HUT75657A - Thrombopoietin - Google Patents

Description

A találmány tárgya a vérképző sejtek, különösen a vérlemezke őssejtek életbenmaradását, proliferáciőját, differenciálódását vagy érését befolyásoló proteinek izolálása tisztítása és rekombináns vagy kémiai módszerekkel történő előállítása. Közelebbről, a találmány tárgya eljárás nukleinsavak klónozására és expresszálására, mely nukleinsavak az mpl (a citokin receptor szuperfamilia egyik tagja) megkötésére és aktiválására képes protein ligandumot kódolnak. A találmány további tárgya az említett proteinek (önmagukban vagy más citokinekkel kombinációban történő) alkalmazása immunbetegségek vagy vérképzési betegségek (köztük a trobocitopénia) kezelésében.

A vérképző rendszer

A vérképző rendszer állítja elő azokat az igen specifikus, érett vérsejteket, melyekről ismert, hogy valamennyi emlős életbenmaradásához nélkülözhetetlenek. Ezek az érett sejtek az eritrociták (vörösvértestek), melyek az oxigén és a szén-dicxid szállítására specializálódtak; a T- és B-limfociták, melyek a sejt- és antitest-közvetítette immunreakciókért felelősek; a vérlemezkék vagy trombiciták, melyek véralvadék (vérrögök) kialakítására specializálódtak; és a granulociták és makrofágok, melyek tisztító szerepet töltenek be, és a fertőzések leküzdéséhez járulékos sejtekként szolgálnak. A granulociták tovább

11676 KB csoportosíthatók neutrofil, eozinofil, bazofil sejtekre, illetve hízósejtekre, melyek meghatározott funkciókra specializálódtak. A specializált érett vérsejtek mindegyike egyetlen közös primitív sejttípusból, ún. pluripotens vagy totipotens stem-sejtből származik, amely elsősorban a csontvelőben található (Dexter és mtsi., Ann. Rév. Cell Bioi., fi, 423-441, 1987).

A nagymértékben specializált, érett vérsejteknek az emlős élete során folyamatosan nagy számban kell termelődni. E specializált vérsejtek döntő többsége csupán néhány órától néhány hétig terjedő ideig marad aktív (Cronkite és mtsi., Blood Cells, 2, 263-284, 1976), következésképpen, az emlős számára szükséges, normális készenléti állapotú vérsejtek számának fenntartásához az érett vérsejtek, a primitív stem-sejtek, illetve a primitív és az érett sejtek közötti intermedier vagy őssejt sejtvonalak folyamatos megújulására van szükség.

A vérképző rendszer középpontjában a pluripotens stem-sejt(ek) áll(nak). Esek a sejtek viszonylag kis mennyiségben vannak jelen, s proliferációval ön-megújuláson mennek keresztül, miközben utód stem-sejtek jönnek létre, illetve számos differenciálódási lépésen keresztül — melyek során a különböző sejtvonalak őssejtjei jönnek létre — átváltozáson mennek át, miáltal végül a nagymértékben specializált érett vérsejtek alakulnak ki.

• ·

- 3 Bizonyos multipotens őssejtek, melyek stem-sejtekből származnak, és amelyeket CFC-Mix néven említünk, proliferációval (ön-megújulás) és fejlődéssel olyan telepeket (kolóniákat) alakítanak ki amelyek valamennyi különböző mieloid sejtet (eritrocitákat, neutrofil sejteket, megakariocitákat [a vérlemezkék elődei], makrofágokat, bazofil sejteket, eozinofil sejteket és hízósejteket) magukban foglalják. A limfoid sejtvonal egyéb őssejtjei proliferálódnak és T-, ill. B-sejtekké fejlődnek.

A CFC-Mix őssejtek és a mieloid sejtek között az őssejtek egy másik csoportja található. Ezek a sejtvonalra korlátozódó őssejtek az általuk létrehozott utódsejtek alapján osztályozhatók. Ilyenformán, a mieloid sejtek közvetlen ismert elődei: az eritrociták esetében az eritroid telepképző egységek (CFU-E); a neutrofil granulociták és a makrofágok esetében a granulocita/makrofág telepképző sejtek (GM-CFC); a megakariociták esetében a megakariocita telepképző sejtek (Meg-CFC); az eozinofil sejtek esetében az eozinofil telepképző sejtek (Eos-CFC), és a hízósejtek esetében a bazofil telepképző sejtek (Bas-CFC). A pluripotens stem-sejtek és az érett vérsejtek között lévő egyéb intermedier elődsejtek ismertek (ld. alább), illetve (különböző mértékű sejtvonal-korlátozódásuk és önmegújulási képességük révén) valószínűleg ismertek lesznek.

A normális vérképző sejtrendszer alapvető jellemzője az önmegújulási képesség csökkenése, ami a multipotens sajátság

- 4 elvesztésével, illetve sejtvonal-korlátozódás és az érettség megszerzésével jár. Ilyenformán, a vérképző sejtek fejlődési spektrumának egyik végén a pluripotens stem-sejtek állnak, melyek önmegújulási és differenciálódási képességgel rendelkeznek (valamennyi sejtyonal-specifikus őssejtté képesek differenciálódni). Ez a képesség képezi a csontvelőátültetés alapját, melynek során a primitív stem-sejtek újranépesítik a teljes vérképzési sejtrendszert. A fejlődési spektrum másik végén a nagymértékben sejtvonalra korlátozódó őssejtek és utódaik állnak, melyek elvesztették önmegújulási képességüket, viszont érett funkcionális aktivitást szereztek.

A stem-sejtek és a sejtvonalra korlátozódó őssejtek proliferációját és fejlődését különböző vérképzési növekedési faktorok és citokinek szabályozzák. E növekedési faktorok in vivő szerepe igen összetett, s napjainkban sem teljesen világos. Néhány növekedési faktor, mint pl. az interleukin-3 (IL-3), a multipotens stem-sejtek és a különböző sejtvonalak specifikus őssejtjeinek (pl. a megakariociték) stimulálására egyaránt képes. Egyéb faktorok, mint pl. a granulocita/makrofág kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF) esetében kezdetben úgy vélték, hogy működése csak a GM-CFC-kre korlátozódik. Később azonban felfedezték, hogy a GM-CSF többek között a megakariociták proliferációját és fejlődését is befolyásolja. Ilyenformán, az IL-3 és a GMCSF biológiai hatása egymással átfedő, bár hatékonyságuk különböző. Az utóbbi időben leírták, hogy az interleukin-6 • ·

- 5 (IL-6) és az interleukin-11 (IL-11) — miközben önmagukban nem hatnak a megakariociták telepképzésére — az IL-3-mal szinergikusan működnek a megakariociták érésének serkentésében (Yonemura és mtsi., Exp. Hematol., 20. 1011-1016, 1992).

Ilyenformán, a vérképzési növekedési faktorok egy vagy több sejtvonal növekedését és differenciálódását is befolyásolhatják, s hatásuk átfedő lehet a csak egy őssejt vonalat érintő növekedési faktorok hatásával, illetve más faktorokkal szinergikusan fejthetik ki hatásukat.

Ogy tűnik továbbá, hogy a vérképzési növekedési faktorok (a totipotens stem-sejttől a különböző speciális sejtvonalra korlátozódó őssejteken keresztül az érett vérsejtekig) különböző sejtfejlődési stádiumokban fejthetik ki hatásukat.

Az eritropoietin (epo), például, csak az érett eritroid őssejtek proliferációját segíti elő, míg az IL-3 korábbi stádiumban fejti ki hatását, mellyel a primitív stem-sejteket és az intermedier sejtvonal-korlátozott őssejteket befolyásolja. Egyéb növekedési faktorok, mint pl. a stem-sejt faktor (SCF), még primitívebb sejt fejlődésére hathatnak.

A fentiek alapján érthető, hogy a vérsejtek vagy őssejtjeik életbenmaradását, proliferációját, differenciálódását vagy érését befolyásoló új vérképzési növekedési faktorok hasznosak lehetnek a — különösen valamilyen betegség vagy

- 6 radioaktív vagy kemoterápiás kezelés következtében — károsodott vérképző rendszer újjáalakításában.

Megakariocitopoézis — vérlemezketermelés

Eszerint, a megakariocita.

mielocita sejtvonalakká

A megakariocitopoézis és a vérlemezketermelés szabályozásának áttekintő leírását ld. Mazur, Exp. Hematol., 15, 248, 1987; és Hoffman, Blood, 24, 1196-1212, 1989).

csontvelői pluripotens stem-sejtek eritrocita és differenciálódnak. Úgy véljük, hogy a stem-sejt és a megakariocita stádium között specifikus megakariocita őssejt hierarchia létezik. A megakariocita őssejtek legalább három osztályát azonosították, nevezetesen a burst-képző egység megakariocitákat (BFU-MK), a telepképző egység megakariocitákat (CFU-MK) és a kis denzitású (light density) megakariocita őssejteket (LD-CFU-MK). A megakariocita érés önmagában egy fejlődési folytonosság, amelyet standard morfológiai ismérvek alapján stádiumokra osztottak. A megakariocita (MK vagy meg) család legkorábbi felismerhető tagjai a megakarioblasztok. Ezek a sejtek kezdetben 20-30 um átmérőjűek, bazofil citoplazmával és némileg szabálytalan rendelkeznek, mely laza, kissé retikulás és több sejtmagvacskát sejtmaggal krómatint tartalmaz. A megakarioblasztok később legfeljebb 32 sejtmagot tartalmazhatnak (poliploid állapot), de a citoplazma ekkor is ritkás és éretlen marad. Az érés előrehaladtával a sejtmag lebenyessé és zömökebbé válik, a citoplazma mennyisége nő, acidofilebbé és szemcséssé válik. E család legérettebb sejtjei felületükön felszabaduló vérlemezkéket viselhetnek. Normális esetben a megakariociték kevesebb, mint 10 %-a van a magvas vörösvérsejt (blaszt) stádiumban, és több, mint 50 %-uk érett. A megakariocita sorozatra alkalmazott önkényes morfológiai osztályozási formák: megakarioblaszt (a legkorábbi stádium); promegakariocita vagy bazofil megakariocita (középső stádium); érett (acidofil, granuláris vagy vérlemezketermelő) megakariocita (végső stádium). Az érett megakariociták szinuszoid helyekre citoplazma filamentumokat bocsátanak ki, és vérlemezkékké darabolódnak fel (Williams és mtsi., Hematology, 1972).

Úgy tartják, a megakariocitopoézist több szabályozó faktor befolyásolja (Williams és mtsi., Br. J. Haematol., 52, 173, 1982; Williams és mtsi., J. Cell. Physiol., 110. 101, 1982). A megakariocitopoézis korai stádiumáról feltételezik, hogy mitózisos jellegű, gyakori sejtproliferációval és telep-iniciációval, melyet a CFU-MK eredményez, de amely a vérlemezkeszámot nem befolyásolja (Burstein és mtsi., J. Cell Physiol., 109. 333, 1981; Kimura és mtsi., Exp. Hematol., 15, 1048, 1985). Az érési folyamat későbbi stádiuma nem mitózisos, megjelenik a sejtmagi poliploidizáció és a citoplazmikus érés, és a szabályozás feltehetően a perifériás vérlemezkeszám által kiváltott feedback mechanizmussal történik (Odell és mtsi., Blood, 48.

765, 1976; Ebbe és mtsi., 52, 787, 1968).

Viták folytak egy különálló és specifikus megakariocita kolónia-stimuláló faktor (MK-CSF) létezéséről (Mazur, Exp. Haematol., Ifi, 340-350, 1987). A legtöbb szerző azonban úgy tartja, hogy az életbenmaradás szempontjából annyira nélkülözhetetlen folyamatot, mint a vérlemezketermelődés, kizárólag az e folyamatért felelős citokin(ek)nek kell szabályozni. A megakariocita/vérlemezke-specifikus citokin(ek) létezésének hipotézise képezte a több, mint 30 éves kutatás alapját — mindezidáig azonban egyedüli MK-CSF-ként (TPO) nem sikerült ilyen citokint tisztítani, szekvenálni, illetve vizsgálatilag igazolni.

Bár beszámoltak arról, hogy sikerült MK-CSF-eket részlegesen tisztítani kísérletileg kialakított trombocitopéniás esetből (Hill és mtsi., Exp. Hematol., IA, 752, 1986), emberi embrióvese kondicionált tápközegből (CM) (McDonald és mtsi., J. Láb. Clin. Med., 85. 59, 1975) és emberben plasztikus anémia és idiopátiás trombocitopéniás purpura vizelet-kivonatokból (Kawakita és mtsi., Blood, fi, 556, 1983; és vérplazmából (Hoffman és mtsi., J. Clin. Invest., 75. 1174, 1985), fiziológiai funkciójuk mindezidáig — a legtöbb esetben — ismeretlen.

Az alkörmös (Phytolacca americana) mitogénje által aktivált lépsejtek (PWM-SpCM) és a WEHI-3 egér myelomonocita sejtvonal kondicionált tápközegét megakariocita serkentőként alkalmazták. A PWM-SpCM a CFU-MK növekedését fokozó faktorokat tartalmaz (Metcalf és mtsi., Proc. Natl. Acad.

faktort még nem A WEHI-3 egy egér

Sci. USA, 22, 1744-1748, 1975; Quesenberry és mtsi., Blood, fifi, 214, 1985; és Iscove, N.N. in: Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 10. kötet, szerk: Golde és mtsi., New York, Academy Press, 37-52. old. , 1978)., melyek egyike az interleukin-3 (IL-3), amely több sejtvonalas kolónia-stimuláló faktor (multi-CSF) (Burstein, Blood Cells, 11, 469, 1986). Az említett tápközegben lévő többi azonosították és nem izolálták.

mielomonocita sejtvonal, amely viszonylag nagy mennyiségű IL-3-at és kisebb mennyiségű GM-CSF-et szekretál. Az IL-3-ról kimutatták, hogy sokféle vérképző sejt növekedését serkenti (Ihle és mtsi., J. Immunoi., 12, 282, 1983). Az

IL-3-ról azt is kimutatták, hogy a nagyon korai multipotens prekurzorok indukálásában és a nagyon nagy kevert vérképzési telepek kialakításában az ismert vérképzési hormonok vagy növekedési faktorok közül sokkal [köztük az eritropoietinnel (EPO) és az interleukin-l-gyel (IL—1)] szinergikusan működik (Bartelmez és mtsi., J. Cell. Physiol., 122.. 362-369, 1985;

és Warren és mtsi., Cell, Ifi, 667-674, 1988).

A megakariocita-serkentő szerek egy másik forrását az egértüdő és csont makrofág sejtvonal, a peritoneális váladéksejtek és a emberi embrióvese sejtek kondicionált tápközege képezi. A néhány ellentétes adat ellenére (Mazur, Exp. Hematol., Ifi, 340-350, 1987), bizonyítékok vannak arra, hogy a megakariocitopoézisben az aktivált T-limfociták, és nem a monociták fejtenek ki serkentő hatást (Geissler és • · • · ·«·· ·

- 10 mtis., Br. J. Haematol., 60. 233-238, 1985). Ezek a felfedezések azt sugallják, hogy az aktivált T-limfocita szekrétumok, mint pl. az interleukinek, szabályozó faktorai lehetnek a megakariocitafejlődésnek (Geissler és mtsi., Exp. Hematol., Ifi, 845-853, 1987). A megakariocitopoézis tisztított eritropoietinnel (EPO) végzett számos vizsgálata (Vainchenker és mtsi., Blood, 54. 940, 1979; McLeod és mtsi. Natúré, 261, 492-494, 1976; és Williams és mtsi., Exp. Hematol., 12, 734, 1984) azt jelzi, hogy ez a hormon serkentő hatást gyakorol a megakariociták telepképzésére. Ezt szérummentes és szérumot tartalmazó tenyészetekben, illetve járulékos sejtek nélkül egyaránt kimutatták (Williams és mtsi., Exp. Hematol., 12, 734, 1984). Az EPO-ról feltételezték, hogy nagyobb szerepet játszik a megakariocitopoézis egy- és kétsejtes stádiumában, mint a PWM-SpCM, amely a megakariocita fejlődés négysejtes stádiumában játszik szerepet. A fenti faktorok megakariocita fejlődés korai és kései stádiumaiban tapasztalható kölcsönhatásai értelmezésre szorulnak.

Több laboratóriumból származó adatok alapján arra következtethetünk, hogy az egyedüli, önmagában MK-kolónia stimuláló aktivitással rendelkező többsejtvonalas faktorok közé kizárólag a GM-CSF és az IL-3, illetve kisebb mértékben, az IL-6 B-sejt-stimuláló faktor tartozik (Ikebuchi és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84. 9035, 1987). Több szerző beszámolt arról, hogy az IL-11 és a leukémia inhibitor faktor (LIF) a megakariociták méretének ·· • · · · · · ······ ···· ·· ··« ··»·

- 11 és ploiditásának fokozásában az IL-3-mal szinergikusan hat (Yonemura és mtsi., British Journal of Hematology, 84.

16-23, 1993; Burstein és mtsi., J. Cell. Physiol., 153.

305-312, 1992; Metcalf és mtsi., Blood, Zü, 50-56, 1990;

Metcalf és mtsi., Blood, ZZ, 2150-2153, 1991; Brúnó és mtsi., Exp. Hematol., IS, 378-381, 1991; és Yonemura és mtsi., Exp. Hematol., 20. 1011-1016, 1992).

Az egyéb idevágó dokumentumok közé tartozik: Eppstein és mtsi., 4,962,091 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Chong, 4,879,111 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Fernandes és mtsi., 4,604,377 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Wissler és mtsi., 4,512,971 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Gottlieb, 4,468,379 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Bennett és mtsi., 5,215,895 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Kogan és mtsi., 5,250,732 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Kimura és mtsi., Eur. J. Immunoi., 20(9). 1927-1931, 1990; Secor és mtsi., J.

of Immunoi., 144(4). 1484-1489, 1990; Warren és mtsi., J. of Immunoi., 140(1). 94-99, 1988; Warren és mtsi., Exp.

Hematol., 17(11). 1095-1099, 1989; Brúnó és mtsi., Exp.

Hematol., 17(10). 1038-1043, 1989; Tanikawa és mtsi., Exp.

Hematol., 17(8). 883-888, 1989; Kőiké és mtsi., Blood,

75(12). 2286-2291, 1990; Lotem, Blood, 75(5). 1545-1551,

1989; Rennick és mtsi,. Blood, 73(7). 1828-1835, 1989; és Clutterbuck és mtsi., Blood, 73(6). 1504-1512, 1989.

Tromboc itopénia

A vérlemezkék a véralvadási mechanizmus kulcsfontosságú elemei. A vérlemezkék keringésben résztvevő mennyiségének csökkenése (melyet trombicitopéniának nevezünk) különböző betegségek és rendellenességek esetében fordul elő. A trombocitopénia, általános definíciója szerint, az az állapot, amikor a vérlemezkék száma literenként 150 x 10® alá csökken. A trombocitopénia fő okai a vérlemezkék élettartama alapján három kategóriába sorolhatók; ezek (1) a vérlemezkék károsodott termelődése a csontvelőben; (2) a vérlemezkék elszigetelődése a lépben (splehomegalia, lépnagyobbodás); és (3) a vérlemezkék fokozott pusztulása a perifériás keringésben (pl. autoimmun trombocitopénia vagy kemoterápiás vagy radioaktív kezelés miatt). Ezenkívül, olyan páciensekben, akik nagy mennyiségű, gyorsan adagolt, vérlemezke-szegény vérkészítményt kapnak, a felhígulás miatt trombocitopénia alakulhat ki.

A trombocitopénia klinikai vérzéses megnyilvánulása a trombocitopéniától, annak okától, és az esetleges kapcsolt koagulációs hibáktól függ. Általában, a literenként 20 x 10® és 100 x 10® közötti vérlemezkeszámmal rendelkező páciensek veszélyeztetettek a sérülés utáni túlzott vérzékenységet illetően, míg a literenként 20 x 10® alatti vérlemezkeszámot mutató páciensek esetében spontán vérzések alakulhatnak ki.

Az utóbbi betegek esetében vérlemezke-transzfúzióra van szükség, ami immunológiai és virális kockázattal jár. A trombocitopénia bármely adott szintje esetében a vérzékenység sokkal súlyosabb, ha a betegség oka a vérlemezkék csökkent termelődése, s nem a vérlemezkék fokozott mértékű pusztulása. Az utóbbi esetben a felgyorsított vérlemezke turnover segítségével fiatalabb, nagyobb, és vérzéscsillapítási szempontból hatásosabb vérlemezkék juttathatók a keringésbe. A trombocitopéniát számos különböző betegség okozhatja, melyeket röviden az alábbiakban írunk le. Részletesebb leírás Schafner, A.I. Thrombocytopenia and Disorders of Piatelet Function című munkájában található (Internál Medicine, 3. kiadás, szerk.: John J. Hutton és mtsi., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London, 1990).

(a) A károsított vérlemezke-termelődés miatt kialakuló trombocitopénia

A veleszületett trombocitopénia okai közé tartozik az általános' szervezeti aplasztikus anémia (Fanconi-szindróma) és az öröklött amegakariocitikus trombocitopénia, amely a csontvázat érintő fejlődési rendellenességgel (deformitással) állhat kapcsolatban. A vérlemezke-termelődés szerzett rendellenességeit a megakariociták hipopláziája vagy a nem kellő hatékonyságú trombocitopoézis okozhatja. A megakariocita hipoplázia különböző betegségek eredménye lehet; ilyen betegség a csontvelő aplázia (beleértve a kemoterápiás szerek vagy a radioaktív kezelés által kiváltott mieloszuppresszió idiopátiás alakjait), ♦ ···

- 14 mielofibrózis, a leukémia, és a csonvelő metasztázisos tumor vagy granulomák általi megtámadása. Néhány esetben toxinok, fertőző anyagok vagy gyógyszerek viszonylag szelektíven akadályozhatják a trombopoézist; példaként említhető az alkohol és bizonyos vírusfertőzések okozta ideiglenes trombocitopénia, illetve a tiazid diuretikumok adagolásával kapcsolatos enyhe trombocitopénia. Végül, a hatástalan trombopoézis — a megaloblasztos folyamatokkal (folát vagy Biz hiány) másodlagosan — szintén okozhat trombocitopéniát, rendszerint anémiával vagy leukopéniával együtt.

A csökkent vérlemezke-termelődés okozta trombocitopéniás betegségek jelenlegi kezelése a csontvelő rendellenesség felismerésétől és fő okának megszüntetésétől függ. A vérlemezke transzfúziót rendszerint azon betegek számára őrzik, akik súlyos vérzéses komplikációkkal rendelkeznek, illetve sebészeti beavatkozásoknál biztosításként alkalmazzák, mivel az izoimmunizálás további vérlemezke transzfúziókhoz vezethet. A súlyos trombocitopéniából származó nyálkahártya vérzés antifibrinolitikus szerek orális vagy intravénás beadásával enyhíthető. Amennyiben disszeminált intravaszkuláris véralvadást (DIC) mutató páciensek esetében antifibrinolitikus szereket alkalmaznak, trombózisos komplikációk léphetnek fel.

• ·

- 15 (b) Lépbeni elkülönülés hatására kialakuló trombocitopénia

A lépnagyobbodás (bármi okozza is) kapcsolatban állhat enyhe-mérsékelt trombocitopéniával. A vérlemezkék lépben történő elkülönülése igen passzív folyamat (hipersplenia, fokozott lépműködés), szemben a vérlemezkék lép általi aktív elpusztításával, amely immun-közvetett trombocitopéniás esetekben fordul elő (ld. lentebb). Bár a fokozott lépműködés legáltalánosabb okozója az alkohol eredetű cirrhosis által előidézett portális hipertenzióból eredő pangásos lépnagyobbodás, a pangásos, beszűrődéses vagy limfoproliferatív lépnagyobbodás egyéb formái is kapcsolatosak a trombocitopéniával. A fokozott lépműködés okozta trombocitopénia esetén a vérlemezkeszám általában nem csökken literenként 50 x 10⁹ érték alá.

(c) Nem immun-közvetett vérlemezkepusztulás által okozott trombocitopénia

A trombocitopénia kialakulhat a vérlemezkék különböző, nem immunológiai folyamatok által kiváltott, felgyorsult pusztulása miatt is. Az ilyen típusú rendellenességek közé tartozik a disszeminált intravaszkuláris véralvadás, a művi intravaszkuláris eszközök, a vér extra testi keringése, valamint a trombózisos hajszálérbetegségek, mint pl. a trombózisos trombocitás purpura okozta pusztulás. Valamennyi fenti esetben a mesterséges felülettel vagy abnormális

érbelhártyával (intima) találkozó, keringő vérlemezkék elpusztulnak ezeken a helyeken vagy károsodást szenvednek, és a retikuloendotél rendszer idő előtt eltávolítja őket. Azon betegségeket és rendellenességeket, melyekben a disszeminált intravaszkuláris véralvadás (DIC) előfordul, részletesebben Braunwald és mtsi. (szerkesztők), Harrison's

Principles of Internál Medicine című munkájában írták le (McGraw Hill, 11. kiadás, 1478. old., 1987). Az intravaszkuláris művi eszközök, mint a szívbillentyűk és az aortán belüli ballonok enyhe-mérsékelt destruktív trombocitopéniát és átmeneti trombocitopéniát okozhatnak olyan páciensekben, akik kardiopulmonáris utakat érintő műtéten vagy hemodialízisen estek át, ami az extra testi keringésben a vérlemezkék elpusztulását eredményezheti.

(d) gyógyszer-indukálta immun trombocitopénia

Az immunológiáilag közvetített trombocitopéniában több, mint 100 gyógyszer hatóanyag játszik közre, azonban csak a kinidint, kinint, aranyat, szulfonamidokat, cephalotint és heparint karakterizálták. A gyógyszer (drog)-indukálta trombocitopénia gyakran nagyon súlyos, és rendszerint hirtelen akkor következik be, amikor a páciensek szenzitizálási kezelésen esnek át.

(e) Immun (autoimmun) trombocitopéniás purpura (ITP)

Felnőttekben az ITP krónikus betegség, melyet az autoimmun

-membránnal

-specifitást vérlemezke pusztulás jellemez. Az autoantitest rendszerint IgG, bár más immunglobulinokról is beszámoltak. Bár azt találták, hogy az ITP autoantitestje a GPII-blIIa vérlemezkeáll kapcsolatban, a vérlemezke antigéna legtöbb esetben nem azonosították. A szenzitizált vérlemezkék extravaszkuláris pusztulása a lép és a máj retikuloendoteliális rendszerében történik. Bár az

ITP esetek több mint fele idiopátiás, sok páciens alapul szolgáló reumatikus vagy autoimmun betegséggel (plszisztémás lupus erythematosus) vagy limfoproliferatív rendellenességgel (pl. krónikus limfocitikus leukémia) rendelkezik.

(f) HÍV-indukálta ITP

Az ITP egyre növekvő mértékben általános komplikációja a HÍV fertőzésnek (Morris és mtsi., Ann. Intern. Med., 96. 714-717, 1982) és a betegség előrehaladásának bármely stádiumában jelentkezhet mindazokban a páciensekben, akikben a szerzett immundeficiencia szindrómát (AIDS), az AIDS-rokon komplexet, illetve az AIDS tünetek nélküli HIV-fertőzést diagnosztizálták. A HIV-fertőzés fertőző betegség, melyet a celluláris immunfunkció súlyos hiányossága, az opportunista fertőzés és a rosszindulatúság jellemez. A HIV-fertőzésből származó elsődleges immunológiai abnormalitás a CD4 sejtfelületi glikoproteint expresszáló T-limfociták előrehaladó kimerülése és funkcionális károsodása (Lane és mtsi., Ann. Rév. Immunoi., 3, 477, 1985). A CD4 • ·

- 18 helper/inducer T-sejt funkció megszűnése feltehetően alapot képez a celluláris és humorális immunitás súlyos defektusának, ami az AIDS opportunista fertőzési és rosszindulatú jellemzőit eredményezi (H. Lane, ld. fentebb).

Bár a HIV-vel kapcsolatos ITP mechanizmusa ismeretlen, úgy tartják, hogy különbözik a HIV-fertőzéssel nem összefüggő ITP mechanizmusától (Walsh és mtsi., N. Eng. J. Med., 311. 635-639, 1984; és Ratner, Am. J. Med., 86. 194-198, 1989).

A trombocitopénia jelenlegi kezelése

A trombocitopéniában szenvedő betegek kezelése az adott helyzet súlyosságától és a beavatkozás sürgősségétől függ. A HIV-vel összefüggő, illetve a HIV-vel nem kapcsolatos trombocitopénia kezelése hasonló, s bár számos különböző terápiás megközelítést alkalmaznak, a gyógykezelés továbbra is vitatott.

A trombocitopéniás páciensek vérlemezkeszámát glükokortikoid (pl. prednisolon) terápiával sikeresen növelték, azonban a legtöbb betegben a reakció nem teljes, illetve visszaesés következik be, amikor a glükokortikoid dózist csökkentik vagy amikor befejezik az adagolást. HIV-fertőzéssel kapcsolatos ITP-vel rendelkező páciensekkel végzett vizsgálatok alapján néhány kutató felvetette, hogy a glükokortikoid terápia AIDS-re való hajlamot eredményezhet. A glükokortikoidokat rendszerint akkor adagolják, ha a

vérlemezkeszám 20 x 10®/liter érték alá esik, vagy ha spontán vérzés fordul elő. A glükokortikoidokkal nehezen gyógyítható páciensek esetében a nem HIV-fertőzéssel kapcsolatos ITP súlyos esetének kezelésében sikerrel alkalmazták a 4-(2-klór-fenil)-9-metil-2-[3-(4- morfolinil)-3-propanon-l-il]-6H-tieno-[3,2,f][l,2,4]triazolo-[4,3,a]-[l,4]diazepin (WEB 2086) vegyületet. Egy 37000-58000/ul vérlemezkeszámmal rendelkező pácienst WEB 2086-tal kezeltek, és egy-két hétig tartó kezelés után a vérlemezkeszám 140000-190000/ul értékre emelkedett (EP 361,077 számú európai szabadalom; és Lohman és mtsi., Láncét, 1147, 1988).

Bár a szerzett amegakariocitikus trombicitopéniás purpura (AATP) optimális kezelése bizonytalan, kimutatták, hogy az anti-timocita globulin (ATG) (a humán timusz-szövet ló antiszéruma) hosszú időtartamú teljes javulást eredményez (Trimble és mtsi., Am. J. Hematol., 37. 126-127, 1991). Egy másik cikkben azonban azt írják, hogy az ATG vérképzésre gyakorolt hatásai a thimerosalnak tulajdoníthatók, ahol a protein feltehetően mint higany-hordozókén működik (Panellá és mtsi., Cancer Research, 52, 4429-4435, 1990).

Jó eredményekről számoltak be a lépeltávolítással kapcsolatban. A lép eltávolításával megszüntetjük a vérlemezkék megsemmisítésének legfőbb helyszínét, illetve sok páciens esetében az autoantitest-termelés fő forrását. Ez a beavatkozás sok páciens esetében hosszú ideig tartó, kezelésmentes enyhülést eredményez, azonban, mivel az

immunológiailag veszélyeztetett pácienseknél a műtéti beavatkozást általában kerülendő, a lépeltávolítást csak olyan páciensek esetében ajánlják, akik súlyos trombocitopéniában (pl. súlyos, HIV-vel kapcsolatos ITP) szenvednek; akik 2-3 hetes glükokortikoidos kezelés után sem mutatnak reakciót; illetve, akik a glükokortikoid kezelés befejezése után nem mutatnak hosszú ideig tartó reakciót. Jelenlegi tudásunk alapján nem tisztázott, hogy a lépeltávolítás hajlamossá teszi-e a betegeket az AIDS-re.

A prednisolon terápián és a lépeltávolátáson kívül bizonyos citotoxikus szerek, pl. a vincristine és az azido-timidin,

AZT, zidovudin) szintén ígéretesek a HÍV-indukálta ITP kezelésében, azonban csak bevezető eredmények állnak rendelkezésre.

A fentiek alapján látható, hogy a trombocitopénia kezelésének egyik módja lehet olyan szer alkalmazása, amely képes a megakariociták vagy prekurzoraik differenciálódását és érését felgyorsítani, hogy azok vérlemezke-termelő alakká fejlődjenek. Jelentős erőfeszítéseket tettek ilyen szer azonosítására, melyet általánosan trombopoietinnék (TPO) nevezünk. A TPO tudományos irodalomban található egyéb elnevezései: trombocitopoézist stimuláló faktor (TSF); megakariocita kolónia-stimuláló faktor (MK-CSF); megakariocita-stimuláló faktor; és megakariocita-aktivátor (potentiator). A ΤΡΟ-aktivitást már 1959-ben észlelték (Rak és mtsi., Med. Exp., 1, 125), és e szer karakterizálására és tisztítására irányuló kísérletek mind a mai napig folynak. Miközben beszámoltak a TPO-aktivitású polipeptidek részleges tisztításáról (ld. pl. Tayrien és mtsi., J. Bioi. Chem., 262. 3262, 1987; Hoffman és mtsi, J. Clin Invest., 75. 1174, 1985), mások abból indultak ki, hogy a TPO nem egy önálló egész, hanem egy ismert hormon (IL-3) polifunkcionális megnyilvánulása (Sparrow és mtsi., Prog. Clin. Bioi. Rés., 215. 123, 1986). Függetlenül alakjuktól és eredetüktől, a trombopoézlses aktivitással rendelkező molekulák jelentős gyógyászati értékkel rendelkezhetnek. Bár TPO-ként egy proteint sem azonosítottak egyértelműen, nagy érdeklődés övezi azt az újabb felfedezést, hogy az mpl, amely egy feltételezett citokin receptor, trombopoézises jelet képes átalakítani.

Az mpl egy megakariocitopoézises citokin receptor

A vérképző sejtek proliferációja és érése olyan faktorok szigorú szabályozása alatt áll, amelyek pozitívan vagy negatívan modulálják proliferációját és differenciálódását protein faktorok történő, nagy a

több

Ezeket a pluripotens stem-sejtek sejtvonallá történő hatásokat extracelluláris specifikus sejtfelületi receptorokhoz affinitású kötődése közvetíti. Ezek a sejtfelületi receptorok nagymértékben homológok, és általánosan a citokin receptor szupercsaládba sorolják őket.

E szupercsalád tagjai az alábbi faktorok receptorai: IL-2 (béta és gamma lánc) (Hatakeyama és mtsi., Science, 244.

• ·

- 22 551-556, 1989; Takeshita és mtsi., Science, 257. 379-382, 1991); IL-3 (Itoh és mtsi., Science, 247. 324-328, 1990; Gorman és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87. 5459-5463, 1990; Kitamura és mtsi., Cell, 88, 1165-1174, 1991; Kitamura és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88. 5082-5086, 1991); IL-4 (Mosley és mtsi., Cell, 59. 335-348, 1989); IL-5 (Takaki és mtis., EMBO J., 2, 4367-4374, 1990;

Tavernier és mtsi., Cell, 88, 1175-1184, 1991); IL-6 (Yamasaki és mtsi., Science, 241. 825-828, 1988; Hibi és mtsi., Cell, 83, 1149-1157, 1990); IL-7 (Goodwin és mtsi., Cell, 60. 941-951, 1990); IL-9 (Renault és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5690-5694, 1992); granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF) (Gearing és mtsi., EMBO J., 8, 3667-3676, 1991; Hayashida és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244, 9655-9659, 1990); granulocita kolónia-stimuláló faktor (G-CSF) (Fukunaga és mtsi., Cell, 84, 341-350, 1990; Fukunaga és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SZ, 8702-8706, 1990; Larsen és mtsi., J. Exp. Med., 172. 1559-1570, 1990); leukémia inhibitor faktor (LIF) (Gearing és mtsi., EMBO J., 10. 2839-2848, 1991; onkosztatin M (OSM) (Rose és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SS, 8641-8645, 1991); valamint a prolaktin (Boutin és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SS, 7744-7748, 1988; Edery és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SS, 2112-2116, 1989); a növekedési hormon (GH) (Leung és mtsi., Natúré,

330. 537-543, 1987); és a csillós neutrofil faktor (CNTF) (Davis és mtsi., Science, 2SS, 59-63, 1991).

A citokin receptor szupercsalád tagjai három funkcionális kategóriába sorolhatók (áttekintést ld. Nicola és mtsi., Cell, £2, 1-4, 1991). Az első osztályba az egy láncból álló receptorok tartoznak, mint pl. az eritropoietin receptor (EPO-R) vagy a granulocita kolónia-stimuláló faktor receptor (G-CSF-R), melyek az extracelluláris doménen keresztül nagy affinitással kötődnek a ligandumhoz, és intracelluláris jelet is képeznek. A második receptor osztályba (ún. alfa-alegységek) az interleukin-6 receptor (IL6-R), a granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor receptor (GM-CSF-R), az interleukin-3 receptor (IL3-R-alfa) és a citokin receptor szupercsalád más tagjai tartoznak. Ezek az alfa alegységek kis affinitással kötődnek a ligandumhoz, de nem képesek intracelluláris jelet átalakítani (transzdukció). Egy alfa-alegység és a citokin receptorok harmadik osztálya, a β-alegységek között kialakuló heterodimer révén nagy affinitású receptor jön létre, amely képes jelet kialakítani; ilyen pl. a β<=, amely a három alfa-alegység (az IL3-R-alfa és a GM-CSF-R) közös béta alegysége.

Azt, hogy az mpl a citokin receptor szupercsalad tagja, a szekvencia-homológia (Gearing, EMBO J., fi, 3667-3676, 1983;

Bazan, Proc. Natl. Acad.

Davis és mtsi., Science, mtsi., Proc. Natl. Acad.

valamint azon képessége jeleket képes transzdukálni.

Sci. USA, fii, 6834-6938, 1990; 253, 59-63, 1991; és Vígon és Sci. USA, fi2, 5640-5644, 1992), bizonyítja, hogy proliferatív *··* ··

- 24 Az egér c-mpl molekuláris klónozása alapján leszármaztatott aminosav-szekvencia azt mutatja, hogy ez a protein homológ más citokin receptorokkal. Az extracelluláris dómén 465 aminosav-gyököt tartalmaz és két szubdoménból áll, melyek négy, nagymértékben konzervált ciszteint, valamint az N-terminális és C-terminális szubdoménban egy sajátos motívumot tartalmaznak. A ligandum-kötő extracelluláris domének feltehetően hasonló kettős β-redő szerkezettel rendelkeznek. Ez a kettős extracelluláris dómén nagymértékben homológ az IL-3, IL-5 és GM-CSF közös jel-transzdukáló láncával, valamint a LIF kis affinitású kötő doménjével (Vígon és mtsi., Oncogene, fi, 2607-2615, 1993). Ilyenformán, az mpl valószínűleg a kis affinitású ligandum-kötő citokin receptorok osztályába tartozik.

Az egér mpl és az érett humán mpl P összehasonlítása azt mutatja, hogy e két protein szekvenciája 81 %-ban azonos. Az

N-terminális és C-terminális extracelluláris szubdomének 75 %-os, illetve 80 %-os szekvencia-azonosságot mutatnak. A legnagyobb mértékben konzervált mpl régió a citoplazmikus dómén, amely 91 %-os azonosságot mutat, s a transzmembrán dómén melletti 37 aminosav-gyökből álló szekvencia mindkét fajban azonos. Ennek megfelelően, az mpl a citokin receptor szupercsalád legnagyobb mértékben konzervált tagjainak egyike (Vigon, ld. fentebb).

Az mpl proliferatív jel transzdukclójára képes, funkcionális receptor, amire kiméra receptorok konstruálása szolgáltat

• · ···· ·* bizonyítékot, mely receptorok mpl citoplazmikus doménnel rendelkező ismert citokinhez nagy affinitást mutató citokin receptorból származó extracelluláris domént tartalmaznak. Mivel az mpl ismert ligandumáról nem számoltak be, egy első osztályból származó citokin receptorból (mint pl. az IL4-R vagy a G-CSFR) kimérikus, nagy affinitésú ligandum-kötő extracelluláris domént kellett konstruálni Vígon és mtsi. (ld. fentebb) a G-CSFR extracelluláris doménjét a c-mpl transzmembrán és citoplazmikus doménjével fuzionálták. A G-CSFR/jnpl kimérával (és egy teljes hosszúságú G-CSFR kontrollal) IL-3 dependens sejtvonalat (BAF/B03 [Ba/F3]) transzfektáltak. A kimérával transzfektált sejtek IL-3 vagy G-CSF jelenlétében egyaránt jól fejlődtek. Hasonlóan, a G-CSFR-rel transzfektált sejtek szintén jól növekedtek, akár IL-3, akár G-CSF jelenlétében. A növekedési faktorok hiányában mindegyik sejt elpusztult. Skoda és mtsi. (EMBO J. 12(7). 2645-2653, 1993) hasonló kísérletet végeztek, melynek során a humán IL-4 receptor (hIL-4-R) extracelluláris és transzmembrán dóménjét az egér mpl citoplazmikus doménhez fuzionálták, és ezt a konstrukciót egér IL-3 dependens Ba/F3 sejtvonalba transzfektálták. A vad típusú hIL-4-R receptorral transzfektált Ba/F3 sejtek a faj-specifikus IL-4 vagy IL-3 jelenlétében normálisan proliferálódtak. A hIL-4R/znp.Z konstrukcióval transzfektált Ba/F3 sejtek hIL-4 jelenlétében (IL-3 jelenlétében vagy hiányában) normálisan proliferálódtak, ami azt bizonyítja, hogy Ba/F3 sejtekben az mpl citoplazmikus dómén az összes olyan elemet tartalmazza, amely proliferatív jel átalakításához szükséges.

A fenti kimérikus kísérletek bizonyítják az mpl citoplazmikus dómén proliferációs jelölő képességét, azonban nem mondanak semmit arról, hogy az mpl extracelluláris dómén képes-e ligandumhoz kötődni. Ezen eredmények alapján legalább két lehetőség áll fenn; nevezetesen, az mpl egyláncú (első osztályba tartozó) receptor, mint az EPO-R vagy G-CSFR; vagy jelátalakító (transzdukáló) β-alegység (harmadik osztály), amely alfa alegységet (mint pl. az IL-3) igényel (Skoda és mtsi., ld. fentebb).

Az mpl ligandum egy trombopoietin (TPO)

Amint fentebb említettük, felvetődött, hogy a vérszérum tartalmaz egy egyedülálló faktort, melyet időnként trombopoietinnek (TPO) neveznek, amely a megakariociták növekedésének és érésének elősegítése terén más citokinekkel szinergikusan működik. Annak ellenére, hogy több kutatócsoport nagy erőfeszítéseket tett e faktor azonosítása érdekében, sem vérszérumból, sem másfajta forrásból nem sikerült soha ilyen természetes faktort izolálni. Még ha nem is ismert, hogy az mpl képes lenne közvetlenül egy megakariocita-stimuláló faktorhoz kötődni, újabb kísérletek azt bizonyítják, hogy az mpl apláziás csontvelővel rendelkező páciensek vérszérumában található faktorból vagy faktorokból származó proliferatív jel-transzdukcióban játszik szerepet (Methia és mtsi., Blood, 82(5). 1395-1401,

1993).

• ·

- 27 A c-mpl expresszió primitív és specifikus vérképző sejtvonalakban tapasztalható megoszlásának vizsgálata és az egyik ilyen sejtvonallal végzett mpl antiszensz vizsgálatok bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy egy, az IL-l-alfától, IL-3-tól, IL-4-től, IL-6-tól, IL-ll-től, SCF-től, EPO-tól, G-CSF-től és GM-CSF-től eltérő, vérszérum kolónia-képző faktor az mpl-en keresztül proliferatív jelet transzdukál.

Immun-tisztított humán vérképző sejtekben reverz transzkriptáz (RT) PCR technika alkalmazásával Methia és mtsi. (ld. fentebb) kimutatták, hogy erős mpl mRNS üzenetek csak a tisztított CD34* sejtekben, a megakariocitákban és a vérlemezkékben találhatók. A csontvelőből (BM) tisztított

CD34* sejtek a csontvelősejtek kb. 1 %-át teszik ki, és sok közülük primitív stem-sejt, illetve a különböző sejtvonalak (pl. eritroid, granulomakrofág, megakariocita) specifikus őssejtje.

Az mpl antiszensz oligonukleotidőkről kimutatták, hogy gátolja az apláziás csontvelővel rendelkező páciensek vérszérumában (amely gazdag forrása a megakariocita kolónia-stimuláló aktivitásnak [MK-CSA]) tenyésztett totipotens CD34* sejtekből kiinduló megakariocita telepképződést. Ugyanezek az antiszensz oligonukleotidok nem gyakorolnak hatást az eritrociták vagy a granulomakrofágok telepképzésére.

····

Továbbra is ismeretlen, hogy az mpl közvetlenül kötődik-e-a ligandumhoz, vagy a megakariocitopoézist kiváltó szérum faktor az mpl-en keresztül hat-e. Felvetették, hogy amennyiben az mpl közvetlenül kötődik a ligandumhoz, aminosav-szekvenciája valószínűleg nagymértékben konzervált, és a humán és egér extracelluláris mpl domének jelentős mértékű szekvencia-azonosságának betudható okok miatt fajok közötti kereszt-reaktivitást mutat (Vígon és mtsi., ld. fentebb [1993]).

A fentiek ismeretében nyilvánvaló, hogy jelenleg is szükség van olyan molekulák izolálására és azonosítására, amelyek képesek a vérképző sejtek, különösen a megakariociták vagy őssejtjeik érésének differenciálódásának és amelyek alkalmazhatók a Az mpl ligandumot ilyen proliferáclójának, serkentésére, és trombocitopénia kezelésében, molekulának tartjuk, így szükség van az ilyen ligandum(ok) izolálására, hogy értékelni tudjuk a sejtnövekedésben és differenciálódásban betöltött szerepüket.

Ennek megfelelően, a találmány egyik tárgya gyógyszerészeti szempontból tiszta molekula, amely képes a megakariociták proliferációjának, differenciálódásának és/vagy érésének érett vérlemezke-termelő alak irányában történő serkentésére.

A találmány további tárgya formája, amely vérképzési az említett molekula olyan rendellenesség, különösen trombocitopénia kezelésében alkalmazható.

A találmány további tárgya eljárás olyan protein ligandumok izolálására, tisztítására és specifikus azonosítására, amelyek in vivő képesek egy citokih szupercsaládba tartozó receptorhoz, név szerint az mpl-hez, kötődni és proliferatív jelet transzdukálni.

A találmány további tárgya nukleinsav-molekulák, melyek az említett protein ligandumokat kódolják, továbbá e nukleinsav-molekulák alkalmazása mpl-kötő ligandumok előállítására rekombináns sejttenyészetben, diagnosztikai és gyógyászati célokra.

A találmány további tárgya a protein ligandumok származékai és módosított alakjai, köztük az aminosav-szekvencia változatok, a glikoprotein variáns alakok és ezek kovalens származékai.

A találmány egy másik tárgya fúziós polipeptid alakok, melyek egy mpl ligandum, valamint egy heterológ protein vagy kovalens származéka kombinációjából állnak.

A találmány további tárgya polipeptid alakok változatai, melyek egy mpl ligandumot az EPO szekvenciából származó aminosav addíciókkal és szubsztitúciókkal kombinálva tartalmaznak, miáltal olyan protein jön létre, amely képes a vérlemezkék és a vörösvérsejt őssejtek proliferációját és ·· ··. · • · · :

• · :

- 30 növekedését szabályozni.

A találmány további tárgya immunogének előállítása mpl ligandumok vagy fúziós alakjaik elleni antitestek kialakítása érdekében; továbbá olyan antitestek, amelyek képesek az említett ligandumokhoz kötődni.

A találmány fenti és egyéb tárgyai a találmány leírása alapján a szakember számára érthetőek lesznek.

A találmány tárgyainak gyakorlati megvalósításához megakariocitopoézises proliferációt és érést elősegítő emlős proteint (melyet mpl ligandumnak [ML] vagy trombopoietinnék [TPO] nevezünk) izolálunk, amely képes a megakariociták proliferációját, érését és/vagy érett vérlemezke-termelő alakká differenciálódását serkenteni.

A fenti, lényegében homogén protein természetes forrásból tisztítható, melynek során (1) tisztítani kívánt mpl ligandumot tartalmazó vérplazmát rögzített receptor polipeptiddel (speciálisan egy hordozón rögzített mpl vagy mpl fúziós polipeptiddel) hozunk érintkezésbe, olyan körülmények között, amelyek hatására a tisztítani kívánt mpl ligandum molekulák szelektíven adszorbeálódnak a rögzített receptor polipeptiden; (2) a rögzített receptor polipeptidet és hordozóját lemossuk, hogy eltávolítsuk a nem adszorbeált anyagot; és (3) a rögzített receptor polipeptidből elúciós pufferrel eluáljuk az mpl ligandum molekulákat. Természetes ·· ·· • · · · • · · • · · ···· ·· forrásként előnyösen mpl ligandumot tartalmazó emlős vérplazmát vagy vizeletet alkalmazunk. Adott esetben az emlős apláziás, és a rögzített receptor mpl-IgG fúziós polipeptid.

Adott esetben olyan, megakariocitopoézises proliferációt és érést elősegítő proteint izolálunk, amely lényegében homogén — szintetikus vagy rekombináns módszerekkel előállított — mpl ligandum polipeptid.

A találmány szerinti mpl ligandum polipeptid vagy TPO előnyösen legalább 70 %-ban azonos a nagymértékben tisztított, lényegében homogén sertés mpl ligandum polipeptid aminosav-szekvenciájával, és legalább 80 %-os szekvencia-azonosságot mutat a sertés mpl ligandum polipeptid EPO-doménjével. A találmány szerinti mpl ligandum, adott esetben, érett humán mpl ligandum (hML), amely az első ábrán bemutatott érett aminosav-szekvenciával (1. számú szekvencia) rendelkezik, vagy az érett humán mpl ligandum változata vagy poszttranszkripcionálisan módosított változata, vagy egy olyan protein, amely az érett humán mpl ligandummal kb. 80 %-os szekvencia-azonosságot mutat. Az mpl ligandum változata az érett humán mpl ligandum (hML) (elsősorban N-terminális vagy EPO-domén) fragmentje. Az

N-terminális fragment előnyösen a humán ML 1. cisztein-gyökétől 4. cisztein-gyökéig terjedő teljes szekvenciájával rendelkezik, de tartalmazhat ezen a régión kívül eső további addíciókat, deléciókat vagy szubsztitúciókat is. E

- 32 megvalósítási mód értelmében, a polipeptid fragment az alábbi képlettel fejezhető ki

X-hML(7-151)-Y amelyben hML(7-151) jelentése a humán TPO (hML) 7. cisztein-gyöktől 151. cisztein-gyökig terjedő aminosav-szekvenciája; X jelentése a 7. cisztein-gyök aminocsoportja, vagy az érett hML egy vagy több N-terminális aminosav-gyöke vagy a szekvenciához kapcsolt egyéb aminosavak (pl. Met vagy Tyr) vagy leader-szekvenciák, pl. proteolitikus (Xa faktor vagy trombin) hasítási helyek; Y jelentése pedig a 151. cisztein-gyök C-terminális csoportja vagy az érett hML egy vagy több C-terminális aminosav-gyöke, vagy a szekvenciához kapcsolt egyéb aminosavak.

Az mpl ligandum polipeptid vagy fragmentje adott esetben heterológ polipeptidhez (kiméra) is fúzionálható. Előnyös heterológ polipeptidek a citokinek, kolónia-stimuláló faktorok vagy interleukinek, illetve ezek fragmentjei, különösen a kit-ligandum (KL), IL-1,. IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF vagy LIF. Adott esetben előnyös heterológ polipeptidek az immunglubulin láncok, különösen a humán

IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM vagy ezek fragmentjei, elsősorban az IgG nehéz láncának konstans doménjét tartalmazók.

A találmány egyik tárgya izolált mpl agonistát tartalmazó készítmény, amely mpl agonista biológiailag aktív, és előnyösen képes a jelölt nukleotidők (pl. ³H-timidin) • ·« ···· humán mpl-lel transzfektált, IL-3-dependens Ba/F3 sejtek DNS-ébe történő beépülését stimulálni. Az mpl agonista adott esetben biológiailag aktív mpl ligandum, és előnyösen képes a ^3BS-izotóp keringő vérlemezkékbe történő beépülését egér vérlemezke rebound vizsgálatban stimulálni. Az alkalmas mpl agonisták közé tartozik a hMLie3, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML és pML2, illetve ezek fragmentjei.

A találmány egy másik megvalósítási módjában mpl ligandumhoz kötődni képes, izolált antitestet bocsátunk rendelkezésre. Az mpl ligandumhoz kötődni képes, izolált antitest adott esetben egy második polipeptidhez fuzionálható, és az antitest vagy fúziója a rögzített mpl esetében fentebb leírt forrásból mpl ligandum izolálására és tisztítására alkalmazható. A találmány egy másik vonatkozásának megfelelően eljárást írunk le mpl ligandum in vitro vagy in vivő kimutatására, melynek során az antitestet egy mintával, elsősorban vérszérum-mintával hozzuk érintkezésbe, melyről feltételezzük, hogy tartalmazza a ligandumot, és detektáljuk a kötődés létrejöttét.

A találmány további megvalósítási módjában izolált nukleinsav-molekulát bocsátunk rendelkezésre, amely az mpl ligandumot vagy fragmentjeit kódolja, s amely adott esetben detektálható gyökkel jelölhető. A találmány egy másik tárgya olyan nukleinsav-molekula, amely mpl ligandumot kódoló szekvenciával rendelkező nukle insav-molekulával komplementer, vagy mérsékelttől az igen szigorúig terjedő körülmények között képes ahhoz hibridizálódni. Azok a nukleinsav-molekulák az előnyösek, amelyek humán, sertés és egér mpl ligandumot kódolnak; ezek lehetnek RNS-ek vagy DNS-ék (genomiális és cDNS). A találmány egy másik megvalósítási módjában a nukleinsav-molekula mpl ligandumot kódoló DNS, amelynek része egy replikálható vektor is, amelyben a DNS a vektorral transzformált gazda által felismert kontroll szekvenciákhoz működőképesen van kapcsolva. A DNS adott esetben cDNS, amely az 1. ábrán látható 5'-3' szekvenciával (2. sz. szekv.), 3'-5' szekvenciával vagy azok fragmentjével rendelkezik. E megvalósítási mód részét képezik a vektorral transzformált gazdasejtek, előnyösen CHO sejtek, valamint a DNS alkalmazási eljárása mpl ligandum előállításában, melynek során az mpl ligandumot kódoló cDNS-t előnyösen a transzformált gazdasejtek tenyészetében expresszáljuk, és az mpl ligandumot kinyerjük a gazdasejtekből vagy a gazdasejt-tenyészetből. Az e módszerrel előállított mpl ligandum előnyösen humán mpl ligandum.

A találmány további tárgya eljárás vérképzési rendellenességben, elsősorban trombocitopéniában szenvedő emlős kezelésére, melynek során az mpl ligandum gyógyászatilag hatásos mennyiségét adjuk be az emlősnek. Adott esetben, az mpl ligandumot citokinnel, különösen kolónia-stimuláló faktorral vagy interleukinnal kombinálva adagoljuk. Az előnyös kolóniastimuláló faktorok és

- 35 ·· ·· • · · « • · · ···· ·· • · ···· interleukinek közé tartozik a kit-ligandum (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 és IL-11.

A találmány további tárgya eljárás TPO (ML) izolálására és tisztítására TPO-t termelő mikroorganizmusból, melynek során (1) feltárjuk vagy lizáljuk a TPO-t tartalmazó sejteket;

(2) adott esetben elkülönítjük az oldható anyagot a TPO-t tartalmazó oldhatatlan anyagtól;

(3) az oldhatatlan anyagban szolubilizálószerrel szolubilizáljuk a TPO-t;

(4) a szolubilizált TPO-t elkülönítjük a többi oldható és oldhatatlan anyagtól;

(5) redox pufferben visszaállítjuk a TPO harmadlagos szerkezetét (refolding); és (6) a megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező TPO-t elkülönítjük a hibás harmadlagos szerkezetű TPO-tól.

Az eljárásban a TPO-t tartalmazó oldhatatlan anyag szolubilizálási lépése során kaotróp szert (guanidin-sót, nátrium-tiocianátot vagy karbamidot) alkalmazunk. Az eljárás során a szolubilizált TPO-t elválasztjuk az egyéb oldható vagy oldhatatlan anyagoktól, amihez egy vagy több lépésben centrifugálást, gélfiltrálást vagy reverz fázisú kromatográfiát alkalmazunk. Az eljárásban alkalmazott refolding lépéshez redox puffért alkalmazunk, amely oxidálóés redukálószert egyaránt tartalmaz. Oxidálószerként általában oxigént vagy legalább egy diszulfid-kötést tartalmazó vegyületet, redukálószerként pedig legalább egy ·· ··- · • · · · · • · ί «··· ·· · szabad szulfhidrilcsoportot tartalmazó vegyületet alkalmazunk. Oxidálószerként előnyösen oxidált glutation(GSSG)-t és ciszteint, redukálószerként pedig redukált glutation(GSH)-t és ciszteint, még előnyösebben oxidálószerként oxidált glutation(GSSG)-t, redukálószerként pedig redukált glutation(GSH)-t alkalmazunk. Szintén előnyös, ha az oxidálószer mólaránya azonos vagy nagyobb, mint a redukélószeré. A redox puffer ezenkívül tartalmaz még detergenst, előnyösen CHAPS-t vagy CHAPSO-t, mely legalább 1 % mennyiségben van jelen, továbbá NaCl-t, előnyösen kb. 01-0,5 M koncentráció-tartományban, valamint glicerint, előnyösen 15 %-nál nagyobb koncentrációban. A redox puffer pH-ja előnyösen 7,5-9. A refolding lépést előnyösen 4 ’C-on, 12-48 órán keresztül végezzük, melynek során biológiailag aktív TPO-t kapunk, melyben az EPO dómén N-terminálisához legközelebbi cisztein-gyök és C-terminálisához legközelebbi cisztein-gyök között diszulfid-kötés alakul ki.

A találmány további tárgya eljárás biológiailag aktív TPO mikroorganizmusból történő tisztítására, melynek során (1) a mikroorganizmus legalább extracelluláris membránját lizáljuk;

(2) a TPO-t tartalmazó lizátumot kaotróp szerrel kezeljük;

(3) visszaállítjuk a TPO harmadlagos szerkezetét; és (4) a megfelelően visszaállított harmadlagos szerkezettel rendelkező TPO-tól elkülönítjük a szennyezéseket és a hibás harmadlagos szerkezetű TPO-t.

• ·

- 37 Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a humán mpl ligandum (hML) cDNS leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (1. sz. szekv.) és kódoló nukleotid-szekvenciád át (2. sz. szekv.) mutatjuk be. A nukleotidok számozását a sorok elején tüntetjük fel. Az 5' és 3' transzlálatlan régiókat kisbetűkkel jelöljük. Az aminosavakat az érett mpl ligandum (ML) protein 1. szerin-gyökétől kezdődően a szekvencia fölött számozzuk. A feltételezett exon 3 határait nyilakkal jelöljük, a potenciális N-glikozilálási helyeket pedig bekereztük. A cisztein-gyököket a szekvencia fölötti ponttal jelöljük. Az aláhúzott szekvencia a sertés vérplazmából tisztított mpl ligandumból meghatározott N-terminális szekvenciának felel meg.

A 2. ábrán az mpl ligandum ³H-timidin beépülési vizsgálathoz alkalmazott eljárást mutatjuk be. A különböző forrásokból származó mpl ligandum jelenlétének meghatározása érdekében az mpl P Ba/F3 sejteket 37 ’C-on 5 % C02-ot tartalmazó levegőjű, párásított inkubátorban 24 óra hosszat IL-3 hiányában inkubáltuk. Az IL-3 éheztetés után a sejteket hígított mintákkal vagy azok nélkül 96 üregű tenyésztőlemezekre helyeztük, és 24 óra hosszat inkubáltuk. Az inkubálás utolsó 6-8 órájában valamennyi üreghez 1 uCi ³H-timidint tartalmazó 20 ul, szérummentes RPMI tápközeget adtunk. A sejteket ezután 96 üregű filter lemezeken összegyűjtöttük és vízzel mostuk, majd a filtereken ·· ·· • · • · ···· ·· számoltuk a beütésszámot.

A 3. ábrán a pronáz, a DTT, és a hő APP (apláziás sertés vérplazma) Ba/F3-znp2 sejtproliferációt stimuláló képességére gyakorolt hatását mutatjuk be. Az APP pronázos emésztéséhez pronázt (Boehringer Mannheim) vagy szarvasmarha szérumalbumint Affi-gellO gyantához (Biorad) kapcsoltunk, és 37 ’C-on 18 órán keresztül (egymástól függetlenül) APP-vel inkubáltuk. A gyantákat ezután centrifugálással eltávolítottuk, majd vizsgáltuk a felülúszókat. Az APP-t további vizsgálatához 4 percre 80 ’C-ra melegítettük, illetve 100 uM végkoncentrációban DTT-t adtunk hozzá, majd

PBS-sel szemben dializáltuk.

A 4. ábrán az mpl ligandum aktivitás Fenil-Toyopearl, Blue-Sepharose és Ultralink-mpi oszlopról történő elúciójának eredményeit mutatjuk be. Az mpl affinitási oszlopról származó 4-8. frakciók képezték az oszlopról eluált csúcs aktivitású frakciókat.

Az 5. ábrán az eluált Ultrái ink-mp-Z frakciók SDS-PAGE analízisének eredményét mutatjuk be. Az 2-8. frakció mindegyikének 200 ul-éhez -20 ’C-on 1 mM HCl-ot taratalmazó ml acetont adtunk. -20 ’C-on három óra elteltével a mintákat lecentrifugáltuk, és a kapott üledékeket -20 ’C-on acetonnal kétszer mostuk. Az acetonos üledéket ezután 30 ul

SDS-szolubilizáló pufferben oldottuk, 100 zjM végkoncentrációban DTT-t adtunk hozzá, és 90 ’C-on 5 percig

- 39 melegítettük. A mintákat ezután 4-20 %-os SDS-poliakril-amid gélen komponenseikre bontottuk, és a proteineket ezüstfestéssel láthatóvá tettük.

A 6. ábrán az mpl ligandum aktivitás SDS-PAGE gélről végzett elúciójának eredményét mutatjuk be. Az mpl-affinitás oszlopról származó 6. frakciót nem redukáló feltételek mellett 4-20 %-os poliakril-amid gélen komponenseire bontottuk. Az elektroforézis után a gélt 12 egyforma részre vágtuk, és ezeket a példákban leírt módon elektroeluáltuk. Az elektroeluált mintákat PBS-sel szemben dializáltuk, és 1/20 hígításban vizsgáltuk. A gél kalibrálásához Novex Mark standardokat alkalmaztunk.

A 7. ábrán mpl ligandumot nem tartalmazó APP humán megakariocitaképződésre (megakariocitopoézis) gyakorolt hatását mutatjuk be. A mpl ligandumot nem tartalmazó APP-t úgy hoztuk létre, hogy 1 ml APP-t 1 ml mpl affinitás! oszlopon (700 ug mp_Z-IgG/ml NHS-Superose, Pharmacia) engedtünk át. 10 % APP-t vagy mpl ligandumot nem tartalmazó tartalmazó humán perifériás stem-sejt készítettünk, és ezeket 12 napig tenyésztettük. A megakariocitaképződést a példákban leírt módszerrel értékeltük.

% APP-t tenyészeteket

A 8. ábrán az mpl-IgG humán megakariocitaképződést stimuláló APP-t befolyásoló hatását mutatjuk be. 10 % APP-t tartalmazó humán perifériás stem-sejt tenyészeteket készítettünk, és

·· ··· ezeket 12 napig tenyésztettük. A 0., 2. és 4. napon mpl-IgG-t (0,5 ug) vagy ANP-IgG-t (0,5 ug) adtunk a tenyészethez. A 12. nap után a megakariocitaképződést a példákban leírt módon értékeltük. Az ábrán a kétszeri ismétléssel készített minták eredményének átlaga látható (zárójelben feltüntettük az egyes minták eredményeit).

A 9. ábrán az mpl ligandumot kódoló humán genom DNS 390 bp-os fragmentjének két szála látható. Feltüntettük az exon 3 leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (3. sz. szekv.), a kódoló szekvenciát (4. sz. szekv.), illetve annak komplementer párját (5. sz. szekv.).

A 10. ábrán a érett humán mpl ligandum (hML) leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (6. sz. szekv.) és az érett humán eritropoietin leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (7. sz. szekv.) mutatjuk be. A humán mpl ligandum megjósolt aminosav-szekvenciáját a humán eritropoietin aminosav-szekvenciájával rendeztük egymás alá (alignment). Az azonos aminosavakat bekereteztük, az optimális egymás alá rendezés érdekében réseket iktattunk be, melyeket kötőjelekkel jelöltünk. A potenciális N-glikozilálási helyeket a hML esetében síma vonallal, a hEPO esetében pontozott vonallal húztuk alá. Az eritropoietin-aktivitás szempontjából lényeges két cisztein-gyököt nagy ponttal jelöltük.

A 11. ábrán az érett humán mpl ligandum izoalakjai, a hML

- 41 ···· ·· ·· !

• · · • · · • ··: ···· · (6. sz. szekv.), hML2 (8. sz. szekv.), hML3 (9. sz. szekv.) és hML4 (10. sz. szekv.) leszármaztatott aminosav-szekvenciáját mutatjuk be. Az azonos aminosavakat bekereteztük, s az optimális egymás alá rendezés érdekében beiktatott réseket szaggatott vonalakkal (kötőjelekkel) jelöltük.

A 12/A ábrán a humán mpl ligandum Ba/F3-znp2 sejtproliferációra gyakorolt hatását; a 12/B ábrán az in vitro humán megakariocitaképződés — GPIIblIIa. megakariocita glikoproteinre specifikus, radioaktívan jelölt egér IgG monoklonális antitest alkalmazásával végzett — mennyiségi értékelését; a 12/C ábrán pedig a vérlemezke rebound” vizsgálattal mért egér trombopoézist mutatjuk be.

A CaPO^ módszer (Gorman, C., DNA Cloning: A New Approach, 2, 143-190, 1985) alkalmazásával, 293-as sejteket egy éjszakán keresztül pRJK5 vektorral önmagában, vagy pRK5-hML vagy pRK5-MLis3 plazmiddal transzfektáltunk. (A pRK5-MLi53 plazmidot úgy alakítottuk ki, hogy a hML 153. aminosav-gyöke után PCR-ral egy stop kodont vittünk be.) A tápközeget 36 óra hosszat kondicionáltuk, majd a Ba/F3-/np2 sejtproliferáció serkentésére (ld. 1. példa; 12/A ábra), illetve az in vitro humán megakariocitaképződés serkentésére vizsgáltuk (12/B ábra). A megakariocitaképződés mennyiségi értékeléséhez a GPIIblIIa. megakariocita-specifikus glikoprotein elleni, ^12BI-izotóppal jelölt egér IgG monoklonális antitestet (HP1-1D) alkalmaztuk (ld. Grant és

• · • · · · · · ··· ····

- 42 mtsi., Blood, £2, 1334-1339, 1987). A részlegesen tisztított rekombináns (rML) in vivő vérlemezketermelődésre gyakorolt hatását (12/C ábra) a McDonald, T.P. által leírt rebound trombocitózis vizsgálattal ((Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 144. 1006-1012, 1973) határoztuk meg. A rekombináns ML-t tartalmazó 200 ml kondicionált tápközegből részlegesen tisztított rML-t készítettünk. A tápközeget PBS-sel ekvilibrált 2 ml Blue-Sepharose oszlopon engedtük át, majd az oszlopot 2 M karbamidot és 2 M NaCl-ot tartalmazó PBS-sel mostuk. Az aktív frakciót PBS-ben dializáltuk, és endotoxinrnentes BSA-val 1 mg/ml koncentrációra állítottuk be. A minta ml-enként egy egységnél kevesebb endotoxint tartalmazott. Az egereket 64000, 32000 vagy 16000 egység rML-lel vagy önmagában a hordozóval oltottuk. Valamennyi csoport hat egérből állt. Az ábrákon feltüntettük az egyes csoportok közepes és standard eltérését. A p értékeket t-próbával határoztuk meg.

A 13. ábrán a humán mpl ligandum izoalakjainak és változatainak Ba/F3-znp2 sejtproliferációs vizsgálatban tapasztalt hatását mutatjuk be. A mintákat (hML, vakpróba, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) és hML153) az 1. példában leírt különböző hígításokban vizsgáltuk.

A 14/A, 14/B és 14/C ábrán a humán mpl ligandum (hML) vagy humán TPO (hTPO) leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (1.

sz. szekv) és a humán genomiális DNS kódoló szekvenciát (11.

sz. szekv.) mutatjuk be. A nukleotidok és az aminosav-gyökök

- 43 ···· ·· számozását a sorok elején tüntettük fel.

A 15. ábrán a tisztított 293-rhML332 és a tisztított

293-rhMLiB3 SDS-PAGE analízisének eredménye látható.

A 16. ábrán az egér ML izoalak nyitott leolvasási keretének cDNS kódoló nukleinsav-szekvenciáját (12. sz. szekv.) és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (13. sz. szekv.) mutatjuk be. Ez az érett egér mpl ligandum izoalak 331 aminosav-gyökből áll, ami néggyel rövidebb, mint a feltételezett teljes hosszúságú mML, ezért mML2-vel jelöljük. A nukleotidok számozását a sorok elején tüntettük fel, míg az aminosavakat az 1. szerinnel kezdődően a szekvencia fölött számozzuk. A potenciális N-glikozilálási helyeket aláhúzással, a cisztein-gyököket a szekvencia fölötti ponttal jelöljük.

A 17. ábrán az egér ML izolalak (mML) cDNS-szekvenciáját (14. sz. szekv.) és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (15. sz. szekv.) mutatjuk be. Az aminosavakat az 1.

szerin-gyökkel kezdődően a szekvencia fölött számozzuk. Ez az érett egér mpl ligandum izoalak 335 aminosavból áll, s úgy tartjuk, hogy ez a teljes hosszúságú mpl ligandum (mML). A szignál szekvenciát szaggatott vonallal aláhúzva, a valószínű hasítási pontot pedig nyíllal jelöljük. Az 5' és 3' transzlálatlan régiókat kisbetűvel szedve jelöljük. Az alternatív splicing eredményeként létrejött két deléciót (mML2 és mML3) aláhúzással jelöljük. A négy cisztein-gyök

- 44 elhelyezkedését a szekvencia fölötti pontok mutatják, míg a hét potenciális N-glikozilálási helyet bekereteztük.

A 18. ábrán a hML3 humán ML izoalak és az mML3 egér ML izoalak leszármaztatott aminosav-szekvenciájának (9., ill. 16. sz. szekv.) összehasonlítását mutatjuk be. A humán mpl ligandum feltételezett aminosav-szekvenciáját az egér mpl ligandum aminosav szekvenciája alá rendeztük (alignment). Az aminosavakat a sorok elején számozzuk.

A 19. ábrán az egér ML (17. sz. szekv.), sertés ML (18. sz. szekv.) és humán ML (6. sz. szekv.) érett izoalakjainak megjósolt aminosav-szekvenciáját hasonlítjuk össze. A szekvenciákba — az optimális egymás alá rendezés érdekében — réseket iktattunk, melyeket kötőjelekkel jelölünk. Az aminosavak számozását a sorok elején tüntetjük fel. Az azonos aminosav-gyököket bekereteztük. A potenciális N-glikozilálási helyeket sötétebb kerettel jelöljük, a cisztein-gyököket fekete pont mutatja. A konzervált két bázisos aminosav motívumot (amely potenciális proteázos hasítási helyet képvisel) aláhúzás jelzi. A mindhárom szekvenciában megtalálható négy aminosavas deléciót vastababb vonalú kerettel jelöljük.

A 20 szekv szekv ábrán a sertés ML izoalak cDNS-szekvenciáját (19. sz. ) és megjósolt érett aminosav-szekvenciáját (21. sz.

) mutatjuk be. Ez a sertés mpl ligandum izoalak 332 aminosavat tartalmaz, s úgy tartjuk, hogy ez a teljes • · hosszúságú sertés mpl ligandum (pML). A nukleotidok számozását a sorok elején, az aminosavakét (az 1. szerin-gyökkel kezdődően) a szekvencia fölött tüntetjük fel. A 21. ábrán a sertés ML izoalak (pML2) cDNS-szekvenciáját (20. sz. szekv.) és megjósolt érett aminosav-szekvenciáját (21. sz. szekv.) mutatjuk be. Ez a sertés mpl ligandum izoalak 328 aminosavból áll, és a teljes hosszúságú sertés mpl ligandumtól négy aminosavas deléció különbözteti meg (pML2). A nukleotidok számozását a sorok elején, az aminosavakét (az 1. szerin-gyökkel kezdődően) a szekvencia fölött tüntetjük fel.

A 22. ábrán a teljes hosszúságú sertés ML izoalak (pML) (18.

sz. szekv.) és a pML2 sertés ML izoalak (21. sz. szekv.) leszármaztatott aminosav-szekvenciáját hasonlítjuk össze. Az azonos aminosavakat bekereteztük, az optimális egymás alá rendezéshez beiktatott réseket pedig kötőjelekkel jelöltük.

Az aminosavak számozását a sorok elején tüntetjük fel.

A 23. ábrán a CH0-rhTP0s32 előállítása érdekében CH0-DP12 sejtek transzfektálásához alkalmazott pSVI5.ID.LL.MLORF (teljes hosszúságú vagy TPO332) plazmid jellemzőit mutatjuk be.

A 24. ábrán a CH0-rhTP0332 előállítása érdekében CH0-DP12 sejtek transzfektálásához alkalmazott pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (csonkított vagy TPO153) plazmid jellemzőit mutatjuk be.

• ·

- 46 ····

A 25/A, 25/B és 25/C ábrán az E. coli-rhTPOcMe-t^-1, ie3>

normális egerek vérlemezkéire (A), vörösvérsejtjeire (B) és fehérvérsejtjeire (C) gyakorolt hatását mutatjuk be. Két, hat nőstény C57 B6 egérből álló csoportot naponta PBS pufferrel, illetve 0,3 ug E. colj-rhTPOcMet^-1,XB3> ligandummal (100 ul, szubkután) oltottunk. A 0. napon és a

3-7. napokon a szemüregi szinuszból 40 ul vért vettünk, s a vért azonnal szokásos diluenssel hígítottuk, és a teljes vérsejtszámot Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 készülékkel számoltuk. Az adatokat átlag + középérték szórás értékként adjuk meg.

A 26/A. 26/B és 26/C ábrán az E. coli-rhTPOcMs-t^-1, ιβ3>

szubletálisan besugárzott egerek vérlemezkéire (A), vörösvérsejtjeire (B) és fehérvérsejtjeire (C) gyakorolt hatását mutatjuk be. Két, tíz nőstény C57 B6 egérből álló csoportot ¹³⁷Cs forrásból származó 750 cGy gammasugárzással kezeltünk, és az egereket naponta PBS pufferrel, illetve 3,0 ug E. eoli-rhTPO(Met^-1.153> ligandummal (100 ul, szubkután) oltottunk. A 0. napon és későbbi időpontokban az egerek szemüregi szinuszából 40 ul vért vettünk. A vért azonnal szokásos diluenssel hígítottuk, és a teljes vérsejtszámot Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 készülékkel számoltuk. Az adatokat átlag ± középérték szórás értékként adjuk meg.

A 27/A, 27/B és 27/C ábrán a CH0-rhTP0332 normál egerek vérmelezkéire (trombocitáira) (A), vörösvérsejtjeire • · · · ·

- 47 (eritrocitáira) (B) és fehérvérsejtjeire (leukocitáira) (C) gyakorolt hatását mutatjuk be. Két, hat C57 B6 egérből álló csoportot naponta PBS pufferrel, illetve 0,3 ug CH0-rhTP033z ligandummal (100 ul, szubkután) oltottunk. A 0. és a 3-7. napokon az egerek szemüregi szinuszából 40 ul vért vettünk, amit azonnal szokásos diluenssel hígítottunk, és a teljes vérsejtszámot Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 készülékkel számoltuk. Az adatokat átlag ± középérték szórás értékként adjuk meg.

A 28. ábrán különböző sejtvonalakból nyert, különböző rhTPO alakok dózis-reakció görbéit mutatjuk be. A dózis-reakció görbéket az alábbi rhTPO proteinekkel készítettük: CHO (kínai hörcsög petefészek) sejtekből származó teljes hosszúságú hTP0332; hTPOMet^-1,153 (E. coli-ereáetű, rövidített alak, N-terminális metioninnal); hTP0332 (humán 293 sejtekből származó teljes hosszúságú TPO); Met-nélküli 155 E. coli (E. coli-ból származó, terminális metionin nélküli, rövidített alak rrhTPOiss]). A 6 nőstény C57B6 egérből álló csoportokat hét napig, naponta rhTPO-val injektáltuk (mindegyik csoportot más-más rhTPO-val). Az egerek szemüregi szinuszából mindegyik napon 40 ul vért vettünk, és számoltuk a teljes vérsejtszámot. A bemutatott adatok a különböző kezeléseknél tapasztalt maximális hatást mutatják, ami a (Met 153 E. coli) kivételével a kezelés 7.

napján jelent meg. (A Met 153 E. coli csoportnál ez az 5. napon volt tapasztalható. Az adatokat átlag + középérték szórás értékként adjuk meg.

A 29. ábrán a CHO sejtekben termelődött rhTPO teljes hosszúságú és vágott alakjainak dózis-reakció görbéit az E. coli-ból származó rövidített alak dózis-reakció görbéjével hasonlítjuk csoportokat csoportot össze.

naponta más-más

A hat nőstény C57B6 egérből álló rhTPO-val injektáltuk (mindegyik rhTPO-val). Az egerek szemüregi szinuszából a 2-7. napon 40 ul vért vettünk, és számoltuk a teljes vérsejtszámot. A kezelési csoportok az alábbiak: TPO153 — E. coli-'báY származó rövidített TPO alak; TPO332 (kevert frakció) — teljes hosszúsúgú TPO, amely kb. 80-90 % teljes hosszúságú, és 10-20 % vágott alakból áll; TP0332 (30K frakció) — az eredeti kevert készítményből származó tisztított, vágott frakció; TP0332 (70K frakció) — az eredeti kevert frakcióból származó tisztított, teljes hosszúságú TPO frakció. Az adatokat átlag ± középérték szórás értékként adjuk meg.

30. ábrán a TPO mérésére végzett KIRA ELISA vizsgálat menetét mutatjuk be eredeti receptorok

Az ábrán az MPL/Rse.gD kiméra és az megfelelő részei, továbbá a végső konstrukció (30/B ábra), valamint a vizsgálat fontosabb lépéseit bemutató folyamatábra (30/A ábra) láthatók.

A 31. ábrán a TPO mérésére végzett KIRA ELISA vizsgálat égyes lépéseit bemutató műveleti séma látható.

A 32/A-32/Z ábrákon az Rse.gD expressziójához (ld. 17.

példa) alkalmazott pSVI17.ID.LL expressziós vektor • ·· · ·

• · ···· ·· nukleotid-szekvenciáját mutatjuk be.

A 33. ábrán a pMPl plazmid kialakításának sematikus vázlatát mutatjuk be.

A 34.	ábrán a	PMP21	plazmid	kialakításának	sematikus
vázlatát	mutatjuk	be.
A 35.	ábrán a	PMP151	plazmid	kialakításának	sematikus
vázlatát	mutatjuk	be.
A 36.	ábrán a	PMP202	plazmid	kialakításának	sematikus
vázlatát	mutatjuk	be.
A 37.	ábrán a	PMP172	plazmid	kialakításának	sematikus
vázlatát	mutatjuk	be.
A 38.	ábrán a	PMP210	plazmid	kialakításának	sémát ikus
vázlatát	mutatjuk	be.
A 39.	ábrán a	PMP210	plazmid bankból származó	öt legjobb

expressziéit mutató TPO klón látható (23., 24., 25., 26., 27.

és 28. sz. szekv.).

A 40. ábrán a pMP41 plazmid kialakításának sematikus vázlatát mutatjuk be.

A 41. ábrán a pMP57 plazmid kialakításának sematikus vázlatát mutatjuk be.

A 42. ábrán a pMP251 plazmid kialakításának sematikus vázlatát mutatjuk be.

A találmány leírásában, a példákban és a szabadalmi igénypontokban alkalmazott kifejezések meghatározását az alábbiakban írjuk le.

A kaotróp szer olyan vegyület, amely vizes oldatban, megfelelő koncentrációban egy protein térbeli konfigurációjának vagy konformációjának megváltozását okozhatja, oly módon, hogy legalább részben megszakítja a protein normális másodlagos és harmadlagos szerkezetéért felelős kötőerőket. Az ilyen vegyületek közé tartozik, pl. a karbamid, a guanidin-HCl és a nátrium-tiocianát. A proteinek konformációjának megváltoztatásához e vegyületek nagy, rendszerint 4-9M koncentrációjára van szükség.

A citokin elnevezés egy sejtpopuláció által felszabadított olyan proteinek gyűjtőneve, amelyek intercelluláris mediátorként hatnak a másik sejtre. Az ilyen citokinek példái a limfokinek, monokinek és a hagyományos polipeptid hormonok. A citokinek közé tartozik a növekedési hormon, az inzulin-szerű növekedési faktorok, a humán növekedési hormon, az N-metionil humán növekedési hormon, a szarvasmarha növekedési hormon, a mellékpajzsmirigy hormon, a tiroxin, inzulin, proinzulin, relaxin, prorelaxin, a növekedési faktorok glikorpotrin hormonok, mint pl. a folliculus-serkentő hormon (FSH), a pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH) és a luteinizáló hormon (LH), vérképzési növekedési faktor, a máj növekedési faktor, a fibroblaszt növekedési faktor, •prolaktin, méhlepény laktogén hormon, tumor nekrózis faktor (TNF-alfa és TNF-béta), az endometriosist gátló anyag, az egér gonadotropinnel kapcsolatos peptid, inhibin, aktivin, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, integrin, az idegszövet növekedési faktorok, mint az NGF-β, vérlemezke faktor, az átalakulást serkentő növekedési ?GF), mint a TGF-alfa és TGF-béta, az inzulin-szerű növekedési faktor-I és -II, az eritropoietin (EPO), az osteoinduktív faktorok, az interferonok, pl. az interferon-alfa, -béta és -gamma, a kolónia-stimuláló faktorok (CSF), mint a makrofág-CSF (M-CSF), a granulocita-makrofág-CSF (GM-CSF), és a granulocita-CSF (G-CSF), az interleukinek, mint pl. IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4,

IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 és más polipeptid faktorok, mint a LIF, SCF és kit-ligandum. A fenti kifejezések jelentésébe tartozónak tekintjük a természetes forrásból és a rekombináns sejttenyészetből származó proteineket, valamint a biológiailag aktív ekvivalenseket is, amelyek például egy vagy több aminosavban eltérnek az eredeti vegyület aminosav-szekvenciájától vagy különböznek glikoziláltságuk típusában vagy mértékében.

Az mpl ligandum, mpl ligandum polipeptid, ML, trombopoietin vagy TPO kifejezéseket egymással

• · · ••·· ·· helyettesíthető módon használjuk, s olyan polipeptidre vonatkoznak, amelyek képesek a citokin receptor szupercsalád mpl tagjához kötődni, továbbá az ML alábbi biológiai tulajdonságaival rendelkeznek. Az egyik jellemző biológiai tulajdonságuk, hogy képesek a jelölt nukleotidok (pl. ³H-timidin) humán mpl P-vel transzformált IL-3-dependens Ba/F3 sejtek DNS-ébe történő beépülését serkenteni. Másik jellemző tulajdonságuk azon képességük, hogy a ³⁵S-izotóp keringő vérlemezkékbe történő beépülését serkentik (egér vérlemezke “rebound vizsgálatban). Ez a definíció azokat a polipeptideket foglalja magában, amelyeket mpl ligandum forrásból, például a találmányunkban leírt apláziás sertés vérplazmából (APP) vagy más állatfajból (beleértve az embert is) izoláltunk, illetve, amelyeket rekombináns vagy szintetikus módszerekkel állítottunk elő, továbbá ide tartoznak az ilyen polipeptidek változatai, például funkcionális származékai, fragmentjei, alléljai, izoalakjai és analógjai is.

Az mpl ligandum fragment vagy TPO fragment egy természetben előforduló érett, teljes hosszúságú mpl ligandum vagy TPO szekvencia olyan része, amelyből egy vagy több aminosav-gyök vagy szénhidrát egység hiányzik. Az aminosav(ak) a peptid bármely (N-terminális, C-terminális vagy közbülső) részéből hiányozhat(nak). A fragment az mpl ligandummal legalább egy közös tulajdonsággal rendelkezik. Az mpl ligandum fragmentek jellemzően legalább 10, 15, 20, 25, 30 vagy 40 aminosav-gyökből álló folyamatos ···· ··*·

- 53 « szekvenciával rendelkeznek, melyek azonosak az emlősökből izolált mpl ligandum szekvenciáival, beleértve az apláziás sertés vérplazmából izolált ligandumot vagy a humán vagy egér ligandumot, különösen azok EPO doménjét. Az N.-terminális fragmentek jellemző példái a hMLi53 vagy

TP0(Met^-1i-i53).

Az mpl ligandum változatok vagy mpl ligandum szekvencia változatok olyan biológiailag aktív mpl ligandumok, amelyek nem 100 %-ban azonosak a rekombináns sejttenyészetből vagy apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandummal vagy a humán ligandummal, amely az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával (1. sz. szekv.) rendelkezik. A biológiailag aktív mpl ligandum változat aminosav-szekvenciája általában legalább kb. 70 %-ban azonos az apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandum vagy az érett egér vagy humán ligandum (vagy fragmentjei) szekvenciájával. A szekvencia-azonosság előnyösen legalább kb. 75 %-os, még előnyösebben legalább kb. 80 %-os, még előnyösebben legalább kb. 85 %-os, még előnyösebben legalább kb. 90 %-os, és legelőnyösebben legalább kb. 95 %-os.

A kiméra mpl ligandum heterológ polipeptidhez fragmentjéhez fúzionált, vagy annak egy vagy több ligandummal legalább egy rendelkezik. Az említett olyan polipeptid, amely egy másik vagy annak egy vagy több teljes hosszúságú mpl ligandumból fragmentjéből áll. A kiméra az mpl közös biológiai tulajdonsággal másik polipeptid rendszerint egy citokin, immunglobulin, vagy ezek fragmentje.

Az izolált mpl ligandum, nagymértékben tisztított mpl ligandum és lényegében homogén mpl ligandum kifejezések egymást helyettesíthetik, s olyan mpl ligandumra vonatkoznak, amelyet mpl ligandum forrásból tisztítottunk vagy rekombináns vagy szintetikus módszerekkel állítottunk elő (és más peptidektől vagy proteinektől mentes), annak érdekében, hogy (1) csészés centrifugáló szekvenáló berendezés vagy a legjobb szokványos aminosav-szekvenáló berendezés (vagy annak találmányunk bejelentése után publikált módosítása) alkalmazásával az N-terminális vagy egy belső aminosav-szekvencia legalább 15, előnyösen 20 aminosav-gyökét kapjuk; vagy (2) SDS-PAGE gélelektroforézissel, nem redukáló vagy redukáló feltételek mellett, Coomassie kék vagy előnyösen ezüstfestés alkalmazásával homogén proteint kapjunk. A homogenitás itt kb. 5 %-nál kisebb mértékű (más proteinek által okozott) szennyezést jelent.

Az mpl ligandummal vagy az izolált mpl ligandummal kapcsolatban említett “biológiai tulajdonság trombopoézises aktivitást vagy in vivő effektor vagy antigén hatást vagy olyan aktivitást jelent, amelyet közvetve vagy közvetlenül egy mpl ligandum (természetes vagy denaturált konformációban) vagy fragmentje okoz vagy idéz elő. Az effektor funkciók közé tartozik az mpl kötődés és mindenféle hordozó kötési aktivitás, mpl agonizmus vagy antagonizmus, • · · · · · ·

- 55 különösen proliferatív jel transzdukciója, például replikádé, DNS-szabályozási funkció, egyéb citokinek biológiai aktivitásának modulálása, receptor- (különösen citokin-) aktiválás deaktiválás, felül- vagy alulszabályozás, sejtnövekedés, differenciáció és hasonlók.

Az antigén funkció olyan epitóp vagy antigén hatású hely birtoklását jelenti, amely képes a természetes mpl ligandum ellen kialakult antitestekkel való kereszt-reakcióra. Egy mpl ligandum polipeptid legfőbb antigén funkcióját az jelenti, hogy legalább 10⁶ liter/mól nagyságú affinitással kötődik az apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandum elleni antitesthez. A polipeptid rendszerint legalább kb.

10⁷ liter/mól affinitással kötődik az antitesthez. Az antigén szempontból aktív mpl ligandum legelőnyösebben olyan polipeptid, amely a fentebb említett effektor funkciók valamelyikével rendelkező mpl ligandum elleni antitesthez kötődik. A biológiai aktivitás meghatározásához alkalmazott antitestek poliklonális nyúl antitestek, melyeket úgy hoztunk létre, hogy rekombináns sejttenyészetből vagy apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandumot Freund-féle komplett adjuvánssal elegyítettünk, és a kapott készítménnyel szubkután injekciót, majd peritoneális injekcióval emlékeztető oltást adtunk, míg az mpl ligandum antitest titere maximális szintet nem ért el.

Az mpl ligandummal vagy izolált mpl ligandummal kapcsolatban alkalmazott biológiailag aktív kifejezés olyan mpl ligandumra vagy polipeptidre vonatkozik, amely trombopoézises aktivitást mutat, vagy amely az apláziás sertés vérplazmából izolált vagy rekombináns sejttenyészetben expresszált mpl ligandumével azonos effektor funkcióval rendelkezik. Az mpl ligandum vagy polipeptid fő effektor funkciója az mpl-hez való kötődés és a jelölt nukleotidok (pl. ³H-timidin) humán mpl P-vel transzfektált, IL-3 dependens Ba/F3 sejtek DNS-ébe történő beépülésének stimulálása. Az mpl ligandum vagy polipeptid másik ismert effektor funkciója azon képessége, hogy serkenti a ^3BS-izotóp keringő vérlemezkékbe történő beépülését (egér vérlemezke rebound vizsgálatban). Az mpl ligandum további ismert funkciója azon képessége, hogy stimulálja az in vitro humán megakariocitaképződést, ami a GPII-blIIa megakariocita glikproteinre specifikus, radioaktívan jelölt monoklonális antitest alkalmazásával határozható meg (mennyiségileg).

A százalékos aminosav-szekvencia azonosság kifejezés, az mpl ligandum szekvenciáját illetően a lehetséges szekvencia azon aminosav-gyökeinek százalékos arányát jelenti, amelyek azonosak az apláziás sertés vérplazmábóll izolált mpl ligandum szekvenciájában lévő aminosav-gyökökkel vagy az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával (1. sz. szekv.) rendelkező egér vagy humán ligandum aminosav-gyökeive1. Az azonosság megállapítása érdekében a szekvenciákat egymás alá rendezzük, és — ha szükséges — a maximális százalékos azonosság elérése érdekében réseket iktatunk be, továbbá a konzervatív szubsztitúciókat nem tekintjük a szekvencia-azonosság részének. Az mpl ligandum szekvenciájában nem hozhatunk létre olyan N-terminális, C-terminális vagy belső extenziókat, deléciókat vagy inszerciókat, mivel ezek befolyásolják a szekvenciaazonosságot, illetve a homológiát. Az azonos szekvenciájúnak tekintett, biológiailag aktív mpl ligandum polipeptidek példái a pre-pro-mp.Z ligandum, a -pro-mpl ligandum és az érett mpl ligandum.

Az “mpl ligandum mikroszekvenálását bármilyen alkalmas standard eljárással végezhetjük, feltéve, hogy az alkalmazott eljárás elég érzékeny. Az egyik ilyen eljárásban az SDS gélről vagy egy végső HPLC lépésből nyert, nagymértékben tisztított polipeptidet 120A fenil-tiohydantion (PTH) aminosav analizálóval felszerelt 470A Applied Biosystems gázfázisú szekvenáló készülék alkalmazásával, automatizált Edman-lebontással (fenil-izotio-cianátos lebontás) szekvenáljuk. A kémiai lebontással (pl. CNBr, hidroxi1-amin, 2-nitro-5-tio-ciano-benzoát) vagy enzimatikus emésztéssel (pl. tripszin, clostripain, staphylococcus proteáz) előállított mpl ligandum fragmenteket (pl. HPLC-vel végzett) tisztítás után hasonlóan szekvenálhatjuk. A PTH aminosavakat a ChromPerfect adatfeldolgozó rendszer (Justice Innovations, Palo Alto, CA) alkalmazásával analizáljuk. A szekvencia kiértékelését VAX

11/785 Digital Equipment Co. számítógéppel végezzük (ld. Henzel és mtsi., J. Chromatography, 404. 41-52, 1987). A • · · ·

- 58 HPLC alikvotokat adott esetben 5-20 %-os SDS-PAGE gélen elektroforizáljuk, a sávokat PVDF membránra (ProBlott, AIB, Foster City, CA) másoljuk, és a membránt Coomassie Brilliant Blue-val (Matsurdiara, J. Bioi. Chem., 262. 10035-10038, 1987) festjük. Az így azonosított specifikus proteint kivágjuk a lenyomatból, és a fentebb említett gázfázisú szekvenáló készülékkel N-terminális szekvenálást végzünk. A protein belső szekvenciáinak szekvenálásához a HPLC frakciókat vákuum alatt megszárítjuk (SpeedVac), megfelelő pufferekben újraszuszpendáljuk, és cián-bromiddal, Lys-C lizin-specifikus enzimmel (Wako Chemicals, Richmond, VA) vagy Asp-N enzimmel (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) emésztjük. Emésztés után a kapott peptideket elegy formájában szekvenáljuk, vagy az elegyet C4 oszlopon 0,1 %-os TFA-ban propanol gradienssel HPLC-vel kromatografáljuk, és azután végezzük a gázfázisú szekvenálást.

A trombocitopénia definíció szerint olyan rendellenesség, amikor a vérlemezkeszám egy liter vérre vonatkoztatva 150 x 10® alá süllyed.

A trombopoézises aktivitás olyan biológiai aktivitás, amely a megakariociták vagy megakariocita őssejtek vérlemezke-termelő alak kialakulása irányába mutató proliferációjának, differenciálódásának és/vagy érésének felgyorsításából áll. Ez az aktivitás különböző módszerekkel mérhető, többek között in vivő egér vérlemezke rebound szintézis vizsgálattal, vérlemezke sejtfelületi antigén vizsgálattal (humán CMK megakarioblaszt sejtvonal anti-vérlemezke immunvizsgálata [anti-GPIIt>IIIeJ), és megakarioblaszt sejtvonalban (DAMI) végzett poliploidizáció indukálásával.

A trombopoietin (TPO) olyan vegyület, amely emlősökben trombopoézises aktivitással rendelkezik, illetve képes a vérszérum vérlemezkeszámának növelésére. A TPO az endogén vérlemezkeszámot előnyösen legalább 10 %-kal, előnyösebben legalább 50 %-kal, legelőnyösebben pedig egy liter vérre vonatkoztatva 150 x 10^s-nél nagyobb szintre képes növelni.

Az “izolált mpl ligandum nukleinsav” olyan RNS vagy DNS, amely több, mint 16, előnyösen 20 vagy több egymást követő nukleotid bázist tartalmaz, melyek biológiailag aktív mpl ligandumot vagy annak fragmentjét kódolják; az említett RNS-hez vagy DNS-hez komplementer nukleinsav; vagy az említett RNS-hez vagy DNS-hez hibridizáló nukleinsav, amely mérsékelt vagy szigorú körülmények között stabilan hibridizált állapotban marad. Ez a RNS vagy DNS mentes legalább egy szennyező nukleinsavtól, mellyel természetes forrásában normális esetben kapcsolatban áll; előnyösen minden más emlős RNS-től vagy DNS-től mentes. A “legalább egy, természetes forrásában normális esetben kapcsolatban álló szennyező nukleinsavtól mentes kifejezés arra az esetre vonatkozik, amikor a nukleinsav a forrásul szolgáló (vagy természetes) sejtben, de más kromoszomális elhelyezkedésben van jelen, vagy amikor a nukleinsavat olyan ·**· • · · · ·

- 60 nukleinsav-szekvenciák szegélyezik, amelyek normális esetben nem fordulnak elő a forrás-sejtben. Az izolált mpl ligandum nukleinsav egyik példája olyan RNS vagy DNS, amely biológiailag aktív mpl ligandumot kódol, amelynek szekvenciája legalább 75 %-ban, előnyösen legalább 80 %-ban, még előnyösebben legalább 85 %-ban, még előnyösebben legalább 90 %-ban, legelőnyösebben legalább 95 %-ban azonos a humán, egér vagy sertés mpl ligandum szekvenciájával.

A szabályozó (kontroll) szekvenciák olyan DNS-szekvenciák, amelyek egy adott organizmusban szükségesek a működőképesen kapcsolt kódoló szekvencia expressziójához. A prokariótákban alkalmas szabályozó sekvenciák közé például promoter, adott esetben operátor szekvencia, riboszóma-kötő hely, és esetleg más, jelenleg nem teljes mértékben tisztázott funkciójú szekvenciák tartoznak. Az eukarióta sejtekben promoterek, poliadenilációs jelek és enhancerek alkalmazása ismeretes.

A nukleinsavakra vonatkozó működőképesen kapcsolt kifejezés azt jelenti, hogy a nukleinsavak egy másik nukleinsav-szekvenciával funkcionális kapcsolatban állnak.

szekréciós vezető akkor kapcsolódik ha pre-proteinként

Például, egy pre-szekvenciát vagy (leader) szekvenciát kódoló DNS működőképesen egy másik DNS-hez, expresszálódik, amely résztvesz a polipeptid szekréciójában; egy promoter vagy enhancer akkor kapcsolódik működőképesen egy kódoló szekvenciához, ha befolyásolja a szekvencia transzkripcióját; vagy egy riboszóma akkor kapcsolódik • · · · ' ' - 61 működőképesen egy kódoló szekvenciához, ha elhelyezkedése elősegíti a transzlációt. Általánosan, a működőképesen kapcsolt kifejezés azt jelenti, hogy a kapcsolt DNS-szekvenciák egymással szomszédosak, és — a szekréciós vezetőszekvencia esetében — egymással szomszédosak és azonos leolvasási keretbe esnek. Az enhancereknek ezzel szemben nem kell szomszédos helyzetűeknek lenni. A kapcsolás ligálással vagy megfelelő restrikciós helyekkel történhet. Ha nincsenek ilyen helyek, az elfogadott gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonukleotid adaptorok vagy linkerek alkalmazhatók.

Az exogén kifejezés (DNS elemeknél) olyan nukleinsavat jelent, amely az adott sejt szemponjátból idegen.

A sejt, sejtvonal és sejttenyészet” kifejezések egy sejt vagy sejtvonal összes utódára vonatkoznak. Az olyan kifejezések, mint a transzformáns vagy transzformált sejtek, az elsődleges transzformált sejtekre és az azokból származó tenyészetekre vonatkoznak, függetlenül az egymást követő tenyészetek számától. Tudni kell, hogy a szándékos és véletlenszerű mutációk következtében az összes utód DNS-tartalma nem lehet pontosan azonos. Azok a mutáns utódok tartoznak e kifejezések hatálya alá, amelyek az eredetileg transzformált sejtekkel azonos funkcióval és biológiai aktivitással rendelkeznek.

A plazmidok önállóan replikálódó cirkuláris DNS-molekulák, • · · ·

- 62 amelyek független replikációs kezdőhellyel rendelkeznek. A plazmidokat a nagybetűk és/vagy számok előtt álló p jelöli. Találmányunkban a kiindulási plazmidok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők vagy a tudományos irodalomban megtalálhatók, illetve az ilyen plazmidokból ismert eljárásokkal előállíthatok. Ezenkívül, léteznek egyéb egyenértékű plazmidok is, amelyek szintén ismertek.

A DNS vonatkozásában a restrikciós enzimes emésztés kifejezés a DNS belső foszfodiészter kötéseinek katalitikus hasítását jelenti, melyet olyan enzimmel végzünk, amely a DNS-szekvencia adott helyeinél fejti ki hatását. Az ilyen enzimeket restrikciós endonukleázoknak nevezzük. Mindegyik restrikciós endonukleáz egy specifikus DNS-szekvenciát ismer fel, amely kettős szimmetriát mutat. Az általunk alkalmazott, különböző restrikciós enzimek a kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, s a forgalmazók által meghatározott reakciófeltételek, kofaktorok, stb. mellett alkalmazhatók.

azonosítják,

A restrikciós enzimeket rövidítéssel mely rövidítés egy nagybetűből és több kisbetűből áll, melyek arra a mikroorganizmusra vonatkoznak, amelyből a restrikciós enzim eredetileg származik, míg a betűk után álló szám az adott enzimet jelöli. Általában kb. 20 ul pufferoldatban kb. 1 ug plazmidot vagy DNS-fragmentet kb. 1-2 egység enzimmel emésztünk. Az egyes restrikciós enzimekhez megfelelő puffereket és szubsztrát-mennyiséget a gyártó határozza meg. Rendszerint 37 °C-on 1 órás reakciót végzünk, mely azonban az útmutatásoknak megfelelően ····

- 63 változhat. Az inkubálás után a proteint vagy polipeptidet fenollal és kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítjuk, és az emésztett nukleinsavat etanolos kicsapással nyerjük ki a vizes frakcióból. A restrikciós enzimes emésztést követően a terminális 5'-foszfát-csoportokat bakteriális alkalikus foszfátázzál hidrolizálhatjuk, hogy megakadályozzuk a DNS két hasított végének gyűrűvé záródását, ami megakadályozná, hogy a restrikciós helyre újabb DNS-fragmentet inszertáljunk. Ha külön nem jelezzük, a plazmidok emésztése után nem végzünk 5' terminális defoszforilációt. A defoszforilációhoz alkalmazott eljárások és reagensek jól ismertek, s leírásuk megtalálható Sambrook és mtsi. Molecular Cloning: A Laboratory Manual című kézikönyvének (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

1.56-1.61 fejezeteiben.

Egy adott DNS-fragment restrikciós endonukleázos emésztményből való kinyerése vagy izolálása az emésztmény szétválasztását jelenti, melynek során poliakril-amid vagy agaróz gélen elektroforézist végzünk, a megfelelő fragmentet (mobilitását ismert molekulatömegű marker DNS-fragment mobilitásával összehasonlítva) azonosítjuk, a kívánt fragmentet tartalmazó gélszeletet kivágjuk, és a géltől elválasztjuk a DNS-t. Ez az eljárás általánosan ismert (ld. pl. Lawn és mtsi., Nucleic Acids Rés., £, 6103-6114, 1981; Goeddel és mtsi., Nucleic Acids Rés., fi,

4057, 1980).

···· • · · agaroz denaturáljuk,

A Southern analízis vagy Southern biot analízis olyan módszer, amelynek segítségével DNS vagy DNS-tartalmú készítmény restrikciós enzimes emésztményében (ismert, jelölt oligonukleotidhoz vagy DNS-fragmenthez való hibridizáció alapján) bizonyíthatjuk adott DNS-szekvenciák jelenlétét. A Southern analízis során a DNS emésztményt gélen elektroforézissel szétválasztjuk, a DNS-t nitrocellulóz, nylon vagy más alkalmas membránra másoljuk, és radioaktívan jelölt, biotinilált vagy enzimmel jelölt próbával analizáljuk (ld. Sambrook és mtsi. kézikönyve, 9.37-9.52 fejezetek).

jelöljük. A agaróz vagy szétválasztjuk,

A Northern analízis vagy Northern biot analízis olyan módszer, amely ismert próbához (pl. oligonukleotidhoz, DNS-fragmenthez, cDNS-hez vagy fragmentjéhez) hibridizáló RNS-szekvenciák azonosítására alkalmazható. A próbát radioaktív izotóppal (pl. ³²P-izotóppal), biotinnal vagy enzimmel vizsgálni kívánt RNS-t általában poliakril-amid gélen elektroforézissel nitrocellulóz, nylon vagy más alkalmas membránra másoljuk, és az említett próbák valamelyikével hibridizáljuk (ld. Sambrook és mtsi. kézikönyve, 7.39-7.52 fejezetek).

A ligálás nukleinsav-fragmentek közötti foszfodiészter kötések kialakításának folyamata. Két fragment ligálásához a fragmentek végeinek egymással kompatibilisnek kell lenni. Néhány esetben a végek közvetlenül az endonukleázos emésztés ·· ·· · · · · • ·· · · · · · · • · · · · · « • · · · · ··· ···· ·· ······ · után kompatibilisek, más esetekben azonban az endonukleázos emésztést követően általában kialakuló lépcsős (ragadós) végeket tompává kell alakítani, hogy alkalmasak legyenek a ligáláshoz. A tompa végek kialakításához a DNS-t megfelelő pufferben, DNS-polimeráz I vagy T4 DNS-polimeráz Klenow fragmentjének kb. 10 egységével (a négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát jelenlétében) 15 ’C-on legalább 15 percig kezeljük, majd a DNS-t fenol/kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk. Az egymáshoz ligálni kívánt DNS-fragmenteket körülbelül ekvimoláris mennyiségben visszük oldatba, mely oldat tartalmaz ATP-t, ligáz puffért és ligáz enzimet is, pl. T4 DNS-ligázt (0,5 ug DNS-re vonatkoztatva kb. 10 egység mennyiségben). Amennyiben a DNS-t vektorhoz

kívánjuk ligálni, a vektort először megfelelő	restrikciós
endonukleázzal	vagy endonukleázokkal	végzett	emésztéssel
linearizálni	kell. A	linearizált	fragmentet ezután
bakteriális	alkalikus	foszfatázzal vagy	borjúbél
foszfatázzal	kezeljük,	hogy a	ligálási	lépés során

megakadályozzuk az ön-ligálódás bekövetkezését.

A DNS sejtekből történő előállítása a plazmid DNS gazdasejt-tenyészetből való izolálását jelenti, amihez Sambrook és mtsi. fentebb említett kézikönyvének 1.25-1.33 szakaszaiban leírt nagy- és kisléptékű plazmidelőállítási módszert alkalmazzuk (ld. Sambrook és mtsi. kézikönyve,

1.40. szakasz).

Az oligonukleotidok ismert eljárásokkal (pl. foszfo • · · · · · · • · · · · ···· ··«· ·* ··· ···· ·

-triészter, foszfit vagy foszfor-amidit módszerrel, szilárd fázisú technikával [ld. pl. EP 266,032 számú euróbái szabadalom, 1988. május 4.] vagy dezoxinukleotid H-foszfonát intermedierek útján [Froehler és mtsi., Nucl. Acids Rés., 14, 5399-5407, 1986] kémiai úton szintetizált rövid láncú, egy- vagy kétszálú polidexozinukleotidok. Az egyéb alkalmazható módszerek közé tartozik a polimeráz láncreakció (PCR; meghatározását ld. lentebb) és egyéb autoprimer módszerek és szilárd hordozón végzett oligonukleotid-szintézisek. E módszerek leírása megtalálható: Engels és mtsi., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. , 28. 716-734, (1989). Ezek az eljárások akkor alkalmazhatók, ha a gén teljes nukleinsav-szekvenciája ismert, vagy ha rendelkezésre áll a kódoló szállal komplementer nukleinsav-szekvencia. Más lehetőség szerint, ha a megcélzott aminosav-szekvencia ismert, az egyes aminosav-gyökök ismert és előnyös kódoló bázisai alapján következtethetünk a lehetséges nukleinsav-szekvenciára. Az oligonukleotidokat ezután poliakril-amid géleken tisztítjuk.

A polimeráz láncreakció vagy PCR olyan eljárás vagy technika, melynek során egy nukleinsav (RNS és/vagy DNS) specifikus részének kis mennyiségét amplifikáljuk (ld. 4,683,195 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom,

1987. július 28.). A szóban forgó régió végeinek szekvenciájáról általában információkkal kell rendelkeznünk, hogy oligonukleotid primereket tervezhessünk, melyek szekvenciája azonos vagy hasonló lesz az amplifikálni kívánt

- 67 templáttal szembenálló szállal. A két primer 5 terminális nukleotidjai egybeeshetnek az amplifikált anyag végeivel. A PCR-t specifikus RNS-szekvenciák, teljes genomiális DNS-ből származó specifikus DNS-szekvenciák, teljes celluláris RNS-ből átírt cDNS, bakteriofág vagy plazmid-szekvenciák, stb. amplifikálásához alkalmazhatjuk (általános leírást ld. Mullis és mtsi., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi., 51. 263, 1987; Erlich (szerk.) PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). A PCR-t a nukleinsav polimeráz reakciós eljárások (melyek primerként ismert nukleinsav, valamint egy nukleinsav-polimeráz alkalmazásával nukleinsav tesztminta amplifikálásához alkalmasak) csupán egy (nem kizárólagos) példájának tartjuk.

A szigorú feltételek” kifejezést azokra az esetekre alkalmazzuk, amikor (1) a mosáshoz kis ionerősséget és nagy hőmérsékletet alkalmazunk, pl. 50 ’C-on 0,015 M NaCl/0,0015

M nátrium-citrát/O,1 % SDS; vagy (2) hibridizáció során denaturálószert, pl. formamidot alkalmazunk, pl. 0,1 % szarvasmarha szérumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % polivinil-pirrolidon/50 mM nátrium-foszfát pufferben (pH = 6,5) 750 mM NaCl és 75 mM nátrium-citrát jelenlétében 42 ’C-on 50 V/V % formamidot alkalmazunk. Egy másik példa 50 %-os formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M nátrium-citrát), 50 mM nátrium-foszfát (pH - 6,8), 0,1 % nátrium-pirofoszfát, 5 x

Danehardt oldat, hangkezelt lazac sperma DNS (50 ug/ml), 0,1 % SDS és 10 % dextrán-szulfát alkalmazása 42 ’C-on, 0,2 X SSC és 0,1 % SDS elegyében 42 ’C-on végzett mosással.

- 68 A Sambrook és mtsi. által leírt (ld. fentebb) mérsékelten szigorú feltételek kifejezés a fentebb leírtakhoz képest kevésbé szigorú mosási és hibridizációs feltételek alkalmazását jelenti. A mérsékelten szigorú feltételek egyik példája 37 ’C-on egy éjszakás inkubálás 20 % formamid, 5 X SSC (150 mMNaCl, 15 mM trinátrium-citrát), 50 mM nátrium-foszfát (pH = 7,6), 5 X Denhardt oldat, 10 % dextrán-szulfát és 20 ul/ml denaturált lazac sperma DNS elegyében, melyet a filterek 1 X SSC-ben, kb. 37-50 ’C-on végzett mosása követ. A szakember számára nem okoz gondot a hőmérséklet, ionerősség, stb. más faktorokhoz (pl. a próba hosszúsága és hasonlók) való igazítása.

Az antitestek és immunglobulinok azonos szerkezeti tulajdonságokkal rendelkező glikoproteinek. Míg az antitestek egy specifikus antigénhez mutatnak kötési specifitást, az immunglobulinok közé antitestek és egyéb antitest-szerű molekulák tartoznak, melyek antigénspecifitással nem rendelkeznek. Az utóbbi típusba tartozó polipeptideket a nyirokrendszer alacsony szinten, a myelomák nagyobb mennyiségben termelik.

A természetes antitestek és immunglobulinok általában kb. 150 000 D molakulatömegű heterotetramer glikoproteinek, melyek két azonos könnyű (L) láncból és két azonos nehéz (H) láncból állnak. Az egyes könnyű láncok egy kovalens diszulfid kötései kapcsolódnak a nehéz lánchoz, míg a különböző immunglobulin izotípusok nehéz lánca között ····

- 69 a diszulfid kötések száma változó. A nehéz és könnyű láncok továbbá rendelkeznek periodikus elhelyezkedésű, láncok közötti diszulfid hidakkal is. Valamennyi nehéz lánc egyik végén variábilis doménnel (Vh) rendelkezik, melyet számos konstans dómén követ. A könnyű láncok egyik végükön variábilis domént (Vn), másik végükön konstans domént tartalmaznak; a könnyű lánc konstans dóménje a nehéz lánc első konstans doménjéhez, míg a könnyű lánc variábilis doménje a nehéz lánc variábilis doménjéhez illeszkedik. A könnyű és nehéz lánc variábilis doménje között bizonyos aminosavak határfelületet alkotnak (Clothia és mtsi., J. Mól. Bioi., 186. 651-663, 1985; Novotny és Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Q2, 4592-4596, 1985).

A variábilis kifejezés azt jelenti, hogy az antitestekben a variábilis domének bizonyos részei szekvenciájukban nagyon változékonyak, s funkciójuk az egyes antitestek adott antigénhez való kötődésében és specifitásában nyilvánul meg. A változékonyság azonban nem egyenletesen oszlik meg az antitestek variábilis doménjeiben. A változékonyság három szegmentre koncentrálódik, melyeket a könnyű lánc és a nehéz lánc variábilis doménjeiben egyaránt komplementer meghatározó régióknak (CDR) vagy hipervariábilis régióknak nevezünk. A variábilis domének legnagyobb mértékben konzervált részeit vázszerkezetnek (framework, FR) nevezzük.

A természetes nehéz és könnyű láncok variábilis doménjei egyaránt négy FR régióból állnak, melyek nagyobbrészt β-redős konfigurációt vesznek fel, és három, a β-redős struktúrához kapcsolódó (és néhány esetben annak részét képező) CDR-rel csatlakoznak egymáshoz. Az egyes láncokban a CDR-eket az FR régiók tartják egymás közelében, mely régiók (a másik lánc CDR régióival együtt) szerepet játszanak az antitestek antigénkötő helyének kialakításában (ld. Kábát és mtsi., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987). A konstans domének közvetlenül nem játszanak szerepet az antitest antigénhez való kötődésében, hanem különböző effektor funkciókat töltenek be, mint pl. az antitest részvétele az antitest-dependens celluláris toxicitásban.

A antitestek papainnel végzett emésztése két azonos antigénkötő fragmentet, ún. Fab fragmenteket eredményez, melyek külön antigénkötő hellyel rendelkeznek, valamint egy további Fc fragmentet, melynek neve könnyen kristályosodó tulajdonságát tükrözi. Az antitestek pepszines kezelése F(ab')2 fragmentet eredményez, amely két antigén-egyesítő hellyel rendelkezik, és képes az antigén keresztkötésére.

Fv az a minimális antitest-fragment, amely teljes antigén-felismerő és -kötőhelyet tartalmaz. Ez a régió egy nehéz és egy könnyű lánc variábilis doménből álló, nem kovalens kötésű dimer. Ebben a konfigurációban az egyes variábilis domének három CDR régiója kölcsönhatásban áll, miáltal a Vh-Vl dimer felületén egy antigénkötő helyet határoznak meg. A hat CDR régió együttesen biztosítja az antitest antigén-specifitását. Ennek ellenére, egyetlen

- 71 variábilis dómén (vagy az Fv fragment fele, amely három antigén-specifikus CDR-ből áll) is képes felismerni és megkötni az antigént, bár kisebb affinitással, mint a teljes kötőhely.

A Fab fragment a könnyű lánc konstans doménjét és a nehéz lánc első konstans doménjét (CH1) is magában foglalja. A Fab' fragmentek abban különböznek a Fab fragmentektől, hogy a nehéz láncú CH1 dómén C-terminálisán néhány aminosawal több található, köztük az antitest hinge (kapocs) régiójából származó egy vagy több cisztein is. A Fab'-SH azt jelöli, hogy a konstans domének cisztein-gyöke(i) szabad merkaptocsoporttal rendelkeznek. A F(ab')s antitest-fragmentek eredetileg Fab' fragment párokból állnak, melyeket cisztein kapocs (hinge) kapcsol össze. Az antitest-fragmentek egyéb kémiai kapcsolásai is ismertek.

A gerincesekből származó antitestek (immunglobulinok) könnyű láncai konstans doménjeik aminosav-szekvenciája alapján egyértelműen két külön típusba (kappa és lambda) sorolhatók.

Az immunglobulinok nehéz láncai konstans doménjeinek aminosav-szekvenciája alapján az immunglobulinok öt fő osztályba (IgA, IgD, IgE, IgG és IgM) sorolhatók, melyek közül több alosztályokra (izoítpusokra) bontható (pl.IgG-1, IgG-2, IgG-3 és IgG-4; IgA-1 és IgA-2). A különböző immunglobulin osztályoknak megfelelő nehéz lánc konstans ··. .··. ·^: · .· : · • . . · : . ····

·..· ........

doméneket alfa, delta, epszilon, gamma és mű doméneknek nevezzük. A különböző immunglobulin osztályokra jellemző alegység-szerkezetek és háromdimenziós konfigurációk jól ismertek.

Az antitest kifejezés tág értelemben a monoklonális antitestekre (agonista és antagonista antitestek), a pleiotrop specifitású antitest-készítményekre, valamint az antitest-fragmentekre [pl. Fab, F(ab')2 és Fv] vonatkozik, feltéve, hogy ezek a kívánt biológiai aktivitással rendelkeznek.

Az itt használt monoklonális antitest kifejezés lényegében homogén antitestek populációjából nyert antitestre vonatkozik, vagyis olyan antitestekre, amelyek (a természetben előforduló esetleges mutációktól eltekintve) azonosak. A monoklonális antitestek nagymértékben specifikusak, mivel egyetlen antigén tulajdonságú hely ellen irányulnak. Ezenkívül, a hagyományos (poliklonális) antitest-készítményekkel szemben — melyek rendszerint különböző determinánsok (epitópok) elleni antitestekből állnak — minden egyes monoklonális antitest az antigén egyetlen determinánsa ellen irányul. A monoklonális antitestek — specifitásuk mellett — azért is előnyösek, mert szintézisük az egyéb immunglobulinoktól mentes hibridoma tenyészetben történik. A monoklonális jelző az antitest jellegét jelzi, vagyis azt, hogy lényegében homogén antitest-populációból származik, s nem egy bizonyos antitest

- 73 • ·

.....

előállítási módszer eredménye. A találmányban alkalmazott monoklonális antitestek például az elsőként Kohler és Milstein által leírt hibridoma eljárással (Natúré, 256. 495, 1975), vagy rekombináns DNS technikákkal állíthatók elő (ld. pl. Cabilly és mtsi., 4,816,567 számú Amerikai Egyesült

Államok-beli szabadalom).

A monoklonális antitestek közé tartoznak a kimérikus antitestek (immunglobulinok), amelyekben a nehéz és/vagy könnyű lánc rész azonos vagy homológ egy bizonyos fajból származó vagy egy bizonyos antitest osztályba vagy alosztályba tartozó antitestek megfelelő szekvenciáival, míg a többi lánc másik fajból származó, vagy másik osztályba vagy alosztályba tartozó antitestek megfelelő szekvenciájával azonos vagy homológ. (Cabilly és mtsi., 4,816,567 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom; Morrison és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81. 6851-6855, 1984).

A nem humán (pl- egér) antitestek humanizált alakjai olyan kimérikus immunglobulinok, immunglobulin láncok vagy fragmentek (pl. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 vagy más antigénkötő szekvenciák), amelyek minimális nagyságú, nem humán eredetű immunglobulin szekvenciát tartalmaznak. A humanizált antitestek többnyire humán immunglobulinok (recipiens antitest), amelyekben a recipiens komplementer meghatározó régiójának (CDR) gyökeit nem emberből (hanem pl. egérből, patkányból vagy nyúlból) származó, kívánt specifitású,

- 74 • · • · ···· affinitású és kapacitású CDR (donor antitest) gyökeivel helyettesítjük. Néhány esetben a humán immunglobulinok Fv keret gyökeit megfelelő, nem humán eredetű gyökökkel helyettesítjük. A humanizált antitest tartalmazhat továbbá olyan gyököket, amelyek sem a recipiens antitestben, sem a behozott CRD vagy keret szekvenciákban nem találhatók.

Ezeket a módosításokat az antitest további finomítása és tökéletesítése érdekében végezzük. A humanizált antitest általában legalább egy, rendszerint két variábilis domént tartalmaz melyekben a CDR régiók egésze vagy lényegében egésze egy nem humán immunglobulin konszenzus szekvencia FR régióinak felel meg. A humanizált antitest optimális esetben egy immunblobulin (rendszerint humán immunglobulin) konstans régió (Fc) legalább egy részét tartalmazza. További részleteket illetően ld. Jones és mtsi., Natúré, 321. 522-525, 1986; Reichmann és mtsi., Natúré, 332. 323-329,

1988; és Presta, Curr. Op. Struct. Bioi., 2, 593-596, 1992).

Az emberben nem immunogén hatású kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptidet gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagban, gyógyászatilag hatásos mennyiségben egy ember megfelelő szövetével érintkezésbe hozva a polipeptid második beadása után (megfelelő lappangási idő, pl. 8-14 nap elteltével) a polipeptidre vonatkozó érzékenység vagy rezisztencia semmilyen jele nem detektálható.

A találmányban előnyben részesített polipeptidek lényegében homológ, mpl ligandum vagy trombopoietin (TPO) elnevezésű ···· polipeptidek, amelyek képesek az mpl-hez (a citokin receptor szupercsalád egy tagjához) kötődni, és azzal a biológiai sajátsággal rendelkeznek, hogy stimulálják a jelölt nukleotidok (pl. ³H-timidin) humán mpl P-vel transzfektált IL-3 dependens Ba/F3 sejtek DNS-ébe való beépülését. Az előnyösebb mpl ligandumok izolált emlős proteinek, amelyek vérképző, elsősorban megakariocitaképző vagy trombocitaképző aktivitással rendelkeznek, ami azt jelenti, hogy képesek az éretlen megakariociták vagy őssejtjeik érett, vérlemezke-termelő alak irányába mutató proliferációját, érését és/vagy differenciálódását serkenteni. A találmány szerinti legelőnyösebb polipeptidek a humán mpl ligandumok (beleértve fragmentjeiket is), amelyek vérképző, megakariocitaképző vagy trmbocitaképző aktivitással rendelkeznek. Adott esetben ezek a humán mpl ligandumok nem glikoziláltak. Egyéb előnyös humán mpl ligandum a hML EPO-doménje, melyet hMLxe3-nak vagy hTP0xs3-nak nevezünk; a hML rövidített változata (hML245 vagy hTP024s); és az 1.

ábrán bemutatott szekvenciával (1. sz. szekv.) rendelkező érett, teljes hosszúságú polipeptid, melyet hML-nek, hML332-nek vagy hTP0332-nek nevezünk, valamint biológiailag aktív szubsztitúciós változata [hML(R153A, R154A)].

Adott esetben előnyös, találmány szerinti polipeptidek az immunológiailag aktív mpl ligandum változatok, mint a hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML és pML2.

Adott esetben előnyös, találmány szerinti polipeptidek a biológiailag aktív mpl ligandum változatok, melyek aminosav-szekvenciája legalább 70 %-ban azonos a humán mpl ligandum aminosav-szekvenciájával (ld. 1. ábra [1. sz. szekv.]), az egér mpl ligandum aminosav-szekvenciájával (ld. 16. ábra [12. és 13. sz. szekv.]), a rekombináns sertés mpl ligandum aminosav-szekvenciájával (ld. 19. ábra [18. sz. szekv.]), illetve az apláziás sertés vérplazmából izolált sertés mpl ligandum aminosav-szekvenciájával. A szekvencia-azonosság előnyösebben legalább 75 %-os, még előnyösebben legalább 80 %-os, még előnyösebben legalább 85 %-os, még előnyösebben legalább 90 %, és legelőnyösebben legalább 95 %-os.

Az apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandum az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

(1) a részlegesen tisztított ligandum PBS-sel, 0,1 % SDS-t tartalmazó PBS-sel vagy 4 M MgClz-t tartalmazó PBS-sel eluált oszlopról 60000-70000 D molekulatömegű frakcióként eluálódik;

(2) a ligandum aktivitását a pronáz megszünteti;

(3) a ligandum alacsony pH-ig (2,5), 0,1 %-os SDS- és 2M karbamid-koncentrációig stabil;

(4) a ligandum — különböző lektin oszlopokhoz mutatott kötődése alapján — egy glikoprotein;

(5) a nagymértékben tisztított ligandum redukálatlan SDS-PAGE oszlopról 25000-35000 D molekulatömegű frakcióként eluálódik (kisebb mennyiségű aktivitás kb. 18000-22000 D és

60000 D molekulatömegnél is eluálódik);

(6) a nagymértékben tisztított ligandum redukált

SDS-PAGE gélen 28000 D és 31000 D molekulatömegű sávokra válik szét.

(7) a 18000-22000 D-os, 28000 D-os és 31000 D-os sávok

N-terminális szekvenciája azonos: SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (29. sz. szekv. );

(8) a ligandum kötődik az alábbi affinitás! oszlopohoz, és eluálható róluk:

Blue-Sepharose CM Blue-Sepharose

MONO-Q

MONO-S

Lencse lektin Sepharose

WGA Sepharose Con A Sepharose

Éter 650m Toyopearl Butil 650m Toyopearl Fenil 650m Toyopearl Fenil-Sepharose.

ELőnyösebb mpl ligandumok azok a humán genomiális vagy cDNS által kódolt polipeptidek, amelyek az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkeznek (1. sz. szekv.).

A találmány szerinti egyéb előnyös, természetben előforduló, biológiailag aktív mpl ligandum polipeptidek közé tartozik a pre-pro-mpl ligandum, pvo-mpl ligandum, érett mpl ligandum, mpl ligandum fragmentek és ezek glikozilálási változatai.

A találmány szerinti további előnyös polipeptidek közé tartoznak az mpl ligandum szekvencia változatok és a kimérák. Az előnyös mpl ligandum szekvencia-változatok és kimérák rendszerint olyan biológiailag aktív mpl ligandum • · változatok, amelyek aminosav-szekvenciája legalább 70 %-ban azonos a humán mpl ligandum vagy az apláziás sertés vérplazmából izolál mpl ligandum aminosav-szekvenciájával;

ez a szekvencia-azonosság előnyösebben legalább 75 %-os, még előnyösebben legalább 80 %-os, még előnyösebben legalább 85 %-os, még előnyösebben legalább 90 %, és legelőnyösebben legalább 95 %-os. Egy példaként szolgáló, előnyös mpl ligandum változat az N-terminális dómén hML változat, amelyet az eritropoietin szekvenciájával mutatott azonossága miatt EPO-doménnek nevezünk. Az előnyös hML EPO-domén az érett hML első kb. 153 aminosavából áll (hMLi53). Egy másik előnyös hML szekvencia-változatban a C-terminális dómén egy vagy több bázikus vagy kétszeresen bázikus aminosav-gyökét nem bázikus aminosav-gyök (pl. hidrofób, semleges, savas, aromás, Gly, Pro és hasonlók) helyettesíti. Az egyik előnyös hML C-terminális dómén szekvencia-változatban a 153. és 154.

arginint alanin gyökök helyettesítik. E változat elnevezése hML332(R153A, R153A). Egy másik előnyös hML változat hML332-ből vagy hMLie3-ból áll, melyekben a 111-114. aminosav-gyökök (QLPP vagy LPPQ) deléció folytán hiányoznak, és helyükön egy másik tetrapeptid szekvencia áll (pl. AGAG vagy hasonló). A említett deléciós mutánsok elnevezése 44hML332, illetve Z4hMLie3.

····

- 79 Egy előnyös kiméra az mpl ligandum vagy (alább meghatározott) fragmentje és egy heterológ polipeptid vagy fragmentje közötti fúzió. Például, a hMLi53 a vérszérumban mutatptt felezési idejének fokozása érdekében egy IgG fragmenthez fúzionálható, vagy fokozott trombopoézises vagy kimérikus vérképzési aktivitással rendelkező molekula kialakítása érdekében IL-3-hoz, G-CSF-hez vagy EPO-hoz kapcsolható.

Egy másik előnyös humán mpl ligandum kiméra az ML-EPO dómén kiméra, amely a hML N-terminálisának 153-157. gyökeit tartalmazza, melyek a humán EPO egy vagy több (de nem mindegyik) gyökével szubsztituáltak (10. ábra; 7. sz. szekv.). Ebben a megvalósítási módban a hML kiméra kb. 153-166 aminosav hosszúságú lehet, melyben a humán EPO-ból származó, különálló aminosavak vagy aminosav csoportok találhatók (addíció vagy szubsztitúció következtében) a 10. ábrán bemutatott egymás alá rendezésnek (alignment) megfelelő helyeken (6. sz. szekv.). A hML N-terminális részébe inszertált blokk szekvenciák példái közé tartozik az

EPO 24-27., 38-40. és 83-85. aminosavainál lévő N-glikozilálási helyek; az EPO 9-22., 59-76. 90-107. és 132-152. aminosavainál elhelyezkedő megjósolt amfipatikus alfa-helikális kötegek; valamint egyéb, nagymértékben konzervált régiók, beleértve az N-terminális és C-terminális régiókat és az EPO 44-52. aminosavaiból álló szakaszt (ld. pl. Wen és mtsi., Blood, S2, 1507-1516, 1983; Boissel és mtsi., J. Bioi. Chem., 268(21). 15983-15993, 1993). Úgy véljük, hogy az ML-EPO dómén kiméra kevert trombopoézises-eritropoézises (TEPO) biológiai aktivitással rendelkezik.

A találmány szerinti egyéb előnyös polipeptidek közé tartoznak azok az mpl ligandum fragmentek, amelyek legalább 10, 15, 20, 25, 30 vagy 40 aminosavból álló folytonos szekvenciával rendelkeznek, melyek azonosak az apláziás sertés vérplazmából izolált mpl ligandum vagy az itt leírt humán mpl ligandum szekvenciájával (ld. pl. XIV. táblázat, 24. példa). Egy előnyös mpl ligandum fragment a humán MLC1-X], melyben X értéke (az 1-től X-ig terjedő gyökökből álló szekvenciára) 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 vagy

245 (ld. 1. ábra, 1. sz. szekv.). Az egyéb előnyös mpl ligandum fragmentek közé tartoznak a tisztított ligandum kémiai vagy enzimatikus hidrolízisével vagy emésztésével előállított fragmentek.

A találmány egy másik előnyös vonatkozása eljárás mpl ligandum molekulák tisztítására, melynek során az mpl ligandum molekulákat taralmazó mpl ligandum forrást rögzített receptor polipeptiddel (speciálisan mpí-lel vagy mpl vagy mpl fúziós polipeptiddel) hozzuk érintkezésbe, amihez olyan körülményeket alkalmazunk, hogy a tisztítani kívánt mpl ligandum molekulák szelektíven adszorbeálódjanak a rögzített receptor polipeptiden. A rögzített hordozót ezután — a nem adszorbeált anyagok eltávolítása érdekében — mossuk, és a tisztítani kívánt molekulákat eluáló pufferrel eluáljuk a rögzített receptor polipeptidről. Az mpl ligandumot tartalmazó forrás lehet vérplazma, amely esetben rögzített receptorként előnyösem mpl-lgG fúziós polipeptidet alkalmazunk.

Más módon, mpl ligandumot tartalmazó forrásként rekombináns sejttenyészetet alkalmazunk, s ilyenkor az mpl ligandum koncentrációja (akár a tenyésztő tápközegben, akár a sejtlizátumban) általában nagyobb, mint a vérplazmában vagy egyéb természetes forrásokban. Ebben az esetben a fentebb leírt mpl-lgG immunaffinitási módszer (bár továbbra is alkalmazható) rendszerint szükségtelen, s helyette jól ismert, hagyományos proteintisztítási eljárások alkalmazhatók. A lényegében homogén mpl ligandum előállításához alkalmas, előnyös tisztítási eljárás az alábbi lépésekből áll: centrifugálással vagy ultrafiltrálással eltávolítjuk a szemcsés törmeléket (gazdasejtek vagy lizált fragmentek); adott esetben a proteint szokványos protein-koncentráló filterrel bekoncentráljuk; végül a ligandumot elválasztjuk az egyéb szennyezésektől, amihez az alábbi lépések közül egyet vagy többet alkalmazunk: immunaffinitás, ioncsere (pl. DEAE vagy karboxi-metil- vagy szulfo-propil-csoportokat tartalmazó anyagok), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lencse lektin Sepharose, WGA Sepharose, Con A Sepharose, Éter Toyopearl, Butil Toyopearl, Fenil Toyopearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, reverz fázisú HPLC (pl. alifás csoportokkal ellátott szilikagél), Sephadex molekulaszűrő, méretkizárásos kromatográfia és etanolos vagy ammónium-

• · ···· ··

- 82 -szulfátos kicsapás. A proteolízis megakadályozása érdekében a fenti lépések bármelyikében proteáz-inhibitort (pl. metil-szulfonil-fluoridot; PMSF) alkalmazhatunk.

affinitással, affinitással

Más előnyös megvalósítási módokban izolált antitestet bocsátunk rendelkezésre, amely képes az mpl ligandumhoz kötődni. Az előnyös izolált mpl ligandum antitestek monoklonális antitestek (Kohler és Milstein, Natúré, 256. 495-497, 1975; Campbell, Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular Biology, szerk.: Burdon és mtsi.,

13. kötet, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985;

Huse és mtsi., Science, 246. 1275-1281, 1989). Az előnyös izolált mpl ligandum antitest legalább kb. 10® 1/mól előnyösebben legalább kb. 10⁷ 1/mól kötődik az mpl ligandumhoz. Az antitest legelőnyösebben a fentebb leírt effektor funkciók közül eggyel vagy többel rendelkező mpl ligandum ellen irányul. Az mpl ligandumhoz kötődni képes, izolált antitest adott esetben egy másik polipeptidhez fúzionálódhat, és az antitest vagy fúziója az mpl ligandum (rögzített mpl polipeptid esetében fentebb leírt forrásból történő) izolálásához és tisztításához alkalmazható. E megvalósítási inód egy másik előnyös vonatkozásaként eljárást írunk le az mpl ligandum in vitro vagy in vivő detektálására, melynek során az antitestet olyan mintával hozzuk érintkezésbe, melyről feltételezzük, hogy tartalmazza a ligandumot (elsősorban vérszérum mintával), és detektáljuk a kötődés létrejöttét.

ligandumot

-molekulák

További előnyös megvalósítási módokban a találmány tárgya az mpl ligandumot vagy fragmentjeit kódoló izolált nukleinsav, amelyet detektálható jelölőanyaggal jelölhető; továbbá olyan nukleinsav-molekula, amely mpl ligandumot kódoló nukleinsavval komplementer, vagy szigorú vagy mérsékelten szigurú körülmények között hibridizálódik hozzá. Az előnyös mpl ligandum nukleinsav olyan RNS vagy DNS, amely a humán mpl ligandum aminosav-szekvenciájával legalább 75 %-os, előnyösen legalább 80 %-os, előnyösebben legalább 85 %-os, még előnyösebben legalább 90 %-os, legelőnyösebben legalább 95 %-os azonosságot mutató, biológiailag aktív mpl kódol. Az előnyösebb izolált nmukleinsava biológiailag aktív mpl ligandumot kódoló

DNS-szekvenciák, mint pl.(a) emlős mpl ligandum gén kódoló régióján alapuló DNS (pl. az 1. ábrán bemutatott nukleotid-szekvenciával rendelkező DNS [2. sz. szekv.] vagy fragmentjei); (b) legalább mérsékelten szigorú feltételek mellett az (a) pont szerinti DNS-sel hibridizálni képes DNS; és (c) olyan DNS, amely a genetikai kód degeneráltsága következtében az (a) vagy (b) pont szerinti DNS-hez képest degenerált. Az itt leírt új mpl ligandumok olyan ligandumok vagy citokinek családjába tartozhatnak, amelyek megfelelő szekvencia-azonossággal rendelkeznek ahhoz, hogy DNS-ük az 1. ábrán bemutatott DNS-hez (2. sz. szekv.) (vagy komplementer szálához vagy fragmentjeihez) kevéssé vagy mérsékelten szigorú feltételek mellett hibridizálódhasson.

Ennek megfelelően, a találmány további tárgya olyan DNS, amely kismértékben vagy mérsékelten szigorú feltételek • · ··»·

mellett az mpl ligandum polipeptideket kódoló DNS-sel hibridizálódik.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a nukleinsav-molekula egy mpl ligandumot kódoló cDNS, és magában foglal egy replikálható vektort is, amelyben a cDNS a vektorral transzformált gazda által felismert szabályozó szekvenciákhoz működőképesen kapcsolt. E tárgyhoz tartoznak a vektorral transzformált gazdasejtek, valamint a cDNS mpl ligandum termelésének elősegítésében való alkalmazása, melynek során az mpl ligandumot kódoló cDNS-t a transzformált sejtek tenyészetében expresszáljuk, és a gazdasejt-tenyészetből kinyerjük az mpl ligandumot. Az e módszerrel előállított mpl ligandum előnyösen lényegében homogén humán mpl ligandum. Az mpl ligandum termeléséhez előnyös gazdasejt a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejt.

A találmány további tárgya eljárás immunológiai vagy vérképzési betegségben (különösen trombocitopéniában) szenvedő emlős kezelésére, melynek során az emlősnek egy mpl ligandum gyógyászatilag hatásos mennyiségét adjuk be. Az mpl ligandumot adott esetben egy citokinnel, elsősorban kolónia-stimuláló faktorral vagy interleukinnel együtt adagoljuk. Az előnyös kolónia-stimuláló faktorok, illetve interleukinek közé tartozik a kit-ligandum, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 vagy

IL-11.

• · · · ·

- 85 Előállítási eljárások

A vérlemezketermelődésről néhány szerző sokáig azt gondolta, hogy több sejtvonalra kiterjedő, specifikus humorális faktorok szabályozzák. Feltételezték, hogy a megakariocitaképződést és a trombocitaképződést két különböző citokin, a megakariocita kolónia-stimuláló faktor (meg-CSF) és a trombopoietin szabályozza (Williams és mtsi., J. Cell Physiol., 11£), 101-104, 1982; Williams és mtsi., Blood Cells, 1£, 123-133, 1989; és Gordon és mtsi., Blood, 80. 302-307, 1992). E feltételezés szerint a meg-CSF a megakariocita őssejtek proliferációját stimulálja, míg a trombopoietin elsősorban a differenciáltabb sejtek érését, és végső soron a vérlemezkék felszabadulását befolyásolja. Az 1960-as évek óta több cikk jelent meg a meg-CSF és a trombopoietin állatok és emberek vérplazmájában, vérszérumában és vizeletében (a trombocitopéniás időszakot követően) történő indukciójáról és megjelenéséről (Odell és mtsi., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 108. 428-431, 1961;

Nakeeff és mtsi., Acta Haematol., £4, 340-344, 1975;

Specter, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 108. 146-149, 1961;

Schreniner és mtsi., J. Clin. Invest., 4S, 1709-1713, 1970; Ebbe, Blood, 44, 605-608, 1974; Hoffman és mtsi., N. Engl. J. Med., 305. 533, 1981; Straneva és mtsi., Exp. Hematol.,

17. 1122-1127, 1988; Mazur és mtsi., Exp. Hematol., 13.

1164, 1985; Mazur és mtsi., J. Clin. Invest., 68. 733-741, 1981; Sheiner és mtsi., Blood, ££, 183-188, 1980; Hill és msi., Exp. Hematol., 2Ώ., 354-360, 1992; és Hegyi és mtsi., ···· *··* ··· ····

- 86 Int. J. Cell Cloning, fi, 236-244, 1990). Leírták, hogy ezek az aktivitások sejtvonal-specifikusak, és különböznek az ismert citokinektől (Hill, R.J. és mtsi., Blood, 80. 346, 1992; Erickson-Miller, C.L. és mtsi., Brit. J. Haematol., fii, 197-203, 1993; Straneva, J.E. és mtsi., Exp. Hematol.,

20. 4750, 1992; és Tsukada J. és mtsi., Blood, fii, 866-867,

1993). A meg-CSF és a trombopoetin trombocitopéniás vérplazmából vagy vizeletből történő tisztítására irányuló kísérletek mindezidáig sikertelenek voltak.

A trombocitopéniás vérplazmát leíró fenti megfigyelésekkel összhangban, azt találtuk, hogy a besugárzott sertésekből nyert apláziás sertés vérplazma (APP; aplastic porcine plasma) in vitro stimulálja a humán megakariocitaképződést. Felfedeztük, hogy ezt a serkentő hatást a c-mpl oldékony extracelluláris doménje megszünteti, ami azt bizonyítja, hogy az APP a feltételezett mpl ligandum (ML) potenciális forrása. Az APP-ből sikerült mpl ligandumot tisztítani, és az aminosav-szekvenciáról kapott információkat egér, sertés és humán ML cDNS izolálásához használtuk fel. Ezek az mpl ligandumok homológok az eritropoietin szekvenciájával, és egyaránt rendelkeznek meg-CSF és trombopoietin-szerű aktivitással.

(1) Az mpl ligandum tisztítása és azonosítása vérplazmából

Amint fentebb említettük, beszámoltak arról, hogy a különböző fajokból származó apláziás vérplazma olyan aktivitásokat tartalmaz, amelyek in vitro serkentik a vérképződést, miközben korábban nem írtak le vérplazmából izolált vérképzési serkentő faktort. Az apláziás vérplazma egyik forrása a sugárkezelt sertésekből nyert vér. Az apláziás sertés vérplazma (APP) in vitro serkenti a humán vérképződést. Annak meghatározása érdekében, hogy az APP tartalmaz-e mpl ligandumot, a 2. ábrán bemutatott eljárással azt vizsgáltuk, hogy az APP serkenti-e a ³H-timidin humán mpl P-vel transzfektált Ba/'F3 sejtekbe (Ba/F3-z??p2) történő beépülését. Az APP serkentette a ³H-timidin humán Ba/F3-/np2 sejtekbe való beépülését, miközben a Ba/F3 kontroll sejtekbe (melyeket nem transzfektáltunk humán mpl P-vel) nem stimulálta a beépülést. Ezenkívül, normális sertés vérplazma esetében nem tapasztaltunk hasonló aktivitást. Ezek az eredmények azt bizonyították, hogy az APP olyan faktort vagy faktorokat tartalmazott, amely(ek) az mpl receptoron keresztül proliferatív jelet transzdukált(ak), s így ez(ek) e receptor természetes ligandumai lehet(nek). Ezt alátámasztotta az a felfedezés is, hogy az APP oldható mpl-IgG-vel végzett kezelése blokkolta az APP Ba/F3-znp2 sejtekre gyakorolt serkentő hatását.

Az APP-ben található aktivitás proteinnek bizonyult, mivel a pronáz, DTT és a hő megszünteti az APP.aktivitását (3.

ábra). Az aktivitás nem volt dializálható, azonban alacsony pH-ig stabil volt (pH - 2,5, két órán keresztül), s több lektin affinitási oszlophoz kötődött, melyekről eluálható volt, ami azt jelzi, hogy glikorpoteinről van szó. Az • ·

- 88 aktivitás szerkezetének további értékeléséhez és azonosításához mpl-IgG kiméra alkalmazásával APP-ből affinitás-tisztítottuk.

Az APP-t az 1. és 2. példában leírt eljárás szerint kezeltük. Eszerint, az mpl ligandumot hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával kromatográf iával tisztítottuk.

4. ábrán, a (HIC), rögzített festékanyag és mpl affinitás! kromatográfiával

Az egyes lépéseknél az aktivitás kinyerését a tisztítás mértékét pedig az I. táblázatban mutatjuk be. Az aktivitás mpl affinitási oszlopról való teljes kinyerése kb. 10 %-os volt. Az mpl affinitási oszlopról származó csúcs aktivitási frakció (F6) becsült specifikus aktivitása 9,8 x 10⁶ egység/mg volt. 5 liter APPből a teljes tisztítás hozzávatőleg 4 x 10⁶-szeres volt (0,8 egység/mg-ról 3,3 x 10® egység/mg-ra, miközben a proteinmennyiség 83 x 10⁶-szeres csökkenése következett be (250 g-ról 3 ug-ra). Az mpl affinitási oszlopról eluált ligandum specifikus aktivitását kb. 3 x 10⁶ egység/mg-ra becsültük.

I. TÁBLÁZAT

Az api ligandum tisztítása

Minta	V (ml)	Protein (mg/ml)	Egység/ ml	Egység	Specifikus aktivitás (egység/ml)	Hozam (%)	Tisztítás mértéke (x-szeres
APP	5000	50	40	200000	0,8	-	1
Fenil	4700	0,8	40	200000	50	94	62
Blue-	640	0,93	400	256000	430	128	538
Seph.
api ( ul) 12	5 x 10“	4 1666	20000	3300000	10	4100000

(5-7. frakció)

A protein meghatározásához a Bradford módszert alkalmaztuk. Az mpl-eluált 5-7. frakciók protein-koncentrációját az ezüst festésű SDS gél festődési intenzitása alapján becsültük meg. Egy egység definíció szerint az a mennyiség, amely a Ba/F3-mpl sejtproliferáció 50 %-os.maximális stimulálását eredményezi.

Az api affinitási oszlopról eluált frakciók SDS-PAGE analízisét (4-20 %, Novex gél) redukáló feltételek mellett végeztük, s több protein jelenlétét mutattuk ki (5. ábra). Az ezüsttel legnagyobb intenzitással festődött proteinek

66000 D, 55000 D, 30000 D, 28000 D és 18000-20000 D látszólagos molekulatömegű sávokra bontódtak. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, e proteinek közül melyik stimulálja a B&/B3-mpl sejttenyészetek proliferációját, a proteineket a 2. példában leírtak szerint eluáltuk a gélről.

E kísérlet eredményei azt mutatták, hogy az aktivitás zöme arról a gélszeletről eluálődott, amely a 28000-32000 D molekulatömegű proteineket tartalmazta, miközben kisebb aktivitás a gél 18000-22000 D-os régiójáról is eluálődott (6. ábra). E régiókban az egyedüli látható proteinek molekulatömege 30000 D, 28000 D és 18000-22000 D volt. A gél 30 kD-os, 28 kD-os és 18-22 kD-os sávjaiban lévő proteinek azonosítása és aminosav-szekvenciájuk meghatározása érdekében ezt a három proteint a 3. példában leírtak szerint PVDF membránra elektroblottoltuk és szekvenáltuk. A kapott N-terminális szekvenciákat a II. táblázatban mutatjuk be.

II. TÁBLÁZAT mpl ligandum N-terminális szekvenciák kD

1 5	10 15	20	25
(S)PAPP	A(C)DPR LLNKL	LRDD(H/S)	VLH(G)R L	(30.	sz. szekv.)
28 kD
1 5	10 15	20	25
(S)PAPP	AXDPR LLNKL LRDD(H) VLH(G)R	(31.	sz. szekv.)
18-22 kD
1 5	10

XPAPP AXDPR LX(N)(K) (32. sz. szekv.)

• · ·

- 91 Számítógépes analízissel kimuttuk, hogy ezek az aminosav-szekvenciák újak. Mivel mind a három szekvencia azonos volt, úgy véltük, hogy a 30 kD-os, 28 kD-os és 18-22 kD-os protein egymással rokon, s valószínűleg ugyanazon új protein különböző alakjait képviselik. Ez(ek) a protein(ek) a természetes mpl ligandum lehetséges jelöltjeii), mivel az SDS-PAGE analízis során az aktivitás a 4-20 %-os gélen azonos régióban (28-32 kD) bontódott fel. A részlegesen tisztított ligandum Superose 12 (Pharmacia) oszlopon gélfiltrációs kromatográfiával 17-30 kD-nak megfelelő sebességgel vándorolt. Ogy tartjuk, hogy a ligandum különböző molekulatömegű alakjai proteolízises vagy glikozilálási különbségek, vagy egyéb poszt- vagy pretranszlációs módosítások eredményei.

Amint azt korábban említettük, az antiszensz humán mpl RNS CD34+ őssejtekkel dúsított humán csontvelő tenyészetekben megszüntette a megakariocitaképződést, anélkül, hogy az egyéb vérképzési sejtvonalak differenciálódását befolyásolta volna (Methia és mtsi., ld. fentebb). Ez az eredmény azt sugallja, hogy az mpl receptor szerepet játszhat a megakariociták in vitro differenciálódásában és proliferációjában. Az mpl ligandum megakariocitaképződésben betöltött szerepének további értékelése céljából összehasonlítottuk az APP és az mpl ligandum nélküli APP in vitro humán megakariocitaképződésre gyakorolt hatását. Az APP humán megakariocitaképződésre gyakorolt hatását a 4. példában leírt folyadékszuszpenziós megakariocita92 ·· · • · · • ·

-képződési vizsgálat módosításával határoztuk meg. E vizsgálat során humán perifériás stem-sejteket (PSC) APP-vel és mpl-IgG affinitás-kromatográfiás kezelésnek alávetett APP-vel kezeltünk. A megakariocitaképződés GPIItlIIa stimulációját ^12BI-anti-IIt>III& antitesttel értékeltük (7. ábra). Amint a 7. ábrán látható, a 10 %-os APP hozzávetőleg

3-szoros stimulációt eredményezett, míg az mpl ligandum nélküli APP hatástalan volt. Lényeges, hogy az mpl ligandum nélküli APP nem indukálta a Ba/F3-űip-Z sejtek proliferációját.

Egy másik kísérletben 10 % APP-t tartalmazó tenyészetekhez a 0., 2. és 4. napon adott oldható humán znpl-IgG semlegesítette az APP humán megakariocitaképződésre gyakorolt hatását (8. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az mpl ligandum szerepet játszik a humán megakariocitaképződés szabályozásában, s ezáltal hasznos lehet a trombocitopénia kezelésében.

(2) Az mpl ligandum molekuláris klónozása

A 30 kD-os, 28 kD-os és 18-22 kD-os proteinekből nyert N-terminális aminosav-szekvencia alapján (ld. II. táblázat) két degenerált oligonukleotid primer állományt terveztünk, melyeket PCR-ral genomiális sertés DNS amplifikálásához alkalmaztunk. Amennyiben az N-terminális aminosav-szekvenciát egyetlen exon kódolja, úgy a szabályos PCR terméknek 69 bp hosszúságúnak kell lennie. A PCR eredményeként ilyen méretű DNS-fragmentet kaptunk, és ezt pGEMT vektorba szubklónoztuk. A PCR oligonukleotid primerek szekvenciáit és a három kapott kiónt az 5. példában mutatjuk be. A PCR primerek között kódolt peptid aminosav-szekvenciája (PRLLNKLLR: 33. sz. szekv.) azonos volt a sertés ligandum N-terminális aminosav-szekvenálásával kapott szekvenciával (ld. fentebb a 28 kD-os és 30 kD-os sertés protein szekvenciájának 9-17. gyökeit).

Humán genomiális DNS könyvtár screeneléséhez a PCR fragment szekvenciáján alapuló szintetikus oligonukleotidot használtunk. A PCR fragment szekvenciája alapján egy 45-mert (pR45) terveztünk és szintetizáltunk. Ez az oligonukleotid az alábbi szekvenciával rendelkezett:

5'-GCC GTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG-3 (34. sz. szekv.).

Ezt a dezoxioligonukleotidot enyhén szigorú hibridizációs és mosási feltételek mellett, lambda-geml2-ben humán genomiális DNS könyvtár screeneléséhez alkalmaztuk (ld. 6. példa). A pozitív kiónokat kivettük, a plakk eljárással tisztítottuk és restrikciós térképezéssel, valamint Southern biot analízissel vizsgáltuk. A 45-merhez hiibridisáló 390 bp-os EcoRI-Xbal fragmentet pBluescript SK~ vektorba szubklónoztuk. E klón DNS-szekvenálása igazolta, hogy a sertés mpl ligandum humán homológját kódol DNS-t izoláltuk.

A humán DNS-szekvencia és leszármaztatott aminosav-szekvenciája a 9. ábrán látható (3. és 4. sz. szekv.). A szekvenciában nyilakkal jelöltük az intronok megjósolt helyeit, amelyek egy feltételezett exont (exon 3) határoznak meg.

A humán exon 3 szekvencia (6. példa) alapján az exon szekvenciája 3' és 5' végének megfelelő oligonukleotidokat szintetizáltunk. Ezt a két prímért PCR reakciókban alkalmaztuk, melyekben templátként különböző humán szövetekből készített cDNS-t használtunk. A pontos PCR termék várt mérete 140 bp volt. A PCR termékek 12 %-os poliakril-amid gélen végzett analízise után a felnőtt emberi veséből, 293-as magzati sejtekből, valamint humán magzati májból készített cDNS könyvtárakban a várt méretű DNS-fragmentet detektáltuk.

A lambda DR2-ben ezután a humán genomiális könyvtár és a magzati máj cDNS könyvtár screeneléséhez alkalmazott 45-merrel, enyhén szigorú feltételek mellett magzati máj cDNS-könyvtárat (7xlO^e klón) screeneltünk. A pozitív kiónokat kivettük, a plakk eljárással tisztítottuk, és az inszert méretét PCR-ral meghatároztuk. A további analízishez egy 1,8 kb-os inszertet tartalmazó kiónt választottunk ki. A

7. példában leírt eljárás alkalmazásával megkaptuk a humán mpl ligandum (hML) nukleotid-szekvenciáját és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát, melyeket az 1. ábrán mutatunk be (1. és 2. sz. szekv.).

(3) A humán mpl ligandum (hML) szerkezete

A humán mpl ligandum (hML) cDNS-szekvencia (1. ábra; 2. sz. szekv.) 1774 nukleotidból áll, melyet poli(A) farok követ. A szekvencia 215 nukleotidból álló 5' transzlálatlan régiót és 498 nukleotidból álló 3' transzlálatlan régiót tartalmaz. A

216-218. nukleotidoknál lévő feltételezett iniciációs kodon az eukarióta transzláciő-iniciáció szempontjából kedvező konszenzus szekvencián belül helyezkedik el. A nyitott leolvasási keret 1059 nukleotid hosszúságú, és a 220. nukleotidtól kezdődően 353 aminosavas polipeptidet kódol. A leszármaztatott aminosav-szekvencia N-terminálisa igen hidrofób, és valószínűleg egy szignál peptidnek felel meg. A leszármaztatott aminosav-szekvencia számítógépes analízise (von Heijne és mtsi., Eur. J. Biochem., 133. 17-21, 1983) a

21. és 22. aminosav között egy potenciális szignál peptidáz hasítási helyet mutat. Az e pontnál végzett hasítás 332 aminosavas érett polipeptidet eredményez, amely a sertés vérplazmából tisztított mpl ligandumból kapott N-terminális szekvenciával kezdődik. A 332 aminosavas ligandum glikozilálatlan molekulatömege körülbelül 38 kD. Az aminosav-szekvencia hat potenciális N-glikozilálási helyet és négy cisztein-gyököt tartalmaz.

Az mpl ligandum szekvencia Genbank szekvencia adatbázissal való összehasonlítása az érett humán mpl ligandum és a humán eritropoietin 153 aminosavas N-terminálisa között 23 %-os azonosságot mutatott ki (10. ábra; 6. és 7. sz.

• · • ♦ · ♦ ··· szekv.). Ha figyelembe vesszük a konzervatív szubsztitúciókat, a hML e régiója 50 %-os hasonlóságot mutat a humán eritropoietinnel (hEPO). A hEPO és a hML egyaránt négy ciszteint tartalmaz. A négy cisztein közül három (köztük az első és az utolsó) konzervált a hML-ben. Helyre irányuló mutagenezis kísérletekkel kimutatták, hogy az eritropoietin első és utolsó cisztein-gyöke diszulfidkötést hoz létre, amely nélkülözhetetlen a működéshez (Wang, F.F. és mtsi., Endocrinology, 116. 2286-2292, 1983). A hML első és utolsó cisztein-gyöke szintén kulcsfontosságú diszulfidkötést alakít ki. A hML-ben a glikozilálási helyek egyike sem konzervált. Valamennyi potenciális N-glikozilálási hely a hML polipeptid C-terminális felében található.

A hEPO-hoz hasonlóan a hML mRNS nem tartalmaz sem AAUAAA konszenzus poliadenilációs szekvenciát, sem AUUUA regulátor elemet, amely sok citokin 3' transzlálatlan régiójában megtalálható, és úgy vélik, befolyásolja az mRNS stabilitását (Shawer és mtsi., Cell, 46. 659-667, 1986). Northern biot analízissel magzati és felnőtt májban egyaránt egy 1,8 kb-os hML RNS transzkriptum alacsony szintje mutatható ki. Hosszú expozíció után felnőtt vesében azonos méretű, gyengébb sáv detektálható. összehasonlításul, a humán eritropoietin magzati májban, és (hypoxia hatására) felnőtt vesében és májban expresszálódik (Jacobs és mtsi., Natúré, 313. 804-809, 1935; és Bondurant és mt3i., Molec. Cell. Bioi., fi, 2731-2733, 1986).

• · • · · ···· ·* ··· ····

- 97 A hML C-terminális régiójának jelentősége továbbra is értelmezésre szorul. A hat potenciális N-glikozilálási hely jelenléte és a ligandum lektin-affinitási oszlopokhoz mutatott kötődési képessége alapján a hML e régiója valószínűleg glikozilált. Néhány gél-elúciós kísérletben kb. 60000 D molekulatömegű aktivitást észleltünk, amely valószínűleg a teljes hosszúságú glikozilált molekulát reprezentálja. Ilyenformán, a C-terminális régió funkciója a keringésben lévő hML stabilizálása és felezési idejének fokozása. Az eritropoietin esetében a glikozilálatlan alak teljes in vitro biológiai aktivitással rendelkezik, miközben vérplazmában tapasztalható felezési ideje a glikozilált eritropoietinéhez képest lényegesen kisebb (Takeuchi és mtsi., J. Bioi. Chem., 265. 12127-12130, 1990; Narhi és mtsi., J. Bioi. Chem., 266. 23022-23026, 1991; és Spivack és mtsi., Blood, 1, 90-99, 1989). A hML C-terminális doménje két kétbázisú aminosav-motívumot tartalmaz (a 153-154. és a

245-246. Arg-Arg motívum), emlyek potenciális Processing helyként szolgálhatnak. Az e helyeken bekövetkező hasítás lehet felelős az ML APP-ből izolált 30 kD-os, 28 kD-os és

18-22 kD-os alakjainak kialakulásáért. Lényeges, hogy az Argie3-Argi54 motívum közvetlenül az ML eritropoietin-szerű doménje után található. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy teljes hosszúságú ML egy prekurzor proteint képviselhet, amely korlátozott mértékű proteolízisen átesve az érett ligandumot hozza létre.

• ·

- 98 (4) A humán mpl ligandum izoalakjai és változatai

Felnőtt emberi májban PCR-ral a humán mpl ligandum izoalakjait vagy alternatív splicing-gal összeillesztett alakjait detektáltuk. Röviden; a hML kódoló szekvenciája végeinek és kiválasztott belső régióinak megfelelő primereket szintetizáltunk, és ezeket a primereket RT-PCR eljárásban felnőtt emberi máj RNS amplifikálásához alkalmaztuk (ld. 10. példa). A teljes hosszúságú alak (hML) mellett három másik alakot (hML2, hML3 és hML4) is észleltünk. A négy izoalak leszármaztatott, érett aminosav-szekvenciáját a 11. ábrán mutatjuk be (6., 8., 9. és 10. sz. szekv.). A hML3 a 700. helynél 116 nukleotidos delécióval rendelkezik, amely aminosav-deléciót és kereteltolódást (frameshift) eredményez. A cDNS így 265 aminosav hosszúságú érett polipeptidet kódol, amely a 139.

aminosavnál tér el a hML szekvenciától. A hML4 a 618.

nukleotidot követően 12 nukleotidos delécióval (amely egér és sertés szekvenciákban is megtalálható; ld. lentebb) és a hML3 116 bázispáros deléciójával egyaránt rendelkezik. Bár egy olyan kiónt sem izoláltunk, amely csak a 619. nukleotidot követő 12 bp-os delécióval rendelkezik, ez az alak (melyet hML2-nek neveztünk el) minden bizonnyal létezik, mivel ilyen izoalakot egérben és sertésben (ld.

lentebb), továbbá a hML4 116 nukleotidos deléciójával kapcsolatban is azonosítottak.

Előállítottuk a hML szubsztitúciós változatát (melyben a • · * · · kétbázisú Argi53-Argi54 helyettesíti), valamint a szekvenciát két alanin hML rövidített EPO-domén alakját, hogy meghatározzuk, vajon a teljes hosszúságú ML szükséges-e a biológiai aktivitás kifejtéséhez. Az ArgiB3-Argi54 kétbázisú szekvencia .szübsztitúciós változatát, melyet hML(R153A, R154A)-nak nevezünk, a 10. példában leírtak szerint PCR-ral állítottuk elő. Az EPO-domén rövidített alakot (hMLiB3) szintén PCR-rel készítettük, oly módon, hogy a 153. arginin-gyök után stop kodont építettünk be.

(5) Rekombináns humán mpl ligandum (rhML) expresszálása ideiglenesen transzfektált humán embrió vese (293-as) sej tekben

Annak igazolása érdekében, hogy a klónozott humán cDNS mpl ligandumot kódol, a ligandumot a pRK5-hML vagy pRK5-hMLis3 expressziós vektorok alkalmazásával, citomegalovírus közvetlen korai promoter kontrollja alatt 293-as emlőssejtekben expresszáltuk. Az átmenetileg transzfektált humán embrionális 293-as vesesejtekből származó felülúszóról kimutattuk, hogy stimulálja a ³H-timidin Ba/F3-znpl sejtekbe történő beépülését, az eredeti Ba/F3 sejtekbe azonban nem (12/A ábra). Az egyedül pRK vektorral transzfektált 293-as sejtekből származó tápközeg nem tartalmazta ezt az aktivitást. Ha a tápközeghez mpl-IgG-t adtunk, a stimuláció megszűnt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a klónozott cDNS funkcionális humán ML-t (hML) kódol.

100

Hogy meghatározzuk, vajon az ’ΈΡΟ-domén önmagában képes-e az mpl-hez kötődni, illetve azt aktiválni, a hML rövidített alakját, az rhMLie3-at 293-as sejtekben expresszáltuk. A transzfektált sejtekből származó felülúszókról kimutattuk, hogy hasonló aktivitással rendelkeznek, mint ami a teljes hosszúságú hML-t expresszáló sejtek felülúszójában található (12/A ábra), ami azt jelzi, hogy az ML C-terminális doménje nem szükséges a c-mpl kötődéséhez és aktiválásához.

(6) Az mpl ligandum serkenti a megakariocitaképződést és a trombocitaképződést

A teljes hosszúságú rhML és az rhML rövidített rhMLi53 alakjai egyaránt stimulálják az in vitro megakariocitaképződést (12/B ábra). Ezt a hatást más, külsőleg hozzáadott vérképzési növekedési faktorok hiányában figyeltük meg. Az IL-3 kivételével az ML volt az egyetlen tesztelt vérképzési faktor, amely rendelkezett ezzel az aktivitással. Vizsgálatunkban az IL-11, IL-6, IL-1, eritropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit-ligandum (KL), M-CSF, OSM és GM-CSF külön-külön tesztelve nem gyakorolt hatást a megakariocitaképződésre (adatokat nem mutatunk be). Ez az eredmény azt mutatja, hogy az ML rendelkezik megakariocita-stimuláló aktivitással, és szerepet játszik a megakariocitaképződés szabályozásában.

A trombocitopéniás állatok vérplazmájában jelenlevő trombopoézises aktivitásról kimutatták, hogy egér • · · · ·

101 rebound trombocitózis vizsgálatban serkenti a vérmelezkék termelődését (McDonald, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 14. 1006-1001, 1973; McDonald és mtsi., Scand J. Haematol., 16. 326-334, 1976). Ebben a modellben az egereket specifikus anti-vérlemezke szérummal akut módon trombocitopéniássá teszik, ami előre megjósolható rebound trombocitózist (magas trombocitaszám) eredményez. Az ilyen immuntrombocitémiás egerek érzékenyebbek az exogén trombopoietin-szerű aktivitásokra, mint a normális egerek (McDonald, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 14, 1006-1001, 1973), ugyanúgy, mint ahogy az ex-hipoxiás egerek érzékenyebbek az eritropoietinre, mint a normális egerek (McDonald és mtsi., J. Láb. Clin. Med., 77. 134-143, 1971). Hogy meghatározzuk, vajon az rML in vivő stimulálja-e a vérlemezketermelődést, a rebound trombocitózisos egereket részlegesen tisztított rhML-lel injektáltuk, majd meghatároztuk a vérlemezkeszámot és a ^3SS vérlemezkékbe történő beépülését. Az egerekbe injektált 64000, illetve 32000 egység rML jelentős mértékben fokozta a vérlemezketermelődést, amit a kezelt egerekben a vérlemezkeszám kb. 20 %-os növekedése (p = 0,0005, ill. p = 0,0001), valamint a ³⁵S vérlemezkékbe történő beépülésének kb. 40 %-os emelkedése (p - 0,003) bizonyított (a %-os változások a csak vivőanyaggal injektált egerekben megfigyelt értékekhez képest értendők) (12/C ábra). Az ilyen szintű stimuláció hasonló az e modellben IL-6 alkalmazásával megfigyelt szinthez (adatokat nem közlünk). A 16000 egység rML-lel végzett kezelés nem stimulálta jelentősen a vérlemezketermelődést. Ezek az eredményez azt jelzik, hogy • · · · • ·

- 102 az ML dózisfüggő módon stimulálja a termelődését, ezáltal trombopoetin-szerű rendelkezik.

vérlemezkék aktivitással

A 293-as sejteket a fentebb leírt egyéb hML izoalak konstrukciókkal is transzfektáltuk, és a felülúszókat a Ba/F3-/npl proliferációs vizsgálat alkalmazásával vizsgáltuk (ld. 13. ábra). A hML2 és hML3 nem mutatott detektálható aktivitást, miközben a hML(R153A, R154A) aktivitása hasonló volt.a hML és a hMLi53 aktivitásához, ami arra utal, hogy az az Argi53-Argi54 kétbázisú hely érése (Processing) az aktivitás szempontjából nem szükséges, de nem is káros.

(7) Megakariocitaképződés és az mpl ligandum

Feltételezték, hogy a megakariocitaképződés több celluláris szinten szabályozott (Williams és mtsi., J. CE11 Physiol., 11£), 101-104, 1982; Williams és mtsi., Blood Cells, 15.

123-133, 1989). Ez a feltevés azon a megfigyelésen alapul, hogy bizonyos vérképzési növekedési faktorok stimulálják a megakariocita őssejtek proliferációját, míg mások elsősorban az érést befolyásolják. Az általunk bemutatott eredmények azt sugallják, hogy az ML proliferációs és érési faktorként egyaránt működik. Többrétű bizonyítékok állnak rendelkezésre annak igazolására, hogy az ML serkenti a megakariocita őssejtek proliferációját. Először is, az APP in vitro serkenti a humán megakariociták proliferációját és érését, és ezt a stimulációt az zr/pl-IgG teljes mértékben gátolja (7.

·· · • · · • ·

Ζ·· *··’ ··· ····

- 103 és 8. ábra). Ezenkívül, az a tény, hogy a c-mpl antiszensz oligonukleotidok gátolják a megakariocita telepképződést (Methia és mtsi., Blood, 82, 1395-1401, 1993), és a c-mpl proliferatív jelet képes transzdukálni azokban a sejtekben, melyekbe transzfektálták (Skoda és mtsi., EMEO, 12. 2645-2653, 1993; Vigon és mtsi., Oncogene, 2, 2607-2615,

1993), szintén azt jelzi, hogy az ML serkenti a proliferációt. A c-mpl expresszié ja a megakariocita-differenciálódás valamennyi stádiumában (Methia és mtsi., ld. fentebb), valamint a rekombináns ML in vivő vérlemezketermelődést gyorsan serkentő képessége arra utal, hogy az ML az érési folyamatot is befolyásolja. A rekombináns ML hozzáférhetősége lehetővé teszi a megakariocitaképződésben és a trombopoézisben játszott szerepének, valamint más vérképzési sejtvonalakat befolyásoló képességének alapos értékelését.

(8) Humán mpl ligandum (TPO) gén izolálása

A TPO gén humán genomiális kiónjait humán genomiális könyvtár pR45 alkalmazásával, az mpl ligandumot kódoló humán cDNS 3' felének megfelelő fragmenttel lamda-Geml2-ben végzett screenelésével izoláltuk. Két átfedő, 35 kb-t átívelő lambda kiónt izoláltunk, és két átfedő, a teljes TPO gént tartalmazó fragmentet (BamHI és EcoRI) szubklónoztunk és szekvenáltunk (14/A, 14/B és 14/C ábra).

A humán gén struktúrája a genomiális DNS 7 kb-án belül hat

104 exonból épül fel. Az összes exon/intron kapcsolódás határa egybeesik az emlős génekre megállapított konszenzus modellel (Shapiro, M.B. és mtsi., Nucl. Acids Rés., Ifi, 7155, 1987). Az 1. és 2. exon 5' transzlálatlan szekvenciát, valamint a szignál peptid első négy aminosavát tartalmazza. A szekréciós jel többi részét és az érett protein 26 aminosavát a 3. exon kódolja. A teljes karboxil domént és 3' transzlálatlan szekvenciát, valamint az eritropoietin-szerű dómén kb. 50 aminosavát a 6. exon kódolja. A hML-2 (hTPO-2) szekvenciájában megfigyelt delécióba eső négy aminosavat a 6. exon 5' vége kódolja.

A humán genomiális DNS Southern biot módszerrel végzett vizsgálata azt jelezte, hogy a TPO génje egy kópiában van jelen. A gén kromoszomális elhelyezkedését fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) határoztuk meg; eszerint a gén a 3q27-28 kromoszóma régióban található.

(9) Δ TPO expresszálása és tisztítása 293-as sejtekből

A TPO 293-as sejtekből történő előállítását és tisztítását részletesen a 19. példában írjuk le. A TPO teljes nyitott leolvasási keretének megfelelő cDNS-t pRK5-hr?pl I alkalmazásával PCR reakcióval kaptuk. A PCR terméket tisztítottuk, és a pRKStkneo plazmid (amely egy pRK5-ből származó vektor, melyet úgy módosítottunk, hogy a timidin kináz promoter szabályozása alatt neomicin-rezisztencia gént expresszáljon) Clal és Xbal restrikciós helyei közé

····

- 105 klónoztuk, miáltal a pRK.5tkneo.0RF vektort kaptuk (amely a teljes nyitott leolvasási keretet kódolja).

Hasonló módon, de más PCR primerek alaklmazásával egy másik — az EPO homológ domént kódoló — vektort (pRK5-tkneoEP0-D) állítottunk elő.

Ezt a két kosntrukciót kalcium-foszfátos módszerrel humán embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk, majd neomicin-rezisztens kiónokat szelektáltunk, és a rezisztens kiónokat konfluens állapot eléréséig hagytuk növekedni. Kondicionált tápközegben az ML153 és ML332 fenti klónokból származó expresszióját a Ba/F3-mp2 proliferációs vizsgálattal értékeltük.

Az rhML332-t a 19. példában leírtak szerint tisztítottuk. Röviden; a 293-rhML332 kondicionált tápközeget

Blue—Sepharose (Pharmacia) oszlopra töltöttük, amit 2M karbamidot tartalmazó pufferrel mostunk. Az oszlopot 2M karbamidot és 1M NaCl-ot tartalmazó pufferrel eluáltuk, majd az eluált, egyesített frakciókat WGA-Sepharose oszlopra vittük, 10-szeres oszloptérfogatnyi (2M karbamidot és 1M

NaCl-ot) tartalmazó pufferrel mostuk, majd 0,5 M N-acetil-Dglükóz-amint tartalmazó, előzővel azonos pufferrel eluáltuk.

A WGA-Sepharose eluátumot C4-HPLC (Synchrom, Inc.) oszlopra töltöttük, és lépcsőzetes propanol gradienssel eluáltuk.

SDS-PAGE analízissel a tisztított 293-rhML332 széles sávként a gél 68-80 kD-os régiójában vándorol, (ld. 15. ábra).

• · • · · ···

106

Az rhMLi53 tisztítását szintén a 19. példában leírtak szerint végeztük. Röviden; a 293-rhMLie3 kondicionált tápközeget Blue-Sepharose oszlopon az rhML332 esetében leírtak szerint eluáltuk. A kapott eluátumot a fentebb leírtak szerint közvetlenül mpl affinitási oszlopra töltöttük. Az mpl affinitási oszlopról eluált rhMLi53-at C4-HPLC oszlopon (az rhML332-höz alkalmazott feltételek mellett) homogénné tisztítottuk. Az rhMLi53 SDS-PAGE elektroforézissel két nagy és két kis sávra válik szét, kb. 18-22 kD tartományban (ld. 15. ábra).

(10) Az egér mpl ligandum

PCR-ral a humán mpl ligandum kódoló régiójának megfelelő DNS-fragmentet kaptunk, melyet gélen tisztítottunk és ³²P-dATP és ³²P-dCTP jelenlétében jelöltünk. Est a próbát lambda-GT10-ben egér máj cDNS könyvtár 10⁶ kiónjának screeneléséhez alkalmaztuk. Egy 1443 bázispárt tartalmazó egér klónt (16. ábra; 12. és 13. sz. szekv.) izoláltunk és szekvenáltunk. A 138-141. helyen lévő, feltételezett kezdő kodon az eukarióta transzláció iniciációjához kedvező konszenzus szekvencián belül helyezkedett el (Kozák, M., J.

Cell. Bioi., 108. 229-241, 1989). Ez a szekvencia 1056 nukleotidból álló nyitott leolvasási keretet határoz meg, ami 352 aminosavas primer transzlációs terméket kódol. E nyitott leolvasási keret két végén 137 nukleotidos 5' és 247 nukleotidos 3' transzlálatlan szekvencia található. A 3' transzlálatlan régió után nincs poli(A) farok, ami arra • · ·· ····

- 107 utal, hogy a klón feltehetően nem teljes. A megjósolt aminosav-szekvencia N-terminálisa nagymértékben hidrofób, és valószínűleg egy szignál peptidet reprezentál. A számítógépes analízis (von Heijne, G. Eur. J. Biochem., 133.

17-21, 1983) a 21. és 22. aminosav-gyök között egy potenciális szignál peptidáz hasítási helyet jelzett. Az itt bekövetkező hasítás 331 aminosavas (35 kD) érett polipeptidet eredményes, melyet mML33i-nek (vagy az alábbiakban leírt okok miatt mML2-nek) neveztünk el. Ez a szekvencia négy ciszteint . (melyek mindegyike konzervált a humán szekvenciában), valamint hét potenciális

N-glikozilálási helyet tartalmaz (mely utóbbiak közül öt konzervált a humán szekvenciában). Hasonlóan a hML-hez, mind a hét potenciális N-glikozilálási hely a protein

C-terminális felében található.

A humán ML-lel összehasonlítva az egér ML-ek EPO-doménjeiben (mind a nukleotid-szekvenciában, mind a leszármaztatott aminosav-szekvenciában) számottevő azonosságot találtunk. Ha azonban a humán és egér ML-eket egymás alá rendeztük (alignment), látható volt, hogy az egér szekvencia a 111-114. gyököknél négy aminosavas delécióval rendelkezik, ami megfelel a humán cDNS (ld. fentebb) és a sertés cDNS (ld. lentebb) 618. nukleotidja után található 12 nukleotidos deléciónak. Ennek megfelelően, a lehetséges egér

ML izoalakok detektálása érdekében további kiónokat vizsgáltunk. Az egyik klón egy 335 aminosavas leszármaztatott szekvenciával rendelkező polipeptidet ·· ·· · I · · · · • · · • « · • · · · · · · ····

- 108 kódolt, mely tartalmazta a hiányzó LPLQ tetrapeptidet. Ezt az alakot tartjuk a teljes hosszúságú egér ML-nek, s mML-nek vagy mML33B-nek nevezzük. Az mML nukleotid-szekvenciáját és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a 17. ábrán mutatjuk be (14. és 15. sz. szekv.). A cDNS klón 1443 bázispárból áll, melyet poli(A) farok követ. A szekvencia 1068 bp-os nyitott leolvasási keretet tartalmaz, melyet 134 bp-os 5' és 241 bp-os 3' transzlálatlan szekvencia szegélyez. A feltételezett kezdő (iniciációs) kodon a 138-140. helyen található. A nyitott leolvasási keret 356 aminosavas leszármaztatott proteint kódol, melynek első 21 aminosava igen hidrofób, és valószínűleg szekréciós jelként funkcionál.

Izoláltunk és szekvenáltunk egy harmadik egér kiónt is, mely a hML3-nak megfelelő 116 nukleotidos deléciót tartalmazott, következésképpen, ezt az egér izoalakot mML3-nak neveztük el. A két izoalak leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a

18. ábrán hasonlítjuk össze (9. és 16. sz. szekv.).

A humán és egér ML aminosav-szekvenciája 72 %-os azonosságot mutat (19. ábra; 9. és 16. sz. szekv.), de ez a homológia nem egyenletesen oszlik meg. Az ún. EPO-domén régió (a humán ML 1-153., és az egér ML 1-149. aminosavai) nagyobb mértékben konzerváltak (86 %), mint a protein C-terminális régiója (62 %). Ez azt jelentheti, hogy a protein biológiai aktivitása szempontjából csak az EPO-domén fontos.

Érdekes, hogy a hML-ben található két kétbázisos motívum

109 közül csak a közvetlenül az EPO-domén után lévő kétbázisos motívum (153-154. hely) van jelen az egér szekvenciában. Ez összhangban áll azzal a lehetőséggel, hogy a teljes hosszúságú ML egy prekurzor protein, amely korlátozott mértékű proteolízisen átesve az érett ligandummá alakul. Más lehetőség szerint a 153. és 154. arginin közötti proteolízis elősegítheti a hML clearance-ét.

Az 1. példában leírtak szerint az mML teljes kódoló szekvenciáját tartalmazó expressziós vektort ideiglenesen 293-as sejtekbe transzfektáltuk. Az e sejtekből származó kondicionált tápközeg serkentette a ³H-timidin egér vagy humán mpl-t expresszáló Ba/F3 sejtekbe történő beépülését, de hatástalan volt az eredeti mpl-t nem tartalmazó sejtvonalra. Ez azt jelzi, hogy a klónozott egér ML cDNS olyan funkcionális ligandumot kódol, amely egyaránt képes az egér és humán ML receptort (mpl) aktiválni.

(11) A sertés mpl ligandum

A sertés ML-t (pML) a 13. példában leírtak szerint RACE PCR-ral izoláltuk. Sertés vesében egy 1342 bp-os PCR cDNS terméket találtunk, melyet szubklónoztunk. Több kiónt szekvenáltunk, és ezekről megállapítottuk, hogy 332 aminosavas sertés mpl ligandumot (pML vagy PML332) kódolnak, melynek nukleotid-szekvenciáját és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a 20. ábrán mutatjuk be (18. és 19. sz.

szekv.).

110

Ebben az esetben is azonosítottunk egy második alakot (pML2), amely négy aminosavas delécióval rendelkező, 228 aminosavas proteint kódol (ld. 21. ábra; 21. sz. szekv.). A pML és pML2 aminosav-szekvenciák összehasonlítása azt mutatja, hogy a két szekvencia azonos, azzal a különbséggel, hogy az utóbbiból deléció folytán hiányzik a 111-114. helyeknek megfelelő QLPP tetrapeptid (ld. 22. ábra; 18. és 21. sz. szekv.). Az egér és sertés ML cDNS-ben megfigyelt négy aminosavas deléció a leszármaztatott proteinekben pontosan ugyanazon a helyen található.

A humán, egér és sertés érett ML leszármaztatott aminosav-szekvenciája (19. ábra; 6., 17. és 18. sz. szekv.) az egér és humán szekvencia között átlagosan 72 %-os, az egér és sertés szekvencia között átlagosan 68 %-os, a sertés és humán szekvencia között pedig átlagosan 73 %-os azonosságot mutat. A homológia az ML N-terminális felében lényegesen nagyobb mértékű (EPO homológ dómén). Ez a dómén bármelyik két faj szekvenciája esetében 80-84 %-os azonosságot mutat, míg a C-terminális fél (szénhidrát dómén) csak 57-67 %-ban azonos. A feltehetően proteázos hasítási helyet reprezentáló kétbázisos motívum az eritropoietin-homológ dómén C-terminálisán található (19. ábra; 6., 17. és 18. sz. szekv.). A humán szekvencia 245-246. helyén található másik kétbázisos hely nincs jelen az egér és sertés szekvenciában. Az egér és sertés ML szekvencia négy ciszteint tartalmaz, melyek mindegyike konzervált a humán szekvenciában. Az egér ligandumban hét potenciális

111

N-glikozilálási hely van, míg a sertés ligandumban hat, melyek közül öt konzervált a humán szekvenciában. Valamennyi potenciális N-glikozilálási hely a protein C-terminális felében helyezkedik el.

(12) Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekből származó

TPO expresszálása és tisztítása

A CHO sejtek transzfektálásához a pCSI5.ID.LL.MLORF (teljes hosszúságú TPO vagy TPO332) és a pSVI5.ID.LL.MLEPO-D expressziós vektort (rövidített vagy TPO153) alkalmaztuk. E plazmidok jellemzőit a 23. és 24. ábrán mutatjuk be.

A transzfektálási eljárást a 20. példában írjuk le. A TPO teljes leolvasási keretének megfelelő cDNS-t PCR-ral kaptuk. A PCR terméket tisztítottuk és a pCSVI5.ID.LL plazmid Clal és Sáli restrikciós helye közé klónoztuk, miáltal a pCSVI5.ID.LL.MLORF vektort kaptuk. Az EPO-homológ doménnek megfelelő második konstrukciót hasonló módon állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy másfajta reverz prímért (EPOD.Sall) alkalmaztunk. A TPO EPO-homológ doménjét kódoló vektor végső konstrukcióját pSVI5.ID.LL.MLEPO-D-nek nevezzük.

A fenti két konstrukciót NotI enzimmel linearizáltuk, és elektroporációval kínai hörcsög petefészek sejtekbe (CHO-DP12 sejtek, EP 307,247 számú európai szabadalom, 1989. március 15.) transzfektáltuk. BRL elektroporációs

112 készülékben (350 V, 330 mF, alacsony kapacitás) 10^T sejtet 10 mg, 25 mg vagy 50 mg DNS jelenlétében, korábbi leírás szerint (Andreason, G.L., J. Tissue Cult. Meth., 15, 56, 1993) kezeltünk. A transzfekció utáni napon a sejteket DHFR szelektív tápközegbe (nagy glükóztartalmú DMEM:F12 50:50, glicin nélkül, 2 mM glutamin, 2-5 % dializált magzati borjúszérum) osztottuk szét. 10-15 nappal később 96 üregü lemezre különálló telepeket vittünk, és ezeket konfluens állapot eléréséig hagytuk növekedni. Az e kiónokból származó kondicionált tápközegben az ML153 vagy ML332 expresszióját Ba/F3-mpl proliferációs vizsgálattal értékeltük (ld. 1. példa).

Az összegyűjtött CHO sejttenyészeti folyadékból származó TPO tisztítási és izolálási eljárását a 20. példában írjuk le. Eszerint, a betakarított sejttenyészeti folyadékot (HCCF) hozzávetőleg 100 liter HCCF/1 liter gyanta arányban Blue-Sepharose (Pharmacia) oszlopra töltjük, az oszlopot 3-5 oszloptérfogatnyi pufferrel, majd 3-5 oszloptérfogatnyi, 2,0M karbamidot tartalmazó pufferrel mossuk. Ezután a TPO-t

3-5 oszloptérfogatnyi, 2,0M karbamidot és l,0M NaCl-ot tartalmazó pufferrel eluáljuk.

A Blue-Sepharose oszlopról összegyűjtött, TPO-t tartalmazó eluátomot ezután búzacsíra lektin Sepharose oszlopra (Pharmacia) vittük, melyet előzetesen 8-16 ml puffer/ml gyanta arányban ekvilibráltunk. Az a Blue-Sepharos oszlopot 2-3 eluáló pufferrel oszloptérfogatnyi

113 ekvilibráló pufferrel mostuk, majd 2,0 M karbamidot és 0,5 M N-acetil-glükóz-amint tartalmazó puffer 2-5-szörös oszloptérfogatnyi mennyiségével eluáltuk.

A TPO-t tartalmazó búzacsíra lektin eluátumot ezután megsavanyítottuk és 0,04 %-os végkoncentrációban Ci2Es-at adtunk hozzá. A kapott elegyet 0,1 % TFA-t és 0,04 % Ci2Es-at tartalmazó oldattal ekvilibrált C4 reverz fázisú oszlopra töltöttük, hozzávetőleg 0,2-0,5 mg protein/ml gyanta mennyiségben.

A proteint 0,1 % TFA-t és 0,04 % Ci2Es-at tartalmazó kétfázisú acetonitril gradienssel eluáltuk, és a megfelelő frakciókat SDS-PAGE alapján egyesítjük.

A C4 oszlopról kapott egyesített eluátum frakciókat hígítjuk, és hozzávetőleg hatszoros térfogatnyi pufferrel szemben Amicon YM vagy hasonló, 10-30 kD-os átengedési határral rendelkező ultrafiltráló membránon diafiltráljuk. A kapott diafiltrátum ezután közvetlenül feldolgozható vagy ultrafiltrálással tovább koncentrálható. A diafiltrátumot vagy koncentrátumot rendszerint 0,01 %-os Tween-80 végkoncentrációra állítjuk be.

A diafiltrátum/koncentrátum egészét vagy a kiszámított oszloptérfogat 2-5 %-ának megfelelő részét 0,01 % Tween-80-at tartalmazó pufferrel ekvilibrált Sephacryl S-300 HR oszlopra (Pharmacia) visszük és kromatográfáljuk. A TPO-t

114 tartalmazó frakciókat, melyek aggregátumoktól és proteolízises bomlástermékektől mentesek, SDS-PAGE alapján egyesítjük. A kapott frakciót leszűrjük és 2-8 ’C-on tároljuk.

(13) Eljárások a TPO-szintézis mikroorganizmusban történő megváltoztatására és indukálására, valamint az előállított TPO izolálására, tisztítására és harmadlagos szerkezetének visszaállítására (refolding) transzlációs biztosítanak.

Az E. coli TPO expressziós vektorok előállítását a 21.

példában írjuk le részletesen. A pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 és pMP202 plazmid mindegyikét úgy terveztük, hogy egy rövid leader szekvenciától (amely a különböző konstrukciókban különbözik) downstream irányban a TPO első 155 aminosavát expresszálják. A leader szekvenciák elsősorban magas szintű iniciációt és gyors tisztíthatóságot A pMP210-l, -T8, -21, -22, -24 és -25 plazmidot úgy terveztük, hogy egy iniciációs metionintői downstream irányban a TPO első 153 aminosavát expresszálják. Ezek a plazmidok a TPO első 6 aminosavára vonatkozó kodon-felhasználásban különböznek, míg a pMP251 a pMP210-l származéka, melyben a TPO C-terminális végét két aminosawal meghosszabbítottuk. E. coli-ban a triptofán promoter (Yansura, D.G. és mtsi., Methods in Enzymology, szerk.: Goeddel, D.V:, 185. 54-60, Academic Press, San Diego, 1990) indukciójának hatására a fenti plazmidok mindegyike magas szintű intracelluláris TPO expressziót biztosít. A pMPl és • ·

115 pMP172 plazmid a fenti TPO intracelluláris expressziós plazmidok előállításában köztestermékként szolgál.

A fenti TPO expressziós plazmidokat CaClz hősokk eljárással (Mandel, M. és mtsi., J. Mól., Bioi., £3, 159-162, 1970) és a 21. példában leírt egyéb eljárásokkal E. coli transzformálásához alkalmaztuk. Eszerint, a transzformált sejteket először 37 °C-on addig növesztettük, míg a tenyészet optikai denzitása 600 nm-nél el nem érte a kb. 2-3 értéket. A tenyészetet ezután hígítottuk, és levegőztetéssel végzett tenyésztés után savat adtunk hozzá. A tenyészetet ezután levegőztetés mellett további 15 óra hosszat növesztettük, majd a sejteket centrifugálással összegyűj tőttük.

A biológiailag aktív, visszaállított harmadlagos szerkezetű humán TPO vagy fragmentjei előállítása érdekében végzett izolálási, tisztítási és refolding (harmadlagos szerkezet visszaállítása) eljárásait a 22. és 23. példában írjuk le, és esek az eljárások bármilyen TPO változat (beleértve az Nés C-terminálison meghosszabbított alakokat is) előállításához alkalmazhatók. A rekombináns vagy szintetikus TPO harmadlagos szerkezetének visszaállításához alkalmas egyéb eljárásokat illetően ld. Builder és mtsi., 4,511,502 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Jones és mtsi., 4,512,922 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; Olson, 4,518,526 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; és Builder és mtsi., 4,620,948 számú Egyesült Államok-beli szabadalom,

116 melyekben E. coli-ban oldhatatlan alakban expresszál különböző rekombináns proteinek kinyerési és refolding eljárásainak általános leírása található.

(A) A nem oldható TPO kinyerése

Valamilyen alkalmas plazmid által kódolt TPO-t expresszáló mikroorganizmust (pl.

coli-t) olyan feltételek mellett fermentálunk, amelyek mellett a TPO oldhatatlan fénytörő testekben rakódik le. A sejteket adott esetben először sejtfeltáró pufferben mossuk. Rendszerint kb. 100 g sejtet kb. 10-szeres térfogatú sejtfeltáró pufferben (pl. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH = 8), például Polytron homogenizátorral újraszuszpendálunk, és a sejteket 30 percig 5000 x g-vel centrifugáljuk. A sejteket ezután hagyományos eljárással, pl. hangsugárzással, ciklikus nyomásváltoztatással, kémiai vagy enzimatikus módszerekkel lizáljuk. A mosott sejtüledéket homogenizátorral újabb 10-szeres térfogatú sejtfeltáró pufferben újraszuszpendálhatjuk, és a sejtszuszpenziót a gyártók útmutatásai szerint LH sejtfeltáró készüléken (LH Inceltech, Inc.) vagy Microfluidizer-en (Microfluidics International) átpaszírozzuk. A TPO-t tartalmazó szemcsésanyagot ezután elkülönítjük a folyadék fázistól, és adott esetben megfelelő folyadékkal mossuk. Például, a sejtlizátum szuszpenzióját 5000 x g-vel 30 percig centrifugáljuk, újraszuszpendáljuk, és adott esetben másodszor is centrifugáljuk, hogy mosott, fénytörő testekből álló ····

- 117 üledéket kapjunk. A mosott üledék azonnal felhasználható, vagy fagyasztva tárolható (pl. -70 ’C-on).

(B) A monomer TPO szolubilizálása és tisztítása elősegítése redukálószert

A fénytörő testek üledékében lévő oldhatatlan TPO-t szolubilizáló pufferrel szolubilizáljuk. A szolubilizáló puffer kaotróp szert tartalmaz, pH-ja lúgos, továbbá a monomer TPO hozamának fokozása érdekében redukálószert is tartalmaz. A jellemző kaotróp szerek közé tartozik a karbamid, a guanidin-HCl és a nátrium-tio-cianát, melyek közül a guanidin-HCl-ot részesítjük előnyben. A kaotróp szer koncentrációja rendszerint 4-9 M, előnyösen 6-6 M. A szolubilizáló puffer pH-ját alkalmas pufferrel 7,5-9,5, előnyösen 8,0-9,0, legelőnyösebben 8,0 értéken tartjuk. A szolubilizáló puffer — a TPO monomer alakja kialakulásának érdekében — előnyösen tartalmaz egy is. Az alkalmas redukálószerek közé tartoznak a szabad merkaptocsoportot tartalmazó szerves vegyületek (RSH). A jellemző redukálószerek közé tartozik a ditio-treitol (DTT), a ditio-eritritol (DTE), a merkapto-etanol, a glutation (GSH), a ciszteamin és a cisztein, melyek közül a ditio-treitolt (DTT) részesítjük előnyben. A szolubilizáló puffer adott esetben tartalmazhat egy enyhe oxidálószert (pl. molekuláris oxigént) és egy szulfit-sót, hogy a monomer TPO szulfitolízis útján alakuljon ki. Ebben az esetben a képződött TPO-S-szulfonátot később a redox puffer (pl. GSH/GSSG) jelenlétében visszük a

118 • · • · · ··· refolding reakcióba, hogy a megfelelő harmadlagos szerkezetű TPO-t alakuljon ki.

A TPO proteint rendszerint tovább tisztítjuk, például centrifugálással, gélfiltrációs kromatográfiával és reverz fázisú oszlopkromatográfiával.

Bemutatási célból leírjuk, hogy az alábbi eljárás megfelelő hozamú monomer TPO-t eredményezett. A fénytörő testek üledékét kb. 5 térfogatnyi szolubilizáló pufferben (6-8 M guanidint és 25 mM DTT-t tartalmazó 20 mM Tris; pH = 8) újraszuszpendáljuk, és 4 °C-on 1-3 óra hosszat (vagy egy éjszakán keresztül) keverjük, hogy elősegítsük a TPO protein szolubilizációját. Nagy koncentrációjú karbamid (6-8 M) szintén előnyös, de rendszerint valamivel kisebb hozamot eredményez, mint a guanidin. Szolubilizálás után az oldatot 30 000 x g-vel 30 percig centrifugáljuk, miáltal denaturált, monomer TPO proteint tartalmazó, tiszta felülúszót kapunk. A felülúszót ezután Superdex 200 gélfiltrációs oszlopon (Pharmacia, 2,6 cm x 60 cm) 2 ml/perc átfolyási sebességgel kromatográfáljuk, és a proteint 10 mM DTT-t tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát oldattal (pH = 6,0) eluáljuk. A 160-200.

ml-nél eluált frakciókat, melyek a denaturált, monomer TPO proteint tartalmazzák, összeöntjük. A TPO proteint félpreparatív 04 reverz fázisú oszlopon (2 cm x 20 cm VYDAC) tovább tisztítjuk. A mintát 5 ml/perc átfolyási sebességgel,

0,1 %-os TFA-ban (trifluor-ecetsav) 30 %-os acetonitrillel ekvilibrált oszlopra visszük, és a proteint acetonitril

- 119 lineáris gradiensével (60 percig 30 % -> 60 %) eluáljuk.

A tisztított, redukált protein hozzávetőleg 50 % acetonitril-koncentrációnál eluálódik. A kapott anyagot a harmadlagos szerkezet visszaállításához (refolding) használjuk, ami a biológiailag aktív TPO változatot adja.

( C) A_ΙΕΩ_harmadlagos_szerkezetének visszaállítása (a biológiailag aktív alak kialakítása)

A TPO szolubilizálása és újabb tisztítása után a biológiailag aktív alakot úgy kapjuk, hogy a denaturált, monomer TPO harmadlagos szerkezetét redox pufferben visszaállítjuk. A TPO nagy hatóképessége miatt (a Ba/F3 rendszerben az 50 %-os stimulációt kb. 3 pg/ml TPO koncentrációnál értük el) a biológiailag aktív TPO-t sok különféle puffer, detergens és redox feltétel alkalmazásával kialakíthatjuk, azonban leggyakrabban csak kis mennyiségű (10 % alatt) megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező anyagot kapunk. A nagyüzemi előállítási eljárásokhoz kívánatos, hogy a visszaredőzés hozama legalább 10 %-os, előnyösebben 30-50 %-os, legelőnyösebben több mint 50 %-os legyen. Számos különböző detergenst (köztük a Triton Χ-100-at, dodecil-C-maltozidot, CHAPS-t, CHAPSO-t, SDS-t, szarkozilt, Tween 20-at, Tween 80-at, Zwittergent 3-14-et és másokat) alkalmasnak találtunk ahhoz, hogy legalább némi megfelelően visszaállított harmadlagos szerkezettel rendelkező anyagot kapjunk. E detergensek közül a CHAPS és

- 120 CHAPSO volt a legelőnyösebb, melyek a refolding reakcióban a legjobb eredményt mutatták, és korlátozták a protein aggregálódását és a nem megfelelő diszulfidkötések kialakulását. A CHAPS esetében kb. 1 %-nál nagyobb mennyiség volt a legelőnyösebb. A legjobb hozamok eléréséhez nátrium-kloridra volt szükség, melynek optimális koncentrációja 0,1 M és 0,5 M között volt. A redox pufferben az EDTA jelenléte (1-5 mM) előnyös volt a fém-katalizálta oxidáció (és aggregáció) mértékének csökkentése szempontjából, ami egyébként néhány készítménynél előfordult. A 15 %-nál nagyobb glicerin-koncentráció optimális refolding feltételeket teremtett. A maximális hozam érdekében kulcsfontosságú volt, hogy a redox pufferben legyen redox pár, amely oxidált és redukált szerves tiolból (RSH) áll. Az alkalmas redox párokat a merkapto-etanol, a glutation (GSH), a ciszteamin, a cisztein, illetve megfelelő oxidált alakjaik alkotják. Az előnyös redox pár a glutation (GSHVoxidált glutation (GSSG), illetve a cisztein/cisztin pár volt;

legelőnyösebb a glutation (GSH)/oxidált glutation (GSSG) pár. Általában nagyobb hozamot értünk el, ha a redox pár oxidált tagjának mólaránya azonos vagy nagyobb volt, mint a redukált tagé. A TPO változatok harmadlagos szerkezetének visszaállításához 7,5 és kb. 9 közötti pH értékek voltak előnyösek. A szerves oldószerek (pl. etanol, acetonitril, metanol) 10-15 %-os vagy kisebb koncentrációban voltak tolerálhatok; a szerves oldószerek nagyobb mennyisége növelte a nem megfelelő harmadlagos szerkezetű alakok mennyiségét. A Tris és foszfát-pufferek általában hasznosak ··

- 121 «· · ···· ·· voltak. A 4 ’C-on végzett inkubálás nagyobb mennyiségű megfelelő harmadlagos szerkezetű TPO-t eredményezett.

Az első C4 lépéssel tisztított TPO készítmények esetében (a refolding reakcióban alkalmazott redukált és denaturált TPO mennyiségére vonatkoztatva) 40-60 %-os refolding hozam jellemző. Aktív anyag akkor is nyerhető, ha kevésbé tiszta készítményeket alkalmazunk (pl. közvetlenül a Superdex 200 oszlopon végzett kromatografálás vagy a fénytörő testes extrakció után kapott készítményeket), bár ilyen esetekben a hozamok a TPO refolding eljárás során a nem TPO proteinek precipitációja és zavaró hatása miatt kisebbek.

Mivel a TPO négy cisztein-gyököt tartalmaz, e protein három különböző diszulfid változata állítható elő:

1. változat: az 1. és 4., illetve a 2. és 3. cisztein közötti diszulfidkötés;

2. változat: az 1. és 2., illetve a 3. és 4. cisztein közötti diszulfidkötés;

3. változat: az 1. és 3., illetve a 2. és 4. cisztein közötti diszulfidkötés.

A refolding feltételek meghatározása érdekében végzett kezdeti kísérletek során 04 reverz fázisú kromatográfiával több különböző, TPO proteint tartalmazó csúcsot választottunk el. E csúcsok közül csak egy rendelkezett jelentős biológiai aktivitással, amint azt a Ba/F3 vizsgálattal meghatároztuk. Ezt követően a refolding feltételeket úgy alakítottuk, hogy elsődlegesen ez a • ·

- 122 » változat alakuljon ki. Ilyen körülmények között a hibás harmadlagos szerkezetű változatok a szolubilizálási lépésben kapott monomer TPO kevesebb, mint 10-20 %-át tették ki.

Tömegspektrométriával meghatároztuk, hogy diszulfidkötései az 1.

és protein-szekvenálással a biológiailag aktív TPO és 4., illetve a 2. és 3. cisztein-gyök között helyezkedtek el (a cisztein-gyököket az Nterminálistól kezdve számozzuk). Ez a cisztein kereszt-kötési mintázat összhangban van az eritropoietin rokon molekula ismert diszulfidkötési mintázatával.

(D) A rekombináns. visszaállított harmadlagos szerkezetű

TPO biológiai aktivitása

A visszaállított harmadlagos szerkezetű és tisztított TPO in vitro és in vivő vizsgálatokban egyaránt aktivitást mutat. Például, a Ba/F3 vizsgálatban a timidin Ba/F3 sejtekbe való beépülésének 50 %-os serkentését a TPO (Met^-1 1-153) 3,3 pg/ml (0,3 pM) koncentrációnál eredményezte. Az mpl receptor-alapú ELISA vizsgálatban az 50 %-os aktivitás 1,9 ng/ml (120 pM) koncentrációnál jelentkezett. Egészséges, illetve letális közeli röntgensugárzással mieloszuppresszált állatokban a visszaállított harmadlagos szerkezetű

TP0(Met^-1l-153) az új vérlemezkék termelődésének serkentésében igen hatásos volt (egerenként mindössze 30 ng dózisnál is tapasztaltunk aktivitást). A fentebb leírt eljárásokkal visszaállított harmadlagos szerkezettel ··

- 123 rendelkező egyéb TPO alakok esetében is hasonló biológiai * aktivitást tapasztaltunk (ld. 25., 26. és 28. ábra).

(14) A trombopoézises aktivitás mérési módszerei

A trombopoézises aktivitás különböző vizsgálatokkal mérhető, köztük az 1. példában leírt Ba,/F3 mpl ligandum vizsgálattal; in vivő egér vérlemezke rebound szintézis vizsgálattal; vérlemezke sejtfelületi antigén indukciós vizsgálattal, amit humán megakarioblasztos sejtvonalra (CMK) anti-vérlemezke immunvizsgálattal (anti-GPIItolIIa) mérünk (ld. Sato és mtsi., Brit. J. Haematol., Z2, 184-190, 1990) (ld. még a 4. példában leírt folyadékszuszpenziós megakariocitaképződési vizsgálatot); valamint megakarioblasztos sejtvonalban (DAMI) a poliploidizáció indukciójával (ld. Ogura és mtsi., Blood, 72(1), 49-60, 1988). A megakariociták éretlen, nagyobbrészt

DNS-t nem szintetizáló sejtekből morfológiailag azonosítható megakariocitákká érése olyan folyamat, amely a citoplazmikus organellumok megjelenését, a membrán antigének (GPII-blIIa) megszerzését, a vérlemezkék endoreplikációját és felszabadulását foglalja magában. A megakariocita érésének sejtvonal-specifikus promoterétől (azaz az mpl ligandumtól) azt várhatjuk, hogy az érett megakariociták fenti változásai közül legalább néhányat indukáljon, ami a vérlemezkék felszabadulását és a trombocitopénia enyhítését eredményezi.

Ennek megfelelően, olyan vizsgálatokat terveztünk, amelyekkel mérhető e paraméterek éretlen megakariocita sejtvonalakban ((CMK és DAMI sejtek) való felbukkanása. A • ·

- 124 CMK vizsgálat (4. példa) egy specifikus vérlemezke marker, a ί*· GPIIblIIa megjelenését és a vérlemezkék leválását méri. A

DAMI vizsgálat (15. példa) az endoreplikációt méri, mivel a ploiditás növekedése az érett megakariociták ismertető jegye. A felismerhető megakariociták 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, stb. plloiditási értékekkel rendelkeznek. Végül, az in vivő egér vérlemezke rebound vizsgálat (16. példa) alkalmas annak bizonyítására, hogy a tesztvegyület (esetünkben az mpl ligandum) a vérlemezkék számának növekedését eredményezi.

A ΤΡΟ-aktivitás mérésére két további in vitro vizsgálatot fejlesztettünk ki. Az egyik a kináz receptor aktiválási (KIRA) ELISA vizsgálat, melyben CHO sejteket mpl-Rse kimérával transzfektálunk, és miután a kiméra mpl része érintkezésbe került az mpl ligandummal, ELISA-val mérjük az Rse tirozin-foszforilációját (ld. 17. példa). A második vizsgálat egy receptor alapú ELISA, melyben a nyúl anti-humán IgG-vel bevont ELISA lemez befogja a humán mpl-IgG kiméra receptort, amely a vizsgálandó mpl ligandumhoz kötődik. A kötött mpl ligandum detektálásához mpl ligandum (TPOibb) elleni biotinilált poliklonális nyúl antitestet alkalmazunk, s a kötődést a 18. példában leírt módon sztreptavidin-peroxidáz alkalmazásával mérjük.

(15) A TPO-val kezelt normális, illetve szubletális dózisban sugárkezelt egerek in vivő biológiai reakciója

Normális és szubletálisan besugárzott egereket kínai hörcsög

125 petefészek (CHO) sejtekből, E. co-Zi-ból és humán embrionális vese (293-as) sejtekből izolált rövidített és teljes hosszúságú TPO-val kezeltünk. A három gazdában termelődött TPO mindkét alakja serkentette az egerekben a vérlemezkék termelődését, azonban a CHO sejtekből izolált teljes hosszúságú TPO mutatta a legnagyobb In vivő reakciót. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a C-terminális dómén pontos glikozilálása szükséges lehet az optimális in vivő aktivitás szempontjából.

(a) E. coíi-rhTPO(MQ-t-¹.153)

Az EPO dómén E. coli-kan termelődött Met alakját (a -1 helyen metionin + a humán TPO első 153 gyöke) (ld. 23. példa) naponta normális nőstény 057 B6 egerekbe injektáltuk, (ld. 25/A, 25/B és 25/0 ábrák leírása). Ezek az ábrák azt a TPO E. coli-kan termelődött rövidített alakja, melynek harmadlagos szerkezetét a fentebb leírtak szerint visszaállítottuk, normális egerekben a vérlemezketermelődés kb. kétszeres növekedését képes stimulálni, anélkül, hogy befolyásolná a vörös- vagy fehérvérsejt populációkat.

mutatják, hogy glikozilálatlan,

Ugyanez a molekula szubletálisan besugárzott (¹³⁷Os) nőstény C57 B6 egerekbe injektálva (ld. 26/A, 26/B és 26/C ábrák leírása) serkentette a vérlemezkék regenerációját és csökkentette a mélypontot, de nem befolyásolta az eritrocltákat és a leukocitákat.

126 (b) CHO-rhTBDsaz

A CHO sejtekben termelődött teljes hosszúságú TPO alakot naponta normális nőstény C57 B6 egerekbe injektáltuk (ld. 27/A, 27/B és 27/C ábrák leírása), ami a vérlemezketermelődés körülbelül ötszörös növekedését eredményezte, anélkül, hogy befolyásolta volna az eritrocita és leukocita populációt.

(c) CHQ-rhTPQ332: E. co-Zi-rhTPOÍMat-³-. 1.53):

293-rhTPQ332 és E. coli-rhTPQieb

A normális egerek különböző sejtvonalakból származó rhTPO-val (CHO-rhTPOsss; E. co2i-rhTP0(Met^--,iss);

293-rhTPC>332 és E. colz-rhTPOiss) végzett kezeléséhez dózis-reakció görbéket készítettünk (ld. 28. ábra leírása). A 28. ábrán látható, hogy a molekula valamennyi tesztelt alakja serkentette a vérlemezketermelődést, de a CHO sejtekben termelődött teljes hosszúságú alak mutatta a legnagyobb in vivő aktivitást.

(d) CHQ-rhTPQ-iE3, CHO-rhTPO··^*^·· és CHQ-rhTP0s32

A normális egerek különböző sejtvonalakból származó rhTPO-val (CHO-rhTPOiss, CHO-rhTPO··vágott és CHO-rhTPO332) végzett kezeléséhez is készítettünk dózis-reakció görbéket (ld. 29. ábra leírása). Az ábrán látható, hogy a molekula valamennyi tesztelt alakja serkentette a ·· • · · • ···· ···· ·

- 127 vérlemesketermelődést, de a 70 kd-os, teljes hosszúságú alak mutatta a legnagyobb in vivő aktivitást.

(16) Az mpl ligandum és változatai általános rekombináns előállítási módszere

Az mpl ligandumot előnyösen standard rekombináns eljárásokkal állítjuk elő, melyek során sejteket tenyésztünk (melyeket úgy transzfektáltunk, rendszerint expressziós vektorral végzett transzformációval, hogy mpl ligandum nukleinsavat expresszáljanak), és a sejtekből kinyerjük a polipeptidet. Adott esetben az mpl ligandum homológ rekombinációval vagy rekombináns előállítási módszerekkel is előállítható, melyek során a már mpl ligandumot kódoló DNS-t tartalmazó sejtekbe szabályozó elemeket juttatunk be. Például, a kívánt gazdasejtbe (a kívánt mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS közelébe és annak transzkripciójának befolyásolásához megfelelő orientációban) hatásos promoter/enhancer elemet, szuppresszort vagy exogén transzkripciós modulátor elemet inszertálhatunk. A szabályozó elem nem kódol mpl ligandumot. Ezután a sejteket arra vizsgáljuk, hogy termelik-e a találmány szerinti receptor polipeptidet, vagy hogy az expresszió növelt vagy csökkentett szintű-e.

Ennek megfelelően, a találmány tárgya eljárás mpl ligandum előállítására, melynek során egy sejt mpl ligandum nukleinsav-molekulát tartalmazó genomjába (a nukleinsav·· ·» • · · · • · · • · · • · · • ···· ···· ·

- 128 molekula megfelelő közelségébe és transzkripciójának befolyásolásához megfelelő orientációban) transzkripciós modulátor elemet inszertálunk, és adott esetben, további lépésként a transzkripciós modulátor elemet és a nukleinsav-molekulát tartalmazó sejtet tenyésztjük. A találmány további tárgya a gazdasejt által felismert exogén szabályozó elemekhez működőképesen kapcsolt endemikus mpl ligandum nukleinsav-molekulát tartalmazó sejtek.

(A) Az mpl ligandum oolipeotidet kódoló DNS izolálása

Az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS olyan szövetből készített cDNS könyvtárból nyerhető, mely szövetről úgy véljük, hogy rendelkezik az mpl ligandum mRNS-sel és detektálható szinten expresszálja azt. Az mpl ligandum gén genomiális DNS könyvtárból vagy a teljes nukleotid- vagy aminosav-szekvenciából in vitro oligonukleotid szintézissel nyerhető.

A könyvtárakat a szóban forgó gén vagy az általa kódolt protein azonosításához tervezett próbákkal screenelhetjük. A cDNS expressziós könyvtárakhoz alkalmas próbák közé tartoznak azok a poliklonális antitestek, amelyek felismerik és specifikusan megkötik az mpl ligandumot. A cDNS könyvtárakhoz alkalmas próbák kb. 20-80 bázis hosszúságú oligunukleotidok (amelyek az ugyanazon vagy eltérő fajból származó mpl ligandum cDNS ismert vagy feltételezett részeit kódolják) és/vagy komplementer vagy homológ cDNS-ek vagy

129 azok fragmentjei, amelyek azonos vagy hasonló géneket kódolnak. A genomiális cDNS könyvtárakhoz alkalmas próbák közé tartoznak (nem kizárólagosan) az olyan oligonukleotidok, cDNS-ek vagy fragmentek, amelyek azonos vagy hasonló gént kódolnak, és/vagy a homológ genomiális DNS-ek vagy fragmentjeik. A cDNS vagy a genomiális könyvtár standard eljárások alkalmazásával screenelhető a kiválasztott próbával (ld. Sambrook és mtsi. kézikönyvének 10-12. fejezetei).

Az mpl ligandumot kódoló gén izolálásának másik módszere szerint PCR technikát alkalmazunk, melynek leírása Sambrook és mtsi. kézikönyvének 14. fejezetében található. Ez a módszer olyan oligonukleotid próbák alkalmazását igényli, amelyek az mpl ligandumot kódoló DNS-hez hibridizálódnak. Az oligonukleotidok kiválasztásának módszereit a későbbiekben írjuk le.

A találmány gyakorlati megvalósításának előnyös módszere szerint a különböző szövetekből (előnyösen emberi vagy sertés [kifejlett vagy magzati] veséből vagy májásejt-vonalakból) származó cDNS könyvtárak gondosan kiválasztott oligonukleotid alkalmazunk. Például, a humán magzati másejt-vor.al cDNS könyvtárakat az oligonukleotid próbákkal screeneljük. Más screeneléséhez szekvenciákat lehetőség szerint, humán genomiális könyvtárak screenelhetők az oligonukleotid próbákkal.

- 130 A próbaként kiválasztott oligonukleotid szekvenciáknak megfelelő hosszúságúnak és kellőképpen egyértelműnek kell lenniük, hogy a hamis pozitív eredmények minimálisra csökkenjenek. Az aktuális nukleotid-szekvenciá(ka)t rendszerint a legkisebb redundanciával rendelkező mpl ligandum régiói alapján jelöljük. Az oligonukleotidok egy vagy több helyen degeneráltak lehetnek. A degenerált oligonukleotidok alkalmazása különösen fontos olyan esetekben, amikor olyan fajból származó könyvtárat screenelünk, melynek előnyben részesített kodonfelhasználása nem ismert.

Az oligonukleotidot úgy kell jelölni, hogy a screenelni kívánt könyvtárban lévő DNS-hez való hibridizáció után detektálható legyen. Az előnyös jelölési módszer az ATP (pl. gamma-³²P) és polinukleotid kináz alkalmazása, amivel az oligonukleotid 5' vége radioaktívan jelölhető. Az oligonukleotid jelöléséhez egyéb módszerek is alkalmazhatók, mint például (nem kizárólagos jelleggel) a biotinilálás vagy az enzimes jelölés.

Különösen jelentős az olyan mpl ligandum nukleinsav, amely teljes hosszúságú mpl ligandum polipeptidet kódol. Néhány előnyös megvalósítási módban a nukleinsav-szekvencia magában foglalja a természetes mpl ligandum szignál szekvenciát. A teljes protein-kódoló szekvenciával rendelkező nukleinsavat kiválasztott cDNS vagy genomiális könyvtár (leszármaztatott aminosav-szekvenciaval végzett) screenelésével kapjuk.

• ·

131 (B) A természetes mól ligandum aminosav-szekvencia változatai

Az mpl ligandum aminosav-szekvencia változatait úgy állítjuk elő, hogy az mpl ligandum DNS-ben megfelelő nukleotidokat változtatunk meg, vagy a kívánt mpl ligandum polipeptidet in vitro szintetizáljuk. Az ilyen változatok például a sertés mpl ligandum aminosav-szekvenciájában lévő aminosavakat érintő deléciók, inszerciók vagy szubsztitúciók eredményei lehetnek. Például, az érett, teljes hosszúságú mpl ligandum C-terminális részei in vivő vagy in vitro proteolízises hasítással, vagy egy fragment vagy a teljes hosszúságú mpl ligandumot kódoló DNS klónozásával és expresszálásával eltávolithatók, miáltal biológiailag aktív változat jön létre. A deléciók, inszerciók és szubsztitúciók bármely kombinációját a végső konstrukció kialakítása érdekében alakítjuk ki, feltéve, hogy a végső konstrukció rendelkezik a kívánt biológiai aktivitással. Az aminosav cserék megváltoztathatják az mpl ligandum transzlációs érési folyamatait, például a glikozilálási helyek számának vagy elhelyezkedésének megváltoztatásával. Az mpl ligandum aminosav-szekvencia változatainak tervezéséhez a mutációs hely elhelyezkedése és a mutáció természete az mpl ligandum módosítani kívánt jellemzőitől függ. A mutációs helyek egyenként vagy sorozatban módosíthatók, pl. (1) először a konzervatív aminosav lehetőségekkel helyettesítve, majd — az elért eredményektől függően — radikálisabb szelekcióval; (2) a megcélzott aminosav-gyök deléciójával; vagy (3) azonos

132 vagy különböző osztályba tartozó aminosav-gyökök lokalizált helyre történő inszertálásával, illetve a fenti három lehetőség kombinálásával.

Az mpl ligandum polipeptid bizonyos, a mutagenezis szempontjából előnyös helyeket biztosító aminosav-gyökei vagy régiói azonosításának hasznos módszere az ún. alanin-pásztázó mutagenezis (alanine scanning mutagenesis; ld. Cunningham és Wells, Science, 244. 1081-1085, 1989). Itt egy gyököt vagy gyökcsoportot azonosítunk (pl. töltéssel rendelkező gyököket, mint az arginin, aszparaginsav, hisztidin, lizin és glutaminsav), és ezeket bármilyen, de előnyösen semleges vagy negatív töltésű aminosawal (legelőnyösebben alaninnal vagy polialaninnal) helyettesítjük, miáltal módosítjuk az aminosavak sejten belüli vagy kívüli vizes környezettel való kölcsönhatását.

A szubsztitúciókra funkcionális szenzitivitást mutató doméneket ezután a szubsztitúció helyére (vagy helyett) további vagy egyéb változatok bevitelével finomítjuk. így, bár az aminosav-szekvencia módosításának helye előre meghatározott, a mutáció természetét nem kell előre meghatározni. Például, egy adott helyen egy mutáció hatásának javítása érdekében a megcélzott kodonnál vagy régiónál alanin pásztázást vagy random mutagenezist végzünk, és az expresszált mpl ligandum változatokat a kívánt aktivitás optimális kombinációjára sőréénéljük.

Az aminosav-szekvencia változatok kialakításában két

133 alapvető változó van: a mutációs hely elhelyezkedése és a mutáció természete. Például, az api ligandum polipeptid változatok közé tartoznak az api ligandum szekvenciából származó változatok, és természetben előforduló allélokat (melyek nem igénylik az api ligandum DNS manipulációját) vagy a DNS mutációjával kialakított, előre meghatározott mutáns alakokat képviselhetnek, melyeket a természetben nem található alléi vagy változat kialakítása érdekében hoztunk létre. A választott mutáció elhelyezkedése és természete általában a api ligandum módosítani kívánt tulajdonságától függ.

Az aminosav-szekvencia előnyösebben kb. 1-10 rendszerint folytonosak.

deléciók általában kb. 1-30, aminosav-gyököt érintenek, és Más lehetőség szerint, az api ligandum esetében az aminosav-szekvencia deléciók a C-terminális glikcprotein dómén egy részére vagy egészére terjedhetnek ki. Az aminosav-szekvencia deléciói az érett protein első hat N-terminális aminosava közül egyet vagy többet is érinthetnek. Adott esetben az aminosav-szekvencia deléciók a helikális nyalábok között elhelyezkedő egy vagy több hurok (loop) régió egy vagy több aminosav-gyökét foglalják magukban. A szomszédos deléciók rendszerint páros számú aminosav-gyököt érintenek, de az egyetlen vagy páratlan számú aminosavat érintő deléciók is a találmány tárgykörébe tartoznak. Deléclókat vihetünk be azokba a régiókba, amelyek a legnagyobb szekvencia-azonossággal rendelkező ligandumok között a legkisebb homológiával

134 rendelkeznek, s ezáltal megváltoztathatjuk az mpl ligandum aktivitását, továbbá deléciókat vihetünk be a humán mpl ligandum és a humán mpl ligandummal legnagyobb szekvencia-azonossággal rendelkező egyéb emlős mpl ligandum között kismértékű homológiát mutató régiókba. Az emlős mpl ligandum polipeptidet olyan területeken érintő deléciók, mely területek jelentős homológiát mutatnak más emlős mpl ligandumokkal, nagyobb valószínűséggel és nagyobb hatással módosítják az mpl ligandum biológiai aktivitását. Az egymás utáni deléciók számát úgy választjuk meg, hogy az érintett doménben megőrizzük az mpl ligandumok harmadlagos szerkezetét (béta-redős vagy alfa-hélix).

Az aminosav-szekvencia inszerciók közé N-terminális és/vagy C-terminális fúziók tartoznak, melyek hosszúsága egy aminosav-gyöktől száz vagy több aminosavat tartalmazó polipeptidekig terjed; ide tartoznak továbbá a szekvencián belüli, egy vagy több aminosavas inszerciók. A szekvencián belüli (azaz az érett mpl ligandum szekvenciáján belüli) inszerciók általában kb. 1-10 aminosavasak, előnyösebben 1-5, legelőnyösebben 1-3 aminosavasak lehetnek. Egy példaként szolgáló előnyös fúzió az mpl ligandum vagy fragmentje és egy másik citokin vagy citokin-fragment terminális inszerciók példái közé tartozik az ligandum N-terminális metionil-gyökkel való ami az érett mpl ligandum rekombináns fúziója. A érett mpl kapcsolódása, sej ttenyészetben való közvetlen expressziójának mellékterméke, továbbá egy heterológ N-terminális szignál • · · · · *

- 135 szekvencia érett mpl ligandum molekula N-terminálisához való fúziója, ami elősegíti az érett mpl ligandum rekombináns gazdákból történő szekrécióját. Az ilyen szignál szekvenciák általában a kívánt gazdasejt fajból származnak, és ezáltal homológok. Az E. coli-hoz alkalmas szekvenciák közé tartozik az STII vagy Ipp, az élesztőkhöz az alfafaktor, emlős sejtekhez pedig virális szignál szekvenciák, mint pl. a herpes gD.

Az mpl ligandum molekula egyéb inszerciós változatai közé tartozik az immunogén polipeptidek (amelyek arra a gazdára nézve, amelybe a fúziós molekulát beadjuk, nem endemikusak; pl. bakteriális polipeptidek, mint a β-laktamáz vagy egy, a E. coli trp lokusz által kódolt enzim, továbbá élesztő protein) mpl ligandum N- vagy C-terminálisához történő fúziójával létrejött fúziós molekulák, továbbá a hosszú felezési idejű proteinekkel, mint pl. az immunoglobulin konstans régiójával vagy más immunglobulin régiókkal, albuminnal vagy ferritinnel kialakult C-terminális fúziók (ld. WO 89/02922 számú szabadalom, 1989. április 6.).

A változatok harmadik csoportját az aminosav szubsztitúciós változatok képezik. Ezekben a változatokban az mpl ligandum molekula legalább egy aminosav-gyöke egy másik aminosav-gyökkel van helyettesítve. A szubsztitúciós mutagenezis szempontjából legnagyobb jelentőségű helyek közé tartoznak az mpl ligandum aktív hely(i)ként azonosított helyek, továbbá azok a helyek, ahol a más analógokban « · • ····

- 136 található aminosavak az oldallánc térigényében, töltésében vagy hidrofóbitásában jelentősen különböznek, de ahol a különböző mpl ligandum fajták között és/vagy egy mpl ligandum tag különböző állatfajokban található analógjai között nagyfokú szekvencia-azonosság van.

Egyéb jelentős helyek azok, ahol a különböző mpl ligandumok adott aminosav-gyökei azonosak. Ezek a helyek, különösen, amelyek legalább három másik, azonosan konzervált helyből álló szekvenciába esnek, viszonylag konzervatív módon szubsztituálhatók. Ilyen konzervatív szubsztitúciókat z

mutatunk be a III. táblázatban, az előnyös szubsztitúciók oszlopban. Ha az ilyen szubsztitúciók a biológiai aktivitás változását eredményezik, úgy alapvetőbb változtatásokat iktatunk be (melyeket a III. táblázatban példaként szolgáló szubsztitúciókként jelölünk, és az alábbiakban az aminosav osztályokat illetően részletesebben leírunk), és vizsgáljuk a termékeket.

···· ·· • ·· · · · • , · · ·

S · · ·*ί· '·· ···· ·

137

III. táblázat

Eredeti aminosav

Példaként szolgáló szubsztitúció

Előnyös szubsztitúció

Alá	(A)	Val; Leu;	Ile	Val
Arg	(R)	Lys; Gin;	Asn	Lys
Asn	(N)	Gin; His;	Lys; Arg	Gin
Asp	(D)	Glu		Glu
Cys	(C)	Ser		Ser
Gin	(Q)	Asn		Asn
Glu	(E)	Asp		Asp
Gly	(G)	Pro		Pro
His	(H)	Asn; Gin;	Lys; Arg	Arg
Ile	(I)	Leu: Val;	Met; Alá; Phe;
		norleucin		Leu
Leu	(L)	norleucin	; Ile; Val;
		Met; Alá;	Phe	Ile
Lys	(K)	Arg: Gin;	Asn	Arg
Met	(M)	Leu; Phe;	Ile	Leu
Phe	(F)	Leu; Val;	Ile; Alá	Leu
Pro	(P)	Gly		Gly
Ser	(S)	Thr		Thr
Thr	(T)	Ser		Ser
Trp	(W)	Tyr		Tyr
Tyr	(Y)	Trp; Phe;	Thr; Ser	Phe
Val	(V)	Ile; Leu;	Met; Phe;

Alá; norleucin

Leu '»· ····

138

Az mpl ligandum működését vagy immunológiai azonosságát érintő alapvető módosításokat azon szubsztitúciók kiválasztásával valósítjuk meg, amelyek (a) a szubsztitúció körzetében a polipeptid váz szerkezetének (pl. β-redős vagy alfa-helikális konformáció) fenntartására; (b) a megcélzott helyen a molekula töltésének vagy hidrofóbitásénak fenntartására vagy (c) az oldallánc térigényének fenntartására gyakorolt hatásukban jelentősen különböznek egymástól. A természetben előforduló gyököket közös oldallánc tulajdonságaik alapján csoportokba osztjuk.

(1) hidrofób: norleucin, Met, Alá, Val, Leu, Ile;

(2) semleges hidrofil: Cys, Ser, Thr;

(3) savas: Asp, Glu;

(4) bázisos: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) a lánc orientációját befolyásoló gyökök: Gly, Pro;

(6) aromás: Trp. Tyr, Phe.

A nem konzervatív szubsztitúciók a fenti osztályok egyik tagjának egy másikra való cserélődését eredményezik. Az ilyen szubsztituált gyökök bevihetők a konzervatív szubsstitúciós helyekre is, vagy előnyösebben, a többi (nem konzervatív) helyre.

A találmány egyik megvalósítási módjában kívánatos a molekulában jelenlévő egy vagy több proteázos hasítási hely inaktiválása. Ezeket a helyeket úgy azonosítjuk, hogy a kódolt aminosav-szekvenciát, például a tripszin esetében, arginil- vagy lizinil-gyök jelenlétére vizsgáljuk. A • · · · • ·

- 139 proteázos hasítási helyeket, azonosításuk után, inaktívvá tesszük a proteázos hasításra, oly módon, hogy a megcélzott gyököt egy másik, előnyösen bázikus aminosav-gyökkel (pl. glutaminnal) vagy hidrofób gyökkel (pl. szerinnel) helyettesítjük; delécióval eltávolítjuk; vagy közvetlenül a szóban forgó gyök után egy prolil-gyököt inszertálunk.

Egy másik megvalósítási módban a szignál szekvencia első metionil-gyökén kívül valamennyi metionil-gyököt, illetve az ilyen metionil-gyöktől N- vagy C-terminális irányban kb. három gyök távolságban elhelyezkedő valamennyi gyököt egy másik aminosav-gyökkel helyettesítjük (előnyösen a III. táblázat szerint) vagy delécióval eltávolítjuk. Más módon, az ilyen helyek mellé közvetlenül kb. 1-3 aminosav-gyököt inszertálunk.

Az mpl ligandum megfelelő konformációjának fenntartásában szerepet nem helyettesíthetők, játszó cisztein-gyökök szintén általában szerinnel, ami fokozza a molekula oxidatív stabilitását és megakadályozza a hibás keresztkötés-képzést. Azt találtuk, hogy az EPO dómén első és negyedik cisztein gyöke (az N-terminálistól számítva) szükséges a megfelelő konformáció fenntartásához, míg a második és harmadik nem. Ennek megfelelően, az EPO doménben a második és harmadik ciszteint helyettesíthető.

Az mpl ligandum aminosav-szekvencia változatait kódoló nukleinsav-molekulák számos ismert eljárással előállíthatok.

• ·

- 140 E módszerek közé tartozik (nem kizárólagos jelleggel) a természetes forrásból történő izolálás (a természetben előforduló aminosav-szekvencia változatok esetében), valamint egy korábban előállított változat vagy az mpl ligandum polipeptid nem változat alakjának oligonukleotid-közvetítette (helyre irányuló) műtagenezisével, PCR mutagenezisével vagy kazetta mutagenezisével történő előállítás.

Az mpl ligandum DNS szubsztitúciós, deléciós és inszerciós változatainak előállításához előnyös módszer az oligonukleotid-közvetítette mutagenezis. E technika leírását ld. Adelman és mtsi., DNA, 2, 183, 1983). Eszerint, az mpl ligandum DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a kívánt mutációt kódoló oligonukleotidot egy DNS templáthoz hibridizáljuk, mely templát az mpl ligandum változatlan vagy eredeti DNS-szekvenciáját tartalmazó plazmid vagy bakteriofág egyszálú alakja. Hibridizáció után a templát teljes második komplementer szálának szintetizálásához

DNS-polimerázt alkalmazunk, mely második szál tartalmazni fogja az oligonukleotid prímért, és az mpl ligandum DNS kívánt módosítását fogja kódolni.

Általában legalább 25 nukleotid hosszúságú oligonukleotidokat alkalmazunk. Egy optimális oligonukleotid 12-15 olyan nukleotiddal rendelkezik, amely a mutációt kódoló nukleotidíok) mindkét oldalán tökéletesen komplementer a templáttal. Ez biztosítja, hogy az • ·· ·

- 141 oligonukleotid megfelelően hibridizálódjon az egyszálú DNS templát molekulához. Az oligonukleotidok ismert technikákkal könnyen előállíthatok (ld. pl. Crea és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765, 1978).

A DNS templát azokkal a vektorokkal alakítható ki, amelyek M13 bakteriofág vektorokból származnak (a szokványos M13mpl8 és M13mpl9 vektorok alkalmasak) vagy amelyek egyszálú fág replikációs kezdőhelyet tartalmaznak (Viera és mtsi., Meth. Enzymol., 153» 3, 1987). Ilyenformán, a mutációval módosítani kívánt DNS-t e vektorok egyikébe inszertálhatjuk, hogy egyszálú DNS templátot alakítsunk ki. Az egyszálú templát előállításának leírása megtalálható: Sambrook és mtsi., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 4.21-4.41 szakasz, 1989).

Más módon, az egyszálú DNS templát kétszálú plazmid (vagy más) DNS standard eljárással végzett denaturálásával is előállítható.

Az eredeti DNS-szekvencia megváltozatatásához (pl.

aminosav-szekvencia változatok kialakítása érdekében) az oligonukleotidot megfelelő hibridizációs feltételek mellett egyszálú templáthoz hibridizáljuk. A templát komplementer szálának szintetizálása érdekében ezután DNS polimeráz enzimet, rendszerint a DNS polimeráz I Klenow fragmentjét adjuk a templáthoz, s a szintézishez primerként az oligonukleotidot alkalmazzuk. E módszerrel egy heteroduplex

142 molekula alakul ki, melynek egyik szála az mpl ligandum mutált alakját, másik szála (az eredeti templát) az mpl ligandum természetes, nem módosított szekvenciáját kódolja. Ezt a heteroduplex molekulát ezután megfelelő (rendszerint prokarióta) gazdasejtbe, pl. E. coli JM101 sejtekbe transzformáljuk. A sejteket növesztésük után agaróz lemezekre kenjük, és a mutált DNS-t tartalmazó baktérium telepek azonosítása érdekében ³²P-izotóppal jelölt oligonukleotid primerrel screeneljük. A mutált régiót eltávolítjuk, és a proteintermeléshez megfelelő vektorba, általában egy megfelelő gazda transzformációjához jellemzően alkalmazott típusú expressziós vektorba helyezzük.

A fentebb leírt eljárás úgy módosítható, hogy homoduplex molekulát alakítunk ki, melyben a plazmid mindkét szála tartalmazza a mutáció(ka)t. Ezt a módosítást úgy végezzük, hogy az egyszálú oligonukleotidot a fentebb leírtak szerint az egyszálú templáthoz dezoxiribonukleotid, a hibridizáljuk, ezután három dezoxiriboadenozin (dATP), a dezoxiriboguanozin (dGTP) és a dezoxiribotimidin (dTTP) elegyét módosított tio-dezoxiribocitozinnal [dCTP-(aS); amely az Amersham Corporation-tói szerezhető be] elegyítjük, és az így kapott elegyet a templát-oligonukleotid komplexhez adjuk. Ehhez az elegyhez DNS polimerázt adva a templáttal (a mutált bázisok kivételével) azonos szál alakul ki, ráadásul, ez az új DNS szál dCTP helyet dCTP-(aS)-t tartalmaz, amely megóvja a restrikciós endonukleázos emésztéstől.

···

- 143 Miután a kétszálú heteroduplex templát szálát alkalmas restrikciós enzimmel bemetszettük, a templát szál a mutagenizálni kívánt helye(ke)t tartalmazó régión túl ExoIII nukleázzal vagy más alkalmas nukleázzal emészthető. A reakciót úgy állítjuk le, hogy csak részlegesen egyszálú molekula maradjon. Ezután DNS polimeráz alkalmazásával, a négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát, ATP és DNS ligás jelenlétében teljes kétszálú DNS homoduplexet alakítunk ki. A homoduplex molekula ezután megfelelő gasdasejtbe, például

E. coli JM101 törzsbe transzformálható.

Az egynél több aminosav szubsztitúciót tartalmazó mpl ligandum mutánsokat kódoló DNS több módon is előállítható. Ha az aminosavak a polipeptid láncban egymáshoz közel helyezkednek el, egy oligonukleotid alkalmazásával (amely valamennyi kívánt aminosav szubsztitúciót kódolja) egyszerre mutálhatok. Eszel szemben, ha az aminosavak egymástól bizonyos távolságban helyezkednek el (kb. 10 aminosavnál több választja el őket egymástól), bonyolult egyetlen olyan oligonukleotidot kialakítani, amely valamennyi kívánt szubsztitúciót kódolja; ehelyett, az alábbi két alternatív eljárás egyikét alkalmazzuk.

Az első módszer szerint minden egyes szubsztituálni kívánt aminosavhoz külön oligonukleotidot készítünk, majd ezeket egyszerre a templát DNS-hez hibridizáljuk, és a DNS templátról szintetizált másik szála a kívánt aminosav szubsztitúciókat fogja kódolni.

····

144

A másik módszerben a kívánt mutáns kialakítása érdekében két vagy több lépésben végezzük a mutagenezist. Az első lépést az egyetlen mutációt tartalmazó mutáns esetében leírtak szerint végezzük; templátként vad típusú DNS-t alkalmazunk, és e templáthoz az első kívánt aminosav szubsztitúció(ka)t kódoló oligonukleotidőt hibridizálunk, miáltal heteroduplex DNS molekulát kapunk. A második mutagenezis lépéshez az előző lépésben előállított mutált DNS-t alkalmazzuk templátként, így ez a templát már tartalmaz egy vagy több mutációt. A további kívánt aminosav szubsztitúció(ka)t kódoló oligonukleotidot ehhez a templáthoz hibridizáljuk, és a képződött DNS szál a mutagenezis első és második lépésében kialakított mutációkat kódolja. Ez a DNS egy harmadik mutagenezis lépésben alkalmazható templátként, stb.

A PCR mutagenezis szintén alkalmas az mpl ligandum polipeptid aminosav változatainak előállítására. Bár az alábbi leírás DNS-re vonatkozik, tudni kell, hogy ez a technika RNS-re is alkalmazható. A PCR technika általánosan az alábbi eljárást jelenti (ld. Erlich, fentebb, az R.

Higuchi által írt fejezetben, 61-70. oldal). Amikor a PCR-ban kiindulási anyagként kis mennyiségű templát DNS-t alkalmazunk, a templát DNS megfelelő régiójától csekély mértékben eltérő primerek alkalmazhatók viszonylag nagy mennyiségű specifikus DNS-fragment kialakításához, amely a templát szekvenciájától csak azon a helyen tér al, ahol a primerek különböznek a templáttól. Egy mutáció plazmid DNS-be történő beviteléhez a primerek egyikét úgy alakítjuk

- 145 ki, hogy átfedje a mutáció helyét és tartalmazza a mutációt; a másik primer szekvenciájának azonosnak kell lennie a plazmid ellenkező szála szekvenciájának egy szakaszával, de ez a szekvencia a plazmid DNS-en bárhol elhelyezkedhet. Ennek ellenére, előnyös, ha a második primer szekvenciája az első primerétől 200 nukleotid távolságon belül helyezkedik el, hogy a DNS primerek által határolt teljes amplifikált régiója könnyen szekvenálható legyen. A fentebb leírthoz hasonló primer pár alkalmazásával végzett PCR amplifikáció olyan DNS fragmenteket eredményez, melyek a primer által meghatározott mutációs helyben térnek el (és esetleg más helyeken, mivel a templát másolás némileg hibára hajlamos).

Ha a templát/termék arány nagyon alacsony, a termék DNS fragmentek döntő többsége beépíti a kívánt mutáció(ka)t. Ezt a terméket használjuk a plazmid PCR templátként szolgáló, megfelelő régiójának standard DNS technikával történő helyettesítésére. A egyidejűleg vihetők különböző helyeken lévő mutációk be, akár mutáns második primer alkalmazásával, akár egy második PCR elvégzésével (melyhez különböző mutáns primereket alkalmazunk), mely utóbbi esetben a két PCR fragmentet három (vagy több) lépéses ligálással egyidejűleg ligáijuk a vektor fragmenthez.

A PCR mutagenezis egy specifikus példájában templát plazmid DNS-t (1 ug) olyan restrikciós enzimmel végzett emésztéssel linearizálunk, amelynek a plazmid DNS-ben — az amplifikálni kívánt régión kívül eső — egyetlen felismerési helye van.

···· ··

146

Ebből az anyagból 100 ng-ot adunk a PCR puffért tartalmazó PCR elegyhez, amely a négy dezoxinukleotid-trifoszfétből áll (és a GeneAmp^R készletek részét képezi; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT és Emeryville, CA), továbbá mindegyik Qligonukleotid primerből 25 pmólt adunk hozzá (50 ul

A reakcióelegyet 35 ul ásványi olajjal A reakcióelegyet 100 ’C-on öt percig denaturáljuk, rövid időre jégre helyezzük, majd az ásványi olaj réteg alá 1 ul Thermus aquaticus (Taq) DNS polimerázt (Perkin-Elmer Cetus; 5 egység/ml) adunk. A reakcióelegyet ezután PCR készülékbe helyezzük (DNA Thermal Cycler, Perkin-Elmer Cetus), melyet az alábbi progammal működtetünk:

’C-on 2 perc;

’C-on 30 másodperc; majd 19 ciklusban:

végtérfogatban). felülrétegezzük.

94	’C-on	30
55	’C-on	30
72	’C-on	30

másodperc; másodperc; másodperc.

és

A program végén a reakcielegyet tartalmazó fiolát kivesszük a készülékből, a vizes fázist új fiolába tesszük, fenol és kloroform 50:50 térfogatarányú elegyével extraháljuk, etanolos kicsapást végzünk, és a DNS-t standard eljárással kinyerjük. A kapott anyagot később megfelelő kezelésekkel vektorba inszertáljuk.

A változatok előállításának egy másik módja a kazetta mutagenezis, amely a Wells és mtsi. által leírt eljáráson alapul (Gene, 34. 315, 1985). Ennél az eljárásnál a ·· ♦ • ·

- 147 kiindulási anyag a mutációval módosítani kívánt mpl ligandum DNS-t tartalmazó plazmid (vagy más vektor). Először azonosítjuk a mutálni kívánt mpl ligandum DNS kodonjait. Az azonosított mutációs helyiek) mindkét oldalén egyedi restrikciós endonukleázos helynek kell lenni. Ha nincsenek ilyen felismerési helyek, a fentebb leírt oligonukleotid-közvetítette mutagenezis módszerrel kell kialakítani ezeket, az mpl ligandum DNS megfelelő helyein. Miután a restrikciós helyeket bevittük a plazmidba, a plazmidot ezeknél hasítva linearizáljuk. Standard kétszálú oligonukleotidot szintetizálunk.

restrikciós helyek közötti, de a kívánt mutációkat tartalmazó DNS szekvenciáját kódolja. A két szálat külön-külön szintetizáljuk, majd standard eljárással egymáshoz hibridizáljuk őket. A kétszálú oligonukleotidot nevezzük kazettának, melyet úgy terveztünk, hogy 3' és 5' végei kompatibilisek legyenek a linearizált plazmid végeivel, miáltal közvetlenül a plazmidba ligálható, s ennek következtében a plazmid a mutált mpl ligandum

DNS-szekvenciát tartalmazza.

eljárásokkal amely a (C) Nukleinsav inszercié.ia replikálható vektorba

A természetes mpl ligandum polipept.idet vagy annak változatát kódoló nukleinsavat (pl. cDNS vagy genomiális DNS) további klónozás (DNS amplifikálás) vagy expresszió céljából replikálható vektorba inszertáljuk. Sok vektor áll rendelkezésre; ezek közül a megfelelő kiválasztása attól • ·

- 148 függ, hogy (1) a vektort DNS amplifikáláshoz vagy DNS expresszióhoz kívánjuk-e alkalmazni; (2) milyen a vektorba inszertálni kívánt nukleinsav mérete; és (3) milyen sejtet kívánunk a vektorral transzformálni. A vektorok, funkciójuktól (DNS amplifikáció vagy DNS expresszió) és a velük kompatibilis gazdasejttől függően, különböző komponenseket tartalmaznak. A vektor komponensek közé általában (nem kizárólagosan) az alábbiak tartoznak: szignál szekvencia, replikációs kezdőhely (origó), egy vagy több marker gén, enhancer elem, promoter és transzkripciós terminátor szekvencia.

(i) Szignál szekvencia komponens

A találmány szerinti mpl ligandum nemcsak közvetlenül expresszálható, hanem heterológ polipeptiddel, előnyösen szignál szekvenciával vagy más, az érett protein vagy polipeptid N-terminálisén specifikus hasítási hellyel rendelkező polipeptiddel alkotott fúzióként is. A szignál szekvencia általában a vektor komponense vagy a vektorba inszertálni kívánt mpl ligandum DNS része lehet. Olyan heterológ szignál szekvenciát kell kiválasztani, amelyet a gazdasejt felismer és feldolgoz (vagyis szignál peptidázzal hasít). Azon prokarióta gazdasejtek esetében, amelyek nem ismerik és nem dolgozzák fel a természetes mpl ligandum szignál szekvenciát, a szignál szekvenciát prokarióta szignál szekvenciával, például alkalikus foszfatázzal, penicillinázzal, Ipp-vel vagy hőstabil enterotoxin II leader

149 szekvenciákkal helyettesítjük. Az élesztőben való szekrécióhoz a szignál szekvencia pl. élesztő invertázzal, alfa faktorral vagy savas foszfatáz leader szekvenciával, a C. albicans glüko-amiláz leader szekvenciával (1990. április

4-én közrebocsátott EP 362,179 számú európai szabadalom) vagy az 1990. november 15. én közrebocsátott, WO 90,/13646 számú szabadalomban leírt szignál szekvenciával helyettesíthető. Az emlőssejtekben való expresszióhoz a természetes szignál szekvencia (azaz az mpl ligandum preszekvencia, amely normális esetben az mpl ligandum eredeti emlőssejtjeiből történő in vivő szekrécióját irányítja) megfelelő, bár egyéb emlős szignál szekvenciák is alkalmasak lehetnek, mint például az egyéb mpl ligandum polipeptidekből vagy más állatfajokból azonos mpl ligandumából származó szignál szekvenciák, az azonos vagy rokon fajok szekretált polipeptidjelből származó szignál szekvenciák, valamint a virális szekréciós leader szekvenciák, mint pl. a herpes simplex gD szignál szekvencia.

(ii) Replikációs kezdőhely komponens

Az expressziós és klónozó vektorok egyaránt tartalmaznak olyan nukleinsav-szekvenciát, amely lehetővé teszi, hogy a vektor egy vagy több kiválasztott gazdasejtben replikálódjon. A klónozó vektorokban ez a szekvencia általában olyan, amely lehetővé teszi, hogy a vektor a gazda kromoszómális DNS-étől függetlenül replikálódjon, és replikációs kezdőhelyet vagy autonóm replikációra képes

150 szekvenciákat foglal magában. Az ilyen szekvenciák számos baktériumhoz, élesztőhöz és vírushoz jól ismertek. A pBR322 plazmid replikációs kezdőhelye a legtöbb Gram-negatív baktérium számára megfelelő; a 2 u plazmid kezdőhely az élesztők számára alkalmas, míg a különböző virális kezdőhelyek (SV40, polioma, adenovírus, VSV vagy BPV) az emlőssejtekben alkalmazott klónozó vektorokhoz alkalmasak. A replikációs kezdőhely komponens általában nem szükséges az emlős expressziós vektorokhoz (rendszerint csak az SV40 kezdőhely alkalmazható, mivel a korai promotert tartalmazza).

A legtöbb expressziós vektor ingázó” (shuttle) vektor, vagyis legalább egy organizmus osztályban képesek replikálódni, de az expresszióhoz egy másik organizmusba vihetők át. Például, egy vektort E. ccli-ban klónozunk, majd ugyanezt a vektort az expresszióhoz élesztő vagy emlős sejtekbe transzfektáljuk, még akkor is, ha nem képes a gazdasejt kromoszómájától függetlenül replikálódni.

DNS-t gazdasejt genomjába történő inszercióval is amplifikálhatunk. Ezt gazdaként Bacillus fajok alkalmazásával könnyen megvalósíthatjuk, például oly módon, hogy a vektorba olyan DNS-szekvenciát foglalunk, amely komplementer egy Bacillus genomiális DNS-ben található szekvenciával. A Bacillus e vektorral végzett transzfekciója a genommal homológ rekombinációt, és az mpl ligandum DNS inszercióját eredményezi. Ebben az esetben az mpl ligandumot

151 kódoló genomiális DNS kinyerése összetettebb feladat, mint egy külsőleg replikáit vektor esetében, hiszen az mpl ligandum DNS kivágásához restrikciós enzimes emésztésre van szükség.

(iii) Szelekciós gén komponens

Az expressziós és klónozó vektorok tartalmazhatnak szelekciós gént is, melyet szelektálható markernek is nevesünk. Ez a gén olyan proteint kódol, amely nélkülözhetetlen a szelektív tenyésztő tápközegben növesztett, transzformált gazdasejtek életbenmaradásához és fejlődéséhez. A szelekciós gént tartalmazó vektorral nem transzformált gazdasejtek nem maradnak életben az ilyen tenyésztő tápközegben. A jellemző szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek (a) antibiotikumokkal vagy más toxinokkal (pl. ampicillin, neomicin, metotrexát vagy tetraciklin) szemben rezisztenciát biztosítanak; (b) kiegészítik az auxotróf deficinenciákat; vagy (c) a komplex tápközegből nem hozzáférhető, kulcsfontosságú tápanyagokat biztosítanak, pl. a Bacillus fajok számára D-alanin racemázt kódoló gén.

A szelekció egyik példájaként olyan hatóanyagot alkalmazunk, amely megakadályozza a gazdasejtek növekedését. Azok a sejtek, amelyeket sikeresen transzformáltunk a heterológ génnel, expresszálnak egy proteint, amely rezisztenenciát biztosít az említett hatóanyaggal (droggal) szemben, és ·«··

152 ezáltal a sejtek túlélik a szelekciót. Az ilyen domináns szelekcióhoz alkalmazott hatóanyagok példája a neomicin (Southern és mtsi., J. Molec. Appl. Génét., 1, 327, 1982), a mikofenolsav (Mulligan és mtsi., Science, 209. 1422, 1980) vagy a hygromicin (Sugden és mtsi., Mól. Cell. Bioi., 5, 410-413, 1985). E három példában eukarióta szabályozás alatt álló bakteriális géneket alkalmazunk, melyek rezisztenciát biztosítanak a megfelelő hatóanyaggal szemben; G418 vagy neomicin (geneticin), xgpt (mikofenolsav), illetve hygromicin.

Az emlőssejtekhez alkalmas egyéb szelektálható markerek példái azok, amelyek lehetővé teszik az mpl ligandum nukleinsavat felvenni képes sejtek azonosítását; ilyen pl. a dihidrofolát reduktáz (DHFR) vagy a timidin kinéz. Az emlőssejt transzformánsokat szelekciós nyomás hatásának tesszük ki, hogy a marker felvétele folytán kizárólag a transzformánsok maradjanak életben. A szelekciós nyomást úgy fejtjük ki, hogy a transzformánsokat olyan körülmények között tenyésztjük, melyekben a szelekciós ágens koncentrációját folyamatosan változtatjuk, ami a szelekciós gén és az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS amplifikációját eredményezi. Az amplifikáció az a folyamat, melynek során az olyan gének, melyekre a növekedés szempqntjából kulcsfontosságú protein termelése miatt nagy szükség van, a rekombináns sejtek egymást követő generációinak kromoszómáin belül egymás után ismétlődnek. Az amplifikált DNS-ből nagyobb mennyiségű mpl ligandum

153

szintetizálódik.

Például, a DHFR szelekciós génnel transzformált sejteket először úgy azonosítjuk, hogy az összes transzformánst metotrexátot (Mtx; a DHFR kompétitív antagonistája) tartalmazó tenyésztő tápközegben tenyésztjük. A vad típusú DHFR alkalmazása esetén alkalmas gazdasejt a DHFR aktivitás szempontjából hiányos kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonal, melyet Urlaaüb és Chasin leírása szerint készítünk és szaporítunk (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77. 4216, 19.80). A transzformált sejteket ezután nagyobb mennyiségű metotrexáttal hozzuk érintkezésbe, ami a DHFR gén több kópiájának szintézisét, és ennek velejárójaként, az expressziós vektorokat tartalmazó más DNS (mint pl. az mpl kódoló DNS) több kópiájának szintézisét Ez az amplifikációs technika bármilyen, egyébként alkalmas gazdasejttel (pl. ATCC No CCL61 CHO-Kl) alkalmazható, az endogén DHFR jelenlétének ellenére is, ha például az Mtx-re nagymértékben rezisztens, mutáns DHFR gént alkalmazunk (EP 117,060). Más módon, az mpl ligandumot, vad típusú DHFR proteint és más szelektálható markert (pl. amino-glikozid-3'-foszfo-transzferázt (APH)) kódoló DNS-szekvenciákkal transzformált vagy ko-transzformált gazdasejtek (különösen az endogén DHFR-t tartalmazó vad típusú gazdasejtek) a szelektálható markerhez való szelektáló ágenst (mint pl. amino-glikozidos antibiotikumot, pl. kanamycint, neomycint vagy G418-at) tartalmazó ligandumot eredményezi.

tápközegben mutatott sejtnövekedésük alapján szelektálhatok ·· : ; · ··· ···· ·· ··· ···· ·

- 154 (ld. 4,965,199 számú Egyesült Államok-beli szabadalom).

Élesztőkben alkalmazható szelekciós gén az YRp7 élesztő plazmidban található trpl gén (Stinchcomb és mtsi., Natúré,

282, 39, 1979; Kingsman és mtsi., Gene, Z, 141, 1979; vagy

Tschemper és mtsi., Gene, lű, 157, 1980). A trpl gén olyan mutáns élesztő törzs számára biztosít szelekciós markert, amely nem képes triptofánon növekedni, mint pl. az ATCC No. 44076 vagy PEP4-1 (Jones, Genetics, 85. 12, 1977). Az élesztő gazdasejt genomban trpl lézió jelenléte hatásos körülményt biztosít a transzformáció triptofán hiányában mutatott növekedés alapján történő kimutatásának. Hasonlóan, a Leu2-deficiens élesztőtörzseket (ATCC No. 20622 vagy

38626) a Leu2 gént hordozó, ismert plazmidokkal egészítjük ki.

(iv) Promoter komponens

Az expressziós és klónozó vektorok rendszerint tartalmaznak egy gazdaorganizmus által felismert promotert, amely működőképesen kapcsolódik az api ligandum nukleinsavhoz. A promoterek nem transzlálódó szekvenciák, melyek egy strukturális gén start kodonjától upstream (5') irányban helyezkednek el (általában kb. 100-1000 bp távolságon belül), és egy adott nukleinsav-szekvencia transzkripcióját és transzlációját szabályozzák, mint pl. az api ligandum nukleinsav-szekvenciáét, melyhez működőképesen kapcsolódnak.

Az ilyen promoterek lehetnek indukálhatok és konstitutívak.

155

Az indukálható promoterek a szabályozásuk alatt álló DNS fokozott szintű transzkripcióját a tenyésztési feltételek valamilyen megváltozásának (pl. egy tápanyag jelenléte vagy hiánya vagy a hőmérséklet változása) hátasára indítják be. Jelenleg sok, különböző potenciális gazdasejt által felismert promoter ismeretes. Ezek a promoterek úgy kapcsoljuk működőképesen az mpl ligandumot kódoló DNS-hez, hogy a forrás DNS-ből restrikciós enzimes emésztéssel eltávolítjuk a promotert, és az izolált promoter-szekvenciát a vektorba inszertáljuk. A természetes mpl ligandum promoter-szekvenciája és sok heterológ promoter is alkalmazható az mpl ligandum DNS amplifikációjának és/vagy expressziójának irányításához, azonban a heterológ promotereket részesítjük előnyben, mivel általában magasabb szintű transzkripciót és az expresszált mpl ligandum nagyobb hozamát teszik lehetővé, mint a természetes mpl ligandum promoter.

A prokarióta gazdák esetében alkalmas promoterek közé tartoznak a β-laktamáz és laktóz promoter rendszerek (Chang és mtsi., Natúré, 275. 615, 1978; és Goeddel és mtsi., Natúré, 281. 544, 1979), az alkalikus foszfatáz, triptofán (trp) promoter rendszer (Goeddel, Nucleic Acids Rés., β, 4057, 1980; és EP 36,776 számú európai szabadalom), valamint a hibrid promterek, mint pl. a tac promoter (deBoer és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80. 21-25, 1983). Ezeken kívül egyéb ismert bakteriális promoterek is alkalmasak.

Nukleotid-szekvenciáik ismertek, így a szakemberek • · • ··· ·

- 156 — a kívánt restrikciós helyek beiktatása érdekében linkerek vagy adaptorok alkalmazásával — működőképesen hozzáligálhatják őket az mpl ligandumot kódoló DNS-hez (Siebenlist és mtsi., Cell, 20, 269, 1980). A bakteriális rendszerekben alkalmazható promoterek az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva tartalmazhatnak Shine-Dalgarno (S.D.) szekvenciát is.

Eukariótákhoz is ismeretesek promoter-szekvenciák. Gyakorlatilag valamennyi eukarióta gén rendelkezik AT-gazdag régióval, amely a transzkripció kezdőhelyétől upstream (5) irányban kb. 25-30 bázis távolságra található. Sok gén transzkripciós kezdőhelyétől upstream irányban 70-80 bázis távolságban található egy másik szekvencia is, a CXCAAT régió, melyben X bármilyen nukleotid lehet. A legtöbb eukarióta gén 3'-végén AATAAA szekvencia található, amely a poli(A) farok kódoló szekvencia 3'-végéhez való hozzákapcsolásának szignálja lehet.

Az élesztő gazdasejtek esetében alkalmazható promoter-szekvenciák példái közé tartoznak a 3-foszfo-glicerát kinázhoz való promoterek (Hitzeman és mtsi., J. Bioi. Chem., 255. 2073, 1980 vagy más glikolízises enzimekéhez (mint pl. az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfo-glicerát mutáz, piruvát kináz, trióz-foszfát izomeráz, foszfo-glükóz izomeráz és glükokináz) való promoterek (Hess és mtsi., J. Adv. Enzyme

157

Reg., Ί., 149, 1968; és Holland, Biochemistry, 12, 4900,

1978).

Az egyéb élesztő promoterek, melyek indukálhatok és megvan az az előnyük, hogy a transzkripciót a növekedési feltételek szabályozzák, az alkohol dehidrogenáz 2-höz, az izocitokróm C-hez, a savas foszfatázhoz, a nitrogén anyagcserével összefüggő lebontó enzimekhez, a metallotioneinhez, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázhoz, és a maltóz és galaktóz felhasználásért felelős enzimekhez való promoterek. Az élesztő expresszióban való alkalmazáshoz megfelelő vektorok és promoterek leírását ld. Hitzeman és mtsi., EP 73,657A számú európai szabadalmi bejelentés. Az élesztő promoterekkel előnyösen alkalmazhatók az élesztő enhancerek

IS .

Emlőssejtekben a vektorokból származó mpl ligandum transzkripciót vírusok (pl. polioma vírus, baromfihimlő vírus [1989. július 5-én közrebocsátott UK 2,211,504 számú szabadalom], adenovírus [pl. adenovírus 2], szarvasmarha papilloma vírus, madár sarcoma vírus, cytomegalovírus, retrovírus, hepatitis B vírus, és legelőnyösebben SV40 vírus) genomjából származó promoterek szabályozzák, továbbá heterológ emlős promoterek, pl. aktin promoter vagy immunglobulin promoter, hősokk promoterek vagy az mpl ligandum szekvenciával normális esetben kapcsolatban álló promoter, feltéve, hogy ezek a promoterek kompatibilisek a gazdasejttel.

···· » · ·!· ···· • · · ·

- 158 Az SV40 korai és kései promotere SV40 restrikciós fragmentként könnyen előállítható, amely tartalmazza az SV40 replikációs kezdőhelyet is (Fiers és mtsi., Natúré, 273. 113, 1978; Mulligan és Berg, Science, 209. 1422-1427, 1980; Pavlakis és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78. 7398-7402, 1981). A humán citomegalovírus közvetlen korai promotere HindlII E restrikciós fragmentként könnyen kialakítható (Greenway és mtsi., Gene, 13, 355-360, 1982). A 4,419,446 számú Egyesült Államok-beli szabadalomban emlős gazdákban, vektorként szarvasmarha papilloma vírus alkalmazásával végzett DNS expresszálási rendszert írtak le. E rendszer módosítását a 4,601,978 számú Egyesült Államok-beli szabadalomban írták le (ld. még Gray és mtsi., Natúré, 295. 503-508, 1982 [immun interferont kódoló cDNS expresszálása majomsejtekben]; Reyes és mtsi., Natúré, 297. 598-601, 1982 [humán β-interferon cDNS herpes simplex vírusból származó timidin kináz promoter szabályozása alatt történő expresszálása egérsejtekben]; Canaani és Berg, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 79. 5166-5170, 1982 [a humán interferon βΐ gén expresszálása tenyésztett egér- és nyúlsejtekben]; Gorman és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 23, 6777-6781, 1982 [bakteriális CAT szekvenciák expresszálása CV-1 majomvese sejtekben, csirke embrió fibroblasztokban, kínai hörcsög petefészek sejtekben, HeLa sejtekben és egér NIH-3T3 sejtekben, promoterként a Rous sarcoma vírus hosszú terminális ismétlődésének alkalmazásával]).

159 (v) Enhancer elem komponens

A találmány szerinti mpl ligandumot kódoló DNS magasabbrendű eukarióták által történő transzkripcióját gyakran úgy fokozzuk, hogy a vektorba egy enhancer szekvenciát inszertálunk. Az enhancerek a DNS cisz-működésű elemei (rendszerint 10-300 bp hosszúsággal), melyek úgy hatnak a promoterre, hogy fokozzák annak transzkripcióját. Az enhancerek viszonylagosan orientáció- és pozíció-függőek, és a transzkripciós egységtől 5' (Laimins és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78. 993, 1981) és 3' irányban (Lusky és mtsi., Mól. Cell. Bio., fi, 1108, 1983), intronon belül (Banerji és mtsi., Cell, fifi, 729, 1983), valamint magán a kódoló szekvencián belül (Osborne és mtsi., Mól. Cell Bio., 4, 1293, 1984) találhatók. Sok enhancer szekvencia ismert az emlős génekből (globin, elasztáz, albumin, alfa-fetoprotein és inzulin), azonban általában eukarióta sejt vírusból származó enhancer elemet alkalmazunk. Ezek példái közé tartozik a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő SV40 enhancer (100-270. bp), a cytomegalovírus korai promoter enhancer, a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő polyoma enhancer és az adenovírus enhancerek. Az eukarióta promoterek aktiválásához alkalmas enhancer elemeket illetően ld. még: Yaniv, Natúré, 297. 17-18, (1982). Az enhancer elem az mpl ligandum kódoló szekvenciájától 5' vagy 3' irányban illeszthető be, de előnyösen a promotertől 5' irányban helyezzük el.

160 (vi) Transzkripciós terminációs komponens

Az eukarióta gazdasejtekben (élesztők, gombák, rovarok, növények, állatok, ember, vagy más többsejtű organizmus sejtmagvas sejtjei) alkalmazott expressziós vektorok tartalmaznak a transzkripció leállításához és az mRNS stabilizálásához szükséges szekvenciákat is. Az ilyen szekvenciák álalában az eukarióta és virális DNS-ek vagy cDNS-ek 5' (esetenként 3') transzlálatlan régiójából nyerhetők. Ezek a régiók olyan nukleotid szegmenteket tartalmaznak, amelyek az mpl ligandumot kódoló mRNS transzlálatlan részében poliadenilált fragmentekként íródnak át (transzkripció).

(vii) Vektorok konstruálása és analízise

A fentebb felsorolt komponensek közül egyet vagy többet tartalmazó vektorok előállításához standard ligálási technikákat alkalmazunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS-fragmenteket hasítjuk, megfelelő méretűre vágjuk, és a kívánt plazmidhoz megfelelő alakban visszaligáljuk.

A kialakított plazmidokban a megfelelő szekvencia meglétének igazolása érdekében végzett analízishez a ligálási eleggyel E. coli K12 294-es törzset (ATCC No. 31446) transzformálunk, és sikeres transzformánsokat ampicillin- vagy tetraciklin-rezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformánsokból elkészítjük a plazmidokat, melyeket restrikciós

161 endonukleázos emésztéssel és/vagy Messing és mtsi. (Nucleic

Acids Rés., 2, 309, 1981) vagy Maxam és mtsi. (Methods in

Enzymology, fifi, 499, 1980) eljárásával végzett szekvenálással vizsgálunk.

(viii) Átmeneti expressziós vektorok

Találmányunk gyakorlati megvalósításában különösen hasznosak az olyan expressziós vektorok, amelyek lehetővé teszik az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS emlőssejtekben történő átmeneti expresszióját. Általában, az átmeneti expresszióhoz olyan expressziós vektort alkalmazunk, amely a gazdasejtben hatékonyan képes replikálódni, miáltal a gazdasejt az expressziós vektor sok példányát halmozza fel, s így az expressziós vektor által kódolt, kívánt polipeptidet magas szinten expresszálja (Sambrook és mtsi., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 16.17-16.22.). A megfelelő expressziós vektorból és gazdasejtből álló átmeneti expressziós rendszerek lehetővé teszik a klónozott DNS-ek által kódolt polipeptidek kényelmes pozitív azonosítását, továbbá az ilyen polipeptidek kívánt biológiai vagy fiziológiai tulajdonságokra történő screenelését. Ennek megfelelően, az átmeneti expressziós rendszerek találmányunkban az mpl ligandum polipeptid olyan analógjainak és változatainak azonosításában hasznosak, amelyek rendelkeznek az mpl ligandum polipeptid biológiai aktivitásával.

- 162 (ix) Gerinces sejt vektorok

Rekombináns gerinces sejttenyészetben az mpl ligandum szintéziséhez alkalmas egyéb eljárások, vektorok és gazdasejtek leírását ld. Gething és mtsi., Natúré, 293. 620-625, 1981; Mantel és mtsi., Natúré, 281. 40-46, 1979;

Levinson és mtsi., EP 117,060 és EP 117,058 számú európai szabadalmak. Az mpl ligandum emlőssejt tenyészetben való expressziójához különösen hasznos plazmid a pRK5 (EP 307,247, 5,258,287 számú Egyesült Államok-beli szabadalom) vagy pSVI6B (W0 91/08291 számú PCT közzétételi irat).

(D) A gazdasejtek szelekciója és transzformálása

A vektorok klónozásához vagy expresszálásához alkalmas gazdasejtek a fentebb leírt prokarióta, élesztő vagy magasabbrendű eukarióta sejtek. Az alkalmas prokarióták közé tartoznak a valódi baktériumok (eubacteria), mint a Gram-negatív és Gram-pozitív. organizmusok, pl. az E. coli, a Bacillus fajok (pl. B. subtilis), a Pseudomonas fajok (pl. P. aeruginosa), a Salmonella typhimurium vagy a Serratia marcescens. Az egyik előnyös E. coli klónozó gazda a 294-es

E. coli törzs (ATCC No. 31446), bár más törzsek is megfelelőek (pl. E. coli B, E. coli X1776 [ATCC No. 31537] és E. coli W3110 [ATCC No. 27325]). Ezeket a példákat csak jellemzésül, s nem korlátozó jelleggel említjük. A gazdasejt előnyösen minimális mennyiségű proteolitikus enzimet szekretálhat. Más lehetőség szerint, az in vitro klónozási

módszerek (pl. PCR vagy más nukleinsav polimeráz reakciók) alkalmasak.

Az mpl ligandumot kódoló vektorok gazdasejtjeiként a prokariótákon kívül eukarióta mikrobák, például fonalas gombák vagy élesztők is alkalmasak. Az alacsonyabbrendű eukarióta gazdasejtek közül a Saccharomyces cerevisiae vagy közönséges sütőélesztő a leggyakrabban használt gazdasejt, de széles kőimen alkalmazhatók egyéb fajok, nemzetségek és törzsek is, mint pl. a Schizosaccharomyces pombe (Beach és Nurse, Natúré, 290. 140, 1981; EP 139,383 számú, 1985. május 2-án közrebocsátott európai szabadalom), KIuyveromyces fajok (4,943,529 számú Egyesült Államok-beli szabadalom), mint pl. a K. lactis (Louvencourt és mtsi., J. Bacteriol., 737, 1983), a K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotoleráns és K. marxianus, yarrowia (EP 402,226 számú szabadalom), a Plchia pastoris (EP 183,070 számú szabadalom; Sreekrishna és mtsi., J. Basic Microbiol., 28. 265-278, 1988), a Candida fajok, a Trichoderma reesia (EP 244,234 számú szabadalom), Neurospora crassa (Case és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ifi, 5259-5263, 1979) és a fonalas gombák, mint pl. a Neurospora, Penicillium és Tolypocladium fajok (E0 91/00357 számú közrebocsátási irat, 1991. január

10.), valamint az Aspergillus fajok, mint pl. az A. nidulans (Ballance és mtsi., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 112. 284-289, 1983; Tilburn és mtsi., Gene, 26. 205-221, 1983; Yelton és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, fii, 1470-1474, 1984) és az A. niger (Kelly és Hynes, EMBO J., 4, 475-479,

164

1985).

A glikozilált mpl ligandum expressziójához alkalmas gazdasejtek többsejtű organizmusokból származnak. Az ilyen gazdasejtek komplex érési (processing) és glikozilálási aktivitással rendelkeznek. Elvileg bármilyen magasabbrendű eukarióta sejttenyészet alkalmazható, függetlenül attól, hogy gerines vagy gerinctelen élőlények sejtjeiről van szó. A gerinctelenek sejtjei közé növényi és rovarsejtek tartoznak. Számos baculovirus törzset és változatot, valamint nekik megfelelő rovar gazdasejteket azonosítottak olyan gazdákból, mint a Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti Aedes albopictus, Drosphila melanogaster és Bombyx móri (ld.

pl. Luckow és mtsi., Bio/Technology, £, 47-55, 1988; Miller és mtsi., Genetic Engineering, szerk: Setlow és mtsi., 8. kötet, 277-279. oldal, Plenum Publishing, 1986; Maeda és mtsi, Natúré, 315. 592-594, 1985). A tudományos irodalomban számos, transzfekcióhoz alkalmas vírus törzs leírása megtalálható, mint pl. az Autographa californica NPV L-l változata és a Bombyx móri NPV Bm-5 törzse. Az ilyen vírusok a találmány szerinti vírusként, elsősorban Spodoptera frugiperda sejtek transzfektálásához alkalmazhatók.

A gyapot, kukorica, burgonya, szójabab, petúnia, paradicsom és dohány sejttenyészetei szintén alkalmazhatók gazdaként. A növényi sejteket rendszerint bizonyos Agrobacterium tumefaciens törzsekkel inkubálva transzfektáljuk, mely baktériumtörzset előzetesen úgy manipuláltunk, hogy

165 tartalmazza az mpl ligandum DNS-t. A növényi sejttenyészet Agrobacterium turné faciens-szel végzett inkubálása során az mpl ligandumot kódoló DNS átkerül a növényi gazdasejtbe, és az így transzfektált gazdasejt (megfelelő körülmények között) expresszálja az mpl ligandum DNS-t. Ezenkívül, rendelkezésre állnak növényi sejtekkel kompatibilis szabályozó és jelző (szignál) szekvenciák is, mint pl. a nopalin szintáz promoter és poliadenilációs szignál szekvenciák (Depicker és mtsi., J. Mól. Appl. Gén., 1, 561, 1982). A T-DNS 780 génből upstream régiójából izolált DNS-szegmentek rekombináns DNS-t tartalmazó növényi szövetben képesek a növényben expresszálható gének transzkripcióját aktiválni, illetve a transzkripció szintjét fokozni (1989. június 21-én közrebocsátott EP 321,196 számú szabadalom).

Az utóbbi években a gerincessejtek szövettenyészetben való szaporítása rutinszerű eljárás lett (Tissue Culture, Academic Press, szerk: Kruse és Patterson, 1973). A hasznos emlős gazdasejtek példái közé tartozik az SV40-nel transzformált CV1 majomvese sejtvonal (COS-7, ATCC CRL

1651); a humán embrionális vesesejt-vonal (293-as sejtek vagy szuszpenziós tenyészetven való növekedéshez szubklónozott 293-as sejtek; Graham és mtsi., J. Gén. Virol., 59, 1977); újszülött hörcsög vesesejtek (BHK, ATCC CCL 10); kínai hörcsög petefészeksejtek/-DHFR (CHO, Urlaub és Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 4216,

1980); egér sertoli sejtek (TM4, Mather, Bioi. Repród., 23.

• ·

- 166 243-251, 1980); majom vesesejtek (CV1 ATCC CCL 70); afrikai zöld majom vesesejtek (VERO-76, ATCC CRL-1587); humán nyaki karcinoma sejtek (HELA, ATCC CCL 2); kutya vesesejtek (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo patkány májsejtek (BRL 3A, ATCC CRL 1442); emberi tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); emberi májsejtek (Hep G2, HB 8065), egér emlőtumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI sejtek (Mather és mtsi., Annals N.Y. Acad.

Sci., 383. 44-68, 1982; MRC 5 sejtek; FS4 sejtek és humán hepatoma sejtvonal (Hep G2).

A gazdasejteket a fentebb leírt, találmány szerinti expressziós és klónozó vektorokkal transzfektáljuk és, előnyösen, transzformáljuk, majd — a promoterek indukálásához, a transzformánsok szelekciójához vagy a kívánt szekvenciákat kódoló gének amplifikálásához megfelelően módosított — hagyományos tápközegben tenyésztjük.

A transzfekció azt jelenti, hogy a gazdasejt felveszi az expressziós vektort, függetlenül attól, hogy valóban expresszál-e kódoló szekvenciát. Számos transzfekciós eljárás ismert, mint pl. a kalcium-foszfátos és az elektroporációs módszer. A sikeres transzfekciót általában akkor ismerjük fel, ha a gazdasejtben a vektor működésének valamilyen jele mutatkozik meg.

A transzformáció a DNS valamilyen organizmusba történő bevitelét jelenti, s az így bevitt DNS replikálható, akár ·· ·· • · · · • · ♦ • · · ···· ·· ·· · • · · • · · • ····

- 167 456-457, előnyös.

extrakromoszómális elemként, akár a kromoszómába épülve. Az alkalmazott gazdasejtektől függően a transzformációt a gazdasejtekhez megfelelő standard eljárások felhasználásával végezzük. A prokariótákhoz és más, jelentős sejtfal határokkal rendelkező sejtekhez a kalcium-klorid alkalmazásával végzett kalciumos kezelést használjuk (ld. Sambrook és mtsi. fentebb említett kézikönyvének 1.82 szakasza). Bizonyos növényi sejtek transzformálásához

Agrobactez'ium tumefaciens fertőzést alkalmazunk (ld. Shaw és mtsi., Gene, 23. 315, 1983; és WO 89/05859 számú közzétételi irat, 1989. június 29.). A növények ultrahangos kezeléssel is transzfektálhatók (ld. WO 91/00358 számú közzétételi irat, 1991. január 10.). A sejtfal nélküli emlőssejtek esetében a Graham és van dér Eb által leírt (Virology, 52.

1978) kalcium-foszfátos kicsapási eljárás az Az emlős gazdasejt rendszerrel végzett transzformációk általános jellemzőit Axel írta le (4,399,216 számú Egyesült Államok-beli szabadalom, 1983. augusztus 16.) Az élesztők transzformálását rendszerint Van Solingen és mtsi. (J. Bact., 130. 946, 1977) és Hsiao és mtsi. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3829, 1979) szerint végezzük. A fentieken kívül a DNS sejtekbe történő beviteléhez egyéb módszerek is alkalmazhatók, mint pl. a sejtmagi injektálás, elektroporáció vagy protoplaszt fúzió.

(E) A gazdase.~itek tenyésztése

A találmány szerinti mpl ligandumm termeléséhez alkalmazott

168 prokarióta sejteket alkalmas tápközegben tenyésztjük (általános leírást ld. Sambrook és mtsi. kézikönyvében).

A találmány szerinti mpl ligandumm termeléséhez alkalmazott emlős gazdasejteket különböző tápközegekben tenyészthetjük. A gazdasejtek tenyésztéséhez szokványos tápközegek alkalmasak, mint pl. a Ham-féle F10 (Sigma), Minimál Esszenciális Tápközeg (MÉM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) és Dulbecco-féle módosított Eagle's tápközeg (DMEM, Sigma). A gazdasejtek tenyésztéséhez a fentieken kívül egyéb tápközegek is alkalmazhatók (Ham és Wallace, Meth. Enz., 58. 44, 1979; Barnes és Sato, Anal. Biochem., 102. 255, 1980;

4,767,704; 4,657,866; 4,927,762 vagy 4,560,655 számú

Egyesült Államok-beli szabadalmak; WO 90/03430; W0 87/00195; U.S. Patent Re. 30,985; valamint az elbírálás alatt álló U.S.S.N 07/592,107 és 07/592,141 számú, 1990. október 3-án benyújtott szabadalmi bejelentések) (a fenti források mindegyikét hivatkozásul említjük).

E tápközegek mindegyike szükség szerint hormonokkal és/vagy egyéb növekedési faktorokkal (pl. inzulin, transzferrin vagy epidermális növekedési faktor), sókkal (pl. nátrium-klorid, kalcium-, magnézium- és HEPES), nukleozidokkal antibiotikumokkal (pl(szervetlen vegyületek, foszfát-sók), pufferekkel (pl. (pl. adenozin és timidin),

Gentamycin™) nyomelemekkel melyek rendszerint mikromoláris tartományba eső koncentrációban vannak jelen), valamint glükózzal és azzal egyenértékű energiaforrással egészíthető

169 ·· · • · • · · más a

ki. Bármilyen alkalmazhatók, koncentrác iókban mint a hőmérséklet, pH és expresszióhoz kiválasztott alkalmazottakkal.

szükséges kiegészítő anyagok is szakemberek számára ismert

Az alkalmazott tenyésztési feltételek, hasonlók, megegyeznek az gazdasejtekhez korábban t a1álmányunkban említett gazdasejtek in vitro tenyészetben, vonatkoznak.

valamint gazdaállatban lévő sejtekre (F) A gén amolifikáció/exuresszió detektálása

A gén amplifikációja és/vagy expressziója egy mintában közvetlenül mérhető, pl. az mRNS transzkripciójának mennyiségi meghatározására végzett hagyományos Southern biot, northern biot technikával (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 5201-5205, 1980), dót biot technikával (DNS analízis) vagy in situ hibridizációval, megfelelően jelölt próbák alkalmazásával. Különböző jelölőanyagok alkalmazhatók, legáltalánosabban radioaktív izotópok, elsősorban ³²P-izotóp. A fentieken kívül egyéb technikák is alkalmazhatók, mint például a biotinnal módosított nukleotidok polinukleotidokba történő bevitele. A biotin kötődési helyként szolgál az avidinhez vagy antitestekhez, melyek különböző jelölőanyagokkal, pl. radioaktív nuklidokkal, fluoreszkáló anyagokkal, eznimekkel és hasonlókkal jalölhetők. Más lehetőség szerint, specifikus

170 duplexeket (DNS duplexeket, RNS duplexeket, DNS-RNS hibrid duplexeket vagy DNS-protein duplexeket) felismerő antitestek alkalmazhatók, melyek jelölhetők. A vizsgálatot olyan helyen végezzük, ahol a duplex egy felülethez kötődik, így a felületen a duplex kialakulása után kimutatható a duplexhez kötődött antitest jelenléte.

expresszioja.

alkalmazása

A génexpresszió immunológiai módszerekkel is mérhető, például szövetmetszetek immun-hisztokémiai festésével és sejttenyészet vagy testfolyadékok vizsgálatával, melyekkel közvetlenül mennyiségileg értékelhető a géntermék

Immun-hisztokémiai festési technikák esetén egy sejtmintát készítünk (előnyösen dehidratálással és fixálással), melyet a géntermékre specifikus jelölt antitesttel reagáltatunk (jelölőanyagként rendszerint vizuálisan detektálható, pl. enzimatikus, fluoreszcens, lumineszcens és hasonló jelölőanyagokat alkalmazunk). Egy, a találmányunkban alkalmazható, különösen érzékeny festési technikát Hsu és mtsi. írtak le (Am. J. Clin. Path., 25, 734-738, 1980).

A minta folyadékok immun-hisztokémiai festéséhez alkalmas antitesteek lehetnek monoklonálisak vagy poliklonálisak, s bármely emlősben termeltethetők.. A antitesteket alkalmas módon egy természetes mpl ligandum polipeptid vagy a találmány szerinti DNS-szekvenciákon alapuló szintetikus peptid ellen alakítjuk ki (ld. később).

171 (G) Az mól ligandum polipeptid tisztítása

Az mpl ligandumot előnyösen szekretált polipeptiáként nyerjük ki a tenyésztő tápközegből, azonban kinyerhető a gazdasejt lizátumából is, ha szekréciós szignál nélkül közvetlenül expresszálódik.

Ha az mpl ligandumot nem humán eredetű rekombináns sejtben expresszáljuk, az mpl ligandum tökéletesen mentes más, humán eredetű proteinektől vagy polipeptidektől, azonban rendszerint ilyen esetekben is szükség van az mpl ligandum más rekombináns sejtproteinektől vagy polipeptidektől való megtisztítására, hogy olyan készítményeket kapjunk, melyek lényegében homogének, mint az mpl ligandum önmagában. Első lépésként a tenyésztő tápközeget vagy lizátumot a szemcsés sejttörmelék eltávolítása érdekében centrifugáljuk, majd a sejtmembrán és az oldható proteinek frakcióját elkülönítjük. Más lehetőség szerint szokványos protein-koncentráló filterek (pl. Amicon vagy Millipore Pellicon ultrafiltrációs készülékek) alkalmazhatók. Az mpl ligandumot ezután az oldható protein frakcióból vagy a tenyészet lizátum membrán frakciójából tisztíthatjuk, attól függően, hogy az mpl ligandum membrán kötött-e vagy sem. Az mpl ligandumot ezután kisózással vagy különböző gélek alkalmazásával végzett ioncserével vagy kromatográfiával megtisztítjuk a szennyező oldható proteinektől és polipeptidektől. Az említett gélekként a proteintisztításban általánosan alkalmazott akril-amidot, agarózt, dextránt, cellulózt és hasonlókat ·· · • ·

- 172 használunk. A proteintisztításhoz alkalmas kromatográfiás eljárások példái közé tartozik az immun-affinitási kromatográf ia (pl- anti-h/npl ligandum monoklonális antitesttel); receptor-affinitási kromatográfia (pl. mpl-lgG vagy protein A Sepharose alkalmazásával); hidrofób kölcsönhatási kromatográfia (HIC; pl. éter, butil vagy fenil Toyopearl), lektin kromatográfia (pl. Con A Sepharose, lencse lektin Sepharose), méretkizárásos kromatográfia (pl. Sephadex G-75), kation- és anioncserélő oszlopkromatográfia (pl. DEAE vagy karboxi-metil- és szulfo-propil-cellulóz) és reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC) (ld. pl. Urdal és mtsi., J. Chromatog., 296. 171, 1984; akik rekombináns humán IL-2 tisztításához két, egymást követő RP-HPLC lépést alkalmaznak). Adott esetben egyéb tisztítási lépések is alkalmazhatók, így az etanolos kicsapés, ammónium-szulfátos kicsapás, kromatofókuszálás, preparatív SDS-PAGE és hasonlók.

Azokat az mpl ligandum változatokat, melyekből aminosavakat deletáltunk, vagy amelyek inszertált vagy szubsztituált aminosavakat tartalmaznak, a természetes mpl ligandumhoz hasonló módon nyerjük ki, figyelembe véve a változatatás által okozott lényeges eltéréseket. Például, az mpl ligandum egy másik proteinnel vagy polipeptiddel, például bakteriális vagy virális antigénnel képzett fúziója elősegíti a tisztítást; ilyen esetben az antigén elleni antitestet tartalmazó immun-affinitási oszlopot alkalmazhatunk a fúziós polipeptid adszorbeálásához. Az mpl ligandum

173 • · · • · · • · · »··· ·« • · • · · ··· — legalább egy megmaradt epitóphoz való kötéssel történő — adszorbeálásához immun-affinitási oszlopok alkalmazhatók, mint pl. a poliklonélis nyúl anti-mpl ligandum oszlop. Más lehetőség szerint, kromatográfiával is az mpl ligandum affinitási tisztítható, amihez (előnyösen) immobilizált gyantához (pl. Affi-Gel 10 [Bio-Rad, Richmond, CA]) kapcsolt, tisztított mpl-IgG-t alkalmazunk. A tisztítás során a proteolitikus lebontás megakadályozása érdekében inhibitort, pl. fenil-metil-szulfonil-fluoridot alkalmazhatunk, az esetleges fertőzések kifejlődésének megelőzése érdekében pedig antibiotikumok használhatók. Tudni kell, hogy a természetes mpl ligandumhoz alkalmas tisztítási eljárások módosításokat igényelhetnek, hogy a rekombináns sejttenyészetben expreszált mpl ligandumhoz vagy változataihoz megfelelőek legyenek.

proteáz (PMSF) (H) Az mpl ligandum oolipe-ptid kovalens módosításai

Az mpl ligandum polipeptid kovalens módosításai a találmány tárgykörébe tartoznak. A természetes mpl ligandumban és az mpl ligandum aminosav változataiban egyaránt kialakíthatók kovalens módosítások. A legfeljebb kb. 40 aminosav-gyököt tartalmazó mpl ligandum fragment változatok kémiai szintézissel vagy az mpl ligandum teljes hosszúságú alakjának (vagy változatának) enzimatikus vagy kémiai hasításával kényelmesen előállíthatok. Az mpl ligandum vagy fragmentjei kovalens módosításainak egyéb típusait úgy visszük be a molekulába, hogy az mpl ligandum vagy

- 174 fragmentjei megcélzott aminosav-gyökeit szerves dérivatizáló ágenssel reagáltatjuk, amely képes reagálni a kiválasztott oldalláncokkal vagy az N- vagy C-terminális gyökökkel.

A ciszteinil-gyököket leggyakrabban alfa-balogén-acetátokkal (és a megfelelő aminokkal) reagáltatjuk, például klór-ecetsavval vagy klór-acetamiddal, hogy karboxi-metil- vagy karboxi-amido-metil-származékokat kapjunk. A ciszteinil gyököket bróm-trifluor-acetonnal, alfa-bróm-G-(5-imidazoil)-propionsawal, klór-acetil-foszfáttal, N-alkil-maleimiddel,

3-nitro-2-piridil-diszulfiddal, metil-2-piridildiszulfiddal, p-klór-higany-benzoáttal, 2-klór-higany-4-nitro-fenollal vagy klór-7-nitro-benzo-2-oxa-l,3-diazollal is reagáltathatjuk.

A hisztidil-gyoköket dietil-pirokarbonáttal 5,5-7,0 pH mellett reagáltatjuk, mivel ez a szer viszonylag specifikus a hisztidil oldalláncra. A para-bróm-fenacil-bromid szintén hasznos; ebben az esetben a reakciót előnyösen 0,1 M nátrium-kakodilátban, 6,0 pH-η végezzük.

A lizinil- és N-terminális gyököket borostyánkősav- vagy más karbonsav-anhidriddel reagáltatjuk. Az ilyen szerekkel végzett derivatizálás megváltoztatja a lizinil-gyökök töltését. Az aminocsoportot tartalmazó egyéb gyökök dérivatizálásához alkalmas reagensek közé tartoznak az imido-észterek, mint pl. a metil-pikolin-imidát, piridoxálfoszfát, piridoxál, klór-bór-hidrid, trinitro-benzol··

- 175 -szulfonsav, O-metil-izokarbamid, 2,4-pentán-dion, továbbá alkalmazható a glioxiláttal végzett transzamináz-katalizálta reakció.

Az arginil-gyököket egy vagy több hagyományos reagenssel (többek között fenil-glioxállal, 2,3-bután-dionnal,

1,2-ciklohexán-dionnal és ninhidrinnel) reagáltatva módosítjuk. Az arginin-gyökök módosításához arra van szükség, hogy a reakciót — a guanidin funkcióscsoport nagy pK_a értéke miatt — lúgos körülmények között végezzük. Ezenkívül, a fenti reagensek reagálhatnak a lizin csoportjaival, valamint az arginin epszilon aminocsoportjavai is.

A tirozil-gyökök specifikus módosítása (különös tekintettel a spektrális jelölőanyagok bevitelére) aromás diazónium vegyületekkel vagy tetranitro-metánnal végzett reakcióval valósítható meg. Az O-acetil-tirozil változatok és a 3-nitro származékok kialakításához legáltalánosabban N-acetil-imidazolt és tetranitro-metánt alkalmazunk. A tirozil-gyököket ¹²⁵I- vagy ¹³¹I-izotóp alkalmazásával jódozzuk, hogy a rádióimmunvizsgálatban alkalmazható jelölt proteineket kapjunk (a fentebb leírt klór-amin T eljárás alkalmazható).

A karboxil oldalláncok (aszpartil- vagy gutamil-gyök) karbodiimidekkel [R-N=C=N-R'; ahol R és R' jelentése különböző alkilcsoportok; pl. l-ciklohexil-3-(2-morfolinil- 176 ♦· · · ϊ .

• · · · • · ··· ··· ···· ·

-4-etil)-karbodiimid) vagy l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetil-pentil)-karbodiimid] végzett reakcióval szelektíven módosíthatók. Az aszpartil- és glutamil-gyökökt ammóniumionokkal végzett reakcióval aszparaginil-, illetve glutaminil-gyökökké alakítható.

A bifunkciós ágenssekkel végzett módosítás az mpl ligandum vízben oldhatatlan hordozóhoz vagy felülethez történő keresztkötéséhez hasznos, ami elősegíti az anti-znpl ligandum antitestek tisztítását. Az általánosan alkalmazott keresztkötés-képző ágensek közé tartozik, pl. az 1,l-bisz(-diazo-acetil)-2-fenil-etán; a glutáraldehid; az N-hidroxi-szukcinimid-észterek, például a 4-azido-szalicilsawal képzett észterek, a homo-bi funkciós imidoészterek, beleértve a diszukcinimidil-észtereket, mint a 3,3'-ditio-bisz(szukcinimidil-propionát); valamint a bifunkciós maleimidek, mint pl. a bisz-N-maleimido-1,8-oktán. Az olyan derivatizáló ágensek, mint pl. a metil-3-[(p-azidő-fenil)-ditio]-propio-imidát, fénnyel aktiválható intermediereket eredményeznek, amelyek fény jelenlétében keresztkötések kialakítására képesek. Más lehetőség szerint, a proteinek immobilizálásához vízben oldható, reaktív anyagokat, például cián-bromiddal aktivált szénhidrátokat, valamint a 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 és 4,330,440 számú Egyesült Államok-beli szabadalmakban leírt reaktív anyagokat alkalmazzuk.

• · • · · · · ··· ···· ·· ···♦··· ·

- 177 Λ * A glutaminil- és aszparaginil-gyököket gyakran a megfelelő glutamil-, illetve aszparagil-gyökökké dezamináljuk, amit semleges vagy bázisos körülmények között végzünk. E gyökök dezaminált alakja a találmány tárgykörébe tartozik.

Az egyéb módosítások közé tartozik a prolin és lizin hidroxilezése, a szeril- vagy treonil-gyökök hidroxilcsoportjainak foszforilálása, a lizin, arginin és hisztidin oldalláncok alfa-aminocsoportjainak metilálása (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86. old., 1983), az N-terminális aminocsoport acetilézése és a C-terminális karboxilcsoport amidálása.

Az mpl ligandum polipeptid találány tárgyába tartozó kovalens módosításának egy másik típusa a polipeptid eredeti glikozilálási mintázatának megváltoztatását foglalja magában. A megváltoztatáson a természetes mpl ligandumban található egy vagy több szénhidrát-gyök delécióját, és/vagy a természetes mpl ligandumban eredetileg meg nem lévő glikozilálási helyek kialakítását értjük.

A polipeptidek glikoziláltsága jellemzően N- vagy O-kötésű. Az N-kötés azt jelenti, hogy a szénhidrát gyök egy aszparagin gyök oldalláncához kapcsolódik. Az aszparagin-X-szerin és aszparagin-X-treonin összeállítású tripeptid szekvenciák (ahol X jelentése a prolin kivételével bármilyen aminosav) a szénhidrát gyök aszparagin oldallánhoz • ·

- 178 való enzimatikus kapcsolásának felismerési szekvenciáit képezik. Ennek megfelelően, egy polipeptidben e tripeptid szekvenciák jelenléte potenciális glikozilálási helyet eredményez. az O-kötésű glikozilálás azt jelenti, hogy az N-acetil-galaktóz-amin, galaktóz vagy xilóz valamelyike egy hidroxilcsoporttal rendelkező aminosavhoz, leggyakrabban szerinhez vagy prolinhoz kapcsolódik, bár alkalmazható a

5-hidroxi-prolin vagy az 5-hidroxi-lizin is.

A glikozilálási helyeket alkalmas módon az aminosav-szekvencia megváltoztatásával visszük be az mpl ligandum polipeptidbe, hogy (az N-glikozilálási helyek esetén) a fentebb leírt tripeptid szekvenciákból egyet vagy többet tartalmazzon. Az O-glikozilálási helyek kialakítása esetén a szekvencia módosítását egy vagy több szerin vagy treonin addíciójával vagy szubsztitúciójával végezzük. Az egyszerűség kedvéért az mpl ligandum aminosav-szekvenciáját előnyösen a DNS szintjén végzett változtatásokkal módosítjuk, elsősorban az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS kiválasztott bázisoknál történő mutációjával, hogy olyan kodonokat alakítsunk ki, amelyek a kívánt aminosavat kódolják. A DNS mutáció(ka)t az mpl ligandum aminosav-szekvencia változatai című szakaszban leírtak szerint hozzuk létre.

Az mpl ligandumon a szénhidrát-gyökök száma növelésének egy másik módszere a glikozidok kémiai vagy enzimatikus kapcsolása. Ezek az eljárások azért előnyösek, mert nincs ····

179 szükség arra, hogy a polipeptidet olyan gazdasejtekben termeltessük, amelyek N- vagy O-glikozilálási képességgel rendelkeznek. Az alkalmazott kapcsolási módtól függően a cukor rész(eke)t (a) argininhez és hisztidinhez; (b) szabad karboxilcsoportokhez; (c) szabad szulfhidralcsoportokhoz (mint pl. a cisztein esetében); (d) szabad hidroxilcsoportokhoz (pl. a szerin, treonin vagy hidroxi-prolin esetében); (e) aromás gyökökhöz, mint pl. a fenil-alanin, tirozin vagy triptofán esetében; vagy (f) a glutamin amidcsoportjához kapcsoljuk. E módszerek leírását ld. WO 87/05330 számú közrebocsátási irat, 1987. szeptember

11.; és Aplin és Wriston, CRC Crit. Rec. Biochem., 259-306,

1981).

Az mpl ligandum polipeptiden lévő szénhidrát részeket kémiai vagy enzimatikus úton távolíthatjuk el. A kémiai deglikoziláláshoz a polipeptidet trifluor-metán-szulfonsavval vagy azzal egyenértékű vegyülettel hozzuk érintkezésbe. Ez a kezelés a legtöbb vagy valamennyi cukrot elhasítja, kivéve a kötő cukrokat (N-acetil-glükóz-amin vagy N-acetil-galaktóz-amin), miközben a polipeptidet érintetlenül hagyja. A kémiai deglikozilálás leírását ld. Hakimuddin és mtsi., Arch. Biochem. Biophys., 259. 52, 1987; és Edge és mtsi., Anal. Biochem., 118. 131, 1981). A polipeptidek szénhidrát-gyökeinek enzimatikus hasítása különböző endo- és exo-glikozidázok alkalmazásával valósítható meg (ld. Thotakura és mtsi., Meth. Enzymol.,

133, 350, 1987).

····

- 180 A potenciális glikozilálási helyeken történő glikozilálás a tunicamycin nevű vegyület alkalmazásával akadályozható meg (ld. Duskin és mtsi., J. Bioi. Chem., 257. 3105, 1982). A tunnicamycin gátolja a protein-N-glikozid kötések kialakulását.

Az mpl ligandum kovalens módosításának másik típusa abból áll, hogy az mpl ligandum polipeptidet a 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670417; 4,791,192 vagy 4,179,337 számú Egyesült Államok-beli szabadalmakban leírt módon valamilyen nem proteinjellegű polimerhez, pl. polietilén-glikolhoz, polipropilén-glikolhoz vagy polioxi-alkilénekhez kapcsoljuk.

Tudni kell, hogy az mpl-hez való kötődéshez optimális, a fentebb meghatározott immunológiai és/vagy biológiai aktivitással rendelkező mpl ligandum változat kiválasztásához a kinyert mpl ligandum változatok valamilyen screenelésére van szükség. Screenelhetjük a rekommbináns sejttenyészetben vagy vérplazmában mutatott stabilitást (pl.

proteolitikus hasítással szemben); az mpl-hez való affinitást; az oxidatív stabilitást; a fokozott mennyiségű szekréciós képességet és hasonlókat. Az mpl ligandum polipeptid immunológiai karakterének (pl. egy adott antitestre vonatkozó affinitásának) megváltozása például kompetitív típusú immunológiai vizsgálattal mérhető. A protein vagy polipeptid tulajdonságok (mint pl. a redox vagy hőstabilitás, hidrofóbitás, proteolízises lebontásra való ···· ·· • · · · · • · · ···· ······· ·

181 érzékenység) lehetséges változásait jól ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk.

Az mpl ligandum elleni antitestek előállításának általános eljárásai

Antitestek előállítása (i) Poliklonális antitestek

Az mpl ligandum polipeptidek vagy fragmentek elleni poliklonális antitesteket rendszerint állatokban alakítjuk ki, oly módon, hogy az mpl ligandummal és egy adjuvánssal többszöri szubkután (se) vagy intraperitoneális (ip) injektálást végzünk. Hasznos lehet az mpl ligandumot vagy a megcélzott aminosav-szekvenciát tartalmazó fragmentet egy, az immunizálni kívánt fajban immunogén hatású proteinhez, pl. keyhole limpet hemocianinhoz, szérumalbuminhoz, tiroglobulinhoz vagy konjugálni, amihez például maleimido-benzoil-szulfo-szukcinimidésztert (a cisztein-gyökökön keresztüli konjugációhoz), N-hidroxi-szukcinimidet (a lizin-gyökökön keresztüli konjugációhoz), glutáraldehidet, borostyánkősavanhidridet,

SOCl2-t vagy R¹N=C=NR-t, ahol R és R¹ különböző alkilcsoportok.

szarvasmarha inhibitorhoz használunk, szójabab tripszin bifunkciós ágenst

Az állatokat az mpl ligandum polipeptid vagy fragment, • · · · • · · • · · ···· ··

182 immunogén konjugátumok vagy származékok ellen immunizáljuk, oly módon, hogy 1 mg, illetve 1 ug peptidet vagy konjugátumot (nyulak, illetve egerek esetében) háromszoros térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal elegyítünk, és az oldatot több helyre intradermálisan injektáljuk. Egy hónap elteltével az állatoknak a peptid vagy konjugátum eredeti mennyiségének 1/5 vagy 1/10 részével, Freund-féle komplett adjuvánsban, szubkután injekcióval, az állat testén több helyre emlékeztetőoltást adunk. 7-14 nappal később az állatoktól vért veszünk, és a vérszérumot az mpl ligandum elleni antitest titerre vizsgáljuk. Az állatoknak addig adunk emlékeztetőoltásokat, míg a titer maximumot nem ér el. Az emlékeztetőoltást az állatoknak előnyösen ugyanazon mpl ligandum konjugátumával adjuk, azzal a különbséggel, hogy az mpl ligandum egy másik proteinhez és/vagy egy másik keresztkötés-képző reagenssel van konjugálva. A konjugátumok rekombináns sejttenyészetben fúziós proteinek alakjában is előállíthatok. Az immunreakció fokozásához aggregálószerek (pl. timsó) is alkalmazható.

(ii) Monoklonális antitestek

A monoklonális antitesteket lényegében homogén antitestek populációjából nyerjük, azaz olyan antitestek alkotta populációból, amelyek az esetleges természetesen előforduló, kis mennyiségben jelenlevő mutációktól eltekintve azonosak. Ennek megfelelően, a monoklonális jelző az antitest azon jellemzőjére vonatkozik, hogy nem különálló antitestek

183 keverékéről van szó.

A találmány szerinti monoklonális mpl ligandum antitestek például az elsőként Kohler és Milstein által leírt hibridoma eljárás (Natúré, 495, 1975) alkalmazásával vagy rekombináns DNS technikákkal (Cabilly és mtsi., 4,816,567 számú Egyesült Államok-beli szabadalom) állíthatók elő.

A hibridoma eljárásban egeret vagy más alkalmas gazdaállatot, például hörcsögöt, a fentebb leírtak szerint immunizálunk, hogy az immunizáláshoz alkalmazott proteinhez specifikusan kötődő antitesteket termelő (vagy azok termelésére képes) limfocitákat alakítsunk ki. Más lehetőség szerint, a limfociták in vitro immunizálhatok. A limfocitákat később alkalmas fúzionáló szer (pl. polietilén-glikol) alkalmazásával mieloma sejtekkel fuzionáljuk, hogy hibridoma sejteket alakítsunk ki (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103. old., Academic Press, 1986).

Az így előállított hibridoma sejteket megfelelő tenyésztő tápközegbe helyezzük és abban növesztjük. A tápközeg előnyösen egy vagy több olyan anyagot tartalmaz, amely gátolja a fúzionálatlan eredeti mieloma sejtek növekedését vagy életbenmaradását. Például, ha az eredeti mieloma sejtekből hiányzik a hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz (HGPRT vagy HPRT) enzim, a hibridomák tenyésztő tápközegébe hipoxantint, aminopterint és timidint tesztünk • · · « ···« ·· ·

- 184 (HAT tápközeg), mert ezek az anyagok megakadályozzák a HGPRT-deficiens sejtek növekedését.

Azok az előnyös mieloma sejtek, amelyek hatékony fúzióra képesek; elősegítik a kiválasztott antitest-termelő sejtek által termelt antitestek stabil, magas szintű expresszióját; és érzékenyek az olyan tápközegre, mint pl. a HAT tápközeg. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező mieloma sejtek közül az egér mieloma sejtvonalak az előnyösek, pl. az MOPC-21 és MPC-11 egér tumorokból származó sejtvonalak (melyek a Salk Institute Cell Distribution Center-bői [San Diego] szerezhetők be), valamint az SP-2 sejtek (American Culture Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA). Humán monoklonális antitestek előállításához leírták a humán mieloma és egér-humán heteromieloma sejtvonalak alkalmazását is (Kozbor, J. Immunoi., 133. 3001, 1984; Brodeur és mtsi., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63. old., Marcel Dekker Inc., New York, 1987).

A tenyésztő tápközeget, melyben a hibridoma sejteket növesztettük, az mpl ligandum elleni monoklonális antitestek termlésére vizsgáljuk. A hibridoma sejtek által termelt monoklonális antitestek kötési specifitását előnyösen immunprecipitációval vagy in vitro kötési vizsgálattal (radioaktív immunvizsgálattal [RIA] vagy enzim-kötött immunabszorbens vizsgálattal [ELISA]) határozzuk meg.

A monoklonális antitest kötési affinitása például Munson és • · · ·

- 185 Pollard Scatchard analízisével (Anal. Biochem., 107. 220, 1980) határozható meg.

Miután azonosítottuk a kívánt specifitású, affinitású és/vagy aktivitású antitesteket termelő hibridoma sejteket, a kiónok határhígítási eljárással szubklónozhatók és standard eljárásokkal növeszthetők (Goding, ld. fentebb). Az e célra alkalmas tenyésztő tápközegek közé tartozik pl. a Dulbecco-féle módosított Eagle's tápközeg vagy az RPMI-1640 tápközeg. A hibridoma sejtek állatokban in vivő hasvízkór tumorként is növeszthetők.

A szubklónok által szekretált monoklonális antitesteket hagyományos immunglobulin tisztítási eljárásokkal, pl. protein A Sepharose, hidroxi1-apatit kromatográfia, gélelektroforézis, dialízis vagy affinitási kromatográfia alkalmazásával elkülönítjük a tápközegtől, hasvízkór folyadéktól vagy vérszérumtól.

A találmány szerinti monoklonális antitesteket kódoló DNS hagyományos eljárások alkalmazásával könnyen izolálható és szekvenálható (pl. az egér antitestek nehéz és könnyű láncait kódoló génekhez specifikusan kötődni képes oligonukleotid próbák alkalmazásával) .. A találmány szerinti hibridoma sejtek az ilyen DNS előnyös forrásaiként szolgálnak. Izolálás után a DNS-t expressziós vektorokba helyezhetjük, melyeket később gazdasejtekbe, pl. majom COS sejtekbe, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe vagy • · · · ·

- 186 egyébként immunglobulint nem termelő mieloma sejtekbe transzfektálunk, és ezáltal a monoklonális antitestek a rekombináns gazdasejtekben szintetizálódnak.

DNS-t módosíthatjuk úgy is, hogy a humán nehéz és könyű lánc konstans doméneket kódol szekvenciákat a homológ egér szekvenciák helyére szubsztituáljuk (Cabilly és mtsi., ld. fentebb; Morrison és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81. 6851, 1984), vagy egy nem immunglobulin polipeptid kódoló szekvenciájának egészét vagy részét kovalensen az immunglobulin kódoló szekvenciájához kapcsoljuk.

Az ilyen nem immunglobulin polipeptideket rendszerint egy találmány szerinti antitest kosntans doménje helyére vagy egy találmány szerinti antitest egyik antigén-kapcsolódási helyének variábilis doménje helyére szubsztituáljuk, hogy kétértékű, kimérikus antitestet alakítsunk ki, amely egy mpl ligandumra specifikus antigén-kapcsolódási hellyel és egy másik antigénre specifikus másik antigén-kapcsolódási hellyel rendelkezik.

kiméra vagy hibrid antitestek szintetikus proteinkémiában ismert (pl. keresztkötés-képző szereket felhasználó) eljárások alkalmazásával in vítro is előállíthatok. Például, diszulfid-cserés reakcióval vagy tioéter kötés kialakításával immuntoxinok állíthatók elő. Az e célra alkalmas reagensek példái az imino-tiolát és a metil-4-merkapto-butirimidát.

·· ·· • · · · • · ·

187

Diagnosztikai célokra a találmány szerinti antitesteket rendszerint detektálható jelölőanyaggal jelöljük, amely — közvetlenül vagy közvetve — detektálható jelet képes adni. A detektálható jelölőanyag lehet pl. radioaktív izotóp (³H, ¹⁴C, ³²P, ^3eS, vagy ^12eI), fluoreszcens vagy kemilumineszcens vegyület (pl. fluoreszcein-izotiocianát, rodamin vagy luciferin), vagy enzim, pl. alkalikus foszfatáz, β-galaktozidáz vagy torma peroxidáz.

Az antitestek detektálható anyagokhoz való kapcsolásához ismert eljárások bármelyike alkalmazható, mint pl. a Hunter és mtsi. (Natúré, 144, 945, 1962), Dávid és mtsi., (Biochemistry, 13, 1014, 1974), Pain és mtsi. (J. Immunoi. Meth., 43, 219, 1981) és Nygren (J. Histochem. and

Cytochem., 33, 407, 1982) által leírt eljárások.

A találmány szerinti antitestek bármely ismert vizsgálati eljárásban alkalmazhatók, köztük a kompetitív kötési vizsgálatokat, közvetlen és közvetett szendvizs vizsgálatokat és az immunprecipitációs vizsgálatokat (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158. old., CRC Press, Inc., 1987)

A kompetitív kötési vizsgálatok egy jelölt standard (mely lehet egy mpl ligandum vagy annak immunológiailag reaktív része) azon tulajdonságán alapulnak, hogy korlátozott mennyiségű antitesttel való kötődést illetően képesek a vizsgálandó tesztmintával (mpl ligandummal) kompetícióba

- 188 lépni. A tesztmintában az mpl ligandum mennyisége fordítottan arányos a standard mennyiségével, amely az antitestekhez kötődik. A kötődött satandard mennyisége meghatározásának elősegítéséhez az antitesteket általában (a kompetíció előtt vagy után) oldhatatlanná tesszük, így az antitesthez kötődött standard és tesztminta kényelmesen elkülöníthető a kötetlenül maradt standardtól és tesztmintától.

A szendvics vizsgálatokban két antitestet alkalmazunk, melyek a detektálni kívánt protein (mpl ligandum) különböző immunogén részéhez vagy epitópjához képesek kötődni. E vizsgálat során a vizsgálandó tesztmintát egy szilárd hordozóhoz rögzített első antitesthez kapcsoljuk, majd egy második antitest kötődik a mitához, miáltal egy oldhatatlan három komponensű komplex alakul ki (Dávid és Greene, 4,376,110 számú Egyesült Államok-beli szabadalom). A második antitestet detektálható jelölőanyaggal jelölhetjük (közvelten szendvics vizsgálat) vagy jelölt anti-immunglobulin antitest alkalmazásával detektálhatjuk (közvetett szendvics vizsgálat). A szendvics vizsgálat egyik típusa az ELISA, melyben a detektálható anyag egy enzim (pl. torma peroxidáz).

(iii) Humanizált és humán antitestek

A nem humán antitestek humanizálási eljárásai jól ismertek.

Egy humanizált antitest általában tartalmaz egy vagy több ·« ·· • · · » • · · • ♦ · ·«·· ··

189 mtsi., ld.

variábilis olyan aminosav-gyököt, amelyek nem humán forrásból származnak (ezeket gyakran import gyököknek nevezzük, s jellemzően import variábilis doménból származnak). A humanizálást lényegében Winter és mtsi. eljárása szerint végezzük (Jones és mtsi., Natúré, 321. 522-525, 1986;

Riechmann és mtsi., Natúré, 332. 323-327, 1988; Verhoeyen és mtsi., Science, 239. 1534). Az eljárás során egy humán antitest megfelelő szekvenciáit rágcsáló CDR-ekkel vagy CDR szekvenciákkal helyettesítünk. Ennek megfelelően, a humanizált antitestek olyan kiméra antitestek (Cabilly és fentebb), amelyekben egy nem teljes humán domént egy más fajból származó, megfelelő szekvenciával helyettesítettünk. A gyakorlatban a humanizált antitestek jellemzően humán antitestek, melyekben néhány CDR gyököt és esetleg néhány FR gyököt rágcsáló antitestek analóg helyeiről származó gyökökkel helyettesítünk.

A humanizált antitestek előállításához használandó humán variábilis domének (nehéz és könnyű lánc egyaránt) kiválasztása nagyon lényeges az antigenitás csökkentése szempontjából. Az ún. legjobb illeszkedés (best fit) eljárás szerint egy rágcsáló antitest variábilis doménjének szekvenciáját az imsert humán variábilis dómén szekvenciák teljes könyvtárával szemben screeneljük. A rágcsáló szekvenciához legközelebb álló humán szekvenciát a humanizált antitest humán vázának (framework; FR) fogadjuk el (Sims és mtsi., J. Immunoi., 151. 2296, 1993; Chothia és Lesk, J. Mól. Bioi., 196. 901, 1987). Egy másik eljárás

190 értelmében egy adott könnyű és nehéz lánc alcsoportba tartozó humán szekvenciák konszenzus szekvenciájából származó vázat alkalmazunk. Ugyanaz a váz több különböző humanizált antitesthez alkalmazható (Carter és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, fifi, 4285, 1992; Presta és mtsi., J. Immunoi., 151. 2623, 1993).

Az is fontos szempont, hogy a humanizálni kívánt aktitestek megőrizzék az antigénre vonatkozó nagy affinitásukat és egyéb kedvező biológiai tulajdonságaikat. E cél elérése érdekében a humanizált antitesteket előnyösen az eredeti szekvenciák és különböző humanizált termékek vizsgálati eljárásával állítjuk elő, amihez az eredeti és a humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeit használjuk. A háromdimenziós immunglobulin modellek a szakemberek számára jól ismertek. Rendelkezésre állnak olyan számítógépes programok, amelyek illusztrálják és megjelenítik a kiválasztott jelölt (lehetséges) immunglobulin szekvenciák feltételezett háromdimenziós konformációs szerkezetét. E szerkezetek vizsgálata lehetővé teszi az aminosav-gyökök jelölt immunglobulin szekvenciák működésében játszott feltételezhető szerepének analízisét, vagyis azon gyökök vizsgálatát, amelyek befolyásolják a jelölt immunglobulin antigénhez való kötődési képességét. Ezzel a módszerrel a konszenzus és import szekvenciából FR gyökök szelektálhatok és kombinálhatok, miáltal megvalósíthatók a kívánt antitest jellemzők, pl. a célantigén(ek)re vonatkozó fokozott affinitás. A CDR gyökök általában közvetlenül befolyásolják ···· ····

191 az antigén megkötését (további részleteket illetően ld. 07/934,373 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, 1992. augusztus. 21., amely az 1991. június 14-én benyújtott 07/715,272 számú bejelentés részbeni folytatása).

Más lehetőség szerint előállíthatunk olyan transzgénikus állatokat (pl. egereket), amelyek immunizálás hatására (endogén immunglobulinok termelése nélkül) képesek a humán antitestek teljes készletének termelésére. Leírták például, hogy az antitest nehéz lánc kapcsoló régió (Jh) génjének homozigóta deléciója kimérikus és csíravonal mutáns egerekben az endogén antitest-termelés teljes gátlását eredményezi. Ha az ilyen csíravonal mutáns egerekbe átvisszük a humán csíravonal immunglobulin géneket, az antigén megjelenésével humán antitestek fognak termelődni (ld. pl. Jakobovits és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ββ, 2551-155, 1993; Jakobovits és mtsi., Natúré, 362.

255-258, 1993; Bruggermann és mtsi., Year in Immuno., 2, 33,

1993). Humán antitestek fág display könyvtárakban is előállíthatok (Hoogenboom és Winter, J. Mól. Bioi., 227. 381, 1991; Marks és msti., J. Mól. Bioi., 222. 581, 1991).

(iv) Bispecifikus antitestek

A bispecifikus antitestek előnyösen humán vagy humanizált, monoklonális antitestek, amelyek legalább két különböző antigénre mutatnak kötési specifitást. A bispecifikus • ·

- 192 antitestek előállítási eljárásai ismertek.

A bispecifikus antitestek hagyományos rekombináns előállítása két immunglobulin nehéz lánc - könnyű lánc pár együttes expresszióján alapul, ahol a két nehéz lánc különböző specifitású (Millstein és Cuello, Natúré, 305. 537-539, 1983). Az immunglobulin nehéz és könnyű láncok random készlete miatt ezek a hibridómák (quadrómák) potenciálisan tíz különböző antitest molekula elegyét termelik, melyek közül csak egy rendelkezik a megfelelő bispecifikus szerkezettel. A megfelelő molekula tisztítása (amit rendszerint affinitási kromatográfiával végzünk) igen körülményes, és a termék hozama alacsony. Hasonló eljárásokat írtak le a WO 93/08829 számú PCT közzétételi iratban, ill. Traunecker és mtsi., EMBO, 13, 3655-3659,

1991.

Egy másik, előnyösebb megoldás szerint a kívánt kötési specifitással rendelkező variábilis antitest doméneket (antitest-antigén kapcsolódási helyek) fúzionáljuk az immunglobulin konstans dómén szekvenciákhoz. A fúziót előnyösen immunglobulin nehéz lánc konstans doménnel valósítjuk meg, ami a CH2 és CH3 csukló (hinge) régió legalább egy részét tartalmazza. Előnyös, ha legalább az egyik fúzióban résztvesz a könnyű lánc kapcsolódásához szükséges első nehéz lánc konstans dómén (CH1). Az immunglobulin nehéz lánc fúziókat (és kívánt esetben a könnyű láncokat) kódoló DNS-eket külön expressziós • · · · ···· ·

- 193 vektorokba inszertáljuk, és megfelelő gazdaszervezetbe együttesen transzfektáljuk. Ez a három polipeptid fragment együttes mennyiségeinek beadásában nagy rugalmasságot tesz lehetővé, olyan esetekben, amikor a konstrukcióhoz a három polipeptid lánc különböző arányokban történő alkalmazása biztosítja az optimális hozamot. Amennyiben legalább két polipeptid lánc azonos aránya biztosítja a legnagyobb hozamot, vagy ha az arányoknak nincs különösebb jelentősége, lehetőség van arra is, hogy két vagy mindhárom polipeptid lánc kódoló szekvenciáját inszertáljuk egy expressziós vektorba. E megközelítés egyik előnyös megvalósítási módjában a bispecifikus antitestek hibrid immunglobulin nehéz láncból állnak, melynek egyik karja egy bizonyos kötési specifitással rendelkezik, másik karja pedig hibrid immunglobulin nehéz lánc - könnyű lánc párt tartalmaz, amely egy másfajta kötési specifitást biztosít. Azt találtuk, hogy ez az asszimetrikus szerkezet elősegíti a kívánt bispecifikus vegyület nem kívánatos immunglobulin lánc kombinációktól való elkülönítését, mivel ha egy immunblobulin könnyű lánc a bispecifikus molekula csupán egyik felében van jelen, egyszerű elkülönítési módot tesz lehetővé. E módszer leírása az elbírálás alatt álló, 1992.

augusztus 17-én benyújtott, 07/931,811 számú Egyesült

Államok-beli szabadalmi bejelentésben található.

A bispecifikus antitestek előállításénak további részleteit ld. pl. Suresh és mtsi., Methods in Enzymology, 121. 210,

1986).

·· ·· • · · ····

- 194 (v) Heterokonjugált antitestek immunrendszer megcélzásához

A heterokonjugált antitestek szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Ezek az antitestek két kovalensen kapcsolódó antitestből állnak. Az ilyen antitesteket, például, az nem kívánatos sejtek elleni sejtjei (4,676,980 számú Egyesült Államok-beli szabadalom) és HÍV fertőzés kezeléséhez ajánlották (W0 91/00360 és W0 92/00373 számú PCT közzétételi irat; EP 03089 számú szabadalom). A heterokonjugált antitestek bármilyen megfelelő keresztkötési eljárással előállíthatok. Az alkalmas keresztkötési ágensek jól ismertek, leírásuk (számos keresztkötés-képzési eljárással együtt) megtalálható a 4,676,980 számú Egyesült Államok-beli szabadalomban.

A megakariocita mpl ligandum protein gyógyászati alkalmazása

A vérképzési effektor funkcióval rendelkező, biológiailag aktív mpl ligandum, melyet megakariocitopoézises vagy trombicitopoézises proteinnek (TPO) nevezünk, a vérlemezkék elégtelen termelődésének, elkülönülésének vagy fokozott pusztulásának köszönhető trombocitopéniában szenvedő páciensek megakariocitaképző vagy trombocitaképző aktivitásának serkentésére alkalmas, steril gyógyszerészeti készítményekben alkalmazhatók. A trombocitopéniával összefüggő csontvelő hipoplázia (pl. kemoterápiás kezelést vagy csontvelőátültetést követő apláziás anémia), valamint olyan rendellenességek, mint a disszeminált intravaszkuláris • · ·

- 195 ··»· koaguláció (DIC), immun trombocitopénia (beleértve a HÍV-indukálta ITP-t és a nem HÍV-indukálta ITP-t), a trombocitopénia, a veleszületett mielodiszplázia és trombózisos krónikus idiopátiás trombocitopénia, a trombocitopénia hatásosan kezelhető a találmány szerinti vegyületekkel. Ezek hasznosak lehetnek a megakariocitopoézises proteinek a mieloproliferatív trombicitózisos betegségek, valamint a gyulladásokból és vashiányból eredő trombocitózis kezelésében.

A találmány szerinti megakariocitopoézises vagy trombicitopoézises protein (TPO) előnyösen alkalmazható a leukémia vagy kemény tumorok mielotoxikus kemoterápiás kezelésében; az autológ vagy transzplantátumok kemoterápiájában; a idiopatikus apláziás anémia, allogén csontvelő mielodiszplázia, az a veleszületett trombocitopénia, és az immun trombocitopénia kezelésében.

A találmány szerinti megakariocitopoézises proteinekkel hatásosan kezelhető egyéb rendellenességek közé tartozik a vérlemezkék drogok, mérgezés vagy mesterséges felületeken való aktiválódás által okozott károsodása. Ezekben az esetekben az említett vegyületek az új, egészséges vérlemezkék felszabadulásának serkentésére alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek alkalmazási lehetőségének teljesebb felsorolása a találmány leírásának elején, a technika állása részben, különösen az (a)-tól (f)-ig terjedő pontokban, illetve az ott említett hivatkozásokban

- 196 • · • · ·· · • · · • · • ·« • ···· található.

A találmány szerinti megakariocitapoézises proteinek önmagukban vagy más citokinekkel, hematopoietinekkel, interleukinekkel, növekedési faktorokkal vagy antitestekkel kombinációban alkalmazhatók a fentebb említett betegségek és rendellenességek kezelésében. Ennek megfelelően, a találmány szerinti vegyületek egyéb, trombopoézises aktivitással rendelkező proteinekkel vagy peptidekkel együtt alkalmazhatók; ilyenek a G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, eritropoietin (EPO), kit ligandum IL-6 és IL-11.

A találmány szerinti megakariocitapoézises proteineket gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal alkotott elegyben készítjük el. Az így kapott gyógyászati készítmény intravénásán, illetve orron vagy tüdőn át adható be. A készítmény ezenkívül beadható parenterálisan vagy szubkután is, kívánság szerint. Szisztémás adagolás esetében a gyógyászati készítménynek pirogén-mentesnek kell lennie, és (a pH-t, izotonitást és stabilitást illetően) parenterális beadáshoz alkalmas oldatban kell elkészíteni. Tároláshoz vagy azonnali alkalmazáshoz a találmány szerinti vegyületek dózisalakjait úgy készítjük el, hogy a kívánt tisztaságú vegyületet fiziológiailag elfogadható vivőanyagokkal, kötőanyagokkal vagy stabilizálószerekkel elegyítjük. Az ilyen anyagok (az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban) a recipiens számára nem toxikusak; ilyenek a bufferek, mint pl. a foszfát-, citrát-, acetát-puffer és

99»

- 197 más szerves savak sóiból készült pufferek; az antioxidánsok, mint pl. az aszkorbinsav; a kis molekulatömegű (kb. 10 aminosav-gyöknél kevesebbet tartalmazó) peptidek, mint pl. a poliarginin; proteinek, mint pl. a szérumalbumint, zselatin vagy az immunglobulinok; hidrofil polimerek, mint pl. a polivinil-pirrolidinon; aminosavak, mint pl. a glicin, glutaminsav, aszparaginsav vagy arginin; monoszacharidok, diszacharidok és más szénhidrátok, mint pl. a cellulóz és származékai, a glükóz, mannóz vagy a dextrinek; kelátképzők, pl. EDTA; cukoralkoholok, pl. a mannitol és a szorbitol; ionpárok, pl. nátrium és/vagy nemionos felületaktív anyagok, mint a Tween, Plurinics vagy polietilén-glikol.

A szabad sav vagy bázis vagy gyógyszerészetileg elfogadható só alakjában álló megakariocitapoézises protein kb. 0,5-500 mg-ját fiziológiailag elfogadhatű vivőanyaggal, hordozóval, kötőanyaggal, tartósítószerrel, stabilizátorral, Ízesítővel, stb. (a gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelően) alakítjuk készítménnyé. Ezekben a készítményekben az aktív alkotórész mennyiségét úgy választjuk meg, hogy a jelzett tartománynak megfelelő dózist kapjunk.

Az injektáláshoz való steril készítményeket szintén a hagyományos gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelően készítjük. Az aktív vegyületet valamilyen vivőanyagban, például vízben, természetes növényi olajban (szezámmag-, földimogyoró- vagy gyapotmagolaj) vagy szintetikus zsíros vivőanyagban (pl. etil-oleát vagy hasonló) készített oldat

- 198 -

« · ο · « ···· vagy szuszpenzió formájában alkalmazhatjuk. Az elfogadott gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelően pufferek, tartósítószerek, antioxidánsok és hasonlók szintén alkalmazhatók.

A tartós kibocsátású készítmények példái közé tartoznak a polipeptidet tartalmazó, szilárd hidrofób polimerekből álló, féligáteresztő mikrokapszulák kibocsátású anyagok anyagok, melyek pl. filmek vagy alakjában készíthetők el. A tartós közé tartoznak a poliészterek, hidrogélek [pl. poli(2-hidroxi-etil-metakrilát); ld. Langer és mtsi., J. Biomed. Mater. Rés., Ifi, 167-277, 1981; Langer, Chem. Tech., 12, 98-105, 1982; vagy a poli(vinilalkohol)], a polilaktidok (3,773,919 számú Egyesült Államok-beli szabadalom; EP 58,481 számú európai szabadalom), az L-glutaminsav és a gamma-etil-L-glutamát kopolimerei (Sidman és mtsi., Biopolymers, 22, 547-556, 1983) a le nem bontható etilén-vinil-acetát (Langer és mtsi., ld. fentebb), a lebontható tejsav-glikolsav kopolimerek, mint a Lupron Depot™ (tejsav-glikolsav kopolimerből és leuprolid-acetátból álló, injektálható mikrogömbök), valamint a poli-D-(-)-3-hidroxi-vajsav (EP 133,988 számú európai szabadalom).

Míg az olyan polimerek, mint az tej sav - glikolsav polimer, képesek 100 napig kibocsátani, bizonyos etilén - vinil-acetát és a molekulákat több, mint hidrogélek a proteinek rövidebb időtartamú kibocsátására alkalmasak. Amikor a tokba • · • · · · · • · · · • · · · · *·· ···· ·

- 199 zárt proteinek hosszú ideig a testben maradnak, 37 ’C-on, nedvesség hatására denaturálódhatnak vagy aggregálődhatnak, ami a biológiai aktivitást csökkenését és az immunogenitás esetleges változásait eredményezi. A protein stabilizálására, a mechanizmustól függően, ésszerű stratégiákat alakíthatunk ki. Például, ha az aggregációt diszulfid kicserélődés következtében kialakuló, molekulák közötti S-S kötés okozza, a stabilizációt a merkaptáncsoportok módosítsával, savas oldatokból végzett liofilizálással, a nedvességtartalom kontrollálásával, megfelelő adalékanyagok alkalmazásával és specifikus polimer készítmények kifejlesztésével valósíthatjuk meg.

A tartós kibocsátású megakariocitopoézises protein készítmények közé tartozik a liposzómákba ágyazott megakariocitopoézises protein. A megakariocitopoézises proteint tartalmazó liposzómákat ismert eljárásokkal állítjuk elő (ld. DE 3,218,121 számú német szabadalom; Epstein és mtsi., Proc. Natl. ACad. Sci. USA, 82. 3688-3692, 1985; Hwang és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 4030-4034, 1980; EP 52,322, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641 éás EP 102,324 számú európai szabadalmak; 83-118008 számú japán szab. bejelentés; 4,485,045 és 4,544,545 számú Egyesült Államok-beli szabadalom. Általában kisméretű (kb. 200-800 Angström), unilamelláris típusú liposzómákat alkalmazunk, melyek lipidtartalma kb. 30 mól% koleszterinnél nagyobb.

• ····

- 200 • · · · • · · • · · ··· ·· ·

Az adagolást a gyógyszerek hatását befolyásoló tényezők (mint pl. a betegség típusa és súlyossága, testtömeg, nem, táplálkozás, az adagolás időtartama és módja, egyéb gyógykezelések és egyéb klinikai tényezők) figyelembe vételével a kezelőorvos határozza meg. A napi dózis rendszerint 0,1-100 ug/testtömeg-kilogramm, előnyösen 0,1-50 ug/testtömeg-kilogramm. A kezdeti dózis előnyösebben napi 1-5 ug/testtömeg-kilogramm. A dózistartomány adott esetben megegyezhet az egyéb citokinek, elsősorban a G-CSF, GM-CSF és EPO dózistartományábal. A gyógyászatilag hatásos adagolást in vitro vagy in vivő eljárásokkal határozhatjuk meg.

Az alábbi példákkal a találmány előnyben részesített megvalósítási módjait kívánjuk bemutatni.

1. példa

A sertés mpl ligandum részleges tisztítása

Normális és apláziás sertésekből vérlemezke-szegény vérplazmát gyűjtöttünk. A sertéseket 4 mEV-os lineáris gyorsító alkalmazásával 900 cGy, teljes testfelületet érintő sugárzással tettük apláziássá. A besugárzott sertéseket 6-8 napon át intramuszkuláris cefazolin injekciókkal kezeltük, majd általános altatás mellett teljes vértérfogatukat levettük, heparinnal kezeltük és 30 percig 1800 x g-vel centrifugáltuk, miáltal vérlemezke-szegény vérplazmát kaptunk. A megakariocita-stimuláló aktivitás a besugárzás • · • · · · · ·

- 201 utáni 6. napon érte el maximumát.

A besugárzott sertésekből vett apláziás vérplazmában 4M koncentrációban NaCl-ot oldunk, és szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. A képződött csapadékot Sorvall RC3B készülékben 3800-as percenkénti fordulattal végzett centrifugálással eltávolítjuk, és a felülúszót 4M NaCl-ot tartalmazó 10 mM NaP04-oldattal ekvilibrált Phenyl-Toyopearl oszlopra (220 ml) töltjük. Az oszlopot a fenti pufferrel addig mossuk, míg az A2S0 érték 0,05 alá nem csökken, majd desztillált vízzel eluáljuk. Az eluált protein-csúcsot 15 mS konduktivitás eléréséig desztillált vízzel hígítjuk, és PBS-sel ekvilibrált Blue-Sepharose oszlopra (240 ml) töltjük. Az oszlopot ezután 5-5 oszloptérfogatnyi PBS-sel, illetve 2M karbamidot tartalmazó 10 mM NaPCU-oldattal (pH = 7,4) mossuk. A proteineket 2M karbamidot és 1M NaCl-ot tartalmazó 10 mM NaPCU-oldattal (pH = 7,4) eluáljuk az oszlopról. Az eluált protein csúcsot tartalmazó frakcióban 0,01 % oktil-glükozidot (n-oktil-S-D-glükopiranozid), 1 mM EDTA-t és 1 mM Pefabloc-ot (Boehringer Mannheim) oldunk, és egymás után kapcsolt CD4-IgG (Capon, D.J. és mtsi., Natúré, 337. 525-532, 1989) és mpl-IgG Ultralink (Pierce) oszlopra (ld. lentebb) töltjük. A CD4-IgG (2 ml) oszlopot a minta feltöltése után eltávolítjuk, és az mpl-lgG oszlopot (4 ml) 10-szeres oszloptérfogatnyi PBS-sel, illetve ugyancsak 10-szeres oszloptérfogatnyi, 2 M NaCl-ot tartalmazó PBS-sel mossuk, majd 0,1 M glicin-HCl pufferrel (pH = 2,25) eluáljuk. A • · • ·

- 202 frakciókat 1/10 térfogatnyi 1M Tris-HCl pufferben (pH = 8,0) gyűjtjük.

Az mpl-offinitási oszlopról eluált frakciók redukáló feltételek mellett végzett SDS-PAGE analízise (4-20 % Novex gél) több protein jelenlétét mutatta ki (5. ábra). A legnagyobb intenzitású ezüstfestődést mutató proteinek 66000 D, 55000 D, 30000 D, 28000 D és 14000 D látszólagos molekulatömegű sávokra válnak szét. Annak meghatározása érdekében, hogy e proteinek közül melyik serkenti a Ba/F3-mp_Z sejttenyészetek proliferáció j át, a proteineket a 2. példában leírtak szerint eluáltuk a gélből.

Ultralink affinitási oszlopok

PBS-ben 10-20 mg mpl-IgG-t vagy CD4-IgG-t 0,5 g Ultralink gyantához (Pierce) kapcsolunk (a gyártó útmutatásai szerint).

znp-Z-IaG kialakítása és expresszálása

A humán mpl teljes extracelluláris doménjét (1-491. aminosavak) és a humán IgGl molekula Fc régióját tartalmazó kiméra molekulát 293-as sejtekben expresszáltuk. A humán mpl 1-491. aminosavait tartalmazó cDNS-fragmentet humán megakariocitikus CMK sejt cDNS könyvtárból PCR-ral kaptuk és szekvenáltuk. Az 5'-végre Clal helyet, a 3'-végre BstEII helyet inszertáltunk. Ezt a fragmentet Bluescript vektorban

- 203 • ···· • ···· · az IgGI Fc kódoló régiótól upstream (5') irányban, a Clal és a BstEII hely közé klónoztuk (a PCR termék BstEII-vel végzett részleges emésztése után, mivel az mpl extracelluláris doménjét kódoló DNS-ben két másik BstEII hely is jelen van). Az mpl PCR termék 3'-végére bevitt BstEII helyet azért alakítottuk ki, hogy az Fc régiót az mpl extracelluláris doménnel egy leolvasási keretben legyen. A konstrukciót pRK5-tkneo vektor Clal és Xbal helyei közé szubklónoztuk, és kalcium-foszfátos eljárással 293-as humán embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk. A sejtkeket 0,4 mg/ml G418-cal szelektáltuk, és különálló kiónokat izoláltunk. Az izolált kiónok mpl-lgG expresszióját humán Fc-specifikus ELISA vizsgálattal határoztuk meg. A legjobb expressziót mutató klón 1-2 mg/ml znpi-IgG-t expresszált.

Ba/F3 mól P-exoresszáló sejtek

A humán mpl P teljes kódoló régiójának megfelelő cDNS-t előzetesen Notl-gyel linearizált pRK5-tkneo vektorba klónoztuk, majd elektroporációval IL-3-dependens Ba/F3 sejtvonalba transzfektáltuk (1 x 10⁷ sejt, 9605 F, 250 V). Három nappal később 2 mg/ml G418 jelenlétében szelekciót végeztünk. A sejteket tömegben szelektáltuk, vagy 96 üregű lemezen határhígítással különálló kiónokat kaptunk. A szelektált sejteket 15 % FBS-t, 1 mg/ml G418-at, 20 mM glutamint, 10 mM HEPES puffért és 100 ug/ml Pen-Strep-et tartalmazó RPMI tápközegbben tartottuk. A szelektált kiónokban az mpl P expresszióját anti-mpl P poliklonális • · »··· • · · • · · • ···· ·«·· ·

204 nyúl antitest alkalmazásával FACS analízissel határoztuk meg.

Ba/F3 avl ligandum vizsgálat

Az api ligandum vizsgálatot a 2. ábrán bemutatott módon végeztük. A különböző forrásokból származó api ligandum jelenlétének kimutatásához az api P Ba/F3 sejteket nagy páratartalmú, 5 % C02-ot és levegőt tartalmazó inkubátorban, 5 x 10⁵ sejt/ml sejtsűrűség mellett, 37 ’C-on, 24 órán keresztül IL-3-ra éheztettük. Az IL-3 éheztetés után a sejteket hígított mintákkal vagy azok nélkül 96 üregű szövettenyésztő csészékre kentük (200 ul tápközegben 50000 sejt mennyiségben), és sejttenyésztő inkubátorban 24 óra hosszat tenyésztettük. A tenyésztés utolsó 6-8 órájára mindegyik üreghez 1 uCi ^{2 3}H-timidint tartalmazó 20 ul szérummentes RPMI tápközeget adtunk. A sejteket 96 üregű GF/C filter lemezeken összegyűjtöttük és vízzel ötször mostuk. A filtereket 40 ul szcintillációs folyadék (Microsint 20) jelenlétében Packard Top Count számlálóval értékeltük.

2. példa

Nagymértékben tisztított sertés mpl ligandum

Gélelúciós eljárás

Az affinitás-tisztított mpl ligandum (az mpí-IgG oszlopról

205 ···· · eluált 6. frakció) és 2X Laemmli minta puffer azonos mennyiségét szobahőmérsékleten redukáló puffer nélkül elegyítettük, és a lehető leggyorsabban Novex 4-20 % poliakril-amid gélre vittük fel. A mintát nem melegítettük. Kontrollként egy szomszédos sávban ligandum nélküli minta puffért futtattunk. A gélt 135 V feszültséggel 4-6 ’C-on hozzávetőleg 2 V4 óra hosszat futtattuk. A futtató puffer kezdetben szobahőmérsékletű volt. A gélt ezután kivettük a géldobozból, és az gél egyik oldalán lévő lemezt eltávolítottuk.

A gélt nitrocellulóz filterre másoltuk. Egy darab nitrocellulózt desztillált vízzel benedvesítettünk, és a gél szabad felületére helyeztük, hogy légbuborékok ne maradjanak a két réteg között. A nitrocellulózra és a géllemezre vonatkoztatási jeleket tettünk, hogy a másolatot a festés után pontosan visszahelyezhessük. Hozzávetőleg két perc elteltével a nitrocellulózt óvatosan levettük, a gélt műanyag fóliával befedtük nitrocellulózt Biorad gold és hűtőbe helyeztük. A totál protein festékkel festettük, melynek során először 3 x 10 ml 0,1 % Tween 20 ΊΟ, 5 M NaCl + 0,1 M Tris-HCl (pH - 7,5) elegyben kb. 45 percig, majd 3 x 10 ml tisztított vízben 5 percig kevertük. Az aranyfestéket ezután adtuk az elegyhez, és az előhívást a standard sávok megjelenéséig folytattuk. A másolatot vízzel mostuk, a gélen lévő műanyag fóliára helyeztük, és a vonatkoztatási jelekhez igazítottuk. A géllemezen megjelöltük a Novex standardok elhelyezkedését, és a vágási ····

- 206 helyek jelzésére vonalakat húztunk. Δ nitrocellulózt és a műanyag fóliát levettük a gélről, és a gélt a vonalak mentén éles borotvapengével elvágtuk. A vágások túlnyúltak a minta sávjain, így ezeket a gél festésekor a gélszeletek pozíciójának meghatározásához használhattuk. A gélszeletek eltávolítása után a megmaradt gélt ezüsttel festettük, és megmértük a standardok és a vágási helek elhelyezkedését. A vágási helyeknek megfelelő molekulatömegeket a Novex standardok alapján határoztuk meg.

A 12 gélszeletet két Biorad model 422 elektroelúciós készülék celláiba helyeztük. A cellákban 12-14 kD-os átengedési határú membránsüveget alkalmaztunk. Az elúciós puffér összetétele 50 mM ammónium-bikarbonát + 0,05 % SDS (pH = kb. 7,8) volt. A puffér egy literét felhasználás előtt

4-6 ’C-os hidegszobában kb. egy óra hosszat hűtöttük. A gélszeleteket 4-6 °C-os hidegszobában 10 mA/cella áramerősséggel (kezdetben 40 V) eluáltuk. Az elúció hozzávetőleg 4 órát vett igénybe. A cellákat ezután óvatosan eltávolítottuk, és az üvegzománc-őrlegmény (fritt) feletti folyadékot pipettával eltávolítottuk. Az elúciós kamrát kivettük, és a membránsüveg felett lévő összes folyadékot pipettával eltávolítottuk. A membránsüvegben lévő folyadékot Pipetman alkalmazásával kivettük és félretettük. A süvegbe ezután 50 nl-es adagokban tisztított vizet tettünk, kevertük és eltávolítottuk, s ezt addig ismételtük, míg valamennyi SDS kristály fel nem oldódott. Ezeket a mosófolyadékokat a fenti, félretett folyadékkal

207 • · · • · · ···· ·· · szemben dializáltuk.

kicseréltük, és a elegyítettük. Az elúciós minta teljes térfogata gélszeletenként 300-500 ul volt. A mintákat 12-14 kD-os átengedési határú, 10 mm-es Spectrapor 4 dializáló csőbe helyeztük, amit előzetesen több óráig tisztított vízben áztattunk. A mintákat 4-6 ’C-on, egy éjszakán keresztül 600 ml foszfát-puffereit sóoldattal (6 mintára vonatkoztatva) A puffért a következő reggelen dialízist további 2,5 óra hosszat folytattuk. A mintákat ezután eltávolítottuk a dializáló zsákokból, és mikrocentrifugáló csövekbe helyeztük. A csöveket egy órára jégre tettük, percenkénti 14000-es fordulattal 3 percig centrifugáltuk, és a felülúszót óvatosan eltávolítottuk a kicsapódott SDS-ről. A felülúszót kb. órára jégre tettük, és 4 percig ismét centrifugáltuk. A felülúszót foszfát-pufferelt sóoldatban hígítottuk, és így használtuk fel az aktivitási vizsgálatban. A megmaradt mintákat -70 ’C-on fagyasztottuk.

3. példa

A sertés mpl ligandum mikroszekvenálása

Az mpl-lgG affinitási oszlopról származó 6. frakciót (2,6 ml) Microcon-10 (Amicon) membránon bekoncentráltuk. Az mpl membránhoz történő abszorpciójának megakadályozása érdekében a membránt 1 %-os SDS-sel öblítettük, és a 6. frakcióhoz 5 ul 10 %-os SDS-t adtunk. A Microcon membránon végzett bekoncentrálás után a 6. frakcióhoz (20 ul) minta puffért (20 ul) adtunk, és a teljes térfogatot (40 ul) egy sávban

208

4-20 % gradiensű akril-amid gélre (Novex) vittük fel. A gélt Novex eljárás szerint futtatuk. Ezt követően a gélt az elektroblottolás előtt 10 % metanolt tartalmazó 10 mM

3-(ciklohexil-amino)-l-propán-szulfonsav (CAPS) pufferben (pH = 11,0) ekvilibráltuk. Az egyenárammal, BioRad Trans-Blot végeztük. A PVDF membránt 0,1 festékkel, 40 % metanol és 0,1 % festettük, majd 10 % ecetsav és percig kezeltük. A biot 18-35 proteinek molekulatömege 30 kD, elektroblottolást 250 mA másoló cellában 45 percig %-os Coomassie Blue R-250 ecetsav elegyében 1 percig 50 % metanol elegyében 2-3 kD-os régiójában látható kD és 22 kD volt.

A 30 kD, 28 kD és 22 kD molekulatömegnek megfelelő sávokat protein-szekvenálásnak vetettük alá, amit PTH analizátorral közvetlen kapcsolatban álló Applied Biosystem 470A szekvenálóval végeztünk. A szekvenálókészüléket úgy módosítottuk, hogy a minta 80-90 %-át injektálja (Rodriguez, J. Chromatogr., 350. 217-225, 1985). Az UV abszorbancia kiegyensúlyozása érdekében az A oldószerhez acetont (kb. 12 ul/1) adtunk. Az elektroblottolt proteineket Blott kazettában szekvenáltuk. A csúcsokat Nelson Analytical 970 interface-ek alkalmazásával Justice Innovation szoftverrel integráltuk. A szekvencia kiértékeléséhez VAX 5900-at használtunk (Henzel és mtsi., J. Chromatogr., 404, 41-52, 1987). Az N-terminális szekvenciákat és a kapott anyag mennyiségét (szögletes zárójelben) a II' táblázatban mutatjuk be (egybetűs kódot alkalmazunk; a bizonytalan gyököket zárójelbe tettük).

209

II' TÁBLÁZAT

N-terminális mpl ligandum szekvenciák kD [1,8 pmó1]

5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D PRLLNKLLRDD (H/S) V L H (G) R L (30. sz. szekv.) kD [0,5 pmó1]

5 10 15 20 25 (S) P A P P A X D P R L L N K L L R D D (Η) V L (H) G R (31. sz. szekv.)

18-22 kD [0,5 pmó1]

10

XPAPPAXDPRLX(N) (K) (32. sz. szekv.)

4. példa

Folyadékszuszpenziós megakariocitaképződési vizsgálat önkéntes páciensektől fett humán perifériás stem-sejteket (PSC) IMDM tápközeggel (Difco) ötszörös térfogatra hígítottunk, és szobahőmérsékleten 15 percig 800 x g-vel centrifugáltunk. A sejtüledéket IMDM tápközegben újraszuszpendáltuk, 60 %-os Percoll-ra (1,077 g/ml sűrűség) rétegeztük), majd 30 percig 800 x g-vel centrifugáltuk. A kis sűrűségű egymagvú sejteket a határfelületnél leszívtuk, • · · · ·

- 210 kétszer IMDM tápközeggel mostuk, és 30 % FBS-t tartalmazó IMDM tápközegben, 1 ml végtérfogatban, 1-2 x 10® sejt/ml mennyiségben 24 üregű szövettenyésztő lemezekre (Costar) kentük. A tenyészetekhez 10 % mennyiségben APP-t vagy mpl ligandumot nem tartalmazó APP-t adtunk, és a sejteket 37 °C-on, nagy páratartalmú inkubátorban, 5 % CŰ2-ot tartalmazó levegőben 12-14 napig növesztettük. A tenyészeteket a 0., 2. és 4. napon adott 0,5 ug mp_Z-IgG-t tartalmazó 10 % APP jelenlétében is inkubáltuk. Az APP-ben az mpl ligandumot úgy távolítottuk el, hogy az APP-t mpl-IgG affinitási oszlopon engedtük át.

E folyadékszuszpenziós tenyészetekben a megakariocitaképződés mennyiségi meghatározásához Solberg és mtsi. eljárásának módosított változatát használtuk, amihez GPIIblIIa elleni, radioaktívan jelölt egér IgG monoklonális antitestet (HP1-1D) (Dr. Nichols, Mayo Clinic) alkalmaztunk. A HP1-1D 100 ug-ját (ld. Grant, B. és mtsi., Blood, 69. 1334-1339, 1987) Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) alkalmazásával (a gyártó útmutatásai szerint) 1 mCi Na¹²⁵I-dal jelöltük. A radioaktívan jelölt HP1-1D antitesteket -70 ’C-on 0,01 % oktil-glükozidot tartalmazó PBS-ben tároltuk. A jellemző specifikus aktivitást 1-2 x 10® cpm/ug volt.

A folyadékszuszpenziós tenyészeteket minden kísérleti ponthoz háromszori ismétléssel alakítottuk ki. 12-14 napos tenyésztés után az 1 ml-es tenyészeteket 1,5 ml-es Eppendorf csövekbe tettük és szobahőmérsékleten 800 x g-vel • ·· ·

- 211 centrifugáltuk, majd a kapott sejtüledékeket 0,02 % EDTA-t és 20 % borjú szérumot tartalmazó 100 ul PBS-ben újraszuszpendáltuk. Az újraszuszpendált tenyésztekhez 50 ul vizsgálati pufferben 10 ng ¹²⁵I-HP1-1D antitestet adtunk, és az elegyet időnként megrázva szubahőmérsékleten 60 percig inkubáltuk. A sejteket szobahőmérsékleten 800 x g-vel 10 percig végzett centrifugálással összegyűjtöttük, és kétszer a vizsgálati pufferrel mostuk. Az üledékek beütésszámát egy percig gamma-számlálóban (Packard) számláltuk. A nem-specifikus kötődést úgy határoztuk meg, hogy a jelölt HP1-1D antitestek hozzáadása előtt 60 percre jelöletlen HP1-1D antitesteket adtunk az üledékhez. A specifikus kötődés meghatározása: az összes kötött ¹²⁵I-HP1-1D mennyiségéből kivonva a feleslegben adott jelöletlen HP1-1D jelenlétében kötődött mennyiség.

5. példa

PCR oligonukleotid primerek

A 30 kD-os, 28 kD-os és 18-22 kD-os proteinekből kapott N-terminális aminosav-szekvencia alapján polimeráz láncreakció (PCR) primerekként való felhasználáshoz degenerált oligonukleotidokat terveztünk (ld. IV. táblázat). Két primer állományt szintetizáltunk; a 2-8. aminosav-gyököket (mpl 1) kódoló pozitív szensz 20-mer állomány és a 18-24 aminosavakat (mpl 2) kódoló szekvenciával komplementer antiszensz 22-mer állományt.

- 212 IV. TÁBLÁZAT

Degenerált oligonukleotid primer állományok mpl 1: 5'-CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA-3' (2048-szoros degeneráltság) (35. sz. szekv.) mpl 2: 5'-NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC-3' (2048-szoros degeneráltság) (36. sz. szekv. )

A PCR-hoz templátként sertés perifériás vér limfocitákból izolált sertés genomiális DNS-t alkalmaztunk. Az 50 ul reakcióelegy összetétele az alábbi volt: 0,8 ug sertés genomiális DNS, 10 mM Tris-HCl (pH = 8,3), 50 mM KC1, 3 mM MgClz, 100 ug/ml BSA, 400 lü dNTP-k, mindkét primer állományból 1-1 uM és 2,5 egység Taq polimeráz. A templátot 94 ’C-on 8 percig denaturáltuk, majd 35 ciklusban 45 másodpercig 95 ’C-on, 1 percig 55 ’C-on és 1 percig 72 ’C-on végeztük a reakciót Az utolsó ciklust 72 ’C-on 10 percig végeztük. A PCR termékeket 12 %-os poliakril-amid gélen elektroforézissel választottuk el egymástól, és etidium-bromidos festéssel tettük őket láthatóvá. Ha az N-terminális aminosav-szekvenciát egy exon kódolja, a megfelelő PCR terméknek 69 bp hosszúnak kell lennie. A gélről eluáltunk egy ilyen méretű DNS-fragmentet, és ezt pGEMT vektorba (Promega) szubklónoztuk. Az V. táblázatban három klón szekvenciáját mutatjuk be.

213

V. TÁBLÁZAT bp-os sertés genomiális DNS-fragmentek gemT3

5'-CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'-GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACI

TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (37. sz. szekv.)

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (38. sz. szekv.) gemT7

5'-CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA

3'-GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCA3I

CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (39. sz. szekv.)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (40. sz. szekv.) gemT9 P R L L N K L L R(32.sz. szekv. )

5'-CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG

3'-GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC

ATCATGTCTATCACGGT-3' (41. sz. szekv.)

TAGTACAGATAGTGCCA-5' (42. sz. szekv.)

A PCR primerek elhelyezkedését az aláhúzott bázisok jelzik. Ezek az eredmények igazolják a 30 kD-os, 28 kD-os és 18-22 kD-os proteinek 9-17. aminosavaira kapott N-terminális • · · ···· • · · · ··· • · ··· ···· ·

- 214 szekvenciát, és azt jelzik, hogy ezt a szekvenciát a sertés DNS egyetlen exonja kódolja.

6. példa

Humán mpl ligandum gén

Az 5. példában kapott eredmények alapján genomiális könyvtár screeneléséhez egy 45-mer dezoxioligonukleotidot (pR45) terveztünk és szintetizáltunk, melynek szekvenciája az alábbi:

5'GCC GTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG GAG TTT ATT TAG GAG TCG-3' (28. sz. szekv.)

Ezt az oligonukleotidot (gamma-³²P)-ATP-vel és T4 kinázzal radioaktívan jelöltük, és enyhén szigorú hibridizálási és mosási feltételek mellett lambda-geml2-ben készített humán genomiális könyvtár screeneléséhez használtuk (ld. 7. példa). A pozitív kiónokat kivettük, plakk módszerrel tisztítottuk és restrikciós térképezéssel, valamint Southern biot technikával analizáltuk. A további vizsgálathoz a 4.

kiónt választottuk ki.

A 45-mer-hez hibridizáló 2,8 kb-os BamHI-Xbal fragmentet pBluescript SK- vektorba szubklónoztunk. E klón részleges DNS-szekvenálását primerként sertés mpl ligandum DNS-szekvenciára specifikus oligonukleotidok alkalmazásával végeztük. A kapott szekvencia megerősítette, hogy a sertés mpl ligandum emberi homológját kódoló DNS-t izoláltuk. A • · · · ·

- 215 szekvenciában egy EcoRI restrikciós helyet mutattunk ki, ami lehetővé tette, hogy a 2,8 kb-os BamHI-Xbal fragmentből egy 390 bp-os EcoRI-Xbal fragmentet izoláljunk, és azt pBluescript SK- vektorba szübklónozzuk.

A kapott fragment mindkét szálát szekvenáltuk. A humán

DNS-szekvenciát és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát a 9. ábrán mutatjuk be (3. és 4. sz. szekv.). A genomiális szekvenciában az intronok megjósolt helyeit nyilakkal jelöljük, ami egy feltételezett exont (exon 3) határoz meg.

A feltételezett aminosav-szekvencia vizsgálata megerősíti, hogy az érett mpl ligandum első aminosava szerin, E kodontól közvetlenül upstream irányban a megjósolt aminosav-szekvencia igen erősen szignál szekvenciára utal, ami az érett mpl ligandum szekréciójában játszik szerepet. A szignál szekvenciát kódoló régiót valószínűleg egy intron szakítja meg a 68. nukleotidnál.

3' irányban az exon a 196 nukleotidnál végződik, így ez az exon 42 aminosavas szekvenciát kódol, melyből 16 aminosav valószínűleg egy szignál szekvencia része, 26 aminosav pedig az érett humán mpl ligandum részét képezi.

216

7. példa

Teljes hosszúságú humán mpl ligandum cDNS

A humán exon 3 szekvencia (6. példa) alapján két nem degenerált oligonukleotidot szintetizáltunk, amelyek az exon 3 szekvencia 3' és 5' végének felelnek meg (VI.

táblázat).

VI. TÁBLÁZAT

Humán cDNS nem degenerált PCR oligonukleotid primerek

Fwd primer: 5'-GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC

TTC T-3' (43. sz. szekv.)

Rvs primer: 5'-CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G-3' (44.sz.szekv.)

Ezt a két prímért használtuk a — templátként különböző humán cDNS könytárakból származó DNS vagy a különböző szövetekből származó 1 ng Quick Clone cDNS (Clonetech) alkalmazásával végzett — PCR reakciókban, melyeket az 5. példában leírt körülmények között hajtottunk végre. A megfelelő (pontos) PCR termék várt mérete 140 bp volt. A PCR termékek 12 %-os poliakril-amid gélen végzett analízise után felnőtt veséből és 293-as magzati vesesejtekből készített cDNS könyvtárakban, valamint a humán magzati májból készített cDNS-ben (Clonetech, katalógusszám: 7171-1) ilyen méretű DNS-fragmentet mutattunk ki.

• · » · · ····

- 217

Lambda-DR2-ben készített magzati máj cDNS könyvtárat (Clonetech, kat.sz.: HL1151x) a humán genomiális könyvtár screeneléséhez alkalmazott 45-mer oligonukleotiddal screeneltünk. Az oligonukleotidot T4 polinukleotid kináz alkalmazásával (gamma-³²P)-ATP-vel jelöltük. A könyvtárat enyhén szigorú hibridizációs feltételek mellett screeneltük. A filtereket két óra hosszat előhibridizáltuk, majd a próbával egy éjszakán át 20 % formamidot, 5xSSC-t lOxDenhardt's oldatot, 0,05 M nátrium-foszfátot (pH = 6,5), 0,1 % nátrium-pirofoszfátot, 50 ug/ml hangkezelt lazacsperma DNS-t tartalmazó elegyben 16 óra hosszat hibridizáltuk. A filtereket ezután 2xSSC-ben áztattuk, majd egyszer 0,5xSSC és 0,1 % SDS elegyében 42 °C-on mostuk. A filtereket egy éjszakán át Kodak röntgenfilmre exponáltuk. A pozitív kiónokat kivettük, plakk módszerrel tisztítottuk, és az inszert méretét a lamda-DR2 (Clonetech kat.sz.: 6475-1)

BamHI-Xbal fragmentjét szegélyező oligonukleotidok alkalmazáséval végzett PCR-ral határoztuk meg. Templátforrásként 5 ul fág törzset használtunk. A 94 ’C-on 7 percig végzett kezdeti denaturáció után 30 ciklusos amplifikációt végeztünk (94 ’C-on 1 perc, 52 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1,5 perc). Az utolsó lépést 72 ’C-on 15 percig végeztük. Az FL2b klón rendelkezett egy 1,8 kb-os inszerttel, így ezt a kiónt választottuk ki a további vizsgálathoz.

A lambda-DR2 fág karokon belül található pDR2 plazmidot (Clonetech, lambda-DR2 és pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, 42. old.) a gyártó útmutatásai • ·· · • · · • · ♦ ···· ·· • ····

- 218 szerint mentettük (Clonetech, lambda-DR2 és pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, 29-30. old.). A pDR2-FL2b plazmid BamHI és Xbal enzimmel végzett restrikciós analízise az inszertben egy belső BamHI restrikciós hely jelenlétét mutatta ki, hozzávetőleg a 650. helyen. A plazmidot BamHI és Xbal enzimmel emésztve két fragmentre hasítottuk (0,65 kb és 1,15 kb). A fragmentek DNS-szekvenciáját a pDR2-FL2b plazmidból származó két különböző templáttal határoztuk meg. A kétszálú plazmid DNS-t a festékkel jelölt didezoxi-nukleozid-trifoszfát terminátorokhoz (festék-terminátorok) való standard eljárások és egyedileg szintetizált, ún. sétáló (walking) primerek (Sanger és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74. 5463-5467, 1977; Smith és mtsi., Natúré, 321, 674-679, 1986) alkalmazásával ABI373 automatizált fluoreszcens DNS-szekvenáló készülékkel (Applied Biosystems, Foster City,

California) szekvenáltuk. A láncreakcióval amplifikált szekvenálását egyedi primerek és festék-terminátor reakciók alkalmazásával ABI373 szekvenáló készülékkel végeztük. Az M13 Janus vektorral (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland és mtsi., Nucl. Acids Rés., 21. 3385-3390, 1993) egyszálú templátot hoztunk létre. A pDR2-FL2b plazmidból BamHI-Xbal (1,15 kb) és BamHI fragmentet (0,65 kb) izoláltunk, a fragmentek végeit dezoxinukleotidok jelenlétében T4 DNS-polimerázzal feltöltöttük, majd az M13

Janus vektor Smal helyére szubklónoztuk. A szekvenálást az plazmidból fragmentek polimeráz közvetlen festékkel jelölt M13 univerzális és reverz primerekhez vagy ····

219 a sétáló primerekhez és festék-terminátorok való standard eljárások szerint végeztük. A manuális szekvenálási reakciókat egyszálú M13 DNS-en sétáló primerek és standard didezoxi-terminátor technológia (Sanger és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 5463-5467, 1977), valamint ³³P-izotóppal jelölt alfa-dATP és Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) alkalmazásával végeztük. A DNS-szekvenciát Sequencher V2.1bl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arhor, Michigan) alkalmazásával állítottuk össze. A hML nukleotid-szekvenciáját és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be (1. sz.

szekv.).

8. példa

Humán mpl ligandum (TPO) gén izolálása

A TPO gén humán genomiális DNS kiónjait humán genomiális könyvtár lambda-Geml2-ben pR45 (egy korábban leírt oligonukleotid próba) alkalmazásával, kevéssé szigorú feltételek között (ld. 7. példa), vagy nagymértékben szigorú feltételek mellett, az mpl ligandumot kódoló humán cDNS (BamHI helytől a 3' végéig terjedő) 3' felének megfelelő fragment alkalmazásával végzett screenelésével izoláltuk. Két átfedő, 35 kb távolságot átívelő lambda kiónt izoláltunk. Két, a teljes TPO gént tartalmazó átfedő fragmentet (BamHI és EcoRI) szubklónoztunk és szekvenáltunk. A humán gén szerkezete a genomiális DNS 7 kb-án belül 6 • · ·

- 220 ···· ·· · exonból áll (14/A, 14/B és 14/C ábra). Az exon/intron érintkezések határai jó egyezést mutattak az emlős génekre megállapított konszenzus motívummal (Shapiro, M.B. és mtsi., Nucl. Acids Rés., 18, 7155, 1987). Az 1. és 2. exon 5' transzlálatlan szekvenciát és a szignál peptid első négy aminosavát kódoló szekvenciát tartalmaz. A szekréciós jel többi részét és az érett protein első 26 aminosavát a 3.

exonon belüli DNS-szakasz kódolja. A teljes C-terminális domént és a 3' transzlálatlan szekvenciát, valamint az eritropoietin-szerű dómén kb. 50 aminosavát a 6. exonon belüli DNS-szakasz kódolja. A hML-2-ben (hTPO-2) megfigyelt delécióban szereplő négy aminosavat a 6. exon 5' vége kódolja.

9. példa

A humán mpl ligandum (hML) átmeneti expressziója

A pDR2-FL2b plazmidban lévő teljes hosszúságú inszert szubklónozása érdekében a plazmidot Xbal-gyel teljesen, majd

BamHI-gyel részlegesen emésztettük. Az 1,8 kb-os inszertnek megfelelő DNS-fragmentet gélen tisztítottuk és a citomegalovírus korai promoter kontrollja alatt pRK5-be szubklónoztuk (pRK5-hznpl I) (a pRK5 konstruálását illetően ld. az 5,258,287 számú Egyesült Államok-beli szabadalmat). A pRK5-hznp-2 I konstrukcióból származó DNS-t a PEG módszerrel készítettük, és F-12 tápanyageleggyel, 20 mM HEPES pufferrel (pH = 7,4) és 10 % magzati borjúszérummal kiegészített

Dulbecco-féle módosított Eagle (DMEM) tápközegben tartott ·*«· ··

- 221

293-as humán embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk. A sejteket C. Gorman által leírt (in: DNA Cloning: A Practical Approach, szerk.: Glove, D.M. és mtsi., II. kötet, 143-190 old., IRL Press, Washington D.C.) kalcium-foszfátos eljárással transzfektáltuk. A transzfekció után 36 órával a transzfektált sejtek felülúszóját a proliferációs vizsgálatban aktivitásra teszteltük (ld. 1. példa). A pRK vektorral transzfektált 293-as sejtek felülúszója nem stimulálta a Ba/F3 vagy Ba/F3-/npl sejteket (12/A ábra). A pRK5-hmp2 I konstrukcióval transzfektált sejtek felülúszója nem gyakorolt hatást a Ba/F3 sejtekre, de jelentős mértékben serkentette a Ba/F3-mpi proliferáció ját (12/A ábra), ami azt jelzi, hogy ez a cDNS funkcionálisan aktív mpl ligandumot kódol.

10. példa

A hML2, hML3 és hML4 humán mpl ligandum izoalakok

A hML alternatív módon hasított és összerendezett (splicing) alakjainak azonosítása érdekében a hML kódoló szekvenciája végeinek megfelelő primereket szintetizáltunk. Ezeket a primereket RT-PCR-ban felnőtt humán máj RNS amplifikálásához alkalmaztuk. Ezenkívül, a kiválasztott, jelentős régiókat szeegélyező belső primereket is konstruáltunk, melyeket hasonlóan alkalmaztunk. A PCR termék végeinek közvetlen szekvenálása egy, a humán magzati máj könyvtárból izolált cDNS szekvenciájának pontosan megfelelő szekvenciát eredményezett (ld. 1. ábra [1. sz. szekv.]). Az EPO dómén • ·

- 222 e · · • · · ··· ·· ·

C-terminálisa közelében (a PCR termék közepén) elhelyezkedő régió komplex szekvencia mintázatot mutatott, ami ebben a régióban egy lehetséges splicing változat létezésére utal. E splicing változatok izolálása érdekében a VII. táblázatban bemutatott primereket (melyek a szóban forgó régiót szegélyezik) használtuk a PCR reakcióban a humán felnőtt máj cDNS templátjaként.

VII. TÁBLÁZAT

Humán ML izoalak PCR primerek phmpllcdna.3el: 5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3' (45. sz. szekv.) Pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3' (46. sz. szekv.)

A PCR termékeket tompa véggel M13-ba szubklónoztuk. Az egyes szubklónok szekvenálása legalább 3 ML izoalak létezését mutatta ki. Egyikük, a hML (vagy hML33z) a leghosszabb alak, és pontosan a magzati máj könyvtárból izolált szekvenciának felel meg. A négy humán mpl ligandum izoalak szekvenciáját (a leghosszabbtól [hML] a legrövidebbig [hML-4]) a 11. ábrán mutatjuk be (6., 8., 9. és 10. sz. szekv.).

11. példa

Humán mpl ligandum izoalakok és szubsztitúciós változatok kialakítása és átmeneti expressziója

A hML2 és hML3 izoalakokat, valamint a hML(R153A, R154A)

223 szubsztitúciós változatot Russell Higuchi által leírt rekombináns PCR technika (in: PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, szerk: M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky és T.J. White) alkalmazáséval hML-ből alakítottuk ki.

Mindegyik konstrukció esetében a VIII. táblázatban látható külső primereket, és a IX. táblázatban bemutatott átfedő primereket alkalmaztuk.

VIII. TÁBLÁZAT

Külső primerek

Cla.FL.F2:

5'-ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G-3' (47.sz.szekv.)

HMPLL-R

5'-GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA-3' ····

- 224 IX. TÁBLÁZAT

Átfedő primerek hML-2:

MLá4.F: 5'-CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC-3' (49. sz. szekv.) MLÁ4.R: 5'-GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG-3' (50. sz. szekv.) hML-3:

hMLA116+ 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT-3' (51.sz.szekv.) hMLáll6- 5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG-3' (52.sz.szekv.) hML(R153A, R154A):

RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C3' (53.sz.szekv.)

RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G3' (54.sz.szekv.)

Valamennyi PCR amplifikációt klónozott Pfu DNS-polimeráz (Stratagene) alkalmazásával, az alábbi feltételek mellett végeztük: a templát kezdeti denaturálása 94 °C-on 7 percig; majd 30 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc, 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1,5 perc); végül az utolsó ciklust 72 ’C-on 10 percig végeztük. A végső PCR terméket Clal és Xbal enzimekkel emésztettük, gélen tisztítottuk és pRK5tkneo plazmidba klónoztuk. A 293-as sejteket a fentebb leírt különböző kosntrukciókkal transzfektáltuk, és a felülúszót a Ba/F3-;np2 proliferációs vizsgálattal teszteltük. A hML-2 és hML-3 e vizsgálatban nem mutatott detektálható aktivitást, miközben a hML(R153A, R154A) aktivitása hasonló volt a hMLéhez, ami arra utal, hogy szubsztitúcióval érintett kétbázisos helyen végbemenő érési folyamat (Processing) nem ···· ·· · • · · · ·

- 225 szükséges az aktivitáshoz (ld. 13. ábra).

12. példa mML, mML-2 és mML-3 egér mpl ligandum cDNS mML cDNS izolálása

PCR-ral a humán mpl ligandum teljes kódoló régiójának megfelelő DNS-fragmentet kaptunk, ezt gélen tisztítottuk, és ³²P-dATP és ³²P-dCTP jelenlétében random priming módszerrel jelöltük. Ezt a próbát lambda-GTIO fágban készített egér máj cDNS könyvtár (Clontech, kát.sz.: ML3001a) 10⁶ kiónjának screeneléséhez használtuk. 35 % formamid, 5xSSC, lOxDenhardts, 0,1 % SDS, 0,05 M nátrium-foszfát (pH - 6,5), 0,1 % nátrium-pirofoszfát és 100 ug/ml hangkezelt lazacsperma DNS elegyében a próba jelenlétében két példányban filtereket hibridizáltunk. A filtereket 2xSSC-ben áztattuk, majd 42 ’C-on egyszer 0,5xSSc és 0,1 % SDS elegyében mostuk. A hibridizáló fágot plakk módszerrel tisztítottuk, és a cDNS inszerteket Bluescript SK- plazmid EcoRI helyére szubklónoztuk. A további vizsgálathoz egy 1,5 kb-os inszertet tartalmazó LD klónt választottunk ki, és mindkét szálat a humán ML cDNS-hez fentebb leírtak szerint szekvenáltuk. Az LD kiónból származó nukleotid-szekvenciát és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát a 14. ábrán mutatjuk be (1. és 11. sz. szekv.). Az e klónból származó, leszármaztatott érett ML szekvencia 331 aminosav hosszúságú volt, és ezt mML33i (vagy — később leírt okok miatt — • · ··

- 226 mML-2) névvel azonosítottuk. Ezen mpl ligandumok nukleotid-szekvenciájában és leszármaztatott aminosav-szekvenciájában jelentős azonosságot találtunk, ha azonban a humán és egér mpl ligandumokat egymás alá rendeztük (alignment), az egér szekvencia a 111-114. humán gyököknél egy tetrapeptid deléciót mutatott, ami a humán (ld. fentebb) és sertés (ld.

később) cDNS-ek 618. nukleotidját követő 12 nukleotidos deléciőjának felel meg. Ennek megfelelően, az esetleges egér

ML izoalakok kimutatása érdekében további kiónokat vizsgáltunk. Az egyik klón (L7) a hiányzó LPLQ tetrapeptidet tartalmazó 335 aminosavas leszármaztatott szekvenciából álló

1,4 kb-os inszerttel rendelkezett. Ezt az alakot tartjuk a teljes hosszúságú egér ML-nek, és ezt mML-nek vagy mML335-nek nevezzük. Az mML nukleotid-szekvenciáját és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a 16. ábrán (12. és

13. sz. szekv.) mutatjuk be. Végül, az L2 kiónt izoláltuk és szekvenáltuk. Ez a klón a hML-3-nak megfelelően 116 nukleotidos deléciót mutat, így mML-3-nak neveztük el. E két izoalak leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a 16. ábrán hasonlítjuk össze.

Rekombináns mML expresszálása

Az egér ML-hez alkalmas expressziós vektorokat lényegében a

8. példában leírtak szerint készítettük. Az mML-t és mML-2-t kódoló kiónokat a pRKötkneo emlős expressziós vektorba szubklónoztuk (mely vektor a CMV promoter és egy SV40 poliadenilációs jel kontrollja alatti expressziót biztosít).

227

A kapott expresssziós vektorokat (mMLpRKtkneo és mML2pRKtkneo) a kalcium-foszfátos módsszerrel átmenetileg 293-as sejtekbe transzfektáltuk. Az átmeneti transzfekció után a tápközeget öt napig kondicionáltuk. A sejteket 10 % magzati borjúszérummal kiegészített, nagy glükóztartalmú DMEM tápközegben tartottuk.

Egér mnl (huppJ) expressz ió.i a Ba/F3 sejtekben

Lényegében a humán mpl esetében 1. példában leírtak szerint m.mpl pRKtkneo transzfekciójával c-mpl-t expresszáló stabil sejtvonalakat kaptunk. Röviden; az egér mpl teljes kódoló szekvenciáját tartalmazó expressziós vektort (20 ug, linearizált) (Skoda, R.C. és mtsi, EMBO J., 12, 2645-2653, 1993) elektroporációval Ba/F3 sejtekbe tranzsfektáltuk (5 x 10⁶ sejt, 250 V, 960 uF), majd 2 mg/ml G418 alkalmazásával neomicin-rezisztenciára végeztünk szelekciót. Az mpl expresszióját nyúl anti-egér mpl-lgG antiszérum alkalmazásával áramlásos citometriával értékeltük. A Ba/F3 sejteket (az IL-3 forrásául szolgáló WEHI -3B sejtekből származó RPMI 1640 tápközegben tartottuk. Az mML-lel és mML-2-vel átmenetileg transzfektált 293-as sejtek felülúszóit mmpl-lel és hmpl-lel transzfektált Ba/F3 sejtekben vizsgáltuk (az 1. példában leírtak szerint).

·«·· ·· ·

- 228 13. példa pML és pML-2 sertés mpl ligandum cDNS

A sertés ML (pML) cDNS-t RACE PCR-ral izoláltuk. A sertés ML gén apláziás sertés vérszérumból tisztított ML N-terminálisát kódoló exonja szekvenciája alapján egy oligodT prímért és két specifikus prímért terveztünk. Különböző apláziás sertés szövetekből készített cDNS-t kaptunk és amplifikáltunk. A vesében egy 1342 bp-os cDNS PCR terméket találtunk, melyet szubklónoztunk. Több klón szekvenáltunk, melyekről megállapítottuk, hogy az érett (a teljes szekréciós jel nélküli) sertés mpl ligandumot kódolják. A cDNS egy 332 aminosavas érett proteint kódol (PML332), melynek szekvenciáját a 18. ábrán mutatjuk be (9. és 16. sz.

szekv.).

pML gén és cDNS izolálása

A sertés ML gén genomiális kiónjait EMBL3-ban (Clontech Inc.) készített sertés genomiális könyvtár pR45 alkalmazásával végzett screenelésével izoláltuk. A screenelést lényegében a 7. példában leírtak szerint végeztük. Több kiónt izoláltunk, és a tisztított ML szekvenciájával azonos aminosav-szekvenciát kódoló exont szekvenáltuk. A sertés ML cDNS-t a RACE PCR eljárás módosításával kaptuk. A sertés ML gén szekvenciája alapján két specifikus ML prímért terveztünk. Apláziás sertések veséjéből, korábbi leírás szerint, poliadenilált mRNS-t

- 229 izoláltunk, és a közvetlenül az mRNS poliadenozin farkával szemben álló BamdT primerrel végzett reverz transzkripcióval cDNS-t állítottunk elő.

(BamdT: 5'-GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3') (55. sz. szekv.)

Az ML-specifikus h-forward-1 primer (5'-GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT-3') (43. sz.szekv.) és a BAMAD primer (5'-GACTCGAGGATCCATCG-3') (56. sz. szekv.) alkalmazásával, 100 ml reakcióélégyben (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, 10 mM Tris pH = 8,0, 0,2 mM dNTP-k, 0,05 E/ml Amplitaq polimeráz [Perkin Elmer Inc.]) első PCR amplifikációs lépést végeztünk (28 ciklus, ciklusonként 1 percig 95 °C, 1 percig 58 °C és 1,5 percig 72 ’C). A PCR terméket Clal enzimmel emésztettük, fenol/kloroform 1:1 arányú elegyével extraháltuk, etanollal kicsaptuk, majd Clal-gyel és Kpnl-gyel hasított 0,1 mg Bluescript SK- vektorhoz (Stratagene Inc.) ligáltuk. Szobahőmérsékleten két órás inkubálás után a ligáló elegy egynegyedét egy második PCR lépéshez használtuk (22 ciklus, a fentiek szerint), amihez egy másik

ML-specifikus forward-1 prímért (5'-GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG-3') (57. sz. szekv.) és T3-21 oligonukleotidot (amely a Bluescript SK- vektoron belüli többszörös klónozóhellyel szomszédos szekvenciához kötődik) (5'-CGAAATTAACCCTCACTAAAG-3') (58. sz. szekv.) alkalmaztunk. A kapott PCR terméket Xbal-gyel és Clal-gyel emésztettük és Bluescript SK- vektorba szubklónoztuk. Több, a független PCR reakciókból származó kiónt szekvenáltunk.

• · · ·

- 230 Azonosítottunk egy második alakot is (pML-2), amely 4 aminosavas delécióval rendelkező (328 aminosavból álló) proteint kódol (21. ábra; 21. sz. szekv.) A pML és pML-2 aminosav-szekvencia összehasonlítása azt mutatja, hogy a két szekvencia azonos, azzal a kivétellel, hogy az utóbbiból a

111-114. aminosavnak megfelelő QLPP tetrapeptid deléció folytán hiányzik (ld. 22. ábra; 18. és 21. sz. szekv.). Az egér, humán és sertés ML cDNS-ben megfigyelt négy aminosavas deléciók a leszármaztatott proteinekben pontosan ugyanazon a helyen találhatók.

14. példa

A GPIIt>IIIa. vér lemezke antigén-expresszié trombopoietines (TPO) indukciójának CMK vizsgálata

A CMK sejteket 10 % magzati borjúszérummal és 10 mM glutaminnal kiegészített RPMI 1640 (Sigma) tápközegben tartottuk. A vizsgálat előkészületeként a sejteket összegyűjtöttük, mostuk, majd 5 x 10^B sejt/ml mennyiségben 5 mg/ml szarvasmarha inzulinnal, 10 mg/1 apo-transzferrinnel és IX nyomelemekkel kiegészített szérum-mentes GIF tápközegben újraszuszpendáltuk. 96 üregű, lapos aljú lemezen mindegyik üregbe TPO standardot vagy kísérleti mintákat adtunk (100 ul térfogatban, megfelelő hígításban). Valamennyi üreghez 100 ul CMK sejtszuszpenziót adtunk, és a lemezeket 5 % C02-ot tartalmazó inkubátorban, 37 °C-on 48 óra hosszat inkubáltuk. Ezután a lemezeket 4 °C-on 1000 percenkénti fordulattal öt percig centrifugáltuk. A

I · · · · • · · • · · ···· ·· · • · • · · ···

231 felülúszókat eldobtuk, és mindegyik üregbe 100 ul FITC-vel konjugált GPIItolIIa monoklonális 2D2 antitestet adtunk. 4 °C-on egy óráig végzett inkubálás után a lemezeket 1000 percenkénti fordulattal öt percig centrifugáltuk. A nem kötődött antitesteket tartalmazó felülúszókat eldobtuk, és valamennyi üregbe 200 ul 0,1 % BSA-PBS mosófolyadékot tettünk. A 0,1 % BSA-PBS mosási lépést háromszor megismételtük, majd a sejteket FASCAN készüléken a relatív fluoreszcens intenzitást mérő standard egyparaméteres analízissel vizsgáltuk.

15. példa

A trombopoietin (TPO) DAMI vizsgálata a DAMI sejtek endomitózisos aktivitásának 96 üregű mikrotiter lemezeken végzett mérésével

A DAMI sejteket 10 mM glutaminnal, 100 ng/ml penicillin G-vel és 50 ug/ml sztreptomicinnel kiegészített IMDM + 10 % lószérum (Gibco) tápközegben tartottuk. A vizsgálat előkészítéséhez a sejteket összegyűjtöttük, mostuk, és 1 x 10® sejt/ml mennyiségben IMDM + 1 % lószérum tápközegben újraszuszpendáltuk. 96 üregű, kerek aljú lemezen a DAMI sejtszuszpenzióhoz 100-100 ul TPO standardot vagy kísérleti mintákat adtunk. A sejteket ezután 5 % C02-ot tartalmazó inkubátorban 37 ’C-on 48 órán át inkubáltuk, majd a lemezeket Sorvall 6000B centrifugában 4 ’C-on, percenként 1000 fordulattal öt percig centrifugáltuk. A felülúszókat eldobtuk, és a sejteket 200 ul PBS - 0,1 % BSA eleggyel ·· ·

- 232 több lépésben mostuk. etanol/PBS eleggyel újraszuszpendáltuk. 4 lemezeket percenként centrifugáltuk, és

A sejteket 200 ul jéghideg 70 %-os rögzítettük, és felszívással

C-on 15 perces inkubálás után a 2000 fordulattal öt percig mindegyik üreghez 0,1 mg/ml propidium-jodidot és 0,05 % Tween-20-at tartalmazó 150 ul 1 mg/ml RN-áz oldatot adtunk. 37 °C-on egy óra hosszat végzett inkubálás után a DNS-tartalom változásait áramlásos citometriával mértük. A poliploiditást az alábbiak szerint mértük (Normalizált poliploid arány = NPR):

(% sejt >G2+M-ben/% sejt <G2+M-ben) TPO jelenlétében

NPR = (% sejt >G2+M-ben/% sejt <G2+M-ben) a kontroliban

16. példa

In vivő trombopoietin (TPO) vizsgálat (egér vérlemezke “rebound* vizsgálat) (A vérlemezketermelés ^3BS-izotóp alkalmazásával végzett in vivő vizsgálata)

C57BL6 egereket (Charles River) trombocitopénia kialakítása érdekében az 1. napon intraperitoneálisan (ip) 1 ml kecske anti-egér vérlemezke szérummal oltottunk. Az 5. és 6. napon az egereket a TPO-val vagy (kontrollként) PBS-sel i.p. oltottuk. A 7. napon intravénásán 0,1 ml sóoldatban oldott 30 uCi Nas³⁵S04-ot injektáltunk az egerekbe, és a kezelt és kontroll egerekből vett vérmintákban mértük a ^3BS-izotóp ···· ··

- 233 keringő vérlemezkékbe való beépülését. A vérlemezkék és a leukociták számlálását a retro-orbitális szinuszból vett vérben egyszerre végeztük.

17. példa

A trombopoietin (TPO) KIRA ELISA vizsgálata az mpl-Rse.gD kiméra receptor foszforilációjának mérésével

A humán mpl receptort Vígon és mtsi. (PNAS, USA, 89. 564005644, 1992) írták le. Az itt leírt KIRA ELISA vizsgálathoz az mpl receptor extracelluláris doménjét (ECD) és a C-terminális flag (zászló) polipeptiddel rendelkező Rse (Mark és mtsi., J. of Bioi. Chem., 269(14). 10720-10728, 1994) (vagyis Rse.gD) transzmembrán és intracelluláris doménjét (TM, ill. ICD) állítottuk elő. A vizsgálatot vázlatosan a 30. és 31. ábrán mutatjuk be.

(a) Befogó ágens készítmény

Egy Herpes simplex vírus glikoprotein D-ből (Paborsky és mtsi., Protein Engineering, 3(6). 547-553, 1990) származó peptid ellen monoklonális anti-gD antitestet (5B6 klón) készítettünk. A tisztított törzskészítményt 3,0 mg/ml végkoncentrációban foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS) (pH = 7,4) egészítettük ki, és -20 °C-on 1,0 ml-es alikvotokat tároltunk.

- 234 (b) Anti-foszfotirozin antitest készítmény

A monoklonális anti-foszfotirozin antitestet (4G10 klón) a (JBI-tól (Laké Piacid, NY) vásároltuk, és hosszú karú biotin-N-hidroxi-szukcin-amid (Biotin-X-NHS, Research

Organics, Cleveland, OH) alkalmazásával biotiniláltuk.

(c) Ligandum

Az mpl . ligandumot az itt leírt rekombináns technikával állítottuk elő. A tisztított mpl ligandumot törzsoldatként 4 ’C-on tároltuk.

(d) Rse.gD nukleinsav előállítása

Szintetikus, kétszálú oligonukleotidokat készítettünk, hogy rekonstruáljuk az Rse 10 C-terminális aminosavát (880-890. aminosavak) kódoló szekvenciát, és hogy további 21 aminosavas (az 5B6 antitest epitópját és egy stop kodont magában foglaló) szekvenciát adjunk hozzá. A X. táblázatban bemutatjuk a fúziós gén szintetikus részének végső szekvenciáját.

235

X. TÁBLÁZAT

A humán Rse fúziós gén szintetikus kétszálú része

Kódoló szál:

5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA

TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3' (59. sz. szekv.)

Nem kódoló (antiszensz) szál:

5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA

TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3' (60. sz. szekv.)

A szintetikus DNS-t a humán Rse 1-880. aminosavait kódoló cDNS-hez a humán Rse cDNS közrebocsátott szekvenciájának (Mark és mtsi., Journal of Biological Chemistry, 269(14). 10720-10728, 1994) 2644. nukleotidjánál kezdődő PstI helyénél és a pSVI7.ID.LL expressziós vektor (ld. 32/A-L ábra; 22. sz. szekv.) HindlII helyeinél ligáltuk, miáltal a pSVI7.ID.Rse.gD expressziós plazmidot kaptuk. Az expressziós plazmid egy kétcisztronos primer transzkriptummal rendelkezik, amely 5' splice donor és 3' splice akceptor intron splicing helyek által határolt, DHFR-t kódoló szekvenciát, és az azt követő, Rse.gD-t kódoló szekvenciát tartalmaz. A teljes hosszúságú üzenet az első leolvasási keretként DHFR-t tartalmaz és így DHFR proteint hoz létre, ami lehetővé teszi a stabil transzformánsok szelektálását.

236 (e) mp.Z-Rse.gD nukleinsav előállítása

A fentebb leírt módon előállított pSV.ID.Rse.gD expressziós plazmidot a humán mpl extracelluláris doménjét (EDC; 1-491. aminosavak) kódoló szekvenciát az Rse.gD transzmembrán és intracelluláris doménjeinek (429-911. aminosavak) kódoló szekvenciájához fúzionálva tartalmazó pSV.ID.M.tmRd6 plazmid kialakítása érdekében módosítottuk. A humán mpl extracelluláris doménjét kódoló szekvencia Rse kódoló szekvenciához való kapcsolásához (amit kétlépéses PCR klónozási reakcióval végeztünk; ld. Mark és mtsi., J. Bioi. Chem., 267. 26266-26171, 1992) szintetikus oligonukleotidokat használtunk. Az első PCR reakcióhoz az alábbi primereket használtuk;

mpl cDNS templáttal:

Ml primer: 5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3' (61. sz. szekv.)

M2 primer: 5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3' (62. sz. szekv.) Rse cDNS templáttal:

RÍ primer: 5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3' (63, sz. szekv.);

R2 primer: 5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3' (64. sz. szekv.).

E fúziós kapcsolódás PvuII-Smal részét a teljes hosszúságú kiméra receptor kialakításához alkalmaztuk.

(f) Sejttranszformáció

DP12.CH0 sejteket (EP 307,247 számú, 1989 március 15-én • ·

I · · ····

237 közrebocsátott európai szabadalom) elektroporációval az egyetlen NotI helyen linearizált pSV.ID.M.tmRd6 plazmiddal transzformáltunk. A DNS-t etanollal kicsaptuk, fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és 20 ul 1:10 Tris/EDTA elégyben újraszuszpendáltuk. Ezután jégen, 1 ml PBS-ben 10 ug DNS-t 10 percig 10⁷ CHO DP12 sejttel inkubáltunk, majd az elektroporációt 400 V feszültség és 330 uF kapacitás mellett végeztük. A sejteket ezután 10 percre visszahelyeztük a jégre, majd nem szelektív táptalajra kentük őket. 24 óra elteltével a sejtekhez nukleozid-mentes tápközeget adtunk, amivel stabil DHFR+ kiónokat szelektáltunk.

(g) A KIRA ELISA vizsgálatban alkalmazható transzformált sejtek szelektálása

Az mpi/Rse.gD-t expresszáló kiónokat a teljes sejtlizátumok SDS-PAGE elektroforézissel végzett frakcionálás után végzett Western biot analízisével azonosítottuk, amihez a gD epitóp toldalékot detektáló 5B6 antitestet alkalmaztuk.

(h) Tápközeg

A sejteket F12 ég DMEM 1:1 arányú elegyében (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) növesztettük. A tápközeget 10 % diafiltrált FBS-sel (HyClone, Logan, UTAH), 25 mM HEPES pufferrel és 2 mM L-glutaminnal egészítettük ki.

• · · · • · · • · · ··«· ·*

- 238 * * (i) KIRA ELISA

Az mpl-Rse.gD-vel transzformált DP12.CHO sejteket lapos aljú, 96 üregű lemezek üregeiben 100 ul tápközegbe helyeztük (3 x 10⁴/üreg), és 5 % COz-ot tartalmazó inkubátorban 37 ’C-on egy éjszakán át tenyésztettük. A következő reggelen a felülűszókat leöntöttük, és a lemezeket papírtörölközővel óvatosan leitattuk. Ezután az egyes üregekhez kísérleti mintákat vagy 200 ng/ml, 50 ng/ml, 12,5 ng/ml, 3,12 ng/ml, 0,78 ng/ml, 0,19 ng/ml, 0,048 ng/ml vagy 0 ng/ml mpl ligandumot tartalmazó 50-50 ul tápközeget adtunk. A sejteket 37 ’C-on 30 percig stimuláltuk, a felülűszókat leöntöttük, és a lemezeket papírtörölközővel ismét óvatosan leitattuk. A sejtek lizálása és a kiméra receptorok szolubilizálása érdekében mindegyik üreghez 100 ul lizáló puffért adtunk. A lizáló puffer összetétele: 150 mM NaCl, 50 mM HEPES (Gibco), 0,5 % Triton-X 100 (Gibco), 0,01 % thimerosal, 30 KlU/ml aprótinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(2-amino-etil)-benzol-szulfonil-fluorid-hidroklorid (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 í.ü leupeptin (ICN Biochemicals), és 2 mM nátrium-ortovanadát (Na3V0<i; Sigma Chemical Co. , St. Louis, M0) (pH = 7,5). A lemezt vízszintes rázógépen (Bellco Instruments, Vineland, NJ) szobahőmérsékleten 60 percig óvatosan kevertük.

Amíg a sejteket szolubilizáltuk, egy 4 ’C-on egy éjszakára 5B6 anti-gD monoklonális antitesttel (50 ug/ml 50 mM karbonát-pufferben, pH = 9,6, 100 ul/üreg) bevont ELISA ····

239 ί

mikrotiter lemezről (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dánia) leöntöttük az oldatot, papírtörölközővel leitattuk, és 150 ul/üreg mennyiségű blokkoló pufferrel (0,5 % BSA-t [Intergen Company, Purchase, NY] és 0,01 % thimerosal-t tartalmazó PBS) szobahőmérsékleten, óvatos kevergetés mellett 60 percig blokkoltuk. Ezután az anti-gD 5B6 antitesttel bevont lemezt mosópufferrel (0,05 % Tween-20-at és 0,01 % thimerosal-t tartalmazó PBS) hatszor mostuk, amihez automata lemezmosót (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA) alkalmaztunk.

A sejttenyésztő mikrotiter üregből származó, szolubilizált mpí/Rse.gD-t tartalmazó lizátumot 85 ul/üreg mennyiségben az anti-gD 5B6 antitesttel bevont és blokkolt ELISA üregekbe vittük, és szobahőmérsékleten óvatos kevergetés közben két óra hosszat inkubáltuk. A nem kötődött mpí-Rse.gD-t mosópufferrel eltávolítottuk, és mindegyik üreghez 100 ul biotinilált 4G10-et (anti-foszfo-tirozin) adtunk (amit hígító pufferben [0,5 % BSA-t, 0,05 % Tween-20-at, 5 mM EDTA-t és 0,01 % thimerosal-t tartalmazó PBS] 1:18000 arányban hígítottunk, azaz 56 ng/ml koncentrációjú). Szobahőmérsékleten két órán át végzett inkubálás után a lemezt mostuk és mindegyik üreghez hígító pufferben 1:60000 arányban hígított 100 ul torma peroxidázzal (HRP0) konjugált sztreptavidint (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) adtunk. A lemezt szobahőmérsékleten óvatos kevergetés mellett 30 percig inkubáltuk. A szabad avidin konjugátumot lemostuk, és valamennyi üreghez 100 ul frissen készített «···

240 szubsztrát oldatot (tetrametil-benzidin [TMB]; kétkomponensű szubsztrát-készlet; Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) adtunk. A reakciót 10 percig végeztük, majd a szín kifejlődését üregenként 100 ul 1,0 M H3P04-oldat hozzáadásával leállítottuk. Az abszorbanciát 450 nm-nél (650 nm-es vonatkoztatási hullámhosszal) (ABS45ozeso) Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) és DeltaSoft (BioMetallics, Inc., Princeton, NI) szoftverek által vezérelt vmax lemez-leolvasókészülék (Molecular Devices, Palo Alto, CA) alkalmazásával olvastuk le.

0,78 ng/ml, koncentrációjú

A standard görbét úgy készítettük, hogy dpl2.trkA,B vagy C.gD sejteket 200 ng/ml, 50 ng/ml, 12,5 ng/ml, 3,12 ng/ml, 0,19 ng/ml, 0,048 ng/ml vagy 0 ng/ml mpl ligandummal stimuláltunk, és az eredményt DeltaSoft program alkalmazásával ng/ml TPO vs. átlag ABS450/SB0 ± SD függvényként fejeztük ki. A minta koncentrációit a standard görbén megfigyelt abszorbanciájuk interpolációjával kaptuk, és ng/ml TPO-aktivitás értékként fejeztük ki.

Az mpl ligandumról megállapítottuk, hogy koncentráció-függő és ligandum-specifikus módon képes az zzzpl-Rse.gD kiméra receptor aktiválására. Ezenkívül, az znp.Z-Rse.gD KIRA-ELISA-t egészen 100 %-os humán szérumig (ld. lentebb), illetve 100 %-os vérplazmáig (nem mutatjuk be) toleránsnak találtuk, ami lehetővé teszi, hogy a vizsgálatot páciensek és pK minták egyszerű screeneléséhez használjuk.

• ·

- 241 A 293-as sejtek által termelt TPO332 standard görbéje

A TPO EC50 értékek összefoglalása

TPO alak (sejttípus)	EC50	(m/v)	EC50 (M)
Humán TPO332 (293)	2,56	ng/ml	67,4 pM
Egér TPOs.32 (293)	3,69	ng/ml	97.1 PM
Humán TPO153 (293)	kb. 41	ng/ml	kb. 1,08 nM
Humán TPO155 (E. coli)	0,44	ng/ml	11,6 PM
Humán TPOissmat (E. coli'.	) 0,829	ng/ml	21,8 pM

• · «··· ··

18. példa

A trombopoietin (TPO) receptor-alapú ELISA vizsgálata

ELISA lemezeket 4 °C-on, karbonát-pufferben (pH = 9,6) egy éjszakás kezeléssel nyúl F(ab')2 anti-humán IgG (Fc) antitesttel vontunk be. A lemezeket szobahőmérsékleten egy óra hosszat PBS-ben 0,5 %-os szarvasmarha szérumalbuminnal blokkoltuk. A lemezekhez mpl-lgG kiméra receptort tartalmazó fermentor oldatot adtunk, és 2 óra hosszat inkubáltuk. A lemezekhez a standard (293-as sejtekben termelt, kvantitatív aminosav analízissel meghatározott koncentrációjú TPO332) kétszeres sorozathígításait (0,39-25 ng/ml) és a minták 0,5 % szarvasmarha szérumalbumin és 0,05 % Tween 20 elegyében készített sorozathígításait adtuk, és az inkubálást két órán át folytattuk. A kötött TPO-t protein A-val tisztított, biotinilált (£. coli-ban termelt TPOiss elleni) nyúl (1 órás inkubálás), majd sztreptavidin(30 perces inkubálás) és szubsztrátként

3,3',5,5'-tetrametil-benzidinnel detektáltuk. Az abszorbanciát 450 nm-nél olvastuk le. A lépések között a lemezeket lemostuk. Az adatok feldolgozásához a standard görbét a Kaleidagraph négyparaméteres görbeillesztő program alkalmazásával közelítettük. A minták koncentrációit a standard görbéből számítottuk.

antitestekkel

-peroxidázzal • · · • · ·· · • ·· · *

243

19. példa

A TPO expresszálása és tisztítása 293-as sejtekből (1) Expressziós vektorok készítése 293-as sejtekhez

Az alábbi oligonukleotidok, mint primerek, alkalmazásával végzett PCR-ral a TPO teljes nyitott leolvasási keretének megfelelő cDNS-t kaptunk.

XI. TÁBLÁZAT

293-as PCR primerek

Cla.FL.F: 5'-ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG-3' (65. sz. szekv.) hmpll-R: 5'-GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA-3 (48. sz. szekv.)

A reakcióhoz templátként — pfu DNS polimeráz (Stratagene) jelenlétében — a 9. példában leírt PRK5-h/npl I-et alkalmaztuk. A kezdeti denaturálást 94 ’C-on 7 percig végeztük, majd a reakciót 25 ciklusos amplifikációval folytattuk (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc, 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). Az utolsó lépést 72 ’C-on 15 percig végeztük. A PCR terméket tisztítottuk, és a pRK5tkneo (amely egy pRK5-ből származó, a timidin kináz promoter kontrollja alatt neomycin-rezisztenciát expresszálóvá alakított vektor) plazmid Clal és Xbal restrikciós helyei közé klónoztuk, • ·

..: · · ···· ......... ···· ·

- 244 miáltal a pRK5tkneo.ORF vektort kaptuk. Hasonló módon, de forward primerként Cla.FL.F-et, reverz primerként pedig az Arg.STOP.Xba prímért (5'-TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC-3') (66. sz. szekv.) alkalmazva egy, az EPO homológ doménnek megfelelő második konstrukciót hoztunk létre. A végső konstrukciót pRK5-tkneoEP0-D-nek nevezzük. A két konstrukció szekvenciáját a 7. példában leírt módon igazoltuk.

(2) Humán embrionális vesesejtek transzfekciója

A fenti két konstrukciót a 9. példában leírtak szerint, kalcium-foszfátos eljárással humán embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk. A transzfekció után 24 órával 0,4 mg/ml koncentrációjú G418.10 jelenlétében neomycin-rezisztens kiónok szelekcióját kezdtük meg, majd 15 nappal később a különálló telepeket 96 üregű lemezekre vittük, és a sejteket konfluens állapotik hagytuk növekedni. Az e kiónokból származó kondicionált tápközegben az ML153, illetve ML332 expresszióját a Ba/F3-z?íp7 proliferációs vizsgálattal (ld. 1. példa) értékeltük.

(3) Az rhMLs.22 tisztítása

A 293-rhML332 kondicionált tápközeget 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH =7,4) (A puffer) ekvilibrált Blue-Sepharose (Pharmacia) oszlopra töltöttük. Az oszlopot ezután 10-szeres ·· · • · • · · • ····

- 245 oszloptérfogatnyi A pufferrel, és 10-szeres oszloptérfogatnyi, 2M karbamidot tartalmazó A pufferrel mostuk. Az oszlopot 2M karbamidot és 1M NaCl-ot tartalmazó A pufferrel eluáltuk. A Blue-Sepharose oszlopról eluált frakciót közvetlenül WGA-Sepharose oszlopra vittük (melyet előzőleg A pufferrel ekvilibráltunk). A WGA-Sepharose oszlopot 10-szeres oszloptérfogatnyi (2M karbamidot és 1M mostuk, és 0,5M előzővel azonos

NaCl-ot tartalmazó) A pufferrel

N-acetil-D-glükóz-amint tartalmazó, pufferrel eluáltuk. A WGA-Sepharose oszlopról származó eluátum frakciót C4-HPLC oszlopra (Synchrom, Inc.) töltöttük, melyet 0,1 %-os TFA-val ekvilibráltunk. A C4-HPLC oszlopot szakaszos propanol gradienssel (0-25 %, 25-35 %, 35-70 %) eluáltuk. Az rhML332 a 28-30 % propanol-koncentrációnál eluálódott. A tisztított rhML.332 SDS-PAGE elektroforézissel széles sávként a gél 68-80 kD-os régiójában vándorol (ld. 15. ábra).

(4) Az rhMLjsa tisztítása fentebb leírtak szerint oszlopra vittük. Az

A 293-rhMLi53 kondicionált tápközeget az előző pontban leírtak szerint Blue-Sepharose oszlopon bontottuk fel. A Blues-Sepharose eluátumot a közvetlenül mpl-affinitási mpí-affinitási oszlopról eluált rhMLi53-at az rhML332 esetében leírtakkal azonos körülmények mellett végzett C4-HPLC oszlopkromatográfiával homogén állapotúra tisztítottuk.

A tisztított rhMLi53

SDS-PAGE

- 246 elektroforézissel két nagy és két kis (kb. 18-21 kD molekulatömegű) sávra válik szét (ld. 15. ábra).

20. példa

TPO expresszálása és tisztítása CHO sejtekből (1) CHO expressziós vektorok

Az elektroporációs eljárásokban alkalmazott expressziós vektorokat az alábbiak szerint jelöltük:

pSVI5.ID.LL.MLORF (teljes hosszúságú vagy hTP0332; pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (rövidített vagy hTP0x53.

E plazmidok jellemzőit a 23. és 24. ábrán mutatjuk be.

(2) A CHO expressziós vektorok előállítása

A XII. táblázatban látható oligonukleotid primerekkel végzett PCR-ral egy, a hTPO teljes nyitott leolvasási keretének megfelelő cDNS-t kaptunk.

XII. TÁBLÁZAT

CHO expressziós vektor PCR primerek

Cla.FL.F2: 5'-ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G-3' (47. sz. szekv.)

ORF.Sal: 5'-AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC-3' (67. sz. szekv.)

247

A PCR reakcióhoz templátként — pfu DNS polimeráz (Stratagene) jelenlétében — a 7. és 9. példában leírt PRK5-hmp2 I-et alkalmaztuk. A kezdeti denaturálást 94 °C-on 7 percig végeztük, majd a reakciót 25 ciklusos amplifikációval folytattuk (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc, 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). Az utolsó lépést 72 ’C-on 15 percig végeztük. A PCR terméket tisztítottuk és a pSVI5.ID.LL plazmid Clal és Sáli helyei közé klónoztuk, miáltal a pSVI5.ID.LL.MLORF vektort kaptuk. Hasonló módon, de forward primerként a Cla.FL.F2-t, reverz primerként pedig az EPOD.Sal prímért (5'-AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC-3') (68. sz. szekv.) alkalmazva egy második, az EPO homológ doménnek megfelelő konstrukciót hoztunk pSVI5.ID.LL.MLEP0-D-nek létre. A végső konstrukciót neveztük el. A két konstrukció szekvenciáját a 7. és 9. példában leírtak szerint igazoltuk.

A teljes hosszúságú és a rövidített ligandum kódoló szekvenciáját a pSVI5.ID.LL. CHO expressziós vektor többszörös klónozó helyére vittük be. Ez a vektor SV40 korai promoter/enhancer régiót; az egér DHFR cDNS-t tartalmazó módosított splicing egységet; a kívánt gén (esetünkben a leírt TPO szekvencia) beviteléhez alkalmas többszörös klónozó helyet; SV40 poliadenilációs jelet és replikációs kezdőhelyet; valamint a plazmid szelekciójához és baktériumokban való amplifikációjához béta-laktamáz gént tartalmaz.

• ·· ·

- 248 (3) A rekombináns humán TPO33z-t és TTPQiss-at expresszáló stabil CHO se.itvonalak kialakítása (a) Az eredeti CHO sejtvonal

A találmány szerinti TPO molekulák expressziójához alkamazott CHO (kínai hörcsög petefészek) gazdasejtvonal CHO-DP12 néven ismert (ld. EP 307,247 számú, 1989. március

15. közrebocsátott szabadalom). Ezt az emlős sejtvonalat az eredeti sejtvonal (CHO-Kl DUX-B11(DHFR-)-, melyet Dr. L. Chasin engedélyével Dr. Frank Lee-től [Standord University] kaptunk) prepro-inzulint expresszáló vektorral végzett transzfekciójával kapott sejtekből klonálisan szelektáltuk (alacsony inzulinigényű sejtek kinyerése érdekében). Ezek a sejtek szintén DHFR- sajátságúak, és a kiónok nukleozid kiegészítőktől (glicin, hipoxantin és timidin) mentes tápközegen mutatott növekedés alapján DHFR cDNS vektor szekvenciák jelenlétére szelektálhatok. A stabil expressziót mutató CHO sejtvonalak e szelekciós rendszerét általánosan alakalmazzák.

(b) Transzfektálási módszer (elektroporáció)

A TPO33Z- és TPOiss-expresszáló sejtvonalak kialakításához DP12 sejteket elektroporáció (ld. pl. Andreason, G.L. , J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56, 1993) alkalmazásával, linearizált pSVI5.ID.LL.MLORF, illetve pSVI5.ID.LL.MLEPO-D plazmiddal transzfektáltunk. A plazmidok hasításához három restrikciós

249 enzimes reakcióelegyet alakítottunk ki; a vektor 10, 25 és 50 ug-ját NotI enzimmel, standard molekuláris biológiai módszerekkel hasítottuk. Ez a restrikciós hely a vektor 3' linearizálási régiójában csupán egy helyen van jelen, ami a TPO ligandum transzkripciós egységen kívül esik (ld. 23. ábra). A 100 ul térfogatú reakcióelegyeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. A következő napon az elegyeket fenol/kloroform/izoamil-alkohol 50:49:1 arányú elegyével egyszer extraháltuk, majd szárazjégen hozzávetőleg egy óráig etanollal kicsaptuk. A csapadékot 15 perces mikrocentrifugálással összegyűjtöttük és szárítottuk. A linearizált DNS-t standard antibiotikumokkal és 2 mM glutaminnal kiegészített 50 ul Ham-féle DMEM-F12 (1:1) tápközegben újraszuszpendáltuk.

A 3zuszpenzióban növekvő DP12 sejteket összegyűjtöttük, a linarizált DNS újraszuszpendálásához leírt tápközeggel egyszer mostuk, végül ugyenezen tápközegben 10⁷ sejt/750 ul koncentrációban újraszuszpendáltuk. A sejtek alikvotjait (750 ul) és az egyes linearizált DNS elegyeket szobahőmérsékleten egy óráig együtt inkubáltuk, majd BRL elektroporációs cellába helyeztük. A reakcióelegyeket standard BRL elektroporációs készülékben 350 V feszültséggel és 330 uF kapacitással kezeltük. Az elektroporáció után a sejteket 5 percig hagytuk a készülékben leülepedni, majd jégen további 10 percig inkubáltuk. Az elektroporációval kezelt sejteket 60 mm-es sejttenyésztő csészékbe tettük, melyek CHO sejtekhez való komplett tápközeget (IX GHT-vel, 2 • ·

• · · • · · · · ···· ·

- 250 mM glutaminnal és 5 % magzati borjúszérummal kiegészített glicin nélküli, nagy glükóztartalmú DMEM-F12 50:50 arányú elegy) tartalmaztak, és a sejteket egy éjszakán keresztül 5 % C0₂-ot tartalmazó sejttenyésztő inkubátorban növesztettük.

(c) Szelektálás! és screenelési eljárás

A következő napon a sejteket standard módszerrel végzett tripszines kezeléssel leválasztottuk a csészékről, és DHFR szelektív tápközeget (a fentebb leírt Ham-féle DMEM-F12 1:1 arányú tápközeg 2 % vagy 5 % dializált magzati borjúszérummal kiegészítve, de glicin, hipoxantin és timidin nélkül — ez az általunk használt standard DHFR szelekciós tápközeget tartalmazó 150 mm-es szövettenyésztő csészékbe tettük. Az egyes 60 mm-es csészékből származó sejteket öt

150 mm-es csészére kentük. A sejteket 37 ’C-on 5 % C02-ot tartalmazó inkubátorban 10-15 napig inkubáltuk (egy tápközeg cserével), míg a kiónok el nem érték azt a méretet, amely alkalmas a 96 üregü csészékbe történő áthelyezéshez. A sejteket 4-5 nap alatt átvittük a 96 üregü csészékbe. A konfluens állapot eléréséig hagytuk növekedni napig), majd a csészéket tripszinnel az eredeti csészéből két példányt E példányok közül kettőt rövid ideig fagyasztóban tartottunk, és a sejteket mindegyik üregben 10 % FCS-t tartalmazó 50 ul DMSO-val hígítottuk. A harmadik csészében a konfluens sejtek üregeiből származó öt napos, szérummentes kondicionált tápközeg mintákat a Ba/F sej teket (általában 3-5 kezeltük, és reprodukáltunk.

♦ · · · · ··· ·*·« ·· ··· ···· ·

- 251 aktivitási vizsgálattal TPO expresszióra analizáltuk. Az e vizsgálat alapján legnagyobb expressziót mutató kiónokat reaktiváltuk, és a szuszpenziós feldolgozás, az újbóli vizsgálat és a tárolás érdekében két, egymással összekapcsolt, 150 mm-es T-nyakú lombikban helyeztük el.

(d) Amplifikációs eljárás

A fentebb leírt szelekció eredményeként kapott legnagyobb titerű sejtvonalak közül többet standard metotrexátos amplifikációs kezelésnek vetettünk alá, hogy magasabb titerű kiónokat kapjunk. A CHO sejt kiónokat szaporítottuk, és két vagy három különböző mennyiségben (csészénként 10⁵, 5 x

10⁵ és 10® sejt) négy különböző koncentrációjú metotrexátot (50 nM, 100 nM, 200 nM és 400 nM) tartalmazó 10 cm-es csészékbe vittük. Ezeket a tenyészeteket 5 % C02-tartalom mellett 37 °C-on a kiónok kialakulásáig inkubáltuk, amikor a kiónok a további vizsgálat érdekében alkalmasak a 96 üregű csészékbe történő átvitelre. Az e szelekciós lépésből származó több magas titerű kiónt ismét nagyobb koncentrációjú metotrexáttal inkubáltuk (600 nM, 800 nM, 1000 nM és 1200 nM), és a rezisztens kiónokat ezúttal is 96 üregű csészékbe vittük és vizsgáltuk.

(4) A rekombináns humán TPOsag-at és TPOiss-at expresszáló stabil CHO sejtvonal tenyésztése

A tárolt sejteket felolvasztottuk, és a sejtpopulációt

- 252 standard növesztés! eljárásokkal (szérum-mentes vagy szérumtartalmú tápközegben) szaporítottuk. A megfelelő sejtsűrűség elérése után a sejteket az elhasznált tenyésztő tápközeg eltávolítása érdekében mostuk, majd bármilyen standard eljárással (pl. szakaszos, rátáplálásos szakaszos vagy folyamatos tenyésztés) 25-40 ’C-on, semleges pH-n, legalább 5 %-os oldott oxigéntartalom mellett a konstitutívan szekretált TPO felhalmozódásáig tenyésztettük. A sejttenyészeti folyadékot mechanikai úton (pl. centrifugálással) elkülönítettük a sejtektől.

(5) A rekombináns humán TPO tisztítása CHO sejtek tenyészeti folyadékából

Az összegyűjtött sejttenyészeti folyadékot (HCCF) közvetlenül Blue-Sepharose 6 Fást Flow oszlopra (Pharmacia) (melyet előzetesen 0,01M Na-foszfát (pH = 7,4) és 0,15 M NaCl oldatával ekvilibráltunk) vittük fel, a Blue-Sepharose gyanta térfogatára vonatkoztatva hozzávetőleg 100 1 HCCF/1 1 gyanta mennyiségben, és kb. 300 ml/óra/cm² átfolyási sebességgel. Az oszlopot ezután 3-5 oszloptérfogatnyi ekvilibráló pufferrel, majd 3-5 oszloptérfogatnyi, 0,01M Na-foszfátból (pH = 7,4) és 2,0 M karbamidból álló oldattal mostuk. A TPO-t 0,01M Na-foszfát (pH = 7,4), 2,0 M karbamid és 1,0 M NaCl 3-5 oszloptérfogatnyi oldatával eluáltuk.

A Blue-Sepharose oszlopról eluált, TPO-t tartalmazó frakciókat 0,01 M Na-foszfát, 2,0 M karbamid és 1,0 M NaCl » · · · · • · · • · · •··· ·· ·

253 oldatával ekvilibrált búzacsíra lektin Sepharose 6MB oszlopra (Pharmacia) vittük fel, a lektin Sepharose gyanta térfogatára vonatkoztatva 8-16 ml Blue-Sepharose frakció/ml gyanta mennyiségben és hozzávetőleg 50 ml/óra/cm² átfolyási sebességgel. Az oszlopot ezután 2-3 oszloptérfogatnyi ekvilibráló pufferrel mostuk, majd a TPO-t 0,01 M Na-foszfát (pH = 7,4), 2,0 M karbamid és 0,5 M N-acetil-D-glükóz-amin 2-5 oszloptérfogatnyi elegyével eluáltuk.

A búzacsíra lektin Sepharose-ról eluált frakciókat 0,04 % CisEs és 0,1 % trifluor-ecetsav (TFA) végkoncentrációra állítottuk be. A kapott elegyet 0,1 % TFA és 0,04 % C12ES elegyével ekvilibrált C4 reverz fázisú oszlopra (Vydac 214TP1022) vittük (hozzávetőleg 0,2-0,5 mg protein/ml gyanta mennyiségben, 157 ml/óra/cm² átfolyási sebességgel).

A proteint 0,1 % TFA-t és 0,04 % Ci2Es-at tartalmazó kétfázisú, lineáris acetonitril gradienssel eluáltuk. Az első fázist 0 % —> 30 % lineáris acetonitril gradienssel 15 percig, a második fázist 30 % —> 60 % lineáris acetonitril gradienssel 60 percig végeztük. A TPO kb. 50 %-os acetonitril koncentrációnál eluálódott. SDS-PAGE alapján egy frakciót alakítottunk ki.

A C4 frakciót 0,01 M Na-foszfát (pH = 7,4) és 0,15 M NaCl kétszeres térfogatú elegyével hígítottuk, és Amicon YM vagy hasonló, 10-30 kD molekulatömeg átengedési határral rendelkező ultrafiltráló membránon, 0,01 M Na-foszfát (pH =

254 = 7,4) és 0,15 M NaCl hozzávetőleg hatszoros térfogatával szemben diafiltráltuk. A kapott diafiltrátum közvetlenül feldolgozható vagy ultrafiltrációval tovább koncentrálható. A diafiltrátumot vagy a koncentrátumot 0,01 % Tween-80 koncentrációra állítjuk be.

A diafiltrátum/koncentrátum egészét vagy részét (amely a kiszámított oszloptérfogat 2-5 %-ával egyenértékű) 0,01 M Na-foszfát (pH = 7,4), 0,15 M NaCl és 0,01 % Tween-80 elegyével ekvilibrált Sephacryl S-300 HR oszlopra (Pharmacia) vittük, és hozzávetőleg 17 ml/óra/cm² átfolyási sebességgel kromatográfáltuk. Az aggregátumoktól és proteolízises bomlástermékektől mentes, TPO-t tartalmazó frakciókat SDS-PAGE alapján elegyítettük. A kapott elegyet 0,22 um-es filteren (Millex-GV vagy hasonló) szűrtük és 2-8 ’C-on tároltuk.

21. példa

A TPO protein-szintézis transzformációja és indukciója

E. coli-tan (1) E. coli expressziós vektorok konstruálása

A pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 és pMP202 plazmidot a TPO első 155 aminosavának expresszálásához terveztük. A TPO e szakaszát kódoló szekvencia a plazmidokban egy rövid vezető (leader) szekvenciától downstream irányban helyezkedik el, mely vezetőszekvencia a különböző konstrukciókban más és

255 más.

vezetőszekvenciák elsősorban magas szintű iniciációt

A pMP210-l, transzlációs biztosítanak és gyors tisztíthatóságot -T8, -21, -22, -24 és -25 plazmidot a TPO első 153 aminosavának expresszálásához terveztük. A TPO e szakaszát kódoló szekvencia a plazmidokban egy iniciációs metionintól downstream irányban helyezkedik el. A plazmidok a TPO első hat aminosavát érintő kodonfelhasználásban különböznek egymástól. A pMP251 plazmid a pMP210-l származéka, melyben a TPO C-terminális vége két aminosavval hosszabb. Triptofán promoter indukálására (Yansura, D.G. és mtsi., Methods in Enzymology [szerk.: Goeddel, D.V.] 185. 54-60, Academic Press,, San Diego, 1990) a fenti plazmidok mindegyike E. coli-ban magas szintű intracelluláris TPO expressziót biztosít. A pMPl és pMP172 plazmid a fenti TPO intracelluláris expressziós plazmidok előállításában intermedierként szolgálnak.

(a) pMPl plazmid

A pMPl a TPO első 155 aminosavának szekréciós vektora, melyet a 33. ábrán bemutatott módon öt DNS fragment összeligálásával hoztunk létre. E fragmentek közül az első a pPho21, melyből a rövid MluI-BamHI fragmentet eltávolítottuk. A pPho21 a phGHl (Chang, C.N. és mtsi., Gene, 55, 189-196, 1987) származéka, melyben a humán növekedési hormon gént az E. coli phoA génnel helyettesítettük, és a 20-21. aminosavaknál az STII szignál szekvencia kódoló szekvenciájába Miül restrikciós helyet

- 256 inssertáltunk.

A következő két fragmentet, a pRK5-hr?p_ZI plazmidból (9. példa) származó 258 bázispáros Hinfl-PstI DNS-szakaszt (amely a TPO 19-103. aminosavait kódolja), és a TPO 1-18.

aminosavait kódoló, alábbi szintetikus DNS-t:

5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG

TG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC

ACTGA-5' (69. sz. szekv.) (70. sz. szekv.)

T4 DNS-ligázzal összeligáltuk, majd PstI enzimmel hasítottuk. A negyedik fragment a pRK5h/??p2I plazmidból származó, a TPO 104-155. aminosavait kódoló 152 bp-os Pstl-HaelII fragment, míg az utolsó fragment a pdhl08 plazmid lambda to transzkripciós terminátort (Scholtissek,

S. és mtsi., NAR, Ifi, 3185, 1987) tartalmazó, 412 bp-os Sul-BamHI fragmentje volt.

(b) pMP21 plazmid

A pMP21 plazmidot a TPO első 155 aminosavának az STII szignál szekvencia egy részéből álló 13 aminosavas leader segítségével történő expresszálásához terveztük. E plazmid kialakításához a 34. ábrán látható módon három DNS fragmentet ligáltunk össze, melyek közül az első a pVEG31 vektor, melyből egy rövid

Xbal-Sphl fragmentet • · · ·

257 eltávolítottunk. A pVEG31 vektor a pHGH207-l (de Boer, H.A. és mtsi., in: Promoter Structure and Function, szerk: Rodriguez, R.L. és Chamberlain, M.J., Praeger, New York, 462. old., 1982) származéka, melyben a humán növekedési hormon génjét az érfal endoteliális növekedési faktor génje helyettesíti.

A második ligáit szakasz az alábbi szekvenciával rendelkező szintetikus DNS duplex:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (71. sz. szekv.) (72. sz. szekv.)

Az utolsó szakasz a pMPl plazmid 1072 bp-os Mlul-Sphl fragmentje volt, amely a TPO első 155 aminosavát kódolja.

(c) pMP151 plazmid

A pMP151 plazmidot a TPO első 155 aminosavának expresszálásához terveztük. E plazmidban a TPO 155 aminosavát kódoló szekvencia az STII szignál szekvencia 7 aminosavából, 8 hisztidinből és Xa faktor hasítási helyből álló leader szekvenciától downstream irányban helyezkedik el. Amint a 35. ábrán látható, a pMP151 kialakításához három DNS fragmentet ligáltunk össze, melyek közül az első a fentebb említett pVEG31 vektor, melyből egy rövid Xbal-Sphl fragmentet eltávolítottunk. A második fragment az alábbi

258 szekvenciával rendelkező szintetikus DNS duplex:

5' -CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCG

AAGGTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGC

TTCCAGCAT-5' (73. sz. szekv.) (74. sz. szekv.)

Az utolsó fragment a pMPll plazmidból származó, a TPO 154 aminosavát kódoló, 1064 bp-os Bgll-Sphl fragment volt. A pMPll plazmid azonos a pMPl-gyel, azzal a különbséggel, hogy az STII szignál szekvenciában (ez a fragment a pMPl-ből nyerhető) néhány kodon meg van változtatva.

(d) pMP202 plazmid

A pMP202 nagyon hasonló a pMP151 expressziós vektorhoz; a kettő között az a különbség, hogy a pMP202-ben a leader szekvencia Xa faktor hasítási helyét trombin hasítási hellyel helyettesítettük. Amint a 36. ábrán látható, a pMP202 kialakításához három DNS fragmentet ligáltunk össze.

Ezek közül az első a fentebb említett pVEG31 vektor, melyből egy rövid Xbal-Sphl fragmentet eltávolítottunk. A második fragment az alábbi szekvenciával rendelkező szintetikus DNS duplex:

···· ·· · ·· · • · · · * · · • · · · · · • · · · ··· ·· ··· ···· ·

259

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCG

AACCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGC

TTGGTGCAT-5' (75. sz. szekv.) (76. sz. szekv.)

Az utolsó szakasz a fentebb említett pMPll plazmid 1064 bp-os Bgll-Sphl fragmentje volt.

(e) pMP172 plazmid

Ez a plazmid a TPO első 153 aminosavának szekréciós vektora, illetve a pMP210 plazmid kialakításához szolgáló intermedier. Amint a 37. ábrán látható, a pMP172 kialakításához három DNS fragmentet ligáltunk össze. Az első a pLS321amB vektor volt, melyből a rövid EcoRI-HindlII szakaszt eltávolítottuk. A második fragment a fentebb említett pMPll plazmádból származó 946 bp-os EcoRI-Hgal fragment, a harmadik szakasz pedig az alábbi szekvenciájú szintetikus DNS duplex volt:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (77. sz. szekv.)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (78. sz. szekv.) (f) pMP210 plazmid

A pMP210 plazmidot a TPO (egy transzlációs kezdő metionin után álló) első 153 aminosavának expresszálásához terveztük. Ezt a plazmidot valójában plazmid bankként állítottuk elő, ···

- 260 melynek tagjaiban a TPO első hat kodonja az egyes kodonok harmadik bázisában véletlenszerűen eltér egymástól. Δ plazmidok kialakításához három DNS-fragmentet ligáltunk össze (38. ábra). Az első fragment a fentebb említett pVEG31 vektor volt, melyből a rövid Xbal-Sphl fragmentet eltávolítottuk. A második fragment az alábbi szintetikus DNS duplex volt, melyet először DNS polimeráz I-gyel (Klenow) kezeltünk, majd Xbal és HinfI enzimekkel emésztettünk (ez a szintetikus DNS a kezdő metionint és a TPO véletlenszerűen változó első hat kodonját kódolja):

5-GCAGCAGTTGTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCT

GTTCTCAGTAAA (79. sz. szekv.)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (80. sz. szekv.)

A ligáláshoz harmadik fragmentként a pMP172 plazmid 19-153. TPO aminosavakat kódoló, 890 bp-os Hinfl-Sphl fragmentjét használtuk.

A hozzávetőleg 3700 klónból álló pMP210 plazmid bankot nagy tetraciklin-tartalmú (50 ug/ml) LB lemezekre vittük, hogy kiszelektáljuk a magas szintű transzlációs iniciációt mutató kiónokat (Yansura, D.G. és mtsi., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 4, 151-1558, 1992). A nagy tetraciklin-tartalmú lemezeken megjelent 8 telep közül a (TPO expresszió tekintetében) öt legjobbat DNS-szekvenálásnak vetettük alá. Az eredményeket a 39. ábrán mutatjuk be (23., 24., 25., 26., 27. és 28. sz. szekv.).

·· ·

- 261 (g) pMP41 plazmid

A pMP41 plazmidot a TPO első 155 aminosavát kódoló, az STII szignál szekvencia hét aminosavából és Xa faktor hasítási helyből álló leader szekvenciához fúziónált DNS-szekvencia expresszálásához terveztük. A plazmidot a 40.

ábrán látható módon három DNS szakasz összeligálásával alakítottuk ki. Az első szakasz a fentebb említett pVEG31 melyből a rövid Xbal-Sphl fragmentet

A második szakaszként az alábbi szintetikus

DNS duplexet alkalmaztuk:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (81.sz.szekv.)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (82.sz.szekv.)

A ligáláshoz alkalmazott harmadik szakasz a fentebb említett pMPll plazmidból származó 1064 bp-os Bgll-Sphl fragment volt.

vektor volt, eltávolítottuk.

(h) pMP57 plazmid

A pMP57 plazmid a TPO első 155 aminosavát kódolja, mely kódoló szekvencia a plazmidban az STII szignál szekvencia 9 aminosavából és a kétbázisos Lys-Arg helyből álló leader szekvenciától downstream irányban helyezkedik el. A kétbázisos hely lehetővé teszi, hogy a leader szekvenciát ArgC proteázzal eltávólíthassuk. A plazmidot a 41. ábrán bemutatott módon, három DNS szakasz összeligálásával alakítottuk ki. Első szakaszként a fenti pVEG31 vektort alkalmaztuk, melynek rövid Xbal-Sphl fragmentjét

262 eltávolítottuk. A második fragment az alábbi szintetikus DNS duplex volt:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (83.sz.szekv.)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (84.sz.szekv.)

A ligáláshoz alkalmazott harmadik szakasz a fentebb említett pMPll plazmidból származó 1064 bp-os Bgll-Sphl fragment volt.

(i) pMP251 plazmid

A pMP251 plazmid a pMP210-l származéka, melyben a C-terminálison a TPO két további aminosavát is magában foglalja. Amint a 42. ábrán látható, e plazmid kialakításához két DNS szakaszt ligáltunk össze, melyek közül az első a fentebb leírt pMP21 plazmid volt, melyből a rövid Xbal-Apal fragmentet előzetesen eltávolítottuk. A második ligáit szakasz a pMP210-l plazmidból származó 316 bp-os Xbal-Apal fragment volt.

(2) Az E. coli transzformálása és indukálása TPO expressziós vektorokkal

A fenti TPO expressziós plazmidokat a 44C6 E. coli törzs (w3110 tonA^ rpoHta Ion_á clpP_A galE) CaCl2 hősokk eljárással (Mandel, M. és mtsi., J. Mól. Bioi., fifi, 159-162, 1970) végzett transzformálásához alkalmaztuk. A transzformált sejteket először 37 ’C-on 50 ug/ml carbenicillint tartalmazó LB tápközegben addig növesztettük, míg a tenyészet optikai

- 263 ···* «· • ·· • · · ♦ » » • ··· ···« * denzitása (600 nm-nél) el nem érte a kb. 2-3 értéket. Az LB tenyészetet ezután 0,49 % (m/V) kazaminosavakat és 50 ug/ml carbenicillint tartalmazó M9 tápközegben 20-szorosára hígítottuk. Levegőztetéssel 30 ’C-on egy órán át végzett növesztés után a tenyészethez 50 ug/ml végkoncentrációban indol-3-akrilsavat adtunk. A tenyészetet ezután 30 ’C-on levegőztetéssel további 15 órán keresztül növesztettük, majd a sejteket centrifugálással összegyűj töttük.

22. példa

Biológiailag aktív TPO (Met^-1 1-153) termelése E. coli—bán

A biológiailag aktív, visszaállított harmadlagos szerkezetű (refolded) TPO (Met^-1 1-153) előállításához alábbiakban leírt eljárások hasonlóan alkalmazhatók más TPO változatok beleértve az N- és C-terminálison meghosszabbított alakokat) előállításához is (ld. 23. példa).

(A) Nem oldható TPO (Met^-1 1-153) kinyerése

A pMP210-l plazmid által kódolt TPO (Met^-1 1-153)-at expresszáló E. coll sejteket a fentebb leírtak szerint fermentáltunk. Polytron homogenizáló készülékkel kb. 100 g sejtet egy liter (tízszeres térfogat) sejtfeltáró pufferben (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH =8) szuszpendáltunk, és a sejteket 5000 x g-vel 30 percig centrifugáltuk. A mosott sejtüledéket a Polytron homogenizáló készülékkel újabb 1 • · ·

- 264 liter sejtfeltáró pufferben szuszpendáltuk, és a sejtszuszpenziót a gyártó útmutatásai szerint LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc.) vagy Microfluidizer (Microfluidics International) készüléken kezeltük. A szuszpenziót 5000 g-vel 30 percig centrifugáltuk, majd újraszuszpendáltuk és ismét centrifugáltuk, miáltal mosott, fénytörő test üledéket kaptunk. A mosott üledéket azonnal felhasználtuk vagy -70 ’C-on lefagyasztottuk.

(B) A monomer TPO(Met-¹ 1-153) szolubllizálása és tisztítása

Az előző lépésben kapott üledéket 20 mM Tris (pH - 8), 6-8 M guanidin és 25 mM DTT (ditio-treitol) ötszörös tömegű elegyében újraszuszpendáljuk, és 1-3 óra hosszat vagy egy éjszakán át 4 ’C-on keverjük, hogy elősegítsük a TPO protein szolúbilizálását. Nagy koncentrációjú (6-8 M) karbamid szintén hasznos, de általában alacsonyabb hozamot ad, mint a guanidin. Szolubilizálás után az oldatot 30 000 X g-vel 30 percig centrifugáljuk, miáltal dentarurált, monomer TPO proteint tartalmazó tiszta felülúszót kapunk. Ezt a felülúszót Superdex 200 gélfiltrációs oszlopon (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) 2 ml/perc átfolyási sebességgel kromatografáljuk, és a proteint 10 mM DTT-t tartalmazó 20 mM Na-foszfát pufferrel (pH = 6,0) eluáljuk. A 160. és 200. ml között eluált, monomer, denaturált TPO proteint tartalmazó frakciókat egyesítjük. A TPO proteint félpreparatív C4 reverz fázisú oszlopon (2 x 20 cm, VYDAC) tovább tisztítjuk.

A mintát 5 ml/perc sebességgel (30 % acetonitrilt tartalmazó

- 265 0,1 %-os TFA-val ekvilibrált) oszlopra visszük. A proteint lineáris acetonitrili gradienssel (30-60 %) 60 percig eluáljuk. A tisztított, redukált protein kb. 50 %-os acetonitril koncentrációnál eluálódik. Ezt az anyagot használjuk a TPO változat harmadlagos szerkezetének visszaállításához (refolding), ami biológiailag aktív TPO változatot eredményez.

(C) Biológiailag aktív TPO (Met¹ 1-153) kialakítása %-acetonitrilt tartalmazó 0,1 %-os TFA elegyben (40 ml) lévő, hozzávetőleg 20 mg monomer, redukált és denaturált TPO proteint 360 ml refolding pufferben elegyítünk. A puffer optimálisan az alábbi reagenseket tartalmazza:

mM Tris

0,3 M NaCl mM EDTA % CHAPS detergens % glicerin mM oxidált glutation mM redukált glutation (pH = 8,3)

Elegyítés után a refolding puffért — a megfelelő diszulfidkötésű TPO alak (ld. lentebb) maximális hozamának elérése érdekében — 4 ’C-on 12-48 órán át óvatosan keverjük. Az oldatot ezután 0,2 % végkoncentrációban TFA-val savanyítjuk, 0,45 vagy 0,22 mikronos filteren szűrjük, és • · ··’·:' : · '.· :··· . ·..· ........

···· ··

- 266 1/10 térfogat acetonitrilt adunk hozzá. Ezt az oldatot C4 reverz fázisú oszlopra visszük, és a tisztított, visszaállított harmadlagos szerkezetű TPO (Met^-1 1-153)-at a fentivel azonos gradiens programmal eluáljuk. A biológiailag aktív TPO ilyen feltételek mellett kb. 45 % acetonitril koncentrációnál eluálódik. A TPO nem megfelelő diszulfidkötésű változatai korábban eluálódnak. A tisztított

TPO (Met^-1 1-153) tisztasága 95 %-nál nagyobb, amit SDS gélen és analitikai C4 reverz fázisú kromatográfiával állapítottunk meg. Állatkísérletekhez a C4 kromatográfiával tisztított anyagot fiziológiailag kompatibilis pufferekkel (150 mM NaCl-ot és 0,01 % Tween 80-at tartalmazó izotóniás pufferekkel [10 mM Na-acetát, pH = 5,5; 10 mM Na-szukcinát, pH = 5,5; vagy 10 mM Na-foszfát, pH - 7,4]) dializáltuk.

A TPO Ba/F3 vizsgálatban mutatott nagy aktivitása (az 50 %-os stimulációt kb. 3 pg/ml koncentrációnál figyeltük meg) miatt sok különböző puffer, detergens és redox feltétel alkalmazható a biológiailag aktív anyag kinyerésére, azonban a legtöbb esetben csak kevés megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező anyagot (10 % alatt) kapunk. A nagyüzemi előállítási folyamatokban előnyös, ha a harmadlagos szerkezet visszaállításának (refolding) hozama legalább 10 %-os, előnyösebben 30-50 %-os, legelőnyösebben % feletti. A magas refolding hozamok kialakításában mutatott hatékonyság tekintetében számos különböző detergenst (Triton X-100, dodecil-béta-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, szarkozil, Tween 20 és Tween 80, Zwittergent

267

3-14 és mások) értékeltünk. E detergensek közül csak a CHAPS családot (CHAPS és CHAPSO) találtuk általánosan hasznosnak a refolding reakcióban a protein aggregáció és a nem megfelelő diszulfidkötések kialakulának korlátozása szempontjából. Az 1 %-nál nagyobb CHAPS koncentrációk voltak a leghatásosabbak. A jobb hozamok eléréséhez nátrium-kloridra volt szükség, melynek optimális koncentrációja 0,1 M és 0,5 M közötti. Az EDTA jelenléte (1-5 mM koncentrációban) csökkentette a fém-katalizálta oxidáció (és aggregáció) mértékét, ami néhány készítmény esetében előfordult. Az optimális refolding feltételeket 15 %-nál nagyobb glicerin-koncentráció biztosítta. A maximális hozam érdekében redox reagens párként kulcsfontosságú volt az oxidált és redukált glutation vagy oxidált és redukált cisztein egyidejű jelenléte. Általában magasabb hozamot értünk el, ha az oxidált reagens mólaránya azonos vagy nagyobb volt, mint a redox pár redukált tagjának mólaránya. E TPO változatok harmadlagos szerkezetének visszaállításához a 7,5 és kb. 9 közötti pH értékek voltak optimálisak. A szerves oldószerek (pl. etanol, acetonitril, metanol) 10-15 %-os vagy alacsonyabb koncentrációban voltak tolerálhatok. A szerves oldószerek nagyobb koncentrációja fokozta a nem megfelelő diszulfidkötésű alakok mennyiségét. A Tris és a foszfát-pufferek általában hasznosak voltak. A 4 ’C-on végzett inkubálás szintén fokozta a megfelelően visszaállított harmadlagos szerkezetű TPO mennyiségét.

268

Az első C4 lépésben tisztított TPO készítmények esetében (a refolding reakcióban alkalmazott redukált és denaturált TPO mennyiségére vonatkoztatott) 40-60 %-os refolding hozam jellemző. Aktív anyagot kaphatunk akkor is, ha kevésbé tiszta (pl. közvetlenül a Superdex 200 oszlopon végzett tisztítás vagy a kezdeti fénytörő test kivonás utáni) készítményeket alkalmazunk, bár a hozamok — a TPO refolding folyamat során a nem TPO proteinek fokozott kicsapódása és kölcsönhatása miatt — kisebbek.

Mivel a TPO (Met^-1 1-153) 4 cisztein gyököt tartalmaz, e protein három különböző diszulfid-változata alakítható ki:

1. változat: az 1. és 4., illetve 2. és 3. cisztein gyök közötti diszulfidkötés;

2. változat: az 1. és 2., illetve 3. és 4. cisztein gyök közötti diszulfidkötés;

3. változat: az 1. és 3., illetve 2. és 4. cisztein gyök közötti diszulfidkötés.

A refolding körülmények meghatározásának kezdeti kutatásai során C4 reverz fázisú kromatográfiával több különböző, TPO proteint tartalmazó csúcsot választottunk el.

Ba/F3 vizsgálattal megállapítottuk, hogy e csúcsok közül csak az egyik rendelkezett jelentős biológiai aktivitással. Ezt követően a refolding reakciófeltételeket úgy alakítottuk, hogy elsősorban ez a változat képződjön. Ilyen körülmények között a nem megfelelő harmadlagos szerkezetű (misfolded) változatok az összes kapott monomer TPO kevesebb, mint 10-20 %-át teszik ki.

269

A biológiailag aktív TPO diszulfid mintázatát tömegspektrometriával és proteinszekvenálással határoztuk meg, s eszerint a diszulfidkötések az 1. és 4., illetve a 2. és 3. cisztein gyök között helyezkednek el, ami az 1. változatnak felel meg. A C4 oszlopon felbontott különböző csúcsok alikvotjait (5-10 nmól) tripszinnel emésztettük (1:25 tripszin : protein mólarány). Az emésztési elegyet DTT-vel végzett redukció előtt és után közeggel segített lézer deszorpciós tömegspektrometriával analizáltuk. Redukció után többnyire a TPO tripszines emésztéssel kapott nagyobb peptidjeinek megfelelő tömegeket detektáltunk. A redukálatlan mintákban e tömegek közül néhány hiányzott, és új tömegek jelentek meg. Az új csúcsok tömege lényegében megfelelt a tripszines emésztéssel kapott különálló, a diszulfid párban szereplő peptidek tömege összegének. Ilyenformán, a visszaállított harmadlagos szerkezetű, rekombináns, biológiailag aktív TPO diszulfid mintázata egyértelműen 1-4 és 2-3, ami megfelel a rokon eritropoietin molekula ismert diszulfid mintázatával.

(D) £ rekombináns. visszaállított harmadlagos szerkezetű

TPO (Met^-1 1-153) biológiai aktivitása

A visszaállított harmadlagos szerkezetű, tisztított TPO (Met^-1 1-153) in vitro és in vivő vizsgálatokban egyaránt aktivitást mutat. A Ba/F3 vizsgálatban ez a TPO alak a timidin Ba/F3 sejtekbe való beépülésének 50 %-os serkentését 3,3 pg/ml (0,3 pM) koncentrációnál muttatta. Az • ··

- 270 mpl receptor alapú ELISA vizsgálatban az 50 %-os aktivitás 1,9 ng/ml (120 pM) koncentrációnál tapasztaltuk. Normális és (majdnem letális dózisú röntgensugárzással kezelt) mieloszuppresszált állatokban a TPO (Met^-1 1-153) az új vérlemezkék termelődésének serkentésében igen hatásos volt (mindössze 30 ng/egér dózisnál észlelhető volt a hatás).

23. példa

Egyéb biológiailag aktív TPO változatok termelése

E. colj-ban

Az alábbiakban három különböző, E. coli-baxt termelt, tisztított és visszaállított harmadlagos szerkezetű TPO változatot írunk le.

(1) MLF

A bakteriális eredetű STII szignál szekvencia 13 gyökét a TPO N-terminális doménjéhez (1-155. aminosavak) fúzionéltuk.

Az így kapott szekvencia:

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC...CVRRA (85. sz. szekv.) (a leader szekvenciát aláhúzással jelöltük; a C...C a 7. ciszteintől a 151. ciszteinig terjedő szekvenciát jelenti). Ezt a változatot azért készítettük, hogy a TPO receptorként és biológiai vizsgálatokban való alkalmazása érdekében végzett radioaktív jódozásához tirozint biztosítsunk.

271 (2) H8MLF

Az SYII szekvencia 7 gyökét, 8 hisztidin gyököt és az Xa faktor enzimatikus hasítási szekvenciát (IEGR) a TPO

N-terminális doménjéhez (1-155. aminosavak) fuzionáltuk.

Az így kapott szekvencia:

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC...CVRRA (86. sz. szekv.) (a leder szekvenciát aláhúzással jelöltük; a C...C a 7. ciszteintől a 151. ciszteinig terjedő szekvenciát jelenti). Ez a változat — tisztításkor és a harmadlagos szerkezet visszaállításakor — az Xa faktor enzimmel kezelhető, amely az IEGR szekvencia arginin gyöke után hasít, s ezáltal 155 aminosavas TPO változatot eredményez, amely természetes szerin N-terminális aminosavval rendelkezik.

(3) T-H8MLF

Ezt a változatot a H8MLF-hez hasonlóan állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy a TPO N-terminális doménjéhez trombinra érzékeny szekvenciát (IEPR) fúzionáltunk. Az így kapott szekvencia az alábbi:

MKENIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC...CVRRA (87. sz. szekv.) (a leder szekvenciát aláhúzással jelöltük; a C...C a 7. ciszteintől a 151. ciszteinig terjedő szekvenciát jelenti). Ez a változat - tisztításkor és a harmadlagos szerkezet visszaállításakor - a trombin enzimmel kezelhető, amely természetes, 155 aminosavas TPO változatot eredményez.

• ·

- 272 (A) Az (1). (2) és_L3J_monomer, biológiailag aktív TPO változatok kinyerése, szolubilizálása és tisztítása

Valamennyi változatot E. coli-ban expresszáltuk. A változatok döntő többségét a fénytörő testekben találtuk, amint az a 22.

megfigyeltük. A szolubilizálásához példában a TPO(Met^-1 1-153) esetében monomer TPO változatok kinyeréséhez, és tisztításához a 22. példában leírtakkal azonos eljárásokat alkalmaztunk. A TPO (Met^-1 1-153) esetében leírt refolding reakciófeltételeket 30-50 %-os hozammal alkalmaztuk. A harmadlagos szerkezet visszaállítása (refolding) után a TPO változatokat 0,1 %-os

TFA-ban acetonitril gradiens alkalmazásával (ld. fentebb) C4 reverz fázisú kromatográfiával tisztítottuk. A TPO változatok mindegyike (proteolizálatlan alakban) rendelkezett biológiai aktivitással (Ba/F3 vizsgálat), s az 50 %-os aktivitás 2-5 pM koncentrációnál jelentkezett.

(B) Δ_L2J_ás_L2ü_változat_proteolízises feldolgozása (Processing)_a_valódi_N-terminális TPO( 1-155) kialakítása érdekében

A (2) és (3) TPO változatot úgy alakítottuk ki, hogy a TPO normális N-terminális aminosav-gyöke előtt enzimatikusan hasítható leader peptidet tartalmazzanak. A (2) és (3) TPO változatot (harmadlagos szerkezetük visszaállítása és tisztításuk után) a megfelelő enzimmel emésztettük. A C4 reverz fázisú kromatográfiás lépésből származó acetonitrilt

273 mindkét változat esetében úgy távolítottuk el, hogy az oldaton óvatosan nitrogéngázt áramoltattunk át. Ezután a két változatot az alábbiak szerint Xa faktorral, illetve trombinnal kezeltük.

A (2) TPO változat esetében az acetonitril-mentes oldathoz 50 mM végkoncentrációban 1 M Tris puffért (pH = 8) adtunk, és a pH-t szükség esetén 8-ra állítottuk. Az oldathoz 0,1 M koncentrációban NaCl-ot, illetve 2 mM koncentrációban CaClz-ot adtunk. Az Xa faktort (New England Biolabs) a TPO változathoz viszonyítva 1:25 - 1:100 mólarányban adagoltuk.

A mintát a maximális hasítás elérése érdekében (amit az SDS gélen látható vándorlás — leader szekvencia leválását mutató — változásával értékeltünk) szobahőmérsékleten 1-2 óra hosszat inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet C4 reverz fázisú kromatográfiával tisztítottunk, melynek során a megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező változatok tisztításához leírt gradienst és feltételeket alkalmaztuk. Az alkalmazott körülmények hatására a nem hasított B változat elkülönül a hasított (2) változattól. Kimutattuk, hogy az N-terminális aminosavak szekvenciája SPAPP, ami azt jelzi, hogy az N-terminális leader szekvencia eltávolítása sikeres volt. Az Xa faktor a TPO doménben különböző számú belső hasítást is eredményezett; a 118. arginin után megfigyeltünk egy hasítást, ami egy újabb N-terminális szekvenciát (TTAHKDP; 88. sz. szekv.) eredményezett. Az Xa faktorral hasított változat esetében nem redukáló SDS gélen egyetlen, hozzávetőleg 17 kD-os sávot figyeltünk meg;

274 •, . · : . ···, • · · ,·· ···· ···· ·· ezzel szemben, redukáló gélen két, hozzávetőleg 12 kD-os és 5 kD-os sávot detektáltunk, ami jó egyezést mutat a 118. arginin gyöknél történt hasítással. Ez a megfigyelés igazolta azt is, hogy a molekula két részét az 1. és 4. cisstein gyök közötti diszulfidkötés tartotta össze, amire a fentebb leírt tripszines emésztési kísérletekből is következtettünk. A Ba/F3 biológiai vizsgálatban a tisztított

TPO (1-155) változat — az N-terminális leader szekvencia eltávolítása után és a belső hasítással — 0,2-0,3 pM koncentrációban fejtette ki 50 %-os aktivitását. A leader szekvenciával rendelkező sértetlen változat 50 %-os aktivitása 2-4 pM volt.

A (3) változat esetében 50 mM Tris (pH - 8), 2 % CHAPS, 0,3M NaCl, 5 mM EDTA és a TPO változatra viszonyítva 1:25 - 1:50 tömegarányú humán vagy szarvasmarha trombin (Calbiochem) elegyéből álló emésztő puffért alkalmaztunk. Az emésztést szobahőmérsékleten 2-6 órán át végeztük. Az emésztés előrehaladását SDS géleken vizsgáltuk (az Xa faktoros emésztéshez hasonlóan). Az említett idő alatt általában a leader szekvencia 90 %-nál nagyobb mértékű hasítását értük el. A kapott TPO-t a fentebb leírtak szerint C4 reverz fázisú oszlopokon tisztítottuk. Aminosav-szekvenálással kimutattuk, hogy a TPO a kívánt N-terminális szekvenciával rendelkezett. Az Xa faktor esetében megfigyelt arginin-treonin kapcsolódásnál csak nagyon kismértékű (<5 %) belső hasítást tapasztaltunk. A keletkezett TPO protein nagy biológiai aktivitással rendelkezett; a Ba/F3 vizsgálatban • ·

- 275 0,2-0,4 pM koncentrációnál mutatott 50 %-os aktivitást, mpl receptoron alapuló ELISA vizsgálatban ez a protein 2-4 mg/ml tisztított protein koncentrációnál (120-140 pM) adott 50 %-os reakciót, míg a leader szekvenciával rendelkező sértetlen változat mindkét vizsgálatban 5-10-szer kevésbé volt hatásos. Állatkísérletekhez a HPLC-vel tisztított, hasított proteint fiziológiailag elfogadható pufferekkel (150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80 és 10 mM nátrium-szukcinát, pH = 7,4 vagy 10 mM nátrium-acetát, pH = 5,5 vagy 10 mM nátrium-foszfát, pH =7,4) szemben dializáltuk. A HPLC-vel és SDS-PAGE elektroforézissel tisztított protein 4 °C-on tárolva több hétig stabil volt. Normális és mieloszuppresszált egerekben a valódi N-terminális szekvenciával rendelkező tisztított TPO igen aktív volt; a vérlemezkék termelődését mindössze 30 ng/egér dózisban is serkentette.

24. példa

Szintetikus mpl ligandum

Annak ellenére, hogy a humán mpl ligandumot (hML) rendszerint rekombináns eljárásokkal állítjuk elő, az alábbiakban leírt módszerek alkalmazásával szintetikus peptid fragmentek enzimatikus összekapcsolásával is szintetizálható. A hML szintetikus előállítása lehetővé teszi nem természetes aminosavak vagy szintetikus vegyületek (pl. polietilén-glikol) beépítését is. Korábban leírták, hogy a szerin proteáz szubtilizin BPN egy mutánsát, a • · • ·

- 276 szubtiligázt (S221C/P225A) génsebészeti módszerekkel úgy manipulálták, hogy vizes oldatban hatásosan ligáija a peptid-észtereket (Abrahamsen és mtsi., Biochem., 30. 4151-4159, 1991). Kimutatták, hogy szintetikus peptidek enzimatikus egymás után ligálásával enzimatikusan aktív, hosszú peptidek és proteinek alakíthatók ki, mint pl. a ribonukleáz A (Jackson és mtsi., Science, 1994). Ez a technika, melyet az alábbiakban részletesebben ismertetünk, lehetővé tette, hogy kémiai úton olyan hosszú proteineket szintetizáljunk, amelyeket korábban csak rekombináns DNS technikával állíthattunk elő.

aktivált

A reakció

A hMLi53 szubtiligáz alkalmazásával végzett szintézisének általános stratégiáját az 1. reakcióvázlatban mutatjuk be. A reakciót védőcsoport nélküli peptiddel kezdjük, amely a protein C-terminálisának felel meg, és ehhez egy N-terminálison védett, C-terminálison peptid-észtert adunk (szubtiligázzal együtt).

befejeződése után a terméket reverz fázisú HPLC-vel izoláljuk, és az N-terminálisről eltávolítjuk a védőcsoportot. Ezután a következő peptidet ligáijuk, védőcsoportját eltávolítjuk, és a folyamatot az egymást követő peptidek alkalmazásával addig ismételjük, míg a teljes hosszúságú protein ki nem alakul. Ez az eljárás hasonló a szilárd fázisú technikához, melyben egy Nterminálison védett, C-terminálison aktivált peptidet az előző peptid N-terminálisához ligálunk, és a proteint C —>N irányban szintetizáljuk. Mivel azonban minden egyes

- 277 kapcsolás 50 aminosav hozzáadását jelenti, és a termékeket minden ligálás után izoláljuk, a szubtiligázos eljárással jelentős hozam mellett sokkal hosszabb tiszta proteinek szintetizálhatok.'

1. REAKCIÓVÁZLAT hML szintézise szubtiligáz alkalmazásával

R-NH-Pept ids-CO-R' + ΗζΝ-ΖΡθρρίζ. zLd n_-C02

1) Szubtiligáz

R-NH-ZP ept. ida-CO-NH-ZP θIpto ö_ d □_-COz

2) Zn/CHsCOOH

H2N-ZP e p t i_ d -CO-NH-ZP θ p> ts 1_ d □_ -CO2

3) 1 + 2 ismétlése

H2N-Pept ids-CO-NH-Pept i_ ds-CO-NH-Pept i_d-C02

ismereteink fragmentre

A szubtiligáz szekvencia-specifitásáról, valamint a hML biológiailag aktív epo-doménjérői rendelkezésre álló alapján a hMLiss-at hét, 18-25 aminosavas osztottuk. Teszt ligáló tetrapeptideket szintetizáltunk. hogy meghatározzuk a 18-25-merek megfelelő ligálási kapcsolódásait. A XIII. táblázatban e teszt • ·

- 278 ligálások eredményeit mutatjuk be.

XIII. TÁBLÁZAT hML teszt ligálások

A donor és nukleofil peptideket 22 ’C-on 10 mM koncentrációban 100 mM tricinben (pH = 7,8) oldottuk. A ligást 1,6 mg/ml (kb. 70 uM) koncentrációjú törzsoldatból 10 uM végkoncentrációban adtuk az oldathoz, és a ligálási reakciót egy éjszakán át végeztük. A hozamot a %-os ligálás és a %-os hidrolízis hányada adja.

Hely Donor Nukleof1I-NH2 Hidrolízis Ligálás (glc-K-NHa) % %

1	(23/24)	HVLH	SRLS	92	8
		(89.sz.szekv.)	(90.sz.szekv.)
	(22/23)	SHVL	HSRL	48	52
		(91.sz.szekv.)	(92.sz.szekv.)
2	(46/47)	AVDF	SLGE	22	78
		(93.sz.szekv.)	(94.sz.szekv.)
3	(69/70)	AVTL	LLEG	53	47
		(95.sz.szekv. )	(96.sz.szekv.)
4	(89/90)	LSSL	LGQL	95	5
		(97 . sz. szekv. )	(98.sz.szekv.)
	(88/90)	C(acm)LSS	LLGQ	0	0
		(99.sz.szekv.)	(100.sz.szekv.)
	(90/91)	SSLL	GQLS	45	55

(101.sz.szekv.) (102.sz.szekv.) ···· • · · · ·

- 279 XIII. TÁBLÁZAT (folytatás)

Hely

Donor Nukleof1I-NH2 (glc-K-NH₂)

Hidrolízis Ligálás % % (88/89) CLSS (103.sz.szekv. ) (107/108) LQSL (104.sz.szekv. ) (106/107) ALQS (106.sz.szekv. ) (128/129) NAIF (108.sz.szekv.)

LLGQ 90 10 (100.sz.szekv.)

LGTQ 99 1 (105.sz.szekv.)

LLGT 70 30 (107.sz.szekv.)

LSSFQ 60 40 (109.sz.szekv.)

E kísérletek alapján a XIV. táblázatban felsorolt ligáié peptidek hatékonyan ligálhatók a szubtiligáz alkalmazásával. A donor peptid-észterek N-terminálisa védőcsoportjának meg kell akadályoznia az önligálódást. Mi egy izonikotinil (iNOC) védőcsoportot (Veber és mtsi., J. Org. Chem., 42. 3286-3289, 1977) választottunk, mivel ez vízoldékony, a szilárd fázisú peptidszintézis utolsó lépésében építhető be, és stabil a védőcsoport eltávolításához és a peptidek szilárd gyantáról történő lehasításához alkalmazott vízmentes HF-dal szemben. Az iNOC védőcsoport ráadásul enyhe redukáló körülmények (Zn/CH3C00H) alkalmazásával minden egyes ligálási lépés után eltávolítható a peptidről, ami a következő ligálásokhoz szabad N-terminálist biztosít.

• ··

- 280 A C-terminális aktiválásához korábbi kísérletek alapján glikolát-lizil-amid (glc-K-NH2) észtert alkalmaztunk, mivel ezt a vegyületet a szubtiligáz hatékonyan acilezi (Abrahmsen és mtsi., Biochem., 30. 4151-4159, 1991). Az iNOC csoporttal védett, glc-K-amiddal aktivált peptidek a 2.

reakcióvázlatban bemutatott standard szilárd fázisú eljárással szintetizálhatok. A peptideket egymás után addig ligáljuk, míg ki nem alakul a teljes protein, és a végtermék harmadlagos szerkezetét in vitro állítjuk vissza (refolding) Az EPO-val mutatott homológia alapján úgy véljük, hogy a diszulfid párok a 7. és 151., illetve a 28. és 85. cisztein aminosavak között alakulnak ki. A diszulfidokat egyszerűen úgy oxidáljuk, hogy a redukált anyagot néhány órán keresztül oxigén atmoszféra alatt kevergetjük. A visszaállított harmadlagos szerkezetű proteint ezután HPLC-vel tisztíthatjuk, és az aktív proteint tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Más lehetőség szerint, a diszulfidok megkülönböztető módon védhetők, ami szabályozza a specifikus diszulfid párok egymás utáni oxidációját. Ha a

7. és 151. cisztein gyököt acetamido-metil (acm) csoportokkal védjük, a 28. és 85. cisztein gyök fog oxidálódni. Az acm csoportok ezután eltávolíthatók, és a 7. és 151. cisztein gyök oxidálható. Ez a műveletsor fordítottan is elvégezhető. Adott esetben a 28. és 85. cisztein (a 7. és 151. cisztein gyök megfelelő oxidációjának biztosítása érdekében) más természetes vagy nem természetes gyökkel is helyettesíthető.

• · ·

- 281 XIV. TÁBLÁZAT

A hML szubtiligáz alkalmazásával végzett teljes szintéziséhez használt peptid-fragmentek (110. sz. szekv.) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NHz (1-22) (111. sz. szekv.) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NHz (23-46) (112. sz. szekv.) iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NHz (47-69) (113. sz. szekv.) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NHz (70-90) (114. sz. szekv.) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NHs (90-106) (115. sz. szekv.) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NHs (107-128) (116. sz. szekv.)

H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)

A peptidek ligálását frissen készített vagy 5 um-es filteren vákuumszűréssel gáztalanított 100 mM tricinben 25 ’C-on végezzük. A C-terminális fragmentet pufferben oldjuk (2-5 mM peptid) és a szubtiligáz tízszeres koncentrációjú törzsoldatát (1 mg/ml 100 mM tricinben, pH = 8) adjuk hozzá, hogy az enzim végkoncentrációja kb. 5 uM legyen. Az oldathoz ezután 3-5-szörös moláris feleslegben hozzáadjuk a glikolát-lizil-amiddal aktivált donor peptidet (szilárd alakban),

····

- 282 feloldjuk, és az elegyet 25 ’C-on állni hagyjuk. A ligálás előrehaladását analitikai reverz fázisú C18 HPLC-vel követjük nyomon (0,1 % TFA-val CH3CN/H2O gradiens). A ligálási termékeket preparatív HPLC-vel tisztítjuk és liofilizáljuk. Az izonikotinil (iNOC) védőcsoportok eltávolításához a védett peptidet ecetsavban HCl-dal aktivált cinkporral keverjük. A cinkport szűréssel eltávolítjuk, és az ecetsavat vákuum alatt lepároljuk. A keletkezett peptidet közvetlenül felhasználhatjuk a következő lépésben, amelyben a folyamatot megismételjük. A szintetikus hMLi53-at a fentebb leírttal analóg eljárásokkal szintetikus vagy rekombináns hMLi54-332-höz ligálhatjuk, miáltal szintetikus vagy félszintetikus, teljes hosszúságú hML-t állíthatunk elő.

A szintetikus hML-nek sok előnye van a rekombinánssal szemben. A hatékonyság vagy specifitás fokozása érdekében nem természetes oldalláncokat építhetünk be. A hatás időtartamának növelése érdekében polimer csoportokat (pl. polietilén-glikol) is beépíthetünk. A polietilén-glikol például egy vagy több elvégzett ligálási lépés előtt vagy után az egyes fragmentek (XIV. táblázat) lizin gyökeihez kapcsolható. A proteázos hasításra érzékeny peptidkötések az in vivő stabilitás fokozása érdekében eltávolíthatók vagy megváltoztathatók. Ezenkívül, a szerkezetmeghatározás elősegítése érdekében nehézatomos származékok szintetizálhatok.

- 283 2. REAKCIÓVÁZLAT

A peptid-fragmentek szilárd fázisú szintézise

HoN.

O boc-νη^Λ ^nh R O R

MBHA\ (automatizált szintézis) ayin ti / -^; _Hx^(Peptidehr^NH/O-Tr

e , f(hasítás) o o o f^oA_H'^(PeP^tide\^ífflr^xo-''''tr^NHr^

NH₀

O (CH₂)₄ nh₂

Izonikotinil-csoport (iNOC)

Glikozilát-lizil-amid-csoport (glc-K-NHs)

a) Lizil-parametil-benzil-hidril-amin (MBHA) gyantát (1) (0,63 mekv./g, Advanced ChemTech) dimetil-acetamidban (DMA) ’C-on egy órán át bróm-ecetsavval (5 ekv.) és diisopropil-karbo-diimiddel (5 ekv.) keverjük, miáltal a bróm-acetil származékot (2) kapjuk.

b) A gyantát DMA-val alaposan mossuk, és a különálló Boc-védett aminosavakat (3 ekv., Bachem) 50 ’C-on dimetil-formamidban (DMF) nátrium-bikarbonáttal (6 ekv.) 24 óráig keverve észteresítjük, miáltal a megfelelő glikolát-fenil• · • · · · · · ·_Α • · · · · ···· ···· ·· ······· ·

- 284 -alanil-amid gyantát (3) kapjuk. Ezt az amino-acetilezett gyantát (3) háromszor DMF-fel és háromszor diklór-metánnal mossuk (ilyen állapotban a gyanta szobahőmérsékleten több hónapig eltartható). A gyantát (3) automatizált peptid-ssintetizáló készülékbe (Applied Biosystems 430A) helyezzük, és a peptideket standard szilárd fázisú eljárások alkalmazásával hosszabbítjuk.

c) Az N-alfa-Boc csoportot diklór-metánban 45 %-os trifluor-ecetsav oldattal eltávolítjuk.

d) A következő Boc-védett aminosavakat (5 ekv.) benzo-triazol-l-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluorfoszfát (BOP, 4 ekv.) és N-metil-morfolin (NMM; 10 ekv.) DMA-ban készített elegyével előaktiváljuk, és a kapcsolást 1-2 óra hosszat végezzük.

e) Az utolsó N-alfa-Boc védőcsoportot eltávolítva (TFA/CH2CI2) a (4) vegyületet kapjuk, és az izonikotinil (iNOC) védőcsoportot 25 ’C-on, DMA-ban 4-izonikotinil-2,4-dinitro-fenil-karbonáttal (3 ekv.) és NMM-mel (6 ekv.) 24 óra hosszat végzett keveréssel visszük be.

f) A peptid hasításával és a védőcsoport vízmentes HF-dal (5 % anizol/5 % etil-metil-szulfid) 0 ’C-on 1 órás kezeléssel végzett eltávolításával a iNOC csoporttal védett, glikolát-lizinil-amiddal aktivált peptidet (5) kapjuk, melyet reverz fázisú C18 HPLC kromatográfiával tisztítunk (CH3CN/H2O gradiens, 0,1 % TFA). A szubsztrátok azonosságát tömegspektrometriával igazoljuk.

285

Az American Type Culture Collection-nél (ATCC) (Rockviile, MD, Amerikai Egyesült Államok) az alábbi sejtvonalakat helyeztük letétbe:

Escherichía coli, DHlOB-pBSK-hmpl I 1.8,

ATCC deponálási szám: CRL 69575, 1994. február 24.;

PSVI5.ID.LL.MLORF plazmid,

ATCC deponálási szám: CRL 75958, 1994. december 2.;

CHO DP-12 sejtek, ML 1/50 MCB (#1594),

ATCC deponálási szám: CRL 11770, 1994. december 2.

Míg a találmány szükségszerűen az előnyös megvalósítási módokkal összefüggésben jellemeztük, a találmány tárgykörétől való eltérés nélkül különböző változtatások, egyenértékű anyagokkal való helyettesítések és módosítások hajthatók végre. Ilyenformán, a találmány gyakorlati megvalósítása az itt leírtaktól eltérő módon is lehetséges.

A találmány leírásában említett valamennyi irodalmi forrást kifejezetten hivatkozásul soroltuk fel.

*· *

- 286 SZEKVENCIALISTA

Szekvenciák száma: 144

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 353 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:	1.	SZ.	SZEKV.
Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu	Leu	Val	Val Met Leu Leu Leu Thr
1 5			10 15
Alá Arg Leu Thr Leu Ser Ser	Pro	Alá	Pro Pro Alá Cys Asp Leu
20			25 30
Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu	Arg	Asp	Ser His Val Leu His Ser
35			40 45
Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu	Val	His	Pro Leu Pro Thr Pro Val
50			55 60
Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe	Ser	Leu	Gly Glu Trp Lys Thr Gin
65			70 75
Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin	Asp	Ile	Leu Gly Alá Val Thr Leu
80			85 90
Leu Leu Glu Gly Val Met Alá	Alá	Arg	Gly Gin Leu Gly Pro Thr
95			100 105
Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly	Gin	Leu	Ser Gly Gin Val Arg Leu
110			115 120
Leu Leu Gly Alá Leu Gin Ser	Leu	Leu	Gly Thr Gin Leu Pro Pro
125			130 135
Gin Gly Arg Thr Thr Alá His	Lys	Asp	Pro Asn Alá Ile Phe Leu
140			145 150
Ser Phe Gin His Leu Leu Arg	Gly	Lys	Val Arg Phe Leu Met Leu
155			160 165
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys	Val	Arg	Arg Alá Pro Pro Thr Thr
170			175 180
Alá Val Pro Ser Arg Thr Ser	Leu	Val	Leu Thr Leu Asn Glu Leu
185			190 195
Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu	Leu	Glu	Thr Asn Phe Thr Alá Ser
200			205 210

·**·

- 287 -

Alá Arg Thr Thr Gly

Ser

Gly

Leu

Leu Lys 220

Trp Gin

Gin Gly

Phe 225

215

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

230

235

240

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

Kis

Glu

Leu

Leu

Asn

245

250

255

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

260

265

270

Alá

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

290

295

300

Thr

Gly

C-ln

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

305

310

315

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

Pro

320

325

330

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

335

340

345

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

350 353

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 1795 bázis (B) TÍPUS: nukleinsav (0) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZ. SZEKV.

TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50

CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100

CCCCACCCTA CTCTGCCGAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150

CCCAC-GAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAC-CC ACGCCAGCCA 200

GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCC7CG TGGTCATGCT 250

TCTCCTAACT GCAAGC-CTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300

ACC7CCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCA7CT CCTTCACAGC 350

- 288 GGTTCACCCT TTGCCTACAC

TGGGAGAATG GAAAACCCAG

GGAGCAGTGA CCCTTCTGCT

GGGACCCACT TGCCTCTCAT

GTCTCCTCCT TGGGGCCCTG

CAGGGCAGGA CCACAGCTCA

CCAACACCTG CTCCGAGGAA

CCACCCTCTG CGTCAGGCGG

ACCTCTCTAG TCCTCACACT

GTTGGAGACA AACTTCACTG

TGAAGTGGCA GCAGGGATTC

ACCTCCAGGT CCCTGGACCA

ACTCTTGAAT GGAACTCGTG

TAGGAGCCCC GGACATTTCC

CCCAACCTCC AGCCTGGATA

ACAGTATACG CTCTTCCCTC

AGCTCCACCC CCTGCTTCCT

AGCCCTCTTC TAAACACATC

AGGGTAAGGT TCTCAGACAC

AC-ACTGAGCC AGTGCCCAGA

GCCTGCTGTG GACTTTAGCT

CCAAGGCACA GGACATTCTG

ATGGCAGCAC GGGGACAACT

GCAGCTTTCT GGACAGGTCC

TTGGAACCCA GCTTCCTCCA

AATGCCATCT TCCTGAGCTT

CCTGATGCTT GTAGGAGGGT

CCACAGCTGT CCCCAGCAGA

CCAAACAGGA CTTCTGGATT

AACTACTGGC TCTGGGCTTC

TTCCTGGTCT GCTGAACCAA

TACCTGAACA C-GATACACGA

TC-GACCCTCA CGCAGGACCC

CAGACACAGG CTCCCTGCCA

CCAACCCATC CTCCTACTGG

CTTGCCCACC CCTGTGGTCC

CTCCAACGCC CACCCCTACC

TCCCAGAATC TGTCTCAGGA

CTGTCCTGCT 400

ATGGAGGAGA 450

GGAGGGAGTG 500

CCCTCCTGGG 550

CAGAGCCTCC 600

CAAC-GATCCC 650

AGGTGCGTTT 700

GCCCCACCCA 750

GAACGAGCTC 800

CCTCAGCCAG 850

AGAGCCAAGA 900

AATCCCCGGA 950

GACTCTTTCC 1000

TCAGGAACAT 1050

TTCTCCTTCC 1100

TTCCACCCAC 1150

GACCCTTCTG 1200

CTACACCCAC 1250

TGCCGACATC 1300

AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGC-GAGAC 1350

289

AACTGGACAA	GATTTCCTAC	TTTCTCCTGA	AACCCAAAGC	CCTGGTAAAA	1400
GGGATACACA	C-GACTGAAAA	GGGAATCATT	TTTCACTGTA	CATTATAAAC	1450
CTTCAGAAGC	TATTTTTTTA	AGCTATCAGC	AATACTCATC	AGAGCAGCTA	1500
GCTCTTTGGT	C7ATTTTCTG	CAGAAATTTG	CAACTCACTG	ATTCTCTACA	1550
TGCTCTTTTT	CTGTGATAAC	TCTGCAAAGG	CCTGGGCTGG	CCTGGCAGTT	1600
GAACAGAGGG	AGAGACTAAC	CTTGAGTCAG	AAAACAGAGA	AAGGGTAATT	1650
TCCTTTGCTT	CAAATTCAAG	GCCTTCCAAC	GCCCCCATCC	CCTTTACTAT	1700
CATTCTCAGT	C-GGACTCTGA	TCCCATATTC	TTAACAGATC	TTTACTCTTG	1750
AGAAATGAAT	AAGCTTTCTC	TCAGAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAA 1795
TUDNIVALÓK A	3. SZÁMÚ	SZEKVENCIÁHOZ

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 42 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:	3.	SZ.	SZEKV.
Leu Leu Leu Val Val Met Leu	Leu	Leu	Thr Alá Arg Leu Thr Leu
1 5			10 15
Ser Ser Pro Alá Pro Pro Alá	Cys	Asp	Leu Arg Val Leu Ser Lys
20			25 30
Leu Leu Arg Asp Ser His Val	Leu	His	Ser Arg Leu
35			40 42

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 390 bázis (B) TIFUS: nukleinsav

290 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZ. SZEKV.

GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50

CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100

GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150

CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200

GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250

CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300

TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350

TCTTCACAAT ACAGCCCC-CA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA -JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 390 bázis (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZ. SZEKV.

CTTAAGGACC TTATGGTCGA CTGTTACTAA AGGAGGAGTA GAAAGTTGGA 50

GTGGAGAGGA GTAGATTCTT AACGAGGAGC ACCAGTACGA AGAGGATTGA 100

CGTTCCGATT GCGACAGGTC GGGCCGAGGA GGACGAACAC TGGAGGCTCA 150

GGAGTCATTT GACGAAGCAC TGAGGGTACA GGAAGTGTCG TCTGACCACT 200

CTTGAGGGTT GTAATAGGGG AAATAGGCGC ATTGACCATT CTGTGGGTAT 250 ·· · • · · 291

GAGGGTCCTT CTGTGGTAGT GAAGGAGATT GAGGAACTGG GTTACTGATA 300

AGAAGGGTAT AACAGGGGTG GATGACTAGT GTGAGAGACT GTTCTTAATA 350

AGAAGTGTTA TGTCGGGCGT AAATTTTCGA GAGCAGATCT 390

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 332 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:	6. (	5Z.	SZEKV.
Ser Pro Aia Pro Pro Aia Cys	Asp	Leu	Arg Val Leu Ser Lys Leu
1 5			10 15
Leu Arg Asp Ser Kis Val Leu	His	Ser	Arg Leu Ser Gin Cys Pro
20			25 30
Glu Val His Pro Leu Pro Thr	Pro	Val	Leu Leu Pro Alá Val Asp
35			40 45
Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys	Thr	Gin	Met Glu Glu Thr Lys Alá
50			55 60
Gin Asp Ile Leu Gly Alá Val	Thr	Leu	Leu Leu Glu Gly Val Met
65			70 75
Alá Alá Arg Gly Gin Leu Gly	Pro	Thr	Cys Leu Ser Ser Leu Leu
80			85 90
Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val	Arg	Leu	Leu Leu Gly Alá Leu Gin
95			100 105
Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu	Pro	Pro	Gin Gly Arg Thr Thr Alá
110			115 120
His Lys Asp Pro Asn Alá Ile	Phe	Leu	Ser Phe Gin His Leu Leu
125			130 135
Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu	Met	Leu	Val Gly Gly Ser Thr Leu
140			145 150
Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro	Thr	Thr	Alá Val Pro Ser Arg Thr
155			160 165
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn	Glu	Leu	Pro Asn Arg Thr Ser Gly
170			175 180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Alá

Ser

Alá

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

185

190

195

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

200

205

210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

215

220

225

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

230

235

240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

245

250

255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

260

265

270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

275

280

285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

290

295

300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

305

310

315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

320

325

330

Glu

Gly

332

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 166 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ÁLAK: 1iné ár i s (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZ. SZEKV.

Alá 1

Pro

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Leu

Glu

Alá

Lys 20

Glu

Alá

Glu

Asn

Ile 25

Thr

Thr

Gly

Cys

Alá 30

Glu

His

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr 40

Val

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val Asn Phe Tyr Alá Trp Lys Arg Két Glu Val Gly Gin Gin Alá 50 55 60

- 293 -

Val

Glu

Val

Trp

Gin

Gly

Leu

Alá

Leu

Leu

Ser

Glu

Alá

Val

Leu

65

70

75

Arg

Gly

Gin

Alá

Leu

Leu

Val

Asn

Ser

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

80

85

90

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

Lys

Alá

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

95

100

105

Thr

Thr

Leu

Leu

Arg

Alá

Leu

Gly

Alá

Gin

Lys

Glu

Alá

Ile

Ser

110

115

120

Pro

Pro

Asp

Alá

Alá

Ser

Alá

Alá

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Alá

125

130

135

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

140

145

150

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Alá

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

155

160

165

Arg

165

TUDNIVA

LÓK

A 8

o . O

ZÁMO

' SZEKVENCIÁHOZ

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 328 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZ. SZEKV.

Ser 1

Pro

Alá

Pro

Pro 5

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Alá

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Alá

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Alá Leu Gin 95 100 105

- 294 ····

Ser

Leu Leu Gly Thr 110

Gin Gly Arg

Thr

Thr 115

Alá

His

Lys

Asp

Pro 120

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

140

145

150

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

155

160

165

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

170

175

180

Asn

Phe

Thr

Alá

Ser

Alá

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

185

190

195

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

200

205

210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

215

220

225

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

230

235

240

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

245

250

255

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

C-ly

Tyr

Ser

Pro

Ser

260

265

270

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser

Alá

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

305

310

315

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

C-In

Glu

Gly

320

325

328

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (ii SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZOSÁG: 265 aminosav (E) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZ. SZEKV

- 295 -

Ser 1

Pro Alá

Pro

Pro 5

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg Val 1Ö

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg Leu 25

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu Leu 40

Pro

Alá

Val

Asp 45

Phe

Ser Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Mer Glu ζ £

Glu

Thr

Lys

Alá 60

Gin

Asp Ile

Leu

Gly 65

Alá

Val

Thr

Leu

Leu Leu 70

Glu

Gly

Val

Met 75

Alá

Alá Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys Leu 85

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu Leu ICO

Gly

Alá

Leu

Gin 105

Ser

Leu Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

C-ln Gly 115

Arg

Thr

Thr

Alá 120

Kis

Lys Asp

Pro

Asn 125

Alá

Ile

Phe

Leu

SSZT ?Γ1Θ 13 Q

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly Lys

Asp

Phe 140

Trp

Ile

Val

Gly

Asp Lys 145

Leu

His

Cys

Leu 150

Ser

Gin Asn

Tyr

Trp 155

Leu

Trp

Alá

Ser

Glu Val 16 C

Alá

Alá

Gly

Ile 165

Gin

Ser Gin

Asp

Ser 170

Trp

Ser

Alá

Glu

Pro Asn 175

Leu

Gin

Val

Pro 180

Gly

Pro Asn

Pro

Arg 185

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp Thr ISO

Arg

Thr

Leu

Glu 195

Trp

Asn Ser

Trp

Thr 200

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu Thr 205

Gin

Asp

Pro

Arg 210

Ser

Pro Gly

His

Phe 215

Leu

Arg

Asn

Ile

A.rg His 22 0

Arg

Leu

Pro

Alá 225

Thr

Gin Pro

Pro

Alá 230

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe Pro 235

Asn

Pro

Ser

Ser 240

Tyr

Trp Thr

Val

Tyr 245

Alá

Leu

Pro

Ser

Ser Thr 25 0

His

Leu

Alá

His 255

Pro

Cys Gly

Pro

Alá

Pro

Pro

Pro

Alá

Ser

260 265

296

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 261 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris

:xi) sz:	EKVENCIA LEÍRÁS:	10.	SZ.	SZEKV.
Ser Pro 1	Alá Pro	Pro 5	Alá	Cys	Asp	Leu	Arg 10	Val	Leu Ser	Lys	Leu 15
Leu Arg	Asp Ser	His 20	Val	Leu	His	Ser	Arg 25	Leu	Ser Gin	Cys	Pro 30
Glu Val	His Pro	Leu 35	Pro	Thr	Pro	Val	Leu 40	Leu	Pro Alá	Val	Asp 45
Phe Ser	Leu Gly	Glu 50	Trp	Lys	Thr	Gin	Met 55	Glu	Glu Thr	Lys	Alá 60
Gin Asp	Ile Leu	Gly 65	Alá	Val	Thr	Leu	Leu 70	Leu	Glu Gly	Val	Met 75
Alá Alá	Arg Gly	Gin 80	Leu	Gly	Pro	Thr	Cys 85	Leu	Ser Ser	Leu	Leu 90
Gly Gin	Leu Ser	Gly 95	Gin	Val	Arg	Leu	Leu 100	Leu	Gly Alá	Leu	Gin 105
Ser Leu	Leu Gly	Thr 110	Gin	Gly	Arg	Thr	Thr 115	Alá	Kis Lys	Asp	Pro 120
Asn Alá	Ile Phe	Leu 125	Ser	Phe	Gin	His	Leu 130	Leu	Arg Gly	Lys	Asp 135
Phe Trp	Ile Val	Gly 140	Asp	Lys	Leu	His	Cys 145	Leu	Ser Gin	Asn	Tyr 150
Trp Leu	Trp Alá	Ser 155	Glu	Val	Alá	Alá	Gly 160	Ile	Gin Ser	C-ln	Asp 165
Ser Trp	Ser Alá	Glu 170	Pro	Asn	Leu	Gin	Val 175	Pro	Gly Pro	Asn	Pro 180
Arc Ile	Pro Glu	Gin 185	Asp	Thr	Arg	Thr	Leu 190	Glu	Trp Asn	Ser	Trp 195
Thr Leu	Ser Trp	Thr 200	Leu	Thr	Gin	Asp	Pro 205	Arg	Ser Pro	Gly	His 210
Phe Leu	Arg Asn	Ile 215	Arg	His	Arg	Leu	Pro 220	Alá	Thr Gin	Pro	Pro 225

- 297 -

Alá Trp	Ile	Phe	Ser 230	Phe	Pro Asn Pro Ser 235	Ser	Tyr	Trp	Thr	Val 240
Tyr Alá	Leu	Pro	Ser 245	Ser	Thr His Leu Alá 250	His	Pro	Cys	Gly	Pro 255
Alá Pro	Pro	Pro	Alá 260	Ser 261
TUDNIVALÓK	A	11.	SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 7849 bázis (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZ. SZEKV.

CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TCCCTGGTCA TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT 50

GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACTATCC TCCCAGCTAT CCCTACACCC 100

TCCTTCCTAA TCTTGGGAGA CATCTCGTCT GGCTGGACGG GAAAATTCCA 150

GGATCTAGGC CACACTTCTC AGCAGACATG CCCATCCTTG GGGAGGAGGA 200

ACAGGAGAGA GCCTGAGGAA GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT GATGGGATCA 250

AGGTCAGGCC AGGAAGCCCC TGAGGACAGA GACTGTGGGG AGACTGGGAC 300

TGGGAAGAAA GCAAAGGAGC TAGAGCCAGG GCCAAAGGAA AAGGGGGGCC 350

AGCAGGGAGG TATTTGCGGG GGAGGTCCAG CAGCTGTCTT TCCTAAGACA 400

GGGACACATG GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT CACATGTGGA ACGGTAGGAG 450

ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500

- 298 TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC

CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA

GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT

ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC

GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA

AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA

GAAATTTGGA TAGCCAGGGA GTGAAAACCC

TCTGTGCTTC TTCCCCAGCA ACACAAATGT

AAAAAACTTC TGCTCCTGTC CCCCTCCAGG

GGAAAAGATG GATCCCCCTA TCCAAATCTT

GAGGAGTC-GA CCCTGGTCCA GGCAGGGGCT

CTTCCGGGGG CCTTCACCAG TGTCTGGTGG

GAAGTGGCCC AGGCAGGCGT ATGACCTGCT

CACCGCCACA TGTCTTCCTA CCCATCTGCT

TGCACTTGGG TCCTGGAGCC CTTCTCCACC

GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC

CTGGGGGAGG GGCAGGCAAA CTGGAACCTA

GAAGAGTGTA GCCTTCCCAG AATGGGAGGA

GGGGTGGGGT GCTGGTTTCT GAGGGACTGA

CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550

CATACATGTG CCCCGCACCT 600

CCCCATAACA CCAACCCATA 650

CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700

TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750

GGTATGATGT CCAGGGAAAA 800

CACCAATCTT AAACAAGACC 850

CCTGCCAGAT TCCTCCTGGA-900

TCCCAGGTTG CCCATGTCCA 950

CTCCGTGGTG TGTGTGGGTG 1000

CCAGGC-AAGA GAAGGCGTCA 1050

CTCCCTTCTC TGATTGGGCA 1100

GCTGTGGAGG GGCTGTGCCC 1150

CCCCAGAGGG CTGCCTGCTG 1200

CGGTGAGTGG CCAGCAGGGT 1250

AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300

CAGGCACTGA CCTTTGTCGA 1350

GCAGGGCAGA GCAGGGGTAG 1400

TCACTTACTT GGTGGAATAC 1450

AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG GGACATGAGC CCAC-GGAGAA 1500

- 299 AATAAGAGAG GGAGCTGCAC TTAGGGCTTA GCAAACACAG TAGTAAGATG 1550

GACACAGCCC CAATCCCCAT TCTTAGCTGG TCATTCCTCG TTAGCTTAAG 1600

GTTCTGAATC TGGTGCTGGG GAAGCTGGGC CAGGCAAGCC AGGGCGCAAG 1650

GAGAGGGTAA TGGGAGGAGG GCCCACTCAT GTTGACAGAC CTACAGGAAA 1700

TCCCAATATT GAATCAGGTG CAAGCCTCTT TGCACAACTT GTGAAAGGAG 1750

GAGGAAGCCA TGTGGGGGGT CCTGTGAAGG AACCGGAAC-G GGTTCTGCCA 1800

AGGGGGCAGG GAGGCAGGTG TGAGCTATGA GACAGATATG TTAGTGGGCG 1850

CCTAAGACAA GGTAAGCCCC .TAAGGTGGGC ATCACCCAGC AGGTGCCCGT 1900

TCCTGGGCAG CTGGTCTCAG GAAGGAAGTC CCAGAACTGT TAGCCCATCT 1950

CTTGGCCTCA GATAATGGAG TATTTCAGGA CTTGGAGTCC AAAGAAAAGC 2000

TCCAGTGGCT TTATGTGTGG GGGTAGATAG GGAAAGAATA GAGGTTAATT 2050

TCTCCCATAC CGCCTTTTAA TCCTGACCTC TAGTGGTCCC AGTTACAGCT 2100

TTGTGCAGTT CCCCTCCCCA GCCCCACTCC CCACCGCAGA AGTTACCCCT 2150

CAACATATTG CGCCCGTTTG CCAGTTCCTC ACCCAGGCCC TGCATCCCAT 2200

TTTCCACTCT CTTCTCCAGG CTGAAGCCAC AATACTTTCC TTCTCTATCC 2250

CCATCCCAGA. TTTTCTCTGA CCTAACAACC AAGGTTGCTC AGAATTTAAG 2300

GCTAATTAAG ATATGTGTGT ATACATATCA TGTCCTGCTG CTCTCAGCAG 2350

GGGTAGGTGG CACCAAATCC GTGTCCGATT CACTGAGGAG TCCTGACAAA 2400

AAGGAGACAC CATATGCTTT CTTGCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTTT 2450

TTTTTTTTGA GACGGAGTTT CACTCTTATT GCCCAGGCTG GAGTGCAATG 2500

GTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC 2550

	- 300 -	• · · • · · • · · · · ·	Φ · ··· ··
TCCTGTCTCA	GCCTCCCAAG	TAGCTTGGAT	TACAGGCATG	AC-CCACCACA	2600
CCCTGCTAGT	TTTTTTGTAT	TTCGTAGAGC	CGGGGTTTCA	CCATGTTAGT	2650
GAGGCTGGTG	GCGAACTCCT	GACCTCAGGT	GATCCACCCG	CCTTGGACTC	2700
CCAAAGTGCT	GGGATTACAG	GCATGAGCCA	GTGCACCCGG	CACACCATAT	2750
gctttcatca	CAAGAAAATG	TGAGAGAATT	CAGGGCTTTG	GCAGTTCCAG	2800
C-CTGGTCAGC	ATCTCAAGCC	CTCCCCAGCA	TCTGTTCACC	CTGCCAGGCA	2850
GTCTCTTCCT	AGAAACTTGG	TTAAATGTTC	ACTCTTCTTG	CTACTTTCAG	2900
GATAGATTCC	TCACCCTTGG	CCCGCCTTTG	CCCCACCCTA	CTCTGCCCAG	2950
AAGTGCAAGA	GCCTAAGCCG	CCTCCATGGC	CCCAGGAAGG	ATTCAGGGGA	3000
GAGGCCCCAA	ACAGGGAGCC	ACGCCAGCCA	GACACCCCGG	CCAGAATGGA	3050
GCTGACTGGT	GAGAACACAC	CTGAGGGGCT	AGGGCCATAT	GGAAACATGA	3100
CAGAAGGGGA	GAGAGAAAGG	AGACACGCTG	CAGGGGGCAG	C-AAGCTGGGG	3150
GAACCCATTC	TCCCAAAAAT	AAGGGGTCTG	AGGGGTGGAT	TCGCTGGGTT	3200
TCAGGTCTGG	GTCCTGAATG	GGAATTCCTG	GAATACCAGC	TC-ACAATGAT	3250
TTCCTCCTCA	TCTTTCAACC	TCACCTCTCC	TCATCTAAGA	A-TTGCTCCTC	3300
C-TGGTCATGC	TTCTCCTAAC	TGCAAGGCTA	ACGC7GTCCA	C-CCCGGCTCC	3350
7CCTGCTTGT	GACCTCCGAG	TCCTCAGTAA	ACTGCTTCGT	GACTCCCATG	3400
TCCTTCACAG	CAGACTGGTG	AGAACTCCCA	ACATTATCCC	CTTTATCCGC	3450
GTAACTGGTA	AGACACCCAT	ACTCCCAGGA	AGACACCATC	ACTTCCTCTA	3500

ACTCCTTGAC CCAATGACTA TTCTTCCCAT A.TTGTCCCCA CCTACTGATC 3550

- 301 ····

ACACTCTCTG ACAAGAATTA	TTCTTCACAA	TACAGCCCGC	ATTTAAAAGC	3600
TCTCGTCTAG AGATAGTACT	CATGGAGGAC	TAGCCTGCTT	ATTAGGCTAC	3650
CATAGCTCTC TCTATTTCAG	CTCCCTTCTC	CCCCCACCAA	TCTTTTTCAA	3700
CAGAGCCAGT GCCCAGAGGT	TCACCCTTTG	CCTACACCTG	TCCTGCTGCC	3750
TGCTGTGGAC TTTAGCTTGG	GAGAATGGAA	AACCCAGATG	GTAAGAAAGC	3800
CATCCCTAAC CTTGGCTTCC	CTAAGTCCTG	TCTTCAGTTT	CCCACTGCTT	3850
CCCATGGATT CTCCAACATT	CTTGAGCTTT	TTAAAAATAT	CTCACCTTCA	3900
GCTTGGCCAC CCTAACCCAA	TCTACATTCA	CCTATGATGA	TAGCCTGTGG	3950
ATAAGATGAT GGCTTGCAGG	TCCAATATGT	GAATAGATTT	GAAGCTGAAC	4000
ACCATGAAAA GCTGGAGAGA	AATCGCTCAT	GGCCATGCCT	TTGACCTATT	4050
CCYGTTCAGT CTTCTTAAAT	TGGCATGAAG	AAGCAAGACT	CATATGTCAT	4100
CCACAGATGA CACAAAGCTG	GGAAGTACCA	CTAAAATAAC	AAAAGACTGA	4150
ATCAAGATTC AAATCACTGA	AAGACTAGGT	CAAAAACAAG	GTGAAACAAC	4200
AGAGATATAA ACTTCTACAT	GTGGGCCGGG	GGCTCACGCC	TGTAATCCCA	4250
GCACTTTGGG AGGCCGAGGC	AGGCAGATCA	CCTGAGGGCA	GGAGTTTGAG	4300
AGCAGCCTGG CCAACATGGC	GAAACCCCGT	CTCTACTAAG	AATACAAAAT	4350
TAC-CCGGGCA TGGTAGTGCA	TGCCTGTAAT	CCCAGCTACT	TGGAAGGCTG	4400
AAGCAC-GAGA ATCCCTTGAA	CCCAGGAGGT	GGAGGTTGTA	GTGAGCTGAG	4450
ATCATGCCAA TGCACTCCAG	CCTGGGTGAC	AAGAGCAAAA	CTCCGTCTCA	4500

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4550

302 ·· ··. .: . · · • : · · .· :.:

• ·,.· ........

CAGCTTTCAG GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600

AGCACTTCCT ACGAAAAGGA TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA 4650

CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT 4700

GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA GAACTCTATT 4750

CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 4800

GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT 4850

CTAGAAAGCA GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG 4900

CAATAGTTTA AAAAACTAAA ATCTATCCTC AAC-AACCCTA GCGTCCCTTC 4950

TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG CAC-TTCCTAT GGGTCCCTTC 5000

TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT CTCATACCTA 5050

CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 5100

CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC 5150

CCGGATTCAA GCGATTCTCC TGCCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC 5200

AGGTGCCCAC CACCATGCCC AGCTAATTTT TGTATTTTTG GTAGAGATGG 5250

GGTTTCACCA TGTTGGCCAG GCTGATCTTG AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 5300

CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG TGAGCCACTG 5350

CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 5400

CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAC-AGGTAAA AGCTGTAACA 5450

GGGCAGATTT CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500

AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG 5550

CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG GAATTCCTGC CCTGGGTGGG 5600

303

ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC TGC7GGCTAC 5650

TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAC-TGCGCTT 5700

CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AGGAGGAGAC CAAGGCACAG GACATTCTGG 5750

GAGCAGTGAC CCTTCTGCTG GAGGGAGTGA TGGCAGCACG GGGACAACTG 5800

GGACCCACTT GCCTCTCATC CCTCCTGGGG CAGGTTTCTG GACAGGTCCG 5850

TCTCCTCCTT GGGGCCCTGC AGAGCCTCCT TGGAACCCAG GTAAGTCCCC 5900

AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCACTAGAA 5950

GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG 6000

ATCTACTAAG AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC 6050

TGTCTTTCCT ACTTAGACAA GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG 6100

GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAGCTTC CTCCACAGGG CAGGACCACA 6150

GCTCACAAGG ATCCCAATGC CATCTTCCTG AGTTTCCAAC ACCTGCTCCG 6200

AGGAAAGGTG CGTTTCCTGA TGCTTGTAGG AGGGTCCACC CTCTGCGTCA 6250

GGCGGGCCCC ACCCACCACA GCTGTCCCCA GCAGAACCTC TCTAGTCCTC 6300

ACACTGAACG AGCTCCCAAA CAGGACTTCT GGATTGTTGG AGACAAACTT 6350

CACTGCCTCA GCCAGAACTA CTGGCTCTGG GCTTCTGAAG TGGCAGCAGG 6400

GATTCAGAGC CAAGATTCCT GGTCTGCTGA ACCAAACCTC CAGGTCCCTG 6450

GACCAAATCC CCGGATACCT GAACAGGATA CACGAACTCT TGAATGGAAC 6500

TCGTGGACTC TTTCCTGGAC CCTCACGCAG GACCCTAGGA GCCCCGGACA 6550

TTTCCTCAGG AACATCAGAC ACAGGCTCCC TGCCACCCAA CCTCCAGCCT 6600 • · • · • ····

- 304 GGATATTCTC CTTCCCCAAC CCATCCTCCT ACTGGACAGT ATACGCTCTT 6650

CCCTCTTCCA CCCACCTTGC CCACCCCTGT GGTCCAGCTC CACCCCCTGC 6700

TTCCTGACCC TTCTGCTCCA ACGCCCACCC CTACCAGCCC TCTTCTAAAC 6750

ACATCCTACA CCCACTCCCA GAATCTGTCT CAGGAAGGGT AAGGTTCTCA 6800

GACACTGCCG ACATCAGCAT TGTCTCATGT ACAGCTCCCT TCCCTGCAGG 6850

GCGCCCCTGG GAGACAACTG GACAAGATTT CCTACTTTCT CCTGAAACCC 6900

AAAGCCCTC-G TAAAAGGGAT ACACAGGACT GAAAAGGGAA TCATTTTTCA 6950

CTGTACATTA TAAACCTTCA GAAGCTATTT TTTTAAGCTA TCAGCAATAC 7000

TCATCAGAGC AGCTAGCTCT TTGGTCTATT TTCTGCAGAA ATTTGCAACT 7050

CACTGATTCT CTACATGCTC TTTTTCTGTG ATAACTCTGC AAAGGCCTGG 7100

GCTGGCCTGG CAGTTGAACA GAGGGAGAGA CTAACCTTGA GTCAGAAAAC 7150

AGAGAAAGGG TAATTTCCTT TGCTTCAAAT TCAAGGCCTT CCAACGCCCC 7200

CATCCCCTTT ACTATCATTC TCAGTGGGAC TCTGATCCCA TATTCTTAAC 7250

AGATCTTTAC TCTTGAGAAA TGAATAAGCT TTCTCTCAGA AATGCTGTCC 7300

CTATACACTA GACAAAACTG AGCCTGTATA AGGAATAAAT GGGAGCGCCG 7350

AAAAGCTCCC TAAAAAGCAA GGGAAAGATG TTCTTCGAGG GTGGCAATAG 7400

ATCCCCCTCA CCCTGCCACC CCAAACAAAA AAGCTAACAG GAAGCCTTGG 7450

AGAGCCTCAC ACCCCAGGTA AGGCTGTGTA GACAGTTCAG TAÁAGACAGG 7500

ACCTGGATGT GACAGCTGAG CAAACAGCTA GAGCTTTGGC AGCTCAGCAG 7550

GAGGCTTTGC CAGGCATGGA CGCCTGCCTC CCTCCTGTGG AGGTCAGGAG 7600

305

GAAGTGCAGG'AAGTGGCATG AGTCAGGCTC CTTGAGCTCA CACAGCAGGA 7 650

GAACAAGTAC AAGTCAAGTA CAAGTTGAAG GCTCATTTCC CAGTTCCCGC 7700

AAATGCATCT AAAAAGCAGC TCTGTGTGAC CACCATAAAC TCTGCTAGGG 7750

GATCTCTAAA AAGGAGTCAG GCTTATGGGG CTTTGCAAAT AAGTGCTGCC 7800

TTGGTGCTCA GGAAAAGGTT TGTGTTGCAC AAAACACAAA TTCCACTGC 7849

TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 1443 bázis (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 12. SZ. SZEKV.

GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAC-GGCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTG 150

ATTTGCTCCT GGCGGCCATG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTC7GTCC 200

AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250

TGACTCCCAC CTCCTTCACA GCCGACTGAG TCAGTGTCCC GACGTCGACC 300

CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA 350

TGGAAAACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 400

GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450 ·· ··- · • · · * · • · ·

	- 306 -	• « ····	• · ·· *·
CCTGCCTCTC	ATCCCTCCTG	GGACAGCTTT	CTGGGCAGGT	TCGCCTCCTC	500
TTGGGGGCCC	TGCAGGGCCT	CCTAGGAACC	CAGGGCAGGA	CCACAGCTCA	550
CAAGGACCCC	AATGCCCTCT	TCTTGAGCTT	GCAACAACTG	CTTCGGGGAA	600
AGGTGCGCTT	CCTGCTTCTG	GTAGAAGGTC	CCACCCTCTG	TC-TCAGACGG	650
ACCCTGCCAA	CCACAGCTGT	CCCAAGCAGT	ACTTCTCAAC	TCCTCACACT	700
AAACAAGTTC	CCAAACAGGA	CTTCTGGATT	GTTGGAGACG	AACTTCAGTG	750
TCACAGCCAG	AACTGCTGGC	CCTGGACTTC	TGAGCAGGCT	TCAGGGATTC	800
AGAGTCAAGA	TTACTCCTGG	TCAGCTAAAT	CAAACCTCCA	GGTCCCCAGT	850
CCAAATCTCT	GGATACCTGA	ACAGGACACA	CGGACCTGTG	AATGGAACTC	900
ATGGGCTCTT	TGCTGGAACC	TCACTTCAGA	CCCTGGAAGC	CTCAGACATC	950
TCGCCCGGAG	CTTTCAACAA	AGGCTCCCTG	GCATTCAACC	TCCAGGGTGG	1000
ACTTCCTCCT	TCTCCAAGCC	TTGCTCCTGA	TGGACACACA	CCCTTCCCTC	1050
CTTCACCTGC	CTTGCCCACC	ACCCATGGAT	CTCCACCCCA	GCTCCACCCC	1100
CTGTTTCCTG	ACCCTTCCAC	CACCATGCCT	AACTCTACCG	CCCCTCATCC	1150
AGTCACAATG	TACCCTCATC	CCAGGAATTT	GTCTCAGGAA	ACATAGCGCG	1200
C-C-CACTGGCC	CAGTGAGCGT	CTGCAGCTTC	TCTCGGGGAC	AAGCTTCCCC	1250
AGGAAGGCTG	AGAGGCAGCT	GCATCTGCTC	CAGATGTTCT	GCTTTCACCT	1300
AAAAGGCCCT	GGGGAAGGGA	TACACAGCAC	TGGAGATTGT	AAAATTTTAG	1350
GAGCTATTTT	TTTTTAACCT	ATCAGCAATA	TTCATCAGAG	CAGCTAGCGA	1400

TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT TCT 1443

307

TUDNIVALÓK A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 352 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 13. SZ. SZEKV.

Met 1

Glu

Leu

Thr

Asp 5

Leu

Leu

Leu

Alá

Alá 10

Met

Leu

Leu

Alá

Val 15

Alá

Arg

Leu

Thr

Leu 20

Ser

Ser

Pro

Val

Alá 25

Pro

Alá

Cys

Asp

Pro 30

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys 35

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser 40

His

Leu

Leu

His

Ser 45

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys 50

Pro

Asp

Val

Asp

Pro 55

Leu

Ser

Ile

Pro

Val 60

Leu

Leu

Pro

Alá

Val 65

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly 70

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin 75

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys 80

Alá

Gin

Asp

Ile

Leu 85

Gly

Alá

Val

Ser

Leu 90

Leu

Leu

Glu

Gly

Val 95

Met

Alá

Alá

Arg

Gly 100

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser 105

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu 110

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser 115

Gly

Gin

Val

Arg

Leu 120

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu 125

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly 130

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr 135

Thr

Alá

His

Lys

Asp 140

Pro

Asn

Alá

Leu

Phe 145

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin 150

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys 155

Val

Arg

Phe

Leu

Leu 160

Leu

Val

Glu

Gly

Pro 165

Thr

Leu

Cys

Val

Arg 170

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr 175

Thr

Alá

Val

Pro

Ser 180

Ser

Thr

Ser

Gin

Leu 185

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys 190

Phe

Pro

Asn

Arg

Thr 195

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu 200

Thr

Asn

Phe

Ser

Val 205

Thr

Alá

Arg

Thr

Alá 210

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu 215

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly 220

Phe

Arg

Val

Lys

Ile 225

Thr

Pro

Gly

C-ln

Leu 230

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg 235

Ser

Pro

Val

Gin

Ile 240

···· ·· • · ·♦ ·

Claims (38)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Izolált, lényegében homogén mpl ligandum polipeptid.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptid, amely (a) egy polipeptid fragment;

   (b) egy polipeptid változat; vagy (c) egy kiméra polipeptid.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptid, amely (a) emlősből izolált polipeptid;

   (b) rekombináns módszerekkel előállított polipeptid;

   * vagy (c) szintetikus módszerekkel előállított polipeptid.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptid, amely (a) humán polipeptid; vagy (b) emberben nem immunogén hatású polipeptid.
5. 5. Izolált, lényegében homogén mpl agonista, amely (a) serkenti a jelölt nukleotidok (³H-timidin) humán mpl P-vel transzfektált, IL-3 dependens Ba/F3 sejtek DNS-ébe történő beépülését; vagy (b) vérlemezke rebound vizsgálatban serkenti a ^3eS-izotóp keringő vérlemezkékbe történő beépülését.

   • ····

   - 368
6. 6. A 2. igénypont szerinti polipeptid fragment, amely az alábbi

   X-hTPO(7-151)-Y képlettel fejezhető ki, melyben hTPO(7-151) jelentése a humán TPO (hML) 7. cisztein gyökétől 151. cisztein gyökéig terjedő szekvenciája;

   X jelentése a 7. cisztein gyök aminocsoportja vagy az alábbi N-terminális aminosav-gyök(ök) valamelyike

   M, MA, MPA, MPPA (117. sz. szekv MAPPA (118. sz. szekv MPAPPA (119. sz. szekv MSPAPPA (120. sz. szekv A, PA, PPA, APPA (121. sz. szekv PAPPA (122. sz. szekv 3PAPPA (123. sz. szekv

   Y jelentése a 151. cisztein gyök C-terminális csoportja vagy az alábbi C-terminális aminosav-gyök(ők) valamelyike

   V,

   VR,

   VRR,

   VRRA (124. sz. szekv.),

   VRRAP (125. sz. szekv.),

   - 369 VRRAPP (126. sz. szekv.),

   VRRAPPT (127 . sz. szekv.),

   VRRAPPTT (128. sz. szekv.),

   VRRAPPTTA (129. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAV (130. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVP (131. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPS (132. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSR (133. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRT (134. sz. szekv.), VRRAPPTTAVPSRTS (135. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRTSL (136. sz. szekv.), VRRAPPTTAVPSRTSLV (137. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRTSLVL (138. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRTSLVLT (139. sz. szekv.), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL (140. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN (141. sz. szekv.), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE (142. sz. szekv.), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL (143. sz. szekv.),

   VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP (144. sz. szekv.);

   N-terminális aminosav kibővítések, melyek az 1. ábrán bemutatott humán ML (1. sz. szekv.) 176-332. aminosavai közül egyet vagy többet tartalmaznak, és ezek pegilált alakjai.
7. 7. Egy 6. igénypont szerinti polipeptid fragment, amely a TPO(1-153) vagy a TPO(1-245).
8. 8. Egy 2. igénypont szerinti polipeptid fragment, ···· • ·

   - 370 melynek aminosav-szekvenciája

   SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL (110. sz. szekv.),

   HSRLSQCPEVHLPLPTPVLLPAVDF (111. sz. szekv.),

   SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL (112. sz. szekv.),

   LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL (113. sz. szekv.),

   GQLSGQVRLLLGALQS (114. sz. szekv.),

   LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF (115. sz. szekv.), LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR (116. sz. szekv.), vagy ezek kombinációja.
9. 9. A 6. igénypont szerinti polipeptid, amely glikozilálatlan.
10. 10. Izolált polipeptid, amelyet az 1. ábrán nukleinsav-szekvenciával (1. sz. szekv.) nukleinsav-molekulákhoz mérsékelten szigorú mellett hibridizáló szekvenciával rendelkező kódol.

    bemutatott rendelkező feltételek nukleinsav
11. 11. A 11. igénypont szerinti polipeptid, amely biológiailag aktív.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely a hML, hMLiss, nML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML vagy pML2 valamelyike.
13. 13. Egy 2. igénypont szerinti polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája az 1. ábrán bemutatott aminosav• · • · · ··· ···· ··

    - 371 -szekvencia (1. sz. szekv.) 1. aminosav-gyökétől X-ik aminosav-gyökéig terjed, ahol X értéke, 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 vagy 332.
14. 14. Izolált, lényegében homológ mpl ligandum polipeptid, amelynek szekvenciája a 13. szerinti polipeptiddel legalább

    80 %-ban azonos.
15. 15. A 13. igénypont szerinti polipeptid, amelyben X értéke 153.
16. 16. Kiméra, ligandumot egy tartalmazza.

    amely a 13. igénypont szerinti mpl heterológ polipeptidhez fuzionálva
17. 17. A 16. igénypont szerinti kiméra, amelyben a heterológ polipeptid egy immunglobulin polipeptid.
18. 18. A 16. igénypont szerinti kiméra, amelyben a heterológ polipeptid egy interleukin polipeptid.
19. 19. Kiméra, amely a hML 1. gyökétől körülbelül 153-157. gyökéig terjedő N-terminális aminosav-gyököket tartalmazza, melyek a 10. ábrán bemutatott mellérendezésnek (aligiiment) megfelelő helyeken a humán EPO egy vagy több, de nem valamennyi gyökével szubsztituáltak.
20. 20. Antitest, amely képes megkötni a 13. igénypont • · • · • · ···· ··

    - 372 szerinti mpl ligandum polipeptidet.
21. 21. Hibridoma sejtvonal, amely a 20. igénypont szerinti antitestet termeli.
22. 22. Izolált nukleinsav-molekula, amely az 1. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptidet kódolja.
23. 23. Izolált nukleinsav-molekula, amely a 13. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptidet kódolja.
24. 24. Izolált nukleinsav-molekula, amely amely az 1. ábrán bemutatott nyitott leolvasási keret nukleinsav-szekvnenciát (2. sz. szekv.) tartalmazza.
25. 25. A 24. igénypont szerinti izolált nukleinsav-molekula, amely a hML, hMLi53, nML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML vagy pML2 mpl ligandum polipeptidek valamelyikét kódolja.
26. 26. Izolált nukleinsav-molekula, amely (a) az mpl ligandum gén kódoló régiójának nukleotid-szekvenciáját tartalmazó cDNS klón;

    (b) szigorú feltételek mellett az (a) pontban említett cDNS kiónhoz hibridizálódni képes DNS-szekvencia; vagy (c) az (a) vagy (b) pontban említett DNS-szekvenciák valamelyikének genetikai változata, amely egy természetben előforduló mpl ligandum polipeptid biológiai tulajdonságával

    373 rendelkező polipeptidet kódol.
27. 27. Izolált DNS molekula, amely az 1. ábrán bemutatott DNS-szekvenciához (2. sz. szekv.) mérsékelten szigorú feltételek mellett hibridizálódni képes szekvenciával rendelkezik, és a DNS-molekula biológiailag aktív mpl ligandum polipeptidet kódol.
28. 28. A 25. igénypont szerinti nukleinsav-molekula, amely a nukleinsav-molekulához működőképesen kapcsolva tartalmaz egy promotert is.
29. 29. Expressziós vektor, amely a 25. igénypont szerinti nukleinsav-szekvenciát a vektorral transzformált gazdasejt által felismert kontroll szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva tartalmazza.
30. 30. Gazdasejt, amely a 29. igénypont szerinti vektorral transzformált.
31. 31. Eljárás az mpl ligandum polipeptidet kódoló nukleinsav-molekula alkalmazására az mpl ligandum polipeptid termelésének elősegítésében, azzal jellemezve, hogy a 30. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztjük.
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az mpl ligandum polipeptidet a gazdasejtből nyerjük ki.

    374
33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az mpl ligandum polipeptidet a gazdasejt tenyésztő tápközegéből nyerjük ki.
34. 34. Eljárás mpl ligandum polipeptid jelenlétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy az mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS-t egy nukleinsav teszmintáh'oz hibridizáljuk, és meghatározzuk az mpl ligandum polipeptid DNS jelenlétét.
35. 35. Eljárás nukleinsav tesztminta amplifikálására, azzal jellemezve, hogy egy mpl ligandum polipeptidet kódoló nukleinsavval nukleinsav polimeráz reakciót indítunk be.
36. 36. Készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti mpl ligandum polipeptidet és gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot tartalmaz.
37. 37. Eljárás trombocitopéniában szenvedő vagy annak kockázatával veszélyeztetett emlős kezelésére, azzal jellemezve, hogy az ilyen kezelésre szoruló emlősnek a 36. igénypont szerinti készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségét adagoljuk.
38. 38. A jellemezve, interleukin

    36. igénypont szerinti készítmény, azzal hogy egy citokin, kolónia stimuláló faktor vagy közül kiválasztott ágens gyógyászatilag hatásos mennyiségét is tartalmazza.

    ···

    - 375 39. A 38. igénypont szerint készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett ágensként KL-t, LIF-et, G-CSF-et, GM-CSF-et, M-CSF-et, EPO-t, mIL-l-et, IL-2-t,

    IL-3-at, IL-5-öt, IL-6-ot, IL-7-et, IL-8-at, IL-9-et vagy IL-ll-et tartalmaz. 40. Eljárás humán mpl ligandum polipeptid

    bioszintézisére, mely polipeptid egy humán mpl ligandum polipeptid aminosav-szekvenciájával, úgymint az 1. ábrán bemutatottal (1. sz. szekv.) rendelkezik, azzal jellemezve, hogy (a) egy, a humán mpl ligandum polipeptidet kódoló DNS-izolátumot tartalmazó gasdasejttenyészetet növesztünk;

    (b) kinyerjük a humán mpl ligandum polipeptidet a tenyészetből; és (c) tisztítjuk az mpl ligandum polipeptidet, hogy lényegében homogén, biológiailag aktív humán mpl ligandum polipeptidet kapjunk.

    A meghatalmazott: