SI9420079A - Thrombopoietin. - Google Patents

Description

Genentech, Inc.

Trombopoetin

Predloženi izum se nanaša na izolacijo, čiščenje in rekombinantno ali kemično sintezo proteinov, ki vplivajo na preživetje, proliferacijo, diferenciacijo ali zorenje hematopoetičnih celic, posebno trombocitnih predniških celic. Predloženi izum se posebno nanaša na kloniranje in ekspresijo nukleinskih kislin, ki kodirajo proteinski ligand, ki je sposoben vezanja in aktiviranja mpl, člana citokinske receptorske superdružine. Predloženi izum se nadalje nanaša na uporabo teh proteinov, samih ali v kombinaciji z drugimi citokini, za zdravljenje imunskih ali hematopoetičnih motenj, vključno trombocitopenije.

I. Hematopoetični sistem

Hematopoetični sistem ustvaijajo zrele visokospecializirane krvne celice, za katere je znano, da so potrebne za preživetje sesalcev. Te zrele celice vključujejo: eritrocite, specializirane za transport kisika in ogljikovega dioksida, limfocite T in B, odgovorne za celično in protitelesno posredovane imunske odzive, krvne ploščice ali trombocite, specializirane za tvorbo krvnih strdkov, in granulocite ter makrofage, specializirane kot odstranjevalce (scavengers) in kot akcesome celice, ki se borijo proti infekciji. Granulociti so nadalje razdeljeni v: nevtrofilce, eozinofilce, bazofilce in mastocite, specializirane celične tipe, ki imajo diskretne funkcije. Posebnost je v tem, da so vse specializirane zrele krvne celice izvedene samo iz enega, navadno primitivnega, celičnega tipa, imenovanega pluripotentna (ali totipotentna) matična celica, ki so jo prvotno ugotovili v kostnem mozgu (Dexter et al., Ann., Rev. Celi Biol., 3:423-441 [198η).

Zrele visokospecializirane krvne celice morajo nastajati v velikem številu kontinuirno skozi vse življenje sesalca. Precejšnji večini teh specializiranih krvnih celic je usojeno, da ostanejo funkcionalno aktivne le nekaj ur do nekaj tednov (Cronkite et al., Blood Celiš, 2:263-284 [1976]). Zaradi tega je potrebno kontinuirno obnavljanje zrelih krvnih celic, samih primitivnih matičnih celic, kot tudi vseh intermediatnih ali rodovno usmerjenih predniških celičnih linij, ki so med primitivnimi in zrelimi celicami, za vzdrževanje normalnih potreb po ustaljenem stanju krvnih celic sesalca.

V osredju hematopoetičnega sistema so pluripotentne matične celice. Teh celic je po številu relativno malo in so izpostavljene samoobnovitvi s proliferacijo, tako da nastanejo hčerinske matične celice ali pa se transformirajo v vrsti diferenciacijskih stopenj v vedno bolj zrele rodovno omejene predniške celice, ki končno tvorijo visokospecializirane zrele krvne celice.

Nekatere multipotentne predniške celice, ki so npr. imenovane CFC-Mix, izvedene iz matičnih celic, so izpostavljene proliferaciji (samoobnovitvi) in razvoju, da nastanejo kolonije, ki vsebujejo vse različne mieloidne celice; eritrocite, nevtrofilce, megakariocite (predhodniki trombocitov), makrofage, bazofilce, eozinofilce in mastocite. Druge predniške celice limfoidnega rodu so izpostavljene proliferaciji in razvoju v celice T in B.

Poleg tega je med predniškimi celicami CFC-Mix in mieloidnimi celicami druga vrsta predniških celic z intermediatno usmerjenostjo za njihovo potomstvo. Te rodovno omejene predniške celice so razvrščene na osnovi potomstva, ki ga ustvaijajo. Znani neposredni predhodniki mieloidnih celic so: eritroidno kolonijo tvoreče enote (CFU-E) za eritrocite, granulocitno/makrofagno kolonijo tvoreče celice (GM-CFC) za nevtrofilce in makrofage, megakariocitno kolonijo tvoreče celice (Meg-CFC) za megakariocite, eozinofilno kolonijo tvoreče celice (Eos-CFC) za eozinofilce in bazofilno kolonijo tvoreče celice (Bas-CFC) za mastocite. Druge intermediatne predhodniške celice med pluripotentnimi matičnimi celicami in zrelimi krvnimi celicami so znane (glej spodaj) ali pa bo verjetno dokazano, da imajo različne stopnje rodovne omejitve in sposobnosti za samoobnovitev.

Osnovni princip normalnega hematopoetičnega celičnega sistema je zmanjšana sposobnost za samoobnovitev, ker se multipotentnost izgubi, pridobi pa se rodovna omejitev in zrelost. Torej je na eni strani hematopoetičnega celičnega spektra pluripotentna matična celica, ki ima sposobnost za samoobnovitev in diferenciacijo v vse vrste predniških celic, ki so rodovno specifično usmerjene. Ta sposobnost je osnova za terapijo transplantacije kostnega mozga, kjer primitivne matične celice repopulirajo celoten hematopoetični celični sistem. Na drugi strani spektra pa so visoko rodovno omejeni predniki in njihovo potomstvo, ki so izgubili sposobnost za samoobnovitev, pridobili pa zrelo funkcionalno aktivnost.

Proliferacijo in razvoj matičnih celic in rodovno omejenih predniških celic skrbno nadzorujejo različni hematopoetični rastni faktorji ali citokini. Vloga teh rastnih faktorjev in vivo je kompleksna in ni popolnoma razumljiva. Nekateri rastni faktorji, kot npr. interlevkin-3 (IL-3), so sposobni, da stimulirajo tako multipotentne matične celice kot tudi usmerjene predniške celice različnih rodov, vključno npr. megakariocite. Za druge faktorje, kot je granulocitno/makrofagno kolonijo stimulirajoči faktor (GM-CSF), so prvotno mislili, da so omejeni v svojem delovanju na GM-CFC. Kasneje pa so ugotovili, da GM-CSF med drugim vpliva tudi na proliferacijo in razvoj megakariocitov. Za IL-3 in GM-CSF so torej ugotovili, da imata prekrivajoče biološke aktivnosti, čeprav z različno zmogljivostjo. Zadnje čase pa ugotavljajo, da tako interlevkin-6 (EL-6) kot tudi interievkin-11 (IL-11), čeprav sama nimata vidnega vpliva na tvorbo meg- kolonije, delujeta sinergistično z IL-3, tako da je zorenje megakariocitov stimulirano (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:10111016 [1992]).

Hematopoetični rastni faktorji torej lahko vplivajo na rast in diferenciacijo enega ali več rodov, lahko se prekrivajo z drugimi rastnimi faktorji pri vplivanju na posamezno predniško celično linijo, ali pa lahko delujejo sinergistično z drugimi faktorji.

Razvidno je tudi, da imajo hematopoetični rastni faktorji lahko vpliv na različnih stopnjah celičnega razvoja, od totipotentne matične celice preko raznih usmerjenih rodovno omejenih prednikov do zrele krvne celice. Za eritropoetin (epo) je npr. ugotovljeno, da pospešuje le proliferacijo zrelih eritroidnih predniških celic. Za IL-3 je ugotovljeno, da izraža svoj učinek prej, pri čemer vpliva na primitivne matične celice in intermediatne rodovno omejene predniške celice. Drugi rastni faktorji, kot npr. faktor matične celice (SCF), lahko vplivajo celo na razvoj bolj primitivnih celic.

Iz navedenega sledi, da bi bili novi hematopoetični rastni faktorji, ki vplivajo na preživetje, proliferacijo, diferenciacijo ali zorenje vseh krvnih celic ali njihovih predhodnikov, koristni, posebno kot pomoč pri ponovni vzpostavitvi oslabljenega hematopoetičnega sistema, povzročenega z boleznijo, ali po obsevanjih, ali kemoterapiji.

II. Megakariocitopoeza - nastajanje trombocitov

Regulacija megakariocitopoeze in nastajanje trombocitov sta prikazana v Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] in Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. Na kratko, pluripotentne matične celice kostnega mozga se diferencirajo v megakariocitne, eritrocitne in mielocitne celične linije. Verjetno obstaja hierarhija usmerjenih megakariocitnih predniških celic med matičnimi celicami in megakariociti. Vsaj trije razredi megakariocitnih predniških celic so identificirani, in sicer: izbruh tvoreča enota megakariocitov (BFU-MK), kolonijo tvoreča enota megakariocitov (CFUMK) in megakariocitne predniške celice z majhno gostoto (LD-CFU-MK). Samo megakariocitno zorenje je nadaljevanje razvoja, ki se loči v stopnje, ki temeljijo na standardnih morfoloških merilih. Najzgodnejši spoznani člani megakariocitne (MK ali meg) družine so megakarioblasti. Te celice imajo na začetku premer 20 do 30 μ-m, bazofilno citoplazmo in rahlo nepravilno jedro s prostim, nekoliko retikulamim kromatinom, in več nukleoli. Kasneje pa so megakarioblasti lahko vsebovali do 32 jeder (ploiploid), vendar pa je citoplazma ostala redka in nezrela. Pri nadaljnjem zorenju pa je postalo jedro bolj lobulamo in piknotično, citoplazma se je količinsko povečala in postala bolj acidofilna in granulama. Večina zrelih celic te družine lahko daje videz sproščanja trombocitov v njihovi periferiji. Normalno je manj kot 10 % megakariocitov v blastni stopnji, več kot 50 % pa je zrelih. Arbitrarne morfološke klasifikacije, ki se navadno uporabljajo za megakariocitno vrsto, so: mekarioblast za najzgodnejšo obliko; promegakariocit ali bazofilni megakariocit za intermediatno obliko; in zreli (acidofilni, granulami ali trombocite tvoreči) megakariocit za pozne oblike. Zreli megakariociti razširjajo filamente citoplazme v sinusoidne prostore, kjer se ločijo in fragmentirajo v individualne trombocite (Williams et al., Hematology, 1972).

Za megakariocitopoezo domnevajo, da vključuje različne regulatome faktorje (Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] in Williams et al., J. Celi Physiol., 110:101 [1982]). Za zgodnjo stopnjo megakariocitopoeze domnevajo, da je mitotična in vpliva na celično proliferacijo in iniciacijo kolonije iz CFU-MK, vendar nanjo ne vpliva število trombocitov (Burstein et al., J. Celi Physiol., 109:333 [1981] in Kimura et al., Exp. Hematol., 13:1048 [1985]). Kasnejša stopnja zorenja je nemitotična in vključuje nuklearno poliploidizacijo in citoplazemsko zorenje in je verjetno uravnavana s povratnim mehanizmom s številom perifernih trombocitov (Odeli et al., Blood, 48:765 [1976] in Ebbe et al., Blood, 32:787 [1968]).

O eksistenci jasnega in specifično megakariocitno kolonijo stimulirajočega faktorja (MK-CSF) obstajajo razprave (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]). Večina avtorjev verjame, da naj bi postopek, ki je tako nujno potreben za preživetje, kot je nastajanje trombocitov, uravnavali citokini, izključno odgovorni za ta postopek. Hipoteza, da obstajajo megakariocitno/trombocitno specifični citokini, je dala osnovo za več kot 30-letne raziskave, vendar pa do sedaj še niso očistili, sekvencirali in določili s poskusi nobenega takega citokina, kot je edinstveni MK-CSF (TPO).

Čeprav je navedeno, da so bili MK-CSF delno očiščeni na osnovi eksperimentalno ustvarjene trombocitopenije (Hill et al., Exp. Hematol., 14:752 [1986]), iz kondicioniranega medija humanih embrionalnih ledvic [CM] (McDonald et al., J. Lab. Ciin. Med., 85:59 [1975]) ter v človeku z aplastično anemijo in idiopatično trombocitopenično purpuro urinamih ekstraktov (Kawakita et al., Blood, 6:556 [1983]) in plazme (Hoffman et al., J. Ciin. Invest., 75:1174 [1985]), pa je njihovo fiziološko delovanje še neznano v večini primerov.

Kondicioniran medij vraničnih celic, aktiviranih s pokeweed mitogenom (PWMSpCM), in murino mielomonocitno celično linijo WEHI-3 (WEHI-3CM) so uporabili kot megakariocitne potenciatorje. PWM-SpCM vsebuje faktorje, ki povečujejo rast CFU-MK (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., ZDA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; in Iscove, N.N., v Hematopoietic Celi Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., izd. [New York, Academy Press] str. 37-52 [1978]), pri čemer je eden od teh interlevkin-3 (IL-3), večrodovno kolonijo stimulirajoči faktor (multi-CSF [Burstein, Blood Celiš, 11:469 [1986]). Drugi faktorji v tem mediju niso bili identificirani in izolirani. WEHI-3 je murina mielomonocitična celična linija, ki izloča relativno velike količine IL-3 in manjše količine GM-CSF. Za IL-3 so ugotovili, da omogoča rast širokega območja hematopoetičnih celic (Ihle et al., J. Immunol., 13:282 [1983]). Za IL-3 so tudi ugotovili, daje v sinergiji z mnogimi znanimi hematopoetičnimi hormoni ali rastnimi faktorji (Barteimez et al., J. Celi Physiol., 122:362-369 [1985] in Warren et al., Celi, 46:667-674 [1988]), ki vključujejo tako eritropoetin (EPO) kot tudi interlevkin-1 (IL-1), pri indukciji zelo zgodnjih multipotentnih predhodnikov in tvorbi zelo velikih mešanih hematopoetičnih kolonij.

Druge vire megakariocitnih potenciatorjev so ugotovili v kondicioniranih medijih murinih pljuč, kosti, makrofagnih celičnih linij, peritonealnih eksudatnih celic in humanih embrionalnih ledvičnih celic. Kljub nekaterim spornim podatkom (Mazur, Exp. HematoL, 15:340-350 [1987]) je nekaj dokazov (Geissler et al., Br. J. HaematoL, 60:233-238 [1985]), da imajo aktivirani limfociti T večjo vlogo v megakariocitopoezi kot pa monociti. Te ugotovitve navajajo k temu, da so lahko sekrecije aktiviranih limfocitov T, kot npr. interlevkinov, regulatorni faktorji pri razvoju MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Iz številnih študij megakariocitopoeze z očiščenim eritropoetinom EPO (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]); McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976]); in Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) je razvidno, da ima ta hormon pospeševalni učinek na tvorbo kolonije MK. To je bilo tudi prikazano tako v kulturah brez sexuma kot tudi v tistih, ki ga vsebujejo, in v odsotnosti akcesomih celic (Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Za EPO domnevajo, da je vključen bolj v eno- in dvocelični stadij megakariocitopoeze v nasprotju z učinki PWM-SpCM, ki je vključen v štiricelični stadij megakariocitnega razvoja. Interakcija vseh teh faktorjev tako v zgornji kot tudi pozni fazi megakariocitnega razvoja še vedno ostaja nepojasnjena.

Podatki iz različnih laboratorijev navajajo na to, da so edini večrodovni faktorji, ki imajo individualno MK-kolonijo stimulirajočo aktivnost: GM-CSF in IL-3 ter v manjši meri B-celični stimulirajoči faktor IL-6 (Ikebuchi et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 84:9035 [1987]). Nedavno so različni avtorji poročali, da IL-11 in levkemični inhibitomi faktor (LIF) delujeta sinergistično z IL-3 pri povečevanju megakariocitne velikosti in ploidije (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Celi. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; in Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Drugi zanimivi dokumenti vključujejo: Eppstein et al., US Patent št. 4,962,091; Chong, US Patent št. 4,879,111; Femandes et al., US Patent št. 4,604,377; Wissler et al., US Patent št. 4,512,971; Gottlieb, US Patent št. 4,468,379; Bennett et al., US Patent št. 5,215,895; Kogan et al., US Patent št. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol. 20(9):1927-1931 [1990]; Secor et al., J. Of Immunol., 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5):1545-1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73(7):1828-1835 [1989]; in Outterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512 [1989].

III. Trombocitopeniia

Trombociti so kritični elementi mehanizma strjevanja krvi. Do deplecije krožečega nivoja trombocitov, imenovanega trombocitopenija, pride pri različnih kliničnih stanjih in motnjah. Trombocitopenija je navadno definirana kot število trombocitov, kije pod 150 x IO⁹/!. Glavne vzroke trombocitopenije lahko na široko razdelimo v tri kategorije na osnovi življenjske dobe trombocitov, in sicer: (1) poslabšano nastajanje trombocitov v kostnem mozgu, (2) sekvestracija trombocitov v vranici (splenomegalija) in (3) povečana destrukcija trombocitov v perifernem kroženju (npr. avtoimunska trombocitopenija ali kemijska in obsevalna terapija). Poleg tega se v pacientnih, ki prejemajo velike volumne krvnih produktov, revnih s trombociti, s hitrim dajanjem lahko razvije trombocitopenija zaradi razredčitve.

Manifestacije kliničnih krvavitev pri trombocitopeniji so odvisne od resnosti trombocitopenije, njenih vzrokov in možnih združenih koagulacijskih defektov. Na splošno so pacienti, ki imajo število trombocitov med 20 in 100 x 10⁹/l, v nevarnosti za prekomerno posttravmatsko krvavenje, medtem ko lahko tisti, ki imajo število trombocitov pod 20 x 10⁹/l, krvavijo spontano. Ti, slednji pacienti so kandidati za transfuzijo trombocitov s spremljajočim imunskim in virusnim tveganjem. Za katerokoli povzročeno stopnjo trombocitopenije je tendenca krvavenja bolj resna, če je vzrok zmanjšano nastajanje trombocitov, kot pa če je vzrok zvečana destrukcije le-teh. V zadnji situaciji je posledica pospešenega preobrata trombocitov, kroženje mlajših, večjih in hemostatično bolj učinkovitih trombocitov. Trombocitopenija je lahko posledica raznih motenj, ki so na kratko opisane spodaj. Bolj podroben opis je v Schafner, A. I., Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Intemal Medicine, 3. izdaja, John J. Hutton et al., izd., Little Brown in Co., Boston/Toronto/London [1990].

(a) Trombocitopenija zaradi poslabšanega nastajanja trombocitov

Vzroki za kongenitalno trombocitopenijo vključujejo kongenitalno aplastično anemijo (sindrom Fanconi) in prirojeno amegakariocitično trombocitopenijo, ki je lahko povezana s skeletno deformiranostjo. Pridobljene motnje za nastajanje trombocitov povzročajo bodisi hipoplazija megakariocitov ali neefektivna trombopoeza. Megakariocitična hipoplazija je lahko posledica različnih stanj, ki vključujejo aplazijo mozga (vključno idiopatične oblike mielosupresije zaradi kemoterapevtskih sredstev ali obsevalne terapije), mielofibrozo, levkemijo in invazijo kostnega mozga z metastatičnimi tumorji ali granulomi. V nekaterih primerih lahko toksini, infekcijska sredstva ali zdravila interferirajo s trombopoezo relativno selektivno; primeri vključujejo prehodne trombocitopenije, povzročene z alkoholom in določenimi virusnimi infekcijami, in blago trombocitopenijo, povezano z dajanjem tiazidnih diuretikov. Končno lahko neefektivna trombopoeza, sekudamo megaloblastičnim procesom (pomanjkanje folata ali B₁₂), tudi povzroči trombocitopenijo, navadno z soobstoječima anemijo in levkopenijo.

Sedanje zdravljenje trombocitopenije zaradi zmanjšanega nastajanja trombocitov je odvisno od identifikacije in preobrata osnovnega vzroka napake kostnega mozga. Transfuzije trombocitov so navadno rezervirane za paciente z resnimi krvavitvenimi komplikacijami ali za kritje med kirurškimi postopki, ker izoimunizacija lahko vodi do refraktamosti za nadaljnjo transfuzijo trombocitov. Mukozne krvavitve, ki so posledica resne trombocitopenije, lahko izboljšajo z oralnim ali intravenoznim dajanjem antifibrinolitičnih sredstev. Seveda pa se lahko razvijejo trombotične komplikacije, če antifibrinolitična sredstva uporabimo pri pacientih z razširjeno intravaskulamo koagulacijo (DIC).

(b) Trombocitopenija zaradi vranične sekvestracije

Splenomegalija, zaradi kateregakoli vzroka, je lahko povezana z blago do zmerno trombocitopenijo. To je precej pasiven proces (hipersplenizem) sekvestracije vraničnih trombocitov v nasprotju z aktivno destrukcijo trombocitov v vranici v primerih imunsko posredovane trombocitopenije, obravnavane spodaj. Čeprav je najbolj običajen vzrok hipersplenizma kongestivna splenomegalija zaradi portalne hipertenzije pri alkoholni cirozi, pa so druge oblike kongestivne, infiltrativne ali limfoproliferativne splenomegalije prav tako povezane s trombocitopenijo. Število trombocitov na splošno ne pride pod 50 x 10⁹/l kot posledica hipersplenizma samega.

(c) Trombocitopenija zaradi neimunsko posredovanega nastajanja trombocitov

Trombocitopenija je lahko posledica pospešene destrukcije trombocitov z raznimi neimunološkimi postopki. Motnje tega tipa vključujejo razširjeno intravaskulamo koagulacijo, prostetične intravaskulame naprave, ekstrakorporalni krvni obtok in trombotične mikroangiopatije, kot je trombotična trombocitična purpura. V vseh teh situacijah so krožeči trombociti, ki so izpostavljeni tako umetnim površinam kot tudi nenormalni vaskulami intimi, bodisi konzumirani na teh mestih ali poškodovani in nato prenaglo očiščeni z retikuloendotelijskim sistemom. Bolezenska stanja ali motnje, pri katerih lahko nastane razširjena intravaskulama koagulacija (DIC), so podrobno navedena v Braunwald et al. (izd.), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 11. izdaja, str. 1478, McGraw Hill [1987]. Intravaskulame prostetične naprave, ki vključujejo srčne ventile in intraaortne balone, lahko povzročijo blago do zmerno destruktivno trombocitopenijo; prehodna trombocitopenija v pacientih, ki so izpostavljeni kardiopulmonamemu obvodu (bypass) ali hemodializi, pa je lahko posledica iztrošenja ali poškodbe trombocitov v ekstrakorporalnem obtoku.

(d) Z zdravili inducirana imunska trombocitopenija

Več kot sto zdravil je vključenih v imunološko posredovano trombocitopenijo. Vendar so dobro označeni le gvanidin, gvanin, zlato, sulfonamidi, cefalotin in heparin. Trombocitopenija, inducirana z zdravili, je pogosto zelo resna in do nje značilno pride pospešeno v dnevih, ko pacienti jemljejo senzibilizima zdravila.

(e) Imunska (avtoimunska) trombocitopenična purpura (ΓΓΡ)

ΓΓΡ pri odraslih je kronična bolezen, označena z avtoimunsko destrukcijo trombocitov. Avtoprotitelo je navadno IgG, čeprav so navedeni tudi drugi imunoglobulini. Čeprav so za avtoprotitelo ΓΓΡ ugotovili, da je povezano s trombocitno membrano GPII_bIII_a, pa specifičnost trombocitnega antigena v večini primerov še ni identificirana. Do ekstravaskulame destrukcije senzibiliziranih trombocitov pride v retikuloendotelijskem sistemu vranice in jeter. Čeprav je več kot polovica vseh primerov ITP idiopatskih, pa ima mnogo pacientov osnovno revmatično ali avtoimunsko bolezen (npr. sistemski lupus eritematosus) ali limfoproliferativne motnje (npr. kronično limfocitno levkemijo).

(f) ΓΓΡ, inducirana s HIV

ΓΓΡ je vedno bolj običajna komplikacija infekcije s HIV (Morris et al., Ann. Intem. Med., 96:714-717 [1982]), do katere lahko pride v vsaki stopnji bolezenske progresije, tako pri pacientih z diagnozo za sindrom pridobljene imunske pomankljivosti (AIDS), pri tistih s kompleksom, sorodnim AIDS-u, in tistih z infekcijo s HIV, toda brez simptomov za AIDS. Infekcija s HIV je prenosljiva bolezen, končno označena s temeljitim pomanjkanjem celičnega imunskega delovanja kot tudi z navzočnostjo priložnostne infekcije in malignosti. Primarna imunološka nenormalnost, ki je posledica infekcije s HIV, je progresivna deplecija in funkcionalna oslabitev limfocitov T, ki eksprimirajo celični površinski glikoprotein CD4 (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3:477 [1985]). Izguba CD4 pomočniške/induktorske T-celične funkcije je veijetno osnova za nedoumljive defekte v celični in humoralni imunosti, ki vodi do priložnostnih infekcij in malignosti, značilnih za AIDS (H. Lane, zgoraj).

Čeprav je mehanizem ΓΓΡ, povezane s HIV, neznan, pa smatrajo, da je različen od mehanizma ΓΓΡ, ki ni povezana z infekcijo s HIV. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; in Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]).

IV. Zdajšnja terapija trombocitopeniie

Terapevtski način zdravljenja pacientov s trombocitopenijo je določen z resnostjo in nujnostjo klinične situacije. Zdravljenje je podobno za trombocitopenijo, ki je v zvezi s HIV, in za tisto, ki ni v zvezi z njim, in čeprav uporabljajo številne različne terapevtske načine, je terapija še vedno sporna.

Število trombocitov v pacientih z diagnozo za trombocitopenijo uspešno povečajo s terapijo z glukokortikoidi (kot je npr. prednisolon), vendar je pri večini pacientov odziv nepopolen ali pa pride do relapsa, če je doza glukokortikoidov zmanjšana, ali je dajanje prekinjeno. Na osnovi študija pacientov z ΓΓΡ, povezane s HIV, nekateri raziskovalci navajajo, da je lahko posledica terapije z glukokortikoidi predispozicija za AIDS. Glukokortikoide navadno dajejo, če število trombocitov pade pod 20 x 10^/1, ali če pride do spontane krvavitve.

Za paciente, ki so odporni proti glukokortikoidom, uspešno uporabijo spojino:

4-(2-klorfenil)-9-metil-2-[3-(4-morfolinil)’3-propanon-l-il]6H-tieno[3,2,f][l,2,4]triazolo[4,3,a][l,4]diazepin (WEB 2086), za zdravljenje resnega primera ITP, ki ni povezana s HIV. Paciente, ki imajo število trombocitov od 37000-58000/μ1, zdravijo z WEB 2086, in po 1-2 tednih zdravljenja število trombocitov naraste na 140000-190000/μ1 (EP 361,077 in Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Čeprav optimalno zdravljenje za pridobljeno amegakariocitično trombocitopenično purpuro (AATP) ni jasno, pa je za antitimocitni globulin (ATG), konjski antiserum za humano timusno tkivo, pokazano, da proizvede podaljšano kompletno remisijo (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]). V nedavnem poročilu je prikazano, da so hematopoetični učinki ATG pripisljivi timerosalu, kjer verjetno protein deluje kot nosilec živega srebra (Panella et al., Cancer Research, 50:44294435 [1990]).

Dobri rezultati so navedeni za splenektomijo. Splenektomija odstrani glavno mesto destrukcije trombocitov in glavni vir proizvajanja avtoprotiteles pri mnogih pacientih. Ta postopek ima za posledico podaljšano zdravljenje brez remisij pri velikem številu pacientov. Ker se kirurškim postopkom na splošno izogibajo pri imunsko ogroženih pacientih, splenektomijo priporočajo le v resnih primerih trombocitopenije (npr. resna ΓΓΡ, povezana s HIV) pri pacientih, ki se ne odzovejo po 2-3 tednih zdravljenja z glukokortikoidi ali ne dosežejo zadržanega odziva po prekinitvi dajanja glukokortikoidov. Glede na sedanje znanstveno znanje ni jasno, ali splenektomija predisponira paciente za AIDS.

Poleg terapije s prednisolonom in splenektomije se kažejo obetavna tudi nekatera citotoksična sredstva, npr. vincristin in azidotimidin (AZT, zidovudin), pri zdravljenju ΓΓΡ, inducirane s HIV, vendar pa so rezultati preliminarni.

Iz predhodno navedenega sledi, da bi bil en način zdravljenja trombocitopenije takšen, da bi dobili sredstvo, ki bi bilo sposobno pospeševanja diferenciacije in zorenja megakariocitov ali njihovih predhodnikov v trombocite tvorečo obliko. Precejšnji trud je bil vložen v identificiranje takšnega sredstva, ki ga navadno imenujemo trombopoetin (TPO). Druga imena za TPO, ki jih navadno najdemo v literaturi, so: trombocitopoezo stimulirajoči faktor (TSF), megakariocitno kolonijo stimulirajoči faktor (MK-CSF), megakariocite stimulirajoči faktor in megakariocitni potenciator. Aktivnost TPO so opazili že leta 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1:125), poskusi za označitev in očiščenje tega sredstva pa se nadaljujejo do danes. Čeprav obstajajo poročila o delnem čiščenju TPO-aktivnih polipeptidov (npr.: Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] in Hoffman et al., J. Ciin. Invest. 75:1174 [1985]), pa nekateri navajajo, da TPO ni diskretna entiteta sam po sebi, ampak je prej enostavno polifunkcionalna manifestacija znanega hormona (IL-3, Sparrow et al., Prog. Ciin. Biol. Res., 215:123 [1986]). Molekula, ki bi imela trombopoetično aktivnost, bi imela precejšnjo terapevtsko vrednost, ne glede na njeno obliko ali izvor. Čeprav noben protein ni bil tako nedvoumno identificiran kot TPO, pa je precej zanimanja okrog sedanjega odkritja, da mpl, domnevni citokinski receptor, lahko transducira trombopoetični signal.

V. Mpl ie megakariocitopoetični citokinski receptor

Verjetno je, da proliferacijo in zorenje hematopoetičnih celic močno uravnavajo faktorji, ki pozitivno ali negativno modulirajo proliferacijo pluripotentnih matičnih celic in večrodovno diferenciacijo. Ti učinki so posredovani z visoko afinitetno vezavo ekstraceličnih proteinskih faktorjev na specifične celične površinske receptorje. Ti celični površinski receptorji prispevajo precejšnjo homologijo in so na splošno klasificiram kot člani citokinske receptorske superdružine. Člani superdružine vključujejo receptorje za: IL-2 (β in γ verige) (Hatakeyama et al., Science, 244:551556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257:379-382 [1991]), IL-3 (Itoh et al., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 87:54595463 [1990]; Kitamura et al., Celi, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Celi, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9:4367-4374 [1990]; Tavemier et al., Celi, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241:825-828 [1988]; Hibi et al., Celi, 63:1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Celi, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 89:5690-5694 [1992]), granulocitno makrofagno kolonijo stimulirajoči faktor (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 244:9655-9659 [1990]), granulocitno kolonijo stimulirajoči faktor (G-CSF) (Fukunaga et al., Celi, 61:341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZSA, 87:8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1570 [1990]), EPO (D’Andrea et al. Celi, 57:277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76:31-35 [1990]), inhibitomi faktor levkemije (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), onkostatin M (OSM) (Rose et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 88:8641-8645 [1991]) in tudi receptorje za prolaktin (Boutin et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 88:7744-7748 [1988]; Edery et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZSAA, 86:2112-2116 [1989]), rastni hormon (GH) (Leung et al., Nature, 330:537-543 [1987]) in ciliami nevrotrofni faktor (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63 [1991].

Člane citokinske receptorske superdružine lahko razdelimo v tri funkcionalne kategorije (za pregled glej: Nicola et al., Celi, 67:1-4 [1991]). Prvi razred obsega receptorje z enojno verigo, kot npr. eritropoetinski receptor (EPO-R) ali receptor za granulocitno kolonijo stimulirajoči faktor (G-CSF-R), ki veže ligand z visoko afiniteto preko ekstracelične domene in tudi ustvari intracelični signal. Drugi razred receptorjev, tako imenovane α-podenote, vključuje receptor interlevkina-6 (EL6-R), receptor granulocitno-makrofagno kolonijo stimulirajočega faktorja (GM-CSF-R), receptor interlevkina-3 (IL-3-Ra) in druge člane citokinske receptorske superdružine. Te α-podenote vežejo ligand z nizko afiniteto, vendar ne morejo transducirati intraceličnega signala. Visoko afinitetni receptor, ki je sposoben signaliziranja, ustvari heterodimer med α-podenoto in članom tretjega razreda citokinskih receptorjev, označenih j8-podenot, npr. 0_c, ki je običajna j8-podenota za tri α-podenote IL3-Ra: in GM-CSF-R.

Dokaz, da je mpl član citokinske receptorske superdružine, izhaja iz sekvenčne homologije (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 87:6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253:59-63 [1991] in Vigon et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 89:5640-5644 [1992]) in njegove sposobnosti, da transducira proliferativne signale.

Proteinska sekvenca, izvedena z molekulskim kloniranjem murinega c-mpl, razkriva, da je protein homologen za druge citokinske receptorje. Ekstracelična domena vsebuje 465 aminokislinskih ostankov in je sestavljena iz dveh poddomen, vsaka s 4 visoko konzerviranimi cisteini in posebnim motivom v N-terminalni subdomeni in C-terminalni subdomeni. Za ligand vezavne ekstracelične domene domnevajo, da imajo podobno dvojno j8-sodčkasto (j8-barrel) zgubano strukturno geometrijo. Ta podvojena ekstracelična domena je visoko homologna za signal transducirajočo verigo, navadno za receptorje EL-3, IL-5 in GM-CSF kot tudi za nizko afinitetno vezavno domeno LIF (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Tako lahko mpl spada v nizko afinitetni razred citokinskih receptorjev, ki vežejo ligand.

k primerjave med murinim mpl in zrelim humanim mpl P je razvidno, da imata ta dva proteina 81 % sekvenčno identičnost. Bolj specifično imata N-terminalna in C-terminalna ekstracelična subdomena 75 % oz. 80 % sekvenčno identičnost. Najbolj konzervirana regija mpl je citoplazemska domena, ki ima 91 % aminokislinsko identičnost s sekvenco 37 ostankov blizu transmembranske domene, ki je identična v obeh vrstah. V skladu s tem je za mpl navedeno, da je eden od najbolj konzerviranih članov citokinske receptorske superdružine (Vigon, zgoraj).

Dokaz, da je mpl funkcionalen receptor, ki je sposoben transduciranja proliferativnega signala, izhaja iz konstrukcije kimemih receptorjev, ki vsebujejo ekstracelično domeno od citokinskega receptorja, ki ima visoko afiniteto za znan citokin s citoplazemsko domeno mpl. Ker ni naveden še noben znan ligand za mpl, je potrebno, da konstruiramo kimemo visoko afinitetno ligand vezavno ekstracelično domeno iz razreda citokinskih receptorjev, kot so IL-4R ali G-CSFR. Vigon et al., zgoraj, so spojili ekstracelično domeno G-CSFR tako s transmembransko kot tudi s citoplazemsko domeno c-mpl. IL-3 odvisno celično linijo BAF/B03 (Ba/F3) so transfektirali z G-CSFR/mp/ kimero skupaj z G-CSFR kontrolo s popolno dolžino. Celice, transfektirane s kimero, rastejo enako dobro bodisi v prisotnosti citokinskega IL-3 ali G-CSF. Podobno celice, transfektirane z G-CSFR, tudi dobro rastejo bodisi v IL-3 ali G-CSF. Vse celice odmrejo v odsotnosti rastnih faktorjev. Podoben eksperiment so izvedli Skoda et al., EMBO J., 12(7):2645-2653 [1993], v katerem so tako ekstracelično kot tudi transmembransko domeno humanega receptorja IL-4 (hIL-4R) spojili s citoplazemsko domeno murinega mpl in transfektirali v murino celično linijo Ba/F3, odvisno od IL-3. Celice Ba/F3, transfektirane s hIL-4-R divjega tipa, proliferirajo normalno v prisotnosti enega od obeh vrstno specifičnih IL-4 ah IL-3. Celice Ba/F3, transfektirane s hIL-4R/wp/, proliferirane normalno v prisotnosti hIL-4 (v prisotnosti ah odsotnosti IL-3), dokazujejo, da v celicah Ba/F3 citoplazemska domena mpl vsebuje vse elemente, ki so potrebni za transduciranje proliferativnega signala.

Iz teh kimemih eksperimentov je razvidna sposobnost citoplazemske domene mpl, da signalizira proliferacijo, ni pa razvidno, da ekstracelična domena mpl lahko veže ligand. Ti rezultati so konsistentni z vsaj dvema možnostima, in sicer, daje mpl receptor z enojno verigo (razred 1), podoben EPO-R ali G-CSFR, ali je signal transducirajoča /3-podenota (razred tri), ki potrebuje α-podenoto, podobno kot IL-3 (Skoda et al. zgoraj).

VI, Mpl ligand ie trombopoetin (TPO)

Kot je opisano zgoraj, vsebuje serum edini faktor, na katerega se včasih sklicujemo kot na trombopoetin (TPO), ki deluje sinergistično z raznimi drugimi citokini, tako da zvečuje rast in zorenje megakariocitov. Nobenega takega naravnega faktorja še niso izolirali iz seruma ali kakšnega drugega vira, čeprav so številne skupine v to vložile precej truda. Čeprav še ni znano, ali je mpl sposoben direktne vezave megakariocite stimulirajočega faktorja, pa je iz nedavnih eksperimentov razvidno, da je mpl vključen v transdukcijo proliferativnega signala iz faktorja ali faktorjev, ugotovljenih v serumu pacientov z aplastičnim kostnim mozgom (Methia et al., Blood, 82(5):1395-1401 (1993]).

Dokaz, da edini serumsko kolonijo tvoreči faktor, različen od IL-Ία, IL-3, EL-4, IL-6, EL-11, SCF, EPO, G-CSF in GM-CSF, transducira proliferativni signal preko mpl, izhaja iz raziskave porazdelitve ekspresije c-mpl v primitivnih in usmerjenih hematopoetičnih celičnih linijah in iz antisens študij mpl v eni od teh celičnih linij.

Z uporabo reverzne transkriptaze (RT)-PCR v imunsko očiščenih humanih hematopoetičnih celicah so Methia et al., zgoraj, dokazali, da so močne signale mRNA mpl ugotovili le v očiščenih celicah CD34⁺, megakariocitih in trombocitih. Celice CD34⁺, očiščene iz kostnega mozga (BM), pomenijo približno 1 % vseh celic BM in so obogatene v primitivnih in usmerjenih prednikih vseh rodov (npr. eritroidnem, granulomakrofagnem in megakariocitnem).

Za mpl antisens oligodeoksinukleotide je prikazano, da preprečujejo tvorbo megakariocitične kolonije iz pluripotentnih celic CD34⁺, kultiviranih v serumu pacientov z aplastičnim mozgom (bogat vir megakariocitno kolonijo stimulirajoče aktivnosti [MK-CSA]). Ti, isti antisens oligodeoksinukleotidi nimajo vpliva na tvorbo eritroidne ali granulomakrofagne kolonije.

Ali mpl direktno veže ligand in ali serumski faktor, za katerega je znano, da povzroča megakariocitopoezo, delujeta preko mpl, je še vedno neznano. Vendar pa navajajo, da je, če mpl direktno veže ligand, njegova aminokislinska sekvenca verjetno visoko konzervirana in ima navzkrižno reaktivnost za vrste, zaradi znatne sekvenčne identičnosti med ekstraceličnimi domenami humanega in murinega mpl (Vigon et al., zgoraj [1993]).

VII. Predmeti

Glede na pred tem navedeno je razumljivo, da obstaja nenehna potreba v tehniki, da bi izolirali in identificirali molekule, ki bi bile sposobne stimulirati proliferacijo, diferenciacijo in zorenje hematopoetičnih celic, posebno megakariocitov ali njihovih predhodnikov, za terapevtsko uporabo pri zdravljenju trombocitopenije. Verjetno je takšna molekula mpl ligand in zato obstaja nadaljnja potreba, da bi izolirali takšen ligand(e), da bi ovrednotili njegovo vlogo (njihove vloge) v celični rasti in diferenciaciji.

V skladu s tem je prvi predmet predloženega izuma ustvaritev farmacevtsko čiste molekule, sposobne stimuliranja proliferacije, diferenciacije in/ali zorenja megakariocitov v zrelo trombocite tvorečo obliko.

Nadaljnji predmet je, da zagotovimo molekulo v obliki za terapevtsko uporabo pri zdravljenju hematopoetičnih motenj, posebno trombocitopenije.

Nadaljnji predmet predloženega izuma je, da izoliramo, očistimo in specifično identificiramo proteinske ligande, sposobne vezave receptorja citokinske superdružine, znanega kot mpl, in vivo, in transduciranja proliferativnega signala.

Nadaljnji predmet je, da zagotovimo molekule nukleinske kisline, ki kodirajo takšne proteinske ligande, in da uporabimo te molekule nukleinske kisline za izdelavo mpl vezivnih ligandov v rekombinantni celični kulturi za diagnostično in terapevtsko uporabo.

Še nadaljnji predmet je, da zagotovimo derivate in modificirane oblike proteinskih ligandov, ki vključujejo variante aminokislinskih sekvenc, variante glikoproteinskih oblik in njihove kovalentne derivate.

Dodaten predmet je, da zagotovimo fuzijske polipeptidne oblike, ki združujejo mpl ligand in heterologni protein ter njegove kovalentne derivate.

Še dodatni predmet je, da zagotovimo variante polipeptidnih oblik, ki združujejo mpl ligand z aminokislinskimi adicijami in substitucijami iz sekvence EPO, da se tvori protein, sposoben reguliranja proliferacije in rasti tako trombocitnih prednikov kot tudi prednikov rdečih krvnih celic.

Še nadaljnji predmet je, da pripravimo imunogene za snovanje protiteles proti mpl ligandom ali njihovim fuzijskim oblikam, kot tudi da dobimo protitelesa, ki bi lahko vezala takšne ligande.

Ti in drugi predmeti predloženega izuma bodo jasni strokovnjakom ob upoštevanju celotne specifikacije.

Predmete predloženega izuma dosežemo s tem, da zagotovimo izoliran protein sesalcev, ki pospešuje megakariocitopoetično proliferacijo in zorenje, imenovan mpl ligand (ML) ali trombopoetin (TPO), in je sposoben stimuliranja proliferacije, zorenja in/ali diferenciacije megakariocitov v obliko, tvorečo zrele trombocite.

Ta, v bistvu homogeni protein lahko očistimo iz naravnega vira s postopkom, ki obsega: (1) kontaktiranje plazemskega vira, ki vsebuje molekule mpl liganda, ki jih je potrebno očistiti, z mobiliziranim receptorskim polipeptidom, posebno mpl ali mpl fuzijskim polipeptidom, mobiliziranim na nosilcu, pri pogojih, kjer molekule mpl liganda, ki jih je potrebno očistiti, selektivno adsorbiramo na mobiliziran receptorski polipeptid, (2) izpiranje mobiliziranega receptorskega polipeptida in njegovega nosilca, da odstranimo neadsorbirano snov, in (3) eluiranje molekul mpl liganda iz mobiliziranega receptorskega polipeptida, na katerem so adsorbirane, z eluimim pufrom. Prednostni naravni vir je plazma ali urin sesalca, ki vsebuje mpl ligand. V danem primeru je sesalec aplastičen in je mobiliziran receptor fuzija mplIgG.

V danem primeru je prednosten protein, ki pospešuje megakariocitopoetično proliferacijo in zorenje, izoliran v bistvu homogen mpl ligandski polipeptid, narejen s sintetičnimi ali rekombinantnimi postopki.

Mpl ligandski polipeptid ali 'TPO v smislu izuma ima prednostno vsaj 70 % celotno sekvenčno identičnost z aminokislinsko sekvenco visoko očiščenega, v bistvu homogenega prašičjega mpl Ugandskega polipeptida, in vsaj 80 % sekvenčno identičnost z EPO-domeno prašičjega mpl Ugandskega poUpeptida. V danem primeru je mpl Ugand v smislu izuma zreU humani mpl Ugand (hML), ki ima zrelo aminokislinsko sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ID NO [identifikacijska številka sekvence]: 1) aU njegova varianta ali posttranskripcijsko modificirana oblika aU protein, ki ima približno 80 % sekvenčno identičnost z zrelim humanim mpl Ugandom. V danem primeru je varianta mpl Uganda fragment, posebno amino terminalni ali fragment EPO-domene zrelega humanega mpl Uganda (hML). Prednostno amino terminalni fragment ohrani v bistvu vso sekvenco humanega ML med prvim in četrtim cisteinskim ostankom, lahko pa vsebuje dodatne adicije, delecije ali substitucije zunaj te regije. V skladu s to izvedbo lahko polipeptidni fragment predstavimo s formulo:

X-hML(7-151)-Y kjer pomeni hML(7-151) aminokislinsko sekvenco humanega TPO (hML), od Cys⁷ do vključno Cys¹⁵¹; X pomeni amino skupino Cys⁷ ali enega ali več aminoterminalnih aminokislinskih ostankov zrelega hML ali ekstenzije aminokislinskih ostankov le-tega, kot so npr. Met, Tyr, ali vodilne sekvence, ki vsebujejo npr. proteolitična cepišča (npr. faktor Xa ali trombin); in Y pomeni karboksi terminalno skupino Cys¹⁵¹ ali enega ali več karboksiterminalnih aminokislinskih ostankov zrelega hML ali ekstenzije le-teh.

V danem primeru mpl Ugandski poUpeptid aU njegov fragment lahko spojimo s heterolognim poUpeptidom (kimera). Prednostni heterologni poUpeptid je citokin, kolonijo stimuUrajoči faktor, aU interlevkin aU njegov fragment, posebno kit-Ugand (KL), EL-1, EL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF aU LIF. V danem primeru je prednostni heterologni poUpeptid imunoglobuUnska veriga, posebno humani IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM aU njegov fragment, ki posebno obsega konstantno domeno težke verige IgG.

Z nadaljnjega vidika predloženega izuma je zagotovljen sestavek, ki obsega izoUranega agonista mpl, ki je biološko aktiven in prednostno sposoben stimuliranja vgraditve označenih nukleotidov (npr. ³H-timidin) v DNA cehe Ba/F3, odvisnih od IL-3, transfektiranih s humanim mpl. N danem primeru je agonist mpl biološko aktiven mpl Ugand in je prednostno sposoben stimuliranja vgraditve ³⁵S v krožeče trombocite pri testu oživitve mišjih trombocitov. Prikladni agonisti mpl vključujejo hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML in pML2 aU njihove fragmente.

V drugi izvedbi zagotavlja predloženi izum izolirano protitelo, kije sposobno vezave na mpl Ugand. Izolirano protitelo, ki je sposobno vezave na mpl Ugand, lahko v danem primeru spojimo z drugim poUpeptidom in protitelo aU njegovo fuzijo uporabimo, da izoUramo in očistimo mpl Ugand iz vira, kot je opisano zgoraj za imobilizirani mpl. N nadaljnjem vidiku te izvedbe zagotavlja predloženi izum postopek za detektiranje mpl liganda in vitro ali in vivo, pri čemer obsega kontaktiranje protitelesa z vzorcem, posebno serumskim vzorcem, za katerega predvidevamo, da vsebuje Ugand, in detektiranje, če pride do vezave. V še nadaljnjih izvedbah zagotavlja predloženi izum izolirano molekulo nukleinske kisline, ki kodira mpl ligand ali njegove fragmente, pri čemer je lahko molekula nukleinske kisline v danem primeru označena z detektibilnim deležem, in molekulo nukleinske kisline, ki ima sekvenco, ki je komplementarna oz. se hibridizira pri zmernih do ostrih pogojih z molekulo nukleinske kisline, ki ima sekvenco, ki kodira mpl ligand. Prednostne molekule nukleinske kisline so tiste, ki kodirajo humani, prašičji in murini mpl ligand in vključujejo RNA in DNA, tako genomsko kot tudi cDNA. Nadaljnji vidik te izvedbe je molekula nukleinske kisline DNA, ki kodira mpl ligand in nadalje obsega replikabilni vektor, v katerem je DNA funkcionalno vezana na kontrolne sekvence, spoznane od gostitelja, transformiranega z vektorjem. DNA je v danem primeru cDNA s sekvenco, prikazano na sl. 1, 5’-3’ (SEQ ID NO: 2), 3’-5’ ali njen fragment. Ta vidik nadalje vključuje gostiteljske celice, prednostno celice CHO, transformirane z vektorjem, in postopek uporabe DNA, da tvorimo mpl ligand, ki prednostno obsega ekspresijo cDNA, ki kodira mpl ligand v kulturi transformiranih gostiteljskih celic, in rekuperiranje mpl liganda iz gostiteljskih celic ali gostiteljske celične kulture. Mpl ligand, pripravljen na ta način, je prednostno humani mpl ligand.

Predloženi izum nadalje vključuje postopek za zdravljenje sesalcev s hematopoetično motnjo, posebno trombocitopenije, ki obsega dajanje terapevtsko učinkovite količine mpl liganda sesalcu. V danem primeru damo mpl ligand v kombinaciji s citokmom, posebno s kolonijo stimulirajočim faktorjem ali interlevkinom. Prednostni kolonijo stimulirajoči faktorji ali interlevkini vključujejo: kit-ligand (KL), LIF, G-CSF, GMCSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 in IL-11.

Predloženi izum nadalje vključuje postopek za izoliranje in čiščenje TPO (ML) iz TPO izdelujočega mikroorganizma, ki obsega:

(1) razkrojevanje ali liziranje celic, ki vsebujejo TPO (2) v danem primeru ločevanje topne snovi od netopne, ki vsebuje TPO (3) solubiliziranje TPO v netopni snovi s solubilizimim pufrom (4) ločitev solubiliziranega TPO od drugih topnih in netopnih snovi (5) renaturiranje TPO v redoks pufru in (6) ločevanje pravilno zgubanega TPO od nepravilnega.

Postopek zagotavlja solubiliziranje netopne snovi, ki vsebuje TPO, s kaotropičnim sredstvom, pri čemer le-to izberemo izmed soli gvanidina, natrijevega tiocianata ali sečnine. Postopek nadalje zagotavlja, da solubilizirani TPO ločimo od drugih topnih in netopnih snovi v eni ali več stopnjah, izbranih izmed centrifugiranja, gelske filtracije in kromatografije z reverzno fazo. Procesno stopnjo renaturiranja izvedemo z redoks pufrom, ki vsebuje tako oksidacijsko kot tudi redukcijsko sredstvo. Na splošno je oksidacijsko sredstvo kisik ali spojina, ki vsebuje vsaj eno disulfidno vez, redukcijsko sredstvo pa je spojina, ki vsebuje vsaj en prosti sulfhidril. Prednostno oksidacijsko sredstvo izberemo izmed oksidiranega glutationa (GSSG) in čistina, redukcijsko sredstvo pa izberemo izmed reduciranega glutationa (GSH) in cisterna. Najbolj prednostno oksidacijsko sredstvo je oksidirani glutation (GSSG) in redukcijsko sredstvo reducirani glutation (GSH). Prednostno sta oksidacijsko in redukcijsko sredstvo v enakem molskem razmerju oz. je oksidacijsko sredstvo v prebitku. Redoksni pufer dodatno vsebuje detergent, prednostno izbran izmed CHAPS in CHAPSO, v količini vsaj 1 %. Redoks pufer dodatno vsebuje NaC, prednostno v koncentracijskem območju približno 0,1 do 0,5 M, in glicerol, prednostno v koncentraciji, večji od 15 %. pH redoks pufra je prednostno v območju od približno 7,5 do 9,0, procesno stopnjo renaturiranja pa vodimo pri 4 °C 12-48 ur. V stopnji renaturiranja dobimo biološko aktiven TPO, v katerem se tvori disulfidna vez med Cys, kije najbližji amino-terminalu, in Cys, kije najbližji karboksi-terminalu domene EPO.

Predloženi izum nadalje vključuje postopek za čiščenje biološko aktivnega TPO iz mikroorganizma, ki obsega:

(1) liziranje vsaj ekstracelične membrane mikroorganizma (2) obdelovanje lizata, ki vsebuje TPO, s kaotropičnim sredstvom (3) renaturiranje TPO in (4) ločevanje nečistot in nepravilno zgubanega TPO od pravilnega.

Na sl. 1 je prikazana deducirana aminokislinska sekvenca (SEQ ID NO: 1) cDNA humanega mpl liganda (hML) in kodirna nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 2). Nukleotidi so oštevilčeni na začetku vsake vrste. Netranslatirani regiji 5’ in 3’sta označeni z malimi črkami, aminokislinski ostanki so oštevilčeni nad sekvenco in se začnejo s Ser 1 proteinske sekvence zrelega mpl liganda (ML). Meje domnevnega eksona 3 so označene s puščicami, potencialna N-glikozilima mesta pa so v okvirčkih. Cisteinski ostanki so označeni s piko nad sekvenco. Podčrtana sekvenca ustreza N-terminalni sekvenci, določeni za mpl ligand, očiščen iz prašičje plazme.

SL 2 prikazuje postopek, uporabljen za test vgraditve ³H-timidina v mpl ligand. Da bi določili prisotnost mpl liganda iz različnih virov, celice Ba/F3 mpl P stradamo IL-3 24 ur v vlažnem inkubatoiju pri 37 °C, v mešanici 5 % CO₂ v zraku. Po končanem IL-3 stradanju celice zasadimo v posode za kulturo s 96 vdolbinicami z razredčenimi vzorci ali brez njih in kultiviramo 24 ur v inkubatorju za celično kulturo. V vsako vdolbinico dodamo 20 μΐ seruma brez medija RPMI, ki vsebuje 1 /xCi ³H-timidina, in pustimo 6-8 ur. Celice nato zberemo na filtrimih ploščah s 96 vdolbinicami in izperemo z vodo. Filtre nato preštejemo.

Sl. 3 prikazuje učinek pronaze, DTT in toplote na sposobnost APP za stimulacijo Ba/F3-mp/ celične proliferacije. Za pronazno digestijo APP pripojimo pronazo (Boehringer Mannheim) ali goveji serumski albumin na Affi-gellO (Biorad) in inkubiramo individualno z APP 18 ur pri 37 °C. Nato smole odstranimo s centrifugiranjem in testiramo supematante. APP segrejemo tudi za 4 minute na 80 °C ali naredimo 100 μΜ DTT, nato pa dializiramo proti PBS.

Sl. 4 prikazuje eluiranje aktivnosti mpl Uganda iz kolon: fenil-Toyopearl, bluesefaroze in ultralink-mp/. Frakcije 4-8 iz mpl afinitetnih kolon so tiste z najvišjo aktivnostjo, eluirane iz kolone.

Sl. 5 prikazuje SDS-PAGE eluiranih ultralink-mp/ frakcij. K 200 μΐ vsake frakcije 2-8 dodamo 1 ml acetona, ki vsebuje HCI (1 mM) pri -20 °C. Po 3 urah pri -20 °C vzorce centrifugiramo in nastale pelete izperemo 2-krat z acetonom pri -20 °C. Te pelete nato raztopimo v 30 μΐ SDS solubilizacijskega pufra, naredimo 100 μΜ DTT in segrevamo pri 90 °C 5 minut. Vzorce nato ločimo na SDS-poUakrilamidnem gelu (420 %) in proteine vizualiziramo z barvanjem s srebrom.

Sl. 6 prikazuje eluiranje aktivnosti mpl liganda iz SDS-PAGE. Frakcijo 6 iz mpl afinitetne kolone ločimo na SDS-poliakrilamidnem gelu (4-20 %) pri nereduktivnih razmerah. Po elektroforezi razrežemo gel v 12 enakih regij in elektroeluiramo, kot je opisano v primerih. Elektroeluirane vzorce dializiramo v PBS in testiramo pri 1/20 razredčitvi. Standardi za Mr (molska masa), uporabljeni za kalibriranje gela, so standardi Novex Mark 12.

Sl. 7 prikazuje učinek APP z odstranjenim mpl ligandom, na humano megakariocitopoezo. APP z odstranjenim mpl ligandom naredimo s prepuščanjem 1 ml preko 1 ml mpl afinitetne kolone (700 pg mpMgG/ml NHS-superoze, Pharmacia). Kulture humanih perifernih matičnih cehe naredimo 10 % z APP ali 10 % z APP z odstranjenim mpl ligandom in kultiviramo 12 dni. Megakariocitopoezo kvantitativno določimo, kot je opisano v primerih.

Sl. 8 prikazuje učinek mpZ-IgG na stimulacijo humane megakariocitopoeze z APP. Kulture humanih perifernih matičnih celic naredimo 10 % z APP in kultiviramo 12 dni. Na dneve 0,2 in 4 dodamo mpMgG (0,5 /xg) ali ANP-R-IgG (0,5 Mg)- Po 12 dneh kvantitativno določimo megakariocitopoezo, kot je opisano v Primerih. Grafično je prikazano povprečje paralelk vzorcev, dejanski podatki za paralelke pa so v oklepajih.

Sl. 9 prikazuje obe vijačnici fragmenta s 390 bp (bazni par) humane genomske DNA, ki kodira mpl ligand. Prikazani so: deducirana aminokislinska sekvenca eksona 3 (SEQ ED NO: 3), kodirna sekvenca (SEQ ID NO: 4) in njen komplement (SEQ ID NO:5).

Sl. 10 prikazuje deducirano aminokislinsko sekvenco zrelega humanega mpl liganda (hML) (SEQ ID NO: 6) in zrelega humanega eritropoetina (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Napovedana aminokislinska sekvenca za humani mpl ligand je uvrščena s humano eritropoetinsko sekvenco. Identične amino kisline so v okvirčkih, praznine, uvedene za optimalno uvrstitev, pa so označene s pomišljaji. Potencialna N-glikozilacijska mesta so podčrtana s celo črto za hML in s prekinjeno za hEPO. Dva cisterna, pomembna za eritropoetinsko aktivnost, sta označena z veliko piko.

Sl. 11 prikazuje deducirano aminokislinsko sekvenco iz izo-oblik zrelega humanega mpl liganda hML (SEQ ID NO:6), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ED NO: 9) in hML4 (SEQ ID NO: 10). Identične amino kisline so v okvirjih, praznine pa so uvedene za optimalno uvrstitev in so označene s pomišljaji.

Sl. 12A, 12B in 12C prikazujejo učinek humanega mpl liganda na Ba/F3-mp/ celično proliferacijo (A), humano megakariocitopoezo in vitro, kvantitativno določeno z uporabo radioaktivno označenega monoklonskega protitelesa murinega IgG, specifičnega za megakariocitni glikoprotein GPII_bIII_a (B), in murino trombopoezo, izmerjeno s testom oživitve trombocitov (C).

293 celic transfektiramo s CaPO₄ postopkom (Gorman, C v DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]) z vektorjem pRK5 samim, pRK5-hML ali s pRK5ML₁₅₃ preko noči (pRK5-ML₁₅₃ nastane z uvedbo stop kodona po ostanku 153 hML s PCR). Medij nato kondicioniramo 36 ur in testiramo za stimulacijo celične proliferacije Ba/F3-mp/, kot je opisano v Primeru 1 (A), ali humane megakariocitopoeze in vitro (B). Megakariocitopoezo kvantitativno določimo z uporabo ¹²⁵J radioaktivno označenega monoklonskega protitelesa (HP1-1D) murinega IgG za megakariocite specifičnega glikoproteina GPn_bffl_a, kot opisujejo (Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987]). Učinek delno očiščenega rekombinantnega ML (rML) na nastajanje trombocitov in vivo (C) določimo z uporabo testa oživitve trombocitoze, ki ga opisujejo McDonald, T.P. Proc.Soc.Exp. Biol. Med. 144:1006-1012 (1973). Delno očiščen rML pripravimo iz 200 ml kondicioniranega medija, ki vsebuje rekombinanten ML. Medij spustimo skozi 2 ml kolono bluesefaroze, uravnoteženo v PBS, in kolono izperemo s PBS ter eluiramo s PBS, ki vsebuje sečnino (2 M) in NaCl (2 M). Aktivno frakcijo dializiramo v PBS in naredimo 1 mg/ml z endotoksinom brez BSA. Vzorec vsebuje manj kot eno enoto endotoksina/ml. Mišim injiciramo bodisi 64000, 32000 ali 16000 enot rML ali samo polnilo. Vsako skupino sestavlja 6 miši. Prikazani sta srednja in standardna deviacija za vsako skupino, p vrednosti določimo z dvokončnim T-testom (2-tailed T-test) s primerjavo medianov.

Sl. 13 primerja učinek izo-oblik in variant humanega mpl liganda pri testu Ba/F3-znp/ celične proliferacije. hML, mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) in hML153 testiramo pri raznih razredčitvah, kot je opisano v Primeru 1.

Sl. 14A, 14B in 14C prikazujejo deducirano aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO:1) humanega mpl liganda (hML) ali humanega TPO (hTPO) in kodirno sekvenco humane genomske DNA (SEQ ID NO: 11). Nukleotidni in aminokislinski ostanki so oštevilčeni na začetku vsake vrste.

Sl. 15 prikazuje SDS-PAGE očiščenih 293-rhML₃₃₂ in 293-rhML₁₅₃.

Sl. 16 prikazuje nukleotidno sekvenco: cDNA kodirno (SEQ ID NO: 12) in deducirano aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO: 13) odprtega bralnega okvirja izooblike murinega ML. Ta izo-oblika zrelega murinega mpl liganda vsebuje 331 amino kislinskih ostankov, 4 manj kot domnevni mML s popolno dolžino, in je zato označena kot mML2. Nukleotidi so oštevilčeni na začetku vsake vrste. Aminokislinski ostanki so oštevilčeni nad sekvenco in se začnejo s Ser 1. Potencialna N-glikozilacijska mesta so podčrtana. Cisteinski ostanki so označeni s piko nad sekvenco.

Sl. 17 prikazuje sekvenco cDNA (SEQ ED NO: 14) in domnevno proteinsko sekvenco (SEQ ID NO: 15) izooblike tega murinega ML (mML). Nukleotidi so oštevilčeni na začetku vsake vrste. Aminokislinski ostanki so oštevilčeni nad sekvenco in se začnejo s Ser 1. Ta izo-oblika zrelega murinega mpl Uganda vsebuje 335 aminokislinskih ostankov in je verjetno mpl Ugand s popolno dolžino, označen kot mML. Signalna sekvenca je podčrtana s pomišljali, verjetna cepitvena točka pa je označena s puščico. Netranslatirani regiji 5’ in 3’ sta označeni z malimi črkami. Dve deleciji, ugotovljeni kot rezultat alternativnega spajanja (mML2 in mML3), sta podčrtani. Štirje cisteinski ostanki so označeni s piko. Sedem potencialnih N-glikozilacijskih mest je v okvirčkih.

Na sl. 18 je primerjava sekvence deducirane amino kisline izo-oblike humanega ML (hML3) (SEQ ID NO:9) in izo-oblike murinega ML, označene kot mML3 (SEQ ED NO:16). Domnevna aminokislinska sekvenca za humani mpl Ugand je uvrščena s sekvenco murinega mpl Uganda. Identične amino kisline so v okvirčkih, praznine pa so uvedene za optimalno uvrstitev in označene s pomišljaji. Amino kisline so oštevilčene na začetku vsake vrste.

Na sl. 19 je primerjava domnevnih aminokislinskih sekvenc izo-oblik zrelega ML iz mišjega ML (SEQ ED NO:17), prašičjega ML (SEQ ED NO: 18) in humanega ML (SEQ ED NO: 6). Aminokislinske sekvence so uvrščene s prazninami, označenimi s pomišljaji, uvedenimi za optimalno uvrstitev. Amino kisline so oštevilčene na začetku vsake vrste z identičnimi ostanki v okvirčkih. Potencialna N-glikozilacijska mesta so označena z osenčenimi okvirčki, cisteinski ostanki pa so označeni s piko. Konzervirani dibazični aminokislinski motiv, ki je potencialno cepišče proteaze, je podčrtan. Delecija štirih amino kislin, do katere pride v vseh treh vrstah (ML2), je obkrožena s poudarjenim okvirčkom.

Sl. 20 prikazuje sekvenco cDNA (SEQ ID NO: 19) in domnevno sekvenco zrelega proteina (SEQ DD NO: 18) izo-obUke prašičjega ML (pML). Ta izo-oblika prašičjega mpl Uganda vsebuje 332 aminokislinskih ostankov in je verjetno mpl Ugand s popolno dolžino, označen kot pML. Nukleotidi so oštevilčeni na začetku vsake vrste. Aminokislinski ostanki so oštevilčeni nad sekvenco in se začnejo s Ser 1.

Sl. 21 prikazuje sekvenco cDNA (SEQ ED NO: 20) in domnevno sekvenco zrelega proteina (SEQ ID NO: 21) izo-obUke prašičjega ML (pML2). Ta izo-oblika prašičjega mpl Uganda vsebuje 328 aminokisUnskih ostankov in je prašičji mpl Ugand s popolno dolžino v takšni obliki, ki ima delecijo štirih ostankov, označeni kot pML2.

Nukleotidi so oštevilčeni na začetku vsake vrste. Amino kislinski ostanki so oštevilčeni nad sekvenco in se začnejo s Ser 1.

Na sl. 22 je primerjava deducirane aminokislinske sekvence izo-oblike prašičjega ML (pML) s popolno dolžino (SEQ ID NO: 18) in izo-oblike prašičjega ML, označene kot pML2 (SEQ ID NO:21). Domnevna aminokislinska sekvenca za pML je uvrščena s sekvenco pML2. Identične amino kisline so v okvirčkih, praznine so uvedene za optimalno uvrstitev in so označene s pomišljaji. Amino kisline so oštevilčene na začetku vsake vrste.

Sl. 23 prikazuje pertinentne lastnosti plazmida pSVI5.ID.LL.MLORF (popolna dolžina ali TPO₃₃₂) , uporabljenega za transfekcijo gostiteljskih celic CHO-DP12 za izdelavo CHO-rhTPO₃₃₂.

Sl. 24 prikazuje pertinentne lastnosti plazmida pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrajšan ali TPO₁₅₃), uporabljenega za transfektiranje gostiteljskih celic CHO-DP12 za izdelavo CHO-rh-TPO₁₅₃.

Sl. 25A, 25B in 25C prikazujejo učinek E. coli-rhTPO(_Me ⁴ 153) na trombocite (A), eritrocite (B) in levkocite (C) v normalnih miših. Dvema skupinama po 6 samic miši C57 B6 injiciramo dnevno bodisi pufer PBS ali 0,3/xg E. coli-rhTPO(Me ⁴ 153) (100μΐ sc.). Na dan 0 in na dneve 3-7 vzamemo 40 μΐ krvi iz orbitalnega sinusa. To kri takoj razredčimo v 10 ml komercialnega razredčila, popolno štetje krvnih celic pa izvedemo na hematološkem analizatorju Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja.

Sl. 26A, 26B in 26C prikazujejo učinek E. coli-rhTPO(_Met ⁴ 153) na trombocite (A), eritrocite (B) in levkocite (C) v subletalno obsevanih miših. Dve skupini po 10 samic miši C57 B6 izpostavimo subletalnemu obsevanju s 750 cGy gama radiacije iz vira ¹³⁷Cs in jim injiciramo dnevno bodisi pufer PBS ali 3,0 μξ E. coli-rhTPO(Met⁴ ₁₅₃) (100 μ\ sc.). Na dan 0 in pri kasnejših vmesnih časovnih točkah vzamemo 40 μΐ krvi iz orbitalnega sinusa. To kri takoj razredčimo v 10 ml komercialnega razredčila, popolno štetje krvnih celic pa izvedemo na hematološkem analizatorju Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja.

Sl. 27A, 27B in 27C prikazujejo učinek CHO-rhTPO₃₃₂ na trombocite (A), eritrocite (B) in levkocite (C) v normalnih miših. Dvema skupinama po 6 samic miši C67 B6 injiciramo dnevno bodisi pufer PBS ali 0,3 /tg CHO-rhTPO^ (100 /tl sc.). Na dan 0 in na dneve 3-7 vzamemo 40 /tl krvi iz orbitalnega sinusa. To kri takoj razredčimo v 10 ml komercialnega razredčila, popolno štetje krvnih celic pa izvedemo na hematološkem analizatorju Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja.

Sl. 28 prikazuje krivulje odziva na dozo za različne oblike rhTPO, dobljenega iz različnih celičnih linij. Krivulje odziva na dozo so konstruirane za rhTPO iz naslednjih celičnih linij: hTPO₃₃₂ iz CHO (popolna dolžina iz ovarijskih celic kitajskega hrčka); hTO_Met ⁴ ₁₅₃) (iz E. coli izvedena skrajšana oblika z N-terminalnim metioninom); hTPO₃₃₂ (TPO s popolno dolžino iz 293 humanih celic; 155 E-Coli brez Met (skrajšana oblika [rhTPO₁₅₅] brez terminalnega metionina iz E.coli). Skupinam po 6 samic miši C57 B6 injiciramo dnevno 7 dni rhTPO, odvisno od skupine. Vsak dan vzamemo 40 /tl krvi iz orbitalnega sinusa za popolno štetje krvi. Podatki, predstavljeni zgoraj, so maksimalni učinki, ki jih opazimo pri različnih obdelavah, z izjemo (met 153 E-Coli), in do katerih pride na sedmi dan obdelave. V zgoraj omenjeni skupini met 153 E-Coli opazimo petega dne maksimalni učinek. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja.

Sl. 29 prikazuje krivulje odziva na dozo, pri čemer primerjamo aktivnost nastalega rhTPO s popolno dolžino in pristriženega, nastalega v celicah CHO s skrajšano obliko iz E. coli. Skupinam po 6 samic miši C57 B6 injiciramo dnevno 0,3 /tg rhTPO različnih tipov. Na dneve 2-7 vzamemo 40 /tl krvi iz orbitalnega sinusa za popolno štetje krvi. Obdelovane skupine so: TPO₁₅₃, skrajšana oblika TPO iz E. coli; TPO₃₃₂ (mešana frakcija) TPO s popolno dolžino, ki vsebuje približno 80-90 % oblike s popolno dolžino in 10-20 % pristrižene oblike; TPO332(30K frakcija) = očiščena pristrižena frakcija iz originalnega mešanega pripravka; TPO332(70K frakcija) = očiščena frakcija TPO s popolno dolžino iz originalnega mešanega pripravka. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja.

Na sl. 30 je shema, ki prikazuje test KIRA ELISA za merjenje TPO. Slika prikazuje kimero MPL/Rse.gD in ustrezne dele parentalnih receptorjev, končni konstrukti (desni del slike) in diagram poteka (levi del slike) pa prikazujejo ustrezne stopnje testa.

Sl. 31 je diagram poteka testa KIRA ELISA, ki prikazuje vsako stopnjo v postopku.

Sl. 32A-32L prikazujejo nukleotidno sekvenco (SEQ ID NO: 22) ekspresijskega vektorja pSVI17.ID.LL, uporabljenega za ekspresijo Rse.gD v primeru 17.

Sl. 33 shematično prikazuje pripravo plazmida pMPl.

Sl. 34 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP21.

Sl. 35 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP151.

Sl. 36 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP202.

Sl. 37 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP172.

Sl. 38 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP210.

Sl. 39 prikazuje tabelo petih klonov, ki najbolje izražajo TPO iz pMP210 plazmidne banke (SEQ ID NOS: 23,24,25,26,27 in 28).

Sl. 40 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP41.

Sl. 41 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP57.

Sl. 42 shematično prikazuje pripravo plazmida pMP251.

I. Definicije

Na splošno imajo naslednje besede ali fraze določeno definicijo, kadar jih uporabljamo v opisu, primerih in zahtevkih.

Kaotropično sredstvo se nanaša na spojino, ki v vodni raztopini in v prikladnih koncentracijah lahko povzroči spremembo v prostorski konfiguraciji ali konformaciji proteina z vsaj delno prekinitvijo sil, ki so odgovorne za vzdrževanje normalne sekundarne in terciarne strukture proteina. Take spojine vključujejo npr. sečnino, gvanidin.HCl in natrijev tiocianat. Visoke koncentracije, navadno 4-9M, teh spojin so normalno potrebne, da izrazijo konformacijske efekte na proteinu.

Citokin je generični izraz za proteine, ki jih sprošča ena celična populacija in delujejo na drugo celico kot intercelični mediatoiji. Primeri takih citokinov so limfokini, monokini in tradicionalni polipeptidni hormoni. Med citokine so vključeni rastni hormoni, insulinu podobni rastni faktorji, humani rastni hormon, N-metionilni humani rastni hormon, goveji rastni hormon, paratiroidni hormon, tiroksin, insulin, proinsulin, relaksin, prorelaksin, glikoproteinski hormoni, kot npr. folikle stimulirajoči hormon (FSH), tiroid stimulirajoči hormon (TSH) in leutinizirajoči hormon (LH), hematopoetični rastni faktor, hepatični rastni faktor, fibroblastni rastni faktor, prolaktin, placentni laktogen, tumor nekrotizirajoči faktor - a (TNF-α in TNF-/3), mulerian inhibirajoča substanca, z mišjim gonadotropinom povezan peptid, inhibin, aktivin, vaksulami endotelijski rastni faktor, integrin, živčni rastni faktorji, kot npr. NGF-jS, trombocitni rastni faktor, faktorji za transformiranje rasti (TGF), kot npr. TGF-α in TGF-/3, insulinu podoben rastni faktor I in II, eritropoetin (EPO), osteoinduktivni faktorji, interferoni, kot interferon-α, β in γ, kolonije stimulirajoči faktorji (CSF), kot npr. makrofagni CSF (M-CSF), granulocitni makrofagni-CSF (GM-CSF) in granulocitni-CSF (G-CSF), interlevkini (IL), kot npr. IL-1, EL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, BL-11, IL-12 in drugi polipeptidni faktorji, vključno LIF, SCF in kit-ligand. Predhodni izrazi, kot jih uporabljamo tukaj, so mišljeni, da vključujejo proteine iz naravnih virov ali iz rekombinatne celične kulture. Podobno so izrazi namenjeni, da vključujejo tudi biološko aktivne ekvivalente; npr. take, ki se razlikujejo v aminokislinski sekvenci po eni ali več amino kislin ali po tipu ali obsegu glikozilacije.

mpl ligand, mpl ligandski polipeptid, ML, trombopoetin ali TPO so uporabljeni izmenljivo in obsegajo katerikoli peptid, ki ima lastnost za vezavo na mpl, člana citokinske receptorske superdružine, in ima biološko lastnost ML, definirano spodaj. Zgledna biološka lastnost je sposobnost, da stimulira vgraditev označenih nukleotidov (npr. ³H-timidin) v DNA od IL-3 odvisnih celic Ba/F3, transfektiranih s humanim mpl P. Druga zgledna biološka lastnost je sposobnost, da stimulira vgraditev ³⁵S v krožeče trombocite pri testu oživitve mišjih trombocitov. Ta definicija obsega polipeptid, izoliran iz vira mpl Uganda, kot npr. aplastične prašičje plazme, opisane tukaj, aU iz drugega vira, kot npr. druge živalske vrste, vključno ljudi, aU pripravljen z rekombinantnimi ali sintetičnimi postopki, vključuje pa tudi variantne obhke, vključno njihove funkcionalne derivate, fragmente, alele, izo-oblike in analoge.

Fragment mpl Uganda ali fragment TPO je del sekvence naravnega zrelega mpl liganda ali TPO s popolno dolžino z delecijo enega ali več aminokislinskih ostankov ali enot ogljikohidratov. Do delecije aminokislinskih ostankov lahko pride kjerkoli v peptidu, vključno na bodisi N-terminalnem ali C-terminalnem koncu ali interno. Fragment ima vsaj eno biološko lastnost skupno z mpl ligandom. Fragment mpl liganda ima značilno zaporedno sekvenco vsaj 10,15,20,25,30 ali 40 aminokislinskih ostankov, ki so identični tistim v sekvenci mpl liganda, izoliranega iz sesalca, vključno liganda, izoliranega iz aplastične prašičje plazme ali humanega ali murinega liganda, posebno iz njegove EPO-domene. Reprezentativna primera N-terminalnih fragmentov sta hML₁₅₃ ali TP0(Met⁴ 1-153).

Variante mpl liganda ali sekvenčne variante mpl liganda, kot je definirano tukaj, pomenijo biološko aktiven mpl ligand, kot je definiran spodaj, ki ima manj kot 100 % sekvenčno identičnost z mpl ligandom, izoliranim iz rekombinantne celične kulture ali aplastične prašičje plazme ali humanim ligandom z deducirano sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ED NO: 1). Navadno ima varianta biološko aktivnega mpl liganda aminokislinsko sekvenco z vsaj približno 70 % aminokislinsko sekvenčno identičnostjo z mpl ligandom, izoliranim iz aplastične prašičje plazme ali zrelim murinom ali humanim ligandom ali njegovimi fragmenti (sl. 1 [SEQ ID NO: 1]), prednostno vsaj približno 75 %, bolj prednostno vsaj približno 80 %, še bolj prednostno vsaj približno 85 %, še celo bolj prednostno vsaj 90 % in najbolj prednostno vsaj približno 95 %.

Kimemi mpl ligand je polipeptid, ki obsega mpl ligand s popolno dolžino ali enega ali več njegovih fragmentov, ki so pripojeni ali vezani na drug heterologen polipeptid ali enega ali več njegovih fragmentov. Kimera ima vsaj eno biološko lastnost, skupno z mpl ligandom. Drugi polipeptid je značilno citokin, imunoglobulin ali njegov fragment.

Izolirani mpl ligand, visoko očiščeni mpl ligand in v bistvu homogeni mpl ligand uporabljamo izmenljivo in pomeni mpl ligand, ki je očiščen iz vira mpl liganda ali je pripravljen z rekombinantnimi ali sintetičnimi postopki in je zadosti očiščen drugih peptidov ali proteinov, da (1) dobimo vsaj 15 in prednostno 20 aminokislinskih ostankov N-terminalne ali interne aminokislinske sekvence z uporabo sekvenatoija z vrtečo čašo ali najboljšega komercialno dosegljivega aminokislinskega sekvenatoija ali takega, ki je modificiran po objavljenih postopkih, npr. od datuma vložitve te prijave, ali (2) do homogenosti z SDS-PAGE pri nereduktivnih ali reduktivnih pogojih z uporabo barvila Coomassie blue ali prednostno srebrne barve.

Homogenost tukaj pomeni manj kot približno 5 % kontaminacijo z drugimi proteinskimi viri.

Biološka lastnost, kadar jo uporabimo v zvezi z mpl ligandom ali izoliranim mpl ligandom, pomeni, da ima le-ta trombopoetično aktivnost ali efektorsko ali antigensko funkcijo ali aktivnost in vivo, ki je direktno ali indirektno povzročena ali izvedena z mpl ligandom (ali v njegovi naravni ali denaturirani konformaciji) ali njegovim fragmentom. Efektorske funkcije vključujejo vezavno aktivnost mpl in vse vezavne aktivnosti nosilca, agonizem ali antagonizem mpl, posebno transdukcijo proliferativnega signala, vključno replikacijo, regulatorno funkcijo DNA, modulacijo biološke ativnosti drugih citokinov, receptorsko (posebno citokinsko) aktivacijo, deaktivacijo, regulacijo navzgor ali navzdol, celično rast ali diferenciacijo ipd. Antigenska funkcija pomeni, da ima epitopsko ali antigensko mesto, ki je sposobno navzkrižne reakcije s protitelesi, vzgojenimi proti naravnemu mpl ligandu. Glavna antigenska funkcija mpl Ugandskega polipeptida je ta, da se veže z afiniteto vsaj 10⁶ 1/mol na protitelo, vzgojeno proti mpl ligandu, izoliranem iz aplastične prašičje plazme. Navadno se polipeptid veže z afiniteto vsaj 10⁷1/mol. Najbolj prednostno je antigensko aktiven mpl Ugandski polipeptid takšen, ki se veže na protitelo, vzgojeno proti mpl Ugandu, ki ima eno od zgoraj opisanih efektorskih funkcij. Protitelesa, uporabljena za to, da definirajo biološko aktivnost, so zajčja poliklonska protitelesa, ki jih vzgojimo s formuliranjem mpl Uganda, izoliranega iz rekombinantne ceUčne kulture ali aplastične prašičje plazme v Freundovem kompletnem adjuvansu, subkutanim injiciranjem formulacije, in poživitvijo imunskega odziva z intraperitonealno injekcijo formulacije do titra protitelesnega platoja mpl Uganda.

Izraz biološko aktiven, kadar ga uporabljamo v zvezi z mpl Ugandom aU izoliranim mpl Ugandom, pomeni mpl Ugand ali poUpeptid, ki ima trombopoetično aktivnost aU prispeva efektorsko funkcijo mpl Uganda, izoliranega iz aplastične prašičje plazme aU eksprimiranega v rekombinantni ceUčni kulturi, opisani tukaj. Glavna, tukaj znana efektorska funkcija mpl Uganda aU poUpeptida je vezanje na mpl in stimuliranje vgrajevanja označenih nukleotidov (³H-timidin) v DNA od IL-3 odvisnih cehe Ba/F3, transfektiranih s humanim mpl P. Druga, tukaj znana efektorska funkcija mpl Uganda ali poUpeptida je sposobnost, da stimulira vgraditev ³⁵S v krožeče trombocite pri izvajanju testa oživitve mišjih trombocitov. Še nadaljnja znana efektorska funkcija mpl liganda je sposobnost, da stimulira humano megakariocitopoezo in vitro, ki jo lahko kvantitativno določimo z uporabo radioaktivno označenega monoklonskega protitelesa, specifičnega za megakariocitni glikoprotein GPII_bIII_a.

Odstotek aminokislinske sekvenčne identičnosti glede na sekvenco mpl liganda je tukaj definiran kot odstotek aminokislinskih ostankov v kandidatni sekvenci, ki so identični ostankom v sekvenci mpl liganda, izoliranega iz aplastične prašičje plazme, ali murinega ali humanega liganda, ki ima deducirano aminokislinsko sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ED NO: 1), po uvrstitvi sekvenc in uvedbi praznin, če je potrebno, da dosežemo maksimalni odstotek sekvenčne identičnosti, ne da bi pri tem upoštevali katerokoli konzervativno substitucijo kot del sekvenčne identičnosti. Nobena od N-terminalnih, C-terminalnih ali internih ekstenzij, delecij ali insercij v sekvenci mpl liganda ni konstruirana tako, da bi vplivala na sekvenčno identičnost ali homologijo. Zgledni biološko aktivni mpl Ugandski polipeptidi, za katere je mišljeno, da imajo identične sekvence, vključujejo: prepro-mp/ Ugand, ρτο-mpl Ugand in zreU mpl Ugand.

Mikrosekvenciranje mpl Uganda lahko izvedemo s katerimkoU standardnim primernim postopkom, ki zagotavlja njegovo zadostno občutljivost. V enem takem postopku visoko očiščeni polipeptid, ki ga dobimo iz gelov SDS ali iz končne stopnje HPLC, sekvenciramo direktno z avtomatizirano Edmanovo (fenil izocianat) razgradnjo z uporabo sekvenatorja s plinsko fazo AppUed Biosystems model 470A, opremljenega s feniltiohidantionskim (ΡΊΉ) aminokislinskim analizatorjem 120A. Poleg tega lahko fragmente mpl Uganda, pripravljene s kemijsko (npr. CNBr, hidroksilamin, 2-nitro-5-tiocianobenzoat) ali encimatsko (npr. tripsin, klostripain, stafilokokna proteaza) digestijo in nato očiščene (npr. HPLC), podobno sekvenciramo. PTH amino kisline analiziramo z uporabo podatkovnega sistema ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Sekvenčno interpertacijo izvedemo na računalniku VAX 11/785 Digital Equipment Co., kot opisujejo Henzel et al., J. Chromatography, 404:41-52 [1987]. V danem primeru lahko alikvote frakcij HPLC izpostavimo elektroforezi na SDS-PAGE (5-20 %), elektrotransferiramo na membrano PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) in obarvamo z barvilom Coomassie BrilUant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]. Specifični protein identificiramo po barvi, izrežemo iz popivka in N-terminalno sekvenciranje izvedemo s sekvenatorjem s plinsko fazo, opisanim zgoraj. Za interne proteinske sekvence frakcije HPLC posušimo v vakuumu (SpeedVac), resuspendiramo v ustreznih pufrih in izvedemo digestijo s cianogen bromidom, Lysspecifičnim encimom Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) ali Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Po digestiji nastale peptide sekvenciramo kot zmes, ali po ločitvi s HPLC na koloni C4 razvijemo s propanolnim gradientom v TFA (0,1 %) pred sekvenciranjem v plinski fazi.

Trombocitopenija je definirana kot število ploščic pod 150 χ IO⁹/! krvi.

Trombopoetična aktivnost je definirana kot biološka aktivnost, ki je sestavljena iz pospeševanja proliferacije, diferenciacije in/ali zorenja megakariocitov ali megakariocitnih predhodnikov v trombocite tvorečo obliko teh celic. To aktivnost lahko izmerimo z različnimi testi, ki vključujejo test oživitve sinteze mišjih trombocitov in vivo, test indukcije celičnega površinskega antigena trombocitov, kot ga izmerimo z antitrombocitnim imunotestom (anti-GPII_bIII_a) za humano levkemično megakarioblastno celično linijo (CMK) in indukcijo poliploidizacije v megakarioblastni celični liniji (DAMI).

'Trombopoetin (TPO) je definiran kot spojina s trombopoetično aktivnostjo ali takšna, ki je sposobna, da zveča število serumskih trombocitov v sesalcu. TPO je prednostno sposoben, da zveča število endogenih trombocitov za vsaj 10 %, bolj prednostno 50 % in najbolj prednostno, da zveča število trombocitov v človeku na več kot 150 x 10^/1 krvi.

Izolirana nukleinska kislina mpl liganda je RNA ali DNA, ki vsebuje več kot 16 in prednostno 20 ali več zaporednih nukleotidnih baz, ki kodirajo biološko aktiven mpl ligand ali njegov fragment, je komplementarna RNA ali DNA, ali se hibridizira z RNA ali DNA in ostane stabilno vezana pri zmernih do ostrih pogojih. Ta RNA ali DNA je vsaj brez enega kontaminimega vira nukleinske kisline, s katerim je navadno skupaj v naravnem viru, in je prednostno v bistvu brez vsake druge RNA ali DNA sesalca. Fraza vsaj brez enega kontaminimega vira nukleinske kisline, s katerim je normalno skupaj, vključuje primer, kjer je nukleinska kislina prisotna v viru ali naravni celici, vendar je v različni kromosomski lokaciji ali je drugače bočno vezana na sekvence nukleinske kisline, ki se navadno ne nahaja v celičnem viru. Primer izolirane nukleinske kisline mpl liganda je RNA ali DNA, ki kodira biološko aktiven mpl ligand, ki ima vsaj 75 % sekvenčno identičnost, bolj prednostno vsaj 80 %, še bolj prednostno vsaj 85 %, še celo bolj prednostno 90 % in najbolj prednostno 95 % sekvenčno identičnost s humanim, murinim ali prašičjim mpl ligandom.

Kontrolne sekvence, kadar se sklicujemo na ekspresijo, pomenijo sekvence DNA, potrebne za ekspresijo funkcionalno vezane kodirne sekvence v posebnem gos33 titeljskem organizmu. Kontrolne sekvence, ki so prikladne za prokariote vključujejo npr. promotor, v danem primeru operatersko sekvenco, ribosomsko vezišče, lahko pa tudi druge, še slabo razumljive sekvence. Evkariotske celice so znane, da uporabljajo promotorje, poliadenilacijske signale in spodbujevalce.

Funkcionalno vezan, kadar se sklicujemo na nukleinske kisline, pomeni, da so nukleinske kisline nameščene v funkcionalni zvezi z drugo sekvenco nukleinske kisline. Npr. DNA je za presekvenco ali sekretomega voditelja funkcionalno vezana na DNA za polipeptid, če je ta eksprimiran kot preprotein, ki sodeluje pri sekreciji polipeptida; promotor ali spodbujevalec je funkcionalno vezan na kodirno sekvenco, če ta vpliva na transkripcijo sekvence; ali ribosomsko vezišče je funkcionalno vezano na kodirno sekvenco, če je ta v taki legi, da omogoča translacijo. Na splošno funkcionalno vezan pomeni, da so sekvence DNA, ki so vezane, sosednje, v primeru sekretomega voditelja sosednje in v fazi branja. Vendar pa za spodbujevalce ni potrebno, da so sosednji. Vezavo izvedemo z ligacijo ugodnih restrikcijskih mest. Če taka mesta ne obstajajo, uporabimo sintetične oligonukleotidne adapteije ali linkeije v skladu z običajno prakso.

Eksogen, kadar se nanaša na element, pomeni sekvenco nukleinske kisline, ki je tuja za celico ali homologna zanjo, vendar v položaju v nukleinski kislini gostiteljske celice, v kateri se element navadno ne nahaja.

Celica, celična linija in celična kultura uporabljamo izmenljivo in te oznake vključujejo vse potomce celice ali celične linije. Tako npr. izrazi, kot so transformanti ali transformirane celice, vključujejo primarno subjektno celico in iz nje izvedene kulture ne glede na število prenosov. Razumljivo je, da ni potrebno, da so vsi potomci natančno identični po vsebnosti DNA zaradi namernih ali nenamernih mutacij. Vključeni so tudi mutantni potomci, ki imajo enako funkcijo ali biološko aktivnost, kot je selekcionirana za originalno transformirano celico. Kjer so predvidene razlikovalne oznake, je to razvidno iz teksta.

Plazmidi so avtonomno replikativne krožeče molekule DNA, ki imajo neodvisne izvore replikacije in so označeni tukaj z malo črko p, ki je pred velikimi črkami in/ali številkami in/ali ji le-te sledijo. Izhodni plazmidi so vsi komercialno in javno dosegljivi brez omejitev ali jih lahko konstruiramo iz takih, dosegljivih plazmidov v skladu z objavljenimi postopki. Poleg tega so v tehniki znani tudi drugi ekvivalentni plazmidi, ki so znani strokovnjakom.

Restrikcijska encimska digestija, kadar je v zvezi z DNA, pomeni katalitično cepitev internih fosfodiesterskih vezi DNA z encimom, ki deluje le na določenih lokacijah ali mestih v sekvenci DNA Taki encimi se imenujejo restrikcijske endonukleaze. Vsaka restrikcijska endonukleaza spozna specifično sekvenco DNA, imenovano restrikcijsko mesto, ki ima dvojno simetrijo. Različni restrikcijski encimi, ki jih uporabljamo tukaj, so komercialno dosegljivi, pri tem pa upoštevamo njihove reakcijske pogoje, kofaktoije in druge zahteve, določene od dobavitelja. Restrikcijski encimi so navadno označeni z okrajšavami, sestavljenimi iz velike črke, kiji nato sledijo druge črke, ki pomenijo mikroorganizem, iz katerega je vsak restrikcijski encim originalno dobljen, in nato številka, ki označuje poseben encim. Na splošno uporabimo približno 1 μ-g plazmida ali fragmenta DNA s približno 1-2 enotama encima v približno 20 gl raztopine pufra. Ustrezne količine pufrov in substratov za posebne restrikcijske encime določi izdelovalec. Navadno uporabimo inkubacijo približno 1 uro pri 37 °C, vendar pa se lahko spreminja v skladu z navodili dobavitelja. Po inkubaciji protein ali polipeptid odstranimo z ekstrakcijo s fenolom in kloroformom, digerirano nukleinsko kislino pa rekuperiramo iz vodne frakcije z obaijanjem z etanolom. Digestiji z restrikcijskim encimom lahko sledi hidroliza terminalnih 5’ fosfatov z bakterijsko alkalno fosfatazo, da preprečimo, da bi dva restrikcijsko cepljena konca fragmenta DNA cirkularizirala oz. tvorila zaprto zanko, ki bi preprečila insercijo drugega fragmenta DNA na restrikcijskem mestu. Če ni drugače navedeno, digestiji plazmidov ne sledi 5’ terminalna defosforilacija. Postopki in reagenti za defosforilacijo so konvencionalni in so opisani v odstavkih 1.56-1.61 avtorja Sambrooka et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

Rekuperacija ali izolacija nekega fragmenta DNA iz restrikcijskega digesta pomeni ločitev digesta na poliakrilamidnem ali agaroznem gelu z elektroforezo, identifikacijo fragmenta, ki nas zanima, s primerjanjem njegove mobilnosti s tisto od markiranih fragmentov DNA z znano molekulsko maso, odstranitev dela gela, ki vsebuje želen fragment in ločitev gela od DNA Ta postopek je splošno znan. Npr.: Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981], in Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980].

Southern analiza ali Southern blotting je postopek, s katerim potrdimo prisotnost sekvenc DNA v restrikcijskem endonukleaznem digestu DNA ali DNA-vsebujočem sestavku s hibridizacijo z znanim, označenim oligonukleotidom ali fragmentom DNA.

Southern analiza značilno vključuje elektroforetsko ločitev digestov DNA na agaroznih gelih, denaturacijo DNA po elektroforetski ločitvi in prenos DNA na nitrocelulozo, najlon ali drugi primerni membranski nosilec za analizo z radioaktivno označeno, biotinilirano ali encimsko označeno sondo, kot je opisano v odstavkih 9.37-9.52, avtorja Sambrooka et al., zgoraj.

Northern analiza ali Northern blotting je postopek, ki ga uporabimo za identificiranje sekvenc RNA, ki se hibridizirajo z znano sondo, kot je oligonukleotid, fragment DNA, cDNA ali njen fragment ali fragment RNA. Sondo označimo z radioaktivnim izotopom, kot je ³²P, ali z biotinilacijo ali z encimom. RNA, ki jo je treba analizirati, navadno ločimo elektroforetično na agarozi ali poliakrilamidnem gelu, prenesemo na nitrocelulozo, najlon ali drugo prikladno membrano in hibridiziramo s sondo s standardnimi tehnikami, dobro znanimi strokovnjakom, kot so npr. tiste, opisane v poglavjih 7.39-7.52, avtorja Sambrooka et al., zgoraj.

Ugacija je postopek tvorbe fosfodiestrskih vezi med dvema fragmentoma nukleinske kisline. Za ligacijo obeh fragmentov morata biti konca fragmentov kompatibilna, eden z drugim. V nekaterih primerih so konci direktno kompatibilni po endonukleazni digestiji. Vendar pa je lahko potrebno, da najprej konce, ki so nekompatibilno razporejeni in navadno nastanejo po endonukleazni digestiji, pretvorimo v odrezane (tope) konce, da jih naredimo kompatibilne za ligacijo. Zato, da odrežemo konce, DNA obdelujemo v prikladnem pufru vsaj 15 minut pri 15 °C s približno 10 enotami Klenowega fragmenta DNA polimeraze I ali T4 DNA polimeraze v prisotnosti štirih deoksiribonukleotidnih trifosfatov. DNA nato očistimo s fenolkloroformsko ekstrakcijo in etanolnim obarjanjem. Fragmente DNA, ki jih je potrebno ligirati skupaj, damo v raztopino v približno ekvimolamih količinah. Raztopina vsebuje tudi ATP, ligazni pufer in ligazo, kot npr. T4 DNA ligazo, v količini približno 10 enot na 0,5 μ-g DNA. Če je DNA potrebno ligirati v vektor le-tega, najprej lineariziramo z digestijo z ustreznimi restrikcijskimi endonukleazami. Lineariziran fragment nato obdelamo z bakterijsko alkalno fosfatazo ali telečjo intestinalno fosfatazo, da preprečimo samoligacijo med stopnjo ligiranja.

Priprava DNA iz celic pomeni izoliranje plazmidne DNA iz kulture gostiteljskih celic. Navadno uporabljeni postopki za pripravo DNA so priprave plazmidov v velikem in majhnem obsegu, opisane v odstavkih 1.25-1.33, Sambrook et al., zgoraj. Po pripravi DNA le-to očistimo s postopki, dobro znanimi v tehniki, kot je opisano v odstavku 1.40, Sambrook et al., zgoraj.

Oligonukleotidi so kratki, enojno- ali dvojno-vijačni polideoksinukleotidi, ki jih kemijsko sintetiziramo z znanimi postopki (kot je kemija fosfotriestrov, fosfitov ali fosforamiditov, z uporabo tehnik v trdni fazi, kot je opisano v EP 266,032, obj. 4. maja 1988, ali preko deoksinukleozidnih H-fosfonatnih intermediatov, kot jih opisujejo Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407 [1986]). Nadaljnji postopki vključujejo verižne polimerazne reakcije, definirane spodaj, in druge avtoprimerske metode in oligonukleotidne sinteze na trdnih nosilcih. Vse te postopke opisujejo Engels et al., Agnew. Chem. Int. ED. Engl. 28:716-734 (1989). Te postopke uporabimo, če je celotna sekvenca nukleinske kisline gena znana ali je sekvenca nukleinske kisline, ki je komplementarna s kodirno verigo, na voljo. Alternativno, če je ciljna aminokislinska sekvenca znana, lahko izvedemo potencialne sekvence nukleinske kisline z uporabo znanih in prednostnih kodirnih ostankov za vsak aminokislinski ostanek. Oligonukleotide nato očistimo na poliakrilamidnem gelu.

Verižna polimerazna reakcija ali PCR je postopek ali tehnika, pri kateri se zelo majhne količine specifičnega kosa nukleinske kisline, RNA in/ali DNA pomnožijo, kot je opisano v US patentu št. 4683195, izd. 28. julija 1987. Na splošno pa morajo biti na voljo sekvenčne informacije za konce regije, ki nas zanima, ali več kot le-to, tako da lahko oblikujemo oligonukleotidne primerje; ti primerji so identični ali podobni v sekvenci nasprotnim vijačnicam kalupa, ki ga je potrebno pomnožiti. 5’ terminalni nukleotidi obeh primeijev lahko sovpadajo s konci pomnožene snovi. PCR lahko uporabimo za pomnoževanje specifičnih sekvenc RNA, specifičnih sekvenc DNA iz celotne genomske DNA, in cDNA, transkribirane iz celotne celične RNA, bakteriofagne ali plazmidne sekvence itd. Na splošno to opisujejo Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987]; Erlich, izd. PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). Za PCR, kot uporabljamo tukaj, smatramo, da je eden vendar ne edini zgled postopka reakcije polimerazne nukleinske kisline za pomnoževanje nukleinske kisline testnega vzorca, pri čemer uporabimo znano nukleinsko kislino kot primer in polimerazno nukleinsko kislino, da pomnožimo ali naredimo specifičen kos nukleinske kisline.

Ostri pogoji so tisti (1), pri katerih uporabimo nizko ionsko jakost in visoko temperaturo za izpiranje, npr. NaCl (0,0015 M)/natrijev citrat (0,0015 M)/NaDodSO₄ (SDS) (0,1 %) pri 50 °C ali (2), pri katerih uporabimo med hibridizacijo denaturimo sredstvo, kot npr. formamid, npr. formamid 50 % (vol./vol.) z govejim serumskim albuminom (0,1 %)/Ficollom (0,1 %)/polivinilpirolidonom (0,1 %)/natrijim fosfatnim pufrom (50 mM) pri pH 6,5 z NaCl (750 mM) in natrijevim citratom (75 mM) pri 42 °C. Drugi zgled je uporaba formamida (50 %), 5-krat SSC [NaCl (0,75 M), natrijev citrat (0,075 M)], natrijev fosfat (50 mM, pH 6,8), natrijev pirofosfat (0,1 %), 5 x Denhardtova raztopina, sonificirana DNA lososove sperme (50/ig/ml), SDS (0,1 %) in dekstran sulfat (10 %) pri 42 °C z izpiranji pri 42 °C v 0,2 x SSC in SDS (0,1 %).

Zmerno ostri pogoji so opisani pri Sambrooku et al., zgoraj, in vključujejo uporabo izpiralne raztopine in hibridizacijske pogoje (npr. temperaturo, ionsko jakost in % SDS), manj ostre, kot so opisani zgoraj. Zgled zmerno ostrih pogojev je npr. inkubacija pri 37 °C preko noči v raztopini, ki vsebuje: formamid (20 %), 5 x SSC [NaCl (150 mM), trinatrijev citrat (15 mM)], natrijev fosfat (50 mM, pH 7,6), 5x Denhardtovo raztopino, dekstransulfat (10 %) in 20 μΐ/ml denaturirane strižno obdelane DNA lososove sperme, in nato izpiranje filtrov v 1 x SSC pri približno 37-50 °C. Strokovnjakom je jasno, kako naravnati temperaturo, ionsko jakost itd., kot je potrebno za prilagoditev faktorjev, kot je dolžina sonde ipd.

Protitelesa (Ab) in imunoglobulini (Ig) so glikoproteini z enakimi strukturnimi značilnostmi. Medtem ko imajo protitelesa vezavno specifičnost za specifični antigen, imunoglobulini vključujejo tako protitelesa kot tudi druge protitelesom podobne molekule, ki nimajo antigenske specifičnosti. Polipeptide slednje vrste izdelujejo v nizkih nivojih limfni sistemi, v zvečanih pa mielomi.

Naravna protitelesa in imunoglobulini so navadno heterotetramemi glikoproteini s približno 150000 daltoni, sestavljeni iz dveh identičnih lahkih (L) verig in dveh identičnih težkih (H) verig. Vsaka lahka veriga je vezana na težko z eno kovalentno disulfidno vezjo, medtem ko število disulfidnih povezav variira med težkimi verigami različnih imunoglobulinskih izo-tipov. Vsaka težka in lahka veriga ima tudi regularno razmaknjene medverižne disulfidne mostičke. Vsaka težka veriga ima na enem koncu variabilno domeno (V_H), ki ji sledijo številne konstantne domene. Vsaka lahka veriga ima variabilno domeno na enem koncu ter (VJ in konstantno domeno na njenem drugem koncu; konstantna domena lahke verige se ujema s prvo konstantno domeno težke verige in variabilna domena lahke verige se ujema z variabilno domeno težke verige. Posebni aminokislinski ostanki verjetno tvorijo vmesno površino med variabilnimi domenami lahkih in težkih verig (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651 - 663 [1985]; Novotny in Haber, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 82:4592-4596 [1985]).

Izraz variabilen je v zvezi z dejstvom, da se nekateri deli variabilne domene znatno razlikujejo v sekvenci med protitelesi in se uporabljajo pri vezavi in specifičnosti vsakega posebnega protitelesa za njegov poseben antigen. Vendar pa variabilnost ni enakomerno porazdeljena v variabilnih domenah protiteles. Koncentrirana je v treh segmentih, imenovanih komplementarnost določujoče regije (CDR) ali hipervariabilne regije tako v variabilnih domenah lahke verige kot tudi težke. Bolj visoko konzervirani deli variabilnih domen so imenovani ogrodja (FR). Vsaka variabilna domena naravnih težkih in lahkih verig obsega štiri regije FR z močno privzeto /3-ravninsko konfiguracijo, povezane s tremi CDR, ki tvorijo povezavo zank in v nekaterih primerih del /3-ravninske strukture. CDR se v vsaki verigi držijo skupaj v neposredni bližini regij FR, in s CDR iz druge verige prispevajo k tvorbi antigenskih vezišč protiteles (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interesi, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Konstantne domene niso direktno vključene pri vezavi protitelesa na antigen, vendar pa imajo razne efektorske funkcije, kot npr. sodelovanje protitelesa pri celični toksičnosti, odvisni od protitelesa.

S papainsko digestijo protiteles nastaneta dva identična fragmenta za vezavo antigena, imenovana fragmenta Fab, vsak z enojnim veziščem za antigen in residualnim fragmentom Fc, katerega ime izraža njegovo sposobnost, da z lahkoto kristalizira. Z obdelavo s pepsinom dobimo fragment F(ab’)₂, ki ima dve vezišči za antigen in je še vedno sposoben premreženja antigena.

Fv je najmanjši fragment protitelesa, ki vsebuje kompletno antigensko spoznanje in vezišče. Ta regija je sestavljena iz dimera z eno težko in eno lahko verigo variabilne domene v tesni nekovalentni asociaciji. V tej konfiguraciji pride do interakcije treh CDR vsake variabilne domene, da definirajo vezišče za antigen na površini dimera V_H-V_L. Kolektivno šest CDR da specifičnost za vezavo antigena na protitelo. Vendar pa ima posamezna variabilna domena (ali polovica Fv, ki obsega samo tri CDR, specifične za antigen) sposobnost, da spozna in veže antigen, čeprav pri nižji afiniteti kot celotno vezišče.

Fragment Fab prav tako vsebuje konstantno domeno lahke verige in prvo konstantno domeno (CH1) težke verige. Fragmenti Fab’ se razlikujejo od fragmentov Fab po dodatnih nekaj ostankih na karboksi terminalu težke verige CH1 domene, ki vključujejo enega ali več cisteinov iz gibljive regije protitelesa. Fab’-SH je tukaj oznaka za Fab’ v katerem cisteinski ostanki konstantne domene nosijo prosto tiolno skupino. Protitelesni fragmenti F(ab’)₂ nastanejo originalno kot pari fragmentov Fab’, ki imajo gibljive cisterne med seboj. Znane so tudi druge kemijske pripojitve protitelesnih fragmentov.

Lahke verige protiteles (imunoglobulinov) iz katerekoli vrste vretenčarjev lahko dodelimo enemu od dveh, jasno različnih tipov, imenovanih kapa in lambda (λ), na osnovi aminokislinskih sekvenc njihovih konstantnih domen.

Imunoglobuline lahko, odvisno od aminokislinske sekvence konstantne domene njihovih težkih verig, razdelimo v različne razrede. Obstaja pet glavnih razredov imunoglobulinov: IgA, IgD, IgE, IgG in IgM in nekatere od teh lahko dalje razdelimo v podrazrede (izotipi), npr. IgG-1, IgG-2, IgG-3 in IgG-4; IgA-1 in IgA-2. Konstantne domene težke verige, ki ustrezajo različnim razredom imunoglobinov, so imenovane a, delta, epsilon, 7 oz. μ.. Strukture podenot in tridimenzionalnih konfiguracij različnih razredov imunoglobinov so dobro znane.

Izraz protitelo uporabljamo v najširšem smislu in specifično pokriva posamezna monoklonska protitelesa (vključno agonistična in antagonistična protitelesa), protitelesne sestavke s poliepitopično specifičnostjo, kot tudi fragmente protiteles (npr. Fab, F(ab’)₂ in Fv), toliko časa, dokler imajo želeno biološko aktivnost.

Izraz monoklonsko protitelo, kot ga uporabljamo tukaj, je v zvezi s protitelesom, ki ga dobimo iz populacije v bistvu homogenih protiteles, t.j. individualna protitelesa, ki obsegajo populacijo, so identična, razen za možne naravne mutacije, ki so lahko prisotne v manjših količinah. Monoklonska protitelesa so visoko specifična, pri čemer so usmerjena proti posameznemu antigenskemu mestu. Poleg tega je v nasprotju z običajnimi (poliklonskimi) pripravki protiteles, ki značilno vključujejo različna protitelesa, usmerjena proti različnim determinantam (epitopi), vsako monoklonsko protitelo usmerjeno proti posamezni determinanti na antigenu. Poleg svoje specifičnosti pa so monoklonska protitelesa prednostna v tem, da jih sintetizira hibridomska kultura, nekontaminirana z drugimi imunoglobulini. Modificiran monoklonski pomeni značaj protitelesa, ki je dobljen iz v bistvu homogene populacije protiteles in ni konstruiran za potrebno tvorbo protitelesa po nekem posebnem postopku. Npr. monoklonska protitelesa za uporabo v skladu s predloženim izumom lahko naredimo s hibridomskim postopkom, ki so ga prvi opisali Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975), ali ga lahko naredimo po postopku rekombinantne DNA (npr. US patent št. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

Monoklonska protitelesa tukaj specifično vključujejo kimerna protitelesa (imunoglobuline), v katerih je del težke in/ali lahke verige identičen z ustreznimi sekvencami, ali homologen za te sekvence, v protitelesih, izvedenih iz posebne vrste ali pripadajočih k posebnemu razredu ali podrazredu protiteles, medtem ko je ostanek verige (verig) identičen ali homologen za ustrezne sekvence v protitelesih, izvedenih iz drugih vrst ali pripadajočih drugemu razredu ali podrazredu protiteles, kot tudi fragmente takih protiteles, toliko Časa, dokler imajo želeno biološko aktivnost (US patent št. 4,816,567 (Cabilly et al.); in Morrison et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 81:6851-6855 [1984]).

Humanizirane oblike ne-humanih (npr. murinih) protiteles so kirnemi imunoglobulini, imunoglobulinske verige ali njihovi fragmenti (kot npr. Fv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ ali druge antigen-vezavne podsekvence protiteles), ki vsebujejo minimalno sekvenco, izvedeno iz nehumanega imunoglobulina. Večinoma so humanizirana protitelesa humani imunoglobulini (recipientno protitelo), v katerih so ostanki iz recipientne CDR nadomeščeni z ostanki CDR iz nehumanih vrst (donorsko protitelo), kot npr. miši, podgane ali zajca, ki imajo želeno specifičnost, afiniteto in kapaciteto. V nekaterih primerih so Fv ogrodni ostanki humanega imunoglobulina nadomeščeni z ustreznimi nehumanimi ostanki. Nadalje lahko humanizirano protitelo obsega ostanke, ki niso niti v protitelesnih recipientnih niti v uvoženih CDR ali ogrodnih sekvencah. Te modifikacije naredimo zato, da nadalje očistimo in optimiziramo izvedbo protitelesa. Na splošno, humanizirano protitelo obsega v bistvu v celoti vsaj eno in značilno dve variabilni domeni, v katerih vse ali v bistvu vse regije CDR ustrezajo nehumanim imunoglobulinskim in so vse ali v bistvu vse regije FR od humane imunoglobulinske konsenzne sekvence. Humanizirano protitelo optimalno obsega tudi vsaj del imunoglobulinske konstantne regije (Fc), značilno humane imunoglobulinske. Za nadaljnje podrobnosti glej: Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988]; in Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 [1992]).

Ne-imunogenski v človeku pomeni, da po kontaktiranju polipeptida v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu in v terapevtsko učinkoviti količini z ustreznim humanim tkivom, ni možno opaziti stanja občutljivosti ali rezistence na polipeptid po drugem dajanju polipeptida po ustrezni latentni periodi (npr. 8-14 dni).

II. Prednostne izvedbe izuma

Prednostni polipeptidi v smislu predloženega izuma so v bistvu homogeni polipeptidi, imenovani mpl Ugandi ah trombopoetini (TPO), ki imajo to lastnost, da se vežejo na mpl, člana receptorske citokinske superdružine in imajo biološko lastnost, da stimulirajo vgraditev označenih nukleotidov (³H-timidin) v DNA od IL-3 odvisnih ceUc Ba/F3, transfektiranih s humanim mpl P. Bolj prednostni mpl Ugandi so izolirani iz proteinov sesalcev, ki imajo hematopoetično, posebno megakariocitopoetično aU trombocitopoetično aktivnost, in sicer so sposobni stimuliranja proUferacije, zorenja in/aU diferenciacije nezrelih megakariocitov aU njihovih predhodnikov v zrelo trombocite tvorečo obliko. Najbolj prednostni poUpeptidi v smislu izuma so humani mpl Ugandi, vključno njihovi fragmenti, ki imajo hematopoetično, megakariocitopoetično aU trombopoetično aktivnost. V danem primeru pri teh humanih mpl Ugandih ni gUkozilacije. Drugi prednostni mpl Ugandi so EPO-domena od hML, imenovana hML₁₅₃ aU hTPO₁₅₃, skrajšana oblika hML, imenovana hML^ aU hTPO^, in zreU poUpeptid s popolno dolžino, ki ima aminokislinsko sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ID NO: 1), imenovan hML, hML₃₃₂ aU hTPO₃₃₂, in biološko aktivna substitucijska varianta hML(R153A, R154A).

Fakultativno prednostni poUpeptidi v smislu izuma so biološko aU imunološko aktivne variante mpl Ugandov, izbrane izmed hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML in pML2.

Fakultativno prednostni poUpeptidi v smislu izuma so biološko aktivne variante mpl Uganda, ki imajo aminokisUnsko sekvenco, ki ima vsaj 70 % aminokislinsko sekvenčno identičnost s humanim mpl Ugandom (sl. 1 [SEQ ID NO: 1]), murinim mpl Ugandom (sl. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), rekombinantnim prašičjim mpl Ugandom (sl. 19 [SEQ ID NO: 18]) aU prašičjim mpl Ugandom, izoliranim iz aplastične prašičje plazme, prednostno vsaj 75 %, bolj prednostno vsaj 80 %, še bolj prednostno vsaj 85 %, celo bolj prednostno vsaj 90 % in najbolj prednostno vsaj 95 %.

Mpl ligand, izoliran iz aplastične prašičje plazme, ima naslednje značilnosti:

(1) delno očiščen Ugand se eluira iz kolone za gelsko filtracijo bodisi v

PBS, PBS, ki vsebuje SDS (0,1 %) aU PBS, ki vsebuje MgCl₂ (4M) z Mr 60000-70000;

(2) aktivnost Uganda uniči pronaza;

(3) Ugand je stabilen pri nizkem pH (2,5), SDS do 0,1 % in sečnini (2M);

(4) ligand je glikoprotein, osnovan na njegovi vezavi v različnih lektinskih kolonah;

(5) visoko očiščeni ligand se eluira iz nereducirane SDS-PAGE z Mr 2500035000. Manjše količine aktivnosti se tudi eluirajo z Mr od približno 18000 do 22000 in 60000;

(6) visoko očiščeni ligand se loči na reducirani SDS-PAGE kot dublet z Mr 28000 in 31000;

(7) aminoterminalna sekvenca prog z Mr 18000-22000, 28000 in 31000 je enaka -SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); in (8) ligand se veže in eluira iz afinitetnih kolon, kot so:

blue-sefaroza

CM blue-sefaroza

MONO-Q

MONO-S lektin(leča)-sefaroza

WGA-sefaroza

Con A(=konkanavalin A)-sefaroza eter 650 m Toyopearl butil 650 m Toyopearl fenil 650 m Toyopearl in fenil-sefaroza.

Bolj prednostni mpl Ugandski pohpeptidi so tisti, kijih kodira humana genomska ah cDNA, ki ima aminokislinsko sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ID NO: 1).

Drugi prednostni naravni biološko aktivni mpl Ugandski poUpeptidi v smislu izuma vključujejo prepro-mp/ Ugand, ρτο-mpl Ugand, zreU mpl Ugand, fragmente mpl Uganda in njihove gUkozilacijske variante.

Še drugi prednostni poUpeptidi v smislu izuma vključujejo variante sekvence mpl Uganda in kimere. Navadno so prednostne variante sekvence mpl Uganda in kimere biološko aktivne variante mpl Uganda, ki imajo aminokisUnsko sekvenco z vsaj 70 % aminokislinsko sekvenčno identičnostjo s humanim mpl ligandom ali mpl Ugandom, izoUranim iz aplastične prašičje plazme, prednostno vsaj 75 %, bolj prednostno vsaj 80 %, še bolj prednostno vsaj 85 %, še celo bolj prednostno vsaj 90 % in najboj prednostno vsaj 95 %. Zgledno prednostna varianta mpl Uganda je varianta N-terminalne domene hML (imenovana ΈΡΟ-domena zaradi njene sekvenčne homologije za eritropoetil). Prednostna ΕΡΟ-domena hML obsega približno prvih 153 aminokislinskihostankov zrelega hML in je označena hML₁₅₃. V danem primeru je prednostna varianta sekvence hML tista, v kateri je eden ali več bazičnih ali dibazičnih amino kislinskih ostankov v C-terminalni domeni substituiranih z ne-bazičnimi amino kislinskimi ostanki (npr. hidrofobni, nevtralni, kisli, aromatski, Gly, Pro ipd.). Prednostna varianta sekvence C-terminalne domene hML je tista, v kateri sta ostanka Arg 153 in 154 nadomeščena z ostanki Ala. Ta varianta je označena kot hML₃₃₂(R153A, R154A). Alternativno prednostna varianta hML obsega bodisi hML₃₃₂ ali hML₁₅₃, v katerem so amino ostanki 111-114 (QLPP ali LPPQ) deletirani ali nadomeščeni z drugačno tetrapeptidno sekvenco (npr. AGAG ipd.). Prej omenjeni delecijski mutanti so označeni kot A4hML₃₃₂ ali A4hML₁₅₃.

Prednostna kimera je fuzija med mpl ligandom ali njegovim fragmentom (definirano spodaj) in heterolognim polipeptidom ali njegovim fragmentom. Npr. hML₁₅₃ lahko spojimo s fragmentom IgG, da izboljšamo serumsko razpolovno dobo, ali z EL-3, G-CSF ali EPO, da nastane molekula s povečano trombopoetično ali kimemo hematopoetično aktivnostjo.

Alternativno prednostna kimera humanega mpl liganda je ML-EPO-domenska kimera, ki je sestavljena iz N-terminala 153 do 157 ostankov hML, substituiranih z enim ali več, toda ne vsemi, ostanki humanega EPO, približno uvrščenimi, kot je prikazano na sl. 10 (SEQ ED NO:7). V tej izvedbi naj bi imela kimera hML po dolžini približno 153-166 ostankov, kjer so individualni ostanki ali bloki le-teh iz sekvence humanega EPO dodani ali substituirani v sekvenci hML na položajih, ki ustrezajo uvrstitvi, prikazani na sl. 10 (SEQ ID NO: 6). Zgledni inserti sekvenčnih blokov v N-terminalnem delu hML naj bi vključevali eno ali več N-glikozilacijskih mest na položajih (EPO) 24-27, 38-40 in 83-85; enega ali več od Štirih napovedanih amfipatičnih α-vijačnih spletov na položajih (EPO) 9-22, 59-76, 90-107, 132-152; in druge visoko koncentrirane regije, ki vključujejo N-terminalne in C-terminalne regije in položaje ostankov (EPO) 44-52 (glej npr. Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] in Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Po pričakovanju naj bi ta ML-EPO domenska kimera imela mešano trombopoetično-eritropoetično (TEPO) biološko aktivnost.

Drugi prednostni polipeptidi v smislu izuma vključujejo fragmente mpl liganda z zaporedno sekvenco vsaj 10, 15, 20, 25, 30 ali 40 aminokislinskih ostankov, ki so identični v sekvencah mpl liganda, izoliranega iz aplastične prašičje plazme, ali humanega mpl liganda, opisanega tukaj (tabela 14, Primer 24). Prednostni fragment mpl liganda je humani ML[1-X], kjer je X 153,164,191, 205, 207, 217, 229 ali 245 (sl. 1 [SEQ ID NO: 1] za sekvenco ostankov l-Χ). Drugi prednostni fragmenti mpl liganda vključujejo tiste, ki nastanejo kot rezultat kemijske ali encimatske hidrolize ali digestije očiščenega liganda.

Nadaljnji prednostni vidik predloženega izuma je postopek za čiščenje molekul mpl liganda, ki obsega kontaktiranje vira mpl liganda, ki vsebuje molekule mpl liganda, z mobiliziranim receptorskim polipeptidom, posebno mpl ali mpl fuzijskim polipeptidom pri pogojih, kjer se molekule mpl liganda, ki jih je potrebno očistiti, selektivno adsorbirajo na imobilizirani receptorski polipeptid, izpiranje mobiliziranega nosilca, da odstranimo neadsorbirano snov, in eluiranje molekul, ki jih je potrebno očistiti, iz mobiliziranega receptorskega polipeptida z eluimim pufrom. Vir, ki vsebuje mpl ligand, je lahko plazma, kjer je mobiliziran receptor prednostno fuzija znpMgG.

Alternativno je vir, ki vsebuje mpl ligand, rekombinantna celična kultura, kjer je koncentracija mpl liganda bodisi v kulturnem mediju ali v celičnih lizatih na splošno višja kot v plazmi ali v drugih naravnih virih. V tem primeru zgoraj opisani imunoafinitetni postopek znpMgG, čeprav še vedno uporaben, navadno ni potreben in lahko uporabimo bolj tradicionalne postopke za čiščenje proteinov, znane v tehniki. Na kratko, prednostni postopek čiščenja, pri katerem dobimo v bistvu homogeni mpl ligand, obsega: odstranjevanje delcev debrisa, bodisi gostiteljskih celic ali liziranih fragmentov z npr. centrifugiranjem ali ultrafiltracijo; v danem primeru lahko protein koncentriramo s komercialno dosegljivim filtrom za koncentriranje proteinov; in nato ločevanje Uganda od drugih nečistot v eni ali več stopnjah, izbranih izmed: imunoafinitete, ionske izmenjave (npr. DEAE ali matrice, ki vsebujejo karboksimetilne ali sulfopropilne skupine), blue-sefaroze, CM blue-sefaroze, MONO-Q, MONO-S, lektin (leča)-sefaroze, WGA-sefaroze, Con A-sefaroze, eter Toyopearla, butil Toyopearla, fenil Toyopearla, protein A-sefaroze, SDS-PAGE, HPLC z reverzno fazo (npr. silikagel z dodanimi alifatskimi skupinami) ali molekularnih sit sefadeks ah velikostno izključitvene kromatografije in obaijanja z etanolom ali amonijevim sulfatom. Proteazni inhibitor, kot npr. metilsulfonilfluorid (PMSF), lahko vključimo v katerokoli od prej omenjenih stopenj za inhibiranje proteolize.

V drugi prednostni izvedbi predloženi izum zagotavlja izolirano protitelo, ki je sposobno vezave na mpl ligand. Prednostno izolirano protitelo mpl liganda je monok45

Ionsko (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., izd., Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; in Huse et al., Science, 246:12751281 [1989]). Prednostno izolirano protitelo mpl liganda je tisto, ki se veže na mpl ligand z afiniteto vsaj približno 10⁶1/mol. Bolj prednostno protitelo se veže z afiniteto vsaj približno 10⁷ 1/mol. Najbolj prednostno vzgojimo protitelo proti mpl ligandu, ki ima eno od zgoraj opisanih efektorskih funkcij. Izolirano protitelo, ki je sposobno vezave na mpl ligand, lahko v danem primeru spojimo z drugim polipeptidom, protitelo ali njegovo fuzijo pa lahko uporabimo, da izoliramo in očistimo mpl ligand iz vira, kot je opisano zgoraj za imobilizirani mpl polipeptid. V nadaljnjem prednostnem vidiku te izvedbe zagotavlja predloženi izum postopek za detektiranje mpl liganda in vitro ali in vivo, pri čemer obsega kontaktiranje protitelesa z vzorcem, posebno serumskim vzorcem, za katerega domnevamo, da vsebuje ligand, in detektiranje, če je prišlo do vezave.

V še nadaljnji prednostni izvedbi zagotavlja predloženi izum izolirano molekulo nukleinske kisline, ki kodira mpl ligand ali njegove fragmente, pri čemer je molekula nukleinske kisline lahko označena ali neoznačena z detektibilnim deležem in ima molekula nukleinske kisline sekvenco, ki je komplementarna ali se hibridizira pro ostrih ali zmerno ostrih pogojih z molekulo nukleinske kisline, ki ima sekvenco, ki kodira mpl ligand. Prednostna nukleinska kislina mpl liganda je RNA ali DNA, ki kodira biološko aktiven mpl ligand in ima vsaj 75 % sekvenčno identičnost, bolj prednostno vsaj 80 %, še bolj prednostno vsaj 85 %, celo bolj prednostno 90 % in najbolj prednostno 95 % sekvenčno identičnost s humanim mpl ligandom. Bolj prednostne izolirane molekule nukleinske kisline so sekvence DNA, ki kodirajo biološko aktiven mpl ligand, izbrane izmed: (a) DNA, ki temelji na kodirni regiji gena mpl liganda sesalca (npr. DNA, ki obsega nukleotidno sekvenco, prikazano na sl. 1 (SEQ ID NO: 2) ali njeni fragmenti); (b) DNA, kije sposobna hibridiziranja z DNA od (a) pri vsaj zmerno ostrih pogojih; in (c) DNA, ki je degenerirana DNA, definirana pri (a) ali (b) in je rezultat degeneracije genetičnega koda. Ugotovili smo, da so lahko novi mpl Ugandi, opisani tukaj, člani družine Ugandov ah citokinov, ki imajo prikladno sekvenčno identičnost, da se njihova DNA lahko hibridizira z DNA s sl. 1 (SEQ ID NO: 2) (ali njenim komplementom ali fragmentom) pri manj do zmerno ostrih pogojih. Tako nadaljnji vidik predloženega izuma vključuje DNA, ki se hibridizira pri manj do zmerno ostrih pogojih z DNA, ki kodira mpl Ugandske poUpeptide.

V nadaljnji prednostni izvedbi predloženega izuma je molekula nukleinske kisline cDNA, ki kodira mpl ligand in nadalje obsega vektor, ki se da replicirati, v katerem je cDNA funkcionalno vezana na kontrolne sekvence, spoznane od gostitelja, transformiranega z vektorjem. Ta vidik nadalje vključuje gostiteljske celice, transformirane z vektorjem in postopek za uporabo cDNA, da vpliva na nastanek mpl liganda, ki obsega ekspresijo cDNA, ki kodira mpl ligand v kulturi transformiranih gostiteljskih celic, in rekuperiranje mpl liganda iz gostiteljske celične kulture. Mpl ligand, pripravljen na ta način, je prednostno v bistvu homogeni humani mpl ligand. Prednostne gostiteljske celice za tvorbo mpl liganda so ovarijske celice kitajskega hrčka (celice CHO).

Predloženi izum nadalje vključuje prednosten postopek za zdravljenje sesalca z imunološkimi ali hematopoetičnimi motnjami, posebno trombocitopenije, ki obsega dajanje terapevtsko učinkovite količine mpl liganda temu sesalcu. V danem primeru damo mpl ligand v kombinaciji s dtokinom, posebno kolonijo stimulirajočim faktorjem ali interlevkinom. Prednosti kolonije stimulirajoči faktorji ali interlevkini vključujejo: kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, LL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ali IL-11.

III. Postopki izdelave

Nekateri avtorji so dolgo mislili, da je nastajanje trombocitov kontrolirano z multiplimi rodovno specifičnimi humoralnimi faktorji. Domnevali so, da aktivnosti dveh različnih citokinov, imenovanih megakariocitno kolonijo stimulirajoči faktor (megCSF) in trombopoetin regulirata megakariocitopoezo in trombopoezo (Williams et al., J. Celi Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams et al., Blood Celiš, 15:123-133 [1989]; in Gordon et al., Blood, 80:302-307 [1992]). V skladu s to hipotezo stimulira meg-CSF proliferacijo predniških megakariocitov, medtem ko trombopoetin primarno vpliva na zorenje bolj diferenciranih celic in na končno sproščanje trombocitov. Od leta 1960 naprej je dobro dokumentirana indukcija in nastanek aktivnosti tako za meg-CSF kot tudi za trombopoetin v plazmi, serumu in urinu živali ter ljudi po trombocitopoetičnih poteh (Odeli et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proč. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Ciin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et al., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur et al., J. Ciin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol.,

20:354-360 [1992]; in Hegyi et al., Int. J. Celi Cloning, 8:236-244 [1990]). Za te aktivnosti je navedeno, da so rodovno specifične in različne od znanih citokinov (Hill R.J. et al., Blood 80:346 (1992); Erickson-Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84:197-203 (1993); Straneva J.E. et al., Exp. Hematol. 20:4750 (1992); in Tsukada J. et al., Blood 81:866-867 [1993]). Prejšnji poskusi, da bi očistili meg-CSF ali trombopoetin iz trombocitopenične plazme ali urina, so bili neuspešni.

Skladno z zgornjimi opažanji, ki opisujejo trombocitopenično plazmo, smo ugotovili, da aplastična prašičja plazma (APP), dobljena iz obsevanih prašičev, stimulira humano megakariocitopoezo in vitro. Ugotovili smo, da se ta stimulatoma aktivnost odpravi s topno ekstracelično domeno c-mpl, kar potrjuje APP kot potencialni vir domnevnega mpl liganda (ML). Uspešno smo očistili mpl ligand iz APP, aminokislinsko sekvenčno informacijo pa smo uporabili za izolacijo cDNA murinega, prašičjega in humanega ML Ti ML imajo sekvenčno homologijo za eritropoetin in aktivnosti, podobne tako meg-CSF kot tudi trombopoetinu.

1. Čiščenje in identifikacija mp/ liganda iz plazme

Kot je omenjeno zgoraj, je za aplastično plazmo iz različnih vrst navedeno, da vsebuje aktivnosti, ki stimulirajo hematopoezo in vitro, vendar pa pred tem ni bil naveden noben hematopoetični stimulatomi faktor, izoliran iz plazme. En vir aplastične plazme je tisti, ki ga dobimo iz obsevanih prašičev. Ta aplastična prašičja plazma (APP) stimulira humano hematopoezo in vitro. Da določimo, če APP vsebuje mpl ligand, testiramo njegov učinek z merjenjem vgraditve ³H-timidina v celice Ba/F3, transfektirane s humanim mpl P (Ba/F3-mp/) s postopkom, prikazanim na sl.

2. APP stimulira vgraditev ³H-timidina v celici Ba/F3-mp/, ne pa v kontrolne celice Ba/F3 (t.j. netransfektirane s humanim mpl P). Poleg tega nismo opazili nobene take aktivnosti v normalni prašičji plazmi. Iz teh rezultatov je razvidno, da APP vsebuje faktor ali faktorje, ki transducirajo proliferativni signal skozi mpl receptor in je zato naravni ligand za ta receptor. To je nadalje podprto z ugotovitvijo, da obdelava APP s topnim mpl-lgG blokira stimulatome učinke APP na celice Ba/F3-zzip/.

Videti je, da je aktivnost v APP proteinska, ker pronaza, DTT ali toplota uničijo aktivnost v APP (sl. 3). Aktivnosti se tudi ne da dializirati. Aktivnost pa je vsekakor stabilna pri nizkem pH (pH 2,5;2 uri) in se veže in eluira iz različnih lektinskih afinitetnih kolon, iz česar je razvidno, da je to glikoprotein. Za nadaljnjo osvetlitev strukture in identičnosti te aktivnosti le-to afinitetno očistimo iz APP z uporabo kimere mp/-IgG.

APP obdelamo v skladu s predpisi, navedenimi v Primerih 1 in 2. Na kratko, mpl ligand očistimo z uporabo hidrofobne interakcijske kromatografije (HIC), imobilizirane barvne kromatografije in mp/-afinitetne kromatografije. Rekuperiranje aktivnosti iz vsake stopnje je prikazano na sl. 4, večkratnost očiščenja pa v tabeli 1. Celotno rekuperiranje aktivnosti skozi mp/-afinitetno kolono je približno 10 %. Frakcija (F6) z maksimalno aktivnostjo iz mp/-afinitetne kolone ima določeno specifično aktivnost 9,8x1ο⁶ enot/mg. Celotno očiščenje iz 5 1 APP je približno 4x1ο⁶kratno (0,8 enot/mg do 3,3 χ 10⁶ enot/mg) s 83 x lO^kratno redukcijo proteina (250 g na 3 gg). Za specifično aktivnost liganda, eluiranega iz w/?/-afinitetne kolone, smo ugotovili, daje približno 3 χ 10⁶ enot/mg.

TABELA 1

Čiščenje mpl liganda

vzorec	volumen ml	protein mg/ml	enote/ ml	enote	specifič- na aktiv» nost^enote/mg	do- bi- tek %	n-kratno očiščenje
APP	5000	50	40	200,000	0.8	-	1
fenil	4700	0.8	40	200.000	50	94	62
blue-sef.	640	0.93	400	256,000	430	128	538
mpl Cul) ;št.fr. -5=n-	12	5x10’4	1666	20,000	3.300,000	1 0	4,100,000

Protein določimo z Bradfordovim testom. Proteinsko koncentracijo mpl eluiranih frakcij 5-7 določimo na osnovi intenzitete barvanja gela SDS, obarvanega s srebrom. Ena enota je definirana tako, da povzroči 50 % maksimalne stimulacije Ba/F3-mp/ celične proliferacije.

Iz analize eluiranih frakcij iz znpZ-afinitetne kolone z SDS-PAGE (4-20 %, Novex gel) pri redukcijskih pogojih je razvidna prisotnost različnih proteinov (sl. 5). Proteini, ki se obarvajo s srebrom z najmočnejšo intenziteto, se ločijo z jasnimi Mr: 66000,55000, 30000, 28000 in 18000-22000. Da določimo, kateri od teh proteinov stimulira proliferacijo Ba/F3-mpZ celičnih kultur, jih eluiramo iz gela, kot je opisano v Primeru

2.

Iz rezultatov tega eksperimenta je razvidno, da se večino aktivnosti eluira iz rezine gela, ki vključuje proteine z Mr 28000-32000, z manjšo aktivnostjo pa se eluirajo v delu gela z Mr 18000-22000 (sl. 6). Edini proteini, vidni v teh delih, imajo Mr 30000, 28000 in 18000-22000. Da identificiramo in dobimo proteinske sekvence za proteine, ki se ločijo v tem delu gela (t.j. proge pri 30, 28 in 18-22 kDa) te tri proteine elektro popivnamo na P VDF in sekvenciramo, kot je opisano v Primeru 3. Dobljene aminoterminalne sekvence so prikazane v tabeli 2.

TABELA 2

Amino-terminalne sekvence mpl liganda

30 kDa 1 5 10 15 20 25 fS) P A P P A(C)D P R L L N K L L R D D (H/S) V L H (G) R L	(SEQ ID NO: 30)
28 kDa 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR	(SEQ ID NO: 31)
18-22 kDa 1 5 10 X P A P P A X D P R L X (N) (K)	(SEQ ID NO: 32)

Računalniška analiza dokazuje, da so te aminokislinske sekvence nove. Ker so vse tri sekvence enake, je verjetno, da so proteini 30 kDa, 28 kDa in 18-22 kDa sorodni in so lahko različne oblike istega novega proteina. Nadalje so ti proteini možni kandidati za naravni mpl ligand, ker se aktivnost loči na SDS-PAGE v istem delu (28000-32000) gela (4-20 %). Poleg tega delno očiščeni ligand migrira v regijo z Mr 17000-30000, če ga izpostavimo gelski filtracijski kromatografiji z uporabo kolone superoze 12 (Pharmacia). Veijetno so oblike liganda z različnimi Mr rezultat proteoliznih ali glikozilacijskih razlik ali drugih po- ali pred-translacijskih modifikacij.

Kot je opisano pred tem, antisens RNA humanega mpl odpravi megakariocitopoezo v kulturah humanega kostnega mozga, obogatenih s predniškimi celicami CD 34⁺, ne da bi vplivala na diferenciacijo drugih rodov hematopoetičnih celic (Methia et al., zgoraj). Ta rezultat navaja k temu, da ima lahko mpl receptor vlogo pri diferenciaciji in proliferaciji megakariocitov in vitro. Za nadaljnjo osvetlitev te vloge mpl liganda v megakariocitopoezi primerjamo učinke APP in APP z odstranjenim mpl ligandom na humano megakariocitopoezo in vitro. Učinek APP na humano megakariocitopoezo določimo z modifikacijo testa tekočinske suspenzijske megakariocitopoeze, opisanega v Primeru 4. Pri tem testu humane periferne matične celice (PSC) obdelamo z APP pred in po mp/-IgG afinitetni kromatografiji. GPIIbIIIa stimulacijo megakariocitopoeze kvantitativno določimo s ¹²⁵J-anti-IIbIII_a protitelesom (sl. 7). Kot je prikazano na sl. 7 10 % APP povzroči približno 3-kratno stimulacijo, medtem ko APP z odstranjenim mpl ligandom nima vpliva. Značilno je, da APP z odstranjenim mpl ligandom ne inducira proliferacije celic Ba/F3-mp/.

Pri drugem eksperimentu topen humani mpl-lgG, dodan na dneve 0,2 in 4 kulturam, ki vsebujejo 10 % APP, nevtralizira stimulatorne učinke APP na humano megakariocitopoezo (sl. 8). Iz teh rezultatov je razvidno, da ima mpl ligand vlogo pri reguliranju humane megakariocitopoeze in je zato lahko koristen za zdravljenje trombocitopenije.

2. Molekulsko kloniranje mpl liganda

Na osnovi amino-terminalne aminokislinske sekvence, dobljene iz 30 kDa, 28 kDa in 18-22 kDa proteinov (tabela 2, zgoraj), oblikujemo dva degenerirana oligonukleotidna primerska poola in uporabimo za pomnožitev prašičje genomske DNA s PCR. Utemeljeno je, da, če amino-terminalno aminokislinsko sekvenco kodira posamezen ekson, potem pričakujemo, da ima pravilen produkt PCR dolžino 69 bp. Fragment DNA te velikosti smo ugotovili in subklonirali v pGEMT. Sekvence oligonukleotidnih PCR primeijev in trije dobljeni kloni so prikazani v Primeru 5.

Aminokislinska sekvenca (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) peptida, kodiranega med PCR primeiji, je identična tisti, ki jo dobimo pri sekvenciranju aminoterminalnega proteina prašičjega Uganda (ostanki 9-17 za sekvence prašičjega proteina z 28 in 30 kDa, zgoraj).

Sintetični oligonukleotid, ki temelji na sekvenci fragmenta PCR uporabimo za selekcioniranje knjižnice humane genomske DNA. 45-memi oUgonukleid, označen s pR45, oblikujemo in sintetiziramo na osnovi sekvence fragmenta PCR. Ta oligonukleotid ima naslednjo sekvenco:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQ ID NO: 34)

Ta deoksioUgonukleotid uporabimo za selekcioniranje knjižnice humane genomske DNA v Xgeml2 pri manj ostrih pogojih hibridizacije in izpiranja v skladu s Primerom 6. Pozitivne klone zberemo, plake očistimo in analiziramo z restrikcijskim mapiranjem in Southern blotting-om. Fragment EcoRI-XbaI s 390 bp, ki se hibridizira s 45merom, subkloniramo v pBluescript SK-. Sekvenciranje DNA tega klona potrjuje, da smo izoliraU DNA, ki kodira humani homolog prašičjega mpl Uganda. Sekvenca humane DNA in sekvenca deducirane amino kisUne sta prikazani na sl. 9 (SEQ ED NO: 3 & 4). Napovedani položaji intronov v genomski sekvenci so tudi prikazani s puščicami in definirajo domnevni ekson (ekson 3).

Na osnovi sekvence humanega eksona 3 (Primer 6) sintetiziramo oligonukleotide, ki ustrezajo 3’ in 5’ koncem sekvence eksona. Ta dva primerja uporabimo v reakcijah PCR, kjer uporabimo kot kalup cDNA, pripravljeno iz različnih humanih tkiv. Pričakovana velikost pravilnega produkta PCR je 140 bp. Po analizi produktov PCR na poliakrilamidnem gelu (12 %) detektiramo fragment DNA pričakovane velikosti v knjižnicah cDNA, pripravljene iz ledvic odraslega človeka, 293 celic fetalnih ledvic in cDNA, pripravljene iz humanih fetalnih jeter.

Knjižnico cDNA fetalnih jeter (7x1ο⁶ klonov) v lambda DR2 nato selekcioniramo z istim 45-mernim oligonukleotidom, uporabljenim za selekcioniranje humane genomske knjižnice in knjižnice cDNA fetalnih jeter pri manj ostrih pogojih hibridizacije. Pozitivne klone zberemo, plake očistimo in določimo velikost inserta s PCR. En klon z insertom 1,8 kb izberemo za nadaljnjo analizo. Z uporabo postopkov, opisanih v Primeru 7, dobimo nukleotid in deducirano aminokislinsko sekvenco humanega mpl liganda (hML). Te sekvence so prikazane na sl. 1 (SEQ ID NO: 1 & 2).

3. Struktura humanega mpl liganda (hML)

Sekvenca cDNA humanega mpl liganda (hML) (sl. 1 [SEQ ID NO: 2]) obsega 1774 nukleotidov, ki jim sledi poli(A) rep. Le ta vsebuje 215 nukleotidov 5’ netranslatirane sekvence in 3’ netranslatirano regijo 498 nukleotidov. Domnevni iniciacijski kodon na nukleotidnem položaju (216-218) je znotraj konsenzne sekvence, ugodne za evkariotsko translacijsko iniciacijo. Odprt bralni okvir ima dolžino 1059 nukleotidov in kodira polipeptid s 353 aminokislinskimi ostanki, začne pa se pri nukleotidnem položaju 220. N-terminal napovedane aminokislinske sekvence je visoko hidrofoben in vetjetno ustreza signalnemu peptidu. Iz računalniške analize predvidene aminokislinske sekvence (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) je razvidno potencialno cepišče za signalno peptidazo med ostankoma 21 in 22. Cepitev v tem položaju bi dala zreli polipeptid s 332 aminokislinskimi ostanki, ki se začne z amino-terminalno sekvenco, dobljeno iz mpl liganda, očiščenega iz prašičje plazme. Napovedana molekulska masa neglikoziliranega liganda s 332 aminokislinskimi ostanki je približno 38 kDa. Ima 6 potencialnih N-glikozilacijskih mest in 4 cisteinske ostanke.

Primerjava sekvence mpl liganda s sekvenco po podatkih Genbanke razkriva 23 % identičnost med 153 amino-terminalnimi ostanki zrelega humanega mpl liganda in humanega eritropoetina (sl. 10 [SEQ ID NOS: 6 & 7]). Če upoštevamo konzervativne substitucije, ima ta regija hML 50 % podobnost s humanim eritropoetinom (hEPO). Oba hEPO in hML vsebujeta štiri cisterne. Trije od štirih cisteinov so konzervirani v hML, vključno prvi in zadnji cistein. Iz eksperimentov za položajno usmerjeno mutagenezo je razvidno, da prvi in zadnji cistein eritropoetina tvorita disulfidno vez, ki je potrebna za delovanje (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). Analogno prvi in zadnji cistein hML prav tako lahko tvorita kritično disulfidno vez. Nobeno glikozilacijsko mesto ni konzervirano v hML. Vsa potencialna N-vezana glikozilacijska mesta hML so locirana v karboksi-terminalni polovici hML polipeptida.

Podobno kot hEPO tudi hML mRNA ne vsebuje konsenzne poliadenilacijske sekvence AAUAAA niti regulatornega elementa AUUUA, ki je prisoten v 3’ netranslatiranih regijah mnogih citokinov in domnevno vpliva na stabilnost mRNA (Shawet et al., Celi, 46:659-667 [1986]). Analiza Northern blotting razkriva nizke nivoje posameznega 1,8 kb hML RNA transkripta tako v fetalnih kot tudi v odraslih jetrih. Po daljši izpostavitvi je možno detektirati slabšo progo enake velikosti v ledvicah odraslega. Za primerjavo humani eritropoetin eksprimirajo v fetalnih jetrih in za odziv na hipoksijo v ledvicah in jetrih odraslega človeka (Jacobs et al., Nature, 313:804-809 [1985] in Bondurant et al., Moleč. Celi. Biol., 6:2731-2733 [1986]).

Pomembnost C-terminalne regije hML pa ostane nepojasnjena. Na osnovi prisotnosti šestih potencialnih mest za N-vezano glikozilacijo in sposobnosti liganda, da se veže v lektinskih afinitetnih kolonah, je ta regija hML verjetno glikozilirana. V nekaterih eksperimentih gelskega eluiranja opazimo aktivnost, ki se loči z Mr približno 60000, ki lahko pomeni glikozilirano molekulo s popolno dolžino. C-terminalna regija torej lahko deluje tako, da stabilizira in poveča razpolovno dobo krožečega hML. V primeru eritropoetina ima ne-glikozilirana oblika popolno biološko aktivnost in vitro, vendar ima značilno znižano plazemsko razpolovno dobo glede na glikoziran eritropoetin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] in Spivack et al., Blood, 7:90-99 [1989]). C-terminalna domena hML vsebuje dve dibazični aminokislinski sekvenci [Arg-Arg motiva na položajih 153-154 in 245-246], ki sta lahko potencialni procesimi mesti. Cepitev na teh mestih je lahko odgovorna za nastajanje oblik ML, izoliranega iz APP s 30, 28 in 18-22 kDa. Značilno je, da sekvenca Arg₁₅₃Arg₁₅₄ nastane takoj po domeni ML, podobni eritropoetinu. Iz teh opažanj je razvidno, da ML s popolno dolžino lahko pomeni predhodniški protein, ki je izpostavljen omejeni proteolizi, da tvori zreli ligand.

4. Izo-oblike in variante humanega mpl liganda

Izo-oblike ali alternativno spojene oblike humanega mpl liganda detektiramo s PCR v jetrih odraslega človeka. Na kratko, primeije sintetiziramo ustrezno vsakemu koncu, prav tako pa izberemo tudi interne regije kodirne sekvence hML. Te primeije uporabimo v RT-PCR, da pomnožimo RNA jeter odraslega človeka, kot je opisano v Primeru 10. Poleg oblike s popolno dolžino, označene hML, opazujemo oz. deduciramo tudi tri druge oblike, označene hML2, hML3 in hML4. Zrele deducirane aminokislinske sekvence vseh štirih izo-oblik so prikazane na sl. 11 (SEQ ED NOS: 6, 8,9&10).

hML3 ima delecijo 116 nukleotidov na položaju 700, kar ima za posledico tako delecijo amino kisline kot tudi premik okvirja. cDNA sedaj kodira zreli polipeptid, ki ima dolžino 265 amino kislin in se razlikuje od sekvence hML pri aminokislinskem ostanku 139. Končno ima hML4 tako delecijo 12 nukleotidov po nukleotidnem položaju 618 (ugotovljeno tudi v mišjih in prašičjih sekvencah [glej spodaj]) in delecijo 116 bp, ugotovljeno v hML3. Čeprav niso bili izolirani nobeni kloni samo z delicijo 12 bp (po nukleotidu 619) v človeku (označeno hML2), ta oblika verjetno obstaja, ker je bila taka izo-oblika identificirana tako pri miši kot tudi pri prašiču (glej spodaj) in ker je bila identificirana v zvezi z delecijo 116 nukleotidov v hML4.

Obe, substitucijsko varianto hML, v kateri je dibazična sekvenca Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ nadomeščena z dvema alaninskima ostankoma, in skrajšano obliko 'ΈΡΟ-domene hML konstruiramo tako, da določimo, ali je ML s popolno dolžino potreben za biološko aktivnost. Substitucijsko varianto dibazične sekvence Arg₁₅₃-Arg₁₅₄, imenovano hML (R153A, R154A), konstruiramo z uporabo PCR, kot je opisano v Primeru 10. Naredimo tudi skrajšano obliko ΕΡΟ-domene, hML₁₅₃, z uporabo PCR z uvedbo stop kodona po Argl53.

5. Ekspresija rekombinantnega humanega mpl liganda (rhML) v prehodno transfektiranih 293 celicah humanih embrionalnih ledvic

Da potrdimo, da klonirana humana cDNA kodira ligand za mpl, ligand eksprimiramo v 293 celicah sesalca ob kontroli citomegalovirusnega neposrednega zgodnjega promotoija z uporabo ekspresijskega vektorja pRK5-hML ali pRK5hML₁₅₃. Za supematante iz prehodno transfektiranih 293 celic humanih embrionalnih ledvic ugotovimo, da stimulirajo vgraditev ³H-timidina v celice Ba/F3-zMjpZ, ne pa v parentalne celice Ba/F3 (sl. 12A). Medij iz 293 celic, transfektiranih samo z vektorjem pRK, ne vsebuje te aktivnosti. Dodatek mplAgG k mediju uniči stimulacijo (podatki niso prikazani). Iz teh rezultatov je razvidno, da klonirana cDNA kodira funkcionalni humani ML (hML).

Da določimo, ali samo EPO-domena lahko veže in aktivira mpl, skrajšano obliko hML, rhML₁₅₃, eksprimiramo v 293 celicah. Za supematante iz transfektiranih celic ugotovimo, da imajo aktivnost, podobno tisti, kije prisotna v supematantih iz celic, ki eksprimirajo hML s popolno dolžino (sl. 12A), iz česar je razvidno, da C-terminalna domena ML ni potrebna za vezavo in aktiviranje G-mpl.

6, mpl ligand stimulira megakariocitopoezo in trombopoezo

Tako oblika rhML s popolno dolžino kot tudi skrajšana oblika rhML₁₅₃ rekombinantnega hML stimulirata humano megakariocitopoezo in vitro (sl. 12B). Ta učinek opazujemo v odsotnosti drugih eksogeno dodanih hematopoetičnih rastnih faktorjev. Razen IL-3 je ML edini hematopoetični rastni faktor, kije testiran, da ima to aktivnost. IL-11, IL-6, IL-1, eritropoetin, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM in GM-CSF nimajo vpliva na megakariocitopoezo, če jih v našem testu testiramo ločeno (podatki niso prikazani). Iz teh rezultatov je razvidno, da ima ML megakariocite stimulirajočo aktivnost in označuje vlogo ML pri reguliranju megakariocitopoeze.

Za trombopoetične aktivnosti, prisotne v plazmi trombocitopeničnih živali, je prikazano, da stimulirajo nastajanje trombocitov pri izvajanju testa oživitve mišje trombocitoze (McDonald, Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] in McDonald et al., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976]). V tem modelu naredimo miši akutno trombocitopenične z uporabo specifičnega antitrombocitnega seruma, kar ima za posledico predvidljivo ožitev trombocitoze. Take imunotrombocitemične miši so bolj odzivne na eksogene trombopoetinu podobne aktivnosti kot normalne miši (McDonald, Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973]), prav tako kot so ekshipoksične miši bolj občutljive za eritropoetin kot normalne miši (McDonald, et al., J. Lab. Ciin. Med., 77:134-143 [1971]). Da ugotovimo, ali rML stimulira nastajanje trombocitov in vivo, mišim z oživljeno trombocitozo injiciramo delno očiščen rhML. Kvantitativno določimo število trombocitov in vgraditev ³⁵S vanje. Injiciranje 64000 ali 32000 enot rML mišim znatno poveča nastajanje trombocitov, kar dokazuje ~20 % zvečanje števila trombocitov (p=0,0005 oz. 0,0001) in ~ 40 % zvečanje vgraditve ³⁵S vanje (p=0,003) v obdelanih miših v primerjavi s kontrolnimi, injiciranimi samo z nosilcem (sl. 12C). Ta nivo stimulacije je primerljiv s tistim, ki ga dobimo z IL-6 v tem modelu (podatki niso prikazani). Obdelava s 16000 enotami rML znatno ne stimulira nastajanja trombocitov. Ti rezultati dokazujejo, da ML stimulira nastajanje trombocitov na način, ki je odvisen od doze in ima zaradi tega trombopoetinu podobno aktivnost.

293 celic transfektiramo tudi z drugimi konstrukti izo-oblike hML, opisanimi zgoraj, in supematante testiramo z uporabo testa proliferacije Ba/F3-znp/ (sl. 13). hML2 in hML3 nimata aktivnosti, ki bi sejo dalo detektirati v tem testu, vendar pa je aktivnost hML(R153A, R154A) podobna hML in hML₁₅₃, kar dokazuje, da procesiranje na dibazičnem mestu Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ ni niti potrebno niti škodljivo za aktivnost.

7, Megakriocitopoeza in mpl ligand

Navedeno je, da megakariocitopoezo regulirajo multiple celične stopnje (Williaras et al., J.Cell Physiol., 110:101-104 [1982] in Williams et al., Blood Celiš, 15:123-133 [1989]). To temelji večinoma na opažanjih, da določeni hematopoetični rastni faktorji stimulirajo proliferacijo megakariocitnih prednikov, medtem ko drugi primarno vplivajo na zorenje. Rezultati, prikazani tukaj, navajajo k temu, da ML deluje kot proliferativni faktor in kot faktor zorenja. Da ML stimulira proliferacijo megakariocitnih predhodnikov, podpirajo številni dokazi. Kot prvo, APP stimulira tako proliferacijo, kot tudi zorenje humanih megakariocitov in vitro, to stimulacijo pa popolnoma inhibira mpl-lgG (sl. 7 in 8). Poleg tega inhibiranje tvorbe megakariocitne kolonije z antisens oligonukleotidi c-mpl (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) in ugotovitev, da c-mpl lahko transducira proliferativni signal v celicah, v katerih je transfektiran (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653 [1993] in Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]), prav tako dokazuje, da ML stimulira proliferacijo. Očitna ekspresija c-mpl med vsemi stopnjami megakariocitne diferenciacije (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) in sposobnost rekombinantnega ML, da hitro stimulira nastajanje trombocitov in vivo, naznačuje, da ML vpliva tudi na zorenje. Rekombinantni ML omogoča natančno ocenitev njegove vloge pri reguliranju megakariocitopoeze in trombopoeze, kot tudi njegove zmogljivosti, da vpliva na druge hematopoetične rodove.

8. Izolacija gena humanega mpl liganda (TPO)

Klone humane genomske DNA gena TPO izoliramo s selekcioniranjem humane genomske knjižnice v X-geml2 s pR45 pri manj ostrih pogojih ali pri zelo ostrih pogojih s fragmentom, ki ustreza 3’ polovici humane cDNA, ki kodira mpl ligand. Izoliramo dva prekrivajoča lambda klona z obsegom 35 kb. Dva prekrivajoča fragmenta (BamHl in EcoRI), ki vsebujeta celotni gen TPO, subkloniramo in sekvenciramo (sl. 14A, 14B in 14C).

Struktura humanega gena je sestavljena iz 6 eksonov znotraj 7 kb genomske DNA. Meje vseh eksonskih/intronskih povezav so konsistentne s konsenznim motivom, določenim za gene sesalcev (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). Ekson 1 in ekson 2 vsebujeta 5’ netranslatirano sekvenco in začetne štiri amino kisline signalnega peptida. Ostanek sekietornega signala in prvih 26 amino kislin zrelega proteina so kodirani v eksonu 3. Celotna karboksilna domena in 3’ netranslatirana kot tudi približno 50 amino kislin eritropoetinu slične domene so kodirani v eksonu 6. Štiri amino kisline, vključene v delecijo, ki jo zaznamo v hML·! (hTPO-2), so kodirane na 5’ koncu eksona 6.

Analiza humane genomske DNA s Southern blottingom označuje, da je gen za TPO prisoten v enojni kopiji. Kromosomsko lokacijo gena določimo s fluorescentno hibridizacijo in situ (FISH), kije mapirana za kromosome 3q27-28.

9. Ekspresija in čiščenje TPO iz 293 celic

Priprava in čiščenje ML ali TPO iz 293 celic sta podrobno opisana v Primeru 19. Na kratko, cDNA, ki ustreza celotnemu odprtemu bralnemu okvirju TPO, dobimo s PCR z uporabo pRK5-h/np/I. Dobljeni PCR očistimo in kloniramo med restrikcijskima mestoma Clal in XBaI plazmida pRK5tkneo (vektor izveden iz pRK5, modificiran za ekspresijo gena, odpornega proti neomicinu ob kontroli zviševanja timidin kinaze), da dobimo vektor pRK5tkneo.ORF (vektor, ki kodira za celoten odprt bralni okvir).

Drugi vektor, ki kodira za homologno domeno EPO, naredimo enako, le da uporabimo drugačne primeije PCR, da dobimo končni konstrukt, imenovan pRK5tkneoEPO-D.

Ta dva konstrukta transfektiramo v celice humanih embrionalnih ledvic s CaPO₄ postopkom ter klone, odporne proti neomicinu, selekcioniramo in pustimo, da rastejo do konfluence. Ekspresijo ML₁₅₃ ali ML₃₃₂ v kondicioniranem mediju iz teh klonov preizkusimo s testom proliferacije Ba/F3-mp/.

Čiščenje rhML₃₃₂ izvedemo, kot je opisano v Primeru 19. Na kratko, kondicioniran medij 293-rhML₃₃₂ nanesemo na kolono blue-sefaroze (Pharmacia), ki jo nato izperemo s pufrom, ki vsebuje sečnino (2M). Kolono eluiramo s pufrom, ki vsebuje sečnino (2M) in NaCl (IM). Elucijski pool blue-sefaroze nato direktno nanesemo na kolono WGA-sefaroze, izperemo z 10 kolonskimi volumni pufra, ki vsebuje sečnino (2M) in NaQ (IM) in eluiramo z istim pufrom, ki vsebuje N-acetil-D-glukozamin (0,5M). WGA-sefarozni eluat nanesemo na kolono C4-HPLC (Synchrom, Inc.) in eluiramo z diskontinuimim propanolnim gradientom. Pri SDS-PAGE migrira očiščeni 293-rhML₃₃₂ kot široka proga v področju gela 68-80 kDa (sl. 15).

Čiščenje rhML₁₅₃ prav tako izvedemo, kot je opisano v Primeru 19. Na kratko, kondicioniran medij 293-rhML₁₅₃ ločimo na blue-sefarozi, kot je opisano za rhML₃₃₂. Eluat blue-sefaroze nanesemo direktno na /np/-afinentno kolono, kot je opisano zgoraj. rhML₁₅₃, ki se eluira iz mp/-afinitetne kolone, očistimo do homogenosti, pri čemer uporabimo kolono C4-HPLC pri enakih pogojih kot za rhML₃₃₂. Z SDSPAGE se očiščeni rhML₁₅₃ loči v dve večji in dve manjši progi z Mr ~ 18000-22000 (sl. 15).

10. Murini mpl ligand

Fragment DNA, ki ustreza kodirni regiji humanega mpl liganda, dobimo s PCR, gelsko očistimo in označimo v prisotnosti ³²P-dATP in ³²P-dCTP. To sondo uporabimo za selekcioniranje 10⁶ klonov knjižnice cDNA mišjih jeter v \GT10. Murini klon (sl. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), ki vsebuje insert 1443 baznih parov, izoliramo in sekvenciramo. Predvideni iniciacijski kodon je pri nukleotidnem položaju 138-141 v konsenzni sekvenci, ugodni za evkariotično translacijsko iniciacijo (Kozak, M. J.Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Ta sekvenca definira odprt bralni okvir 1056 nukleotidov, kar napoveduje primarno translatiran produkt s 352 amino kislinami. Bočno k temu odprtemu bralnemu okvirju je 137 nukleotidov od 5’ in 247 nukleotidov od 3’ netranslatirane sekvence. Ni pa nobenega poli(A) repa po 3’ netranslatirani regiji, ki bi označeval, da klon verjetno ni kompleten. N-terminal predvidene aminokislinske sekvence je visoko hidrofoben in predstavlja signalni peptid. Računalniška analiza (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) naznačuje potencialno cepišče za signalno peptidazo med ostankoma 21 in 22. Cepitev v tem položaju bi dala zreli polipeptid s 331 amino kislinami (35 kDa), identificiran kot mML₃₃₁ (ali mML2 zaradi razlogov, opisanih spodaj). Sekvenca vsebuje štiri cisteine, vse konzervirane v humani sekvenci, in sedem potencialnih N-glikozilacijskih mest, od katerih je pet konzerviranih v humani sekvenci. Ponovno, kot pri hML, je vseh sedem potencialnih N-glikozilacijskih mest lociranih v C-terminalni polovici proteina.

Če primerjamo s humanim ML, opazimo precejšnjo identičnost tako za nukleotidne kot tudi za deducirane aminokislinske sekvence v EPO-domenah teh ML. Vendar pa, če uvrstimo deducirane aminokislinske sekvence humanega ML in mišjega ML, kaže, da ima mišja sekvenca tetrapeptidno delecijo med ostanki 111-114, ki ustreza deleciji 12 nukleotidov po nukleotidnem položaju 618, razvidno tako v humani cDNA (glej zgoraj) kot tudi prašičji (glej spodaj). V skladu s tem dodatne klone raziščemo, da odkrijemo možne izo-oblike murinega ML En klon kodira deducirano sekvenco polipeptida s 335 amino kislinami, ki vsebuje manjkajoči (missing) tetrapeptid LPLQ. Za to obliko domnevamo, da je murini ML s popolno dolžino in je imenovana mML ali mML^. Nukleotid in deducirana aminokislinska sekvenca za mML sta prikazana na sl. 17 (SEQ ED NOS: 14 & 15). Ta klon cDNA je sestavljen iz 1443 baznih parov, ki jim sledi poli(A) rep. Ima odprt bralni okvir iz 1068 bp, ki imajo bočno 134 baz od 5’ in 241 baz od 3’ netranslatirane sekvence. Domnevni inidacijski kodon je pri nukleotidnih položajih 138-140. Odprt bralni okvir kodira napovedani protein s 356 amino kislinami, pri čemer je prvih 21 zelo hidrofobnih in veijetno delujejo kot sekrecijski signal.

Končno izoliramo tretji murini klon, sekvenciramo in ugotovimo, da vsebuje delecijo 116 nukleotidov, ki ustreza hML3. Ta murina izo-oblika je zato označena mML3. Primerjava deducimih aminokislinskih sekvenc teh dveh izo-oblik je prikazana na sl. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

Celotna aminokislinska sekvenčna identičnost med humanim in mišjim ML (sl. 19 [SEQ ED NOS: 6 & 17]) je 72 %, vendar pa ta homologija ni pravilno porazdeljena. Regija, ki je definirana kot ΕΡΟ-domena (amino kisline 1-153 za humano sekvenco in 1-149 za mišjo) je bolje konzervirana (86 % homologija) kot karboksiterminalna regija proteina (62 % homologija). To lahko nadalje pomeni, da je samo ΕΡΟ-domena pomembna za biološko aktivnost proteina. Zanimivo je, da je od dveh dibazičnih aminokislinskih motivov, ugotovljenih v hML, le dibazični motiv, kije neposredno takoj za EPO-domeno (položaj ostankov 153-154) v humani sekvenci, prisoten v murini sekvenci. To je konsistentno z možnostjo, da ML s popolno dolžino lahko predstavlja predhodniški protein, ki je izpostavljen omejeni proteolizi, da tvori zreli ligand. Alternativno lahko proteoliza med Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ olajša odstranitev hML.

Ekspresijski vektor, ki vsebuje celotno kodirno sekvenco mML, predhodno transfektiramo v 293 celic, kot je opisano v Primeru 1. Kondicioniran medij iz teh celic stimulira vgraditev ³H-timidina v celice Ba/F3, ki eksprimirajo tako murini kot humani mpl, nima pa vpliva na parentalno (brez mpl) celično linijo. Iz tega je raz60 vidno, da klonirana cDNA murinega ML kodira funkcionalni ligand, ki je sposoben da aktivira tako receptor murinega kot tudi humanega ML (mpl).

11. Prašičji mpl ligand cDNA prašičjega ML (pML) izoliramo z RACE PCR, kot je opisano v Primeru 13. PCR cDNA produkt s 1342 bp ugotovimo v ledvicah in subkloniramo. Različne klone sekvenciramo in ugotovimo, da kodirajo prašičji mpl ligand s 332 aminokislinskimi ostanki, imenovan pML (ah pML₃₃₂), ki ima nukleotidno in deducirano aminokislinsko sekvenco, ki sta prikazani na sl. 20 (SEQ ID NOS: 18 & 19).

Ponovno identificiramo drugo obliko, označeno pML2, ki kodira protein z delecijo štirih aminokislinskih ostankov (228 aminokislinskih ostankov) (sl. 21 [SEQ ID NO: 21]). Iz primeijave aminokislinskih sekvenc pML in pML2 je razvidno, daje slednja oblika identična, razen da ima delecijo tetrapeptida QLPP, ki ustreza ostankom od 111 do vključno 114 (sl. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Do delecije štirih amino kislin, ki jo zaznamo tako v cDNA murinega kot tudi prašičjega ML, pride na točno enakem položaju v napovedanih proteinih.

Iz primeijave napovedanih aminokislinskih sekvenc zrelega ML človeka, miši in prašiča (sl. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]) je razvidno, da je celotna sekvenčna identičnost 72 %, če primeijamo mišjo in humano, 68 % če primerjamo mišjo in prašičjo ter 73 % če primeijamo prašičjo in humano. Homologija je bistveno večja v amino-terminalni polovici ML (EPO homologna domena). Ta domena ima 80-84 % identičnost, če primeijamo katerikoli dve vrsti, pri čemer je karboksiterminalna polovica (ogljikohidratna domena) samo 57-67 % identična. Dibazični aminokislinski motiv, ki bi lahko pomenil proteazno cepišče, je prisoten na karboksilnem koncu eritropoetinske homologne domene. Ta motiv je konzerviran med tremi vrstami (species) na tem položaju (sl. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]). Drugo dibazično mesto, prisotno na položajih 245 in 246 v humani sekvenci, ni prisotno v mišjih ali prašičjih sekvencah. Sekvenca murinega in prašičjega ML vsebuje 4 cisterne, vse konzervirane v humani sekvenci. Obstaja 7 potencialnih N-glikozilacijskih mest v mišjem Ugandu in 6 v prašičjem ML, od katerih je 5 konzerviranih v humani sekvenci. Ponovno so vsa potencialna N-glikozilacijska mesta locirana v C-terminalni polovici proteina.

12. Ekspresija in čiščenje TPO iz ovariiskih celic kitajskega hrčka (celice CHO)

Ekspresijski vektorji, uporabljeni za transfektiranje celic CHO so označeni: pSVI5.ID.LL.MLORF (popolna dolžina ali TPO^), in pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrajšan ali TPO₁₅₃). Pertinentne lastnosti teh plazmidov so prikazane na sl. 23 in 24.

Transfekcijski postopki so opisani v Primeru 20. Na kratko, cDNA, ki ustreza celotnemu odprtemu bralnemu okviru TPO, dobimo s PCR. Produkt PCR očistimo in kloniramo med dve restrikcijski mesti (Clal in Šali) plazmida pSVI5.ID.LL, da dobimo vektor pSVI5.ID.LL.MLORF. Drugi konstrukt, ki ustreza homologni domeni EPO, izdelamo na enak način, le da uporabimo drugačen, reverzni primer (EPOD.SaI). Končni konstrukt za vektor, ki kodira za EPO homologno domeno TPO, je imenovan pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.

Ta dva konstrukta Imeariziramo z Noti in transfektiramo v ovarijske celice kitajskega hrčka (celice CHO-DP12, EP 307,247, objavljeno 15. marca 1989) z elektroporacijo. 10⁷ celic elektroporiramo v napravi za elektroporacijo BRL (350 voltov, 330 mF, nizka kapacitanca) v prisotnosti 10, 25 ali 50 mg DNA, kot opisujejo (Andreason, G.L J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). Dan po transfekciji celice cepimo v selektivni medij DHFR (visoko glukozni DMEM-F12 50:50, brez glicina, glutamin (2 mM), dializiran fetalni telečji serum (2-5 %)). 10 do 15 dni kasneje prenesemo individualne kolonije na plošče s 96 vdolbinicami in pustimo, da rastejo do klonfluence. Ekspresijo ML₁₅₃ ali ML₃₃₂ v kondicioniranem mediju iz teh klonov ugotovimo s testom proliferacije Ba/F3-mpl (opisano v Primeru 1).

Postopek čiščenj in izoliranj TPO iz zbrane tekočine celične kulture CHO je opisan v primeru 20. Na kratko, zbrano tekočino celične kulture (HCCF) nanesemo na kolono blu-sefaroze (Pharmacia) pri razmerju približno 100 1 HCCF na liter smole. Kolono nato izperemo s 3 do 5 kolonskimi volumni pufra, nato s 3 do 5 kolonskimi volumni pufra, ki vsebuje sečnino (2,0 M). TPO nato eluiramo s 3 do 5 kolonskimi volumni pufra, ki vsebuje sečnino (2,0M) in NaG (l,0M).

Eluatni pool iz blue-sefaroze, ki vsebuje TPO, nato nanesemo na kolono lektin (pšenični kalčki)-sefaroze (Pharmacia), uravnotežno v eluimem pufru blue-sefaroze pri razmerju od 8 do 16 ml eluata blue-sefaroze na ml smole. Kolono nato izperemo z 2 do 3 kolonskimi volumni uravnoteževalnega pufra. TPO nato eluiramo z 2 do 5 kolonskimi volumni pufra, ki vsebuje sečnino (2,0M) in N-acetil-D-glukozamin (0,5Μ).

Eluat lektina pšeničnih kalčkov, ki vsebuje TPO, nato nakisamo in dodamo C₁₂E_g do končne koncentracije 0,04 %. Dobljeni pool nanesemo na kolono z reverzno fazo C4, uravnoteženo v TFA (0,1 %), C₁₂E_g (0,04 %), s polnitvijo približno 0,2 do 0,5 mg proteina na ml smole.

Protein se eluira v dvofaznem linearnem gradientu acetonitrila, ki vsebuje TFA (0,1 %) in C₁₂E_g (0,04 %), pool pa naredimo na osnovi SDS-PAGE.

Pool C4 nato razredčimo in diafiltriramo proti približno 6 volumnom pufra na ultrafiltracijski membrani Amicon YM ali podobni z mejnimi (cut-off) molekulskimi masami od 10000 do 30000 Da. Dobljeni diafiltrat nato direktno predelamo ali dalje koncentriramo z ultrafiltracijo. Diafiltratu/koncentratu navadno naravnamo končno koncentracijo 0,01 % Tweena-80.

Ves diafiltrat/koncentrat ali le del, ekvivalenten 2 do 5 % izračunanega kolonskega volumna, nato nanesemo na kolono sefakril S-300 HR (Pharmacia), uravnoteženo v pufru, ki vsebuje Tween-80 (0,01 %), in kromatografiramo. Frakcije, ki vsebujejo TPO, ki so brez agregata in produkte proteolitične degradacije nato združimo v pool na osnovi SDS-PAGE. Dobljeni pool filtriramo in shranimo pri 2-8 °C.

13. Postopki za transformiranje in induciranje sinteze TPO v mikroorganizmu in izoliranje, čiščenje in renaturiranie TPO, narejenega v njem

Konstrukcija ekspresijskih vektorjev E. coli TPO je podrobno opisana v Primeru 21. Na kratko, plazmidi pMP21, pMP151, pMP141, pMP57 in pMP202 so vsi oblikovani tako, da eksprimirajo prvih 155 amino kislin TPO navzdol od majhnega voditelja, ki variira med različnimi konstrukti. Voditelji (leaders) primarno zagotavljajo visok nivo translacijske iniciacije in hitro čiščenje. Plazmidi pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 so oblikovani za ekspresijo prvih 153 amino kislin TPO navzdol od iniciacijskega metionina in se razlikujejo le v uporabi kodona za prvih 6 amino kislin TPO, plazmid pMP251 pa je derivat pMP210-l v katerem je karboksi-terminalni konec TPO razširjen z dvema amino kislinama. Vsi od zgornjih plazmidov dajo visoke nivoje intracelične ekspresije TPO v E. coli po indukciji triptofanskega promotorja (Yansura, D. G. et al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., izd.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmida pMPl in pMP172 sta intermediata v konstrukciji zgornjih intraceličnih ekspresijskih plazmidov TPO.

Zgornje ekspresijske plazmide TPO uporabimo za transformiranje E.coli z uporabo postopka toplotnega šoka s CaCl₂ (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) in drugih postopkov, opisanih v Primeru 21. Na kratko, transformirane celice najprej rastejo pri 37 °C, dokler optična gostota (600 nm) kulture ne doseže približno 2-3. Kulturo nato razredčimo in po rasti ob aeraciji dodamo kislino. Kulturo nato pustimo, da kontinuirno raste ob aeraciji nadaljnjih 15 ur, nakar celice zberemo s centrifugiranjem.

Postopki izoliranja, čiščenja in renaturiranja, navedeni spodaj, za izdelavo biološko aktivnega renaturiranega humanega TPO ali njegovih fragmentov, so opisani v Primerih 22 in 23 in jih lahko uporabimo za rekuperiranje katerekoli variante TPO, vključno N- in C-terminalo razširjenih oblik. Drugi postopki, prikladni za renaturiranje rekombinantnega ali sintetičnega TPO, so v naslednjih patentih: Builder et al., U.S. Patent 4,511,502; Jones et al., U.S. Patent 4,512,922; Olson U.S. Patent 4,518,526 in Builder et al., U.S. Patent 4,620,948; za splošen opis postopkov rekuperiranja in renaturiranja za različne rekombinantne proteine, eksprimirane v netopni obliki v E. coli.

A. Rekuperiranje netopnega TPO

Mikroorganizem, kot npr. E. coli, ki eksprimira TPO, kodiran s katerimkoli prikladnim plazmidom, fermentiramo pri pogojih, pri katerih se TPO deponira v netopna refraktilna telesa. V danem primeru celice najprej izperemo v pufru za razkroj celic. Značilno je, da približno 100 g celic resuspendiramo v približno 10 volumnih pufra za razkroj celic (npr. tris (10 mM), EDTA (5 mM), pH 8) npr. s homogenizatoijem Polytron in celice centrifugiramo pri 5000 g 30 minut. Celice nato liziramo s katerokoli konvencionalno tehniko, kot so npr. tonični šok, sonifikacija, tlačno cikliranje, kemijski ali encimatski postopki. Npr., zgornji izprani celični pelet lahko resuspendiramo v drugih 10 volumnih pufra za razkroj celic s homogenizatorjem in celično suspenzijo spustimo skozi napravo za razkroj celic (LH Celi Disrupter; LH Inceltech, Inc.) ali skozi mikrofluidizator (Microfluidizer; Microfluidics International) po navodilih izdelovalca. Delce snovi, ki vsebujejo TPO, nato ločimo od tekoče faze in v danem primeru izperemo s prikladno tekočino. Npr. suspenzijo celičnega lizata lahko centrifugiramo pri 5000 g 30 minut, resuspendiramo in v danem primeru drugič centrifugiramo, da naredimo izprani pelet refraktilnih teles.

Izprani pelet lahko uporabimo takoj ali v danem primeru zamrznjenega shranimo (pri približno -70 °C).

B. Solubiliziranje in čiščenje monomemega TPO

Netopen TPO v peletu refraktilnih teles nato solubiliziramo s solubilizimim pufrom. Solubilizimi pufer vsebuje kaotropično sredstvo in ima navadno s pufrom naravnan bazični pH ter vsebuje redukcijsko sredstvo za izboljšanje dobitka monomemega TPO. Ustrezna kaotropična sredstva vključujejo sečnino, gvanidin.HCl in natrijev tiocianat. Prednostno kaotropično sredstvo je gvanidin.HCl. Koncentracija kaotropičnega sredstva je navadno 4-9M, prednostno 6-8M. pH solubilizimega pufra vzdržujemo s katerimkoli prikladnim pufrom v območju od približno 7,5 do 9,5, prednostno 8,0-9,0 in najbolj prednostno 8,0. Prednostno solubilizimi pufer vsebuje tudi redukcijska sredstva zaradi lažje tvorbe monomeme oblike TPO. Prikladna redukcijska sredstva vključujejo organske spojine, ki vsebujejo prosti tiol (RSH). Reprezentativna redukcijska sredstva vključujejo ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), merkaptoetanol, glutation (GSH), cisteamin in cistein. Prednostno redukcijsko sredstvo je ditiotreitol (DTT). V danem primem lahko solubilizimi pufer vsebuje blago oksidacijsko sredstvo (npr. molekulami kisik) in sulfitno sol, da nastane monomemi TPO preko sulfitolize. V tej izvedbi nastali TPO-S-sulfonat kasneje renaturiramo v prisotnosti redoks pufra (npr. GSH/GSSG), da dobimo pravilno zguban TPO.

Protein TPO navadno nadalje očistimo z uporabo npr. centrifugiranja, gelske filtracijske kromatografije in kolonske kromatografije z reverzno fazo.

Za ilustracijo navajamo naslednji postopek, s katerim smo dobili ugodne dobitke monomemega TPO. Pelet refraktilnih teles resuspendiramo v približno 5 masnih volumnih solubilizimega pufra (tris (20 mM), pH 8, z gvanidinom (6-8 M) in DTT (25 mM)) ter mešamo 1-3 ure ali preko noči pri 4 °C, da povzročimo solubilizacijo proteina TPO. Visoke koncentracije sečnine (6-8 M) so tudi uporabne, vendar dajo na splošno nekoliko nižje dobitke, če jih primerjamo z gvanidinom. Po solubilizaciji raztopino centrifugiramo pri 30000 g 30 minut, da dobimo bister supematant, ki vsebuje denaturiran monomeren protein TPO. Supematant nato kromatografiramo na gelski filtracijski koloni superdeks 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) pri hitrosti pretoka 2 ml/min in protein eluiramo z Na-fosfatom (20 mM), pH 6,0 z DTT (10 mM). Frakcije, ki vsebujejo monomemi denaturirani protein TPO, ki se eluirajo med

160 in 200 ml, zberemo v pool. Protein TPO nadalje očistimo na semipreparativni koloni z reverzno fazo C4 (2 x 20 cm VYDAC). Vzorec nanesemo s 5 ml/min na kolono, uravnoteženo v TFA (trifluoroocetna kislina (0,1 %)) z acetonitrilom (30 %). Protein eluiramo z linearnim gradientom acetonitrila (30-60 % v 60 min). Očiščeni reducirani protein se eluira približno pri 50 % acetonitrilu. To snov uporabimo za renaturiranje, da dobimo biološko aktivno varianto TPO.

C. Renaturiranje TPO, da dobimo biološko aktivno obliko

Po solubilizaciji in nadaljnjem čiščenju TPO dobimo biološko aktivno obliko z renaturiranjem denaturiranega monomemega TPO v redoks pufru. Zaradi visoke zmogljivosti TPO (polovica maksimalne stimulacije v testu Ba/F3 je dosežena pri približno 3 pg/ml) je možno, da dobimo biološko aktivno snov z uporabo različnih številnih pufrov, detergentov in redoks pogojev. Vendar pa pri večini pogojev dobimo le majhno količino pravilno zgubane snovi (<10 %). Za komercialne proizvodne postopke je želeno, da imajo vsaj 10 % dobitke renaturiranja, bolj prednostno 30-50 % in najbolj prednostno >50 %. Za mnoge, različne detergente, ki vključujejo Triton Χ-100, dodecil-beta-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozil, Tween 20 in Tween 80, Zwittergent 3-14 in druge, smo ugotovili, da so prikladni za izdelovanje vsaj nekoliko pravilno zgubane snovi. Od teh so najbolj prednostni detergenti iz družine CHAPS (CHAPS in CHAPSO), za katere smo ugotovili, da delujejo najbolje pri reakciji renaturiranja in da omejijo agregacijo proteina in nepravilno bisulfidno tvorbo. Nivoji CHAPS, ki so večji kot približno 1 %, so najbolj prednostni. Natrijev klorid je potreben za najboljše dobitke z optimalnimi nivoji med 0,1 M in 0,5 M. Prisotnost EDTA (1-5 mM) v redoks pufru je prednostna, da omeji oksidacijo, katalizirano s kovino (in agregacijo), zaznano pri nekaterih pripravkih. Koncentracije glicerola, večje od 15 %, ustvarijo optimalne pogoje za renaturiranje. Za maksimalne dobitke je bistveno, da imamo redoks par v redoks pufru, ki je sestavljen tako iz oksidiranega kot tudi iz reduciranega organskega tiola (RSH). Prikladni redoks pari vključujejo merkaptoetanol, glutation (GSH), cisteamin, cistein in njihove ustrezne oksidirane oblike. Prednostni redoks pari so glutation (GSH): oksidirani glutation (GSSG) ali cistein:cistin. Najbolj prednostni redoks parje glutation (GSH):oksidirani glutation (GSSG). Na splošno dobimo visoke dobitke, če sta oksidirani in reducirani član redoks para v enakem molskem razmerju oz. je oksidirani član v prebitku. pH vrednosti med 7,5 in približno 9 so optimalne za renaturiranje teh variant TPO. Organska topila (npr. etanol, acetonitril, metanol) toleriramo pri koncentracijah od 10 do 15 % ali nižjih. Višji nivoji organskih topil zvečajo količino nepravilno zgubanih oblik. Tris in fosfatni pufri so na splošno uporabni. Inkubacija pri 4 °C prav tako daje visoke nivoje pravilno zgubanega TPO.

40-60 % dobitki renaturiranja (glede na količino reduciranega in denaturiranega TPO, uporabljenega v reakciji renaturiranja) so značilni za pripravke TPO, ki jih očistimo v prvi stopnji C4. Aktivno snov lahko dobimo, če so pripravki manj čisti (npr. direktno po koloni superdeks 200 ali po začetni ekstrakciji refraktilnih teles), čeprav so dobitki manjši zaradi obsežne precipitacije in interference ne-TPOproteinov med postopkom renaturiranja TPO.

Ker TPO vsebuje 4 cisteinske ostanke, je možno, da naredimo 3 različne disulfidne verzije proteina:

verzija 1: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-4 in 2-3 verzija 2: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-2 in 3-4 verzija 3: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-3 in 2-4.

Med začetnim raziskovanjem določevanja pogojev renaturiranja smo ločili številne različne vrhove, ki vsebujejo protein TPO, s kromatografijo z reverzno fazo C4. Le eden od teh vrhov ima značilno biološko aktivnost, ugotovljeno s testom Ba/F3. Kasneje smo pogoje renaturiranja optimizirali, da smo dobili to prednostno verzijo. Pri teh pogojih je nepravilno zgubanih verzij manj od 10-20 % celotnega monomemega TPO, dobljenega v stopnji solubiliziranja.

Za disulfidni model biološko aktivnega TPO je bilo ugotovljeno z masno spektrometrijo in proteinskim sekvenciranjem, da je verzija z disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-4 in 2-3, pri čemer so cisteini oštevilčeni zaporedno od aminoterminala. Ta model cisteinskega premreževanja je konsistenten z znanim modelom disulfidnih vezav sorodne molekule eritropoetina.

D. Biološka aktivnost rekombinantnega renaturiranega TPO

Renaturirani in očiščeni TPO ima aktivnost tako pri testu in vitro kot tudi in vivo. Npr. pri testu Ba/F3 dosežemo polovično maksimalno stimulacijo vgraditve timidina v celice Ba/F3 za TPO (Met'¹1-153) pri 3,3 pg/ml (0,3 pM). V ELISI, ki temelji na receptorju mpl, pride do polovične maksimalne aktivnosti pri 1,9 ng/ml (120 pM). V normalnih živalih in takih z mielosupresijo, dobljenih s skoraj letalnim obsevanjem z rentgenskimi žarki, je renaturirani TPO (Met¹ 1-153) visoko zmogljiv (aktivnost opazna pri nizkih dozah, kot npr. 30 ng/miš) za stimulacijo nastajanja novih trombocitov. Podobno biološko aktivnost opazimo tudi pri drugih oblikah renaturiranega TPO v skladu z zgoraj opisanimi postopki (sl. 25,26 in 28).

14. Postopki za merjenje trombopoetične aktivnosti

Trombopoetično aktivnost lahko izmerimo z različnimi testi, ki vključujejo test mpl liganda Ba/F3 (opisano v Primeru 1), test oživitve sinteze mišjih trombocitov in vivo, test indukcije celičnega površinskega antigena trombocitov, kot ga izmerimo z antitrombocitnim imunotestom (anti-GPII_bIII_a) za humano levkemično megakarioblastično celično linijo (CMK) (Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72:184-190 [1989]) (glej tudi test tekočinske suspenzijske megakariocitopoeze; opisano v Primeru 4), in indukcijo poliploidizacije v megakarioblastni celični liniji (DAMI) (Ogura et al., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Zorenje megakariocitov iz nezrelih, pretežno DNA nesintetizimih celic, v megakariocite, ki se dajo morfološko identificirati, obsega postopek, ki vključuje nastanek citoplazemskih organelov, akvizicijo membranskih antigenov (GPII_bIII_a), endoreplikacijo in sproščanje trombocitov, kot je opisano v ozadju. Za rodovno specifični promotor (t.j. mpl ligand) megakariocitnega zorenja bi pričakovali, da inducira vsaj nekaj od teh sprememb v nezrelih megakariocitih, odločujočih za sproščanje trombocitov in zmanjšanje trombocitopenije. Testi so torej oblikovani za megenje dejanske pojavnosti teh parametrov v nezreli megakariocitni celični liniji, t.j. celicah CMK in DAMI. Test CMK (Primer 4) meri nastanek specifičnega trombocitnega markeg'a, GPII_bIII_a in izgubljanje trombocitov. Test DAMI (Primer 15) meri endoreplikacijo, ker so porasti v ploidiji pristni znaki megakariocitov. Spoznavni megakariociti imajo ploidne vrednosti 2N, 4N, 8N, 16N, 32N itd.. Končno je test oživitve mišjih trombocitov in vivo (Primer 16) koristen za to, da prikažemo, da je posledica dajanja testne spojine (tukaj mpl ligand) zvečanje števila trombocitov.

Dva dodatna testa in vitro sta razvita za megenje aktivnosti TPO. Prvi je analiza, ki temelji na aktivaciji kinaznega receptorja (KIRA) ELISA, v katerem celice CHO transfektiramo s kimemim mp/-Rse, tirozinsko fosforiliziranje Rse pa izmerimo s testom ELISA po izpostavitvi kimemega mpl dela mpl ligandu (Primer 17). Drugi pa je ELISA, ki temelji na receptogu, pri čemer zajčji antihumani IgG, razmazan na plošči za test ELISA, zajame (kaptira) humani kimemi receptor mp/-IgG, ki veže mpl ligand, ki ga testiramo. Biotinilirano zajčje poliklonsko protitelo za mpl ligand (TPO₁₅₅) uporabimo, da detektiramo vezani mpl ligand, ki ga izmerimo z uporabo streptavidin-peroksidaze, kot je opisano v Primeru 18.

15. Biološki odziv in vivo normalnih in subletalno obsevanih miši, obdelanih s TPO

Tako normalne kot tudi subletalno obsevane miši obdelamo s skrajšanim TPO in s takim s popolno dolžino, izoliranim iz ovarijskih celic kitajskega hrčka (celice CHO),

E. coli, in 293 celic humanih embrionalnih ledvic. Obe obliki TPO, nastali v teh treh gostiteljih, stimulirata nastajanje trombocitov v miših, vendar pa TPO s popolno dolžino, izoliran iz CHO, ustvari največji odziv in vivo. Iz teh rezultatov je razvidno, da je pravilna glikozilacija karboksi-terminalne domene verjetno potrebna za optimalno aktivnost in vivo.

(aJE-coli-rh-TTO^·¹,^

Obliko Met EPO-domene (Met v položaju -1 plus prvih 153 ostankov humanega TPO), nastalo v E. coli (Primer 23), injiciramo dnevno v normalne samice miši C57 B6, kot je opisano v legendah na sl. 25A, 25B in 25C. Te slike prikazujejo, da je neglikozilirana skrajšana oblika TPO, nastala v E.coli, in renaturirana, kot je opisano zgoraj, sposobna, da stimulira približno 2-kratno zvečanje nastajanja ploščic v normalnih miših, ne da bi vplivala na populacijo eritrocitov ali levkocitov.

Ista molekula, injicirana dnevno v subletalno obsevane (¹³⁷Cs) samice miši C57 B6, kot je opisano v legendah na sl. 26A, 26B in 26C, stimulira rekuperirane trombocitov in vpliva na najnižjo točko, vendar pa ne vpliva na eritrocite ali levkocite.

(b) CHO-rhTPO₃₃₂

Oblika TPO s popolno dolžino, izdelana v CHO in injicirana dnevno v normalne samice miši C57 B6, kot je opisano v legendah na sl. 27A, 27B in 27C, ustvari približno 5-kratno zvečanje nastajanja trombocitov v normalnih miših, ne da bi vplivala na populacijo eritrocitov ali levkocitov.

(c) CHO-rhTPO₃₃₂; E. coli-rhTPO^'¹153); 293-rhTPO₃₃₂; in E. coli-rhTPO₁₅₅.

Krivulje odziva na dozo konstruiramo za obdelovanje normalnih miši z rhTPO iz različnih celičnih linij (CHO-rhTPO₃₃₂; E. coli-rhTPO^'¹153); 293-rhTPO₃₃₂ in

E. coli-rhTPO₁₅₅), kot je opisano v legendi na sl. 28. Ta slika prikazuje, da vse testirane oblike molekule stimulirajo nastajanje trombocitov, vendar pa ima oblika s popolno dolžino, nastala v CHO, največjo aktivnost in vivo.

(d) CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPOpristrižen in CHO-rhTPO₃₃₂

Konstruiramo tudi krivuljo odziva na dozo za obdelovanje normalnih miši z različnimi oblikami rhTPO, narejenega v CHO (CHO-rhTPO₁₅₃, CHOrhTPOpristrižen in CHO-rhTPO^), kot je opisano v legendi na sl. 29. Ta slika prikazuje, da vse testirane oblike molekule CHO stimulirajo nastajanje trombocitov, vendar pa ima oblika s popolno dolžino 70 kDa največjo aktivnost in vivo.

16. Splošna rekombinantna priprava mpl liganda in variant

Prednostno mpl ligand pripravimo s standardnimi rekombinantnimi postopki, ki vključujejo izdelovanje mpl Ugandskega poUpeptida s kultiviranjem cehe, transfektiranih za ekspresijo nukleinske kisline mpl Uganda (značilno s transformiranjem celic z ekspresijskim vektorjem) in rekuperiranje poUpeptida iz ceUc. UgotoviU smo, da v danem primeru mpl Ugand lahko izdelamo s homologno rekombinacijo aU rekombinantnimi postopki z uporabo kontrolnih elementov, uvedenih v ceUce, ki že vsebujejo DNA, ki kodira mpl Ugand. Npr., močan element promotor/spodbujevalec, supresor aU eksogeni transkripcijski modulatomi element lahko inseriramo v genom predvidene gostiteljske ceUce v zadovoljivi bližini in orientaciji, da vpUva na transkripcijo DNA, ki kodira želeni mpl Ugandski poUpeptid. Kontrolni element ne kodira mpl Uganda, ampak je prej DNA indigena za genom gostiteljske ceUce. Naslednji pa selekcionira ceUce za izdelavo receptorskega poUpeptida v smislu izuma aU za zvečanje aU zmanjšanje nivojev ekspresije, če je potrebno.

V smislu izuma torej preučujemo postopek za izdelavo mpl Uganda, ki obsega insercijo v genom ceUce, ki vsebuje molekulo nukleinske kisline mpl Uganda, transkripcijskega modulatornega elementa v zadovoljivi bližini in orientaciji glede na molekulo nukleinske kisline, da vpUva na njeno transkripcijo, in v danem primeru nadaljnjo stopnjo, ki obsega kultiviranje ceUce, ki vsebuje transkripcijski modulatomi element in molekulo nukleinske kisline. Predloženi izum prav tako preučuje gostiteljsko celico, ki vsebuje indigeno molekulo nukleinske kisline mpl Uganda, funkcionalno vezano na eksogene kontrolne sekvence, spoznane od gostiteljske ceUce.

A. Izolacija DNA, ki kodira mpl Ugandski poUpeptid

DNA, ki kodira mpl Ugandski poUpeptid, lahko dobimo iz katerekoU knjižnice cDNA, pripravljene iz tkiva, za katerega verjamemo, da ima mRNA mpl Uganda in da le-to eksprimira na nivoju, ki se da detektirati. Gen mpl Uganda prav tako lahko dobimo iz knjižnice genomske DNA aU z oUgonukleotidno sintezo in vitro iz kompletne nukleotidne ali aminokislinske sekvence.

Knjižnice selekcioniramo s sondami, oblikovanimi tako, da identificirajo gen, ki nas zanima, aU protein, ki ga le-ta kodira. Za ekspresijske knjižnice cDNA prikladne sonde vključujejo monoklonska aU poliklonska protitelesa, ki spoznajo mpl Ugand in se specifično vežejo nanj. Za knjižnice cDNA prikladne sonde vključujejo oUgonukleotide s približno 20-80 bazami v dolžini, ki kodirajo znane aU domnevne dele cDNA mpl Uganda iz enakih aU razUčnih vrst in/aU komplementarne aU homologne cDNA aU njihove fragmente, ki kodirajo enak ali podoben gen. Ustrezne sonde za selekcioniranje knjižnic genomske DNA vključujejo, vendar ne omejujoče, oUgonukleotide, cDNA aU njihove fragmente, ki kodirajo enak aU podoben gen in/aU homologne genomske DNA ali njihove fragmente. Selekcioniranje cDNA ali genomske knjižnice z izbrano sondo lahko izvedemo z uporabo standardnih postopkov, kot je opisano v poglavjih 10-12 avtorja Sambrooka et al., zgoraj.

Alternativni način, da izoUramo gen, ki kodira mpl Ugand je, da uporabimo metodologijo PCR, kot je opisana v odstavku 14 avtorja Sambrooka et al., zgoraj. Ta postopek zahteva uporabo oUgonukleotidnih sond, ki se hibridizirajo z DNA, ki kodira mpl Ugand. Strategije za selekcijo oligonukleotidov so opisane spodaj.

V prednostnem postopku v smislu izuma uporabimo natančno izbrane oUgonukleotidne sekvence, da selekcioniramo knjižnice cDNA iz razUčnih tkiv, prednostno ceUčne Unije humanih ali prašičjih ledvic (odraslih aU fetalnih) aU jeter. Npr. knjižnice cDNA ceUčne Unije humanih fetalnih jeter selekcioniramo z oUgonukleotidnimi sondami. Alternativno lahko humane genomske knjižnice selekcioniramo z oUgonukleotidnimi sondami.

OUgonukleotidne sekvence, izbrane kot sonde, morajo biti dovolj dolge in dovolj nedvoumne, da so napačni pozitivi minimalni. Dejanska nukleotidna sekvenca je navadno oblikovana na osnovi regij mpl liganda, ki imajo najmanjšo kodonsko izobilje. Oligonukleotidi so lahko degenerirani na enem ali več položajih. Uporaba degeniranih oligonukleotidov je posebno pomembna, kadar je knjižnica selekcionirana iz vrste, v kateri preferenčna uporaba kodona ni znana.

Oligonukleotid mora biti označen tako, da ga lahko detektiramo po hibridizaciji z DNA v knjižnici, ki jo selekcioniramo. Prednosten postopek označevanja je uporaba ATP (npr. -γ³²Ρ) in polinukleotidne kinaze, da radioaktivno označimo 5’ konec oligonukleotida. Vsekakor pa so uporabni tudi drugi postopki za označevanje oligonukleotidov, vključno, vendar ne omejujoče, biotiniliranje ali encimsko označevanje.

Posebno zanimiva je nukleinska kislina mpl liganda, ki kodira mpl Ugandski polipeptid s popolno dolžino. V nekaterih prednostnih izvedbah sekvenca nukleinske kisline vključuje signalno sekvenco naravnega mpl liganda. Nukleinsko kislino, ki ima vso proteinsko kodirno sekvenco, dobimo s selekcioniranjem izbrane cDNA ali genomskih knjižnic z uporabo deducirane aminokislinske sekvence.

B. Variante aminokislinske sekvence naravnega mpl Uganda

Variante aminokislinske sekvence mpl Uganda pripravimo z uvedbo ustreznih nukleotidih sprememb v DNA mpl Uganda aU s sintezo in vitro želenega mpl Ugandskega polipeptida. Take variante vključujejo npr. delecije aU insercije aU substitucije ostankov v aminokisUnski sekvenci za prašičji mpl Ugand. Npr. karboksi-terminalne dele zrelega mpl Uganda s popolno dolžino lahko odstranimo s proteoUtično cepitvijo bodisi in vivo aU in vitro ali s kloniranjem aU eksprimiranjem fragmenta aU DNA, ki kodira mpl Ugand s popolno dolžino, da dobimo biološko aktivno varianto. Vse kombinacije delecij, insercij in substitucij naredimo zato, da pridemo do končnega konstrukta, pod pogojem, da ima končni konstrukt želeno biološko aktivnost. AminokisUnske spremembe lahko spremenijo post translacijske postopke mpl Uganda, kot je npr. sprememba števila ali položajev mest za glikozilacijo. Za modeliranje variant aminokisUnske sekvence mpl Uganda sta lokacija mesta mutacije in narava mutacije odvisni od značilnosti mpl liganda, ki ga modificiramo. Mesta za mutacijo lahko modificiramo individualno aU v seriji, npr. (1) s substitucijo najprej s konzervativnimi izbirami amino kislin in nato z bolj radikalnimi selekcijami, odvisno od doseženih rezultatov, (2) z delecijo ciljnega ostanka ali (3) z insercijo ostankov enakega ali razUčnega razreda zraven lociranega mesta ali s kombinacijami opcij 1-3.

Uporaben postopek za identifikacijo določenih ostankov ali regij mpl Ugandskega poUpeptida, ki so prednostne lokacije za mutagenezo, je imenovan alaninska skenirna mutageneza, ki jo opisujejo Cunningham in WeUs, Science, 244:1081-1085 [1989]. Pri tem ostanek aU skupino ciljnih ostankov identificiramo (npr. nabiti ostanki, kot npr. arg, asp, his, lys in glu) in nadomestimo s katerokoli, prednostno pa z nevtralno ali negativno nabito amino kislino (najbolj prednostno alanin ali poUalanin), da vpUvamo na interakcijo amino kislin z obdajajočim vodnim okoljem v ceUci ali zunaj nje. Tiste domene, ki imajo funkcionalno občutljivost za substitucije, nato očistimo z uvedbo nadaljnjih aU drugih variant na aU za mesta za substitucijo. Medtem ko je mesto za uvedbo variante aminokislinske sekvence predhodno določeno, pa za naravo same mutacije ni potrebno, daje predhodno določena. Npr., da optimiziramo izvedbo mutacije na določenem mestu, vodimo ala-skeniranje ali naključno mutagenezo na ciljnem kodonu aU regiji, eksprimirane variante mpl Uganda pa selekcioniramo za optimalno kombinacijo želene aktivnosti.

V konstrukciji variante aminokislinske sekvence sta dve načelni spremenljivki: lokacija mesta mutacije in narava mutacije. Npr. variante mpl Ugandskega poUpeptida vključujejo variante sekvence mpl Uganda in lahko pomenijo naravne alele (za katere ni potrebna manipulacija DNA mpl Uganda), aU predhodno določene mutantne oblike, narejene z mutacijo DNA, da dobimo alelo aU varianto, ki se ne nahaja v naravi. Na splošno je izbira lokacije in narave mutacije odvisna od značilnosti mpl Uganda, ki ga modificiramo.

Delecije aminokislinske sekvence obsegajo na splošno približno 1 do 30 ostankov, bolj prednostno približno 1 do 10 ostankov, in so značilno sosednje. Alternativno lahko delecije aminokisUnske sekvence za mpl Ugand vključujejo del karboksiterminalne glikoproteinske domene aU celotno. Delecije aminokisUnske sekvence lahko vključujejo tudi enega ali več od prvih 6 amino-terminalnih ostankov zrelega proteina. Opcijske delecije aminokisUnske sekvence obsegajo enega aU več ostankov v eni aU več regijah zank, ki obstajajo med spleti vijačnic. Sosednje delcije navadno naredimo tako, da obsegajo parno število ostankov, vendar pa so v obsegu predloženega izuma tudi delecije posameznih in neparnega števila ostankov. Delecije lahko uvedemo v regije z nizko homologijo med mpl Ugandi, ki prispevajo največ sekvenčne identičnosti, da modificiramo aktivnost mpl Uganda. Delecije pa lahko uvedemo tudi v regije z nizko homologijo med humanim mpl Ugandom in drugimi mpl Ugandskimi poUpetidi sesalca, ki prispevajo največ sekvenčne identičnosti za humani mpl ligand. Bolj verjetno je, da delecije mpl Ugandskega poUpeptida sesalca na področjih bistvene homologije z drugimi mpl Ugandi sesalca bolj značilno modificirajo biološko aktivnost mpl Uganda. Število sosednjih delecij izberemo tako, da ohranimo terciarno strukturo mpl Ugandov v prizadeti domeni, npr. beta nagubana ravnina aU alfa vijačnica.

Insercije aminokislinske sekvence vključujejo amino- in/aU karboksilne-terminalne fuzije z dolžinami, ki obsegajo en ostanek, do poUpetidov s 100 aU več ostanki, kot tudi intrasekvenčne insercije posameznih aU multiplih aminokislinskih ostankov. Intrasekvenčne insercije (t.j. insercije v sekvenci zrelega mpl Uganda) lahko obsegajo na splošno približno 1 do 10 ostankov, bolj prednostno 1 do 5, še bolj prednostno 1 do 3. Zgledno prednostna je fuzija mpl Uganda aU njegovega fragmenta in drugega citokina aU njegovega fragmenta. Primeri terminalnih insercij vključujejo zreU mpl Ugand z N-terminalnim metionilnim ostankom, artefakt direktne ekspresije zrelega mpl Uganda v rekombinantni ceUčni kulturi in fuzijo heterologne N-terminalne signalne sekvence z N-terminalom molekule zrelega mpl Uganda, da se pospeši sekrecija zrelega mpl Uganda iz rekombinantnih gostiteljev. Take signalne sekvence - in na ta način tudi homologne - dobimo na splošno iz predvidenih vrst gostiteljskih ceUc. Prikladne sekvence vključujejo STII ali Ipp za E. coU, alfa faktor za kvasovke in virusne signale, kot npr. herpes gD za celice sesalcev.

Druge insercijske variante molekule mpl liganda vključujejo fuzijo z N- ali C-terminalom mpl Uganda imunogenih poUpeptidov (t.j., niso endogeni za gostitelja, na katerem izvajamo fuzijo), kot so npr.: bakterijski poUpeptidi, kot je beta laktamaza aU encim, kodiran z lokusom E. coU trp, aU protein kvasovk in C-terminalne fuzije s proteini, ki imajo dolgo razpolovno dobo, kot npr. imunoglobulinske konstantne regije (aU druge imunoglobulinske regije), albumin aU feritin, kot je opisano v WO 89/02922 objavljeno 6. aprila 1989.

Tretja skupina variant so aminokislinske substitucije. Te variante imajo odstranjen vsaj en aminokislinski ostanek v molekuU mpl Uganda odstranjen, na njegovo mesto pa je vstavljen drugačen ostanek. Mesta, ki so najbolj zanimiva za substitucijsko mutagenezo, vključujejo tista, ki so identificirana kot aktivna mesta mpl Uganda in tista, kjer so amino kisline, ki so ugotovljene v drugih analogih, v bistvu drugačne glede obsega stranske verige, naboja ah hidrofobnosti, vendar pa obstaja tudi visoka stopnja sekvenčne identičnosti na izbranem mestu med razUčnimi vrstami mpl Uganda in/ali v razUčnih živalskih analogih enega člana mpl Uganda.

Druga zanimiva mesta so tista, kjer so posebni ostanki mpl liganda, dobljenega iz članov različnih družin in/ali živalskih vrst, identični v enem članu. Ta mesta, posebno tista, ki so znotraj sekvence vsaj treh drugih identično konzerviranih mest, so substituirana na relativno konzervativen način. Takšne konzervativne substitucije so prikazane v tabeli 3 pod naslovom prednostne substitucije. Če je posledica teh substitucij sprememba biološke aktivnosti, potem uvedemo več bistvenih sprememb, ki so v tabeli 3 imenovane zgledne substitucije, ali kot je dalje spodaj opisano pri navajanju aminokislinskih razredov, in produkte selekcioniramo.

TABELA 3

Originalni	Zgledne	Prednostne
ostanek	substitucije	substitucije
Ala (A)	Val; Leu; De	Val
Arg(R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn(N)	Gin; His; Lys; Arg	Gin
Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe;
	norleucin	Leu
Leu (L)	norleucin; De; Val; Met; Ala; Phe	De
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; De	Leu
Phe (F)	Leu; Val; De; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	De; Leu; Met; Phe;

Ala; norlevcin Leu

Bistvene modifikacije v funkciji ali imunološki identičnosti mpl liganda izvedemo z izbiranjem substitucij, ki se značilno razlikujejo po njihovem učinku na vzdrževanje (а) strukture polipeptidnega ogrodja na področju substitucij, npr. ravninska ali vijačna konformacija, (b) naboja ali hidrofobnosti molekule na ciljnem mestu ali (c) obsežnosti stranske verige. Naravni ostanki so razdeljeni v skupine, ki temeljijo na splošnih lastnostih stranske verige:

(1) hidrofoben: norlevcin, Met, Ala, Val, Leu, Ile (2) nevtralno hidrofilen: Cys, Ser, Thr (3) kisel: Asp, Glu (4) bazičen: Asn, Gin, His, Lys, Arg (5) ostanki, ki vplivajo na orientacijo verige: Gly, Pro in (б) aromatski: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne substitucije sprožijo zamenjavo enega člana teh razredov z drugim. Take substituirane ostanke lahko uvedemo tudi v konzervativna substitucijska mesta ali bolj prednostno v preostala (nekonzervirana) mesta.

V eni izvedbi v smislu izuma je želeno, da inaktiviramo eno ali več proteaznih cepišč, ki so v molekuli. Ta mesta so identificirana z nadzorom kodirane aminokislinske sekvence, v primeru tripsina, npr. za arginilm ali lizililni ostanek. Ko identificiramo proteazna cepišča, jih naredimo neaktivna za proteolitično cepitev s substituiranjem ciljnega ostanka z drugim ostankom, prednostno bazičnim ostankom, kot npr. glutaminom ali hidrofobnim ostankom, kot je serin z delecijo ostanka ali z insercijo prolilnega ostanka, takoj po ostanku.

V drugi izvedbi substituiramo katerikoli metionilni ostanek, drugačen od začetnega metionilnega ostanka signalne sekvence, ali katerikoli ostanek, lociran znotraj približno treh ostankov N- ali C-terminala za vsak tak metionilni ostanek, z drugim ostankom (prednostno v skladu s tabelo 3), ali deletiramo. Alternativno lahko inseriramo približno 1-3 ostanke zraven takšnih mest.

Vsak cisteinski ostanek, ki ni vključen v vzdrževanje pravilne konformacije mpl liganda, prav tako lahko substituiramo na splošno s serinom, da izboljšamo oksidativno stabilnost molekule in preprečimo zmotno premreženje. Ugotovili smo, da sta prvi in četrti cistein v EPO domeni, oštevilčeno od amino-terminala, potrebna za vzdrževanje pravilne konformacije, drugi in tretji pa ne. Zato lahko drugi in tretji cistein v EPO domeni substituiramo.

Molekule nukleinske kisline, ki kodirajo variante amino kislinske sekvence mpl liganda, pripravimo z raznimi postopki, znanimi v tehniki. Ti postopki vključujejo, vendar ne omejujoče, izolacijo iz naravnega vira (v primeru variant naravne aminokislinske sekvence) ali pripravo z oligonukleotidno posredovano (ali položajno usmerjeno) mutagenezo, mutagenezo PCR in kasetno mutagenezo predhodno pripravljene variante ali ne-variante mpl Ugandskega polipeptida.

OUgonukleotidno posredovana mutageneza je prednostni postopek za pripravo substitucijskih, delecijskih in insercijskih variant DNA mpl Uganda. Ta tehnika je dobro znana in jo opisujejo Adelman et al., DNA, 2:183 [1983]. Na kratko, DNA mpl Uganda spremenimo s hibridiziranjem oUgonukleotida, ki kodira želeno mutacijo za kalup DNA, kjer je kalup enojnovijačna oblika plazmida aU bakteriofaga, ki vsebuje nespremenjeno ali naravno sekvenco DNA mpl Uganda. Po hibridizaciji uporabimo polimerazo DNA za sintezo celotne druge komplementarne vijačnice kalupa, ki na ta način vgradi oUgonukleotidni primer in kodira za izbrano spremembo v DNA mpl Uganda.

Na splošno uporabimo oUgonukleotide z dolžino vsaj 25 nukleotidov. Optimalni oUgonukleotid ima 12 do 15 nukleotidov, ki so popolnoma komplementarni s kalupom na obeh straneh nukleotidov, ki kodirajo za mutacijo. To zagotavlja, da se oligonukleotid pravilno hibridizira s kalupom enojnovijačne molekule DNA. OUgonukleotide enostavno sintetiziramo z uporabo tehnik, znanih strokovnjakom, kot jih opisujejo Crea et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 75:5765 [1978].

Kalup DNA lahko naredimo s tistimi vektoiji, ki so bodisi izvedeni iz vektorjev bakteriofaga M13 (komercialna dosegljiva vektorja M13mpl8 in M13mpl9 sta primerna), ali takih, ki vsebujejo fagni-enojnovijačni izvor replikacije, kot to opisujejo Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 [1987]. Na ta način DNA, ki jo je potrebno mutirati, lahko inseriramo v enega od teh vektorjev, da naredimo enojnovijačni kalup. Izdelava enojnovijačnega kalupa je opisana v odstavkih 4.21-4.41 avtorja Sambrooka et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY1989).

Alternativno lahko naredimo kalup enojnovijačne DNA z denaturiranjem dvojnovijačnega plazmida (ali drugega) DNA z uporabo standardnih tehnik.

Za spremembo sekvence naravne DNA (za izdelavo variant aminokislinske sekvence) oligonukleotid hibridiziramo z enojnovijačnim kalupom pri prikladnih pogojih za hibridizacijo. Nato dodamo DNA polimerizimi encim, navadno Klenow fragment DNA polimeraze I, da sintetiziramo komplementarno vijačnico kalupa z uporabo oligonukleotida kot primerja za sintezo. Na ta način se tvori heterodupleksna molekula, tako da ena vijačnica DNA kodira mutirano obliko mpl Uganda, druga vijačnica (originalni kalup) pa kodira naravno nespremenjeno sekvenco mpl Uganda. To heterodupleksno molekulo nato transformiramo v prikladno gostiteljsko ceUco, ki je navadno prokariot, kot npr. E. coli JM101. Potem ko ceUce zrastejo, jih zasadimo na agarozne plošče in selekcioniramo z uporabo oUgonukleotidnega primerja, radioktivno označenega z 32-fosfatom, da identificiramo bakterijske kolonije, ki vsebujejo mutirano DNA. Mutirano regijo nato odstranimo in damo v ustrezen vektor za izdelavo proteina, na splošno ekspresijski vektor tipa, ki se značilno uporablja za transformacijo ustreznega gostitelja.

Postopek, opisan tik pred tem zgoraj, lahko modificiramo tako, da oblikujemo homodupleksno molekulo, v kateri obe vijačnici plazmida vsebujeta mutacije. Modifikacije so naslednje: enojnovijačni oUgonukleotid aneliramo na enojnovijačni kalup, kot je opisano zgoraj. Zmes treh deoksiribonukleotidov, deoksiriboadenozina (dATP), deoksiribogvanozina (dGTP) in deoksiribotimidina (dlTP) kombiniramo z modificiranim tiodeoksiribocitozinom, imenovanim dCTP-(aS) (ki ga lahko dobimo pri Amersham Corporation). To zmes dodamo k kalupnemu oUgonukleotidnemu kompleksu. Po dodatku polimeraze DNA k tej zmesi nastane vijačnica DNA, identična kalupu, razen za mutirane baze. Poleg tega ta nova vijačnica DNA vsebuje dCTP-(aS) namesto dCTP, ki jo varuje pred restrikcijsko endonukleazno digestijo.

Potem ko vijačnico kalupa dvojnovijačnega heterodupleksa prelomimo z ustreznim restrikcijskim encimom, lahko vijačnico kalupa digeriramo z nukleazo ΕχοΙΙΙ ali drugo ustrezno nukleazo zunaj regije, ki vsebuje mesta za mutagenezo. Reakcijo nato ustavimo, da ostane molekula, ki je le delno enojnovijačna. Popolni homodupleks dvojnovijačne DNA nato tvorimo z uporabo polimeraze DNA v prisotnosti vseh štirih deoksiribonukleotidnih trifosfatov ATP in ligaze DNA. To molekulo homodupleksa lahko nato transformiramo v prikladno gostiteljsko celico, kot je E. coli JM101, kot je opisano zgoraj.

DNA, ki kodira mutante mpl liganda, v katerih je potrebno substituirati več kot eno amino kislino, lahko izdelamo na različne načine. Če so amino kisline locirane blizu skupaj v polipeptidni verigi lahko mutirajo simultano z uporabo tistega oligonukleotida, ki kodira za vse želene aminokislinske substitucije. Če pa so amino kisline locirane v neki razdalji ena od druge (ločene z več kot približno 10 amino kislinami), je bolj težko, da naredimo posamezen oligonukleotid, ki kodira vse želene spremembe. Namesto tega lahko uporabimo enega od dveh alternativnih postopkov.

V prvem postopku naredimo ločen oligonukleotid za vsako amino kislino, ki jo je treba substituirati. Oligonukleotide nato aneliramo simultano na enojnovijačni kalup DNA, druga vijačnica DNA, ki jo sintetiziramo iz kalupa, pa kodira vse želene aminokislinske substitucije.

Alterantivni postopek vključuje dva ali več krogov mutageneze, da nastane želen mutant. Prvi krog je tak, kot je opisano za posamezne mutante: DNA divjega tipa uporabimo za kalup, oligonukleotid, ki kodira prvo želeno aminokislinsko substitucijo, aneliramo na ta kalup in nato nastane heterodupleksna molekula DNA. V drugem krogu mutageneze uporabimo mutirano DNA, narejeno v prvem krogu mutageneze kot kalup. Ta kalup že vsebuje eno ali več mutacij. Oligonukleotid, ki kodira dodatne želene aminokislinske substitucije nato aneliramo na ta kalup in tako sedaj nastala vijačnica DNA kodira mutacije, tako iz prvega kot tudi drugega kroga mutageneze. To nastalo DNA lahko uporabimo kot kalup v tretjem krogu mutageneze itd.

Mutageneza PCR je tudi prikladna za izdelavo aminokislinskih variant mpl Ugandskega polipeptida. Čeprav je naslednja obravnava v zvezi z DNA, je razumljivo, da je tehnika uporabna tudi za RNA- Tehnika PCR je na splošno v zvezi z naslednjim postopkom (Erlich, zgoraj, poglavje od R. Higuchi, str. 61-70): kadar uporabimo majhne količine kalupne DNA kot izhodno snov v PCR, lahko uporabimo primeije, ki se v sekvenci malo razlikujejo od ustrezajoče regije v kalupni DNA, da izdelamo relativno velike količine fragmenta specifične DNA, ki se razlikuje od sekvence kalupa le v položajih, kjer se primeiji razlikujejo od kalupa. Za uvedbo mutacije v plazmidno DNA oblikujemo enega od primerjev tako, da prekriva položaj mutacije in vsebuje mutacijo; sekvenca drugega primerja mora biti identična odseku sekvence nasprotne vijačnice plazmida, vendar pa je ta sekvenca lahko locirana kjerkoli vzdolž plazmidne DNA. Prednostno je, da je sekvenca drugega primeija locirana znotraj 200 nukleotidov prvega primerja, tako da na koncu celotno pomnoženo regijo DNA, vezano s primeiji, z lahkoto sekvenciramo. Pomnoževanje PCR z uporabo para primeijev, takega kot je bil pravkar opisan, ima za posledico populacijo fragmentov DNA, ki je različna v položaju mutacije, ki jo specificira primer in možno na drugih položajih, kjer je kopiranje kalupa nekako nagnjeno k napakam.

Če je razmeije kalupa proti izdelani snovi ekstremno nizko, velika večina fragmentov izdelane DNA vgradi želene mutacije. To izdelano snov uporabimo, da nadomestimo ustrezno regijo v plazmidu, ki rabi kot kalup PCR, z uporabo standardne tehnologije DNA. Mutacije na ločenih položajih lahko uvedemo simultano, bodisi z uporabo mutantnega drugega primeija ali izvajanjem druge PCR z različnimi mutantnimi primeiji in ligacijo obeh nastalih fragmentov PCR, simultano za vektorski fragment v

3- (ali več) delni ligaciji.

V specifičnem primeru mutageneze PCR, lineariziramo kalupno plazmidno DNA (1 jug) z digestijsko restrikcijsko endonukleazo, ki ima edinstveno spoznavno mesto v plazmidni DNA zunaj regije, ki jo je treba pomnožiti. Od te snovi dodamo 100 ng k zmesi PCR, ki vsebuje pufer PCR, ki vsebuje 4 deoksinukleotidne trifosfate in je vključen v kompletu GeneAmp® (dobavitelj Perkm-Elmer Cetus, Norwalk, CT in Emeryville, CA), in 25 pmol vsakega oligonukleotidnega primeija do končnega volumna 50 /ul. Reakcijsko zmes prekrijemo s 35 jul mineralnega olja. Reakcijsko zmes denaturiramo 5 minut pri 100 °C, damo za kratek čas na led in nato dodamo 1 jul Thermus aquaticus (Taq) polimeraze DNA (5 enot/jul, dobavitelj Perkin-Elmer Cetus) pod plast mineralnega olja.

Reakcijsko zmes nato vložimo v napravo za toplotno termostatiranje DNA Thermal Cycler (dobavitelj Perkin-Elmer Cetus), programirano takole:

min., 55 °C s, 72 °C, nato 19 ciklov nasalednje:

s, 94 °C s, 55 °C in s, 72 °C.

Na koncu programa reakcijsko fiolo odstranimo iz naprave za toplotno termostatiranje in vodno fazo prenesemo v novo fiolo, ekstrahiramo s fenolom/kloroformom (50:50 vol.), oborimo z etanolom in DNA rekuperiramo s standardnimi postopki. To snov nato izpostavimo ustreznim obdelavam za insercijo v vektor.

Drugi postopek za pripravo variant kasetne mutageneze temelji na tehniki, ki jo opisujejo Wells et al., Gene, 34:315 [1985]. Izhodna snov je plazmid (ali drugi vektor), ki obsega DNA mpl liganda, ki jo je treba mutirati. Kodoni v DNA mpl liganda, ki jih je potrebno mutirati, so identificirani. Na vsaki strani indentificiranega mesta za mutacijo mora biti edinstveno restrikcijsko endonukleazno mesto. Če ni takih restrikcijskih mest, jih lahko naredimo z uporabo zgoraj opisane oligonukleotidno posredovane mutageneze, da jih uvedemo na primerna mesta v DNA mpl liganda. Po uvedbi restrikcijskih mest v plazmid, le-tega prerežemo na teh mestih, da ga lineariziramo. Dvojnovijačni oligonukleotid, ki kodira sekvenco DNA med restrikcijskima mestoma, vsebuje pa želene mutacije, sintetiziramo z uporabo standardnih postopkov. Obe vijačnici sintetiziramo ločeno in nato hibridiziramo skupaj z uporabo standardnih tehnik. Ta dvojnovijačni oligonukleotid imenujemo kaseta. Ta kaseta je oblikovana tako, da ima 3’ in 5’ konca, ki sta kompatibilna s konci lineariziranega plazmida, tako da jo lahko direktno legiramo na plazmid. Plazmid tako vsebuje mutirano sekvenco DNA mpl liganda.

C. Insercija nukleinske kisline v replikabilni vektor

Nukleinsko kislino (npr. cDNA ali genomska DNA), ki kodira naravni mpl Ugandski polipeptid ali njegovo varianto, inseriramo v replikabilni vektor za nadaljnje kloniranje (pomnoževanje DNA) aU ekspresijo. Mnogi vektoiji so na voljo in izbira ustreznega vektoija je odvisna od tega, (1) aU ga bomo uporabiU za pomnoževanje DNA aU za ekspresijo DNA (2) od velikosti nukleinske kisline, ki bo inserirana v novi vektor in (3) od gostiteljske ceUce, ki bo transformirana z vektorjem. Vsak vektor vsebuje različne komponente, odvisne od njegove funkcije (pomnoževanje DNA ali ekspresija DNA) in gostiteljske celice, s katero je kompatibilen. Vektorske komponente na splošno vključujejo, vendar ne omejujoče, eno ali več od naslednjih: signalno sekvenco, izvor repUkacije, enega ali več markerskih genov, spodbujevalni element, promotor in transkripcijsko terminacijsko sekvenco.

(i) Komponenta signalna sekvenca

Mpl Ugand v smislu izuma lahko eksprimiramo, ne samo direktno, ampak tudi kot fuzijo s heterolognim poUpeptidom, prednostno s signalno sekvenco aU drugim poUpeptidom, ki ima specifično cepišče na N-terminalu zrelega proteina ali poUpep81 tida. Na splošno je signalna sekvenca lahko komponenta vektorja, ali je lahko del DNA mpl liganda, inseriranega v ta vektor. Izbrana heterologna signalna sekvenca naj bi bila tista, ki je spoznana in procesirana (t.j. cepljena s signalno peptidazo) od gostiteljske celice. Za prokariotske gostiteljske celice, ki ne spoznajo in ne procesirajo signalne sekvence mpl liganda, substituiramo signalno sekvenco s prokariotsko signalno sekvenco, izbrano npr. iz skupine alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ali voditeljev toplotno stabilnih enteretoksinov II. Za izločanje kvasovk lahko naravno signalno sekvenco substituiramo npr. z invertazo kvasovk, alfa faktorjem ali kislinskimi fosfataznimi voditelji, C. albicans glukoamilaznim voditeljem (EP 362,179, obj. 4. aprila 1990) ali signalom, opisanim v WO 90/13646, obj. 15. novembra 1990. Pri ekspresiji celice sesalca je zadovoljiva naravna signalna sekvenca (t.j. presekvenca mpl liganda, ki normalno usmerja sekrecijo mpl liganda iz njegovih naravnih celic sesalca in vivo), čeprav so prikladne tudi druge signalne sekvence sesalca, kot npr. signalne sekvence iz drugih mpl Ugandskih poUpeptidov aU iz enakega mpl Uganda iz razUčnih živalskih vrst, signalne sekvence iz mpl Uganda in signalne sekvence iz izločenih poUpeptidov, enakih aU sorodnih vrst, kot tudi virusni sekretomi voditelji, npr. herpes simpleks gD signal.

(n) Komponenta izvor replikacije

Tako ekspresijski kot tudi klonimi vektorji vsebujejo sekvenco nukleinske kisline, ki omogoča replikacijo vektorja v eno aU več izbranih gostiteljskih ceUc. Na splošno je v klonimih vektorjih ta sekvenca tista, ki omogoča replikacijo vektorja, neodvisno od gostiteljske kromosomske DNA, in vključuje izvore replikacije aU avtonomno replikativne sekvence. Take sekvence so dobro znane za različne vrste bakterij, kvasovk in virusov. Izvor replikacije iz plazmida pBR322 je prikladen za večino gram negativnih bakterij, izvor 2 μια plazmid je prikladen za kvasovke, razni virusni izvori (SV40, polioma, adenovirus, VSV ali BPV) pa so koristni za kloniranje vektorjev v ceUcah sesalcev. Na splošno komponenta - izvor replikacije - ni potrebna za ekspresijske vektorje sesalcev (izvor SV40 lahko značilno uporabimo le zato, ker vsebuje zgodnji promotor).

Večinoma so ekspresijski vektorji dvojni (shuttle), to je, sposobni so repUkacije vsaj enega razreda organizmov, vendar pa se lahko transfektirajo v drug organizem za ekspresijo. Npr. vektor je kloniran v E. coli in nato je isti vektor transfektiran v ceUcah kvasovk aU sesalca za ekspresijo, čeprav ni sposoben repUkacije, neodvisno od kromosoma gostiteljske celice.

DNA prav tako lahko pomnožimo z insercijo v gostiteljski genom. To z lahkoto izvedemo z uporabo vrste Baccilus kot gostitelja npr. tako, da vključimo v vektor sekvenco DNA, kije komplementarna sekvenci, ugotovljeni v genomski DNA Bacillusa. Transfekcija Bacillusa z drugim vektorjem ima za posledico homologno rekombinacijo z genomom in insercijo DNA mpl liganda. Vendar pa je rekuperiranje genomske DNA, ki kodira mpl ligand, bolj kompleksno kot tisto od eksogeno repliciranega vektorja, ker je potrebna restrikcijska encimska digestija, da izrežemo DNA mpl liganda.

(iii) Komponenta selekcijski gen

Ekspresijski in klonimi vektorji naj bi vsebovali selekcijski gen, tudi označen kot selektibilni marker. Ta gen kodira protein, potreben za preživetje ali rast transformiranih gostiteljskih celic, zraslih v selektivnem kulturnem mediju. Gostiteljske celice, ki niso transformirane z vektorjem, ki vsebuje selekcijski gen, ne preživijo v kulturnem mediju. Značilni selekcijski geni kodirajo proteine, ki (a) dajo odpornost proti antibiotikom ali drugim toksinom, npr. ampicilinu, neomicinu, metotreksatu ali tetraciklinu (b) dopolnijo avksotrofne pomankljivosti ali (c) oskrbijo kritična hranila, ki niso na voljo v kompleksnem mediju, kot je npr. gen kodirna D-alanin racemaza za Bacille.

En primer selekcijske sheme uporablja zdravilo, da ustavi rast gostiteljske celice. Tiste celice, ki so uspešno transformirane s heterolognim genom, eksprimirajo protein, ki daje odpornost proti zdravilom, in na ta način preživijo selekcijski režim. Zgledi take dominantne selekcije uporabljajo zdravila: neomicin (Southern et al., J. Moleč. Appl. Genet., 1:327 [1982]), mikofenolno kislino (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) ali higromicin (Sugden et al., Mol. Celi. Biol., 5:410-413 [1985]). Trije zgledi, navedeni zgoraj, uporabljajo bakterijske gene ob evkariotski kontroli, da posredujejo odpornost za ustrezno zdravilo G418 ali neomicin (geneticin), xgpt (mikofenolna kislina) oz. higromicin.

Zgledi drugih prikladnih selektibilnih marketjev za celice sesalcev so tisti, ki omogočajo identifikacijo celic, kompetentnih, da navzamejo nukleinsko kislino mpl liganda, kot je npr. dehidrofolat reduktaza (DHFR) ali timidin kinaza. Transformante celic sesalcev damo pod selekcijski pritisk, tako da so transformantni edini, ki so adaptirani za preživetje zaradi tega, ker so navzeli marker. Selekcijski pritisk uvedemo s kultiviranjem transformantov pri pogojih, pri katerih se koncentracija selekcijskega sredstva v mediju zaporedno spreminja, kar vodi do pomnožitve tako selekcijskega gena kot tudi DNA, ki kodira mpl Ugandski polipeptid. Pomnožitev je postopek, pri katerem se geni v večji zahtevi za izdelovanje proteina, kritični za rast, ponavljajo v tandemu v kromosomih zaporednih generacij rekombinantnih ceUc. Povečane koUčine mpl Uganda sintetiziramo iz pomnožene DNA.

Npr. ceUce, transformirane s selekcijskim genom DHFR, najprej identificiramo s kultiviranjem vseh transformantov v mediju kulture, ki vsebuje metotreksat (Mtx), konkurenčni antagonist DHFR. Ustrezna gostiteljska ceUca, kadar uporabimo DHFR divjega tipa, je ovarijska ceUčna linija kitajskega hrčka (celična Unija CHO) s pomanjkanjem aktivnosti DHFR, pripravljena in propargirana, kot opisujeta Urlaub in Chasin, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 77:4216 [1980]. Transformirane ceUce nato eksponiramo povečanim nivojem Mtx. To vodi do sinteze multiplih kopij gena DHFR in istočasno multiplih kopij druge DNA, ki obsega ekspresijske vektorje, kot npr. DNA, ki kodira mpl Ugand. To tehniko pomnoževanja lahko uporabimo z vsakim, sicer prikladnim gostiteljem, npr. ATCC št. CCL61 CHO-K1, kljub prisotnosti endogenega DHFR, če npr. uporabimo mutantni gen DHFR, ki je zelo odporen proti Mtx (EP 117.060). Alternativno lahko gostiteljske ceUce [posebno gostiteljske ceUce divjega tipa, ki vsebujejo endogeni DHFR] transformirane aU sotransformirane s sekvencami DNA, ki kodirajo mpl Ugand, protein DHFR divjega tipa in drug selektibilen marker, kot npr. aminoglikozid 3’ fosfotransferazo (APH), selekcioniramo s celično rastjo v mediju, ki vsebuje selekcijsko sredstvo za selektibilni marker, kot je amino gUkozidni antibiotiki, npr. kanamicin, neomicin aU G418. Glej US patent št. 4,965,199.

Prikladen selekcijski gen za uporabo pri kvasovkah je gen trpi, prisoten v plazmidu kvasovk YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979]; aU Tschemper et al., Gene, 10:157 [1980]). Gen trpi zagotavlja selekcijski marker za mutantni sev kvasovk, ki niso sposobne, da rastejo v triptofanu, npr. ATCC št. 44076 ali PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Prisotnost lezije trpi v genomu gostiteljskih kvasovk nato zagotovi efektivno okolje za detektiranje transformacije z rastjo v odsotnosti triptofana. Podobno komplementiramo seve kvasovk s pomanjkanjem Leu2 (ATCC št. 20,622 ali 38,626) z znanimi plazmidi, ki nosijo gen Leu2.

(iv) Komponenta promotor

Ekspresijski in klonimi vektorji navadno vsebujejo promotor, ki ga spozna gostiteljski organizem in je funkcionalno vezan na nukleinsko kislino mpl liganda. Promotoiji so netranslatirane sekvence, locirane navzgor (5’) od začetnega kodona strukturnega gena (na splošno znotraj približno 100 do 1000 bp), ki kontrolirajo transkripcijo in translacijo posebne sekvence nukleinske kisline, kot npr. sekvenco nukleinske kisline mpl liganda, na katero so funkcionalno vezani. Taki promotoiji značilno spadajo v dva razreda, inducibilnega in konstitutivnega. Inducibilni promotoiji so tisti, ki inicirajo povečane nivoje transkripcije iz DNA ob njihovi kontroli odziva na nekatere spremembe v pogojih kulture, npr. prisotnost ali odsotnost hranila ali spremembe temperature. Sedaj je znanih veliko število promotoijev, ki spoznajo različne potencialne gostiteljske celice. Te promotorje funkcionalno vežemo na DNA, ki kodira mpl ligand, z odstranitvijo promotoija iz vira DNA z restrikcijsko encimsko digestijo in inseriranjem izolirane promotorske sekvence v vektor. Tako promotorsko sekvenco naravnega mpl liganda kot tudi mnoge heterologne promotorje lahko uporabimo za direktno pomnožitev in/ali ekspresijo DNA mpl liganda. Vendar so prednostni heterologni promotoiji, ker na splošno dopuščajo večjo transkripcijo in višje dobitke eksprimiranega mpl liganda v primerjavi s promotoijem naravnega mpl liganda.

Promotoiji, prikladni za uporabo v prokariotskih gostiteljih, vključujejo betalaktamazo in laktozne promotorske sisteme (Chang et al., Nature, 275:615 [1978]; in Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]), alkalno fosfatazo, triptofanski (trp) promotorski sistem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] in EP 36,776) in hibridne promotorje, kot npr. tac promotor (deBoer et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 80:21-25 [1983]). Primerni pa so tudi drugi bakterijski promotoiji. Njihove nukleotidne sekvence so objavljene, kar omogoča strokovnjakom, da jih funkcionalno ligirajo na DNA, ki kodira mpl ligand (Siebenlist et al., Celi, 20:269 [1980]), z uporabo linkerjev ah adapteijev za uvedbo katerihkoli potrebnih restrikcijskih mest. Promotoiji za uporabo v bakterijskih sistemih vsebujejo tudi sekvenco Shine-Dalgamo (S.D.), funkcionalno vezano na DNA, ki kodira mpl ligandski polipeptid.

Promotorske sekvence so znane za evkariote. Dejansko imajo vsi evkariotski geni regijo, bogato z AT, locirano približno 25 do 30 baz navzgor od mesta, kjer se začne transkripcija. Druga sekvenca, ugotovljena 70 do 80 baz navzgor od začetka transkripcije mnogih genov, je regija CXCAAT, kjer je lahko X katerikoli nukleotid. Na 3’ koncu večine evkariotskih genov je sekvenca AATAAA, ki je lahko signal za dodatek poli A repa na 3’ koncu kodirne sekvence. Vse te sekvence so prikladno inserirane v evkariotske ekspresijske vektorje.

Primeri prikladnih promovimih sekvenc za uporabo z gostitelji kvasovk vključujejo promotorje za 3-fosfoglicerat kinazo (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 [1980]) ali druge glikolitične encime (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]); in Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), kot npr. enolazo, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo, heksokinazo, piruvatno dekarboksilazo, fosfofruktokinazo, glukoza-6-fosfat izomerazo, 3-fosfoglicerat mutazo, piruvat kinazo, triosefosfat izomerazo, fosfoglukoza izomerazo in glukokinazo.

Drugi promotoiji kvasovk, ki so inducibilni promotorji z dodatno prednostjo za transkripcijo, kontrolirano z rastnimi pogoji, so promotorske regije za alkohol dehidrogenazo 2, izocitokrom C, kislinsko fosfatazo, razgradne encime, povezane z metabolizmom dušika, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo in encime, odgovorne za uporabo maltoze in galaktoze. Prikladne vektorje in promotorje za uporabo v ekspresiji kvasovk opisujejo Hitzeman et al., EP 73,657A Spodbujevalce kvasovk prav tako prednostno uporabimo s promotorji kvasovk.

Transkripcija mpl liganda iz vektorjev gostiteljskih celic sesalcev je kontrolirana npr. s promotorji, dobljenimi iz genomov virusov, kot so npr.: polioma virus, ptičji poxvirus, (VB 2,211,504, obj. 5. julija 1989), adenovirus (kot npr. Adenovirus 2), goveji papiloma virus, avian virus sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitis-B in najbolj prednostno Simian Virus 40 (SV40) iz heterolognih promotorjev sesalcev, kot je npr. aktinski promotor ah imunoglobulinski promotor, iz promotorjev toplotnega šoka in promotorjev, ki so normalno povezani s sekvenco mpl liganda, pod pogojem, da so le-ti kompatibilni s sistemi gostiteljskih celic.

Zgodnje in pozne promotorje virusa SV40 ugodno dobimo kot restrikcijski fragment SV40, ki tudi vsebuje virusni (SV40) izvor replikacije. Fiers et al., Nature, 273:113 [1978]; Muligan in Berg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 78:7398-7402 [1981]. Neposredni zgodnji promotor humanega citomegalovirusa ugodno dobimo kot restrikcijski fragment Hindlll E Greenaway et al., Gene, 18:355-360 [1982]. Sistem za ekspresijo DNA v gostiteljih sesalcih z uporabo govejega virusa papiloma kot vektorja je prikazan v US patentu št. 4,419,446. Modifikacija tega sistema je opisana v US patentu št. 4,601,978. Glej tudi Gray et al., Nature, 295:503-508 [1982] za ekspresijo cDNA, ki kodira imuni inter86 feron v opičjih celicah; Reyes et al., Nature, 297:598-601[1982] za ekspresijo cDNA humanega jS-interferona v mišjih celicah ob kontroli promotorja timidin kinaze iz virusa herpes simpleks; Canaani in Berg, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 79:5166-5170 [1982] za ekspresijo gena humanega interferona βΐ v kultiviranih celicah miši in zajcev; in Gorman et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 79:6777-6781 [1982] za ekspresijo sekvenc bakterijskih CAT v opičjih ledvičnih celicah CV-1, piščančjih embrionalnih fibroblastih, ovarijskih celicah kitajskega hrčka, celicah HeLa in mišjih celicah NIH-3T3 z uporabo Rousovega virusa sarkoma - dolgo terminalno ponavljanje - kot promotorja.

(v) Komponenta spodbujevalni element

Transkripcijo DNA, ki kodira mpl ligand v smislu izuma, z višjimi evkarioti pogosto povečamo z inseriranjem spodbujevalne sekvence v vektor. Spodbujevalci so cis delujoči elementi DNA, ki imajo navadno približno 10 do 300 bp, ki delujejo na promotor tako, da povečajo njegovo transkripcijo. Spodbujevalce, relativno neodvisne od orientacije in položaja, so ugotovili 5’ (Laimins et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 78:993 [1981]) in 3’ (Lusky et al., Mol. Celi Bio., 3:1108 [1983]) glede na transkripcijsko enoto v intronu (Banerji et al., Celi, 33:729 [1983]) kot tudi v sami kodirni sekvenci (Osborne et al., Mol. Celi Bio., 4:1293 [1984]). Mnoge sekvence spodbujevalcev so znane iz genov sesalcev (globin, elastaza, albumin, a-fetoprotein in insulin). Značilno lahko uporabimo spodbujevalce iz evkariotskega celičnega virusa. Primeri vključujejo spodbujevalec SV40 na pozni strani replikacijskega izvora (bp 100-270), spodbujevalec citomegalovirusnega zgodnjega promotorja, spodbujevalec polioma na pozni strani replikacijskega izvora in adenovirusne spodbujevalce. Glej tudi Yaniv, Nature, 297:17-18 [1982] za spodbujevalne elemente za aktivacijo evkariotskih promotoijev. Spodbujevalec lahko spojimo v vektor na položaju 5’ ali 3’ sekvence, ki kodira mpl ligand, vendar pa je prednostno lociran na mestu 5’ od promotorja.

(vi) Komponenta transkripcijska terminacija

Ekspresijski vektorji, uporabljeni v evkariotskih gostiteljskih celicah (kvasovke, glive, insekti, rastline, živali, ljudje ali nukleirane celice iz drugih multiceličnih organizmov), tudi vsebujejo sekvence, potrebne za terminacijo transkripcije in za stabiliziranje mRNA. Take sekvence so navadno dosegljive od 5’ in priložnostno 3’ netranslatiranih regij evkariotskih ali virusnih DNA ali cDNA. Te regije vsebujejo nukleotidne segmente, transkribirane kot poliadenilirane fragmente v netranslatiranem delu mRNA, ki kodira mpl ligand.

(vii) Konstrukcija in analiza vektorjev

Za konstrukcijo prikladnih vektorjev, ki vsebujejo eno ali več zgoraj navedenih komponent, uporabljamo standardne tehnike ligacije. Izolirane plazmide ali fragmente DNA cepimo, ukrojimo in ponovno ligiramo v želeno obliko, da tvorimo potrebne plazmide.

Za analizo potrditve pravilnih sekvenc v konstruiranih plazmidih uporabljamo ligacijske zmesi, da transformiramo E. coli K12 sev 294 (ATCC št. 31,446) in izberemo uspešne transformante glede na ampicilinsko ali tetraciklinsko odpornost, kjer je potrebno. Plazmide iz transformantov pripravimo in analiziramo z restrikcijsko endonukleazno digestijo ali sekvenciramo po postopku od Messinga et al., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] ali po postopku od Maxama et al., Methods in Enzymology, 65:499 [1980].

(viii) Vektorji za prehodno ekspresijo

Posebno uporabni pri izvajanju predloženega izuma so ekspresijski vektorji, ki zagotovijo prehodno ekspresijo DNA, ki kodira mpl Ugandski poUpeptid v ceUcah sesalca. Na splošno prehodna ekspresija vključuje uporabo ekspresijskega vektoija, ki je sposoben, da se učinkovito replicira v gostiteljski ceUci, tako da gostiteljska ceUca akumulira mnogo kopij ekspresijskega vektoija in v nadaljevanju sintetizira visoke nivoje želenega poUpeptida, kodiranega z ekspresijskim vektorjem. Sambrook et al., zgoraj, str. 16.17-16.22. Prehodni ekspresijski sistemi, ki obsegajo prikladen ekspresijski vektor in gostiteljsko celico, dopuščajo prikladno pozitivno identifikacijo poUpeptidov, kodiranih s kloniranimi DNA, kot tudi hitro selekcioniranje takih poUpeptidov za želene biološke aU fiziološke lastnosti. Tako so prehodni ekspresijski sistemi posebno uporabni v smislu izuma za namene identificiranja analogov in variant mpl Ugandskega poUpeptida, ki ima biološko aktivnost mpl Ugandskega poUpeptida.

(ix) Prikladni zgledni vektoiji celic vretenčarjev

Druge postopke, vektoije in gostiteljske ceUce, prikladne za adaptacijo za sintezo mpl liganda v rekombinantni celični kulturi vretenčarjev, opisujejo Gething et al., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46 [1979]; Levinson et al.;

EP 117,060; in EP 117,058. Posebno koristen plazmid za ekspresijo mpl liganda celične kulture sesalca je pRK5 (EP 307,247, US patent št. 5,258,287) ali pSVI6B (PCT št. objave WO 91/08291).

D. Selekcija in transformacija gostiteljskih celic

Prikladne gostiteljske celice za kloniranje ali ekspresijo vektorjev so tukaj prokarioti, kvasovke ali višje evkariotske celice, opisane zgoraj. Prikladni prokarioti vključujejo bakterije, kot gram-negativne ali gram-pozitivne organizme, npr. E. coli, Bacille, kot npr. B. subtilis, vrsto Pseudomonas, kot npr. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, ali Serratia marcescans. Prednostni E. coli klonimi gostitelj je E. coli 294 (ATCC št. 31,446), čeprav so primerni tudi drugi sevi, kot npr. E. coli B, E. coli Χ1776 (ATCC št. 31,537) in E. coli W3110 (ATCC št. 27,325). Ti zgledi so bolj ilustrativni kot pa omejujoči. Prednostno naj bi gostiteljska celica izločala minimalne količine proteolitičnih encimov. Alternativno so prikladni postopki kloniranja in vitro npr. PCR ali druge reakcije polimeraznih nukleinskih kislin.

Poleg prokariotov so evkariotski mikrobi, kot npr. filamentne glive ali kvasovke, tudi prikladni gostitelji za vektorje, ki kodirajo mpl ligand. Saccharomyces cerevisiae ali splošni pekovski kvas je najbolj splošno uporabljen med nižjimi evkariotskimi gostiteljskimi mikroorganizmi. Vendar pa v smislu izuma lahko uporabimo tudi druge rodove, vrste in seve, ki so splošno dosegljivi in uporabni, kot so npr. Schizosaccharomyces pombe (Beach in Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139,383, obj. 2. maja 1985), gostitelji Kluyveromyces (US patent št. 4,943,529), kot npr. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans in K. maraanus, yarrowia [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Čase et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 76:5259-5263 [1979]), in filamentne glive, kot npr. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, obj. 10. januarja 1991), in gostitelji Aspergillus, kot npr. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 81:1470-1474 [1984]) in A. niger (Kelly in Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]).

Prikladne gostiteljske celice za ekspresijo glikoziliranega mpl liganda so izvedene iz multiceličnih organizmov. Take gostiteljske celice so sposobne kompleksnega procesiranja in glikozilacijskih aktivnosti. Na splošno so uporabne vse višje prokariotske celične kulture, bodisi iz kulture vretenčaijev ali nevretenčaijev. Primeri celic nevretenčaijev vključujejo rastlinske celice in celice insektov. Številni bakulovirusni sevi in variante ter ustrezne dopustne gostiteljske celice insektov iz gostiteljev, kot npr. Spodoptera frugiperda (gosenica), Aedes aegypti (komar), Aedes albopictus (komar), Drosophila melanogaster (vinska mušica), in Bombyx mori so identificirani. Glej npr. Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., izd. vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), str. 277-279; in Maeda et al., Nature, 315:592-594 [1985]. Številni virusni sevi za transfekcijo so javno dosegljivi, npr.: L-l varianta od Autographa californica NPV in sev Bm-5 od Bombyx mori NPV, in jih lahko uporabimo kot viruse v smislu predloženega izuma, posebno za transfekcijo celic Spodoptera frugiperda.

Kulture rastlinskih celic bombaža, koruze, krompiija, soje, petunij, paradižnika in tobaka lahko uporabimo kot gostitelje. Značilno rastlinske celice transfektiramo z inkubacijo z določenimi sevi bakterij Agrobacterium tumefaciens, ki jih predhodno obdelamo, da vsebujejo DNAznp/ liganda. Med inkubacijo rastlinskih celičnih kultur z A. tumefaciens se DNA, ki kodira mpl ligand, transferira v rastlinsko gostiteljsko celico, tako da je le-ta transfektirana in pri ustreznih pogojih eksprimira DNA mpl liganda. Poleg tega so regulatome in signalne sekvence, kompatibilne z rastlinskimi celilcami, dosegljive, kot npr. promotor nopalin sintaza in poliadenilacijske signalne sekvence. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]. Poleg tega so segmenti DNA, izolirani iz navzgomje regije T-DNA gena 780, sposobni aktiviranja ali zvečevanja transkripcijskih nivojev rastlinsko ekspresibilnih genov v rekombinantni DNA, ki jo vsebujejo rastlinska tkiva. EP 321,196, obj. 21. junija 1989.

Seveda pa so najbolj zanimive celice vretenčaijev, tako da je propagacija celic vretenčaijev v kulturi (tkivna kultura) postala rutinski postopek v zadnjih letih (Tissue Culture, Academic Press, Kruse in Patterson, izd. [1973]). Primeri uporabnih gostiteljskih celičnih linij sesalca so opičja ledvična linija CV1, transformirana z SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna ledvična linija (293) ali 293 celic, subkloniranih za rast v suspenzijski kulturi, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); ledvične celice mladiča hrčka (BHK, ATCC CCL 10);ovarijske celice kitajskega hrčka/DHFR (CHO, Urlaub in Chasin, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 77:4216 [1980]); mišje celice sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); opičje ledvične celice (CV1ATCC CCL 70); ledvične celice afriške zelene opice (VERO-76, ATCC CRL-1587); celice humanega cervikalnega karcinoma (HELA, ATCC CCL 2); pasje ledvične celice (MDCK, ATCC CCL 34); jetrne celice volovske podgane (buffalo rat liver celiš) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane pljučne celice (W138, ATCC CCL 75); humane jetrne celice (HEP G2, HB 8065); mišji mamami tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); celice TRI (Mather et al., Annals Ν.Υ. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); celice MRC 5; celice FS4; in humana hepatomna linija (Hep G2).

Gostiteljske celice transfektiramo in prednostno transformiramo z zgoraj opisanimi ekspresijskimi ali klonimimi vektorji v smislu izuma in kultiviramo v konvencionalnih hranilnih medijih, modificiranih kot je potrebno za induciranje promotoijev, selekcioniranje transfomantov ali pomnoževanje genov, ki kodirajo želene sekvence.

Transfekcija se nanaša na navzemanje ekspresijskega vektorja z gostiteljsko celico, bodisi, da je dejansko eksprimirana kakršnakoli kodirna sekvenca ali ne. Številni postopki za transfekcijo so znani strokovnjakom, npr. CaPO₄ in elektroporadja. Uspešno transfekcijo na splošno spoznamo po katerikoli indikaciji delovanja vektorja v gostiteljski celici.

Transformacija pomeni uvedbo DNA v organizem tako, da je DNA replikabilna, bodisi kot ekstrakromosomski element ali s kromosomskim integrantom. Odvisno od uporabljene gostiteljske celice naredimo transformacijo z uporabo standardnih tehnik, ustreznih za take celice. Obdelava s kalcijem z uporabo kalcijevega klorida, kot je opisano v poglavju 1.82 avtorja Sambrooka et al., zgoraj, se na splošno uporablja za prokariote ali druge celice, ki vsebujejo bistvene celične stenske bariere. Infekcija z Agrobacterium tumefaciens se uporablja za transformacijo določenih rastlinskih celic, kot to opisujejo Shaw et al., Gene, 23:315 [1983] in WO 89/05859, obj. 29. junija 1989. Poleg tega lahko rastline transfektiramo z uporabo ultrazvoka, kot je opisano v WO 91/00358, obj. 10. januarja 1991. Za celice sesalcev brez takih celičnih sten je prednosten obarjalni postopek s kalcijevim fosfatom, ki ga opisujejo Graham in van der Eb, Virology, 52:456-457 [1978]. Splošne vidike za transformacije sistema gostiteljskih celic sesalcev opisuje Axel v US patentu št. 4,399,216, izd. 16. avgusta 1983. Transformacije v kvasovke značilno izvedemo v skladu s postopkom od Van Solingena et al., J. Bact., 130:946 [1977] in Hsiao et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (ZDA, 76:3829 [1979]. Prav tako lahko uporabimo tudi druge postopke za uvedbo DNA v celice, kot npr. nuklearno injiciranje, elektroporacijo ali protoplastno fuzijo.

E. Kultiviranje gostiteljskih celic

Prokariotske celice, uporabljene za izdelavo mpl Ugandskega poUpeptida v smislu izuma kultiviramo v prikladnih medijih, kot to na splošno opisujejo Sambrook et al., zgoraj.

Gostiteljske celice sesalcev, uporabljene za izdelavo mpl liganda v smislu predloženega izuma, lahko kultiviramo v različnih medijih. Komercialno dosegljivi mediji, kot npr.: Ham’s F10 (Sigma), minimalno esencialni medij ([ΜΕΜ], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), in Eaglov medij, modificiran po Dulbecco-u ([DMEM], Sigma), so prikladni za kultiviranje gostiteljskih ceUc. Poleg tega še kateregakoU od medijev, ki jih opisujejo: Ham in WaUace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Bames in Sato. Anal. Biochem., 102:255 [1980], US patent št. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; aU 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; US patent Re. 30,985; aU istočasno v postopku US serij. št. 07/592,107 aU 07/592,141, oba vložena 3. oktobra 1990, katerih opisi so vključeni tukaj z referencami, lahko uporabimo kot kulturni medij za gostiteljske ceUce. Vse te medije lahko dopolnimo, če je potrebno s hormoni in/aU drugimi rastnimi faktorji (kot so inzulin, transferin aU epidermalni rastni faktor), solmi (kot so natrijev klorid, kalcij, magnezij in fosfat), pufri (kot je HEPES), nukleozidi (kot sta adenozin in timidin), antibiotiki (kot je Gentamycin™ zdravilo), elementi v sledovih (definirani kot anorganske spojine, ki so navadno prisotne v končnih koncentracijah v mikromolskih koUčinah) in glukozo aU ekvivalentnim virom energije. Vse druge potrebne dodatke tudi lahko vključimo v ustreznih koncentracijah, znanih strokovnjakom. Pogoji za kulturo, kot npr. temepratura, pH ipd., so tisti, ki se prednostno uporabljajo za gostiteljsko celico, izbrano za ekspresijo, in so strokovnjakom znani.

Gostiteljske celice, na katere se sklicujemo v temu opisu, obsegajo celice v kulturi in vitro kot tudi celice, ki so v gostiteljski živali.

F. Detektiranje pomnožitve/ekspresije gena

Pomnožitev in/ali ekspresijo gena lahko izmerimo v vzorcu direktno, npr. s konvencionalnimi tehnikami, kot so: Southern blotting, Northern blotting, da kvantitativno določimo transkripcijo mRNA (Thomas, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 77:5201-5205 [1980]), s kapljičnim nanosom (dot blotting) (DNA analiza) ali s hibridizacijo in situ, z uporabo ustreznih označenih sond, ki temeljijo na sekvencah, zagotovljenih tukaj. Uporabimo lahko različna sredstva za označevanje, najbolj običajno radioaktivne izotope, posebno ³²P. Uporabimo pa lahko tudi druge tehnike, kot npr. tisto z uporabo nukleotidov, modificiranih z biotinom, za uvedbo v polinukleotid. Biotin nato rabi kot mesto za vezavo na avidin ali protitelesa, ki so lahko označena z različnimi označevalnimi sredstvi, kot npr. radionuklidi, fluorescentnimi sredstvi, encimi ipd. Alternativno lahko uporabimo protitelesa, ki lahko spoznajo specifične duplekse, vključno duplekse DNA duplekse RNA in hibridne duplekse DNA-RNA ali duplekse DNA-protein. Protitelesa lahko nato označimo in izvedemo test, kjer se dupleks veže na površino tako, da po tvorbi dupleksa na površini lahko detektiramo prisotnost protitelesa, vezanega na dupleks.

Gensko ekspresijo lahko alternativno izmerimo z imunološkimi postopki, kot npr. z imunohistokemijskim barvanjem tkivnih predelov in testiranjem celične kulture ali telesnih tekočin, da direktno kvantitativno določimo ekspresijo nastalega gena. Z imunohistokemijskimi tehnikami barvanja pripravimo celični vzorec, značilno z dehidracijo in fiksiranjem, čemur sledi reakcija z označenimi protitelesi, specifičnimi za pripojeni nastali gen, pri čemer so oznake navadno vizualno detektibilne, kot npr. encimatske oznake, fluorescentne, luminiscentne in ipd. Posebno občutljivo tehniko barvanja, prikladno za uporabo v predloženem izumu, opisujejo Hsu et al., Am. J. Ciin. Path., 75:734-738 [1980].

Protitelesa, uporabna za imunohistokemijsko barvanje in/ali testiranje vzorčnih tekočin, so lahko bodisi monoklonska ali poliklonska in jih lahko pripravimo v kateremkoli sesalcu. Prikladno lahko pripravimo protitelesa proti naravnemu mpl Ugandskemu poUpeptidu ali protisintetičnemu peptidu, ki temelji na sekvencah DNA zagotovljenih tukaj, kot je opisano nadalje spodaj.

G. Čiščenje mpl Ugandskega poUpeptida

Mpl Ugand prednostno rekuperiramo iz medija kulture kot izločen poUpeptid, čeprav ga lahko rekuperiramo tudi iz lizatov gostiteljske celice, kadar je direktno eksprimiran brez sekretomega signala.

Če je mpl Ugand eksprimiran v rekombinantni ceUci, ki ni humanega izvora, je mpl ligand popolnoma brez proteinov ali polipeptidov humanega izvora. Vendar je Še vedno navadno potrebno, da očistimo mpl ligand drugih rekombinantnih celičnih proteinov ali polipeptidov, da dobimo pripravke, ki so v bistvu homogeni glede na mpl ligand sam po sebi. Kot prvo stopnjo medij kulture ali lizat centrifugiramo, da odstranimo delčke celičnega debrisa. Membrano in topne proteinske frakcije nato ločimo. Alternativno lahko uporabimo komercialno dosegljiv proteinski koncentracijski filter (npr. ultrafiltracijske enote Amicon ali Millipore Pellicon). Mpl ligand lahko nato očistimo iz topne proteinske frakcije in iz membranske frakcije kulturnega lizata, če se mpl ligand veže na membrano. Mpl ligand nato očistimo kontiminantnih topnih proteinov in polipeptidov z izsoljevanjem in izmenjavo ali kromatografskimi postopki z uporabo različnih gelskih matric. Te matrice vključujejo: akrilamid, agarozo, dekstran, celulozo in druge, običajne za čiščenje proteinov. Zgledni kromatografski postopki, prikladni za čiščenje proteinov vključujejo: imunoafinitetno kromatografijo (npr. anti-hmp/ ligand Mab), receptorsko afiniteto (npr. znpZ-IgG ali protein A-sefarozo), hidrofobno interakcijsko kromatografijo (HIC) (npr.: eter, butil ali fenil Toyopearl), lektinsko kromatografijo (npr.: Con A-sefaroza, lektin (leča)-sefaroza), velikostno izključitveno kromtografijo (npr.: sefadeks G-75), kationsko in anionsko izmenjalno kolonsko kromatografijo (npr.: DEAE ali karboksimetil- in sulfopropil-celuloza) in HPLC z reverzno fazo (RP-HPLC) (glej npr. Urdal et al., J. Chromatog., 296:171 [1984], kjer uporabimo dve zaporedni stopnji RP-HPLC, da očistimo rekombinantni humani IL-2). Druge stopnje čiščenja v danem primeru vključujejo: etanolno obaijanje; obaijanje z amonijevim sulfatom, kromatofokusiranje, prepartivno SDS-PAGE ipd.

Variante mpl liganda, v katerih so ostanki deletirani, inserirani ali substituirani, rekuperiramo na enak način kot naravni mpl ligand, pri čemer upoštevamo vse bistvene spremembe v lastnostih, povzročenih z variiranjem. Npr., pripravek fuzije mpl liganda z drugim proteinom ali polipeptidom, npr. bakterijskim ali virusnim antigenom, olajša čiščenje; imunoafinitetno kolono, ki vsebuje protitelo za antigen, lahko uporabimo za adsorbiranje fuzijskega polipeptida. Imunoafinitetne kolone, kot npr. kolono za zajčji poliklonski anti-mp/ ligand, lahko uporabimo za absorbiranje variante mpl liganda z njeno vezavo na vsaj en preostali imuni epitop. Alternativno lahko mpl ligand očistimo z afinitetno kromatografijo z uporabo očiščenega /np/-IgG, pripojenega na (prednostno) imobilizirano smolo, kot npr. Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) ipd. na način, dobro znan v tehniki. Proteazni inhibitor, kot npr. fenil metil sulfonil fluorid (PMSF) tudi lahko uporabimo za inhibiranje proteolitične degradacije med čiščenjem, antibiotike pa lahko vključimo, da preprečimo rast naključnih kontaminantov. Strokovnjakom je jasno, da je postopke čiščenja, prikladne za naravni mpl ligand, morda potrebno modificirati zaradi sprememb v značaju mpl liganda ali njegovih variant po ekspresiji v rekombinantni celični kulturi.

H. Kovalentne modifikacije mpl Ugandskega poUpeptida

Kovalentne modifikacije mpl Ugandskega poUpeptida so vključene v obseg predloženega izuma. Tako naravni mpl Ugand kot tudi variante aminokislinske sekvence mpl Uganda lahko kovalentno modificiramo. En tip kovalentne modifikacije, vključen v obseg predloženega izuma, je fragment mpl Uganda. Varianto fragmenta mpl Uganda, ki ima do približno 40 aminokisUnskih ostankov, lahko prikladno pripravimo s kemijsko sintezo aU z encimatskim ali kemijskim cepljenjem mpl Ugandskega poUpeptida s popolno dolžino ali njegove variante. Druge tipe kovalentnih modifikacij mpl Uganda aU njegovih fragmentov uvedemo v molekulo z reakcijo ciljnih aminokislinskih ostankov mpl Uganda aU njegovih fragmentov z organskim derivatizimim sredstvom, ki je sposobno reagirati z izbranimi stranskimi verigami ali N- aU C-terminalnimi ostanki.

Cisteinilni ostanki najbolj običajno reagirajo z α-haloacetati (in ustreznimi amini), kot npr. klorocetno kislino aU kloracetamidom, da nastanejo karboksimetil aU karboksiamidometil derivati. Cisteinilne ostanke prav tako derivatiziramo z reakcijo z bromotrifluoroacetonom, a-bromo-/?-(5-imidozoil)propionsko kislino, kloroacetil fosfatom, N-aUrilmaleimidi, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-kloromerkuribenzoatom, 2-kloromerkuri-4-nitrofenolom, aU kloro-7-nitrobenzo2-oksa-l,3-diazolom.

Histidilne ostanke derivatiziramo z reakcijo z dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0, ker je to sredstvo relativno specifično za histidilno stransko verigo. Parabromofenacil bromid je prav tako uporaben; reakcijo prednostno izvedemo v natrijevem kakodilatu (O,1M) pri pH 6,0.

Lizinil in amino-terminalni ostanki reagirajo z anhidridi jantarne aU drugih karboksilnih kislin. Derivatizacija s temi sredstvi vpliva na spremembo naboja Uzinilnih ostankov. Drugi prikladni reagenti za derivatiziranje ostankov, ki vsebujejo amino ostanke, vključujejo imidoestre, kot so : metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; kloroborohidrid; trinitrobenzensulfonska kislina; O-metilizosečnina, 2,4pentandion; in reakcijo z glioksilatom, katalizirano z transaminazo.

Arginilne ostanke modificiramo z reakcijo z enim ali več konvencionalnimi reagenti, med katerimi so: fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion in ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostankov mora potekati v alkalnih pogojih zaradi visoke pK_a gvanidinske funkcionalne skupine. Nadalje lahko ti reagenti reagirajo s skupinami lizina kot tudi z argininsko epsilon-amino skupino.

Specifično modifikacijo tirozilnih ostankov lahko naredimo posebno zanimivo z uvedbo spektralnih označb v tirozilne ostanke z reakcijo z aromatskimi diazonijevimi in spojinami ali tetranitrometanom. Najbolj običajno uporabimo N-acetilimidazol in tetranitrometan, da tvorimo O-acetil tirozilno vrsto oz. 3-nitro derivate. Tirozilne ostanke jodiramo z uporabo ¹²⁵J ali¹³¹ J, da pripravimo označene proteine za uporabo v radioimunskem testu, pri čemer je prikladen postopek s kloraminom T, opisan zgoraj.

Karboksilne stranske skupine (aspartil ali glutamil) selektivno modificiramo z reakcijo s karbodiimidi (R-N=C=N-R’), kjer sta R in R’ različni alkilni skupini, kot npr. l-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ali l-etil-3-(4-azonia-4,4dimetilpentil)karbodfimid. Nadalje aspartilne in glutamilne ostanke pretvorimo v asparaginilne in glutaminilne ostanke z reakcijo z amonijevimi ioni.

Derivatizacija z bifunkcionalnimi sredstvi je uporabna za premreževanje mpl liganda na nosilni matrici ali površini, ki ni topna v vodi, za uporabo v postopku za čiščenje anti-mp/ Ugandskih protiteles in obratno. Navadno uporabljena premreževalna sredstva vključujejo npr. l,l-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estre, npr. estre s 4-azidosaUcilno kislino, homobifunkcionalne imidoestre, vključno disukcinimidil estre, kot npr. 3,3’ditiobis(sukcinimidilpropionat), in bifunkcionalne maleimide, kot npr. bis-Nmaleimido-l,8-oktan. Derivatizima sredstva, kot je metil3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat, dajo fotoaktivime intermediate, ki so sposobni, da tvorijo premreženja v prisotnosti svetlobe. Alternativno, reaktivne v vodi netopne matrice, kot so ogljikovi hidrati, aktivirani s cianogenbromidom in reaktivne substrate, opisane v US patentih št. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; in 4,330,440, uporabimo za proteinsko imobilizacijo.

Glutaminilne in asparaginilne ostanke pogosto deamidiramo v ustrezne glutamilne oz. aspartilne ostanke. Ti ostanki se deamidirajo pri nevtralnih ali bazičnih pogojih.

Deamidirane oblike teh ostankov so tudi v obsegu predloženega izuma.

Druge modifikacije vključujejo hidroksiliranje prolina in lizina, fosforiliranje hidroksilnih skupin serilnih ali treonilnih ostankov, metiliranje α-amino skupin lizina, arginina in histidinskih stranskih verig (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 [1983]), acetiliranje N-terminalnega amina in amidiranje katerekoli C-terminalne karboksilne skupine.

Drugi tip kovalentne modifikacije mpl Ugandskega poUpeptida, kije vključen v obseg predloženega izuma, obsega spreminjanje modelov naravne glikozilacije poUpeptida. S spreminjanjem je mišljena delecija enega ali več ogljikohidratnih deležev, ugotovljenih v naravnem mpl Ugandu, in/ali dodajanje enega aU več glikozilacijskih mest, ki niso prisotna v naravnem mpl Ugandu.

Glikozilacija poUpeptidov je značilno bodisi N-vezana aU O-vezana. N-vezana se nanaša na povezanost ogljikohidratnega deleža s stransko verigo asparaginskega ostanka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin in asparagin-X-treonm, kjer je X katerakoU amino kislina razen prolina, so spoznavne sekvence za encimatsko povezanost ogljikohidratnega deleža z asparaginsko stransko verigo. Na ta način prisotnost katerekoU od teh tripeptidnih sekvenc v poUpeptidu ustvari potencialno mesto za glikozilacijo. O-vezana gUkozilacija se nanaša na povezanost enega od sladkorjev,kot so N-acetilgalaktozamin, galaktoza aU ksiloza s hidroksiamino kislino, najbolj običajno serinom ali treoninom, čeprav lahko uporabimo tudi

5-hidroksiprolin ali 5-hidroksiUzin.

Adicijo mest za glikoziliranje mpl Ugandskega poUpeptida ugodno izvedemo s spreminjanjem aminokislinske sekvence, tako da le-ta vsebuje eno aU več zgoraj opisanih tripeptidnih sekvenc (za N-vezana mesta glikozilacije). Spremembe lahko naredimo tudi tako, da izvedemo adicijo aU substitucijo enega ali več serinskih aU treoninskih ostankov v sekvenci naravnega mpl Uganda (za O-vezana mesta gUkozilacije). Ugodno aminokisUnsko sekvenco mpl Uganda prednostno spremenimo s spremembami na nivoju DNA, posebno z mutiranjem DNA, ki kodira mpl Ugandski poUpeptid na predhodno izbranih bazah, tako da nastanejo kodoni, ki se translatirajo v želene amino kisline. Mutacije DNA lahko naredimo s postopki, opisanimi zgoraj pod naslovom Variante aminokislinske sekvence mpl Uganda.

Drug način za povečevanje števila ogljikohidratnih deležev mpl liganda je kemijsko ali encimatsko pripajanje glikozidov na polipeptid. Ti postopki so prednostni v tem, da ni potrebno izdelati polipeptida v gostiteljski celici s sposobnostjo glikoziliranja za N- ali O-vezano glikozilacijo. Odvisno od uporabljenega načina pripajanja se sladkorji lahko vežejo na (a) arginin in histidin, (b) prosto karboksilno skupino, (c) proste sulfhidrilne skupine, kot so tiste od cisterna, (d) proste hidroksilne skupine, kot so tiste od serina, treonina ali hidroksiprolina in (e) aromatske ostanke, kot so tisti od fenilanalina, tirozina ali triptofana ali (f) na amidno skupino glutamina. Ti postopki so opisani v WO 87/05330, obj. 11. septembra 1987, in v Aplin in Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259-306 [1981].

Odstranitev ogljikohidratnih deležev, prisotnih na mpl Ugandskem poUpeptidu, lahko izvedemo kemijsko aU encimatsko. Kemijska degUkozilacija zahteva izpostavitev poUpeptidov trifluorometansulfonski kislini aU ekvivalentni spojini. Ta obdelava povzroči cepitev večine ali vseh sladkorjev razen vezivnega sladkorja (Nacetilglukozamin ali N-acetilgalaktozamin), medtem ko ostane polipeptid intakten. Kemijsko degUkozilacijo opisujejo Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 [1987] in Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 [1981]. Encimatsko cepitev ogljikohidratnih deležev na poUpeptidih lahko dosežemo z uporabo razUčnih endoin ekso-glikozidaz, kot opisujejo Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 [1987].

Glikozilacijo na potencialnih mestih za glikozilacijo lahko preprečimo z uporabo spojine tunicamicina, kot opisujejo Duskin et al., J. Biol. Chem., 257:3105 [1982]. Tunicamicin blokira tvorbo protein-N-glikozidnih povezav.

Drugi tip kovalentne modifikacije mpl liganda obsega vezavo mpl Ugandskega polipeptida na enega od raznih neproteinskih polimerov, kot so npr. poUetilen glikol, polipropilen gUkol aU polioksialkileni, na način, opisan v US patentih št. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ali 4,179,337. Mpl Ugandski poUpeptidi, kovalentno vezani na pred tem navedene polimere, so tukaj imenovani pegilirani mpl Ugandski poUpeptidi.

Upoštevati je treba, da je potrebno selekcioniranje rekuperirane variante mpl Uganda, da izberemo optimalno varianto za vezavo na mpl, ki bo imela imunološko in/ali biološko aktivnost, definirano zgoraj. Selekcioniramo lahko glede na stabilnost v rekombinantni celični kulturi ali v plazmi (npr. proti proteolitični cepitvi), visoko afiniteto za člana mpl, oksidativno stabilnost, sposobnost, da se izloči v večjih dobit98 kih ipd. Spremembe imunološkega značaja mpl Ugandskega polipeptida, kot je afiniteta za dano protitelo, izmerimo z imunskim testom kompetitivnega tipa. Druge potencialne modifikacije proteina ali polipeptidnih lastnosti, kot je redoks ali termalna stabilnost, hidrofobnost ali občutljivost za proteoUtično degradacijo, preizkusimo s postopki, dobro znanimi v tehniki.

17. Splošni postopki za pripravo protiteles za mpl Ugand

Priprava protiteles (i) Poliklonska protitelesa

Poliklonska protitelesa za mpl Ugandske poUpeptide aU fragmente na splošno vzgojimo v živalih z multipUmi subkutanimi (sc) aU intraperitonealnimi (ip) injekcijami mpl Uganda in adjuvansa. Koristno je, da konjugiramo mpl Ugand aU fragment, ki vsebuje ciljno aminokisUnsko sekvenco, s proteinom, ki je imunogen v vrstah, ki jih je potrebno imunizirati, kot so npr. hemocianin morskega polža, serumski albumin, goveji tiroglobulin ali inhibitor sojin tripsin z uporabo bifunkcionalnega ali derivatizimega sredstva, npr. maleimidobenzoil sulfosukcinimid estra (konjugacija skozi cisteinske ostanke), N-hidroksisukcinimida (skozi lizinske ostanke), glutaraldehida, anhidrida jantarne kisUne, SOC^ aU R¹N=C=NR, kjer sta R in R¹ različni alkilni skupini.

ŽivaU imuniziramo proti mpl Ugandskemu polipeptidu aU fragmentu, imunogenim konjugatom aU derivatom s kombiniranjem 1 mg od 1 /ig peptida aU konjugata (za zajce oz. miši) s 3 volumni Freundovega kompletnega adjuvansa in injiciramo raztopino intradermalno na multipUh mestih. En mesec kasneje ŽivaU poživimo z 1/5 do 1/10 originalne koUčine peptida aU konjugata v Freundovem kompletnem adjuvansu s subkutano injekcijo na multipUh mestih. 7 do 14 dni kasneje živalim odvzamemo kri in serum testiramo za mpl Ugandski protiteiesni titer. Živalim dajemo poživilne injekcije, dokler ne dosežemo končne točke (plato) titra. Prednostno ŽivaU poživimo s konjugatom istega mpl Uganda, vendar konjugiranega z razUčnim proteinom in/ali skozi razUčen premreževalni reagent. Konjugate lahko naredimo tudi v rekombinantni celični kulturi kot proteinske fuzije. Agregacijska sredstva, kot je alum prav tako lahko uporabimo, da povečamo imunski odziv.

(u) Monoklonska protitelesa

Monoklonska protitelesa dobimo iz populacije v bistvu homogenih protiteles, t.j. in99 dividualna protitelesa, ki obsegajo populacijo, so identična, razen možnih naravnih mutacij, ki so lahko prisotne v manjših količinah. Modificiran izraz monoklonski označuje značaj protitelesa, ki ni zmes diskretnih protiteles.

Npr. monoklonska protitelesa mpl liganda v smislu izuma lahko naredimo z uporabo hibridomskega postopka, ki so ga prvi opisali Kohler & Milstein, Nature, 256:495 [1975] (US patent št. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

V hibridomskem postopku miš ali drugo ustrezno gostiteljsko žival, kot je hrček, imuniziramo , kot je opisano pred tem zgoraj, da izzovemo limfocite, ki tvorijo ali so sposobni tvorbe protiteles, da se specifično vežejo na protein, uporabljen za imunizacijo. Alternativno lahko limfocite imuniziramo in vitro. Limfocite nato fuzioniramo z mielomskimi celicami z uporabo prikladnega fuzijskega sredstva, kot je polietilen glikol, da nastane hibridomska celica (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 [Academic Press, 1986]).

Tako pripravljene hibridomske celice zasejemo in pustimo, da rastejo v prikladnem kulturnem mediju, ki prednostno vsebuje eno ali več substanc, ki inhibirajo rast ali preživetje nespojenih parentalnih mielomskih celic. Če npr. parentalne mielomske celice nimajo encima hipoksantin gvanin fosforibozil transferaze (HGPRT ali HPRT), kulturni medij za hibridome značilno vključuje hipoksantin, aminopterin in timidin (medij HAT), pri čemer substance preprečujejo rast celic s pomanjkanjem HGPRT.

Prednostne mielomske celice so tiste, ki se fuzionirajo učinkovito, vzdržujejo stabilen visok nivo ekspresije protitelesa z izbranimi protitelesa tvorečimi celicami in so občutljive za medij, kot je HAT. Med prednostnimi mielomskimi celičnimi linijami so murine mielomske linije, kot tiste, izvedene iz mišjih tumorjev MOPC-21 in MPC-11, dosegljive pri Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, Califomia ZDA, in celice SP-2, dosegljive pri American Type Culture Collection Rockville, Maryland ZDA. Humane mielomske in mišje-humane heteromielomske celične linije so prav tako opisane za izdelavo humanih monoklonskih protiteles (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Kulturni medij, v katerem rastejo hibridomske celice, testiramo za izdelovanje monoklonskih protiteles, naravnanih proti mpl ligandu. Prednostno določimo

100 vezavno specifičnost monoklonskih protiteles, izdelanih od hibridomskih celic, z imunoprecipitacijo ali s testom vezave in vitro, kot je radioimunski test (RIA) ali z encimsko imunskim testom (ELISA).

Vezavno afiniteto monoklonskih protiteles npr. določimo s Scatchardovo analizo od Munsona & Pollarda, Anai. Biochem., 107:220 [1980].

Potem ko hibridomske celice identificiramo, da izdelujejo protitelesa želene specifičnosti, afinitite in/ali aktivnosti, lahko klone subkloniramo z limitiranjem razredčevalnih postopkov in rastjo po standardnih postopkih (Goding, zgoraj). Prikladni kulturni mediji za te namene vključujejo npr. Eaglov medij, modificiran po Dulbecco-u, ali medij RPMI-1640. Poleg tega lahko hibridomske celice rastejo kot ascitesni tumorji v živalih in vivo.

Monoklonska protitelesa, izločena od subklonov, prikladno ločimo iz kulturnega medija, ascitesne tekočine ali seruma s konvencionalnimi imunoglobulinskimi postopki čiščenja, kot so npr. protein-A-sefaroza, hidroksilapatitna kromatografija, gelska elektroforeza, dializa ali afinitetna kromatografija.

DNA, ki kodira monoklonska protitelesa v smislu izuma, z lahkoto izoliramo in sekvenciramo z uporabo konvencionalnih postopkov (npr. z uporabo oligonukleotidnih sond, ki so sposobne specifičnega vezanja na gene, ki kodirajo težke in lahke verige murinih protiteles). Hibridomske celice v smislu izuma so prednosten vir take DNA. Ko DNA izoliramo, jo lahko plasiramo v ekspresijske vektoije, ki jih nato transfektiramo v gostiteljske celice, kot simian COS, ovarijske celice kitajskega hrčka (celice CHO) ali mielomske celice, ki drugače ne tvorijo imunoglobulinskih proteinov, da pride do sinteze monoklonskih protiteles v rekombinantnih gostiteljskih celicah. DNA lahko modificiramo npr. tudi s substitucijo kodirne sekvence za težke in lahke verige konstantnih humanih domen namesto homolognih murinih sekvenc (Cabily et al., zgoraj; Morrison, et al., Proč. Nat. Acad. Sci., 81:6851 [1984]) ali s kovalentnim povezovanjem z imunoglobulinsko kodirno sekvenco celotne ali dela kodirne sekvence za ne-imunoglobulinski polipeptid.

Značilno take ne-imunoglobulinske polipeptide substituiramo za konstantne domene protitelesa v smislu izuma ali jih substituiramo za variabilno domeno enega antigenvezavnega mesta protitelesa v smislu izuma, da kreiramo kimemo divalentno protitelo, ki obsega eno antigen vezavno mesto s specifičnostjo za mpl ligand in drugo

101 antigen vezavno mesto s specifičnostjo za drugačen antigen.

Kimerna ali hibridna protitelesa lahko pripravimo tudi in vitro z uporabo znanih postopkov v kemiji sintetičnih proteinov, vključno tistih, ki vključujejo premreževalna sredstva. Npr. imunotoksine lahko konstruiramo z reakcijo izmenjave disulfidov ali s tvorbo tioetrske vezi. Primeri prikladnih reagentov za ta namen vključujejo imunotiolat in metil-4-merkaptobutirimidat.

Za diagnostično uporabo značilno označimo protitelesa v smislu izuma z detektibilnim deležem. Detektibilni delež mora biti takšen, da je sposoben tvoriti bodisi direktno ali indirektno detektibilen signal. Detektibilni delež je lahko radioaktiven izotop, kot je ³H, ¹⁴C, ’Ψ, ³⁵S ali¹²⁵J, fluorescentna in kemiluminiscentna spojina, kot je fluorescein, izotiocianat, rodamin ali luciferin; radioaktivno izotopsko označevalno sredstvo, kot je npr. ¹²⁵J, ³²P, ¹⁴C ali ³H, ali encim, kot je alkana fosfataza, betagalaktozidaza ali hrenova peroksidaza.

Katerikoli postopek, znan v tehniki, za ločeno konjugiranje protitelesa z detektibilnim deležem, lahko uporabimo, vključno tiste postopke, kijih opisujejo Hunter et al., Nature, 144:945 [1962]; David, et al., Biochemistry, 13:1014 [1974]; Pain, et al., J. Immunol. Meth., 40:219 [1981]; in Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 [1982].

Protelesa v smislu predloženega izuma lahko uporabimo v kateremkoli znanem testu, kot npr. v kompetitivnih vezavnih testih, direktnih in indirektnih sendvič testih in imunoprecipitacijskih testih. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press. Inc., 1987).

Kompetitivni vezavni testi se nanašajo na sposobnost označenega standarda (ki je lahko mpl ligand ali njegov imunološko reaktivni del) za tekmovanje s testnim vzorcem analita (mpl ligand) za vezavo z omejeno količino protitelesa. Količina mpl liganda v testnem vzorcu je obratno proporcionalna količini standarda, ki se veže na protitelesa. Da olajšamo določevanje količine standarda, ki se veže, protitelesa navadno insolubiliziramo pred tekmovanjem ali po njem, tako da standard in analit, ki se vežeta na protitelesa, lahko prikladno ločimo od standarda in analita, ki ostaneta nevezana.

Sendvič testi vključujejo uporabo dveh protiteles, pri čemer je vsako sposobno

102 vezave na različen imunogenski del ali epitop proteina (mpl ligand), ki ga detektiramo. V sendvič testu se testni vzorec analita veže najprej s prvim protitelesom, ki je imobilizirano na trdnem nosilcu, nato pa se drugo protitelo veže na analit in na tak način tvori netopen tridelni kompleks (David & Greene, US patent št. 4,376,110). Drugo protitelo je lahko samo označeno z detektibilnim deležem (direktni sendvič testi), ali pa ga lahko izmerimo z uporabo antiimunoglobulinskega protitelesa, ki je označeno z detektibilnim deležem (indirektni sendvič testi). Npr. en tip sendvič testa je test ELISA, pri čemer je detektibilni delež encim (npr. hrenova peroksidaza).

(iii) Humanizirana in humana protitelesa

Postopki za humaniziranje nehumanih protiteles so dobro znani v tehniki. Na splošno ima humanizirano protitelo enega ali več aminokislinskih ostankov, ki so vanj uvedeni iz nehumanega vira. Ti nehumani aminokislinski ostanki so pogosto imenovani uvoženi ostanki, ki so značilno vzeti iz uvožene variabilne domene. Humanizacijo lahko v bistvu izvedemo po postopku Winteqa in sodelavcev (Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 [1988]), tako da s CDR ali sekvencami CDR glodalcev substituiramo ustrezne sekvence humanega protitelesa. V skladu s tem so humanizirana protitelesa kimema protitelesa (Cabilly et al., zgoraj), v katerih je bistveno manj kot intaktna humana variabilna domena substituirana z ustrezno sekvenco iz nehumane vrste. V praksi so humanizirana protitelesa, značilno humana protitelesa v katerih je nekaj ostankov CDR in možno nekaj ostankov FR, substituiranih z ostanki iz analognih mest v protitelesih glodavcev.

Izbira humanih variabilnih domen, tako lahkih kot težkih, za izdelavo humaniziranih protiteles je zelo pomembna, da znižamo antigenost. V skladu s tki. najboljše prilagojenim postopkom sekvenco variabilne domene protitelesa glodalca selekcioniramo za celotno knjižnico znanih humanih sekvenc variabilne domene. Humana sekvenca, ki je najbližja glodalski, je nato sprejeta kot humano ogrodje (FR) za humanizirano protitelo (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia in Lesk,

J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Drugi postopek uporablja posebno ogrodje, izvedeno iz konsenzne sekvence posebne podskupine lahkih ali težkih verig popolnoma humanih protiteles. Enako ogrodje lahko uporabimo za številna različna humanizirana protitelesa (Carter et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 89:4285 [1992]; Presta et al., J. Immnol., 151:2623 [1993]).

103

Nadalje je pomembno, da protitelesa humaniziramo z retencijo visoke afinitete za antigen in druge ugodne biološke lastnosti. Da dosežemo ta cilj v skladu s prednostnim postopkom, pripravimo humanizirana protitelesa s postopkom analiziranja parentalnih sekvenc in različnih konceptualno humaniziranih produktov z uporabo tridimenzionalnih modelov parentalnih in humaniziranih sekvenc. Tridimenzionalni imunoglobulinski modeli so navadno dosegljivi in strokovnjakom znani. Na voljo so računalniški programi, ki ilustrirajo in prikazujejo verjetne tridimenzionalne konformacijske strukture izbranih kandidatnih imunoglobulinskih sekvenc. Natančen pregled teh ponazoritev omogoča analiziranje verjetne vloge ostankov v delovanju kandidatne imunoglobulinske sekvence, tj. analizo ostankov, ki vplivajo na sposobnost kandidatnega imunoglobulina, da veže svoj antigen. Na ta način lahko ostanke FR izberemo in kombiniramo iz konsenzne in uvožene sekvence, tako da dosežemo želene značilnosti protitelesa, da povečamo afiniteto za ciljne antigene. Na splošno ostanki CDR direktno in najbolj bistveno vplivajo na vezavo antigena. Za nadaljnje podrobnosti glej US prijavo ser. št. 07/934,373, vloženo 21. avgusta 1992, ki je delno nadaljevanje prijave s ser. št. 07/715,272, vložene 14. junija 1991.

Alternativno je sedaj možno, da vzgojimo transgenske živali (npr. miši), ki so sposobne, da po imunizaciji izdelajo popoln repertoar humanih protiteles v odsotnosti endogene imunoglobulinske produkcije. Opisano je, da je posledica homozigotne delecije težke verige protitelesa, ki povezuje regijo (J_H) gena v kimernih in mutantnih miših germinalne linije, popolna inhibicija izdelovanja endogenih protiteles. Transfer humane germinalno linijske imunoglobulinske genske vrste v take germinalno linijske mutantne miši ima za posledico izdelovanje humanih protiteles po antigenskem izzivu. Glej npr. Jakobovits et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 90:2551-255 [1993]; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 [1993]; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 [1993]. Humana protitelesa prav tako lahko nastajajo v knjižnicah za prikazovanje fagov (Hoogenboom in Winter, J. Mol. Biol. 227,381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222,581 [1991]).

(iv) Bispecifična protitelesa

Bispecifična protitelesa so monoklonska, prednostno humana ali humanizirana protitelesa, ki imajo vezavne specifičnosti za vsaj dva različna antigena. Postopki za izdelovanje bispecifičnih protiteles so znani v tehniki.

Tradicionalno temelji rekombinantno izdelovanje bispecifičnih protiteles na

104 koekspresiji dveh imunoglobulinskih parov težka veriga-lahka veriga, kjer imata obe težki verigi različne specifičnosti (Millstein in Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Zaradi naključne izbire imunoglobulinskih težkih in lahkih verig ti hibridomi (kvadromi) izdelujejo potencialno zmes 10 različnih protitelesnih molekul, od katerih ima samo ena pravilno bispecifično strukturo. Čiščenje pravilne molekule, ki navadno poteka s stopnjami afinitetne kromatografije, je precej neugodno, dobitki produkta pa so nizki. Podobni postopki so prikazani v PCT, obj. št. WO 93/08829 (obj. 13. maja 1993) in v Traunecker et al., EMBO, 10:3655-3659 [1991].

V skladu z različnim in bolj prednostnim pristopom protitelesa variabilne domene z želenimi vezavnimi specifičnostmi (protitelo-antigen vezišča) spojimo z imunoglobulinskimi sekvencami konstantnih domen. Fuzija je prednostno s konstantno domeno imunoglobulinske težke verige, ki obsega vsaj del gibljive, CH2 in CH3 regije. Prednostno je, da je konstantna regija prve težke verige (CHl), ki vsebuje mesto, potrebno za vezavo lahke verige, prisotna v vsaj eni od fuzij. DNA ki kodirajo fuzije imunoglobulinskih težkih verig, in če je potrebno imunoglobulinske lahke verige, inseriramo v ločene ekspresijske vektorje in kotransfektiramo v prikladni gostiteljski organizem. To zagotavlja veliko fleksibilnost pri prilagajanju skupnih razmerij treh polipeptidnih fragmentov v izvedbah, kjer neenaka razmerja treh polipeptidnih verig, uporabljenih pri konstrukciji, zagotavljajo optimalne dobitke. Možna je tudi insercija kodirnih sekvenc za dve ali tri polipeptidne verige v enem ekspresijskem vektorju, če ekspresija vsaj dveh polipeptidnih verig v enakih razmerjih daje visoke dobitke ali, če razmerja niso posebno pomembna. V prednostni izvedbi tega načina so bispecifična protitelesa sestavljena iz hibridne imunoglobulinske težke verige s prvo vezavno specifičnostjo v enem kraku in hibridnega imunoglobulinskega para težka veriga-lahka veriga (zagotovljena druga vezavna specifičnost) v drugem kraku. Ugotovili smo, da ta asimetrična struktura pospešuje ločitev želenih bispecifičnih spojin iz neželene kombinacije imunoglobulinske verige, ker prisotnost imunoglobulinske lahke verige samo v eni polovici bispecifične molekule zagotavlja lažjo pot ločitve. Ta način je prikazan v prijavi, ki je istočasno v postopku s ser. št. 07/931,811, vloženi 17. avgusta 1992.

Nadaljnje podrobnosti za izdelovanje bispecifičnih protiteles opisujejo npr. Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 [1986].

(v) Heterokonjugirana protitelesa

105

Heterokonjugirana protitelesa tudi spadajo v obseg predloženega izuma. Heterokonjugirana protitelesa so sestavljena iz dveh kovalentno povezanih protiteles. Taka protitelesa so predlagana za ciljne celice imunskega sistema za neželene celice (US patent št. 4,676,980) in za zdravljenje infekcij s HIV (PCT obj. št. WO 91/00360 in WO 92/00373; EP 03089). Heterokonjugirana protitelesa lahko naredimo z uporabo kateregakoli prikladnega premreževalnega postopka. Prikladna premreževalna sredstva so dobro znana v tehniki in so prikazana v US patentu št. 4,676,980 skupaj s številnimi premreževalnimi tehnikami.

IV. Terapevtska uporaba megakariocitopoetičnega proteinskega mpl liganda

Biološko aktivni mpl ligand s hematopoetičnim efektorskem delovanjem, imenovan tukaj megakariocitopoetični ali trombocitopoetični protein (TPO), lahko uporabimo v sterilnem farmacevtskem pripravku ali formulaciji, da stimuliramo megakariocitopoetično ali trombopoetično aktivnost pri pacientih, ki trpijo zaradi trombocitopenije, zaradi poslabšanega nastajanja, sekvestracije ali povečane destrukcije trombocitov. Hipoplazijo kostnega mozga, povezano s trombocitopenijo (npr. aplastična anemija po kemoterapiji ali transplantaciji kostnega mozga) lahko učinkovito zdravimo s spojinami v smislu izuma, kot tudi motnje, kot je razširjena intravaskulama koagulacija (DIC), imuna trombocitopenija (ki vključuje ΓΓΡ inducirano s HIV in ΓΓΡ neinducirano s HIV), kronična idiopatična trombocitopenija, kongenitalna trombocitopenija, mielodisplazija in trombotična trombocitopenija. Poleg tega so ti megakariocitopoetični proteini lahko koristni pri zdravljenju mieloproliferativnih trombocitotičnih bolezni kot tudi trombocitoze zaradi vnetnih pogojev in pomankanja železa.

Prednostne uporabe megakariocitopoetičnega ali trombocitopoetičnega proteina (TPO) v smislu izuma so v: mielotoksični kemoterapiji za zdravljenje levkemije ali trdih tumoijev, mieloablativni kemoterapiji za avtologne ali alogene transplantacije kostnega mozga, mielodisplaziji, idiopatični aplastični anemiji, kongenitalni trombocitopeniji in imuni trombocitopeniji.

Nadaljnje motnje, ki jih uspešno zdravimo z megakariocitopoetičnimi proteini v smislu izuma, vključujejo defekte ali poškodbe trombocitov, nastale zaradi zdravil, zastrupitev ali aktivacije na umetnih površinah. V teh primerih lahko uporabimo predložene spojine, da stimuliramo prelivanje novih, nepoškodovanih trombocitov. Bolj popoln seznam koristnih aplikacij je naveden pod naslovom ozadje,

106 zgoraj, posebno sekcije (a)-(f) in v tam citiranih referencah.

Megakariocitopoetične proteine v smislu predloženega izuma lahko uporabimo same ali v kombinaciji z drugimi citokini, hematopoetini, interlevkini, rastnimi faktorji ali protitelesi pri zdravljenju zgoraj identificiranih motenj ali stanj. Tako lahko predložene spojine uporabimo v kombinaciji z drugimi proteini ali peptidi, ki imajo trombopoetično aktivnost in vključujejo: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, eritropoetin (EPO), kit ligand, IL-6 in IL-11.

Megakariocitopoetične proteine v smislu izuma pripravimo v zmesi s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem. Ta terapevtski sestavek lahko damo intravenozno ali skozi nos ali pljuča. Sestavek lahko po želji damo parenteralno ali subkutano. Pri sistematičnem dajanju terapevtski sestavek ne sme biti pirogen, mora pa biti v parenteralno sprejemljivi raztopini, ki je glede na pH izotonična in stabilna. Ti pogoji so znani strokovnjakom. Na kratko, dozirne formulacije spojin v smislu izuma pripravimo za shranjevanje ali dajanje, z mešanjem spojine, ki ima želeno stopnjo čistote, s fiziološko sprejemljivimi nosilci, polnili ali stabilizatorji. Taki materiali so netoksični za recipiente v uporabljenih dozah in koncentracijah in vključujejo pufre, kot so fosfat, citrat, acetat in druge soli organskih kislin; antioksidante kot je askorbinska kislina; peptide z nizko molekulsko maso (manj od približno 10 ostankov), kot je poliargenin, proteine, kot je serumski albumin, želatino ali imunoglobuline; hidrofilne polimere, kot je polivinilpirolidinon; amino kisline, kot so glicin, glutaminska kislina, asparaginska kislina ali arginin; monosaharide, disaharide in druge ogljikohidrate, vključno celulozo ali njene derivate, glukozo, manozo ali dekstrine; kelima sredstva kot je EDTA; sladkorne alkohole, kot manitol ali sorbitol; protiione, kot je natrij in/ali neionska površinska sredstva, kot je Tween Pluronic ali polietilenglikol.

Približno 0,5 do 500 mg spojine ali zmesi megakariocitopoetičnega proteina v obliki proste kisline ali baze ali farmacevtsko sprejemljive soli združimo s fiziološko sprejemljivim nosilcem, polnilom, vezivom, prezervativom, stabilizatorjem, aromo itd., kot zahteva sprejeta farmacevtska praksa. Količina aktivne sestavine v teh sestavkih je taka, da dobimo prikladno doziranje v označenem območju.

Sterilne sestavke za injekcijo lahko formuliramo v skladu s konvencionalno farmacevtsko prakso. Npr. raztopine ali suspenzije aktivne spojine v nosilcih, kot je voda ali naravno rastlinsko olje, kot je sezamovo ali arašidno ali olje bombažnih

107 semen ali sintetična maščoba, kot etil oleat ipd., so lahko potrebne. Pufre, prezervative, antioksidante ipd. lahko vgradimo v skladu s sprejeto farmacevtsko prakso.

Prikladni primeri pripravkov za zadržano sproščanje vključujejo semipermeabilne matrice trdnih hidrofobnih polimerov, ki vsebujejo polipeptid, pri čemer so matrice v obliki izdelkov, kot so npr. tanke plasti ali mikrokapsule. Primeri matric za zadržano sproščanje vključujejo poliestre, hidrogele [npr. poli(2-hidroksietil-metakrilat), kot opisujejo Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] in Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982], ali poli(vinilalkohol)], polilaktide (US patent št. 3,773,919, EP 58,481), sopolimere L-glutaminske kisline in gama etil-L-glutamata (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), nerazgradljivi etilen-vinil acetat (Langer et al., zgoraj), razgradljive sopolimere mlečne kisline-glikolne kisline, kot je Lupron Depot™ (injicime mikrokroglice sestavljene iz sopolimera mlečne kisline-glikolne kisline in levprolid acetat) in poli-D-(-)-3-hidroksimasleno kislino (EP 133,988).

Medtem ko polimeri, kot sta etilen-vinilni acetat in mlečna kislina-glikolna kislina omogočajo sproščanje molekul nad 100 dni, pa določeni hidrogeli sproščajo proteine krajši čas. Če zakapsulirani proteini ostanejo v telesu daljši čas, se lahko denaturirajo ali agregirajo kot posledica izpostavitve vlagi pri 37 °C, kar ima za posledico izgubo biološke aktivnosti in možne spremembe v imunogenosti. Racionalne spremembe si lahko zamislimo za proteinsko stabilizacijo, odvisno od vključenega mehanizma. Če odkrijemo, da je mehanizem agregacije tvorba intermolekulske S-S vezi skozi disulfidne izmenjave, lahko dosežemo stabilizacijo z modificiranjem sulfhidrilnih ostankov, liofiliziranjem iz kislinskih raztopin, kontroliranjem vsebnosti vlage, z uporabo ustreznih aditivov in z razvijanjem specifičnih polimernih matričnih sestavkov. Megakariocitopoetični proteinski sestavki za zadržano sproščanje vključujejo tudi liposomsko vgrajene megakariocitopoetične proteine. Uposome, ki vsebujejo megakariocitopoetični protein, pripravimo po postopkih, znanih per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 82:3688:3692 [1985]; Hwang et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 77:4030-4034 [1980]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; japonska patentna prijava 83-118008; US patenta št. 4,485,045 in 4,544,545; in EP 102,324. Navadno so liposomi majhni (približno 20-80 nm), enolamelnega tipa, v njih pa je vsebnost lipidov večja od približno 30 mol.% holesterola, pri čemer izbrano razmerje prilagodimo za optimalno megakariocitopoetično proteinsko terapijo. Doziranje določi spremljajoči zdravnik ob upoštevanju raznih faktorjev, znanih, da modificirajo delovanje zdravil, kot so resnost in tip bolezni, telesna masa, spol, dieta, čas in način dajanja, druga zdravila in

108 drugi relevantni klinični faktorji. Značilno je dnevni režim v območju od 0,1-100 /ig/kg telesne mase, prednostno je doziranje v območju od 0,1-50 μ-g/kg telesne mase. Bolj prednostno je začetno doziranje v območju od 1 do 5 jtig/kg/dan. V danem primeru je dozirno območje enako kot za druge citokine, posebno G-CSF, GM-CSF in EPO. Terapevtsko učinkovite doze lahko določimo s postopki in vitro ali in vivo.

PRIMERI

Verjamemo, da lahko strokovnjaki brez nadaljnjega opisa, ob uporabi predhodnega opisa in ilustrativnih Primerov, naredijo in uporabijo predloženi izum v popolnem obsegu. Naslednji delovni Primeri tako specifično ponazarjajo prednostne izvedbe predloženega izuma in niso narejeni tako, da bi kakorkoli omejevali preostali opis.

PRIMERI

Delno čiščenje prašičjega mpl liganda

Trombocitno revno plazmo zberemo v normalnih ali aplastično anemičnih prašičih. Prašiče naredimo aplastične z obsevanjem z 900 cGy celotnega obsevanja telesa z uporabo linearnega pospeševalnika 4meV. Obsevane prašiče vzdržujemo 6-8 dni z intramuskularnimi injekcijami cefazolina. Nato celoten volumen njihove krvi odstranimo pod splošno anestezijo, hepariniziramo in centrifugiramo pri 1800 g 30 minut, da naredimo trombocitno revno plazmo. Vrh megakariocitne stimulime aktivnosti ugotovimo 6 dni po obsevanju.

Aplastično prašičjo plazmo, ki jo dobimo iz obsevanih prašičev, naredimo 4M z NaCl in mešamo 30 minut pri sobni temperaturi. Nastalo oborino odstranimo s centrifugiranjem s 3800 obr./min v Sorvallu RC3B in supernatant napolnimo na kolono fenil-Toyopearl (220 ml) uravnoteženo v NaPO₄ (10 mM), ki vsebuje NaG (4M). Kolono izpiramo s tem pufrom, dokler ni A^ <0,05 in eluiramo z dH^O. Eluirani proteinski vrh razredčimo z dH₂O do konduktivnosti 15mS in s tem polnimo kolono blue-sefaroze, uravnoteženo v PBS (240 ml). Nato kolono izperemo s 5 kolonskimi volumni vsakega PBS in NaPO₄ (10 mM) (pH 7,4), ki vsebuje sečnino (2M). Proteine eluiramo iz kolone z NaPO₄ (10 mM) (pH 7,4), ki vsebuje sečnino (2M) in NaG (IM). Iz eluiranega proteinskega vrha naredimo 0,01 % oktil glukozid(n-oktil /3-D-glukopiranozid) in 1 mM, v obeh primerih z EDTA in Pefabloc-om (Boehinger Mannheim), in le-to polnimo direktno na tandemsko vezani

109 koloni CD4-IgG (Capon, D.J. et al. Nature 337:525-531 [1989]) in mp/-IgG Ultralink (Pierce) (glej spodaj). Kolono CD4-IgG (2 ml) odstranimo, potem ko vzorec napolnimo, kolono mp/-IgG (4 ml) pa izperemo z lO-kolonskimi volumni vsakega PBS in PBS, ki vsebuje NaCl (2 M), in eluiramo z glicin-HCl (0,1 M), pH 2,25. Frakcije zberemo v 1/10 volumna tris-HQ (1 M) (pH 8,0).

Iz analize frakcij, eluiranih iz znp/-afinitetne kolone z SDS-PAGE (4-20 %, Novex gel), ki poteka pri redukcijskih pogojih, je razvidna prisotnost različnih proteinov (sl. 5). Proteini, ki se obarvajo s srebrom z najmočnejšo intenziteto, se ločijo z jasno Mr 66000, 55000, 30000, 28000 in 14000. Da določimo, kateri od teh proteinov stimulira proliferacijo BafF3-mpl celičnih kultur, te proteine eluiramo iz gela, kot je opisano v Primeru 2 spodaj.

Afinitetne kolone Ultralink

10-20 mg mpl-lgG ali CD4-IgG v PBS pripojimo na 0,5 g smole Ultralink (Pierce) po navodilih izdelovalca.

Konstrukcija in ekspresija /npMgG

Kimemo molekulo, ki obsega celotno ekstracelično domeno humanega mpl (amino kisline 1-491) in regijo Fc humane molekule IgGl eksprimiramo v 293 celic. Fragment cDNA, ki kodira amino kisline 1-491 humanega mpl, dobimo s PCR iz humane megakariocitične CMK celične cDNA knjižnice in sekvenciramo. Mesto Clal inseriramo na 5’ koncu in mesto BstEII na 3’ koncu. Ta fragment kloniramo navzgor od kodirne regije IgGI Fc v vektor Bluescript med mesti Clal in BstEII po delni digestiji produkta PCR z BstEII zaradi dveh drugih mest BstEII, prisotnih v DNA, ki kodira ekstracelično domeno mpl. Mesto BstEII, uvedeno na 3’ koncu produkta PCR mpl je označeno, da ima regijo Fc v okviru z mpl ekstra celično domeno. Konstrukt subkloniramo v vektor pRK5-tkneo med mesti Clal in Xbal in transfektiramo v 293 humanih embrionalnih ledvičjih celic po postopku s kalcijevim fosfatom. Celice zberemo v 0,4 mg/ml G418 in izoliramo idividualne klone. Ekspresijo mpl-lgG iz izoliranih klonov določimo z uporabo ELISE, specifične za humani Fc. Najboljši ekspresijski klon ima ekspresijski nivo 1-2 mg/ml tnpl-lgG.

Ba/F3 mpl P eksprimime celice

110 cDNA, ki ustreza celotni kodirni regiji humanega mpl P kloniramo v pRK5-tkneo, ki ga nato lineariziramo z Noti in transfektiramo v celično linijo Ba/F3, odvisno od IL-3, z elektroporacijo (lxl0⁷ celic, 9605F, 250V). Tri dni kasneje začnemo selekcijo v prisotnosti 2mg/ml G418. Celice zberemo kot poole ali dobimo individualne klone z omejeno razredčitvijo na ploščah s 96 vdolbinicami. Izbrane celice vzdržujemo v RPMI, ki vsebuje FBS (15 %), 1 mg/ml G418, glutamin (20 mM), HEPES (10 mM) in 100 μg/ml Pen-Strepa. Ekspresijo mpl P v zbranih klonih določimo z analizo FACS z uporabo zajčjih poliklonskih protiteles anti-mp/ P.

Ba/F3 mpl ligandski test mpl ligandski test vodimo, kot je prikazano na sl. 2. Da določimo prisotnost mpl liganda iz različnih virov celice Ba/F3 mpl P stradamo IL-3 24 ur pri celični gostoti 5x1ο⁵ celic/ml v ovlaženem inkubatorju pri 37 °C v mešanici zraka in 5 % CO₂. Po končanem stradanju celice zasadimo v posode za kulturo s 96 vdolbinicami z gostoto 50000 celic v 200 μΐ medija z razredčenimi vzorci ali brez in kultiviramo 24 ur v inkubatorju za celično kulturo. 20 μΐ medija RPMI brez seruma, ki vsebuje 1 μ-Ci ³Htimidina, dodamo v vsako vdolbinico za 6-8 ur. Celice nato zberemo na filtrimih ploščah GF/C s 96 vdolbinicami in izperemo 5-krat z vodo. Filtre preštejemo v prisotnosti 40 μΐ scintilacijske tekočine (Microscint 20) v napravi za štetje Packard Top Count.

PRIMER 2

Visoko očiščeni prašičji mpl ligand

Predpis gelske elucije

Enake količine afinitetno očiščenega mpl liganda (frakcija 6, eluirana iz kolone mplIgG) in vzorčnega pufra 2X Laemmli zmešamo pri sobni temperaturi brez redukcijskega sredstva in damo na poliakrilamidni gel Novex 4-20 %, kolikor hitro je mogoče. Vzorec se ne segreje. Kot kontrolo vzdržujemo vzorčni pufer brez liganda v sosednji liniji. Gel vzdržujemo pri 4-6 °C pri 135 voltih približno 2 1/4 ure. Pufer vzdržujemo na začetku pri sobni temperaturi. Gel nato odstranimo iz predela za gel in ploščo na eni strani gela odstranimo.

111

Repliko gela naredimo na nitrocelulozi, kot sledi: kos nitroceluloze omočimo z destilirano vodo in previdno položimo na vrh eksponirane površine gela, tako da izključimo zračne mehurčke. Izhodiščne (fiducial) oznake damo na nitrocelulozo in gelsko ploščo, tako da lahko repliko natančno repozicioniramo po barvanju. Po približno 2 minutah nitrocelulozo previdno odstranimo in gel ovijemo v ovitek iz umetne snovi in damo v hladilnik. Nitrocelulozo obarvamo z Bioradovim zlatim barvilom, ki obarva celotne proteine (Biorad’s gold total protein stain), tako da jo najprej mešamo v 3x10 ml Tweena 20 (0,1 %) + NaG (0,5 M) + tris-HG (0,1 M) (pH 7,5) približno 45 minut, nato pa s 3x10 ml očiščene vode 5 minut. Nato dodamo zlato barvilo in pustimo, da se razvija, dokler proge v standardih niso vidne. Repliko nato speremo z vodo, položimo čez ovitek iz umetne snovi v modelu in previdno poravnamo z izhodiščnimi oznakami. Pozicije standardov Novex označimo na gelski plošči in narišemo linije, da označimo mesta za prerez. Nitrocelulozo in ovitek iz umetne snovi nato odstranimo in gel prerežemo vzdolž označenih linij z ostrim rezilom britve. Prerezi se razširijo čez vzorčno linijo, tako da jih lahko uporabimo, da določimo pozicije za rezine, ko obarvamo gel. Ko rezine odstranimo, preostali gel obarvamo s srebrom in izmerimo pozicije standardov in oznake prerezov. Molekulske mase, ki ustrezajo pozicijam prerezov, določimo s standardi Novex.

rezin gela damo v celice v dveh napravah za elektroeluiranje Biorad model 422. Za celice uporabimo membranske kape z mejno vrednostjo za molekulsko maso 1214K. Eluimi pufer je amonijev bikarbonat (50 mM) + SDS (0,05 %) (pH pribl. 7,8). 11 pufra hladimo približno 1 uro pred uporabo v hladni sobi pri 4-6 °C. Rezine gela eluiramo pri 10 ma/celico (40 v začetno) v hladni sobi pri 4-6 °C. Eluiranje poteka približno 4 ure. Celice nato previdno odstranimo, tekočino nad fritom pa odstranimo s pipeto. Eluimo komoro odstranimo, kakršnokoli tekočino nad membransko kapo pa odstranimo s pipeto. Tekočino v membranski kapi odstranimo s pipeto (Pipetman) in shranimo. 50 /tl alikvote očiščene vode damo nato v kapo, mešamo in odstranimo, ko se vsi kristali SDS raztopijo. Te izpiralne tekočine združimo s shranjeno zgornjo tekočino. Celotni eluimi volumen vzorca je 300-500 /tl na rezino gela. Vzorce damo v 10 mm dializne cevke Spectrapor 4 z mejno vrednostjo za molekulsko maso 12-14K, ki smo jih namakali nekaj ur v očiščeni vodi. Vzorce dializiramo preko noči pri 4-6 °C proti 600 ml fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS je približno 4 mM v kaliju) na 6 vzorcev. Pufer zamenjamo naslednje jutro in dializo nadaljujemo 2,5 ure. Vzorce nato odstranimo iz dializnih vrečk in damo v cevke za mikrofugiranje. Cevke damo za eno uro na led, mikrofugiramo pri 14K obr./min 3 minute in supematante previdno odstranimo iz oborjenega SDS. Super112 natante damo nato na led še za približno 1 uro in mikrofugiramo ponovno 4 minute. Supernatante razredčimo v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom in izpostavimo testu za aktivnost. Preostale vzorce zamrznemo pri -70 °C.

PRIMER 3

Mikrosekvenciranie prašičjega mpl liganda

Frakcijo 6 (2,6 ml) iz afinitetne kolone mpl-lgG koncentriramo na napravi Microcon-10 (Amicon). Zato, da preprečimo absorbiranje mpl liganda na Microcon, membrano izperemo z SDS (1 %) in dodamo 5 μΐ SDS (10 %) k frakciji 6. Vzorčni pufer 2X (20 μΐ) dodamo k frakciji št. 6 po koncentriranju (20 μ.1) na Microconu in celotni volumen (40 μΐ) napolnimo na eno linijo gradientnega akrilamidnega gela (420 %, Novex). Gel vzdržujemo po predpisu Novexa. Gel nato uravnotežujemo 5 minut pred elektropopivnanjem (electroblotting) v pufru 3-(cikloheksilamino)-lpropansulfonske kisline (CAPS) (10 mM), pH 11,0, ki vsebuje metanol (10 %). Elektropopivnanje na membrane Immobilon-PSQ (Millipore) izvedemo v 45 minutah pri konstantnem toku 250 mA v napravi za transfer celic BioRad Trans-Blot (32). Membrane PVDF barvamo z barvilom Coomassie blue R-250 (0,1 %) v metanolu (40 %), ocetni kislini (0,1 %) 1 minuto in razbarvamo v 2-3 minutah z ocetno kislino (10 %) v metanolu (50 %). Edini proteini, ki so vidni v področju z Mr 18000-35000, imajo Mr 30000,28000 in 22000.

Proge pri 30,28 in 22 kDa izpostavimo sekvenciranju proteinov. Avtomatizirano sekvenciranje proteina izvedemo na sekvenatoiju Applied Biosystem model 470A, opremljenim z on-line analizatoijem PTH. Sekvenator modificiramo tako, da injiciramo 80-90 % vzorca (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). Aceton (~ 12 μ]/ϊ) dodamo k topilu A, da uravnotežimo UV absorbanco. Elektropopivnane proteine sekvenciramo v patrone za popivnanje (Blott cartridge). Vrhove integriramo z računalniškim programom Jostice Innovation z uporabo vmesnikov Nelson Analytical 970. Interpretacijo sekvenc izvedemo na VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]). N-terminalne sekvence (ob uporabi kode z eno črko z nedoločenimi ostanki v oklepajih) in količina dobljenega materiala (v oklepajih) so predstavljeni v tabeli 2’.

113

TABELA 2’

Amino-terminalne sekvence mpl liganda

30 kDa [1.8 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D PRLLNKLLRDD (H/S) V L H (G) R L	(SEQ ID NO: 30)
28 kDa [0.5 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR	(SEQ ID NO: 31)
18-22 kDa [0.5 pmol] 1 5 10 XPA,PPAX,DPR,LX(N)(K)	(SEQ ID NO: 32)

PRIMER 4

Test tekočinske suspenzijske megakriocitopoeze

Humane periferne matične celice (PSC) (dobljene od pacientov z njihovo privolitvijo) razredčimo 5-krat z medijem IMDM (Gibco) in centrifugiramo pri 800 g 15 minut pri sobni temperaturi. Celične pelete resuspendiramo v IMDM in damo na Percoll (60 %), gostota 1,077 g/ml (Pharmacia) in centrifugiramo pri 800 g 30 minut. Mononukleame celice z majhno (light) gostoto aspiriramo na vmesni površini in izperemo 2-krat z IMDM in zasadimo 1-2 χ 10⁶ celic/ml v IMDM, ki vsebuje FBS (30 %) (končni volumen 1 ml), v 24 vdolbinic s skupki tkivne kulture (Costar). APP ali APP z odstranjenim mpl ligandom dodamo do 10 % in pustimo, da kulture rastejo 12-14 dni v ovlaženem inkubatorju pri 37 °C v mešanici zraka in 5 % CO_y Kulture rastejo tudi v prisotnosti APP (10 %) z 0,5 gg znp/-IgG, dodanega na dneve 0, 2 in 4. APP odstranimo mpl ligand s prepuščanjem APP skozi mplAgG afinitetno kolono.

114

Za kvantitavno določitev megakariocitopoeze v teh tekočinskih suspenzijskih kulturah uporabimo modifikacijo Solberga et al. in radioaktivno označeno monoklonsko protitelo murinega IgG (HP1-1D) za GPIIbIIIa (dobavitelj Dr. Nichols, Mayo Clinic). 100 μ-g HP1-1D (glej Grant, B. et al., Blood 69:1334-1339 [1987]), radioaktivno označimo z lmCi Na¹²⁵J z uporabo Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) po navodilih izdelovalca. Radioaktivno označen HP1-1D shranimo pri -70 °C v PBS, ki vsebuje oktilglukozid (0,01 %). Značilne specifične aktivnosti so 1-2 χ 10⁶ cpm/p-g (>95 % se obori s trikloroocetno kislino (12,5 %)).

Tekočinske suspenzijske kulture pripravimo v trajniku za vsako eksperimentalno točko. Po 12-14 dneh kultiviranja po 1 ml kultur prenesemo v 1,5 ml eppendorfske cevke in centrifugiramo pri 800 g 10 minut pri sobni temperaturi in nastale celične pelete resuspendiramo v 100 μλ PBS, ki vsebuje EDTA (0,02 %) in goveji telečji serum (20 %). 10 ng ¹²⁵J-HP1-1D v 50 μΐ testnega pufra dodamo k resuspendiranim kulturam in inkubiramo 60 minut pri sobni temepraturi (RT) z občasnim stresanjem. Nato celice zberemo s centrifugiranjem pri 800 g 10 minut pri RT in izperemo 2-krat s testnim pufrom. Pelete štejemo 1 minuto v števcu gama (Packard). Nespecifično vezavo določimo z dodajanjem 1 /xg neoznačenega HP1-1D 60 minut pred dodatkom označenega HP1-1D. Specifično vezavo določimo kot celotno vezavo ¹²⁵J-HP1-1D, minus vezava v prisotnosti prebitka neoznačenega HP1-1D.

PRIMER 5

Oligonukleotidni PCR primerii

Na osnovi amino-terminalne aminokislinske sekvence, dobljene iz proteinov s 30 kDa, 28 kDa in 18-22 kDa, oblikujemo degenerirane oligonukleotide, da jih uporabimo kot primeije verižne polimerazne reakcije (PCR) (glej tabelo 4). Sintetiziramo dva primerska poola, pozitivni-sens 20-memi pool, ki kodira aminokislinske ostanke 2-8 (mpl 1) in anti-sens 21-memi pool, komplementaren sekvencam, ki kodirajo amino kisline 18-24 (mpl 2).

115

TABELA4

Primerski pooli degeneriranih olieonukleotidov

mpl 1:5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (2,048-krat decmpri ran)	(SEQ ID NO: 35)
mpl 2:5’ NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3’ (2,048-krat cfeomprirm)	(SEQ ID NO: 36)

Prašičjo genomsko DNA, izolirano iz prašičjih perifernih krvnih limfocitov, uporabimo kot kalup za PCR. 50 /tl reakcijske zmesi vsebuje: 0,8 /xg prašičje genomske DNA v tris-HCl (10 mM) (pH 8,3), KC1 (50 mM), MgC^ (3 mM), 100 /ig/ml BSA, dNTP (400 μΜ), 1 μΜ vsakega primerskega poola in 2,5 enot Taq polimeraze. Začetno kalupno denaturiranje je pri 94 °C 8 minut, čemur sledi 35 ciklov po 45 sekund pri 94 °C, 1 minuto pri 55 °C in 1 minuto pri 72 °C. Končni cikel pustimo, da traja 10 minut pri 72 °C. Produkte PCR ločimo z elektroforezo na poliakrilamidnem gelu (12 %) in vizualiziramo z barvanjem z etidijevim bromidom. Utemljeno je, da če amino-terminalno aminokislinsko sekvenco kodira posamezen ekson, potem pričakujemo, da ima pravilen produkt PCR 69 bp. Fragment DNA te velikosti eluiramo iz gela in subkloniramo v pGEMT (Promega). Sekvence treh klonov so prikazane spodaj v tabeli 5.

TABELA 5

Fragmenti prašičje genomske DNA z 69 bp gemT3

5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACI

TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 37)

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEP ID NO: 38)

116 gemT7

5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCA£I

CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG(SEQ ID NO: 40) gemT9

P R L L N K L LR (SEQ ID

NO: 32)

S» pCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG 3* GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCA£Iia£

ATCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41)

TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEP ID NO: 42)

Položaj primerjev za PCR je označen s podčrtanimi bazami. Ti rezultati potrjujejo N-terminalno sekvenco, dobljeno za amino kisline 9-17 za proteine s 30 kDa, 28 kDa in 18-22 kDa in označujejo, da to sekvenco kodira posamezen ekson prašičje DNA

PRIMER 6

Gen humanega mpl liganda

Na osnovi rezultatov iz Primera 5 oblikujemo 45-merni deoksioligonukleotid, imenovan pR45, in ga sintetiziramo za selekcioniranje genomske knjižnice. 45-mer ima naslednjo sekvenco:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQ ID NO: 28)

Ta oligonukleotid je ³²P-označen z (γ³²Ρ)-ΑΤΡ in kinazo T4 in ga uporabimo za

117 selekcioniranje humane genomske DNA knjižnice v Xgeml2 pri manj ostrih pogojih za hibridizacijo in izpiranje (glej Primer 7). Pozitivne klone zberemo, plake očistimo in analiziramo z restrikcijskim mapiranjem in Southern blottingom. Klon št. 4 izberemo za dodatno analizo.

2,8 kb fragment BamHI-XbaI, ki se hibridizira s 45-merom subkloniramo v pBluescript SK-. Delno sekvenciranje DNA tega klona izvedemo tako, da kot primeije uporabimo oligonukleotide, specifične za sekvenco DNA prašičjega mpl liganda. Dobljena sekvenca potrjuje, da smo izolirali DNA, ki kodira humani homolog prašičjega mpl liganda. Restrikcijo mesto EcoRI detektiramo v sekvenci, kar nam omogoča, da izoliramo fragment EcoRI-XbaI s 390 bp iz 2,8 kb BamHIXbal in ga subkloniramo v pBluescript SK-.

Obe vijačnici tega fragmenta sekvenciramo. Sekvenca humane DNA in deducirana aminokislinska sekvenca sta prikazani na sl. 9 (SEQ ID NOS: 3 & 4). Napovedani položaji intronov v genomski sekvenci so prikazani s puščicami, definiran pa je tudi domnevni ekson (ekson 3).

Raziskovanje napovedane aminokislinske sekvence potrjuje, da je serinski ostanek prva amino kislina zrelega mpl liganda, kot določimo z direktno analizo aminokislinske sekvence. Takoj navzgor od tega kodona napovedana aminokislinska sekvenca zelo spominja na signalno sekvenco, vključeno v izločanje zrelega mpl liganda. Ta kodirna regija sedanje sekvence je verjetno prekinjena pri nukleotidnem položaju 68 z intronom.

V 3’ smeri kaže, da se ekson konča pri nukleotidu 196. Ta ekson zato kodira sekvenco 42 amino kislin, od katerih jih je 16 verjetno del signalne sekvence in 26 del zrelega humanega mpl liganda.

PRIMER 7 cDNA humanega mpl liganda s popolno dolžino

Na osnovi humane sekvence eksona 3 (Primer 6) sintetiziramo dva nedegenerirana oligonukleotida, ki ustrezata 3’ in 5’ koncema sekvence eksona 3 (tabela 6).

118

TABELA 6

Humana cDNA nedegeneriranih oligonukleotidnih primeriev PCR

(prednji 5' GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3' primer)	(SEOIDNO: 43)
(reverzni 5· CAG TCT GCCGTG AAG GAC ATG G 3’ primer)	(SEOIDNO: 44)

Ta dva primerja uporabimo v reakcijah PCR, pri čemer uporabimo kot kalup DNA iz različnih knjižnic humane cDNA ali 1 ng cDNA Quick Clone (Clonetech) iz različnih tkiv ob pogojih, opisanih v primeru 5. Pričakovana velikost pravilnega produkta PCR je 140 bp. Po analizi produktov PCR na poliakrilamidnem gelu (12 %) detektiramo fragment DNA pričakovane velikosti v knjižnicah cDNA, pripravljenih iz odraslih ledvic, 293 fetalnih ledvičnih celic in cDNA pripravljene iz humanih fetalnih jeter (Clonetech kat. št. 7171-1).

t

Knjižnico cDNA fetalnih jeter v λ DR2 (Clonetech kat. št. HL115lx) selekcioniramo z istim 45-memim oligonukleotidom, ki smo ga uporabili za selekcioniranje humane genomske knjižnice. Oligonukleotid označimo z (γ³²Ρ)-ΑΤΡ z uporabo polinukleotidne kinaze T4. Knjižnico selekcioniramo pri manj ostrih pogojih hibridizacije. Filtre predhibridiziramo 2 uri in nato hibridiziramo s sondo preko noči 16 h pri 42 °C v formamidu (20 %), 5xSSC, 10xDenhardtovem reagentu, natrijevem fosfatu (0,05 M) (pH 6,5), natrijevem pirofosfatu (0,1 %), 50 Mg/ml sonificirane DNA lososove sperme. Filtre nato splaknemo v 2xSSC in nato izperemo enkrat v 0,5xSSC, SDS (0,1 %) pri 42 °C. Filtre izpostavimo preko noči kodakovemu rentgenskemu filmu. Pozitivne klone zberemo, plake očistimo, velikost inserta pa določimo s PCR z uporabo oligonukleotidov, ki so bočno k BamHI-XbaI, ki je kloniran v XDR2 (Conetch kat. št. 6475-1). 5 μΐ izhodnega faga uporabimo kot kalupni vir. Začetna denaturacija poteka 7 minut pri 94 °C, nato pa sledi 30 pomnoževalnih ciklov (1 min. pri 94 °C, 1 min. pri 52 °C in 1,5 min. pri 72 °C). Končna razširitev je 15 min pri 72 °C.

119

Klon št. FL2b ima 1,8 kb insert in ga izberemo za nadaljnjo analizo.

Plazmid pDR2 (Clonetech, \DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, str. 42), ki se nahaja v krakih faga \DR2, osvobodimo po navodilih izdelovalca (Clonetech, XDR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, str. 29-30). Iz restrikcijske analize plazmida pDR2-FL2b z BamHI in Xbal je razvidna prisotnost internega restrikcijskega mesta BamHI v insertu približno na položaju 650. Digestija plazmida BamHI-XbaI prereže insert na dva fragmenta, enega z 0,65 kb in drugega z 1,15 kb. Sekvenco DNA določimo s tremi različnimi razredi kalupov, ki so izvedeni iz plazmida pDR2-FL2b. Sekvenciranje dvojnovijačne plazmidne DNA izvedemo z avtomatskim fluorescentnim sekvenatoijem DNA ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija), pri čemer uporabimo predpise za barvno označene dideoksi nukleozid trifosfatne terminatorje (barvni terminatorji) in po naročilih sintetizirane sprehajajoče (walking) primeije (Sanger et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 74:5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature, 321:674-679 [1986]). Direktno sekvenciranje fragmentov, pomnoženih z verižno polimerazno reakcijo iz plazmida, naredimo s sekvenatorjem ABI373 z uporabo narejenih primerjev in reakcij z barvnimi terminatorji. Enojnovijačni kalup izdelamo z Janusovim vektorjem M13 (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). Fragmenta BamHI-XbaI (1,15 kb) in BamHI (0,65 kb) izoliramo iz plazmida pDR2-FL2b, konce izpolnimo (zacelimo) z DNA polimerazo T4 v prisotnosti deoksinukleotidov in nato subkloniramo v mesto Smal Janusovega vektorja M13. Sekvenciranje izvedemo po standardnih predpisih za barvno označene univerzalne M13 in reverzne primeije ali sprehajajoče primeije in barvne terminatorje. Reakcije manualnega sekvenciranja izvedemo na enojno vijačni DNA M13 z uporabo sprehajajočih primerjev in standardne dideoksi-terminatorske kemije (Sanger et al., Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 74:5463-5467 [1977]), ³³P-označene α-dATP in Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Sestavljanje sekvence DNA izvedemo na napravi Sequencher V2.1bl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Nukleotidne in deducirane sekvence hML so prikazane na sl. 1 (SEQ ID NO:1).

PRIMER 8

Izolacija gena humanega mpl liganda (TPO)

Klone humane genomske DNA gena TPO izoliramo s selekcioniranjem humane

120 genomske knjižnice v X-geml2 s pR45, predhodno opisano oligonukleotidno sondo, pri manj ostrih pogojih (Primer 7), pri zelo ostrih pogojih pa s fragmentom, ki ustreza 3’ polovici humane cDNA, ki kodira mpl ligand (od mesta BamHI do 3’ konca). Izoliramo dva prekrivajoča λ klona, ki obsegata 35 kb. Dva prekrivajoča fragmenta (BamHI in EcoRI), ki vsebujeta celoten gen TPO, subkloniramo in sekvenciramo. Struktura humanega gena je sestavljena iz šestih eksonov znotraj 7 kb genomske DNA (sl. 14A, B in C). Meje vseh eksonskih/intronskih povezav so konsistentne s konsenznim motivom, določenim za gene sesalcev (Shapiro, M. B., et al., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). Ekson 1 in ekson 2 vsebujeta 5’ netranslatirano sekvenco in začetne 4 amino kisline signalnega peptida. Ostanek sekretomega signala in prvih 26 amino kislin zrelega proteina so kodirani v eksonu 3. Celotna karboksilna domena in 3’ netranslatirana kot tudi približno 50 aminokislinska eritropoetinu podobna domena so kodirani v eksonu 6. Štiri amino kisline, vključene v delecije, opažene v hML-2 (hTPO-2), so kodirane na 5’ koncu eksona 6.

PRIMER 9

Prehodna ekspresija humanega mpl liganda (hML)

Zato da subkloniramo insert s popolno dolžino, vsebovan v pDR2-FL2b, plazmid popolnoma digeriramo z Xbal, nato pa delno z BamHI. Fragment DNA, ki ustreza insertu z 1,8 kb, gelsko očistimo in subkloniramo v pRK5 (pRK5-hmp/1) (US patent št. 5,258,287 za konstrukcijo pRK5) ob kontroli citomegalovirusnega neposrednega zgodnjega promotoija. DNA iz konstrukta pRK5-hmp/I pripravimo z metodo PEG in transfektiramo v 293 humanih embrionalnih ledvičnih celic, vzdrževanih v Eaglovem mediju, modificiranem po Dulbecco-u (DMEM), dopolnjenem s hranilno zmesjo F-12, Hepesom (20 mM) (pH 7,4) in fetalnim govejim serumom (10 %). Celice transfektiramo po kalcijevem fosfatnem postopku, kot opisujejo Gorman, C. [1985] v DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., ed) Vol. II, str. 143190, IRL Press, Washington, D.C.. 36 ur po transfekciji supernatant transfektiranih celic testiramo za aktivnost v proliferacijskem testu (Primer 1). Supernatant 293 celic, transfektiranih samo z vektorjem pRK, ne stimulira celic Ba/F3 ali Ba/F3-mp/ (sl. 12A). Supernatant celic, transfektiranih s pRK5-hmp/I ne vpliva na celice Ba/F3, pač pa znatno stimulira proliferacijo celic Ba/F3-mp/ (sl. 12A), iz česar je razvidno, da cDNA kodira funkcionalno aktivni humani mpl ligand.

121

PRIMER 10

Izo-oblike humanega mpl liganda hML2. hML3 in hML4

Zato da idenficiramo alternativno spojene oblike hML, primerje sintetiziramo ustrezno vsakemu koncu kodirne sekvence hML. Te primeije uporabimo v RT-PCR, da pomnožimo RNA humanih odraslih jeter. Dodatno konstruiramo interne primeije, ki so bočno k izbranim regijam, ki nas zanimajo (glej spodaj), in jih podobno uporabimo. Direktno sekvenciranje koncev produkta PCR dokazuje enojno sekvenco, ki natančno ustreza sekvenci cDNA, izolirani iz knjižnice humanih fetalnih jeter (sl. 1 [SEQ ID NO: 1]). Vendar pa ima regija poleg C-terminala EPOdomene (v sredini produkta PCR) vzorec kompleksne sekvence, kar navaja k obstoju možnih spojenih variant v tej regiji. Da izoliramo te spojene variante, uporabimo primeije, prikazane v tabeli 7, ki so bočno k tej regiji v PCR, kot kalupe cDNA humanih odraslih jeter.

TABELA 7

Primerii PCR izo-oblike humanega ML

phmpllcdna.3e1:	5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3'	(SEQ ID NO: 45)
pbx4.f2:	5’GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3’	(SEQ ID NO: 46)

Produkte PCR subkloniramo topo (blunt) v M13. Iz sekvenciranja individualnih subklonov je razvidna eksistenca vsaj 3 izo-oblik ML. Ena od njih, hML (imenovana tudi hML₃₃₂), je najdaljša oblika in natančno ustreza sekvenci, izolirani iz knjižnice fetalnih jeter. Sekvence štirih izo-oblik humanega mpl liganda so navedene od najdaljše (hML) do najkrajše (hML-4) in so prikazane na sl. 11 [SEQ ID NOS: 6,8,9

122 & 10].

PRIMER 11

Konstrukcija in prehodna ekspresija izo-oblik humanega mpl liganda in nadomestnih variant hML2, hML3 in hML(R153A, R154A1

Izo-oblike hML2 in hML3 in nadomestne variante hML(Rl53A, R154A) rekonstruiramo iz hML z uporabo rekombinantnih tehnik PCR, kot opisujejo Russell Higuchi v predpisih PCR, A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White, izdajatelji.

V vseh konstruktih uporabimo zunanje primerje, ki so prikazani v tabeli 8, in prekrivajoče primerje, ki so prikazani v tabeli 9.

TABELA 8

Zunanji primeril

Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3'	(SEQ ID NO: 47)
HMPLL-R: 5'GCT AGC TCT AGA CAG.GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3'	(SEQ ID NO: 48)

TABELA 9

Prekrivajoči primeril

hML-2:	5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3‘	(SEQ ID NO: 49)
MLA4.F:
MLA4.R	5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3'	(SEQ ID NO: 50)

123

hML:!; hMLA116+: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3* h M LA 116 -: 5ΆΑΤ CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3'	(SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52)
hML(R15.3Au... R354A): RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3’	(SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 54)

Vse pomnožitve PCR izvedemo s klonirano Pfu DNA polimerazo (Stratagene), pri čemer uporabimo naslednje pogoje: začetno kalupno denaturiranje je pri 94 °C 7 minut, čemur sledi 30 ciklov po 1 min. pri 94 °C, 1 min. pri 55 °C in 1,5 min. pri 72 °C. Končni cikel pustimo, da traja 10 min. pri 72 °C. Končni produkt PCR digeriramo s Clal-Xbal, gelsko očistimo in kloniramo v pRK5tkneo. 293 celic transfektiramo z različnimi konstrukti, kot je opisano zgoraj, supernatant pa testiramo, pri čemer uporabimo test profileracije Ba/F3-mp/. Za hML-2 in hML-3 ni razvidna detektibilna aktivnost v tem testu, vendar pa je aktivnost hML(R153A, R154A) podobna hML, iz česar je razvidno, da procesiranje na tem dibazičnem mestu ni potrebno za aktivnost (sl. 13).

PRIMER 12 cDNA murinega mpl liganda mML, mML-2 in mML-3

Izolacija cDNA mML

Fragment DNA, ki ustreza celotni kodirni regiji humanega mpl liganda, dobimo s PCR, gelsko očistimo in označimo z naključnim iniciranjem v prisotnosti ³²P-dATP in ³²P-dCTP. To sondo uporabimo, da selekcioniramo 10⁶ klonov knjižnice cDNA mišjih jeter v \GT10 (Clontech kat. št. ML3001a). Filtre v paralelki hibridiziramo v formamidu (35 %), 5xSSC, 10xDenhardtovem reagentu, SDS (0,1 %), natrijevem fosfatu (0,05M) (pH 6,5), natrijevem pirofosfatu (0,1 %), 100 μ-g/ml sonificirane DNA lososove sperme preko noči v prisotnosti sonde. Filtre splaknemo v 2xSSC in nato izperemo enkrat v 0,5xSSC, SDS (0,1 %) pri 42 °C. Hibridizime fage očistimo plakov in inserte cDNA subkloniramo v mesto EcoRI plazmida Bluescript SK-. Klon

124

LD z 1,5 kb insertom izberemo za nadaljnjo analizo in obe vijačnici sekvenciramo, kot je opisano zgoraj za cDNA humanega ML. Nukleotid in deducirane aminokislinske sekvence iz klona LD so prikazane na sl. 14 (SEQ ID NOS:1 & 11). Deducirana sekvenca zrelega ML iz tega klona ima dolžino 331 aminokislinskih ostankov in je identificirana kot mML₃₃₁ (ali mML-2 zaradi razlogov opisanih spodaj). Znatno identičnost tako za nukleotid kot tudi za deducirane aminokislinske sekvence opazimo v domenah, podobnih EPO teh ML. Vendar pa je pri razvrstitvi deduciranih aminokislinskih sekvenc humanih in mišjih ML razvidno, da ima mišja sekvenca tetrapeptidno delecijo med humanimi ostanki 111-114, ki ustreza deleciji 12 nukleotidov po nukleotidnem položaju 618, vidni tako v humani (glej zgoraj) kot tudi prašičji (glej spodaj) cDNA. V skladu s tem raziščemo tudi dodatne klone, da detektiramo možne izo-oblike murinega ML. En klon L7 ima 1,4 kb insert z deducirano sekvenco 335 amino kislin, ki vsebuje manjkajoči tetrapeptid LPLQ. Ta oblika je verjetno murini ML s popolno dolžino, imenovana mML ali mML^. Nukleotid in deducirana aminokislinska sekvenca za mML sta prikazana na sl. 16 (SEQ ID NOS: 12 & 13). Končno klon L2 izoliramo in sekvenciramo. Ta klon ima delecijo 116 nukleotidov, ki ustreza hML3 in je zato označen mML-3. Primerjava deduciranih aminokislinskih sekvenc teh dveh izo-oblik je prikazana na sl. 16.

Ekspresija rekombinantnega mML

Ekspresijske vektorje za murine ML pripravimo v bistvu tako, kot je opisano v primeru 8. Klone, ki kodirajo mML in mML-2, subkloniramo v pRK5tkneo, ekspresijski vektor sesalca, ki zagotavlja ekspresijo ob kontroli promotorja CMV in poliadenilacijskega signala SV40. Nastale ekspresijske vektorje mMLpRKtkneo in mML2pRKtkneo prehodno transfektiramo v 293 celic s kalcijevim fosfatnim postopkom. Po prehodni transfekciji medij kondicioniramo 5 dni. Celice vzdržujemo v zelo glukoznem mediju DMEM, dopolnjenim s fetalnim telečjim serumom (10 %).

Ekspresija murinega mpl (mmpl) v celicah Ba/F3

Stabilne celične linije, ki eksprimirajo c-mpl, dobimo s transfekcijo mmpl pRKtkneo v bistvu tako, kot je opisano za humani mpl v Primeru 1. Na kratko, ekspresijski vektor (20 μ-g; lineariziran), ki vsebuje celotno kodirno sekvenco murinega mpl (Skoda, R. C., et al., EMBO J. 12:2645-2653 [1993]), transfektiramo v celice Ba/F3 z elektroporacijo (5x1ο⁶ celic, 250 voltov, 960 μ-F), nato pa sledi selekcija za neomicinsko odpornost z 2 mg/ml G418. Ekspresijo mpl testiramo s pretočno

125 citometrično analizo z uporabo zajčjega antimurinega znp/-IgG anti-seruma. Celice Ba/F3 vzdržujemo v mediju RPMI 1640 iz celic WEHI-3B kot vir IL-3. Supematante 293 celic, prehodno transfektirane tako z mML kot tudi z mML-2, testiramo v celicah Ba/F3, transfektiranih tako z mmpl kot tudi hmpl, kot je opisano v Primeru 1.

PRIMER 13 cDNA prašičjega mpl liganda pML in pML-2 cDNA prašičjega ML (pML) izoliramo z RACE PCR. Na kratko, primer oligo dT in 2 specifična primerja oblikujemo na osnovi sekvence eksona gena prašičjega ML, ki kodira amino terminal ML, očiščenega iz aplastičnega prašičjega seruma. Dobimo cDNA, pripravljeno iz raznih aplastičnih prašičjih tkiv, in pomnožimo. Produkt cDNA PCR s 1342 bp ugotovimo v ledvicah in subkloniramo. Različne klone sekvenciramo in ugotovimo, da kodirajo zreli prašičji mpl ligand (ni vključen popolen sekrecijski signal). Za cDNA ugotovimo, da kodira zreli protein s 332 amino kislinami (pMLj₃₂), ki ima sekvenco, prikazano na sl. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

POSTOPEK:

Izolacija gena pML in cDNA. Genomske klone gena prašičjega ML izoliramo s selekcioniranjem prašičje genomske knjižnice v EMBL3 (Clontech Inc.) s pR45. Knjižnico selekcioniramo v bistvu tako, kot je opisano v Primeru 7. Različne klone izoliramo in ekson, ki kodira aminokislinsko sekvenco, identično tisti, ki jo dobimo iz očiščenega ML, sekvenciramo. cDNA prašičjega ML dobimo z modifikacijo predpisa RACE-PCR. Dva specifična primerja ML oblikujemo na osnovi sekvence gena prašičjega ML. Poliadenilirano mRNA izoliramo iz ledvic aplastičnih prašičev v bistvu tako, kot je opisano pred tem. cDNA pripravimo z reverzno transkripcijo s primeijem BamdT, (BamdT: 5’ GACTCGAGGATCCATCGAI1111111IIIIITITT 3') (SEQ ID NO: 55) usmerjenim proti poliadenozinskemu repu mRNA. Začetni cikel pomnoževanja PCR (28 ciklov pri 95 °C 60 sekund, pri 58 °C 60 sekund in 72 °C 90 sekund) iz126 vedemo tako, da uporabimo h-prednji (forward)-l primer, specifičen za ML (h-forward-1: 5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3¹) (SEQ ID NO: 43) in primer BAMAD (BAMAD: 5‘ GACTCGAGGATCCATCG 3') (SEQ ID NO: 56) v 100 ml reakcijske zmesi KC1 (50 mM), MgCl (1,5 mM), tris (10 mM) pH 8,0 dNTP (0,2 mM) z 0,05 E/ml Amplitaq polimeraze [Perkin Elmer Inc.]). Produkt PCR nato digeriramo s Clal, ekstrahiramo s fenolom-kloroformom (1:1), oborimo z etanolom in legiramo z 0,1 mg vektoija Bluescript SK- (Stratagene Inc.), ki je prerezan s Clal in Kpnl. Po dveumi inkubaciji pri sobni temperaturi eno četrtino ligacijske zmesi dodamo direktno k drugemu ciklu PCR (22 ciklov, kot je opisano zgoraj), pri čemer uporabimo drugi prednji-1 primer, specifičen za ML (forward-1: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO: 57) in T3-21 (oligonukleotid, ki se veže na sekvenco zraven multiple klonime regije v vektorju Bluescript SK-):

(5' CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3’) (SEQ ID NO: 58).

Nastali produkt PCR digeriramo z Xbal in Clal in subkloniramo v Bluescript SK-. Sekvenciramo različne klone iz neodvisnih reakcij PCR.

Ponovno identificiramo drugo obliko, označeno pML-2, ki kodira protein z delecijo 4 aminokislinskih ostankov (328 aminokislinskih ostankov) (sl. 21 [SEQ ID NO: 21]). Iz primerjave aminokislinskih sekvenc za pML in pML-2 je razvidno, da je slednja oblika identična, razen da ima delecijo tetrapeptida QLPP, ki ustreza ostankom od 111 do vključno 114 (sl. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Do delecije štirih amino kislin,

127 ki jo zaznamo v cDNA murinega, humanega in prašičjega ML, pride na natančno enakem položaju v napovedanih proteinih.

PRIMER 14

Test CMK za trombopoetinsko (TPO) indukcijo ekspresije trombocitnega antigena

GPU. III

-—2

Celice CMK vzdržujemo v mediju RMPI 1640 (Sigma), dopolnjenem s fetalnim govejim serumom (10 %) in glutaminom (10 mM). Pri pripravi za test celice zberemo, izperemo in resuspendiramo ΙΟχΙΟ⁵ celic/ml v mediju GIF brez seruma, dopolnjenem s 5 mg/1 govejega inzulina, 10 mg/1 apo-transferina, 1 X elementi v sledovih. V vsako vdolbinico plošče z ravnim dnom in s 96 vdolbinicami damo standard TPO ali eksperimentalne vzorce pri ustreznih razredčitvah v 100 μΐ volumnih. 100 μΐ celične suspenzije CMK dodamo v vsako vdolbinico in plošče inkubiramo pri 37 °C v inkubatorju s 5 % CO₂ 48 ur. Po inkubaciji plošče vrtimo s 1000 obr./min. pri 4 °C 5 minut. Supematante zavržemo, v vsako vdolbinico pa dodamo 100 μΐ FITCkonjugiranih GPII_bIII_a monoklonskih 2D2 protiteles. Po inkubaciji pri 4 °C 1 uro plošče ponovno vrtimo s 1000 obr./min. 5 minut. Supematante, ki vsebujejo nevezana protitelesa zavržemo in v vsako vdolbinico dodamo 200 μΐ BSA-PBS izpiralne raztopine (0,1 %). Stopnjo izpiranja z BSA-PBS (0,1 %) ponovimo trikrat. Celice nato analiziramo na FASCAN z uporabo standardne eno-parametrske analize, pri čemer merimo relativno fluorescentno intenziteto.

PRIMER 15

Test DAMI za trombopoetin (TPO) z merjenjem endomitotične aktivnosti celic

DAMI na mikrotiterskih ploščah s 96 vdolbinicami

Celice DAMI vzdržujemo v IMDM + konjskem serumu (10 %) (Gibco), dopolnjenem z glutaminom (10 mM), 100 ng/ml Penicillina G in 50 μ-g/ml streptomicina. Pri pripravi za ta test celice zberemo, izperemo in resuspendiramo ΙχΙΟ⁶ celic/ml v IMDM + konjskem serumu (1 %). V ploščo z okroglim dnom s 96 vdolbinicami dodamo 100 μΐ standarda TPO ali eksperimentalnih vzorcev k celični suspenziji DAMI. Celice nato inkubiramo 48 ur pri 37 °C v inkubatorju s 5 % CO₂. Po inkubaciji plošče vrtimo v centrifugi Sorvall 6000B s 1000 obr./min 5 minut pri 4 °C. Supematante zavržemo in ponovimo izpiralno stopnjo z 200 μΐ PBS-BSA (0,1 %).

128

Celice fiksiramo z dodatkom 200 gl ledeno-hladnega 70% etanola - PBS in resuspendiramo z aspiracijo. Po inkubaciji pri 4 °C 15 minut ploščo vrtimo z 2000 obr./min 5 minut in dodamo v vsako vdolbinico 150 gl od 1 mg/ml RNA-ze, ki vsebuje 0,1 mg/ml propidijevega jodida in Tween-20 (0,05 %). Po 1 uri inkubacije pri 37 °C izmerimo spremembe v vsebnosti DNA s pretočno citometrijo. Poliploidijo izmerimo in kvantitativno določimo, kot sledi:

Normalizirano poliploidno razmerje (NPR) = (%celic v >G2+M/%celic v <G2+M) s TPO (%celic v >G2+M/%celic v <G2+M) v kontroli

PRIMER 16

Test trombopoetina (TPO) in vivo (Test oživitve mišjih trombocitov)

Test nastajanja trombocitov z določitvijo ^S, in vivo

Mišim C57BL6 (dobljene pri Charles Riveiju) injiciramo intraperitonealno (IP) 1 ml kozjega protimišjega trombocitnega seruma (6 ampul) na dan 1, da ustvarimo trombocitopenijo. Na dneva 5 in 6 damo mišim dve injekciji faktorja IP ali PBS kot kontrolo. Na dan 7 injiciramo intravenozno 30 gCi Na₂ ³⁵SO₄ v 0,1 ml fiziološke raztopine soli in izmerimo odstotek vgraditve ³⁵S injicirane doze v krožeče trombocite v krvnih vzorcih, ki jih dobimo iz obdelanih in kontrolnih miši. Število trombocitov in levkocitov določimo istočasno v krvi, ki jo dobimo iz retro-orbitalnega sinusa.

PRIMER 17

KIRA ELISA za trombopoetin (TPO) z merjenjem fosforilaciie kimemega receptorja mpJ-Rse.gD

Receptor humanega mpl so opisali Vigon et al., PNAS, ZDA 89:5640-5644 (1992). Kimemi receptor, ki obsega ekstracelično domeno (ECD) mpl receptorja in transmembrano (TM) in intracelično domeno (ICD) Rse (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269 (14):10720-10728 [1994]) s karboksi-terminalnim polipeptidom z repom (flag polipeptidom) (t.j. Rse.gD) naredimo za uporabo v KIRA ELISA, opisano tukaj. Ta test je prikazan z diagrami na sl. 30 in 31.

(a) Pripravek kaptažnega sredstva

129

Monoklonski anti-gD (klon 5B6) izdelamo za peptid iz glikoproteina virusa Herpes simpleks (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 [1990]). Očiščeni izhodni pripravek naravnamo na 3,0 mg/ml v fiziološki raztopini soli s fosfatnim pufrom (PBS), pH 7,4 in 1,0 ml alikvote shranimo pri -20 °C.

(b) Pripravek anti-fosfotirozinskega protitelesa

Monoklonski anti-fosfotirozin, klon 4G10, nabavimo pri UBI (Lake Placid, NY) in biotiniliramo z dolgokrakim biotin-N-hidroksisukcinamidom (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Ligand

Mpl ligand pripravimo z rekombinantnimi tehnikami, opisanimi tukaj. Očiščeni mpl ligand shranimo pri 4 °C kot izhodno osnovno raztopino.

(d) Priprava nukleinske kisline Rse.gD

Sintetične dvojnovijačne oligonukleotide uporabimo za rekonstituiranje kodirne sekvence za C-terminal 10 amino kislin (880-890) humanega Rse in dodamo dodatnih 21 amino kislin, ki vsebujejo epitop za protitelo 5B6 in stop kodon. V tabeli 10 je prikazana končna sekvenca sintetičnega dela fuzijskega gena.

TABELA 10

Sintetični dvoinovijačni del fuzijskega gena humanega Rse

kodirna vijačnica: 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3'

(SEQ ID NO: 59)

130 nekodima (anti-sens) vijačnica:

5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3* (SEQ ID

Sintetično DNA ligiramo s cDNA, ki kodira amino kisline 1-880 humanega Rse, na mestu Pstl z začetkom pri nukleotidu 2644 objavljene sekvence cDNA humanega Rse (Mark et al., Journal of Biological Chemistiy 269(14):10720-10728 [1994]) in mestih Hindlll v poli linkeiju ekspresijskega vektorja pSVI7.ID.LL (sl. 32 A-L: SEQ ID NO: 22), da ustvarimo ekspresijski plazmid pSV.ID.Rse.gD. Na kratko, ekspresijski plazmid obsega dicistronski primarni transkript, ki vsebuje sekvenco ki kodira DHFR, vezano z intronskimi spajalnimi mesti 5’ spajalnega donoija in 3’ spajalnega akceptoija, čemur sledi sekvenca, ki kodira Rse.gD. Sporočilo s popolno dolžino (nespojeno) vsebuje DHFR kot prvi odprti bralni okvir in zato ustvari protein DHFR, da omogoči selekcijo stabilnih transformatnov.

(e) Priprava nukleinske kisline mp/-Rse.gD

Ekspresijski plazmid pSV.ID.Rse.gD, izdelan kot je opisano zgoraj, modificiramo, da izdelamo plazmid pSV.ID.M.tmRd6, ki vsebuje kodirne sekvence od ECD humanega mpl (amino kisline 1-491), spojene s transmembransko domeno in intracelično domeno Rse.gD (amino kisline 429-911). Sintetične oligonukleotide uporabimo, da povežemo kodirno sekvenco dela ekstracelične domene humanega mpl z delom kodirne sekvence Rse v dvostopenjski klonimi reakciji PCR, kot opisujejo Mark et al., J. Biol. Chem. 267:26166-26171 (1992). Primeija, ki ju uporabimo za prvo reakcijo PCR, sta Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID NO: 61) inM2

131 (5*-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3’) (SEQ ID NO: 62) s kalupno cDNA mpl in RI (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3‘) (SEQ ID NO: 63) in R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) s kapulno cDNA Rse. Delež PvuII-Smal te fuzijske povezave uporabimo za konstrukcijo kimernega receptorja s popolno dolžino.

(f) Celična transformacija

Celice DP12.CHO (EP 307,247, obj. 15. marca 1989) elektroporiramo s pSV.ID.M.tmRd6, ki ga lineariziramo kot edino mesto Noti v plazmidnem ogrodju. DNA oborimo z etanolom po ekstrakciji s fenolom/kloroformom in resuspendiramo v 20 μλ 1/10 tris EDTA Nato 10 /zg DNA inkubiramo z 10⁷ celic DP12 CHO v 1 ml PBS na ledu 10 minut pred elektroporiranjem pri 400 voltih in 330 /zF. Celice damo na led za 10 minut, predno jih zasadimo v neselektivni medij. Po 24 urah celice nahranimo z medijem, ki ne vsebuje nukleozidov, da jih izberemo za stabilen DHFR+klone.

(g) Selekcija transformiranih celic za uporabo v KIRA ELISA

Klone, ki eksprimirajo MPL/Rse.gD indentificiramo z westem-blotting-om celotnih celičnih lizatov po frakcionaciji z SDS-PAGE z uporabo protitelesa 5B6, ki detektira epitopni tag gD.

(h) Medij

Celice zrastejo v F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Medij dopolnimo z diafiltriranim FBS (10 %) (HyClone, Logan, Utah), HEPES-om (25 mM) in L-glutaminom (2 mM).

132 (i)KIRA ELISA

Celice DP12.CHO, transformirane z mpZ-Rse.gD, zasejemo (3x1ο⁴ na vdolbinco) v vdolbinice plošče za kulturo z ravnim dnom in s 96 vdolbinicami v 100 μΐ medija in kultiviramo preko noči pri 37 °C v 5 % CO₂. Naslednjo jutro v vdolbinicah supernatante dekantiramo in plošče rahlo popivnamo na papirnate brisače. Nato dodamo v vsako vdolbinico 50 μΐ medija, ki vsebuje bodisi eksperimentalne vzorce ali 200,50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ali 0 ng/ml mpl liganda. Celice stimuliramo pri 37 °C 30 minut, supematante v vdolbinicah dekantiramo in plošče ponovno enkrat rahlo popivnamo na papirnato brisačo. Za lizo celic in solubiliziranje kimemih receptoijev dodamo v vsako vdolbinico 100 μΐ liznega pufra. Lizni pufer je sestavljen iz NaCl (150 mM), ki vsebuje HEPES (50 mM) (Gibco), Triton-X 100 (0,5 %) (Gibco), timerosal (0,01 %), 30 KIE/ml aprotina (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 4-(2aminoetil)-benzensulfonil fluorid hidroklorid (1 mM), (AEBSF: ICN Biochemicals), levpeptin (50 μΜ) (ICN Biochemicals) in natrijev ortovanadat (2 mM) (Na₃VO₄: Sigma Chemical Co, St. Louis. MO), pH 7,5. Plošče nato rahlo tresemo na ploščnem tresalniku (Belico Instruments, Vineland, NJ) 60 minut pri sobni temperaturi.

Medtem ko se celice solubilizirajo, mikrotitrsko ploščo ELISA (Nune Maxisorp, Inter Med, Danska), ki je preko noči premazana z monoklonskim anti-gD protitelesom 5B6 pri 4 °C (5,0 μg/ml v karbonatnem pufru (50 mM), pH 9,6, 100 μΙ/vdolbinico), dekantiramo, popivnamo na papirnato brisačo in blokiramo s 150 μΙ/vdolbinico pufra za blokiranje [PBS, ki vsebuje BSA (0,5 %) (Intergen Company, Purchase, NY) in timerosal (0,01 %)] 60 minut pri sobni temperaturi ob rahlem tresenju. Po 60 minutah ploščo, premazano z anti-gD 5B6, izperemo 6-krat z izpiralnim pufrom (PBS, ki vsebuje Tween-20 (0,05 %) in timerosal (0,01 %)) z avtomatiziranim ploščnim izpiralnikom (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc. Sterling, VA).

Lizat, ki vsebuje solubiliziran mp//Rse.gD, iz mikrotitrske vdolbinice s celično kulturo prenesemo v vdolbinico ELISE (85 μΙ/vdolbinico), premazano z anti-gD 5B6 in blokirano, ter nato inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi ob rahlem tresenju. Nevezani mpl Rse.gD odstranimo z izpiranjem z izpiralnim pufrom in v vsako vdolbinico dodamo 100 μΐ biotiniliranega 4G10 (anti-fosfotirozin) razredčenega 1:18000 v razrečevalnem pufru (PBS, ki vsebuje BSA (0,05 %), Tween-20 (0,05 %), EDTA (5

133 mM) in timerosal (0,01 %), t.j. 56 ng/ml. Po inkubaciji 2 uri pri sobni temperaturi ploščo izperemo in v vsako vdolbinico dodamo 100 μΐ streptavidina, konjugiranega s hrenovo peroksidazo (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) in razredčenega 1:60000 v razredčevalnem pufru. Ploščo inkubiramo 30 minut pri sobni temperaturi ob rahlem tresenju. Nevezani avidinski konjugat odstranimo s spiranjem in v vsako vdolbinico dodamo 100 μΐ sveže pripravljene substratne raztopine (tetrametil benzidin [TMB]; 2-komponentni substratni kit; Kirkegaard in Peny, Gaithersburg, MD). Pustimo, da reakcija poteka 10 minut, in nato ustavimo razvijanje barve z dodatkom 100 μλ H₃PO₄ (1,0 M)/vdolbinico. Absorbanco pri 450 nm odčitamo z referenčno valovno dolžino 650 nm (ABS_450/650) z uporabo ploščnega čitalnika vmax (Molecular Devices, Palo Alto, CA), nadzorovanega z Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) in programske opreme Delta Soft (BioMetallics, Inc, Princeton, NJ).

Standardno krivuljo naredimo s stimuliranjem dpl2.trkA,B ali celic C.gD z 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ali 0 ng/ml mpl liganda in prikažemo kot TPO v ng/ml proti povprečju ABS_450/650 ± sd (standardna deviacija) z uporabo programa DeltaSoft. Vzorčne koncentracije dobimo z interpolacijo njihovih absorbanc na standardni krivulji in jih izrazimo kot aktivnost TPO v ng/ml.

Za mpl ligand ugotovimo, da je sposoben da aktivira kimemi receptor mpl-Rse.gD na koncentracijsko odvisen in Ugandsko specifičen način. Nadalje smo ugotovfli, da je test mpl-Rse.gD s KERA-ELISO toleranten za humani serum do 100 % (prikazano) aU plazmo do 100 % (ni prikazano), kar dopušča, da test lahko uporabimo za enostavno selekcioniranje pacienta in vzorcev pK.

134

Standardna krivulja za TPO^, izdelan v 293 celicah

(ng/ml)

Povzetek EC50 vrednosti TPO

Oblika TPO (celice)	EC50 (mas./vol.)	EC50 (molamost)
Hu TPO 332 (293)	2.56 ng/ml	67.4 pM
Mu TPO 332 (293)	3.69 ng/ml	97.1 pM
Hu TPO 153 (293)	-41 ng/ml	-1.08 nM
Hu TPO 155 (£ coli)	0.44 ng/ml	11.6 pM
Hu TPO 153met (E. coli)	0.829 ng/ml	21.8 pM

135

PRIMER 18

Receptorsko osnovana ELISA za trombopoetin (TPO)

Plošče za ELISO prevlečemo z zajčjim F(Ab’)₂ anti-humanim IgG (Fc) v karbonatnem pufru s pH 9,6 in vzdržujemo preko noči pri 4 °C. Plošče blokiramo z govejim serumskim albuminom (0,5 %) v PBS pri sobni temperaturi 1 uro. Produkt fermentacije, ki vsebuje kimemi receptor, mp/-IgG, dodamo na plošče in inkubiramo 2 uri. Nato dodamo na plošče dvojne serijske razredčitve (0,39 -25 mg/ml) standarda (TPO₃₃₂, izdelan v 293 celicah s koncentracijo, določeno s kvantitativno aminokislinsko analizo) in serijsko razredčene vzorce v govejem serumskem albuminu (0,5 %), Tween-u-20 (0,05 %) in inkubiramo 2 uri. Vezan TPO detektiramo s proteinom A, očiščenimi biotiniliranimi zajčjimi protitelesi za TPO₁₅₅, ki je izdelan v E. coli (inkubacija 1 uro), in nato s streptavidin-peroksidazo (inkubacija 30 minut) in 3,3’,5,5’-tetrametil benzidinom kot substratom. Absorbanco odčitamo pri 450 nm. Plošče med stopnjami izpiramo. Za analizne podatke umerimo standardno krivuljo z uporabo štiriparametrskega programa za umerjanje krivulj od Kaleidagrapha. Koncentracijo vzorcev izračunamo iz standardne krivulje.

PRIMER 19

Ekspresija in čiščenje TPO iz 293 celic

1. Priprava ekpresijskih vektorjev 293 celic cDNA, ki ustreza celotnemu odprtemu bralnemu okviiju TPO, dobimo s PCR z uporabo naslednjih oligonukleotidov kot primeijev:

TABELAH

Primerji PCR 293 celic

Cla.FL.F: 5' ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3‘	(SEOIDNO: 65)
hmpll-R: 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3'	(SEOIDNO: 48)

136

PRK5-hmp/1 (opisan v Primeru 9) uporabimo kot kalup za reakcijo v prisotnosti pfu DNA polimeraze (Stratagene). Začetno denaturiranje je 7 minut pri 94 °C, čemur sledi 25 ciklov pomnoževanja (1 min. pri 94 °C, 1 min. pri 55 °C in 1 min. pri 72 °C). Končna razširitev je 15 min. pri 72 °C. Produkt PCR očistimo in kloniramo med restrikcijski mesti Clal in Xbal plazmida pRK5tkneo, vektorja, izvedenega iz pRK5, modificiranega za ekspresijo gena, rezistentnega proti neomicinu, ob kontroli timidin kinaznega promotorja, da dobimo vektor pRK5tkneo.ORF. Drugi konstrukt, ki ustreza homologni domeni EPO, izdelamo na enak način, le z uporabo Cla.FLF kot prednjega (forward)-primeija in naslednjega reverznega primerja:

Arg.STOP.Xba: 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO: 66)

Končni konstrukt je imenovan pRK5.tkneoEPO-D. Sekvenci obeh konstruktov potrdimo, kot je opisano v Primeru 7.

2. Transfekcije humanih embrionalnih ledvičnih celic

Ta dva konstrukta transfektiramo v humane embrionalne ledvične celice s CaPO₄ postopkom, kot je opisano v Primeru 9. 24 ur po transfekciji začnemo selekcijo klonov, rezistentnih proti neomicinu, v prisotnosti 0,4 mg/ml G418.10 do 15 dni kasneje individulane kolonije prenesemo na plošče s 96 vdolbinicami in pustimo, da rastejo do konfluence. Ekspresijo ML₁₅₃ ali MLj₃₂ v kondicioniranem mediju določimo iz teh klonov s testom proliferacije Ba/F3-mp/ (opisano v Primeru 1).

3. Čiščenje rhML₃₃₂

Kondicioniran medij 293-rhML₃₃₂ nanesemo na kolono blue-sefaroze (Pharmacia), uravnoteženo v natrijevem fosfatu (10 mM), pH 7,4 (pufer A). Kolono nato izperemo z 10 kolonskimi volumni tako pufra A kot tudi pufra A, ki vsebuje sečnino (2M). Kolono nato eluiramo s pufrom A, ki vsebuje sečnino (2M) in NaCI (IM). Elucijski pool blue-sefaroze nato direktno nanesemo na kolono WGA-sefaroze, uravnotežene v pufru A Kolono WGA-safaroze nato izperemo z 10 kolonskimi volumni pufra A ki vsebuje sečnino (2M) in NaCI (IM) in eluiramo z enakim pufrom, ki vsebuje N-acetil-D-glukozamin (0,5 M). Eluat WGA-sefaroze nanesemo

137 na kolono C4-HPLC (Synchrom, Inc.), uravnoteženo v TFA (0,1 %). Kolono C4HPLC eluiramo z diskontinuimim propanolnim gradientom (0-25 %, 25-35 %, 35-70 %). rhMLj^ se eluira v 28-30 % propanolnem področju gradienta. Pri SDS-PAGE migrira očiščeni rHML^ kot široka proga v 68-80 kDa področju gela (sl. 15).

4. Čiščenje rhML₁₅₃

Kondicioniran medij 293-rhML₁₅₃ ločimo na blue-sefarozi, kot je opisano za rhML^. Eluat blue-sefaroze nanesemo direktno na mp/-afinitetno kolono, kot je opisano zgoraj. rhML₁₅₃, eluiran iz znp/-afinentne kolone, očistimo do homogenosti v koloni C4-HPLC pri enakih pogojih, kot so opisani za rhML^. Z SDS-PAGE očiščeni rhML₁₅₃ ločimo v 2 glavni in 2 manjši progi z Mr približno 18000-21000 (sl. 15).

PRIMER 20

Ekspresija in čiščenje TPO iz CHO

1. Opis ekspresijskih vektorjev CHO

Ekspresijski vektorji, uporabljeni v predpisani elektroporaciji, opisani spodaj, so označeni:

pSVI5.ID.LL.MLORF (popolna dolžina ali hTPO₃₃₂) in pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrajšan ali hTPO₁₅₃).

Pertinentne lastnosti teh plazmidov so prikazane na sl. 23 in 24.

2. Priprava ekspresijskih vektorjev CHO cDNA, ki ustreza celotnemu odprtemu bralnemu okvirju hTPO, dobimo s PCR z uporabo oligonukleotidnih primeijev iz tabele 12.

138

TABELA 12

Primeril PCR ekspresijskih vektorjev CHO

Cla.FL.F2	5’ ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CČA G 3'	(SEOIDNO: 47)
ORF. Sal	5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3'	(SEQ ID NO: 67)

PRK5-hmp/1 (opisan v Primerih 7 in 9) uporabimo kot kalup za reakcijo v prisotnosti pfu DNA polimeraze (Stratagene). Začetna denaturacija je 7 min. pri 94 °C, čemur sledi 25 ciklov pomnoževanja (1 min. pri 24 °C, 1 min. pri 55 °C in 1 min. pri 72 °C). Končna razširitev je 15 min. pri 72 °C. Produkt PCR očistimo in kloniramo med restrikcijski mesti Clal in Šali plazmida pSVI5.ID.LL, da dobimo vektor pSVI5.ID.LL.MLORF. Drugi konstrukt, ki ustreza homologni domeni EPO, izdelamo na enak način, le z uporabo CIa.FL.F2 kot prednjega primerja in naslednjega reverznega primerja:

EPOD.SaI 5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3’ (SEQ ID NO: 68)

Končni produkt je imenovan pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Sekvence obeh konstruktov potrdimo, kot je opisano v Primerih 7 in 9.

Kodirne sekvence za ligand s popolno dolžino in skrajšani ligand v bistvu uvedemo v multiplo klonimo mesto CHO ekspresijskega vektorja pSVI5.ID.LL. Ta vektor vsebuje zgodnjo promotorsko/spodbujevalno regijo SV40, modificirano spojeno enoto, ki vsebuje cDNA mišjega DHFR, multiplo klonimo mesto za uvedbo iskanega gena (v tem primeru opisane sekvence TPO), poliadenilacijski signal SV40 in izvor replikacije ter beta-laktamazni gen za plazmidno selekcijo in pomnožitev v bakterijah.

139

3. Metodologija za vzpostavljenje stabilnih celičnih linij CHO, ki eksprimirajo rekombinantni humani TPO₃₃₂ in TPO₁₅₃

a. Opis parentalne celične linije CHO

Gostiteljska celična linija CHO, uporabljena za ekspresijo molekul TPO, opisana tukaj, je znana kot CHO-DP12 (EP 307,247, obj. 15. marca 1989). To celično linijo sesalcev klonalno izberemo od transfekcije parentalne linije (CHO-K1 DUXBll(DHFR-), ki jo dobimo pri Dr. Franku Lee-ju iz Stanford University z dovoljenjem dr. L Chasina) z vektorjem, ki eksprimira preproinsulin, da dobimo klone z znižanimi insulinskimi zahtevami. Te celice so tudi DHFR minus, klone pa izberemo za prisotnost vektorskih sekvenc cDNA DHFR z rastjo v mediju brez nukleozidnih dodatkov (glicin, hipoksantin in timidin). Ta selekcijski sistem se navadno uporablja za stabilno ekspresijo celične linije CHO.

b. Transfekcijski postopek (elektroporacija)

TPO₃₃₂ in TPO₁₅₃, ki eksprimirata celične linije, izdelamo s transfektiranjem celic DP12 z elektroporacijo (glej npr. Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Meth., 15,56 [1993]) z lineariziranim plazmidom pSVI5.ID.LL.MLORF oz. pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Tri reakcijske zmesi restrikcijskih encimov nastavimo za prerezovanje vsakega plazmida; 10 /ig, 25 /ig in 50 /ig vektorja z encimom Noti s standardnimi postopki molekularne biologije. To restrikcijsko mesto ugotovimo samo enkrat v vektorju v linearizacijski regiji 3’ in zunaj transkripcijskih enot TPO liganda (sl. 23). 100 μϊ reakcijske zmesi nastavimo za inkubacijo preko noči pri 37 °C. Naslednji dan zmesi ekstrahiramo s fenolom-kloroformom-izoamil alkoholom (50:49:1), enkrat, in oborimo z etanolom na suhem ledu v približno 1 uri. Oborino nato zberemo s 15 minutnim mikrocentrifugiranjem in posušimo. Linearizirano DNA resuspendiramo v 50 μϊ Hamovega medija DMEM-F12 1:1, dopolnjenega s standardnimi antibiotiki in glutaminom (2mM).

V suspenziji rastoče celice DP12 zberemo, enkrat izperemo v mediju, opisanem za resuspendiranje DNA, in končno resuspendiramo v enakem mediju pri koncentraciji 10⁷ celic/750 /d. Alikvote celic (750 μΐ) in vsako linearizirano mešanico DNA inkubiramo skupaj pri sobni temperaturi 1 uro in nato prenesemo v komoro za elektroporacijo BRL Vsako reakcijsko mešanico nato elektroporiramo v standardni napravi za elektroporacijo BRL pri 350 voltih, naravnano pri 330 /iF in nizki

140 kapacitanci. Po elektroporaciji celice pustimo 5 minut, da se ustalijo v napravi, in nato na ledu inkubiramo dodatnih 10 minut. Elektroporirane celice prenesemo v 60 mm posode za celično kulturo, ki vsebujejo 5 ml standarda, kompletni rastni medij za celice CHO (visoko glukozni DMEM-F12 50:50 brez glicina, dopolnjen z IX GHT, glutaminom (2 mM) in fetalnim telečjim serumom (5 %)) in pustimo, da rastejo preko noči v inkubatorju za celično kulturo s 5 % CO₂.

c. Selekcija in selekcioniral postopek

Naslednji dan celice tripsiniziramo iz plošč s standardnimi postopki in jih prenesemo v 150 mm posode za tkivne kulture, ki vsebujejo selektivni medij DHFR (Hamov DMEM-F12 1:1, opisan zgoraj , dopolnjen z 2 % ali 5 % dializiranega fetalnega telečjega seruma, vendar brez glicina, hipoksantina in timidina; t.j. standardni selekcijski medij DHFR, ki ga mi uporabljamo). Celice iz vsake 60 mm posode nato ponovno zasadimo v 5/150 mm posode. Celice nato inkubiramo 10 do 15 dni (z eno zamenjavo medija) pri 37 °C/5 % CO₂, dokler ne nastanejo kloni in dosežejo velikost, primemo za prenos v posode s 96 vdolbinicami. Po 4 do 5 dnevih celične linije prenesemo v posode s 96 vdolbinicami s pipeto s sterilnimi rumenimi nastavki (pipettman), naravnanimi na 50 ml. Celice pustimo, da rastejo do konfluence (navadno 3-5 dni) in nato pladnje tripsiniziramo in dve kopiji originalnega pladnja reproduciramo. Dve od teh kopij za kratek čas shranimo v zmrzovalniku s celicami v vsaki vdolbinici, razredčenimi v 50 /tl FCS (10 %) v DMSO. Vzorce medija brez seruma, kondicionirane 5 dni, testiramo iz konfluentnih vdolbinic v tretjem pladnju za ekspresijo TPO s testom aktivnosti na osnovi celic Ba/F. Klone z najvišjo ekspresijo na osnovi tega testa oživimo iz zaloge in odmerimo za 2 konfluenta 150 mm T-stekleničk (scaled up to 2 confluent 150 mm T-flasks) za prenos v skupino celične kulture za suspenzijsko adaptacijo, ponovni test in shranjevanje v banki.

d. Predpis pomnoževanja

Več celičnih linij z najvišjim titrom iz selekcije, opisane zgoraj, nato izpostavimo standardnemu pomnoževalnemu režimu z metotreksatom, da izdelamo visoko titme klone. Klone celic CHO ekspandiramo in zasadimo v posode s premerom 10 cm pri 4 koncentracijah metotreksata (t.j. 50 nM, 100 nM, 200 nM in 400 nM) pri dveh ali treh številih celic (105, 5x105 in 106 celic na posodo). Te kulture nato inkubiramo pri 37 °C/5 % CO₂, dokler niso kloni vzpostavljeni in primerni za transfer v posode s 96 vdolbinicami za nadaljnji test. Več visokotitmih klonov iz te selekcije ponovno izpos141 tavimo večjim koncentracijam metotreksata (t.j. 600 nM, 800 nM, 1000 nM in 1200 nM) in kot pred tem rezistentne klone pustimo, da se vzpostavijo in jih nato prenesemo v posode s 96 vdolbinicami in testiramo.

4. Kultiviranje stabilne celične linije CHO, ki eksprimira rekombinantni humani TPO^z in TPO₁₅₃

Celice, shranjene v banki, odtajamo in celično populacijo ekspandiramo s standamimi postopki za rast celic, bodisi v medij, ki ne vsebuje seruma ali takega, ki ga vsebuje. Po ekspanziji do zadostne celične gostote celice izperemo, da odstranimo izrabljen medij celične kulture. Celice nato kultiviramo s katerimkoli standardnim postopkom, vključno šaržnim, polnilnim šaržnim ali kontinuiranim kultiviranjem pri 2540 °C, nevtralnem pH, z vsebnostjo raztopljenega O₂ vsaj 5 %, da se akumulira konstitutivno izločen TPO. Tekočino celične kulture nato ločimo od celic mehanično, npr. s centrifugiranjem.

5. Čiščenje rekombinantnega humanega TPO iz tekočin kulture CHO

Zbrane tekočine celične kulture (HCCF) direktno nanesemo na hitro pretočno kolono blue-sefaroze 6 (Pharmacia), uravnoteženo v natrijevem fosfatu (0,01M), pH (7,4), NaCl (0,15 M), v razmerju približno 1001HCCF/1 smole in pri linearni pretočni hitrosti približno 300 ml/h/cm². Kolono nato izperemo s 3 do 5 kolonskimi volumni uravnoteževalnega pufra in nato s 3 do 5 kolonskimi volumni Na-fosfata (0,01M), pH 7,4, sečnine (2,0 M). TPO nato eluiramo s 3 do 5 kolonskimi volumni Na-fosfata (0,01 M), pH (7,4), sečnine (2,0 M), NaCl (1,0 M).

Pool blue-sefaroze, ki vsebuje TPO, nato nanesemo na kolono lektin(pščenični kalčki)-sefaroze 6MB (Pharmacia), uravnoteženo v Na-fosfatu (0,01M), pH (7,4), sečnini (2,0M) in NaCl (1,0 M), v razmerju od 8 do 16 ml poola blue-sefaroze/ml smole pri pretočni hitrosti približno 50 ml/h/cm². Kolono nato izperemo z 2 do 3 kolonskimi volumni uravnoteževalnega pufra. TPO nato eluiramo z 2 do 5 kolonskimi volumni Na-fosfata (0,01M), pH (7,4), sečnine (2,0M), N-acetil-Dglukozamina (0,5M).

Pool lektina pšeničnih kalčkov nato naravnamo na končno koncentracijo C₁₂E₈ (0,04 %) in trifluorocetne kisline (TFA) (0,1 %). Nastali pool nanesemo na kolono z reverzno fazo C4 (Vydac 214TP1022), uravnoteženo v TFA (0,1 %), C₁₂E_g (0,04 %),

142 pri čemer polnimo približno 0,2 do 0,5 mg proteina/ml smole s pretočno hitrostjo 157 ml/h/cm².

Protein se eluira v dvofaznem linearnem gradientu acetonitrila, ki vsebuje TFA (0,1 %), C₁₂E₈ (0,04 %). Prva faza je sestavljena iz linearnega gradienta acetonitrila (0-30 %), 15 minut, druga faza pa je sestavljena iz linearnega gradienta acetonitrila (30-60 %), 60 minut. TPO se eluira pri približno 50 % acetonitrilu. Pool naredimo na osnovi SDS-PAGE.

Pool C4 nato razredčimo z 2 volumnoma Na-fosfata (0,01 M), pH (7,4), NaCl (0,15 M) in diafiltriramo proti približno 6 volumnom Na-fosfata (0,01 M), pH (7,4), NaCl (0,15 M) na ultrafiltracijski membrani Amicon YM ali podobni, ki ima mejne molekulske mase 10000 do 30000 Daltonov. Nastali diafiltrat lahko direktno procesiramo ali nadalje koncentriramo z ultrafiltradjo. Diafiltrat/koncentrat naravnamo na končno koncentracijo 0,01 % Tweena-80. Ves diafiltrat/koncentrat ali le del, ekvivalenten 2 do 5 % izračunanega kolonskega volumna, nanesemo na kolono sefakril S-300 HR (Pharmacia), uravnoteženo v Na-fosfatu (0,01 M), pH (7,4), NaCl (0,15M), Tweenu-80 (0,01 %) in kromatografiramo pri pretočni hitrosti približno 17 ml/h/cm². TPO, ki vsebuje frakcije, ki so brez agregatov in proteolitičnih degradacijskih produktov, zberemo v poole na osnovi SDS-PAGE. Dobljeni pool filtriramo na 0,22 μτη filtru, Millex-GV ali podobnem in shranimo pri 2-8 °C.

PRIMER 21

Transformacija in indukcija sinteze proteina TPO v E.coli

1. Konstrukcija ekspresijskih vektoijev E.coli TPO

Plazmidi pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 in pMP202 so vsi oblikovani za ekspresijo prvih 155 amino kislin TPO navzdol od majhnega voditelja, ki variira med različnimi konstrukti. Voditelji zagotavljajo primarno visok nivo translacijske iniciacije in hitro čiščenje. Plazmidi pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 so oblikovani za ekspresijo prvih 153 amino kislin TPO navzdol od iniciacijskega metionina in se razlikujejo le v kodonski uporabi za prvih 6 amino kislin TPO, medtem ko je plazmid pMP251 derivat pMP210-l, v katerem je karboksi terminalni konec TPO razširjen z dvema amino kislinama. Vsi zgornji plazmidi proizvedejo visoke nivoje intracelične ekspresije TPO v E.coli po indukciji triptofanskega promotoija (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., izd.) 185:54-60, Academic Press, San Diego

143 [1990]). Plazmida pMPl in pMP172 sta intermediata v konstrukciji zgornjih intraceličnih ekspresijskih plazmidov TPO.

(a) Plazmid pMPl

Plazmid pMPl je sekrecijski vektor za prvih 155 amino kislin TPO in ga konstruiramo z ligiranjem skupaj 5 fragmentov DNA, kot je prikazano na sl. 33. Prvi od teh je vektor pPho21, v katerem je odstranjen majhen fragment MIuI-BamHI. pPho21 je derivat phGHl (Chang, C.N. et al., Gene 55:189-196 [1987]), v katerem je gen humanega rastnega hormona nadomeščen z genom phoA E.coli in je restrikcijsko mesto MIuI konstruirano v kodirni sekvenci za signalno sekvenco STII pri amino kislinah 20-21.

Naslednja dva fragmenta, košček DNA z 258 bp Hinfl-Pstl iz pRK5-hznp/I (Primer 9), ki kodira amino kisline 19-103 TPO in naslednjo sintetično DNA, ki kodira amino kisline 1-18

5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG

TG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC

ACTGA-5' (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) predhodno ligiramo z ligazo T4-DNA, drugega pa prerežemo s Pstl. Četrti je fragment s 152 bp Pstl-Haelll od pRK5hmpII, ki kodira amino kisline 104-155 TPO. Zadnji je fragment s 412 bp StuI-BamHI iz pdhl08, ki vsebuje lambdo za transkripcijski terminator, kot so pred tem opisali (Scholtissek, S. et al., NAR 15:3185 [1987]).

(b) Plazmid pMP21

Plazmid pMP21 oblikujemo za ekspresijo prvih 155 amino kislin TPO z voditeljem s 13 amino kislinami, ki obsega del signalne sekvence STIL Konstruiramo ga z ligiranjem skupaj treh framgnetov DNA, kot je prikazano na sl. 34, pri čemer je prvi vektor pVEG31, v katerem je majhen fragment Xbal-Sphl odstranjen. Vektor pVEG31 je

144 derivat pHGH207-l (de Boer, H.A. et al., v Promoter Strucutre and Function (Rodriguez, R.L. in Chamberlain, M.J. izd.), 462, Praeger, New York [1982]), v katerem je gen humanega rastnega hormona nadomeščen z genom vaskulamega endotelijskega rastnega faktorja (ta identični vektorski fragment lahko dobimo iz slednjega plazmida).

Drugi del v ligaciji je sintetični dupleks DNA z naslednjo sekvenco

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTmTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5· (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Zadnji košček je fragment MluI-SphI z 1072 bp iz pMPl, ki kodira 155 amino kislin TPO.

(c) Plazmid pMP151

Plazmid pMP151 je oblikovan za ekspresijo prvih 155 amino kislin TPO navzdol od voditelja, ki obsega 7 amino kislin signalne sekvence STII, 8 histidinov in cepišče faktorja Xa. k sl. 35 je razvidno, daje pMP151 konstruiran z ligiranjem skupaj treh fragmentov DNA, pri čemer je prvi, predhodno opisani vektor, pVEG31, iz katerega je odstranjen majhen fragment XbaI-SphL Drugi je sintetični dupleks DNA z naslednjo sekvenco:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG

GTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC

CAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

Zadnji je fragment Bgll-SphI s 1064 bp iz pMPll, ki kodira 154 amino kislin TPO. Plazmid pMPll je identičen pMPl, razen nekaj kodonskih sprememb v signalni sekvenci STII (ta fragment lahko dobimo iz pMPl).

145 (d) Plazmid pMP202

Plazmid pMP202 je zelo podoben ekspresijskemu vektorju pMP151, razen da je cepišče faktorja Xa v voditelju nadomeščeno s trombinskim cepiščem. Iz sl. 36 je razvidno, da pMP202 konstruiramo z ligiranjem skupaj treh fragmentov DNA. Prvi od teh je predhodno opisani pVEG31, v katerem je majhen fragment Xbal-Sphl odstranjen. Drugi je sintetični dupleks DNA z naslednjo sekvenco:

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA

CCACGTAGCC

TTAATACPTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT

GGTGCAT-5' (SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)

Zadnji košček je fragment Bgll-SphI s 1064 bp iz predhodno opisanega plazmida pMPll.

(e) Plazmid pMP172

Plazmid pMP172 je sekrecijski vektor za prvih 153 amino kislin TPO in je intermediat za konstrukcijo pMP210. Iz sl. 37 je razvidno, da pMP172 pripravimo z ligiranjem skupaj treh fragmentov DNA, pri čemer je prvi vektor pLS32IamB, v katerem je majhen predel EcoRI-Hindlll odstranjen. Drugi je framgnet EcoRI-Hgal s 946 bp iz predhodno opisanega plazmida pMPll. Zadnji košček je sintetični dupleks DNA z naslednjo sekvenco:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT

GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 78) (f) Plazmid pMP210

146

Plazmid pMP210 oblikujemo za ekspresijo prvih 153 amino kislin TPO po translacijskem iniciacijskem metioninu. Ta plazmid dejansko naredimo kot banko plazmidov, v katerih je prvih 6 kodonov TPO naključnih v tretjem položaju vsakega kodona, in ga konstruiramo, kot je prikazano na sl. 38, z ligacijo treh fragmentov DNA. Prvi od teh je predhodno opisani vektor pVEG31, v katerem je majhen fragment Xbal-Sphl odstranjen. Drugi je sintetični dupleks DNA, prikazan spodaj, obdelan najprej z DNA polimerazo I (Klenow) in nato digeriran z Xbal in Hinfl, in kodira iniciacijski metionin in naključnih prvih 6 kodonov TPO.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCT

GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5’ (SEQ ID NO: 80)

Tretji je fragment Hinfl-Sphl z 890 bp iz pMP172, ki kodira amino kisline 19-153 TPO.

Plazmidno banko pMP210 s približno 3700 kloni retransformiramo na visoko tretraciklinske (50 /ig/ml) plošče LB, da izberemo visoko translacijsko iniciacijske klone (Yansura, D.G. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158 [1992]). Od 8 kolonij, ki nastanejo na visoko tetraciklinskih ploščah, jih pet najboljših glede na ekspresijo TPO izpostavimo sekvenciranju DNA, rezultati pa so prikazani na sl. 39 (SEQ ID NOS: 23,24,25,26,27 in 28).

(g) Plazmid pMP41

Plazmid pMP41 oblikujemo za ekspresijo prvih 155 amino kislin TPO, spojenega z voditeljem, ki je sestavljen iz 7 amino kislin signalne sekvence STII, čemur sledi cepišče faktoija Xa. Plazmid konstruiramo, kot je prikazano na sl. 40, z ligiranjem skupaj treh koščkov DNA, pri čemer je prvi predhodno opisani vektor pVEG31, v katerem je majhen fragment Xbal-Sphl odstranjen. Drugi je naslednji sintetični dupleks DNA:

147

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81)

TTAATACTnTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO: 82)

Zadnji košček ligacije je fragment Bgll-SphI s 1064 bp iz predhodno opisanega plazmida pMPll.

(h) Plazmid pMP57

Plazmid pMP57 eksprimira prvih 155 amino kislin TPO navzdol od voditelja, ki je sestavljen iz 9 amino kislin signalne sekvence STII in dibazičnega mesta Lys-Arg. To dibazično mesto zagotavlja sredstvo za odstranitev voditelja s proteazo ArgC. Plazmid konstruiramo, kot je prikazano na sl. 41, z ligiranjem skupaj treh koščkov DNA. Prvi od teh je predhodno opisani vektor pVEG31, v katerem je majhen fragment Xbal-Sphl odstranjen. Drugi je naslednji sintetični dupleks DNA:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)

Zadnji del ligacije je fragment Bgll-SphI s 1064 bp iz predhodno opisanega plazmida pMPll.

(i) Plazmid pMP251

Plazmid pMP251 je derivat pMP210-l, v katerega sta vljučeni dve dodatni amino kislini TPO na karboksi terminalnem koncu. Iz sl. 42 je razvidno, da ta plazmid konstruiramo z ligiranjem skupaj dveh koščkov DNA pri čemer je prvi od teh predhodno opisani pMP21, v katerem je majhen fragment Xbal-Apal odstranjen. Drugi del ligacije je fragment s 316 bp Xbal-Apal iz pMP210-l.

2. Transformacija in indukcija E.coli z ekspresijskimi vektoiji TPO

Zgornje ekspresijske plazmide TPO uporabimo za transformiranje E.coli seva 44C6 (w3110 ίοηΑ_Δ rpoH_u Ιοη_Δ clpP_A galE), pri Čemer uporabimo postopek toplotnega šoka s CaClj (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol. 53:159-162, [1970]). Transformirane celice rastejo najprej pri 37 °C v mediju LB, ki vsebuje 50 Mg/ml karbenicilina, dokler optična gostota (600 nm) kulture ne doseže 2-3. Kulturo LB nato razredčimo 20-krat

148 v medij M9, ki vsebuje kazamino kisline (0,49 mas./vol.%) in 50 /ig/ml karbenicilina. Po enourni rasti z aeracijo pri 30 °C dodamo indol-3-akrilno kislino do končne koncentracije 50/xg/ml. Kulturo nato pustimo, da raste pri 30 °C ob aeraciji nadaljnjih 15 ur, nakar celice zberemo s centrifugiranjem.

PRIMER 22

Izdelovanje biološko aktivnega TPO (Met-1-153) v E. coli

Postopke, navedene spodaj, za izdelovanje biološko aktivnega renaturiranega TPO (Met⁴ 1-153) lahko analogno uporabimo za rekuperiranje drugih variant TPO, ki vključujejo N- in C-terminalno razširjene oblike (Primer 23).

A. Rekuperiranje netopnega TPO (Met⁴ 1-153)

Celice E. coli, ki eksprimirajo TPO (Met⁴ 1-153), ki je kodiran s plazmidom pMP210-l fermentiramo, kot je opisano zgoraj. Značilno približno 100 g celic resuspendiramo v 11 (10 volumnov) pufra za razkroj celic (tris (10 mM), EDTA (5 mM), pH 8) s homogenizatorjem Polytron in celice centrifugiramo pri 5000 g 30 minut. Izprani celični pelet ponovno resuspendiramo v 11 pufra za razkroj celic s homogenizatorjem Polytron in celično suspenzijo spustimo skozi napravo za razkroj celic LH Celi Dissrupter (LH Inceltech, Inc.) ali skozi mikrofluidizator (Microfluidizer, Microfluidics International) po navodilih izdelovalca. Suspenzijo centrifugiramo pri 5000 g 30 minut in resuspendiramo ter centrifugiramo drugič, da naredimo izprani pelet refraktilnih teles. Izprani pelet takoj uporabimo ali zmrznjenega shranimo pri -70 °C.

B. Solubilizacija in čiščenje monomemega TPO (Met⁴ 1-153)

Zgornji pelet resuspendiramo v 5 volumnih (masnih) tris-a (20 mM), pH 8 z gvanidinom (6-8 M) in DTT (ditiotreitol) (25 mM) in mešamo 1-3 ure ali preko noči pri 4 “C, da povzročimo solubilizacijo proteina TPO. Visoke koncentracije sečnine (6-8 M) prav tako lahko uporabimo, vendar pa so navadno dobitki nižji, če jih primerjamo z gvanidinom. Po solubilizaciji raztopino centrifugiramo pri 30000 g (30 minut), da dobimo bister supernatant, ki vsebuje denaturirani monomemi protein TPO. Supernatant nato kromatografiramo na gelski filtracijski koloni superdeks 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) pri pretočni hitrosti 2 ml/min in protein eluiramo z Na149 fosfatom (20 ml), pH 6,0 in zberemo poole frakcij DTT (10 mM), ki vsebujejo monomemi denaturirani protein TPO, ki se eluira med 160 in 200 ml. Protein TPO nadalje očistimo na semipreparativni koloni z reverzno fazo C4 (2 x 20 cm VYDAC). Vzorec nanesemo s 5 ml/min. na kolono, uravnoteženo v TFA (trifluoroocetna kislina) (0,1 %) z acetonitrilom (30 %). Protein se eluira z linearnim gradientom acetonitrila (30-60 % v 60 min). Očiščeni redukcijski protein se eluira pri približno 50 % acetonitrilu. To snov uporabimo za renaturiranje, da dobimo biološko aktivno varianto TPO.

C. Izdelava biološko aktivnega TPO (Met¹1-153)

Približno 20 mg monomemega reduciranega in denaturiranega proteina TPO v 40 ml TFA (0,1 %)/acetonitril (50 %) razredčimo v 360 ml renaturimega pufra, ki vsebuje optimalno naslednje reagente:

mM tris

0,3 M NaCl

5mMEDTA % detergent CHAPS % glicerol mM oksidirani glutation mM reducirani glutation pH naravnan na 8,3.

Po zmešanju komponent renaturimi pufer blago mešamo pri 4 °C 12-48 ur, da povzročimo maksimalne dobitke renaturiranja pravilno disulfidno vezane oblike TPO (glej spodaj). Raztopino nato nakisamo s TFA do končne koncentracije 0,2 %, filtriramo skozi 0,45 ali 0,22 μτη filter in dodamo 1/10 volumna acetonitrila. To raztopino nato črpamo direktno na kolono z reverzno fazo C4 in očiščeni, renaturirani TPO (Met¹ 1-153) eluiramo z enakim gradientnim programom kot zgoraj. Renaturirani biološko aktivni TPO se eluira pri približno 45 % acetonitrilu pri enakih pogojih. Nepravilne disulfidno vezane verzije TPO se eluirajo prej.

Končni očiščeni TPO (Met¹ 1-153) ima čistoto, ki je višja od 95 %, kot določimo z SDS geli in analitično kromatografijo z reverzno fazo C4. Za živalske študije snov, očiščeno na C4, dializiramo v fiziološko kompatibilnih pufrih. Uporabimo izotonične pufre (Na-acetat (10 mM), pH 5,5, Na-sukcinat (10 mM), pH 5,5 ali Na-fosfat (10

150 mM), pH 7,4), ki vsebujejo NaCl (150 mM) in Tween 80 (0,01 %).

Zaradi visoke zmogljivosti TPO v testu Ba/F3 (polovična maksimalna stimulacija, dosežena pri približno 3 pg/ml) je možno, da dobimo biološko aktivno snov z uporabo mnogih različnih pufrov, detergentov in redoks pogojev. Vendar pa pri večini pogojev dobimo le majhno količino pravilno zgubane snovi (<10 %). Za komercialne izdelovalne postopke so želeni dobitki renaturiranja vsaj 10 %, bolj prednostno 30-50 % in najbolj prednostno >50 %. Mnogo različnih detergentov (Triton Χ-100, dodecil-beta-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozil, Tween 20 in Tween 80, Zwittergent 3-14 in drugi) smo preizkusili glede njihove učinkovitosti, da prispevajo k visokim dobitkom renaturiranja. Od teh detergentov smo ugotovili, da je le družina CHAPS (CHAPS in CHAPSO) na splošno uporabna v reakcijah renaturiranja, da omejimo proteinsko agregacijo in nepravilno disulfidno tvorbo. Nivoji CHAPS, večji od 1 %, so najbolj uporabni. Natrijev klorid je potreben za boljše dobitke z optimalnimi nivoji med 0,1 M in 0,5 M. Prisotnost EDTA (1-5 mM) omeji oksidacijo, katalizirano s kovino (in agregacijo), ki jo opazimo pri nekaterih pripravkih. Koncentracije glicerola, večje od 15 %, ustvarijo optimalne pogoje za renaturiranje. Za maksimalne dobitke je bistveno, da imamo tako oksidiran kot tudi reduciran glutation ali oksidiran in reduciran cistein kot redoks reagentni par. Na splošno dobimo višje dobitke, če sta oksidirani in reducirani reagent v redoks paru v enakem molskem razmerju oz. je oksidirani reagent v prebitku. pH vrednosti med 7,5 in približno 9 so optimalne za renaturiranje teh variant TPO. Organska topila (npr. etanol, acetonitril, metanol) so dopustna pri koncentracijah od 10 do 15 % ali nižjih. Višji nivoji organskih topil povečajo količino nepravilno zgubanih oblik. Na splošno uporabimo tris in fosfatne pufre. Inkubacija pri 4 °C prav tako ustvari višje nivoje pravilno zgubanega TPO.

Renaturirni dobitki od 40 do 60 % (na osnovi količine reduciranega in denaturiranega TPO, uporabljenega v reakciji renaturiranja) so značilni za pripravke TPO, ki so očiščeni s prvo stopnjo C4. Aktivno snov dobimo tudi, če so pripravki manj čisti (npr. direktno po koloni superdeks 200 ali po začetni ekstrakciji refraktilnih teles), čeprav so dobitki manjši, zaradi obširne precipitacije in interference neTPO proteinov med postopkom renaturiranja TPO.

Ker TPO (Met¹ 1-153) vsebuje 4 cisteinske ostanke, je možno, da izdelamo tri različne disulfidne verzije tega proteina:

151 verzija 1: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-4 in 2-3 verzija 2: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-2 in 3-4 verzija 3: disulfidi med cisteinskimi ostanki 1-3 in 2-4

Med začetnim raziskovanjem določevanja pogojev renaturiranja smo številne različne vrhove, ki so vsebovali protein TPO, ločili s kromatografijo z reverzno fazo C4. Samo eden od teh vrhov je imel značilno biološko aktivnost, določeno s testom Ba/F3. Nato smo pogoje renaturiranja optimizirali, da smo dobili to prednostno verzijo. Pri teh pogojih je nepravilno zgubane verzije manj od 10-20 % celotnega dobljenega monomera TPO.

Za disulfidni vzorec biološko aktivnega TPO smo določili z masno spektrometrijo in proteinskim sekvenciranjem, da je 1-4 in 2-3 (t.j. verzija 1). Alikvote različnih vrhov, ločenih na C4 (5-10 mmol) smo digerirali s tripsinom (molsko razmerje tripsina:proteinu 1:25). Digestijsko zmes smo analizirali z lasersko desorpcijsko masno spektrometrijo z matrico pred redukcijo z DTT in po njej. Po redukciji smo detektirali mase, ki ustrezajo večini od večjih triptičnih peptidov TPO. V nereduciranih vzorcih so nekatere od teh mas manjkale, opazili pa smo nove. Masa novih vrhov je ustrezala v bistvu vsoti individualnih triptičnih peptidov, vključenih v disulfidni par. Tako je bilo možno, da smo nedvoumno določili za sulfidni vzorec renaturiranega, rekombinantnega biološko aktivnega TPO, da je 1-4 in 2-3. To je konstistentno z znanim disulfidnim vzorcem sorodne molekule eritropoetina.

D. Biološka aktivnost rekombinantnega renaturiranega TPO (Met'¹1-153)

Renaturirani in očiščeni TPO (Met¹ 1-153) ima aktivnost tako v testih in vitro kot tudi in vivo. V testu Ba/F3 dosežemo polovično maksimalno stimulacijo timidinske vgraditve v celice Ba/F3 pri 3,3 pg/ml (0,3 pM). V ELISI na osnovi mpl receptorja pride do polovične maksimalne aktivnosti pri 1,9 ng/ml (120 pM). V normalnih in mielosuprimiranih živalih, ki jih dobimo s skoraj letalnim obsevanjem z rentgenskimi žarki, je TPO (Met¹ 1-153) visoko potenten (aktivnost vidna pri tako nizkih dozah, kot npr. 30 ng/miš) za stimuliranje nastajanje novih trombocitov.

PRIMER 23

Izdelovanje drugih biološko aktivnih variant TPO v E. coli

152

Tri različne variante TPO, izdelane v E. coli, očiščene in renaturirane v biološko aktivnih oblikah, so navedene spodaj.

(1) MLF - 13 ostankov iz bakterijsko izvedene signalne sekvence STII spojimo z N-terminalno domeno TPO (ostanki 1-155). Nastala sekvenca je:

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 85) kjer je vodilna sekvenca podčrtana in C....C pomeni Cys⁷ do Cys¹⁵¹. To varianto konstruiramo, da dobimo tirozin za radioaktivno jodiranje TPO za receptorske in biološke študije.

(2) H8MLF - 7 ostankov iz sekvence STII, 8 histidinskih ostankov in s faktorjem Xa encimatsko cepljivo sekvenco IEGR spojimo z N-terminalno domeno (ostanki 1-155) TPO. Sekvenca je:

M.KKNIAFHHHHHHHHIFARSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 86) kjer je vodilna sekvenca podčrtana, in C....C pomeni Cys⁷ do Cys¹⁵¹. To varianto, ko je očiščena in renaturirana, lahko obdelamo z encimom faktorjem Xa, ki cepi po argininskem ostanku sekvence IEGR, pri čemer nastane varianta TPO z dolžino 155 ostankov z naravno serinsko N-terminalno amino kislino.

(3) T-H8MLF pripravimo, kot je opisano zgoraj, za varianto (2), razen da trombinsko senzitivno sekvenco IEPR spojimo z N-terminalno domeno TPO. Nastala sekvenca je:

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 87) kjer je vodilna sekvenca podčrtana, in C....C pomeni Cys⁷ do Cys¹⁵¹. To varianto lahko po čiščenju in renaturiranju obdelamo z encimom trombinom, da naredimo naravno N-terminalno varianto TPO z dolžino 155 ostankov.

153

A. Rekuperiranje, solubilizacija in čiščenje monomemih biološko aktivnih variant TPO (1),(2) in (3).

Vse te variante eksprimiramo v E. coli. Večino variant ugotovimo v reffaktilnih telesih, kot je razvidno v Primeru 22 za TPO (Met⁴ 1-153). Izvedemo identične postopke za rekuperiranje, solubilizacijo in čiščenje monomemih variant TPO, kot je opisano v primem 22. Uporabimo identične pogoje za renaturiranje kot za TPO (Met⁴ 1-153) s celotnimi dobitki 30-50 %. Po renaturiranju variante TPO očistimo s kromatografijo z reverzno fazo C4 v TFA (0,1 %) z uporabo acetonitrilnega gradienta, kot je že opisano pred tem. Vse variante TPO (v njihovih neproteoliziranih oblikah) imajo biološko aktivnost določeno s testom Ba/F3 s polovičnimi maksimalnimi aktivnostmi 2-5 pM.

B. Proteolitično procesiranje variant (2) in (3), da izdelamo avtentični N-terminalni TPO (1-155)

Variante TPO (2) in (3), zgoraj, oblikujemo z encimatsko cepljivim vodilnim peptidom pred normalnim N-terminalnim in aminokislinskim ostankom TPO. Po renaturiranju in čiščenju variant (2) in (3), kot je opisano zgoraj, vsako izpostavimo digestiji z ustreznim encimom. Za vsako varianto acetonitril iz stopnje kromatografije z reverzno fazo C4 odstranimo z vpihovanjem blagega toka dušika v raztopino. Nato obe varianti obdelamo bodisi s faktorjem Xa ali s trombinom, kot je opisano spodaj.

Za varianto TPO (2), dodamo tris pufer (1 M), pH 8, k raztopini, ki ne vsebuje acetonitrila, do končne koncentracije 50 mM in pH naravnamo na 8, če je potrebno. Dodamo NaG in CaC^ do 0,1 M oz. 2 mM. Faktor Xa (New England Biolabs) dodamo, da dosežemo približno molsko razmerje encima proti varianti od 1:25 do 1:100. Vzorec inkubiramo pri sobni temperaturi 1-2 uri, da dosežemo maksimalno cepitev, ki jo določimo s spremembo v migraciji na gelih SDS, kar pomeni izgubo vodilne sekvence. Nato rekacijsko zmes očistimo s kromatografijo z reverzno fazo C4 z uporabo enakega gradienta in pogojev, kot je opisano zgoraj za čiščenje pravilno zgubanih variant. Necepljeno varianto B ločimo od cepljene variante (2) pri teh pogojih. Za N-terminalne amino kisline je razvidno, da so SP APP, kar pomeni, da je odstranitev N-terminalne vodilne sekvence uspešna. Faktor Xa prav tako naredi variabilne količine interne cepitve v domeni TPO; cepitev opazimo po argininskem ostanku na položaju št. 118, zaradi česar nastane dodatna N-terminalna sekvenca TTAHKDP (SEQ ID NO: 88). Na nereducimih gelih SDS, opazimo eno progo pri

154 približno 17000 Da, za varianto, cepljeno s faktorjem Xa; na reducirnih gelih opazimo dve progi z molekulskimi masami približno 12000 in 5000 Da, konsistentni s cepitvijo na argininu 118. To zaznavanje potrjuje, da se dva dela molekule držita skupaj z disulfidno vezjo med prvim in četrtim cisteinskim ostankom, kar izvedemo s triptičnimi digestijskimi eksperimenti, opisanimi zgoraj. V biološkem testu Ba/F3 ima očiščena varianta TPO (1-155), po odstranitvi N-terminalne vodilne sekvence in interni cepitvi, polovično maksimalno aktivnost 0,2 do 0,3 pmol. Intaktna varianta z vodilno sekvenco ima polovično maksimalno aktivnost 2-4 pmol.

Za varianto (3) je digestijski pufer sestavljen iz trisa (50 mM), pH 8, CHAPS-a (2 %), NaCl (0,3 M), EDTA (5 mM) in humanega ali govejega trombina (Calbiochem) pri masnem razmerju encima proti proteinu variante TPO od 1:25 do 1:50. Digestijo vodimo pri sobni temperaturi 2-6 ur. Napredek digestije določimo z geli SDS, kot je opisano zgoraj za cepitveno reakcijo faktorja Xa. Na splošno dosežemo več kot 90 % cepitev vodilne sekvence v tem času. Nastali TPO očistimo na kolonah z reverzno fazo C4, kot je opisano zgoraj, z aminokislinskim sekvenciranjem pa določimo, da ima želeni N-terminal. Dobimo le zelo majhne (<5 %) količine interne cepitve na isti arginin-treoninski vezi, ki smo jih zaznali zgoraj s faktorjem Xa. Nastali protein TPO ima visoko biološko aktivnost s polovičnimi maksimalnimi odzivi pri testu Ba/F3 pri 0,2-0,4 pmol proteinu. V testu ELISA na osnovi receptorja mpl ima ta protein polovični maksimalni odziv pri 2-4 ng/ml očiščenega proteina (120-240 pmol), medtem ko je intaktna varianta, ki vsebuje vodilno sekvenco, 5-10 krat manj zmogljiva v obeh testih. Za živalske študije s HPLC očiščen cepljen protein dializiramo v fiziološko sprejemljive pufre z NaCl (150 mM), Tweenom 80 (0,1 %) in natrijevim sukcinatom (10 mM), pH 5,5 ali natrijevim acetatom (10 mM), pH 5,5 ali natrijevim fosfatom (10 mM), pH 7,4. S HPLC in geli SDS očiščen protein je stabilen več tednov, če ga shranimo pri 4 °C. Pri normalnih in mielosuprimiranih miših je ta očiščeni TPO z avtentično N-terminalno sekvenco visoko aktiven in stimulira nastajanje trombocitov pri nizkih dozah, kot npr. 30 ng/miš.

PRIMER 24

Sintetični mpl ligand

Čeprav humani mpl ligand (hML) navadno naredimo z uporabo rekombinantnih postopkov, pa ga prav tako lahko sintetiziramo z encimatsko ligacijo sintetičnih peptidnih fragmentov z uporabo postopkov, opisanih spodaj. Sintetična izdelava hML

155 dopušča vgraditev nenaravnih amino kislin ali sintetičnih funkcionalnosti, kot je polietilenglikol. Pred tem so mutant serin proteaza subtilizin BPN, subtiligazo (S221C/P225A), konstruirali z učinkovito ligacijo peptidnih estrov v vodni raztopini (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Sedaj pa je razvidno, da lahko sintetične peptide encimatsko ligiramo v zaporedju, da dobimo encimatsko aktivne dolge peptide in proteine, kot je ribonukleaza A (Jackson et al., Science, [1994]). Ta tehnologija, opisana bolj podrobno spodaj, omogoča kemijsko sintetiziranje dolgih proteinov, ki so jih pred tem lahko naredili le s tehnologijo rekombinantne DNA.

Splošna strategija sinteze hML₁₅₃ z uporabo subtiligaze je prikazana na shemi 1. Pričnemo s popolnoma deprotektiranim peptidom, ki ustreza C-terminalnemu fragmentu proteina, ki mu dodamo N-terminalno zaščiten C-terminalno aktiviran estrski peptid skupaj s subtiligazo. Ko je reakcija končana, produkt izoliramo s HPLC z reverzno fazo in zaščitno skupino odstranimo od N-terminala. Ligiramo naslednji peptidni fragment, deprotektiramo in postopek ponovimo z uporabo zaporednih peptidov, dokler ne dobimo popolne dolžine proteina. Ta postopek je podoben metodologiji v trdni fazi v tem, da N-terminalno zaščiten C-terminalno aktiviran peptid ligiramo na N-terminalu predhodnega peptida in protein sintetiziramo v smeri C-*N. Ker je posledica vsake pripojitve dodatnih 50 ostankov in ker produkte izoliramo po vsaki ligaciji, lahko sintetiziramo mnogo daljše visoko čiste proteine v primernih dobitkih.

156

Shema 1. Strategija za sintezo hML z uporabo subtiligaze

R-NH-Peptid₂ -CO-R' + HjN-Peptid, -CO₂

1¹⁾ subtiligaza

R-NH-Peptid₂ -CO-NH-Peptid, -co₂ I 2) Zn/CH₃CO₂H

H₂N-Peptid₂ -CO-NH-Peptid, -CO₂

3) ponovitev 1+2

H₂N-Peptid ₃ -CO-NH-Peptid ₂ -CO-NH-Peptid! -CO₂

Glede na naše poznavanje sekvenčne specifičnosti subtiligaze kot tudi aminokislinske sekvence biološko aktivne EPO-domene hML, razdelimo hML₁₅₃ v sedem fragmentov z dolžino 18-25 ostankov. Testne ligacijske tetrapeptide sintetiziramo, da določimo primerne ligacijske povezave za 18-25-mere. Iz tabele 13 so razvidni rezultati teh testnih ligacij.

157

TABELA 13

Testne ligaciie hML. Donor in nukleofilne peptide raztopimo, da dobimo koncentracijo 10 mM, v tricinu (100 mM), pH 7,8 pri 22 °C. Ligazo dodamo do končne koncentracije 10 μΜ iz izhodne raztopine 1,6 mg/ml (~70 μΜ) in pustimo, da ligacija poteka preko noči. Dobitki so osnovani na % ligacije proti hidrolizi donorskih peptidov.

Mesto	Donor (gle-K-NH2)	Nukleofil-ML,	% hidrolize	fe ligaci jel
1 (23/24)	HVLH (SEQ ID NO: 89)	SRLS (SEQ ID NO: 90)	92	08
(22/23)	SHVL (SEQ ID NO: 91)	HSRL (SEQ ID NO: 92)	48	52
2 (46/47)	AVDF (SEQ ID NO: 93)	SLGE (SEQ ID NO: 94)	22	78
3 (69/70)	AVTL (SEQ ID NO: 95)	LLEG (SEQ ID NO: 96)	53	47
4 (89/90)	LSSL (SEQ ID NO: 97)	LGQL (SEQ ID NO: 98)	95	05
(88/89)	C(acm)LSS (SEQ ID NO: 99)	LLGQ (SEQ ID NO: 100)	00	00
(90/91)	SSLL (SEOID NO: 101)	GQLS (SEQ ID NO: 102)	45	55
(88/89)	CLSS (SEQ ID NO: 103)	LLGQ (SEQ ID NO: 100)	90	10
5(107/108)	LQSL (SEQ ID NO: 104)	LGTQ (SEQ ID NO: 105)	99 .	01
(106/107)	ALQS (SEQ ID NO: 106)	LLGT (SEQ ID NO: 107)	70	30
6(128/129)	NAIF (SEQ ID NO: 108)	LSFQ (SEQ ID NO: 109)	60	40

j·,·.r.kv:ntnc '<<,< •Λΐ'ίΰνιχ.* i

158

Na osnovi teh eksperimentov se ligacijski peptidi, prikazani v tabeli 14, učinkovito ligirajo s subtiligazo. Prikladna zaščitna skupina za N-terminal vsakega donorskega estrskega peptida je potrebna, da preprečimo samoligacijo. Izbrali smo izonikotinilno (iNOC) zaščitno skupino (Veber et al., J. Org. Chem., 42:3286-3289 [1977]), ker je vodotopna in jo lahko vgradimo v zadnji stopnji sinteze peptidov v trdni fazi in je stabilna v brezvodnem HF, uporabljenem za deprotekcijo in cepitev peptidov od smolne trdne faze. Poleg tega jo lahko odstranimo od peptida po vsaki ligaciji pri milih redukcijskih pogojih (Zn/CHjCO^), da dobimo prosti N-terminal za kasnejše ligacije. Glikolat-lizil-amid (glc-K-NH^) ester uporabimo za C-terminalno aktivacijo, osnovano na predhodnih eksperimentih, iz katerih je razvidno, da se le-ta učinkovito acilira z subtiligazo (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). iNOC zaščitene, glc-K-amidno aktivirane peptide lahko sintetiziramo z uporabo standardnih postopkov v trdni fazi, kot je prikazano na shemi 2. Peptide nato zaporedno ligiramo, dokler ne izdelamo popolnega proteina in končni produkt renaturiramo in vitro. Na osnovi homologije z EPO domnevamo, da se disulfidni pari tvorijo med ostankoma 1 in 51 in med 28 in 85. Oksidacijo disulfidov lahko izvedemo z enostavnim mešanjem reducirane snovi nekaj ur pod atmosfero kisika. Renaturirano snov lahko nato čistimo s HPLC in zberemo poole frakcij, ki vsebujejo aktivni protein in liofiliziramo. Alternativno lahko disulfide različno zaščitimo za nadzorovanje zaporedne oksidacije med specifičnimi disulfidnimi pari. Zaščita cisteinov 7 in 151 z acetamidometilnimi (acm) skupinami zagotavlja oksidacijo 28 in 85. Skupine acm lahko nato odstranimo in ostanka 7 in 151 oksidiramo. Obratno lahko ostanka 28 in 85 zaščitimo z acm in oksidiramo v primeru, da je potrebna zaporedna oksidacija za pravilno zgubanje. V danem primeru lahko cisterna 28 in 85 substituiramo z drugimi naravnimi ali nenaravnimi ostanki, drugačnimi od Cys, da zagotovimo pravilno oksidacijo cisteinov 7 in 151.

159

TABELAM

Peptidni fragmenti, uporabljeni za celokupno sintezo h-ML z uporabo subtiligaze

Fragment

Sekvenca (SEQ ID NO: 110) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1 -22) (SEQ ID NO: 111)

INOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) (SEQ ID NO: 112) iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NK2 (47-69) (SEQ ID NO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90) (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106) (SEQ ID NO: 115) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128) (SEQ ID NO: 116)

H2N-LSFOHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)

Peptidne ligacije izvedemo pri 25 °C v tricinu (100 mM), pH 8 (sveže pripravljen in razplinjen z vakuumsko filtracijo skozi 5 μΜ filter). Značilno C-terminalni fragment

160 raztopimo v pufru (2-5 mM peptid) in dodamo 10x izhodno osnovno raztopino subtiligaze (1 mg/ml v tricinu (100 mM), pH 8), da dosežemo končno encimsko koncentracijo približno 5 gM. Nato dodamo 3-5 molov prebitka donorskega peptida, aktiviranega z glc-K-Nl·^, kot trdno snov, raztopimo in zmes pustimo, da stoji pri 25 °C. Ligacije nadzorujemo z analitično HPLC z reverzno fazo 08 (CH^CN/F^O gradient s TFA (0,1 %)). Produkte ligacije očistimo s preparativno HPLC in liofiliziramo. Izonikotinilno (iNOC) deprotekcijo izvedemo z mešanjem cinkovega prahu, aktiviranega s HC1, z zaščitenim peptidom v ocetni kislini. Cinkov prah odstranimo s filtracijo in ocetno kislino uparimo v vakuumu. Nastali peptid lahko uporabimo direktno v naslednji ligaciji in postopek ponovimo. Sintetični hML₁₅₃ lahko ligiramo po postopkih, analognih tistim, opisanim zgoraj, za sintetični ali rekombinantni hML₁₅₄₃₃₂, da naredimo sintetični ali semisintetični hML popolne dolžine.

Sintetični hML ima mnogo prednosti pred rekombinantnim. Nenaravne stranske verige lahko uvedemo zato, da izboljšamo zmogljivost ali specifičnost. Polimerne funkcionalnosti, kot je polietilenglikol, lahko vgradimo, da izboljšamo trajanje delovanja. Polietilenglikol lahko npr. vežemo na lizinske ostanke individualnih fragmentov (tabela 14) pred ali po eni ali več izvedenih ligacijskih stopenj. Proteazno občutljive peptidne vezi lahko odstranimo ali spremenimo, da izboljšamo stabilnost in vivo. Poleg tega lahko sintetiziramo derivate težkih atomov za pomoč pri določevanju strukture.

161

Shema 2. Sinteza v trdni fazi peptidnih fragmentov za segmentno ligaciio

H,N'

O .(Peptid K nh

e,f (cepitev)»

izonikotinil (iNOC) glikolat-lizil-amid (glc-K-NHp)

a) Lizil-parametilbenzhidrilaminsko (MBHA) smolo 1 (0,63 mekv./g, Advanced ChemTech) mešamo z bromoocetno kislino in diizopropilkarbodiimidom (5 ekv.) eno uro pri 25 °C v dimetilacetamidu (DMA), da dobimo bromoacetilni derivat 2. b) Smolo temeljito izperemo z DMA in individualne Boc-zaščitene amino kisline (3 ekv., Bachem) esterificiramo z mešanjem z natrijevim bikarbonatom (6 ekv.) v dimetilformamidu (DMF) 24 ur pri 50 °C, da dobimo ustrezno glikolat-fenilalanilamidno smolo 3. Amino acetilirano smolo 3 izperemo z DMF (3x) in dik162 lorometanom (CHjClj) (3x) in lahko shranimo pri sobni temperaturi za več mesecev. Smolo 3 lahko nato napolnimo v avtomatiziran peptidni sintetizator (Applied Biosystems 430A) in peptide podaljšamo z uporabo standardnih postopkov v trdni fazi (5). c) Ν-α-Boc-skupino odstranimo z raztopino 45 % trifluoroocetne kisline v CF^C^. d) Boc-zaščitene amino kisline (5 ekv.) nato predaktiviramo z uporabo benzotriazol-1il-oksi-tris-(dimetilamino) fosfonijevega heksafluorofosfata (BOP, 4 ekv.) in N-metilmorfolina (NMM, 10 ekv.) v DMA in pripojimo v 1-2 urah. e) Končno N-aBoc skupino odstranimo (TFA/CF^Cl^, da dobimo 4, in izonikotinilno (iNOC) zaščitno skupino uvedemo, kot je opisano pred tem, (4), z mešanjem s 4-izonikotinil2-4-dinitrofenil karbonatom (3 ekv.) in NMM (6 ekv.) v DMA pri 25 °C 24 ur. f) S cepitvijo in deprotekcijo peptida z obdelavo z brezvodnim HF (5 % anizol/5 % etilmetil sulfid) pri 0 °C 1 uro dobimo iNOC-zaščiten, glikolat-lys-amidno aktiviran peptid 5, ki ga očistimo s HPLC z reverzno fazo 08 (CH^CN/H^O gradient, TFA (0,1 %)). Identičnost vseh substratov potrdimo z masno spektrometrijo.

DODATNE INFORMACIJE

Predloženi izum je omogočen na osnovi zgornjega opisa in z lahkoto dosegljivih referenc in izhodnih materialov. Prijavitelji so deponirali pri American Type Culture Collection, Rockville, Md., ZDA (ATCC) naslednje celične linije:

Escherichia coli, DHlOB-pBSK-hrap/ I 1,8, ATCC dostopna št. CRL 69575, deponirano 24. februarja 1994;

plazmid, pSVI5.ID.LLML0RF, ATCC dostopna št. CRL 75958; deponirano 2. decembra 1994; in celice CHO DP-12, ML 1/50 MCB (označeno št. 1594), ATCC dostopna št. CRL 11770; deponirano 6. decembra 1994.

Le to deponiramo po predpisih budimpeštanske pogodbe za mednarodno priznanje deponiranih mikroorganizmov za namene patentnih postopkov in temu ustreznih pravil (Budapest Treaty). To zagotavlja vzdrževanje kultur, sposobnih za življenje 30 let od dneva depozita. Organizmi so dosegljivi od ATCC po določbah Budapest Treaty in izpostavljeni dogovoru med prijavitelji in ATCC, ki zagotavlja neomejeno dosegljivost po izdaji pristojnega US patenta. Dosegljivost deponiranega seva si ni možno razlagati kot licenco za izvajanje predloženega izuma v nasprotju s pravicami, podeljenimi pod avtoriteto katerekoli vlade v skladu z njenimi patentnimi zakoni.

163

Čeprav je predloženi izum nujno opisan v povezavi s prednostnimi izvedbami in specifičnimi delovnimi primeri, pa strokovnjak na osnovi predhodnega opisa lahko iz vede številne spremembe ter substitucije ekvivalentov in preoblikuje predložene predmete, navedene tukaj, ne da bi se oddaljil od njegovega namena in obsega. Torej lahko izum izvajamo na načine, ki so drugačni od tistih, specifično navedenih tukaj. Zato je mišljeno, da naj bi zaščita, podeljena s patentno listino, omejevala le z predložene zahtevke in njihove ekvivalente.

Vse reference, navedene tukaj, so jasno vključene z referenco.

Claims (36)

1. Mpl Ugandski polipeptid, označen s tem, da ga lahko dobimo po postopku, ki obsega:

(i) selekcioniranje humane genomske knjižnice z oligonukleotidom, ki temelji na genomski sekvenci, prikazani na sl. 9 za izoUranje genomske DNA, ki vključuje eksonsko kodirno sekvenco mpl Uganda, prikazano na sl. 9, skupaj s preostalimi eksoni gena (U) inseriranje DNA v ekspresijski vektor (iii) transfektiranje ceUce sesalca z vektorjem in eksprimiranje gena in (iv) rekuperiranje mpl Ugandskega poUpeptida iz ceUčnega kulturnega medija.

2. Mpl Ugandski poUpeptid, označen s tem, da ga lahko dobimo po postopku, ki obsega:

(i) izoUranje iz genomske knjižnice genomsko DNA, ki se hibridizira pri manj ostrih pogojih s sekvenco DNA:

5 ' GCCCTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTTATTTAGGAGTCG 3 ' in vsebuje eksone, ki kodirajo mpl Ugandski poUpeptid (U) inseriranje DNA v ekspresijski vektor (in) transfektiranje ceUce sesalca z vektorjem in eksprimiranje gena in (iv) rekuperiranje mpl Ugandskega poUpeptida iz ceUčnega kulturnega medija.

3. Mpl Ugandski polipeptid, označen s tem, da ga lahko dobimo po postopku, ki obsega:

(i) identificiranje prikladnega ceUčnega vira RNA za humani mpl ligand in pripravo

165 ene ali več knjižnic cDNA iz navedene RNA in (iii) hibridizacijsko selekcioniranje knjižnice ali knjižnic z označenim oUgonukleotidom, ki temelji na kodirni sekvenci, prikazani na sl. 9, da identificiramo in izoliramo klon, ki vsebuje kodirno sekvenco mpl liganda (iv) inseriranje kodirne DNA v ekspresijski vektor, prikladen za ekspresijo v celicah sesalca (v) transfektiranje celice sesalca z vektoijem in eksprimiranje cDNA in (vi) rekuperiranje mpl Ugandskega polipeptida iz cehčnega kulturnega medija.

4. Mpl Ugandski poUpeptid, označen s tem, da ga dobimo po postopku, ki obsega:

(i) pripravo knjižnice aU knjižnic cDNA iz mRNA, ekstrahirane iz ceUc humanih ledvic (u) hibridizacijsko selekcioniranje knjižnice aU knjižnic z označenim oUgonukleotidom, ki temelji na kodirni sekvenci, prikazani na sl. 9, da identificiramo in izoliramo klon, ki vsebuje kodirno sekvenco mpl Uganda (in) inseriranje kodirne DNA v ekspresijski vektor, prikladen za ekspresijo v ceUcah sesalca (iv) transfektiranje ceUce sesalca z vektoijem in eksprimiranje cDNA in (v) rekuperiranje mpl Ugandskega polipeptida iz ceUčnega kulturnega medija.

5. Izolirani, v bistvu homogeni mpl Ugand, označen s tem, da:

(a) Ugand stimulira vgraditev označenih nukloetidov (³H-timidin) v DNA ceUc Ba/F3, odvisnih od IL-3, transfektiranih s humanim mpl P (b) Ugand stimulira vgraditev ³⁵S v krožeče trombocite pri testu oživitve trombocitov;

(c) je Ugand stabilen za pH 2,5, SDS pri 0,1 % in 2M sečnino

166 (d) je ligand glikoprotein (e) je amino terminalna sekvenca polipeptida.

SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR ali SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL

6. Mpl ligand, označen s tem, da ga dobimo s čiščenjem iz aplastične plazme s hidrofobno interakcijsko kromatografijo, imobilizirano barvno kromatografijo in mp/-afinitetno kromatografijo in ima jasno molekulsko maso, določeno s SDS-PAGE pri redukcijskih pogojih, v območju od 18-22 kD, 28 kD ali 30 kD.

7. Izolirani mpl Ugandski poUpeptid, označen s tem, da ga kodira nukleinska kislina, ki ima sekvenco, ki se hibridizira pri zmerno ostrih pogojih z nukleinsko kislino, ki ima sekvenco od nukleotida 119 naprej, s sl. 9 (ID NO: 4 aU ID NO: 5).

8. Izolirani mpl Ugand po kateremkoU od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da je biološko aktiven.

9. Mpl Ugandski poUpeptid, označen s tem, da ima vsaj 70 % sekvenčno identičnost s polipeptidom, po kateremkoU od zahtevkov 1 do 7.

10. Mpl Ugandski polipeptid, označen s tem, da je alela ali varianta poUpeptida po kateremkoU od zahtevkov 1 do 7, ki ohrani mpl Ugandsko biološko aktivnost.

11. Mpl Ugandski poUpeptid po kateremkoU od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da je izveden iz humane vrste.

12. Mpl ligadanski poUpeptid po kateremkoU od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, daje izveden iz nehumane vrste.

13. Mpl Ugandski poUpeptid po kateremkoU od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, daje neglikoziliran.

14. Fuzija, označena s tem, da obsega mpl Ugand po kateremkoU od prejšnjih zahtevkov, spojen s heterolognim polipeptidom.

167

15. Izolirana molekula nukleinske kisline označena s tem, da kodira polipeptid po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov.

16. Izolirana molekula nukleinske kisline, označena s tem, daje izbrana izmed:

(a) klona cDNA, ki ga dobimo iz stopnje (iii) zahtevka 3 ali stopnje (ii) zahtevka 4 (b) sekvence DNA, kije sposobna hibridiziranja pri ostrih pogojih s klonom (a) in (c) genetske variante katerekoli sekvence DNA od (a) in (b), ki kodira polipeptid, ki ima biološko lastnost naravnega mpl Ugandskega polipeptida.

17. Izolirana nukleinska kislina, označena s tem, da ima sekvenco, ki se hibridizira pri zmerno ostrih pogojih z nukleinsko kislino, ki ima sekvenco od nukleotida 119 naprej, s sl. 9 (ID NO: 4 ali ID NO: 5) in kodira mpl ligand.

18. Genomska DNA ali cDNA, označena s tem, da ustreza vsaj delno genu mpl liganda in se hibridizira pri zmerno do zelo ostrih pogojih z naravno molekulo nukleinske kisline, ki ima sekvenco, ki kodira mpl ligand, pri čemer je mpl ligand definiran v kateremkoli od zahtevkov 1 do 7.

19. Nukleinska kislina po kateremkoli od zahtevkov 15 do 18, označena s tem, da je funkcionalno vezana na promotor.

20. Ekspresijski vektor, označen s tem, da obsega nukleinsko kislino po kateremkoli od zahtevkov 15 do 18, funkcionalno vezano na kontrolne sekvence, spoznane od gostiteljske celice.

21. Gostiteljska celica, transformirana z nukleinsko kislino po kateremkoli od zahtevkov 15 do 20, označena s tem, daje sposobna ekspresije navedene nukleinske kisline, da tvori mpl Ugandski poUpeptid.

22. Postopek, označen s tem, da obsega ekspresijo rekombinantne nukleinske kisline po kateremkoU od zahtevkov 15 do 20 v prikladni gostiteljski ceUci, da tvori mpl Ugandski poUpeptid.

23. Postopek po zahtevku 22, označen s tem, da mpl Ugandski polipeptid

168 rekuperiramo iz gostiteljske celice ali kulturnega medija gostiteljske celice.

24. Postopek, označen s tem, da obsega ekspresijo v celici indigenega gena mpl liganda ob nadzoru promotorskega/spodbujevalnega elementa, supresoija ali eksogenega transkripcijskega modulatomega elementa, ki je inseriran v genom celice v zadostni bližini in taki orientaciji, da vpliva na transkripcijo DNA, ki kodira mpl Ugandski poUpeptid.

25. Sestavek, označen s tem, da obsega mpl Ugand po kateremkoU od zahtevkov 1 do 14, aU kot ga dobimo po postopku zahtevka 22 ah 23, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

26. Postopek, označen s tem, da obsega uporabo mpl Ugandskega poUpeptida po kateremkoU od zahtevkov 1 do 14 aU dobljenega po postopku zahtevka 22 aU 23, pri pripravi zdravila.

27. Sestavek po zahtevku 25 ah kot ga dobimo po postopku zahtevka 26, označen s tem, da nadalje obsega terapevtsko učinkovito kohčino sredstva, izbranega izmed citokinov, kolonijo stimuhrnih faktorjev in interlevkinov.

28. Sestavek po zahtevku 27, označen s tem, da sredstvo izberemo izmed LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Epo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 in IL-11.

29. Postopek za pomnoževanje testnega vzorca nukleinske kisline, označen s tem, da obsega iniciranje poUmerazne reakcije nukleinske kisline z nukleinsko kislino, ki ustreza vsaj delu genomske aU cDNA po zahtevku 18.

30. Postopek za določevanje prisotnosti mpl Ugandskega poUpeptida, označen s tem, da obsega hibridiziranje nukleinske kisline po zahtevku 18 s testnim vzorcem nukleinske kisline in določevanje prisotnosti nukleinske kisline mpl Ugandskega poUpeptida.

31. Postopek, označen s tem, da obsega uporabo mpl Ugandskega poUpeptida po kateremkoU od zahtevkov 1 do 14 ah dobljenega po postopku zahtevka 22 ah zahtevka 23, pri pripravi protiteles, specifičnih za mpl Ugand.

32. Postopek po zahtevku 31, označen s tem, da pripravimo monoklonsko protitelo.

169

33. Protitelo, označeno s tem, da ga dobimo po postopku zahtevka 31 ali 32.

34. Protitelo, označeno s tem, da je sposobno vezave mpl Ugandskega poUpeptida po kateremkoU od zahtevkov 1 do 14.

35. Protitelo po zahtevku 34, označeno s tem, daje monoklonsko.

36. Hibridomska ceUčna Unija, označena s tem, da izdeluje protitelesa po zahtevku 33