ES2907033T3 - Reducción de la retención de intrones - Google Patents

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ES2907033T3 ES15729929T ES15729929T ES2907033T3 ES 2907033 T3 ES2907033 T3 ES 2907033T3 ES 15729929 T ES15729929 T ES 15729929T ES 15729929 T ES15729929 T ES 15729929T ES 2907033 T3 ES2907033 T3 ES 2907033T3
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Igor Vorechovsky
Jana Kralovicova
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Abstract

Un polímero de ácido polinucleico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección, donde: (i) dicho polímero de ácido polinucleico se hibrida con una secuencia diana en un intrón completo retenido de un transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde la secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado no comprende un sitio de corte y empalme, y donde el transcrito de ARNm parcialmente procesado que comprende la secuencia diana codifica una forma funcional de longitud completa de una proteína según se codifica por el transcrito de ARNm completamente procesado; y (ii) dicho polímero de ácido polinucleico induce el corte y empalme del intrón completo retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado para producir el transcrito de ARNm completamente procesado que codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína; por ende (iii) la retención de intrones en el transcrito de ARNm se corrige, aumentando así la expresión de la forma funcional de longitud completa de la proteína codificada por el transcrito de ARNm.

Description

DESCRIPCIÓN
Reducción de la retención de intrones
REFERENCIA
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente del Reino Unido N.°: 1410693.4, presentada el 16 de junio de 2014.
ANTECEDENTES
El corte y empalme alternativo puede ser un fenómeno frecuente en el transcriptoma humano. La retención de intrones es un ejemplo de corte y empalme alternativo en el que un ARNm parcialmente procesado conserva la retención de al menos un intrón después de someterse a un corte y empalme parcial. En algunos casos, la presencia de un intrón retenido en un ARNm parcialmente procesado puede prevenir o reducir la traducción de una proteína funcional. ROBERTS ET AL, MOLECULAR THERAPY, NATURE PUBLISHING GROUP, Reino Unido, vol. 14, n.° 4, 1 de octubre de 2006, páginas 471-475, se refieren al intercambio de corte y empalme eficiente y persistente mediante oligonucleótidos de LNA administrados sistémicamente en ratones.
RESUMEN
La presente invención se refiere a un procedimiento para reducir o prevenir la retención de intrones en un transcrito (por ejemplo, un transcrito de ARNm parcialmente procesado) y el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con la retención inadvertida de intrones. La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos descritos en esta invención no forman parte de la invención reivindicada.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para la prevención o tratamiento de una enfermedad en un sujeto que comprende reducir la incidencia de retención de intrones en los transcritos génicos, donde la enfermedad es inducida por la expresión proteica defectuosa provocada por la retención de intrones en los transcritos génicos. En algunos aspectos, se describe un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en la SEQ ID NO: 46, o una región que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 46.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en la SEQ ID NO: 46, o una región que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 46.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en la SEQ ID NO: 3, o una región que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos, se describe un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 46, o una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 46.
En algunos aspectos, se describe un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 3, o una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.
En algunos aspectos, se describe un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico, donde la región comprende o consiste en una secuencia complementaria con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas; u opcionalmente una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 47 a 434.
En algunos aspectos, se describe un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas; y opcionalmente donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina
En algunos aspectos, se describe un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas; y opcionalmente donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina.
En algunos aspectos, se describe una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde la secuencia diana se encuentra entre dos cuádruplex G, donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con el intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado.
En algunos aspectos, se describe una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende un primer motivo c Cc , y donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
En algunos casos, el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende además un segundo motivo CCC. En algunos casos, el primer motivo CCC está a aproximadamente 3 o más bases de nucleótidos del segundo motivo CCC. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un elemento regulador del corte y empalme intrónico que comprende un motivo CCCAG o un motivo AGGCC.
En algunos aspectos, se describe una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión no forma un cuádruplex G, y donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico comprende un nucleótido de piridina en la posición terminal 3' y/o en la posición terminal 5'. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico comprende dos nucleótidos consecutivos de piridina en la posición terminal 3' y/o en la posición terminal 5'.
En algunos aspectos, se describe una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, y donde el motivo de unión forma una estructura de horquilla, donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico es capaz además de desestabilizar la estructura de horquilla. En algunos casos, el vehículo de suministro comprende un péptido de penetración celular o una nanopartícula a base de péptidos. En algunos casos, el vehículo de suministro forma un complejo con el polímero de ácido polinucleico mediante enlace iónico.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50, aproximadamente 10 y aproximadamente 45, aproximadamente 10 y aproximadamente 40, aproximadamente 10 y aproximadamente 30, aproximadamente 10 y aproximadamente 25, o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia del polímero de ácido polinucleico es al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 100 % complementaria con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, la secuencia del polímero de ácido polinucleico tiene 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se modifica en el resto de nucleósido o en el resto de fosfato. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico comprende una o más bases de nucleótidos artificiales. En algunos casos, la una o más bases de nucleótidos artificiales comprenden una modificación por 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo
(2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de etileno (ENA), ácido nucleico peptídico (PNA), ácidos nucleicos de 1', 5'-anhidrohexitol (HNA), morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se modifica en el grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa del resto de nucleósido del polímero de ácido polinucleico. En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' es mediante un resto 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2-O-MOE), 2'-O-aminopropilo,
2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-ON-metilacetamido (2'-O-NMA).
En algunos casos, se añade un grupo metilo al grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa para generar un resto de 2'-O-metil ribosa. En algunos casos, se añade un grupo metoxietilo al grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa para generar un resto de 2'-O-metoxietil ribosa. En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' está unida al carbono 4' por un grupo metileno. En algunos casos, el anillo de ribosa se sustituye por un anillo de morfolino de seis miembros para generar un análogo de nucleótido artificial de morfolino. En algunos casos, la cadena principal de fosfato se sustituye por un resto de tipo oligoglicina para generar ácido nucleico peptídico (PNA). En algunos casos, la cadena principal de fosfato se modifica por un grupo tiol o un grupo metilo. En algunos casos, se modifica el extremo 5', el extremo 3' o una combinación de los mismos. En algunos casos, la modificación protege al polímero de ácido polinucleico de las nucleasas endógenas en el sujeto. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico modificado no induce o tiene una capacidad reducida para inducir la escisión del ARN por la RNasa H. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se modifica para aumentar su estabilidad. En algunos casos, la hibridación es una hibridación específica.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un transcrito de ARNm que comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con al menos 13 bases contiguas de SEQ ID NO:
46. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un transcrito de ARNm que comprende al menos
10 bases contiguas de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un transcrito de ARNm que comprende al menos un 63 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15,
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36,
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, o combinaciones de las mismas. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un transcrito de ARNm que comprende al menos un 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico comprende al menos un 63 %, 70 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 11, : 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, 20, 22, : 23, SEQ ID
Figure imgf000004_0002
25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 31, SEQ ID NO: 32,
Figure imgf000004_0001
: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, 41, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, o combinaciones de las mismas, y opcionalmente donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico comprende al menos un 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 95 %, o comprende un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o combinaciones de las mismas, y opcionalmente donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un transcrito de ARNm que comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con al menos 13 bases contiguas de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 47-434, o combinaciones de las mismas.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico es un polímero de ácido polinucleico sintetizado.
En algunos casos, la composición farmacéutica que comprende el polímero de ácido polinucleico se administra por vía intravenosa o subcutánea.
En algunos aspectos, se describe una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una composición farmacéutica descrita en esta invención. En algunos casos, la enfermedad o afección está asociada a una producción alterada de una proteína o está caracterizada por un corte y empalme defectuoso. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad hereditaria. En algunos casos, un sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en ARNm completamente procesado, codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, un sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcribe correctamente en ARNm completamente procesado, codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, un sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia defectuosa del gen, que es incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, la enfermedad o afección es diabetes. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer. En algunos casos, la composición para su uso comprende además seleccionar un sujeto para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a una producción alterada de una proteína que comprende (a) determinar si el sujeto
tiene la enfermedad o afección asociada a una producción alterada de la proteína; y (b) administrar al sujeto una composición farmacéutica de las reivindicaciones 42-82 si el sujeto tiene la enfermedad o afección asociada a una producción alterada de la proteína. En algunos casos, la composición para su uso comprende además seleccionar un sujeto para el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por un corte y empalme defectuoso, que comprende (a) determinar si el sujeto tiene la enfermedad o afección caracterizada por el corte y empalme defectuoso; y (b) administrar al sujeto una composición farmacéutica de las reivindicaciones 42-82 si el sujeto tiene la enfermedad o afección caracterizada por el corte y empalme defectuoso.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para tratar una enfermedad o afección caracterizada por la producción alterada de una forma funcional de longitud completa de una proteína en un sujeto que lo necesite, que comprende: (a) administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende: un agente terapéutico que induce un aumento en el corte y empalme de un intrón en un transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro; donde el sujeto tiene un grupo de transcritos de ARNm parcialmente procesados, que son capaces de codificar copias de la forma funcional de longitud completa de la proteína y cada uno de los cuales comprende al menos un intrón retenido que inhibe la traducción de los transcritos de ARNm parcialmente procesados; y (b) poner en contacto una célula diana del sujeto con el agente terapéutico para inducir en una porción del grupo de los transcritos de ARNm parcialmente procesados el corte y empalme para eliminar el al menos un intrón retenido de cada uno de los transcritos de ARNm parcialmente procesados en la porción, para producir transcritos de ARNm completamente procesados, donde los transcritos de ARNm completamente procesados se traducen para expresar copias de la forma funcional de longitud completa de la proteína, que tratan la enfermedad o afección.
En algunos casos, el agente terapéutico provoca la activación de uno o más complejos de proteínas de corte y empalme en la célula para eliminar al menos un intrón retenido de cada uno de los transcritos de ARNm parcialmente procesados en la porción del grupo de los transcritos de ARNm parcialmente procesados. En algunos casos, el agente terapéutico inhibe una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. En algunos casos, el agente terapéutico activa una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. En algunos casos, el agente terapéutico se une a una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. En algunos casos, el agente terapéutico se une a la secuencia de polinucleótidos diana de los transcritos de ARNm parcialmente procesados. En algunos casos, el agente terapéutico es un polímero de ácido polinucleico. En algunos casos, el agente terapéutico es una molécula pequeña.
En algunos casos, la composición farmacéutica es la composición farmacéutica descrita en esta invención.
En algunos casos, la producción alterada de una forma funcional de longitud completa de la proteína comprende una producción por debajo de lo normal de la forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, la producción alterada de una forma funcional de longitud completa de la proteína se debe a la ausencia de expresión de la forma funcional de longitud completa de la proteína o un nivel de expresión de la forma funcional de longitud completa de la proteína que es lo suficientemente bajo como para causar la enfermedad o afección. En algunos casos, la producción alterada de una forma funcional de longitud completa de la proteína comprende la ausencia de producción de la proteína o la producción de una forma defectuosa de la proteína. En algunos casos, la forma defectuosa de la proteína es una forma truncada de la proteína, una forma mal plegada de la proteína o una forma de la proteína con unión a diana aberrante. En algunos casos, el tratamiento del sujeto da como resultado una mayor expresión de la forma funcional de longitud completa de la proteína.
En algunos aspectos, se describe un procedimiento para inducir el procesamiento de un transcrito de ARNm parcialmente procesado para eliminar un intrón retenido con el fin de producir un transcrito de ARNm completamente procesado que codifica una forma funcional de longitud completa de una proteína, que comprende: (a) hibridar un polímero de ácido polinucleico aislado con el transcrito de ARNm parcialmente procesado, que es capaz de codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína y que comprende al menos un intrón retenido; (b) eliminar el al menos un intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado para producir un transcrito de ARNm completamente procesado que codifica una forma funcional de longitud completa de la proteína; y (c) traducir la forma funcional de longitud completa de la proteína del transcrito de ARNm completamente procesado. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar una composición farmacéutica que comprende el polímero de ácido polinucleico aislado a un sujeto que necesite la misma.
En algunos casos, la producción alterada de la forma funcional de longitud completa de la proteína está correlacionada con una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad hereditaria. En algunos casos, el sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en ARNm completamente procesado, codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, el sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcribe correctamente en ARNm completamente procesado, codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, el sujeto con la enfermedad hereditaria tiene un genoma que comprende una copia defectuosa del gen, que es incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína. En algunos casos, la enfermedad o afección es diabetes. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer.
En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico es una secuencia no codificante. En algunos casos, la secuencia no codificante se híbrida con un intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, la secuencia no codificante se hibrida con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende un motivo CCC. En algunos casos, la secuencia no codificante se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión no forma un cuádruplex G. En algunos casos, la secuencia no codificante se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión está entre dos cuádruplex G. En algunos casos, la secuencia no codificante se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión tiene un primer motivo CCC y un segundo motivo CCC. En algunos casos, el primer motivo CCC está a aproximadamente 3 o más bases de nucleótidos del segundo motivo CCC. En algunos casos, la secuencia del polímero de ácido polinucleico es al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 100 % complementaria con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, la secuencia del polímero de ácido polinucleico tiene 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, 1 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50, aproximadamente 10 y aproximadamente 45, aproximadamente 10 y aproximadamente 40, aproximadamente 10 y aproximadamente 30, aproximadamente 10 y aproximadamente 25 o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, el sujeto es un eucariota. En algunos casos, el sujeto es un eucariota seleccionado de un ser humano, ratón, rata, primate no humano o mamífero no primate.
En algunos aspectos, se describe una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico induce el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y cuyos dibujos adjuntos:
Figura 1. Ubicación de los SSO en el gen de proinsulina humana. (A) Esquemas del indicador INS y sus productos de ARNm. Los SSO se muestran como barras horizontales de color negro debajo de los exones (recuadros numerados) y debajo del intrón 1 (línea); sus secuencias se encuentran en la Tabla 2. Los codones iniciador y finalizador se indican mediante puntas de flecha. El corte empalme canónico (líneas continuas) y críptico (líneas discontinuas) se muestra encima del transcrito primario; la designación de los sitios de corte y empalme crípticos está en color gris. Los SSO dirigidos a los segmentos del4-del7 del intrón 1 se muestran en el panel inferior. (B) Isoformas de ARNm (numeradas 1-6) generadas por la construcción del indicador INS. La descripción de las isoformas que no producen proinsulina está marcada con *.
Figura 2. Inhibición inducida por SSO de la retención del intrón 1 de INS. (A) Cotransfección de la construcción del indicador INS (IC D-F) con los SSO indicados en células HEK293. Los productos de corte y empalme descritos en la figura 1B se muestran a la derecha. Las barras representan el porcentaje de isoformas que contienen el intrón 1 con respecto a los transcritos naturales (panel superior) o el porcentaje de corte y empalme en el sitio de corte y empalme 3' críptico del intrón 2 con respecto al total (panel inferior). Las barras de error representan D.E.; sc, control aleatorio; SSO-, control "sin SSO". La concentración final de SSO fue de 1, 3, 10 y 30 nM, excepto para SSO6 y SSO8 (10 y 30 nM). (B) Promoción mediada por SSO21 del corte y empalme del intrón 1 en clones que carecen del 3ss del intrón 2. Los productos de ARN están a la derecha. (C) Un factor de cambio en la retención del intrón 1 inducida por SSO21 en transcritos que contienen y que carecen del 3'ss críptico del intrón 2. La concentración final de SSO21 fue de 30 nM en transfección por duplicado. La designación de las construcciones de indicador se encuentra en la parte inferior.
Figura 3.SSO de INS dirigidos a sitios de corte y empalme 3' crípticos. (A) Activación del 3'ss críptico del intrón 2 (cr3'ss+126; figura 1A) por SSO6 y promoción del salto del exón 2 por SSO8. La concentración de cada SSO fue de 2, 10, 50 y 250 nM. Los SSO se muestran en la parte superior, los productos de corte y empalme a la derecha, el indicador en la parte inferior. (B) Una horquilla estable prevista entre los sitios de corte y empalme 3' auténticos y crípticos del intrón 2 de INS. Las bases a las que se dirige SSO6 se representan por asteriscos y los hexámeros potenciadores de corte y empalme previstos (enumerados a la derecha) se representan por una línea discontinua.
(C) SSO4 no impide la activación de 81 pares de bases del 3'ss críptico cadena abajo de su equivalente auténtico (cr3'ss+81) en células con agotamiento de U2AF35, pero induce el salto de exones. La concentración final de cada SSO en células COS7 fue de 5, 20 y 80 nM. La concentración final del dúplex de ARNip U2AF35ab (77) fue de 70 nM. El indicador era el mismo que en el panel A.
Figura 4. Optimización de la diana de retención de intrones mediante microcaminata no codificante con una resolución de un solo nucleótido. (A) Ubicación de los oligorribonucleótidos. Los SSO y oligos de microcaminata usados para CD/RMN se representan por barras de color negro horizontales por debajo y por encima del transcrito primario, respectivamente. Las secuencias del intrón 1 previstas para formar cuádruplex G de ARN se resaltan en color gris. La dirección de la microcaminata se muestra con flechas de color gris; los oligos ganadores se resaltan en color negro. Un recuadro indica un polimorfismo de un solo nucleótido informado anteriormente (20). (B) Niveles de retención de intrones de cada SSO de microcaminata en dos líneas celulares. Las barras de error indican las D.E. obtenidas de dos cotransfecciones independientes con el indicador IC D-F.
Figura 5. Caracterización biofísica de la formación de estructuras secundarias de ARN. (A) Espectro de CD de UV lejano a 25 °C para ARN de CD1 (19-mer) y CD2 (20-mer), que revela un máximo de elipticidad a 265 y 270 nm, respectivamente. (B) Espectros de 1H Rm N de CD1 y CD2 registrados a 800 MHz y 298 K que muestran grupos característicos de resonancias de bases G unidas a H. (C) Curvas de fusión de CD sigmoidales para los dos ARN que muestran un punto medio de transición a 56,8 ± 0,2 °C y a 69,0 ± 0,45 °C, respectivamente. Las dos curvas se han desplazado ligeramente entre sí para mayor claridad. (D) La estructura cuádruplex paralela propuesta con dos tétradas G apiladas conectadas por secuencias de asa corto para CD1 (panel superior). Las estructuras de horquilla previstas para CD2 se muestran en el panel inferior. Las mutaciones G^-C están en color rojo.
Figura 6. Transiciones cuádruplex/horquilla conformacionales que implican la diana no codificante. (A) Equilibrio esquemático entre las estructuras de horquilla (color negro) y cuádruplex (color azul oscuro) propuestas para la formación dentro del motivo rico en G que abarca el oligorribonucleótido CD3. CD4 contiene una mutación CC^-UU (resaltada con *). (B) El espectro de RMN en la región de 9-15 ppm revela señales de protones imino correspondientes a bases unidas por hidrógeno. Las señales entre 10 y 12 ppm son características de los G con enlaces de hidrógeno de Hoogsteen dentro de una tétrada G (recuadro Q), mientras que las señales >12 ppm son indicativas de pares de bases de Watson-Crick A-U y G-C dentro de estructuras de horquilla (recuadro H). En CD3, la horquilla H1 está significativamente poblada, pero las mutaciones en CD4 desestabilizan H1, lo que convierte a H2 en la especie principal, con ambas en equilibrio con la estructura cuádruplex. (C) Predicciones en el pliegue M de dos posibles horquillas, en consonancia con los datos de RMN. (D) Reducción de la retención de intrones tras la desestabilización de la estructura de horquilla por la mutación CC^-UU. Las barras de error representan la D.E. de un experimento duplicado con el indicador iC D-C. Del5, el indicador IC D-C que carece del segmento del5 (figura 1A); M1, un indicador que contiene dos sustituciones (Tabla 1A) para desestabilizar tanto el cuádruplex G como el tallo-asa.
Figura 7. Identificación de proteínas que interactúan con pre-ARNm que abarcan la diana no codificante para la retención de intrones. (A) Niveles de retención de intrones para construcciones de indicadores de tipo silvestre y mutantes (IC D-C) después de transfecciones transitorias en células HEK293T. Las mutaciones se muestran en la Tabla 1A. Los productos de ARN están a la derecha. La presencia de los cuádruplex de ARN previstos, las horquillas H1/H2 y el ciclo de C4 cadena arriba y cadena abajo se indican debajo de la figura del gel. Las barras de error representan las D.E. obtenidas de dos experimentos repetidos. (B) Los niveles de retención de intrones de los ARN probados se correlacionan con sus estabilidades previstas a través de la diana no codificante.
(C)Análisis de transferencia de Western de un ensayo de precipitación con anticuerpos indicados a la derecha. n E, extractos nucleares; B, control solo de perlas; AV3, oligo de ARN de control que contiene un ciclo de citosina y un 3'ss AG (7). La secuencia del ARN de CD5 se muestra en la figura 4A.
Figura 8. Patrón de corte y empalme de minigenes ricos y pobres en cuádruplex tras el agotamiento de DHX36. (A) Esquemas de construcciones de indicadores. Los cuádruplex previstos se representan mediante rectángulos de color negro; sus densidades se muestran en la Tabla 1. Los exones (recuadros) están numerados; la barra diagonal representa el acortamiento del intrón 3 de F9 (24). Los minigenes F9 y TSC2 contienen sustituciones de punto de ramificación c.253-25C y c.5069-18C, respectivamente, que perjudican el corte y empalme (24). Cr5'ss-104; 5'ss críptico 104 cadena arriba del 5'ss auténtico del intrón 2. (B) Inmunotransferencia con anticuerpos contra DHX36. sc, ARNsi aleatorio; c, células no tratadas. Las barras de error son la D.E. de dos experimentos de transfección. (C-E) Retención de intrones y salto de exones de los indicadores indicados. La concentración final del ARNip de DHX36 fue de 50 nM. Los productos de ARN se muestran esquemáticamente a la derecha. Las barras de error son la D.E. de dos experimentos de transfección.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los genes tales como los genes eucariotas contienen secuencias intermedias o intrones que deben eliminarse con precisión de los transcritos primarios para crear ARNm funcionales capaces de codificar proteínas (1). Este proceso modifica la composición del ARNm de una manera muy dinámica, empleando interacciones interdependientes de cinco ARN nucleares pequeños (ARNnp) (por ejemplo, U1, U2, U4, U5 y u6) y un gran número de proteínas con secuencias conservadas pero degeneradas en el pre-ARNm (2). En particular, los intrones pueden definirse por los elementos del sitio de corte y empalme central que comprenden el sitio de corte y empalme 5' (5'ss) que puede comprender un motivo GU conservado, el sitio de corte y empalme 3' (3'ss) que puede terminar con un motivo AG invariable, la secuencia de punto de ramificación que puede comprender una base de adenina conservada y el tramo de polipirimidina (Py). La reacción de corte y empalme se puede iniciar con la unión de la snRNP U1 al motivo GU conservado en el 5'ss, seguido de la unión de la snRNP U2 en la base de adenina conservada del punto de ramificación y, finalmente, las interacciones de las snRNP U4, U5 y U6 cerca del sitio de corte y empalme 5' y 3'. El complejo formado por las snRNP y el intrón respectivo puede denominarse espliceosoma. Los factores de corte y empalme adicionales, tales como el factor auxiliar 1 de ARN nuclear pequeño U2 (U2AF35), U2AF2 (U2AF65) y el factor de corte y empalme 1 (SF1), pueden contribuir al ensamblaje del espliceosoma y facilitan el evento de corte y empalme.
El corte y empalme de intrones generalmente promueve la acumulación de ARNm y la expresión de proteínas entre especies (3-5). Este proceso puede verse alterado por mutaciones o variantes intrónicas que también pueden afectar a las rutas de expresión de genes acoplados, incluida la transcripción, la exportación y la traducción de ARNm. Esto se ilustra por los intrones en la 5'UTR donde las variantes o mutaciones naturales que modifican la retención de intrones alteran la abundancia relativa de transcritos con marcos de lectura abiertos cadena arriba (uORF) u otros motivos reguladores e influyen drásticamente en la traducción (6,7). Además, la traducción alterada de proteínas debido a un corte y empalme defectuoso tal como la retención de intrones ha llevado al desarrollo de enfermedades y/o la progresión de enfermedades tales como trastornos o afecciones genéticas (por ejemplo, enfermedades hereditarias o cáncer). Sin embargo, no se han desarrollado estrategias exitosas específicas de secuencia para normalizar la expresión génica en dichas situaciones.
Los oligonucleótidos de intercambio de corte y empalme (SSO, por sus siglas en inglés) son reactivos no codificantes que modulan el corte y empalme de intrones uniendo secuencias reguladoras o de reconocimiento del sitio de corte y empalme y compitiendo con factores que actúan en cis y trans por sus dianas (8). Se ha demostrado que restauran el corte y empalme aberrante, modifican la expresión relativa de los ARNm existentes o producen variantes de corte y empalme novedosas que normalmente no se expresan (8). La estabilidad mejorada de los dúplex de SSO-ARN dirigidos por una serie de modificaciones de SSO, tales como 2'-O-metil y 2'-O-metoxietil ribosa, facilitó los estudios que exploran su potencial terapéutico para un número creciente de genes de enfermedades humanas, incluyendo DMD en distrofia muscular (9,10), SMN2 en atrofia muscular espinal (11), ATM en ataxia-telangiectasia (12) y BTK en agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (13). Aunque dichos enfoques están cerca de alcanzar su potencial clínico para un número restringido de enfermedades (8), más de 300 trastornos mendelianos resultantes del corte y empalme aberrante inducido por mutaciones (14) y un número creciente de rasgos complejos pueden ser susceptibles de corrección mediada por SSO de la expresión génica.
La etiología de la diabetes de tipo 1 tiene un fuerte componente genético conferido por los antígenos leucocitarios humanos (HLA) y una serie de locus no HLA modificadores (15). El modificador más fuerte se identificó en la región del gen de la proinsulina (INS) en el cromosoma 11 (denominado IDDM2) (15). El mapeo adicional de esta área sugirió que INS es la diana IDDM2 más probable (16), consistente con una función crítica de este autoantígeno en la patogénesis (17). El riesgo genético de esta enfermedad en IDDM2 se ha atribuido a niveles diferenciales de ARN en estado estacionario de haplotipos INS predisponentes y protectores, lo que podría implicar una secuencia de ADN minisatélite cadena arriba de este gen (18,19). Sin embargo, el examen sistemático de los polimorfismos de INS de origen natural reveló niveles de expresión de proinsulina específicos de haplotipo en construcciones informadoras desprovistas de la secuencia minisatélite, dando como resultado dos variantes en el intrón 1 (7), denominadas IVS1+5ins4 (también conocida como rs3842740 o INS-69) e IVS1-6A/T (rs689, INS-27 o HphI+/-) (16,20). La primera variante activa un sitio de corte y empalme 5' críptico del intrón 1, mientras que la adenina (A) en la última variante, que reside 6 nucleótidos cadena arriba del sitio de corte y empalme 3' (3'ss), promueve la retención de intrones, expandiendo la abundancia relativa de transcritos con 5'UTR extendida (21). En comparación con la timina (T), el alelo A en IVS1-6A/T disminuye la afinidad por las proteínas de unión a pirimidina in vitro y hace que el 3'ss sea más dependiente del factor auxiliar de la ribonucleoproteína nuclear pequeña U2 (U2AF) (7), un heterodímero necesario para la unión de U2, el ensamblaje del espliceosoma y la selección de 3'ss (22). Los transcritos que contienen el intrón 1 están sobrerrepresentados en las genotecas de ADNc derivadas de IVS1-6A preparadas a partir de tejidos productores de insulina (21), se exportan desde el núcleo (23) y contienen un uORF corto específico de Homininae que coevolucionó con la relajación del 3'ss del intrón 1 en primates superiores (7). La menor expresión de proinsulina conferida por el alelo A puede conducir a una presentación subóptima de péptidos de proinsulina en el timo fetal y a una inadecuada selección negativa de linfocitos T autorreactivos, lo que culmina en la destrucción autoinmunitaria de los linfocitos p productores de insulina en el páncreas (7).
Un objetivo de la invención es inducir el procesamiento de un transcrito de ARNm parcialmente procesado para eliminar un intrón retenido con el fin de producir un transcrito de ARNm completamente procesado que codifica una forma funcional de longitud completa de una proteína. Un objetivo adicional es tratar una enfermedad o afección caracterizada por la producción alterada de una proteína y/o una enfermedad o afección caracterizada por un corte y empalme defectuoso en un sujeto que lo necesite.
Otro objetivo de la descripción es corregir la baja eficacia de la eliminación del intrón 1 de INS de los pre-ARNm que contienen IVS1-6A y reducir la retención de intrones a los niveles observados para el alelo T protector de la enfermedad. Otro objetivo de la descripción de la invención es proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades genéticas, incluido el cáncer, que se caracterizan por (o están asociadas con) la retención irregular o aberrante de intrones.
Según un primer aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para la prevención o tratamiento de una enfermedad en un sujeto que comprende la corrección de la retención de intrones en transcritos génicos maduros, donde la enfermedad se induce por la expresión de proteínas defectuosas causada por la retención de intrones en los transcritos génicos.
Intrón retenido
El intrón retenido es uno de los cinco tipos de corte y empalme alternativo que también pueden incluir salto de exones, sitio de corte y empalme 5' alternativo, sitio de corte y empalme 3' alternativo y exones mutuamente excluyentes. El salto de exones puede ocurrir cuando un exón se omite o se corta y se empalma del ARNm procesado y puede ser el tipo más común de corte y empalme alternativo. El 5'ss alternativo y el 3'ss alternativo pueden significar sitios de corte y empalme alternativos tales como sitios de corte y empalme crípticos o pseudositios de corte y empalme. Pueden aparecer exones mutuamente excluyentes cuando solo uno de los dos exones se retiene en el ARNm procesado después del corte y empalme. Aunque la retención de intrones puede ser menos común que el salto de exones, se ha demostrado que la retención de intrones se produce con más frecuencia de lo que se creía anteriormente. De hecho, un estudio de 21.106 genes humanos realizado por el grupo De Souza ha demostrado que aproximadamente el 15 % de los genes analizados mostraban retención de intrones (véase, Galante y col, "Detection and evaluation of intron retention events in the human transcriptome", Bioinformatics 10:757-765 (2004)). Además, un estudio realizado por el grupo de Moore ha demostrado que aproximadamente el 35 % de las 5'-UTR humanas y aproximadamente el 16 % de las 3'-UTR albergan intrones (Bicknell y col., "Introns in UTRs: Why we should stop ignoring them", Bioessays 34:1025-1034 (2012)). Como tal, la retención de intrones puede producirse en una región codificante, una región no codificante, en la 5' UTR o en la 3' UTR. En la región codificante, el intrón retenido puede codificar aminoácidos en marco, o puede estar desalineado, lo que puede generar proteínas truncadas o proteínas no funcionales debido al codón finalizador o cambios en el marco. Además, el intrón puede estar entre dos exones, ubicado en la 5' UTR o ubicado en la 3' UTR.
En comparación con un intrón no retenido, un intrón retenido se puede caracterizar por tener una longitud de secuencia más corta. La longitud de secuencia del intrón retenido puede ser inferior a 5 kb, inferior a 4 kb, inferior a 3 kb, inferior a 2,5 kb, inferior a 2 kb, inferior a 1,5 kb, inferior a 1 kb, inferior a 0,5 kb, inferior a 0,4 kb, inferior a 0,3 kb, inferior a 0,2 kb o inferior a 0,1 kb.
Además, en comparación con un intrón no retenido, un intrón retenido se puede caracterizar por tener un contenido de G/C de entre aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. El contenido de G/C del intrón retenido puede ser de aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o aproximadamente el 60 %.
El intrón retenido también puede estar flanqueado por un sitio de corte y empalme 5' débil, un sitio de corte y empalme 3' débil o ambos. Un sitio de corte y empalme débil puede referirse a un sitio de corte y empalme que puede requerir una proteína reguladora, tal como un potenciador de corte y empalme intrónico para funcionar.
Además, un intrón retenido puede comprender una menor presencia de un motivo GGG en relación con un intrón no retenido. En algunos casos, el motivo GGG es un potenciador de corte y empalme intrónico.
Un transcrito de ARNm parcialmente procesado es un transcrito de ARNm que ha experimentado un corte y empalme parcial y comprende al menos un intrón retenido. El al menos un intrón puede estar dentro de la 5' UTR, 3' UTR o en una posición interna entre dos exones. El transcrito de ARNm parcialmente procesado puede ser incapaz de traducirse para producir una proteína funcional o de longitud completa.
Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que se caracteriza por una longitud de secuencia corta. Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que está caracterizado por una secuencia de menos de 3 kb, menos de 2,5 kb, menos de 2 kb, menos de 1,5 kb, menos de 1 kb, menos de 0,5 kb, menos de 0,4 kb, menos de 0,3 kb, menos de 0,2 kb o menos de 0,1 kb.
Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que está caracterizado por tener un contenido de G/C de entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 60 %. Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que está caracterizado por tener un contenido de G/C de aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o aproximadamente el 60 %.
Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que está flanqueado por un sitio de corte y empalme 5' débil, un sitio de corte y empalme 3' débil o ambos.
Un transcrito de ARNm parcialmente procesado puede comprender un intrón que puede comprender una menor presencia de un motivo GGG con respecto a un intrón no retenido.
En algunos casos, se retienen uno o más intrones en un transcrito de ARNm parcialmente procesado. El ARNm parcialmente procesado puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más intrones retenidos.
Un transcrito de ARNm completamente procesado es aquel que se ha sometido a corte y empalme para eliminar intrones, tales como intrones retenidos y es capaz de traducirse para producir una proteína tal como una proteína funcional de longitud completa. Un transcrito de ARNm parcialmente procesado con uno o más intrones retenidos puede someterse a corte y empalme para convertirse en un ARNm completamente procesado.
Una proteína funcional de longitud completa tiene la misma longitud y función que la forma de tipo silvestre de la proteína. La proteína funcional de longitud completa puede ser la forma de tipo silvestre de la proteína. La proteína funcional de longitud completa puede ser una isoterma de la proteína de tipo silvestre con la misma longitud que la proteína de tipo silvestre. La proteína funcional de longitud completa puede comprender una mutación tal como una sustitución de un aminoácido por un residuo aminoacídico alternativo con propiedades similares para que el fenotipo (por ejemplo, la función) de la proteína no se altere por la mutación.
Los aminoácidos de ejemplo con propiedades similares pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales cargadas eléctricamente: arginina, histidina y lisina que están cargadas positivamente; o ácido aspártico y ácido glutámico que están cargados negativamente; residuos de aminoácidos polares: serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína y metionina; aminoácidos no polares: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y prolina; y aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptófano.
En algunos casos, el transcrito de ARNm parcialmente procesado conduce a la producción alterada de una proteína. La producción alterada de la proteína puede ser la producción alterada de una forma funcional de longitud completa de la proteína que puede comprender la producción por debajo de lo normal de la forma funcional de longitud completa de la proteína. La producción alterada de una forma funcional de longitud completa de la proteína puede comprender la producción de una forma defectuosa de la proteína. La forma defectuosa de la proteína puede ser una forma truncada de la proteína, una forma mal plegada de la proteína o una forma de la proteína que comprende un sitio de unión a diana aberrante.
Polímero de ácido polinucleico
Los polímeros de ácido polinucleico descritos en esta invención se pueden usar para hibridarse con un transcrito de ARNm parcialmente procesado para iniciar la eliminación de un intrón retenido. En algunos casos, el polímero de ácido polinucleico es un polímero de ácido polinucleico no codificante. El polímero de ácido polinucleico no codificante puede hibridarse con una región de un transcrito de ARNm parcialmente procesado con un alto contenido de G/C, tal como una región que comprende entre aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. El polímero de ácido polinucleico no codificante puede comprender un alto contenido de G/C, tal como entre aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. El polímero de ácido polinucleico no codificante puede hibridarse con una región de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que está en, junto a, o cerca de un sitio de corte y empalme 5' débil o un sitio de corte y empalme 3' débil. El polímero de ácido polinucleico no codificante puede hibridarse con una región de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que puede comprender una menor presencia de un motivo GGG.
La secuencia no codificante del polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La secuencia no codificante puede hibridarse con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado. El elemento regulador del corte y empalme intrónico puede incluir un potenciador de corte y empalme intrónico o un silenciador de corte y empalme intrónico. La secuencia no codificante puede hibridarse con un silenciador de corte y empalme intrónico. El elemento regulador del corte y empalme intrónico puede modular el corte y empalme afectando a las etapas tempranas y/o intermedias del ensamblaje espliceosomal, tal como cuando las snRNP U1 y U2 se emparejan en los sitios de corte y empalme a través de un exón durante la definición del exón o durante la transición posterior al complejo de expansión de intrones. Los elementos reguladores de corte y empalme intrónico de ejemplo pueden incluir proteína de unión al tramo de polipirimidina (PTB), U2AF65 y/o U2AF35, hnRNP L y hnRNP A1.
El polímero de ácido polinucleico puede hibridarse en el sitio de corte y empalme 5', el sitio de corte y empalme 3', el punto de ramificación, el tramo de polipirimidina o un potenciador intrónico del intrón. El polímero de ácido polinucleico también puede hibridarse a una distancia de aproximadamente 30 bases, 25 bases, 20 bases, 15 bases, 10 bases o 5 bases de un sitio de corte y empalme 5', un sitio de corte y empalme 3', un punto de ramificación, un tramo de polipirimidina o un potenciador intrónico para promover o mejorar el corte y empalme. La hibridación del polímero de ácido polinucleico en o cerca de los sitios de corte y empalme puede promover o mejorar el corte y empalme reclutando factores de corte y empalme hacia los sitios de corte y empalme, iniciando así el corte y empalme.
Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse en un sitio silenciador de intrones (por ejemplo, un sitio silenciador de intrones de novo), un sitio de corte y empalme de intrones críptico o un pseudositio de corte y empalme. El sitio silenciador de intrones puede reconocerse por un silenciador que suprime la reacción de corte y empalme. El sitio de corte y empalme de intrones críptico se puede crear mediante una mutación, tal como una sustitución, una deleción o una inserción. El sitio de corte y empalme de intrones críptico puede ser un sitio de corte y empalme 5' críptico o un sitio de corte y empalme 3' críptico. El sitio de corte y empalme de intrones críptico puede ser un sitio de corte y empalme 5' críptico. El pseudositio de corte y empalme puede ser un sitio de corte y empalme débil en el que su activación puede dar como resultado una mutación del sitio de corte y empalme canónico. El pseudositio de corte y empalme puede ser un pseudositio de corte y empalme 5' o un pseudositio de corte y empalme 3'. La hibridación en un sitio silenciador de intrones puede bloquear estéricamente la unión de un silenciador y puede ayudar a prevenir la interrupción del ensamblaje y el procesamiento del espliceosoma. La hibridación en un sitio de corte y empalme de intrones críptico puede redirigir la interacción hacia un sitio de corte y empalme canónico, tal como un sitio de corte y empalme débil canónico.
Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con una región interna del intrón. La región interna del intrón puede no abarcar un sitio de corte y empalme, tal como un sitio de corte y empalme 5' (por ejemplo, un sitio de corte y empalme 5' canónico, críptico o pseudo), un sitio de corte y empalme 3' (por ejemplo, un sitio de corte y empalme 3' canónico, críptico o pseudo), un sitio potenciador o un sitio silenciador. La hibridación del polímero de ácido polinucleico en una región interna puede promover o potenciar el corte y empalme reclutando factores de corte y empalme hacia los sitios de corte y empalme, tal como un sitio potenciador de intrones.
Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado. El elemento regulador del corte y empalme intrónico puede comprender un motivo CCC. La secuencia no codificante puede hibridarse con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión no forma un cuádruplex G. La secuencia no codificante puede hibridarse con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión está entre dos cuádruplex G. La secuencia no codificante también puede hibridarse con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión tiene un primer motivo CCC y un segundo motivo CCC. El primer motivo CCC puede estar a aproximadamente 3 o más bases de nucleótidos del segundo motivo CCC. Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado en el que el motivo de unión forma una estructura de horquilla. El polímero de ácido polinucleico puede ser capaz además de desestabilizar la estructura de horquilla.
Un polímero de ácido polinucleico puede comprender un nucleótido de piridina en la posición terminal 3' y/o en la posición terminal 5'. El polímero de ácido polinucleico puede comprender además dos nucleótidos consecutivos de piridina en la posición terminal 3' y/o en la posición terminal 5'.
En algunos casos, un polímero de ácido polinucleico puede ser un oligonucleótido de intercambio de corte y empalme (SSO). El oligonucleótido de intercambio de corte y empalme puede hibridarse con un intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado. El oligonucleótido de intercambio de corte y empalme puede hibridarse con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado.
Los oligonucleótidos de intercambio de corte y empalme (SSO) se han usado ampliamente para inhibir el uso de exones, pero no se han desarrollado estrategias no codificantes que promuevan la eliminación de intrones completos para aumentar la expresión génica mediada por corte y empalme. Usando una serie de indicadores de corte y empalme que contienen el gen de la proinsulina humana, se ha demostrado que se puede reducir la retención del intrón 1 de INS por parte de los SSO que se unen a los transcritos obtenidos de un haplotipo humano que expresa bajos niveles de proinsulina. La promoción asistida por SSO de la eliminación de intrones débiles de la 5'UTR a través de estructuras de ARN canónicas y no canónicas que compiten facilita el desarrollo de estrategias no codificantes basadas en secuencias para mejorar la expresión génica.
Se entiende por la expresión "corrección de retención de intrones" la corrección de retención irregular o aberrante de intrones. La corrección puede ser una corrección completa o una corrección parcial. La corrección puede comprender reducir la incidencia de retención de intrones. La corrección puede comprender reducir la retención de intrones aberrantes.
La referencia a "defectuoso" en el contexto de la expresión de proteínas provocada por la retención de intrones en los transcritos génicos puede comprender una expresión de proteínas inadecuada, defectuosa o aberrante.
La corrección de la retención de intrones puede comprender la administración de un polímero de ácido polinucleico dispuesto para hibridarse con el transcrito génico. La corrección de la retención de intrones puede comprender la administración de un polímero de ácido polinucleico dispuesto para hibridarse con el transcrito génico para alterar estructuras de orden superior en el transcrito génico. La corrección de la retención de intrones puede comprender la administración de un polímero de ácido polinucleico dispuesto para hibridarse con el transcrito génico para interferir con una o más transiciones conformacionales de estructuras de ARN canónicas (tallo-asas); no canónicas (cuádruplex G); interacciones con factores que actúan en trans; y la velocidad de formación del complejo de ARN-proteína. La corrección de la retención de intrones puede comprender la administración de un polímero de ácido polinucleico dispuesto para hibridarse con el transcrito génico para interferir con, por ejemplo bloquear, transiciones conformacionales de estructuras de ARN canónicas (tallo-asas) y/o no canónicas (cuádruplex G). El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en elementos reguladores del corte y empalme intrónico. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en elementos reguladores del corte y empalme intrónico superpuestos conservados en mamíferos. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en segmentos intrónicos que contienen motivos reguladores de corte y empalme cortos de pentámero a heptámero corto. Los motivos reguladores de corte y empalme pueden comprender CCCAG o AGGCC. Los motivos reguladores de corte y empalme pueden comprender cualquiera de los motivos proporcionados por Yeo GW, y col. (2007). PLoS Genet 3:e85 y/o Voelker RB y Berglund JA (2007). Genome Res 17:1023-1033.
La región diana puede no comprender ciclos de C para evitar la formación de cuádruplex G. La región diana puede no estar próxima a los sitios de corte y empalme 5' y 3', tramos de polipirimidina, sitios de ramificación y/o regiones suprarramificadas.
El polímero de ácido polinucleico puede proporcionar plataformas de unión para factores de corte y empalme que se ha demostrado que influyen en el corte y empalme del intrón 1 y el exón 2 de INS, incluyendo Tra2, SRSF3 o U2AF35 u otros péptidos, ácidos nucleicos codificantes o no codificantes, moléculas pequeñas u otros productos químicos para facilitar el suministro del polímero de ácido polinucleico y/o dirigir el ácido nucleico a un tejido, célula o etapa de desarrollo específicos. Tal estrategia no codificante puede ayudar a reducir la retención generalizada de intrones en las células cancerosas, particularmente aquellas que contienen mutaciones somáticas de los genes del factor de corte y empalme, como se mostró por primera vez para sustituciones específicas en el dominio de dedos de cinc de U2AF35 en enfermedades mieloproliferativas (76). Estas mutaciones se producen en muchos tumores y dan como resultado defectos de corte y empalme que pueden contribuir al crecimiento neoplásico. La invención puede ayudar a controlar la proliferación celular y reducir el crecimiento neoplásico en una fracción significativa de pacientes con cáncer que portan mutaciones en factores de corte y empalme implicados en el reconocimiento del sitio de corte y empalme 3', estimado actualmente en >15 % (76).
La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede ser al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o un 99,5 % complementaria con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede ser un 100 % complementaria con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado.
La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede tener 4 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede tener 3 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede tener 2 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La secuencia del polímero de ácido polinucleico puede tener 1 o menos emparejamientos erróneos con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado.
El polímero de ácido polinucleico puede hibridarse específicamente con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La especificidad puede tener una complementariedad de secuencia del 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o el 100 % del polímero de ácido polinucleico con una secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado. La hibridación puede realizarse en condiciones de hibridación muy rigurosas.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 55 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 46.
Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un transcrito de ARNm que comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 99 % de identidad de secuencia con al menos 13 bases contiguas de SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un transcrito de ARNm que comprende un 100 % de identidad de secuencia con al menos 13 bases contiguas de SEQ ID NO: 46.
Un polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 55 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
La referencia a no codificante con respecto al menos a parte de una región diana del transcrito puede comprender al menos 5 nucleótidos consecutivos o al menos 10 nucleótidos consecutivos. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a 5 nucleótidos consecutivos de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a 10 nucleótidos consecutivos de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a 15 nucleótidos consecutivos de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto al menos a 20 nucleótidos consecutivos de una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 46.
Un polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un transcrito de ARNm que comprende al menos 10 bases contiguas de SEQ ID NO: 46. El polímero de ácido polinucleico puede hibridarse con un transcrito de ARNm que consiste en al menos 10 bases contiguas de SEQ ID NO: 46.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3;
SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ
ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas.
Un polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO:
12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:
33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:
15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO:
36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO:
18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO:
39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 85
% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO:
3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24;
SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6;
SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27;
SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o com de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID
NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID
NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO:
12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:
33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:
15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO:
36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 63 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO:
18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO:
39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42;
SEQ ID NO: 45; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 50
% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO:
3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24;
SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 45;
o combinaciones de las mismas.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3;
SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 36; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 36; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 36; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9;
y SEQ ID NO: 36; o combinaciones de las mismas.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 6. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID
NO: 9. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 36.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 63 %, al menos un 60 %, al menos un 55 % o al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 63 %, al menos un 60 %, al menos un 55 % o al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 6. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 63 %, al menos un 60 %, al menos un 55 % o al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 9. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región diana del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 63 %, al menos un 60 %, al menos un 55 % o al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 36.
El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 55 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede ser no codificante con respecto a una región del transcrito que comprende o que consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 50 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El experto en la técnica comprenderá que los nucleótidos de uracilo pueden sustituirse por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias).
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 75 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 70 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 65 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 55 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 50 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; s Eq ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ iD NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ iD NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 75 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 70 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 65 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ iD NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 55 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 50 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO 5; SEQ IN NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 34; y SEQ ID NO: 35; o combinaciones de las mismas.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ iD NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o s Eq ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o s Eq ID NO: 35. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias).
El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO:
47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 75 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO:
47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 70 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 65 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO:
47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 55 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias). El polímero de ácido polinucleico puede comprender o consistir en una secuencia de polímero de ácido polinucleico que tiene al menos un 50 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas, donde los nucleótidos de uracilo están sustituidos por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias).
Ventajosamente, la descripción identifica SSO que reducen la abundancia relativa de transcritos de intrones (por ejemplo, transcritos que retienen el intrón 1) y delimita la diana no codificante optimizada con una resolución de un solo nucleótido.
Un polímero de ácido polinucleico puede comprender un oligonucleótido de intercambio de corte y empalme (SSO).
El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 19 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 17 nucleótidos de longitud.
El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 16 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 13 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 11 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. El polímero de ácido polinucleico puede tener entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
Un polímero de ácido polinucleico, tal como los SSO, puede comprender ARN o ADN. El polímero de ácido polinucleico, tal como los SSO, puede comprender ARN. El polímero de ácido polinucleico, tal como los SSO, puede comprender bases o análogos de nucleótidos naturales, sintéticos o artificiales, que tienen una complementación equivalente a la del ADN o el ARN. El polímero de ácido polinucleico, tal como los SSO, puede comprender combinaciones de ADN, ARN y/o análogos de nucleótidos. Los análogos de nucleótidos pueden comprender PNA o LNA. En otra realización, el ácido nucleico, tal como los SSO, puede comprender o consistir en PMO.
En algunos casos, los análogos o bases de nucleótidos sintéticos o artificiales pueden comprender modificaciones en uno o más del resto de ribosa, resto de fosfato, resto de nucleósido o una combinación de los mismos.
Los análogos de nucleótidos o bases de nucleótidos artificiales pueden comprender un ácido nucleico con una modificación en un grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa. La modificación puede ser una modificación 2'-O-metilo o una modificación 2'-O-metoxietilo (2-O-MOE). La modificación 2'-O-metilo puede añadir un grupo metilo al grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa, mientras que la modificación 2'O-metoxietilo puede añadir un grupo metoxietilo al grupo hidroxilo 2' del resto de ribosa. A continuación se ilustran estructuras químicas de ejemplo de una modificación 2'-O-metilo de una molécula de adenosina y una modificación 2'O-metoxietilo de una uridina.
Figure imgf000020_0001
Una modificación adicional en el grupo hidroxilo 2' puede incluir una conformación de azúcar 2'-O-aminopropilo que puede implicar un grupo amina extendido que comprende un enlazador propilo que une el grupo amino al oxígeno 2'. Esta modificación puede neutralizar la carga negativa global derivada de fosfato de la molécula de oligonucleótidos mediante la introducción de una carga positiva del grupo amina por azúcar y, por lo tanto, puede mejorar las propiedades de captación celular debido a sus propiedades zwitteriónicas. A continuación se ilustra una estructura química de ejemplo de una fosforamidita de nucleósido de 2'-O-aminopropilo.
Figure imgf000020_0002
Otra modificación en el grupo hidroxilo 2' puede incluir una conformación de ribosa bloqueada o puenteada (por ejemplo, ácido nucleico bloqueado o LNA), donde también puede estar involucrada la posición 4' de ribosa. En esta modificación, la molécula de oxígeno unida en el carbono 2' puede unirse al carbono 4' mediante un grupo metileno, formando así un monómero de ribonucleótido bicíclico unido a 2'-C,4'-C-oxi-metileno. A continuación se ilustran representaciones de ejemplo de la estructura química de LNA. La representación que se muestra a la izquierda destaca las conectividades químicas de un monómero de LNA. La representación que se muestra a la derecha destaca la conformación bloqueada 3'-endo (3E) del anillo de furanosa de un monómero de LNA.
Figure imgf000021_0001
LNA (Ácidos Nucleicos Bloqueados)
Una modificación adicional en el grupo hidroxilo 2' puede comprender ácidos nucleicos de etileno (ENA) tales como, por ejemplo, ácido nucleico con puente de 2'-4'-etileno, que bloquea la conformación del azúcar en una conformación de astringencia del azúcar C3'-endo. Los ENA forman parte de la clase de ácidos nucleicos puenteados de ácidos nucleicos modificados que también comprende LNA. A continuación se ilustran estructuras químicas de ejemplo del ENA y ácidos nucleicos puenteados.
Figure imgf000021_0002
3'-amino- 2', 4'-BNA 2', 4'-BNA-2-piridina 2', 4'-ENA 2', 4'-BNA-1-isoquinoleína
Aún otras modificaciones en el grupo hidroxilo 2' pueden incluir 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-ON-metilacetamido (2'-O-NMA).
Los análogos de nucleótidos pueden comprender morfolinos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas, ácidos nucleicos de 1', 5'-anhidrohexitol (HNA) o una combinación de los mismos. El oligo morfolino o fosforodiamidato morfolino oligo (PMO) comprende moléculas sintéticas cuya estructura imita la estructura del ácido nucleico natural al desviarse de las estructuras normales de azúcar y fosfato. En su lugar, el anillo de ribosa de cinco miembros se puede sustituir por un anillo de morfolino de seis miembros que contiene cuatro carbonos, un nitrógeno y un oxígeno. Los monómeros de ribosa pueden estar unidos por un grupo fosforodiamidato en lugar de un grupo fosfato. Estas alteraciones de la cadena principal pueden eliminar todas las cargas positivas y negativas, lo que hace que los morfolinos sean moléculas neutras que pueden atravesar las membranas celulares sin la ayuda de agentes de liberación celular tales como los que usan los oligonucleótidos cargados.
Figure imgf000022_0001
El ácido nucleico peptídico (PNA) no contiene anillo de azúcar ni enlace fosfato. En cambio, las bases se pueden unir y espaciar adecuadamente mediante moléculas de tipo oligoglicina, por lo tanto, eliminando una carga de la cadena principal.
Figure imgf000022_0002
La modificación de la cadena principal de fosfato también puede comprender modificaciones de metilo o tiol tales como nucleótido de metilfosfonato y. A continuación se ilustran un nucleótido de tiolfosfonato (izquierda) y un nucleótido de metilfosfonato (derecha) de ejemplo.
Figure imgf000022_0003
Además, las 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas de ejemplo se ilustran como:
N3-P5'-fosforamidita
Y un ácido nucleico de hexitol de ejemplo (o ácidos nucleicos de 1', 5'-anhidrohexitol (HNA)) se ilustra como:
Figure imgf000023_0001
Además de la modificación del resto de ribosa, la cadena principal de fosfato y el nucleósido, los análogos de nucleótidos también pueden modificarse, por ejemplo, en el extremo 3' o 5'. Por ejemplo, el extremo 3' puede incluir un grupo catiónico 3' o invertir el nucleósido en el extremo 3' con un enlace 3'-3'. En otra alternativa, el extremo 3' puede bloquearse con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un C5-aminoalquil 3' dT. El extremo 5' puede bloquearse con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un sustituyente 5'-O-alquilamino. Otros conjugados 5' pueden inhibir la escisión exonucleolítica 5'-3'. Otros conjugados 3' pueden inhibir la escisión exonucleolítica 3'-5'.
En algunos casos, uno o más de los análogos de nucleótidos artificiales descritos en esta invención son resistentes a las nucleasas tales como, por ejemplo, una ribonucleasa tal como RNasa H, desoxirribonucleasa tal como DNasa o una exonucleasa tal como 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa en comparación con polímeros de ácido polinucleico natural. En algunos casos, los análogos de nucleótidos artificiales que comprenden modificación con 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-d Ma EOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NmA), LNA, ENA, PNA, HnA, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas o combinaciones de los mismos son resistentes a las nucleasas tales como, por ejemplo, una ribonucleasa tal como RNasa H, una desoxirribonucleasa tal como DNasa o una exonucleasa tal como 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-metilo puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'O-metoxietilo (2'-O-MOE) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-aminopropilo puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-desoxi puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con T-desoxi-2'-fluoro puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con LNA puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con ENA puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con HNA puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Los morfolinos pueden tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). El PNA puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con nucleótidos de metilfosfonato puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico modificado con nucleótidos de tiofosfonato puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa). Un polímero de ácido polinucleico que comprende 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas puede tener resistencia a las nucleasas (por ejemplo, resistencia a RNasa H, DNasa, 5'-3' exonucleasa o 3'-5' exonucleasa).
En algunos casos, uno o más de los análogos de nucleótidos artificiales descritos en esta invención tienen una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. El uno o más de los análogos de nucleótidos artificiales que comprenden modificación con 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-0-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA), LnA, EnA, PNA, HNA, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas pueden tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-metilo puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-metoxietilo (2-O-MOE) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-aminopropilo puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-desoxi puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con T-desoxi-2'-fluoro puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con LNA puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con ENA puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con PNA puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con HNA puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con morfolino puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificados con nucleótidos de metilfosfonato puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico modificado con nucleótidos de tiolfosfonato puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. Un polímero de ácido polinucleico que comprende 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas puede tener una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm con respecto a un polímero de ácido polinucleico natural equivalente. La mayor afinidad se puede ilustrar con una Kd más baja, una temperatura de fusión más alta (Tm) o una combinación de las mismas.
En casos adicionales, un polímero de ácido polinucleico descrito en el presente documento puede modificarse para aumentar su estabilidad. En una realización donde el polímero de ácido polinucleico es ARN, el polímero de ácido polinucleico puede modificarse para aumentar su estabilidad. El polímero de ácido polinucleico puede modificarse por una o más de las modificaciones descritas anteriormente para aumentar su estabilidad. El polímero de ácido polinucleico puede modificarse en la posición de hidroxilo 2', tal como por una modificación con 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2'-desoxi, T-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-0-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), TO-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) o por una conformación de ribosa bloqueada o puenteada (por ejemplo, LNA o ENA). El polímero de ácido polinucleico puede modificarse por 2'-O-metil y/o 2'-O-metoxietil ribosa. El polímero de ácido polinucleico también puede incluir morfolinos, PNA, HNA, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas para aumentar su estabilidad. Las modificaciones adecuadas del ARN para aumentar la estabilidad para el suministro serán evidentes para el experto en la técnica.
Un polímero de ácido polinucleico descrito en esta invención puede construirse usando síntesis química y/o reacciones de ligadura enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polímero de ácido polinucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre el polímero de ácido polinucleico y los ácidos nucleicos diana. Los procedimientos de ejemplo pueden incluir los descritos en los documentos: US5.142.047; US5.185.444; WO2009099942; o EP1579015. Los procedimientos de ejemplo adicionales pueden incluir los descritos en: Griffey y col., "2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides", J. Med. Chem. 39(26):5100-5109 (1997)); Obika, y col. "Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering". Tetrahedron Letters 38 (50): 8735 (1997); Koizumi, M. "ENA oligonucleotides as therapeutics". Current opinion in molecular therapeutics 8 (2): 144-149 (2006); y Abramova y col., "Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities", Indian Journal of Chemistry 48B: 1721-1726 (2009). Como alternativa, el polímero de ácido polinucleico se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el que un polímero de ácido polinucleico se ha subclonado en una orientación no codificante (es decir, el ARN transcrito del polímero de ácido polinucleico insertado tendrá una orientación no codificante con respecto a un polímero de ácido polinucleico diana de interés).
Un polímero de ácido polinucleico se puede unir a cualquier molécula de ácido nucleico, tal como otra molécula no codificante, un péptido u otros productos químicos para facilitar el suministro del polímero de ácido polinucleico y/o dirigir el ácido nucleico a un tejido, tipo de célula, o etapa de desarrollo celular específicos. El polímero de ácido polinucleico puede unirse a una proteína o ARN. La proteína unida al polímero de ácido polinucleico puede comprender un factor de corte y empalme para mejorar, inhibir o modular el corte y empalme y la eliminación de intrones. El ARN anclado al polímero de ácido polinucleico puede comprender un aptámero o cualquier estructura que mejore, inhiba o module el corte y empalme y la eliminación de intrones. El polímero de ácido polinucleico puede ser un ácido nucleico aislado.
Un polímero de ácido polinucleico puede conjugarse o unirse a un vehículo de suministro adecuado para suministrar a las células el polímero de ácido polinucleico. Las células pueden ser un tipo de célula específico o una etapa de desarrollo específica. El vehículo de suministro puede ser capaz de realizar un suministro específico del sitio, específico del tejido, específico de la célula o específico de la etapa de desarrollo. Por ejemplo, el vehículo de suministro puede ser una partícula viral específica de una célula, o un componente de la misma, como alternativa, el vehículo de suministro puede ser una partícula de anticuerpo específica de una célula, o un componente de la misma. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a las células beta en el páncreas. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a las células tímicas. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a células neoplásicas. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a células preneoplásicas (que se sabe que se desarrollan en fenotipos neoplásicos evidentes en un futuro previsible, tal como preleucemias y síndromes mielodisplásicos o lesiones o afecciones precancerosas definidas histopatológicamente.
En una realización, el polímero de ácido polinucleico puede unirse a una molécula química (por ejemplo, una molécula basada en ácido nucleico o no peptídica), tal como un fármaco. El fármaco puede ser una molécula pequeña (por ejemplo, con un peso molecular inferior a 900 Da).
En una realización de la descripción, el vehículo de suministro puede comprender un péptido de penetración celular (CPP). Por ejemplo, el polímero de ácido polinucleico se puede unir o formar un complejo con un CPP. El experto en la técnica entenderá que cualquier CPP adecuado puede conjugarse con el polímero de ácido polinucleico para facilitar el suministro del polímero de ácido polinucleico hacia y/o dentro de las células. Dichos CPP pueden ser cualquier tecnología de CPP adecuada descrita por Boisguérin y col. (2015, Advanced Drug Delivery Reviews doi: 10.1016/j.addr.2015.02.008),. También se describen vehículos de suministro adecuados para la conjugación con el polímero de ácido polinucleico en Lochmann y col. ((European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58 (2004) 237-251)).
El CPP puede ser un péptido rico en arginina y/o lisina, por ejemplo, donde la mayoría de los residuos en el péptido son lisina o arginina. El CPP puede comprender una poli-L-lisina (PLL). Como alternativa, el CPP puede comprender una poliarginina. Los CPP adecuados pueden seleccionarse del grupo que comprende Penetratina; R6-Penetratina; Transportano; oligo-argininas; F-3; péptido B; B-MSP; péptidos Pip, tales como Pip1, Pip2a, Pip2b, Pip5e, Pip5f, Pip5h, Pip5j; Pip5k, Pip5l, Pip5m, Pip5n, Pip5o, Pip6a, Pip6b, Pip6c, Pip6d, Pip6e, Pip6f, Pip6g o Pip6h; péptido de secuencia PKKKRKV; Penatratina; Lys4 ; SPACE; Tat; Tat-DRBD (dominio de unión a ARNbc); (RXR)4; (RFF)aRXB; (KFF)aK; R9F2 ; CPP obtenido de linfocitos T; Pep-3; PEGpep-3; MPG-8; MPG-8-Chol; PepFect6; P5RHH; R15; y Chol-Rg; o variantes funcionales de los mismos (por ejemplo, véase, Boisguérin y col. (2015, Advanced Drug Delivery Reviews doi: 10.1016/j.addr.2015.02.008).
En una realización, el CPP comprende o consiste en un péptido Pip. El péptido Pip se puede seleccionar del grupo que comprende Pip1, Pip2a, Pip2b, Pip5e, Pip5f, Pip5h, Pip5j; Pip5k, Pip5l, Pip5m, Pip5n, Pip5o, Pip6a, Pip6b, Pip6c, Pip6d, Pip6e, Pip6f, Pip6g y Pip6h.
En una realización de la descripción, el vehículo de suministro puede comprender una nanopartícula basada en péptidos (PBN), donde una pluralidad de CPP (por ejemplo, uno o más CPP adecuados analizados en esta invención) forman un complejo con el polímero de ácido polinucleico a través de las interacciones de carga. Dichas nanopartículas pueden tener un tamaño de entre aproximadamente 50 nm y 250 nm. En una realización, las nanopartículas pueden tener un tamaño de aproximadamente 70-200 nm. En otra realización, las nanopartículas pueden tener un tamaño de aproximadamente 70-100 nm o un tamaño de 125-200 nm.
En una realización, el polímero de ácido polinucleico puede formar un complejo con un vehículo de suministro, por ejemplo mediante enlace iónico. Como alternativa, el polímero de ácido polinucleico se puede unir covalentemente al vehículo de suministro. Se describen procedimientos de conjugación/unión en Lochmann y col. ((European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58 (2004) 237-251)). Por ejemplo, un procedimiento de conjugación puede comprender la introducción de un enlace adecuado que contenga un grupo reactivo (por ejemplo, -NH2 o -SH2) al polímero de ácido polinucleico y añadir el vehículo de suministro, tal como un péptido, postsintéticamente como un intermedio activo, seguido de la realización de la reacción de acoplamiento en medio acuoso. Un procedimiento alternativo puede comprender realizar la conjugación de forma lineal sobre un único soporte en fase sólida.
El vehículo de suministro y el polímero de ácido polinucleico pueden estar ligados a tiol y/o maleimida, tal como ligados a tiol-maleimida. La conjugación del polímero de ácido polinucleico y el vehículo de suministro puede ser por química clic, tal como la reacción de grupos funcionales azido o 2'-0-propiargilo y grupos alquino en las moléculas respectivas a conjugar. En una realización, el vehículo de suministro y el polímero de ácido polinucleico pueden estar unidos por un puente tioéter. En otra realización, el vehículo de suministro y el polímero de ácido polinucleico pueden estar unidos por un puente disulfuro. El experto en la técnica identificará fácilmente los grupos de unión o las reacciones adecuadas para la conjugación del polímero de ácido polinucleico y el vehículo de suministro, tal como un péptido.
El transcrito génico puede codificar la proinsulina. El transcrito génico puede transcribirse a partir del gen INS. Los transcritos génicos pueden obtenerse de un haplotipo humano que expresa bajos niveles de proinsulina. El intrón puede comprender el intrón 1 de INS.
El transcrito génico puede transcribirse desde un gen o ORF seleccionado de cualquiera de los genes o ORF que comprenden ABCD4; ABCF3; ACADVL; ALKBH6; AP1G2; APEX1; ARFRP1; ATHL1; ATP1A3; ATP5D; ATP13A1; BAX; BDH2; BRD2; C1orf63; C1orf630; C1orf631; C1orf124; C2orf49; C8orf82; C16orf59; CAPRIN2; CDCA7; CEP164; CEP170; CLCN7; CPNE1; CPSF3L; DCXR; DENND4B; DFFA; DIS3L2; DNAJB12; DPF1; DRG2; DSN1; EML3; EWSR1; EWSR10; FGFR4; FTSJ1; GBAP1; GMPPA; GMPR2; GNPTG; GORASP1; GPATCH4; HGS; HMG20B; IFFO1; ISYNA1; KRI1; LOC148413; LZTR1; MAN2C1; MAP4K2; MCOLN1; MDP1; MIB2; MITD1; MOK; MOV10; MRPL35; MTMR11; MUS81; NAPEPLD; NBEAL2; NDRG4; NDUFB10; NFATC4; NFKBIB; NIT1; NKTR; NPRL2; NSUN5P1; NUDT22; PAN2; PDDC1; PDLIM4; PHF1; PIK3CD; PITPNM1; PPIL2; PPP1R35; PPP4C; PQLC2; PRPF39; PSME2; PTPMT1; QARS; RAD52; RHOT2; RMND5B; RNF123; RPL10A; RPP21; RPS6KB2; RUSC1; SCRN2; SCYL1; SFR1; SGSM3; SIRT7; SLC25A3; SLC25A3; SLC30A7; SLC37A4; STK19; STX10; TCF25; TOMM40; TP53I3; TRIM41; TRPT1; TSTA3; TTC14; TTC140; TUBGCP6; U2AF1L4; UCK1; UNC45A; VAMP1; VAMP10; VARS; VPS28; WDR24; WDR90; WRAP53; YDJC; YIPF3; YIPF3; ZCCHC8; ZCCHC18; ZFAND1; ZNF131; ZNF300; ZNF317; ZNF692; ZNF711; ZNRD1; ZWINT; o combinaciones de los mismos.
Las expresiones "polímero de ácido polinucleico" y "ácido nucleico" se pueden usar de manera intercambiable y pueden referirse a un polímero de ácido polinucleico que tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
Enfermedades
Los procedimientos y composiciones que se describen en esta invención pueden usarse para tratar una enfermedad o afección caracterizada por una producción alterada de una proteína. Los procedimientos y composiciones que se describen en esta invención también pueden usarse para tratar una enfermedad o afección caracterizada por un corte y empalme defectuoso. La enfermedad o afección puede ser una enfermedad o afección genética. El trastorno o afección genética puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína. El trastorno o afección genética también puede caracterizarse por un corte y empalme defectuoso. El trastorno o afección genética puede ser un trastorno hereditario, o un defecto no hereditario en una o más ubicaciones dentro del genoma. El trastorno genético puede ser una enfermedad hereditaria. La enfermedad hereditaria puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína. La enfermedad hereditaria puede caracterizarse por un corte y empalme defectuoso. Un sujeto con una enfermedad hereditaria puede tener un genoma que puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con una enfermedad hereditaria puede tener un genoma que comprende una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con una enfermedad hereditaria puede tener un genoma que puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
El trastorno o afección genética puede ser un defecto no hereditario en una o más ubicaciones dentro del genoma. El defecto no hereditario puede ser una mutación puntual, una deleción, una inserción o un cambio de marco. El trastorno o afección genética asociada con el defecto no hereditario puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína. El trastorno o afección genética asociada con el defecto no hereditario puede caracterizarse por un corte y empalme defectuoso. Un sujeto con un defecto no hereditario puede tener un genoma que puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con un defecto no hereditario puede tener un genoma que comprende una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con un defecto no hereditario puede tener un genoma que puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
El trastorno o afección genética puede ser un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico. A veces una enfermedad hereditaria también puede caracterizarse como una enfermedad hereditaria dominante autosómica, recesiva autosómica, dominante ligada al cromosoma X, recesiva ligada al cromosoma X, mitocondrial ligada al cromosoma Y, mitocondrial o multifactorial o poligénica. Un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína. Un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico puede caracterizarse por un corte y empalme defectuoso. Un sujeto con un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico puede tener un genoma que puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico puede tener un genoma que comprende una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína. Un sujeto con un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico puede tener un genoma que puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
La enfermedad hereditaria de ejemplo puede incluir acondroplasia, hemocromatosis hereditaria, síndrome de Down, esferocitosis hereditaria, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, intolerancia hereditaria a la fructosa, hemofilia, distrofia muscular (por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne o DMD), trastornos poligénicos, cáncer de mama, cáncer de ovario, enfermedad de Parkinson, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, diabetes, cardiopatía, artritis, enfermedad de la motoneurona, albinismo, síndrome de Cri-du-Chat, fibrosis quística, síndrome X frágil, galactosemia, enfermedad de Huntington, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Klinefelter, enfermedad de Krabbe, síndrome de Langer-Giedion, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Marfan, distrofia miotónica, síndrome de Nail-Patella, neurofibromatosis, síndrome de Noonan, síndrome triple X, osteogénesis imperfecta, síndrome de Patau, fenilcetonuria, porfiria, retinoblastoma, síndrome de Rett, enfermedad de células falciformes, síndrome de Turner, síndrome de Usher, síndrome de Von Hippel-Lindau, síndrome de Waardenburg, enfermedad de Wilson, xenoderoma pigmentoso, síndrome XXXX o síndrome YY.
Una enfermedad hereditaria tal como, por ejemplo: acondroplasia, hemocromatosis hereditaria, síndrome de Down, esferocitosis hereditaria, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, intolerancia hereditaria a la fructosa, hemofilia, distrofia muscular (por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne o DMD), trastornos poligénicos, cáncer de mama, cáncer de ovario, enfermedad de Parkinson, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, diabetes, cardiopatía, artritis, enfermedad de la motoneurona, albinismo, síndrome de Cri-du-Chat, fibrosis quística, síndrome X frágil, galactosemia, enfermedad de Huntington, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Klinefelter, enfermedad de Krabbe, síndrome de Langer-Giedion, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Marfan, distrofia miotónica, síndrome de Nail-Patella, neurofibromatosis, síndrome de Noonan, síndrome triple X, osteogénesis imperfecta, síndrome de Patau, fenilcetonuria, porfiria, retinoblastoma, síndrome de Rett, enfermedad de células falciformes, síndrome de Turner, síndrome de Usher, síndrome de Von Hippel-Lindau, síndrome de Waardenburg, enfermedad de Wilson, xenoderoma pigmentoso, síndrome XXXX o síndrome YY, puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína, o por un corte y empalme defectuoso. Una enfermedad hereditaria tal como, por ejemplo: acondroplasia, hemocromatosis hereditaria, síndrome de Down, esferocitosis hereditaria, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, intolerancia hereditaria a la fructosa, hemofilia, distrofia muscular (por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne o DMD), trastornos poligénicos, cáncer de mama, cáncer de ovario, enfermedad de Parkinson, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, diabetes, cardiopatía, artritis, enfermedad de la motoneurona, albinismo, síndrome de Cri-du-Chat, fibrosis quística, síndrome X frágil, galactosemia, enfermedad de Huntington, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Klinefelter, enfermedad de Krabbe, síndrome de Langer-Giedion, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Marfan, distrofia miotónica, síndrome de Nail-Patella, neurofibromatosis, síndrome de Noonan, síndrome triple X, osteogénesis imperfecta, síndrome de Patau, fenilcetonuria, porfiria, retinoblastoma, síndrome de Rett, enfermedad de células falciformes, síndrome de Turner, síndrome de Usher, síndrome de Von Hippel-Lindau, síndrome de Waardenburg, enfermedad de Wilson, xenoderoma pigmentoso, síndrome XXXX, o síndrome YY, puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Como se ha descrito anteriormente, el trastorno o afección genética puede ser un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico. El trastorno o afección genética puede ser un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico que puede ser un trastorno caracterizado por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso.
El trastorno dominante autosómico de ejemplo puede incluir enfermedad de Huntington, neurofibromatosis tipo 1, neurofibromatosis tipo 2, síndrome de Marfan, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, exostosis múltiple hereditaria, esclerosis tuberosa, enfermedad de Von Willebrand o porfiria intermitente aguda.
Un trastorno dominante autosómico tal como enfermedad de Huntington, neurofibromatosis tipo 1, neurofibromatosis tipo 2, síndrome de Marfan, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, exostosis múltiple hereditaria, esclerosis tuberosa, enfermedad de Von Willebrand o porfiria intermitente aguda puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno dominante autosómico, tal como enfermedad de Huntington, neurofibromatosis tipo 1, neurofibromatosis tipo 2, síndrome de Marfan, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, exostosis múltiple hereditaria, esclerosis tuberosa, enfermedad de Von Willebrand o porfiria intermitente aguda puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Un trastorno recesivo autosómico de ejemplo puede incluir albinismo, deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, atrofia muscular espinal o síndrome de Roberts.
Un trastorno recesivo autosómico tal como: albinismo, deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, atrofia muscular espinal o síndrome de Roberts, puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno recesivo autosómico tal como: albinismo, deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, atrofia muscular espinal o síndrome de Roberts puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Un trastorno dominante ligado al cromosoma X de ejemplo puede incluir raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, síndrome de Rett, incontinencia pigmenti tipo 2, síndrome de Aicardi o síndrome de Klinefelter.
Un trastorno dominante ligado al cromosoma X tal como: raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, síndrome de Rett, incontinencia pigmenti tipo 2, síndrome de Aicardi o síndrome de Klinefelter puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno dominante ligado al cromosoma X tal como: raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, síndrome de Rett, incontinencia pigmenti tipo 2, síndrome de Aicardi o síndrome de Klinefelter puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína. Un trastorno recesivo ligado al cromosoma X de ejemplo puede incluir hemofilia A, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyhan o síndrome de Turner.
Un trastorno recesivo ligado al cromosoma X tal como: hemofilia A, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyhan o síndrome de Turner puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno recesivo ligado al cromosoma X tal como: hemofilia A, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyhan o síndrome de Turner puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Un trastorno ligado al cromosoma Y de ejemplo puede incluir síndrome de Swyer o una forma de retinitis pigmentosa.
Un trastorno ligado al cromosoma Y tal como síndrome de Swyer o una forma de retinitis pigmentosa puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno ligado al cromosoma Y tal como síndrome de Swyer o una forma de retinitis pigmentosa, puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Una enfermedad mitocondrial de ejemplo puede incluir neuropatía óptica hereditaria de Leber.
Una enfermedad mitocondrial tal como neuropatía óptica hereditaria de Leber, puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Una enfermedad mitocondrial, tal como neuropatía óptica hereditaria de Leber, puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
Un trastorno multifactorial o poligénico de ejemplo puede incluir cardiopatía, diabetes, enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer.
Un trastorno multifactorial o poligénico tal como cardiopatía, diabetes, enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer, puede caracterizarse por una producción alterada de una proteína o por un corte y empalme defectuoso. Un trastorno multifactorial o poligénico tal como cardiopatía, diabetes, enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer, puede comprender una copia de un gen que comprende un exón que, cuando se transcribe correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, puede comprender una copia de un gen que puede comprender una copia de un gen que comprende un conjunto de exones que, cuando se transcriben correctamente en el ARNm completamente procesado, puede codificar la forma funcional de longitud completa de la proteína, o puede comprender una copia defectuosa del gen, que puede ser incapaz de producir una forma funcional de longitud completa de la proteína.
En algunos casos, las composiciones y los procedimientos descritos en esta invención se usan para tratar un trastorno o afección genética tal como una enfermedad hereditaria. Las composiciones y los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para tratar un trastorno o afección genética tal como una enfermedad hereditaria que se caracteriza por una producción alterada de una proteína. Las composiciones y los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para tratar un trastorno o afección genética tal como una enfermedad hereditaria que se caracteriza por un corte y empalme defectuoso.
Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención también pueden usarse para tratar un trastorno o afección genética tal como un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico. Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención pueden usarse para tratar un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico, en los que el trastorno o afección se caracteriza por una producción alterada de una proteína. Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención también pueden usarse para tratar un trastorno dominante autosómico, un trastorno recesivo autosómico, un trastorno dominante ligado al cromosoma X, un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, un trastorno ligado al cromosoma Y, una enfermedad mitocondrial o un trastorno multifactorial o poligénico, en los que el trastorno o afección se caracteriza por un corte y empalme defectuoso.
En algunos casos, una enfermedad o afección incluye distrofia muscular, atrofia muscular espinal (SMA), ataxiatelangiectasia, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, diabetes o cáncer.
La distrofia muscular es un grupo de enfermedades musculares que pueden debilitar el sistema musculoesquelético y pueden dificultar la locomoción. Puede caracterizarse por la debilidad progresiva del músculo esquelético, defectos en las proteínas musculares y la muerte de células y tejidos musculares. Una forma común de distrofia muscular puede ser la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Formas adicionales de distrofia muscular pueden incluir distrofia muscular de Becker, de cintura, congénita, facioescapulohumeral, miotónica, oculofaríngea, distal y de Emery-Dreifuss.
La atrofia muscular espinal (SMA) es un trastorno autosómico recesivo que es una de las causas genéticas más comunes de mortalidad infantil. La principal característica de la enfermedad puede ser una pérdida progresiva de las neuronas motoras de la médula espinal, lo que da como resultado la denervación del músculo esquelético con la posterior debilidad, atrofia y parálisis de los músculos voluntarios. El locus de la SMA se puede mapear con respecto a una repetición invertida compleja de ~500 kb en el cromosoma 5q13 que contiene varios genes. La causa principal de la SMA puede ser la pérdida homocigótica de la copia telomérica del gen sobreviviente de la neurona motora (SMN1) que se encuentra dentro de la repetición invertida. También se puede transcribir un gen duplicado dentro de la copia centromérica de la repetición invertida (SMN2), pero el gen SMN2 no compensa completamente la pérdida de la función de SMN1.
La ataxia-telangiectasia (A-T) o síndrome de Louis-Bar es una enfermedad hereditaria neurodegenerativa rara. El término "ataxia" se refiere a una mala coordinación y el término "telangiectasia" se refiere a vasos sanguíneos pequeños dilatados. Ambos términos caracterizan las características distintivas de esta enfermedad. La AT puede dañar el cerebelo y áreas adicionales del cerebro que pueden causar problemas de movimiento y coordinación. La AT también puede debilitar el sistema inmunitario, lo que aumenta la infección y puede afectar a la reparación del ADN, lo que aumenta el riesgo de cáncer. La A-T puede estar asociada a un defecto en el gen ATM, que es responsable de gestionar la respuesta celular a múltiples formas de estrés.
La agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, también conocida como hipogammaglobulinemia ligada al cromosoma X, XLA, agammaglobulinemia de tipo Bruton, síndrome de Bruton o agammaglobulinemia ligada al sexo, es un trastorno genético ligado al cromosoma X que puede afectar a la capacidad del cuerpo para combatir infecciones. Los pacientes con XLA carecen de linfocitos B maduros y, como resultado, carecen de los anticuerpos necesarios para combatir la infección. La tirosina cinasa de Bruton (BTK) se puede asociar con la mediación del desarrollo y la maduración de los linfocitos B y el gen BTK se puede asociar con la XLA.
La diabetes mellitus (DM) (comúnmente conocida como diabetes) es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por un alto nivel de azúcar en sangre durante un período prolongado. Los síntomas de la diabetes pueden incluir pérdida de peso, poliuria o aumento de la orina, polidipsia o aumento de la sed y polifagia o aumento del hambre. La diabetes se puede clasificar en cuatro categorías: tipo 1, tipo 2, diabetes gestacional y otros tipos específicos de diabetes. La diabetes tipo 1 se puede caracterizar por una pérdida de células beta productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que conduce a una deficiencia de insulina. La diabetes tipo 2 se puede caracterizar por resistencia a la insulina, que también se puede combinar con una secreción reducida de insulina. La diabetes gestacional puede parecerse a la diabetes tipo 2 y puede implicar una combinación de secreción y capacidad de respuesta inadecuadas de la insulina. Otros tipos específicos de diabetes pueden incluir prediabetes, diabetes autoinmune latente de adultos (LADA) y diabetes congénita.
El cáncer puede ser un tumor sólido o una neoplásica hematológica. Un tumor sólido puede ser un sarcoma o un carcinoma. Un sarcoma puede ser un cáncer de hueso, cartílago, grasa muscular, tejidos vasculares o hematopoyéticos. Un sarcoma de ejemplo puede incluir rabdomiosarcoma alveolar, sarcoma alveolar de las partes blandas, ameloblastoma, angiosarcoma, condrosarcoma, cordoma, sarcoma de células claras de tejido blando, liposarcoma desdiferenciado, tumor desmoide, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, rabdomiosarcoma embrionario, fibrosarcoma epitelioide, hemangioendotelioma epitelioide, sarcoma epitelioide, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor rabdoide extrarrenal, condrosarcoma mixoide extraesquelético, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, tumor de células gigantes, hemangiopericitoma, fibrosarcoma infantil, tumor miofibroblástico inflamatorio, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma óseo, liposarcoma, liposarcoma óseo, histiocitoma fibroso maligno (MFH), histiocitoma fibroso maligno (MFH) de hueso, mesenquimoma maligno, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, condrosarcoma mesenquimatoso, mixofibrosarcoma, liposarcoma mixoide, sarcoma fibroblástico mixoinflamatorio, neoplasias con diferenciación de células epiteoides perivasculares, osteosarcoma, osteosarcoma paróstico, neoplasia con diferenciación de células epiteioides perivasculares, osteosarcoma perióstico, liposarcoma pleomórfico, rabdomiosarcoma pleomórfico, PNET/tumor de Ewing extraesquelético, rabdomiosarcoma, liposarcoma de células redondas, osteosarcoma microcítico, tumor fibroso solitario, sarcoma sinovial, osteosarcoma telangiectásico.
Un carcinoma puede ser un cáncer desarrollado a partir de células epiteliales. Un carcinoma de ejemplo puede incluir adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, carcinoma anaplásico, carcinoma de células grandes, carcinoma de células pequeñas, cáncer de ano, cáncer de apéndice, cáncer de las vías biliares (es decir, colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de cuello del útero, cáncer de colon, cáncer de origen primario desconocido (CUP, por sus siglas en inglés), cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer gastroenterológico, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, meduloblastoma, melanoma, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, enfermedad paratiroidea, cáncer de pene, tumor hipofisario, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de garganta, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de vagina o cáncer de vulva.
La neoplasia hematológica es una neoplasia del sistema sanguíneo y puede incluir neoplasias basadas en linfocitos T y basadas en linfocitos B. La neoplasia hematológica de ejemplo puede incluir leucemia mieloide, neoplasias mieloproliferativas, linfoma de linfocitos T periférico no específicado de otro modo (PTCL-NOS), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioinmunoblástico, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma/leucemia de linfocitos T en adultos (ATLL), linfoma blástico de linfocitos NK, linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía, linfoma hepatoesplénico de linfocitos T gama-delta, linfoma linfoblástico, linfomas nasales de linfocitos NK/T, linfomas de linfocitos T relacionados con el tratamiento, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico pequeño (SLL), CLL de alto riesgo, linfoma no CLL/SLL, leucemia prolinfocítica (PLL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), linfoma de células del manto (MCL), macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, linfoma de linfocitos B de la zona marginal extranodal, linfoma de linfocitos B de la zona marginal nodal, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos B de alto grado no Burkitt, linfoma de linfocitos B mediastinal primario (PMBL), linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma esplénico de la zona marginal, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de linfocitos B grandes mediastinales (tímicos), linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de derrame primario o granulomatosis linfomatoide.
En algunos casos, las composiciones y procedimientos descritos en esta invención se usan para tratar la distrofia muscular, atrofia muscular espinal (SMA), ataxia-telangiectasia, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, diabetes o cáncer. Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención pueden usarse para tratar la distrofia muscular, atrofia muscular espinal (SMA), ataxia-telangiectasia, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, diabetes o cáncer, en los que la enfermedad o trastorno está asociada con una producción alterada de una proteína. Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención pueden usarse para tratar la distrofia muscular, atrofia muscular espinal (SMA), ataxia-telangiectasia, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, diabetes o cáncer, en las que la enfermedad o trastorno se caracteriza por un corte y empalme defectuoso.
La enfermedad puede ser cualquier afección genética causada por mutaciones que conducen a la retención de intrones completos en transcritos maduros. La enfermedad puede ser diabetes. La enfermedad puede ser diabetes tipo I. La enfermedad puede ser diabetes tipo II. En otra realización, la enfermedad puede ser cáncer. El cáncer puede ser leucemia mieloide o neoplasias mieloproliferativas. El cáncer puede sufrir mutaciones en cualquiera de los componentes espliceosomales que facilitan el reconocimiento de los sitios de corte y empalme 3'. El polímero de ácido polinucleico puede usarse para aumentar la expresión endógena en un sujeto con actividad residual de linfocitos p. El polímero de ácido polinucleico puede usarse para aumentar la expresión de proinsulina en otros pacientes diabéticos, incluidos aquellos que recibieron linfocitos p trasplantados. El polímero de ácido polinucleico puede usarse como terapia no codificante de tumores neoplásicos que contienen mutaciones en genes que codifican componentes U2 (por ejemplo, >20 % de las leucemias mieloides).
En una realización, donde la enfermedad es diabetes, la reducción de la incidencia de retención de intrones puede realizarse durante el desarrollo fetal del sujeto. Por ejemplo, a una madre embarazada se le puede administrar el polímero de ácido polinucleico para reducir la retención de intrones en el feto.
El sujeto puede ser eucariota. El sujeto puede ser un mamífero. El sujeto puede ser humano. El sujeto puede ser un primate no humano. El sujeto puede ser un mamífero no primate tal como una rata, un ratón, un hurón, un perro, un gato o un cerdo. El sujeto puede ser un feto, tal como un feto humano.
El procedimiento puede comprender una etapa para determinar si la patología de una enfermedad está causada por una retención de intrones en un transcrito génico antes del tratamiento. La determinación puede usar cualquier ensayo adecuado o análisis genético disponible para el experto en la técnica.
En algunos casos, la detección se realiza a nivel de ácido nucleico con técnicas basadas en ácido nucleico tales como hibridación in situ y RT-PCR. Las tecnologías de secuenciación pueden incluir tecnologías de secuenciación de próxima generación tales como secuenciación de molécula única verdadera Helicos (tSMS, por sus siglas en inglés) (Harris T.D. y col. (2008) Science 320:106-109); secuenciación 454 (Roche) (Margulies, M. y col. 2005, Nature, 437, 376-380); tecnología SOLiD (Applied Biosystems); secuenciación SOLEXA (Illumina); tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT™) de Pacific Biosciences; secuenciación de nanoporos (Soni GV y Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001); secuenciación de semiconductores (Ion Torrent; Personal Genome Machine); secuenciación de nanobolas de ADN; secuenciación usando tecnología de Dover Systems (Polonator) y tecnologías que no requieren amplificación ni transforman el ADN nativo antes de la secuenciación (por ejemplo, Pacific Biosciences y Helicos), tales como estrategias basadas en nanoporos (por ejemplo, Oxford Nanopore, Genia Technologies y Nabsys). Las tecnologías de secuenciación también pueden incluir secuenciación Sanger, secuenciación Maxam-Gilbert, secuenciación Shotgun, PCR puente, secuenciación basada en espectrometría de masas, secuenciación Sanger basada en microfluidos, secuenciación basada en microscopía, secuenciación RNAP o secuenciación basada en hibridación.
La secuenciación de un transcrito génico de interés también puede incluir una etapa de amplificación. Las metodologías de amplificación de ejemplo incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), replicación de secuencias autosostenida (3SR), amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de genoma completo, amplificación de desplazamiento múltiple, amplificación de desplazamiento de cadena, amplificación dependiente de helicasa, reacción de amplificación de enzimas melladoras, amplificación de polimerasa recombinante, PCR de transcripción inversa, PCR mediada por ligadura o PCR específica de metilación.
Los procedimientos adicionales que se pueden usar para obtener una secuencia de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, matriz de expresión de ARN del genoma completo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), secuenciación genómica, secuenciación de novo, secuenciación s MrT de Pacific Biosciences, inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC), espectrometría de masas, espectrometría de masas en tándem, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), hibridación in situ, hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación in situ cromogénica (CISH), hibridación in situ con plata (SISH), PCR digital (dPCR), PCR de transcripción inversa, PCR cuantitativa (Q-PCR), qPCR de marcador único, PCR en tiempo real, análisis nCounter (tecnología Nanostring), transferencia de Western, transferencia de Southern, SDS-PAGE, electroforesis en gel y transferencia de Northern.
En algunos casos, la detección se puede realizar a nivel de proteína, usando, por ejemplo, ensayos basados en inmunoprecipitación tales como transferencia de Western o ELISA. Además, también se pueden utilizar procedimientos tales como electroforesis y análisis de espectrometría de masas para la detección de una proteína de interés.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en la SEQ ID NO: 46, u opcionalmente, una región que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. La región puede tener al menos un 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 46. Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en la SEQ ID NO: 3, u opcionalmente, una región que tiene al menos un 95 % de identidad con la s Eq ID NO: 3. La región puede tener al menos un 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en una secuencia complementaria con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para modular el corte y empalme de intrones en una célula, que comprende hibridar un polímero de ácido polinucleico con una región de pre-ARNm, donde la región comprende o consiste en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. La región puede comprender o consistir en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 98 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. La región puede comprender o consistir en una secuencia complementaria con una secuencia que tiene al menos un 99 % de identidad con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas.
La célula puede estar in vitro. Las células pueden estar ex vivo. La célula puede ser una célula eucariota o una célula procariota. La célula puede ser una célula eucariota. La célula puede ser una célula de mamífero de ser humano; primate no humano; o mamíferos no primates tales como gatos, ratas, ratones, perros, hurones o cerdos. La célula puede ser una célula humana tal como una célula epitelial, una célula de tejido conjuntivo, una célula secretora de hormonas, una célula nerviosa, una célula del músculo esquelético, una célula sanguínea o una célula del sistema inmunitario. La célula puede ser una célula tumoral tal como una célula tumoral sólida o una célula neoplásica hematológica.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 46, u opcionalmente una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 46. La región puede tener al menos un 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 46.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 3, u opcionalmente una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3. La región puede tener al menos un 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con
respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico, donde la región comprende o consiste
en una secuencia complementaria con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434;
o combinaciones de las mismas.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que es no codificante con
respecto al menos a parte de una región de un polímero de ácido polinucleico, donde la región comprende o consiste
en una secuencia complementaria con cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434;
o combinaciones de las mismas; u opcionalmente una región de un polímero de ácido polinucleico que comprende o
que consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 47 a 434.
La región puede tener al menos un 98 % o un 99 % de identidad con las SEQ ID NO: 47 a 434.
El experto en la técnica puede entender que la referencia a ser no codificante con respecto al menos a parte de una
región de un polímero de ácido polinucleico significa una región de al menos 5 nucleótidos consecutivos. El experto
en la técnica puede entender que la referencia a ser no codificante con respecto al menos a parte de una región de
un polímero de ácido polinucleico significa una región de al menos 10 nucleótidos consecutivos.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste
en una secuencia de ácido nucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID
NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13;
SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23;
SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34;
SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44;
o combinaciones de las mismas.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste
en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de
cualquiera del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7;
SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28;
SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38;
SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. Según otro
aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una
secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera
del grupo que comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO:
8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO:
19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO:
40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas. Según otro aspecto de la
descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia de
ácido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que
comprende la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID
NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 1 NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 2 NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; y SEQ ID NO: 44; o combinaciones de las mismas.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste
en una secuencia de ácido nucleico seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434;
o combinaciones de las mismas. Se entiende que los nucleótidos de uracilo pueden sustituirse por nucleótidos de
timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias).
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste
en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia seleccionada de
cualquiera del grupo que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. Según otro aspecto
de la descripción, se proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia
de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo
que comprende las SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. Según otro aspecto de la descripción, se
proporciona un polímero de ácido polinucleico que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico que
tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende las
SEQ ID NO: 47 a 434; o combinaciones de las mismas. Se entiende que los nucleótidos de uracilo pueden sustituirse
por nucleótidos de timina (por ejemplo, la forma de ADN del ARN de dichas secuencias).
El polímero de ácido polinucleico puede ser un polímero de ácido polinucleico aislado. El polímero de ácido polinucleico
puede conjugarse o unirse a un vehículo de suministro adecuado para suministrar a las células el polímero de ácido
polinucleico. El vehículo de suministro puede ser capaz de realizar un suministro específico del sitio, específico del
tejido o específico de la célula. Por ejemplo, el vehículo de suministro puede ser una partícula viral específica de una célula, o un componente de la misma, como alternativa, el vehículo de suministro puede ser una partícula de anticuerpo específica de una célula, o un componente de la misma. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a las células beta en el páncreas. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a las células tímicas. El polímero de ácido polinucleico puede dirigirse para su suministro a células neoplásicas. El polímero de ácido polinucleico puede modificarse para aumentar su estabilidad. En una realización donde el polímero de ácido polinucleico es ARN, el polímero de ácido polinucleico puede modificarse para aumentar su estabilidad. El polímero de ácido polinucleico puede modificarse por 2'-O-metil y 2'-O-metoxietil ribosa. Las modificaciones adecuadas del ARN para aumentar la estabilidad para el suministro serán evidentes para el experto en la técnica.
El polímero de ácido polinucleico puede formar parte de un vector plasmídico. El polímero de ácido polinucleico puede formar parte de un vector viral. El polímero de ácido polinucleico puede estar codificado en un vector viral.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un vector que comprende el polímero de ácido polinucleico de la invención. El vector puede comprender un vector viral. El vector viral puede comprender un vector viral adenoasociado. El vector puede comprender cualquier virus que dirija el polímero de ácido polinucleico a células neoplásicas o a un tipo de célula específico.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un vehículo de suministro que comprende, o se une al polímero de ácido polinucleico de la invención. El vehículo de suministro puede comprender una nanopartícula a base de lípidos; un péptido catiónico de penetración celular (CPP, por sus siglas en inglés); o un polímero catiónico lineal o ramificado; o un bioconjugado, tal como colesterol, ácido biliar, lípido, péptido, polímero, proteína o un aptámero, que se conjuga con el polímero de ácido polinucleico para el suministro intracelular y/o una estabilidad mejorada. El vehículo de suministro puede ser específico de una célula o tejido o específico de una etapa de desarrollo. El vehículo de suministro puede comprender un anticuerpo, o parte del mismo. El anticuerpo puede ser específico para un marcador de superficie celular en la célula de interés para el suministro del polímero de ácido polinucleico a la célula específica. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti GAD para el suministro de polímero de ácido polinucleico no viral dirigido a células beta de islotes según Ji Hoon Jeong y col. (Journal of Controlled Release 107 (2005) 562-570). Por ejemplo, el anticuerpo anti GAD que conjuga el fragmento Fab' anti GAD con PEI a través de un enlazador PEG (PEI-PEG-Fab'). Se pueden usar otros anticuerpos específicos en tal conjugación para el suministro tisular dirigido del polímero de ácido polinucleico.
Composición/formulaciones farmacéuticas, dosificación y regímenes de tratamiento
Según un aspecto de la descripción, se proporciona un agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por la producción alterada de una forma funcional de una proteína que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico que induce un aumento en el corte y empalme de un intrón en un transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el sujeto tiene un grupo de transcritos de ARNm parcialmente procesados, que son capaces de codificar copias de la forma funcional de longitud completa de la proteína y cada uno de los cuales comprende al menos un intrón retenido que inhibe la traducción de los transcritos de ARNm parcialmente procesados; y poner en contacto una célula diana del sujeto con el agente terapéutico para inducir el corte y empalme de una porción del grupo de los transcritos de ARNm parcialmente procesados para eliminar el al menos un intrón retenido de cada uno de los transcritos de ARNm parcialmente procesados en la porción, con el fin de producir transcritos de ARNm completamente procesados, donde los transcritos de ARNm completamente procesados se traducen para expresar copias de la forma funcional de longitud completa de la proteína, que tratan la enfermedad o afección.
El agente terapéutico puede provocar la activación de uno o más complejos de proteínas de corte y empalme en la célula para eliminar el al menos un intrón retenido de cada uno de los transcritos de ARNm parcialmente procesados en la porción del grupo de los transcritos de ARNm parcialmente procesados. El agente terapéutico puede inhibir una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. El agente terapéutico puede activar una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. El agente terapéutico puede interactuar o unirse a una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. El agente terapéutico puede interactuar o unirse a la secuencia polinucleotídica diana de los transcritos de ARNm parcialmente procesados. En algunas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un polímero de ácido polinucleico, tales como los polímeros de ácido polinucleico descritos en esta invención. En algunas realizaciones, el agente terapéutico puede ser una molécula pequeña.
La molécula pequeña puede ser una molécula de menos de 900 Dalton, y puede iniciar uno o más complejos de proteínas de corte y empalme en la célula para eliminar el al menos un intrón retenido de cada uno de los transcritos de ARNm parcialmente procesados en la porción del grupo de los transcritos de ARNm parcialmente procesados. La pequeña molécula puede inhibir una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. La pequeña molécula puede activar una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones. La pequeña molécula puede interactuar o unirse a una proteína que regula la actividad de corte y empalme de intrones, o puede interactuar o unirse a la secuencia polinucleotídica diana de los transcritos de ARNm parcialmente procesados.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende el polímero de ácido polinucleico de la invención. La composición puede ser una composición farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender un agente activo adicional, tal como un fármaco o profármaco. La composición puede comprender combinaciones de diferentes polímeros de ácido polinucleico, tales como SSO, para terapia.
La composición puede comprender al menos otra molécula biológicamente activa además del polímero de ácido polinucleico. La molécula biológicamente activa puede ser un fármaco o un profármaco. La molécula biológicamente activa puede comprender un ácido nucleico o un aminoácido. La molécula biológicamente activa puede comprender una molécula pequeña (por ejemplo, una molécula de <900 Dalton).
Una composición farmacéutica descrita en esta invención puede comprender un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde la secuencia diana se encuentra entre dos cuádruplex G, donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro. La composición farmacéutica descrita en esta invención también puede comprender un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende un primer motivo CCC, y donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro. Además, la composición farmacéutica descrita en esta invención puede comprender un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde el motivo de unión no forma un cuádruplex G, y donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
Una composición farmacéutica descrita en esta invención puede comprender además un polímero de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de un transcrito de ARNm parcialmente procesado que codifica una proteína y que comprende un intrón retenido, donde el polímero de ácido polinucleico se hibrida con un motivo de unión del transcrito de ARNm parcialmente procesado, y donde el motivo de unión forma una estructura de horquilla, donde el polímero de ácido polinucleico es capaz de inducir el corte y empalme del intrón retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo de suministro.
Una formulación farmacéutica descrita en esta invención se puede administrar a un sujeto por múltiples vías de administración, incluyendo, pero sin limitación, las vías de administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), oral, intranasal, bucal, tópica, rectal o transdérmica. En algunos casos, la composición farmacéutica descrita en esta invención se formula para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular). En otros casos, la composición farmacéutica descrita en esta invención se formula para administración oral. Aún en otros casos, la composición farmacéutica descrita en esta invención se formula para administración intranasal.
Una formulación farmacéutica descrita en esta invención puede incluir, pero sin limitación, dispersiones líquidas acuosas, dispersiones autoemulsionantes, soluciones sólidas, dispersiones liposomales, aerosoles, formas farmacéuticas sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada.
Una formulación farmacéutica puede incluir un portador o materiales portadores que pueden incluir cualquier excipiente de uso común en productos farmacéuticos y deben seleccionarse sobre la base de la compatibilidad con la composición describa en esta invención y las propiedades del perfil de liberación de la forma farmacéutica deseada. Los materiales portadores de ejemplo incluyen, por ejemplo, aglutinantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración, agentes de carga, tensioactivos, solubilizantes, estabilizantes, lubricantes, agentes humectantes, diluyentes y similares. Los materiales portadores farmacéuticamente compatibles pueden incluir, pero sin limitación, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnesio, polivinilpirrolidona (PVP), colesterol, ésteres de colesterol, caseinato de sodio, lecitina de soja, ácido taurocólico, fosfotidilcolina, cloruro de sodio, fosfato de tricalcio, fosfato de dipotasio, celulosa y conjugados de celulosa, azúcares, estearoil lactilato de sodio, carragenano, monoglicérido, diglicérido, almidón pregelatinizado y similares. Véanse, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y., 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed. (Lippincott Williams y Wilkins 1999). Una formulación farmacéutica puede incluir agentes dispersantes y/o agentes moduladores de la viscosidad que pueden incluir materiales que controlan la difusión y la homogeneidad de un fármaco a través de un medio líquido o un procedimiento de granulación o un procedimiento de mezcla. En algunas realizaciones, estos agentes también facilitan la eficacia de un revestimiento o matriz erosionable. Los facilitadores de difusión/agentes dispersantes de ejemplo incluyen, por ejemplo, polímeros hidrófilos, electrolitos, Tween ® 60 u 80, PEG, polivinilpirrolidona (PVP; conocida comercialmente como Plasdone®), y los agentes dispersantes a base de carbohidratos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosas (por ejemplo, HPC, HPC-SL y HPC-L), hidroxipropilmetilcelulosas (por ejemplo, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15m y HPMC K100M), carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), celulosa no cristalina, silicato de aluminio y magnesio, trietanolamina, alcohol polivinílico (PVA), copolímero de vinilpirrolidona/acetato de vinilo (S630), polímero de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenol con óxido de etileno y formaldehído (también conocido como tiloxapol), poloxámeros (por ejemplo, Pluronics F68®, F88® y F108®, que son copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno; y poloxaminas (por ejemplo, Tetronic 908®, también conocido como Poloxamine 908®, que es un copolímero de bloque tetrafuncional derivado de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilendiamina (BASF Corporation, Parsippany, N.J.)), polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25, o polivinilpirrolidona K30, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo (S-630), polietilenglicol, por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 6000, o de aproximadamente 3350 a aproximadamente 4000, o de aproximadamente 7000 a aproximadamente 5400, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, polisorbato-80, alginato de sodio, gomas, tales como, por ejemplo, goma tragacanto y goma arábiga, goma guar, xantanos, incluyendo goma xantana, azúcares, celulósicos, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, polisorbato-80, alginato de sodio, monolaurato de sorbitán polietoxilado, monolaurato de sorbitán polietoxilado, povidona, carbómeros, alcohol polivinílico (PVA), alginatos, quitosanos y combinaciones de los mismos. Los plastificantes tales como celulosa o trietilcelulosa también se pueden usar como agentes dispersantes. Los agentes dispersantes particularmente útiles en las dispersiones liposómicas y las dispersiones autoemulsionantes son dimiristoil fosfatidilcolina, fosfatidilcolina natural de huevos, fosfatidilglicerol natural de huevos, colesterol y miristato de isopropilo.
Una formulación farmacéutica puede incluir agentes de ajuste del pH o agentes tamponantes que pueden incluir ácidos tales como ácido acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico y clorhídrico; bases tales como hidróxido de sodio, fosfato de sodio, borato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, lactato de sodio y tris-hidroximetilaminometano; y tampones tales como citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio y cloruro de amonio. Dichos ácidos, bases y tampones se incluyen en la cantidad necesaria para mantener el pH de la composición en un intervalo aceptable.
Una formulación farmacéutica también puede incluir una o más sales en una cantidad requerida para llevar la osmolalidad de la composición a un intervalo aceptable. Dichas sales pueden incluir aquellas que tienen cationes de sodio, potasio o amonio y aniones de cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato o bisulfito; las sales adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, tiosulfato de sodio, bisulfito de sodio y sulfato de amonio.
Una formulación farmacéutica puede incluir además un diluyente que también puede usarse para estabilizar compuestos porque pueden proporcionar un entorno más estable. Las sales disueltas en soluciones tamponadas (que también pueden proporcionar control o mantenimiento del pH) pueden utilizarse como diluyentes en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, una solución salina tamponada con fosfato. En determinados casos, los diluyentes aumentan el volumen de la composición para facilitar la compresión o crear suficiente volumen para una mezcla homogénea para el llenado de cápsulas. Dichos compuestos pueden incluir, por ejemplo, lactosa, almidón, manitol, sorbitol, dextrosa, celulosa microcristalina tal como Avicel ®; fosfato de calcio dibásico, fosfato de dicalcio dihidrato; fosfato de tricalcio, fosfato de calcio; lactosa anhidra, lactosa secada por pulverización; almidón pregelatinizado, azúcar comprimible, tal como Di-Pac® (Amstar); manitol, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa, diluyentes a base de sacarosa, azúcar glasé; sulfato de calcio monobásico monohidrato, sulfato de calcio dihidrato; lactato de calcio trihidrato, dextratos; sólidos de cereales hidrolizados, amilosa; celulosa en polvo, carbonato de calcio; glicina, caolín; manitol, cloruro de sodio; inositol, bentonita y similares.
Una formulación farmacéutica puede incluir agentes de desintegración o desintegrantes para facilitar la fragmentación o desintegración de una sustancia. El término "desintegrar" puede incluir tanto la disolución como la dispersión de la forma farmacéutica cuando entra en contacto con fluido gastrointestinal. Los ejemplos de agentes de desintegración pueden incluir un almidón, por ejemplo, un almidón natural tal como almidón de maíz o almidón de patata, un almidón pregelatinizado tal como National 1551 o Amijel®, o glicolato de almidón de sodio tal como Promogel® o Explotab®, una celulosa tal como un producto de madera, celulosa metilcristalina, por ejemplo, Avicel®, Avicel® PH101, Avicel® PH102, Avicel® PH105, Elcema® P100, Emcocel®, Vivacel®, Ming Tia® y Solka-Floc®, metilcelulosa, croscarmelosa o una celulosa reticulada, tal como carboximetilcelulosa de sodio reticulada (Ac-Di-Sol®), carboximetilcelulosa reticulada o croscarmelosa reticulada, un almidón reticulado tal como glicolato sódico de almidón, un polímero reticulado tal como crospovidona, una polivinilpirrolidona reticulada, alginato tal como ácido algínico o una sal de ácido algínico tal como alginato de sodio, una arcilla tal como Veegum® HV (silicato de magnesio y aluminio), una goma tal como agar, goma guar, algarroba, Karaya, pectina o tragacanto, glicolato sódico de almidón, bentonita, una esponja natural, un tensioactivo, una resina tal como una resina de intercambio catiónico, pulpa de cítricos, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio en combinación con almidón y similares.
Una formulación farmacéutica puede incluir agentes de carga tales como lactosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, polvo de celulosa, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, polietilenglicol y similares.
Una formulación farmacéutica puede incluir agentes saporíferos y/o edulcorantes tales como, por ejemplo, jarabe de acacia, acesulfamo K, alitame, anís, manzana, aspartamo, plátano, crema bávara, baya, grosella negra, caramelo duro, citrato de calcio, alcanfor, caramelo, cereza, crema de cereza, chocolate, canela, chicle, cítrico, ponche de cítricos, crema de cítricos, algodón de azúcar, cacao, cola, cereza fresca, cítricos frescos, ciclamato, cilamato, dextrosa, eucalipto, eugenol, fructosa, ponche de frutas, jengibre, glicirretinato, jarabe de glycyrrhiza (regaliz), uva, pomelo, miel, isomalta, limón, lima, crema de limón, glicirricinato monoamónico (MagnaSweet®), maltol, manitol, arce, malvavisco, mentol, crema de menta, mezcla de baya, neohesperidina DC, neotame, naranja, pera, melocotón, hierbabuena, crema de hierbabuena, polvo Prosweet®, frambuesa, cerveza de raíz, ron, sacarina, safrol, sorbitol, menta verde, crema de menta verde, fresa, crema de fresa, estevia, sucralosa, sacarosa, sacarina sódica, sacarina, aspartamo, acesulfamo potásico, manitol, talina, silitol, sucralosa, sorbitol, crema suiza, tagatosa, mandarina, taumatina, tutti fruitti, vainilla, nuez, sandía, cereza silvestre, gaulteria, xilitol, o cualquier combinación de estos ingredientes saporíferos, por ejemplo, anís-mentol, cereza-anís, canela-naranja, cereza-canela, chocolate-menta, miel-limón, limón-lima, limón-menta, mentol-eucalipto, crema de naranja, vainilla-menta y mezclas de los mismos. También se pueden incluir lubricantes y deslizantes en las formulaciones farmacéuticas descritas en esta invención que pueden prevenir, reducir o inhibir la adhesión o la fricción de los materiales. Los lubricantes de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, ácido esteárico, hidróxido de calcio, talco, estearilfumerato de sodio, un hidrocarburo tal como aceite mineral o aceite vegetal hidrogenado tal como aceite de soja hidrogenado (Sterotex®), ácidos grasos superiores y sus sales de metales alcalinos y metales alcalinotérreos, tales como aluminio, calcio, magnesio, cinc, ácido esteárico, estearatos de sodio, glicerol, talco, ceras, Stearowet®, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, un polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000) o un metoxipolietilenglicol tal como Carbowax™, oleato de sodio, benzoato de sodio, behenato de glicerilo, polietilenglicol, lauril sulfato de magnesio o sodio, sílice coloidal tal como Syloid™, Cab-O-Sil®, un almidón tal como almidón de maíz, aceite de silicona, un tensioactivo y similares. Los plastificantes pueden ser compuestos usados para ablandar el material de microencapsulación o los revestimientos de película para hacerlos menos quebradizos. Los plastificantes adecuados incluyen, por ejemplo, polietilenglicoles tales como PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350 y PEG 800, ácido esteárico, propilenglicol, ácido oleico, trietilcelulosa y triacetina. Los plastificantes también pueden funcionar como agentes dispersantes o agentes humectantes.
Los solubilizantes pueden incluir compuestos tales como triacetina, citrato de trietilo, oleato de etilo, caprilato de etilo, laurilsulfato de sodio, docusato de sodio, TPGS de vitamina E, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, N-hidroxietilpirrolidona, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilciclodextrinas, etanol, n-butanol, alcohol isopropílico, colesterol, sales biliares, polietilenglicol 200-600, glicofurol, transcutol, propilenglicol y dimetilisosorbida y similares.
Los estabilizadores pueden incluir compuestos tales como agentes antioxidantes, tampones, ácidos, conservantes y similares.
Los agentes de suspensión pueden incluir compuestos tales como polivinilpirrolidona, por ejemplo, polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25, o polivinilpirrolidona K30, copolímero de vinilpirrolidona/acetato de vinilo (S630), polietilenglicol, por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 6000, o de aproximadamente 3350 a aproximadamente 4000, o de aproximadamente 7000 a aproximadamente 5400, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroximetilcelulosa, polisorbato-80, hidroxietilcelulosa, alginato de sodio, gomas, tales como, por ejemplo, goma tragacanto y goma arábiga, goma guar, xantanos, incluyendo goma xantana, azúcares, celulósicos, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polisorbato-80, alginato de sodio, monolaurato de sorbitán polietoxilado, monolaurato de sorbitán polietoxilado, povidona y similares.
Los tensioactivos pueden incluir compuestos tales como laurilsulfato de sodio, docusato de sodio, Tween 60 u 80, triacetina, TPGS de vitamina E, monooleato de sorbitán, monooleato de sorbitán polioxietilenado, polisorbatos, polaxómeros, sales biliares, monoestearato de glicerilo, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, por ejemplo, Pluronic® (BASF) y similares. Los tensioactivos adicionales pueden incluir glicéridos de ácidos grasos de polioxietileno y aceites vegetales, por ejemplo, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno (60); y éteres alquílicos de polioxietileno y éteres de alquilfenilo, por ejemplo, octoxinol 10, octoxinol 40. A veces se pueden incluir tensioactivos para mejorar la estabilidad física o para otros fines.
Los agentes potenciadores de la viscosidad pueden incluir, por ejemplo, metilcelulosa, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, carbómero, alcohol polivinílico, alginatos, goma arábiga, quitosanos y combinaciones de los mismos.
Los agentes humectantes pueden incluir compuestos tales como ácido oleico, monoestearato de glicerilo, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, monooleato de sorbitán polioxietilenado, monoolaurato de sorbitán polioxietilenado, docusato de sodio, oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, docusato de sodio, triacetina, Tween 80, TPGS de vitamina E, sales de amonio y similares.
Formulaciones inyectables
Las formulaciones adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa pueden incluir soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuoso y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, cremophor y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para inyección subcutánea también pueden contener aditivos tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispensadores. La prevención del crecimiento de microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Para inyecciones intravenosas, los compuestos descritos en esta invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Para otras inyecciones parenterales, las formulaciones apropiadas pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas, preferiblemente con tampones o excipientes fisiológicamente compatibles. Dichos excipientes se conocen generalmente en la técnica.
Las inyecciones parenterales pueden implicar una inyección rápida o una infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes multidosis, con un conservante añadido. La composición farmacéutica descrita en esta invención puede estar en una forma adecuada para inyección parenteral como suspensiones, soluciones o emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para su administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas para inyección adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Como alternativa, el principio activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes de su uso.
Formulaciones orales
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mezclando uno o más excipientes sólidos con uno o más de los compuestos descritos en esta invención, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados pueden incluir, por ejemplo, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio; u otros tales como: polivinilpirrolidona (PVP o povidona) o fosfato de calcio. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como croscarmelosa de sodio reticulada, polivinilpirrolidona, agar o ácido algínico o una sal de las mismas, tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se pueden proporcionar con revestimientos adecuados. Para ello, se pueden usar soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las formas farmacéuticas sólidas pueden estar en forma de comprimido (incluyendo un comprimido de suspensión, un comprimido de fusión rápida, un comprimido de desintegración de mordida, un comprimido de desintegración rápida, un comprimido efervescente o un comprimido encapsulado), una píldora, un polvo (incluido un polvo envasado estéril, un polvo dispersable o un polvo efervescente), una cápsula (incluyendo cápsulas blandas o duras, por ejemplo, cápsulas hechas de gelatina de origen animal o HPMC de origen vegetal, o "cápsulas para espolvorear"), dispersión sólida, solución sólida, forma farmacéutica bioerosionable, formulaciones de liberación controlada, formas farmacéuticas de liberación pulsátil, formas farmacéuticas multiparticuladas, microgránulos, gránulos o un aerosol. En otros casos, la formulación farmacéutica está en forma de un polvo. Aún en otros casos, la formulación farmacéutica está en forma de un comprimido, incluyendo, pero sin limitación, un comprimido de fusión rápida. Además, las formulaciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden administrar como una cápsula única o en forma farmacéutica de múltiples cápsulas. En algunos casos, la formulación farmacéutica se administra en dos, tres o cuatro cápsulas o comprimidos.
Las formas farmacéuticas sólidas de dosificación pueden incluir una composición descrita en esta invención y uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables tales como un portador compatible, aglutinante, agente de carga, agente de suspensión, agente saporífero, agente edulcorante, agente disgregante, agente dispersante, tensioactivo, lubricante, colorante, diluente, solubilizante, agente humectante, plastificante, estabilizante, potenciador de la penetración, agente humectante, agente antiespumante, antioxidante, conservante, o una o más combinaciones de los mismos. Aún en otros aspectos, usando procedimientos de revestimiento estándar, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición (2000).
Los portadores adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, pero sin limitación, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnesio, caseinato de sodio, lecitina de soja, cloruro de sodio, fosfato de tricalcio, fosfato de dipotasio, estearoil lactilato de sodio, carragenano, monoglicérido, diglicérido, almidón pregelatinizado, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa, celulosa microcristalina, lactosa, manitol y similares.
Los agentes de carga adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, pero sin limitación, lactosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, polvo de celulosa, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, polietilenglicol y similares.
Los aglutinantes imparten cohesión a las formulaciones de formas farmacéuticas orales sólidas: para la formulación de cápsulas llenas de polvo, facilitan la formación de tapones que se pueden cargar en cápsulas de cubierta blanda o dura y para la formulación de comprimidos, aseguran que el comprimido permanezca intacta después de la compresión y ayudan a asegurar la uniformidad de la mezcla antes de una etapa de compresión o llenado. Los materiales adecuados para su uso como aglutinantes en las formas farmacéuticas sólidas descritas en esta invención incluyen, pero sin limitación, carboximetilcelulosa, metilcelulosa (por ejemplo, Methocel®), hidroxipropilmetilcelulosa (por ejemplo, hipromelosa USP Pharmacoat-603, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa (Aqoate HS-LF y HS), hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa (por ejemplo, Klucel®), etilcelulosa (por ejemplo, Ethocel®) y celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel®), dextrosa microcristalina, amilosa, silicato de aluminio y magnesio, ácidos de polisacárido, bentonitas, gelatina, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, crospovidona, povidona, almidón, almidón pregelatinizado, tragacanto, dextrina, un azúcar, tal como sacarosa (por ejemplo, Dipac®), glucosa, dextrosa, molasas, manitol, sorbitol, xilitol (por ejemplo, Xylitab®), lactosa, una goma natural o sintética, tal como goma arábiga, tragacanto, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, almidón, polivinilpirrolidona (por ejemplo, Povidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10 y Povidone® K-12), arabinogalactano de alerce, Veegum®, polietilenglicol, ceras, alginato de sodio y similares.
Los lubricantes o deslizantes adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, pero sin limitación, ácido esteárico, hidróxido de calcio, talco, almidón de maíz, estearilfumerato de sodio, sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como aluminio, calcio, magnesio, cinc, ácido esteárico, estearatos de sodio, estearato de magnesio, estearato de cinc, ceras, Stearowet®, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, un polietilenglicol o un metoxipolietilenglicol tal como Carbowax™, PEG 4000, PEG 5000, PEG 6000, propilenglicol, oleato de sodio, behenato de glicerilo, palmitoestearato de glicerilo, benzoato de glicerilo, lauril sulfato de magnesio o sodio y similares.
Los diluyentes adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, pero sin limitación, azúcares (incluyendo lactosa, sacarosa y dextrosa), polisacáridos (incluyendo dextratos y maltodextrina), polioles (incluyendo manitol, xilitol y sorbitol), ciclodextrinas y similares.
Los agentes humectantes adecuados para su uso en formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, por ejemplo, ácido oleico, monoestearato de glicerilo, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, monooleato de sorbitán polioxietilenado, monoolaurato de sorbitán polioxietilenado, compuestos de amonio cuaternario (por ejemplo, Polyquat 10®), oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, estearato de magnesio, docusato de sodio, triacetina, TPGS de vitamina E y similares.
Los tensioactivos adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, monooleato de sorbitán, monooleato de sorbitán polioxietilenado, polisorbatos, polaxómeros, sales biliares, monoestearato de glicerilo, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, por ejemplo, Pluronic® (BASF) y similares.
Los agentes de suspensión adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas pueden incluir, pero sin limitación, polivinilpirrolidona, por ejemplo, polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25, o polivinilpirrolidona K30, polietilenglicol, por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 6000, o de aproximadamente 3350 a aproximadamente 4000, o de aproximadamente 7000 a aproximadamente 5400, copolímero de vinilpirrolidona/acetato de vinilo (S630), carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polisorbato-80, hidroxietilcelulosa, alginato de sodio, gomas, tales como, por ejemplo, goma tragacanto y goma arábiga, goma guar, xantanos, incluyendo goma xantana, azúcares, celulósicos, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polisorbato-80, alginato de sodio, monolaurato de sorbitán polietoxilado, monolaurato de sorbitán polietoxilado, povidona y similares.
Los antioxidantes adecuados para su uso en las formas farmacéuticas sólidas incluyen, por ejemplo, por ejemplo, hidroxitolueno butilado (BHT), ascorbato de sodio y tocoferol.
Las formas farmacéuticas de formulación líquida para administración oral pueden ser suspensiones acuosas seleccionadas del grupo que incluye, pero sin limitación, dispersiones orales acuosas farmacéuticamente aceptables, emulsiones, soluciones, elixires, geles y jarabes. Véase, por ejemplo, Singh y col., Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 2a Ed., págs. 754-757 (2002). Además, las formas farmacéuticas líquidas pueden incluir aditivos, tales como: (a) agentes disgregantes; (b) agentes dispersantes; (c) agentes humectantes; (d) al menos un conservante, (e) agentes potenciadores de la viscosidad, (f) al menos un agente edulcorante y (g) al menos un agente saporífero. En algunas realizaciones, las dispersiones acuosas pueden incluir adicionalmente un inhibidor cristalino.
Las suspensiones y dispersiones acuosas descritas en esta invención pueden permanecer en un estado homogéneo, como se define en The USP Pharmacists' Pharmacopeia (edición del 2005, capítulo 905), durante al menos 4 horas. La homogeneidad debe determinarse mediante un procedimiento de muestreo compatible con la determinación de la homogeneidad de toda la composición. En una realización, una suspensión acuosa se puede volver a suspender en una suspensión homogénea mediante agitación física que dura menos de 1 minuto. En otro aspecto, una suspensión acuosa se puede volver a suspender en una suspensión homogénea mediante agitación física que dura menos de 45 segundos. Todavía en otro aspecto, una suspensión acuosa se puede volver a suspender en una suspensión homogénea mediante agitación física que dura menos de 30 segundos. Aún en otra realización, no es necesaria la agitación para mantener una dispersión acuosa homogénea.
En otro aspecto, las formas farmacéuticas pueden incluir formulaciones microencapsuladas. En algunas realizaciones, uno o más materiales compatibles están presentes en el material de microencapsulación. Los materiales de ejemplo incluyen, pero sin limitación, modificadores de pH, facilitadores de la erosión, agentes antiespumantes, antioxidantes, agentes saporíferos, y materiales portadores tales como aglutinantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración, agentes de carga, tensioactivos, solubilizantes, estabilizantes, lubricantes, agentes humectantes y diluyentes.
Los materiales de microencapsulación de ejemplo útiles para retrasar la liberación de las formulaciones que incluyen compuestos descritos en esta invención incluyen, pero sin limitación, éteres de hidroxipropilcelulosa (HPC) tales como Klucel® o Nisso HPC, éteres de hidroxipropilcelulosa de baja sustitución (L-HPC), éteres de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) tales como Seppifilm-LC, Pharmacoat®, Metolose SR, Methocel®-E, Opadry YS, PrimaFlo, Benecel MP824 y Benecel MP843, polímeros de metilcelulosa tales como Methocel®-A, acetato estearato de hidroxipropilmetilcelulosa Aqoat (HF-LS, h F-LG,HF-MS) y Metolose®, etilcelulosas (EC) y mezclas de los mismos, tales como E461, Ethocel®, Aqualon®-EC, Surelease®, alcohol polivinílico (PVA) tal como Opadry AMB, hidroxietilcelulosas tales como Natrosol®, carboximetilcelulosas y sales de carboximetilcelulosas (CMC) tales como Aqualon®-CMC, copolímeros de alcohol polivinílico y polietilenglicol tales como Kollicoat IR®, monoglicéridos (Myverol), triglicéridos (k Lx ), polietilenglicoles, almidón alimenticio modificado, polímeros acrílicos y mezclas de polímeros acrílicos con éteres de celulosa tales como Eudragit® EPO, Eudragit® L30D-55, Eudragit® FS 30D Eudragit® L100-55, Eudragit® L100, Eudragit® S100, Eudragit® RD100, Eudragit® E100, Eudragit® L12.5, Eudragit® S12.5, Eudragit® NE30D y Eudragit® NE 40D, acetato ftalato de celulosa, sepifilms tales como mezclas de HPMC y ácido esteárico, ciclodextrinas y mezclas de estos materiales. Los plastificantes pueden incluir polietilenglicoles, por ejemplo, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350 y PEG 800, y se incorporan ácido esteárico, propilenglicol, ácido oleico y triacetina al material de microencapsulación. En otras realizaciones, el material de microencapsulación útil para retrasar la liberación de las composiciones farmacéuticas es de la USP o del Formulario Nacional (NF, National Formulary). Todavía en otras realizaciones, el material de microencapsulación es Klucel. Aún en otras realizaciones, el material de microencapsulación es metocel. Las composiciones microencapsuladas se pueden formular mediante procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Dichos procedimientos conocidos incluyen, por ejemplo, procesos de secado por aspersión, procesos de disco giratorio con disolvente, procesos de fusión en caliente, procedimientos de enfriamiento por aspersión, lecho fluido, deposición electrostática, extrusión centrífuga, separación rotacional de la suspensión, polimerización en la interfaz líquido-gas o sólido-gas, extrusión a presión, o baño de extracción del disolvente de pulverización. Además de estos, también podrían usarse varias técnicas químicas, por ejemplo, coacervación compleja, evaporación de disolventes, incompatibilidad polímero-polímero, polimerización interfacial en medios líquidos, polimerización in situ, secado en líquido y desolvatación en medios líquidos. Además, también se pueden usar otros procedimientos, tales como compactación con rodillos, extrusión/esferonización, coacervación, o recubrimiento con nanopartículas.
Formulaciones intranasales
Se conocen en la técnica formulaciones intranasales y se describen, por ejemplo, en las Pat. de EE.UU. N.° 4.476.116 y 6.391.452. Las formulaciones que incluyen las composiciones descritas en esta invención, que se preparan según las técnicas descritas anteriormente y otras bien conocidas en la técnica, se preparan como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes adecuados conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Ansel, H. C. y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6a Ed. (1995). Preferentemente, estas composiciones y formulaciones se preparan con ingredientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables adecuados. Estos ingredientes se conocen por los expertos en la preparación de formas farmacéuticas nasal y algunos de ellos se pueden encontrar en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, 2005, una referencia estándar en el campo. La elección de portadores adecuados depende en gran medida de la naturaleza exacta de la forma farmacéutica nasal deseada, por ejemplo, soluciones, suspensiones, ungüentos o geles. Generalmente, las formas farmacéuticas nasales contienen grandes cantidades de agua además del principio activo. También pueden estar presentes cantidades menores de otros ingredientes tales como ajustadores de pH, emulsionantes o agentes dispersantes, conservantes, tensioactivos, agentes gelificantes o tamponantes y otros agentes estabilizantes y solubilizantes. La forma farmacéutica nasal debe ser isotónica con las secreciones nasales.
Para la administración por inhalación descrita en esta invención puede estar en forma de aerosol, bruma o polvo. Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se administran convenientemente en forma de una presentación de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos, tales como, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla de polvo del compuesto descrito en esta invención y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Regímenes terapéuticos
Las composiciones se pueden administrar para aplicaciones terapéuticas o como terapia de mantenimiento, por ejemplo, para un paciente en remisión. La composición puede administrarse una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o más. La composición puede administrarse diariamente, todos los días, cada día alterno, cinco días a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas, dos semanas al mes, tres semanas al mes, una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes o más. La composición puede administrarse durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 3 años o más.
En el caso de que el estado del paciente mejore, según el criterio del médico, la administración de los compuestos se puede administrar de forma continua; como alternativa, la dosis del fármaco que se administra puede reducirse temporalmente o suspenderse temporalmente durante un determinado período de tiempo (es decir, un "descanso farmacológico"). La duración del descanso farmacológico puede variar entre 2 días y 1 años, incluyendo, únicamente a modo de ejemplo, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días, 15 días, 20 días, 28 días, 35 días, 50 días, 70 días, 100 días, 120 días, 150 días, 180 días, 200 días, 250 días, 280 días, 300 días, 320 días, 350 días o 365 días. La reducción de la dosis durante un descanso farmacológico puede ser del 10 %-100 %, incluyendo, únicamente a modo de ejemplo, del 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o del 100 %.
Una vez que se ha producido la mejora de las condiciones del paciente, se administra una dosis de mantenimiento, si es necesario. Posteriormente, la dosificación o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, hasta un nivel en el que se mantenga la enfermedad, trastorno o afección mejorados. Sin embargo, los pacientes pueden requerir un tratamiento intermitente a largo plazo ante cualquier reaparición de los síntomas.
La cantidad de un agente dado que corresponderá a tal cantidad variará dependiendo de factores tales como el compuesto particular, la gravedad de la enfermedad, la identidad (por ejemplo, el peso) del sujeto o huésped que necesita tratamiento, pero no obstante puede determinarse rutinariamente de una manera conocida en la técnica según las circunstancias particulares que rodean el caso, incluyendo, por ejemplo, el agente específico que se administra, la vía de administración y el sujeto o huésped que se trata. La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una sola dosis o en dosis divididas administradas simultáneamente (o durante un período corto de tiempo) o a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día.
La composición farmacéutica descrita en esta invención puede estar en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración única de dosificaciones precisas. En una forma farmacéutica unitaria, la formulación se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de uno o más compuestos. La dosificación unitaria puede estar en forma de un paquete que contiene cantidades independientes de la formulación. Los ejemplos no limitantes son comprimidos o cápsulas envasadas y polvos en viales o ampollas. Las composiciones de suspensión acuosa se pueden envasar en recipientes de dosis única que no se pueden volver a cerrar. Como alternativa, se pueden usar envases que se pueden volver a cerrar de dosis múltiples, en cuyo caso es típico incluir un conservante en la composición. Únicamente a modo de ejemplo, las formulaciones para inyección parenteral pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria, que incluye, pero sin limitación, ampollas, o en envases multidosis, con un conservante añadido.
Los intervalos anteriores son meramente indicativos, ya que el número de variables con respecto a un régimen de tratamiento individual es grande, y no son infrecuentes desviaciones considerables de estos valores recomendados. Dichas dosis pueden modificarse dependiendo de una serie de variables, sin limitarse a la actividad del compuesto usado, la enfermedad o afección a tratar, el modo de administración, los requisitos del sujeto individual, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando y el criterio del médico.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos regímenes terapéuticos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, incluyendo, pero sin limitación, la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre la DL50 y la DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad mínima. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para seleccionar un sujeto para el tratamiento, que comprende determinar si el sujeto tiene una enfermedad inducida por una expresión de proteínas defectuosa provocada por la retención de intrones en los transcritos génicos, donde el sujeto se selecciona para el tratamiento tras una confirmación positiva; y opcionalmente tratar el sujeto.
El tratamiento puede comprender la corrección de la retención de intrones en los transcritos génicos. El tratamiento puede comprender la hibridación de un polímero de ácido polinucleico según la invención con el transcrito génico para inducir la eliminación de intrones del transcrito génico.
Según otro aspecto de la descripción, se proporciona el uso de un polímero de ácido polinucleico no codificante para normalizar la expresión génica mediante la corrección de la retención de intrones en células cancerosas.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona el polímero de ácido polinucleico según la invención, la composición según la invención, el vector según la descripción, o el vehículo de suministro según la descripción, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona el polímero de ácido polinucleico según la invención, la composición según la invención, el vector según la descripción, o el vehículo de suministro según la descripción, para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad.
La enfermedad puede ser diabetes o cáncer.
Cuando se hace referencia a una secuencia de polímero de ácido polinucleico, el experto en la técnica entenderá que se pueden tolerar una o más sustituciones, opcionalmente se pueden tolerar dos sustituciones en la secuencia, de modo que mantenga la capacidad de hibridarse con la secuencia diana, o cuando la sustitución está en una secuencia diana, la capacidad de reconocerse como la secuencia diana. Las referencias a la identidad de secuencia pueden determinarse mediante alineación de secuencias BLAST (www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/) usando parámetros estándar/predeterminados. Por ejemplo, la secuencia puede tener un 99 % de identidad y seguir funcionando según la invención. En otras realizaciones, la secuencia puede tener un 98 % de identidad y seguir funcionando según la invención. En otra realización, la secuencia puede tener un 95 % de identidad y seguir funcionando según la invención. Cuando se hace referencia a reducir o corregir la retención de intrones, la reducción puede ser completa, por ejemplo, al 100 %, o puede ser parcial. La reducción puede ser clínicamente significativa. La reducción/corrección puede ser con respecto al nivel de retención de intrones en el sujeto sin tratamiento, o con respecto a la cantidad de retención de intrones en una población de sujetos similares. La reducción/corrección puede ser al menos un 10 % menos de retención de intrones con respecto al sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento. La reducción puede ser al menos un 20 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento.
La reducción puede ser al menos un 40 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento. La reducción puede ser al menos un 50 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento. La reducción puede ser al menos un 60 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento. La reducción puede ser al menos un
80 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento. La reducción puede ser al menos un 90 % menos de retención de intrones con respecto a un sujeto promedio o el sujeto antes del tratamiento.
Kits/Artículos de fabricación
En esta invención se proporcionan kits y artículos de fabricación para su uso con uno o más procedimientos descritos en esta invención. Los kits pueden contener uno o más de los polímeros de ácido polinucleico descritos en esta invención, tales como los polímeros de ácido polinucleico identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID N 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:
35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. Los kits también pueden contener uno o más de los polímeros de ácido polinucleico que son no codificantes con respecto a los polímeros de ácido polinucleico descritos en esta invención, tales como, por ejemplo, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o
SEQ ID NO: 47-434. Los kits pueden contener además reactivos y tampones necesarios para la constitución y suministro de los polímeros de ácido polinucleico.
Los kits también pueden incluir un portador, envase o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados, tales como los polímeros de ácido polinucleico y los reactivos, para usarse en un procedimiento descrito en esta invención. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico.
Los artículos de fabricación proporcionados en esta invención contienen materiales de envasado. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéutico incluyen, pero sin limitación, frascos, tubos, bolsas, recipientes, botellas y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y el modo previsto de administración y tratamiento.
Un kit típicamente incluye etiquetas que enumeran el contenido y/o instrucciones de uso, y prospectos con instrucciones de uso. Típicamente, también se incluirá un conjunto de instrucciones.
El experto en la técnica entenderá que las características opcionales de una realización o aspecto de la invención pueden ser aplicables, en su caso, a otras realizaciones o aspectos de la invención.
Ahora se describirán con más detalle realizaciones de la invención, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos.
EJEMPLOS
Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no para limitar el alcance de las reivindicaciones proporcionadas en esta invención.
Ejemplo 1
La mayoría de los genes eucariotas contienen secuencias intermedias o intrones que deben eliminarse con precisión de los transcritos primarios para crear ARNm funcionales capaces de codificar proteínas (1). Este proceso modifica la composición de la mRNP de una manera muy dinámica, empleando interacciones interdependientes de cinco ARN nucleares pequeños y un gran número de proteínas con secuencias conservadas pero degeneradas en el pre-ARNm
(2). El corte y empalme de intrones generalmente promueve la acumulación de ARNm y la expresión de proteínas entre especies (3-5). Este proceso puede verse alterado por mutaciones o variantes intrónicas que también pueden afectar a las rutas de expresión de genes acoplados, incluida la transcripción, la exportación y la traducción de ARNm.
Esto se ilustra por los intrones en la región 5' no traducida (5'UTR) donde las variantes o mutaciones naturales que modifican la retención de intrones alteran la abundancia relativa de transcritos con marcos de lectura abiertos cadena arriba (uORF) u otros motivos reguladores e influyen drásticamente en la traducción (6,7). Sin embargo, no se han desarrollado estrategias exitosas específicas de secuencia para normalizar la expresión génica en dichas situaciones.
Los oligonucleótidos de intercambio de corte y empalme (SSO, por sus siglas en inglés) son reactivos no codificantes que modulan el corte y empalme de intrones uniendo secuencias reguladoras o de reconocimiento del sitio de corte y empalme y compitiendo con factores que actúan en cis y trans por sus dianas (8). Se ha demostrado que restauran el corte y empalme aberrante, modifican la expresión relativa de los ARNm existentes o producen variantes de corte y empalme novedosas que normalmente no se expresan (8). La estabilidad mejorada de los dúplex de SSO-ARN dirigidos por una serie de modificaciones de SSO, tales como 2'-O-metil y 2'-O-metoxietil ribosa, facilitó los estudios que exploran su potencial terapéutico para un número creciente de genes de enfermedades humanas, incluyendo DMD en distrofia muscular (9,10), SMN2 en atrofia muscular espinal (11), ATM en ataxia-telangiectasia (12) y BTK en agammaglobulinemia ligada al X (13). Aunque dichos enfoques están cerca de alcanzar su potencial clínico para un número restringido de enfermedades (8), más de 300 trastornos mendelianos resultantes del corte y empalme aberrante inducido por mutaciones (14) y un número creciente de rasgos complejos pueden ser susceptibles de corrección mediada por SSO de la expresión génica.
La etiología de la diabetes de tipo 1 tiene un fuerte componente genético conferido por los antígenos leucocitarios humanos (HLA) y una serie de locus no HLA modificadores (15). El modificador más fuerte se identificó en la región del gen de la proinsulina (INS) en el cromosoma 11 (denominado IDDM2) (15). El mapeo adicional de esta área sugirió que INS es la diana IDDM2 más probable (16), consistente con una función crítica de este autoantígeno en la patogénesis (17). El riesgo genético de esta enfermedad en IDDM2 se ha atribuido a niveles diferenciales de ARN en estado estacionario de haplotipos INS predisponentes y protectores, lo que podría implicar una secuencia de ADN minisatélite cadena arriba de este gen (18,19). Sin embargo, el examen sistemático de los polimorfismos de INS de origen natural reveló niveles de expresión de proinsulina específicos de haplotipo en construcciones informadoras desprovistas de la secuencia minisatélite, dando como resultado dos variantes en el intrón 1 (7), denominadas IVS1+5ins4 (también conocida como rs3842740 o INS-69) e IVS1-6A/T (rs689, INS-27 o HphI+/-) (16,20). La primera variante activa un sitio de corte y empalme 5' críptico del intrón 1, mientras que la adenina (A) en la última variante, que reside 6 nucleótidos cadena arriba del sitio de corte y empalme 3' (3'ss), promueve la retención de intrones, expandiendo la abundancia relativa de transcritos con 5'UTR extendida (21). En comparación con la timina (T), el alelo A en IVS1-6A/T disminuye la afinidad por las proteínas de unión a pirimidina in vitro y hace que el 3'ss sea más dependiente del factor auxiliar de la ribonucleoproteína nuclear pequeña U2 (U2AF) (7), un heterodímero necesario para la unión de U2, el ensamblaje del espliceosoma y la selección de 3'ss (22). Los transcritos que contienen el intrón 1 están sobrerrepresentados en las genotecas de ADNc derivadas de IVS1-6A preparadas a partir de tejidos productores de insulina (21), se exportan desde el núcleo (23) y contienen un uORF corto específico de Homininae que coevolucionó con la relajación del 3'ss del intrón 1 en primates superiores (7). La menor expresión de proinsulina conferida por el alelo A puede conducir a una presentación subóptima de péptidos de proinsulina en el timo fetal y a una inadecuada selección negativa de linfocitos T autorreactivos, lo que culmina en la destrucción autoinmunitaria de los linfocitos p productores de insulina en el páncreas (7). Sin embargo, no se han realizado intentos para corregir la baja eficacia de la eliminación del intrón 1 de INS de los pre-ARNm que contienen IVS1-6A y reducir la retención de intrones a los niveles observados para el alelo T protector de la enfermedad.
Este estudio se propuso buscar SSO que aumenten la eficacia del corte y empalme del intrón 1 de INS y repriman los silenciadores de corte y empalme o los sitios de corte y empalme señuelo en el pre-ARNm para mejorar la expresión de proinsulina. Se identificaron los SSO que reducen la abundancia relativa de transcritos de retención del intrón 1, se muestra la delineación de la diana no codificante optimizada con una resolución de un solo nucleótido, y se muestra evidencia de la formación de un cuádruplex G paralelo adyacente a la secuencia diana no codificante y la identificación de proteínas que se unen a esta región.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Oligonucleótidos no codificantes
Los SSO se adquirieron en MWG Biotech (Alemania). Todos los SSO y los controles aleatorios tenían una cadena principal de fosforotioato de longitud completa con 2'-O-metil ribonucleótidos en la segunda posición de ribosa. Además de los SSO de INS y sus versiones aleatorias, se emplearon SSO que se dirigen a otros genes humanos como controles adicionales, como se describe (13). La ubicación de cada SSO se muestra en la figura 1A y sus secuencias en la Tabla 2.
Construcciones de indicador de corte y empalme
El indicador de corte y empalme de tipo silvestre que porta el haplotipo asociado a la diabetes de tipo 1 denominado IC se notificó previamente (7, 21). Cada construcción contiene todos los exones de INS e intrones íntegros, pero difieren en la longitud del último exón. Los indicadores IC se clonaron usando los cebadores D-C, D-F y D-B; IC D-B carece del 3'ss críptico del intrón 2. La abundancia relativa de isoformas con corte y empalme en este sitio es menor para IC DF que para IC D-C (7, 21). Para probar los SSO dirigidos al sitio de corte y empalme 5' críptico del intrón 1, la construcción IC se modificó mediante una inserción de 4 nt en rs3842740 para crear un indicador denominado ICIVS1+ 5ins4. Las construcciones TSC2 y F9 se notificaron previamente (24). Los plásmidos se propagaron en la cepa DH5a de E. coliy el ADN plasmídico se extrajo utilizando el kit Wizard Plus SV Miniprep (Promega, EE.UU.). Sus inserciones se secuenciaron completamente para confirmar la identidad de cada una de las 14 variantes naturales intragénicas y para excluir mutaciones no deseadas.
Cultivos celulares y transfecciones
Se cultivaron células de riñón embrionario humano 293 (HEK293), de carcinoma hepático hepatocelular humano HepG2 y de mono verde africano COS7 en medio Eagle modificado de Dulbecco, suero de ternero fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina (Life Technologies, EE.UU.). Las transfecciones transitorias se realizaron como se describe (13), usando jetPRIME (Polyplus, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. La regulación negativa de U2AF35 por interferencia de ARN (ARNi) para inducir el 3'ss críptico del intrón 1 se realizó con dos aciertos de ARN interferente pequeño (ARNip) U2AF35ab, como se informó anteriormente (7, 25); el dúplex de ARNip dirigido a DHX36 fue como se ha descrito (26). El segundo acierto se aplicó 24 h antes de la adición de SSO y/o indicador. Los cultivos celulares se recogieron 24 h después de la adición de las construcciones de indicador.
Análisis de productos de corte y empalme
El ARN total se extrajo con reactivo TRI Reagent y se trató con DNasa (Life technologies, EE.UU.). El ADNc de la primera hebra se transcribió inversamente usando cebadores oligo-(dT)15 y transcriptasa inversa del virus murino Moloney (Promega, EE.UU.). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó con una combinación de un cebador específico de vector PL3 y un cebador E dirigido a la 3'UTR, como se informó previamente (7). Los productos de PCR se separaron en geles de poliacrilamida y su intensidad de señal se midió como se describe (27). La identidad de cada isoforma de ARNm se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos de Sanger.
Dicroísmo circular y espectroscopia de resonancia magnética nuclear
Los oligorribonucleótidos para dicroísmo circular (CD) y resonancia magnética nuclear (RMN) se adquirieron en Thermo Scientific, se desprotegieron según las instrucciones del fabricante, se liofilizaron y almacenaron a -20 °C. Las soluciones madre se prepararon a partir de las muestras liofilizadas desalinizadas por resuspensión en agua milliQ o tampón KC1 (KC1 100 mM, K2HPO4 10 mM/KH2PO4, pH 7,0, agua milliQ) hasta una concentración final de 2-4 pM. Los espectros de CD se adquirieron usando un espectrofotómetro PiStar-180 (Applied Photophysics Ltd, Surrey, Reino Unido), equipado con un baño de agua circulante LTD6G (Grant Instruments, Reino Unido) y un controlador de temperatura termoeléctrico (Melcor, EE.UU.). Las muestras se calentaron en la celda a 95 °C durante un período total de 15 min, a continuación las muestras se hibridaron dejándolas enfriar a temperatura ambiente durante un período mínimo de 4 h. Los espectros de CD se registraron en un intervalo de longitud de onda de 215-340 nm usando una cubeta de cuarzo libre de tensión de 1 cm de longitud de trayectoria y a las temperaturas indicadas. Puntos de datos registrados a intervalos de 1 nm. Se usó un ancho de banda de 3 nm y se adquirieron 5000 recuentos en cada punto con el muestreo adaptativo habilitado. Cada trazo se muestra como la media de tres barridos (±D.E.). Las rampas de temperatura de CD se adquirieron a 265 nm correspondientes a la banda máxima de las especies cuádruplex plegadas. Se usaron intervalos entre 5 y 99 °C, con puntos adquiridos a intervalos de 0,5 °C con un paso del tiempo de 120-180 s entre aumentos de 0,5 °C. Los puntos se adquirieron con 10.000 recuentos y el muestreo adaptativo habilitado. Se compararon los estudios de calentamiento y enfriamiento para verificar la histéresis y la reversibilidad general. Los espectros de RMN (1H) se recogieron a 800 MHz usando un espectrómetro Bruker Avance III con una criosonda de resonancia triple. Se usaron parámetros de adquisición estándar de Bruker. Los datos se recopilaron usando Topspin (v. 3.0) y se procesaron en CCPN Analysis (v. 2.1).
Ensayos de precipitación y transferencia de Western
La transcripción in vitro se realizó usando MEGAshortscriptTM T7 (LifeTechnologies, EE.UU.) y productos de PCR marcados con T7 amplificados con los cebadores 5'-ATTAATACGACTCACTATAGGGCTCAGGGTTCCAGG y 5'-TGCAGCAGGGAGGACG, y ADN de los plásmidos indicados como plantilla. Los ARN sintéticos indicados se adquirieron en Eurofins UK. Se trataron 500 pmol de cada ARN con m-peryodato de sodio 5 mM y se unieron a perlas de agarosa deshidratadas con ácido adípico (Sigma, EE.UU.). Las perlas con ARN unidos se lavaron tres veces en 2 ml de NaCl 2 M y tres veces en tampón D (HEPES-KOH 20 mM, pH 7, glicerol al 6,5 % v/v, KCl 100 mM, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM), incubadas con extractos nucleares de HeLa y tampón D con heparina a una concentración final de 0,5 mg/ml. Las proteínas no unidas se lavaron cinco veces con tampón D. Las proteínas unidas se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 %, teñidas con azul de Coomassie y/o membranas de nitrocelulosa transferidas.
La transferencia de Western se realizó como se describe (7). Los anticuerpos se adquirieron en Sigma (hnRNP E1/E2, número de producto R4155, U2AF65, número de producto U4758 y SFRS2, número de producto S2320), Abcam (DHX36, número de producto ab70269) y Millipore (SC35, clon 1SC-4F11). Antisuero contra hnRNP F y hnRNP H proporcionado por el Prof. Douglas Black, UCLA.
Análisis de espectrometría de masas
Después de la digestión con tripsina, las muestras se liofilizaron y se resuspendieron con 25 pl de ACN al 5 %/ácido fórmico al 0,1 % para espectrometría de masas (MS). Los péptidos se analizaron mediante LC/MS/MS usando un sistema Surveyor LC y lCq Deca XP Plus (ThermoScientific). Los archivos de datos sin procesar se convirtieron en archivos genéricos mascot usando la herramienta de conversión de archivos MassMatrix (Versión 2.0; http://www.massmatrix.net) para introducirlos en el algoritmo de búsqueda de Mascot (Matrix Science).
Sondeo estructural enzimático
La determinación de la estructura secundaria del ARN con el uso de digestión limitada de ARNasa VI (Ambion), ARNasa T1 (Ambion) y nucleasa S1 (Fermentas) se ha descrito en detalle en otra parte (28). Brevemente, se digirieron alícuotas de 1 |jg de ARN de pre-ARNm de inserción (ins) y deleción (del) con 0,002 U de ARNasa V1, 0,05 U de ARNasa T1 y 19 U de nucleasa S1 en 100 j l a 30 °C durante 10 min. Se usó una alícuota libre de enzimas como control (C). Los ARN escindidos se retrotranscribieron según protocolos estándar usando cebadores no codificantes marcados con [32P]-ATP en el extremo 5'.
RESULTADOS
Oligonucleótidos no codificantes que promueven el corte y empalme de pre-ARNm de un intrón débil en 5'UTR
Para identificar los SSO capaces de reducir la retención del intrón 1 de INS y aumentar la mejora de la traducción mediada por corte y empalme, se diseñó una serie de SSO de fosforotioato modificado con 2'-0-metilo, se coexpresó individualmente cada s So con una construcción de indicador de corte y empalme que lleva el haplotipo IC en células HEK293 y se examinó la abundancia relativa de productos de ARNm exógeno (figura 1A y B). El haplotipo IC en el indicador carecía de la secuencia minisatélite y contenía un total de 14 sitios polimórficos (7,20), incluido el alelo A en rs689. Este alelo inhibe el corte y empalme del intrón 1 y produce niveles más bajos de proinsulina en comparación con el alelo T más común (21). Los SSO dirigidos al intrón 1 y al exón 2 se eligieron en regiones que mostraban las alteraciones más prominentes de inclusión de exón o retención de intrones en análisis anteriores de eliminación sistemática de estas secuencias (7). Los SSO en el exón 3 se ubicaron entre el 3'ss auténtico del intrón 2 y un 3'ss críptico de fuerte competición de 126 nt cadena abajo para identificar motivos pre-ARNm que modifican su uso (figura 1A). Del conjunto inicial de 15 SSO de INS ensayados en células HEK293, 11 mostraron alteraciones reproducibles en la abundancia relativa de isoformas de ARNm (Tabla 2). La retención del intrón 1 se redujo significativamente con un único oligorribonucleótido SSO21 (P <0,01, prueba de suma de rangos de Mann-Whitney; figura 2A). SSO21 se dirigió al intrón 1 en las posiciones 59-74, abarcando un motivo (denominado del5) que previamente se encontró que confería la mayor reducción de retención de intrones tras la eliminación (7). La disminución en los niveles de retención de intrones inducida por SSO21 fue dependiente de la dosis (figura 2A) y también se observó en células HepG2 y células COS7 de Chlorocebus aethiops, lo que concuerda con la expresión ubicua y un alto grado de conservación evolutiva de los componentes del espliceosoma que emplean secuencias de corte y empalme auxiliares (1,2). Además de reducir la retención del intrón 1, SSO21 promovió el 3'ss críptico del intrón 2 (figura 2A). Sin embargo, este efecto también se observó para otros SSO de INS y para controles aleatorios (figura 3 y Tabla 2), lo que sugiere interacciones no específicas. Para confirmar que la mejora inducida por SSO21 del corte y empalme del intrón 1 no se ve facilitada por el 3'ss críptico del intrón 2, se cotransfectó este SSO con un indicador más corto que carecía de este sitio y que conservaba solo los primeros 89 nucleótidos del exón 3. La figura 2B muestra que SSO21 fue capaz de promover el corte y empalme del intrón 1 en la misma medida que el indicador con el exón 3 más largo. Por el contrario, la disminución inducida por SSO21 de la retención de intrones no se observó para el indicador que carecía del segmento del5. Aparte de la retención de intrones, se observó un aumento del salto del exón 2 para cinco SSO, incluyendo SSO8 que se unía cadena abajo del 3'ss críptico del intrón 1 (cr3'ss+81; figuras 1 y 3C, Tabla 2). Este 3'ss críptico se indujo por el agotamiento mediado por ARNi de la subunidad pequeña de U2AF (U2AF35) y no se revirtió por un oligorribonucleótido de puenteo (SSO4) en células que carecían de U2AF35; en cambio, se observó el salto del exón 2 (figura 3C). El agotamiento de U2AF35 también reprimió el 3'ss críptico del intrón 2. En conjunto, se identificó un solo SSO que redujo la retención del intrón 1 de INS en varias líneas celulares de primates.
Optimización de la diana de retención de intrones a nivel de un solo nucleótido
Curiosamente, otros SSO diseñados para dirigirse al segmento del5 no redujeron la retención del intrón 1, excepto por un pequeño efecto de SSO20 (figuras 1A y 2A). Para probar la importancia de los nucleótidos que flanquean Ss O21 y para mapear la diana óptima en una resolución de base única, se realizó una microcaminata no codificante detallada en esta región. El indicador INS se cotransfectó individualmente con 18 nucleótidos 1-9 unidos de 16-mer adicionales 5' y 3' de SSO21 en células HEK293 y se examinaron sus productos de ARN. La retención del intrón 1 fue más reprimida por SSO21 y por SSO que se desplazaron 1-2 nucleótidos en cada dirección (figura 4). De acuerdo con el cribado inicial, los SSO dirigidos a más de una citosina en el ciclo cadena arriba de cuatro C (C4, véase SSO1 y SSO2, figura 1A) no fueron eficaces (SSO21-3r a SSO21-10r, figura 4). En la dirección opuesta, los SSO dirigidos a G consecutivos, que a menudo se encuentran en los potenciadores de corte y empalme intrónico (29-31), aumentaron la retención de intrones. Por lo tanto, la diana no codificante óptima para reducir la retención del intrón 1 de INS se mapeó con una resolución de un solo nucleótido en una región previamente identificada como la más represiva mediante un análisis de deleción sistemática del intrón completo (7).
La diana no codificante para la retención de intrones está adyacente a un cuádruplex de ARN paralelo
Cabe apreciar que la diana estaba intercalada entre dos segmentos intrónicos que se predijo que formarían cuádruplex estables de guanina (G) de ARN (intrón 1, nucleótidos 36-61 y 78-93; resaltados en la figura 4a ). Estas estructuras se producen mediante el apilamiento de cuartetos G que consiste en cuatro G organizadas en una disposición cíclica de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen (32) y se han visto implicados en procesos celulares importantes, incluyendo la replicación, la recombinación, la transcripción, la traducción (33,34) y el procesamiento del a Rn (35-39). Para probar si se forman in vitro, se emplearon ribonucleótidos sintéticos obtenidos de esta región en espectroscopia de CD que se ha usado ampliamente para caracterizar estructuras cuádruplex de ADN y ARN in vitro (40-43). El espectro de CD de un 19-mer cadena abajo (denominado CD1) registrado entre 215 y 330 nm a 25 °C reveló una fuerte elipticidad positiva a 265 nm con una intensidad negativa a aproximadamente 240 nm, indicativa de un cuádruplex paralelo (figura 5A). Para confirmar la presencia de un cuádruplex, en lugar de otros motivos estables de estructura secundaria, se registraron los espectros de absorbancia UV a 5 °C y 95 °C. El espectro de diferencia de absorbancia UV a las dos temperaturas (por debajo y por encima del punto de transición de fusión) mostró el cambio hipercrómico característico a -295 nm y un doble máximo a 240 nm y 280 nm, lo que proporciona evidencia de la formación de un cuádruplex estable de ARN de cadena paralela in vitro. Esto se confirmó por estudios de 1H RMN de CD1 (figura 5B) que mostraron una envolvente característica de señales entre 10 y 12 ppm correspondientes a G con enlaces H de Hoogsteen dentro de estructuras de tétrada G. Las mediciones de estabilidad térmica por CD produjeron una transición de despliegue cooperativo sigmoidal altamente reversible con una Tm = 56,8 ± 0,2 °C (figura 5C). La figura 5D (panel superior) muestra una posible disposición del 19-mer en dos tétradas G apiladas conectadas por secuencias de asa relativamente cortas de 1-4 nucleótidos.
Modelo de transición conformacional para el corte y empalme de secuencias inhibidoras en el intrón 1 de IN S
El CD de un 20-mer sintético obtenido de una región cadena arriba de la diana no codificante (denominada CD2) también mostró evidencia de la formación de una estructura estable, dando una envolvente de absorción más amplia centrada de aproximadamente 270 nm y una transición de despliegue térmica sigmoidal (Tm = 69,0 ± 0,45 °C; figura 5A). A diferencia del oligo cadena abajo CD1, no se encontró ningún cambio hipercrómico en la UV en el espectro de diferencia térmica. Sin embargo, un conjunto bien definido de señales nítidas en el espectro de 1H RMN entre 12 y 14 ppm que diferían de las de CD1 mostró la formación de pares de bases unidos por H de Watson-Crick características del a Rn bicatenario (figura 5B). Las predicciones de estructura secundaria de segmentos intrónicos superpuestos usando pliegue M sugirieron que el pre-ARNm forma tallos-asas locales estables; uno de ellos se estabilizó aún más por una mutación G^-C (denominada G2; figura 5D, panel inferior) que aumentó la retención del intrón 1 (7). Otra sustitución G^-C (denominada G3) ubicada más cadena abajo y que desestabiliza la estructura del cuádruplex (figura 5D, panel superior) también reprimió el corte y empalme de intrones (7). Finalmente, los oligonucleótidos CD2 que contenían A o G en un polimorfismo de un solo nucleótido (figura 4A y (20) exhibieron espectros de CD muy similares con transiciones de fusión bien definidas y valores de Tm, lo que sugiere que los alelos G y A forman la misma estructura.
Para probar adicionalmente la importancia de un equilibrio tentativo entre estructuras canónicas y no canónicas en el corte y empalme de intrones, se usó una combinación de experimentos de CD, RMN y mutagénesis (figura 6). Se sintetizó un oligorribonucleótido CD3 que abarcaba el extremo 5' de la diana de retención del intrón y se predijeron tallo-asas/cuádruplex (figuras 4A y 6A). También se sintetizó una versión mutada de CD4, que llevaba dos transiciones C ^U que desestabilizaban la horquilla pero mantenían la estabilidad del cuádruplex. La misma mutación también se introdujo en la construcción de indicador IC transfectada en células HEK293. El espectro de RMN de CD3 reveló la coexistencia de señales para las estructuras de horquilla de pares de bases canónicas y de tétrada G (denominadas H1 y H2) en equilibrio (figura 6B y C). Los efectos del Mg2+ sobre el equilibrio conformacional entre el cuádruplex y la horquilla se investigaron añadiendo 2 mM y a continuación 6 mM de MgCh a la solución tamponada que contenía KCl 100 mM. Según lo informado por Bugaut y col. (57), el equilibrio conformacional no se perturbó significativamente por la adición de Mg2+ en presencia de KCl. Por lo tanto, se observó la formación de las estructuras de horquilla y cuádruplex de ARN en un entorno que imita el contexto celular donde tanto los iones K+ como Mg2+ estaban presentes en altas concentraciones. La curva de fusión de CD mostró una transición amplia (Tm = 79,9 °C), consistente con múltiples estados conformacionales con diferentes estabilidades. La mutación CC^-UU en CD4 dio como resultado la pérdida de señales de RMN para H1 (figura 6B) y una reducción en la Tm de 13 °C, consistente con la desestabilización selectiva de la horquilla H1 más estable, lo que llevó a un aumento en la población de H2 en equilibrio con el cuádruplex. Las transfecciones transitorias mostraron que la mutación C C ^ u U mejoró el corte y empalme del intrón 1, mientras que una mutación denominada M1 prevista para desestabilizar tanto el cuádruplex como la horquilla tuvo solo un pequeño efecto (figura 6D, Tabla 1A).
Para explorar cómo el equilibrio de estas estructuras afecta al corte y empalme de intrones de manera más sistemática, se prepararon una serie de construcciones mutadas para desestabilizar/mantener las estructuras de cuádruplex, H1/H2 previstas y dos ciclos de citosina (Tabla 1A). Sus transcritos mostraron diferencias significativas en los niveles de retención de intrones (figura 7; P = 0,0001, ANOVA unidireccional de Kruskal-Wallis en rangos). En primer lugar, la eliminación del cuádruplex G aumentó la retención del intrón 1, que se mejoró aún más al eliminar cada ciclo de citosina (véanse, mutaciones 4-6 con el tipo silvestre, P = 0,0004). Estas mutaciones parecían tener efectos aditivos sobre la retención de intrones (véase, tipo silvestre frente a mutaciones 1 o 9; 3 frente a 2 y 4 frente a 5). En segundo lugar, la mayor retención de intrones en ausencia del cuádruplex G no se alteró al eliminar H1 y H2, pero su eliminación mejoró el salto de exones (véase la isoforma 2 para mutaciones 4 frente a 6). En tercer lugar, cuando solo estaba presente uno de los dos ciclos de C4, la eliminación de H1 mejoró algo el corte y empalme del intrón 1 (véase 8 frente a 9), de acuerdo con una correlación estadísticamente significativa entre la retención de intrones y la estabilidad prevista de los ARN ensayados (figura 7B). Por lo tanto, la eficiencia del corte y empalme de intrones se controló por transiciones conformacionales entre estructuras canónicas y no canónicas en equilibrio.
TABLA 1A Mutaciones del intrón 1 de IN S que alteran los cuádruplex G de ARN previstos, los tallos-asas y dos ciclos de citosina en construcciones lasmídicas
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Interacciones proteína-ARN en la región diana de los SSO ganadores
Para identificar las proteínas que interactúan con los ARN que abarcan la diana no codificante y/o las estructuras canónicas y no canónicas asociadas, se realizaron ensayos de precipitación usando ARN de tipo silvestre y del5 transcritos a partir de productos de PCR marcados con T7, un ARN sintético (CD5) que representa la secuencia diana, y un oligo de control que contenía un 3'ss CAG, denominado AV3. La transferencia de Western mostró que tanto los transcritos de tipo silvestre como del5 se unían a hnRNP F/H pero esta unión estaba ausente para CD5 (figura 7C). Estas proteínas también se detectaron mediante análisis MS/MS de fragmentos teñidos diferencialmente de geles de precipitación con ARN de tipo silvestre y del5 en comparación con controles solo de perlas. Dos anticuerpos contra SRSF2, que mostraron la puntuación más alta de supuesta actividad de unión entre varias proteínas SR, no pudieron detectar ninguna interacción específica (figura 7C). Aunque la señal de hnRNP E1/E2, que constituye una importante actividad de unión a poli(C) en células de mamífero (44), estuvo por encima del origen para del5 (figura 7C), no se observó ningún cambio en la retención de intrones en células que carecían de hnRNP E1/E2.
Patrón de corte y empalme de indicadores ricos en G y pobres en G tras el agotamiento de DHX36
Los cuádruplex G de ARN se unen a la helicasa DHX36, que es capaz de convertir el ARN de cuádruplex en un dúplex estable y es una fuente importante de actividad de resolución de cuádruplex en células HeLa (26,45). DHX36 se entrelazó con un potenciador de corte y empalme intrónico en el pre-ARNm de ATM (46) y pudo desenrollar la estructura del cuádruplex dentro de la región 5' de TERC (26). Para probar si el agotamiento de DHX36 puede influir en el corte y empalme de INS, los indicadores ricos y pobres en cuádruplex G se transfectaron transitoriamente (figura 8A, Tabla 1) en células agotadas. Se eligieron construcciones de control para dar una representación aproximadamente igual de los productos de corte y empalme, lo que se logró debilitando el sitio de ramificación (24), proporcionando así un ensayo de corte y empalme ex vivo sensible. Sin embargo, a pesar del agotamiento eficiente de DHX36 (figura 8B), no se observaron alteraciones estadísticamente significativas de la retención del intrón 1 de INS en construcciones cortas o largas, ni se observó cambios importantes en los controles ricos en G y pobres en G (figura 8C-E). Estos resultados son acordes con una falta previa de enriquecimiento significativo de secuencias cuádruplex entre transcritos regulados negativamente en células agotadas en DHX36 (47) y con la ausencia de respuesta de ATM a la atenuación (46).
Represión inducida por SSO de un sitio de corte y empalme 5' críptico específico de la población del intrón 1 de INS
Además de rs689, el corte y empalme del intrón 1 de INS se ve influenciado por una inserción TTGC polimórfica en rs3842740 ubicada en la proximidad del 5'ss natural (21). Esta inserción está presente en una cuarta parte de todos los cromosomas africanos, pero está ausente en los haplotipos IC caucásicos (20). La inserción activa un 5'ss críptico cadena abajo (figura 1A), extendiendo la 5'UTR de los ARNm resultantes en 26 nucleótidos adicionales y reprimiendo la expresión de proinsulina (7,21). Para probar si el nuevo 5'ss puede inhibirse eficazmente por los SSO, se introdujo la misma inserción en la construcción IC y los indicadores de tipo silvestre y mutados se coexpresaron con un oligorribonucleótido de puenteo denominado SSO10. Aunque se inhibió el corte y empalme críptico, el corte y empalme canónico del intrón 1 no se restauró completamente ni siquiera a altas concentraciones de SSO10, muy probablemente como resultado de un reconocimiento subóptimo del 5'ss auténtico debilitado por la inserción.
Para obtener conocimientos iniciales sobre el plegamiento de las secuencias 5'UTR en presencia y ausencia de la inserción, se realizó un sondeo estructural enzimático usando digestión de ARN parcial con ARN específicos monocatenarios y bicatenarios. Las posiciones escindibles generales y las intensidades detectadas para el ARN de tipo silvestre fueron ampliamente consistentes con las predicciones del pliegue m, en las que dos regiones principales de tallo-asa (SL1 y SL2) se interrumpieron por varias protuberancias internas. Tanto el sondeo estructural como las predicciones del pliegue m sugirieron que la inserción en rs3842740 extendió la protuberancia central en SL1 a medida que aumentó el número de escisiones T1 y S1 en esta región en contraste con las porciones restantes de SL1 y en SL2. Finalmente, los transcritos no se digirieron por la RNasa VI en regiones que mostraban formación de cuádruplex in vitro.
ANÁLISIS
Diana de retención de intrones no codificante en un silenciador de corte y empalme del intrón 1 de INS Aquí se demuestra el primer uso de tecnología no codificante para reducir la retención del intrón completo en transcritos maduros y para modificar la expresión de INS dependiente de haplotipo usando SSO. La identificación de los SSO ganadores que compensan el impacto adverso del alelo A en rs689 en el procesamiento eficiente del ARN se vio facilitada por la mutagénesis sistemática del intrón 1 (7) y por estrategias de macrocaminata (figura 1) y microcaminata (figura 4). Curiosamente, la secuencia diana contiene un motivo CAG(G/C) en tándem, que se parece a un consenso de 3'ss (figura 4). Dichos "pseudoaceptores" estuvieron implicados previamente en la represión del sitio de corte y empalme experimentalmente (27) y se sobrerrepresentan en los silenciadores de corte y empalme. Por ejemplo, los dos tetrámeros son más comunes entre los silenciadores de corte y empalme intrónico 102 de alta confianza (49) y se agotan en 109 potenciadores (50) identificados por el cribado activado por fluorescencia de 10­ mers aleatorios. Los motivos YAG también fueron más frecuentes de lo esperado entre los silenciadores de corte y empalme QUEPASA (51), lo que sugiere que son componentes funcionales importantes de la diana de retención. El tramo de citosina intermedio también puede desempeñar un papel importante, ya que la frecuencia de ciclos de C4 entre los silenciadores QUEPASA es ~2 veces mayor de lo esperado. Estos motivos también se encontraron en el 4 % de los elementos reguladores del corte y empalme intrónico identificados mediante un cribado sistemático de secuencias insertadas en las posiciones -62/-51 en relación con un 3'ss probado (52). Este estudio identificó un elemento denominado ISS22 (AAATAGAGGCCCCAG) que compartía un nonámero 3' (subrayado) con la diana óptima de retención de intrones. Sin embargo, a diferencia de una secuencia de reconocimiento de 3'ss óptima de AV3, este ensayo de precipitación junto con transferencia de Western reveló solo una unión muy débil, si es que hubo alguna, a U2AF65 (figura 7c ).
Transición conformacional entre cuádruplex y horquillas en el control de procesamiento de ARN
La diana no codificante se identificó justo cadena arriba de un ARN potencial de formación de cuádruplex G cuya estructura se confirmó posteriormente mediante análisis de CD y RMN (figuras 1A y 5). Los cuádruplex de ARN son más estables que sus equivalentes de ADN, se han visto implicados cada vez más en la regulación del metabolismo del ARN (33,34,41,42) y ofrecen vías únicas para el desarrollo de fármacos (53). Los cuádruplex de 2 cuartetos son termodinámicamente menos estables que sus equivalentes de 3 o 4 cuartetos y probablemente son cinéticamente más lábiles, pero aún muestran una estabilidad pronunciada y pueden servir como interruptores más flexibles y dinámicos entre estructuras cuádruplex y no cuádruplex en respuesta a entorno celular (54-56). Los SSO ganadores pueden bloquear las interacciones con los factores que actúan en trans, alterar las estructuras de orden superior, la velocidad de formación del complejo de ARN-proteína o afectar a la transición conformacional entre el cuádruplex de 2 cuartetos y H1/H2 (figura 5). Recientemente se ha descrito una transición similar para un cuádruplex no previsto ab in it io (57), lo que plantea la posibilidad de que secuencias adicionales en el intrón 1 rico en G puedan participar en los equilibrios cerca de la diana no codificante, posiblemente involucrando múltiples motivos cuádruplex y tallos-asas competitivos.
Los experimentos de unión (figura 7C) funcionales que muestran el aumento de la retención del intrón 1 tras el agotamiento de hnRNP F/H y el efecto opuesto tras la sobreexpresión de hnRNP F/H (7) indican que estas proteínas interactúan con secuencias auxiliares de corte y empalme clave en este intrón. En contraste con un informe anterior que concluyó que hnRNP F se une directamente al cuádruplex de ARN (58), se ha demostrado que hnRNP F previene la formación de cuádruplex de ARN al unirse exclusivamente a tramos de G monocatenarios (59). Las predicciones basadas en genomas de primates sugieren que es probable que la mayoría de los cuádruplex putativos se plieguen en estructuras canónicas (60). Disminución de la ocupación de pre-ARNm por parte de estas proteínas, lo que presumiblemente promueve la formación de cuádruplex (59) y reduce potencialmente la eficiencia del corte y empalme. Cuádruplex de ARN en corte y empalme acoplado y control de expresión génica traduccional
Se predijeron cuádruplex de a Rn en -8,0 % de 5'UTR y se propuso que actuaran como inhibidores generales de la traducción (60,61). El intrón 1 de IN S se somete a corte y empalme débilmente y depende de U2AF35 (7) y una fracción significativa de los transcritos que contienen el intrón 1 se exporta desde el núcleo (23). Esto sugiere que el cuádruplex G de ARN formado por CD1 podría influir en la traducción de estos ARNm, que contienen un uORF de tres aminoácidos específico para H o m in in a e (7). Este uORF inhibe notablemente la expresión de proinsulina y se encuentra solo unos pocos pares de bases cadena abajo, lo que genera el concepto de que los cuádruplex G pueden promover la traducción mediante el secuestro de uORF. Se requieren cuádruplex de 2 cuartetos funcionales para la actividad de los sitios de entrada ribosómicos internos (54).
Tabla 1. Densi r l x ARN r vi n n r i n in i r
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aLa longitud de las secuencias cuádruplex no superpuestas y sus puntuaciones G se calcularon como se describe (78).
Estrategias no codificantes para dependencias en la selección de sitios de corte y empalme
Además de la isoforma 4 de ARNm canónico, se han encontrado las isoformas 2, 3 y 6 (figura 1B) en bases de datos de etiquetas de secuencias expresadas obtenidas de genotecas de ADNc de tejidos productores de insulina (21). Esto sugiere que los sitios de corte y empalme crípticos producidos por la construcción de indicador se reconocen in v ivo y que este sistema indicador dependiente de haplotipos recapitula estos eventos con precisión en células cultivadas sin importar si las células expresan o no insulina endógena. Además de reprimir los transcritos que conservan el intrón 1, los SSO óptimos aumentaron la utilización del 3'ss críptico del exón 3 (figura 2). Este efecto no deseado podría explicarse por la coordinación del corte y empalme de exones e intrones adyacentes, que se observó previamente para genes individuales y globalmente (63-67). Además, los sitios de inicio de la transcripción cadena abajo de riqueza G se han asociado con los sitios de pausa de la ARN polimerasa II (68). Aunque es probable que los dos 3'ss del intrón 2 de fuerte competición respondan a señales no específicas que influyen en el plegamiento del ARN (figura 3, Tabla 2), podría ser posible aliviar las dependencias observadas y reducir la activación del 3'ss críptico usando combinaciones de SSO en sitios de corte y empalme ligados y examinar sus sinergias o antagonismos, beneficiándose del uso de construcciones de genes completos en lugar de minigenes.
Oligonucleótidos no codificantes multifuncionales para reducir la retención del intrón 1 de INS
Desde el primer uso de SSO de 2'-0-metil-fosforotioato (69), este tipo de modificación química se ha aprovechado con éxito para muchas aplicaciones in v itro e in v ivo (9,10,70). Para afinar aún más la expresión de las isoformas de ARNm, se pueden diseñar SSO optimizados para unir factores de corte y empalme que actúen en tra n s adecuados a sus secuencias diana (11,71). Un candidato obvio para este sistema es U2AF35 porque el intrón 1 es débil como resultado de la relajación del 3'ss en los primates superiores y se debilita aún más por el alelo A en rs689, lo que hace que este intrón sea altamente dependiente de U2AF35 (figura 3) (7). Además de U2AF35, las futuras estrategias no codificantes bifuncionales o multifuncionales pueden emplear plataformas de unión para factores de corte y empalme que previamente se demostró que influyen en el corte y empalme del intrón 1 y el exón 2 de INS, tal como Tra2p o SRSF3 (7). Es probable que Tra2p se una a la diana de SSO6 que forma una estructura de horquilla estable prevista con un potente potenciador de corte y empalme de GAA en un asa terminal (figura 3B). SRSF3 es necesario para la represión del 3'ss críptico del intrón 2 (7) y se une a la secuencia rica en pirimidina con un consenso (A/U)C(A/U)(A/U)C (72). El motivo CAUC, que interactúa con el motivo de reconocimiento de ARN de SRSF3 (73), está presente justo cadena arriba del 3'ss críptico.
Normalización de los niveles de retención de intrones en enfermedades genéticas humanas
Estos resultados brindan la oportunidad de usar medios no genéticos para compensar el corte y empalme menos eficiente y la menor expresión de INS de los haplotipos que predisponen a la diabetes de tipo 1.
Las variantes comunes tales como rs689 contribuyen en gran medida a la heredabilidad de rasgos complejos, incluidas las enfermedades autoinmunitarias (74), pero se desconocen en gran medida sus consecuencias funcionales y estructurales. Si los SSO de INS optimizados pueden introducirse de manera segura y eficiente en el timo en desarrollo, este enfoque puede ofrecer un enfoque preventivo novedoso para promover la tolerancia al autoantígeno principal en la diabetes de tipo 1. Las candidatas más obvias para tal intervención son las madres que tuvieron un niño homocigoto afectado para los alelos de predisposición a la enfermedad en los locus HLA e INS. Dichos genotipos se asociaron con un riesgo de enfermedad extremadamente alto para los hermanos (75). Aparte de la prevención primaria de la diabetes de tipo 1, los futuros productos terapéuticos basados en SSO podrían ser aplicables a pacientes con actividad residual significativa de linfocitos p en el momento del diagnóstico y a aquellos que son aptos para recibir trasplantes de linfocitos p y pueden beneficiarse de una mayor mejora mediada por intrones de expresión de proinsulina a partir de células trasplantadas. También es posible prever el uso de esta modalidad terapéutica para otros pacientes con diabetes a través de una mejora más drástica del corte y empalme de intrones y la expresión de proinsulina al dirigirse a múltiples motivos reguladores de corte y empalme con SSO multifuncionales. Los s So pueden tener utilidad en las células epiteliales tímicas y las células 13 que pueden proporcionar un sistema más natural para probar su impacto en la expresión de proinsulina tanto exo como endógena. Finalmente, estrategias no codificantes similares pueden ayudar a reducir la retención generalizada de intrones en las células cancerosas como resultado de mutaciones somáticas de los genes del factor de corte y empalme, como lo ilustran las sustituciones específicas en el dominio de dedos de cinc de U2AF35 en enfermedades mieloproliferativas (76).
Reducción de la retención de intrones en células neoplásicas
Se seleccionó un conjunto de 146 secuencias intrónicas que se conservan preferentemente en células HEK293 deficientes en U2AF usando datos de RNAseq de muestras replicadas seleccionadas con poliA, seguido de inspección de cada evento de retención de intrones en buscadores de genoma. Estas secuencias se enmascararon repetidamente usando una versión sensible de RepeatMasker, disponible en http://www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker. Debido a que la diana no codificante óptima para reducir la retención del intrón 1 de INS [Kralovicova J y col. (2014). Nucleic Acids Res doi: 10.1093/nar/gku507, publicado el 17 de junio de 2014] superpuso elementos reguladores de corte y empalme intrónico conservados en mamíferos [Yeo GW, y col. (2007). PLoS Genet 3:e85], incluyendo CCCAG, AGGCC (figura 4 en Kralovicova y col. 2014), se seleccionaron dianas no codificantes en segmentos intrónicos que contenían estos motivos cortos de pentámero a heptámero y un conjunto de motivos reguladores de corte y empalme intrónico derivado de forma independiente [Voelker RB y Berglund JA (2007). Genome Res 17:1023-1033], aumentando así la posibilidad de que los oligonucleótidos interactúen con estas dianas para influir en el procesamiento del ARN. Las secuencias diana se sometieron a un diseño rutinario de oligonucleótidos no codificantes, incluida la eliminación de secuencias que contenían ciclos de C para evitar la formación de cuádruplex G. También se evitaron la proximidad de los sitios de corte y empalme 5' y 3', tramos de polipirimidina, sitios de ramificación y regiones suprarramificadas. Esta selección produjo un conjunto de 388 compuestos (Tabla 3), que cubren ~15 % de las longitudes totales de los intrones sensibles a U2AF y representan ~0,001 % de todas las secuencias intrónicas humanas. Por lo tanto, este conjunto de oligonucleótidos tiene como objetivo regiones enriquecidas para el corte y empalme de secuencias inhibidoras de intrones dependientes de U2, que no cuentan con la ayuda suficiente de factores auxiliares en células neoplásicas que sustentan mutaciones o deleciones en la ruta U2.
SECUENCIAS RELACIONADAS CON LA INSULINA
Secuencias de SSO candidatas
Nota: Los candidatos marcados con "*" son los oligos ganadores analizados en la figura 4.
CD5
Forma de ARN - CUGCAGAGCUGGGGCCUG (SEQ ID NO: 1)
Forma de ADN - CTGCAGAGCTGGGGCCTG (SEQ ID NO: 2)
Se une a caggccccagcucugcag (SEQ ID NO: 3)
SSO21 *
Forma de ARN - UGCAGAGCUGGGGCCU (SEQ ID NO: 4) Forma de ADN - TGCAGAGCTGGGGCCT (SEQ ID NO: 5) Se une a aggccccagcucugca (SEQ ID NO: 6)
SSO21-2r*
Forma de ARN - GCAGAGCUGGGGCCUG (SEQ ID NO: 7) Forma de ADN - GCAGAGCTGGGGCCTG (SEQ ID NO: 8) Se une a caggccccagcucugc (SEQ ID NO: 9)
SSO21-3r
Forma de ARN - CAGAGCUGGGGCCUGG (SEQ ID NO: 10) Forma de ADN - CAGAGCTGGGGCCTGG (SEQ ID NO: 11) Se une a ccaggccccagcucug (SEQ ID NO: 12)
SSO21-4r
Forma de ARN - AGAGCUGGGGCCUGGG (SEQ ID NO: 13) Forma de ADN - AGAGCTGGGGCCTGGG (SEQ ID NO: 14) Se une a cccaggccccagcucu (SEQ ID NO: 15)
SSO21-5r
Forma de ARN - GAGCUGGGGCCUGGGG (SEQ ID NO: 16) Forma de ADN - GAGCTGGGGCCTGGGG (SEQ ID NO: 17) Se une a ccccaggccccagcuc (SEQ ID NO: 18)
SSO21-6r
Forma de ARN - AGCUGGGGCCUGGGGU (SEQ ID NO: 19) Forma de ADN - AGCTGGGGCCTGGGGT (SEQ ID NO: 20) Se une a accccaggccccagcu (SEQ ID NO: 21)
SSO21-7r
Forma de ARN - GCUGGGGCCUGGGGUC (SEQ ID NO: 22) Forma de ADN - GCTGGGGCCTGGGGTC (SEQ ID NO: 23) Se une a gaccccaggccccagc (SEQ ID NO: 24)
SSO21-8r
Forma de ARN - CUGGGGCCUGGGGUCC (SEQ ID NO: 25) Forma de ADN - CTGGGGCCTGGGGTCC (SEQ ID NO: 26) Se une a ggaccccaggccccag (SEQ ID NO: 27)
SSO21-9r
Forma de ARN - UGGGGCCUGGGGUCCA (SEQ ID NO: 28) Forma de ADN - TGGGGCCTGGGGTCCA (SEQ ID NO: 29) Se une a uggaccccaggcccca (SEQ ID NO: 30)
SSO21-10r
Forma de ARN - GGGGCCUGGGGUCCAG (SEQ ID NO: 31) Forma de ADN - GGGGCCTGGGGTCCAG (SEQ ID NO: 32) Se une a cuggaccccaggcccc (SEQ ID NO: 33)
SSO21-14f*
Forma de ARN - CUGCAGAGCUGGGGCC (SEQ ID NO: 34) Forma de ADN - CTGCAGAGCTGGGGCC (SEQ ID NO: 35)
Se une a ggccccagcucugcag (SEQ ID NO: 36)
SSO21-15f
Forma de ARN - GCUGCAGAGCUGGGGC (SEQ ID NO: 37)
Forma de ADN - GCTGCAGAGCTGGGGC (SEQ ID NO: 38)
Se une a gccccagcucugcagc (SEQ ID NO: 39)
SSO21-16f
Forma de ARN - UGCUGCAGAGCUGGGG (SEQ ID NO: 40)
Forma de ADN - TGCTGCAGAGCTGGGG (SEQ ID NO: 41)
Se une a ccccagcucugcagca (SEQ ID NO: 42)
SSO21-17f
Forma de ARN - CUGCUGCAGAGCUGGG (SEQ ID NO: 43)
Forma de ADN - CTGCTGCAGAGCTGGG (SEQ ID NO: 44)
Se une a cccagcucugcagcag (SEQ ID NO: 45)
Secuencia de la región diana del transcrito de pre-ARNm (por ejemplo, para unir los SSO) cuggaccccaggccccagcucugcagcag (SEQ ID NO: 46)
Tabla 2
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SECUENCIAS RELACIONADAS CON EL CANCER
Las secuencias de la siguiente tabla (Tabla 3) también se pueden proporcionar con residuos de timina en sustitución de los residuos de uracilo (por ejemplo, en forma de ADN). Cada secuencia de la siguiente tabla puede ser una realización del polímero de ácido polinucleico de la invención. Cada gen u ORF al que se hace referencia en la siguiente tabla (Tabla 3) bajo "nombre del compuesto", puede comprender el gen diana para la corrección de la retención de intrones.
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Aunque las realizaciones preferidas de la invención se han mostrado y descrito en esta invención, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los procedimientos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones se incluyan de ese modo.
Los procedimientos, composiciones y kits particulares descritos pueden variar. También debe comprenderse que la terminología usada en esta invención tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporcionan valores, se puede entender que cada valor se puede expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. "Aproximadamente" también puede incluir una cantidad exacta. Por ejemplo, "aproximadamente 5 jl" puede significar "aproximadamente 5 jl" o "5 jl". Generalmente, el término "aproximadamente" puede incluir una cantidad que se espera que esté dentro del 10 % del valor mencionado.
Los encabezados de sección usados en esta invención son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención pueden tener el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la materia objeto reivindicada. Las descripciones en esta invención son solo ilustrativas y de ejemplo y no son restrictivas de ninguna materia objeto reivindicada. En esta solicitud, el uso del singular puede incluir el plural, a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pueden incluir referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" puede significar "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluir", "incluye" e "incluido", no es limitante.
1. Smith, C.W. and Valcarcel, J. (2000) Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control. Trends Biochem. Sci., 25, 381-388.
2. Wahl, M.C., Will, C.L. and Luhrmann, R. (2009) The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell, 136, 701-718.
3. Callis, J., Fromm, M. and Walbot, V. (1987) Introns increase gene expression in cultured maize cells. Genes Dev., 1, 1183-1200.
4. Buchman, A.R. and Berg, P. (1988) Comparison of intron-dependent and intron-independent gene expression. Mol. Cell. Biol., 8, 4395-4405.
5. Le Hir, H., Nott, A. and Moore, M.J. (2003) How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. Trends Biochem. Sci., 28, 215-220.
6. Cazzola, M. and Skoda, R.C. (2000) Translational pathophysiology: a novel molecular mechanism of human disease. Blood, 95, 3280-3288.
7. Kralovicova, J. and Vorechovsky, I. (2010) Allele-dependent recognition of the 3' splice site of INS intron 1. Hum. Genet., 128, 383-400.
8. Kole, R., Krainer, A.R. and Altman, S. (2012) RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat. Rev. Drug Discov., 11, 125-140.
9. Aartsma-Rus, A. and van Ommen, G.J. (2007) Antisense-mediated exon skipping: a versatile tool with therapeutic and research applications. RNA, 13, 1609-1624.
10. Goyenvalle, A., Seto, J.T., Davies, K.E. and Chamberlain, J. (2012) Therapeutic approaches to muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet., 20, R69-78.
11. Hua, Y., Sahashi, K., Hung, G., Rigo, F., Passini, M.A., Bennett, C.F. and Krainer, A.R. (2010) Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes Dev., 24, 1634­ 1644.
12. Du, L., Pollard, J.M. and Gatti, R.A. (2007) Correction of prototypic ATM splicing mutations and aberrant ATM function with antisense morpholino oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 104, 6007-6012.
13. Kralovicova, J., Hwang, G., Asplund, A.C., Churbanov, A., Smith, C.I. and Vorechovsky, I. (2011) Compensatory signals associated with the activation of human GC 5' splice sites. Nucleic Acids Res., 39, 7077-7091.
14. Buratti, E., Chivers, M.C., Hwang, G. and Vorechovsky, I. (2011) DBASS3 and DBASS5: databases of aberrant 3' and 5' splice sites in human disease genes. Nucleic Acids Res., 39, D86-D91.
15. Davies, J.L., Kawaguchi, Y., Bennett, S.T., Copeman, J.B., Cordell, H.J., Pritchard, L.E., Reed, P.W., Gough, S.C., Jenkins, S.C., Palmer, S.M. et al. (1994) A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes. Nature, 371, 130-136.
16. Barratt, B.J., Payne, F., Lowe, C.E., Hermann, R., Healy, B.C., Harold, D., Concannon, P., Gharani, N., McCarthy, M.I., Olavesen, M.G. et al. (2004) Remapping the insulin gene/IDDM2 locus in type 1 diabetes. Diabetes, 53, 1884— 1889.
17. Zhang, L., Nakayama, M. and Eisenbarth, G.S. (2008) Insulin as an autoantigen in NOD/human diabetes. Curr. Opin. Immunol., 20, 111-118.
18. Vafiadis, P., Bennett, S.T., Todd, J.A., Nadeau, J., Grabs, R., Goodyer, C.G., Wickramasinghe, S., Colle, E. and Polychronakos, C. (1997) Insulin expression in human thymus is modulated by INS VNTR alleles at the IDDM2 locus. Nat. Genet., 15, 289—292.
19. Pugliese, A., Zeller, M., Fernandez, A. Jr, Zalcberg, L.J., Bartlett, R.J., Ricordi, C., Pietropaolo, M., Eisenbarth, G.S., Bennett, S.T. and Patel, D.D. (1997) The insulin gene is transcribed in the human thymus and transcription levels correlated with allelic variation at the INS VNTR-IDDM2 susceptibility locus for type 1 diabetes. Nat. Genet., 15, 293-297.
20. Stead, J.D., Hurles, M.E. and Jeffreys, A.J. (2003) Global haplotype diversity in the human insulin gene región. Genome Res., 13, 2101-2111.
21. Kralovicova, J., Gaunt, T.R., Rodríguez, S., Wood, P.J., Day, I.N.M. and Vorechovsky, I. (2006) Variants in the human insulin gene that affect pre-mRNA splicing: is -23Hphl a functional single nucleotide polymorphism at IDDM2? Diabetes, 55, 260-264.
22. Ruskin, B., Zamore, P.D. and Green, M.R. (1988) A factor, U2AF, is required for U2 snRNP binding and splicing complex assembly. Cell, 52, 207-219.
23. Wang, J., Shen, L., Najafi, H., Kolberg, J., Matschinsky, F.M., Urdea, M. and German,M. (1997) Regulation of insulin preRNA splicing by glucose. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 94, 4360-4365.
24. Kralovicova, J., Haixin, L. and Vorechovsky, I. (2006) Phenotypic consequences of branchpoint substitutions. Hum. Mutat., 27, 803-813.
25. Pacheco, T.R., Gomes, A.Q., Barbosa-Morais, N.L., Benes, V., Ansorge, W., Wollerton, M., Smith, C.W., Valcarcel, J. and Carmo-Fonseca, M. (2004) Diversity of vertebrate splicing factor U2AF35: identification of alternatively spliced U2AF1 mRNAS. J. Biol. Chem., 279, 27039-27049.
26. Booy, E.P., Meier, M., Okun, N., Novakowski, S.K., Xiong, S., Stetefeld, J. and McKenna, S.A. (2012) The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the PI helix template boundary. Nucleic Acids Res., 40, 4110-4124.
27. Lei, H. and Vorechovsky, I. (2005) Identification of splicing silencers and enhancers in sense Alus: a role for pseudo-acceptors in splice site repression. Mol. Cell. Biol., 25,6912-6920.
28. Buratti, E., Muro, A.F., Giombi, M., Gherbassi, D., Iaconcig, A. and Baralle, F.E. (2004) RNA folding affects the recruitment of SR proteins by mouse and human polypurinic enhancer elements in the fibronectin EDA exon. Mol. Cell. Biol., 24, 1387-1400.
29. Nussinov, R. (1988) Conserved quartets near 5' intron junctions in primate nuclear pre-mRNA. J. Theor. Biol., 133, 73-84.
30. Sirand-Pugnet, P., Durosay, P., Brody, E. and Marie, J. (1995) An intronic (A/U)GGG repeat enhances the splicing of an alternative intron of the chicken beta-tropomyosin pre-mRNA. Nucleic Acids Res., 23, 3501-3507.
31. Kralovicova, J. and Vorechovsky, I. (2006) Position-dependent repression and promotion of DQB1 intron 3 splicing by GGGG motifs. J. Immunol., 176, 2381— 2388.
32. Neidle, S. and Balasubramanian, S. (2006) Quadruplex Nucleic Acids. RSC Biomolecular Sciences, Cambridge, UK.
33. Bugaut, A. and Balasubramanian, S. (2012) 5'-UTR RNA G-quadruplexes: translation regulation and targeting. Nucleic Acids Res., 40, 4727-4741.
34. Millevoi, S., Moine, H. and Vagner, S. (2012) G-quadruplexes in RNA biology. Wiley Interdiscip. Rev. RNA, 3, 495—507.
35. Gomez, D., Lemarteleur, T., Lacroix, L.,Mailliet, P., Mergny, J.L. and Riou, J.F. (2004) Telomerase downregulation induced by the G-quadruplex ligand 12459 in A549 cells is mediated by hTERT RNA alternative splicing. Nucleic Acids Res., 32, 371-379.
36. Didiot, M.C., Tian, Z., Schaeffer, C., Subramanian, M., Mandel, J.L. and Moine, H. (2008) The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Res., 36, 4902­ 4912.
37. Hai, Y., Cao, W., Liu, G., Hong, S.P., Elela, S.A., Klinck, R., Chu, J. and Xie, J. (2008) A G-tract element in apoptotic agents-induced alternative splicing. Nucleic Acids Res., 36, 3320-3331.
38. Marcel, V., Tran, P.L., Sagne, C., Martel-Planche, G., Vaslin, L., Teulade-Fichou, M.P., Hall,J., Mergny, J.L., Hainaut, P. and Van Dyck, E. (2011) G-quadruplex structures in TP53 intron 3: role in alternative splicing and in production of p53 mRNA isoforms. Carcinogenesis, 32, 271-278.
39. Melko, M., Douguet, D., Bensaid, M., Zongaro, S., Verheggen, C., Gecz, J. and Bardoni, B. (2011) Functional characterization of the AFF (AF4/FMR2) family of RNA-binding proteins: insights into the molecular pathology of FRAXE intellectual disability. Hum. Mol. Genet., 20, 1873-1885.
40. Balagurumoorthy, P., Brahmachari, S.K., Mohanty, D., Bansal, M. and Sasisekharan, V. (1992) Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences. Nucleic Acids Res., 20, 4061-4067.
41. Derecka, K., Balkwill, G.D., Garner, T.P., Hodgman, C., Flint, A.P. and Searle, M.S. (2010) Occurrence of a quadruplex motif in a unique insert within exon C of the bovine estrogen receptor alpha gene (ESR1). Biochemistry (Mosc.). 49, 7625-7633.
42. Balkwill, G.D., Derecka, K., Garner, T.P., Hodgman, C., Flint, A.P. and Searle, M.S. (2009) Repression of translation of human estrogen receptor alpha by G-quadruplex formation. Biochemistry (Mosc.). 48, 11487-11495.
43. Garner, T.P., Williams, H.E., Gluszyk, K.I., Roe, S., Oldham, N.J., Stevens, M.F., Moses, J.E. and Searle, M.S. (2009) Selectivity of small molecule ligands for parallel and anti-parallel DNA G-quadruplex structures. Org. Biomol. Chem., 7, 4194-4200.
44. Thisted, T., Lyakhov, D.L. and Liebhaber, S.A. (2001) Optimized RNA targets of two closely related triple KH domain proteins, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and alphaCP-2KL, suggest Distinct modes of RNA recognition. J. Biol. Chem., 276, 17484-17496.
45. Creacy, S.D., Routh, E.D., Iwamoto, F., Nagamine, Y., Akman, S.A. and Vaughn, J.P. (2008) G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J. Biol. Chem., 283, 34626-34634.
46. Pastor, T. and Pagani F. (2011) Interaction of hnRNPA1/A2 and DAZAP1 with an Alu-derived intronic splicing enhancer regulates ATM aberrant splicing. PLoS One, 6, e23349.
47. Iwamoto, F., Stadler, M., Chalupnikova, K., Oakeley, E. and Nagamine, Y. (2008) Transcription-dependent nucleolar cap localization and possible nuclear function of DExH RNA helicase RHAU. Exp. Cell Res., 314, 1378­ 1391.
48. Singh, N.N., Hollinger, K., Bhattacharya, D. and Singh, R.N. (2010) An antisense microwalk reveals critical role of an intronic position linked to a unique long-distance interaction in pre-mRNA splicing. RNA, 16, 1167-1181. 49. Wang, Y., Xiao, X., Zhang, J., Choudhury, R., Robertson, A., Li, K., Ma, M., Burge, C.B. and Wang, Z. (2012) A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat. Struct. Mol. Biol., 20, 36-45.
50. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X. and Wang, Z. (2012) Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat. Struct. Mol. Biol., 19, 1044-1052.
51. Ke, S., Shang, S., Kalachikov, S.M.,Morozova, I., Yu, L., Russo, J.J., Ju, J. and Chasin, L.A. (2011) Quantitative evaluation of all hexamers as exonic splicing elements. Genome Res., 21, doi10.1101/gr.119628.119110.
52. Culler, S.J., Hoff, K.G., Voelker, R.B., Berglund, J.A. and Smolke, C.D. (2010) Functional selection and systematic analysis of intronic splicing elements identify active sequence motifs and associated splicing factors. Nucleic Acids Res., 38, 5152— 5165.
53. Collie, G.W. and Parkinson, G.N. (2011) The application of DNA and RNA G-quadruplexes to therapeutic medicines. Chem. Soc. Rev., doi 10.1039/c1cs15067g.
54. Morris, M.J., Negishi, Y., Pazsint, C., Schonhoft, J.D. and Basu, S. (2010) An RNA G-quadruplex is essential for cap-independent translation initiation in human VEGF IRES. J. Am. Chem. Soc., 132, 17831-17839.
55. Wieland, M. and Hartig, J.S. (2007) RNA quadruplex-based modulation of gene expression. Chem. Biol., 14, 757-763.
56. Zhang, A.Y. and Balasubramanian, S. (2012) The kinetics and folding pathways of intramolecular g-quadruplex nucleic acids. J. Am. Chem. Soc., 134, 19297- 19308.
57. Bugaut, A., Murat, P. and Balasubramanian, S. (2012) An RNA hairpin to g-quadruplex conformational transition. J. Am. Chem. Soc., 134, 19953-19956.
58. Decorsiere, A., Cayrel, A., Vagner, S. and Millevoi, S. (2011) Essential role for the interaction between hnRNP H/F and a G quadruplex in maintaining p53 pre-mRNA 3'-end processing and function during DNA damage. Genes Dev., 25, 220- 225.
59. Samatanga, B., Dominguez, C., Jelesarov, I. and Allain, F.H. (2013) The high kinetic stability of a G-quadruplex limits hnRNP F qRRM3 binding to G-tract RNA. Nucleic Acids Res., 41, 2505-2516.
60. Lorenz, R., Bernhart, S.H., Qin, J., Honer, Zu, Siederdissen, C., Tanzer, A., Amman, F., Hofacker, I.L. and Stadler, P.F. (2013) 2D meets 4G: G-quadruplexes in RNA secondary structure prediction. IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. Bioinform.
61. Beaudoin, J.D. and Perreault, J.P. (2010) 5'-UTR G-quadruplex structures acting as translational repressors. Nucleic Acids Res., 38, 7022—7036.
62. Fred, R.G., Sandberg, M., Pelletier, J. and Welsh, N. (2011) The human insulin mRNA is partly translated via a cap- and eIF4A-independent mechanism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 412, 693-698.
63. Schwarze, U., Starman, B.J. and Byers, P.H. (1999) Redefinition of exon 7 in the COL1A1 gene of type I collagen by an intron 8 splice-donor-site mutation in a form of osteogenesis imperfecta: influence of intron splice order on outcome of splice-site mutation. Am. J. Hum. Genet., 65, 336-344.
64. Xing, Y., Resch, A. and Lee, C. (2004) The multiassembly problem: reconstructing multiple transcript isoforms from EST fragment mixtures. Genome Res., 14, 426-441.
65. Fededa, J.P., Petrillo, E., Gelfand, M.S., Neverov, A.D., Kadener, S., Nogues, G., Pelisch, F., Baralle, F.E., Muro, A.F. and Kornblihtt, A.R. (2005) A polar mechanism coordinates different regions of alternative splicing within a single gene. Mol. Cell, 19, 393—404.
66. Emerick, M.C., Parmigiani, G. and Agnew, W.S. (2007) Multivariate analysis and visualization of splicing correlations in single-gene transcriptomes. BMC Bioinformatics, 8, 16.
67. Peng, T., Xue, C., Bi, J., Li, T., Wang, X., Zhang, X. and Li, Y. (2008) Functional importance of different patterns of correlation between adjacent cassette exons in human and mouse. BMC Genomics, 9, 191.
68. Eddy, J., Vallur, A.C., Varma, S., Liu, H., Reinhold, W.C., Pommier, Y. and Maizels, N. (2011) G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res., 39, 4975-4983. 69. Mayeda, A., Hayase, Y., Inoue, H., Ohtsuka, E. and Ohshima, Y. (1990) Surveying cis-acting sequences of premRNA by adding antisense 2_-O-methyl oligoribonucleotides to a splicing reaction. J. Biochem., 108, 399-405. 70. Dominski, Z. and Kole, R. (1993) Restoration of correct splicing in thalassemic pre-mRNA by antisense oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 90, 8673- 8677.
71. Baughan, T.D., Dickson, A., Osman, E.Y. and Lorson, C.L. (2009) Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet., 18, 1600-1611.
72. Cavaloc, Y., Bourgeois, C.F., Kister, L. and Stevenin, J. (1999) The splicing factors 9G8 and SRp20 transactivate splicing through different and specific enhancers. RNA, 5,468-483.
73. Hargous, Y., Hautbergue, G.M., Tintaru, A.M., Skrisovska, L., Golovanov, A.P., Stevenin, J., Lian, L.Y., Wilson, S.A. and Allain, F.H. (2006) Molecular basis of RNA recognition and TAP binding by the SR proteins SRp20 and 9G8. EMBO J., 25, 5126-5137.
74. Hunt, K.A., Mistry, V., Bockett, N.A., Ahmad, T., Ban, M., Barker, J.N., Barrett, J.C., Blackburn, H., Brand, O., Burren, O. et al. (2013) Negligible impact of rare autoimmune-locus coding-region variants on missing heritability.
Nature, 498, 232-235.
75. Aly, T.A., Ide, A., Jahromi, M.M., Barker, J.M., Fernando, M.S., Babu, S.R., Yu, L., Miao, D., Erlich, H.A., Fain, P.R. et al. (2006) Extreme genetic risk for type 1A diabetes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 103, 14074-14079.
76. Yoshida, K., Sanada, M., Shiraishi, Y., Nowak, D., Nagata, Y., Yamamoto, R., Sato, Y., Sato-Otsubo, A., Kon, A., Nagasaki, M. et al. (2011) Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature, 478, 64-69.
77. Pacheco, T.R., Moita, L.F., Gomes, A.Q., Hacohen, N. and Carmo-Fonseca, M. (2006) RNA interference knockdown of hU2AF35 impairs cell cycle progression and modulates alternative splicing of Cdc25 transcripts. Mol. Biol. Cell, 17, 4187- 4199.
78. Kikin, O., D_Antonio, L. and Bagga, P.S. (2006) QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Res., 34, W676-W682.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un polímero de ácido polinucleico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección, donde:
(i) dicho polímero de ácido polinucleico se híbrida con una secuencia diana en un intrón completo retenido de un transcrito de ARNm parcialmente procesado, donde la secuencia diana del transcrito de ARNm parcialmente procesado no comprende un sitio de corte y empalme, y donde el transcrito de ARNm parcialmente procesado que comprende la secuencia diana codifica una forma funcional de longitud completa de una proteína según se codifica por el transcrito de ARNm completamente procesado; y
(ii) dicho polímero de ácido polinucleico induce el corte y empalme del intrón completo retenido del transcrito de ARNm parcialmente procesado para producir el transcrito de ARNm completamente procesado que codifica la forma funcional de longitud completa de la proteína; por ende
(iii) la retención de intrones en el transcrito de ARNm se corrige, aumentando así la expresión de la forma funcional de longitud completa de la proteína codificada por el transcrito de ARNm.
2. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 1, donde la secuencia diana: es un motivo de unión que forma una estructura de horquilla;
se encuentra entre dos cuádruplex G de un transcrito de ARNm parcialmente procesado; o no forma un cuádruplex G.
3. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 1, donde la secuencia diana es un elemento regulador del corte y empalme intrónico del transcrito de ARNm parcialmente procesado.
4. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 3, donde el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende un primer motivo CCC o un segundo motivo CCC, y donde el primer motivo CCC está a aproximadamente 3 o más bases de nucleótidos del segundo motivo CCC.
5. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 4, donde el elemento regulador del corte y empalme intrónico comprende un motivo CCCAG o un motivo AGGCC.
6. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 1, donde el polímero de ácido polinucleico comprende una secuencia que es complementaria con al menos 5 nucleótidos consecutivos o al menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia diana.
7. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 1, donde el polímero de ácido polinucleico se modifica en el resto nucleosídico, en el resto fosfato, en el extremo 5', en el extremo 3' o una combinación de los mismos.
8. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 7, donde el polímero de ácido polinucleico comprende una o más bases de nucleótidos artificiales.
9. El polímero de ácido polinucleico para su uso según la reivindicación 8, donde la una o más bases de nucleótidos artificiales comprenden una modificación por 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2-desoxi, T-desoxi-2-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de etileno (ENA), ácido nucleico peptídico (PNA), ácidos nucleicos de 1', 5'-anhidrohexitol (HNA), morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas.
10. Un polímero de ácido polinucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la enfermedad es una enfermedad hereditaria.
11. Un polímero de ácido polinucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la enfermedad es diabetes.
12. Un polímero de ácido polinucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la enfermedad es cáncer.
13. Una composición farmacéutica que comprende un polímero de ácido polinucleico como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo para su uso como medicamento.
ES15729929T 2014-06-16 2015-06-16 Reducción de la retención de intrones Active ES2907033T3 (es)

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US (5) US9745577B2 (es)
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IL (2) IL249392B (es)
SG (2) SG10202112949PA (es)
WO (1) WO2015193651A1 (es)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
WO2016040748A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject
JP6867945B2 (ja) 2014-10-03 2021-05-12 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 核内遺伝子出力の標的とされた増強
WO2017060731A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
EP3848035A1 (en) 2015-12-10 2021-07-14 PTC Therapeutics, Inc. 1,4-disubstituted pyridazine compounds for treating huntington's disease
EP3933041B1 (en) 2015-12-14 2024-01-31 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant retardation
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
CA3005128A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 Cold Spring Harbor Laboratory Compositions and methods for treatment of eye diseases
EP3390635A4 (en) * 2015-12-14 2019-05-01 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for the treatment of a tuberous sclerosis complex
EP3485016A4 (en) * 2016-07-15 2020-03-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING TRANSCRIPTION PROCESSING
US20190330626A1 (en) * 2016-07-15 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for use in dystrophin transcript
SG11201911615WA (en) 2017-06-05 2020-01-30 Ptc Therapeutics Inc Compounds for treating huntington's disease
CA3067591A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
CA3067592A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
KR102636383B1 (ko) 2017-08-04 2024-02-14 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
PL3673080T3 (pl) 2017-08-25 2024-03-11 Stoke Therapeutics, Inc. Oligomery antysensowne do leczenia stanów i chorób
WO2019111791A1 (ja) * 2017-12-07 2019-06-13 第一三共株式会社 ジストロフィン遺伝子のイントロンリテンションを解消するアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2019191092A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
JP7421507B2 (ja) 2018-06-27 2024-01-24 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチントン病を処置するためのヘテロ環式およびヘテロアリール化合物
BR112021003224A2 (pt) 2018-08-20 2021-07-20 Rogcon, Inc. oligonucleotídeos antissentido direcionados a scn2a para o tratamento de encefalopatias por scn1a
JP2022521467A (ja) 2019-02-05 2022-04-08 スカイホーク・セラピューティクス・インコーポレーテッド スプライシングを調節するための方法および組成物
KR20210135507A (ko) 2019-02-06 2021-11-15 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
US11129829B2 (en) 2019-06-17 2021-09-28 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods for modulating splicing
CN110718265B (zh) * 2019-09-05 2021-02-26 复旦大学 靶向生物毒素的g-四联体式核酸适配体三级结构预测方法
WO2021112106A1 (ja) * 2019-12-02 2021-06-10 第一三共株式会社 色素性乾皮症ｆ群治療薬
CA3173034A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating smn2
KR20230022409A (ko) 2020-05-11 2023-02-15 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환의 치료를 위한 opa1 안티센스 올리고머
WO2023288111A2 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 Aptah Bio, Inc. Polynucleotide compositions and methods for gene expression regulation

Family Cites Families (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4476116A (en) 1982-12-10 1984-10-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
US6294520B1 (en) 1989-03-27 2001-09-25 Albert T. Naito Material for passage through the blood-brain barrier
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
WO1994002501A1 (en) 1992-07-23 1994-02-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
US5914396A (en) 1990-01-11 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
CA2089376C (en) 1990-08-13 2010-05-04 Phillip Dan Cook Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
DE69435005T2 (de) 1993-05-11 2008-04-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense Oligonukleotide die anomales Splicing verhindern und deren Verwendung
JPH09507751A (ja) 1993-12-24 1997-08-12 メディカル リサーチ カウンシル 多発性嚢胞腎１型遺伝子及びその使用
US5656612A (en) 1994-05-31 1997-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
FR2727867B1 (fr) 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
BR9707529A (pt) 1996-02-14 2000-01-04 Isis Pharmaceuticals Inc Oligunucleotìdeo especificamente hibridizável com dna ou rna.
GB9605808D0 (en) 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
AU8435698A (en) 1997-06-03 1998-12-21 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Regulatory sequences capable of conferring expression of a heterologous dna sequence in endothelial cells in vivo and uses thereof
US6963589B1 (en) 1997-07-03 2005-11-08 Canon Kabushiki Kaisha Information processing apparatus for and method of transmitting and/or receiving broadcast signal
US6391452B1 (en) 1997-07-18 2002-05-21 Bayer Corporation Compositions for nasal drug delivery, methods of making same, and methods of removing residual solvent from pharmaceutical preparations
GB9716231D0 (en) 1997-07-31 1997-10-08 Amersham Int Ltd Base analogues
EP2341058A3 (en) 1997-09-12 2011-11-23 Exiqon A/S Oligonucleotide Analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US7071324B2 (en) 1998-10-13 2006-07-04 Brown University Research Foundation Systems and methods for sequencing by hybridization
US20030224514A1 (en) 2002-05-31 2003-12-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of PPAR-delta expression
US6436657B1 (en) 1998-12-18 2002-08-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotides encoding aminomethyltransferases
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
CN1350542A (zh) 1999-03-18 2002-05-22 埃克西库恩公司 木－lna类似物
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
ATE332909T1 (de) 1999-03-24 2006-08-15 Exiqon As Verbesserte synthese für 2.2.1.öbicyclo- nukleoside
US6383752B1 (en) 1999-03-31 2002-05-07 Hybridon, Inc. Pseudo-cyclic oligonucleobases
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6083482A (en) 1999-05-11 2000-07-04 Icn Pharmaceuticals, Inc. Conformationally locked nucleosides and oligonucleotides
US6531591B1 (en) 1999-07-07 2003-03-11 Exiqon A/S Synthesis of stable quinone and photoreactive ketone phosphoramidite reagents for solid phase synthesis of photoreactive-oligomer conjugates
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6677445B1 (en) 1999-08-27 2004-01-13 Chiron Corporation Chimeric antisense oligonucleotides and cell transfecting formulations thereof
US6187586B1 (en) 1999-12-29 2001-02-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of AKT-3 expression
US6784291B2 (en) 2000-05-04 2004-08-31 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
US6809194B1 (en) 2000-05-10 2004-10-26 Chiron Corporation Akt3 inhibitors
WO2002006529A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Detection and treatment of polycystic kidney disease
AU2001282522A1 (en) 2000-08-29 2002-03-13 Takeshi Imanishi Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
EP1313768B1 (de) 2000-09-02 2008-02-06 Grünenthal GmbH Antisense oligonukleotide gegen vr 1
WO2002028875A2 (en) 2000-10-04 2002-04-11 Cureon A/S Improved synthesis of purine locked nucleic acid analogues
JP2002345489A (ja) 2000-11-03 2002-12-03 Astrazeneca Ab 化学物質
DE60202681T2 (de) 2001-07-12 2006-01-12 Santaris Pharma A/S Verfahren zur herstellung des lna phosphoramidite
WO2003016492A2 (en) 2001-08-16 2003-02-27 The Regents Of The University Of Michigan Adamts13 genes and proteins and variants, and uses thereof
JP2005514005A (ja) 2001-09-04 2005-05-19 エクシコン エ／エス 新規のｌｎａ組成物およびその使用
US6936589B2 (en) 2001-09-28 2005-08-30 Albert T. Naito Parenteral delivery systems
AU2002347981A1 (en) 2001-11-07 2003-05-19 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
US7615619B2 (en) 2002-02-13 2009-11-10 Takeshi Imanishi Nucleoside analogues and oligonucleotide derivative comprising nucleotide analogue thereof
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
ES2290448T3 (es) 2002-05-08 2008-02-16 Santaris Pharma A/S Sistesis de derivados de acidos nucleicos bloqueados.
US7291461B2 (en) 2002-06-21 2007-11-06 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mRNA decay
US20040023220A1 (en) 2002-07-23 2004-02-05 Lawrence Greenfield Integrated method for PCR cleanup and oligonucleotide removal
CA2493297A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 Universite De Sherbrooke Methods to reprogram splice site selection in pre-messenger rnas
AU2003259803B2 (en) 2002-08-12 2007-08-02 The Regents Of The University Of Michigan Diagnosis and treatment of tuberous sclerosis
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
US7790867B2 (en) * 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
DK2216407T3 (en) 2003-03-07 2016-03-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc therapeutic compositions
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
EP2141234B1 (en) 2003-03-21 2016-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Short Interfering RNA (siRNA) Analogues
EP1620450A4 (en) 2003-04-13 2011-01-19 Enzon Pharmaceuticals Inc POLYMER OLIGONUCLEOTIDE PRODRUGS
US20050053981A1 (en) 2003-09-09 2005-03-10 Swayze Eric E. Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini
US20070009899A1 (en) * 2003-10-02 2007-01-11 Mounts William M Nucleic acid arrays for detecting gene expression in animal models of inflammatory diseases
GB0326578D0 (en) 2003-11-14 2003-12-17 Univ Belfast Cancer diagnosis and therapy
US20050221354A1 (en) 2004-02-18 2005-10-06 Wyeth Nucleic acid arrays for monitoring expression profiles of drug target genes
IL179285A (en) 2004-05-14 2011-04-28 Rosetta Genomics Ltd Micrornas and uses thereof
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US20070087376A1 (en) 2004-08-30 2007-04-19 Potashkin Judith A Splice variants of pre-mRNA transcripts as biomarkers in idiopathic neurodegenerative diseases
WO2006055786A2 (en) 2004-11-19 2006-05-26 Acadia Pharmaceuticals Inc. Methods to identify ligands of hormone nuclear receptors
WO2006081311A2 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute Compositions and methods for the intracellular disruption of vegf and vegfr-2 by intraceptors
US20100150839A1 (en) 2005-02-04 2010-06-17 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and Methods for Modulating Cognitive Function
JP5202296B2 (ja) 2005-04-01 2013-06-05 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド 肝臓傷害のバイオマーカー
US7557198B2 (en) * 2005-05-04 2009-07-07 Exagen Diagnostics, Inc. Acute myelogenous leukemia biomarkers
ATE544866T1 (de) 2005-06-17 2012-02-15 Baxter Int Adamts13-haltige zusammensetzungen mit thrombolytischer wirkung
WO2007002390A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
EP4332227A1 (en) 2005-08-23 2024-03-06 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
WO2007047913A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Isis Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modulation of lmna expression
US20080280848A1 (en) 2005-10-28 2008-11-13 Volker Patzel Structures of Active Guide Rna Molecules and Method of Selection
WO2007048629A2 (en) 2005-10-28 2007-05-03 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modulation of rna silencing efficiency by argonaute proteins
EP1954254A4 (en) 2005-11-01 2010-12-22 Harvard College MODULATION OF ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS IN THE TREATMENT OF TUBEROUS SCLEROSIS
US7785834B2 (en) * 2005-11-10 2010-08-31 Ercole Biotech, Inc. Soluble TNF receptors and their use in treatment of disease
EP1792981A1 (en) 2005-12-02 2007-06-06 Humboldt-Universität zu Berlin Microginin producing proteins and nucleic acids encoding a microginin gene cluster as well as methods for creating microginins
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
JP5213723B2 (ja) 2006-01-27 2013-06-19 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド マイクロｒｎａの調節に使用するためのオリゴマー化合物及び組成物
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
US8007790B2 (en) 2006-04-03 2011-08-30 Stowers Institute For Medical Research Methods for treating polycystic kidney disease (PKD) or other cyst forming diseases
CN103554205A (zh) 2006-05-05 2014-02-05 Isis制药公司 调节gccr的表达的化合物和方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
JP5466402B2 (ja) 2006-06-08 2014-04-09 株式会社アミノアップ化学 ｉＮＯＳの発現制御作用を有するセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含む組成物
US20090186946A1 (en) 2006-06-27 2009-07-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Genetically Modified Animal and Use Thereof
CA2993381C (en) 2006-07-24 2020-07-14 Athena Diagnostics, Inc. Method of detecting the occurrence of adpkd based on presence of nucleotide sequence alteration in pkd1
DK2410054T4 (da) 2006-10-18 2020-02-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisenseforbindelser
US20090264353A1 (en) 2007-10-19 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Splice Switching Oligomers for TNF Superfamily Receptors and their Use in Treatment of Disease
WO2007054100A2 (en) 2006-11-13 2007-05-18 Santaris Pharma A/S Lna nucleoside phosphoramidates
US8293684B2 (en) 2006-11-29 2012-10-23 Exiqon Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids
US8048998B2 (en) 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
CL2008000696A1 (es) 2007-03-09 2008-09-12 Pioneer Hi Bred Int Polinucleotido aislado que codifica un modificador de un transportador de amonio (amt); casete de expresion y celula huesped que comprende la celula huesped; metodo para modular el amt en plantas.
EP2130835B1 (en) 2007-03-09 2012-05-23 Riken Compound having structure derived from mononucleoside or mononucleotide, nucleic acid, labeling substance, and method and kit for detection of nucleic acid
WO2008111908A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Jyoti Chattopadhyaya Five- and six-membered conformationally locked 2',4'- carbocyclic ribo-thymidines for the treatment of infections and cancer
EP2149605B1 (en) 2007-03-22 2013-07-03 Santaris Pharma A/S Short RNA antagonist compounds for the modulation of target mRNA
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
WO2009023855A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
CA2704049A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
WO2009064920A2 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
US8846386B2 (en) 2007-12-18 2014-09-30 University Of Kentucky Research Foundation sVEGFR-2 and its role in lymphangiogenesis modulation
WO2009084472A1 (ja) 2007-12-28 2009-07-09 Public University Corporation Yokohama City University 新生児期～乳児期発症の難治性てんかんの検出方法
US20110065774A1 (en) 2008-01-31 2011-03-17 Alnylam Pharmaceuticals Chemically modified oligonucleotides and uses thereof
US8530640B2 (en) 2008-02-07 2013-09-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US8071291B2 (en) 2008-03-13 2011-12-06 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof
EP2274423A2 (en) 2008-04-04 2011-01-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
EP2285819B1 (en) 2008-04-04 2013-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
EP2119783A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
WO2009149921A2 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Bionucleon S.R.L. Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
EP2151248A1 (en) 2008-07-30 2010-02-10 Johann Bauer Improved pre-mRNA trans-splicing molecule (RTM) molecules and their uses
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
CA2735129C (en) 2008-11-07 2012-06-26 Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine Syngap1 dysfunctions and uses thereof in diagnostic and therapeutic applications for mental retardation
US8927511B2 (en) 2008-12-04 2015-01-06 Curna, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (VEGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to VEGF
WO2010080509A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Philadelphia Health And Education Corporation Compositions and methods for diminishing viral infection and inflammation associated with viral infection
US20100166784A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-01 The Washington University Method and compositions for modulating th17 cell development
CA2750379A1 (en) 2009-01-14 2010-07-22 Gordon J. Lutz Modulation of pre-mrna using splice modulating oligonucleotides as therapeutic agents in the treatment of disease
US9012139B2 (en) 2009-05-08 2015-04-21 Curna, Inc. Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DMD family
CN106983768B (zh) 2009-06-17 2023-04-07 冷泉港实验室 用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法
EP2275545A1 (en) 2009-07-16 2011-01-19 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Use of microRNA-24 and/or its targets for the treatment and prevention of ischemia and induction of angiogenesis
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US20120252877A1 (en) 2009-08-14 2012-10-04 Theramind Research, Llc Methods and compositions for treatment of tuberous sclerosis complex
JP2013503646A (ja) 2009-09-08 2013-02-04 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 自閉症スペクトラム障害を診断するための組成物および方法
WO2011032034A2 (en) 2009-09-10 2011-03-17 University Of Idaho Nucleobase-functionalized conformationally restricted nucleotides and oligonucleotides for targeting nucleic acids
WO2011052436A1 (ja) 2009-10-29 2011-05-05 国立大学法人大阪大学 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド
PL2499249T3 (pl) * 2009-11-12 2019-03-29 Univ Western Australia Cząsteczki antysensowne i sposoby leczenia patologii
JP2013511984A (ja) 2009-11-25 2013-04-11 エリテック・ホールディング・ベスローテン・フェンノートシャップ 副溝結合剤（ＭＧＢ）−オリゴヌクレオチドｍｉＲＮＡアンタゴニスト
WO2011085102A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CA2789005A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Selective reduction of allelic variants
US9193752B2 (en) 2010-03-17 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011119842A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 The J. David Gladstone Institutes Compositions and methods for treating neurological disorders
WO2011127210A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 Massachusetts Institute Of Technology Targeted delivery of nucleic acids
US20110269735A1 (en) 2010-04-19 2011-11-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
ES2638309T3 (es) 2010-04-19 2017-10-19 Nlife Therapeutics S.L. Composiciones y métodos para la distribución selectiva de moléculas de oligonucleótidos a tipos específicos de neuronas
WO2011139695A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified 5' diphosphate nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8802642B2 (en) 2010-04-28 2014-08-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. Spinal muscular atrophy treatment via targeting SMN2 catalytic core
US20130184223A1 (en) 2010-05-20 2013-07-18 University Of Rochester Methods and compositions related to modulating autophagy
US8957200B2 (en) 2010-06-07 2015-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2582397A4 (en) 2010-06-15 2014-10-29 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING THE INTERACTION BETWEEN PROTEINS AND TARGET NUCLEIC ACIDS
RU2016118528A (ru) 2010-06-23 2018-10-31 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
US20130309246A1 (en) 2011-02-02 2013-11-21 The Trustees Of Princeton University Jagged1 as a marker and therapeutic target for breast cancer bone metastasis
WO2012138487A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Oligonucleotide modulation of splicing
US9644035B2 (en) 2011-04-08 2017-05-09 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
WO2012149438A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US20140357558A1 (en) 2011-06-24 2014-12-04 Cold Spring Harbor Laboratory Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US8592156B2 (en) 2011-08-08 2013-11-26 Roche Molecular Systems, Inc. Predicting response to anti-CD20 therapy in DLBCL patients
EP3640332A1 (en) 2011-08-29 2020-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EA029151B1 (ru) 2011-09-06 2018-02-28 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ
US9453261B2 (en) 2011-09-20 2016-09-27 The George Washington University Alternative splicing variants of genes associated with prostate cancer risk and survival
CN103946380A (zh) 2011-11-11 2014-07-23 桑塔瑞斯制药公司 用于调控smn2剪接的化合物
WO2013074814A2 (en) 2011-11-15 2013-05-23 University Of Utah Research Fourdation Morpholinos, morpholino upregulating, and associated methods
EP2785860B1 (en) 2011-11-29 2015-06-03 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
WO2013106770A1 (en) 2012-01-11 2013-07-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of ikbkap splicing
EP3330278A1 (en) 2012-02-08 2018-06-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of rna by repeat targeting
EA029542B1 (ru) 2012-02-10 2018-04-30 ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. ПРОИЗВОДНЫЕ 4Н-ПИРИДО[1,2-а]ПИРИМИДИН-4-ОНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ
US8846885B2 (en) 2012-02-17 2014-09-30 Ajinomoto Co., Inc. Oligonucleotide with protected base
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
EP2839006B1 (en) 2012-04-20 2018-01-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US20140378526A1 (en) 2012-05-11 2014-12-25 City Of Hope Design of nucleic acid binding molecules with non-watson crick and non-canonical pairing based on artificial mutation consensus sequences to counter escape mutations
WO2013177188A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3',5'-cyclic phosphoramidate prodrugs for hcv infection
EP2852605B1 (en) 2012-05-22 2018-01-31 Idenix Pharmaceuticals LLC 3',5'-cyclic phosphate prodrugs for hcv infection
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
KR20220139425A (ko) 2012-07-13 2022-10-14 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
MY174339A (en) 2012-08-13 2020-04-09 Novartis Ag 1,4-disubstituted pyridazine analogs and methods for treating smn-deficiency-related conditions
EP2885313A4 (en) 2012-08-20 2016-03-09 Univ California POLYNUCLEOTIDES WITH BIOREVERSIBLE GROUPS
EP2898072A1 (en) 2012-09-24 2015-07-29 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Restoration of the cftr function by splicing modulation
WO2014049536A2 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Universidade De Lisboa Drug targets for cystic fibrosis and other conditions
EP2900682A1 (en) 2012-09-27 2015-08-05 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. Esters and malonates of sate prodrugs
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
US9029335B2 (en) 2012-10-16 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20150291957A1 (en) 2012-10-26 2015-10-15 Larry J. Smith METHODS AND COMPOSITIONS TO PRODUCE ss-RNAi ACTIVITY WITH ENHANCED POTENCY
WO2014078749A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Splice modulating oligonucleotides that inhibit cancer
EP2935304A1 (en) 2012-12-19 2015-10-28 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. 4'-fluoro nucleosides for the treatment of hcv
CN103667438B (zh) 2013-01-07 2015-04-01 赵晨 一种筛查HRDs致病突变的方法及涉及的基因芯片杂交探针设计方法
US20150361497A1 (en) 2013-01-18 2015-12-17 Anna Mary ROSE Therapeutics and diagnostics based on minisatellite repeat element 1 (msr1)
EP3778618A1 (en) 2013-02-04 2021-02-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
WO2014126229A1 (ja) 2013-02-18 2014-08-21 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
US9339541B2 (en) 2013-03-04 2016-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Thiophosphate nucleosides for the treatment of HCV
WO2014137926A1 (en) 2013-03-04 2014-09-12 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3'-deoxy nucleosides for the treatment of hcv
US9187515B2 (en) 2013-04-01 2015-11-17 Idenix Pharmaceuticals Llc 2′,4′-fluoro nucleosides for the treatment of HCV
US10590412B2 (en) 2013-04-19 2020-03-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation nucleic acids through nonsense mediated decay
EP2992009B1 (en) 2013-05-01 2020-06-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
WO2014198890A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of erythropoietic protoporphyria
WO2014201413A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating non-coding rna
US20160145270A1 (en) 2013-06-25 2016-05-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Compounds for treating spinal muscular atrophy
WO2015023939A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin
WO2015023941A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Oligonucleotides targeting euchromatin regions of genes
EP3033423A4 (en) 2013-08-16 2017-04-26 Rana Therapeutics Inc. Epigenetic regulators of frataxin
JP2016528897A (ja) 2013-08-16 2016-09-23 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｎａを調節するための組成物および方法
JP6689197B2 (ja) 2013-08-19 2020-04-28 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト スクリーニング方法
EP3690048A1 (en) 2013-09-04 2020-08-05 Cold Spring Harbor Laboratory Reducing nonsense-mediated mrna decay
CN111235149B (zh) 2013-09-05 2024-04-16 萨罗塔治疗公司(美国) 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
US10059947B2 (en) 2013-09-11 2018-08-28 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
HRP20220379T1 (hr) 2014-06-10 2022-05-27 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonukleotidi korisni u liječenju pompeove bolesti
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
GB201411468D0 (en) 2014-06-27 2014-08-13 Univ Edinburgh Novel treatment for endometriosis
GB2547586A (en) 2014-08-20 2017-08-23 Lifesplice Pharma Llc Splice modulating oligonucleotides and methods of use thereof(In the PCT request)
JP6867945B2 (ja) 2014-10-03 2021-05-12 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 核内遺伝子出力の標的とされた増強
EP3207048A4 (en) 2014-10-17 2018-05-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of treating muscular dystrophy
US10822369B2 (en) 2014-11-14 2020-11-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of proteins
GB201421379D0 (en) 2014-12-02 2015-01-14 Isis Innovation Ltd And Medical Res Council Molecule
JP2018509387A (ja) 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
WO2016128343A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Compounds for the treatment of cancer
US9840709B2 (en) 2015-02-20 2017-12-12 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Antisense compounds targeting genes associated with cystic fibrosis
WO2016138534A2 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
CN107429250B (zh) 2015-04-03 2022-03-01 Ionis制药公司 用于调节tmprss6表达的化合物和方法
WO2016196386A1 (en) 2015-05-30 2016-12-08 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for modulating rna splicing
US20180265911A1 (en) 2015-09-24 2018-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Triptycene derivatives for nucleic acid junction stabilization
GB2591194B (en) 2015-10-09 2021-10-13 Univ Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
WO2017060731A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
EP3183347A4 (en) 2015-10-17 2018-04-18 Lifesplice Pharma LLC Splice modulating oligonucleotides and methods of use thereof
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
ES2903394T3 (es) 2015-12-14 2022-04-01 Cold Spring Harbor Laboratory Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13
EP3390635A4 (en) 2015-12-14 2019-05-01 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for the treatment of a tuberous sclerosis complex
EP3933041B1 (en) 2015-12-14 2024-01-31 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant retardation
JP7049247B2 (ja) 2015-12-14 2022-04-06 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 腎臓病の処置のための組成物と方法
JP2019500345A (ja) 2015-12-14 2019-01-10 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 肝臓病の処置のための組成物および方法
EP3389671A4 (en) 2015-12-14 2019-07-17 Cold Spring Harbor Laboratory ANTISENSE OLIGOMERS FOR THE TREATMENT OF ALAGILLE'S SYNDROME
EP4104867A3 (en) 2015-12-14 2023-03-01 Cold Spring Harbor Laboratory Compositions and methods for treatment of central nervous system diseases
CA3005128A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cold Spring Harbor Laboratory Compositions and methods for treatment of eye diseases
WO2017106211A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of polycystic kidney disease
CA3058189A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Encoded Therapeutics, Inc. Tissue selective transgene expression
PL3673080T3 (pl) 2017-08-25 2024-03-11 Stoke Therapeutics, Inc. Oligomery antysensowne do leczenia stanów i chorób
KR20200070367A (ko) 2017-10-23 2020-06-17 스톡 테라퓨틱스, 인크. 넌센스 매개 rna 분해 기반 병태 및 질환 치료를 위한 안티센스 올리고머

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