KR20170029512A - 인트론 잔류의 감소 - Google Patents

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KR20170029512A
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Abstract

본원은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하도록 잔류된 인트론을 제거하기 위해 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 프로세싱을 유도하기 위한 방법, 조성물, 다중핵산 중합체, 검정법, 및 키트를 개시한다. 또한 본원은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 피험체에서 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 기술한다.

Description

인트론 잔류의 감소{REDUCING INTRON RETENTION}
교차-참조
본 출원은 2014년 6월16일 출원된 UK 특허 출원 제1410693.4호의 혜택을 청구하며, 이의 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
선택적 스플라이싱은 인간 전사체에서 빈번한 현상이다. 인트론 잔류(intron retention)는 부분적으로 프로세싱된 mRNA가 부분 스플라이싱을 진행한 후 적어도 하나의 인트론 잔류를 보유하는 선택적 스플라이싱의 일례이다. 일례에서, 부분적으로 프로세싱된 mRNA에 잔류된 인트론의 존재는 기능적 단백질의 번역을 방지하거나 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명은 전사물(예를 들어, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물)에서 인트론 잔류를 감소시키거나 또는 예방하는 방법 및 우연한 인트론 잔류와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 유전자 전사물에서 인트론 잔류의 발생률을 감소시키는 단계를 포함하는 피험체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개시하고, 여기서 질환은 유전자 전사물 내 인트론 잔류로 인해 야기된 결함적 단백질 발현에 의해 유도된다.
일부 측면에서, 본 발명은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하는, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 개시하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 46, 또는 서열번호 46과 적어도 95% 동일성을 갖는 영역을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 발명은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하는, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 개시하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 46, 또는 서열번호 46과 적어도 95% 동일성을 갖는 영역을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 발명은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하는, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 개시하며, 여기서 상기 영역은 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 영역을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 발명은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하는, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 개시하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 서열번호 46과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 개시한다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 개시한다.
일부 측면에서, 본원은 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 개시하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 경우에 따라 다중핵산 중합체 영역은 서열번호 47 내지 434와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 개시하고, 경우에 따라 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 개시하고, 경우에 따라 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다.
일부 측면에서, 본 발명은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 개시하고, 여기서 상기 표적 서열은 2개의 G 사중체 사이에 존재하고, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화한다.
일부 측면에서, 본 발명은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 개시하고, 여기서 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화하고, 상기 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제1 CCC 모티프를 포함하며, 여기서 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다.
일례에서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제2 CCC 모티프를 더 포함한다. 일례에서, 제1 CCC 모티프는 제2 CCC 모티프로부터 약 3개 이상의 뉴클레오티드 염기이다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 CCCAG 또는 AGGCC 모티프를 포함하는 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화한다.
일부 측면에서, 본 발명은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 개시하고, 여기서 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않으며, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에 피리딘 뉴클레오티드를 포함한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에서 2개의 연속되는 피리딘 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 개시하고, 여기서 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모이어티와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 헤어핀 구조를 형성하며, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 또한 헤어핀 구조를 탈안정화시킬 수 있다. 일례에서, 전달 비히클은 세포 투과 펩티드 또는 펩티드-기반 나노입자를 포함한다. 일례에서, 전달 비히클은 이온 결합에 의해서 다중핵산 중합체와 복합체를 형성한다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 50개, 약 10 내지 약 45개, 약 10 내지 약 40개, 약 10 내지 약 30개, 약 10 내지 약 25개, 또는 약 10 내지 약 20개 뉴클레오티드이다. 일례에서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 100% 상보적이다. 일례에서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 미스매치를 갖는다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 뉴클레오시드 모이어티 또는 포스페이트 모이어티에서 개질된다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 1 이상의 인공 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 일례에서, 1 이상의 인공 뉴클레오티드 염기는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된, 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA), 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 다중핵산 중합체의 뉴클레오티드 모이어티의 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에서 개질된다. 일례에서, 2' 히드록실 기에서 개질은 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 모이어티에 의한다. 일례에서, 메틸 기는 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에 부가되어 2'-O-메틸 리보스 모이어티가 생성된다. 일례에서, 메톡시에틸 기는 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에 부가되어 2'-O-메톡시에틸 리보스 모이어티가 생성된다. 일례에서, 2' 히드록실 기에서 개질은 메틸렌 기에 의해 4' 탄소에 연결된다. 일례에서, 리보스 고리는 6원 몰폴리노 고리로 치환되어 몰폴리노 인공 뉴클레오티드 유사체가 생성된다. 일례에서, 포스페이트 골격은 올리고글리신-유사 모이어티로 치환되어 펩티드 핵산(PNA)이 생성된다. 일례에서, 포스페이트 골격은 티올 기 또는 메틸 기에 의해 개질된다. 일례에서, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이의 조합이 개질된다. 일례에서, 개질은 피험체의 내생성 뉴클레아제로부터 다중핵산 중합체를 보호한다. 일례에서, 개질된 다중핵산 중합체는 RNA의 RNase H 절단을 유도하는 능력을 유도하지 않거나 또는 감소시킨다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 그 안정성이 증가되도록 개질된다. 일례에서, 혼성화는 특이적 혼성화이다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 13개 인접한 염기와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 10개의 인접한 염기를 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 63%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화한다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43, 및 서열번호 44, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 63%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 100% 서열 동일성을 포함하고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 포함하거나, 또는 100% 서열 동일성을 포함하고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 서열번호 47-434, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 적어도 13개의 인접한 염기와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화한다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 합성된 폴리핵산 중합체이다.
일례에서, 다중핵산 중합체를 포함하는 약학 조성물은 정맥내 또는 피하 투여된다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 조성물을 개시하고, 본원에 개시된 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 질환 또는 병태는 단백질의 손상된 생산과 연관되거나 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 한다. 일례에서, 질환 또는 병태는 유전성 질환이다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 코딩하는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 질환 또는 병태는 당뇨병이다. 일례에서, 질환 또는 병태는 암이다. 일례에서, 사용을 위한 조성물은 (a) 피험체가 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태를 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 피험체가 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태를 가지면 제42항 내지 제82항 중 어느 하나의 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 위해 피험체를 선별하는 단계를 더 포함한다. 일례에서, 사용을 위한 조성물은 (a) 피험체가 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 피험체가 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 가지면 제42항 내지 제82항 중 어느 하나의 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료를 위해 피험체를 선별하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 피험체에서 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 개시하고, 이 방법은 (a) 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물에서 인트론의 스플라이싱에 의한 제거의 증가를 유도하는 치료제; 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계로서, 피험체는 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 카피들을 코딩할 수 있고 각각은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 번역을 억제하는 적어도 하나의 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 풀을 가지는 것인 단계; 및 (b)피험체의 표적 세포를 치료제와 접촉시켜 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 풀의 일부분이 스플라이싱을 진행하도록 유도하여 일부분의 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 각각으로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하여, 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생성시키는 단계로서, 상기 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 카피들을 발현하도록 번역되어, 질환 또는 병태가 치료되는 단계를 포함한다.
일례에서, 치료제는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분의 각각의 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하도록 세포에서 1 이상의 스플라이싱 단백질 복합체의 활성화를 야기한다. 일례에서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 억제한다. 일례에서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 활성화시킨다. 일례에서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질에 결합한다. 일례에서, 치료제는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합한다. 일례에서, 치료제는 다중핵산 중합체이다. 일례에서, 치료제는 소형 분자이다.
일례에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 약학 조성물이다.
일례에서, 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 손상된 생산은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 정상 이하 생산을 포함한다. 일례에서, 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 손상된 생산은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 발현 부재 또는 질환 또는 병태를 야기할 정도로 충분히 낮은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 발현도에 기인한다. 일례에서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 단백질 생산의 부재 또는 단백질의 결함적 형태의 생산을 포함한다. 일례에서, 단백질의 결함적 형태는 단백질의 절두 형태, 단백질의 미스폴딩 형태 또는 비정상적 표적 결합의 단백질 형태이다. 일례에서, 피험체의 치료는 전체 길이의 기능적 형태의 단백질의 높은 발현을 일으킨다.
일부 측면에서, 본 발명은 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하도록 잔류된 인트론을 제거하기 위해 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 프로세싱을 유도하는 방법을 개시하고, (a) 단리된 다중핵산 중합체를 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 코딩할 수 있고 적어도 하나의 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물과 혼성화시키는 단계; (b) 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하여 전체 길이의 기능적 형태의 단백질을 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하는 단계; 및 (c) 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 번역하는 단계를 포함한다. 일례에서, 상기 방법은 단리된 다중핵산 중합체를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
일례에서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 질환 또는 병태와 상관있다. 일례에서, 질환 또는 병태는 유전성 질환이다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 유전성 질환이 있는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함하는 게놈을 갖는다. 일례에서, 질환 또는 병태는 당뇨병이다. 일례에서, 질환 또는 병태는 암이다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 안티센스 서열이다. 일례에서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화한다. 일례에서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화한다. 일례에서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 CCC 모티프를 포함한다. 일례에서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 여기서 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않는다. 일례에서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 여기서 결합 모티프는 2개의 G 사중체 사이에 존재한다. 일례에서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 여기서 상기 결합 모티프는 제1 CCC 모티프 및 제2 CCC 모티프를 포함한다. 일례에서, 제1 CCC 모티프는 제2 CCC 모티프로부터 약 3개 이상의 뉴클레오티드 염기이다. 일례에서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 100% 상보적이다. 일례에서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA의 표적 서열과 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 미스매치를 갖는다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 50개, 약 10 내지 약 45개, 약 10 내지 약 40개, 약 10 내지 약 30개, 약 10 내지 약 25개, 또는 약 10 내지 약 20개 뉴클레오티드이다.
일례에서, 피험체는 진핵생물이다. 일례에서, 피험체는 인간, 마우스, 래트, 인간이외의 영장류, 또는 영장류 이외의 포유동물에서 선택된 진핵생물이다.
일부 측면에서, 본원은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물을 기술하고, 여기서 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도한다.
본 발명의 신규 특성은 첨부된 청구항에서 상세하게 기재한다. 본 발명의 특성 및 장점의 보다 나은 이해는 본 발명의 원리를 활용하는, 예시적인 실시형태, 및 이하의 첨부된 도면을 기재한 하기의 구체적인 내용을 참조하여 얻을 수 있다:
도 1. 인간 프로인슐린 유전자에서 SSO의 위치. (A) INS 리포터 및 이의 mRNA 생성물의 개략도. SSO는 엑손(번호붙인 박스) 및 인트론 1(실선) 아래에 검은 수평 막대로서 표시하였고, 그들 서열을 표 2에 나타내었다. 출발 및 중지 코돈은 화살촉으로 표시하였다. 정규(실선) 및 암호화(점선) 스플라이싱을 1차 전사물 위에 표시하였고, 암호화 스플라이싱 부위의 명칭은 회색으로 하였다. 인트론 1 절편 del4-del7을 표적화하는 SSO는 아래 패널에 도시하였다. (B) INS 리포터 구성체에 의해 생성된 mRNA 이소폼(1-6번으로 번호매김). 프로인슐린을 생산하지 않는 이소폼의 설명은 *표로 표지하였다.
도 2. INS 인트론 1 잔류의 SSO-유도된 억제. (A) 표시된 SSO와 INS 리포터 구성체(IC D-F)의 HEK293 세포로의 공동 형질감염. 도 1B에 기술한 스플라이싱된 생성물은 우측에 도시한다. 막대는 천연 전사물(위 패널) 대비 인트론 1-함유 이소폼의 백분율 또는 전체(아래 패널) 대비 인트론 2의 암호화 3' 슬라이싱 부위에 대한 슬라이싱 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 SD를 의미하고, sc는 스크램블드 대조군이고, SSO-, 'SSO 무함유' 대조군이다. SSO의 최종 농도는 SSO6 및 SSO8(10 및 30 nM)을 제외하고, 1, 3, 10 및 30 nM이었다. (B) 인트론 2의 암호화 3'ss가 결여된 클론에서 인트론 1 스플라이싱의 SSO21-매개 촉진. RNA 생성물은 우측이다. (C) 인트론 2의 암호화 3'ss가 포함 및 결여된 전사물에서 SSO21-유도된 인트론 1의 배수 변화. SSO21의 최종 농도는 이중 형질감염시 30 nM이었다. 리포터 구성체의 명칭은 맨 아래에 있다.
도 3. 암호화 3' 스플라이싱 부위를 표적으로 하는 INS SSO. (A) SSO6에 의한 인트론 2의 암호화 3'ss(cr3'ss+126; 도 1A)의 활성화 및 SSO8에 의한 엑손 2 스킵핑의 촉진. 각각의 SSO의 농도는 맨 위에, 스플라이싱된 생성물은 우측에, 리포터는 맨 아래에 표시하였다. (B) INS 인트론 2의 정식 및 암호화 3'ss 사이의 예측된 안정한 헤어핀. SSO6에 의해 표적화된 염기는 별표로 표시하였고 예측된 스플라이싱 인핸서 헥사머(우측에 열거)는 점선으로 표시하였다. (C) SSO4는 U2AF35가 고갈된 세포에서 그의 정식 대응물(cr3'ss+81)의 하류의 암호화 3'ss 81의 활성화를 방지하지는 않지만 엑손 스킵핑은 유도한다. COS7 세포에서 각각의 SSO의 최종 농도는 5, 20 및 80 nM이었다. siRNA 이중체 U2AF35ab(77)의 최종 농도는 70 nM이었다. 리포터는 패널 A에서와 같았다.
도 4. 단일-뉴클레오티드 분해에서 안티센스 마이크로워크에 의한 인트론 잔류 표적의 최적화. (A) 올리고리보뉴클레오티드의 위치. CD/NMR에 사용된 마이크로워크 SSO 및 올리고는 각각 1차 전사물 아래 및 위에 수평 검은색 막대로 표시하였다. RNA G-사중체를 형성할 것으로 예상되는 인트론 1 서열은 회색으로 강조하였다. 마이크로워크 방향은 회색 화살표로 표시하였고, 위너 올리고는 검은색으로 강조하였다. 박스는 이전에 보고된 단일 뉴클레오티드 다형성을 표시한다(20). (B) 2개 세포주에서 각각의 마이크로워크 SSO의 인트론 잔류 수준. 오차 막대는 리포터 IC D-F와 2종의 독립적인 공동 형질감염으로 얻은 SD를 표시한다.
도 5. RNA 2차 구조 형성의 생물리적 특징규명. (A) CD1(19량체) 및 CD2(20량체) RNA에 대한 25℃에서 원자외선 CD 스펙트럼은 각각, 265 및 270 nm에서 타원율 최대임을 밝혀주었다. (B) H-결합된 G 염기로부터 공명의 특징적 기를 보여주는 800 MHz 및 298 K에서 기록된 CD1 및 CD2의 1H NMR. (C) 각각 56.8 ± 0.2℃ 및 69.0 ± 0.45℃에서 전이 중간점을 보여주는 2개 RNA에 대한 S자형 CD 용융 곡선. 2개 곡선은 명확함을 위해 서로 약간 이동시켰다. (D) CD1에 대해 짧은 루프 서열에 의해 연결된 2개의 적층된 G-사분자를 갖는 제안된 평행한 사중체 구조(상부 패널). CD2에 대해 예측되는 헤어핀 구조를 아래 패널에 도시하였다. G→C 돌연변이는 붉은색으로 나타내었다.
도 6. 안티센스 표적을 포함하는 입체형태적 사중체/헤어핀 전이. (A) 올리고리보뉴클레오티드 CD3을 포함하는 G-풍부 모티프 내에 형성되는 것으로 제안된 헤어핀(검은색) 및 사중체(진한 파란색) 사이의 개략적인 평형. CD4는 CC→UU 돌연변이(*표로 강조함)를 함유한다. (B) 9-15 ppm 영역의 NMR 스펙트럼은 수소 결합된 염기에 상응하는 이미노 양자 신호를 나타냈다. 10 내지 12 ppm 사이의 신호는 G-사분자(Q 박스) 내에 후그스틴 수소 결합된 G의 특징인 한편, 신호 > 12 ppm는 헤어핀 구조(H 박스) 내에 왓슨-크릭 A-U 및 G-C 염기쌍을 의미한다. CD3에서, 헤어핀 H1이 상당하게 존재하지만, CD4의 돌연변이가 H1을 탈안정화시켜서, H2를 주요종으로 만들며, 둘 모두는 사중체 구조와 평형 상태이다. (C) NMR 데이타와 일관적인, 2개의 가능한 헤어핀의 Mfold 예측치. (D) CC→UU 돌연변이에 의한 헤어핀 구조의 탈안정화시 인트론 잔류의 감소. 오차 막대는 리포터 IC D-C를 사용한 이중 실험의 SD를 의미한다. 절편 del5가 결여된, IC D-C 리포터인, Del5(도 1A); G-사중체 및 스템-루프 둘 모두를 탈안정화시키는 2개 치환(표 1A)을 함유하는 리포터, M1.
도 7. 인트론 잔류에 대한 안티센스 표적을 포함하는 프리 mRNA와 상호작용하는 단백질의 동정. (A) HEK293T 세포로 일시적 형질감염 후 야생형 및 돌연변이된 리포터 구성체(IC D-C)에 대한 인트론 잔류 수준. 돌연변이는 표 1A에 도시한다. RNA 생성물은 우측에 표시한다. 예측되는 RNA 사중체, 헤어핀 H1/H2 및 상류 및 하류 C4 연속부의 존재는 아래 겔 도면에 표시하였다. 오류 막대는 2회 반복 실험으로 얻은 SD를 의미한다. (B) 시험된 RNA의 인트론 잔류 수준은 안티센스 표적에 걸쳐 그들의 예측되는 안정성과 상관있다. (C) 항체를 사용한 풀-다운 검정의 웨스턴 블롯 분석은 우측에 나타내었다. NE, 핵 추출물; B, 비드-단독 대조군; AV3, 시토신 연속부 및 3'ss AG를 함유하는 대조군 RNA 올리고(7). CD5 RNA의 서열은 도 4A에 도시한다.
도 8. DHX36 고갈시 사중체-풍부 및 사중체-빈약 꼬마유전자의 스플라이싱 패턴. (A) 리포터 구성체의 개략도. 예측되는 사중체는 검은색 직사각형으로 표시하였고, 그들의 밀도를 표 1에 도시하였다. 엑손(박스)은 번호표시하였고, 앞쪽 사선은 F9 인트론 3의 단축을 표시한다(24). F9 및 TSC2 꼬마유전자는 스플라이싱을 손상시킨, 각각 분지점 치환 c.253-25C 및 c.5069-18C을 함유한다(24). Cr5'ss-104; 인트론 2의 정식 5'ss. (B) DHX36에 대항한 항체를 사용한 면역블롯. sc, 스크램블드 siRNA; c, 미처리된 세포. 오차 막대는 2회 형질감염 실험의 SD이다. (C-E) 표시된 리포터의 인트론 잔류 및 엑손 스키핑. DHX36 siRNA의 최종 농도는 50 nM이었다. RNA 생성물은 개략적으로 우측에 도시하였다. 오류 막대는 2회 형질감염 실험의 SD이다.
유전자 예컨대 진핵생물 유전자는 단백질을 코딩할 수 있는 기능적 mRNA를 생성하도록 1차 전사물로부터 정확하게 제거되어야만 하는 개재 서열 또는 인트론을 함유한다(1). 이러한 과정은 프리-mRNA의 보존적이지만 축퇴성인 서열과 5개의 소형 핵 RNA(snRNA)(예, U1, U2, U4, U5, 및 U6) 및 다수 단백질의 상호의존적 상호작용을 적용하는, 고도로 역동적인 방식으로 mRNA 조성을 개질시킨다(2). 구체적으로, 인트론은 보존된 GU 모티프를 포함할 수 있는 5' 스플라이싱 부위(5'ss), 불변 AG 모티프로 종결될 수 있는 3' 스플라이싱 부위(3'ss), 보존된 아데닌 염기를 포함할 수 있는 분지점 서열, 및 폴리피리미딘(Py) 트랙을 포함하는 코어 스플라이싱 부위 성분으로 정의될 수 있다. 스플라이싱 반응은 5'ss 상의 보존성 GU 모티프에 U1 snRNP의 결합에 이어서, 분지점의 보존성 아데닌 염기에 U2 snRNP의 결합이 후속되고, 마지막으로 5' 및 3' 스플라이싱 부위 근처에서 U4, U5, 및 U6 snRNP 상호작용시에 개시될 수 있다. snRNP 및 개별 인트론에 의해 형성된 복합체는 스플라이시오솜이라고 할 수 있다. 추가의 스플라이싱 인자 예컨대 U2 소형 핵 RNA 보조 인자 1(U2AF35), U2AF2(U2AF65) 및 스플라이싱 1(SF1)은 스플라이시오솜 조립에 기여하여 스플라이싱 사건을 촉진할 수 있다.
인트론 스플라이싱은 대체로 종들에 걸쳐 mRNA 축적 및 단백질 발현을 촉진한다(3-5). 이러한 과정은 전사, mRNA 수출 및 번역을 포함한, 커플링된 유전자 발현 경로를 또한 손상시킬 수 있는 인트론 돌연변이 또는 변이에 의해 변경될 수 있다. 이는 인트론 잔류를 수정하는 천연 변이체 또는 돌연변이가 상류 오픈 리딩 프레임(uORF) 또는 다른 조절 모티프를 갖는 전사물의 상대적 풍부함을 변경시키고 극적으로 번역에 영향을 미치는 5'UTR의 인트론을 예로 들 수 있다(6,7). 또한, 인트론 잔류등과 같은 결함적 스플라이싱에 기인한 손상된 단백질 번역은 유전자 질병 또는 병태(예, 유전성 질환 또는 암)와 같은 질환의 발병 및/또는 질환의 진행을 초래하였다. 그러나, 이러한 상황에서 유전자 발현을 정상화시키는 성공적인 서열-특이적 전략은 개발되지 않았다.
스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드(스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드; SSO)는 스플라이싱-부위 인식 또는 조절 서열에 결합하여 그들 표적에 대한 시스-작용 및 트랜스-작용 인자와 경쟁하여 인트론 스플라이싱을 조정하는 안티센스 시약이다(8). 그들은 비정상적 스플라이싱을 복원하거나, 존재하는 mRNA의 상대적 발현을 수정하거나, 또는 정상적으로 발현되지 않는 신규한 스플라이싱 변이체를 생성시키는 것으로 확인되었다(8). 수많은 SSO 개질, 예컨대 2'-O-메틸 및 2'-O-메톡시에틸 리보스에 의한 표적화 SSO-RNA 이중체의 개선된 안정성은 근이영양증의 DMD을 포함해, 증가하는 수많은 인간 질환 유전자에 대한 그들의 치료적 잠재력을 활용하는 연구들을 가능하게 한다. 이러한 접근법들은 제한된 많은 질환에 대한 그들의 임상적 잠재력을 획득하는데 가깝지만(8), 돌연변이-유도된 비정상적 스플라이싱(14) 및 증가되는 많은 복합 특성으로 인해 초래된 > 300종의 멘델 유전 질환은 유전자 발현의 SSO-매개 교정을 할 수 있다.
제1형 당뇨병의 원인론은 인간 백혈구 항원(HLA) 및 수많은 개질된 비 HLA 유전자좌에 의해 부여된 강력한 유전적 성분을 갖는다(15). 가장 강력한 개질자는 염색체 11 상의 프로인슐린 유전자(INS) 영역에서 동정되었다(IDDM2라고 함)(15). 이 영역의 추가 맵핑은 발병론에서 이 자가항원의 결정적 역할(17)과 일관되게, INS가 가장 가능성있는 IDDM2 표적(16)임을 시사한다. IDDM2에서 이 질환에 대한 유전적 위험성은 잠재적으로 이 유전자 상류의 소위성 DNA 서열을 포함하는, 소인적 및 보호적 INS 일배체형으로부터의 차등적 정상 상태 RNA 수준에 기인하였다(18,19). 그러나, 천연 발생 INS 다형성의 체계적 조사는 IVS1+5ins4(rs3842740 또는 INS-69라고도 알려짐) 및 IVS1-6A/T(rs689, INS-27 또는 HphI+/-)(16,20)라고 하는, 인트론 1의 2종 변이체(7)로 인한, 소위성 서열이 없는 리포터 구성체의 일배체형-특이적 프로인슐린 발현 수준을 밝혀주었다. 전자의 변이체는 인트론 1의 암호화 5' 스플라이싱 부위를 활성화시키는데 반해, 3' 스플라이싱 부위(3'ss)의 6개 뉴클레오티드 상류에 존재하는, 후자 변이체에서의 아데닌(A)은 인트론 잔류를 촉진시켜, 연장된 5'UTR을 갖는 전사물의 상대적 풍부함을 확대시켰다(21). 티민(T)과 비교하여, IVS1-6A/T의 A 대립유전자는 시험관 내에서 피리미딘-결합 단백질에 대한 친화성이 감소하고, 3'ss를 U2 결합, 스플라이시오솜 조립 및 3'ss 선별에 필요한 이종이량체(22)인, U2 소형 핵 리보뉴클레오단백질(U2AF)(7)의 보조 인자에 더 의존적이게 한다. 인트론 1-함유 전사물은 인슐린 생산 조직(21)으로부터 준비한 IVS1-6A-유도된 cDNA 라이브러리에서 과도하게 나타나고(21), 핵으로부터 이출되며(23), 고등 영장류에서 인트론 1의 3'ss의 완화와 공동 진화되는, 짧은, 사람아과-특이적 uORF를 함유한다(7). A 대립유전자에 의해 부여되는 낮은 프로인슐린 발현은 태아 흉선에서 프로인슐린 펩티드의 최적 이하의 제시와 자가반응성 T 세포의 부적절한 음성적 선택을 초래하여, 결국 췌장에서 인슐린-생산 β-세포의 자가면역 파괴를 야기한다(7).
본 발명의 목적은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하도록 잔류된 인트론을 제거하기 위해 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 프로세싱을 유도시키는 것이다. 추가 목적은 단백질의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태 또는 이를 필요로 하는 피험체에서 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 IVS1-6A-함유 프리-mRNA로부터 INC 인트론 1 제거의 낮은 효율을 교정하고 질환-보호적 T 대립유전자에서 관찰되는 수준으로 인트론 잔류를 감소시키는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 불규칙적이거나 또는 비정상적인 인트론 잔류를 특징으로 하는(또는 연관된) 암을 포함한 유전적 질환에 대한 신규한 요법 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 측면에 따라서, 성숙한 유전자 전사물에서 인트론 잔류의 교정 단계를 포함하는 피험체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 질환은 유전자 전사물의 인트론 잔류에 의해 야기된 결함적 단백질 발현에 의해 유도된다.
잔류된 인트론
잔류된 인트론은 엑손 스킵핑, 선택적 5' 스플라이싱 부위, 선택적 3' 스플라이싱 부위, 및 상호 배타적 엑손을 또한 포함할 수 있는 다섯 가지 유형의 선택적 스플라이싱 중 하나이다. 엑손 스킵핑은 엑손이 프로세싱되는 mRNA 상에서 스킵핑되거나 또는 스플라이싱되어 버리는 경우에 발생할 수 있고 선택적 스플라이싱의 가장 흔한 유형일 수 있다. 선택적 5' ss 및 선택적 3' ss는 교대식 스플라이싱 부위 예컨대 암호화 스플라이싱 부위 또는 슈도 스플라이싱 부위를 의미할 수 있다. 상호 배타적 엑손은 2개 엑손 중 오직 하나가 스플라이싱 후 프로세싱된 mRNA에 잔류될 때 일어날 수 있다. 인트론 잔류가 엑손 스킵핑보다 덜 흔하지만, 인트론 잔류는 이전에 인식되었던 것보다 더 빈번하게 일어나는 것으로 확인되었다. 게다가, De Souza 그룹에 의한 21,106 인간 유전자 연구는 시험된 유전자의 약 15%가 인트론 잔류를 보이는 것으로 확인되었다(Galante et al, "Detection and evaluation of Intron retention events in the human transcriptome" Bioinformatics 10:757-765(2004)). 또한, Moore 그룹의 연구는 5'-UTR의 약 35% 및 3'-UTR의 약 16%가 인트론을 품은 것을 확인하였다(Bicknell et al., "Introns in UTRs: Why we should stop ignoring them," Bioessays 34:1025-1034(2012)). 이와 같이, 인트론 잔류는 코딩 영역, 비코딩 영역, 5' UTR, 또는 3' UTR에서 일어날 수 있다. 코딩 영역에서, 잔류된 인트론은 인프레임으로 아미노산을 코딩하거나, 또는 중지 코돈 또는 프레임 이동으로 인해 절두형 단백질 또는 비기능적 단백질을 생성할 수 있는 오정렬일 수 있다. 또한, 인트론은 5' UTR에 위치하거나, 또는 3' UTR에 위치하는, 2개 엑손 사이에 존재할 수 있다.
비잔류된 인트론과 비교하여, 잔류된 인트론은 더 짧은 서열 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 잔류된 인트론의 서열 길이는 5 kb 미만, 4 kb 미만, 3 kb 미만, 2.5 kb 미만, 2 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만, 0.4 kb 미만, 0.3 kb 미만, 0.2 kb 미만, 또는 0.1 kb 미만일 수 있다.
또한, 비잔류된 인트론과 비교하여, 잔류된 인트론은 약 40% 내지 약 60%의 G/C 함량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 잔류된 인트론의 G/C 함량은 약 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 약 60%일 수 있다.
잔류된 인트론은 또한 약한 5' 스플라이싱 부위, 약한 3' 스플라이싱 부위, 또는 둘 모두가 측접할 수 있다. 약한 스플라이싱 부위는 기능을 위한 인트론 스플라이싱 인핸서와 같은 조절 단백질을 필요로 할 수 있는 스플라이싱 부위라고 할 수 있다.
또한, 잔류된 인트론은 비잔류된 인트론에 비해 더 적은 GGG 모티프 존재를 포함할 수 있다. 일례에서, GGG 모티프는 인트론 스플라이싱 인핸서이다.
부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 부분 스플라이싱을 진행하고 적어도 하나의 잔류된 인트론을 포함하는 mRNA 전사물이다. 적어도 하나의 인트론은 5' UTR, 3' UTR 내에 또는 2개 엑손 사이의 내부 위치에 있을 수 있다. 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 기능적 또는 전체 길이 단백질을 생산하도록 번역될 수 없다.
부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 짧은 서열 길이를 특징으로 하는 인트론을 포함한다. 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 3 kb 미만, 2.5 kb 미만, 2 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만, 0.4 kb 미만, 0.3 kb 미만, 0.2 kb 미만, 또는 0.1 kb 미만인 서열을 특징으로 하는 인트론을 포함할 수 있다.
부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 약 40% 내지 약 60%의 G/C 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 인트론을 포함할 수 있다. 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 약 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 약 60%의 G/C 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 인트론을 포함할 수 있다.
부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 약한 5' 스플라이싱 부위, 약한 3' 스플라이싱 부위, 또는 둘 모두가 측접한 인트론을 포함할 수 있다.
부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 비잔류된 인트론에 비해 더 낮은 GGG 모티프의 존재를 포함할 수 있는 인트론을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 1 이상의 인트론이 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물에 잔류된다. 부분적으로 프로세싱된 mRNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 잔류된 인트론을 포함할 수 있다.
완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물은 인트론, 예컨대 잔류된 인트론을 제거하기 위한 스플라이싱을 진행하고 단백질 예컨대 전체 길이 기능적 단백질을 생산하도록 번역될 수 있는 것이다. 1 이상의 잔류된 인트론을 갖는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 완전하게 프로세싱된 mRNA가 되도록 스플라이싱될 수 있다.
전체 길이 기능적 단백질은 단백질의 야생형 형태와 동일한 길이 및 기능을 갖는다. 전체 길이 기능적 단백질은 단백질의 야생형 형태일 수 있다. 전체 길이 기능적 단백질은 야생형 단백질과 동일한 길이를 갖는 야생형 단백질의 이소폼일 수 있다. 전체 길이 기능적 단백질은 돌연변이 예컨대 단백질의 표현형(예를 들어, 기능)이 돌연변이에 의해 변경되지 않도록 유사한 특성을 갖는 대안적인 아미노산 잔기로의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
유사한 특성을 갖는 예시적인 아미노산은 전기적으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산: 양으로 하전된 아르기닌, 히스티딘, 및 리신; 또는 음으로 하전된 아스파르트산 및 글루탐산; 극성 아미노산 잔기: 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 및 메티오닌; 비극성 아미노산: 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 및 프롤린; 및 방향족 아미노산: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함할 수 있다.
일례에서, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물은 단백질의 손상된 생산을 초래한다. 단백질의 손상된 생산은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 정상 이하 생산을 포함할 수 있는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산일 수 있다. 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 단백질의 결함적 형태의 생산을 포함할 수 있다. 단백질의 결함적 형태는 단백질의 절두된 형태, 단백질의 미스폴딩된 형태, 또는 비정상적 표적 결합 부위를 포함하는 단백질 형태일 수 있다.
다중핵산 중합체
본원에 기술된 다중핵산 중합체는 잔류된 인트론의 제거를 개시하도록 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물과 혼성화시키는데 사용될 수 있다. 일례에서, 다중핵산 중합체는 안티센스 다중핵산 중합체이다. 안티센스 다중핵산 중합체는 G/C 함량이 높은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 영역, 예컨대 약 40% 내지 약 60%를 포함하는 영역과 혼성화할 수 있다. 안티센스 다중핵산 중합체는 높은 G/C 함량, 예컨대 약 40% 내지 약 60%를 포함할 수 있다. 안티센스 다중핵산 중합체는 약한 5' 스플라이싱 부위, 또는 약한 3' 스플라이싱 부위에, 그 옆에, 또는 그 근처에 있는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 영역과 혼성화할 수 있다. 안티센스 다중핵산 중합체는 낮은 GGG 모티프 존재를 포함할 수 있는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 영역과 혼성화할 수 있다.
다중핵산 중합체의 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화할 수 있다. 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화할 수 있다. 인트론 스플라이싱 조절 성분은 인트론 스플라이싱 인핸서 또는 인트론 스플라이싱 사일렌서를 포함할 수 있다. 안티센스 서열은 인트론 스플라이싱 사일렌서와 혼성화할 수 있다. 인트론 스플라이싱 조절 성분은 스플라이시오솜 조립의 초기 및/또는 중간 단계, 예컨대 엑손 정의 동안 또는 인트론-스패닝 복합체로의 후속 전이 동안 엑손에 걸쳐 스플라이싱 부위에서 U1 및 U2 snRNP가 쌍을 이룰 때 영향을 미쳐 스플라이싱을 조정할 수 있다. 예시적인 인트론 스플라이싱 조절 성분은 폴리피리미딘-트랙-결합 단백질(PTB), U2AF65 및/또는 U2AF35, hnRNP L 및 hnRNP A1을 포함할 수 있다.
다중핵산 중합체는 인트론의 5' 스플라이싱 부위, 3' 스플라이싱 부위, 분지점, 폴리피리미딘 트랙, 또는 인트론 인핸서에서 혼성화할 수 있다. 다중핵산 중합체는 또한 스플라이싱을 촉진하거나 또는 강화하기 위해 5' 스플라이싱 부위, 3' 스플라이싱 부위, 분지점, 폴리피리미딘 트랙 또는 인트론 인핸서로부터 약 30개 염기, 25개 염기, 20개 염기, 15개 염기, 10개 염기, 또는 5개 염기가 떨어진 거리에서 혼성화할 수 있다. 스플라이싱 부위에서 또는 그 근처에서 다중핵산 중합체의 혼성화는 스플라이싱 부위를 향해서 스플라이싱 인자들을 동원하여, 스플라이싱을 개시시켜 촉진하거나 또는 강화될 수 있다.
다중핵산 중합체는 인트론 사일렌서 부위(예를 들어, 신규 인트론 사일렌서 부위), 암호화 인트론 스플라이싱 부위, 또는 슈도 스플라이싱 부위에서 혼성화할 수 있다. 인트론 사일렌서 부위는 스플라이싱 반응을 억제하는 사일렌서에 의해 인식될 수 있다. 암호화 인트론 스플라이싱 부위는 돌연변이, 예컨대 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 생성될 수 있다. 암호화 인트론 스플라이싱 부위는 암호화 5' 스플라이싱 부위 또는 암호화 3' 스플라이싱 부위일 수 있다. 암호화 인트론 스플라이싱 부위는 암호화 5' 스플라이싱 부위일 수 있다. 슈도 스플라이싱 부위는 그 활성화가 정규 스플라이싱 부위의 돌연변이로 인해 초래될 수 있는 약한 스플라이싱 부위일 수 있다. 슈도 스플라이싱 부위는 슈도 5' 스플라이싱 부위 또는 슈도 3' 스플라이싱 부위일 수 있다. 인트론 사일렌서 부위에서 혼성화는 결합으로부터 사일렌서를 입체적으로 차단할 수 있고 조립의 파괴 및 스플라이시오솜의 프로세싱을 방해하는데 도움을 줄 수 있다. 암호화 인트론 스플라이싱 부위에서 혼성화는 정규 스플라이싱 부위 예컨대 정규의 약한 스플라이싱 부위를 향한 상호작용을 재지정할 수 있다.
다중핵산 중합체는 인트론의 내부 영역에서 혼성화할 수 있다. 인트론의 내부 영역은 스플라이싱 부위, 예컨대 5' 스플라이싱 부위(예, 정규, 암호화, 또는 슈도 5' 스플라이싱 부위), 3' 스플라이싱 부위(예, 정규, 암호화, 또는 슈도 3' 스플라이싱 부위), 인핸서 부위 또는 사일렌서 부위를 포함하지 않을 수 있다. 내부 영역에서 다중핵산 중합체의 혼성화는 스플라이싱 부위, 예컨대 인트론 인핸서 부위를 향해서 스플라이싱 인자들을 동원하여 스플라이싱을 촉진하거나 또는 강화시킨다.
다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화할 수 있다. 인트론 스플라이싱 조절 성분은 CCC 모티프를 포함할 수 있다. 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화할 수 있고, 여기서 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않는다. 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프에 혼성화할 수 있고, 여기서 결합 모티프는 2개의 G 사중체 사이에 있다. 안티센스 서열은 또한 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화할 수 있고, 여기서 결합 모티프는 제1 CCC 모티프 및 제2 CCC 모티프를 갖는다. 제1 CCC 모티프는 제2 CCC 모티프로부터 약 3개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기일 수 있다.
다중핵산 중합체는 결합 모티프가 헤어핀 구조를 형성하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화할 수 있다. 다중핵산 중합체는 헤어핀 구조를 더욱 탈안정화시킬 수 있다.
다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에서 피리딘 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에서 2개의 연속하는 피리딘 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일례에서, 다중핵산 중합체는 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)일 수 있다. 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화할 수 있다. 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화할 수 있다.
스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)는 엑손 사용을 억제하는데 광범위하게 사용되지만 스플라이싱-매개 유전자 발현을 증가시키도록 전체 인트론의 제거를 촉진하는 안티센스 전략은 개발된 적이 없다. 인간 프로인슐린 유전자를 함유하는 일련의 스플라이싱 리포터를 사용하여, 낮은 수준으로 프로인슐린을 발현하는 인간 일배체형에서 유도된 전사물에 결합하는 SSO에 의해 INS 인트론 1 잔류를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 비정규 및 정규 RNA 구조의 경쟁을 통해서 5' UTR로부터 약한 인트론 제거의 SSO-보조된 촉진은 유전자 발현을 강화시키도록 서열-기반 안티센스 전략의 개발을 용이하게 한다.
용어 "인트론 잔류의 교정"은 불규칙하거나 또는 비정상적인 인트론 잔류의 교정으로 이해한다. 교정은 완전한 교정이거나 또는 부분 교정일 수 있다. 교정은 인트론 잔류의 발생률을 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 교정은 비정상적인 인트론 잔류를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다.
유전자 전사물의 인트론 잔류로 인해 야기된 단백질 발현에서의 "결합"에 대한 언급은 부적절하거나, 결함적이거나, 또는 비정상적인 단백질 발현을 포함할 수 있다.
인트론 잔류의 교정은 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 인트론 잔류의 교정은 유전자 전사물의 고차 구조를 변경시키기 위해 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 인트론 잔류의 교정은 정규(스템 루프); 비정규(G 사중체) RNA 구조의 입체형태 전이; 트랜스-작용 인자와의 상호작용; 및 RNA-단백질 복합체 형성 속도 중 1 이상을 방해하기 위해 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 인트론 잔류의 교정은 정규(스템 루프) 및/또는 비정규(G 사중체) RNA 구조의 입체형태 전이를 방해, 예컨대 차단하기 위해서 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체는 인트론 스플라이싱 조절 성분을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 포유동물에서 보존된 중복된 인트론 스플라이싱 조절 성분을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 짧은 펜타머 내지 헵타머 스플라이싱 조절 모티프를 함유하는 인트론 절편을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 스플라이싱 조절 모티프는 CCCAG 또는 AGGCC를 포함할 수 있다. 스플라이싱 조절 모티프는 문헌 [Yeo GW, et al(2007), PLoS Genet 3:e85] 및/또는 [Voelker RB, & Berglund JA(2007), Genome Res 17:1023-1033]에서 제공하는 임의의 모티프를 포함할 수 있고, 이들 두 문헌은 참조하여 본원에 편입시킨다. 표적 영역은 G-사중체 형성을 피하기 위해 C 연속부를 포함하지 않을 수 있다. 표적 영역은 5' 및 3' 스플라이싱 부위 둘 모두, 폴리피리미딘 트랙, 분지 부위 및/또는 초분지 영역에 가깝지 않을 수 있다.
다중핵산 중합체는 Tra2, SRSF3 또는 U2AF35를 포함한, INS 인트론 1 및 엑손 2 스플라이싱에 영향을 주는 것으로 확인된 스플라이싱 인자들을 위한 결합 플랫폼, 또는 다중핵산 중합체의 전달을 용이하게 하고/하거나 핵산을 특이적 조직, 세포 또는 발생 단계로 표적화하기 위한 Tra2, SRSF3 또는 U2AF35, 또는 다른 펩티드, 센스 또는 안티센스 핵산, 소형 분자, 또는 다른 화학물을 제공할 수 있다. 이러한 안티센스 전략은 암 세포에서, 특히 골수증식성 질환에서 U2AF35의 아연 핑거 도메인 내 특이적 치환에서 처음 확인된 바와 같이(76), 스플라이싱 인자 유전자의 체액성 돌연변이를 함유하는 것들에서 만연한 인트론 잔류를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다. 이들 돌연변이는 많은 종양에서 발생하며 악성 성장의 원인이 될 수 있는 스플라이싱 결함을 야기할 수 있다. 본 발명은 현재 > 15%로 추산되는, 3' 스플라이싱 부위 인식에 관여하는 스플라이싱 인자들에 돌연변이를 보유하는 암환자의 유의한 비율에서 세포 증식을 제어하고 악성 성장을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다(76).
다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.5% 상보적일 수 있다. 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 100% 상보적일 수 있다.
다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 4개 이상의 미스매치를 가질 수 있다. 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 3개 이하의 미스매치를 가질 수 있다. 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 2개 이하의 미스매치를 가질 수 있다. 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 1개 이상의 미스매치를 가질 수 있다.
다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있다. 특이성은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 다중핵산 중합체의 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 상보적일 수 있다. 혼성화는 고엄격 혼성화 조건 하에서 일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분과 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 55% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46과 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 13개 인접하는 염기와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화할 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 13개 인접하는 염기와 100% 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화할 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 55% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스일 수 있다.
전사물의 표적 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스의 언급은 적어도 5개 연속적인 뉴클레오티드, 또는 적어도 10개 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 5개 연속적인 뉴클레오티드에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 10개 연속적인 뉴클레오티드에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 15개 연속적인 뉴클레오티드에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역의 적어도 20개 연속적인 뉴클레오티드에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 10개의 인접한 염기를 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화할 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 적어도 10개의 인접한 염기로 이루어진 mRNA 전사물과 혼성화할 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군 중 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 63% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 및 서열번호 36; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 및 서열번호 36; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 및 서열번호 36; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 및 서열번호 36; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 6을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 9를 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 36을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 63%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 6과 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 63%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 9와 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 63%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 36과 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 63%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스일 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 서열과 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열과 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 65% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 60% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 55% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 50% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스일 수 있다. 당업자는 우라실 뉴클레오티드가 티민 뉴클레오티드로 치환될 수 있음을 이해한다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태).
다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 65% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 60% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 55% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군으 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 65% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 60% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 55% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 34; 및 서열번호 35; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어 질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 65% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 34 또는 서열번호 35와 적어도 60% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 각 서열의 RNA의 DNA 형태).
다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함한 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 65% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 60% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 55% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태). 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환된다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태).
유리하게, 본 발명은 인트론 전사물(예, 인트론 1-잔류 전사물)의 상대적 풍부함을 감소시키는 SSO를 동정하였고 단일-뉴클레오티드 분해에서 최적의 안티센스 표적을 기술한다.
다중핵산 중합체는 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 45개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 40개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 35개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 30개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 25개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 20개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 19개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 18개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 17개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 15개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 14개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 13개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 12개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 11개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 45개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 40개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 35개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 30개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 25개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 20개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드일 수 있다. 다중핵산 중합체는 길이가 약 12 내지 약 30개 뉴클레오티드일 수 있다.
다중핵산 중합체, 예컨대 SSO는 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체, 예컨대 SSO는 RNA를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체, 예컨대 SSO는 DNA 또는 RNA와 균등한 상보성을 갖는, 천연 또는 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체, 예컨대 SSO는 DNA, RNA 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 PNA 또는 LNA를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산, 예컨대 SSO는 PMO를 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.
일례에서, 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기는 리보스 모이어티, 포스페이트 모이어티, 뉴클레오시드 모이어티, 또는 이의 조합 중 1 이상에서 개질을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체 또는 인공 뉴클레오티드 염기는 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에서 개질을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. 개질은 2'-O-메틸 개질 또는 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 개질일 수 있다. 2'-O-메틸 개질은 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에 메틸 기를 부가할 수 있는 한편 2'O-메톡시에틸 개질은 리보스 모이어티의 2' 히즈록실 기에 메톡시에틸 기를 부가할 수 있다. 아데노신 분자의 2'-O-메틸 개질 및 우리딘의 2'O-메톡시에틸 개질의 예시적인 화학 구조를 이하에 예시한다.
Figure pct00001
2' 히드록실 기에서 추가 개질은 2' 산소에 아민 기를 결합시키는 프로필 링커를 포함하는 연장된 아민 기를 포함할 수 있는 2'-O-아미노프로필 당 입체형태를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 당류 당 아민 기로부터 1개의 양전하를 도입시켜 올리고뉴클레오티드 분자의 포스페이트 유래된 전체 음전하를 중화시켜서, 그 쯔 위터이온 특성에 기인한 세포 흡수 특성을 개선시킬 수 있다. 2'-O-아미노프로필 뉴클레오시드 포스포르아미디트의 예시적인 화학 구조를 하기에 예시한다.
Figure pct00002
2' 히드록실 기에서 다른 개질은 잠금 또는 가교 리보스 입체형태(예, 잠금 핵산 또는 LNA)를 포함하며 여기서 4' 리보스 위치가 또한 포함될 수 있다. 이러한 개질에서 2' 탄소에 결합된 산소 분자는 메틸렌 기에 의해 4' 탄소에 연결되어서, 2'-C,4'-C-옥시-메틸렌-연결된 이환식 리보뉴클레오티드 단량체를 형성할 수 있다. LNA의 화학 구조의 예시적인 대표예를 이하에 예시한다. 좌측에 도시한 대표도는 LNA 단량체의 화학적 연결성을 강조한다. 우측에 도시한 대표도는 LNA 단량체의 푸라노스의 잠금 3'-엔도(3E) 입체형태를 강조한다.
Figure pct00003
2' 히드록실 기에서 추가 개질은 C3'-엔도 당 퍼커링 입체형태로 당 입체형태를 잠그는, 에틸렌 핵산(ENA) 예컨대 예를 들어, 2'-4'-에틸렌-가교 핵산을 포함할 수 있다. ENA는 LNA를 또한 포함하는 개질된 핵산의 가교된 핵산 부류의 일부분이다. ENA 및 가교된 핵산의 예시적인 화학 구조를 하기에 예시한다.
Figure pct00004
2' 히드록실 기에서 또 다른 개질은 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O- 디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA)를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 몰폴리노, 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트, 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA) 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다. 몰폴리노 또는 포스포로디아미데이트 몰폴리노 올리고(PMO)는 그 구조가 정상적인 당 및 포스페이트 구조를 벗어나서 천연 핵산 구조를 모방하는 합성 분자를 포함한다. 대신, 5원 리보스 고리는 4개 탄소, 1개 질소 및 1개 산소를 함유하는 6원 몰폴리노 고리로 치환될 수 있다. 리보스 단량체는 포스페이트 기 대신 포스포르디아미데이트 기에 의해 연결될 수 있다. 이들 골격 변경은 모든 양전하 및 음전하를 제거하여 몰폴리노를 예컨대 하전된 올리고뉴클레오티드가 사용되는 세포 전달제의 도움없이 세포막을 가로지를 수 있는 중성 분자로 만든다.
Figure pct00005
펩티드 핵산(PNA)은 당 고리 또는 포스페이트 연결부를 함유하지 않는다. 대신, 염기는 올리고글리신-유사 분자가 부착되어 적절하게 공간을 차지해서, 골격 전하를 제거할 수 있다.
Figure pct00006
포스페이트 골격의 개질은 또한 메틸 또는 티올 개질 예컨대 메틸포스포네이트 뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 예시적인 티올포스포네이트 뉴클레오티드(좌) 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드(우)를 이하에 예시한다.
Figure pct00007
또한, 예시적인 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 이하에 예시한다:
Figure pct00008
그리고 예시적인 헥시톨 핵산(또는 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA))은 이하와 같이 예시한다:
Figure pct00009
리보스 모이어티, 포스페이트 골격 및 뉴클레오시드의 개질 이외에도, 뉴클레오티드 유사체는 또한 예를 들어 3' 또는 5' 말단에서 개질될 수 있다. 예를 들어, 3' 말단은 3' 양이온 기를 포함하거나, 또는 3'-3' 연결로 3'-말단에서 뉴클레오티드를 전환시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 대안에서, 3'-말단은 아미노알킬 기, 예를 들어, 3' C5-아미노알킬 dT로 차단될 수 있다. 5'-말단은 아미노알킬 기, 예를 들어, 5'-O-알킬아미노 치환기로 차단될 수 있다. 다른 5' 접합체는 5'-3' 엑소뉴클레아제분해 절단을 억제할 수 있다. 다른 3' 접합체는 3'-5' 엑소뉴클레아제분해 절단을 억제할 수 있다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 인공 뉴클레오티드 유사체 중 1 이상은 천연 다중핵산 중합체와 비교시 뉴클레아제 예컨대 예를 들어, 리보뉴클레아제 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제 예컨대 DNase, 또는 엑소뉴클레아제 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제에 대해 내성이다. 일례에서, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된, LNA, ENA, PNA, HNA, 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트, 또는 이의 조합을 포함하는 인공 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레아제 예컨대 예를 들어, 리보뉴클레아제 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제 예컨대 DNase, 또는 엑소뉴클레아제 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제에 대해 내성이다. 2'-O-메틸 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성일 수 있다(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성). 2'O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-O-아미노프로필 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-데옥시 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. T-데옥시-2'-플루오로 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. LNA 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. ENA 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. HNA 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 몰폴리노는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. PNA는 뉴클레아제에 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 메틸포스포네이트 뉴클레오티드 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 티올포스포네이트 뉴클레오티드 개질된 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함하는 다중핵산 중합체는 뉴클레아제 내성(예, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다.
일례에서, 본원에 기술된 인공 뉴클레오티드 유사체 중 1 이상은 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다. 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-0-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된, LNA, ENA, PNA, HNA, 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함하는 인공 뉴클레오티드 유사체의 1 이상은 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-메틸 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-아미노프로필 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-데옥시 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체와 비교하여 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. T-데옥시-2'-플루오로 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. LNA 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. ENA 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들의 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. PNA 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. HNA 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 몰폴리노 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 메틸포스포네이트 뉴클레오티드 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 티올포스포네이트 뉴클레오티드 개질된 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함하는 다중핵산 중합체는 균등한 천연 다중핵산 중합체에 비해 그들 mRNA 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 증가된 친화성은 낮은 Kd, 높은 용융점(Tm), 또는 이의 조합으로 예시할 수 있다.
추가 예에서, 본원에 기술된 다중핵산 중합체는 그의 안정성이 증가되도록 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체가 RNA인 실시형태에서, 다중핵산 중합체는 그의 안정성을 증가시키기 위해 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체는 그의 안정성을 증가시키기 위해 상기 기술된 개질 중 1 이상에 의해 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체는 예컨대 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-0-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O- 디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질에 의해 또는 잠금 또는 가교 리보스 입체형태(예, LNA 또는 ENA)에 의해 2' 히드록실 위치에서 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체는 2'-O-메틸 및/또는 2'-O-메톡시에틸 리보스에 의해 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체는 또한 그의 안정성을 증가시키기 위해 몰폴리노, PNA, HNA, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함할 수 있다. 전달을 위한 안정성을 증가시키기 위해 RNA에 적합한 개질은 당업자에게 자명하다.
본원에 기술된 다중핵산 중합체는 당분야에 잘 알려진 절차를 사용해 화학 합성 및/또는 효소 결찰 반응을 사용해 제작될 수 있다. 예를 들어, 다중핵산 중합체는 다중핵산 중합체와 표적 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키거나 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 디자인된 다양한 개질된 뉴클레오티드 또는 천연 발생 뉴클레오티드를 사용해 화학적으로 합성할 수 있다. 예시적인 방법은 US5,142,047; US5,185,444; WO2009099942; 또는 EP1579015에 기술된 것들이다. 추가의 예시적인 방법은 다음의 문헌들에 기술된 것들을 포함할 수 있다: Griffey et al., "2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides," J. Med. Chem. 39(26):5100-5109(1997)); Obika, et al. "Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering". Tetrahedron Letters 38(50): 8735(1997); Koizumi, M. "ENA oligonucleotides as therapeutics". Current opinion in molecular therapeutics 8(2): 144-149(2006); and Abramova et al., "Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities," Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726(2009). 대안적으로, 다중핵산 중합체는 다중핵산 중합체가 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용해 생물학적으로 생산할 수 있다(즉, 삽입된 다중핵산 중합체로부터 전사된 RNA가 관심 표적 다중핵산 중합체에 대해 안티센스 배향이게 됨).
다중핵산 중합체는 임의의 핵산 분자, 예컨대 다른 안티센스 분자, 펩티드 또는 다른 화학물에 결합되어 다중핵산 중합체의 전달 및/또는 핵산을 특이적 조직, 세포 유형, 또는 세포 발생 단계로 표적화시키는 것을 용이하게 할 수 있다. 다중핵산 중합체는 단백질 또는 RNA에 결합할 수 있다. 다중핵산 중합체에 속박된 단백질은 스플라이싱 및 인트론 제거를 강화, 억제 또는 조정하기 위한 스플라이싱 인자를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체에 속박된 RNA는 스플라이싱 및 인트론 제거를 강화, 억제 또는 조성하는 앱타머 또는 임의 구조를 포함할 수 있다. 다중핵산 중합체는 단리된 핵산일 수 있다.
다중핵산 중합체는 세포에 다중핵산 중합체를 전달하는데 적합한 전달 비히클에 접합되거나, 또는 결합될 수 있다. 세포는 특이적 세포 유형이거나, 또는 특이적 발생 단계일 수 있다. 전달 비히클은 부위 특이적, 조직 특이적, 세포 특이적 또는 발생 단계 특이적 전달을 할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 세포 특이적 바이러스 입자, 또는 이의 성분일 수 있고, 대안적으로, 전달 비히클은 세포 특이적 항체 입자, 또는 이의 성분일 수 있다. 다중핵산 중합체는 췌장의 베타 세포로 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 흉선 세포로의 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 악성 세포로의 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 가까운 미래에 명백한 악성 표현형으로 발전되는 것으로 알려진 전악성 세포, 예컨대 전백혈병 및 골수이형성 증후군 또는 조직병리학적으로 정의된 전암성 병변 또는 병태로의 전달을 위해 표적화될 수 있다.
일 실시형태에서, 다중핵산 중합체는 화학 분자(예를 들어, 비펩티드 또는 핵산 기반 분자), 예컨대 약물에 결합될 수 있다. 약물은 소형 분자(예를 들어, MW가 900 Da 미만)일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 전달 비히클은 세포 침투 펩티드(CPP)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중핵산 중합체는 CPP와 결합하거나 또는 복합체 형성할 수 있다. 당업자는 세포로 및/또는 그 내부로 다중핵산 중합체의 전달을 보조하기 위해 다중핵산 중합체와 접합될 수 있다. 그러한 CPP는 참조하여 본원에 편입시키는 문헌 [Boisguerin et al.(2015, Advanced Drug Delivery Reviews doi: 10.1016/j.addr.2015.02.008)]에 기술된 임의의 적합한 CPP 기술일 수 있다. 다중핵산 중합체와 접합을 위해 적합한 전달 비히클은 본원에 참조하여 편입되는, 문헌 [Lochmann et al.(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004) 237-251)]에 기술된 것일 수 있다.
CPP는 아르기닌 및/또는 리신 풍부 펩티드일 수 있고, 예를 들어, 펩티드내 잔기의 대부분은 리신 또는 아르기닌이다. CPP는 폴리-L-리신(PLL)을 포함할 수 있다. 대안적으로, CPP는 폴리-아르기닌을 포함할 수 있다. 적합한 CPP는 페너트란틴; R6-페너트란틴; 트린스포탄; 올리고-아르기닌; F-3; B-펩티드; B-MSP; Pip 펩티드, 예컨대 Pip1, Pip2a, Pip2b, Pip5e, Pip5f, Pip5h, Pip5j; Pip5k, Pip5l, Pip5m, Pip5n, Pip5o, Pip6a, Pip6b, Pip6c, Pip6d, Pip6e, Pip6f, Pip6g, 또는 Pip6h; 서열 PKKKRKV의 펩티드; 페나트란트; Lys4; SPACE; Tat; Tat-DRBD(dsRNA-결합 도메인);(RXR)4;(RFF)3RXB;(KFF)3K; RgF2; T-세포 유래 CPP; Pep-3; PEGpep-3; MPG-8; MPG-8-Chol; PepFect6; P5RHH; R15; 및Chol-R9; 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 군에서 선택될 수 있다(예, 문헌 [Boisguerin et al.(2015, Advanced Drug Delivery Reviews doi: 10.1016/j.addr.2015.02.008] 참조).
일 실시형태에서, CPP는 Pip 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. Pip 펩티드는 Pip1, Pip2a, Pip2b, Pip5e, Pip5f, Pip5h, Pip5j; Pip5k, Pip5l, Pip5m, Pip5n, Pip5o, Pip6a, Pip6b, Pip6c, Pip6d, Pip6e, Pip6f, Pip6g, 및 Pip6h를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 전달 비히클은 펩티드-기반 나노입자(PBN)를 포함할 수 있고, 여기서 다수의 CPP(예를 들어, 본원에 기술된 1 이상의 적합한 CPP)는 전하 상호작용을 통해 다중핵산 중합체와 복합체를 형성한다. 이러한 나노입자는 크기가 약 50 nm 내지 250 nm이다. 일 실시형태에서, 나노입자는 크기가 약 70-200 nm일 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 크기가 약 70-100 nm 또는 125-200 nm일 수 있다.
일 실시형태에서, 다중핵산 중합체는 예를 들어, 이온 결합에 의해, 전달 비히클과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 다중핵산 중합체는 전달 비히클에 공유적으로 결합될 수 있다. 접합/결합 방법은 참조하여 본원에 편입시킨, 문헌 [Lochmann et al.(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004) 237-251)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 접합 방법은 반응성 기(예, -NH2 또는 -SH2)를 함유하는 적합한 테더를 다중핵산 중합체에 도입시키고 전달 비히클, 예컨대 펩티드를 합성 후에 활성 중간체로서 부가한 후, 수성 매질에서 커플링 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 대안적 방법은 단일 고체상 지지체 위에서 선형 방식으로 접합을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
전달 비히클 및 다중핵산 중합체는 티올 및/또는 말레이미드 연결, 예컨대 티올-말레이미드 연결될 수 있다. 다중핵산 중합체 및 전달 비히클의 접합은 클릭-화학, 예컨대 접합하려는 개별 분자 상의 아지도 또는 2'-O-프로피아르길 작용기 및 알킨 기의 반응에 의할 수 있다. 일 실시형태에서, 전달 비히클 및 다중핵산 중합체는 티오에테르 가교에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, 전달 비히클 및 다중핵산 중합체는 디설피드 가교에 의해 연결될 수 있다. 당업자는 다중핵산 중합체 및 전달 비히클, 예컨대 펩티드의 접합을 위해 적합한 연결기 또는 방법을 쉽게 식별할 수 있다.
유전자 전사물은 프로-인슐린을 코딩할 수 있다. 유전자 전사물은 INS 유전자로부터 전사될 수 있다. 유전자 전사물은 낮은 수준으로 프로인슐린을 발현하는 인간 일배체형으로부터 유도될 수 있다. 인트론은 INS 인트론 1을 포함할 수 있다.
유전자 전사물은 ABCD4; ABCF3; ACADVL; ALKBH6; AP1G2; APEX1; ARFRP1; ATHL1; ATP1A3; ATP5D; ATP13A1; BAX; BDH2; BRD2; C1orf63; C1orf630; C1orf631; C1orf124; C2orf49; C8orf82; C16orf59; CAPRIN2; CDCA7; CEP164; CEP170; CLCN7; CPNE1; CPSF3L; DCXR; DENND4B; DFFA; DIS3L2; DNAJB12; DPF1; DRG2; DSN1; EML3; EWSR1; EWSR10; FGFR4; FTSJ1; GBAP1; GMPPA; GMPR2; GNPTG; GORASP1; GPATCH4; HGS; HMG20B; IFFO1; ISYNA1; KRI1; LOC148413; LZTR1; MAN2C1; MAP4K2; MCOLN1; MDP1; MIB2; MITD1; MOK; MOV10; MRPL35; MTMR11; MUS81; NAPEPLD; NBEAL2; NDRG4; NDUFB10; NFATC4; NFKBIB; NIT1; NKTR; NPRL2; NSUN5P1; NUDT22; PAN2; PDDC1; PDLIM4; PHF1; PIK3CD; PITPNM1; PPIL2; PPP1R35; PPP4C; PQLC2; PRPF39; PSME2; PTPMT1; QARS; RAD52; RHOT2; RMND5B; RNF123; RPL10A; RPP21; RPS6KB2; RUSC1; SCRN2; SCYL1; SFR1; SGSM3; SIRT7; SLC25A3; SLC25A3; SLC30A7; SLC37A4; STK19; STX10; TCF25; TOMM40; TP53I3; TRIM41; TRPT1; TSTA3; TTC14; TTC140; TUBGCP6; U2AF1L4; UCK1; UNC45A; VAMP1; VAMP10; VARS; VPS28; WDR24; WDR90; WRAP53; YDJC; YIPF3; YIPF3; ZCCHC8; ZCCHC18; ZFAND1; ZNF131; ZNF300; ZNF317; ZNF692; ZNF711; ZNRD1; ZWINT; 또는 이의 조합을 포함하는 유전자 또는 ORF 중 어느 하나에서 선택된 유전자 또는 ORF에서 전사될 수 있다.
용어 "다중핵산 중합체" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 길이가 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드인 다중핵산 중합체를 의미할 수 있다.
질환
본원에 기술된 방법 및 조성물은 단백질의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 질환 또는 병태는 유전자적 질병 또는 병태일 수 있다. 유전자적 질병 또는 병태는 단백질의 손상된 생산을 특징으로 할 수 있다. 유전자적 질병 또는 병태는 또한 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 유전자적 질병 또는 병태는 유전성 질병이거나, 게놈 내에 1 이상의 위치에 비유전성 결함일 수 있다. 유전자적 질병은 유전성 질환일 수 있다. 유전성 질환은 단백질의 손상된 생산을 특징으로 할 수 있다. 유전성 질환은 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 전사될 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다. 유전성 질환이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사될 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 유전성 질환이 있는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다.
유전자적 질병 또는 병태는 게놈 내에 1 이상의 위치에 비유전성 결함일 수 있다. 비유전성 결함은 점 돌연변이, 결실, 삽입, 또는 프레임 이동일 수 있다. 비유전성 결함과 연관된 유전자적 질병 또는 병태는 단백질의 손상된 생산을 특징으로 할 수 있다. 비유전성 결합과 연관된 유전자적 질병 또는 병태는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 비유전성 결함이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사될 때 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다. 비유전성 결함이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사될 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 비유전성 결함이 있는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다.
유전자적 질병 또는 병태는 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병일 수 있다. 때때로, 유전성 질환은 또한 상염색체 우성, 상염색체 열성, X-연관 우성, X-연관 열성, Y-연관, 미토콘드리아, 또는 다인성 또는 다유전자성 유전성 질환으로서 특징될 수 있다. 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병은 단백질의 손상된 생산을 특징으로 할 수 있다. 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병은 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다. 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병이 있는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병이 있는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있는 게놈을 가질 수 있다.
예시적인 유전성 질환은 연골 형성 부전증, 유전성 혈색소 침착증, 다운 증후군, 유전성 구상 적혈구증, 테이-삭스 질환, 어셔 증후군, 유전성 프룩토스 불내성증, 혈우병, 근이영양증(예, 뒤센 근이영양증 또는 DMD), 다유전자성 질병, 유방암, 난소암, 파킨슨 질환, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 당뇨병, 심장 질환, 관절염, 운동 뉴런 질환, 백색증, 고양이 울음 증후군, 낭포성 섬유증, 취약 X 증후군, 갈락토스혈증, 헌팅톤 질환, 잭슨-바이스 증후군, 클라인펠터 증후군, 크라베 질환, 랑거-기디온 증후군, 레쉬-니한 증후군, 마판 증후군, 근긴장성 이영양증, 조슬개골 증후군, 신경섬유종증, 누난 증후군 삼중 X 증후군, 골형성 부전증, 파타우 증후군, 페닐케톤뇨증, 포르피린증, 망막아세포종, 레트 증후군, 겸상 세포 질환, 터너 증후군, 어셔 증후군, 폰 히펠-린다우 증후군, 바르덴부르크 증후군, 윌슨 질환, 색소성 건피증, XXXX 증후군, 또는 YY 증후군을 포함할 수 있다.
유전성 질환 예컨대 예를 들어, 연골 형성 부전증, 유전성 혈색소 침착증, 다운 증후군, 유전성 구상 적혈구증, 테이-삭스 질환, 어셔 증후군, 유전성 프룩토스 불내성증, 혈우병, 근이영양증(예, 뒤센 근이영양증 또는 DMD), 다유전자성 질병, 유방암, 난소암, 파킨슨 질환, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 당뇨병, 심장 질환, 관절염, 운동 뉴런 질환, 백색증, 고양이 울음 증후군, 낭포성 섬유증, 취약 X 증후군, 갈락토스혈증, 헌팅톤 질환, 잭슨-바이스 증후군, 클라인펠터 증후군, 크라베 질환, 랑거-기디온 증후군, 레쉬-니한 증후군, 마판 증후군, 근긴장성 이영양증, 조슬개골 증후군, 신경섬유종증, 누난 증후군 삼중 X 증후군, 골형성 부전증, 파타우 증후군, 페닐케톤뇨증, 포르피린증, 망막아세포종, 레트 증후군, 겸상 세포 질환, 터너 증후군, 어셔 증후군, 폰 히펠-린다우 증후군, 바르덴부르크 증후군, 윌슨 질환, 색소성 건피증, XXXX 증후군, 또는 YY 증후군은 단백질의 손상된 생산, 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 유전성 질환 예컨대 예를 들어, 연골 형성 부전증, 유전성 혈색소 침착증, 다운 증후군, 유전성 구상 적혈구증, 테이-삭스 질환, 어셔 증후군, 유전성 프룩토스 불내성증, 혈우병, 근이영양증(예, 뒤센 근이영양증 또는 DMD), 다유전자성 질병, 유방암, 난소암, 파킨슨 질환, 바르데-비들 증후군, 프레더-윌리 증후군, 당뇨병, 심장 질환, 관절염, 운동 뉴런 질환, 백색증, 고양이 울음 증후군, 낭포성 섬유증, 취약 X 증후군, 갈락토스혈증, 헌팅톤 질환, 잭슨-바이스 증후군, 클라인펠터 증후군, 크라베 질환, 랑거-기디온 증후군, 레쉬-니한 증후군, 마판 증후군, 근긴장성 이영양증, 조슬개골 증후군, 신경섬유종증, 누난 증후군 삼중 X 증후군, 골형성 부전증, 파타우 증후군, 페닐케톤뇨증, 포르피린증, 망막아세포종, 레트 증후군, 겸상 세포 질환, 터너 증후군, 어셔 증후군, 폰 히펠-린다우 증후군, 바르덴부르크 증후군, 윌슨 질환, 색소성 건피증, XXXX 증후군, 또는 YY 증후군은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자의 카피를 포함할 수 있거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이, 유전자적 질병 또는 병태는 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병일 수 있다. 유전자적 질병 또는 병태, 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병일 수 있고, 단백질이 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질병일 수 있다.
예시적인 상염색체 우성 질병은 헌팅톤 질환, 제1형 신경섬유종증, 제2형 신경섬유종증, 마판 증후군, 유전성 비용종성 직결장암, 유전성 다발성 외골종증, 결절성 경화증, 폰 빌레브란트 질환, 또는 급성 간헐성 포르피린증을 포함할 수 있다.
상염색체 우성 질병 예컨대 헌팅톤 질환, 제1형 신경섬유종증, 제2형 신경섬유종증, 마판 증후군, 유전성 비용종성 직결장암, 유전성 다발성 외골종증, 결절성 경화증, 폰 빌레브란트 질환, 또는 급성 간헐성 포르피린증은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 상염색체 우성 질병 예컨대 헌팅톤 질환, 제1형 신경섬유종증, 제2형 신경섬유종증, 마판 증후군, 유전성 비용종성 직결장암, 유전성 다발성 외골종증, 결절성 경화증, 폰 빌레브란트 질환, 또는 급성 간헐성 포르피린증은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 상염색체 열성 질병은 백색증, 중간-사슬 아실-CoA 디히드로게나제 결핍증, 낭포성 섬유증, 겸상 세포 질환, 테이-삭스 질환, 니만-피크 질환, 척수성 근위축증, 또는 로버츠 증후군을 포함할 수 있다.
상염색체 열성 질병 예컨대, 백색증, 중간-사슬 아실-CoA 디히드로게나제 결핍증, 낭포성 섬유증, 겸상 세포 질환, 테이-삭스 질환, 니만-피크 질환, 척수성 근위축증, 또는 로버츠 증후군은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 상염색체 열성 질병 예컨대, 백색증, 중간-사슬 아실-CoA 디히드로게나제 결핍증, 낭포성 섬유증, 겸상 세포 질환, 테이-삭스 질환, 니만-피크 질환, 척수성 근위축증, 또는 로버츠 증후군은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 X-연관 우성 질병은 X-연관 저인산염혈증 구루병, 레트 증후군, 제2형 색소실소증, 아이카디 증후군, 또는 클라인펠터 증후군을 포함할 수 있다.
X-연관 우성 질병 예컨대, X-연관 저인산염혈증 구루병, 레트 증후군, 제2형 색소실소증, 아이카디 증후군, 또는 클라인펠터 증후군은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. X-연관 우성 질병 예컨대, X-연관 저인산염혈증 구루병, 레트 증후군, 제2형 색소실소증, 아이카디 증후군, 또는 클라인펠터 증후군은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 X-연관 열성 질병은 혈우병 A, 뒤센 근이영양증, 레쉬-니한 증후군, 또는 터너 증후군을 포함할 수 있다.
X-연관 열성 질병 예컨대, 혈우병 A, 뒤센 근이영양증, 레쉬-니한 증후군, 또는 터너 증후군은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. X-연관 열성 질병 예컨대, 혈우병 A, 뒤센 근이영양증, 레쉬-니한 증후군, 또는 터너 증후군은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 Y-연관 질병은 스와이어 증후군 또는 망막 색소 변성증 형태를 포함할 수 있다.
Y-연관 질병 예컨대 스와이어 증후군 또는 망막 색소 변성증 형태는 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. Y-연관 질병 예컨대 스와이어 증후군 또는 망막 색소 변성증 형태는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 미토콘드리아 질환은 레베르 유전성 시각 신경병증을 포함할 수 있다.
미토콘드리아 질환 예컨대 레베르 유전성 시각 신경병증은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 미토콘드리아 질환 예컨대 레베르 유전성 시각 신경병증은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질이 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
예시적인 다인성 또는 다유전자성 질병은 심장 질환, 당뇨병, 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증, 염증성 장질환, 또는 암을 포함할 수 있다.
다인성 또는 다유전자성 질병 예컨대 심장 질환, 당뇨병, 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증, 염증성 장질환, 또는 암은 단백질의 손상된 생산 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 할 수 있다. 다인성 또는 다유전자성 질병 예컨대 심장 질환, 당뇨병, 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증, 염증성 장질환, 또는 암은 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하거나, 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함할 수 있는 유전자 카피를 포함하거나, 또는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함할 수 있다.
일례에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 유전자적 질병 또는 병태 예컨대 유전성 질환을 치료하는데 사용된다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 단백질의 손상된 생산을 특징으로 하는 유전자적 질병 또는 병태 예컨대 유전성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 유전자적 질병 또는 병태 예컨대 유전성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 유전자적 질병 또는 병태 예컨대 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병을 치료하는데 사용될 수 있고, 이러한 질환 또는 병태는 단백질의 손상된 생산을 특징으로 한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 상염색체 우성 질병, 상염색체 열성 질병, X-연관 우성 질병, X-연관 열성 질병, Y-연관 질병, 미토콘드리아 질환, 또는 다인성 또는 다유전자성 질병을 치료하는데 사용될 수 있고, 이러한 질병 또는 병태는 결함적 스플라이싱을 특징으로 한다.
일례에서, 질환 또는 병태는 근이영양증, 척수성 근위축증(SMA), 모세혈관확장성운동실조, X-연관 무감마글로불린혈증, 당뇨병, 또는 암을 포함한다.
근이영양증은 근골격 체계가 약화되어 운동능을 방해할 수 있는 근육 질환군이다. 이는 진행성 골격근 약화증, 근육 단백질의 결함, 근육 세포 및 조직의 사멸을 특징으로 할 수 있다. 근이영양증의 일반적인 형태 중 하나는 뒤센 근이영양증(DMD)이다. 근이영양증의 추가 형태는 베커, 지대형, 선천성, 안면견갑상완, 근긴장성, 눈인두, 원위, 및 에머리-드레이푸스 근이영양증을 포함할 수 있다.
척수성 근위축증(SMA)은 유아기 사망률의 가장 일반적인 유전적 원인 중 하나인 상염색체 열성 질병이다. 이 질환의 주요 특징은 약화, 위축, 및 수의근의 마비가 후속되는 골격근 신경제거를 야기하는, 척수 운동 신경의 진행적 손실일 수 있다. SMA 유전자좌는 몇몇 유전자를 함유하는 염색체 5q13 상의 ∼500 kb의 복합 인버티드 반복부로 맵핑될 수 있다. SMA의 주요 원인은 인버티드 반복부에 위치된 운동 신경 유전자(SMN1)의 생존자의 텔로머 카피의 동형접합성 손실일 수 있다. 인버티드 반복부의 센트로머 카피 내 이중 유전자(SMN2)가 또한 전사될 수 있지만, SMN2 유전자는 SMN1 기능 손실을 완전하게 보상하지 않는다.
모세혈관확장성운동실조(A-T) 또는 루이스-바 증후군은 희귀한 신경퇴행성 유전 질환이다. 용어 "운동실조증"은 협동 저하를 의미하고, 용어 "모세혈관확장증"은 작은 팽창성 혈관을 의미한다. 두 용어는 이 질환의 특질을 규명한다. AT는 소뇌 및 손상된 운동성 및 협동성을 야기할 수 있는 뇌의 추가 영역을 손상시킬 수 있다. AT는 또한 면역계를 약화시켜 감염을 증가시키고 DNA 복구를 손상시켜, 암 위험성을 증가시킬 수 있다. A-T는 다수 형태의 스트레스에 대응하여 세포 반응을 관리하는 책임을 지는 유전자 ATM의 결함과 연관된다.
X-연관 저감마글로불린혈증, XLA, 브루톤 유형 무감마글로불린혈증, 브루톤 증후군, 또는 성-연결 무감마불린혈증이라고도 알려진, X-연관 무감마글로불린혈증은 감염과 싸우는 신체 능력에 영향을 미치는 X-연관 유전자 질병이다. XLA 환자는 성숙한 B 세포가 결여되어 있어서, 그 결과 감염과 싸우는 필수 항체가 결여되어 있다. 브루톤 티로신 키나제(BTK)는 B 세포 발생 및 성숙화 매개와 연관되고 BTK 유전자는 XLA와 연관된다.
진성 당뇨병(DM)(통상 당뇨병이라 알려짐)은 장기간 동안 고혈당 수준을 특징으로 하는 대사 질환군이다. 당뇨병 증상은 체중 감량, 다뇨증 또는 배뇨 증가, 조갈증 또는 갈증 증가, 및 다식증 또는 허기 증가를 포함한다. 당뇨병은 제1형, 제2형, 임신성 당뇨병, 및 다른 특별한 유형의 당뇨병의 2가지 카테고리로 분류될 수 있다. 제1형 당뇨병은 인슐린 결핍을 초래하는, 췌장의 랑게한스섬의 인슐린-생산 베타 세포의 손실을 특징으로 한다. 제2형 당뇨병은 감소된 인슐린 분비와 조합될 수 있는, 인슐린 내성을 특징으로 한다. 임신성 당뇨병은 제2형 당뇨병과 비스하고, 부적절한 인슐린 분비 및 반응성의 조합을 포함한다. 다른 특별한 유형의 당뇨병은 전당뇨병, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병(LADA) 및 선천성 당뇨병을 포함할 수 있다.
암은 고형 종양이거나, 또는 혈액학적 악성종양일 수 있다. 고형 종양은 육종 또는 암종일 수 있다. 육종은 뼈, 연골, 지방 근육, 혈관 또는 조혈 조직의 암일 수 있다. 예시적인 육종은 포상 횡문근육종, 포상 연부 육종, 법랑질아세포종, 혈관육종, 연골육종, 척색종, 연조직의 투명 세포 육종, 탈분화성 지방육종, 유건종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 배아 횡문근육종, 상피양 섬유육종, 상피양 혈관내피종, 상피양 육종, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 신장외 간상소체 종양, 골격외 점액성 연골육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 거대세포 종양, 혈관주위 세포종, 유아 섬유육종, 염증성 근섬유아세포 종양, 카포시 육종, 뼈의 평활근육종, 지방육종, 뼈의 지방육종, 악성 섬유성 조직구종(MFH), 뼈의 악성 섬유성 조직구종(MFH), 악성 간엽세포종, 악성 말초 신경초 종양, 간엽 연골육종, 점액섬유육종, 점액성 지방육종, 점액염증성 섬유아세포 육종, 말초혈관 상피양 세포 분화의 신생물, 골육종, 골곁 골육종, 말초혈관 상피양 세포 분화의 신생물, 골막 골육종, 다형성 지방육종, 다형성 횡문근육종, PNET/골격외 유잉 종양, 횡문근육종, 원형 세포 지방육종, 소세포 골육종, 고립성 섬유 종양, 활액 육종, 모세혈관확장성 골육종을 포함한다.
암종은 상피 세포에서 발생된 암이다. 예시적인 암종은 선암종, 편평세포 암종, 선편평세포 암종, 역형성 암종, 거대 세포 암종, 소세포 암종, 항문암, 충수암, 담관암(즉, 담관암종), 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 불명 원발성 암(CUP), 식도암, 안암, 나팔관암, 위장암, 신장암, 간암, 폐암, 수아세포종, 흑색종, 경구암, 난소암, 췌장암, 부갑상선 질환, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 직장암, 피부암, 위암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 자궁암, 질암, 또는 외음부암을 포함한다.
혈액학적 악성종양은 혈관계의 악성종양이고 T-세포 기반 및 B-세포 기반 악성종양을 포함할 수 있다. 예시적인 혈액학적 악성종양은 골수성 백혈병, 골수증식성 종양형성, 달리 분류되지 않은 말초 T-세포 림프종(PTCL-NOS), 역형성 거대 세포 림프종, 혈관면역아세포성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 아구성 NK-세포 림프종, 장병증형 T-세포 림프종, 간비장성 감마-델타 T-세포 림프종, 림프아구성 림프종, 코 NK/T-세포 림프종, 치료-관련 T-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소형 림프구성 림프종(SLL), 고위험성 CLL, 비CLL/SLL 림프종, 프로림프구성 백혈병(PLL), 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 절외 변연부 B 세포 림프종, 절변연부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고급 B 세포 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종(PMBL), 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, B 세포 프로림프구성 백혈병, 림프구형질세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출성림프종, 또는 림프종양 육아종증을 포함한다.
일례에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 근이영양증, 척수성 근위축증(SMA), 모세혈관확장성운동실조, X-연관 무감마글로불린혈증, 당뇨병, 또는 암을 치료하는데 사용된다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 질환 또는 질병이 단백질의 손상된 생산과 연관된 근이영양증, 척수성 근위축증(SMA), 모세혈관확장성운동실조, X-연관 무감마글로불린혈증, 당뇨병, 또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 질환 또는 질병이 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 근이영양증, 척수성 근위축증(SMA), 모세혈관확장성운동실조, X-연관 무감마글로불린혈증, 당뇨병, 또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
질환은 성숙한 전사물에 전체 인트론의 잔류를 초래하는 돌연변이로 인해 야기된 임의의 유전자 병태일 수 있다. 질환은 당뇨병일 수 있다. 질환은 제I형 당뇨병일 수 있다. 질환은 제II형 당뇨병일 수 있다. 다른 실시형태에서, 질환은 암일 수 있다. 암은 골수성 백혈병 또는 골수증식성 종양형성일 수 있다. 암은 3' 스플라이싱 부위의 인식을 용이하게 하는 임의의 스플라이시오솜 성분에 돌연변이가 지속될 수 있다. 다중핵산 중합체는 잔여 β-세포 활성을 갖는 피험체에서 내생성 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 다중핵산 중합체는 이식된 β-세포를 받은 이들을 포함하여, 다른 당뇨병 환자에서 프로인슐린의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 다중핵산 중합체는 U2 성분을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 함유(예, 골수성 백혈병의 20% 초과)하는 악성 종양의 안티센스 요법으로서 사용될 수 있다.
질환이 당뇨병인 실시형태에서, 인트론 잔류의 발생 감소는 피험체의 태아 발생 동안일 수 있다. 예를 들어, 임산부는 태아에서 인트론 잔류를 감소시키기 위해 다중핵산 중합체를 투여받을 수 있다.
피험체는 진핵생물일 수 있다. 피험체는 포유동물일 수 있다. 피험체는 인간일 수 있다. 피험체는 인간이외의 영장류일 수 있다. 피험체는 영장류 이외의 포유동물, 예컨대 래트, 마우스, 페렛, 개, 고양이 또는 돼지일 수 있다. 피험체는 태아, 예컨대 인간 태아일 수 있다.
방법은 질환 병리가 치료 전 유전자 전사물의 인트론 잔류에 의해 야기된 것인지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 결정 단계는 당업자가 이용할 수 있는 임의의 적합한 검정법 또는 유전자 분석을 사용할 수 있다.
일례에서, 검출은 핵산-기반 기술 예컨대 동소 발생 혼성화 및 RT-PCR을 사용해 핵산 수준에서 수행된다. 서열분석 기술은 차세대 서열분석 기술 예컨대 Helios True 단일 분자 서열분석(tSMS)(Harris T.D. et al.(2008) Science 320:106-109); 454 서열분석(Roche)(Margulies, M. et al. 2005, Nature, 437, 376-380); SOLiD 기술(Applied Biosystems); SOLEXA 서열분석(Illumina); Pacific Biosciences의 단일 분자, 실시간(SMRT™) 기술; 나노포어 서열분석(Soni GV and Meller A.(2007) Clin Chem 53: 1996-2001); 반도체 서열분석(Ion Torrent; Personal Genome Machine); DNA 나노볼 서열분석; Dover Systems의 기술을 사용한 서열분석(Polonator), 및 서열분석 전에 증폭 또는 아니면 천연 DNA 형질전환을 필요로 하지 않는 기술(예, Pacific Biosciences 및 Helicos), 예컨대 나노포어-기반 전략(e.g. Oxford Nanopore, Genia Technologies, and Nabsys)을 포함한다. 서열분석 기술은 또한 Sanger 서열분석, Maxam-Gilbert 서열분석, 샷건 서열분석, 브릿지 PCR, 질량 분광법 기반 서열분석, 미세유체 기반 Sanger 서열분석, 현미경-기반 서열분석, RNAP 서열분석, 또는 혼성화 기반 서열분석을 포함한다.
관심 유전자 전사물의 서열분석은 증폭 단계를 또한 포함할 수 있다. 예시적인 증폭 방법론은 제한없이, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 자가-지속 서열 복제(3SR), 루프 매개 등열 증폭(LAMP), 가닥 치환 증폭(SDA), 전체 게놈 증폭, 다중 치환 증폭, 가닥 치환 증폭, 헬리카제 의존적 증폭, 니킹 효소 증폭 반응, 재조합 중합효소 증폭, 역전사 PCR, 결찰 매개 PCR, 또는 메틸화 특이적 PCR을 포함한다.
핵산 서열을 얻는데 사용할 수 있는 추가 방법은 예를 들어, 전체 게놈 RNA 발현 어레이, 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA), 게놈 서열분석, 신규 서열분석, Pacific Biosciences SMRT 서열분석, 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 질량 분광법, 탠덤 질량 분광법, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광법(MALDI-TOF MS), 동소발생 혼성화, 형광발광 동소발생 혼성화(FISH), 발색 동소발생 혼성화(CISH), 은 동소발생 혼성화(SISH), 디지탈 PCR(dPCR), 역전사 PCR, 정량적 PCR(Q-PCR), 단일 마커 qPCR, 실시간 PCR, nCounter 분석(Nanostring technology), 웨스턴 블롯팅, 서던 블롯팅, SDS-PAGE, 겔 전기영동, 및 노던 블로팅을 포함한다.
일부 경우에서, 검출은 단백질 수준에서, 예를 들어, 면역침전 기반 검정법, 예컨대 웨스턴 블롯, 또는 ELISA를 사용해 수행할 수 있다. 추가적으로, 전기영동 및 질량 분광 분석법과 같은 방법을 관심 단백질의 검출에 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA의 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 경우에 따라 상기 영역은 서열번호 46과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 상기 영역은 서열번호 46과 적어도 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 상기 영역은 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 경우에 따라 상기 영역은 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 상기 영역은 서열번호 3과 적어도 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 제공하고, 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하며, 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
세포는 시험관 내에 있을 수 있다. 세포는 생체외일 수 있다. 세포는 진핵생물 세포이거나 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 인간; 인간이외의 영장류; 또는 영장류 이외의 포유동물 예컨대 고양이, 래트, 마우스, 개, 페렛, 또는 돼지 유래의 포유동물 세포일 수 있다. 세포는 인간 세포 예컨대 상피 세포, 연결 조직 세포, 호르몬 분비 세포, 신경 세포, 골격 근육 세포, 혈액 세포, 또는 면역계 세포 유래일 수 있다. 세포는 종양 세포 예컨대 고형 종양 세포 또는 혈액학적 악성 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 경우에 따라 서열번호 46과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 제공한다. 상기 영역은 서열번호 46과 적어도 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 경우에 따라 서열번호 3과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 제공한다. 상기 영역은 서열번호 3과 적어도 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 제공하고, 여기서 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체를 제공하고, 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 경우에 따라 다중핵산 중합체 영역은 서열번호 47 내지 434와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 상기 영역은 서열번호 47 내지 434와 적어도 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스의 언급은 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오티드 영역을 의미함을 당업자는 이해할 것이다. 다중핵산 중합체의 적어도 일부분에 대한 안티센스의 언급은 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 영역을 의미함을 이해할 것이다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환될 수 있음을 이해한다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태).
본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체를 제공한다. 우라실 뉴클레오티드가 티민 뉴클레오티드로 치환될 수 있음을 이해한다(예, 이러한 서열의 RNA의 DNA 형태).
다중핵산 중합체는 단리된 다중핵산 중합체일 수 있다. 다중핵산 중합체는 세포에 다중핵산 중합체를 전달하는데 적합한 전달 비히클에 접합되거나, 또는 결합된다. 전달 비히클은 부위 특이적, 조직 특이적 또는 세포 특이적 전달을 할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 세포 특이적 바이러스 입자, 또는 이의 성분이거나, 대안적으로, 전달 비히클은 세포 특이적 항체 입자, 또는 이의 성분일 수 있다. 다중핵산 중합체는 췌장의 베타 세포로 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 흉선 세포로 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 악성 세포로의 전달을 위해 표적화될 수 있다. 다중핵산 중합체는 그의 안정성을 증가시키기 위해 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체가 RNA인 실시형태에서, 다중핵산 중합체는 그의 안정성을 증가시키기 위해 개질될 수 있다. 다중핵산 중합체는 2'-O-메틸 및 2'-O-메톡시에틸 리보스에 의해 개질될 수 있다. 전달을 위해 안정성을 증가시키는데 적합한 RNA에 대한 개질은 당업자에게 자명하다.
다중핵산 중합체는 플라스미드 벡터의 일부분일 수 있다. 다중핵산 중합체는 바이러스 벡터의 일부분일 수 있다. 다중핵산 중합체는 바이러스 벡터 상에서 코딩될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 본 발명의 다중핵산 중합체를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-회합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 악성 세포 또는 특이적 세포 유형으로 다중핵산 중합체를 표적화하는 임의의 바이러스를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 본 발명의 다중핵산 중합체를 포함하거나, 또는 그에 결합된 전달 비히클을 제공한다. 전달 비히클은 세포내 전달 및/또는 안정성 개선을 위해 다중핵산 중합체에 접합되는, 지질-기반 나노입자; 양이온성 세포 투과 펩티드(CPP); 또는 선형 또는 분지형 양이온성 중합체; 또는 생접합체, 예컨대 콜레스테롤, 담즙산, 지질, 펩티드, 중합체, 단백질, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 전달 비히클은 세포 또는 조직 특이적이거나 또는 발생 단계 특이적일 수 있다. 전달 비히클은 항체, 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 항체는 특이적 세포로 다중핵산 중합체의 전달을 위해 관심 세포 상의 세포 표면 마커에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 항체는 참조하여 본원에 편입된 문헌 [Ji Hoon Jeong et al(Journal of Controlled Release 107(2005) 562-570)]에 따라서 섬 베타 세포에 표적화된 비바이러스 다중핵산 중합체 전달을 위한 항-GAD 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-GAD 항체는 PEG 링커를 통해 PEI에 항-GAD Fab' 단편을 접합시킨다(PEI-PEG-Fab'). 다른 특이적 항체는 다중핵산 중합체의 표적화 조직 전달을 위한 그러한 접합에서 사용될 수 있다.
약학 조성물/제제, 투약, 및 치료 계획
본 발명의 일 측면에 따라서, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물에서 인트론의 스플라이싱에 의한 제거의 증가를 유도하는 치료제를 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계로서, 상기 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 카피들을 코딩하고, 각각 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 번역을 억제하는 적어도 하나의 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀을 갖는 것인 단계; 및 피험체의 표적 세포를 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분이 그 부분의 각각의 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하도록 유도시켜, 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하게 하는 치료제와 접촉시키는 단계로서, 상기 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물은 번역되어 질환 또는 병태를 치료하는, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 카피들을 발현하는 것인 단계를 포함하는 단백질의 기능적 형태의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료를 위한 치료제를 제공한다.
치료제는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분에서 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 각각으로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하도록 세포 내 1 이상의 스플라이싱 단백질 복합체의 활성화를 야기할 수 있다. 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 억제할 수 있다. 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 활성화시킬 수 있다. 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질과 상호작용하거나 또는 결합한다. 치료제는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 상호작용하거나 또는 결합한다. 일부 실시형태에서 치료제는 다중핵산 중합체, 예컨대 본원에 기술된 다중핵산 중합체이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 소형 분자이다.
소형 분자는 900 달톤 미만의 분자이고, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분에서 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 각각으로부터 적어도 하나의 잔류된 인트론을 제거하도록 세포에서 1 이상의 스플라이싱 단백질 복합체를 개시시킬 수 있다. 소형 분자는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 억제할 수 있다. 소형 분자는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 활성화시킬 수 있다. 소형 분자는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질과 상호작용하거나 또는 결합하거나, 또는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 상호작용하거나 또는 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 본 발명의 다중핵산 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 조성물일 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 추가 활성제, 예컨대 약물 또는 프로드러그를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상이한 다중핵산 중합체, 예컨대 SSO의 조합을 요법을 위해 포함할 수 있다.
상기 조성물은 다중핵산 중합체뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 생물학적으로 활성인 분자를 포함할 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자는 약물이거나 또는 프로드러그일 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자는 핵산 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자는 소형 분자(예, < 900 달톤의 분자)를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함할 수 있고, 여기서 표적 서열은 2개의 G 사중체 사이에 있으며, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은 또한 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물이 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하고, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화하며, 상기 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제1 CCC 모티프를 포함하고, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 약학 조성물은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하고, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않으며, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클을 더 포함할 수 있고, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 결합 모티프는 헤어핀 구조를 형성하며, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있다.
본원에 기술된 약학 제제는 제한없이, 비경구(예, 정맥내, 피하, 근육내), 경구, 비내, 구강, 국소, 직장 또는 경피 투여 경로를 포함한, 다수 투여 경로에 의해 피험체에게 투여될 수 있다. 일례에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 비경구(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여를 위해 제제화된다. 다른 예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 경구 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 비내 투여를 위해 제제화된다.
본원에 기술된 약학 제제는 제한없이, 수성 액상 분산물, 자가 유화 분산물, 고형 용액, 리포솜 분산물, 에어로졸, 고체 제형, 분말, 즉시 방출 제제, 제어 방출 제제, 신속 용융 제제, 정제, 캡슐, 알약, 지연 방출 제제, 연장 방출 제제, 박동식 방출 제제, 복수미립자 제제, 및 혼합 즉시 및 제어 방출 제제를 포함할 수 있다.
약학 제제는 약학에서 임의의 통용되는 부형제를 포함할 수 있고 본원에 개시된 조성물과의 상용성, 및 바람직한 제형의 방출 프로파일을 기반으로 선택되어야 하는 담체 또는 담체 물질을 포함할 수 있다. 예시적인 담체 물질은 예를 들어, 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. 약학적으로 상용성인 담체 물질은 제한없이, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 나트륨 카세이네이트, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로스 및 셀룰로스 접합체, 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세리드, 디글리세리드, 호화 전분 등을 포함한다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed.(Lippincott Williams & Wilkins1999).
약학 제제는 블렌드 방법 또는 과립화 방법 또는 액체 매질을 통해 약물의 분산 및 균질화를 제어하는 물질을 포함할 수 있는 점성 조절제, 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 작용제는 또한 코팅 또는 침식 매트릭스의 효율을 가능하게 한다. 예시적인 분산 촉진제/분산제는 예를 들어, 친수성 중합체, 전해질, Tween® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈(PVP; Plasdone®으로 시판됨), 및 탄수화물-기반 분산제 예컨대, 예를 들어, 히드록시프로필 셀룰로스(예, HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 히드록시프로필 메틸셀룰로스(예, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M, 및 HPMC K100M), 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 비정질 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알콜(PVA), 비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체(S630), 산화에틸렌 및 포름알데히드와 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 중합체(틸록사폴이라고 알려짐), 폴록사머(예, 산화에틸렌 및 산화프로필렌의 블록 공중합체인 Pluronics F68®, F88®, 및 F108®); 및 폴록사민(예, 에틸렌디아민에 산화프로필렌 및 산화에틸렌의 후속 부가로 유도된 4기능성 블록 공중합체이며, Poloxamine 908®로도 알려진, Tetronic 908®(BASF Corporation, Parsippany, N.J.)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체(S-630), 폴리에틸렌 글리콜로서, 예를 들어, 분자량이 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400인 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리솔베이트-80, 나트륨 알기네이트, 검, 예컨대, 예를 들어, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아르 검, 잔탄검을 포함한, 잔탄, 당류, 셀룰로식, 예컨대, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리솔베이트-80, 나트륨 알기네이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카보머, 폴리비닐 알콜(PVA), 알기네이트, 키토산 및 이의 조합을 포함한다. 가소제 예컨대 셀룰로스 또는 트리에틸 셀룰로스가 또한 분산제로서 사용될 수 있다. 리포솜 분산물 및 자가-유화 분산물에서 특이 유용한 분산제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 계란 유래 천연 포스파티딜 콜린, 계란 유래 천연 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트를 포함한다.
약학 제제는 산 예컨대 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기 예컨대 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨 및 트리스-히드록시메틸아미노메탄을 포함하는 pH 조정제 또는 완충제; 및 완충제 예컨대 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함할 수 있다. 그러한 산, 염기 및 완충제는 허용되는 범위로 조성물의 pH를 유지하는데 필요한 양으로 포함된다.
약학 제제는 또한 조성물의 삼투질 농도를 허용되는 범위가 되게 하는데 필요한 양으로 1 이상의 염을 포함할 수 있다. 그러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 바이카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 바이설파이트 음이온을 갖는 것을 포함하고, 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 아황산나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
약학 제제는 보다 안정한 환경을 제공할 수 있기 때문에 화합물을 안정화시키는데 또한 사용될 수 있는 희석제를 더 포함할 수 있다. 완충된 용액에 용해된 염(또한 pH 제어 또는 유지를 제공할 수 있음)이 당분야의 희석제로서 이용될 수 있고, 제한없이, 인산염 완충 염수 용액을 포함한다. 일정 예에서, 희석제는 압착을 촉진하거나 또는 캡슐 충전용 균질한 블렌드를 위한 충분한 부피를 생성시키도록 조성물의 부피를 증가시킨다. 이러한 화합물은 예를 들어, 락토스, 전분, 만니톨, 솔비톨, 덱스트로스, 미세결정질 셀룰로스 예컨대 Avicel®; 2염기성 인산칼슘, 인산이칼슘 2수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토스, 분무-건조 락토스; 호화 전분, 압착당, 예컨대 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 수크로스-기반 희석제, 당과용 당; 1염기성 황산칼슘 1수화물, 황산칼슘 2수화물; 락트산칼슘 3수화물, 덱스트레이트; 가수분해 시리얼 고체, 아밀로스; 분말화 셀룰로스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
약학 제제는 물질의 분해 또는 붕해를 촉진하기 위한 붕해제 또는 붕해물을 포함할 수 있다. 용어 "붕해"는 위장액과 접촉시 제형의 용해 및 분산 둘 모두를 포함할 수 있다. 붕해제의 예에는 전분, 예를 들어, 천연 전분 예컨대 옥수수 전분 또는 감자 전분, 호화 전분 예컨대 National 1551 또는 Amijel®, 또는 나트륨 전분 글리콜레이트 예컨대 Promogel® 또는 Explotab®, 셀룰로스 예컨대 나무 생성물, 메틸결정질 셀룰로스, 예를 들어, Avicel®, Avicel® PH101, Avicel® PH102, Avicel® PH105, Elcema® P100, Emcocel®, Vivacel®, Ming Tia®, 및 Solka-Floc®, 메틸셀룰로스, 크로사멜로스, 또는 가교 셀룰로스, 예컨대 가교 나트륨 카복시메틸셀룰로스(Ac-Di-Sol®), 가교 카복시메틸셀룰로스, 또는 가교 크로사멜로스, 가교 전분 예컨대 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교 중합체 예컨대 크로스포비돈, 가교 폴리비닐피롤리돈, 알기네이트 예컨대 알긴산 또는 알긴산의 염 예컨대 나트륨 알기네이트, 클레이 예컨대 Veegum® HV(마그네슘 알루미늄 실리케이트), 검 예컨대 한천, 구아르, 로커스트 빈, 카라야, 펙틴, 또는 트라가칸트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 벤토나이트, 천연 스폰지, 계면활성제, 수지 예컨대 양이온-교환 수지, 시트러스 펄프, 나트륨 라우릴 설페이트, 전분과 조합된 나트륨 라우릴 설페이트 등이 포함된다.
약학 제제는 충전제, 예컨대 락토스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 2염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 전분, 호화 전분, 수크로스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
약학 제제는 풍미제 및/또는 감미제, 예컨대 예를 들어, 아카시아 시럽, 아세설팜 K, 알리탐, 아니스, 사과, 아스파탐, 바나나, 바바리안 크림, 베리, 블랙 커런트, 버터스카치, 칼슘 시트레이트, 캠포, 카라멜, 체리, 체리 크림, 초콜렛, 시나몬, 버블 검, 시트러스, 시트러스 펀치, 시트러스 크림, 솜사탕, 코코아, 콜라, 쿨 체리, 쿨 시트러스, 시클라메이트, 실라메이트, 덱스트로스, 유칼립투스, 유제놀, 프룩토스, 프룻 펀치, 생강, 글리시레티네이트, 글리시리자(감초) 시럽, 포도, 자몽, 꿀, 이소말트, 레몬, 라임, 레몬 크림, 모 노암모늄 글리시지네이트(MagnaSweet®), 말톨, 만니톨, 메이플, 마시멜로우, 멘톨, 민트 크림, 혼합 베리, 네오헤스페리딘 DC, 네오탐, 오렌지, 배, 복숭아, 페퍼민트, 페퍼민트 크림, Prosweet® 분말, 라스베리, 루트 비어, 럼, 사카린, 사프롤, 솔비톨, 스피어민트, 스피어민트 크림, 딸기, 딸기 크림, 스테비아, 수크라로스, 수크로스, 나트륨 사카린, 사카린, 아스파탐, 아세설팜 칼륨, 만니톨,탈린, 시리톨, 수크라로스, 솔비톨, 스위스 크림, 타가토스, 탠저린, 타우마틴, 투티 프루티, 바닐라, 월넛, 수박, 야생 체리, 윈터그린, 자일리톨, 또는 이들 풍미 성분의 임의 조합, 예를 들어, 아니스-멘톨, 체리-아니스, 시나몬-오렌지, 체리-시나몬, 초콜렛-민트, 꿀-레몬, 레몬-라임, 레몬-민트, 멘톨-유칼립투스, 오렌지-크림, 바닐라-민트, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
윤활제 및 활택제가 물질의 마찰 또는 부착을 방지, 감소 또는 억제할 수 있도록 본원에 기술된 약학 제제에 포함될 수 있다. 예시적인 윤활제는 예를 들어, 스테아르산, 수산화칼슘, 탈크, 나트륨 스테아릴 푸머레이트, 탄화수소 예컨대 미네랄유, 또는 수소화 식물성유, 예컨대 수소화 대두유(Sterotex®), 고급 지방산 및 그들의 알칼리 금속 및 알칼리토 금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤, 탈크, 왁스, Stearowet®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 루신, 폴리에틸렌 글리콜(예, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 예컨대 Carbowax™, 나트륨 올레에이트, 벤조산나트륨, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 설페이트, 콜로이드성 실리카 예컨대 Syloid™, Cab-O-Sil®, 전분 예컨대 옥수수 전분, 실리콘유, 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
가소제는 덜 취성으로 만들기 위해 필름 코팅제 또는 미세캡슐화 재료를 연화시키는데 사용되는 화합물이다. 적합한 가소제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로스 및 트리아세틴을 포함한다. 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.
가용화제는 화합물 예컨대 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세타미드, N-메틸피롤리돈, N-히드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 시클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알콜, 콜레스테롤, 담즙염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코푸롤, 트랜스쿠톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소솔비드 등을 포함할 수 있다.
안정화제는 화합물 예컨대 항산화제, 완충제, 산, 보존제 등을 포함할 수 있다.
현탁제는 화합물 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 분자량이 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400인 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 폴리솔베이트-80, 히드록시에틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 검, 예컨대, 예, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아르 검, 잔탄 검을 포함한, 잔탄, 당류, 셀룰로식, 예컨대, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리솔베이트-80, 나트륨 알기네이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 포비돈 등을 포함할 수 있다.
계면활성제는 화합물 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 솔비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 산화에틸렌 및 산화프로필렌의 공중합체, 예를 들어 Pluronic®(BASF) 등을 포함할 수 있다. 추가 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 수소화 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥토시놀 10, 옥토시놀 40을 포함한다. 때대로, 계면활성제는 물리적 안정성을 향상시키거나 또는 다른 목적으로 포함될 수 있다.
점성 강화제는 예를 들어, 메틸 셀룰로스, 잔탄 검, 카복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 카보머, 폴리비닐 알콜, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
습윤제는 화합물 예컨대 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 솔비탄 모노올레에이트, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트, 나트륨 도쿠세이트, 나트륨 올레에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 트리아세틴, Tween 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등을 포함할 수 있다.
주사용 제제
근육내, 피하, 또는 정맥내 주사에 적합한 제제는 생리적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산물, 현탁물 또는 에멀션, 및 멸균 주사용 용액 또는 분 산물로 재구성을 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매, 또는 비히클의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌-글리콜, 글리세롤, 크레모포 등), 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅재 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우, 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 피하 주사에 적합한 제제는 또한 첨가제 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 성장의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산 등에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 약학 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의할 수 있다.
정맥내 주사를 위해서, 본원에 기술된 화합물은 수용액, 바람직하게 생리적으로 상용성인 완충제 예컨대 행크액, 링거액 또는 생리적 염수 완충액에 제제화될 수 있다. 경점막 투여를 위해서, 투과되는 장벽에 적합한 투과제가 제제에 사용된다. 그러한 투과제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 다른 비경구 주사를 위해, 적절한 제제는 바람직하게 생리적 상용성 완충제 또는 부형제와 함께 수성 또는 비수성 용액을 포함할 수 있다. 그러한 부형제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있다.
비경구 주사는 볼러스 주사 또는 연속 주입을 포함할 수 있다. 주사용 제제는 단위 제형, 예를 들어 보존제가 부가된, 앰풀 또는 다중용량 용기로 존재할 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 멸균 현탁물, 용액 또는 에멀션으로서 비경구 주사용으로 적합한 형태로 존재하고, 제제화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 부가적으로, 활성 화합물의 현탁물은 적절한 유성 주사 현탁물로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일 예컨대 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁물은 현탁물의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 현탁물은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 가용성을 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열원 무함유 물과 구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.
경구 제제
경구 사용을 위한 약학 조제물은 1 이상의 고형 부형제를 본원에 기술된 화합물 중 1 이상과 혼합하고, 경우에 따라 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 바람직하다면, 정제 또는 당의정을 얻기 위해 적합한 보조제를 부가하기 전에 과립 혼합물을 프로세싱하여 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 솔비톨을 포함한, 당; 셀룰로스 조제물 예컨대, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스; 또는 다른 것들 예컨대: 폴리비닐피롤리돈(PVP 또는 포비돈) 또는 인산칼슘을 포함할 수 있다. 바람직하다면, 붕해제는 예컨대 가교 크로사멜로스 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염 예컨대 나트륨 알기네이트가 부가될 수 있다.
당의정은 적합한 코팅재가 제공될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 농축된 당용액이 사용되는데, 경우에 따라 검 아라빅, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 염료 또는 안료가 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 특징으로 하거나 또는 식별을 위해 정제 또는 당의정 코팅에 부가될 수 있다.
고체 제형은 정제(현탁 정제, 급속-용융 정제, 바이트-붕해 정제, 신속-붕해 정제, 발포 정제, 또는 캐플렛 포함), 알약, 분말(멸균 포장 분말, 분배용 분말, 발포성 분말), 캡슐(연질 또는 경질 캡슐, 예를 들어 동물 유래 젤라틴 또는 식물 유래 HPMC,또는 "스프링클 캡슐" 포함), 고형 분산물, 고형 액체, 생침식성 제형, 제어 방출 제제, 박동성 방출 제형, 다중미립자 제형, 펠렛, 과립, 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 다른 예에서, 약학 제제는 분말 형태이다. 여전히 다른 예에서, 약학 제제는 제한없이, 급속-용융 정제를 포함한, 정제 형태이다. 부가적으로, 본원에 기술된 약학 제제는 단일 캡슐로서 또는 다중 캡슐 제형으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 약학 제제는 2, 또는 3, 또는 4개 캡슐 또는 정제로 투여된다.
약학 고체 제형은 본원에 기술된 조성물 및 1 이상의 약학적으로 허용되는 첨가제 예컨대 상용성 담체, 결합제, 충전제, 현탁제, 향미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 가용화제, 보습제, 가소제, 안정화제, 침투 강화제, 흡윤제, 소포제, 항산화제, 보존제, 또는 1 이상의 이의 조합을 포함한다. 여전히 다른 측면에서, 표준 코팅 과정, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition(2000)]에 기술된 것을 사용한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 담체는 제한없이, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 락트산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 나트륨 카세이네이트, 콩 레시틴, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세리드, 디글리세리드, 호화 전분, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 수크로스, 미세결정질 셀룰로스, 락토스, 만니톨 등을 포함할 수 있다.
고체 제형에 사용하기 적합한 충전제는 제한없이, 락토스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 2염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 호화 전분, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 수크로스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
결합제는 고체 경구 제형 제제에 응집성을 부여하며, 분말 충전 캡슐 제형의 경우, 연질 또는 경질 껍질 캡슐에 충전할 수 있는 플러그 형성을 보조하며 정제 제형의 경우, 압착 후 정제가 온전하게 남도록 하고 압착 또는 충전 단계 전에 블렌드 균일성을 확보하도록 돕는다. 본원에 기술된 고체 제형에서 결합제로 사용하기 적합한 물질은 제한없이, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스(예, Methocel®), 히드록시프로필메틸셀룰로스(예, 히프로멜로스 USP Pharmacoat-603, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트(Aqoate HS-LF 및 HS), 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스(예, Klucel®), 에틸셀룰로스(예, Ethocel®), 및 미세결정질 셀룰로스(예, Avicel®), 미세결정질 덱스트로스, 아밀로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 다당류 산, 벤토나이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체, 크로스포비돈, 포비돈, 전분, 호화 전분, 트라가칸트, 덱스트린, 당, 예컨대 수크로스(예, Dipac®), 포도당, 덱스트로스, 당밀, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨(예, Xylitab®), 락토스, 천연 또는 합성 검 예컨대 아카시아, 트라가칸트, 가티 검, 이사폴 허스크의 점질물, 전분, 폴리비닐피롤리돈(예, Povidon® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10, 및 Povidon® K-12), 라치 아라보갈락탄, Veegum®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 나트륨 알기네이트 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 윤활제 또는 활택제는 제한없이, 스테아르산, 수산화칼슘, 탈크, 옥수수 전분, 나트륨 스테아릴 푸머레이트, 알칼리 금속 및 알칼리토 금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 왁스, Stearowet®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 루신, 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 예컨대 Carbowax™, PEG 4000, PEG 5000, PEG 6000, 프로필렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 벤조에이트, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 설페이트 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 희석제는 제한없이, 당(락토스, 수크로스, 및 덱스트로스 포함), 다당류(덱스트레이트 및 말토덱스트린 포함), 폴리올(만니톨, 자일리톨, 및 솔비톨 포함), 시클로덱스트린 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 습윤제는 예를 들어, 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 솔비탄 모노올레에이트, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트, 4차 암모늄 화합물(예, Polyquat 10®), 나트륨 올레에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 도쿠세이트, 트리아세틴, 비타민 E TPGS 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 계면활성제는 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 솔비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 산화에틸렌과 산화프로필렌의 공중합체, 예를 들어, Pluronic®(BASF) 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 현탁제는 제한없이, 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 분자량이 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400인 폴리에틸렌 글리콜, 비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체(S630), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시-프로필메틸셀룰로스, 폴리솔베이트-80, 히드록시에틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 검, 예컨대, 예를 들어, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아르 검, 잔탄 검을 포함한, 잔탄, 당, 셀룰로식, 예컨대, 예, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리솔베이트-80, 나트륨 알기네이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 폴리에톡시화 솔비탄 모노라우레이트, 포비돈 등을 포함한다.
고체 제형에 사용하기 적합한 항산화제는 예를 들어, 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 나트륨 아스코베이트, 및 토코페롤을 포함한다.
경구 투여를 위한 액체 제제 제형은 제한없이, 약학적으로 허용되는 수성 경구 분산물, 에멀션, 용액, 엘릭시르, 겔, 및 시럽을 포함하는 군에서 선택된 수성 현탁물일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Singh et al., Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 2nd Ed., pp. 754-757(2002)]을 참조한다. 또한 액체 제형은 첨가제, 예컨대:(a) 붕해제;(b) 분산제;(c) 습윤제;(d) 적어도 하나의 보존제,(e) 점도 증강제,(f) 적어도 하나의 감미제, 및 (g) 적어도 하나의 향미제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 수성 분산물을 결정질 억제제를 더 포함할 수 있다.
본원에 기술된 수성 현탁물 및 분산물은 적어도 4시간 동안, 미국 약전(2005판, 905장)에 정의된 바와 같이, 균질한 상태로 남아 있을 수 있다. 균질성은 전체 조성물의 균질성을 결정하는것에 관해 일관적인 샘플링 방법에 의해 결정해야 한다. 일 실시형태에서, 수성 현탁물은 1분 미만으로 물리적 교반을 지속하여 균질한 현탁물로 재현탁될 수 있다. 다른 측면에서, 수성 현탁물은 45초 미만으로 물리적 교반을 지속하여 균질한 현탁물로 재현탁될 수 있다. 또 다른 측면에서, 수성 현탁물은 30초 미만으로 물리적 교반을 지속하여 균질한 현탁물로 재현탁될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 균질한 수성 분산물을 유지하는데 교반이 필수적이지 않다.
다른 측면에서, 제형은 미세캡슐화된 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1 이상의 다른 상용성 물질이 미세캡슐 물질에 존재한다. 예시적인 물질은 제한없이, pH 개질제, 침식 촉진제, 소포제, 항산화제, 향미제, 및 담체 물질 예컨대 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 및 희석제를 포함한다.
본원에 기술된 화합물을 포함하는 제제의 방출을 지연시키는데 유용한 예시적인 미세캡슐 물질은 제한없이, 히드록시프로필 셀룰로스 에테르(HPC) 예컨대 Klucel® 또는 Nisso HPC, 저치환된 히드록시프로필 셀룰로스 에테르(L-HPC), 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 에테르(HPMC) 예컨대 Seppifilm-LC, Pharmacoat®, Metolose SR, Methocel®-E, Opadry YS, PrimaFlo, Benecel MP824, 및 Benecel MP843, 메틸셀룰로스 중합체 예컨대 Methocel®-A, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트 Aqoat(HF-LS, HF-LG,HF-MS) 및 Metolose®, 에틸셀룰로스(EC) 및 이의 혼합물 예컨대 E461, Ethocel®, Aqualon®-EC, Surelease®, 폴리비닐 알콜(PVA) 예컨대 Opadry AMB, 히드록시에틸셀룰로스 예컨대 Natrosol®, 카복시메틸셀룰로스 및 카복시메틸셀룰로스(CMC)의 염 예컨대 Aqualon®-CMC, 폴리비닐 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜 공중합체 예컨대 Kollicoat IR®, 모노글리세리드(Myverol), 트리글리세리드(KLX), 폴리에틸렌 글리콜, 개질 식품 전분, 아크릴산 중합체 및 아크릴산 중합체와 셀룰로스 에테르의 혼합물 예컨대 Eudragit® EPO, Eudragit® L30D-55, Eudragit® FS 30D Eudragit® L100-55, Eudragit® L100, Eudragit® S100, Eudragit® RD100, Eudragit® E100, Eudragit® L12.5, Eudragit® S12.5, Eudragit® NE30D, 및 Eudragit® NE 40D, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 세피필름 예컨대 HPMC 및 스테아르산의 혼합물, 시클로덱스트린, 및 이들 물질의 혼합물을 포함한다.
가소제는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800을 포함할 수 있고, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 및 트리아세틴이 미세캡슐화 물질에 도입된다. 다른 실시형태에서, 약학 조성물의 방출을 지연시키는데 유용한 미세캡슐화 물질은 USP 또는 국민의약품집(NF)에 의한다. 또 다른 실시형태에서, 미세캡슐화 물질은 Klucel이다. 또 다른 실시형태에서 미세캡슐화 물질은 methocel이다.
미세캡슐화된 조성물은 당업자에게 공지된 방법으로 제제화할 수 있다. 이러한 공지 방법은 예를 들어, 분무 건조 방법, 스피닝 디스크-용매 방법, 열간 용융 방법, 분무 냉각 방법, 유동층, 정전기 증착, 원심분리 압출, 회전식 현탁 분리, 기체-가스 또는 고체-가스 계면 중합, 압력 압출, 또는 분무 용매 추출조를 포함한다. 이들 이외에도, 몇몇 화학 기술, 예를 들어, 복합 코아세르베이션, 용매 증발, 중합체-중합체 비상용성, 액상 매질에서 계면 중합, 동소발생 중합, 액상 건조, 및 액체 매질 중 탈용매화가 또한 사용될 수 있다. 또한, 다른 방법들, 예컨대 롤러 압밀, 압출/회전타원체화, 코아세르베이션, 또는 나노입자 코팅이 또한 사용될 수 있다.
비내 제제
비내 제제는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제4,476,116호 및 제6,391,452호에 기술되어 있다. 당분야에 잘 알려진 다른 기술들 및 상기 기술된 바에 따라 제조된, 본원에 기술된 조성물을 포함하는 제제는 벤질 알콜 또는 당분야에 공지된 다른 적합한 보존제, 플루오로탄소, 및/또는 다른 가용화제 또는 분산제를 적용하여, 염수 중 용액으로서 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Ansel, H. C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Ed.(1995)]을 참조한다. 바람직하게, 이들 조성물 및 제제는 적합한 무독성의 약학적으로 허용되는 성분으로 제조된다. 이들 성분은 코 제형의 제조 숙련가들에게 공지되어 있고 이들 중 일부는 이 분야의 표준 참조문헌인 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, 2005]에서 확인할 수 있다. 적합한 담체의 선택은 바람직한 코 제형, 예를 들어 용액, 현탁물, 연고, 또는 겔의 정확한 특성에 고도로 의존적이다. 코 제형은 일반적으로 활성 성분뿐만 아니라 대량의 물을 함유한다. 소량의 다른 성분들 예컨대 pH 조정제, 유화제 또는 분산제, 보존제, 계면활성제, 겔화제 또는 완충제 및 다른 안정화제 및 가용화제가 또한 존재할 수 있다. 코 제형은 코 분비물과 등장성이어야 한다.
본원에 기술된 흡입에 의한 투여를 위해서, 에어로졸, 미스트 또는 분말의 형태일 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분무 제시 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 단위 제형은 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예컨대, 단지 예로서, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 카트리지 및 캡슐이 본원에 기술된 화합물의 분말 믹스 및 적합한 분말 베이스 예컨대 락토스 또는 정분을 함유하여 제제화될 수 있다.
치료 계획
조성물은 예를 들어, 차도가 있는 환자에 대한 유지 요법으로서 또는 치료 용도로 투여될 수 있다. 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 조성물은 1일, 날마다, 격일로, 주당 5일, 주당 1회, 2주마다, 월당 2주, 월당 3주, 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 조성물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 2년, 3년, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다.
환자의 상태가 의사 판단으로, 호전되는 경우, 화합물의 투여는 계속적으로 제공될 수 있고, 대안적으로, 투여되는 약물의 용량은 일시적으로 감소되거나 또는 일시적으로 일정 기간 동안 중단(즉, "휴약기")될 수 있다. 휴약기 길이는 단지 예로서, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 또는 365일을 포함하여 2일 내지 1년으로 다양할 수 있다. 휴약기 동안 용량 감소는 단지 예로서, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함하여, 10% 내지 100%일 수 있다.
환자 병태의 호전이 일어나면, 유지 용량이 필요하다면 투여된다. 후속하여, 용량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 증상에 따라서, 호전된 질환, 질병 또는 병태가 유지되는 정도로 감소될 수 있다. 그러나, 환자는 임의의 증상 재발시 장기간 기준으로 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.
그러한 양에 상응하는 소정 작용제의 양은 인자들, 예컨대 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료를 필요로 하는 피험체 또는 숙주의 정체(예, 체중)에 따라서 다양할 수 있지만 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 투여되는 특정 작용제, 투여 경로, 및 치료되는 피험체 또는 숙주를 포함하여, 그 사례 주변의 특정 상황에 따라서 당분야에 공지된 방식으로 일상적으로 결정할 수 있다. 바람직한 용량은 단일 용량으로 존재하거나 또는 동시에(또는 단기간 동안) 또는 적절한 간격, 예를 들어 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위 용량으로, 분배된 용량으로 존재할 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 정밀한 용량의 단일 투여에 적합한 단위 제형일 수 있다. 단위 제형에서, 제제는 1 이상의 화합물의 적절한 분량을 함유하는 단위 용량으로 나뉘어 진다. 단위 제형은 제제의 개별 분량을 함유하는 패키지 형태일 수 있다. 비제한적인 예는 포장된 정제 또는 캡슐, 및 바이알 또는 앰풀 내 분말이다. 수성 현탁 조성물은 단일 용량의 재밀봉 불가한 용기에 포장될 수 있다. 대안적으로, 다수 용량의 재밀봉가능한 용기를 사용할 수 있고, 이 경우에는 조성물에 보존제가 포함되는 것이 전형적이다. 단지 예로서, 비경구 주사용 제제는 제한없이, 추가의 보존제와 함께, 다수 용량 용기, 또는 앰풀을 포함하는, 단위 제형으로 존재할 수 있다.
전술한 범위는 단지 제안적인 것이며, 개별 치료 계획과 관련하여, 변수들이 많으므로, 이들 추천값의 상당한 이탈이 일반적이다. 그러한 용량은 제한없이, 사용되는 화합물이 활성, 치료하려는 질환 또는 병태, 투여 방식, 개별 피험체의 요건, 치료하려는 질환 또는 병태의 중증도, 및 담당의의 판단 등 수많은 변수들에 따라 변경될 수 있다.
이러한 치료 계획의 치효 효율 및 독성은 제한없이, LD50(개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 결정을 포함하여, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 따라 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 간 용량 비율이 치료 지수이고 LD50과 ED50 간 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정법 및 동물 실험에서 얻은 데이터는 인간에서 사용을 위한 용량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물이 용량은 바람직하게 최소 독성의 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 용량은 적용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 그 범위 내에서 다양할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 피험체가 유전자 전사물의 인트론 잔류에 의해 야기된 결함적 단백질 발현으로 유도된 질환을 갖는지 여부를 결정하는 단계로서, 상기 피험체는 양성 확인 시 치료에 선택되는 것인 단계, 및 경우에 따라 피험체를 치료하는 단계를 포함하는, 치료를 위해 피험체를 선별하는 방법을 제공한다.
치료는 유전자 전사물의 인트론 잔류의 교정 단계를 포함할 수 있다. 치료는 유전자 전사물로부터 인트론 제거를 유도하기 위해 유전자 전사물과 본 발명에 따른 다중핵산 중합체를 혼성화시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 암 세포에서 인트론 잔류의 교정에 의해 유전자 발현을 정상화시키기 위한 안티센스 다중핵산 중합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 다중핵산 중합체, 본 발명에 따른 조성물, 본 발명에 따른 벡터, 또는 본 발명에 따른 전달 비히클을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 다중핵산 중합체, 본 발명에 따른 조성물, 본 발명에 따른 벡터, 또는 본 발명에 따른 전달 비히클을 제공한다.
질환은 당뇨병 또는 암일 수 있다.
다중핵산 중합체 서열을 참조하여, 당업자는 1 이상의 치환이 내성일 수 있고, 경우에 따라 2개 치환이 서열에서 내성일 수 있어서, 표적 서열과 혼성화하는 능력이 유지되거나, 또는 치환이 표적 서열에 있는 경우, 표적 서열로서 인식하는 능력이 유지될 수 있음을 이해한다. 서열 동일성에 대한 참조는 표준/디폴트 변수를 사용하는 BLAST 서열 정렬(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열은 99% 동일성을 가지며 본 발명에 따라 여전히 기능할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열은 98% 동일성을 가지고 본 발명에 따라 여전히 기능할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열은 95% 동일성을 가지고 본 발명에 따라 여전히 기능할 수 있다.
인트론 잔류를 감소시키거나 또는 교정하는데 있어서, 감소는 완전하거나, 예를 들어 100%이거나, 또는 부분적일 수 있다. 감소는 임상적으로 유의할 수 있다. 감소/교정은 치료하지 않은 피험체에서 인트론 잔류 수준에 비하거나, 또는 유사한 피험체의 개체군에서 인트론 잔류량에 비한 것일 수 있다. 감소/교정은 평균 피험체, 또는 치료전 피험체에 비해 적어도 10% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 20% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 40% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 50% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 60% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 80% 미만의 인트론 잔류일 수 있다. 감소는 평균 피험체, 또는 치료 전 피험체에 비해 적어도 90% 미만의 인트론 잔류일 수 있다.
키트/제조 물품
키트 및 제조 물품이 본원에 기술된 1 이상의 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 키트는 본원에 기술된 다중핵산 중합체의 1 이상을 함유할 수 있고, 예컨대 다중핵산 중합체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43, 또는 서열번호 44로서 식별된다. 키트는 또한 본원에 기술된 다중핵산 중합체, 예컨대 예를 들어 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45, 서열번호 46, 또는 서열번호 47-434에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체의 1 이상을 함유할 수 있다. 키트는 다중핵산 중합체의 구성 및 전달에 필수적인 완충제, 및 시약을 더 함유할 수 있다.
키트는 또한 캐리어, 패키지, 또는 1 이상의 용기, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획된 용기를 포함할 수 있고, 각각의 용기(들)은 본원에 기술된 방법에서 사용되는, 개별 성분들, 예컨대 다중핵산 중합체 및 시약 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조 물품은 포장된 물질을 함유한다. 약학적으로 포장된 물질의 예에는 제한없이, 선택된 제제 및 의도하는 투여 방식 및 치료에 적합한 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 임의의 포장 물질을 포함할 수 있다.
키트는 전형적으로 내용물 및/또는 사용 설명이 열거된 라벨, 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함한다. 설명서 세트가 또한 전형적으로 포함될 수 있다.
당업자는 본 발명의 일 실시형태 또는 측면의 선택적 특징들이 적절한 경우에, 본 발명의 다른 실시형태 또는 측면들에 적용될 수 있음을 이해한다.
본 발명의 실시형태를, 단지 예로서, 첨부된 도면을 참조하여, 보다 구체적으로 이제 설명한다.
실시예
이들 실시예는 오직 예시적인 목적으로 제공되며 본원에 제공된 청구항의 범주를 한정하려는 것이 아니다.
실시예 1
대부분의 진핵생물 유전자는 단백질을 코딩할 수 있는 기능적 mRNA를 생성하기 위해 1차 전사물로부터 정확하게 제거되어야 하는 개재 서열 또는 인트론을 함유한다(1). 이러한 과정은 프리-mRNA의 보존적이지만 축퇴성인 서열을 갖는 다수의 단백질과 5종의 소형 핵 RNA의 상호독립적인 상호작용을 채택하여, 고도로 역동적인 방식으로 mRNP 조성을 변형시킨다(2). 인트론 스플라이싱은 대체로 종에 걸쳐 단백질 발현 및 mRNA 축적을 촉진한다(3-5). 이러한 과정은 전사, mRNA 수출 및 번역을 포함한, 커플링된 유전자 발현 경로를 역시 손상시킬 수 있는 인트론 돌연변이 또는 변이에 의해 변경될 수 있다. 인트론 잔류를 변형시키는 천연 변이체 또는 돌연변이가 상류 오픈 리딩 프레임(uORF) 또는 다른 조절 모티프로 전사물의 상대적 풍부함을 변경시키고 번역에 극적으로 영향을 미치는 5' 비번역 영역(5'UTR)내 인트론의 최고의 예이다(6,7). 그러나, 이러한 상황에서 유전자 발현을 정상화시키는 성공적인 서열-특이적 전략은 개발되지 않았다.
스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)는 스플라이싱-부위 인식 또는 조절 서열에 결합하여 그들 표적에 대해 시스-작용성 및 트랜스-작용성 인자들과 경쟁하여 인트론 스플라이싱을 조정하는 안티센스 시약이다(8). 그들은 비정상적 스플라이싱을 복원하거나, 존재하는 mRNA의 상대적 발현을 변형시키거나 또는 정상적으로 발현되지 않는 신규 스플라이싱 변이체를 생산하는 것으로 확인되었다(8). 수많은 SSO 개질, 예컨대 2'-O-메틸 및 2'-O-메톡시에틸 리보스에 의한 표적화된 SSO-RNA 이중체의 개선된 안정성은 근이영양증의 DMD(9,10), 척수성 근위축증의 SMN2(11), 모세혈관확장성운동실조의 ATM(12) 및 X-연관 무감마글로불린혈증의 BTK(13)를 포함한 증가되는 수의 인간 질환 유전자에 대한 그들의 치료적 잠재력을 이용하는 연구들을 촉진시켰다. 이러한 접근법이 제한된 수의 질환에 대한 그들의 임상적 잠재력을 획득하는데 근접하지만(8), 돌연변이-유도된 비정상적 스플라이싱(14) 및 증가되는 수의 복합 특성으로 인해 > 300종 멘델 유전질병이 유전자 발현의 SSO-매개 교정이 가능할 수 있다.
제1형 당뇨병의 병인은 인간 백혈병 항원(HLA)에 의해 부여된 강력한 유전적 성분 및 수많은 개질된 비HLA 유전자좌를 갖는다(15). 최고로 강력한 개질자는 염색체 11 상의 프로인슐린 유전자(INS) 영역에서 동정되었다(IDDM2라고 함)(15). 이 영역의 추가 맵핑은 발병에서 이 자가항원의 핵심적인 역할과 일관되게(17) INS가 가장 가능성 있는 IDDM2 표적임을 시사하였다(16). IDDM2에서 이 질환에 대한 유전적 위험성은 잠재적으로 이 유전자의 소위성 DNA 서열을 포함(18, 19)하는, 소인적이고 보호적인 INS 일배체형으로부터의 차등적인 정상-상태 RNA 수준에 기인하였다. 그러나, 천연 발생 INS 다형성의 체계적 조사는 IVS1+5ins4(rs3842740 또는 INS-69라고도 알려짐) 및 IVS1-6A/T(rs689, INS-27 또는 HphI+/-)(16,20)라고 하는, 인트론 1의 2개 변이체(7)로 인한, 소위성 서열없는 리포터 구성체에서 일배체형-특이적 프로인슐린 발현도를 밝혀주었다. 전자의 변이체는 인트론 1의 암호화 5' 스플라이싱 부위를 활성화시키는데 반해 3'스플라이싱 부위(3' ss) 상향에 6개 뉴클레오티드가 존재하는, 후자의 변이체에서 아데닌(A)은 연장된 5'UTR을 갖는 전사물의 상대적 풍부함을 확대하는, 인트론 잔류를 촉진시킨다(21). 티민(T)과 비교하여, IVS1-6A/T에서 A 대립유전자는 시험관 내 피리미딘-결합 단백질에 대한 친화성을 감소시키고 3'ss를 U2 결합, 스플라이시오솜 조립 및 3'ss 선택에 필요한 이종이량체인, U2 소형 핵 리보뉴클레오단백질(U2AF)(7)의 보조 인자에 더욱 의존적이게 한다(22). 인트론 1-함유 전사물은 인슐린 생산 조직(21)에서 준비한 IVS1-6A-유도된 cDNA 라이브러리에서 과도하게 제시되었고, 핵으로부터 이출되고(23) 고등 영장류에서 인트론 1의 3'ss의 완화와 공동 진화된 짧은, 사람아과-특이적 uORF를 함유한다(7). A 대립유전자에 의해 부여된 낮은 프로인슐린 발현은 태아 흉선에서 프로인슐린 펩티드의 최적이하 제시 및 자가반응성 T 세포의 적절치 않은 음성적 선별을 초래해, 결국 췌장의 인슐린-생산 β 세포의 자가면역 파괴를 일으킨다(7). 그러나, IVS1-6A-함유 프리-mRNA로부터 INS 인트론 1 제거의 낮을 효율을 교정하고 질환-보호적 T 대립유전자에서 관찰된 수준으로 인트론 잔류를 감소시키려는 시도가 이루어지지 않았었다.
이 실험은 프로인슐린 발현을 향상시키기 위해 프리-mRNA에서 스플라이싱 사일렌서 또는 디코이 스플라이싱 부위를 억제하고 INS 인트론 1 스플라이싱 효율을 증가시키는 SSO를 검색하기 위해 수행된다. 인트론 1-잔류 전사물이 상대적 풍부함을 감소시키는 SSO를 동정하였고, 단일-뉴클레오티드 분해에서 최적 안티센스 표적의 모형을 확인하고, 안티센스 표적 서열에 인접한 평행한 G-사중체의 형성 및 이 영역에 결합하는 단백질의 동정에 대한 증거를 보여준다.
재료 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오티드
SSO는 MWG Biotech(Germany)에서 구매하였다. 모든 SSO 및 스크램블드 대조군은 제2 리보스 위치에 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드를 갖는 전체 길이 포스포로티오에이트 골격을 가졌다. INS SSO 및 그들의 스크램블드 형태를 제외하고, 우리는 기술된 바와 같이, 추가 대조군으로서 다른 인간 유전자를 표적으로 하는 SSO를 적용하였다(13). 각 SSO의 위치를 도 1A에 도시하였고 그들 서열은 표 2에 나타내었다.
스플라이싱 리포터 구성체
IC라고 하는 제1형 당뇨병 연관된 일배체형을 보유한 야생형 스플라이싱 리포터가 이전에 보고되었다(7,21). 각각의 구성체는 모든 INS 엑손 및 미단축 인트론을 함유하지만 마지막 엑손의 길이가 상이하다. IC 리포터는 프라이머 D-C, D-F 및 D-B를 사용해 클로닝하였고, IC D-B는 인트론의 암호화 3'ss가 결여되었다. 이 부위에서 스플라이싱된 이소폼의 상대적 풍부함은 IC D-C에 대한 것보다 IC DF에 대해 더 낮다(7,21). 인트론 1의 암호화 5' 스플라이싱 부위를 표적으로 하는 SSO를 시험하기 위해, IC 구성체는 rs3842740에서 4-nt 삽입에 의해 개질되어 ICIVS1+ 5ins4라고 하는 리포터가 생성되었다. TSC2 및 F9 구성체는 이전에 보고되었다(24). 플라스미드는 이. 콜라이 균주 DH5α에서 증폭시키고 플라스미드 DNA를 위저드 플러스 SV 미니프렙 키트(Promega, USA)를 사용해 추출하였다. 그들 삽입부를 완전하게 서열분석하여 14개의 유전자간 천연 변이체 각각의 정체를 확인하였고 원치않는 돌연변이를 배제하였다.
세포 배양 및 형질감염
인간 배아 신장 293(HEK293), 인간 간세포 간암종 HepG2 및 아프리카 녹색 원숭이 COS7 세포를 둘베코의 개질 이글 배지, 10% 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신(Life technologies, USA)에서 배양하였다. 일시적 형질감염은 제조사의 추천에 따라서 jetPRIME(Polyplus, USA)을 사용해 기술된 대로(13) 수행하였다. 인트론 1의 암호화 3'ss를 유도하기 위해 RNA 간섭(RNAi)에 의한 U2AF35의 하향조절을 이전에 보고된 바와 같이(7,25), 소형 간섭 RNA(siRNA) U2AF35ab의 2개 히트를 사용해 수행하였고, DHX36을 표적으로 하는 siRNA 이중체는 기술된 대로 하였다(26). 제2 히트는 SSO 및/또는 리포터의 부가 전 24시간에 적용하였다. 세포 배양은 리포터 구성체의 부가 후 24시에 회수하였다.
스플라이싱된 생성물의 분석
총 RNA는 TRI 시약으로 추출하였고 DNase(Life technologies, USA)를 처리하였다. 제1 가닥 cDNA는 올리고-(dT)15 프라이머 및 몰로니 마우스 바이러스 역 전사효소(Promega, USA)를 사용해 역전사시켰다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 이전에 보고된 바와 같이, 벡터-특이적 프라이머 PL3 및 프라이머 E 표적화 3'UTR의 조합을 사용해 수행하였다. PCR 생성물은 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였고 그들의 신호 강도를 보고된 대로 측정하였다(27). 각 mRNA 이소폼의 정체는 Sanger 뉴클레오티드 서열분석으로 확인하였다.
원편광 이색성 및 핵자기 공명 분광법
원편광 이색성(CD) 및 핵자기 공명(NMR)을 위한 올리고리보뉴클레오티드는 Thermo Scientific에서 구매하였고, 제조사의 설명에 따라 탈보호시키고, 동결건조시켜서 -20℃에 저장하였다. 스톡 용액은 2-4 μM의 최종 농도로 milliQ 물 또는 KCl 완충액(100 mM KCl, 10mMK2HPO4/KH2PO4, pH 7.0, milliQ 물)에 재현탁시켜, 탈염된, 동결건조 샘플로부터 준비하였다. CD스펙트럼은 LTD6G 순환 수조(Grant Instruments, UK) 및 열전기 온도 제어기(Melcor, USA)가 장착된 PiStar-180 분광광도계(Applied Photophysics Ltd, Surrey, UK)를 사용해 얻었다. 샘플은 셀에서 총 15분간 95℃로 가열하였고, 다음으로 샘플을 최소 4시간 동안 실온으로 냉각하여 어닐링시켰다. CD 스펙트럼은 표시된 온도에서 1 cm 경로 길이 스트레인-무함유 석영 큐벳을 사용해 215-340 nm의 파장 범위에서 기록하였다. 데이터 지점은 1 nm 간격으로 기록하였다. 3 nm의 대역폭을 사용하였고 적응적 샘플링이 가능한 각 지점에서 5000 계측치를 얻었다. 각 기록은 3회 스캔의 평균(±SD)으로서 보여주었다. CD 온도 램프는 폴딩된 사중체 종의 대역 최대에 상응하는 265 nm에서 얻었다. 5 내지 99℃ 범위를 사용하였고, 0.5℃ 승온 사이에 120-180s 시간 스텝으로 0.5℃ 간격에서 지점을 획득하였다. 지점은 10,000 계측치로 획득하였고 적응적 샘플링이 가능하였다. 가열 및 냉각 실험은 이력 현상 및 전체 가역성에 대해 검토하기 위해 비교하였다. NMR 스펙트럼(1H)은 삼중 공명 저온탐침으로 Bruker Avance III 분광계를 사용해 800 MHz에서 수집하였다. 표준 Bruker 획득 변수를 사용하였다. 데이터는 Topspin(v. 3.0)을 사용해 얻고 CCPN 분석(v. 2.1)으로 처리하였다.
풀-다운 검정법 및 웨스턴 블롯팅
시험관 내 전사는 주형으로 표시된 플라스미드의 DNA 및 프라이머 5'- ATTAATACGACTCACTATAGGGCTCAGGGTTCCAGG 및 5'- TGCAGCAGGGAGGACG를 사용해 증폭된 T7-태깅된 PCR 생성물 및 MEGAshortscriptTM T7(LifeTechnologies, USA)을 사용해 수행하였다. 표시된 합성 RNA는 Eurofins UK에서 구매하였다. 500 pmol의 각 RNA를 5 mM 나트륨 m-페리오데이트로 처리하고 아디프산 디히드라지드 아가로스 비드(Sigma, USA)에 결합시켰다. RNA가 결합된 비드를 3회 2 mL의 2 M NaCl로 세척하고 3회 완충액 D(20 mM HEPES-KOH, pH 7, 6.5% v/v 글리세롤, 100 m M KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM 디티오트레이톨)로 세척하고, HeLa 핵 추출물 및 최종 농도 0.5 mg/mL의 헤파린을 함유한 완충액 D로 항온반응시켰다. 미결합된 단백질은 완충액 D로 5회 세척하였다. 결합된 단백질을 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 쿠마시 블루로 염색하고/하거나 니트로셀룰로스 막에 블롯팅하였다.
웨스턴 블롯팅을 기술된 대로 수행하였다(7). 항체는 Sigma(hnRNP E1/E2, 제품 번호 R4155, U2AF65, 제품 번호 U4758 및 SFRS2, 제품 번호 S2320), Abcam(DHX36, 제품 번호 ab70269) 및 Millipore(SC35, clone 1SC-4F11)에서 구매하였다. hnRNP F 및 hnRNP H에 대한 항혈청은 Douglas Black 교수(UCLA)가 제공하였다.
질량 분광분석
트립신 분해 후, 샘플을 냉동 건조시키고 질량 분광법(MS)을 위해 25 ㎕의 5% ACN/0.1% 포름산에 재현탁하였다. 펩티드는 Surveyor LC 시스템 및 LCQ Deca XP Plus(ThermoScientific)를 사용해 LC/MS/MS로 분석하였다. 미가공 데이터 파일은 Mascot 검색 알고리즘(Matrix Science)에 입력을 위해 MassMatrix 파일 전환 도구(버전 2.0; http://www.massmatrix.net)를 사용해 mascot 일반 파일로 전환시켰다.
효소 구조 프로빙
제한적 V1 RNAse(Ambion), T1 RNAse(Ambion) 및 S1 뉴클레아제(Fermentas) 분해를 사용한 RNA 2차 구조 결정은 다른 곳에 상세하게 기술되어 있다(28). 간략하게, 삽입(ins) 및 결실(del) 프리-mRNA로부터 1 ㎍ 분취량의 RNA를 10분간 30℃에서 100 ㎕ 중 0.002 U의 RNAse V1, 0.05 U의 RNAse T1 및 19 U의 S1 뉴클레아제로 분해하였다. 효소 무함유 분취량을 대조군(C)으로 사용하였다. 절단된 RNA는 5' 말단에 [32P]-ATP로 표지된 안티센스 프라이머를 사용한 표준 프로토콜에 따라 레트로 전사시켰다.
결과
5'UTR의 약한 인트론의 프리-mRNA 스플라이싱을 촉진하는 안티센스 올리고뉴클레오티드
INS 인트론 1의 잔류를 감소시키고 스플라이싱-매개 번역 강화를 증가시킬 수 있는 SSO를 동정하기 위해, 일련의 2'-O-메틸-개질된 포스포로티오에이트 SSO를 디자인하고, 개별적으로 각각의 SSO를 HEK293 세포에서 일배체형 IC를 보유하는 스플라이싱 리포터 구성체와 공동 발현시키고 외생성 mRNA 생성물의 상대적 풍부함을 조사하였다(도 1A 및 B). 리포터의 IC 일배체형은 소위성 서열이 없고 rs689에 A 대립유전자를 포함하여, 총 14개 다형성 부위를 함유하였다(7,20). 이러한 대립유전자는 인트론 1 스프라이싱을 억제하고 보다 일반적인 T 대립유전자와 비교하여 낮은 프로인슐린 수준을 산출하였다(21). 이들 서열의 이전의 체계적인 결실 분석에서 엑손 포함 또는 인트론 잔류의 가장 두드러진 변경을 보여준 이 영역에서 인트론 1 및 엑손 2를 표적으로 하는 SSO를 선택하였다(7). 엑손 3의 SSO는 그들의 용법을 변형시키는 프리-mRNA 모티프를 동정하기 위해 인트론 2의 정식 3'ss와 126 nt 하류의 강력한 경쟁적 암호화 3'ss 사이에 위치시켰다(도 1A). HEK293 세포에서 시험된 초기 15개 INS SSO 세트 중에서, 11개는 mRNA 이소폼의 상대적 풍부함에서 재현가능한 변경을 보였다(표 2). 인트론 1 잔류는 단일 올리고리보뉴클레오티드 SSO21에 의해 유의하게 감소되었다(P < 0.01, Mann-Whitney 순위합 검정; 도 2A). SSO21은 결실 시 인트론 잔류의 최대 감소를 부여하는 것으로 이전에 확인된 모티프(del5라고 함)를 함유하는 인트론 1 위치 59-74를 표적화하였다(7). SSO21에 의해 유도된 인트론 잔류 수준의 감소는 용량 의존적(도 2A)이었고 HepG2 세포 및 클로로세버스 애티옵스(Chlorocebus aethiops) COS7 세포에서도 관찰되었으며, 보조적 스플라이싱 서열을 적용하는 스플라이시오솜 성분의 높은 정도의 진화적 보존성 및 편재적 발현과 일관되었다(1,2). 인트론 1 잔류의 감소이외에도, SSO21은 인트론 2의 암호화 3'ss를 촉진시켰다(도 2A). 그러나 이러한 효과는 또한 다른 INS SSO 및 스크램블드 대조군(도 3 및 표 2)에서도 확인되어서, 비특이적 상호작용을 시사하였다. 인트론 1 스플라이싱의 SSO21-유도된 강화가 인트론 2의 암호화 3'ss에 의해 촉진되는 것이 아님을 확인하기 위해, 우리는 이 SSO를 이 부위가 결여되고 엑손 3의 처음 89개 뉴클레오티드만을 보유하는 보다 짧은 리포터와 함께 공동 형질감염시켰다. 도 2B는 SSO21이 보다 긴 엑손 3이 있는 리포터와 동일한 정도로 인트론 1 스플라이싱을 촉진할 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 인트론 잔류의 SSO21-유도된 감소는 del5 절편이 결여된 리포터에서는 관찰되지 않았다. 인트론 잔류를 제외하고, 엑손 2 스킵핑의 증가가 인트론 1의 암호화 3'ss의 하류에 결합하는 SSO8을 포함한, 5 SSO에서 관찰되었다(cr3'ss+81; 도 1 및 3C, 표 2). 이 암호화 3'ss는 U2AF(U2AF35)의 소형 서브유닛의 RNAi-매개 고갈에 의해 유도되었고 U2AF35가 결여된 가교 올리고리보뉴클레오티드(SSO4)에 의해 역전되지 않았으며, 대신 엑손 2 스킵핑이 관찰되었다(도 3C). Depletion of U2AF35의 고갈이 또한 인트론 2의 암호화 3'ss를 억제하였다. 이들과 함께, 몇몇 영장류 세포주에서 INS 인트론 1 잔류를 감소시킨 단일 SSO가 동정되었다.
단일 뉴클레오티드 수준에서 인트론 잔류 표적의 최적화
흥미롭게도, 다른 del5 절편을 표적으로 하도록 디자인된 SSO는 SSO20의 작은 효과를 제외하고, 인트론 1 잔류를 감소시키지 않았다(도 1A 및 2A). SSO21이 측접하는 뉴클레오티드의 중요성을 시험하고 단일-염기 분해에서 최적 표적을 맵핑하기 위해, 이 영역에서 상세한 안티센스 마이크로워크를 수행하였다. INS 리포터는 HEK293 세포로 SSO21의 추가적인 18개의 16량체 결합된 1-9 뉴클레오티드 5' 및 3'과 공동 형질감염시키고 그들의 RNA 생성물을 조사하였다. 인트론 1 잔류는 SSO21 및 각 방향으로 1-2 뉴클레오티드 이동된 SSO들에 의해 대부분 억제되었다(도 4). 초기 스크린과 일관되게, 4개 C의 상향 연속부의 1 이상의 시토신을 표적으로 하는 SSO(C4, SO1 및 SSO2 참조, 도 1A)는 효과적이지 않았다(SSO21-3r 내지 SSO21-10r, 도 4). 반대 방향으로, 인트론 스플라이싱 인핸서에서 종종 발견되는, 연속 G를 표적으로 하는 SSO(29-31)는 인트론 잔류를 증가시켰다. 따라서, INS 인트론 1의 잔류를 감소시키기 위한 최적 안티센스 표적은 전체 인트론의 체계적 결실 분석에 의해 가장 억제적인 것으로 이전에 동정된 영역까지 단일 뉴클레오티드 분해에서 맵핑하였다(7).
인트론 잔류를 표적으로 하는 안티센스는 평형 RNA 사중체에 인접한다
표적은 안정한 RNA 구아닌(G) 사중체를 형성할 것으로 예측된 2개 인트론 절편(인트론 1 뉴클레오티드 36-61 및 78-93; 도 4A에서 강조함) 사이에 끼워져 있는 것으로 확인되었다. 이들 구조는 환형 후그스틴 수소 결합 배열(32)로 구조화된 4개의 G로 이루어진 G-4개세트를 적층시켜 생성되고 복제, 재조합, 전사, 번역(33, 34) 및 RNA 프로세싱(35-39)을 포함한, 중요한 세포 과정에 연관되었다. 그들이 시험관 내에서 형성되는지를 시험하기 위해, 이 영역에서 유도된 합성 리보뉴클레오티드를 시험관 내에서 DNA 및 RNA 사중체 구조를 특정규명하는데 광범위하게 사용되는 CD 분광법에 적용하였다(40-43). 25℃에서 215 내지 330 nm에서 기록된 하류 19량체의 CD 스펙트럼(CD1이라고 함)은 240 nm 주변에서 음성 강도로 265 nm에서 강력한 양성 타원율이 밝혀졌으며, 평형 사중체를 시사한다(도 5A). 다른 안정한 2차 구조 모티프보다는, 사중체 존재를 확인하기 위해, UV 흡광 스펙트럼을 5℃ 및 95℃에서 기록하였다. 2개 온도(용융 전이 온도 아래 및 위)에서 UV 흡광 차이 스펙트럼은 ∼295 nm에서 특징적인 고색소성 이동 및 240 nm 및 280 nm에서 이중 최대치가 확인되어, 시험관 내에서 안정한 평행한-가닥의 RNA 사중체 형성에 대한 증거가 제공되었다. 이는 CD1의 1H NMR 실험(도 5B)으로 확인하였는데, G-사분자 구조 내에 후그스틴 H-결합된 G에 상응하는 10 내지 12 ppm 사이 신호의 특징적인 엔벨로프가 확인되었다. CD에 의한 열적 안정성 측정은 T m = 56.8 ± 0.2℃로, 고도의 가역적인 S자형의 협력적 언폴딩 전이를 생성시켰다(도 5C). 도 5D(위 패널)는 1-4개 뉴클레오티드의 비교적 짧은 루프 서열에 의해 연결된 2개의 적층된 G-사분자로 19량체의 가능한 배열을 보여준다.
INS 인트론 1의 스플라이싱 억제성 서열에 대한 입체형태 전이 모델
안티센스 표적의 상향 영역에서 유도된 합성 20량체의 CD(CD2라고 함)는 또한 안정한 구조 형성 증거를 보여주어서, 대략 270 nm에 집중되는 광범위한 흡광 엔벨로프 및 S자형 열적 언폴딩 전이를 제공한다(T m = 69.0 ± 0.45°C; 도 5A). 하류 올리고 CD1과 달리, UV에서 어떠한 고색소 이동이 열 차이 스펙트럼에서 보이지 않았다. 그러나, CD1에 대한 것과는 상이한 12 내지 14 ppm 사이의 1H NMR 스펙트럼에서 잘 정의된 가파른 신호 세트가 이중 가닥 RNA의 특징인 왓슨-크릭 H-결합된 염기쌍의 형성을 보여주었다(도 5B). Mfold를 사용한 중복 인트론 절편의 2차 구조 예측은 프리-mRNA가 안정한 국소 스템-루프를 형성함을 시사하고, 그들 중 하나는 인트론 1 잔류를 증가시키는 GC 돌연변이(G2라고 함; 도 5D, 아래 패널)에 의해 더 안정화되었다(7). 다른 G→C 치환(G3이라고 함)은 더욱 하류에 위치하였고 사중체 구조의 탈안정화(도 5D, 위 패널)가 역시 인트론 스플라이싱을 억제하였다(7). 마지막으로, 단일-뉴클레오티드 다형성에서 A 또는 G를 함유하는 CD2 올리고뉴클레오티드(도 4A 및 (20)는 매우 유사한 CD 스펙트럼과 잘 정의된 용융 전이 및 T m 값을 나타내서, G 및 A 대립유전자가 동일한 구조를 형성함을 시사하였다.
인트론 스플라이싱의 정규 및 비정규 구조 간 잠정적인 평형 상태의 중요성을 더 시험하기 위해서, CD, NMR 및 돌연변이유발 실험의 조합을 사용하였다(도 6). 인트론 잔류 표적의 5' 말단을 포함하는 올리고리보뉴클레오티드 CD3을 합성하였고 스템-루프/사중체를 예측하였다(도 4A 및 6A). 헤어핀을 탈안정화시키지만 사중체의 안정성을 유지시키는 2개 CU 전이를 보유하는, 돌연변이된 형태의 CD4를 또한 합성하였다. HEK293 세포에 형질전환된 IC 리포터 구성체에 동일한 돌연변이를 도입시켰다. CD3의 NMR 스펙트럼은 평형 상태인 G-사분자 및 정규 염기쌍 헤어핀 구조(H1 및 H2라고 함)에 대한 신호의 동시 존재를 밝혀주었다(도 6B 및 C). 사중체와 헤어핀 간 입체형태 평형 상태에 대한 Mg2+의 효과는 100 mM KCl을 함유하는 완충 용액에 2 mM 및 이어서 6 mM MgCl2를 부가하여 조사하였다. Bugaut 등(57)이 보고한 바와 같이, 입체형태 평형 상태는 KCl 존재 하에 Mg2+의 부가에 의해 유의하게 동요되지 않았다. 따라서, 우리는 K+ 및 Mg2+ 이온 둘 모두가 고농도로 존재하는 세포 상황을 모방하는 환경에서 RNA 헤어핀 및 사중체 구조의 형성을 관찰하였다. CD 용융 곡선은 광범위한 전이(T m = 79.9C)를 보여주었고, 상이한 안정성의 다중 입체형태 상태와 일관되었다. CD4에서 CC→UU 돌연변이는 H1에 대한 NMR 신호의 손실(도 6B) 및 13℃만큼 Tm의 감소를 야기하였고, 사중체와 평형 상태인 H2 개체군의 증가를 초래하는 보다 안정한 헤어핀 H1의 선택적 탈안정화와 일관되었다. 일시적 형질감염은 CC→UU 돌연변이가 인트론 1 스플라이싱을 향상시키는 반면 사중체와 헤어핀 둘 모두를 탈안정화할 것으로 예측되는 M1이라고 하는 돌연변이는 오직 적은 효과만을 가졌다(도 6D, 표 1A).
이들 구조의 평형 상태가 어떻게 인트론 스플라이싱에 보다 체계적으로 영향을 주는지 확인하기 위해서, 일련의 돌연변이된 구성체를 예측된 사중체, H1/H2 구조 및 2개의 시토신 연속부를 탈안정화/유지시키기 위해 제조하였다(표 1A). 그들 전사물은 인트론 잔류 수준에 유의한 차이를 보였다(도 7; P = 0.0001, Kruskal-Wallis의 순위에 대한 단측 ANOVA 검정). 먼저, G-사중체의 제거는 인트론 1 잔류를 증가시켰고, 각 시토신 연속부 제거로 더 향상되었다(cf. 돌연변이 4-6과 야생형, P = 0.0004). 이들 돌연변이는 인트론 잔류에 대해 추가 효과를 갖는 것으로 나타났다(cf. 야생형 대 돌연변이 1 또는 9; 3 대 2 및 4 대 5). 두번째, G-사중체 부재 하에서 증가된 인트론 잔류는 H1 및 H2 제거에 의해 변경되지 않았지만, 그들의 제거는 엑손 스킵핑을 강화시켰다(cf. 돌연변이 4 대 6에 대한 이소폼 2). 세번째, 2개 C4 연속부 중 오직 하나만 존재할 경우, H1의 제거는 어느 정도 인트론 1 스플라이싱을 개선시켜서(cf. 8 대 9), 인트론 잔류와 시험된 RNA의 예측 안정성 간 통계적으로 유의한 상관성과 일관되었다(도 7B). 인트론 스플라이싱의 효율은 따라서 평형 상태의 정규 및 비정규 구조 간 입체형태 전이에 의해 제어되었다.
[표 1a]
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위너 SSO에 의해 표적화된 영역에서 단백질-RNA 상호작용
안티센스 표적 및/또는 연관된 정규 및 비정규 구조를 포함하는 RNA와 상호작용하는 단백질을 동정하기 위해, T7-태깅된 PCR 생성물에서 전사된 야생형 및 del5 RNA, 표적 서열을 나타내는 합성 RNA(CD5), 및 AV3이라고 하는 3'ss CAG를 함유하는 대조군 올리고를 사용해 풀-다운 검정법을 수행하였다. 야생형 및 del5 전사물은 hnRNP F/H 결합되었지만 이 결합은 CD5에 대해서는 부재하는 것으로 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 7C). 이들 단백질은 또한 비드 단독 대조군과 비교하여 야생형 및 del5 RNA를 사용한 풀 다운 겔로부터 차등적으로 염색된 단편의 MS/MS 분석에 의해 검출되었다. 몇몇 SR 단백질 중에서 추정 결합 활성에 대해 최고 점수를 보인, SRSF2에 대항한 2종 항체는 임의의 특이적 상호작용을 검출하는데 실패하였다(도 7C). 포유동물 세포에서 주요 폴리(C) 결합 활성을 구성하는, hnRNP E1/E2 유래의 신호(44)가 del5에 대한 배경값보다 높지만(도 7C), hnRNP E1/E2 결여된 세포에서 인트론 잔류 변화가 관찰되지 않았다.
DHX36 고갈 시 G-풍부 및 G-빈약 리포터의 스플라이싱 패턴
RNA G-사중체는 헬리카제 DHX36에 결합하고, 이는 사중체 RNA를 안정한 이중체로 전환시킬 수 있고, HeLa 세포에서 사중체-분해 활성의 주요 공급원이다(26,45). DHX36은 ATM 프리-mRNA에서 인트론 스플라이싱 인핸서와 가교결합(46)하였고 TERC의 5' 영역 내에서 사중체 구조를 풀 수 있다(26). DHX36 고갈이 INS 스플라이싱에 영향을 주는지를 시험하기 위해, G-사중체-빈약 및 -풍부 리포터를 고갈된 세포에 일시적으로 형질감염시켰다(도 8A, 표 1). 대조군 구성체는 분지점을 약화(24)시켜 얻을 수 있는, 스플라이싱된 생성물의 대략 균등한 표시를 제공하도록 선택되어, 감응성 생체외 스플라이싱 검정법을 제공한다. 그러나, 효율적인 DHX36 고갈(도 8B)에도 불구하고, INS 인트론 1 잔류의 통계적으로 유의한 변경은 단형 또는 장형 구성체에서 확인되지 않았고, G-빈약 및 G-풍부 대조군에서 주요한 변화를 관찰하지 못하였다(도 8C-E). 이들 결과는 DHX36-고갈된 세포에서 하향 조절된 전사물 중 사중체 서열의 유의한 농축의 사전 결여(47) 및 넉다운에 대한 ATM 반응 부재(46)와 일관된다.
INS 인트론 1의 개체군-특이적 암호화 5' 스플라이싱 부위의 SSO-유도된 억제
rs689 , INS 인트론 1 스플라이싱은 천연 5'ss 부근에 위치된 rs3842740에서 다형성 TTGC 삽입에 의해 영향받는다(21). 이러한 삽입은 모든 아프리카 염색체의 4분의 1에 존재하지만 백인 IC 일배체형에는 부재한다(20). 이러한 삽입은 하류 암호화 5'ss를 활성화시켜(도 1A), 추가 26개 뉴클레오티드에 의해 얻어진 mRNA의 5'UTR을 연장시키고 프로인슐린 발현을 억제한다(7,21). 새로운 5'ss가 SSO에 의해 효율적으로 억제되는지를 시험하기 위해서, 동일한 삽입부를 IC 구성체에 도입시켰고 야생형 및 돌연변이된 리포터를 SSO10이라고 한 가교 올리고리보뉴클레오티드와 공동발현시켰다. 암호화 스플라이싱이 억제되었지만, 인트론 1의 정규 스플라이싱은 높은 SSO10 농도에서도 완전하게 복원되지 않았고, 아마도 삽입에 의해 약화된 정식 5'ss의 최적 이하 인식에 의한 것인 듯 하다.
삽입이 존재 및 부재하는 5'UTR 서열의 폴딩에 대한 초기 이해를 얻기 위해서, 효소적 구조 탐침을 단일 가닥 및 이중 가닥 특이적 RNAse를 사용한 부분 RNA 분해를 사용해 수행하였다. 야생형 RNA에 대해 검출된 전체 절단 위치 및 강도는 mfold 예측과 광범위하게 일관적이었고, 여기서 2개의 주요 스템 루프 영역(SL1 및 SL2)은 몇몇 내부 벌지에 의해 방해되었다. 구조적 탐침 및 mfold 예측 둘 모두는rs3842740에서의 삽입이 SL1 및 Sl2의 나머지 위치와 대조하여 이 영역에서 T1 및 S1 절단 수가 증가됨에 따라 SL1에서 중심 벌지를 연장시켰다. 마지막으로, 전사물은 시험관 내에서 사중체 형성을 보이는 영역에서 RNase V1에 의해 분해되지 않았다.
고찰
INS 인트론 1의 스플라이싱 사일렌서에서 안티센스 인트론 잔류 표적
여기서 SSO를 사용하여 일배체형-의존적 INS 발현을 변형시키고 성숙한 전사물에서 전체 인트론의 잔류를 감소시키는 안티센스 기술의 최초 사용을 입증하였다. 효율적인 RNA 프로세싱 중에 rs689에서 A 대립유전자의 부정적 영향을 약화시키는 위너 SSO의 동정은 인트론 1의 체계적 돌연변이유발법(7), 및 마크로워크(도 1) 및 마이크로워크(도 4) 전략에 의해 가능하였다. 흥미롭게도, 표적 서열은 3'ss 공통서열과 닮은 탠덤 CAG(G/C) 모티프를 함유한다(도 4). 이러한 '슈도-억셉터'는 이전에 실험적으로 스플라이싱-부위 억제에 연관되어 있었고(27) 스플라이싱 사일렌서에서 과제시되었다. 예를 들어, 2개의 사량체는 고신뢰 102 인트론 스플라이싱 사일렌스(49) 중에서 가장 일반적이고 무작위 10량체의 형광발광 활성화 스크리닝에 의해 동정된 109 인핸서에서 고갈되었다(50). YAG 모티프는 또한 QUEPASA 스플라이싱 사일렌서 중에 예상되는 것보다 더 빈번하였고(51), 그들이 유지 표적의 중요한 기능적 성분임을 시사하였다. 개재된 시토신 트랙은 또한 QUEPASA 사일렌서 중 C4 연속부의 빈도가 예상보다 ∼2배 더 높으므로 중요한 역할을 수행할 수 있다. 이들 모티프는 시험된 3'ss에 비해 위치 -62/-51에 삽입된 서열의 체계적 스크리닝에 의해 동정된 인트론 스플라이싱 조절 성분의 4%에서 발견되었다(52). 이 연구는 최적 인트론 잔류 표적과 3' 나노머(밑줄)를 공유하는 ISS22(AAATAGAGGCCCCAG)라고 하는 성분을 동정하였다. 그러나, AV3의 최적 3'ss 인식 서열과 달리, 우리의 웨스턴 블롯과 커플링된 풀-다운 검정법은 만약 있어도 U2AF65에 대해 매우 약한 결합만을 밝혀주었다(도 7C).
RNA 프로세싱 제어에서 사중체와 헤어핀 간 입체형태 전이
안티센스 표적은 그 구조가 이후에 CD 및 NMR 분석에 의해 확인된 가능한 G-사중체 형성 RNA의 바로 상향에서 동정되었다(도 1A 및 5). RNA 사중체는 그들의 DNA 대항물보다 더 안정하고, RNA 대사 조절에 점차적으로 연루되어 있고(33,34,41,42) 약물 개발에 고유한 방안을 제공한다(53). 2-사분자 사중체는 그들의 3- 또는 4-사분자 대응물보다 열역학적으로 덜 안정하고 아마도 역학적으로 더 불안정하지만, 여전히 확연한 안정성을 나타내고 세포 환경에 대응하여 사중체 및 비사중체 구조 간에 보다 순응적이고 동적인 전환을 제공할 수 있다(54-56). 위너 SSO는 트랜스-작용성 인자들과의 상호작용을 차단하거나, 고차원 구조를 변경시키거나, RNA-단백질 복합체 형성 속도를 변경시키거나 또는 2-사분자 사중체 및 H1/H2 사이의 입체형태 전이를 손상시킬 수 있다(도 5). 유사한 전이가 처음에 예측하지 못한 사중체에 대해 최근에 기술되었고(57), G-풍부 인트론 1의 추가 서열이 안티센스 표적 근처의 균형에 참여할 가능성이 증가되어, 아마도 다수의 사중체 모티프가 관여하고 스템-루프와 경쟁할 것이다.
hnRNP F/H 고갈시 증가된 인트론 1 잔류 및 hnRNP F/H 과발현 시 반대 효과(7)를 보이는 결합(도 7C) 및 기능적 실험은 이들 단백질이 이 인트론의 핵심 스플라이싱 보조 서열과 상호작용함을 의미한다. hnRNP F가 직접 RNA 사중체에 결합한다고 결론내린 이전 보고(58)와 대조적으로, hnRNP F는 독점적으로 단일 가닥 G-트랙에 결합하여 RNA 사중체의 형성을 방지하는 것으로 확인되었다(59). 영장류 게놈 기반 예측은 추정 사중체의 대부분이 정규 구조로 폴딩될 것이라고 시사한다(60). 이들 단백질에 의해 감소된 프리-mRNA 점유는 아마도 사중체 형성을 촉진(59)하고, 잠재적으로 스플라이싱 효율을 감소시킨다.
커플링된 스플라이싱 및 번역 유전자 발현 제어에서 RNA 사중체
RNA 사중체는 5'UTR의 ∼8%에서 예측되었고 번역의 일반적인 억제제로 기능한다고 제안되었다(60,61). INS 인트론 1은 약하게 스플라이싱되고 U2AF35-의존적(7)이고 인트론 1-함유 전사물의 유의한 분획이 핵으로 이출된다(23). 이는 CD1에 의해 형성된 RNA G-사중체가 사람아과에 특이적인 3-아미노산 uORF를 함유하는 이들 mRNA의 번역에 영향을 줄 수 있음을 시사한다(7). 이 uORF는 프로인슐린 발현을 두드러지게 억제하고 단지 소수의 염기쌍 하류에 위치하여, G-사중체가 uORF를 격리시켜 번역을 촉진할 수 있다는 개념을 유도한다. 기능적 2-사분자 사중체는 내부 리보솜 진입 부위의 활성에 필요하다(54).
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스플라이싱-부위 선별에서 독립성을 위한 안티센스 전략
정규 mRNA 이소폼 4를 제외하고, 이소폼 2, 3 및 6(도 1B)은 인슐린 생산 조직 유래의 cDNA 라이브러리에서 유도된 발현된 서열 태그 데이터베이스에서 발견되었다(21). 이는 리포터 구성체에 의해 생산된 암호화 스플라이싱 부위가 생체 내에서 인식되며 우리의 일배체형-의존적 리포터 시스템이 세포가 내생성 인슐린을 발현하건 또는 발현하지 않건 무관하게 배양된 세포에서 이들 사건을 정확하게 반복한다는 것을 시사한다. 인트론 1-잔류 전사물 억제이외에도, 최적 SSO는 엑손 3의 암호와 3'ss의 이용을 증가시켰다(도 2). 이러한 원치않는 효과는 개별 유전자에 대해 이전에 전세계적으로 관찰(63-67)된, 인접한 엑손 및 인트론의 스플라이싱의 협동에 의해 설명될 수 있다. 또한, G-풍부 하류 전사 출발 부위는 RNA 중합효소 II 휴면 부위와 연관되었다(68). 인트론 2의 2개의 강건하게 경쟁하는 3'ss가 RNA 폴딩에 영향을 주는 비특이적 신호에 반응하는 듯 하지만(도 3, 표 2), 연결된 스플라이싱 부위에서 SSO 조합을 사용해 암호화 3'ss 활성화를 감소시키고 관찰된 의존성을 경감시키며, 꼬마유전자에 대항하여 전체 길이 구성체의 사용으로 이득을 얻은, 그들의 상승효과 또는 길항효과를 조사하는 것이 가능할 수 있다.
INS 인트론 1 잔류를 감소시키기 위한 다중기능성 안티센스 올리고뉴클레오티드
2'-O-메틸-포스포로티오에이트 SSO의 최초 사용으로(69), 이 유형의 화학적 개질은 많은 시험관내 및 생체내 용도를 위해 성공적으로 활용되었다(9,10,70). 더욱 mRNA 이소폼의 미세-조율 발현을 위해, 최적 SSO는 그들 표적 서열에 적합한 트랜스-작용성 스플라이싱 인자를 속박하도록 디자인될 수 있다(11,71). 이 시스템에 명백한 후보는 U2AF35인데 인트론 1이 고등 영장류에서 3'ss의 완화 결과로서 약하고 rs689에서 A 대립유전자에 의해 더욱 약화되어, 이 인트론을 고도로 U2AF35-의존적이게 만들기 때문이다(도 3)(7). U2AF35이외에도, 향후 이중 또는 다중기능성 안티센스 전략은 INS 인트론 1 및 엑손 2 스플라이싱에 영향을 주는 것으로 이전에 확인된 스플라이싱 인자에 대한 결합 플랫폼, 예컨대 Tra2b 또는 SRSF3을 적용할 수 있다(7). Tra2b는 말단 루프에서 강력한 GAa 스플라이싱 인핸서와 예측된 안정한 헤어핀 구조를 형성하는 SSO6 표적에 결합하는 듯 하다(도 3B). SRSF3은 인트론 2의 암호화 3'ss의 억제를 필요로 하고(7) 공통 서열 (A/U)C(A/U)(A/U)C을 갖는 피리미딘-풍부 서열에 결합한다(72). SRSF3의 RNA 인식 모티프와 상호작용하는 CAUC 모티프(73)는 암호화 3'ss의 바로 상류에 존재한다.
인간 유전자 질환에서 인트론 잔류 수준 정상화
이들 결과는 제1형 당뇨병 소인이 있는 일배체형으로 부터의 낮은 효율의 스플라이싱 및 낮은 INS 발현을 보상하기 위해 비유전자 수단을 사용하는 기회를 제공한다.
일반적인 변이체 예컨대 rs689는 자가면역 질환을 포함한, 복합 특질의 유 전성에 상당한 정도로 기여하지만(74), 그들의 기능적 및 구조적 결과는 거의 알려져 있지 않다. 최적 INS SSO가 안전하고 효율적으로 발생되는 흉선에 도입되면, 이 접근법은 제1형 당뇨병의 주요 자가-항원에 대한 내성을 촉진시키는 신규한 예방적 접근법을 제공할 수 있다. 이러한 중재법에 가장 명백한 후보는 HLA 및 INS 유전자좌에서 질환-소인 대립유전자에 대한 아이 동형접합체에 영향을 미치는 모체이다. 이러한 유전자형은 형제에 대한 극도로 높은 질환 위험성과 연관되었다(75). 제1형 당뇨병의 1차 예방이외에도, 향후 SSO-기반 요법은 진단시 유의한 잔류 B 세포 활성을 갖는 환자 및 B 세포 이식을 받을 수 있고 이식된 세포로부터 프로인슐린 발현의 증가된 인트론-매개 향상으로 이득을 얻을 수 있는 개체에게 적용할 수 있다. 또한 다중기능성 SSO를 사용해 다수 스플라이싱 조절 모티프를 표적화하여 인트론 스플라이싱 및 프로인슐린 발현의 보다 극적인 향상을 통해 당뇨병이 있는 다른 환자에 이 치료적 양식을 사용하는 것을 상상하는 것이 가능하다. SSO는 외생성 및 내생성 프로인슐린 발현 둘 모두에 대한 그들의 영향을 시험하기 위한 보다 자연적인 시스템을 제공할 수 있는 흉선 상피 세포 및 13-세포에서의 활용성을 가질 수 있다. 마지막으로, 유사한 안티센스 전략은 골수증식성 질환의 U2AF35의 아연 핑거 도메인에서의 특이적 치환으로 예시된 바와 같이(76), 스플라이싱 인자 유전자의 체액성 돌연변이로 인해 암 세포에서 만연된 인트론 잔류를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다.
악성 세포에서 인트론 잔류 감소
U2AF-결핍 HEK293 세포에서 우선적으로 잔류된 146개 인트론 서열 세트를 c복제된, 폴리A-선택 샘플 유래의 RNAseq 데이터를 사용해 선별한 후, 게놈 브라우저에서 각 인트론 잔류 사건을 검사하였다. 이들 서열은 http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker에서 이용할 수 있는 RepeatMasker의 감응성 형태를 사용해 반복-차폐하였다. INS 인트론 1 잔류를 감소시키기 위한 최적 안티센스 표적[Kralovicova J et al(2014). Nucleic Acids Res doi: 10.1093/nar/gku507, 2014년 6월 17일 공개]은 CCCAG, AGGCC(문헌 [Kralovicova et la. 2014]의 도 4)를 포함한, 포유동물에서 보존된 인트론 스플라이싱 조절 성분[Yeo GW, et al(2007). PLoS Genet 3:e85]과 중복되므로, 이들 짧은 펜타머 내지 햅타머 모티프를 함유하고 인트론 스플라이싱 조절 모티프 세트에서 독립적으로 유도된 인트론 절편의 안티센스 표적[Voelker RB, & Berglund JA(2007). Genome Res 17:1023-1033]을 선택하였고, 따라서 RNA 프로세싱에 영향을 주는 이들 표적과 상호작용하는 올리고뉴클레오티드의 기회가 증가되었다. 표적 서열에 대해 G-사중체 형성을 피하도록 C 연속부 함유 서열의 제거를 포함해, 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 디자인을 수행하였다. 5' 및 3' 스플라이싱 부위, 폴리피리미딘 트랙, 분지점 및 초분지 영역의 근접을 또한 피하였다. 이러한 선택은 U2AF-감응성 인트론의 총 길이의 ∼15%를 포괄하고, 모든 인간 인트론 서열의 ∼0.001%를 대표하는, 388개 화합물 세트(표 3)를 산출하였다. 따라서, 이러한 세트의 올리고뉴클레오티드 표적 영역은 U2-의존적 인트론의 스플라이싱 억제성 서열에 대해 농축되었고, 이는 U2 경로에서 돌연변이 또는 결실을 지속하는 악성 세포에서 보조 인자로부터 충분한 도움을 받지 못하였다.
인슐린 관련 서열
후보 SSO 서열
주: "*" 표시된 후보는 도 4에 기술된 위너 올리고이다.
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Figure pct00015
Figure pct00016
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암 관련 서열
하기 표(표 3)의 서열들은 우라실 잔기를 치환시킨 티민 잔기로 제공할 수 있다(예, DNA 형태로). 하기 표의 각 서열은 본 발명의 다중핵산 중합체의 실시형태이다. "화합물 명칭" 하에 하기 표(표 3)에 언급된 각 유전자 또는 ORF는 인트론 잔류의 교정을 위한 유전자 표적을 포함한다.
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본 발명의 바람직한 실시형태를 본원에서 확인하고 기술하였지만, 이러한 실시형태들은 단지 예로서 제공된 것임이 당업자에게는 자명하다. 본 발명을 벗어나지 않고 수많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 일어날 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기의 청구항이 본 발명의 범주를 한정하며 이들 청구항 범주 내의 방법 및 구조들 및 그들 균등물을 이에 포괄하고자 한다.
기술된 특정 방법, 조성물, 및 키트가 다양할 수 있다. 또한 본원에서 사용된 용어들은, 본 발명의 범주는 오직 첨부된 청구항에 의해 제한되므로, 단지 특정 실시형태를 설명하려는 목적이고, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값들이 제공되는 경우, 각각의 값은 "약" 특정 값 또는 범위로 표현됨을 이해한다. "약"은 또한 정확한 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 5 ㎕"는 "약 5 ㎕" 또는 "5 ㎕"를 의미할 수 있다. 대체로, 용어 "약"은 언급한 값의 10% 이내로 예상되는 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 표제부는 오직 구조적인 목적이며 설명된 대상을 한정하려는 것으로 이해하지 않는다.
달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 대상이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 설명은 예시적이고 단지 설명을 위한 것이며 청구된 임의의 대상을 한정하는 것이 아니다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 특별히 언급하지 않으면 복수를 포함하고자 한다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 달리 명확하게 언급하지 않으면 복수 의미를 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않으면 "및/또는"을 의미할 수 있다. 또한, 용어 "포함하는"을 비롯하여 다른 형태 예컨대 "포함한다", "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한적이지 않다.
참조로 편입
이 명세서에서 언급한 모든 출판물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조하여 편입된다고 시사한 바와 동일한 정도로 그 전체를 참조하여 본원에 편입시킨다.
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SEQUENCE LISTING <110> University of Southampton <120> Reducing Intron Retention <130> JDM73649P.WOP <140> PCT/GB2015/051756 <141> 2015-06-16 <150> GB1410693.4 <151> 2014-06-16 <160> 462 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 1 cugcagagcu ggggccug 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 2 ctgcagagct ggggcctg 18 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 caggccccag cucugcag 18 <210> 4 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 4 ugcagagcug gggccu 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 5 tgcagagctg gggcct 16 <210> 6 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 aggccccagc ucugca 16 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 7 gcagagcugg ggccug 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 8 gcagagctgg ggcctg 16 <210> 9 <211> 16 <212> RNA <213> Homo 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uaccuugaaa au 22 <210> 88 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 gagggcaauc uucagaauuc ag 22 <210> 89 <211> 35 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 uaaucagauu ugacaguugg cuuucugaaa guuuu 35 <210> 90 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 acauuucugg agaauuauaa uaaacuuau 29 <210> 91 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 caauuacaca gauucauuua gaua 24 <210> 92 <211> 32 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 ucagauuugc uacuuugaau uuagcacauu au 32 <210> 93 <211> 31 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 aaauaaagcu cauuaaucuc ccauuuucau g 31 <210> 94 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 ugaaaaugaa aaaaauaaau gu 22 <210> 95 <211> 34 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 gcuacaaaca cucuguaaau agcuuagaaa aacu 34 <210> 96 <211> 34 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 caugauuucu auaagacaga aauagagcag auaa 34 <210> 97 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 caauuaccaa cagauuuucu ucaucaaug 29 <210> 98 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 acauaaacuu 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326 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 326 caauuugaau gcacauuuga u 21 <210> 327 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 327 cgacagacgu ggccaaggca 20 <210> 328 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 328 agacacagca accgaagcca acacu 25 <210> 329 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 329 acacaggccg cgggcuccac aaac 24 <210> 330 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 330 gagcuccauu acucuccuca u 21 <210> 331 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 331 caccucccgc caaccauucc 20 <210> 332 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 332 uuccuucaua uuuccagagu c 21 <210> 333 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 333 uccccagcuc ugaaaucucu 20 <210> 334 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 334 cucacacaag caggagaaag gagau 25 <210> 335 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 335 cuagucuuca gcccacccag 20 <210> 336 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 336 acaauacuua gaaacacaua augg 24 <210> 337 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 337 cguagaauuu aaaccacc 18 <210> 338 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 338 cacauuaugu uaauuaacaa c 21 <210> 339 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 339 agaagaaaaa caaaauuauu uaauaaaau 29 <210> 340 <211> 37 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 340 uaacugaaau gaauucauuc aagaggaaaa uauggaa 37 <210> 341 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 341 ucagaauuac agaguaagga aaagaccu 28 <210> 342 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 342 ggcaucacaa aaugacuuua auuucugga 29 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 343 cuaaccccag agaggucucu a 21 <210> 344 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 344 uggagacccu gggucccugc ag 22 <210> 345 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 345 ccacaggagc ucugggcu 18 <210> 346 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 346 ugggcccacc gccaaagcag cg 22 <210> 347 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 347 uccacgcccu ugaagagguc acggcgg 27 <210> 348 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 348 auuucucucu uuuaaaaagc ug 22 <210> 349 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 349 gcacaaaaga aaagaccaaa agu 23 <210> 350 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 350 cagaagucaa aaagauuugg aggaaag 27 <210> 351 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 351 aaaccucaga agucaaaaag au 22 <210> 352 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 352 uaugacaauc caaacaggc 19 <210> 353 <211> 31 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 353 uaagaaaggg cgcucccaca ugcucuuuag g 31 <210> 354 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 354 uccuaaaaua ucuugacaag caau 24 <210> 355 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 355 aagcucacau uacagggaag aggga 25 <210> 356 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 356 ucauuuuauu aacaagaaga guc 23 <210> 357 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 357 accaagaacu gaauucuauu ucagg 25 <210> 358 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 358 gaaacacggg caaccaugca agagagacu 29 <210> 359 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 359 cccaccagga cugaccccuc cc 22 <210> 360 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 360 cccuccugcu gcuggaagca ggucc 25 <210> 361 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 361 gucacagaaa ugugaaaaug cacc 24 <210> 362 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 362 uucuuuagga agcaggacug a 21 <210> 363 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 363 gacucagccc cagcaaaucc gc 22 <210> 364 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 364 gcacccggcu ccggcccc 18 <210> 365 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 365 gcaaaucaca cucccucuga guuggaagc 29 <210> 366 <211> 37 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 366 ccgccuccag accgauccca cccggaacac agauggg 37 <210> 367 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 367 auaccgaaga gaagcaggga c 21 <210> 368 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 368 cccagaggga aaagcaaaag cugagg 26 <210> 369 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 369 gcagacaggc ucacguuucu cu 22 <210> 370 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 370 cccagacaag aacucuccuc ag 22 <210> 371 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 371 gcugggccuc agcagga 17 <210> 372 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 372 cuuacugagg cuggcacgaa gacc 24 <210> 373 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 373 ccuuaaguuu aaaaauacug a 21 <210> 374 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 374 aaauguuucu aaauuauuca uaaagaug 28 <210> 375 <211> 32 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 375 aauacuuuca uauuuuuauu uacuuuaccu cc 32 <210> 376 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 376 ucuuuaauaa gaaaauacau ggaacaca 28 <210> 377 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 377 uauucuauau uuuaauucua agauacucu 29 <210> 378 <211> 43 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 378 ugaaagacag acuuuuuuca acacuaccuu aaaaacuuaa gac 43 <210> 379 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 379 aagaucuaau uuuacuauua agcac 25 <210> 380 <211> 32 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 380 uauuuguuuc cuuuaaagau uuuauaaaag cu 32 <210> 381 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 381 ccugccaaca gcaacugc 18 <210> 382 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 382 acgugcuggg aaccagccag c 21 <210> 383 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 383 uccgccccca uccacaggag aug 23 <210> 384 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 384 ggcuuagggu uaggcucauc ugaggau 27 <210> 385 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 385 cugaaauaac uagaguucua agacacga 28 <210> 386 <211> 36 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 386 caggaccugc cgccagccuc ggccaggcag gcacgg 36 <210> 387 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 387 ccacagaagc ccuacagcuc c 21 <210> 388 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 388 cggugcagcg gucccagagu cc 22 <210> 389 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 389 aggcuugucc aucaaagaaa uc 22 <210> 390 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 390 agggcgaaag gaaaggaagg aug 23 <210> 391 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 391 agccccacuu ccucagaaca gg 22 <210> 392 <211> 35 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 392 ggaaaagaga aagagacagg agaaaacaag agggu 35 <210> 393 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 393 aacuugagag uacagaaaaa gcagg 25 <210> 394 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 394 ccaguggcca gguuuucuag a 21 <210> 395 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 395 acgaacagau uagaaauaac u 21 <210> 396 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 396 cuguagaaaa uguaaagaag agaaagc 27 <210> 397 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 397 uagaauucag acaggaaagg g 21 <210> 398 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 398 caaaccaugc aaagaggagg aagagaaa 28 <210> 399 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 399 ccuccagacc cucaaagc 18 <210> 400 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 400 ccgccuggcu gggaggg 17 <210> 401 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 401 agcagcccca gccccugg 18 <210> 402 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 402 ccccacccac agugccag 18 <210> 403 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 403 cucagggauc cgacgcagag 20 <210> 404 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 404 uguuugaaug cggaagucau cc 22 <210> 405 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 405 auccucaggc agcuuucaac c 21 <210> 406 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 406 ugaucucagc cucaccuag 19 <210> 407 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 407 cacagauuua ugauaauaag aaaccauua 29 <210> 408 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 408 cuucuaauuc uagaugacau ag 22 <210> 409 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 409 gccgcuuccg uuuaauaaaa gcauc 25 <210> 410 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 410 cugguagaaa gagacugagc 20 <210> 411 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 411 cuuaguggca agaugcauaa aag 23 <210> 412 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 412 ugcaaaauuu ggaaauuguu uuaa 24 <210> 413 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 413 cacuuaaaca gauauacaaa gugugaa 27 <210> 414 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 414 ugacagcuga aguuccacaa 20 <210> 415 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 415 auggaacaag uccuucacau 20 <210> 416 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 416 uucaggaaag acaacaaaua uaaaca 26 <210> 417 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 417 uauuugacau uuaauuuaau aca 23 <210> 418 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 418 uaauuuucuc ugaacuucua aaacagu 27 <210> 419 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 419 caacuaacaa auaauagaaa aauccaa 27 <210> 420 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 420 uuaauuucau uuauauuaua aaucaugu 28 <210> 421 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 421 gacagacaag aauguuaaac agaaaua 27 <210> 422 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 422 gaagcucugc aagaauucca gcaugcac 28 <210> 423 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 423 ggaaacagau gcuacauaaa uc 22 <210> 424 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 424 gagcaagggc cugagauuuu gcaagcaug 29 <210> 425 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 425 cuucagaugc aacccugaca agggacuaau 30 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 426 gccccugccc uuucugucuc a 21 <210> 427 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 427 guuaaaacau agguuauaaa agaagaac 28 <210> 428 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 428 uagaagaaag caaaacaaca aaacu 25 <210> 429 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 429 aguaaaccaa aaauaaugg 19 <210> 430 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 430 uuugagaaaa aaaugcaauu gacaa 25 <210> 431 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 431 auucuguccc aggaccuagg agu 23 <210> 432 <211> 29 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 432 ugcagagcag cuugucuuuc uucugagag 29 <210> 433 <211> 31 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 433 uacucacggc ucgugucuuc agaagccaag g 31 <210> 434 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 434 ccuuccccac ucaggucagc ugcua 25 <210> 435 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 435 agcuggggcc uggggu 16 <210> 436 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 436 ugcagagcug gggccugggg u 21 <210> 437 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 437 caugcuucac gagcccagcc 20 <210> 438 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 438 aaggcugcgg cuggguc 17 <210> 439 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 439 ugguagaggg agcagaugcu g 21 <210> 440 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 440 ugguacagca uuguuccaca 20 <210> 441 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 441 cgcacacuag guagagagc 19 <210> 442 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 442 gaugcagccu guccuggag 19 <210> 443 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 443 gagcccaccu gacgcaaagg c 21 <210> 444 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 444 uggagggcug agggcugcu 19 <210> 445 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 445 auggccucuu cugaugca 18 <210> 446 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 446 ucacccccac augcuuc 17 <210> 447 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 447 acaugcuuca cgag 14 <210> 448 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 448 cuggggccug gggu 14 <210> 449 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 449 ugcagagcug gggccu 16 <210> 450 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 450 aggugcucgc gggugg 16 <210> 451 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 451 ggguggaagc guccggucgu g 21 <210> 452 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 452 acacacugug ccucgccagc 20 <210> 453 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 453 gacucacuug ccguaguuaa 20 <210> 454 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSO <400> 454 cacgcucagu agagaaggc 19 <210> 455 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 455 ggauuccagg guggcuggac cccaggcccc 30 <210> 456 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 456 ggauuccagg guggcugg 18 <210> 457 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 457 ggauuccagg guggcugcac gccaggcccc 30 <210> 458 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 458 ggauuccagg guggcuggac ccgaggcgcc 30 <210> 459 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 459 ggauuccagg augguaggac ccgaggcgcc 30 <210> 460 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 460 ggauuccagg augguaggac cccaggcccc 30 <210> 461 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 461 ggauuccagg guugcuggac cccagucccc 30 <210> 462 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 462 ggauuccagg guugcuggac ccgagucgcc 30

Claims (129)

  1. 성숙한 유전자 전사물에서 인트론 잔류(intron retention)의 교정 단계를 포함하는 피험체에서의 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 질환은 유전자 전사물의 인트론 잔류로 야기된 결함적 단백질 발현에 의해 유도되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인트론 잔류의 교정 단계는 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 또는 치료 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인트론 잔류의 교정 단계는 유전자 전사물과 혼성화하도록 배열되고 정규(스템 루프); 비정규(G 사중체) RNA 구조의 입체형태 전이; 트랜스-작용 인자와의 상호작용; 및 RNA-단백질 복합체 형성 속도 중 1 이상을 방해하도록 배열된 다중핵산 중합체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 또는 치료 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 인트론 스플라이싱 조절 성분을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역 중 적어도 일부분에 대한 안티센스인 예방 또는 치료 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 46; 또는 서열번호 46과 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역 중 적어도 일부분에 대한 안티센스인 예방 또는 치료 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 또는 서열번호 3과 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역 중 적어도 일부분에 대한 안티센스인 예방 또는 치료 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 3; 서열번호 6; 서열번호 9; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 18; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 27; 서열번호 30; 서열번호 33; 서열번호 36; 서열번호 39; 서열번호 42; 서열번호 45; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 표적 영역에 대한 안티센스인 예방 또는 치료 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군 중 어느 하나와 95% 이상의 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 전사물의 영역에 대한 안티센스인 예방 또는 치료 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군 중 어느 하나에서 선택된 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군 중 어느 하나에서 선택된 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드인 예방 또는 치료 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 이의 안정성이 증가되도록 개질되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 단백질 또는 앱타머에 연결되고, 여기서 단백질은 스플라이싱 및 인트론 제거를 강화, 억제 또는 조정하기 위한 스플라이싱 인자인 예방 또는 치료 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 세포 또는 조직으로 및/또는 세포 또는 조직 내로 다중핵산 중합체를 전달하는데 적합한 전달 비히클에 접합되거나 또는 결합되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  15. 제1항 내지 제7항, 제9항, 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 전사물은 프로-인슐린을 코딩하는 것인 예방 또는 치료 방법.
  16. 제1항 내지 제4항, 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 전사물은 ABCD4 ABCF3; ACADVL; ALKBH6; AP1G2; APEX1; ARFRP1; ATHL1; ATP1A3; ATP5D; ATP13A1; BAX; BDH2; BRD2; C1orf63; C1orf630; C1orf631; C1orf124; C2orf49; C8orf82; C16orf59; CAPRIN2; CASKIN2; CDCA7; CEP164; CEP170; CLCN7; CPNE1; CPSF3L; DCXR; DENND4B; DFFA; DIS3L2; DNAJB12; DPF1; DRG2; DSN1; EML3; EWSR1; EWSR10; FGFR4; FTSJ1; GBAP1GMPPA; GMPR2; GNPTG; GORASP1; GPATCH4; HGS; HMG20B; IFFO1ISYNA1; KRI1; LOC148413; LZTR1; MAN2C1; MAP4K2; MCOLN1; MDP1; MIB2; MITD1; MOK; MOV10; MRPL35; MTMR11; MUS81; NAPEPLD; NBEAL2; NDRG4NDUFB10; NFATC4; NFKBIB; NIT1; NKTR; NPRL2; NSUN5P1; NUDT22; PAN2; PDDC1; PDLIM4; PHF1; PIK3CD; PITPNM1; PPIL2; PPP1R35; PPP4C; PQLC2; PRPF39; PSME2; PTPMT1; QARS; RAD52; RHOT2; RMND5B; RNF123; RPL10A; RPP21; RPS6KB2RUSC1; SCRN2; SCYL1; SFR1; SGSM3; SIRT7; SLC25A3; SLC30A7; SLC37A4; STK19; STX10; TCF25; TOMM40; TP53I3; TRIM41; TRPT1; TSTA3; TTC14; TTC140; TUBGCP6; U2AF1L4UCK1; UNC45A; VAMP1; VAMP10; VARS; VPS28; WDR24; WDR90; WRAP53; YDJC; YIPF3; ZCCHC8; ZCCHC18; ZFAND1; ZNF131; ZNF300ZNF317; ZNF692; ZNF711; ZNRD1; ZWINT; 또는 이의 조합을 포함하는 유전자 또는 ORF 중 어느 하나에서 선택된 유전자 또는 ORF에서 전사되는 것인 예방 또는 치료 방법.
  17. 제1항 내지 제7항, 제9항, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 당뇨병인 예방 또는 치료 방법.
  18. 제1항 내지 제4항, 제8항, 제10항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 암인 예방 또는 치료 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 병리형이 치료 전에 유전자 전사물의 인트론 잔류에 의해 야기되는 것인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 예방 또는 치료 방법.
  20. 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법으로서, 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 상기 영역은 서열번호 46, 또는 서열번호 46과 95% 이상의 동일성을 갖는 영역을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 조정 방법.
  21. 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법으로서, 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 상기 영역은 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 95% 이상의 동일성을 갖는 영역을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 조정 방법.
  22. 세포에서 인트론 스플라이싱을 조정하는 방법으로서, 다중핵산 중합체를 프리-mRNA 영역과 혼성화시키는 단계를 포함하고, 상기 영역은 서열번호 47 내지 434, 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군 중 어느 하나와 95% 이상의 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 조정 방법.
  23. 서열번호 46을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 서열번호 46과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체.
  24. 서열번호 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역, 또는 서열번호 3과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체.
  25. 다중핵산 중합체 영역의 적어도 일부분에 대한 안티센스인 다중핵산 중합체로서, 상기 영역은 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 서열 군의 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 경우에 따라 다중핵산 중합체의 영역은 서열번호 47 내지 434와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 다중핵산 중합체.
  26. 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 43; 및 서열번호 44; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 다중핵산 중합체.
  27. 서열번호 47 내지 434; 또는 이의 조합을 포함하는 군의 어느 하나에서 선택된 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 다중핵산 중합체 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 다중핵산 중합체.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 세포로 다중핵산 중합체를 전달하는데 적합한 전달 비히클에 접합되거나, 또는 결합되는 것인 다중핵산 중합체.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 다중핵산 중합체를 포함하는 벡터.
  30. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 다중핵산 중합체를 포함하거나, 또는 그에 결합된 전달 비히클.
  31. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항의 다중핵산 중합체, 또는 제29항에 따른 벡터, 또는 제30항에 따른 전달 비히클을 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 추가의 생물학적 활성 분자를 더 포함하는 조성물.
  33. 치료를 위해 피험체를 선별하는 방법으로서, 피험체가 유전자 전사물의 인트론 잔류로 인해 야기된 결함적 단백질 발현에 의해 유도된 질환을 갖는지 여부를 결정하는 단계로서, 양성 확인 시, 피험체는 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 다중핵산 중합체, 또는 제29항에 따른 벡터, 또는 제30항에 따른 전달 비히클, 또는 제31항 또는 제32항에 따른 조성물에 의한 치료를 위해 선별되는 것인 단계, 및 경우에 따라 피험체를 치료하는 단계를 포함하는 것인 선별 방법.
  34. 암 세포에서 인트론 잔류의 교정에 의해 유전자 발현을 정상화시키기 위한 안티센스 다중핵산 중합체의 용도.
  35. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 전사물은 인트론 스플라이싱 조절 성분인 방법.
  36. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 2개의 G 사중체 사이에 존재하는 것인 방법.
  37. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제1 CCC 모티프를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제2 CCC 모티프를 더 포함하는 것인 방법.
  39. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 CCCAG 또는 AGGCC 모티프를 더 포함하는 것인 방법.
  40. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 G 사중체를 형성하지 않는 것인 방법.
  41. 선행 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 유전자 전사물과 특이적으로 혼성화하는 것인 방법.
  42. 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체로서, 상기 표적 서열은 2개의 G 사중체 사이에 존재하고, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있는 것인 다중핵산 중합체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  44. 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체로서, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화하고, 상기 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제1 CCC 모티프를 포함하며, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있는 것인 다중핵산 중합체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 제2 CCC 모티프를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 제1 CCC 모티프는 제2 CCC 모티프로부터 약 3개 이상의 뉴클레오티드 염기 떨어져 있는 것인 약학 조성물.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 CCCAG 또는 AGGCC 모티프를 포함하는 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  48. 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체로서, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않으며, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있는 것인 다중핵산 중합체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에 피리딘 뉴클레오티드를 포함하는 것인 약학 조성물.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 3' 말단 위치 및/또는 5' 말단 위치에 2개의 연속적인 피리딘 잔기를 포함하는 것인 약학 조성물.
  51. 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체로서, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 헤어핀 구조를 형성하며, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있는 것인 다중핵산 중합체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  52. 단백질을 코딩하고 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 혼성화하는 다중핵산 중합체로서, 상기 다중핵산 중합체는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 잔류된 인트론의 스플라이싱에 의한 제거를 유도할 수 있는 것인 다중핵산 중합체; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 다중핵산 중합체는 추가로 헤어핀 구조를 탈안정화시킬 수 있는 것인 약학 조성물.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클은 세포 투과 펩티드 또는 펩티드-기반 나노입자를 포함하는 것인 약학 조성물.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클은 이온 결합에 의해 다중핵산 중합체와 복합체를 형성하는 것인 약학 조성물.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 50개, 약 10 내지 약 45개, 약 10 내지 약 40개, 약 10 내지 약 30개, 약 10 내지 약 25개, 또는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드인 약학 조성물.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%, 또는 100% 상보적인 약학 조성물.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 미스매치를 갖는 것인 약학 조성물.
  59. 제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 뉴클레오시드 모이어티 또는 포스페이트 모이어티에서 개질되는 것인 약학 조성물.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 1 이상의 인공 뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 약학 조성물.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 1 이상의 인공 뉴클레오티드 염기는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 개질된, 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA), 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미디트를 포함하는 것인 약학 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 다중핵산 중합체는 다중핵산 중합체의 뉴클레오시드 모이어티의 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에서 개질되는 것인 약학 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 2' 히드록실 기에서의 개질은 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 모이어티에 의한 것인 약학 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 메틸 기가 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에 부가되어 2'-O-메틸 리보스 모이어티가 생성되는 것인 약학 조성물.
  65. 제63항에 있어서, 메톡시에틸 기가 리보스 모이어티의 2' 히드록실 기에 부가되어 2'-O-메톡시에틸 리보스 모이어티가 생성되는 것인 약학 조성물.
  66. 제63항에 있어서, 2' 히드록실 기에서의 개질은 메틸렌 기에 의해 4' 탄소에 연결되는 것인 약학 조성물.
  67. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 리보스 고리가 6원 몰폴리노 고리로 치환되어 몰폴리노 인공 뉴클레오티드 유사체가 생성되는 것인 약학 조성물.
  68. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트 골격이 올리고글리신-유사 모이어티로 치환되어 펩티드 핵산(PNA)이 생성되는 것인 약학 조성물.
  69. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트 골격은 티올 기 또는 메틸 기에 의해 개질되는 것인 약학 조성물.
  70. 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이의 조합이 개질되는 것인 약학 조성물.
  71. 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 개질은 피험체의 내생성 뉴클레아제로부터 다중핵산 중합체를 보호하는 것인 약학 조성물.
  72. 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 개질된 다중핵산 중합체는 RNA의 RNase H 절단을 유도하는 능력을 감소시키거나 또는 유도하지 않는 것인 약학 조성물.
  73. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 이의 안정성이 증가되도록 개질되는 것인 약학 조성물.
  74. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 13개 이상의 인접한 염기와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 포함하거나 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  75. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 46의 10개 이상의 인접한 염기를 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  76. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 63%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  77. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 3과 적어도 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  78. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43, 및 서열번호 44, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 63%, 70%, 80%, 90% 또는 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 약학 조성물.
  79. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 포함하거나, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하고, 경우에 따라 우라실 뉴클레오티드는 티민 뉴클레오티드로 치환되는 것인 약학 조성물.
  80. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 서열번호 47-434, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 서열의 13개 이상의 인접한 염기와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 포함하는 mRNA 전사물과 혼성화하는 것인 약학 조성물.
  81. 제42항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 혼성화는 특이적 혼성화인 약학 조성물.
  82. 제42항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 합성된 다중핵산 중합체인 약학 조성물.
  83. 제42항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체를 포함하는 약학 조성물은 정맥내 또는 피하 투여로 투여되는 것인 약학 조성물.
  84. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 질환 또는 병태는 단백질의 손상된 생산과 연관되거나 또는 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 것인 조성물.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 질환인 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사된 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 조성물.
  88. 제86항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사된 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 조성물.
  89. 제86항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 조성물.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병인 조성물.
  91. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 암인 조성물.
  92. 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 피험체가 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태를 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및
    b) 피험체가 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태를 갖는 경우 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 단백질의 손상된 생산과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 위해 피험체를 선별하는 단계를 더 포함하는 조성물.
  93. 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 피험체가 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및
    b) 피험체가 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 갖는 경우 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 결함적 스플라이싱을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료를 위해 피험체를 선별하는 단계를 더 포함하는 조성물.
  94. 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 피험체에서 상기 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    a) 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물에서 인트론의 스플라이싱에 의한 제거의 증가를 유도하는 치료제; 및
    약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 전달 비히클
    을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계로서,
    상기 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 카피들을 코딩할 수 있고 각각은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 번역을 억제하는 1 이상의 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 풀을 갖는 것인 단계; 및
    b) 피험체의 표적 세포를 치료제와 접촉시켜 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분이 스플라이싱을 진행하도록 유도시켜 그 일부분의 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 각각으로부터 1 이상의 잔류된 인트론을 제거하여, 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하는 단계로서, 상기 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물은 번역되어 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 카피들을 발현함으로써 질환 또는 병태가 치료되는 것인 단계
    를 포함하는 치료 방법.
  95. 제94항에 있어서, 치료제는 세포 내 1 이상의 스플라이싱 단백질 복합체의 활성을 야기시켜 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물 풀의 일부분에서 각각의 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 1 이상의 잔류된 인트론을 제거하는 것인 치료 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 억제하는 것인 치료 방법.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질을 활성화시키는 것인 치료 방법.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 인트론 스플라이싱 활성을 조절하는 단백질에 결합하는 것인 치료 방법.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 것인 치료 방법.
  100. 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 다중핵산 중합체인 치료 방법.
  101. 제94항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 소형 분자인 치료 방법.
  102. 제94항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물은 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항의 약학 조성물인 치료 방법.
  103. 제94항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 정상 이하 생산을 포함하는 것인 치료 방법.
  104. 제94항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 발현 부재 또는 질환 또는 병태를 야기할 만큼 충분히 낮은 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 발현 수준에 기인하는 것인 치료 방법.
  105. 제94항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 단백질 생산의 부재 또는 단백질의 결함적 형태의 생산을 포함하는 것인 치료 방법.
  106. 제105항에 있어서, 단백질의 결함적 형태는 단백질의 절두 형태, 단백질의 미스폴딩된 형태 또는 비정상적 표적 결합된 단백질 형태인 치료 방법.
  107. 제94항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체의 치료는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 증가된 발현을 일으키는 것인 치료 방법.
  108. 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하기 위해 잔류된 인트론을 제거하도록 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 프로세싱을 유도하는 방법으로서,
    a) 단리된 다중핵산 중합체를, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩할 수 있고 1 이상의 잔류된 인트론을 포함하는, 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물과 혼성화시키는 단계;
    b) 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 1 이상의 잔류된 인트론을 제거하여 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물을 생산하는 단계; 및
    c) 완전하게 프로세싱된 mRNA 전사물로부터 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 번역하는 단계
    를 포함하는 것인 유도 방법.
  109. 제108항에 있어서, 단리된 다중핵산 중합체를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 유도 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 단백질의 전체 길이의 기능적 형태의 손상된 생산은 질환 또는 병태와 상관있는 것인 유도 방법.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 질환인 유도 방법.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손을 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 유도 방법.
  113. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 완전하게 프로세싱된 mRNA로 적절하게 전사되는 경우 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 코딩하는 엑손 세트를 포함하는 유전자 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 유도 방법.
  114. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 유전성 질환을 갖는 피험체는 단백질의 전체 길이의 기능적 형태를 생산할 수 없는, 유전자의 결함적 카피를 포함하는 게놈을 갖는 것인 유도 방법.
  115. 제108항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 당뇨병인 유도 방법.
  116. 제108항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태는 암인 유도 방법.
  117. 제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 안티센스 서열인 유도 방법.
  118. 제108항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 잔류된 인트론과 혼성화하는 것인 유도 방법.
  119. 제108항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 인트론 스플라이싱 조절 성분과 혼성화하는 것인 유도 방법.
  120. 제119항에 있어서, 인트론 스플라이싱 조절 성분은 CCC 모티프를 포함하는 것인 유도 방법.
  121. 제108항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 G 사중체를 형성하지 않는 것인 유도 방법.
  122. 제108항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 2개의 G 사중체 사이에 존재하는 것인 유도 방법.
  123. 제108항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 결합 모티프와 혼성화하고, 상기 결합 모티프는 제1 CCC 모티프 및 제2 CCC 모티프를 갖는 것인 유도 방법.
  124. 제123항에 있어서, 제1 CCC 모티프는 제2 CCC 모티프로부터 약 3개 이상의 뉴클레오티드 염기 떨어져 있는 것인 유도 방법.
  125. 제101항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%, 또는 100% 상보적인 유도 방법.
  126. 제108항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체의 서열은 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사물의 표적 서열에 대해 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 미스매치를 갖는 것인 유도 방법.
  127. 제108항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 다중핵산 중합체는 길이가 약 10 내지 약 50개, 약 10 내지 약 45개, 약 10 내지 약 40개, 약 10 내지 약 30개, 약 10 내지 약 25개, 또는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드인 유도 방법.
  128. 제108항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체는 진핵생물 또는 원핵생물인 유도 방법.
  129. 제94항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체는 인간, 마우스, 래트, 인간이외의 영장류, 또는 영장류 이외의 포유동물에서 선택되는 진핵생물인 방법.
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