CN114269360A - 用于治疗递送的平台、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于产生细胞外囊泡的平台。本文描述了细胞外囊泡的组合物。本文还描述了使用所述细胞外囊泡用于治疗递送的方法。

Description

用于治疗递送的平台、组合物和方法
交叉引用
本申请要求在2019年6月21日年提交的第62/864,566号美国临时和2019年7月17日年提交的第62/875,001号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。
引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用被具体和单独地并入的程度相同。本申请包括“Riazifar M，Mohammadi MR，Pone EJ等人，Stem Cell-Derived Exosomes asNanotherapeutics for Autoimmune and Neurodegenerative Disorders.ACSNano.2019；13(6):6670-6688.doi:10.1021/acsnano.9b01004”，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
将治疗递送至靶细胞的有效手段是现代医学的基础之一。已经研究了细胞外囊泡并将其用作用于将治疗递送至靶细胞的载体。
发明内容
目前通过细胞外囊泡递送治疗的方法具有缺点。细胞外囊泡在大小、数量、膜特性或稳定性方面可能是异质的。可以通过细胞外囊泡递送的治疗的量可能不均匀的或不可预测，导致无效的治疗结果。在一些情况下，细胞外囊泡的产率可能不足。另外，由于循环中的大多数细胞外囊泡在肝、脾和肾中积累，将细胞外囊泡引导至体内靶细胞是是一个持续挑战。因此，还需要包含将足够量的治疗递送至靶细胞的细胞外囊泡的组合物和药物组合物。还需要用于产生细胞外囊泡的平台和方法以将足够量的治疗递送至靶细胞。还需要使用细胞外囊泡递送治疗的方法和使用细胞外囊泡治疗疾病或病况的方法。
本公开一方面包括包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4或其任何组合；和跨膜部分，其中所述跨膜部分包含CD63，其中所述CD63包含3个跨膜结构域；其中所述免疫检查点部分连接至所述跨膜部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分连接至所述CD63的胞外环以产生修饰后的CD63。在一些实施方案中，所述胞外环是所述修饰后的CD63的大胞外环或第二胞外环。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含与SEQ ID NO：6-17中所示氨基酸序列的任一个序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含与SEQ ID NO：6-17中所示氨基酸序列的任一个序列至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含SEQ ID NO：6-17中所示氨基酸序列的任一个序列。
一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分包含PD-L1；和跨膜部分，其中所述跨膜部分包含乳凝集素；其中所述免疫检查点部分连接至所述跨膜部分。一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分包含T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、PD-L1、CTLA-4或其任何组合；和跨膜部分，其中所述跨膜部分包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)；其中所述免疫检查点部分连接至所述跨膜部分。一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含以下中的至少一种：免疫检查点部分；和跨膜部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分被所述细胞外囊泡封装。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分在所述细胞外囊泡的表面上表达。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分由所述细胞外囊泡分泌。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分与所述跨膜部分复合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分与所述跨膜部分共价连接。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H4(VTCN1)、HVEM(CD270、TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(粘连蛋白-2、CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、Stabilin-1(Clever-1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44、SIRPα(CD172a)或其组合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4或其组合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含PD-L1。在一些实施方案中，所述跨膜部分选自14-3-3蛋白ζ/δ、4-3-3蛋白ε、78kDa葡萄糖调节蛋白、乙酰胆碱酯酶/AChE-S、AChE-E、肌动蛋白、细胞质1(ACTA)、ADAM10、碱性磷酸酶、α-烯醇酶、α-突触核蛋白、氨肽酶N、淀粉样蛋白βA4/APP、膜联蛋白5A、膜联蛋白A2、AP-1、ATF3、ATP柠檬酸裂合酶、ATP酶、β肌动蛋白(ACTB)、β-淀粉样蛋白42、小窝蛋白-1、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD142、CD146、CD163、CD24、CD26/DPP4、CD29/ITGB1、CD3、CD37、CD41、CD42a、CD44、CD45、CD47、CD49、CD49d、CD53、CD63、CD64、CD69、CD73、CD81、CD82、CD9、CD90、密封蛋白、密封蛋白-1、丝切蛋白-1、补体结合蛋白CD55和CD59、胞质热激蛋白90α、胞质热激蛋白90β、EBV LMP1、EBV LMP2A、EF-α-1、EF2、EFGR EGFR VIII、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子/CD147、烯醇酶1α(ENO1)、EPCAM、ERBB2、四分子交联体家族成员9(CD9、CD63和CD81)、脂肪酸合酶、胎球蛋白-A、筏蛋白-1、筏蛋白-2、果糖-二磷酸醛缩酶A、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、血型糖蛋白A、GPC1、GPI-锚定5′核苷酸酶、GTP酶、热激蛋白8(HSPA8)、热激蛋白(HSP70和HSP90)、硫酸类肝素蛋白多糖、肝素酶、异源三聚体G蛋白、HIV Gag、HIV Nef、HLA-DRA、HLA-G、HSV gB、HTLV-1Tax、亨廷顿蛋白、ICAM1、整联蛋白、乳凝集素、LAMP1/2、富亮氨酸重复受体激酶2、l-乳酸脱氢酶A链、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、MHC I型、MHC II型、MUC1、多药耐药相关蛋白、肌肉丙酮酸激酶(PKM2)、n-钙粘蛋白、NKCC2、PDCD6IP/Alix、PECAM1、磷酸甘油酸激酶、胎盘朊病毒蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、丙酮酸激酶(PKM)、Rab-14、Rab-5a、Rab-5b、Rab-5c、Rab-7、Rap 1B、抵抗素、音猬因子(SHH)、存活蛋白(surviving)、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-4、同线蛋白-1、运铁蛋白受体(TFR2)、TSG101、TSPAN8、肿瘤相关糖蛋白跨膜四蛋白-8、酪氨酸3、单氧酶/色氨酸5-单氧酶活化蛋白、TYRP-2、囊泡分选蛋白35或ζ多肽(YWHAZ)。在一些实施方案中，所述跨膜部分包含乳凝集素。在一些实施方案中，所述跨膜部分包含LAMP2或其变体或其片段，所述LAMP2与SEQ ID NO：4的肽序列至少70％同一，在一些实施方案中，所述跨膜部分包含CD63或其变体或其片段，所述CD63与SEQ ID NO：5的肽序列至少70％同一。在一些实施方案中，所述CD63是修饰后的CD63。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63是截短的CD63。在一些实施方案中，所述修饰的CD63被修饰以包含至少一个额外的CD63跨膜结构域。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含1个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含2个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含3个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含4个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述修饰后的CD63包含5个跨膜结构域。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分在修饰后的CD63的胞外环处与所述修饰后的CD63复合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分在修饰后的CD63的大胞外环处与所述修饰后的CD63复合。在一些实施方案中，所述组合物还包含靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分包含靶向细胞因子的肽。在一些实施方案中，所述靶向部分包含靶向癌细胞标记物的肽。在一些实施方案中，所述组合物还包含促进融合部分。在一些实施方案中，所述促进融合部分包含病毒促进融合部分。在一些实施方案中，所述促进融合部分包含哺乳动物促进融合部分。在一些实施方案中，所述组合物还包含免疫逃避部分。在一些实施方案中，所述免疫逃避部分包含CD47。如前述权利要求中任一项的所述组合物，不包含除核细胞。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含外来体、囊泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡小体、凋亡体、癌小体、外显子、包膜病毒、外泌体或其他非常大的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含外来体。在一些实施方案中，细胞外囊泡包含多个免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少10,000个单位的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少9,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少8,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少7,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少6,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少5,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有100nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少3,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有50nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少2,500个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有50nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少2,000个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有50nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡的至少1,500个单元的所述免疫检查点部分，且所述细胞外囊泡具有50nm的直径。在一些实施方案中，所述组合物包含多种外来体。在一些实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少10^6个外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少10^7个外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少10^8个外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少1μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少10μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少20μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少50μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少100μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少150μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少200μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少250μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少500μg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少750μg的外来体。在一些实施方案中，所述所述组合物还包含至少1mg外来体。在一些实施方案中，所述所述组合物还包含至少2mg的外来体。在一些实施方案中，所述所述组合物还包含至少3mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少4mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少5mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少6mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少7mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少100mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少200mg外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少300mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少400mg外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少500mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少600mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少700mg的外来体。在一些实施方案中，所述组合物来源于细胞。在一些实施方案中，所述组合物是冷藏保存的。在一些实施方案中，所述组合物是冻干的。在一些实施方案中，所述组合物在37℃稳定24小时。在一些实施方案中，所述组合物在37℃稳定48小时。在一些实施方案中，所述组合物在37℃稳定72小时。
本公开的另一方面包括产生本文所述的实施方案中的任一种的细胞外囊泡或外来体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，其中所述细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是遗传修饰细胞。在一些实施方案中，所述细胞被遗传修饰以产生本文所述的实施方案中的任一种中所述的细胞外囊泡或外来体。
本公开的另一个方面包括纯化用于表达一个或多个免疫检查点部分的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：获得细胞外囊泡的异质群体；使所述细胞外囊泡的异质群体经受检测分析溶液，所述检测分析溶液包含用于与所述免疫检查点部分复合的检测部分；检测由所述免疫检查点部分和所述检测部分之间形成的复合物产生的信号，其中所述信号的强度与所表达的免疫检查点部分的单位成正比；以及基于信号强度分离细胞外囊泡的亚群。在一些实施方案中，所述检测部分包含抗体。在一些实施方案中，所述检测部分包含抗VISTA抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4或其组合。在一些实施方案中，所述检测部分包含所述免疫检查点部分的配体。在一些实施方案中，所述检测分析溶液还包含用于结合所述免疫检查点部分的肽。在一些实施方案中，所述用于结合所述免疫检查点部分的肽包含PD-1、CD80、CD86或其组合。
本公开的另一方面包括包含本文所述的实施方案的任一种的组合物的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种额外的活性剂。在一些实施方案中，所述药物组合物用于鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜内、静脉内、肌内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、脑实质内、皮下或其组合内施用。
本公开的另一方面包括治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括施用本文所述的实施方案中的任一种的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化症、炎性肠病、乳糜泻、克罗恩病、格雷夫斯病、幼年型关节炎、慢性莱姆病、视神经炎、银屑病性关节炎、巩膜炎、硬皮病、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎、炎性眼病、白癜风、慢性阻塞性肺病、器官移植并发症或移植物抗宿主病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
本公开的另一方面包括抑制需要治疗的患者中的CD8+CD25+细胞的方法，所述方法包括施用本文所述实施方案中任一种的所述组合物。
本公开的另一方面包括包含本文所述的实施方案中的任一种的所述药物组合物的试剂盒。
本公开的另一方面包括一种平台，其包含用于生成本文所述的实施方案中的任一种的所述组合物的组分。
附图说明
本专利申请包含至少一幅彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请的副本会由官方在发出请求并支付必要的费用后提供。
图1例示了对人MSC来源的外来体检测的蛋白质组学分析。程序性死亡配体-1(PD-L1)。
图2例示了用于阻断PD-L1以确定阻断PD-L1如何影响CD8+T细胞的实验设计。
图3例示了阻断性PD-L1抗体的存在阻断了PD-L1对CD25+CD8+细胞的影响。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开时可以采用本文所述实施方案的各种替代方案。意图是，所附权利要求限定本公开的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应该”、“不应”、“必须”、“不得”、“第一”、“最初”、“下一个”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”，不旨在限制本文公开的实施方案的范围，而是作为示例。
除非上下文另有明确指示，如本文所用，单数形式“一”和“该”旨在也包括复数形式。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“具有”、“带有”或其变体而言，这样的术语旨在具有类似于术语“包括”的方式的包含性。
如本文所使用的，短语“至少一个”、“一个或多个”以及“和/或“是开放式表达，其在操作中是连接词也是转折连词。例如，表述“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”中的每一个表达单独的A、单独的B、单独的C、A和B、A和C、B和C、或A、B和C。
本文描述的任何系统、方法、软件和平台是模块化的，并且不限于顺序步骤。因此，诸如“第一”和“第二”的术语不一定意味着优先级、重要性顺序或动作顺序。
术语“约”或“大致”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其部分地取决于该值是如何测量或确定的，例如测量系统的限制因素。例如，根据给定值的惯例，“约”可以表示在1个标准偏差内或超过1个标准偏差内。除非另有说明，在申请和权利要求中描述特定值的情况下，术语“约”应当被假定为表示特定值的可接受的误差范围。
在本文中术语“增加的”或“增加”通常用于表示增加统计学上显著的量；在一些实施方案中，术语“增加的”或“增加的”是指相较于参考水平增加至少10％，例如相较于参考水平、标准或对照增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至多并包括100％增加、或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他示例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
在本文中术语“降低的"”或“降低”通常用于表示降低统计学上显著的量。在某些实施方案中，“降低的”或降低”是指相较于参考水平降低了至少10％，例如：降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至多并包括100％(例如,相较参考水平无降低或不可检出的降低水平)，或相较于参考水平10-100％之间的任何降低。在标记物或症状中，这些术语是指此类水平的统计学上显著的降低。例如，所述降低可为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，且优选为下降至无给定疾病的个体的正常范围内的可接受水平。
术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。这些术语都不需要或限于以健康护理工作者(例如，医生、注册护士、护士从业者、医师助理、护理员或临终关怀员工)的监督(例如，持续或间歇性的)为特征的情况。
如本文所用，“细胞”通常指生物细胞。细胞可以是活体的基本结构、功能和/或生物学单元。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性示例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如，来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、小麦、种子、番茄、水稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、球果植物、裸子植物、蕨类植物、石松、角苔类植物、苔类植物和藓类植物)、藻类细胞(例如布朗葡萄藻、莱茵衣藻、海洋富油微拟球藻、蛋白核小球藻、马尾藻等)、海藻(例如，巨藻)、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人类等)的细胞等等。有时，细胞不是源自天然生物(例如，细胞可以是合成制备的，有时称为人工细胞)。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸盐组合。核苷酸可以包括合成的核苷酸。核苷酸可以包括合成的核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷、腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)和脱氧核苷三磷酸，例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。所述衍生物可以包括，例如[αS]dATP、7-去氮-dGTP和7-去氮-dATP以及赋予含有其的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文所用的术语核苷酸可以指双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)及其衍生物。双脱氧核苷三磷酸的说明性示例可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过公知技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测的标记物可以包括例如放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和酶标记物。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4'二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、瀑布蓝、俄勒冈绿、德州红、花青和5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体示例可包括从加利福尼亚州福斯特城珀金埃尔默获得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMA]ddGTP和[dROX]ddTTP；从伊利诺伊阿灵顿高地阿默舍姆获得的FluoroLink DeoxyNucleotides、Fluorolink Cy3-dCTP、Fluorolink Cy5-dCTP、Fluorolink Fluor X-dCTP、Fluorolink Cy3-dUTP和Fluorolink Cy5-dUTP；从印第安纳州印第安纳波利斯宝灵曼获得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2'-dATP；和从俄勒冈州尤金分子探针公司获得的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、瀑布蓝-7-UTP、瀑布蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基若丹明-6-UTP、四甲基若丹明-6-dUTP、德州红-5-UTP、德州红-5-dUTP和德州红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰标记或标识。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化dNTP的一些非限制性示例可包括生物素-dATP(例如，生物素-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指单链、双链或多链形式的任何长度的聚合形式的核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸对于细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。如果存在，可在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。类似物的一些非限制性示例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-去氮-GTP、荧光团(例如，连接到糖的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、连接生物素的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性示例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
术语“转染”或“转染的”通常指通过非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。参见，例如，Sambrook等1989年分子克隆：实验室手册，18.1-18.88。
术语“表达”指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录后的mRNA随后转译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码后的多肽可统称为“基因产物”。“如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。关于表达的“上调”通常指相对于其在野生型状态下的表达水平多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平增加，而“下调”通常指相对于其在野生型状态下的表达多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平降低。
本文所用的术语“基因”是指任选地与相关调节区如启动子、操纵子、终止子等一起的编码单个蛋白质或RNA的核酸片段(也称为“编码序列”或“编码区”)，相关调节区可以位于编码序列的上游或下游。术语“基因”应作广义解释，并且可以包括基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在一些应用中，术语“基因”包括转录序列，包括5′和3′非翻译区(5′-UTR和3′-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，所述转录区含有编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些方面，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(ribosomal)和转运RNA(tRNA)基因。在一些方面，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，非转录区包括上游和下游调节区、增强子和启动子。术语“基因”可以包括基因的mRNA、cDNA和基因组形式。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可在涉及氨基酸残基的聚合物时互换使用。蛋白可以指从编码开放阅读框翻译的全长多肽，或加工成其成熟形式，而多肽或肽可以指仍然独特地或可鉴别的映射于特定蛋白质的降解片段或处理片段。多肽可以是通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起的氨基酸的单一线性聚合物链。多肽可以例如通过添加碳水化合物、磷酸化等被修饰。蛋白可以包含一种或多种多肽。
如本文所用，术语“片段”或等同术语可指具有小于蛋白全长的长度并可选地维持蛋白的功能的蛋白质的一部分。此外，当针对该蛋白质比对蛋白质的该部分时，蛋白质序列的该部分可以与蛋白序列的一部分例如至少80％的同一。
如本文所用，术语“互补物”、“互补的”和“互补性”通常是指与给定序列完全互补并且可与给定序列杂交的序列。在一些情况下，如果与给定核酸杂交的序列在给定区域上的碱基序列能够互补性地结合其结合配偶体的碱基序列，使得形成例如A-T、A-U、G-C和G-U碱基对，则该序列被称为给定分子的“互补物”或“反向互补物”。通常，可与第二序列杂交的第一序列可与第二序列特异性或选择性杂交，使得在杂交反应期间与第二序列或第二序列组的杂交对于与非靶序列杂交是优选的(例如，在给定的条件组下，如本领域中通常使用的严格条件下，热力学上更稳定)。通常，可杂交序列在其各自长度的全部或部分上共有一定程度的序列互补性，例如25％-100％之间的互补性，包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％序列互补性。序列同一性，如为了评估互补性百分比，可以通过任何合适的比对算法进行测量，且算法包括但不限于尼德勒曼-翁施算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/Psa/Embose_Needle/Nucleotide.html获得的EMBOSS针比对工具，可选择地具有默认设置)、BLAST算法(参见例如可在Blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi获得的BLAST比对工具，可选择地具有默认设置)或Smith-erman算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/Psa/Embose_Water/Nucleotide.html获得的EMBOSS Water比对工具，任选地具有默认设置)。最佳比对可以使用所选算法的任何合适参数(包括默认参数)进行评估。
如本文所用，术语“同一性百分比(％)”通常是指在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比同一性(即，可在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入缺口用于最佳比对，并且出于比较目的可忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核酸)残基与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。为了确定同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式实现比对，例如，使用公开的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。两个序列的同一性百分比可通过使用BLAST比对测试序列与比较序列，确定比对的测试序列中与比较序列的相同位置的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，并将相同的氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中的氨基酸或核苷酸的数目来计算。
术语“错配”通常指在比对时两个核苷酸之间缺乏互补性。DNA中的互补碱基是A-T和G-C。RNA中的互补碱基是A-U和G-C。因此，当两个寡核苷酸序列进行比对时并且在DNA中A不与T配对、或G不与C配对、或在RNA中A不与U配对、或G不与C配对的一个或多个核苷酸位置处，发生错配。
如本文所用，术语“体内”可用于描述在受试者的体内发生的事件。
如本文所用，术语“离体”可用于描述在受试者的体外发生的事件。不能对受试者进行“离体”测定。相反，其可以在与受试者分离的样品上进行。离体可用于描述在受试者的体外的完整细胞中发生的事件。
如本文所用，术语“体外”可用于描述发生在用于容纳实验室试剂的容器中的事件使其与获得该材料的活的生物来源生物体分离。体外测定可包括基于细胞的测定，且测定使用活的或死的细胞。体外测定也可包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
“治疗”或“处理”可以指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)靶向性病理状况或疾病。需要治疗的受试者包括已经患有病症的受试者，以及有患有疾病的倾向的受试者，或需要预防疾病的受试者。治疗益处可以指症状或所治疗的潜在疾病的根除或改善。此外，通过根除或改善与潜在疾病相关的一种或多种生理症状使得在受试者中观察到改善，尽管受试者仍然可以受潜在疾病的折磨可以实现治疗益处。预防效果可包括延迟、预防或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。对于预防性益处，处于发生特定疾病的风险中的受试者或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者可以进行治疗，即使不能进行对该疾病的诊断。
在本文中术语“有效量”和“治疗有效量”可互换使用，通常指组合物例如包含免疫细胞如淋巴细胞(例如T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物、包含本发明的系统的量，其在施用于有需要治疗的受试者后足以产生所需的活性。在本公开的上下文中，术语“治疗有效”是通过本公开的方法足以延迟临床表现、阻止进展、减轻或缓解疾病的至少一种症状的组合物的量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上，组分可以是“药学上可接受的”。组分也可以适用于与人和动物的组织或器官接触，且没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，且与合理的利益/风险比相称。参见，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition；LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,5th Edition"；Rowe等人,Eds.,The Pharmaceutical Press and the AmericanPharmaceutical Association:2005；and Handbook of Pharmaceutical Additives,3rdEdition；Ash and Ash Eds.,Gower Publishing Company:2007；PharmaceuticalPreformulation and Formulation,Gibson Ed.,CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004)。
术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与如稀释剂或载体的其他化学组分的混合物。所述药物组合物可有利于所述化合物向生物体的施用。本领域存在多种化合物施用技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、非消化道施用和局部施用。
本公开涉及用PD-L1改造的间充质干细胞外来体：一种在自身免疫疾病和移植中诱导耐受的新颖的无细胞疗法。例如外来体和微泡(也称为脱落囊泡)的细胞外囊泡携带影响细胞外环境和免疫系统的生物活性分子。已经显示，外来体PD-L1具有与细胞表面PD-L1相同的膜拓扑结构，其中其胞外域暴露于外来体的表面上。外来体PD-L1以浓度依赖性地结合PD-1，并且该相互作用可被PD-L1-阻断抗体破坏。高水平的外来体PD-L1可反映T细胞“衰竭”到其不再能通过抗PD-1治疗再具有活力的阶段。此外，响应IFN-γ的外来体PD-L1的增加可使肿瘤细胞自适应灭活CD8T细胞。
首先从健康个体中分离间充质干细胞。一旦扩增，这些细胞可以储存以备进一步使用。然后，这些细胞可以用PD-L1改造。为此，PDL1基因可与乳凝集素基因融合。其使得PD-L1分子插入到外来体外部。在证实改造成功后，这些细胞在生物反应器上生长，并且可以收获条件培养基以分离外来体。对于外来体分离，可用切向流过滤获得和纯化外来体。这些外来体具有抑制免疫系统特别是CD8+和CD25+效应细胞的能力。这些效应细胞是所有自身免疫疾病发病机理和移植中排斥过程的关键。一旦这些外来体在cGMP设施下产生并满足所有能力和其他要求，这些外来体就可用于治疗患者。在一些实施方案中，所述间充质干细胞外来体可用PD-L1改造以增强其抑制活性。在一些实施方案中，PD-L1改造的间充质干细胞外来体可为包括I型糖尿病、多发性硬化症、COPD、狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎或银屑病的所有自身免疫疾病和移植的进行治疗。在一些实施方案中，如果在低氧条件下培养改造的调节性T细胞，则所述PD-L1改造的间充质干细胞外来体的功能可被提高。在一些实施方案中，所述PD-L1改造的间充质干细胞外来体可具有抑制患者中的活化的免疫系统特别是CD8+CD25+细胞的能力。在一些实施方案中，通过使用本文所述的平台，可将任何其他细胞或外来体进行改造以包含PD-L1，类似于间充质干细胞和间充质干细胞来源的外来体。在一些实施方案中，所述PD-L1改造的间充质干细胞外来体可在cGMP设备下进行制备。在一些实施方案中，所述PD-L1改造的间充质干细胞外来体可被认为是临床级外来体，以治疗所有自身免疫疾病和作为移植程序接受任何器官的患者。
本公开涉及用VISTA/PD-L1/CTLA-4改造的间充质干细胞外来体：一种在自身免疫疾病和移植中诱导耐受的新颖的无细胞治疗。例如外来体和微泡(也称为脱落囊泡)的细胞外囊泡携带影响细胞外环境和免疫系统的生物活性分子。已经显示，外来体PD-L1具有与细胞表面PD-L1相同的膜拓扑结构，其中其胞外域暴露于外来体的表面上。外来体PD-L1以浓度依赖性地结合PD-1，并且该相互作用可被PD-L1-阻断抗体破坏。高水平的外来体PD-L1可反映T细胞“衰竭”到其不再能通过抗PD-1治疗再具有活力的阶段此外，响应IFN-γ的外来体PD-L1的增加可使肿瘤细胞自适应灭活CD8T细胞。T细胞活化的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)是在造血细胞上表达的T细胞功能的有效负调节因子。VISTA水平在肿瘤微环境中升高，且在该环境中其阻断可增强小鼠中的抗肿瘤免疫反应。VISTA主要在造血区室中进行表达，且在髓系中表达最高。VISTA-Ig抑制T细胞的增殖并钝化T细胞因子和活化标记的产生。VISTA是抑制性免疫检查点分子，当在抗原呈递细胞上进行表达时，其抑制CD4+和CD8+T细胞活化。VISTA在TLR7刺激后严格调节由DC和产生IL-17的TCRγδ+和CD4+Th17T细胞介导的炎症应答。CTLA4或CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152(分化抗原簇152)是一种作为免疫检查点发挥功能并下调免疫应答的蛋白受体。CTLA4在调节性T细胞中进行结构性表达，但在活化后仅在常规T细胞中上调-在癌症中特别值得注意的现象。当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，其作为一种“关闭”开关。
在一些实施方案中，间充质干细胞可以首先从健康个体分离。一旦扩增，这些细胞可以储存以备进一步使用。然后，这些细胞可以用VISTA/PD-L1/CTLA-4单独或组合地进行改造。可以使用下列免疫检查点代替VISTA、PD-L1和CTLA-4或与其组合：PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H4(VTCN1)、HVEM(CD270，TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(粘连蛋白-2，CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、Stabilin-1(Clever-1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44或SIRPα(CD172a)。
为此，本文所述的免疫检查点基因中的一种或组合可与乳凝集素基因或GPI蛋白或其他蛋白质或接头融合。其允许检查点蛋白被插入到外来体的外部。在证实改造成功后，这些细胞在生物反应器上生长，并且可以收集条件培养基以分离外来体。对于外来体分离，可用切向流过滤获得和纯化外来体。所述外来体具有抑制免疫系统特别是抑制CD4+/CD25+，CD8+CD25+效应细胞或树突细胞和B细胞的能力。这种抑制取决于外来体表面上的检查点分子的组合。所述效应细胞是所有自身免疫疾病发病机理和移植中排斥过程的关键。一旦所述外来体在cGMP设施下产生并满足所有能力和其他要求，所述外来体就可用于治疗患者。在一些实施方案中，间充质干细胞外来体可用检查点分子改造以增强其抑制活性。所述检查点可以是VISTA/PD-L1/CTLA-4的组合或单独的。在一些实施方案中，所述检查点可以是本文所述的免疫检查点基因的任何组合。在一些实施方案中，所述检查点修饰的间充质干细胞外来体可以用于所有自身免疫疾病和移植，包括但不限于类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化症、炎性肠病、乳糜泻、克罗恩病、格雷夫斯病、幼年型关节炎、慢性莱姆病、视神经炎、银屑病性关节炎、巩膜炎、硬皮病、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎、炎性眼病、白癜风、COPD或器官移植的治疗。在一些实施方案中，通过利用本文所述的平台，可以用免疫检查点(类似于人成纤维细胞的间充质干细胞及其外来体)改造任何其他细胞或外来体。在一些实施方案中，具有检查点分子的经修饰的外来体可以制造为可注射的、滴眼剂、喷雾器或喷雾剂、乳膏剂和局部软膏剂或视为药物的任何其他形式30。在一些实施方案中，外来体可以在cGMP设备下制备，并且可以被认为是临床级外来体，以治疗所有自身免疫疾病和作为移植程序接受任何器官的患者。
I.组合物
在一些实施方案中，本文描述了包含从本文所述的平台和方法产生的细胞外囊泡的组合物。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是由细胞分泌的膜结合颗粒。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是体外产生的膜结合颗粒。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是离体产生的膜结合颗粒。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是在无细胞的情况下产生的膜结合颗粒。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含外来体、微泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡小体、凋亡体、癌小体、外显子、包膜病毒、外泌体或其他非常大的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是外来体。
在一些情况下，所述细胞外囊泡包括1nm至约10,000nm的直径。在一些情况下，所述细胞外囊泡包括约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约50nm、约1nm至约100nm、约1nm至约200nm、约1nm至约500nm、约1nm至约1,000nm、约1nm至约2,000nm、约1nm至约5,000nm、约1nm至约10,000nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约50nm、约5nm至约100nm、约5nm至约200nm、约5nm至约500nm、约5nm至约1,000nm、约5nm至约2,000nm、约5nm至约5,000nm、约5nm至约10,000nm、约10nm至约20nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约200nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约2,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约20nm至约50nm，约20nm至约100nm、约20nm至约200nm、约20nm至约500nm、约20nm至约1,000nm、约20nm至约2,000nm、约20nm至约5,000nm、约20nm至约10,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约200nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约2,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约100nm至约200nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约2,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约200nm至约500nm、约200nm至约1,000nm、约200nm至约2,000nm、约200nm至约5,000nm、约200nm至约10,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约2,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约1,000nm至约2,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm、约2,000nm至约5,000nm、约2,000nm至约10,000nm或约5,000nm至约10,000nm的直径。在一些情况下，所述细胞外囊泡包括约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。在一些情况下，所述细胞外囊泡包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm或约5,000nm的直径。在一些情况下，所述细胞外囊泡包括至多约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。
在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包括至少约1nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包括至少约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约50nm、约1nm至约100nm、约1nm至约200nm、约1nm至约500nm、约1nm至约1,000nm、约1nm至约2,000nm、约1nm至约5,000nm、约1nm至约10,000nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约50nm、约5nm至约100nm、约5nm至约200nm、约5nm至约500nm、约5nm至约1,000nm、约5nm至约2,000nm、约5nm至约5,000nm、约5nm至约10,000nm、约10nm至约20nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约200nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约2,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约20nm至约50nm、约20nm至约100nm、约20nm至约200nm、约20nm至约500nm、约20nm至约1,000nm、约20nm至约2,000nm、约20nm至约5,000nm、约20nm至约10,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约200nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约2,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约100nm至约200nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约2,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约200nm至约500nm、约200nm至约1,000nm、约200nm至约2,000nm、约200nm至约5,000nm、约200nm至约10,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约2,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约1,000nm至约2,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm、约2,000nm至约5,000nm、约2,000nm至约10,000nm、或约5,000nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm或约5,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包括至少至多约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。
在一些实施方案中，所述组合物包含多个细胞外囊泡的异质群体。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体具有约1nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体具有约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约50nm、约1nm至约100nm、约1nm至约200nm、约1nm至约500nm、约1nm至约1,000nm、约1nm至约2,000nm、约1nm至约5,000nm、约1nm至约10,000nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约50nm、约5nm至约100nm、约5nm至约200nm、约5nm至约500nm、约5nm至约1,000nm、约5nm至约2,000nm、约5nm至约5,000nm、约5nm至约10,000nm、约10nm至约20nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约200nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约2,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约20nm至约50nm、约20nm至约100nm、约20nm至约200nm、约20nm至约500nm、约20nm至约1,000nm、约20nm至约2,000nm、约20nm至约5,000nm、约20nm至约10,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约200nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约2,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约100nm至约200nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约2,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约200nm至约500nm、约200nm至约1,000nm、约200nm至约2,000nm、约200nm至约5,000nm、约200nm至约10,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约2,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约1,000nm至约2,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm、约2,000nm至约5,000nm、约2,000nm至约10,000nm、或约5,000nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm之间的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm或约5,000nm之间的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至多约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm之间的直径。
在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少约1nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约50nm、约1nm至约100nm、约1nm至约200nm、约1nm至约500nm、约1nm至约1,000nm、约1nm至约2,000nm、约1nm至约5,000nm、约1nm至约10,000nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约50nm、约5nm至约100nm、约5nm至约200nm、约5nm至约500nm、约5nm至约1,000nm、约5nm至约2,000nm、约5nm至约5,000nm、约5nm至约10,000nm、约10nm至约20nm、约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约200nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约2,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约20nm至约50nm、约20nm至约100nm、约20nm至约200nm、约20nm至约500nm、约20nm至约1,000nm、约20nm至约2,000nm、约20nm至约5,000nm、约20nm至约10,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约200nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约2,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约100nm至约200nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约2,000nm、约100nm至约5,000nm、约100nm至约10,000nm、约200nm至约500nm、约200nm至约1,000nm、约200nm至约2,000nm、约200nm至约5,000nm、约200nm至约10,000nm、约500nm至约1,000nm、约500nm至约2,000nm、约500nm至约5,000nm、约500nm至约10,000nm、约1,000nm至约2,000nm、约1,000nm至约5,000nm、约1,000nm至约10,000nm、约2,000nm至约5,000nm、约2,000nm至约10,000nm、或约5,000nm至约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少约1nm、约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm或约5,000nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的异质群体包括至少至多约5nm、约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1,000nm、约2,000nm、约5,000nm或约10,000nm的直径。
在一些实施方案中，所述组合物包含多个细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的同质群体包括约10nm至约150nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的同质群体包括约10nm至约30nm、约10nm至约40nm、约10nm至约50nm、约10nm至约60nm、约10nm至约70nm、约10nm至约80nm、约10nm至约90nm、约10nm至约100nm、约10nm至约110nm、约10nm至约120nm、约10nm至约150nm、约30nm至约40nm、约30nm至约50nm、约30nm至约60nm、约30nm至约70nm、约30nm至约80nm、约30nm至约90nm、约30nm至约100nm、约30nm至约110nm、约30nm至约120nm、约30nm至约150nm、约40nm至约50nm、约40nm至约60nm、约40nm至约70nm、约40nm至约80nm、约40nm至约90nm、约40nm至约100nm、约40nm至约110nm、约40nm至约120nm、约40nm至约150nm、约50nm至约60nm，约50nm至约70nm、约50nm至约80nm、约50nm至约90nm、约50nm至约100nm、约50nm至约110nm、约50nm至约120nm、约50nm至约150nm、约60nm至约70nm、约60nm至约80nm、约60nm至约90nm、约60nm至约100nm、约60nm至约110nm、约60nm至约120nm、约60nm至约150nm、约70nm至约80nm、约70nm至约90nm、约70nm至约100nm、约70nm至约110nm、约70nm至约120nm、约70nm至约150nm、约80nm至约90nm、约80nm至约100nm、约80nm至约110nm、约80nm至约120nm、约80nm至约150nm、约90nm至约100nm、约90nm至约110nm、约90nm至约120nm、约90nm至约150nm、约100nm至约110nm、约100nm至约120nm、约100nm至约150nm、约110nm至约120nm、约110nm至约150nm或约120nm至约150nm的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的同质群体包括约10nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm、约120nm或约150nm之间的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的同质群体包括至少约10nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm或约120nm之间的直径。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡的同质群体包括至多约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm、约120nm或约150nm之间的直径。
免疫检查点部分
在一些实施方案中，本文公开的是包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含多个免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分可以相同或不同。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分被所述细胞外囊泡封装。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分在所述细胞外囊泡的表面上表达。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分由所述细胞外囊泡分泌。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分被所述细胞外囊泡封装。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分在所述细胞外囊泡的表面上表达；由细胞外囊泡分泌；通过细胞外囊泡被递送至靶细胞或靶微环境；或其组合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含用于治疗疾病或病症的治疗特性。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，可向受试者施用包含含有所述免疫检查点部分的所述细胞外囊泡的所述组合物以治疗疾病或病症。
在一些实施方案案中，所述免疫检查点部分包含多肽，所述多肽包含编码VISTA、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H3、B7-H4(VTCN1)、IDO、KIR、LAG3、A2AR、HVEM(CD270，TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(粘连蛋白-2，CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、Stabilin-1(Clever-1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44或SIRPα(CD172a)的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码VISTA的肽序列或其变体或其片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：1(表1)100％同一的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码PD-L1的肽序列或其变体或其片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：2(表1)100％同一的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码CTLA-4的肽序列或其变体或其片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：3至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的肽序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与SEQ ID NO：3(表1)100％同一的肽序列。
表1.VISTA，CTLA-4，PD-L1和CTLA-4的肽序列
Figure BDA0003512945010000281
Figure BDA0003512945010000291
在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包括mRNA、rRNA、SRP RNA、tRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、gRNA、aRNA、crRNA、lncRNA、miRNA、ncRNA、piRNA、siRNA和shRNA。在一些情况下，所述异源多核苷酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码VISTA、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H3、B7-H4(VTCN1)、IDO、KIR、LAG3、A2AR、HVEM(CD270，TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(粘连蛋白-2，CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、Stabilin-1(Clever-1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44或SIRPα(CD172a)的核酸序列。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码VISTA的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码PD-L1的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码CTLA-4的异源多核苷酸。
在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含编码细胞因子的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含含有细胞因子的肽序列的多肽。可用作所述免疫检查点部分的示例性细胞因子包括4-1BBL、酰化刺激蛋白、脂肪细胞因子、alb干扰素、APRIL、Arh、BAFF、Bcl-6、CCL1、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CD153、CD154、CD178、CD40LG、CD70、CD95L/CD178、Cerberus(蛋白)、趋化因子、CLCF1、CNTF、集落刺激因子、共用b链(CD131)、共用g链(CD132)、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCR3、CXCR4、CXCR5、EDA-A1、Epo、促红细胞生成素、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Flt-3L、FMS样酪氨酸激酶3配体、Foxp3、GATA-3、GcMAF、G-CSF、GITRL、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFNω/IFNW1、IL-1、IL-10、IL-10家族、IL-10-like、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17家族、IL-17A–F、IL-18、IL-18BP、IL-19、IL-1A、IL-1B、IL-1F10、IL-1F3/IL-1RA、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1-like、IL-1RA、IL-1RL2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-3、IL-31、IL-33、IL-35、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6-like、IL-7、IL-8/CXCL8、IL-9、炎性体、干扰体、干扰素、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、干扰素I型、干扰素II型、干扰素III型、干扰素、白介素、白介素1受体拮抗剂、白介素8、IRF4、瘦素、白血病抑制因子(LIF)、白细胞促进因子、LIGHT、LTA/TNFB、LT-β、淋巴因子、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白、巨噬细胞活化因子、M-CSF、MHC III型、杂血细胞生成素、单核因子、MSP、肌细胞因子、肌联素、烟酰胺磷酸核糖转移酶、制瘤素M(OSM)、奥普瑞白介素、OX40L、血小板因子4、Promegapoietin、RANKL、SCF、STAT3、STAT4、STAT6、基质细胞来源的因子1、TALL-1、TBX21、TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF4、TNFSF8、TNF-α、TNF-β、Tpo、TRAIL、TRANCE、TWEAK、血管内皮生长抑制物、XCL1或XCL2。
在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可与本文所述的跨膜部分复合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可与本文所述的跨膜部分非共价复合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可与本文所述的跨膜部分共价复合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可表达为包含免所述疫检查点部分和所述跨膜部分两者的融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可表达包含免所述疫检查点部分和所述跨膜部分的一片段的两者的融合蛋白的一部分，在一些实施方案中，所述免疫检查点部分的N-端可融合至所述跨膜部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分的C端可融合至本文所述的跨膜部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分可在所述免疫检查点部分的N和C端两侧被融合并且侧翼是所述跨膜部分。例如，所述免疫检查点部分可以作为融合肽的一部分插入一跨膜部分，其中所述融合肽的N端包含所述跨膜部分的片段，之后是所述免疫检查点部分(或其变体或其片段)，再之后是包含所述跨膜部分的另一片段的所述融合肽的C端。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含所述融合肽，其中所述免疫检查点部分与所述跨膜部分融合。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与所述跨膜部分复合的所述免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与所述跨膜部分非共价复合的所述免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述免疫检查点部分包含与所述跨膜部分共价复合的所述免疫检查点部分。
在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含多个本文所述的免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述多个免疫检查点部分被封装在所述细胞外囊泡中。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡封装至少1个、10个、100个、500个、1,000个、5,000个、10,000个、50,000个、100,000个、500,000个、1,000,000个、5,000,000个或更多个单位的所述免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡将所述封装的免疫检查点递送至靶细胞或靶微环境。
在一些实施方案中，所述细胞外囊泡分泌多个本文所述的免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡分泌至少1个、10个、100个、500个、1,000个、5,000个、10,000个、50,000个、100,000个、500,000个、1,000,000个、5,000,000个或更多个单位的所述免疫检查点部分。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡将所述免疫检查点部分分泌至靶细胞或靶环境。
在一些实施方案中，所述多个免疫检查点部分在所述细胞外囊泡的表面上表达。在一些实施方案中，所述多个免疫检查点部分表达为包含免疫检查点部分和跨膜部分的融合肽的一部分。在一些情况下，包含在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的细胞外囊泡与靶细胞或靶环境接触。
在一些实施方案中，可以在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的数量单位受限于由以下之间的比率所确定的理论最大值：所述细胞外囊泡的尺寸；以及所表达的免疫检查点部分或包含所述免疫检查点部分的所表达的融合肽的尺寸。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡表面上表达的免疫检查点部分单位的理论最大数量单位的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的理论最大数量单位的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少30％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少70％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少75％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少80％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少85％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少90％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少95％。在一些实施方案中，本文所述的平台和方法可以产生和选择在细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体，所述多个单位是可在所述细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分单元的理论最大数量单位的至少95％。
在一些实施方案中，每个细胞外囊泡在所述细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分，其中所述多个单位可以是约5个单位至约1,000,000个单位。在一些实施方案中，每个细胞外囊泡在所述细胞外囊泡表面上表达多个单位的免疫检查点部分，其中所述多个单位可以是约5个单位至约10个单位、约5个单位至约50个单位、约5个单位至约100个单位、约5个单位至约500个单位、约5个单位至约1,000个单位、约5个单位至约5,000个单位、约5个单位至约10,000个单位、约5个单位至约50,000个单位、约5个单位至约100,000个单位、约5个单位至约500,000个单位、约5个单位至约1,000,000个单位、约10个单位至约50个单位、约10个单位至约100个单位、约10个单位至约500个单位、约10个单位至约1,000个单位、约10个单位至约5,000个单位、约10个单位至约10,000个单位、约10个单位至约50,000个单位、约10个单位至约100,000个单位、约10个单位至约500,000个单位、约10个单位至约1,000,000个单位、50个单位至约100个单位、约50个单位至约500个单位、约50个单位至约1,000个单位、约50个单位至约5,000个单位、约50个单位至约10,000个单位、约50个单位至约50,000个单位、约50个单位至约100,000个单位、约50个单位至约500,000个单位、约50个单位至约1,000,000个单位、约100个单位至约500个单位、约100个单位至约1,000个单位、约100个单位至约5,000个单位、约100个单位至约10,000个单位、约100个单位至约50,000个单位、约100个单位至约100,000个单位、约100个单位至约500,000个单位、约100个单位至约1,000,000个单位、约500个单位至约1,000个单位、约500个单位至约5,000个单位、约500个单位至约10,000个单位、约500个单位至约50,000个单位、约500个单位至约100,000个单位、约500个单位至约500,000个单位、约500个单位至约1,000,000个单位、约1,000个单位至约5,000个单位、约1,000个单位至约10,000个单位、约1,000个单位至约50,000个单位、约1,000个单位至约100,000个单位、约1,000个单位至约500,000个单位、约1,000个单位至约1,000,000个单位、约5,000个单位至约10,000个单位、约5,000个单位至约50,000个单位、约5,000个单位至约100,000个单位、约5,000个单位至约500,000个单位、约5,000个单位至约1,000,000个单位、约10,000个单位至约50,000个单位、约10,000个单位至约100,000个单位、约10,000个单位至约500,000个单位、约10,000个单位至约1,000,000个单位、约50,000个单位至约100,000个单位、约50,000个单位至约500,000个单位、约50,000个单位至约1,000,000个单位、约100,000个单位至约500,000个单位、100,000个单位至约1,000,000个单位或约500,000个单位至约1,000,000个单位。在一些实施方案中，每个细胞外囊泡在所述细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分，其中所述多个单位可以是约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。在一些实施方案中，每个细胞外囊泡在所述细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分，其中所述多个单位可以是至少约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位或约500,000个单位。在一些实施方案中，每个细胞外囊泡在所述细胞外囊泡的表面上表达多个单位的免疫检查点部分，其中所述多个单位可以是至多约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含细胞外囊泡的异质群体，细胞外囊泡的表面上表达任何数量单位的本文所述的免疫检查点部分。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含细胞外囊泡的表面上表达数量单位范围内的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达为至少约5个单位至约1,000,000个单位的多个单位的免疫检查点部分。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分的单位的数量，多个单位为至少约5个单位至约10个单位、约5个单位至约50个单位、约5个单位至约100个单位、约5个单位至约500个单位、约5个单位至约1,000个单位、约5个单位至约5,000个单位、约5个单位至约10,000个单位、约5个单位至约50,000个单位、约5个单位至约100,000个单位、约5个单位至约500,000个单位、约5个单位至约1,000,000个单位、约10个单位至约50个单位、约10个单位至约100个单位、约10个单位至约500个单位、约10个单位至约1,000个单位、约10个单位至约5,000个单位、约10个单位至约10,000个单位、约10个单位至约50,000个单位、约10个单位至约100,000个单位、约10个单位至约500,000个单位、约10个单位至约1,000,000个单位、约50个单位至约100个单位、约50个单位至约500个单位、约50个单位至约1,000个单位、约50个单位至约5,000个单位、约50个单位至约10,000个单位、约50个单位至约50,000个单位、约50个单位至约100,000个单位、约50个单位至约500,000个单位、约50个单位至约1,000,000个单位、约100个单位至约500个单位、约100个单位至约1,000个单位、约100个单位至约5,000个单位、约100个单位至约10,000个单位、约100个单位至约50,000个单位、约100个单位至约100,000个单位、约100个单位至约500,000个单位、约100个单位至约1,000,000个单位、约500个单位至约1,000个单位、约500个单位至约5,000个单位、约500个单位至约10,000个单位、约500个单位至约50,000个单位、约500个单位至约100,000个单位、约500个单位至约500,000个单位、约500个单位至约1,000,000个单位、约1,000个单位至约5,000个单位、约1,000个单位至约10,000个单位、约1,000个单位至约50,000个单位、约1,000个单位至约100,000个单位、约1,000个单位至约500,000个单位、约1,000个单位至约1,000,000个单位、约5,000个单位至约10,000个单位、约5,000个单位至约50,000个单位、约5,000个单位至约100,000个单位、约5,000个单位至约500,000个单位、约5,000个单位至约1,000,000个单位、约10,000个单位至约50,000个单位、约10,000个单位至约100,000个单位、约10,000个单位至约500,000个单位、约10,000个单位至约1,000,000个单位、约50,000个单位至约100,000个单位、约50,000个单位至约500,000个单位、约50,000个单位至约1,000,000个单位、约100,000个单位至约500,000个单位、约100,000个单位至约1,000,000个单位或约500,000个单位至约1,000,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至少约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至少约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位或约500,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至少至多约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。
在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多约5个单位至约1,000,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多约5个单位至约10个单位、约5个单位至约50个单位、约5个单位至约100个单位、约5个单位至约500个单位、约5个单位至约1,000个单位、约5个单位至约5,000个单位、约5个单位至约10,000个单位、约5个单位至约50,000个单位、约5个单位至约100,000个单位、约5个单位至约500,000个单位、约5个单位至约1,000,000个单位、约10个单位至约50个单位、约10个单位至约100个单位、约10个单位至约500个单位、约10个单位至约1,000个单位、约10个单位至约5,000个单位、约10个单位至约10,000个单位、约10个单位至约50,000个单位、约10个单位至约100,000个单位、约10个单位至约500,000个单位、约10个单位至约1,000,000个单位、约50个单位至约100个单位、约50个单位至约500个单位、约50个单位至约1,000个单位、约50个单位至约5,000个单位、约50个单位至约10,000个单位、约50个单位至约50,000个单位、约50个单位至约100,000个单位、约50个单位至约500,000个单位、约50个单位至约1,000,000个单位、约100个单位至约500个单位、约100个单位至约1,000个单位、约100个单位至约5,000个单位、约100个单位至约10,000个单位、约100个单位至约50,000个单位、约100个单位至约100,000个单位、约100个单位至约500,000个单位、约100个单位至约1,000,000个单位、约500个单位至约1,000个单位、约500个单位至约5,000个单位、约500个单位至约10,000个单位、约500个单位至约50,000个单位、约500个单位至约100,000个单位、约500个单位至约500,000个单位、约500个单位至约1,000,000个单位、约1,000个单位至约5,000个单位、约1,000个单位至约10,000个单位、约1,000个单位至约50,000个单位、约1,000个单位至约100,000个单位、约1,000个单位至约500,000个单位、约1,000个单位至约1,000,000个单位、约5,000个单位至约10,000个单位、约5,000个单位至约50,000个单位、约5,000个单位至约100,000个单位、约5,000个单位至约500,000个单位、约5,000个单位至约1,000,000个单位、约10,000个单位至约50,000个单位、约10,000个单位至约100,000个单位、约10,000个单位至约500,000个单位、约10,000个单位至约1,000,000个单位、约50,000个单位至约100,000个单位、约50,000个单位至约500,000个单位、约50,000个单位至约1,000,000个单位、约100,000个单位至约500,000个单位、约100,000个单位至约1,000,000个单位或约500,000个单位至约1,000,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多至少约5个单位、约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位或约500,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多至多约10个单位、约50个单位、约100个单位、约500个单位、约1,000个单位、约5,000个单位、约10,000个单位、约50,000个单位、约100,000个单位、约500,000个单位或约1,000,000个单位。
在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为约1,000个单位至约10,000个单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，其为约1,000单位至约1,500单位、约1,000单位至约2,000单位、约1,000单位至约2,500单位、约1,000单位至约3,000单位、约1,000单位至约4,000单位、约1,000单位至约5,000单位、约1,000单位至约6,000单位、约1,000单位至约7,000单位、约1,000单位至约8,000单位、约1,000单位至约9,000单位、约1,000单位至约10,000单位、约1,500单位至约2,000单位、约1,500单位至约2,500单位、约1,500单位至约3,000单位、约1,500单位至约4,000单位、约1,500单位至约5,000单位、约1,500单位至约6,000单位、约1,500单位至约7,000单位、约1,500单位至约8,000单位、约1,500单位至约9,000单位、约1,500单位至约10,000单位、约2,000单位至约2,500单位、约2,000单位至约3,000单位、约2,000单位至约4,000单位、约2,000单位至约5,000单位、约2,000单位至约6,000单位、约2,000单位至约7,000单位、约2,000单位至约8,000单位、约2,000单位至约9,000单位、约2,000单位至约10,000单位、约2,500单位至约3,000单位、约2,500单位至约4,000单位、约2,500单位至约5,000单位、约2,500单位至约6,000单位、约2,500单位至约7,000单位、约2,500单位至约8,000单位、约2,500单位至约9,000单位、约2,500单位至约10,000单位、约3,000单位至约4,000单位、约3,000单位至约5,000单位、约3,000单位至约6,000单位、约3,000单位至约7,000单位、约3,000单位至约8,000单位、约3,000单位至约9,000单位、约3,000单位至约10,000单位、约4,000单位至约5,000单位、约4,000单位至约6,000单位、约4,000单位至约7,000单位、约4,000单位至约8,000单位、约4,000单位至约9,000单位、约4,000单位至约10,000单位、约5,000单位至约6,000单位、约5,000单位至约7,000单位、约5,000单位至约8,000单位、约5,000单位至约9,000单位、约5,000单位至约10,000单位、约6,000单位至约7,000单位、约6,000单位至约8,000单位、约6,000单位至约9,000单位、约6,000单位至约10,000单位、约7,000单位至约8,000单位、约7,000单位至约9,000单位、约7,000单位至约10,000单位、约8,000单位至约9,000单位、约8,000单位至约10,000单位或约9,000单位至约10,000单位。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为约1,000个单位、约1,500个单位、约2,000个单位、约2,500个单位、约3,000个单位、约4,000个单位、约5,000个单位、约6,000个单位、约7,000个单位、约8,000个单位、约9,000个单位或约10,000个单位之间。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至少约1,000个单位、约1,500个单位、约2,000个单位、约2,500个单位、约3,000个单位、约4,000个单位、约5,000个单位、约6,000个单位、约7,000个单位、约8,000个单位或约9,000个单位之间。在一些实施方案中，细胞外囊泡的同质群体表达多个单位的免疫检查点部分，多个单位为至多约1,500个单位、约2,000个单位、约2,500个单位、约3,000个单位、约4,000个单位、约5,000个单位、约6,000个单位、约7,000个单位、约8,000个单位、约9,000个单位或约10,000个单位之间。
跨膜部分
在一些实施方案中，本文公开的是包含含有跨膜部分细胞外囊泡的组合物。在一些实施方案中，跨膜部分包含全长蛋白或其变体或其片段。在一些实施方案中，跨膜选自：14-3-3蛋白ζ/δ、4-3-3蛋白ε、78kDa葡萄糖调节蛋白、乙酰胆碱酯酶/AChE-S、AChE-E、肌动蛋白、胞质1(ACTA)、ADAM10、碱性磷酸酶、α-烯醇酶、α-突触核蛋白、氨肽酶N、淀粉样蛋白βA4/APP、膜联蛋白5A、膜联蛋白A2、AP-1、ATF3、ATP柠檬酸裂解酶、ATP酶、β肌动蛋白(ACTB)、β-淀粉样蛋白42、小窝蛋白-1、CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD14，CD142，CD146，CD163，CD24，CD26/DPP4、CD29/ITGB1、CD3、CD37、CD41、CD42a、CD44、CD45、CD47、CD49、CD49d、CD53、CD63、CD64、CD69、CD73 CD81、CD82、CD9、CD90，密封蛋白、密封蛋白-1、丝切蛋白-1，补体结合蛋白CD55和CD59、胞质热激蛋白90α、胞质热激蛋白90β、胞质热激蛋白、EBV LMP1、EBV LMP2A、EF-1α-1、EF2、EFGR EGFR VIII、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子/CD147、烯醇酶1α(ENO1)、EPCAM、ERBB2、跨膜四蛋白(CD9、CD63和CD81)、脂肪酸合酶、胎球蛋白-A、阀蛋白-1、阀蛋白-2、果糖二磷酸醛缩酶A、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、血型糖蛋白A、GPC1、GPI锚定的5′-核苷酸酶、GTP酶、热激蛋白8(HSPA8)、热激蛋白(HSP70和HSP90)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、肝素酶、异源三聚体G蛋白、HIV Gag、HIV Nef、HLA-DRA、HLA-G、HSV gB、HTLV-1Tax、亨廷顿蛋白、ICAM1、整联蛋白、乳凝集素、LAMP1/2、LAMP2b、富含亮氨酸的受体激酶2、L-乳酸脱氢酶A链、溶酶体相关的膜糖蛋白1、溶酶体相关的膜糖蛋白2、MHC I类、MHC II类、MUC1、多药耐药相关蛋白、肌肉丙酮酸激酶(PKM2)、N-钙粘蛋白、NKCC2、PDCD6IP/Alix、PECAM1、磷酸甘油酸激酶、胎盘朊病毒蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、丙酮酸激酶(PKM)、Rab-14、Rab-5a、Rab-5b、Rab-5c、Rab-7、Rap1B、抵抗素、音猬因子(SHH)、存活蛋白(surviving)、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-4、同线蛋白-1、转铁蛋白受体(TFR2)、TSG101、TSPAN8、肿瘤相关糖蛋白跨膜四蛋白-8、酪氨酸3单氧酶/色氨酸5单氧酶激活蛋白、TYRP-2、膜泡分拣蛋白35或ζ多肽(YWHAZ)。在一些实施方案中，所述跨膜部分包含乳凝集素。在一些实施方案中，跨膜部分包含乳凝集素的C1C2结构域。在一些实施方案中，跨膜部分包含LAMP2。在一些实施方案中，跨膜部分包含LAMP2的LAMP样结构域1。在一些实施方案中，跨膜部分包含LAMP2b。在一些实施方案中，跨膜部分包含与SEQ ID NO：4(表2)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的肽。在一些实施方案中，跨膜部分包含与SEQ IDNO：4 100％同一的肽。在一些实施方案中，跨膜部分包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分包含GPI的聚糖部分。在一些实施方案中，跨膜部分包含GPI的脂质部分。在一些情况下，跨膜部分包含CD63。在一些实施方案中，跨膜部分包含与SEQ ID NO：5(表2)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的肽。在一些实施方案中，跨膜部分包含与SEQ ID NO：5 100％同一的肽。在一些实施方案中，跨膜部分包含经修饰的CD63。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含至少一个CD63跨膜结构域。跨膜结构域可以是CD63的跨膜结构域1(TM1)、CD63的跨膜结构域2(TM2)、CD63的跨膜结构域3(TM3)、CD63的跨膜结构域4(TM4)或其任何组合。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含CD63的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含一个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含两个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含三个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含四个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含五个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含六个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含七个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含八个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含九个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含十个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63可以是截短的CD63，其中去除至少一个跨膜结构域。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含CD63的截短和CD63的至少一个跨膜结构域的添加两者。例如，经修饰的CD63可在N-末端截短以去除TM1，并且进一步包含额外的TM3和TM4，产生经修饰的CD63，其依次包含CD63、TM2、TM3、TM4、TM3和TM4的跨膜结构域。
表2.Lamp2b和CD63的肽序列
Figure BDA0003512945010000431
Figure BDA0003512945010000441
在一些实施方案中，经修饰的CD63包括插入或替代经修饰的CD63的非跨膜结构域(胞质环或胞外环)。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含被免疫检查点部分插入或替代的胞质环。在一些实施方案中，经修饰的CD63包含被免疫检查点部分插入或替代的胞外环。例如，包含免疫检查点部分的多肽可插入经修饰的CD63的胞外环中。或者，包含免疫检查点部分的多肽可替代经修饰的CD63的胞外环的片段。在一些实施方案中，免疫检查点部分可融合至经修饰的CD63的截短版本。在一些实施方案中，免疫检查点部分可融合至经修饰的CD63的N-末端，其中经修饰的CD63在N-末端截短以去除跨膜结构域中的至少一个和/或非跨膜结构域的至少一个。在一些实施方案中，免疫检查点部分可融合至经修饰的CD63的N-末端，其中经修饰的CD63在N-末端截短以去除跨膜结构域中的至少一个和/或非跨膜结构域的至少一个。
在一些实施方案中，免疫检查点部分可通过接头融合至跨膜部分，诸如CD63。在一些实施方案中，接头是连接肽。连接肽不仅用于连接所述部分，而且在一些情况下还提供许多其他功能，诸如，维持协同的结构域间相互作用或保持生物活性(Gokhale RS,KhoslaC.Role of linkers in communication between protein modules.Curr Opin ChemBiol.2000；4:22–27；Ikebe M,Kambara T,Stafford WF,Sata M,Katayama E,Ikebe R.Ahinge at the central helix of the regulatory light chain of myosin iscritical for phosphorylation-dependent regulation of smooth muscle myosinmotor activity.J Biol Chem.1998；273:17702–17707；和Chen XY,Zaro J,and ShenWC.Fusion protein linkers:property,design and functionality.Adv Drug DelivRev 2014；65,1357-1369被并入本文中)。连接肽可以分组为小、中和大接头，尽管也考虑了由这三个范围限定的组内任何位置的示例，其平均长度分别小于或多达4.5±0.7、9.1±2.4和21.0±7.6个残基或较长。在一些实施方案中，连接肽包含5至200个氨基酸。在其他实施方案中，连接肽包含5至25个氨基酸。在一些实施方案中，连接肽是可切割的(例如，包含可被Tev蛋白酶识别和切割的肽序列的连接肽)。
SEQ ID NOS：6-17说明了融合至跨膜部分CD63的免疫检查点部分PD-L1的各种排列(表3)。
表3.免疫检查点部分和跨膜部分融合的肽序列
Figure BDA0003512945010000451
Figure BDA0003512945010000461
Figure BDA0003512945010000471
Figure BDA0003512945010000481
Figure BDA0003512945010000491
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：6至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：6 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：6的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
7在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：7至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：7 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：7的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：8至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：8 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：8的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：9至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：9 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：9的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：10至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：10 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：10的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：11至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：11 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：11的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：12至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：12 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：12的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：13至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：13 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：13的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：14至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：14 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：14的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：15至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：15 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：15的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：16至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：16 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：16的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：17至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的多肽。在一些实施方案中，本文所述的细胞外囊泡表达与SEQ ID NO：17 100％同一的多肽。在一些实施方案中，对应于SEQID NO：17的所表达的多肽被部分地嵌入细胞外囊泡的膜中，并且部分地在细胞外囊泡的表面上表达。
在一些实施方案中，跨膜部分可与本文所述的免疫检查点部分复合。在一些实施方案中，跨膜部分可以与本文所述的免疫检查点部分非共价复合。在一些实施方案中，跨膜部分可与本文所述的免疫检查点部分共价复合。在一些实施方案中，跨膜部分可在跨膜部分的N末端融合到本文所述的免疫检查点部分。在一些实施方案中，跨膜部分可在跨膜部分的C末端融合到本文所述的免疫检查点部分。
在一些实施方案中，免疫检查点部分包含用于治疗疾病或病症的治疗特性。在一些实施方案中，免疫检查点部分包含用于治疗本文所述的自身免疫性疾病的治疗特性。在一些实施方案中，免疫检查点部分靶向并调节免疫细胞的活性。在一些实施方案中，免疫细胞可以是T细胞，包括细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、调节性T细胞和T辅助细胞。
靶向部分
在一些实施方案中，本文描述了包含靶向部分的细胞外囊泡。在一些实施方案中，靶向部分可以在细胞外囊泡的表面上表达。在一些实施方案中，靶向部分可以由细胞外囊泡分泌。，包含靶向部分的细胞外囊泡在靶细胞或靶环境的定位比不含靶向部分的细胞外囊泡的定位高至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，靶向部分包括EBV糖蛋白350，其靶向CD19+B细胞。在一些实施方案中，靶向部分包含LAMP2b，其靶向神经元上的乙酰胆碱受体。在一些实施方案中，靶向部分包含靶向免疫细胞或血细胞的乳凝集素的C1C2结构域。在一些实施方案中，靶向部分包含靶向EGFR或表达EGFR的细胞的PDGFR。在一些实施方案中，靶向部分包含GPI锚定膜蛋白。
在一些实施方案中，靶向部分可以靶向细胞表面蛋白或由靶细胞分泌的蛋白。细胞表面或分泌蛋白的非限制性示例包括本文所述的趋化因子中的任一种。
药物组合物
本文描述了包含本文所述组合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含含有细胞外囊泡的组合物和分泌细胞外囊泡的细胞。如本文所用，药物组合物是指包含细胞外囊泡的治疗剂与其他化学组分(即，药学上可接受的非活性成分)(诸如，载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、保湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合)的混合物。任选地，组合物包含两种或更多种如本文所讨论的治疗剂(例如，一种或多种治疗剂和一种或多种额外的试剂)。在实施本文提供的治疗方法或用途时，将治疗有效量的本文所述的治疗剂以药物组合物的形式施用于患有待治疗的疾病、病症或病况，例如，自身免疫性疾病的哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类。治疗有效量可根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用治疗剂的效力和其他因素而广泛变化。治疗剂可以单独使用或与一种或多种治疗剂组合作为混合物的组分使用。
本文所述的药物制剂通过适当的施用途径施用于受试者，包括但不限于，静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊、局部、经皮、直肠、肌内、皮下、骨内、经粘膜、吸入或腹膜内施用途径。本文所述的药物制剂，包括但不限于，水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散液、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控释制剂、快速熔化制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂和混合立即控释制剂。
包含治疗剂的药物组合物以常规方式制备，诸如，仅作为示例，通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、磨细、乳化、封装、包埋或压制方法制备。
药物组合物可以包含作为活性成分的游离酸或游离碱形式或药学上可接受的盐形式的至少一种治疗剂。此外，本文所述的方法和药物组合物包含使用N-氧化物(如果合适)、晶体形式、无定形相以及这些化合物的具有相同类型活性的活性代谢物。在一些实施方案中，治疗剂以非溶剂化形式或具有药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)的溶剂化形式存在。治疗剂的溶剂化形式也被认为在本文中公开。
在一些实施方案中，治疗剂作为互变异构体存在。所有互变异构体都包括在本文所呈现的试剂的范围内。因此，应当理解，治疗剂或其盐可表现出互变现象，由此两种化合物能够通过交换两个原子之间的氢原子而容易地互变，其中氢原子与两个原子中的任一种形成共价键。由于互变异构化合物以彼此流动平衡存在，因此它们可以被认为是同一化合物的不同异构形式。
在一些实施方案中，治疗剂以对映体、非对映体或其他立体异构形式存在。本文公开的试剂包括所有对映体、非对映体和差向异构形式以及其混合物。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂可以制备为前药。“前药”是指在体内转化为母体药物的试剂。前药通常是有用的，因为在一些情况下，它们可能比母体药物更容易施用。例如，它们可以通过口服施用而被生物利用，而母体则不能。前药在药物组合物中的溶解度也可以高于母体药物。前药的非限制性示例是本文所述的治疗剂，其作为酯(“前药”)施用以促进跨细胞膜的传递，其中水溶性对移动性有害，但一旦进入水溶性有益的细胞内，其随后代谢水解为活性实体羧酸。前药的另一个示例可以是与酸基团结合的短肽(聚氨基酸)，其中肽被代谢以暴露活性部分。在某些实施方案中，通过体内施用，前药化学转化为治疗剂的生物学、药学或治疗活性形式。在某些实施方案中，前药通过一个或多个步骤或过程酶促代谢成治疗剂的生物学、药学或治疗活性形式。
治疗剂的前药形式包括在权利要求的范围内，其中，前药在体内代谢产生如本文所述的试剂。本文所述治疗剂的前药形式包括在权利要求的范围内，其中，前药在体内代谢以产生本文所述的试剂。在一些情况下，本文所述的一些治疗剂可以是另一种衍生物或活性化合物的前药。在本文所述的一些实施方案中，腙在体内代谢以产生治疗剂。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如，Merfen和硫柳汞；稳定化的二氧化氯；和季铵化合物，诸如，苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲铵和氯化十六烷基吡啶。
在一些实施方案中，本文所述的制剂受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物和其他一般稳定剂。这种稳定剂的示例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v的甘油、(b)约0.1％至约1％w/v的甲硫氨酸、(c)约0.1％至约2％w/v的单硫代甘油、(d)约1mM至约10mM的EDTA、(e)约0.01％至约2％w/v的抗坏血酸、(f)0.003％至约0.02％w/v的聚山梨醇酯80、(g)0.001％至约0.05％w/v的聚山梨醇酯20、(h)精氨酸、(i)肝素、(j)硫酸葡聚糖、(k)环糊精、(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素、(m)二价阳离子，诸如，镁和锌；或(n)其组合。
本文所述的药物组合物被配制成任何合适的剂型，包括但不限于，水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液、固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、快速熔化制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉末、丸剂、糖锭剂、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂和混合立即释放控释制剂。在一个方面，本文讨论的治疗剂，例如，治疗剂被配制成适于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。在一个方面，适于肌内、皮下或静脉内注射的制剂包括生理上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的示例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、氢化蓖麻油等)、其合适的混合物、植物油(诸如，橄榄油)和可注射的有机酯，诸如，油酸乙酯。例如，通过使用包衣，诸如，卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在一些实施方案中，适于皮下注射的制剂还含有添加剂，诸如，防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的生长。在一些情况下，需要包含等渗剂，诸如，糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收的试剂，诸如，单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于静脉注射或滴注或输注，本文所述的治疗剂被配制在水溶液中，优选地，在生理相容的缓冲液，诸如，汉克氏液、林格氏液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。对于其他肠胃外注射，合适的制剂包括水性或非水性溶液，优选地，具有生理相容性缓冲液或赋形剂。这些赋形剂是已知的。
肠胃外注射可以涉及快速浓注或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如，在安瓿或多剂量容器中，其具有添加的防腐剂。本文所述的药物组合物可以是适于肠胃外注射的形式，如在油性或水性载体中的无菌悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配方制剂，诸如，悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在一个方面，活性成分是用于在使用前与合适的载体，例如，无菌无热原水重构的粉末形式。
对于吸入施用，治疗剂被配制成气雾剂、雾或粉末使用。本文所述的药物组合物方便地以气雾剂喷雾形式呈现使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体从加压包装或雾化器中递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒，诸如，仅作为示例的明胶，可以配制为含有本文所述的治疗剂和合适的粉末基质(诸如，乳糖或淀粉)的粉末混合物。
代表性的鼻内制剂描述于，例如，第4,476,116号、第5,116,817号和第6,391,452号美国专利中。包含治疗剂的制剂采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂被制备为盐水溶液。参见，例如，Ansel，H.C等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版(1995)。优选地，这些组合物和制剂用合适的无毒的药学上可接受的成分制备。这些成分对于制备鼻剂型的技术人员来说是已知的，并且其中一些可以在REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY，第21版，2005找到。合适载体的选择取决于所需鼻用剂型的确切性质，例如，溶液、悬浮液、软膏或凝胶。鼻用剂型除了活性成分之外通常还含有大量水。任选存在少量的其他成分，诸如，pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂或缓冲剂和其他稳定剂和增溶剂。优选地，鼻剂型应与鼻分泌物等渗。
口服使用的药物制剂通过以下方式获得：通过将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文所述的治疗剂混合，任选地，研磨得到的混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物以得到片剂或糖锭剂核。合适的赋形剂包括，例如，填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，诸如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙的其他。如果需要，添加崩解剂，诸如，交联的交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或诸如海藻酸钠的其盐。在一些实施方案中，将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴别或表征活性治疗剂剂量的不同组合。
在一些实施方案中，治疗剂的药物制剂是胶囊形式，包括由明胶制成的推入配合式胶囊，以及由明胶和增塑剂，诸如甘油或山梨醇，制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊含有与填充剂(诸如，乳糖)、粘合剂(诸如，淀粉)和/或润滑剂(诸如，滑石或硬脂酸镁)以及，任选地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性治疗剂溶解或悬浮在合适的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。在一些实施方案中，添加稳定剂。例如，可以通过将治疗剂制剂的散装混合物置于胶囊内来制备胶囊。在一些实施方案中，将制剂(非水性悬液和溶液)置于软明胶胶囊中。在其他实施方案中，将制剂置于标准明胶胶囊或非明胶胶囊，诸如包含HPMC的胶囊中。在其他实施方案中，将制剂置于喷洒胶囊中，其中，将胶囊整个吞咽或将胶囊打开且在食用前将内容物喷洒在食物上。
所有口服施用制剂都是适于这种施用的剂量。在一个方面，固体口服剂型通过将治疗剂与以下一种或多种混合来制备：抗氧化剂、调味剂和载体材料(诸如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀释剂)。在一些实施方案中，本文公开的固体剂型为片剂(包括悬浮片剂、快速熔化片剂、咬合崩解片剂、快速崩解片剂、泡腾片剂或囊片)、丸剂、粉末、胶囊、固体分散体、固体溶液、生物可腐蚀剂型、控释制剂、脉冲释放剂型、多颗粒剂型、珠粒、小丸、颗粒的形式。在其他实施方案中，药物制剂是粉末形式。压缩片剂是通过将上述制剂的散装混合物压实而制备的固体剂型。在各种实施方案中，片剂将包括一种或多种调味剂。在其他实施方案中，片剂将包括围绕最终压制片剂的膜。在一些实施方案中，薄膜包衣可以提供治疗剂从制剂中的延迟释放。在其他实施方案中，薄膜包衣有助于患者依从性(例如，
Figure BDA0003512945010000581
包衣或糖包衣)。包括
Figure BDA0003512945010000582
的薄膜包衣通常在片剂重量的约1％至约3％的范围内。在一些实施方案中，固体剂型，例如片剂、泡腾片和胶囊，通过将治疗剂颗粒与一种或多种药物赋形剂混合以形成散装混合组合物来制备。散装混合物易于分成等效的单位剂型，诸如，片剂、丸剂和胶囊。在一些实施方案中，所述个体单位剂量包括薄膜包衣。这些制剂通过常规的制剂技术制备。
在另一方面，剂型包括微囊化制剂。在一些实施方案中，一种或多种其他相容材料存在于微囊化材料中。示例性的材料包括但不限于pH调节剂、促蚀剂、消泡剂、抗氧化剂、调味剂和载体材料(诸如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀释剂)。示例性的有用的微囊化材料包括但不限于羟丙基纤维素醚(HPC)，诸如
Figure BDA0003512945010000583
或Nisso HPC；低取代羟丙基纤维素醚(L-HPC)；羟丙基甲基纤维素醚(HPMC)，诸如Seppifilm-LC、
Figure BDA0003512945010000591
Metolose SR、
Figure BDA0003512945010000592
-E、Opadry YS、PrimaFlo、Benecel MP824和Benecel MP843；甲基纤维素聚合物，诸如
Figure BDA0003512945010000593
-A、乙酸羟丙基纤维素硬脂酸酯Aqoat(HF-LS、HF-LG、HF-MS)和
Figure BDA0003512945010000594
乙基纤维素(EC)和其混合物，诸如E461、
Figure BDA0003512945010000595
-EC、
Figure BDA0003512945010000596
聚乙烯醇(PVA)，诸如Opadry AMB、Adry OpB；羟乙基纤维素，诸如
Figure BDA0003512945010000597
羧甲基纤维素和羧甲基纤维素盐(CMC)，诸如
Figure BDA0003512945010000598
-CMC；聚乙烯醇和聚乙二醇共聚体，诸如Kollicoat
Figure BDA0003512945010000599
甘油单酯(Myverol)、甘油三酯(KLX)、聚乙二醇；改性食品用淀粉；丙烯酸类聚合物和丙烯酸类聚合物与纤维素醚的混合物，诸如
Figure BDA00035129450100005910
EPO、
Figure BDA00035129450100005911
L30D-55、
Figure BDA00035129450100005912
FS30D
Figure BDA00035129450100005913
L100-55、
Figure BDA00035129450100005914
L100、
Figure BDA00035129450100005915
S 100、
Figure BDA00035129450100005916
RD100、
Figure BDA00035129450100005917
E100、
Figure BDA00035129450100005918
L12.5、
Figure BDA00035129450100005919
S 12.5、
Figure BDA00035129450100005920
NE30D和
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NE 40D；邻苯二甲酸乙酸纤维素、Sepifilms，诸如HPMC和硬脂酸的混合物；环糊精和这些材料的混合物。
用于口服施用的液体制剂剂型，任选地是，选自包括但不限于以下的水性悬液：药学上可接受的水性口服分散体、乳剂、溶液、酏剂、凝胶和糖浆。参见，例如，Singh等人Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，第2版，第754-757页(2002)。除了治疗剂之外，液体剂型，任选地，包括添加剂，诸如：(a)崩解剂；(b)分散剂；(c)润湿剂；(d)至少一种防腐剂，(e)粘度增强剂，(f)至少一种甜味剂，和(g)至少一种调味剂。在一些实施方案中，水性分散体还包含晶体形成抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的药物制剂是自乳化药物递送系统(SEDDS)。乳液是不混溶相在另一种中的分散体，通常为液滴形式。通常，乳液通过剧烈的机械分散产生。与乳液或微乳液相反，SEDDS在被添加到过量的水中且无需任何外部机械分散或搅拌时自发形成乳液。SEDDS的优点是只需要温和的混合就可将液滴分散在整个溶液中。另外，任选地，在临施用前添加水或水相，这确保不稳定或疏水活性成分的稳定性。因此，SEDDS提供了用于口服和肠胃外递送疏水性活性成分的有效递送系统。在一些实施方案中，SEDDS提供了疏水性活性成分的生物利用度的改善。制备自乳化剂型的方法包括但不限于，例如，第5,858,401号、第6,667,048号和第6,960,563号美国专利。
使用本领域已知的各种制剂施用包含治疗剂的颊制剂。例如，此类制剂包括但不限于第4,229,447号、第4,596,795号、第4,755,386号和第5,739,136号美国专利。此外，本文所述的口腔剂型还可包含生物可侵蚀的(可水解的)聚合物载体，该聚合物载体也用于将剂型粘附到颊粘膜。对于颊或舌下施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶剂的形式。
对于静脉注射，治疗剂，任选地，配制在水溶液中，优选地，在生理相容性缓冲液，诸如，汉克氏液、林格式液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。对于其他肠胃外注射，合适的制剂包括水性或非水性溶液，优选地，具有生理相容性缓冲液或赋形剂。
不经肠道注射，任选地，涉及快速浓注或连续输注。注射用制剂，任选地，以单位剂型存在，例如，在其中添加防腐剂的安瓿或多剂量容器中。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是作为在油性或水性载体中的无菌悬浮液、溶液或乳液的适合于肠胃外注射的形式，并且含有配制试剂，诸如，悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物制剂包含试剂的水溶液，其以水溶性形式调节颈动脉体的活性。另外，任选地，适当制备调节颈动脉体活性的试剂的悬浮液，例如，油性注射悬浮液。
常规的配制技术包括，例如，以下方法中的一种或组合：(1)干混；(2)直接压制；(3)碾磨；(4)干法或非水制粒；(5)湿法制粒；或(6)熔融。其他方法包括，例如，喷雾干燥、锅包衣、熔体制粒、制粒、流化床喷雾干燥或包衣(例如，沃斯特包衣)、切向包衣、顶部喷雾、压片、挤出等。
用于本文所述固体剂型的合适载体包括，但不限于，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、蔗糖、微晶纤维素、乳糖、甘露醇等。
用于本文所述固体剂型的合适填充剂包括，但不限于，乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、葡萄糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
用于本文所述的固体剂型的合适的崩解剂包括，但不限于，天然淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉；预胶化淀粉或羟基乙酸淀粉钠；纤维素，诸如甲基结晶纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素；交联羧甲基纤维素或交联纤维素，诸如交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素或交联羧甲基纤维素；交联淀粉，诸如羟基乙酸淀粉钠；交联聚合物，诸如交聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮；藻酸盐，诸如藻酸；或藻酸盐，诸如海藻酸钠；树胶，诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐树胶、果胶或黄蓍胶；羟基乙酸淀粉钠；膨润土；十二烷基硫酸钠；十二烷基硫酸钠组合淀粉等。
粘合剂赋予固体口服剂型制剂以粘结性：对于粉末填充的胶囊制剂，它们有助于形成可以填充到软壳或硬壳胶囊中的栓，并且对于片剂制剂，它们确保在压制后片剂保持完整，且有助于确保在压制或填充步骤之前的混合均匀性。适合在本文所述的固体剂型中用作粘合剂的材料包括，但不限于，羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和微晶纤维素、微晶葡萄糖、直链淀粉、硅酸镁铝、多糖酸、膨润土、明胶、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、交聚维酮、聚维酮、淀粉、预胶化淀粉、黄蓍胶、糊精、诸如蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖的糖、诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、印度树胶、依莎贝果壳粘液的天然或合成树胶、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、落叶松阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
通常，在粉末填充的明胶胶囊制剂中使用20-70％的粘合剂水平。片剂中粘合剂的使用水平是变化的，无论是直接压片、湿法制粒、碾压，还是使用诸如本身可作为中等粘合剂的填充剂的其他赋形剂。在片剂制剂中粘合剂水平通常高达70％。
用于本文所述固体剂型的合适的润滑剂或助流剂包括，但不限于，硬脂酸、氢氧化钙、滑石、玉米淀粉、硬脂酰富马酸钠、诸如铝、钙、镁、锌的碱金属和碱土金属盐、硬脂酸、硬脂酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸锌、蜡、
Figure BDA0003512945010000621
硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇，诸如，CarbowaxTM、PEG 4000、PEG 5000、PEG 6000、丙二醇、油酸钠、山嵛酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、苯甲酸甘油酯、月桂基硫酸镁或硫酸钠等。
用于本文所述固体剂型的合适稀释剂包括，但不限于糖(包括乳糖、蔗糖和右旋糖)、多糖(包括葡萄糖结合剂和麦芽糖糊精)、多元醇(包括甘露醇、木糖醇和山梨醇)、环糊精等。
用于本文所述固体剂型的合适的润湿剂包括，例如，油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、季铵化合物(例如，Polyquat
Figure BDA0003512945010000622
)、油酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酸镁、多库酯钠、三醋精、维生素E TPGS等。
用于本文所述的固体剂型的合适的表面活性剂包括，例如，十二烷基硫酸钠、失水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、例如，
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(BASF)的环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物等。
用于本文所述固体剂型的合适的悬浮剂包括，但不限于，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30的聚乙烯吡咯烷酮；聚乙二醇，例如，能够具有分子量为约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400的聚乙二醇；乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)；羧甲基纤维素钠；甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；聚山梨醇酯-80；羟乙基纤维素；海藻酸钠；树胶，诸如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、包括黄胞胶的黄原胶；糖；纤维素，诸如例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素；聚山梨醇酯-80；海藻酸钠；聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯；聚维酮等。
用于本文所述的固体剂型的合适的抗氧化剂包括，例如，丁羟甲苯(BHT)、抗坏血酸钠和生育酚。
应当理解，在本文所述的固体剂型中使用的添加剂之间存在相当大的重叠。因此，上述添加剂应仅作为示例，而不是限制可包括在本文所述药物组合物的固体剂型中的添加剂类型。本领域技术人员可以根据所需的特定性能容易地确定这些添加剂的量。
在各种实施方案中，治疗剂的颗粒和一种或多种赋形剂被干混并压缩成诸如片剂的块，其具有足以提供在口服施用后在小于约30分钟、小于约35分钟、小于约40分钟、小于约45分钟、小于约50分钟、小于约55分钟或小于约60分钟内基本上崩解从而将制剂释放到胃肠液中的药物组合物的硬度。
在其他实施方案中，配制包含治疗剂的粉末以包含一种或多种药物赋形剂和调味剂。例如，通过混合治疗剂和任选的药物赋形剂以形成散装混合组合物来制备此类粉末。另外的实施方案还包括悬浮剂和/或润湿剂。将该散装混合物均匀地细分成单位剂量包装或多剂量包装单位。
在其他实施方案中，还制备泡腾粉。泡腾盐已用于将药物分散在水中以口服施用。
在一些实施方案中，药物剂型被配制以提供治疗剂的控释。控释是指在延长时间段内治疗剂从剂型中的释放，在该剂型中治疗剂根据所需曲线被引入。控释性质包括，例如，持续释放、延长释放、脉冲释放和延迟释放性质。与立即释放组合物相反，控释组合物允许根据预定曲线在延长时间段内将试剂递送至受试者。与常规的快速释放剂型相比，这种释放速率可提供延长时间段内的治疗有效水平的试剂，从而提供较长的药理学响应时间，同时使副作用最小化。这种较长的响应时间提供了相应的短效、立即释放制剂所不能实现的许多固有的益处。
在一些实施方案中，本文所述的固体剂型被配制为肠溶包衣的延迟释放口服剂型，即，配制为本文所述的药物组合物的利用肠溶包衣影响在小肠或大肠中的释放的口服剂型。在一个方面，肠溶包衣剂型是含有活性成分和/或其他组合物组分的颗粒、粉末、小丸、珠粒或颗粒的压制或模制或挤出片剂/模具(包衣或未包衣)，所述活性成分和/或其他组合物组分本身是包衣或未包衣的。在一个方面，肠溶包衣口服剂型是含有小丸、珠粒或颗粒的胶囊形式，其包括包衣或未包衣的治疗剂。
任何包衣都应被施用至足够的厚度，以使整个包衣在低于约5的pH值不溶于胃肠液，但在约5及以上的pH值溶解。包衣通常选自以下任一种：虫胶-该包衣溶解在pH值＞7的介质中；丙烯酸聚合物-合适的丙烯酸聚合物的示例包括甲基丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸铵共聚物。Eudragit系列E、L、S、RL、RS和NE(Rohm Pharma)可以溶解在有机溶剂、水性分散体或干粉中获得。Eudragit系列RL、NE和RS在胃肠道中不溶，但可渗透，主要用于结肠靶向。Eudragit系列E在胃中溶解。Eudragit系列L、L-30D和S在胃中不溶，在肠中溶解；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)-PVAP在pH值＞5时溶解，并且其对水蒸气和胃液的渗透性低得多。采用常规的包衣技术，诸如，喷雾或锅包衣应用包衣。包衣厚度必须足以确保口服剂型保持完整，直到到达肠道中局部递送的所需部位。
在其他实施方案中，本文所述的制剂使用脉冲剂型递送。脉冲剂型能够在受控滞后时间后的预定时间点或在特定部位提供一个或多个立即释放脉冲。示例性的脉冲剂型及其制备方法在第5,011,692号、第5,017,381号、第5,229,135号、第5,840,329号和第5,837,284号美国专利中公开。在一个实施方案中，脉冲剂型包括至少两组颗粒(多颗粒)，每组都含有本文所述的制剂。第一组颗粒在被哺乳动物摄取时提供基本上立即剂量的治疗剂。第一组颗粒可以是未包衣的或包括包衣和/或密封剂。在一个方面，第二组颗粒包括包衣颗粒。第二组颗粒上的包衣在摄入后释放第二剂量前提供约2小时至约7小时的延迟。用于药物组合物的合适包衣在本文中描述或在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，提供了包括治疗剂颗粒和至少一种分散剂或悬浮剂的用于口服向受试者施用的药物制剂。该制剂可以是用于悬浮的粉末和/或颗粒，并且在与水混合后，获得基本上均匀的悬浮液。
在一些实施方案中，将配制用于控释的颗粒掺入凝胶或贴剂或伤口敷料中。
在一个方面，用于口服施用和/或用于作为洗液的局部施用的液体制剂剂型是水性悬液的形式，所述水性悬液选自包括但不限于以下的组，药学上可接受的水性口服分散体、乳液、溶液、酏剂、凝胶和糖浆。参见，例如，Singh等人，Encyclopedia ofPharmaceutical Technology,2nd Ed.,pp.754-757(2002)。除了治疗剂的颗粒之外，液体剂型还包括添加剂，诸如：(a)崩解剂；(b)分散剂；(c)润湿剂；(d)至少一种防腐剂，(e)粘度增强剂，(f)至少一种甜味剂，和(g)至少一种调味剂。在一些实施方案中，水性分散体可进一步包括结晶抑制剂。
在一些实施方案中，液体制剂还包括本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂。示例性的乳化剂是乙醇；异丙醇；碳酸乙酯；乙酸乙酯；苄醇；苯甲酸苄酯；丙二醇；1，3-丁二醇；二甲基甲酰胺；月桂基硫酸钠；二十二碳六烯酸钠；胆固醇；胆固醇酯；牛磺胆酸；磷脂酰胆碱；油，诸如棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油；甘油；四氢糠醇；聚乙二醇；失水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。
此外，药物组合物任选地包括一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，诸如，柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲液的含量应使组合物的pH值保持在可接受的范围内。
另外，药物组合物任选地包括使组合物的同渗重摩达到可接受的范围所需量的一种或多种盐。此类盐包括具有钠阳离子、钾阳离子或铵阳离子和氯阴离子、柠檬酸根阴离子、抗坏血酸根阴离子、硼酸根阴离子、磷酸根阴离子、碳酸氢根阴离子、硫酸根阴离子、硫代硫酸根阴离子或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
其他药物组合物任选地包括一种或多种防腐剂以抑制微生物活动。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如Merfen和硫柳汞；稳定化的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲铵和氯化十六烷基吡啶。
在一个实施方案中，本文所述的水性悬液和分散体保持在如USP药师药典(2005版，第905章)中所定义的均相状态至少4小时。在一个实施方案中，通过持续小于1分钟的物理搅拌将水性悬液重新悬浮成均匀悬浮液。在另一个实施方案中，不需要搅拌来保持均匀水性分散体。
用于水性悬液和分散体的崩解剂的示例包括，但不限于，淀粉，例如，天然淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉；预胶化淀粉或淀粉羟乙酸钠；纤维素，诸如甲基结晶纤维素、甲基纤维素；交联羧甲基纤维素或交联纤维素，诸如交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素或交联羧甲基纤维素；交联淀粉，诸如淀粉羟乙酸钠；交联聚合物，诸如交聚维酮；交联聚乙烯吡咯烷酮；诸如藻酸的海藻酸或诸如海藻酸钠的藻酸盐；树胶，诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐树胶、果胶或黄蓍胶；羟基乙酸淀粉钠；膨润土；天然海绵；表面活性剂；树脂，诸如阳离子交换树脂；柑橘渣；月桂基硫酸钠；淀粉组合的月桂基硫酸钠等等。
在一些实施方案中，适用于本文所述的水性悬液和分散体的分散剂包括，例如，亲水性聚合物；电解质；
Figure BDA0003512945010000671
60或80；PEG；聚乙烯吡咯烷酮和碳水化合物基分散剂，诸如，例如，羟丙基纤维素和羟丙基纤维素醚、羟丙基甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素醚、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯硬脂酸酯、非结晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛聚合物(也称为泰洛沙泊尔)、泊洛沙姆；和泊洛沙胺。在其他实施方案中，分散剂选自不包含以下试剂之一的组：亲水性聚合物；电解质；Tween60或80；PEG；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；羟丙基纤维素和羟丙基纤维素醚；羟丙基甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素醚；羧甲基纤维素钠；甲基纤维素；羟乙基纤维素；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯；非结晶纤维素；硅酸铝镁；三乙醇胺；聚乙烯醇(PVA)；4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛聚合物；泊洛沙姆；或泊洛沙胺。
适用于本文所述的水性悬液和分散体的润湿剂包括，但不限于，鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如，可商购的
Figure BDA0003512945010000672
诸如，Tween
Figure BDA0003512945010000673
和Tween
Figure BDA0003512945010000674
)、和聚乙二醇、油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、油酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、维生素E TPGS、牛磺胆酸钠、二甲硅油、磷脂酰胆碱等。
用于本文所述的水性悬液或分散体的合适的防腐剂包括，例如，山梨酸钾；对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)；苯甲酸及其盐；对羟基苯甲酸的其他酯，诸如对羟基苯甲酸丁酯；醇，诸如乙醇或苯甲醇；酚化合物，诸如苯酚；或季铵化合物，诸如苯扎氯铵。如本文所用，防腐剂以足以抑制微生物生长的浓度掺入到剂型中。
用于本文所述的水性混悬剂或分散体的合适的粘度增强剂包括，但不限于，甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、
Figure BDA0003512945010000681
S-630、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。粘度增强剂的浓度将取决于所选择的试剂和所需的粘度。
适用于本文所述的水性悬液或分散体的甜味剂的示例包括，例如，阿拉伯树胶糖浆、乙酰舒泛K、阿力甜、阿斯巴甜、巧克力、肉桂、柑橘、可可、环己氨基磺酸盐、右旋糖、果糖、姜、甘草次酸盐、甘草(洋甘草)糖浆、甘草酸单铵盐
Figure BDA0003512945010000682
麦芽糖醇、甘露醇、薄荷醇、新橙皮苷DC、纽甜、
Figure BDA0003512945010000683
粉、糖精、山梨醇、甜叶菊、三氯蔗糖、蔗糖、糖精钠、糖精、阿斯巴甜、乙酰舒泛钾、甘露醇、三氯蔗糖、塔格糖、索马甜、香草、木糖醇或其任何组合。
在一些实施方案中，治疗剂被制备为经皮剂型。在一些实施方案中，本文所述的经皮制剂包含至少三种组分：(1)治疗剂；(2)渗透增强剂；和(3)任选的水性佐剂。在一些实施方案中，经皮制剂包括额外的组分，诸如，但不限于，胶凝剂、乳膏和软膏基质等。在一些实施方案中，经皮制剂作为贴剂或伤口敷料存在。在一些实施方案中，经皮制剂还包含织物或非织物背衬材料以增强吸收并防止经皮制剂从皮肤移除。在其他实施方案中，本文所述的经皮制剂可保持饱和或过饱和状态以促进扩散到皮肤中。
在一个方面，适于经皮施用本文所述治疗剂的制剂采用经皮递送装置和经皮递送贴剂，并且可以是溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中的亲脂性乳液或缓冲的水溶液。在一个方面，构建此类贴剂用于连续、脉动或按需递送药物试剂。更进一步地，本文所述的治疗剂的经皮递送可以通过离子电渗贴片等实现。在一个方面，经皮贴剂提供治疗剂的受控递送。在一个方面，经皮装置是绷带的形式，其包括背衬部件、含有治疗剂和任选的载体的贮存器、任选的速率控制屏障以在延长时间段内以受控和预定的速率将治疗递送至宿主的皮肤，以及将装置固定至皮肤的工具。
在进一步的实施方案中，局部制剂包括凝胶制剂(例如，粘附于皮肤的凝胶贴剂)。在一些此类实施方案中，凝胶组合物包括在与身体接触时形成凝胶的任何聚合物(例如，包含透明质酸的凝胶制剂、普朗尼克聚合物、基于聚(乳酸-共-乙醇酸(PLGA)的聚合物等)。在组合物的一些形式中，制剂包含低熔点蜡，诸如，但不限于，脂肪酸甘油酯的混合物，任选地，与首先熔化的可可油组合。任选地，所述制剂还包含保湿剂。
在某些实施方案中，可以使用药物治疗剂的递送系统，诸如，脂质体和乳剂。在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含粘膜粘着剂聚合物，其选自例如羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂可以局部施用并且可以配制成多种可局部施用的组合物，诸如，溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药棒、香膏、乳膏或软膏。此类药物治疗剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
用于鼻腔施用的气雾剂通常是设计成以滴剂或喷雾剂形式施用到鼻腔通道的水溶液。鼻用溶液可以类似于鼻分泌物，因为它们通常是等渗的并被弱缓冲以维持约5.5至约6.5的pH值，尽管可以另外使用该范围以外的pH值。制剂中也可以包括抗微生物剂或防腐剂。
用于吸入的气雾剂制剂和吸入剂可以被设计成使得当通过鼻或口呼吸道途径施用时，所述试剂或试剂的组合被携带到受试者的呼吸树中。吸入溶液可以，例如，通过喷雾器施用。包括细粉末或液体药物的吸入或吹入可以作为试剂或试剂组合在推进剂中的溶液或悬浮液的药物气雾剂递送至呼吸系统，例如，以帮助分配。推进剂可以是液化气体，包括例如，碳氟化合物诸如氟化的氯化烃、氢氯氟烃和氢氯烃的卤化碳以及烃和烃醚。
卤化碳推进剂可以包括其中所有氢都被氟取代的碳氟化合物推进剂、其中所有氢都被氯和至少一个氟取代的含氯氟烃推进剂、含氢的碳氟化合物推进剂、和含氢的含氯氟烃推进剂。有用的烃推进剂包括，例如，丙烷、异丁烷、正丁烷、戊烷、异戊烷和新戊烷。烃的混合物也可用作推进剂。醚推进剂包含，例如，二甲醚以及醚。气雾剂制剂也可以包含超过一种推进剂。例如，气雾剂制剂可以包含来自相同类别的超过一种推进剂，诸如，两种或更多种碳氟化合物；或超过一种、超过两种、超过三种的不同类别的推进剂，诸如，氟代烃和烃。本公开的药物组合物还可以用压缩气体(例如，惰性气体，诸如，二氧化碳、一氧化二氮或氮气)分配。
气雾剂制剂也可包含其他组分，例如，乙醇、异丙醇、丙二醇，以及表面活性剂或其他组分，诸如，油和洗涤剂。这些组分可以用于稳定制剂和/或润滑阀部件。
气雾剂制剂可在压力下包装，并且可采用溶液、悬浮液、乳液、粉末和半固体制剂配制成气雾剂。例如，溶液气雾剂制剂可以包含，诸如，(基本上)纯推进剂中的转运体、载体或离子通道抑制剂的试剂的溶液或作为推进剂和溶剂的混合物。溶剂可用于溶解试剂和/或减缓推进剂的蒸发。溶剂可以包括，例如，水、乙醇和二醇。可使用合适溶剂的任何组合，任选地，与防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分组合。
气雾剂制剂可以是分散体或悬浮液。悬浮型气雾剂制剂可以包含试剂或试剂组合，例如，转运体、载体或离子通道抑制剂、和分散剂的悬浮液。分散剂可包括，例如，失水山梨糖醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂和玉米油。悬浮型气雾剂制剂还可以包括润滑剂、防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分。
气雾剂制剂可类似地配制成乳液。乳浊型气雾剂制剂可以包括，例如，醇(诸如，乙醇)、表面活性剂、水和推进剂，以及例如，转运体、载体或离子通道的试剂或试剂的组合。所用的表面活性剂可以是非离子、阴离子或阳离子的。乳浊型气雾剂制剂的一个示例包括，例如，乙醇、表面活性剂、水和推进剂。乳浊型气雾剂制剂的另一个示例包括，例如，植物油、单硬脂酸甘油酯和丙烷。
试剂盒
在一些实施方案中，本文公开了使用本文所述组合物的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于治疗受试者的疾病或病症；或选择治疗的受试者和/或监测本文公开的治疗。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的组合物，其可用于实施本文所述的方法。试剂盒包括材料或组分的集合，包括至少一种组合物。因此，在一些实施方案中，试剂盒含有包括药物组合物的组合物，用于治疗自身免疫性疾病。
在一些情况下，本文所述的试剂盒包含用于选择细胞外囊泡的同质群体的组分。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于测定在细胞外囊泡表面上表达的免疫检查点部分的单位数量的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含用于进行分析(诸如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)、PCR和qPCR)的组分。试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案被配置用于治疗本文公开的受试者的疾病或病症(例如，自身免疫性疾病)的目的。在一些实施方案中，试剂盒特别地被配置用于治疗哺乳动物受试者的目的。在一些实施方案中，试剂盒特别地被配置用于治疗人类受试者的目的。
使用说明书可以被包括在试剂盒中。任选地，试剂盒还含有其他有用的成分，诸如，稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、包扎材料或其他有用的用具。在试剂盒中组装的材料或组分可以以任何方便和合适的方式储存以保持其可操作性和实用性，提供给医师。例如，组分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。这些组分通常包含在合适的包装材料中。本文所用的短语“包装材料”是指用于容纳诸如组合物等的试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料通过公知的方法构造，优选地，提供无菌、无污染的环境。试剂盒中使用的包装材料是通常用于基因表达分析和施用治疗中的那些包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳单个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，诸如，玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于容纳合适量的药物组合物的玻璃小瓶或预填充注射器。包装材料具有外部标签，外部标签指示试剂盒及其组分的内容物和/或目的。
II.平台
在一些实施方案中，本文描述了用于产生本文所述的细胞外囊泡的平台。在一些实施方案中，平台符合良好生产规范(GMP)标准。在一些实施方案中，包含细胞外囊泡的组合物是根据良好生产规范(GMP)产生的。在一些实施方案中，组合物包括基本上不含病原体的病原体水平。在一些实施方案中，组合物具有基本上不含污染物的污染物水平。在一些实施方案中，组合物包括低免疫原性。
在一些实施方案中，本文所述的组合物通过低渗处理和离心产生和分离。在一些实施方案中，主要通过使用低渗处理，使得MSC破裂并释放细胞外囊泡的方式，从表达细胞外囊泡的间充质干细胞(MSC)分离出细胞外囊泡。在一些情况下，将MSC重悬于低渗溶液中以诱导细胞肿胀。在一些实施方案中，平台包含相差显微镜以监测细胞肿胀。在一些实施方案中，平台包含均化器以使肿胀的细胞破裂从而释放细胞外囊泡。在一些实施方案中，平台包含用于以梯度(例如，蔗糖梯度)分离破裂的细胞以分离出细胞外囊泡的工具。在一些实施方案中，平台包含用于产生细胞外囊泡的其他组分，裂解MSC的其他方法，诸如，温和超声处理、冻融、弗氏压碎器或针传代。在一些实施方案中，平台包括离心机以离心并分离包含细胞外囊泡的级分。在一些实施方案中，平台包括用于通过在不连续的蔗糖密度梯度中漂浮以分离包含细胞外囊泡的级分的工具。
在一些实施方案中，平台包括用于通过挤出产生细胞外囊泡的工具。在一些实施方案中，挤出过程基于细胞外囊泡的尺寸或直径分离和隔离细胞外囊泡。示例性的挤出方法包括使用具有各种孔径的膜。所述膜可基于细胞外囊泡的尺寸或直径将细胞外囊泡与包含破裂的MSC的溶液分离。细胞外囊泡可以被进一步分离，并且通过连续挤出在以越来越小的膜孔径挤出后其尺寸减小，范围为150nm至10nm。当最终的挤出完成时，可以通过离心沉淀细胞外囊泡。在一些实施方案中，平台包括用于进行超声处理、挤出、高压/均化、微流化或洗涤剂透析的组分。
在一些实施方案中，平台包括用于确定每个细胞外囊泡的免疫检查点部分的单位数量的组分。
III.方法
产生细胞外囊泡
在一些实施方案中，本文描述了利用本文所述的平台产生本文所述的组合物的方法。在一些实施方案中，细胞外囊泡可以从细胞分离或由细胞分泌。例如，细胞外囊泡可以通过裂解细胞以释放细胞外囊泡而产生。在一些情况下，细胞分泌细胞外囊泡，其中，然后可以分离细胞外囊泡。
在一些实施方案中，用于产生细胞外囊泡的细胞可以来自细胞系、干细胞、原代细胞或分化细胞。在一些实施方案中，细胞外囊泡供体细胞可以选自：人胚胎成纤维细胞(HEF)、树突细胞、间充质干细胞、骨髓衍生的树突细胞、骨髓衍生的基质细胞、脂肪基质细胞、内皮细胞、去核细胞、神经干细胞、未成熟的树突细胞和免疫细胞、骨髓基质细胞、骨髓衍生的成体祖细胞(MAPCs)、内皮祖细胞(EPC)、胚细胞、脑室下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌母细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞或肝母细胞。
在一些实施方案中，用于产生细胞外囊泡的细胞可以是遗传修饰的细胞，其中，遗传修饰部分被引入到经修饰的细胞中。在一些实施方案中，将至少一种编码转基因的异源多核苷酸引入到经修饰的细胞中。在一些实施方案中，异源多核苷酸编码本文所述的免疫检查点部分中的任一种。在一些实施方案中，异源多核苷酸编码本文所述的靶向部分中的任一种。在一些实施方案中，异源多核苷酸编码本文所述的任一个跨膜部分。在一些实施方案中，异源多核苷酸编码本文所述的融合肽中的任一种。在一些实施方案中，异源多核苷酸编码本文所述的任一种免疫逃避部分。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以整合到经修饰的细胞的染色体中。在一些实施方式中，异源多核苷酸未整合到经修饰的细胞的染色体中。
在一些实施方案中，所述遗传修饰部分调节所述异源多核苷酸的表达。在一些实施方案中，所述遗传修饰部分提高所述异源多核苷酸的表达。在一些实施方案中，所述遗传修饰部分包含CRISPR-Cas多肽。在一些实施方式中，所述遗传修饰部分可以是，例如，1类CRISPR相关(Cas)多肽、2类Cas多肽、I型Cas多肽、II型Cas多肽、III型Cas多肽、IV型Cas多肽、V型Cas多肽和VI型CRISPR相关RNA结合蛋白或其功能片段。适于与本公开一起使用的Cas多肽可以包括Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(or Cas12a)、C2C1、C2C2(or Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、or Cul966；其任何衍生物、其任何变种、或其任何片段。在一些实施方式中，Cas13可以包括，但不限于，Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d(例如，CasRx)。CRISPR/Cas可以是DNA和/或RNA切割，或可以表现出降低的切割活性。遗传修饰部分可以被配置成与至少一种异源RNA多核苷酸复合。在一些情况下，遗传修饰部分可以与转录激活因子或转录阻抑物融合。
任何合适的核酸酶(例如，核酸内切酶)可以用作遗传修饰部分。合适的核酸酶包括，但不限于，CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；AGO蛋白质(Ago)蛋白(例如，原核AGO蛋白质(pAgo)、古细菌AGO蛋白质(aAgo)、真核AGO蛋白质(eAgo)和来自格氏嗜盐碱杆菌AGO蛋白质(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢核酸内切酶，或其任何功能片段，其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
本文公开的遗传修饰部分可偶联(例如，连接或融合)于不参与调节基因表达的其他肽序列，例如，接头序列、靶向序列等。本文所用的术语“靶向序列”是指编码靶向多肽的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，所述靶向多肽介导蛋白定位(或保留)至亚细胞位置，例如，质膜或给定细胞器的膜、细胞核、胞质溶胶、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或其他细胞器。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将蛋白(例如，受体多肽或衔接多肽)引导至核；在细胞核外，利用核输出信号(NES)例如引导至细胞质；利用线粒体靶向信号引导至线粒体；利用ER保留信号引导至内质网(ER)；利用过氧化物酶体靶向信号引导至过氧化物酶体；利用膜定位信号引导至质膜；或其组合。
本文公开的遗传修饰部分可以是融合构建体(例如，融合蛋白)的一部分。如本文所用，“融合物”可指包含一个或多个非天然序列(例如，部分)的蛋白和/或核酸。融合物可包含一个或多个相同的非天然序列。融合物可包含一个或多个不同的非天然序列。融合物可以是嵌合体。融合物可包含核酸亲和标签。融合物可以包含条形码。融合物可以包含肽亲和标签。融合物可提供位点定向多肽的亚细胞定位(例如，用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)、用于靶向线粒体的线粒体定位信号、用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号、内质网(ER)滞留信号等)。融合物可提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如，亲和标签)。融合物可以是小分子，诸如，生物素或染料，诸如，Alexa Fluor染料、花青3染料、花青5染料。
融合物可以指具有功能性作用的任何蛋白。例如，融合蛋白可以包括甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性(例如，逆转录酶活性)、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性或糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化修饰活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化化活性、豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性或脱豆蔻酰化活性。效应蛋白可以修饰基因组基因座。融合蛋白可以是Cas蛋白中的融合物。融合蛋白可以是Cas蛋白中的非天然序列。
在一些实施方案中，遗传修饰部分可以与一个或多个转录阻抑物结构域、激活子结构域、表观遗传结构域、重组酶结构域、转座酶结构域、翻转酶结构域、切口酶结构域或其任何组合融合。所述激活子结构域可以包括位于所述蛋白的羧基末端的一个或多个串联激活结构域。在一些情况下，遗传修饰部分包括位于蛋白的羧基末端的一个或多个串联阻抑物结构域。非限制性的示例性激活结构域包括GAL4、单纯疱疹活化结构域VP16、VP64(单纯疱疹活化结构域VP16的四聚体)、NF-κB p65亚基、Epstein-Barr病毒R反式激活蛋白(Rta)，并且描述于Chavez等人，Nat Methods,2015,12(4):326-328中。非限制性的示例性抑制结构域包括Kox1的KRAB(Kruppel-相关盒)结构域、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)、ERF阻抑物结构域(ERD)，并且描述于Chavez等人，Nat Methods,2015,12(4):326-328中。在一些实施方案中，遗传修饰部分包括位于蛋白的氨基末端的一个或多个串联阻抑物结构域。
在一些实施方案中，本文公开的核酸酶可以是缺乏核酸切割活性的蛋白。在一些情况下，Cas蛋白是死亡Cas蛋白。死亡Cas蛋白可以是缺乏核酸切割活性的蛋白。Cas蛋白可以包括野生型Cas蛋白的修饰形式。野生型Cas蛋白的修饰形式可包含降低Cas蛋白的核酸切割活性的氨基酸改变(例如，缺失、插入或取代)。例如，Cas蛋白的修饰形式可具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型Cas蛋白(例如，来自化脓性链球菌的Cas9)的核酸切割活性。Cas蛋白的修饰形式可不具有实质性核酸切割活性。当Cas蛋白是不具有实质性核酸切割活性的修饰形式时，它可以被称为酶学失活的和/或“死亡的”(缩写为“d”)。死亡Cas蛋白(例如，dCas、dCas9)可以结合靶多核苷酸，但不能切割靶多核苷酸。在一些方面，死亡Cas蛋白是死亡Cas9蛋白。
在一些实施方案中，dCas(例如，dCas9)多肽可以与单引导RNA(sgRNA)缔合以激活或抑制靶DNA的转录。sgRNA可被引入表达工程化的嵌合受体多肽的细胞中。在一些情况下，此类细胞含有靶向相同核酸的一种或多种不同的sgRNA。在其他情况下，sgRNA靶向细胞中的不同核酸。
在一些实施方案中，遗传修饰部分可以包含催化失活的Cas多肽，其中，Cas多肽的核酸酶活性被消除或基本上消除。
在一些情况下，遗传修饰部分可以包括催化失活的Cas9(dCas9)、其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
在一些情况下，遗传修饰部分可以包括催化失活的Cas12(dCas12)、其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
在一些情况下，遗传修饰部分可以包含催化失活的Cas13(dCas13)；其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
在一些实施方案中，遗传修饰部分可以与本文所述的至少一种异源多核苷酸复合。在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸可以是异源DNA多核苷酸或异源RNA多核苷酸。在一些实施方案中，遗传修饰部分可以与至少一种异源RNA多核苷酸复合。在一些实施方案中，与至少一种异源RNA多核苷酸的复合将遗传修饰部分引导并靶向异源多核苷酸的部分。
在一些情况下，本文所述的组合物和方法包含至少一种异源多核苷酸。在一些情况下，本文所述的组合物和方法包含多种异源核酸。在一些实施方案中，多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，DNA序列可以是单链或双链的。在一些实施方案中，所述至少一种异源核酸多核苷酸可以是核糖核酸(RNA)。
在一些实施方案中，遗传修饰部分可以与至少一种异源RNA多核苷酸复合。所述至少一种异源RNA多核苷酸可以包含核酸靶向区，所述核酸靶向区包含异源多核苷酸的核酸序列的互补序列，所述异源多核苷酸的核酸序列编码本文所述的用于遗传修饰部分依赖性靶向的特异性部分中的任一种。在一些实施方案中，至少一种异源RNA多核苷酸可以是可被称为双引导核酸的包含两个单独的核酸分子的引导核酸(或引导RNA)或可被称为单引导核酸的单一核酸分子(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，该引导核酸是包含融合的CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的单引导核酸。在一些实施方案中，所述引导核酸是包含crRNA的单引导核酸。在一些实施方案中，所述引导核酸是包含crRNA但缺乏tracRNA的单引导核酸。在一些实施方案中，所述引导核酸是包含非融合crRNA和tracrRNA的双引导核酸。示例性的双引导核酸可以包含crRNA样分子和tracrRNA样分子。示例性的单引导核酸可包含crRNA样分子。示例性的单引导核酸可包含融合的crRNA样分子和tracrRNA样分子。
crRNA可包含引导核酸的核酸靶向片段(例如，间隔区)和可形成引导核酸的Cas蛋白结合片段的双链双链体的一半的一段核苷酸。
tracrRNA可包含形成gRNA的Cas蛋白结合片段的双链双链体的另一半的一段核苷酸。crRNA的一段核苷酸可以与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交，以形成引导核酸的Cas蛋白结合结构域的双链双链体。
crRNA和tracrRNA可以杂交形成引导核酸。crRNA还可以提供与靶核酸识别序列(例如，原型间隔子)杂交的单链核酸靶向片段(例如，间隔区)。crRNA的序列，包括间隔区或tracrRNA分子，可以被设计为对引导核酸将被使用的物种是特异性的。
在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度可以为18至72个核苷酸。引导核酸的核酸靶向区(例如，间隔区)的长度可为约12个核苷酸至约100个核苷酸。例如，引导核酸的核酸靶向区(例如，间隔区)的长度可以为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约12nt至约18nt、约12nt至约17nt、约12nt至约16nt、或约12nt至约15nt。或者，DNA靶向片段的长度可以为约18nt至约20nt、约18nt至约25nt、约18nt至约30nt、约18nt至约35nt、约18nt至约40nt、约18nt至约45nt、约18nt至约50nt、约18nt至约60nt、约18nt至约70nt、约18nt至约80nt、约18nt至约90nt、约18nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt、或约20nt至约100nt。核酸靶向区的长度可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。核酸靶向区(例如，间隔序列)的长度可以是至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区(例如，间隔区)的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，引导核酸的核酸靶向区的长度为22个核苷酸。
与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的引导核酸的核苷酸序列的长度可以为，例如，至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的引导核酸的核苷酸序列的长度可以为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约60nt或约20nt至约60。
靶多核苷酸的前间隔区序列可通过鉴定所关注区域内的PAM并选择PAM上游或下游的期望大小的区域作为前间隔区来鉴定。通过测定前间隔区的互补序列可以设计相应的间隔区序列。
可使用计算机程序(例如，机器可读代码)鉴定间隔区序列。计算机程序可以使用变量，诸如，预测的解链温度、二级结构形成和预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可接近性、％GC、基因组发生的频率、甲基化状态、SNP的存在等。
核酸靶向序列(例如，如本文所公开的至少一种异源多肽的间隔区序列)和靶核酸(例如，编码本文所述的部分中的任一种的异源多核苷酸的前间隔区序列)之间的百分比互补性可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。核酸靶向序列和靶核酸之间的百分比互补性在约20个连续核苷酸内可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
引导核酸的Cas蛋白结合片段可包含彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)。彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)可以通过介入核苷酸(例如，在单引导核酸的情况下的接头)共价连接。彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)可以杂交以形成Cas蛋白结合片段的双链RNA双链体或发夹，从而产生茎-环结构。crRNA和tracrRNA可以通过crRNA的3'末端和tracrRNA的5'末端共价连接。或者，tracrRNA和crRNA可以通过tracrRNA的5'末端和crRNA的3'末端共价连接。
引导核酸的Cas蛋白结合片段的长度可以为约10个核苷酸至约100个核苷酸，例如，约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt。例如，引导核酸的Cas蛋白结合片段的长度可以为约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。
引导核酸的Cas蛋白结合片段的dsRNA双链体的长度可以为约6个碱基对(bp)至约50bp。例如，蛋白结合片段的dsRNA双链体的长度可以为约6bp至约40bp、约6bp至约30bp、约6bp至约25bp、约6bp至约20bp、约6bp至约15bp、约8bp至约40bp、约8bp至约30bp、约8bp至约25bp、约8bp至约20bp或约8bp至约15bp。例如，Cas蛋白结合片段的dsRNA双链体的长度可以为约8bp至约10bp、约10bp至约15bp、约15bp至约18bp、约18bp至约20bp、约20bp至约25bp、约25bp至约30bp、约30bp至约35bp、约35bp至约40bp、或约40bp至约50bp。
在一些实施方案中，Cas蛋白结合片段的dsRNA双链体的长度可以为36个碱基对。杂交形成蛋白结合片段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的百分比互补性可以是至少约60％。例如，杂交形成蛋白结合片段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的百分比互补性可以是至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％。在一些情况下，杂交形成蛋白结合片段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的百分比互补性是100％。
接头(例如，在单引导核酸中连接crRNA和tracrRNA的接头)的长度可以为约3个核苷酸至约100个核苷酸。例如，接头的长度可以为约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt。例如，接头的长度可以为约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt。在一些实施方案中，靶向DNA的RNA的接头是4nt。
本公开的引导核酸可以包括提供额外的期望特征(例如，经修饰的或经调节的稳定性；亚细胞靶向；用荧光标记追踪；用于蛋白或蛋白复合物的结合位点等等)的修饰或序列。此类修饰的示例包括，例如，5'帽(7-甲基鸟嘌呤帽(M7G))；3'聚腺苷酸化尾(3'聚(A)尾)；核糖开关序列(例如，以允许经调节的稳定性和/或通过蛋白和/或蛋白复合物调节的可接近性)；稳定性控制序列；形成dsRNA双链体的序列(发夹)；将RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列；提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合、与促进荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)；为蛋白(例如，作用于DNA的蛋白，包括转录激活子、转录阻抑物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶及其组合)提供结合位点的修饰或序列。
引导核酸可包含一个或多个修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以提供具有新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)的核酸。引导核酸可包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷酸的碱基部分可以是杂环碱基。这种杂环碱基的两种最常见的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2'、3'或5'羟基部分。在形成引导核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。进而，该线性聚合物的各端可进一步连接以形成环状化合物；然而，线性化合物也是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。此外，在引导核酸内，磷酸基团通常可被称为形成引导核酸的核苷酸内主链。引导核酸的键或主链可以是3'至5'磷酸二酯键。
引导核酸可包含经修饰的主链和/或经修饰的核苷酸间键。经修饰的主链可以包含在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。
其中含有磷原子的合适的经修饰的引导核酸主链可以包含，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯如3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酰酰胺、硫代烷基膦酸酯、硫代氨基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和具有正常3'-5'键的硼基磷酸酯、2'-5'连接的类似物，以及其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'、5'至5'或2'至2'键的具有反向极性的那些。具有反向极性的合适的引导核酸可以在最3'-端核苷酸间键处包含单个3'至3'键合(诸如，单个反向核苷残基，其中，缺失核碱基或在其适当位置具有羟基基团)。还可以包含各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。
引导核酸可包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷内键，特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中，天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。
引导核酸可包含吗啉代主链结构。例如，核酸可包含取代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酰二胺或其他非磷酸二酯核苷间键取代磷酸二酯键。
引导核酸可包含多核苷酸主链，该多核苷酸主链由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。这些多核苷酸主链可以包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)的那些多核苷酸主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链。
引导核酸可以包含核酸模拟物。术语“模拟物”可包括多核苷酸，其中，仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团取代，仅呋喃糖环的取代也可称为糖替代。杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分可以保持与合适的靶核酸杂交。一种此类核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺主链特别是氨基乙基甘氨酸主链取代。核苷酸可以保留并直接或间接地结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子。PNA化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，其使PNA具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。
引导核酸可包含连接的吗啉代单元(吗啉代核酸)，所述吗啉代单元具有连接至吗啉代环的杂环碱基。接头可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。非离子吗啉代基低聚化合物与细胞蛋白的不期望的相互作用可以更少。基于吗啉代的多核苷酸可以是引导核酸的非离子模拟物。吗啉代类中的各种化合物可以使用不同的接头基团连接。另一类多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可被环己烯基环取代。CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体可以被制备且用于使用亚磷酰胺化学合成寡聚化合物。CeNA单体向核酸链中的掺入可以提高DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸互补物形成具有与天然复合物相似稳定性的复合物。进一步的修饰可包括锁核酸(LNA)，其中，2'-羟基基团与糖环的4'碳原子连接，从而形成2'-C，4'-C-氧亚甲基键，从而形成双环糖部分。该键可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，其中，n是1或2。LNA和LNA类似物可显示出与互补核酸的极高双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3'-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性质。
引导核酸可包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可以包含选自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。特别合适的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中，n和m为1至约10。糖取代基可以选自：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善引导核酸药代动力学性质的基团、或用于改善引导核酸药效学性质的基团、以及具有类似性质的其他取代基。合适的修饰可以包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2 CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE，烷氧基烷氧基基团)。进一步合适的修饰可以包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基、(O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE)和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)、2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2 CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2-CH＝CH2)和氟(F)。2'-糖取代基可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。合适的2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。类似的修饰也可以在寡聚化合物的其他位置进行，特别是在3'末端核苷或2'-5'连接的核苷酸中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡聚化合物还可以具有糖模拟物，诸如，取代呋喃戊糖基糖的环丁基部分。
引导核酸也可以包括核碱基(或“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))、和嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成的和天然的核碱基，诸如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代，特别是，5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-去氮腺嘌呤和7-去氮腺嘌呤以及3-去氮腺嘌呤和3-去氮腺嘌呤。经修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如，吩恶嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶(5,4-b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹子，诸如，取代的吩恶嗪胞嘧啶核苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶(5,4-(b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶(3',2'：4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如，7-去氮腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核碱基可以用于提高多核苷酸化合物的结合亲和力。这些可以包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代可以将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且可以是合适的碱基取代(例如，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)。
引导核酸的修饰可以包括将可以增强引导核酸的活性、细胞分布或细胞摄取一个或多个部分或缀合物化学连接至引导核酸。这些部分或缀合物可以包括共价结合到诸如，伯或仲羟基基团的官能团的缀合基团。缀合基团可以包括，但不限于，嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团和增强低聚物的药代动力学性质的基团。缀合基团可包括，但不限于，胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。可以增强药代动力学性质的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合部分可以包括，但不限于，脂质部分，诸如，胆固醇部分、胆酸A硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)；多胺或聚乙二醇链；或金刚烷乙酸；棕榈基部分；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分。
在一些实施方案中，本文描述了包含crRNA的异源RNA多核苷酸。在一些实施方案中，cRNA包含与编码本文所述部分的任一种异源多核苷酸互补的靶向序列。
在一些实施方案中，crRNA包含5nt至100nt。在一些实施方案中，crRNA包含5nt至6nt、5nt至7nt、5nt至8nt、5nt至9nt、5nt至10nt、5nt至15nt、5nt至20nt、5nt至25nt、5nt至50nt、5nt至100nt、6nt至7nt、6nt至8nt、6nt至9nt、6nt至10nt、6nt至15nt、6nt至20nt、6nt至25nt、6nt至50nt、6nt至100nt、7nt至8nt、7nt至9nt、7nt至10nt、7nt至15nt、7nt至20nt、7nt至25nt、7nt至50nt、7nt至100nt、8nt至9nt、8nt至10nt、8nt至15nt、8nt至20nt、8nt至25nt、8nt至50nt、8nt至100nt、9nt至10nt、9nt至15nt、9nt至20nt、9nt至25nt、9nt至50nt、9nt至100nt、10nt至15nt、10nt至20nt、10nt至25nt、10nt至50nt、10nt至100nt、15nt至20nt、15nt至25nt、15nt至50nt、15nt至100nt、20nt至25nt、20nt至50nt、20nt至100nt、25nt至50nt、25nt至100nt、或50nt至100nt。在一些实施方案中，crRNA包含5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt或50nt。在一些实施方案中，crRNA包含至多6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少5nt至100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少5nt至6nt、5nt至7nt、5nt至8nt、5nt至9nt、5nt至10nt、5nt至15nt、5nt至20nt、5nt至25nt、5nt至50nt、5nt至100nt、6nt至7nt、6nt至8nt、6nt至9nt、6nt至10nt、6nt至15nt、6nt至20nt、6nt至25nt、6nt至50nt、6nt至100nt、7nt至8nt、7nt至9nt、7nt至10nt、7nt至15nt、7nt至20nt、7nt至25nt、7nt至50nt、7nt至100nt、8nt至9nt、8nt至10nt、8nt至15nt、8nt至20nt、8nt至25nt、8nt至50nt、8nt至100nt、9nt至10nt、9nt至15nt、9nt至20nt、9nt至25nt、9nt至50nt、9nt至100nt、10nt至15nt、10nt至20nt、10nt至25nt、10nt至50nt、10nt至100nt、15nt至20nt、15nt至25nt、15nt至50nt、15nt至100nt、20nt至25nt、20nt至50nt、20nt至100nt、25nt至50nt、25nt至100nt、或50nt至100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt或50nt。在一些实施方案中，crRNA包含至少至多6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至多5nt至100nt。在一些实施方案中，所述crRNA包含至多5nt至6nt、5nt至7nt、5nt至8nt、5nt至9nt、5nt至10nt、5nt至15nt、5nt至20nt、5nt至25nt、5nt至50nt、5nt至100nt、6nt至7nt、6nt至8nt、6nt至9nt、6nt至10nt、6nt至15nt、6nt至20nt、6nt至25nt、6nt至50nt、6nt至100nt、7nt至8nt、7nt至9nt、7nt至10nt、7nt至15nt、7nt至20nt、7nt至25nt、7nt至50nt、7nt至100nt、8nt至9nt、8nt至10nt、8nt至15nt、8nt至20nt、8nt至25nt、8nt至50nt、8nt至100nt、9nt至10nt、9nt至15nt、9nt至20nt、9nt至25nt、9nt至50nt、9nt至100nt、10nt至15nt、10nt至20nt、10nt至25nt、10nt至50nt、10nt至100nt、15nt至20nt、15nt至25nt、15nt至50nt、15nt至100nt、20nt至25nt、20nt至50nt、20nt至100nt、25nt至50nt、25nt至100nt、或50nt至100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至多5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。在一些实施方案中，crRNA包含至多至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt或50nt。在一些实施方案中，crRNA包含至多6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt、25nt、50nt或100nt。
在一些实施方案中，遗传修饰部分和异源多核苷酸可通过使用表达载体递送至细胞中。在表达载体的情况下，载体可通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物方法将表达载体转入宿主细胞中。在一些实施方案中，遗传修饰部分和异源多核苷酸可通过物理方法，诸如，磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔等递送到细胞中。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法适用于本文的方法(参见，例如，Sambrook等人，2012，分子克隆：实验室手册，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。在一些实施方式中，遗传修饰部分和异源多核苷酸可通过生物学方法诸如使用DNA和RNA载体递送至细胞中。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物例如人类细胞的最广泛使用的方法。在一些实施方案中，其他病毒载体衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。示例性的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、痘病毒载体、细小病毒载体、杆状病毒载体、麻疹病毒载体或单纯疱疹病毒载体(HSV)。在一些示例中，所述逆转录病毒载体包括γ逆转录病毒载体，诸如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV、MMLV、MuLV或MLV)或鼠干细胞病毒(MSCV)基因组的载体。在一些示例中，所述逆转录病毒载体包括慢病毒载体，诸如，源自人免疫缺陷病毒(HIV)基因组的慢病毒载体。在一些示例，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些示例中，所述病毒载体是嵌合病毒载体，包含来自两种或更多种病毒的病毒部分。在另外的示例中，所述病毒载体是重组病毒载体。在一些实施方案中，遗传修饰部分和异源多核苷酸可以通过化学手段(诸如，大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统)递送到细胞中，基于脂质的系统包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术中核酸靶向递送的其他方法是可用的，诸如，用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米尺寸的递送系统递送多核苷酸。在一些实施方案中，遗传修饰部分和异源多核苷酸可通过非病毒递送系统递送至细胞中。非病毒递送系统可以是脂质体。脂质制剂的使用被预期用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸与脂质相关。在一些实施方案中，与脂质缔合的核酸被封装在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸两者都缔合的连接分子附着到脂质体，被截留在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，在一些实施方案中，它们以双层结构、胶束形式存在，或具有“坍塌”结构。或者，它们简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，在一些实施方案中，其是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类，诸如，脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。适合使用的脂质得自商业来源。例如，在一些实施方案中，双肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)从密苏里州圣路易斯的西格玛获得。在一些实施方案中，双十六烷基磷酸(“DCP”)从K&K实验室(纽约普莱恩维尤)获得。在一些实施方案中，胆固醇(“Choi”)获自Calbiochem-Behring；双肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质通常得自阿凡提极地脂质公司(阿拉巴马州伯明翰)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液通常储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体的通称。脂质体通常表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991年Glycobiology 5：505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，在一些实施方案中，脂质呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。在一些实施方案中，可以通过细胞外囊泡包装遗传修饰部分和异源多核苷酸并将其递送至细胞。细胞外囊泡可以是任何膜结合颗粒。在一些实施方案中，细胞外囊泡可以是由至少一个细胞分泌的任何膜结合颗粒。在一些示例中，细胞外囊泡可以是体外合成的任何膜结合颗粒。在一些示例中，细胞外囊泡可以是在无细胞的情况下合成的任何膜结合颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是外来体、微泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡体、癌小体、外显子、包膜病毒、外泌体或其他非常大的细胞外囊泡。
鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体
在一些实施方案中，本文描述了利用本文所述平台产生包含细胞外囊泡的同质群体的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法基于细胞外囊泡的尺寸(例如，直径或大小)来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法基于细胞外囊泡的质量来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法基于在细胞外囊泡表面上封装、分泌或表达的免疫检查点部分的单位数量来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法基于免疫检查点部分是否封装、分泌或表达在细胞外囊泡的表面上的尺寸和单位数量的组合来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法基于细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的尺寸和单位数量的组合来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。
在一些实施方案中，鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体的方法包括进行差速超速离心以基于密度分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法包括进行过滤或超滤以基于重量或大小分离细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，所述方法包括进行HPLC。在一些实施方案中，该方法包括进行细胞外囊泡沉淀，其中，不含水的聚合物，诸如，聚乙二醇(PEG)可以束缚水分子并迫使较少的可溶性组分离开溶液。这样，通过低速离心或过滤分离含有细胞外囊泡的沉淀。在一些实施方案中，所述方法包括通过免疫亲和捕获细胞外囊泡进行基于亲和力的捕获。细胞外囊泡表面展示的蛋白或表位的示例包括CD9、CD63、CD81、Alix、小窝蛋白-1、CD41、CD4、阀蛋白、Rab5、HSC70和Lamp-3。在一些实施方案中，所述方法包括进行基于微流体的细胞外囊泡的分离方法，用于基于尺寸、密度和免疫亲和性鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体，可以实施创新的分选机制，诸如，声学、电泳和电磁操作。通过使用这种装置，预期样品体积、试剂消耗和分离时间显著减少。
在一些实施方案中，鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体的方法包括基于在细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的数量。在一些实施方案中，所述方法包括免疫测定，其中，使用识别免疫检查点部分的抗体。在一些实施方案中，抗体与可检测部分缀合。在一些实施方案中，从识别并结合免疫检查点部分的抗体检测到的信号与在细胞外囊泡表面上表达的免疫检查点部分的数量相关。示例性可检测部分包括酶部分(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、荧光染料、发光部分、放射性部分、比色标记、有色乳胶颗粒或纳米颗粒、以及金属缀合部分，诸如，金属纳米层、金属纳米颗粒或金属纳米壳缀合部分。在一些实施方案中，可检测部分被直接或间接标记用于通过流式细胞术(FACS)、放射自显影电子显微镜、免疫染色或亚细胞分级分离的比色测定(例如，用于检测HRP或β-半乳糖苷酶活性)；使用光学显微镜、免疫荧光显微术、共聚焦显微镜的外观检验。
在一些实施方案中，鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体的方法包括基于细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的直径和单位数量两者来鉴定和分离细胞外囊泡的同质群体。例如，该方法鉴定和分离包含直径为约50nm且约2000单位的细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点部分的细胞外囊泡的同质群体。在一些实施方案中，该方法鉴定和分离，包含直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm或更大且500个单位、1000个单位、1500个单位、2000个单位、2500个单位、3000个单位、3500个单位、4000个单位、4500个单位、5000个单位、5500个单位、6000个单位、7500个单位、8000个单位、8500个单位、9000个单位、9500个单位、10000个单位、11000个单位、12000个单位、13000单位、14000个单位、15000单位或更多的细胞外囊泡的表面上表达的免疫检查点的细胞外囊泡的同质群体。
治疗
在一些实施方案中，本文公开了治疗受试者的疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化、炎性肠病、乳糜泻、克罗恩氏病、格雷夫斯病、幼年型关节炎、慢性莱姆病、视神经炎、银屑病关节炎、巩膜炎、硬皮病、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎、炎性眼病、白癜风、COPD、来自器官移植的并发症或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：使所述细胞与如本文所述的组合物或药物组合物接触；在所述接触时，免疫检查点部分被递送至靶细胞。在一些实施方案中，免疫检查点部分调节靶细胞的免疫应答。在一些实施方案中，在体内、离体或体外发生接触。在一些实施方案中，组合物或药物组合物可直接施用于受试者。
在一些实施方案中，组合物或药物组合物可单独施用至受试者(例如，独立治疗)。在一些实施方案中，组合物与额外的试剂组合施用。在一些实施方案中，组合物是用于疾病或病症的一线治疗。在一些实施方案中，所述组合物是用于自身免疫性疾病的二线、三线或四线治疗。
通常，本文公开的方法包括通过口服施用组合物。然而，在一些示例中，方法包括通过腹膜内注射施用组合物。在一些示例中，方法包括施用肛门栓剂形式的组合物。在一些示例中，方法包括通过静脉内(“i.v.”)施用来施用组合物。可以想象，也可通过其他途径施用本文公开的组合物，诸如，皮下注射、肌内注射、皮内注射、经皮注射经皮施用、鼻内施用、淋巴管内注射、直肠施用、胃内施用或任何其他合适的肠胃外施用。在一些实施方案中，与全身途径相比，更靠近损伤或炎症部位的局部递送途径是优选的。可以调节施用治疗剂的途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施方案中，治疗剂的施用在疾病或病症的急性和慢性症状的任一种或两者发作之前或之后。
本文预防或治疗自身免疫性疾病的组合物的有效剂量和剂量由观察到的与自身免疫性疾病或病症或自身免疫性疾病的症状相关的有益应答来定义。在一些示例中，所述有益应答包括自身免疫性疾病症状的减轻。额外的有益应答包括预防、减轻、阻止或治愈自身免疫性疾病。在组合物不是治疗有效的或不能使疾病或病症或疾病或病症的症状充分缓解的示例中，则可改变施用的剂量和/或途径，或可将额外的试剂与组合物一起施用给受试者。在一些实施方案中，当患者开始组合物的方案时，患者也中断了(例如，逐步降低剂量)第二治疗方案。
给予受试者的合适剂量和剂量由以下因素确定，这些因素包括，但不限于，特定组合物、疾病况况及其严重性、需要治疗的受试者的身份(例如，体重、性别、年龄)，并且可以根据围绕病例的特定情况确定，包括，例如，施用的特定试剂、施用途径、治疗的状况和治疗的受试者。
在一些实施方案中，每小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时、每10小时、每11小时、每12小时、每13小时、每14小时、每15小时、每16小时、每17小时、每18小时、每19小时、每20小时、每21小时、每22小时、每23小时、每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每11天、每12天、每13天、每14天、每15天、每1个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、每1年、.每2年、每3年、每4年、每5年或每10年施用一次组合物。有效剂量范围可以基于受试者对治疗的应答来调节。一些施用途径比其他途径需要更高浓度的有效量的治疗剂。
在某些实施方案中，当患者的病症没有改善时，根据医生的判断，长期施用组合物，即，施用延长的时间段(包括在患者生命的整个持续时间内)以改善或以其他方式控制或限制患者的疾病或病症的症状。在患者的状态确实改善的某些实施方案中，可以暂时减少或暂时中止所施用的组合物的剂量达一定时间长度(即，“休药期”)。在具体实施方案中，休药期的长度为2天至1年，仅作为示例包括，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅作为示例，休药期期间的剂量减少10％-100％，包括，仅作为示例，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在某些实施方案中，可以暂时减少或暂时中止施用的药物剂量一段时间(即，“药物分流”)。在具体实施方案中，药物分流长度为2天至1年，仅作为示例包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅作为示例，药物分流期间的剂量减少10％-100％，仅作为示例包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在合适的时间长度之后，任选地，恢复正常的施用方案。
在一些实施方案中，一旦患者的病况已发生改善，如果需要，施用维持剂量。随后，在特定实施方案中，根据症状将施用的剂量或频率或两者降低至保持改善的疾病、病症或病况的水平。然而，在某些实施方案中，患者在症状复发后需要长期的间歇治疗。
通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法，包括，但不限于，测定LD50和ED50，确定这种治疗方案的毒性和治疗效果。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它表示为LD50和ED50之间的比。在某些实施方案中，从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制用于包括人类的哺乳动物的治疗有效的日剂量范围和/或治疗有效的单位剂量。在一些实施方式中，本文所述组合物的日剂量在包括ED50以及最小毒性的循环浓度范围内。在某些实施方案中，日剂量范围和/或单位剂量在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。
组合物可以单独使用或与额外的试剂组合使用。在一些情况下，如本文所用的“额外的试剂”是单独施用的。组合物和额外的试剂可以一起或顺序施用。联合疗法可在同一天内施用，或可相隔一天或多天、一天或多周、一天或多月或一天或多年施用。额外的试剂的示例可以包括其他免疫调节剂，诸如，靶向细胞因子或小分子的抗体。
虽然本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本发明不受说明书中提供的具体实施方案的限制。尽管已经参照上述说明书描述了本发明，但是本文实施方案的描述和说明不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，可以预期本发明还将覆盖任何这样的替代、修改、变化或等效物。意图是，所附权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。
实施例
以下说明性实施例是本文所述的刺激、系统和方法的代表性实施方案，并且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.间充质干细胞(MSC)及其相应的细胞外囊泡(EV)包含PD-L1。
MSC和它们相应的细胞外囊泡的PD-L1的存在通过蛋白质印迹证实。如图1所示，在MSC和相应的外来体中检测到45kDa大小的清晰条带。饥饿培养基用作阴性对照，胰岛外来体用作阳性对照。为了标准化这些结果，对来自脐带MSC的三个不同供体的MSC EV进行相同的测定。
MSC裂解物和MSC EV样品通过超声处理制备，其中MSC裂解物和MSC EV样品的体积相当于25μg蛋白。使用梯度预制聚丙烯酰胺凝胶(小型垂直电泳槽；伯乐实验室，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市)分析这些样品。然后将样品转移到硝酸纤维素膜上，用Tris-缓冲盐水(TBS)中的5％印迹级Blocker脱脂奶粉(伯乐实验室)阻断2小时。随后将膜与针对纯化的抗人CD274(B7-H1，PD-L1)抗体(Biolegne；cat#329701)的第一抗体在TBS-Tween(TBST)中的0.25％印迹级Blocker脱脂奶粉中于4℃孵育过夜。然后用TBST洗涤膜10分钟，三次。用TBST中的0.25％印迹级Blocker脱脂奶粉稀释的二抗ECL抗小鼠IgG辣根过氧化物酶连接的F(ab')2片段与膜一起孵育1.5小时。最后用ECL Prime蛋白质印迹检测(GE Healthcare)和VersaDoc 4000MP(伯乐实验室)分析膜。
实施例2.MSC EV抑制CD25+CD8+免疫细胞
在用IL-2(500U/ml)刺激6天的人外周血单核细胞(PBMC)中观察到显著的CD25+CD8+免疫细胞抑制。还观察到，在PBMC还与PD-L1抑制性抗体接触的实验组中，这种抑制减弱。该实验的示意图示于图2中。
图3的代表性流式细胞术图显示，在阻断PD-L1存在下，MSC EV对CD8+CD25+群体的抑制活性显著降低。此外，包含同种型对照抗体的对照组显示与单独的MSC EV相似的相同抑制活性。这些结果显示MSC EV的抑制活性主要取决于PD-L1存在。
实施例3.经遗传修饰以比野生型MSC产生更多的外来体PD-L1的MSC
从健康供体的脐带收获MSC。一旦收获，培养这些MSC用于进一步的实验。跨膜CD63通过已知技术(例如，CRISPR/Cas9)靶向遗传修饰。PD-L1的细胞外结构域与CD63融合。CD63氨基酸序列的几个特定亚组已被鉴定为PD-L1融合物的特别有利的区域：直接在RDKVMSE之后；直接在NNNFRQQ之后；以及直接在YPKNNHT之后。CD63的这些部分在CD63的大胞外环(LEL)中发现。1、2、3或更多个G4S接头用于将PD-L1的细胞外结构域融合至CD63。
在MSC的遗传修饰之后，培养遗传修饰的MSC。按照实施例1的方案制备遗传修饰的MSC裂解物和遗传修饰的MSC EV的样品。通过蛋白质印迹分析来分析这些样品以测试PD-L1的存在。在遗传修饰的MSC及其相应的外来体中检测到大小为45kDa的清晰条带。这些条带的颜色比实施例1的蛋白质印迹分析更暗，表明，与野生型MSC和由野生型MSC相比，遗传修饰的MSC及其对应的外来体产生的EV产生更多的PD-L1。饥饿培养基用作阴性对照，胰岛外来体用作阳性对照。
实施例4.经遗传修饰以产生外来体免疫检查点抑制剂的MSC
利用实施例3的方法转录任何免疫检查点抑制剂，其选自VISTA、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H4(VTCN1)、HVEM(CD270、TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(Nectin-2、CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、斯塔尔-1(克里弗1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44、SIRPα(CD172a)或其组合。
对经遗传修饰的MSC和它们相应的EV进行蛋白质印迹分析以测试所选择的免疫检查点抑制剂的存在。
实施例5.有效的遗传修饰的MSC及其对应的EV的产生/纯化
分析来自实施例3的遗传修饰的MSC及其对应的EV，以产生与实施例2的结果相比足以提高的CD25+CD8+免疫细胞抑制的有效的MSC及其对应的EV。
在包含与可检测标记缀合的抗PD-L1抗体和可溶性PD-1的溶液中制备来自实施例3的遗传修饰的MSC及其对应的EV。可溶性PD-1结合外来体PD-L1。由于存在于MSC和其对应的EV表面上的可溶性PD-1和外来体PD-L1之间的相互作用，与其中相应的外来体PD-L1被样品中存在的可溶性PD-1占据的MSC和EV相比，与可检测标记缀合的抗PD-L1抗体选择性结合表达更高水平的外来体PD-L1的样品中的MSC和EV。
使用该测定，从样品中产生/纯化有效的MSC和EV。
实施例6.有效的遗传修饰的MSC及其对应的EV显示增强的CD25+CD8+免疫细胞抑 制
在实施例2的实验中分析来自实施例5的有效的MSC和EV。与图3的结果相比，包含有效的MSC和EV的实验组显示了显著提高的CD25+CD8+免疫细胞抑制。
实施例7.用于治疗类风湿性关节炎的有效的遗传修饰的MSC及其对应的EV
制备包含来自实施例5和6的有效EV和药学上可接受的赋形剂的药物组合物以治疗患有类风湿性关节炎的患者。所述药物组合物包含约10^6至约10^8个EV或约1μg至约700mg的EV。
将所述药物组合物施用于患有炎症部位的类风湿性关节炎的患者。EV的提高的CD25+CD8+免疫细胞抑制足以治疗类风湿性关节炎。
实施例8.用于治疗接受肾移植的患者中的移植物抗宿主病的有效遗传修饰MSC及 其对应的EV
制备包含来自实施例5和6的有效EV和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，以治疗正在进行肾移植的患者中的患有移植物抗宿主病的患者。所述药物组合物包含约10^6至约10^8个EV或约1μg至约700mg的EV。
将所述药物组合物在炎症部位给予进行肾移植的患者中患有移植物抗宿主病的患者。EV的提高的CD25+CD8+免疫细胞抑制足以治疗进行肾移植的患者中的移植物抗宿主病。
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述公开，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本公开的真实范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献通过引用整体并入用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文献出于所有目的被单独地并独立地指出通过引用并入。

Claims (110)

1.一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：
a.免疫检查点部分，其中，所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4或其任何组合；以及
b.跨膜部分，其中，所述跨膜部分包含CD63，其中，所述CD63包含3个跨膜结构域；
其中，所述免疫检查点部分偶联至所述跨膜部分。
2.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分偶联至所述CD63的胞外环以产生经修饰的CD63。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外环是所述经修饰的CD63的大胞外环或第二胞外环。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含与SEQ IDNO：6-17中所示的氨基酸序列中任一个至少90％同一的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含与SEQ IDNO：6-17中所示的氨基酸序列中任一个至少95％同一的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含SEQ ID NO：6-17中所示的氨基酸序列中任一个。
7.一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：
a.免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分包含PD-L1；以及
b.跨膜部分，其中所述跨膜部分包含乳凝集素；
其中，所述免疫检查点部分偶联至所述跨膜部分。
8.一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含：
a.免疫检查点部分，其中所述免疫检查点部分包含T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、PD-L1、CTLA-4或其任何组合；以及
b.跨膜部分，其中所述跨膜部分包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)；
其中，所述免疫检查点部分偶联至所述跨膜部分。
9.一种包含细胞外囊泡的组合物，所述细胞外囊泡包含以下a和b中的至少一种：
a.免疫检查点部分；以及
b.跨膜部分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分被所述细胞外囊泡封装。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分在所述细胞外囊泡的表面上表达。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分由所述细胞外囊泡分泌。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分与所述跨膜部分复合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分与所述跨膜部分共价连接。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3(CD276)、B7-H2、B7-H4(VTCN1)、HVEM(CD270、TNFRSF14)、半乳凝素9、半乳凝素3、CEACAM1(CD66a)、OX-2(CD200)、PVR(CD155)、PVRL2(Nectin-2、CD112)、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、CD47、Stabilin-1(Clever-1)、神经毡蛋白1、神经毡蛋白2、CD158(家族)、IGSF2(CD101)、CD155、GITRL、CD137L、OX40L、LIGHT、CD70、PD-1、RGMB、CTLA-4(CD152)、BTLA、CD160、Tim-3、CD200R、TIGIT、CD112R(PVRIG)、LAG-3(CD223)、PECAM-1、CD44、SIRPα(CD172a)或其组合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分包含VISTA、PD-L1、CTLA-4或其组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分包含PD-L1。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜部分选自：14-3-3蛋白ζ/δ、4-3-3蛋白ε、78kDa葡萄糖调节蛋白、乙酰胆碱酯酶/AChE-S、AChE-E、肌动蛋白、胞质1(ACTA)、ADAM10、碱性磷酸酶、α-烯醇酶、α-突触核蛋白、氨肽酶N、淀粉样蛋白βA4/APP、膜联蛋白5A、膜联蛋白A2、AP-1、ATF3、ATP柠檬酸裂解酶、ATP酶、β肌动蛋白(ACTB)、β-淀粉样蛋白42、小窝蛋白-1、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD142、CD146、CD163、CD24、CD26/DPP4、CD29/ITGB1、CD3、CD37、CD41、CD42a、CD44、CD45、CD47、CD49、CD49d、CD53、CD63、CD64、CD69、CD73 CD81、CD82、CD9、CD90、密封蛋白、密封蛋白-1、丝切蛋白-1、补体结合蛋白CD55和CD59、胞质热激蛋白90α、胞质热激蛋白90β、EBV LMP1、EBV LMP2A、EF-1α-1、EF2、EFGR EGFRVIII、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子/CD147、烯醇酶1α(ENO1)、EPCAM、ERBB2、跨膜四蛋白(CD9、CD63和CD81)、脂肪酸合酶、胎球蛋白-A、阀蛋白-1、阀蛋白-2、果糖二磷酸醛缩酶A、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、血型糖蛋白A、GPC1、GPI锚定的5′-核苷酸酶、GTP酶、热激蛋白8(HSPA8)、热激蛋白(HSP70和HSP90)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、肝素酶、异源三聚体G蛋白、HIV Gag、HIV Nef、HLA-DRA、HLA-G、HSV gB、HTLV-1Tax、亨廷顿蛋白、ICAM1、整联蛋白、乳凝集素、LAMP1/2、富含亮氨酸的受体激酶2、L-乳酸脱氢酶A链、溶酶体相关的膜糖蛋白1、溶酶体相关的膜糖蛋白2、MHC I类、MHC II类、MUC1、多药耐药相关蛋白、肌肉丙酮酸激酶(PKM2)、N-钙粘蛋白、NKCC2、PDCD6IP/Alix、PECAM1、磷酸甘油酸激酶、胎盘朊病毒蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、丙酮酸激酶(PKM)、Rab-14、Rab-5a、Rab-5b、Rab-5c、Rab-7、Rap 1B、抵抗素、音猬因子(SHH)、存活蛋白、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-4、同线蛋白-1、转铁蛋白受体(TFR2)、TSG101、TSPAN8、肿瘤相关糖蛋白跨膜四蛋白-8、酪氨酸3单氧酶/色氨酸5单氧酶激活蛋白、TYRP-2、膜泡分拣蛋白35或ζ多肽(YWHAZ)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜部分包含乳凝集素。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜部分包含LAMP2或其变体或其片段，所述LAMP2与SEQ ID NO：4的肽序列至少70％同一。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜部分包含CD63或其变体或其片段，所述CD63与SEQ ID NO：5的肽序列至少70％同一。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述CD63是经修饰的CD63。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述经修饰的CD63是截短的CD63。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述经修饰的CD63被修饰为包含至少一个额外的CD63跨膜结构域。
25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含1个跨膜结构域。
26.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含2个跨膜结构域。
27.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含3个跨膜结构域。
28.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含4个跨膜结构域。
29.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经修饰的CD63包含5个跨膜结构域。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分在所述经修饰的CD63的胞外环处与所述经修饰的CD63复合。
31.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点部分在所述经修饰的CD63的大胞外环处与所述经修饰的CD63复合。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含靶向部分。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述靶向部分包含靶向细胞因子的肽。
34.根据权利要求32或33所述的组合物，其中所述靶向部分包含靶向癌细胞标志物的肽。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含促进融合部分。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述促进融合部分包含病毒促进融合部分。
37.根据权利要求35或36所述的组合物，其中所述促进融合部分包含哺乳动物促进融合部分。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含免疫逃避部分。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述免疫逃避部分包含CD47。
40.如前述权利要求中任一项的所述组合物，其不包含除核细胞。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含外来体、微泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡体、癌小体、大膜泡、包膜病毒、外泌体或其他非常大的细胞外囊泡。
42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含外来体。
43.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含多个免疫检查点部分。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少10,000个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
45.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少9,000个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
46.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少8,000个单元的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
47.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少7,000个单元的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
48.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少6,000个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
49.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少5,000个单元的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括100nm的直径。
50.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少3,000个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括50nm的直径。
51.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少2,500个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括50nm的直径。
52.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少2,000个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括50nm的直径。
53.如权利要求43所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含每个细胞外囊泡至少1,500个单位的免疫检查点部分，所述细胞外囊泡包括50nm的直径。
54.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多种外来体。
55.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的外来体。
56.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少10^6外来体。
57.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少10^7外来体。
58.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少10^8个外来体。
59.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少1μg的外来体。
60.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少10μg的外来体。
61.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少20μg的外来体。
62.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少50μg的外来体。
63.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少100μg的外来体。
64.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少150μg的外来体。
65.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少200μg的外来体。
66.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少250μg的外来体。
67.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少500μg的外来体。
68.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少750μg的外来体。
69.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少1mg的外来体。
70.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少2mg的外来体。
71.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少3mg的外来体。
72.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少4mg的外来体。
73.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少5mg的外来体。
74.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少6mg的外来体。
75.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少7mg的外来体。
76.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少100mg的外来体。
77.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少200mg外泌体。
78.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少300mg的外来体。
79.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少400mg的外来体。
80.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少500mg的外来体。
81.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少600mg的外来体。
82.根据权利要求54或55所述的组合物，其包含至少700mg的外来体。
83.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物来源于细胞。
84.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冷藏保存的。
85.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冻干的。
86.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物在37℃稳定24小时。
87.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物在37℃稳定48小时。
88.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物在37℃稳定72小时。
89.一种细胞，被配置成产生根据权利要求1-88中任一项所述的细胞外囊泡。
90.根据权利要求89所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。
91.根据权利要求89所述的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
92.根据权利要求89所述的细胞，其中所述细胞是非人类细胞。
93.根据权利要求89至92中任一项所述的细胞，其中所述细胞是间充质干细胞。
94.权利要求89至93中任一项的细胞，其中所述细胞是遗传修饰的细胞。
95.一种纯化被配置成表达一个或多个免疫检查点部分的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.获得细胞外囊泡的异质群体；
b.使所述细胞外囊泡的异质群体经受检测分析溶液，所述检测分析溶液包含用于与所述免疫检查点部分复合的检测部分；以及
c.检测由所述免疫检查点部分和所述检测部分之间形成的复合物产生的信号，其中，所述信号的强度与所表达的免疫检查点部分的单位成比例；以及
d.基于所述信号的强度分离所述细胞外囊泡的亚群。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述检测部分包括抗体。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述检测部分包含抗VISTA抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4或其组合。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述检测部分包含所述免疫检查点部分的配体。
99.根据权利要求95所述的方法，其中所述检测分析溶液还包含被配置成结合所述免疫检查点部分的肽。
100.根据权利要求99所述的方法，其中被配置成结合所述免疫检查点部分的肽包含PD-1、CD80、CD86或其组合。
101.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-88中任一项所述的组合物。
102.根据权利要求101所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。
103.根据权利要求101所述的药物组合物，其包含至少一种额外的活性剂。
104.根据权利要求101所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、脑实质内、皮下或其组合施用。
105.一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括施用根据权利要求101至104中任一项所述的药物组合物。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化、炎性肠病、乳糜泻、克罗恩病、格雷夫斯病、幼年型关节炎、慢性莱姆病、视神经炎、银屑病性关节炎、巩膜炎、硬皮病、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎、炎性眼病、白癜风、COPD、来自器官移植的并发症或移植物抗宿主病。
107.根据权利要求106得到的方法，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎。
108.一种抑制有需要的患者中的CD8+CD25+细胞的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-88中任一项所述的组合物。
109.一种试剂盒，其包含根据权利要求101-104所述的药物组合物。
110.一种平台，其包含用于产生根据权利要求1-88中任一项所述的组合物的组分。
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