JPS59220189A - ひとインターロイキン2様ポリペプチドをコードするdna配列、該dna配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 - Google Patents
ひとインターロイキン2様ポリペプチドをコードするdna配列、該dna配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌Info
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- JPS59220189A JPS59220189A JP59019524A JP1952484A JPS59220189A JP S59220189 A JPS59220189 A JP S59220189A JP 59019524 A JP59019524 A JP 59019524A JP 1952484 A JP1952484 A JP 1952484A JP S59220189 A JPS59220189 A JP S59220189A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の要約
ひとインタロイキンλ型の生物学的もしくは免疫学的活
性を示すポリペプチドを製造するためのDNA配列、組
換DNA分子およびこれらにより形質転換された宿主、
これらポリペプチドを暗号化する遺伝子、並びにこれら
DNA配列5分子、宿主、遺伝子およびポリペプチドを
作成しかつ使用する方法について開示する。
性を示すポリペプチドを製造するためのDNA配列、組
換DNA分子およびこれらにより形質転換された宿主、
これらポリペプチドを暗号化する遺伝子、並びにこれら
DNA配列5分子、宿主、遺伝子およびポリペプチドを
作成しかつ使用する方法について開示する。
DNA配列は、ひとインタロイキン2型の生物学的もし
くは免疫学的活性を示すポリペプチドを暗号化すること
を特徴とする。適当な宿主において、これらDNA配列
お上び組換DNA分子はひとインタロイキンコ型の免疫
学的もしくは生物学的活性を示す遺伝子およびポリペプ
チドの生産および同定を可能にすると共に、これらを免
疫治療剤および方法に使用しがっT−細胞の確立および
長期増殖に使用することを可能にする。
くは免疫学的活性を示すポリペプチドを暗号化すること
を特徴とする。適当な宿主において、これらDNA配列
お上び組換DNA分子はひとインタロイキンコ型の免疫
学的もしくは生物学的活性を示す遺伝子およびポリペプ
チドの生産および同定を可能にすると共に、これらを免
疫治療剤および方法に使用しがっT−細胞の確立および
長期増殖に使用することを可能にする。
本発明は、ひとインタロイキンλ様ポリペプチドを製造
するためのDNAN列配列換DNA分子および製造方法
に関するものである。さらに詳細には、本発明はDNA
配列および適当な宿主生物におけるその発現に関するも
のである。
するためのDNAN列配列換DNA分子および製造方法
に関するものである。さらに詳細には、本発明はDNA
配列および適当な宿主生物におけるその発現に関するも
のである。
ここに記載する組換DNA分子は、ひとインタロイキン
λ型の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドを暗号化するDNA配列を特徴とする。以下の開示
から明らかとなるように、本発明のDNA配列、組換D
NA分子および方法は、各種の医薬およびその他の有益
な産業用途に使用し得るポリペプチドの生産に使用する
ことができる。
λ型の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドを暗号化するDNA配列を特徴とする。以下の開示
から明らかとなるように、本発明のDNA配列、組換D
NA分子および方法は、各種の医薬およびその他の有益
な産業用途に使用し得るポリペプチドの生産に使用する
ことができる。
インタロイキンλ型(rIL−2J )はリンホキンで
ある。リンホキンは、ミトゲンによる刺戟に際しリンパ
球で合成される生産物である。
ある。リンホキンは、ミトゲンによる刺戟に際しリンパ
球で合成される生産物である。
これらは可溶性の免疫反応調整化合物である。
多数のリンホキンは、その医薬用途および実験室用途に
対し重要である。たとえば、免疫インタ7エロン(IF
N−γ)は抗ウィルス、抗癌および免疫調整活性を有す
るリンホキンである〔たとえば、アール・デポス等、ヌ
クレイツク・アシッド・リサーチ、第70巻、第217
17−60/頁(tFl、z)”J。この文献をここに
引用する。
対し重要である。たとえば、免疫インタ7エロン(IF
N−γ)は抗ウィルス、抗癌および免疫調整活性を有す
るリンホキンである〔たとえば、アール・デポス等、ヌ
クレイツク・アシッド・リサーチ、第70巻、第217
17−60/頁(tFl、z)”J。この文献をここに
引用する。
インタロイキンλ型は、重要かつ有用な生物学的性質を
有する他のリンホキンである〔ギリス等1 イミューノ
ロジカル・レビュー%第tJ巻、第tAA−209頁(
i p+rz ) )。たとえば、IL2は、(al試
験管内において抗原特異性の有効T−細胞の長期増殖を
刺戟し、(bl胸腺細胞の有線分裂を促進し、かっ(、
)細胞毒性のT−細胞反応性および創出ねずみ牌細胞の
培養物におけるグラーク形成反応を誘発する〔キリスお
よびワトンン、ジャーナル・エキスプリメンタル・メデ
イスン、第1!2巻、第170り〜lり頁(/910)
iリュー・リュー・ファジー等、イミューノロジカル・
レビュー、第63巻、第12り〜t!頁(lりJ’、2
))。
有する他のリンホキンである〔ギリス等1 イミューノ
ロジカル・レビュー%第tJ巻、第tAA−209頁(
i p+rz ) )。たとえば、IL2は、(al試
験管内において抗原特異性の有効T−細胞の長期増殖を
刺戟し、(bl胸腺細胞の有線分裂を促進し、かっ(、
)細胞毒性のT−細胞反応性および創出ねずみ牌細胞の
培養物におけるグラーク形成反応を誘発する〔キリスお
よびワトンン、ジャーナル・エキスプリメンタル・メデ
イスン、第1!2巻、第170り〜lり頁(/910)
iリュー・リュー・ファジー等、イミューノロジカル・
レビュー、第63巻、第12り〜t!頁(lりJ’、2
))。
生物学的性質の結果、インタロイキンλ型を使用して、
免疫系が阻害された癌患者におけるひと白血球抗原の制
限された腫瘍特異性の細胞毒性細胞の補給を、たとえば
胸腺刺戟によって刺戟することができる。したがって、
IL2による処理は、各種の細菌およびその他の感染に
対しこれらの患者の耐性を増大させる。しげしげ、これ
らの感染は癌治療、特に照射および薬剤治療を複雑化さ
せる。
免疫系が阻害された癌患者におけるひと白血球抗原の制
限された腫瘍特異性の細胞毒性細胞の補給を、たとえば
胸腺刺戟によって刺戟することができる。したがって、
IL2による処理は、各種の細菌およびその他の感染に
対しこれらの患者の耐性を増大させる。しげしげ、これ
らの感染は癌治療、特に照射および薬剤治療を複雑化さ
せる。
さらに5免疫系を刺戟するIL−の能力は、免疫系の機
能障害に関連する病気、たとえばエイズ(AIDS)、
狼癒、多発性硬化症および関節リューマチ症の治療に有
用である。公表された臨床学的研究は、これらの病気と
’l’ −IJンパ球における異常性または異常抗体の
生成との間の関係奮示している。たとえば、試験管内の
研究が示唆するところでは、免疫系の少なくとも幾つか
の機能は、ILコの投与によってエイズ患者を回復させ
ることができる。さらに、試験管内の研究が示すところ
では、低レベルのIL2は、免疫系のこれら病気の幾つ
かに関連する異常抗体の生成に関係する。
能障害に関連する病気、たとえばエイズ(AIDS)、
狼癒、多発性硬化症および関節リューマチ症の治療に有
用である。公表された臨床学的研究は、これらの病気と
’l’ −IJンパ球における異常性または異常抗体の
生成との間の関係奮示している。たとえば、試験管内の
研究が示唆するところでは、免疫系の少なくとも幾つか
の機能は、ILコの投与によってエイズ患者を回復させ
ることができる。さらに、試験管内の研究が示すところ
では、低レベルのIL2は、免疫系のこれら病気の幾つ
かに関連する異常抗体の生成に関係する。
さらに、公表された研究によれば、IL2は広範囲の癌
の治療に有用であると信じられる。
の治療に有用であると信じられる。
さらに、固体腫瘍、たとえば肺癌、結腸−大腸癌および
胸痛を治療するための補助治療として特に廟用である。
胸痛を治療するための補助治療として特に廟用である。
また、IL、2は単独でまたは補助治療と共に陰部庖疹
およびその他のウィルス病を治療するのにも有用である
。
およびその他のウィルス病を治療するのにも有用である
。
さらに、インタ7エロンの抗癌活性が高められ、かつI
L2を必要とさえすることが示されている。例数なら、
IL2はインタ7エロンの抗癌活性における主原因であ
ると考えられる「天然キラー」細胞の全活性を刺戟する
がらでアル〔シー・ニス・ヘニー、ネイチャー誌、第コ
タ1巻、第333〜3g頁(/りgi)〕。また、IL
、zは幾種かの免疫病、たとえば多発性硬化症の特徴で
ある適当な抑圧細胞の欠陥を防止するにも有用でおる。
L2を必要とさえすることが示されている。例数なら、
IL2はインタ7エロンの抗癌活性における主原因であ
ると考えられる「天然キラー」細胞の全活性を刺戟する
がらでアル〔シー・ニス・ヘニー、ネイチャー誌、第コ
タ1巻、第333〜3g頁(/りgi)〕。また、IL
、zは幾種かの免疫病、たとえば多発性硬化症の特徴で
ある適当な抑圧細胞の欠陥を防止するにも有用でおる。
最後に、IL2は診断および治療目的でT細胞の培養物
の確立および長期増殖についても使用される。たとえば
、同型細胞毒性T細胞の選択を可能にするため、現在で
は癌細胞が使用されている。これらのT細胞を試験管内
で培養し、患者に注射して腫瘍を後退させる。
の確立および長期増殖についても使用される。たとえば
、同型細胞毒性T細胞の選択を可能にするため、現在で
は癌細胞が使用されている。これらのT細胞を試験管内
で培養し、患者に注射して腫瘍を後退させる。
生化学的レベルにおいて、IL、2は約/jOOOダル
トンの分子量を有しかつグリコジル化されていると信じ
られる。グリコジル化されていると仮定すれば、これは
100乃至130個のアミノ酸を有するはずである。I
L2はカラム上で若干異質的に作用する。SOSゲルに
おいて、恐らくサブ単位であるλつのバンド(/、20
00および/3000ダルトン)が観察される〔リュー
・ダプリュウ・マイエルおよびアール・シー・ガロ、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−Φサイエンス
、USA、第77巻、第ti34t−3g頁、(lりg
o))。さらに、IL2は1種より多い化合物である。
トンの分子量を有しかつグリコジル化されていると信じ
られる。グリコジル化されていると仮定すれば、これは
100乃至130個のアミノ酸を有するはずである。I
L2はカラム上で若干異質的に作用する。SOSゲルに
おいて、恐らくサブ単位であるλつのバンド(/、20
00および/3000ダルトン)が観察される〔リュー
・ダプリュウ・マイエルおよびアール・シー・ガロ、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−Φサイエンス
、USA、第77巻、第ti34t−3g頁、(lりg
o))。さらに、IL2は1種より多い化合物である。
これは白血球インタフエロン(IFN−α)と同様に、
m々ナレヘルの免疫治療活性を示す7群の生産物である
。
m々ナレヘルの免疫治療活性を示す7群の生産物である
。
また、IL、2は多形質でもある。たとえば、特定個体
の細胞はより一般的なIL、2分類内のIL、2種類を
生産することができ、これら種類はそれが属する種類の
原型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異なっ
ている。
の細胞はより一般的なIL、2分類内のIL、2種類を
生産することができ、これら種類はそれが属する種類の
原型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異なっ
ている。
リンホキンの7種であるIFN−rは、遺伝子工学の応
用によって多量に生産されている〔アール・デボス等、
上記〕。IL2はこの方法では生産されていない。
用によって多量に生産されている〔アール・デボス等、
上記〕。IL2はこの方法では生産されていない。
しかしながら、Ilコの多くの重要な免疫治療活性のた
め、並びに診断および治療目的に対するT細胞の確立お
よび長期増殖におけるその必要用途のため、Ilコの大
規模生産に関し種々の方法および手段が研究されている
が、まだ成功を収めたものはない。
め、並びに診断および治療目的に対するT細胞の確立お
よび長期増殖におけるその必要用途のため、Ilコの大
規模生産に関し種々の方法および手段が研究されている
が、まだ成功を収めたものはない。
本発明は、IL2を暗号化するDNA配列を位置決定し
かつ同定し、これら配列によって適当な宿主を形質転換
させ、それによりひとインタロイキンλ型の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドの生産に使用す
るDNA配列、組換DNA分子およびその使用方法を提
供することにより、上記問題を解決する。
かつ同定し、これら配列によって適当な宿主を形質転換
させ、それによりひとインタロイキンλ型の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドの生産に使用す
るDNA配列、組換DNA分子およびその使用方法を提
供することにより、上記問題を解決する。
本発明によれば、免疫治療剤および方法並びにT細胞の
確立および長期増殖に使用するための、Ilコの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ること
ができる。本発明は、従来不可能であった量および方法
でこれらポリペプチドを製造することを可能にする。
確立および長期増殖に使用するための、Ilコの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ること
ができる。本発明は、従来不可能であった量および方法
でこれらポリペプチドを製造することを可能にする。
以下の開示から明らかなように、本発明のDNA配列お
よび組換DNA分子は、IL、2の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを適当な宿主により生産
することに向けられる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらDNA配列および組換DNA分子の複製は、これら
ポリペプチドを暗号化する遺伝子を多量に製造すること
を可能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子
梅漬および性質は、かくして容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主中で生産された
ままで或いは適当に誘4または改変した後に、これら生
産物自身の生成を検出しかつ改善するだめの組成物およ
び方法、免疫治療剤および方法に使用するための組成物
および方法、並びにT細胞の確立および長期増殖のため
の組成物および方法に使用するのに有用である。
よび組換DNA分子は、IL、2の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを適当な宿主により生産
することに向けられる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらDNA配列および組換DNA分子の複製は、これら
ポリペプチドを暗号化する遺伝子を多量に製造すること
を可能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子
梅漬および性質は、かくして容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主中で生産された
ままで或いは適当に誘4または改変した後に、これら生
産物自身の生成を検出しかつ改善するだめの組成物およ
び方法、免疫治療剤および方法に使用するための組成物
および方法、並びにT細胞の確立および長期増殖のため
の組成物および方法に使用するのに有用である。
上記から判かるように、本発明の基本的局面は、IL2
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを
暗号化する仁とを特徴とするDNA配列を提供すること
であり、或いはDNA配列の集団からこの種の配列を少
なくとも選択し得ることであり、これらDNA配列はD
NA挿入物blL2−0.bIL2−/、前記DNA挿
入物のいずれかにヒブリド化しがっIL、zを暗号化す
るDNA配列、および前記DNA配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するDNA配列よりなる群から選択される。本発明の
配列はさらに、宿主においてIL、2およびIl、2様
ポリペプチドの生産を可能にすることを特徴とする。
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを
暗号化する仁とを特徴とするDNA配列を提供すること
であり、或いはDNA配列の集団からこの種の配列を少
なくとも選択し得ることであり、これらDNA配列はD
NA挿入物blL2−0.bIL2−/、前記DNA挿
入物のいずれかにヒブリド化しがっIL、zを暗号化す
るDNA配列、および前記DNA配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するDNA配列よりなる群から選択される。本発明の
配列はさらに、宿主においてIL、2およびIl、2様
ポリペプチドの生産を可能にすることを特徴とする。
本発明を一層よく理解し得るよう以下詳細に説明する。
以下の説明において次の用語を使用する:ヌクレオチド
: 糖成分(ペントース)と燐酸と含窒素複素環塩基と
よりなるDNAもしくはRNAのモノマ一単位。この塩
基はグリコシド炭素(ペントースのl′炭素)を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性化され
る。≠種のDNA塩基はアデニン(rAJ )、グアニ
ン(rGJ )、シトシン(rcJ)、およびチミン(
rTJ )である。
: 糖成分(ペントース)と燐酸と含窒素複素環塩基と
よりなるDNAもしくはRNAのモノマ一単位。この塩
基はグリコシド炭素(ペントースのl′炭素)を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性化され
る。≠種のDNA塩基はアデニン(rAJ )、グアニ
ン(rGJ )、シトシン(rcJ)、およびチミン(
rTJ )である。
弘種のRNA塩基は、A、G、Cおよびウラシル(rU
J )である。
J )である。
DNA配列: 瞬接ペントースと3′炭素とj′炭素と
の間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
の間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
i上ヱ: mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信号
または翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレオチド(
トリプレット)のDNA配列。
または翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレオチド(
トリプレット)のDNA配列。
たとえば、ヌクレオチドトリプレットTTA。
TTG、CTT、CTC,CTAおjびcTGU7ミノ
酸ロイシン(rLeuJ )を暗号化し、TAG。
酸ロイシン(rLeuJ )を暗号化し、TAG。
TAAおよびTGAは翻訳停止信号であり、またATG
は翻訳開始信号である。
は翻訳開始信号である。
読 枠: mRNAをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しな
ければならない。たとえば、配列GCTGGTTGTA
AGは3つの読枠もしくは相で翻訳することができる。
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しな
ければならない。たとえば、配列GCTGGTTGTA
AGは3つの読枠もしくは相で翻訳することができる。
これら相のそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を与える
:GCT GGT TGT AAG −−Ala−Gl
y−Cys−LysG CTG GTT GTA AG
−−Leu−Val−ValGO工9旦エエ91ムΔ
G −−Trp−Leu −(停止)ポリペプチド=
瞬接アミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基との間でペ
プチド結合により互いに接続されたアミノ酸の線状列。
:GCT GGT TGT AAG −−Ala−Gl
y−Cys−LysG CTG GTT GTA AG
−−Leu−Val−ValGO工9旦エエ91ムΔ
G −−Trp−Leu −(停止)ポリペプチド=
瞬接アミノ酸のα−アミン基とカルボキシ基との間でペ
プチド結合により互いに接続されたアミノ酸の線状列。
ゲノム: 細胞またはウィルスの全DNA0これは特に
物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペ
レータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシャインーダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペ
レータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシャインーダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
遺伝子: 雛型またはメツセンジャーRNA(「mRN
AJ )を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ
酸の配列を暗号化するDNA配列。
AJ )を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ
酸の配列を暗号化するDNA配列。
転 写: 遺伝子からm RN Aを生産する過程。
翻 訳: mRNAからポリペプチドを生産する過程
。
。
発 現@ DNA配列もしくは遺伝子によりポリペプ
チドを生産するために受ける過程。こ ゛れは転写
と翻訳との組合せである。
チドを生産するために受ける過程。こ ゛れは転写
と翻訳との組合せである。
プラスミド: プラスミドが宿主細胞で複製されるよう
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのDNAの結果として変化し、或い
は形質転換することができる。たとえば、テトラサイク
リン耐性(Tet)に対する遺伝子を有するプラスミド
は、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラ
サイクリンに対し耐性の細胞まで形質転換することがで
きる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転
換体」と呼ぶ。
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのDNAの結果として変化し、或い
は形質転換することができる。たとえば、テトラサイク
リン耐性(Tet)に対する遺伝子を有するプラスミド
は、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラ
サイクリンに対し耐性の細胞まで形質転換することがで
きる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転
換体」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ: 細菌性ウィルス
であって、その多くは蛋白質エンベロブまたはコート(
「カプシド」)にカプセル化されたDNA配列よりなっ
ている。
であって、その多くは蛋白質エンベロブまたはコート(
「カプシド」)にカプセル化されたDNA配列よりなっ
ている。
クローン化ベヒクル: 宿主細胞において複製しうるプ
ラスミド、7アージDNAまたはその他のDNA配列で
あって、これはDNAの本質的生物学機能、たとえば複
製コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、或いはプロモ
ータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前記
DNA配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の
同定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイク
リン耐性またはアンピシリン耐性を有する1個もしくは
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
ラスミド、7アージDNAまたはその他のDNA配列で
あって、これはDNAの本質的生物学機能、たとえば複
製コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、或いはプロモ
ータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前記
DNA配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の
同定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイク
リン耐性またはアンピシリン耐性を有する1個もしくは
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化: 前記1種の生物もしくは配列から誘導さ
れる生物またはDNA配列の集落を無性繁殖によって得
る過程。
れる生物またはDNA配列の集落を無性繁殖によって得
る過程。
組換DNA分子またはヒプリドDNA: 生細胞の外
部で端部結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染し
てそこに維持される能力を有する異なるゲノムからのD
NA断片よりなる分子。
部で端部結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染し
てそこに維持される能力を有する異なるゲノムからのD
NA断片よりなる分子。
発現制御配列: DNA配列もしくは遺伝子の発現を、
これら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌク
レオチドの配列。これらはファージλのlae系、
krp系、主オペレータおよびプロモータ領域、fdコ
ート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは成熟核
細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御すること
が知られたその他の配列またはそれらの組合せを包含す
る。
これら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌク
レオチドの配列。これらはファージλのlae系、
krp系、主オペレータおよびプロモータ領域、fdコ
ート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは成熟核
細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御すること
が知られたその他の配列またはそれらの組合せを包含す
る。
IL、2型: I12の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原IL、
2のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、或いは原I
Lコのアミノ酸の全部を含まないこともできる。
性を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原IL、
2のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、或いは原I
Lコのアミノ酸の全部を含まないこともできる。
インタロイキンλ型の生物学的分析
(a)原理
インタロイキンλ型(IL、2)またはT−細胞成長因
子は可溶性化合物であって、ミトゲンのクローン化誘導
体または抗原刺戟されたT細胞の長期培養を可能にする
〔デー・ニー・モルガン等、サイエンス誌、第1り3巻
、第7007−0ざ頁(lり71))。これら細胞の成
長および増殖は、投与方式に応じて培地中のIL2の存
在に依存する。したがって、増殖量の測定(すなわち、
トリチル化チミジンの混入による)は、培地中のIL、
2の濃度を示唆する。
子は可溶性化合物であって、ミトゲンのクローン化誘導
体または抗原刺戟されたT細胞の長期培養を可能にする
〔デー・ニー・モルガン等、サイエンス誌、第1り3巻
、第7007−0ざ頁(lり71))。これら細胞の成
長および増殖は、投与方式に応じて培地中のIL2の存
在に依存する。したがって、増殖量の測定(すなわち、
トリチル化チミジンの混入による)は、培地中のIL、
2の濃度を示唆する。
(b) 目的細胞
「リンホプレプ」 (ファルマシア社)によりひとの末
梢血液から単一核細胞を単離し、これら細胞を(中間層
において)、2回洗浄し、そしてこれらを5x10
a胞/祷の濃度にてRPMI/600培地で培養し、こ
の培地には1%L−グルタミンと抗性物質(下記参照)
とio%胎児牛血清とを補充した。次いで、これら細胞
を10μq7mi’tでのフィトヘマグルチニン(PH
A)(ウェルカム社)により37℃で、20時間刺戟し
、細胞を集めて激しく洗浄し、そしてこれらをPHAを
含まない培地中でさらに3日間培養した。グ日目に、こ
れら細胞に対し、部分精製したひとILコ調製物(PH
A刺戟した牌細胞の培地から得られたjO〜goチの(
NH4)2804沈澱物を初期容量のタコ。まで再溶解
し、かつ燐酸塩緩衝液に対し徹底的に透析したもの〔モ
ル ゛ガン等、上記〕)の7%を補給した。次いで
、これら細胞を3〜V日毎にl:コの割合で分割した。
梢血液から単一核細胞を単離し、これら細胞を(中間層
において)、2回洗浄し、そしてこれらを5x10
a胞/祷の濃度にてRPMI/600培地で培養し、こ
の培地には1%L−グルタミンと抗性物質(下記参照)
とio%胎児牛血清とを補充した。次いで、これら細胞
を10μq7mi’tでのフィトヘマグルチニン(PH
A)(ウェルカム社)により37℃で、20時間刺戟し
、細胞を集めて激しく洗浄し、そしてこれらをPHAを
含まない培地中でさらに3日間培養した。グ日目に、こ
れら細胞に対し、部分精製したひとILコ調製物(PH
A刺戟した牌細胞の培地から得られたjO〜goチの(
NH4)2804沈澱物を初期容量のタコ。まで再溶解
し、かつ燐酸塩緩衝液に対し徹底的に透析したもの〔モ
ル ゛ガン等、上記〕)の7%を補給した。次いで
、これら細胞を3〜V日毎にl:コの割合で分割した。
培養物を約2〜3週問直いた後、これらからの生存細胞
を洗浄し、かつこれら細胞を弘θ%胎児牛血清とio%
ジメチルスルホキシドとを含有するILλを含まない培
地中で2 x / 0’細胞/祷の最終濃度まで培養し
た。その直後に、細胞を1mlのガラス瓶中で、調節速
度のフリーザ(クリオンン社)およびz’c/min、
の冷却速度を用いて一4/−JT、まで凍結させ、次い
で急速に−rO℃まで凍結させた。これら目的の細胞を
液体窒素中で保存した〔グラマツキ等、ジャーナル・イ
ミュノロジカル・メソッド、第53巻、第202〜.2
0頁(lりざコ)〕。これら細胞を使用する直前に、こ
れらを37℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段階的
に混合し、そして洗浄した。調製した細胞の生存度をチ
ロール青排除によって検査した。
を洗浄し、かつこれら細胞を弘θ%胎児牛血清とio%
ジメチルスルホキシドとを含有するILλを含まない培
地中で2 x / 0’細胞/祷の最終濃度まで培養し
た。その直後に、細胞を1mlのガラス瓶中で、調節速
度のフリーザ(クリオンン社)およびz’c/min、
の冷却速度を用いて一4/−JT、まで凍結させ、次い
で急速に−rO℃まで凍結させた。これら目的の細胞を
液体窒素中で保存した〔グラマツキ等、ジャーナル・イ
ミュノロジカル・メソッド、第53巻、第202〜.2
0頁(lりざコ)〕。これら細胞を使用する直前に、こ
れらを37℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段階的
に混合し、そして洗浄した。調製した細胞の生存度をチ
ロール青排除によって検査した。
(0) 微量分析
ギリス等、ジャーナル・イミューノロジー、第720巻
、第2027〜3.2員(/り7g) により実質的に
記載されたIL2微量分析を行なった。先ず、100μ
lのIL2試料をりを穴のミクロ測定板(ファルコン社
)中へ11次にl:2希釈した(RPMI 77≠o、
io%胎児牛血清、/%L−グルタミンおよび抗生物質
、下記参照)。次いで、目的細胞をコx10 細胞/
ゴの濃度で懸濁し、100μlの細胞を穴へ約u X
/ 0’細胞/穴の最終濃度まで加えた。
、第2027〜3.2員(/り7g) により実質的に
記載されたIL2微量分析を行なった。先ず、100μ
lのIL2試料をりを穴のミクロ測定板(ファルコン社
)中へ11次にl:2希釈した(RPMI 77≠o、
io%胎児牛血清、/%L−グルタミンおよび抗生物質
、下記参照)。次いで、目的細胞をコx10 細胞/
ゴの濃度で懸濁し、100μlの細胞を穴へ約u X
/ 0’細胞/穴の最終濃度まで加えた。
これらミクロ測定板を空気中s%co2の加湿雰囲気に
おいて37℃で2弘時間培養し、O,SμC1のH5−
標識したチミジン(アメルシャム社。
おいて37℃で2弘時間培養し、O,SμC1のH5−
標識したチミジン(アメルシャム社。
、20〜30 Ci 7mM )を各ミクロ測定板の穴
へ加え、そして細胞をさらに5時間培養した。次いで、
培養物をガラスフィルタ片の上へ回収しくセル−ハーベ
スタ、MASHQ型を用いる)、かつ液体シンチレーシ
ョンカウンターによってH3−チミジン混入量を測定し
た。
へ加え、そして細胞をさらに5時間培養した。次いで、
培養物をガラスフィルタ片の上へ回収しくセル−ハーベ
スタ、MASHQ型を用いる)、かつ液体シンチレーシ
ョンカウンターによってH3−チミジン混入量を測定し
た。
(d)定 量
ひとIL、2標準試料を用いて、各試験試料の相対活性
を決定した。この標準(任意に選択したひとIL2含肩
の上澄液)はioo単位/νを含有するものと規定した
。これはH3−チミジン吸収により測定して、/:4Z
−/:1の希釈率まで最大の増殖を誘発する。一般に、
標準曲線の直線的下降部分の中央において、この試料の
最大活性の30%が観察された。
を決定した。この標準(任意に選択したひとIL2含肩
の上澄液)はioo単位/νを含有するものと規定した
。これはH3−チミジン吸収により測定して、/:4Z
−/:1の希釈率まで最大の増殖を誘発する。一般に、
標準曲線の直線的下降部分の中央において、この試料の
最大活性の30%が観察された。
さらに、一連の希釈物において各試料を試験し、それら
の力価をグラフ分析によって計算した。次いで、各試料
の活性を式〔サタドラー等、ジャーナル・イミュノロジ
ー、第12g巻、第1t20〜2を頁(/り♂、2))
: 逆タイタ を用いて単位に変換した。
の力価をグラフ分析によって計算した。次いで、各試料
の活性を式〔サタドラー等、ジャーナル・イミュノロジ
ー、第12g巻、第1t20〜2を頁(/り♂、2))
: 逆タイタ を用いて単位に変換した。
本発明の方法に使用したRNAは、ミトゲン刺戟したD
との牌細胞から抽出した。提供された牌細胞は、単一供
与体から多量の免疫系細胞を供給するという利点を有し
、さらにひと末梢血液リンパ球により生成される量より
も多い量でインタロイキンコを生成するという利点を有
する〔ニー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメン
タル・イミュノロジー* 第4’ p 巻、第、262
〜269頁(/りざ/)〕。
との牌細胞から抽出した。提供された牌細胞は、単一供
与体から多量の免疫系細胞を供給するという利点を有し
、さらにひと末梢血液リンパ球により生成される量より
も多い量でインタロイキンコを生成するという利点を有
する〔ニー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメン
タル・イミュノロジー* 第4’ p 巻、第、262
〜269頁(/りざ/)〕。
(、) ひと牌細胞の単離
外科部門から得られたひと牌臓勿無mフラスチツク袋中
に入れて実験室1で運び、実験室内において無菌カラス
皿に移した。無菌解剖鋏によって牌臓の外膜を除去し、
jOnh’の牌臓組織を切除した。この組織をプラスチ
ックベトリ皿(直径/j[s)に入れ、さらに小さい片
(0,j鍋3まで)に切断した。約10m1のRPMT
/A4tO培地(ギブコ社)C2Fi/lのNaHC
O5と、20mMのHEPESとを補充したもの)を添
加した後、2rnlプラスチツク注射器からの棒の端部
で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分を弛緩させた。
に入れて実験室1で運び、実験室内において無菌カラス
皿に移した。無菌解剖鋏によって牌臓の外膜を除去し、
jOnh’の牌臓組織を切除した。この組織をプラスチ
ックベトリ皿(直径/j[s)に入れ、さらに小さい片
(0,j鍋3まで)に切断した。約10m1のRPMT
/A4tO培地(ギブコ社)C2Fi/lのNaHC
O5と、20mMのHEPESとを補充したもの)を添
加した後、2rnlプラスチツク注射器からの棒の端部
で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分を弛緩させた。
次いで、この懸濁物を約!OmlのRPMI /6≠O
培地で希釈し、そして得られた懸濁物を充分に混合した
。次いで1組織および細胞懸濁物を無菌金属FFi (
I x o、g 関/薗)に移して、液体を他のプラス
チックペトリ皿に排液した。次いで、この組織tl−篩
を通して元のグラスチック皿に戻し、そして前記と同様
に砕きかつ濾過した。最後に、全細胞懸濁物を0.61
のプラスチック管へ注ぎ入れた。この手順を全牌臓が調
製されるまで新鮮な片につき反復した。
培地で希釈し、そして得られた懸濁物を充分に混合した
。次いで1組織および細胞懸濁物を無菌金属FFi (
I x o、g 関/薗)に移して、液体を他のプラス
チックペトリ皿に排液した。次いで、この組織tl−篩
を通して元のグラスチック皿に戻し、そして前記と同様
に砕きかつ濾過した。最後に、全細胞懸濁物を0.61
のプラスチック管へ注ぎ入れた。この手順を全牌臓が調
製されるまで新鮮な片につき反復した。
プラスチック管の底部に凝集して濃厚沈澱物を形成した
死細胞の大部分を、再び金属篩による懸濁物の濾過によ
って除去した。次いで、細胞懸濁物をシリコーン処理し
た100tnlの無菌円錐カラス遠沈管に移し、この管
の底部または懸濁物の表面に存在する凝集物を除去した
。
死細胞の大部分を、再び金属篩による懸濁物の濾過によ
って除去した。次いで、細胞懸濁物をシリコーン処理し
た100tnlの無菌円錐カラス遠沈管に移し、この管
の底部または懸濁物の表面に存在する凝集物を除去した
。
次いで、室温にてり00xgで10分間遠心分離するこ
とにより細胞を集め、これら細胞を70倍容量の冷トリ
ス−NH4C1(0,♂3チNHa C1り部とトリス
−HCJ 7部との混合物、コ0−A I /l 、
P)(7,,2)溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶解
させた。t℃にて70分間後、底部に凝集した全ての死
細胞を除去し、白色細胞を集め、そしてRPMI tt
oo培地で少なくとも2回洗浄した。次いで、細胞を完
全培地(0,03% L−グルタミンと/ 001J/
Mペニシリンと/ 00μfi/FILEのストレプト
マイシンと2jμg/mlのネオマイシンとjxlo−
5Mのβ−メルカプトエタノールと10%胎児牛血清と
を補充したRPMI/l≠O培地)へ移して2−IX/
θ6細1ff!/#I7の濃度にした。
とにより細胞を集め、これら細胞を70倍容量の冷トリ
ス−NH4C1(0,♂3チNHa C1り部とトリス
−HCJ 7部との混合物、コ0−A I /l 、
P)(7,,2)溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶解
させた。t℃にて70分間後、底部に凝集した全ての死
細胞を除去し、白色細胞を集め、そしてRPMI tt
oo培地で少なくとも2回洗浄した。次いで、細胞を完
全培地(0,03% L−グルタミンと/ 001J/
Mペニシリンと/ 00μfi/FILEのストレプト
マイシンと2jμg/mlのネオマイシンとjxlo−
5Mのβ−メルカプトエタノールと10%胎児牛血清と
を補充したRPMI/l≠O培地)へ移して2−IX/
θ6細1ff!/#I7の濃度にした。
(b) ミトゲンによるひと牌細胞の刺戟上記細胞懸
濁物(sr%/x10 細胞)を遠心分離フラスコに
移し、フィトヘマグルチニン(rPHAJ )(ウェル
カム社)をioμg/dの濃度まで加え、或いは0.0
g% PHA−P(ディフコ社)およびi 0 nJi
T /mlの/j−0テトラデカノイルホルボール−1
3−アセテ−) (rTPAJ )(ビー・エル・バイ
オケミカルス社)を加えた。培養物上方の雰囲気を5%
C02の気体混合物で飽和した後−懸濁物を37℃で2
0時間ゆっくり攪拌した。
濁物(sr%/x10 細胞)を遠心分離フラスコに
移し、フィトヘマグルチニン(rPHAJ )(ウェル
カム社)をioμg/dの濃度まで加え、或いは0.0
g% PHA−P(ディフコ社)およびi 0 nJi
T /mlの/j−0テトラデカノイルホルボール−1
3−アセテ−) (rTPAJ )(ビー・エル・バイ
オケミカルス社)を加えた。培養物上方の雰囲気を5%
C02の気体混合物で飽和した後−懸濁物を37℃で2
0時間ゆっくり攪拌した。
次いで、上記と同様にIL2依存性のひと末梢血液リン
パ球によるH3標識チミジンの吸収を測定して、IL2
活性につき懸濁物を分析した。
パ球によるH3標識チミジンの吸収を測定して、IL2
活性につき懸濁物を分析した。
PHA/TPA誘発された牌細胞を遠心分離により集め
、これらを冷PBSで洗浄した。これらの誘発牌細胞か
ら全RNAを単離するため、これら細胞を直ちにチオシ
アン酸グアニジウムの溶液で溶菌させた〔ジエー・エム
・チャーブウィン等、「リボヌクレアーゼの豊富々原料
からの生物学上活性なリボ核酸の単離」、)(イオヶミ
ストリー、第it巻、第!λりを一タタ頁(/り7り)
〕。牌臓1個当り平均して3Qダの全RNAを得た。次
いで、とのRNAをグアニジウム塩酸塩溶液からの沈澱
によりかつオリゴ(dT)セルロース上でのクロマトグ
ラフィーによって精製した〔ジエー・エム・チャーブウ
ィン等、上記〕。この段階で、約/〜のRNA(その内
60%以上がrRNAである)が残留した。
、これらを冷PBSで洗浄した。これらの誘発牌細胞か
ら全RNAを単離するため、これら細胞を直ちにチオシ
アン酸グアニジウムの溶液で溶菌させた〔ジエー・エム
・チャーブウィン等、「リボヌクレアーゼの豊富々原料
からの生物学上活性なリボ核酸の単離」、)(イオヶミ
ストリー、第it巻、第!λりを一タタ頁(/り7り)
〕。牌臓1個当り平均して3Qダの全RNAを得た。次
いで、とのRNAをグアニジウム塩酸塩溶液からの沈澱
によりかつオリゴ(dT)セルロース上でのクロマトグ
ラフィーによって精製した〔ジエー・エム・チャーブウ
ィン等、上記〕。この段階で、約/〜のRNA(その内
60%以上がrRNAである)が残留した。
得られたボlJA+RNAを無菌水に溶解させ、混合物
を7f’Cにて7分間加熱し、そしてこれを10mM)
リス−HeI!(pH7,1)と/ mMEDTAとに
おける・タ〜コ0チ蔗糖濃度勾配において分別し、その
際濃度勾配当りl−−?〜のRNAとベックマンSW弘
/型Tiロータにおけるt℃でuO,000rpmの1
6時間にわたる遠心分離とを用いた。2j個のフラクシ
ョン(それぞれ0.10をl5COfi度分別装置に集
め、光学密度(2! II nm ) t一連続的に測
定した。
を7f’Cにて7分間加熱し、そしてこれを10mM)
リス−HeI!(pH7,1)と/ mMEDTAとに
おける・タ〜コ0チ蔗糖濃度勾配において分別し、その
際濃度勾配当りl−−?〜のRNAとベックマンSW弘
/型Tiロータにおけるt℃でuO,000rpmの1
6時間にわたる遠心分離とを用いた。2j個のフラクシ
ョン(それぞれ0.10をl5COfi度分別装置に集
め、光学密度(2! II nm ) t一連続的に測
定した。
RNAを通過させた約J 00 Ill!のオリゴ(d
T)セルロースの並行濃度勾配における遠心分離の後に
、s8およびllSのrRNAピーク(218rRNA
はチューブの底に存在した)の高さを測定することによ
り単離RNAの品質を分析した。
T)セルロースの並行濃度勾配における遠心分離の後に
、s8およびllSのrRNAピーク(218rRNA
はチューブの底に存在した)の高さを測定することによ
り単離RNAの品質を分析した。
各フラクション中のRNAを−20℃にて少なくとも2
時間沈澱させ、遠心分離(iooo。
時間沈澱させ、遠心分離(iooo。
rpm、 30 min 、−2θ℃、HB弘ツルバー
ル型モータ)によって集め、70%エタノールで洗浄し
た。このRNAを乾燥させた後、これをコ5−sott
tの無菌水中に溶解させた。
ル型モータ)によって集め、70%エタノールで洗浄し
た。このRNAを乾燥させた後、これをコ5−sott
tの無菌水中に溶解させた。
ポリA+ RN A蔗糖濃度勾配フラクションのそれぞ
れを小麦胚芽抽出物(全容量topl)においてS −
メチオニンの存在下で翻訳し〔ピー・ロバーツおよびビ
ー・エム・パターンン、「市販の小麦胚芽からの無細胞
系におけるTMVRNAおよびうさぎグロビンjS R
NAの効率的翻訳」、グロシーデイング・ナショナル争
アカデミ−・ザイエンス・USA、第7θ巻、第一33
0〜34’頁(lり73)〕、そして合成された蛋白質
をlコ、jチの8DB−ポリアクリルアミドゲル上で分
析した〔ニー・ケーφラメlハ[バクテリオファージT
μの頭部を組込む際の構造蛋白質の開裂]、ネイチャー
誌、第227巻、第6ざ0−46頁(lり70)〕。こ
の力式における大型ポリペプチドの合成娃1、ここで試
製されたRNAフラクションが試験管内翻訳の抑制剤を
含まないRNAを含有したことを示した。
れを小麦胚芽抽出物(全容量topl)においてS −
メチオニンの存在下で翻訳し〔ピー・ロバーツおよびビ
ー・エム・パターンン、「市販の小麦胚芽からの無細胞
系におけるTMVRNAおよびうさぎグロビンjS R
NAの効率的翻訳」、グロシーデイング・ナショナル争
アカデミ−・ザイエンス・USA、第7θ巻、第一33
0〜34’頁(lり73)〕、そして合成された蛋白質
をlコ、jチの8DB−ポリアクリルアミドゲル上で分
析した〔ニー・ケーφラメlハ[バクテリオファージT
μの頭部を組込む際の構造蛋白質の開裂]、ネイチャー
誌、第227巻、第6ざ0−46頁(lり70)〕。こ
の力式における大型ポリペプチドの合成娃1、ここで試
製されたRNAフラクションが試験管内翻訳の抑制剤を
含まないRNAを含有したことを示した。
78−/Isの間の81M勾配で沈降したポリA+RN
Aフラクションを分析して、このmRNAにより暗号
化されたIL、2の活性を決定した。
Aフラクションを分析して、このmRNAにより暗号
化されたIL、2の活性を決定した。
この分析のため、soμlのポリA+RNA(/mg/
1nl)をそれぞれt!−20個の南アンリカ産蛙(X
enopu* 1aevis )の卵細胞へ微量注入し
、この卵細胞をHEPES緩衝された改変パルス溶液(
MBS−H)中で3日間培養し、この緩衝溶液は0.1
%のポリエチレングリコールとθ、ケチのアプロチニン
原液(シグマ社)とを含有した。
1nl)をそれぞれt!−20個の南アンリカ産蛙(X
enopu* 1aevis )の卵細胞へ微量注入し
、この卵細胞をHEPES緩衝された改変パルス溶液(
MBS−H)中で3日間培養し、この緩衝溶液は0.1
%のポリエチレングリコールとθ、ケチのアプロチニン
原液(シグマ社)とを含有した。
次いで、培地を抜き取り、分泌された翻訳生成物をその
ILコ活性につき上記のように分析した。第1図は典型
的な分析実験の結果を示すグラフである。これらの結果
が示すように、ひとIL、2活性を暗号化するmRNA
g類は、約10〜//Sの蔗糖勾配で沈降した。
ILコ活性につき上記のように分析した。第1図は典型
的な分析実験の結果を示すグラフである。これらの結果
が示すように、ひとIL、2活性を暗号化するmRNA
g類は、約10〜//Sの蔗糖勾配で沈降した。
さらに、ミトゲン肪発牌細胞から単離した蔗糖勾配分別
ボIJA+RNAの微慧注入の後に、南ア産蛙の卵細胞
によるひとIllの分泌の動力学を検査した。ここで、
卵細胞培養培地におけるIL、2の蓄積は少なくとも7
2時間持続することが観察された。
ボIJA+RNAの微慧注入の後に、南ア産蛙の卵細胞
によるひとIllの分泌の動力学を検査した。ここで、
卵細胞培養培地におけるIL、2の蓄積は少なくとも7
2時間持続することが観察された。
この点において認識すべきことは、蔗糖勾配から得られ
るボIJA+RNA生成物でさえ極めて多数の異なるm
RN Aを含有することでおる。
るボIJA+RNA生成物でさえ極めて多数の異なるm
RN Aを含有することでおる。
hILJに対し特異的なm RN Aを除き、他のm
RN Aは望ましくない汚染物である。残念ながら、こ
れらの汚染物RNAは、本発明のクローン化工程の残部
においてずつとhIL、2m RN Aと同様に挙動す
る。したがって、ポリ(A)RNAにおけるその存在は
IL、z以外のポリペプチドを暗号化する遺伝子を含有
する多数の望1しくない細菌クローンを最終的に生成す
、 る。この汚染は、所望のILコヒブリドクローン金
単離する際に複雑な選別問題を提起する。
RN Aは望ましくない汚染物である。残念ながら、こ
れらの汚染物RNAは、本発明のクローン化工程の残部
においてずつとhIL、2m RN Aと同様に挙動す
る。したがって、ポリ(A)RNAにおけるその存在は
IL、z以外のポリペプチドを暗号化する遺伝子を含有
する多数の望1しくない細菌クローンを最終的に生成す
、 る。この汚染は、所望のILコヒブリドクローン金
単離する際に複雑な選別問題を提起する。
IL、2の場合、選別問題は、所望クローンの同定に対
する選別試料として役立つような充分精製されたIL、
z mRNAもしくはDNAまたはその部分の試料が
無いためさらに悪化する。
する選別試料として役立つような充分精製されたIL、
z mRNAもしくはDNAまたはその部分の試料が
無いためさらに悪化する。
したがって、IL2クローンの選別法は極めて時間の力
・かる困難なものである。さらに、極めて少割合のIL
2クローンしか生物学的もしくは免疫学的な活性型でI
Lコを発現しないと予想されるので、活性クローンの単
離は[藁の中から針を探ず」ような選別工程となる。
・かる困難なものである。さらに、極めて少割合のIL
2クローンしか生物学的もしくは免疫学的な活性型でI
Lコを発現しないと予想されるので、活性クローンの単
離は[藁の中から針を探ず」ような選別工程となる。
有利なことに、本発明は組換DNA技術を使用してIL
、2 mRNAもしくはcDNAまたはその一部の精製
試料を生成させることができる。次いで、この精製され
たm RN Aもしくはe D N Aを使用して、極
めて多数の細菌クローンを迅速に選別し、かつそれによ
りIL、2を活性型で発現するクローンを単離すること
ができる。
、2 mRNAもしくはcDNAまたはその一部の精製
試料を生成させることができる。次いで、この精製され
たm RN Aもしくはe D N Aを使用して、極
めて多数の細菌クローンを迅速に選別し、かつそれによ
りIL、2を活性型で発現するクローンを単離すること
ができる。
hIL2 mRNAの豊富なポリ(A)RNAi雛型
として使用して補完的D N A ([a DNA、l
)を調製した。これね、バクテリオファージM8.2
RNAのDNAコピーを含有するプラスミドの作成につ
きデボス等により実質的に記載されている〔「バクテリ
オファージMS、2 RNAの#1は完全寸法のDN
Aコピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第1.2g
巻、第jりS〜61りJ¥(lり7り)〕。
として使用して補完的D N A ([a DNA、l
)を調製した。これね、バクテリオファージM8.2
RNAのDNAコピーを含有するプラスミドの作成につ
きデボス等により実質的に記載されている〔「バクテリ
オファージMS、2 RNAの#1は完全寸法のDN
Aコピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第1.2g
巻、第jりS〜61りJ¥(lり7り)〕。
30μgのボj7A+RNA(蔗糖勾配からの3つの7
ラクシヨン)をs o IllのjOmMトリ、x、
IICJ! (p)l L3 )と30mMのβ−メル
カプトエタノールと10mMのKC1!と10mMのM
QC12とそれぞれ0.3mMのtつのdNTPと10
μ9のpT+2−+eと100μCiのα−p S 2
dATPと100BC5のα−P”dCTP (それぞ
れ、2!00Ci1モル)と4℃mMのNa2P207
と100単位のAMV逆転写酵素との混合物において4
I3℃で30分間培養した。EDTAにより反応を停止
させかつフェノール抽出した後、この混合物をセファデ
ックス−G75カラムに充填した。空隙フラクションに
おける核酸をエタノールで一、20℃にて7晩沈澱させ
、そしてこれらを遠心分離によp集めだ。ペレットを7
0チエタノールで洗浄し、乾燥させ、弘Oμlの水中に
溶解させた。
ラクシヨン)をs o IllのjOmMトリ、x、
IICJ! (p)l L3 )と30mMのβ−メル
カプトエタノールと10mMのKC1!と10mMのM
QC12とそれぞれ0.3mMのtつのdNTPと10
μ9のpT+2−+eと100μCiのα−p S 2
dATPと100BC5のα−P”dCTP (それぞ
れ、2!00Ci1モル)と4℃mMのNa2P207
と100単位のAMV逆転写酵素との混合物において4
I3℃で30分間培養した。EDTAにより反応を停止
させかつフェノール抽出した後、この混合物をセファデ
ックス−G75カラムに充填した。空隙フラクションに
おける核酸をエタノールで一、20℃にて7晩沈澱させ
、そしてこれらを遠心分離によp集めだ。ペレットを7
0チエタノールで洗浄し、乾燥させ、弘Oμlの水中に
溶解させた。
上記で合成したc D N A試料は、実際上濃厚化し
たポリA+mRNAに存在する異なるm RN Aから
生じた複雑なc D N Aの混合物である。さらに、
AMV逆転写酵素による早期停止のため、c D N
Aの多くはボIJA+RNAにおける各種mRNAの不
完全コピーである。
たポリA+mRNAに存在する異なるm RN Aから
生じた複雑なc D N Aの混合物である。さらに、
AMV逆転写酵素による早期停止のため、c D N
Aの多くはボIJA+RNAにおける各種mRNAの不
完全コピーである。
cDNAを二重鎖にする前に、これを上記水混合物をi
oo℃にて30秒間加熱することにより補完的雛型mR
NAに対する結合から切離し、次いで直ちに0℃で冷却
した。3μ9の膵臓RNアーゼと3単位のT1−RNア
ーゼとを加え、そして混合物を37℃で30分間培養し
た。
oo℃にて30秒間加熱することにより補完的雛型mR
NAに対する結合から切離し、次いで直ちに0℃で冷却
した。3μ9の膵臓RNアーゼと3単位のT1−RNア
ーゼとを加え、そして混合物を37℃で30分間培養し
た。
K−ホスフェート(pi(A、り)(最終濃度io。
m M )とジチオスレイトール(1mM)とMllC
12(/ OmM )と4tdNTP (それぞれコs
oμM)と!OμCiα−P” dATPとsoμCi
α−P dCTP(それぞれ、2!00Ci1モル)
との混合物を加えて混合物をio。
12(/ OmM )と4tdNTP (それぞれコs
oμM)と!OμCiα−P” dATPとsoμCi
α−P dCTP(それぞれ、2!00Ci1モル)
との混合物を加えて混合物をio。
μlに調整し、イー・コリDNAポリメラーゼ■(ビオ
ラブ社、100単位)を加えかつ得られた混合物を75
℃にて3時間培養することにより、aDNA鎖を二重鎖
にした。反応をEDTAにより停止させ、混合物をフェ
ノール処理し、セファデックス−G77カラムに通し、
そして空隙フラクションを前記と同様にエタノールによ
って−、20℃でl晩沈澱させた。
ラブ社、100単位)を加えかつ得られた混合物を75
℃にて3時間培養することにより、aDNA鎖を二重鎖
にした。反応をEDTAにより停止させ、混合物をフェ
ノール処理し、セファデックス−G77カラムに通し、
そして空隙フラクションを前記と同様にエタノールによ
って−、20℃でl晩沈澱させた。
二重鎖o D N A fg造に残存する単一鎖のヘア
ピンループを開裂させるため、遠心分離によりDNAを
除去し、ペレットを乾燥し、そしてこれを再び水中に取
り、混合物を0..2 MのNaC1!と10mMのN
a0Aa (pH4LJ )と/mMのZnC/2と7
0単位のSIヌクレアーゼ(シグマ社)との100m1
中で37℃にて30分間培養した。混合物をフェノール
/ CHCl y、 /イソアミルアルコールで抽出す
ることにより反応を停止させ1.200μlの−MのN
H40Acとioμ9のイーΦコリt RNAと/属の
エタノールとを加えることにより、−20℃で2時間お
よび一−70℃で70分間沈澱させた。遠心分離により
ペレットを取出し、そしてこれを乾燥した。
ピンループを開裂させるため、遠心分離によりDNAを
除去し、ペレットを乾燥し、そしてこれを再び水中に取
り、混合物を0..2 MのNaC1!と10mMのN
a0Aa (pH4LJ )と/mMのZnC/2と7
0単位のSIヌクレアーゼ(シグマ社)との100m1
中で37℃にて30分間培養した。混合物をフェノール
/ CHCl y、 /イソアミルアルコールで抽出す
ることにより反応を停止させ1.200μlの−MのN
H40Acとioμ9のイーΦコリt RNAと/属の
エタノールとを加えることにより、−20℃で2時間お
よび一−70℃で70分間沈澱させた。遠心分離により
ペレットを取出し、そしてこれを乾燥した。
二重鎖cDN人のこの混合物は、これを調製するための
雛型として使用したボIJA+RNAの異質性の結果、
並びにAMV逆転写酵素によるc D N A転写の早
期停止により異質と々る。
雛型として使用したボIJA+RNAの異質性の結果、
並びにAMV逆転写酵素によるc D N A転写の早
期停止により異質と々る。
上記の異質性の効果を弱めるため、二重鎖c D N
A混合物を寸法決定し、この際ペレットを70mMトリ
ス−HCl (pH7,j )とtmMEDTAとの、
20μl中に取り、これをjj’cにて5分間培養し、
ブロモフェノールブルー−キシレンシアノールFFと蔗
糖とを加え、DNAを4L%ポリアクリルアミドゲル(
トリス−硼酸塩、20(mx II 0orn xθ、
3偏1.200V、20mA)で7晩電気泳動した。こ
の場合、ファージφX/ 74MDNA(Dj’−P”
−標識Has ill切断物を並行移動路に標識として
電気泳動させた。ゲルを放射線分析した後、このDNA
をゲル上の位置にしたがってフラクションM / (1
000−i3oobp)、Ml(7!0−1000bp
)、MJ (600−7j0bp )およびMl、!
、(!00−6θ0bp)に分離した。各フラクション
に対応するゲルスライスを切除し、これらを2MのQ、
jtMのNH40ACと10mMの’hUlc12と0
.1%SDSとでl晩溶出させ、そしてDNAを一容量
のエタノールで沈澱させた(−,20℃)。遠心分離し
た後、各ペレットを100μノの水中に取り、そしてこ
れを200μlのtOmM燐酸ナトリウム(pH7,グ
)とtooal(充填容量)のヒドロキシアパタイト(
ビオラド社)との存在下で37℃にて10分間培養した
。次いで、ヒドロキシアパタイトをセファデックス−0
73カラムに充填し、そしてとのカラムを2mMの燐酸
ナトリウム(…7.り)で充分洗浄した後、DNAをO
6≠jMの燐酸ナトリウム(P)1?、lI)で溶出さ
せ、そして’/lo容量の2MのNa0Ac (pH,
r )と2容量のエタノールとで沈澱させた。
A混合物を寸法決定し、この際ペレットを70mMトリ
ス−HCl (pH7,j )とtmMEDTAとの、
20μl中に取り、これをjj’cにて5分間培養し、
ブロモフェノールブルー−キシレンシアノールFFと蔗
糖とを加え、DNAを4L%ポリアクリルアミドゲル(
トリス−硼酸塩、20(mx II 0orn xθ、
3偏1.200V、20mA)で7晩電気泳動した。こ
の場合、ファージφX/ 74MDNA(Dj’−P”
−標識Has ill切断物を並行移動路に標識として
電気泳動させた。ゲルを放射線分析した後、このDNA
をゲル上の位置にしたがってフラクションM / (1
000−i3oobp)、Ml(7!0−1000bp
)、MJ (600−7j0bp )およびMl、!
、(!00−6θ0bp)に分離した。各フラクション
に対応するゲルスライスを切除し、これらを2MのQ、
jtMのNH40ACと10mMの’hUlc12と0
.1%SDSとでl晩溶出させ、そしてDNAを一容量
のエタノールで沈澱させた(−,20℃)。遠心分離し
た後、各ペレットを100μノの水中に取り、そしてこ
れを200μlのtOmM燐酸ナトリウム(pH7,グ
)とtooal(充填容量)のヒドロキシアパタイト(
ビオラド社)との存在下で37℃にて10分間培養した
。次いで、ヒドロキシアパタイトをセファデックス−0
73カラムに充填し、そしてとのカラムを2mMの燐酸
ナトリウム(…7.り)で充分洗浄した後、DNAをO
6≠jMの燐酸ナトリウム(P)1?、lI)で溶出さ
せ、そして’/lo容量の2MのNa0Ac (pH,
r )と2容量のエタノールとで沈澱させた。
ここでも認識されるように、aDNA77クシヨンのそ
れぞれには多数のc D N Aが存在し、その極く僅
かのみがbIL2関連のc D N Aである。
れぞれには多数のc D N Aが存在し、その極く僅
かのみがbIL2関連のc D N Aである。
二重鎖c D N Aのクローン化
本発明により調製された二重鎖c D N Aをクロー
ン化しまたは発現させる際に、多くの種類の宿主/クロ
ーン化ベヒクルの組合せを使用することができる。たと
えば、有用なりローン比重たは発現ベヒクルL染色体、
非染色体および合成りNA配列の断片、たとえば5V4
LOの各種の公知誘導体および公知の細菌プラスミド、
たとえばcol F/、pCR/、pBRJ、2ノ、p
MBりおよびその誘導体からのプラスミド、広範囲の宿
主プラスミド、たとえばRP4L、ファージDNA、た
とえばファージλの多くの誘導体、たとえばNMりざり
およびその他のDNA7アージ、たとえばMI!および
フィラメント状単一鎖DNAファージ並びにプラスミド
とファージDNAとの組合せから得られるベクター、た
とえばファージDNAを使用するよう改変したプラスミ
ドまたはその他の発現制御配列または酵母プラスミド、
たとえばλμプラスミドもしくはその誘導体よりなるこ
とができる。有用なりローン化もしくは発現宿主は細菌
宿主、たとえばイー・コリHBtO/、イーコリXt7
7A、イー−コリXλuJ’J、イー・コリMRCIお
よびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の
細菌類、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物もしく
は植物宿主、たとえば培養物における動物(ひとを含む
)もしくは植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必らずしモ全ての宿主/ベクター組合せが同等に有
効であるとは限らない。宿主/クローン化ベヒクル組合
せの特定の選択は、ここに記載した原理を考慮して本発
明の範囲を逸脱することなく当業者により行なうことが
できる。
ン化しまたは発現させる際に、多くの種類の宿主/クロ
ーン化ベヒクルの組合せを使用することができる。たと
えば、有用なりローン比重たは発現ベヒクルL染色体、
非染色体および合成りNA配列の断片、たとえば5V4
LOの各種の公知誘導体および公知の細菌プラスミド、
たとえばcol F/、pCR/、pBRJ、2ノ、p
MBりおよびその誘導体からのプラスミド、広範囲の宿
主プラスミド、たとえばRP4L、ファージDNA、た
とえばファージλの多くの誘導体、たとえばNMりざり
およびその他のDNA7アージ、たとえばMI!および
フィラメント状単一鎖DNAファージ並びにプラスミド
とファージDNAとの組合せから得られるベクター、た
とえばファージDNAを使用するよう改変したプラスミ
ドまたはその他の発現制御配列または酵母プラスミド、
たとえばλμプラスミドもしくはその誘導体よりなるこ
とができる。有用なりローン化もしくは発現宿主は細菌
宿主、たとえばイー・コリHBtO/、イーコリXt7
7A、イー−コリXλuJ’J、イー・コリMRCIお
よびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の
細菌類、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物もしく
は植物宿主、たとえば培養物における動物(ひとを含む
)もしくは植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必らずしモ全ての宿主/ベクター組合せが同等に有
効であるとは限らない。宿主/クローン化ベヒクル組合
せの特定の選択は、ここに記載した原理を考慮して本発
明の範囲を逸脱することなく当業者により行なうことが
できる。
さらに、それぞれ特異的クローン化もしくは発現ベヒク
ルには、二重鎖DNAを挿入するため各種の部位を選択
することができる。これらの部位は、一般にそこを切断
する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。これら
の部位は当業者によシ充分知られている。勿論5本発明
に有用なりローン化もしくは発現ベヒクルは、選択DN
A断片を挿入するだめの制限エンドヌクレアーゼ部位を
持つ必要がないことを了解すべきである。寧ろ、ベヒク
ルは他の手段によって断片に結合することができる。
ルには、二重鎖DNAを挿入するため各種の部位を選択
することができる。これらの部位は、一般にそこを切断
する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。これら
の部位は当業者によシ充分知られている。勿論5本発明
に有用なりローン化もしくは発現ベヒクルは、選択DN
A断片を挿入するだめの制限エンドヌクレアーゼ部位を
持つ必要がないことを了解すべきである。寧ろ、ベヒク
ルは他の手段によって断片に結合することができる。
ベクターまたはクローン化もしくは発現ベヒクル、およ
び特に選択DNA断片を付着させて組換DNA分子を生
成させるためにここに選択される部位は種々の因子、た
とえば特定の制限酵素の作用を受ける部位の個数、発現
すべき蛋白質の寸法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対
する所望蛋白質の感受性、精製の際除去することが困難
な宿主細胞蛋白質により発現すべき蛋白質の汚染または
結合、たとえばベクター配列に対する開始コドンおよび
停止コドンの位置のような発現特性、並びに当業者に知
られたソノ他の因子によシ決定される。特定遺伝子に対
するベクターおよび挿入部位の選択はこれら因子のバラ
ンスによって決定され、必らずしも全ての選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
び特に選択DNA断片を付着させて組換DNA分子を生
成させるためにここに選択される部位は種々の因子、た
とえば特定の制限酵素の作用を受ける部位の個数、発現
すべき蛋白質の寸法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対
する所望蛋白質の感受性、精製の際除去することが困難
な宿主細胞蛋白質により発現すべき蛋白質の汚染または
結合、たとえばベクター配列に対する開始コドンおよび
停止コドンの位置のような発現特性、並びに当業者に知
られたソノ他の因子によシ決定される。特定遺伝子に対
するベクターおよび挿入部位の選択はこれら因子のバラ
ンスによって決定され、必らずしも全ての選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
外来D N A lクローン化ベヒクルまたは発現ベク
ター中に挿入して組換DNA分子を生成させるには当業
界で幾つかの方法が知られているが、本発明による初期
クローン化につき好適な方法は抛H1によりpsVjλ
りDNA(後記)を切断し、ハmHI部位に充填し、か
つ末端トランスフェラーゼによってdC末端を3′末端
に付加することである。次いで、二重鎖c D N A
ヲコのpsVj、?りDNAへ先ずこれヲdG 末端で
処理した後に結合させる。次いで、切断DNAと切断c
D N Aとを融合させて、DNAをプラスミドの選
択部位に挿入すると共にヒブリドDNAを再環化させる
ことができ、dG−dc末端の補完的性質はそれらの凝
集およびシ1mHI部位の再編成を可能にする。かくし
て得られ九組換DNA分子は、クローン化ベクターにお
ける選択位置に挿入遺伝子を有する(第2図)。
ター中に挿入して組換DNA分子を生成させるには当業
界で幾つかの方法が知られているが、本発明による初期
クローン化につき好適な方法は抛H1によりpsVjλ
りDNA(後記)を切断し、ハmHI部位に充填し、か
つ末端トランスフェラーゼによってdC末端を3′末端
に付加することである。次いで、二重鎖c D N A
ヲコのpsVj、?りDNAへ先ずこれヲdG 末端で
処理した後に結合させる。次いで、切断DNAと切断c
D N Aとを融合させて、DNAをプラスミドの選
択部位に挿入すると共にヒブリドDNAを再環化させる
ことができ、dG−dc末端の補完的性質はそれらの凝
集およびシ1mHI部位の再編成を可能にする。かくし
て得られ九組換DNA分子は、クローン化ベクターにお
ける選択位置に挿入遺伝子を有する(第2図)。
勿論、DNA配列をクローン化もしくは発現ベヒクル中
へ挿入して組換DNA分子を生成させるその他の公知の
方法も、本発明に同等に有用である。たとえは、これら
はdA−dT末端処理、直接結合、合成リンカ、エキソ
ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結
合、またはDNAポリメラーゼによるDNA鎖の延長お
よび適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含する。
へ挿入して組換DNA分子を生成させるその他の公知の
方法も、本発明に同等に有用である。たとえは、これら
はdA−dT末端処理、直接結合、合成リンカ、エキソ
ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結
合、またはDNAポリメラーゼによるDNA鎖の延長お
よび適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含する。
勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入されたヌク
レオチド配列またはcDNA断片は、所望のポリペプチ
ドを暗号化する実際の遺伝子の一部でないヌクレオチド
を包含するか、或い社所望の蛋白質に対する完全遺伝子
の断片のみを包含し得ることを了解すべきである。DN
Aが最終的に挿入された場、声・、形質転換された宿主
がIL、2の生物学的もしくは免疫学的活性を有するポ
リペプチドを生産すること、或いはDNA配列自身がI
L2の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドの生産に有用なりNA配列を含有するクローンを選
択するだめのヒプリド化試料として使用し得るものであ
ることのみを必要とする。
レオチド配列またはcDNA断片は、所望のポリペプチ
ドを暗号化する実際の遺伝子の一部でないヌクレオチド
を包含するか、或い社所望の蛋白質に対する完全遺伝子
の断片のみを包含し得ることを了解すべきである。DN
Aが最終的に挿入された場、声・、形質転換された宿主
がIL、2の生物学的もしくは免疫学的活性を有するポ
リペプチドを生産すること、或いはDNA配列自身がI
L2の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドの生産に有用なりNA配列を含有するクローンを選
択するだめのヒプリド化試料として使用し得るものであ
ることのみを必要とする。
外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルまたは発現ベ
クターを使用して宿主を形質転換させ、この宿主が遺伝
子の暗号化するIL、2の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチドを発現するようにさせる。適当な
宿主の選択は当業界で知られた多くの因子により管理さ
れるOこれらは−だとえげ選択ベクターとの適合性、ヒ
プリドプラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所
望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および
コストなどを包含する。
クターを使用して宿主を形質転換させ、この宿主が遺伝
子の暗号化するIL、2の免疫学的もしくは生物学的活
性を示すポリペプチドを発現するようにさせる。適当な
宿主の選択は当業界で知られた多くの因子により管理さ
れるOこれらは−だとえげ選択ベクターとの適合性、ヒ
プリドプラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所
望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および
コストなどを包含する。
これら因子のバランスは、必らずしも全ての宿主が特定
組換DNA分子のクローン化または発現のいずれかに同
等に有効でないという理解と一致せねばならない。
組換DNA分子のクローン化または発現のいずれかに同
等に有効でないという理解と一致せねばならない。
本合成において、好適な初期クローン化ベヒクルはp8
V!2りであり、かつ好適な初期制限エンドヌクレアー
ゼ部位はBamHIである。好適な初期宿主はイー・コ
+)HB10/である。
V!2りであり、かつ好適な初期制限エンドヌクレアー
ゼ部位はBamHIである。好適な初期宿主はイー・コ
+)HB10/である。
psVj、2りは、多量の領域が除去されているキメラ
5vti−oプラスミド発現ベクターである(第2図)
。この構造はVP/遺伝子の大部分(Olりas−o、
i≠3地図単位)を欠如するが転写の複製、開始および
停止、並びに/JSおよび/りSmRNAの切断および
ポリアデニル化に関与する全ての領域を保持する。pS
Vjコタは、5v4LO転写制御の下で遺伝子を発現す
るよう設計される〔ディー・ゲイセンおよびダブリュー
・フイエルス、ジャーナル・モレキュラー・アプライド
・ジエネテイツクス、第1巻、第38’j〜タグ頁(l
りr、z))。
5vti−oプラスミド発現ベクターである(第2図)
。この構造はVP/遺伝子の大部分(Olりas−o、
i≠3地図単位)を欠如するが転写の複製、開始および
停止、並びに/JSおよび/りSmRNAの切断および
ポリアデニル化に関与する全ての領域を保持する。pS
Vjコタは、5v4LO転写制御の下で遺伝子を発現す
るよう設計される〔ディー・ゲイセンおよびダブリュー
・フイエルス、ジャーナル・モレキュラー・アプライド
・ジエネテイツクス、第1巻、第38’j〜タグ頁(l
りr、z))。
psVj、2りの主たる特徴は次の通シである:(a)
S V 110ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小
型−tおよび大型−T抗原を暗号化し、さらに猿の細胞
における複製に必要な領域も存在し、これらは叩」の領
域の方向に位置する「エンハンサ−」配列である:(b
)主たる宿造蛋白質vPlに対する遺伝子が削除されて
いる( 0.9113− o、i≠!地図単位からのH
ind [1−Ba旦HI断片)i(、)独特なりam
H1部位がキメラプラスミドに存在し、そこに外来DN
A配列を挿入してs’vtoプロモータの制御下で発現
させることができ、このハユHI部位は148mRNA
アクセプタースプライスから3′?個のヌクレオチドの
後にかつVP/遺伝子の開始コドン(既に除去されてい
る)から12個のヌクレオチドの前に存在する;(d)
主たるitsメツセージに対するドナーおよびアクセプ
タースプライス部位が存在する; (a) S V≠O
領域からのポリアデニル化部位が存在する(SVpO地
図単位o、/7);(f) S V a o D N
Aの2010 bp断片(0,33〜0.7コjの地
図位置の間)の複製は猿細胞における同質の組換f:司
能にすると共に、ブシスミド配列が既に除去でれている
がウィルス構造遺伝子VP/の代りに挿入遺伝子を含む
SVa。
S V 110ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小
型−tおよび大型−T抗原を暗号化し、さらに猿の細胞
における複製に必要な領域も存在し、これらは叩」の領
域の方向に位置する「エンハンサ−」配列である:(b
)主たる宿造蛋白質vPlに対する遺伝子が削除されて
いる( 0.9113− o、i≠!地図単位からのH
ind [1−Ba旦HI断片)i(、)独特なりam
H1部位がキメラプラスミドに存在し、そこに外来DN
A配列を挿入してs’vtoプロモータの制御下で発現
させることができ、このハユHI部位は148mRNA
アクセプタースプライスから3′?個のヌクレオチドの
後にかつVP/遺伝子の開始コドン(既に除去されてい
る)から12個のヌクレオチドの前に存在する;(d)
主たるitsメツセージに対するドナーおよびアクセプ
タースプライス部位が存在する; (a) S V≠O
領域からのポリアデニル化部位が存在する(SVpO地
図単位o、/7);(f) S V a o D N
Aの2010 bp断片(0,33〜0.7コjの地
図位置の間)の複製は猿細胞における同質の組換f:司
能にすると共に、ブシスミド配列が既に除去でれている
がウィルス構造遺伝子VP/の代りに挿入遺伝子を含む
SVa。
レプリコンを発生する。
!0ttll(DpSV!29 DNAfllO単位
のh二HI制限酵素で37℃にて2時間にわたりtot
tzのざm M M gCI!2と弘OmM NaC1
!と100mM)リス−HCl (pHq、a ) に
おいて切断した。EDTAにょシこの反応を停止させ、
そして混合物をフェノール化しく3回)、エーテル抽出
しく2回)、’/10 答Rの、2MKOAc(pHj
)とλ容量のエタノールとで沈澱させた。
のh二HI制限酵素で37℃にて2時間にわたりtot
tzのざm M M gCI!2と弘OmM NaC1
!と100mM)リス−HCl (pHq、a ) に
おいて切断した。EDTAにょシこの反応を停止させ、
そして混合物をフェノール化しく3回)、エーテル抽出
しく2回)、’/10 答Rの、2MKOAc(pHj
)とλ容量のエタノールとで沈澱させた。
沈澱しかつ線状化した( Ba皿HI ) p SV、
t、2りDNAを次いで分離し、これを70%エタノー
ルで2回洗浄し、乾燥させ、水中に入れ、そしてjOm
M)リス−HCl (PHr、3)と! OmMKCj
とt OmM MIIC12と30mM β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ2j01tMの弘dNTPとj
O年単位AMV逆転写酵素との混合物jOμlにおいて
37℃で30分間培養した。EDTAにより反応を停止
させ、この混合物をフェノール/CHCl5/インアミ
ルアルコールで抽出した。緩衝液および混合物をセファ
デックス−G7jカラム(,20eX O,!m& )
に10mM トリス−)1c/ (p)(7,j )
と7mMEDTAとで充填し、空隙フラクションを2M
KOA c (pHj )とエタノールとで一20℃に
て7時間沈澱させた。
t、2りDNAを次いで分離し、これを70%エタノー
ルで2回洗浄し、乾燥させ、水中に入れ、そしてjOm
M)リス−HCl (PHr、3)と! OmMKCj
とt OmM MIIC12と30mM β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ2j01tMの弘dNTPとj
O年単位AMV逆転写酵素との混合物jOμlにおいて
37℃で30分間培養した。EDTAにより反応を停止
させ、この混合物をフェノール/CHCl5/インアミ
ルアルコールで抽出した。緩衝液および混合物をセファ
デックス−G7jカラム(,20eX O,!m& )
に10mM トリス−)1c/ (p)(7,j )
と7mMEDTAとで充填し、空隙フラクションを2M
KOA c (pHj )とエタノールとで一20℃に
て7時間沈澱させた。
DNAを遠心分離により分離し、乾燥させ、30μmの
/□mM)リス−HCl!(p)l 7J )と1mM
EDTAとに入れ、6g℃にて30秒間加熱し、そ
して氷上で冷却した。次いで、このDNAを0.117
M K−カコジル酸と30mMトリス緩衝液(PHJ
、ざ)と/ mM Co3O4と1mMジチオスレイ
トールと0.1mM dCTPと100μCi α
−P dCTP(コよ00Ci1モル)とlθO単
位の末端テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ(
P−Lビオケミカルス社)との混合物200μl中で3
7℃にて培養した。5分間およびio分間後、700μ
lの量を抜き取って、EDTAにより反応を停止させた
。
/□mM)リス−HCl!(p)l 7J )と1mM
EDTAとに入れ、6g℃にて30秒間加熱し、そ
して氷上で冷却した。次いで、このDNAを0.117
M K−カコジル酸と30mMトリス緩衝液(PHJ
、ざ)と/ mM Co3O4と1mMジチオスレイ
トールと0.1mM dCTPと100μCi α
−P dCTP(コよ00Ci1モル)とlθO単
位の末端テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ(
P−Lビオケミカルス社)との混合物200μl中で3
7℃にて培養した。5分間およびio分間後、700μ
lの量を抜き取って、EDTAにより反応を停止させた
。
これらの部分をフェノール/CHCl5/イソアミルア
ルコールで抽出し、DNAを上記のようにセファデック
ス−075力ラム全通してクロマトグラフィーにより精
製した。空隙フラクションにおけるDNAをエタノール
により沈澱させ1遠心分離し、乾燥しそして30μlの
10mM)すy、−HCl (Pl(7,s )と1m
MのEDTAとに入れた。平均して22個および3を個
のdCMP残基が、それぞれ5分間および10分間の培
養の後に線状化psVtコタDNAの3′末端に付加さ
れると計算された。さらに、 Pvu 11で切断した
dC末端psVj2りDNAのアガロースゲル電気泳動
により示されるように、殆んど内部切断が生じなかった
。
ルコールで抽出し、DNAを上記のようにセファデック
ス−075力ラム全通してクロマトグラフィーにより精
製した。空隙フラクションにおけるDNAをエタノール
により沈澱させ1遠心分離し、乾燥しそして30μlの
10mM)すy、−HCl (Pl(7,s )と1m
MのEDTAとに入れた。平均して22個および3を個
のdCMP残基が、それぞれ5分間および10分間の培
養の後に線状化psVtコタDNAの3′末端に付加さ
れると計算された。さらに、 Pvu 11で切断した
dC末端psVj2りDNAのアガロースゲル電気泳動
により示されるように、殆んど内部切断が生じなかった
。
上記の二重鎖c D N A (フラクションM−およ
びM3)をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタイト上
でN製し、かつオリゴdGと共に煮沸し、この場合慣用
方法と末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
とを使用した。
びM3)をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタイト上
でN製し、かつオリゴdGと共に煮沸し、この場合慣用
方法と末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
とを使用した。
フラクションM2およびM3のそれぞれからのdG末端
daDNAを、充填されかつdC末端処理したBamH
Iで線状化したpsVj、2りと混合し、標準条件下で
融合させた。
daDNAを、充填されかつdC末端処理したBamH
Iで線状化したpsVj、2りと混合し、標準条件下で
融合させた。
融合後に得られるヒプリドDNAII′i、、勿論、挿
入DNA配列を含まない種々の組換DNA分子と幾つか
のクローン化ベヒクルとの混合物である。しかしながら
、各組換DNA分子は、桓H1部位にe D N A断
片を含有する。この種の各a D N A断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて少数のc
D N A断片のみがIL2iたけその部分を暗号化
する。大多数は、mRNAが本発明の方法に使用される
ポリ(A)RNAの一部であるような他の蛋白質または
その部分の7種を暗号化する。さらに、上記で得られた
クローンのいずれもIL、2の免疫学的もしくは生物学
的活性を不ずポリペプチドの発現を可能にしないことを
了解すべきである。
入DNA配列を含まない種々の組換DNA分子と幾つか
のクローン化ベヒクルとの混合物である。しかしながら
、各組換DNA分子は、桓H1部位にe D N A断
片を含有する。この種の各a D N A断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて少数のc
D N A断片のみがIL2iたけその部分を暗号化
する。大多数は、mRNAが本発明の方法に使用される
ポリ(A)RNAの一部であるような他の蛋白質または
その部分の7種を暗号化する。さらに、上記で得られた
クローンのいずれもIL、2の免疫学的もしくは生物学
的活性を不ずポリペプチドの発現を可能にしないことを
了解すべきである。
寧ろ、これらはこの種のクローンを選別しかつ同定する
際にのみ有用である。
際にのみ有用である。
形質転換法および得られた形質転換体を処理するその後
の工程に対し、必要に応じ適尚な封じ込め施設を使用し
た。
の工程に対し、必要に応じ適尚な封じ込め施設を使用し
た。
融合DNAの混合物(フラクションMλおよびM3のそ
れぞれにつき)を、標準形質転換条件を用いて競合イー
・コリHBIO7細胞へ付加した。
れぞれにつき)を、標準形質転換条件を用いて競合イー
・コリHBIO7細胞へ付加した。
次いで、これら細胞を10θμl/mlのカルベニシリ
ンを含有するLB−寒天板に接種した。
ンを含有するLB−寒天板に接種した。
プラスミドp8Vjλりはペニシリン耐性の遺伝子を含
むので、この遺伝子を有するプラスミドで形質転換され
たイー・コリ宿主は、このように形質転換されない細菌
を除き、抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
。したがって、カルベニシリン含有培地における増殖は
。
むので、この遺伝子を有するプラスミドで形質転換され
たイー・コリ宿主は、このように形質転換されない細菌
を除き、抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
。したがって、カルベニシリン含有培地における増殖は
。
組換DNA分子または再環化ベクターにより形質転換さ
れた宿主の選択を可能にする。
れた宿主の選択を可能にする。
個々のコロニーを採取し、そしてこれらを微小測定板に
おける200μlのLB培地(カルベニシリンを含有す
る)においてl晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを
10チの最終濃度まで加えた後、これらプレートを−、
20℃で貯蔵した。M、2およびM3 DNA7ラクシ
ヨンからそれぞれ約7300個および1000個のクロ
ーンを得た。
おける200μlのLB培地(カルベニシリンを含有す
る)においてl晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを
10チの最終濃度まで加えた後、これらプレートを−、
20℃で貯蔵した。M、2およびM3 DNA7ラクシ
ヨンからそれぞれ約7300個および1000個のクロ
ーンを得た。
各フラクション(M、2およびM3)のカルベニシリン
耐性のクローンは、誘発牌細胞から得られたボIJA十
RNAの混合物の寸法決定された完全もしくは部分コピ
ーを示す各種の組換DNA分子を含有する。これらクロ
ーンの大部分は、単一の組換DNA分子を含有するであ
ろう。しかしながら、これら組換DNA分子の極く少数
のみがIL、2に関連する。したがって、これらクロー
ンは、IL2関連クローンを他のクローンから選択する
よう選別せねばならない。
耐性のクローンは、誘発牌細胞から得られたボIJA十
RNAの混合物の寸法決定された完全もしくは部分コピ
ーを示す各種の組換DNA分子を含有する。これらクロ
ーンの大部分は、単一の組換DNA分子を含有するであ
ろう。しかしながら、これら組換DNA分子の極く少数
のみがIL、2に関連する。したがって、これらクロー
ンは、IL2関連クローンを他のクローンから選択する
よう選別せねばならない。
bILノ cDNAを含有する細菌クローンを選別する
には幾つかの方法がある。これらは、たとえばRN A
選択ヒプリド化(アーウィン等、下記)、分別ヒブリド
化(ティー・ピー・セント・クローンおよびアール・ダ
ブリュー・デービス、[分別プラーク・フィルタヒプリ
ド化によるザツカロミセス・セレビシーからのガラクト
ース誘発性DNA配列の単離51、セル誌、第14巻、
第tμ3〜グj2頁(lり7り)〕、合成試料によるヒ
プリド化〔ピー・ノイエス等。
には幾つかの方法がある。これらは、たとえばRN A
選択ヒプリド化(アーウィン等、下記)、分別ヒブリド
化(ティー・ピー・セント・クローンおよびアール・ダ
ブリュー・デービス、[分別プラーク・フィルタヒプリ
ド化によるザツカロミセス・セレビシーからのガラクト
ース誘発性DNA配列の単離51、セル誌、第14巻、
第tμ3〜グj2頁(lり7り)〕、合成試料によるヒ
プリド化〔ピー・ノイエス等。
[オリゴデオキシヌクレオチド試料を用いるガストリン
m RN Aの検出および部分配列分析J1プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−のサイエンス・USA
、第76巻、第1770〜74’頁(/り7り)〕、ま
たは所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析〔エ
ル・ピラーコマロア等、「プロインシュリンを合成する
細菌クローン」、プロシーディングeナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・USA、第75巻、第3727−
3/頁(/り7g)〕または生物学的分析〔ニー・シー
・ワイーチャング等、「ねプ“みジヒドロホレート・レ
ダクターセを暗号化するDNA配列のイー伽コリにおけ
る表現型発現」、ネイチャー誌、第、27j巻、第A7
7〜21I−頁(lり7ざ)〕による選別を包含する。
m RN Aの検出および部分配列分析J1プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−のサイエンス・USA
、第76巻、第1770〜74’頁(/り7り)〕、ま
たは所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析〔エ
ル・ピラーコマロア等、「プロインシュリンを合成する
細菌クローン」、プロシーディングeナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・USA、第75巻、第3727−
3/頁(/り7g)〕または生物学的分析〔ニー・シー
・ワイーチャング等、「ねプ“みジヒドロホレート・レ
ダクターセを暗号化するDNA配列のイー伽コリにおけ
る表現型発現」、ネイチャー誌、第、27j巻、第A7
7〜21I−頁(lり7ざ)〕による選別を包含する。
本発明においては、主たるクローン選別に対する最も便
利かつ有望な方法としてRNA選択ヒプリド化を選択し
た。
利かつ有望な方法としてRNA選択ヒプリド化を選択し
た。
RNA選択ヒプリド化により同定される組換DNA分子
およびそれにより形質転換された細菌培養物が完全IL
2 cDNA配列を含有するという保証はなく、また
DNA配列が実際にILコを暗号化しまたはIL、2の
免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをク
ローンに発現させ得るという保証さえない。しかしなが
ら1組換DNA分子は確かにI L、2 mRNA暗号
化配列に補完的なヌクレオチド配列を含不する。したが
って、組換DNA分子は、少なくとも他の組1DNA分
子およびそれにより形質転換されたクローンを選別する
だめの試料源として使用し、棟準または完全IL、2ヌ
クレオチド暗号化配列を含有する他の種類のクローンを
同定することもできる。次いで、これらクローンを、I
L2の生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチ
ドの可能な発現につき直接に分析することができる。さ
らに重要なことに、これらヒブリドプラスミドの挿入D
NA断片およびそのアミノ酸翻訳生産物のヌクレオチド
配列は常套手段によって決定することができ、このDN
A配列を使用して適当な発現ベクターを作成し、これに
より形質転換された適当な宿主においてIL、2の合成
を行なうことができる。
およびそれにより形質転換された細菌培養物が完全IL
2 cDNA配列を含有するという保証はなく、また
DNA配列が実際にILコを暗号化しまたはIL、2の
免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをク
ローンに発現させ得るという保証さえない。しかしなが
ら1組換DNA分子は確かにI L、2 mRNA暗号
化配列に補完的なヌクレオチド配列を含不する。したが
って、組換DNA分子は、少なくとも他の組1DNA分
子およびそれにより形質転換されたクローンを選別する
だめの試料源として使用し、棟準または完全IL、2ヌ
クレオチド暗号化配列を含有する他の種類のクローンを
同定することもできる。次いで、これらクローンを、I
L2の生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチ
ドの可能な発現につき直接に分析することができる。さ
らに重要なことに、これらヒブリドプラスミドの挿入D
NA断片およびそのアミノ酸翻訳生産物のヌクレオチド
配列は常套手段によって決定することができ、このDN
A配列を使用して適当な発現ベクターを作成し、これに
より形質転換された適当な宿主においてIL、2の合成
を行なうことができる。
A、RNA選択選択リプリド化
分析選択ヒブリド化の背景
蔗糖濃度勾配からのボIJA+RNAは約lμ9のRN
A/ltlを含有し、その内30n’)(30nりを各
卵細胞へ微量注入する。I L、2 mRNAが蔗糖勾
配のビークフラクションにおいて全部IJ A+R’N
Aの0.3 %を構成すると仮定して、0、/ np
のIL2 mRNAを各卵細胞中に微量注入する。この
量の”10%すなわち0.0 / ns/のIL−2m
RNAは卵細胞中への注入後に検出することができる。
A/ltlを含有し、その内30n’)(30nりを各
卵細胞へ微量注入する。I L、2 mRNAが蔗糖勾
配のビークフラクションにおいて全部IJ A+R’N
Aの0.3 %を構成すると仮定して、0、/ np
のIL2 mRNAを各卵細胞中に微量注入する。この
量の”10%すなわち0.0 / ns/のIL−2m
RNAは卵細胞中への注入後に検出することができる。
上記の推定によれは、ピークフラクションにはポリA十
RNA1μy当り3npのIL2 mRNAが存在す
る筈であり、またヒプリド化−溶出分析にっきjoμp
のポリA+RNAを使用すれば/ j OngのIL、
2mRNAが得られるであろう。
RNA1μy当り3npのIL2 mRNAが存在す
る筈であり、またヒプリド化−溶出分析にっきjoμp
のポリA+RNAを使用すれば/ j OngのIL、
2mRNAが得られるであろう。
SO個のクローンからなる各群は約10個の挿入物を含
有する。3〜jμgの挿入DNAを蔗糖勾配遠心分離に
よって精製し、ニトロセルロースフィルタに結合させた
。かくして、o、3〜o3μgの個々の挿入DNA(個
々のクローンから得られたもの)がフィルタに結合され
る。
有する。3〜jμgの挿入DNAを蔗糖勾配遠心分離に
よって精製し、ニトロセルロースフィルタに結合させた
。かくして、o、3〜o3μgの個々の挿入DNA(個
々のクローンから得られたもの)がフィルタに結合され
る。
10nliのI L、2 mRNA (i 30 n
gが利用s o o ngのIL、2 cDNA挿入
物とヒプリド化し得ると仮定し、かっこのRN Aの3
0%が溶出後に回収され得ると仮定して、3n9のIL
、2 mRNAをコμlの水中へ入れ、その内30
nlもしくは0.0.fngのIL2 mRNAを卵
細胞中へ注入する。これは分析中に検出される筈である
。
gが利用s o o ngのIL、2 cDNA挿入
物とヒプリド化し得ると仮定し、かっこのRN Aの3
0%が溶出後に回収され得ると仮定して、3n9のIL
、2 mRNAをコμlの水中へ入れ、その内30
nlもしくは0.0.fngのIL2 mRNAを卵
細胞中へ注入する。これは分析中に検出される筈である
。
それぞれ10個の挿入物(60種のクローンから得られ
たもの)を含有する30個のフィルタを分析して、ヒプ
リド化すべき300個の個々の挿入物を与えた。IL2
mRNAがdsoDNA合成に使用したボIJAR
NAの。、3チを構成すると仮定して、平均で7個のI
L、zc D N Aクローンがフィルタ中に存在する
筈である。
たもの)を含有する30個のフィルタを分析して、ヒプ
リド化すべき300個の個々の挿入物を与えた。IL2
mRNAがdsoDNA合成に使用したボIJAR
NAの。、3チを構成すると仮定して、平均で7個のI
L、zc D N Aクローンがフィルタ中に存在する
筈である。
実施例
工程A: 「挿入DNAJの精製およびこの[挿入DN
AJを含有するニトロ −セルロースフィルタの調
製 上記で調製したもの(M2およびM3)のそれぞれを5
0個のクローンからなる群に分割し、SO個の各群を単
一の寒天板上でl晩増殖させた。次いで、これらクロー
ンから得られた細菌を10NのLB培地に懸濁させ、0
.31の脳心臓潅流物(HHI−ジフコ)Kこの懸濁物
を接種した。細菌懸濁物を7晩増殖させた後(プラスミ
ドの増加を伴わない)、5DS−アルカリ溶菌によって
これら培養物からDNAを単離した(ティー・イーシュ
ーホロビッツおよびシュー・エフ11パーク、ヌクレイ
ツク・アシド・リサーチ、第り巻、第コタlり〜−タタ
1頁(/9ざ/))。
AJを含有するニトロ −セルロースフィルタの調
製 上記で調製したもの(M2およびM3)のそれぞれを5
0個のクローンからなる群に分割し、SO個の各群を単
一の寒天板上でl晩増殖させた。次いで、これらクロー
ンから得られた細菌を10NのLB培地に懸濁させ、0
.31の脳心臓潅流物(HHI−ジフコ)Kこの懸濁物
を接種した。細菌懸濁物を7晩増殖させた後(プラスミ
ドの増加を伴わない)、5DS−アルカリ溶菌によって
これら培養物からDNAを単離した(ティー・イーシュ
ーホロビッツおよびシュー・エフ11パーク、ヌクレイ
ツク・アシド・リサーチ、第り巻、第コタlり〜−タタ
1頁(/9ざ/))。
次いで、50個のクローンの各混合物(200μg)か
らのプラスミドDNAを、200μlの10mMトリス
−HC/ (pH7,3)と/mMのEDTAにおいて
BamHI制限エンドヌクレアーゼにより切断して、[
挿入DNAJを切除した。反応が完結した後(クチポリ
アクリルアミドゲルにおいてよμlを電気泳動させて検
査する)、DNA混合物を6g℃にて5分間加熱し、こ
れを水中で冷却し、そし、て//μlの5−20%蔗糖
勾配へ10mMトリJ’ −HCj? (pH7,5)
と/mMのEDTAとで充填した。各濃度勾配をベック
マンSW!/型ロータにて≠OKかつ参℃でtA時間遠
心分離した。
らのプラスミドDNAを、200μlの10mMトリス
−HC/ (pH7,3)と/mMのEDTAにおいて
BamHI制限エンドヌクレアーゼにより切断して、[
挿入DNAJを切除した。反応が完結した後(クチポリ
アクリルアミドゲルにおいてよμlを電気泳動させて検
査する)、DNA混合物を6g℃にて5分間加熱し、こ
れを水中で冷却し、そし、て//μlの5−20%蔗糖
勾配へ10mMトリJ’ −HCj? (pH7,5)
と/mMのEDTAとで充填した。各濃度勾配をベック
マンSW!/型ロータにて≠OKかつ参℃でtA時間遠
心分離した。
次いで、各濃度勾配を分別しかつ[挿入DNAJの混合
物(、t−10ng)を含有するフラクションを/21
0容量の2M KOA o (pHj )とコ容量のエ
タノールとで一、20℃にて少なくとも3時間沈澱させ
た。
物(、t−10ng)を含有するフラクションを/21
0容量の2M KOA o (pHj )とコ容量のエ
タノールとで一、20℃にて少なくとも3時間沈澱させ
た。
[挿入D N A Jの沈澱混合物を遠心分離により集
め、ペレットを全部で、20μlのiomMトリス−H
C/ (pH7,1)と/mMEDTAとに入れ(,2
μlを4Z%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に使用
した)、この混合物を700℃にて1分間加熱し、水中
で冷却し、そして10μlの/、j N NaOHを加
えた。混合物を室温で10分間培養した後、s Oli
tの2 M NH40A(+を加え、これをニトロセル
ロースフィルタに打点シ(りIII++2、シュ2イヒ
ヤーおよびシュエルBAざj 、 0.”ll ! 、
/7m ) / M NH40Acで湿潤化させて、
「挿入DNAJをフィルタへ吸着させた。これらフィル
タを空気乾燥し、OlりMNaCj’と0.09 Mク
エン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥し、そしてgo℃に
て減圧下にl晩焼成した。
め、ペレットを全部で、20μlのiomMトリス−H
C/ (pH7,1)と/mMEDTAとに入れ(,2
μlを4Z%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に使用
した)、この混合物を700℃にて1分間加熱し、水中
で冷却し、そして10μlの/、j N NaOHを加
えた。混合物を室温で10分間培養した後、s Oli
tの2 M NH40A(+を加え、これをニトロセル
ロースフィルタに打点シ(りIII++2、シュ2イヒ
ヤーおよびシュエルBAざj 、 0.”ll ! 、
/7m ) / M NH40Acで湿潤化させて、
「挿入DNAJをフィルタへ吸着させた。これらフィル
タを空気乾燥し、OlりMNaCj’と0.09 Mク
エン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥し、そしてgo℃に
て減圧下にl晩焼成した。
工程B: 「挿入 DNAJとポリA+RNAとのヒプ
リド化 ヒプリド化選択のため、30個のニトロセルロースフィ
ルタを、45%ホルムアミド(アンパライトM B l
、セルバ社、により脱イオン化したもの)とo、248
8sと20mMHEPE817.4’)と0.4tM
NaC/との混合物、t o o tttヲ含有する/
、tm/のシリコン処理した無菌コレクツスチューブ中
で30℃にて2時間予備ヒプリド化させた。次いで、溶
液を、ポリA+RNAを含有する同一の混合物(PHA
/TPA誘発された牌細胞から得られるj−7!0%蔗
糖勾配で上記したように精製しかつ41℃にて1分間予
備加熱したもの10Lg)で交換した。次いで、これら
フィルタおよび混合物を50℃にて5時間培養した。3
0個のニトロセルロースフィルタは、上記のようにRb
2およびM3フラクションの一部からそれぞれ調製され
たSO個のクローンよりなるSOWを示した。
リド化 ヒプリド化選択のため、30個のニトロセルロースフィ
ルタを、45%ホルムアミド(アンパライトM B l
、セルバ社、により脱イオン化したもの)とo、248
8sと20mMHEPE817.4’)と0.4tM
NaC/との混合物、t o o tttヲ含有する/
、tm/のシリコン処理した無菌コレクツスチューブ中
で30℃にて2時間予備ヒプリド化させた。次いで、溶
液を、ポリA+RNAを含有する同一の混合物(PHA
/TPA誘発された牌細胞から得られるj−7!0%蔗
糖勾配で上記したように精製しかつ41℃にて1分間予
備加熱したもの10Lg)で交換した。次いで、これら
フィルタおよび混合物を50℃にて5時間培養した。3
0個のニトロセルロースフィルタは、上記のようにRb
2およびM3フラクションの一部からそれぞれ調製され
たSO個のクローンよりなるSOWを示した。
工程C:非ヒプリド化ボIJARNAからのヒプリド化
ポリA RNA−挿入 DNAの分離 ヒプリド化ポリA+RN A−挿入DNAを含有する3
0個のフィルタをromtのプラスチックチューブに移
し、これらを5OrrtlEの10mMトリス−HCJ
(pH7,!; )と0./ j M NaCj’と
tmMのEDTAとo、s%80sとの溶液s。
ポリA RNA−挿入 DNAの分離 ヒプリド化ポリA+RN A−挿入DNAを含有する3
0個のフィルタをromtのプラスチックチューブに移
し、これらを5OrrtlEの10mMトリス−HCJ
(pH7,!; )と0./ j M NaCj’と
tmMのEDTAとo、s%80sとの溶液s。
Nで2回洗浄し、かつSD8を含まない上記の緩衝液で
65℃にて2回洗浄した。次いで、それぞれ個々のフィ
ルタ”qiooμlの水とコμl(≠μg)のポリA”
−RNAとを含有するシリコン処理したエツベンドルフ
管へ移した(オリゴ(dT)セルロースカラムには牌細
胞からのRNA全通した)。これらチューブを100℃
にて1分間加熱し、そして直ちにこれらをCO2/エタ
ノール浴中で凍結させた。これらチューブを室温で解凍
した後、フィルタを各チューブから取出し、溶出しだR
NAを一20℃にて1stttの、2 M Na0A
c (pHj )と300μlのエタノールとでl晩沈
澱させた。遠心分離によりRNAを集め、ペレットを7
0チエタノールで2回洗浄しそして乾燥させた。
65℃にて2回洗浄した。次いで、それぞれ個々のフィ
ルタ”qiooμlの水とコμl(≠μg)のポリA”
−RNAとを含有するシリコン処理したエツベンドルフ
管へ移した(オリゴ(dT)セルロースカラムには牌細
胞からのRNA全通した)。これらチューブを100℃
にて1分間加熱し、そして直ちにこれらをCO2/エタ
ノール浴中で凍結させた。これらチューブを室温で解凍
した後、フィルタを各チューブから取出し、溶出しだR
NAを一20℃にて1stttの、2 M Na0A
c (pHj )と300μlのエタノールとでl晩沈
澱させた。遠心分離によりRNAを集め、ペレットを7
0チエタノールで2回洗浄しそして乾燥させた。
工程D : Il、2−mRNA活性の測定30個のペ
レットのILココ−RNA活性を分析するため、30個
のフィルタに対応する、すなわちR1およびM3フラク
ションからの30個のクローンよりなる初期の30群に
対応するペレットのそれぞれをコμlの水中に取シ、こ
のRNA溶液を15〜20個の南ア産蛙の卵細胞へ上記
と同様に注入した。−3℃で3日間後、卵細胞培地を除
去し、IL、2活性につき分析した(上記と同様)。
レットのILココ−RNA活性を分析するため、30個
のフィルタに対応する、すなわちR1およびM3フラク
ションからの30個のクローンよりなる初期の30群に
対応するペレットのそれぞれをコμlの水中に取シ、こ
のRNA溶液を15〜20個の南ア産蛙の卵細胞へ上記
と同様に注入した。−3℃で3日間後、卵細胞培地を除
去し、IL、2活性につき分析した(上記と同様)。
to個のクローンよりなる30群(cDNAフラクショ
ンM、2 (760−1000bp)からの1g群およ
びc D N AフラクションM3(600−7j□b
p)からの/、2群〕のうち2群、すなわち群M3−2
(フィルタ、20)と群M3−1(フィルタ、24L
)とが、卵細胞注入分析で測定してIL2活性を暗号化
するmRNA(誘発牌細胞からのボIJ A+ RN
Aから得られたもの)にヒプリド化する挿入DNAを含
有した。この分析の結果を第1表に示す。
ンM、2 (760−1000bp)からの1g群およ
びc D N AフラクションM3(600−7j□b
p)からの/、2群〕のうち2群、すなわち群M3−2
(フィルタ、20)と群M3−1(フィルタ、24L
)とが、卵細胞注入分析で測定してIL2活性を暗号化
するmRNA(誘発牌細胞からのボIJ A+ RN
Aから得られたもの)にヒプリド化する挿入DNAを含
有した。この分析の結果を第1表に示す。
第1表
5 M2−5 293
6 M2−6 410
011 +++ 11654
022−−− ?1B61
ブランク5 −−− 31/1標準’
−−−20576 末梢血液IJンパ球による卵細胞培養培地の1:A希釈
物のH3−チミジン組込みを意味する。
−−−20576 末梢血液IJンパ球による卵細胞培養培地の1:A希釈
物のH3−チミジン組込みを意味する。
1 [’CIJは第10比紋、すなわちヒブリド化−
溶出分析に使用する前にポリA+RNAを南ア産蛙に注
入することを意味する。
溶出分析に使用する前にポリA+RNAを南ア産蛙に注
入することを意味する。
2 「C2」は’AE2の比較、すなわちニトロセルロ
ースフィルタによるヒブリド化の後にポリA”4NA
(非ヒブリド化f(、NA)を南ア産蛙に注入するこ
とを意味する。
ースフィルタによるヒブリド化の後にポリA”4NA
(非ヒブリド化f(、NA)を南ア産蛙に注入するこ
とを意味する。
6 「ブランク」はIL2分析に使用した完全培地(R
PIVi 16 A O/10%FC8)の100μt
を意味する。
PIVi 16 A O/10%FC8)の100μt
を意味する。
4 「標準」はP、HA/Tl’A誘発牌細胞培誘発小
細胞培養物製されたIL2調製物を意味する。
細胞培養物製されたIL2調製物を意味する。
上記したように第2のヒプリド化と分析とを行なった後
、群M3−2およびM3−6が再び陽性を示した。NM
3− ’lの50個のクローンを14個のサブ群、す
なわちサブ#A−Nにそれぞれ分割した(各群は7個の
クローンを含有し、ただしサブ群Nは8個のクローンを
含有し、全群における陽性クローンの存在は2つの陽性
サブ群をもたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使
用する)。次いで、上記のヒブリド化および分析手順を
、これら14個のサブ群からの挿入DNAを含有するニ
トロセルロースフィルタについて反復し、ザブ、41V
I3−2D(りp−ンM3−2−4,11.1B、25
,32.39および46を含有する)とサブ群M3−2
L(クローンM3−2−29.30,31,32゜33
.34および35を含有する)とがiL2活性を示すこ
とを突き止めた。したがって、個々のクローンIVi3
−2−32がひとIL2−m几NAに補完的な[挿入D
NAJを有するグラスミドを含有するクローンとして同
定された。
、群M3−2およびM3−6が再び陽性を示した。NM
3− ’lの50個のクローンを14個のサブ群、す
なわちサブ#A−Nにそれぞれ分割した(各群は7個の
クローンを含有し、ただしサブ群Nは8個のクローンを
含有し、全群における陽性クローンの存在は2つの陽性
サブ群をもたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使
用する)。次いで、上記のヒブリド化および分析手順を
、これら14個のサブ群からの挿入DNAを含有するニ
トロセルロースフィルタについて反復し、ザブ、41V
I3−2D(りp−ンM3−2−4,11.1B、25
,32.39および46を含有する)とサブ群M3−2
L(クローンM3−2−29.30,31,32゜33
.34および35を含有する)とがiL2活性を示すこ
とを突き止めた。したがって、個々のクローンIVi3
−2−32がひとIL2−m几NAに補完的な[挿入D
NAJを有するグラスミドを含有するクローンとして同
定された。
したがって、クローンM3−2−32の挿入D I’J
A ′fr:単離し、lnI製し、そしてこれをニト
ロセルロースフィルタに結合式せ、このl(、N Aヒ
プリド化分析を上記と同様に反復しまた。この分析にお
いて116々のクローンM3−2−32は約6800C
pmのII、2活性を示した。
A ′fr:単離し、lnI製し、そしてこれをニト
ロセルロースフィルタに結合式せ、このl(、N Aヒ
プリド化分析を上記と同様に反復しまた。この分析にお
いて116々のクローンM3−2−32は約6800C
pmのII、2活性を示した。
このクローンをイーeコリHB101(1)SV529
(Ham HI/bII、2−0 )と命名し、
ソ(DililAD I’JA分子’ff I) sv
529 (B amj(I )/hIL2−0 (r
p8V−hIL2−OJ ) と命名し、かつその
D N A挿入物をh fL2−0と命名した・この命
名法は、クローンおよび組換1)NA分子がBamHI
部位にh 1L2−関連c 1)NAを含有するプラ
スミドpsV529からなることを示し、時定クローン
が最初に示されている。
(Ham HI/bII、2−0 )と命名し、
ソ(DililAD I’JA分子’ff I) sv
529 (B amj(I )/hIL2−0 (r
p8V−hIL2−OJ ) と命名し、かつその
D N A挿入物をh fL2−0と命名した・この命
名法は、クローンおよび組換1)NA分子がBamHI
部位にh 1L2−関連c 1)NAを含有するプラ
スミドpsV529からなることを示し、時定クローン
が最初に示されている。
同定
上記のように単離したp8V−hiL2−[]を使用し
て、群]vi2およびM3のc 1)NAから予め調製
したクローンを集落ヒブリド化によって選別した〔エム
・グルンスタインおよびディー・ニス・ホグイ、ス、「
1(定遺伝子伊3むクローン化D r4 Aり単i71
法」、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ−舎サ
イエンス・U SA、 紀72巷、第3961−65貝
(1975))。この方法は、I) S V −h I
L 2−0 カbイ’tfN’;aiLfc放射性試
料をニトロセルロースフィルタに固定された溶し亘i+
111a集落のD N Aに対しヒプリド化させ゛C関
連コロニーを迅速に同定することをiiJ’能にする。
て、群]vi2およびM3のc 1)NAから予め調製
したクローンを集落ヒブリド化によって選別した〔エム
・グルンスタインおよびディー・ニス・ホグイ、ス、「
1(定遺伝子伊3むクローン化D r4 Aり単i71
法」、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ−舎サ
イエンス・U SA、 紀72巷、第3961−65貝
(1975))。この方法は、I) S V −h I
L 2−0 カbイ’tfN’;aiLfc放射性試
料をニトロセルロースフィルタに固定された溶し亘i+
111a集落のD N Aに対しヒプリド化させ゛C関
連コロニーを迅速に同定することをiiJ’能にする。
上記のように、微少測定板に集めたクローンk l”J
様2 寸法のニトロセルロースシー)(0,45μm
の孔直山、シュライビヤ−2よびシュエルまたはミリボ
ア社)で復製したが、これらノートはθl″、剤を除去
するため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニシ
リン(100μP/d)を含有するLB寒天板の上に置
いた。細菌集落を37℃にで1晩増夕1αさぜた。ニト
ロセルロースシート上の細菌の浴閑およびI]定を、0
.5NNa())I (約7分間2回)とIM)リス−
Hct(pH7,5)(約7分)と0.5M+−リス−
HCt(1)i(7,5)および1.5八4 NaCL
(約7分)と、2x S、]C(Oy15 M Na
C1,0,015Mクエン服ナトリウム(pH7,2)
(約7分)とで順次に況イナすることに上り行〃つた。
様2 寸法のニトロセルロースシー)(0,45μm
の孔直山、シュライビヤ−2よびシュエルまたはミリボ
ア社)で復製したが、これらノートはθl″、剤を除去
するため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニシ
リン(100μP/d)を含有するLB寒天板の上に置
いた。細菌集落を37℃にで1晩増夕1αさぜた。ニト
ロセルロースシート上の細菌の浴閑およびI]定を、0
.5NNa())I (約7分間2回)とIM)リス−
Hct(pH7,5)(約7分)と0.5M+−リス−
HCt(1)i(7,5)および1.5八4 NaCL
(約7分)と、2x S、]C(Oy15 M Na
C1,0,015Mクエン服ナトリウム(pH7,2)
(約7分)とで順次に況イナすることに上り行〃つた。
エタノールで元号洗浄しかつ風乾した俵、これらシート
を減圧下で80℃にて2時間焼成し、室温で貯蔵した・ 挿入DNk h I L 2−0ilji片ttc4
異的なf(infiiJ限断片を、集落ヒプリド化に対
する試料として使用した。この断片(450塩基対)を
、pbv−h j、L2−0 ノffll1f VJE
JT生成物(7)4%ポリアクリルアミドゲルにおける
7q気泳向で4”74 Mした。、DNi’−バンドを
臭化エチジウムで染色した後、特定断片を俗用させ、そ
して残留する臭化エチジウムをイソアミルアルコール抽
出によつ゛C除去した。次いで、特定断片をエタノール
での沈澱により」縮(−1「ニック翻訳、JによりP
−標識し〔ビー・ダブリウ串ジエー・リグピー停、「D
1”;j AポリメラーゼIでのニック翻訳による試
験管内でのデオキシリボ核酸の高lケ異活性の標識」、
ジャーナル・モレキュラ一番バイオロジー、第113巻
、第237−251頁(19’77))、この揚台それ
ぞれdc’l’P。
を減圧下で80℃にて2時間焼成し、室温で貯蔵した・ 挿入DNk h I L 2−0ilji片ttc4
異的なf(infiiJ限断片を、集落ヒプリド化に対
する試料として使用した。この断片(450塩基対)を
、pbv−h j、L2−0 ノffll1f VJE
JT生成物(7)4%ポリアクリルアミドゲルにおける
7q気泳向で4”74 Mした。、DNi’−バンドを
臭化エチジウムで染色した後、特定断片を俗用させ、そ
して残留する臭化エチジウムをイソアミルアルコール抽
出によつ゛C除去した。次いで、特定断片をエタノール
での沈澱により」縮(−1「ニック翻訳、JによりP
−標識し〔ビー・ダブリウ串ジエー・リグピー停、「D
1”;j AポリメラーゼIでのニック翻訳による試
験管内でのデオキシリボ核酸の高lケ異活性の標識」、
ジャーナル・モレキュラ一番バイオロジー、第113巻
、第237−251頁(19’77))、この揚台それ
ぞれdc’l’P。
d TTI’およびdGTPを4OOμMで2.5μを
含有し、かつ1100pのα−ATP (アメルシャム
社、2000Ci/mM )と2.5単位の1)NA−
ポリメラーゼI(ベーリンガー社)とを含有する 50
μtの50mM)リス−HCL(pH7,A )と10
mM MgCl2 と20rnMβ−メルカグトエタ
ノールにおいて15℃にて45分間培養した。未反応の
デオキ7ヌクレオシド三燐酸ヲ、セファデックスG−7
5カラムにおけるTE緩衝剤でのゲル濾過によって除去
した・高度にP −標識された1) N Aを0.1容
量の2M酢酸ナトリウム(pH5,1)と2.5容量の
エタノールとにより20′Cにて沈澱させた。
含有し、かつ1100pのα−ATP (アメルシャム
社、2000Ci/mM )と2.5単位の1)NA−
ポリメラーゼI(ベーリンガー社)とを含有する 50
μtの50mM)リス−HCL(pH7,A )と10
mM MgCl2 と20rnMβ−メルカグトエタ
ノールにおいて15℃にて45分間培養した。未反応の
デオキ7ヌクレオシド三燐酸ヲ、セファデックスG−7
5カラムにおけるTE緩衝剤でのゲル濾過によって除去
した・高度にP −標識された1) N Aを0.1容
量の2M酢酸ナトリウム(pH5,1)と2.5容量の
エタノールとにより20′Cにて沈澱させた。
フィルタ含浸されたDNAに対する上記試料のヒプリド
化を行なった〔これはディー・ハナハンおよびエム・メ
セルンンにより、[高集落密夏におけるゲラスミトポ別
」、ジーン誌、錆104、第63−67μ(1980)
に53質的に記載されている〕。上記し7′cように調
製したフィルタ金0.1%フィコール、0.1%ポリビ
ニルピロリドン、0.1%牛血清アルブミン、0.15
へ41”JaCt、 0.03M ) リス−HC
4(pH8)、1 mfVI E D ’J’ Aにお
いて68℃にて2時間予備培養し、次いで0.02%ノ
イコール、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02
%牛血清アルブミン、0.75Ai NaC1,D、
15fJ トリス−HCL (pH8)、5 m M
ED ’l’ Aおよび0.5% SDSにて洗浄
した。上記洗7p浴液と同一の? hLでヒプリド化f
!:68℃にて進行させ、この場合使用VC先立ち10
0℃にて5分間変性したP52標識試料を使用した。ヒ
プリド化したフィルタfOjM NaC1,0,06M
)リス−HCt (pH83、2m M g
D T A &<こて 68 ℃で2 her’
ll1i32回洗浄した後、風乾しかつ放射線分析し
た。
化を行なった〔これはディー・ハナハンおよびエム・メ
セルンンにより、[高集落密夏におけるゲラスミトポ別
」、ジーン誌、錆104、第63−67μ(1980)
に53質的に記載されている〕。上記し7′cように調
製したフィルタ金0.1%フィコール、0.1%ポリビ
ニルピロリドン、0.1%牛血清アルブミン、0.15
へ41”JaCt、 0.03M ) リス−HC
4(pH8)、1 mfVI E D ’J’ Aにお
いて68℃にて2時間予備培養し、次いで0.02%ノ
イコール、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02
%牛血清アルブミン、0.75Ai NaC1,D、
15fJ トリス−HCL (pH8)、5 m M
ED ’l’ Aおよび0.5% SDSにて洗浄
した。上記洗7p浴液と同一の? hLでヒプリド化f
!:68℃にて進行させ、この場合使用VC先立ち10
0℃にて5分間変性したP52標識試料を使用した。ヒ
プリド化したフィルタfOjM NaC1,0,06M
)リス−HCt (pH83、2m M g
D T A &<こて 68 ℃で2 her’
ll1i32回洗浄した後、風乾しかつ放射線分析し
た。
cDI寸Aフラクンヨン1v12から生じ7と約160
0個のクローンとcDNAフラクションM3から生じた
1050個のクローンとを選別した。この集落ヒプリド
化選別の結果、IL2試料に強力にヒブリド化したフラ
クションM3 cl)NAから生ずる1個の集落を同
定した。フラクションM3からのこのクローンをpsV
−hlL2−1と命名した。これは1(NA選択分析に
おいて予め陽性であったM6−6群から生じたものであ
る。
0個のクローンとcDNAフラクションM3から生じた
1050個のクローンとを選別した。この集落ヒプリド
化選別の結果、IL2試料に強力にヒブリド化したフラ
クションM3 cl)NAから生ずる1個の集落を同
定した。フラクションM3からのこのクローンをpsV
−hlL2−1と命名した。これは1(NA選択分析に
おいて予め陽性であったM6−6群から生じたものであ
る。
1)NA挿入物hlL2−1は約230 bpを示した
(そのG/C末端を含む)。この挿入物はhJL2−0
の内部Hinf断片とヒプリド化するので、この挿入物
は内部ニックでdG末端処理されたda cl)NA
分子を挿入することにより生じたものと思われる。
(そのG/C末端を含む)。この挿入物はhJL2−0
の内部Hinf断片とヒプリド化するので、この挿入物
は内部ニックでdG末端処理されたda cl)NA
分子を挿入することにより生じたものと思われる。
勿論、上記のようにhiL2−0挿入1)NAまたはそ
の挿入物を使用して同定されたクローンのその他のDN
A挿入物を用いるクローン選別のこの方法は組換1)N
A技術、合成、天然源またはその組合せから生ずるDN
A配列を含有するその他のクローン、或いは単一もしく
は複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突然変
異による上記L)NA配列のいずれかに関連したDNA
配列を含むクローンについても同等に使用することがで
きる。したがって、この種の1)NA配列およびその同
定も本発明の範囲内に入る。さらに、上記1)NA配列
によル選別されないが、ヌクレオチド配列の結果として
上記DNA配列によシ暗号化されたポリペプチドを暗号
化するようなりNA配列も本発明の範囲内に入ると了解
すべきである。
の挿入物を使用して同定されたクローンのその他のDN
A挿入物を用いるクローン選別のこの方法は組換1)N
A技術、合成、天然源またはその組合せから生ずるDN
A配列を含有するその他のクローン、或いは単一もしく
は複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突然変
異による上記L)NA配列のいずれかに関連したDNA
配列を含むクローンについても同等に使用することがで
きる。したがって、この種の1)NA配列およびその同
定も本発明の範囲内に入る。さらに、上記1)NA配列
によル選別されないが、ヌクレオチド配列の結果として
上記DNA配列によシ暗号化されたポリペプチドを暗号
化するようなりNA配列も本発明の範囲内に入ると了解
すべきである。
さらに、ひとインタロイキン2を暗号化する1)NA配
列とねずみ、豚、にわとシ、牛または犬のようなひと以
外の原料から得られるLL2を暗号化するDNA配列と
の間には同質性が予想されるので、本発明のDNA配列
はこれらのひと以外のインタロイキン2を暗号化する1
)NAの選択において、および免疫治療剤および方法に
使用するためのひと以外のインタロイキンのクローン化
および発現において有用である。最後に、本発明の13
r4 A配列゛チたはそれから調髪?かつ誘導される
オリゴヌクレオテドヲ1更用して、インタロイキン2で
はないインタロイキン1列連のポリペプチドを暗号化す
るその他の1)NA配列を選択することもできる。これ
らの配列およびポリペプチドも本発明の1部である。
列とねずみ、豚、にわとシ、牛または犬のようなひと以
外の原料から得られるLL2を暗号化するDNA配列と
の間には同質性が予想されるので、本発明のDNA配列
はこれらのひと以外のインタロイキン2を暗号化する1
)NAの選択において、および免疫治療剤および方法に
使用するためのひと以外のインタロイキンのクローン化
および発現において有用である。最後に、本発明の13
r4 A配列゛チたはそれから調髪?かつ誘導される
オリゴヌクレオテドヲ1更用して、インタロイキン2で
はないインタロイキン1列連のポリペプチドを暗号化す
るその他の1)NA配列を選択することもできる。これ
らの配列およびポリペプチドも本発明の1部である。
bti、2−関連の挿入1)NAを含イ1するプラスミ
ドで形質転換するためのアフリカ産緑猿(A)’8)の
痔臓細紹を調製するため、これら細胞をデュルベツコの
改変イーグル最小培地(「Dr’viEJ ) (ギプ
コ社)に^li持した。この培地1d1()%新生中の
血清(ギプコ社)と1が当り100単位のペニシリンと
1ml当9100μyのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、DH,AE−デキストラン改変法分
用いてプラスミド1)NAによシ形質転換させた。
ドで形質転換するためのアフリカ産緑猿(A)’8)の
痔臓細紹を調製するため、これら細胞をデュルベツコの
改変イーグル最小培地(「Dr’viEJ ) (ギプ
コ社)に^li持した。この培地1d1()%新生中の
血清(ギプコ社)と1が当り100単位のペニシリンと
1ml当9100μyのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、DH,AE−デキストラン改変法分
用いてプラスミド1)NAによシ形質転換させた。
次の工程を行なった:細胞の単一層をトリプシン−E
D ’1’ Aにより約1時間徹底的に処理し、次いで
10%の新生中血清を含有するDiViEにおいて17
間の穴(1枚の板当り24穴、コスタ−社)に分散させ
た。24時間ソご、こR’Lらの細胞をHEPijs緩
衝最小必須培地で2回洗浄し、そし゛Cプラスミド1)
NA(12μtのFll−)JEPnS 緩衝液中に
約1〜10μり/μtで溶解) k 500 fit/
mlのDEAE−デキストラン(ファルマシア社)を含
有する120μtのD iVL Bに加えた。この混合
物を次いで細胞の単−Jgdへ7fJ30〜60分間か
け−C加えた〔ジエー・エッチ・マツクチャンおよびジ
エー・ニス・パガノ、「ジエチルアミンエテル−デキス
トランによる猿ウィルス40デオキシリボ核酸の感染性
の促進」、ジャーナル・ナショナル・カンサーーインス
チチュート、紀41巻、第351−57頁(1978)
;ジー拳チューおよびビー拳ニー・シャープ、[懸濁物
における細胞のS■4(3DNA形質転換二T−抗原の
転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第13巻、第
197−202頁(1981)J。これら細胞をDME
で3回洗浄した後、新鮮な培地CDi〜IE+10%牛
血清+100μf/rnlペニシリン および100μ
f/dストレプトマイシン)を加えそして細胞培養物を
C(J2培養器において37℃で72時間培養した。
D ’1’ Aにより約1時間徹底的に処理し、次いで
10%の新生中血清を含有するDiViEにおいて17
間の穴(1枚の板当り24穴、コスタ−社)に分散させ
た。24時間ソご、こR’Lらの細胞をHEPijs緩
衝最小必須培地で2回洗浄し、そし゛Cプラスミド1)
NA(12μtのFll−)JEPnS 緩衝液中に
約1〜10μり/μtで溶解) k 500 fit/
mlのDEAE−デキストラン(ファルマシア社)を含
有する120μtのD iVL Bに加えた。この混合
物を次いで細胞の単−Jgdへ7fJ30〜60分間か
け−C加えた〔ジエー・エッチ・マツクチャンおよびジ
エー・ニス・パガノ、「ジエチルアミンエテル−デキス
トランによる猿ウィルス40デオキシリボ核酸の感染性
の促進」、ジャーナル・ナショナル・カンサーーインス
チチュート、紀41巻、第351−57頁(1978)
;ジー拳チューおよびビー拳ニー・シャープ、[懸濁物
における細胞のS■4(3DNA形質転換二T−抗原の
転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第13巻、第
197−202頁(1981)J。これら細胞をDME
で3回洗浄した後、新鮮な培地CDi〜IE+10%牛
血清+100μf/rnlペニシリン および100μ
f/dストレプトマイシン)を加えそして細胞培養物を
C(J2培養器において37℃で72時間培養した。
形質転換に使用したプラスミドDNAはりゾチームー洗
剤の溶菌によりイー・コリI(B101(pSV−hl
l2−0 )集落カラ調4i11.、臭化エチジウムの
存在下におけるCsC1勾配での同密度遠心分離によっ
て精製した〔エム・カーノ等、「プラスミドCot E
lから誘導されたプラスミドクローン化ベヒクル」、メ
ソッド・イン・エンチモロジー、468巻、Q換DNA
(アール・ウー編)、第268−280頁(1979)
に実質的に記載されている〕。
剤の溶菌によりイー・コリI(B101(pSV−hl
l2−0 )集落カラ調4i11.、臭化エチジウムの
存在下におけるCsC1勾配での同密度遠心分離によっ
て精製した〔エム・カーノ等、「プラスミドCot E
lから誘導されたプラスミドクローン化ベヒクル」、メ
ソッド・イン・エンチモロジー、468巻、Q換DNA
(アール・ウー編)、第268−280頁(1979)
に実質的に記載されている〕。
72時間培養した後、上a液(1/?/)を形質転換2
110胞から除去し、そしてこれを慣用の■L2分析に
使用して、上澄液における生物学的活性なhIi、2−
関連ポリペプチドの存在をdlり足した(上記)。
110胞から除去し、そしてこれを慣用の■L2分析に
使用して、上澄液における生物学的活性なhIi、2−
関連ポリペプチドの存在をdlり足した(上記)。
/a−ypsV−hll2−0 からのIL2活性の発
現は何ら観察されなかった。その後のD J’4 A配
列決定(下記)が示すところでは、このクローンのL)
NA挿入物hfL2−0はその5末端に2いて不完全で
あり、開始信号を含まない。■ * hIi2−0の5末端における長欠ヌクレオチド
の数を確定するため、短かい(63bp)制限断片を単
離した。5標識し、ストランド分離し、そして誘発1j
キ細胞からn4+られたポリA”RNAヘヒブリド化し
た後に逆転写酵素により延長化した。変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上でのcDNk生成物の分析は約210ヌ
クレオチドのバンドを示した。この分析から、b I
L 2−0は全長さのIL2mRINAよシも約110
個のヌクレオチドだけ短かいと推定された。
現は何ら観察されなかった。その後のD J’4 A配
列決定(下記)が示すところでは、このクローンのL)
NA挿入物hfL2−0はその5末端に2いて不完全で
あり、開始信号を含まない。■ * hIi2−0の5末端における長欠ヌクレオチド
の数を確定するため、短かい(63bp)制限断片を単
離した。5標識し、ストランド分離し、そして誘発1j
キ細胞からn4+られたポリA”RNAヘヒブリド化し
た後に逆転写酵素により延長化した。変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上でのcDNk生成物の分析は約210ヌ
クレオチドのバンドを示した。この分析から、b I
L 2−0は全長さのIL2mRINAよシも約110
個のヌクレオチドだけ短かいと推定された。
ここで防用した発現ベクターは開始信号を与えない。し
たがって、いかなるhIL2元現も。
たがって、いかなるhIL2元現も。
h IJL、2−0のみを使用するこの発現系において
期待することができなかった。しかしながら、D N
A g入物、b I L 2−0を使用して存在するク
ローンから、或いは工L2の完全陪号化配列を持たない
もしくはhIi2−oの配列と組合せるための配列の喪
失部分を供給するような他のクローンまたは染色体から
、その他のクローンを選択しイυることを了解すべきで
ある。この種の選択技術は上記に記載され、これを以下
に例示する6hIh2に対する完全暗号化配列ケ・汀す
るクローンを同定した後、この配列を使用して猿細胞忙
上記のように形質転換させ、或いはその他の適当な宿主
を形質転換させて。
期待することができなかった。しかしながら、D N
A g入物、b I L 2−0を使用して存在するク
ローンから、或いは工L2の完全陪号化配列を持たない
もしくはhIi2−oの配列と組合せるための配列の喪
失部分を供給するような他のクローンまたは染色体から
、その他のクローンを選択しイυることを了解すべきで
ある。この種の選択技術は上記に記載され、これを以下
に例示する6hIh2に対する完全暗号化配列ケ・汀す
るクローンを同定した後、この配列を使用して猿細胞忙
上記のように形質転換させ、或いはその他の適当な宿主
を形質転換させて。
h■L2様ポリペプチドを生成させることができる6さ
らに、このhIi2−0配列を常法にj リA T G
開始コドンと組合せて、成熟り工L2を暗号化するその
配列またはその部分?:発現させることができる。
らに、このhIi2−0配列を常法にj リA T G
開始コドンと組合せて、成熟り工L2を暗号化するその
配列またはその部分?:発現させることができる。
第5図は、hIi2−ODNA配列を使用し゛rhiL
2i生成する幾つかの作成を示している。これらの作成
においては、先ずpSV−h l L 2−0 ノBa
m Hl −Ham f(I断片を単離した。これは第
4図に示したヌクレオチド配列を有する断片(hIi2
−0)である(ただし、下線金施こした部分ヶ除く)。
2i生成する幾つかの作成を示している。これらの作成
においては、先ずpSV−h l L 2−0 ノBa
m Hl −Ham f(I断片を単離した。これは第
4図に示したヌクレオチド配列を有する断片(hIi2
−0)である(ただし、下線金施こした部分ヶ除く)。
操作を単純化するため、先ずこの断片をpA’l”15
3にサブクローン化しく第5図)1次いで1υられたh
ll、2−0暗号化配列ケ含有するプラスミドpAT1
53をHg1A1によって線状化させ、T aポリメラ
ーゼにより3′末端を除去し、次いでHam l(+に
より線状1) I’J Aを制限してh fL2含有の
断片を単1〜[1t、、この113片の5末端FiCC
T (第4図に示される第3のアミノ酸に対するコドン
)で始−チリ、またその3末端はh I L 2IP、
f号化領域の末端を越える(第4図)。この断片をhI
i21と命名した。
3にサブクローン化しく第5図)1次いで1υられたh
ll、2−0暗号化配列ケ含有するプラスミドpAT1
53をHg1A1によって線状化させ、T aポリメラ
ーゼにより3′末端を除去し、次いでHam l(+に
より線状1) I’J Aを制限してh fL2含有の
断片を単1〜[1t、、この113片の5末端FiCC
T (第4図に示される第3のアミノ酸に対するコドン
)で始−チリ、またその3末端はh I L 2IP、
f号化領域の末端を越える(第4図)。この断片をhI
i21と命名した。
1)NA配列111 L 21はPro(ia図に示し
たb I L 2−0配列の第3のアミノ酸)で始まる
蛋白質を暗号化するので、この配列の1AE2のアミノ
酸(Ata )をも暗号化する1) N A配列を調製
することに決定した。” ■ 成@hlL2はこのアラニンで始まる。
たb I L 2−0配列の第3のアミノ酸)で始まる
蛋白質を暗号化するので、この配列の1AE2のアミノ
酸(Ata )をも暗号化する1) N A配列を調製
することに決定した。” ■ 成@hlL2はこのアラニンで始まる。
この作成を行なうため、先ずho、21断片をpAT1
53から調製した断片へ結合させ、その際このプラスミ
ドをNar I (GG CGCC)により線状化し
、末端に1)NAポリメラーゼI(フレ/ −) (B
anI部位をも形成する)を充填し、かつ線状断片をB
am HIで制限した。
53から調製した断片へ結合させ、その際このプラスミ
ドをNar I (GG CGCC)により線状化し
、末端に1)NAポリメラーゼI(フレ/ −) (B
anI部位をも形成する)を充填し、かつ線状断片をB
am HIで制限した。
得られたプラスミド、すなわち第5図においてpAT1
53(hiL2B) は結合部に次の配列を有する: GGCGOCT・・・ Pr。
53(hiL2B) は結合部に次の配列を有する: GGCGOCT・・・ Pr。
次いで、このプラスミドをBanIで線状化し、5末端
にIJNAポリメラーゼ■(クレノー)を充填し、そし
てこの線状プラスミドをBam1(Iで制限した。倚ら
れたhIi、2含有の断片をhIL201と命名した。
にIJNAポリメラーゼ■(クレノー)を充填し、そし
てこの線状プラスミドをBam1(Iで制限した。倚ら
れたhIi、2含有の断片をhIL201と命名した。
その5′末端はGCGOCT(Ala −k’roを暗
号化する)で始′まり、その3′末端はBam H1部
位であって、hii、2暗号化配列の末端を越える。次
いで、これら断片を、A ’I’ G 1’A 始コド
ンに隣接し、かつプロモー1およびリポソーム結合部位
の下流に存在する種々の発現ベクター中へ挿入した。こ
の種の作成により、アミン末端としてそれぞれMet−
1’ro−Thrまたは1Jet−Ala−Pro−’
I’hrを有するhlL2関連の生成物が得ら7’した
。
号化する)で始′まり、その3′末端はBam H1部
位であって、hii、2暗号化配列の末端を越える。次
いで、これら断片を、A ’I’ G 1’A 始コド
ンに隣接し、かつプロモー1およびリポソーム結合部位
の下流に存在する種々の発現ベクター中へ挿入した。こ
の種の作成により、アミン末端としてそれぞれMet−
1’ro−Thrまたは1Jet−Ala−Pro−’
I’hrを有するhlL2関連の生成物が得ら7’した
。
上記の配列を発現ベクターpPLcIJu299(ゲー
リープエルの寄贈による)中へ挿入した。
リープエルの寄贈による)中へ挿入した。
このベクターはファージMu■から得られるPLプロモ
ータとリポソーム結合部位とを含有する。
ータとリポソーム結合部位とを含有する。
これはさらに、菱遠■部位< CCATGG)の一部で
あるATG開始コドンと、さらに下流の独特なりarn
H1部位とを・特徴とする。
あるATG開始コドンと、さらに下流の独特なりarn
H1部位とを・特徴とする。
■ このベクターはpPLc236からイqられた〔イ
ー・レモート等、「コリファージλのPLプロモータに
より制御される高効率発現に対するプラスミドベクター
」、ジーンd 、a 81−93頁(1981))。こ
れら配列を含有する微生物およびプラスミドは、198
2年8月16 B付tj”C’AT CCi託番号39
173としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託した。この培養物は入手し得ると同時に、
後記する培養物も入手することができる。
ー・レモート等、「コリファージλのPLプロモータに
より制御される高効率発現に対するプラスミドベクター
」、ジーンd 、a 81−93頁(1981))。こ
れら配列を含有する微生物およびプラスミドは、198
2年8月16 B付tj”C’AT CCi託番号39
173としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託した。この培養物は入手し得ると同時に、
後記する培養物も入手することができる。
したがって、pPLcMu299をNcolによって線
状化し、5末端に1)NAポリメラーゼ■(クレノー断
片)を全ての4つのdNTPの存在下に充填し、かつさ
らに線状DNAをBam)IIにより切断した。アガロ
ースゲル上で精製した後、線状化したpPLcMu29
9を上記のhlL2含有断片と結合させ、そして得られ
たプラスミドp)’LcMu−hjL21 およびpf
’Lct4u −h IL201を、挿入されたhiL
2含有断片に基づいて命名した・構造pPLcMu−h
fL21の結合部における1)NAA配列次の通りであ
る: TTAGGAGGGT’、[’T’I”1’ACCAT
GCCT・Φ・S、D、 MetPro
***構造pPLcMu−hLL201の結合部におけ
るD N A配列は次の通りである: ’l”1’AGGAGIJGTT’l”TTACCAT
GGCGCC’l’ 、 。
状化し、5末端に1)NAポリメラーゼ■(クレノー断
片)を全ての4つのdNTPの存在下に充填し、かつさ
らに線状DNAをBam)IIにより切断した。アガロ
ースゲル上で精製した後、線状化したpPLcMu29
9を上記のhlL2含有断片と結合させ、そして得られ
たプラスミドp)’LcMu−hjL21 およびpf
’Lct4u −h IL201を、挿入されたhiL
2含有断片に基づいて命名した・構造pPLcMu−h
fL21の結合部における1)NAA配列次の通りであ
る: TTAGGAGGGT’、[’T’I”1’ACCAT
GCCT・Φ・S、D、 MetPro
***構造pPLcMu−hLL201の結合部におけ
るD N A配列は次の通りである: ’l”1’AGGAGIJGTT’l”TTACCAT
GGCGCC’l’ 、 。
S 、D、 1Vfe tAl aP
ro a aさらに、pPLMu−hIL21 の
第1馨造、ファージMuからのリポソーム結合部位およ
びPLプロモータ′t−特徴とする第2のプラスミドを
、pPLcMu−hLL21 の初期領域をpPLc
28の領域で交換することにより作成した〔イーーレモ
ート等、上記〕。このより小さいプラスミドをpPLc
Mu−hlL22 と命名した(第5図)。
ro a aさらに、pPLMu−hIL21 の
第1馨造、ファージMuからのリポソーム結合部位およ
びPLプロモータ′t−特徴とする第2のプラスミドを
、pPLcMu−hLL21 の初期領域をpPLc
28の領域で交換することにより作成した〔イーーレモ
ート等、上記〕。このより小さいプラスミドをpPLc
Mu−hlL22 と命名した(第5図)。
次いで、イー・コリに12ΔHIΔtrpをこれら発現
ベクターのそれぞれで形質転換し、得られた培養物を4
2℃で6時間誘発させた0次いで、煮沸8D8中で細菌
を破壊することにより細菌抽出物を作成し、この抽出物
をSDSポリアクリルアミドで分析した(セルバブル−
で染色)。3つの抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に
約15にの新たな蛋白質バンドが存在した。
ベクターのそれぞれで形質転換し、得られた培養物を4
2℃で6時間誘発させた0次いで、煮沸8D8中で細菌
を破壊することにより細菌抽出物を作成し、この抽出物
をSDSポリアクリルアミドで分析した(セルバブル−
で染色)。3つの抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に
約15にの新たな蛋白質バンドが存在した。
しかし、このバンドは28℃で生育させた形質転換細胞
からの抽出物には存在しなかった。
からの抽出物には存在しなかった。
15にの蛋白質は全細胞蛋白質の約5−10%であると
推定された。
推定された。
さらに上記したH5−チミジン組込み分析により、これ
ら形質転換宿主から作成された透明な抽出物のh jL
2生物学的活性を分析した。この分析において、培養か
つ誘発した細胞を洗剤の不存在下で音波処理により開裂
させ、細胞残骸を30000Fで遠心分離し、上溌液を
0.2μのミリポアフィルタを通して清澄させた。この
分析の結果を下記第■表に示す。
ら形質転換宿主から作成された透明な抽出物のh jL
2生物学的活性を分析した。この分析において、培養か
つ誘発した細胞を洗剤の不存在下で音波処理により開裂
させ、細胞残骸を30000Fで遠心分離し、上溌液を
0.2μのミリポアフィルタを通して清澄させた。この
分析の結果を下記第■表に示す。
第■表
H目2標準 100
Hi12 + 25% 比較抽出物 Z。
H目2 +2.5% 比較抽出物 81pP
Lctviu−hJh21 (28℃)〈1pPL
cMu−hZL21 (12℃)25pPLcMu
−hIL22 (28℃)<1pPLcMu−hl
h22 (42℃) 130p)’LcMu−
hlL2[11(28℃)<1pPLcMu−hIL2
01 (12℃) 850■ これらの分析は、
h IL2の大部分がペレット中に残留する/とめ、形
質転換宿主で生成される蛋白質の全量に関1−1定性的
でしかない。したがって、透明抽出物中に存在するhl
L2の量はhfL2の全細菌合成に対し何らの関係もな
い。
Lctviu−hJh21 (28℃)〈1pPL
cMu−hZL21 (12℃)25pPLcMu
−hIL22 (28℃)<1pPLcMu−hl
h22 (42℃) 130p)’LcMu−
hlL2[11(28℃)<1pPLcMu−hIL2
01 (12℃) 850■ これらの分析は、
h IL2の大部分がペレット中に残留する/とめ、形
質転換宿主で生成される蛋白質の全量に関1−1定性的
でしかない。したがって、透明抽出物中に存在するhl
L2の量はhfL2の全細菌合成に対し何らの関係もな
い。
次いで、上記のhIL2配列を発現ベクターpTrp3
21 (ゲーリープエルの寄贈)に挿入した。このベク
ターはTrp減衰領域から侍られる’l’rpプロモー
タとリポソーム結合部位とを含有する。ベクタ一部分は
実質的にpHi(322であり、開始ATGコドンはN
coI部位の部分であり、かつ独特なりam)(I部位
が存在する。
21 (ゲーリープエルの寄贈)に挿入した。このベク
ターはTrp減衰領域から侍られる’l’rpプロモー
タとリポソーム結合部位とを含有する。ベクタ一部分は
実質的にpHi(322であり、開始ATGコドンはN
coI部位の部分であり、かつ独特なりam)(I部位
が存在する。
したがつ°C1上記(alの項に記載したと同じ作成技
術にしたがって、hlL2配列を含有するプラスミドを
作成した。これらのプラスミドを、使用したh IL2
含有断片に基づいて、pTrp−hlL21およびpT
rp−hjL201と命名 ゛した・構造pTrp−
hiL21の結合部に赴ける1)NA配列は次の通りで
ある: AAAGGGTA’l”CUAT’l’CCATGCC
T −、。
術にしたがって、hlL2配列を含有するプラスミドを
作成した。これらのプラスミドを、使用したh IL2
含有断片に基づいて、pTrp−hlL21およびpT
rp−hjL201と命名 ゛した・構造pTrp−
hiL21の結合部に赴ける1)NA配列は次の通りで
ある: AAAGGGTA’l”CUAT’l’CCATGCC
T −、。
S、D−Me tJP ro ++ * e構造pT
rp−hIL201 の結合部におけるDNA配列は
次の通りである: 、AAA、GUGTA’I’CGA’I”I’CCAT
GGCGCCT−−−MetAlaPro−−。
rp−hIL201 の結合部におけるDNA配列は
次の通りである: 、AAA、GUGTA’I’CGA’I”I’CCAT
GGCGCCT−−−MetAlaPro−−。
次いで、イーφコリに514λをp T r p −h
LL21およびpTrp−h)L201で形質転換させ
、そし°にれら形質転換fa主をトリプトファン欠乏に
よって37℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞内
に151(の蛋白質バンドが観察された。予想通り、こ
のバンドは誘発しない細胞には存在しなかった。ここで
も、ひとインタロイキン2の活性の誘発合成のレベルは
全細胞蛋白質の5−10%であった。
LL21およびpTrp−h)L201で形質転換させ
、そし°にれら形質転換fa主をトリプトファン欠乏に
よって37℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞内
に151(の蛋白質バンドが観察された。予想通り、こ
のバンドは誘発しない細胞には存在しなかった。ここで
も、ひとインタロイキン2の活性の誘発合成のレベルは
全細胞蛋白質の5−10%であった。
さらに、洗剤の不存在下で音波処理により誘発培養物の
細胞を開裂させ、IvI[胞残骸を300002にて遠
心分離し、かつ上澄7(Lko、2μのミリポアフィル
タに通した後、生物学的活性につき分析した。これら分
析の結果全第N表に示す。
細胞を開裂させ、IvI[胞残骸を300002にて遠
心分離し、かつ上澄7(Lko、2μのミリポアフィル
タに通した後、生物学的活性につき分析した。これら分
析の結果全第N表に示す。
第璽表
a;i 2標準 100
Hi12 + 25%比較抽出物 70H11
2+2.5%比較抽出物 81pTrp 32
1 <1pTrp−h(L21
(誘発) 2100pi”rp−hlh20
1 (誘発) 3800■ ここでも、これ
らの結果はhiL2活性の大部分が未分析のペレット中
に残任して、分析し、た透明抽出物には存在したいため
定性的でしかない。
2+2.5%比較抽出物 81pTrp 32
1 <1pTrp−h(L21
(誘発) 2100pi”rp−hlh20
1 (誘発) 3800■ ここでも、これ
らの結果はhiL2活性の大部分が未分析のペレット中
に残任して、分析し、た透明抽出物には存在したいため
定性的でしかない。
Icl に111菌抽出物からの生物学的活性の回収
1111/ノ培養物(pf’hcMu−hlL21
またはp ’1’ r p −h I L 21 )か
ら作成した細菌ペレットを1%8JJ8−1%β−メル
カプトエタノールを含有するラメリの屯気泳拗用緩衝液
(200μt)中に懸濁させ、そしてこの懸、蜀物を3
7℃で1時間培養し、次いで音波処理した□これら抽出
物(d[]μt ) f:、0.1%81)Sを含有1
−る15’、?i’AGE(ラメリ)に通してf4f気
泳動した後、このゲルを2間のスライスに切iノ↑し、
各ゲルスライスを微小測定板の穴に入れた。次いで、ゲ
ルスライスff:10%胎児牛血清を含有するl?、
PiJ i 16 A O培地(ストレプトマイシン
とペニシリンとを補充)で2回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で破砕し、そして200μtの培地中へ拡散させ
ることによシ3Z℃で1晩溶出した。プレートを4℃で
2時間培養した後、これを200Fにて15分間遠心分
離し、そして上澄液を前記と同僚にb I 1+ 2活
性につき分析した。
1111/ノ培養物(pf’hcMu−hlL21
またはp ’1’ r p −h I L 21 )か
ら作成した細菌ペレットを1%8JJ8−1%β−メル
カプトエタノールを含有するラメリの屯気泳拗用緩衝液
(200μt)中に懸濁させ、そしてこの懸、蜀物を3
7℃で1時間培養し、次いで音波処理した□これら抽出
物(d[]μt ) f:、0.1%81)Sを含有1
−る15’、?i’AGE(ラメリ)に通してf4f気
泳動した後、このゲルを2間のスライスに切iノ↑し、
各ゲルスライスを微小測定板の穴に入れた。次いで、ゲ
ルスライスff:10%胎児牛血清を含有するl?、
PiJ i 16 A O培地(ストレプトマイシン
とペニシリンとを補充)で2回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で破砕し、そして200μtの培地中へ拡散させ
ることによシ3Z℃で1晩溶出した。プレートを4℃で
2時間培養した後、これを200Fにて15分間遠心分
離し、そして上澄液を前記と同僚にb I 1+ 2活
性につき分析した。
この分析の結果、細菌抽出物(pPLcMu−hlL2
1またはpTrp−bjL21 )のhiL2生物学活
性は、形質転換細胞の誘発の際現われる15に蛋白質バ
ンドと共に移動し、かっこの生物学的活性はS JJ
S −PAGJ!iから回収され得ることが確認された
。
1またはpTrp−bjL21 )のhiL2生物学活
性は、形質転換細胞の誘発の際現われる15に蛋白質バ
ンドと共に移動し、かっこの生物学的活性はS JJ
S −PAGJ!iから回収され得ることが確認された
。
hi、L21カ連挿入1) IN Aの特性化第4図を
参照して、挿入DNノk hiL2−0の物理的地図
を、供給菓者により特定された条件下における種々の制
限酵素(二ニー・イングランド・バイオラブ社またはベ
ーリンガー社)での切Eaしこよって作成した。切断生
成物を2.2%アガロースゲルまたは6%ポリアクリル
アミドゲルにおいてAOmM トリス−HLJAC(
pH7,8)と20 tn tV E D ’11’
A T:電気泳動サセタ。
参照して、挿入DNノk hiL2−0の物理的地図
を、供給菓者により特定された条件下における種々の制
限酵素(二ニー・イングランド・バイオラブ社またはベ
ーリンガー社)での切Eaしこよって作成した。切断生
成物を2.2%アガロースゲルまたは6%ポリアクリル
アミドゲルにおいてAOmM トリス−HLJAC(
pH7,8)と20 tn tV E D ’11’
A T:電気泳動サセタ。
これらを臭化エチジウムで染色して肉眼化した後、また
は制限断片をP −ホスフェート(下記)で末端標識す
る放射線分析の後に分析し、pBIL322の詳細な物
理的地図と比較した〔ジエー・ジー〇サツトクリフ、「
大j腸菌プラスミドpi31(,322の完全ヌクレオ
チド配列」、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポ
ジウム、ml13巻、第1号、gl’; 77−90頁
(1978)J。制限地図を、これら切断パターンVこ
基づいて作成した。これらをD I’N A挿入物の配
列決定により規定した〔ニー・エム・マキサムおよびダ
プリヮ・ギルバート、「1)NAの新規な配列決定方法
」、ブローシーディグ・ナンヨナルΦアカテミー・サイ
エンス−USA=第74咎、第560−611頁(19
771の方法による〕。h If、2−0の配列は、下
記するゲノムhIL2クローンからの配列情報によって
補充した。ゲノム情報を第4図に示す。
は制限断片をP −ホスフェート(下記)で末端標識す
る放射線分析の後に分析し、pBIL322の詳細な物
理的地図と比較した〔ジエー・ジー〇サツトクリフ、「
大j腸菌プラスミドpi31(,322の完全ヌクレオ
チド配列」、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポ
ジウム、ml13巻、第1号、gl’; 77−90頁
(1978)J。制限地図を、これら切断パターンVこ
基づいて作成した。これらをD I’N A挿入物の配
列決定により規定した〔ニー・エム・マキサムおよびダ
プリヮ・ギルバート、「1)NAの新規な配列決定方法
」、ブローシーディグ・ナンヨナルΦアカテミー・サイ
エンス−USA=第74咎、第560−611頁(19
771の方法による〕。h If、2−0の配列は、下
記するゲノムhIL2クローンからの配列情報によって
補充した。ゲノム情報を第4図に示す。
プラスミドI)NAをイシニーホロビッツおよびパーク
(上記)の方法によってp8V−hfL2−0から作成
し、この方法を選別用として一群のクローンから1)N
Aを単離するために使用した。4人DNkfpsV−h
lL2−Oc7)BamH■制限によつ′C得、と几を
前記と同様に中性蔗糖濃度勾配遠心分離によって精製し
た(約740bp)。次いで、製造業者にニー・イング
ランド・バイオラブ社)によυ推奨されるように、極々
の制限酵素で制限した。
(上記)の方法によってp8V−hfL2−0から作成
し、この方法を選別用として一群のクローンから1)N
Aを単離するために使用した。4人DNkfpsV−h
lL2−Oc7)BamH■制限によつ′C得、と几を
前記と同様に中性蔗糖濃度勾配遠心分離によって精製し
た(約740bp)。次いで、製造業者にニー・イング
ランド・バイオラブ社)によυ推奨されるように、極々
の制限酵素で制限した。
制限したJJNAを、4単位のr+411菌性アルカリ
ホスファターゼと0.1%の808との存在下に65℃
にて30分間脱燐酸した。2回フェノール抽出しかつエ
タノール沈、改した後、1)I〜Aをr −P52−
A’l’P (3DOoci 7mR4)と ポリヌク
レオチドキナーゼ(P−Lバイオケミカルス社)とで5
末端柳識した。或いは、制限断片を、α−標識したP
−ヌクレオシドトリホスフェート(1000Ci/mM
)の存在下fDNAポリメラーゼ反応(クレノー断片
、ベーリンガー社)により3′末端標識した。
ホスファターゼと0.1%の808との存在下に65℃
にて30分間脱燐酸した。2回フェノール抽出しかつエ
タノール沈、改した後、1)I〜Aをr −P52−
A’l’P (3DOoci 7mR4)と ポリヌク
レオチドキナーゼ(P−Lバイオケミカルス社)とで5
末端柳識した。或いは、制限断片を、α−標識したP
−ヌクレオシドトリホスフェート(1000Ci/mM
)の存在下fDNAポリメラーゼ反応(クレノー断片
、ベーリンガー社)により3′末端標識した。
配列決定のため、標識した断片を2つの方法で処理した
。すなわち、成るものは第2の制限酵素で開裂する前に
ポリアクリルアミドゲルで精製した。他のものは第2の
制限酵素で直ちに開裂した。両者の場合、所望の断片を
ポリアクリルアミドゲル上でトリス硼酸4−El)TA
緩衝液にて分離した。第3図はA111々の制限断片1
円および正方形はそI”Lぞれ3 または5標識を示し
、矢印は配列決定の方向を乃くす)および使用した配列
決定法を示している。酵素AccI 。
。すなわち、成るものは第2の制限酵素で開裂する前に
ポリアクリルアミドゲルで精製した。他のものは第2の
制限酵素で直ちに開裂した。両者の場合、所望の断片を
ポリアクリルアミドゲル上でトリス硼酸4−El)TA
緩衝液にて分離した。第3図はA111々の制限断片1
円および正方形はそI”Lぞれ3 または5標識を示し
、矢印は配列決定の方向を乃くす)および使用した配列
決定法を示している。酵素AccI 。
加、Nロエ、肌II 、凹状El 、乃棟工。
Hpai 、 I(pM 、 K凹■・Nぜ■・N些I
・Nrul 、 PvuI 、 i’vulf
、 5acl 、 SmaI 。
・Nrul 、 PvuI 、 i’vulf
、 5acl 、 SmaI 。
5phjおよびTaq tcついては制限部位が見ら
れなかった。
れなかった。
これらhlJ7片をニー・エム・マキサムおよびダブリ
ュー・ギルバート(上記)の方法にしたがって分解した
。生成物を、独々の4度および長さのアクリルアミドゲ
ルで50mM)リス硼酸塩と1 mfVi FilJ’
l”A (pH8,3)Kテ900 V〜2000vを
用いて分別した。このようにして得られた腹合ヌクレオ
チド配列およびその対応アミノ酸配列を第4図に示す。
ュー・ギルバート(上記)の方法にしたがって分解した
。生成物を、独々の4度および長さのアクリルアミドゲ
ルで50mM)リス硼酸塩と1 mfVi FilJ’
l”A (pH8,3)Kテ900 V〜2000vを
用いて分別した。このようにして得られた腹合ヌクレオ
チド配列およびその対応アミノ酸配列を第4図に示す。
b I L 2−0に関し第4図に示した1)NA配列
は=GC末端から−9〜−14の位置にポリアデニル化
信号AATAAAを有する。これは停止信号で終端する
133個のアミノ酸を暗号化するオープン読み枠を有す
る。hlL2の分子量に基づきかつ原hil、2がグリ
コジル化されていると仮定して、成熟h■L2は100
〜130個のアミノ酸を有するであろうと予想した。し
たがって、挿入hIL2−0は成熟hiL2に苅する完
全暗号化配列を含むと伯じられるが、ブレhii、2の
抽W信号配列およびこの信号配列のA ’I’ G開始
信号のアミノ酸に対する暗号化領域の少なくとも1部を
費失していると思われる。”ここでも、これらの喪失ア
ミノ敲を暗号化するクローンを前記と同様に選択し、或
いは作成することかできる。たとえば、第4図において
、この部分はゲノムクローン(下線)からの配列情報に
よって供給さtしる。しかしながら、この配列は、これ
により形質転換された宿主におけるhIL24fiポリ
ペプチドの合成を可能にする。
は=GC末端から−9〜−14の位置にポリアデニル化
信号AATAAAを有する。これは停止信号で終端する
133個のアミノ酸を暗号化するオープン読み枠を有す
る。hlL2の分子量に基づきかつ原hil、2がグリ
コジル化されていると仮定して、成熟h■L2は100
〜130個のアミノ酸を有するであろうと予想した。し
たがって、挿入hIL2−0は成熟hiL2に苅する完
全暗号化配列を含むと伯じられるが、ブレhii、2の
抽W信号配列およびこの信号配列のA ’I’ G開始
信号のアミノ酸に対する暗号化領域の少なくとも1部を
費失していると思われる。”ここでも、これらの喪失ア
ミノ敲を暗号化するクローンを前記と同様に選択し、或
いは作成することかできる。たとえば、第4図において
、この部分はゲノムクローン(下線)からの配列情報に
よって供給さtしる。しかしながら、この配列は、これ
により形質転換された宿主におけるhIL24fiポリ
ペプチドの合成を可能にする。
≠ 推定信号ペプチドは第4図における矢印で示される
ように8erとAta との間で成熟h II、2から
開裂されると思われるのこの配列は、単〒もしくは多重
の塩基置換、削除、挿入または逆転を含む突然変異のよ
うな遺伝子に対する改変が既に遺伝子で生じていなくて
も、或いはその後に使用してその性質′またはそれから
発現はれるポリペプチドの性質を改変させなく−rもよ
いという可能性を排除するものではない。さらに、生理
学的に同じであるが、構造的には第4図に示したものと
若干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすような
任意の多形性を排除するものでもない・ 勿論、常法によりポリA I(NAから倚られ! たクローン化cl)NA(上記)は5末端ヌクレオチド
を欠如1−てい°Cも、また人工的配列を含んでいCも
よいことを了解すべきである〔アール・アイ・リチャー
ド等、「成長雛のβ−グロビンc 1)NAの分子クロ
ーン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシド・リサ
ーチ、第7巻、第1137−46頁(1979))。
ように8erとAta との間で成熟h II、2から
開裂されると思われるのこの配列は、単〒もしくは多重
の塩基置換、削除、挿入または逆転を含む突然変異のよ
うな遺伝子に対する改変が既に遺伝子で生じていなくて
も、或いはその後に使用してその性質′またはそれから
発現はれるポリペプチドの性質を改変させなく−rもよ
いという可能性を排除するものではない。さらに、生理
学的に同じであるが、構造的には第4図に示したものと
若干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすような
任意の多形性を排除するものでもない・ 勿論、常法によりポリA I(NAから倚られ! たクローン化cl)NA(上記)は5末端ヌクレオチド
を欠如1−てい°Cも、また人工的配列を含んでいCも
よいことを了解すべきである〔アール・アイ・リチャー
ド等、「成長雛のβ−グロビンc 1)NAの分子クロ
ーン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシド・リサ
ーチ、第7巻、第1137−46頁(1979))。
さらに、成熟核m RN A K L−いて、5末端か
ら最初のAUGトリプレットは、一般に蛋白質甘酸のr
cめの開始部位である〔エム・コザック、[メツセンジ
ャー1(NAlc′J、−ける開始領域を成熟核リポソ
ームはどのように選択するか」、セル誌、第15巻、第
1109−25頁(1978)J。
ら最初のAUGトリプレットは、一般に蛋白質甘酸のr
cめの開始部位である〔エム・コザック、[メツセンジ
ャー1(NAlc′J、−ける開始領域を成熟核リポソ
ームはどのように選択するか」、セル誌、第15巻、第
1109−25頁(1978)J。
勿論、5g4図に示したポリペプチドの41り造は、生
体内に2けるFJI ’f=との、itt互作用、l’
cとえはグリコジル化によってもたらされるポリペプチ
ドに対する何らの改変をも考慮に入れていない・したが
って、第4図に示したアミノ酸配列は、生体内で生成さ
れるII、2とは同一でないこともあると理解せねばな
らない。
体内に2けるFJI ’f=との、itt互作用、l’
cとえはグリコジル化によってもたらされるポリペプチ
ドに対する何らの改変をも考慮に入れていない・したが
って、第4図に示したアミノ酸配列は、生体内で生成さ
れるII、2とは同一でないこともあると理解せねばな
らない。
れかつ&ol(Jリンカによってλシャロン4Aアーム
に結合された胎児ひと染色体1) N Aの断片から得
られるヒプリドファージ金、アール・エム・ローン等に
よって作成したしセル誌、第15巻、第1157−74
頁(1978)J、同様に、±■での部分開裂により生
成されるひと染色体1)NA断片を、λA7のBam)
IJ部位にクローン化すセた〔ダフIjユ・ニー・エム
・レーネンおよびダブリュー・リュー・プランマー、ジ
ーン誌、第20巻、第249−59頁(1980);リ
ュー・デラマータ、私的通信〕、両遺伝子は前記’7J
L ウニp S V −h I L 2−0 ノP
−標識[ig■工 断片を試料として使用する(その
場での)方法によって選別した〔ダブリュー・デー−ヘ
ントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエンス
誌、第196巻、第180−82頁(1977);ティ
ー・マニアチス等、セル誌・第15巻、第687−70
1頁(1978))。
に結合された胎児ひと染色体1) N Aの断片から得
られるヒプリドファージ金、アール・エム・ローン等に
よって作成したしセル誌、第15巻、第1157−74
頁(1978)J、同様に、±■での部分開裂により生
成されるひと染色体1)NA断片を、λA7のBam)
IJ部位にクローン化すセた〔ダフIjユ・ニー・エム
・レーネンおよびダブリュー・リュー・プランマー、ジ
ーン誌、第20巻、第249−59頁(1980);リ
ュー・デラマータ、私的通信〕、両遺伝子は前記’7J
L ウニp S V −h I L 2−0 ノP
−標識[ig■工 断片を試料として使用する(その
場での)方法によって選別した〔ダブリュー・デー−ヘ
ントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエンス
誌、第196巻、第180−82頁(1977);ティ
ー・マニアチス等、セル誌・第15巻、第687−70
1頁(1978))。
ローン遺伝子の1,300,000個のプラークから2
個およびレーネン遺伝子の700,000個のプラーク
から6個のヒプリド化陽性ファージクローンを単離した
うこれらプラークを繰返し精製して、これらをそれぞれ
λCl(4A−ghih2−1.λcH4A−ghIL
2−2並びにλJl、、17−ghLl、2−1 、λ
L47−ghIL2−2 およびλI、17−ghI
L2−3 と命名した。
個およびレーネン遺伝子の700,000個のプラーク
から6個のヒプリド化陽性ファージクローンを単離した
うこれらプラークを繰返し精製して、これらをそれぞれ
λCl(4A−ghih2−1.λcH4A−ghIL
2−2並びにλJl、、17−ghLl、2−1 、λ
L47−ghIL2−2 およびλI、17−ghI
L2−3 と命名した。
第6図は、全hiL2遺伝子を有するクラークλcH4
A−ghIL2−1の=B分制限地図を示している。さ
らに、この遺伝子をpLIR250において、そtLぞ
れ2.7Kbおよび3.8に、bの2つのEcoRI断
片としてサブクローン化したランドの迅速な化学的開裂
決定全可能にする」、ヌクレイツク・アシッド・リザー
テ、第10巻、第5765−72頁(1981)J、制
限分析およびヒプリド化のデータに基づき、pLIR−
ghlh2−1/2700bp 1(,1−4Iはh
lL2の信号配列とプロモータ領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびpLHL−ghCL
2−1/3800bl)kもI−1も工の制限分析はさ
らに、hiL2af号化領域に鉱化領域iflのエクソ
ンと6個のイントロンとが存在することを示唆した。
A−ghIL2−1の=B分制限地図を示している。さ
らに、この遺伝子をpLIR250において、そtLぞ
れ2.7Kbおよび3.8に、bの2つのEcoRI断
片としてサブクローン化したランドの迅速な化学的開裂
決定全可能にする」、ヌクレイツク・アシッド・リザー
テ、第10巻、第5765−72頁(1981)J、制
限分析およびヒプリド化のデータに基づき、pLIR−
ghlh2−1/2700bp 1(,1−4Iはh
lL2の信号配列とプロモータ領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびpLHL−ghCL
2−1/3800bl)kもI−1も工の制限分析はさ
らに、hiL2af号化領域に鉱化領域iflのエクソ
ンと6個のイントロンとが存在することを示唆した。
lL2活性を暗号化する染色体遺伝子はIfiBs宿主
において発現できないこともあることを了解すべきであ
る。<rJI故なら、これらの介入配列はこの種の宿主
によって正確に処理されないことがあるからである。染
色体遺伝子は成熟核宿主におけるIL2の生産において
極めて有用であると思われ、この場合ひと非暗号化領域
、イントロンおよび暗号化領域は1高レベルの発現ふ・
よび生物学的活性な11.2への生成物の正確な処理に
対し極めて重要である。
において発現できないこともあることを了解すべきであ
る。<rJI故なら、これらの介入配列はこの種の宿主
によって正確に処理されないことがあるからである。染
色体遺伝子は成熟核宿主におけるIL2の生産において
極めて有用であると思われ、この場合ひと非暗号化領域
、イントロンおよび暗号化領域は1高レベルの発現ふ・
よび生物学的活性な11.2への生成物の正確な処理に
対し極めて重要である。
向上
蛋白質の生産レベルは3つの主要な因子により支配され
る:すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝
子コピーが転写される効率およびこれらが翻訳される効
率である。転写および翻訳(これらは−緒K y、’−
って)jう現を構成する】の効率はヌクレオチド配列、
一般VCは所望の暗号化配列の前方に位置する配列に依
存する。
る:すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝
子コピーが転写される効率およびこれらが翻訳される効
率である。転写および翻訳(これらは−緒K y、’−
って)jう現を構成する】の効率はヌクレオチド配列、
一般VCは所望の暗号化配列の前方に位置する配列に依
存する。
これらのヌクレオチド配列または発現制御配列は、・待
に、几NAポリメラーゼが反応して転写を開始する位置
(グロモータ配列)と、リポソームがm u N A
(転写の生成物]と結合かつ反応して翻訳を開始する位
置とを規戻する。必らずしも全てのこの種の発現制御配
列が同等な効率を有するとは限らない。したがって、所
望の蛋白質に対する・特定暗号化配列を隣接するヌクレ
オチド配列から分離して、とノLら全曲の公知の発現制
御配列へ融合はせ、より高レベルの発現會得ることが有
利である。これが、41A’、された後、υ[たに作成
されたD N A 1lJi片をより多数のコヒープラ
スミド中へ、またはバクテリオファージ誘導体中へ挿入
して、細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることができる
。
に、几NAポリメラーゼが反応して転写を開始する位置
(グロモータ配列)と、リポソームがm u N A
(転写の生成物]と結合かつ反応して翻訳を開始する位
置とを規戻する。必らずしも全てのこの種の発現制御配
列が同等な効率を有するとは限らない。したがって、所
望の蛋白質に対する・特定暗号化配列を隣接するヌクレ
オチド配列から分離して、とノLら全曲の公知の発現制
御配列へ融合はせ、より高レベルの発現會得ることが有
利である。これが、41A’、された後、υ[たに作成
されたD N A 1lJi片をより多数のコヒープラ
スミド中へ、またはバクテリオファージ誘導体中へ挿入
して、細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることができる
。
上記のように数種の発現制御配列を使用することができ
る。こルらはイー・コリの乳糖オペロン(rlac系J
)のオペレータ、プロモータおよびリボンーム結合p
よび相互反応配列(たとえばシャインーダルガルノ配列
のような配列を含む)、イーeコリのトリプトファンシ
ンセターゼ系(「倶工系」)の対応する配列、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域(上記し之よう
な0LPLおよび0RP)L)、鷹維状の単一鎖1)N
Aファージの制御領域、または成熟核もしくは原始核細
胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またI′iそれらの組合せを包含する。したが
って、適当な個主における特定ポリペプチドの生産を向
上はせるには、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を
上記のように作成し、かつこれをその兄現制御配列に近
接して、または上記の改善発現制御配列の1種の制イ卸
下で組換1)NA分子中に挿入する。この種の方法は当
業界で公知である。
る。こルらはイー・コリの乳糖オペロン(rlac系J
)のオペレータ、プロモータおよびリボンーム結合p
よび相互反応配列(たとえばシャインーダルガルノ配列
のような配列を含む)、イーeコリのトリプトファンシ
ンセターゼ系(「倶工系」)の対応する配列、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域(上記し之よう
な0LPLおよび0RP)L)、鷹維状の単一鎖1)N
Aファージの制御領域、または成熟核もしくは原始核細
胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またI′iそれらの組合せを包含する。したが
って、適当な個主における特定ポリペプチドの生産を向
上はせるには、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を
上記のように作成し、かつこれをその兄現制御配列に近
接して、または上記の改善発現制御配列の1種の制イ卸
下で組換1)NA分子中に挿入する。この種の方法は当
業界で公知である。
翻訳の効率を向上さぜる他の方法は、化孝的または酵素
的に作成したオリゴヌクレオチドを開始コドンの前方に
挿入することを含む。この方法により、一層最適なメツ
センジャー几NAの1次および2次構造を得ることがで
きる。さらに詳細には、開始AtJGコドンが容易に処
理し得る位置(すなわち2次僧孝造により遮閉され°C
いない)においてヘアピンの頂部に生ずるか、または他
の単一鎖・唄域に生ずるように配列を設計することがで
きる。ざらに、上記シャインーダルガルノ断片の位置お
よび配列も同様に最適化することができる。メツセンジ
ャーRN Aの一般的構造(折・、イみ〕の重要性が示
されている〔ティー拳イセレンタントおよびダフ゛リュ
ー・7アイエルス、「m RN Aの2次4Ft造およ
び、lIJ]訳開始の効率」、ジーン誌、第9巻、第1
〜12貞(1980))。
的に作成したオリゴヌクレオチドを開始コドンの前方に
挿入することを含む。この方法により、一層最適なメツ
センジャー几NAの1次および2次構造を得ることがで
きる。さらに詳細には、開始AtJGコドンが容易に処
理し得る位置(すなわち2次僧孝造により遮閉され°C
いない)においてヘアピンの頂部に生ずるか、または他
の単一鎖・唄域に生ずるように配列を設計することがで
きる。ざらに、上記シャインーダルガルノ断片の位置お
よび配列も同様に最適化することができる。メツセンジ
ャーRN Aの一般的構造(折・、イみ〕の重要性が示
されている〔ティー拳イセレンタントおよびダフ゛リュ
ー・7アイエルス、「m RN Aの2次4Ft造およ
び、lIJ]訳開始の効率」、ジーン誌、第9巻、第1
〜12貞(1980))。
所望生産物の細胞収率の増加は、細胞内で利用し伶る遺
伝子数の増加に依存する。これは、IL2遺伝子をその
転写および1翻訳制御要素を用いて、または用いずに高
コピー数プラスミドへ、または温度制御されたコピー数
プラスミドCすなわち、プラスミドのコピー数が温度の
上昇変化の後に増大する〔ピー・ウーリン等、「クロー
ン遺伝子およびその生殖物の増大に対するIN i依存
性コピー赦を有するグラスミドJ、ジーン誌、第6巻、
第91−106頁(1979L)ように突然変異したプ
ラスミド)へ挿入することにより達成される。
伝子数の増加に依存する。これは、IL2遺伝子をその
転写および1翻訳制御要素を用いて、または用いずに高
コピー数プラスミドへ、または温度制御されたコピー数
プラスミドCすなわち、プラスミドのコピー数が温度の
上昇変化の後に増大する〔ピー・ウーリン等、「クロー
ン遺伝子およびその生殖物の増大に対するIN i依存
性コピー赦を有するグラスミドJ、ジーン誌、第6巻、
第91−106頁(1979L)ように突然変異したプ
ラスミド)へ挿入することにより達成される。
或いは、遺伝子量の増加は、たとえば上記のように作成
された組換1) N A分子金特に簡単に □は制
限酵素でのプラスミドの切断によって雛型バクテリオフ
ァージλ中へ挿入して線状分子を生り見させ、仄いでこ
れt市+] 1t11フアージλクローン化ベヒクルと
混合することにより達成され〔/ことえば、エヌ・イー
・ムレ−等、「試験管内組換体の回収をtli単にする
ファージλ」、モレキュラー・ゼネラル・ジエネテイツ
クス、第150巻、第53−61頁(1977) 訃
よびエヌ伽イー・ムレ−等、「バクテリオファージ°r
4からのl) N A IJガーゼ遺伝子の分子クロー
ン化コ、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
162巻、第、193−505頁(1979)」、そし
て組換DN八へ子を1)NA11ガーゼと共に培養して
生成させる。次いで、所望の組換7アージを前記と同様
に選択し、かつこれを使用してイ〜・コリの宿主菌株を
溶菌させる□したがって1本発明の挿入DNAは5V5
29プラスミドから除去して、これを目1■記と同様に
他の発現ベクター中へ挿入し、これらベクターを釉々の
宿主でtsfl記と同様に使用してIf、2を暗号化す
る遺伝子の発現全向上ぜせ得ることを了解すべきである
。
された組換1) N A分子金特に簡単に □は制
限酵素でのプラスミドの切断によって雛型バクテリオフ
ァージλ中へ挿入して線状分子を生り見させ、仄いでこ
れt市+] 1t11フアージλクローン化ベヒクルと
混合することにより達成され〔/ことえば、エヌ・イー
・ムレ−等、「試験管内組換体の回収をtli単にする
ファージλ」、モレキュラー・ゼネラル・ジエネテイツ
クス、第150巻、第53−61頁(1977) 訃
よびエヌ伽イー・ムレ−等、「バクテリオファージ°r
4からのl) N A IJガーゼ遺伝子の分子クロー
ン化コ、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
162巻、第、193−505頁(1979)」、そし
て組換DN八へ子を1)NA11ガーゼと共に培養して
生成させる。次いで、所望の組換7アージを前記と同様
に選択し、かつこれを使用してイ〜・コリの宿主菌株を
溶菌させる□したがって1本発明の挿入DNAは5V5
29プラスミドから除去して、これを目1■記と同様に
他の発現ベクター中へ挿入し、これらベクターを釉々の
宿主でtsfl記と同様に使用してIf、2を暗号化す
る遺伝子の発現全向上ぜせ得ることを了解すべきである
。
本発明による生成されるi L 2様ボリペグチドの生
物学的活性はさらに、本発明のi) I’J A配列を
使用1−て桶乳動物の細胞系を形狙転換させかつ遺伝子
をこれらの系で発現させるべく改善することもできる。
物学的活性はさらに、本発明のi) I’J A配列を
使用1−て桶乳動物の細胞系を形狙転換させかつ遺伝子
をこれらの系で発現させるべく改善することもできる。
この柿の1’/M乳動物系は公知である〔jtとえば、
ピー・ジエー・サウザーン=i)−よびピー拳ベルク、
ジャーナル・モレキュラー・アブライドージエネテイソ
クス、第1巻、第327−11頁(1982);ニス・
ザブラマ二等、モレキュラー争セル・バイオロジー、第
1巻、第85,1−64頁(1981);アール・ジエ
ー・カウフマンpよびピー・ニー争シャープ、モレキュ
ラー愉セル会バイオロジー、(出版中)〕。好適な系は
、遺伝子発現をメトトレキセー)(MT、’()によシ
増大させ得るC 11 (J(チャイニーズe〕\ムス
ターー、tバリー)(IJHFRl細胞系である。こi
tらの発現系は。
ピー・ジエー・サウザーン=i)−よびピー拳ベルク、
ジャーナル・モレキュラー・アブライドージエネテイソ
クス、第1巻、第327−11頁(1982);ニス・
ザブラマ二等、モレキュラー争セル・バイオロジー、第
1巻、第85,1−64頁(1981);アール・ジエ
ー・カウフマンpよびピー・ニー争シャープ、モレキュ
ラー愉セル会バイオロジー、(出版中)〕。好適な系は
、遺伝子発現をメトトレキセー)(MT、’()によシ
増大させ得るC 11 (J(チャイニーズe〕\ムス
ターー、tバリー)(IJHFRl細胞系である。こi
tらの発現系は。
グリコジル化蛋白質の生成kOI能にする。
ざらに、IL2活性を示すポリペプチド(本発明によp
1乍成)も融付蛋白質(7ヒとえば分泌全行なう原始核
もしくは成熟IN−末端d片へ結合したもの)の形態、
グロインタロイキン2(たとえば分泌の際、開裂し得る
インタロイキン2の1ヒ号配列の全部または1部で出発
する)の形態、或いは成熟インタロイキン2(発現およ
び分泌の際の初期メチオニンを含む菌体外アミノ酸の開
裂による)として、またはf−met−iL2として作
成することもできる。本発明に赴いて特Vこ有用な1A
!j!のポリペプチドは、アミン末端に結訃した容易に
開裂し1砦るアミノ酸も1.<は一連のアミノ酸を有す
る成熟インタロイキン2である。この構造は、成k)^
インタロイキン2に存在1−ない開始信号全必要とする
ような適当な宿主に2ける蛋白質の合成を可能にし、仄
いて余分のアミノ酸全開裂して成熟インタロイキン2金
生産することをh」能にする。
1乍成)も融付蛋白質(7ヒとえば分泌全行なう原始核
もしくは成熟IN−末端d片へ結合したもの)の形態、
グロインタロイキン2(たとえば分泌の際、開裂し得る
インタロイキン2の1ヒ号配列の全部または1部で出発
する)の形態、或いは成熟インタロイキン2(発現およ
び分泌の際の初期メチオニンを含む菌体外アミノ酸の開
裂による)として、またはf−met−iL2として作
成することもできる。本発明に赴いて特Vこ有用な1A
!j!のポリペプチドは、アミン末端に結訃した容易に
開裂し1砦るアミノ酸も1.<は一連のアミノ酸を有す
る成熟インタロイキン2である。この構造は、成k)^
インタロイキン2に存在1−ない開始信号全必要とする
ような適当な宿主に2ける蛋白質の合成を可能にし、仄
いて余分のアミノ酸全開裂して成熟インタロイキン2金
生産することをh」能にする。
こnら種々異なる形叩のポリペプチドの収率は、上記方
法のいずれかfンjは組合せによって改善することがで
きる。さらに、本1) 1’J A配列に使用したコド
ンの1部または全部に対し、撞々異ンヨるコドンを;ロ
イ(灸することもできる。こルらの置換コドンは、交換
されたコドンにより +’;J号化さiLるものと同一
のアミノ酸を暗号化することができ、しかもポリペプチ
ドの高収率をもたらす。或いは、アミノ酸置換51/ヒ
はより長いもしくばより短いL L 21A連ポリペプ
チドをもたらすコドンの1つのij換よ之は組合せも、
一般にその性質を変化させる(たとえは、安定性をJd
大させ、′13解度を増大メせ、免疫治療活性を・増大
させ、長期のT 、y+t+胞の増殖活性を増大させる
)。
法のいずれかfンjは組合せによって改善することがで
きる。さらに、本1) 1’J A配列に使用したコド
ンの1部または全部に対し、撞々異ンヨるコドンを;ロ
イ(灸することもできる。こルらの置換コドンは、交換
されたコドンにより +’;J号化さiLるものと同一
のアミノ酸を暗号化することができ、しかもポリペプチ
ドの高収率をもたらす。或いは、アミノ酸置換51/ヒ
はより長いもしくばより短いL L 21A連ポリペプ
チドをもたらすコドンの1つのij換よ之は組合せも、
一般にその性質を変化させる(たとえは、安定性をJd
大させ、′13解度を増大メせ、免疫治療活性を・増大
させ、長期のT 、y+t+胞の増殖活性を増大させる
)。
最後に、本発明の組換1)NA分子により生産はれたポ
リペプチドの活性は、周知手段により本発明の範囲を逸
脱することなく、本発明のD N A配列も1−〈はボ
1ノペグチド〒14訂片化し、改変り、捷たは誘導化す
ることにより改善することもできる。たとえば、他りイ
ンタフエロンとのヒブリドを遺伝子レベルで作成して適
当な宿主で発現させることもでき、或いは化学合成法で
蛋白質レベルで作成することもできる。
リペプチドの活性は、周知手段により本発明の範囲を逸
脱することなく、本発明のD N A配列も1−〈はボ
1ノペグチド〒14訂片化し、改変り、捷たは誘導化す
ることにより改善することもできる。たとえば、他りイ
ンタフエロンとのヒブリドを遺伝子レベルで作成して適
当な宿主で発現させることもでき、或いは化学合成法で
蛋白質レベルで作成することもできる。
ここに記載した方法で作成された微生物および組換D
N A分子は、1986年2月8日付けで西ドイツ+A
]、ゲッチンゲン在、ドイツチェ・ザンムルング・フォ
ノ・ミクロオルガニスムノ培]Q物コレクションに寄託
した培養物で例示される: hiL2−A: W、 coli HBlol(psV
−hiL2−03 h I L 2−13 m k 、c o I I H
B I Ll 1(psV−hiL2−1 ) これら培養物は、それぞれ舒託舒号JJSM2595お
よび2596が付与されている。
N A分子は、1986年2月8日付けで西ドイツ+A
]、ゲッチンゲン在、ドイツチェ・ザンムルング・フォ
ノ・ミクロオルガニスムノ培]Q物コレクションに寄託
した培養物で例示される: hiL2−A: W、 coli HBlol(psV
−hiL2−03 h I L 2−13 m k 、c o I I H
B I Ll 1(psV−hiL2−1 ) これら培養物は、それぞれ舒託舒号JJSM2595お
よび2596が付与されている。
さらに、ここに記載した方法で作成された微生物および
組換IJ N A分子を、1983年4月18日付けで
メリーランド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションの培養物コレクションに寄託
した: h I L 2− Ca b c o l
I K 5111 λ(p’I’rp−hlL2D
1) hiL 2−1): 1弓、 cO目 K121
も1も■ΔA415(λCR4A−ghfL2−1/ 27001)p 几i−n、l) hHJ2−g: g、coli i<12ルIt)
6M15(λcHaA−ghJ、、L2−1/ 3800bp ij、I−Rfl これら培養物には、それぞれATCC39338゜39
339および39340 の有託番号が付与さnた。
組換IJ N A分子を、1983年4月18日付けで
メリーランド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションの培養物コレクションに寄託
した: h I L 2− Ca b c o l
I K 5111 λ(p’I’rp−hlL2D
1) hiL 2−1): 1弓、 cO目 K121
も1も■ΔA415(λCR4A−ghfL2−1/ 27001)p 几i−n、l) hHJ2−g: g、coli i<12ルIt)
6M15(λcHaA−ghJ、、L2−1/ 3800bp ij、I−Rfl これら培養物には、それぞれATCC39338゜39
339および39340 の有託番号が付与さnた。
以上、本発明の多数の具体[3’11につき説明したが
、この基本構成を改変して本発明の方法および構成を利
用する他の具体例全与えることもできる。したがって、
本発明の範囲は上記の具体例のみに限定されない。
、この基本構成を改変して本発明の方法および構成を利
用する他の具体例全与えることもできる。したがって、
本発明の範囲は上記の具体例のみに限定されない。
431図は本発明によシ製造される一連の)!R糖一度
内配ILNAフラクションのill”N暗号化活性を示
すグラフであり、 第2図はpsvs29並びにそ(1) Bam 111
部位に仲人されたII、2関連D tN A挿入物を有
するベクターの説明図でアリ。 第3図は本発明のfL2関連DNA配列の制限地図およ
びこの1)NA配列を決定する際に使用する配列決定法
の説明図であり、 第4図は本発明のIL2関連1)NA配列のヌクレオチ
ド配列であり、 第5図は適当な宿主を形質転換させてこれを培養した際
、本発明のIL2様生産生産物産させるのに使用し得る
本発明の各種の組換D N A分子の製造を示す略図で
あり、 第6図は全h IL2遺伝子金含むλCH4A−gbl
L2−1プラークの部分制限地図である。 特許用1?tt人 バイオジエン ナームローズ ヘン
ノソトシャノプ図面の+:r′ij (白書に変更なし
)Fiり、l 第1頁の続き 二=L C12R1/19 ) (C12N 5100 C12R1/91 ) (C12P 21102 C12R1/19 ) 優先権主張 91983年6月10日■イギリス(G
B )@8315981 0発 明 者 レーン・ロバート・デボスベルギー国8
400オーステンプ。 ニブイス・ケーベルストリート 56番 手 綻に ネ市 j「ろ 密二(力式)%式% 2、発明の名称 ひとインクロイキン2様ボリペプヂ1′を製造するため
のI)Nへ配列、組1g!DNA分子およびその製造方
法3、補正をする者 事件との関1系 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ・\ンノノトン
ヤノフ代表者 エヌ ブイ フィデス (国籍)(オランダ領アンチル) 4、代理人 6、補正の対象 7、補正の内容
内配ILNAフラクションのill”N暗号化活性を示
すグラフであり、 第2図はpsvs29並びにそ(1) Bam 111
部位に仲人されたII、2関連D tN A挿入物を有
するベクターの説明図でアリ。 第3図は本発明のfL2関連DNA配列の制限地図およ
びこの1)NA配列を決定する際に使用する配列決定法
の説明図であり、 第4図は本発明のIL2関連1)NA配列のヌクレオチ
ド配列であり、 第5図は適当な宿主を形質転換させてこれを培養した際
、本発明のIL2様生産生産物産させるのに使用し得る
本発明の各種の組換D N A分子の製造を示す略図で
あり、 第6図は全h IL2遺伝子金含むλCH4A−gbl
L2−1プラークの部分制限地図である。 特許用1?tt人 バイオジエン ナームローズ ヘン
ノソトシャノプ図面の+:r′ij (白書に変更なし
)Fiり、l 第1頁の続き 二=L C12R1/19 ) (C12N 5100 C12R1/91 ) (C12P 21102 C12R1/19 ) 優先権主張 91983年6月10日■イギリス(G
B )@8315981 0発 明 者 レーン・ロバート・デボスベルギー国8
400オーステンプ。 ニブイス・ケーベルストリート 56番 手 綻に ネ市 j「ろ 密二(力式)%式% 2、発明の名称 ひとインクロイキン2様ボリペプヂ1′を製造するため
のI)Nへ配列、組1g!DNA分子およびその製造方
法3、補正をする者 事件との関1系 特許出願人 名称 バイオジエン ナームロース ・\ンノノトン
ヤノフ代表者 エヌ ブイ フィデス (国籍)(オランダ領アンチル) 4、代理人 6、補正の対象 7、補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) psV−hIL、!−IODNA挿入物、前
記DNA挿入物にヒプリド化しかつIL、2様ポリペプ
チドを暗号化するDNA配列、並びに上記DNA配列お
よび挿入物のいずれかにより発現に際して暗号化された
ポリペプチドを発現の際に暗号化するDNA配列よりな
る群から選択されるDNA配列。 +21 DNA挿入物にヒブリド化するDNA配列を
pSV−blL、2−t(DDNAn入物、前記DNA
挿入物のいずれかにヒプリド化しかっIL、2様ポリペ
プチドを暗号化するDNA配列、並びに前記DNA配列
および挿入物のいずれかにより発現に際し暗号化された
ポリペプチドを発現の際に暗号化するDNA配列よりな
る群から選択する特許請求の範囲第1項記載のDNA配
列。 13)DNA挿入物にヒブリド化するDNA配列がひと
染色体遺伝子群から選択されるDNA配列である特許請
求の範囲第1項記載のDNA配列。 (41DNA配列をλCHグA−、ghIL、2−/。 λCH弘A−ghIL、2−2.λLグアー4bILJ
−/、λL弘7−ghI1.2−2およびλLl/17
−ghIL2−JのhIL2関連部分よりなる群から選
択する特許請求の範囲第3項記載のDNA配列。 (5)式: %式% CT、G弘αコC■イNTに臥CAAAGAAAACA
CAGCrACAACrGGAGCCrAMGG0五1
弘MOWメn0■faロW頁″rGCIGATGAGA
CAGCAACCATrGTAGAATTrCTGAA
CACATGGATTACCITrrGTCAAAGC
AπλのDNA配列、並びに前記DNA配列のいずれか
によシ発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際
に暗号化するDNA配列よりなる群から選択される特許
請求の範囲第1項乃至第弘項のいずれかに記載のDNA
配列。 (6)式; %式% のDNA配列、並びに前記DNA配列のいずれかにより
発現に際し暗号化されたポリペプチドを発現の際に暗号
化するDNA配列よシなる群から選択される特許請求の
範囲第1項乃至第y項のいずれかに記載のDNA配列。 (7)特許請求の範囲第1項乃至第6項のいずれかに記
載のDNA配列よりなる群から選択されるDNA配列か
らなる組換DNA分子。 (3)DNA配列が発現制御配列に作用結合している特
許請求の範囲第7項記載の組換DNA分子。 (9)発現制御配列がlac系、β−1ao系、 tr
p系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域
、fd被覆蛋白の制御領域、原始核もしくは成熟核細胞
およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他の
配列、並びにその組合せよりなる群から選択される特許
請求の範囲第ざ項記載の組換DNA分子。 (l pPLcMu−bIL2/、pPLc、Mu−
blL22 、pPLoMu−bIL、2θ/ 、 p
’l’r p −h IL21およびpTrp−hIL
、2o/ よりなる群から選択される特許請求の範囲
第7項記載の組換DNA分子。 ←υ 特許請求の範囲第7項乃至第10項のいずれかに
記載の少なくともl槙の組換DNA分子によシ形質転換
された宿主。 α2 イー・コリ、シュードモナス、枯草菌、高熱細菌
、その他の細菌類、酵母、その他の真菌類の菌株、ねず
みまたはその他の動物もしくは植物宿主、並びにひと組
繊細胞よりなる群から選択される特許請求の範囲第1/
項記載の宿主。 a3 特許請求の範囲第1項乃至第を項の配列よシな
る群から選択されるDNA配列によp形質転換されたイ
ーーコ」ハシュードモナス、枯草菌、高熱細菌、その他
の細菌類、酵母、その他の真菌類の菌株、ねずみまたは
その他の動物もしくは植物宿主、またはひと組繊細胞よ
シなる群から選択される特許請求の範囲第1/項または
第1コ項記載の形質転換宿主。 01 %許請求の範囲第1/項乃至第73項の°いず
れかに記載の形質転換宿主により生産される。ひとイン
タロイキンコ型の免役学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチド。 ttS %W!f請求の範囲第1項乃至第6項のいず
れかに記載のDNA配列により暗号化されるポリペプチ
ド。 (151)NA挿入物hIL!−oにょシ暗号化された
特許請求の範囲第1j項記載のポリペプチド。 αη 式: %式% のポリペプチドおよびそのbIL、2様断片よりなる群
から選択される特許請求の範囲第14項乃至第16項の
いずれかに記載のポリペプチド。 賭 特許請求の範囲第1項乃至第を項のいずれかに記載
のDNA配列をクローン化用ベヒクル中へ導入すること
を特徴とする組換DNA分子の製造方法。 αI 特許請求の範囲第り項記載の発現制御配列をクロ
ーン化用ベヒクル中へ導入する工程をさらに含み、前記
発現制御配列を前記クローン化用ベヒクル中へ導入して
、DNA配列の発現を制御すると共に調整することを特
徴とする特許請求の範囲第it項記載の方法。 ■ 特許請求の範囲第r項乃至第10項のいずれかに記
載の組換DNA分子によって適当な宿主を形質転換させ
、この宿主を培養しかっポリペプチドを回収することを
特徴とする、ひとインタロイキン、2型の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドの製造方法。 (21)宿主をイー・コリ、シュードモナス、枯草菌、
高熱細菌、その他の細菌類、酵母、具菌類の菌株、動物
もしくは植物宿主、およびひと組繊細胞よりなる群から
選択する特許請求の範囲第20項記載の方法。 (2、特許請求の範囲第を項乃至第1O項のいずれかに
記載の組換DNA分子により形質転換された宿主を培養
し、かつポリペプチドを回収することを特徴とする、ひ
とインタロイキンλ型の免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチドの製造方法。 (23)どのDNA配列が特許請求の範囲第1項乃至第
を項のいずれかに記載のDNA配列にヒプリド化するか
を決定することを特徴とする、IL、2の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化するDN
A配列をDNA配列群から選択する方法。 (24)どのDNA配列が特許請求の範囲第1項乃至第
を項のいずれかに記載のDNA配列にヒプリド化するか
を決定することを特徴とする、非ひとインタロイキンコ
型の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
を暗号化するDNA配列の選択方法。 (25)選別妊れるDNA配列を天然源からのDNA配
列、合成りNA配列、組換DNA分子からのDNA配列
、および前記DNA配列のいずれかの組合せであるDN
A配列から選択する特許請求の範囲第23項または第2
1項記載の方法。 (2、特許請求の範囲第74’項乃至第17項のいずれ
かに記載のポリペプチドよりなる群から選択される少な
くとも7種のポリペプチドの医薬上有効量を含有する、
免疫治療用の医薬上許容し得る組成物。 (2、特許請求の範囲第J、g項記載の組成物の有効量
を医薬上許容し得る方法で投与することを特徴とする免
疫治療法。 ずれかに記載のポリペプチドよりなる群から選択される
少Aくとも181のポリペプチドを含有するCとを特徴
とする、試験管内のT細胞培養における増殖試薬として
使用する〕組成物。 (2、特許請求の範囲第、2ざ項記載の組成物の有効量
を培養物に投与することを特徴とする。 試験管内におりるT細胞培養物の増殖力法。 (30) I L−、?様ポリペプチドを暗号化するI
) N A配列に選択的にヒプリド化する、特許請求の
範囲第1項乃至第を項のいずれかに記載のDNA配列か
ら誘導されまたは訓製されるオリゴヌクレオチド。 (31)どのDNA配列が特許請求の範囲第1項乃至第
2項のいずれかに記載のDNA配列゛または特許請求の
範囲第30項記載のオリゴヌクレオチドにヒプリド化す
るかを決定することを特徴とする、インタロイキン関連
ホリペプチドを暗号化するDNA配列の選択方法。 (62、特許請求の範囲第7弘項乃至第17項のいずれ
かに記載のポリペプチドよりなる群から選択される少な
くとも7種のポリペプチドの医薬上有効量を含有してな
る、医薬上許容し得る抗ウィルスもしくは抗癌組成物。 (66)特許請求の範囲第3λ項記載の組成物の有効量
を医薬上許容し得る方法で投与することを特徴とする抗
ウィルスもしくは抗癌治療法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB838303383A GB8303383D0 (en) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | Sequences recombinant dna molecules |
GB8303383 | 1983-02-08 | ||
GB8315981 | 1983-06-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59220189A true JPS59220189A (ja) | 1984-12-11 |
JPH0156757B2 JPH0156757B2 (ja) | 1989-12-01 |
Family
ID=10537631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59019524A Granted JPS59220189A (ja) | 1983-02-08 | 1984-02-07 | ひとインターロイキン2様ポリペプチドをコードするdna配列、該dna配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59220189A (ja) |
GB (2) | GB8303383D0 (ja) |
ZA (1) | ZA84512B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
JPS61257931A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Ajinomoto Co Inc | インタ−ロイキン2ポリペプチドの回収方法 |
Citations (5)
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JPS5779897A (en) * | 1980-07-01 | 1982-05-19 | Hoffmann La Roche | Polypeptide containing amino acid arrangement of aged human corpuscle interferone |
JPS59140882A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-08-13 | Japan Found Cancer | インターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JPS59144719A (ja) * | 1983-02-03 | 1984-08-18 | Japan Found Cancer | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
EP0118977A1 (en) * | 1983-02-08 | 1984-09-19 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides |
-
1983
- 1983-02-08 GB GB838303383A patent/GB8303383D0/en active Pending
- 1983-06-10 GB GB838315981A patent/GB8315981D0/en active Pending
-
1984
- 1984-01-23 ZA ZA84512A patent/ZA84512B/xx unknown
- 1984-02-07 JP JP59019524A patent/JPS59220189A/ja active Granted
Patent Citations (5)
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JPS59140882A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-08-13 | Japan Found Cancer | インターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JPS59144719A (ja) * | 1983-02-03 | 1984-08-18 | Japan Found Cancer | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
EP0118977A1 (en) * | 1983-02-08 | 1984-09-19 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interleukin two-like polypeptides |
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WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
JPS61257931A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Ajinomoto Co Inc | インタ−ロイキン2ポリペプチドの回収方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8315981D0 (en) | 1983-07-13 |
ZA84512B (en) | 1984-09-26 |
JPH0156757B2 (ja) | 1989-12-01 |
GB8303383D0 (en) | 1983-03-16 |
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