CN115058344A - 去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人、其制备方法及应用 - Google Patents

去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除废水中的SARS‑CoV‑2及其变异株的诱饵微机器人、其制备方法及应用。该诱饵微机器人包括：藻类，以及包裹在藻类上的细胞膜囊泡，细胞膜囊泡为SARS‑CoV‑2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后提取的细胞膜制备得到。应用本发明的技术方案，简单、安全、有效的诱饵微机器人可以主动清除废水中的SARS‑CoV‑2及其变体。本发明在不影响藻类运动行为和ACE2靶向功能的情况下，利用具有病毒进入蛋白受体ACE2的转基因细胞膜囊泡伪装藻类，制备了诱饵微机器人；所得到的ACE2藻类诱饵微机器人表现出了出色的运动能力，能够在各种水基质中有效地“实时”去除SARS‑CoV‑2刺突蛋白和假病毒。

Description

去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人、其制 备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人、其制备方法及应用。
背景技术
作为一种具有强大传染性和致命性的新型冠状病毒，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 （SARS-CoV-2）可以通过多种传播途径传播，包括直接通过空气传播和间接污染物传播。它还可以通过长期停留的粪便样本感染胃肠道。除了粪便样本中存在的SARS-CoV-2，还在污水和下游河流的生活污水中发现了它。这些报告令人担忧，废水可能是通过粪口传播的SARS-CoV-2感染的潜在途径。具有更高感染能力和更隐蔽症状的高关注变异株（VOCs）的出现，进一步凸显了预防SARS-CoV-2及其变体在废水中传播的紧迫性。有人提出了几种物理、化学和生物策略，包括过滤、沉降、酶降解和用氧化剂或紫外线消毒，以解决废水中的SARS-CoV-2污染。但是这些方法不够简单、快速、有效。
发明内容
本发明旨在提供一种去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人、其制备方法及应用，可以主动并且实时清除废水中的SARS-CoV-2及其变体。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人。该诱饵微机器人包括：藻类，以及包裹在藻类上的细胞膜囊泡，细胞膜囊泡为SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后提取的细胞膜制备得到。
进一步地，SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种；优选为ACE2。
进一步地，藻类选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种；优选的，藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种；更优选为莱茵衣藻。
进一步地，工程细胞选自293T细胞系、MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系、HCT 116细胞系、COS7细胞系和3T3细胞系中的一种或多种；优选为293T细胞系。
根据本发明的另一个方面，提供一种诱饵微机器人的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达，提取工程细胞的细胞膜制备细胞膜囊泡；将细胞膜囊泡包裹在藻类上，得到诱饵微机器人。
进一步地，SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种；优选为ACE2；优选的，藻类选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种；进一步优选的，藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种；更优选为莱茵衣藻；优选的，工程细胞选自293T细胞系、MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系、HCT 116细胞系、COS7细胞系和3T3细胞系中的一种或多种；优选为293T细胞系。
进一步地，SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后，工程细胞通过低渗裂解缓冲液处理后，用匀浆器匀浆，再用DNase和RNase处理后，离心收集细胞膜；再将离心收集的细胞膜悬浮在磷酸盐缓冲盐水中冲洗，并用蛋白酶抑制剂处理；最后通过微型推挤机挤出，制备得到细胞膜囊泡。
进一步地，通过对藻类和细胞膜囊泡混合后搅拌，将细胞膜囊泡包裹在藻类上，得到诱饵微机器人。
进一步地，藻类和细胞膜囊泡的摩尔比为1:100-100:1。
根据本发明的再一方面，提供了一种诱饵微机器人在去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株中的应用。
应用本发明的技术方案，简单、安全、有效的诱饵微机器人可以主动清除废水中的SARS-CoV-2及其变体。本发明在不影响藻类运动行为和ACE2靶向功能的情况下，利用具有病毒进入蛋白受体ACE2的转基因细胞膜囊泡伪装藻类，制备了诱饵微机器人；所得到的ACE2藻类诱饵微机器人表现出了出色的运动能力，能够在各种水基质中有效地“实时”去除SARS-CoV-2刺突蛋白和假病毒。此外，鉴于新出现的SARS-CoV-2变种与ACE2受体具有类似的结合机制，诱饵微型机器人对SARS-CoV-2及其变种的广谱清除效率很高，原始的SARS-CoV-2、Delta变种的效率为92%，Omicron变种的效率为93%。考虑到本实验中病毒载量浓度较高（109 copies mL−1），每个诱饵微机器人最多可以去除900个SARS-CoV - 2病毒复制体，与传统的废水病毒处理相比，具有较高的去除效果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了ACE2衣藻诱饵微型机器人去除废液中的SARS-CoV-2及其变体：（A）示意图显示通过用基因工程的ACE2细胞膜囊泡包被衣藻来制备ACE2衣藻诱饵微型机器人，（B）示意图显示ACE2衣藻诱饵微型机器人通过与S蛋白相互作用来捕获废液中的SARS-CoV-2及其变体，（C）SEM图像显示单个诱饵微型机器人捕获假病毒SARS-CoV-2（比例尺，3微米）。
图2示出了ACE2衣藻诱饵微型机器人的制备与表征：（A）共聚焦荧光图像和（B）293T和遗传修饰的293T/ACE2细胞上ACE2的流式细胞定量（比例尺，15微米）；（C）裸藻和ACE2衣藻微型机器人的Zeta电位；（D）裸藻和（E）ACE2衣藻诱饵微型机器人的TEM图像（比例尺，2微米）；（F）裸藻和ACE2衣藻诱饵微型机器人中ACE2的免疫印迹法分析。数据点表示为平均值±S.D.（n=3）。
图3示出了ACE2衣藻诱饵微型机器人具有强大的自我推动能力，可有效消除SARS-CoV-2 S蛋白：（A）裸藻和ACE2衣藻诱饵微型机器人在纯水中超过10秒运动的代表性光学轨迹（比例尺，50微米）；（B）TAP培养基中裸藻和ACE2衣藻诱饵微型机器人的速度；（C）ACE2衣藻诱饵微型机器人在TAP培养基，纯水和河水中的速度；（D）诱饵微型机器人密度对纯水中S蛋白去除的影响；（E）使用ACE2衣藻，死ACE2衣藻，裸藻或细胞壁缺陷衣藻微型机器人的纯水中S蛋白消除效率的动力学曲线；（F）ACE2衣藻诱饵微型机器人对TAP培养基，纯水和河水中S蛋白消除的性能。数据点表示为平均值±S.D.（n=5）。
图4示出了ACE2衣藻诱饵微型机器人，用于有效去除废水中的假病毒，SARS-CoV-2及其变种病毒：（A）诱饵微型机器人的密度对纯水假病毒去除的影响；（B）使用ACE2衣藻，死ACE2衣藻，裸藻或细胞壁缺陷衣藻微型机器人从纯水中去除假病毒功效的动力学曲线；（C）ACE2衣藻诱饵微型机器人在纯水和河水中去除假病毒的性能；ACE2衣藻诱饵微型机器人在去除（D）SARS-CoV-2 野生型菌株，（E）Delta变体和（F）来自废水的Omicron变体方面的性能；数据点表示为平均值±S.D.（n=5）。
图5示出了ACE2 衣藻诱饵微型机器人的活性：（A）代表性的荧光图像和（B）裸藻和ACE2 衣藻诱饵微型机器人的统计数据（比例尺，15微米）；衣藻用FDA和PI染色，绿色和红色荧光分别显示活衣藻和死衣藻。数据点表示为平均值±S.D.（n=5）。
图6示出了时间对衣藻运动的影响：（A）裸藻和（B）ACE2衣藻诱饵微型机器人在24小时内的速度；数据点表示为平均值±标准偏差（n=5）。
图7示出了用诱饵微型机器人清除祖SARS-CoV-2病毒：（A）诱饵微型机器人密度对纯水中祖SARS-CoV-2病毒去除的影响；（B）利用ACE2衣藻、死ACE2衣藻、裸藻或细胞壁缺陷衣藻微型机器人从纯水中去除SARS-CoV-2效能的动力学曲线；（C）ACE2衣藻诱饵微型机器人在纯水和河水中去除祖SARS-CoV-2病毒的性能；数据点表示为平均值±标准差（n=5）。
图8示出了诱饵微型机器人对SARS-CoV-2及其变种的抑制作用：ACE2衣藻诱饵微型机器人抑制（A）祖SARS-CoV-2，（B）Delta变体和（C）Omicron变体感染的性能；数据点表示为平均值±标准差（n=5）。
图9示出了絮凝剂后处理对SARS-CoV-2变种去除的影响：（A）Delta变体和（B）Omicron变体在使用ACE2衣藻诱饵微型机器人并通过絮凝剂（即0.5%壳聚糖）处理后的去除效率；数据点表示为平均值±S.D.（n=5）。
图10示出了诱饵微型机器人再利用的性能：重复使用的诱饵微型机器人在消除（A）Delta变体和（B）Omicron变体的感染方面的性能；数据点表示为平均值±S.D.（n=5）。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明的诱饵微机器人去除SARS-CoV-2的策略依赖于血管紧张素转换酶II（ACE2）功能化的藻类（也称“ACE2藻类诱饵微机器人”）。ACE2蛋白对SARS-CoV-2的识别起着至关重要的作用，与病毒刺突蛋白（S蛋白）的S1亚基具有很高的结合亲和力，发明人研究发现，表达ACE2受体的工程细胞膜囊泡（ACE2囊泡）可以作为诱饵与宿主细胞竞争用于SARS-CoV-2结合和抑制。在本发明一种典型的实施方式中，选择莱茵衣藻作为诱饵微型机器人的模型藻类，因为它们易于生产、运动快速和寿命长。诱饵微型机器人是用ACE2囊泡包覆藻类制造的（图1中A）。在没有外部驱动器的情况下，产生的ACE2藻类诱饵微型机器人显示出快速的自推进，从而能够有效地结合和“实时”去除废水中的SARS-CoV-2及其变体（图1中B）。扫描电子显微镜（SEM）显示ACE2藻类诱饵微型机器人有效捕获SARS-CoV-2假病毒（图1中C）。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人，包括：藻类，以及包裹在藻类上的细胞膜囊泡，细胞膜囊泡为SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后提取的细胞膜制备得到。SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种，当然也可以是其他能够特性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体；但基于捕获效率及可行性考虑，优选为ACE2。其中，SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达采用本领域常规基因工程化技术即可完成，例如首先获取目的基因，其次构建载体，然后将目的基因导入受体细胞后，可以在受体细胞稳定表达。
在本发明中，藻类可以选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种；优选的，藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种；更优选选择莱茵衣藻作为诱饵微型机器人的模型藻类，因为它们易于生产、运动快速和寿命长。
在本发明的具体实施方式中，工程细胞可以选自293T细胞系、MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系和HCT 116细胞系中的一种或多种。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。293T细胞就是一种表达SV40病毒T抗原的细胞系，它来源于人胚胎肾细胞293HEK。经改造后在其中插入了T抗原，因此用293T细胞做转染可以获得较高的表达水平。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种诱饵微机器人的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达，提取工程细胞的细胞膜制备细胞膜囊泡；将细胞膜囊泡包裹在藻类上，得到诱饵微机器人。
SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种，当然也可以是其他能够特性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体；但基于捕获效率及可行性考虑，优选为ACE2。
在本发明中，藻类可以选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种；优选的，藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种；更优选选择莱茵衣藻作为诱饵微型机器人的模型藻类，因为它们易于生产、运动快速、寿命长并且环保。
在本发明的具体实施方式中，工程细胞可以选自293T细胞系MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系、HCT 116细胞系、COS7细胞系和3T3细胞系中的一种或多种；优选为293T细胞系。
典型的，SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后，工程细胞通过低渗裂解缓冲液处理后，用匀浆器匀浆，再用DNase和RNase处理后，离心收集细胞膜；再将离心收集的细胞膜悬浮在磷酸盐缓冲盐水中冲洗，并用蛋白酶抑制剂处理；最后通过微型推挤机挤出，制备得到细胞膜囊泡；例如在本发明一实施例中，微型推挤器将细胞膜挤压通过400和200 nm的聚碳酸酯膜，来形成细胞膜囊泡。在本发明一实施例中，通过对藻类和细胞膜囊泡混合后搅拌，将细胞膜囊泡包裹在藻类上，得到诱饵微机器人。优选的，藻类和细胞膜囊泡的摩尔比为1:100-100:1。
诱饵微机器人在去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株中的应用。
本发明的诱饵微机器人可以主动清除废水中的SARS-CoV-2及其变体，因此诱饵微机器人可以在去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株中进行应用。
下面将结合试验数据进一步说明本发明的有益效果。在下述实施例中如果没有详细描述的步骤或试剂均可采用本领域的常规方法或试剂完成。
实施例1
制造诱饵微型机器人
在本实施例中，诱饵微型机器人的制造大致包括两个步骤：第一步是制备经过基因工程处理的ACE2囊泡，第二步是将ACE2囊泡包裹在藻类上。
具体步骤如下：
首先通过将ACE2转导到293T细胞上制备转基因293T/ACE2细胞，基因修饰上ACE2的293T细胞。源细胞和基因修饰的细胞被播种到细胞板上确认ACE2的存在,经过一夜的孵育后,使用重组SARS-CoV-2 刺突RBD-Fc蛋白(嘉汉生物，中国)处理细胞30分钟，然后，使用二抗PE偶联的驴抗人体IgG(Jackson ImmunoResearch)对其进行标记。接着，用DAPI对其进行标记后，使用共聚焦激光扫描显微镜进行观察。流式细胞术也用于验证293T/ACE2细胞中ACE2的存在。二抗染色后，用7-AAD活力染色液去除死亡细胞。使用CytoFLEX流式细胞仪收集数据，并使用相应的CytExpert软件(Beckman Coulter)进行处理。
免疫荧光成像和流式细胞术证实ACE2在工程细胞上高表达（图2中的A、B）。为了提取细胞膜囊泡，通过低渗溶解、机械破坏和梯度离心的联合处理去除细胞内内容物。随后，通过连续超声和293T/ACE2细胞膜在微型挤出机上的微孔挤压制备ACE2囊泡。具体地，293T/ACE2细胞经低渗裂解缓冲液（低渗裂解缓冲液包括30 mM Tris-HCl（pH 7.5）、225 mMd-甘露醇、75 mM蔗糖、0.2 mM EGTA和蛋白酶抑制剂）处理后，用Dounce匀浆器匀浆20次，用0.1mg/mLDNase和RNase处理15分钟，样品在3200h下旋转3分钟，收集上清液，在20000g下旋转30分钟，再在80000g下离心1.5h。收集沉淀后，将它们重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水冲洗(PBS)中，并用蛋白酶抑制剂处理。然后处理超声处理5分钟。最终，使用微型推挤器(Avantipolar lipids) 将样品挤压通过400和200 nm的聚碳酸酯膜，来形成ACE2囊泡。
然后，通过对藻类（在本实施例中为莱茵衣藻）和ACE2囊泡进行温和的磁搅拌（常温，600rpm），将藻类包裹上ACE2囊泡层。具体地，藻类从琼脂平板转移到TAP培养基（购自Thermo Fisher）中，在室温下进行12h光照和12h黑暗循环培养。为了制作ACE2藻类诱饵微型机器人，将裸藻在500 g下旋转3 min，用纯水冲洗5次以清除TAP介质，然后在纯水中重新悬浮。为使ACE2囊泡包覆藻类，将制备好的ACE2囊泡悬浮在纯净水中，与藻类（体积比1:1）在4℃下温和磁搅拌混合过夜。将得到的ACE2藻类诱饵微型机器人在500 g下旋转3分钟，用TAP培养基洗涤3次，收集备用。
采用动态光散射（DLS; Nano-Zen 3600, Malvern Instruments, UK）在ACE2囊泡包裹前后评估诱饵微型机器人的zeta电势。用透射电子显微镜（TEM;JEM-2010HT, JEOL,Japan）来观察诱饵微型机器人的形态。采用Western blot法对诱饵微机器人进行蛋白分析。在10%聚丙烯酰胺凝胶中放置裸藻和ACE2藻类诱饵微型机器人的变性样本。随后，将蛋白跨膜导入聚偏氟乙烯（PVDF）中，用5%脱脂乳阻断1小时。一抗4℃过夜孵育处理ACE2（AbClone, China）。然后将PVDF膜与辣根过氧化物酶结合的二抗（Thermo Fisher）孵育1小时，观察印迹。
包裹后，动态光散射（DLS）展示了电动电势的藻类从-22 mV增加到-17 mV（图2中C）和透射电子显微镜（TEM）显示层10 nm外脂质壳的诱饵微型机器人（图2中D和E），显示在藻类上成功包裹ACE2囊泡。Western blot分析显示ACE2藻类诱饵微机器人含有ACE2特异性蛋白标记物（图2中F），进一步说明诱饵微机器人制作成功。
实施例2
诱饵微型机器人的运动行为
在实施例1的基础上，研究ACE2藻类诱饵微机器人的运动行为。
发明人分析了在TAP介质（Tris-Acetate stock（Tris-醋酸储备液） 10mL，5xBeijerincks 10mL，Phosphate Solution（磷酸盐溶液）8.33mL，Hunter's TraceElements stock（亨特微量元素储备液）1mL, pH 6.0）、纯水、河水等不同介质中裸藻和ACE2藻类诱饵微型机器人的运动情况。
将ACE2藻类诱饵微型机器人与河水一同置于皿中，通过Dragonfly 共焦显微镜系统来分别研究1 h、4 h、12 h、24 h运动速度。使用Dragonfly 共焦显微镜系统来捕获并分析运动情况。另外，对藻类生存能力进行了测量：采用二乙酸荧光素（FDA）和碘化丙啶（PI）荧光染色法研究ACE2藻类的活力，其中FDA用于活藻染色，PI用于死藻染色。简单地说，为了消除TAP培养基的影响，将新鲜制备的ACE2藻类500 g旋转3分钟，用纯水冲洗5次。细胞溶液浓缩，用1ml FDA/PI溶液（Thermo Fisher）染色10min，再用纯水冲洗5次。最后，将细胞悬浮在纯水中，接种在混合培养皿（BIOFIL）中，测试藻类活力。利用ImageJ的内置阈值插件，计算活细胞和死细胞的数量并确定相对比例。活/死试验重复进行三次，每个培养皿拍照三次。
我们发现，裸藻和ACE2藻的运动速度分别为90 μm/s和88 μm/s（图3中A、B），说明功能化过程对藻类运动的影响可以忽略不计。值得注意的是，单独的ACE2藻类的跟踪轨迹反映了诱饵微机器人在水中高度稳定的运动（图3中A和图5）。将制备好的ACE2藻类诱饵微机器人转移到各种水介质中，测试其移动性，显示在不需要任何外部燃料的情况下，在三乙酸磷酸盐（TAP）介质、纯水和河水中快速移动（>85 μm/s）（图3中C）。具有ACE2囊泡的藻类表面功能化对藻类生存能力的影响可以忽略不计（图5），而诱饵微型机器人在纯水中和河水中都表现出了持久的运动（图6）。这些诱饵微机器人的这种稳健、快速、连续的运动可以加速它们与病毒S蛋白的碰撞，从而提高对废水中目标威胁的特异性结合和去除。
实施例3
利用诱饵微机器人去除SARS-CoV-2 S蛋白
研究ACE2藻类诱饵微机器人去除SARS-CoV-2 S蛋白的性能。
为了调查藻密度对S蛋白去除效率的影响，不同密度的ACE2藻类诱饵微型机器人和4 ng mL-1 S蛋白在纯水中共同孵育，藻类密度分别为2 × 106、5 × 106、1 × 107、2 ×107和5 × 107 mL-1，并且在孵育24h后测试去除效率。为了研究S蛋白去除效率的动力学变化，密度为5 × 107 mL-1的活ACE2藻类、死ACE2藻类、裸藻（即不包裹ACE2囊泡）和细胞壁缺失藻类（商购，细胞壁缺失藻类为莱茵衣藻CC-400细胞壁缺失型，来自美国杜克大学衣藻中心）与4 ng mL-1的S蛋白在纯水中孵育，并且在孵育1、2、4、8、12、16和24 h后测试去除效率。为了研究去除效率的环境因素影响，将5 × 107 mL-1的ACE2藻与4 ng mL-1的S蛋白在不同的培养基中孵育8 h，培养基包括TAP培养基（Tris-Acetate stock（Tris-醋酸储备液）10mL，5xBeijerincks 10mL，Phosphate Solution（磷酸盐溶液）8.33mL，Hunter's TraceElements stock（亨特微量元素储备液）1mL, pH 6.0）、纯水和河水。为了测定S蛋白的去除效率，所有组在500 g下旋转3 min，用SARSCoV-2刺突RBD蛋白ELISA试剂盒 （ABclonal）定量分析。
发明人发现，随着诱饵微机器人密度的增加，去除过程的速度和效率提高，5 ×107 mL−1的诱饵微机器人在24小时内从纯水中去除91%的4 ng/mL的S蛋白（图3中D）。此外，发明人比较了活ACE2藻类、死ACE2藻类、裸藻和细胞壁缺失藻类等不同藻类组对S蛋白的去除能力，发现活ACE2藻类具有很强的结合能力，连续运动8 h后，去除效率达86%（图3中E）。相比之下，死ACE2藻类和缺乏ACE2的活的裸藻在运行16 h后的去除率分别为68%和34%，说明藻类运动和ACE2改性对S蛋白的去除速度和效率具有关键作用。裸藻对S蛋白的去除可能是由于藻类表面存在多种功能基团（如羧基或氨基）而导致的非特异性结合。此外，ACE2藻类诱饵微机器人在不同介质（包括TAP介质、纯水、河水）中也表现出了较强的S蛋白去除能力（图3中F），表明了这一具有吸引力的微机器人平台在复杂环境环境修复中的巨大潜力。
实施例4
利用诱饵微机器人去除SARS-CoV-2假病毒
此外，利用SARS-CoV-2假病毒进行研究，考察ACE2藻类诱饵微机器人去除病毒的能力。其中，假病毒是一种重组病毒，它的基因通常被改变或修饰，以消除其本身表面蛋白的表达，用另一个质粒表达替代性表面蛋白，可以感染易感宿主细胞。由于病毒表面蛋白在进入宿主细胞中起着关键作用，因此假病毒表面蛋白的构象结构与天然病毒蛋白具有高度相似性；然而，与野生型（WT）病毒相比，假病毒的毒力有所减弱，使它们能够在P2实验室中安全处理。 由于新冠病毒具有较高的危险性，研究条件苛刻，因此，使用SARS-CoV-2假病毒进行研究。使用HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础载体转染293T细胞后，包装成SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike假病毒。
具体地，将HIV-1骨干编码荧光素酶报告基因与具有293T/SARS-CoV-2/GFP 的S蛋白表达载体的293T细胞共转染。转染72 h后收集上清，SARS-CoV-2假病毒存在于上清中，3000 g旋转10 min，-80℃保存。将密度分别为103、104、105、106和107 mL-1的ACE2藻类诱饵微机器人与SARS-CoV-2假病毒的纯水中培养，假病毒浓度为8×108 copies mL-1。24 h后评价去除效果。在纯水中假病毒浓度为8×108 copies mL-1时，活ACE2藻类、死ACE2藻类、裸藻和细胞壁缺失藻类对于SARS-CoV-2假病毒的去除效率是与时间相关的，在孵育2、4、8、12、16 h时测试清除效率。为了研究环境对去除效率的影响，107 mL-1 ACE2藻类诱饵微型机器人也与SARS-CoV-2假病毒在纯水和河水中共同孵育4h，假病毒浓度为8×108 copies mL-1。使用扫描电镜进一步观察ACE2藻类诱饵微型机器人对于SARS-CoV-2假病毒的特异性吸附。
发明人研究了机器人密度对从纯水中去除假病毒的效率的影响。发现ACE2的藻类诱饵微型机器人去除效率的逐步提高，随着将机器人密度从104 mL−1增加到107 mL−1，在24h内8×108 copies mL−1 的SARS-CoV-2假病毒的去除效率从 19% 增加到 90%（图4中A）。此外，发明人评估了活ACE2藻类、死ACE2藻类、裸藻和细胞壁缺失藻类处理的纯水的病毒去除动力学特征。活ACE2藻类处理4 h后有效去除90%的假病毒（图4中B）；作为对比，处理12 h后，死ACE2藻类、裸藻和细胞壁缺失藻类的去除率分别为76%、46%和25%。此外，ACE2藻类诱饵微机器人在纯水和河水中也表现出较强的假病毒去除能力（图4中C），为这些诱饵微机器人在复杂环境下的进一步实际应用提供了保障。总之，这些结果表明，在废水样本中，藻类快速运动对病毒接触和ACE2受体对病毒结合的重要贡献是高效去除病毒。
实施例5
利用诱饵微型机器人移除SARS-CoV-2及其变体
最后，测试了ACE2藻类诱饵微型机器人在去除废水样本中的SARS-CoV-2及其变体的性能。
首先研究了机器人密度、机器人类型、操作时间和介质类型对病毒去除性能的影响。为了研究藻类密度对SARS-CoV-2消除效率的影响，将不同密度103、104、105、106和107mL-1的ACE2藻类诱饵微型机器人与原始SARS-CoV-2（WHU01菌株）在纯水中以109病毒拷贝mL-1的浓度温育并在孵育后24小时测试去除效率。为了探讨SARS-CoV-2去除效率与时间的依赖性，ACE2藻类、死ACE2藻类、裸藻以及细胞壁缺陷藻类与含有SARS-CoV-2 109病毒拷贝mL-1的纯水中孵育，并在孵育后1、2、4、8、12和16小时检测去除效率。为了研究环境对去除效率的影响，还将107 mL-1 ACE2藻类诱饵微型机器人与SARS-CoV-2以109 病毒拷贝mL-1的浓度在纯水和河水中培养4小时。我们发现，经过4小时的连续移动，密度为107 mL−1的ACE2藻类有效地从纯水中去除95%的109 copies mL−1 的原始SARS-CoV-2（WHU01株）（图7）。在优化条件下（4小时运动，ACE2藻类诱饵微型机器人密度107 mL−1），每个诱饵微型机器人最多可以移除900个原始SARS-CoV-2病毒复制体。相比之下，死ACE2藻和活的裸藻在运行12 h后的去除率分别为78%和55%。
为了测试ACE2藻类诱饵微型机器人在去除废水样本中的SARS-CoV-2及其变体的性能，我们从病人分离SARS-CoV-2 WT株（IME-BJ01株，Genbank No. MT291831），Delta（CSTR.16698.06.NPRC6.CCPM-B-V-049-2105-6） 和 Omicron （SARS-CoV-2 strainOmicron CoV/human/CHN_CVRI-01/2022） 变异株，并在生物安全三级（BSL3）实验室中进行SARS-CoV-2 WT株及其变异株的实验。为探讨ACE2藻类诱饵微机器人消除SARS-CoV-2及其变异株的性能，将不同密度（103、104、105、106和107 mL-1）的ACE2藻类诱饵微机器人与SARS-CoV-2 WT株、Delta株、或Omicron株在纯水中共同孵育，病毒浓度为109 copies mL-1 。500g离心3分钟后，收集上清，QRT PCR进行RNA定量分析。使用EasyPureViral DNA和RNA Kit（TransGen，中国）从上清液中分离病毒RNA，使用One Step PrimeScrip RT-PCR Kit（Takara，日本）进行定量分析。我们发现，诱饵微机器人对来自废水样本的SARS-CoV - 2变体具有广谱的去除作用，对于原始SARS-CoV-2病毒的去除效率为95%，对于Delta（B.1.617.2）变体的去除效率为92%，对于Omicron （B.1.1.529）变体的去除效率为93%（图4中D-F）。
实施例6
发明人测试了对SARS-CoV-2及其变体感染的抑制，为了探索诱饵微型机器人处理后对SARS-CoV-2感染的抑制作用，将不同密度为103、104、105、106和107 mL-1的ACE2藻类诱饵微型机器人与SARS-CoV-2，Delta菌株或Omicron菌株一起孵育，在纯水中浓度为109病毒拷贝mL-1，持续4小时。收集上清液并在500g离心样品3分钟后转移至1×PBS中。将50μL上清液加入到Vero-E6细胞中。在37℃温育1小时后，用含有2%FBS的新培养基代替上清液。再过48小时后，收集上清液，通过检测病毒RNA水平评估病毒感染的抑制。我们发现，经过微机器人处理后，废水上清液显示宿主细胞对SARS-CoV - 2及其变异株的感染效率降低（图8）。
实施例7
发明人还测试了诱饵微型机器人的后处理和再利用情况。
具体地，对于后处理，ACE2藻类诱饵微型机器人用0.5%壳聚糖处理10分钟。相比之下，对照组通过500g离心处理3分钟。为了再利用，ACE2藻类诱饵微型机器人将密度为107ml-1的细胞与浓度为109病毒拷贝mL-1的Delta菌株或Omicron菌株在纯水中温育4小时。在5次重复后评估诱饵微型机器人对病毒去除的性能。我们发现，采用絮凝剂（0.5%壳聚糖）对ACE2藻类诱饵微机器人进行后处理来清洗微机器人，絮凝剂可以在不影响病毒去除效率的情况下将诱饵微机器人从废水中分离出来（图9）。此外，诱饵微机器人可以重复使用，在5次重复循环后达到90%的病毒清除效率（图10），进一步表明我们的诱饵微机器人平台在实际环境修复应用中具有相当大的潜力。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明在不影响藻类运动行为和ACE2靶向功能的情况下，利用具有病毒进入蛋白受体ACE2的转基因细胞膜囊泡伪装藻类，制备了诱饵微机器人；所得到的ACE2藻类诱饵微机器人表现出了出色的运动能力，能够在各种水基质中有效地“实时”去除SARS-CoV-2刺突蛋白和假病毒。此外，鉴于新出现的SARS-CoV-2变种与ACE2受体具有类似的结合机制，诱饵微型机器人对SARS-CoV-2及其变种的广谱清除效率很高，原始的SARS-CoV-2、Delta变种的效率为92%，Omicron变种的效率为93%。考虑到本实验中病毒载量浓度较高（109 copies mL−1），每个诱饵微机器人最多可以去除900个SARS-CoV - 2病毒复制体，与传统的废水病毒处理相比，具有较高的去除效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株的诱饵微机器人，其特征在于，包括：
藻类，以及
包裹在所述藻类上的细胞膜囊泡，所述细胞膜囊泡为SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后提取的细胞膜制备得到。
2.根据权利要求1所述的诱饵微机器人，其特征在于，所述SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的诱饵微机器人，其特征在于，所述藻类选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的诱饵微机器人，其特征在于，所述藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的诱饵微机器人，其特征在于，所述藻类为莱茵衣藻。
6.根据权利要求1所述的诱饵微机器人，其特征在于，所述工程细胞选自293T细胞系、MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系、HCT 116细胞系、COS7细胞系和3T3细胞系中的一种或多种。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的诱饵微机器人的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达，提取所述工程细胞的细胞膜制备细胞膜囊泡；
将所述细胞膜囊泡包裹在所述藻类上，得到所述诱饵微机器人。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述SARS-CoV-2的S蛋白受体为ACE2、ASGR1和KREMEN1中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述藻类选自绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门或红藻门中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述藻类选自扁藻、盐藻、小球藻、绿微球藻、衣藻、小环藻、定鞭金藻、异胶藻和螺旋藻中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述藻类为莱茵衣藻。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述工程细胞选自293T细胞系、MDA-MB-435细胞系、DU 145细胞系、CAL 27细胞系、HCT 116细胞系、COS7细胞系和3T3细胞系中的一种或多种。
13.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，SARS-CoV-2的S蛋白受体在工程细胞上过表达后，所述工程细胞通过低渗裂解缓冲液处理后，用匀浆器匀浆，再用DNase和RNase处理后，离心收集细胞膜；再将离心收集的所述细胞膜悬浮在磷酸盐缓冲盐水中冲洗，并用蛋白酶抑制剂处理；最后通过微型推挤机挤出，制备得到所述细胞膜囊泡。
14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，通过对所述藻类和所述细胞膜囊泡混合后搅拌，将所述细胞膜囊泡包裹在所述藻类上，得到所述诱饵微机器人。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述藻类和所述细胞膜囊泡的摩尔比为1:100-100:1。
16.如权利要求1至6中任一项所述的诱饵微机器人在去除废水中的SARS-CoV-2及其变异株中的应用。
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