JPH05504681A - 感染性タンパク質デリバリーシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１、　ウィルス粒子の生産方法であって、請求項１０に記載の細胞を細胞培養 培地中で培養し、そして生産されたウィルス粒子を該培地から回収することを含 んで成る方法。

１２、タンパク質を細胞に導入する方法であって、請求項１に記載のウィルス粒 子を該細胞に導入することを含んで成る方法。

１３、前記細胞が請求項１０の細胞である、請求項１２に記載の細胞。

１４、請求項１のウィルス粒子を含んで成り、野生型ウィルス粒子を含まない医 薬組成物。

１５、前記タンパク質がＴＮＦ、　ｒＬ−２，ＭＤＲまたはそれらのタンパク質 のミューティンから成る群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。

１６、前記調節配列およびパッケージング部位が力（ＭｏＭＬＶ由来である、請 求項１５に記載の医薬組成物。

１７．前記調節配列が、ＭｏＭＬＶスプライス供与部位をＨａＳＶ由来の配列で 置き換えることにより変更されている、請求項１６に記載の医薬組成物。

１８、前記エンベロープタンパク質がヒト細胞の感染を引き起こすことができる 、請求項１４に記載の医薬組成物。

１９、　ＡＴＣＣ受託番号６８１１８を有するｐＬＴＮＦ６、またはそれから誘 導されるウィルス。

２０、　ＡＴＣＣ受託番号６８１１９を有するｐＬＩＬ−２６、またはそれから 誘導されるウィルス。

２１、　ＡＴＣＣ受託番号６８１２０を有するｐＬＭＤＲ６、またはそれから誘 導されるウィルス。

２２、　ＡＴＣＣ受託番号６８１２１を有するｐＵｃ、ＦＶＸＭΔＨＩＩＴ　Ｔ ＮＦ　ｒ　ｓｉｇ、またはそれから誘導されるウィルス。

２３、成ＰＴＮＦおよび前記成熟ＴＮＦの分泌を増強するそれに関連するシグナ ルペプチドをコードするＤＮＡ配列。

２４、請求項２３に記載のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、 前記シグナルペプチドが実質的にｒインターフェロンシグナルペプチドであるＤ ＮＡ配列。

２５、請求項２４のＤＮＡ配列を含んで成る細胞。

２６、請求項２３のＤＮＡ配列によりコードされるＴＮＦ　。

２７、請求項２４のＤＮＡ配列によりコードされるＴＮＦ　。

２８、　Ｉ？ＮＡゲノムを含んで成るウィルス粒子であって、該ゲノムが２つの 組換えタンパク質をコードするＲＮＡ配列を含んで成り、そして該ＲＮＡ配列が 調節配列に、およびｇａｇ配列を含んで成るレトロウィルス由来のパッケージン グ部位に作用可能に連結されており、前記ゲノムが標的細胞を感染することがで きるエンベロープタンパク質中に含まれていることを特徴とするウィルス粒子。

２９、前記タンパク質がＴＮＦ、　Ｉｔ、−２およびＭＤＩ？から成る群から選 択される、請求項２８に記載のウィルス粒子。

３０、一方のタンパク質が細胞に薬剤耐性を特徴する請求項２８に記載のウィル ス粒子。

３１、前記薬剤耐性がネオマイシンに対する耐性である、請求項３０に記載のウ ィルス粒子。

３２、ウィルス粒子ｐＬＴＮＦＳＮ−２２゜３３、ウィルス粒子ｐＬＩＬ２ｓＮ −１６゜３４、ウィルス粒子ｐｔ、　ＩＬ２ＳＮ−２０゜３５、動物を癌に対し て治療する方法であって、次の段階：ａ）前記動物からＴＩＬ細胞を単離し；ｂ ）前記ＴＩＬ細胞を、癌を治療するのに有効なタンパク質をコードする岨換えレ トロウィルス粒子で感染せしめ；そして Ｃ）前記動物に有効量の前記レトロウィルス粒子を投与する、 を含んで成る方法。

３６、前記組換えレトロウィルス粒子が薬剤選択可能マーカーを更に含んで成る 、請求項３５に記載の方法。

３７、前記薬剤選択可能マーカーがネオマイシン耐性である、請求項３６に記載 の方法。

３８、前記癌を治療するのに有効なタンパク質がサイトカインまたはリンホカイ ンから成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。

３９、前記タンパク質が多剤耐性タンパク質である、請求項３５に記載の方法。

４０６前記タンパク質がｒＬ−２である、請求項３５に記載の方法。

４１、前記タンパク質がＴＮＦまたはＴＮＦの分泌形である、請求項３５に記載 の方法。

４２、Δ（１→１２）、Δ（１＋　１２）およびΔ（１＋１３）から成る群から 選択されたＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューティン。

４３、前記ＴＮＦ欠失ミューティンがΔ（１→１２）を含んで成る、請求項４２ に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューティン。

４４、前記ＴＮＦ欠失ミューティンがΔ（１＋　１２）を含んで成る、請求項４ ２に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューティン。

４５、前記ＴＮＦ欠失ミューティンがΔ（１＋　１３）を含んで成る、請求項４ ２に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューティン。

４６、Δ（ｌ→１２）、Δ（１＋　１２）およびΔ（１＋　１３）から成る群か ら選択されたＴＮＦ　ミューティンをコードする組換えＤＮＡを含んで成る組換 え宿主細胞。

４７、Δ（１→１２）、Δ（１±１２）およびΔ（１＋　１３）から成る群から 選択されたＴＮＦ　ミューティンをコードする組換えＤＮＡ　。

４８、細胞毒性細胞結合型ＴＮＦプロホルモンミューティンの有効量を動物に投 与することを含んで成る、病気の治療方法。

４９、前記ＴＮＦ　ミューティンがΔ（１→１２）を含んで成る、請求項４８に 記載の方法。

５０、前記ＴＮＦ　ミューティンがΔ（１＋　１２）を含んで成る、請求項４８ に記載の方法。

５１、Δ（１→１２）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の組 換え宿主細胞。

５２、Δ（１＋　１３）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の 組換え宿主細胞。

５３、Δ（１＋　１２）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の 組換え宿主細胞。

５４、正常細胞を実質的に殺すことなく腫瘍細胞を選択的に殺す方法であって、 細胞毒性細胞結合型ＴＮＦプロホルモンミューティンをコードする組換えレトロ ウィルス粒子によりＮＬ細胞を感染させ、そして前記ＩＩＩ瘍細胞を有効量の前 記感染ＴＩＬ細胞と接触させることを含んで成る方法。

５５、前記ＴＮＦプロホルモンミューティンがΔ（１→１２）を含んで成る、請 求項５４に記載の方法。

５６、前記ＴＮＦプロホルモンミューティンがΔ（１＋　１２）を含んで成る、 請求項５４に記載の方法。

浄１１（内容に変ＷなＬ） 明　細　書 感染性タンパク質デリバリーシステム 本発明は、細胞へのタンパク質のデリバリ−を行うためのＤＮＡ組換え技術の利 用に関する。特に、本発明は、細胞に１または複数の所望のタンパク質をデリバ リ−するための高および低力値組換えレトロウィルスベクターの利用、またはタ ンパク質の存在から利益を得るであろう宿主生物に関する。

ｌｌ瘍壊死因子、インターロイキン、特にインターロイキン■、および細胞に多 剤耐性を付与するタンパク質を含む様々なタンパク質をデリバリ−することがで きる。

この分野の調査が不適当であり且つ役立たないであろう所望の標的細胞への、タ ンパク質、特に医学的に有益な用途を有するタンパク質のデリバリ−を行うのに 非常に多数のアプローチが用いられている。しかしながら、事実上は、現在使用 されている全てのデリバリ−システムが被検体生物の循環系に対する関門を貫通 するという問題を扱い、そしてタンパク質での処置に向けられる特定細胞による 取り込みの問題を扱っていないことに注目すべきである。よって、それらの関門 の通過を保証する最も単純な形態である活性成分の溶液の静注では、タンパク質 の供給は単に血液中を循環する活性成分を生じるだけであり、処置または致死す ることが望まれる細胞の細胞質または核中への道をタンパク質が見出すことを保 証する特別な機構への用意がない。例えば抗体の利用により、特定の細胞を標的 することができる一方、細胞膜を通る浸透は、細胞により通常使われるかまたは 適当な処理部位が必ず細胞外であるどんな機構によっても行われる。

もちろん、ウィルス粒子が通常の感染経路において外来の核酸およびタンパク質 を細胞中に導入することができることは確立されている。遺伝子療法の目的で標 的哺乳類細胞中に遺伝物質を輸送するためにウィルス粒子を使用することは主要 なアプローチであり、この技術を発展させるために現在追求されつつある。例え ばＭｃＣｏｒｎ＋ｉｃｋ、　Ｄ、、…ｏ／Ｔｅｃｈｎｏ　Ｉｏ■てマウス血液細 胞系中に自己分泌増殖を誘導することができた。Ｌａｎｇの研究では、ＧＭ−Ｃ ５ＦをコードするｃＤＮＡを、ウィルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｎ＋１ｎａｌ 　ｒｅｐｅａｔ）のプロモーター／エンハンサ−の調節下においてモロニーマウ ス白血病ウィルスベースのベクター中に挿入し、そしてψ２パッケージング細胞 系中にトランスフェクトせしめることにより惑染性無ヘルパーウィルスを生産し た。生産されたＧＭＶウィルスは、造血細胞系においてＧＭ−Ｃ５Ｆ生産を行う ことができた。しかしながら、この能力は、デザインされたタンパク質薬剤を無 傷の生物体に輸送するのに今まで利用されていない。

特にレトロウィルスが外来遺伝子挿入のためのベクターとして使われており、レ トロウィルスの生物学はかなりの程度解明されている。レトロウィルスはタンパ ク質エンベロープに被包された一本鎖ＲＮＡゲノムから成る。５′から３′まで 読み取るゲノムそれ自体は、キャップ、５′非翻訳領域、ＲＮＡをタンパク質中 にパンケージングするのに必要である“ψ”と称するＲＮＡのセグメント、即ち パンケージング部位、次いで幾つかのタンパク質、即ちレトロウィルスコアタン パクｆ（ｇａｇ）　、ＤＮＡ転写産物から成る中間段階を促進する逆転写酵素（ ｐｏｐ）およびウィルスエンベロープまたはキャプシドタンパク質（ｅｎｖ）の コード配列、それらの後方の幾つかの３′非翻訳配列を含む。上記３つのタンパ ク質は、ウィルスゲノムの感染性に必要であり、パンケージング部位は追加の感 染性ウィルスを生産するのに必要である。

レトロウィルスは、ＲＮＡのタンパク譬コード領域の二本鎖ｃＤＮＡコピーを含 む「プロウィルス」段階を経験する。しかしながら、この段階では、非翻訳３′ および５′領域は、このタンパク質コードｃＤＮＡのいずれかの末端において、 ＤＮＡ転写を行う適当なプロモーターおよびエンハンサ−配列並びにコード部分 に関して作用可能な位置に転写終結配列を得るために変更される。

通常感染では、プロウィルス二本鎖ｃＤＮＡを宿主細胞ゲノム中に組み込み、そ してそこから、そのタンパク質夾膜中にパフケージングされたＲＮＡゲノムを含 む追加のウィルス粒子の生産を行うことができる。この方法を行うためには、ψ パッケージング部位がプロウィルス中に存在することが重要である。

変更されたウィルスが宿生細胞に感染するとウィルスの発現系を使用するように 、レトロウィルスのタンパク質コード配列を所望のタンパク質のものに置き換え ることができる別のものが見出された。米国特許第４，４０５，７１２号および Ｌａｎｇ　（前掲）を参照のこと。しかしながら、これを行うために、変更ウィ ルスゲノムは、キャプシドタンパク質を合成しそして外来ＤＮＡのＩ？ＮＡ転写 産物をパッケージングすることができるヘルパーウィルスを必要とした。

従って、「遺伝子療法」のために、プロウィルスＤＮＡ　形を適当なベクター中 に挿入し、そしてヘルパーウィルスの助けをかりてウィルスエンベロープ中にパ ッケージングする。一般的概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｗ、Ｆ、、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２６：４０１−４０９　；　Ｃｏｆｆ１ｎ、 　Ｊ、＋　”Ｇｅｎｏｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ”、　ＲＮＡ　ＴｕｍｏｒＶｉ ｒｕｓｅｓ＋　第１２巻＋　Ｗｅｉｓｓら編、第２版（１９８５）　Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹを参照のこと。

遺伝子療法の研究に最もよく使われるレトロウィルスは、マウス肉腫ウィルス（ ＭＳＶ）またはモロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）である［Ｍａｎｎ 、　Ｒ，ら、並置（１９８３）３３：１５３−１５９）　。

それらのレトロウィルスのプロウィルス形を単離し、増幅のために大体標準的な 細菌クローニングベクター中に挿入する。

次いでパッケージング部位と共に、調節配列を含むＬＴＨにより隣接されたｇａ ｇｌ　ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするｌｌＲＮＡを含むプロウィルス挿入断片 を操作し、タンパク質をコードするＲＮＡを含む領域を所望の外来遺伝子と！き 換える。このＤＮＡを、完全なウィルスまたはパンケージング部位のみを欠く欠 陥ウィルスにより感染されている宿主細胞中にトランスフェクトせしめれば、変 更プロウィルスから合成されるＲＮＡは別の細胞の再感染のためにウィルス粒子 中にパンケージングされる。

これは、感染による細胞中への所望の活性成分または薬剤をコードするＩ）ＮＡ の導入機構を提供する。

これに取り掛かるには２つの方法がある。１つのアプローチでは、細胞中に共存 する未変更ウィルスからの感染を有する細胞中に変更プロウィルスＤＮＡをトラ ンスフェクトする。

通常のウィルスベクターはパンケージングされた物質を合成し、そして変更プロ ウィルスにより生産される成る種のｍＲＮＡは正常のウィルスＲＮＡと同様な方 法でパンケージングされ、次いでタンパク質の生産のためこのｍＲＮＡを用いて 標的細胞をトランスフェクトすることができる。しかしながら、それらの利用さ れるウィルスエンベロープと共に、「デリバリ−トランク」ウィルスから分離さ れなければ、幾らかの数の正常のウィルスＲＮＡが再パンケージソゲされ、これ がこのウィルス生産循環の生産物により感染された宿主細胞において追加のウィ ルス感染を簡単に引き起こすであろう。

より有用なアプローチでは、所望の遺伝子を含むプロウィルスクローニングベク ターを使って、全くウィルスゲノムＲＮＡを含まない欠陥ウィルスエンベロープ 、要するに空のデリバリ−トランク、を生産するように遺伝子修飾されている細 胞をトランスフェクトする。それらの細胞は、市パッケージング部位を欠く変更 レトロウィルスのプロウィルス形の組み込みにより得られ、幾つかのそのような 細胞系はそれらを必要とする全てに利用可能である。ψ−１またはψ−２と命名 された２つの系がＭａｎｎ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８３）　３３：１５３ −１５９　（前掲）に詳細に記載されており、これはψパンケージング部位が削 除されているＭｏＭＬＶプロウィルス挿入断片を含むプラスミドを用いて宿主Ｎ ＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞をトランスフェクトせしめることにより作製される。ψ− ２細胞は、生殖の過程において生来のウィルスのウィルスエンベロープに対応す る細胞当たり幾つかの空のウィルスエンベロープを明らかに生産する。

それらの細胞を外来遺伝子とパッケージング部位型の両方を含むプロウィルスＤ ＮＡによりトランスフェクトせしめると、それらは外来遺伝子を含むプロウィル スＤＮＡからのｍＲＮＡ転写産物を空のエンベロープ中にパンケージングし、通 常ＭｏＭＬＶの宿主であるいずれかの細胞（この場合マウス）に感染するとかで きる変更ウィルスを生じる。しかしながら、この組換え変更ウィルスは、それが 「感染する」細胞において追加の変更（または他の）ウィルス粒子の生産を引き 起こすことができないという点で欠陥性であることに注目すべきである。

「感染された」細胞において該遺伝子がコードするタンパク質の生産を引き起こ すことができるが、追加のウィルス粒子が全く生産されないため、この感染は追 加の細胞に広がることができない。

本発明において医薬の調製のために中−２よりもっと有用であるのは、Ｃｏｎｅ 、　Ｒ，Ｄ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ） （１９８４）　８１：６３４９−６３５３から入手できるψ−ＡＭ系である。そ れらの系は、ｐＭＡＶ−ψ−と称するベクターを用いてＮＩＨ３Ｔ３　！Ｉｔ胞 をトランスフェクトすることによっても得られる。しかしながら、ｐＭＡＶ−ψ 〜は、ＭｏＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌ配列と雨間性ウィルス４０７０Ａ由来のエン ベロープ配列をコードするハイブリッドである。それらの細胞系により生産され る空のキャプシドは、同時トランスフェクトされた変更プロウィルスＤＮＡのＲ ＮＡ転写物をパッケージングし、ヒト、ラットおよびマウス細胞系を認識しそし てそれに感染するプソイドウィルスを生産する。

ｇａｇ配列を有するレトロウィルスベクターはそれらの配列を欠くウィルスより も高い力価を示すことが最近観察されている。Ｂｅｎｄｅｒら、１９８７．　Ｊ 、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　６１（５）：１６３９−１６４６゜そのような高力価 ウィルスは、遺伝子療法のための標的である種々の細胞／組織の効率的感染を促 進する。それらのウィルスの高力価は、今までウィルス粒子へのウィルスＲＮＡ のパッケージングに関与すると考えられていなかったｇａｇ　６Ｍ域配列の存在 に関係し、より効率的なパッケージングに備えることができると考えられる。と にかく、そのような高力価ウィルスは遺伝子療法における用途を有するだろう。

従って、該技術は、過去において、遺伝子療法または自己分泌増殖因子の作製に のみ使用していた怒受性細胞中に遺伝子を運ぶだめのシステムを提供する。それ らの方法は、必然的にレトロウィルスベクターに対する標的細胞の生体外暴露を 使用する３本発明では、常用の投与法を使って細胞を標的するための医薬を運ぶ 同様なシステムを集め、高度に行き止まりの局在化された「感染Ｊをもたらす。

本発明は、非常に珍しい医薬組成物およびウィルス感染を受けやすい生物体の細 胞に活性薬層をデリバリ−する方法に向けられる。１つの態様では、該医薬組成 物は、薬剤で処理しようとする目的生物体において一時的で且つ非複製の細胞感 染を引き起こすことができるエンベロープタンパク質を含むデリバリ−ウィルス から成る。それらの医薬組成物は、血流中への注入により、または望ましくない 細胞、例えば腫瘍細胞の環中への局所注入により投与される。あるいは、ウィル ス感染を受けやすい細胞を宿主生物体から除去し、適当なウィルスで感染せしめ 、次いで宿主生物体に戻し、そこでそれらが所望のタンパク質薬剤を分泌するこ ともできる。

第一の観点では、本発明は、デリバリ−レトロウィルスを含んで成るドラッグデ リバリ−システムに関する。レトロウィルスは、レトロウィルスに由来する調節 配列と市パッケージング部位に作用可能に連結された所望の活性タンパク質成分 、および標的宿主細胞だけが「感染Ｊされてこの感染が他の細胞に広がらないよ うにウィルス粒子による標的細胞の感染を成し遂げることができるエンベロープ タンパク質をコードするＲＮＡを含んで成る「ゲノム」を有する。

本発明の第二の観点では、高力価のレトロウィルスドラッグデリバリ−システム が記載され、ここでこのシステムの高力価特徴はベクター中に存在するｇａｇ配 列の存在から誘導される。このベクターは、高力価のウィルスを要求する細胞ま たは組織、好ましくは浸潤性腫瘍リンパ球または骨髄細胞を形質転換せしめるの に特に有用である。

本発明の第三の観点では、■または複数の薬剤がデリバリ−されそして腫瘍壊死 因子、プロホルモンもしくはホルモンのいずれか、インターロイキン−２、また は薬剤耐性を付与するタンパク質、例えば多剤耐性タンパクｔ　（ＭＤＲ）を含 むことができる高力価レトロウィルスドラッグプリハリ−システムが記載される 。

本発明の第四の観点は、レトロウィルスが高度に細胞分泌性の形態のＩｌｌ瘍壊 死因子をコードするＤＮＡを担持している、レトロウィルスドラッグデリバリ− システムの記載である。

本発明の第五の観点は、目的のを推動物宿主に１または複数の活性タンパク質を 投与する方法であって、このドラングデリバリーシステムを局所的にまたは全身 的に投与することを含んで成る方法に関する。または、上述したように、該ドラ ッグデリバリ−システムはウィルス感染を受けやすい細胞に投与することができ 、この場合感染は試験管内で起こり、そして感染された細胞が宿生生物体に戻さ れ、そこでそれが所望のタンパク質を生産する。

本発明の第六の観点は、細胞の感染を引き起こすのに高力価のレトロウィルスを 必要とするを椎動物宿主細胞に活性タンパク質をデリバリ−する方法であって、 該タンパク質を該細胞に、結果としてを椎動物宿主に投与することを含んで成る 方法に関する。

本発明の第七の観点は、上記ドラングデリバリーシステムの調製に重要である材 料および方法に関する。それらは、所望の活性タンパク質をコードするＤＮＡ配 列を含んで成るプロウィルスＤＮＡを包含する。好ましい分子は、癌化学寮法に おいて使用することができるもの、例えば腫瘍壊死因子、ＩＬ−２、多剤耐性タ ンパク質等である。それらの配列は、レトロウィルスに由来しそしてレトロウィ ルス由来のＬＴＲにより隣接された調節配列（パッケージング部位を含む）に、 またはタンパク質薬剤の発現に正常に応答できる相同の調節配列に、作用可能に 連結され得る。

別の態様では、本発明の一般的方法は、前項のプロウィルスＤＮＡによりトラン スフェクトされたψ細胞、またはそれらが生産するプソイドウィルス粒子により 感染された細胞を移植し、所望のタンパク質のその場での生産を成し遂げること により、行うこともできる。従って、同時トランスフェクトされた中細胞および それらが生産する変更ウィルスにより感染された細胞は、本発明の観点でもある 医薬組成物を提供する。

本発明の更なる観点は、上述のψパッケージング細胞により生産されるデリバリ −ウィルス粒子を単離することを含んで成るその組成物の調製方法である。

図１は、ＴインターフェロンシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および 成ＰＴＮＦをコードするＤＮＡ配列の一部分である。

図２は、ｐＦＶＸ　ＴＮＦによりコードされる３５Ｓ−メチオニン標識ＴＮＦの 免疫沈澱分析である。レーンＡ、トランスフェクトされてない細胞；レーンＢ、 　ｐＦＶＸ　ＴＮＦによりトランスフェクトされた細胞。メチオニンは２５ｋＤ 前駆体のみを標識し、１７ｋＤの「成熟」形は標識しない（アミノ酸配列から推 定される）。

図３は、ｐＦＶＸ　ＴＮＦによりコードされる３５Ｓ−システィン標識ＴＮＦの 免疫沈澱分析である。レーンＡ、トランスフェクトされてない細胞；レーンＢ、 　ｐＦＶＸ　ＴＮＦによりトランスフェクトさ乳た細胞。システィンは２５ｋＤ 前駆体と１７ｋＤ成熟形の両方を標識する（アミノ酸配列から推定される）。

図４は、レトロウィルス感染された３５Ｓ−システィン標識３Ｔ３細胞のＴＮＦ の免疫沈澱分析である。レーンＡ、　ＮｒＨ３Ｔ３細胞由来の上清；レーンＢ、 　ＮＩ）Ｉ　３Ｔ３細胞の細胞質溶解物；レーンＣ，ＦＶＸ　ＴＮＦ　レトロウ ィルスにより感染された細胞由来の上１（ＴＮＦ−Ｖ）　；およびレーンＤ、同 レトロウィルスにより感染された細胞由来の細胞質溶解物。２６ｋＤ形のＴＮＦ は細胞質溶解物中に認められず分泌されないが、１７ｋＤ　ｒ成熟」形または分 泌形のＴＮＦは細胞質抽出物と上清の両方に認められることに注目のこと。

図５は、ＴＮＦレトロウィルスゲノムの構造および生物活性を示す。レーンＡ、 　ＦＶＸ　ＴＮＦレトロウィルスゲノムの制限地図；レーンＢ、ｐＦＶχＴＮＦ によりトランスフェクトされたｐｓｉ−ａＩＩ細胞のプラークアッセイ。該アッ セイは下記のようにして行った。

Ｇ４１８耐性コロニーを有する培養皿の上に、７．３　ＸＩＯ’細胞／ｄの密度 でＬ９２９細胞を重層した。３０分復線胞が接着したら培地を吸引し、そして１ ０χＦＣ５と０．９χＮｏｂｂｌｅ寒天が補足されたＤＭＥＭを細胞の上に重層 した。１８〜２４時間インキュヘーション後、Ｌ９２９細胞の溶解帯により囲ま れた細胞をクローニング用シリンダーにより単離し、そして大量培養に拡大した 。

図６は、感染性ドラッグデリバリーレトロウィルスｐＬＭＤＲＬ６．　ｐＬＴＮ ＦＬ６およびｐＬＩＬ−２Ｌ６の作製方法を示す。

図７は、ｐＬＴＮＦＬ６プラスミドまたはｐＬＴＮＦＬ６由来の高力価レトロウ ィルスのいずれかでトランスフェクトまたは感染された細胞の免疫沈澱分析を示 す。レーンＡ、２６ｋＤと１７ｋＤの両方のＴＮＦをコードする高力価レトロウ ィルスによりトランスフェクトされたＰＡ３１７細胞；レーンＢ、未感染のＮｒ ）ｌ　３Ｔ３細胞；レーンＣ，ｐＬＴＮＦＬ６でトランスフェクトされたＰＡ３ １７細胞の細胞培養上清中に存在する高力価レトロウィルスＬＴＮＦＬ６クロー ン８によりトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。

図８は、ＴＮＦ　レトロウィルスＬＴＮＦＬ６で感染された３５Ｓシスティン標 識ヒト黒色腫細胞の免疫沈澱分析を示す。レーンＡ、ＬＴＮＦＬ６でトランスフ ェクトされたＰＡ３１７細胞；レーンＢおよびＣ１それぞれ未感染のＮ１）ｌ　 ３Ｔ３細胞およびｐＬＴＮＦＬ６ウイルスにより感染されたＮＩＨ３Ｔ３細胞； レーンＤおよびＥ、それぞれ未感染のヒト黒色腫細胞およびｐＬＴＮＦＬ６ウイ ルスにより感染されたヒト黒色腫細胞。

図９は、ｐＬＴＮＦＬ６ウイルスにより感染されたＩＩｌ蕩浸潤リンパ球（ＴＩ Ｌ）のＰＣＲ分析を示す。レーンＡ、未感染のＴＩＬ　、レーンＢおよびＣ，感 染されたヒトＴＴＬ　、レーンＤ、　ｐＬＴＮＦＬ６によりトランスフェクトさ れたＰＡ３１７　；レーンＥ、ＦおよびＧ、それの１：１０．１：１００および １　：　１０００希釈物。

図１０は、優性選択可能な矛オマイシン耐性マーカーおよびＴＮＦをコードする ２遺伝子怒染性ドラッグデリバリ−レトロウィルスの作製方法を示す。

図１１のパネルＡは２６ｋＤ　ＴＮＦをコードするｃＤＮ＾配列の制限地図を示 し、パネルＢは２６ｋＤ　ＴＮＦのヒトロバシープロットをｊし、そしてパネル Ｃは該分子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配ダを示す。

図１２は、２６ｋＤ　ＴＮＦをコードするｃＤＮＡ配列の制限地図、お」び様々 な変異タンパクｆ（ミューティン）を生産するために削除された該分子の領域を 示す。

表Ｉは種々のＴＮＦ　Ｗｉ成物の細胞毒性活性を示す。

本明細書で使用する時、「ドラッグデリバリ−ウィルス粒子」とは、ゲノムが１ または複数の「活性成分」タンパク質コード配列に作用可能に連結されたレトロ ウィルス核酸由来の調節配列を含むＲＩＩＩＡである、変更されたレトロウィル スについて言う。該ゲノムは、処理しようとする被検体と適合性であって且つ被 検体中に含まれたゲノムにより「感染」を引き起こすことができるタンパク質エ ンベロープ中にパンケージングされる。この場合の感染は、細胞中への所望のＲ ＮＡの進入およびタンパク質の生産にのみ及ぶ。追加の感染性ウィルスは全く生 産されない。

「高力価ドラッグプリハリ−ウィルス粒子」または「高力価レトロウィルス」と は、少なくとも１０’〜１０’　ｃｆｕ／１ｉｄｌの力価におけるレトロウィル スの生産を可能にする当業界において既知のベクターを言う。この種のウィルス の例は、Ｂｅｎｄｅｒら、前掲中に示されている。

示　「行き止まり」感染は、ウィルスエンベロープが細胞を中り１　への変更ウ ィルスの進入を促進し、そして含まれたゲノムが発現されるが、新規ウィルス粒 子は生産されないような変更よ　された感染形態を言う。

：こ　「調節配列Ｊとは、所望の活性タンパク質に作用可能に連結されたコード 配列の発現による所望の活性タンパク質成分の生産に必要且つ十分である、例え ばプロモーターおよびしばしばエンハンサ−を含む核酸配列を言う。

本発明のドラッグデリバリ−レトロウィルスの場合、Ｉ？ＮＡゲノムおよびその プロウィルス相当物もψパッケージング部ｙ　位を含む。

【　本明細１中で使用するｒｍ瘍壊死因子ｊまたはｒＴＮＦ　Ｊと（は、この既 知の哺乳類サイトカインの生来形と組換え形の両方について言う。ＴＨＦは文献 中で「力ヶクチン」およびＥ　’ＴＮＦ−ａ　Ｊといった他の名称によって言及 されている。「組１　換えＴＮＦ　Ｊまたはｒ　ｒＴＮＦ　」とは、生来のＴＮ Ｆ同一のまたは実質的に同一のアミノ酸配列を有する組換えＤＩＪＡ　（または その）　部分）の発現により生産され、そしてＴＮＦの試験管内および生体内生 物活性を保持しているタンパク質（ミューティンを含む）をＳう。生来のおよび ＆ｌＩ換え哺乳ＩＩＴＮＦ　（ヒトＴＮＦを［含む）の単離および生産は、当業 界において既知である。例えば、Ｃａｒｓｗｅｌｌら、１９７５＋　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２：３６６６−３６７０　 ；　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ［ＪＳＡ　、　８０：５３９７−５４０１　；　Ｗａｎｇ　ら、１９ ８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２鉦１４９−１５４　；　Ｂｅｕｔｌｅｒ　ら、１９ ８５．　Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、、　皿９８４；　Ｂｅｕｔｌｅｒら、１９８ ５．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：８６９　；　Ｂｅｕｔｌｅｒ　ら、１９８５． 　Ｎａｔｕｒｅ。

３１監５５２　；　Ｐｅｎｎ１ｃｉａら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ、　皿７２ ４　；　ＡｇｇａｒｗａＩら、１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　 匠２３４５を参照のこと。

ＴＮＦに関しては、「プロホルモン」および「成熱ホルモン」なる用語は次の意 味を有する。プロホルモンは２６ｋＤ分子について言及し、一方成熟ホルモンは ７６アミノ酸リーダー配列の除去から生じる１７ｋＤ分子について言う。プロホ ルモンは膜結合型であり自由に循環しないことが知られているが、成熟ホルモン は膜結合せず、自由に循環する。ＴＮＦの定義に含まれるのは、プロホルモンと 成熟ホルモン形、更には７６アミノ酸リーダー配列が除去されておりそして成熟 ホルモンの分泌を促進する別のリーダー配列により置き換えられている別の形態 のＴＮＦである。多数のリーダー配列がこの機能を行うだろうが、Ｇｒａｙ、　 Ｐ、ら、１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５：５０３により記載されたＴイン ターフェロンリーダー配列が好ましい。

「核酸配列」は、時々、ＤＮＡとｌ？ＮＡ断片の両方を包含する総称的用語とし て本明細書で使われるだろう。本発明の物質がレトロウィルスゲノムおよびそれ らのプロウィルス相当物、特に機能的配列は、ＲＮＡとＤＮＡ形の両方で存在す るだろう。

対応する遺伝子座は、ＤＮＡとＲＮＡの両方におけるそれらの存在について交換 できるように言及される。というのは、通常の感染過程ではそのような機能が実 際に交換できると理解されるであろうからである。例えば、ψパンケージング部 位は明らかにパンケージングしようとするＲＮＡゲノムにおいて作用可能である 。しかしながら、対応する配列はプロウィルスＤＮＡ　中に存在する。同様に、 プロモーター、エンハンサ−およびターミネータ−配列も、僅かに異なる形態で あるが、ゲノムＩ？ＮＡおよびプロウィルスＤＮＡの両方に存在する。ウィルス 生活環の様々なファージ中でのそれらの機能の相互交換性は当業者により理解さ れており、従ってむしろＤＮＡおよびＲＮＡ状態に関してはそれらを言及するの に厳宙でない用語法がしばしば使用される。

本発明の医薬組成物は、ψヘルパープロウィルスにより形質転換されているトラ ンスフェクトされた中間細胞により生産されるドラングデリバリーウィルス粒子 を含み、従って空のエンベロープを生産する。この組成物の調製において使われ るそれらの細胞を言及する際の囚易化のため、それらの細胞を「パフケージング 」細胞と呼称する。

得られたデリバリ−ウィルス粒子は、試験管内において野生型細胞を感染せしめ るのに使用することもでき、例えば、標的宿主中での所望のタンパク質の生産を 引き起こすことができる能力のモデルとして使用することができる。それらの感 染細胞は本明細書中では「テスター」細胞と呼称される。

Ｂ・二股煎Ｅ藍 本発明の組成物の調製における重大な中間体は、投与しようとするタンパク質薬 剤のコード配列を含むプロウィルスＤＮＡベクターである。好ましい態様のタン パク譬薬剤は、腫瘍細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性であるもの、好 ましくは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ま たは効果的な化学療法において使用できる薬剤、例えば多剤耐性タンパク質であ る。そのような活性タンパク質成分をコードするＤＮＡは、任意の便利な源から 得ることができ、そして選択されるタンパク質に応じて、化学的に合成するか、 ｃＤＮＡライブラリーから回収するか、ゲノムＤＮＡから単離するか、または当 業界で既知の手段により他の方法で得ることができる。

本発明の方法に従って投与することができるタンパク質は、処置しようとする被 検体中の感染細胞に対して所望の効果を有する任意のタンパク質を包含する。本 発明のドラッグデリバリ−システムの利点は、特にタンパク質が標的細胞の細胞 質中で作用する時に体験される。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は腫瘍細胞を 選択的に殺すことができるが、その効果を発揮するのに細胞膜を通過する必要が ある。他のタンパク質、例えばりホトキシンおよび種々のコロニー刺激因子もま た細胞内で作用する。

２つの遺伝子を発現するように作製されたレトロウィルスベクターが予防的また は治療的価値を有する２つのタンパク質を含むか、または１遺伝子が２つの遺伝 子構成物によりトランスフェクトされた細胞の同定を促進するであろう優性選択 可能マーカーを発現できることが適当であろう。適当なマーカーの例は、ネオマ イシン遺伝子配列の存在により細胞に付与されるＧ４１８に対する耐性であろう 。

本発明のシステムは、その機能が標的細胞の外側で行われるか、または細胞表面 上のレセプターへの結合により機能する物質に適用できる。しかしながら、この 場合には、ドラッグデリバリ−ウィルス粒子は、ドラッグデリバリ−ウィルス粒 子より感染されたテスター細胞またはトランスフェクトされたパッケージング細 胞の移植片として間接的に投与される。

例えば、それ自身血流中で血液中の可溶性酵素に対して直接に作用する組織プラ スミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼを、それらの移植細胞によりその場 で生産することができる。

外来タンパク質をコードするＤＮＡは当業界において入手可能であり、そして所 望であれば便利な操作のためにリンカ−配列とひとまとめにして得ることができ る。該デリバリ−システムの性質は、プロウィルスによりトランスフェクトされ た環境中ではイントロンがプロセシングされ得るので、ゲノム配列とｃＤＮＡ配 列の両方を使用できるようなものである。タンパク質薬剤は、所望するタンパク 質の任意の形態、例えば活性形、成熟形、融合タンパク質、プレタンパク質また はプレプロタンパク質を指定するようにデリバリ−ウィルス粒子中でコードされ 得る。下記に示す実施例では、ＴＮＦ、　ＩＬ−２またはＭＤＲタンパク質をコ ードするｃＤＮＡクローンがコード配列の源として使用される。しかしながら、 これは例示的にすぎず、他の任意の所望のコード配列も使用することができる。

更に、上記分子のうちの１つが６４１８耐性といった選択可能マーカーと共に発 現される２遺伝子ウイルスを作製することができる。

ウィルス伝達ヘクターは、レトロウィルス、例えば常用されるマウス肉腫ウィル ス（ＭＳＶ）　、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬν）、ハーベイ肉腫 ウィルス（ＨａＳＶ）または種々の他のレトロウィルスの適当なプロウィルス形 の単離によって得られる。幾つかの標的細胞／組織については、それらが感染状 態になるのに高力価のレトロウィルスを要求することが知られている。そのよう な場合、好ましいレトロウィルスはｇａｇ配列を含むもの、いわゆるｇａｇ＋ベ クターである。そのようなベクターの例は、Ｂｅｎｄｅｒら、前掲；および旧１ １ｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　−−−−ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ　、１２２頁、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（ＧｌｕｚｍａｎおよびＨｕｇｈｅｓＷ 、　１９８８）により記載されたものである。ウィルス粒子自体に関連づけられ るタンパク質が構成物中に欠失しているので、ヒトにおいて病気を引き起こす感 染性レトロウィルス、例えば肝炎ウィルス、１（ＴＬＶ　ＩおよびＬＡＶ　Ｉに 由来する成分でも使うことができる。しかし、もちろん、処置しようとする被検 体の中で心理的抵抗の可能性があるそのような物質を使用することは必要でない 。更に、感染性宿主範囲は、組換えプロウィルスまたはパッケージング中型細胞 形のいずれかに外来ウィルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子（即ち、狂犬病、 ｖＳｖ等）を導入することにより変えることができる。

選択されたレトロウィルスのプロウィルス形は、該ウィルスを組織培養において 増殖させ、プロウィルスＤＮＡを単離し、このプロウィルスＤＮＡをλフアージ クローニングベクター中にクローニングし、そしてファージが組み込まれる感受 性細石宿主中で組換えベクターを増殖させることにより得られる。

プロウィルスＤＮＡを切り出し、再単離する。次いでプロウィルスＤＮＡに適当 なリンカ−を提供し、そして増幅のため細菌クローニングベクターに挿入する。

適当な細菌クローニングベクターとしては、ｐＢＲ３２２，ｐＭＬまたはｐＵｃ 　シリーズのベクターが挙げられる。それらは、制限部位を削除または変更する などのために修飾することが必要なことがある。クローニングベクターを制限し 、次いでリンカ−により組み立てられたプロウィルスＤＮＡの挿入断片を提供す る。

生来のプロウィルスＤＮＡ挿入断片は、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌｒ ｅｐｅａ　ｔ）配列により隣接されたウィルスタンパク質コード配列を含み、該 ＬＴＲの一方の近位にパンケージング部位を含む。

パンケージング部位と他方のＬＴＲとの間のタンパク質コード配列を適当な制限 および／またはエンドヌクレアーゼ消化により削除し、そしてリンカ−またはポ リリンカー配列により置き換える。適当な部位が既に介在領域中に入手可能であ ってもよく、または入手できない場合には、当業者で公知であるような部位特異 的突然変異誘発を使って得ることができる。

増幅後、変更プロウィルスを含むベクターを適当な制限酵素で開裂せしめ、所望 のコード配列の挿入のために該ベクターを開環させる。パッケージング部位以外 の調節配列はＬＴＲ中に存在するので、リンカ−中への所望のタンパク質薬剤コ ード配列の挿入は、それを該調節により作用可能な連鎖中に１く。得られた変更 ウィルス粒子はウィルスタンパク質の代わりに所望のタンパク質の発現系になる が、この変更ウィルスゲノムを感染性であるようにするパンケージング部位をま だ保持している。

それらのドラッグデリバリ−プロウィルスＤＮＡを公知技術により増幅し、単離 し、ψパッケージング細胞にトランスフェクト用ＤＮＡの源を提供する。

所望であれば、変更ウィルス粒子、高または低力価ウィルス粒子中の挿入コード 配列は、マーカー配列を更に含むことができる。２遺伝子レトロウイルスベクタ ーを使用する場合、ｌ遺伝子はネオマイシン耐性をコードし、従ってＧ４１８に 対する耐性を付与することができる。挿入配列の発現に有意な減少が観察される 場合、適当なマーカー、最も適切にはＧ４１８耐性マーカーを含むベクターによ る形質転換と同時にψパッケージング細胞のトランスフェクションを行うことが できる。

もちろん、任意の適当なマーカーを使うことができ、そのようなマーカーとして は、例えば、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するＥｃｏ　ｇｐｔおよびメ トトレキセート耐性を付与するＤＦＩＦＲが挙げられる。

変更プロウィルス粒子は、必要ならマーカープラスミドと一緒に、標準的トラン スフェクション技術、例えばリン酸カルシウム沈澱を使って、受容体パンケージ ング細胞中にトランスフェクトされる。形質転換体はそれらの特定細胞種に適当 な培養において増殖される。下記に例示されるψ−３Ｔ３細胞は、野生型３Ｔ３ 細胞に通常使われる条件下で培養される。もちろん、好結果の形質転換体を選択 するために培地に選択的成分、例えば６４１８を含めてもよい。

適宜培地または細胞溶解物中のタンパク質濃度を評価することにより、トランス フェクトされたパッケージング細胞が変更ウィルス粒子中の挿入コード断片によ りコードされるタンパク質を好結果に生産することを示すことができる。

パフケージングされた組換えウィルス粒子を得るために、パンケージング細胞か らの上清を、例えば０．４５μｍフィルターを使って、細胞から分離する。例え ばウィルス粒子を収穫するための高速遠心によって濾液からウィルスが得られ、 または濾液それ自体が使われる。濃縮されたウィルス粒子または濾液を医薬組成 物として製剤化する。

更に、ウィルス粒子調製物は、空のウィルス夾膜を全く生産しないテスター細胞 系、例えばパッケージング細胞の野生型相当物、またはウィルスによる感染に対 して、好ましくは組換えウィルス粒子により生産されるタンパク質に対しても怒 受性である任意の細胞系を使うことにより、標的細胞へのドラッグデリバリ−を 成し遂げる適確性について評価することができる。このテスター細胞により生産 される所望のタンパク質の量を評価することができ、そして適当な細胞の場合に は、この評価は細胞に対する該タンパク質の直接効果によることができる。

パッケージング細胞とテスター細胞の両方を、タンパク質薬剤の源をその場で提 供する移植片として使用することもできる。

ＬＴＲがプロモーターとエンハンサ−を包含するレトロウィルスの転写調節要素 のほとんどを含むことに注目することが重要である。よって、挿入されたタンパ ク質薬剤ＤＮＡ配列がウィルス調節要素の支配下で転写され得るが、ウィルス調 節要素が特定のタンパク質薬剤の転写を調節するプロモーター／エンハンサ−に より置き換えられているウィルスベクターも本発明に包含するつもりである。

薬剤をコードするＤＮＡ配列がそれらの通常の調節要素の支配下にある種々のタ ンパク質薬剤の発現を得るための少なくとも２つの基本的アプローチが存在する 。

第一のアプローチは、レトロウィルスの３ルトロウイルスＬＴＲ中のプロモータ ー、エンハンサ−およびプロモーター、またはエンハンサ−を、異種ウィルスま たは細胞の遺伝子由来のプロモーター、エンハンサ−およびプロモーター、また はエンハンサ−と置換することを伴う。トランスフェクションすると、そのよう なプロウィルスは野生型レトロウィルスＬＴＲから自分自身を発現するだろう。

レトロウィルス生活環の性質によるウィルス救援後、３　’　ＬＴＲ中の異種発 現要素の置換は新たに組み込まれたプロウィルスの５　’　ＬＴＲにおいて不滅 化されるようになる。よって岨換えレトロウィルス中に挿入された外因性遺伝子 の発現は、組換えプロウィルスの３′ＬＴＲ中に独創的に存する異種発現要素か ら誘導される。

第二のアプローチは、制限エンドヌクレアーゼ消化によるかまたは部位特異的突 然変異誘発の通用を通した、３　’　ＬＴＲ中に存するエンハンサ−とプロモー ターまたは単にプロモーターの削除を伴う。そのようなベクターが感染性レトロ ウィルスとして救援される時、得られた感染性プロウィルスは５′と３　’　Ｌ ＴＲの両方の中の発現要素を欠く。この場合、発現不全は、組換えプロウィルス のＬＴＲＯ間の、発現させようとする遺伝子のすぐ５′側への、外因性プロモー ター、またはプロモーター／エンハンサ−組合せ、またはプロモーター／エンハ ンサ−組合せ十追加のシス作用性要素（例えばＨＴＶＬ−１のＵ５要素）の挿入 により補完される。それらの状況下では、感染および遺伝子伝達後、伝達された 遺伝子は新たに近位のプロモーターにより課される制御調節を受ける。ＬＴＲ中 の発現要素の欠失は、ＬＴＲプロモーターからの妨害が全くないことを保証する 。

上記のアプローチを使って、対応するタンパク質の転写を指図する、ＩＬ−２プ ロモーターまたはＩＬ−２レセプタープロモーターといった様々なプロモーター を有するレトロウィルスを生産することができる。

Ｃ１苅月］目ＪＬｌ与 本発明のドラッグデリバリ−システムは、それらがタンパク質薬剤の効果を及ぼ すことができる細胞中にタンパク質薬剤を伝達することの最終結果において効果 的である。伝達はウィルス感染によって起こるため、単にドラッグデリバリ−ウ ィルス粒子を標的細胞と並置することが必要であるに過ぎない。標的細胞が、例 えば固形腫瘍中に局在化する場合には、本発明の組成物を直接固形腫瘍中に注入 することができる。

しかし、白血病のように細胞が広く分散している場合または例えば赤血球細胞も しくは骨髄細胞を標的しようとする場合、全身的外注が要求される。

あるいは、細胞を試験管内で感染させ、そしてタンパク質薬剤を発現する宿主生 物体に感染細胞を戻すことにより、薬剤をデリバリ−することができる。この方 法は、骨髄細胞および皮膚繊維芽細胞といった特定のタイプの細胞を必要とする 遺伝子療法に特に有用である。

本明細書に記載のドラッグデリバリ−システムの注目に値する適用は、腫瘍浸潤 リンパ球、またはタンパク質薬剤を腫瘍細胞に運搬するビヒクルとして作用する 他の機能的に類似した細胞タイプの感染を伴うだろう。好ましくは、タンパク譬 薬剤はＩＬ−２またはＴＮＦである。膜結合型であり且つ細胞毒性であるＴＮＦ のミューティンが最も好ましい。例えば、下記に記載されるように、プロホルモ ンのＴＮＦ欠失ミューティンＴＮＦΔ（１→１２）およびＴＮＦΔ（１＋１２） は経膜タンパク質であり、よって細胞表面に堅固に付着される。両方とも細胞毒 性でる。該ミューティンのいずれかを腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中に発現させ ることができる。選択される細胞がＴＩＬである場合、それらの内因性腫瘍細胞 毒性活性に加えてＴＮＦ　ミューティンに起因する細胞毒性のため、それらは高 度に細胞毒性であろう。この方式において使用すると、ＴＮＦ　ミューティンΔ （１→１２）に関連する追加の利点は、それが膜結合型でありそして細胞外環境 中に放出されないため、非特異的な細胞毒性がほとんどまたは全くないというこ とであると認識されよう。同様な利点がΔ（１＋　１２）　ミューティンに関係 づけられる。

該ミューティンから約１７ｋＤの分子が遊離されるけれども、それは非細胞毒性 である。

ウィルス粒子は、当業界において既知であるようにして、等張食塩溶液または他 の適当な医薬賦形剤中への懸濁により、薬剤の投与に適当な典型的方法での注射 のために調製される。

パッケージング細胞またはテスター細胞の移植は、それらを適当な適合性製剤、 例えば生理的食塩水中に製剤化し、そしてそれらを所望の場所に注入することに より行われる。該細胞は、封入技術を使って製剤化することもできる。（例えば 、米国特許第４，３９１．９０９号を参照のこと）。

Ｄ、盗準迭 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適当な標準的技術を使って形質 転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）（１９７２）　６９：２１１０ により記載された塩化カルシウムを使ったカルシウム処理、またはＭａｎｉａｔ ｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｎｕａｌ　（１９８２）　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、 　ｐ、２５４に記載のＰｄＣｌ２法は、原核細胞または実質的な細胞壁を含む他 の細胞に使用する。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞には、Ｇｒａｈａｒ ｇおよびＶａｎ　ｄｅｒＥｂ、■ｒｏｌｏ■、　１９７８．５２：５４６のリン 酸カルシウム沈澱法が好ましい。

所望のコード配列および調節配列を含む適当なベクターの作製は、当業界で公知 である標準的連結および制限技術を使用する。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列 または合成オリゴヌクレオチドを所望の形で開裂し、操作し、そして再連結する 。

部位特異的突然変異誘発は、当業界において一般に知られている条件下で１また は複数の適当な制限酵素で処理することによって行われ、その詳細はそれらの市 販の制限酵素の製造業者により指定されている。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの商品カタログを参照のこと。一般に、約１μｇのプラスミ ドまたはＤＮＡ配列を約２０μ２の緩衝液中で１単位の酵素により開裂させる。

本明細書中の実施例では、典型的には、ＤＮＡ配列の完全消化を保証するために 過剰の制限酵素を使用する。

３７°Ｃで約１時間〜２時間のインキュベーション時間が実行可能であるが、変 更を行うことができる。各インキュベーション後、フェノール／クロロホルム抽 出によりタンパク質を除去し、この後エーテル抽出してもよく、そしてエタノー ル沈澱により水性画分から核酸を回収し、そして１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｗＭ ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５中に再懸濁する。所望であれば、標準技術を使ったポリ アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により開裂断片のサイズ分離 を行うこともできる。サイズ分離の一般的記載はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ 　ｌ１ｏｌｏ　、　１９８０，６５：４９９−５６０中に見つかる。

制限開裂断片は、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ＤＮＡポリメラーシーの大断片（フレノウ断片 ）での処理により、２０〜２５°Ｃにおいて約１５〜２５分間のインキュベーシ ョン時間を使って５０ｍＭＴｒｉｓ。

ｐＨ７，６，５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　６＋＋＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、　６ｍＭ　ＤＴ Ｔおよび５〜１０ＩＭｄＮＴＰ中で平滑末端にすることができる。フレノウ断片 は５′粘着末端をフィルインするが、４種のｄＮＴＰが存在しても３′−末鎖を 後ろに突き出す。所望であれば、粘着末端の性質により要求される限定内でｄＮ ＴＰのうちの１つまたは選択したｄＮＴＰのみを供給することにより、選択的修 復を行うことができる。フレノウでの処理後、混合物をフェノール／クロロホル ムで抽出し、そしてエタノール沈澱後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラ ムに流す。適当な条件下での８１ヌクレアーゼ処理は、任意の一本鎖部分の加水 分解をもたらす。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ら、１９８１．　Ｊ、　Ａｒ ＠。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１０３：３１８５のトリエステル法により、または市販 の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使って調製される。

アニーリング前のまたは標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、過剰の、例えば ０．１ナノモルの基質に対して約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを使って 、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，６＋１０１１＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、　５ｍＭジ チオトレイトール、　１〜２ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ、　１．７ピコモルのＴ３Ｚｐ−八 ＴＰ　（２，９ｍＣ１／ミリモル）＋　０．１ｍＭスペルミジン。

０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で達成される。

連結は、次のの標準条件および温度のもとて１５〜３０λ容量で行われる：　２ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　５ａ＋Ｍ　 ＤＴＴ。

３３ｔｔｇ／１ｔｔｉのＢＳＡ、　１０ｍＭ　〜５０＠Ｍ　ＮａＣ１，および４ ０ｕＭ　ＡＴＰ、　０．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｉ）単位のＴ４　ＤＮＡリガ ーゼ、４℃（「粘着末端」連結について）または１ｍＭ　ＡＴＰ、　０．３〜０ ．６（Ｗｅｉｉ）単位のＴ４ＤＮＡ　リガーゼ、１４°Ｃ（ｒ平滑末端」連結に ついて）のいずれかである。分子間「粘着末端」連結は、通常３３〜１００μｇ ／ｄの全ＤＮＡ　ｉｌ１度（５〜ｌｏｏｎＭの全末端濃度）において行われる。

分子間平滑末端連結（通常は１０〜３０倍モル過剰のリンカ−を使用する）は１ μ員の全末端濃度において行われる。

「ベクター断片」を使うベクター作製では、５′リン酸を除去しそしてベクター の再連結を防ぐために普通はベクター断片を細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡ Ｐ）で処理する　ＢＡＰ消化は、ｐＨ８において約１５Ｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ中で Ｎａ”とＭｇ”の存在下で、ベクター１μｇあたり約１単位のＢＡＰを使って６ ０°Ｃにて約１時間行う。核酸断片を回収するため、調製物をフェノール／クロ ロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、そして５ａｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピ ンカラムへの通用により脱塩する。あるいは、所望でない断片の追加の制限酵素 消化によって二重消化されているベクターにおいて再連結を防ぐことができる。

配列の変更を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分につ いては、部位特異的プライマー指令突然変異誘発が使用される。これは、所望の 変異を表す限定された不整合以外は突然変異誘発せしめようとする一本鎖ファー ジＤＮＡに相補的な合成プライマーオリゴヌクレオチドを使って行われる。簡単 に言えば、合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の合成を指令する プライマーとして使用し、そして得られた二本＠ＤＮＡを用いて、ファージを含 む宿主細菌を形質転換せしめる。形質転換された細菌の培養物を表面寒天プレー トに塗布し、ファージを含む単一細胞からプラーク形成させる。

理論的には、新規プラークの５０％が、一本領の変異形としてファージを含み、 ５０％が元の配列を有するだろう。得られたプラークを、正確な整合のハイブリ ダイゼーションを可能にするが元の鎖との不整合がハイブリダイゼーションを妨 害するのに充分であるような温度において、リン酸化された合成プライマーとハ イブリダイズせしめる。プローブとハイブリダイズするプラークを選択し、培養 し、そしてＤＮＡを回収する。部位特異的突然変異方法の詳細は、特定の実施例 において後述される。

更に詳しくは、突然変異誘発は、当業界で既知の多数の方法を使って行うことが できる。それらの技術はＳｍ１ｔｈ、　１９８５゜Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ 　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、旦：４２３に記載されており、そして該技術の幾つ かの変形がル牡勧旦ｓ　ｉｎ旦１１リセ」Ｌエ　匪パートＥ、ＷｕおよびＧｒｏ ｓｓｒａａｎｋＪＡ　（１９８７）　、　１７．１８．１９および２０章に記載 されている。好ましい方法は、ギャップ含有二本鎖部位特異的突然変異誘発法の 変形である。一般的方法はＫｒａｍｅｒら、上記のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚ　ｍｏｌｏ　の１７章に記載されている。

常用のＭ１３突然変異変異性は、突然変異させようとするクローニングされた標 的コード配列を有する一零ＭＭｉ３Ｉ］ＮＡに、短い合成オリゴヌクレオチドを アニーリングすることを伴う。

オリゴヌクレオチドは標的細胞に完全ではないがほとんど相補的であり、少な（ とも１つの誤対合ヌクレオチドを含む。

アニーリング反応後、一本領ＤＮＡの残りの部分をフィルインし、変異の発現に 備えて適当な宿主細胞中にトランスフェクトできるヘテロ二本鎖ＯＮへを提供し なければならない。ギャップ含有二本鎖法では、標的領域と一本鎖ＤＮＡ　ＯＮ Ａの残部が暴露されている従来法とは異なり、標的領域のみが暴露されている部 分ＤＮ八へ本鎖が作製される。従来法と同様に、短いオリゴヌクレオチドを標的 領域にアニールし、伸長し、そして連結せしめてヘテロ二本鎖を生成する。しか しながら、ギヤ、ブ含有二末鎖法では一本鎖ＤＮＡの小部分のみがハイブリダイ ゼーションに利用できるので、オリゴヌクレオチドはＭ１３ゲノム中の望ましく ない部位にはアニールしない。更にこの方法は、標的領域の片側のＤＮＡのごく 小さい領域のみをフィルインすればよいので、ヘテロ二本鎖の形成中にほとんど 誤りを導入しないという追加の利点を有する。

更に詳しくは、ギヤツブ含有二重錆性は、例えば終止コドンアンバー変異といっ た適当な選択可能マーカーを担持する適当なＭ１３ファージ中に標的ＤＮ＾配列 をクローニングすることを伴う。終止コドンアンバー変異は、該変異の作用を抑 制することができない宿主細胞中での陰性選択に備える。好ましくは、該ファー ジは、重大なファージ遺伝子中に２つのアンバーコドンを含むＭｌ：３ｗｐ９で ある。２６ｋＤ　ＴＮＦをコードする配列をＭ１３ｍｐ９アンバー十中にクロｍ ；ングし、そして標準法を使ってそこから一本！ＮＤＮＡを調製する。次に、ア ンバーコドンを欠く遺伝子操作された阿１３誘導体であるＭｌ３　ＧＡＰからの 二本鎖複製可能形ＤＮＡを旧ｎｃＩＩ制限酵素で開裂させる。１１３ＧＡＰの塩 基配列はＭ１３ａ＋ρ１８に類似しているが、塩基対６１７２と６３２３の間の 配列およびアンバーコドンの両方を欠く。この欠失はＭ１３ｍｐシリーズの多重 クローニング部位に隣接し、ユニーク）ｌｉｎｅＩ！部位を生成する。ギャップ 含有二本鎖ＤＮＡは、標準的ＤＮＡ／ＤＮＡハイプリダイゼーシゴン技術を使っ て形成され、そしてアンバーコドンを有する一本１ｊＤＮＡおよびアンバーコド ンとＴＮＦコード配列の両方を欠（ＨｉｎｃＩ［消化Ｍ１３　ＧＡＰからの第二 鎖ＤＮＡから成る。暴露されるギヤノブ含有二本鎖の部分のみが２６ｋＤ　ＴＮ Ｆ標的配列である。所望のオリゴヌクレオチドをギャップ含有二本鎖ＤＮＡにア ニールさせ、そして残ったギヤツブをＤＮ八へリメラーゼでフィルインし、ＤＮ Ａ　リガーゼを使ってニックを塞いでヘテロ二本鎖を生ぜしめる。このヘテロ二 本鎖を好ましくは誤対合修復不全宿主中にトランスフェクトし、そして混合ファ 一ジを生産させる。当業界で公知のようにして、プラスミドの作製方式に依存し て、アンピシリン、テトラサイタリンもしくは他の抗生物質耐性によりまたは他 のマーカーを使って、好結果の形質転換体を選択する。

次いで所望によりクロラムフェニコール増幅（Ｃ１ｅｔｖｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、。

１９７２、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１１０：６６７）の後に、Ｃｌｅ ｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、ら、１９６９、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　６９：１１５９の方法に従って、形質転換体からプラ スミドを調製する。単離したＤＮＡは、Ｆｌｅｓｓｉｎｇら、１９８１．　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、＋　９：３０９により更に記載されている ようなＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７４：５４６３のジデオキシ法により、 またはＭａＸａｌｌ　ら、１９８０．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｔｘｏ ｌｏ　、６５：４９９の方法により、制限分析および／または配列決定される。

本明細書中でクローニングおよび発現に使われる宿主株は次のものである。

クローニングおよび配列決定には、大腸菌８８１０１株を宿主として使用した。

Ｍ１３ファージ組換えには、ファージ感染を受けやすい大腸菌株、例えば大腸菌 に１２　ＤＧ９８株を使用する。　ＤＧ９８株は１９８４年７月１３日にＡＴＣ Ｃに寄託されており、受託番号１９６５を有する。

Ｅ、Ｘｉ！ＬｆＭ 次の実施例は本発明の例示としてここに提供され、本発明を限定するものと解釈 してはならない。

実施勇士 ＴＮＦ”−プロウィルス１　の１０１１ヒトＴＮＦのコード配列は、１９８７年 ６月３０日発行の米国特許第４．６７７、０６３号（これは参考として本明細書 中に組み込まれる）に詳細に記載されたｃＤＮＡクローンであるクローンｐ８１ １カら得た。それは米国特許第４，６７７．０６３号に示されたクローンｐＢ１ １から誘導することもできる。このクローンはまた、１９８４年１０月１５日に ＡＴＣＣにＡＴＣＣ１３９８８４のもとに寄託されている。

同じく上記刊行物に記載されておりそして１９８４年１１月８日にＡＴＣＣ１＋ ３９８８で寄託されているプラスミドｐＡＷ７１１も、ＴＮＦの源として使用す ることができる。

パンケージング部位と共にプロウィルス形のレトロウィルス調節配列を含むベク ターは、ｐＥＶＸの誘導体である。ｐＥＶＸは、ｐＭＬ　（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、 　Ｍ、ら、１９８４．　Ｃｅ１ｌ、　３８：４８３−４９１）　のＥｃｏＲＩ部 位に挿入されたＭｏＭＬＶ由来のＬＴＲおよびψ部位を含む。

ｐＥＶＸのＳｗａｍ／Ｂａ１ｌセグメントを、５　’　ＬＴＲの３′部分とＨａ ＳＶゲノムの５′部分を含むハーベイ肉腫ウィルス（ＨａＳν）由来の９７８ｂ ｐ　Ｓｍａｌ／Ｓｍａｌ断片で１き換えることにより変更してスプライス部位を 削除した。得られた構成物を５ｓｔＵで完全消化しそしてＢｇｌ［Ｉで部分消化 し、必須でないＨａＳＶ領域を欠く６６９　ｂｐ断片を得た。この断片をゲル精 製し、Ｓｍａｌ／Ｂａ１Ｉ消化されたｐＥＶＸに再連結せしめた。得られたベク ターｐＦＶＸＭは、ＭｏＭＬＶ由来のＬＴＲ断片の間にポリリンカーを含み、そ してこのウィルス由来のパンケージング部位を含むが、上流ＬＴＲ中のスプライ ス供与部位を欠く。ｐＦＶＸＭはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（ＡＴＣＣ）に受託番号６７、１０３のちとに寄託されている。

ｐＦＶＸＭベクターを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ＦＩＢＩＯＩ株中で増幅し 、プラスミドＤＮＡを単離する。ｐＢｌｌを同様に大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　） Ｈ８１０１株中で増幅し、プラスミドＤＮＡとして再び単離する。

これら２つのプラスミドＤＮＡ　ｍ製物をＰｓｔｌで処理する（ｐａｉｌからＴ ＮＦコード領域を切除するため、およびｐＦＶＸＭをポリリンカー領域中で開環 させるため）。標準条件を使って断片の連結を行い、連結混合物を用いて大腸菌 ＨＢＩＯＩをＡｎ＋ｐＭに形質転換せしめた。再びプラスミドＤＮＡを単離し、 制限分析により挿入断片の正しい方向を確かめた。正しい方向のＴＮＦコード配 列を有する組換えプラスミドをｐＦＶＸＭＴＮＦと命名し、これを用いて後述の ようにして適当なパッケージング細胞をトランスフェクトせしめる。１つのその ようなベクターｐＦＶＸＭＴＮＦ６はより詳細に下記に記載される。

同様にして、例えば、ｐＦＶＸＭをＰｓｔｌで消化し、リシンＡ毒素、Ｃ３Ｆ− １およびウロキナーゼをコードするＤＮ＾配列（各々必要な時には適当なＰｓｔ ｌリンカ−が提供される）に連結することができる。更に望ましいのは、白血球 インターフェロン、およびＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｎ、Ｎ、　ヘの米国特許第４ ．６７８．７５１号に記載されたようなハイブリッドインターフェロン分子をコ ードするベクターである。特に好ましいのは、ＬｅＩＦ−ＡＤ（Ｂｇｔ）と命名 されたハイブリッドインターフェロンである。得られたベクターを、それぞれｐ ＦＶＸＭＲＡ、　ｐＦＶＸＭＣ３Ｆ、　ｐＦＶＸＭＵＫおよびｐＦＶＸＭＩＦと 命名する。リシンＡ毒素をコードするＤＮＡ配列はヨーロッパ特許出願環２３７ ．６７６号に記載されており、一方ｍＣ３Ｆおよびウロキナーゼをコードするｃ ＤＮＡ配列はそれぞれ米国特許第４、８４７．２０１号、第４．８６８．１１９ 号およびＥＰＯ９２，１８２号、並びにＪａｃｏｂｓら、１９８６．　ＤＮＡ、 ４（２）：１３９−１４６に記載されている。

ｐＦＶＸＭＴＮＦ中に存在するＴＮＦ配列は、部分的に欠失されたプロホルモン に関係する７６アミノ酸リーダー配列を育するか、または成熟形のＴＮＦを大量 生産する別のリーダー配列に置き換えることができることは認識されるだろう。

例えば、この構成物は、ｐＦＶＸＭＴＮＦからＴＮＦ　ｐｓｔｒ断片を取り出し 、そしてそれを適当なＭ１３ベクター中にサブクローニングした後、適当なオリ ゴヌクレオチドを用いて突然変異誘発せしめることにより、作製することができ る。

２６ｋＤ　ＴＮＦをコードする断片をｐＦＶＸＭＴＮＦから切り出し、Ｍ１３ｍ ｐ１９アンバー中へのサブクローニング後、γ−インターフェロンシグナルペプ チドをコードする下記のオリゴヌクレオチド（Ｃｅｔｕｓ番号ＣＰ３８３）を使 って突然変異誘発せしめた。

５°−ＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ丁ＣＴＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡ ＡＡＣＧＡ丁ＧＣＡＧＡＧＣ−丁ＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＡ丁ＡＡＣＴＴＧ 丁ＡＴＡＴＴＴＣＡ丁ＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧ−３゜γ−インター フェロンシグナルペプチドを含む変異原性構成物をＭ１３ベクターから切り出し 、ｐｌＪｃ、　ＦＶＸＭΔ旧１１と称するｐＦＶＸＭノ誘導体中ニクローニンク シ、ｐｕｃ、　ＦＶＸＭ　Δ旧ＩＩ　ＴＮＦ７ｓｉｇを作製した。後者の構成物 は受託番号６８１２１のもと（こアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン１こ寄託されており、そして更にシータス・マスター・カルチャー・コレクシ ョンに寄託され３６８８を与えられている。γ−インターフェロンシグナルペプ チドを有する成熟形のＴＮＦをコードするＤＮＡを図１に示す。１７ｋＤ分子を コードするＤＮＡの一部のみ力（描写されている。下記は１７ｋＤ　ＴＮＦに連 結したγ−インターフｐ［Ｊｃ、　ＦＶＸＭΔＨ［ＩＩは、それが５’−ＬＴＲ の上流の１１１０塩基対を欠くこと以外はｐＦＶＸＭと同じである。ｐＵＣ，Ｆ ＶＸＭΔ旧ＩＩ　ＴＮＦ７ｓｉｇによりトランスフェクトされたＮｒＨ−３Ｔ３ 細胞から得られた溶解物および上清の両方の細胞抽出物の免疫沈澱後の５ＤＳ− ＰＡＧＥは、検出可能な２６ｋＤ　ＴＮＦを全く示さないが、かなりの量の１７ ｋＤ分子を示した。

１７ｋＤまたは２６ｋＤ　ＴＮＦに加えて、それらの分子のミューティンをコー ドするレトロウィルスを作製することができる。好ましいミューティンはＴＮＦ を膜結合型の細胞毒性形態に維持するものである。より好ましくは、成熟形のＴ ＮＦ（即ち１７ｋＤＴＮＦ）の最初の１２アミノ酸を欠失しているミューティン ＴＮＦ△（ｌ→１２）、または最初と１２番目のアミノ酸を欠失しているミュー ティンＴＮＦΔ（１＋１２）である。それらの２つのミューティンとは異なり、 ＴＮＦΔ（１＋１３）は膜結合型であるが細胞毒性ではない。従って、それは下 記に与えられる幾つかの実施例において対照として使われる。アミノ酸のナンバ リングは、ｅｌｌ中に示されたＴＮＦのプロホルモン形のアミノ酸配列に対応す る。該ミューティンは、標準的な突然変異誘発技術および突然変異誘発を行うの に下記のオリゴヌクレオチドを使って生成することができる。

０４６７　Δ（ｌ→１２） ５’−ＴＡＣＡＡＣ’、へ丁ＧＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧ− ３゜ＣＰ　４７２：　５ｃｒｅｅｎｓΔ（１→１２）５−丁ＧＧＯＣＴＡＣＴＧ ＣＣＴＧＧＧ　−３゜５゛−ＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣ ｉＣＣＡＧＡＧＧ−３５’−ＴＧＡ丁ＣＴＴＧＣＣＴＣ−３゜５−丁ＡＣＡＡＣ Ａ丁ＧＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴ−３゛５’−ＧＧＣ丁ＡＣ ＣＴＴＧＴＣ−３’５−丁ＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣＡ ＣＴＣＧＧ−３’５’−ＡＴＧＧＧＣＡＧＧ　ＣＴｒ　、３゜簡単に言えば、次 の反応溶液と条件を使って上記オリゴヌクレオチドをリン酸化する：３μｌのｌ ０ＸＫＢ緩衝液、３λの１０ｍＭ　ｒＡＴＰ　（０，１Ｍ　ｒＡＴＰ原液のＩ　 ：　１０希釈液）、２λの変異原性オリゴヌクレオチド（１００ピコモル／λ） 、２１λのＨ，０および１λのポリヌクレオチドキナーゼ（１０型位／λ）。反 応を３７°Ｃで４５分間、次いで６５〜６８°Ｃで５分間行う。次に、２４λの リン酸化オリゴヌクレオチドを５６λのＨ２Ｏで希釈し、２ピコモル／λを与え る。

下記のようにしてギャップ含有二本鎖を形成させ、次いで該オリゴヌクレオチド をアニーリングさせる。次の試薬を総容量４０λにおいて混合する：８λの５　 ＸＧＤＢ　Ｉｌ衝液、０．５０ピコモルの５ｓＤＮＡ　、および０．１０ピコモ ルの旧ｎｃ［線状化Ｍ１３ＧＡＰ　Ｉ？Ｆ　ＤＮＡ、　１０λを更なる使用のた めに取り出し、残りの３゜λを１００″Ｃで３分間、６５°Ｃで５分間、次いで 室温で３０分間と順次処理し、そして反応混合物を氷上に置く。次に、１ｏλの ギャップ含有二本鎖と１ｏλの対照のギャップ不含有物質を、アガロースゲル上 での電気泳動にかけ、ギャップ含有二本鎖形成を調べる。該ゲルが第三のバンド の存在を示すと仮定すればギャップ含有二本鎖が形成されており、１６λのギャ ップ含有二本鎖反応混合物と４λの希釈されたリン酸化オリゴヌクレオチドとを 混合し、そしてこの混合物を６５°Ｃに３分間加熱し、次いで室温に２０分間冷 却することにより、リン酸化オリゴヌクレオチドを該二本鎖にアニールせしめる ことができる。

ＴＮＦΔ（１＋１２）およびＴＮＦΔ（１＋　１３）を製造するために、２つの リン酸化オリゴヌクレオチドを同一ギャップ含有二本鎖にアニールせしめた。Ｃ Ｐ　４９５．　ＣＰ　４９７およびＣＰ　４９９を上述のようにリン酸化し、た だし４ピコモル／λの濃度に希釈した。ＴＮＦΔ（１＋　１２）を製造するため には、２λのＣＰ　４９５と２λのＣＰ　４９７を１６λのギャップ含有二本鎖 に添加してアニールせしめた。ＴＮＦΔ（１＋　１３）を製造するためには、２ λのＣＰ４９５と２λのＣＰ　４９９を１６λのギャップ含有二本鎖に添加して アニールせしめた。

次の試薬を総容量４０λにおいて混合することから成る適当な伸長および連結反 応により、ヘテロ二本鎖を完成させた：１０λのギャップ含有二本鎖およびプラ イマー、４λの１０×ＰＥＬ　ｉ衝液、４λのｄＮＴＰｓ　（１０ｍＭ原液から 作った０、２５＋ａＭ溶液）、３λのＡＴＰ　（１０λの０．ＩＭ　ＡＴＰ原液 ＋１４９０λのＨＪ　＝０．６６２ｍＭ）、１７λのＨ，０，１λのフレノウ（ ５単位／λ）、およびＩλの７４１）ＮＡリガーゼ（Ｑ、６　Ｗｅｉｓｓ単位／ λ；　ｌ　ＸＰＥＬで原液を希釈）。反応を１６°Ｃで２時間行った後、１０λ の伸長／連結混合物を用いて２００　λの解凍したコンピテントＨＢ２１５４細 胞を形質転換せしめた。細胞を０°Ｃで３０分間、次いで４２°Ｃで１．５分間 維持した後、様々な容量の形質転換混合物（例えば５０λ、ＩＯλなど）をｌＯ Ｏλの）１Ｂ２１５１細胞の新鮮な一晩培養物＋３．０　λの軟寒天に塗抹した 。

プラークハイブリダイゼーション法を使って、得られたプラークをスクリーニン グした。様々なそういった方法が既知であり、好ましい方法の詳細に従う。プレ ートを二重複製ニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ　ｈａ−８５型）上にプレートを 転写し、そして０．５Ｎ　ＮａＯＨ＋１．５Ｍ　ＮａＣ１；　１．ＯＭ　ＮａＣ ＋　＋　０．５Ｍ　ＴｒｉｓＨＣＩ。

ｐＨ７，４：および２　Ｘ５ＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ　５ａｌｉｎｅ　ｃｉｔｒ ａｔｅ）で順次５分間処理することにより、ＤＮＡを濾紙に固定させる。

二重複製フィルターを、フィルター１枚あたり１０−のハイブリダイゼーション 緩衝液（５Ｘ５ＳＣ，ｐＨ７，０，５Ｘデンハルト溶液（ポリビニルピロリドン ＋フィコールおよびウシ血清アルブミン；１×各０．０２％）　、５０ｍ門リン すナトリウム緩衝液ｐＨ７，０，５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．１χＳＤＳおよび １００μｇ／ｌｄのサケ精子ＤＮＡ　）を使って５５゛Ｃで２時間プレハイブリ ダイズせしめる。

プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、所望する緊縮性に応じた条件下で 、試料を適当なリン酸化プローブ、即ち上記に示したようなリン酸化オリゴヌク レオチドをハイブリダイズせしめる。約２×１０６ｃｐＨ／ＷＩｌ全容量が使用 される。典型的な中程度の緊縮条件は、４２℃の温度と５０％ホルムアミド、１ 〜５Ｍ１／フイルターのＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液含有プローブを使 った２４〜３６時間である。より高い緊縮性には、高温および短時間が使われる 。好ましいハイブリダイゼーション条件は、５　Ｘ５ＳＣ，５Ｘデンハルト溶液 、　５０ｍ１Ｍ　ＮａＰＯ４＋ｐＨ７，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．Ｕ　ＳＯ ５および１００　ｐｇ／Ｍ１のサケ精子ＤＮＡ中で、スクリーニングを行うのに 使用するオリゴヌクレオチドの毬より１００°Ｃ下において、プローブをフィル ターにハイブリダイズせしめることから成る。次に、該フィルターを各回３０分 間室温にて２　Ｘ５ＳＣ，０，１χＳＤＳで２回洗浄し、次いでスクリーニング に使用するオリゴヌクレオチドのＴＭより５　’Ｃ下において２　Ｘ５ＳＣおよ び０．１χＳＤＳで１回洗浄し、そして風乾する。最後に、フィルターを一７６ ℃で３６時間オートラジオグラフィーにかける。オートラジオグラフィーは、着 目のミューティンを有するウィルスを含むプラークを暴露する。

二重変異体についてスクリーニングするために、１ｍのフィルターを１つのスク リーニングオリゴヌクレオチドで探査し、そして複製組のフィルター（同一プレ ートから上げたもの）を適当なスクリーニングオリゴヌクレオチドで探査した。

得られたオートラジオグラフを整列し、両方のスクリーニングオリゴヌクレオチ ドにハイブリダイズしたプラークを採取し、配列決定した。

種々のＴＮＦ　ミューティンを含む変異誘発された構成物をＭ１３ベクターから 切り出し、そして怒染性レトロウィルスを生産する幾つかの可能なベクターのう ちの１つにクローニングした。典型的なベクターとしては、ｐＦＶＸＭ、　ｐＵ ＣＦＶＸＭΔ旧ＩＩ。

高力価レトロウィルスベクター、好ましくは実施例５に記載のｐＬＮＬ６　、ま たは２遺伝子レトロウイルスを生じるベクター、好ましくは実施例７に記載のｐ ＬＮｓＸ、　ｐＬＸＳＮおよびｐｔ、Ｎｃｘが挙げられる。最後の３つのベクタ ーは全てネオマイシン耐性配列を担持している。

尖旌斑至 ＴＮＦをコードするドラッグプリハリ−レトロウィルス、　の 実施例１に記載のようにして調製したｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ　（１０μｇ）を、抗 生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するマーカー配列を含む１ＭｇのｐｓＶ２− ＮＥＯ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、　１９８２．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　Ｉ。

７２５のリン酸カルシウム法の変形を使ってトランスフェクションを行った。簡 単に言えば、無菌の１ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐ）ｌ　ｓ、ＬＯ，１ｚＭ　ＥＤＴＡ で希釈したｌｏｔｌｇの担体ＤＮＡを、５０〜１，０００　ｎｇ／１００　ｍペ トリ皿のプラスミドＤＮＡと一緒に１００閣ペトリ皿に添加し、次いで２．５Ｍ 　ＣａＣ１ｚを添加した。この混合物を徹底的に攪拌して均質混合物にし、そし て同容量の２　ＸＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′− ２−エタンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ７，１を添加した。この混合物も攪拌して 均質混合物にし、その後沈澱を形成させておいた。３０分後、ｌｄの該懸濁液を 、１０％ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭ　１０ｉの入った１００　ａａベト リ皿中のｐｓｉ　ＡＭ細胞に添加した。培養物を３７°Ｃで１６時間インキュベ ートし、次いで培地を新鮮な増殖培地で置き換えた。次に、増殖培地を、Ｇｉｂ ｃｏから入手したＧ４１８４００μｇ／、ｄが補足された新鮮な増殖培地で再び 置き換えた。最初の増殖期間後、４００μｇ／ｄのＧ４１８を含む選択培地上で 細胞を増殖させ、そして耐性コロニーを採取し、ＴＮＦ生産について試験するた めに２４ウエルの組織培養皿に移した。

細胞性タンパク質を２５５−システィンまたは３５Ｓ−メチオニンのいずれかで 標識した。まず細胞を、システィンまたはメチオニンを欠くが５％透析済ウつ胎 児血清を含むＤ？’ｌＥＭ上で３７゛Ｃで３０分間培養し、システィンまたはメ チオニン飢餓を行った。

約４００Ｃｉ／ミリモルの比活性を有する１００　μＣｉの３５Ｓ−システィン または３５５−メチオニンを添加し、更に細胞を３７℃で２時間インキュベート した。上清を除去し、取っておいた。細胞を溶解緩衝液で溶解させ、溶解物上清 を遠心により回収した。

清澄化された溶解物と培養上清の両方を次のようにしてＴＮＦの存在について試 験した。

ウサギにおいて調製した組換えＴＮＦに対するポリクローナル抗血清を遠心管中 の各試験物質に添加し、そして振盪しなから４°Ｃで１時間インキュベートした 。この後、５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂに結合されたプロティンへの５０％懸濁 液を添加し、次いで４°Ｃで３０分間インキュベートした。

遠心機中でビーズをペレット化し、洗浄した。ＳＤＳ中で煮沸することにより沈 ′＃物質をビーズから取り外した。可溶化されたＴＮＦ含有溶液を電気泳動のた め１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を固定し、染色並 びにオートラジオグラフィーにより読み取った。この結果を図２および３に示す 。

図２は、ｆｆ５５−メチオニンでの標識の結果を示す。標識は、溶解物中の２６ 　ｋＤのプロセシングされてないタンパク質のリーダー配列中にのみ出現し、成 熟の１７　ｋＤの分泌形（メチオニン残基を含まない）中には全く存在しない。

図３は、３５５−システィン標識の結果を示す。予想通り、プロセシングされて ない形と成熟形の両方が標識される。

下記のＬ−９２９アツセイを使って細胞上清もＴＮＦについてアッセイした。Ｔ ＮＦ活性を示すそれらの上滑の能力は、ウサギ抗−ＴＮＦ抗血清とのプレインキ ュヘーションにより完全に破壊された。

スＪ１１１ ドーノグー゛リバリーウイルス１　の０培地中にＴＮＦを分泌する実施例２の細 胞からの上清を０．４５μＩの旧１１ｉｐｏｒｅフィルターを通して濾過し、細 胞が移らないようにした。同様に、上清を３，０００　ｘｇで遠心して細胞また は細胞破片をペレット化することもできる。その上清は、ＴＮＦ−Ｖと命名され た組換えウィルス粒子を含む。

尖施勇土 一ス　−　の′−″′　盛汎 実施例２で調製したＴＮＦ−Ｖを使って、４Ｍｇｏｄのポリブレンと共にＣＯ２ 恒温槽中で３７°Ｃにて一晩インキユベートすることにより、Ｉ　ＸＩＯ’　Ｎ ＩＨ３Ｔ３またはＲＡＴ２細胞を怒染せしめた。

３５５−システィン標識を使って細胞上清および溶解物をＴＮＦ生産について分 析した。怒染細胞についての結果を図４に示す。　１７ｋＤと２６ｋＤ形の両方 のＴＮＦが標識を含む。

それらの細胞からの上清もまた、Ｌ−９２９細胞毒性アフセイによりＴＮＦ活性 を示した。この活性は、ウサギ抗−ＴＮＦ抗血清とのインキュベーションにより 除去された。

ＴＮＦ’、についてのアンセイ 図５は、ＴＮＦ　レトロウィルスゲノムの構造および生物活性を示す。レーンＡ はＦＶＸ　ＴＮＦの制限地図であり、そしてレーンＢはｐＦＶＸＭでトランスフ ェクトされたｐｓｉ−ａ−細胞のブラークアンセイである。ＴＮＦの生物活性を アッセイするために、Ｌ−９２９アンセイ系を使った。Ｌ−！’＋２９細胞をミ クロタイターブレート中で単層として一晩調製する。プレートを横切って試験試 料を倍々希釈し、ＵＶ照射し、次いで上記の調製した細胞単層に添加する。ウェ ル中の培地を１ｄｇｉｒｄアクチノマイシンＤに調整する。プレートを３７°Ｃ で１８時間インキュベートし、次いでプレートを顕微境下で視覚的に採点する。

各ウェルに、ウェル中の細胞死の程度を示す５０．７５または１００％の点数を 与える。ＴＮＦ活性１単位は、５０％の死滅が起こる希釈度の逆数として定義さ れる。

加えて、このアッセイのより高怒度の変形を開発した。この変形は、試験試料と アクチノマイシンＤで処理した時、予め標識した細胞からの３５５標識ペプチド の放出をモニタリングするものである。該アッセイのこの変形を使って、効能を 定量することができ、例えば卵母細胞翻訳物質の相対的効能を評価することがで きる。簡単に言えば、活発に増殖しているＬ−９２９培養物を、２％の透析済ウ シ胎児血清が補足されたメチオニン不含有培地中で３５８メチオニン（２００μ Ｃｉ／Ｉｄ）により３時間標識する。次いで細胞を洗浄し、９６ウエルプレート 中に添加し、−晩インキユベートし、そして翌日試験試料の倍々希釈液と１ｄｇ ／−のアクチノマイシンＤで処理する。

次いで培養物を３７°Ｃで１８時間インキュベートする。各ウェルからの１００ 　λ上清アリコートを別の９６ウエルプレートに移し、酸（ＴＣＡ）沈澱させ、 そしてグラスファイバーフィルター上に収集する。フィルターを９５％エタノー ルで洗浄し、乾燥し、そしてカウントする。ＮＰａ。洗剤対照を各アッセイに含 め、細胞からの放射能の最大放出を測定する。次いで処理細胞と未処理対照との 間の計数の差を、ＮＰ、。処理細胞と未処理対照との差により割った比率、即ち 下式： により、３５Ｓ放出％を算出する。

より高いＴＮＦ効能はこの比率の値が高い。

１施１ タンパク　゛　コード配置を４む ゛　１　プロウィルスｔ　のｉａ　！ ヒトＴＮＦ、　ＩＬ−２およびＭＤＲをコードする配列を高力価レトロウィルス ベクターｐＬＮＬ６中にクローニングした。このベクターはＢｅｎｄｅｒら、　 １９８７．　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、６Ｈ５）：１６３９−１６４６に記載さ れている。図６は感染性ドラッグデリバリ−レトロウィルスｐＬＭＤＲＬ６．　 ｐＬＴＮＦＬ６およびｐＬＩＬ−２Ｌ６の作製方法を示す。

ＭＤＲ配ＩＬ門ＤＲＬ６の ｐＬ？’１ＤＲＬ６の作製における最初の段階は、ＭＤＲをコードするＤＮＡ配 列の単離である。？ＩＤＩ？をコードするＤＮＡ配列はＰＣＴ／ＵＳ８７１００ ７５８に記載されている。ＭＤＲタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列はこ のＰＣＴ明細書の表５に示されている。これをまず市販のベクターｐＧＥＭ３Ｚ （ｆ−）中にＸｂａＩ−ＣＩａＩ断片としてクローニングした。これを成し遂げ るため、ＣＩａＴ−ＨｉｎｄｒＩＩリンカ−アダプターをＣ１ａＬＸｂａＩ　Ｍ ＤＲ断片に連結せしめた。この構成物をｐＧＥＭ３Ｚ　（ｆ−）中のＸｂａｌ− 旧ｎｄ　ＩＩＩ部位に連結せしめ、ｐＧＥ門３Ｚ（ｆ−）ＭＤＩ？を得た。

ｐＧＥ門３Ｚ　（ｆ−）　ＭＤＲを使って、高力価ヘクターｐＬ門ＤＲＬ６を次 のようにして製造した。５ａＩｇのｐＧＥＭ３Ｚ　Ｃｆ−）ＭＤＲを、３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、　ｐＨ７，９から成るＴｒｉｓ−酢酸緩衝ｆｉ（６６ｗＭ酢酸 カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ＩＩＭジチオトレイトール）中で 全量５００　λにおいて２００単位のＣ１ａｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉ。

Ｌａｂｓ）で消化した。この反応を３７°Ｃで６０分間行い、その後ＤＮＡをフ ェノール抽出し、そして２．５Ｍ酢酸アンモニウムを含むエタノール溶液中でエ タノール沈澱せしめた。この沈澱物を４００　λの水に再懸濁し、Ｃ１ａｌ消化 されたｐＧＥＭ３Ｚ（ｆ−）ＭＤＲを次のようにしてＥｃｏＲＩでの第二消化に かけた。

エタノール沈澱させ再懸濁した４５０　λの物質に、５０λの１０ＸＴｒｉｓ酢 酸緩衝液および３８単位のＥｃｏＲＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏ−１ ａｂｓ）を添加した。この混合物を３７°Ｃで６０分間インキュベートし、そし てこれを前記の通りフェノール抽出し、エタノール沈澱せしめた。エタノール沈 Ｂ物を１００　λのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８ ，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁した。水中の０．２５％ブロモフェノールブ ルー、０．２５％キシレンシアツール（１５％フィコール）４００型から成る２ ０λの負荷緩衝液を添加することにより電気泳動用試料を調製した。この試料を ４０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−酢酸、　ｐＨ８，０（２ｄＭ　ＥＤＴＡ）電気泳動用緩衝 液から成るＴｒｉｓ−酢酸緩衝液中で１％アガロース調製ゲル上で電気泳動した 。

電気泳動後、４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩ断片を含むゲル断片をゲルから 切り出し、そして標準的ガラスピーズ精製技術を使ってＤＮＡを単離した。

匹ｙ卵玉」因」袈 高力価レトロウィルスベクターｐＬＮＬ６を、上記４．２ｋｂ　ＭＤＲＥｃｏＲ Ｉ−Ｃ１ａＩ断片を挿入するために次のように準備した。採用した方法は、ｐＧ ＥＭ３Ｚ　（ｆ−）　ＭＤＲベクター中への該断片の挿入に使った方法と同様で あった。簡単に言えば、５ａＩｇのｐＬＮＬ６をＣ１ａｌで次に３８単位のＥｃ ｏＲｒで消化した。これは４．７ｋｂのＣ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を与え、標準 的な電気泳動技術を使って該断片を単離した。次に、４．２ｋｂ　ＭＤＲＥｃｏ ＲＩ−Ｃ１ａＩ断片と４．７ｋｂＣ１ａｌ−ＥｃｏＲＩ　ｐＬＮ６断片とを連結 せしめ、高力価ＭＤＲ発現ベクターｐＬＭＤＲＬ６を作製した。この方法は、４ 腸Ｍ　ＡＴＰおよび４００型位の７４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇＩａｎ ｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）を含むＴｒｉｓ−酢酸緩衝液中で全量２５λにおいて、 １ｄｇのＭＤＲＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩ断片をＬａｇの４．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ− Ｃ１ａｌ　ｐＬＮ６断片と連結せしめることから成る。この反応を４°Ｃで１６ 時間進行させ、次いで連結混合物をＴＥ緩衝液により１：４希釈した。この混合 物５λをコンピテントＤＨ５ａ細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ ａｂｓ）中に形質転換せしめた。８個のクローンを採取し、−晩増殖させ、下記 の通りにＭＤＲ挿入断片の存在について分析した。

８個のクローンそれぞれの一晩増殖物１ｄを遠心分離機中で遠心し、上清を除去 し、そして細菌ペレットを、２００　λのフェノール、１７０　λのＴＥ緩衝液 および３０λの６×負荷緩衝液から成る破砕用緩衝液を使って破砕した。この試 料を攪拌し、５分間遠心し、そして上清をＴＡＥ　［衝液中、０．８％アガロー スゲル上で５０ボルトで１６時間電気泳動した。最も遅く移動したクローンを更 なる分析のため選択し、該クローンのうちの１つであるクローン５をミニブレブ 制限消化による分析のため選択した。クローン５は制限分析の結果に基づくとプ ラスミドｐｉ、Ｎｌ、６・ＭＤＩ？を有することが示された。

μ　ＭＯＲウィルスの ｐＬ河ＤＲＬ６ベクターを使って、下記の通りにＭＤＲ配列を含む両開性ウィル ス粒子を生産した。約４　ＸｌＯｓ個のＰＳＩ−２細胞を１００１の組織培養皿 に塗抹し、１６時間後、ＰＳＩ−２細胞中へのベクターｐＬＭＤＲＬ６のトラン スフェクション３　時間前に、ＰＳＩ−２細胞に新鮮な培地を再供給し、そして リン酸カルシウム媒介遺伝子伝達を介して細胞をトランスフェクトせしめた。

次のようにして、ＰＳＩ−２細胞から収集したウィルス粒子を含む培地によりＰ ＾３１７細胞を感染させた。６０ｄｍの組織培養皿あたり５　ＸＩＯ’個のＰＡ ３１７細胞を接種し、−晩細胞を増殖させた。トランスフェクトされたＰＳＩ− ２細胞から培地を除去し、細胞に４ｄの新鮮培地を再供給した。Ｐｓｉ−２細胞 を培地中に一晩ウイルス粒子を分泌させておき、その後培地を収得し、８．００ ０　ｒｐｌｌで５分間遠心した。その上清を使ってＰＡ３１７細胞を感染させた 。感染は、ＰＡ３１７　細胞から細胞培養培地を除去し、そして該細胞を４μｇ ／ｄのポリブレンの存在下で２ｄのＰＳＩ−２上清と共にインキュベートするこ とから成る。２４時間後、ＰＡ３１７　Ｉ［１胞を継代培養し、３〜４　ＸＩＯ ’細胞／細胞７画０細胞を２０ｄｇ／ｄのビンブラスチンへの暴露により多剤耐 性について選択した。７〜１０日後、コロニーが出現した。トランスフェクトさ れない対照においてはコロニーは全（出現しなかった。個々のコロニーを採取す ると、それらは連続継代において２０ｄｇ／ｌｒｉのビンブラスチンに耐性であ ることがわかった。このようなコロニー由来の上清は、通常の薬剤怒受性細胞の 感染時に、１　ｘｔｏ’　ｃｆｕ／ｍの力価ををする薬剤耐性を付与することが わかった。

匹ハ測 ｐ［、ＴＮＦ６を作製するのに使用するＴＮＦコード配列は、米国特許第４，　 ６７７、　０６３号に記載のプラスミドＢｌｌから得られた。このＴＮＦ配列は Ｐｓｔｌ断片中に存在するので、ＰｓｔＩ消化によって取り出し、そして市販の ベクターｐＧＥＭ−３　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＰｓｔ１部位に挿入し、ｐＧＥＭ ＴＮＦ１４を作製した。

匹運」αλ」製 へ／）　））　−ｐＬＴＮＦＬ６は複数の段階において作った。第１に、上記の ベクターｐＬＭＤＩ？Ｌ６中のＭＤＲ配列を、ＴＮＦをコードするベクターｐＧ ＥＭＴＮＦ１４からの配列と同様にして切り出した。

ＭＤＲ配列を欠（ベクター断片とこのＴＮＦ配列を平滑末端にし、そして連結せ しめてｐＬＴＮＦＬ６を作製した。

より詳しくは、これが必要とするのは、２００単位のＢａ摺Ｈ１（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）、２００単位のＦｌｉｎｄ　ｍ　（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄＢｉｏ　Ｌａｂｓ）及び９０単位のＣ１ａ−　１により、ＴＡＮ衝 液中で、最終容量５００人にて３７°Ｃで２時間、５０ｄｇのｐＬＮＬ　−　Ｍ ＤＲを消化することによってＭＤＲ配列を切り出すことである。このインキュヘ ーション期間に続いてＭＤＲコード配列を欠いているベクター断片を、ｌＯλ（ ７）１０＋ｗＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ） 並びに６３単位のＴ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加しそしてこ の混合物を更に３７°Ｃで２０分間、次に６８゛Ｃで更に１０分間インキユーヘ ートすることにより、平滑末端にした。次に本質的には前記の方法を用いて、反 応消化物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、そして１％アガロースゲル 上で電気泳動した。４．７ｋｂの平滑末端断片をゲルから切り出し、そして標準 的なガラスピーズ精製方法を用いて単離した。

同様に、５０ｄｇのｐＧＥＭ　ＴＮＦ１４をＴＡ緩衝液中で２００単位のＰｓｔ Ｉにより、最終審査５００　スにて３７°Ｃで２時間消化した。この反応消化物 を上記と同様に処理し、そして１％のアガロースゲル上で分画した。ＴＮＦコー ド配列を有する１．１ｋｂのコード断片をゲルから切り出し、そして上記の通り ガラスピースを使って単離した。この断片を次のようにして平滑末端にした。１ μｇのこの断片を、０．０５ｍＭ　ｄＮＴＰ及び０．１５単位のＴ４ＯＮＡポリ メラーゼを含むＴＡｌｉ衝液３０λ中でインキュベートした。混合物は３７℃で ２０分間、その後６８°Ｃで更に１０分間インキュベートした。この平滑末端断 片をガラスピーズを用いて精製し、そしてこれを平滑末端化された４．７ｋｂの ベクター断片への連結１！備のため、水の中に再懸濁した。

連結反応は以下の通りに行った。１．１ｋｂの平滑末端化ＴＮＦ断片０．８μｇ を４．７ｋｂの平滑末端化断片１．０ｄｇと、全容量２５λのＴＡ緩衝液中で混 合した。該緩衝液は４ｍＭ　ＡＴＰ及び４００単位のＴ，　ＤＮＡリガーゼ（Ｎ ＥＢ）を含んだ。連結を４°Ｃにて１６時間行い、その後連結混合物をＴＥ緩衝 液で１：４希釈し、次いで５λのこの混合物を用いて１００λのコンピテント０ ８５α細胞を形質転換せしめた。次に、種々の希釈度の形質転換細胞混合物をニ トロセルロースフィルターに塗布し、そして５０ｄｇ／ｄのアンピシリンを含む 培養プレート上でインキュベートせしめた。３７°Ｃで１６時間後、第２セント のニトロセルロースフィルターを用いてこのプレートを複製塗布した。この新し いニトロセルロースフィルターはマスタープレートとして働く。細菌ＤＮＡをフ ィルターに固定化するため、もとのフィルターを標準的アルカリ溶解法を利用し て処理した。次に、ＴＮＦを含むコロニーを、以下の配列：５　’　−ＴＣＡ　 ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣ　ＣＡＴ　ＴＧＧ−３’を有する末端標識オリゴヌクレ オチドプローブを用いて同定した。

ハイブリダイゼーションは、フィルターを５　Ｘ５ＳＣ，　４Ｘデンハルト、５ ０ｄＭ　ＮａＰＯ４−　ｐＨ６．８．　０．１％ドデシル硫酸ナトリウム及び１ ００　ｕ　ｇ／ｄのサケ精子ＤＮＡ中でブレインキュベートすることより成る。

このフィルターを１時開ブレインキュベートし、次にリン酸化プローブを含む同 溶液１５ｄ中で１時間インキュベートした。２０ピコモルのプローブを用い、５ ５℃の１１１２３７時間の後、フィルターを以下の通り減少する濃度のＳＳＣ溶 液により洗浄した。第１洗浄は０．１％ＳＤＳを含む６ｘｓｓｃから成り、第２ 洗浄は０．１％ＳＯＳを含む４×５ＳＣ１そして第３洗浄は０．１％ＳＯ５を含 む２ＸＳＳＣから成った。第１及び第２洗浄は２回繰り返し、洗浄時間は１５分 間であった．第３洗浄は１回行い、これも１５分間の洗浄時間であった。全ての 洗浄は６０″Ｃにて、１２Ｏｒｐｍ＋の撹拌により行った．洗浄後、フィルター を玉軸し、そして−７０°Ｃでオートラジオグラフィーにかけた、オートラジオ グラフ結果に基づき、８個のりｂ−ンをマスタープレートから採取し、そして２ ００μｇ／−のアンピシリンが補足されたＲ２培地３．５ｄに接種した。細菌を 標準的な条件下で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離しそしてεｃｏＲＴにより 制限し、正しい方向においてＴＮＦ断片が挿入されているものを同定した。Ｅｃ ｏＲＩ消化は、ＩＯＸ緩衝液（０，３３Ｍ　ｌ−リス−酢酸、　ｐＨ７，９；０ ．６６Ｍ酢酸力’Ｊ　’７　ム；　０．１０Ｍ酢酸マグネシウム；　５ｍＭジチ オトレイトール）　３１．５λ、ＲＮａｓｅ　（１０＋ｍｇ／ｍ＞２．５λ、ガ ラス葵留水２６５λ及びＥｃｏＲＩ　１３λ　（２０単位／λ＋　ＮｅｗＥｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）中で行った。反応混合物がＥｃｏＲｒを含まない対 照実験を実施した。反応は、１λの適切なりローンと３４λの反応混合物を混ぜ 合わせることにより開始させ、その後３７°Ｃで１時間インキュベートした。反 応消化物を１％ＴＥＡＥゲル上に流した。、３つのクローン、ＴＮＦ３．　ＴＮ Ｆ６及びＴＮＦ７は、３１８０、１６１３及び９００塩基対数を有する期待の断 片を示した。

従って、ＴＮＦコード配列についての予測配向と一致するそれらの結果に基づき 、ベクターｐＬＴＮＦＬ６と一致するＴＮＦ３を更なる研究のために選んだ。Ｔ ＮＦ３を増殖させて大規模のプラスミド調製物を作り、そしてＴＮＦコード配列 の方向を確認するためＥｃｏＲＩを用いる制限消化により分析した。

ＬＴＮＦＬ６によるＰＡ３１７細　のトランスフェクションＰ＾３１７細胞のト ランスフェクションは、１０ｍ１の培地を含む１００　ｍｍの組織培養皿当り３ Ｘ１０’個の細胞を接種することにより行った。細胞を２４時間増殖させ、次い で培地を除去し、そして次の溶液：ｌＯμｇのｐＬＴＮＦＬ６　、Ｉμｇのβ− アクチン−ネオマイシンベクター、１０Ｍｇの剪断されたＬＴＫ担体ＤＮＡ、及 び５００　λの２　ＸＨＢＳ（１０ｍＭ　ＫＣＩ、　ＬＩＴＩＭ　Ｏ−グルコー ス、１．４ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，４２＋Ｍ　Ｈｅｐｅｓ及び１７１１Ｍ　Ｎａ ｃｌ、　ｐＨ７，０５）を添加することによりトランスフェクトせしめた。最終 容量９５０　λとなるように水を加えた。次に５０λの２．５Ｍ　ＣａＣ１ｚを 加え、そしてこの２つを直ちに１５秒間渦動攪拌した。沈澱が形成された後、試 験管を室温で３０分間インキュベートした。次に溶液全体をＰＡ３１７細胞を含 む１００ｍｍのｍ織培養皿に加え、そしてこの皿を３７℃で１夜インキユベート した。その後、この培地を新鮮培地を交換し、更に３７°Ｃで２４時間インキュ ベートし、そして細胞をトリプシン処理し、そして４００μｇ／ｄのＧ４１８が 補足された培地に逐次１：４希釈度にて平板培養した。培地を３〜４日毎に交換 し、そしてトランスフェクションの１５日後、クローニングシリンダーを用いて クローンを単離し、そして得られたクローンを大量培養において増殖させ、そし て米国特許第４　、６７７　、０６３号に記載の通り又は本質的には上記の通り 、Ｌ９２９アッセイを使ってＴＮＦ発現についてアッセイした。試験した１０個 のクローンのうち５個が、トランスフェクトされたＦＡ３１７　ｍ胞を増殖せし めた２日後に約１３から７０単位よりわずかに高いＴＮＦ／ｄまでの値を示した 。

ＰＡ３１７ｐＬＴＮＦＬ６　トランスフェクト細胞が感染性ウィルス粒子を生産 できることを示すため、トランスフェクト細胞を１０％ウシ胎児血清が補足され たダルベツコ改良イーグル培地に３×１０５細胞／１００ｄ皿の密度において接 種し、そして１６時間インキュベートした。その後、培地を除去し、そしてあら ゆる細胞破片及び全細胞を除去するために３，０００Ｘｇで５分間遠心すること によってウィルスを集めた。ウィルス粒子を含む得られた培地上清を感受性細胞 培養物の感染に使用した。

種々の細胞タイプを感染せしめ、これにはＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト腫瘍浸潤リン パ球（置細胞）又はヒト黒色腫細胞が含まれる。ヒトＴＩＬ及び黒色腫細胞はＲ ｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、ら、１９８６゜５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３　：　 １３１８　；　Ｔｏｐａｌｉａｎ、Ｓ、ら、１９８８＋　Ｊ、Ｃｌ１ｎ　０ｎｃ ｏ１．。

６　：　８３９　；　Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ、　Ａ、ら、　１９８８．　Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８　：　２０６　；又はＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、ら 、１９８８．　Ｎｅｗ　Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、に記載された通りに得られた。感 受性細胞の感染は、細胞培養培地を除去し、そして感染を促進させるために４ｄ ｇ／ｄのポリプレンが補足されたウィルス粒子含有培地上清で置き換えることか ら成った。１６時間後、新鮮培地を培養物に加え、そして免疫沈澱によるＴＮＦ の検出を可能にするために培養物を代謝的に標識した。

該細胞及びＴＮＦを生産することが分っている対照細胞系の代謝的標識は、以下 の細胞タイプ、ＴＮＦ６−８．　ＮＩＨ３Ｔ３及びＰＡ３１７については、カル シウム又はマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝化塩溶液中で培養物を２回すす ぎ、そしてシスティンを含まない最少必須培地中で細胞を３７°Ｃにてインキュ ベートすることから成る。黒色腫細胞ロスウェルパークメモリアルインスティテ ユート（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）シ スティン不含有培地中でインキュベートした。

使用した培地のタイプにかかわらず、培地は５％の透析済ウシ胎児が補足された 。次に、細胞培養皿から培地を吸引除去し、そしてそれを１００−３００　μＣ ｉ／−の［３５５］　システィン含有培地で置き換えることにより、３７°Ｃで ３時間細胞を［３５５］　システィンで標識した。１００胴皿当り２ｄの放射性 培地を用いた。

標識期間の間培養物を攪拌し、その後培地を吸引し、そして２０ｍＭのＴｉｒｓ 、　ｐＨ８，０，２００１ＭＭ　Ｌｉｃｋ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５％Ｎ Ｐ−４０から成る溶解緩衝液ｌｄ中で細胞を溶解せしめた。この溶解緩衝液の添 加後、この細胞培養皿を４°Ｃで５分間インキュベートし、そしてＴＮＦの存在 を決定するために溶解物を免疫沈澱せしめた。

免疫沈澱は、ヒト組換えＴＮＦに対して生起されたウサギ抗−ＴＮＦ血清を用い て、溶解物中に存在するＴＮＦを沈澱せしめることから成る。溶解物をＴＮＰ抗 体と反応させる前、これをプロティンＡ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂビー ズの５０％懸濁液３０λに連続攪拌下で４°Ｃで１時間予備吸着させた。試験管 を遠心してビーズをペレット化し、そして３．７５λのウサギ抗−ＴＮＦ血清が 加えである別の試験管に上清を移し入れた。この試験管を攪拌しなから４°Ｃで １時間インキュベートし、そして１４．００Ｏｒｐｍにて１５秒間遠心した。上 清を取り出し、そして別の試験管の中に移し入れ、その後３０λのプロティン八 −５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂビーズを上清に加え、次に混合物を攪拌しな から４°Ｃで１時間インキュベートした。次いでビーズをペレット化し、そして 溶解緩衝液で２回、そして緩衝液Ｂ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０゜１ ００ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％ＮＰ４０）で２回洗浄した。洗浄は、ビーズを７ ．０００ｒｐ＋＊で８秒間ペレント化し、上清を捨て、そしてｌｄの適当な洗浄 液を加えることから成る。最後に、最後の洗浄の後、ビーズに結合している物質 を４％ＳＯ３，１５％グリセロール、６．２５ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，８， ０，１％ブロモフェノールブルー及び１　ｍＭ　ＤＴＴより成るゲル電気泳動用 負荷緩衝液３０λを添加することにより電気泳動にかけた。電気泳動用緩衝液を 加えたら直ちにこの試料を５分間煮沸し、そして１２％ポリアクリルアミドゲル 上で電気泳動にかけた。図７及び８に結果を示す。図７は、ＬＴＮＦＬ６ブラス ミドまたはＬＴＮＦＬ６由来の高力価ＴＮＦレトロウィルスのいづれかによりト ランスフェクトまたは感染された細胞の免疫沈澱分析を示す。レーンＡは、２６ ｋＤ及び１７ｋＤ　ＴＮＦの両者をコードする高力価レトロウィルスＬＴＮＦＬ ６によりトランスフェクトされたＰＡ３１７細胞であり；レーンＢは未感染のＮ ＩＨ３Ｔ３細胞であり；そしてレーンＣは、ＬＴＮＦＬ６によりトランスフェク トされたＰＡ３１７細胞の細胞培養上清中に存在する高力価ＴＮＦ　レトロウィ ルスＬＴＮＦＬ６クローン８により感染されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。

図８は、ＴＮＦ　レトロウィルスＬＴＮＦＬ６により感染された３５Ｓ−システ ィン標識ヒト黒色腫細胞の免疫沈澱分析である。レーンＡはＬＴＮＦＬ６により トランスフェクトされたＰＡ３１７１！ｌ胞；レーンＢ及びＣは、それぞれ未感 染のＮＩＨ３Ｔ３細胞およびｐＬＴＮＦＬ６ウイルスにより感染されたＮＩＨ３ Ｔ３細胞；そしてレーンＤ及び巳はそれぞれ未感染のヒト黒色腫細胞およびｐＬ ＴＮＦＬ６ウイルスにより感染されたヒト黒色腫細胞である。

ヒ）ＴＩＬ中へのＴＮＦをコードするＤＮＡ配列の組込みの確認は、ｐＬＴＮＦ Ｌ６により感染されたヒ）ＴＩＬ中に゛存在する５００塩基対のセグメントのポ リメラーゼ連鎖反応増幅により得られた。

この反応は標準的ＰＣＲ技術及び以下のオリゴヌクレオチドブライマー、 ＣＰ４８４：　５’　−ＴＮＦプライマー５　’　−ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　 ＧＧＧ　ＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＣ−３’ＣＰ４８７：　３’　−ＭｏＭＬシプライ マー５　’　−ＣＴＡ　ＴＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡ−３’ を用いることにより行った。

図９に結果を示す。レーンＡは非感染のＴＩＬ　、そしてレーンＢ及びＣは感染 ＴＩＬを示す。レーンＤは正の対照であり、ｐＬＴＮＦＬ６によりトランスフェ クトされたＰＡ３１７細胞を示す。

５００塩基対のＴＮＦ配列の増幅は、ＴＩＬ細胞がＴＮＦレトロウィルスにより 感染されていることを確証する。

更に、実質的に前記と同様に行った免疫沈澱は、該ＴＩＬ細胞がＴＮＦを分泌し ているを示した。

下記の意思外は、ｐＬＮＬ　−ＭＤＲ又はｐＬＮＬ　−ＴＮＦを作製するのに使 ったものと本質的に同じ材料及び方法を使って、ベクターＰＬＩＬ−２Ｌ６を作 製した。

第１に、ＩＣ−２をコードする配列はＰｓｔｌ　フラグメント上にある。これは 発明者Ｍａｒｋらの米国特許第４．５１８．５８４号に詳細に記載されている。

第２に、ＩＬ−２配列を含む形質転換細菌を探査するのに用いるオリゴヌクレオ チドは以下の配列を有する；ＫＤ１２：　ｓ’　−ＧＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧ ＴＡＣＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴ−３’ハイブリダイゼ一シヨン条件は、Ｍ ＤＲ又はＴＮＦ配列を含むクローンを同定のに使ったのと本質的に同じであるが 、但しＴｍは６９°Ｃであった。ＩＬ−２クローンについてのスクリーニングは オートラジオグラフィーにより８個のクローンの存在を示し、即ち、ＥｃｏＲＩ 及び５ｔｕｌでの二重消化において制限した時、適切な方向のＩＬ２コード配列 を有するクローンを示した。

ＥｃｏＲＩ及び５ｔｕＩ消化はＩＱｘＴＡ　３１．５λ、ＲＮａｓｅ　Ａ（１０ ｍｇ／　ｄ）２．５　λ、ガラス蒸留水２５２λ、ＥｃｏＲＩ（２０単位／λ） １３　λ、及び５ｔｕＩ（８単位／λ）１３　λから成る溶液中で行った。

２隻±亙 匹爪■旦９１里 癌の化学療法処置の有効性は、副作用を伴わないで患者に投与することができる 用量により部分的にＭ曜されている。

このような副作用は、患者の免疫応答に必要な正常リンパ系細胞の減少を含む。

従って、レトロウィルスｐＬＭＤＲＬ６の重要な用途は、正常リンパ系細胞にお ける薬剤耐性を確実にする能力にあり、これによって一層多量の化学療法剤が投 与できるようになる。

リンパ系細胞に薬剤耐性を付与する方法及びその利点は、Ｎ瘍浸潤リンパ球又は ＴＩＬを生体内においてｐＬＭＤＲＬ６により感染せしめ、そしてこれらの細胞 を化学療法的に感受性の腫瘍負荷を経験している免疫学的受容性宿主動物に戻す ことにより実証されうる。　ＴＩＬを得るための方法及びＴＩＬをＭＤＲ両同雨 間ィルスにより感染せしめる方法は上記に与えられている。感染ＴＩＬ細胞を動 物に戻すと、有効数の細胞が腫瘍塊に付着するか又はこれを浸潤する。その後、 動物に腫瘍負荷の治療に有効な１又は複数の化学療法剤を投与する。トランスフ ェクトされたＴＩＬ細胞は腫瘍に対して毒性である濃度の化学療法剤に耐性であ るため、医師はＴＩＬ細胞を殺さずに付与することができる投与量を起えて、腫 瘍に対して有効な化学療法剤の投与量を徐々に増加させることができる。こうし て、患者本来の抗−腫瘍防御は損害を免れ、そして実際、腫瘍を高められた投与 量の化学療法剤に暴露することによって増強される。

ス１」じ− ２゛　云　レトロウィルスＤＮＡ ネオマイシン遺伝子及びｒＮＦの両方を発現できるレトロウィルスを作製した。

この２遺伝子レトロウイルスヘクターを製造するため作製方法を図１０に示す。

ベクターｐＬＮＳＸ、　ｐＬＸＳＮ及びｐＬＮＣＸの全てがネオマイシン遺伝子 配列を保有している。

更に、これらのベクターはＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎの１９８９゜旦旦匹旦組 朋虹７　（９）　：　９８０に記載されている。

コ（７）ＴＮＦ構成物は、へ’）９−ｐＵｃ、ＦＶＸＭΔＨＩＩＩ　ＴＮＦｒ　 ｓｉｇニ存在するＴ−インターフェロンシグナルペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含んだ。該方法は、１５０μｇのｐＧＥＭＴＮＦ１４及び１５０　ｐ ｇのｐ［Ｉｃ、ＦＶＸＭΔＨｍ　ＴＮＦｒ　ｓｉｇを６００単位のＰｓｔＩ（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化することから成った。消化 は３３ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０１酢酸 マグネシウム、０．５ｍＭジチオトレイトールから成る制限酵素緩衝液１５００ μＩ中で３７°Ｃにて６０分間行った。消化物をフェノール抽出し、エタノール 沈澱し、そしてＴｒｉｓ−酢酸電気泳動用緩衝液（４０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ、　Ｉ ＩＩＭ　ＥＤＴＡ、　５ｗＭ酢酸ナトリウム、　ｐＨ７，５）中で１％アガロー スゲル上で分画した。１０７０ｂｐの野性型ＴＮＦ断片及び９０２ｂｐのＴＮＦ 　１　ｓｉｇ断片のそれぞれをガラスピーズによって単離した。

それぞれのＰｓｔｌ断片をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって断片化 した。各断片４μｇを６．３ユニットの７４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）と、３３ＩＷＭトリスー酢酸、ｐＨ７，９，６ ６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５１Ｍジチオトレイトー ル並びにそれぞれ０．１０ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ及びｄＧＴ Ｐから成る１２５μｍの容量において、３７°Ｃで１０分間、次いで６８°Ｃで ５分間処理した。各平滑末端断片をガラスピーズ単離により精製した。

各ベクター４μｇを、平滑末端を作り上げる適切な酵素により、１００μｍの容 量（３３ｍＭ　）リス−酢酸、ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ＩＩＩ Ｍ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭジチオトレイトール）において以下の通りに消 化した：　ｐＬＮＣＸは１０単位のＨｐａｌ（ＮＥＢ）　ニより、ｐＬＮＳＸは １６単位の５ＴＵＩ　（ＮＥＢ）　ニより、ｐＬＸＳＮは１０単位のＨｐａｌ　 （ＮＥＢ）により３７°Ｃで６０分間の処理。

各消化ベクターを、１６μｇ／−のベクター及び１６μｇ／−のＴＮＦフラグメ ント、３３Ｉｌ１Ｍトリスー酢酸、ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０１ 酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ　ジチオトレイトール、４ｍＭＡＴＰ、１６，０ ００単位／ｉのＴ４　ＤＮＡリガーセ（ＮＥＢ）を含む連結混合物２５μｍ中に おいて各平滑末端化ＴＮＦ断片と連結せしめた。連結は１６°Ｃで１６時間のイ ンキュベーショによる。連結せしめたＤＮＡを用いてコンビ−テントＤＨ５α細 胞（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）を製造者の指示に従って形 質転換せしめた。

得られたコロニーを、プローブとしてＴＮＦオリゴヌクレオチドブライマーＣＰ ３６５　（５’　−ＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＧ−３’　）を用いる 標準的な方法によりスクリーニングした。配向性は制限エンドヌクレアーゼアッ セイにより確認した。

ＴＮＦ遺伝子を保有する１つのプラスミドｐＬＴＮＦＳＮをＰＡ３１７細胞の中 にトランスフェクトし、そしてこのトランスフェクトクローンを単離した。ＬＴ ＮＦＳＮ−２２と命名したクローンのうちの１つからウィルスを取り出した。こ れは、標準的な手法を使って、１．６　Ｘ　１０６ｎｅｏ’　ｃｆｕ／ａｄ！の 力価を有し且つ６２単位のＴＮＦ／−を生産するものとして特徴付けられた。

ネオマイシン耐性及びＩＬ−２の両方をコードする２遺伝子ウイルスを、前記の ベクターｐＬＮＳＸ、　ｐＬＸＳＮ及びｐＬＮＣＸを用いて作製した。この方法 は以下の点、即ちＩＬ−２をコードするＰｓｔｌ断片を平滑末端化し、そして該 ベクターに挿入すること以外は同じである。ＩＬ−２断片は発明者Ｍａｒｋｅｒ らの米国特許第４，５１８，５８４号に記載されている。ＩＬ−２コロニーをオ リゴヌクレオチドＫＤ１２を用いてスクリーニングした。

ＩＬ−２遺伝子を保有するプラスミドの１つｐＬＩＬ　２ＳＮをＰＡ３１７細胞 にトランスフェクトせしめ、そしてこのトランスフェクトクローンを単離した。

２つのクローンからウィルスを取出し、ｐＬＩＬ　２ＳＮ−１６及びｐＬＩＬ　 ２５Ｎ−２０と命名した。これはそれぞれ以下の力価、２．ＯＸ　１０５及び２ ．２Ｘ１０５のｎｅｏ’　ｃｆｕ／ｄを示し、そして約８単位／戚のＴＬ−２を それぞれ生産した。

最後に、ＴＮＦ突然変異タンパク質ＴＮＦΔ（１→１２）を用いて２遺伝子構成 物を作製した。簡単に述べると、ｐＦＶＸＦＩ　ΔＨＩＩ［ＴＮＦΔ１２由来の ハ旦断片を平滑末端化し、そしてｐＬＸｓＮのＨρａ１部位にクローニングして ｐＬＴＮＦΔ１２ＳＮを作製した。

実崖貫Ｉ ＴＮＦとネオマイシンの ＴＮＦ及びふオマイシン耐性をコードするウィルス粒子により感染された細胞の 驚くべき特性は、抗生物質Ｇ４１８をこの感染直後に加えた場合の６４１８によ る選別に対するそれらの高められた感受性にある。このことは、ウィルス粒子ｐ ＬＴＮＦＳＮ−２２による細胞感染及び該細胞を６４１８における選別に直ちに かけることにより示される。感染に適する標的細胞はＰＡ３１７であり、そして Ｇ４１８の適切な濃度は４００ｉｇ／ｌｘｌである。

これらの条件を用い、ｐＬＴＮＦＳＸ−２２を保有する細胞の約６０％が、Ｇ４ １８の存在下において、この選別培地中にて２４時間の時点にて殺される。一方 、同一のウィルスではあるがＴＮＦ配列を含まないものにより感染された細胞は １０％以下が殺される。

特定の理論に固執するつもりはないが、６４１８の存在下におけるＴＮＦを発現 せしめる細胞の感受性は、感染細胞がネオマイシン耐性表現型を発現するのに十 分な時間を有さないために起きるものと考えられる。これは即ち、通常細胞をＴ ＮＦ殺傷に耐性にするタンパク質の合成をＧ４１８が阻害することを可能にして いる。従って、６４１８の存在下において、細胞はＴＮＦにより殺される。

この仮説は、ｐＬＴＮＦＳＮ−２２により感染された細胞に感染の４８時間迄に Ｇ４１８選別を通用しない場合、その後の２４時間の間に細胞死がほとんど起き ないことにより支持される。

もしＴＮＦウィルス粒子を有する細胞がＧ４１８を用いて、又はその他の類似の 抗生物質選別を用いて有効に単離されるならば、ネオマイシン遺伝子がこの感染 細胞にＧ４１８耐性を付与するのに十分なる発現時間があるものと当業者により 理解されるであろう。

ス１ｊレー ＴＮＦ１然゛　ンパク　の 前記のオリゴヌクレオチドを用いて作った、以下のＴＮＦのＴＮＦ欠失ミューテ ィンをその細胞毒性活性について試験した：ＴＮＦΔ（１→１２）　、　ＴＮＦ Δ（１＋１２）及びＴＮＦΔ（１＋１３ン。

これはそれぞれ、最初の１２個のアミノ酸の欠失、１および１２番目のアミノ酸 の欠失、並びに１及び１３番目のアミノ酸欠失を意味する。ＮＴＨ３Ｔ３細胞を 、β−アクチン−ネオ及びｐＵＣ。

ＦＶＸＭΔＨＩ［［ＴＮＦプラスミド系列の１つと共にトランスフェクトせしめ 、その後４００　ａ　ｇ／−〇Ｇ４１８中で選別した。細胞毒性活性は、１００ ｉの組織培養皿上に、６４１８耐性不均一集団の一連の希釈液を接種することに より測定した。約２０−５０個のコロニーが出現したら、培地を吸引除去し、そ してこのコロニ−に１０％の仔牛血清が補足されたダルベツコ改良イーグル培地 中の約４ＸｌＯ”個のＬ９２９細胞を積載した。細胞を３０分間平板培養させた 後、培地を吸引し、そして細胞の上にｌＯｄのダルベツコ改良イーグル培地、０ ．９％のノープル（Ｎｏｂｌｅ）寒天（Ｄｉｒｃｏ）及び１０％のウシ胎児血清 より成る溶液を重層した。

この組成物を重層する前進４５°Ｃで溶融状態に保ち、冷却してこの細胞上に重 層させた。次に、この寒天を室温で３０分間固化せしめ、そしてプレートを３７ °Ｃで４８時間インキュベートし、その後寒天を取り除き、１０１ｆ１！のリン 酸塩緩衝化塩溶液を加え、その後１２％グルタルアルデヒド、１％メチレンブル ーを含む溶液１ｄを加えた。後者の溶液は、細胞のコロニー形成を可能にしなが ら細胞を固定し且つ染色し、従って致死ゾーンを容易に識別することができる。

最後にプレートを室温で６０分間インキュベートし、そして水の中ですすぎ、風 乾した。

細胞毒性活性は、トランスフェクトされたコロニーの周辺の致死領域として評価 した。２種類の致死領域が観察された：拡散型及び非散型領域。非拡散型領域は 、ＴＮＦ　ミューティンカ膜に結合したままであり、トランスフェクトコロニー カラ広がってＬ９２９の致死を引き起こさないことを示唆する。一方、拡散型致 死は、ＴＮＦ　ミューティンが細胞から広がり、そして広い領域にわたって致死 を引き起こすさとを示唆する。

表Ｉはこの結果を要約する。細胞毒性活性について試験したミューティンの他に 、比較の目的でベクタ一対照、野生型ＴＮＦ及びＴＮＦ　Ｔ−ｓｉｇも試験した 。この表から明らかな通り、ベクタ一対照及びＴＮＦΔ（１＋１３）のみがＬ９ −２９積層アンセイにより細胞毒性を示さないことが分った。更に、野生型ＴＮ Ｆ及びＴＮＦ　γ−５１ｇは細胞毒性活性を有するが、その活性はトランスフェ クトコロニーのまわりに拡散型のパターンを示し、従って野生型ＴＮＦ及びＴＮ Ｆ　ｒ−ｓｉｇはトランスフェクトコロニーから分泌されることを示した。一方 、ＴＮＦΔ（ｌ→１２）及びＴＮＦΔ（１＋１２）は非拡散型致死パターンを示 した。このことは、それらの分子が細胞表層に結合したまま且っＬ９２９．！Ｉ Ｆ胞との直接的な接触によって該細胞の致死を引き起こすことベクタ一対照　〈 ５　− ＴＮＦ　Ｗ、Ｔ、　１３４　＋ ＴＮＦΔ　（１→１２）　＜５　＋’ ＴＮＦ　Δ　（１＋１２）　＜５　＋ゝＴＮＦΔ（１±１３）　＜５　− 注意：ａ、標的コロニーの周辺の拡散型致死６１＃として評価した陽性結果。

ｂ、コロニーの周辺の拡散型致死領域は認められないが、Ｌ９２９細胞致死が細 胞コロニー上に直接観察されたことを示す（細胞間接触）。

即時型（ｉｎｓｔａｎｔ）　ミューティンの細胞毒性活性を評価するため、そし て特にＴＮＦΔ（１→１２）及びＴＮＦΔ（１＋１２）の細胞表層の局在化を確 認するため、第２の実験を行った。この実験は２つの部分より構成される。第１ に、種々のＴＮＦ　ミューティンを保有する細胞を、当業界においてよく知られ ている方法を用いて細胞表層放射性ヨウ素化せしめた。この結果が示すには、驚 くべきことに両方のミューティンが細胞表層に結合していた。第２に、ＴＮＦ　 ミューティンのそれぞれを発現するトランスフェクト細胞を培養培地中で増殖さ せ、そして３Ｓ５−システィンにより標識し、その後培地を回収し、そして抗− ＴＮＦポリクローナル抗体により免疫沈澱せしめた。このような抗体及び免疫沈 澱方法は当業界において既知である。

この免疫沈澱物を１２％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で泳動し、そしてＴ ＮＦΔ（１＋１２）及びＴＮＦΔ（１＋１３）によりトランスフェクトされた細 胞に関して、約１７ｋＤの分子が免疫沈澱されることが観察された。ＴＮＦΔ（ １→１２）由来の培地においてはなにも検出されなかった。

上記の結果を一緒に考察すると以下のことがわかる：　ＴＮＦΔ（１→１２）は 膜結合し、細胞培養培地中に分泌されず、そしてこの膜結合型は細胞毒性である 。ＴＮＦΔ（１＋１２）も膜結合しており、且つこの膜結合型は細胞毒性である 。驚くべきことに、このトランスフェクト細胞により約１７ｋＤの分子も分泌さ れた。最後に、ＴＮＦΔ（１±１３）は膜に結合して現われるが、この膜結合型 は細胞毒性でなかった。この構成物も約１７ｋＤの分子を分泌した。

ＴＮＦΔ（１＋１２）及びＴＮＦΔ（１−１−１３）によりトランスフェクトさ れた細胞により分泌される約１７ｋｉ）の分子量を有す可溶性分子が細胞毒性活 性を有するかどうか調べるための実験を行った。この実験は、適切に形質転換さ れた３７３　！胞を増殖せしめ、そして該細胞と分泌分子を含む培地とを分ける ことにより行なわれる。培地を前記の通りにＬ９２９細胞においてアッセイする と、細胞毒性活性を有さないことが示された。

従って、この分泌された１７ｋＤ分子は野生型１７ｋＤ　ＴＮＦと異なり、細胞 毒性でなかった。

図１２は２６ｋＤのＴＮＦをコードするｃＤＮＡ配列、及び種々のミューティン を作製するために削除された分子の領域の制限地図である。

前記のウィルス粒子ｐＬＩＬ２ｓＮ−１６を、標準技術を用いて単離したヒトＴ ＩＬ細胞を感染せしめることにより腫瘍治療に利用した。この方法は、Ｒｏｓｅ ｎｂｅｒｇ、　Ｓら、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３　：１３１８　； 　Ｔｏｐａｌｉａｎ、　Ｓ　ら、　１９８８．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１． 、６：８３９　；Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ、Ａら、１９８９．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、、　４８：２０６；　又はＲｏｓｅｎｂｅｒｇ。

Ｓら、　１９８８．独り勘■ｌ疫Ｊ、ｌ’ｌ岨、に記載されている。怒受性培養 物の感染は、細胞培養培地を除去し、そして感染を促進せしめるために４μｇ／ ｄのポリブレンが添加されたウィルス粒子含有培養上清で１き換えることから成 る。

ＴＩＬ　ｉｌｌ胞を洗浄して細胞破片、ポリブレン、その他を除去してＭ患者へ の点滴注入に通するようにした。感染ＴＩＬ　ｔｉｎ胞の投与量は異なることが でき、最適投与量は担当医師により経験的に決定することができる。感染ＴＩＬ 細胞の複数の点滴注入が十分な治療のために望ましいことが期待される。初期治 療及びその後に続き、患者の腫瘍塊をモニターし、そして有意なる縮小が４週間 の時点で現れた。

実質的に同じ方法を用い、ＴＮＦ　ミューティンＴＮＦΔ（１→１２）をコード するレトロウィルス粒子によってＴＩＬ細胞を感染させることができる。これは 、ｐＬＴＮＦΔ１２ＳＮを適切な宿主細胞中にトランスフェクトせしめ、そして この細胞培養培地中に分泌されるウィルス粒子を単離することによって作られる レトロウィルス粒子を用いることによる。

以下の材料はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、　ＭＤ、　ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）に、特許手続上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブタペスト条約（ブタペスト条約）に従って寄託され、そしてこれ らはブタペスト条約に従って保管され且つ入手できる。このような菌株の入手可 能性は、特許法に従って政府当局のもとに認められる権利に反して本発明を実施 する承諾であると解釈してはならない。

以下の材料はＡＴＣＣに寄託され、そして表示のＡＴＣＣ寄託番号が付けられて いる。これらはシータスコーポレーション、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｃａ１ｉ ｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ（本出願の譲受人）のマスターカルチャーコレクション （ＣＭＣＣ）にも寄託され、そして表示のＣＭＣＣ寄託番号が与えられている。

ｐｉｌｌ（ｐＥ４）　２１３８　３９８９４　１９８４年ＩＯ月１５日ｐＡＷ７ １１　２１６２　３９９１８　１９８４年１１月８日ｐＦＶＸＭ　２７０１　６ ７１０３　１９８６年４月２４日ｐＬＴＮＦＬ６　３６８４　６８１１８　１９ ８９年１０月１２日ｐＬＩＬ−２Ｌ６　３６８５　６８１１９　１９８９年１０ 月１３日ｐｔ、門ＤＲＬ６　３６８７　６８１２０　１９８９年１０月１３日ｐ Ｕ、Ｃ，ＦＶＸＭ Δ旧ＩＩ　ＴＮＦ　ｒ　ｓｉｇ　３６８８　６８１２１　１９８９年１０月１３ 日ｐＬＴＮＦＳＮ　３７５９ ｐＬＴＮＦ　ｒｓｉｇ　ＳＮ　３７５８ｐＬＮｓＴＮＦ　ｒ　ｓｉｇ　３７５６ ｐＬＮＳＴＮＦ　３７５７ ｐＬＮＣＴＮＦ　ｒ　ｓｉｇ　３７６０ｐＬＮＣＴＮＦ　３７６１ ＰＡ３１７　ＣＲＬ９０７８ トランスフェクト３Ｔ３ｙ１１ ＴＮＦΔ（１＋　１３）　［ＴＮＦΔＹｌ　１０７２９ＴＮＦ　ｒ　ｓｉｇ　１ ０７２６　ＣＲＬ１０３３３ＴＮＦ６　［野生型ＴＮＦＩ　１０７３０ＴＮＦΔ （１→１２）　［ＴＮＦΔ１２］１０７２８　ＣＲＬ１０３３４ＴＮＦΔ（１＋ 　１２）　［ＴＮＦΔ−１１０７２７ＦＩＧ、４　ＡＳ　ＣＤ ＡＢＣ ＦＩＧ、７ ＢＣＤＥ ＦｉＧ、８ ＦＩＧ、１１Ａ リーダー　１７ｋＤＴＮＦ ＡＴＧ　ＡＴＣＣＧＧ　ＧＡＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ 　ＧＣＧ　ＣＴＣＣＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＧＧＭｅｔ　Ｉｌｅ　Ａｒ ９Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ 　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　fｌｙ ＧＧＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＴＣＣＡＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣＣ ＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣｎｃＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　 Ｓｅｒ　ＰｈｅＣＴＧ　ＡＴＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧ　Ｃ ＴＣｎｃ　ＴＧ（：　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣｍ　ＧＧＡ　ＧＴＧＬｅｕ　ｌｉ ｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙ ｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ@Ｖａｌ ＧＴＡ　ＧＣＣＣＡＴ　Ｇｎ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ 　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧＶａｌ　Ａｈａ　Ｈ ｌｓ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌ’／　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒ垂kｅｕ ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＧＣＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＧＧ ＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＡＣＡｓｎ　Ａｒｑ　Ａｒｑ　 Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒ９Ａｓｐ　`ｓｎ ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＣＣＴＧ　Ｔ ＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＣＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ 　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ 　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＶａｌＣ丁ＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＣＣＡＡ　ＧＧＣＴＧＣＣ ＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＬｅｕ　Ｐ ｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｈ ｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ@Ｔｈｒ ＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＡＡＧ　Ｇ ＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＩｃｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｖａ ｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　５ｅｒＧＣＣＡＴＣＡＡＧ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　 ＡＣＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＡＧＡｌａ　ｌｉｅ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ@Ｌｙｓ ＣＣＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ 　ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙ ｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈ ｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ@Ｇｌｙ 手続補正書（方式） 平成５年り月十日

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＮゲノムを含んで成るウイルス粒子であって、該ゲノムがタンパク質薬剤 をコードするＲＮＡ配列を含んで成り、該ＲＮＡ配列は調節配列に、およびｇａ ｇ配列を含んで成るレトロウイルス由来のパッケージング部位に作用可能に連結 されており、前記ゲノムが標的対象細胞を感染することができるエンベロープタ ンパク質中に含まれていることを特徴とするウイルス粒子。
2. ２．前記タンパク質薬剤が、ＴＮＦ、ＩＬ−２およびＭＤＲから成る群から選択 される、請求項１に記載のウイルス粒子。
3. ３．前記調節配列およびパッケージング部位がＨｏＭＬＶに由来する、請求項１ に記載のウイルス粒子。
4. ４．前記調節配列が、ＭｏＭＬＶスプライス供与部位をＨａＳＶ由来の配列で置 き換えることにより変更されている、請求項３に記載のウイルス粒子。
5. ５．前記エンベロープタンパク質がヒト細胞の感染を引き起こすことができる、 請求項１に記載のウイルス粒子。
6. ６．レトロウイルス由来の調節配列に作用可能に連結された所望のタンパク質薬 剤をコードする配列を含んで成るプロウイルスＤＮＡであって、ｇａｇ配列を含 むΨパッケージング部位を含み且つレトロウイルス由来のＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔ ｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）により隣接されているプロウイルスＤＮＡ配列。
7. ７．前記タンパク質薬剤が、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＭＤＲまたはそれらのタンパク 質のミューテインから選択される、請求項６のプロウイルス配列。
8. ８．ＲＮＡ配列であって、レトロウイルス調節配列およびｇａｇ配列を含むパッ ケージング部位を含んで成る第二のＲＮＡ配列に作用可能に連結された所望の非 ウイルス性タンパク質をコードする第一のＲＮＡ配列を含んで成るＲＮＡ配列。
9. ９．レトロウイルス由来の２つのＬＴＲの間に連結されている所望の非ウイルス 性タンパク質をコードし、そしてｇａｇ配列を含むΨパッケージング部位を含有 するプロウイルス粒子。
10. １０．請求項９に記載のプロウイルス粒子によりトランスフェクトされた、Ψパ ッケージング部位欠失レトロウイルス形質転換細胞。
11. １１．ウイルス粒子の生産方法であって、請求項１０に記載の細胞を細胞培養培 地中で培養し、そして生産されたウイルス粒子を該培地から回収することを含ん で成る方法。
12. １２．タンパク質を細胞に導入する方法であって、請求項１に記載のウイルス粒 子を該細胞に導入することを含んで成る方法。
13. １３．前記細胞が請求項１０の細胞である、請求項１２に記載の細胞。
14. １４．請求項１のウイルス粒子を含んで成り、野生型ウイルス粒子を含まない医 薬組成物。
15. １５．前記タンパク質がＴＮＦ，ＩＬ−２，ＭＤＲまたはそれらのタンパク質の ミューテインから成る群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. １６．前記調節配列およびパツケージング部位ががＭｏＭＬＶ由来である、請求 項１５に記載の医薬組成物。
17. １７．前記調節配列が、ＭｏＭＬＶスプライス供与部位をＨａＳＶ由来の配列で 置き換えることにより変更されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. １８．前記エンベロープタンパク質がヒト細胞の感染を引き起こすことができる 、請求項１４に記載の医薬組成物。
19. １９．ＡＴＣＣ受託番号６８１１８を有するｐＬＴＮＦ６、またはそれから誘導 されるウイルス。
20. ２０．ＡＴＣＣ受託番号６８１１９を有するｐＬＩＬ−２６、またはそれから誘 導されるウイルス。
21. ２１．ＡＴＣＣ受託番号６８１２０を有するｐＬＭＤＲ６、またはそれから誘導 されるウイルス。
22. ２２．ＡＴＣＣ受託番号６８１２１を有するｐＵＣ．ＦＶＸＭΔＨＩＩＩ　ＴＮ Ｆ　γ　ｓｉｇ、またはそれから誘導されるウイルス。
23. ２３．成熟ＴＮＦおよび前記成熟ＴＮＦの分泌を増強するそれに関連するシグナ ルペプチドをコードするＤＮＡ配列。
24. ２４．請求項２３に記載のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、 前記シグナルペプチドが実質的にγインターフェロンシグナルペプチドであるＤ ＮＡ配列。
25. ２５．請求項２４のＤＭＡ配列を含んで成る細胞。
26. ２６．請求項２３のＤＮＡ配列によりコードされるＴＮＦ。
27. ２７．請求項２４のＤＮＡ配列によりコードされるＴＮＦ。
28. ２８．ＲＮＡゲノムを含んで成るウイルス粒子であって、該ゲノムが２つの組換 えタンパク質をコードするＲＮＡ配列を含んで成り、そして該ＲＮＡ配列が調節 配列に、およびｇａｇ配列を含んで成るレトロウイルス由来のパッケージング部 位に作用可能に連結されており、前記ゲノムが標的細胞を感染することができる エンベロープタンパク質中に含まれていることを特徴とするウイルス粒子。
29. ２９．前記タンパク質がＴＮＦ，ＩＬ−２およびＭＤＲから成る群から選択され る、請求項２８に記載のウイルス粒子。
30. ３０．一方のタンパク質が細胞に薬剤耐性を付与する、請求項２８に記載のウイ ルス粒子。
31. ３１．前記薬剤耐性がネオマイシンに対する耐性である、請求項３０に記載のウ イルス粒子。
32. ３２．ウイルス粒子ｐＬＴＮＦＳＮ−２２。
33. ３３．ウイルス粒子ｐＬＩＬ２ＳＮ−１６。
34. ３４．ウイルス粒子ｐＬＩＬ２ＳＮ−２０。
35. ３５．動物を癌に対して治療する方法であって、次の段階：ａ）前記動物からＴ ＩＬ細胞を単離し；ｂ）前記ＴＩＬ細胞を、癌を治療するのに有効なタンパク質 をコードする組換えレトロウイルス粒子で感染せしめ；そして ｃ）前記動物に有効量の前記レトロウイルス粒子を投与する、 を含んで成る方法。
36. ３６．前記組換えレトロウイルス粒子が薬剤選択可能マーカーを更に含んで成る 、請求項３５に記載の方法。
37. ３７．前記薬剤選択可能マーカーがネオマイシン耐性である、請求項３６に記載 の方法。
38. ３８．前記癌を治療するのに有効なタンパク質がサイトカインまたはリンホカイ ンから成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
39. ３９．前記タンパク質が多剤耐性タンパク質である、請求項３５に記載の方法。
40. ４０．前記タンパク質がＩＬ−２である、請求項３５に記載の方法。
41. ４１．前記タンパク質がＴＮＦまたはＴＮＦの分泌形である、請求項３５に記載 の方法。
42. ４２．Δ（１→１２）、Δ（１＋１２）およびΔ（１＋１３）から成る群から選 択されたＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューテイン。
43. ４３．前記ＴＮＦ欠失ミューテインがΔ（１→１２）を含んで成る、請求項４２ に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューテイン。
44. ４４．前記ＴＮＦ欠失ミューテインがΔ（１＋１２）を含んで成る、請求項４２ に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューテイン。
45. ４５．前記ＴＮＦ欠失ミューテインがΔ（１＋１３）を含んで成る、請求項４２ に記載のＴＮＦプロホルモンのＴＮＦ欠失ミューテイン。
46. ４６．Δ（１→１２）、Δ（１＋１２）およびΔ（１＋１３）から成る群がら選 択されたＴＮＦミューテインをコードする組換えＤＮＡを含んで成る組換え宿主 細胞。
47. ４７．Δ（１→１２）、Δ（１＋１２）およびΔ（１＋１３）から成る群がら選 択されたＴＮＦミューテインをコードする組換えＤＮＡ。
48. ４８．細胞毒性細胞結合型ＴＮＦプロホルモンミューテインの有効量を動物に投 与することを含んで成る、病気の治療方法。
49. ４９．前記ＴＮＦミューテインがΔ（１→１２）を含んで成る、請求項４８に記 載の方法。
50. ５０．前記ＴＮＦミューテインがΔ（１＋１２）を含んで成る、請求項４８に記 載の方法。
51. ５１．Δ（１→１２）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の組 換え宿主細胞。
52. ５２．Δ（１＋１３）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の組 換え宿主細胞。
53. ５３．Δ（１＋１２）をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４６に記載の組 換え宿主細胞。
54. ５４．正常細胞を実質的に殺すことなく腫瘍細胞を選択的に殺す方法であって、 細胞毒性細胞結合型ＴＮＦプロホルモンミューテインをコードする組換えレトロ ウイルス粒子によりＴＩＬ細胞を感染させ、そして前記腫瘍細胞を有効量の前記 感染ＴＩＬ細胞と接触させることを含んで成る方法。
55. ５５．前記ＴＮＦプロホルモンミューテインがΔ（１→１２）を含んで成る、請 求項５４に記載の方法。
56. ５６．前記ＴＮＦプロホルモンミューテインがΔ（１＋１２）を含んで成る、請 求項５４に記載の方法。