CN113769106A - 用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用 - Google Patents

用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用。其中，该融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。本发明的融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和制备，不会带来免疫毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以单独定制，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性与免疫抗原，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。

Description

用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用。
背景技术
免疫检查点阻断疗法(ICB疗法)属于肿瘤免疫疗法。其中，免疫阻断点包括适应性和先天性的免疫阻断点，比如PD-L1和CD47。作为一种适应性的免疫阻断点，PD-L1可以抑制抗肿瘤T细胞的活性和通过PD-1受体来减少抗肿瘤适应性的免疫响应，因此，PD-L1/PD-1信号通路的中断可以恢复抗肿瘤T细胞的免疫响应。作为一种先天的免疫阻断点，CD47可以通过与它的受体(信号调控蛋白SIRPα)相互作用减少巨噬细胞的吞噬作用。因此，阻断CD47和SIRPα信号通路也可以抑制肿瘤的生长。
由于PD-L1和CD47都可以在肿瘤细胞上过表达，分别充当至关重要的适应性和先天的阻断点，它们是否在免疫调控方面具有协同作用变得非常有吸引力。但同时也存在着一定的技术问题，例如：FU Y X，LIU X J.Dual targeting of innate and adaptivecheckpoints on tumor cells limits immune evasion[J].Cancer Research,2018,78(13).公开了一种融合蛋白，可以同时阻断PD-L1和CD47，展示了相对于单一阻断点更好的治疗效果。但是融合蛋白技术需要复杂的设计和隔离，并且不具有肿瘤靶向性，还会带来蛋白毒性。又如，ZHANG X D，WANG C，WANG J Q，et al.PD-1Blockade Cellular Vesiclesfor Cancer Immunotherapy[J].Advanced Materials,2018,30(22).公开了在过表达PD-1的单一细胞膜囊泡用于肿瘤的免疫治疗。但是这种方法对于同时表达有PD-L1和CD47的肿瘤细胞来说，只阻断PD-L1/PD-1信号通路，其治疗效果并不好。
发明内容
本发明旨在提供一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用，以改善肿瘤免疫治疗的效果。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡。该融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。
进一步地，免疫检查点对应的受体包括SIRPα变体、PD-1、CLTA-4、TIM3、LAG3和VISTA。
进一步地，不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。
根据本发明的另一个方面，提供一种上述融合细胞膜纳米囊泡的制备方法。该制备方法包括以下步骤：选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达免疫检查点对应的受体的细胞为两种或两种以上，每种过表达免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种免疫检查点对应的受体；分别制备衍生于过表达免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分，得到融合细胞膜纳米囊泡。
进一步地，融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分包括：将两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成融合细胞膜纳米囊泡；优选的，微型推挤机的孔径为100～400nm；优选的，超声处理的时间为5～20分钟；优选的，用DLS监测融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分的过程；更优选的，在通过微型推挤机挤出前，各单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记。
进一步地，单一细胞膜囊泡组分的制备包括：用低渗裂解缓冲液和均质器破坏过表达免疫检查点对应的受体的细胞，得到第一溶液；用DNase和RNase处理第一溶液，然后离心收集细胞膜囊泡；用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤细胞膜囊泡，然后细胞膜囊泡经过超声处理后，在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压得到单一细胞膜囊泡组分。
进一步地，过表达免疫检查点对应的受体的细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。
进一步地，对细胞进行基因工程化包括：用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆4T1细胞，得到过表达SIRPα变体的4T1细胞；将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中，然后转染B16F10细胞，得到过表达PD-1的B16F10细胞。
根据本发明的又一个方面，提供一种用于肿瘤免疫治疗的药物。该药物包括上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡，以及医学上可以接受的载体；优选的，医学上可以接受的载体包括磷脂纳米颗粒。
进一步地，药物还包括包裹在融合细胞膜纳米囊泡内的化疗药物和/或小分子核酸药物。
根据本发明的再一个方面，提供上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
应用本发明的技术方案，融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和隔离，不会带来蛋白毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以各自制定，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了Fus-CVs的制备和表征，其中图1中的a示出了在原始的和基因工程化的4T1细胞的SIRPα表达(标尺棒：10微米)；b示出了在原始的和基因工程化的B16F10细胞的PD-1表达(标尺棒：10微米)；c示出了Fus-CVs的荧光图像(标尺棒：10微米)；d示出了Fus-CVs的TEM图(左标尺棒：100微米；右标尺棒：50微米)；e示出了PBS中的Fus-CVs的大小分布(双方差分析以及Tukey's检验；*P<0.05,***P<0.001)；f示出了SIRPα-CVs,PD-1-CVs andFus-CVs样本中的SIRPα和PD-1的蛋白免疫印迹分析；g示出了在PBS中14天的Fus-CVs的水动力大小和zeta电势；h示出了脂质体，RBC-CVs和Fus-CVs的体内药代动力学特征；i示出了在肝、脾、肾和肿瘤的脂质体，RBC-CVs和Fus-CVs的体内分布(普通单向方差分析以及Tukey’s检验；ns无显著性，*P<0.05,**P<0.01)。所有的数据都是平均±S.D.(n＝4/组)。
图1-1示出了PD-1-CVs，Fus-CVs和SIRPα-CVs的SDS-PAGE分析。
图2示出了Fus-CVs会阻断CD47和PD-L1检查点，引发抗肿瘤免疫，其中，图2中的a示出了吞噬分析的荧光图(标尺棒：100微米)；b示出了不同培养浓度的RAW264.7细胞吞噬4T1细胞的能力的定量分析；c示出了用MFI测量CD80在CD45+CD11c+细胞里的表达；d示出了用MFI测量CD86在CD45+CD11c+细胞里的表达；e示出了在肿瘤中Foxp3+调节性T(Treg)细胞的流体细胞计数；f示出了在肿瘤中Gr1+CD11b+骨髓源性抑制细胞(MDSCs)的流体细胞计数；g示出了经过处理后的T细胞和B16F10细胞的孵化里的IFN-γ的ELISA测量；h示出了肿瘤里的CD4+T细胞的流体细胞计数；i示出了肿瘤里的CD8+T细胞的流体细胞计数；j示出了引流淋巴结中的IFN-γ+CD8+T细胞的流体细胞计数。普通单向方差分析以及Tukey’s检验；ns无显著性,*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。所有的数据都是平均±S.D.(n＝5/组)。
图2-1示出了流式细胞术门控策略图示，其中，图2-1中的a示出了MFI检测CD11c+细胞中CD80和CD86的表达，b示出了肿瘤组织中Foxp3+Treg细胞，c示出了肿瘤组织中Gr1+CD11b+MDSCs。
图2-2示出了流式细胞术门控策略图示，其中，图2-2中的a示出了肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞；b示出了引流淋巴结中IFN-γ+CD8+T细胞。
图3示出了Fus-CV的CD47和PD-L1的双重阻断抑制B16F10肿瘤生长，促进抗肿瘤免疫；其中，图3中的a示出了B16F10的老鼠模型方案；b示出了在不同组里的单独的肿瘤生长动力学曲线，c示出了在不同组里的平均的肿瘤生长动力学曲线；d示出了不同的治疗小组的生存曲线；e示出了肿瘤组织的免疫荧光图像展示Ki-67水平(标尺棒：50微米)；f示出了肿瘤组织中的CD206+M2巨噬细胞的流式细胞计数，g示出了肿瘤组织中的Gr1+CD11b+MDSCs的流式细胞计数，h示出了肿瘤组织中的CD8+T cells的流式细胞计数；i示出了引流淋巴结中的IFN-γ+CD8+T细胞的流式细胞计数。普通单向方差分析以及Tukey’s检验；ns无显著性，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。所有的数据都是平均±S.D.(n＝6/组)。
图3-1示出了经过不同治疗之后的肿瘤组织的照片。
图4示出了Fus-CV的CD47和PD-L1的双重阻断抑制外科手术后的4T1肿瘤生长和转移；其中，图4中的a示出了4T1的外科手术后的复发和转移的老鼠模型方案；b示出了在不同组里的单独的肿瘤生长动力学曲线；c示出了在不同组里的平均的肿瘤生长动力学曲线(双方差分析以及Tukey's检验；*P<0.05,***P<0.001)；d示出了墨水染色的肺的照片，红色箭头表示转移灶(普通单向方差分析以及Tukey’s检验；ns无显著性，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001)；e示出了在指定的治疗后的肺部转移灶的数量；f示出了H&E染色的肺切片，黑色箭头表示转移灶；g示出了在指定的治疗后的转移率；h示出了在指定治疗组的生存曲线。(Log-rank(Mantel-Cox)测试；**P<0.01)所有的数据都是平均±S.D.(n＝6/组)。
图5示出了全血生化实验。
图6示出了主要器官的H&E染色切片图像。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中融合蛋白技术需要复杂的设计和隔离，并且不具有肿瘤靶向性，还会带来蛋白毒性，单一细胞膜囊泡用于肿瘤的免疫治疗，治疗效果并不好的技术问题，本发明提出了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡。该融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。
应用本发明的技术方案，融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和制备，不会带来免疫毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以单独制定，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性与免疫抗原，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
在本发明中，免疫检查点对应的受体可以是本领域已知的免疫检查点对应的受体，例如可以是SIRPα变体(SIRPα变体是免疫检查点CD47的受体)、PD-1(PD-1是免疫检查点PD-L1的受体)、CLTA-4、TIM3、LAG3和VISTA等，当然这只是例举，并不限定于这些受体。对于受体的选择，本领域技术人员可以在本发明发明构思的指导下，根据不同的疾病的免疫检查点进行合理选择。
来自不同来源细胞的融合细胞膜囊泡(Fus-CVs)从不同来源细胞中继承了特性。例如，在本发明一典型的实施例中，不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。通过融合单一的基因工程化的细胞膜囊泡(CVs)，Fus-CVs同时过表达了不同的SIRPα和PD-1(图1中a所示)。先天性的阻断点CD47和适应性的阻断点PD-L1的双重靶向的大大改进了巨噬细胞和树突状细胞(DCs)抗原展示，并且引发了抗肿瘤T细胞的免疫响应(图1中b所示)。并且，Fus-CVs的双特异性的靶向设计确保了更多的肿瘤细胞的靶向性，并且更少的对于其他细胞的靶向性，这有效减少了系统副作用，增强了治疗功效。
根据本发明一典型的实施方式，提供一种上述融合细胞膜纳米囊泡的制备方法。该制备方法包括以下步骤：选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达免疫检查点对应的受体的细胞为两种或两种以上，每种过表达免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种免疫检查点对应的受体；分别制备衍生于过表达免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分，得到融合细胞膜纳米囊泡。
通过该方法制备方法不需要复杂的设计即可以得到融合细胞膜纳米囊泡，方法简单易于操作，并且单细胞膜囊泡组件可以各自制定，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
在本发明一种优选的实施方式中，融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分包括：将两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成融合细胞膜纳米囊泡。此种方法操作简便，易于控制。优选的，微型推挤机的孔径为100～400nm；优选的，超声处理的时间为5～20分钟。在本发明一实施例中，优选的，在通过微型推挤机挤出前，各单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记，用DLS(动态光散射，Dynamic Light Scattering)监测融合两种或两种以上单一细胞膜囊泡组分的过程。这样可以很方便的监测单一细胞膜囊泡组分的融合过程，判断其是否可以融合成功。例如，将SIRPα-CVs和PD-1-CVs混合(蛋白质量比为1:2)，超声5min，在微型推挤机上通过100nm的孔挤出。用DLS监测Fus-CVs的制备过程。用透射电子显微镜(TEM)观察了Fus-CVs的形貌，透射电镜样品用醋酸铀酰负染色。荧光成像也用于确定SIRPα-CVs和PD-1-CVs是否融合。在挤压前，SIRPα-CVs和PD-1-CVs分别用1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基林甲二碳菁、4-氯苯磺酸盐(DiD)和1,1’-二喹啉-3,3,3’,3’-四甲基林甲碳菁高氯酸盐(Dil)进行标记。融合后，将Fus-CVs固定在甘油中，并在CLSM下观察。用DLS法测定Fus-CVs在PBS中的稳定性。
在本发明一种优选的实施方式中，单一细胞膜囊泡组分的制备包括：用低渗裂解缓冲液和均质器破坏过表达免疫检查点对应的受体的细胞，得到第一溶液；用DNase和RNase处理第一溶液，然后离心收集细胞膜囊泡；用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤细胞膜囊泡，然后细胞膜囊泡经过超声处理后，在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压得到单一细胞膜囊泡组分。例如在本发明一实施例中，为了获得单一基因工程化的CVs，用低渗裂解缓冲液和Dounce均质器破坏SIRPα变体工程化的4T1细胞和PD-1工程化的B16F10细胞，然后用DNase和RNase处理溶液，再在3200g下离心5min，将富集的上清液分别20000g离心30min和80000g离心1.5h。然后，收集细胞膜囊泡，用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤3次，超声5min，最后在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压分别得到SIRPα-CVs和PD-1-CVs。用动态光散射对SIRPα-CVs和PD-1-CVs测量动态直径和zeta电势。
根据本发明一典型的实施方式，对细胞进行基因工程化包括：用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆4T1细胞，得到过表达SIRPα变体的4T1细胞；将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中，然后转染B16F10细胞，得到过表达PD-1的B16F10细胞。
在本发明一具体的实施方式中，融合细胞膜纳米囊泡(Fus-CVs)的制备具体包括以下步骤：
(1)基因工程化的细胞的构建：
用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆上述细胞，得到过表达SIRPα变体的4T1细胞。
为了得到PD-1过表达的B16F10细胞，首先将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中。DNA测序证实了PD-1质粒的存在，用具有lipofectamine2000的质粒瞬时转染B16F10细胞。为了建立稳定的细胞，用pCMV6-OFR-PD-1转染B16F10细胞，然后用潮霉素b对其进行筛选。过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞采用免疫荧光和流式细胞术对其进行表征。
(2)分别制备衍生于过表达SIRPα变体的肿瘤细胞和过表达的PD-1的肿瘤细胞的单一细胞膜囊泡(CV)组分：
为了获得单一基因工程化的CVs，用低渗裂解缓冲液和Dounce均质器破坏SIRPα变体工程化的4T1细胞和PD-1工程化的B16F10细胞，然后用DNase和RNase处理溶液，再在3200g下离心5min，将富集的上清液分别20000g离心30min和80000g离心1.5h。然后，收集细胞膜囊泡，用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤3次，超声5min，最后在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压分别得到SIRPα-CVs和PD-1-CVs。用动态光散射对SIRPα-CVs和PD-1-CVs测量动态直径和zeta电势。
(3)融合CV组分得到Fus-CVs：
将SIRPα-CVs和PD-1-CVs混合(蛋白质量比为1:2)，超声5min，在微型推挤机上通过100nm的孔挤出。用DLS监测Fus-CVs的制备过程。用透射电子显微镜(TEM)观察了Fus-CVs的形貌，透射电镜样品用醋酸铀酰负染色。荧光成像也用于确定SIRPα-CVs和PD-1-CVs是否融合。在挤压前，SIRPα-CVs和PD-1-CVs分别用1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基林甲二碳菁、4-氯苯磺酸盐(DiD)和1,1’-二喹啉-3,3,3’,3’-四甲基林甲碳菁高氯酸盐(Dil)进行标记。融合后，将Fus-CVs固定在甘油中，并在CLSM下观察。用DLS法测定Fus-CVs在PBS中的稳定性。
根据本发明一典型的实施方式，提供一种用于肿瘤免疫治疗的药物。该药物包括上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡，以及医学上可以接受的载体；优选的，医学上可以接受的载体包括磷脂纳米颗粒。本发明的融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和隔离，不会带来蛋白毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；另外，融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以各自制定，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
典型的，上述药物还可以包括包裹在融合细胞膜纳米囊泡内的化疗药物和/或小分子核酸药物等。由于融合细胞膜纳米囊泡与肿瘤细胞膜的同源靶向性，可以增加化疗药物和/或小分子核酸药物等的靶向性递送，进一步提高药物的治疗效果。
根据本发明一典型的实施方式，提供上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或上述任一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
下面将结合试验数据进一步说明本发明的有益效果。
实施例
材料：除非另有说明，化学试剂均从Sigma Aldrich购买。抗PD-L1和抗CD47单克隆抗体均来自Bio-X细胞。
细胞系：B16F10黑色素瘤(B16F10细胞)、4T1乳腺癌(4T1细胞)和RAW 264.7巨噬细胞的小鼠细胞系均来自美国类型培养物保藏中心(ATCC)，并在ATCC提供的指导下培养。
老鼠：雌性BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠(6-10周)购自北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd)。
具体操作及结果如下：
首先，基因工程细胞的构建与鉴定。SIRPα变体和PD-1分别在4T1小鼠乳腺瘤和B16F10小鼠黑色素瘤细胞上通过慢病毒被过表达。SIRPα变体和PD-1在相应细胞上的表达通过免疫荧光成像和流式细胞术(图1中的a和b)来确认。具体地，为了证实基因工程化的4T1细胞上的过表达的SIRPα变体，首先将原始和基因工程化的细胞分别接种到玻璃底皿中并培养过夜。然后将细胞分别与小鼠CD47-人体IgG融合蛋白(1μg/mL)在25℃下共培养30分钟，再使用PE-驴-人体IgG在4℃下染色20分钟，再用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)在25℃下染色10分钟。最终，使用共焦激光扫描显微镜(CLSM)监控样品形貌。另外，发明人也使用了流式细胞术来验证细胞上的SIRPα变体表达。将原始的和基因工程化的细胞分别与不同浓度的小鼠CD47-人体IgG融合蛋白在4℃下共培养1h，再使用PE-驴-人体IgG在4℃下染色30分钟。最后，使用7-AAD细胞活力染色液来排除死细胞。采用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集数据，用CytExpert(Beckman Coulter)软件来分析数据。PD-1过表达的B16F10细胞也用与上述4T1细胞的表征方法相同的方法来进行表征以确定B16F10细胞上PD-1的过表达。为了得到PD-1过表达的B16F10细胞，首先将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中(Sino Biological)。DNA测序证实了PD-1质粒的存在，用具有脂质体2000(Invitrogen)的质粒瞬时转染B16F10细胞。为了建立稳定的细胞，用pCMV6-OFR-PD-1转染B16F10细胞，然后用潮霉素b对其进行筛选。
其次，通过裂解和离心来清除细胞内组分从而得到单一的CV组分，通过重复的超声和重复的使用迷你推挤器推挤纳米尺寸的细胞膜囊泡来获得CVs。具体的，为了获得单一基因工程化的CVs，用低渗裂解缓冲液和Dounce均质器破坏SIRPα变体工程化的4T1细胞和PD-1工程化的B16F10细胞，然后用DNase和RNase(Invitrogen)处理溶液，再在3200g下离心5min，将富集的上清液分别20000g离心30min和80000g离心1.5h。然后，收集细胞膜囊泡，用PBS混合蛋白酶抑制剂片洗涤3次，超声5min，最后在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压分别得到SIRPα-CVs和PD-1-CVs。用动态光散射对SIRPα-CVs和PD-1-CVs测量动态直径和zeta电势(DLS；Nano-Zen 3600,Malvern Instruments,UK)。
然后，将获得的SIRPα-CVs和PD-1-CVs进行混合，超声和推挤来形成纳米尺度的Fus-CVs。为了判断CVs是否完全混合，单一CVs在混合之前使用了不同的染料标记。具体的，将SIRPα-CVs和PD-1-CVs混合(蛋白质量比为1:2)，超声5min，在微型推挤机上通过100nm的孔挤出。用DLS监测Fus-CVs的制备过程。用透射电子显微镜(TEM)观察了Fus-CVs的形貌，透射电镜样品用醋酸铀酰负染色。荧光成像也用于确定SIRPα-CVs和PD-1-CVs是否融合。在挤压前，SIRPα-CVs和PD-1-CVs分别用1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基林甲二碳菁、4-氯苯磺酸盐(DiD)和1,1’-二喹啉-3,3,3’,3’-四甲基林甲碳菁高氯酸盐(Dil)进行标记。融合后，将Fus-CVs固定在甘油中，并在CLSM下观察。用DLS法测定Fus-CVs在PBS中的稳定性。
当使用共聚焦显微镜观察Fus-CVs时，可以观察到荧光信号的不同的重叠(如图1中c)，这表明了SIRPα-CVs和PD-1-CVs成功地进行了混合。投射电子显微镜(TEM)观察和动态光散射分析(DLS)进一步表明了Fus-CVs是圆形的脂质液滴，具有100nm的平均直径(如图1中的d和e)。并且，SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析表明了Fus-CVs分别从SIRPα-cvs和PD-1-cvs处遗传了特异性蛋白标记SIRPα和PD-1(如图1中的f)。从SIRPα-cvs和PD-1-cvs中标记SIRPα和PD-1(图1中的f和图1-1)。具体地，为了使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将SIRPα-CVs、PD-1-CVs和Fus-CVs加入到蛋白提取缓冲液中，用双茚二酮酸(BCA)试剂盒(Sigma-Aldrich)测定蛋白含量。样品在95℃加热5分钟，每个20μg的样品装入10％sds-聚丙烯酰胺凝胶中。将样品在120V下运行2h，再用考马斯蓝染色4h，脱色过夜后观察。为了进行免疫蛋白印迹分析(Western blotting)，将蛋白样品变性后装入10％sds-聚丙烯酰胺凝胶中。分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5％(w/v)脱脂牛奶在25℃下封闭1小时，并与SIRPα和PD-1一抗在4℃下孵育过夜。并与酶标二抗进一步孵育，印迹使用West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate kit(Thermo Fisher Scientific)开发。
值得注意的是，Fus-CVs在缓冲液中可以保持稳定至少14天(图1中的g)并且具有长的体循环时间，它的体循环时间几乎与红细胞衍生的细胞膜囊泡(RBC-CVs)相当(图1中的h)。此外，发明人还检测了在B16F10黑色素瘤小鼠模型上的Fus-CVs的体内生物分布。将1×106个B16F10细胞皮下注射C57BL/6小鼠右侧。在肿瘤接种后第8天，小鼠静脉注射含有1μg/μL DID标记的脂质体RBC-CVs或Fus-CVs的100μL PBS。在指定的时间点，从尾静脉采血20μL。采集的样品用30μL PBS稀释，用IVIS成像系统(Perkin Elmer)测量荧光信号。注射后72h，采集肿瘤组织和主要器官进行荧光成像。可以看到，与RBC-CVs和脂质体相比，Fus-CVs在肝、脾、肾处减少了积聚，并增强了在肿瘤处的积聚(图1中i)，这可能是因为癌细胞膜囊泡的独特的免疫逃避能力和同源靶向性。
为了测试SIRPα-cvs能否触发巨噬细胞吞噬癌细胞，用初始的CVs或SIRPα-CVs来处理4T1细胞，然后和RAW 264.7巨噬细胞共培养。具体地，为了进行荧光显微镜分析，首先将4T1细胞与指示浓度的未基因工程化的CVs或SIRPα-CVs孵育。之后，RAW 264.7和4T1细胞分别用CellTrackerTMGreen和CellTrackerTMRed(均来自赛莫Fisher Scientific)染色。将荧光标记的RAW 264.7和4T1细胞共培养到指定的时间，测量RAW 264.7细胞吞噬4T1细胞的情况，红色荧光信号与RAW 264.7细胞中吞噬体的形成有关。共聚焦成像显示巨噬细胞的吞噬能力随着SIRPα-CV的剂量增多而提高(图2中a和b)。接下来发明人基于4T1小鼠模型对SIRPα-CVs对免疫调节的体内效应进行了研究。用流式细胞术来采集数据，观察到CD11c+细胞增加，这些细胞显示了CD80和CD86的高表达(图2中的c和d，图2-1中的a)，表明其成熟状态和促进了抗原呈现。在用SIRPα-CVs处理后，观察到了在肿瘤微环境(TME)中Foxp3+调节性T(Treg)细胞和Gr1+CD11b+骨髓源性抑制细胞(MDSCs)会减少(图2中的e，f，图2-1中的b，c)，这表明了肿瘤免疫抑制的逆转。
PD-1/PD-L1阻断疗法的初步成功大大促进了ICB疗法在临床上的广泛应用。
机制上，PD-1通过与PD-L1连接，转换抑制T细胞的增殖及其功能的信号，其功能包括细胞毒性和IFN-γ的产生。为了检测PD-1-cvs是否阻断PD-1/PD-L1通路并且激活T细胞免疫，将B16F10细胞与初始的CVs或者PD-1-CVs一起处理后，再与T细胞共培养。具体地，将1×106个B16F10癌细胞注射到C57BL/6小鼠体内。接种后第14天处死长有瘤的小鼠，收集腹股沟淋巴结。然后将淋巴结压碎，用70μm尼龙细胞滤器过滤。用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，CD8+T细胞用CD8 MicroBeads(Ly-2mouse；Miltenyi Biotic)分离。1×106CD8+T细胞在涂布有cd3抗体/cd28抗体(CD3抗体2μg/mL；CD28抗体2μg/mL)的培养皿中培养和活化48h。先将B16F10细胞(1×106cells/mL)与原始的CVs或PD-1-CVs以50μg/mL浓度孵育，再与活化的CD8+T细胞以1:1的比例共培养48h。然后收集上清液。对培养液上清液进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，结果显示在使用PD-1-CVs处理后，培养上清液中IFN-γ明显增加(图2中的g)，这表明了有效的t细胞激活。此外，在B16F10小鼠模型中测试了PD-1-CVs对t细胞免疫的激活的体内影响。用流式细胞术来采集数据发现，经PD-1-CVs处理后，观察到了CD4+、CD8+和IFN-γ+CD8+T的显著增加(图2中的h-j，图2-2)，这表明由PD-1-CVs触发了较强的抗肿瘤免疫。
在确认了SIRPα-CVs和PD-1-CVs的免疫调节的能力后，发明人进一步调查了Fus-CVs的抗肿瘤作用。鉴于肿瘤抗原的特异性，自体CVs一直被应用，并且表现出更好的癌症免疫治疗的治疗结果。因此，在这个工作中，发明人对B16F10肿瘤小鼠每隔一天静脉注射三剂磷酸盐缓冲盐水(PBS)、SIRPα-CVs(200微克每只老鼠)、PD-1-CVs(400微克每只老鼠)、等量的SIRPα-CVs+PD-1-CVs或Fus-CVs(图3中的a)。具体地，将1×106B16F10癌细胞注射到C57BL/6小鼠体内。接种后第10天，将小鼠每隔一天分别注射PBS、SIRPα-CVs(200μg/只)、PD-1-CVs(400μg/只)、同等质量的SIRPα-CVs+PD-1-CVs或Fus-CVs 3次。在指定的时间点用数字卡尺测量肿瘤体积。肿瘤组织切片用酒精复水，用PBS洗三次，然后用柠檬酸钠在高压锅中取出，用含2.5％BSA的PBS缓冲液在37℃中封闭1小时，随后用一抗和二抗孵育，用DAPI安装在Vectasshield(Vector Laboratories)中，最后用CLSM可视化。使用以下的抗体用于免疫荧光：抗-CD8兔mAb、抗-ki-67小鼠mAb，Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG和Alexa Fluor594山羊抗小鼠IgG(均来自Invitrogen公司)。发现SIRPα-CVs和PD-1-CVs对肿瘤生长的抑制作用有限。相比之下，Fus-CVs治疗显著防止了肿瘤的生长，这甚至比SIRPα-CVs+PD-1-CVs的鸡尾酒疗法更好(图3中的b，c和图3-1)。
Fus-CVs的双重靶向设计确保了对肿瘤细胞更好的靶向性，并且对其他细胞更少的靶向，这使得增强了治疗的结果。由于肿瘤生长受到抑制。经fus-cvs处理的小鼠在30天后的存活率提高到50％(图3中的d)。Ki-67的荧光染色表明经过Fus-CVs处理后对肿瘤细胞增殖有抑制作用(图3中的e)。采用了流式细胞术来采集数据。此外，流式细胞术结果显示CD206+M2巨噬细胞和Gr1+CD11b+MDSCs明显减少(图3中的f，g)，这表明肿瘤的免疫抑制有下调。与此同时，相比于其他的处理，Fus-CVs显著增加了在TME中的CD8+T细胞的含量和引流淋巴结中IFN-γ+CD8+T细胞的含量(图3中的h，i)。通过同时阻断先天和适应性的免疫检查点(如CD47和PD-L1)，Fus-CVs显著促进抗原交叉提呈和促进抗肿瘤t细胞免疫响应。
在临床中，超过90％的癌症死亡率可以归因于复发和转移。通过激活人体免疫，ICB疗法在抑制癌症复发和转移方面已显示出巨大的潜力。为了评估Fus-CVs对抑制肿瘤复发和转移的作用，建立了手术后的4T1肿瘤模型。在对小鼠肿瘤经手术不完全切除后，留下残留的微肿瘤(约1％的原肿瘤)，对小鼠每隔一天静脉注射三剂PBS、SIRPα-CVs、PD-1-CVs,SIRPα-CVs+PD-1-CVs或Fus-CVs(图4中的a)。具体地，1×106 4T1细胞注射进BALB/c小鼠。接种后第12天，手术切除肿瘤不完全，留下残留的微肿瘤(约为原肿瘤块的1％)。同时，每隔一天分别注射PBS、SIRPα-CVs(200μg/只)、PD-1-CVs(400μg/只)、同等质量的SIRPα-CVs+PD-1-CVs或Fus-CVs 3次。在指定的时间点用数字卡尺测量肿瘤体积。进一步用墨汁观察肺转移灶。处死前在小鼠气管内注射墨汁(两滴氨水和15mL印度墨水，加入85mL H2O)。收集肿瘤组织，用Fekete溶液固定2-6小时。肿瘤病灶漂白，正常肺组织染色正常。将富集后的肺制成常规的H&E切片并进行后续组织学分析。我们发现，与单独的SIRPα-CVs或PD-1-CVs相比，Fus-CVs显示了对肿瘤复发有更有效的抑制作用，其中6只小鼠中有3只没有检测到肿瘤(图4中的b，c)。值得注意的是，墨水染色的肺照片和苏木精和伊红(H&E)染色肺检查显示Fus-CVs治疗显著减少了转移灶的形成(图4中的d-f)，转移率由100％降低至Fus-CVs处理后的33.33％(图4中的g)。受益于有效控制肿瘤复发和肺转移，在接种肿瘤后的第60天，依然有超过83％的接受Fus-CVs治疗的小鼠存活(图4中的h)。因此，利用Fus-CVs双阻断CD47和PD-L1有效激活了宿主对癌症复发和转移的免疫力。
流式细胞术的具体步骤：首先制备单细胞悬液。简单地说，从小鼠体内富集肿瘤组织，用温和的MACSTM组织解离器切碎成小块，在含有DNases(25U/ml)、胶原酶IV(0.2mg/ml)和透明质酸酶(0.1mg/ml)的10ml细胞培养液中37℃消化2h，然后用70μm细胞过滤器过滤。随后，在室温黑暗条件下用荧光标记的特异性抗体对细胞进行染色：CD45、CD8a，INF-γ，CD4，CD25，Foxp3、CD11b、Gr-1、F4/80、CD206、CD11c、CD80、CD86，CD103(全部来自Becton&Dickinson)。对于T细胞分析，从引流淋巴结中获得细胞，用细胞模拟鸡尾酒(eBioscience)培养8小时，然后收集培养物，分别用相应的缓冲液固定和渗透。用荧光偶联抗体对细胞进行染色：抗CD8，抗IFN-γ(全部来自Becton&Dickinson)。对于Treg细胞分析，细胞表面用荧光偶联的CD4抗体(Becton&Dickinson)，然后使用Foxp3/转录因子染色缓冲液(eBioscience)固定和渗透，然后用抗Foxp3染色。细胞悬液在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)和CytoExpert软件(Beckman Coulter)上运行。
潜在的体内毒性仍然是一个生物材料的主要问题。对静脉注射PBS或含有Fus-CVs的PBS的小鼠进行了体内毒性研究。为了研究Fus-CVs的体内毒性，分别给C57BL/6小鼠注射PBS或Fus-CVs。注射后30天安乐死小鼠，采集血样，用血液生化自动分析仪(7080，HITACHI，Japan)进行全血和血清生化检查。将主要组织标本制成切片，并用H&E染色进行组织学检查。在30天之后，没有在PBS组和Fus-CVs组之间观察到死亡或者明显的重量差异，这证明Fus-CVs没有引发可检测到的副作用。分别于Fus-CVs处理后第1、7、15天进行血清生化和全血测试。并在Fus-CVs处理后第30天摘取主要器官，进行组织学检查，证明了静脉注射Fus-CVs没有对实验动物引起剧烈的副作用(图5、图6)。统计分析：所有数据均以均数±标准差(S.D.)表示。所有数据采用Prism 8.0.1软件(GraphPad)进行分析。采用Log-rank(Mantel-Cox)检验测量小鼠生存获益，多组比较采用普通单因素或双因素方差分析和Tukey检验。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：不需要复杂的设计和制备，不会带来免疫毒性；不仅相对于具有单一靶向标记的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同靶向标记的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以单独定制，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性和免疫抗原，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)融合细胞膜囊泡不需要复杂的设计和制备，不会带来免疫毒性；
2)不仅相对于具有单一受体的细胞膜囊泡来说改善了治疗效果，而且相对于简单混合使用具有不同受体的细胞膜囊泡的鸡尾酒疗法来说，也改善了治疗效果；
实验数据证明，使用Fus-CVs对CD47和PD-L1的双重阻断显著增加巨噬细胞吞噬癌细胞，促进巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈现，并激活抗肿瘤t细胞的免疫。更重要的是，双重靶向设计确保更好地靶向肿瘤细胞，更少的其他细胞，提高治疗效果。在恶性黑色素瘤小鼠模型中，Fus-CVs展示了对肿瘤生长抑制有显著的作用，并且效果比SIRPα-CVs和PD-1-CVs的鸡尾酒疗法更好。此外，在乳腺肿瘤模型中，SIRPα-CVs或PD-1-CVs治疗显示轻度免疫治疗效果；相比之下，Fus-CVs通过控制术后复发和转移显著提高了总体生存率。这些令人鼓舞的结果保证了这些细胞衍生物质在癌症免疫治疗方面的转化潜力。
3)融合细胞膜囊泡中的单细胞膜囊泡组件可以各自定制，使得结构具有高自由度，可选择靶向多种不同的肿瘤细胞；又由于肿瘤细胞膜的同源靶向性与免疫抗原，可同时提高多种肿瘤的治疗效果。
尽管目前的实施例是靶向了SIRPα-CVs和PD-1-CVs，但是根据本发明的教导，本领域技术人员可以预期Fus-CVs平台可以做扩展到同时靶向其他检查点或者协同作用的癌症免疫疗法。并且，不同于其他的纳米材料，Fus-CVs继承丰富的来自源细胞的跨膜蛋白。因此，Fus-CVs平台可以作为一个强大的蛋白和核酸的细胞质递送平台。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的所述细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。
2.根据权利要求1所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述免疫检查点对应的受体包括SIRPα变体、PD-1、CLTA-4、TIM3、LAG3和VISTA。
3.根据权利要求1或2所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。
4.一种如权利要求1至3中任一项所述的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞为两种或两种以上，每种过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种所述免疫检查点对应的受体；
分别制备衍生于过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及
融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分，得到所述融合细胞膜纳米囊泡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分包括：
将两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成所述融合细胞膜纳米囊泡；
优选的，所述微型推挤机的孔径为100～400nm；
优选的，所述超声处理的时间为5～20分钟；
优选的，用DLS监测融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分的过程；
更优选的，在所述通过微型推挤机挤出前，各所述单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单一细胞膜囊泡组分的制备包括：
用低渗裂解缓冲液和均质器破坏过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞，得到第一溶液；
用DNase和RNase处理所述第一溶液，然后离心收集细胞膜囊泡；
用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤所述细胞膜囊泡，然后所述细胞膜囊泡经过超声处理后，在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压得到所述单一细胞膜囊泡组分。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述对细胞进行基因工程化包括：
用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆所述4T1细胞，得到所述过表达SIRPα变体的4T1细胞；
将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中，然后转染B16F10细胞，得到所述过表达PD-1的B16F10细胞。
9.一种用于肿瘤免疫治疗的药物，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或如权利要求5至8中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡，以及医学上可以接受的载体；
优选的，所述医学上可以接受的载体包括磷脂纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括包裹在所述融合细胞膜纳米囊泡内的化疗药物和/或小分子核酸药物。
11.如权利要求1至4中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或如权利要求5至8中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
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