JPS59220189A - ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 - Google Patents
ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌Info
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- JPS59220189A JPS59220189A JP59019524A JP1952484A JPS59220189A JP S59220189 A JPS59220189 A JP S59220189A JP 59019524 A JP59019524 A JP 59019524A JP 1952484 A JP1952484 A JP 1952484A JP S59220189 A JPS59220189 A JP S59220189A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の要約
ひとインタロイキンλ型の生物学的もしくは免疫学的活
性を示すポリペプチドを製造するためのＤＮＡ配列、組
換ＤＮＡ分子およびこれらにより形質転換された宿主、
これらポリペプチドを暗号化する遺伝子、並びにこれら
ＤＮＡ配列５分子、宿主、遺伝子およびポリペプチドを
作成しかつ使用する方法について開示する。
性を示すポリペプチドを製造するためのＤＮＡ配列、組
換ＤＮＡ分子およびこれらにより形質転換された宿主、
これらポリペプチドを暗号化する遺伝子、並びにこれら
ＤＮＡ配列５分子、宿主、遺伝子およびポリペプチドを
作成しかつ使用する方法について開示する。
ＤＮＡ配列は、ひとインタロイキン２型の生物学的もし
くは免疫学的活性を示すポリペプチドを暗号化すること
を特徴とする。適当な宿主において、これらＤＮＡ配列
お上び組換ＤＮＡ分子はひとインタロイキンコ型の免疫
学的もしくは生物学的活性を示す遺伝子およびポリペプ
チドの生産および同定を可能にすると共に、これらを免
疫治療剤および方法に使用しがっＴ−細胞の確立および
長期増殖に使用することを可能にする。
くは免疫学的活性を示すポリペプチドを暗号化すること
を特徴とする。適当な宿主において、これらＤＮＡ配列
お上び組換ＤＮＡ分子はひとインタロイキンコ型の免疫
学的もしくは生物学的活性を示す遺伝子およびポリペプ
チドの生産および同定を可能にすると共に、これらを免
疫治療剤および方法に使用しがっＴ−細胞の確立および
長期増殖に使用することを可能にする。
本発明は、ひとインタロイキンλ様ポリペプチドを製造
するためのＤＮＡＮ列配列換ＤＮＡ分子および製造方法
に関するものである。さらに詳細には、本発明はＤＮＡ
配列および適当な宿主生物におけるその発現に関するも
のである。
するためのＤＮＡＮ列配列換ＤＮＡ分子および製造方法
に関するものである。さらに詳細には、本発明はＤＮＡ
配列および適当な宿主生物におけるその発現に関するも
のである。
ここに記載する組換ＤＮＡ分子は、ひとインタロイキン
λ型の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドを暗号化するＤＮＡ配列を特徴とする。以下の開示
から明らかとなるように、本発明のＤＮＡ配列、組換Ｄ
ＮＡ分子および方法は、各種の医薬およびその他の有益
な産業用途に使用し得るポリペプチドの生産に使用する
ことができる。
λ型の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドを暗号化するＤＮＡ配列を特徴とする。以下の開示
から明らかとなるように、本発明のＤＮＡ配列、組換Ｄ
ＮＡ分子および方法は、各種の医薬およびその他の有益
な産業用途に使用し得るポリペプチドの生産に使用する
ことができる。
インタロイキンλ型（ｒＩＬ−２Ｊ ）はリンホキンで
ある。リンホキンは、ミトゲンによる刺戟に際しリンパ
球で合成される生産物である。
ある。リンホキンは、ミトゲンによる刺戟に際しリンパ
球で合成される生産物である。
これらは可溶性の免疫反応調整化合物である。
多数のリンホキンは、その医薬用途および実験室用途に
対し重要である。たとえば、免疫インタ７エロン（ＩＦ
Ｎ−γ）は抗ウィルス、抗癌および免疫調整活性を有す
るリンホキンである〔たとえば、アール・デポス等、ヌ
クレイツク・アシッド・リサーチ、第７０巻、第２１７
１７−６０／頁（ｔＦｌ、ｚ）”Ｊ。この文献をここに
引用する。
対し重要である。たとえば、免疫インタ７エロン（ＩＦ
Ｎ−γ）は抗ウィルス、抗癌および免疫調整活性を有す
るリンホキンである〔たとえば、アール・デポス等、ヌ
クレイツク・アシッド・リサーチ、第７０巻、第２１７
１７−６０／頁（ｔＦｌ、ｚ）”Ｊ。この文献をここに
引用する。
インタロイキンλ型は、重要かつ有用な生物学的性質を
有する他のリンホキンである〔ギリス等１ イミューノ
ロジカル・レビュー％第ｔＪ巻、第ｔＡＡ−２０９頁（
ｉ ｐ＋ｒｚ ） ）。たとえば、ＩＬ２は、（ａｌ試
験管内において抗原特異性の有効Ｔ−細胞の長期増殖を
刺戟し、（ｂｌ胸腺細胞の有線分裂を促進し、かっ（、
）細胞毒性のＴ−細胞反応性および創出ねずみ牌細胞の
培養物におけるグラーク形成反応を誘発する〔キリスお
よびワトンン、ジャーナル・エキスプリメンタル・メデ
イスン、第１！２巻、第１７０り〜ｌり頁（／９１０）
ｉリュー・リュー・ファジー等、イミューノロジカル・
レビュー、第６３巻、第１２り〜ｔ！頁（ｌりＪ’、２
））。
有する他のリンホキンである〔ギリス等１ イミューノ
ロジカル・レビュー％第ｔＪ巻、第ｔＡＡ−２０９頁（
ｉ ｐ＋ｒｚ ） ）。たとえば、ＩＬ２は、（ａｌ試
験管内において抗原特異性の有効Ｔ−細胞の長期増殖を
刺戟し、（ｂｌ胸腺細胞の有線分裂を促進し、かっ（、
）細胞毒性のＴ−細胞反応性および創出ねずみ牌細胞の
培養物におけるグラーク形成反応を誘発する〔キリスお
よびワトンン、ジャーナル・エキスプリメンタル・メデ
イスン、第１！２巻、第１７０り〜ｌり頁（／９１０）
ｉリュー・リュー・ファジー等、イミューノロジカル・
レビュー、第６３巻、第１２り〜ｔ！頁（ｌりＪ’、２
））。
生物学的性質の結果、インタロイキンλ型を使用して、
免疫系が阻害された癌患者におけるひと白血球抗原の制
限された腫瘍特異性の細胞毒性細胞の補給を、たとえば
胸腺刺戟によって刺戟することができる。したがって、
ＩＬ２による処理は、各種の細菌およびその他の感染に
対しこれらの患者の耐性を増大させる。しげしげ、これ
らの感染は癌治療、特に照射および薬剤治療を複雑化さ
せる。
免疫系が阻害された癌患者におけるひと白血球抗原の制
限された腫瘍特異性の細胞毒性細胞の補給を、たとえば
胸腺刺戟によって刺戟することができる。したがって、
ＩＬ２による処理は、各種の細菌およびその他の感染に
対しこれらの患者の耐性を増大させる。しげしげ、これ
らの感染は癌治療、特に照射および薬剤治療を複雑化さ
せる。
さらに５免疫系を刺戟するＩＬ−の能力は、免疫系の機
能障害に関連する病気、たとえばエイズ（ＡＩＤＳ）、
狼癒、多発性硬化症および関節リューマチ症の治療に有
用である。公表された臨床学的研究は、これらの病気と
’ｌ’ −ＩＪンパ球における異常性または異常抗体の
生成との間の関係奮示している。たとえば、試験管内の
研究が示唆するところでは、免疫系の少なくとも幾つか
の機能は、ＩＬコの投与によってエイズ患者を回復させ
ることができる。さらに、試験管内の研究が示すところ
では、低レベルのＩＬ２は、免疫系のこれら病気の幾つ
かに関連する異常抗体の生成に関係する。
能障害に関連する病気、たとえばエイズ（ＡＩＤＳ）、
狼癒、多発性硬化症および関節リューマチ症の治療に有
用である。公表された臨床学的研究は、これらの病気と
’ｌ’ −ＩＪンパ球における異常性または異常抗体の
生成との間の関係奮示している。たとえば、試験管内の
研究が示唆するところでは、免疫系の少なくとも幾つか
の機能は、ＩＬコの投与によってエイズ患者を回復させ
ることができる。さらに、試験管内の研究が示すところ
では、低レベルのＩＬ２は、免疫系のこれら病気の幾つ
かに関連する異常抗体の生成に関係する。
さらに、公表された研究によれば、ＩＬ２は広範囲の癌
の治療に有用であると信じられる。
の治療に有用であると信じられる。
さらに、固体腫瘍、たとえば肺癌、結腸−大腸癌および
胸痛を治療するための補助治療として特に廟用である。
胸痛を治療するための補助治療として特に廟用である。
また、ＩＬ、２は単独でまたは補助治療と共に陰部庖疹
およびその他のウィルス病を治療するのにも有用である
。
およびその他のウィルス病を治療するのにも有用である
。
さらに、インタ７エロンの抗癌活性が高められ、かつＩ
Ｌ２を必要とさえすることが示されている。例数なら、
ＩＬ２はインタ７エロンの抗癌活性における主原因であ
ると考えられる「天然キラー」細胞の全活性を刺戟する
がらでアル〔シー・ニス・ヘニー、ネイチャー誌、第コ
タ１巻、第３３３〜３ｇ頁（／りｇｉ）〕。また、ＩＬ
、ｚは幾種かの免疫病、たとえば多発性硬化症の特徴で
ある適当な抑圧細胞の欠陥を防止するにも有用でおる。
Ｌ２を必要とさえすることが示されている。例数なら、
ＩＬ２はインタ７エロンの抗癌活性における主原因であ
ると考えられる「天然キラー」細胞の全活性を刺戟する
がらでアル〔シー・ニス・ヘニー、ネイチャー誌、第コ
タ１巻、第３３３〜３ｇ頁（／りｇｉ）〕。また、ＩＬ
、ｚは幾種かの免疫病、たとえば多発性硬化症の特徴で
ある適当な抑圧細胞の欠陥を防止するにも有用でおる。
最後に、ＩＬ２は診断および治療目的でＴ細胞の培養物
の確立および長期増殖についても使用される。たとえば
、同型細胞毒性Ｔ細胞の選択を可能にするため、現在で
は癌細胞が使用されている。これらのＴ細胞を試験管内
で培養し、患者に注射して腫瘍を後退させる。
の確立および長期増殖についても使用される。たとえば
、同型細胞毒性Ｔ細胞の選択を可能にするため、現在で
は癌細胞が使用されている。これらのＴ細胞を試験管内
で培養し、患者に注射して腫瘍を後退させる。
生化学的レベルにおいて、ＩＬ、２は約／ｊＯＯＯダル
トンの分子量を有しかつグリコジル化されていると信じ
られる。グリコジル化されていると仮定すれば、これは
１００乃至１３０個のアミノ酸を有するはずである。Ｉ
Ｌ２はカラム上で若干異質的に作用する。ＳＯＳゲルに
おいて、恐らくサブ単位であるλつのバンド（／、２０
００および／３０００ダルトン）が観察される〔リュー
・ダプリュウ・マイエルおよびアール・シー・ガロ、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−Φサイエンス
、ＵＳＡ、第７７巻、第ｔｉ３４ｔ−３ｇ頁、（ｌりｇ
ｏ））。さらに、ＩＬ２は１種より多い化合物である。
トンの分子量を有しかつグリコジル化されていると信じ
られる。グリコジル化されていると仮定すれば、これは
１００乃至１３０個のアミノ酸を有するはずである。Ｉ
Ｌ２はカラム上で若干異質的に作用する。ＳＯＳゲルに
おいて、恐らくサブ単位であるλつのバンド（／、２０
００および／３０００ダルトン）が観察される〔リュー
・ダプリュウ・マイエルおよびアール・シー・ガロ、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−Φサイエンス
、ＵＳＡ、第７７巻、第ｔｉ３４ｔ−３ｇ頁、（ｌりｇ
ｏ））。さらに、ＩＬ２は１種より多い化合物である。
これは白血球インタフエロン（ＩＦＮ−α）と同様に、
ｍ々ナレヘルの免疫治療活性を示す７群の生産物である
。
ｍ々ナレヘルの免疫治療活性を示す７群の生産物である
。
また、ＩＬ、２は多形質でもある。たとえば、特定個体
の細胞はより一般的なＩＬ、２分類内のＩＬ、２種類を
生産することができ、これら種類はそれが属する種類の
原型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異なっ
ている。
の細胞はより一般的なＩＬ、２分類内のＩＬ、２種類を
生産することができ、これら種類はそれが属する種類の
原型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異なっ
ている。
リンホキンの７種であるＩＦＮ−ｒは、遺伝子工学の応
用によって多量に生産されている〔アール・デボス等、
上記〕。ＩＬ２はこの方法では生産されていない。
用によって多量に生産されている〔アール・デボス等、
上記〕。ＩＬ２はこの方法では生産されていない。
しかしながら、Ｉｌコの多くの重要な免疫治療活性のた
め、並びに診断および治療目的に対するＴ細胞の確立お
よび長期増殖におけるその必要用途のため、Ｉｌコの大
規模生産に関し種々の方法および手段が研究されている
が、まだ成功を収めたものはない。
め、並びに診断および治療目的に対するＴ細胞の確立お
よび長期増殖におけるその必要用途のため、Ｉｌコの大
規模生産に関し種々の方法および手段が研究されている
が、まだ成功を収めたものはない。
本発明は、ＩＬ２を暗号化するＤＮＡ配列を位置決定し
かつ同定し、これら配列によって適当な宿主を形質転換
させ、それによりひとインタロイキンλ型の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドの生産に使用す
るＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子およびその使用方法を提
供することにより、上記問題を解決する。
かつ同定し、これら配列によって適当な宿主を形質転換
させ、それによりひとインタロイキンλ型の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドの生産に使用す
るＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子およびその使用方法を提
供することにより、上記問題を解決する。
本発明によれば、免疫治療剤および方法並びにＴ細胞の
確立および長期増殖に使用するための、Ｉｌコの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ること
ができる。本発明は、従来不可能であった量および方法
でこれらポリペプチドを製造することを可能にする。
確立および長期増殖に使用するための、Ｉｌコの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ること
ができる。本発明は、従来不可能であった量および方法
でこれらポリペプチドを製造することを可能にする。
以下の開示から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列お
よび組換ＤＮＡ分子は、ＩＬ、２の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを適当な宿主により生産
することに向けられる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子の複製は、これら
ポリペプチドを暗号化する遺伝子を多量に製造すること
を可能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子
梅漬および性質は、かくして容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主中で生産された
ままで或いは適当に誘４または改変した後に、これら生
産物自身の生成を検出しかつ改善するだめの組成物およ
び方法、免疫治療剤および方法に使用するための組成物
および方法、並びにＴ細胞の確立および長期増殖のため
の組成物および方法に使用するのに有用である。
よび組換ＤＮＡ分子は、ＩＬ、２の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを適当な宿主により生産
することに向けられる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子の複製は、これら
ポリペプチドを暗号化する遺伝子を多量に製造すること
を可能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子
梅漬および性質は、かくして容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主中で生産された
ままで或いは適当に誘４または改変した後に、これら生
産物自身の生成を検出しかつ改善するだめの組成物およ
び方法、免疫治療剤および方法に使用するための組成物
および方法、並びにＴ細胞の確立および長期増殖のため
の組成物および方法に使用するのに有用である。
上記から判かるように、本発明の基本的局面は、ＩＬ２
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを
暗号化する仁とを特徴とするＤＮＡ配列を提供すること
であり、或いはＤＮＡ配列の集団からこの種の配列を少
なくとも選択し得ることであり、これらＤＮＡ配列はＤ
ＮＡ挿入物ｂｌＬ２−０．ｂＩＬ２−／、前記ＤＮＡ挿
入物のいずれかにヒブリド化しがっＩＬ、ｚを暗号化す
るＤＮＡ配列、および前記ＤＮＡ配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するＤＮＡ配列よりなる群から選択される。本発明の
配列はさらに、宿主においてＩＬ、２およびＩｌ、２様
ポリペプチドの生産を可能にすることを特徴とする。
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを
暗号化する仁とを特徴とするＤＮＡ配列を提供すること
であり、或いはＤＮＡ配列の集団からこの種の配列を少
なくとも選択し得ることであり、これらＤＮＡ配列はＤ
ＮＡ挿入物ｂｌＬ２−０．ｂＩＬ２−／、前記ＤＮＡ挿
入物のいずれかにヒブリド化しがっＩＬ、ｚを暗号化す
るＤＮＡ配列、および前記ＤＮＡ配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するＤＮＡ配列よりなる群から選択される。本発明の
配列はさらに、宿主においてＩＬ、２およびＩｌ、２様
ポリペプチドの生産を可能にすることを特徴とする。
本発明を一層よく理解し得るよう以下詳細に説明する。
以下の説明において次の用語を使用する：ヌクレオチド
： 糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素複素環塩基と
よりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ一単位。この塩
基はグリコシド炭素（ペントースのｌ′炭素）を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性化され
る。≠種のＤＮＡ塩基はアデニン（ｒＡＪ ）、グアニ
ン（ｒＧＪ ）、シトシン（ｒｃＪ）、およびチミン（
ｒＴＪ ）である。
： 糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素複素環塩基と
よりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ一単位。この塩
基はグリコシド炭素（ペントースのｌ′炭素）を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性化され
る。≠種のＤＮＡ塩基はアデニン（ｒＡＪ ）、グアニ
ン（ｒＧＪ ）、シトシン（ｒｃＪ）、およびチミン（
ｒＴＪ ）である。
弘種のＲＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵ
Ｊ ）である。
Ｊ ）である。
ＤＮＡ配列： 瞬接ペントースと３′炭素とｊ′炭素と
の間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
の間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
ｉ上ヱ： ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（
トリプレット）のＤＮＡ配列。
または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（
トリプレット）のＤＮＡ配列。
たとえば、ヌクレオチドトリプレットＴＴＡ。
ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおｊびｃＴＧＵ７ミノ
酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ ）を暗号化し、ＴＡＧ。
酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ ）を暗号化し、ＴＡＧ。
ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、またＡＴＧ
は翻訳開始信号である。
は翻訳開始信号である。
読 枠： ｍＲＮＡをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しな
ければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡ
ＡＧは３つの読枠もしくは相で翻訳することができる。
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しな
ければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡ
ＡＧは３つの読枠もしくは相で翻訳することができる。
これら相のそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を与える
：ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ
−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＯ工９旦エエ９１ムΔ
Ｇ −−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ −（停止）ポリペプチド＝
瞬接アミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基との間でペ
プチド結合により互いに接続されたアミノ酸の線状列。
：ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ
−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＯ工９旦エエ９１ムΔ
Ｇ −−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ −（停止）ポリペプチド＝
瞬接アミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基との間でペ
プチド結合により互いに接続されたアミノ酸の線状列。
ゲノム： 細胞またはウィルスの全ＤＮＡ０これは特に
物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペ
レータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシャインーダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペ
レータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシャインーダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
遺伝子： 雛型またはメツセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮ
ＡＪ ）を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ
酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
ＡＪ ）を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ
酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
転 写： 遺伝子からｍ ＲＮ Ａを生産する過程。
翻 訳： ｍＲＮＡからポリペプチドを生産する過程
。
。
発 現＠ ＤＮＡ配列もしくは遺伝子によりポリペプ
チドを生産するために受ける過程。こ ゛れは転写
と翻訳との組合せである。
チドを生産するために受ける過程。こ ゛れは転写
と翻訳との組合せである。
プラスミド： プラスミドが宿主細胞で複製されるよう
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖ＤＮＡ配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのＤＮＡの結果として変化し、或い
は形質転換することができる。たとえば、テトラサイク
リン耐性（Ｔｅｔ）に対する遺伝子を有するプラスミド
は、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラ
サイクリンに対し耐性の細胞まで形質転換することがで
きる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転
換体」と呼ぶ。
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖ＤＮＡ配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのＤＮＡの結果として変化し、或い
は形質転換することができる。たとえば、テトラサイク
リン耐性（Ｔｅｔ）に対する遺伝子を有するプラスミド
は、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラ
サイクリンに対し耐性の細胞まで形質転換することがで
きる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転
換体」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ： 細菌性ウィルス
であって、その多くは蛋白質エンベロブまたはコート（
「カプシド」）にカプセル化されたＤＮＡ配列よりなっ
ている。
であって、その多くは蛋白質エンベロブまたはコート（
「カプシド」）にカプセル化されたＤＮＡ配列よりなっ
ている。
クローン化ベヒクル： 宿主細胞において複製しうるプ
ラスミド、７アージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列で
あって、これはＤＮＡの本質的生物学機能、たとえば複
製コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、或いはプロモ
ータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前記
ＤＮＡ配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の
同定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイク
リン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個もしくは
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
ラスミド、７アージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列で
あって、これはＤＮＡの本質的生物学機能、たとえば複
製コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、或いはプロモ
ータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前記
ＤＮＡ配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の
同定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイク
リン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個もしくは
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化： 前記１種の生物もしくは配列から誘導さ
れる生物またはＤＮＡ配列の集落を無性繁殖によって得
る過程。
れる生物またはＤＮＡ配列の集落を無性繁殖によって得
る過程。
組換ＤＮＡ分子またはヒプリドＤＮＡ： 生細胞の外
部で端部結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染し
てそこに維持される能力を有する異なるゲノムからのＤ
ＮＡ断片よりなる分子。
部で端部結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染し
てそこに維持される能力を有する異なるゲノムからのＤ
ＮＡ断片よりなる分子。
発現制御配列： ＤＮＡ配列もしくは遺伝子の発現を、
これら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌク
レオチドの配列。これらはファージλのｌａｅ系、
ｋｒｐ系、主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコ
ート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは成熟核
細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御すること
が知られたその他の配列またはそれらの組合せを包含す
る。
これら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌク
レオチドの配列。これらはファージλのｌａｅ系、
ｋｒｐ系、主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコ
ート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは成熟核
細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御すること
が知られたその他の配列またはそれらの組合せを包含す
る。
ＩＬ、２型： Ｉ１２の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原ＩＬ、
２のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、或いは原Ｉ
Ｌコのアミノ酸の全部を含まないこともできる。
性を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原ＩＬ、
２のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、或いは原Ｉ
Ｌコのアミノ酸の全部を含まないこともできる。
インタロイキンλ型の生物学的分析
（ａ）原理
インタロイキンλ型（ＩＬ、２）またはＴ−細胞成長因
子は可溶性化合物であって、ミトゲンのクローン化誘導
体または抗原刺戟されたＴ細胞の長期培養を可能にする
〔デー・ニー・モルガン等、サイエンス誌、第１り３巻
、第７００７−０ざ頁（ｌり７１））。これら細胞の成
長および増殖は、投与方式に応じて培地中のＩＬ２の存
在に依存する。したがって、増殖量の測定（すなわち、
トリチル化チミジンの混入による）は、培地中のＩＬ、
２の濃度を示唆する。
子は可溶性化合物であって、ミトゲンのクローン化誘導
体または抗原刺戟されたＴ細胞の長期培養を可能にする
〔デー・ニー・モルガン等、サイエンス誌、第１り３巻
、第７００７−０ざ頁（ｌり７１））。これら細胞の成
長および増殖は、投与方式に応じて培地中のＩＬ２の存
在に依存する。したがって、増殖量の測定（すなわち、
トリチル化チミジンの混入による）は、培地中のＩＬ、
２の濃度を示唆する。
（ｂ） 目的細胞
「リンホプレプ」 （ファルマシア社）によりひとの末
梢血液から単一核細胞を単離し、これら細胞を（中間層
において）、２回洗浄し、そしてこれらを５ｘ１０
ａ胞／祷の濃度にてＲＰＭＩ／６００培地で培養し、こ
の培地には１％Ｌ−グルタミンと抗性物質（下記参照）
とｉｏ％胎児牛血清とを補充した。次いで、これら細胞
を１０μｑ７ｍｉ’ｔでのフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）（ウェルカム社）により３７℃で、２０時間刺戟し
、細胞を集めて激しく洗浄し、そしてこれらをＰＨＡを
含まない培地中でさらに３日間培養した。グ日目に、こ
れら細胞に対し、部分精製したひとＩＬコ調製物（ＰＨ
Ａ刺戟した牌細胞の培地から得られたｊＯ〜ｇｏチの（
ＮＨ４）２８０４沈澱物を初期容量のタコ。まで再溶解
し、かつ燐酸塩緩衝液に対し徹底的に透析したもの〔モ
ル ゛ガン等、上記〕）の７％を補給した。次いで
、これら細胞を３〜Ｖ日毎にｌ：コの割合で分割した。
梢血液から単一核細胞を単離し、これら細胞を（中間層
において）、２回洗浄し、そしてこれらを５ｘ１０
ａ胞／祷の濃度にてＲＰＭＩ／６００培地で培養し、こ
の培地には１％Ｌ−グルタミンと抗性物質（下記参照）
とｉｏ％胎児牛血清とを補充した。次いで、これら細胞
を１０μｑ７ｍｉ’ｔでのフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）（ウェルカム社）により３７℃で、２０時間刺戟し
、細胞を集めて激しく洗浄し、そしてこれらをＰＨＡを
含まない培地中でさらに３日間培養した。グ日目に、こ
れら細胞に対し、部分精製したひとＩＬコ調製物（ＰＨ
Ａ刺戟した牌細胞の培地から得られたｊＯ〜ｇｏチの（
ＮＨ４）２８０４沈澱物を初期容量のタコ。まで再溶解
し、かつ燐酸塩緩衝液に対し徹底的に透析したもの〔モ
ル ゛ガン等、上記〕）の７％を補給した。次いで
、これら細胞を３〜Ｖ日毎にｌ：コの割合で分割した。
培養物を約２〜３週問直いた後、これらからの生存細胞
を洗浄し、かつこれら細胞を弘θ％胎児牛血清とｉｏ％
ジメチルスルホキシドとを含有するＩＬλを含まない培
地中で２ ｘ ／ ０’細胞／祷の最終濃度まで培養し
た。その直後に、細胞を１ｍｌのガラス瓶中で、調節速
度のフリーザ（クリオンン社）およびｚ’ｃ／ｍｉｎ、
の冷却速度を用いて一４／−ＪＴ、まで凍結させ、次い
で急速に−ｒＯ℃まで凍結させた。これら目的の細胞を
液体窒素中で保存した〔グラマツキ等、ジャーナル・イ
ミュノロジカル・メソッド、第５３巻、第２０２〜．２
０頁（ｌりざコ）〕。これら細胞を使用する直前に、こ
れらを３７℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段階的
に混合し、そして洗浄した。調製した細胞の生存度をチ
ロール青排除によって検査した。
を洗浄し、かつこれら細胞を弘θ％胎児牛血清とｉｏ％
ジメチルスルホキシドとを含有するＩＬλを含まない培
地中で２ ｘ ／ ０’細胞／祷の最終濃度まで培養し
た。その直後に、細胞を１ｍｌのガラス瓶中で、調節速
度のフリーザ（クリオンン社）およびｚ’ｃ／ｍｉｎ、
の冷却速度を用いて一４／−ＪＴ、まで凍結させ、次い
で急速に−ｒＯ℃まで凍結させた。これら目的の細胞を
液体窒素中で保存した〔グラマツキ等、ジャーナル・イ
ミュノロジカル・メソッド、第５３巻、第２０２〜．２
０頁（ｌりざコ）〕。これら細胞を使用する直前に、こ
れらを３７℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段階的
に混合し、そして洗浄した。調製した細胞の生存度をチ
ロール青排除によって検査した。
（０） 微量分析
ギリス等、ジャーナル・イミューノロジー、第７２０巻
、第２０２７〜３．２員（／り７ｇ） により実質的に
記載されたＩＬ２微量分析を行なった。先ず、１００μ
ｌのＩＬ２試料をりを穴のミクロ測定板（ファルコン社
）中へ１１次にｌ：２希釈した（ＲＰＭＩ ７７≠ｏ、
ｉｏ％胎児牛血清、／％Ｌ−グルタミンおよび抗生物質
、下記参照）。次いで、目的細胞をコｘ１０ 細胞／
ゴの濃度で懸濁し、１００μｌの細胞を穴へ約ｕ Ｘ
／ ０’細胞／穴の最終濃度まで加えた。
、第２０２７〜３．２員（／り７ｇ） により実質的に
記載されたＩＬ２微量分析を行なった。先ず、１００μ
ｌのＩＬ２試料をりを穴のミクロ測定板（ファルコン社
）中へ１１次にｌ：２希釈した（ＲＰＭＩ ７７≠ｏ、
ｉｏ％胎児牛血清、／％Ｌ−グルタミンおよび抗生物質
、下記参照）。次いで、目的細胞をコｘ１０ 細胞／
ゴの濃度で懸濁し、１００μｌの細胞を穴へ約ｕ Ｘ
／ ０’細胞／穴の最終濃度まで加えた。
これらミクロ測定板を空気中ｓ％ｃｏ２の加湿雰囲気に
おいて３７℃で２弘時間培養し、Ｏ，ＳμＣ１のＨ５−
標識したチミジン（アメルシャム社。
おいて３７℃で２弘時間培養し、Ｏ，ＳμＣ１のＨ５−
標識したチミジン（アメルシャム社。
、２０〜３０ Ｃｉ ７ｍＭ ）を各ミクロ測定板の穴
へ加え、そして細胞をさらに５時間培養した。次いで、
培養物をガラスフィルタ片の上へ回収しくセル−ハーベ
スタ、ＭＡＳＨＱ型を用いる）、かつ液体シンチレーシ
ョンカウンターによってＨ３−チミジン混入量を測定し
た。
へ加え、そして細胞をさらに５時間培養した。次いで、
培養物をガラスフィルタ片の上へ回収しくセル−ハーベ
スタ、ＭＡＳＨＱ型を用いる）、かつ液体シンチレーシ
ョンカウンターによってＨ３−チミジン混入量を測定し
た。
（ｄ）定 量
ひとＩＬ、２標準試料を用いて、各試験試料の相対活性
を決定した。この標準（任意に選択したひとＩＬ２含肩
の上澄液）はｉｏｏ単位／νを含有するものと規定した
。これはＨ３−チミジン吸収により測定して、／：４Ｚ
−／：１の希釈率まで最大の増殖を誘発する。一般に、
標準曲線の直線的下降部分の中央において、この試料の
最大活性の３０％が観察された。
を決定した。この標準（任意に選択したひとＩＬ２含肩
の上澄液）はｉｏｏ単位／νを含有するものと規定した
。これはＨ３−チミジン吸収により測定して、／：４Ｚ
−／：１の希釈率まで最大の増殖を誘発する。一般に、
標準曲線の直線的下降部分の中央において、この試料の
最大活性の３０％が観察された。
さらに、一連の希釈物において各試料を試験し、それら
の力価をグラフ分析によって計算した。次いで、各試料
の活性を式〔サタドラー等、ジャーナル・イミュノロジ
ー、第１２ｇ巻、第１ｔ２０〜２を頁（／り♂、２））
： 逆タイタ を用いて単位に変換した。
の力価をグラフ分析によって計算した。次いで、各試料
の活性を式〔サタドラー等、ジャーナル・イミュノロジ
ー、第１２ｇ巻、第１ｔ２０〜２を頁（／り♂、２））
： 逆タイタ を用いて単位に変換した。
本発明の方法に使用したＲＮＡは、ミトゲン刺戟したＤ
との牌細胞から抽出した。提供された牌細胞は、単一供
与体から多量の免疫系細胞を供給するという利点を有し
、さらにひと末梢血液リンパ球により生成される量より
も多い量でインタロイキンコを生成するという利点を有
する〔ニー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメン
タル・イミュノロジー＊ 第４’ ｐ 巻、第、２６２
〜２６９頁（／りざ／）〕。
との牌細胞から抽出した。提供された牌細胞は、単一供
与体から多量の免疫系細胞を供給するという利点を有し
、さらにひと末梢血液リンパ球により生成される量より
も多い量でインタロイキンコを生成するという利点を有
する〔ニー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメン
タル・イミュノロジー＊ 第４’ ｐ 巻、第、２６２
〜２６９頁（／りざ／）〕。
（、） ひと牌細胞の単離
外科部門から得られたひと牌臓勿無ｍフラスチツク袋中
に入れて実験室１で運び、実験室内において無菌カラス
皿に移した。無菌解剖鋏によって牌臓の外膜を除去し、
ｊＯｎｈ’の牌臓組織を切除した。この組織をプラスチ
ックベトリ皿（直径／ｊ［ｓ）に入れ、さらに小さい片
（０，ｊ鍋３まで）に切断した。約１０ｍ１のＲＰＭＴ
／Ａ４ｔＯ培地（ギブコ社）Ｃ２Ｆｉ／ｌのＮａＨＣ
Ｏ５と、２０ｍＭのＨＥＰＥＳとを補充したもの）を添
加した後、２ｒｎｌプラスチツク注射器からの棒の端部
で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分を弛緩させた。
に入れて実験室１で運び、実験室内において無菌カラス
皿に移した。無菌解剖鋏によって牌臓の外膜を除去し、
ｊＯｎｈ’の牌臓組織を切除した。この組織をプラスチ
ックベトリ皿（直径／ｊ［ｓ）に入れ、さらに小さい片
（０，ｊ鍋３まで）に切断した。約１０ｍ１のＲＰＭＴ
／Ａ４ｔＯ培地（ギブコ社）Ｃ２Ｆｉ／ｌのＮａＨＣ
Ｏ５と、２０ｍＭのＨＥＰＥＳとを補充したもの）を添
加した後、２ｒｎｌプラスチツク注射器からの棒の端部
で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分を弛緩させた。
次いで、この懸濁物を約！ＯｍｌのＲＰＭＩ ／６≠Ｏ
培地で希釈し、そして得られた懸濁物を充分に混合した
。次いで１組織および細胞懸濁物を無菌金属ＦＦｉ （
Ｉ ｘ ｏ、ｇ 関／薗）に移して、液体を他のプラス
チックペトリ皿に排液した。次いで、この組織ｔｌ−篩
を通して元のグラスチック皿に戻し、そして前記と同様
に砕きかつ濾過した。最後に、全細胞懸濁物を０．６１
のプラスチック管へ注ぎ入れた。この手順を全牌臓が調
製されるまで新鮮な片につき反復した。
培地で希釈し、そして得られた懸濁物を充分に混合した
。次いで１組織および細胞懸濁物を無菌金属ＦＦｉ （
Ｉ ｘ ｏ、ｇ 関／薗）に移して、液体を他のプラス
チックペトリ皿に排液した。次いで、この組織ｔｌ−篩
を通して元のグラスチック皿に戻し、そして前記と同様
に砕きかつ濾過した。最後に、全細胞懸濁物を０．６１
のプラスチック管へ注ぎ入れた。この手順を全牌臓が調
製されるまで新鮮な片につき反復した。
プラスチック管の底部に凝集して濃厚沈澱物を形成した
死細胞の大部分を、再び金属篩による懸濁物の濾過によ
って除去した。次いで、細胞懸濁物をシリコーン処理し
た１００ｔｎｌの無菌円錐カラス遠沈管に移し、この管
の底部または懸濁物の表面に存在する凝集物を除去した
。
死細胞の大部分を、再び金属篩による懸濁物の濾過によ
って除去した。次いで、細胞懸濁物をシリコーン処理し
た１００ｔｎｌの無菌円錐カラス遠沈管に移し、この管
の底部または懸濁物の表面に存在する凝集物を除去した
。
次いで、室温にてり００ｘｇで１０分間遠心分離するこ
とにより細胞を集め、これら細胞を７０倍容量の冷トリ
ス−ＮＨ４Ｃ１（０，♂３チＮＨａ Ｃ１り部とトリス
−ＨＣＪ ７部との混合物、コ０−Ａ Ｉ ／ｌ 、
Ｐ）（７，，２）溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶解
させた。ｔ℃にて７０分間後、底部に凝集した全ての死
細胞を除去し、白色細胞を集め、そしてＲＰＭＩ ｔｔ
ｏｏ培地で少なくとも２回洗浄した。次いで、細胞を完
全培地（０，０３％ Ｌ−グルタミンと／ ００１Ｊ／
Ｍペニシリンと／ ００μｆｉ／ＦＩＬＥのストレプト
マイシンと２ｊμｇ／ｍｌのネオマイシンとｊｘｌｏ−
５Ｍのβ−メルカプトエタノールと１０％胎児牛血清と
を補充したＲＰＭＩ／ｌ≠Ｏ培地）へ移して２−ＩＸ／
θ６細１ｆｆ！／＃Ｉ７の濃度にした。
とにより細胞を集め、これら細胞を７０倍容量の冷トリ
ス−ＮＨ４Ｃ１（０，♂３チＮＨａ Ｃ１り部とトリス
−ＨＣＪ ７部との混合物、コ０−Ａ Ｉ ／ｌ 、
Ｐ）（７，，２）溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶解
させた。ｔ℃にて７０分間後、底部に凝集した全ての死
細胞を除去し、白色細胞を集め、そしてＲＰＭＩ ｔｔ
ｏｏ培地で少なくとも２回洗浄した。次いで、細胞を完
全培地（０，０３％ Ｌ−グルタミンと／ ００１Ｊ／
Ｍペニシリンと／ ００μｆｉ／ＦＩＬＥのストレプト
マイシンと２ｊμｇ／ｍｌのネオマイシンとｊｘｌｏ−
５Ｍのβ−メルカプトエタノールと１０％胎児牛血清と
を補充したＲＰＭＩ／ｌ≠Ｏ培地）へ移して２−ＩＸ／
θ６細１ｆｆ！／＃Ｉ７の濃度にした。
（ｂ） ミトゲンによるひと牌細胞の刺戟上記細胞懸
濁物（ｓｒ％／ｘ１０ 細胞）を遠心分離フラスコに
移し、フィトヘマグルチニン（ｒＰＨＡＪ ）（ウェル
カム社）をｉｏμｇ／ｄの濃度まで加え、或いは０．０
ｇ％ ＰＨＡ−Ｐ（ディフコ社）およびｉ ０ ｎＪｉ
Ｔ ／ｍｌの／ｊ−０テトラデカノイルホルボール−１
３−アセテ−） （ｒＴＰＡＪ ）（ビー・エル・バイ
オケミカルス社）を加えた。培養物上方の雰囲気を５％
Ｃ０２の気体混合物で飽和した後−懸濁物を３７℃で２
０時間ゆっくり攪拌した。
濁物（ｓｒ％／ｘ１０ 細胞）を遠心分離フラスコに
移し、フィトヘマグルチニン（ｒＰＨＡＪ ）（ウェル
カム社）をｉｏμｇ／ｄの濃度まで加え、或いは０．０
ｇ％ ＰＨＡ−Ｐ（ディフコ社）およびｉ ０ ｎＪｉ
Ｔ ／ｍｌの／ｊ−０テトラデカノイルホルボール−１
３−アセテ−） （ｒＴＰＡＪ ）（ビー・エル・バイ
オケミカルス社）を加えた。培養物上方の雰囲気を５％
Ｃ０２の気体混合物で飽和した後−懸濁物を３７℃で２
０時間ゆっくり攪拌した。
次いで、上記と同様にＩＬ２依存性のひと末梢血液リン
パ球によるＨ３標識チミジンの吸収を測定して、ＩＬ２
活性につき懸濁物を分析した。
パ球によるＨ３標識チミジンの吸収を測定して、ＩＬ２
活性につき懸濁物を分析した。
ＰＨＡ／ＴＰＡ誘発された牌細胞を遠心分離により集め
、これらを冷ＰＢＳで洗浄した。これらの誘発牌細胞か
ら全ＲＮＡを単離するため、これら細胞を直ちにチオシ
アン酸グアニジウムの溶液で溶菌させた〔ジエー・エム
・チャーブウィン等、「リボヌクレアーゼの豊富々原料
からの生物学上活性なリボ核酸の単離」、）（イオヶミ
ストリー、第ｉｔ巻、第！λりを一タタ頁（／り７り）
〕。牌臓１個当り平均して３Ｑダの全ＲＮＡを得た。次
いで、とのＲＮＡをグアニジウム塩酸塩溶液からの沈澱
によりかつオリゴ（ｄＴ）セルロース上でのクロマトグ
ラフィーによって精製した〔ジエー・エム・チャーブウ
ィン等、上記〕。この段階で、約／〜のＲＮＡ（その内
６０％以上がｒＲＮＡである）が残留した。
、これらを冷ＰＢＳで洗浄した。これらの誘発牌細胞か
ら全ＲＮＡを単離するため、これら細胞を直ちにチオシ
アン酸グアニジウムの溶液で溶菌させた〔ジエー・エム
・チャーブウィン等、「リボヌクレアーゼの豊富々原料
からの生物学上活性なリボ核酸の単離」、）（イオヶミ
ストリー、第ｉｔ巻、第！λりを一タタ頁（／り７り）
〕。牌臓１個当り平均して３Ｑダの全ＲＮＡを得た。次
いで、とのＲＮＡをグアニジウム塩酸塩溶液からの沈澱
によりかつオリゴ（ｄＴ）セルロース上でのクロマトグ
ラフィーによって精製した〔ジエー・エム・チャーブウ
ィン等、上記〕。この段階で、約／〜のＲＮＡ（その内
６０％以上がｒＲＮＡである）が残留した。
得られたボｌＪＡ＋ＲＮＡを無菌水に溶解させ、混合物
を７ｆ’Ｃにて７分間加熱し、そしてこれを１０ｍＭ）
リス−ＨｅＩ！（ｐＨ７，１）と／ ｍＭＥＤＴＡとに
おける・タ〜コ０チ蔗糖濃度勾配において分別し、その
際濃度勾配当りｌ−−？〜のＲＮＡとベックマンＳＷ弘
／型Ｔｉロータにおけるｔ℃でｕＯ，０００ｒｐｍの１
６時間にわたる遠心分離とを用いた。２ｊ個のフラクシ
ョン（それぞれ０．１０をｌ５ＣＯｆｉ度分別装置に集
め、光学密度（２！ ＩＩ ｎｍ ） ｔ一連続的に測
定した。
を７ｆ’Ｃにて７分間加熱し、そしてこれを１０ｍＭ）
リス−ＨｅＩ！（ｐＨ７，１）と／ ｍＭＥＤＴＡとに
おける・タ〜コ０チ蔗糖濃度勾配において分別し、その
際濃度勾配当りｌ−−？〜のＲＮＡとベックマンＳＷ弘
／型Ｔｉロータにおけるｔ℃でｕＯ，０００ｒｐｍの１
６時間にわたる遠心分離とを用いた。２ｊ個のフラクシ
ョン（それぞれ０．１０をｌ５ＣＯｆｉ度分別装置に集
め、光学密度（２！ ＩＩ ｎｍ ） ｔ一連続的に測
定した。
ＲＮＡを通過させた約Ｊ ００ Ｉｌｌ！のオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースの並行濃度勾配における遠心分離の後に
、ｓ８およびｌｌＳのｒＲＮＡピーク（２１８ｒＲＮＡ
はチューブの底に存在した）の高さを測定することによ
り単離ＲＮＡの品質を分析した。
Ｔ）セルロースの並行濃度勾配における遠心分離の後に
、ｓ８およびｌｌＳのｒＲＮＡピーク（２１８ｒＲＮＡ
はチューブの底に存在した）の高さを測定することによ
り単離ＲＮＡの品質を分析した。
各フラクション中のＲＮＡを−２０℃にて少なくとも２
時間沈澱させ、遠心分離（ｉｏｏｏ。
時間沈澱させ、遠心分離（ｉｏｏｏ。
ｒｐｍ、 ３０ ｍｉｎ 、−２θ℃、ＨＢ弘ツルバー
ル型モータ）によって集め、７０％エタノールで洗浄し
た。このＲＮＡを乾燥させた後、これをコ５−ｓｏｔｔ
ｔの無菌水中に溶解させた。
ル型モータ）によって集め、７０％エタノールで洗浄し
た。このＲＮＡを乾燥させた後、これをコ５−ｓｏｔｔ
ｔの無菌水中に溶解させた。
ポリＡ＋ ＲＮ Ａ蔗糖濃度勾配フラクションのそれぞ
れを小麦胚芽抽出物（全容量ｔｏｐｌ）においてＳ −
メチオニンの存在下で翻訳し〔ピー・ロバーツおよびビ
ー・エム・パターンン、「市販の小麦胚芽からの無細胞
系におけるＴＭＶＲＮＡおよびうさぎグロビンｊＳ Ｒ
ＮＡの効率的翻訳」、グロシーデイング・ナショナル争
アカデミ−・ザイエンス・ＵＳＡ、第７θ巻、第一３３
０〜３４’頁（ｌり７３）〕、そして合成された蛋白質
をｌコ、ｊチの８ＤＢ−ポリアクリルアミドゲル上で分
析した〔ニー・ケーφラメｌハ［バクテリオファージＴ
μの頭部を組込む際の構造蛋白質の開裂］、ネイチャー
誌、第２２７巻、第６ざ０−４６頁（ｌり７０）〕。こ
の力式における大型ポリペプチドの合成娃１、ここで試
製されたＲＮＡフラクションが試験管内翻訳の抑制剤を
含まないＲＮＡを含有したことを示した。
れを小麦胚芽抽出物（全容量ｔｏｐｌ）においてＳ −
メチオニンの存在下で翻訳し〔ピー・ロバーツおよびビ
ー・エム・パターンン、「市販の小麦胚芽からの無細胞
系におけるＴＭＶＲＮＡおよびうさぎグロビンｊＳ Ｒ
ＮＡの効率的翻訳」、グロシーデイング・ナショナル争
アカデミ−・ザイエンス・ＵＳＡ、第７θ巻、第一３３
０〜３４’頁（ｌり７３）〕、そして合成された蛋白質
をｌコ、ｊチの８ＤＢ−ポリアクリルアミドゲル上で分
析した〔ニー・ケーφラメｌハ［バクテリオファージＴ
μの頭部を組込む際の構造蛋白質の開裂］、ネイチャー
誌、第２２７巻、第６ざ０−４６頁（ｌり７０）〕。こ
の力式における大型ポリペプチドの合成娃１、ここで試
製されたＲＮＡフラクションが試験管内翻訳の抑制剤を
含まないＲＮＡを含有したことを示した。
７８−／Ｉｓの間の８１Ｍ勾配で沈降したポリＡ＋ＲＮ
Ａフラクションを分析して、このｍＲＮＡにより暗号
化されたＩＬ、２の活性を決定した。
Ａフラクションを分析して、このｍＲＮＡにより暗号
化されたＩＬ、２の活性を決定した。
この分析のため、ｓｏμｌのポリＡ＋ＲＮＡ（／ｍｇ／
１ｎｌ）をそれぞれｔ！−２０個の南アンリカ産蛙（Ｘ
ｅｎｏｐｕ＊ １ａｅｖｉｓ ）の卵細胞へ微量注入し
、この卵細胞をＨＥＰＥＳ緩衝された改変パルス溶液（
ＭＢＳ−Ｈ）中で３日間培養し、この緩衝溶液は０．１
％のポリエチレングリコールとθ、ケチのアプロチニン
原液（シグマ社）とを含有した。
１ｎｌ）をそれぞれｔ！−２０個の南アンリカ産蛙（Ｘ
ｅｎｏｐｕ＊ １ａｅｖｉｓ ）の卵細胞へ微量注入し
、この卵細胞をＨＥＰＥＳ緩衝された改変パルス溶液（
ＭＢＳ−Ｈ）中で３日間培養し、この緩衝溶液は０．１
％のポリエチレングリコールとθ、ケチのアプロチニン
原液（シグマ社）とを含有した。
次いで、培地を抜き取り、分泌された翻訳生成物をその
ＩＬコ活性につき上記のように分析した。第１図は典型
的な分析実験の結果を示すグラフである。これらの結果
が示すように、ひとＩＬ、２活性を暗号化するｍＲＮＡ
ｇ類は、約１０〜／／Ｓの蔗糖勾配で沈降した。
ＩＬコ活性につき上記のように分析した。第１図は典型
的な分析実験の結果を示すグラフである。これらの結果
が示すように、ひとＩＬ、２活性を暗号化するｍＲＮＡ
ｇ類は、約１０〜／／Ｓの蔗糖勾配で沈降した。
さらに、ミトゲン肪発牌細胞から単離した蔗糖勾配分別
ボＩＪＡ＋ＲＮＡの微慧注入の後に、南ア産蛙の卵細胞
によるひとＩｌｌの分泌の動力学を検査した。ここで、
卵細胞培養培地におけるＩＬ、２の蓄積は少なくとも７
２時間持続することが観察された。
ボＩＪＡ＋ＲＮＡの微慧注入の後に、南ア産蛙の卵細胞
によるひとＩｌｌの分泌の動力学を検査した。ここで、
卵細胞培養培地におけるＩＬ、２の蓄積は少なくとも７
２時間持続することが観察された。
この点において認識すべきことは、蔗糖勾配から得られ
るボＩＪＡ＋ＲＮＡ生成物でさえ極めて多数の異なるｍ
ＲＮ Ａを含有することでおる。
るボＩＪＡ＋ＲＮＡ生成物でさえ極めて多数の異なるｍ
ＲＮ Ａを含有することでおる。
ｈＩＬＪに対し特異的なｍ ＲＮ Ａを除き、他のｍ
ＲＮ Ａは望ましくない汚染物である。残念ながら、こ
れらの汚染物ＲＮＡは、本発明のクローン化工程の残部
においてずつとｈＩＬ、２ｍ ＲＮ Ａと同様に挙動す
る。したがって、ポリ（Ａ）ＲＮＡにおけるその存在は
ＩＬ、ｚ以外のポリペプチドを暗号化する遺伝子を含有
する多数の望１しくない細菌クローンを最終的に生成す
、 る。この汚染は、所望のＩＬコヒブリドクローン金
単離する際に複雑な選別問題を提起する。
ＲＮ Ａは望ましくない汚染物である。残念ながら、こ
れらの汚染物ＲＮＡは、本発明のクローン化工程の残部
においてずつとｈＩＬ、２ｍ ＲＮ Ａと同様に挙動す
る。したがって、ポリ（Ａ）ＲＮＡにおけるその存在は
ＩＬ、ｚ以外のポリペプチドを暗号化する遺伝子を含有
する多数の望１しくない細菌クローンを最終的に生成す
、 る。この汚染は、所望のＩＬコヒブリドクローン金
単離する際に複雑な選別問題を提起する。
ＩＬ、２の場合、選別問題は、所望クローンの同定に対
する選別試料として役立つような充分精製されたＩＬ、
ｚ ｍＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその部分の試料が
無いためさらに悪化する。
する選別試料として役立つような充分精製されたＩＬ、
ｚ ｍＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその部分の試料が
無いためさらに悪化する。
したがって、ＩＬ２クローンの選別法は極めて時間の力
・かる困難なものである。さらに、極めて少割合のＩＬ
２クローンしか生物学的もしくは免疫学的な活性型でＩ
Ｌコを発現しないと予想されるので、活性クローンの単
離は［藁の中から針を探ず」ような選別工程となる。
・かる困難なものである。さらに、極めて少割合のＩＬ
２クローンしか生物学的もしくは免疫学的な活性型でＩ
Ｌコを発現しないと予想されるので、活性クローンの単
離は［藁の中から針を探ず」ような選別工程となる。
有利なことに、本発明は組換ＤＮＡ技術を使用してＩＬ
、２ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその一部の精製
試料を生成させることができる。次いで、この精製され
たｍ ＲＮ Ａもしくはｅ Ｄ Ｎ Ａを使用して、極
めて多数の細菌クローンを迅速に選別し、かつそれによ
りＩＬ、２を活性型で発現するクローンを単離すること
ができる。
、２ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその一部の精製
試料を生成させることができる。次いで、この精製され
たｍ ＲＮ Ａもしくはｅ Ｄ Ｎ Ａを使用して、極
めて多数の細菌クローンを迅速に選別し、かつそれによ
りＩＬ、２を活性型で発現するクローンを単離すること
ができる。
ｈＩＬ２ ｍＲＮＡの豊富なポリ（Ａ）ＲＮＡｉ雛型
として使用して補完的Ｄ Ｎ Ａ （［ａ ＤＮＡ、ｌ
）を調製した。これね、バクテリオファージＭ８．２
ＲＮＡのＤＮＡコピーを含有するプラスミドの作成につ
きデボス等により実質的に記載されている〔「バクテリ
オファージＭＳ、２ ＲＮＡの＃１は完全寸法のＤＮ
Ａコピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１．２ｇ
巻、第ｊりＳ〜６１りＪ￥（ｌり７り）〕。
として使用して補完的Ｄ Ｎ Ａ （［ａ ＤＮＡ、ｌ
）を調製した。これね、バクテリオファージＭ８．２
ＲＮＡのＤＮＡコピーを含有するプラスミドの作成につ
きデボス等により実質的に記載されている〔「バクテリ
オファージＭＳ、２ ＲＮＡの＃１は完全寸法のＤＮ
Ａコピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１．２ｇ
巻、第ｊりＳ〜６１りＪ￥（ｌり７り）〕。
３０μｇのボｊ７Ａ＋ＲＮＡ（蔗糖勾配からの３つの７
ラクシヨン）をｓ ｏ ＩｌｌのｊＯｍＭトリ、ｘ、
ＩＩＣＪ！ （ｐ）ｌ Ｌ３ ）と３０ｍＭのβ−メル
カプトエタノールと１０ｍＭのＫＣ１！と１０ｍＭのＭ
ＱＣ１２とそれぞれ０．３ｍＭのｔつのｄＮＴＰと１０
μ９のｐＴ＋２−＋ｅと１００μＣｉのα−ｐ Ｓ ２
ｄＡＴＰと１００ＢＣ５のα−Ｐ”ｄＣＴＰ （それぞ
れ、２！００Ｃｉ１モル）と４℃ｍＭのＮａ２Ｐ２０７
と１００単位のＡＭＶ逆転写酵素との混合物において４
Ｉ３℃で３０分間培養した。ＥＤＴＡにより反応を停止
させかつフェノール抽出した後、この混合物をセファデ
ックス−Ｇ７５カラムに充填した。空隙フラクションに
おける核酸をエタノールで一、２０℃にて７晩沈澱させ
、そしてこれらを遠心分離によｐ集めだ。ペレットを７
０チエタノールで洗浄し、乾燥させ、弘Ｏμｌの水中に
溶解させた。
ラクシヨン）をｓ ｏ ＩｌｌのｊＯｍＭトリ、ｘ、
ＩＩＣＪ！ （ｐ）ｌ Ｌ３ ）と３０ｍＭのβ−メル
カプトエタノールと１０ｍＭのＫＣ１！と１０ｍＭのＭ
ＱＣ１２とそれぞれ０．３ｍＭのｔつのｄＮＴＰと１０
μ９のｐＴ＋２−＋ｅと１００μＣｉのα−ｐ Ｓ ２
ｄＡＴＰと１００ＢＣ５のα−Ｐ”ｄＣＴＰ （それぞ
れ、２！００Ｃｉ１モル）と４℃ｍＭのＮａ２Ｐ２０７
と１００単位のＡＭＶ逆転写酵素との混合物において４
Ｉ３℃で３０分間培養した。ＥＤＴＡにより反応を停止
させかつフェノール抽出した後、この混合物をセファデ
ックス−Ｇ７５カラムに充填した。空隙フラクションに
おける核酸をエタノールで一、２０℃にて７晩沈澱させ
、そしてこれらを遠心分離によｐ集めだ。ペレットを７
０チエタノールで洗浄し、乾燥させ、弘Ｏμｌの水中に
溶解させた。
上記で合成したｃ Ｄ Ｎ Ａ試料は、実際上濃厚化し
たポリＡ＋ｍＲＮＡに存在する異なるｍ ＲＮ Ａから
生じた複雑なｃ Ｄ Ｎ Ａの混合物である。さらに、
ＡＭＶ逆転写酵素による早期停止のため、ｃ Ｄ Ｎ
Ａの多くはボＩＪＡ＋ＲＮＡにおける各種ｍＲＮＡの不
完全コピーである。
たポリＡ＋ｍＲＮＡに存在する異なるｍ ＲＮ Ａから
生じた複雑なｃ Ｄ Ｎ Ａの混合物である。さらに、
ＡＭＶ逆転写酵素による早期停止のため、ｃ Ｄ Ｎ
Ａの多くはボＩＪＡ＋ＲＮＡにおける各種ｍＲＮＡの不
完全コピーである。
ｃＤＮＡを二重鎖にする前に、これを上記水混合物をｉ
ｏｏ℃にて３０秒間加熱することにより補完的雛型ｍＲ
ＮＡに対する結合から切離し、次いで直ちに０℃で冷却
した。３μ９の膵臓ＲＮアーゼと３単位のＴ１−ＲＮア
ーゼとを加え、そして混合物を３７℃で３０分間培養し
た。
ｏｏ℃にて３０秒間加熱することにより補完的雛型ｍＲ
ＮＡに対する結合から切離し、次いで直ちに０℃で冷却
した。３μ９の膵臓ＲＮアーゼと３単位のＴ１−ＲＮア
ーゼとを加え、そして混合物を３７℃で３０分間培養し
た。
Ｋ−ホスフェート（ｐｉ（Ａ、り）（最終濃度ｉｏ。
ｍ Ｍ ）とジチオスレイトール（１ｍＭ）とＭｌｌＣ
１２（／ ＯｍＭ ）と４ｔｄＮＴＰ （それぞれコｓ
ｏμＭ）と！ＯμＣｉα−Ｐ” ｄＡＴＰとｓｏμＣｉ
α−Ｐ ｄＣＴＰ（それぞれ、２！００Ｃｉ１モル）
との混合物を加えて混合物をｉｏ。
１２（／ ＯｍＭ ）と４ｔｄＮＴＰ （それぞれコｓ
ｏμＭ）と！ＯμＣｉα−Ｐ” ｄＡＴＰとｓｏμＣｉ
α−Ｐ ｄＣＴＰ（それぞれ、２！００Ｃｉ１モル）
との混合物を加えて混合物をｉｏ。
μｌに調整し、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ■（ビオ
ラブ社、１００単位）を加えかつ得られた混合物を７５
℃にて３時間培養することにより、ａＤＮＡ鎖を二重鎖
にした。反応をＥＤＴＡにより停止させ、混合物をフェ
ノール処理し、セファデックス−Ｇ７７カラムに通し、
そして空隙フラクションを前記と同様にエタノールによ
って−、２０℃でｌ晩沈澱させた。
ラブ社、１００単位）を加えかつ得られた混合物を７５
℃にて３時間培養することにより、ａＤＮＡ鎖を二重鎖
にした。反応をＥＤＴＡにより停止させ、混合物をフェ
ノール処理し、セファデックス−Ｇ７７カラムに通し、
そして空隙フラクションを前記と同様にエタノールによ
って−、２０℃でｌ晩沈澱させた。
二重鎖ｏ Ｄ Ｎ Ａ ｆｇ造に残存する単一鎖のヘア
ピンループを開裂させるため、遠心分離によりＤＮＡを
除去し、ペレットを乾燥し、そしてこれを再び水中に取
り、混合物を０．．２ ＭのＮａＣ１！と１０ｍＭのＮ
ａ０Ａａ （ｐＨ４ＬＪ ）と／ｍＭのＺｎＣ／２と７
０単位のＳＩヌクレアーゼ（シグマ社）との１００ｍ１
中で３７℃にて３０分間培養した。混合物をフェノール
／ ＣＨＣｌ ｙ、 ／イソアミルアルコールで抽出す
ることにより反応を停止させ１．２００μｌの−ＭのＮ
Ｈ４０Ａｃとｉｏμ９のイーΦコリｔ ＲＮＡと／属の
エタノールとを加えることにより、−２０℃で２時間お
よび一−７０℃で７０分間沈澱させた。遠心分離により
ペレットを取出し、そしてこれを乾燥した。
ピンループを開裂させるため、遠心分離によりＤＮＡを
除去し、ペレットを乾燥し、そしてこれを再び水中に取
り、混合物を０．．２ ＭのＮａＣ１！と１０ｍＭのＮ
ａ０Ａａ （ｐＨ４ＬＪ ）と／ｍＭのＺｎＣ／２と７
０単位のＳＩヌクレアーゼ（シグマ社）との１００ｍ１
中で３７℃にて３０分間培養した。混合物をフェノール
／ ＣＨＣｌ ｙ、 ／イソアミルアルコールで抽出す
ることにより反応を停止させ１．２００μｌの−ＭのＮ
Ｈ４０Ａｃとｉｏμ９のイーΦコリｔ ＲＮＡと／属の
エタノールとを加えることにより、−２０℃で２時間お
よび一−７０℃で７０分間沈澱させた。遠心分離により
ペレットを取出し、そしてこれを乾燥した。
二重鎖ｃＤＮ人のこの混合物は、これを調製するための
雛型として使用したボＩＪＡ＋ＲＮＡの異質性の結果、
並びにＡＭＶ逆転写酵素によるｃ Ｄ Ｎ Ａ転写の早
期停止により異質と々る。
雛型として使用したボＩＪＡ＋ＲＮＡの異質性の結果、
並びにＡＭＶ逆転写酵素によるｃ Ｄ Ｎ Ａ転写の早
期停止により異質と々る。
上記の異質性の効果を弱めるため、二重鎖ｃ Ｄ Ｎ
Ａ混合物を寸法決定し、この際ペレットを７０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ （ｐＨ７，ｊ ）とｔｍＭＥＤＴＡとの、
２０μｌ中に取り、これをｊｊ’ｃにて５分間培養し、
ブロモフェノールブルー−キシレンシアノールＦＦと蔗
糖とを加え、ＤＮＡを４Ｌ％ポリアクリルアミドゲル（
トリス−硼酸塩、２０（ｍｘ ＩＩ ０ｏｒｎ ｘθ、
３偏１．２００Ｖ、２０ｍＡ）で７晩電気泳動した。こ
の場合、ファージφＸ／ ７４ＭＤＮＡ（Ｄｊ’−Ｐ”
−標識Ｈａｓ ｉｌｌ切断物を並行移動路に標識として
電気泳動させた。ゲルを放射線分析した後、このＤＮＡ
をゲル上の位置にしたがってフラクションＭ ／ （１
０００−ｉ３ｏｏｂｐ）、Ｍｌ（７！０−１０００ｂｐ
）、ＭＪ （６００−７ｊ０ｂｐ ）およびＭｌ、！
、（！００−６θ０ｂｐ）に分離した。各フラクション
に対応するゲルスライスを切除し、これらを２ＭのＱ、
ｊｔＭのＮＨ４０ＡＣと１０ｍＭの’ｈＵｌｃ１２と０
．１％ＳＤＳとでｌ晩溶出させ、そしてＤＮＡを一容量
のエタノールで沈澱させた（−，２０℃）。遠心分離し
た後、各ペレットを１００μノの水中に取り、そしてこ
れを２００μｌのｔＯｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，グ
）とｔｏｏａｌ（充填容量）のヒドロキシアパタイト（
ビオラド社）との存在下で３７℃にて１０分間培養した
。次いで、ヒドロキシアパタイトをセファデックス−０
７３カラムに充填し、そしてとのカラムを２ｍＭの燐酸
ナトリウム（…７．り）で充分洗浄した後、ＤＮＡをＯ
６≠ｊＭの燐酸ナトリウム（Ｐ）１？、ｌＩ）で溶出さ
せ、そして’／ｌｏ容量の２ＭのＮａ０Ａｃ （ｐＨ，
ｒ ）と２容量のエタノールとで沈澱させた。
Ａ混合物を寸法決定し、この際ペレットを７０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ （ｐＨ７，ｊ ）とｔｍＭＥＤＴＡとの、
２０μｌ中に取り、これをｊｊ’ｃにて５分間培養し、
ブロモフェノールブルー−キシレンシアノールＦＦと蔗
糖とを加え、ＤＮＡを４Ｌ％ポリアクリルアミドゲル（
トリス−硼酸塩、２０（ｍｘ ＩＩ ０ｏｒｎ ｘθ、
３偏１．２００Ｖ、２０ｍＡ）で７晩電気泳動した。こ
の場合、ファージφＸ／ ７４ＭＤＮＡ（Ｄｊ’−Ｐ”
−標識Ｈａｓ ｉｌｌ切断物を並行移動路に標識として
電気泳動させた。ゲルを放射線分析した後、このＤＮＡ
をゲル上の位置にしたがってフラクションＭ ／ （１
０００−ｉ３ｏｏｂｐ）、Ｍｌ（７！０−１０００ｂｐ
）、ＭＪ （６００−７ｊ０ｂｐ ）およびＭｌ、！
、（！００−６θ０ｂｐ）に分離した。各フラクション
に対応するゲルスライスを切除し、これらを２ＭのＱ、
ｊｔＭのＮＨ４０ＡＣと１０ｍＭの’ｈＵｌｃ１２と０
．１％ＳＤＳとでｌ晩溶出させ、そしてＤＮＡを一容量
のエタノールで沈澱させた（−，２０℃）。遠心分離し
た後、各ペレットを１００μノの水中に取り、そしてこ
れを２００μｌのｔＯｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，グ
）とｔｏｏａｌ（充填容量）のヒドロキシアパタイト（
ビオラド社）との存在下で３７℃にて１０分間培養した
。次いで、ヒドロキシアパタイトをセファデックス−０
７３カラムに充填し、そしてとのカラムを２ｍＭの燐酸
ナトリウム（…７．り）で充分洗浄した後、ＤＮＡをＯ
６≠ｊＭの燐酸ナトリウム（Ｐ）１？、ｌＩ）で溶出さ
せ、そして’／ｌｏ容量の２ＭのＮａ０Ａｃ （ｐＨ，
ｒ ）と２容量のエタノールとで沈澱させた。
ここでも認識されるように、ａＤＮＡ７７クシヨンのそ
れぞれには多数のｃ Ｄ Ｎ Ａが存在し、その極く僅
かのみがｂＩＬ２関連のｃ Ｄ Ｎ Ａである。
れぞれには多数のｃ Ｄ Ｎ Ａが存在し、その極く僅
かのみがｂＩＬ２関連のｃ Ｄ Ｎ Ａである。
二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａのクローン化
本発明により調製された二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａをクロー
ン化しまたは発現させる際に、多くの種類の宿主／クロ
ーン化ベヒクルの組合せを使用することができる。たと
えば、有用なりローン比重たは発現ベヒクルＬ染色体、
非染色体および合成りＮＡ配列の断片、たとえば５Ｖ４
ＬＯの各種の公知誘導体および公知の細菌プラスミド、
たとえばｃｏｌ Ｆ／、ｐＣＲ／、ｐＢＲＪ、２ノ、ｐ
ＭＢりおよびその誘導体からのプラスミド、広範囲の宿
主プラスミド、たとえばＲＰ４Ｌ、ファージＤＮＡ、た
とえばファージλの多くの誘導体、たとえばＮＭりざり
およびその他のＤＮＡ７アージ、たとえばＭＩ！および
フィラメント状単一鎖ＤＮＡファージ並びにプラスミド
とファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター、た
とえばファージＤＮＡを使用するよう改変したプラスミ
ドまたはその他の発現制御配列または酵母プラスミド、
たとえばλμプラスミドもしくはその誘導体よりなるこ
とができる。有用なりローン化もしくは発現宿主は細菌
宿主、たとえばイー・コリＨＢｔＯ／、イーコリＸｔ７
７Ａ、イー−コリＸλｕＪ’Ｊ、イー・コリＭＲＣＩお
よびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の
細菌類、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物もしく
は植物宿主、たとえば培養物における動物（ひとを含む
）もしくは植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必らずしモ全ての宿主／ベクター組合せが同等に有
効であるとは限らない。宿主／クローン化ベヒクル組合
せの特定の選択は、ここに記載した原理を考慮して本発
明の範囲を逸脱することなく当業者により行なうことが
できる。
ン化しまたは発現させる際に、多くの種類の宿主／クロ
ーン化ベヒクルの組合せを使用することができる。たと
えば、有用なりローン比重たは発現ベヒクルＬ染色体、
非染色体および合成りＮＡ配列の断片、たとえば５Ｖ４
ＬＯの各種の公知誘導体および公知の細菌プラスミド、
たとえばｃｏｌ Ｆ／、ｐＣＲ／、ｐＢＲＪ、２ノ、ｐ
ＭＢりおよびその誘導体からのプラスミド、広範囲の宿
主プラスミド、たとえばＲＰ４Ｌ、ファージＤＮＡ、た
とえばファージλの多くの誘導体、たとえばＮＭりざり
およびその他のＤＮＡ７アージ、たとえばＭＩ！および
フィラメント状単一鎖ＤＮＡファージ並びにプラスミド
とファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター、た
とえばファージＤＮＡを使用するよう改変したプラスミ
ドまたはその他の発現制御配列または酵母プラスミド、
たとえばλμプラスミドもしくはその誘導体よりなるこ
とができる。有用なりローン化もしくは発現宿主は細菌
宿主、たとえばイー・コリＨＢｔＯ／、イーコリＸｔ７
７Ａ、イー−コリＸλｕＪ’Ｊ、イー・コリＭＲＣＩお
よびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の
細菌類、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物もしく
は植物宿主、たとえば培養物における動物（ひとを含む
）もしくは植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必らずしモ全ての宿主／ベクター組合せが同等に有
効であるとは限らない。宿主／クローン化ベヒクル組合
せの特定の選択は、ここに記載した原理を考慮して本発
明の範囲を逸脱することなく当業者により行なうことが
できる。
さらに、それぞれ特異的クローン化もしくは発現ベヒク
ルには、二重鎖ＤＮＡを挿入するため各種の部位を選択
することができる。これらの部位は、一般にそこを切断
する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。これら
の部位は当業者によシ充分知られている。勿論５本発明
に有用なりローン化もしくは発現ベヒクルは、選択ＤＮ
Ａ断片を挿入するだめの制限エンドヌクレアーゼ部位を
持つ必要がないことを了解すべきである。寧ろ、ベヒク
ルは他の手段によって断片に結合することができる。
ルには、二重鎖ＤＮＡを挿入するため各種の部位を選択
することができる。これらの部位は、一般にそこを切断
する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。これら
の部位は当業者によシ充分知られている。勿論５本発明
に有用なりローン化もしくは発現ベヒクルは、選択ＤＮ
Ａ断片を挿入するだめの制限エンドヌクレアーゼ部位を
持つ必要がないことを了解すべきである。寧ろ、ベヒク
ルは他の手段によって断片に結合することができる。
ベクターまたはクローン化もしくは発現ベヒクル、およ
び特に選択ＤＮＡ断片を付着させて組換ＤＮＡ分子を生
成させるためにここに選択される部位は種々の因子、た
とえば特定の制限酵素の作用を受ける部位の個数、発現
すべき蛋白質の寸法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対
する所望蛋白質の感受性、精製の際除去することが困難
な宿主細胞蛋白質により発現すべき蛋白質の汚染または
結合、たとえばベクター配列に対する開始コドンおよび
停止コドンの位置のような発現特性、並びに当業者に知
られたソノ他の因子によシ決定される。特定遺伝子に対
するベクターおよび挿入部位の選択はこれら因子のバラ
ンスによって決定され、必らずしも全ての選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
び特に選択ＤＮＡ断片を付着させて組換ＤＮＡ分子を生
成させるためにここに選択される部位は種々の因子、た
とえば特定の制限酵素の作用を受ける部位の個数、発現
すべき蛋白質の寸法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対
する所望蛋白質の感受性、精製の際除去することが困難
な宿主細胞蛋白質により発現すべき蛋白質の汚染または
結合、たとえばベクター配列に対する開始コドンおよび
停止コドンの位置のような発現特性、並びに当業者に知
られたソノ他の因子によシ決定される。特定遺伝子に対
するベクターおよび挿入部位の選択はこれら因子のバラ
ンスによって決定され、必らずしも全ての選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
外来Ｄ Ｎ Ａ ｌクローン化ベヒクルまたは発現ベク
ター中に挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるには当業
界で幾つかの方法が知られているが、本発明による初期
クローン化につき好適な方法は抛Ｈ１によりｐｓＶｊλ
りＤＮＡ（後記）を切断し、ハｍＨＩ部位に充填し、か
つ末端トランスフェラーゼによってｄＣ末端を３′末端
に付加することである。次いで、二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ
ヲコのｐｓＶｊ、？りＤＮＡへ先ずこれヲｄＧ 末端で
処理した後に結合させる。次いで、切断ＤＮＡと切断ｃ
Ｄ Ｎ Ａとを融合させて、ＤＮＡをプラスミドの選
択部位に挿入すると共にヒブリドＤＮＡを再環化させる
ことができ、ｄＧ−ｄｃ末端の補完的性質はそれらの凝
集およびシ１ｍＨＩ部位の再編成を可能にする。かくし
て得られ九組換ＤＮＡ分子は、クローン化ベクターにお
ける選択位置に挿入遺伝子を有する（第２図）。
ター中に挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるには当業
界で幾つかの方法が知られているが、本発明による初期
クローン化につき好適な方法は抛Ｈ１によりｐｓＶｊλ
りＤＮＡ（後記）を切断し、ハｍＨＩ部位に充填し、か
つ末端トランスフェラーゼによってｄＣ末端を３′末端
に付加することである。次いで、二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ
ヲコのｐｓＶｊ、？りＤＮＡへ先ずこれヲｄＧ 末端で
処理した後に結合させる。次いで、切断ＤＮＡと切断ｃ
Ｄ Ｎ Ａとを融合させて、ＤＮＡをプラスミドの選
択部位に挿入すると共にヒブリドＤＮＡを再環化させる
ことができ、ｄＧ−ｄｃ末端の補完的性質はそれらの凝
集およびシ１ｍＨＩ部位の再編成を可能にする。かくし
て得られ九組換ＤＮＡ分子は、クローン化ベクターにお
ける選択位置に挿入遺伝子を有する（第２図）。
勿論、ＤＮＡ配列をクローン化もしくは発現ベヒクル中
へ挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるその他の公知の
方法も、本発明に同等に有用である。たとえは、これら
はｄＡ−ｄＴ末端処理、直接結合、合成リンカ、エキソ
ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結
合、またはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の延長お
よび適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含する。
へ挿入して組換ＤＮＡ分子を生成させるその他の公知の
方法も、本発明に同等に有用である。たとえは、これら
はｄＡ−ｄＴ末端処理、直接結合、合成リンカ、エキソ
ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結
合、またはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の延長お
よび適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含する。
勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入されたヌク
レオチド配列またはｃＤＮＡ断片は、所望のポリペプチ
ドを暗号化する実際の遺伝子の一部でないヌクレオチド
を包含するか、或い社所望の蛋白質に対する完全遺伝子
の断片のみを包含し得ることを了解すべきである。ＤＮ
Ａが最終的に挿入された場、声・、形質転換された宿主
がＩＬ、２の生物学的もしくは免疫学的活性を有するポ
リペプチドを生産すること、或いはＤＮＡ配列自身がＩ
Ｌ２の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドの生産に有用なりＮＡ配列を含有するクローンを選
択するだめのヒプリド化試料として使用し得るものであ
ることのみを必要とする。
レオチド配列またはｃＤＮＡ断片は、所望のポリペプチ
ドを暗号化する実際の遺伝子の一部でないヌクレオチド
を包含するか、或い社所望の蛋白質に対する完全遺伝子
の断片のみを包含し得ることを了解すべきである。ＤＮ
Ａが最終的に挿入された場、声・、形質転換された宿主
がＩＬ、２の生物学的もしくは免疫学的活性を有するポ
リペプチドを生産すること、或いはＤＮＡ配列自身がＩ
Ｌ２の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドの生産に有用なりＮＡ配列を含有するクローンを選
択するだめのヒプリド化試料として使用し得るものであ
ることのみを必要とする。
外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルまたは発現ベ
クターを使用して宿主を形質転換させ、この宿主が遺伝
子の暗号化するＩＬ、２の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチドを発現するようにさせる。適当な
宿主の選択は当業界で知られた多くの因子により管理さ
れるＯこれらは−だとえげ選択ベクターとの適合性、ヒ
プリドプラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所
望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および
コストなどを包含する。
クターを使用して宿主を形質転換させ、この宿主が遺伝
子の暗号化するＩＬ、２の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチドを発現するようにさせる。適当な
宿主の選択は当業界で知られた多くの因子により管理さ
れるＯこれらは−だとえげ選択ベクターとの適合性、ヒ
プリドプラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所
望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および
コストなどを包含する。
これら因子のバランスは、必らずしも全ての宿主が特定
組換ＤＮＡ分子のクローン化または発現のいずれかに同
等に有効でないという理解と一致せねばならない。
組換ＤＮＡ分子のクローン化または発現のいずれかに同
等に有効でないという理解と一致せねばならない。
本合成において、好適な初期クローン化ベヒクルはｐ８
Ｖ！２りであり、かつ好適な初期制限エンドヌクレアー
ゼ部位はＢａｍＨＩである。好適な初期宿主はイー・コ
＋）ＨＢ１０／である。
Ｖ！２りであり、かつ好適な初期制限エンドヌクレアー
ゼ部位はＢａｍＨＩである。好適な初期宿主はイー・コ
＋）ＨＢ１０／である。
ｐｓＶｊ、２りは、多量の領域が除去されているキメラ
５ｖｔｉ−ｏプラスミド発現ベクターである（第２図）
。この構造はＶＰ／遺伝子の大部分（Ｏｌりａｓ−ｏ、
ｉ≠３地図単位）を欠如するが転写の複製、開始および
停止、並びに／ＪＳおよび／りＳｍＲＮＡの切断および
ポリアデニル化に関与する全ての領域を保持する。ｐＳ
Ｖｊコタは、５ｖ４ＬＯ転写制御の下で遺伝子を発現す
るよう設計される〔ディー・ゲイセンおよびダブリュー
・フイエルス、ジャーナル・モレキュラー・アプライド
・ジエネテイツクス、第１巻、第３８’ｊ〜タグ頁（ｌ
りｒ、ｚ））。
５ｖｔｉ−ｏプラスミド発現ベクターである（第２図）
。この構造はＶＰ／遺伝子の大部分（Ｏｌりａｓ−ｏ、
ｉ≠３地図単位）を欠如するが転写の複製、開始および
停止、並びに／ＪＳおよび／りＳｍＲＮＡの切断および
ポリアデニル化に関与する全ての領域を保持する。ｐＳ
Ｖｊコタは、５ｖ４ＬＯ転写制御の下で遺伝子を発現す
るよう設計される〔ディー・ゲイセンおよびダブリュー
・フイエルス、ジャーナル・モレキュラー・アプライド
・ジエネテイツクス、第１巻、第３８’ｊ〜タグ頁（ｌ
りｒ、ｚ））。
ｐｓＶｊ、２りの主たる特徴は次の通シである：（ａ）
Ｓ Ｖ １１０ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小
型−ｔおよび大型−Ｔ抗原を暗号化し、さらに猿の細胞
における複製に必要な領域も存在し、これらは叩」の領
域の方向に位置する「エンハンサ−」配列である：（ｂ
）主たる宿造蛋白質ｖＰｌに対する遺伝子が削除されて
いる（ ０．９１１３− ｏ、ｉ≠！地図単位からのＨ
ｉｎｄ ［１−Ｂａ旦ＨＩ断片）ｉ（、）独特なりａｍ
Ｈ１部位がキメラプラスミドに存在し、そこに外来ＤＮ
Ａ配列を挿入してｓ’ｖｔｏプロモータの制御下で発現
させることができ、このハユＨＩ部位は１４８ｍＲＮＡ
アクセプタースプライスから３′？個のヌクレオチドの
後にかつＶＰ／遺伝子の開始コドン（既に除去されてい
る）から１２個のヌクレオチドの前に存在する；（ｄ）
主たるｉｔｓメツセージに対するドナーおよびアクセプ
タースプライス部位が存在する； （ａ） Ｓ Ｖ≠Ｏ
領域からのポリアデニル化部位が存在する（ＳＶｐＯ地
図単位ｏ、／７）；（ｆ） Ｓ Ｖ ａ ｏ Ｄ Ｎ
Ａの２０１０ ｂｐ断片（０，３３〜０．７コｊの地
図位置の間）の複製は猿細胞における同質の組換ｆ：司
能にすると共に、ブシスミド配列が既に除去でれている
がウィルス構造遺伝子ＶＰ／の代りに挿入遺伝子を含む
ＳＶａ。
Ｓ Ｖ １１０ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小
型−ｔおよび大型−Ｔ抗原を暗号化し、さらに猿の細胞
における複製に必要な領域も存在し、これらは叩」の領
域の方向に位置する「エンハンサ−」配列である：（ｂ
）主たる宿造蛋白質ｖＰｌに対する遺伝子が削除されて
いる（ ０．９１１３− ｏ、ｉ≠！地図単位からのＨ
ｉｎｄ ［１−Ｂａ旦ＨＩ断片）ｉ（、）独特なりａｍ
Ｈ１部位がキメラプラスミドに存在し、そこに外来ＤＮ
Ａ配列を挿入してｓ’ｖｔｏプロモータの制御下で発現
させることができ、このハユＨＩ部位は１４８ｍＲＮＡ
アクセプタースプライスから３′？個のヌクレオチドの
後にかつＶＰ／遺伝子の開始コドン（既に除去されてい
る）から１２個のヌクレオチドの前に存在する；（ｄ）
主たるｉｔｓメツセージに対するドナーおよびアクセプ
タースプライス部位が存在する； （ａ） Ｓ Ｖ≠Ｏ
領域からのポリアデニル化部位が存在する（ＳＶｐＯ地
図単位ｏ、／７）；（ｆ） Ｓ Ｖ ａ ｏ Ｄ Ｎ
Ａの２０１０ ｂｐ断片（０，３３〜０．７コｊの地
図位置の間）の複製は猿細胞における同質の組換ｆ：司
能にすると共に、ブシスミド配列が既に除去でれている
がウィルス構造遺伝子ＶＰ／の代りに挿入遺伝子を含む
ＳＶａ。
レプリコンを発生する。
！０ｔｔｌｌ（ＤｐＳＶ！２９ ＤＮＡｆｌｌＯ単位
のｈ二ＨＩ制限酵素で３７℃にて２時間にわたりｔｏｔ
ｔｚのざｍ Ｍ Ｍ ｇＣＩ！２と弘ＯｍＭ ＮａＣ１
！と１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨｑ、ａ ） に
おいて切断した。ＥＤＴＡにょシこの反応を停止させ、
そして混合物をフェノール化しく３回）、エーテル抽出
しく２回）、’／１０ 答Ｒの、２ＭＫＯＡｃ（ｐＨｊ
）とλ容量のエタノールとで沈澱させた。
のｈ二ＨＩ制限酵素で３７℃にて２時間にわたりｔｏｔ
ｔｚのざｍ Ｍ Ｍ ｇＣＩ！２と弘ＯｍＭ ＮａＣ１
！と１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨｑ、ａ ） に
おいて切断した。ＥＤＴＡにょシこの反応を停止させ、
そして混合物をフェノール化しく３回）、エーテル抽出
しく２回）、’／１０ 答Ｒの、２ＭＫＯＡｃ（ｐＨｊ
）とλ容量のエタノールとで沈澱させた。
沈澱しかつ線状化した（ Ｂａ皿ＨＩ ） ｐ ＳＶ、
ｔ、２りＤＮＡを次いで分離し、これを７０％エタノー
ルで２回洗浄し、乾燥させ、水中に入れ、そしてｊＯｍ
Ｍ）リス−ＨＣｌ （ＰＨｒ、３）と！ ＯｍＭＫＣｊ
とｔ ＯｍＭ ＭＩＩＣ１２と３０ｍＭ β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ２ｊ０１ｔＭの弘ｄＮＴＰとｊ
Ｏ年単位ＡＭＶ逆転写酵素との混合物ｊＯμｌにおいて
３７℃で３０分間培養した。ＥＤＴＡにより反応を停止
させ、この混合物をフェノール／ＣＨＣｌ５／インアミ
ルアルコールで抽出した。緩衝液および混合物をセファ
デックス−Ｇ７ｊカラム（，２０ｅＸ Ｏ，！ｍ＆ ）
に１０ｍＭ トリス−）１ｃ／ （ｐ）（７，ｊ ）
と７ｍＭＥＤＴＡとで充填し、空隙フラクションを２Ｍ
ＫＯＡ ｃ （ｐＨｊ ）とエタノールとで一２０℃に
て７時間沈澱させた。
ｔ、２りＤＮＡを次いで分離し、これを７０％エタノー
ルで２回洗浄し、乾燥させ、水中に入れ、そしてｊＯｍ
Ｍ）リス−ＨＣｌ （ＰＨｒ、３）と！ ＯｍＭＫＣｊ
とｔ ＯｍＭ ＭＩＩＣ１２と３０ｍＭ β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ２ｊ０１ｔＭの弘ｄＮＴＰとｊ
Ｏ年単位ＡＭＶ逆転写酵素との混合物ｊＯμｌにおいて
３７℃で３０分間培養した。ＥＤＴＡにより反応を停止
させ、この混合物をフェノール／ＣＨＣｌ５／インアミ
ルアルコールで抽出した。緩衝液および混合物をセファ
デックス−Ｇ７ｊカラム（，２０ｅＸ Ｏ，！ｍ＆ ）
に１０ｍＭ トリス−）１ｃ／ （ｐ）（７，ｊ ）
と７ｍＭＥＤＴＡとで充填し、空隙フラクションを２Ｍ
ＫＯＡ ｃ （ｐＨｊ ）とエタノールとで一２０℃に
て７時間沈澱させた。
ＤＮＡを遠心分離により分離し、乾燥させ、３０μｍの
／□ｍＭ）リス−ＨＣｌ！（ｐ）ｌ ７Ｊ ）と１ｍＭ
ＥＤＴＡとに入れ、６ｇ℃にて３０秒間加熱し、そ
して氷上で冷却した。次いで、このＤＮＡを０．１１７
Ｍ Ｋ−カコジル酸と３０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨＪ
、ざ）と／ ｍＭ Ｃｏ３Ｏ４と１ｍＭジチオスレイ
トールと０．１ｍＭ ｄＣＴＰと１００μＣｉ α
−Ｐ ｄＣＴＰ（コよ００Ｃｉ１モル）とｌθＯ単
位の末端テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
Ｐ−Ｌビオケミカルス社）との混合物２００μｌ中で３
７℃にて培養した。５分間およびｉｏ分間後、７００μ
ｌの量を抜き取って、ＥＤＴＡにより反応を停止させた
。
／□ｍＭ）リス−ＨＣｌ！（ｐ）ｌ ７Ｊ ）と１ｍＭ
ＥＤＴＡとに入れ、６ｇ℃にて３０秒間加熱し、そ
して氷上で冷却した。次いで、このＤＮＡを０．１１７
Ｍ Ｋ−カコジル酸と３０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨＪ
、ざ）と／ ｍＭ Ｃｏ３Ｏ４と１ｍＭジチオスレイ
トールと０．１ｍＭ ｄＣＴＰと１００μＣｉ α
−Ｐ ｄＣＴＰ（コよ００Ｃｉ１モル）とｌθＯ単
位の末端テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
Ｐ−Ｌビオケミカルス社）との混合物２００μｌ中で３
７℃にて培養した。５分間およびｉｏ分間後、７００μ
ｌの量を抜き取って、ＥＤＴＡにより反応を停止させた
。
これらの部分をフェノール／ＣＨＣｌ５／イソアミルア
ルコールで抽出し、ＤＮＡを上記のようにセファデック
ス−０７５力ラム全通してクロマトグラフィーにより精
製した。空隙フラクションにおけるＤＮＡをエタノール
により沈澱させ１遠心分離し、乾燥しそして３０μｌの
１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｌ （Ｐｌ（７，ｓ ）と１ｍ
ＭのＥＤＴＡとに入れた。平均して２２個および３を個
のｄＣＭＰ残基が、それぞれ５分間および１０分間の培
養の後に線状化ｐｓＶｔコタＤＮＡの３′末端に付加さ
れると計算された。さらに、 Ｐｖｕ １１で切断した
ｄＣ末端ｐｓＶｊ２りＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
により示されるように、殆んど内部切断が生じなかった
。
ルコールで抽出し、ＤＮＡを上記のようにセファデック
ス−０７５力ラム全通してクロマトグラフィーにより精
製した。空隙フラクションにおけるＤＮＡをエタノール
により沈澱させ１遠心分離し、乾燥しそして３０μｌの
１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｌ （Ｐｌ（７，ｓ ）と１ｍ
ＭのＥＤＴＡとに入れた。平均して２２個および３を個
のｄＣＭＰ残基が、それぞれ５分間および１０分間の培
養の後に線状化ｐｓＶｔコタＤＮＡの３′末端に付加さ
れると計算された。さらに、 Ｐｖｕ １１で切断した
ｄＣ末端ｐｓＶｊ２りＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
により示されるように、殆んど内部切断が生じなかった
。
上記の二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ （フラクションＭ−およ
びＭ３）をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタイト上
でＮ製し、かつオリゴｄＧと共に煮沸し、この場合慣用
方法と末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
とを使用した。
びＭ３）をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタイト上
でＮ製し、かつオリゴｄＧと共に煮沸し、この場合慣用
方法と末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
とを使用した。
フラクションＭ２およびＭ３のそれぞれからのｄＧ末端
ｄａＤＮＡを、充填されかつｄＣ末端処理したＢａｍＨ
Ｉで線状化したｐｓＶｊ、２りと混合し、標準条件下で
融合させた。
ｄａＤＮＡを、充填されかつｄＣ末端処理したＢａｍＨ
Ｉで線状化したｐｓＶｊ、２りと混合し、標準条件下で
融合させた。
融合後に得られるヒプリドＤＮＡＩＩ′ｉ、、勿論、挿
入ＤＮＡ配列を含まない種々の組換ＤＮＡ分子と幾つか
のクローン化ベヒクルとの混合物である。しかしながら
、各組換ＤＮＡ分子は、桓Ｈ１部位にｅ Ｄ Ｎ Ａ断
片を含有する。この種の各ａ Ｄ Ｎ Ａ断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて少数のｃ
Ｄ Ｎ Ａ断片のみがＩＬ２ｉたけその部分を暗号化
する。大多数は、ｍＲＮＡが本発明の方法に使用される
ポリ（Ａ）ＲＮＡの一部であるような他の蛋白質または
その部分の７種を暗号化する。さらに、上記で得られた
クローンのいずれもＩＬ、２の免疫学的もしくは生物学
的活性を不ずポリペプチドの発現を可能にしないことを
了解すべきである。
入ＤＮＡ配列を含まない種々の組換ＤＮＡ分子と幾つか
のクローン化ベヒクルとの混合物である。しかしながら
、各組換ＤＮＡ分子は、桓Ｈ１部位にｅ Ｄ Ｎ Ａ断
片を含有する。この種の各ａ Ｄ Ｎ Ａ断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて少数のｃ
Ｄ Ｎ Ａ断片のみがＩＬ２ｉたけその部分を暗号化
する。大多数は、ｍＲＮＡが本発明の方法に使用される
ポリ（Ａ）ＲＮＡの一部であるような他の蛋白質または
その部分の７種を暗号化する。さらに、上記で得られた
クローンのいずれもＩＬ、２の免疫学的もしくは生物学
的活性を不ずポリペプチドの発現を可能にしないことを
了解すべきである。
寧ろ、これらはこの種のクローンを選別しかつ同定する
際にのみ有用である。
際にのみ有用である。
形質転換法および得られた形質転換体を処理するその後
の工程に対し、必要に応じ適尚な封じ込め施設を使用し
た。
の工程に対し、必要に応じ適尚な封じ込め施設を使用し
た。
融合ＤＮＡの混合物（フラクションＭλおよびＭ３のそ
れぞれにつき）を、標準形質転換条件を用いて競合イー
・コリＨＢＩＯ７細胞へ付加した。
れぞれにつき）を、標準形質転換条件を用いて競合イー
・コリＨＢＩＯ７細胞へ付加した。
次いで、これら細胞を１０θμｌ／ｍｌのカルベニシリ
ンを含有するＬＢ−寒天板に接種した。
ンを含有するＬＢ−寒天板に接種した。
プラスミドｐ８Ｖｊλりはペニシリン耐性の遺伝子を含
むので、この遺伝子を有するプラスミドで形質転換され
たイー・コリ宿主は、このように形質転換されない細菌
を除き、抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
。したがって、カルベニシリン含有培地における増殖は
。
むので、この遺伝子を有するプラスミドで形質転換され
たイー・コリ宿主は、このように形質転換されない細菌
を除き、抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
。したがって、カルベニシリン含有培地における増殖は
。
組換ＤＮＡ分子または再環化ベクターにより形質転換さ
れた宿主の選択を可能にする。
れた宿主の選択を可能にする。
個々のコロニーを採取し、そしてこれらを微小測定板に
おける２００μｌのＬＢ培地（カルベニシリンを含有す
る）においてｌ晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを
１０チの最終濃度まで加えた後、これらプレートを−、
２０℃で貯蔵した。Ｍ、２およびＭ３ ＤＮＡ７ラクシ
ヨンからそれぞれ約７３００個および１０００個のクロ
ーンを得た。
おける２００μｌのＬＢ培地（カルベニシリンを含有す
る）においてｌ晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを
１０チの最終濃度まで加えた後、これらプレートを−、
２０℃で貯蔵した。Ｍ、２およびＭ３ ＤＮＡ７ラクシ
ヨンからそれぞれ約７３００個および１０００個のクロ
ーンを得た。
各フラクション（Ｍ、２およびＭ３）のカルベニシリン
耐性のクローンは、誘発牌細胞から得られたボＩＪＡ十
ＲＮＡの混合物の寸法決定された完全もしくは部分コピ
ーを示す各種の組換ＤＮＡ分子を含有する。これらクロ
ーンの大部分は、単一の組換ＤＮＡ分子を含有するであ
ろう。しかしながら、これら組換ＤＮＡ分子の極く少数
のみがＩＬ、２に関連する。したがって、これらクロー
ンは、ＩＬ２関連クローンを他のクローンから選択する
よう選別せねばならない。
耐性のクローンは、誘発牌細胞から得られたボＩＪＡ十
ＲＮＡの混合物の寸法決定された完全もしくは部分コピ
ーを示す各種の組換ＤＮＡ分子を含有する。これらクロ
ーンの大部分は、単一の組換ＤＮＡ分子を含有するであ
ろう。しかしながら、これら組換ＤＮＡ分子の極く少数
のみがＩＬ、２に関連する。したがって、これらクロー
ンは、ＩＬ２関連クローンを他のクローンから選択する
よう選別せねばならない。
ｂＩＬノ ｃＤＮＡを含有する細菌クローンを選別する
には幾つかの方法がある。これらは、たとえばＲＮ Ａ
選択ヒプリド化（アーウィン等、下記）、分別ヒブリド
化（ティー・ピー・セント・クローンおよびアール・ダ
ブリュー・デービス、［分別プラーク・フィルタヒプリ
ド化によるザツカロミセス・セレビシーからのガラクト
ース誘発性ＤＮＡ配列の単離５１、セル誌、第１４巻、
第ｔμ３〜グｊ２頁（ｌり７り）〕、合成試料によるヒ
プリド化〔ピー・ノイエス等。
には幾つかの方法がある。これらは、たとえばＲＮ Ａ
選択ヒプリド化（アーウィン等、下記）、分別ヒブリド
化（ティー・ピー・セント・クローンおよびアール・ダ
ブリュー・デービス、［分別プラーク・フィルタヒプリ
ド化によるザツカロミセス・セレビシーからのガラクト
ース誘発性ＤＮＡ配列の単離５１、セル誌、第１４巻、
第ｔμ３〜グｊ２頁（ｌり７り）〕、合成試料によるヒ
プリド化〔ピー・ノイエス等。
［オリゴデオキシヌクレオチド試料を用いるガストリン
ｍ ＲＮ Ａの検出および部分配列分析Ｊ１プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−のサイエンス・ＵＳＡ
、第７６巻、第１７７０〜７４’頁（／り７り）〕、ま
たは所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析〔エ
ル・ピラーコマロア等、「プロインシュリンを合成する
細菌クローン」、プロシーディングｅナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７−
３／頁（／り７ｇ）〕または生物学的分析〔ニー・シー
・ワイーチャング等、「ねプ“みジヒドロホレート・レ
ダクターセを暗号化するＤＮＡ配列のイー伽コリにおけ
る表現型発現」、ネイチャー誌、第、２７ｊ巻、第Ａ７
７〜２１Ｉ−頁（ｌり７ざ）〕による選別を包含する。
ｍ ＲＮ Ａの検出および部分配列分析Ｊ１プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−のサイエンス・ＵＳＡ
、第７６巻、第１７７０〜７４’頁（／り７り）〕、ま
たは所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析〔エ
ル・ピラーコマロア等、「プロインシュリンを合成する
細菌クローン」、プロシーディングｅナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７−
３／頁（／り７ｇ）〕または生物学的分析〔ニー・シー
・ワイーチャング等、「ねプ“みジヒドロホレート・レ
ダクターセを暗号化するＤＮＡ配列のイー伽コリにおけ
る表現型発現」、ネイチャー誌、第、２７ｊ巻、第Ａ７
７〜２１Ｉ−頁（ｌり７ざ）〕による選別を包含する。
本発明においては、主たるクローン選別に対する最も便
利かつ有望な方法としてＲＮＡ選択ヒプリド化を選択し
た。
利かつ有望な方法としてＲＮＡ選択ヒプリド化を選択し
た。
ＲＮＡ選択ヒプリド化により同定される組換ＤＮＡ分子
およびそれにより形質転換された細菌培養物が完全ＩＬ
２ ｃＤＮＡ配列を含有するという保証はなく、また
ＤＮＡ配列が実際にＩＬコを暗号化しまたはＩＬ、２の
免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをク
ローンに発現させ得るという保証さえない。しかしなが
ら１組換ＤＮＡ分子は確かにＩ Ｌ、２ ｍＲＮＡ暗号
化配列に補完的なヌクレオチド配列を含不する。したが
って、組換ＤＮＡ分子は、少なくとも他の組１ＤＮＡ分
子およびそれにより形質転換されたクローンを選別する
だめの試料源として使用し、棟準または完全ＩＬ、２ヌ
クレオチド暗号化配列を含有する他の種類のクローンを
同定することもできる。次いで、これらクローンを、Ｉ
Ｌ２の生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチ
ドの可能な発現につき直接に分析することができる。さ
らに重要なことに、これらヒブリドプラスミドの挿入Ｄ
ＮＡ断片およびそのアミノ酸翻訳生産物のヌクレオチド
配列は常套手段によって決定することができ、このＤＮ
Ａ配列を使用して適当な発現ベクターを作成し、これに
より形質転換された適当な宿主においてＩＬ、２の合成
を行なうことができる。
およびそれにより形質転換された細菌培養物が完全ＩＬ
２ ｃＤＮＡ配列を含有するという保証はなく、また
ＤＮＡ配列が実際にＩＬコを暗号化しまたはＩＬ、２の
免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをク
ローンに発現させ得るという保証さえない。しかしなが
ら１組換ＤＮＡ分子は確かにＩ Ｌ、２ ｍＲＮＡ暗号
化配列に補完的なヌクレオチド配列を含不する。したが
って、組換ＤＮＡ分子は、少なくとも他の組１ＤＮＡ分
子およびそれにより形質転換されたクローンを選別する
だめの試料源として使用し、棟準または完全ＩＬ、２ヌ
クレオチド暗号化配列を含有する他の種類のクローンを
同定することもできる。次いで、これらクローンを、Ｉ
Ｌ２の生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチ
ドの可能な発現につき直接に分析することができる。さ
らに重要なことに、これらヒブリドプラスミドの挿入Ｄ
ＮＡ断片およびそのアミノ酸翻訳生産物のヌクレオチド
配列は常套手段によって決定することができ、このＤＮ
Ａ配列を使用して適当な発現ベクターを作成し、これに
より形質転換された適当な宿主においてＩＬ、２の合成
を行なうことができる。
Ａ、ＲＮＡ選択選択リプリド化
分析選択ヒブリド化の背景
蔗糖濃度勾配からのボＩＪＡ＋ＲＮＡは約ｌμ９のＲＮ
Ａ／ｌｔｌを含有し、その内３０ｎ’）（３０ｎりを各
卵細胞へ微量注入する。Ｉ Ｌ、２ ｍＲＮＡが蔗糖勾
配のビークフラクションにおいて全部ＩＪ Ａ＋Ｒ’Ｎ
Ａの０．３ ％を構成すると仮定して、０、／ ｎｐ
のＩＬ２ ｍＲＮＡを各卵細胞中に微量注入する。この
量の”１０％すなわち０．０ ／ ｎｓ／のＩＬ−２ｍ
ＲＮＡは卵細胞中への注入後に検出することができる。
Ａ／ｌｔｌを含有し、その内３０ｎ’）（３０ｎりを各
卵細胞へ微量注入する。Ｉ Ｌ、２ ｍＲＮＡが蔗糖勾
配のビークフラクションにおいて全部ＩＪ Ａ＋Ｒ’Ｎ
Ａの０．３ ％を構成すると仮定して、０、／ ｎｐ
のＩＬ２ ｍＲＮＡを各卵細胞中に微量注入する。この
量の”１０％すなわち０．０ ／ ｎｓ／のＩＬ−２ｍ
ＲＮＡは卵細胞中への注入後に検出することができる。
上記の推定によれは、ピークフラクションにはポリＡ十
ＲＮＡ１μｙ当り３ｎｐのＩＬ２ ｍＲＮＡが存在す
る筈であり、またヒプリド化−溶出分析にっきｊｏμｐ
のポリＡ＋ＲＮＡを使用すれば／ ｊ ＯｎｇのＩＬ、
２ｍＲＮＡが得られるであろう。
ＲＮＡ１μｙ当り３ｎｐのＩＬ２ ｍＲＮＡが存在す
る筈であり、またヒプリド化−溶出分析にっきｊｏμｐ
のポリＡ＋ＲＮＡを使用すれば／ ｊ ＯｎｇのＩＬ、
２ｍＲＮＡが得られるであろう。
ＳＯ個のクローンからなる各群は約１０個の挿入物を含
有する。３〜ｊμｇの挿入ＤＮＡを蔗糖勾配遠心分離に
よって精製し、ニトロセルロースフィルタに結合させた
。かくして、ｏ、３〜ｏ３μｇの個々の挿入ＤＮＡ（個
々のクローンから得られたもの）がフィルタに結合され
る。
有する。３〜ｊμｇの挿入ＤＮＡを蔗糖勾配遠心分離に
よって精製し、ニトロセルロースフィルタに結合させた
。かくして、ｏ、３〜ｏ３μｇの個々の挿入ＤＮＡ（個
々のクローンから得られたもの）がフィルタに結合され
る。
１０ｎｌｉのＩ Ｌ、２ ｍＲＮＡ （ｉ ３０ ｎ
ｇが利用ｓ ｏ ｏ ｎｇのＩＬ、２ ｃＤＮＡ挿入
物とヒプリド化し得ると仮定し、かっこのＲＮ Ａの３
０％が溶出後に回収され得ると仮定して、３ｎ９のＩＬ
、２ ｍＲＮＡをコμｌの水中へ入れ、その内３０
ｎｌもしくは０．０．ｆｎｇのＩＬ２ ｍＲＮＡを卵
細胞中へ注入する。これは分析中に検出される筈である
。
ｇが利用ｓ ｏ ｏ ｎｇのＩＬ、２ ｃＤＮＡ挿入
物とヒプリド化し得ると仮定し、かっこのＲＮ Ａの３
０％が溶出後に回収され得ると仮定して、３ｎ９のＩＬ
、２ ｍＲＮＡをコμｌの水中へ入れ、その内３０
ｎｌもしくは０．０．ｆｎｇのＩＬ２ ｍＲＮＡを卵
細胞中へ注入する。これは分析中に検出される筈である
。
それぞれ１０個の挿入物（６０種のクローンから得られ
たもの）を含有する３０個のフィルタを分析して、ヒプ
リド化すべき３００個の個々の挿入物を与えた。ＩＬ２
ｍＲＮＡがｄｓｏＤＮＡ合成に使用したボＩＪＡＲ
ＮＡの。、３チを構成すると仮定して、平均で７個のＩ
Ｌ、ｚｃ Ｄ Ｎ Ａクローンがフィルタ中に存在する
筈である。
たもの）を含有する３０個のフィルタを分析して、ヒプ
リド化すべき３００個の個々の挿入物を与えた。ＩＬ２
ｍＲＮＡがｄｓｏＤＮＡ合成に使用したボＩＪＡＲ
ＮＡの。、３チを構成すると仮定して、平均で７個のＩ
Ｌ、ｚｃ Ｄ Ｎ Ａクローンがフィルタ中に存在する
筈である。
実施例
工程Ａ： 「挿入ＤＮＡＪの精製およびこの［挿入ＤＮ
ＡＪを含有するニトロ −セルロースフィルタの調
製 上記で調製したもの（Ｍ２およびＭ３）のそれぞれを５
０個のクローンからなる群に分割し、ＳＯ個の各群を単
一の寒天板上でｌ晩増殖させた。次いで、これらクロー
ンから得られた細菌を１０ＮのＬＢ培地に懸濁させ、０
．３１の脳心臓潅流物（ＨＨＩ−ジフコ）Ｋこの懸濁物
を接種した。細菌懸濁物を７晩増殖させた後（プラスミ
ドの増加を伴わない）、５ＤＳ−アルカリ溶菌によって
これら培養物からＤＮＡを単離した（ティー・イーシュ
ーホロビッツおよびシュー・エフ１１パーク、ヌクレイ
ツク・アシド・リサーチ、第り巻、第コタｌり〜−タタ
１頁（／９ざ／））。
ＡＪを含有するニトロ −セルロースフィルタの調
製 上記で調製したもの（Ｍ２およびＭ３）のそれぞれを５
０個のクローンからなる群に分割し、ＳＯ個の各群を単
一の寒天板上でｌ晩増殖させた。次いで、これらクロー
ンから得られた細菌を１０ＮのＬＢ培地に懸濁させ、０
．３１の脳心臓潅流物（ＨＨＩ−ジフコ）Ｋこの懸濁物
を接種した。細菌懸濁物を７晩増殖させた後（プラスミ
ドの増加を伴わない）、５ＤＳ−アルカリ溶菌によって
これら培養物からＤＮＡを単離した（ティー・イーシュ
ーホロビッツおよびシュー・エフ１１パーク、ヌクレイ
ツク・アシド・リサーチ、第り巻、第コタｌり〜−タタ
１頁（／９ざ／））。
次いで、５０個のクローンの各混合物（２００μｇ）か
らのプラスミドＤＮＡを、２００μｌの１０ｍＭトリス
−ＨＣ／ （ｐＨ７，３）と／ｍＭのＥＤＴＡにおいて
ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断して、［
挿入ＤＮＡＪを切除した。反応が完結した後（クチポリ
アクリルアミドゲルにおいてよμｌを電気泳動させて検
査する）、ＤＮＡ混合物を６ｇ℃にて５分間加熱し、こ
れを水中で冷却し、そし、て／／μｌの５−２０％蔗糖
勾配へ１０ｍＭトリＪ’ −ＨＣｊ？ （ｐＨ７，５）
と／ｍＭのＥＤＴＡとで充填した。各濃度勾配をベック
マンＳＷ！／型ロータにて≠ＯＫかつ参℃でｔＡ時間遠
心分離した。
らのプラスミドＤＮＡを、２００μｌの１０ｍＭトリス
−ＨＣ／ （ｐＨ７，３）と／ｍＭのＥＤＴＡにおいて
ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断して、［
挿入ＤＮＡＪを切除した。反応が完結した後（クチポリ
アクリルアミドゲルにおいてよμｌを電気泳動させて検
査する）、ＤＮＡ混合物を６ｇ℃にて５分間加熱し、こ
れを水中で冷却し、そし、て／／μｌの５−２０％蔗糖
勾配へ１０ｍＭトリＪ’ −ＨＣｊ？ （ｐＨ７，５）
と／ｍＭのＥＤＴＡとで充填した。各濃度勾配をベック
マンＳＷ！／型ロータにて≠ＯＫかつ参℃でｔＡ時間遠
心分離した。
次いで、各濃度勾配を分別しかつ［挿入ＤＮＡＪの混合
物（、ｔ−１０ｎｇ）を含有するフラクションを／２１
０容量の２Ｍ ＫＯＡ ｏ （ｐＨｊ ）とコ容量のエ
タノールとで一、２０℃にて少なくとも３時間沈澱させ
た。
物（、ｔ−１０ｎｇ）を含有するフラクションを／２１
０容量の２Ｍ ＫＯＡ ｏ （ｐＨｊ ）とコ容量のエ
タノールとで一、２０℃にて少なくとも３時間沈澱させ
た。
［挿入Ｄ Ｎ Ａ Ｊの沈澱混合物を遠心分離により集
め、ペレットを全部で、２０μｌのｉｏｍＭトリス−Ｈ
Ｃ／ （ｐＨ７，１）と／ｍＭＥＤＴＡとに入れ（，２
μｌを４Ｚ％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に使用
した）、この混合物を７００℃にて１分間加熱し、水中
で冷却し、そして１０μｌの／、ｊ Ｎ ＮａＯＨを加
えた。混合物を室温で１０分間培養した後、ｓ Ｏｌｉ
ｔの２ Ｍ ＮＨ４０Ａ（＋を加え、これをニトロセル
ロースフィルタに打点シ（りＩＩＩ＋＋２、シュ２イヒ
ヤーおよびシュエルＢＡざｊ 、 ０．”ｌｌ ！ 、
／７ｍ ） ／ Ｍ ＮＨ４０Ａｃで湿潤化させて、
「挿入ＤＮＡＪをフィルタへ吸着させた。これらフィル
タを空気乾燥し、ＯｌりＭＮａＣｊ’と０．０９ Ｍク
エン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥し、そしてｇｏ℃に
て減圧下にｌ晩焼成した。
め、ペレットを全部で、２０μｌのｉｏｍＭトリス−Ｈ
Ｃ／ （ｐＨ７，１）と／ｍＭＥＤＴＡとに入れ（，２
μｌを４Ｚ％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に使用
した）、この混合物を７００℃にて１分間加熱し、水中
で冷却し、そして１０μｌの／、ｊ Ｎ ＮａＯＨを加
えた。混合物を室温で１０分間培養した後、ｓ Ｏｌｉ
ｔの２ Ｍ ＮＨ４０Ａ（＋を加え、これをニトロセル
ロースフィルタに打点シ（りＩＩＩ＋＋２、シュ２イヒ
ヤーおよびシュエルＢＡざｊ 、 ０．”ｌｌ ！ 、
／７ｍ ） ／ Ｍ ＮＨ４０Ａｃで湿潤化させて、
「挿入ＤＮＡＪをフィルタへ吸着させた。これらフィル
タを空気乾燥し、ＯｌりＭＮａＣｊ’と０．０９ Ｍク
エン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥し、そしてｇｏ℃に
て減圧下にｌ晩焼成した。
工程Ｂ： 「挿入 ＤＮＡＪとポリＡ＋ＲＮＡとのヒプ
リド化 ヒプリド化選択のため、３０個のニトロセルロースフィ
ルタを、４５％ホルムアミド（アンパライトＭ Ｂ ｌ
、セルバ社、により脱イオン化したもの）とｏ、２４８
８ｓと２０ｍＭＨＥＰＥ８１７．４’）と０．４ｔＭ
ＮａＣ／との混合物、ｔ ｏ ｏ ｔｔｔヲ含有する／
、ｔｍ／のシリコン処理した無菌コレクツスチューブ中
で３０℃にて２時間予備ヒプリド化させた。次いで、溶
液を、ポリＡ＋ＲＮＡを含有する同一の混合物（ＰＨＡ
／ＴＰＡ誘発された牌細胞から得られるｊ−７！０％蔗
糖勾配で上記したように精製しかつ４１℃にて１分間予
備加熱したもの１０Ｌｇ）で交換した。次いで、これら
フィルタおよび混合物を５０℃にて５時間培養した。３
０個のニトロセルロースフィルタは、上記のようにＲｂ
２およびＭ３フラクションの一部からそれぞれ調製され
たＳＯ個のクローンよりなるＳＯＷを示した。
リド化 ヒプリド化選択のため、３０個のニトロセルロースフィ
ルタを、４５％ホルムアミド（アンパライトＭ Ｂ ｌ
、セルバ社、により脱イオン化したもの）とｏ、２４８
８ｓと２０ｍＭＨＥＰＥ８１７．４’）と０．４ｔＭ
ＮａＣ／との混合物、ｔ ｏ ｏ ｔｔｔヲ含有する／
、ｔｍ／のシリコン処理した無菌コレクツスチューブ中
で３０℃にて２時間予備ヒプリド化させた。次いで、溶
液を、ポリＡ＋ＲＮＡを含有する同一の混合物（ＰＨＡ
／ＴＰＡ誘発された牌細胞から得られるｊ−７！０％蔗
糖勾配で上記したように精製しかつ４１℃にて１分間予
備加熱したもの１０Ｌｇ）で交換した。次いで、これら
フィルタおよび混合物を５０℃にて５時間培養した。３
０個のニトロセルロースフィルタは、上記のようにＲｂ
２およびＭ３フラクションの一部からそれぞれ調製され
たＳＯ個のクローンよりなるＳＯＷを示した。
工程Ｃ：非ヒプリド化ボＩＪＡＲＮＡからのヒプリド化
ポリＡ ＲＮＡ−挿入 ＤＮＡの分離 ヒプリド化ポリＡ＋ＲＮ Ａ−挿入ＤＮＡを含有する３
０個のフィルタをｒｏｍｔのプラスチックチューブに移
し、これらを５ＯｒｒｔｌＥの１０ｍＭトリス−ＨＣＪ
（ｐＨ７，！； ）と０．／ ｊ Ｍ ＮａＣｊ’と
ｔｍＭのＥＤＴＡとｏ、ｓ％８０ｓとの溶液ｓ。
ポリＡ ＲＮＡ−挿入 ＤＮＡの分離 ヒプリド化ポリＡ＋ＲＮ Ａ−挿入ＤＮＡを含有する３
０個のフィルタをｒｏｍｔのプラスチックチューブに移
し、これらを５ＯｒｒｔｌＥの１０ｍＭトリス−ＨＣＪ
（ｐＨ７，！； ）と０．／ ｊ Ｍ ＮａＣｊ’と
ｔｍＭのＥＤＴＡとｏ、ｓ％８０ｓとの溶液ｓ。
Ｎで２回洗浄し、かつＳＤ８を含まない上記の緩衝液で
６５℃にて２回洗浄した。次いで、それぞれ個々のフィ
ルタ”ｑｉｏｏμｌの水とコμｌ（≠μｇ）のポリＡ”
−ＲＮＡとを含有するシリコン処理したエツベンドルフ
管へ移した（オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムには牌細
胞からのＲＮＡ全通した）。これらチューブを１００℃
にて１分間加熱し、そして直ちにこれらをＣＯ２／エタ
ノール浴中で凍結させた。これらチューブを室温で解凍
した後、フィルタを各チューブから取出し、溶出しだＲ
ＮＡを一２０℃にて１ｓｔｔｔの、２ Ｍ Ｎａ０Ａ
ｃ （ｐＨｊ ）と３００μｌのエタノールとでｌ晩沈
澱させた。遠心分離によりＲＮＡを集め、ペレットを７
０チエタノールで２回洗浄しそして乾燥させた。
６５℃にて２回洗浄した。次いで、それぞれ個々のフィ
ルタ”ｑｉｏｏμｌの水とコμｌ（≠μｇ）のポリＡ”
−ＲＮＡとを含有するシリコン処理したエツベンドルフ
管へ移した（オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムには牌細
胞からのＲＮＡ全通した）。これらチューブを１００℃
にて１分間加熱し、そして直ちにこれらをＣＯ２／エタ
ノール浴中で凍結させた。これらチューブを室温で解凍
した後、フィルタを各チューブから取出し、溶出しだＲ
ＮＡを一２０℃にて１ｓｔｔｔの、２ Ｍ Ｎａ０Ａ
ｃ （ｐＨｊ ）と３００μｌのエタノールとでｌ晩沈
澱させた。遠心分離によりＲＮＡを集め、ペレットを７
０チエタノールで２回洗浄しそして乾燥させた。
工程Ｄ ： Ｉｌ、２−ｍＲＮＡ活性の測定３０個のペ
レットのＩＬココ−ＲＮＡ活性を分析するため、３０個
のフィルタに対応する、すなわちＲ１およびＭ３フラク
ションからの３０個のクローンよりなる初期の３０群に
対応するペレットのそれぞれをコμｌの水中に取シ、こ
のＲＮＡ溶液を１５〜２０個の南ア産蛙の卵細胞へ上記
と同様に注入した。−３℃で３日間後、卵細胞培地を除
去し、ＩＬ、２活性につき分析した（上記と同様）。
レットのＩＬココ−ＲＮＡ活性を分析するため、３０個
のフィルタに対応する、すなわちＲ１およびＭ３フラク
ションからの３０個のクローンよりなる初期の３０群に
対応するペレットのそれぞれをコμｌの水中に取シ、こ
のＲＮＡ溶液を１５〜２０個の南ア産蛙の卵細胞へ上記
と同様に注入した。−３℃で３日間後、卵細胞培地を除
去し、ＩＬ、２活性につき分析した（上記と同様）。
ｔｏ個のクローンよりなる３０群（ｃＤＮＡフラクショ
ンＭ、２ （７６０−１０００ｂｐ）からの１ｇ群およ
びｃ Ｄ Ｎ ＡフラクションＭ３（６００−７ｊ□ｂ
ｐ）からの／、２群〕のうち２群、すなわち群Ｍ３−２
（フィルタ、２０）と群Ｍ３−１（フィルタ、２４Ｌ
）とが、卵細胞注入分析で測定してＩＬ２活性を暗号化
するｍＲＮＡ（誘発牌細胞からのボＩＪ Ａ＋ ＲＮ
Ａから得られたもの）にヒプリド化する挿入ＤＮＡを含
有した。この分析の結果を第１表に示す。
ンＭ、２ （７６０−１０００ｂｐ）からの１ｇ群およ
びｃ Ｄ Ｎ ＡフラクションＭ３（６００−７ｊ□ｂ
ｐ）からの／、２群〕のうち２群、すなわち群Ｍ３−２
（フィルタ、２０）と群Ｍ３−１（フィルタ、２４Ｌ
）とが、卵細胞注入分析で測定してＩＬ２活性を暗号化
するｍＲＮＡ（誘発牌細胞からのボＩＪ Ａ＋ ＲＮ
Ａから得られたもの）にヒプリド化する挿入ＤＮＡを含
有した。この分析の結果を第１表に示す。
第１表
５ Ｍ２−５ ２９３
６ Ｍ２−６ ４１０
０１１ ＋＋＋ １１６５４
０２２−−− ？１Ｂ６１
ブランク５ −−− ３１／１標準’
−−−２０５７６ 末梢血液ＩＪンパ球による卵細胞培養培地の１：Ａ希釈
物のＨ３−チミジン組込みを意味する。
−−−２０５７６ 末梢血液ＩＪンパ球による卵細胞培養培地の１：Ａ希釈
物のＨ３−チミジン組込みを意味する。
１ ［’ＣＩＪは第１０比紋、すなわちヒブリド化−
溶出分析に使用する前にポリＡ＋ＲＮＡを南ア産蛙に注
入することを意味する。
溶出分析に使用する前にポリＡ＋ＲＮＡを南ア産蛙に注
入することを意味する。
２ 「Ｃ２」は’ＡＥ２の比較、すなわちニトロセルロ
ースフィルタによるヒブリド化の後にポリＡ”４ＮＡ
（非ヒブリド化ｆ（、ＮＡ）を南ア産蛙に注入するこ
とを意味する。
ースフィルタによるヒブリド化の後にポリＡ”４ＮＡ
（非ヒブリド化ｆ（、ＮＡ）を南ア産蛙に注入するこ
とを意味する。
６ 「ブランク」はＩＬ２分析に使用した完全培地（Ｒ
ＰＩＶｉ １６ Ａ Ｏ／１０％ＦＣ８）の１００μｔ
を意味する。
ＰＩＶｉ １６ Ａ Ｏ／１０％ＦＣ８）の１００μｔ
を意味する。
４ 「標準」はＰ、ＨＡ／Ｔｌ’Ａ誘発牌細胞培誘発小
細胞培養物製されたＩＬ２調製物を意味する。
細胞培養物製されたＩＬ２調製物を意味する。
上記したように第２のヒプリド化と分析とを行なった後
、群Ｍ３−２およびＭ３−６が再び陽性を示した。ＮＭ
３− ’ｌの５０個のクローンを１４個のサブ群、す
なわちサブ＃Ａ−Ｎにそれぞれ分割した（各群は７個の
クローンを含有し、ただしサブ群Ｎは８個のクローンを
含有し、全群における陽性クローンの存在は２つの陽性
サブ群をもたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使
用する）。次いで、上記のヒブリド化および分析手順を
、これら１４個のサブ群からの挿入ＤＮＡを含有するニ
トロセルロースフィルタについて反復し、ザブ、４１Ｖ
Ｉ３−２Ｄ（りｐ−ンＭ３−２−４，１１．１Ｂ、２５
，３２．３９および４６を含有する）とサブ群Ｍ３−２
Ｌ（クローンＭ３−２−２９．３０，３１，３２゜３３
．３４および３５を含有する）とがｉＬ２活性を示すこ
とを突き止めた。したがって、個々のクローンＩＶｉ３
−２−３２がひとＩＬ２−ｍ几ＮＡに補完的な［挿入Ｄ
ＮＡＪを有するグラスミドを含有するクローンとして同
定された。
、群Ｍ３−２およびＭ３−６が再び陽性を示した。ＮＭ
３− ’ｌの５０個のクローンを１４個のサブ群、す
なわちサブ＃Ａ−Ｎにそれぞれ分割した（各群は７個の
クローンを含有し、ただしサブ群Ｎは８個のクローンを
含有し、全群における陽性クローンの存在は２つの陽性
サブ群をもたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使
用する）。次いで、上記のヒブリド化および分析手順を
、これら１４個のサブ群からの挿入ＤＮＡを含有するニ
トロセルロースフィルタについて反復し、ザブ、４１Ｖ
Ｉ３−２Ｄ（りｐ−ンＭ３−２−４，１１．１Ｂ、２５
，３２．３９および４６を含有する）とサブ群Ｍ３−２
Ｌ（クローンＭ３−２−２９．３０，３１，３２゜３３
．３４および３５を含有する）とがｉＬ２活性を示すこ
とを突き止めた。したがって、個々のクローンＩＶｉ３
−２−３２がひとＩＬ２−ｍ几ＮＡに補完的な［挿入Ｄ
ＮＡＪを有するグラスミドを含有するクローンとして同
定された。
したがって、クローンＭ３−２−３２の挿入Ｄ Ｉ’Ｊ
Ａ ′ｆｒ：単離し、ｌｎＩ製し、そしてこれをニト
ロセルロースフィルタに結合式せ、このｌ（、Ｎ Ａヒ
プリド化分析を上記と同様に反復しまた。この分析にお
いて１１６々のクローンＭ３−２−３２は約６８００Ｃ
ｐｍのＩＩ、２活性を示した。
Ａ ′ｆｒ：単離し、ｌｎＩ製し、そしてこれをニト
ロセルロースフィルタに結合式せ、このｌ（、Ｎ Ａヒ
プリド化分析を上記と同様に反復しまた。この分析にお
いて１１６々のクローンＭ３−２−３２は約６８００Ｃ
ｐｍのＩＩ、２活性を示した。
このクローンをイーｅコリＨＢ１０１（１）ＳＶ５２９
（Ｈａｍ ＨＩ／ｂＩＩ、２−０ ）と命名し、
ソ（ＤｉｌｉｌＡＤ Ｉ’ＪＡ分子’ｆｆ Ｉ） ｓｖ
５２９ （Ｂ ａｍｊ（Ｉ ）／ｈＩＬ２−０ （ｒ
ｐ８Ｖ−ｈＩＬ２−ＯＪ ） と命名し、かつその
Ｄ Ｎ Ａ挿入物をｈ ｆＬ２−０と命名した・この命
名法は、クローンおよび組換１）ＮＡ分子がＢａｍＨＩ
部位にｈ １Ｌ２−関連ｃ １）ＮＡを含有するプラ
スミドｐｓＶ５２９からなることを示し、時定クローン
が最初に示されている。
（Ｈａｍ ＨＩ／ｂＩＩ、２−０ ）と命名し、
ソ（ＤｉｌｉｌＡＤ Ｉ’ＪＡ分子’ｆｆ Ｉ） ｓｖ
５２９ （Ｂ ａｍｊ（Ｉ ）／ｈＩＬ２−０ （ｒ
ｐ８Ｖ−ｈＩＬ２−ＯＪ ） と命名し、かつその
Ｄ Ｎ Ａ挿入物をｈ ｆＬ２−０と命名した・この命
名法は、クローンおよび組換１）ＮＡ分子がＢａｍＨＩ
部位にｈ １Ｌ２−関連ｃ １）ＮＡを含有するプラ
スミドｐｓＶ５２９からなることを示し、時定クローン
が最初に示されている。
同定
上記のように単離したｐ８Ｖ−ｈｉＬ２−［］を使用し
て、群］ｖｉ２およびＭ３のｃ １）ＮＡから予め調製
したクローンを集落ヒブリド化によって選別した〔エム
・グルンスタインおよびディー・ニス・ホグイ、ス、「
１（定遺伝子伊３むクローン化Ｄ ｒ４ Ａり単ｉ７１
法」、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ−舎サ
イエンス・Ｕ ＳＡ、 紀７２巷、第３９６１−６５貝
（１９７５））。この方法は、Ｉ） Ｓ Ｖ −ｈ Ｉ
Ｌ ２−０ カｂイ’ｔｆＮ’；ａｉＬｆｃ放射性試
料をニトロセルロースフィルタに固定された溶し亘ｉ＋
１１１ａ集落のＤ Ｎ Ａに対しヒプリド化させ゛Ｃ関
連コロニーを迅速に同定することをｉｉＪ’能にする。
て、群］ｖｉ２およびＭ３のｃ １）ＮＡから予め調製
したクローンを集落ヒブリド化によって選別した〔エム
・グルンスタインおよびディー・ニス・ホグイ、ス、「
１（定遺伝子伊３むクローン化Ｄ ｒ４ Ａり単ｉ７１
法」、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ−舎サ
イエンス・Ｕ ＳＡ、 紀７２巷、第３９６１−６５貝
（１９７５））。この方法は、Ｉ） Ｓ Ｖ −ｈ Ｉ
Ｌ ２−０ カｂイ’ｔｆＮ’；ａｉＬｆｃ放射性試
料をニトロセルロースフィルタに固定された溶し亘ｉ＋
１１１ａ集落のＤ Ｎ Ａに対しヒプリド化させ゛Ｃ関
連コロニーを迅速に同定することをｉｉＪ’能にする。
上記のように、微少測定板に集めたクローンｋ ｌ”Ｊ
様２ 寸法のニトロセルロースシー）（０，４５μｍ
の孔直山、シュライビヤ−２よびシュエルまたはミリボ
ア社）で復製したが、これらノートはθｌ″、剤を除去
するため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニシ
リン（１００μＰ／ｄ）を含有するＬＢ寒天板の上に置
いた。細菌集落を３７℃にで１晩増夕１αさぜた。ニト
ロセルロースシート上の細菌の浴閑およびＩ］定を、０
．５ＮＮａ（））Ｉ （約７分間２回）とＩＭ）リス−
Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）（約７分）と０．５Ｍ＋−リス−
ＨＣｔ（１）ｉ（７，５）および１．５八４ ＮａＣＬ
（約７分）と、２ｘ Ｓ、］Ｃ（Ｏｙ１５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１，０，０１５Ｍクエン服ナトリウム（ｐＨ７，２）
（約７分）とで順次に況イナすることに上り行〃つた。
様２ 寸法のニトロセルロースシー）（０，４５μｍ
の孔直山、シュライビヤ−２よびシュエルまたはミリボ
ア社）で復製したが、これらノートはθｌ″、剤を除去
するため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニシ
リン（１００μＰ／ｄ）を含有するＬＢ寒天板の上に置
いた。細菌集落を３７℃にで１晩増夕１αさぜた。ニト
ロセルロースシート上の細菌の浴閑およびＩ］定を、０
．５ＮＮａ（））Ｉ （約７分間２回）とＩＭ）リス−
Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）（約７分）と０．５Ｍ＋−リス−
ＨＣｔ（１）ｉ（７，５）および１．５八４ ＮａＣＬ
（約７分）と、２ｘ Ｓ、］Ｃ（Ｏｙ１５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１，０，０１５Ｍクエン服ナトリウム（ｐＨ７，２）
（約７分）とで順次に況イナすることに上り行〃つた。
エタノールで元号洗浄しかつ風乾した俵、これらシート
を減圧下で８０℃にて２時間焼成し、室温で貯蔵した・ 挿入ＤＮｋ ｈ Ｉ Ｌ ２−０ｉｌｊｉ片ｔｔｃ４
異的なｆ（ｉｎｆｉｉＪ限断片を、集落ヒプリド化に対
する試料として使用した。この断片（４５０塩基対）を
、ｐｂｖ−ｈ ｊ、Ｌ２−０ ノｆｆｌｌ１ｆ ＶＪＥ
ＪＴ生成物（７）４％ポリアクリルアミドゲルにおける
７ｑ気泳向で４”７４ Ｍした。、ＤＮｉ’−バンドを
臭化エチジウムで染色した後、特定断片を俗用させ、そ
して残留する臭化エチジウムをイソアミルアルコール抽
出によつ゛Ｃ除去した。次いで、特定断片をエタノール
での沈澱により」縮（−１「ニック翻訳、ＪによりＰ
−標識し〔ビー・ダブリウ串ジエー・リグピー停、「Ｄ
１”；ｊ ＡポリメラーゼＩでのニック翻訳による試
験管内でのデオキシリボ核酸の高ｌケ異活性の標識」、
ジャーナル・モレキュラ一番バイオロジー、第１１３巻
、第２３７−２５１頁（１９’７７））、この揚台それ
ぞれｄｃ’ｌ’Ｐ。
を減圧下で８０℃にて２時間焼成し、室温で貯蔵した・ 挿入ＤＮｋ ｈ Ｉ Ｌ ２−０ｉｌｊｉ片ｔｔｃ４
異的なｆ（ｉｎｆｉｉＪ限断片を、集落ヒプリド化に対
する試料として使用した。この断片（４５０塩基対）を
、ｐｂｖ−ｈ ｊ、Ｌ２−０ ノｆｆｌｌ１ｆ ＶＪＥ
ＪＴ生成物（７）４％ポリアクリルアミドゲルにおける
７ｑ気泳向で４”７４ Ｍした。、ＤＮｉ’−バンドを
臭化エチジウムで染色した後、特定断片を俗用させ、そ
して残留する臭化エチジウムをイソアミルアルコール抽
出によつ゛Ｃ除去した。次いで、特定断片をエタノール
での沈澱により」縮（−１「ニック翻訳、ＪによりＰ
−標識し〔ビー・ダブリウ串ジエー・リグピー停、「Ｄ
１”；ｊ ＡポリメラーゼＩでのニック翻訳による試
験管内でのデオキシリボ核酸の高ｌケ異活性の標識」、
ジャーナル・モレキュラ一番バイオロジー、第１１３巻
、第２３７−２５１頁（１９’７７））、この揚台それ
ぞれｄｃ’ｌ’Ｐ。
ｄ ＴＴＩ’およびｄＧＴＰを４ＯＯμＭで２．５μを
含有し、かつ１１００ｐのα−ＡＴＰ （アメルシャム
社、２０００Ｃｉ／ｍＭ ）と２．５単位の１）ＮＡ−
ポリメラーゼＩ（ベーリンガー社）とを含有する ５０
μｔの５０ｍＭ）リス−ＨＣＬ（ｐＨ７，Ａ ）と１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２ と２０ｒｎＭβ−メルカグトエタ
ノールにおいて１５℃にて４５分間培養した。未反応の
デオキ７ヌクレオシド三燐酸ヲ、セファデックスＧ−７
５カラムにおけるＴＥ緩衝剤でのゲル濾過によって除去
した・高度にＰ −標識された１） Ｎ Ａを０．１容
量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，１）と２．５容量の
エタノールとにより２０′Ｃにて沈澱させた。
含有し、かつ１１００ｐのα−ＡＴＰ （アメルシャム
社、２０００Ｃｉ／ｍＭ ）と２．５単位の１）ＮＡ−
ポリメラーゼＩ（ベーリンガー社）とを含有する ５０
μｔの５０ｍＭ）リス−ＨＣＬ（ｐＨ７，Ａ ）と１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２ と２０ｒｎＭβ−メルカグトエタ
ノールにおいて１５℃にて４５分間培養した。未反応の
デオキ７ヌクレオシド三燐酸ヲ、セファデックスＧ−７
５カラムにおけるＴＥ緩衝剤でのゲル濾過によって除去
した・高度にＰ −標識された１） Ｎ Ａを０．１容
量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，１）と２．５容量の
エタノールとにより２０′Ｃにて沈澱させた。
フィルタ含浸されたＤＮＡに対する上記試料のヒプリド
化を行なった〔これはディー・ハナハンおよびエム・メ
セルンンにより、［高集落密夏におけるゲラスミトポ別
」、ジーン誌、錆１０４、第６３−６７μ（１９８０）
に５３質的に記載されている〕。上記し７′ｃように調
製したフィルタ金０．１％フィコール、０．１％ポリビ
ニルピロリドン、０．１％牛血清アルブミン、０．１５
へ４１”ＪａＣｔ、 ０．０３Ｍ ） リス−ＨＣ
４（ｐＨ８）、１ ｍｆＶＩ Ｅ Ｄ ’Ｊ’ Ａにお
いて６８℃にて２時間予備培養し、次いで０．０２％ノ
イコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２
％牛血清アルブミン、０．７５Ａｉ ＮａＣ１，Ｄ、
１５ｆＪ トリス−ＨＣＬ （ｐＨ８）、５ ｍ Ｍ
ＥＤ ’ｌ’ Ａおよび０．５％ ＳＤＳにて洗浄
した。上記洗７ｐ浴液と同一の？ ｈＬでヒプリド化ｆ
！：６８℃にて進行させ、この場合使用ＶＣ先立ち１０
０℃にて５分間変性したＰ５２標識試料を使用した。ヒ
プリド化したフィルタｆＯｊＭ ＮａＣ１，０，０６Ｍ
）リス−ＨＣｔ （ｐＨ８３、２ｍ Ｍ ｇ
Ｄ Ｔ Ａ ＆＜こて ６８ ℃で２ ｈｅｒ’
ｌｌ１ｉ３２回洗浄した後、風乾しかつ放射線分析し
た。
化を行なった〔これはディー・ハナハンおよびエム・メ
セルンンにより、［高集落密夏におけるゲラスミトポ別
」、ジーン誌、錆１０４、第６３−６７μ（１９８０）
に５３質的に記載されている〕。上記し７′ｃように調
製したフィルタ金０．１％フィコール、０．１％ポリビ
ニルピロリドン、０．１％牛血清アルブミン、０．１５
へ４１”ＪａＣｔ、 ０．０３Ｍ ） リス−ＨＣ
４（ｐＨ８）、１ ｍｆＶＩ Ｅ Ｄ ’Ｊ’ Ａにお
いて６８℃にて２時間予備培養し、次いで０．０２％ノ
イコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２
％牛血清アルブミン、０．７５Ａｉ ＮａＣ１，Ｄ、
１５ｆＪ トリス−ＨＣＬ （ｐＨ８）、５ ｍ Ｍ
ＥＤ ’ｌ’ Ａおよび０．５％ ＳＤＳにて洗浄
した。上記洗７ｐ浴液と同一の？ ｈＬでヒプリド化ｆ
！：６８℃にて進行させ、この場合使用ＶＣ先立ち１０
０℃にて５分間変性したＰ５２標識試料を使用した。ヒ
プリド化したフィルタｆＯｊＭ ＮａＣ１，０，０６Ｍ
）リス−ＨＣｔ （ｐＨ８３、２ｍ Ｍ ｇ
Ｄ Ｔ Ａ ＆＜こて ６８ ℃で２ ｈｅｒ’
ｌｌ１ｉ３２回洗浄した後、風乾しかつ放射線分析し
た。
ｃＤＩ寸Ａフラクンヨン１ｖ１２から生じ７と約１６０
０個のクローンとｃＤＮＡフラクションＭ３から生じた
１０５０個のクローンとを選別した。この集落ヒプリド
化選別の結果、ＩＬ２試料に強力にヒブリド化したフラ
クションＭ３ ｃｌ）ＮＡから生ずる１個の集落を同
定した。フラクションＭ３からのこのクローンをｐｓＶ
−ｈｌＬ２−１と命名した。これは１（ＮＡ選択分析に
おいて予め陽性であったＭ６−６群から生じたものであ
る。
０個のクローンとｃＤＮＡフラクションＭ３から生じた
１０５０個のクローンとを選別した。この集落ヒプリド
化選別の結果、ＩＬ２試料に強力にヒブリド化したフラ
クションＭ３ ｃｌ）ＮＡから生ずる１個の集落を同
定した。フラクションＭ３からのこのクローンをｐｓＶ
−ｈｌＬ２−１と命名した。これは１（ＮＡ選択分析に
おいて予め陽性であったＭ６−６群から生じたものであ
る。
１）ＮＡ挿入物ｈｌＬ２−１は約２３０ ｂｐを示した
（そのＧ／Ｃ末端を含む）。この挿入物はｈＪＬ２−０
の内部Ｈｉｎｆ断片とヒプリド化するので、この挿入物
は内部ニックでｄＧ末端処理されたｄａ ｃｌ）ＮＡ
分子を挿入することにより生じたものと思われる。
（そのＧ／Ｃ末端を含む）。この挿入物はｈＪＬ２−０
の内部Ｈｉｎｆ断片とヒプリド化するので、この挿入物
は内部ニックでｄＧ末端処理されたｄａ ｃｌ）ＮＡ
分子を挿入することにより生じたものと思われる。
勿論、上記のようにｈｉＬ２−０挿入１）ＮＡまたはそ
の挿入物を使用して同定されたクローンのその他のＤＮ
Ａ挿入物を用いるクローン選別のこの方法は組換１）Ｎ
Ａ技術、合成、天然源またはその組合せから生ずるＤＮ
Ａ配列を含有するその他のクローン、或いは単一もしく
は複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突然変
異による上記Ｌ）ＮＡ配列のいずれかに関連したＤＮＡ
配列を含むクローンについても同等に使用することがで
きる。したがって、この種の１）ＮＡ配列およびその同
定も本発明の範囲内に入る。さらに、上記１）ＮＡ配列
によル選別されないが、ヌクレオチド配列の結果として
上記ＤＮＡ配列によシ暗号化されたポリペプチドを暗号
化するようなりＮＡ配列も本発明の範囲内に入ると了解
すべきである。
の挿入物を使用して同定されたクローンのその他のＤＮ
Ａ挿入物を用いるクローン選別のこの方法は組換１）Ｎ
Ａ技術、合成、天然源またはその組合せから生ずるＤＮ
Ａ配列を含有するその他のクローン、或いは単一もしく
は複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突然変
異による上記Ｌ）ＮＡ配列のいずれかに関連したＤＮＡ
配列を含むクローンについても同等に使用することがで
きる。したがって、この種の１）ＮＡ配列およびその同
定も本発明の範囲内に入る。さらに、上記１）ＮＡ配列
によル選別されないが、ヌクレオチド配列の結果として
上記ＤＮＡ配列によシ暗号化されたポリペプチドを暗号
化するようなりＮＡ配列も本発明の範囲内に入ると了解
すべきである。
さらに、ひとインタロイキン２を暗号化する１）ＮＡ配
列とねずみ、豚、にわとシ、牛または犬のようなひと以
外の原料から得られるＬＬ２を暗号化するＤＮＡ配列と
の間には同質性が予想されるので、本発明のＤＮＡ配列
はこれらのひと以外のインタロイキン２を暗号化する１
）ＮＡの選択において、および免疫治療剤および方法に
使用するためのひと以外のインタロイキンのクローン化
および発現において有用である。最後に、本発明の１３
ｒ４ Ａ配列゛チたはそれから調髪？かつ誘導される
オリゴヌクレオテドヲ１更用して、インタロイキン２で
はないインタロイキン１列連のポリペプチドを暗号化す
るその他の１）ＮＡ配列を選択することもできる。これ
らの配列およびポリペプチドも本発明の１部である。
列とねずみ、豚、にわとシ、牛または犬のようなひと以
外の原料から得られるＬＬ２を暗号化するＤＮＡ配列と
の間には同質性が予想されるので、本発明のＤＮＡ配列
はこれらのひと以外のインタロイキン２を暗号化する１
）ＮＡの選択において、および免疫治療剤および方法に
使用するためのひと以外のインタロイキンのクローン化
および発現において有用である。最後に、本発明の１３
ｒ４ Ａ配列゛チたはそれから調髪？かつ誘導される
オリゴヌクレオテドヲ１更用して、インタロイキン２で
はないインタロイキン１列連のポリペプチドを暗号化す
るその他の１）ＮＡ配列を選択することもできる。これ
らの配列およびポリペプチドも本発明の１部である。
ｂｔｉ、２−関連の挿入１）ＮＡを含イ１するプラスミ
ドで形質転換するためのアフリカ産緑猿（Ａ）’８）の
痔臓細紹を調製するため、これら細胞をデュルベツコの
改変イーグル最小培地（「Ｄｒ’ｖｉＥＪ ） （ギプ
コ社）に＾ｌｉ持した。この培地１ｄ１（）％新生中の
血清（ギプコ社）と１が当り１００単位のペニシリンと
１ｍｌ当９１００μｙのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、ＤＨ，ＡＥ−デキストラン改変法分
用いてプラスミド１）ＮＡによシ形質転換させた。
ドで形質転換するためのアフリカ産緑猿（Ａ）’８）の
痔臓細紹を調製するため、これら細胞をデュルベツコの
改変イーグル最小培地（「Ｄｒ’ｖｉＥＪ ） （ギプ
コ社）に＾ｌｉ持した。この培地１ｄ１（）％新生中の
血清（ギプコ社）と１が当り１００単位のペニシリンと
１ｍｌ当９１００μｙのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、ＤＨ，ＡＥ−デキストラン改変法分
用いてプラスミド１）ＮＡによシ形質転換させた。
次の工程を行なった：細胞の単一層をトリプシン−Ｅ
Ｄ ’１’ Ａにより約１時間徹底的に処理し、次いで
１０％の新生中血清を含有するＤｉＶｉＥにおいて１７
間の穴（１枚の板当り２４穴、コスタ−社）に分散させ
た。２４時間ソご、こＲ’Ｌらの細胞をＨＥＰｉｊｓ緩
衝最小必須培地で２回洗浄し、そし゛Ｃプラスミド１）
ＮＡ（１２μｔのＦｌｌ−）ＪＥＰｎＳ 緩衝液中に
約１〜１０μり／μｔで溶解） ｋ ５００ ｆｉｔ／
ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社）を含
有する１２０μｔのＤ ｉＶＬ Ｂに加えた。この混合
物を次いで細胞の単−Ｊｇｄへ７ｆＪ３０〜６０分間か
け−Ｃ加えた〔ジエー・エッチ・マツクチャンおよびジ
エー・ニス・パガノ、「ジエチルアミンエテル−デキス
トランによる猿ウィルス４０デオキシリボ核酸の感染性
の促進」、ジャーナル・ナショナル・カンサーーインス
チチュート、紀４１巻、第３５１−５７頁（１９７８）
；ジー拳チューおよびビー拳ニー・シャープ、［懸濁物
における細胞のＳ■４（３ＤＮＡ形質転換二Ｔ−抗原の
転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第１３巻、第
１９７−２０２頁（１９８１）Ｊ。これら細胞をＤＭＥ
で３回洗浄した後、新鮮な培地ＣＤｉ〜ＩＥ＋１０％牛
血清＋１００μｆ／ｒｎｌペニシリン および１００μ
ｆ／ｄストレプトマイシン）を加えそして細胞培養物を
Ｃ（Ｊ２培養器において３７℃で７２時間培養した。
Ｄ ’１’ Ａにより約１時間徹底的に処理し、次いで
１０％の新生中血清を含有するＤｉＶｉＥにおいて１７
間の穴（１枚の板当り２４穴、コスタ−社）に分散させ
た。２４時間ソご、こＲ’Ｌらの細胞をＨＥＰｉｊｓ緩
衝最小必須培地で２回洗浄し、そし゛Ｃプラスミド１）
ＮＡ（１２μｔのＦｌｌ−）ＪＥＰｎＳ 緩衝液中に
約１〜１０μり／μｔで溶解） ｋ ５００ ｆｉｔ／
ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社）を含
有する１２０μｔのＤ ｉＶＬ Ｂに加えた。この混合
物を次いで細胞の単−Ｊｇｄへ７ｆＪ３０〜６０分間か
け−Ｃ加えた〔ジエー・エッチ・マツクチャンおよびジ
エー・ニス・パガノ、「ジエチルアミンエテル−デキス
トランによる猿ウィルス４０デオキシリボ核酸の感染性
の促進」、ジャーナル・ナショナル・カンサーーインス
チチュート、紀４１巻、第３５１−５７頁（１９７８）
；ジー拳チューおよびビー拳ニー・シャープ、［懸濁物
における細胞のＳ■４（３ＤＮＡ形質転換二Ｔ−抗原の
転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第１３巻、第
１９７−２０２頁（１９８１）Ｊ。これら細胞をＤＭＥ
で３回洗浄した後、新鮮な培地ＣＤｉ〜ＩＥ＋１０％牛
血清＋１００μｆ／ｒｎｌペニシリン および１００μ
ｆ／ｄストレプトマイシン）を加えそして細胞培養物を
Ｃ（Ｊ２培養器において３７℃で７２時間培養した。
形質転換に使用したプラスミドＤＮＡはりゾチームー洗
剤の溶菌によりイー・コリＩ（Ｂ１０１（ｐＳＶ−ｈｌ
ｌ２−０ ）集落カラ調４ｉ１１．、臭化エチジウムの
存在下におけるＣｓＣ１勾配での同密度遠心分離によっ
て精製した〔エム・カーノ等、「プラスミドＣｏｔ Ｅ
ｌから誘導されたプラスミドクローン化ベヒクル」、メ
ソッド・イン・エンチモロジー、４６８巻、Ｑ換ＤＮＡ
（アール・ウー編）、第２６８−２８０頁（１９７９）
に実質的に記載されている〕。
剤の溶菌によりイー・コリＩ（Ｂ１０１（ｐＳＶ−ｈｌ
ｌ２−０ ）集落カラ調４ｉ１１．、臭化エチジウムの
存在下におけるＣｓＣ１勾配での同密度遠心分離によっ
て精製した〔エム・カーノ等、「プラスミドＣｏｔ Ｅ
ｌから誘導されたプラスミドクローン化ベヒクル」、メ
ソッド・イン・エンチモロジー、４６８巻、Ｑ換ＤＮＡ
（アール・ウー編）、第２６８−２８０頁（１９７９）
に実質的に記載されている〕。
７２時間培養した後、上ａ液（１／？／）を形質転換２
１１０胞から除去し、そしてこれを慣用の■Ｌ２分析に
使用して、上澄液における生物学的活性なｈＩｉ、２−
関連ポリペプチドの存在をｄｌり足した（上記）。
１１０胞から除去し、そしてこれを慣用の■Ｌ２分析に
使用して、上澄液における生物学的活性なｈＩｉ、２−
関連ポリペプチドの存在をｄｌり足した（上記）。
／ａ−ｙｐｓＶ−ｈｌｌ２−０ からのＩＬ２活性の発
現は何ら観察されなかった。その後のＤ Ｊ’４ Ａ配
列決定（下記）が示すところでは、このクローンのＬ）
ＮＡ挿入物ｈｆＬ２−０はその５末端に２いて不完全で
あり、開始信号を含まない。■ ＊ ｈＩｉ２−０の５末端における長欠ヌクレオチド
の数を確定するため、短かい（６３ｂｐ）制限断片を単
離した。５標識し、ストランド分離し、そして誘発１ｊ
キ細胞からｎ４＋られたポリＡ”ＲＮＡヘヒブリド化し
た後に逆転写酵素により延長化した。変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上でのｃＤＮｋ生成物の分析は約２１０ヌ
クレオチドのバンドを示した。この分析から、ｂ Ｉ
Ｌ ２−０は全長さのＩＬ２ｍＲＩＮＡよシも約１１０
個のヌクレオチドだけ短かいと推定された。
現は何ら観察されなかった。その後のＤ Ｊ’４ Ａ配
列決定（下記）が示すところでは、このクローンのＬ）
ＮＡ挿入物ｈｆＬ２−０はその５末端に２いて不完全で
あり、開始信号を含まない。■ ＊ ｈＩｉ２−０の５末端における長欠ヌクレオチド
の数を確定するため、短かい（６３ｂｐ）制限断片を単
離した。５標識し、ストランド分離し、そして誘発１ｊ
キ細胞からｎ４＋られたポリＡ”ＲＮＡヘヒブリド化し
た後に逆転写酵素により延長化した。変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上でのｃＤＮｋ生成物の分析は約２１０ヌ
クレオチドのバンドを示した。この分析から、ｂ Ｉ
Ｌ ２−０は全長さのＩＬ２ｍＲＩＮＡよシも約１１０
個のヌクレオチドだけ短かいと推定された。
ここで防用した発現ベクターは開始信号を与えない。し
たがって、いかなるｈＩＬ２元現も。
たがって、いかなるｈＩＬ２元現も。
ｈ ＩＪＬ、２−０のみを使用するこの発現系において
期待することができなかった。しかしながら、Ｄ Ｎ
Ａ ｇ入物、ｂ Ｉ Ｌ ２−０を使用して存在するク
ローンから、或いは工Ｌ２の完全陪号化配列を持たない
もしくはｈＩｉ２−ｏの配列と組合せるための配列の喪
失部分を供給するような他のクローンまたは染色体から
、その他のクローンを選択しイυることを了解すべきで
ある。この種の選択技術は上記に記載され、これを以下
に例示する６ｈＩｈ２に対する完全暗号化配列ケ・汀す
るクローンを同定した後、この配列を使用して猿細胞忙
上記のように形質転換させ、或いはその他の適当な宿主
を形質転換させて。
期待することができなかった。しかしながら、Ｄ Ｎ
Ａ ｇ入物、ｂ Ｉ Ｌ ２−０を使用して存在するク
ローンから、或いは工Ｌ２の完全陪号化配列を持たない
もしくはｈＩｉ２−ｏの配列と組合せるための配列の喪
失部分を供給するような他のクローンまたは染色体から
、その他のクローンを選択しイυることを了解すべきで
ある。この種の選択技術は上記に記載され、これを以下
に例示する６ｈＩｈ２に対する完全暗号化配列ケ・汀す
るクローンを同定した後、この配列を使用して猿細胞忙
上記のように形質転換させ、或いはその他の適当な宿主
を形質転換させて。
ｈ■Ｌ２様ポリペプチドを生成させることができる６さ
らに、このｈＩｉ２−０配列を常法にｊ リＡ Ｔ Ｇ
開始コドンと組合せて、成熟り工Ｌ２を暗号化するその
配列またはその部分？：発現させることができる。
らに、このｈＩｉ２−０配列を常法にｊ リＡ Ｔ Ｇ
開始コドンと組合せて、成熟り工Ｌ２を暗号化するその
配列またはその部分？：発現させることができる。
第５図は、ｈＩｉ２−ＯＤＮＡ配列を使用し゛ｒｈｉＬ
２ｉ生成する幾つかの作成を示している。これらの作成
においては、先ずｐＳＶ−ｈ ｌ Ｌ ２−０ ノＢａ
ｍ Ｈｌ −Ｈａｍ ｆ（Ｉ断片を単離した。これは第
４図に示したヌクレオチド配列を有する断片（ｈＩｉ２
−０）である（ただし、下線金施こした部分ヶ除く）。
２ｉ生成する幾つかの作成を示している。これらの作成
においては、先ずｐＳＶ−ｈ ｌ Ｌ ２−０ ノＢａ
ｍ Ｈｌ −Ｈａｍ ｆ（Ｉ断片を単離した。これは第
４図に示したヌクレオチド配列を有する断片（ｈＩｉ２
−０）である（ただし、下線金施こした部分ヶ除く）。
操作を単純化するため、先ずこの断片をｐＡ’ｌ”１５
３にサブクローン化しく第５図）１次いで１υられたｈ
ｌｌ、２−０暗号化配列ケ含有するプラスミドｐＡＴ１
５３をＨｇ１Ａ１によって線状化させ、Ｔ ａポリメラ
ーゼにより３′末端を除去し、次いでＨａｍ ｌ（＋に
より線状１） Ｉ’Ｊ Ａを制限してｈ ｆＬ２含有の
断片を単１〜［１ｔ、、この１１３片の５末端ＦｉＣＣ
Ｔ （第４図に示される第３のアミノ酸に対するコドン
）で始−チリ、またその３末端はｈ Ｉ Ｌ ２ＩＰ、
ｆ号化領域の末端を越える（第４図）。この断片をｈＩ
ｉ２１と命名した。
３にサブクローン化しく第５図）１次いで１υられたｈ
ｌｌ、２−０暗号化配列ケ含有するプラスミドｐＡＴ１
５３をＨｇ１Ａ１によって線状化させ、Ｔ ａポリメラ
ーゼにより３′末端を除去し、次いでＨａｍ ｌ（＋に
より線状１） Ｉ’Ｊ Ａを制限してｈ ｆＬ２含有の
断片を単１〜［１ｔ、、この１１３片の５末端ＦｉＣＣ
Ｔ （第４図に示される第３のアミノ酸に対するコドン
）で始−チリ、またその３末端はｈ Ｉ Ｌ ２ＩＰ、
ｆ号化領域の末端を越える（第４図）。この断片をｈＩ
ｉ２１と命名した。
１）ＮＡ配列１１１ Ｌ ２１はＰｒｏ（ｉａ図に示し
たｂ Ｉ Ｌ ２−０配列の第３のアミノ酸）で始まる
蛋白質を暗号化するので、この配列の１ＡＥ２のアミノ
酸（Ａｔａ ）をも暗号化する１） Ｎ Ａ配列を調製
することに決定した。” ■ 成＠ｈｌＬ２はこのアラニンで始まる。
たｂ Ｉ Ｌ ２−０配列の第３のアミノ酸）で始まる
蛋白質を暗号化するので、この配列の１ＡＥ２のアミノ
酸（Ａｔａ ）をも暗号化する１） Ｎ Ａ配列を調製
することに決定した。” ■ 成＠ｈｌＬ２はこのアラニンで始まる。
この作成を行なうため、先ずｈｏ、２１断片をｐＡＴ１
５３から調製した断片へ結合させ、その際このプラスミ
ドをＮａｒ Ｉ （ＧＧ ＣＧＣＣ）により線状化し
、末端に１）ＮＡポリメラーゼＩ（フレ／ −） （Ｂ
ａｎＩ部位をも形成する）を充填し、かつ線状断片をＢ
ａｍ ＨＩで制限した。
５３から調製した断片へ結合させ、その際このプラスミ
ドをＮａｒ Ｉ （ＧＧ ＣＧＣＣ）により線状化し
、末端に１）ＮＡポリメラーゼＩ（フレ／ −） （Ｂ
ａｎＩ部位をも形成する）を充填し、かつ線状断片をＢ
ａｍ ＨＩで制限した。
得られたプラスミド、すなわち第５図においてｐＡＴ１
５３（ｈｉＬ２Ｂ） は結合部に次の配列を有する： ＧＧＣＧＯＣＴ・・・ Ｐｒ。
５３（ｈｉＬ２Ｂ） は結合部に次の配列を有する： ＧＧＣＧＯＣＴ・・・ Ｐｒ。
次いで、このプラスミドをＢａｎＩで線状化し、５末端
にＩＪＮＡポリメラーゼ■（クレノー）を充填し、そし
てこの線状プラスミドをＢａｍ１（Ｉで制限した。倚ら
れたｈＩｉ、２含有の断片をｈＩＬ２０１と命名した。
にＩＪＮＡポリメラーゼ■（クレノー）を充填し、そし
てこの線状プラスミドをＢａｍ１（Ｉで制限した。倚ら
れたｈＩｉ、２含有の断片をｈＩＬ２０１と命名した。
その５′末端はＧＣＧＯＣＴ（Ａｌａ −ｋ’ｒｏを暗
号化する）で始′まり、その３′末端はＢａｍ Ｈ１部
位であって、ｈｉｉ、２暗号化配列の末端を越える。次
いで、これら断片を、Ａ ’Ｉ’ Ｇ １’Ａ 始コド
ンに隣接し、かつプロモー１およびリポソーム結合部位
の下流に存在する種々の発現ベクター中へ挿入した。こ
の種の作成により、アミン末端としてそれぞれＭｅｔ−
１’ｒｏ−Ｔｈｒまたは１Ｊｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−’
Ｉ’ｈｒを有するｈｌＬ２関連の生成物が得ら７’した
。
号化する）で始′まり、その３′末端はＢａｍ Ｈ１部
位であって、ｈｉｉ、２暗号化配列の末端を越える。次
いで、これら断片を、Ａ ’Ｉ’ Ｇ １’Ａ 始コド
ンに隣接し、かつプロモー１およびリポソーム結合部位
の下流に存在する種々の発現ベクター中へ挿入した。こ
の種の作成により、アミン末端としてそれぞれＭｅｔ−
１’ｒｏ−Ｔｈｒまたは１Ｊｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−’
Ｉ’ｈｒを有するｈｌＬ２関連の生成物が得ら７’した
。
上記の配列を発現ベクターｐＰＬｃＩＪｕ２９９（ゲー
リープエルの寄贈による）中へ挿入した。
リープエルの寄贈による）中へ挿入した。
このベクターはファージＭｕ■から得られるＰＬプロモ
ータとリポソーム結合部位とを含有する。
ータとリポソーム結合部位とを含有する。
これはさらに、菱遠■部位＜ ＣＣＡＴＧＧ）の一部で
あるＡＴＧ開始コドンと、さらに下流の独特なりａｒｎ
Ｈ１部位とを・特徴とする。
あるＡＴＧ開始コドンと、さらに下流の独特なりａｒｎ
Ｈ１部位とを・特徴とする。
■ このベクターはｐＰＬｃ２３６からイｑられた〔イ
ー・レモート等、「コリファージλのＰＬプロモータに
より制御される高効率発現に対するプラスミドベクター
」、ジーンｄ 、ａ ８１−９３頁（１９８１））。こ
れら配列を含有する微生物およびプラスミドは、１９８
２年８月１６ Ｂ付ｔｊ”Ｃ’ＡＴ ＣＣｉ託番号３９
１７３としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託した。この培養物は入手し得ると同時に、
後記する培養物も入手することができる。
ー・レモート等、「コリファージλのＰＬプロモータに
より制御される高効率発現に対するプラスミドベクター
」、ジーンｄ 、ａ ８１−９３頁（１９８１））。こ
れら配列を含有する微生物およびプラスミドは、１９８
２年８月１６ Ｂ付ｔｊ”Ｃ’ＡＴ ＣＣｉ託番号３９
１７３としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託した。この培養物は入手し得ると同時に、
後記する培養物も入手することができる。
したがって、ｐＰＬｃＭｕ２９９をＮｃｏｌによって線
状化し、５末端に１）ＮＡポリメラーゼ■（クレノー断
片）を全ての４つのｄＮＴＰの存在下に充填し、かつさ
らに線状ＤＮＡをＢａｍ）ＩＩにより切断した。アガロ
ースゲル上で精製した後、線状化したｐＰＬｃＭｕ２９
９を上記のｈｌＬ２含有断片と結合させ、そして得られ
たプラスミドｐ）’ＬｃＭｕ−ｈｊＬ２１ およびｐｆ
’Ｌｃｔ４ｕ −ｈ ＩＬ２０１を、挿入されたｈｉＬ
２含有断片に基づいて命名した・構造ｐＰＬｃＭｕ−ｈ
ｆＬ２１の結合部における１）ＮＡＡ配列次の通りであ
る： ＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴ’、［’Ｔ’Ｉ”１’ＡＣＣＡＴ
ＧＣＣＴ・Φ・Ｓ、Ｄ、 ＭｅｔＰｒｏ
＊＊＊構造ｐＰＬｃＭｕ−ｈＬＬ２０１の結合部におけ
るＤ Ｎ Ａ配列は次の通りである： ’ｌ”１’ＡＧＧＡＧＩＪＧＴＴ’ｌ”ＴＴＡＣＣＡＴ
ＧＧＣＧＣＣ’ｌ’ 、 。
状化し、５末端に１）ＮＡポリメラーゼ■（クレノー断
片）を全ての４つのｄＮＴＰの存在下に充填し、かつさ
らに線状ＤＮＡをＢａｍ）ＩＩにより切断した。アガロ
ースゲル上で精製した後、線状化したｐＰＬｃＭｕ２９
９を上記のｈｌＬ２含有断片と結合させ、そして得られ
たプラスミドｐ）’ＬｃＭｕ−ｈｊＬ２１ およびｐｆ
’Ｌｃｔ４ｕ −ｈ ＩＬ２０１を、挿入されたｈｉＬ
２含有断片に基づいて命名した・構造ｐＰＬｃＭｕ−ｈ
ｆＬ２１の結合部における１）ＮＡＡ配列次の通りであ
る： ＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴ’、［’Ｔ’Ｉ”１’ＡＣＣＡＴ
ＧＣＣＴ・Φ・Ｓ、Ｄ、 ＭｅｔＰｒｏ
＊＊＊構造ｐＰＬｃＭｕ−ｈＬＬ２０１の結合部におけ
るＤ Ｎ Ａ配列は次の通りである： ’ｌ”１’ＡＧＧＡＧＩＪＧＴＴ’ｌ”ＴＴＡＣＣＡＴ
ＧＧＣＧＣＣ’ｌ’ 、 。
Ｓ 、Ｄ、 １Ｖｆｅ ｔＡｌ ａＰ
ｒｏ ａ ａさらに、ｐＰＬＭｕ−ｈＩＬ２１ の
第１馨造、ファージＭｕからのリポソーム結合部位およ
びＰＬプロモータ′ｔ−特徴とする第２のプラスミドを
、ｐＰＬｃＭｕ−ｈＬＬ２１ の初期領域をｐＰＬｃ
２８の領域で交換することにより作成した〔イーーレモ
ート等、上記〕。このより小さいプラスミドをｐＰＬｃ
Ｍｕ−ｈｌＬ２２ と命名した（第５図）。
ｒｏ ａ ａさらに、ｐＰＬＭｕ−ｈＩＬ２１ の
第１馨造、ファージＭｕからのリポソーム結合部位およ
びＰＬプロモータ′ｔ−特徴とする第２のプラスミドを
、ｐＰＬｃＭｕ−ｈＬＬ２１ の初期領域をｐＰＬｃ
２８の領域で交換することにより作成した〔イーーレモ
ート等、上記〕。このより小さいプラスミドをｐＰＬｃ
Ｍｕ−ｈｌＬ２２ と命名した（第５図）。
次いで、イー・コリに１２ΔＨＩΔｔｒｐをこれら発現
ベクターのそれぞれで形質転換し、得られた培養物を４
２℃で６時間誘発させた０次いで、煮沸８Ｄ８中で細菌
を破壊することにより細菌抽出物を作成し、この抽出物
をＳＤＳポリアクリルアミドで分析した（セルバブル−
で染色）。３つの抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に
約１５にの新たな蛋白質バンドが存在した。
ベクターのそれぞれで形質転換し、得られた培養物を４
２℃で６時間誘発させた０次いで、煮沸８Ｄ８中で細菌
を破壊することにより細菌抽出物を作成し、この抽出物
をＳＤＳポリアクリルアミドで分析した（セルバブル−
で染色）。３つの抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に
約１５にの新たな蛋白質バンドが存在した。
しかし、このバンドは２８℃で生育させた形質転換細胞
からの抽出物には存在しなかった。
からの抽出物には存在しなかった。
１５にの蛋白質は全細胞蛋白質の約５−１０％であると
推定された。
推定された。
さらに上記したＨ５−チミジン組込み分析により、これ
ら形質転換宿主から作成された透明な抽出物のｈ ｊＬ
２生物学的活性を分析した。この分析において、培養か
つ誘発した細胞を洗剤の不存在下で音波処理により開裂
させ、細胞残骸を３００００Ｆで遠心分離し、上溌液を
０．２μのミリポアフィルタを通して清澄させた。この
分析の結果を下記第■表に示す。
ら形質転換宿主から作成された透明な抽出物のｈ ｊＬ
２生物学的活性を分析した。この分析において、培養か
つ誘発した細胞を洗剤の不存在下で音波処理により開裂
させ、細胞残骸を３００００Ｆで遠心分離し、上溌液を
０．２μのミリポアフィルタを通して清澄させた。この
分析の結果を下記第■表に示す。
第■表
Ｈ目２標準 １００
Ｈｉ１２ ＋ ２５％ 比較抽出物 Ｚ。
Ｈ目２ ＋２．５％ 比較抽出物 ８１ｐＰ
Ｌｃｔｖｉｕ−ｈＪｈ２１ （２８℃）〈１ｐＰＬ
ｃＭｕ−ｈＺＬ２１ （１２℃）２５ｐＰＬｃＭｕ
−ｈＩＬ２２ （２８℃）＜１ｐＰＬｃＭｕ−ｈｌ
ｈ２２ （４２℃） １３０ｐ）’ＬｃＭｕ−
ｈｌＬ２［１１（２８℃）＜１ｐＰＬｃＭｕ−ｈＩＬ２
０１ （１２℃） ８５０■ これらの分析は、
ｈ ＩＬ２の大部分がペレット中に残留する／とめ、形
質転換宿主で生成される蛋白質の全量に関１−１定性的
でしかない。したがって、透明抽出物中に存在するｈｌ
Ｌ２の量はｈｆＬ２の全細菌合成に対し何らの関係もな
い。
Ｌｃｔｖｉｕ−ｈＪｈ２１ （２８℃）〈１ｐＰＬ
ｃＭｕ−ｈＺＬ２１ （１２℃）２５ｐＰＬｃＭｕ
−ｈＩＬ２２ （２８℃）＜１ｐＰＬｃＭｕ−ｈｌ
ｈ２２ （４２℃） １３０ｐ）’ＬｃＭｕ−
ｈｌＬ２［１１（２８℃）＜１ｐＰＬｃＭｕ−ｈＩＬ２
０１ （１２℃） ８５０■ これらの分析は、
ｈ ＩＬ２の大部分がペレット中に残留する／とめ、形
質転換宿主で生成される蛋白質の全量に関１−１定性的
でしかない。したがって、透明抽出物中に存在するｈｌ
Ｌ２の量はｈｆＬ２の全細菌合成に対し何らの関係もな
い。
次いで、上記のｈＩＬ２配列を発現ベクターｐＴｒｐ３
２１ （ゲーリープエルの寄贈）に挿入した。このベク
ターはＴｒｐ減衰領域から侍られる’ｌ’ｒｐプロモー
タとリポソーム結合部位とを含有する。ベクタ一部分は
実質的にｐＨｉ（３２２であり、開始ＡＴＧコドンはＮ
ｃｏＩ部位の部分であり、かつ独特なりａｍ）（Ｉ部位
が存在する。
２１ （ゲーリープエルの寄贈）に挿入した。このベク
ターはＴｒｐ減衰領域から侍られる’ｌ’ｒｐプロモー
タとリポソーム結合部位とを含有する。ベクタ一部分は
実質的にｐＨｉ（３２２であり、開始ＡＴＧコドンはＮ
ｃｏＩ部位の部分であり、かつ独特なりａｍ）（Ｉ部位
が存在する。
したがつ°Ｃ１上記（ａｌの項に記載したと同じ作成技
術にしたがって、ｈｌＬ２配列を含有するプラスミドを
作成した。これらのプラスミドを、使用したｈ ＩＬ２
含有断片に基づいて、ｐＴｒｐ−ｈｌＬ２１およびｐＴ
ｒｐ−ｈｊＬ２０１と命名 ゛した・構造ｐＴｒｐ−
ｈｉＬ２１の結合部に赴ける１）ＮＡ配列は次の通りで
ある： ＡＡＡＧＧＧＴＡ’ｌ”ＣＵＡＴ’ｌ’ＣＣＡＴＧＣＣ
Ｔ −、。
術にしたがって、ｈｌＬ２配列を含有するプラスミドを
作成した。これらのプラスミドを、使用したｈ ＩＬ２
含有断片に基づいて、ｐＴｒｐ−ｈｌＬ２１およびｐＴ
ｒｐ−ｈｊＬ２０１と命名 ゛した・構造ｐＴｒｐ−
ｈｉＬ２１の結合部に赴ける１）ＮＡ配列は次の通りで
ある： ＡＡＡＧＧＧＴＡ’ｌ”ＣＵＡＴ’ｌ’ＣＣＡＴＧＣＣ
Ｔ −、。
Ｓ、Ｄ−Ｍｅ ｔＪＰ ｒｏ ＋＋ ＊ ｅ構造ｐＴ
ｒｐ−ｈＩＬ２０１ の結合部におけるＤＮＡ配列は
次の通りである： 、ＡＡＡ、ＧＵＧＴＡ’Ｉ’ＣＧＡ’Ｉ”Ｉ’ＣＣＡＴ
ＧＧＣＧＣＣＴ−−−ＭｅｔＡｌａＰｒｏ−−。
ｒｐ−ｈＩＬ２０１ の結合部におけるＤＮＡ配列は
次の通りである： 、ＡＡＡ、ＧＵＧＴＡ’Ｉ’ＣＧＡ’Ｉ”Ｉ’ＣＣＡＴ
ＧＧＣＧＣＣＴ−−−ＭｅｔＡｌａＰｒｏ−−。
次いで、イーφコリに５１４λをｐ Ｔ ｒ ｐ −ｈ
ＬＬ２１およびｐＴｒｐ−ｈ）Ｌ２０１で形質転換させ
、そし°にれら形質転換ｆａ主をトリプトファン欠乏に
よって３７℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞内
に１５１（の蛋白質バンドが観察された。予想通り、こ
のバンドは誘発しない細胞には存在しなかった。ここで
も、ひとインタロイキン２の活性の誘発合成のレベルは
全細胞蛋白質の５−１０％であった。
ＬＬ２１およびｐＴｒｐ−ｈ）Ｌ２０１で形質転換させ
、そし°にれら形質転換ｆａ主をトリプトファン欠乏に
よって３７℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞内
に１５１（の蛋白質バンドが観察された。予想通り、こ
のバンドは誘発しない細胞には存在しなかった。ここで
も、ひとインタロイキン２の活性の誘発合成のレベルは
全細胞蛋白質の５−１０％であった。
さらに、洗剤の不存在下で音波処理により誘発培養物の
細胞を開裂させ、ＩｖＩ［胞残骸を３００００２にて遠
心分離し、かつ上澄７（Ｌｋｏ、２μのミリポアフィル
タに通した後、生物学的活性につき分析した。これら分
析の結果全第Ｎ表に示す。
細胞を開裂させ、ＩｖＩ［胞残骸を３００００２にて遠
心分離し、かつ上澄７（Ｌｋｏ、２μのミリポアフィル
タに通した後、生物学的活性につき分析した。これら分
析の結果全第Ｎ表に示す。
第璽表
ａ；ｉ ２標準 １００
Ｈｉ１２ ＋ ２５％比較抽出物 ７０Ｈ１１
２＋２．５％比較抽出物 ８１ｐＴｒｐ ３２
１ ＜１ｐＴｒｐ−ｈ（Ｌ２１
（誘発） ２１００ｐｉ”ｒｐ−ｈｌｈ２０
１ （誘発） ３８００■ ここでも、これ
らの結果はｈｉＬ２活性の大部分が未分析のペレット中
に残任して、分析し、た透明抽出物には存在したいため
定性的でしかない。
２＋２．５％比較抽出物 ８１ｐＴｒｐ ３２
１ ＜１ｐＴｒｐ−ｈ（Ｌ２１
（誘発） ２１００ｐｉ”ｒｐ−ｈｌｈ２０
１ （誘発） ３８００■ ここでも、これ
らの結果はｈｉＬ２活性の大部分が未分析のペレット中
に残任して、分析し、た透明抽出物には存在したいため
定性的でしかない。
Ｉｃｌ に１１１菌抽出物からの生物学的活性の回収
１１１１／ノ培養物（ｐｆ’ｈｃＭｕ−ｈｌＬ２１
またはｐ ’１’ ｒ ｐ −ｈ Ｉ Ｌ ２１ ）か
ら作成した細菌ペレットを１％８ＪＪ８−１％β−メル
カプトエタノールを含有するラメリの屯気泳拗用緩衝液
（２００μｔ）中に懸濁させ、そしてこの懸、蜀物を３
７℃で１時間培養し、次いで音波処理した□これら抽出
物（ｄ［］μｔ ） ｆ：、０．１％８１）Ｓを含有１
−る１５’、？ｉ’ＡＧＥ（ラメリ）に通してｆ４ｆ気
泳動した後、このゲルを２間のスライスに切ｉノ↑し、
各ゲルスライスを微小測定板の穴に入れた。次いで、ゲ
ルスライスｆｆ：１０％胎児牛血清を含有するｌ？、
ＰｉＪ ｉ １６ Ａ Ｏ培地（ストレプトマイシン
とペニシリンとを補充）で２回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で破砕し、そして２００μｔの培地中へ拡散させ
ることによシ３Ｚ℃で１晩溶出した。プレートを４℃で
２時間培養した後、これを２００Ｆにて１５分間遠心分
離し、そして上澄液を前記と同僚にｂ Ｉ １＋ ２活
性につき分析した。
１１１１／ノ培養物（ｐｆ’ｈｃＭｕ−ｈｌＬ２１
またはｐ ’１’ ｒ ｐ −ｈ Ｉ Ｌ ２１ ）か
ら作成した細菌ペレットを１％８ＪＪ８−１％β−メル
カプトエタノールを含有するラメリの屯気泳拗用緩衝液
（２００μｔ）中に懸濁させ、そしてこの懸、蜀物を３
７℃で１時間培養し、次いで音波処理した□これら抽出
物（ｄ［］μｔ ） ｆ：、０．１％８１）Ｓを含有１
−る１５’、？ｉ’ＡＧＥ（ラメリ）に通してｆ４ｆ気
泳動した後、このゲルを２間のスライスに切ｉノ↑し、
各ゲルスライスを微小測定板の穴に入れた。次いで、ゲ
ルスライスｆｆ：１０％胎児牛血清を含有するｌ？、
ＰｉＪ ｉ １６ Ａ Ｏ培地（ストレプトマイシン
とペニシリンとを補充）で２回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で破砕し、そして２００μｔの培地中へ拡散させ
ることによシ３Ｚ℃で１晩溶出した。プレートを４℃で
２時間培養した後、これを２００Ｆにて１５分間遠心分
離し、そして上澄液を前記と同僚にｂ Ｉ １＋ ２活
性につき分析した。
この分析の結果、細菌抽出物（ｐＰＬｃＭｕ−ｈｌＬ２
１またはｐＴｒｐ−ｂｊＬ２１ ）のｈｉＬ２生物学活
性は、形質転換細胞の誘発の際現われる１５に蛋白質バ
ンドと共に移動し、かっこの生物学的活性はＳ ＪＪ
Ｓ −ＰＡＧＪ！ｉから回収され得ることが確認された
。
１またはｐＴｒｐ−ｂｊＬ２１ ）のｈｉＬ２生物学活
性は、形質転換細胞の誘発の際現われる１５に蛋白質バ
ンドと共に移動し、かっこの生物学的活性はＳ ＪＪ
Ｓ −ＰＡＧＪ！ｉから回収され得ることが確認された
。
ｈｉ、Ｌ２１カ連挿入１） ＩＮ Ａの特性化第４図を
参照して、挿入ＤＮノｋ ｈｉＬ２−０の物理的地図
を、供給菓者により特定された条件下における種々の制
限酵素（二ニー・イングランド・バイオラブ社またはベ
ーリンガー社）での切Ｅａしこよって作成した。切断生
成物を２．２％アガロースゲルまたは６％ポリアクリル
アミドゲルにおいてＡＯｍＭ トリス−ＨＬＪＡＣ（
ｐＨ７，８）と２０ ｔｎ ｔＶ Ｅ Ｄ ’１１’
Ａ Ｔ：電気泳動サセタ。
参照して、挿入ＤＮノｋ ｈｉＬ２−０の物理的地図
を、供給菓者により特定された条件下における種々の制
限酵素（二ニー・イングランド・バイオラブ社またはベ
ーリンガー社）での切Ｅａしこよって作成した。切断生
成物を２．２％アガロースゲルまたは６％ポリアクリル
アミドゲルにおいてＡＯｍＭ トリス−ＨＬＪＡＣ（
ｐＨ７，８）と２０ ｔｎ ｔＶ Ｅ Ｄ ’１１’
Ａ Ｔ：電気泳動サセタ。
これらを臭化エチジウムで染色して肉眼化した後、また
は制限断片をＰ −ホスフェート（下記）で末端標識す
る放射線分析の後に分析し、ｐＢＩＬ３２２の詳細な物
理的地図と比較した〔ジエー・ジー〇サツトクリフ、「
大ｊ腸菌プラスミドｐｉ３１（，３２２の完全ヌクレオ
チド配列」、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポ
ジウム、ｍｌ１３巻、第１号、ｇｌ’； ７７−９０頁
（１９７８）Ｊ。制限地図を、これら切断パターンＶこ
基づいて作成した。これらをＤ Ｉ’Ｎ Ａ挿入物の配
列決定により規定した〔ニー・エム・マキサムおよびダ
プリヮ・ギルバート、「１）ＮＡの新規な配列決定方法
」、ブローシーディグ・ナンヨナルΦアカテミー・サイ
エンス−ＵＳＡ＝第７４咎、第５６０−６１１頁（１９
７７１の方法による〕。ｈ Ｉｆ、２−０の配列は、下
記するゲノムｈＩＬ２クローンからの配列情報によって
補充した。ゲノム情報を第４図に示す。
は制限断片をＰ −ホスフェート（下記）で末端標識す
る放射線分析の後に分析し、ｐＢＩＬ３２２の詳細な物
理的地図と比較した〔ジエー・ジー〇サツトクリフ、「
大ｊ腸菌プラスミドｐｉ３１（，３２２の完全ヌクレオ
チド配列」、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポ
ジウム、ｍｌ１３巻、第１号、ｇｌ’； ７７−９０頁
（１９７８）Ｊ。制限地図を、これら切断パターンＶこ
基づいて作成した。これらをＤ Ｉ’Ｎ Ａ挿入物の配
列決定により規定した〔ニー・エム・マキサムおよびダ
プリヮ・ギルバート、「１）ＮＡの新規な配列決定方法
」、ブローシーディグ・ナンヨナルΦアカテミー・サイ
エンス−ＵＳＡ＝第７４咎、第５６０−６１１頁（１９
７７１の方法による〕。ｈ Ｉｆ、２−０の配列は、下
記するゲノムｈＩＬ２クローンからの配列情報によって
補充した。ゲノム情報を第４図に示す。
プラスミドＩ）ＮＡをイシニーホロビッツおよびパーク
（上記）の方法によってｐ８Ｖ−ｈｆＬ２−０から作成
し、この方法を選別用として一群のクローンから１）Ｎ
Ａを単離するために使用した。４人ＤＮｋｆｐｓＶ−ｈ
ｌＬ２−Ｏｃ７）ＢａｍＨ■制限によつ′Ｃ得、と几を
前記と同様に中性蔗糖濃度勾配遠心分離によって精製し
た（約７４０ｂｐ）。次いで、製造業者にニー・イング
ランド・バイオラブ社）によυ推奨されるように、極々
の制限酵素で制限した。
（上記）の方法によってｐ８Ｖ−ｈｆＬ２−０から作成
し、この方法を選別用として一群のクローンから１）Ｎ
Ａを単離するために使用した。４人ＤＮｋｆｐｓＶ−ｈ
ｌＬ２−Ｏｃ７）ＢａｍＨ■制限によつ′Ｃ得、と几を
前記と同様に中性蔗糖濃度勾配遠心分離によって精製し
た（約７４０ｂｐ）。次いで、製造業者にニー・イング
ランド・バイオラブ社）によυ推奨されるように、極々
の制限酵素で制限した。
制限したＪＪＮＡを、４単位のｒ＋４１１菌性アルカリ
ホスファターゼと０．１％の８０８との存在下に６５℃
にて３０分間脱燐酸した。２回フェノール抽出しかつエ
タノール沈、改した後、１）Ｉ〜Ａをｒ −Ｐ５２−
Ａ’ｌ’Ｐ （３ＤＯｏｃｉ ７ｍＲ４）と ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）とで５
末端柳識した。或いは、制限断片を、α−標識したＰ
−ヌクレオシドトリホスフェート（１０００Ｃｉ／ｍＭ
）の存在下ｆＤＮＡポリメラーゼ反応（クレノー断片
、ベーリンガー社）により３′末端標識した。
ホスファターゼと０．１％の８０８との存在下に６５℃
にて３０分間脱燐酸した。２回フェノール抽出しかつエ
タノール沈、改した後、１）Ｉ〜Ａをｒ −Ｐ５２−
Ａ’ｌ’Ｐ （３ＤＯｏｃｉ ７ｍＲ４）と ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）とで５
末端柳識した。或いは、制限断片を、α−標識したＰ
−ヌクレオシドトリホスフェート（１０００Ｃｉ／ｍＭ
）の存在下ｆＤＮＡポリメラーゼ反応（クレノー断片
、ベーリンガー社）により３′末端標識した。
配列決定のため、標識した断片を２つの方法で処理した
。すなわち、成るものは第２の制限酵素で開裂する前に
ポリアクリルアミドゲルで精製した。他のものは第２の
制限酵素で直ちに開裂した。両者の場合、所望の断片を
ポリアクリルアミドゲル上でトリス硼酸４−Ｅｌ）ＴＡ
緩衝液にて分離した。第３図はＡ１１１々の制限断片１
円および正方形はそＩ”Ｌぞれ３ または５標識を示し
、矢印は配列決定の方向を乃くす）および使用した配列
決定法を示している。酵素ＡｃｃＩ 。
。すなわち、成るものは第２の制限酵素で開裂する前に
ポリアクリルアミドゲルで精製した。他のものは第２の
制限酵素で直ちに開裂した。両者の場合、所望の断片を
ポリアクリルアミドゲル上でトリス硼酸４−Ｅｌ）ＴＡ
緩衝液にて分離した。第３図はＡ１１１々の制限断片１
円および正方形はそＩ”Ｌぞれ３ または５標識を示し
、矢印は配列決定の方向を乃くす）および使用した配列
決定法を示している。酵素ＡｃｃＩ 。
加、Ｎロエ、肌ＩＩ 、凹状Ｅｌ 、乃棟工。
Ｈｐａｉ 、 Ｉ（ｐＭ 、 Ｋ凹■・Ｎぜ■・Ｎ些Ｉ
・Ｎｒｕｌ 、 ＰｖｕＩ 、 ｉ’ｖｕｌｆ
、 ５ａｃｌ 、 ＳｍａＩ 。
・Ｎｒｕｌ 、 ＰｖｕＩ 、 ｉ’ｖｕｌｆ
、 ５ａｃｌ 、 ＳｍａＩ 。
５ｐｈｊおよびＴａｑ ｔｃついては制限部位が見ら
れなかった。
れなかった。
これらｈｌＪ７片をニー・エム・マキサムおよびダブリ
ュー・ギルバート（上記）の方法にしたがって分解した
。生成物を、独々の４度および長さのアクリルアミドゲ
ルで５０ｍＭ）リス硼酸塩と１ ｍｆＶｉ ＦｉｌＪ’
ｌ”Ａ （ｐＨ８，３）Ｋテ９００ Ｖ〜２０００ｖを
用いて分別した。このようにして得られた腹合ヌクレオ
チド配列およびその対応アミノ酸配列を第４図に示す。
ュー・ギルバート（上記）の方法にしたがって分解した
。生成物を、独々の４度および長さのアクリルアミドゲ
ルで５０ｍＭ）リス硼酸塩と１ ｍｆＶｉ ＦｉｌＪ’
ｌ”Ａ （ｐＨ８，３）Ｋテ９００ Ｖ〜２０００ｖを
用いて分別した。このようにして得られた腹合ヌクレオ
チド配列およびその対応アミノ酸配列を第４図に示す。
ｂ Ｉ Ｌ ２−０に関し第４図に示した１）ＮＡ配列
は＝ＧＣ末端から−９〜−１４の位置にポリアデニル化
信号ＡＡＴＡＡＡを有する。これは停止信号で終端する
１３３個のアミノ酸を暗号化するオープン読み枠を有す
る。ｈｌＬ２の分子量に基づきかつ原ｈｉｌ、２がグリ
コジル化されていると仮定して、成熟ｈ■Ｌ２は１００
〜１３０個のアミノ酸を有するであろうと予想した。し
たがって、挿入ｈＩＬ２−０は成熟ｈｉＬ２に苅する完
全暗号化配列を含むと伯じられるが、ブレｈｉｉ、２の
抽Ｗ信号配列およびこの信号配列のＡ ’Ｉ’ Ｇ開始
信号のアミノ酸に対する暗号化領域の少なくとも１部を
費失していると思われる。”ここでも、これらの喪失ア
ミノ敲を暗号化するクローンを前記と同様に選択し、或
いは作成することかできる。たとえば、第４図において
、この部分はゲノムクローン（下線）からの配列情報に
よって供給さｔしる。しかしながら、この配列は、これ
により形質転換された宿主におけるｈＩＬ２４ｆｉポリ
ペプチドの合成を可能にする。
は＝ＧＣ末端から−９〜−１４の位置にポリアデニル化
信号ＡＡＴＡＡＡを有する。これは停止信号で終端する
１３３個のアミノ酸を暗号化するオープン読み枠を有す
る。ｈｌＬ２の分子量に基づきかつ原ｈｉｌ、２がグリ
コジル化されていると仮定して、成熟ｈ■Ｌ２は１００
〜１３０個のアミノ酸を有するであろうと予想した。し
たがって、挿入ｈＩＬ２−０は成熟ｈｉＬ２に苅する完
全暗号化配列を含むと伯じられるが、ブレｈｉｉ、２の
抽Ｗ信号配列およびこの信号配列のＡ ’Ｉ’ Ｇ開始
信号のアミノ酸に対する暗号化領域の少なくとも１部を
費失していると思われる。”ここでも、これらの喪失ア
ミノ敲を暗号化するクローンを前記と同様に選択し、或
いは作成することかできる。たとえば、第４図において
、この部分はゲノムクローン（下線）からの配列情報に
よって供給さｔしる。しかしながら、この配列は、これ
により形質転換された宿主におけるｈＩＬ２４ｆｉポリ
ペプチドの合成を可能にする。
≠ 推定信号ペプチドは第４図における矢印で示される
ように８ｅｒとＡｔａ との間で成熟ｈ ＩＩ、２から
開裂されると思われるのこの配列は、単〒もしくは多重
の塩基置換、削除、挿入または逆転を含む突然変異のよ
うな遺伝子に対する改変が既に遺伝子で生じていなくて
も、或いはその後に使用してその性質′またはそれから
発現はれるポリペプチドの性質を改変させなく−ｒもよ
いという可能性を排除するものではない。さらに、生理
学的に同じであるが、構造的には第４図に示したものと
若干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすような
任意の多形性を排除するものでもない・ 勿論、常法によりポリＡ Ｉ（ＮＡから倚られ！ たクローン化ｃｌ）ＮＡ（上記）は５末端ヌクレオチド
を欠如１−てい°Ｃも、また人工的配列を含んでいＣも
よいことを了解すべきである〔アール・アイ・リチャー
ド等、「成長雛のβ−グロビンｃ １）ＮＡの分子クロ
ーン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシド・リサ
ーチ、第７巻、第１１３７−４６頁（１９７９））。
ように８ｅｒとＡｔａ との間で成熟ｈ ＩＩ、２から
開裂されると思われるのこの配列は、単〒もしくは多重
の塩基置換、削除、挿入または逆転を含む突然変異のよ
うな遺伝子に対する改変が既に遺伝子で生じていなくて
も、或いはその後に使用してその性質′またはそれから
発現はれるポリペプチドの性質を改変させなく−ｒもよ
いという可能性を排除するものではない。さらに、生理
学的に同じであるが、構造的には第４図に示したものと
若干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすような
任意の多形性を排除するものでもない・ 勿論、常法によりポリＡ Ｉ（ＮＡから倚られ！ たクローン化ｃｌ）ＮＡ（上記）は５末端ヌクレオチド
を欠如１−てい°Ｃも、また人工的配列を含んでいＣも
よいことを了解すべきである〔アール・アイ・リチャー
ド等、「成長雛のβ−グロビンｃ １）ＮＡの分子クロ
ーン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシド・リサ
ーチ、第７巻、第１１３７−４６頁（１９７９））。
さらに、成熟核ｍ ＲＮ Ａ Ｋ Ｌ−いて、５末端か
ら最初のＡＵＧトリプレットは、一般に蛋白質甘酸のｒ
ｃめの開始部位である〔エム・コザック、［メツセンジ
ャー１（ＮＡｌｃ′Ｊ、−ける開始領域を成熟核リポソ
ームはどのように選択するか」、セル誌、第１５巻、第
１１０９−２５頁（１９７８）Ｊ。
ら最初のＡＵＧトリプレットは、一般に蛋白質甘酸のｒ
ｃめの開始部位である〔エム・コザック、［メツセンジ
ャー１（ＮＡｌｃ′Ｊ、−ける開始領域を成熟核リポソ
ームはどのように選択するか」、セル誌、第１５巻、第
１１０９−２５頁（１９７８）Ｊ。
勿論、５ｇ４図に示したポリペプチドの４１り造は、生
体内に２けるＦＪＩ ’ｆ＝との、ｉｔｔ互作用、ｌ’
ｃとえはグリコジル化によってもたらされるポリペプチ
ドに対する何らの改変をも考慮に入れていない・したが
って、第４図に示したアミノ酸配列は、生体内で生成さ
れるＩＩ、２とは同一でないこともあると理解せねばな
らない。
体内に２けるＦＪＩ ’ｆ＝との、ｉｔｔ互作用、ｌ’
ｃとえはグリコジル化によってもたらされるポリペプチ
ドに対する何らの改変をも考慮に入れていない・したが
って、第４図に示したアミノ酸配列は、生体内で生成さ
れるＩＩ、２とは同一でないこともあると理解せねばな
らない。
れかつ＆ｏｌ（Ｊリンカによってλシャロン４Ａアーム
に結合された胎児ひと染色体１） Ｎ Ａの断片から得
られるヒプリドファージ金、アール・エム・ローン等に
よって作成したしセル誌、第１５巻、第１１５７−７４
頁（１９７８）Ｊ、同様に、±■での部分開裂により生
成されるひと染色体１）ＮＡ断片を、λＡ７のＢａｍ）
ＩＪ部位にクローン化すセた〔ダフＩｊユ・ニー・エム
・レーネンおよびダブリュー・リュー・プランマー、ジ
ーン誌、第２０巻、第２４９−５９頁（１９８０）；リ
ュー・デラマータ、私的通信〕、両遺伝子は前記’７Ｊ
Ｌ ウニｐ Ｓ Ｖ −ｈ Ｉ Ｌ ２−０ ノＰ
−標識［ｉｇ■工 断片を試料として使用する（その
場での）方法によって選別した〔ダブリュー・デー−ヘ
ントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエンス
誌、第１９６巻、第１８０−８２頁（１９７７）；ティ
ー・マニアチス等、セル誌・第１５巻、第６８７−７０
１頁（１９７８））。
に結合された胎児ひと染色体１） Ｎ Ａの断片から得
られるヒプリドファージ金、アール・エム・ローン等に
よって作成したしセル誌、第１５巻、第１１５７−７４
頁（１９７８）Ｊ、同様に、±■での部分開裂により生
成されるひと染色体１）ＮＡ断片を、λＡ７のＢａｍ）
ＩＪ部位にクローン化すセた〔ダフＩｊユ・ニー・エム
・レーネンおよびダブリュー・リュー・プランマー、ジ
ーン誌、第２０巻、第２４９−５９頁（１９８０）；リ
ュー・デラマータ、私的通信〕、両遺伝子は前記’７Ｊ
Ｌ ウニｐ Ｓ Ｖ −ｈ Ｉ Ｌ ２−０ ノＰ
−標識［ｉｇ■工 断片を試料として使用する（その
場での）方法によって選別した〔ダブリュー・デー−ヘ
ントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエンス
誌、第１９６巻、第１８０−８２頁（１９７７）；ティ
ー・マニアチス等、セル誌・第１５巻、第６８７−７０
１頁（１９７８））。
ローン遺伝子の１，３００，０００個のプラークから２
個およびレーネン遺伝子の７００，０００個のプラーク
から６個のヒプリド化陽性ファージクローンを単離した
うこれらプラークを繰返し精製して、これらをそれぞれ
λＣｌ（４Ａ−ｇｈｉｈ２−１．λｃＨ４Ａ−ｇｈＩＬ
２−２並びにλＪｌ、、１７−ｇｈＬｌ、２−１ 、λ
Ｌ４７−ｇｈＩＬ２−２ およびλＩ、１７−ｇｈＩ
Ｌ２−３ と命名した。
個およびレーネン遺伝子の７００，０００個のプラーク
から６個のヒプリド化陽性ファージクローンを単離した
うこれらプラークを繰返し精製して、これらをそれぞれ
λＣｌ（４Ａ−ｇｈｉｈ２−１．λｃＨ４Ａ−ｇｈＩＬ
２−２並びにλＪｌ、、１７−ｇｈＬｌ、２−１ 、λ
Ｌ４７−ｇｈＩＬ２−２ およびλＩ、１７−ｇｈＩ
Ｌ２−３ と命名した。
第６図は、全ｈｉＬ２遺伝子を有するクラークλｃＨ４
Ａ−ｇｈＩＬ２−１の＝Ｂ分制限地図を示している。さ
らに、この遺伝子をｐＬＩＲ２５０において、そｔＬぞ
れ２．７Ｋｂおよび３．８に、ｂの２つのＥｃｏＲＩ断
片としてサブクローン化したランドの迅速な化学的開裂
決定全可能にする」、ヌクレイツク・アシッド・リザー
テ、第１０巻、第５７６５−７２頁（１９８１）Ｊ、制
限分析およびヒプリド化のデータに基づき、ｐＬＩＲ−
ｇｈｌｈ２−１／２７００ｂｐ １（，１−４Ｉはｈ
ｌＬ２の信号配列とプロモータ領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびｐＬＨＬ−ｇｈＣＬ
２−１／３８００ｂｌ）ｋもＩ−１も工の制限分析はさ
らに、ｈｉＬ２ａｆ号化領域に鉱化領域ｉｆｌのエクソ
ンと６個のイントロンとが存在することを示唆した。
Ａ−ｇｈＩＬ２−１の＝Ｂ分制限地図を示している。さ
らに、この遺伝子をｐＬＩＲ２５０において、そｔＬぞ
れ２．７Ｋｂおよび３．８に、ｂの２つのＥｃｏＲＩ断
片としてサブクローン化したランドの迅速な化学的開裂
決定全可能にする」、ヌクレイツク・アシッド・リザー
テ、第１０巻、第５７６５−７２頁（１９８１）Ｊ、制
限分析およびヒプリド化のデータに基づき、ｐＬＩＲ−
ｇｈｌｈ２−１／２７００ｂｐ １（，１−４Ｉはｈ
ｌＬ２の信号配列とプロモータ領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびｐＬＨＬ−ｇｈＣＬ
２−１／３８００ｂｌ）ｋもＩ−１も工の制限分析はさ
らに、ｈｉＬ２ａｆ号化領域に鉱化領域ｉｆｌのエクソ
ンと６個のイントロンとが存在することを示唆した。
ｌＬ２活性を暗号化する染色体遺伝子はＩｆｉＢｓ宿主
において発現できないこともあることを了解すべきであ
る。＜ｒＪＩ故なら、これらの介入配列はこの種の宿主
によって正確に処理されないことがあるからである。染
色体遺伝子は成熟核宿主におけるＩＬ２の生産において
極めて有用であると思われ、この場合ひと非暗号化領域
、イントロンおよび暗号化領域は１高レベルの発現ふ・
よび生物学的活性な１１．２への生成物の正確な処理に
対し極めて重要である。
において発現できないこともあることを了解すべきであ
る。＜ｒＪＩ故なら、これらの介入配列はこの種の宿主
によって正確に処理されないことがあるからである。染
色体遺伝子は成熟核宿主におけるＩＬ２の生産において
極めて有用であると思われ、この場合ひと非暗号化領域
、イントロンおよび暗号化領域は１高レベルの発現ふ・
よび生物学的活性な１１．２への生成物の正確な処理に
対し極めて重要である。
向上
蛋白質の生産レベルは３つの主要な因子により支配され
る：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝
子コピーが転写される効率およびこれらが翻訳される効
率である。転写および翻訳（これらは−緒Ｋ ｙ、’−
って）ｊう現を構成する】の効率はヌクレオチド配列、
一般ＶＣは所望の暗号化配列の前方に位置する配列に依
存する。
る：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝
子コピーが転写される効率およびこれらが翻訳される効
率である。転写および翻訳（これらは−緒Ｋ ｙ、’−
って）ｊう現を構成する】の効率はヌクレオチド配列、
一般ＶＣは所望の暗号化配列の前方に位置する配列に依
存する。
これらのヌクレオチド配列または発現制御配列は、・待
に、几ＮＡポリメラーゼが反応して転写を開始する位置
（グロモータ配列）と、リポソームがｍ ｕ Ｎ Ａ
（転写の生成物］と結合かつ反応して翻訳を開始する位
置とを規戻する。必らずしも全てのこの種の発現制御配
列が同等な効率を有するとは限らない。したがって、所
望の蛋白質に対する・特定暗号化配列を隣接するヌクレ
オチド配列から分離して、とノＬら全曲の公知の発現制
御配列へ融合はせ、より高レベルの発現會得ることが有
利である。これが、４１Ａ’、された後、υ［たに作成
されたＤ Ｎ Ａ １ｌＪｉ片をより多数のコヒープラ
スミド中へ、またはバクテリオファージ誘導体中へ挿入
して、細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることができる
。
に、几ＮＡポリメラーゼが反応して転写を開始する位置
（グロモータ配列）と、リポソームがｍ ｕ Ｎ Ａ
（転写の生成物］と結合かつ反応して翻訳を開始する位
置とを規戻する。必らずしも全てのこの種の発現制御配
列が同等な効率を有するとは限らない。したがって、所
望の蛋白質に対する・特定暗号化配列を隣接するヌクレ
オチド配列から分離して、とノＬら全曲の公知の発現制
御配列へ融合はせ、より高レベルの発現會得ることが有
利である。これが、４１Ａ’、された後、υ［たに作成
されたＤ Ｎ Ａ １ｌＪｉ片をより多数のコヒープラ
スミド中へ、またはバクテリオファージ誘導体中へ挿入
して、細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることができる
。
上記のように数種の発現制御配列を使用することができ
る。こルらはイー・コリの乳糖オペロン（ｒｌａｃ系Ｊ
）のオペレータ、プロモータおよびリボンーム結合ｐ
よび相互反応配列（たとえばシャインーダルガルノ配列
のような配列を含む）、イーｅコリのトリプトファンシ
ンセターゼ系（「倶工系」）の対応する配列、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域（上記し之よう
な０ＬＰＬおよび０ＲＰ）Ｌ）、鷹維状の単一鎖１）Ｎ
Ａファージの制御領域、または成熟核もしくは原始核細
胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またＩ′ｉそれらの組合せを包含する。したが
って、適当な個主における特定ポリペプチドの生産を向
上はせるには、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を
上記のように作成し、かつこれをその兄現制御配列に近
接して、または上記の改善発現制御配列の１種の制イ卸
下で組換１）ＮＡ分子中に挿入する。この種の方法は当
業界で公知である。
る。こルらはイー・コリの乳糖オペロン（ｒｌａｃ系Ｊ
）のオペレータ、プロモータおよびリボンーム結合ｐ
よび相互反応配列（たとえばシャインーダルガルノ配列
のような配列を含む）、イーｅコリのトリプトファンシ
ンセターゼ系（「倶工系」）の対応する配列、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域（上記し之よう
な０ＬＰＬおよび０ＲＰ）Ｌ）、鷹維状の単一鎖１）Ｎ
Ａファージの制御領域、または成熟核もしくは原始核細
胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またＩ′ｉそれらの組合せを包含する。したが
って、適当な個主における特定ポリペプチドの生産を向
上はせるには、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を
上記のように作成し、かつこれをその兄現制御配列に近
接して、または上記の改善発現制御配列の１種の制イ卸
下で組換１）ＮＡ分子中に挿入する。この種の方法は当
業界で公知である。
翻訳の効率を向上さぜる他の方法は、化孝的または酵素
的に作成したオリゴヌクレオチドを開始コドンの前方に
挿入することを含む。この方法により、一層最適なメツ
センジャー几ＮＡの１次および２次構造を得ることがで
きる。さらに詳細には、開始ＡｔＪＧコドンが容易に処
理し得る位置（すなわち２次僧孝造により遮閉され°Ｃ
いない）においてヘアピンの頂部に生ずるか、または他
の単一鎖・唄域に生ずるように配列を設計することがで
きる。ざらに、上記シャインーダルガルノ断片の位置お
よび配列も同様に最適化することができる。メツセンジ
ャーＲＮ Ａの一般的構造（折・、イみ〕の重要性が示
されている〔ティー拳イセレンタントおよびダフ゛リュ
ー・７アイエルス、「ｍ ＲＮ Ａの２次４Ｆｔ造およ
び、ｌＩＪ］訳開始の効率」、ジーン誌、第９巻、第１
〜１２貞（１９８０））。
的に作成したオリゴヌクレオチドを開始コドンの前方に
挿入することを含む。この方法により、一層最適なメツ
センジャー几ＮＡの１次および２次構造を得ることがで
きる。さらに詳細には、開始ＡｔＪＧコドンが容易に処
理し得る位置（すなわち２次僧孝造により遮閉され°Ｃ
いない）においてヘアピンの頂部に生ずるか、または他
の単一鎖・唄域に生ずるように配列を設計することがで
きる。ざらに、上記シャインーダルガルノ断片の位置お
よび配列も同様に最適化することができる。メツセンジ
ャーＲＮ Ａの一般的構造（折・、イみ〕の重要性が示
されている〔ティー拳イセレンタントおよびダフ゛リュ
ー・７アイエルス、「ｍ ＲＮ Ａの２次４Ｆｔ造およ
び、ｌＩＪ］訳開始の効率」、ジーン誌、第９巻、第１
〜１２貞（１９８０））。
所望生産物の細胞収率の増加は、細胞内で利用し伶る遺
伝子数の増加に依存する。これは、ＩＬ２遺伝子をその
転写および１翻訳制御要素を用いて、または用いずに高
コピー数プラスミドへ、または温度制御されたコピー数
プラスミドＣすなわち、プラスミドのコピー数が温度の
上昇変化の後に増大する〔ピー・ウーリン等、「クロー
ン遺伝子およびその生殖物の増大に対するＩＮ ｉ依存
性コピー赦を有するグラスミドＪ、ジーン誌、第６巻、
第９１−１０６頁（１９７９Ｌ）ように突然変異したプ
ラスミド）へ挿入することにより達成される。
伝子数の増加に依存する。これは、ＩＬ２遺伝子をその
転写および１翻訳制御要素を用いて、または用いずに高
コピー数プラスミドへ、または温度制御されたコピー数
プラスミドＣすなわち、プラスミドのコピー数が温度の
上昇変化の後に増大する〔ピー・ウーリン等、「クロー
ン遺伝子およびその生殖物の増大に対するＩＮ ｉ依存
性コピー赦を有するグラスミドＪ、ジーン誌、第６巻、
第９１−１０６頁（１９７９Ｌ）ように突然変異したプ
ラスミド）へ挿入することにより達成される。
或いは、遺伝子量の増加は、たとえば上記のように作成
された組換１） Ｎ Ａ分子金特に簡単に □は制
限酵素でのプラスミドの切断によって雛型バクテリオフ
ァージλ中へ挿入して線状分子を生り見させ、仄いでこ
れｔ市＋］ １ｔ１１フアージλクローン化ベヒクルと
混合することにより達成され〔／ことえば、エヌ・イー
・ムレ−等、「試験管内組換体の回収をｔｌｉ単にする
ファージλ」、モレキュラー・ゼネラル・ジエネテイツ
クス、第１５０巻、第５３−６１頁（１９７７） 訃
よびエヌ伽イー・ムレ−等、「バクテリオファージ°ｒ
４からのｌ） Ｎ Ａ ＩＪガーゼ遺伝子の分子クロー
ン化コ、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
１６２巻、第、１９３−５０５頁（１９７９）」、そし
て組換ＤＮ八へ子を１）ＮＡ１１ガーゼと共に培養して
生成させる。次いで、所望の組換７アージを前記と同様
に選択し、かつこれを使用してイ〜・コリの宿主菌株を
溶菌させる□したがって１本発明の挿入ＤＮＡは５Ｖ５
２９プラスミドから除去して、これを目１■記と同様に
他の発現ベクター中へ挿入し、これらベクターを釉々の
宿主でｔｓｆｌ記と同様に使用してＩｆ、２を暗号化す
る遺伝子の発現全向上ぜせ得ることを了解すべきである
。
された組換１） Ｎ Ａ分子金特に簡単に □は制
限酵素でのプラスミドの切断によって雛型バクテリオフ
ァージλ中へ挿入して線状分子を生り見させ、仄いでこ
れｔ市＋］ １ｔ１１フアージλクローン化ベヒクルと
混合することにより達成され〔／ことえば、エヌ・イー
・ムレ−等、「試験管内組換体の回収をｔｌｉ単にする
ファージλ」、モレキュラー・ゼネラル・ジエネテイツ
クス、第１５０巻、第５３−６１頁（１９７７） 訃
よびエヌ伽イー・ムレ−等、「バクテリオファージ°ｒ
４からのｌ） Ｎ Ａ ＩＪガーゼ遺伝子の分子クロー
ン化コ、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
１６２巻、第、１９３−５０５頁（１９７９）」、そし
て組換ＤＮ八へ子を１）ＮＡ１１ガーゼと共に培養して
生成させる。次いで、所望の組換７アージを前記と同様
に選択し、かつこれを使用してイ〜・コリの宿主菌株を
溶菌させる□したがって１本発明の挿入ＤＮＡは５Ｖ５
２９プラスミドから除去して、これを目１■記と同様に
他の発現ベクター中へ挿入し、これらベクターを釉々の
宿主でｔｓｆｌ記と同様に使用してＩｆ、２を暗号化す
る遺伝子の発現全向上ぜせ得ることを了解すべきである
。
本発明による生成されるｉ Ｌ ２様ボリペグチドの生
物学的活性はさらに、本発明のｉ） Ｉ’Ｊ Ａ配列を
使用１−て桶乳動物の細胞系を形狙転換させかつ遺伝子
をこれらの系で発現させるべく改善することもできる。
物学的活性はさらに、本発明のｉ） Ｉ’Ｊ Ａ配列を
使用１−て桶乳動物の細胞系を形狙転換させかつ遺伝子
をこれらの系で発現させるべく改善することもできる。
この柿の１’／Ｍ乳動物系は公知である〔ｊｔとえば、
ピー・ジエー・サウザーン＝ｉ）−よびピー拳ベルク、
ジャーナル・モレキュラー・アブライドージエネテイソ
クス、第１巻、第３２７−１１頁（１９８２）；ニス・
ザブラマ二等、モレキュラー争セル・バイオロジー、第
１巻、第８５，１−６４頁（１９８１）；アール・ジエ
ー・カウフマンｐよびピー・ニー争シャープ、モレキュ
ラー愉セル会バイオロジー、（出版中）〕。好適な系は
、遺伝子発現をメトトレキセー）（ＭＴ、’（）によシ
増大させ得るＣ １１ （Ｊ（チャイニーズｅ〕＼ムス
ターー、ｔバリー）（ＩＪＨＦＲｌ細胞系である。こｉ
ｔらの発現系は。
ピー・ジエー・サウザーン＝ｉ）−よびピー拳ベルク、
ジャーナル・モレキュラー・アブライドージエネテイソ
クス、第１巻、第３２７−１１頁（１９８２）；ニス・
ザブラマ二等、モレキュラー争セル・バイオロジー、第
１巻、第８５，１−６４頁（１９８１）；アール・ジエ
ー・カウフマンｐよびピー・ニー争シャープ、モレキュ
ラー愉セル会バイオロジー、（出版中）〕。好適な系は
、遺伝子発現をメトトレキセー）（ＭＴ、’（）によシ
増大させ得るＣ １１ （Ｊ（チャイニーズｅ〕＼ムス
ターー、ｔバリー）（ＩＪＨＦＲｌ細胞系である。こｉ
ｔらの発現系は。
グリコジル化蛋白質の生成ｋＯＩ能にする。
ざらに、ＩＬ２活性を示すポリペプチド（本発明によｐ
１乍成）も融付蛋白質（７ヒとえば分泌全行なう原始核
もしくは成熟ＩＮ−末端ｄ片へ結合したもの）の形態、
グロインタロイキン２（たとえば分泌の際、開裂し得る
インタロイキン２の１ヒ号配列の全部または１部で出発
する）の形態、或いは成熟インタロイキン２（発現およ
び分泌の際の初期メチオニンを含む菌体外アミノ酸の開
裂による）として、またはｆ−ｍｅｔ−ｉＬ２として作
成することもできる。本発明に赴いて特Ｖこ有用な１Ａ
！ｊ！のポリペプチドは、アミン末端に結訃した容易に
開裂し１砦るアミノ酸も１．＜は一連のアミノ酸を有す
る成熟インタロイキン２である。この構造は、成ｋ）＾
インタロイキン２に存在１−ない開始信号全必要とする
ような適当な宿主に２ける蛋白質の合成を可能にし、仄
いて余分のアミノ酸全開裂して成熟インタロイキン２金
生産することをｈ」能にする。
１乍成）も融付蛋白質（７ヒとえば分泌全行なう原始核
もしくは成熟ＩＮ−末端ｄ片へ結合したもの）の形態、
グロインタロイキン２（たとえば分泌の際、開裂し得る
インタロイキン２の１ヒ号配列の全部または１部で出発
する）の形態、或いは成熟インタロイキン２（発現およ
び分泌の際の初期メチオニンを含む菌体外アミノ酸の開
裂による）として、またはｆ−ｍｅｔ−ｉＬ２として作
成することもできる。本発明に赴いて特Ｖこ有用な１Ａ
！ｊ！のポリペプチドは、アミン末端に結訃した容易に
開裂し１砦るアミノ酸も１．＜は一連のアミノ酸を有す
る成熟インタロイキン２である。この構造は、成ｋ）＾
インタロイキン２に存在１−ない開始信号全必要とする
ような適当な宿主に２ける蛋白質の合成を可能にし、仄
いて余分のアミノ酸全開裂して成熟インタロイキン２金
生産することをｈ」能にする。
こｎら種々異なる形叩のポリペプチドの収率は、上記方
法のいずれかｆンｊは組合せによって改善することがで
きる。さらに、本１） １’Ｊ Ａ配列に使用したコド
ンの１部または全部に対し、撞々異ンヨるコドンを；ロ
イ（灸することもできる。こルらの置換コドンは、交換
されたコドンにより ＋’；Ｊ号化さｉＬるものと同一
のアミノ酸を暗号化することができ、しかもポリペプチ
ドの高収率をもたらす。或いは、アミノ酸置換５１／ヒ
はより長いもしくばより短いＬ Ｌ ２１Ａ連ポリペプ
チドをもたらすコドンの１つのｉｊ換よ之は組合せも、
一般にその性質を変化させる（たとえは、安定性をＪｄ
大させ、′１３解度を増大メせ、免疫治療活性を・増大
させ、長期のＴ 、ｙ＋ｔ＋胞の増殖活性を増大させる
）。
法のいずれかｆンｊは組合せによって改善することがで
きる。さらに、本１） １’Ｊ Ａ配列に使用したコド
ンの１部または全部に対し、撞々異ンヨるコドンを；ロ
イ（灸することもできる。こルらの置換コドンは、交換
されたコドンにより ＋’；Ｊ号化さｉＬるものと同一
のアミノ酸を暗号化することができ、しかもポリペプチ
ドの高収率をもたらす。或いは、アミノ酸置換５１／ヒ
はより長いもしくばより短いＬ Ｌ ２１Ａ連ポリペプ
チドをもたらすコドンの１つのｉｊ換よ之は組合せも、
一般にその性質を変化させる（たとえは、安定性をＪｄ
大させ、′１３解度を増大メせ、免疫治療活性を・増大
させ、長期のＴ 、ｙ＋ｔ＋胞の増殖活性を増大させる
）。
最後に、本発明の組換１）ＮＡ分子により生産はれたポ
リペプチドの活性は、周知手段により本発明の範囲を逸
脱することなく、本発明のＤ Ｎ Ａ配列も１−〈はボ
１ノペグチド〒１４訂片化し、改変り、捷たは誘導化す
ることにより改善することもできる。たとえば、他りイ
ンタフエロンとのヒブリドを遺伝子レベルで作成して適
当な宿主で発現させることもでき、或いは化学合成法で
蛋白質レベルで作成することもできる。
リペプチドの活性は、周知手段により本発明の範囲を逸
脱することなく、本発明のＤ Ｎ Ａ配列も１−〈はボ
１ノペグチド〒１４訂片化し、改変り、捷たは誘導化す
ることにより改善することもできる。たとえば、他りイ
ンタフエロンとのヒブリドを遺伝子レベルで作成して適
当な宿主で発現させることもでき、或いは化学合成法で
蛋白質レベルで作成することもできる。
ここに記載した方法で作成された微生物および組換Ｄ
Ｎ Ａ分子は、１９８６年２月８日付けで西ドイツ＋Ａ
］、ゲッチンゲン在、ドイツチェ・ザンムルング・フォ
ノ・ミクロオルガニスムノ培］Ｑ物コレクションに寄託
した培養物で例示される： ｈｉＬ２−Ａ： Ｗ、 ｃｏｌｉ ＨＢｌｏｌ（ｐｓＶ
−ｈｉＬ２−０３ ｈ Ｉ Ｌ ２−１３ ｍ ｋ 、ｃ ｏ Ｉ Ｉ Ｈ
Ｂ Ｉ Ｌｌ １（ｐｓＶ−ｈｉＬ２−１ ） これら培養物は、それぞれ舒託舒号ＪＪＳＭ２５９５お
よび２５９６が付与されている。
Ｎ Ａ分子は、１９８６年２月８日付けで西ドイツ＋Ａ
］、ゲッチンゲン在、ドイツチェ・ザンムルング・フォ
ノ・ミクロオルガニスムノ培］Ｑ物コレクションに寄託
した培養物で例示される： ｈｉＬ２−Ａ： Ｗ、 ｃｏｌｉ ＨＢｌｏｌ（ｐｓＶ
−ｈｉＬ２−０３ ｈ Ｉ Ｌ ２−１３ ｍ ｋ 、ｃ ｏ Ｉ Ｉ Ｈ
Ｂ Ｉ Ｌｌ １（ｐｓＶ−ｈｉＬ２−１ ） これら培養物は、それぞれ舒託舒号ＪＪＳＭ２５９５お
よび２５９６が付与されている。
さらに、ここに記載した方法で作成された微生物および
組換ＩＪ Ｎ Ａ分子を、１９８３年４月１８日付けで
メリーランド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションの培養物コレクションに寄託
した： ｈ Ｉ Ｌ ２− Ｃａ ｂ ｃ ｏ ｌ
Ｉ Ｋ ５１１１ λ（ｐ’Ｉ’ｒｐ−ｈｌＬ２Ｄ
１） ｈｉＬ ２−１）： １弓、 ｃＯ目 Ｋ１２１
も１も■ΔＡ４１５（λＣＲ４Ａ−ｇｈｆＬ２−１／ ２７００１）ｐ 几ｉ−ｎ、ｌ） ｈＨＪ２−ｇ： ｇ、ｃｏｌｉ ｉ＜１２ルＩｔ）
６Ｍ１５（λｃＨａＡ−ｇｈＪ、、Ｌ２−１／ ３８００ｂｐ ｉｊ、Ｉ−Ｒｆｌ これら培養物には、それぞれＡＴＣＣ３９３３８゜３９
３３９および３９３４０ の有託番号が付与さｎた。
組換ＩＪ Ｎ Ａ分子を、１９８３年４月１８日付けで
メリーランド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションの培養物コレクションに寄託
した： ｈ Ｉ Ｌ ２− Ｃａ ｂ ｃ ｏ ｌ
Ｉ Ｋ ５１１１ λ（ｐ’Ｉ’ｒｐ−ｈｌＬ２Ｄ
１） ｈｉＬ ２−１）： １弓、 ｃＯ目 Ｋ１２１
も１も■ΔＡ４１５（λＣＲ４Ａ−ｇｈｆＬ２−１／ ２７００１）ｐ 几ｉ−ｎ、ｌ） ｈＨＪ２−ｇ： ｇ、ｃｏｌｉ ｉ＜１２ルＩｔ）
６Ｍ１５（λｃＨａＡ−ｇｈＪ、、Ｌ２−１／ ３８００ｂｐ ｉｊ、Ｉ−Ｒｆｌ これら培養物には、それぞれＡＴＣＣ３９３３８゜３９
３３９および３９３４０ の有託番号が付与さｎた。
以上、本発明の多数の具体［３’１１につき説明したが
、この基本構成を改変して本発明の方法および構成を利
用する他の具体例全与えることもできる。したがって、
本発明の範囲は上記の具体例のみに限定されない。
、この基本構成を改変して本発明の方法および構成を利
用する他の具体例全与えることもできる。したがって、
本発明の範囲は上記の具体例のみに限定されない。
４３１図は本発明によシ製造される一連の）！Ｒ糖一度
内配ＩＬＮＡフラクションのｉｌｌ”Ｎ暗号化活性を示
すグラフであり、 第２図はｐｓｖｓ２９並びにそ（１） Ｂａｍ １１１
部位に仲人されたＩＩ、２関連Ｄ ｔＮ Ａ挿入物を有
するベクターの説明図でアリ。 第３図は本発明のｆＬ２関連ＤＮＡ配列の制限地図およ
びこの１）ＮＡ配列を決定する際に使用する配列決定法
の説明図であり、 第４図は本発明のＩＬ２関連１）ＮＡ配列のヌクレオチ
ド配列であり、 第５図は適当な宿主を形質転換させてこれを培養した際
、本発明のＩＬ２様生産生産物産させるのに使用し得る
本発明の各種の組換Ｄ Ｎ Ａ分子の製造を示す略図で
あり、 第６図は全ｈ ＩＬ２遺伝子金含むλＣＨ４Ａ−ｇｂｌ
Ｌ２−１プラークの部分制限地図である。 特許用１？ｔｔ人 バイオジエン ナームローズ ヘン
ノソトシャノプ図面の＋：ｒ′ｉｊ （白書に変更なし
）Ｆｉり、ｌ 第１頁の続き 二＝Ｌ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） （Ｃ１２Ｎ ５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１ ） （Ｃ１２Ｐ ２１１０２ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） 優先権主張 ９１９８３年６月１０日■イギリス（Ｇ
Ｂ ）＠８３１５９８１ ０発 明 者 レーン・ロバート・デボスベルギー国８
４００オーステンプ。 ニブイス・ケーベルストリート ５６番 手 綻に ネ市 ｊ「ろ 密二（力式）％式％ ２、発明の名称 ひとインクロイキン２様ボリペプヂ１′を製造するため
のＩ）Ｎへ配列、組１ｇ！ＤＮＡ分子およびその製造方
法３、補正をする者 事件との関１系 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ・＼ンノノトン
ヤノフ代表者 エヌ ブイ フィデス （国籍）（オランダ領アンチル） ４、代理人 ６、補正の対象 ７、補正の内容
内配ＩＬＮＡフラクションのｉｌｌ”Ｎ暗号化活性を示
すグラフであり、 第２図はｐｓｖｓ２９並びにそ（１） Ｂａｍ １１１
部位に仲人されたＩＩ、２関連Ｄ ｔＮ Ａ挿入物を有
するベクターの説明図でアリ。 第３図は本発明のｆＬ２関連ＤＮＡ配列の制限地図およ
びこの１）ＮＡ配列を決定する際に使用する配列決定法
の説明図であり、 第４図は本発明のＩＬ２関連１）ＮＡ配列のヌクレオチ
ド配列であり、 第５図は適当な宿主を形質転換させてこれを培養した際
、本発明のＩＬ２様生産生産物産させるのに使用し得る
本発明の各種の組換Ｄ Ｎ Ａ分子の製造を示す略図で
あり、 第６図は全ｈ ＩＬ２遺伝子金含むλＣＨ４Ａ−ｇｂｌ
Ｌ２−１プラークの部分制限地図である。 特許用１？ｔｔ人 バイオジエン ナームローズ ヘン
ノソトシャノプ図面の＋：ｒ′ｉｊ （白書に変更なし
）Ｆｉり、ｌ 第１頁の続き 二＝Ｌ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） （Ｃ１２Ｎ ５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１ ） （Ｃ１２Ｐ ２１１０２ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） 優先権主張 ９１９８３年６月１０日■イギリス（Ｇ
Ｂ ）＠８３１５９８１ ０発 明 者 レーン・ロバート・デボスベルギー国８
４００オーステンプ。 ニブイス・ケーベルストリート ５６番 手 綻に ネ市 ｊ「ろ 密二（力式）％式％ ２、発明の名称 ひとインクロイキン２様ボリペプヂ１′を製造するため
のＩ）Ｎへ配列、組１ｇ！ＤＮＡ分子およびその製造方
法３、補正をする者 事件との関１系 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ・＼ンノノトン
ヤノフ代表者 エヌ ブイ フィデス （国籍）（オランダ領アンチル） ４、代理人 ６、補正の対象 ７、補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ｐｓＶ−ｈＩＬ、！−ＩＯＤＮＡ挿入物、前
記ＤＮＡ挿入物にヒプリド化しかつＩＬ、２様ポリペプ
チドを暗号化するＤＮＡ配列、並びに上記ＤＮＡ配列お
よび挿入物のいずれかにより発現に際して暗号化された
ポリペプチドを発現の際に暗号化するＤＮＡ配列よりな
る群から選択されるＤＮＡ配列。 ＋２１ ＤＮＡ挿入物にヒブリド化するＤＮＡ配列を
ｐＳＶ−ｂｌＬ、２−ｔ（ＤＤＮＡｎ入物、前記ＤＮＡ
挿入物のいずれかにヒプリド化しかっＩＬ、２様ポリペ
プチドを暗号化するＤＮＡ配列、並びに前記ＤＮＡ配列
および挿入物のいずれかにより発現に際し暗号化された
ポリペプチドを発現の際に暗号化するＤＮＡ配列よりな
る群から選択する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配
列。 １３）ＤＮＡ挿入物にヒブリド化するＤＮＡ配列がひと
染色体遺伝子群から選択されるＤＮＡ配列である特許請
求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 （４１ＤＮＡ配列をλＣＨグＡ−、ｇｈＩＬ、２−／。 λＣＨ弘Ａ−ｇｈＩＬ、２−２．λＬグアー４ｂＩＬＪ
−／、λＬ弘７−ｇｈＩ１．２−２およびλＬｌ／１７
−ｇｈＩＬ２−ＪのｈＩＬ２関連部分よりなる群から選
択する特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。 （５）式： ％式％ ＣＴ、Ｇ弘αコＣ■イＮＴに臥ＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡ
ＣＡＧＣｒＡＣＡＡＣｒＧＧＡＧＣＣｒＡＭＧＧ０五１
弘ＭＯＷメｎ０■ｆａロＷ頁″ｒＧＣＩＧＡＴＧＡＧＡ
ＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴｒＧＴＡＧＡＡＴＴｒＣＴＧＡＡ
ＣＡＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＩＴｒｒＧＴＣＡＡＡＧＣ
ＡπλのＤＮＡ配列、並びに前記ＤＮＡ配列のいずれか
によシ発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際
に暗号化するＤＮＡ配列よりなる群から選択される特許
請求の範囲第１項乃至第弘項のいずれかに記載のＤＮＡ
配列。 （６）式； ％式％ のＤＮＡ配列、並びに前記ＤＮＡ配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するＤＮＡ配列よシなる群から選択される特許請求の
範囲第１項乃至第ｙ項のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 （７）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
載のＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列か
らなる組換ＤＮＡ分子。 （３）ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合している特
許請求の範囲第７項記載の組換ＤＮＡ分子。 （９）発現制御配列がｌａｃ系、β−１ａｏ系、 ｔｒ
ｐ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域
、ｆｄ被覆蛋白の制御領域、原始核もしくは成熟核細胞
およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他の
配列、並びにその組合せよりなる群から選択される特許
請求の範囲第ざ項記載の組換ＤＮＡ分子。 （ｌ ｐＰＬｃＭｕ−ｂＩＬ２／、ｐＰＬｃ、Ｍｕ−
ｂｌＬ２２ 、ｐＰＬｏＭｕ−ｂＩＬ、２θ／ 、 ｐ
’ｌ’ｒ ｐ −ｈ ＩＬ２１およびｐＴｒｐ−ｈＩＬ
、２ｏ／ よりなる群から選択される特許請求の範囲
第７項記載の組換ＤＮＡ分子。 ←υ 特許請求の範囲第７項乃至第１０項のいずれかに
記載の少なくともｌ槙の組換ＤＮＡ分子によシ形質転換
された宿主。 α２ イー・コリ、シュードモナス、枯草菌、高熱細菌
、その他の細菌類、酵母、その他の真菌類の菌株、ねず
みまたはその他の動物もしくは植物宿主、並びにひと組
繊細胞よりなる群から選択される特許請求の範囲第１／
項記載の宿主。 ａ３ 特許請求の範囲第１項乃至第を項の配列よシな
る群から選択されるＤＮＡ配列によｐ形質転換されたイ
ーーコ」ハシュードモナス、枯草菌、高熱細菌、その他
の細菌類、酵母、その他の真菌類の菌株、ねずみまたは
その他の動物もしくは植物宿主、またはひと組繊細胞よ
シなる群から選択される特許請求の範囲第１／項または
第１コ項記載の形質転換宿主。 ０１ ％許請求の範囲第１／項乃至第７３項の°いず
れかに記載の形質転換宿主により生産される。ひとイン
タロイキンコ型の免役学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチド。 ｔｔＳ ％Ｗ！ｆ請求の範囲第１項乃至第６項のいず
れかに記載のＤＮＡ配列により暗号化されるポリペプチ
ド。 （１５１）ＮＡ挿入物ｈＩＬ！−ｏにょシ暗号化された
特許請求の範囲第１ｊ項記載のポリペプチド。 αη 式： ％式％ のポリペプチドおよびそのｂＩＬ、２様断片よりなる群
から選択される特許請求の範囲第１４項乃至第１６項の
いずれかに記載のポリペプチド。 賭 特許請求の範囲第１項乃至第を項のいずれかに記載
のＤＮＡ配列をクローン化用ベヒクル中へ導入すること
を特徴とする組換ＤＮＡ分子の製造方法。 αＩ 特許請求の範囲第り項記載の発現制御配列をクロ
ーン化用ベヒクル中へ導入する工程をさらに含み、前記
発現制御配列を前記クローン化用ベヒクル中へ導入して
、ＤＮＡ配列の発現を制御すると共に調整することを特
徴とする特許請求の範囲第ｉｔ項記載の方法。 ■ 特許請求の範囲第ｒ項乃至第１０項のいずれかに記
載の組換ＤＮＡ分子によって適当な宿主を形質転換させ
、この宿主を培養しかっポリペプチドを回収することを
特徴とする、ひとインタロイキン、２型の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドの製造方法。 （２１）宿主をイー・コリ、シュードモナス、枯草菌、
高熱細菌、その他の細菌類、酵母、具菌類の菌株、動物
もしくは植物宿主、およびひと組繊細胞よりなる群から
選択する特許請求の範囲第２０項記載の方法。 （２、特許請求の範囲第を項乃至第１Ｏ項のいずれかに
記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培養
し、かつポリペプチドを回収することを特徴とする、ひ
とインタロイキンλ型の免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチドの製造方法。 （２３）どのＤＮＡ配列が特許請求の範囲第１項乃至第
を項のいずれかに記載のＤＮＡ配列にヒプリド化するか
を決定することを特徴とする、ＩＬ、２の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化するＤＮ
Ａ配列をＤＮＡ配列群から選択する方法。 （２４）どのＤＮＡ配列が特許請求の範囲第１項乃至第
を項のいずれかに記載のＤＮＡ配列にヒプリド化するか
を決定することを特徴とする、非ひとインタロイキンコ
型の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
を暗号化するＤＮＡ配列の選択方法。 （２５）選別妊れるＤＮＡ配列を天然源からのＤＮＡ配
列、合成りＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子からのＤＮＡ配列
、および前記ＤＮＡ配列のいずれかの組合せであるＤＮ
Ａ配列から選択する特許請求の範囲第２３項または第２
１項記載の方法。 （２、特許請求の範囲第７４’項乃至第１７項のいずれ
かに記載のポリペプチドよりなる群から選択される少な
くとも７種のポリペプチドの医薬上有効量を含有する、
免疫治療用の医薬上許容し得る組成物。 （２、特許請求の範囲第Ｊ、ｇ項記載の組成物の有効量
を医薬上許容し得る方法で投与することを特徴とする免
疫治療法。 ずれかに記載のポリペプチドよりなる群から選択される
少Ａくとも１８１のポリペプチドを含有するＣとを特徴
とする、試験管内のＴ細胞培養における増殖試薬として
使用する〕組成物。 （２、特許請求の範囲第、２ざ項記載の組成物の有効量
を培養物に投与することを特徴とする。 試験管内におりるＴ細胞培養物の増殖力法。 （３０） Ｉ Ｌ−、？様ポリペプチドを暗号化するＩ
） Ｎ Ａ配列に選択的にヒプリド化する、特許請求の
範囲第１項乃至第を項のいずれかに記載のＤＮＡ配列か
ら誘導されまたは訓製されるオリゴヌクレオチド。 （３１）どのＤＮＡ配列が特許請求の範囲第１項乃至第
２項のいずれかに記載のＤＮＡ配列゛または特許請求の
範囲第３０項記載のオリゴヌクレオチドにヒプリド化す
るかを決定することを特徴とする、インタロイキン関連
ホリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列の選択方法。 （６２、特許請求の範囲第７弘項乃至第１７項のいずれ
かに記載のポリペプチドよりなる群から選択される少な
くとも７種のポリペプチドの医薬上有効量を含有してな
る、医薬上許容し得る抗ウィルスもしくは抗癌組成物。 （６６）特許請求の範囲第３λ項記載の組成物の有効量
を医薬上許容し得る方法で投与することを特徴とする抗
ウィルスもしくは抗癌治療法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB838303383A GB8303383D0 (en) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | Sequences recombinant dna molecules |
| GB8303383 | 1983-02-08 | ||
| GB8315981 | 1983-06-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59220189A true JPS59220189A (ja) | 1984-12-11 |
| JPH0156757B2 JPH0156757B2 (ja) | 1989-12-01 |
Family
ID=10537631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59019524A Granted JPS59220189A (ja) | 1983-02-08 | 1984-02-07 | ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59220189A (ja) |
| GB (2) | GB8303383D0 (ja) |
| ZA (1) | ZA84512B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
| JPS61257931A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Ajinomoto Co Inc | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5621596A (en) * | 1979-07-05 | 1981-02-28 | Genentech Inc | Microbiological expressing method of partially synthesized gene |
| JPS5779897A (en) * | 1980-07-01 | 1982-05-19 | Hoffmann La Roche | Polypeptide containing amino acid arrangement of aged human corpuscle interferone |
| JPS59140882A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-08-13 | Japan Found Cancer | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
| JPS59144719A (ja) * | 1983-02-03 | 1984-08-18 | Japan Found Cancer | ヒトインタ―ロイキン２活性を有するポリペプチド |
| EP0118977A1 (en) * | 1983-02-08 | 1984-09-19 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides |
-
1983
- 1983-02-08 GB GB838303383A patent/GB8303383D0/en active Pending
- 1983-06-10 GB GB838315981A patent/GB8315981D0/en active Pending
-
1984
- 1984-01-23 ZA ZA84512A patent/ZA84512B/xx unknown
- 1984-02-07 JP JP59019524A patent/JPS59220189A/ja active Granted
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5621596A (en) * | 1979-07-05 | 1981-02-28 | Genentech Inc | Microbiological expressing method of partially synthesized gene |
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| JPS59140882A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-08-13 | Japan Found Cancer | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
| JPS59144719A (ja) * | 1983-02-03 | 1984-08-18 | Japan Found Cancer | ヒトインタ―ロイキン２活性を有するポリペプチド |
| EP0118977A1 (en) * | 1983-02-08 | 1984-09-19 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
| JPS61257931A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Ajinomoto Co Inc | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8315981D0 (en) | 1983-07-13 |
| ZA84512B (en) | 1984-09-26 |
| JPH0156757B2 (ja) | 1989-12-01 |
| GB8303383D0 (en) | 1983-03-16 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |