LU88573A1 - Thrombopoietin. - Google Patents

Description

THROMBOPOIETIN

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, Reinigung und rekombinante oder chemische Synthese von Proteïnen, die das Überleben, die Proliferation, die Differenzierung oder Reifung von hämatopoetischen'Zeilen, insbesondere von Plätt-chenvorläuferzellen, beeinflussen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Klonieren und die Expression von Nukleinsäuren, die einen Proteinliganden kodieren, der an mpl, ein Mitglied der Zytokinrezeptorsuperfamilie, binden und diesen aktivieren kann. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser Proteine alleine oder in Kombination mit anderen Zytokinen zum Behandeln von immunologischen oder hämatopoetischen Beeinträchtigungen, einschließlich Thrombo-zytopenie. I. Das hämatopoetische System

Das hämatopoetische System erzeugt die reifen hochspeziali-sierten Blutzellen, von denen bekannt ist, daß sie für das Überleben von allen Säugern notwendig sind. Diese reifen Zeilen umfassen Erythrozyten, spezialisiert für den Transport., von Sauerstoff und Kohlendioxyd, T- und B-Lymphozytan, verantwortlich für Zeil- und Antikörper-vermittelte Im-munantworten, Plättchen oder Thrombozyten, spezialisiert zum Bilden von Blutpfropfen, und Granulozyten und Makrophagen, spezialisiert als Freßzellen und akzessorische Zeilen zur Bekämpfung von Infektionen. Granulozyten werden weiter un-terteilt in Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Mastzel-len, wobei spezialisierte Zelltypen bestimmte Funktionen ausüben. Bemerkenswerterweise stammen alle diese speziali-sierten reifen Blutzellen aus einer einzigen gemeinsamen primitiven Zellart, bezeichnet als die pluripotente (oder totipotente) Stammzelle, die primär in Knochenmark gefunden wird (Dexer et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3:423-441 [1987]).

Die reifen hochspezialisierten Blutzellen mtissen in großen Zahien kontinuierlich über das ganze Leben eines Säugers hergestellt werden. Die ganz große Mehrzahl dieser speziali-sierten Blutzellen sind dazu bestimmt, nur fiir einige wenige Stunden bis Wochen funktionell aktiv zu sein (Cronkite et al., Blood Cells, 2:263-284 [1976]). Somit ist eine kontinu-ierliche Erneuerung der reifen Blutzellen, der primitiven Stammzellen selbst wie auch jeder intermediären Oder zu einer Abstammungslinie gehorende Vorläuferzellinien, die zwischen den primitiven und den reifen Zeilen angesiedelt sind, notwendig, urn den normalen Steady-State-Bedarf des Säugers an Blutzellen aufrechtzuerhalten.

Dem Kern des hämatopoetischen Systems liegt die pluripotente Stammzelle bzw. -zeilen zugrundê. Diese Zeilen kommen in re-lativ geringer Zahl vor, und sie durchlaufen eine Selbster-neuerung durch Proliferation, urn Tochterstammzellen zu er-zeugen, Oder sie werden transformiert, in einer Serie von Differenzierungsschritten, zu zunehmend reifen auf eine be-stimmte Abstammungslinie beschränkte Vorläuferzeilen, wobei sie ietztendlich die hochspezialisierten reifen Blutzellen bzw. -zelle bilden.

Zum Beispiel durchlaufen bestimmte multipotente Vorläufer-zellen, als CFC-Mix bezeichnet, die von Stammzellen abstam-men, eine Proliferation (Selbsterneuerung) und Entwicklung, urn Koloniën zu bilden, die alle die verschiedenen Mye-loidzellen, Erythrozyten, Neutrophile, Megakaryozyten (Vorläufer der Plättchen), Makrophagen, Basophile, Eosinophile und Mastzellen, enthalten. Andere Vorläuferzellen der lymphoiden Abstammungslinie durchlaufen Proliferation und Entwicklung zu T-Zellen und B-Zellen.

Weiterhin liegt zwischen den CFC-Mix-Vorläuferzellen und Myeloidzellen ein weiterer Rang an Vorläuferzellen von in-termediärer Festlegung. auf ihre Nachkommen. Diese auf eine Abstammungslinie festgelegten Vorläuferzellen werden klassi- fiziert auf der Grundlage der Nachfolger, die sie erzeugen. Somit sind. die unmittelbaren bekannten Vorläufer der myeloi-den Zeilen: Erythroide-Kolonie-bildende Einheiten (CFU-E) für Erythrozyten, Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-bildende Zeilen (GM-CFC) für Neutrophile und Makrophagen, Megakaryo-zyten-Kolonie-bildende Zeilen (Meg-CFC) für Megakaryozyten, Eosinophile-Kolonie-bildende Zeilen (Eos-CFC) für Eosinophile, und Basophile-Kolonie-bildende Zeilen (Bas-CFC) für Mastzellen. Andere intermédiare Vorläuferzellen zwischen den pluripotenten Stammzellen und den reifen Blutzellen sind be-kannt (siehe unten) Oder werden wahrscheinlich aufgefunden werden, wobei sie variierende Grade der Festlegung auf eine * Abstammungslinie und der Fähigkeit zur Selbsterneuerung ha-ben.

Daß dem normalen hämatopoetischen Zellsystem zugrundelie-gende Prinzip scheint zu sein eine verringerte Fähigkeit zur Selbsterneuerung sowie die Multipotenz verlorengeht und die Festlegung auf eine Abstammungslinie erfolgt und der Reife-grad erworben wird. Somit liegt an einem Ende des hämatopoe-tischen Zellspektrums die pluripotente Stammzelle, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung zu all den verschiedenen Vorläuferzellen, die auf eine spezielle Abstammungslinie festgelegt sind, besitzt. Diese Fähigkeit bildet die Grundlage der Knochenmarkstransplantationsthera-pie, wo primitive Stammzellen das gesarate hämatopoetische Zellsystem wieder aufbauen. An dem anderen Ende des Spek-trums liegen die stark auf eine Abstammungslinie festgeleg-ten Vorläufer und deren Nachkommen, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren haben aber eine reife funktionelle Aktivität erworben haben.

Die Proliferation und Entwicklung von Stammzellen und auf eine Abstammungslinie festgelegten Vorläuferzellen wird sorgfältig kontrolliert durch eine Vielzahl von hämatopoeti-schen Wachstumsfaktoren oder Zytokinen. Die Rolle dieser Wachstumsfaktoren in vivio ist komplex und unvollständig verstanden. Einige Wachstumsfaktoren, wie Interleukin-3 (IL-3), können sowohl multipotente Stammzellen stimulieren wie auch festgelegte Vorläuferzellen für verschiedene Abstam-mungslinien, einschließlich z.B. Megakaryozyten. Von anderen Faktoren, wie dem Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulie-renden Faktor (GM-CSF) wurde ursprünglich angenommen, daß er hinsichtlich seiner Wirkung auf GM-CFC's beschränkt sei. Später wurde jedoch gefunden, daß GM-CSF auch die Proliferation und Entwicklung von unter anderem Megakaryozyten beein-flußt. Somit ist von IL-3 und GM-CSF gefunden worden, daß sie überlappende biologische Aktivitäten besitzen jedoch mit verschiedener Potenz. Erst in jüngerer Zeit wurde gefunden, daß Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-11 (IL-11), obwohl sie keinen offensichtlichen Einfluß auf die meg-Koloniebil-dung alleine besitzen, synergistisch mit IL-3 wirken, urn die Reifung von Megakaryozyten zu stimulieren (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Somit können hämatopoetische Wachstumsfaktoren das Wachstum und die Differenzierung von einer oder mehrerer Abstammungs-linien beeinflussen, sie können anderen Wachstumsfaktoren bei der Beeinflussung einer einzigen Vorläuferzellinie über-lappen, oder sie können mit anderen Faktoren synergistisch wirken.

Es scheint auch, daß hämatopoetische Wachstumsfaktoren ihre Wirkung zu verschiedenen Stadiën der Zellentwicklung von der totipotenten Stammzelle bis zu verschiedenen auf Abstam-mungslinien festgelegte Vorläuferzellen bis zu der reifen Blutzelle ausüben können. Zum Beispiel scheint Erythropoien-tin (epo) die Proliferation nur von reifen erythroiden Vor-läuferzellen zu fördern. IL-3 scheint seine Wirkung früher auszuüben, indem es primitive Stammzellen und intermédiare auf Abstammungslinien festgelegte Vorläuferzellen beein-

Es ist aus dem zuvor genannten ersichtlich, daß neue hâmato-poetische Wachstumsfaktoren, die das Überleben, die Proliferation, die Differenzierung oder Reifung von einer beliebi-gen Blutzelle oder deren Vorläufer beeinflussen, nützlich wären, insbesondere um bei dem erneuten Aufbau eines zer-störten hämatopoetischen Systems, hervorgerufen durch Krank-heit oder nach einer Bestrahlung- oder Chemotherapie, zu helfen. II. Hegakaryozytopoese - Plättchenherstellung

Die Regulation der Megakaryozytopoese und der Plättchenher-stellung ist in einem Übersichtsartikel dargestellt: Mazur,

Exp. Hematol., 15:248 [1987] und Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1989]. Kurz ausgeführt, pluripotente Knochenmarks-stammzellen differenzieren zu megakaryozytartigen, erythro-zytartigen und myelozytartigen Zellinien. Es wird angenom-men, daß es eine Hiérarchie von festgelegten megakaryozytartigen Vorläuferzellen zwischen den Stammzellen und den Mega-karyozyten gibt. Es sind mindestens drei Klassen an megakaryozytartigen Vorläuferzellen identifiziert worden,, näm-lich Burst-Forming-Unit-Megakaryozyren (BFU-MK), Kolonie-Forming-Unit-Megakaryozyten (CFU-MK) und Light-Density-Mega-karyozyten-Vorläuferzellen (LD-CFU-MK). Die Megakaryozyten-^ Reifung selbst ist ein Kontinuum der Entwicklung, das in Stadiën aufgelöst worden ist, basierend auf morphologischen Standardkriterien. Das früheste erkennbare Mitglied der Me-gakaryozyten(MK oder meg)-Familie sind die Megakaryoblasten.

Diese Zeilen besitzen anfänglich einen Durchmesser von 20 bis 30 μια mit einem basophilen Zytoplasma und einem leicht unregelmäßigen Kern, lockerem, etwas retikulärem Chromatin und mehreren Nukleoli. Später können Megakaryoblasten bis zu 32 Kerne (polyploid) enthalten, aber das Zytoplasma bleibt spärlich und unreif. Sowie der Reifungsprozeß fortschreitet wird der Kern mehr lobular und pyknotisch, das Zytoplasma nimmt in der Menge zu und wirkt starker acidophil und granu- lär. Die reifesten Zeilen dieser Familien können das Er-scheinungsbild des Freisetzens von Plättchen in ihre Umge-bung annehmen. Normalerweise sind weniger als 10% der Mega-karyozyten in dein Blasten-Stadium und mehr als 50% sind reif. Die willkürliche morphologische Klassifikation, die üblicherweise angewendet wird auf die megakaryozytenartigen Reihen, gibt an den Megakaryoblasten als die früheste Form; Promegakaryozyt oder basophiler Megakaryozyt für die intermédiare Form; und reifer (acidophile, granuläre Oder plätt-chenerzeugende) Megakaryozyt für die späte Form. Der reife Megekaryozyt erstreckt Filamente des Zytoplasmas in sinusoïdale Räume, wo sie sich ablösen und zu einzelnen Plättchen fragmentieren (Williams et al., Hematology, 1972).

Von der MegakaryozytopoeSe wird angenommen, daß sie mehrere regulierende Faktoren umfaßt (Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [198'2] und Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101 (1982]). Der frühe Spiegel der Megakaryo-zytopoese wird als mitotisch postuliert und betrifft die Zellproliferation und die Initiation der Koloniebildung durch CFU-MK, aber sie ist nicht beeinflußt von der Plätt-chenzahl (Burstein et al., J. Cell Physiol., 109:333 [1981] und Kimura et al., Exp. Hematol., 13:1048 [1985]). Das spate Stadium der Reifung ist nicht-mitotisch, umfaßt die Kern-polyploidisierung und zytoplasmatische Reifung und ist ver-mutlich reguliert durch einen Rückkopplungsmechanismus durch die periphere Plättchenzahl (Odell et al., Blood, 48:765 [1976] und Ebbe et al., Blood, 32:787 [1968]).

Die Existenz eines bestimmten und spezifischen Megakaryo-zyten-koloniestimulierenden Faktors (MK-CSF) ist kontrovers diskutiert worden (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]). Doch nehmen die meisten Autoren an, daß ein solch vitaler Vorgang für das Überleben, wie die Plättchenproduktion, von einem bzw. mehreren Zytokinen reguliert wird, die aus-schließlich für diesen Vorgang verantwortlich sind. Die Hypothese, daß Megakaryozyt/Plättchen-spezifische Zytokine bzw. Zytokin existiert, war die Grundlage für mehr als 30 Jahre Forschung - aber bis heute ist ein solches Zytokin nicht gereinigt, sequenziert Oder durch einen Assay als ein einzigartiger MK-CSF (TPO) nachgewiesen worden.

Obwohl berichtet worden ist, daß MK-CSF's teilweise gereinigt worden sind aus experimenten erzeugter Thrombozytope-nie (Hill et al., Exp. Hematol., 14:752 [1986] und humanem konditioniertem embryonalem Nierenmedium [CM] (Mc Donald et al., J. Lab. Clin. Med., 85:59 [1975] und aus Mensch von Patiënten mit plastischer Anämie und mit idiopathischer throm-bozytopenieartiger Purpura aus Harnextrakten (Kawakita et al., Blood, 6:556 [1983] und aus Plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75:11174 [1985]), ist deren physiologische Funktion bisher in 'den meisten Fallen noch unbekannt.

Das konditionierte Medium von mit Kermesbeerenmitogen-akti-vierten Milzzellen (pokeweed mitogen; PWM-SpCM) und die Mäuse-Myelomonozytenzellinie WEHI-3 (WEHI-3CM) sind als Me-gakaryozytenverstärker verwendet worden. PWM-SpCM enthält Faktoren, die das CFU-MK-Wachstum verstärken (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; und Iscove, N.N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] Seiten 37-52 [1978], von dtnen eins Interleukin-3 (IL-3) ist, ein koloniestimulierender Faktor für mehrere Abstammungslinien (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Die anderen Faktoren in diesem Medium sind noch nicht identifiziert und isoliert worden. WEHI-3 ist eine mäusemyelomonozytäre Zellinie, die relativ große Mengen an IL-3 und kleinere Mengen an GM-CSF ausscheidet. Von IL-3 ist gefunden worden, daß es das Wachstum einer großen Viel-zahl von hämatopoetischen Zeilen verstärkt (Ihle et al., J. Immunol. 13:282 [1983]). Von IL-3 ist auch gefunden worden, daß es mit vielen der bekannten hämatopoetischen Hormone oder Wachstumsfaktoren synergistisch zusammenwirkt (Bartelmez et al., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] und Warren et al., Cell, 36:667-674 [1988]) einschließlich mit Erythropoietin (EPO) und Interleukin-1 (IL-1) bei der Induk-tion von sehr frühen multipotenten Vorläufern und der Bil-dung von sehr großen gemischten hämatopoetischen Koloniën.

Andere Quellen für Megakaryozytenverstarker sind aufgefunden worden in den konditionierten Medien von Lunge, Knochen, ma-krophagen Zellinien, in Zeilen des Bauchhöhlenexudats bei der Maus und in humanen embryonalen Nierenzellen. Trotz ei-niger widersprüchlicher Daten (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]) gibt es einige Hinweise (Geissler et al., Br. J. Haematol., 60:233-238 [1985]), daß eher aktivierte T-Lympho-zyten als Monozyten eine verstärkende Rolle bei der Mega-karyozytopese spielen. Diese Befunde legen nahe, daß Aus-scheidungen aktivierter T-Lymphozyten, wie Interleukine, re-gulatorische Faktoren bei der MK-Entwicklung sein können (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Eine An-zahl an Untersuchungen über die Megakaryozytopoese mit ge-reinigtem Erythropoietin EPO (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976]; und Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) weisen darauf hin, daß dieses Hormon eine verstärkende Wirkung auf die MK-Koloniebildung besitzt. Dieses ist auch gezeigt worden in serumfreien und serumhaltigen Kuituren und in der Abwesen-heit von akzessorischen Zeilen (Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Von EPO ist behauptet worden, daß es mehr in die Aspekte des Einzell- und Zweizellstadiums der Megakaryozytopoese verwickelt ist, im Gegensatz zu der Wirkung von PWM-SpCM, das in dem Vierzellstadium der Megakaryo-zytenentwicklung beteiligt ist. Die Wechselwirkuhg all die-ser Faktoren in der frühen und späten Phase der Megakaryo-zytenentwicklung bleibt noch aufzuklären.

Von verschiedenen Labors erzeugte Daten legen nahe, daß die einzigen mehrere Abstammungslinien beeinflußende Faktoren die individuell MK-Kolonie-stimulierende Aktivität besitzen, GM-CSF und IL-3 sind und zu einem geringeren Maß der B-Zell-stimulierende Faktor IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Kürzlich haben mehrere Au-toren berichtet, daß IL-11 und Leukämie-inhibierender-Fak-tor(LIF) synergistisch mit IL-3 wirken, urn die Megakaryo-zytengröße und Ploidie zu steigern (Yonemura et al.,

Britisch Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; und Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Weiter Dokumente von Bedeutung umfassen: US-Patent Nr. 4,962,091; Chong, US-Patent Nr. 4,879,111; Fernandes et al., US-Patent Nr. 4,604,377; Wissler et al., US-Patent Nr. 4,512,971; Gottlieb, US-Patent Nr. 4,468,379; Bennett et al., US-Patent Nr. 5,215,895; Kogan et al., US-Patent Nr. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5):1545-1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73(7):1828-1335 [1989]; und Clutterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512 [1989]. III. Thrombozytopenie

Plättchen sind kritische Elemente in dem Blutgerinnungsme-chanismus. Das Verarmen des zirkulierenden Plâttchenspie-gels, Thrombozytopenie genannt, erfolgt unter verschiedenen klinischen Bedingungen und Stôrungen. Thrombozytopenie wird üblicherweise definiert als eine Plâttchenzahl unter 150 x 109 pro Liter. Hauptursachen für Thrombozytopenie konnen grob eingeteilt werden in drei Kategorien auf der Grundlage der Plâttenchenlebensdauer, nämlich: (1) beeinträchtigte

Production von Plättchen durch das Knochenmark, (2) Plätt-chensequestration in der Milz (Splenomegalie) oder (3) ge-steigerte Zerstörung von Plättchen in der peripheren Zirku-lation (z.B. Autoimmunthrombozytopenie Oder Chemo- und Strahlentherapie). Weiterhin können Patiënten, die große Volumina an rasch verabreichten blutplättchenarmen Blutpro-dukten erhalten, Thrombozytopenie entwickeln, aufgrund der Verdünnung.

Die klinischen Blutungsmanifestationen bei Thrombozytopenie hängen von der Schwere der Thrombozytopenie, ihrer Ursache und möglicherweise von damit zusammenhängenden Gerinnungsde-fekten ab. Im allgemeinen haben Patiënten mit Plättchenzah-len zwischen 20 und 100 x 109 pro Liter das Risiko von ex-zessiven posttraumatischen Blutungen, während solche, mit Plättchenzahlen unterhalb von 20 x 10 pro Liter spontane Blutungen haben können. Letztere Patiënten sind Kandidaten für eine Plättchentransfusion mit damit zusammenhängendem immunologiechem und viralem Risiko. Für jeden gegebenen Grad an Thrombozytopenie scheint die Blutung schlimmer zu sein, wenn die Ursache eher eine verringerte Produktion ist als die gesteigerte Zerstörung von Plâttchen. Bei der letzten Situation führt der beschleunigte Plätten-Turnover zu der Zirkulation von jüngeren, größeren und hâmostatisch wirksa-meren Plâttchen. Thrombozytopenie kann von einer Vielzahl von Störungen, wie unten kurz beschrieben, herrühren. Eine ausführlichere Beschreibung kann gefunden werden in Schaf-ner, A. I., "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function", Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990]. (a) Thrombozytopenie aufgrund einer beeinträchtigten Plätt-chenproduktion

Ursachen von kongenitaler Thrombozytopenie umfassen konsti-tutionelle aplastische Anämie (Fanconi-Syndrom) und kongeni- tale amegakaryozytäre Thrombozytopenie, die mit Skelettmiß-bildungen assoziiert sein kann. Erworbene Störungen der Plâttchenproduktion werden verursacht entweder durch Hypo plasie von Megakaryozyten oder ineffektive Thrombopoese. Me-gakaryozytâre Hypoplasie kann von einer Vielzahl von Bedin-gungen herrühren, emschließlicn Knochenmarkaplasie (einschließlich idiopathische Formen oder Myelosuppression chemotherapeutische Mittel oder Strahlentherapie) , Myelfibrose, Leukâmie und Invasion des Knochenmarks durch metastatische Tumore oder Granulomas. In einigen Situationen kônnen Toxine, infektiôse Mittel oder Medikamente relativ selektiv mit der Thrombopoese wechselwirken; Beispiele um-fassen transiente Thrombozytopenien, verursacht durch Alko-hol und bestimmte virale Infektionen, und milde Thrombozytopenie, assoziiert mit der Verabreichung von Thiaziddi-uretika. Schließlich kann eine ineffektive Thrombopoese als eine Sekundârfolge von megaloplastischen Vorgângen (Folat-oder Bi2-Man,3el) auch Thrombozytopenie verursachen, übli-cherweise mit koexistierender Anâmie und Leukopenie.

Die gegenwârtige Behandlung von Thrombozytopenie aufgrund einer erniedrigten Plâttchenproduktion hângt ab von der Identifizierung und Umkehrung der zugrundeliegenden Ursache des Knochenmarkversagens. Plâttchentransfusionen sind übli-cherweise reserviert für Patiënten mit ernsthaften Blutungs-komplikationen oder zur Absicherung wâhrend chirurgischen Eingriffen, da die Isoimmunisierung einer weiteren Plâtt-chentransfusion erhöhten Widerstand leisten kann. Mukosablu-tung, die das Ergebnis starker Thrombozytopenie ist, kann abgeschwacht werden durch die orale oder intravenôse Verabreichung von antifibrinolytischen Mitteln. Thrombotische Komplikationen können sich jedoch entwickeln, wenn antifi brinolytische Mittel in Patiënten mit ausgebreiteter intra-vaskulârer Gerinnung (DIC) verwendet werden. (b) Thrombozytopenie aufgrund der Milzsequestration

Splenomegalie aufgrund einer beliebigen Ursache kann mit milder bis moderater Thrombozytopenie assoziiert sein. Dies ist ein im wesentlichen passiver Vorgang (Hypersplenie) der Milzplättchensequestration, im Gegensatz zu der aktiven Zer-störung der Plättchen durch die Milz in Fallen der unten diskutierten immunvermittelten Thrombozytopenie. Obwohl die häufigste Ursache von Hypersplenie Stauungssplenomegalie durch portalen Hochdruck aufgrund von alkoholischer Zirrhose ist, sind andere Formen der Stauungs-, infiltrativen oder lymphoproliferativen Splenomegalie ebenfalls mit Thrombozytopenie assoziiert. Die Plättchenzahlen fallen üblicher-weise nicht unter 50 x 109 pro Liter als ein Ergebnis von Hypersplenie alleine. (c) Thrombozytopenie aufgrund nichtimmunologisch vermittel-ter Plättchenzerstörung

Thrombozytopenie kann Folge der beschleunigten Zerstörung von Plättchen bei verschiedenen nichtimmunologischen Vorgän-gen sein. Störungen dieses Typs.umfassen ausgebreitete in-travaskuläre Gerinnung, intravaskuläre Prothesegegenstände, extrakoporale Zirkulation des Bluts und thrombotische Mikro-angiophatien, wie thrombotische thrombozytäre Purpura. Bei all diesen Situationen werden zirkulierende Plättchen, die entweder den künstlichen Oberflächen Oder einer abnormalen vaskulären Intima ausgesetzt werden, an diesen Stellen ver-braucht oder geschädigt und dann vor der Reifung durch das retikuloendotheliale System entfernt. Krankheitsstadien oder Störungen, bei denen ausgebreitete intravaskuläre Gerinnung (DIC) auftreten können, sind ausführlich erläutert in Braun-wald et al. (Herausgeber), Harrison's Principles of Internal Medicine, 11. Ausgabe, Seite 1478, McGraw Hill [1987]. In-travaskuläre prothetische Gegenstände, einschließlich Herz-klappen und Intraaortaballons, können eine milde bis moderate destruktive Thrombozytopenie und transiente Thrombozytopenie in Patiënten hervorrufen, die sich einer kardio-pulmonaren Beipaßbehandlung oder Hämodialyse unterziehen, wobei sie aus dem Verbrauch oder der Schädigung von Plätt-chen in dem extrakorporalen Kreislauf resultiert. (d) Wirkstoffinduzierte Immunthrombozytopenie

Mehr als 100 Wirkstoffe sind mit immunologisch vermittelter Thrombozytopenie in Zusammenhang gebracht worden. Jedoch sind nur chinidin, Chmin, Gold, Sulfonamide, Cephalothm und Heparin gut charakterisiert worden. Wirkstoffinduzierte Thrombozytopenie tritt regelmäßig sehr gravierend und tritt üblicherweise jäh innerhalb von Tagen auf, während die Patiënten die sensibilisierende Medikation einnehmen. (e) Immunologische (autoimmunologische) thrombozytopenäre Purpura (ITP) ITP in Erwachsenen ist eine chronische Erkrankung, die ge- kennzeichnet ist durch autoimmunologische Plättchenzerstö-rung. Der Autoantikörper ist typischerweise IgG, obwohl dies auch von anderen Immunglobulinen berichtet worden ist. Obwohl von dem Autoantikörper für ITP gefunden worden ist, daß er mit dem GPIIbIIIa der Plättchenmembran assoziiert ist, ist die Plättchenantigenspezifität in den meisten Fallen noch nicht identifiziert worden. Extravaskuläre Zerstörung von sensibilisierten Plättchen tritt in dem retikuloendothe-lialen System der Milz und der Leber auf. Obwohl mehr als die Hälfte aller Falie von ITP idiopathisch sind, haben viele Patiënten zugrundeliegende rheumatische oder autoimmune Erkrankungen (z.B. Systemischer Lupus Erythematosus) oder lymphoproliférative Störungen (z.B. chronische lympho zytäre Leukämie).

(f) HIV-induzierte ITP ITP ist eine zunehmend übliche Komplikation bei HIV-Infek- tion (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96:714-717 [1982]) und kann in jedem Stadium des Fortschreitens der Krankheit auftreten, sowohl in Patiënten, bei denen das erworbene Im-munschwächesyndrom (AIDS) diagnosticiert worden ist, wie auch bei solchen mit dem AIDS-related Complex, und solchen mit einer HIV-Infektion aber ohne AIDS-Symptome. Die HIV-In-fektion ist eine übertragbare Krankheit, die im Endstadium gekennzeichnet ist durch einen starken Mangel der zellulären Immunfunktion wie auch dem Auftreten von opportunistischen Infektionen und Krebs. Die primäre immunologische Abnormali-tät, die das Ergebnis einer Infektion mit HIV ist, ist die progressive Verarmung und funkrionelle Beeinträchtigung von T-Lymphozyten, die das CD4-0berflächenglycoprotein exprimie-ren (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3:477 [1985]). Der Verlust an CD4-Helfer-/T-Zellinduktorfunktion liegt vermut-lich den starken Defekten bei der zellulären und humoralen Immunität zugrunde, wobei dies zu den opportunistischen In-' fektionen und den malignen Erscheinungen führt, die charak-teristisch für AIDS sind (H. Lane, siehe oben).

Obwohl der Mechanismus der HIV-assoziierten ITP unbekannt ist, wird angenommen, daß er verschieden ist von dem Mechanismus von ITP, der nicht mit einer HIV-Infektion assoziiert ist (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; und Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]). IV. Gegenwärtige Therapie der Thrombozytopenie

Der therapeutsche Ansatz für die Behandlung von Patiënten mit Thrombozytopenie wird diktiert durch die Schwere und die Dringlichkeit der klinischen Situation. Die Behandlung ist ähnlich für die HIV-assoziierte und die nicht-HIV-assozi-ierte Thrombozytopenie, und obwohl eine Anzahl an verschie-denen therapeutschen Ansätzen verwendet worden ist, bleibt die Therapie umstritten.

Die Plättchenzahl ist in Patiënten, bei denen Thrombozytopenie diagnostiziert wurde, erfolgreich gesteigert worden durch eine Glucokortikoid- (z.B. Prednisolon) Therapie, je- doch ist in den meisten Patiënten die Antwort unvollständig ^ Oder ein Rückfall erfolgt, wenn die Glucokortikoiddosis ver-ringert wird Oder die Verabreichung unterbrochen wird, Ba-sierend auf Studiën mit Patiënten mit HIV-assoziierter ITP haben einige Forscher vorgeschlagen, daß die Glucokortikoid-Therapie zu einer Prâdisposition für AIDS führen kann. Giucokortikoide werden üblicherweise verabreicht, falls die Plâttenzahl unter 20 x 109 pro Liter fällt Oder wenn spontan eine Blutung auftritt. Für Patiënten die auf Giucokortikoide nicht ansprechen ist die Verbindung: 4- (2-Chlorpheny1)-9-methyl-2-[3-(4-morpholiny1)-3-propanon-l-yl]6H-thieno[3,2,f][1,2,4]triazolo[4,3, a,][1,4]diazepm (WEB 2086) erfolgreich verwendet worden, um einen schweren Fall von nicht-HIV-assoziierter ITP zu behandeln. Ein Patient mit einer Plättchenzahl von 37000-58000/μ1 wurde behandelt mit WEB 2086, und nach 1-2 Wochen der Behandlung stieg die Plättchenzahl auf 140000-190000/μ1 (EP 361,077 und Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Obwohl die optimale Behandlung für erworbene amegakaryo-zytäre Thrombozytopenie Purpura (AATP) unsicher ist, ist von Antithymozytenglobulin (ATG), einem Pferdeantiserum gegen humanes Thymusgewebe, gezeigt worden, daß es eine verlän-gerte vollständige Remission erzeugt (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]). Ein jüngster Bericht jedoch legt nahe, daß der hämatopoetische Effekt von ATG auf Thio-mersal zurückzuführen ist, wo vermutlich das Protein als ein QuecksilbertrMger wirkt (Panelle et al., Cancer Research, 50:4429-4435 [1990]).

Gute Ergebnisse sind berichtet worden bei Splenektomie. Splenektomie entfernt die hauptsächliche Stelle der Platt- chenzerstörung und eine Hauptquelle der Autoantikörperpro-duktion bei vielen Patiënten. Dieses Verfahren führt zu einer verlängerten behandlungsfreien Remission in einer Vielzahl von Patiënten. Da jedoch chirurgische Verfahren im allgemeinen in einem immunkompromitierten Patiënten zu vermeiden sind, wird Splenektomie nur empfohlen in schlimmen Fällen von Thrombozytopenie (z.B. schlimmer HIV-assoziierter ITP), und in Patiënten, denen es nicht gelingt, auf eine 2-bis 3-wöchige Glucokortikoidbehandlung anzusprechen oder denen es nicht gelingt, eine anhaltende Antwort nach Abbrechen der Glucokortikoidverabreichung zu erzielen. Basierend auf gegenwärtigem wissenschaftlichem Wissen ist es unklar, ob Splenektomie Patiënten für AIDS prädisponiert.

Zusätzlich zur Prädnisolontherapie und Splenektomie verspre-chen bestimmte zytotoxische Mittel, z.B. Vincristin und Azidothymidin (AZT, Zidovudin) Vorteile bei der Behandlung von HIV-induzierter ITP; jedoch sind die Ergebnisse noch vorläufig.

Es ist aus dem zuvor genannten ersichtlich, daß ein Weg zum Behandeln von Thrombozytopenie ist, ein Mittel zu erhalten, das die Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten oder Vorläufern davon zu der Plättchen-produzierenden Form be-schleunigen kann. Beträchtliche Anstrengungen sind daraufhin gerichtet worden, solche Mittel zu identifizieren, im allgemeinen bezeichnet als "Thrombopoietin" (TPO). Andere Namen für TPO, die im allgemeinen in der Literatur gefunden werden, umfassen Thrombozytopoese-stimulierender Faktor (TSF), Megakaryozyten-koloniestimulierender Faktor (MK-CSF), Mega-karyozyten-stimulierender Faktor und Megakryozytenverstär-ker. TPO-Aktivität wurde bereits 1959 beobachtet (Rak et al., Med. Exp., 1:125), und die Versuche, dieses Mittel zu charakterisieren und zu reinigen, sind bis zum heutigen Tag fortgesetzt worden. Während Berichte über die partielle Rei-nigung von TPO-aktiven Polypeptiden existieren (siehe z.B. Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] und Hoffmann et al., J. Clin, Invest. 75:1174 [1985]) haben andere postu-liert, daß TPO nicht eine bestimmte Einheit selbst ist son-dern vielmehr einfach die polyfunktionelle Manifestation eines bekannten Hormons (IL-3, Sparrow et al., Prog. Clin. Bic. Res., 215:123 [1986]). Unabhângig von seiner Form oder seinem Ursprung wâre ein Molekül mit thrombopoetischer Akti-vitât von beträchtlichem therapeutischem Wert. Obwohl noch kein Protein zweifelsfrei als TPO identifiziert worden ist, ist die kürzliche Entdeckung, daß mpl, ein vermeintlicher Zytokinrezeptor, ein thrombopoetisches Signal erzaugen bzw. weiterleiten (transduce) könnte, von großem Interesse. V. Mpl ist ein megakaryozytopoetischer Zytokinrezeptor

Es wird angenommen, daß die Proliferation und Reifung von hâmatopoetischen Zeilen strikt reguliert wird durch Fakto-ren, die positiv oder negativ die Proliferation der pluripo-tenten Stammzelle und Differenzierung zu mehreren Abstam-mungslinien moduliert. Diese Effekte werden vermittelt durch die Bindung von extrazellulâren Proteinfaktoren mit hoher Affinitât an spezifische Zelloberflâchenrezeptoren. Diese Zelloberflâchenrezeptoren teilen eine beträchtliche Homologie und werden im allgemeinen klassifiziert als die Mitglie-der der Zytokinrezeptorsuperfamilie. Mitglieder dieser Su- perfamilie umfassen Rezeptoren für: IL-2 (ß- und γ-Ketten) (Hatakeyama et al., Science, 244:551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257:379-382 [1991]), IL-3 (Itoh et al., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 87:5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59:335-348 [1989]), IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9:4367-4374 [1990]; Tavernier et al., Cell, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241:825-828 [1988]; Hibi ét al., Cell, 63:1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 89:5690-5694 [1992], Granulocyten-Makrophagen-Ko-lonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:9655-9659 [1990], Granulocyten-Kolonie-stimu-lierender Faktor (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61:341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et al., Cell, 57:277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76:31-35 [1990], Leukämie-inhibierender Faktor (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), Oncostatin M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645 [1991]) und auch Rezeptoren für Prolactin (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116 [1989]), Wachstumshormon (GH) (Leung et al., Nature, 330:537-543 [1987]) und Zilliar-Neurotropher-Faktor (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63 [1991]).

Mitglieder der Zytokinrezeptorsuperfamilie konnen in drei funktionelle Kategorien eingruppiert werden (zur Übersicht siehe Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). Die erste Klasse umfaßt Rezeptoren mit einer Kette, wie der Erythropoietin-rezeptor (EPO-R) oder der Rezeptor für den Granulozyten-Ko-lonie-stimulierenden Faktor (G-CSF-R), die einen Liganden mit hoher Affinitât über die extrazelluläre Domâne binden und auch ein intrazelluâres Signal erzeugen. Eine zweite Klasse an Rezeptoren, sogenannte a-Untereinheiten, umfassen Interleükin-6-Rezeptor (IL6-R), Rezeptor für den Granulo-zyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF-R), Interleukin-3-Rezeptor (IL3-Ra) und andere Mitglieder der

Zytokinrezeptorsuperfamilie. Diese a-Untereinheiten binden Liganden mit niedriger Affinitât, aber sie konnen kein in-trazellulâres Signal erzeugen. Ein Rezeptor mit hoher Affinitât, der zur Signalübertragung fâhig ist, wird erzeugt durch ein Heterodimer zwischen einer α-Untereinheit und einem Mitglied einer dritten Klasse an Zytokinrezeptoren, besser ß-Untereinheiten genannt, z.B. ßc, die gemeinsame ß-Untereinheit für die drei a-Untereinheiten IL3-Ra und GM-CSF-R.

Ein Hinweis darauf, daß mpl ein Mitglied der Zytokinrezep-torsuperfamilie ist, kommt aus der Sequenzhomologie (Gearing, EMBO J., 8:3-667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253:59-63 [1991] und Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 [1992]) und seine Fähigkeit, proliferative Signale zu erzeugen.

Die aus der molekularen Klonierung des Mâuse-c-mpl geschlos-sene Proteirisequenz zeigt, daß dieses Protein homolog zu anderen Zytokinrezeptoren ist. Die extrazelluläre Domâne ent-hâlt 465 Aminosaurereste und setzt sich aus zwei Unterdomä-nen zusammen mit jeweils vier hochkonservierten Cysteinen und einem speziellen Motiv in der N-terminalen Unterdomâne und in der C-terminalen Unterdomâne. Die den Liganden bindenden extrazellulären Domänen haben vermutlich ähnliche Doppelte-ß-Faltblattstrukturgeometrien. Diese duplizierte extrazelluläre Domâne ist hochhomolog mit der Signalübertra-gungskette, die IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptoren wie auch der Bindungsdomâne mit geringer Affinität von LIF gemein ist (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Somit kann mpl zu der Klasse an Zytokinrezeptoren mit niedriger Affinitât für die Ligandenbindung gehôren.

Ein Vergleich von Mâuse-mpl und reifem humanem mpl P zeigt, daß diese zwei Proteine 81% Sequenzidentitât zeigen. Xnsbe-sondere zeigen die N-terminalen und C-terminalen extrazellu- lären Subdomänen 75% bzw. 80% Sequenzidentitât. Die am mei-sten konservierte mpl-Region ist die zytoplasmatische Domâne, die 91% Aminosäureidentität zeigt, wobei eine Sequenz von 37 Resten nahe der Transmembrandomâne in beiden Spezies identisch ist. Demzufolge wird von mpl berichtet, daß es eine der am meisten konservierten Mitglieder der Zytokinre-zeptorsuperfamilie ist (Vigon, siehe oben).

Beweis dafür, daß mpl ein funktioneller Rezeptor ist, der ein prolifératives Signal weiterleiten kann, kommt von d'er Konstruktion von chimären Rezeptoren, die eine extrazallu-läre Domäne von einem Zytokinrezeptor mit hoher Affinität für ein bekanntes Zytokin enthalten und die mpl-zytoplasma-tische Domäne. Da noch kein bekannter Ligand für mpl berich-tet worden ist, war es notwendig, die chimäre extrazellulëre Domäne mit hoher Affinität für die Ligandenbindung aus der ersten Klasse eines Zytokinrezeptors, wie IL-4R Oder G-CSFR, zu konstruieren. Vigon et al., siehe oben, fusionierte die extrazelluläre Domâne von G-CSFR mit der Transmembran- und zytoplasmatischen Domâne von c-mpl. Eine IL-3 abhângige Zel-linie, BAF/B03 (Ba/F3) wurde transfektiert mit der G-CSFR/mpl-Chimëre zusammen mit einer vollstândigen (full length) G-CSFR-Kontrolle. Die mit der Chimëre transfektier-ten Zeilen wuchsen gleich gut in der Anwesenheit von Zytokin IL-3 oder G-CSF. Ähnlich wuchsen auch Zeilen, die mit G-CSRF transfektiert waren, gut in jeweils IL-3 oder G-CSF. Alle Zeilen starben in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Ein ëhnliches Experiment wurde durchgeführt von Skoda et al., EMBO J.-, 12 (7):2645-2653 [1993], bei dem die extrazellulëren und Transmembrandomënen von humanem IL-4-Rezeptor (IL-4-R) mit der Mëuse-mpl-zytoplasmatischen Domâne fusioniert wur-den, und dieses Konstrukt wurde in eine IL-3 abhängige Mäu-sezellinie BA/F3 transfektiert. Mit dem Wildtyp hIL-4-R transfektierte Ba/F3-Zeilen vermehrten sich normal in der Anwesenheit von jedem der Spezies-spezifischen IL-4 oder IL-3. Mit hIL-4R/mpl transfektierte Ba/F3-Zellen vermehrten sich normal in der Anwesenheit von hIL-4 (in der Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-3), wobei dies zeigt, daß in Ba/F3-Zellen die mpl-zytoplasmatische Domëne alle die Elemente enthëlt, die notwendig sind ein prolifératives Signal zu erzeugen.

Diese Chimären-Experimente zeigen die Fähigkeit zum Erzeugen von proliferationsfördernden Signalen durch die mpl-zyto-plasmatische Domäne, aber sie sagen nichts darüber aus. ob die mpl-extrazelluläre Domäne einen Liganden binden kann. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit mindestens zwei Möglichkeiten, nämlich mpl ist ein Rezeptor mit einer einzi-gen Kette (Klasse eins), wie EPO-R Oder G-CSFR, Oder er ist eine signalweiterleitende ß-Untereinheit (Klasse drei), die eine a-Untereinheit benötigt, wie IL-3 (Skoda et al. siehe oben). VI. Der mpl-Ligand ist ein Thrombopoietin (TPO)

Wie oben beschrieben, ist vorgeschlagen worden, daß das Serum einen einzigartigen Faktor enthält, der manchmal als Thrombopoientin (TPO) bezeichnet wird, der synergistisch mit verschiedenen anderen Zytokinen wirkt, um das Wachsen und Reifen von Megakaryozyten zu fördern. Kein solcher natürli-cher Faktor ist jemals isoliert worden aus Serum oder einem anderen Ausgangsmaterial, obwohl von zahlreichen Gruppen be-trachtlicher Aufwand in dieser Richtung betrieben worden ist. Obwohl es nicht bekannt ist, ob mpl direkt einen Mega-karyozyten-stimulierenden Faktor binden kann, zeigen jüngste Expérimente, daß mpl in die Weiterleitung eines proliferati-ven Signals von einem Faktor oder von Faktoren verwickelt ist, die in dem Serum von Patiënten mit aplastischem Kno-chenmark gefunden werden (Methia et al., Blood, 82(5):1395-1401 [1993]).

Ein Hinweis darauf, daß ein einzigartiger koloniestimulie- render Faktor aus Serum, der sich von IL-la, IL-33, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF und GM-CSF unterscheidet, ein prolifératives Signal durch mpl erzeugt, kommt aus der Un-tersuchung der Verteilung der c-mpI-Expression in primitiven und festgelegten hämatopoetischen Zellinien und aus mpl-Antisense-Untersuchungen in einer dieser Zellinien.

Unter Verwendung von reverser Transkriptase (RT)-PCR in immunologisch gereinigten humanen hämatopoetischen Zeilen zeigten Methia et al., siehe oben, daß starke mpI-mRNA-Messages nur gefunden wurden in CD34+ gereinigten Zeilen, Megakaryozyten und Plättchen. CD34+-Zellen, gereinigt aus Knochenmark (BM), repräsentieren ungefähr 1% aller BM-Zellen und sind angereichert mit primitiven und festgelegten Vor-läuferzellen für alle Abstammungslinien (z.B. erythroidar-tig, granulomakrophagenartig und megakaryozytenartig).

Von mpl-Antisense-Oligodesoxynukleotiden wurde gezeigt, daß sie die Megakaryozyten-Koloniebildung aus der pluripotenten CD34+-Zelle, kultiviert in Serum von Patiënten mit aplasti-schem Knochenmark (einer reichen Quelle für Megakaryozyten-Kolonie-stimulierende Aktivität [MK-CSA]) unterdrücken.

Diese gleiche Antisense-Oligodesoxynukleotide hatten keinen Effekt auf die Erythroid- Oder Granulomakrophagen-Kolonie-bildung.

Ob mpl direkt einen Liganden band und ob der Serumfaktor, von dem gezeigt wurde, daß er Megakaryozytopoese hervorruft, über mpl wirkte, war noch unbekannt. Es ist jedoch vorge-schlagen worden, daß, falls mpl direkt einen Liganden band, seine Aminosäuresequenz wahrscheinlich hochkonserviert war und Kreuzreaktivität zwischen Spezies zeigt, aufgrund der beträchtlichen Sequenzidentität zwischen humanen und mpl-ex-trazellulären Domänen der Maus (Vigon et al., siehe oben [1993]). VII. Aufgaben

Angesichts des Zuvorgenannten ist es offensichtlich, daß ein gegenwärtiger und fortwährender Bedarf besteht, Moleküle zu isolieren und identifizieren, die die Proliferation, Diffe-renzierung und Reifung von hämatopoetischen Zeilen stimulie-ren können, insbesondere von Megakaryozyten oder deren Vor- läufern, für die therapeutische Verwendung bei der Behand-lung von Thrombozytopenie. Es wird angenommen, daß ein sol-ches Molekül ein mpl-Ligand ist, und deshalb besteht ein weiterer Bedarf zum Isolieren· eines solchen Liganden bzw. sclcher Liganden, um deren Rolle(n) beim Zellwachstunm und der Differenzierung aufzuklären.

Demzufolge ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein pharmazeutisch reines Molekül zu erhalten, das die Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten zu der reifen Plättchen-produzierenden Form stimulieren kann.

Eine weitere Aufgabe ist es, ein Molekül in einer Form be-reitzustellen, die für die therapeutische Verwendung bei der Behandlung von einer hämatopoetischen Störung, insbesondere von Thrombozytopenie, geeignet ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pro-teinliganden zu isolieren, zu reinigen und insbesondere zu identifizieren, die in vivo an einen Rezeptor der Zytokin-superfamilie, bekannt als mpl, binden können, um ein prolifératives Signal zu erzeugen.

Es ist eine weitere Aufgabe, Nukleinsäuremoleküle bereitzu-stellen, die für einen solchen Proteinliganden kodieren, und diese Nukleinsäuremoleküle zu verwenden, um mpl-bindende Liganden in rekombinanter Zellkultur für diagnostische und therapeutische Zwecke herzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe, Derivate und modifizierte For- men des Proteinliganden bereitzustellen, einschließlich Ami-nosäuresequenzvarianten, variante Glycoproteinformen und ko-valente Derivate davon.

Eine weitere Aufgabe, Fusionpolypeptidformen bereitzustel-len, die einen mpl-Liganden und ein heterologes Protein kom-binieren, sowie kovalente Derivate davon.

Es ist eine weitere Aufgabe, variante Polypeptidformen be-reitzustellen, die einen mpl-Liganden kombinieren mit Ami-nosäureanfügungen und -substitutionen aus der EPO-Sequenz, um ein Protein zu erzeugen, das die Proliferation und das Wachstum sowohl von Plättchen als auch von roten Blutzell-vorläufern regulieren kann.

Es ist eine weitere Aufgabe, Immunogene herzustellen zum Erzeugen von Antikörpern gegen mpl-Liganden oder Fusionsformen davon, wie auch Antikörper zu erhalten, die solche Liganden binden können.

Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden deutlich an-hand der folgenden Beschreibung.

Die der Erfindung zugrundeliegendeh Aufgabe werden gelost durch Bereitstellen eines isolierten Proteins aus Säugern, das die megakaryozytopoetische Proliferation und Reifung fördert, bezeichnet als der "mpl-Ligand" (ML) oder "Thrombopoietin" (TPO), das die Proliferation, Reifung und/oder Differenzierung von Megakaryozyten zu der reifen Plättchen-produzierenden Form stimulieren kann.

Das im wesentlichen homogene Protein kann gereinigt werden aus einem natürlichen Ausgangsmaterial nach einem Verfahren umfassend: (1) Inkontaktbringen eines Plasma-Ausgangsmateri- als enthaltend die zu reinigenden mpl-Ligandenmoleküle mit einem immobilisierten Rezeptorpolypeptid, insbesondere mpl oder einem mpl-Fusionspolypeptid, immobilisiert auf einem Trager, unter Bedingungen, bei denen die zu reinigenden mpl-Ligandenmoleküle selektiv an das immobilisierte Rezeptor- polypeptid adsorbiert werden, (2) Waschen des immobilisierten Rezeptorpolypeptids und dessen Trager, um nichtadsor- biertes Materail zu entfernen und (3) Eluieren der mpl-Li-gandenmoleküle von dem immobilisierten Rezeptorpolypeptid, an die sie adsorbiert sind, mit einem Elutionspuffer. Vor-zugsweise ist das natürliche Ausgangsmaterial ein Säuger-plasma oder Urin enthaltend den mpl-Liganden. Gegebenenfalls ist der säurer aplastisch und der immobilisierte Rezeptor ist eine mpl-IgG-Fusion.

Gegebenenfalls ist das bevorzugte, die megakaryozytopoeti-sche Proliferation und Reifung fördernde Prorein ein iso-liertes, im wesentliches homogenes mpl-Ligandenpolypeptid, hergestellt durch synthetische oder rekombinante Mittel.

Das "mpI-Liganden"-Polypeptid oder "TPO" dieser Erfindung besitzt vorzugsweise zumindestens 70% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des hochgereinigten, im wesentli-chen homogenen mpl~Ligandenpolypeptids aus Schwein und mm- destens 80% Sequenzidentitât mit der "EPO-Domäne" des mpl-Ligandenpolypeptids aus Schwein. Gegebenenfalls ist der er-findungsgemäße mpl-Ligand ein reifer humaner mpl-Ligand (hML), mit der reifen Aminosäuresequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), oder eine Variante oder posttranskriptional modifizierte Form davon oder ein Protein mit ungefähr 80% Sequenzidentitât mit reifem humanem mpl-Ligand. Gegebenenfalls ist die mpl-Ligandenvariante ein Fragment, insbeson-dere ein Aminoterminus- oder "EPO-Domäne"-Fragment des reifen humanen mpl-Liganden (hML). Vorzugsweise enthâlt das aminoterminale Fragment im wesentlichen die gesamte humane ML-Sequenz zwischen dem ersten und vierten Cysteinrest, aber es kann betrachtliche Hinzufügungen, Deletionen oder Substi-tutionen außerhalb dieser Region enthalten. Gemäß dieser Ausführungsform kann das Polypeptidfragment dargestellt werden durch die Formel:

X-hML(7-151)"Y worin hML(7-l51) darstellt die humane TOP (hML)-Aminosäure-sequenz von Cys7 bis Cys151einschließlich; X stellt dar die Aminogruppe von Cys oder einen oder mehrere der aminotermi-nalen Aminosäurereste des reifen hML oder Aminosäurerestver-längerungen davon wie Met, Tyr oder Leadersequenzen, enthal-tend z.B. proteolytische Spaltstellen (z.B. Faktor Xa oder Thrombin); und Y stellt dar die carboxyterminale Gruppe Cys151 oder eine oder mehrere carboxyterminale Aminosäure-reste des reifen hML oder Extensionen daran.

Gegebenenfalls kann das mpl-Ligandenpolypeptid oder ein Fragment davon fusioniert werden an heterologes Polypeptid (Chimäre). Ein bevorzugtes heterologes Polypeptid ist ein Zytokin, Kolonie-stimulierender Faktor oder Interleukin oder ein Fragment davon, insbesondere kit-Ligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF oder LIF. Ein gegebenenfalls bevorzugtes heterologes Polypeptid ist eine Imraunglobulin-kette, insbesondere humanes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA,

IgE, IgD, IgM oder ein Fragment davon, insbesondere umfas-send die konstante Domäne einer IgG-schweren Kette.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen iso-lierten mpl-Agonisten, der biologisch aktiv ist und der vor-zugsweise in der Lage ist, den Einbau von markierten Nukleo-tiden (z.B. 3H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, transfektiert mit humanem mpl,zu stimulieren. Gegebenenfalls ist der mpl-Agonist ein biologisch aktiver mpl-Ligand und ist vorzugsweise in der Lage, den Einbau von 35S in zirkulierende Plättchen in einem Maus-Plättchen-Rebound-Assay zu stimulieren. Ein geeiqneter mpl-Agonist um-faßt hMLi53, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mMl, mML2, mML3, pML und pML2 oder Fragmente davon.

Bei einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein isolierter Antikörper bereitgestellt, der an den mpl-Ligan-den binden kann. Der isolierte Antikörper, der an den mpl-

Liganden binden kann, kann gegebenenfalls fusioniert sein mit einem zweiten Polypeptid, und der Antikörper oder die Fusion davon kann verwendet werden zum Isolieren und Reinigen des mpl-Liganden aus einem Ausgangsmaterial, wie oben beschrieben für immobilsierten mpl. In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Nachweis des mpl-Liganden in vitro oder in vivo umfassend Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer Analy-senprobe, vorzugsweise einer Serumanalysenprobe, von. der an-genommen wird, daß sie den Liganden enthält, und dessen Nachweis, wenn die Bindung erfolgt ist.

Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das für den mpl-Liganden oder Fragmente davon kodiert, wobei das Nukleinsäure-molekül gegebenenfalls mit einem nachweisbaren Rest markiert sein kann, und es wird ein Nukleinsäuremolekül bereitge-stellt mit einer Sequenz, die komplementär ist zu oder unter moderaten oder stark stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsauremolekül mit einer Sequenz, die für einen mpl-Li-ganden kodiert, hybridisiert. Bevorzugte Nukleinsäuremole-küle sind solche, die einen huroanen mpl-Liganden oder aus Schwein oder Maus kodiert, und sie umfassen RNA und DNA so-wie genomische und cDNA. Bei einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül eine DNA, die den mpl-Liganden kodiert, und die weiterhin umfaßt einen re-plizierbaren Vektor, in den die DNA funktionsfähig unter die Kontrollsequenzen gebracht wird, die von einem Wirt erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert wird. Gegebenenfalls ist die DNA eine cDNA mit der Sequenz, wie in Fig. 1 gezeigt, 5'-3' (SEQ ID NO: 2), 3 ' -5' oder ein Fragment davon. Dieser Aspekt umfaßt weiterhin Wirtszellen, vorzugsweise CHO-Zellen, die mit dem Vektor transformiert sind, und ein Verfahren unter Verwendung der DNA zum Bewirken der Her-stellung eines mpl-Liganden, vorzugsweise umfassend Expri-mieren der cDNA, die den mpl-Liganden kodiert, in einer Kul-tur der transformierten Wirtszellen und Gewinnen des mpl-Li- ganden aus den Wirtszellen oder der Wirtszellkultur. Der auf diese Weise hergestellte mpl-Ligand ist vorzugsweise ein humaner mpl-Ligand.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Behandeln eines Säugers mit einer hämatopoetischen Störung, insbeson-dere mit Thrombozytopenie, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines mpl-Liganden an den Säu-ger. Gegebenenfalls wird der mpl-Ligand verabreicht in Kom-bination mit einem Zytokin, insbesondere einem Kolonie-sti-mulierenden Faktor oder Interleukin. Bevorzugte Kolonie-sti-mulierende Faktoren oder Interleukine umfassen kit-Ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 und IL-11.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von TPO (ML) aus einem TPO-produzierenden Mi-kroorganismus, umfassend: (1) Aufbrechen oder Lysieren von Zeilen enthaltend TPO, (2) gegebenenfalls Abtrennen von löslichem Material von un-löslichem Material enthaltend TPO, (3) Solubilisieren von TPO in dem unlöslichen Material mit einem Solubilisierungspuffer, (4) Abtrennen von solubilisiertem TPO von anderem löslichem oder unlöslichem Material, (5) Zurückfalten von TPO in einem Redoxpuffer, und (6) Abtrennen von richtig gefaltetem TPO von falsch gefalte-tem TPO.

Das Verfahren stellt zum Solubilisieren des unlöslichen Materials, enthaltend TPO, ein chaotropes Mittel bereit, wobei das chaotrope Mittel ausgewählt wird aus einem Salz von Guanidin, Natr'iumthiocyanat oder Harnstoff. Das Verfahren stellt weiterhin bereit, daß solubilisiertes TPO von anderem löslichem oder unlöslichem Material getrennt wird durch einen oder mehrere .Schritte ausgewählt aus Zentrifugation,

Gelfiltration und Umkehrphasenchromatographie. Der Rückfal-tungsschritt des Verfahrens stellt einen Redoxpuffer bereit, enthaltend ein oxidierendes und reduzierendes Mittel. Übli-cherweise ist das oxidierende Mittel Sauerstoff oder eine Verbindung enthaltend zumindest eine Disulfidbindung, und das reduzierende Mittel ist eine Verbindung enthaltend zu- mindestens eine freie Sulfhydrylgruppe. Vorzugsweise wird das oxidierende Mittel ausgewählt aus oxidiertem Glutathion (GSSG) und Cystin, das reduzierende Mittel wird ausgewählt aus reduziertem Glutathion (GSH) und Cystein. Besonders be-vorzugt als oxidierendes Mittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG) und das reduzierende Mittel ist reduziertes Glutathion (GSH). Es ist auch bevorzugt, daß das molare Ver-hältnis des oxidierenden Mittels gleich oder größer ist als das des reduzierenden Mittels. Der Redoxpuffer enthält zu-sätzlich ein Detergens, vorzugsweise ausgewählt aus CHAPS und CHAPSO, das in einer Menge von mindestens 1% vorliegt. Der Redoxpuffer enthält zusätzlich NaCl, vorzugsweise mit einer Konzentration in dem Bereich von ungefähr 0,1-0,5 M, und Glycerol, vorzugsweise bei einer Konzentration von grö-ßer als 15%. Der pH des Redoxpuffers liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr pH 7,5 - pH 9,0, und der Rückfal-tungsschritt wird durchgeführt in 4 Stufen für 12-48 Stun-den. Der Rückfaltungsschritt erzeugt biologisch aktives TPO, in dem eine Disulfidbindung ausgebildet wird zwischen dem Cystein, das dem Aminoterminus am nächsten ist, mit dem Cystein, das dem Carboxyterminus der EPO-Domäne am nächsten ist.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Reinigen von biologisch aktivem TPO aus einem Mikroorganismus umfas-send: (1) Lysieren von zumindest der extrazellulären Membran des Mikroorganismus, (2) Behandeln des Lysats enthaltend TPO mit einem chaotropen Agenz (3) Rückfalten des TPO, und (4) Abtrennen von Verunreinigungen und falsch gefaltetem TPO von richtig gefaltetem TPO.

Fig.l zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) aus der humanen mpl-Liganden-(hML)-cDNA und der kodierenden Nukleotidsequenz (SEQ ID.NO: 2). Die Nukleotide sind am Be-ginn einer jeden Zeile numeriert. Die nichttranslatierten 5'- und 3'-Bereiche sind durch Kleinbuchstaben angegeben.

Die Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend bei Ser 1 der Proteinsequenz des reifen mpI-Liganden (ML). Die Grenzen des vermuteten Exon 3 sind gekennzeichnet durch die Pfeile, und die potentiellen N-Glycosylierungs-stellen sind durch Rechtecke eingerahmt. Cysteinreste sind durch einen Punkt oberhalb der Sequenz gekennzeichnet. Die unterstrichene Sequenz entspricht der N-terminalen Sequenz, die für den mpl-Liganden ermittelt wurde, der aus Schweine-plasma isoliert wurde.

Fig. 2 zeigt das Verfahren, das verwendet wurde für den

Assay zum Nachweis des 3H-Thymidineinbaus durch den mpl-Li- ganden. Zum Bestimmen der Anwesenheit des mpl-Liganden in verschiedenen Quellen wurde den mpl P-haltigen Ba/F3-Zeilen

IL-3 für 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% co2 und Luft entzogen. Auf den IL-3-Entzug folgend wurden die Zeilen ausplattiert in 96-Lochplattei. mit Oder ohne verdünnten Analysenproben und für 24 Stunden in einem

Zellkulturinkubator kultiviert. 20 pl serumfreie RPMI-Me-. . 3 dien, enthaltend 1 pCi H-Thymidm, wuren jedem Loch für mindestens 6-8 Stunden zugesetzt. Dann wurden die Zeilen auf 96-Lochfilterplatten geerntet und mit Wasser gewaschen. Die Filter wurden ausgezählt.

Fig. 3 zeigt den Effekt von Pronase, DTT und Warme auf die Fähigkeit von APP, die Ba/F3-mp2-Zellproliferation zu stimu-lieren. Für den Pronaseabbau von APP wurde Pronase (Boehringer Mannheim) Oder Rinderserumalbumin gekoppelt an

Affi-Gel 10 (Biorad) und jeweils inkubiert mit APP für 18 h bei 37°C. Anschließend wurden die Harze entfernt durch Zen-trifugation, und die Überstände wurden getestet. APP wurde auch erwärmt auf 80°C für 4 min oder auf 100 μΜ DTT einge-stellt, gefolgt von der Dialyse gegen PBS.

Fig. 4 zeigt die Elution der mpl-Ligandenaktivität von Phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose und Ultralink-mpl-Säulen. Fraktionen 4-8 von der mpl -Affinitätssäule waren die Frak- tionen mit der Spitzenaktivität, die von der Säule eluiert wurden.

Fig. 5 zeigt die SDS-PAGE von eluierten Ultralink-mpl-frak-tionen. Zu 200 μΐ einer jeden Fraktion 2-8 wurde 1 ml Aceton zugesetzt enthaltend 1 mM HCl bei -20°C. Nach 3 h bei -20°C wurden die Analysenproben zentrifugiert, und die erhaltenen Pellets wurden zweimal mit Aceton bei -20°C gewaschen. Die Acetonpellets wurden anschließend aufgelöst in 30 μΐ SDS-So-lubilisierungspuffer, auf 100 μΜ DTT eingestellt und erwärmt bei 90°C für 5 min. Die Analysenproben wurden dann aufge-trennt auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamidgel, und die Proteine wurden sichtbar gemacht durch Silberfärbung.

Fig. 6 zeigt die Elution von mpl-Ligandenaktivität aus SDS-PAGE. Fraktion 6 von der mpl-Affinitässäule wurde aufge-trennt auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamidgel unter nichtredu- zierenden Bedingungen. Auf die Elektrophorese folgend wurde das Gel in 12 gleiche Streifen geschnitten und elektroelu-iert, wie beschrieben in den Beispielen. Die elektroeluierte Analysenprobe wurde dialysiert in PBS und analysiert bei einer 1/20 Verdünnung. Die Mr-Standards, die zum Kalibrieren des Gels verwendet wurden, waren Novex Mark 12-Standards.

Fig. 7 zeigt die Wirkung von APP, verarmt an mpl-Ligand, auf humane Megakaryozytopoese. Das an mpl-Ligand verarmte APP wurde hergestellt durch Durchleiten von 1 ml über eine 1 mpl-Affinitätssäule (700 pg mpl-IgG/ml NHS-Superose, Phar- macia). Humane periphere Stammzellkulturen wurden auf 10% APP oder 10% mpl-ligandenverarmtes APP eingestellt und für 12 Tage kultiviert. Die Megakaryozytopoese wurde quantifi-ziert, wie beschrieben in den Beispielen.

Fig. 8 zeigt die Wirkung von mpl-IqG auf die Stimulierung der humanen Megakaryozytopoese durch APP. Humane periphere Stammzellkulturen wurden auf 10% APP eingestellt und für 12 Tage kultiviert. Am Tag 0, 2 und 4 wurde mpl-IqG (0,5 pg) oder ANP-R-IgG (0,5-pg) zugesetzt. Nach 12 Tagen wurde die Megakaryozytopoese quantifiziert, wie in den Beispielen beschrieben. Der Mittelwert von zweifachen Analysenproben ist graphisch dargestellt, mit den tatsächlichen zweifachen Daten in Klammern.

Fig. 9 zeigt beide Stränge eines 390 bp-Fragments von humaner . genomischer DNA, die den mpl-Liganden kodiert. Die ge-folgerte Aminosäuresequenz für "Exon 3n (SEQ ID NO: 3), die kodierende Sequenz (SEQ ID NO: 4) und deren komplementäre Sequenz (SEQ ID NO: 5) sind gezeigt.

Fig. 10 zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz des reifen humanen mpl-Ligandën (hML) (SEQ ID NO: 6) und von reifem hu-manem Erythropoietin (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Die vorherge-sagte Aminosäuresequenz für den humanen mpl-Liganden ist ausgerichtet (aligned) mit der humanen Erythropoietin-sequenz. Identische Aminosäuren sind eingerahmt und Lücken, die zur optimalen Ausrichtung eingeführt sind, sind durch Striche gekennzeichnet. Potentielle N-Glycosylierungsstellen sind unterstrichen mit einer durchgezogenen Linie für das hML und mit einer unterbrochenen Linie für hEPO. Die zwei für die Erythropoietinaktivität wichtigen Cysteine sind durch einen großen Punkt gekennzeichnet.

Fig. 11 zeigt die gefolgerte Aminosäuresequenz von reifen humanen mpl-Ligandenisoformen hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) und hML4 (SEQ ID NO: 10).

Identische Aminosäuren sind eingerahmt und Lücken, die zur optimalen Ausrichtung eingeführt wurden, sind durch Striche gekennzeichnet.

Figuren 12A, 12B und 12C zeigen die Wirkung von humanen mpl-Liganden auf die Ba/F3-mpl-Zellproliferation (A), die humane Megakaryozytopoese in vitro, guantifiziert unter Verwendung eines radiomarkierten IgG monoklonalen Mäuseantikörpers, der spezifisch ist für das Megakaryozyten-Glycoprotein GPIIbIIIa (B), und die Thrombopoese in Maus, gemessen in einem Plätt-chen-Rebound-Assay (C) . 293-Zellen wurden transfektiert durch das CaPC>4-Verfahren (Gorman, C in DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]) mit pRK5-Vektor alleine, pRK5-hML oder mit pRK5-ML153 iiber Nacht (pRK5-ML153 wurde erzeugt durch Einfiihren eines Stopp-codons nach dem Rest 153 von hML durch PCR). Die Medien wur den fiir 36 h konditioniert und getestet auf die Stimulation der Zellproliferation von Ba/F3-mpl, wie beschrieben in Bei-spiel 1 (A), Oder auf humane Megakaryozytopoese in vitro (B). Die Megakaryozytopoese wurde quantifiziert mit Hilfe eines radiomarkierten IgG-monoklonalen Mäuseantikörpers (HP1-1D) gegen das Megakaryozyten-spezifische Glycoprotein GPIIbHIa/ wie beschrieben (Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987]). Der Effekt von teilsweise gereinigtem rekombinanten ML (rML) auf die in vivo Plättchenproduktion (C) wurde er-mittelt mit Hilfe des Rebound-Thrombozytose-Assays, wie beschrieben von McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-10012 [1973]. Teilweise gereinigtes rML wurde her-gestellt aus 200 ml konditioniertem Medium enthaltend das rekombinate ML. Das'Medium wurde iiber eine 2 ml Blue-Sepa-rose-Säule geleitet, die equilibriert war in PBS, und die Saule wurde gewaschen mit PBS und eluiert mit PBS enthaltend jewelIs 2M Harnstoff und NaCl. Die aktive Fraktion wurde dla3_ysiert in PBS und auf lmg/ml mit Endotoxin-freiem BSA eingestellt. Die Analysenprobe enthielt weniger als eine Einheit Endotoxin/ml. Mäuse wurden injiziert mit jeweils 64000, 32000 oder 16000 Einheiten rML Oder dem Hilfsstoff alleine. Jede Gruppe bestand aus sechs Mäusen. Der Mittel-wert und die Standardabweichung einer jeden Gruppe ist ge-zeigt. p-Werte wurden ermittelt mit Hilfe eines 2-Tailed-T-Tests unter Vergleich der in der Mitte liegenden Werte (medians).

Fig. 13 vergleicht die Wirkung von humanen mpl-Ligandeniso-formen und Varianten in dem Ba/F3-mpl-Zellproliferations-assay. hML, Mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) und hML153 wurden getestet unter verschiedenen Verdünnungen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Figuren 14A, 14B und 14C zeigen die gefolgerte Aminosäure-sequenz (SEQ ID NO: 1) von humanen mp2-Liganden (hML) Oder humanem TPO (hTPO) und der humanen genomischen DNA-kodieren-den Sequenz (SEQ ID NO: 11). Nukleotide und Aminosäurereste sind am Anfang einer jeden Zeile numeriert.

Fig. 15 zeigt eine SDS-PAGE von gereinigtem 293-rhML332 und gereinigtem 293-rhMLi53.

Fig. 16 zeigt die Nukleotidsequenz: cDNA-kodierende Sequenz (SEQ ID NO: 12) und gefolgerte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 13) des offenen Leserasters einer ML-Isoform der Maus. Diese reife mpl-Ligandenisoform der Maus enthält 331 Aminosäure-reste, vier weniger als der mutmaßliche vollständige mML, und er wird deshalb als mML2 bezeichnet. Die Nukleotide sind am Beginn einer jeden Zeile numeriert. Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1. Die po-tentiellen N-Glycosylierungsstellen sind unterstrichen. Cysteinreste sind gekennzeichnet durch einen Punkt oberhalb -der Sequenz.

Fig. 17 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 14) und die gefolgerte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 15) dieser ML-Mäuseiso-form (mML). Die Nukleotide sind numeriert an dem Beginn einer jeden Zeile. Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1. Diese reife mpl-Ligandeniso-form der Maus enthält 335 Aminosäurereste, und ist vermut-lich der vollständige mpl-Ligand, bezeichnet mML. Die Signalsequenz ist gekennzeichnet durch eine unterbrochene Unterstreichung, und der wahrscheinliche Punkt der Spaltung ist mit einem Pfeil gekennzeichnet- Die nichttranslatierten 5'- und 3'-Regionen sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Die Deletionen, die aufgefunden wurden als das Ergebnis von alternativem Spleißen (mML 2 und mML3), sind unterstri-chen. Die vier Cysteinreste sind durch einen Punkt gekennzeichnet. Die sieben potentiellen N-Glycosylierungsstellen sind eingerahmt.

Fig. 18 vergleicht die gefolgerte Aminosäuresequenz der hu-manen ML-Isoform hML3 (SEQ ID NO: 9) und einer Mäuse-ML-Iso-form, als mML3 (SEQ ID NO: 16) bezeichnet. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für den humanen mpl-Liganden ist mit der jnpl-Ligandensequenz der Maus ausgerichetet. Identische Ami-nosäuren sind eingerahmt und Lücken, die eingeführt wurden für die optimale Ausrichtung, sind durch Striche gekennzeichnet. Aminosäuren sind am Beginn einer jeden Zeile numeriert.

Fig. 19 vergleicht die vorhergesagte Aminosäuresequenzen von reifen ML-Isoformen aus Mäuse-ML (SEQ ID NO: 17), Schweine-ML (SEQ ID NO: 18) und humanem ML (SEQ ID NO: 6). Die Ami-nosäuresequenzen sind mit Lücken ausgerichtet, die durch Striche gekennzeichnet sind, die eingeführt wurden zur optimal en Ausrichtung. Aminosâurereste sind an dem Beginn einer jeden Zeile numeriert, wobei identische Reste eingerahmt sind. Potentielle N-Glycosylierungsstellen sind durch eine schraffierte Box gekennzeichnet, und die Cysteinreste sind mit einem Punkt gekennzeichnet. Das konservierte dibasische Aminosäuremotiv, das eine potentielle Proteasespaltstelle darstellt, ist unterstrichen. Die vier Aminosäurenlange De- letion. die in allen drei Spezies (ML2) vorkommt, ist durch eine fett gedruckte Box gekennzeichnet.

Fig. 20 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 19) und die vor-hergesagte reife Proteinsequenz (SEQ ID NO: 18) einer Schweine-ML-Isoform (pML). Diese mpl-Ligandenisoform aus Schwein enthält 332 Aminosäurereste und ist vermutlich der vollständige mpl-Ligand aus Schwein, bezeichnet als pML. Die Nukleotide sind am Anfang einer jeden Zeile numeriert. Die Aminosäurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1.

Fig. 21 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 20) und vorherge-sagte reife Proteinsequenz (SEQ ID NO: 21) einer Schweine-ML-Isoform (pML2). Diese mpl-Ligandenisoform aus Schwein enthält 328 Aminosäurereste und stellt eine Form mit einer Deletion von vier Resten des vollständigen mpl-Liganden aus Schwein dar, bezeichnet als pML2. Die Nukleotide sind an dem Beginn einer jeden Zeile numeriert. Die Aminosâurereste sind oberhalb der Sequenz numeriert, beginnend mit Ser 1.

Fig. 22 vergleicht die gefolgerte Aminosâuresequenz für die vollstândige ML-Isoform aus Schwein pML (SEQ ID NO: 18) und eine ML-Isoform aus Schwein, bezeichnet als pML2 (SEQ ID NO: 21). Die vorhergesagte Aminosâuresequenz für das pML ist ausgerichtet mit der pML2-Sequenz. Identische Aminosâuren sind eingerahmt und Lücken, die für die optimale Ausrichtung eingeführt wurden, sind durch Striche gekennzeichnet. Die Aminosâuren sind am Beginn einer jeden Zeile numeriert.

Fig. 23 zeigt die relevanten Merkmale von Plasmid pSVI5.ID.LL.MLORF ("vollstândig" ("full length") oder TPO332) , das verwendet wurde zum Transfektieren der CHO-DP12-Wirtszellen zum Herstellen von CH0-rhTP0332.

Fig. 24 zeigt die relevanten Merkmale von Plasmid pSVI5.ID.LL.MLEPO-D ("verkürzt" oder TP0153) , das verwendet wurde zum Transfektieren der CH0-DP12-Wirtszellen zum Her stellen von CH0-rhTP0153.

Figuren 25A, 25B und 25C zeigen den Effekt von E. Coli-rhTPO (Met_1, 153) auf Plâttchen (A), rote Blutzellen (B) und (C) weiße Blutzellen in normalen Mäusen. Zwei Gruppen von je-weils 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 0,3 jLtg E. Coli-rhTPO(Met1, 153) (100 μΐ sc.)· Am Tag 0 und am Tag 3-7 wurden 40 μΐ Blut aus dein Orbitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort verdünnt in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels, und die Ge-samtblutauszählung wurde erhalten mittels eines Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Die Daten sind als Mittel- werte ± der Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Figuren 26A, 26B und 26C zeigen den Effekt von E. Coli- rhTPO (Met"1/ 153) auf Plâttchen (A), rote Blutzellen (B) und (C) weiße Blutzellen in s.ublethal bestrahlten Mausen. Zwei

Gruppen von 10 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden sublethal be- . 137 strahlt mit 750 cGy einer Gammastrahlung aus einer Cs-Quelle und täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 3,0 Mg E. Coli-rhTPO(ΜΕΤ_1, i53) (100 μΐ sc.). Am Tag 0 und an anschließenden Zeitpunkten wurden 40 μΐ Blut aus dem Orbitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels verdünnt, und die Gesamt-blutauszählung wurde erhalten auf einem Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Figuren 27A, 27B und 27C zeigen'den Effekt von CH0-rhTP0332 auf (A) Plâttchen (Thrombozyten), (B) rote Blutzellen (Erythrozyten) und (C) weiße Blutzellen (Leukozyten) in normalen Mäusen. Zwei Gruppen von 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich injiziert mit entweder PBS-Puffer oder 0,3 Mg CH0-rhTP0332 (100 Ml SC.). Am Tag 0 und an Tagen 3-7 wurden 40 Ml Blut aus dem Orbitalsinus entnommen. Das Blut wurde sofort in 10 ml eines gewerblichen Verdünnungsmittels ver-diinnt, und die Gesamtblutauszählung wurde erhalten mit einem Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Die Daten sind als

Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben. ' Fig. 28 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve für verschiedene For-men von rhTPO, erhalten aus verschiedenen Zellinien. Die Do-sis-Antwort-Kurven wurden für rhTPO aus den folgenden Zellinien erstellt: hTP0332 aus CHO (vollständig, aus Ovarienzel-len des chinesischen Hamsters); hTPOMet_1, 153 (von E. Coli-stammende verkürztë Form mit einem N-terminalen Methionin); hTP0332 (vollständiges TPO aus humanen 293-Zellen); Met-freies 155 E-Coli (die verkürzte Form [rhTP0155] ohne das N-terminale Methionin von E. Coli). Gruppen von 6 weiblichen C57 B6-Mäusen wurden täglich für 7 Tage injiziert mit rhTPO, abhängig von der Gruppe. An jedem Tag wurden 40 μΐ Blut aus dem Orbitalsinus für die Gesamtblutauszählung entnommen. Die oben gezeigten Daten stellen die maximale Wirkung dar, die mit den verschiedenen Behandlungen beobachtet wurden, und mit der Ausnahme von (Met 153 E-Coli) folgte dies am Tag 7 der Behandlung. In der zuvorerwähnten "Met 153 E-Coli"-Gruppe wurde der maximale Effekt am Tag 5 beobachtet. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittels-werts angegeben.

Fig. 29 zeigt die Dosis-Antwort-Kurven bei denen die Aktivi-tät von vollständigen und "gestutzten" ("cliped") Formen von rhTPO·, hergestellt in CHO-Zellen, mit der verkürzten Form aus E. Coli verglichen wird. Gruppen von 6 weiblichen C57 Ββ-Mäusen wurden täglich injiziert mit 0,3 jug rhTPO von verschiedenen Typen. An Tagen 2-7 wurden 40 μΐ Blut aus dem Orbitalsinus für die Gesamtblutauszählung entommen. Behand-lungsgruppen waren TP0153, der verkürzten Form von TPO aus E. Coli; TP0332 (gemischte Fraktion) vollständiges TPO enthal-tend ungefähr 80-90% vollständiges und 10-20% gestutzte Formen; TP0332 (3 0K-Fraktion) = gereinigte, gestutzte Fraktion ?>us der ursprünglichen "Mix"-Präparation; TPO332 (70K Frak-tion) = gereinigte Fraktion mit vollständigem TPO aus der ursprünglichen "Mix"-Präparation. Die Daten sind als Mittel- werte ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben.

Fig. 30 ist ein Kartoon, der den KIRA-ELISA-Assay zum Messen von TPO zeigt. Die Figur zeigt die MPL/Rse.gD-Chimäre und relevante Teile des Ausgangsrezeptors wie auch das endgül-tige Konstrukt (rechter Teil der Figur) und ein Fließdia-gramm (linker Teil der Figur), das die relevanten Schritte des Assays zeigt.

Fig. 31 ist ein Fließdiagramm für den KIRA-ELISA-Assay, das jeden Schritt des Verfahrens zeigt.

Figuren 32A-32L geben die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 22) . des pSVI17.ID.LL Expressionsvektors an, der zur Expression von Rse.gD in Beispiel 17 verwendet wurde.

Fig. 33 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMPl.

Fig. 34 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP21.

Fig. 35 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP151.

Fig. 36 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP202.

Fig. 37 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP172. /

Fig. 38 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP210.

Fig. 39 zeigt eine Tabelle der fünf besten TPO-exprimieren-den Klone aus der pMP210-Plasmidbank (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 und 28).

Fig. 40 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP4l.

Fig. 41 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP57.

Fig. 42 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid pMP251. I. Definitionen

Im allgemeinen besitzen die folgenden Worte und Ausdrücke die angegebene Bedeutung, wenn sie in der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen verwendet werden. "Chaotropes Mittel" bedeutet eine Verbindung, die in einer wäßrigen Lösung und in einer geeigneten Konzentration eine Änderung in der räumlichen Konfiguration oder Konformation eines Proteins hervorrufen kann durch zumindest teilweise Zerstörung der Kräfte, die verantwortlich sind zum Aufrecht-erhalten der normalen sekundären und tertiären Struktur des Proteins. Solche Verbindungen umfassen z.B. Harnstoff, Gua-nidin-HCl und Natriumthiocyanat. Hohe Konzentrationen, iibli-cherweise 4-9 M, dieser Verbindungen sind normalerweise er-forderlich, urn den Einfluß auf die Konformation des Proteins auszuüben. "Zytokin" ist ein allgemeiner Begriff für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als interzelluläre Mediatoren wirken. Beispiele für . solche Zytokine sind Lymphokine, Monokine und traditionelle Polypeptidhormone. Eingeschlossen unter den Zytokinen werden

Wachstumshormon, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon, humanes N-Methionyl-Wachstumshormon, Rin-derwachstumshormon, Parathyroidhormon, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glycoproteinhormone wie Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH), hämatopoeti-scher Wachstumsfaktor, hepatischer Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Prolaktin, Plazentalaktogen, Tumornekrosisfaktor-a (TNF-a und TNF-ß) Mullerian-inhibie-rende Substanz, Gonadotropin-assoziiertes Peptid der Maus, Inhibin, Aktivin, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, Integrin, Nervenwachstumsfaktoren wie NGF-ß, Plättchenwachs-tumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs) wie TGF-a und TGF-ß, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und-II, Erythropoietin (EPO), osteoinduktive Faktoren, Interferone wie Interferon-cc, ~ß, ~y, koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulozyten-Makropha-gen-CSF (GM-CSF) und Granulozyten-CSF (G-CSF), Interleukine (IL1s) Wie IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 und andere Polypeptidfaktoren ein-schließlich LIF, SCF und kit-Ligand. Wie hierin verwendet bedeuten die zuvorgenannten Ausdrücke, daß sie Proteïne aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Zellkulturen um-fassen. Ähnlich sollen die Begriffe auch biologisch aktive Äquivalente umfassen; z.B. die sich in der Ammosäuresequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren oder in der Art oder dem Ausmaß der Glycosylierung unterscheiden. "mpl-Ligand", "mpl-Ligandenpolypeptid", "ML", "Thrombopoietin" oder "TPO".werden austauschbar hierin verwendet und umfassen ein beliebiges Polypeptid, das die Eigenschaft zur Bindung an mpl, ein Mitglied der Zytokinrezep-torsuperfamilie, besitzt, und das eine biologische Eigenschaft des ML, wie oben definiert, besitzt. Eine beispiel-hafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, den Einbau von markierten Nukleotiden (z.B.3H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, transiektiert mit humanem mpl P, zu stimuiieren. Eine weitere beispielhafte biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, den Einbau von 35S in zirku-lierende Plättchen in einem Mäuse-Plättchen-Rebound-Assay zu stimuiieren. Diese Definition umfaßt das Polypeptid, iso-liert aus einer mpl-LigandenquelIe, wie aus einem hierin be-schriebenen aplastischen Schweineplasma, Oder aus einer anderen Quelle (Ausgangsmaterial), wie einer anderen Tierart, einschließlich Mensch, Oder hergestellt durch rekombinante Oder synthetische Verfahren, und es umfaßt variante Formen einschließlich funktionelle Derivate, Fragmente, Allele, Isoformen und Analoga davon.

Ein "mpl-Ligandenfragment" oder "TPO-Fragment" ist ein Teil eines natiirlich vorkommenden reifen vollständigen mpl-Ligan-den Oder einer TPO-Sequenz, wobei eine Oder mehrere Ami-nosäurereste Oder Kohlenhydrateinheiten deletiert sind. Die deletierten Aminosäurereste bzw. -rest können an beliebiger Stelle in dem Peptid vorkommen, einschließlich entweder an dem N-terminalen Ende oder dem C-terminalen Ende Oder inner-halb der Sequenz. Das Fragment teilt zumindestens eine biologische Eigenschaft gemeinsam mit dem mpl-Liganden. Mpl-Ligandenfragmente haben eine fortlaufende Sequenz von minde-stens 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, die iden-tisch sind zu der Sequenz des mpI-Liganden, isoliert aus einem Säuger einschließlich dem Liganden isoliert von apla-stischem Schweineplasma oder dem humanen oder Mäuseliganden, insbesondere der EPO-Domäne davon. Repräsentative Beispiele des N-terminalen Fragments sind hML153 oder TPO (Met 1 1-153)'. "Mpl-Ligandenvarianten" oder "mpl-Ligandensequenzvarianten" wie hierin definiert, bedeuten einen biologisch aktiven mpl-Liganden, wie unten definiert, mit weniger als 100% Sequenz-identitât mit dem mpl-Liganden, isoliert aus rekombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma oder dem humanen

Liganden mit der gefolgerten Seguenz, wie beschrieben in Fig. 1 (SEQ' ID NO: 1). Üblicherweise besitzt eine biologisch aktive mpl-Ligandenvariante eine Aminosâuresequenz mit min-destens ungefähr 70% Aminosâuresequenzidentität mit dem mpl - Liganden isoliert aus aplastischem Schweineplasma oder dem reifen Mäuse- oder humanen Liganden oder Fragmenten davon (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), vorzugsweise mindestens unge-fähr 75%, ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr 80%, noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 85% und noch mehr bevorzugt sind mindestens ungefähr 90% und am bevorzugtesten sind mindestens ungefähr 95% Identität.

Ein "chimärer mpI-Ligand" ist ein Polypeptid umfassend den vollständigen mpl-Liganden oder eines oder mehrere Fragmente davon, die fusioniert oder gebunden sind an ein zweites he-terologes Polypeptid oder ein oder mehrere Fragmente davon. Die Chimäre hat mindestens eine biologische Eigenschaft ge-meinsam mit dem io.pl-Liganden. Das zweite Polypeptid wird ty pischerweise ein Zytokin, Immunglobulin oder Fragmente davon sein. "Isolierter mpl-Ligand", "hochgereinigter mpl-Ligand" und "im wesentlicher homogener mpl-Ligand" sind austauschbar und bedeuten einen mpl-Liganden, der gereinigt worden ist aus einer mpl-LigandenquelIe oder der hergestellt worden ist durch rekombinante oder synthetische Verfahren, und der aus-reichend frei ist von anderen Peptiden oder Proteïnen, (1) urn zumindestens 15 und vorzugsweise 20 Aminosâurereste an dem N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz unter· Verwendung eines Spinnung-Cup-Sequenzautomaten oder des besten gewerblich erhältlichen Aminosäuresequenzierautomaten auf dem Markt oder nach modifizierten, am Einreichungstag der vorliegenden Erfindung veröffentlichten Verfahren, zu erhalten, oder (2) der bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie Blue oder vorzugsweise von Sil-ärbung gereinigt ist. Homogenität hier bedeutet eine

Verunreinigung von veniger als 5% mit anderen Proteïnen des Ausgangsmaterials. "Biologische Eigenschaft", wenn verwendet in Verbindung mit entweder dem "mpl-Liganden" oder "isoliertem mpl-Liganden", bedeutet, daß er thrombopoetische Aktivität besitzt oder eine in vivo Effektor- oder Antigenfunktion oder Aktivität, die direkt oder indirekt verursacht oder ausgeübt wird durch einen mpl-Liganden (entweder in seiner nativen oder denatu-rierten Konformation) oder von einem Fragment davon. Effek-torfunktionen umfassen mpl-Bindung und jede Trägerbindungs-aktivität, Agonismus oder Antagonismus von mpl, insbesondere die Erzeugung (Transduktion) eines proliferativen Signals, einschließlich Replikation, DFA-regulierende Funktion, Modulation der biologischen Aktivität von anderen Zytokinen, Re-zeptor(insbesondere Zytokin)-Aktivierung, Deaktivierung, Hoch- und Runterregulierung, Zellwachstum oder Differenzie-rung und ähnliches. Eine antigene Funktion bedeutet besitzen eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die in der Lage ist, mit Antikörpern kreuzzureagieren, die gegen den nativen mpl-Liganden gerichtet sind. Die grundlegende antigene Funktion eines mpl-Ligandenpolypeptids liegt darin, daß es mit einer Affinität von mindestens ungefähr 106l/Mol an einen Antikörper bindet, der gegen den mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma, hergestellt ist. Üblicherweise bindet das Polypeptid mit einer Affinität von mindestens un-gefähr 107 1/Mol. Besonders bevorzugt ist das antigenisch aktive mpl-Ligandenpolypeptid, das an einen Antikörper bindet, der gegen den mpl-Liganden mit einer der oben beschrie-benen Effektorfunktionen gerichtet ist. Die Antikörper, die verwendet wurden zum Definiëren von "biologischer Aktivi-tät", sind polyklonale Kaninchenantikörper, die erhalten wurden durch Formulieren des mpl-Liganden, isoliert aus re-kombinanter Zellkultur oder aplastischem Schweineplasma, in Freund's vollständigem Adjuvants, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperito- neale Injektion der Formulierung bis der Titer des mpl-Ligandenantikörpers ein Plateau erreicht. "Eiologisch aktiv", wenn verwendet in Verbindungen mit ent-weder dem "mpl-Liganden" oder "isoliertem mpl-Ligand" bedeu-tet ein mpl-Ligand oder Polypeptid, der bzw. das thrombopoe-tische Aktivitât zeigt oder eine Effektorfunktion mit dem mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma oder exprimiert in rekombinanter Zellkultur, wie hierin beschrie-ben, teilt. Eine prinzipiell bekannte Effektorfunktion des mpl-Liganden oder des Folypeptids ist hierin die Bindung an mpl und die Stimulierung des Einbaus von markierten Nukleo-tiden (3H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, transfektiert mit humanem mpl P. Eine weitere bekannte Effektorfunktion des mpl-Liganden oder des Polypep-tids hierin ist die Fähigkeit zum Stimulieren des Einbaus von 35S in zirkulierende Plättchen in einem Mäuse-Plättchen-Rebound-Assay. Eine weitere bekannte Effektorfunktion des mpl-Liganden ist die Fähigkeit, in vitro die humane Mega-karyozytopoese zu stimulieren, die quantifiziert werden kann unter Verwendung eines radiomarkierten monoklonalen Antikör-pers, der spezifisch ist für das Megakaryozytenglycoprotein GPIIbIIIa. "Prozent Aminosäuresequenzidentität" hinsichtlich der mpl-Ligandensequenz ist hierin definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in der fraglichen Sequenz, die identisch sind mit den Resten in der mpl-Ligandensequenz, isoliert aus aplastischem Scheineplasma oder dem Mäuse- oder humanen Liganden mit der gefolgerten Aminosäuresequenz, wie beschrie-ben in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), nach Ausrichten der Sequenzen und Einführen von Lücken, falls erforderlich, urn die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erzielen, und wobei konservative Austausche nicht als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die mpl-Ligandensequenz werden .als die Sequenzidentität oder Ho- mologie beeinflussend angesehen. Somit umfassen beispiel-hafte biologisch aktive mpl-Ligandenpolypeptide, von denen eine identische Sequenz angenommen wird, Präpro-mpl-Ligand, Pro-mpl-Ligand und reifer mpl-Ligand. "Mpl-Ligandenmikrosequenzierung" kann durchgeführt werden durch ein jedes geeignetes Standardverfahren, vorausgesetzt das Verfahren ist sensitiv genug. Bei einem solchen Verfah-ren wird hochgereinigtes Polypeptid, erhalten von SDS-Gelen oder einem abschließenden HPLC-Schritt, direkt sequenziert durch einen automatisierten Edman (Phenylisothiocyanat)-Ab-bau unter Verwendung eines Modells 470A Applied Biosystems Gasphasensequenzierautomaten, ausgestattet mit einem 12OA Phenylthiohydantion (PTH)-Aminosäureanalysator. Weiterhin können mpl-Ligandenfragmente, hergestellt durch chemischen (z.B. CNBr, Hydroxylamin, 2-Nitro-5-thiocyanobenzoat) oder enzymatischen (z.B. Trypsin, Clostripain, Staphylokokkuspro-tease) Verdau, gefolgt von der Fragmentreinigung (z.B. HPLC), auf ähnliche Weise sequenziert werden. PTH-Aminosäu-ren werden analysiert mit Hilfe des ChromPerfect-Daten-systems (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Die Sequenz-interpretation wird durchgeführt auf einer VAX 11/785 Digital Dquipment Co. Computer, wie beschrieben bei Henzel et al., J. Chromatography, 404:41-52 [1987]. Gegebenenfalls können Aliquots der HPLC-Fraktionen einer Elektrophorese unter zogen werden auf 5-20% SDS-PAGE, elektrotransferiert werden auf eine PVDF-Membran (ProBlott, AIB, Foster City, CA) und gefärbt werden mit Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]). Ein durch die Färbung identifiziertes spezielles Protein wird aus dem Blot ausgeschnitten und die N-terminale Sequenzie-rung wird durchgeführt mit dem oben beschriebenen Gasphasensequenzierautomaten. Für interne Proteinsequenzen werden HPLC-Fraktionen unter Vakuum (SpeedVAC) getrocknet, resus-pendiert in geeignetem Puffer und verdaut mit Cyanbromid, dem Lys-spezifischen Enzym Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) oder Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Nach

Verdauung werden die erhaltenen Peptide sequenziert als eine Mischung oder nach HPLC-Auftrennung auf einer C4-Säule, die mit einem Propanolgradienten in 0,1% TFA vor dem Gasphasen-sequenzieren entwickelt wird. "Thrombozytopenie" wird definiert als Plättchenzahl unter 150X109 pro Liter Blut. "Thrombopoetische Aktivität" wird definiert als biologische Aktivität, die besteht aus dem Beschleunigen der Proliferation, der Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryo-zyten oder Megakaryozytenvorläufern zu den Plättchen-produ-zierenden Formen disser Zeilen. Diese Aktivität kann gemes sen werden in verschiedenen Assays, einschließlich einem in vivo-Mäuse-Plättchen-Rebound-Synthese-Assay, durch Induktion eines Plättchen-Oberflächenantigen-Assays, wie gemessen durch einen Anti-Plättchen-Immuno-Assay (anti-GPIIbIIIa) für eine humane megakaryoplastische Leukämiezellinie (CMK), und Induktion der Polyploidisierung in einer megakaryoplasti-schen Zellinie (DAMI). "Thr.ombopoientin" (TPO) wird definiert als eine Verbindung mit thrombopoetischer Affinität oder die die Serumplättchen- zahl in einem Säuger steigern kann. TPO ist vorzugsweise in der Lage die endogenen Plättchenzahlen um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 50%, zu steigern, und ganz besonders bevorzugt kann es die Plättchenzahl in einem Menschen auf mehr als 150xl09 pro Liter Blut steigern. "Isolierte mpl-Ligandennukleinsäure" ist RNA oder DNA ent-haltend mehr als 16 und vorzugsweise 20 oder mehr Nukleotid-basen in Abfolge, die einen biologisch aktiven mpl-Liganden oder ein Fragment davon kodieren, sie ist komplementär zu der RNA oder DNA oder hybridisiert zu der RNA oder DNA und verbleibt stabil gebunden unter moderaten bis stringenten Bedingungen. Diese RNA oder DNA ist frei von mindestens einer kontaminierenden Nukleinsäure des Ausgangsmaterials, mit der sie normalerweise in dem natürlichen Ausgangsmate-rial assoziiert ist, und sie ist vorzugsweise im wesentli-chen frei von jeder anderen Säuger-RNA oder -DNA. Der Aus-druck "frei von mindestens einer kontaminierenden Nuklein-sâure des Ausgangsmaterials, mit der sie normalerweise assoziiert ist" umfaßt den Fall, wo die Nukleinsäure in dem Aus-gangsmaterial Oder der natürlichen Zelle vorhanden ist, sie sich aber an einer anderen chromosomalen Stelle befindet Oder von anderen Nukleinsäuresequenzen flankiert wird, die normalerweise nicht in der Ausgangsmaterialzelle gefunden werden. Ein Beispiel für isolierte mpl-Ligandennukleinsäure ist RNA oder DNA, die einen biologisch aktiven mpI-Liganden kodiert, der mindestens 75% Sequenzidentität, mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 85% und noch mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Sequenziden-tität mit den humanen, dem Mäuse- oder Schweine-jnpl-Liganden aufweist. "Kontrollsequenzen", wenn auf die Expression Bezug genommen wird, bedeutet DNA-Sequenzen, die notwendig sind zur Expression einer funktionsfähig daniit verknüpften kodierenden Se-quenz in einem speziellen Wirtsorganismus. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z.B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise weitere bisher noch wenig verstandene Sequenzen. Von eukaryotischen Zeilen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden. "Funktionsfähig verknüpft", wenn auf Nukleinsäure Bezug genommen wird, bedeutet, daß die Nukleinsäuren in einer funk-tionellen Beziehung mit anderen Nukleinsäuresequenzen ste-hen. 'Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader funktionsfähig verknüpft mit DNA für ein Polypeptid, wenn dieses als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer kodierenden Sequenz funktionsfähig verknüpft, wenn er die Transkription der Se-quenz beeinflußt; Oder eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionsfähig verknüpft mit einer kodierenden Sequenz, wenn sie so angeordnet ist, daß sie die Translation erleichtert. lm allgemeinen bedeutet "funktionsfähig verknüpft", daß die DNA-Sequenzen fortlaufend und in dem Fall eines sekretori-schen Leaders, fortlaufend und im Leseraster verknüpft sind. Jedoch müssen Enhancer nicht fortlaufend angeordnet sein.

Das Verknüpfen wird bewirkt durch Ligation an geeigneten Re-striktionsschmttstellen. Falls solche Stellen nicht exi stieren werden synthesische Oligonukleotidadaptoren oder Linker nach herkömmlichen Verfahren verwendet. "Exogen", wenn auf ein Element Bezug genommen wird, bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die für die Zelle fremd ist oder für die Zelle homolog ist, aber in einer Position in der Wirtszellnukleinsäure gelegen ist, in der das Element übli-cherweise nicht gefunden wird. "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" werden austauschbar nierin verwendet, und solche Bezeichnungen umfassen alle Nachkommen einer Zelle oder Zellinie. Somit umfassen bei-spielsweise Begriffe wie "Transformanden" und "transformierte Zeilen" die primäre Zelle und davon abstam-mende Kuituren, ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Auch wird davon ausgegangen, daß nicht alle Nachkommen genau identisch in dem DNA-Gehalt sein müssen, aufgrund von bewuß-ten oder unvermeidbaren Mutationen. Mutante Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität besitzen, nach der die ursprünglich transformierte Zelle abgesucht wurde, sind eingeschlossen. Wo verschiedene Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird dies aus dem Zusammenhang klar. 4L· "Plasmide" sind autonom replizierende ringförmige DNA-Mole-küle, die unabhängige Replikationsursprünge besitzen, und sie werden hierin durch einen Kleinbuchstaben "p" bezeich-net, der Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangestellt ist.

Die Ausgangsplasmide sind entweder gewerblich erhältlich, öffentlich erhältlich in nichtbeschränkter Weise, oder sie können aus solchen erhältlichen Plasmiden geinäß veröffent-lichten Verfahren hergestellt werden. Weiterhin sind andere äquivalente Plasmide in dem Stand der Technik bekannt und sind dem Durchschnittsfachmann geläufig. "Restriktionsenzymverdau(-spaltung)", wenn auf DNA Bezug ge~ nommen wird, bedeutet die katalytische Spaltung von internen Phosphodiester-Bindungen von DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Positionen und Stellen in der DNA-Sequenz wirkt. Solche Enzyme werden "Restriktionsendonukleasen" genannt. Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, "Restriktionsschnittstelle(-spaltstelle)" genannt, die eine zweifache Symmetrie zeigt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind gewerblich erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfor-dernisse, wie durch den Enzymherstel1er angegeben, werden verwendet. Restriktionsenzyme werden üblicherweise bezeich-net durch Abkiirzungen, die sich zusammensetzen aus einem Großbuchstaben gefolgt von anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem das einzelne Restrikti-onsenzym ursprünglich erhalten worden ist, und dann folgt eine Nummer, die das spezielle Enzym angibt. Im allgemeinen wird 1 ßq Plamid oder DNA mit ungefähr 1-2 Einheiten Enzym in ungefähr 20 μΐ Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller spezifiziert. Typischerweise wird eine Inkubation für ungefähr 1 Stunde bei 37°C verwendet, aber sie kann variieren in Übereinstimmung mit den Herstelleran-gaben. Nach Inkubation wird Protein oder Polypeptid entfernt durch Extraktion mit Phenol und Chlorofom, und die gespal-tene Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion gewonnen durch Präzipitation mit Ethanol. Der Spaltung mit einem Re-striktionsenzym kann die Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase folgen, urn zu vermeiden, daß die zwei Enden der restriktionsgespaltenen DNA eines DNA-Fragments "zirkularisieren" oder eine ge-schlossene Schleife bilden, was das Einfügen eines anderen DNA-Fragments in die Restriktionsschnittstelle erschweren würde. Sofern nicht anders angegeben, folgt der Spaltung der Plasmide keine 5'-terminale Dephosphorylierung. Die Verfah-ren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind die herkömm-lichen, wie beschrieben in Abschnitten 1.56-1.61 von Sam-brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 19891. "Gewinnen" Oder "Isolieren" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsspaltansatz bedeutet Auftrennen des Spaltansatzes auf einem Polyacrylamid Oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifizieren des Fragments von Interesse durch Vergleich von dessen Mobilität mit der von Marker DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernen des Gelabschnitts, enthaltend das gewünschte Fragment, und Ab-trennen des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist allgemein be- kannt. Zum Beispiel siehe Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981], und Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980]. "Southern-Analyse" oder "Southern-Blotten" ist ein Verfah-• ren, bei dem die Anwesenheit von DNA-Sequenzen in einem Re-striktionsendonukleasespaltansatz von DNA oder DNA-enthal-tender Zusammensetzung bestätigt wird durch Hybridisieren an ein bekanntes markiertes Oligonukleotid oder DNA-Fragment. Southern-Analayse umfaßt typischerweise die elektrophoreti-sche Auftrennung eines DNA-Spaltansatzes auf Agarosegelen, Denaturieren der DNA nach der elektrophoretischen Auftrennung und Transfer der DNA auf Nitrocellulose, Nylon oder andere geeignete Membranträger zur Analyse mit einer radiomar-kierten, biotinylierten oder enzymmarkierten Probe, wie beschrieben in Abschnitten 9.37-9.52 von Sambrook et al., siehe oben. "Northern-Analyse" Oder "Northern-Blotten" ist ein Verfah-ren, das verwendet wird zum Identifizieren von RNA-Sequen-zen, die an eine bekannte Probe, wie ein Oligonukleotid, ein DNA-Fragment, cDNA oder ein Fragment davon, oder an ein RNA-

Fragment hybridisieren. Die Probe ist mit einem Radioisotop, 32 ... . . P, oder durch Biotmylierung oder mit einem Enzym mar- kiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektro-phoretisch aufgetrennt auf einem Agarose- Oder Polyacryl-amidgel, auf Nitrocellulose, Nylon oder eine andere geeig-nete Membran transferiert und mit der Probe hybridisiert un-ter Verwendung von Standardtechniken, die im Stand der Tech-nik gut gekannt sind, wie diejenigen, beschrieben in Ab-schnitten 7.39-7.52 von Sambrook et al., siehe oben. "Ligation" ist das Verfahren zum Bilden von Phosphodiester-bindungen zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten. Zur Ligation dieser zwei Fragmente müssen die Enden der Fragmente mitein-ander kompatibel sein. In einigen Fällen können die Enden direkt kompatibel sein nach der Endonukleasespaltung. Jedoch kann es zunächst erforderlich sein, die typischerweise nach Endonukleasespaltung erzeugten überhängenden Enden zu stump-fen Enden umzuwandeln, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Zum Erzeugen glatter (stumpfer) Enden wird die DNA in einem geeigneten Puffer für mindestens 15 Minuten bei 15 °C mit ungefähr 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I oder T4 DNA-Polymerase in der Anwesenheit der vier Desoxyribonukleotidtriphosphate behandelt. Die DNA wird dann gereinigt durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation. Die miteinander zu ligierenden DNA-Fragmente werden in eine Lösung eingebracht in ungefähr äquimolaren Mengen. Die Lösung enthält auch ATP, Ligasepuf-fer und eine Ligase, wie T4 DNA-Ligase, mit ungefähr 10 Einheiten pro 0,5 μg pro DNA. Wenn die DNA in einen Vektor li-giert werden soil, wird der Vektor zunächst linearisiert durch Spaltung mit dem bzw. den geeigneten Restriktionsendo-nuklease(n). Das linearisierte Fragment wird dann mit bakte-rieller alkalischer Phosphatase oder intestinaler Kalbsphos- phatase behandelt, um die Selbstligation wâhrend des Ligati-onsschritts zu verhindern. "Herstellen (Präparation)" von DNA aus Zeilen bedeutet Iso-lieren der Plasmid-DNA aus einer Kultur der Wirtszellen. Ty-pischerweise verwendete Verfahren zum DNA-Herstellen sind die Plasmidherstellverfahren im großen und kleinen Maßstab, wie beschrieben in Abschnitten 1.25-1.33 von Sambrook et al., siehe oben. Nach dem Herstellen der DNA kann sie gerei-nigt werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, vie deraj enigen beschrieben in Abschnitt 1.40 von Sambrook et al·., siehe oben. "Oligonukleotide" sind kurzkettige, einzel- Oder doppel-strängige Polydesoxynukleotide, die chemisch synthetisiert werden mit bekannten Verfahren, wie einer Phosphotriester-, Phosphit- Oder Phosphoramiditchemie unter Verwendung von Festphasentechniken, wie beschrieben in EP 266,032, veröf-fentlicht 4. Mai 1988, Oder liber Desoxynuklosid-H-Phos-phonat-Zwischenprodukte, wie beschrieben durch Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407 [1986]. Weitere Verfahren umfassen die Polymerasekettenreaktion, wie unten be- schrieben, und andere selbstprimende (autoprimer) Verfahren und Oligonukleotidsynthesen auf festen Trägern. Alle diese Verfahren sind beschrieben in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 [1989]. Diese Verfahien werden verwendet, wenn die vollständige Nukleinsäuresequenz des Gens bekarint ist oder die zu dem kodierenden Strang komple-mentäre Nukleinsäuresequenz verfügbar ist. Alternativ, falls die Ziel-Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man auf potentielle Nukleinsäuresequenzen schließen, unter Verwendung von bekannten und bevorzugten kodierenden Resten für jeden Ami-nosâurerest. Die Oligonukleotide werden dann auf Polyacryl-amidgelen gereinigt. "Polymerasekettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich auf ein Verfahren oder eine Technik, bei der winzige Mengen eines spezifischen Stücks einer Nukleinsäure, RNA und/oder DNA, vervielfacht werden, wie beschrieben in US-Patent Nr. 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987. Ira allgemeinen muß Se-quenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder der darüber hinausgehenden Region verfügbar sein, so daß Oligonukleotidprimer entworfen werden können. Diese Primer sind identisch oder ähnlich in ihrer Sequenz zu den Ge-gensträngen der zu vervielfachenden Matrize. Die 5'-termina-len Nukleotide der zwei Primer können übereinstimmen mit den Enden des zu vervielfachenden Materials. PCR kann verwendet werden zum Vervielfachen von spezifischen RNA-Sequenzen, spezifischen DNA-Sequenzen aus gesamter genomischer DNA und cDNA, transkribiert aus gesamter zellulärer RNA, Baktriopha-gen- oder Plasmidsequenzen usw.. Siehe allgemein Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Wie hierin verwendet' wird PCR als ein aber nicht als einziges Beispiel für ein Nukleinsäurepolymerasekettenreaktionsver-fahren zum Vervielfachen einer Nukleinsäuretestanalysenprobe angesehen, das die Verwendung einer bekannten Nukleinsäure als Primer und einer Nukleinsäurepolymerase zum Vervielfäl-tigen oder Erzeugen eines spezifischen Stücks an Nuklein-säure umfaßt. "Stringente Bedingungen" sind solche, die (1) zum Waschen eine niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur einsetzen, z.B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodS04(SDS) bei 50°C, oder (2) die während dem Hybridisieren ein denatu-rierendes Mittel, wie Formamid, verwenden, z.B. 50% (Vol/Vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/O,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C.

Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natrium-phosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 x Denhardt's Lösung, beschallte Lachsspermien DNA (50 Mg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschvorgängen bei 42°C in 0,2xSSC und 0,1% SDS. "Moderat stringente Bedingungen" sind beschrieben in Sam-brook et al., siehe oben und umfassen die Verwendung einer Wasc'nlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und %SDS), die weniger stringent sind als oben beschrieben. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen sind Bedingungen, wie die über Nacht Xnkubation bei 37°C in einer Lösung umfassend: 20% Formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 x Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μΐ/ml denatu-rierte gescherte Lachsspermien DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 1 x SSC bei ungefähr 37-50°C. Der Durchschnitts-fachmann wird erkennen, wie die Temperatur, Ionenstärke usw. einzustellen ist, um sie auf Faktoren, wie die Probenlänge und ähnliches, einzustellen. "Antikörper" (Abs) und "Immunglobuline" (Igs) sind Glycoprotéine mit den gleichen strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper wie auch andere antikörperähnliche Moleküle, die keine Antigenspezi-fität haben. Polypeptide des letzteren Typs werde z.B. in geringen Spiegeln durch das Lymphsystem hergestellt und mit gesteigerten Spiegeln durch Myelomas. "Native Antikörper und Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glycoprotéine von ungefähr 150000 Daltons, die sich zusammensetzen aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten. Jede leichte Kette ist mit einer schweren Kette verknüpft über eine kovalente Disulfidbindung, während die Anzahl der Di-sulfidverknüpfungen variiert zwischen den schweren Ketten für verschiedene Immunglobulinisotypen. Jede schwere und leichte Kette besitzt auch gleichmäßig angeordnete Disulfid-brücken innerhalb der Kette. Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne (VH) gefolgt von einer An-• zahl von konstanten Doxnänen. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne an einem Ende (V^) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende; die konstante Domäne der leichten Kette ist ausgerichtet zu der ersten konstanten Domäne der schweren Kette, und die variable Domäne der leichten Kette ist ausgerichtet mit der variablen Dornane der schweren Kette. Spezielle Aminosäurereste bilden vermutlich die Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette (Clothia et al., J. Mol. Biol., 1986:651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985]).

Der Begriff "variabel" bezieht sich auf den Umstand, daß be-stimmte Anteile der variablen Domäne sich ausgiebig in der Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden, und sie sind an der Bindung und der Spezifität eines jeden speziellen Anti-körpers für sein spezielles Antigen beteiligt. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig verteilt über die variablen Domänen von Antikörpern. Sie ist konzentriert in drei

Segmenten, sogenannte die Komplementarität bestimmende Re- * gionen (CDRs) Oder hypervariable Regionen, die sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette und der schweren Kette vorkommen. Die starker konservierten Anteile der variablen Domänen werden als sogenanntes "Framework" (FR) bezeichnet. Die variblen Domänen der nativen schweren und leichten Ket-ten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die im wesentlichen eine ß-Faltblattkonfiguration annehmen, verbunden mit drei CDRs, die Schleifen bilden, die mit der ß-Faltblattstruktur verbunden und in manchen Fallen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden in enger Nachbarschaft zusammen-gehalten durch die FR-Regionen, und mit den CDRs der anderen Kette tragen sie zu der Bildung der Antigenbindungsstelle des Antikörpers bei (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Die konstanten Doraänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen einbezogen, aber sie zeigen verschiedene Effektorfunktionen, wie die Teilnahme des Antikörpers in der antikörperabhängi-gen zellulären Toxizität.

Papainspaltung von Antikörpern erzeugt zwei identische Anti-gen-bindende Fragmente, genannt "Fab"-Fragmente, wobei jedes eine einzelne Antigenbindungsstelle besitzt, und ein restli-ches "Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit wiedergibt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung erzeugt ein F (ab ' )2-Fragment, das zwei Antigenbindungsstellen enthält, und das noch Antigen vernetzen kann. "Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollstän-dige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Domäne ein .r schweren und einer leichten Kette in enger, nichkova-lenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt Wechsel-wirkung der CDRs einer jeden variblen Domäne miteinander, urn eine Antigenbindungsstelle auf der Oberfläche des VH-VL-Di-meren zu definiëren. In kollektiver Weise verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Antigenbindungsspezifität. Je-doch besitzt selbst eine einzige variable Domäne (Oder die Hälfte eines Fv, umfassend nur drei CDRs, die spezifisch für ein Antigen sind), die Fähigkeit, ein Antigen zu erkennen und zu binden, obwohl nur mit geringerer Affinität als die vollständige Bindungsstelle.

Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CHI) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz von einigen wenigen Resten an den Carboxyterminus der CHI-Domäne der schweren Kette, ein- schließlich ein oder mehrere Cysteine der Hinge-Region des Antikörpers. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', bei dem der bzw. die Cysteinrest(e) der konstanten Domäne eine freie Thiolgruppe trägt. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich hergestellt als Paare von Fab'-Fragmenten, die Hinge-Cysteine zwischen sich haben. Andere chemische Kupplungsvarianten von Antikörperfragmenten sind eben-falls bekannt.

Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) von einer beliebigen Vertebratenart. können einer von zwei deut-lich unterschiedlichen Arten, genannt Kappa und Lambda (λ), zugewiesen werden, basierend auf den Aminosäuresequenzen der konstanten Domänen.

Abhängig von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ih-rer schweren Ketten können Immunglobuline verschieder.en Klassen zugeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen an Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und einige davon können waiter unterteilt werden in Subklassen (Isotypen), z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Domänen der schweren Kette, die den verschiedenen

Klassen der Immunglobuline entsprechen, werden a, Delta, Epsilon, γ und μ genannt. Die Untereinheitstukturen und die dreidimensionalen Konfigurationen der verschiedenen Klassen der Immunglobuline sind gut bekannt.

Der Begriff "Antikörper" wird in dem breitesten Sinn verwen-det und betrifft insbesondere einzelne monoklonale Antikörper (einschließlich Agonist- und Antagonistantikörper), An-tikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, wie auch Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')2 und Fv), Solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen. "Monoklonaler Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, erhalten aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern, d.h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfaßt, sind identisch außer für möglicherweise auftretende natürliche Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikör- per sind hochspezifisch und gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet. Weiterhin, in Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparationen, die typischerweise verschiedene Antikörper enthalten, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, ist jeder monoklo-nale Antikörper gegen eine einzige Déterminante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft insofern als sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden und nicht durch andere Immunglobuline kontaminiert sind. Der modifizierende Begriff "monoklonal" deutet den Charakter des Antikörpers an, daß dieser aus einer im wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten ist, und es bedeutet nicht, daß die Herstellung des Antikörpers ein spezielles Verfahren verlangt. Zum Beispiel können die gemäß der vorliegenden Er-findung zu verwendenden monoklonalen Antikörper hergestellt werden nach dem Hybridomaverfahren, das zuerst beschrieben wurde von Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975), Oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch ist mit oder ho molog ist zu den entsprechenden Seguenzen in Antikörpern, die von einer speziellen Art oder zu einer speziellen Anti-körperklasse oder Subklasse gehören, während der Rest der Kette(n) identisch ist oder homolog ist zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von anderen Arten erhalten oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Subklasse gehören, wie auch Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 4,816,567 (Cabilly et a.); und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]. "Humanisierte" Formen von nichthumanen (z.B. Mäuse) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder

Fragmente davon (wie Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere An-tigen-bindende Subsequenzen der Antikôrper), die eine minimale Sequenz enthalten, die von einem nichthumanen Immunglo-bulin stammt. Meistens sind humanisierte Antikôrper humane Immùnglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste einer die Komplementaritât bestimmenden Region (CDR) des Empfangers ersetzt sind durch Reste einer CDR aus einer nichthuma- ' nen Spezies (Donorantikörper) wie einer Maus, Ratte oder Kanninchen, die die gewünschte Spezifität, Affinitât und Ka-pazitât besitzt. In einigen Fâllen werden Fv-Framework-Reste des humanen Immunglobulins ersetzt durch entsprechende nichthumane Reste. Weiterhin kann ein humanisierter Antikôrper Reste umfassen, die weder in dem Empfängerantikörper noch in dem eingebrachten CDR oder der Framework-Sequenzen vorkommen. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Leistungsfâhigkeit des Antikôrpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im allgemeinen wird der humanisierte Antikôrper im wesentlichen den gesamten Anteil mindestens einer und typischerweise von zwei variablen Domânen umfassen, in denen die gesamte oder im wesentlichen die gesamten CDR-Regionen denen eines nichthumanen Immunglobulins entsprechen, und· die vollstandige oder im wesentlichen vollstândige FR-Regionen sind die aus einer humanen Immunglobulinkonsensussequenz.

Der humanisierte Antikôrper wird optimalerweise mindestens auch einen Anteil einer konstanten Region eines Immunglobulins (Fc) umfassen, typischerweise den eines humanen Immunglobulins. Für weitere Einzelheiten siehe: Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988] und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 [1992]). "Nicht-immunogen im Menschen" bedeutet, daß beim Inkontakt-bringen des Polypeptids in einem pharmazeutisch vertrâgli-chen Trager und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen kein Zustand der Sensi-bilisierung oder Resistenz gegen das Polypeptid bei der zweiten Verabreichung des Polypeptids nach einer geeigneten Latenzperiode (z.B. 8 bis 14 Tage) nachweisbar ist. II. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind ira wesentlichen ein homogènes Polypeptid bzw. Polypeptide, bezeichnet als mpl-Ligand(en) oder Thrombopoietin (TPO) , die die Eigenschaft des Bindans an mpl, einem Mitglied der Rezeptorzyto-kinsuperfamilie, besitzen, und die die biologische Eigenschaft des Stimulierens des Einbaus von markierten Nukleoti-den (3H-Thym.idin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zel-len, transfektiert mit humanem mpl P, besitzen. Bevorzugtere mpl-Ligand(en) sind isolierte Sâugerprotein(e) mit hämato-poetischer, insbesondere megakaryozytopoetischer oder throm-bozytopoetischer Aktivität - nämlich sie können die Proliferation, Reifung und/oder Differenzierung von unreifen Mega-karyozyten oder deren Vorläufer in die reife Plättchen-pro-duzierende Form stimulieren. Am meisten bevorzugte erfin- dungsgeraäße Polypeptide sind humane mpl-Ligand(en) ein-schließlich Fragmente davon mit hämatopoetischer, megakaryozytopoetischer oder thrombopoetischer Aktivität. Gegebenen-falls können diese humane mpl-Ligand(en) keine Glycosylie-rung aufweisen. Andere bevorzugte humane mpl-Liganden sind die "EPO-Domäne" von hML, bezeichnet als hMLis3 oder I1TOP153, eine verkürzte Form von hML, bezeichnet als hML245 oder hTP0245, und das reife vollständige Polypeptid mit der Ami-nosäuresequenz, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), bezeichnet als hML, hML332 oder hTP0332/ und die biologisch ak-tive substituierte Variante- hML(R153A, R154A).

Gegebenenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind biologisch oder immunologisch aktive mpl-Ligandenvarianten ausgewählt aus hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML und pML2 .

Gegebenenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide sind biologisch aktive mpl-Ligandenvariante(n), die eine Ami-nosauresequenz besitzen mit mindestens 70% Aminosäurese-quenzidentität mit dem humanen mpl-Liganden (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), dem Mäuse-mpl-Liganden (siehe Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), dem rekombinanten Schweine-mpI-Liganden (siehe Fig. 19 [SEQ ID NO: 18]) oder dem Schweine-mpl-Ligan-den isoliert aus aplastischem Schweineplasma, vorzugsweise mindestens 75%, noch bevorzugter mindestens 80%, noch bevor-zugter mindestens 85%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Identität.

Der aus aplastischem Schweineplasma isolierte mpI-Ligand be-sitzt die folgenden Eigenschaften: (1) der teilweise gereinigte Ligand eluiert von einem Gel-filtrationssäulenlauf entweder in PBS, PBS enthaltend 0,1% SDS Oder PBS enthaltend 4M MgCl2 mit Mr von 60000-70000; (2) die Ligandenaktivität wird zerstört durch Pronase; (3) der Ligand ist stabil bis zu dem niedrigen pH (2,5), SDS bis zu 0,1% und 2M Harnstoff; (4) der Ligand ist ein Glycoprotein, basierend auf seiner Bindung an verschiedene Lectinsäulen; (5) der hochgereinigte Ligand eluierr aus nichtreduzierender SDS-PAGE mit einem Molekulargewicht von 25000-35000. Geringere Mengen an Aktivität eluieren auch mit Molekulargewicht von 18000-22000 und 60000; (6) der hochgereinigte Ligand wird auf reduzierender SDS-PAGE als ein Doublet aufgetrennt mit Mr von 28000 und 31000; (7) die aminoterminale Sequenz der 18000-22000, 28000 und 31000-Banden ist die gleiche - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); und (8) der Ligand bindet an und eluiert von den folgenden Affi-nitätssäulen

Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S,

Lentil-Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose,

Con A-Sepharose,

Ether-650m-Toyopearl,

Butyl-650m-Toyopearl,

Phenyl-650m-Toyopearl und Phenyl-Sepharose.

Bevorzugtere mpl -Ligandenpolypeptide sind solche, die ko- cjïert werden durch die humane genomische oder cDNA, mit einer Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 beschrieben (SEQ ID NO: 1).

Weitere bevorzugte natürlich vorkommende biologisch aktive inpl- Ligandenpolypeptide gemäß der Erf indung umf assen Präpro- mpl-Ligand, Pro-mpl-Ligand, reifer mpI-Ligand, mpl-Liganden-fragmente und Glycosylierungsvarianten davon.

Noch weitere bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide umfassen mpl-Ligandensequenzvarianten und Chimären. Üblicherweise sind bevorzugte mpl-Ligandensequenzvarianten und Chimären biologisch aktive mpl-Ligandenvarianten, die eine Aminosäu-resequenz besitzen mit mindestens 70% Aminosäuresequenziden-tität mit dem humanen mpl-Liganden Oder dem mpl-Liganden isoliert aus aplastischem Schweineplasma, vorzugsweise mit mindestens 75%, bevorzugter mit mindestens 80%, noch bevor- zugter mit mindestens 85%, noch bevorzugter mit mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mit mindestens 95% Identi-tät. Eine beispielhaft bevorzugte mpl-Ligandenvariante ist eine N-terminale-Domane-hML-Variante (bezeichnet als die "EPO-Domäne" wegen ihrer Sequenzhomologie zu Erythropoietin) . Die bevorzugte hML EPO-Domäne umfaßt ungefähr die er-sten 153 Aminosäurereste von reifem hML und wird als hMLi53 bezeichnet. Eine gegebenenfalls bevorzugte hML-Sequenzvari-ante umfaßt eine, bei der einer oder mehrere der basischen Oder dibasischen Aminosäurerest(e) in der C-terminalen Do-mane substituiert ist mit einem nichtbasischen Aminosäure-rest(en) (z.B. hydrophobe, neutrale, saure, aromatische,

Gly, Pro und ähnliche). Eine bevorzugte hML-C-terminale-Do-mäne-Sequenzvariante umfaßt eine, bei der Arg-Reste 153 und 154 ersetzt sind mit Ala-Resten. Diese Variante wird bezeichnet als hML332(R153A, R154A). Eine alternativ bevorzugte hML-Variante umfaßt entweder hML332 oder hML153, bei der die Aminosäurereste 111-114 (QLPP oder LPPQ) deletiert sind oder ersetzt sind mit einer unterschiedlichen Tetrapeptidsequenz (z.B. AGAG oder ähnliches). Die zuvorerwähnten Deletionsmu- tanten werden als Ä4hML332 Oder A4hML153 bezeichnet.

Eine bevorzugte Chimäre ist eine Fusion zwischen dem mpl-Li-ganden oder einem Fragment (unten definiert) davon mit einem heterologen Polypeptid oder einem Fragment davon. Zum Bei-spiel kann hMLis3 fusioniert werden an ein IgG-Fragment, um dessen Serum-Halbwertszeit zu verbessern oder an IL-3, G-CSF oder EPO, um ein Molekül zu erzeugen mit gesteigerter throm-bopoetischer Oder chimärer hämatopoetischer Aktivität.

Eine alternative bevorzugte humane mpl-Ligandenchimäre ist eine "ML-EPO-Domäne-Chimäre", die besteht aus den N-termina-len 153 bis 157 hML-Resten, substituiert mit einem oder meh-reren, aber nicht allen, Resten von humanem EPO, ungefähr ausgerichtet wie in Fig. 10 (SEQ ID NO: 7). Bei dieser Aus-filhrungsform ist die hML-Chimäre ungefähr 153-166 Reste lang, in der einzelne oder Blöcke von Resten aus der humanen EPO-Sequenz zugefügt oder Reste in der hML-Sequenz substitu-ieren an -Positionen entsprechend der Ausrichtung, wie in Fig. 10 (SEQ ID NO: 6) gezeigt. Beispielhafte, blockartige Sequenzeinschiibe in den N-terminalen Anteil von hML umfassen eine oder mehrere der N-Glycosylierungsstellen an Positionen (EPO) 24-27, 38-40 und 83-85; eine Oder mehrere der vier vorhergesagten amphipatischen a-helikalen Bündel an Positionen (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 und 132-152; und andere stark konservierte Regionen einschließlich die N-terminalen und C-terminalen Regionen und Restepositionen (EPO) 44-52 (siehe z.B. Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] und Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Es ist of-fensichtlich, daß diese "ML-EPO-Domäne-Chimäre" gemischte thrdmbopoetische, erythropoetische (TEPO) biologische Akti-vitât besitzt.

Andere bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide umfassen mpl-Ligandenfragmente mit einer zusammenhangenden Sequenz von mindestens 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosâureresten, die .identisch sind zu den Sequenzen des mpl-Liganden, isoliert aus aplastischem Schweineplasma, oder dem humanen mpl-Liganden, wie hierin beschrieben. (siehe Tabelle 14, Beispiel 24). Ein bevorzugtes mpl-Ligandenfragment ist humanes ML[1-X], worin X ist 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 oder 245 (siehe Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) für die Sequenz der Reste 1-X). Andere bevorzugte mpl-Ligandenfragmente umfassen solche, die hergestellt werden als das Ergebnis einer chemischen oder enzymatischen Hydrolyse oder einer Spaltung des gereinigten Liganden.

Andere bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung sind ein Verfahren zum Reinigen von mpl-Ligandenmolekülen, umfas-send das Inkontaktbringen eines mpl-Ligandenausgangsmateri-als enthaltend die mpl-Ligandenmoleküle mit einem immobili-sierten Rezeptorpolypeptid, insbesondere mit mpl oder einem mpl-Fusionspolypeptid, unter Bedingungen, unter denen die zu reinigenden mpl-Ligandenmolekiile selektiv an das immobili-sierte Rezeptorpolypeptid adsorbiert werden, Waschen des im-mobilisierten Trägers, urn nicht-adsorbiertes Material zu entfernen, und Eluieren des zu reinigenden Moleküls von dem immobiliserten Rezeptorpolypeptid mit einem Elutionspuffer. Das Ausgangsmaterial, enthaltend den mpl-Liganden, kann ein Plasma sein, wobei der immobilisierte Rezeptor vorzugsweise eine mpl-IgG-Fusion darstellt.

Als Alternative ist das Ausgangsmaterial, enthaltend den mpl-Liganden, eine rekombinante Zellkultur, wobei die Kon-zentration an mpl-Ligand sowohl in dem Kulturmedium wie auch in den Zellysaten im allgemeinen höher ist als im Plasma Oder anderen natürlichen Ausgangsmaterialien. In diesem Fall wird die oben beschriebene mpl-IgG-Immunaffinitätsmethode immer noch nützlich sein, aber sie ist normalerweise nicht erforderlich, und traditiopellere Proteinreinigungsverfah-ren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind,. können an-gewendet werden. Kurz ausgeführt, das bevorzugte Reinigungs-verfahren zum Bereitstellen von im wesentlichen homogenen mpl-Liganden umfaßt: Entfernen von partikulären Trümmern, entweder Wirtszellen oder lysierten Fragmenten, durch z.B. Zentrifugation oder Ultrafiltration; gegebenenfalls kann das Protein konzentriert werden mit einem gewerblich erhältli-chen Proteinkonzentrierungsfilter; gefolgt von Abtrennen des Liganden von anderen Verunreinigungen durch einen oder meh-rere Schritte ausgewählt aus: Immunaffinität, Ionenaustausch (z.B. DEAE oder Materialien enthaltend Carboxymethyl- oder Sulfopropylgruppen), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil-Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether-Toypearl, Butyl-Toypearl, Phenyl-Toypearl, Protein-A-Sepharose, SDS-PAGE, Umkehrphaserr-HPLC (z.B. Silicagel mit anhängigen aliphatischen Gruppen) oder Sephadex-Molekularsieb- oder Größenausschlußchromatographie und Ethanol- oder Ammoniumsulfatfällung. Ein- Proteatinhibi-tor, wie Methylsulfonylfluorid (PMSF), kann in jedem der zu- vorgenannten Schritte enthalten sein, um die Proteolyse zu hemmen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Antikörper bereit, der an den mpl-Liganden binden kann. Ein bevorzugter Anti-inpl-Ligandenantikörper ist monoklonal (Kohier and Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Band 13, Elsevier Science Publisrers, Amsterdam [1985]; und Huse et al., Science, 246:1275-1281 [1989]). Ein bevorzugter isolierter Anti-mpl-Liganden-Antikörper ist einer, der an den mpl-Liganden mit einer Affinität von mindestens unge-fähr 106 1/Mol bindet. Bevorzrgter bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens ungefähr 10 1/Mol. Am bevor-zugtesten ist ein Antikörper gegen den ιαρί -Liganden, der eine der oben beschriebenen Effektorfunktionen besitzt. Der isolierte Antikörper, der an den rapl-Liganden binden kann, kann gegebenenfalls an ein zweites Polypeptid fusioniert werden, und der Antikörper oder das Fusionsprodukt kann ver-wendet werden zum Isolieren und Reinigen von mpl-Ligand aus einem Ausgangsmaterial, wie oben beschrieben, zum Immobili-sieren von mpl -Polypeptid. Bei einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Nachweisen des mpl-Liganden in vitro oder in vivo, um- fassend Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer Analysen-probe, insbesondere einer Serumanalysenprobe, von der ange-nommen wird, daß sie den Liganden enthält, und dessen Nach-weis, falls eine Bindung erfolgt ist.

Bei einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das den mpI-Liganden oder Fragmente davon kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül markiert sein kann oder nicht markiert ist mit einem nachweisbaren Rest, und es wird ein Nuklein-säuremolekül bereitgestellt mit einer Sequenz, die komple- mentär ist zu oder unter stringenten Bedingungen oder mode- rat stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Sequenz besitzt, die für einen mpl-Li-ganden kodiert. Eine bevorzugte mpl-Ligandennukleinsäure ist RNA Oder DNA, die einen biologisch aktiven mpl-Liganden kodiert, der mindestens 75% Sequenzidentität, bevorzugter min-destens 80%, noch bevorzugter mindestens 85% und noch mehr bevorzugt 90% und ganz besonders bevorzugt 95% Sequenziden-tität mit dem humanen mpl-Liganden zeigt. Stärker bevorzugte isolierte Nukleinsäuremoleküle sind DNA-Sequenzen, die biologisch aktiven mpl-Liganden kodieren, ausgewählt aus: (a) DNA, basierend auf der kodierenden Region eines Säuger-mpl-Ligandengens (z.B. DNA umfassend die Nukleotidsequenz, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), oder ein Fragment davon); (b) DNA, die an eine DNA aus (a) hybridisieren kann unter zumindest moderat stringenten Bedingungen; und (c) DNA, die gegeniiber einer DNA wie definiert in (a) Oder (b) degene-riert ist, wobei dies aus der Degeneration des genetischen Codes herrührt. Es wird hier davon ausgegangen, daß die hierin beschriebenen neuen mpl-Liganden Mitglieder einer Fa-milien von Liganden oder Zytokinen sind, die eine geeignete Sequenzidentität aufweisen, so daß ihre DNA mit der DNA aus Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) (oder der komplementären Sequenz oder Fragmenten davon) unter geringen bis moderat stringenten Bedingungen hybridisieren kann. Somit umfaßt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung DNA, die unter geringen bis moderat stringenten Bedingungen mit DNA hybridisiert, die die mpl-Ligandenpolypeptide kodiert.

Bei einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausfüh-rungsform ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA, die den mpl-Liganden kodiert und die weiterhin einen replizierbaren Vektor umfaßt, in dem die cDNA funktionsfähig verknüpft ist mit Kontrollsequenzen, die von einem Wirt erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert ist. Dieser Aspekt umfaßt weiterhin Wirtszellen, die mit dem Vektor transformiert sind, und ein Verfahren unter Verwendung der cDNA zum Bewir-ken der Herstellung eines mpl-Liganden, umfassend Exprimie- ren der cDNA, die den mpI-Liganden kodiert, in einer Kultur der transformierten Wirtszellen und Gewinnen des mpl-Ligan-den aus der Wirtszellkultur. Der auf diese Weise herge-stellte mpl-Ligand ist vorzugsweise im wesentlichen ein homogener humaner mpl-Ligand. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Herstellen des mpl-Liganden sind Ovarienzellen des chinesi schen Hamsters (CHO).

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes Verfahren zum Behandeln eines Säugers mit einer immunologischen oder häma-topoetischen Störung, insbesondere von Thrombozytopenie, um-fassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines mpl-Liganden an den Säuger. Gegebenenfalls wird der mpl-Ligand verabraicht in Kombination mit einem Zytokin, insbesondere einem Kolonie-stimulierenden Faktor Oder Interleukin. Bevorzugte Kolonie-stimulierende Faktoren oder Interleukine umfassen: kit-Ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 oder IL-11. III. Herstellungsverfahren

Von der Plättchenproduktion ist lange Zeit durch viele Auto-ren angenommen worden, daß sie durch mehrere Abstammungsli-nien-spezifische humorale Faktoren kontrolliert wird. Es ist postuliert worden, daß zwei bestimmte Zytokinaktivitäten, bezeichnet als Megakaryozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (meg-CSF) und Thrombopoietin, die Megakaryozytopoese und Thrombopoese regulieren (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; und Gordon et al., Blood, 80:302-307 [,1992]). Nach dieser Hypothese stimuliert meg-CSF die Proliferation von Vorläufermegakaryozyten, während Thrombopoietin primär die Reifung von differenzierteren Zeilen und schließlich die Plättchenfreisetzung beeinflußt. Seit den 60er Jahren ist die Induktion und das Auftreten von meg-CSF- und Thrombo- poietinaktivitäten in dem Plasma, Serum und Harn von Tieren und Menschen, folgend thrombocytopenieartigen Episoden, gut dokumentiert worden (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol.

Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et al., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20:354-360 [1922]; und Hegyi et al.,

Int. J. Cell Cloning, 8:236-244 [1990]). Von diesen Aktivi-tâten ist berichtet worden, daß sie spezifisch sind für eine Abstammungslinie und sich von bekannten Zytokinen unter-scheiden (Hill R.J. et al., Blood 80:346 [1992]; Erickson-Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84:197-203 [1993]; Straneva J.E. et al., Exp. Hematol. 20:4750 [1992]; und Tsukada J. et al., Blood 81:866-867 [1993]). Versuche zum Reinigen von meg-CSF oder Thrombopoietin aus Thrombozyto-penieplasma oder -harn sind bisher nicht erfolgreich gewe-sen. '

In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Beobachtungen betreffend Thrombozytopenieplasma haben wir gefunden, daß aplastisches Schweineplasma (APP), erhalten von bestrahlten Schweinen, die humane Megakaryozytopoese in vitro stimu-liert. Wir haben gefunden, daß diese stimulierende Aktivitât unterdrückt wird durch die lösliche extrazellulâre Domane von c-mpl, wobei dies APP als ein môgliches Ausgangsmaterial für den vermeintlichen mpl-Liganden (ML) bestâtigt. Wir haben jetzt erfolgreich den mpl-Liganden aus APP isoliert, und die Aminosâuresequenzinformation wurde verwendet zum Isolie-ren von Mâuse-, Schweine- und humaner ML-cDNA. Diese MLs be-sitzen eine Sequenzhomologie zu Erythropoietin und besitzen meg-CSF- und Thrombopoietin-ähnliche Aktivitäten. 1. Reinigung und Identifizierung des mpl-Liganden aus Plasma

Wie'oben ausgeführt, ist von aplastischem Plasma aus einer Vielzahl von Arten berichtet worden, daß es Aktivitäten ent-hält, die die Hämatopoese in vivo stimuliert, jedoch ist zu-vor kein hämatopoetisch stimulierender Faktor, isoliert aus Plasma, berichtet worden. Ein Ausgangsmaterial für aplasti-sches Plasma ist das, erhalten aus bestrahlten Schweinen.

Das aplastische Schweineplasma (APP) stimuliert die Human-hämatopoese in vitro. Um zu ermitteln, ob APP den mp2~Ligan~ den enthält, wurde dessen Effekt untersucht durch Messen des 3H-Thymidin-Einbaus in Ba/F3-Zellen, transfektiert mit huma-nem mpl P (Ba/F3-mp2), gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Verfah-ren. APP stimulierte den 3H-Thymidin~Einbau in Ba/F3-mpl-Zellen, aber nicht in Ba/F3-Kontrollzellen (d.h., nicht mit humanem mpl P transfektierte Zeilen). Weiterhin wurde eine solche Aktivität nicht beobachtet in normalem Schweineplasma. Diese Ergebnisse deuten an, daß APP einen Faktor oder Faktoren enthält, die ein prolifératives Signal über den mpl-Rezeptor erzeugen, und der bzw. die deshalb den na-türlichen Liganden für diesen Rezeptor darstellen könnten. Dies wurde weiter bestätigt durch den Befund, daß die Be-handlung von APP mit löslichem mpl-IgG die stimulierenden Effekte von APP auf Ba/F3-jnpl-Zellen blockierte.

Die Aktivität in APP schien ein Protein zu sein, da Pronase, DTT oder'Warme die Aktivität in APP zerstört (Fig. 3). Die Aktivität war auch nicht dialysierbar. Die Aktivität war jedoch stabil bei niedrigem pH (pH 2,5 für 2 Std.) und band an und eluierte von mehreren Lektin-Affinitätssäulen, wobei dies anzeigt, daß es ein Glycoprotein ist. Um weiterhin die Struktur und Identität dieser Aktivität aufzuklären wurde es affinitätsgereinigt aus APP unter Verwendung einer mpl-IgG-Chimären. APP wurde gemaß dein Protokoll, wie in Beispielen 1 und 2 ausgeführt, behandelt. Kurz ausgeführt, der mpl-Ligand wurde gereinigt unter Verwendung von hydrophober-Wechselwirkungs-ehromatographie (HIC), immobilisierter-Farbstoff-Chromato-graphie und mpl-Affinitätschromatographie. Das Gewinnen der Aktivität aus jedeiti Schritt ist in Fig. 4 gezeigt, und der Aufreinigungsfaktor ist in Tabelle 1 angegeben. Die gesamte Ausbeute an Aktivität über die mpl-hffinitätssäule betrug ungefähr 10%. Die Fraktion mit dem Aktivitätsgipfel (F6) von der mpl-Affinitätssäule besitzt eine abgeschätzte spezifi-sche Aktivität von 9,8 x 106 Einheiten/mg. Die Gesamtaufrai-nigung aus 5 Litern APP betrug ungefähr das 4 x 106-fache (0,8 Einheiten/mg auf 3,3 x 106 Einheiten/mg) mit einer 83 x 106-fachen Verringerung an Protein (250 g auf 3 pg). Wir be-rechneten die spezifische Aktivität des Liganden, eluiert von der mpl- Af f mitätssäule, als rund 3 x 10 Einheiten/mg. TABELLE 1

Reinigung von mpl-Ligand

Protein wurde ermittelt mit dem Bradford-Assay. Die Pro- teinkonzentration der eluierten mpl-Fraktionen 5-7 wurde berechnet basierend auf der Färbeintensität eines sil- bergefärbten SDS-Gels. Eine Einheit wird definiert als diejenige, die 50% der maximalen Stimulierung der Ba/F3 mpl-Zellproliferation hervorruft.

Die Analyse der eluierten Fraktionen von der mpl-Af f mitats-säule durch SDS-PAGE (4-20%, Novex-Gel) durchgeführt unter reduzierenden Bedingungen, zeigte die Anwesenheit von mehre-ren Proteïnen (Fig. 5). Proteine, die nach Silberfärbung die stärkste Intensität ergaben, wurden aufgelost mit einem apparenten Molekulargewicht (Mr) von 66000, 55000, 30000, 28000 und 18000-22000. Zum Ermitreln, welches dieser Proteine die Proliferation von Ba/F3-mpl-Zellkulturen stimu-lierte, wurden die Proteine aus dem Gel eluiert, wie be-schrieben in Beispiel 2.

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, daß die meiste Aktivität aus einem Gelstreifen eluiert wurde, der Proteine mit Mr 28000-32000 enthielt, wobei geringere Aktivität von der 18000-22000-Region des Gels eluierte (Fig. 6). Die ein zigen sichtbaren Proteine in diesen Regionen besaßen Mr von 30000, 28000 und 18000 bis 22000. Zum Identifizieren und zum Erhalten der Proteinsequenz dieser Proteine, die in diesem Bereich des Gels aufgetrennt wurden (d'.h., Banden bei 30, 28 und 18-22 kDa), wurden diese drei Proteine nach einem Elek-troblot-Verfahren auf PVDF übertragen und sequenziert wie m Beispiel 3 beschrieben. Die erhaltenen aminoterminalen Se-quenzen sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

Aminoterminale Sequenzen des mpl-Liganden

Computergestützte Analysen zeigten, daß diese Aminosäure-sequenzen neu waren. Da alle drei Sequenzen gleich waren, wurde angenommen, daß die 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteine verwandt waren und möglicherweise verschiedene For-itien des gleichen Proteins dar steilten. Weiterhin war dieses Protein bzw. Proteine ein wahrscheinlicher Kandidat für den natürlichen mpl~Liganden, da die Aktivität in der gleichen Region (28000-32000) auf einem 4-20%-Gel der SDS-PAGE aufge-trennt wurde. Weiterhin wanderte der teilweise gereinigte Ligand mit einem Mr von 17000 bis 30000, wenn er einer Gel-filtrat ionschromatographie unter Verwendung einer Superose 12 (Pharmacia)-Säule unterzogen wurde. Es wird angenommen, daß die verschiedenen Mr-Formen des Liganden das Ergebnis einer Proteolyse oder von Glvcosylierungsunterschieden oder von anderen post- oder prätranslationalen Modifikationen sind.

Wie früher beschrieben unterdrückte humane Antisense-mpl-RNA die Megakaryozytopoese in humanen Knochenmarkskulturen, die angereichert waren mit CD 34+-Vorläuferzellen, ohne die Dif-ferenzierung von anderen hämatopoetischen Abstammungszelli- nien zu beeinflussen (Methia et al., siehe oben). Dieses Ergebnis legt nahe, daß der mpl-Rezeptor eine Rolle spielen könnte bei der Differenzierung und Proliferation von Mega-karyozyten in vitro. Um die Rolle des mpl-Liganden bei der Megakaryozytopoese weiter aufzuklären, wurden die Effekte von APP und an mpl-Ligand verarmtem APP auf die humane in- vitro-Megakaryozytopoese verglichen. Der Effekt von APP auf die humane Megakaryozytopoese wurde ermittelt mit Hilfe einer Modifikation des Fliissigsuspension-Megakaryozytopoese-Assays, beschrieben in Beispiel 4. Bei diesem Assay wurden humane periphere Stammzellen (PSC) mit APP vor und nach mpl-IgG-Affinitatschromatographie behandelt. Die GPIIbIIIa-stl-mulierung der Megakaryozytopoese wurde quantifiziert mit einem 125J-Anti-IIbIIIa-Antikörper (Fig. 7). Fig. 7 zeigt, daß 10% APP eine ungefähr dreifache Stimulierung hervorrief, während APP, das an mpl-Ligand verarmt war, keinen Effekt besaß. Signifikanterweise induzierte das an mpl-Ligand ver-armte APP nicht die Proliferation der Ba/F3-mpl-Zellen.

Bei einem weiteren Experiment neutralisierte lösliches huma-nes mpl-IgG, zugesetzt an Tagen 0, 2 und 4, zu Kuituren ent-haltend 10% APP, die stimulierenden Effekte von APP auf die humane Megakaryozytopoese (Fig. 8). Diese Ergebnisse zeigen an, daß der mpl-Ligand eine Rolle bei der Regulierung von humaner Megakaryozytopoese spielt, und deshalb kann er nütz-lich sein bei der Behandlung von Thrombozytopenie. 2. Molekulares Klonieren des mpl-Liganden

Basierend auf den aminoterminalen Aminosäuresequenzen, er-halten von den 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteinen (siehe Tabelle 2 oben), wurden zwei degenerierte Oligo-nukleotid-Primer-Pools entworfen und verwendet zum Vermehren der genomischen Schweine-DNA durch PCR. Es wurde davon aus-gegangen, daß, falls die aminoterminale Aminosäuresequenz durch ein einziges Exon kodiert wird, dann das richtige PCR-Produkt als 69 Basenpaar lang zu erwarten ist. Ein DNA-Frag-ment dieser Größe wurde gefunder, und subkloniert in pGEMT. Die Sequenzen der Oligonukleotid-PCR-Primer und der drei er-haltenen Klone sind in Beispiel 5 gegeben. Die Aminosâure-sequenz (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) des zwischen den PCR-Primern kodierten Peptids war identisch zu der durch das aminoterminale-Protein-Sequenzieren des Schweineliganden er-haltenen Sequenz (siehe Reste 9-17 für die 28- und 30 kDa-Schweineproteinsequenzen oben).

Ein synthetisches Oligonukleotid, basierend auf der Sequenz des PCR-Fragments, wurde verwendet, urn eine humane genomi-sche DNA-Bank abzusuchen. Ein 45-mer-Oligonukleotid, be-zeichnet pR45, wurde entworfen und synthetisiert basierend auf der Sequenz des PCR-Fragments. Dieses Oligonukleotid be-saß die folgende Sequenz:

TCG 3' (SEQ ID NO : 34)

Das Desoxyoligonukleotid wurde zum Absuchen einer humanen genomischen DNA-Bank in Xgeml2 unter niedrig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet, gemäß Bei-spiel 6. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt und durch Restriktionskartierung und Southern-Blotten analy-siert. Ein 390 bp EcoRI-Xbal-Fragment, das an das 45-mer hy-bridisierte, wurde subkloniert in pBluescript SK-. DNA-Se-quenzierung dieses Klons bestätigte, daß DNA isoliert worden war, die das humane Homologe zu dem Schweine-mpl-Liganden kodierte. Die humane DNA-Sequenz und die gefolgerte Amino-säuresequenz sind in Fig. 9 gezeigt (SEQ ID NO: 3 & 4). Die vorhergesagten Positionen der Introns in der genomischen Sequenz sind ebenfalls durch Pfeile angegeben, und sie definiëren ein vermutetes Exon ("Exon 3").

Basierend auf der humanen "Exon 3"-Sequenz (Beispiel 6) wurden Oligonukleotide synthetisiert, die den 3'- und 5'-Enden der Exon-Sequenz entsprechen. Diese zwei Primer wurden verwendet in PCR-Reaktionen unter Verwendung einer Matrizen-cDNA, hergestellt aus verschiedenen humanen Geweben. Die er- wartete Größe des richtigen PCR-Produkts betrug 140 bp. Nach Analyse der PCR-Produkte auf einem 12%-Polyacrylamidgel wurde ein DNA-Fragment der erwarteten Größe in cDNA-Banken nachgewiesen, die hergestellt worden waren aus humaner Niere von Erwachsenen, fötaien 293-Nierenzellen und cDNA, hergestellt aus humaner fötaler Leber.

Eine cDNA-Bank aus fötaler Leber (7 x 106 Klone) in Lambda-DR2 wurde als nächstes abgesucht mit dem gleichen 45-mer Oligonukleotid, das verwendet wurde zum Absuchen der humanen genomischen Bank, und die cDNA-Bank aus fötaler Leber wurde unter niedrig stringenten Hybridisierungsbedingungen abgesucht. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt, und die Insertgröße wurde ermittelt durch PCR. Ein Klon mit einem 1,8 kb-Insert wurde ausgewählt für die weitere Analyse. Unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Ver-fahrens wurde die Nukleotid- und die gefolgerte Aminosäure-sequenz des humanen mpl-Liganden (hML) erhalten. Diese Se-quenzen sind in Fig. 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1 & 2). 3. struktur des humanen mpl-Liganden (hML)

Die humane mpl-Liganden (hML)-cDNA-Sequenz (Fig. 1 [SEQ ID NO; 2]) umfaßt 1774 Nukleotide gefolgt von einem Poly(A)-Schwanz. Sie enthält 215 Nukleotide von 5'-nicht- transla-tierter Sequenz und eine 3'-nicht translatierte Region von 498 Nukleotiden. Das angenommene Startcodon bei Nukleotidpo-sition (216-218) liegt innerhalb einer Konsensussequenz, die für die Initiation der eukaryotischen Translation bevorzugt ist. Der offene Leseraster ist 1059 Nukleotide lang und ko-diert für ein 353 Aminosäurereste langes Polypeptid, beginnend an Nukleotidposition 220. Der N-terminus der vorherge-sagten Aminosäuresequenz ist stark hydrophob und entspricht vermutlich einem Signalpeptid. Die Computeranalyse der vor-hergesagten Aminosäuresequenz (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) weist auf eine potentielle Spaltstelle für die Signalpeptidase zwischen Resten 21 und 22 hin. Die Spaltung an dieser Position würde ein reifes Polypeptid von 332 Aminosäureresten erzeugen, beginnend mit der aminoterminalen Sequenz, erhalten von dem mpl-Liganden, gereinigt aus Schweineplasma. Das vorhergesagte nicht glyco-sylierte Molekulargewicht des 332 Aminosäurereste langen Liganden beträgt ungefähr 38 kDa. Es gibt 6 potentielle N-Glycosylierungsstellen und 4 Cysteinreste.

Ein Vergleich der mpl-Ligandensequenzen mit der Sequenz-datenbank Genbank ergab 23% Identität zwischen den aminoterminalen 153 Resten von reifem humanem mpl-Liganden und huma-nem Erythropoietin (Fig. 10 [SEQ ID NO: 6 & 7]). Wenn kon-servative Substitutionen mit berücksichtigt werden, zeigt diese Region von hML 50% Ähnlichkeit zu humanem Erythropoietin (hEPO). hEPO und das hML enthalten vier Cysteine. Drei der vier Cysteine sind konserviert in hML, einschließlich das erste und das letzte Cystein. Sequenzspezifische (site-directed) Mutageneseexperimente haben gezeigt, daß das erste und letzte Cystein von Erythropoietin eine Disulfidbindung ausbilden, die fiir die Funktion erforderlich ist (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). In analoger Weise können das erste und letzte Cystein von hML ebenfalls eine kritische Disulfidbindung ausbilden. Keine der Glycosy-lierungsstellen sind in hML konserviert. Alle potentiellen N-abhängigen Glycosylierungsstellen in hML sind in der carboxyterminalen Hälfte des hML-Polypeptids gelegen. Ähnlich zu hEPO enthält die mRNA von hML nicht die Konsen-sus-Polyadenylierungssequenz AAUAAA, auch nicht das regulie-rende Element AUUUA, das in der 3'-nicht-translatierten Region von vielen Zytokinen vorhanden ist, und von dem man an-nimmt, daß es die mRNA-Stabilität beeinflußt (Shaw et al., Cell, 46:659-667 [1986]). Die Northern Blot-Analyse zeigt geringe Spiegel eines einzigen 1,8 kb hML RNA-Transkripts in fötaler und erwachsener Leber. Nach längerer Exposition konnte eine schwächere Bande der gleichen Größe in der er-wachsenen Niere nachgewiesen werden. Im Vergleich wird huma- nes Erythropoietin in fötaler Leber exprimiert und, als Ant wort auf Hypoxie, in der erwachsenen Niere und der Leber (Jacobs et al., Nature, 313:804-809 [1985] und Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6:2731-2733 [1986]).

Die Bedeutung der C-terminalen Region des hML ist noch auf-zuklâren. Basierend auf der Anwesenheit der sechs potentiel- len Stellen für die N-abhängige Glycosylierung und der Fä-higkeit des Liganden, an Lektin-Affinitätssäulen zu binden, ist diese Region des hML vermutlich glycosyliert. In einigen Gelelutionsexperimenten beobachteten wir eine Aktivitat, die aufgetrennt wurde mit einem Mr von ungefähr 60000, die das 'Ollständige glycosylierte Molekül darstellen kann. Die C-terminale Region kann deshalb zum Stabilisieren und Verlän gern der Halbwertszeit des zirkulierenden hML dienen. In dera Fall des Erythropoietin besitzt die nicht glycosylierte Form die voile in vitro-biologische Aktivität, aber sie besitzt in signifikanter Weise verringerte Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu glycosyliertem Erythropoietin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] und Spivack et al., Blood, 7:90-99 [1986]). Die C-terminale Domâne von hML ent-hâlt zwei dibasische Aminosâuresequenzen (Arg-Arg-Motive an Positionen 153-154 und 245-246), die als potentielle Prozes-sierungsstellen dienen können. Die Spaltung an diesen Stellen kann verantwortlich sein für das Erzeugen der 30-, 28-und 18-22 kDa-Formen des ML, isoliert aus APP. Signifikan-terweise folgt die Argi53-Ârgi54-Sequenz unmittelbar auf die Erythropoietin-ähnliche Domâne des ML. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß das vollständige ML ein Vorläuferpro-tein darstellen kann, das eine begrenzte Proteolyse durch-läuft, um den reifen Liganden zu bilden. 4. Isoformen und Varianten des humanen mpl-Liganden

Isoformen und alternativ gespleißte Formen von humanem mpl-Liganden wurden nachgewiesen durch PCR in humaner Erwachse-nenleber. Kurz gesagt, Primer wurden synthetisiert, die je-dem Ende wie auch ausgewählten internen Regionen der kodie-renden Sequenz von hML entsprachen. Diese Primer wurden in RT-PCR verwendet, urn humane Erwachsenenleber-RNA zu vermeh-ren, wie beschrieben in Beispiel 10. Zusätzlich zu der voll-ständigen Form, bezeichnet hML, wurden drei andere Formen, bezeichnet hML2, hML3 und hML4, beobachtet oder gefolgert. Die reife gefolgerte Aminosäuresequenz aller vier Isoformen ist dargestellt in Fig. 11 (SEQ ID NO: 6, 8, 9 & 10). hML3 besitzt eine 116 Nukleotide umfassende Deletion an Position 700, die sowohl zu einer Aminosäuredeletion wie auch zu einer Rasterverschiebung fiihrt. Die cDNA kodiert nun ein reifes Polypeptid, das 265 Aminosäuren lang ist und bei dem der Aminosäurerest 139 von der hML-Sequenz divergiert. Schließlich besitzt hML4 eine 12 Nukleotide umfassende Deletion folgand auf Nukleotidposition 618 (auch gafunden in der Mäuse- und der Schweinesequenz (siehe unten)) und besitzt die 116 bp-Deletion, die in hML3 gefunden wird. Obwohl keine Klone mit lediglich der 12 bp-Deletion (folgend Nukleotid 619) isoliert worden sind in dem Menschen (bezeichnet hML2), besteht diese Form vermutlich, da solche Isoformen identifi-ziert worden sind in der Maus und im Schwein (siehe unten), und weil sie identifiziert worden ist in Verbindung mit der 116-Nukleotid-Deletion in hML4.

Eine Substitutionsvariante von hML, in der die dibasische Argi53_Ar<?l54~Se(3uenz ersetzt worden war durch zwei Alanin-reste, und eine MEPO-Domäne"-verkürzte Form von hML wurden konstruiert, um zu bestimmen, ob das vollständige ML erfor-derlich ist für die biologische Aktivität. Die substituierte dibasische Arg^-Arg^-Sequenzvariante, bezeichnet als hML(R153A, R154A), wurde konstruiert mit Hilfe von PCR, wie beschrieben in Beispiel 10. Die 'ΈΡΟ-Domäne''-verkürzte Form, hMLi53, wurde ebenfalls hergestellt mit Hilfe von PCR durch Einfiihren eines Stopcodons folgend auf Argl53. 5. Expression von rekombinantem humanem mpl-Liganden (rhML) in transient transfektierten humanen Embryo-Nieren (293)-Zellen

Um zu bestätigen, daß die klonierte humane cDNA einen Liganden für mpl kodiert, wurde der Ligand exprimiert in 293-Säu-gerzellen unter der. Kontrolle des Zytomegalovirus-Immediate-Early-Promotors unter Verwendung der Expressionsvektoren pRK5-hML Oder pRK5-hML153. Von Überständen der transient transfektierten humanen Embryonalnieren-239-Zellen wurde ge-funden, daß sie den 3H-Thymidineinbau in Ba/F3-mp2-Zellen stimulieren, aber nicht in die parentalen Ba/F3-Zellen (Fig. 12A). Medien von den 293-Zellen, die nur mit dem pRK-Vektor alleine transfektiert waren, zeigten diese Aktivität nicht. Zusatz von mpl-IgG zu den Medien zerstörte die Stimulierung (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, daß die klonierte cDNA ein funkticnelles humanes ML (hML) kodiert.

Um zu bestimmen, ob die "EPO-Domäne" alleine an mpl binden und diesen aktivieren könnte, wurde die verkiirzte Form von hML, rhML153, in 293-Zellen exprimiert. Von Überständen aus transfektierten Zeilen wurde gefunden, daß sie eine ähnliche Aktivität zu derjenigen haben, die in Überständen von Zeilen gefunden wird, die das vollständige hML exprimieren (Fig. 12A), wobei dies anzeigt, daß die C-terminale Domäne von ML nicht erforderlich ist fiir die Bindung und Aktivierung von c-mpl. 6. Der mpl-Ligand stimuliert die Megakaryozytopoese und Thrombopoese

Der vollständige rhML und die verkiirzte rhML153-Form von re-kombinantem hML stimulierte die humane Megakaryozytopoese in vitro (Fig. 12B). Dieser Effekt wurde beobachtet in der An-wesenheit von anderen exogen zugesetzten hämatopoetischen

Wachstumsfaktoren. Mit der Ausnahme von IL-3 war ML der ein-zige getestete hamatopoetische Wachstumsfaktor, der diese Aktivität zeigte. IL-11, IL-6, IL-1, Erythropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit-Ligand (KL), M-CSF, OSM und GM-CSF hatten keinen Effekt auf die Megakaryozytopoese, wenn sie in unse-rem Assay getrennt getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt, daß ML Megakaryozyten-stimulierende Aktivität besitzt, und sie zeigen die Rolle von ML bei der Regulierung der Megakaryozytopoese.

Von thrombopoetischen Aktivitäten, die in dem Plasma von Thrombozytopenie-Tieren vorhanden sind, ist gezeigt worden, daß sie die Plättchenproduktion in einem Mäuse-Rebound-Thrombozytose-Assay stimulieren (McDonald, Proc. Soc. 'Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] und McDonald et al., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976). In diesem Modell wird bei Mäusen eine akute Thrombozytopenie hervorgerufen unter Ver-wendung eines spezifischen Anti-Plättchen-Serums, wobei dies zu einer vorhersehbaren Rebound-Thrombozytose führt. Solche immuno-thrombozythemischen Mäuse antworten besser auf exogene Thrombopoetin-ähnliche Aktivitäten als normale Mäuse (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973]), genau wie exhypoxische Mäuse sensitiver gegen Erythropoietin sind als normale Mäuse (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 77:134-143 [1971]). Urn zu bestimmen, ob der rML die Plätt-chenproduktion in vivo stimuliert, wurden Mâuse mit Rebound-Thrombocytose injiziert mit teilweise gereinigtem rhML. Die Plättchenzahl und der Einbau von 35S in Plättchen wurde dann quantifiziert. Die Injektion von Mäusen mit 64000 und 32000 Einheiten von rML steigerte signifikant die Plättchenproduk-tion, wie belegt wird durch einen rund 20%-Anstieg der Plättchenzahl (p=0,0005 und 0,0001) und eine rund 40%-Zu-nahme im 35S-Einbau in Plättchen (p=0,003) in den behandel-ten Mäusen gegenüber den Kontrollmäusen, die mit dem Hilfs-stoff alleine injiziert wurden (Fig. 12C). Dieser Spiegel der Stimulation ist vergleichbar mit dem Ergebnis, das wir beobachtet haben mit IL-6 in diesem Modell (Daten nicht ge zeigt). Die Behandlung mit 16000 Einheiten von rML zeigte keine signifikante Stimuiierung der Plättchenproduktion.

Diese Ergebnisse zeigen, daß ML die Plättchenproduktion in einer dosisabhängigen Weise stimuliert und deshalb Thrombo-poietin-ähnliche Aktivität besitzt. 293-Zellen wurden ebenfalls transfektiert mit den anderen hML-Isoformkonstrukten, oben beschrieben, und die Überstände wurden getestet unter Verwendung des Ba/F3-mp2-Proliferati-onsassays (siehe Fig. 13). hML2 und hML3 zeigten keine nach-weisbare Aktivität in diesem Assay, jedoch war die Aktivität von hML(R153A, R154A) ähnlich zu hML und hML153, wobei dies zeigt, daß der Besitz der Argi53-Argi54-dibasischen Stelle für die Aktivität weder erforderlich noch schädlich ist. 7. Megakaryozytopoese und der mpl-Ligand

Es ist vorgeschlagen worden, daß die Megakaryozytopoese re-guliert wird auf einer Vielzahl von zellulären Ebenen (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982] und Williams et al·., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Dies ba-slert im wesentlichsn auf der Beobachtung, daß bestimmte hämatopoetische Wachstumsfaktoren die Proliferation von Megakaryozytenvorläufern stimulieren, während andere primär die Reifung zu beeinflussen scheinen. Die hier dargestellten Ergebnisse legen nahe, daß ML sowohl als proliferativer wie auch als Reifungsfaktor wirkt. Der Befund, daß ML die Proliferation der Megakaryozytenvorläufer stimuliert, wird ge-stützt durch mehrere Hinweise. Erstens, APP stimuliert so wohl die Proliferation wie auch die Reifung von humanen Megakaryozyten in vitro, und diese Stimulation wird voll-ständig gehemmt durch mpl-IqG· (Fig. 7 und 8). Weiterhin zeigen auch die Hemmung der Megakaryozytenkoloniebildung durch c-mpl-Antisense-Oligonukleotide (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) und der Befund, daß c-mpl ein prolife- ratives Signal in Zeilen erzeugen kann, in die es transfek-tiert wird (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653 [1993] und Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]), daß ML die Proliferation stimuliert. Die offensichtliche Expression von c-mpl während allen Phasen der Megakaryozytendifferenzierung (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) und die Fähigkeit von rekombinantem ML, die Plättchenproduktion in vivo rasch zu stimulieren, zeigen, daß ML auch die Reifung beeinflußt. Die Verfiigbarkeit von rekombinantem ML ermög-licht es, eine sorgfältige Ermittlung seiner Rolle bei der Regulierung der Megakaryozytopoese und Thrombopoese wie auch sein Potential zum'Beeinflussen anderer hämatopoetischer Abstammungslinien zu untersuchen. 8. Isolierung des Gens für den humanen mpl-Liganden (TPO)

Humane genomische DNA-Klone des TPO-Gens wurden isoliert durch Absuchen einer humanen gencmischen Bank in X-Geml2 mit pR45 unter niedrig stringenten Bedingungen Oder unter hoch stringenten Bedingungen mit einem Fragment, das der 3'-Hälfte der humanen cDNA entsprach, die für den humanen mpl-Liganden kodiert. Zwei überlappende Lambda-Klone, die 35 kb umfassen, wurden isoliert. Zwei überlappende Fragmente (BamHl und EcoRI), die das vollstândige TPO-Gen enthalten, wurden subkloniert und sequenziert (Fig. 14A, 14B und 14C).

Die Struktur des humanen Gens setzt sich zusammen aus sechs Exons innerhalb von 7 kb der genomischen DNA. Die Grenzen aller Exon/Intron-Verbindungen stimmen überein mit dem Kon-sensusmotiv, das für Sâugergene etabliert worden ist (Shapiro, M.B. et al., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]).

Exon 1 und Exon 2 enthalten 5'-nicht- translatierte Sequenz und die anfânglichen vier·Aminosäuren des Signalpeptids. Der Rest des sekretorischen Signals und die ersten 26 Aminosâu-ren des reifen Proteins werden durch Exon 3 kodiert. Die vollstândige Carboxyldomâne und der 31-nicht-translatierte

Bereich wie auch rund 50 Aminosäuren der Erythropoietin-ähn-lichen Domäne werden durch Exon 6 kodiert. Die vier Ami-nosäuren, die an der Deletion beteiligt sind, die in hML-2 beobachtet werden (hTPO-2), werden durch das 5'-Ende des Exons 6 kodiert.

Die Analyse von huiaaner genomischer DNA durch einen Southern Blot zeigte, daß das Gen für TPO in einer einzigen Kopie vorliegt. Die chromosomale Lage des Gens wurde ermittelt durch fluoresz ierende in situ-Hybridisierung (FISH), die dem Chromosom 3q27-28 zugeordnet wurde. 9. Expression und Reinigung von TPO aus 293-Zellen

Herstellen und Reinigen von ML oder TPO aus 293-Zellen ist ausführlich beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgefiihrt, cDNA, die dem vollständigen offenen Leseraster von TPO ent-spricht, wurde erhalten durch PCR mit Hilfe von pRK5-hmp!I. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restrik-tionsspaltstellen Clal und Xbal des Plasmids pRKStkneo (ein von pRK5 stammender Vektor, der modifiziert war zum Expri-mieren eines Neomycinresistenzgens unter der Kontrolle des Thymidinkinasepromotors), kloniert, urn den Vektor pRK5tkneo.ORF (ein Vektor, der für den vollständigen offenen Leseraster kodiert) zu erhalten.

Ein zweiter Vektor, der die EPO-homologe Domäne kodiert, wurde auf die gleiche Weise erzeugt, aber unter-Verwendung verschiedener PCR-Primer, urn das endgültige Konstrukt, pRK5-tkneoEPO-D genannt, zu erhalten.

Diese beiden Konstrukte wurden in humane Embryonennierenzel-len durch das Kalziumphosphatverfahren transfektiert, und Neomycin-resistente Klone wurden ausgewählt und bis zu kon-fluenter Dichte kultiviert. Die Expression von ML153 oder ML332 i-n den konditionierten Medien dieser Klone wurde geines-sen mit Hilfe des Ba/F3-mpi-Proliferationsassays.

Die Reinigung von rhML332 wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgeführt, 293-rhML332-konditionierte Medien wurden auf eine Blue-Sepharose (Pharmacia)-Säule ge-geben, die anschließend gewaschen wurde mit einem Puffer enthaltend 2M Harnstoff. Die Säule wurde eluiert mit einem Puffer enthaltend 2M Harnstoff und 1M NaCl. Der Blue-Sepha-rose-Elutionspool wurde dann direkt auf eine WGA-Sepharose-Säule gegeben, gewaschen mit 10 Säulenvolumina Puffer enthaltend 2M Harnstoff und 1M NaCl, und eluiert mit dem glei-chen Puffer, enthaltend 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin. Das WGA-Sepharose-Eluat wurde auf eine C4-HPLC-Säule (Synchrom,

Ine.) gegeben und eluiert mit einem diskontinuierlichen Pro-panolgradienten. In SDS-PAGE wandert das gereinigte 293-rhML332 als eine breite Bande in dem Bereich 68-80 kDa des Gels (siehe Fig. 15).

Die Reinigung von rhML153 wurde ebenfalls durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 19. Kurz ausgeführt, 293-rhML153-kon-ditionierte Medien wurden aufgetrennt auf Blue-Sepharose, wie beschrieben für rhML332· Das Blue-Sepharose-Eluat wurde direkt auf eine mpI-Affinitätssäule gegeben, wie oben beschrieben. Von der mpl-hffinitätssäule eluiertes rhML153 wurde bis zur Homogenität gereinigt mit Hilfe eines C4-HPLC-Säulenlaufs unter den gleichen Bedingungen wie für rhML332 verwendet. In SDS-PAGE trennt sich das gereinigte rhML153 in zwei Haupt- und zwei Nebenbanden mit Mr von rund 18000-22000 (siehe Fig. 15). 10. Der mpl-Ligand aus Maus

Ein DNA-Fragment entsprechend der kodierenden Region des hu-manen mpI-Liganden wurde erhalten durch PCR, gelgereinigt und markiert in der Anwesenheit von P-dATP und P-dCTP. Diese Probe wurde verwendet zum Absuchen von 106 Klonen einer Mausleber-cDNA-Bank in λΰΤΙΟ. Ein Mäuseklon (Fig. 16 [SEQ ID NO: 12 & 13)), enthaitend ein 1443 Basenpaar-Insert, wurde isoliert und sequenziert. Das vermutete Startcodon an Nukleotidposition 138-141 lag innerhalb einer Konsensusse-quenz, die fiir die eukaryotische Translationsinitiation vor-teilhaft ist (Kozak, M., J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Diese Sequenz definiert einen offenen Leseraster von 1056 Nukleotiden, der ein primäres Translationsprodukt von 352 Aminosäuren vorhersagt. Diesen offenen Leseraster flankieren 137 Nukleotide 5'- und 247 Nukleotide einer 31-nicht-trans-latierten Sequenz. Es gibt keinen Poly(A)-Schwanz, der auf die 3'-nicht-translatierte Region folgt, wobei dies anzeigt, daß der Klon vermutlich nicht vollständig ist. Der N-Termi-nus der vorhergesagten Aminosäuresequenz ist stark hydrophob und stellt vermutlich ein Signalpeptid dar. Die Computeranalyse (von Heijne, G., Eur. J. Biochem. 133:17-21 (1983)) zeigt eine potentielle Spaltstelle fiir die Signal-peptidase zwischen Resten 21 und 22. Die Spaltung an dieser Position würde ein reifes Polypeptid von 331 Aminosäuren (35 kDa) ergeben, das als mML33i identifiziert wird (Oder mML2, aus den Griinden, wie unten angegeben) . Die Sequenz enthält vier Cysteine, die in der humanen Sequenz alle konserviert sind, und sieben potentielle N-Glykosylierungsstellen, von denen fünf in der humanen Sequenz konserviert sind. Wie-derum, wie bei hML, sind die sieben potentiellen N-Glykosy-lierungsstellen in der C-terminalen Hälfte des Proteins lo-kalisiert.

Wenn verglichen mit dem humanen ML, wird beträchtliche Iden- tität fiir die Nukleotid- und die gefolgerten Aminosäurense-quenzen beobachtet in den "EPO-Domänen" dieser ML's. Jedoch wenn die gefolgerten Aminosäurensequenzen von humanem und Mäuse-ML's ausgerichtet werden, scheint die Maussequenz eine Tetrapeptiddeletion zwischen Resten 111-114 zu tragen, die der 12 Nukleotid-Deletion entspricht, die der Nukleotidposition 618 folgt, wie beobachtet in der humanen (siehe oben) und der Schweine- (siehe unten) cDNA. Demzufolge wurden weitere Klone untersucht, um mögliche Mäuse-ML-Isoformen zu identifizieren. Ein Klon kodierte für eine gefolgerte 335 Aminosäure lange Polypeptidsequenz enthaltend das "fehlende" Tetrapeptid LPLQ. Von dieser Form wird angenommen, daß sie den vollständigen ML der Maus darstellt, und sie wird be-zeichnet als mML Oder 111ML335, Die Nukleotid- und die gefolgerte Arainosäuresequenz für mML sind in Fig. 17 angegeben (SEQ ID NO: 14 & 15). Diese cDNA-Klone bestehen aus 1443 Basenpaaren gefolgt von einem Poly(A)-Schwanz. Sie besitzt einen offenen Leseraster von 1068 bp, flankiert von 134 Basen einer 5f- und 241 Basen einer 3'-nicht-translatierten Sequenz. Das vermutete Startcodon liegt an der Nukleotidpo-sition 138-140. Der offene Leseraster kodiert ein vorherge-sagtes Protein von 356 Aminosäuren, die ersten 21 davon sind stark hydrophob und fungieren wahrscheinlich als Sekretions-signal.

Schließlich wurde ein dritter Mäuseklon isoliert, sequen-ziert, und es wurde gefunden, daß er die 116 Nukleotid-Dele-tion, die hML3 entspricht, enthält. Diese Mäuse-Isoform wird deshalb mML3 bezeichnet. Ein Vergleich der gefolgerten Ami-nosäuresequenzen dieser zwei Isoformen ist in Fig. 18 ge-zeigt (SEQ ID NO: 9 & 16).

Die gesamte Aminosäuresequenzidentität zwischen humanem und Mäuse-ML (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6 & 17]) beträgt 72%, aber diese Homologie ist nicht gleichmäßig verteilt. Die als die "EPO-Domäne" bezeichnete Region (Aminosäuren 1-153 für die humane Sequenz und 1-149 für die Maus) ist starker konser-viert (86% Homologie) als die carboxyterminale Region des Proteins (62% Homologie). Dies mag weiterhin darauf hindeu-ten, daß nur die "EPO-Domäne" wichtig ist für die biologische Aktivität des Proteins. Interessanterweise ist von den zwei dibasischen Aminosâuremotiven, die in hML gefunden werden, nur das dibasische Motiv, das unmittelbar der "EPO-Do-mâne" (Resteposition 153-154) in der humanen Sequenz folgt in der Maussequenz vorhanden. Dies ist in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, daß der vollständige ML ein Vorläufer-protein darstellen kann, das eine begrenzte Proteolyse durchläuft, um den reifen Liganden zu erzeugen. Alternativ kann die Proteolyse zwischen Argi53-Argi54 die Clearance von hML erleichtern.

Ein Expressionsvektor, enthaltend die vollständige kodie-rende Sequenz für mML, wurde transient transfektiert in 293-Zellen, wie beschrieben in Beispiel 1. Kcnditionierte Medien von diesen Zeilen stimulierten 3H-Thymidin-Einbau in Ba/F3-Zellen, die entweder den Mäuse- oder humanen mpl exprimier-ten, aber sie hatten keinen Effekt auf die Eltern (mpl-frei)-Zellinie. Dies zeigt, daß die klonierte ML-cDNA der Maus einen funktionellen Liganden kodiert, der in der Lage ist, sowohl den Mäuse- wie auch den humanen ML-Rezeptor (mpl) zu aktivieren. 11. Der mpl-Ligand ans Schwein

Schweine-ML (pML) cDNA wurde isoliert durch RACE-PCR, wie beschrieben in Beispiel 13. Ein PCR-cDNA-Produkt aus 1342 bp wurde in Niere aufgefunden und subkloniert. Mehrere Klone wurden sequenziert, und von diesen wurde gefunden, daß sie einen Schweine-mpI-Liganden von 332 Aminosäureresten, be-zeichnet als pML (oder pML332) , kodiert, der die Nukleotid-und gefolgerte Aminosäuresequenz, wie in Fig. 20 (SEQ ID NO: 18 & 19) gezeigt, besitzt.

Wiederum wurde eine zweite Form, als pML2 bezeichnet, die ein Protein mit einer 4 Aminosäure-Deletion kodiert (228 Aminosäurereste), identifiziert (siehe Fig. 21 [SEQ ID NO. 21]). Ein Vergleich der pML- und pML2-Aminosäuresequenzen zeigt, daß die letztere Form identisch ist, mit der Aus-nahme, daß das Tetrapeptid QLPP, entsprechend den Resten 111-114 einschließlich, deletiert worden vier Amninosäuren lange Deletionen ist (siehe Fig. 22 [SEQ ID NO: 18 & 21]).

Die vier Aminosäuren lange Deletionen, die in Mäuse- und Schweine-ML-cDNA beobachtet werden, treten exakt an der gleichen Position innerhalb des vorhergesagten Proteins auf.

Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen der reifen ML-Form aus Mensch, . Maus und Schwein (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 & 18]) zeigt, daß die Gesamtsequenzidentitât 72% betrâgt zwischen Maus und Mensch, 68% zwischen Maus und Schwein und 73% zwischen Schwein und Mensch. Die Homologie ist beträchtlich größer in der aminoterminalen Hälfte des ML (der EPO-homologen Domäne). Diese Domäne ist zu 80-84% iden-tisch zwischen zwei Arten, wohingegen die carboxyterminale Hälfte (Kohlenhydratdomäne) zu nur 57 bis 67 % identisch ist. Ein dibasisches Aminosäuremotiv, das eine Protease-spaltstelle repräsentieren könnte, ist an dem Carboxyende der Erythropoietin-Homologiedomäne vorhanden. Dieses Motiv ist konserviert zwischen den drei Arten an dieser Position (Fig. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 & 18]). Eine zweite dibasische Stelle, die an Position 245 und 246 in der humanen Sequenz vorhanden ist, ist nicht vorhanden in der Mäuse- Oder Schweinesequenz. Die Mause- und die Schweine-ML-Sequenz ent-hält 4 Cysteine, die alle konserviert sind in der humanen Sequenz. Es gibt sieben potentielle N-Glycosylierungsstellen innerhalb des Maus-Liganden und sechs innerhalb des Schweine-ML, von denen fiinf innerhalb der humanen Sequenz konserviert sind. Wiederum sind alle potentiellen N-Glycosy-lierungsstellen in der C-terminalen Hälfte des Proteins vorhanden. 12. Expression und Reinigung von TPO aus Zeilen des chinesi-schen Hamsters (CHO)

Die zum Transfektieren der CHO-Zellen verwendeten Expressi-onsvektoren werden wie folgt bezeichnet: pSV15.ID.LL.MLORF (vollständig Oder TPO332) , und pSV15. ID.LL.MLEPO-D (verkiirzt Oder TPOX53) . Die wesentlichen Merkmale dieser Plasmide sind in Fig. 23 und 24 gezeigt.

Die Transfektionsverfahren sind in Beispiel 20 beschrieben. Kurz ausgefiihrt, cDNA, die dem vollständigen offenen Lese-raster von TPO entspricht, wurde durch PCR erhalten. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und kloniert zwischen die Re-striktionsspaltstellen (Clal und Sali) des Plasmids pSV15.ID.LL, um den Vektor pSV15.ID.LL.ML0RF zu erhalten.

Ein zweites Konstrukt, entsprechend der EPO-homologen Do-mäne, wurde auf die gleiche Weise erzeugt, aber unter Ver-wendung eines verschiedenen reversen Primers (EPOD.Sal). Das endgiiltige Konstrukt für den Vektor, der für die EPO-homo-loge Domäne von TPO kodiert, wird pSVl5. ID.LL.MLEPO-D ge-nannt.

Diese zwei Konstrukte wurden linearisiert mit Notl und transfektiert in Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO-DP12-Zeilen, EP 307,247, veröffentlicht am 15. März 1989) durch Elektroporation. 107 Zeilen wurden einer Elek-troporation unterzogen in einem BRL-Elektroporationsapparat (350 Volt, 330 mF, geringe Kapazitanz) in der Anwesenheit von 10, 25 Oder 50 mg DNA, wie beschrieben (Andreason, G.L., J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). Am auf die Transfektion folgenden Tag wurden die Zeilen aufgeteilt auf DHFR-selek-tive Medien (Hoch-Glukose-DMEM-F12 50:50 ohne Glyzin, 2 mM Glutamin, 2-5% dialysiertes fötales Kälberserum). 10 bis 15 Tage später wurden einzelne Koloniën in 96-Loch-Platten überführt und bis zur Konfluenz kultiviert. Die Expression von ML153 Oder ML332 in den konditionierten Medien dieser Klone wurde gemessen mit Hilfe des Ba/F3-mpl-Proliféra- tionsassays (beschrieben in Beispiel 1).

Das Verfahren zum Reinigen und Isolieren von TPO aus geern-teter CHO-Zellkulturflüssigkeit ist in Beispiel 20 beschrieben. Kurz ausgefiihrt, geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF) wird auf eine Blue-Sepharose-Säule (Pharmacia) mit einem Verhältnis von ungefähr 100 1 des HCCF pro Liter Harz gege-ben. Die Sâule wird dann mit dem 3- bis 5-fachen Säulenvo- lumen an Puffer gewaschen, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolu-mina eines Puffers enthaltend 2,0 M Harnstoff. TPO wird dann eluiert mit 3 bis 5 Säulenvolumen an Puffer enthaltend 2,0M Harnstoff und l,0M NaCl.

Der eluierte Blue-Sepharose-Pool enthaltend TPO wird dann auf eine Weizenkeimlectin-Sepharosesäule (Pharmacia), equi-libriert in dem Blue-Sepharose-Elutionspuffer, in einem Ver-hältnis von 8 bis 16 ml an Blue-Sepharose-Eluat pro ml Harz gegeben. Die Saule wird dann mit 2 bis 3 Säulenvolumen an Equilibrierungspuffer gewaschen. TPO wird dann eluiert mit 2 bis 5 Säulenvolumen eines Puffers enthaltend 2,0M Harnstoff und 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin.

Das Weizenkeimlektineluat enthaltend TPO wird dann angesäu-ert, und C^Es wir<^ zugesetzt auf eine Endkonzentration von 0,04%. Der erhaltene Pool wird auf eine C4-Umkehrphasen-säule, equilibriert in 0,1% TFA, 0,04% C^Eg, mit einer Bela-dung von ungefähr 0,2 bis 0,5 mg Protein pro ml Harz gegeben.

Das Protein wird eluiert mit einem zweiphasigen linearen Gradiënten aus Acetonitril enthaltend 0,1%· TFA und 0,04%

Ci2Eg, und ein Pool wird hergestellt auf der Basis von SDS-PAGE.

Der C4-Pool wird dann verdiinnt und einer Diaf iltration gegen ungefähr 6 Volumen an Puffer auf einer Araicon YM oder ähnli-chen Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-off des Moleku-largewichts bei 10000 bis 30000 unterzogen. Das erhaltene Diafiltrat kann dann direkt weiterverarbeitet werden oder weiter konzentriert werden durch Ultrafiltration. Das Dia-filtrat/Konzentrat wird iiblicherweise auf eine Endkonzentration von 0,01% Tween-80 eingestellt.

Das vollständige oder ein Teil des Diafiltrats/Konzentrats, das äquivalent ist zu 2 bis 5% des berechneten Säulenvolu- mens, wird dann auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia) gegeben, die equilibriert ist in einem Puffer enthaltend 0,01% Tween-80, und wurde dann chromatographiert. Die TPO enthaltenden Fraktionen, die frei sind von Aggregaten und proteolytischan Abbauprodukten, werden dann verei-nigt auf der Basis von SDS-PAGE. Der erhaltene Pool wird filtriert und bei 2-8°C gelagert.

13. Verfahren zum Transformieren und Induzieren der TPO-Syn-these in einem Mikroorganismus und Isolieren, Reinigen und Zurückfalten des darin hergestellten TPO

Die Konstruktion der E. Coli-TPO-Expressionsvektoren ist ausfiihrlich beschrieben in Beispiel 21. Kurz ausgeführt, Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 wurden alle so entworfen, daß sie die'ersten 155 Aminosäuren von TPO stromabwärts eines kleinen Leaders exprimieren, der zwischen den verschiedenen Konstrukten variiert. Die Leader dienen primär einem hohen Spiegel der Translationsinitiation und der raschen Reinigung. Die Plasmide pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 sind entworfen zum Exprimieren der ersten 153 Ami-nosäuren des TPO stromabwärts von einem Initiations-Methio-nin, und sie unterscheiden sich nur in der Codon-Usage für die ersten sechs Aminosäuren des TPO, während das Plasmid pMP251 ein Dérivât von pMP210-l ist, in dem das carboxyterminale Ende von TPO urn zwei Aminosäuren verlängert ist. Alle obigen Plasmide erzeugen hohe Spiegel an intrazellulärer Expression von TPO in E. Coli durch die Induktion des Trypto-phanpromotors (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Hrsg.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Die Plasmide pMPl und pMP172 sind Zwischenprodukte bei der Konstruktion der obigen Plasmide zur intrazellulären TPO-Expression.

Die obigen TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet zum Transformieren von E. Coli mit Hilfe des CaCl2-Uitzeschock- verfahrens (Mandei, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) und anderer Verfahren, wie in Beispiel 21 beschrie-ben. Kurz ausgeführt, die transformierten Zeilen wurden zu-nächst bei 37°C kultiviert, bis die optische Dichte (600 nm) der Kultur ungefähr 2-3 erreichte. Die Kultur wurde dann i verdünnt, und nach Kultivieren unter Belüftung wurde Säure zugesetzt. Die Kultur wurde dann unter Belüftung für weitere 15 Std. kultiviert, und nach dieser Zeit wurden die Zeilen durch Zentrifugation geerntet.

Die unten angegebenen Isolier-, Reinigungs- und Zurückfal-tungsverfahren zur Herstellung von biologisch aktivem, zu-rückgefaltetem huraanem TPO oder Fragmenten davon werden in Beispielen 22 und 23 beschrieben und können für die Gewin-nung einer beliebigen TPO-Variante verwendet werden, ein-schließlich N- und C-terminal verlängerter Formen. Andere geeignete Verfahren zum Zurückfalten von rekombinantem oder synthetischem TPO können auch in den folgenden Patenten ge-funden werden: Builder et al., U.S.-Patent 4,511,502, Jones et al., U.S.-Patent 4,512,922, Olson U.S.-Patent 4,518,526 und Builder et al., U.S.-Patent 4,620,948; für eine allge-meine Beschreibung der Gewinnung und Zurückfaltungsverfahren für eine Vielzahl von rekombinanten Proteïnen, die in einer unlöslichen Form in E. Coli exprimiert wurden.

A. Gewinnen von unlöslichem TPO

Ein Mikroorganismus, wie E. Coli, der durch ein beliebiges Plasmid kodiertes TPO exprimiert, wird unter Bedingungen fermentiert, unter denen TPO als unlösliche "brechende Kör-per (retractile bodies)" abgelagert werden. Gegebenenfalls werden die Zeilen zunächst gewaschen in einem die Zelle auf-brechenden Puffer. Typischerweise werden ungefähr 100 g Zeilen in ungefähr 10 Volumen eines die Zeilen aufbrechenden Puffers resuspendiert (z.B. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) mit z.B. einem Polytronhomogenisator, und die Zeilen werden zen-trifugiert bei 5000 x g für 30 min. Die Zeilen werden dann lysiert unter Verwendung einer herkömmlichen Technik, wie einem tonischen Schock, Beschallung, Druckaufschluß (pressure cycling), chemischen oder enzymatischen Verfahren. Zum Beispiel kann das obige gewaschene Zellpellet resuspen-diert werden in weiteren 10 Volumen eines die Zeilen aufbre-chenden Puffers mit einem Homogenisator, und die Zellsuspen-sion wird durch einen LH-Cell Disrupter (LH Inceltech, Ine.) oder durch einen Microfluidizer (Microfluidics Interntatio-nal) gemäß den Herstellerangaben durchgeleitet. Das partiku-läre Material enthaltend TPO wird dann von der Flüssigphase abgetrennt und gegebenenfalls mit einer geeigneten Flüssig-keit gewaschen. Zum Beispiel kann eine Suspension des Zell-lysats bei 5000 x g für 30 min zentrifugiert werden, resus-pendiert werden und gegebenenfalls ein zweites Mal zentrifugiert werden, um ein gewaschenes Pellet aus brechenden Körpern zu ergeben. Das gewaschene Pellet kann sofort ver-wendet werden oder gegebenenfalls eingefroren gelagert werden (z.B. bei -70°C).

B. Solubilisierung und Reinigung von monomerem TPO

Unlösliches TPO in dem Pellet der brechenden Körper wird dann solubilisiert mit einem Solubilisierungspuffer. Der So-lubilisierungspuffer enthält ein chaotropes Mittel und wird üblicherweise bei einem basischen pH gepuffert und enthält ein Reduktionsmittel, um die Ausbeute an monomerem TPO zu verbessern. Repräsentative chaotrope Mittel umfassen Harn-stoff, Guanidin-HCl und Natriumthiocyanat. Ein bevorzugtes chaotropes Mittel ist Guanidin-HCl. Die Konzentration des chaotropen Mittels beträgt üblicherweise 4-9M, vorzugsweise 6-8M. Der pH des Solubilisierungspuffers wird bei einem geeigneten pH in einem pH-Bereich von ungefähr 7,5-9,5, vor zugsweise von 8,0-9,0 und ganz besonders bevorzugt bei 8,0, gehalten. Vorzugsweise enthält der Solubilisierungspuffer auch ein Reduktionsmittel, um der Bildung der monomeren Form von TPO zu helfen. Geeignete Reduktionsmittel umfassen organische Verbindungen enthaltend eine freie Thiolgruppe (RSH). Repräsentative Reduktionsmittel umfassen Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), Mercaptoethanol, Glutathion (GSH), Cysteamin und Cystein. Ein bevorzugtes Reduktionsmit-tel ist Dithiothreitol (DTT). Gegebenenfalls kann der Solu-bilisierungspuffer ein mildes Oxidationsmittel enthalten (z.B. molekularen Sauerstoff) und ein Sulfitsalz, um monomères TPO über Sulfitolyse zu bilden. Bei dieser Ausführungs-form wird das erhaltene TPO-S-Sulfonat später zurückgefaltet in der Anwesenheit des Redoxpuffers (z.B. GSH/GSSG), um das geeignet gefaltete TPO zu ergeben.

Das TPO-Protein wird üblicherweise weiter gereinigt mit Hilfe von beispielsweise Zentrifugation, Gelfiltrationschro-matographie und Umkehrphasensäulenchromatographie.

Zur Erläuterung, das folgende Verfahren erzielte geeignete Ausbeuten an monomerem TPO. Das Pellet der brechenden Körper wird resuspendiert in ungefähr 5 Volumen bezogen auf das Gewicht in dem Solubilisierungspuffer (20 mM Tris, pH8, mit 6-8 M Guanidin und 25 mM DTT) und für 1-3 Std. Oder über Nacht gerührt bei 4°C, um die Solubilisierung des TPO-Proteins zu erzielen. Hohe Konzentrationen an Harnstoff (6-8M) sind ebenfalls nützlich, aber sie führen üblicherweise zu einer etwas erniedrigten Ausbeute im Vergleich zu Guanidin. Nach dem Solubilisieren wird die Lösung zentrifugiert bei 30000 x g für 30 min, um einen klaren Überstand zu erzeugen, enthal-tend denaturiertes, monomères TPO-Protein. Der Überstand wird dann chromatographiert auf einer Superdex 200-Gelfil-trationssäule (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) bei einer Flußrate von 2 ml/min, und das Protein wird eluiert mit 20 mM Natri-umphosphat, pH 6,0, mit 10 mM DTT. Fraktion mit monomerem denaturiertem TPO-Protein, die zwischen 160 und 200 ml elu-ieren, werden vereinigt. Das TPO-Protein wird weiter gereinigt auf einer semipräparativen C4-Umkehrphasensäule (2 x 20 cm VYDAC). Die Analysenprobe wird mit 5 ml/min auf eine Saule gegeben, die equilibriert ist in 0,1% TFA (Trifluoressigsâure) mit 30% Acetonitril. Das Protein wird eluiert mit einem linearen Gradiënten aus Acetonitril (30- 60% in 60 min). Das gereinigte reduzierte Protein eluiert bei ungefëhr 50% Acetonitril. Dieses Material wird zum Zu-rückfalten verwendet, urn biologisch aktive TPO-Variante zu erhalten. C. Zurückfalten von TPO erzeugt die biologisch aktive Form

Folgend auf die Solubilisierung und die weitere Reinigung von TPO wird die biologisch aktive Form erhalten durch Zu-rückfalten der denaturierten monomeren TPO-Form in einem Re-doxpuffer. Wegen der hohen Potenz von TPO (die halbmaximale Stimulierung in dem Ba/F3-Assay wird erzielt bei ungefähr 3 pg/ml) ist es möglich, biologisch aktives Material unter Verwendung vieler verschiedener Puffer, Detergentien und Re-doxbedingungen zu erhalten. Jedoch wird unter den meisten Bedingungen nur eine kleine Menge von richtig gefaltetem Material (< 10%) erhalten. Für kommerzielle Herstellungsver-fahren ist es wünschenswert, Ausbeuten der Rückfaltung von mindestens 10%, starker bevorzugt von 30-50% und ganz beson-ders bevorzugt > 50% zu erhalten. Viele verschiedene Deter-gentien, einschließlich Triton X-100, Dodecyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, Sarkosyl, Tween 20 und Tween 80, Zwittergent 3-14 und andere sind geeignet zum Herstellen von zumindest etwas richtig gefaltetem Material. Von diesen jedoch waren die am meisten bevorzugten Detergentien diejenigen der CHAPS-Familie (CHAPS und CHAPSO), von denen gefunden wurde, daß sie am besten bei der Zurückfaltungsreaktion wir-ken, und daß sie die Proteinaggregation und ungeeignete Di-sulfidbildung begrenzen. Spiegel an CHAPS von mehr als unge-fähr 1% waren besonders bevorzugt. Natriumchlorid war für die besten Ausbeuten erforderlich, wobei die optimalen Spiegel zwischen 0,1 M und 0,5 M lagen. Die Anwesenheit von EDTA (1-5 mM) in dem Redoxpuffer war bevorzugt, urn die Menge an meta1lkatalysierter Oxidation (und Aggregation) zu begrenzen, die beobachtet wurde bei einigen Präparationen. Gly-cerolkonzentrationen von mehr als 15% erzeugten die optimalen Zurückfaltungsbedingungen. Für maximale Ausbeuten war es erforderlich, ein Redoxpaar in dein Redoxpuffer zu haben, be-stehend aus einem oxidierten und reduzierten organischen Thiol (RSH). Geeignete Redoxpaare umfassen Mercaptoethanol, Glutathion (GSH), Cysteamin, Cystein und ihre entsprechenden oxidierten Formen. Bevorzugte Redoxpaare waren Glutathion (GSH):oxidiertes Glutathion (GSSG) oder Cystein:Cystin. Das am meisten bevorzugte Redoxpaar war Glutathion (GSH):oxidiertes Glutathion (GSSG). Im allgemeinen wurden höhere Ausbeuten beobachtet, wenn das Molverhâltnis von oxi-diertem Bestandteil des Redoxpaars gleich oder größer war gegenüber dem reduzierten Bestandteil des Redoxpaars. pH-Werte zwischen 7,5 und ungefähr 9 waren optimal für die Zu-rückfaltung dieser TPO-Varianten. Organische Lösungsmittel (z.B. Ethanol, Acetonitril, Methanol) wurden toleriert bei Konzentrationen von 10-15% oder weniger. Hohe Spiegel an organischen Lösungsmitteln steigerten die Menge an unrichtig gefalteten Formen. Tris- und Phosphatpuffer waren im allgemeinen nützlich. Die Inkubation bei 4°c erzeugte höhere Spiegel an richtig gefaltetem TPO. Rückfaltungsausbeuten von 40-60% (basierend auf der Menge an reduziertem und denaturiertem TPO, das in der Rückfaltungs-reaktion eingesetzt wurde) sind typisch für Präparationen von TPO, die durch den ersten C4-Schritt gereinigt worden sind. Aktives Material kann erhalten werden, wenn weniger reine Präparationen verwendet werden (z.B. direkt nach der Superdex 200-Säule oder nach der anfänglichen Extraktion der brechenden Körper), obwohl die Ausbeuten geringer sind wegen der extensiven Präzipitation und der Wechselwirkung mit nicht-TPO-Proteinen während dem TPO-Rückfaltungsvorgang.

Da TPO vier Cysteinreste enthält, ist es möglich, drei ver-schiedene Disulfidversionen dieses Proteins zu erzeugen:

Version 1: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-4 und 2-3

Version 2: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-2 und 3-4

Version 3: Disulfide zwischen Cysteinresten 1-3 und 2-4. Während der anfänglichen Untersuchung bei der Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen vaarden mehrere verschiedene Peaks, enthaltend das TPO-Protein, aafgetrennt durc'n C4-Umkehrpha-senchromatographie. Nur einer dieser Peaks besaß signifi-kante biologische Aktivität, wie ermittelt mit Hilfe des Ba/F3-Assays. Anschließend wurden die Rückfaltungsbedingun-gen optimiert, um vorzugsweise diese Version zu erhalten. Unter diesen Bedingungen betrugen die falsch gefalteten Versionen weniger als 10-20% des gesamten monomeren TPO, erhalten aus dem Solubilisierungsschritt.

Das Disulfidmuster für das biologisch aktive TPO ist ermittelt worden als 1-4 und 2-3 mit Hilfe der Spektrometrie und Proteinsequenzierung, wobei die Cysteine von dem Aminotermi-nus her nacheinander numeriert sind. Dieses Cysteinvernet-zungsmuster steht in Einklang mit dem bekannten Disulfidbin- dungsmuster des verwandten Moleküls Erythropoietin.

D. Biologische Aktivitât von rekombinantem, rückgefaltetem TPO Rückgefaltetes und gereinigtes TPO besitzt Aktivitât in den in vitro- und in vivo-Assays. Zum Beispiel wurde in dem Ba/F3-Assay die halbmaximale Stimulierung des Thymidinein-baus in die Ba/F3-Zellen durch TPO (Met-1 1-153) erzielt bei 3,3 pg/ml (0,3 pM). In dem mpl-Rezeptor-basierenden ELISA trat die halbmaximale Aktivitât bei 1,9 ng/ml (120 pM) auf. In normalen und myelosuprimierten Tieren, erzeugt durch na-hezu letale Röntgenbestrahlung, war rückgefaltetes TPO (Met 1 1-153) hochpotent (eine Aktivitât wurde bei so geringen Dosen wie 30 ng/Maus beobachtet) zum Stimulieren der Produk-tion von neuen Plättchen. Ähnliche biologische Aktivitât wurde für andere Formen von TPO beobachtet, das gemäß den oben beschriebenen Verfahren zurückgefaltet worden war (siehe Fig. 25, 26 und 28). 14. Verfahren zum Messen der thrombopoetischen Aktivität

Die thrombopoetische Aktivität kann in verschiedenen Assays gemessen werden, einschließlich dem Ba/F3-mpI-Ligandenassay, beschrieben in Beispiel 1, einem in vivo-Mäuse-Plättchen-Re-bound-Syntheseassay, einem Assay der Induktion des Plätt-chen-Oberflächenantigens, gemessen durch einen anti-Plätt-chen-Immunoassay (anti-GPIIbIIIa) für eine humane mega-karyoblastische Leukämiezellinie (CMK) (siehe Sato et al., Brit. J. Haematol., 72:184-190 [1989] (siehe auch den Flüs-sigsuspensions-Megakaryozytopoese-Assay beschrieben in Beispiel 4) und durch Induktion der Polyploidisierung in einer magakaryoblastischen Zellinie (DAMI) (siehe Ogura et al., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Die Reifung von Megakaryozyten aus unreifen, im wesentlichen nicht DNA synthetisierenden Zeilen zu morphologisch identifizierbaren Megakaryozyten um-faßt einen Prozeß, der einschließt das Auftreten von zyto-plasmatischen Organellen, den Erwerb von Membranantigenen (GPIIbIIIa) , Endoreplikation und Freisetzen von Plättchen, wie in der Einleitung beschrieben. Von einem abstammungsli-nienspezifischen Promotor (d.h., der mpl-Ligand) der Mega-karyozytenreifung wäre zu erwarten, daß er mindestens einige dieser Änderungen in unreifen Megakaryozyten induziert, wo-bei dies zu Plättchenfreisetzung und Minderung der Thrombo-zytopenie führt. Somit wurden Assays entworfen, urn das Auftreten dieser Parameter in unreifen Megakaryozytenzellinien, d.h., CMK- und DAMI-Zellen, zu messen. Der CMK-Assay (Beispiel 4) mißt das Auftreten eines spezifischen Plätt-chenmarkers, GPIIbIIIa/ und die Plättchenformbildung. Der DAMI-Assay (Beispiel 15) mißt die Endoreplikation, da die Zunahme in der Ploidie ein Kennzeichen für reife Megakaryozyten ist. Erkennbare Megakaryozyten besitzen Ploidiewerte von 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, usw. Schließlich ist der in vivo-Mäuse-Plättchen-Rebound-Assay (Beispiel 16) nützlich zum De- monstrieren, daß die Verabreichung der Testverbindung (hier des mpl-Liganden) zu einer Erhöhung der Plättchenzahl ftihrt.

Zwei weitere in vitro-Assays sind entwickelt worden, um die TPO-Aktivität zu messen. Der erste ist ein Kinaserezeptorak-tivierungs- (KIRA) -ELISA, bei dem CHO-Zellen mit einer mpl-Rse-Chimäre transfektiert werden, und die Tyrosinphosphory-lierung von Rse wird gemessen durch den ELISA, nachdeir. der mpI-Teil der Chimäre dem mpI-Liganden ausgesetzt worden ist (siehe Beispiel 17). Der zweite ist ein auf einem Rezeptor basierender Elisa, bei dem eine ELISA-Platte, beschichtet mit Kaninchen-anti-Mensch-IgG, den humanen chimären Rezeptor mpl-IgG einfängt, der wiederum den zu testenden mpl-Liganden bindet. Ein biotinylierter polyklonaler Kaninchenantikörper gegen den mpl-Liganden (TP0155) wird verwendet zum Nachweis von gebundenem mpl-Liganden, der gemessen wird unter Verwen- dung von Streptavidin-Peroxidase, wie beschrieben in Beispiel 18. 15. Biologische Antwort in vivo von normalen und subletal bestrahlten, mit TPO behandelten Mäusen

Normale und subletal bestrahlte MSuse wurden mit verkürztem und vollständigem TPO, isoliert aus Ovarienzellen des chine-sischen Hamsters (CHO), E. Coli und humanen embryonalen Nieren- (293)-Zeilen, behandelt. Beide Formen von TPO, erzeugt in diesen drei Wirten, stimulierten die Plättchenproduktion in Mäusen, jedoch schien das vollständige TPO, isoliert aus CHO, eine größere in vivo-Antwort hervorzurufen. Die Ergeb-nisse zeigen, daß die richtige Glycosylierung der car-boxyterminalen Domäne erforderlich sein kann für die optimale in vivo-Aktivität. (a) E. Coli-rhTPO(Met-1,153)

Die "Met"-Form der EPO-Domäne (Met in der -1 -Position plus die ersten 153 Reste von humanem TPO), hergestellt in E.

Coli (siehe Beispiel 23), wurde täglich in normale weibliche C57 B6-Mäuse injiziert, wie beschrieben in den Legenden zu Figuren 25 A, B und C. Diese Figuren zeigten, daß die nicht glycosylierte, verkürzte Form von TPO, hergestellt in E. Coli, und zurückgefaltet, wie oben beschrieben, in der Lage ist, eine ungefähr zweifache Zunahme der Plättchenproduktion in normalen Mäusen zu stimulieren, ohne die rote oder weiße Blutkörperchenpopulation zu beeinflussen.

Das gleiche Molekiil, täglich injiziert in subletal be-strahlte ( Cs) weibliche C57 B6-MMuse, wie beschrieben m den Legenden zu Figuren 26A, B und C, stimulierte die Plätt-chenerzeugung und verringerte den Tiefstpunkt, aber hatte keinen Effekt auf Erythrozyten Oder Leukozyten. (b) CH0-rhTP0332

Die vollständige Form von in CHO produziertera TPO, das täg-lich in normale weibliche C57 B6-Mäuse injiziert wurde, wie beschrieben in den Legenden zu Fig. 27A, B und C, erzeugte einen ungefähr fünffachen Anstieg in der Plättchenproduktion in normalen Mäusen, ohne die Erythrozyten- Oder Leukozyten-population zu beeinflussen. (c) CH0-rhTP0332; E. Coli-rhTPO(Met-1,153) ; 293-rhTP0332 und E. Coli-rhTPOi55

Dosis-Antwort-Kurven wurden erstellt fiir die Behandlung von normalen Mäusen mit rhTPO von verschiedenen Zellinien (CHO-rhTP0332; E. Coli-rhTPO (Met-1,153) ; 293-rhTP0332 und E. Coli-rhTP0155) , wie beschrieben in der Legende zu Fig. 28. Diese Figur zeigt, daß alle getesteten Formen des Moleküls die Plättchenproduktion stimulierten, jedoch besitzt die voll- ständige in CHO hergestellte Form die größte in vivo-Aktivi-tät. (d) CH0-rhTP0153/ CHO-rhTPO "gestutzt" und CH0-rhTP0332

Dosis-Antwort-Kurven wurden aucn erstellt für die Behandlung von normalen Mäusen mit verschiedenen Formen von rhTPO, her-gestellt in CHO (CH0-rhTP0153, CHO-rhTPO "gestutzt" und CHO-rhTP0332) , wie beschrieben in der Legende zu Fig. 29. Diese Figur zeigt, daß alle getesteten CHO-Formen des Moleküls die Plättchenproduktion stimulierten, aber daß die vollständige 70 Kda-Form die größte in vivo-Aktivität besitzt. 16. Allgemeine rekombinante Herstellung von mpl-Ligand und Varianten

Vorzugsweise wird mpl-Ligand hergestellt durch rekombinante Standardverfahren, die umfassen das Herstellen des mpl-Li-ganden-Polypeptids durch Kultivieren von transfektierten Zeilen, um mpl-Liganden-Nukleinsäure zu exprimieren (typischerweise durch Transformieren der Zelle mit einem Ex-pressionsvektor), und Gewinnen des Polypeptids aus den Zeilen. Jedoch kommt auch in Betracht, daß der mpl-Ligand durch homologe Rekombination hergestellt werden kann, oder mit re-kombinanten Produktionsverfahren unter Verwendung von Kon-trollelementen, die in Zeilen eingebracht werden, die be-reits DNA enthalten, die für den mpl-Liganden kodiert. Zum Beispiel kann ein wirkungsvolles Promotor/Enhancer-Element, ein Suppressor Oder ein exogenes, die Transkription modulie-rendes Element in das Genom der beabsichtigten Wirtszelle in Nachbarschaft und einer Orientierung eingebracht werden, die ausreichen, die Transkription der DNA zu beeinflussen, die das gewünschte mpl-Ligandenpolypeptid kodiert. Das Kontrol- lelement kodiert nicht den jnpl-Liganden, sondern vielmehr ist die DNA dem Wirtszellgenom eigen. Als nächstes sucht man nach Zeilen, die das erfindungsgemäße Rezeptorpolypeptid herstellen, oder man sucht nach gesteigerten oder verringer-ten Spiegeln der Expression, falls gewünscht.

Somit umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines mpI-Liganden umfassend Einbringen eines die Transkrip-tion modulierenden Elements in das Genom einer Zelle, ent-haltend das mpI-Ligandennukleinsäuremolekül, in ausreichen-der Nähe und Orientierung zu dem Nukleinsäuremolekül, urn dessen Transkription zu beeinflussen, mit einem gegebenen-falls weiteren Schritt, der umfaßt Kultivieren der Zelle enthaltend das die Transkription modulierende Element und das Nukleinsäuremolekül. Die Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle enthaltend das eigene mpl-Liganden-Nukleinsäure-molekül funktionsfähig verknüpft mit exogenen Kontrollse-quenzen, die von der Wirtszelle erkannt werden. A. Isolieren von DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert

Die DNA, die das mpI-Ligandenpolypeptid kodiert, kann erhal-ten werden aus einer beliebigen cDNA-Bank, hergestellt aus Gewebe, von dem angenommen wird, das es die mpl-Liganden-mRNA enthält und diese in einem nachweisbaren Spiegel expri-miert. Das mpl-Ligandengen kann auch erhalten werden aus einer genomischen DNA-Bank oder durch in vitro-Oligonukleo-tidsynthese der vollständigen Nukleotid- oder Aminosäure-sequenz.

Die Banken werden abgesucht mit Proben, die entworfen wur-den, urn das Gen von Interesse oder das von diesem kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbanken umfas-sen geeignete Proben monoklonale oder polyklonale Antikör-per, die den mpl-Liganden erkennen und spezifisch daran binden. Für cDNA-Banken geeignete Proben umfassen Oligonukleo-tide von ungefähr 20 bis 80 Basen in Lange, die bekannte oder angenommene Teile der mpl-Liganden-cDNA aus der glei-chen oder einer verschiedenen Art kodieren; und/oder komple- mentäre oder homologe c-DNAs oder Fragmente davon, die das gleiche oder ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Proben zum Absuchen genomischer DNA-Banken umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Oligonukleotide, cDNAs oder Fragmente davon, die das gleiche oder ein ähnliches Gen kodieren, und/oder homologe genomische DNAs oder Fragmente davon. Das Absuchen der cDNA- oder genomischen Bank mit der ausgewähl-ten Probe kann durchgeführt werden unter Verwendung von Standardverfahren, wie beschrieben in Kapitein 10-12 von Sambrook et al., siehe oben.

Ein alternatives Mittel zum Isolieren des Gens, das für den mpl-Liganden kodiert, ist die Verwendung der PCR-Technik, wie beschrieben in Abschnitt 14 von Sambrook et al., siehe oben. Dieses Verfahren verlangt die Verwendung von Oligo-nukleotidproben, die an DNA hybridisieren, die den mpl-Liganden kodiert. Strategien zur Auswahl der Oligonukleotide sind unten beschrieben.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Ausüben der Erfindung besteht in der Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonukleo-tidsequenzen zum Absuchen von cDNA-Banken von verschiedenen Geweben, vorzugsweise von humanen oder Schweineniere-(erwachsen oder fötal) oder Leberzellinien. Zum Beispiel werden cDNA-Banken einer humanen fötalen Leberzellinie abge-sucht mit den Oligonukleotidproben. Alternativ können humane genomische Banken abgesucht werden mit den Oligonukleotidproben. Die als Probe ausgewählten Oligonukleotidsequen-zen sollten ausreichend lang und ausreichend spezifisch sein, urn falsch positive Ergebnisse zu minimieren. Die tat-sächliche Nukleotidsequenz(en) wird üblicherweise entworfen auf der Basis von Regionen des mpl-Liganden, die die geringste Codonredundanz aufweisen. Die Oligonukleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung von degenerierten oligonukleotiden ist von besonderer Bedeutung, wenn eine Bank abgesucht wird von einer Art, von der die bevorzugte Codon-Usage nicht bekannt ist.

Das Oligonukleotid muß markiert sein, so daß es durch die Hybridisierung an DNA in der abzusuchenden Bank nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Verfahren zum Markieren ist die 32

Verwendung von ATP (z.B. γ P) und Polynukleotidkrnase, um das 5'-Ende des Oligonukleotids radioaktiv zu markieren. Je-doch können andere Verfahren zum Markieren der Oligonukleo-tide verwendet werden, einschließlich, ohne darauf· be-scnränkt zu sein, Biotinylierung und Enzymmarkierung.

Von besonderem Interesse ist die mpl-Liganden-Nukleinsäure, die das vollständige mpl-Ligandenpolypeptid kodiert. Bei ei-nigen bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Nukleinsäure-sequenz die Signalsequenz des nativen mpl-Liganden. Eine Nukleinsäure umfassend die vollständige proteinkodierende Sequenz wird erhalten durch Absuchen ausgewählter cDNA- oder genomischer Banken mit Hilfe der gefolgerten Aminosäure-sequenz. B. Aminosäuresequenzvarianten von nativem mpI-Ligand

Aminosäuresequenzvarianten von mpl-Ligand werden hergestellt durch Einführen geeigneter Nukleotidänderungen in die mpl-Liganden-DNA oder durch in vitro-Synthese des gewünschten mpl-Ligandenpolypeptids. Solche Varianten umfassen z.B. Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz für den Schweine-mpI-Ligan-den. Zum Beispiel können carboxyterminale Anteile des reifen vollständigen mpl-Liganden entfernt werden durch proteolyti-sche Spaltung, entweder in vivo oder in vitro, oder durch Klonieren und Exprimieren eines Fragments oder der DNA, die den vollständigen mpl-Liganden kodiert, um eine biologisch aktive Variante zu erzeugen. Eine beliebige Kombination an Deletion, Insertion und Substitution wird ausgeführt, um zu dem endgültigen Konstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, daß das endgültige Konstrukt die gewünschte biologische Aktivi- tät aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch die post-translationalen Vorgänge an dem mpl-Liganden ändern, wie die Änderung der Anzahl Oder Position der Glykosylierungsstel-len. Für den Entwurf einer Aminosäuresequenzvariante des jnpl-Liganden hängt die Lage der Mutationsstelle und die Art der Mutation ab von der zu verändernden mpl-Liganden-Eigen-schaft(en). Die Stellen für die Mutation können einzeln oder in Serie modifiziert werden, z.B. durch (1) zunächst Substi-tuieren mit einer Wahl konservativer Aminosäuren und dann mit radikaleren Selektionen abhângig von deiti zu erzielenden Ergebnis, (2) Deletieren des Zielrests, oder (3) Einfügen von Resten der gleichen oder einer verschiedenen Klasse in Nachbarschaft zu der lokalisierten Stelle, oder Kombinatio-nen der Möglichkeiten 1-3.

Ein nützliches Verfahren zum Identifizieren von bestimmten Resten oder Regionen des mpl-Ligandenpolypeptids, die bevor-zugte Stellen für die Mutagenese sind, wird "Alanin-Scan-ning-Mutagenese" genannt, wie beschrieben von Cunningham und Wells, Science, 244:1081-1085 [1989]. Hierbei wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z.B. geladene Reste wie arg, asp, his, lys und glu) und ersetzt durch eine beliebige, aber vorzugsweise eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (am meisten bevorzugt sind Alanin oder Polyalanin), urn die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässerigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Diese Domänen, die sich gegenüber den Substitutionen als funktional sensitiv erweisen, werden dann weiter aufgeklärt durch Einfügen von weiteren oder anderen Varianten an den oder für die zu sie substituierenden Stellen. Während somit die Stelle für das Einfügen einer Ami- nosäuresequenzvariation vorab bestimmt ist, muß die Natur der Mutation per se nicht vorab bestimmt sein. Zum Beispiel wird zum Optimieren der Leistungsstärke einer Mutation an einer gegebenen Stelle ala-Scanning oder zufällige Mutagenese an dem Zielcodon oder -region durchgeführt, und die ex- primierten mpl-Ligandenvarianten werden nach der optimalen Kombination von gewünschter Aktivität abgesucht.

Es gibt zwei prinzipielle Variablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: die Lage der Mutationsstelle und die Natur der Mutation. Zum Beispiel umfassen mpI-Liganden-polypeptidvarianten solche Varianten der mpI-Ligandense-quenz, welche natürlich vorkommende Allele darstellen können (wobei dies nicht die Manipulation der mpl-Liganden-DNA verlangt) oder vorab bestimmte Mutantenformen werden erzeugt durch Mutieren der DNA, urn entweder bei einem Allel oder einer Variante anzugelangen, die nicht in der Natur vor-kommt. Im allgemeinen wird die Lage und die Natur der ge-wählten Mutation abhängen von der zu verändernden mpl-Ligan-deneigenschaft.

Aminosauresequenzdeletionen liegen üblicherweise in dem Be-reich von ungefähr 1-30 Resten, vorzugsweise bei ungefähr Ι-ΙΟ Resten, und sind üblicherweise zusammenhängend. Alterna-tiv können die Aminosauresequenzdeletionen für den mpl-Li-ganden einen Teil von oder die vollständige carboxyterminale Glycoproteindomäne erfassen. Aminosäuresequenzdeletionen können auch eine oder mehrere der ersten sechs aminotermi-nalen Reste des reifen Proteins umfassen. Gegebenenfalls um-fassen Aminosäuresequenzdeletionen einen oder mehrere Reste in einer oder mehreren der Loop-Regionen, die zwischen den "helikalen Bündeln (helical bundels)" existieren. Zusammen-hängende Deletionen betreffen üblicherweise eine geradzah-lige Anzahl an Resten, aber einzelne oder ungeradzahlige Deletionen werden ebenfalls hiervon umfaßt. Deletionen können in Regionen mit niedriger Homologie unter den mpl-Liganden eingeführt werden, die die größte Sequenzidentität teilen, urn die Aktivität des mpl-Liganden zu modifizieren. Oder Deletionen können in Regionen mit niedriger Homologie zwischen humanen mpl-Liganden- und anderen Säuger-mpI-Liganden-polypeptiden eingeführt werden, die die größte Sequenziden-tität zu dem humanen mpl-Liganden aufweisen. Deletionen aus einem Säuger-mpl-Ligandenpolypeptid in Bereichen von be trächtlicher Homologie mit anderen Säuger-mpl-Liganden werden eher die biologische Aktivität des mpl-Liganden in si-gnifikanter Weise ändern. Die Anzahl der zusammenhängenden Deletionen wird so ausgewählt, daß die Tertiärstruktur der mpl-Liganden in der betroffenen Domäne beibehalten wird, z.B. ein Beta-Faltblatt oder eine Alphahelix.

Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, die hinsichtlich der Länge in dem Bereich liegen von einem Rest bis zu Polypeptiden enthaltend 100 oder mehr Reste, wie auch Insertionen innerhalb der Sequenz aus einem oder mehreren Aminosäureresten. Insertio- nen innerhalb der Sequenz (Intrasequenzinsertionen) (d.h., Insertionen innerhalb der reifen mpl-Liganden-Sequenz) kön-nen üblicherweise ungefähr 1-10 Reste umfassen, vorzugsweise 1-5, ganz bevorzugt 1-3. Fine beispielhafte bevorzugte Fusion ist die des mpl-Liganden oder Fragments davon mit einem anderen Zytokin oder Fragment davon. Beispiele für terminale Insertionen umfassen den reifen mpl-Liganden mit einem N-terminalen Methionylrest, einem Art'efakt der direkten Expression des reifen mpl-Liganden in rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des reifen mpl-Ligandenmole-küls, urn die Sekretion des reifen mpl-Liganden aus rekombi-nanten Wirten zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im allgemeinen erhalten aus, und sind somit homolog zu, der beabsichtigten Wirtszellart. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. Coli, Alphafaktor für Hefe, und virale Sequenzen, wie Herpes gD für Säugerzellen.

Andere Insertionsvarianten des mpl-Ligandenmoleküls umfassen die Fusion an den N- oder C-Terminus des mpl-Liganden von immunogenen Polypeptiden (d.h., sie sind nicht endogen für den Wirt, an den die Fusion verabreicht wird), z.B. bakteri-elle Polypeptide wie Beta-Lactamase oder ein Enzym, das von dem E. Coli-trp-Lokus kodiert wird, oder Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteïnen mit einer langen Halb-wertszeit, wie den konstanten Regionen von Immunglobulinen (oder andere Immunglobulinregionen), Albumin Oder Ferritin, wie beschrieben in WO 89/02922, veröffentlicht am 6. April 1989.

Eine dritte Gruppe an Varianten sind Aminosäuresubstituti-onsvarianten. Bei diesen Varianten ist mindestens ein Ami-nosäurerest in dem mpl-Ligandenmolekül entfernt worden, und ein verschiedener Rest ist an dessen Stelle eingefügt worden. Die Stellen, die von größtem Interesse für die substi-tutionelle Mutagenese sind, umfassen Stellen, die als die aktive Stelle(n) des mpI-Liganden identifiziert worden sind, und Stellen, wo die Aminosauren, die in anderen Analoga ge-funden werden, beträchtlich verschieden sind hinsichtlich des Umfangs der Seitenkette, der Ladung oder der Hydrophobi-zität, aber auch wo ein hoher Grad an Sequenzidentität an der ausgewähltsn Stelle zwischen verschiedenen mpl-Ligan-denarten und/oder zwischen den verschiedenen Tieranaloga eines mpl-Ligandenmitglieds besteht.

Andere Stellen von Interesse sind solche, an denen spezielle Reste des mpI-Liganden, erhalten aus verschiedenen Familien-mitgliedern und/oder Tierarten für ein Mitglied identisch sind. Diese Stellen, insbesondere solche, die innerhalb einer Sequenz von mindestens drei weiteren identischen kon-servierten Stellen liegen, werden auf relativ konservative Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle 3 unter der Überschrift der bevorzugten Substitutionen aufgeführt. Wenn solche Substitutionen zu einer Ver-änderung der biologischen Aktivität führen, dann werden deutlichere Änderungen, bezeichnet als beispielhafte Substitutionen in Tabelle 3 oder wie unten weiter beschrieben in Bezugnahme auf Aminosäureklassen, eingeführt und die Pro-dukte untersucht.

Beträchtliche Modifikationen der Funktion oder der immunolo-gischen Identität des mpl-Liganden werden bewirkt durch Aus-wählen von Substitutionen, die sich deutlich unterscheiden hinsichtlich ihres Effekts auf das Beibehalten von (a) der Struktùr des Polypeptid-Backbones in dein Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder der Hydrophobizitât des Moleküls an der Zielstelle, oder (c) dein Umfang der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden in Gruppen eingeteilt, basierend auf den gemeinsamen Seitenketteneigenschaften: (1) Hydrophobe Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Neutral, hydrophile Cys, Ser, Thr; (3) Sauere Asp, Glu; (4) Basische Asn, Gin, His, Lys, Arge (5) Reste, die die Kettenanordnung beeinflussene Gly, Pro; und (6) Aromatisch: Trp, Tyr, Phe. • Nicht konservative Substitutionen machen einen Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen durch ein Mitglied einer anderen Klasse erforderlich. Solche substituierten Reste können auch in die konservative Substitutionen tragen-den Stellen eingeführt werden, aber mehr bevorzugt in die restlichen (nicht konservierten) Stellen.

Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es wün-schenswert, eine Oder mehrere Proteasespaltstellen, die in dem Molekül vorhanden sind, zu inaktivieren. Diese Stellen werden identifiziert durch Absuchen der kodierten Amino-säuresequenz, in dem Falie von Trypsin, z.B. nach einem Arginyl- oder Lysinylrest. Wenn Proteasespaltstellen identi-fiziert sind, werden diese inaktiv gemacht gegenüber proteo- t lytischer Spaltung durch Substituieren des Zielrests mit einem anderen Rest, vorzugsweise einem basischen Rest wie Glutamin oder einem hydrophoben Rest wie Serin; durch Dele-tieren des Rests; oder durch Einfügen eines Prolylrests un-mittelbar nach dem Resr.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird jeder Methionylrest, der nicht der Startmethionylrest der Signalsequenz ist, oder jeder Rest, der innerhalb von ungefähr 3 Resten N- oder C-terminal zu einem solchen Methionylrest liegt, substituiert durch einen anderen Rest (vorzugsweise in Übereinstimmung mit Tabelle 3) oder deletiert. Alternatif werden ungefähr 1-3 Reste benachbart zu solchen Stellen eingefügt.

Jeder Cysteinrest, der nicht an der Aufrechterhaltung der richtigen Konformation des mpl-Liganden beteiligt ist, kann auch ersetzt werden, im allgemeinen mit Serin, um die Oxida-tionsstabilitât des Moleküls und zufällige Vernetzung zu verhindern. Es ist gefunden worden, daß das erste und vierte Cystein in der EPO-Domäne, numeriert von dem Aminoterminus, notwendig sind zum Aufrechterhalten der richtigen Konformation, aber daß das zweite und dritte nicht erforderlich ist. Demzufolge kann das zweite und dritte Cystein der EPO-Domäne ersetzt werden.

Nukleinsäuremoleküle, die Aminosäuresequenzvarianten des jnpl-Liganden kodieren, werden hergestellt durch eine Viel- zah'l aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren. Diese Verfahren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sem, die Xso- lierung aus einem natürlichen Ausgangsmaterial (in dem Fail von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) oder die Herstellung durch Oligonukleotid-vermittelte (oder site-directed) Mutagenese, PCR-Mutagenese oder Kassetten-muta-genese einer früher hergestellten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version des mpl-Ligandenpolypeptids.

Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zum Erzeugen von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von mpl-Liganden-DNA. Diese Technik ist in dem Stand der Technik bekannt, wie beschrieben von Adelman et al., DNA, 2:183 [1983]. Kurz ausgeführt, mpl-Liganden-DNA wird verândert durch Hybridisieren eines Oligo-nukleotids, das die gewünschte Mutation kodiert, an eine DNA-Matrize, wobei die Matrize die Einzelstrangform eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, enthaltend die nicht ver-anderte oder native DNA-Sequenz des mpl-Liganden. Nach Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet zum Syn- thetisieren eines voliständigen zweiten komplementären Strangs der Matrize, der somit den Oligonukleotidprimer ein-gebaut enthält und der für die gewählte Veränderung in der mpl-Liganden-DNA kodiert. lm allgemeinen werden Oligonukleotide von mindestens 25 Nukleotiden Länge verwendet. Ein optimales Oligonukleotid besitzt zwölf bis 15 Nukleotide, die vollständig komplemen-tär zu der Matrize auf jeder Seite des bzw. der Nukleotide sind, das bzw. die für die Mutation kodieren. Dieses stellt sicher, daß das Oligonukleotid richtig an das einzelsträn-gige DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonukleotide können leicht synthetisiert werden mit Hilfe von Techniken, die in dem Stand der Technik bekannt sind, wie beschrieben von Créa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978].

Die DNA-Matrize kann von solchen Vektoren erzeugt werden, die entweder von Bakteriophagen M13-Vektoren (die gewerblich erhältlichen M13mpl8- und M13mpl9-Vektoren sind geeignet) oder von solchen Vektoren erhalten werden, die einen einzel-strängigen Phagenreplikationsursprung enthalten, wie beschrieben von Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Somit kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren eingefügt werden, urn eine einzelsträngige Matrize zu erzeu-gen. Das Herstellen der einzelsträngigen Matrize ist beschrieben in Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Alternativ kann eine einzelsträngige DNA-Matrize erzeugt werden durch Denaturieren eines doppelsträngigen Plasmids (oder anderer) DNA mit Hilfe von Standardtechniken.

Zum Verändern der nativen DNA-Sequenz (urn z.B. Aminosäure-sequenzvarianten zu erzeugen) wird das Oligonukleotid an die einzelsträngige Matrize unter geeigneten Hybridisierungs-bedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, normalerweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dazugesetzt, 'urn den komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren unter Verwendung des Oligonukleotids als einem Primer für die Synthese. Ein Hereroduplex wird somit derart gebildet, daß ein Strang der DNA die mutierte Form des mpl-Liganden kodiert, und der andere Strang (die ur-sprüngliche Matrize) kodiert die native, unveränderte Sequenz des mpl-Liganden. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, üblicher-weise einen Prokaryonten wie E. Coli JM101. Nachdem die Zeilen kultiviert wurden, werden sie auf Agaroseplatten aus-plattiert und abgesucht unter Verwendung des mit 32-Phosphor markierten Oligonukleotidprimers, um die Bakterienkolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mu- tierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion eingebracht, üblicherweise in einen Expressionsvektor des Typs, der üblicherweise verwen-det wird zur Transformation eines geeigneten Wirts.

Das oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein Homoduplexmolekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthält. DieModifikationen sind wie folgt: Das einzelsträngige Oligonukleotid wird an die doppelsträngige Matrize hybridisiert (annealed), wie oben beschrieben. Eine Mischung aus drei Desoxyribonukleoti-den, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wird mit einem modifizierten Thio-desoxyribocytosin, dCTP-(aS) genannt (das erhalten werden kann von Amersham Corporation), kombiniert. Diese Mischung wird zu dem Matrizen-Oligonukleotid-Komplex zuge-setzt. Bei Zusatz von DNA-Polymerase zu dieser Mischung wird ein zu der Matrize identischer DNA-Strang, außer der mutier ten Base, erzeugt. Weiterhin enthält dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP, was dazu dient, ihn vor der Restriktionsendonukleasespaltung zu schützen.

Nachdem der Matrizenstrang des doppelsträngigen Heteroduplexes mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten (nicked) worden ist, kann der Matrizenstrang abgebaut werden mit ExoIII-Nuklease Oder einer anderen geeigneten Nuklease, entlang der Region, die die zu mutagenisierende Stelle(n) enthält. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekiil zu-riickzulassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann ge-bildet mit Hilfe von DNA-Polymerase in der Anwasenheit aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase. Dieses Homoduplexmolekül kann in eine geeignete Wirtszelle, wie E. Coli JM101, transformiert werden, wie oben beschrie-ben. DNA, die mpl-Ligandenmutanten mit mehr als einer zu erset-zenden Aminosäure kodiert, kann auf mehreren Wegen herge-stellt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander lokalisiert sind, können sie gleichzeitig mutiert werden unter Verwendung eines Oligonukleotids, das für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Falls jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander (durch mehr als zehn Aminosäurereste getrennt) vorliegen, ist es schwieriger, ein einziges Oligonukleotid zu erzeugen, das alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren angewendet werden.

Bei dem ersten Verfahren wird ein separates Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligo-nukleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Matrizen-DNA hybridisiert, und der zweite DNA-Strang, der von der Matrize synthetisiert wird, kodiert für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen.

Das alternative Verfahren umfaßt zwei oder mehrere Runden der Mutagenese zum Erzeugen der gewünschten Mutante. Die erste Runde entspricht der für die einzige Mutation be-schriebenen: Wildtyp-DNA wird als Matrize verwendet, ein

Oligonukleotid, das die erste gewünschte Aminosäuresubstitu-tion(en) kodiert, wird an die Matrize hybridisiert, und das Heteroduplexmolekül wird dann erzeugt. Die zweite Runde der Mutagenese verwendet das mutierte DNA-Produkt aus der ersten Runde der Mutagenese als die Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligo-nukleotid, das die zusätzlich gewünschte Aminosäuresubstitu-tion(en) kodiert, wird dann an die Matrize hybridisiert, und der erhaltene DNA-Strang kodiert jetzt für Mutationen aus der ersten und zweiten Runde der Mutagenese. Diese erhaltene DNA kann als eine Matrize in einer dritten Runde der Mutagenese verwendet werden, usw. PCR-Mutagenese ist ebenfalls geeignet zum Herstellen von Aminosäurevarianten des mpl-Ligandenpolypeptids. Während sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, ist es selbst-verständlich, daß die Technik auch auf RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich iiu allgemeinen auf folgendes Verfahren (siehe Ehrlich, siehe oben, das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70) Wenn kleine Mengen an Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich leicht in der Seguenz von der entsprechen den Region in einer Matrizen-DNA unterscheiden, verwendet werden zum Erzeugen von relativ großen Mengen eines spezifi-schen DNA-Fragments, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen sich der Primer von der Matrize unterscheidet. Zum Einführen einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so entworfen, daß er mit der Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muß identisch sein mit einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs des Plasmids, aber diese Sequenz kann an beliebiger Stelle entlang dre Plasmid-DNA lokalisiert sein. Es wird jedoch bevorzugt, daß die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nukleo-tiden von der des ersten Primers lokalisiert ist, so daß am Ende die vollständige vermehrte Region der durch die Primer begrenzten DNA leicht sequenziert werden kann. Die Vermeh- rung durch PCR mit Hilfe eines Primerpaars, wie dem gerade beschriebenen, führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der durch den Primer festgelegten Stelle der Mutation unterscheidet und möglicherweise an anderen Positioned da das Kopieren der Matrize etwas fehleranfällig ist.

Wenn das Verhältnis von Matrize zu Produktmaterial extrem niedrig ist, enthält die große Mehrzahl der Produkt-DNA-Fragmente die gewünschte Mutation(en). Das Produktmaterial wird verwendet zum Ersetzen der entsprechenden Region in dem Plasmid, die als PCR-Matrize diente, unter Verwendung von DNA-Standardtechniken. Mutationen an getrennten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden entweder mit Hilfe eines mutierten zweiten Primers oder Durchfiihren einer zwei-ten PCR mit verschiedenen Mutantenprimern und gleichzeitiges Ligieren der zwei erhaltenen PCR-Fragmente an das Vektor-fragment in einer drei (Oder mehr) Teile umfassenden Ligation.

Bei einem speziellen Beispiel einer PCR-Mutagenese wird Matrizen-Plasmid-DNA (1 μς) linearisiert durch Spaltung mit einer Restriktionsendonuklease, die eine einzige Erkennungs-stelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu vermehrenden Region besitzt. Von diesem Material werden 100 ng zu einer PCR-Mischung zugesetzt enthaltend PCR-Puffer, der die vier Desoxynukleotidtriphosphate enthält, und der in den GeneAmpO-Kits (erhalten von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) enthalten ist, und der 25 pMol eines je-den Oligonukleotidprimers enthält, und auf ein Endvolumen von 50 μΐ eingestellt. Die Reaktionsmischung wird mit 35 μΐ Mineralöl iiberschichtet. Die Reaktionsmischung wird für 5 min bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gebracht, und dann wird 1 μΐ Thermus aquaticus (Taq)-DNA-Polymerase (5 Einhei-ten/μΐ, bezogen von Perkin-Elmer Cetus) unterhalb der Mine-ralölschicht zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird dann in einen DNA Thermal Cycler (bezogen von Perkin-Elmer Cetus) eingeführt, der wie folgt programmiert ist: 2 min 55 °C, 30 s 72°C, dann 19 Zyklen wie folgt: 30 s 94°C, 30 s 55°C und 30 s 72°C.

Am Ende des Programms wird das Reaktionsgefäß aus dem Thermal Cycler entfernt, und die wasserige Phase wird in ein neues Gefäß überführt, mit Phenol/Chlcroform (50/50 Volumen) extrahiert, und mit Ethanol präzipitiert, und die DNA wird nach Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird an-schließend den geeigneten Behandlungen zum Einfügen in einen Vektor unterzogen.

Ein anderes Verfahren zum Herstellen von Varianten, Kasset-tenmutagenese, basiert auf der Technik, wie beschrieben von Wells et al., Gene, 34:315 [1985]. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (Oder ein anderer Vektor) enthaltend die zu mutierende mpl~Liganden-DNA. Das bzw. die zu mutierenden Codon(s) in der mpl-Liganden-DNA werden identifiziert. Es muß eine nur einmal vorkommende Restriktionsendonuklease-spaltstelle auf jeder Seite der identifizierten Mutations-stelle(n) vorhanden sein. Falls solche Restriktionsspalt- stellen nicht vorkommen, können sie erzeugt werden mit Hilfe der oben beschriebenen Oligonukleotid-vermittelten Mutagene- semethode, um sie an geeigneten Stellen in die mpl-Liganden-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsspaltstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppel-strängiges Oligonukleotid, das die DNA-Seguenz zwischen den Restriktionsspaltstellen kodiert, aber die gewünschte Mutation (en) enthält, wird synthetisiert mit Hilfe von Standardverfahren. Die zwei Stränge werden separat synthetisiert und dann miteinander hybridisiert unter Verwendung von Standard- techniken. Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so ausgestaltet, daß es 3'- und 5'-Enden besitzr, die mit den Enden des line-arisierten Plasmids kompatibel sind, so daß sie direkt mit dem Plasmid ligiert werden können. Dieses Plasmid enthält jetzt die mutierte mpl-Liganden-DNA-Sequenz. C. Einfügen einer Nukleinsäure in einen replizierbaren Vek-tor

Die Nukleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die ein natives oder verändertes mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Vermehrung (Amplifikation) dor DNA) Oder zur Expression eingeführt. Viele Vektoren sind verfügbar, und die Auswahl des geeigneten Vektors hängt ab von (1) ob er verwendet werden soil zur DNA-Vermehrung oder zur DNA-Expression, (2) der Größe der in den Vektor einzuführenden Nukleinsäure und (3) der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Bestandteile, abhängig von seiner Funktion (Vermehrung von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. Die Vektor-bestandteile umfassen im allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein, eines oder mehrere der folgenden Elemente: Eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. (i) Signalsequenzbestandteil

Der erfindungsgemäße mpI-Ligand kann nicht nur direkt expri-miert werden, sondern auch als Fusion mit einem heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle an dem N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids. Im allgemeinen kann die Signalsequenz einen Bestandteil des Vektors bilden, oder sie kann einen Teil der mpl-Liganden-DNA dar stellen, die in den Vektor eingefiihrt wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz sollte eine Sequenz sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h., durch die Signalpeptidase abgespalten) wird. Für prokaryontische Wirtszellen, die die native mpl~Liganden-Signalsequenz nicht erkennen und nicht prozessieren, wird die Signalsequenz er-setzt durch eine prokaryontische Signalsequenz, ausgewählt aus z.B. der Gruppe der Leader der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp Oder des wärmebeständigen Enterotoxins II. Für die Hefesekretion kann die native Signalsequenz er-setzt werden durch z.B. die Leader der Hefeinvertase, des Alphafaktors oder der sauren Phosphatase, den C. albicans-Glucoamylaseleader (EP 362,179, veröffentlicht am 4. April 1990) Oder das Signal, wie beschrieben in WO 90/13646, veröf fentlicht am 15. November 1990. Bei der Expression in Säu-gerzellen ist die native Signalsequenz (d.h., die mpl-Ligan-den-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion des mpl-Liganden aus· seinen natürlichen Säugerzellen in vivo steu-ert) zufriedenstellend, obwohl andere Säugersignalsequenzen geeignet sein können, wie Signalsequenzen von anderen mpl-Ligandenpolypeptiden oder von dein gleichen mpl-Liganden aus einer verschiedenen Tierart, Signalsequenzen von einem mpl- Liganden, und Signalsequenzen von sezernierten Polypeptiden der gleichen Oder verwandten Art, wie auch virale sekretori-sche Leader, z.B. das Herpes Simplex gD-Signal. (ii) Replikationsursprungsbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nuklein-säuresequenz, die es dem Vektor erlaubt, in einer oder meh reren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemei-nen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine Sequenz, die es dem Vektor erlaubt, sich unabhängig von der chromoso-malen Wirts-DNA zu replizieren, und umfaßt Replikations-ursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und

Viren bekannt. Der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 ist fiir die meisten Gram-negativen Bakterieri geeignet, der Replikationsursprung des 2 μ-Plasmids ist fiir Hefe geeignet, und verschiedene virale Replikationsursprünge (SV40,

Polyoma, Adenovirus, VSV Oder BPV) sind brauchbar fiir Klo-nierungsvektoren in Säugerzellen. Im allgemeinen wird der Replikationsursprungsbestandteil nicht benötigt fiir Säu-gerexpressionsvektoren (der SV40-Replikationsursprung wird iiblicherweise nur verwendet, weil er den Early-Promotor ent-hält).

Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle" -Vektoren, d.h., sie sind mindestens in einer Klasse an Organismen fä-hig zur Replikation, aber sie können in einen anderen Orga-nismus fiir die Expression transfektiert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor in E. Coli kloniert, und dann wird der glei-che Vektor in Hefe oder Säugerzellen zur Expression transfektiert, obwohl er nicht in der Lage ist, sich unabhängig von dem Wirtszellchromosom zu replizieren. DNA kann auch vermehrt werden durch Einfiigen in das Wirts- genom. Dies wird leicht erzielt unter Verwendung von Bacil- lus-Arten als Wirt, z.B. durch Einbringen einer DNA-Sequenz in den Vektor, die komplementär ist zu einer Sequenz, die in genomischer DNA von Bacillus vorkommt. Die Transfektion von

Bacillus mit dem Vektor führt zu homologer Rekombination mit dem Genom und dem Einbau der mpl-Liganden-DNA. Jedoch ist das Gewinnen von genomischer DNA, die den mpl-Liganden ko- diert, komplexer als die Gewinnung eines exogen replizieren-* den Vektors, da Restriktionsenzymspaltung erforderlich ist, urn die mpl-Liganden-DNA auszuschneiden. (iii) Selektionsgenbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektions-gen, auch Selektionsmarker genannt, enthalten. Dieses Gen kodiert fiir ein Protein, das notwendig ist für das Überleben

Oder Wachstum der transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium kultiviert werden. Wirtszellen, die mit dem Vektor, enthaltend das Selekticnsgen, nicht trans-formiert sind, werden in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verlei- hen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat Oder Tetra-cyclin, Oder (b) auxotrophe Mangel komplementieren, oder (c) kritische Nahrungsmittel bereitstellen, die in komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen kodierend für D-Alanin-Racemase für Bacilli.

Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet einen Wirk-stoff, urn das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Solche Zeilen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transfor-miert sind, exprimieren ein Protein, das eine Wirkstoff-resistenz verleiht, und diese überleben somit das Selekti- onsverfahren. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin (Southern et al., J.

Molec. Appl. Genet., 1:327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 [1985]). Die drei oben gegebenen Beispiele verwenden bakterielle Gene un-ter eukaryontischer Kontrolle, um die Resistenz zu verleihen gegen den geeigneten Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsâure) bzw. Hygromycin.

Beispiele für andere geeignete selektierbare Marker für Sâu-gerzellen sind solche, die die Identifizierung von Zeilen erlauben, die die mpl-Liganden-Nukleinsaure aufnehmen kôn-nen, wie Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Die trans-formierten Sâugerzellen werden derart unter Selek- tionsdruck gebracht, daß nur die Transformanden in einzig-artiger Weise an das Überleben angepaßt sind, indem sie den Marker aufgenommen haben. Selektionsdruck wird auferlegt durch Kultivieren der Transformanden unter Bedingungen, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels in dem Medium sukzessiv geändert wird, wobei dadurch die Amplifikation von sowohl dem Selektionsgen wie auch der DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, erfolgt. Amplifikation ist der Vorgang, bei dem Gene, nach denen ein größerer Bedarf für die Produktion eines für das Wachstum kritischen Proteins besteht, in Tandem nacheinander wiederholt werden in den Chromosomen von nachfolgenden Generationen der rekombinanten Zeilen. Gesteigerte Mengen an mpl-Ligand werden von der amplifizierten DNA synthetisiert.

Zum Beispiel werden mit dem DHFR-Selektionsgen transfor-mierte Zeilen zunächst identifiziert durch Kultivieren aller Transformanden in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx) enthält, einen kompetitiven Antagonisten von DHFR. Eine ge-eignete Wirtszelle, falls Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die Ovarienzellinie des chinesischen Hamsters (CHO), die einen Mangel der DHFR-Aktivität aufweist; hergestellt und kultiviert, wie beschrieben von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]. Die transformierten Zeilen werden dann erhöhten Spiegeln an Mtx ausgesetzt. Dies führt zu der Synthese von multiplen Kopien an dem DHFR-Gen und gleichzeitig zu multiplen Kopien an anderer DNA, die die Expressionsvektoren umfassen, wie die DNA, die den mpl-Liganden kodiert. Diese Amplifikationstechnik kann in belie-bigen anderen geeigneten Wirten verwendet werden, zum Beispiel ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Anwesenheit von endogenem DHFR, falls z.B. ein mutiertes DHFR-Gen verwendet wird, das gegenüber Mtx hochresistent ist (EP 117,060). Alternativ können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogenes DHFR enthalten) transformiert oder cotransfor-miert mit DNA-Sequenzen, die den mpl-Liganden, Wildtyp-DHFR-Protein und andere selektierbare Marker, wie Aminoglycosid-31-phosphotransferase (ΑΡΗ) kodieren, selektiert werden über das Zellwachstum in Medium enthaltend ein Selektionsmittel für den Selektionsmarker, wie ein Aminoglycosid-Antibioti-kum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418. Siehe auch U.S.-PS 4,965,199.

Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trpl-Gen, das in dem Hefeplasraid YRp7 vorkómmt (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979] oder Tschemper et al., Gene, 10:157 [1980]). Das trpl-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutanten-stamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit zum Wachsen in Tryptophan fehlt, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Die Anwesenheit der trpl-Läsion in dem Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in der Abwe-senheit von Tryptophan dar. Ähnlich werden Hefestämme mit einem Leu2-Mangel (ATCC Nr. 20,622 oder 38,626) komplemen-tiert durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen enthalten. (iv) Promotorbestandteil

Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten iiblicherweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und der funktionsfähig verknüpft ist mit der mpl-Liganden-Nukleinsäure. Promotoren sind nicht-translatierte Sequenzen, die stromaufwärts (51) von dem Startcodon eines Strukturgens gelegen sind (im allgemeinen innerhalb von ungefähr 100 bis 1000 bp), die die Transkription und Translation von einer speziellen Nukleinsäuresequenz, wie der mpl-Liganden-Nukleinsäuresequenz, mit der sie funktionsfähig verknüpft sind, kontrollieren. Solche Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die die gesteigerten Spiegel der Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle in Antwort auf eine Änderung in den Kulturbedingungen initiieren, z.B. der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder einer Än-derung der Temperatur. Zum jetzigen Zeitpunkt sind eine große Anzahl an Promotoren bekannt, die von einer Vielzahl von potentiellen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden funktionsfähig mit einer den mpl-Liganden kodie-renden DNA verknüpft durch Entfernen des Promotors aus der

Ausgangsmaterial-DNA durch Restriktionsenzymspaltung und Einfügen der isollerten Promotorsequenz in den Vektor. So-wohl die native mpl-Liganden-Promotorsequenz wie auch viele heterologe Promotoren können verwendet werden zum Steuern der Amplifikation und/oder Expression der mpl-Liganden-DNA. Jedoch sind heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im all-gemeinen eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten mpI-Liganden liefern, im Vergleich zu dem nativen mpl-Liganden-Promotor. Für die Verwendung in prokaryontischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die ß-Lactamase- und Lactose-Promotor-systeme (Chang et al., Nature, 275:615 [1978]; und Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] und EP 36,776) und hybride Promotoren, wie der tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Jedoch sind andere bekannte bakteri-elle Promotoren geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen sind ver-öffentlicht worden, wodurch der Durchschnittsfachmann in die Lage versetzt wird, sie funktionsfëhig mit der DNA zu ligie-ren, die den mpl-Liganden kodiert (Siebenlist et al., Cell, 20:269 [1980]), bei Verwendung von Linkern und Adaptoren, urn erforderliche Restriktionsspaltstellen bereitzustellen. Promotoren für die Verwendung in bakteriellen Systemen enthal-ten auch eine Shine-Dalgarno (S.D.)-Sequenz, die funktions-fâhig verknüpft ist mit der DNA, die das mpl-Ligandenpoly-peptid kodiert.

Promotorsequenzen sind für Eukaryonten bekannt. Praktisch alle eukaryontischen Gene besitzen eine AT-reiche Region, die ungefähr 25 bis 30 Basen stromaufwërts von der Stelle, an der die Transkription eingeleitet wird, lokalisiert ist. Eine andere Sequenz, die 70-80 Basen stromaufwërts von dem Start der Transkriptionen bei vielen Genen gefunden wird, ist die CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nukleotid sein kann. An dent 3'-Ende der meisten eukaryontischen Gene befin-det sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für das Anfügen des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz darstellen kann. Alle diese Sequenzen befinden sich in ge-eigneter Weise in eukaryontischen Expressionsvektoren.

Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 [1980]) Oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968] und Holland, Biochemistry, 17.4900 [1978]), wie von Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydroge-nase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyru-vatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.

Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind mit dem weiteren Vorteil der durch die Kultivierbedingungen kon-trollierten Transkription, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom c, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assozi iert sind, Metallothionin, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydro-genase, und Enzyme für die Maltose- und Galactoseverwertung. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Expression in Hefe sind weiterhinbeschrieben bei Hitzeman et al., EP 73,657A. Hefe-Enhancer werden ebenfalls in vorteil-hafter Weise verwendet mit Hefepromotoren.

Die mpl-Liganden-Transkription von Vektoren in Säugerwirts-zellen wird beispielsweise kontrolliert von Promotoren er-halten aus den Genomen von Viren, wie Polyomavirus, Hühner-pockenvirus (UK 2,211,504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinderpapillomvirus, Vögel-sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Vlrus und besonders bevorzugt Simian Virus 40 (SV40), von heterologen Säugerpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, von Heat-Shock-Promotoren und von dein Promotor, der normalerweise assoziiert ist mit der mpl-Ligandensequenz, vorausgesetzt, daß solche Promotoren mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.

Die frühen und späten Promotoren (early und late) des SV40-Virus werden leicht erhalten als eirt SV40-Restriktiönsfrag-ment, das auch den SV40-viralen Replikationsursprung ent-hält. Fiers et al., Nature, 273:113 [1978], Mulligan und Berg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 [1981]. Der Immediate-Ear ly-Promotor des humanen Zytomegalovirus wird geeigneter-weise erhalten als ein HindlII-E-Restriktionsfragment. Greenaway et al., Gene, 18:355-360 [1982]. Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugerwirten unter Verwendung des Rinderpapilloravirus als Vektor ist offenbart in U.S.-PS 4,419,446. Eine Modifikation dieses Systems ist beschrieben in U.S.-PS 4,601,978. Siehe auch Gray et al., Nature, 295:503-508 [1982] zum Exprimieren von Immuninterferon-ko-dierender cDNA in Affenzellen; Reyes et al., Nature, 297:598-601 [1982] zum Exprimieren von humaner ß-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thymidin-kinasepromotors vom Herpes Simplex Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 [1982] zur Expression des humanen Interferon-ßl-Gens in kultivierten Mäuse-und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 [1982] zur Expression von bakterlellen CAT-Seguenzen in CV-l-Affennierenzellen, Hühnerembryo-fibroblasten, Ovarzellen des chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung'des langen endständigen Repeats (LTR) von Rous-Sarcoma-Virus als 'einem Promotor. (v) Enhancerelementbestandteil

Die Transkription einer DNA, die den erfindungsgemäßen mpl-Liganden kodiert, wird in höheren Eukaryonten of trials ge-steigert durch Einfiigen einer Enhancersequenz in den Vektor. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise ungefähr 10-300 bp lang, die einen Promotor beeinflussen, um dessen Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ un-abhängig von der Orientierung und der Position, una sie sind 51(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981]) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3:1108 [1983]) von der Transkriptionseinheit, innerhalb von Introns (Banerji et al., Cell, 33:729 [1983]) wie auch innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984]) gefunden worden. Viele Enhancersequenzen sind von Säugergenen her bekannt (Globin, Elastase, Albumin, a-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer von einem eukaryontischen Zellvirus verwenden. Beispiel.e umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite (late side) des Replikationsursprungs (bp 100-270), den Cytomegalovirus-Early-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite (late side) des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature, 297:17-18 [1982] über Enhancerelemente zum Aktivieren von eukaryontischen Promotoren. Der Enhancer kann in einen Vektor eingefügt werden in einer Position 5' Oder 3' zu der mpl-Liganden-kodierenden Sequenz, aber er wird vorzugsweise an einer Stelle 5' von dem Promotor angebracht. (vi) Transkriptionsterminationsbestandteil

Expressionsvektoren zur Verwendung in eukaryontischen Wirts-zellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch, oder kernhaltige Zeilen von anderen multizellulären Organismen) enthalten auch Sequenzen, die notwendig sind zur Termination der Transkription und der Stabilisierung der mRNA. Solche Sequenzen sind üblicherweise erhältlich von den 5'- und manchmal von den 3'- nicht-translatierten Regionen von eukaryontischen Oder viralen DNAs Oder cDNAs. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in dem nicht-translatierten Anteil der mRNA, die den mpl-Liganden kodiert, transkribiert werden. (vii; Konstruktion und Analyse der Vektoren

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, enthaltend einen Oder mehrere der oben aufgelisteten Bestandteile, verwendet Standardligationstechniken. Isolierte Plasmid- Oder DNA-Fragmente werden gespalten, am Ende verlängert (tailored) und erneut in der gewiinschten Form ligiert, urn das erforder-liche Plasmid zu erzeugen.

Als Analyse zum Bestätigen der richtigen Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen verwendet zum Transformieren von E. Coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31,446), und erfolgreiche Transformanden werden durch Ampicillin- Oder Tetracyclinresistenz, wo dies geeignet er-scheint, selektiert. Plasmide aus den Transformanden werden hergestellt, analysiert durch Restriktionsendonukleasespal-tung und/Oder Sequenzieren nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] Oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 [1980]. (viii) Transiente Expressionsvektoren

Besonders nützlich bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die die transiente Expression in Säugerzellen von DNA bereitstellen, die das mpl-Liganden-polypeptid kodieren. Im allgemeinen umfaßt die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle wirksam zu replizieren, so daß die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akku-muliert und deshalb hohe Spiegel an einem gewiinschten Poly-peptid, kodiert durch den Expressionsvektor, synthetisiert. Sambrook et al., siehe oben, S. 16.17-16.22. Transiente

Expressionssysteme, uiafassend einen geeigneten Expressions-vektor und eine Wirtszelle, erlauben sowohl die leichte positive Identifizierung von Polypeptiden, kodiert durch die klonierten DNAs, wie auch das rasche Absuchen solcher Polypeptide nach der gewünschten biologischen oder physiologi-schen Eigenschaft. Somit sind transiente Expressionssysteme besonders nützlich bei der vorliegenden Erfindung für die Zwecke des Identifizierens von Analoga und Varianten des mpl-Ligandenpolypeptids, die die biologische Aktivität des mpl-Ligandenpolypeptids besitzen. (ix) Geeignete beispielhafte Vektoren für Vertebratzellen

Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die geeignet sind zur Anpassung an die Synthese des mpl-Liganden in re-kombinanten Vertebratzellkulturen, sind beschrieben in Gething et al., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46 [1979]; Levinson et al.; EP 117,060; und EP 117,058. Ein besonders nützliches Plasmid für die Expression von mpl-Ligand in Säugerzellkultur ist pRK5 (EP 307,247, U.S.-PS 5,258,287) oder pSV16B (PCT-Veröffentli-chung WO 91/08291) . D. Selektion und Transformation von Wirtszellen

Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der Vektoren hierin sind die prokaryontischen, Hefe- oder höheren eukaryontischen Zeilen, wie oben beschrieben. Geeignete Pro- karyonten umfassen Eubakterien, wie Gram-negative oder Gram-positive Organismen, z.B. E. Coli, Bacilli wie B. Subtilis, Pseudomonas-Arten wie P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oer Sèrratia marcescans. Ein bevorzugter E. Coli-Klonie-rungswirt ist E. Coli 294 (ATCC Nr. 31,446), obwohl andere Stämme, wie E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC Nr. 31,537) und E. Coli W3110 (ATCC Nr. 27325) geeignet sind. Diese Bei-spiele sind vielmehr erläuternd als beschränkend. Vorzugs-weise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolyti- schen Enzymen sezernieren. Alternativ sind auch in· vitro-Verfahren zum Klcnieren, z.B. PCR oder andere Nukleinsäure-polymerasereaktionen, geeignet.

Zusätzlich zu Prokaryonten sind eukaryontische Mikroben, wie filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Wirte für die mpl-Liganden-kodierenden Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder die herkömmliche Bäckerhefe sind die am meisten verwendeten Organismen unter den niederen eukaryontischen Wirtsmikro-organismen. Jedoch sind eine Vielzahl an anderen Gattungen, Arten und Stämmen allgemein erhältiich und hierin brauchbar, wie Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 [1981],* EP 139,383, veröffentlicht 2. Mai 1985), Kluyveromyces-Wirte (US-PS 4,943,529) wie z.B. K. lactis (Louvenourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans und K. marxianus, yarrowia (EP 402,226), Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1938]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]), und filamentöse Pilze wie z.B. Neurospora, Pénicillium, Toly-pocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991), und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983], Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -81:1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4:475-479 [1985]).

Geeignete Wirtszellen für die Expression von glycosyliertem mpI-Ligand werden von multizellulären Organismen erhalten. Solche Wirtszellen sind zum komplexen Prozessieren in der Lage und besitzen Glycosylierungsaktivitäten. Grundsätzlich ist jede beliebige höhere eukaryontische Zellkultur einsetz-bar, ob von einer Vertebraten- oder Invertebratenkultur. Beispiele für Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und korrespondierende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melano-gaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori sind identifiziert worden. Siehe z.B. Luckcw et al., Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277-279; und Maeda et al., Nature, 315:592-594 [1985]. Eine Vielzahl von viralen Stämmen zur Transfektion sind öffentlich erhältlich, z.B. die L-l-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als das Virus gemäß der Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen.

Pflanzenzellkulturen aus Baumwolle, Getreide, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen trans-fektiert durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakte-riums Agrobacterium tumefaciens, das zuvor manipuliert worden ist, urn die mpl-Liganden-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die· DNA, kodierend den mpl-Liganden, in die Pflanzenwirts-zelle übertragen, so daß diese transfektiert wird, und sie wird unter geeigneten Bedingungen die mpl-Liganden-DNA ex-primieren. Weiterhin sind regulatorische und Signalsequen-zen, die mit den Pflanzenzellen kompatibel sind, verfügbar, wie der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignal-sequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]. Weiterhin können DNA-Segmente, isoliert aus der stromaufwärts gelegenen Region des T-DNA-780-Gens, die Transkriptionsspiegel von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinantera DNA-haltigem Pflanzengewebe aktivieren oder steigern. EP 321,196, veröffentlicht am 21. Juni 1989.

Jedoch war das Interesse an Vertebratenzellen am größten, und die Vermehrung von Vertebratzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren ein Routineverfah- ren geworden (Tissue Culture, Academie Press, Kruse und Patterson, Hrsg. [1973]). Beispiele für nützliche Säuger-wirtszellinien sind die Affennierenlinie CV1, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), die humane embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ova-rienzellen des chinesischen Hamsters/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]) ; Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); Hundenieren-zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Leberzellen der Buffaloratte (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065) ; Mäusebrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 333:44-68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zel-len; und humane Hepatomazellinie (Hep G2).

Die Wirtszelien werden transfektiert und vorzugsweise trans-formiert mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klo-nierungsvektoren gemäß der Erfindung und kultiviert in her-kömmlichen Nährmedien, in geeigneter Weise modifiziert zum Induzieren der Promotoren, dem Selektieren der Transforman-den oder dem Amplifizieren der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren.

Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressi-onsvektors durch eine Wirtszélle, unabhängig davon, ob ko-dierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden. Zahlreiche Verfahren zur Transfektion sind dem Fachmann bekannt, z.B. CaPÜ4 und Elektropora'tion. Eine erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen angenommen, wenn innerhalb der Wirts-zelle ein Hinweis auf das Funktionieren des Vektors auf-tritt.

Transformation bedeutet Eindringen einer DNA in einen Orga-nismus, so daß die DNA replizierbar ist, entweder als ex-trachromosomales Element Oder durch chromosomale Integration. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation durchgefiihrt unter Verwendung von Standard-techniken, die für diese Zeilen geeignet sind. Die Calcium-behandlung, bei der Calciumchlorid verwendet wird, wie be-schrieben in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben, wird üblicherweise verwendet für Prokaryonten oder andere Zeilen, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die In-fektion mit Agrobacterium tumefaciens wird verwendet zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen, wie beschrie-ben von Shaw et al., Gene, 23:315 [1983] und WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989. Weiterhin kônnen Pflanzen transfektiert werden mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung, wie beschrieben in WO 91/00358, veröffentlicht am 10. Januar 1991. Für Säugerzellen ohne Zellwände ist die Calciumphos-phatprazipitationsmethode von Graham und van der Eb, Virology, 52:456-457 [1978] bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Transformationen von Säugerwirtszellsystemen sind beschrieben von Axel in U.S.-PS 4,399,216, herausgegeben am 16. August 1983. Transformationen in Hefe werden, typischer-weise ausgeführt gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 [1977] und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 [1979]. Jedoch konnen auch andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zeilen, wie die Injek-tion in Kerne, Elektroporation Oder Protoplastenfusion verwendet werden. E. Kultivieren der Wirrszellen

Prokaryontische Zeilen, die verwendet werden zum Herstellen des erfindungsgemäßen mpl-Ligandenpolypeptids, werden in ge-eigneten Medien kultiviert, wie allgemein beschrieben in Sambrook et al., siehe oben.

Die Säugerwirtszellen, die verwendet werden zum Herstellen des erfindungsgemäßen mpI-Liganden, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Gewerblich erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) sind geeignet zum Kultivieren der Wirtszellen. Weiterhin kann ein beliebiges Medium, wie be-schrieben in Ham und Wallace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Barnes und Sato, Anal. Biochem., 102 : 255 . [1980], U.S.-PS 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; Oder 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S.-PS 30,985 (Reissue), oder das ebenfalls anhängige U.S.S.N. 07/592,107 oder 07/592,141, beide eingereicht am 3. Oktober 1990, als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie gefordert ergänzt werden mit Hormonen und/oder anderen Wachsturnsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nukleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin™-Wirk-stoff), Spurenelemente (definiert als anorganische Verbin-dungen, die üblicherweise in einer Endkonzentration in dem mikromolaren Bereich vorhanden sind), und Glucose oder eine Mquivalente Energiequelle. Jede andere notwendige Ergänzung kann ebenfalls mit geeigneten Konzentrationen enthalten • sein, die dem Fachmann geläufig sind. Die Kultivrerbedingun-gen, wie Temperatur, pH und ähnliches, sind diejenigen, wie zuvor verwendet für die zur Expression ausgewählte Wirts-zelle, und sie sind dem Fachmann geläufig.

Die Wirtszellen, auf die in der vorliegenden Offenbarung Be-zug genommen wird, umfassen Zeilen in m vicro-Kultur wie auch Zeilen, die in einem Wirtstier vorliegen. F. Nachweis der Genamplifikation/Expression

Genamplifikation und/oder Expression kann in einer Analysen-probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotten, Northern-Blotten, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder durch in situ-Hybridisierung mit Hilfe einer geeigneten markierten Probe, basierend auf den direkt bereitgestellten Sequenzen. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am üb-lichsten sind Radioisotope, insbesondere P. Jedoch können auch andere Techniken verwendet werden, wie die Verwendung von Biotin-modifizierten Nukleotiden zum Einbau in ein Polynukleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl an Markierungen markiert sein können, wie Radionukliden, Fluo-reszenzstoffen, Enzymen oder ähnliches. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexstruktu-ren erkennen, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe oder DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Assay kann ausge-führt werden, wobei der Duplex an eine Oberflâche gebunden ist, so daß durch die Bildung eines Duplex auf der Oberflâche die Anwesenheit eines Antikörpers, gebunden an den Duplex, nachgewiesen werden kann.

Die Genexpression kann alternativ gemessen werden mit immu-nologischen Verfahren, wie einem immunhistochemischen Färben von Gewebeschnitten, und einem Assay mit der Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbetech-niken wird eine Zellanalysenprobe hergestellt, typischer-weise durch Dehydratisierung und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die spezifisch für das Genprodukt sind, wobei die Markierungen üblicherweise durch Betrachtung nachweisbar sind, wie enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und ähnli-che. Eine besonders sensitive Färbetechnik, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist be- schrieben von Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 [1980].

Antikörper, die für die immunhistochemische Färbung und/oder den Assay mit Analysenprobeflüssigkeiten brauchbar sind, können entweder monoklonal Oder polyklonal sein, und sie können in einem beliebigen Säuger hergestellt werden. Gaeig-neterweise können die Antikörper hergestellt werden gegen ein natives mpl-Ligandenpolypeptid oder gegen ein syntheti-sches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, wie unten weiter beschrieben. G. Reinigung von mpl-Ligandenpolypeptid

Mpl-Ligand wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium gewonnen als ein sezerniertes Polypeptid, obwohl es auch aus Wirts-zelllysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt exprimiert wird ohne sekretorisches Signal.

Wenn mpl-Ligand exprimiert wird in einer anderen rekombinan-ten Zelle als der des humanen Ursprungs, ist der mpl-Ligand vollkommen frei von Proteïnen Oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Jedoch ist es üblicherweise immer noch notwendig, den mpl-Liganden von anderen rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu befreien, urn Präparationen zu erhalten, die im wesentlichen homogen sind hinsichtlich des mpl-Ligan-den per se. Als ein erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, urn partikuläre Zelltrümmer zu ent-fernen. Die Membran- und löslichen Proteinfraktionen werden dann getrennt. Alternativ kann ein gewerblich erhältlicher Filter zur Proteinkonzentrierung (z.B. Amicon Oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheiten) verwendet werden. Der mpl-Ligand kann dann aus der löslichen Proteinfraktion und der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden, ab-hängig davon, ob der mpl-Ligand membrangebunden ist. Danach wird der mpl-Ligand von kontaminierenden löslichen Proteïnen und Polypeptiden gereinigt durch Aussalzen und Austausch

Oder durch chroraatographische Verfahren unter Verwendung verschiedener Gelmatrixmaterialien. Diese Matrixmaterialien umfassen Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose und andere übliche Materialien zur Proteinreinigung. Beispielhafte chroraatographische Verfahren, die zur Proteinreinigung ge-eignet sind, umfassen Imraunaffinität (z.B. anti-hmpl-Ligand Mab), Rezeptoraffinität (z.B. mpl-IqG Oder Protein-A-Sepha-rose), hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) (z.B. Ether-, Butyl- Oder Phenyl-Toyopearl), Lectinchromatograpnie (z.B. Con A-Sepharose, Lentil-Lectin-Sepharose), Größenaus-schluß (z.B. Sephadex G-75), Kationen- und Anionenaus-tauschersäulen (z.B. DEAE oder Carboxyraethyl- und Sulfo-propylcellulose), und Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit Umkehrphase (RP-HPLC) (siehe z.B. Urdal et al., J. Chroraatog., 295:171 [1984], wo zwei nacheinander folgende RP-HPLC-Schritte verwendet werden zum Reinigen von rekombi-nantem humanera IL-2) . Andere Re.inigungsschritte umf assen ge-gebenenfalls Ethanolpräzipitation, Ammoniumsulfatpräzipita-tion, Chromatofokussierung, präparative SDS-PAGE und ähnli-ches.

Mpl-Liganden-Varianten, bei denen Reste deletiert, eingefügt oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche Weise wie nativer mpl-Ligand gewonnen, wobei ihre wesentliche Än-derung in den Eigenschaften, hervorgerufen durch die Variation, berücksichtigt wird. Zum Beispiel erleichtert Herstellen einer mpl-Liganden-Fusion mit anderem Protein Oder Poly-peptid, z.B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung," eine Immunaffinitätssäule, enthaltend Antikörper gegen das Antigen, kann verwendet werden zum Adsorbieren des Fusionspolypeptids. Immunaffinitätssäulen, wie eine Säule enthaltend polyklonales Kaninchen-Anti-mpl-Ligandenserum, kann verwendet werden zum Adsorbieren der mpl-Liganden-Variante durch Binden an mindestens ein verbleibendes Immunepi-top. Alternativ kann der mpI-Ligand gereinigt werden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von gereinigtem mpl-IqG, gekoppelt an (vorzugsweise) immobilisiertes Harz, wie Affi-Gel 10 (Bio-Rad,. Richmond, CA) oder ähnliches, durch im Stand der Technik bekannte Mittel. Ein Protease-inhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann eben-falls nützlich sein zum Hemmen von proteolytischem Abbau während der Reinigung, und Antibiotika können eingesetzt werden, urn das Wachstum von zufälligen kontaminierenden Organismen zu verhindern. Der Fachmann wird erkennen, daß die Reinigungsverfahren, die geeignet sind fiir nativen mpl-Ligand,' einer Modifikation bedürfen können, um den Änderun-gen der Eigenschaft von mpl-Ligand Oder seiner Varianten durch die Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen. H. Kovalente Modifikationen von mpl-Ligandenpolypeptid

Kovalente Modifikationen des mpl-Ligandenpolypeptids werden von der vorliegenden Erfindung mit erfaßt. Sowohl nativer jnpl-Ligand wie auch Aminosäuresequenzvarianten des mpl-Liganden können kovalent modifiziert werden. Eine Art der kovalenten Modifikation, die von der vorliegenden Erfindung mit erfaßt wird, ist ein mpl-Liganden-Fragment. Variante mDl-Liganden-Fragmente mit bis zu ungefähr 40 Aminosäure-resten können einfach hergestellt werden durch chemische Synthese Oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des vollständigen oder eines varianten mpl-Ligandenpolypeptids. Andere Arten der kovalenten Modifikationen des mpl-Liganden oder der Fragmente davon werden in das Molekiil eingefiihrt durch Umsetzen der fraglichen Aminosâurereste des mpl-Ligan-den oder der Fragmente davon mit einem organischen derivati-sierenden Mittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten reagieren kann.

Cvsteinylreste werden üblicherweise umgesetzt mit α-Haloace-taten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch derivati- sîejft durch die Reaktion mit Bromtrifluoraceton, cx-Biroin ß (5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkyl-maleimide, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisul-fid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol Oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol.

Histidy.lreste werden derivatisiert durch die Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0, weil dieses Mittel rela-tiv spezifisch ist für die Histidyl-Seitenkette. Pairabroni phenacylbromid ist ebenfalls brauchbar; die Reaktion wird vorzugsweise durchgeführt in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0.

Lysinyl- und aminoterminale Reste werden umgesetzt mit Suc-cinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden. Die Derivati-sierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung det Umkeh^ der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von aminohaltigen Resten umfassen Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharn-stoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.

Arginylreste werden modifiziert durch die Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Mittel, darunter sind Phenyl-glyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-cyclohexandion und Ninhydrin.

Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, wegen dem hohen pKa-Wert der funktionellen Guanidingruppe. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen des Lysins wie auch der Epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.

Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann durchgeführt werden, wobei das Einführen von spektralen Markierun-gen in die Tyrosylreste von besonderem Interesse ist, durch die Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder

Tetranitromethan. Meistens wird N-Acetylimidazol und Tetra-nitroraethan verwendet zum Bilden von O-Acetyltyrosylvarian-ten bzw. 3-Nitroderivaten. Tyrosylreste werden iodiert mit Hilfe von 125J oder 131J, urn markierte Proteine herzustellen zur Verwendung in einem Radioimmunoassay, wobei die oben be-schriebene Chloramin-T-Methode geeignet ist.

Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selek-tiv modifiziert durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=c=N-R'), worin R und R' verschiedene Alkylgruppen darstellen, wie i-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder l-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Weiterhin werden Aspartyl- und Glutamylreste zu Asparaginyl-und Glutaminylresten umgewandelt durch die Reaktion mit Ammoniumionen.

Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich für das Vernetzen des mpI-Liganden mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder einer Oberf lâche zum Verwenden in dem Ver-fahren zur Reinigung von Anti-mpl-Ligand-Antikörpern und um-gekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B, l,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Acidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimi-dylester, wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-oktan.

Derivatisierende Mittel wie Methyl-3-[(p-azido-phenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwi-schenprodukte, die vernetzende Strukturen ausbilden können in der Anwesenheit von Licht. Alternativ können reaktive wasserunlösliche Matrixmaterialien, wie Cyanogenbromid-akti-vierte Kohlenhydrate, und die reaktiven Substrate, beschrie-ben in U.S.-PS 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 zur Proteinimmobilisierung verwendet werden.

Glutaminyl- und Asparaginylreste werden regelmäßig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert.

Diese Reste werden unter neutralen Oder basischen Bedingun-gen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste fällt in den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Andere Modification umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-oder Threonylresten, Methylierung der a-Aminogruppe von Lysin, Arginin und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 [1983]), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-termina-len Carboxylgruppe.

Andere Arten der kovalenten Modifikation des mpl-Liganden-polypeptids, die von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt sind, umfassen das Verändern des nativen Glycosylierungs-musters des Polypeptids. Mit Ändern ist gemeint, Deletieren von einem oder mehreren Kohlehydratresten, die in dem nativen mpl-Liganden vorgefunden werden, und/oder Zufiigen von einem oder mehreren Glycosylierungsstellen, die in dem nativen mpl-Liganden nicht vorhanden sind.

Die Glycosylierung von Polypeptiden erfolgt typischerweise entweder über eine N-Anbindung oder O-Anbindung. N-angebun-den bezieht sich auf das Anfügen des Kohlenhydratrests an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine be-liebige Aminosäure darstellt außer Prolin, sind die Erken-nungssequenzen für die enzymatische Anfügung des Kohlenhydratrests an die Asparaginseitenkette. Somit erzeugt die An-wesenheit einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypep-tid eine potentielle Glycosylierungsstelle. O-angebundene Glycosylierung bedeutet das Anfügen von einem der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galacctose oder Xylose an eine Hydroxy- aminosäure, meistens Serin Oder Threonin, obwohl 5-Hydroxy-prolin Oder 5-Hydroxylysin auch verwendet werden können.

Das Zufügen von Glycosylierungsstellen zu dem mpl-Liganden-polypeptid wird leicht erreicht durch Ändern der Aminosäure-sequenz derart, daß es eine oder mehrere der oben beschrie-benen Tripeptidsequenzen (für N-angebundene Glycosylierungsstellen) enthält. Die Änderung kann ebenfalls erfolgen durch das Anfügen von oder den Ersatz von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an die native mpl-Ligandensequenz (für O-angebundene Glycosylierungsstellen). Aus Gründen der Einfachheit wird die mpl-Liganden-Aminosäuresequenz vorzugs-weise geändert durch Änderungen auf der DNA-Ebene, insbeson-dere durch Mutieren der DNA, die das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, an vorher ausgewählten Basen, so daß Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutation(en) können erzeugt werden mit Hilfe von Verfahren, wie oben beschrieben unter der Überschrift "Aminosäuresequenzvarianten des mpl-Liganden".

Eine andere Möglichkeit zum Steigern der Anzahl der Kohlen-hydratreste an dem mpl-Liganden ist die chemische oder enzymatische Kupplung von Glycosiden an das Polypeptid.

Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie nicht das Herstellen des Polypeptids in einer Wirtszelle verlangen, die Glycosylierungsfähigkeiten für die N- oder O-angebundene Glycosylierung besitzt. Abhängig von dem verwendeten Kupp-lungsverfahren kann der bzw. die Zucker angefügt werden an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie die von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie die von Serin, Threonin oder Hydroxy-prolin, (e) aromatische Reste, wie die von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin. Diese Verfahren sind beschrieben in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 [1981].

Entfernen der Kohlenhydratreste, die auf dein mpl-Liganden polypeptid vorkommen, kann bewirkt werden chemisch oder enzymatisch. Die chemische Deglycosylierung verlangt das Aussetzen des Polypeptids der Verbindung Trifluormethan-sulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Be-handlung führt zur Abspaltung der meisten oder aller Zucker, außer dem anbindenden Zucker (N-Acetylglucosamin oder N-Ace-tylgalactosamin), während das Polypeptid intakt gelassen v/ïrcj. Die chemische Deglycosylierung ist beschrieben bei Hadimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 [1987] und bei Edge et al., Anal. Bochem., 118:131 [1981]. Die enzymatische Abspaltung von Kohlenhydratresten von Polvpep-tiden kann erzielt werden durçh die Verwendung von einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen, wie beschrieben von Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 [1987].

Die Glycosylierung an pctentiellen Glycosylierungsstellen kann verhindert werden durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin, wie beschrieben von Duskin et al., J. Biol. Chem., 257:3105 [1982]. Tunicamycin blockiert die Bildung von protein-N-glycosidbindungen.

Eine weitere Art der kovalenten Modifikation des mpl-Ligan-den umfaßt das Anfügen des mpl-Ligandenpolypeptids an eine Vielzahl von nicht proteinartigen Polymeren, z.B. Poly-ethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylene, auf die Weise, wie ausgeführt in U.S.-PS 4,640,835; 4,496,689; 4301,144; 4,670,417; 4,791,192 oder 4,179,337.

Es ist ersichtlich, daß ein Absuchen der gewonnenen mpl-Liganden-Varianten erforderlich ist dahingehend, die optimale Variante zura Binden an einen mpl auszusuchen und die die oben definierte immunologische und/oder biologische Ak-tivität aufweist. Man kann absuchen nach der Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder in Plasma (z.B. gegen proteo-lytische Spaltung), hoher Affinität für ein mpl-Mitglied, oxidativer Stabilität, Fähigkeit zum Sezernieren in erhöhten Ausbeuten und ähnliches. Zum Beispiel wird eine Änderung in der immunologischen Eigenschaft des mpl-Ligandenpolypeptids, wie die Affinität für einen gegebenen Antikörper, gemessen durch einen Immunoassay vom kompetitiven Typ. Andere potentielle Modifikationen der Protein- oder Polypeptideigen-schaften, wie die Redox- Oder Wärmestabilität, Hydrophobizi-tät oder Empfindlichkeit gegenüber dem proteolytischen Ab-bau, können anhand von bekannten Verfahren getestet werden. 17. Allgemeine Verfahren zum Herstellen von Antikörpern ge-gen den mpl-Liganden

Antikörperherstellung (i) Polyklonale Antikörper

Polyklonale Antikörper gegen mpl-Ligandenpolypeptide oder Fragmente werden üblicherweise erzeugt in Tieren durch meh-rere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des mpl -Liganden und einem Adjuvans. Es kann auch niitzlich sein, den mpl-Liganden oder ein Fragment, enthaltend die Zielaminosäuresequenz, an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Art immunogen ist, z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Serumalbumin, Rinderthyroglobulin Oder Sojabonentrypsininhibitor, unter Verwendung von bifunk-tionellen Oder derivatisierenden Reagenzien, z.B. Maleimido-benzoylsulfosuccinimidester (Konjugation liber Cysteinreste) , N-Hydroxysuccinimid (liber Lysinreste) , Glutaraldehyd, Suc-cinsäureanhydrid, SOCI2 Oder R1N=C=NR, worin R und R1 ver-schiedene Alkylgruppen darstellen.

Die Tiere werden immunisiert gegen das mpl-Ligandenpolypep-tid oder ein Fragment, immunogene Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg bzw. 1 pg des Peptids oder Konju-gats (für Kaninchen bzw. Mause) mit 3 Volumen Freunds voll- ständigem Adjuvans, und Injizieren der Lösung intradermal an mehreren Stellen. Einen Monat später werden die Tiere geboo-stet mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Peptid oder Konjugat in Freunds vollständigem Adjuvans durch subku-tane Injektion an mehreren Stellen. Sieben bis vierzehn Tage späte.r wird den Tieren Blut entnommen, und das Serum wird auf einen mpl-Liganden-Antikörpertiter hin getesteu. Die werden geboostet, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise werden die Tiere geboostet mit dem Konjugat aus dem gleichen mpl-Liganden, aber konjugiert an ein verschie-denes Protein und/oder iiber ein verschiedenes Vernetzungs-mittel damit verbunden. Konjugate können ebenfalls in rekom-binanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch werden aggregierende Mittel, 'wie Alum, verwendet zum Steigern der Immunantwort.

N (ii) Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d.h., die em-zelnen Antikörper, die die Population bilden, sind identisch außer möglichen, natürlicherweise auftretenden Mutationen, die in geringeren Mengen vorhanden sein können. Somit bedeu- tet der modifizierende Begriff "monoklonal", daß der Antikörper nicht eine Mischung aus einzelnen Antikörpern dar- stellt.

Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper gegen mpl-Ligand gemäß der Erfindung hergestellt werden unter Verwen-dung des Hybridoma-Verfahrens, das zuerst beschrieben wurde von Kohier & Milstein, Nature, 256:495 [1975], oder sie kon-nen durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden (U.S.-PS 4,816,567 (Cabilly et al.)).

Bei dem Hybridoma-Verfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie ein Hamster, immunisiert wie zuvor beschrieben, urn Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren Oder produzieren können, die spezifisch gegen das zur Iminunisierung verwendete Protein gerichtet sind. Alternativ können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomazellen fusioniert un-ter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie Poly-ethylenglykol, urn eine Hybridomzellinie zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Die so hergestellten Hybridomazellen werden in ein geeigne-tes Kulturmedium ausgebracht und kultiviert, das vorzugs-weise enthält eine Oder mehrere Substanzen, die das Wachstum Oder das Überleben der nicht fusionierten Elternmyelomzellen hemmen. Zum Beispiel, falls der Elternmyelomzelle das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT Oder HPRT) fehlt, enthält das Kulturmedium fiir die Hybridomas typi-scherweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Me-dium), wobei diese Substanzen das Wachstum von Zeilen ver-hindern, denen HGPRT fehlt.

Bevorzugte Myelomazellen sind solche, die effizient fusio-nieren, einen hohen Spiegel der Expression des Antikörpers durch die ausgewählte Antikörper-produzierende Zelle unter-stützten und die sensitiv sind gegenüber einem Medium, wie HAT-Medium. Unter diesen sind bevorzugte Myelomazellinien die Mäusemyelomalinien, wie solche, die erhalten werden von MOPC-21 und MPC-ll-Mäusetumoren, erhältlich vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, und SP-2-Zellen, erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Humane Myeloma- und Maus-Mensch-Heteromyelomazellinien sind ebenfalls beschrieben worden für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikör-pern (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Das Kulturmedium, in dein Hybridomazellen kultiviert werden, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die .gegen den mpl-Liganden gerichtet sind, getestet. Vorzugs-weise wird die Bindungsspezifität der durch die Hybrido-raazelien erzeugten monoklonalen Antikörper ermittelt durch Immunpräzipitation oder durch einen in vitro-Bindungsassay, vie einen Radioimmunoassay (RXA) oder einen enzymgekoppelten Immunoabsorbentassay (ELISA).

Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z.B. ermittelt werden anhand der Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220 [1980].

Nachdem Hybridomazellen identifiziert worden sind, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität herstellen, können die Klone subkloniert werden durch begrenzte Verdünnungsverfahren (limiting dilution) und kultiviert werden unter Standardverfahren (Goding, siehe oben). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z.B. Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Weiterhin können die Hybridomazellinien kultiviert werden in vivo, als Ascitestumore in einem Tier.

Die von den Subklonen ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper werden geeigneterweise von dem Kulturmedium, der Asci-tesflüssigkeit oder dem Serum abgetrennt durch herkömmliche Reinigungsverfahren für Immunglobuline, wie z.B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie. DNA, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ko-'diert, kann leicht isoliert und sequenziert werden mit Hilfe herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligo-nukleotidproben, die spezifisch an Gene binden können, die die leichte und schwere Kette von Mäuseantikörpern kodie-ren). Die erfindungsgemäßen Hybridomazellen dienen als be- vorzugtes Ausgangsmaterial für diese DNA. 1st die DNA einitial isoliert, kann sie in Expressionsvektoren eingefügt werden, die dann in Wirtszellen transfektiert werden, wie Affen-COS-Zellen, Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder Myelomazellen, die nicht auf andere Weise Immunglobulinpro-tein erzeugen, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch modifiziert werden, z.B. durch Einsetzen dei kodieren-den Sequenz für die konstanten Domänen der humanen leichten und schweren Kette an die Stelle der homologen Mäusesequen-zen (Cabilly et al., siehe oben; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 [1984]), oder durch kovalente Verknüp-fung der immunglobulinkodierenden Sequenz mit einem Teil oder der vollständigen kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid.

Typischerweise ersetzen solche Nicht-Immunglobulin-Polypep-tide die konstanten Domänen der erfindungsgemäßen Antikör-per, oder sie ersetzen die variable Domäne einer Antigenbin-dungsstelle des erfindungsgemäßen Körpers, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen, umfassend eine Antigen-Bindungsstelle mit der Spezifität für einen mpI-Liganden und eine andere Antigen-Bindungsstelle mit der Spezifität für ein anderes Antigen.

Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro herge-stellt werden unter Verwendung bekannter Verfahren auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie, einschließlich sol-, cher, die Vernetzungsmittel verwenden. Zum Beispiel können Immuntoxine hergestellt werden unter Verwendung einer Disul-fidaustauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbin-dung. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat. Für diagnostische Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Antikörper typischerweise markiert mit einem nachweisbaren

Rest. Der nachweisbare Rest kann ein beliebiger Rest sein, der in der Lage ist', entweder direkt Oder indirekt ein nach-weisbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel kann der nach-weisbare Rest sein ein Radioisotop, wie H, C, P, S oder 125J, oder eine fluoreszierende oder chemilumineszie-rende Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; radioaktive Isotopenmarkierungen, wie z.B. 125J, 32P, 14C oder 3H, oder ein Enzym, wie alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.

Ein beliebiges Verfahren aus dein Stand der Technik zum separaten Konjugieren des Antikörpers mit dem nachweisbaren Rest kann verwendet werden, einschließlich der Verfahren, wie be- schrieben von Hunter et al., Nature, 144:945 [1962]; David et al., Biochemistry, 13:1014 [1974]; Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 [1981] und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 [1982].

Die erfindungsgemäßen Antikörper können in jedem bekannten Assayverfahren verwendet werden, wie einem kompetitiven Bin- dungsassay, einem direkten oder indirekten Sandwichassay und einem Immunpräzipitationsassay. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Kompetitive Bindungsassays beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein mpl-Ligand oder ein immunologisch reaktiver Teil davon sein kann) mit dem Analyt (mpl-Ligand) der Testanalysenprobe um die Bindung mit einer be-grenzten Menge an Antikörpern zu konkurrieren. Die Menge an mpl-Ligand in der Testanalysenprobe ist umgekehrt proportional zu der Menge des Standards, der an die Antikörper gebun- den wird. Um die Bestimmung der Menge an gebundenem Standard zu erleichtern, werden die Antikörper im allgemeinen insolu-bilisiert, vor Oder nach der Kompetition, so daß der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht von dem Standard und Analyt, die nicht gebunden sind, abgetrennt werden können.

Sandwichassays umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder in der Lage ist, an einen verschiedenen immuno-genen Teil oder Epitop des nachzuweisenden Proteins (mpl-Ligand) zu binden. In einem Sandwichassay wird der Analyt der Testanalysenprobe durch einen ersten Antikörper gebun-den, der auf einem festen Trager immobilisiert ist, und da-nach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, um somit einen unlöslichen dreiteiligen Komplex zu bilden. David & Greene, U.S.-PS 4,376,110. Der zweite Antikörper selbst kann mit einem nachweisbaren Rest markiert sein (direkter Sandwichassay) , oder er kann gemessen werden mit Hilfe eines anti-Immunglobulin-Antikörpers, der markiert ist mit einem nachweisbaren Rest (indirekter Sandwichassay). Zum Beispiel ist ein Typ des Sandwichassays ein ELISA-Assay, wobei in diesem Fall der nachweisbare Rest ein Enzym ist (z.B. Meer-rettichperoxidase). (iii) Humanisierte und humane Antikörper

Verfahren zum Humanisieren von nicht humanen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Im allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäure-reste, die in ihn eingefiihrt wurden aus einer Quelle, die nicht humanen Ursprungs ist. Diese nicht humanen Aminosäure-reste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typi-scherweise aus einer variablen "Import"-Domäne stammen. Die Humanisierung kann im wesentlichen durchgeführt werden fol-gend dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 [1988]), durch Ersetzen der CDRs oder CDR-Sequenzen eines Nagers durch die entsprechenden Sequenzen eines humanen An-tikörpers. Demzufolge sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al., siehe oben), worin be-trächtlich weniger als eine vollstândige humane variable Do-mâne ersetzt worden ist durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht humanen Art. In der Praxis sind humanisierte An-tikörper typischerweise humane Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste substituiert sind durch Reste aus analogen Stellen von Antikörpern aus Nagern.

Die Wahl der humanen variablen Domänen, sowohl der leichten wie auch der schweren Ke«tte, die für das Herstellen der hu- manisierten Antikörper zu verwenden sind, ist sehr wichtig, urn die Antigenizität zu verringern. Nach der sogenannten "best-fit"-Methode wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagerantikörpers abgesucht gegen eine vollständige Bank bekannter humaner variabler Domänensequenzen. Die humane Sequenz, die der Nagersequenz am nächsten kommt, wird dann als das humane Framework (FR) für den humanisierten Antikörper verwendet (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]).

Ein anderes Verfahren benutzt ein spezielles Framework, das sich von der Konsensussequenz aller humanen Antikörper einer speziellen Subgruppe von leichten oder schweren Ketten ab-leitet. Das gleiche Framework kann verwendet werden für meh-rere verschiedene humanisierte Antikörper (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1992]; Presta et al., J. Imrnunol., 151:2623 [1993]).

Es ist weiterhin wichtig, daß die Antikörper humanisiert werden unter dem Beibehalten einer hohen Affinität für das Antigen oder anderen vorteilhaften biologischen Eigenschaften. Zum Erreichen dieses Ziels wird gemäß eines bevorzugten Verfahrens ein humanisierter Antikörper hergestellt durch ein Analyseverfahren der parentalen Sequenzen und verschie-dener konzeptioneller humanisierter Produkte unter Verwen-dung von dreidimensionalen Modellen der Parental- und huraa-nisierten Sequenzen. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann geläufig. compu-terprogramme sind erhältlich, die die möglichen dreidimen- sionalen Konformationsstrukturen von ausgewählten Immunglo- bulinsequenzkandidaten erläutern und grafisch zeigen. Das Untersuchen dieser Darstellungen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktion der ge-wünschten Immunglobulinsequenz, d.h., die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des gewünschten Immunglobulins be-einflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise kön-nen FR-Reste aus der Konsensussequenz ausgewählt und mit der Importsequenz kombiniert werden, so daß die gewünschte Anti-körpereigenschaft, wie eine gesteigerte Affinität für das bzw. die Zielantigen(e), erzielt wird. Im allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und am stärksten an dem Einfluß auf die Antigenbindung beteiligt. Für weitere Einzelheiten siehe U.S.-Anmeldung, Seriennummer 07/934,373, eingereicht am 21. August 1992, die eine continuation-in-part-Anmeldung der Seriennummer 07/715,271, eingereicht am 14. Juni 1991, ist.

Alternativ ist es jetzt möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) herzustellen, die nach Immunisierung in der Lage sind, ein vollständiges Repertoire an humanen Antikörpern in der Abwesenheit von endogener Immunglobulinproduktion herzustellen. Zum Beispiel ist beschrieben worden, daß die homozygote Deletion des Gens für die Antikörper-schwere-Kette-joining-Region (JH), in chimâren und Keimbahn-mutierten Mâu-sen zu einer vollstândigen Hemmung der endogenen Antikörper-produktion führt. Die Übertragung der Immunglobulingenanord-nung aus humaner Keimbahn in solche keimbahnmutierten Mäuse führt zur Produktion von humanen Antikörpern bei der Kon-frontation mit Antigen. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 [1993]; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 [1993]; Bruggerman et al., Year in Immuno., 7:33 [1993]. Humane Antikörper können auch herge-stellt werden in Phagenbanken (Hoogenboom und Winter, J.

Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]). (iv) Bispezifische Antikörper

Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise humane oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifität für mindestens zwei verschiedene Antigene aufweisen. Verfah-ren zum Herstellen bispezifischer Antikörper sind in dem Stand der Technik bekannt.

Traditionellerweise basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Coexpression von zwei Paaren von Immunglobulin-schweren-Ketten und -leichten-Ket-ten, wobei die zwei schweren Ketten verschiedene Spezifitä-ten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Wegen der zufälligen Paarung von leichten und schweren Immunglobulinketten erzeugen diese Hybridomas (Quadromas) eine potentielle Mischung aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die richtige bispezif ische Struktur aufweist. Die Reinigung des richtigen Mo-leküls, die normalerweise durch Affinitätschromatographie-schritte erfolgt, ist recht mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind offenbart. in der PCT-Veröffentlichung WO 93/08829 (veröffentlicht 13. Max 1993) und in Traunecker et al., ΞΜΒΟ, 10:3655-3659 [1991].

Gemäß einem anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an Immunglobulinsequen-zen für die konstante Domâne fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise innerhalb einer konstanten Domäne der Immunglo- bulin-schweren-Kette, umfassend mindestens einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen. Es ist bevorzugt, daß die er-ste konstante Region der schweren Kette (CHI), die die für die Bindung der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in mindestens einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die die Fusionen der Immunglobulin-schweren-Kette und, falls ge- wünscht, der Immunglobulin-leichten-Kette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren eingefügt und kotransfek-tiert in einen geeigneten Wirtsorganismus. Dies gestattet eine große Flexibilität hinsichtlich des Einstellens der einzelnen Anteile der drei Polypeptidfragraente in Ausfüh-rungsformen, wenn das ungleiche Verhältnis der zur Konstruk-tion verwendeten drei Polypeptidketten die optimalen Ausbeu-ten ermöglicht. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Se-quenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor einzufügen, wenn die Expression von minde-stens zwei Polypeptidketten im gleichen Verhältnis zu hohen Ausbeuten führt, oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Bedeutung sind. Bei einer bevorzugten Ausführungs-form dieses Ansatzes setzen sich die bispezifischen Antikör-per zusammen aus einer hybriden Immunglobulin-schweren-Kette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm, und-einem hybriden Immunglobulin-schwere-Kette-leichte-Kette-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) in dem anderen Arm. Es wurde gefunden, daß diese asymmetrische Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von den unerwünschten Immunglobulinkettenkombinaticnen erleichtert, da die Anwesenheit von nur einer Immunglobulin-leichten-Kette in nur einer Halfte des bispezifischen Moleküls einen erleichterten Weg für die Trennung bereitstellt. Dieser An-satz ist offenbart in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/931,811, eingereicht am 17. August 1992.

Weitere Einzelheiten zum Erzeugen bispezifischer Antikörper sind offenbar z.B. in Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 [1986]. (v) Heterokonjugat-Antikörper

Heterokonjugat-Antikörper werden ebenfalls von der vorlie-genden Erfindung mit erfaßt. Heterokonjugat-Antikörper setzen sich zusammen aus zwei kovalent verknüpften Antikörpern. Von solchen Antikörpern ist z.B. behauptet worden, daß sie die Immunsystemzellen auf nicht-erwünschte Zeilen richten (U.S.-PS 4,676,980) und für die Behandlung von HIV-Infektio-nen geeignet sind (PCT-Veröffentlichung WO 91/00360 und WO 92/00373, EP 03089). Heterokonjugat-Antikörper können herge- stellt werden unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Vernetzungsmethode. Geeignete Vernetzungsraittel sind in dem Stand der Technik bekannt und offenbart in U.S.-PS 4,676,980, zusammen mit einer Vielzahl von Vernetzungstech-niken. IV. Therapeutische Verwendung des megakaryozytopoetischen Proteins mpI-Ligand

Der biologisch aktive mpl-Ligand mit hämatopoetischer Effek-torfunktion und der hierin als megakaryozytopoetisches oder thrombozytopoetisches Protein (TPO) bezeichnet wird, kann in einer sterilen pharmazeutischen Präparation oder Formulie-rung verwendet werden zum Stimulieren der megakaryozytopoetischen oder thrombopoetischen Aktivität in Patiënten, die an Throiubozytopenie leiden aufgrund einer beeinträchtigten Produktion, Sequestration oder gesteigerter Zerstörung von Plättchen. Thrombozytopenie-assoziierte Knochenmarkhyplasie (z.B. aplastische Anämie folgend auf Chemotherapie oder Kno-chenmarktransplantation) kann wirksam behandelt werden mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, wie auch Störungen, wie die ausgebreitete intravaskuläre Gerinnung (DIC), Immunthrombozytopenie (einschließlich HIV-induzierter ITP oder nicht HIV-induzierter ITP), chronische idiopathische Thrombozytopenie, kongenitale Thrombozytopenie, Myelodyspla-sie und thrombotische Thrombozytopenie. Weiterhin können diese megakaryozytopoetischen Proteine nützlich sein zur Be-handlung von myeloproliferativen thrombozytotischen Erkran-kungen wie auch von Thrombozytose als Folge enzündlicher Be-dingungen und Eisenmangel.

Bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen megakaryozytopoetischen Oder thrombozytopoetischen Proteins (TPO) sind in Verbindung mit myelotoxischer Chemotherapie, myeloablativer Chemotherapie und Thrombozytopenie aufgrund des Knochenmark-versagens.

Weitere Störungen, die in nützlicher Weise mit den erfin-dungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteïnen behandelt werden können, umfassen Defekte oder Schaden an Plättchen, die herrühren von Wirkstoffen, Vergiftung oder Aktivierung auf künstlichen Oberflächen. In diesen Fällen können die Verbindungen verwendet werden, urn den "Ausstoß (shedding)" von neuen "unbeschädigten" Plättchen zu stimulieren. Für eine vollständigere Liste nützlicher Anwendungen, siehe die "Einleitung" oben, insbesondere die Abschnitte (a)-(f) und die darin angegebenen Literaturstellen.

Die erfindungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteine können einzeln verwendet werden oder in Kombination mit anderen Zytokinen, Hämatopoetinen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren 'oder Antikörpern zu der Behandlung der oben identifizierten Störungen und Bedingungen. Somit können die vorliegenden Verbindungen verwendet werden in Kombination mit anderen Proteïnen oder Peptiden mit thrombopoetischer Aktivität ein-schließlich: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, Erythropoietin (EPO), kit-Ligand, IL-6 und IL-11.

Die erfindungsgemäßen megakaryozytopoetischen Proteine werden in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zubereitet. Diese therapeutische Zusammensetzung kann intravenös oder über die Nase oder Lunge verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann auch parenteral oder subkutan, falls gewünscht, verabreicht werden. Wenn die therapeutische Zusammensetzung systemisch verabreicht wird, sollte sie pyrogenfrei sein und in einer parenteral verträglichen Lö-sung vorliegen, wobei der pH, die Isotonizitat und die Sta- bilität zu berücksichtigen ist. Diese Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. Kurz ausgeführt, Dosisformulierungen aus den erfindungsgemäßen Verbindungen werden hergestellt zur Lagerung und Verabreichung durch Mischen der Verbindung mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträgli-chen Trägern, Hilfsstoffen und Stabilisatoren. Solche Mate-rialien sind für den Empfanger nicht toxisch in den verwen- deten Dosen und Konzentrationen, und sie umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat, Acetat und andere organische Säuresalze; Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Peptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als 10 Reste), wie Polyarginin, Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Pclyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutarainsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließ-lich Zellulose oder dessen Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannitol oder Sorbitol; Gegenionen wie Natrium- und/oder nichtio-nische oberflachenaktive Mittel wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol.

Ungefähr 0,5 bis 500 mg einer Verbindung oder Mischung des megakaryozytopoetischen Proteins in Form der freien Säure oder Base oder als pharmazeutisch verträgliches Salz wird verarbeitet mit einem physiologisch verträglichem Vehikel, Träger, Hilfsstoff, Bindemittel, Konservierungsmittel, Stabilisator, Aromastoff, usw., je nachdem, wie es die pharma-zeutische Praxis verlangt. Die Menge an aktivem Bestandteil in diesen Zusammensetzungen wird so gewählt, daß eine geeig-nete Dosierung in dem angezeigten Bereich erhalten wird.

Sterile Zusammensetzungen für die Injektion können formu- werden gemäß der üblichen pharmazeutischen Praxis. Zum Beispiel kann das Auflösen oder Suspendieren der aktiven Verbindung in einem Vehikel wie Wasser, oder natürlich vor-kommenden Pflanzenölen, wie Sesam-, Erdnuß- oder Baurawoll samenöl, oder einem synthetischen Fettvehikel, wie Ethylo-leat oder ähnliches, gewünscht sein. Puffer, Konservierungsmittel, Antioxidantien und ähnliches kann gemäß der zulässi-gen pharmazeutischen Praxis eingebracht werden.

Geeignete Beispiele für Präparationen mit verzögerter Frei- setzung umfassen semipermeable Matrixmaterialien aus festen hydrophoben Polymeren enthaltend das Polypeptid, wobei die

Matrixmaterialien in der Form von geformten Körpern vorlie-gen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele fiir Matrixmaterialien mit verzögerter Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie be-schrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] oder Poly(vinylalkchol)), Polylactide (U.S.-PS 3,773,919, EP 58,481), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaethyl-L-glutamat (Sidman et al.., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), nicht abbaubare Ethylen-Vinylacetate (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere, wie das Lupron-Depot™ (injizierbare Mikrokügelchen, die sich zusam-mensetzen aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer und Leupro-lidacetat), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133,988) . Während Polymere, wie Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glycolsäure die Freisetzung von Molekülen über einen Zeit-raum von mehr als 100 Tagen erlauben, setzen bestimmte Hydrogele Proteine in einer kürzeren Zeitspanne frei. Wenn die Proteine eingekapselt werden, verbleiben sie für eine längere Zeit in dem Körper, aber sie können denaturieren oder aggregieren als das Ergebnis des Aussetzens von Feuch-tigkeit bei 37°C, wobei dies zu einem Verlust der biologi-schen Aktivität und möglicherweise zu Änderungen in der Immunogenität führt. Rationale Strategien können entworfen werden für die Proteinstabilisierung, abhängig von dem be-teiligten Mechanismus. Zum Beispiel, wenn gefunden wird, daß der Aggregationsmechanismus auf der intermolekularen S-S-Bindungsbildung aufgrund von Disulfidaustausch beruht, kann die Stabilisierung erzielt werden durch Mpdifizieren der Sulfhydrylreste, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kon-trollieren des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrixzusammen-setzungen.

Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung des megakaryo-zytopoetischen Proteins umfassen auch in Liposomen verpackte megakaryozytopoetisches Frotein. Liposomen enthaltend mega-karyozytopoetisches Protein werden in an sich bekannter Weise hergestellt: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; JP-A-83-118008; U.S.-PS 4,435,045 und 4,544,545; und EP 102,324. Normaler-weise sind die Liposomen von dem kleinen (ungefähr 200-800 Angstrom) unilamellaren Typus, in dem der Lipidgehalt größer ist als ungefähr 30 Mol% Cholesterol, wobei der optimale An-teil so eingestellt wird, daß er für die megakaryozytopoeti-sche Proteintherapie optimal ist.

Die Dosierung wird von dem begleitenden Arzt ermittelt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, von denen bekannt ist, daß sie die Wirkung von Wirkstoffen beeinflussen, ein-schließlich die Schwere und Art der Erkrankung, das Körper-gewicht, das Geschlecht, die Diät, die Zeit und der Weg der Verabreichung, andere Medikationen und andere relevante klinische Faktoren. Typischerweise liegt das tägliche Therapie-schema in dem Bereich von 0,1 bis 100 Mg/kg Körpergewicht. Vorzugsweise liegt die Dosierung in dem Bereich von 0,1-50 j^jg/kg Körpergewicht. Besonders bevorzugt liegt die Dosierung in dem Bereich von 1-5 jng/kg/Tag. Gegebenenfalls kann der Bereich der Dosierung der gleiche sein wie für andere Zyto-kine, insbesondere G-CSF, GM-CSF und EPO. Therapeutisch wirksame Dosierungen können ermittelt werden entweder mit Hilfe von in vitro- Oder in vivo-Verfahren.

BEISPIELE

Es wird angenommen, daß ohne eine weitere Beschreibung der Durchschnittsfachmann unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung und der erläuternden Beispiele die Erfmdung m vcllem Umfang ausüben und verwenden kann. Die folgenden Aus-führungsbeispiele erläutern deshalb spezifische erfindungs-gemäße Ausführungsformen, und sie sind nicht gedacht, die Offenbarung in irgendeiner Weise zu beschränken. BEISPIEL 1

Partielle Reinigung des Schweiner-mpl-Liganden

Plättchenarmes Plasma wurde gesammelt aus normalen und apla-stisch anämischen Schweinen. Die Schweine wurden aplastisch gemacht durch Bestrahlung mit 900 cGY für die gesamte Kör-perbestrahlung mit Hilfe eines 4mEV linearen Beschleunigers. Die bestrahlten Schweine wurden für 6 bis 8 Tage mit intra-muskulären Injektionen von Cefazolin unterstützt. Anschlie-ßend wurde das gesamte Blutvolumen entfernt unter allgemei-ner Betäubung, heparinisiert und zentrifugiert bei 1800 x g für 30 min, urn plättchenarmes Plasma herzustellen. Die Mega-karyozyten-stimulierende Aktivität gip.felte sechs Tage nach der Bestrahlung.

Aplastisches Schweineplasma, erhalten aus den bestrahlten Schweinen, wird auf 4M mit NaCl eingestellt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Präzipität wird durch Zentrifugation bei 3800 Upm in einer Sorvall RC3B entfernt, und der Überstand wird auf eine Phenyl-Toyopearl-Säule (220 ml), equilibriert in 10 mM NaP04 enthaltend 4M NaCl, geladen. Die Säule wird mit diesem Puffer gewaschen, bis eine A28O von <0,05 erreicht wird, und es wird eluiert mit dH2Û. Der eluierte Proteinpeak wird verdünnt mit d^O zu einer Leitfähigkeit von 15 mS und auf eine Blue-Sepharose-Säule, equilibriert (240 ml) in PBS, geladen. Anschließend wird die Säule mit 5 Säulenvolumen von jeweils PBS und 10 mM. NaP04 (pH 7,4), enthaltend 2M Harnstoff, gewaschen. Die Proteine werden von der Säule eluiert mit 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4) enthaltend 2M Harnstoff und 1M NaCl. Der eluierte

Proteinpeak wird auf 0,01% Octylglucosid(n-octyl-ß-D-gluco-pyranosid) und jeweils 1 mM EDTA und Pefabloc (Boehringer Mannheim) eingestellt und direkt auf tandemverbundene CD4-IgG-(Capon, D.J. et al., Nature 337:525-531 (1989)) und mpl-IgG-Ultralink (Pierce)-Säulen (siehe unten) geladen. Die CD4-IgG (2 ml)-Säule wird entfernt, nachdem die Analysen-probe aufgeladen ist, und die mpl-IgG (4 ml)-Säule wird ge-waschen mit 10 Säulenvolumen von jeweils PBS und PBS enthal-tend 2 M NaCl und eluiert mit 0,1M Glycin-HCl pH 2,25. Die Fraktionen werden gesammelt in 1/10-Volumen 1 M Tris-HCl (pH 8,0) .

Die Analyse der eluierten Fraktionen von der mpl-Affinitäts-säule durch SDS-PAGE (4-20%, Novex-Gel), Lauf unter reduzie- .renden Bedingungen, zeigte die Anwesenheit von mehreren Proteïnen (Fig. 5). Proteine, die mit der Silberfärbung die stärkste Intensität zeigen, trennen sich auf mit einem appa-renten Mr von 66000, 55000, 30000, 28000 und 14000. Zum Be-stimmen, welches dieser Proteine die Proliferation von Ba/F3-mpi-Zellkulturen stimuliert, wurden diese Proteine aus dem Gel eluiert, wie in Beispiel 2 unten beschrieben.

Ultralink-Affinitätssäulen 10-20 mg mpl-lqG Oder CD4-IgG in PBS werden gekoppelt an 0,5 g Ultralink-Harz (Pierce), wie in den Herstellerangaben beschrieben.

Konstruktion und Expression von mpl-lqG

Ein chimäres Molekül umfassend die vollständige extrazellu-läre Domäne von humanem mpl (Aminosäuren 1-491) und die Fc-Region von einem humanen IgGl-Molekül wurde in 293-Zellen exprimiert. Ein cDNA-Fragment, das die Aminosäuren 1-491 des humanen mpl kodiert, wurde durch PCR aus einer humanen mega-karyozytischen CMK-Zell-cDNA-Bank erhalten und sequenziert.

Eine Clal-Stelle wurde an dem S'-Ende, und eine BstEII-Stelle an dem 3'-Ende eingefügt. Dieses Fragment wurde stromaufwärts von der IgGl-Fc-kodierenden Region in einem Bluescript-Vektor zwischen der Clal- und der BstEII-Stelle eingebaut nach Partialspaltung des PCR-Produkts mit BstEII, weil zwei weitere BstEII-Stellen in der DNA, die die extra-zelluläre Domäne von mpl kodiert, vorhanden waren. Die BstEII-Stelle, die an dem 3'-Ende des mpl-PCR-Produkts ein-geführt worden war, war so entworfen, daß die Fc-Region im Raster mit der mpl-extrazellulären Domäne war. Das Konstrukt wurde subkloniert in den pRK5-tkneo-Vektor zwischen die Clal- und Xbal-Stellen und transfektiert in humane embryonale 293-Nierenzellen durch das Kalziumphosphatverfahren. Diese Zeilen wurden selektiert in 0,4 mg/ml G418, und individuelle Klone wurden isoliert. Die mpl-IgG-Expression von isolierten Klonen wurde bestimmt mit Hilfe eines für den hu-manen Fc spezifischen ELISA. Der beste Expressionsklon besaß einen Expressionsspiegel von 1-2 mg/ml an mpl-IgG.

Mpl P exprimierende Ba/F3-Zellen

Eine cDNA, die der vollständigen kodierenden Region von hu-manem mpl P entsprach, wurde in pRK5-tkneo kloniert, der an-schließend linearisiert wurde mit Notl und transfektiert wurde in die IL-3-abhängige Zellinie Ba/F3 durch Elektro-poration (1 x 107 Zeilen, 9605 F, 250 Volt). Drei Tage spä-ter wurde die Selektion begonnen in der Anwesenheit von 2 mg/ml G418. Die Zeilen wurden als Pools selektiert oder ein-zelne Klone wurden erhalten durch begrenzte Verdünnung in 96-Loch-Platten. Ausgewählte Zeilen wurden in RPMI gehalten, enthaltend 15% FBS, 1 mg/ml G418, 20 mM Glutamin, 10 mM HEPES und 100 pg/ml Pen-Strep. Die Expression von mpl P in den selektierten Klonen wurde ermittelt durch FACS-Analyse mit Hilfe eines polyklonalen anti-mpl P-Kaninchenantikör-pers.

Ba/F3-mpl-Ligandenassay

Der mpl-Ligandenassay wurde durchgeführt, wie in Fig. 2 ge-zeigt. Zum Ermitteln der Anwesenheit von mpl-Liganden in verschiedenen Ausgangsmaterialien wurden die mpl P Ba/F3-Zellen ausgehungert an IL-3 für 24 Std. bei einer Zelldichte von 5 X 105 Zellen/ml in einem feuchten Inkubator bei 37°C in 5% CO2 und Luft. Folgend auf das IL-3-Aushungern wurden die Zeilen in 96-Loch-Kulturplatten bei einer Dichte von 50000 Zeilen in 200 μΐ Medium mit oder ohne verdünnte Analy-senprobe ausplattiert und kultiviert für 24 Stunden in einem Zellkulturinkubator. 20 μΐ serumfreie RPMI-Medien, enthal-tend 1 /iCi 3H-Thymidin, wurde zu jedem Loch für mindestens 6 bis 8 Stunden zugesetzt. Die Zeilen wurden dann geerntet auf 96-Loch-GF/C-Filterplatten und fünfmal mit Wasser gewaschen. Die Filter wurden ausgezählt in der Anwesenheit von 40 μΐ einer Scintillationsflüssigkeit (Microscint 20) in einem Packard Top Count Zähler. BEISPIEL 2

Hoch gereinigter mpl-Ligand aus Schwein

Gelelutionsprotokoll

Gleiche'Mengen des affinitätsgereinigten mpl-Liganden (von der mpl-IgG-Säule eluierte Fraktion 6) und 2X Laemmli-Pro-benpuffer wurden bei Raumtemperatur ohne reduzierendes Agens gemischt und so schnell wie möglich auf ein Novex 4-20% Polyacrylamidgel geladen. Die Probe wurde nicht erhitzt. Als Kontrolle wurde Probenpuffer ohne Ligand in einer benachbar ten Spur laufen gelassen. Das Gel wurde für ungefähr 2 1/4 Std. bei 4-6°C bei 135 Volt laufen gelassen. Der Laufpuffer hatte anfänglich Raumtemperatur. Das Gel wurde danach aus dem Gelkasten und die Platte auf einer Seite des Gels ent-fernt.

Ein Replika des Gels wurde wie folgt auf Nitrocellulose her-gestellt: Ein Stuck der Nitrocellulose wurde mit destillier- · tem Wasser angefeuchtet und sorgfältig auf die Oberfläche des exponierten Gels derart gelegt, daß Luftblasen ausge-schlossen wurden. Vergleichsmarkierungen wurden auf der Nitrocellulose und der Gelplatte angebracht, so daß das Replika-Filter nach dem Färben wieder genau in die gleiche Stellung gebracht werden konnte. Nach ungefähr 2 min wurde die Nitrocellulose sorgfältig entfernt, und das Gel wurde in eine Plastikhülle eingepackt und in den Kühlschrank ge-stellt. Die Nitrocellulose wurde mit Gold-Gesamtproteinfär-bemittel von Biorad dadurch gefärbt, daß es zuerst in 3 x 10 ml 0,1% Tween 20 + 0,5 M NaCl + 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 für ungefähr 45 min und danach·in 3 x 10 ml gereinigtem Wasser für 5 min bewegt wurde. Das Goldfärbemittel wurde danach zu-gefügt und solange zum Entwickeln stehen gelassen, bis die Banden in den Standardmarkierungen sichtbar wurden. Das Replika-Filter wurde danach mit Wasser gespült, über der Plastikhülle auf das Gel gelegt und sorgfâltig an den Vergleichsmarkierungen ausgerichtet. Die Positionen der Novex-Standardmarker wurden auf der Gelplatte markiert und Linien gezogen, urn die Schneidepositionen anzudeuten. Die Nitrocellulose und die Plastikhülle wurden danach entfernt und das Gel entlang der angezeigten Linien mit einer scharfen Ra-sierklinge geschnitten. Die Schnitte wurden über die Proben-spuren hinaus verlängert, so daß sie verwendet werden konn-ten, um die Positionen der Stückchen zu bestimmen, nachdem das Gel gefârbt wurde. Nachdem die Stückchen entfernt worden waren, wurde das restliche Gel silbergefârbt und die Positionen der Standardmarker und die Schnittmarkierungen gemes-sen. Die den Schnittpositionen entsprechenden Molekular-gewichte wurden ausgehend von den Novex-Standardmarkern be-stimmt.

Die zwôlf Gelstückchen wurden in die Zeilen zweier Biorad Modell 422-Elektroelutionsgerâte eingebracht. 12-14 K Mole-kulargewichtsausschlußmembrandeckel wurden in den Zeilen verwendet. 50 mM Ammoniumbicarbonat + 0,05% SDS (ungefähr pH 7,8) war der Elutionspuffer. 1 1 des Puffers wurde ungefähr 1 Std. in einem 4-6°C-Kühlraum vor der Verwendung gekühlt. Die Gelstückchen wurden bei 10 mA/Zelle (anfangs 40 V) in einem 4-6°C-Kühlraum eluiert. Die Elution dauerte ungefähr 4 Stunden. Die Zeilen wurden danach sorgfältig entfernt, und die Flüssigkeit über der Fritte mit einer Pipette abgenom-men. Die Elutionskammer wurde entfernt, und jegliche Flüs-sïgXext über dem Membrandeckel mit einer Pipette abgenommen. Die Flüssigkeit in dem Membrandeckel wurde mit einer Pipet-tierhilfe (Pipetman) entfernt und aufbewahrt. 50 μΙ-Aliquots gereinigten Wassers wurden danach in den Deckel gegeben, be-wegt und solange entfernt, bis alle SDS-Kristalle gelost waren. Diese Waschschritte wurden mit der vorstehend erwähnten aufbewahrten Flüssigkeit vereinigt. Das Gesamtelutionspro-benvolumen betrug 300-500 jul pro Gelstückchen. Die Proben wurden in 10 mm Spectrapor 4 12-14 K Ausschluß-Dialyse-röhrchen, die mehrere Stunden in gereinigtem Wasser benetzt worden waren, gefüllt. Sie wurden über Nacht bei 4-6°C gegen 600 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS is.t ungefähr 4 mM hinsichtlich Kalium) pro 6 Proben dialysiert. Der Puffer wurde am nächsten Morgen erneuert, und die Dialyse für 2,5 Std. fortgesetzt. Die Proben wurden danach aus den Dia- lysetaschen entfernt und in Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt. Die Röhrchen wurden für 1 Std. auf Eis gestellt, bei 14K Upm für 3 min mikrozentrifugiert, und die Überstände sorgfältig von dem präzipitierten SDS entfernt. Die Über-stände wurden danach für ungefähr eine weitere Stunde auf Eis gestellt und nochmals für 4 min mikrozentrifugiert. Die Überstände wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verdünnt und für den Aktivitätsassay bereitgestellt. Die restlichen Proben wurden bei -70°C eingefroren. BEISPIEL 3

Mikrosequenzierung des mpl-Liganden aus Schwein

Die Fraktion 6 (2,5 ml) von der mpl-IgG-Affinitätssäule wurde in einem Microcon-10 (Amicon) konzentriert. Um zu ver-hindern, daß der mpl-Ligand an dem Mikrocon absorbiert, wurde die Membran mit 1% SDS gespiilt, und 5 μΐ 10% SDS wur-den zu der Fraktion 6 zugegeben. Probenpuffer (20 μΐ) von 2X wurde zu der Fraktion #6 nach der Microcon-Konzentrierung (20 μΐ) zugegeben, und das gesamte Volumen (40 μΐ) wurde auf eine einzige Spur eines 4-20%-Gradienten-Acrylamidgel (Novex) geladen. Das Gel wurde gemäß dem Novex-Protokoll laufen gelassen. Das Gel wurde danach vor dem Elektroblotten in 10 mM 3-(Cyclohexylamino)-l-propansulfonsäure (CAPS)-Puffer, pH 11,0, enthaltend 10% Methanol, für 5 min equili-briert. Das Elektroblotten auf Immobilon-PSQ-Membranen (Millipore) wurde für 45 min bei 250 mA konstanter Strom-stärke in einer BioRad Trans-Blot-Transferzelle (32) durch-geführt. Die PVDF-Merabran wurde mit 0,1% Coomassie Blau R-250 in 40% Methanol, 0,1% Essigsâure für 1 min gefärbt und für 2-3 min mit 10% Essigsâure in 50% Methanol entfärbt. Die einzigen Proteine, die in der 18000-35000-Molekulargewichts-region des Blots sichtbar wurden, hatten MG von 30000, 28000 und 22000.

Die Banden bei 30, 28 und 22 kDa wurden einer Proteinsequen-zierung ausgesetzt. Automatisierte Proteinsequenzierung wurde mit einem Modell 470A Applied Biosystem-Sequenzierge-rät, das mit einem on-line PTH-Analysator ausgescattet war, durchgeführt. Das Sequenziergerät wurde so modifiziert, daß 80-90% der Probe injiziert werden konnte (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). Aceton (ungefähr 12 μΐ/ΐ) wurde zum Lösungsmittel A zugegeben, um die uv-Absorption auszugleichen. Die elektrogeblotteten Proteine wurden in der Blott-Patrone sequenziert. D.ie Peaks wurden mit einer Justice Innovation-Software unter Verwendung von Nelson Analytical 970 Interfaces integriert. Die Sequenzinterpretation wurde an einer VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]) durchgeführt. N-terminale Sequenzen (unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes mit unsicheren Resten in

Klammern) und die Menge des erhaltenen Materials (in Klam-mern) ist in Tabelle 2' dargestellt. TABELLE 2'

Sequenzen des Amino-Terminus vom mpl-Ligand

BEISPIEL 4

Flüssigsuspensions-Megakaryozytopoese-Assay

Humane periphere Stammzellen (PSC) (von Patiënten mit Zu-stimmung erhalten) wurden 5-fach mit IMDM-Medium (Gibco) verdünnt und für 15 min bei Raumtemperatur bei 800 x g zen-trifugiert. Die Zellpellets wurden in IMDM resuspendiert, auf 60% Percoll (Dichte 1,077 g/ml) (Pharmacia) geschichtet und für 30 min bei 800 x g zentrifugiert. Die mononukleären Zeilen niedriger Dichte wurden an der Zwischenphase abge-saugt, 2x mit IMDM gewaschen und zu 1-2 x 106 Zellen/ml in IMDM, enthaltend 30% FBS (1 ml Endvolumen) in Gewebekultur-schalen mit 24 Vertiefungen (Costar) ausgesät. APP oder vom mpl-Liganden befreites APP wurde zu 10% zugegeben, und die Kuituren wurden für 12^-14 Tage in einem befeuchteten Inkuba-tor bei 37°C in 5% C02 und Luft wachsen gelassen. Die Kuituren wurden ebenso in der Gegenwart von 10% APP mit 0,5 pq mpl-IqG, zugegeben an den Tagen 0, 2 und 4, wachsen gelas- sen. APP wurde vora mpl-Liganden dadurch befreit, daß APP durch eine mpl-IgG-Affinitätssäule geschickt wurde.

Uiu die Megakaryozytopoese in diesen Flüssigsuspensionskultu-ren zu quantifizieren, wurde eine Modifizierung von Solberg et al. verwendet, welche einen radioaktiv markierten Maus-IgG monoklonalen Antikörper (HP1-1D) gegen GPIIbllla (zur Verfügung gestellt von Dr. Nichols, Mayo Clinic) benutzt. 100 μg HP1-1D (siehe Grant, B. et al., Blood 69:1334-1339 [1987]) wurden mit 1 mCi Na125I unter Verwendung von-Enzymo-beads (Biorad, Richmond, Ca) radioaktiv markiert, wie durch die Anweisungeh des Herstellers beschrieben. Radioaktiv mar-kierter HP1-1D wurde bei -70°C in PBS, enthaltend 0,01% Octyl-Glucosid, gelagert. Typische spezifische Aktivitäten betrugen 1-2 x 105 cpm/Mg (>95% durch 12,5% Trichloressig-säure präzipitiert).

Die Flüssigsuspensionskulturen wurden dreifach fiir jeden ex-perimentellen Punkt erstellt. Nach 12-14 Tagen in Kultur wurden 1 ml-Kulturen in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen überführt und bei 800 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die resultierenden Zellpellets wurden in 100 μΐ PBS, enthaltend 0,02% EDTA und 20% Kâlberserum, resuspendiert. 10 ng 125J-HP1-1D in 50 μΐ Assaypuffer wurden zu den resuspen-dierten Kuituren zugefügt und für 60 min bei Raumtemperatur (RT) bei gelegentlichem Schütteln inkubiert. Daraufhin wurden die Zeilen durch Zentrifugation bei 800 x g für 10 min bei Raumtemperatur 'gesammelt und 2x mit Assaypuffer gewa-schen. Die Pellets wurden für 1 min in einem Gammazähler (Packard) gezählt. Nicht-spezifisches Binden wurde dadurch bestimmt, daß 1 μg unmarkierter HP1-1D für 60 min vor der Zugabe des markierten HP1-1D zugegeben wurde. Spezifisches Binden wurde bestimmt als der Wert, der sich dadurch ergibt, daß gesamter 125J-HP1-1D gebunden ist, minus dem Wert, der sich dadurch ergibt, daß 125J-HP1-1D in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem HP1-1D' bindet. BEISPIEL 5

Oligonukleotid-PCR-Primer

Auf der Grundlage der von den 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteinen erhaltenen amino-terminalen Aminosäuresequenz wurden degenerierte Oligonukleotide für die Verwendung als Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer (siehe Tabelle 4) entworfen. Zwei Primer-Pools wurden synthetisiert, ein Sinnstrang-20-mer-Pool kodierend für die Aminosäurereste 2-8 (mpl 1) und ein Antisinnstrang-21-mer-Pool, komplementär zu den Sequenzen, die für die Aminosäuren 18-24 (mpl 2) kodie-ren. . TABELLE 4

Degenerierte Oligonukleotid-Primer-Pools

Genomische DNA aus Schwein, isoliert aus peripheren Blutlym-phozyten des Schweins, wurden als Matrize für die PCR ver-wendet. Die 50 μΙ-Reaktion enthielt: 0,8 μρ genomische DNA aus Schwein in 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 3 itiM MgCl2, 100 Mg/ml'BSA, 400 μΜ dNTPs, 1 μΜ von jedem Primer-Pool und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase. Die anfängliche Matrizendenaturierung wurde für 8 min bei 94°C ausgeführt, gefolgt von 35 Zyklen à 45 s bei 94°C, 1 min bei 55°C und 1 min bei 72°C. Den letzten Zyklus ließ man für 10 min bei 72°C extendieren. Die PCR-Produkte wurden durch Elektropho-rese in einem 12%-Polyacrylamidgel getrennt und durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Es wurde geschlossen, daß, wenn die aminoterminale Aminosâuresequenz von einem einzelnen Exon kodiert war, das korrekte PCR-Produkte ver-mutlich 69 bp lang ist. Ein DNA-Fragment dieser Größe wurde aus dem Gel eluiert und in pGEMT (Promega) subkloniert. Se-quenzen von drei Klonen sind nachstehend in der Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 69 bp genomische DNA-Fragmente aus Schwein

Die Position der PCR-Primer ist durch die unterstrichenen Basen angedeutet. Diese Ergebnisse verifizieren die N-termi-nale Sequenz, die für die Aminosauren 9-17 für die 30 kDa-, 28 kDa- und 18-22 kDa-Proteine erhalten wurde und zeigten, daß diese Sequenz durch ein einzelnes Exon der Schweine-DNA kodiert ist. BEISPIEL 6

Humane mpl-Liganden-Gene

Auf der Grundlage der Ergebnisse von Beispiel 5 wurde ein 45-mer-Desoxyoligonukleotid, genannt pR45, entworfen und synthetisiert, um eine genomische Bank zu durchmustern. Das 45-mer hatte die folgende Sequenz:

(SEQ ID NO: 28) . 32 . 3*5

Dieses Oligonukleotid wurde mit (γ P)-ATP und T4~Kinase P-markiert und verwendet, um eine humane, genomische DNA-Bank in Xgeml2 unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen nied-riger Stringenz (siehe Beispiel 7) zu durchmustern. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt und durch Restrik-tionskartierung und Southern-Blotting analysiert. Klon #4 wurde für eine zusätzliche Analyse ausgewählt.

Ein 2,8 kb BamHI-Xbal-Fragment, das an das 45-mer hybridi-sierte, wurde in pBlueskript SK- subkloniert. Teilweise DNA-Sequenzierung dieses Klons wurde unter Verwendung von Oligo-nukleotiden, die spezifisch für die Schweine-mpl-Ligand-DNA-Sequenz sind, als Primer durchgeführt. Die erhaltene Sequenz bestätigte, daß DNA, die für den humanen homologen mpl-Liganden des mpl-Liganden aus Schwein kodiert, isoliert worden ist. Eine EcoRI-Restriktionsstelle wurde in der Sequenz entdeckt, die uns erlaubte, ein 390 bp EcoRI-Xbal-Fragment von dem 2,8 kb BamHI-Xbal zu isolieren und dieses 'in pBlueskript SK- subzuklonieren.

Beide Strange dieses Fragments wurden sequenziert. Die humane DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 9 gezeigt (SEQ ID NO: 3 & 4). Die vorausgesagten Po-sitionen von Introns in der genomischen Sequenz sind durch

Pfeile angedeutet und definiëren ein mutmaßliches Exon ("Exon 3").

Das Studium der vorausgesagten Aminosäuresequenz bestätigt, daß ein Serinrest die erste Aminosäure des reifen mpl-Ligan-den ist, wie durch direkte Aminosäureanalyse bestimmt wurde. Unmittelbar stromaufwärts von diesem Codon läßt die voraus-gesagte Aminosauresequenz stark eine Signalsequenz vermaten, die bei der Sezernierung des reifen mpl-Liganden eine Rolls spielt. Diese für eine Signalsequenz kodierende Region ist wahrscheinlich an der Nukleotidposition 68 durch ein Intron unterbrochen.

In der 3'-Richtung scheint das Exon am Nukleotid 196 zu enden. Dieses Exon kodiert daher für eine Sequenz von 42 Ami-nosäuren, wovon 16 wahrscheinlich Teil einer Signalsequenz und 26 Teil des reifen humanen mpl-Liganden sind. BEISPIEL 7

Humane mpl-Ligand-cDNA voller Länge

Auf der Grundlage der humanen "Exon 3"-Sequenz (Beispiel 6) wurden zwei nicht-degenerierte Oligonukleotide, die den 3'-und 5'-Enden der "Exon 3"-Sequenz entsprechen, synthetisiert (Tabelle 6). TABELLE 6

Nicht-degenerierte PCR-Oligonukleotid-Primer für humane cDNA

Diese zwei Primer wurden in PCR-Reaktionen verwendet, worin als Matrize DNA von verschiedenen humanen cDNA-Banken Oder 1 ng Quick Clone cDNA (Clonetech) von verschiedenen Geweben unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen verwendet wurde. Die erwartete Größe des korrekten PCR-Pro-dukts war 140 bp. Nach der Analyse der PCR-Produkte in einem 12% Polyacrylamidgel wurde ein DNA-Fragment der erwarteten Größe in cDNA-Banken entdeckt, die ausgehend von adulter Niere und 293-fötaie Nierenzellen hergestellt worden war und cDNA, die ausgehend von humaner fötaler Leben (Clonetech Ka-talog-Nr. 7171-1) hergestellt worden war.

Eine cDNA-Bank aus fötaler Leber in λ DR2 (Clonetech Kata-log-Nr. HL1151X) wurde mit demselben 45-mer Oligonukleotid durchmustert, welches verwendet worden war, urn die humane genomische Bank zu durchmustern. Das Oligonukleotid wurde mit (γ32Ρ)-ΑΤΡ unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase markiert. Die Bank wurde unter Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchmustert. Die Filter wurden für 2 Std. vorhybridisiert, danach mit der Probe über Nacht bei 42°C in 20% Formamid, 5xSSC, lOxDenhardt's, 0,05M Natrium-phosphat (pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 Mg/ml be-schallte Lachsspermien-DNA für 16 Std. hybridisiert. Die Filter wurden danach in 2xSSC gespült und daraufhin einmal in 0,5xSSC, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Die Filter wurden über Nacht einem Kodak Röntgenfilm exponiert. Positive Klone wurden abgenommen, Plaque-gereinigt, und die Insert-Größe wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die die BamHI-Xbal-Klonierungsstelle in λ DR2 (Clonetech Katalog Nr. 6475-1) flankieren, bestimmt. 5 μΐ Phagen-Stammlösung wurden als Matrizenquelle verwendet. Die anfängliche Denatu-rierung wurde für 7 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen (1 min bei 94°C, 1 min bei 52°C und 1,5 min bei 72°C). Die letzte Extension wurde für 15 min bei 72°C durchgeführt. Klon Nr. FL2b besaß ein 1,8 kb-Insert und wurde für die weitere Analyse ausgewählt.

Das Plasmid pDR2 (Clonetech, XDR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, S. 42), enthalten in-nerhalb der kDR2-Phagenarme, wurde gewonnen (rescued) wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben ist (Clonetech, XDR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, S. 29-30). Die Restriktionsana-lyse des Plasmids pDR2-FL2b mit BamHI und Xbal wies auf die Gegenwart einer internen BamHI-Restriktionsstelle ungefähr an der Position 650 in dem Insert hin. Der Verdau des Plasmids mit BamHI-Xbal schnitt das Insert in zwei Fragmente, eines von 0,65 kb und eines von 1,15 kb. Die DNA-Sequenz wurde mit drei verschiedenen Klassen an Matrizen bestimmt, die von dem Plasmid pDR2-FL2b stammten. Die DNA-Sequenzie-rung der doppelsträngigen Plasmid-DNA wurde ausgeführt mit dem ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, California) au-tomatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät unter Verwen-dung des Standardprotokolls für Farbstoff-markierte Di-desoxynukleosidtriphosphat-Terminatoren (Farbstoff-Termina-toren) und üblichen synthetisierten walking-Primer (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature, 321:674-679 [1986]). Direkte Sequen-zierung der ausgehend von dem Plasmid amplifizierten Fragmente der Polymerasekettenreaktion wurden mittels des ABI373-Sequenziergeräts unter Verwendung von üblichen Pri-mern und Farbstoff-Terminatorreaktionen durchgeführt. Die einzelsträngige Matrize wurde mit dem M13-Janus-Vektor (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1,15 kb) und BamHI (0,65 kb)-Fragmente wurden ausgehend vom Plasmid pDR2-FL2b isoliert, die Enden mit T4-DNA-Polymerase in der Gegen-war't von Desoxynukleotiden aufgefüllt und danach in die Smal-Stelle des M13-Janus subkloniert. Die Sequenzierung wurde mittels Standardprotokolle für Farbstoff-markierte M13 Universal- und reverse Primer oder walking-Primer und Farbstof f-Terminatoren ausgeführt. Manuelle Sequenzierungsreak-tionen wurden an Einz.elstrang-M13-DNA unter Verwendung von walking-Primer und Standard-Didesoxy-Abbruchchemie (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)), 33P-markiertem a-dATP und Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) durchgeführt. Der DNA-Sequenz-zusammenbau wurde durchgeführt mittels Sequencher V2.Ibl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Die Nukleo-tid- und abgeleiteten Sequenzen des hML sind in Fig. 1 be-reitgestellt (SEQ ID NO: 1). BEISPIEL 8

Isolierung des humanen mpl-Ligand (TPO)-Gens

Humane genomische DNA-Klone des TPO-Gens wurden durch Durch-mustern einer humanen genomischen Bank in X-Geml2 mit pR45, einèr vorstehend beschriebenen Oligonukleotid-Probe, unter Bedingungen niedriger Stringenz (siehe Beispiel 7) oder unter Bedingungen hoher Stringenz mit einem Fragment, welches der 3'-Hälfte der für den mpl-Liganden (von der BamHI-Stelle zum 3'-Ende) kodierenden humanen cDNA isoliert. Zwei über- lappende λ-Klone, die 35 kb überspannen, wurden isoliert. Zwei überlappende Fragmente (BamHÏ und EcoRI), die das ge-samte TPO-Gen enthalten, wurden subkloniert und sequenziert. Die Struktur des humanen Gens ist aufgebaut aus 6 Exons in-nerhalb von 7 kb genomischer DNA (Fig. 14A, B und C). Die Umgebungen aller Exon/Intron-Verknüpfungen sind vereinbar mit dem für Säuger-Gene aufgestellten Konsensusmotiv (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15:7155 (1987)).

Das Exon 1 und Exon 2 enthalten eine 5'-nicht-translatierte Sequenz und die ersten vier Aminosäuren des Signalpeptids. Der Rest des Sezernierungssignals und die ersten 26 Ami-nosäuren des reifen Proteins sind innerhalb des Exons 3 ko- diert. Die gesamte Carboxyl-Domäne und sowohl die 3'-nicht translatierte als auch ungefähr 50 Aminosäuren der Erythro-poietin-ähnlichen Domäne sind innerhalb des Exons 6 kodiert. Die vier Aminosäuren, die in die Deletion verwickelt sind, welche innerhalb des hML-2 (hTPO-2) beobachtet wurde, sind am 5'-Ende des Exons 6 kodiert. BEISPIEL 9

Transiente Expression des humanen mpl-Liganden (hML)

Um das Insert der vollen Lange, das in pDR2-FL2b enthalten ist, subzuklonieren, wurde das Plasmid vollstandig mit Xbal, danach partiell mit BamHI verdaut. Ein DNA-Fragment, welches dem 1,8 kb-Insert entspricht, wurde Gel-gereinigt und in pRK5 (pRK5-hmpl I) (siehe U.S.-PS 5,258,287 hinsichtlich der Konstruktion von pRK5) unter der Kontrolle des immediate-ear ly-Promotors des Zytomegalovirus subkloniert. DNA des Konstrukts pRK5-hmpl I wurde mittels der PEG-Methode herge-stellt und in humane embryonale Nieren-293-Zellen, die in Dulbecco's modifiziertem Eagle1s-Medium (DMEM), ergânzt mit F-12 Nährstoffmischung, 20 mM Hepes (pH 7,4) und 10-i fötalem Rinderserum, gehalten wurden, -transf iziert. Die Zeilen wur-den durch die Calciumphosphat-Methode wie beschrieben trans-fiziert (Gorman, C. (1985) in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., Hrsg.) Bd. II, S. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). 36 Std. nach der Transfektion wurde der Überstand der transfizierten Zeilen auf die Akti-vität in dem Proliferationsassay (siehe Beispiel 1) gete-stet. Der Überstand der nur mit dem pRK-Vektor transfizierten 293-Zellen ergab keine Stimulierung der Ba/F3- oder Ba/F3-mpl-Zeilen (Fig. 12A). Der Überstand der mit dem pRK5-hmpl I transfizierten Zeilen hatte keine Wirkung auf die Ba/F3-Zellen, stimuliert jedoch dramatisch die Proliferation der Ba/F3-mpl-Zellen (Fig. 12A), was zeigt, daß diese cDNA für einen funktionell aktiven humanen mpl-Liganden kodiert. BEISPIEL 10

Humane mpl-Ligand-Isoformen hML2, hML3 und hHL4

Um alternativ gespleißte Formen des hML zu identifizieren, wurden Primer synthetisiert, die jedem Ende der kodierenden Sequenz von hML entsprechen. Diese Primer wurden in der RT-PCR verwendet, um humane RNA aus adulter Leber zu amplifi-zieren. Zusätzlich wurden interne Primer, die ausgewählte Bereiche von Interesse (siehe nachstehend) flankieren, kon-struiert und ähnlich verwendet. Die direkte Sequenzierung der Enden des PCR-Produkts ließ eine einzige Sequenz erkennen, die exakt derjenigen Sequenz der cDNA, die aus der hu-manen Bank aus fötaler Leber isoliert worden war, entsprach (siehe Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). Jedoch wies eine Region in der Nähe des C-Terminus der EPO-Domäne (in der Mitte des PCR-Produkts) ein komplexes Sequenzmuster auf, was die Exi-stenz von möglichen Spleißvarianten in dieser Region andeu-tet. Um diese Spleißvarianten zu isolieren, wurden die Primer, die in Tabelle 7 bereitgestellt sind und den interes-sierenden Bereich flankieren, in einer PCR als Matrizen für humane cDNA aus adulter Leber verwendet. TABELLE 7 PCR-Primer für humane ML-Isoform

Die PCR-Produkte wurden mit glatten Enden in M13 subklc-niert. Die Sequenzierung von einzelnen Subklonen eröffnete die Existenz von wenigstens drei ML-Isoformen. Eine von die-sen, hML (auch bezeichnet als Î1ML332) , ist die langste Form und entspricht exakt der Sequenz, die aus der Bank der fStalen Leber isoliert worden ist. Die Sequenzen der vier huma-nen mpl-Ligand-Isoformen, aufgelistet ausgehend von der längsten (hML) zur kürzesten (hML-4) Isoform, sind in Fig. 11 bereitgestellt (Fig. 11 [SEQ ID NO: 6, 8, 9 & 10]). BEISPIEL 11

Konstruktion und transiente Expression der humanen mpl-Ligand-Isoformen und Substitutions-Varxanten hML2, hML3 und hML(R153A, R154A)

Die Isoformen hML2 und hML3 und die Substitutions-Variante hML(R153A, R154A) wurden ausgehend von hML unter Verwendung der von Russell Higuchi, in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Hrsg. beschriebenen re-kombinanten PCR-Technik rekonstitioniert.

In allen Konstrukten sind die vervendeten "outside"-Primer in Tabelle 8 und die "überlappenden" Primer in Tabelle 9 ge-zeigt. TABELLE 8 Outside-Primer

TABELLE 9 Überlappende Primer

Alle PCR-Amplifikationen wurden mit klonierter Pfu-DNA-Poly-merase (Stratagene) unter Verwendung der folgenden Bedingun- gen durchgeführt: Die anfängliche Matrizendenaturierung wurde für 7 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 1,5 min bei 72°C. Den letzten Zyklus ließ man für 10 min bei 72°C extendieren. Das letztendliche PCR-Produkt wurde mit Clal-Xbal verdaut, Gel-gereinigt und in pRK5tkneo kloniert. 293-Zellen wurden mit den verschiedenen Konstrukten wie vorstehend beschrieben transfiziert, und der Überstand wurde unter Anwendung des Ba/F3-mpI-Proliferationsassays untersucht. hML-2 und hML-3 zeigten keine nachweisbare Aktivität in diesem Assay, jedoch war die Aktivität von hML(R153A, R-154A) ähnlich .zu hML, was zeigt, daß die Prozessierung an dieser di-basischen Stelle nicht für die Aktivität benötigt wird (siehe Fig. 13). BEISPIEL 12

Maus-mpl-Ligand-cDNA mML, mML-2 und mML-3

Isolierung der mML-cDNA.

Ein DNA-Fragment, das der gesamten kodierenden Region des humanen mpl-Liganden entspricht, wurde durch PCR erhalten, Gel-gerei-nigt und durch "random priming" in der Gegenwart von 32P-dATP und 32P-dCTP markiert. Diese Probe wurde verwen- det, um 106 Klone'einer cDNA-Bank aus Mäuseleber in XGTIO (Clontech Katalog-Nr. ML3001a) zu durchmustern. Filterdupli-kate wurden in 35% Formamid, 5xSSC, lOxDenhardt's, 0,1% SDS, 0,05M Natriumphosphat (pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 100 /xg/ml beschallte Lachsspermien-DNA über Nacht in der Gegenwart der Probe hybridisiert. Die Filter wurden in 2xSSC gespült und danach einmal in 0,5xSSC, 0,1% SDS bei 42°C ge-waschen. Der hybridisierende Phage wurde Plaque-gereinigt, und die cDNA-Inserts wurden in die EcoRl-Stelle des Bluescript SK- Plasmids subkloniert. Der Klon "LD" mit einem 1,5 kb Insert wurde für die weitere Analyse gewählt, und beide Stränge wurden wie vorstehend für die humane ML-cDNA beschrieben sequenziert. Die Nukleotid- und abgeleitete Ami-nosauresequenz von Klon LD sind in Fig. 14 (SEQ ID NO: 1 & 11) bereitgestellt. Die abgeleitete reife ML-Sequenz von diesem Klon war 331 Aminosäurereste lang und wurde als 111ML331 (oder aus den nachstehend beschriebenen Gründen mML-2) be-zeichnet. Beträchtliche Identität sowohl hinsichtlich der Nukleotid- als auch der abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden in den EPO-ähnlichen Domänen dieser ML's beobachtet. Nachdem jedoch die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der hu-manen und Maus-ML's zueinander ausgerichtet worden waren, schien die Maussequenz eine Tetrapeptid-Deletion zwischen den hümanen Resten 111 bis 114 zu besitzen, die der 12 Nukleotide langen Deletion entspricht, die auf die Nukleo-tidposition 618 folgt und in sowohl den humanen (siehe oben) und Schwein (siehe unten)-cDNA's gesehen wurde. Dementspre-chend wurden zusätzliche Klone untersucht, urn mögliche Maus-ML-Isoformen zu entdecken. Ein Klon, "L7", besaß ein 1,4 kb^-Insert mit einer abgeleiteten Sequenz von.335 Aminosäuren, welche das "fehlende" Tetrapeptid LPLQ enthält. Diese Form ist vermutlich der Maus-ML voller Lange und wird als mML oder Ï11ML335 bezeichnet. Die Nukleotid- und abgeleitete Ami-nosäuresequenz für mML sind in Fig. 16 (SEQ ID NO: 12 & 13) bereitgestellt. Letztendlich wurde der Klon "L2" isoliert und sequenziert. Dieser Klon besaß die dem hML3 entspre-chende 116 Nukleotide lange Deletion und wird daher mML-3 genannt.. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser zwei Isoformen ist in Fig. 16 gezeigt.

Expression des rekombinanten mML.

Expressionsvektoren für Maus-ML wurden im wesentlichen wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Für mML und mML-2 ko-dierende Klone wurden in pRK5tkneo, einem Säuger-Expressi-onsvektor, der eine Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors und einem SV40-Polyadenylierungssignal ermöglicht, subkloniert. Die resultierenden Expressionsvektoren, mMLpRKtkneo und mML2pRKtkneo, wurden unter Anwendung der Calciumphosphat-Methode transient in 293-Zellen transfi-ziert. Nach der transienten Transfektion wurde das Medium für 5 Tage konditioniert. Die Zeilen wurden in DMEM-Medien mit hoher Glukosekonzentration, ergânzt mit 10% fötalem Käl-berserum, gehalten.

Expression von Maus-mpl (mmpl) in Ba/F3-Zeilen.

Stabile c-mpl exprimierende Zellinien wurden durch Transfektion von vanpl pRKtkneo erhalten, im wesentlichen wie für hu-manen mpl in Beispiel 1 beschrieben. Ein die gesamte kodie-rende Sequenz des Maus-mpI (Skoda, R.C., et al., EMBO J. 12:2645-2653 (1993)) enthaltender Èxpressionsvektor (20 pg; linearisiert) wurde durch Elektroporation (5 x 10 Zeilen, 250 Volt, 960 pF) in Ba/F3-Zellen transfiziert, worauf eine Selektion auf Neomycinresistenz mit 2 mg/ml G418 folgte. Die Expression von mpl wurde durch Durchflußzytometrie-Analyse unter Verwendung von Kaninchen-anti-Maus-mpl-IgG-Antiseren bestimmt. Die Ba/F3-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium von WEHI -3B-Zeilen als Quelle für IL-3 gehalten. Die Überstände von mit sowohl mML als auch mML-2 transient transfizierten 293-Zeilen wurden in mit sowohl mmpl als auch hmpl transfi zierten BaF3-Zellen untersucht, wie in Beispiel 1 beschrieben . BEISPIEL 13 mpl-Ligand-cDNA vom Schwein pML und pML-2

Schweine-ML (pML)-cDNA wurde durch RACE PCR isoliert. Ein Oligo-dT-Primer und zwei spezifische Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz des Exons des für den Amino-Terminus des vom aplastischen Schweineserum isolierten ML kodierenden Schweine-ML-Gens entworfen. Ausgehend von verschiedenen aplastischen Schweinegeweben hergestellte cDNA wurde erhal- ten und amplifiziert. Ein PCR-cDNA-Produkt von 1342 bp wurde in Niere gefunden und subkloniert. Mehrare Klone wurden se-quenziert, und es wurde gefunden, daß diese für den reifen Schweine-mpl-Liganden (nicht ein vollständiges Sezernie-rungssignal umfassend) kodieren. Es wurde gefunden, daß die cDNA für ein reifes Protein aus 332 Aminosäuren (PML332) mit der in Fig. 18 (SEQ ID NO: 9 & 16) gezeigten Sequenz ko-diert.

Verfahren:

Isolierung des pML-Gens und cDNA.

Genomische Klone des Schweine-ML-Gens wurden dadurch iso-liert, daß eine genomische Bank vom Schwein in EMBL3 (Clontech Inc.) mit pR 45 durchmustert wurde. Die Bank wurde im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben durchmustert. Mehrere Klone wurden isoliert, und das Exon, welches für die Aminosäuresequenz kodiert, die identisch zu derjenigen ist, die ausgehend von gereinigtem ML erhalten wurde, sequen-ziert. Schweine-ML-cDNA wurde unter Anwendung einer Modifi-zierung des RACE PCR-Protokolls erhalten. Zwei spezifische ML-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz des Schweine-ML-Gens entworfen. Polyadenylierte mRNA wurde aus der Niere aplastischer Schweine im wesentlichen wie vorstehend beschrieben isoliert. Die cDNA wurde durch reverse Transkrip-tion mit dem BamdT-Primer (BamdT: 5' GACTCGAGG ATCCATCGAI il I I I I I I I I I I I' ITT 3') (SEQ ID NO: 55) der gegen den Polyadenosin-Schwanz der mRNA gerichtet ist, hergestellt. Eine anfängliche Runde der PCR-Amplifikation (28 Zyklen von 95°C für 60 Sekunden, 58°C für 60 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden) wurde untar Verwendung des ML-spe-zifischen h-Vorwärts-1-Printers (h-forward-1: 5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3 ) (SEQ ID NO: 43) und dem BAMAD-Primer (BAMAD: 5' GACTCGAGGATCCATCG 3') (SEQ ID NO: 56) in einer 100 ml-Reaktion (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, 10 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM dNTPs mit 0,05 U/ml Araplitaq-Polymerase [Perkin Elmer Inc.]) durchgefiihrt. Das PCR-Produkt wurde da-nach mit Clal verdaut, mit Phenol-Chloroform (1:1) extra-hiert, Ethanol-präzipitiert und zu 0,1 mg Bluescript SK Vektor (Stratagene Inc.), der mit Clal und Kpnl geschnitten worden war, ligiert. Nach zweistündiger Inkubation bei Raum-temperatur wurde ein Viertel der Ligierungsmischung direkt zu einer zweiten PCR-Runde (22 Zyklen, wie vorstehend be- schrieben) unter Verwendung eines zweiten ML-spezifischen Vorwärts-1-Primers (forward-1: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO: 57) und T3-21 (ein Oligonukleotid, das an eine Sequenz bindet, die benachbart zu der multiplen Klonierungsregion innerhalb des Bluescript SK-Vektors liegt) (5' CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3') (SEQ ID NO: 58). zugefiigt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Xbal und Clal verdaut und in Bluescript SK- subkloniert. Mehrere Kione aus unabhängigen PCR-Reaktionen wurden sequenziert.

Wiederum wurde ein zweite Form, die pML-2 bezeichnet wurde, identifiziert, welche fiir ein Protein mit einer 4 Aminosäu-rereste langen Deletion (328 Aminosäurereste) kodiert (siehe Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). Ein Vergleich der pML- und pML-2-Aminosäuresequenzen zeigt, daß die letztere Form identisch ist, mit der Ausnahme, daß das Tetrapeptid QLPP, welches den

Resten 111-114 einschließlich entspricht, deletiert worden ist (siehe Fig. 22 [SEQ ID NO: 18 & 21]). Die vier Aminosäu-ren lange Deletion, die in Maus-, humaner und Schweine-ML-cDNA beobachtet wurde, kommt an genau derselben Position in-nerhalb der vorausgesagten Proteine vor.

Beispiel 14 CMK-Assay für Thrombopoietin (TPO)-Induktion von Blutplätt- chen-Antigen GPIIblIIa Expression

Die CMK-Zellen werden in RMPI 1640-Medium (Sigma), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 10 mM Glutamin, gehalten.

Zur Vorbereitung des Assays werden die Zeilen geerntet, ge-waschen und zu 5xl05 Zellen/ml in Serum-freien GIF-Medium, ergânzt mit 5 mg/1 Rinderinsulin, 10 mg/1 Apo-Transferrin, 1 X Spurenelemente, resuspendiert. In eine Gewebekulturplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen werden die TPO-Stan-dard- oder Experiment-Proben in geeigneten Verdünnungen in 100 μΙ-Volumina in jede Vertiefung zugefügt. 100 μΐ der CMK- Zellsuspension wird in jede Vertiefung zugefügt, und die Ge-webekulturplatten werden bei 37°C in einem 5% C02-Inkubator für 48 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten bei 1000 Upm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert.

Die Überstände werden verworfen, und 100 μΐ des FITC-konju-gierten GPIIblIIa-monoklonalen 2D2-Antikörpers werden in jede Vertiefung zugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei 4°C werden die Platten wiederum bei 1000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Die nicht-gebundene Antikörper enthaltenden Überstände werden verworfen, und 200 μΐ 0,1% BSA-PBS-Waschlösung wird zu jeder Vertiefung zugefügt. Der Wasch-schritt mit 0,1% BSA-PBS wird dreimal wiederholt. Die Zeilen werden danach in einem FASCAN unter Anwendung einer Stan-dard-Ein-Parameter-Analyse analysiert, wobei die relative Fluoreszenzintensität gemessen wird.

Beispiel 15 DAMI-Assay für Thrombopoietin (TPO) durch Hessen der endo-mitotischen Aktivität von DAMI-Ze]len in 96-Loch-Mikrotiter-platten DAMI-Zellen werden in IMDM + 10% Pferdeserum (Gibco), er-gänzt mit 10 mM Glutamin, 100 ng/ml Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycin, gehalten. Zur Vorbereitung des Assays werden die Zeilen geerntet, gewaschen und zu 1x10 Zellen/ml in IMDM + 1% Pferdeserum resuspendiert. In einer Platte mit 9 6 Vertiefungen mit Rundböden werden 100 μΐ der TPO-Stan-dard- oder Experiment-Proben zu der DAMI-Zellsuspension zu-gefügt. Die Zeilen werden danach für 48 Stunden bei 37°C in einem 5% C02-lnkubator inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten in einer Sorvall 6000B-Zentrifuge bei 1000 Upm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, und der Waschschritt mit 200 μΐ PBS-0,1% BSA wird wiederholt. Die Zeilen werden durch die Zugabe von 200 μΐ eiskaltem 70% Ethanol-PBS fixiert und durch Saugen resuspendiert. Nach 15-minütiger Inkubation bei 4°C werden die Platten bei 2000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert und 150 μΐ 1 mg/ml RNAse, enthalten 0,1 mg/ml Propidiumiodid und 0,05% Tween-20, werden in jede Vertiefung zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°'C werden die Veränderungen hinsichtlich des DNA-Gehalts durch Durchflußzytometrie ge-messen. Polyploïdie wird wie folgt gemessen und quantifi-ziert:

Normalisierte Polyploid-Rate (NPR) = (%Zellen in>G2->-M/%Zellen in <G2+M) mit TPO (%Zellen in >G2+M/%Zellen in <G2+M) in Kontrolle

Beispiel 16

Thrombopoietin (TPO) in vivo-Assay (Maus-Blutplättchen-Rebound-Assay) jjj vivo-Assay für Bestimmung der Blutplättchenproduktion C57BL6-Mäuse (erhalten von Charles River) werden intraperitoneal (IP) mit 1 ml Ziege-Anti-Maus-Blutplättchen-Serum (6 amps) am Tag 1 injiziert, urn Thrombozytopenie zu erzeugen.

An den Tagen 5 und 6 werden den Mäusen zwei IP-Injektionen des Faktors oder PBS als Kontrolle verabreicht. Am Tag 7 werden 30 ßCi Na235S04 in 0,1 ml Kochsalzlösung intravenös injiziert, und der Prozentsatz des 35S-Einbaus der injizier-ten Dosis in zirkulierende Blutplättchen wird in den von den behandelten und Kontrollmäusen erhaltenen Blutproben gemes-sen. Die Blutplättchenzählungen und Leukozytenzählungen werden zur selben Zeit in Blut durchgeführt, das von dem retro-orbitalen Sinus erhalten wurde.

Beispiel 17 KIRA ELISA für Thrombopoietin (TPO) durch Messen der Phos-phorylierung des chimären iupl-Rse.gD-Rezeptors

Der humane mpl-Rezeptor ist von Vigon et al., PNAS, USA 89:5640-5644 (1992) beschrieben worden. Ein chimärer Rezep-tor, der die extrazelluläre Domäne (ECD) des mpl-Rezeptors und die Transmembran (TM)- und intrazelluläre Domäne (ICD) des Rse (Mark et al, J. of Biol. Chem. 269(14):10720-10728 [1994]) mit einem Carboxyl-terminalen Polypeptidanhang (flag polypeptide) (d.h. Rse.gD) umfaßt, wurde für eine Verwendung in dem hierin beschriebenen KIRA ELISA hergestellt. Siehe Fig. 30 und 31 hinsichtlich einer diagrammartigen Beschrei-bung des Assays. (a) Préparation des Abfang-Agens

Monoklonaler Anti-gD (Klon 5B6) wurde gegen ein Peptid des Glycoproteins D von Herpes simplex-virus (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6):547-553[1990]) hergestellt. Die ge-reinigte Stammprâparation wurde auf 3,0 mg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 eingestellt, und 1,0 ml-Aliquots wurden bei -20°C gelagert. (b) Präparation des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers Monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Klon 4G10, wurde von UBI (Lake Placid, NY) bezogen und unter Verwendung von langarmigem Biotin-N-Hydroxysuccinamid (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH) biotinyliert. (c) Ligand

Der mpl-Ligand wurde durch die hierin beschriebenen rekombi-nanten Techniken hergestellt. Der gereinigte mpl-Ligand wurde bei 4°C als Stammlösung gelagert. (d) Präparation der Rse.gD-Nukleinsäure

Synthetische doppelsträngige Oligonukleotide wurden verwennet, um die kodierende Sequenz für die C-terminalen 10 Ami-nosäuren (880-890) des humanen Rse zu rekonstitutionieren und zusätzliche 21 Arainosäuren, die ein Epitop für den Anti-körper 5B6 und ein Stopcodon enthalten, zuzufügen. Die Ta-belle 10 stellt die Endsequenz des synthetischen Teils des Fusiongens dar.

Tabelle 10

Synthetischer doppelsträngiger Teil des humanen Rse-Fusion-

Gens

Die synthetische DNA wurde ligiert mit der für die Amincsäu-ren 1-880 des humanen Rse kodierenden cDNA an der Pstl-Stelle, beginnend am Nukleotid 2644 der publizierten cDNA-Sequenz des humanen Rse (Mark et al, Journal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728 [1994]), und den HindlII-Stel-len in dem Polylinker des Expressionsvektors pSV17.ID.LL (siehe Fig. 32A-L; SEQ ID NO:22), um das Expressionsplasmid pSV.ID.Rse.gD zu erzeugen. Das Expressionsplasmid umfaßt ein dicistronisches primäres Transkript, welches die für den DHFR kodierende Sequenz enthält, die von 5'-Spleißdonor- und 31-Spleißakzeptor-Intronspleißstellen umgeben ist, gefolgt von der Sequenz, die für den Rse.gD kodiert. Die Boten-RNA der vollen Lange (nicht gespleißt), enthält DHFR als erstes offenes Leseraster und erzeugt daher ein DHFR-Protein, wo-durch stabile Transformanten selektiert werden können. (e) Präparation der mpl-Rse.gD-Nukleinsäure

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Expressionsplasmid pSV.ID.Rse.gD wurde modifiziert, um das Plasmid pSV.ID.M.tmRd6 herzustellen, das die kodierende Sequenz der ECO des humanen mpl (Aminosäuren 1-491) fusioniert an die

Transmembrandomäne und die intrazelluläre Domäne des Rse.gD (Aininosäuren 429-911) , enthielt. Synthetische Oligonukleo tide wurden verwendet, urn die kodierende Sequenz eines Teils der extrazellulären Domäne des humanen mpl an einen Teil der für Rse kodierenden Sequenz in einer zweistufigen PCR-Klo-nierungsreaktion zu knüpfen, wie beschrieben von Mark et.al., J.Biol. Chem. 267:26166-26171 (1992). Die für die erste PCR-Reaktion verwendeten Primer waren Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID NO: 61) und M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO: 62)

mit einer mpl-cDNA-Matrize und RI (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3') (SEQ ID NO: 63) und R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) mit einer Rse-cDNA-Matrize. Der PvuII-Smal-Teil dieser Fusi-onsverbindung wurde für die Konstruktion des chimâren Rezep-tors voiler Lange verwendet. (f) Zelltransformation DP12.CHO-Zellen (EP 307247, verôffentlicht am 15. März 1989) wurden durch Elektroporation mit pSV.ID.M.tmRd6, welcher an einer einzigen Notl-Stelle in dem Plasmidteil linearisiert worden war, transformeert. Die DNA wurde nach einer Phenol/Chloroform-Extrakt ion Ethanol-präzipitiert und in 20 μΐ 1/10 Tris EDTA resuspendiert. Danach wurden 10 pg DNA mit 107 CHO DP12-Zellen in 1 ml PBS vor der Elektroporation bei 400 Volt und 330 μί für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zeilen wurden für 10 Minuten zurück zum Eis gebracht, bevor sie in nicht-selektives Medium ausgesät wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zeilen in Nukleosid-freiem Medium inku- biert, urn auf stabile DHFR+ Klone zu selektieren.

(g) Selektion der transformierten Zeilen für die Verwendung in dem KIRA ELISA

Mpl/Rse.gD exprimierende Klone wurden durch Western-Blotting der Gesamtzellysate nach Fraktionierung durch SDS-PAGE unter Verwendung des Antikörpers 5B6, welcher das gD-Epitop-tag erkennt, identifiziert. (h) Medien

Die Zeilen wurden in F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) kultiviert. Die Medien wurden er-gänzt mit 10% diafiltiertem FBS (HyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin.

(i) KIRA ELISA

Mit mpl-Rse.gD transformierte DP12CHO-Zellen wurden in den Vertiefungen einer Kulturplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen in 100 μΐ Medium ausgesät (3xl04 pro Vertie-fung) und über Nacht bei 37°C in 5% C02 kultiviert. Am fol-genden Morgen wurden die Überstände in den Vertiefungen de-kantiert, und die Platten leicht auf einem Papierhandtuch abgeklopft. 50 μΐ Medium, enthaltend entweder die Experi-mentproben oder 200, 50, 12,5, 3,12r 0,78, 0,19, 0,048 oder 0 ng/ml mpl-Ligand, wurden danach zu jeder Vertiefung zuge-geben. Die Zeilen wurdèn bei 37°C für 30 Minuten stimuliert, die Überstände in den Vertiefungen wurden dekantiert und die Platten noch einmal leicht auf einem Papierhandtuch abgeklopft. Um die Zeilen zu lysieren und die chimären Rezepto-ren in Lösung zu bringen, wurden 100 μΐ Lysepuffer zu jeder Vertiefung zugefügt. Der Lysepuffer bestand aus 150 mM NaCl, enthaltend 50 mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% Thimerosal, 30 KIU/ml Aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid-hydrochlorid (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 μΜ Leupeptin (ICN

Biochemicals) und 2 mM Natrium Orthovanadat (Na3V04; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. Die Platte wurde danach auf einem Plattenschüttler (Bellco Instruments, Vineland, NJ) für 60 Minuten bei Raumtemperatur sanft bewegt. Während die Zeilen in Lösung gingen, wurde eine ELISA-Mikro-titerplatte (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dänemark) , die iiber Nacht bei 4°C mit dem monoklonalen Anti-gD-Antikörper 5B6 (5,0 jLig/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, .100 μΙ/Vertiefung) beschichtet worden war, dekantiert, auf einem Papierhandtuch abgeklopft und mit 150 μΙ/Vertiefung Blockie-rungspuffer [PBS, enthaltend 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) und 0,01% Thimerosal] für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit sanfter Bewegung abgesättigt (blockiert).

Nach 60 Minuten wurde die mit Anti-gD 5B6 beschichtete Platte 6 mal mit Waschpuffer (PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 und 0,01% Thimerosal) unter Verwendung eines automatisierten Plattenwaschgeräts (ScanWasher 300, Skatron Instruments,

Inc., Sterling, VA) gewaschen.

Das Lysat, welches solubilisierten MPL/Rse.gD von den Zell-kultur-Mikrotitervertiefungen enthielt, wurde in mit Anti-gD 5B6 beschichtete und abgesättigte ELISA-Vertiefungen trans-feriert (85 μΙ/Vertiefung) und für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit sanfter Bewegung xnkubxert. Ungebundener mpl Rse.gD wurde durch Waschen mit Waschpuffer entfernt, und 100 μΐ biotinylierter 4G10 (Anti-Phosphotyrosin), 1:18000 in Verdünnungspuffer (PBS, enthaltend 0,5% BSA, 0,05-s Tween-20, 5 mM EDTA und 0,01% Thimerosal) verdünnt, d.h. 56 ng/ml wur-den in jede Vertiefung zugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte gewaschen, und 100 μΐ Meerrettichperoxidase (HRPO)-konjugiertes Streptavidin (Zymed Laboratories, S.San Francisco, CA), 1:60000 in Verdünnungspuf fer verdünnt, wurden zu jeder Vertiefung zugefügt. Die Platte wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanfter Bewegung inkubiert. Das freie Avidin-Konjugat wurde weggewaschen, und 100 μΐ frisch hergestellte Substratlösung (Tetramethylbenzidin [TMB]; 2-Komponenten-Substratkit, Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) wurden zu jeder Ver-tiefung hinzugefügt. Man ließ die Reaktion 10 Minuten lang fortschreiten, wonach die Farbentwicklung durch die Zugabe von 100 μΙ/Vertiefung 1,0 M H3P04 gestoppt wurde. Die Absorption bei 450 nm wurde bei einer Bezugswellenlänge von 650 nm (ABS450/650) unter Verwendung eines vmax Platten-Lese-geräts (Molecular Devices, Palo Alto, CA), das durch einen Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) und DeltaSoft Software (BioMetallics, Inc. Princeton, NJ) kon-trolliert wurde, gelesen.

Die Standardkurve wurde durch Stimulieren von dpl2.trkA,B-oder C.gD-Zellen mit 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 oder 0 ng/ml mpl-Ligand erzeugt urd als ng/ml TPO versus

Mittelwert ABS450/650 - unter Anwendung des DeltaSoft-Pro-gramms präsentiert. Die Probenkonzentrationen wurden durch Interpolation ihrer Absorption an der Standardkurve erhalten und sind als ng/ml TPO-Aktivität ausgedrückt.

Es wurde gefunden, daß der mpl-Ligand den chimären mpl-Rse.gD-Rezeptor in einer konzentrationsabhängigen und Li-gand-spezifischen Weise aktivieren kann. Weiterhin wurde gefunden, daß der mpl-Rse.gD KIRA-ELISA bis zu 100% humanes Serum (gezeigt) oder 100% Plasma (nicht gezeigt) toleriert, was die Verwendung des Assays erlaubt, urn schnell Patienten-und pK-Proben zu durchmustern. 293-produziertes TPO332 Std Kurve

TPO Konz. (ng/ml)

Beispiel 18

Rezeptor-vermittelter ELISA für Thrombopoietin (TPO) ELISA-Platten wurden mit Kaninchen F(ab')2-Anti-human IgG (Fc) in Carbonatpuffer, pH 9,6., bei 4°C über Nacht beschich-tet. Die Platten wurden mit 0,5% Rinderserumalbumin in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur abgesättigt. Die Fermen-terernte, enthaltend den chimären Rezeptor, mpl-IgG, wurde zu den Platten zugefügt und für 2 Stunden inkubiert. Zwei-fach-Reihenverdünnungen (0,39-25 ng/ml) des Stai dards (TPO332, hergestellt in 293-Zellen mit der mittels quantita-tiver Aminosäureanalyse bestimmten Konzentration) und rei-henverdünnte Proben in 0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Twen-20 wurden zu den Platten zugefügt und für 2 Stunden inkubiert. Gebundenes TPO wurde mit gereinigtem Protein A, bio-tinylierten Kaninchen-Antikörpern gegen TP0155, welches in E.coli (1 Stunde Inkubation) hergestellt wurde, gefolgt von Streptavidin-Peroxidase (30 Minuten Inkubation) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat detektiert. Die Absorption wurde bei 450 nm abgelesen. Die Platten, wurden zwischen den Schritten gewaschen. Zur Datenanalyse wird die

Standardkurve unter Anwendung eines Vier-Parameter-Kurvenan-passungsprogramms von Kaleidagraph angepaßt. Die Probenkon-zentrationen wurden ausgehend von der Standardkurve berech-net.

Beispiel 19

Expression und Reinigung des TPO von 293-zellen 1. Preparation der Expressionsvektoren für 293-Zellen.

Eine dem gesamten offenen Leseraster für TPO entsprechende cDNA wurde unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide als Primer durch PCR erhalten:

Tabelle 11 293 PCR-Primer

PRK5-hmpl I (beschrieben in Beispiel 9) wurde als Matrize für die Reaktion in der Gegenwart der pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denaturierung er-folgte für 7 Minuten bei 94°C, worauf 25 Amplifikationszy-klen (1 Minute bei 94°, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C) folgten. Die letzte Extension erfolgte für 15 Minuten bei 12°C. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restriktionsstellen Clal und Xbal des Plasmids pRK5tkneo, einem vom pRK5 abstammenden Vektor, der derart modifiziert wurde, daß ein Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Thymidinkinase-Promotors exprimiert wird, kloniert, urn den Vektor pRK5tkneo.ORF zu erhalten. Ein zweites Konstrukt, das der epo-homologen Domäne entspricht, wurde auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwendung des Cla.FL.F als Vorwärts-Primer und des folgenden reversen Primers erzeugt:

Arg.STOP.Xba: 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAG GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO: 66)

Das letztendliche Konstrukt wird pRK5-tkneoEP0-D genannt.

Die Sequenz beider Konstrukte wurde wie in Beispiel 7 be-schrieben verifiziert. 2. Transfektion humaner embryonaler Nieren-Zellen

Diese zwei Konstrukte wurden in humane embryonale Nierenzel-len mittels der CaP04-Methode, wie in Beispiel 9 beschrie-ben, transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Selektion Neomycin-resistenter Klone in der Gegenwart von 0,4 mg/ml G418 gestartet. 10 bis 15 Tage später wurden EinzelkoIonien in Platten mit 96 Vertiefungen überführt und bis zur Konfluenz wachsengelassen. Die Expression von ML153 oder ML332 in den konditionierten Medien von diesen Klonen wurde mittels des Ba/F3-mpI-Proliferationsassays (beschrieben in Beispiel 1) bestimmt. 3. Reinigung von rhML332

Durch 293-rb.ML.332 konditioniertes Medium wurde auf eine Blue-Sepharose(Pharmacia)-Säule, die in 10 mM Natriumphosphat pH 7,4 (Puffer A) equilibriert wurde, appliziert. Die Säule wurde nachfolgend mit 10 Säulenvolumina jeweils des Puffer A und Puffer A, enthaltend 2M Harnstoff, gewaschen. Die Säule wurde danach mit Puffer A, enthaltend 2M Harnstoff und 1 M NaCl, eluiert. Der Blue-Sepharose-Elutionspool wurde danach direkt auf eine im Puffer A equilibrierte WGA-Sepharose-Säule appliziert. Die WGA-Sepharose-Säule wurde danach mit 10 Säulenvolumina des Puffers A, enthaltend 2M Harnstoff und 1 M NaCl, gewaschen und mit demselben Puffer, enthaltend 0,5 M N-Acetyl-D-glucosamin eluiert. Das WGA-Sepharose-Eluat wurde auf eine in 0,1% TFA equilibrierte C4-HPLC-Säule (Synchrom, Inc.) appliziert. Die C4-HPLC-Säule wurde mit einem diskontinuierlichen Propanol-Gradienten (0-25%, 25-35%, 35-70%) eluiert. Es wurde gefunden, daß rhML332 in dem 28-30% Propanolbereich des Gradiënten eluiert..In der SDS-PAGE wandert der gereinigte rhML332 als eine breite Bande im 68-80 kDa-Bereich des Gels (siehe Fig. 15). 4. Reinigung des rhML153

Durch 293-rhML153 konditioniertes Medium wurde an Blue-Sepha-rose, wie für rhML332 beschrieben, aufgetrennt. Das Blue-Sepharose-Eluat wurde direkt auf eine mpl-kffinitätssäule, wie vorstehend beschrieben, appliziert. Von der mpI-Affini-tätssäule eluierter rhML153 wurde zur Homogenität unter Ver-wendung einer C4-HPLC-Säule, die unter denselben Bedingungen wie für rhML332 beschrieben laufengelassen wurde, gereinigt. In der SDS-PAGE trennt sich der gereinigte rhML153 in zwei größere und zwei kleinere Banden mit MG von ungefähr 18000-21000 (siehe Fig. 15).

Beispiel 20

Expression und Reinigung des TPO von CHO 1. Beschreibung der CHO-Expressionsvektoren

Die in den nachstehend beschriebenen Elektroporationsproto-kollen verwendeten Expressionsvektoren sind folgendermaßen bezeichnet worden-: pSVI5. ID.LL.MLORF (volle Lange oder ΜΡ0332) und pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (verkürzt oder hTP0153) .

Die einschlägigen Merkmale dieser Plasmide sind in den Fig. 23 und 24 dargestellt. 2. Preparation der CHO-Expressionsvektoren

Eine cDNA, die dem gesamten offenen Leseraster vom hTPO ent-spricht, wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer der Tabelle 12 durch PCR erhalten.

PRK5-hmpl I (beschrieben in den Beispielen 7 und'9) wurde als Matrize für die Reaktion in der Gegenwart der pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) verwendet. Die anfängliche Denatu-^-ierung erfolgte für 7 Minuten bei 94°C, worauf 25 Amplifi- kationszyklen (1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C) folgten. Die letzte Extension erfolgte für 15 Minuten bei 72°C.· Das PCR-Produkt wurde gereinigt und zwischen die Restriktionsstellen Clal und Sali des Plasmids pSVI5.ID.LL kloniert, um den Vektor pSVI5.ID.LL.MLORF zu er-halten. Ein zweites Konstrukt, das der EPO-homologen Domäne entspricht, wurde auf dieselbe Weise, jedoch unter Verwen-dung des Cla.FL.2 als Vorwärts-Primer und den folgenden re-versen Primer erzeugt: EPOD.SaJ 5' AGT CG A CGT CGA CTC ACC TGA CGC AG A GGG T GG ACC 3' (SEQ ID NO: 68)

Das letztendliche Konstrukt wird pSVI5.ID.LL.MLEPO-D ge-nannt. Die Sequenz beider Konstrukte wurde, wie in den Beispielen 7 und 9 beschrieben, verifiziert.

Im wesentlichen wurden die kodierenden Sequenzen für den Li-ganden der vollen Länge und den verkürzten Liganden in die multiple Klonierungsstelle des CHO-Expressionsvektors pSVI5.ID.LL eingebracht. Dieser Vektor enthält die frühe Promotor/Enhancer-Region des SV40, eine die Maus-DHFR-cDNA enthaltende modifizierte Spleiß-Einheit, eine multiple Klonierungsstelle für das Einbringen des interessierenden Gens (in diesem Fall die beschriebenen TPO-Sequenzen), ein Poly-adenylierungssignal von SV40 und einen Replikationsursprung und das Beta-Lactamase-Gen für die Plasmidselektion und -amplifikation in Bakterien. 3. Methodik zum Etablieren stabiler CHO-Zellinien,'die re-kombinantes humanes TPO332 und TPO153 exprimieren a. Seschreibung der CHO-Elternzellinie

Die CHO (chinesische Hamsterovarien) Wirtszell-Linie, die fiir die Expression der hierin beschriebenen TPO-Moleküle verwendet wurde, ist bekannt als CHO-DP12 (siehe EP 307 247, veröffentlicht am 15. März 1989). Diese Säuger-Zellinie wurde ausgehend von einer Transfektion der Elterniinie (CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-, erhalten von Dr. Frank Lee von der Standford Universität mit der Erlaubnis von Dr.L.Chasin), mit einem Präproinsulin exprimierenden Vektor klonal selek-tiert, urn Klone mit reduzierten Insulinbediirfnissen zu erhalten. Diese Zeilen sind auch DHFR minus, und Klone können auf das Vorhandensein von DHFR cDNA-Vektorsequenzen durch Wachstum auf Medium, dem Nukleosidzusätze (Glycin, Hypo-xanthin und Thymidin) fehlen, selektiert werden. Dieses S'e-lektionssystem auf stabil exprimierende CHO-Zellinien wird allgemein verwendet. b. Transfektionsmethode (Elektroporation) TPO332 und TPO153 exprimierende Zellinien wurden durch Transfektion von DP12-Zellen mittels Elektroporation (siehe z.B. Andreason, G.L. J.Tiss. Cult. Meth., 15,56 [1993]) mit line-arisierten pSVI5.ID.LL.MLORF- bzw. pSVI5. ID.LL.MLEPO-D-Plas-miden erzeugt. Drei (3) Restriktionsenzym-Reaktionsmischun-gen wurden zum jeweiligen Schneiden der Plasmide herge-stellt; 10 μg, 25 μg und 50 μg des Vektors mit dem Enzym NotX durch Standardverfahren der Molekularbiologie. Diese Restriktionsstelle wird nur einmal in dem Vektor in der Li-nearisierungsregion 3' und außerhalb der TPO-Ligand-Trans-kriptionseinheicen (siehe Fig. 23) gefunden. Die 100 μΙ-Re-aktionen wurdén für eine Inkubation über Nacht bei 37°C be-reitet. Am nächsten Tag wurden die Mischungen mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (50:49:1) einmal extrahiert und für ungefähr eine Stunde auf Trockeneis Ethanol-präzipi-tiert. Das Präzipitat wurde danach durch eine 15 minütige Mikrozentrifugation gesammelt und getrocknet. Die 1ineari-sierte DNA wurde in 50 μΐ Ham's DMEM-F12 1:1 Medium, ergänzt mit Standard-Antibiotika und 2 mM Glutamin, resuspendiert.

In Suspensionskultur wachsende DP12-Zellen wurden gesaramelt, einmal in dem für das Resuspendieren der DNA beschriebene Medium gewaschen und letztendlich in demselben Medium zu einer Konzentration von 107 Zeilen pro 750 μΐ resuspendiert. Aliquots der Zeilen (750 μΐ) und jede Mischung der lineari-sierten DNA wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur zusam-men inkubiert und danach in eine BRL-Elektroporationskammer transferiert. Jede Reaktionsmischung wurde dann in einem Standard-BRL-Elektroporationsapparat bei 350 Volt, festge-legt bei 330 ßF, und niedriger Kapazitanz elektroporiert. Nach der Elektroporation ließ man die Zeilen in dem Apparat für 5 Minuten und danach für eine zusätzliche 10-minütige Inkubationszeitdauer auf Eis sich absetzen. Die elektro-porierten Zeilen wurden in 60 mm-Zellkulturschalen, enthal- tend 5 ml komplettes Standard-Wachstumsmedi'um für CHO-Zellen (DMEM-F12 50:50 mit hoher Glucosekonzentration ohne Glycin, ergânzt mit IX GHT, 2 mM Glutamin und 5% fötalem Kälberse-rum) überführt und über Nacht in einem 5% C02-Zellkulturin-kubator wachsen gelassen. c. Selektions- und Durchmusterungs-Methode Am nächsten Tag wurden die Zeilen durch Standardverfahren von den Platten mit Trypsin abgelöst und in 150 mm Gewebe-kulturschalen, enthaltend selektives DHFR-Medium (vorstehend beschriebenes Ham's DMEM-F12, l:l-Medium, ergânzt mit entwe-der 2% oder 5% dialysiertem fötalen Kälberserum, jedoch frei von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; dies ist das DHFR-Standard-Selektionsmedium, das wir verwenden) überführt. Die Zelle von jeder 60 mm-Schale wurden nachfolgend nochmals ir 5/150 mm-Schalen ausgesät. Die Zeilen wurden danach für 10-15 Tage (mit einem Mediumwechsel) bei 37°C/5% C02 inkubiert, bis Klone anfingen zu erscheinen und Größen erreichten, die für einen Transfer in Schalen mit 96 Vertiefungen geeignet waren. Über eine Zeitdauer von 4-5 Tagen hinweg wurden die Zellinien unter Verwendung steriler gelber Spitzen auf einer auf 50 ml eingestellten Pxpettierhilfe in Schalen mit 96

Vertiefungen überführt. Die Zeilen ließ man bis zur Konflu-enz (gewöhnlich 3-5 Tage) wachsen, und danach wurden die Schalen trypsinisiert und zwei Kopien der ursprünglichen Schale reproduziert. Zwei dieser Kopien wurden im Gefrier-schrank mit Zeilen in jeder Vertiefung, verdünnt in 50 μΐ 10% FCS in DMSO kurzzeitig gelagert. 5Tage lang konditio-nierte, serumfreie Mediumproben wurden von konfluent bewach-senen Vertiefungen in der dritten Schale auf TPO-Expression mittels des auf Ba/F-Zellen basierenden Aktivitätsassays un-tersucht. Die auf der Grundlage dieses Assays am höchsten exprimierenden Klone wurden von der Aufbewahrung reaktiviert und zu zwei konfluénten 250 mm T-Flaschen hoc'ngezogen für den Transfer zu der Zellkulturgruppe für e.ine Suspensionsan-passung, Kontrolle und Konservierung. d. Amplifikaktionsprotokoll

Mehrere Zeliinien mit den höchsten Titern aus der vorstehend beschriebenen Selektion wurden nachfolgend durch eine Stan-dard-Methotrexat-Amplifikationsbehandlung geführt, um Klone mit hohen Titern zu erzeugen. CHO-Zellklone werden expan-diert und in 10 cm-Schalen mit 4 Methotrexat-Konzentrâtionen (d.h. 50 nM, 100 nM, 200 nM und 400 nM) zu zwei oder drei Zellzahlen (105, 5x105 und 106 Zeilen pro Schale) ausgesät. Diese Kuituren werden danach bei 37°C/5% CO2 inkubiert, bis Klone etabliert und geeignet zum Transfer in Schalen mit 96 Vertiefungen für den weiteren Assay sind. Mehrere Klone mit hohen Titern von dieser Selektion wurden nochmals größeren Methotrexat-Konzentrâtionen (d.h. 600 nM, 800 nM, 1000 nM und 1200 nM) ausgesetzt, und wie vorstehend beschrieben ließ man die resistenten Klone sich etablieren, worauf diese in Schalen mit 96 Vertiefungen überführt und untersucht wurden. 4. Kultivieren stabiler CHO-Zellinien, die rekombinanten hu-manen TP0332 und TP0153 exprimieren.

Aufbewahrte Zeilen werden aufgetaut, und die Zellpopulation wird durch Standard-Zellwachstumsverfahren in entweder serumfreiem oder Serum-enthaltendem Medium expandiert. Nach der Expansion zu einer ausreichenden Zelldichte werden die Zeilen gewaschen, um verbrauchtes Zellkulturmedium zu ent-fernen. Die Zeilen werden danach durch irgendein Standard-verfahren kultiviert, umfassend Chargen (batch)-, gefütterte Chargen (fed-batch)- oder kontinuierliche Kultur bei 25-40°C, neutralem pH, mit einem Gehalt an gelöstem O2 von min-destens 5% bis das konstitutiv sezernierte TPO angehäuft ist. Die Zellkulturflüssigkeit wird dann von den Zeilen durch mechanische Mittel, wie Zentrifugation, abgetrennt. 5. Reinigung des rekombinanten humanen TPO von CHO-Kultur-flüssigkeiten

Geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF) wird direkt auf eine

Blue-Sepharose 6 Schnelldurchflußsäule (Fast Flow column;

Pharmacia), die in 0,01 M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl zu einer Rate von ungefähr 1001 HCCF pro Liter Harz und zu 2 einer linearen Fließrate von ungefähr 300 ml/h/cm appli-ziert. Die Säule wird danach mit 3 bis 5 Säulenvolumina des Eguilibrierungspuffers, gefolgt von 3 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,OM Harnstoff, gewaschen. Das TPO wird danach mit 3 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,OM Harnstoff, 1,0M NaCl eluiert.

Der TPO enthaltende Blue-Sepharose-Pool wird danach auf eine

Weizenkeimlektin-Sepharose 6MB-Säule (Pharmacia) appliziert,

die in 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,OM Harnstoff und 1,0M

NaCl zu einer Rate von 8 bis 16 ml des Blue-Sepharose-Pools 2 pro ml Harz bei einer Fließrate von ungefähr 50 ml/h/cm appliziert. Die Säule wird danach mit 2 bis 3 Säulenvolumina des Equilibrierungspuffers gewaschen. Das TPO wird danach bis 2 bis 5 Säulenvolumina von 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 2,OM Harnstoff, 0,5M N-Acetyl-D-glucosamin eluiert.

Der Weizenkeimlektin-Pool wird danach zu einer Endkonzentra-tion von 0,04% C12E8 und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) einge-stellt. Der resultierende Pool wird auf eine C4-Umkehrpha-sensäule (Vydac 214TP1022) appliziert, die in 0,1% TFA, 0,04% C]_2E8 zu einer Beladung von ungefähr 0,2 bis 0,5 mg . . 2 Protein pro ml Harz bei einer Fließrate von 157 ml/h/cm equilibriert wurde.

Das Protein wird in einem zweiphasigen linearen Acetonitril-Gradienten, enthaltend 0,1% TFA, 0,04% C^Eg eluiert. Die er-ste Phase besteht aus einem linearen Gradiënten von 0 bis 30% Acetonitril in 15 Minuten. Die zweite Phase besteht aus einem linearen Gradiënten von 30 bis 60% Acetonitril in 60 Minuten. Das TPO eluiert bei ungefähr 50% Acetonitril. Ein Pool wird auf der Grundlage von SDS-PAGE hergestellt.

Der C4-Pool wird danach mit 2 Volumina an 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl verdünnt und gegen ungefähr 6 Volumina von 0,01M NA-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl an einem Amicon YM oder einer ähnlichen Ultrafiltrationsmembran mit einer Mole-kulargewichtsausschlußgröße von 10000 bis 30000 Dalton dia-filtriert. Das resultierende Diafiltrat kann danach direkt weiterverarbeitet oder durch Ultrafiltration weiter konzen-triert werden. Das Diafiltrat/Konzentrat wird auf eine End-konzentration von 0,01% Tween-80 eingestellt.

Das gesamte oder ein Teil des Diafiltrat/Konzentrats, das äquivalent zu 2 bis 5% des berechneten Säulenvolumens ist, wird danach auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (Pharmacia) appliziert, die in 0,01M Na-Phosphat pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,1% Tween-80 equilibriert wurde, und bei einer Fließrate von ungefähr 17 ml/h/cm2 chromatographiert. Die TPO-enthal-tenden Fraktionen, die frei von Aggregaten und proteolyti-schen Abbauprodukten sind, werden auf der Grundlage der SDS-PAGE gesammelt. Der resultierende Pool wird durch ein 0,22 μ-Filter, Millex-GV oder ähnliches, filtriert und bei 2-8°c gelagert.

Beispiel 21

Transformation und Induktion der TPO-Proteinsynthese in E.coli 1. Konstruktion von E.coli TPO-Expresssionsvektoren

Die Plasmide pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 und pMP202 sind aile für die Expression der ersten 155 Aminosâuren des TPO stromabwarts von einem kleinen Leader, der unter den ver-schiedenen Konstrukten variiert, entworfen. Die Leader er-möglichen primâr eine starke Translationsinitiation und schnelle Reinigung. Die Plasmide pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 sind für die Expression der ersten 153 Aminosâuren des TPO stromabwârts von einem Initiations-Methionin entworfen und unterscheiden sich nur in dem Codongebrauch für die ersten Aminosâuren des TPO, wâhrend das Plasmid pMP251 ein Abkömmling von pMP210-l ist, in welchem das Carboxy-termi-nale Ende des TPO durch zwei Aminosâuren verlângert ist.

Aile der vorstehenden Plasmide werden große Raten einer in-trazellulären TPO-Expression in E.coli nach Induktion des . Tryptophan-Promotors produzieren (Yansura, D.G. et al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Hog.) 185:54-60 Academic Press, San Diego [1990]). Die Plasmide pMPl und pMP172 sind Zwischenprodukte· bei der Konstruktion der vorstehenden Plasmide für intrazelluläre Expression des TPO. (a) Plasmid pMPl

Das Plasmid pMPl ist ein Sezernierungsvektor für die ersten 155 Aminosâuren des TPO und wurde dadurch konstruiert, daß 5 DNA-Fragmente, wie in Fig. 33 gezeigt, zusammenligiert wur-den. Das erste davon war der Vektor pPho21, in welchem das kleine MluI-BamHI-Fragment entfernt worden war. pPho21 ist ein Abkömmling von phGHl (Chang, C.N. et. al., Gene 55:189-196 [1987]), in welchem das Gen für das humane Wachstumshor-mon durch das E.coli phoA-Gen ersetzt worden ist und eine Mlul-Restriktionsstelle in die kodierende Sequenz für die STII-Signalsequenz bei den Aminosâuren 20-21 eingebaut worden ist.

Die zwei nächsten Fragmente, ein 258 Basenpaar Hinfl-Pstl-DNA-Stück von dem für die TPO-Aminosäuren 19-103 kodierenden pRK5-hmplI (Beispiel 9), und die folgende synthetische für die Aminosauren 1-18 kodierende DNA.

S'-CQCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG

TG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC ACTGA-5' (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) wurden mittels T4-DNA-Ligase vorligiert und danach mit Pstl geschnitten. Das vierte war ein 152 Basenpaar Pstl-Haelll-Fragment vom für die Aminosäuren 104-155 des TPO kodierenden pRK5hmpII. Das letzte war ein 412 Basenpaar StuI-BamHI-Frag-ment vom pdhl08, welcher den lambda-Transkriptionsterminator enthält, wie früher beschrieben (Scholtissek, S. et.al., NAR 15:3185 [1987]). (b) Plasmid pMP21

Das Plasmid pMP21 ist für die Expression der ersten 155 Ami-nosäuren des TPO mit der Hilfe eines 13 Aminosäuren langen Leaders, welcher einen Teil der Sll-Signalsequenz umfaßt, entworfen. Es wurde dadurch konstruiert, daß drei (3) DNA-Fragmente, wie in Fig. 34 gezeigt, zusammenligiert warden, wobei das erste von diesen der Vektor pVEG31 ist, in welchem das kleine Xbal-SphI-Fragment entfernt worden war. Der Vektor pVEG31 ist ein Abkömmling vom pHGH207-l (de Boer, H.A. et. al., in Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L. und Chamberlain, M.J., Hrg.) 462, Praeger, New York [1982]), in welchem das Gen für das humane Wachstumshormon durch das Gen für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (dieses identische Vektorfragment kann von diesem letzteren Plasmid erhalten werden) ersetzt worden ist.

Das zweite Teil in der Ligierung war ein synthetischer DNA- Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:

S'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Das letzte Stück war ein 1072 Basenpaar( MluI-3phI-Fragment vom für 155 Aminosäuren des TPO kodierenden pMPl. (c) Plasmid pMP151

Das Plasmid pMP151 ist für die Expression der ersten 155 Aminosäuren des TPO stromabwärts von einem Leader, welcher 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, 8 Histidine und eine Faktor Xa-Schnittstelle umfaßt, entworfen. Wie in Fig. 35 gezeigt, wurde pMP151 dadurch konstruiert, daß drei DNA-Fragmente zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der vorstehend beschriebene Vektor pVEG31 ist, von welchem das kleine Xbal-SphI-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang mit der fol-genden Sequenz:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG

GTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

Das letzte war ein 1064 Basenpaar BglI-SphI-Fragment vom für 154 Aminosäuren des TPO kodierenden pMPll. Das Plasmid pMPll ist identisch zu pMPl mit der Ausnahrae einiger weniger Codon-Veränderungen in der STII-Signalsequenz (dieses Fragment kann vom pMPl erhalten werden). (d) Plasmid pMP202

Das Plasmid pMP202 ist dem Expressionsvektor pMP151 sehr ähnlich mit der Ausnahme, daß die Faktor Xa-Schnittstelle in dem Leader durch eine Thrombin-Schnittstelle ersetzt worden ist. Wie in Fig. 36 gezeigt, wurde der pMP202 dadurch kon-struiert, daß drei DNA-Fragmente zusammenligiert wurden. Das erste von diesen war der vorstehend beschriebene pVEG31, in welchem das kleine Xbal-SphI-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein synthetischer DNA-Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:

5'-CTAG AATTAT G AAA AAG AAT AT CG C ATTT CATC ACC AT C ACC AT C ACC ATC ACATCG AA CCACGTAGCC ttaatactttttcttatagcgtaaagtagtggtagtggtagtggtagtgtagctt GGTGCAT-5' (SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)

Das letzte Stück war ein 1064 Basenpaar BglI-SphI-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMPll. (e) Plasmid pMP172

Das Plasmid pMP172 ist ein Sezernierungsvektor für die er-sten 153 Aminosäuren des TPO und ein Zwischenprodukt für die Konstruktion des pMP210. Wie in Fig. 37 gezeigt, wurde der pMP172 dadurch hergestellt, daß drei DNA-Fragmente zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der Vektor pLS321amB war, in welchem das kleine EcoRI-HindlII-Segment entfernt worden war. Das zweite war ein 946 Basenpaar EcoRI-Hgal-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMPll. Das letzte Stück war ein synthetischer DNA-Doppel-strang mit der folgenden Frequenz: 5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77) GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO: 78) (f) Plasmid pMP210

Das Plasmid pMP210 ist für eine Expression der ersten 153 Aminosäuren des TPO nach einem Translationsinitiations-Methionin entworfen. Dieses Plasmid wurde tatsächlich als eine Plasmidbank hergestellt, in welcher die ersten 6 Codons des TPO in der dritten Position eines jeden Codons zufalls-mäßig verandert wurden, und wurde, wie in der Fig. 38 ge-zeigt, durch die Ligierung von drei DNA-Fragmenten konstru-iert. Das erste von diesen war der vorstehend beschriebene Vektor pVEG31, in welchem das kleine Xbal-SphI-Fragment ent-fernt worden war. Das zweite war ein synthetischer DNA-Dop-pelstrang, nachstehend gezeigt, der zuerst mit DNA-Polyme-rasel (Klenow) behandelt wurde, gefolgt von einem Verdau mit Xbal und Hinfl, und der für das Initiations-Methionin und die zufallsmäßig veränderten ersten 6 Codons des TPO ko-diert.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCT GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79) CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5· (SEQ ID NO: 80)

Das dritte war ein 890 Basenpaar HinfI-Sphl-Fragment vom für . die Aminosäure 19-153 des TPO kodierenden pMP172.

Die pMP210-Plasmidbank aus ungefähr 3700 Klonen wurde auf LB-Platten mit hoher Tetracyclin-Konzentration (50 Mg/ml) retransformiert, urn Klone mit einer hohen Translations- initiationsrate zu selektieren (Yansura, D.G. et. al.,

Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158 [1992]). Von den 8 Koloniën, die auf den Platten mit hoher Tetracyclinkonzentration hervorkamen, wurden 5 der hinsicht-lich der TPO-Expression besten Klone einer DNA-Sequenzierung ausgesetzt, und die Ergebnisse sind in Fig. 39 gezeigt (SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 und 28). (g) Plasmid pMP41

Das Plasmid pMP41 ist für eine Expression der ersten 155 Aminosäuren des TPO, fusioniert an einen Leader, der aus 7 Aminosäuren der STII-Signalsequenz, gefolgt von einer' Faktor Xa-Schnittstelle, besteht, entworfen. Das Plasmid wurde, wie in Fig. 40 gezeigt, dadurch kontruiert, daß drei DNA-Stücke zusammenligiert wurden, wobei das erste von diesen der vor-stehend beschriebene Vektor pVEG31 war, in welchem das kleine XBal-SphI-Fragment entfernt wordep war. Das zweite war der folgende synthetische DNA-Doppelstrang: 5'-CT AG A ATT AT G AA A A AG A AT AT CG C ATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ iD NO: 81) TTA ATACI TT TT CTT ATAG CGT A A AT AG CTT C C AG C AT-5' (SEQ ID NO: 82)

Das letzte Stück der Ligierung war das 1064 Basenpaar Bgll-Sphl-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid . pMPll. (h) Plasmid pMP57

Das Plasmid pMP57 exprimiert die ersten 155 Amnosäuren des TPO stromabwärts von einem Leader, der aus 9 Aminosäuren der STII-Sinalsequenz und der dibasischen Stelle Lys-Arg besteht. Diese dibasische Stelle stellt die Möglichkeit zur Verfügung, den Leader mit der Potease ArgC zu entfernen. Dieses Plasmid wurde, wie in Fig. 41 gezeigt, dadurch kon-struiert, daß drei DNA-Stücke zusammenligiert wurden. Das erste von diesen war der vorstehend bechriebene Vektor pVEG31, in welchem das kleine Xbal-SphI-Fragment entfernt worden war. Das zweite war der folgende synthetische DNA-Doppelstrang: 5'-CTAG AATTAT G AAAAAG AATATCGC ATTT CTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)

Das letzte Teil der Ligierung war das 1064 Basenpaar BglI-Sphl-Fragment von dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMPll. (i) Plasmid pMP251

Das Plasmid 251 ist ein Abkömmling von pMP210-l, in welchem zwei zusätzliche Aminosäuren des TPO an dem Carboxy-termina-len Ende umfaßt sind. Wie in Fig. 42 gezeigt, wurde das Plasmid dadurch konstruiert, daß zwei DNA-Stücke zusammenli-giert wurden, wobei das erste von diesen der vorstehsnd be-schriebene pMP21 ist, in welchem das kleine Xbal-Apal-Frag-ment entfernt worden war. Das zweite Teil der Ligierung war ein 316 Basenpaar Xbal-Apal-Fragment vom pMP210-l. 2. Transformation und Induktion von E.coli mit TPO-Expressi- onsvektoren

Die vorstehenden TPO-Expressionsplasmide wurden verwendet, urn den E.coli-Stamm 44C6 (w3110 tonAA rpoHts IonA clpPA galE). unter Anwendung der CaCl2-Hitzeschockmethode zu transformie-ren (Mandei, M. et al., J.Mol.Biol., 53:159-162, [1970]).

Die transformierten Zeilen wurden zuerst bei 37°C in LB-Me-dium, enthaltend 50 μg/ml Carbenicillin solange kultiviert, bis die optische Dichte (600nm) der Kultur ungefähr 2-3 er-reichte. Die LB-Kultur wurde danach 20x in M9-Medium, enthaltend 0,49% Casaminosäuren (Gew./Vol.) und 50 Mg/ml Carbenicillin, verdünnt. Nach Kultivierung bei 30°C für eine Stunde mit Belüftüng, wurde Indol-3-acrylsäure zu einer End-konzentration von 50 ßq/ml zugefügt. Danach ließ man die Kultur bei 30°C mit Belüftüng für weitere 15 Stunden weiter-wachsen, wonach die Zeilen durch Zentrifugation geerntet wurden.

Beispiel 22

Produktion von biologisch aktivem TPO (Met-1 1-153) in E.coli

Die nachstehend beschriebenen Verfahren für eine Produktion von biologisch aktivem, rückgefaltetem TPO (met-1 1-153) kann in analoger Weise für die Gewinnung weiterer TPO-Vari- anten, einschließlich N und C-terminal verlângerter Formen (siehe Beispiel 23) angewendet werden. A. Gewinnung von nicht-löslichem TPO (Met-1 1-153) E.c.oli-Zellen, die durch das Plasmid pMP210-l kodiertes TPO . (Met-1 1-153) exprimieren, wurden wie vorstehend beschrieben fermentiert. Typischerweise werden ungefähr 100 g Zeilen in 11 (10 Volumina) Zelldisruptionspuffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH8) mit einem Polytron-Homogenisiergerät resuspen-diert und die Zeilen bei 5000 x g für 30 Minuten zentrifu-giert. Das gewaschene Zellpellet wird nochmals in 1 1 Zelldisruptionspuf fer mit dem Polytron-Homogenisiergerät resus-pendiert und die Zellsuspension wird durch einen LH-Zell-Disrupter (LH Inceltech, Ine.) oder durch einen Microfluidi-zer (Microfluidics International) gemäß den Anweisungen, des Herstellers geschickt. Die Suspension wird bei 5000 g für 30 Minuten zentrifugiert, resuspendiert und ein zweites Mal zentrifugiert, urn ein gewaschenes Pellet aus brechenden Kör-pern herzustellen. Das gewaschene Pellet wird unmittelbar verwendet oder bei -70°C gefroren gelagert. B. Solubilisierung und Reinigung von monomerem TPO (Met-1 1-153)

Das vorstehend erwähnte Pellet wird in 5 Gewichtsvolumina von 20 mM Tris, pH 8, mit 6-8 M Guanidin und 25 mM DTT (Dithiothreitol) resuspendiert und für 1-3 h oder über Nacht bei 4°C gerührt, urn die Solubilisierung des TPO-Proteins zu bewirken. Hohe Harnstoffkonzentrationen (6-8M) sind ebenso geeignet, ergeben jedoch gewöhnlich, verglichen mit Guanidin, geringere Ausbeuten. Nach der Solubilisierung wird die Lösung bei 30 000 x g für 30 Minuten zentrifugiert, urn einen klaren, das denaturierte, monomere TPO-Protein enthaltenden Überstand herzustellen. Der Überstand wird danach über eine Superdex 200 Gel-Filtrationssäule (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) bei einer Fließrate von 2 ml/min chromatographiert und das

Protein ir.it 2 0 mM Na-Phosphat, pH 6,0, mit 10 mM DTT elu-iert. Die monomères, denaturiertes TPO-Protein enthaltenden Fraktionen, die zwischen 160 und 200 ml eluieren, werden vereinigt. Das TPO-Protein wird iiber eine semi-präparative C4-Umkehrphasen-Säule (2 x 20 cm VYDAC) weiter gereinigt.

Die Probe wird zu 5 ml/min auf eine- Säule appliziert, die in 0,1% HTFA (Trifluoressigsâure) mit 30% Acetonitril equili-briert wurde. Das Protein wird mit einem linearen Acetoni-tril-Gradienten (30-60% in 60 min) eluiert. Das gereinigte, reduzierte Protein eluiert bei ungefähr 50% Acetonitril. Dieses Material wird für das Rückfalten verwendet, urn eine biologisch aktive TPO-Variante zu erhalten. C. Erzeugung von biologisch aktivem TPO (Met-1 1-153)

Ungefähr 20 mg des monomeren, reduzierten und denaturierten TPO-Proteins in 40 ml 0,1% TFA/50% Acetonitril wird in 360 ml des Rückfaltungspuffers vërdünnt, welcher optimal die folgenden Reagenzien enthält:

50 mM Tris 0,3-M NaCl 5 mM EDTA 2% CHAPS-Detergenz 25% Glycerin 5 mM oxidiertes Glutathion 1 mM reduziertes Glutathion pH eingestellt auf 8,3

Nach dem Mischen wird der Rückfaltungspuffer sanft bei 4°C für 12-48 h gerührt, urn maximale Rückfaltungsausbeuten der TPO-Form mit korrekten Disulfidbindungen zu bewirken (siehe nachstehend). Die Lösung wird danach mit TFA zu einer End- konzentration von 0,2% angesäuert, durch ein 0,45 oder 0,22 μ-Filter filtriert und 1/10 Volumen Acetonitril zugeführt. Die Lösung wird danach direkt auf eine C4-Umkehrphasen-Säule gepumpt und das gereinigte, rückgefaltete TPO (Met- 1-153) mit demselben Gradienten-Programm, wie vorstehend beschrie-ben, eluiert. Rückgefaltetes, biologisch aktives TPO wird bei ungefâhr 45% Acetonitril unter diesen Bedingungen eluiert. TPQ-Versionen mit falschen Disulfidbindungen werden früher eluiert. Das endgereinigte TPO ((Met-1 1-153) ist mehr als 95% rein, wie durch SDS-Gele und analytische C4-Um-kehrphasen-Chromatographie bestimmt wurde. Für die Tierver-suche wurde das C4-gereinigte Material in physiologisch ver-trâglichen Puffern dialysiert. Isotonische Puffer (10 mM Na-Acetat, pH 5,5, 10 mM Na-Succinat, pH 5,5 oder 10 mM Na-Phosphat, pH 7,4), enthaltend 150 mM NaCl und 0,01% Tween-80 wurden verwendet.

Aufgrund der hohen Wirksamkeit des TPO im Ba/F3-Assay (halbmaximale Stimulation wird bei ungefâhr 3 pg/ml er-reicht), ist es möglich, biologisch aktives Material unter Verwendung vieler verschiedener Puffer, Detergentien und Redox-Bedingungen zu erhalten. Jedoch wird unter den meisten Bedingungen nur eine geringe Menge an genau gefaltetem Material (<10%) erhalten. Für gewerbliche Herstellungsverfahren ist es wünschenswert, Rückfaltungsraten von mindestens 10%, vorzugsweise 30-50% und am meisten bevorzugt >50% zu errei-chen. Viele verschiedene Detergenzien (Triton X-100, Dode-cyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, Salkosyl, Tween-20 und Tween-80, Zwittergent 3-14 und andere) wurden auf ihre Effizienz untersucht, hohe Rückfaltungsausbeuten zu gewâhr-leisten. Es wurde gefunden, daß unter diesen Detergenzien nur die CHAPS-Familie (CHAPS und CHAPSO) allgemein geeignet für die Rückfaltungsreaktion sind, um eine Proteinaggrega-tion und falsche Disulfid-Bildung zu begrenzen. Mengen an CHAPS größer als 1% waren am geeignetsten. Natriumchlorid wurde für die besten Ausbeuten benötigt, mit den optimalen Mengen zwischen 0,1 M und 0,5 M. Die Gegenwart von EDTA (1-5 mM) begrenzte die Höhe der Metall-katalysierten Oxidation (und Aggregation), die mit.einigen Präparationen beobachtet wurde. Größere Glyceiinkonzentrationen als 15% ergaben die optimalen Rückfaltungsbedingungen. Für maximale Ausbeuten war es wichtig, sowohl oxidiertes als auch reduziertes Glutathion oder oxidiertes und reduziertes Cystein als Redox-Reagenzpaar zu verwenden. Gewöhnlich werden höhere Ausbeuten beobachtet, wenn das Mol-Verhältnis des oxidierten Reagenz gleich zu oder im Überschuß über dem reduzierten Reagenzmitglied des Redoxpaars ist. pH-Werte zwischen 7,5 und ungefähr 9 waren optimal für das Rückfalten dieser TPO-Varianten. Organische Lösungsmdttel, (z.B. Ethanol, Acetoni-tril, Methanol) wurden in Konzentrationen von 10-15% oder niedriger toleriert. Hohe Mengen an organischen Lösungsmit-teln erhöhte die Menge an falsch gefalteten Formen. Tris und Phosphat-Puffer waren gev/öhnlich geeignet. Die Inkubation bei 4°C führte ebenso zu höheren Mengen an richtig gefalte-tem TPO. Rückfaltungsausbeuten von 40-60% (auf der Grundlage der Menge des in der Rückfaltungsreaktion verwendeten reduzierten und denaturierten TPO) sind typisch für TPO-Präparatio-nen, die durch die erste C4-Stufe gereinigt worden sind. Ak-tives Material kann erhalten werden, wenn weniger reine Prä-parationen (z.B. direkt nach der Superdex 200-Säule oder nach der anfänglichen Extraktion von brechenden Körpern) verwendet werden, obwohl die Ausbeuten aufgrund einer exten-siven Präzipitation und Interferenz der Nicht-TPO-Proteine während des TPO-Rückfaltungs-Prozesses geringer sind.

Da TPO (Met-1 1-153) 4 Cysteinreste enthält, ist es möglich, drei verschiedene Disulfidversionen dieses Proteins zu er-zeugen:

Version 1: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-4 und 2-3

Version 2: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-2 und 3-4

Version 3: Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten 1-3 und 2-4 Während der anfänglichen üntersuchung zur Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen, wurden mehrere verschiedene, TPO-Protein enthaitende Peaks durch C4-Umkehrphasen-Chromatogra-phie getrennt. Nur einer dieser Peaks besaß eine signifi-kante biologische Aktivität, wie unter Verwendung des Ba/F3-Assays bestimmt wurde. Nachfolgend wurden die Rückfaltungsbedingungen optimiert, um vorzugsweise diese Version zu er-halten. Unter diesen Bedingungen machen die falsch gefalte-ten Versionen weniger als 10-20% des gesamten erhaltenen mo-nomeren TPO aus.

Es ist durch Mâssenspektrometrie und Proteinsequenzierung bestimmt worden, daß das Disulfidmuster für das biologisch aktive TPO 1-4 und 2-3 (d.h. Version 1) ist. Aliquots der verschiedenen C4-aufgelösten Peaks (5-10 nmol) wurden mit Trypsin verdaut -(1:25 Mol-Verhältnis von Trypsin zu Protein) . Die Verdaumischung wurde durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspektrometrie vor und nach der Reduk-tion mit DTT analysiert. Nach der Reduktion wurden Massen, die den meisten der größeren, tryptischen Peptide des TPO entsprechen, detektiert. In den nicht-reduzierten Proben fehlten einige dieser Massen und neue Massen wurden beobach-tet. Die Masse der neuen Peaks entsprach grundlegend der Summe der einzelnen tryptischen Peptiden, die bei der Disul-fidbindung eine Rolle spielen. Folglich war es möglich, das Disulfidmuster des rückgefalteten, rekombinanten, biologisch aktiven TPO unzweideutig als 1-4 und 2-3 zu bestimmen. Dies ist vereinbar mit dem bekannten Disulfidmuster des verwand-ten Moleküls Erythropoietin. D. Biologische Aktivität des rekombinanten, rückgefalteten TPO (Met 1-153) Rückgefaltetes und gereinigtes TPO (Met-1 1-153) besaß so-wohl in vitro- als auch in vivo-Assay-Aktivität. In dem Ba/F3-Assay wurde eine halbmaximale Stimulierung des Thymi-din-Einbaus in die Ba/F3-Zellen bei 3,3 pg/ml (0,3 pM) er- reicht. In dem mpl-Rezeptor-vermittelten ELISA wurde halb-maximale Aktivität bei 1,9 ng/ml (120 pM) gefunden. In normalen und myelo-supprimierten Tieren, die durch fast-letale Röntgenbestrahlung produziert wurden, war TPO (Met-1 1-153) hoch w.irksam (Aktivität wurde bei so niedrigen Dosen wie 3 0 ng/Maus beobachtet), die Production von neuen Blutplättchen zu stimulieren.

Beispiel 23

Production von weiteren biologisch aktiven TPO-Varianten in E.coli

Drei weitere TPO-Varianten, die in E.coli hergestellt, ge-reinigt und in biologisch aktive Formen rückgefaltet wurden, werden nachstehend bereitgestellt. (1) MLF - 13 Reste von der bakteriell abgeleiteten Signalse-quenz STII werden an die N-terminale Domâne des TPO (Reste 1-155) fusioniert. Die resultierende Sequenz ist MKKNIAFLLNAYASPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 85) _ _ 7 worin die Leader-Sequenz unterstnchen ist und C......C cys bis Cys151 darstellt. Diese Variante wurde konstruiert, um ein Tyrosin für die Radio-Iodierung des TPO für Rezeptor- und biologische Untersuchungen bereitzustellen. (2) H8MLF - 7 Reste von der STII-Sequenz, 8 Histidrnreste und die Enzym-Schnittsequenz IEGR des Faktors Xa werden an die N-terminale Domâne (Reste 1-155) des TPO fusioniert. Die Sequenz ist MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC CVRRA (SEQ ID NO: 86) 7 worin die Leader-Sequenz unterstrichen ist und C.....c cys bis Cys151 darstellt. Diese Variante kann, wenn sie gereinigt und rückgefaltet ist, mit dem Enzym Faktor Xa behandelt werden, das hinter dem Argininrest der Sequenz IEGR schnei-den wird, wodurch sich einé 155 Reste lange TPO-Variante mit einem natürlichen Serin als N-terminale Aminosäure ergibt. (3) T-H8MLF - wird wie vorstehend für die Variante (2) be-schrieben, hergestellt, außer daß eine Thrombin-sensitive Sequenz IEPR an die N-terminale Domäne des TPO fusioniert wird. Die resultierende Sequenz ist MKKN1AFHHHHHHHH1EPRSPAPPAC.....CVRRÀ (SEQ ID NO: 87) 7 worm die Leader-Sequenz unterstrichen ist und C.....C Cys 151 . , bis Cys darstellt. Diese Variante kann nach Reinigung und Rückfaltung mit dem Enzym Thrombin behandelt werden, urn eine 155 Reste lange Variante des TPO mit einem natürlichen N-

Terminus zu erzeugen. A. Gewinnung, Solubilisierung und Reinigung der monomeren, biologisch aktiven TPO-Varianten (1), (2) und (3).

Alle Varianten wurden in E.coli.exprimiert. Die Mehrzahl der Varianten wurden in brechenden Körpern gefunden, wie in Bei-spiel 22 für TPO (Met-1 1-153) beobachtet wurde. Identische Verfahren für die Gewinnung, Solubilisierung und Reinigung der monomeren TPO-Varianten, wie in Beispiel 22 beschrieben, wurden angewendet. Rückfaltungsbedingungen, die zu denjenigen identisch sind, die für TPO (Met 1 1-153) verwendet worden sind, wurden mit Gesamtausbeuten von 30-50% verwendet. Nach dem Rückfalten wurden die TPO-Varianten durch C4-Um-kehrphasen-Chromatographie in 0,1% TFA gereinigt, wobei ein Acetonitril-Gradient, wie vorstehend beschrieben, verwendet wurde. Alle TPO-Varianten (in ihren nicht-proteolysierten Formen) besaßen biologische Aktivität, wie durch den Ba/F3-Assay bestimmt wurde, mit halbmaximalen Aktivitäten von 2-5 pM. B. Proteolytische Prozessierung der Varianten (2) und (3) zur Erzeugung von authentischem, N-terminalen TPO (1-155). Die vorstehend beschriebenen TPO-Varianten (2) und (3) wur- den mit einem enzymatisch schneidbaren Leader-Peptid vor dem normalen N-terminalen Aminosâurerest des TPO entworfen. Nach Rückfaltung und Reinigung der Varianten (2) und (3), wie vorstehend beschrieben, wurde jede einem Verdau mit dem ge-eigneten Enzym ausgesetzt. Für jede Variante wurde das Ace-tonitril aus dem C4-Umkehrphasenschritt dadurch entfernt, daß ein sanfter Stickstoffstrom auf die Lösung geblasen wurde. Danach wurden die zwei Varianten mit entweder Faktor Xa oder Thrombin, wie nachstehend beschrieben, behandelt. Für die TPO-Variante (2) wurde 1 M Tris-Puffer, pH 8, zu einer Endkonzentration von 50 mM zu der Acetonitril-freien Lösung zugegeben und der pH wurde, falls notwendig, auf 8 eingestellt. NaCl und CaCl2 wurden zu 0,1 M bzw. 2 mM zuge-fügt. Faktor Xa (New England Biolabs) wurde so zugegeben, daß ungefähr ein Molverhaltnis von Enzym zu Variante von 1:25 bis 1:100 erreicht wurde. Die Probe wurde bei Raumtem-peratur für l-2h inkubiert, um eine maximale Spaltung zu er-durch eine Veranderung hmsichtlich der Wande rung in SDS-Gelen bestimmt wurde, was den Verlust der Leader-Sequenz anzeigt. Danach wurde die Reaktionsmischung durch C4-Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung des-selben Gradiënten und derselben Bedingungen, wie sie vorstehend für die Reinigung der richtig gefalteten Varianten beschrieben wurden, gereinigt. Nicht-geschnittene Variante B wurde von der geschnittenen Variante (2) durch diese Bedingungen abgetrennt.. Es wurde gezeigt, daß die N-terminalen Aminosäuren SPAPP sind, was anzeigt, daß die Entfernung der N-terminalen Leader-Sequenz erfolgreich war. Der Faktor Xa erzeugte auch variable Mengen einer internen Spaltung inner-halb der TPO-Domäne; die Spaltung wurde hinter dem Agenin-rest bei der Positionsnummer 118 beobachtet, wodurch eine zusätzliche N-terminale Sequenz von TTAHKDP (SEQ ID NO: 88) erzeugt wurde. In nicht-reduzierenden SDS-Gelen wurde eine einzelne Bande bei ungefähr 17000 Dalton für die Faktor Xa geschnittene Variante beobachtet; in reduzierenden Gelen wurden zwei Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 12000 und 5000 Dalton gesehen, was vereinbar mit einer Spal-tung am Arginin 118 ist.Diese Beobachtung bestätigte auch, daß die zwei Molekülteile durch eine Disulfidbindung zwi-schen dem ersten und vierten Cysteinrest zusammengehalten werden, wie aus den vorstehend beschriebenen tryptischen Verdauexperimenten geschlossen wurde. In dem biologischen Ba/F3-Assay besaß die gereinigte TPO (1-155)-Variante nach Entfernung der N-terminalen Leader-Sequenz und mit der internen Spaltung eine halbmaximale Aktivität von 0,2 bis 0,3 Picomolar. Die intakte Variante mit der Leader-Sequenz besaß eine halbmaximale Aktivität von 2-4 Picomolar. Für die Variante (3) war der Spaltungspuffer zusammengesetzt aus 50 mM Tris, pH 8,2% CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA und hu-manem oder Rinder-Thrombin (Calbiochem) zu 1:25 bis 1:50 von Enzym zu TPO-Variantenprotein auf der Grundlage des Ge-wichts. Die Spaltung wurde bei Raumtemperatur für 2-6 Stun-den durchgeführt. Das Fortschreiten der Spaltung wurde durch SDS-Gele bestimmt, wie vorstehend für die Faktor Xa-Spal-tungsreaktion beschrieben wurde. Gewöhnlich wurde mehr als 90% Spaltung der Leader-Sequenz erreicht. Das resultierende TPO wurde über C4-Umkehrphasen-Säulen gereinigt, wie vorstehend beschrieben wurde, und es wurde durch Aminosäure-Se-quenzierung gezeigt, daß dieses den gewünschten N-Terminus besitzt. Nur ein geringer (<5%) Anteil einer internen Spaltung an derselben Arginin-Threonin-Bindung, wie sie vorstehend mit Faktor Xa beobachtet worden ist, wurde erhalten.

Das resultierende TPO-Protein besaß eine hohe biologische Aktivität mit halbmaximalen Antworten in dem Ba/F3-Assay bei 0,2-0,4 Picomolar Protein. In dem mpl-Rezeptor-vermittelten ELISA bewirkte dieses Protein eine halbmaximale Antwort bei 2-4 ng/ml gereinigtem Protein (120-240 Picomolar), während die die Leader-Sequenz enthaltende intakte Variante in beiden Assays 5-10fach weniger wirksam war. Für die Tierversu- che wurde das HPLC-gereinigte, geschnittene Protein in phy-siologisch annehmbaren Puffern, mit 150 mM NaCl, 0,01% Tween-80 und 10 mM Natriumsuccinat, pH 5,5 Oder 10 mM Natri-umacetat, pH 5,5 oder 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 dialy-siert. Durch HPLC und SDS-Gele wurde das gereinigte Protein für mehrere Wochen stabil, wenn es bei 4°C gelagert wurde.

In normalen und myelo-supprimierten Mausen war dieses gereinigte TPO mit der authentischen N-terminalen Sequenz hoch wirksam, wobei die Produktion von Blutplättchen bei so nied- rigen Dosen wie 30 ng/Maus stimuliert wurde.

Beispiel 24

Synthetischer mpl-Ligand

Obwohl der humane mpl-Ligand (hML) gewöhnlich unter Verwen-dung von rekombinanten Verfahren hergestellt wird, kann er ebenso durch enzymatisches Ligieren synthetischer Peptid-fragmente unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Eine synthetische Produktion von hML erlaubt den Einbau unnatürlicher Aminosäuren oder synthetischer funktioneller Gruppen, wie Polyethylenglykol. Friiher wurde eine Mutante der. Serinprotease BPN, Subtiligase (S221C/P225A) entworfen und hergestellt, um Peptidester in wässriger Lösung effizient zu ligieren (Abrahmsen et al., Bioch., 30:4151-4159 [1991]). Es ist jetzt gezeigt worden, daß synthetische Peptide in einer sequentiellen Weise enzymatisch ligiert werden können, um enzymatisch aktive, lange Peptide und Proteine, wie Ribonucléase A (Jackson et al., Science [1994]) herzustellen. Diese nachstehend genau beschriebene Technologie hat es uns ermöglicht, lange Proteine chemisch zu synthetisieren, die früher nur mit rekom- binanter DNA-Technologie hergestellt werden konnten.

Die allgemeine Strategie für eine hMLi53-Synthese unter Ver-wendung von Subtiligase ist gezeigt (Schema 1). Beginnend mit einem Peptid, dessen Schutzgruppen vollständig entfernt sind und das dem C-terminalen Fragment des Proteins ent- spricht, wird ein N-terminal geschützter, C-terminal akti-vierter Peptidester, zusamitien mit Subtiligase zugegeben. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, wird das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und die Schutz-. gruppe vom N-Terminus entfernt. Das nächste Peptidfraginent wird ligiert, die Schutzgruppen werden abgespalten und der Prozeß wird unter Verwendung der aufeinanderfolgenden Peptide solange wiederholt, bis das Protein der vollen Lange erhalten wird. Das Verfahren ist ähnlich zur Festphasen-Methodik, in der ein N-terminal geschütztes, C-terminal ak-tiviertes Peptid an den N-Terminus eines vorhergehenden Pep-tids ligiert wird und das Protein in einer C->N-Richtung synthetisiert wird. Da jedoch jede Verknüpfung zusätzlich bis zu 50 Reste ergibt, und die Produkte nach jeder Ligie-rung isoliert werden, können viel langere, hochreine Proteine in angemessenen Ausbeuten synthetisiert werden.

Schema 1. Strategie für die Synthese von hML unter Verwen-dung von Subtiligase

Nach unseren Kenntnissan sowohl der Sequenzspezifität der Subtiligase als auch der Aminosäure-Sequenz der biologisch aktiven "Epo-Domäne" des hML, teilten wir hMLi53 in sieben 18-25 Reste lange Fragmente. Testligierungs-Tetrapeptide wurden synthetisiert, um geeignete Ligierungs-Verknüpfungen für die 18-25-mere zu bestimmen. Die Tabelle 13 zeigt die Ergebnisse dieser Testligierungen.

Tabelle 13 hML-Testligierungen. Donor- und nukleophile Peptide wurden gelost zu 10 mM in 100 mM Tricin (pH 7,8) bei 22°C. Die Ligase wurde zu einer Endkonzentration von 10 μΜ, ausgehend von einer 1,6 mg/ml Stammlösung (ungefähr 70μΜ) zugefügt, und die Ligierung ließ man übar Nacht fortschreiten. Die Ausbeuten sind ausgedrückt als % Ligierung vs. Hydrolyse der Donorpeptide.

Auf der Grundlage dieser Expérimente sollten die in Tabelle 14 gezeigten Ligierungspeptide durch die Subtilidase effizi-ent ligiert werden. Eine geeignete Schutzgruppe für den N-Terminus jedes Donor-Peptidesters wurde benötigt, um Selbst-ligierung zu verhindern. Wir wählten eine Isonicotinyl (iNOC)-Schutzgruppe (Veber et al., J. Org. Chem., 42:3286-3289 [1977]), weil diese wasserlöslich ist, in der letzten Stufe der Festphasen-Peptidsynthese eingebaut und gegenüber wasserfreier HF stabil ist, die verwendet wird, um die Schutzgruppen zu entfernen und die Peptide von dem Festpha-senharz abzuspalten. Zusätzlich kann sie von dem Peptid nach jeder Ligierung unter milden, reduzierenden Bedingungen (Zn/CH3CO2H) entfernt werden, um einen freien N-Terminus für die nachfolgenden Ligierungen bereitzustellen. Ein Glykolat-lysyl-amid (glc-K-NH2)-ester wurde für die C-terminale Akti-vierung basierend auf frühere Expérimente verwendet, die zeigten, daß dieser durch Subtiligase effizient acyliert wird. (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Die iNOC-geschützten glc-K-Amid-aktivierten Peptide können unter Anwendung von Standard-Festphasenverfahren, wie ausgeführt (Schema 2), synthetisiert werden. Die Peptide werden danach sequentiell ligiert, bis das vollständige Protein herge-stellt ist, und das Endprodukt wird in vitro rückgefaltet. Auf der Grundlage der Homologie mit EPO wird vermutet, daß die Disulfidpaare zwischen den Cysteinresten 7 und 151 und zwischen 28 und 85 gebildet werden. Die Oxidation der Disulfide kann dadurch erreicht werden, daß das reduzierte Material unter einer Sauerstoffatmosphäre für mehrere Stunden einfach gerührt wird. Das rückgefaltete Material kann danach durch HPLC gereinigt, und die das aktive Protein enthalten-den Fraktionen vereinigt und lyophilisiert werden. Als eine Alternative können die Disulfide differenziell geschützt werden, um eine sequenzielle Oxidation zwischen spezifischen Disulfidpaaren zu kontrollieren. Ein Schütz der Cystein 7 und 151 mit Acetamidomethyl (acm)-Gruppen würde die Oxidation von 28 und 85 gewährleisten. Die acm-Gruppen könnten danach entfernt und die Reste 7 und 151 oxidiert werden. Um- gekehrt könnten die Reste 28 und 85 aciu-geschützt und oxi-diert werden, wenn eine séquentielle Oxidation für das kor-rekte Falter, benötigt wird. Wahlweise können die Cystein 28 und 85 durch einen natürlichen oder unnatürlichen Rest, der von Cys verschieden ist, substituiert werden, urn eine kor-rekte Oxidation der Cysteine 7 und 151 zu gewährleisten.

Tabelle 14

Peptidfragmente, die für die Gesamtsynthese des h-MI» unter Verwendung der Subtiligase verwendet werden

Fragment

Seauenz 1 (SEQ ID NO: 110) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1-22) 2 (SEQ ID NO: 111) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) 3 (SEQ ID NO: 112) iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-g!c-K-NH2 (47-69) 4 (SEQ ID NO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90) 5 (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106) 6 (SEQ ID NO: 115) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128) 7 (SEQ ID NO: 116) H2N-LSFQHLLRGKVRFLMtVGGSTLCVR-CQ2 (129-153)

Die Peptidligierungen werden bei 25°C in 100 mM Tricin, pH 8 (frisch hergestellt und durch Vakuumfiltration durch ein 5 μπι-Filter entgast) durchgefiihrt. Typischerweise wird das C-terminale Fragment in Puffer (2-5 mM Peptid) gelost und eine lOx Stammlösung der Subtiligase (lmg/ml in 100 mM Tricin, pH 8) zugefügt, urn die Enzymendkonzentration auf ungefähr 5 μιη zu bringen. Ein 3-5 molarer Überschuß des glc-K-NH2~akti-vierten Donorpeptids wird danach als Feststoff zugegeben, gelost, und die Mischung bei 25°C stehengelassen. Die Ligie-rungen wurden durch analytische Umkehrphasen-C18 HPLC (CH3CN/H20-Gradient mit 0,1% TFA) überwacht. Die Ligierungs-produkta werden durch präparative HPLC gereinigt und lyophi-lisiert. Die Abspaltung der Isonicotinyl (iNOC)-Gruppen wurde dadurch durchgefiihrt, daß HCl-aktivierter Zinkstaub mit dem geschiitzten Peptid in Essigsäure gerührt wurde. Der Zinkstaub wird durch Filtration entfernt und die Essigsäure unter Vakuum abgezogen. Das resultierende Peptid kann direkt in der nächsten Ligierung verwendet werden, und das Verfah-ren wird wiederholt. Synthetischer hML153 kann durch Verfah-ren, die analog zu denjenigen sind, die vorstehend beschrie-ben wurden, an den synthetischen Oder rekombinanten hML154_ 332) ligiert werden, urn synthetischen oder halbsynthetischen hML voller Länge herzustellen.

Synthetischer hML besitzt viele Vorteile gegeniiber rekombi-nantem. Unnatürliche Seitenketten können eingeführt werden, um die Wirksamkeit oder Spezifität zu verbessern. Funktio--nelle Polymergruppen, wie Polyethylenglycol, können einge-baut werden, um die Wirkungsdauer zu verbessern. Zum Bei-spiel kann Polyethylenglycol an Lysinreste der einzelnen Fragmente (Tabelle 14) angehängt werden, bevor oder nachdem ein Ligierungsschritt oder mehrere durchgefiihrt worden sind. Protease-sensitive Peptidbindungen können entfernt oder verandert werden, um die Stabilität in vivo zu verbessern. Zu-sätzlich können Schweratomderivate als Hilfe bei der Struk-turbestimmung synthetisiert werden.

Schema 2. Festphasensynthese der Peptidfragmente für die Segment-Ligierung

a) Lysyl-paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz 1 (0,63 meq./g. Advanced ChemTech) wird für ein Stunde bei 25°C mit Bromessigsäure (5 eq.) und Diisopropylcarbodiimid (5 eq.) in Dimethylacetamid (DMA) geriiht, um das Bromacetyl-Derivat 2 herzustellen. b) Das Harz wird gründlich mit DMA gewaschen, und die einzelnen Boc-geschützten Aminosäuren (3 eq.,

Bachem) werden durch Rühren mit Natriumbicarbonat (6 eq.) in Dimethylformamid (DMF) fiir 24 h bei 50°C esterifiziert, um das entsprechende Glykolat-phenylalanyl-amid-Harz 3 herzustellen. Das Amino-acetylierte Harz 3 wird mit DMF (3x) und Dichlormethan (CH2CI2) (3x) gewaschen und kann bei Raumtem-peratur mehrere Monate lang gelagert werden. Das Harz 3 kann danach in ein automatisiertes Peptid-Synthesegerät (Applied Biosystems 430A) eingebracht und die Peptide unter Verwen-dung von Standard-Festphasenverfahren (5) elongiert werden, c) Die Ν-α-Boc-Gruppe wird mit einer Lösung von 45% Tri-fluoressigsäure in CH2CI2 entfernt. d) Nachfolgende Boc-ge-schützte Aminosäuren (5 eq.) werden unter Verwendung von Benzotriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino) phosphonium-hexafluorphosphat (BOP, 4 eq.) und N-Methylmorpholin (NMM, 10 eq.) in DMA voraktiviert und für 1-2 h verknüpft. e) Die letzte Ν-α-Boc-Gruppe wird entfernt (TFA/CH2CI2) , um 4 herzustellen und die Isonicotinyl (iNOC)-Schutzgruppe wird wie vorstehend (4) beschrieben durch Rühren mit 4-Isonicotinyl2-4-dinitrophenylcarbonat (3 eq.) und NMM (6 eq.) in DMA bei 25°C für 24 h eingeführt. f) Die Spaltung und Entfernung dèr Schutzgruppen des Peptids durch Behandlung mit wasserfreier HF (5% Anisol/5% Ethylmethylsulfid) bei 0°C für eine Stunde ergibt das iNOC-geschützte, Glycolat-lys-amid-aktivierte Peptid 5, welches durch Umkehrphasen-18-HPLC (CH3CN/H20-Gra-dient, 0,1% TFA) gereinigt wird. Die Identitât aller Sub-trate wird durch Massenspektrometrie bestätigt.

Die Erfindung, wie sie beansprucht wird, ist in Übereinstim-mung mit der vorstehenden Beschreibung und den leicht er-hältlichen Referenzen und Ausgangsmaterialien durchführbar.

Trotzdem haben die Anmelder die nachstehend aufgelistete Zellinie bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) hinterlegt:

Escherichia coli, DHlOB-pBSK-hmpl I 1,8, ATCC-Hinterlegungs-Nr.CRL 69575, hinterlegt am 24. Februar 1994.

Plasmid, pSVI5.ID.LL.MLORF, ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL 75958, hinterlegt am 2. Dezember 1994 und CHO DP-12-Zellen, ML 1/50 MCB (markiert # 1594), ATCC-Hin-terlegungs-Nr. CRL 11770, hinterlegt am 6. Dezember 1994.

Diese Hinterlegung wurde nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung, der Hinterlegung von Mikro-organismen für die Zwecke von Patentverfahren und den be-treffenden Vorschriften (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies gewährleistet die Zugänglichkeit einer lebenden Kultur für 30 Jahre nach dem Hinterlegungstag. Der Organismus wird durch die ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Ver-trags zugänglich gemacht.

Claims (39)

1. Isoliertes, im wesentlichen homogenes mpI-Ligandenpoly-peptid.

2. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polypeptidfragment; (b) eiher Polypeptidvariante; und (c) einem chimären Polypeptid.

3. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) dem Polypeptid, das aus einem Säuger isoliert wird; (b) dem Polypeptid, das mit rekombinanten Mitteln her-, gestellt wird; und (c) dem Polypeptid, das mit synthetischen Mitteln her-gestellt wird.

4. Das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) dem Polypeptid, das menschlich ist; und (b) dem Polypeptid, das in einem Menschen nicht immunogen ist.

5. Isolierter, im wesentlichen homogener mpl-Agonist, dadurch gekennzeichnet, daß: (a) der Agonist den Einbau von markierten Nukleotiden (3H-Thymidin) in die DNA von IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen, die mit humanem mpl P transfektiert sind, stimuliert; oder (b) der Agonist den 35S-Einbau in zirkulierende Plätt-chen in einem Plättchen-Rebound-Assay stimuliert.

6. Polypeptidfragment nach Anspruch 2, dargestellt durch

worin hTPO(7-151) darstellt die humane TPO (hML)-Aminosäure- 7,. ^ 151. sequenz von einschließlich Cys bis Cys , X darstellt eine Aminogruppe aus Cys7 Oder einem amino-terminalen Aminosäurerest(en) ausgewählt aus der Gruppe

Y stellt dar die carboxyterminale Gruppe von Cys oder carboxyterminaler bzw. carboxyterminale Aminosäure-rest(e) ausgewählt aus der Gruppe

und aminoterminaler bzw. aminoterminale Ammosäure-rest(e)-Verlängerungen umfassend eine oder mehrere Reste 176-332 von humanem ML, wie dargestellt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

7. Ein Polypeptidfragment nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe TPO(l-153) und TPO(1-245).

8. Ein Polypeptidfragment nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptidfragments umfaßt

und Kombinationen davon.

9. Polypeptid nach Anspruch 6, das nicht glycosyliert ist.

10. Isoliertes Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäure . mit einer Sequenz,· die unter moderat stringenten Bedin-gungen hybridisiert an das Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleinsäuresequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) .

11. Polypeptid nach Anspruch 11, das biologisch aktiv ist.

12. Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe hML, hML153, hML(R153A, R154A) , hML2, hML3, hML4, mMl, ïïlML2, ïïiML3, pML und pML2.

13. Polypeptid nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfaßt Aminosäurereste 1 bis X aus Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), worin X ausgewählt ist aus der Gruppe 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 und 332 .

14. Isoliertes, im wesentliches homogenes mpl-Ligandenpoly-peptid, das mindestens 80% Sequenzidentitât mit dem Polypeptid nach Anspruch 13 teilt.

15. Polypeptid nach Anspruch 13, worin X 153 ist.

16. Die Chimäre, umfassend den mpl-Liganden aus Anspruch 13, fusioniert an ein heterologes Polypeptid.

17. Die Chimäre nach Anspruch 16, worin das heterologe Polypeptid ein Immunglobulinpolypeptid ist.

18. Die Chimäre nach Anspruch 16, worin das heterologe Polypeptid ein Interleukinpolypeptid ist.

19.

Eine Chimäre umfassend die N-terminalen Reste 1 bis ungefähr 153 bis 157 von hML, substituiert mit einem oder mehreren, aber nicht allen, der humanen EPO-Reste, angefügt oder substituiert in den N-terminalen Resten von hML an Positionen, die der Ausrichtung (alignment), wie in Fig. 10 gezeigt, entsprechen. 20. ' Ein Antikörper, der das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 13 binden kann.

21. Eine Hybridomzellinie, die den Antikörper nach Anspruch 20 herstellt.

22. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das das mpl-Ligandenpolypeptid von Anspruch 1 kodiert.

23. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 13 kodiert.

24. Isoliertes Kukleinsäuremolekül umfassend die Nuklein-säuresequenz mit dem offenen Leseraster, wie gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

25. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, das kodiert ein mpl-Ligandenpolypeptid, ausgewählt aus der Gruppe hML, hMLi_53, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mMl, mML2, mML3, pML und pML2.

26. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem cDNA-Klon, umfassend die Nukleotidsequenz der kodierenden Region des mpl-Ligandengens; (b) einer DNA-Sequenz, die unter stringenter. Bedingun-gen an einen Klon aus (a) hybridisieren kann; und (c) einer genetischen Variante von einer der DNA- Sequenzen aus (a) und (b) , die für ein Polypeptid kodiert, das eine biologische Eigenschaft ernes natürlich vorkommenden mpI-Ligandenpolypeptids besitzt.

27. Ein isoliertes DNA-Molekül mit einer Sequenz, die an eine DNA-Sequenz, gezeigt in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), unter moderat stringenter Bedingungen hybridisieren kann, worin das DNA-Molekül ein biologisch aktives mpl-Ligandenpolypeptid kodiert.

28. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 25, das weiterhin umfaßt einen Promotor, der funktionsfâhig mit dem Nukleinsäuremolekül verknüpft ist.

29. Expressionsvektor umfassend die Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 25, funktionsfâhig verknüpft mit Kontroll- sequenzen, die von einer Wirtszeile erkannt werden, der mit dem Vektor transformiert ist.

30. Wirtszeile, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 29 .

31. Ein Verfahren unter Verwendung eines Nukleinsäuremole-kiils, das fiir das mpl -Ligandenpolypeptid kodiert, urn die Herstellung des mpl-Ligandenpolypeptids zu bewir-ken, umfassend Kultivieren der Wirtszeile nach Anspruch 30.

32.

Verfahren nach Anspruch 31, worin das mpl-Ligandenpolypeptid aus der Wirtszeile gewonnen wird. •33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das mpl-Ligandenpolypeptid aus dem Wirtszellkulturmedium gewonnen wird.

34. Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von mpl-Ligandenpolypeptid, umfassend Hybridisieren von DNA, die für das mpl-Ligandenpolypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäureanalysenprobe und Bestimmen der Anwesenheit von DNA fiir das mpl-Ligandenpolypeptid.

35. Ein Verfahren zum Vermehren einer Nukleinsäureanalysen-probe umfassend Starten (priming) einer Nukleinsäure-polymerasereaktion mit Nukleinsäure, die für ein mpl-Ligandenpolypeptid kodiert.

36. Zusammensetzung umfassend das mpl-Ligandenpolypeptid nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Trager.

37. Verwendung eines mpl-Ligandenpolypeptids nach Anspruch 1 zum Behandeln eines Säugers mit oder mit einem Risiko für Thrombozytopenie.

38. Zusammensetzung nach Anspruch 36, die weiterhin umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge eines Agenzes ausge-wählt aus der Gruppe bestehend aus Zytokin, Kolonie-stimulierender Faktor und Interleukin.

39. Zusammensetzung nach Anspruch 38, worin das Agenz aus-gewählt ist aus KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 und IL-11. *