cDNA sa izolovala spôsobom RAČE PCR. Stručne, oligo dT primér a 2 špecifické priméry boli označené na základe sekvencie exónu prasačieho ML génu, kódujúceho amino koniec ML, purifikovaného z aplastického prasačieho séra. Získala sa a amplifikovala cDNA, pripravená z rozličných aplastických prasačích tkanív. V obličkách sa našiel PCR cDNA produkt 1342 bp a subklonoval sa. Niektoré klony sa sekvenovali a zistilo sa, že kódujú zrelý prasačí mpl ligand (nezahrnujúci kompletný sekrečný signál). Našla sa cDNA kódujúca 332 aminokyselinový zrelý proteín (pML₃₃₂), majúci sekvenciu znázornenú na obr. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

Metóda:

Izolácia génu pML a cDNA.

Genómové klony prasačieho ML génu sa izolovali skrínovanim prasačej genómovej knižnice v EMBL3 (Clontech Inc.) s pR45. Knižnica sa skrínovala ako je opísané v príklade 7. Niektoré klony sa izolovali a sekvenoval sa exón kódujúci aminokyselinovú sekvenciu, identickú so získanou z purifikovaného ML. Prasačie ML cDNA sa získali využitím modifikácie RAČE PCR protokolu. Dva špecifické priméry sa označili na základe sekvencie prasačieho ML génu. Polyadenylátová mRNA sa izolovala z obličiek aplastických ošípaných, v podstate ako bolo predtým opísané. cDNA sa pripravila reverznou transkripciou s BamdT primérom (BamdT: 5 GACTCGAGGATCCATCGA'ľľľľľľmTľľlTľľl 3) (SEQ IDNO: 55) smerovaná proti polyadenozínovému chvostu mRNA. Začiatočný okruh PCR amplifikácie (28 cyklov pri 95 °C počas 60 sekúnd, pri 58 °C počas 60 sekúnd a pri 72 °C počas deväťdesiatich sekúnd) sa viedol s použitím ML špecifického h-forward-1 priméru (h-forwand-l: 5 GCTAGCTCTAGAAATTGCTrCHCGTGGÍCATGCTTCT 3) (SEQ ID NO: 43) a BAMAD priméru (BAMAD: 5’GACTCGAGGATCCATCG 3 ) (SEQ ID NO: 56) v 100 ml reakcii (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, 10 mM tris pH 8,0, 0,2 mM dNTPs, s 0,05U/ml Amplitaq polymerázy [Perkin Elmer Inc.]). PCR produkt sa potom štiepil s Clal, extrahoval s fenol-chloroformom (1:1), zrážal etanolom a ligoval do 0,1 mg Bluescript SK- vektora (Stratagene inc.), ktorý sa mal strihať s Clal a Kpn 1. Po dvojhodinovej inkubácii pri teplote miestnosti sa štvrtina ligovanej zmesi pridala priamo k druhému okruhu PCR (22 cyklov ako je opísané vyššie) s použitím druhého ML špecifického forward-1 priméru (forwaid-1:5 GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG3 ) (SEQIDNO: 57) a T3-21 (oligonukleotid, ktorý sa pripája na susednú sekvenciu multiklonovanej oblasti v Bluescript SK- vektore): (5' CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3 ) (SEQIDNO: 58).

Výsledný PCR produkt sa štiepil s Xbal a Clal a subklonoval do Bluescript SK-. Sekvenovali sa niektoré klony z nezávislých PCR reakcií.

Opäť bola identifikovaná druhá forma, označená pML-2, kódujúca proteín s deléciou 4 aminokyselinového zvyšku (328 aminokyselinových zvyškov) (pozri obr.21 [SEQ ID NO: 21]). Porovnanie pML a pML-2 aminokyselinových sekvencií ukazuje, že neskoršia forma je identická, s výnimkou toho, že tetrapeptid QLPP, zodpovedajúci zvyškom 111-114 vrátane, bol deletovaný (pozri obr.22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Štyri amino-kyselinové delécie, pozorované v myšej, humánnej a prasačej ML cDNA, sa vyskytujú na presne tej istej pozícii v predpovedaných proteínoch.

Príklad 14

CMK test trombopoetínovej (TPO) indukčnej expresie antigénu krvných doštičiek GPIItJII_a

CMK bunky sa udržujú v RMPI médiu (Sigma), doplnenom 10 % fetálneho bovinného séra a lOmM glutamínu. V príprave na test sa bunky pozbierajú, premyjú a resuspendujú na 5 x 10⁵ buniek/ml GIF média bez séra, doplneného s 5 mg/1 bovinného inzulínu, 10 mg/1 apo-transferínu, 1 X stopové prvky. TPO štandard alebo experimentálne vzorky sa pridajú do 96-jamkovej platne, do každej jamky s príslušným rozpúšťadlom (100 μΐ objemy). 100 μΐ bunkovej suspenzie sa pridá do každej jamky a doštičky sa inkubujú pri 37 °C, v 5% CO₂ inkubátore počas 48 hodín. Po inkubácii sa doštičky centrifugujú pri 1000 rpm pri 4 °C počas 5 minút. Supematanty sa oddelili a 100 μΐ FITC-konjugovanej GPIIbIII_a monoklonálnej 2D2 protilátky sa pridá do každej jamky. Nasleduje inkubácia pri 4 “C počas 1 hodiny, doštičky sa opäť centrifugujú pri 1000 rpm počas 5 minút. Supematanty obsahujúce nenaviazanú protilátku sa oddelia a 200 μΐ 0,1% BSA-PBS sa pridá do každej jamky. Premývací krok s 0,1% BSA-PBS sa opakoval trikrát. Bunky sa potom analyzovali vo FASCAN s využitím jedného parametra štandardu meraním relatívnej intenzity fluorescencie.

Príklad 15

Trombopoetínový (TPO) DAMI test meraním endomitotickej aktivity DAMI buniek v 96-jamkových mikrotiračných doštičkách

DAMI bunky sa udržovali v IMDM + 10 % konského séra (Gibco), doplnenom lOmM glutamínu, 100 ng/ml Penicilínu G a 50 pg/ml streptomycínu. V príprave na pokus sa bunky pozbierali, premyli a resuspendovali na lxlO⁶ buniek/ml v IMDM + 1% konské sérum. Do 96-jamkovje mikrotitračnej doštičky sa k DAMI bunkovej suspenzii pridalo 100 μΐ TPO štandardu alebo experimentálnych vzoriek. Bunky sa potom inkubovali 48 hodín pri 37 °C v 5 % CO₂ inkubátore. Po inkubácii sa doštičky centrifugovali v Sorvall 6000B centrifúge pri 1000 rpm počas 5 minút pri 4 °C. Supematany sa oddelili a 200 μΐ PBS-0,1% BSA premývací krok sa zopakoval. Bunky sa fixovali pridaním 200 μΐ ľadovo studeného 70% etanol-PBS a resuspendovali ašpiráciou. Po inkubácii pri 4 °C počas 15 minút sa doštičky centrifugujú pri 2000 rpm počas 5 minút a do každej jamky sa pridalo 150 μΐ 1 mg/ml RNAzy obsahujúcej 0,1 mg/ml propídium jodidu a 0,05 Tween-20. Po jednohodinovej inkubácii pri 37 °C sa prietokovou cytometriou zmerali zmeny v obsahu DNA. Polyploidita sa merala a kvantifikovala ako je uvedené:

(% buniek v >G2+M/%buniek v <G2+M) s TPO Normaliwvanýpofypkdáiýpumer (NPR) - .......

buniekv žG2+MMbumek v <G2+M) v kontrole

Príkla d 16

Trombopoetínový (TPO) in vivo test (Spontánny test myších krvných doštičiek)

In vivo test ³⁵S determinácie produkcie krvných doštičiek

Do C57BL6 myší (získané z Charles River) sa intraperitoneálne (IP) injektuje 1 ml kozieho anti-myšieho séra krvných doštičiek (6 amps) v deň 1 na vyvolanie trombocytopénie. Na 5 a 6 deň sa myšiam dali dve IP injekcie faktora alebo PBS ako kontrola. Na siedmy deň sa intravenózne injektuje tridsať pCi Na₂ ³⁵SO₄ v 0,1 ml fyziologického roztoku a percento ³⁵S inkorporácie injektovanej dávky v cirkulujúcich krvných doštičkách sa zmeria vo vzorkách krvi, získaných z ošetrených a kontrolných myší. Spočítanie krvných doštičiek a leukocytov sa vykoná v rovnakom čase z krvi, získanej z retroorbitálnej (očnicovej) dutiny·

Príklad 17

KIRA ELISA trombopoetínu (TPO) meraním fosforylácie mpl-Rse.gD chimerického receptora

Humánny mpl receptor bol opísaný Vigonom et al., PNAS, USA 89: 5640-5644 (1992). Chimerický receptor, obsahujúci extracelulámu doménu (ECD) mpl receptora a transmembránovú (TM) a intracelulámu doménu (ICD) Rse (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269 (14): 10720-10728 [1994]) s karboxy-terminálovým polypeptidom (t.zn. Rse.gD), bol vytvorený na použitie v KIRA ELISA, tu opísanom. Pozri obr.30 a 31 so schematickým opisom pokusu.

a) Príprava zachytávacieho činidla

Monoklonálny anti-gD (kloň 5B6) sa pripravil proti peptidu z glykoproteínu D vírusu Herpes simplex (Paborsky et al., Proteín Engineering 3(6): 547-553 [1990]). Purifikovaný produkt sa upravil 3,0 mg/ml fosforečnanového fyziologického tlmivého roztoku (PBS), pH 7,4 a l,0ml vzorky sa uložili pri -20 °C.

b) Príprava anti-fosfotyrozínovej protilátky

Monoklonálny anti-fosfotyrozín, kloň 4G10, sa získal z UBI (Lake Placid, NY) a biotinyloval sa s použitím dlhoramienkového biotín-N-hydroxysukcínamidu (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

c) Ligand mpl ligand sa pripravil rekombinantnými technikami, tu uvedenými. Purifikovaný mpl ligand sa uložil pri 4 °C, ako roztok mikroorganizmov.

d) Príprava Rse.gD nukleovej kyseliny

Syntetické dvoj vláknité oligonukleotidy sa použili na rekonštituovanie kódujúcej sekvencie pre C-koncových 10 aminokyselín (880 - 890) humánnej Rse a rozšírenie na ďalších 21 aminokyselín, obsahujúcich epitop 5B6 protilátky a stop kodón. tabuľka 10 predstavuje konečnú sekvenciu syntetickej časti syntetizovaného génu.

Tabuľka 10

Syntetická dvoj vláknitá časť humánneho Rse syntetického génu

kódujúc· vlákno: 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTrCCGGTCCTGTAGAAGCT-T	(SEQ 10 NO: 59)
nekóckyúc· (anti-zmyaloYÓ) vlákno: 5'-AQCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGMTCGATTTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCnGCTGCA-3'	(SEQ 10 NO; SO)

Syntetická DNA sa ligovala s cDNA kódujúcou aminokyseliny 1-880 humánnej Rse na Pstl polohe začínajúcej pri nukleotide 2644 publikovanej humánnej Rse cDNA sekvencie (Mark et al., Joumal of Biological Chemistry 269 (14): 10720-10728 [1994]) a HindlII polohách v polylinkeri expresného vektora pSVI7.ID.LL (pozri obr.32 A-L; SEQ ID NO: 22), aby sa vytvoril expresný plazmid pSV.ID.Rse.gD. V skratke, expresný plazmid zahrnuje primárny transkrípt dicistrónu, ktorý obsahuje sekvenciu kódujúcu DHFR naviazanú na 5 donorový úsek a 3 akceptorový úsek polôh intrónu, nasledovaný sekvenciou, ktorá kóduje Rse.gD. Celá dĺžka (nestrihaná) správy obsahuje DHFR ako prvý otvorený čítací rám a takto generuje DHFR proteín na umožnenie selekcie stabilných transformantov.

e) Príprava mpl-Rse.gD nukleovej kyseliny

SK 282265 Β6

Expresný plazmid pSV.ID.Rse.gD, produkovaný ako je opísané, bol modifikovaný na prípravu plazmidu pSV.ID.M.tmRdó, ktorý obsahoval kódujúce sekvencie ECD humánneho mpl (aminokyseliny 1-491) spojené na transmembránovej doméne a intracelulámej doméne Rse.gD (aminokyseliny 429-911). Syntetické oligonukleotidy sa použili na pripojenie kódujúcej sekvencie časti extracelulámej domény humánneho mpl k časti Rse kódujúcej sekvencie v dvoch krokoch PCR klonovacej reakcie, ako opisuje Mark et al., J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 (1992). Primármi, použitými na prvú PCR reakciu, boli Ml (5 -TCTCGCTACCGTTTACAG-3) (SEQ ID NO: 61) aM2 (5-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3 ) (SEQ ID NO: 62) s mpl cDNA templátom a R1 (5-GGGCCATGACACTGTCAA-3) (SEQ ID NO: 63) aR2 (SOAcrxxiľAcrr^GAcrcrcTCGiGGGTACCTrriccnrrrr-i) (SEQ ID NO: 64) s Rse cDNA templátom. Pvull-Smal časť toho fúzovaného spojenia sa použila na konštrukciu chimerického receptora s úplnou dĺžkou.

f) Bunková transformácia

DP12.CHO bunky (EP 307,247, zverejnený 15. marca 1989) boli elektroporované s pSV.ID.M.tmRdó, ktorý bol linearizovaný na zvláštnej Notl polohe v hlavnom reťazci plazmidu. DNA sa zrážala etanolom po fenol/chloroformovej extrakcii a resuspendovala sa v 20 μΐ 1/10 tris EDTA. Potom sa 10 μg DNA inkubovalo s 10⁷ CHO DP12 buniek v 1 ml PBS na ľade počas 10 minúť pred elektroporáciou pri 400 voltoch a 330 pf. Bunky sa opätovne dali na ľad na 10 minút predtým, ako sa preniesli (naočkovali) do neselektívneho média. Po 24 hodinách sa bunky zásobili médiom bez nukleozidu na selekciu stabilných DHFR+ klonov.

g) Selekcia transformovaných buniek na použitie v KIRA ELISA

Expresné klony Ať/’L/RSE.gD boli identifikované západným pijakovaním celých post-frakcionačných bunkových lyzátov prostredníctvom SDS-PAGE, používajúc 5B6 protilátku, ktorá deteguje gD lalôčik epitopu.

h) Médium

Bunky rástli v F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Médium bolo doplnené s 10% diafiltrovaným FBS (HyClone, Logan, Utah), 25mM HEPES a 2mM L-glutaminu.

i) KIRA ELISA

4/p/-Rse.gD transformované DP12.CHO bunky sa očkovali (3xl0⁴ na jamku) do jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky v 100 μΐ média a kultivovali sa cez noc pri 37 °C v 5% CO₂. Nasledujúce ráno sa supematanty dekantovali a doštičky sa zľahka pritlačili na papierovú utierku. 50 μΐ média, obsahujúceho buď experimentálne vzorky alebo 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 alebo 0 ng/ml mpl ligandu sa potom pridalo do každej jamky. Bunky sa stimulovali pri 37 °C počas 30 minút, supematanty sa dekantovali a doštičky sa ešte raz zľahka pritlačili na papiero vú utierku. Na lýzu buniek a solubilizáciu chimerických receptorov sa pridalo do každej jamky 100 μΐ lýzovaného tlmivého roztoku. Tlmivý roztok lýzovania zahrnoval 150 mM NaCl, obsahujúceho 50 mM HEPES (Gibco), 0,5 % Triton-X 100 (Gibco), 0,01 % tiomersalu, 30 KlU/ml aprotinínu (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(2aminoetylj-benzénsulfonylhydro-chloridu (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 μΜ leupeptínu (ICN Biochemicals) a 2 mM ortovanadičňanu sodného (Na₃VO₄; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. Doštička sa potom jemne prctrepala na doštičkovej trepačke (Bellco Instruments, Vineland, NJ) počas 60 minút pri teplote miestnosti.

Zatiaľ čo sa bunky solubilizovali, ELISA mikrotitračná platňa (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) pokrytá cez noc pri 4 °C s 5B6 monoklonálnou anti-gD protilátkou (5,0 pg/ml v 50 mM uhličitého tlmivého roztoku, pH 9,6, 100 μΐ/jamka) sa dekantovala, pritlačila na papierovú utierku a blokovala so 150 μΐ/jamka „Block“ tlmivého roztoku [PBS obsahujúci 0,5 % BSA (Intergen Company, Purchase, NY) a 0,01 % tiomersalu] počas 60 minút pri teplote miestnosti s miernym pretrepávaním. Po 60 minútach sa platňa, pokrytá anti-gD 5B6 premyla 6-krát tlmivým roztokom (PBS obsahujúci 0,05 % Tween-20 a 0,01 % tiomersalu) s využitím automatickej premývačky platničiek (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc, Šterling, VA). Lyzát, obsahujúci solubilizované MPL/Rse.gD z bunkovej kultúry mikrotitračnej jamky sa transferoval (85 μΐ/jamka) do jamiek potiahnutých anti-gD 5B6 a blokovaných ELISA a inkuboval sa 2 hodiny pri izbovej teplote za mierneho pretrepávania. Nenaviazaná mpZ-Rse.gD sa odstránila premývaním s prepieracím tlmivým roztokom a 100 μΐ biotinylovaného 4G10 (anti-fosfotyrozín), zriedeného 1:18000 zrieďovacím tlmivývm roztokom (PBS obsahujúci 0,5 % BSA, 0,05 % Tween-20, 5 mM EDTA a 0,01 % tiomersalu), t.zn. 56 ng/ml sa pridalo do každej jamky. Po dvojhodinovej inkubácii pri izbovej teplote sa doštička premyla a 100 μΐ chrenová peroxidáza (HRPO)-konjugovaný streptavidín (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA), zriedené 1 : 60000 zrieďovacím tlmivývm roztokom, sa pridalo do každej jamky. Doštička sa inkubovala 30 minút pri teplote miestnosti za mierneho pretrepávania. Konjugát bez avidínu sa odstránil premytím a 100 μΐ čerstvo pripraveného roztoku substrátu (tetrametylbenzidín [TMB]; dvojzložkový „kit“ substrát; Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) sa pridalo do každej jamky. Reakcia sa nechala pôsobiť 10 minút, po ktorých sa vývoj farby zastavil pridaním 100 μΐ/jamka l,0M H3PO4. Absorbancia pri 450 nm sa odčítala pri referenčnej vlnovej dĺžke 650 nm (ABS_45O/65o), s použitím vmax snímača (čítača) (Molecular Devices, Palo Alto, CA), riadenej s Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) a DeltaSoft software (BioMetallics, Inc, Princeton, NJ).

Kalibračná krivka bola zostrojená stimuláciou dpl2.trkA,B alebo C.gD buniek s 200, 50, 12,5,3,12,0,78, 0,19, 0,048 alebo 0 ng/ml mpl ligandu a znázornená ako ng/ml TPO voči hodnote ABS₄₅o/₆5o ± sd, s použitím DeltaSoft programu. Koncentrácie vzorky sa ziskali interpoláciou ich absorbancie s kalibračnou krivkou a sú vyjadrené v ng/ml TPO aktivity.

Bol nájdený mpl ligand schopný aktivovať mpLRse.gD chimerický receptor v závislosti od koncentrácie a špecifického druhu ligandu. Ďalej bol nájdený mp/-Rse.gD KIRAELISA, odolný až do 100 % humánneho séra (znázornené) alebo 100 % plazmy (neznázomené), umožňujúci použitie pokusu na skrínovanie pacienta a pK vzoriek.

SK 282265 Β6

Krivka TPO₃₃₂ štandardu produkovaného v 293 bunkách

Prehľad TPOEC50

TPO forma (bunky)	EC50 (hmôt./objem)	EC50 (molarita)
Hu TPO 332 (293)	2,56 ng/ml	67,4 pM
Mu TPO 332(293)	3,69 ng/ml	97,1 pM
Hu TPO 153 (293)	~41 ng/ml	-1,08 nM
Hu TPO 155 (E. coli)	0,44 ng/ml	ll,6pM
Hu TPO 153met (E. coli)	0,829 ng/ml	21,8 pM

Príklad 18

Trombopoetínový (TPO) receptor na báze ELISA

ELISA doštičky sa pokryli králičím F(ab)₂ anti-humánnym IgG (Fc) v uhličitanovom tlmivom roztoku s pH 9,6 pri 4 °C, cez noc. Doštičky sa blokovali s 0,5 % bovinným sérum albumínom v PBS, pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Fermentačná úroda, obsahujúca chimerický receptor, wp/-IgG, sa pridala do doštičiek a inkubovala sa 2 hodiny. Dvojité zriedenie (0,39-25 ng/ml) štandardu (TPO₃₃₂ produkované v 293 bunkách s koncentráciou stanovenou kvantitatívnou analýzou aminokyselín) a následne zriedené vzorky v 0,5% bovinom sérum albumíne, 0,05% Tween 20 sa pridali do doštičiek a inkubovali 2 hodiny. Naviazaný TPO sa detegoval s proteínom A, purifikovanými biotinylovanými králičími protilátkami TPO155, ktoré boli produkované v E. coli (jednohodinová inkubácia), nasledujúc streptavidín-peroxidázou (30-minútová inkubácia) a 3,3,5,5 -tetrametylbenzidínom ako substrátom. Absorbancia sa odčítala pri 450 nm. Doštičky sa medzi stupňami premyli. Kvôli analýze údajov sa zostaví kalibračná krivka s využitím štvor-parametrovej krivky zostavenej programom „Kaleidagraph“. Koncentrácie vzoriek sa vypočítali z kalibračnej krivky.

Príklad 19

Expresia a purifikácia TPO z 293 buniek L Príprava expresných vektorov 293 buniek cDNA, zodpovedajúca celému otvorenému čítaciemu rámčeku TPO sa získala cestou PCR s využitím nasledujúcich oligonukleotidov ako primérov:

Tabuľka 11

293 primérov PCR

CkFLF^ATCGATATCGATCAGOCAGACAOCCOGGCTAGr	(SBQIDNO: 65)
hmpiMtSGCTAGCICTAjACAGGGAAGGGAGCIGTACATG	SEQIDNO:
AGA3'	48)

PRK5-hmpZ I (opísaný v príklade 9) sa použil ako templát pre reakciu v prítomnosti pfii DNA polymerázy (Stratagene). Začiatočná denaturácia bola počas 7 minút pri 94 °C, nasledovaná 25 cyklami amplifikácie (1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 1 minúta pri 72 °C). Konečné predĺženie bolo počas 15 minút pri 72 °C). PCR produkt sa purifikoval a klonoval medzi reštrikčné polohy Clal a Xbal plazmidu pRK5tkneo, pRK5 odvodený vektor bol modifikovaný na expresiu génu, rezistentného na neomycín, za regulovania tymidín kinázy, za získania vektora pRK5tkneo.ORF. Druhá konštrukcia, zodpovedajúca epo homologickej doméne, bola generovaná rovnakým spôsobom, ale s použitím Cla.FL.F ako „forward“ priméru a nasledujúcim reverzným (spätným) primárom:

AigSrOPJ<ba:5TCTAGAirrAGATCACCTGACGCAGAGGGTGGACC3 (SEQ ID NO: 66)

Konečná konštrukcia sa nazýva pRK5-tkneoEPO-D. Sekvencia obidvoch konštruktov bola overená ako je opísané v príklade 7.

2. Transfekcia humánnych embryonálnych obličkových buniek

Tieto dva konštrukty sa transfekovali do humánnych embryonálnych obličkových buniek metódou CaPO₄, ako je opísaná v príklade 9. 24 hodín po transfekcii sa začala selekcia klonov rezistentných na neomycín v prítomnosti 0,4 mg/ml G418. 10 až 15 dní neskôr sa individuálne kolónie transferovali do 96-jamkovej platne a nechali sa súbežne rásť. Expresia ML₁₅₃ alebo ML₃₃₂ v upravenom médiu z týchto klonov sa stanovila použitím Ba/F3-mpZ proliferačného testu (opísaný v príklade 1).

3. Purifikácia rhML₃₃₂

293-rhML₃₃₂ upravené médium sa aplikovalo na BlueSepharose (Pharmacia) kolónu, ktorá bola ekvilibrovaná v lOmM fosforečnane sodnom s pH 7,4 (tlmivý roztok A). Kolóna sa dodatočne premyla s 10 objemami (vztiahnuté na kolónu) tlmivého roztoku A aj tlmivého roztoku A, obsahujúceho 2 M močoviny. Kolóna sa potom eluovala s tlmivým roztokom A, obsahujúcim 2 M močoviny a 1 M NaCl. Eluačný kúpeľ Blue-Sepharosy sa potom priamo aplikoval na WGA-Sepharosovú kolónu, ekvilibrovanú tlmivým roztokom A. WGA-Sepharosová kolóna sa potom premyla s 10 kolónovými objemami tlmivého roztoku A, obsahujúceho 2 M močoviny a 1 M NaCl a eluovala rovnakým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,5 M N-acetyl-D-glukózamínu. WGA-Sepharosový eluát sa aplikoval na C4-HPLC stĺpec (Synchrom, Inc.), ekvilibrovaný v 0,1 % TFA. C4-HPLC kolóna sa eluovala diskontinuálnym gradientom propanolu (0- 25 %, 25-35 %, 35-70 %). rhML₃₃₂ sa vybrala na eluovanie v 28-30% propanolovej oblasti gradientu. Prostredníctvom SDS-PAGE purifikovaný rhML₃₃₂ migruje ako široký pás v 68-80 kDa oblasti gélu (pozri obrázok 15).

4. Purifikácia rhML|₅₃

293-rhML₎₅₃ upravené médium sa rozložilo na BlueSepharose ako je opísané pri rhML₃₃₂. Blue-Sepharose eluát sa priamo aplikoval na mp/-afinitnú kolónu, ako je užopísané. RhML₁₅₃ eluovaný z mp/-aflnitnej kolóny sa purifikoval na homogénnosť s použitím C4-HPLC kolóny a s priebehom za rovnakých podmienok, ako je opísané pre rhML₃₃₂. SDS-PAGE purifikovaný rhML_1J3 sa rozloží na dva väčšie a dva menšie pásy s Mr ~ 18,000 - 21,000 (pozri obrázok 15).

Príklad 20

Expresia a purifikácia TPO z CHO

1. Opis CHO expresných vektorov

Expresné vektory, použité v elektroporačných opísaných protokoloch, boli označené:

pSVI5.ID.LL.MLORF (plná dĺžka alebo hTPO₃₃₂) a pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrátený alebo hTPO₁₅₃).

Znaky, týkajúce sa týchto plazmidov, sú prezentované na obr.23a24.

2. Príprava expresných vektorov cDNA, zodpovedajúca celému otvorenému čítaciemu rámčeku TPO sa získala cestou PCR s využitím oligonukleotidových primérov z tabuľky 12.

Tabuľka 12

PCR priméry CHO expresného vektora

ChFIJ2SATCGATATCGATAGCCAGACAOOCa3G<XAG3	(SEQIDNQ 47)
ORESalSAGrCGACGrOjACGrOGGCAGTOrCIGAGAACC?	(SEQIDNO: 51)

PRK5-hmp/1 (opísaný v príklade 7 a 9) sa použil ako templát na reakciu v prítomnosti pfu DNA polymerázy (Stratagene). Začiatočná denaturácia bola počas 7 minút pri 94 °C, nasledovaná 25 cyklami amplifikácie (1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 1 minúta pri 72 °C). Konečné predĺženie bolo počas 15 minút pri 72 °C). PCR produkt sa puriíikoval a klonoval medzi reštrikčné polohy Clal a Sali plazmidu pSVI5.ID.LL, za získania vektora pSVI5.ID.LL.MLORF. Druhá konštrukcia, zodpovedajúca epo homologickej doméne, bola generovaná rovnakým spôsobom, ale s použitím Cla.FL.F2 ako „forward“ priméru a nasledujúcim reverzným (spätným) primérom:

EPOD.Sal5 AGTOGACGTCGACICACCTGACGCAGAGGGTGGACC3 (SBQDNQ68)

Konečná konštrukcia sa nazýva pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Sekvencia obidvoch konštruktov bola overená ako je opísané v príklade 7 a 9.

V podstate, kódujúce sekvencie úplného a skráteného ligandu boli zavedené do viacnásobného klonovacieho miesta CHO expresného vektora pSVI5.ID.LL. Tento vektor obsahuje SV40 oblasť skorého promótora/zosilňovača, modifikovanú spojenú jednotku, obsahujúcu myšiu DHFR cDNA, viacnásobné klonovacie miesto na zavedenie génu záujmu (v tomto prípade opísané TPO sekvencie) SV40 signálu polyadenylácie a pôvodu replikácie a betalaktamázový gén selekcie plazmidu a amplifikácie v baktérii.

3. Metodológia na zavedenie stabilných CHO bunkových línií expresie rekombinantného TPO₃₃₂ a TPO₁₅₃

a) Opis rodičovskej CHO bunkovej línie

Hostiteľská CHO (vaječník čínskeho škrečka) bunková línia, použitá na expresiu tu opísaných TPO molekúl, je známa ako CHO-DP12 (pozri EP 307,247, publikovaný 15.marca 1989). Táto cicavčia bunková línia bola klonovane selektovaná z transfekovanej rodičovskej línie (CHO-K1 DUX-Bll(DHFR-)-, získanej od Dr. Franka Lee zo Stanford University s dovolením Dr. L. Chasina) s vektorom expresie preproinzulínu na získanie klonov s redukovanými inzulínovými požiadavkami. Tieto bunky sú tiež DHFR mínus a klony môžu byť selektované na prítomnosť DHFR cDNA sekvencie vektora rastom na médiu, zbavenom nuklcozidových doplnkov (glycín, hypoxantín a tymidín). Tento selekčný systém pre stabilnú expresiu CHO bunkových línií sa komerčne používa.

b) Spôsob transfekcie (elektroporácia)

TPO₃₃₂ a TPOj₅₃ exprimované bunkové línie boli vytvorené transfekciou DP12 buniek elektroporáciou (pozri napr. Andreason, G.L., J. Tiss. Cult. Meth., 15,56 [1993]) s linearizovaným plazmidom pSVI5.ID.LL.MLORF alebo pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Tri (3) zmesi reštrikčnej enzýmovej reakcie sa pripravili pre každé strihanie plazmidu; 10 pg, 25pg a 50 pg vektora s NÔTI enzýmom metódami štandardnej molekulovej biológie. Toto reštrikčné miesto je len jedenkrát nájdené vo vektore v linearizovanej 3 oblasti a mimo jednotiek transkripcie TPO ligandu (pozri obr. 23). lOOpl reakcie sa nechali inkubovať cez noc pri 37 °C. Nasledujúci deň sa zmesi jedenkrát extrahovali fenolchloroform-izoamylalkoholom (50:49:1) a zrážali etanolom na suchom ľade asi jednu hodinu. Precipitát sa oddelil 15minútovou mikrocentriíúgáciou a vysušil sa. Linearizovaná DNA sa resuspendovala v 50 pl Hamsovho DMEM-F12 1 : 1 média, doplneného štandardnými antibiotikami a 2 mM glutamínu.

Suspenzia rastúcich DP12 buniek sa oddelila, premyla jedenkrát médiom, opísaným pri resuspendovaní DNA a nakoniec sa resuspendovala v tom istom médiu s koncentráciou 10⁷ buniek na 750 pl. Rovnaké diely buniek (750 pl) a každej z linearizovaných DNA sa spolu inkubovali pri teplote miestnosti jednu hodinu a potom sa preniesli do BRL elektroporačnej komôrky. Každá reakčná zmes sa potom elektroporovala v štandardnom BRL elektroporačnom prístroji pri 350 voltoch 330 pF a nízkej kapacitancii. Po elektroporácii sa bunky nechali v prístroji 5 minút ustáť a potom na ľade pre ďalšiu 10-minútovú inkubačnú dobu. Elektroporované bunky sa preniesli do 60mm nádobiek na kultiváciu buniek, obsahujúcej 5 ml štandardu, kompletné rastové médium pre CHO bunky (High glukóza DMEMF12 50:50 bez glycínového doplnku s IX GHT, 2 mM glutamínu a 5 % fetálneho teľacieho séra) a nechali sa rásť cez noc v bunkovom kultivačnom inkubátore s 5 % CO₂.

c) Spôsob selekcie a skríningu

Na nasledujúci deň sa bunky trypsinizovali štandardnými metódami a preniesli do 150mm nádob na kultiváciu tkanív, obsahujúcich DHFR selektívne médium (Hamsovo DMEM-F12, 1 : 1 médium už opísané, doplnené buď 2 % alebo 5 % dialyzovaného fetálneho teľacieho séra, ale zbaveného glycínu, hypoxantínu a tymidínu, je tu použitým štandardným DHFR selekčným médiom). Bunky z každej 60mm nádobky sa následne premiestnili do piatich 150mm nádobiek. Bunky sa potom inkubovali od 10 do 15 dní (s jednou výmenou média) pri 37 °C/5 % CO₂ až do vzniknutia klonov a dosiahnutia ich veľkosti, dovoľujúcej ich prenos do 96-jamkovej mikrotitračnej platne. O štyri až päť dní sa bunkové línie preniesli do 96-jamkovej platne s použitím sterilných žltých špičiek mikropipetovacej súpravy na 50 ml. Bunky sa nechali súbežne rásť (zvyčajne 3 až 5 dní) a potom sa podložky trypsinizovali a replikovali sa dve kópie originálnej podložky. Dve z týchto kópií sa na krátky čas uložili do mrazničky s bunkami, v každej jamke zriedenými 50 pl 10 % FCS v DMSO. Vzorky 5 dní upravovaného média bez séra sa testovali zo súbežných jamiek v tretej podložke na TPO expresiu testom Ba/F základnej bunkovej aktivity. Najvyššie exprimované klony na základe tohoto testu sa oživili zo zásob a uložili do 2 súbežných 150mm T50 baniek na prenos skupiny kultúry buniek na adaptáciu suspenzie, opätovný test a skladovanie.

d) Amplifikačný protokol

Niektoré z bunkových línií s najvyšším titrom zo selekcie, už opísanej, sa následne vystavili štandardnému metotrexátovému amplifikačnému režimu na generovanie klonov s vyšším titrom. CHO bunkové klony sa rozmnožili a naočkovali do lOcm misiek pri 4 koncentráciách metotrexátu (t.zn. 50 nM, 100 nM, 200 nM a 400 nM) a dvoch alebo troch počtoch buniek (105, 5x105 a 106 buniek na misku). Tieto kultúry sa potom inkubovali pri 37 stupňoch/5 % CO₂ až kým sa klony vyvinuli a boli schopné prenesenia do 96jamkovej mikrotitračnej doštičky na ďalší test. Niekoľko klonov s vysokým titrom z tejto selekcie sa opäť vystavili účinkom vyšších koncentrácií metotrexátu (t.zn. 600 nM, 800 nM, 1000 nM a 1200 nM) a, ako predtým, rezistentné klony sa nechali narásť a potom sa preniesli do 96jamkových mikrotitračných doštičiek a testovali sa.

4. Kultivácia stabilných CI1O bunkových línií expresného rekombinantného TPO₃₃₂ aTPOi₃₃

Uskladnené bunky sa rozmrazili a populácia buniek sa rozmnožila štandardnými metódami rastu buniek a to buď v médiu bez séra alebo s obsahom séra. Po rozmnožení na dostatočnú hustotu buniek sa bunky premyli, aby sa odstránili zvyšky kultivačného média. Bunky sa potom kultivovali akoukoľvek štandardnou metódou, zahrnujúcou: vsádzku, dopĺňanie alebo kontinuálne dávkovanie kultúry pri 25-40 °C, neutrálne pH, s odstránením obsahu O₂ aspoň na 5 %, až do podstatného zhromaždenia vylúčeného TPO. Tekutina bunkovej kultúry sa potom oddelila od buniek mechanickými prostriedkami, ako je napríklad centrifugácia.

5. Purifikácia rekombinantného humánneho TPO z tekutín CHO kultúr

Pozberaná tekutá kultúra buniek (HCCF) sa priamo aplikuje na Blue Sepharose 6 Fast Flow kolónu (Pharmacia) ekvilibrovanú v 0,01M Na fosforečnane, pH 7,4, 0,15M NaCl pri pomere približne 1001 HCCF na liter živice a pri lineárnom prietoku približne 300 ml/h/cm². Stĺpec sa potom premyl s troj- až päťnásobnými objemami rovnovážneho tlmivého roztoku, za čím nasledovala premytie troj- až päťnásobnými objemami (vo vzťahu k objemu stĺpca) 0,01M Na fosforečnanu s pH 7,4, 2,0M močoviny. TPO sa potom eluoval s troj- až päťnásobným stĺpcovými objemami 0.01M Na fosforečnanu s pH 7,4,2,0M močoviny, 1,0M NaCl.

Blue Sepharose Pool, obsahujúca TPO, sa potom aplikovala na Wheat Germ Lecitin Sepharose 6MB kolónu (Pharmacia), vyváženú v 0,01M Na fosforečnane s pH 7,4, 2,0M močovine a l,0M NaCl pri pomere od 8 do 16 ml Blue Sepharose Pool na ml živice a pri prietoku približne 50 ml/h/cm². Stĺpec sa potom premyl s dvoj- až trojnásobnými stĺpcovými objemami vyváženého tlmivého roztoku. TPO sa potom eluoval s dvoj- až päťnásobnými stĺpcovými objemami 0,01M Na fosforečnanu s pH 7,4, 2,0M močoviny, 0,5M N-acetylglukozamínu.

Wheat Germ Lecitin Pool sa potom upravil na konečnú koncentráciu 0,04% C₁₂E_g a 0,1% kyselinou trifluóroctovou (TFA). Výsledný fond (množstvo) sa aplikoval na kolónu s C4 reverznou fázou (Vydac 214TP1022), vyváženú v 0.1% TFA, 0,04% C₁₂E₈ a pri záťaži približne 0,2 až 0,5 mg proteínu na ml živice pri prietoku 157 ml/h/cm².

Proteín sa eluoval dvojfázovým lineárnym gradientom acetonitrilu, obsahujúcim 0.1% TFA, 0.04% C_I2E₈. Prvá fáza je tvorená lineárnym gradientom od 0 do 30% acetonitrilu počas 15 minút, druhá fáza je tvorená lineárnym gradientom od 30 do 60% acetonitrilu počas 60 minút. TPO sa eluuje pri približne 50% acetonitrilu. Fond (banka) sa urobil na báze SDS-PAGE.

C4 banka sa potom zriedila s dvoma objemami 0,0IM Na fosforečnane s pH 7,4, 0,15M NaCl a diafiltrovala oproti približne 6 objemom 0,0IM Na fosforečnanu s pH 7,4, 0,15M NaCl na Amicon YM alebo podobnej ultrafiltračnej membráne, majúcej odstrihnutú molekulovú hmotnosť 10,000 až 30,000 Daltonov. Výsledný diafiltrát sa môže priamo spracovať alebo sa ďalej zahustí ultrafiltráciou. Diafiltrát/koncentrát sa upraví na konečnú koncentráciu pomocou 0,01% Tween-80.

Celé množstvo alebo časť diafiltrátu/koncentrátu, ekvivalentná 2 až 5 % vypočítaného objemu kolóny, sa potom aplikovala na Sephaciyl S-300 HR kolónu (Pharmacia), ekvilibrovanú v 0,01M Na fosforečnane s pH 7,4,0,15M NaCl, 0,01% Tween-80 a chromatografovala pri prietoku približne 17 ml/h/cm². Frakcie obsahujúce TPO bez agregátu a produktov proteolytickej degradácie sa spojili na báze SDS-PAGE. Výsledná banka (fond) sa prefiltrovala 0,22 μ filtrom, Millex-GV alebo podobným, a uskladnila pri 2-8 °C.

Príklad 21

Transformácia a indukcia syntézy TPO proteínu v E. coli

1. Konštrukcia E. coli TPO expresných vektorov

Plazmidy pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 a pMP202 sú všetky zostrojené na expresiu prvých 155 aminokyselín TPO po prúde krátkych štruktúrnych génov, ktoré sa menia medzi rôznymi štruktúrami. Štruktúrne gény poskytujú hlavne iniciáciu pre vysokú úroveň translácie a rýchlu purifikáciu. Plazmidy pMP210-l, -T8, -21, -24, -25 sú zostrojené na expresiu prvých 153 aminokyselín TPO v smere iniciačného metionínu a líšia sa len v kodóne použitom pre prvých 6 aminokyselín TPO, zatiaľ čo plazmid pMP251 je odvodený od pMP210-l, v ktorom karboxyterminálny koniec TPO je rozšírený dvoma aminokyselinami. Všetky z uvedených plazmidov budú produkovať vysoké hladiny vnútrobunkovej expresie TPO v E. coli indukciou tryptofánového promótora (Yansura, D.G. et al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidy pMPl a pMP172 sú medziproduktami v konštrukcii uvedených TPO vnútrobunkových expresných plazmidov.

a) Plazmid pMPl

Plazmid pMPl je sekrečným vektorom pre prvých 155 aminokyselín TPO a skonštruoval sa nadviazaním 5 fragmentov DNA, ako je znázornené na obr.33. Prvým z nich bol vektor pPho21, v ktorom bol odstránený krátky MlulBamHI fragment. pPho21 je derivátom phGHl (Chang, C. N. et. al., Gene 55: 189-196 [1987]), v ktorom bol gén humánneho rastového hormónu nahradený phoA génom E. coli a Mlul reštrikčné miesto bolo začlenené do kódujúcej sekvencie pre STU signálnu sekvenciu aminokyselín 20-21. Dva nasledujúce fragmenty, Hinfl-Pstl časť DNA s 258 bázovými pármi z pRK5- hmpl I (príklad 9), kódujúca TPO aminokyseliny 19-103 a nasledujúca syntetická DNA, kódujúca aminokyseliny 1-18

5CCn3TATCCCAGCCOZKľTCXnrr^ TCAGTAAACraCTICGTC ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACFGGAGGClCAajAGT CATITGACGAAGCACTOA-5 (SEQ ID NO: 69) (SEQ D NO: 70)

SK 282265 Β6 boli predligované s T4-DNA ligázou a druhý odstrihnutý s Pstl. Štvrtý bol Pstl-Haelll fragment z pRK5hmpll so 152 bázovými pármi, kódujúci TPO aminokyseliny 104-155. Posledným bol StuI-BamHI fragment z pghlO8 so 412 bázovými pármi, obsahujúci lambdu transkripčného terminátora, ako bolo uvedené predtým (Scholtissek, S. et. al., NAR 15: 3185 [1987]).

b) Plazmid pMP21

Plazmid pMP21 je skonštruovaný na expresiu prvých 155 aminokyselín TPO s pomocou štrukturálnych fragmentov 13 aminokyselín, obsahujúcich časť STU signálnej sekvencie. Skonštruoval sa ligáciou troch (3) DNA fragmentov, ako je znázornené na obr.34, prvý z nich je vektor pVEG31, v ktorom bol odstránený krátky fragment XbalSphl. Vektor pVEG31 je odvodený od pHGH207-l (de Boer, H.A. et. al., in Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L. and Chamberlain, M.J., Ed), 462, Praeger, New York [1982]), v ktorom bol gén humánneho rastového hormónu nahradený génom vaskulámeho endoteliámeho rastového faktora (tento identický fragment vektora sa môže získať z tohto posledného plazmidu).

Druhá časť ligácie bol duplex syntetickej DNA s nasledujúcou sekvenciou:

5-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5 (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Posledným dielom bol Mlul-SpW fragment z pMPl s 1072 bázovými pármi, kódujúci 155 aminokyselín TPO.

(c) Plazmid pMPl 51

Plazmid pMP151 je skonštruovaný na expresiu prvých 155 aminokyselín TPO v smere štrukturálneho fragmentu, obsahujúceho 7 aminokyselín ST11 signálnej sekvencie, 8 histidínov a faktor Xa štiepiaceho miesta. Ako vidieť z obr.35, pMP151 bol vyhotovený ligáciou troch DNA fragmentov, prvým z nich je už predtým opísaný pVEG31 vektor, z ktorého bol odstránený krátky Xbal-Sphl fragment. Druhým bol duplex syntetickej DNA s nasledujúcou sekvenciou:

S-CTAGAAnATOAAAAAGAWATCHľATTICAlCACCATCACCATC’ALĽAlC ACATCGAAGGIGGTAGOC

TrAATACnTnCľrATAGCGrAAAGrAGroGrAGPjGTAGTOGrAGIGTA GCITOCAGCAT-5 (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

Posledný bol Bgll-Spgl fragment z pMPll s 1064 bázovými pármi, kódujúci 154 aminokyselín TPO. Plazmid pMPll je identický s pMPl, s výnimkou pár kodónových zmien v STU signálnej sekvencii (tento fragment sa môže získať z pMPl).

d) Plazmid pMP202

Plazmid pMP202 je veľmi podobný expresnému vektoru pMP151 s výnimkou toho, že faktor xa štiepiaceho miesta v štrukturálnom fragmente bol nahradený trombínovým štiepiacim miestom. Ako vidno z obr.36, pMP202 sa zhotovil nadviazaním troch DNA fragmentov. Prvým z nich bol už skôr opísaný pVEG31, v ktorom bol odstránený krátky Xbal-Sphl fragment. Druhým bol syntetický DNA duplex s nasledujúcou sekvenciou:

5<TAGAA7TATGAA?tAAGAATATCGCATrrcATCACrATCACCATCAOCATC

ACATCGAACCACGTAGCC

TTAATACnTnUrrATAGCGTAAAGTAGTOGTAGTOOTAGTGGrAGI’GT

AGCľIGGIGCAT-5 (SEQ ID NO: 75) (SEQIDNO: 76)

Poslednou časťou bol Bgii-Ópúf fragment z predtým opísaného plazmidu pMPl 1 s 1064 bázovými pármi.

c) Plazmid pMP 172

Plazmid pMP172 je sekrečným vektorom pre prvých 153 aminokyselín TPO a je medziproduktom konštrukcie pMP210. Ako vidno z obr.37, pMPl72 sa pripravil ligáciou troch DNA fragmentov, prvým z ktorých bol vektor pLS321amB, v ktorom bol odstránený malý úsek EcoRI-HindlII. Druhým bol EcoRI-Hgal fragment z predtým opísaného plazmidu pMPll, s 946 bázovými pármi. Poslednou časťou bol syntetický DNA duplex s nasledujúcou sekvencíou:

'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5 (SEQ ID NO: 78)

f) Plazmid pMP210

Plazmid pMP210 je skonštruovaný na expresiu prvých 153 aminokyselín TPO po translačnom iniciačnom metioníne. Tento plazmid bol vlastne urobený ako banka plazmidov, v ktorých bolo prvých 6 kodónov randomizovaných na tretej polohe každého kodónu, a boli skonštruované ako vidno z obr.38 ligáciou troch DNA fragmentov. Prvým z nich bol už predtým opísaný pVEG31 vektor, z ktorého bol odstránený krátky Xbal-Sphl fragment. Druhým bol duplex syntetickej DNA, znázornený nižšie, spracovaný najskôr s DNA polymerázou (Klenow) a potom štiepením s Xbal a Hiníl a kódujúci iniciačný metionín a randomizovaných prvých 6 kodónov TPO.

SGCACTAOT<^AGAATrATGTU<rNGCN0CNaNGCNIOlOACCIO2 GAACACIGGAGGCronCICAGTAAA (SBQIDNQ79) CAAGAGICXTTIGACGAAGCACKAGGGTACAGGAAG-5’ (SEQ IDNQ 80)

Tretím bol Hinfl-SpÄ/ fragment z pMPl72 s 890 bázovými pármi, kódujúci TPO aminokyseliny 19-153.

Plazmidová banka pMP210 s približne 3700 klonmi sa opätovne preniesla na LB plame s tetracyklínom (50 pg/ml) kvôli výberu klonov s vysokou translačnou iniciáciou (Yansura, D.G. et. al., Methods: A Companion to Methods in Ettzymology 4: 151-158 [1992]). Z 8 kolónií, ktoré vyrástli na tetracyklínových platničkách, sa päť s najlepšími podmienkami TPO expresie sa podrobili DNA sekvencii a výsledky sú uvedené na obr.39 (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 a 28).

g) Plazmid pMP41

Plazmid pMP41 je skonštruovaný na expresiu prvých 155 aminokyselín TPO fúzovaného so štrukturálnym fragmentom, pozostávajúcim zo 7 aminokyselín ST11 signálnej sekvencie, nasledovaným faktorom Xa štiepiaceho miesta. Plazmid bo vyhotovený ako, vidno na obr.40, ligáciou troch častí DNA, prvou z ktorých bol už opísaný vektor pVEG31, z ktorého bol odstránený krátky fragment XbalSphl. Druhou bol nasledujúci duplex syntetickej DNA:

5-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATITATCGAAGGTOGTAGCC (SEQIDNO:81) TTAATACrnTTCrTATAGCGTAAATAGCTrOCAGCAT-5 (SEQIDNO: 82)

Poslednou časťou ligácie bol Bgll-Spúf fragment z už opísaného plazmidu pMPl 1 s 1064 bázovými pármi.

SK 282265 Β6

h) Plazmid pMP57

Plazmid pMP57 exprimuje prvých 155 aminokyselín TPO v smere štrukturálneho fragmentu pozostávajúceho z 9 aminokyselín STU signálnej sekvencie a dibázické miesto Lys-Arg. Toto dibázické miesto poskytuje prostriedky na odstránenie štrukturálneho fragmentu s ArgC proteázou. Plazmid bol vyhotovený, ako vidno z obr.41, ligáciou troch častí DNA. Prvou z nich bol už opísaný vektor pVEG31, z ktorého bol odstránený krátky Xbal-Sphl fragment. Druhým bol nasledujúci duplex syntetickej DNA:

5<TAGMTrÄIUAAAAAGMTATO3CAnTCnaTAAAOOTAGO: _____ (SEQ ID NO: 83) TrAATACnTnCrTATAGOGTAAAGAAGAATrTOCAT-5 (SEQIDNO:84)

Poslednou časťou ligácie bol Bgll-SpAZ fragment z už opísaného plazmidu pMPl 1 s 1064 bázovými pármi.

i) Plazmid pMP251

Plazmid pMP251 je odvodený z pMP210-l, v ktorom sú na karboxyterminálovom konci začlenené dve dodatočné aminokyseliny TPO. Ako vidno z obr.42, tento plazmid bol zhotovený súvislou ligáciou dvoch častí DNA, pričom prvou z nich je už opísaný pMP21, z ktorého bol odstránený krátky ÄW-Apal fragment. Druhou časťou ligácie bol JíW-Apal fragment z pMP210-l s 316 bázovými pármi.

2. Transformácia a indukcia E. coli s TPO expresnými vektormi

Uvedené TPO expresné plazmidy sa použili na transformáciu E. coli kmeňa 44C6 (w3110 tonA_A rpoH_u lon_Ä clpP_A galE) s použitím CaCL₂ horúcej šokovej metódy (Mandel, M. et. al., J. Mol. Biol., 53: 159-162 [1970]). Transformované bunky sa rozmnožovali najskôr pri 37 °C na LB médiu, obsahujúcom 50 pg/ml karbenicilínu až do optickej hustoty (600 nm) kultúry dosiahnutej približne 2-3. LB kultúra sa potom zriedila 20x M9 médiom, obsahujúcim 0,49 % casaminových kyselín (w/v) a 50 pg/ml karbenicilínu. Po raste s aeráciou pri 30 °C počas 1 hodiny sa pridala kyselina indol-3-akrylová až do konečnej koncentrácie 50 pg/ml. Kultúra sa potom nechala ďalej rásť pri 30 °C s aeráciou počas ďalších 15 hodín a potom sa bunky pozberali centrifugáciou.

Príklad 22

Produkcia biologicky aktívneho TPO (Met'^! 1-153) v E. coli

Uvedené postupy na produkciu biologicky účinného, opätovne preloženého TPO (met¹ 1-153) môžu byť analogicky aplikované na získanie ďalších variantov TPO, zahrnujúcich N- aC-koncové predĺžené formy (pozri príklad 23).

A. Získanie nerozpustného TPO (Mef¹ 1-153)

Bunky E. coli exprimujúce TPO (Met'¹ 1-153) kódované pMP210-l plazmidom sa fermentujú, ako je uvedené. Typicky, približne 100 g buniek sa resuspendovalo v 1 1 (10 objemov) tlmivého roztoku bunkovej disrupcie (10 mM Tris , 5 mM EDTA, pH 8) s homogenizérom Polytron a bunky sa centrifúgovali pri 5000x g 30 minút. Premytý bunkový sediment sa znova resuspendoval v 1 1 tlmivého roztoku bunkovej disrupcie s homogenizérom Polytron a suspenzia buniek sa preniesla do disruptéra LH Celí Disrupter (LH Inceltech, Inc.) alebo do mikrofluidizéra Microfluidizer (Microfluidics Intemational), podľa výrobných inštrukcií. Suspenzia sa centriíúguje pri 5000g počas 30 minút a resuspenduje a centriíúguje druhýkrát za získania premytého sedimentu krehkých teliesok. Premytý sediment sa ihneď použije alebo sa uskladni pri -70 °C.

B. Solubilizácia a purifíkácia monomémeho TPO (Mef¹ 1-153)

Uvedený sediment sa resuspenduje v 5 hmotnostných objemoch 20mM Tris, pH 8 so 6-8 M guanidinu a 25 mM DDT (ditiotreitol) a mieša sa 1-3 hodiny alebo cez noc, pri 4 °C za spôsobenia solubilizácie TPO proteínu. Vysoké koncentrácie močoviny (6-8M) sú tiež použiteľné, ale vo všobecnosti majú za výsledok nižšie výťažky, pri porovnaní s guanidinom. Po solubilizácii sa roztok centrifiiguje pri 30,000x g počas 30 minút, za vzniku jasného supematantu, obsahujúceho denaturovaný monomérový TPO proteín. Supematant sa potom chromatografúje na Superdex 200 stĺpcovou gélovou filtráciou (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) pri prietoku 2 ml/min a proteín sa eluuje s 20mM Na fosforečnanom, pH 6,0, s 10 mM DTT. Frakcie, obsahujúce monomérový denaturovaný TPO proteín, eluujúci medzi 160 a 200 ml, sa spojili. TPO proteín sa ďalej purifikuje na stĺpci so semi-preparatívnou C4reverznou fázou (2 x 20 cm, VYDAC). Vzorka sa nanesie s rýchlosťou 5 ml/min na kolónu vyváženú v 0,1% TFA (kyselina trifluóroctová) s 30% acetonitrilom. Proteín je eluovaný s lineárnym gradientom acetonitrilu (30-60 % počas 60 minút). Purifikovaný redukovaný proteín eluuje pri približne 50% acetonitrile. Tento materiál sa použije na prekladanie na získanie biologicky účinného TPO variantu.

C. Vytvorenie biologicky účinného TPO (Mef¹1-153)

Približne 20 mg monomémeho, redukovaného a denaturovaného TPO proteínu v 40 ml 0,1% TFA/50% acetonitril sa zriedi v 360 ml tlmivého roztoku, obsahujúceho optimálne nasledujúce reagenty:

mM Tris

0,3 M NaCl mM EDTA % CHAPS detergent % glycerol mM oxidovaného glutationu mM redukovaného glutationu pH upravené na 8

Po zmiešaní sa refoldingový tlmivý roztok mierne mieša pri 4 °C počas 12-48 hodín kvôli získaniu maximálneho refoldingového výťažku správnej disulfidickej formy TPO (pozri nižšie). Roztok sa potom okyslí s TFA na konečnú koncentráciu 0,2 %, prefíltruje cez 0,45 alebo 0,22 mikrónový filter a pridá sa 1/10 objemu acetonitrilu. Roztok sa potom prečerpá priamo na koíónu s C4 reverznou fázou a purifikuje, preskladané TPO (Mef¹ 1-153) sa eluuje s rovnakým gradientovým programom ako bolo uvedené. Preskladaný biologicky účinný TPO sa eluuje pri približne 45% acetonitrile podľa uvedených podmienok. Nevhodné disulfidické verzie TPO sa eluujú skôr. Konečný purifikovaný TPO (Mef¹ 1-153) má čistotu vyššiu ako 95 %, ako sa stanovilo SDS gélmi a analytickou chromatografiou s C4 reverznou fázou. Na živočíšne účely sa C4 purifikovaný materiál dialyzoval vo fyziologicky kompatibilných tlmivých roztokoch. Použili sa izotonické tlmivé roztoky (10 mM Na acetát, pH 5,5, 10 mM Na sukcinát, pH 5,5 alebo 10 mM Na fosfát, pH 7,4), obsahujúce 150 mM NaCl a 0,01% Tween 80.

Vzhľadom na vysokú účinnosť TPO v Ba/F3 teste (polovica maximálnej stimulácie je dosiahnutá pri približne 3 pg/ml) je možné získať biologicky účinný materiál využitím viacerých rozličných tlmivých roztokov, detergent ných a redoxných podmienok. Avšak pri viacerých podmienkach sa získa len malé množstvo (<10 %) skladaného materiálu. Na komerčné výrobné postupy je žiaduce dosiahnuť refoldingové výťažky aspoň 10%, výhodnejšie 30-50% a najvýhodnejšie >50 %. Boli nájdené viaceré rôzne detergenty (Triton X-100, dodecyl-beta-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozyl, Tween 20 a Tween 80, Zwittergent 3-14 a ďalšie), účinné na dosiahnutie vysokých refoldingových výťažkov. Z týchto detergentov bola zistená len rodina CHAPS (CHAPS a CHAPSO) ako všeobecne použiteľná v refoldingovej reakcii na obmedzenie proteínovej agregácie a nevhodných disulfidových formácií. Hladiny CHAPS vyššie ako 1 % boli užitočnejšie. Kvôli najlepším výťažkom sa požadoval chlorid sodný, s optimálnymi hodnotami medzi 0,1 M a 0,5 M. Prítomnosť EDTA (1-5 mM) limitovala množstvo kovom katalyzovanej oxidácie (a agregácie), ktorá bola pozorovaná pri niektorých prípravách. Koncentrácie glycerolu, vyššie ako 15 %, vytvárajú optimálne refoldingové podmienky. Kvôli maximálnemu výťažku bolo podstatné mať obidva glutationy, oxidovaný aj redukovaný, alebo obidva cysteíny, oxidovaný aj redukovaný, ako redoxný reagentný pár. Vo všeobecnosti sa pozorovali vyššie výťažky, keď molový pomer oxidovaného reagentu je rovnaký alebo vyšší ako redukovaného reagenčného člena redoxného páru. pH hodnoty medzi 7,5 a približne 9 boli optimálne na refolding týchto TPO variantov. Organické rozpúšťadlá (napr. etanol, acetonitril, metanol) boli tolerované pri koncentráciách 10-15 % alebo nižších. Vyššie hladiny organických rozpúšťadiel zvýšili množstvo nevhodne poskladaných foriem. Tris a fosfátové tlmivé roztoky boli vo všeobecnosti použiteľné. Inkubácia pri 4 °C tiež produkovala vyššie hladiny vhodne poskladaného TPO.

Refoldingové výťažky 40-60 % (na báze množstva redukovaného a denaturovaného TPO, použitého v refoldingovej reakcii) sú typické pri prípravách TPO, ktoré sa majú purifikovať prvým C4 krokom. Účinný materiál sa môže získať keď sú menej čisté prípravy (napr. priamo po Superdex 200 kolóne alebo po iniciálnej extrakcii krehkých teliesok), hoci výťažky sú nižšie ako pri intenzívnej precipitácii a interferencii ne-TPO proteínov počas TPO refoldingového procesu.

Keďže TPO (Met’¹1-153) obsahuje 4 cysteínové zvyšky, je možné generovať tri rozličné disulfidové verzie tohoto proteínu:

verzia 1: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1 -4 a 2-3 verzia 2: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-2 a 3-4 verzia 3: disulfidy medzi cysteínovými zvyškami 1-3 a 2-4.

Počas začiatočného skúmania v určujúcich refoldingových podmienkach boli niektoré rozdielne piky, obsahujúce TPO proteín, oddelené C4 reverznou fázovou chromatografiou. Len jeden z týchto pikov mal signifikantnú biologickú účinnosť, ako bola stanovená využitím Ba/F3 testu. Následne sa refoldingové podmienky optimalizovali na získanie prednostne tej verzie. V týchto podmienkach sú nesprávne poskladané verzie nižšie ako 10-20 % získaného celkového TPO monoméru.

Disulfidický charakter biologicky účinného TPO bol stanovený ako 1-4 a 2-3 hmotnostným spektrometrom a proteínovým sekvenovaním (t.zn. verzia 1). Rovnaké diely rozmanitých C4-rozložených píkov (5-10 nmolov) sa štiepili s trypsínom (molový pomer trypsínu k proteínu 1 : 25). Štiepená zmes sa analyzovala laserovou desorpčnou hmotnostnou spektrometriou pomocou matrice pred a po redukcii s DTT. Po redukcii sa detegovali hmotnosti, zodpovedajúce väčšine rozsiahlejších tryptických TPO peptidov. V neredukovaných vzorkách, niektoré z týchto hmotností chýbali a zistili sa nové hmotnosti. Hmotnosť nových píkov zodpovedá v zásade sume individuálnych tryptických peptidov, obsiahnutých v disulfidickom páre. Preto bolo možné jednoznačne určiť disulfidický charakter preskladaného, rekombinantného, biologicky aktívneho TPO ako 1-4 a 2-3. Tento je zlúčiteľný so známym disulfidickým charakterom súvisiacej molekuly erytropoetínu.

D. Biologická aktivita rekombinantného, preskladaného TPO (met 1-153)

Preskladaný a purifikovaný TPO (Met’¹ 1-153) je účinný v obidvoch testoch - in vitro aj in vivo. V Ba/F3 teste sa dosiahla polovica maximálnej stimulácie začlenenia tymidínu do Ba/F3 buniek pri 3,3 pg/ml (0,3 pM). V mpl ELISA na báze receptoru sa polovica maximálnej účinnosti vyskytla pri 1,9 ng/ml (120 pM). V normálnych a myelosupresívnych živočíchoch, vytvorených takmer smrteľnou X-radiáciou, TPO (Met⁴ 1-153) bol vysoko potentný (účinnosť bola videná pri dávkach nižších ako 30 ng/myš) na stimuláciu produkcie nových krvných doštičiek.

Príklad 23

Produkcia ďalších biologicky účinných TPO variantov v E. coli

Tri rôzne TPO varianty, produkované v E. coli, purifikované a preskladané na biologicky aktívne formy, sú uvedené.

1. MLF -13 rezíduá z bakteriálnej odvodenej ST11 signálnej sekvencie sú spojené N-terminálovou doménou TPO (rezíduá - zvyšky 1-155). Výsledná sekvencia je

MKKN1AFLĽNAYASPAPPAC....CVRRA (SEQ ID NO: 85), pričom sekvencia štrukturálneho fragmentu je podčiarknutá a C......C reprezentuje Cys⁷ po Cys¹⁵¹. Tento variant bol skonštruovaný na získanie tyrozínu na rádio-iodizovanie TPO pre receptor a biologické štúdie.

2. H8MLF - 7 rezíduá z ST11 sekvencie, 8 histidínových zvyškov a faktor Xa enzymatického štiepenia sekvencie IEGR sa spojili do N-koncovej domény (zvyšky 1-155) TPO. Sekvencia je

MKKNIAFHHHHHHI MEGRSPAPPAC..CVRRA (SEQ ID NO: 86), pričom sekvencia štrukturálneho fragmentu je podčiarknutá a C......C predstavuje Cys⁷ až Cys¹⁵'.Tento variant, keď sa purifikuje a preskladáva, môže byť spracovaný enzýmovým faktorom Xa, ktorý bude štiepiť po arginínovom zvyšku vytvárania IEGR sekvencie TPO variant 155 zvyškov v dĺžke s prírodnou serinovou N-koncovou aminokyselinou.

3. T-H8MLF - sa pripraví ako je opísané pri variante (2), okrem toho, že trombín senzitívna sequencia IEPR sa spojí s N-koncovou doménou TPO. Výsledná sekvencia je

MKKNIAI'HH1IHHHHHIEPRSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 87), pričom sekvencia štrukturálneho fragmentu je podčiarknutá a C......C predstavuje Cys⁷ až Cys¹⁵¹. Tento variant, po purifikácii a refoldingu, môže byť spracovaný trombínovým enzýmom na vytvorenie prírodného N-koncového variantu TPO s dĺžkou 155 zvyškov.

A. Izolácia, solubilizácia a purifikácia monomémych, biologicky účinných TPO variantov (1), (2) a (3)

Všetky z týchto variantov boli exprimované v E. coli. Väčšina variantov bola nájdená vo forme krehkých teliesok, ako vidieť na obr.22 pri TPO (Met⁴ 1-153). Uskutočnili sa identické postupy izolácie, solubilizácie a purifikácie monomémych TPO variantov, ako je opísané v príklade 22. Použili sa identické refoldingové podmienky, ako pre TPO (Met⁴ 1-153), s výťažkami prevyšujúcimi 30-50 %. Po refoldingu sa TPO varianty purifikovali C4 reverznou fázovou chromatografiou v 0.1% TFA, využijúc acetonitrilový gradient ako už bolo opísané. Všetky z TPO variantov (v ich neproteolyzovaných formách) mali biologický účinok, ako sa preukázalo Ba/F3 testom, s polovicou maximálnej účinnosti 2-5 pM.

B. Proteolytické postupy variantov (2) a (3) na generovanie N-koncového TPO (1-155)

TPO varianty (2) a (3), už uvedené, sa skonštruovali s enzymaticky štiepiteľným peptidovým štrukturálnym fragmentom pred normálnym N-koncovým aminokyselinovým zvyškom TPO. Po refoldingu a purifikácii variantov (2) a (3), ako je opísané, sa každý podrobil štiepeniu s príslušným enzýmom. Pre každý variant sa z kroku C4 reverznej fázy odstránil acetonitril vháňaním mierneho prúdu dusíka do roztoku. Potom sa dva varianty spracovali buď s faktorom Xa alebo s trombínom, ako je opísané vyššie.

Pre TPO variant (2) sa k roztoku, zbavenému acetonitrilu, pridal IM Tris tlmivý roztok, pH 8, do hodnoty konečnej koncentrácie 50 mM a pH sa upravilo, ak to bolo nevyhnutné, na hodnotu 8. NaCl a CaCl₂ sa pridali do 0.1 M resp. 2 mM. Faktor Xa (New England Biolabs) sa pridal na dosiahnutie molového pomeru približne 1:25 až 1:100 enzým:variant. Vzorka sa inkubovala pri teplote miestnosti počas 1-2 hodín, na dosiahnutie maximálneho štiepenia, ako sa preukázalo zmenou v migrácii na SDS géloch predstavujúcou stratu vedúcej sekvencie. Potom sa reakčná zmes purifikovala C4 reverznou fázovou chromatografiou, s použitím rovnakého gradientu a podmienok ako je opísané, pri purifikácii vhodne poskladaných variantov. Neštiepený variant B sa oddelil od rozštiepeného variantu (2) pri týchto podmienkach. N-koncové aminokyseliny sa prejavili ako SPAPP, indikujúc, že odstránenie N-koncovej vedúcej sekvencie bolo úspešné. Faktor Xa tiež vytváral rozličné množstvá interných štiepení TPO domény; štiepenie bolo pozorované po arginínovom zvyšku na polohe číslo 118 vytvárajúc dodatočnú N-koncovú sekvenciu TTAHKDP.(SEQ ID NO: 88). Na neredukujúcich SDS géloch bol pozorovaný jeden pás s približne 17000 daltonmi, pre faktorom Xa Štiepený variant; na redukujúcich géloch boli viditeľné dva pásy molekulovej hmotnosti s približne 12000 a 5000 daltonmi, konzistentný so štiepením pri arginíne 118. Tieto pozorovania tiež potvrdilo to, že dve časti molekuly boli spolu držané disulfidickou väzbou medzi prvým a štvrtým cysteínovými zvyškami, ako vyplynulo z experimentov tryptického štiepenia, opísaných vyššie. V Ba/F3 biologickom teste purifikovaný TPO (1-155) variant, po odstránení N-koncovej vedúcej sekvencie a s vnútorným štiepením, mal polovicu maximálnej účinnosti 0.2 až 0.3 picomolov. Neporušený variant s vedúcou sekvenciou mal polovicu maximálnej aktivity pri 2 až 4 picomoloch.

Pre variant (3) štiepiaci tlmivý roztok obsahoval 50 mM Tris, pH 8, 2% CHAPS, 0.3 M NaCl, 5 mM EDTA a humánny alebo bovinný trombín (Calbiochem) pri hmotnostnom pomere 1:25 až 1:50, vztiahnuté na enzým a proteín TPO variantu. Štiepenie sa uskutočnilo pri teplote miestnosti počas 2-6 hodín. Vývoj štiepenia sa hodnotil SDS gélmi, ako je opísané, pri faktore Xa štiepiacej sa reakcii. Vo všeobecnosti sa v tomto čase dosiahlo viac ako 90% štiepenie vedúcej sekvencie. Výsledný TPO sa purifíkoval na kolónach s C4 reverznou fázou, ako je opísané, a aminokyselinovým sekvenovaním sa ukázalo, že má želaný N-koniec. Získalo sa len veľmi malé množstvo (< 5 %) vnútorného rozštiepenia, pri tom istom arginíntreonínovom mostíku ako sa zistilo, s faktorom Xa. Výsledný TPO proteín bol biologicky vysoko účinný, s polovicou maximálnych odpovedí v Ba/F3 teste pri 0,2-0,4 picomolov proteínu. V mpl receptore na báze ELISA mal tento proteín polovicu maximálnej odpovede pri 2-4 ng/ml purifíkovaného proteínu (120-140 picomolov), zatiaľ čo neporušený variant, obsahujúci leader sekvenciu, mal nižšiu účinnosť v obidvoch testoch 5 až 10 násobne. Pre testy na živočíchoch sa HPLC-purifikovaný štiepený proteín dialyzoval vo fyziologicky prijateľných tlmivých roztokoch, so 150 mM NaCl, 0,01% Tween 80 a 10 mM jantaranu sodného, pH 5,5, alebo 10 mM octanu sodného, pH 5,5 alebo 10 mM fosforečnanu sodného, pH 7.4. Purifikovaný proteín sa stabilizoval HPLC a SDS gélmi, počas niekoľkých týždňov a potom sa uskladnil pri 4 °C. Pri normálnych a myelosupresívnych myšiach bol tento purifikovaný TPO s autentickou N-koncovou sekvenciou vysoko účinný, stimulujúci produkciu krvných doštičiek pri dávkach nižších ako 30 ng/myš.

Príklad 24

Syntetický mpl ligand

Hoci humánny mpl ligand (hML) sa zvyčajne vyrába s využitím rekombinantných metód, môže sa syntetizovať tiež cestou enzymatickej ligácie syntetických peptidových fragmentov s využitím metód, už opísaných. Syntetická príprava hML umožňuje inkorporáciu neprirodzených aminokyselín alebo syntetických funkčných závislostí, takých ako polyetylénglykol. Predtým sa pripravil mutant serínovej proteázy subtilizínu BPN, subtiligáza (S221C/P225A) na účinné ligovanie peptidových esterov vo vodnom roztoku (Abrahmsen et. al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). Teraz sa ukázalo, že syntetické peptidy môžu byť enzymaticky ligované sekvenčným spôsobom na produkciu enzymaticky účinných dlhých peptidov a proteínov, ako je ribonukleáza A (lackson et. al., Science, [1994]). Táto technológia, ktorá je detailnejšie opísaná, umožnila chemicky syntetizovať dlhé proteíny, ktoré predtým mohli byť vyrobené len DNA rekombinantnou technológiou.

Všeobecná stratégia na syntézu hML|₅₃ využívajúca subtiligázu je znázornená (schéma 1). Začínajúc s peptidom, úplne zbaveným ochrany, zodpovedajúcim C-koncovému fragmentu proteínu, N-koncovo konzervovaný, C-koncovo aktivovaný peptidový ester sa pridá so subtiligázou. Keď je reakcia hotová, produkt sa izoluje reverznou fázovou HPLC a chrániaca skupina sa z N-konca odstráni. Nasledujúci peptidový fragment sa liguje, zbaví ochrany a postup sa opakuje s využitím následných peptídov až kým sa získa proteín s úplnou dĺžkou. Postup je podobný s metodológiou v tuhej fáze, v ktorej N-koncovo konzervovaný C-koncovo aktivovaný peptid sa liguje s N-koncom prechádzajúceho peptidu a proteín sa syntetizuje v C->N smere. Avšak pretože každý spojený výsledok, okrem 50 zvyškov a produkty sa izolujú po každej ligácii, môžu sa syntetizovať oveľa dlhšie vysokočisté proteíny v celkom dobrých výťažkoch.

Schéma 1

SK 282265 Β6

Stratégia syntézy hML s využitím subtiligázy

R-NH-Peptid₂-CO-R + H₂N-Peptid-CO₂ i 1) subtiligáza R-NH-Peptid₂-CO-NH-Peptid_rCO₂

4- 2) Zn/CH₃CO₂H H₂N-Peptid₂-CO-NH-Peptid_I-CO₂

4- 3) opakovanie 1+2

H₂N-Peptid₃-CO-NH-Peptid₂-CO-NH-Peptidi-CO₂

O o r= ^R= Ι'Ό^χ^γ^ΝΗγ^'ΝΗ₂

O (CH₂)₄

Ňh₂

Na základe vedomostí sekvenčnej špecificity subtiligázy ako aj aminokyselinovej sekvencie biologicky účinnej epo-domény hML, hML₁₅₃ sa rozdelil na sedem fragmentov s 18-25 zvyškami v dĺžke. Syntetizovali sa skúšobné ligačné tetrapeptidy na stanovenie vhodnosti ligačných spojení pre 18-25mers. V tabuľke 13 sú uvedené výsledky týchto skúšobných ligácií.

Tabuľka 13 hML skúšobné ligácie. Donor a nukleofilné peptidy sa zriedili na 10 mM v 100 mM tricínu (pH 7,8) pri 22 °C. Pridala sa ligáza na konečnú koncentráciu 10 μΜ z 1,6 mg/ml zásobného roztoku (~70 μΜ) a ligácia sa nechala prebehnúť cez noc. Výťažky sú uvedené v % ligácie voči hydrolýze donorových peptidov.

Poloha	Donor (gb-K-Nlh)	Nukleofil-NH2	%hyl· rctfey	%bg^cie
1(23/24)	HVLH (SEQ ID NO: 89)	SRLS (SEQ ©NO: 90)	92	08
(22/23)	SHVL (SEQ ID NO: 91)	HSRL (SEQ©NO:92)	48	52
2(4647)	AVDF (SEQ ©NO: 93)	SLGE (SEQ ©NO: 94)	22	78
3(6970)	AVTL (SEQ ©NO: 95)	LLEG (SEQ ©NO: 96)	53	47
4(89*90)	LSSL (SEQ ID NO: 97)	LGQL (SEQ ©NO: 98)	95	05
(88/89)	C(acm)LSS (SEQ ID NO: 99)	LLGQ (SEQ©NO:1(»)	00	00
(9091)	SSLL (SEQ ID NO: 101)	GQLS (SEQ ©NO: 102)	45	55
(8889)	CLSS (SEQ DNO: 103)	LLGQ (SEQ ©NO: 100)	90	10
5(107/108)	UQSL (SEQ ©NO: 104)	LGTQ (SEQ ©NO: 105)	99	01
(106007)	ALQS (SEQ ©NO: 106)	LLGT (SEQ ©NO: 107)	70	30
6(128/129)	NA© (SEQ ©NO: 108)	LSFQ (SEQ ©NO: 109)	60	40

Ako vyplýva z týchto výsledkov, ligačné peptidy uvedené v tabuľke 14 mali byť účinne ligované subtiligázou. Vhodná ochranná skupina pre N-koniec každého donora peptidového esteru bola potrebná na zabránenie samoligácii. Tu bola vybraná izonikotinylová (iNOC) ochranná skupina (Veber et. al., J. Org. Chem., 42: 3286-3289 [1977]), pretože je vodorozpustná, môže byť inkorporovaná pri poslednom kroku tuhej fázy peptidovej syntézy, je stabilná voči bezvodému HF použitému na odstránenie a odštiepenie peptidov zo živice tuhej fázy. Naviac môže byť odstránená z peptidu po každej ligácii pri miernych redukč ných podmienkach (Zn/CH₃CO₂H) za poskytnutia voľného N-konca pre následné ligácie. Glykolát-lyzyl-amid (glc-K-NH₂) ester sa použil na C-koncovú aktiváciu na základe predchádzajúcich experimentov, ktorá sa ukázala ako účinne acylovaná subtiligázou (Abrahmsen et. al., Biochem., 30: 4145-4159 [1991]). Peptidy, chránené iNOC, aktivované glc-K-amidom, môžu byť syntetizované s využitím štandardných metód tuhých fáz, ako je znázornené (schéma 2). Peptidy sa potom postupne ligujú až do prípravy úplného proteínu a konečný produkt sa preskladáva in vitro. Na základe homológie s EPO sa disulfidické páry považujú za vytvorené medzi cysteínovými zvyškami 7 a 151 a medzi 28 a 85. Oxidácia disulfidov sa môže uskutočniť jednoducho miešaním redukovaného materiálu v atmosfére kyslíka počas niekoľkých hodín. Preskladaný materiál sa potom môže purifikovať HPLC a frakcie, obsahujúce aktívny proteín, oddeliť a lyofilizovať. Alternatívne sa disulfidy môžu diferenciálne chrániť na regulovanie postupnej oxidácie medzi špecifickými disulfidickými pármi. Ochrana cysteínov 7 a 151 s acetamidometylskupinami (acm) by mohla zabezpečiť oxidáciu 28 a 85. Acm skupiny by sa potom mohli odstrániť a zvyšky 7 a 151 oxidovať. Naopak, zvyšky 28 a 85 by mohli byť chránené acm skupinami a oxidované, ako sa požaduje v prípade postupnej oxidácie. Cysteíny 28 a 85 môžu byť ľubovoľne substituované ďalším prirodzeným alebo umelým zvyškom, iným ako Cys, na zabezpečenie vhodnej oxidácie cysteínov 7 a 151.

Tabuľka 14

Peptidové fragmenty použité na úplnú syntézu h-ML s použitím subtiligázy

Fragment

Sekvencia (SEQ ID NO: 110) iNOGHN-SPAPPACDLRVLSKLIRDSHVL-gk-K-NH, (1-22) (SEQ ID NO: 111) ^OC-HN-HSRLSQCPEVHPLFTPVILPAVDF-glc-K-N] I₂ (2346) (SEQ ID NO: 112) iNOC-Ι ΙΝ-βΙΌΕνΚΤηΜΕΕΓΚΛΟΟΙΙΟΑνίΙ^Ιο-Κ-ΝΗ, (47-69) (SEQ ID NO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLLrglc-K-Nlh (70-90) (SEQ ID NO: 114) iNOC-Ι IN-GQLSGQVRLLUjALQS-glc-K-NI I₂ (90-106) (SEQ ID NO: 115) jNOC-HN-LLGTQITPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NlL (102-128) (SEQ Π3 NO: 116)

Η₂Ν-1^Ε0ΗΕ1βΟΚνΚΕΙΜΕν0Ο8Τ1₂0νΚ-0Ο₂ (129-153)

Peptidové ligácie sa uskutočňujú pri 25 °C v lOOmM tricíne, pH 8 (čerstvo pripravený a odplynený vákuovou filtráciou cez 5μΜ filter). Typicky sa C-koncový fragment rozpustí v tlmivom roztoku (2-5 mM peptid) a lOx zásobný roztok subtiligázy (1 mg/ml v lOOmM tricíne, pH 8) sa pridá, aby sa dosiahla konečná koncentrácia enzýmu - ~5μΜ. 3-5 molový prebytok glc-K-NH₂ aktivovaného donoru peptidu sa potom pridá ako tuhá látka, rozpustí sa a zmes sa nechá stáť pri 25 °C. Ligácie sa monitorujú analytickou reverznou C18 fázovou HPLC (CH₃CN/H₂O gradient s 0,1% TFA). Ligačné produkty sa čistia preparatívnou HPLC a lyofilizujú sa. Izonikotinylové (iNOC) zbavenie ochrany sa uskutočnilo miešaním HC1 aktivovanej zinkovým prachom s chráneným peptidom v kyseline octovej. Zinkový prach sa odstráni filtráciou a kyselina octová odparením za vákua. Výsledný peptid sa môže použiť priamo v nasledujúcej ligácii a postup sa opakuje. Syntetický hML₁₅₃ sa môže ligovať postupmi analogickými s tými, ktoré boli uvedené pri syntetickom alebo rekombinantnom hML₁₅₄_₃₃₂ na prípravu syntetických alebo polosyntetických úplných dĺžok hML.

Syntetický hML má v porovnaní s rekombinantným veľa výhod. Neprirodzená strana reťazcov sa môže zaviesť, aby sa zlepšila účinnosť alebo špecificita. Polyméme funkčnosti, ako polyetylénglykolové, môžu byť včlenené, aby sa zlepšilo trvanie účinku. Napríklad, polyetylénglykol sa môže pripojiť k lyzínovým zvyškom individuálnych fragmentov (tabuľka 14), pred alebo po jednom alebo viacerých ligačných krokoch, ktoré sa majú uskutočniť. Peptidové mostíky citlivé na proteázu sa môžu odstrániť alebo upraviť, aby sa zlepšila stabilita in vivo. Ďalej sa môžu syntetizovať deriváty ťažkých atómov na podporu stanovenia štruktúr.

Schéma 2

Syntéza tuhej fázy peptidových fragmentov na ligáciu segmentov

₅ 0 R O (CHA izonikotlnyl (1N0C) glykolát-lyzyl-anid (glc-K-NHj)

a) Lyzyl-parametylbenzhydrylamínová (MBHA) živica 1 (0,63 meq./gm., Advanced ChemTech) sa rozmieša s kyselinou brómoctovou (5 eq.) a diizopropylkarbodiimidom (5 eq.) počas 1 h pri 25 °C v dimetylacetamide (DMA) za poskytnutia brómacetylového derivátu 2.

b) Živica sa intenzívne premyje s DMA a individuálne Boc-chránené aminokyseliny (3 eq., Bachem) sa esterifikujú rozmiešaním s uhličitanom sodným (6 eq.) v dimetylformamide (DMF) počas 24 hodín pri 50 °C za poskytnutia zodpovedajúcej glykolátfenylalanyl-amidovej živice 3. Aminoacetylovaná živica 3 sa premyje s DMF (3x) a dichlórmetánom (CH₂C1₂) (3x) a môže byť skladovaná niekoľko mesiacov pri teplote miestnosti. Živica 3 sa tiež môže vložiť do automatizovaného syntetizéra peptidov (Applied Biosystems 430A) a peptidy sa môžu predĺžiť s využitím štandardných postupov tuhej fázy (5).

c) Ν-α-Boc skupina sa odstráni s roztokom 45% kyseliny trifluóroctovej v CH₂C1₂.

d) Nasledujúce Boc-chránené aminokyseliny (5 eq.) sa predaktivujú s použitím benzotriazol-l-yl-oxy-tris-(dimetylamino)-fosfóniumhexafluórfosfátu (BOP, 4 eq.) a N-metylmorfolínu (NMM, 10 eq.) v DMA a spájaním počas 1 -2 hodín.

e) Konečná Ν-α-Boc skupina sa odstráni (TFA/CH₂C1₂) za poskytnutia 4 a izonikotinylová (iNOC) chrániaca skupina sa zavedie už opísaným spôsobom (4) rozmiešaním 4izonikotinyl-2,4-dinitrofenylkarbonátu (3 eq.) a NMM (6 eq.) v DMA pri 25 °C počas 24 hodín.

f) Rozštiepenie a zbavenie ochrany peptidu cestou spracovania s bezvodým HF (5% anizoí/5% etylmetylsulfid) pri 0 °C počas 1 hodiny poskytuje iNOC-chránený, glykolát-lys-amid aktivovaný peptid 5, ktorý sa čistí reverznou fázovou Cl 8 HPLC (CH₃CN/H₂O gradient, 0,1% TFA). Totožnosť všetkých substrátov je potvrdená hmotnostnou spektrometriou.

DOPLŇUJÚCE USKUTOČNENIA

Vynález, ako je nárokovaný, je uskutočniteľný na základe uvedeného opisu a jednoducho použiteľných odkazov a východiskových materiálov. Napriek tomu má prihlasovateľ uložené v Američan Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) bunkovú líniu, uvedenú nižšie:

Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmp/I 1.8, ATCC prírastkové číslo CRL 69575, uložená 24. februára 1994.

Plazmid pSVI5.ID.LL.MLORF, ATCC prírastkové číslo CRL 75958, uložený 2. decembra 1994; a

CHO DP-12 bunky, ML 1/50 MCB (označené #1594), ATCC prírastkové číslo CRL 11770, uložené 6. decembra 1994.

Toto uloženie bolo vykonané na základe Budapeštianskej dohody o medzinárodnom uznávaní uloženia mikroorganizmov na účely patentového konania a vykonávacích pravidiel (Budapeštianska dohoda). Toto zabezpečuje zachovanie životnosti kultúry počas 30 rokov od dátumu uloženia. Organizmy budú použiteľné cestou ATCC podľa podmienok Budapeštianskej dohody a predmetu dohody medzi prihlasovateľmi a ATCC, ktorá zabezpečí neobmedzenú použiteľnosť až do vydania príslušného US patentu. Použiteľnosť uloženého kmeňa nie je mienené ako licencia na využitie vynálezu pri porušení práv udelených vládnou inštitúciou v súvislosti s jeho patentovými právami.

Keďže vynález je nevyhnutne opísaný v spojení s výhodnými vyhotoveniami a špecifickými pracovnými príkladmi, odborník v odbore po prečítaní predchádzajúceho opisu bude schopný vykonať rôzne zmeny, náhrady ekvivalentov a alternatívy tu predloženého predmetu, bez odchýlenia sa od ducha vynálezu. Preto môže byť vynález využívaný aj inými spôsobmi, než ako sú tu špeciálne opísané. Preto sa očakáva, že patentovou listinou udelená ochrana bude obmedzená len priloženými nárokmi a ich ekvivalentmi.

Všetky tu uvedené odkazy sa týmto považujú za začlenené.

SEKVENČNÝ ZOZNAM (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasoviter: Genentech, Inc.

E<ton,DanL. de Sauvage, Frederic I (n) Názov vynálezu: Trombopoeth (iii) Počet sekvencii: 144 (tv) Korešpondenčná adresa:

(A) Adresa:	Genentech, hc.
(B)UHca:	460 Point San Bnmo Bivd
(C) Mesto:	South San Fnmdsco
(D) Štát:	Califbmia
(E) Krajina;	USA
(F)ZIP:	94080

(v) Počítačová forma:

(A) Typ média : 5.25 palcov, 360 Kb floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software; pätia (Genentech) (vi) Súčasné údaje o prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podanú:

(C) Zatriedenie:

(vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: 08/176553 (B) Dátum podania: 03. január 1994 (vn) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) číslo prihlášky: 08/348657 (B) Dátum podania: 02. december 1994 (vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: 08/185607 (B) Dátum podania: 21. január 1994 (vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: 08/348658 (B) Dátum podania: 02. december 1994 (vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: 08/196689 (B) Dátum podania: 15. február 1994 (vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky; 08/223263 (B) Dátum podania: 04. apríl 1994 (vii) Dátum prioritnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: 08/249376 (B) Dátum podania: 25. máj 1994 (viií) Informácie o zástupcovi:

(A) Meno : Wmter, Daryl B.

(B) Registračné číslo: 32,637 (C) Značka: 871P5PCT (ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón: 415/225-1249 (B) Telefax: 415/952-9881 (C) Telex :910/371-7168 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 1 (i) Sekvenčné charakteristiky;

(A) Dĺžka; 353 aminokyselín (B) Typ: aminokysetna (C) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1

Met

Clu

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu

Leu

Val

val

Met

Leu

Leu

Leu

Thr

1

S

10

1S

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

20

25

30

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Sex

His

Val

Leu

His

Ser

35

40

45

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Clu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

50

55

€0

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

65

70

75

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

íle

Leu

Gly

Ma

Val

Thr

Leu

80

85

90

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

95

100

105

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

110

115

120

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

125

130

135

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ma

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

íle

Phe

Leu

140

145

150

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

155

160

165

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

cya

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

170

175

180

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

1BS

190

195

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

aoo

205

210

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Tep

Gin

Gin

Gly

Phe

215

220

225

Arg

Ala

Ly.

Ila

Pro

Gly

Leu

Ltt

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

230

235

240

Atp

Gin

íle

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Zle

His

Glu

Leu

Leu

Asn

245

2S0

255

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

260

26S

270

Ala

Pro

Asp

íle

ser

ser

Gly

Thr

Ser

Aep

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

278

280

2B5

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

-tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

290

395

300

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Lau

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

305

310

315

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

330

325

330

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

A*r.

Thr

Ser

Tyr

Thr

Bis

335

34C

345

Ser

Sir.

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

350 353 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 2 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍ&·: 1793 Mi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO 2

Tcwceíxce catctgctcc ccagagggct gcctgctgtg cacttgggtc 50

CTGGAGCCCT TMCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGWWTG 100

CCCCACCCTA CTCTOCCaG AABTOCAAGa GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150

CCCAGGÄAGQ ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200

GXCACCCCGG CCAGAATGGX OCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCŤ 2S0

TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTOCTTCTG 300

ACCTCCGAffT CCTCAGTAAA CTGCTTCflTG ACTCCCATGŤ CÍTICACAGC 350

AGACTGAGCC AGŤGCCCAGA GGTTCACCCT TTGCCTACAC CTGTCCTGCT <00
GCCTOCTGTG	GACTTTAGCT	TGGGAGAATC	GAAAACCCAG	ATGGAGGAGA	450
CCAAGGCACA	GGACATTCTS	GGAGCAGTGA	cccttctgct	GGAGGGAGTG	500
ATGGCAGCAC	GGGGACAACT	GGGACCCACT	TGCCTCTCAT	CCCTCCTGGG	550
GCAGCTTTCT	ggacagqtcc	GTCTCCTCCT	TGGGGCCCTG	CAGAGCCTCC	600
TTGGAACCCA	GCTTCCTCCA	CAGGGCAGGÄ	CCACAGCŤCA	CAAGGATCCC	650
AATGCCATCT	TCCTGAGCTT	CCAACACCTG	CTCCCAGGAA	AGGTGCGTOT	700
CCTGATGCTT	GTAGGACGGT	CCÄCCCTCTG	CGTCAGGCGG	GCÚCCACCCA	750
CCACAGCTGT	CCCCAGCAGA	ACCTCTCTAG	TCCTCACACT	OAACGAGCTC	800
CCAAACÄGGA	CTTCTGGATT	GTTGGAGACA	AACTTCACTG	CCTCAGCCAS	850
AACTACTGGC	TCTGGGCTTC	TGAAGTGGCA	GCAGGGATTC	AGAGCCAAGA	>00.
TTCCTGGTCT	GCTGAACCAA	ACCŤCCACGT	CCCTGGXCCA	AATCCGCGGA	950
TACCTGÄACA	GGATACACGA	ACTCTTGAAT	GGAACTCGTG	GACTCTTTCC	1000
TGGACCCTCA	CGCAGGACCC	TAGGAGCCCC	GGACATŤTCC	TCAGGAACAT	1050
CAGACACÄGG	CTCCCTGCCA	CCCAACCTCC	AGCCTGGATA	TTCTCCTTCC	1100
CCAACCCATC	CTCCTACTGG	ÄCAGTATACG	CTCTTCCCTC	TTCCÄCCCAC	1150
CTTGCCCACC	CCTGTGGTCC AGľTCCACCC CCTGCTTCCT GACCCTTCTG	1200
CTCCAACGCC	CACCCCTACC	AGCCCTCTTC	TAAACACATC	CTACACCCAC	1250
TCCCAGAATC	TGTCTCAGGA	A3GGTAAGGT	TCTCAGACAC	TGCCGACATC	1300
AGCATTGTCT	CATGTACAGC	TCCCTTCCCT	GCACGGCGCC	CCTGGGAGAC	1350

(xi) Opil sekvencie: SEQ ID NO: 4

GAATTCCTGG aataccacct gacaatgatt TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50

CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTOCTCCTCG tggtcatgct ťctcctaact 100

GC1AGGCTAA CGCTCTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150

CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACŤCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 300

GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG 7AACTGGTAA GACACCCATA 250

CTCCCAGGAA GACACCAŤCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300

TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350

TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 350 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 5 (i) Sekvenčné chankterstíky:

(A) Dĺžka: 390 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológii: imcimi (ú) Opi· sekvencie·. SEQ ID NO*. $

CTTAAGGACC TTATGGTCGA CTGTTACTAA AGGAGGÄETA GAAAGTTGGA 50

GTGGACAGqA GTAGATTCTT AACGAGGAGC ACCAGTACGA AGKSGATTGA 100

CGTTCCGATT GCGACAGGTC GGGCCGAGGA GGACSAACAC TGGAGGCTCA 150

GGAGTCATTT GACGAAGCAC TGAGGGTACA GGAAG7GTCG TCTGACCACT 200

CTTGAGGGTT GTAATAGGGG AAATAGGCGC ATTGACCATT CTGTGGGTAT 250

GAGGGTCCTT CTGTGGTACT GAAGGAGATT GAGGAACTGG GTTACTGATA 300

AGAAGGGTAT AACAG&3GTG GATGACTAGT GTGAGAGJkCT OTTCTTAATA 3S0

AGAASTGTTA TGTCGGGCGT AAAITTTCGA GAGCAGATCT 390 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 6 (í) Sekvenčné charakteristiky:

AACTCGACAA	GATTTCCTAC	TTTCTCCTGA	AACCCAAXGC	CCTGGTAAAA	1400
GGGATACACA	GGACTGAAÄA	GGGAATCATT	TTTCACTGTA	CATTATAAAC	1450
CTTCAGAACC	ΤΛΤΤΤΤΤΤΤΑ	AGCTATCAGC	AATACTCATC	AGAGCAGCTA	1500
GCTCTTTGGT	CTATTTTCTG	cagaaatttg	CAACTCACTG	ATTCTCTACA	1550
TGCTCTTTTT	CIGTGkTMC	tctgcaaagg	CCTGGGCTGG	CCTGGCÄGTT	1600
GAACAGAGGG	AGAGACTAAC	cttgagtcag	AÄAÄCAGAGA	AAGQGTAATT	1650
TCCTTTGCTT	CAAATTCAAG	gccttccaac	GCCCCCATCC	CCTTTACTAT	1700
CATTCTGAGT	GGGACTCTGA	TCCCATATTC	TTÄACAGATC	TTTACTCTTG	1750
ÄGAAATGAAT	AAGCTTTCTC	TCAGAAAAAA	AAAAAAAAAA	ΑΛΑΛΑ 1795

(2) Iafonnácia pre SEQIDNO·. 3 (i) Sekvenčné charakienstiky:

(A) Dĺžka: 42 amínokysdá (B) Typ: iminokyselina (D) Topotógii ·. Sneáma (xi) Opis sckvende: SEQ ID NO: 3

Leu

Leu

Leu

Val

Val

Met

Leu

Leu

Leu

Thr

Ala

Arg Leu

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

ASP

Leu

Arg

Val Leu

Ser

Lys

20

25

30

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Ara

Leu

35

40

42

(2) Infonnídi pre SEQ ID NO 4 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka·. 390 bU (B) Typ; nukleoví kyaehna (C) Vlákno: jedno (D) Topológi*: lineárni (A) Dĺžka: 332 amiaolcyselm (B) Typ. aminokyselina (D) Topológia: lineárna

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO 6

Ser

Pro

Ale

Pro

Pro

Ala

Cys

A»P

Leu

Arg

val

Leu

Sex

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

ASP

Ser

HÍS

Val

Leu

Hi*

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

cy»

Pro

20

25

30

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

A«P

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lya

Thr

Gin

Met

Glu Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

Íle

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Mat

«5

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Sar

Ser

Leu

Leu

80

65

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Tm-

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Cly Arg

Thr

Thr

Ala

ilo

115

120

His

Lys

ASp

Pro

Asn

Ala

íle

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

HÍS

Leu

Leu

125

130

135

Ara

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly 01y

Ser

Thr

Leu

140

145

150

Cys

Val

*rs

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Sex-

Arg

Thr

155

160

165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

170

175

160

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

18S

190

155

Gly

Leu

Leu

Lys Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Íle

Pro

Gly

200

205

210

Leu

Leu

Aan

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu Asp

Gin

íle

Pro

Gly Tyr

215

220

225

Leu

Asn

Arg

íle

Hla

G1U

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg Gly

Leu

Phe

230

235

240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Atp

íle

Ser

Ser

245

250

255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr Cly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

260

285

270

Τντ Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Hís

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

T/t

Thr

Leu

275

280

285

Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu	Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His
	290	295	300
Pro Leu Leu Pro	Asp Pro Ser	Ala Pro Thr Pro	Thr Pro Thr Ser
	305	310	315
Pro Leu Leu Asn	Thr Ser Tyr	Thr His Ser Gin	Asn Leu Ser Gin
	320	325	330
Glu Gly
332
(2) Informácia pre SEQ ID NO: 7
(i) Sekveníaé charakteristiky:
(A)DÍäi	166 aminokyselín
(B) Typ:	immokyselina
(D) Topológia: faeámi
(xi) Opis sekvende: SEQ ID NO: 7
Ala Pro Pro Arg	Leu íle Cys	Asp Ser Arg Val	Lau Glu Arg Tyr
1	5	10	15
Leu Leu Glu Ala	Lys Glu Ala	Glu Asn íle Thr	Thr Gly Cys Ala
	20	25	30
Glu His Oys Ser	Leu Asn Glu	Asn íle Thr Val	Pro Asp Thr Lys
	35	40	45
Val Asn Phe Tyr	Ala Trp Lys	Arg Het Glu Val	Gly Gin Gin Ala
	50	55	60
Val Glu Val Trp	Gin Gly Leu	Ala Leu Leu Ser	Glu Ala Val Leu
	65	70	75
Arg Gly Gin Ala	Leu Leu Val	Asn Ser Ser Gin	Pro Trp Glu Pro
	80	85	90
Leu Gin Leu His	Val Asp Lys	Ala Val Ser Gly	Leu Arg Ser Leu
	95	100	105
Thr Thr Leu Leu	Arg Ala Leu	Gly Ala Gin Lys	Glu Ala Zle Sor
	110	115	120
Pro Pro Asp Ala	Ala Str Ala	Ala Pro Lau Arg	Thr 11· Thr Ala
	125	130	135
Asp Thr Phe Arg	Lys Leu Phe	Arg Val Tyr Ser	Asn Phe Leu Arg
	140	145	150
Gly Lys Leu Lys	Leu Tyr Thr	Gly Glu Ala Cys	Arg Thr Gly Asp
	155	150	165
Arg
166
(2) Informácia pre SEQ ID NO: 8
(i) Sekvenčné charakteristiky:
(A) Dĺžka: 328 ammokysdfe
(B) Typ:	ammokysdífli
(D) Topológia: hneánia
(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8
Ser Pro Ala	Pro Pro Ala	Cys Asp Leu Arg	Val Leu Ser Lys Leu
1	5	10	15
Leu Arg Asp	Ser his Val	Leu His Ser Arg	Leu Ser Gin Cys Pro
	20	2S	30
Glu Val his	Pro Leu Pro	Thr Pro Val Leu	Leu Pro Ala Val Asp
	35	40	45
Phe Ser Leu	Gly Glu Trp	Lys Thr Cln Met	Glu Glu Thr Lys Ala
	50	55	60
Gin Asp íle	Leu Gly Ala	Val Thr Leu Leu	Leu Glu Gly Val Met
	65	70	75
Ala Ala Arg	Gly Gin Leu	Gly Pro Thr Cys	Leu Ser Ser Leu Leu
	80	8S	90
Gly Gin Leu	Ser Gly Gin	Val Arg Leu Lau	Leu Gly Ala Leu Gin
	95	100	105
Ser Leu Leu	Gly Thr Gin	Gly Arg Thr Thr	Ale His Lys Asp Pro
	110	115	120
Asn Ala íle	Phe Leu Ser	Phe Gin His Leu	Leu Arg Gly Lys Val
	125	130	135
Arg Phe Leu	Met Leu Val	Gly Gly Ser Thr	Leu Cys Val Arg Arg
	140	145	150
Ala Pro Pro	Thr Thr Ala	Val Pro Ser Arg	Thr Ser Leu Val Leu
	155	16C	165
Thr Leu Asn	Glu Lau Pro	Asn Arg Thr Ser	Gly Leu Leu Glu Thr
	170	175	180
Asn Phe Thr	Ala Ser Ala	Arg Thr Thr Gly	Ser Gly Leu Leu Lys
	1B5	190	195
Trp Gin Gin	Gly Phe Arg	Ala Lys íle Pro	Gly Leu Leu Asn Gin
	200	205	210
Thr Ser Arg	Ser Leu Asp	Gin íle Pro Gly	Tyr Leu Asn Arg íle
	215	220	225
His Glu Leu	Leu Asn Gly	Thr Arg Gly Leu	Phe Pro Gly Pro Ser
	230	33$	240
Arg Arg Thr	Leu Gly Ala	Pro Asp íle Ser	Ser Gly Thr Ser Asp
	245	250	256

Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Sér

260 265270

Pro Thr His Pro Pre Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro

275 260285

Pro Thr Leu Pro Thr Pro V<1 Val Gin Leu Hia Pro Leu Leu.Pro

290 29$300

Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn

305 310315

Thr Ser Tyr Thr Hia Ser Gin Aan Leu Ser Gin Glu Gly

320 325328

(2) Informácii pre	SEQ	IDNO:9
(i) Sekvenčné charakteristiky:
(A)	iDižkí:		265 immokyselía
(B)	Typ:		wninokyschni
(D)	1 Topológia:	lineárni
(xi) Opis sekven	de: SEQ ID NO: 9
Ser Pro	Ala Pro	Pro	Ala Cys Asp	Leu	Arg	Val	Leu	Ser	Lys	Leu
1		5			10					15
Leu Arg	Asp Ser	His	Val Leu His	Ser	Arg	Leu	Ser	Gin	cys	Pro
		20			25					30
Glu Val	His Pre	Leu	Pro Thr Pro	Val	Leu	Leu	Pro	Ala	Val	Asp
		35			40					45
Phe Ser	Leu Gly	Glu	Trp Lys Thr	Gin	Het	Glu	Clu	Thr	Lys	Ala
		SO			55					60
Gin Asp	íle Leu	Gly	Ala Val Thr	Leu	Leu	Leu	Glu	Gly	Val	Met
		65			70					75
Ala Ala	Arg Gly	Gin	Leu Gly Pro	Thr	Cys	Leu	Ser	Ser	Leu	Leu
		80			85					90
Gly Gin	Leu Ser	Gly	Gin Val Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Ala	Leu	Gin
		95			100					105

Ser Leu Leu Gly Itir Gin boa Pro Pro Gin Gly Arg Thr ThrAla

110 115120

Hl s Lya Asp Pro Asn Ala Íle Phe Leu Ser Phe Gin His LeuLeu

125 130135

Are Gly Lys Asp Phe Trp íle Val Gly Asp Lys Leu Kás CysLeu

140 145150

Ser Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Glyíle

155 160165

Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gin ValPro

- 170 175L80

Gly Pro Asn Pro Arg íle Pro Clu Gin Asp Thr Arg Thr LeuGlu

185 190195

Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Rir Leu Thr Cln Asp proArg

200 205210

Ser Pro Gly Hie Phe Leu Arg Asn íle Arg His Arg Leu ProAla

215 220225

Thr Gin Pro Pro Ala Trp íle Phe Ser Phe Pro Asn Pro SerSer

230 235240

Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pre Ser Ser Thr His Leu AlaHis

245 250255

Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro AlaSer

260265

(2) Informácii pre SEQ IDNtt 10
(i) Sekvcníaé charakteristiky:
(A) Dĺžka:	261 aminokyselín
(B) Typ:	sminokysdms
(D) Topoíógii;

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Val

His

Pro

Lau

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

35

«0

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Ly·

Ala

SO

55

60

Cln

Asp

Zle

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Sex

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

Mís

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Asn

Ala

íl*

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

H1S

Leu

Leu

Arg

Gly

Itfs

Asp

125

130

135

Phe

Trp

Ila

Val

Gly

Asp

Ly*

Lau

His

Cys

Leu

5er

Gin

Asn

Tyr

140

14S

150

Trp

^Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Val

Ala

Ala

Gly

Zle

Gin

Ser

Gin

Asp

155

160

145

SK 282265 Β6

Gly

Pre

Aar.

Pro

Arg

11«

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

185

190

195

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg

200

205

ZLQ

Ser

Pro

Gly

Mis

Phe

Leu

Arg

Asn

11·

Arg

Hit

Arg

Leu

Pro

Ala

215

220

225

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

Trp

Zle

Ph·

Sex

Ph«

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Val

Tyr

Ala

Leu

Pro

s*r

Ser

Thr

Bia

Leu

Ala

Hla

245

250

2S5

Pro

Cy»

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser

260

265

(2) Infonmcu pre SEQ ID NO: 10 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka : 261 aminokyselín (B) Typ: aminokysetína (D) Topotógji: lineáma (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cya

Asp

Leu

Arg

Vsi

Leu

Ser

Lys

Leu

1

S

10

15

Leu

Arg

ASP

Ser

Hla

Val

Leu

Hla

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

cya

Pro

20

25

30

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Lau

Pro

Ala

Val

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Clu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Slu

Glu

thr

Lys

Ala

SO

55

60

Gin

Asp

11·

Leu.

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Mat

«5

10

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

I*«U

Ser

ser

L«U

Leu

BO

es

PO

Gly

Cla

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

L«u

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

10S

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ale

His

Lya

ASP

Pro

110

115

120

Asn

Ala

11«

Ph·

Leu

Ser

Ph·

Gin

Hla

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

ASP

12S

BO

135

Ph·

Trp

Xl«

Val

Gly

Xap

ty*

Leu

His

Cya

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr

140 140 150

Trpj^u Trp Ma Str Glu Val Ala Ala Gly íle Gin Ser Gin Asp

155 160 165

TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550
CTCAGGCTTA	ACCCAGTGCA	CGTGTGCGCA	catacatgtg	CCCCGCACCT	600
GACAGTCCAC	TCAACCCGTC	CAAACCCTTT	ccccataaca	CCAACCCATA	650
ACAGGAGATT	TCTCTCATGT	GGGCAATATC	cútottccca	CTTCGAAAGG	700
GGGAATGACA	AGATÄGGACÍ	CCCTAGGCGA	ttacaoäaag	AAAAGCAGGA	750
AAGCAAGCAT	CCTGTTGGAT	TTCAGCAGCA	ggtatgatct	CCAGGCAAAA	800
GAAATTTGGA	TAGCCAGGGA	GTGAAAMXC	cäccaatctt	AAACAAGACC	850
TCTGTGCTTC	TTCCCCAGCA	ACACAAATGT	CCTGCCAGAT	TCCTCCTGGA	500
AAAAAÄCnC	TCCTCCTGTC	CCCCTCCAGG	TCCCAGGTTG	CCCATGTCCA	950
GGAAAAGATG	GATCCCCCTA	TCCAAATCTT	CTCCGTGGTG	TGTGTGGGTG	1000
GAGGAGTGGA	CCCTGGTCCA	GGCAGGGGCT	CCAGGGAÄGA	GAAGGCGTCA	1050
CTTCCGGGGG	CCTTCÄCCAG	TGTCTGGTGG	CTCCCTTCTC	TGATTGGGCA	1100
GAAGTGGCCC	AGGCAGGOGT	ATGACCTGCT	GCTGTGGAGG	GGCTGTGCCC	1150
CACCGCCACÄ	tgtcttccta	CCCATCTGCT	CCCCAGAGGG	CTGCCTGCTG	1200
TGCACTTGGG	TCCTGGAGCC	CTTCTCCACC	CGGTGAGTGG	CCAGCAGGGT	1250
GTGGGGTTAT	GTGAGGGTAG	aaaggacagc	AAAGAGAAAT	GGGCTCCCAG	1300
CTGGGGGAGG	GGCAGGCAAA	ctggaaccta	CAGGCACTGA	CCTTTGTCGA	1350
GAAGAGTCTX	GCCTTCCCAG	AATGGGAOGA	GCAGGGCAGA	QCAGGGGTAG	1400
GGGGTGGGGT	gctggtttct	gagggactga	TCACTTACTT	GGTOGAATAC	1450
AGCACAGCCC	TGGCTGGCCC	taaggaaagg	GGACATGAGC	CCASGGAGAA	1500

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

Leu

Gin

Val

Pro

Gly

Pro

Asn

Pro

170

175

180

Arg

íle

Pro

Glu

Gin

Asp

ihr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

185

190

195

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

MP

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

Ph·

Leu

Arg

Asn

11«

Arg

Hli

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

215

220

225

Ala

Trp

11«

Phe

S«r

Ph·

Pro

Asn

pro

S· r

Ser

Tyr

Trp

Thr

Val

230

23S

240

tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

245

2S0

255

Ala

Pro

pro

Pro

Ala

Ser

260 261 (Z) Informácia pre SEQ © NO*. 11 (i) Sekvenčné charakteristiky·.

(A) Dĺžk.. 7849 biz (B) Typ: nukleová kyselín» (C) Vlákna; jedna (D) Tapotógíi: Bneéru (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 11

CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TCCCTOGTCA TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT 50

GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACTATCC TCCCAGCTAT CCCTACACCC 100

TCCTTCCTAA TCJTGGGAGA CATCTCGTCT GGCTGGACGG GAAAATTCCA 150

GGATCTAGGC CACACTTCTC AGCAGACÄTG CCCA'TCCTTC GGGAGGAGGA 200

ACAGGAQAGA OCCTGAGGAA GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT GATGGGATCA 250

AGGTCäGGCC ACGAAGCCCC TGftGGAGAGA GACTGTGGGG AGACTGGGAC 300

TGGGAAGAAÄ CCAAACGAGC TACAQCCAGG GCCAAACGAA AAGGGGGGCC 350

AGCAGOGAGG TATTTCCGGG GGAGGTCCJU3 CAGCTGTCTT TCCTAAGACA 400

GGGACACATO GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT CACATGTGGA ACGGTKGGAG 450 atggaagacg gagacagaac aagcaäagga GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500

AATAAGAGAG	GGAGCTGCAC	TTAGGGCTTA	GCAAACÄCAG	TAGTAAGATG	1550
GACACAGCCC	CAATCCCCAT	TCTTAGCTGG	TCATTCCTCG	TTAGCTTAAG	160Q
GTTCTGAATC	TGGTGCTGGG	GAAGCTGGGC	CAGGCAAGCC	AGQGCGCAM3	1650
GAGAGGGTAA	TGGGÄGGäGG	GCCCÄCTCAT	GTTGACAQAC	CTACAGGAAA	1700
TCCCAATATT	GAATCAGGTO	CAAGCCTCTT	TGCACAACTT	GTGAAAGGAC	1750
GAGGAAGCC*	TGTGGGGGGT	CCTGTGAAGG	AACCGGAAGG	ggttctgcca	1800
AGGGGGCAGG	GAGGCAGGTG	TGAGCTATGA	GACAGATATG	TTAGTGGGCG	1850
CCTAAGACAA	OGTAAGCCCC .TAAGGTGGGC	ATCACCCAGC	AGGTGCCCGT	1900
TCCTGGGCÄG	ctggtctcag gaaggaagtc	CCAGAACTGT	TACCCCATCT	1950
CTTGGCCTCA	GATAATGGAG TATTTCAGGA	CTTGGAGTCC	AAAGAAAAGC	2000
TCCAGTGGCT	TTATGTGTGG GGGTAGATAG	GGAAAGAATA	GÄGGTŤAATT	2050
TCTCCCATAC	CGCCTTTTAA	TCCTGACC7C	TAGTGGTCCC	AGTTACAGCT	2100
TTCTGCAGTT	CCCCTCCCCA	GCCCCACTCC	CCACCGCAGA	AGTTACCCCT	2150
CAACATATTG	CGCCCGTTTG	CCAGTTCCTC	ACCCAGGCCC	TGCATCCCAT	2200
TTTCCACTCT	CTTCTCCAGG	CTGAAGCCAC	AATACTTTCC	TTCTCTATCC	2250
CCATCCCAGA	TTTTCTCTCA	CCTAACAACC	AAGGTTGCTC	AOAATTTAAG	2300
GGTAATTMG	ATATGTGTCT	AIACATATCA	TGTCCTCCTG	CTCTCAGCAG	2350
GOGTAGGTGG	CACCAAATCC	GTGTCCGATT	CACTGAGGAG	TCCTGACAAA	2400
AAGGAGACAC	CATATGCITT	CTTGCTTTCT	TTCTTTCTTT	CTTTCTTTTT	2450
TTTTTTTTGA	GACGGAGTTT	CACTCTTATT	GCCCAGGCTG	GAGTGCAATG	2500
GTGCGATCTC	GGCTCACCAC	AAACCTCCGC	CTCCCAGGTA	CAAGCGATTC	2550

TCCTGTCTCA CCCTCCCAAG TAGCTTQGAT TACAÓGCATG AGCCACCACA 2600
CCCTGCTAGT	tttittgtät	TTCGTAGAGC	CGGGGTTTCA	CCATGTTAGT	2650
OAGGCTGGTG	GCGAACTCCT	GACCTCÄGGT	GATCCACCCG	CCTTGGACTC	2700
CCAAAGTGCT	GGGATTACAG	GCATGAGCCA	CTGCACCCGG	CACACCATAT	2750
GCTTTCATCA	CAAGAAAATG	TGAGAGAATT	CAGGGCTTTG	GCAGTTCCÄO	2800
GCTOGTCAGC	ATCTCAAQCC	CTCGCCAGCA	TCTGTTCACC	CTGCCAGGCA	2850
GTCTCTTCCT	AGAÄACTTGG	ITAAATGTTC	ACTCTTCTTG	C1ACTTTCAG	2900
GATAGATTCC	TCACCCTTGG	CCCGCCTTTC	CCCCACCCTA	CTCTGCCCAG	2950
AAGTGCAAGA	GCCTAAGCCG	CCTCCATGGC	CCCAGGÄÄGG	ATTCAGGGGA	3000
GAGGCCCCAA	ACAGGGAGCC	ACGCCAGCCA	GACACCCCGG	CCAGAATCGA	3050
GCTGACTGGT	GACAACACAC	CTGAGGGGCT	AGGGCCATAT	GGÄAACATGA	3100
CAGAAGGGGA	GAGAGAAAGG	AGACACGCTG	CÄGGGGGCAG	GAAGCTGGGG	3150
GAACCCATTC	TCCCAAAAAT	AAGGGGTCTG	AGGGGTGGAT	TCCCTGGGTT	3200
TCAGGTCTGG	GTCCTGÄATG	GGAATTCCTG	GAATACCACC	TGACAATGAT	3250
TTCCTCCTCA	TCTTTCAACC	TCACCTCTCC	TCATCTAAGA	ATTGCTCCTC	3300
GTOGTCATCC	TTCTCCTAAC	TGCAAGGCTA	ACGCTOTCCA	GCCCGGCTCC	33S0
TCCTGCTTGT	GACCTCCGAG	TCCTCAGTAA	ACTGCTTCGT	GACTCCCATG	3400
TCcrrcACAG	CAGACTGGTG	AGAACTCCCA	XCATTATCCC	CTMATCCGC	3450
GTAACTGGTA	AGACACCCAT	ACTCCCAGGA	AGACAC2ATC	ACTTCCTCTA	3500
ACTCCTTGAC	CCAATGACTA	TTCTTCCCAT	ATTGTCCCCA	CCTACTGATC	3550
ACACTCTCTG	ACAAGÄATTA	TTCTTCACÄA	TACACCCCGC	ATTTAAAAGC	3600
TCTCGTCTAG	AGATAGTACT	CATGGAGGAC	TAGCCTGCTT	ATTAGGCTAC	3650
CATAGCTCTC	TCTATTTCAG	CTCCCTTCTC	CCCCCACCAA	tctttttcaa	3700
CAGAGCCAGT	GCCCAGAGGT	TCACCCTTTG	CCTACACCTG	TCCTGCTGCC	3750
TGCTGTGGAC	TTTAGCTTGG	GAGAATGGAA	AACCCAGATG	GTAAGAAAGC	3800
CATCCCTAAC	CTTGGCTTCC	CTAAGTCCTG	TCTTCAGTTT	CCCACTGCTT	38S0
CCCATGGATT	CTCCAACATT	CTTGAGCTTT	TTAAAAATAT	CTCACCTTCA	3900
GCTTGGCCAC	CCTAACCCAA	TCTACATTCA	CCTATGATGA	TAGCCTGTGG	3950
ATAAGÄTGAT	GGCTTGCAGG	ΤΟΟΛΑΤΑΤΟΤ	GAATAGATTT	GAAGCTGÄAC	4000
ÄCCATGAAÄA	GCTGGAGAGA	AATCGCTCAT	GGCCATGCCT	TTGACCTATT	4050
CCYGTTCAGT	CTTCTTAÄAT	TGGCATGAAG	AAGCAAGACT	CATATGTCAT	4100
CCACAGATGA	CACAAAGCTG	GGAAGTACCA	CTAAAATAAC	AAAAGACTGA	4150
ATCAAGATTC	ÄAATCACTGA	AAGACTAGGT	CAAAÄACAAG	GTGAAACÄAC	4200
AGAGATATAA	ACTTCTÄCAT	GTGGGCCGGG	GGCTCACGCC	TGTAATCCCA	4250
GCACTTTGGG	AGGCCGAGGC	AGGCAGATCA	CCTGAGGGCA	GGAGTTTGAG	4300
AÄCAGCCTGG	CCAACATGGC	GAAACCCCGT	CTCTACTAAG	AATACÄAAAT	43S0
TAGCCGGGCA	TGGTACTGCÄ	TGCCTGTAAT	CCCAGCTACT	TGGAAGGCTG	4400
AAGCAGGAGA	ATCCCTTGAA	CCCAGGAGGT	GGAGGTTGTA	GTGAGCTGAG	4450
ATCATGCCAA	TOCACTCCAG	CCTGGGTGAC	AAGAGCAAAA	CTCCGTCTCA	4500
AAAAGAAAAA	AAAATTCTAC	ATGTGTAAA7	TAATGAGTAA	AGTCCTATTC	4550

CAGCTTTCAG GCCACAATGC CCTCCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600
AGCACT7CCT	ACQAAAAGGA	TCTGAGAGAA	WAAATTGCC	CCCAÄACTTA	4650
CCATGTAACA	TTACTGAAGC	TGCTATTCTT	AAAGCTAGTA	ATTCTTOTer	4700
GTTTGATGTT	TAGCATCCCC	AÍTGTGGAAA	TGCTCGTACA	GAACTCTATT	4750
CCGASTGGAC	TACAOTAAA	TATACTGGCC	TGAACACCGG	ACATCCCCCT	4800
GAAGACATAT	GCTAATTTAT	TAAGAGGGAC	CATATTAAAC	TAACATGTCŤ	4850
CTAGAAAGCA	GCAGCCŤGAA	CAGAAAGAGA	CTAGAAGCAT	GTTTTATGGG	4900
CAATAGTTTA	AAAAACTAAA	ATCTAŤCCTC	AAGAÄŕCOTA	ÔCGTCCCTTC	4950
TTCC7TCAGG	ACTGAGTCAG	GGAAGÄAGGG	CAGTTCCTAT	GGCTCCCTTC	5000
TAGTCCTTTC	TTTTCATCCT	TATGATCATT	ATGGTAGAGT	CTCATACCTA	5050
CATTTAGTTT	ΑΤΤΊΑΤΤΑΤΤ	ATTATTTGAG	ACGGAGTCTC	ACTCTATCCC	5100
CCAGGCTGGA	GTGCAGTGGC	ATGATCTCAA	CTCACTGCAA	CCTCAGCCTC	5150
CCGGATTCAA	GCGATTCTCC	TGCCTCAGTC	TCCCAAGTAG	CTGGGATTAC	5200
AGGTGCCCAC	CACCATGCCC	AGCTAATTTT	TCTATTTTTG	GTAGAGATGG	5250
GGTTTCACCA	TGTTGGCCAG	GCTGATCTTC	AÄCTCCTGAC	CTCAGGTGAT	5300
CCACCTGCCT	CAGCCTCCCA	AAGTGCTGGG	ATTACAGGCG	TQAGCCACTG	5350
CACCCAGCCT	TCATTCAGTT	TAAAAATCAA	ATGATCCTAA	GGTTTTGCAG	5400
CAGAAAGAGT	AAATTTGCAG	CACTAGAACC	AAGAGGTAAA	AGCTGTAACA	5450
gggcagattť	CAGCAACGTA	AGAAAAAAGG	AGCTCTTCTC	ACTGAAACCA	5500
AGTGTAAGAC	CÄGGCTGGAC	TAGAGGACAC	GGGAGTTTTT	GAAGCAGAGG	5550
CTGATGACCA	GCTGTCGGGA	GACTGTGAAG	GAATTCCTGC	CCTGGGTGGG	5600

ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCACCCTGTA TGATTCACTC TGCTGGCTAC 5650
TCCTAAGGCT	CCCCACCCGC	ITTTAGTGTG	CCCTT7GAGG	CAGTGCGCT?	5700
CTCTCTTCCA	TCTCTTTCTC	AGGAGGAGAC	CAAGGCACAG	GACATTCTGG	5750
GAGCAGTGAC	CCTTCTGCTG	GAGGGAGTGA	TGGCAGCACG	GGGACAACTG	5800
GGACCCACTT	GCCTCTCATC	CCTCCTGGGG	CAGCTTTCTG	GACAGGTCCG	5850
TCTCCTCCTT	ggggccctgc	AGAGCCTCCT TGGAACCCAG	GTAAGTCCCĹ2	S900
AGTCAAGGGA	TCTGTAGAAA	CT.™	CTGACTCAGT	CCCACTAGAA	5950
GACCTGAGGG	AAGAAGGGCT	CTTCCAGGGA	GCTCAAGGGC	AGAAGAGCTC	6000
ATCTACTAAG	AGTGCTCCCT	GCCAGCCACA	ATGCCTOGGT	ACTGGCATCC	6050
tctctttcct	ACTTACkCAA	GGGAGGCCŤG	AGATCTGGCC	CTGGTGTTTQ	6100
GCCTCAGGAC	CATCCTCTGC	CCTCAGCTTC	CTCCACAGGG	CAGGACCACA	6150
GCTCACAAGG	ATCCCAATGC	CATCTTCCTG	AGTTTCCAAC	ACCTQCTCCO	6200
AGGAAAGGTG	CGTTTCCTGA	TGCTTGTAGG	AGGGTCCACC	CTCTGCGTCA	6250
GGCGGGCCCC	ACCCACCACA	GCTGTCCCCA	GCAGAACCTC	TCTACTCCTC	6300
ACACTGAACG	AGCTCCCAAA	CAGGACTTCT	GGATTGTTOG	AGACAAACTT	6350
CACTGCCTCA	GCCAGAACTA	CTGGCTCTGG	GCTTCTGAAG	TGGCAGCAGG	6400
GATTCAGAGC	CAAGATTCCT	GGTCTGCTGA	ACCAAACCTC	CAGGTCCCTG	6450
GACCAAATCC	CCQGATACCT	QAACAGGATA	CACGAACTCT	TGAATGGAAC	6500
TCGTGGACTC	TTrecTCGAC	CCTCACGCAG	GACCCTAGGA	GCCCCGGACA	6550
TTTCCTCAGG	AÄCATCAGAC	ACAGGCTCCC	TGCCACCCAA	CCTCCAGCCT	6600

SK 282265 Β6

GOATATTCTC	CTTCCCCAAC	CCATCCTCCT	ACTGGACAGT	ATACGCTCTT	6650
CCCTCTTCCA	CCCACCTTGC	CCACCCCTCT	GGTCCAGCTC	CACCCCCTGC	6700
TTCCTGACCC	TTCTGCTCCA ACQCCCACCC	CTACCAGCCC	TCTTCTAAAC	6750
ACATCCTACA	CCCACTCCCA	GAATCTGTCT	CAGGAAGGGT	aaccttctca	6600
GAČACTGCCG	ACATCAGCAT	TGTCTCATGT	ACAfiCTCCCT	TCCCTGCAGG	6850
GCGCCCCTGG	GAGACAÄCTG	GACAAGATTT	CCTACTTTCT	CCTGAAACCC	6900
AAAGCCCTGG	TAAAACGGAT	ACACASGACT	GAAAAGGGAA	TCATTTTTCA	6950
CTÚTACATTA	TAAACCTTCA	GAAGCTATTT	TTTTAAGCTA	TCAGCAATAC	7000
TCATCAGAGC	AGCTAGCTCT	TTGGTCTATT	TTCTGCAGAA	ATTTGCAACT	7050
CACTGATTCT	CTACATGCTC	TTTTTCTGTG	ATAACTCTGC	AAAGGCCTGG	7100
GCTGGCCT3G	CAGTTGAACA	GAGGGAGAGA	CTAACCTTGA	GTCAGAAAAC	7150
AGÄGAAÄGGG	ΤΑΑΤΠΧΧΤΓ	TGCTTCAAAT	TCAAGGCCTT	CCAACGCCCC	7JO0
CATCCCCTTT	ACTATCATTC	TCAGTGGGAC	TCTGATCCCA	TATTCTTAAC	7250
AGATCTTTAC	TCTTGAGAAA	TGAATAAGCT	TTCTCTCAGA	AATGCTCTCC	7300
CTATÄCACTA	GACAAAACTG	AGCCTGTATA	AGGAATAAAT	GGGAGCGCCG	7350
AAAAJ3CTCCC	TAAAAACCAA	GGGAAAGATG	TrcTTcoajse	GTOGCAATAG	7400
ATCCCCCTCA	CCCTGCCJUX	CCAAACAAAA	AAGCTAACAG	GAAGCCTTGG	7450
AGAGCCTCAC	ACCCCAGGTA	AGGCTGTGTA	GACAGTTCAG	TAAAGACAGG	7500
ACCTGGATGT	GACÄGCTGAG	CAÄACAGCTA	GAGCTTTGGC	AGCTCASCAG	7550
GAG^TTTGC	CAGGCATGGA	CGCCTGCCTC	CCTCCTGTGG	AOGTCAGGAG	7600

GAAGTGCÄGG AAGTGGCATO AGTCAGGCTC CTTGAGCTCA CACAGCAGGA 7650· OAAXZAAGTAC AAGTCAMSTA CäXGTTOMG GCTCÄTTTCC CACTTCCCGC 7700 AAATGCATCT AAAAACCAGC TCTGTGTGAC CACCATAAAC TCTGCTAGGG 7750 GATCTCTAAA AAGGAGTCAG GCTTATGGGG CTTTGCAAAT AAGTGCTGCC 7800 TTCGTGCTCA GGAAAAGGTT TGTGTTGCAC AAAACACAAA TTCCACTGC 7019 (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 12 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžla: 1443 biz (B) Typ: nukleová kyselina (Q Vlákno; jedno (D) Topdógia: fineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12

GÄGTCCTTGG	CCCACCTCTC	TCCCACCCGA	erCTGCCGAA	ÄGÄAGCACÄG	50
AAGCTCAAGC	CGCCTCCATG	GCCCCAGGAA	AOATTCAGGG	GAGÄGGCCCC	100
ATACAGGGAG	CCACTTCAGT	TAGACACCCT	GGCCAGAATG GAGCTGÄCTG	150
ATTTCCTCCT	GGCGGCCATG	CTTCTTGCAG	TGGCAAGACT	AACTCTCTCC	200
AGCCCCGTAG	CTCCTCCCTG	TGACCCCAGA	CTCCTAAATA	AACTGCTCCG	250
TGACTCCCAC	CTCCTTCACA	GCCGACTGAG	TCAGTGTCCC	GACGTCGÄCC	300
CTTTGTCTAT	CCCTGTTCTG	CTGCCTGCTC	TGGACTTTAG	CCTGGGAGAA	350
TGGAXAACCC	AGACGGAACA	GAGCAADGCA	CAGGACATTC	TAGGGGCAGT	400
GTCCCTTCTA	CTGGAGGGAG	TGATGGCAGC	ACGAGGACAS	TTGGAAÚCCT	450
CCTGCCTCTC	ATCCCŤCCTG	GGACAGCTTT	CTGGGCAQGT		500
TTGGGGGCCC	TGCACGGCCT	CCTAGGAACC	CACGGCAGGA	CCACAGCTCA	550
CAAGGACCCC	AATGCCCTCT	TCTTGAGCTT	GCAACAACTG	CTTCGGGGAA	600

ÄGGTGCGCTT	CCTCCTTCTG	GTAGAACGTC	CCACCCTCTG	TGTCAfiACGO	650
ACCCTGCCAA	CCACAGCTGT	CCCÄAGCAGT	ACTTCTCAAC	TCCTCACACT	700
AAACAAGTTC	CCÄAACAGGA	CTTCTGGATT	GTTGGAGACG	AACTTCAGTG	750
TCACAGCCAG	AÄCTGCTCGC	CCTGGACTTC	TGAGCAGGCT	TCAGGGATTC	600
ACAGTCMGA	TTACTCCTGG	TCAGCTAAAT	CAAACCTCCA GGTCCCCAGT	850
CCAAATCTCľ	GGATACCTGA	ACAGGACACA	CGGACCTGTG	AATGGAACTC	900
ATGGGCTCTT	TGCTGGAACC	TCACTTCAGA	CCCTGGAAGC	CTCAGACATC	950
TCGCGCGGAG	CTTTCAACAA	XGGCTCCCTG	GCA1TCAACC	TCCAGGGTCG	1000
ACTTCCTCCT	TCTCCAAGCC	TTGCTCCTGA	TGGACACACA	CCCTTCCCTC	1050
CTTCACCTGC	CTTGCCCACC	ACCCATGGAT	CTCCACCCCA	GCTCCACCCC	1100
CTGTTTCCTG	ACCCTTCCAC	CACCATGCCŤ	AACTCTACCG	CCCCTCATCC	1150
AGTCACAATG	TACCCTCATC	CCAGGAATTT	GTCTCAGGAA	ACATAGCGCG	1200
GGCACTCGCC	CAGTGAGCGT	CTGCAGCTTC	tctcggggac	AMJCTTCCCC	1250
AGGAAGGCTG	AGAGGCAGCT	GCATCTGCTC	CAGATGTTCT	GCTJTCACCT	1300
AAAAGGCCCT	GGGGAAGGGA	TACACAGCAC	TGGAGATTGŤ	AAAATTTTAG	1350
GAGCTATTTT TTTTTAACCT	ÄTCAGCAATA	TTCATCAGAG	CAGCTAOCGA	1400
TCTTTGGTCT ÄTTTTCGGTA	TAAATTTGAA	AATCACTAAT	TCT 1443

(2) Informácia pre SEQ ID NO: 13 (i) SdcvcoSué charakteristiky;

(A) iMžka: 352 aminokyselín (B) Typ: unnokysetini (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO*. 13

Met

Glu

Leu

Tbx

A*p

UU

Leu

Leu

Ala

Ala

Met

Leu

Leu

Ala

Val

1

5

10

15

Ala

Arg

Leu

Thr

Uu

Ser

Ser

Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Cya

Aap

Pro

20

25

30

Arg

Leu

Leu

Aan

Lys

Uu

Uu

Arg

Asp

Ser

Hla

Uu

Leu

Hi«

ser

35

40

45

Aig

Leu

ser

Gin

Cya

Pro

Asp

Val

Asp

Pro

Uu

Sex

íle

Pro

Val

50

55

60

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Pňe

Ser

Uu

Gly

Glu

Trp

Lya

Thr

Gin

65

70

75

Thr

Glu

Glu

Ser

Lys

Ala

Gin

Xsp

íle

Leu

Gly

Ala

Val

Sex

Leu

80

85

90

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

uu

Glu

Pre

Ser

95

100

105

Cy»

Leu

Ser

Sex

Uu

Uu

Cly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

arg

Uu

110

115

120

Leu

Uu

Gly

Ala

Uu

Gin

Gly

Uu

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Axg

Thr

125

130

135

Thr

Ale

H1S

Lya

Acp

Pro

Asn

Ala

Uu

Phe

Leu

Ser

Uu

Gin

Gin

140

14S

150

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Ph·

Uu

Uu

Uu

Val

Clu

Gly

Pro

155

160

165

Thr

Leu

Cya

Val

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

val

Pro

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Ser

Gin

Leu

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

Pre

Asn

Arg

Thr

185

190

195

Ser

Gly

Leu

Uu

Glu

Thr

Aan

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

200

205

210

Gly

Pro

Gly

uu

Leu

Ser

Arg

Uu

Gin

Gly

Phe

Arg

val

Lys

íle

215

220

225

Thr

Pro

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Val

Gin

íle

230

235

240

Ser

Gly

Tyr

Uu

Aan

Arg

Thr

Hla

Gly

Pro

Val

Asn

Gly

Thr

His

245

250

255

Gly

Leu

Ph·

Ala

Gly

Thr

Sex

Leu

Gla

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

260

265

270

íle

Ser

Pro

Gly

Ala

Ph«

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

275

260

285

Gin

Gly

Gly

Uu

Pro

Pro

Ser

Pre

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

Hla

290

295

300

Thr

Pro

Ph·

Pro

Pro

306

Sex

Pro

Ala

Leu

Pro Thr

310

Thr

HÍS

Gly S*r

315

Pro

Pro

Gin

Leu

His

320 pro

Leu

Phe

Pro

Asp Pro

325

Ser

Thr

Thr Met

330

Pro

Asn

Ser

Thr

Ale

335

Pro

His

Pro

Val

Thr Met

340 *yr

Pro

His Pre

345

Arg

Asn

Leu

Ser

Gin

350

Glu

Thr

352 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 14 (i) Sekvenčné charakteristiky: (A) Dĺžka:

1536 báz (B)Typ:

nukleová kyselina (C) Vlákno:

jedno lineárna (D) Topotógb:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14

GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGÄTTCAGGG GAGÄGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT

TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTe 150

ATTTGCTCCT GGCGGCCATG

CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTCTCTCC 200

AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG

TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250

TGACTCCCAC CTCCWCACA GCCGACTGAC TCACTOTCCC GACGTCGACC 300 ctttgtctat ccctgttctg ctgcctgctc tggactttag CCTGGGAGAA 350

TGGAAÄACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 4QQ

GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450

CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG CGACAGCTTT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC 500

TTGGGGGCCC TGCAOSGCCT CCTAGGAACC CAGCTTCCTC TACASÔGCAG 550

GACCACAGCT CACAAGGACC CCAATGCCCT CTTCTTGAGC TTGCAACAAC 600

TGCTTCGGGG AAÄGGTGCGC TTCCTGCTTC TGGTAGAAGG TCCCACCCTC 650

TGTGTCAGAC GGACCCTGCC AACCACAGCT GTCCCAAGCA GTACTTCTCA 700

ACTCCTCACA CTAAACAAGT TCCCAAACAG GACTTCTGGA TTGTTQGäGA 750

CGAACTTCAG TGTCACAGCC AGÄACTGCTG GCCCTCGACT TCTGAGCAGG 80Q

CTTCAGGGAT TCAGAGTCAA GATTACTCCT GGTCAGCTAA ATCAAACCTC 850

CAGGTCCCCA GTCCAAATCT CTGGATACCT GAACAGGACA CACGGACCTG 900

TGAATGGAAC TCATGGGCTC TTTGCTGGAA CCTCACTTCA GACCCTGGAA 950

(B) Typ

anuaokysdini

(D) TopolôgU:

lineárna

(xi) Opis sckven*

áe: SEQ ID Na 15

Met

Glu Leu

Thr

Asp

Leu

Leu Leu

Ala

Ala

Met

Leu

Leu

Ala

val

1

$

10

15

Ale

Arg Leu

Thr

Leu

Ser

Ser Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

20

25

30

Ať«

Leu Leu

Asn

Lys

Leu

Leu Arg

Asp

Ser

Hla

Leu

Leu

His

Ser

35

40

45

Arg

Leu Ser

Gin

Cys

Pro

Asp Val

Asp

Pro

Leu

Ser

íle

Pro

Val

50

55

60

Leu

Leu Pro

Ala

Val

Aap

Phe Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

65

70

75

Thr

Glu Cln

Ser

Lys

Ala

Gin Asp

íle

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

80

85

90

Leu

Leu Glu

Gly

Val

Met

Ala Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

95

100

105

Cys

Leu Ser

Ser

Leu

Leu

Gly GLn

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

110

115

120

Leu

Leu Gly

Ala

Leu

Gin

Gly Leu

Leu

Gly Thr

Cln

Leu

Pro

Leu

12S

130

135

Gin

Gly Arg

Thr

Thr

Ala

His Lys Asp

Pro

Aen

Ala

Leu

Phe

Leu

140

145

150

Ser

Leu Gin

Gin

Leu

Leu

Arg Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

15 S

260

165

val

Glu Gly

Pro

Thr

Leu

Cys Val

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

170

175

180

Ala

Val Pro

Ser

Ser

Thr

Ser Gin

Lau

Lau

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

185

190

195

Pro

Asn Arg

Thr

Ser

Gly

Leu Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Val

Thr

200

205

210

Ala

Arg Thr

Ala Gly

Pro

Gly Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

215

220

225

Arg

Val Lys

íle

Thr

Pro

Gly Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

230

235

240

Pre

Val Gin

íle

Ser

Gly Tyr Leu Asn

*1?

Thr

His

Gly

Pro

Val

245

250

255

Asn

Gly Thr

His

Gly

Leu

Phe Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

250

265

270

Glu

Ala Ser

Asp

íle

Ser

Pro Gly

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

275

280

285

Ala

Phe Asn

Leu

Gin

Gly

Gly Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

i Ala

290

295

300

Pro

Asp Gly

His

Thr

Pro

Phe pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

i Thr

305

310

315

Thr

His Gly

Ser

Pro

Pro

Gin Leu

HLs

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

320

325

330

Ser

Thr Thr

Mat

Pro

Asn

Ser Thr

Ala

Pro

His

Pro

val

Thr

Met

33S

340

345

Tyr

Pro His

Pro

Arg

Asn

Leu ser

Gin

Glu

Thr

350

3S5

356

(2) Informácia pre SEQ ID NO: 16

(i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžka

241 aminokyselín

GCCTCAGACA TCTCQCCCGG AGCTTTCAAC AAAGGCTCCC TGGCATTCAA 1000 aminokyselina

CCTCCAGGGT GGACTTCCTC CTTCTCCAAG CCTTGCTCCT GATGGACACA 1050 (D) Tapológii: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16

CACCCTTCCC TCCTTCACCT GCCTTGCCCA CCACCCATGG ATCTCCACCC 1100

CAGCTCCACC CCCTGTTTCC TGACCOTTCC ACCAGCATGC CTAACTCTAC 1150

CGCCCCTCAT CCAGTCACAA TGTACCCTCA TCCCAGGAAI TTGTCTCAGG 1200

AAÄCATAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAQC GTCTGCAGCT TCTCTCGGGG 12SO

ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG CTGCATCTGC TCCAGÄTGTT 1300

CTGCTTTCAC CTAAAACGCC CTGGGGAAGG GATACACAGC ACTOGAGATT 1350

GTAAAATTTT ACGAGCTATT TTTTTTTAAC CTATCAGCAA TATTCATCÄG 1400

AGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGG TATAAATTTG AAAATCACTA 1450

AAAAAAAAAA AAAAÄAAÄAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1500

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1536 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 15 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžka: 356 Aminokyselín

Ser

Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

íle

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val ·

ASp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

íle

ĹeU

Gly 65

Ala

Val

Ser

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

val

Met 75

Ale

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

GLn

95

100

105

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Lau

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin

Lau

Leu

12 S

130

135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

íle

Val

Gly

Asp

Glu

Leu

Gin

Cys

Ria

140

145

150

Ser

Gin

Asn

cy»

Trp

Pro

Trp

Thr

Ser

Glu

Gin

Ale

Ser

Gly

íle

155

L60

165

Gin

Ser

Gin

Asp

Tyr

Ser

Trp

Ser

Ala

Lys

Ser

Asn

Leu

Gin

Val

170

175

1B0

SK 282265 Β6

Pro

Ser

Pro

Asn

Lau

Trp

íle

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

cye

185

190

195

Glu

Trp

Asn

Sér

Trp

Ala

Leu

Cy«

Trp

Aen

Leu

Thr

Ser

A»p

Pro

200

205

210

Gly

Ser

Leu

Arg

HiS

Leu

Ala

Arg

Ser

Phe

Gin

Gin

Arg

Leu

Pro

215

220

225

Gly

íle

Gin

Pro

Pro

Gly

Trp

Thr

Ser

Ser

Phe

Ser

Lya

Pro

Cye

230

235

240

Ser

341 (2) Informácia pre SEQ Π) NO:17 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍlka : 335 iminokyadxn (B) Typ; ammäkysdiM (D) Topológia: hneárna (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 17

Ser

Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

1

S

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

HiS

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

íle

Pro

Val

teu

Leu

Pro

Ala

Val

A«p

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lya

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Aip

íle

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

<5

70

75

Ale

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Sex

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Gly

Leu

Leu

Gly

ttur

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

lis

120

His

Lys

Asp

Pro

A*n

Ala

Leu

Phe

Leu

Sar

Leu

Gin

Gin

Lau

Leu

U S

130

135

Arg

Gly

Lya

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

val

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

140

145

150

Cye

Val

Arg

Arg

Thr

Leu

PXQ

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

155

160

165

Ser

Gin

L«U

Leu

Thr

Leu

Asn

Lya

Phe

Pro

Aan

Arg

Thr

Sar

Gly

*-

170

175

180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro

185

190

19S

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg

val

Ly*

íle

Thr

Pro

200

205

210

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Val

Gin

Íle

Ser

Gly

215

220

235

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Val

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

230

235

240

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

íle

Ser

245

250

255

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly

260

265

270

Gly

Leu

Pro

Pro

Sar

Pro

Ser

Lau

Ma

Pro

Asp

Gly

His

Thr

Pre

275

280

285

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

ALa

Leu

Pro

Thr

Thr

His

Gly

Ser

Pro

Pro

290

395

300

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

Thr

Thr

Met

Pro

Asn

30S

310

315

Sex

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Val

Thr

Met

Tyr

Pro

His

Pro

Arg

Asn

320 325 33Q

Leu Ser Gin Glu Thr

335 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 18 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia;

(xi) Opis sekvencie: SEQTDNO: 18

332 aminokyselín aminokyselina Hučania

Ser

Pro

Ala

Pr©

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

1

S

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Gly

Arg

Leu

Sar

Gin

Cyi

Pro

20

25

30

Asp

íle

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pre

Ala

Val

Asp

35

40

45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

Val

Leu

Gly

Ala

Thr

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Ala

val

Met

65

70

75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gin

Val

Gly

Pro

Pro

Cy.

Leu

Sar

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Val

Gin

Leu Ser

Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin

95

100

105

Asp

Leu

Leu

Gly

Mat 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly Arg

Thr

Thr

Ma 120

His

Lys

A»p

Pro

Ser 125

Ala

íle

Phe

Leu

Asn 130

Phe

Gin

Gin

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Leu

Leu

Val 145

Val

Gly

Pro

Sar

Leu 150

cye

Ala

Lya

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Ma

Ha

AU Val 160

Pr©

Ser

Ser

Thr 165

Sex

Pro

Phe

HiS

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 160

Leu

Lau

G1U

Thr

Asn 185

Ser

Ser

íle

Ser

Ma 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Phe

Lau

Lys

Arg 200

Leu

Gin

Ale

Phe

Arg 20$

Ala

Lys

íle

Pro

Gly 210

Leu

Lau

Asn

Gin

Thr 215

Sar

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

íle

Pro

Gly

His 225

Gin

Asn

Cly

Thr

His 230

Gly

Pr©

Leu

Ser

Gly 235

XI e

Kla

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Gin

Pro 245

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

íle

Pro

Pro 2S5

Ala

Thr

Ser Gly

Met 260

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr 265

Tyr

Leu

Gin

Pzo

Gly 270

Glu

Sar

Pro

Ser

Pro 275

Ala

His

Pro

Ser

Pro 260

Gly Arg

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Sex

Pro

Sex

Pro 290

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro 295

Thr

Val

Gin

Leu

Gin 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ma

íle

Thr 310

Pro

Asn

Ser

Thr

Sar 315

Pro

Leu

Leu

Phe

Ma 320

Ma

His

Pro

His

Phe 325

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin 330

Glu G1U

333 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 19 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžki: 1026 Hz (B) Typ : nukleová kysdma (C) Vlákno; jedno (D) Topológia; fineénu (xi) Opis sekvencie: SEQ 0) NO: 19

AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG 7GACCCCCGA CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50
TGACTCCCAT	GTCCTTCACG	GCAGACTGAG	CCAGTGCCCA	GACATTAJCC	100
CTTTGTCCAC	ACCTGTCCTG	CTGCCTGCTG	TGGACTTCAC	CTTGGGAGAA	150
TGGAAAACCC	AGACGGAGCA	GACAAAGGCA	CAGGATGTCC	TGGGAGCCAC	200
AACCCTTCTG	CTGGAGGCAG	TGATGACAGC	ACGGGGÄCAA	GTGGGACCCC	250
CTTGCCTCTG	ATCCCTGCTG	GTGCAGCVn	CTGGACAGGT	TCGCCTCCTC	300
CTCCGGGCCC	TGCAGGACCT	CCTTGGAATG	CAGCTTCCTC	CACAGGGAAG	350
GACCACAGCT	CACAAGGATC	CCAGTGCCAT	CTTCCTGAAC	TTCCAACAAC	400
TGCTCCGAGG	AAAGGTGCGT	TTCCTGCTGC	TTGTAGTGGG	GCCCTCCCTC	450
TGTGCCAAGA	GGGCCCCACC	CGCCATAGCT	GTCCCGXGCA GCACCTCTCC	500
ATTCCACACA	CTGAACAAGC	TCCCAAACAG	GACCTCTGGA	TTGTTGGAGA	550
CAAACTCCAG	TATCTCAGCC	AGAACTACTG	GCTCTGGATT	TCTCAAGAGG	600
CTGCAOGCAT	TCAGAGCCAA	GATTCCTGGT	CTGCTGAACC	AAACCTCCAG	650
GTCCCTAGAC	CAAATCCCTG	GACXCCAGAA	TGGGACACAC	GGACCCTTGA	700
GTGGAATTCA	TGGACTCTTT	CCTGGACCCC	AACCCGGGGC	CCTCGGAGCT	7S0
CCAGACATTC	CTCCAGCAAC	TTCAGGCATG	GGCTCCCGGC	CAACCTACCT	600
CCÄGCCTGGA	GAGTCTCCTT	CCCCAGCTCA	CCCTTCTCCT	ÔGACGATACA	850
ctcTcrrcTc	TCCTTCACCC	ACCTCGCCCT	CCCCCACAGT	CCAGCTCCAG	900
	CTGACCCCTC	TGCGATCACA	CCCAACTCTA	CCAGTCCTCT	950
TCTATTTGCA	GCTCACCCTC	ATTTCCAGAA	CCTGTCTCAG	GAAGACTAAG	100(

(2) hfonnádi pre SEQ ID NO: 20

Thr

Leu Asn ty* Leu Pro 170

Atn Arg Thr

Ser Gly Leu 175

Leu Glu Thr 180

(i) Sekvenčné charakteristiky:

Asn

str

Ser

íle

Str

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Phe

Leu

Lya

(A) Dĺžka;

1014 báz

185

190

195

(B) Typ:

nukleová kyselina

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe

Arg

AU

Lys

íle

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

200

205

210

(C) Vlákno:

jedno

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

íle

Pro

Gly

His

Gin

Asn

Gly

Thr

(D) Topológia:

lineárna

21S

220

225

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20

His

Gly

Pro

Leu

Ser

Gly

11«

His

Gly

L*U

Phe

Pro

Gly

Pro

Gin

230

235

240

AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG

TGACCCCCGA

CTCCTÄAATA

AACTGCTTCG

50

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

íle

Pro

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly

245

250

255

TGACTCCCAT GTCCTTCACG

GCAGACTGAG

CCAGTGCCCA

GACATTAACC

100

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro

Gly

Giu

Ser

Pro

Ser

260

265

270

CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG

CTGCCTGCTC

TGGACTTCAC

CTTGGGAGÄA

150

Pro

Ala

His

Pro

Ser

Pro

Gly Arg Tyr

Thr

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser

27$

280

2B5

TGGAAAACCC AGACGGAGCA

GACAAAGGCA

CAGGATGTCC

TUGGAGCCAC

200

Pro

Thr

Ser

Pre

Ser

Pro

Thr

Val

Gin

Leu

Gin

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

ÄACCCTTCTG CTGGAGGCAG

ŤGATGACAGC

ACGGGGACAA

GTGGGACCCC

250

Asp

Pro

Ser

Ala

íle

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Phe

305

310

31S

CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG

GTGCAGCTTT

CTGGACAGGT

TCGCCTCCTC

300

Ala

Ala

His

Pro

His

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Clo

Glu

Glu

328

325

320

CTCGGGGCCC TGCAGGACCT

CCTTGGAATG CAGGCÄAGGÄ CCACAGCTCA 350 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 22

CAAGGATCCC AGTGCCATCT

TCCTCAACTT CCAACAACTC CTCCGAGGAA 400 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDlfia:

5141 báz

AGGTGCGTTT CCTGCTCCTT

GTACTGGGGC CCTCCCTCTC TGCCAAGAGG 450 (B) Typ :

nukleová kyseima

CCCCCACCCG CCATACCTGT

CCCQAGCAGC ACCTCTCCAT TCCACACACT 500 (C) Vlákno:

dvojité lineárna

GAACAAGCTC CCAAACAGGA. CCTCTGGATT GTTGGAGACA AACTCCAGTA 550 (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22

TCTCAGCCAG AACTACTGGC

TCTGGÄ7TTC TCAAGAGGCT GCAGGCATTC 600

TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT

AGAGTCGATC GACAGCTGTC 50

AGAGCCAAGA TTCCTGGTCT

GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTAGACCA·650

GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC

CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100

AATCCCTGGA CACCAGAATG

GGACACACGG ACCCTTGAGT GGAATTCATG

700

GAAGTATOľA AAGCATGCAT

CTCAATTAGT

CKXAACCAG CTGTGGAAAG 150

GACTCTTTCC TGGACCCCAA CCCGGGGCCC TCOGAGCTCC AGACATTCCT

750

TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG

CAGAAGTATG

CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200

CCAGCftACTT CAGGCATGGG CTCCCGGCCA ACCTACCTCC AGCCTGGAGA

800

GTCAGCAACC ATAGTCCCGC

CCCTAACTCC

GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250

GTCTCCTTCC CCAGCTCACC acgatacact ctctťctctc

850

CTTCACCCAC CTGGCCCTCC

CCCACAGTCC AGCTCCAGCC TCTGCTTCCT

900

GACCCCTCTG CGATCACACC

CAACTCTACC ÄGTCCTCTTC TATTTGCAGC

950

CGCCCAGTTC CGCCCATTCT

CCGCCCCATG

TATGCAGAGG CCGÄGGCCGC

AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC

CCGGGAACGG TGCATTGGAA

GCTGACTAAT TTTTTTTATT 300

CTCGGCCTCT GÄGCTATTCC AGAAGTACTG 350

TAGGCTTTTG CÄAAAAGCTA GCTTATCCGG 400

CGCGGATTCC CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 4SO

TCACCCTCAT TTCCAGAACC

TGTCTCAGGA AGAGTAAGGT GCTCAGACCC

1000

CTACCGCCTA TAGÄGCGATA ÄGAGGATTTT ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500

TGCCAACTTC AGCA 1014

TCGACCATTG AACTGCATCG TCGCCGTGTC CCAAAATATG GGGATTGGCA 550 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 21 (i) Sekvenčné charakteristiky:

AGAACGQAGA CCTACCCTCG CCTCCGCTCA GGAACCACTT CAAGTACTTC 600 (A) Dĺžka:

328 aminokyselín

CAAAGAATGA CCACAACCTC TTCAGŤGGAA GGTÄAACAGA ATCTGGTGAT 650 (B) Typ:

aminokyselina irneáma (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ΓΟΝΟ: 21

TATGGGTAGG AAAACCTGGT TCTCCATTCC TGAGAAGAAT CGACCT1TAA 700

AGGACAGAAT TAATATAGTT CTCAGTAGAG AACTCAAAGA ACCACCACGA 750

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

ASP

Ser

HÍS

Val

Leu

Kis

Gly

Arg

LeU

Ser

Gin

cys

Pro

20

25

30

Asp

íle

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

35

40

45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu

Trp

Ly«

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Thr

Lys

Ala

so

55

60

Gin

Asp

Val

Leu

Gly

Ala

Thr

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Ala

Val

Met

65

70

75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gin

Val

Gly

Pro

Pro

Cys

Leu

Ser

Stí

Ltu

Leu

80

8$

90

Val

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Μ»

Leu

Gin

95

100

105

A*p

Leu

Leu

Gly

Het

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

Kis

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Ser

Ala

íle

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Gin

Leu

Leu

Ara

Gly

Lys

Val

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Val

Gly

Pre

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg

HO

145

150

Ala

Pro

Pro

Ala

11«

Ala

val

Pro

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

Pht

Kis

155

160

165

GGAGCTCATF TTCTTGCCAA AAGTTTGGAT GATGCCTTAA GACTTATTGA 800

ACAACCGGAA TTGGCAAGTA AAGTAGACAT GGTTTGGATA GTCGGAGGCA 850

GTTCTGTTTA CCAGGAAGCC ATGAATCAAC CAGGCCACCT TAGACTCTTT 900

GTGACAAGGA TCATGCAGGA ATTTGAAAGT GACACGTTTT TCCCAGAAAT 950

TGAWGGGG AAÄTATAAAC CTCTCCCAGA ATACCCAGGC

1000

AGGTCCAGGA GGAAAAAGGC ATCAAGTATA AGTTTGAAGT CTACGAGAAG 1050

AAAGAC7AAC AGGAAGATGC TTTCAAGTTC TCTGCTCCCC TCCTAAAGCT 1100

ATGCATTTTT ATAAGACCAT GQGACTTTTG CTGGCTTTAG ATCCCCTTGG 1150

CTTCGTTAGA ACGCGGCTAC ÄATTAATACA TAACCTTATG TATCATACAC 1200

ATACGATTtA GGTGACACTA TAGATAACA1 CCACTTTGCC TTTCTCTCCA 12 SO

CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300

SK 282265 Β6

GTCGACTCTA	GAGGATCCCC	GGGGAATTČA	ATCGATGGCC	GCCATGGCCC	1350
AACTTGTTTA	TTGCAGCTTA	TAATGGTTAC	AAATAAAGCA	ATAGCATCAC	1400
AAATTTCACA	AATAAAGCAT	TTTTTTCACT	GCATTCTAGT	TGTGGTTTGT	1450
CCAAACTCAT	CAMGTATCT	TATCATGTCT	GGÄTCGATCG	GGAATTAATT	1500
CGGCGCAGCA	CCATGGCCTG	AAATAACCTC	TGAAAGAGGA	ACTTGGTTAG	1550
GTACCTTCTG	AGGCGGAAAG	AACCAGCTGT	GGAATGTGTG	TCAGTTAGGG	1600
TGTGGÄÄAGT	CCCCAGGCTC	CCCAGCAGGC	ÄGAAGTATGC	AAAGCATGCA	1650
TCTCAATTAG	TCAGCAACCA	GGTGŤGGAAA	GTCCCCAQGC	TCCCCACCAO	1700
GCAGAAGTAT	GCAAAGCATG	CATCTCAATT	AGTCAGCAAC	CATAGTCCCG	1750
CCCCTAACTC	CGCCCÄTCCC	SCCCCTAACT	CCGCCCAGTT	CCGCCCATTC	1800
TCCGCCCCAT	GGCTGACTAA	ΓΓΓΤΤΓΤΓΑΤ	TTATGCAGAG	GCCGAGGCCG	1850
CCTCGGCCTC	TOAGCTATTC	CAGAAGTAGT	GAGGÄGGCTT	TTTTOGAGGC	1900
CTAGGCTTTT	GCAAAAAGCT	GTTACCTCGA	GCGGCCGCTT	AATIAAGGCG	1950
CGCCATTTAA	ATCCTGCAGG	TAACAGCTTG	GCACTGGCCG	TCGTTTTACA	2000
ACGTCGTGAC	TGGGAAAACC	CTGGCGTTAC	CCAACTTAAT	CGCCTTGCAG	2050
CACATCCCCC	CTTCGCCAGC	TGGCGTAATA	GCGAAGAGGC	CCGCACCGAT	2100
CGCCCTTCCC AACAGTTCCG	TAGCCMAAT	GGCGAATGGC	GCCTGATCCG	2150
GTATTTľCTC	CTTACCCATC	TGTGCGGTAT	TTCACACCGC	ATACGTCAAA	2200
GCAACCATAG	TACGCGCCCT	GTAGCGGCGC	ATTAAGCGCG	GCGGGTGTGG	2250
TGGTTACGCG	CAGCGTGACC	GCTACACTTG	CCAGCGCCCT	AGCGCCCGCT	2300
CCTTTCGCTT	TCTTCCCTTC	CTTTCTCGCC	ACGTTCGCCG	GCTTTCCCCG	2350

TCAAGCTCTA	AATCGGGGGC	TCCCTTTÄGG	GTTCCGATTt	AGTGCTTTAC	2400
GGCACCTCGA	CCCCAAAAAA	CTTGATTTGG	gtgatggttc	ACGTAjGTCGG	2450
CCATCGCCCT	GATAGACGGT	TTTTCGCCCT	TTGACGTTGG	ÄGTCCACGTT	2500
CTTTAATAGT	GGACTCTTG7	TCCAAÄCTGG	AACAACACTC	AACCCTATCT	2S50
CGGGCTATTC	TTWGATTTA	TAAGGGATTT	ŤGCCGATTCC	GGCCTATTGG	2600
TTAAAAAATG	agctgattta	ACAAAÄATTT. aacgcgaatt	TTAACAAAAT	2650
ATTAACGTTT	ACAATTTTAT	GGTGCACTCT	CAGTACAATC	TGCTCTGATG	2700
CCGCATAGTt	AAGCCAACTC	CGCTAICGCT	ACGTGACTGG	GTCATGGCTG	2750
CGCCCCGACA	CCCGCCAACA	CCCGCTGACG	CGCCCTGACG	GGCTTCTCTG	2800
CTCCCGGCAT	CCGCTTACAG	ACAAGCTGTG	ACCGTCTCCG	GGAGCTGCAT	2850
gtgtcagagg	TTTTCACCGT	CATCACCGAA	ACGCGCGAGG	CAGTATTCTT	2900
GAAGACGAAA	GGGCCTCG7G	ATACGCCTAT	TTTTATAGGT	ΙΑΑΤΟΤΟΑΤβ	2950
ATäATAATGG	TTŤCTTAfiAC	gtcaggtggc	ACTTTTCGGG	GAAATGTGCG	3000
CGGAACCCC?	ATTTGTTTAT	TTTTCTAAAT	ACATTCAAAT	ATGTATCCGC	3050
TCATGAGÄCA	ATAACCCTQA	TAAATGCTTC	AATAATATCQ	AAAAAGGAAG	3100
AGTATGAGTA	TTCAACATTT	CCGTGTCGCC	CTTATTCCCT	TTTTTSCGGC	31S0
ATTTTGCCTT	CCTGTTTTTG	CTCACCCAGA	AACGCTGGTG	AAXCtAAAAG	3200
ATGCTGAAGA TCAGTrGGGT	GCACGAGTGG	GTTACAŤCGA	ACTSGATCTC	3250
AACAGCGGTA AGATCCTTGA	GAGTOTCGC	CCCGAAGAAC	GTTTTCCAAT	3300
GATG3ÄCACT TTTAAAGTTC	tgctatgtcg	CGCGGTA37A	TCCCÚTGATG	3350

ACGCCGGGCA AGAGCAÄCTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC 3400 TTGGTTGAGT äCTCACCAGT CACAGAäAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC 3450 AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATCAGTGAT AÄCACTCCGG 3500 CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTW 35S0 TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3400 GCTGÄATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG A7GCCAGCAG 3650 CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA 3700 GCTTCCCGGC AACAATTÄAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG 375Q ACCÄC7TCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTCGTTTATT GCTGATAAAT 3800 CTOGAGCGGG TOAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 3850 GATOGTAÄGC CCTCCOGTAT CCTWTJATC TACXCGACGG GGAGTCAGGC 3500 AACTATGGAT GAACGAÄATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCÍCACTGA 3950 TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT 4000 GATTTAAAAC TTCATŤ7TTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT 4050 TCATAATCTC KTGACCAAAA TCCCTTAACC TOAGTTTTCG TIGCACTGÄG 4100 CGTCAfiACCC CCTAGAÄAAG ATCAAAGGAT CTTCTTOAGA ΤΟΟΤΓΤΤΓΓΤ 4150 CTGCGCGŤÄA TCTGCTGCTC GCAAACÄJUA AAACCACCGC TACCAGCOGT 4200 GGTtTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCMC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 4250 GCTTCAGCAG AGCGCXGATA CCAAATACTC ŤCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 4300 TTAGGCCÄCC ACTTCAAGAA CTCÍGTACCA CCGCCTACAT ACCTCGCTG'X 4350 GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCCATAÄG TCOTGTCTTA 4400 CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAASGCGCA GCGCTCGGGC 4450 TOAACGGGGG GTTCCTGCAC ACAGCCCAGC TTGGACCGAA CGACCTACAC 4500 CGÄACTGAGA TACCTACAGC GTGACCATTG AGÄAAGCGCC ACGCTTCCCG 4550 AAGGGASAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GÍGGCAGGGT CGGAACAGGA 4600 GÄGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC 4650 TOTCGGGTIT CGCCACCTC? GACTJGAGCG TCGATTTTTG TGMGCTCGT 4700 CAGCGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCQGC CTTTTTACGG 4750 TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTGTTTC CTOCGTTATC 4800 tľCCTGÄTTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 4850 CTCGCCGCAG CCGAACGACC QAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG 4900 GAAGAGCGCC CAATACGCAA JUXGCCTCTC CCCGCGCGTT GGCCGATTCA 4950 TTAATCCAGC TGGCACGACA GGTTTCCCGA CTGGAAAGCG GCCACTCAGC 5000 GCAACGCAAT TAATGTOAGT TACCTCACTC ATTAGGCAČC CCAGGCTTTA SOSO CACTrrXÍGC TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGÄ GCGGATAACA 5100 ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGAATTA A 5141 (2) Infbimida pre SEQ ID NO: 23 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžki: 21 báz (B) Typ: nukleoví kyselini (C) Vlálmo: jedno (D) Topológia: Hneánia (xi) Opis sekvencie; SEQ Π) NO: 23

ATOTCTCCNG CNCCNCCNGCN 21 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 24 (j) Sékvea&é charakteristiky:

(A) Dĺžka : 21 báz (B) Typ ; nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológii: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ED NO: 24

ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 25 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25 báz nukleová kyselina jedno lineárna

ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21 (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30

Ser Pre Ah Pro Pro Als Cys Asp Pro Arg Leu Leu Aa Lys Leu

10 15

Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu

23 26 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 31 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžka: 25 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárni (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 31

Ser Pro Ah Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu

10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg

25 (2) Informácia pre SEQ ID NO.· 26 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: <B) Typ ;

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(») Opis sekvencie: SEQ ID NO: 26

ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 2i báz nukleová kyselina jedno kneámi (2) Informácii pre SEQ ID NO: 32 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvende: SEQ ID NO: 32

Xaa Pro Ah Pro Pro Ali Xaa Asp pro Arg Leu Xaa Asn Lys 15 10 14 aminokyselín aminokyselina lineárna (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 33 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 27 (i) Sekvenčne charakteristiky.

(A) Dĺžka: 21 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) VUkno: jedno (D) Topológia: lineárna (») Opis sekvencie; SEQ ID NO: 27

ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

aminokyselín aminokyselina lineárna (xí) Opis sekvende: SEQ ID NO: 33 Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg

I 5 9 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 28 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžku: 21 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28

ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) lufonnáda pre SEQ ID NO: 34 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka.

(B) Typ;

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvende; SEQ ID NO: 34 GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG OTATTTAGG AGTCG 45 báz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SĽQ ID NO: 29 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A)DÍäka:

P) Typ:

(D) Topológia:

i aminokyselín aminokyselina lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 33 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno- (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35

CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20 báz nukleová kyselina jedno lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ EDNO: 29

Ser Pro Ah Pro Pro Ah Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asi Lys Leu

5 10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gy Arg

25 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 36 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie; SEQ Π) NO: 36

NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21 báz nukleová kyseline jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 30 (i) Sekvenčné charakteristiky;

(A) Dĺžka ; 26 amínokysefa (B) Typ: aminokyselina (2) Informácia pre SEQ ID NO; 37 (i) Sekvenčné charakteristiky:

SK 282265 Β6

(A) Dĺžka:	69 báz
(B) Typ:	nukleová kyselina
(C) Vlákno:	jedno
(D) Topológia:	bteáma

(2) Informácia pre SEQ ED NO: 44 (i) SekvwČné charakteristiky;

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO; 37

CCAGCGCCGC CAGCCTGTOA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50

TGACCACGTT CAGCACGGC 69 (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

báz nukleoví kyselina jedno lineárna (2) Informácii pre SEQ ID NO: 38 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44

CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

báz nukleová kysebu jedno lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 38

GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GAnTATTTG ACGGAGCACT 50 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 45 (i) Sekvenčné charakteristiky;

(A) Dlžlu (B) Typ:

(C) Vlákno;

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45 báz nukleová kyselku jedno bneáma

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG 65

TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) Informácii pre SEQ Π) NO: 39 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžU: 69 báz (B) Typ: nukleová kyselina (Q Vlákno : jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie·. SEQ ID NO: 39

CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGACCACGTC CATCACGGC 69 (2) lofonnácit pre SEQ ID NO: 46 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ: (CJVlálmo:

(D) Topológia:

báz nukleová kyselina jedno lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46 GGTCCAAGGGA CCTGGAGGTT TG 22 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 40 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDĺžka: 69 báz (B) Typ: nukleová kysetisa (CJVlákno: jedno (2) Informácii pre SEQ JD NO; 47 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(D) Topológia:

lineárna (AJDĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

3i báz nukleová kyselina jedno lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO; 40

GGTCGTGGAG GCCGTACACT GCXjGGCTGAGGATTTATITG ACGAAGCACT 50 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69 báz nukleoví kyselina jedno lineárni (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 41 (i) Sekvenčné cbarakteriaiky: (AJDÍžkí:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia;

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41

CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 48 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDĺžka: 36 Hz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: tineáma (xi) Opis sekvencia: SEQ ID NO: 48

GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36 (2) informácia pre SEQ ID NO: 49 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 42 (i) Sekvea&c charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno (D) Topológia:

báz nukleová kyselina jedno lineárna (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDĺžka: 24 báz (B) Typ: nukleová kysehna (Q Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49 CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24 (xi) Opil ackvcnctc: SEQ ID NO: 42

GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATITATTrG ACGAAGCACT 50

GCTAGTACAG ATAGTOCCA 69 (2) Informácia pre SEQ ID NO; 5Ď (i) Sekvenčné charakteristiky:

(2) Informácia pre SEQ ID NO: 43 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 37 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno *. jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43

GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (A) Dĺžka:

(B) Typ: (Q Vlákno;

(D) Topológia:

báz nukleová kyselina jedno lineárna (xi) Opis sekveade: SEQ ID NO: 50 GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 51 (i) Sekvenčné chankterisiky: (A)DÍžki: 27báz

SK 282265 Β6

(B) Typ:	nukleoví kyselina
(C) Vlákno;	jedno
(D) Topológia:	lioeán»

(xi)Opis sekveacic: SEQIDNO: 51

CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (xi) Opi* sekvencie: SEQ ID NO*. 58

CGAAATTAAC CCTCACTAAA O 21 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 52 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ;

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NG 52

AATCCÄGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27 báz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NG 59 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka r (B) Typ:

(C) Vlákno i (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 59

103 báz nukleová kyselku jedno lineárna

TGĽAGCAAGG gctactgcca cactcgagct gcgcagatgc TAGCCTCAAG 50

AŤGGCTCATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 1CC

GCT 203 (2) Informácia pre SEQ1D NO: 53 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) D(a>:

(B) Typ: (QVlíkzo: (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53 CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28

2tbií nukleová kyselku jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 60 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ;

(C) Vlákno:

(D) Topológia.

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NG 60

103 báz nukleová kyselina jedno lineárna

AGCTTCTACA GSACCGGAAG ATCTTTGCCG CCGAATCGAT TTGGATCAGC 50 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 54 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ;

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NG 54

GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28

Hz nukleová kyselina jedno iineánu (2) Informácia pre SEQ IDNO: 55 (i) Sekvenčné charakteristiky;

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 55

GACTCGAGGA TCCATCOATT ΤΤΤΤΤΤΠΤΓ TTTTT 35 báz nukleová kyselina jedno lineárna (2} Informácia pre SEQ ID NG 36 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia;

(ň) Opis sekvencie: SEQ ID NG 56

GACTCGAGGA TCCATCG 17 báz nukleová kyselku jedno lineárni (2) Informácia pre SEQ ID NO: 57 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 57

GCTAGCTCTA GAAGCCCGOC TCCTCCTGCC TG 32 báz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 58 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ: (Q Vlákno:

(D) Topolápa:

báz nukleová kyselín* jedno lineárna

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCrcGA GTCTGGCACT AGCCCTTCCT 100

GCA 103 (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 61 (i) Sekvenčné charakteristiky;

(A) DÍžki: 18 H:

(B) Typ: suldet (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: hneán (xi) Opil sekvencie; SEQ1DNG 61 TCTCGCTACC GTTTACAG 15 (2) Informácia pre SEQ Π) NG 62 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(C) Vlákno:

(D) Topológia :

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 62

CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25 báz nukleová kyselina jedno tineáoa (2) Informácia pre SEQ IDNO: 63 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžk»:

(B) Typ: (CJVUlmo: (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 63 GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 báz nukleoví kyselina jedno Imeárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: <4 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis äekvencie: SEQ ID NO: 64

GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40

4Cbáz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: ¢5 (i) Sekvenčné charakteristiky: JAJDÍžfa: 32 Mi

SK 282265 Β6 (Q Vlákno: jedno (D) Topológia: iŕneáma (xi) Ópia sekvencie; SEQ Π) NO: 72

CGCGTTAAGA AGAAATGCGA ΤΑΤΤΟΤΤΗΤ CATAATT 37

(B)Typ:	nukleová kyselina
(Q Vlákno:	jedno
(D) Topológia:	bneáma

(xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 65

ATCGATATCG ATCAGCCAQA CACCCCGGCC AG 32 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 66 (j) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍŽka: 35 báz (B) Typ: nukleová kyselín (Q Vlákno: jedno (D) Topológia: tmeáma báz nukleová kyselina jedno lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 66

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 73 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍa>:

(B) Typ:

(Q Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 73

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50 CACATCGAAO GTCGTAGCC 69 (2) Informácii pre SEQ ID NO; 67 (i) Sekvenčné charakteristiky.' (A) Dĺžka: 33 báz (B) Typ: nukleová kysaboa (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárni (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 67

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 74 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dláh:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

báz nukleová kyselina jedno bneáma (xi) Opis sekvencie: SEQ BD NO; 74

TACGACCTTC CATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50 ΤΠΠΓΑΤΑΑ TT 62 (2) hfonuäi pre SEQ Π) NO; 69 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) OÍŽka: 36 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: hneáma (xi) Opis Sekvencie: SEQ ID NO: 68

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 75 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: (B>Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 75 báz nukleová kysetina jedno bneáma (2) Informácia pre SEQ ID NO: 69 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍŽU: 62 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAC CACGTAGCC 69 (D) Topológia; lineárni (xi) Opis sekvencie: SEQ DD NO: 69

CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50

AACTGCTTCG TG 62 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 76 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Otŕka:

(B) Typ:

(C) ) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opil sekvencie: SEQ ID NO: 76

TACGTGGTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GOTGATGAAA TGCGATATTC 50 TmTCATAA TT 62

Mz lúkleová kysdina jedno lineárni (2) informácia pre SEQ ID NO: 70 (i) Sekvenčné charakteristiky: (Airaikí: 61 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: bneáma (») Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 70

AGTCACGAAG CAOTTTACTO AGGACTCGOA GGTCACAAGC AGOAGOAGCC 50 GGGCTWCAT A 61 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 71 (2)Iofonnácia pre SEQ ID NO: 77 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDÍžk·: lSbáz (B) Typ : nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lunárna (xi) Opis sekvencie: SEQ IDNO 77

TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19 (i) Sekvenčné charakterisiky:

(A) DÍika:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

báz nukleová kyselina jedno

Hneánta (xi) Opis sekvencie: SEQONO: 71

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 72 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžb: 37 báz (B) Typ: nukleová kyaefcu (2) Informácia pre SEQ ID NO: 78 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDÍžk.: 18 báz (B) Typ: nukleoví kyselina (Q Vlákno: jedno (D) Topológia: bneáma (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 79 AGCTACCTGA CGCAGAGG 18 (2) Informácii pre SEQ ID NO: 79 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:	62 báz	(A) Dĺžka:	31 amínokyselia
(B) Typ:	nukleová kyaehu	(B) Typ:	amtookysetiu
(QVUkno:	jedno	(D) Topológia:	Imeáma
(D) Topológia:	lineárna	(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 86

(xi} Opis sekvencie: SEQ ONO: 79

GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTO TGACCTCCGA 50

GTTCTCAGTA AA 52

Met Lys Lys Asn íle Ala Pbe His Hs His Hs His His Hs Hs

10 15

De Glu Gty Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg

25 30 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 80 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(Q Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 80

GAAGGACATG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACTCG GAGGTCCCA 49

Ala báz nukleoví kyselina jedno lineárna aminokyselín aminokyselina lineárna (2) Informácia pre SEQ DD NO: 81 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO; 81

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45 báz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 87 (t) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 87

Met LysLys Asn Ee Ala Phe Hs Hs His His His Hs His His 15 10 15

He Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30

Ala

3] (2) informácia pre SEQ Π) NO: 82 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 38 báz (B) Typ: nukleová 1 (QVlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 82 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 88 (i) Sekveičné dunkteristíky.* (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 88 Thr Thr Ala Hs Lys Asp Pro

I 5 7 aminokyae&i ammoltyMlíaa lineárna

TACGACCTTC GATAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT 38 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 83 (Í) Sekvet&ié charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 83

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45 (2) Informácia pre SEQ ID NO 89 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 89

His Val Leu His unáokyseííny amino kyselina tineáma báz nukleová kyselina jedno lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 84 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Vlákno:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 84

TACGTTTAAG AAGAAATOCG ATATTCTTTT TCATAATT 38 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 90 (i) Sekvenčné charakteristiky,· (A) DÍlfca:

(B) Typ: (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO; 90 Ser Arg Leu Ser

4 aminokyseliny aminokyselina lineárna báz nukleová kyselina jedno Imeáma (2) Informácia pre SEQ ID NO: 91 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia;

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 91

Ser Ks Val Leu ’ 1 anunckyseHny aminokyselina tineáma aminokyselín ammokyseBaa lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 85 (í) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:' (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 85

Met Lys Lys Asn Ee Ala Phe Leu Leu Am Ala Tyr Ala Ser Pro 15 10 25

Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala

25 (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 92 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia;

(xí) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 92 aminokyseliny unmokysebia lineárna (2) Informácii pre SEQ ID NO: 8Ó (i) Sekvenčné charakteristiky:

His Ser Arg Leu l 4 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 93 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:	4 ammokyadBiy
(B) Typ:	aminokyselina
(D) Topológia:	Hueáraa

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 93 Ala Val Asp Phe

4 (2) Informácii pre SEQ © NO; 100 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžks: 4 anunokyt (B) Typ: aminDkyseh (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ © NO: 100 Leu Leu Gly Gki

4 (2) Informácii pre SEQ ID NO; 94 (i) Sekveačné charakteristiky.

(A) Dĺžka:	4 aminokysefaty
(B) Typ:	amáokyseáini
(D) Topológia:	lineárna

(«) Opis sekvencie: SEQ © NO: 94 Ser Leu Gly Gh

4 (2) Informácia pre SEQ © NO: 101 (i) Sekvenčné charakteristiky!

(Á) DÍžka t 4 ammokya (B) Typ: anúnokyseh (D) Topológia: tinetana (xi) Opis sekvmae: SEQ © NO: 101 Ser Ser Leu Leu

4 (2) hfonnáca pre SEQ © NO: 95 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:	4 armnotyseiny
(B) Typ.	ammokyacBaa
(D) Topológia;	kueázna

(2) Informácia pre SEQ © NO: 102 (i) Sekvenčné čbanktcriftiky:

(A) DÍŽka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(n)OpttsdnTuáe: SEQ©NO: 102 (By Gin Leu Ser

4 aminokyseliny amitokyedina lmeinu (xi)Opissekvecie: SEQ ©NO: 95

Ala Val Hr Leu

4 (2) hďonnícii pre SEQ © NO: 96 (i) Sekvenčné charakteristiky.

(A) Dhka:	4 anmokyaetiny
(B) Typ: (D) Topológia:	amnokyadiDa lineárna

(2) Informácia pre SEQ © NO: 103 (i) Sekvmčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 4 unmokys (B) Typ: ammokyidi (D) Topológia: Iheáma (xi) Opis mIevokm; SEQ © NO: 103 (xi) Opis sekvencie; SEQ ID NO: 96 Leu Leu Ghi Gly

4

Cys Leu Ser Ser

4 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 104 (d Sekvenčne charakteristiky:

(2) Informácia pre SEQ © NO: 97	(A) Dĺžka:	4ammokyaelny
(i) Sekvenčné charakteristiky:	(B) Typ:	aminokyselina
(A) Dĺžka: 4 ammidcycelmy	(D) Topológia:	bseáma
(B) Typ: tffiinokysdma	(xi) Opis sekvencie: SEQ © NO: 104
(D) Topológia: lineárna	Leu Gn Ser Leu
(xi)OpK sekvencie: SEQ ©NO: 97	1 4

Leu Ser Ser Leu

4 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 105 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(2) Informácii pre SEQ © NO: 98	(A) Dĺžka:	4 ammokyseSuy
(i) Sekvenčné charakteristiky.·	(B) Typ:	aminokyselina
(A) Dĺžka: 4 amhdcysdmy	(D) Topológia:	lineárna
(B) Typ: unmokysehna	(xi) Ópia sekvencie: SEQ © NO: 105
(D) Topológia: lineárna	Leu Gy TV Gn
(xi) Opis sekvencie: SEQ © NO: 98	1 4

Leu Gly Gk Leu

4 (2) Informácia pre SEQ © NO: 99 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) T>p:

(D) Topológia:

(») Opis sekvencie: SEQ © NO: 99

Cys Xaa Leu Ser Ser

5 amiaokyselin irtmrdryrfn»· Iheáma (2) hfonnádapre SEQIDNO: 106 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ © NO: 106

Ala Leu Gta Ser

4 amxudcyiday aminokyselina liacánu (2) Informácia p» SEQ © NO: 107 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka : 4 aminokyseliny (B) Typ: tmiaokyMlfai (D) Typológia: Ineárna (ή) Opis sekvencie: SEQIDNO: 107 Leu Leu Gly Thr l 4

Cys Leu Ser Ser Leu Leu

21 (2) Informácia pre SEQ ID NO 108

0) Sekvenčné charakteristiky aminokysehí amiiokyaelína lineárna (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

aminokysahty aminokyselina lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 108

Affl Ala De Phe (2) Informácia pre SEQ 1D NO: 114 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍikt:

(B) Typ: (D)Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 114

Gy Gin Leu Ser Gk Gn Val Leu Leu Leu Gy Ah Leu Gh 15 10 15

Ser (2) Informácia pre SEQ ID NO: 109 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (D) Topotógu: lineárna (») Opis sekvencie: SEQ ID NO: 109

Leu Ser Phe Gin

4 aminokyselín aohotyMtina linefaH (2) Informácia pre SEQ ID NO: 115 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológh:

(xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 115

Leu Leu Gy Thr Gta Leu Pro Pro Gn Gly Arg Thr Thr Ala Hb 13 10 15

Lys Asp Pro Am Ah De Phe

22 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 110 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dlžk·:

(B) Typ:

(D) Tcpológia:

aminokyselm imiwnlŕyiŕlÍM lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 110

Ser Pro Ala Pro Pro Ah Cys Αφ Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 15 10 15 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 116 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dlík·:

(B) Typ: (D) Topológia;

(xi)Opissekvencie: SEQIDNO: 116

Leu Ser Phe Gn I£s Leu Leu Afg Gy Lys val Arg Phe Leu Met 15 10 15 uninokyselfa aminokysehna lineárna

Leu Arg Asp Ser His Val Leu

22 amiaokyscäi aminokyselina lineárna (2) Informácia pre SEQ ID NO: 111 (i) Sekvenčné charakteristiky: (AJDfžlu: (B) Typ: (D) Topológi*:

(kí) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 111

TBs Ser Arg Leu Ser Ota Cys Pro Gu Val His Pro Leu Pro Thr 15 10 15

Pro Val Leu Leu Pro Ah Val Asp Phe

24

Leu Val Gy Gy Ser Thr Leu Cys Val Arg

23 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 117 (í) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 4 ammokysefaiy (B) Typ: ammokysdiii (D) Topológja: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 117

Met Pro Pro Ah

4 amrnokyacHn uninokyselini lineárna (2) Iiformácia pre SEQ ID NO: 118 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dlžki:

(B) Typ: (D) Topológia i (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11S

Met Ah Pro Pro AU

5

S amimkyselin aminokyselina lineárna (2) Informácii pre SEQ ID NO: 112 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológi*:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 112

Ser Leu Gly Ghi Trp Lys Thr GJn Met Gu Ghi Thr Lys Ah Gin 13 10 15

Asp He Leu Gy Ah Vil Thr Leu

23 anmokynelfa atnfookyselms lineárni (2) Informácia pre SEQ ID NO: 113 (i) Sekvenčné ŕhinktmaíky (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 113

Leu Leu Glu Gly Vil Met Ala Ah Arg Gly Gh Leu Gly Pro Thr 1 5 10 15 (2) Informácia pre SEQIDNO: 119 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 6 imňokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: Snehu (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 119 Met Pro Ah Pro Pro Ah

5 6 (2) In&nnácM pre SEQ ID NO: 120 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 7 anmokyselá (B) Typ: uninokysehu (D) TopoJógii; Imeánu (xi) Opis sekvencie.· SEQ ID NO: 120 Met Ser Pro Ah Pro Pro Ali

5 7 (2) hfonnácia pre SEQ ID NO: 121 (ή Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 4 anriDokyselmy (B) Typ: aminokyselm (D) Topológia:

hneáraa (2) Informácii pre SEQ Π) NO: 128 (i) Sekvenčné charakteristiky*.

(A) Dĺžka : 8 aminokys (B) Typ: ammokyjd (D) Topológia: lineárna (xi) Opis aekveode: SEQ ID NO: 128 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Hr 1 5 8 (xi) Opis sekvencie: SEQ Π) NO: 121

Ah Pro Pro Ala (2) Informácia pre SEQ ID NO: 122 (i) Sekvcaäaé charakteristiky:

(A) DÍžka: 5 aminokyselín (B) Typ: anmokysefai (D) Topológia: hieáma (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 122 Pro Ah Pro Pro Ah

5 (2) iDfomícii pre SEQ ID NO: 123 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka : 6 aminokyadói (B) Typ : amhokyse&u (D) Tapológia: tinefau (xi) Opis sekvende: SEQ ID NO: 123

Ser Pro Ala Pro Pro Ala

3 6 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 124 (2) Informácia pre SEQ Π) Na 129 (i) Sekvenčné charekieriaiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQIDNO: 129

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thi Ala 1 3 9 aminokyselín unmokyadiM lineárna (2) Informácia pre SEQ O Να 130 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka : 10 aminokyselín (B) Typ: ammokyaalina (D) Topológia tineána (xi) Oph sekvende: SEQ ID NO: 130

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ah Val 1 3 10 (2) Infonnáda pre SEQ ID NO 131 (0 Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka.

H anmokyMlii (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍŽka: 4 amáwkyeefaiy (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia:

lineárna (xi) Opá sekvencie. SEQ ID NO: 124

Val Arg Arg Ala

4 (B)Typ:

(D) Topológia;

(xx) Opis sekvende: SEQ ID NO: 131

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ah Val Pro

5 10 Π ammokyseláia Kacáma (2) Infonnácii pre SEQIDNO: 125 (Q Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍŽka: (£)Typ·, (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie; SEQ D Na 125

Val Arg Arg Ah Pro (2) Informácia pre SEQ Π) NO: 132 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 12 aminokyselín (B) Typ: uninokyK&ii (D) Topológia: feteáma (xi) Opis sekvencie: SEQ ID Na 132

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser 1 5 10 12 (2) ínfonnách pre SEQ ID NO: 126 © Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 6 ammokyselm (B) Typ: aminokyseliaa (2) Informácia pre SEQ ID NO: 133 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžki:

(B) Typ: (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ H> NO: 133

Val Arg Arg Ah Pro Pro Thr Thr Ah Val Pro Ser Arg 1 5 10 13 amino1cyac& aminokyseliM lineárna (D) Topológia:

lineárna (») Opis sekvende: SEQ ID NO: 126 Val Arg Arg Ala Pro Pro (2) Informácia pre SEQ ID Na 127 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dúfa:

W Typ:

(D) Topológia:

bneároa (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 127 (2) Informácia pre SEQ ID NG 134 (í) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžka : 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: facánta (xi)Opissekvende; SEQIDNO: 134

Val Arg Arg Ah Pro Pro Thr Thr Ah Val Pro Ser Arg Thr 1 $ 10 14 imiiokywlín unňotyKlm· lmeáns (2) Informácia pre SEQID NO: 135 (í) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia:

(ή) Opíš sekvencie: SEQ Π) NO: 135

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15 aminokyselín anrinokyaelin* lineárna (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológia;

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 141

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn

21

Mnmokyselm UDÍnokysdmi lmeám· «minokyse& ammokyadiu lineárna (2) Informácii pre SEQ Π> NO: 136 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍ8a:

(B) Typ: (D) Topole»*:

(xi) Opis sekvencie: SEQIDNO: 136

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu (2) hifbrmácia pre SEQ ID NO: 137 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍžka : 17 ammokyBC&i (B) Typ : vamokyvehu (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 137

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val (2) Informácii pre SEQ ID NO: 142 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka.

(B) Typ:

(D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ O NO: 142

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Am Glu

22 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 143 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DSki: 23 aminokyselín (B) Typ: amiiokysdina (D) Topológia:

lineárna (xi) Opis sckvoidc; SEQ ID NO: 143 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

10 15

Leu Val Leu Tlr Leu Asn Glu Leu

23 (2) Informácia pre SEQ D NO: 138 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(2) Informácia pre SEQ ID NO: 144 (i) Sekvenčné charakteristiky:

aminokyselín aminokyselina lineárna (A) Dĺžka:

(B) Typ (D) Topológia:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 138

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

10 15 ammokysetn ammokysetitia lineárna

Leu Val Leu (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(D) Topológja:

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 144

Val Arg Arg Ala Pro Pm Thr Thr Ah Val Pro Ser Aig Thr Ser

10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Gta Leu Pro (2) Infomtácii pre SEQ ID NO: 139 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia t lineárna (xi) Ópia sekvencie: SEQ ID NO: 139

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

1$

Leu Val Leu Thr (2) Informáda pre SEQ IDNO: 140 (í) Sekvenčné charakteristiky:

(A) DÍŽka: 20 aminokyselín (B) Typ: ammckyseliM (D) Topológia: hncínii (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 140

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Set Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu (2) Informácia pre SEQ ID NO: 141 (i) Sekvenčné charakteristiky.

Claims (46)

1. Polypeptid mpl ligandu pripraviteľný spôsobom, ktorý zahŕňa:

i) skríning humánnej genómovej knižnice s oligonukleotidom založeným na genómovej sekvencii znázornenej na obrázku 9 na izolovanie genómovej DNA, ktorá zahŕňa exón mpl ligandu kódujúci sekvenciu znázornenú na obrázku 9 spolu so zostávajúcimi exónmi génu, ii) inzerciu DNA do expresného vektora, iii) transfekciu cicavčej bunky génovým expresným vektorom a iv) izoláciu polypeptidu mpl ligandu z bunkového kultivačného média.

2. Polypeptid mpl ligandu pripraviteľný spôsobom, ktorý zahŕňa:

(i) izolovanie genómovej DNA, ktorá hybridizuje za miernych podmienok s DNA sekvenciou 5' GCCCTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTTATTTAGG AGTCG 3' a ktorá obsahuje exóny kódujúce polypeptid mpl ligandu z genómovej knižnice, i i) inzerciu DNA do expresného vektora, iii) transfekciu cicavčej bunky génovým expresným vektorom, a iv) izoláciu polypeptidu mpl ligandu z bunkového kultivačného média.

3. Polypcptid mpl ligandu pripraviteľný spôsobom, ktorý zahŕňa:

i) zistenie vhodného bunkového zdroja RNA humánneho mpl ligandu a prípravu jednej alebo viacerých cDNA knižníc z uvedenej RNA, ii) hybridizáciu-skríning knižnice alebo knižníc s označeným oligonukleotidom založeným na kódujúcej sekvencií zobrazenej na obrázku 9, na identifikáciu a izolovanie klonu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu mpl ligand, iii) inzerciu DNA do expresného vektora vhodného na expresiu v cicavčích bunkách, iv) transfekciu cicavčej bunky vektorom a expresiu cDNA, a

v) izoláciu polypeptidu mpl ligandu z bunkového kultivačného média.

4. Polypeptid mpl ligandu pripraviteľný spôsobom, ktorý zahŕňa:

i) prípravu cDNA knižnice alebo knižníc z mRNA extrahovaných z ľudských obličkových buniek, ii) hybridizáciu-skríning knižnice alebo knižníc s označeným oligonukleotidom založeným na kódujúcej sekvencií zobrazenej na obrázku 9, na identifikáciu a izolovanie klonu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu mpl ligand, iii) inzerciu kódujúcej DNA do expresného vektora vhodného na expresiu v cicavčích bunkách, iv) transfekciu cicavčej bunky vektorom a expresiu cDNA, a

v) izoláciu polypeptidu mpl ligandu z bunkového kultivačného média.

5. Izolovaný mpl ligand obsahujúci menej ako 5 % znečistenia inými zdrojovými proteínmi, ktorý:

a) stimuluje zabudovanie značených (³H-tymidínom) nukleotidov do DNA IL-3 závislých Ba/F3 buniek infikovaných humánnym mpl P;

b) stimuluje zabudovanie ³⁵S do cirkulujúcich krvných doštičiek, v teste krvných doštičiek;

c) je stabilný pri pH 2,5, 0,1% SDS a 2M močovine; je glykoprotein;

d) jeho aminokysclinová sekvencia je

SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR alebo

SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL.

6. Mpl ligand získateľný purifikáciou aplastickej plazmy hydrofóbnou interakčnou chromatografiou, fixovaný farebnou chromatografiou a mpŕ-afinitnou chromatografiou, majúci zdanlivú molekulovú hmotnosť preukázanú pomocou SDS-PAGE za neredukujúcich podmienok v oblasti 18 až 22 kD, 28 kD alebo 30 kD.

7. Izolovaný polypeptid mpl ligandu kódovaný nukleovou kyselinou majúcou sekvenciu, ktorá za miernych podmienok hybridizuje s nukleovou kyselinou so sekvenciou od nukleotidu 119 vpredu na obrázku 9 (ID NO: 4 alebo ID NO: 5).

8. Izolovaný mpl ligand, podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je biologicky aktívny.

9. Polypeptid mpl ligandu majúci aspoň 70% sekvenčnú identitu s polypeptidom, podľa jedného z nárokov 1 až 7.

10. Polypeptid mpl ligandu, ktorý je variantom polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, ktorému zostáva biologická aktivita mpl ligandu.

11. Polypeptid mpl ligandu ľudského pôvodu, podľa jedného z predchádzajúcich nárokov.

12. Polypeptid mpl ligandu nehumánneho pôvodu podľa jedného z predchádzajúcich nárokov.

13. Polypeptid mpl ligandu, podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je neglykozylovaný.

14. Chiméra, ktorá obsahuje mpl ligand, podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, fuzovaný s heterológnym proteinom, pričom uvedený heterológny proteín zdieľa z mpl ligandom aspoň jednu biologickú vlastnosť; alebo uľahčuje purifikáciu chiméry alebo iný procesný krok; alebo iným spôsobom zlepšuje vlastnosti chiméry.

15. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid, podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

16. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, ktorá je vybraná z:

a) cDNA klonu získateľného v kroku (iii) podľa nároku 3, alebo v kroku (ii) podľa nároku 4;

b) DNA sekvencie, ktorá je schopná za miernych podmienok hybridizovať s klonom (a); a

c) genetického variantu akejkoľvek z DNA sekvencií (a) a (b), ktorý kóduje polypeptid majúci biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho polypeptidu mpl ligandu.

17. Izolovaná nukleová kyselina majúca sekvenciu schopnú hybridizovať za miernych podmienok s nukleovou kyselinou, ktorá má sekvenciu od nukleotidu 119 vpredu na obrázku 9 (ID NO: 4 alebo ID NO: 5), pričom mierne prísne podmienky zodpovedajú inkubácii cez noc pri 37 °C v roztoku obsahujúcom: 20 % formamidu, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citran trojsodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtov roztok, 10 % dextransulfát a 20 μΐ/ml poštiepenej denaturovanej DNA z lososích spermií, a za tým premývanie s 1 x SSC pri teplote 37 až 50 °C.

18. Genómová DNA alebo cDNA zodpovedajúca aspoň časti génu mpl ligandu, ktorá hybridizuje za miernych až prísnych podmienok s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny majúcej sekvenciu kódujúcu mpl ligand, pričom mpl ligandom je ligand definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 7.

19. Nukleová kyselina, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 18 operatívne spojená s promótorom.

20. Expresný vektor, ktorý obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov 15 až 20, operatívne spojenú s riadiacimi sekvenciami rozoznávanými hostiteľskou bunkou.

21. Hostiteľská bunka transformovaná nukleovou kyselinou podľa jedného z nárokov 15 až 20 tak, že je schopná expresiou uvedenej nukleovej kyseliny produkovať polypeptid mpl ligandu.

22. Spôsob prípravy mpl ligandového polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa expresiu rekombinantnej nukleovej kyseliny, podľa jedného z nárokov 15 až 20, vo vhodnej hostiteľskej bunke.

23. Spôsob prípravy mpl ligandového polypeptidu podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že polypeptid mpl ligandu sa opätovne získava z hostiteľskej bunky alebo z kultivačného média hostiteľských buniek.

24. Spôsob prípravy mpl ligandového polypeptidu podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa expresiu pôvodného génu mpl ligandu v bunke, ktorá je regulovaná promótorom/zosilňovačom, supresorom alebo exogénnym transkripčným modulátorom, ktoré boli vložené do bunky v mieste a orientácií dostatočných na ovplyvnenie transkripcie DNA kódujúcej polypeptid mpl ligandu.

25. Zmes, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid mpl ligandu podľa jedného z nárokov 1 až 14, alebo získaného spôsobom podľa nároku 22 alebo 23, a farmaceutický prijateľný nosič.

26. Použitie mpl ligandu podľa jedného z nárokov 1 až 14 alebo získaného spôsobom podľa nároku 22 alebo 23 na prípravu liečiva.

27. Zmes podľa nároku 25 alebo pripraviteľná v súlade s nárokom 26, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa terapeuticky účinné množstvo činidla vybraného zo skupiny tvorenej cytokínmi, faktormi stimulujúcimi rast kolónií a interleukínmi.

28. Zmes podľa nároku 27, vyznačujúca sa t ý m , že činidlo je vybrané zo skupiny zahŕňajúcej LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1,1L-2, IL-3, IL-5, IL-6,IL-7, IL-8, IL-9 a IL-1L

29. Spôsob amplifikácie testovanej vzorky nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa polymerázovú reakciu nukleovej kyseliny s nukleovou kyselinou zodpovedajúcou aspoň časti genómovej DNA alebo cDNA podľa nároku 18.

30. Spôsob určenia prítomnosti polypeptidu mpl ligandu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa hybridizáciu nukleovej kyseliny podľa nároku 18 s testovanou vzorkou nukleovej kyseliny a určenie prítomnosti nukleovej kyseliny polypeptidu mpl ligandu.

31. Použitie polypeptidu mpl ligandu podľa jedného z nárokov 1 až 14 alebo získaného spôsobom podľa nároku 22 alebo 23 na prípravu špecifických protilátok mpl ligandu.

32. Použitie podľa nároku 31, pričom sa pripraví monoklonálna protilátka.

33. Protilátka pripraviteľná podľa nároku 31 alebo 32.

34. Protilátka schopná viazať polypeptid mpl ligandu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14.

35. Protilátka podľa nároku 34, ktorá je monoklonálnou protilátkou,

36. Hybridómová bunková línia produkujúca protilátku podľa nároku 33 alebo 35.

85 výkresov

180 _________ 190 200

ΡΓ<4ΑΒΠΑΓ9ΤΙιι|86Γΰ1.ν[,βΜίΒυα1>1Τ>ιι|Α8ηΡΗβΤΗΗΜ356ΓΑ1«ΑΓ0Τ1ΐΓΤΗΓ01ν5ΒΓ01.ν1.βΟ1·611ίν8^,Τιτ>01ηΟ1ηα1νΡΗ6ΑΓαΑ13ίν5ΐ1

801 CCAAACAGG ACTTCTGG ATTGTTCGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTCGCAGC AGGGATTCAGAGCC AAGA tct tcctacccatctgctccccagagggctgcc tgc tgtgcacttgggtcctggagccct cctccacccggatagattcctcaccctĽggcccgcccttg

Al Φ 3 5 « «0 « P © Ε- O Q U X E- 3 U u σ> Ε- 0 υ ti Ε- ti u Q. E- ti b u υ ti o > υ ti Ε- 0 C* K 0 U σ υ ŕ o q> Ε- > «c 0 υ k 0 3 0 Q « Ε- v U υ f-4 0 k U «Η < U < u υ «H p Q 0 ti 0 Μ- P O 0 u 4 0 ti ŕ 3 0 ω < Α» Ε- c u o> O E- > O *C G 0 > υ M < υ μ U 0 E- C 0 k^ rf α e < 3 ti fit υ u b ti 0 Ε- 0 U >1 rf □ 0 u 0 H 0. u ti 3 0 0 rf ti E- u μ u μ < J υ Q Ε- >1 rf 0 b & a p £ Q ti 0 0 υ 0 ο k < <0 ti b h 4 o ti ti U 0 0 r* -c u & «Μ p 0 K Γ J p u O >~| H < CB 4 δ U U 3 £4 < 0 k 0 3 U D> 0 P a υ ti Ε- >1 0 u ti K ti M u ti □ □ υ rH 0 12 3 p 0 U u ti & μ u u k X u u O ti ti 0 & ιμ Q ti E- ti v P 0 H E- ti Ε- 3 0 > 0 ti u < μ b O 0 0 ti Ε- 3 < υ u Ch u ti Ε- O ti U 0 υ O E- o v u « u > υ O ti ť U u 0 U u ω E- •μ < ti í vM u U •μ 4 k E- u 9 e x u r—1 u ti u X u ti b σι ti Ε- rM E- < O ti Ε- C rf ω E- 01 0 υ 5 E* >» -C 0 υ w 3 u b « μ o > 0 fH 8 01 E- 0 u x U t?) Λ υ 3 O 0 k 0 ti K < ti 5Í H < ti 0 rf U r a 0i < σι 0 0 O {m •μ U Λ a k 0 o> Ε- 0 < □ U ti H O k u < < Ch □ υ O μ U ti E- > O Γ·Ί V 0 k U & σ o m Q< υ t*4 í- C 0 W <0 rf ti 0 ti M Q ti υ M < rM < ti P 0 < u <£. 5 • X 0 a u 0 U v Ε- 0 U u ti < υ e- <4 ·£. >, rf 0 υ k U *J r—* u c 0 < O eH u ti υ a u ti < □ 0 < c c 0 x Ε- «μ U Oi U Ε- 0 υ < k c a Κ ti ŕ d £ υ μ υ O y ti u φ υ > 0 ti K οι u ti « W P Ή Ε- Ο ti E- ti d <c «ΐ o u ti E- M « kO M Q 01 ti Ε- o \o < 0 ti Ε- ti υ ·—1 < Q σ □ υ ti t* ti s 0 υ ·—< u k < ti υ 0 u >9 C 0 << Ρ X U v ti p D> ·* J 3 rH < G κ E- < u 0 u M o M U 0 u 0 « M U u O 3 E- < X U > 0 4 3 X U u H ti H M υ E- < F-4 0 0 υ E* « 01 1 0 U V P 3 0 □ 0 k υ 0 u D> V O (fl tií r-4 rf 3 0 a p k U *J O H (0 y 0 0 O ti E- A Ε- a U ti X H < 3 0 σι 0 u u> < 0 < U r- U X p »μ < ti u < υ K U u ti t-> ti Ε- 0 Ό ti ί- W υ a q u > o ti Κ £J P 0 ο ti U u 0 0 b ti E- k u 0 3 <H Q 0 ti h «μ p X <. 41 u (fl u < e Dl > 0 ti E- 0 C Q (fl E- •μ < σ p U· ti p > Ή rf k < X u k 0 U ti ευ u> f- O u ti u O ti Ε- < U 01 0 o —« < k u (fl Ε- (N υ 01 0 ti 0 u H X 0 X u ti υ -H < 0 k 0 ti ti h k U K ti Ε- k < < < u u b ti U ti rf 0 υ X Ο H U u ti 0 to E- >> rf υ E- < ti ŕ- u ti F Q 0 0 3 • s k υ > 0 Ch 0 t- ti < Q. 0 U r* X υ 40 U ti ti 5 < 0 k 0 k t* H < fl s, p

0 > < P 0 0 »μ 0 c 3 0 0 0 1—í ti K 3 p 0 0 ε- W E- 0 k ο 0 U k U 0 G < a ω m£ O r-í 4 0 u Λ □ u k x ŕ- >t < a a E- 0 3

1/85

210 ___________ 2 20 23 0 ___________ 2 4 0

ΡΓθΌ1νΌ&υΕβιΐΑ5ηΟ1ηΤ1~ιιΐ5θτΑΓα3βΓΙ.&υΑ£Ρ0ί1ηΙ1€ΡΓΟ01νΤνΓΕθυΑΕηΑΓ^Ι leHi.sGluLeuLeulAsnClvThri^rQGl vl.puPhpPrn

901 ttcctggtctgctgaaccaaacctccaggtccctggaccäaatccccggatacctgaacaggatacacgaactcttgaatggaactcgtggactctttcc n

U u < 0 υ <0 ro U aj Φ u u b jj O tí U ra » b Φ u ra «0 U © tí 0 b CO b u 10 & ra u M U O h Q tí <0 u « Ch u M U © O u o tí M b Ch (J υ σ Di 9 tí & U α u u tí ra u tí CO h n < Di u D υ u k b < 0 j_> u <0 u u X < 0 b U υ υ © u b b hi U to Dl u & u X < Ch u U 0 ra tí x> 0 □ b « 10 u u ra 0 0 <y b © ffi tí © u 0 b U U rtJ U L) © u U D 0 U u ra © u Ch U 01 h jj o u tí u c u J U U l? ra 0 u (“4 0 U x> CO ra υ © 0 υ M U XI <0 u © u 7 o (b U Dl Dl CT © n 01 H O U O Dl tí « (0 40 J U o < U O ra U c u m x u 3 υ tí ra υ <n < ³ P b u ra u tí « < o f· X 0 u u © tí 0 u >4 U rl 0 XI u XI u U D C 0 0 0 X) σ» o u Ch u Ή < P XI o tí © 0 < 0 U γί 3 U Q υ α M (J P 0 o fO XI ra ra X U ra ŕ Q G u tí tí ra ra 9 O > o m r“< < U tí tí u íl b r< 0 t*l 0 υ u tí ra u J U ffl b ť r tí tí © tí M (J X O Φ u tí tí XI ra tu (J o b W b tí tí © ra U) h M U P P Rf CO tí ra X (J Ch U Φ b © tí o u <~1 0 k- U -4 U <0 U tí XI 0 0 A U G b <0 σι XI XI U d A m A υ ra tí U aC L· 0 Q 3 <0 ro tí © h A h U P o © tí tí D, U 0. u H © ra υ tí w < P 0 0 u XJ υ tí tí < 0 Φ b k u U tí u U u «t J k <U u Rf tí © u íl U k U 0 b <0 U XI tí 0 h x u CO U U u ra tí f-c < fr- < •H < 10 ra u tí X U o 0 Q . X U tJI Rf <0 ra b < σ» M U h u (D ra tí ra X 3 γί (X Q Ä u © tí u tí H 0 0 < b < & ra jj © 0 0 w U hl U σ X» u © M < Ch u X < XI tí XI © Φ (J S b Ä b υ ra tí ra W b 4) t* U u u ra ra hc U >4 U Φ U u Rf © ra 01 (J 0 h 0 b u tí XI © 0 b k u © >4 A o © υ <0 01 b Ch u n A U u tí ra © n b Φ (J r? b < σ u υ ra M < x F G U □> ra u u α O U c < 0 b b D U Φ h W í © ra u u XI tí u ra m ra ra ra 0 0 U V b © lj υ « k< U kl 0 J U XJ u © © b u A U □ b □ Xi XI ra <0 U fr- < Φ b U ra tí u f*A (J k b u U υ u u XI A 0 X < 0 b tí u ra © X< b b hl U u ra ra ra rl 0 C 0 Ch U u ra ra © O 0 r^-1 < bi U υ D © XI 2 < 0 U 01 0 u o ra tí 0 {i X < 0 < tí & u U J U w O h U υ ra © U u 0 0 A u Dl ra u ra A U O M b fr- A 10 ra U ra b < 00 x υ CI b υ ra tí x> Di D ÍN H A k U co © tí u M 0 0 b Ch U tí tí tí <0 a c w (J hl U α υ tí © CB U Ch (J X U tí ra ra ra hi 0 ⁰ ŕ- b < <0 D tí o < U M U 0 U u D u ra μ < Ch 0 M u tí ra X) © φ υ « b Al u u o © D ω f- •H < © M o Jj ra © © 0 u S u r*< A u © υ tí ra K u M U m h 3 tí Rf tí © Ch (J X u O 3 tí tí tí ra X < fr* í v u <0 10 υ u H Q o 3 Ch u u cn XI ra 0 y u U b D> o L> ra h Ch u U <0 © © D r-< •“4 r4 r- fH e-4 o o O O O O O o, —< CM ŕ*l 0 KO rd r~< rH »*- ^4 «Η ♦-<

1701 cattctcagtgggactctgatcccatattcttaacagatctCĽactcttgagaaatgaataagctttctctcagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

2/85

SK 282265 Β6

BaF3 MPLP3 bunky odstránenie IL-3 (24h hladovanie) test vzorky + bunky bez IL-3 inkubácia (cez noc)

OOOOOOOOOOO ooooooooooo OOOOOOOOOOO ooooooooooo o o o o o o o o o o o pridanie ^H-tymldínu do jamiek, inkubácia 6 h ooooooooooo prenesenie obsahov na OOOOOOOOOOO filtračné doštičky OOOOOOOOOOO

OOOOOOOOOOO OOOOOOOOOOO z /OOOOOOOOOOO/ /OOOOOOOOOOO# / OOOOOOOOOOO /__►/OOOOOOOOOOO/ / OOOOOOOOOOO / analýza zabudovania 3H-tymidínu/jamka: indikácia mitogénovej odpovede na testovaný faktor

OBR. 2

3/85

BSA-Sepharose

DBR. 3

4/85 inkorporácia ^JH-tymidínu

OBR. 4

5/85

MWx W-³

OBR. 5

6/85 inkorporácia H--tymidxnu

Prúžky gélu

OBR. 6

7/85

Í25-IHPD-ID viazanie

OBR. 7

8/85

125I-HP1-1D viazanie

OBR. 8

9/85

U s s u (3 o m

OBR

10/85

SK 282265 Β6

> ·— < o O O —i « > 1°= °g| [“ľ⁷⁵⁷! —1 o —i u. -J > Eľ3 E2 -j i— : >· ·— j V3 O. > UJ Z o oe

. O ; O IO = CL = CL ~CL

Σ ® Σ α>Σ φ x x x xxx h-ML 291 T LP T P V V 0 L H P L L P D P S A PI P T P T S P L L N T S Y T H S Q M L S 0 E G

11/85 hML· 1 SPAPPACDLRVLSKLLROSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE 11ML2 1 SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE hML3 1 SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRĽSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE hML4 1 SPAPPACOLRVLSKLLRDSHVLHSRl s q C PEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE

-J _J -J «J u .j •j ae z s s > > > > a σ 0 0 (3 0 e 0 O) CO <0 V> -J -1 J σ o O O o 0 © © _i. .u —J —1 •d •J cn 03 03 03 03 00 03 oi —J _l u O Q O H >- 1- h- Q. CL Ď- C5 0 0 C J _J -J -J σ σ 0 0 CD c © © s K CC tr < < < < < 2 2 2 S > > > > © 0 0 0 UJ Ul UJ Ul wJ «u «J .u J -J «_J -i .J u F- F— f- ♦- > > > > < < < < 0 0 0 0 -J •j -j — — — — Q Q O a 0 0 0 0 < < < < X X x x »- F— F— F“ m Ul UJ UJ UJ Ul UJ UJ S 2 2 2 O 0 0 0 l·- H h~ f- x X x X s 3 3 3

m in m tn

_J Z z H K- .J -J 03 O> x x © © Q Q 0 0 0 0 > > > > -J — — 2 2 j 5 3 IL u. U. a CC o o > > x X x x © 0 © 0 tc C CC s —1 —1 u .j •J Z Z z z 0 0 0 0 u. X u u. 03 03 03 03 —1 «J U. U. CL U. < < < < Z z Z z n. n. CL CL Q Q O o X X X x Z r z z < < < ·< »- H í- h- K h* H tt tt tC CC 0 0 0 0 0 0 0 O. CL CL CL 4 -J -J 0 0 F- F- 1- H © 0 0 0 —i —1 —I _J —J _j 03 W 03 ω O 0 0 σ -J —1 < < < < © 0 © 0 -J rl O O rH O H s

^{147 C v R R A p p T} T A v P S R T S L V L T L NE L P N R T S G L L E T N F T A S A R T T G S G L L K W| 1« c |l s □.........n y wli I.........wa|s I e v a a g iqsqdswsaepnIl |q - OJ í*>

12/85

SK 282265 Β6

< < < < 0 0 1 °· Q. -J —J -> h- t“ CC s □: CC Z z cc ÍĽ CC d*J (Λ m — — 0. a. Z z 0 0 CC CC □L a. -J M. LL u. ÍL. -J •J x X 0 0 0 o cc a E a. h- 1— <o <0 0 0 CC tt z Z CL Q. .J O Q -J -J 0 0 Ul Ul H 1— z X (•J — — h- H E a. 5 £ Z •z. ω CO -J -j —11 > >- H- ŕ- 0 0 s £ a. Ď- CO CO — — z z σ σ £ £ o O Ul Ul -J _sL -J co »- u· EC tt C j=J CO « 1- H* K - a Q σ 0 C c| z Z UJ Ul -J . —1 « 0 0 , a. Q. cu cu — — — — CC a < < CL a a. z Z u. ll Q a 0 o 0 o| o 0 CL a σ 0 > > »-< Λ o (N H i-H rt M m

Z Z —1 * O 0 t > > > > & CL H 1— a. a. _j _i H H- 0 CO a. Ď- 0 0 Q. Q- A. Q. -j -J -J CU D- < < LL LL > > «_> > > H h- h- > > £ £ O a > > O 0 CO 0 ŕ* 1— 0 0 CL CL Q. 0- CL a. Z z Z x t I— P* « Q. CL • co CO 1 ( Q. CL 1 t CO CO a. a. >- > (L u. 0 0 m co a» Q. ll LL 0 O — — •U -J £ £ z z < < a. CL CL CL Q. a. Q- CL j 1 CO co > 0 0 »- H * a a » w 0 « L- b- 0 0 CO 0 <o 0 — — a O 0 0 a. O- H- >-

H t* 10 CN to «Τ ΓΜ Λ

CN CN N N

OBR. 11B (N m cn n

13/85 ¹²⁵l-anti Ubllla ^nav '^azíí i^e (cpm) pH]- tymidín zabudovaný (cpm)

OBR. 12A

30000-

OBR. 12B

14/85

U

-X JÉ π v C CO ·Η C >o SO -r-á .H S Ό-Η Ll 0) >10

OBR. 12C

15/85

00009

Riedenie n

Ďť s nujpTiuX4.-[Híj eto^JodJO>|UT

16/85 eccagcctcetttctcttgt tccctggtcatgcctgcctccctgtctcctgtctctcccLcccacacacacccactatccĽcccagctatccctacaccc

1501 aataagagagggagctgcacttagggct tagcaaacacagtagtaagatggacacagccccaa tceccattcttagctggtcattcctcgťtagcttaag

17/85 < Exon 3 > luLeuLeuLeu

2001 tccagtggctttatgtgtgggggtegatagggaaagaatagaggttaatttctcccataccgcct tttaatcctgacctctagtggĽcccagttacagcĽ

18/85

> o <0 U β U d U P U y y d P W ŕ< P y a y U 4 4 4 4 AJ u u *rt fC. p A u A P d U 4 y U P u x u u A P A P y XI y P o> c u k U u A P A y P y d P y P 9 W U u 4 P y u o D d P a y y V) Ι- p P P A A y 4 A y A u P ό. U P p P A U 4 XI 9 4 9 u y <0 < U P y P p 4 4 P Ol 9 P AJ < u 0 A P y U y U y 9 P U u & ŕ o U 4 p y P P P 9 d P d p k ϋ p Ol A £ ζ A P U d U u 4 9 í 9 4 u U X 4 Li P d d y A A 4 3 h u o V c y A 4 y u y P 4 4 v b u v « «Η >A A y 4 n 9 y y P -1 u <0 y y o u A 4 4 A A y y P 3 O u A c ií U A p y 4 9 A 4 P Φ fr· a U u X U A 4 y d P u y d >4 O σι A c 4 p 4 4 m U u « u W < a U c n < P y 4 y U u 4 P > <5 d A u P P y XI d XI u 4 u < σ> A p >9 *? P y 4 y o A d o h t* 0» U U a o P P 4 y AJ d Cn y φ y A A P u y U a y d 4 P P P w < o U P t- t* y P P x> y y 9 P 3 U o P u ³ 6 A d d U Q P y u Φ f’ O P u <-« < 9 4 u d U u 9 9 U u P a u ϋ y P y y y y u P P -h u U P P 5» P c 9 4 9 9 y u « e* A P u y u p P 4 A U y p > w p A o> c o P y P 4 U d y y y < 4 p A □ y P y 4 y y U 4 y k o U P y Φ ŕ· n a d P y 9 U P < u u A P u t- y u 4 u 4 P y d ³ 9 u A P h U a y P A y y P d w ŕ· « & P φ y a P P U u A u p J L) u A A vi 2 0 P U U u P 4 d ay A A u « t- u y u d y 9 V p w < Cl U U £ P y P d 9 y 9 y * P A ffl P a. μ o y y 4 4 P P y A E^-1 A & y a y P P P y y o d y ôp P 9 P y P U a 4 < o P 4 A y y 4 P P y y y y A y 4 U e ŕ* O P P -· y y u y 4 XI y u p •H U M y y A é- y 4 P y P y o p < u U P y > o P y P 4 P u P P 0 H M U A A E* A a y 4 U u M u k U A A P w U U 4 U 4 9 u 9 o, u P y d < O U P y P U 4 P 4 0 t* y A y O fr* U 4 y 4 9 P A c M O u U U M U P y P d A p 9 u O, U O) P A p4 u P 9 P y y A d P Kí ŕ* u A P 3 y C P 4 P y d 9 P ·-< O u y V y p y y U υ u 4 P d < o P P y J u P P O 4 P A U AJ o y A u y 3 o U y c y 4 y 9 u k o P A A Φ Ε- 4 u 4 4 4 4 4 p tu u P P P *9 U V y y 4 P p 9 AJ k U xi U P ·—· U v 4 P A 9 4 P y φ y U u A d í- c P P A p d 9 4 w < U A p > o p 4 P y U 9 d 4 k O < U U P o e- P y U 4 U 4 P 4 Φ O OJ o U U k U u XI U 4 y d 9 p W ŕ Ό AJ y y a y y d y P u P P 9 a y ή A u P k < d y P d 4 y P 4 Φ H P xi P U X U U P A d y 4 0» 9 j u a P o c b < p d U d P P y p u □ φ A P y 0 t- P P 0 4 y u 0 A £ u a U u A k U u u y P y u 9 4 *5 A A P U P 0 y U 9 v 9 P 3 < -* A P U o y y 4 P 4 y AJ P P Φ ŕ· « O A A tt ŕ* P y A U y 9 y A J U C U U y J b U P U y y y 9 d o> y oi v U y 0 t* U P P d u o A d x y ή P U A k O p 4 U P u o 9 P et λ a u P y Cu u 9 U y y 9 u 9 9 4 < A u y W y 4 4 y 4 9 4 « P •M (_> 4*4 A y P •H < 4 p u 4 9 4 y 9 < □ o a P A x u P 0 4 y p A c p k ŕ· A P V w k y P d 9 9 9 u 4 £UO y A P c b u d 4 y p U a U C XI P u > y u 4 9 P d y d 4 S 3 W CB U A s y P U 4 u υ y y P v 3 O A P H < P 0 y y d P P U «9 U í Eh Ol y y O y υ d A P A P P □ U J U P A 0 < y d 2? A y y y p Φ ŕ- CM < A P k (J y d y 4 P 4 u 4 »9 U k y A d A Λ U P p P y P A y A □ f < 4 y y A U P u y 4 y U P 4 Φ £ k U u a * > o u u y U d y A 4 U U φ y u y U Eh u u A 4 A y 4 d u O m < A A ŕ í U A d 4 y 4 y y d Φ 6- w u & p 0 w < 4 q 4 P P P d d X < •k < P y k y u P U 4 d d y 9 4 •H U K P P P UMU u y y y P u 9 Q 4 ŕ' 3 H O y v y u y P 4 4 9 4 y > a Φ h U u V M < u P d y 9 4 U 4 -< y J U P P O P P u 4 4 O y 4 v P U U u A 4 y v U 9 9 4 d > U Eh d P U U y A U A 4 4 4 9 ή m m p CD «-Ι «-Ι «-i w rH o v O o o o o O O O O O O O m v m c* « Q «-4 cs m tr> m n n 1*» m n o V A¹ V ΠΓ

4601 agcacttcccacgaaaaggatctgagagaattaaactgcccccaaacttaccatgtaacattactgaagctgctattcttaaagctagtaattcttgtct

19/85

4 901 caatagtt taaaaaactaaaatctatcctcaagaaccc tagcgtcccĽtctCcctĽcaggactgagtcagggaagaagggcagttcctatggg tcccĽĽ

0>

u u x O 0 σ x S 0 u & D k 0 <J <5 «J 0 0 D U (y ¢- u x x < U Φ u X Cn U D D O X U x D X □ U C x L) XI σ 0 xi D C u Cl X 4» H 0 0 10 Ch x) 0 Di υ rt 2 x ra Dl X u rt X σι D) XJ 0 D D c u O D> X 5 0 U U Cn m xi cn Cn x * < 0 Q D V H x & U Jj x xl σ W 0 Q Q O J U rf u xi Xl D» υ U ra Q U X cn x Λ U Z «0 Q C Ch 0 υ υ Cn 0 D ra D •H C O u cn υ 0 u υ Cn M O G O D D X U U X <0 0 u σ O < u rt «ť D D C rf U xi 0» X U xi - ’ ra 0 rf 0 U cn Dl rt < u X σι X» υ x u Cn rt O M (J d D> 0 U O c* 0 U u x u XI rf O X u 0 x 4) O ra <ΰ υ Xl U xl x ra rf E- < 0 υ Λ b σ υ XI 0 X XI X rt u > < (J x α b u & u u Dl υ »5 υ rf o r-Ί 0 X ra x b < u u 0 XI cn 0 υ x u O 0 U D Φ 0 «j XI 10 0 ra D υ V b □ H tn ra ω < & U C1 0 D tJi & x < Oi b ra D D 0 ní x? XJ 0 o> 0 x rt 0 U U Di x Φ b ϋι Oi X U ra 0 D 0 b 3 U D (J J u u <0 U x ra Dl x > 0 Φ b Dl U Φ u x O X 0 ra x D > rf X u ra σ X b JJ xi •C 0 ra cn 0 f4 O Vj u 0 o & b 0 0 & 0 R XJ X 0 0 ® 0 D ra Φ U X U X 0 0 U X D 0 CH < X D rt b X & O 0 D 0 4-1 χ rf C 0 X & H rf ra xi σ Xi 0 Cl XI 0 0 < υ Dl ra u Jj O ϋι XJ 0 ra U σ u O u x ra rt U X 0 fC x) X> Ch cn Φ b 0 u u 0 < 0 «3 X U Ch & D υ ►4 (J φ H D u c b xi υ u 0 U Dl u 3 0 X» u D 0 m rf u u Dl u 0 υ u Φ b 0 U D D rf < 81 X) Ľn X 0 jj J U rt (J ra 0 0 o X» 0 x) Xi U cn u D b < 0 0 X x U X & X 0 D jj u φ e* > u σι X 0. u xi u Dl □ 0 υ υ j u rt 0 ra D a. b φ Q Cn XJ JJ U D υ M u 0 o ra 0 <ft < x X (0 fS XI x> ra x> x: u 3 b & X rf C -H X Q D o X u u E- rf Φ b Dl U V) 0 W XJ U U D Xl υ cn H Q X U & U * rf cn x> <Q 0l ra ra cn ra b □ U 0 x tl m X U 0 D & Q > u Φ b CT x cn u u xi 0 X O 0 X) 0 « < x U X x rt raC •rl X d xi D U ra X rt O P u U u I U rt x 0) X D D cn U rf 0 W b υ x ra b d. 10 υ & 0 D XI υ >> rf X U ra tn rt 0 V) U υ σ 0 01 U xi H U 0 b & X <C 0 m u O D c D 0 0 0 X 0 ra D rf o X Xi & Xl D d ra 3 0 < u ra υ £ U > D u XI υ 0 ra x O E-· rt U D» x b rf rt U 0 0 ra 0 D U J U 0 h ra 0 34 U X <0 tn & D X ra cn Q) É-. > U x D £ U C U ra 0 u cn u D> ť C 0 u Dl b rf C ra u Dl o x) cn jj H < rt < 0 tn Dl 0 M U x> 0 ra D 0 U α u 0 U U x u 0 <y u O xl tn Dl 0 cn in rf > < u υ rf rf x O O Dl jj 0 Ο» x rf u rt 0 D ra >1 U rt xi <0 D) σ 0 Xl D ť □ 0 0 X x rt 0 rf tn rt Xl u 0 X X r-4 < u H D Di 0 0 < ra U XI b 0 Xl D 0 U Φ U ra Dl C 0 II o d xl ϋι X Xi 0 β < cn b υ Gi rt rf 11 ra XJ XI ra D XI U X U 2 b x X A □ υ u X u XI u P Dl x rf □ Φ b u D 0 < t! tn <0 Φ ra 0 Q x W 0 X U 0 D <0 U O ll D> U Xl u cn D ra > *5 E 0 D cn Ch U II xl XJ σ u 0 & Di A J rf rt < x x c Obi’ «J υ X 0 0 D x M U O U υ ra o M (J It X JJ & υ U 0 ID X (J >. O x ra x Cu U P xi <e Xl & u ra x P· rf rt O U υ ui □ b u <0 u Xl C? ra u O C D 0 0 U X ra Φ b n U XJ x x) 0 0 x O rt rf D 0 x 0 V U U Ί X u 0 U D D) V X 0 0 Φ b U u 0 0 X 0 & 0 & b 6J □ 0 J u X D < cn 10 xl x XI 0 D K rf 2 U o 0 u x) & U & D D ra V 0 0 Φ b D 0 b íC XI cn <0 0 0 u Dl XJ U X 0 u X) 0 O 0 D X x 0 X o V D Q x υ D « d D U U Φ u 0 X u υ &l D D 0 0 X x 10 b ra D O u & U U U & x 0 X < 0 U b X xl Gi U D Dl D x 4> U D D u 0 & jj X X> xl 0 X cn b ra X b O 10 0 U x; U O X □ ω x υ U X u U u X D U CJ ω b D cn U x σι D & 0 D x X x u x x b x XI 0 0 0 0 D U « o D D rf X σ> D u 0 D X X * 0 x 0 U U d U x· x) O U 0 u b 0 m U X σ» 0 U D <0 U u X b D ra < X & U U 0 Cn x u x u & ra □ x* xi U σ σ 0 Di x b < & x 0 O U U XJ 0 0 bi x o u 0 u < U D 01 U ra xl x U x u 0 0 υ X σ x U ra D x x α u U x b Gi n D> 0 Dl Xl D U >, rf x u U 0 u tn D ra D D x . rt u D X U X u 0 U u 0 RJ U 0 0 ra ra u 1—1 r-i rt T4 r- rt m rt rt m rt o O o O o o O r- o O O o O m o O CN n m k£> t- rt <X> on © rt <-» m in in in in 1Λ m in m in l£> so

159 GLyL>ysValArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaVa.LProSerArgThrSerLeuValLeu

6201 AGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGäGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTC *End of EPO docrnain

191 Thr LeuAsnGluLeuPr oAsnArgThr 5θΓ01γΕ£ΐι1.βυ01υΤΠΓΑ5ηΡΗθΤΗΓΑ133βε·Λ1Β Αζ^ΤΠΓΤΗΓΰ^δθΓαίγΕβί-ΐΙΙ,βυΕγδΤΓρΟΙηΟΙηΟΙγ

6 3 01 ACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGG ATTGTTGGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACTGGCľTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGG

20/85

2 25 PheArgAlaLysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnlleProGlyTyrbeuAsnArglleHisCluLeubeuAsnGlyThr

4 01 GATTCAGAGCCAÄGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAÄCCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAAC

5 Q) CQ LlJ 0 b J U 4 U U 0 0 U C © © © U u k 3 0 U U < O Q U ra fl © fl © u 0. 0 Φ h b 0 b b U ^v H u fl © u © c o J U U u U ^&1n « U © u c o U b 2 2 U 0 _u V) fl fl fl u u □ u k 0 b 2 u 0 (J u tí U © υ M c> (X 3 U a, u b 0 u 0 0 < Ď> λ m fl _> AJ AJ m V h v> U O 0 b a tí AJ r-i cn fl © © © o J 0 •H < b < u u 2 0 « Q u «0 © 4 4 c u I u w 2 0 b tí 0 C ÍL © JJ fl U fl 22 3 U ’ h b < (j b *C < © © © U AJ Φ h > 0 •u b 0 Ε- 0 D> « © υ fl 0 u J U M 0 b u b υ « O u AJ tj n u o C 0 0 0 b 0 u 0 0 © © ra & u l-t < ³ 'í b b 0 b U tJ AJ u u 0 < 0 0 0 2 y 0 U A) © U <0 © k v rt Q 0 U tí b tí b AJ fl U U AJ C- Q ra e- C 0 b b tí 2 u U u u AJ xJ S G > 0 -5 X 0 υ b u fl υ υ AJ 4» t' H 0 0 u U < h b AJ © u © U »4 U β H k £-> f 0 b b © fl u © © k u > 0 Φ u b h b < U u AJ e © u o 0 H ω e» b b Q 2 0 fl © υ a © VI b M U 3 0 < < b 2 © jJ υ © © Cm Q Φ b 0 tí K U u 2 fl © α AJ JJ «-Α 0 k U J 0 u b b b fl AJ AJ JJ fl 0 ϋ X u E b 2 0 tí b b 5 fl u 0 © AJ kí < h < M «ť 0 b U 2 © © U A AJ £ U 0 U < 2 2 b Q o © © © 4 V ť- < k U C 0 0 O b b b © fl υ U © D. U C. u < P 4 u b < fl fl a 4 © M < 5 0 0 u b 0 b b 2 4 JJ © jJ fl < 0 Φ b k 0 U b u U 2 U © © © u k < »4 b O (J < b 0 u 0 σ © AJ n AJ « (j k 0 10 b 2 u b b < ra fl « m © W b X U w u u U < b o 10 u U υ fl k < b < ♦Τ» < tí tí U b b u © AJ » X O 0 U x υ C 2 tí b 10 y © © © í- 2 k U k U < 2 b 2 U fl 0 fl 4 n > 2 b U X O 0 b u b b 4J « u fl n rH U O < b < O tí b O U U u o U CD □ 0 k 0 k O 0 b u 0 tí U fl © 4 fl k < o. u X< b b b 0 b u u JJ iJ 4 Φ u □ b b b 0 < b b A> AJ JJ © aj u) e- «1 b k 0 0 0 tí b u υ JJ 4 U k u J U Φ U 0 tí 0 U © υ u >0 AJ u u 0 b 4Λ b U b b 0 b <0 © © CJ υ •A b k U k < 0 P U tí « 10 <0 © 4 aj ® b A. U X 0 0 b tí 0 e fl © fl ra 4 •-i H Φ (J b < 0 U u < fl n © © © H < X b c o O tí b U 0 © © © fl © D. U b b si 0 U V < υ © fl © © u ΙΛ 4 3 U b -í 2 υ AJ υ © © © < O Φ b □ 2 U b 2 b © AJ © fl 4 AJ 0 0 0 U v b P b u b υ L· a u AJ u k U k 0 P O b h C 0 0 © U u © U 4 b 0 X U 9 b U h b < b fl © AJ fl © υ 4 U b < Φ b o tí b U b © 10 U u AJ o ·-* u k b U U u 0 b b tí © fl © fl U AJ < o > < 0 b b b 0 b © © fl u AJ JJ > < b b k U b tí 2 < < AJ © u ra υ ro o C 0 b 0 U tí 1C □ 0 α fl © u 4 4 0 0 <“» < k d U 0 0 b U CD U © 4 4 5 < 0 0 Φ 0 0 0 tí b u fl fl AJ υ fl U v b >1 < W tí b U U U b U fl AJ © Aj 4 J u <-t 0 k U 0 0 U tí fl JJ AJ 4 fl (J k U 0 0 X U 0 b tí 0 fl u υ © υ 4 X U k b b < tí U tí P © © © JJ u 4 H < X U 0 b U b b U © fl a JJ 4 4 © O b < k U tí 0 b U b fl fl © U u 4 k O o b a u b b b < U » fl n> U u U «C < k U k 0 P 0 b 0 aJ fl u JJ fl fl 0» u (L U x U b tí tí < 0 fl fl u υ © U k 0 o b b < 2 0 b Q A> fl © © AJ © < U M 0 0 0 0 0 U < 0 © u fl © © AJ k < P. U k 0 b < b 0 b jJ fl u ra AJ AJ Φ U e b a u U U C U 0 U fl n u © © W b •H < k Q b «< 0 C tí U fl m AJ JJ AJ 0 u x u X U •0 0 b tí U © 0 fl © U © k (J k u b h b 0 b fl u υ fl aJ 4J A. 0 X u o 2 b b b < U © u © © (J AJ > < b 2 k U tí tí U U f- AJ u 4 AJ © AJ <-1 0 o 2 CL (J υ 0 ť «5 b U n © fl fl © 0 0 k 0 4 b 0 0 U 2 4 n u jJ U U © O h £. (J w O tí 0 0 o 0 a u U © © fl k U k Q < C u < b b <c o o © fl fl O, Q 0 U k b b 2 b ί- < n AJ fl fl 4 «1 b ω b Φ U tí U ο b u u u © fl fl X b o b «π b 0 ίζ 0 < 0 10 u fl fl 4 © b F k U 0 b tí b tí U < © u © 4 fl © 5 U CU u k U 0 0 u 0 b fl to AJ © fl Φ b k b M 0 0 0 0 u b u u © © U U J O U U Q. 0 U b < b b u XJ JJ 4 AJ AJ > < ω b W C 0 U o 0 U fl u <D u fl U O M b C u b U tí U 0 u u © © U © C 0 > < 0 b 0 0 u 0 0 16 υ © © AJ O b b b k 0 < O b 0 0 AJ u JJ © JJ © k 0 > < b 0 0 tí b b fl u U fl <0 © < U rH O b < 0 U tí <u AJ υ 4 fl JJ ŕ· 0 0 b 0 £ b 0 U υ fl « © fl AJ ¢0 rA W m h i-A rH *4 ^4 rM -A m q © O n o O O O O O Q O o O O O Γ4 1/Ί <N V> m r* CD m O rj r> tn Ό r* W> c© Ό o r· Γ» r- r- r- r- C* r-

21/85

ML332

MLI 53

--200

66.3

55.4

---36.5

---31.1

----2 l .5 ........

OBR. 15

22/85

100

140 _e 150 260

ValAvgPh eLeuLeuLeu ValGluGlyP xoThrLeuCy sValArgArg ThrLeuProT hrThrAlaVa lProSerSer ThrSerGlnL euLeuThrLeii

601 AGGTGCGCTT CCTGCTTCTG GTAGAAGGTC CCACCCTCTG TGTCAGACGG ACCCTGCCAA CCACAGCTGT CCCAAGCAGT ACTTCTCAAC TCCTCACACT

23/85

101

170 1Β0 190 20D

AsnLysPhe ProAsnArgT hrSerGlyLe uLeuGluThr AsnPheSerV alThrAlaAr gThrAlaGly ProGlyLeuL euSerArgLe uGlnGlyPhe

701 AAACAAGTTC CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACG AACTTCAGTG TCACAGCCAG AACTGCTGGC CCTGGACTTC TGAGCÄGGCT TCAGGGATTC

1401 TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT TCT

00 ’O r—I

0Í

2 4/85

102 u u u u D> C» 4 en 4 o* w 0> 0> Q 0

4 <n

0» oi

U U U

U o· o (J Cn n

4 O>

U

U Cr

4 σ

4 en u u Di (3*Ľ>

*4č í£

4 cr>

U U o

0>

U U U

U

IQ σ u υ c u u u en o>

«J u u ο» o D*

O 4 U *J U U n u u o 4 r o o 4 U 4

4 .

> (5 O P

U Q. ' «

£ «4 - μ Φ u w p 5 O • P U P p U

O □ u o c fJQ □ O ω μ j o a(j m u < u 4Γ > (5 C 0 Í8 o O Φ 5 tň P □ P « μ u u C 0 ~ < W -4 0 O o 5 C

O · b O .J U □ U 35 M U Φ u ω h v < Φ u §5 35 VI (J • NU U P H O 41 U CA μ op hi (J CL Q 53 00 30 Φ F J μ CC O Ή < to 0O x ~<o o o tn< M U «c o 4< <8 4 Λ IH U <o U0 ΦΗ X A HO 4 μ > u x H O DO 3 O H < 88 35 9 <

o v μ r* u u □ μ 35 M 0 φ u 0 μ

G φ kJ u C <C

- c o u G <

- < o u 3 U

Φ 0 -1 (Λ C

O 0 « μ □ μ

0 0 0 □ «C 3B žy u u >u 5 8 C 0 55 □ u w Λ 0 i* O -H 0 O D □ 0 «? H J μ

O 0(5

Q

CN

170 ________ ΙβΟ 1·9θ 20ι

LeuLeuThrLeuAsnLysPheProlAsnArgThrlSerGlyLeuLeuGluThrpVsnPheSétValThrAlaArqThrAlaGlvProGlvĽeDLgusarAri 701 ACTCCTCACACTAAACAAGTTCCCAAACÄGGACTTCTGGATTGTTGGAGACGAACTTCAGTGTCACAGCCAGAACTCCT'CGCCCTr.GACT-rrTr.A^rAnt

25/85

103

Cn > e o p o σ aj u

0 O c o >-i 4 © 0 U O M u m ú* U

O r*l CN

Ό <0

Ch (J £ P 0 < «_ U XJ XJ to X Ui p U u w P iTj 10 Ό —«u « 4 Q. (j 0) u o ϋ O U 0 rA U M p « P « XJ Q in U < O <u u 3 o u XJ Ό •m < □ C « P Φ P Ľ «0 0 z u OJ í- X J P XJ O Τη< J U rt 0 O c P u Ό Ό £ u M U 0 0 rt M < tn 83 ti P < 0) U m P rt < < XJ U <0 CDU V) p H < 0)0 u D) <0 MO >rU = U M 0 XJ « to < < rt 0 M u < < flj U <0 d u oo £ U 0 u u XJ <0 «Κ M < P < P u o <0 «J Iďj2 X U u Oj U u U 2 o U < £ U « P U CJ to ® P o d u P < •H -c D> CJ «0 J u us cn *ť 0 U S u 4J «0 id M U CN < *£ MU 0 P (J rt 10 X dl 0 Ch Q M u tn c

o u rt u *0 p > 0 o o < CN M U Γί Λ U M U OJ U V) p σιυ M O < < U OJ u V) P Au £ *· P d υ ( C I v, < Lsd·

P < . O p J U e u rt < o o >p o 0 o O 0 P rt M U ΓΝ £ P cu ριΰ P rt U Λ O >1« rt 0 O 0 o u h U Ch u M O OJ U vi H 0) U rt P rt < Ď.U w) < *t U M < (U U (Λ P « U rt U < 0 © 2 < ΙΛ rt < CN 0 0

2 O W P J U M U £ U P < C o

2 Φ J M

2 O Ch u 0) xj 10 Φ P M u rt XJ to J P x Cn U <0 u P P rt U rt rt U u U 0> u « < 0 ϋ p XJ XJ rt O 0 P U jj <0 Φ M u M 3 O XJ 10 (N Ch U £ U CT rt 10 M < P< «J XJ to OJ U rt u ffi Ľ m ω p CO p 0) 0 <0 0 P > 0 0) rt <0 M u 0 < <0 & «0 Ch u M U U tn «3 op Ch u u <0 10 M U O W P υ <0 Ch u CJ «Η < u XJ <0 V U rt X u XJ XJ 10 £ P 0 P XJ XJ (0 Ch P M U U 10 (0 0 u Ch u 0» 10 tú

m u rt U ň“ £ O t- <

M p 0) u W p CU

M U Ch U M O o H Z «< MU £ U P < M O £U P< O M U M OJU <0

U «5 0» σ cn cn u aj u u u c ftj XJ

D >0 tc Hl «5 <o u υ to u u to to (0 ffl CD

CD r* (X

C2

O

(L U rt o 0 < rt V) P <0 M P O 0 M U 0 P n £ U <0 P Ch u Li u AJ P < H U M p Ch u Cn Φ p 0 Q) U Q.U m rt p Φ P W p m < u rt < £ P 0 P < 0 u m u CL P M U 0 P o x o 5 U cu u M U Cn J < « P 0 P Oj U f rt U (N J U M u Φ P xJ •0 p >0 &i U £ P U > O rt 0 2 P th P fl CB< 0 U Φ P 3 0 L· M O W p >J u OJ P cn < < •H «í x JU 01 Φ u X u rt 0 0 u 0» £ P r^n P 0 o M U u Ch p c u o >P Ch U cn ľX P < r· rt 0 m U u rt o 2 ΓΝ 0 0 rt < 0 0 u c o z U < C 0 0 0 rt < 2 U P rt < C P u u Φ P M < 0 U w 2 U J U £ U 2 P Ä. 2 Φ P C 0 P < tu ρ u J 0 rt < í J U P U 0 U < rt ' O o o O Q o σ» o n rt rt rt

m Xj U U flj u u u u u o* XJ U

26/85 kJ u Q Q 10 XJ tÚ XJ O D» U XJ

XJ xj tQ U υ n Cn & u

Xj U xj « o Cl t? •0 XJ u C TO U tn

104 hML3 i |s p|a p|p a c d|l |r|v |l |s |k l l adshMlhs rlsqcp|e|v|h|pl|pt|pvllpavdfsl qe

j -J -j CC K > > σ O o Φ co W _l _l σ o © 0 —J > -J V) tO w (Λ «J -J U U μ· w Q. £X 0 UJ -J -J O Q o 0 CC cr < < < < Z x > > CD © IX' Ul -a j .a -j w· 4Λ > > < < 0 -1 — — C Q O O < < x X

f- w uj O £šľ3

S >o □ j- rbč

5 ?

♦H n n J J

j X o O x o Sd UJ O Q © © > > — — 5 Ž u. U. Q O © © CC C -j J —i —1

x o

Γ5~σ1

U- -J © V) —I —Ϊ u. u. - _l < < z Z a. G. Q Q Z X Z < < ŕ- I- μ- μ- IX CC © © σ σ Q. -j Q. o. J mI o σ 1- t- © © l —J —l © © O O J < < © 0 —J -i O k-t o •M

m n ►J kj <n n J J

27/85

Ž

W w W o o- a- Z se Q. © U. IL CO CO u. © — ŕ- Ž fe «c © o. Cl CL CL σ o H < © CL CL· «J _J CC c x σ K o - LL· z CO CC CC' rj < LL «J x © CZ Q. J ω C0I CĹ © Q. Q_ O Q O © (- - J -» »— z 3 fe <n 0 J -» í— < o n n Γ*) J m .♦J

co os s o hML3 250 STHĽAHPCGPAPPPAS

105

SK 282265 Β6 ^Ω °Lľť, α_ o. Ď_ o o o a o o o <Λ CO </5 o o o m m

C\ tn d -J -J d .J -j

2 S 2 ? S 2

E á j: E cl j:

<λ [a. a, | o ec ca o

28/85

106

5βΓΡΕ·οΑ1ΒΡΓθΡΓθΑ1&ΟγβΑ5ρΡΓθΑΓ5ΐ46υΙ^πΑ8ηΙ>γ5ίΛβυΙ;«’ΔΑΓ9Α5ρ3βΓΗ13να1ίιθυΗίΗ61γΑΓ5Εβυ5βΓθ1Γ^γ«ΡτοΑ5ρΙ1όΑ5ηΡ agcccggctcctcctgcctgtgacccccgactcctaaataaactgcttcgtgactcccatgtccttcacggcagactgagccagtgcccagacattaacc < e fN oc CC c

29/85

107

σ> o U) rf φ p O C 0 0 M O □ u J U o rk rf < «C < w p k U m 0 U A w O x P > < 5 (J Ε- > rf 0 u ŕ P Φ b 3 0 J A k U 14 U J u F-1 rf 5 U CL U X U C 0 O 0 Φ P > rf fr- *5 rk rf 3 A J U -< u o 3 0 U H A V p 0 u h U r4 u 0 D X h α W O P U ί- e C U P p m -k rf σ· 0 > ο m rf > rf N t U M 0 U rf n 0 U rk Q M rf < u x u k b 0 0 X U k U P rf Φ u k h P A Φ u 0 u ω b Φ U >0 W p k u □ P W p H 0 > u CL u w Ε- > U 0 u M 0 k u υ •k O C P 0 0 Φ u c U 0 p ΙΛ rf 0X0 V) P tň rf M ŕ í vp v p Q u A rf x u C 0 04 Σ A h 0 C 0 é- rf rk < > u Qi u rk A k P 0 O rrí 0 M 0 0 U x u tft U O 0 V u Φ U p rf •k rf M A U) Γ- X b σι rf X u Í) (J k 0 CL fr- M 0 A 0 P X u Vi b < rf 0 k P ί- A •H rf e u 0 0 X U o ο u Ϊ U f4 U 0 P fr- rf ΓΛ k u C Ε- rf □ k U Γ4 P u 14 υ U rf CL U FH 0 k rf CL U V U Φ U A 0 Q) u to u to p f-* P 0 rf ω b •«4 rf « o H rf M U 0 Ε- t u H t-· C rf * U k 0 α P

U Ε- 0 u k U k p rf u ν 0 O au P U V u O rt rf W rf 04 10 A Φ P 0 P N rl (J k U oj rf 0 r-4 P Φ u íl rf o V U 3 rf M A X P Φ H 0 b v p a u P P X P c u J U tn a 3 U p P W rf k U A 0 Φ P ³ rf rf rf Φ U 0 rf J U Φ P k 2 0 P k U k P J u X U Cl 0 P u X U 2 ŕ fr* A k 0 o to p P rf Φ P 5 0 rf rf n h U k U J u f4 rf k u 04 rf 0 > * 0 P O 0 V u > A P P k ϋ 3 0 0 p f4 0 σι rf p u V p k U 0 0 k 0 k P J P X U 5 U A U Φ 0 5 O fr- rf V P >,rf W rf V b C rf J U rk o k U J b to u Q 0 X U >, rf 0 u H U O 0 P P rf •k 0 G U rf 0 CO k U k p 0 0 Vi rf >0 04 P U Φ U k Ε- rf 2 r4 0 k p w P Φ U 3 0 0 0 Φ u c u W b Φ P 0 U ω p W rf k U J U k U 0 P rf rf X U 3 0 P o k U D U P rf Φ P e rf P u k U σ> 0 J U »k 2 W u p U k 0 O >P 0 U •k < O k rf rf rf - k 0 0 U — u rk X U C U 04 0 p k U 4J P m p rf w rf 0 P a u H U Φ U A 2 k U >> < rf u f4 P 0 A CL U r4 U 0 rf m rf k U Φ P C 0 k u e 0 p u -- P o p a u H U 3 U H rf k U k u rf 0 V p to 0 P u Φ u k P J U >» rf o V P W p Φ U W 0 D 2 5? X P 0 p W P

rf 2 k 0 > rf U) P CO rf 3 0 rf A Fk 0 5 0 A 0 V P Φ U 0 0 »k < C P x u X P W P p U k U k < P P •H rf O Xrf a u X u rt rf I U r· 0 5 P P < 1—i u V P 04 0 0 Φ P n u rf 0 -k p 0 P u> u •k rf c u ^w rf k U □ 0 X u rf >. 2 P u <n p v u 0 u -k 0 C P X u X P 3 0 c 0 rk A 0 P P P Φ P P O U k u rf U u 0 U p u ^4 <-4 r4 <-4 o o O O Q VI m r* CD

30/85 u ľ u s u

CD O M

CC

CD

O

108

OBR. 21A

31/85

109

170 lfiO 190 200

AsnLysLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnSerSHr IleSeiľAlaArgThrThrGlySerGlyPheLeLiLysArgLeuGlnAlaPhe 501 aAACAAGCTCCCAAACAGGACCTCTGGATTGTTGGAG ACAAACTCCAGTATCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGATTTCTCAAGAGGCTGCAGGCAT'rC

3 rH rf o 0 Ε- U 0 0 o k Ο u r» (k U u rh 0 3 Γ- rf o o 0 Ι- 0 0 A J Ο rf h U 3 c u & (J 0 Ε- Ε- C 0 «J ϋ υ r-4 rf 0 Ε- o o U k υ Ε- 3 U Ch U Ο 0 A E 0 0 rf J u r4 rf k O C U rf >rf 3 u Ε- £ a 0 A 3 Ο M u iJ u rh rf £ u E 0 0 C a <í r4 rf 3 rf O o 2 0 u rh 2 VO k u rh o 0 o d o, u fl A E o Dl 0 > 0 rh < h 0 k rf 0 u rf U £ u k Ε- M U W rf 0 ϋ 0 U 0 u CO Ε- W A M u 5 Ο >1 U Ch u 0 Ε- H 0 o M u J υ 0 0 σ» W u E u XI 0 d U] Ε- 14 rf 0 A 0 Ο rf 2 £ rf M O Έ o > U Ch U rh < 0 k 0 O u 0 0 0 U v u b < (/) Ε- £ P 01 U M Ο Oh A W A JU U O W A k A H rf d »H rf £. U 0 U m X U A rf h o D Ε- 4 rf cu u k υ H U k rf Ph U rf 0 0 u <n u 0 rf U) A Ή rf M u 0 A £ u & u k u <d Ε- O 0 A (X U H ϋ tn k U k Ε- rf O d íh u o υ d rf 0 A W Ε- H U H H 0 υ rf P M rf £ A 0 A ao & A £ A ta Λ 3 U Ch A rf O Φ a 3 rf 0 < J U 0 Ε- h U o k Ε- J υ & U <0 £ Ο 3 h « A d H rf 0 A Ή O h U U U rf 0 > rf 0 A ŕ E- k U H Q Drf Ch U 0 0 M 0 M H □ o rf U 0 0 αι b >rf U) 4 u u Q D Íl U 10 U 0 Q Γ- £ U rh u 0 η μ rf rf U k U k A >0 a. U 0 U rH Ď k Ε- W h O 0 0 Ο C U D U W A n rf k U O Ε- rf 2 a u M υ 0 u O c rf Ch U k u TT <0 U Ch u N o u M rf k rf 0 u X O £ u k U M Ε- A rf 0« O M Ο Φ u >trf rf 0 rk b r-4 0 0 rf H rf P 0 k O « U 0 A th O <-h U h O O k o rf P Ch U 0 u k Ε- 0 A d W A 0 υ £ e* 0 Ε- W A cu a k Ο 0 O 3 U a U k O 0 A k Ε- Ch U J u Φ ϋ a u < U) Ε- (Λ < o Ο rf U

©

CN o CD

O o>

1001 TGCCAACTTCAGCA

32/85

110 pML· 1 SPAPPACDPAĽLNKILRDSHVIHGRLSOCPD I H P L S T P V L L P A V O F T L G E pML2 1 SPAPPACDPALLNKLLRDSHVLHGRLSOCPDINPLSTPVLLPAVDFTLGE

Mt m

-J _l © to Q. Q. © © > > 2> .J -J «J -U -J LL LL X K > > X X © © E E _l j O a σ σ U- u. z z X —1 u_ u. — — < < © (ň cl a. o Q x X x X < < »- F- F- CC C 0 © 0 O o. Q. _z 0 S 2 0 © -j -J a Q o O -t < c © 0 o o «-*

z Z x x x -í u. u. 0 0 © © © 0 F- H >- H CC E < < © © — — © © CO © Z Z F~ F- w W _i -J _i © © © © F- 1- EC E Z Z EL a. -J •j X x z z *4 1- I- x x IX Ll a. Cl © © F- »- ΕΛ © W © a. CL > > <c < — — < < a. £L a. Q. < < a CC x X < < O o r- © r-i

< < © © -j -j K < 0 © a. a. o 0 a. Q. © © a. a. u. LL -J © © X x — — © © © © -J J a. CL 0 o X x F- F- © © Z z σ 0 x x 0 © CL CL — — 0 0 0 Q © </) cz CC © u> I- F^ O 0 z Z -j -j —i 0 O a. CL — — X X «C < a 'Č u. lx < < 0 O j

J □ J J X x Σ x a a a a

J S

OJ pML 251 PDIPPATSGMGSRPTYLQPGESPSPAHPSPGRYTIFSPSPTSPSPTVOLQ pML2 247 PD I PPATSGMGSRPTYLQPGESPSPAHPSPGA YTLFSPSPTSPSPTVaLQ

33/85

111

Stul(366)

Nhel(387) darca spojenia Xbal(487)

Mlul(617)

Sstl(705)

Pvull(6065)

Mstl(4774)

Sspl(4192)

SstlW

PVU11(43)

Sspl(3756)

Pvull(3175)

Pstl(1717) BamHI(1773) Pvull(1883)

Sstl(1924) príjemca spojenia

Clal(i3i9}

Nael(3445) Narl(3246)

SaJl(242T)

Pstl(2433) Hindlll(2439) cial(259i]

Pvull(26B2)

StUl(3005) l|Xhol(3034) ľNotl(3039) [paclí3O47] IASCl(3O55)

Pstl(3072)

OBR. 23

34/85

112

Sspl(3635)

Aatll(35i9)

Sspl(3199)

Pvull(55oa)

Mätl(4237)

Sstl(4) Pvull(43)

SV40PolyA

SV40OI

Naei(2888)

SlUl(2448) Xhol(2477) Notl(2482) PaCl(2490) Ascl(2498)

PStl(2515] 'PVUll(2618) Narl(2689) príjemca spojenia

C1al(i3i9)

Stul(366)

Nhel(387) darca spojenia

Xbal(487)

Mlul(617)

SStl(7B5)

Pstl(1717) BamHI(l773)

Sal 1(1870)

PStl(1876) Hindlll(i882) Clal(2034) Kpnl(2ioi) Pvull(2125)

OBR. 24

35/85

113 mil./ Cu mm krvné doštičky (tis. ! Cu mm)

Oni po ošetrení

Dni po ošetrení

36/85

114 tis./Cumm tis. / Cu mm

Dni po ošetrení

OBR. 25C

37/85

115 lutuno/'Hin tuiu no/-stí

OBR. 26B

Dni po ošetrení

Obr. Z6C

38/85

116 iuuj no /-ituí

Dni pa ošetrení OBR. 270

39/85

117

Krvné doštičky (tis. / Cu mm) tis. ^{1 Cu mrn}

Θ— 332 z CHO

Dávka (mikrog/deň)

OBR. 28

40/85

118

Krvné doštičky (tis. /Cu mm)

OBR. 29

41/85

119

5B6

-C +

42/85

120

SK 282265 Β6

Rse.gD

MPL/Rse.gD

FIG. 30B

43/85

121

SxlO^MPL/Rse.gD buniek na jamku v 96-jatnkovej kultivačnej platničke (dno doštičky)

I stimulácia w/ljgand X 30 minút

Stimulácia sa môže urobiť v 50 alebo 100 μΐ

Solubilizácia v:

150 mM NaCl

0.5 % Triton-X 100

50 mM HEPES. pH 7.5

NaiVOj (índí-bítor ’í osí at'ázy)

Leupeptln. Aprotinin & AEBSF (inhibitory proteázy)

Transfer 65 jil bunkového-lyzátu do jamky s ELISA so zachytenou protilátkou, 5B6 (antí-gD peptid mAbJ inkubovanie x 2 h.

Ý

Premytie platničky a pridanie biotynylovaného 4G10, 400pg/ml. ΙΟΟμΙ/jamka

I inkubovanie x2 h.

i

Premytie a pridanie ľyned streptavidinu/HRP , l:10K, 100 μ!/ jamka i

inkubovanie x30min i

Premytie a pridanie Kirkegaard& PerryTMB substrátu 100 μΐ/ jamka i

Vyvíjanie xlOtnin ψ OBR. 31

Zastavenie s ) M HjPO, a čítanie 450/650 nM

44/85

122 co

M < n p ru w

M O JD E uj C •H

Eh < 0 U 0 · 0 μ μ

0 < u

0 Q S < U H 0

Eh , 0 0 μ 0

H 0

H

0 o < u u

<

0 0 H < 0 0 μ < u 0 0 ω < μ O 0 δδ <

O

0 .5 < E0 *'

Cli M cŕ > Z m m U CO 0 <0 jj X U > 0 cn m a x w E <D Ό X) ro tu cn

z ÍD U-4 (0 ffi H H = r-4 £ G Cl w

CL W c

0 o rt · υ u _ sn υ c 0 o < ~ u

H 0 < ÉΕυ < U H

S μ En 0 δ

Ε5

0 _ H d< <í ’ C

E0 U < h 0 U H H

U _ 0 0 μ < Eh <

CM

KS

L· δ μ Ε0 x

CD

Q

Φ

E CO Eh < rtí h Ll E 0 0 Q 0 < E* 0 0

0 H H < ŕ* É<

o Ž

Í

H o u < ευ u 0 u

S δ υ ’

0 U + 0 0 μ S > E 0 0 H < M U H < < H (0 H •0 0 0 0 0 H M h-l — 0 0 < H C Ĺu M Cí > Z H M 0 0 0 0 M (0 0 m 4J X < h m 0 0 O > U 01 cn a co 0 0 K U 0 <0 E Φ Ό -Q co ω u 0 CL U 0 JQ U 0

CO M kô 1-1 15 υ υ 0 t-4 0 CD rf U υ E- < H H M m CM X M Ε- <í 0 υ P H H O < rH «-c X M H υ υ i£ E- JJ υ •r< ‘H rH a-d >1 C υ υ (ť E- (Ú CO (Ú CP CP U ot cn E <0 H < Ε- í? E- cn CO £ £ cu X) X) Λ Λ συ υ 0 υ ro υ υ 0 υ 4J E- < H ΰ: E- rf 0 υ

Γ»

45/85

123 ro z ra U-Í co u μ ϋ CQ

U 0 t—< μ-t O u u o ra M M4 M ·-> E- < § ŕ* r-i > O ra ra rf E- rf Ε- C 4J U w w U 0 υ 0 w c Ό XI U 0 u u U 0 rf Ε- M M u 0 υ 0 <-H •H 0 U H rf n U u 0 0 u Ό ra u 0

rf H H

3 U Cm U s r

EEm rf

Em

Λ .

u u

U 0 u u M 0 o •H U U c

£ 0 u H C 0 U < εH < 0 U rf Eδ o < H tu

O U (D CL F—1 U 0 ra u 0 Ό \ Em rf 2 H 0 u E- rf *0 M HM U 0 CL M W X L·- rf E- rf t-4 Ε- tí CL x: a cl< μ H 0 U C H υ 0 CL <0 W U 0 U rf! E* É Φ U u H tfí c C 0 u (0 U 0 ra 0 O M Λ E- X) U 0 M x: 0 u t-C rf E- U 0 —1 w U 0 ra rf Ε- Hf 0 U ra H Ε- tí > υ 0 •H u 0 Q, Ή ra υ 0 ra U H C w 's. K· 0 U ra u 0 X 1—1 E x> H U 0 H H E-· rf H í H M •T-f 0 U •H t-i rf Ej U 0 □ H H M M u U 0 CO ra Em tí rf H c σ»Ή Φ ra U 0 C »-4 0 U 2 H Ή X) Ψ4 ra H ra 0 U C rf e- H rf n £ r-H a w U u 2 E- U 0 C \ rf Ε- 0 U U 0 E H ra 0 υ rf Ε- U 0 M CC u O υ 0 U 0 M X) u 0 M & 0 U •H 0 U ra H 0 u 0 U U U 0 x: r—1 u u rf Ε- nj U 0 C tz Em υ 0 M U 0 E 0 U 0 U H rf < E- G t- 0 rf Ε- u O U 0 U-l υ 0 0 U U 0 U 0 f- rf ·—. U 0 U 0 rf H *ŕ U 0 n 0 U E- rf E •H o E- rf U U 0 H rf Ό U 0 ra u 0 Em 2 H —' 0 U H rf rf E- H Z M Hl 0 U U 0 Em

TO

E a*

CD

O

CD

CN n

4J cn Ό

CL ra ro w

Λ rf U u u u H

Em Ľ) Ľ) Ľ) 0 rf

35 u 5 U <J o e h H H E-< ÉÉ>

o ra O w 0 U H U 0 ÉM rf Φ Ό rf E- -H 0 U rf £m rf E- U U 0 rf E- rf H ra u u E- rf 0 U U 0 U 0 0 U H rf rf H + H rf 0 U 0 U E 0 U rf Em H rf u H rf E- rf U 0 Ό 0 U rf É- 0 U

(N m CN

46/85

124

rt h u u E- « b < rt f- rf E- (J CJ E- rf <J 0 rf E- O CJ Hi rf E- rt e- 2 M rf E- 0 u r-< M 2 E- M < £- <h co u 0 X Eh < CLX u 0 r—1 H< U U-i < E- u 0 Φ Q H < H rf M x w cj c3 CD U »“4 H Hl CJ 0 E- rf <o H •H 0 u 0 U CL H υ Hf U 0 Ll U 0 x (Q «j H kD U 0 O U 0 H E Λ Clrf E- C 0 u 1-4 x ω (0 ŕ- rf 0 u 0 Hi μ U 0 u Ό E- rf Q) hi M M Hl HH CO U θ' 0) M Hl M 0 U rf h Φ 0 u x υ flj «5 <*-t Q. co c u M 2 E- υ Hl U 0 E OJ OJ u w CLU 0 H E- rf •H Z E- rf £ X U 0 Φ H 0 U Ή fO rf H Kj < CO Hl O 0 α <1-1 CJ 0 rf E- E H4 rf E- co W 0 U H 5 (D 0 u c H rf H rf íD E- < U 0 Hl U 0 E (J U rf E- □ 0 U rf H 2 E-

CJ) CM

QT

CQ

O

H

co ro (D Hf rf b 0 u 0 U E d Φ m e- < rf E- E- rf Lt E X 3 CJ 0 rf Ε- e* rf C rH 0 U υ 0 rf H ro rf K< U 0 U 0 rf E- 0 U U 0 rf E- H rf H rf H rf’E- 0 U crU u rf Ε- U 0 ro U 0 Ο 0 U 0 4J E- rf

0 EH m u.

Hl G > E υ u u u H rf

E- rf

0 U O (J

E- rf •H C X H rf CO E- rf M E- rf Ή .H Hl ΓΊ rf E- •H rf E- < U 0 44 X M Hl H CN 0 U C U 0 0 <0 0 Q •H M Q O «-1 0 Q E- rf E- 0« 0 u U CO □ 4-1 X U 0 rf Ε- rf Hf Hl H \ H rf F CO X G CO 0 0 υ 0 <0 Hi r? M Hl Hl Φ E- rf 4J U-i X X U 0 M U 0 tí E >4 d C M Hl d X Ui Li 4J CO Ή > M E U 0 rf E- *□* H H U U X CO Ώ Ώ Π5 <U M M U 0 2 E- 3 > H< E- rf O <3 □ O H 0 U 0 u C X ID Hl U O X 4-> o r-| 0 u 0 U M-f X CL-H 0 u « x C rf E- e- < CO (J U 0 E U (J < C <0 U 0 0 U rf E- U 0

H EH

U 0 U E-

e- < 0 u f-¹ <5 0 u Eh < U 0 O CJ rf E- H Ľ) U 2 E- r—I o u Hl Hf n 0 U C < L· tu Hl l-i Hl > Hf 0 U E U U Li -K CL CO (0 3 0 U U CJ O (J (0 CL (0 CO u 0 < Eh ω c E X Ό U u 0

U 0 H < rf EH rf E- rf E- rf K· < rf E0 u 0 u rf E0 U rf b in m o

Ό· r47/85

125 haelTI/pall hael ser FI mval bsrBI ecoRII

b U 0 b b 3 b u U b b b O 0 U 0 b M M b a ω M kO 0 0 k ro Q, H < b u 0 <n H (0 k υ o 0 U < b 3 b u 0 b Λ b a 0 0 c < b o 0 0 h r 0 0 c CL< b E « b X (0 U U 0 U H b Φ U 0 Ό b < M Ό U 0 •H 0 0 υ U 0 nj — M u 0 4- H b tC E C 0 0 U E 0 0 Ό m 0 U > Z M M 0 U CO XJ >1O b < (0 W Q. ľD 0 0 Ό £ ra n U 0 £ U 0 < b b 0 0 0 U H < H < f- É W 0 0 (0 CO c b -Q £ 0 U 0 U 0 U *5 b b o U < b c b u 0 0 U 0 U b < b a tí. b 0 U 0 0 0 0

QJ •σ Ό 0 0 0 0 b < b <C b U 0 0 0 b + 0 0 E b U M *0 b H M 0 0 H CC > Z Hl HC 0 U <0 0 ra u X b < > u in ω α x U 0 e v Ό Δ ra Φ U 0 ιη b < b < b < b 0 U 0 0 b b 0 0 0 U 0 U b < H H «C b < f- Μ 0 u £ b <C CL0 0 £ 0 U b < U 0 M b c H Uj b ••4 C Η U-i •H ζ tí b XJ £ 3 0 U bi b ra O 0 < b b a b b 0 0 0 0 b a b μ-< 0 0 (N 0 0 m b < NP 0 O l-< α < b r* σ> U 0 m H Λί b C 0 M X b a 0 0 Μ Q) £ k Η 0 0 E ra b < α C 0 0 E U 0 b 2 b u 0 b 0 0 0 0

iD tfil tru9I tru9I hinfl msel msel ddel mboll taql ahalll/dral asel/asnl/vspl bsll mnll

681 tgagaagaat cgacctttaa aggacagaat taatatagtt CTCAGTAGAG aactcaaaga accaccacga ACTCTTCTTA GCTGGAAATT TCCTGTCTTA ATTATATCAA GAGTCATCTC TTGAGTTTCT TGGTGGTGCT

48/85

126

SK 282265 Β6

(ΰ & 0 o a CC > H a ω U 0 Ll O ro M x: w U 0 0 u ffí C a rf to o TJ M •H rf Ε- M £ υ U t—1 rf H to H r—< rf Ε- •H C r-» ϋ U M—< + H § U E H rf U rf £ h-i Ό μ rf Lh 1—I w ·-1 H rf a Hl x > Z M Ll U U Ll ro 0 <o 4J M-f rf μ U > U w <0 a Ό u u w E U £3 «j X. 1—1 rf ** H (P 2 b •H CO μ rf U-l E μ rf ro U 0 M U O Z 0 U to μ < u-l rf μ <0 u u

co H O L4 rf μ C H -s. LO CO rf U 0 H 6-t m ťM 2 M M μ rf M H H rf rH rd X M l-H 3 U 0 0 JJ υ •H *r4 Ή a ή C Ή O U υ cn ra & tn U to tn E <0 ÍO rf μ fO cn to £ -C Φ a a Ώ a u U 0 U

821 AAGTAGACAT GGTTTGGATA GTCGGAGGCA GTTCTGTTTA CCAGGAAGCC ATGAATCAAC CAGGCCACCT TTCATCTGTA CCAAACCTAT CAGCCTCCGT CAAGACAAAT GGTCCŤTCGG TACTTAGTTG GTCCGGTGGA

49'85

127

0 (J

E·* rf u c H rf

M M — γ 0 rf h-( M + E -> u H ÚJ E ro i o ro Ό β Ό E b i α *0 n? rf C rf M Ό U n M M W H D 0 C C M ro _Q CL α 3 rf ω ε Ό 0 ro 0

σ\ oo

N r\ z o u OJ

M i-H e £ »-t x > ro U to ro Ό x

ro M CT C ro *—1 £ •H x: M M .C ro [u í—1 α > M ro o ro U > u U) W E Q) Ό

z

4-1

V) Ώ α <o mnll bsaJI bsll ddel

961 AAATATAAAC CTCTCCCAGA ATACCCAGGC GTCCTCTCTG TTTATATTTG GAGAGGGTCT TATGGGTCCG CAGGAGAGAC

Of

CĎ

50/85

128 scrFI mval ecoRII dsaV bstNI

H Z Π5 U-i w

o 0 0 U ti < Hl < Ε- H 0 0 0 < E- £2 Ε- X E 0 υ Lu 0 U X E-> Q U 0 O < E- Z E- ω e- rf < u 0 Ε- 0 υ rf E-> rf E- «4, E- H M 0 O 0 Ä E- n <3 E— E c U < Ε- 0 υ o C P E- Hl U 0 U U H (Ú e u

í

Eh «£

H 3

H 3 e o < H

M > H CbkD ro σ>

□

Π3 w

ro a H > ω 0 u ro Q 0 o C H

o O n

M (0 H M M —l > o (C

C 4J u w » c n •D (0 (0 x>

□ •—I rtj

1071 TTTCAAGTTC TCTGCTCCCC TCCTAAAGCT ATGCATTTTT ATAAGACCAT GGGACTTTTG AAAGTTCAAG AGACGAGGGG AGGATTTCGA TACGTAAAAA TATTCTGGTA CCCTGAAAAC

51/85

129

SK 282265 Β6 i

E

4 τ>

<y>

□ Uf JJ

M C > E

U C © Ht H-f rf b □ ra 3 M u U (0 > M Há f-< < b m ra ra Ĺf t-f a > 2 b rf U ra 0 ra AJ rf b U > υ w m (J U V) E <u Ό J3 b rf < b b rf Ľ) O b < b b 2

b rf u o M Q ϋ D<rf b W rf b > b < x.

M rf b c U O w rf b 4 b rf

U U m rf b e μ rf (Ί UO H H KJ Ľ) U

Q D rl Ľ>U □ J-» £ UD

C V) W 0L>

9J Ό «D UU rf b maelll apyl|dcm+] hphl scfl fokl bsll bsaJI

1201 ATACGATTTA GGTGACACTA TAGATAACAT CCACTTTGCC TTTCTCTCCA CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC TATGCTÄAAT CCACTGTGAT ATCTATTGTA GGTGAAACGG AAAGAGAGGT GTCCACAGGT GAGGGTCCAG

52/85

130 ►H

a (0 M M a Uj H M M > \ w ih H V ·Η a ra ra M w X w > M n ϋ ϋ Vl a. (0 ra ra M •H ro 3 ra w c E r Ό E E U υ co ra X Vi ω c TJ U X)

H — 1 E W M M *H —H T) 1—1 + H Φ E ra 3 0 ra ra Ό ra T) ra r Vi > M C Ό u x X) ra Ä X — >—i n M 1—1 M > M M 3 0 c C H >· Ä ra Λ a a ra 4J E E *o Ό '“i ra c Π Δ

«5

E w U ih M-r Q C •“i ·Η PH ar σ ra jj

U-i υ co alul pstl sali mael alwl[dam-J mnll hindlll bspMI hindl/hindll alwltdambsaJI ddel bsgl accl xbal mnll bsaJI

1271 CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG GTCGACTCTA GAGGATCCCC GTTGACGTGG AGCCAAGATT CGAAGACGTC CAGCTGAGAT CTCCTAGGGG

53/85

131 □ S >—I -ej* Π5 □ C «4-1 rf u U

Ž rf b

U rf fr* H 0 0 b á H í b U 0 rf U 0 b b

EH b· rf 0 rf ε- U υ 0 b b rf Eh U 0 b rf rf rf b b rf b b U 0 Bh U 0 0 b rf § 0 U b rf Eh rf u b rf u 0 U rf 0 U b H rf ÍH 0 U rf b* rf Eh b rf M H 0 U

ra E rf

H

U b b n 0

Q) CO E

E co b

S ž

0 u sau96I acil haelll/pall ínuíHI asul bgll nlalll sfil styl

rf b <—I b rf b rf U 0 b rf CO rf b b rf Φ U 0 0 U b rf b rf o b rf b rf mt b rf U 0 > b rf rf Eh 0 b rf rf ŕ- < b rf U 0 EM rf u U rf b u 0 U 0 O u 0 U H M o U rf b H M r-4 b rf rf b O CO Φ <0 rf b rf b CJ η α 0 U 0 b rf CT3XX) U 0 5 £ l-l 0 U rf b

OBR. 323

LD

Hl O U 0 rf Hl H Q) H U 0 U 0 Q) M (U 0-0 u rf b ro M-4 £ 0 0 U U 0 Φ D X b rf b rf H x < h b rf CF H 0 U m b rf CO ÍC U 0 0 rf b JJ b rf arf b U rf b CG rf b rf b U 0 U 0 rf b w b rf Hl U 0 X Hl b rf X b rf 0 O rf b ÍO rf b □ 0-rf b M-l U 0 W CO 0 U m 0 U 0 U rf 0 U b rf 0 U rf E-

OJ m <3\ en

54/85

132

M LO

Q □,> H tr) en M m O k O ffl C -H h α σ C JÄ £

1 H w A rf ra h rf E Ch r-. H X < A <0 a i ai H O rf A Ό u ε w r— ra o h rf x> ro E i m w r- H rf M ~ | Ό £ c ra drf h H + E H — ra E w rf H 0 g ro O *0 x ro d u < Ό (o ό a 1 o — — d u c C Ό ~ « E «—> ·“· 1 ·Η X. ·— M £ rad XH + e ~ o u σ» H H H X Ό m ra Em i u 0 m 0 C C H M — £3 Ό ra Ό E H rf k Ώ CL Q. 3 k M \ H c Ό — a rf A 0 ε Ό Ό t> u CTl-h rf X. — M Ό 0 U CL E nj ra n h M l-< — U O o +j ή □ o C C M H rf -T ϋ ra D Q. Q. Ϊ rf H > W E Ό Ό ή 0 U «

55'85 bbvl dsal bani hinPI bsaJI asp718 mnll hhal/cfol nlalll mnll mnll acc65I ddel acil

1501 CGGCGCAGCA CCATGGCCTG ÄAATAACCTC TGAAAGAGGA ACTTGGTTAG GTACCTTCTG AGGCGGAAAG GCCGCGTCGT GGTACCGGAC TTTATTGGAG ACTTTCTCCT TGAACCAATC CATGGAAGAC TCCGCCTTTC

133

U 0 0 U U u rf F U 0 0 U rf H u 0 υ 0 — u 0 ·► > E u 0 M U ŕ- < ro M Ό v 0 r—| Hl 1—1 n 0 U C Lu M IX > Z Hl M 0 U u ro 0 flj 4-» >.·□ rf F u > u 0 0 o. ro u 0 (0 E 0 Ό Λ ro 0 υ u 0 e U 0

0 0 rf F 0 0 0 0 <C É- 0 0 U 0 ·— 0 0 + U 0 > E F rf H U ro Ό U 0 r—( •— 0 0 C Hl Z w M 0 U ro 4J > •ro rf F > W α ro 0 0 E r <0 © U 0 & U 0 u 0 F rf 0 0

u 5 rf F rf F F rf 0 0 u o U 0 0 0 M 0 0 Ή υ U 0 ro 0 0 H 0 0 0 rf F «4 0 0 U 0 0 0 H 0 0 -H 0 0

u tcua

H rf rf F 0 0 l-l rf F H l-l M rf F ef F Ll CZ > 0 U ff F 0 ro 1—1 Ľ) u 0 0 O O CO 4· F rf 0 U © (U Ό E 0 U H rf U F rf 0 Q •o 0 u H rf M ·— 0 0 f—1 Z H4 H 0 U ro 4J > rf rf f* 0 U > W £L U 0 0 0 E J2 ro 01 U 0 rf £ Hl w rf F H rf H H rf F H 2 Ll cd > u C 0 0 ί- 0 ro 0 U rf F ο U w rf F 0 0 w Q) Ό u 0 H rf F rf

F rf rf F F a M rf F rf F M u 0 a F H F rf u 0 ro U 0 F rf M > F rf U 0 z h ro rf F F rf ro o h U 0

F rf o Hl rf F w p ♦H H M 0 U r4 Hl U 0 CL W ro M K Hl F rf □ H M 0 U α G Ή 5 M CD U 0 CL ro h< Hl X F rf C »—( □ α 0 u H CL > x: CL CXrf F ro > w rf F Z ro o- CO w U 0 Q* C O 0 ro 'k. M W C C 0 0

56/85

134 nlalll styl ncol bsrl bsll dsal asil acil acil bsaJI mnll

U u M 0 0 □ 0 0 <-< H 0 0 φ ·~Ι 0 0 M (0 μ < Φ d Ό \ 0 0 •O H H μ rf <-4 Hl μ rf C H rf μ g φ 0 0 ro 0 o H M £ 0 u rH H O o 0 ro h ro 0 0 Q. C ω o u M x e D

0 0 C OJ r-4 (0 rf μ MM -O MM (0 H< ro 0 0 cn £ '-i CL H 0 u C s. »3 0 0 E M ra 0 U H <0 0 u Hi £ 0 0 Φ ro T^-1 £

1941 GCCGAGGCCG CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC CGGCTCCGGC GGAGCCGGAG ACTCGATAAG GTCTTCATCA CTCCTCCGAA AAAACCTCCG

57/85

135

H H w O X Γ- e CJ Q ΟΟ C H W M kH m n U e n p p CTOD C3 u

W CL (0 £ W U Ľ) ro μ « o e P Ό H < •H 's < E- V)

(Λ M H ŕ- «—< P M U t- ro H k <U (0 H H rf CL H C P £ E CO e- rf X 0 > (Ώ 3 H <4-1 E H H OT E- 0 υ O \© U ϋ p H M H P Γ) υ 0 C H H M f—1 H H U CN H o U •H Ck H X > z C (0 M Q D H x. H M o Ľ) k ÍU O P •H £ fU □ P Dj H £ X Ό □ > u w w x: £ £ C n C ro h « cn o U Φ CO E 0) TJ £3 P P £ •H £ O £ cn u C P £ £ cn £ o o k H <0 H o u 0) X ΟΊ H E- W r-1 5 Q) 2 C U k W H < •H Φ P E F < H ''•v H < H k H h-1 Ot M H < E-> (U 4 M □ U 0>

n x O U H H D U o c O H H M H X C u □ 0 4 k CT o; H k 'T H P o u •H £ υ ro ro P P □ •H o u P g ω y 0 (J C U M ω o ro c P ro ffl υ υ N M k M t* V) < Ε- k CTH CĹ H £ o Ο ro ro 0 Φ ro M o o ro P £ ro > H Ε- < 00 c X CL ro C H Ο u t-f —4 E H O 0 rH H H < H U < H 0» F < D ro ro H < Q. a E D O Hs. p H H H H H □ U ro H Ή O U P <y Hl

maelll cfrl maelll apyl(dcm+] tru9I alul bsrl maell bsrl bsaJI maelll msel

1971 TAACAGCTTG gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc CTGGCGTTAC CCAACTTAAT ATTGTCGAAC CGTGACCGGC AGCAAAATGT TGCAGCACTG ACCCTTTTGG GACCGCAATG GGTTGAATTA

58/85

136 sau3AI sau96I mbol/ndell[dam-

+ c M M μ rf E a P M rf H (0 Ό > O o U Ό Q. E u 0 u 0 H rf μ C M u 0 a Ή H 0 U Ό υ CM o 0 l-l <0 m υ 0 ·—< H ra d0 0 •H Q M (0 0 U υ M ''x M ώί 0 u <0 z M C H x < μ Π3 M E H W 0 υ M M Ή M 1—i 0 i4 μ 0 M Φ P £ (0 rf μ 0 0 <0 OT e Φ 0 a U íD £ to 0 ο M \ ''x 0 0 H > M H M

c CO M M M —l O M M μ •H £ <0 M cn c •H <D C H < £ £ M (0 CO •id cn <o to 4 μ C C £ £ £ £

bgll ahalI/bsaHI sfaNI

2101 CGCCCTTCCC AACAGTTGCG TAGCCTGAAT GGCGAATGGC GCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC GCGGGAAGGG TTGTCAACGC ATCGGACTTA CCGCTTACCG CGGACTACGC CATAAAAGAG GAATGCGTAG

59/85

137

CL· rt U 0 E rt ra b *í C (Ú w 0 U Li 0 E o 3 rt £ x U 0 rt ''s. U 0 £ £ H 0 O Oj W rt U 0 3 -H 0 U C ra H 0 υ C □ cj e Ή £ ra U 0 M-| 0 υ £ £ ra 0 Q rf h £ rf b W p rf U 0 C rt rt 0 u U 0 > u-r O E 0 W rt rt b rf 0 u V) U rt U 0 b rf rt M n w U 0 p 2 Cj rt H OJ H £ U 0 U 0 C M Q n T—i ro 0 U rf P rt Π3 Z jj £ £ U 0 · u c £ £ C w U] £ 0 U rf P rt rt £ £ rt U 0 b rf H KD rf P U 0 CO a H rf rt 0 u co w rt M U 0 υ O rt O 0 rf H (0 rt CJ 0

0 o rf P 3 C rt w CL· rt c ra rt rt rt Q CO rt CN 0 rt rt £ > U £ £ 0 P P rt £ £ £ i-c U 0 ra 3 rt 0 £ C w CO n CJ H p rf rt rt £ £ w rf ra U u U H ra u 0 ro P E rf P E 0 P rf 0 rf P P

rt u 0 0 U •H 0 υ 0 L> U u 0 H rf ra u 0 U Q rf P H b rf u 0 C 0 U rf P > H 0 U u 0 E Ή rt rt 0 U P rf H \ U O co U 0 P 2 rt ra rt n 0 U rt H U H OJ P rf 3 H a D M *s. •H rt 0 u rf P C ra 3 rt Cb rt U £ u 0 P rf rt £ C U C ra ra CO 0 u i-i 0 u rt rt £ •H £ £ u 0 H 0 u £ £ μ 0 0 υ u 0 <T> rt rf b ra 0 υ 3 ra rf b P rf M CO P rf 0 u rt E b 2 P rf rf b

hpall bspl286 nael bmyl mboll maell cfrlOI alul banll

2301 CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC GGAAAGCGAA AGAAGGGAAG GAAAGAGCGG TGCAAGCGGC CGAAAGGGGC AGTTCGAGAT TTAGCCCCCG

138

SK 282265 Β6

X α x o o 0 U b rf b rf b rf rf b 0 U £3 υ (5

Φ ra

E

U U υ u b b b b b b 0 0 U u o δ U 15 U 15 0 · o b b b b

V) x>

rf b b b rf e b b b b

U b b < b (J

U _ 0 υ u · u b U b rf b U o u ž rf

0 Ž § ω

M rf t- b rf σ 0 U 0 U bi ra U 0 U 0 b* b rf u 0 C υ 0 rf b E > bi U 0 3 u M U bi rf b rf b ra •H C υ c H rf «—i σ' ra 0 u rf b c X Λ □ υ 0 U □ c b rf U 0 b rf M U 0 b rf U 0 b rf ra 0 u U 0 α U 0 0 U x. b rf b rf I-1 rf b 0 U M M U 0 rf b bi kO U 0

σι < b δ 0 0 b b

U 0

B b b 0 b b

Q U b b b 0 b Sž I s o o b U o

b rf ra □ D 0 (J b rf x ra w 0 U b rf vi.ra 0 u rf b b rf C O 0 U U 0 bl rf b U 0 »H ►h b rf > b rf 0) bl H 0 O M b rf ra H rf U 0 ra 0 u E ra co rf b M w G 0 U TJ Λ U 0 0 U b rf rf b H 3 ¢- rf 0 U b rf 0 u b rf b rf U 0 rf b U 0 0 U U O b rf b rf 0 U

CJ _ u 0 h Eh

C

Eh Eh

O H

U δ u <

rf y rf 0 b υ o

b rf C U rf H bl b rf σ» bi rf b 2 (U rf b ti ω b rf bl E b rf b rf U 0

o m (N tru9I tru9l msel haelll/pall msel alul msel apol

2571 TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT ATTCCCTAAA ACGGCTAAAG CCGGATAACC AATTTTTTAC TCGACTAAAT TGTTTTTAAA

61 /85

139

H H U 0 OJ 0 U rf fr· <o H rf 4-4 0 CJ E 0 CJ 0 U 0 H fr- rf U-l u CJ □ 0 0 U u 0 Ή 0 u h* •*X u 0 m rf E- £b 4-4 o o < E- C M HJ u 0 U 0 •H X £ rf fr·

£ sr £ M 0 U U 0 □ > fr· rf 0 U H < C 4-1 jQ 0 0 tí fr* tí fr· U-< M XI 0 CJ 0 0 H tí fr· M 0 u < H 1-4 kO U 0 ro 4-4 e- rf μ tí «3 CL tí fr· >—f α tí fr- fr· tí n w H rf c to u 0 M U 0 ki u 0 CJ (0 fr· rf ••“f 0 0 tí fr· \ 0 u O U 0 M 4-4 1—1 U 0 M (0 U 0 X Φ M 0 0 u ►—4 1—1 CL Ό 0 c H rf H <-4 0 u Z X H rf to Ό C w U 0 M 4-^ r-i fr· < CO 0 tí H m k0 >—4 W '•x fr· < to 4-1 £ U 0 U-l M O 0 'x CD rf \ H 0 0 XJ 4-4 XJ rf fr*· ω 1-4 h-4 M 4-1 0 0 M CJ X 4—4 sr tí fr· (U 4—4 XJ 0 0 α f0 ÍXl 4—4 > 4-4 0 U tí rH X 1-4 £ «7· U 0 CO H fr· < (0 a h -4 CO 5 U 0 -H CL-H > «J 2 0 U E Q) 1—1 0 U E £ U U ω <0 0 0 Cn CO <0 E Q. ŕ—f H C ro c U 0 CO c U u 0 £ Λ Λ £ <D fĽ 0 U E ŕ0 rf E-· H tí 0 U M 0 0

rf 0 3 0 0 KÍ É- 0 u H < fr· rf U 0 U 0 fr· rf fr· rf fr· fr· rf rf fr· 0 0 fr· rf fr· rf E-* rf rf H U 0 fr* 2 rf fr· w 0 0 0 0 ČJ 0 •H 0 0 0 U rf fr· υ 0 u F4 «j O 0 kD fr· rf fr· rf H 0 0 M O H rf u 3 •σ 0 0 4-4 ST dj rf f- μ-t u rf fr· Φ f—1 0 u 2 fr- M C Ό 0 U CtJ Q. M 0 0 u 0 O > fr· rf E «η σ» tH tí fr· υ 0 *J E 4-4 0 0 Q. 3 Φ 2 fr· 0 0 U k0 U 0 U (0 e- rf 4-4 rf fr· h-4 X. M 0Ί 0 0 4—1 E e? 2 en M 2 fr· CU 1-4 M l-l ΓΜ 0 U rf fr· 3 Φ C f!JHÚ D U 0 M M CO e- rf •H £ (B 3 4J X α h rf xJ E H rf £ £ £ C (0 (0 M 0 U to rf H 0 (J JJ M XI Ό CO U 0 to 2 fr· E^-1 en rf Ε- rf fr· H rf H £ 0 υ d. fr· rf fr- h-4 fr· rf μ-f U 0 H O 0 O 1- 0 υ ΟΊ m tí h H •Ή 0 C ÍL 0 0 D Φ 2 6- X υ U 0 CO CJ 0 0 M k* W H tí *r (0 0 0 C CD U υ C -w E h· 2 P U υ > C μ-< E H t* rf V-i Z 0 0 rf e· *X. 4-f k£> fr· 2 C0 fr* < 0 0 w O (Ό tí fr- Ψ-Ι rf fr· fr· 4-f Q, M OJ 2 fr· to 0 U 2 H α CD «-Η 0 U P rf u 0 D 4J £ 0 0 u 0 1-4 υ 0 c 10 CO 0 U fr* rf ·*—1 0 U M-i XJ Ό U Ľ> 0 0 υ υ 0 tí fr- 0 0 (U 0 0 2 fr- E- rf o 0

62/85

140

SK 282265 Β6

ro □ £ £ U 0 x <£) 0 £ C W « O U M r*) Ή JJ Ή £ £ U o M M M Od 0 Λ. H H •H M o D r-1 M x. M U (0 □ 4J £ cu H rf M H 0 u (0 £ G W cn c ra rf E** ro M X H rf 4J Μ-ί £ £ •H £ 0 U M (0 a< e* £ £ U 0 C u « o u

£ E- rf IH rf E-* rf Eh σ» H rt E- U 0 □ 0) Eh rf M V) H rf £ E E-· rf 0 U 0 U U 0 0 u IH U 0 rf H £ ä. H Eh rf au 0 rf H £ h rf H rf H rf H rf H rf H rf H rt. H rf

HUU Eh rf U 0 H Ľ) O rt h 0 U e < t- h *S 0 U ε u o U 0 M Eh rf Λ Ε- U 0 H X O U υ o 0 u > ra c u b < 0 0 U « rf Eh u u rt h ra £ u u n E-i.< H rf x. X M fr4 rf w Ľ? Q <-> h < h M M M M 0 Q MM M 1-4 M M M Φ H X <0 H < (D ra 0 u c ic aj ro u 0 Q. Q.H Q. H Eh rf •h £ ra g rf E-< « m x c o u Ό 0 U £ ra ra 0 u C C «Τ H <J O H H X U 0 M rf Eh 3 > M H rf ^H H M H H rf a) Eh rf G £ 3 U 0 CH σ U 0 Ό En rf wXHOU E Φ σ m o u 0 *0 U 0 ra rt H ra 3 3 tH 0 (J H rf 0 U £ ra co O 0 U F· rf M H H 0 U w ra 0 0 U Eh rf Lu M M M J> M u kl •h a ra ra 3 0 u <U rf &4 0 U υ u w am ra u0 rf H 0 u co αε£·ϋ h u u 0 rf H En rf m < h rf 0 U rf Eh n E u 0 U 0 rf H a « m < MM rf H H rf cjXhCU M rf H 0 u rt S Φ W U 0 0 3 W rf Eh rt En £ U O £ d£ rf E- e- rt < f- E X) £ 0 U rf s

M M M n Q m co ΟΊ σ\ 04 04 OJ

63/85

141

rt Ε- E-* rt υ u O 0 e- rt U 0 u u U 0 u u e- rt u u E- rt < E- rt e- · rt E- E- 3 1-4 f- rt e- rt z rt e- U 0 ro <4-1

rt ť- U 0 ω 0 U H U 0 U 0 rt E- —R rt rt F 0 U rt E- 1 E n U U U 0 rt H E w M rt E- e- rt rt E- 10 Xi Hl H u u U u E- rt Ό M to x e- rt H rt 0 u <— n> f-H Qrt É- 0 U rt E- n l 0 C ω u 0 U 0 rt ^H H + ε M Λ E- rt U 0 rt E- Φ E Π0 4—1 Ό to Ό ώ H u 0 E- rt M 0 U H C *0 — Ll •H O U h rt £ E- rt rt —¹ I—I (0 U U 0 E- rt CL0 u r> 1—4 4—4 M X) <0 U U rt =- JZ o u 2 O C C E-· rt U 0 e- rt Π5 X> ο. α rt H rt E- U 0 w E Ό Ό e- rt rt Ε- 0 U o u υ 0 U U h rt E- rt rt ^H rt E- E- rt rt E-

o

H Ert

U <

rt H H 60 í l·· 0

Ert Ε0 δ b - rt a μ tn * X

CQ m kO

H rt U ΕΟ rt Ert u frt o rt o u H O £ rt au X P

EU

Ευ 0 O EO . rt U 0

E- rt rt frt Ert h H M 0 U 0 U e- rt rt e- rt 4-4 0 X) ε äž (U 0 EEU E- rt 0 U h rt CL O U rt E- H rt V) e- rt rt E- 0 O ro h< í- rt E- h < oo rt E- rt rt E- U 0 HNid- E- rt rt U 0 rt ι-t X 1 M

•H Qu Ή

E- rt 0 U E- rt σ> tň W ε rt £- E- rt e- rt -G X) £} Ό X) e- rt H rt U u —— e- rt h rt h u u >—1 »—1 E- rt D. E- rt 0 u 1-1 + U u « rf Ε- μ rt 0) ε e- rt ν) rt E- E- rt o H rt μ rt e- rt M C Ό e-* rt rf E- e- rt rt — rt e- 2 F rt Ε- n H 4—f H 2 0 C E- rt U 0 X υ o to X) CL U 0 H rt 4-4 u u cn ε Ό U 0 e- 2 □ «H u u U 0 u u C □ U 0 > U 0 u u L-l rc 0 U M rt E- E- rt H rt <0 rt Ε- rt E- E- rt Ή υ u 2 ^H e- rt C 0 U 2 E- E- rt U 0 E- rt E- rt i—l i—l o r- o o m n ΓΊ

dpnll(dam-) bstYI/xhoIT mboll(dam-l apaLI/snol taql alwl[dam-] acil eco57I alw441/snol maellí bsrl nspBII

3201 ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA TACGACTTCT AGTCAACCCA CGTGCTCACC CAATGTAGCT TGACCTAGAG TTGTCGCCAT

64/85

142

0. ra b tí KOU Vi U m H< b tí E O d CO tí (J (3 b tí (XI 2 a. b O 0 tí x M U U hH tí b •H ĽL-4 >0 U CP a b σ cn cn E tí b U U 0 £ £ £ £ 0 O £ ω u b < < b tí b 0 u U U tí b b tí tí b tí b M U 0 2 b M w M H< X 0 U u 0 ω H M H > >r H ra 0 U u 0 k H Q. CO r® U 9 í0 0 U b tí □ U n Cl m ra ra £ U 0 M b· tí w c e x: τ> \ 0 X U 0 10 b tí M M 0 U O b tí ·—1 M M U 0 XT o o o C ra ra tí b H r4 o •H en£ ra Q. H r· u o £ £ ra 0 u w Vi c α tí b b tí M CX E w Ή 2 b tí b X <0 W O U 0 U

*-< 1 Hl M + g 1 Ht 0) E ra E 0 Ό ra *0 ra £ M c Ό Ξ X tí ·—· 1—' \ m H Hl H< M H» 3 0 C e 3 ÍM ra £ α a-» 4J cn E XS Ό ra Ώ £

o e C o u > o u E M H tf X M E-> rt m n o E- <í H( ♦—* h—1 CXJ U4 H < •H M Q D w 0 O u u ra a íj £ h -s < H ra £ C V) m Oj hc Ľ> O 4J M-J £ £} C ra •H £ d H £ £

csp6l bsrl ddel scal hphl maelll sfaNI fokl

3381 TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGTGATAAG AGTCTTACTG AACCAACTCA TGAGTGGTCA GTGTCTTTTC GTAGAATGCC

65/85

143

H

E- < r— u 0 M 0 U Hl U 0 1 u u > < μ Ή rt e- E (J 0 C £ u 0 (TJ E- < Hl ra μ rf HM £ 0 U CL t- 3 Hl *O U 0 < μ U U Hl — rf μ u 0 Hl š E- Φ Hl r—. 1 2 μ u 0 Hl 2 Ε- Hl ra Hl μ- E μ rf Hl 0 C Hl υ 0 Hl E Φ ε ra 1 0 U Z E- rf Q) Ht Hl H4 U 0 Hl Ό ra Ό E μ rf ra μ ra Φ IM Z ra Hl C *ϋ ro Um £ ra UH tr M U u μ rf \ -— Hl Ό rf μ W 0 u Φ U 3 -H 0 u e cn Hl Hl H« C 0 U u C U u u D 0 C C w μ rf μ um ra 0 u ra Ώ a a 3 rf μ U 0 t- < ω E *O •D **M 0 u U o U 0 ro 0 0 rt μ rt Ε- 0 U Hl U 0 0 0 Hl 0 u M < μ < E- Hl o u H u U 2 E- Hl μ rf Φ Ε- rf ra ro H < <-M rf μ E 0 u < Ε- C u 0 U 0 0 U rf μ 0 u E- rt rf μ rt μ H 0 U u 0 0 0 Hl a. ε- rf μ u 0 Ht υ u u 0 rt μ ra E- < 0 U o U rM < Ε- μ rf u 0 C υ u μ rf < μ U 0 μ rf μ Ä E- μ rf 2 μ 2 E- μ 2 u 0 H < μ & u 0 < Ε- H 0 0 < μ υ 0 •H 0 0 e- < Hl U U U 0 0 < μ Z 0 U ro υ 0 u 0 X7 M E- ťf rf μ u 0 □ > U 0 rf μ 0 υ

> CN

S s O

Um £ Ο U Hl E- «t rf μ μ rt 3 U 0 rf μ U υ ·—( 0 U 0 u < Ε- ra st Ε- μ rf υ U 0 U rf μ Ο u 0 U rf μ Ε- < < E- 0 U f- ŕ— 2 Ε- μ rf Ε- 1 0 U 1—1 0 0 Ε- 2 H E U 0 3 0 u L0 M ra < t- Ch H4 H1 Ό u u ro Hl rf μ E- □ ra □ *-* < H H Ht Hl 0 o 0 U ro > cn Hl *— 1 ►M 0 U a ra s 0 u < Ε- w ra ro H + E f—< »—1 0 U CO 1 Cl ra 0 0 0 0 Φ E ra U C *c h E > E £ w 0 0 Λ E- Ό ro Ό a e 0 u H ro £ rf μ 2 E- H C Ό ^l—' cn 0 U ro Ξ rf μ ŕ- rf \ ·— H £ U U H í—( 0 u υ U m H Hl Hl E- C C w ~ 1 0 υ Ε- 3 0 C C Hl Hl < Ε- M + E 0 u ra £ Q. a 3 H Φ E ro Η U υ CO E Ό Ό > U 0 U Ό ro Ό μ rf Μ < Ε- Q- E U 0 Hl C Ό — H rf Μ 0 0 A rf \ — M u u (D Ε- < 2 Ε- cn Hl H Hl u 0 <—1 rf Ε- υ 0 3 0 C C μ c u 0 < Ε- ra £ n. a< Ε- 0 U 0 U w E Ό *0 0 0 0 U E- < μ Η < U U μ 2 E- e- «; Q u

t-4 CD m cn

144

C u 0 U rf H M Ε- rf rf E- 0 U L υ u 2 E- M E- rf m H4 M l-( .c X> cn M E- rf Γ- M H o a 0 U 3 OJ 2 H Η < ct ra «h x: H 0 u Le (0 H rf í w a μ E U 0 .iJ E H 2 ►-· 3 u E x M > au 0 rf e- •H u o o t-4 XI 0 u ŕ- rf U u o ra \ rf μ r-4 M U u (D HC 0 u r—< M 0 u 0 a < E- 0 o C a 0 u U-l ω 2 E-· C rf Ε- W E- rf O U_i < E- E υ u σ*υ 0

e-4 u u u u H rf M 0 u M E- rf rf f- •H e-t u u Ja! rf 21- > \0 0 u 0 M 0 U rf É- ra H O E- rf ►M au u . H rf H H 2 M w H rf rf E* a> w 0 u m > U 0 0 U ra au 0 X> rf Ε- E- rf E cn rf F »—1 0 U U 0 a 2 F c rf H 0 U v> U U M ra H rf H rf rf E- cn t-« \ rf E- 2 2 £m □ Φ M 2 E- < ŕ* u 0 U cn Φ H rf £-· rf u U 4J E W H 2 E- rf 0 u (0 rf E- 2 H rf 2 Ε- 0 U rf E- υ o 0 U 2 ŕ- rf E- rf u 0 2 n U 0

m LD r>

r-1 rM Γη ω r* n

67/85

145 e o eFEE0 rt 0 frU G <

§ Ευ <

σι

υ υ 0 U P O rt E- Φ υ υ fr- ? k w E- ra M υ υ E- rt XJ E H rf E cn rt e- rt p £- 2 P Hl υ o υ υ H 2 M Hl U-l fr- rt Hl 0 u E- rf 4J OJ C g υ ΟΊ Hl rt e- rt Ε- ·—1 -H í ^H P 01 rt h U υ rt frx: M g υ k W e- ·$ Hl E- m υ υ JJ E E- rt ra Ε- rt o k t—I υ υ í Ό υ g 1—( g υ 0 O \ t- E O 0 fr- rt Hl Hl J? E- ra c Ε- U 0 σ» H< Hi rt E- o> υ υ rt e- p 0) Hl rt L·

ω w

0 U ž

ÉK, υ o υ o u g E- rt

U G FŽ

X M ΙΛ o* s o □ w ra

U

O a: frG É0 Ert

U

S frH

S

H 0 U

G í g u § G

H υ υ u W ra b rt r—1 h rt 4-> E £ E- rt C υ υ ra h rt E U G rt Ε- > Ht 0 U Ο u M υ m ra •H C É- rt É- rt rH •—1 σ ra 0 U e- rt C 1 £ Ώ 0 U rt e- E rt 8 υ ra b < rt E- Ό rt E- rt 1 *—> υ υ e- rt E H — 1 rt Ε- e- rt ra Ht M h- E υ υ U 0 *σ Φ Φ E ra e- < rt E- Ό TJ ra ό Hl Ό H C Ό U G e- < M rt x — M υ υ rt e- Φ ΓΊ Hl H H U 0 E- rt TJ P 0 C C f- rt rt fr- M C ro .Q Q. CLrt fr- h rt rt n E υ *ό υ υ rt E- m h

«ο rt Ért Ert E3 EU 0 υ o rt Ευ u E- < ~ rt frra o. υ w U Ό — I — Hl + E I M E <D E O ra n ra x: Ό ~ Ό X υ o f- rt υ υ h < S£ c s 0 o b⁴ rt

S E0

O _ U 0

h υ G rt Ε- υ υ P 0 C C Ϊ Ή E- rt υ 0 E- < ra .d ~ a Qj '-i c υ υ < p υ g n E 1 Ό Ό ra E ω o υ υ rt E- E ra υ υ rt E- e-< rt Ό υ υ E- rt F- rt M rt fr- rt E- H rt x: M —. 1 H rt E- rt b* g υ Ο,Η + E *-< e-« rt rt Ε- rt E- m x: Φ E ra o Hl 0 U υ u rt Ε- ra Ό ro Ό X -í g υ U 0 υ G E M c τ> — X ra e- rt rt E- υ o i- rt 'x — H> \ Q. rt E- rt Ε- rt ε- n H< XX H« Hl \ υ υ υ υ υ u P 0 c C >

ra

Λ Q. CL M

rt Ε- M H rt rt Ε- «0 E TJ Ό o rH M υ υ -x rt E- υ G x> ra ό

O M-l

G U υ u υ

S Eο υ e- < rt t

H U á <

0 H F

H Ž H oj rt Era E- rt e υ υ

G U 0 G rt fr⁴ rt Ert H rt EC> H H □ Q) H .

M (Λ Φ É- rt

U E£ l· tf (D H rt rt ΕOD· cn o Ch m to cn m

Γ4 O

68/85

146

I g ra Ό

0 U b < b rf b rf 0 0 b rf b rf b rf 0 U 0 U

U 0 b rf 0 0 rf b b < rf b rf b rf b 0 0 U 0 Hí rf p 0 b rf ή rf b υ 0 u rf b H 0 U ra 0 u £ u U £ O U rf b

Ό Π) δ δ — w I £ g

—> i Hl ra b + e ►k — -c b ε ra O 0 ra ό c E —H b o — X ra i h b “ H \TJ E 0 u

Φ

Ό H C rf

Π H H H W “ ffl JJ 0 C C H Ό g b ra £ a a aj F-. rf <0 E Ό Ό w ·—f H »— 1 u JQ ra H + E 0 Q) E ra rf Ό ra Ό rf Hl C Ό — rf •x. —· H u m H H H b 5 0 C c rf

ra χ α α » e -ο ·σ α b 0 b 0 Ž 0 § 0

Hl Η um__ ra q.0 0 ta ' c rf b U 0 0 0 rf b b rf u u

5 b

U h 0 u o rf b m U 0 o b rf U b rf w U 0 0 U >«Ν

Η» x cn o rf b u u b b b U í

0 0

0 U U U 0 0

5 0

0 0 rf b rf b rf b m Q U k h b rf n h u 0 a h < p a? rf b ra b rf E 0 U U U

0 b b b — b 0 0 rf b b rf 0 0 0 0 rf b rf b rf rf b U 0 rf b rf b rf b U 0 0 0

0 0 U 0 U U b rf b rf b rf b rf b rf U 0 b rf

0 0 0 0 0 0 δ u rf b U 0 b rf 0 U £á

0 0 u y u δ 0 0 u δ t ε ra •σ

0 0 rf b rf b 0 0 0 0 rf b

Μ

ra 0 0 > b rf Hl + E — σ· E H Hl Q) E ra i £ 0 U x. kD 0 rf b Ό ra ό ε H rf b Ht D Lk rf b M C Ό — ra Φ 0 U M H CN U b rf rf \ Hl ό Ό b rf M Q □ Hl XUU CO H M Hl ·—· Ό u U ra □ AJ £ Cu M U O □ 0 C C H rf b £ C n V) C ra 0 U ra £ a a j 0 U kJ Lk £ £ •H £ 0 0 » E *0 Ό M u 0 £ £ 0 U ra

δδ b b h b rf □ 00 -H 0 U “b ra rf u 0 t! rf m rf b H H Q (J d ra 0 u w au u E £ U O σι ο

CN

69/85

147 rmal haelll/pall mael bsll hael scfl acil mnll

4 2Θ1 TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT AGGAAGATCA CATCGGCATC AATCCGGTGG TGAAGTTCTT GAGACATCGT GGCGGATGTA TGGAGCGAGA

Cu£ íu id U

I M h-l > •H d t0 (0 o « - rf 0 (J a.

S u μ H 0 0 0 U μ u 0 μ u μ μ 0 <

rf μ rf μ o u u 0 0 ·*

0 0

H μ

P 0 -4 0, ca rf μ u 0 U 0 0 0 ih 0 U o rf μ c u 0

WCEÄOOU0 w c to rf μ io to IH to s rf μ “x CD rf X. »H 0 0 μ rf 1-1 cq X M 'a· rf μ μ rf rf H X H ►q U 0 U 0 •H d Ή >1 ro S 0 U • μ rf σ' cn w E d H μ rf 0 U £ £ £ £ <0 C0 0 U μ < U 0 o u n 5 U 0 μ 3 μ rf 0 u

0 0 0 0 rf μ 0 U rf μ 0 0 μ rf 0 0 rf μ 0 υ 0 u 0 0 0 0 rf μ 0 0 rf μ 0 0 o υ μ rf μ rf IH 0 u 0 0 m rf μ 0 υ M W U 0 0 υ X £ 0 0 0 Ο ’T H 0 0 Ο 0 P > μ rf K μ rf c £ M Q 0 U IH 0 0

x ’T P C

Md u rf 0 _ x Q,er cn p

U (0

M 0 U O U ·“ C υ -X rf u

ŕ» μ

Η 0 0 c e £ cu m u 0 ζ μ rf Md £ c to 0 0 ►Η 0 0 •H £ 0 0 ιΗ U rf μ ££00 (0 to 0 0 0 0 £ Η Ο 0 rf μ η rf μ rf μ Μ μ rf μ rf Φ μ rf rf μ to IH E 0 U H H H 0 0 μ rf d CC S 0 0 0 0 cn d to h 0 0

o μ í μ υ 0

0 rf H H

S υ

1-10 0 h rf μ φ μ rf μ rf E 0 U ss hinPI hhal/cfol ddel scfl haell

4491 CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA

GCTGGATGTG GCTTGACTCT ATGGATGTCG CACTCGTAAC TCTTTCGCGG TGCGAAGGGC TTCCCTCTTT

70/85

148

L·/ ϋ

to

CC o u OJ

ct u 0 F rf 0 rf F 0 0 (J rf F U 0 0) — rf F F rf + 00 M u 3 6 0 0 z 0 0 0 0 0 ro F rf 0 0 0 M-í rf F H4 H — 0 0 (0 0 U «SI > Z ·Ό H rf F F < 1 ro p rc > bj co to to CLU 0 0 U <S| Ό £ £ ro u 0 F rf ΓΛ F rf F rf >+ F rf F rf q; □ U 0 F rf ffi -4 0 0 H rf D ro rf f 1-4 rf F 3 0 cr 3 U C 0 ro 0 0 M 0 0 4-1 H rf ^4 M Hl C 0 rf F ro 0 0

ε

Oj C ♦H -C cnu ϋ

U U 0 £ 0 0 v. rf F rf F Hl Hl U 0 3 0 r4 ro 0 0 F rf ro £ 0 0 w F rf α H £ 0 0 *ϋ U 0 •Xs C rf F K rf F H M > 0 u T) 3 U H <H E M M Hl to \ S43 rf F F rf Φ X) M m 0 0 M U 0 (0 xy H< Hl w 04 0 U . -4 F rf £ 0 -H H( 1=) o «—{ rf F C U 0 C u ro □ 4J £ U 0 E U 0 44 ro £ C CO CO F rf F 4J U4 £ £

F U U 0

U 0

U 0 0 0 0 0

U 0

0 _ u U) 0 0 U 0

E- < F rf 0 υ F rf 0 u F rf U U 0 0 ►H rt E- 0 0 = U 0 0 O vr H 0 U U 0 □ -H 0 U F rf e u u o 0 O >u ro u u H rf rt E- U 0 rt h 0 0 H e- rt F rf W M M H 0 u 0 0 α ro n S 0 u rf F <0 Q. ro ro u 0 F rf ε x: Ό 0) U 0 rf F J3 E- rt H rf a b! F rf H rt b rf

_ w 13 O O Ľ) Λ Ert Ef£ Ert H rt f->

O O 0 y ss U -0 u δ u rf F

0 u + 00 0 u E E- rt rt Ε- o rt b υ U •o e- rt rt E- Hl M — O U 0 u tu > Z n 0 u 0 U M ro £ >f- rt U 0 U CO (0 au u 0 u CO •σ Λ ra u o 0 u 0 U

in

T (Ώ Λ0 •er

C + 0 U

U U 0

RJ 0 0 0 U 0 0 0 0 0 U 0 U rf F 0 0

O r*

71/85

149

M O 0 rt M E-· rf U 0 b rf U 0 H Hf flj rt O IM U \ rt H α x α (0 w rt U4 < H rt m u O 0 rt 0 U rt c c CD rf h in υ u 0 C M «3 rt ω 0 XJ CD u 0 •H Φ r t—1 t* rf b X CD x Π3 rt o 0 b rf x: r—1 u U rf b i-t C CD b· 0 U α α b rf b rf (D \ b 2 rt U 0 <Q i-( b rt} 2 0 Q μ rt M U 0 (D rf b (P rt O 0 0 U <0 (D 0 U b rf x: CD 0 U 0 U

rt rt E b rf rt tQ υ O 0 0 H Ό rt U 0 ro w rt >—< — α 0 U x u> rt CC > Z Hl rtj Ľ) u J-i PO 0 CO 4J >η£ b rf U > U (0 V) CL 0 0 (0 e 0 Ό XJ (D 0 0 > b rf rt b rf ro rt 0 U

hinPI hinfl rrboll mnll hhal/cfol mnll acil earl/ksp6321 acil

4871 GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAGAGCGCC CAATACGCAA ACCGCCTCTC CTCGCGTCGC TCAGTCACTC GCTCCTTCGC CTTCTCGCGG GTTATGCGTT TGGCGGAGAG

72/85

150

SK 282265 Β6

•H 0 u < E- U u u + E- fC ra u u E t- 2 E- □ E- 2 E- M Ό U 0 2 E- t—< h-t m 0 U e U Cu M d > z M 0 U o O U ra 0 ra u <X Ε- M E- < O > u to CO α'Ό 0 0 La u e CO e φ r £ ra ra U 0 W CO .Q Ε- X) U 0 o 0 > M U 0 u Ľ) H O W tf Ε- υ 0 ra •H C υ 0 o 0 r—f cn ra 0 u E- rt* c £ XI 0 0 E- f? «ί E- E- fl: E-i (C 0 u E- 2 <5 u < P

rt E- rH E- Ä U 0 C U 0 0 U H E U 0 0 U I—I < E- M J—I Ε- < M f- 2 I—< M CL M Φ H O M CO m υ 0 ra CLE- < H □ > 0,0 U E M 0 U ra > X CO < E- > «C E- CL M c U 0 x. 0 U c u 0 I—I E- 2 I—I (0 E- C C 0 U cn ra M >5 E— W E- < □ X%. Φ 2 E- H ra fC E- H CO E- < os H •x <£ E- -J Q) E E- 2 □ Φ H E- 2 W CO u CO Φ Í“Í ra < E- 4J E <0 E- 2 ra H U 0 ra 2 E- CL M V-í E- 2 2 Ε- x* -H C E- 2 H υ 0 H U-i Ή ε- 0 0 U H JJ £ S ο U4 U 0 H H U 0 U 2 E- C CD U 0 M X, 2 Ε- > H ra H H 0 u & H υ o E m I—I C £ Φ Ui 0 U C ra υ υ X» \D o > ra M-i ♦H £ m n U-i E H Φ U E- 2 £ £ υ 0 M H OJ 0 x. \c E- 2 υ υ Q D ή H X M n 0 U « Η □ 4-> x: CL· M M M OJ U 0 0 u C CO CO c ra m O O rH 0 U E- 2 Ή XJ X) •h x ra □ 4J £ H H U 0 0 υ £ £ £ C CO CO r-i •H 0 υ < Ε- jJ U-l Ό X> CO U U 0 υ υ XI ra U 0 0 υ U 0 0 υ

73/85

151 mspl acil hpall bsrBI alul nlalll

5061 TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA AAGGCCGAGC ATACAACACA CCTTAACACT OGCCTATTGT TAAAGTGTGT CCTTTGTCGA TACTGGTACT >lengch: 5141

74/85

152

SK 282265 Β6

BamHI Mlu! Mluf Psll Pst! Hasil! Stu! BamHI

75/85

153

1igácia

Terminátor

76/85

154

Mlul

Sphl izolácia fragmentu

1072 bp

I---------------------------------- H— =1 1 phl Xbal Xbal Mlul Mlul Sphl

□BR. 34

77/85

155

Syntetická

DNA l·

Xbal Bgll

Bgll

Sphl izol. fragnentu s 1064 bp i i i ,, ligácia

OBR. J5

78/85

156

SK 282265 Β6

Bgll SpM.

izol. fragmentu s 1064 bp ¹-------------------------------------------------------------------^:-----------------------------------------------!--------------------------------------------------------------------------------------------------------------¹

1 llgácia

OBR. 36

79/85

157

SK 282265 Β6

EcoRI

HindlII izol. vektora

Syntetická DNA I----------H

Hgal HindlII

HindlII

EcoRI h 1 I— - H

EcoRI Hgal Hgal HindlII __________________________________________________________________________________________________________________________________________________i ligácia

OBR. 37

80/85

158

SK 282265 Β6

DNA polyneráza I (Klenow) Xbal

Hnil

Hinll

Spili izol. fragmentu s 890 bp

Sphl Xbal

Xbal

Hinfl

Hinll

Sphl ligácia

OBR. 38

81/85

159

Met Ser

MP210 Banka ATG TCN MP210-1 ATG TCT MP210-T8 ATG TCG MP210-21 ATG TCG MP210-24 ATG TCC MP210-25 ATG TCG

Pro Ala Pro Pro Ala

CCN GCN CCN CCN GCN

CCA GCG CCG CCA GCG

CCT GCT CCA CCT GCT

CCA GCG CCA CCA GCC

CCA GCC CCA CCC GCA CCA GCG CCG CCA GCG

82/85

160

SK 282265 Β6

1igácia

OBR. 40

83/85

161

SK 282265 Β6

Bstt

Sphl izol-. fragmentu s 1064 bp

Bgll Sphl | ligácia

OBR. 41

84/85

162

Trp

I I

Xbal Apíl

Apal Xbal

OBR. 42

85/85