CN107073137A - 减少内含子保留 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于诱导部分加工的mRNA转录物的加工以去除保留内含子，从而产生编码蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物的方法、组合物、多核酸聚合物、分析和试剂盒。本文还描述了用于在受试者中治疗特征为蛋白质全长功能形式的产生受损的疾病或病症或者治疗特征为缺陷性剪接的疾病或病症的方法和组合物。

Description

减少内含子保留
交叉引用
本申请要求2014年6月16日提交的英国专利申请NO:1410693.4的权益，该专利申请通过引用全文并入本文。
背景技术
选择性剪接可能是人类转录物组中的常见现象。内含子保留是选择性剪接的一个实例，其中部分加工的mRNA在经历部分剪接后保持保留至少一个内含子。在一些情况下，部分加工的mRNA中保留的内含子的存在可以阻止或减少功能性蛋白质的翻译。
发明内容
本发明涉及减少或防止转录物(例如，部分加工的mRNA转录物)中的内含子保留以及治疗或预防与非故意的内含子保留有关的疾病的方法。
在一些方面，本发明公开了一种预防或治疗受试者的疾病的方法，其包括降低基因转录物中内含子保留的发生率，其中所述疾病是由所述基因转录物中的所述内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导。
在一些方面，本发明公开了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的区域或者由其组成。
在一些方面，本发明公开了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的区域或者由其组成。
在一些方面，本发明公开了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的区域或者由其组成。
在一些方面，本发明公开了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成。
在一些方面，本发明公开了一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的多核酸聚合物的区域，或者包含与SEQ ID NO:46具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
在一些方面，本发明公开了一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的多核酸聚合物的区域，或者包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
在一些方面，本发明公开了一种多核酸聚合物，其对于多核酸聚合物的区域(其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一互补的序列或由其组成)；或者任选地，包含与SEQ ID NO:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
在一些方面，本发明公开了一种多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ IDNO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
在一些方面，本发明公开了一种多核酸聚合物，其包含与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其组成；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
在一些方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交的多核酸聚合物，其中所述靶序列在两个G四链体之间，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。在一些情况下，所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的所述保留内含子杂交。
在一些方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
在一些情况下，所述内含子剪接调节元件还包含第二CCC基序。在一些情况下，所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。在一些情况下，所述多核酸聚合物与包含CCCAG或AGGCC基序的内含子剪接调节元件杂交。
在一些方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
在一些情况下，所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。在一些情况下，所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含两个连续的吡啶核苷酸。
在一些方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，并且其中所述结合基序形成发夹结构，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
在一些情况下，所述多核酸聚合物还能够使所述发夹结构失稳定。在一些情况下，所述递送载体包含细胞穿透肽或基于肽的纳米颗粒。在一些情况下，所述递送载体通过离子键合与所述多核酸聚合物复合。
在一些情况下，所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。在一些情况下，所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互补。在一些情况下，所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或1个或更少的错配。
在一些情况下，所述多核酸聚合物在核苷部分或在磷酸酯部分被修饰。在一些情况下，所述多核酸聚合物包含一个或多个人工核苷酸碱基。在一些情况下，所述一个或多个人工核苷酸碱基包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些情况下，所述多核酸聚合物在所述多核酸聚合物的核苷部分的核糖部分的2’羟基处被修饰。在一些情况下，在2’羟基处的修饰是通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)部分。在一些情况下，将甲基添加到核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲基核糖部分。在一些情况下，将甲氧基乙基添加到核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲氧基乙基核糖部分。在一些情况下，在所述2’羟基处的修饰通过亚甲基与4’碳连接。在一些情况下，核糖环被六元吗啉环替代以产生吗啉人工核苷酸类似物。在一些情况下，磷酸酯骨架被寡聚甘氨酸样部分替代以产生肽核酸(PNA)。在一些情况下，磷酸酯骨架被巯基或甲基修饰。在一些情况下，5’端、3’端或其组合被修饰。在一些情况下，所述修饰保护所述多核酸聚合物免受受试者中的内源性核酸酶影响。在一些情况下，被修饰的多核酸聚合物不诱导RNA酶H切割RNA或者诱导RNA酶H切割RNA的能力降低。在一些情况下，所述多核酸聚合物被修饰以提高其稳定性。在一些情况下，所述杂交是特异性杂交。
在一些情况下，所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ IDNO:46的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％或者具有100％序列同一性。在一些情况下，所述多核酸聚合物与包含SEQ ID NO:46的至少10个连续碱基的mRNA转录物杂交。在一些情况下，所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:39，SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:45或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。在一些情况下，所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ ID NO:3具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％序列同一性。在一些情况下，所述多核酸聚合物与选自SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，和SEQ ID NO:44或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％或者100％序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。在一些情况下，所述多核酸聚合物与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其组合的序列具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％或具有100％序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。在一些情况下，所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ ID NO:47-434或其组合的序列的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％序列同一性。
在一些情况下，所述多核酸聚合物是合成的多核酸聚合物。
在一些情况下，包含所述多核酸聚合物的所述药物组合物用于静脉内或皮下施用。
在一些方面，本发明公开了一种用于治疗有需要的患者的疾病或病症的组合物，其包括向所述患者施用本文公开的药物组合物。在一些情况下，所述疾病或病症与蛋白质产生受损相关或者特征为缺陷性剪接。在一些情况下，所述疾病或病症是遗传性疾病。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，所述疾病或病症是糖尿病。在一些情况下，所述疾病或病症是癌症。在一些情况下，所述用途的组合物还包括选择用于治疗与蛋白质产生受损相关的疾病或病症的受试者，其包括(a)确定所述受试者是否患有与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症；和(b)如果所述受试者患有与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求42-82的药物组合物。在一些情况下，所述用途的组合物还包括选择用于治疗特征为缺陷性剪接的疾病或病症的受试者，其包括(a)确定所述受试者是否患有特征为缺陷性剪接的疾病或病症；和(b)如果所述受试者患有特征为缺陷性剪接的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求42-82的药物组合物。
在一些方面，本发明公开了一种治疗有需要的受试者中特征为蛋白质全长功能形式的产生受损的疾病或病症的方法，其包括：(a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：诱导提高部分加工的mRNA转录物中内含子剪除的治疗剂；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；其中所述受试者具有部分加工的mRNA转录物的池，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，并且所述部分加工的mRNA转录物各自包含抑制所述部分加工的mRNA转录物的翻译的至少一个保留内含子；和(b)使所述受试者的靶细胞与所述治疗剂接触，以诱导所述部分加工的mRNA转录物的池的一部分经历剪接而从所述部分中的每个所述部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子，从而产生完全加工的mRNA转录物，其中所述完全加工的mRNA转录物被翻译以表达所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，这治疗所述疾病或病症。
在一些情况下，所述治疗剂引起所述细胞中一种或多种剪接蛋白复合物的激活，以从所述部分加工的mRNA转录物的池的部分中的每个所述部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子。在一些情况下，所述治疗剂抑制调节内含子剪接活性的蛋白质。在一些情况下，所述治疗剂激活调节内含子剪接活性的蛋白质。在一些情况下，所述治疗剂结合调节内含子剪接活性的蛋白质。在一些情况下，所述治疗剂结合所述部分加工的mRNA转录物的靶多核苷酸序列。在一些情况下，所述治疗剂是多核酸聚合物。在一些情况下，所述治疗剂是小分子。
在一些情况下，所述药物组合物是本文描述的药物组合物。
在一些情况下，所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括所述蛋白质全长功能形式的亚常态生产。在一些情况下，所述蛋白质全长功能形式的产生受损是由于不存在所述蛋白质全长功能形式的表达，或者所述蛋白质全长功能形式的表达水平足够低以引起所述疾病或病症。在一些情况下，所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括不存在所述蛋白质的产生，或者产生所述蛋白质的缺陷形式。在一些情况下，所述蛋白质的缺陷形式是所述蛋白质的截短形式、所述蛋白质的错误折叠形式或具有异常靶结合的所述蛋白质的形式。在一些情况下，治疗所述受试者导致所述蛋白质的全长功能形式的表达增加。
在一些方面，本发明公开了一种诱导部分加工的mRNA转录物的加工以去除保留内含子而产生编码蛋白质全长功能形式的完全加工的mRNA转录物的方法，其包括：(a)将分离的多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物杂交，该部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式且包含至少一个保留内含子；(b)从所述部分加工的mRNA转录物中去除所述至少一个保留内含子以产生编码所述蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物；和(c)从所述完全加工的mRNA转录物翻译所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，所述方法还包括将包含所述分离的多核酸聚合物的药物组合物施用于有需要的受试者。
在一些情况下，所述蛋白质全长功能形式的产生受损与疾病或病症相关。在一些情况下，所述疾病或病症是遗传性疾病。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。在一些情况下，所述疾病或病症是糖尿病。在一些情况下，所述疾病或病症是癌症。
在一些情况下，所述多核酸聚合物是反义序列。在一些情况下，所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的保留内含子杂交。在一些情况下，所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。在一些情况下，所述内含子剪接调节元件包含CCC基序。在一些情况下，所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体。在一些情况下，所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序在两个G四链体之间。在一些情况下，所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序具有第一CCC基序和第二CCC基序。在一些情况下，所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。在一些情况下，所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互补。在一些情况下，所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或者1个或更少的错配。在一些情况下，所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。
在一些情况下，所述受试者是真核生物。在一些情况下，所述受试者是选自人、小鼠、大鼠、非人灵长类动物或非灵长类哺乳动物的真核生物。
在一些方面，描述了一种药物组合物，其包含与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述式以及附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方，附图中：
图1.SSO在人胰岛素原基因中的位置。(A)INS报道体及其mRNA产物的示意图。SSO显示为外显子(编号框)下方和内含子1(线)下方的黑色水平条；它们的序列在表2中。起始和终止密码子由箭头表示。标准(实线)和隐蔽(虚线)剪接显示在初级转录物上方；隐蔽剪接位点的名称为灰色。SSO靶向内含子 1区段del4-del7在下方图中显示。(B)由INS报告基因构建体产生的mRNA异构体(编号1-6)。不产生胰岛素原的异构体的描述用*标记。
图2.SSO诱导的INS内含子1保留的抑制。(A)用指示的SSO将INS报告基因构建体(IC D-F)共转染到HEK293细胞中。图1B中描述的剪接产物在右侧示出。条代表相对于天然转录物的含内含子1的异构体的百分比(上图)或相对于总数的内含子2的隐蔽3’剪接位点的剪接百分比(下图)。误差棒表示SD；sc，乱序对照(scrambled control)；SSO-，“无SSO”对照。SSO的最终浓度为1、3、10和30nM，除了SSO6和SSO8(10和30nM)。(B)缺乏内含子2的隐蔽3ss的克隆中，SSO21介导的内含子1剪接的促进。RNA产物在右侧。(C)在含有和缺乏内含子2的隐蔽3’ss的转录物中，SSO21诱导的内含子1保留的倍数变化。在重复的转染中SSO21的终浓度为30nM。报告基因构建体的名称在底部。
图3.靶向隐蔽3’剪接位点的INS SSO。(A)通过SSO6激活内含子2的隐蔽3’ss(cr3’ss+126；图1A)和通过SSO8促进外显子2跳读。每种SSO的浓度为2、10、50和250nM。SSO显示在顶部，剪接产物显示在右侧，报道体显示在底部。(B)INS内含子2的真实和隐蔽3’ss之间的预测的稳定发夹。由SSO6靶向的碱基用星号表示，并且预测的剪接增强子六聚体(右侧列出)用虚线表示。(C)SSO4不阻止U2AF35耗尽的细胞中其真实对应物(cr3’ss+81)下游的隐蔽3’ss 81个碱基对的激活，但诱导外显子跳读。COS7细胞中每种SSO的最终浓度为5、20和80nM。siRNA双链体U2AF35ab(77)的最终浓度为70nM。报道体与A图中相同。
图4.通过单核苷酸分辨率的反义微行走(microwalk)优化内含子保留靶。(A)寡核糖核苷酸的位置。用于CD/NMR的微行走SSO和寡聚物分别由在初级转录物下方和上方的水平黑条表示。预测形成RNA G-四链体的内含子1序列以灰色突出显示。微行走方向由灰色箭头表示；获胜寡聚物以黑色突出显示。框表示此前报道的单核苷酸多态性(20)。(B)两种细胞系中每种微行走SSO的内含子保留水平。误差条表示从报道体IC D-F的两个独立的共转染获得的SD。
图5.RNA二级结构形成的生物物理表征。(A)在25℃下对于CD1(19聚体)和CD2(20聚体)RNA的远UV CD谱，分别显示在265和270nm处的椭圆率最大值。(B)在800MHz和298K下记录的CD1和CD2的1H NMR谱，显示来自H键合的G碱基的共振的特征组。(C)两种RNA的S形CD熔解曲线，分别显示在56.8±0.2℃和69.0±0.45℃的转换中点。为了清楚起见，两条曲线已经略微相互移动。(D)对于CD1所提出的具有通过短环序列连接的两个堆叠的G-四联体的平行四链体结构(上图)。CD2的预测发夹结构显示在下图。G→C突变为红色。
图6.涉及反义靶的四链体/发夹构象转换。(A)提出在包含寡核糖核苷酸CD3的富G基序内形成的发夹(黑色)和四链体(深蓝色)结构之间的示意性平衡。CD4含有CC→UU突变(以*突出显示)。(B)9-15ppm区域中的NMR谱显示对应于氢键合碱基的亚氨基质子信号。10和12ppm之间的信号是G-四联体内的Hoogsteen氢键合的G的特征(Q盒)，而>12ppm的信号指示发夹结构内的沃森-克里克A-U和G-C碱基对(H盒)。在CD3中，发夹H1被明显填充，但是CD4中的突变使H1失稳定，使得H2成为主要物质，两者都与四链体结构平衡。(C)两种可能发夹的Mfold预测，与NMR数据一致。(D)通过CC→UU突变在发夹结构失稳定时内含子保留的减少。误差条表示使用报道体IC D-C的重复实验的SD。Del5，缺乏区段del5的IC D-C报道体(图1A)；M1，含有使G-四链体和茎-环失稳定的两个置换(表1A)的报道体。
图7.针对内含子保留鉴别与包含反义靶的前mRNA相互作用的蛋白质。(A)瞬时转染到HEK293T细胞中后野生型和突变报告基因构建体(IC D-C)的内含子保留水平。突变显示在表1A中。RNA产物在右侧。预测的RNA四链体、发夹H1/H2以及上游和下游C4运行的存在在凝胶图下方显示。误差棒表示从两个重复实验获得的SD。(B)测试RNA的内含子保留水平与它们在反义靶上的预测的稳定性相关。(C)使用右侧所示的抗体的下拉试验的蛋白质印迹分析。NE，核提取物；B，仅珠的对照；AV3，含胞嘧啶对照RNA寡聚物运行和3’ss AG(7)。CD5RNA的序列显示在图4A中。
图8.DHX36耗尽时富含四链体和缺乏四链体的小基因的剪接模式。(A)报告基因构建体的示意图。预测的四链体由黑色矩形表示；它们的密度示于表1中。对外显子(盒)编号；正斜线表示F9内含子3的缩短(24)。F9和TSC2小基因分别含有影响剪接的分支点置换c.253-25C和c.5069-18C(24)。Cr5’ss-104；内含子2的真实5’ss上游的隐蔽5’ss 104。(B)用针对DHX36的抗体进行的免疫印迹。sc，乱序siRNA；c，未处理细胞。误差棒是两个转染实验的SD。(C-E)指示的报道体的内含子保留和外显子跳读。DHX36siRNA的终浓度为50nM。RNA产物在右侧示意性地显示。误差棒是两个转染实验的SD。
具体实施方式
如真核基因的基因含有必须准确地从初级转录物中去除以产生能够编码蛋白质的功能性mRNA的间插序列或内含子(1)。该过程以高度动态的方式改变mRNA组成，利用五种小核RNA(snRNA)(例如U1、U2、U4、U5和U6)和大量蛋白质与前mRNA中的保守但简并的序列的相互依赖的相互作用。特别地，内含子可以由核心剪接位点元件限定，所述核心剪接位点元件包含可包含保守GU基序的5’剪接位点、可以终止于不变的AG基序的3’剪接位点(3’ss)、可包含保守腺嘌呤碱基的分支点序列和多聚嘧啶(Py)序列。剪接反应可以在U1snRNP与5’ss上的保守GU基序结合时开始，随后在分支点的保守腺嘌呤碱基处U2snRNP结合，和最后是在5’和3’剪接位点附近的U4、U5和U6snRNP相互作用。由snRNP和相应内含子形成的复合体可以称为剪接体。另外的剪接因子如U2小核RNA辅助因子1(U2AF35)、U2AF2(U2AF65)和剪接因子1(SF1)可以有助于剪接体组装和促进剪接事件。
内含子剪接通常促进跨种类的mRNA累积和蛋白质表达(3-5)。这个过程可以通过内含子突变或变体而改变，该内含子突变或变体也可以削弱偶联的基因表达途径，包括转录、mRNA输出和翻译。这通过5’UTR中的内含子示例，其中改变内含子保留的天然变体或突变改变具有上游开放阅读框(uORF)或其他调节基序的转录物的相对丰度并显著影响翻译(6,7)。此外，由于缺陷性剪接(例如内含子保留)引起的受损蛋白质翻译已经导致疾病的发生和/或疾病的进展，例如遗传障碍或病症(如遗传性疾病或癌症)。然而，尚未开发出在这类情况下使基因表达正常化的成功的序列特异性策略。
剪接转换寡核苷酸(SSO)是通过结合剪接位点识别或调节序列并与顺式和反式作用因子竞争其靶标来调节内含子剪接的反义试剂(8)。它们已经显示为恢复异常剪接、改变现有mRNA的相对表达或产生不正常表达的新型剪接变体(8)。通过大量SSO修饰(例如2’-O-甲基和2’-O-甲氧基乙基核糖)提高的靶向SSO-RNA双链体的稳定性有利于探索其对于越来越多的人类疾病基因的治疗潜力的研究，包括肌肉营养不良中的DMD(9，10)、脊髓性肌萎缩中的SMN2(11)、共济失调-毛细血管扩张症中的ATM(12)和X连锁无丙种球蛋白血症中的BTK(13)。虽然这些方法接近于实现其对有限数量的疾病的临床潜力(8)，但由突变诱导的异常剪接(14)所导致的>300种孟德尔病症和越来越多的复杂性状可能适合于SSO介导的基因表达的改正。
1型糖尿病的病因学具有由人白细胞抗原(HLA)和多种修饰性非HLA基因座赋予的强遗传成分(15)。在染色体11上的胰岛素原基因(INS)区域(称为IDDM2)中鉴别到最强的修饰子(modifier)(15)。这一区域的进一步作图表明INS是最可能的IDDM2靶标(16)，与这种自身抗原在发病机制中的关键作用一致(17)。在IDDM2处对于这种疾病的遗传风险已归因于与易感性和保护性INS单倍型的差异稳态RNA水平，可能涉及该基因上游的小卫星DNA序列(18，19)。然而，对天然存在的INS多态性的系统性检验揭示了没有小卫星序列的报告基因构建体中单倍型特异性胰岛素原表达水平，其由内含子1(7)中称为IVS1+5ins4(也称为rs3842740或INS-69)和IVS1-6A/T(rs689，INS-27或HphI+/-)的两个变体所导致(16，20)。前一个变体激活内含子1的隐蔽5’剪接位点，而位于3’剪接位点(3’ss)上游6个核苷酸的后一个变体的腺嘌呤(A)促进内含子保留，从而增加具有延伸的5’UTR的转录物的相对丰度(21)。与胸腺嘧啶(T)相比，IVS1-6A/T的A等位基因在体外降低了对嘧啶结合蛋白的亲和力，并使3’ss更依赖于U2小核核糖核蛋白的辅助因子(U2AF)(7)(U2结合、剪接体组装和3’ss选择所需的异源二聚体(22))。含内含子1的转录物在从产生胰岛素的组织制备的IVS1-6A衍生cDNA文库中过度表现(21)，从核排出(23)，并含有与高等灵长类中内含子1的3’ss的弛缓(relaxation)共同进化的短的人亚科特异性uORF(7)。由A等位基因赋予的更低的胰岛素原表达可能导致胰岛素原肽在胎儿胸腺中的次优表现和自身反应性T细胞的不充分负向选择，最终导致胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏(7)。
本发明的目的是诱导部分加工的mRNA转录物的加工以去除保留内含子，从而产生编码蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物。另外的目的是在有需要的受试者中治疗特征为蛋白质产生受损的疾病或病症和/或特征为缺陷性剪接的疾病或病症。
本发明的另一个目的是改正从含有IVS1-6A的前mRNA中去除INS内含子1的低效率，并将内含子保留降低至针对疾病保护性T等位基因所观察到的水平。本发明的另一个目的是提供包括特征为不规则或异常内含子保留(或与之相关)的遗传疾病(包括癌症)的新治疗方法。
根据本发明的第一方面，提供了一种预防或治疗受试者的疾病的方法，其包括成熟基因转录物中内含子保留的改正，其中所述疾病由所述基因转录物中的内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导。
保留的内含子
保留的内含子是也可包括外显子跳读、选择性5’剪接位点、选择性3’剪接位点和互斥外显子的五种类型的选择性剪接中的一种。当外显子被跳过或从加工的mRNA中剪切掉时，可以发生外显子跳读，且其可能是最常见的选择性剪接类型。选择性5’ss和选择性3’ss可以表示选择性剪接位点，例如隐蔽剪接位点或假剪接位点。当剪接后加工的mRNA中仅保留两个外显子中的一个时，可以出现互斥外显子。虽然内含子保留可能比外显子跳读更不常见，但已表明内含子保留比以前认识到的更加频繁地发生。事实上，De Souza小组对21,106个人基因的研究已经表明，测试的基因中约15％显示内含子保留(参见Galante等人，“Detection and evaluation of intron retention events in the humantranscriptome”，Bioinformatics 10：757-765(2004))。此外，Moore小组的研究已经显示约35％的人5’-UTR和约16％的3’-UTR携带内含子(Bicknell等人，“Introns in UTRs：Whywe should stop ignoring them，Bioessays 34：1025-1034(2012))。因此，内含子保留可在编码区中、在非编码区中、在5’UTR处或在3’UTR处发生。在编码区中，保留内含子可以在框架中编码氨基酸，或者可以是在可以由于终止密码子或阅读框移位而产生截短的蛋白质或非功能性蛋白质的错位中。此外，内含子可以在两个外显子之间、位于5’UTR处或位于3’UTR处。
与非保留内含子相比，保留内含子可以被表征为具有较短的序列长度。保留内含子的序列长度可以小于5kb，小于4kb，小于3kb，小于2.5kb，小于2kb，小于1.5kb，小于1kb，小于0.5kb，小于0.4kb，小于0.3kb，小于0.2kb或小于0.1kb。
此外，与非保留内含子相比，保留内含子可以表征为具有约40％至约60％的G/C含量。保留内含子的G/C含量可以为约40％，45％，50％，55％或约60％。
保留内含子也可以侧邻弱5’剪接位点、弱3’剪接位点或两者。弱剪接位点可以指可能需要调节蛋白(例如内含子剪接增强子)起作用的剪接位点。
此外，保留内含子可包含相对于非保留内含子较低的GGG基序存在。在一些情况下，GGG基序是内含子剪接增强子。
部分加工的mRNA转录物是已经经历部分剪接并包含至少一个保留内含子的mRNA转录物。所述至少一个内含子可以是在5’UTR、3’UTR内，或处于两个外显子之间的内部位置处。部分加工的mRNA转录物可能不能被翻译以产生功能性或全长蛋白质。
部分加工的mRNA转录物可包含特征为短序列长度的内含子。部分加工的mRNA转录物可包含特征为小于3kb，小于2.5kb，小于2kb，小于1.5kb，小于1kb，小于0.5kb，小于0.4kb，小于0.3kb，小于0.2kb或小于0.1kb的序列的内含子。
部分加工的mRNA转录物可包含特征为具有约40％至约60％的G/C含量的内含子。部分加工的mRNA转录物可包含特征为具有约40％，45％，50％，55％或约60％的G/C含量的内含子。
部分加工的mRNA转录物可包含侧邻弱5’剪接位点、弱3’剪接位点或两者的内含子。
部分加工的mRNA转录物可包含相对于非保留内含子具有较低的GGG基序存在的内含子。
在一些情况下，一个或多个内含子保留在部分加工的mRNA转录物中。部分加工的mRNA可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保留内含子。
完全加工的mRNA转录物是已经经历剪接以去除内含子(例如保留内含子)并且能够被翻译以产生蛋白质(例如全长功能性蛋白质)的转录物。具有一个或多个保留内含子的部分加工的mRNA转录物可以被剪接从而成为完全加工的mRNA。
全长功能蛋白具有与野生型形式的蛋白相同的长度和功能。全长功能蛋白可以是野生型形式的蛋白。全长功能蛋白可以是与野生型蛋白具有相同长度的野生型蛋白的异形体。全长功能蛋白可包含突变，例如氨基酸置换具有相似性质的可选氨基酸残基，使得蛋白质的表型(例如，功能)不被突变改变。
具有相似性质的示例性氨基酸可包括具有带电侧链的氨基酸：带正电荷的精氨酸、组氨酸和赖氨酸；或带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸；极性氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；非极性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；和芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在一些情况下，部分加工的mRNA转录物导致蛋白质产生受损。蛋白质产生受损可以是蛋白质全长功能形式的产生受损，其可包括蛋白质全长功能形式的亚常态生产。蛋白质全长功能形式的产生受损可包括蛋白质的缺陷形式的产生。蛋白质的缺陷形式可以是蛋白质的截短形式、蛋白质的错误折叠形式或包含异常靶结合位点的蛋白质的形式。
多核酸聚合物
本文所述的多核酸聚合物可用于与部分加工的mRNA转录物杂交以启动保留内含子的去除。在一些情况下，多核酸聚合物是反义多核酸聚合物。反义多核酸聚合物可以与具有高G/C含量的部分加工的mRNA转录物的区域(例如包含约40％至约60％的区域)杂交。反义多核酸聚合物可包含高G/C含量，例如约40％至约60％。反义多核酸聚合物可以与在弱5’剪接位点或弱3’剪接位点处、接着弱5’剪接位点或弱3’剪接位点或者其附近的部分加工的mRNA转录物的区域杂交。反义多核酸聚合物可以与可包含较低的GGG基序存在的部分加工的mRNA转录物的区域杂交。
多核酸聚合物的反义序列可以与部分加工的mRNA转录物的保留内含子杂交。反义序列可以与部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。内含子剪接调节元件可包括内含子剪接增强子或内含子剪接沉默子。反义序列可以与内含子剪接沉默子杂交。内含子剪接调节元件可以通过影响剪接体装配的早期和/或中间步骤来调节剪接，例如当U1和U2snRNP在外显子限定期间或在随后转换为内含子跨越复合物期间在跨外显子的剪接位点处配对时。示例性内含子剪接调节元件可包括多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)、U2AF65和/或U2AF35、hnRNP L和hnRNP A1。
多核酸聚合物可以在内含子的5’剪接位点、3’剪接位点、分支点、多聚嘧啶序列或内含子增强子处杂交。多核酸聚合物还可以在离5’剪接位点、3’剪接位点、分支点、多聚嘧啶序列或内含子增强子约30个碱基、25个碱基、20个碱基、15个碱基、10个碱基或5个碱基的距离处杂交以促进或增强剪接。多核酸聚合物在剪接位点处或剪接位点附近的杂交可以通过向剪接位点募集剪接因子而促进或增强剪接，从而启动剪接。
多核酸聚合物可以在内含子沉默子位点(例如，从头(de novo)内含子沉默子位点)、隐蔽内含子剪接位点或假剪接位点处杂交。内含子沉默子位点可被抑制剪接反应的沉默子识别。隐蔽内含子剪接位点可以通过突变(例如置换、缺失或插入)产生。隐蔽内含子剪接位点可以是隐蔽5’剪接位点或隐蔽3’剪接位点。隐蔽内含子剪接位点可以是隐蔽5’剪接位点。假剪接位点可以是弱剪接位点，其中其激活可以由标准剪接位点的突变引起。假剪接位点可以是假5’剪接位点或假3’剪接位点。内含子沉默子位点处的杂交可以在空间上阻断沉默子结合，并且可以从防止剪接体组装的破坏和剪接体的加工而帮助。在隐蔽内含子剪接位点处的杂交可以将相互作用重定向到标准剪接位点，例如标准弱剪接位点。
多核酸聚合物可以与内含子的内部区域杂交。内含子的内部区域可以不包含剪接位点，例如5’剪接位点(例如，标准、隐蔽或假5’剪接位点)、3’剪接位点(例如，标准、隐蔽或假3’剪接位点)、增强子位点或沉默子位点。多核酸聚合物在内部区域处的杂交可以通过向剪接位点(例如内含子增强子位点)募集剪接因子来促进或增强剪接。
多核酸聚合物可以与部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。内含子剪接调节元件可包含CCC基序。反义序列可以与部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中结合基序不形成G四链体。反义序列可以与部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中结合基序在两个G四链体之间。反义序列还可以与部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中结合基序具有第一CCC基序和第二CCC基序。第一CCC基序可以距第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。
多核酸聚合物可以与部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中结合基序形成发夹结构。多核酸聚合物还可以能够使发夹结构失稳定。
多核酸聚合物可以在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。多核酸聚合物还可以在3’端位置和/或5’端位置包含两个连续的吡啶核苷酸。
在一些情况下，多核酸聚合物可以是剪接转换寡核苷酸(SSO)。剪接转换寡核苷酸可以与部分加工的mRNA转录物的保留内含子杂交。剪接转换寡核苷酸可以与部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。
剪接转换寡核苷酸(SSO)已经广泛用于抑制外显子的使用(exon usage)，但尚未开发出促进整个内含子的去除以增加剪接介导的基因表达的反义策略。使用一系列含有人胰岛素原基因的剪接报道体，已经显示可以减少结合源自表达低水平胰岛素原的人单倍型的转录物的SSO的INS内含子1保留。通过竞争非标准和标准RNA结构从5’UTR去除弱内含子的SSO辅助促进有助于开发基于序列的反义策略以增强基因表达。
术语“内含子保留的改正”理解为改正不规则或异常的内含子保留。改正可以是完全改正或部分改正。改正可包括降低内含子保留的发生率。改正可包括减少异常的内含子保留。
在由基因转录物中的内含子保留引起的蛋白质表达的上下文中提及“缺陷性”可包括不充分的、缺陷的或异常的蛋白质表达。
内含子保留的改正可包括施用配置为与基因转录物杂交的多核酸聚合物。内含子保留的改正可包括施用配置为与基因转录物杂交以改变基因转录物中的更高级结构的多核酸聚合物。内含子保留的改正可包括施用配置为与基因转录物杂交以干扰以下中的一个或多个的多核酸聚合物：经典RNA结构(茎环)、非经典RNA结构(G四链体)的构象转变，与反式作用因子的相互作用和RNA-蛋白复合物形成速率。内含子保留的改正可包括施用配置为与基因转录物杂交以干扰(例如阻断)经典(茎环)和/或非经典(G四链体)RNA结构的构象转变的多核酸聚合物。多核酸聚合物可以对于包含内含子剪接调节元件或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含在哺乳动物中保守的重叠内含子剪接调节元件或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含含有短的五聚体至七聚体剪接调节基序的内含子区段或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。剪接调节基序可包含CCCAG或AGGCC。剪接调节基序可包含由Yeo GW等人(2007)提供的基序中的任一种。PLoS Genet 3：e85和/或Voelker RB,&Berglund JA(2007)，Genome Res 17：1023-1033，两篇文献通过引用并入本文。靶区域可以不包含C运行以避免G-四链体形成。靶区域可以不靠近5’和3’剪接位点、多聚嘧啶序列、分支位点和/或超分支区域。
多核酸聚合物可提供已显示影响INS内含子1和外显子2剪接的剪接因子(包括Tra2、SRSF3或U2AF35，或其它肽、正义或反义核酸、小分子或其它化学品)的结合平台，以促进多核酸聚合物的递送和/或将核酸靶向到特定组织、细胞或发育阶段。这样的反义策略可以帮助减少癌细胞(特别是含有剪接因子基因的体细胞突变的那些)中的普遍内含子保留，如首先对于在骨髓增生性疾病中U2AF35的锌指结构域中的特定置换显示的(76)。这些突变在许多肿瘤中发生并导致可能有助于恶性生长的剪接缺陷。本发明可以帮助在携带涉及3’剪接位点识别的剪接因子中的突变的显著部分的癌症患者中(目前估计为>15％)控制细胞增殖并减少恶性生长(76)。
多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或99.5％互补。多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列100％互补。
多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列有3个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列有2个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列有1个或更少的错配。
多核酸聚合物可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列特异性杂交。特异性可以是多核酸聚合物与部分加工的mRNA转录物的靶序列的95％，98％，99％，99.5％或100％的序列互补性。杂交可以在高严格的杂交条件下进行。
多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少99％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQID NO:46具有至少98％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少80％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少75％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少70％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ IDNO:46具有至少65％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少60％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少55％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:46具有至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
多核酸聚合物可以与mRNA转录物杂交，该mRNA转录物与SEQ ID NO:46的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％、95％或99％的序列同一性。多核酸聚合物可以与mRNA转录物杂交，该mRNA转录物与SEQ ID NO:46的至少13个连续碱基具有100％的序列同一性。
多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少99％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ IDNO:3具有至少98％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少75％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少65％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少60％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少55％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ IDNO:3具有至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
提及对于转录物的靶区域的至少一部分反义的可包括至少5个连续核苷酸或至少10个连续核苷酸。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的转录物的靶区域的至少5个连续核苷酸是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的转录物的靶区域的至少10个连续核苷酸是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的转录物的靶区域的至少15个连续核苷酸是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的转录物的靶区域的至少20个连续核苷酸是反义的。
多核酸聚合物可以与包含SEQ ID NO:46的至少10个连续碱基的mRNA转录物杂交。多核酸聚合物可以与由SEQ ID NO:46的至少10个连续碱基组成的mRNA转录物杂交。
多核酸聚合物可以对于包含选自包括以下的组中任一的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ IDNO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ IDNO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。
多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少99％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少98％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ IDNO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ IDNO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ IDNO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少90％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以与包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少85％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少80％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少75％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ IDNO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少70％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ IDNO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少65％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ IDNO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少63％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少60％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ IDNO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少50％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ IDNO:30；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。
多核酸聚合物可以对于包含选自包括以下的组中任一的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；和SEQ ID NO:36或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少99％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；和SEQ ID NO:36或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少98％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:6；SEQ ID NO:9；和SEQ ID NO:36或其组合。多核酸聚合物可以对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；和SEQ ID NO:36或其组合。
多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:6或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:9或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含SEQ ID NO:36或由其组成的转录物的靶区域是反义的。
多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:3具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:6具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:9具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与SEQ ID NO:36具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的。
多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少99％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少98％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少90％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少85％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少80％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一种具有至少75％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少70％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少65％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ IDNO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少60％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少55％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。多核酸聚合物可以对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少50％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。本领域技术人员应理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。
多核酸聚合物可包含选自包括以下的组中任一的多核酸聚合物序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。
多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少99％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ IDNO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少98％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ IDNO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一种的序列具有至少90％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ IDNO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少85％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少80％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ IDNO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少75％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ 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NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少60％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ IDNO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少55％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少50％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID 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多核酸聚合物可包含选自包括以下的组中任一的多核酸聚合物序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少99％同一性：SEQ IDNO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少98％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ IDNO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ IDNO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少90％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少85％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少80％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少75％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少70％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ INNO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少65％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少60％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少55％同一性：SEQID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ IDNO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少50％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO 5；SEQ IN NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:34；和SEQ ID NO:35或其组合。
多核酸聚合物可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或者由其组成。多核酸聚合物可包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或者由其组成。多核酸聚合物可包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:8或者由其组成。多核酸聚合物可包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35或者由其组成。
多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少75％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少65％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少60％同一性的序列或由其组成。
多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少99％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少98％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少75％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少65％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少60％同一性的序列或由其组成。
多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少99％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少98％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少65％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少60％同一性的序列或由其组成。
多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少99％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少98％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少95％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少85％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少80％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ IDNO:35具有至少75％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQID NO:35具有至少70％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少65％同一性的序列或由其组成。多核酸聚合物可包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少60％同一性的序列或由其组成。
多核酸聚合物可包含选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的多核酸聚合物序列或由其组成。多核酸聚合物可包含选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的多核酸聚合物序列或由其组成，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。
多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少99％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少99％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少98％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少98％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少90％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少85％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少80％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少75％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少70％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少65％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少60％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少55％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少50％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。
有利地，本发明鉴别了降低内含子转录物(例如，内含子1保留的转录物)的相对丰度的SSO，并以单核苷酸分辨率描述优化的反义靶标。
多核酸聚合物可包含剪接转换寡核苷酸(SSO)。多核酸聚合物长度可以为约50个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约45个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约40个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约35个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约30个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约25个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约20个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约19个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约18个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约17个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约16个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约15个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约14个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约13个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约12个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约11个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约50个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约45个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约40个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约35个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约30个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约25个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约10至约20个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约15至约25个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约15至约30个核苷酸。多核酸聚合物长度可以为约12至约30个核苷酸。
多核酸聚合物(例如SSO)可包含RNA或DNA。多核酸聚合物(例如SSO)可包含RNA。多核酸聚合物(例如SSO)可包含具有与DNA或RNA等同的互补作用的天然或合成或人工核苷酸类似物或碱基。多核酸聚合物(例如SSO)可包含DNA、RNA和/或核苷酸类似物的组合。核苷酸类似物可包括PNA或LNA。在另一个实施方式中，核酸(例如SSO)可包含PMO或由其组成。
在一些情况下，合成或人工核苷酸类似物或碱基可包含在核糖部分、磷酸酯部分、核苷部分或其组合中的一个或多个处的修饰。
核苷酸类似物或人工核苷酸碱基可构成在核糖部分的2’羟基处具有修饰的核酸。修饰可以是2’-O-甲基修饰或2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰。2’-O-甲基修饰可以向核糖部分的2’羟基添加甲基，而2’O-甲氧基乙基修饰可以向核糖部分的2’羟基添加甲氧基乙基。下面图示说明腺苷分子的2’-O-甲基修饰和尿苷的2’O-甲氧基乙基修饰的示例性化学结构。
2’羟基处的另外的修饰可包括2’-O-氨基丙基糖构象，其可以涉及延长的胺基(包含将胺基结合到2’氧的丙基接头)。这种修饰可以通过每个糖从胺基引入一个正电荷来中和寡核苷酸分子的磷酸酯来源的总负电荷，并且可以由于其两性离子性质而由此改善细胞摄取性质。下文图示说明2’-O-氨基丙基核苷亚磷酰胺的示例性化学结构。
2’羟基处的另外的修饰可包括锁定或桥接的核糖构象(例如，锁核酸或LNA)，其中也可以涉及4’核糖位置。在该修饰中，在2’碳处结合的氧分子可以通过亚甲基与4’碳连接，从而形成2’-C,4’-C-氧-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。下文图示说明LNA的化学结构的示例性表示。左侧所示的表现形式突出显示了LNA单体的化学连接性。右侧所示的表现形式突出显示了LNA单体的呋喃糖环的锁定的3’-内(3E)构象。
在2’羟基处的另外的修饰可包括乙烯核酸(ENA)，例如2’-4’-亚乙基桥接核酸，其将糖构象锁定为C3’-内糖折叠构象。ENA是同样包含LNA的修饰核酸的桥接核酸类的部分。下文图示说明ENA和桥接核酸的示例性化学结构。
在2’羟基处的再其它的修饰可包括2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
核苷酸类似物可以进一步包括吗啉核苷酸、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸、2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)或其组合。吗啉核苷酸或亚磷二酰胺酯(phosphorodiamidate)吗啉核苷酸寡聚物(PMO)包括合成分子，其结构通过偏离正常的糖和磷酸酯结构而模拟天然核酸结构。相反，五元核糖环可以被含有四个碳、一个氮和一个氧的六元吗啉环替换。核糖单体可以通过亚磷二酰胺酸酯基团而不是磷酸酯基团连接。这些骨架改变可以去除所有的正电荷和负电荷，从而制得可以在没有细胞递送剂(例如带电寡核苷酸所使用的那些)帮助的情况下穿过细胞膜的吗啉核苷酸中性分子。
肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯连接。相反，碱基可以通过寡甘氨酸样分子连接和适当隔开，因此消除骨架电荷。
磷酸酯骨架的修饰还可包括甲基或巯基修饰，例如甲基膦酸酯核苷酸和。下文图示说明示例性巯基膦酸酯核苷酸(左)和甲基膦酸酯核苷酸(右)。
此外，示例性的2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺图示为：
且示例性的己糖醇核酸(或1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA))图示为：
除了核糖部分、磷酸酯骨架和核苷的修饰之外，核苷酸类似物还可以例如在3’或5’端修饰。例如，3’端可包括3’阳离子基团，或者通过用3’-3’连接翻转在3’-端的核苷。在另一个替代方式中，3’-端可以用氨基烷基封闭，例如3’C5-氨基烷基dT。5’-端可以用氨基烷基封闭，例如5’-O-烷基氨基取代基。其他5’缀合物可以抑制5’-3’核酸外切切割。其他3’缀合物可以抑制3’-5’核酸外切切割。
在一些情况下，在与天然多核酸聚合物相比时，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对核酸酶例如核糖核酸酶(例如RNA酶H)、脱氧核糖核酸酶(例如DNA酶)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶具有抗性。在一些情况下，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸、2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺或其组合的人工核苷酸类似物对核酸酶例如核糖核酸酶(例如RNA酶H)、脱氧核糖核酸酶(例如DNA酶)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶)具有抗性。2’-O-甲基修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-氨基丙基修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-脱氧修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。T-脱氧-2’-氟修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。LNA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。ENA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。HNA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。吗啉核苷酸可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。PNA可以对核酸酶具有抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。巯基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。包含2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。
在一些情况下，相对于等同的天然多核酸聚合物，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的一种或多种人工核苷酸类似物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-甲基修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-氨基丙基修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-脱氧修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。T-脱氧-2’-氟修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。LNA修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。ENA修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。PNA修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。HNA修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。吗啉修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。巯基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。包含2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸聚合物相对于等同的天然多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力。提高的亲和力可以用较低的Kd、较高的熔融温度(Tm)或其组合说明。
在另外的情况下，本文所述的多核酸聚合物可以被修饰以增加其稳定性。在多核酸聚合物是RNA的实施方式中，多核酸聚合物可以被修饰以增加其稳定性。多核酸聚合物可以通过上述修饰中的一种或多种进行修饰而增加其稳定性。多核酸聚合物可以在2’羟基位置处被修饰，例如通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰，或者通过锁定或桥接的核糖构象(例如LNA或ENA)。多核酸聚合物可以通过2’-O-甲基和/或2’-O-甲氧基乙基核糖修饰。多核酸聚合物还可包含吗啉核苷酸、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺以增加其稳定性。对RNA的适合修饰以增加递送稳定性对于本领域技术人员是明显的。
可以使用本领域已知的程序，使用化学合成和/或酶促连接反应来构建本文所述的多核酸聚合物。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物学稳定性或增加在多核酸聚合物和靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性的多样修饰的核苷酸来化学合成多核酸聚合物。示例性方法可包括在US5,142,047；US5,185,444；WO2009099942；或EP1579015中描述的那些方法。另外的示例性方法可包括在以下文献中描述的那些：Griffey等人，“2’-O-aminopropyl ribonucleotides:a zwitterionic modificationthat enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisenseoligonucleotides”，J.Med.Chem.39(26)：5100-5109(1997))；Obika等人，“Synthesis of2′-O,4′-C-methyleneuridine and-cytidine.Novel bicyclic nucleosides having afixed C3，-endo sugar puckering".Tetrahedron Letters 38(50):8735(1997)；Koizumi，M."ENA oligonucleotides as therapeutics".Current opinion in moleculartherapeutics 8(2)：144-149(2006)；和Abramova等人，“Novel oligonucleotideanalogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies：newchemical possibilities”，Indian Journal of Chemistry 48B：1721-1726(2009)。或者，可以使用其中已经以反义方向亚克隆多核苷酸聚合物的表达载体来生物地产生多核酸聚合物(即，从插入的多核酸聚合物转录的RNA将具有对于感兴趣的靶多核酸聚合物的反义取向)。
多核酸聚合物可以结合任何核酸分子(例如另一个反义分子)、肽或其他化学物质，以促进多核酸聚合物的递送和/或将核酸靶向到特定的组织、细胞类型或细胞发育阶段。多核酸聚合物可以结合蛋白质或RNA。束缚于多核酸聚合物的蛋白质可包含剪接因子以增强、抑制或调节剪接和内含子去除。束缚于多核酸聚合物的RNA可包含增强、抑制或调节剪接和内含子去除的适体或任何结构。多核酸聚合物可以是分离的核酸。
多核酸聚合物可以与适合于将多核酸聚合物递送至细胞的递送载体缀合或结合。细胞可以是特定细胞类型或特定发育阶段。递送载体可以能够进行位点特异性、组织特异性、细胞特异性或发育阶段特异性的递送。例如，递送载体可以是细胞特异性的病毒颗粒或其成分，或者，递送载体可以是细胞特异性的抗体颗粒或其成分。多核酸聚合物可以靶向于递送到胰腺中的β细胞。多核酸聚合物可以靶向于递送到胸腺细胞。多核酸聚合物可以靶向于递送到恶性细胞。多核酸聚合物可以靶向于递送到前恶性细胞(已知在可预见的未来期间发展成明显的恶性表型，例如前白血病和骨髓增生异常综合征或组织病理学上定义的癌前病变或病症)。
在一个实施方式中，多核酸聚合物可以结合化学分子(例如非肽或核酸基的分子)，例如药物。药物可以是小分子(例如具有小于900Da的MW)。
在本发明的一个实施方式中，递送载体可包含细胞穿透肽(CPP)。例如，多核酸聚合物可以与CPP结合或复合。技术人员应理解，任何适合的CPP都可以与多核酸聚合物缀合以帮助将多核酸聚合物递送至细胞和/或递送至细胞中。这样的CPP可以是Boisguérin等人(2015，Advanced Drug Delivery Reviews doi：10.1016/j.addr.2015.02.008)描述的任何适合的CPP技术，该文献通过引用并入本文。用于与多核酸聚合物缀合的适合递送载体还描述于Lochmann等人((European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004)237-251)，其通过引用并入本文)中。
CPP可以是富含精氨酸和/或赖氨酸的肽，例如，其中肽中的大多数残基是赖氨酸或精氨酸。CPP可包含聚-L-赖氨酸(PLL)。或者，CPP可包含聚精氨酸。适合的CPP可以选自包括以下的组：穿膜素(Penetratin)；R6-穿膜素(R6-Penetratin)；转运素(Transportan)；寡聚精氨酸；F-3；B-肽；B-MSP；Pip肽，例如Pip1，Pip2a，Pip2b，Pip5e，Pip5f，Pip5h，Pip5j，Pip5k，Pip5l，Pip5m，Pip5n，Pip5o，Pip6a，Pip6b，Pip6c，Pip6d，Pip6e，Pip6f，Pip6g或Pip6h；序列PKKKRKV的肽；Penatratin；Lys4；SPACE；Tat；Tat-DRBD(dsRNA结合结构域)；(RXR)4；(RFF)3RXB；(KFF)3K；RgF2；T细胞衍生CPP；Pep-3；PEGpep-3；MPG-8；MPG-8-Chol；PepFect6；P5RHH；R15；和Chol-R9；或其功能性变体(例如参见Boisguérin等人(2015，Advanced Drug Delivery Reviews doi：10.1016/j.addr.2015.02.008)。
在一个实施方式中，CPP包含Pip肽或由其组成。Pip肽可以选自包括Pip1，Pip2a，Pip2b，Pip5e，Pip5f，Pip5h，Pip5j；Pip5k，Pip5l，Pip5m，Pip5n，Pip5o，Pip6a，Pip6b，Pip6c，Pip6d，Pip6e，Pip6f，Pip6g和Pip6h的组。
在本发明的一个实施方式中，递送载体可包含基于肽的纳米颗粒(PBN)，其中多个CPP(例如本文所讨论的一种或多种适合的CPP)通过电荷相互作用与多核酸聚合物形成复合物。这种纳米颗粒的尺寸可以为约50nm至250nm。在一个实施方式中，纳米颗粒的尺寸可以为约70-200nm。在另一个实施方式中，纳米颗粒的尺寸可以为约70-100nm或125-200nm。
在一个实施方式中，多核酸聚合物可以与递送载体复合，例如通过离子键。或者，多核酸聚合物可以共价结合于递送载体。缀合/结合方法描述于Lochmann等人((EuropeanJournal of Pharmaceutics和Biopharmaceutics 58(2004)237-251)，其通过引用并入本文)中。例如，缀合方法可包括将含有反应性基团(例如-NH2或-SH2)的适合的系链(tether)引入到多核酸聚合物并且作为活性中间体在合成后添加递送载体，例如肽，接着在水性介质中进行偶联反应。替代方法可包括在单一固相载体上以线性模式进行缀合。
递送载体和多核酸聚合物可以是硫醇和/或马来酰亚胺连接的，例如硫醇-马来酰亚胺连接的。多核酸聚合物和递送载体的缀合可以是通过点击化学，例如在待缀合的相应分子上的叠氮基或2’-O-炔丙基官能团和炔基的反应。在一个实施方式中，递送载体和多核酸聚合物可以通过硫醚桥连接。在另一个实施方式中，递送载体和多核酸聚合物可以通过二硫桥连接。技术人员应容易确定用于缀合多核酸聚合物和递送载体(例如肽)的适合的连接基团或反应。
基因转录物可以编码胰岛素原。基因转录物可以自INS基因转录。基因转录物可以源自表达低水平胰岛素原的人单倍型。内含子可包含INS内含子1。
基因转录物可以转录自基因或ORF，所述基因或ORF选自包括以下的基因或ORF中的任一种：ABCD4；ABCF3；ACADVL；ALKBH6；AP1G2；APEX1；ARFRP1；ATHL1；ATP1A3；ATP5D；ATP13A1；BAX；BDH2；BRD2；C1orf63；C1orf630；C1orf631；C1orf124；C2orf49；C8orf82；C16orf59；CAPRIN2；CDCA7；CEP164；CEP170；CLCN7；CPNE1；CPSF3L；DCXR；DENND4B；DFFA；DIS3L2；DNAJB12；DPF1；DRG2；DSN1；EML3；EWSR1；EWSR10；FGFR4；FTSJ1；GBAP1；GMPPA；GMPR2；GNPTG；GORASP1；GPATCH4；HGS；HMG20B；IFFO1；ISYNA1；KRI1；LOC148413；LZTR1；MAN2C1；MAP4K2；MCOLN1；MDP1；MIB2；MITD1；MOK；MOV10；MRPL35；MTMR11；MUS81；NAPEPLD；NBEAL2；NDRG4；NDUFB10；NFATC4；NFKBIB；NIT1；NKTR；NPRL2；NSUN5P1；NUDT22；PAN2；PDDC1；PDLIM4；PHF1；PIK3CD；PITPNM1；PPIL2；PPP1R35；PPP4C；PQLC2；PRPF39；PSME2；PTPMT1；QARS；RAD52；RHOT2；RMND5B；RNF123；RPL10A；RPP21；RPS6KB2；RUSC1；SCRN2；SCYL1；SFR1；SGSM3；SIRT7；SLC25A3；SLC25A3；SLC30A7；SLC37A4；STK19；STX10；TCF25；TOMM40；TP53I3；TRIM41；TRPT1；TSTA3；TTC14；TTC140；TUBGCP6；U2AF1L4；UCK1；UNC45A；VAMP1；VAMP10；VARS；VPS28；WDR24；WDR90；WRAP53；YDJC；YIPF3；YIPF3；ZCCHC8；ZCCHC18；ZFAND1；ZNF131；ZNF300；ZNF317；ZNF692；ZNF711；ZNRD1；ZWINT或其组合。
术语“多核酸聚合物”和“核酸”可以互换使用，并且可以指长度为约10至约50个核苷酸的多核酸聚合物。
疾病
本文所述的方法和组合物可用于治疗特征为蛋白质产生受损的疾病或病症。本文所述的方法和组合物还可用于治疗特征为缺陷性剪接的疾病或病症。疾病或病症可以是遗传障碍或病症。遗传障碍或病症的特征可以为蛋白质产生受损。遗传障碍或病症还可以特征为缺陷性剪接。遗传障碍或病症可以是遗传性障碍，或基因组中一个或多个位置内的非遗传缺陷。遗传性障碍可以是遗传性疾病。遗传性疾病的特征可以为蛋白质产生受损。遗传性疾病的特征可以为缺陷性剪接。患有遗传性疾病的受试者可以具有可包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。患有遗传性疾病的受试者可以具有可包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。患有遗传性疾病的受试者可以具有可包含基因的缺陷拷贝的基因组，其可能不能产生蛋白质的全长功能形式。
遗传障碍或病症可以是基因组中一个或多个位置内的非遗传缺陷。非遗传缺陷可以是点突变、缺失、插入或阅读框移位。与非遗传性缺陷相关的遗传障碍或病症的特征可以为蛋白质产生受损。与非遗传性缺陷相关的遗传障碍或病症的特征可以为缺陷性剪接。具有非遗传性缺陷的受试者可以具有可包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。具有非遗传性缺陷的受试者可以具有可包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。具有非遗传性缺陷的受试者可以具有可包含基因的缺陷拷贝的基因组，其可能不能产生蛋白质的全长功能形式。
遗传障碍或病症可以是常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或多因素或多基因障碍。有时候，遗传性疾病的特征也可以表征为常染色体显性、常染色体隐性、X连锁显性、X连锁隐性、Y连锁、线粒体或者多因素或多基因遗传性疾病。常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍的特征可以为蛋白质产生受损。常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因子或多基因障碍的特征可以为缺陷性剪接。患有常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍的受试者可以具有可包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。患有常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍的受试者可以具有可包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式。患有常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍的受试者可以具有可包含缺陷的基因拷贝的基因组，其可能不能产生蛋白质的全长功能形式。
示例性遗传性疾病可包括软骨发育不全，遗传性血色素沉着症，唐氏综合征，遗传性球形红细胞增多症，泰-萨克斯病，Usher综合征，遗传性果糖不耐受症，血友病，肌营养不良(例如杜氏肌营养不良或DMD)，多基因障碍，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴尔得-别德尔综合征，普拉德-威利综合征，糖尿病，心脏病，关节炎，运动神经元病，白化病，Cri-du-Chat综合征，囊性纤维化，脆性X综合征，半乳糖血症，亨廷顿氏病，Jackson-Weiss综合征，克兰费尔特综合征，克拉伯病，Langer-Giedion综合征，莱施-奈恩综合征，马方综合征，肌强直性营养不良，指甲髌骨综合征，神经纤维瘤病，努南综合征，X三体综合征，成骨不全，Patau综合征，苯丙酮尿症，卟啉症，视网膜母细胞瘤，Rett综合征，镰状细胞病，特纳综合征，Usher综合征，Von Hippel-Lindau综合征，Waardenburg综合征，Wilson病，着色性干皮病，XXXX综合征或YY综合征。
示例性遗传性疾病例如软骨发育不全，遗传性血色素沉着症，唐氏综合征，遗传性球形红细胞增多症，泰-萨克斯病，Usher综合征，遗传性果糖不耐受症，血友病，肌营养不良(例如杜氏肌营养不良或DMD)，多基因障碍，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴尔得-别德尔综合征，普拉德-威利综合征，糖尿病，心脏病，关节炎，运动神经元病，白化病，Cri-du-Chat综合征，囊性纤维化，脆性X综合征，半乳糖血症，亨廷顿氏病，Jackson-Weiss综合征，克兰费尔特综合征，克拉伯病，Langer-Giedion综合征，莱施-奈恩综合征，马方综合征，肌强直性营养不良，指甲髌骨综合征，神经纤维瘤病，努南综合征，X三体综合征，成骨不全，Patau综合征，苯丙酮尿症，卟啉症，视网膜母细胞瘤，Rett综合征，镰状细胞病，特纳综合征，Usher综合征，Von Hippel-Lindau综合征，Waardenburg综合征，Wilson病，着色性干皮病，XXXX综合征或YY综合征的特征可以为蛋白质产生受损或者缺陷性剪接。示例性遗传性疾病例如软骨发育不全，遗传性血色素沉着症，唐氏综合征，遗传性球形红细胞增多症，泰-萨克斯病，Usher综合征，遗传性果糖不耐受症，血友病，肌营养不良(例如杜氏肌营养不良或DMD)，多基因障碍，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴尔得-别德尔综合征，普拉德-威利综合征，糖尿病，心脏病，关节炎，运动神经元病，白化病，Cri-du-Chat综合征，囊性纤维化，脆性X综合征，半乳糖血症，亨廷顿氏病，Jackson-Weiss综合征，克兰费尔特综合征，克拉伯病，Langer-Giedion综合征，莱施-奈恩综合征，马方综合征，肌强直性营养不良，指甲髌骨综合征，神经纤维瘤病，努南综合征，X三体综合征，成骨不全，Patau综合征，苯丙酮尿症，卟啉症，视网膜母细胞瘤，Rett综合征，镰状细胞病，特纳综合征，Usher综合征，Von Hippel-Lindau综合征，Waardenburg综合征，Wilson病，着色性干皮病，XXXX综合征或YY综合征可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
如上所述，遗传障碍或病症可以是常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍。遗传障碍或病症可以是常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍，其可以是特征为蛋白质产生受损或缺陷性剪接的障碍。
示例性常染色体显性障碍可包括亨廷顿氏病，1型神经纤维瘤病，2型神经纤维瘤病，马方综合征，遗传性非息肉性结肠直肠癌，遗传性多发性外生骨疣，结节性硬化，血管性血友病或急性间歇性卟啉病。
常染色体显性障碍例如亨廷顿氏病，1型神经纤维瘤病，2型神经纤维瘤病，马方综合征，遗传性非息肉性结肠直肠癌，遗传性多发性外生骨疣，结节性硬化，血管性血友病或急性间歇性卟啉病的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。常染色体显性障碍例如亨廷顿氏病，1型神经纤维瘤病，2型神经纤维瘤病，马方综合征，遗传性非息肉性结肠直肠癌，遗传性多发性外生骨疣，结节性硬化，血管性血友病或急性间歇性卟啉病可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性常染色体隐性障碍可包括白化病，中链酰基辅酶A脱氢酶缺陷，囊性纤维化，镰状细胞病，泰-萨克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎缩或罗伯茨综合征。
常染色体隐性障碍如白化病，中链酰基辅酶A脱氢酶缺陷，囊性纤维化，镰状细胞病，泰-萨克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎缩或罗伯茨综合征的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。常染色体隐性障碍例如白化病，中链酰基辅酶A脱氢酶缺陷，囊性纤维化，镰状细胞病，泰-萨克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎缩或罗伯茨综合征可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性X连锁显性障碍可包括X连锁低磷酸盐血性佝偻病，Rett综合征，2型色素失调症，Aicardi综合征或克兰费尔特综合征。
X连锁显性障碍如X连锁低磷酸盐血性佝偻病，Rett综合征，2型色素失调症，Aicardi综合征或克兰费尔特综合征的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。X连锁显性障碍如X连锁低磷酸盐血性佝偻病，Rett综合征，2型色素失调症，Aicardi综合征或克兰费尔特综合征可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性X连锁隐性障碍可包括血友病A，杜氏肌营养不良，莱施-奈恩综合征或特纳综合征。
X连锁隐性障碍如血友病A，杜氏肌营养不良，莱施-奈恩综合征或特纳综合征的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。X连锁隐性障碍如血友病A，杜氏肌营养不良，莱施-奈恩综合征或特纳综合征可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性Y连锁障碍可包括Swyer综合征或一种形式的色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)。
Y连锁障碍如Swyer综合征或色素性视网膜炎的形式的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。Y连锁障碍例如Swyer综合征或色素性视网膜炎的形式可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性线粒体疾病可包括Leber氏遗传性视神经病。
线粒体疾病如Leber氏遗传性视神经病的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。线粒体疾病如Leber氏遗传性视神经病可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
示例性多因素或多基因障碍可包括心脏病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多发性硬化)，炎性肠病或癌症。
多因素或多基因障碍如心脏病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多发性硬化)，炎性肠病或癌症的特征可以为蛋白质产生受损或缺陷性剪接。多因素或多基因障碍如心脏病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多发性硬化)，炎性肠病或癌症可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子的基因拷贝，可包含含有在适当地转录为完全加工的mRNA时可以编码蛋白质的全长功能形式的外显子组的基因拷贝，或者可包含可能不能产生蛋白质的全长功能形式的缺陷基因拷贝。
在一些情况下，本文所述的组合物和方法用于治疗遗传障碍或病症(例如遗传性疾病)。本文所述的组合物和方法可用于治疗特征为蛋白质产生受损的遗传障碍或病症(例如遗传性疾病)。本文所述的组合物和方法可用于治疗特征为缺陷性剪接的遗传障碍或病症(例如遗传性疾病)。
本文所述的组合物和方法还可用于治疗遗传障碍或病症，例如常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍。本文所述的组合物和方法可用于治疗特征为蛋白质产生受损的常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍。本文所述的组合物和方法可用于治疗特征为缺陷性剪接的常染色体显性障碍、常染色体隐性障碍、X连锁显性障碍、X连锁隐性障碍、Y连锁障碍、线粒体疾病或者多因素或多基因障碍。
在一些情况下，疾病或病症包括肌营养不良，脊髓性肌萎缩(SMA)，共济失调-毛细血管扩张，X连锁性无丙种球蛋白血症，糖尿病或癌症。
肌营养不良是可削弱肌肉骨骼系统并可阻碍运动的一组肌肉疾病。其可通过进行性骨骼肌无力，肌肉蛋白质缺乏，以及肌肉细胞和组织的死亡来表征。一种常见的肌营养不良形式可以是杜氏肌营养不良(DMD)。另外的肌营养不良形式可包括Becker型、肢带型、先天性、面肩肱型、肌强直性、眼咽型、远端型和Emery-Dreifuss型肌营养不良。
脊髓性肌萎缩(SMA)是常染色体隐性障碍，其是儿童死亡的最常见的遗传原因之一。该疾病的主要特征可以是脊髓运动神经元的进行性丧失，导致骨骼肌去神经，伴随后续的自主肌肉的弱化、萎缩和麻痹。SMA基因座可以映射到含有几个基因的染色体5q13上～500kb的复杂反向重复序列。SMA的主要原因可以是位于反向重复序列内的运动神经元存活基因(SMN1)的端粒拷贝的纯合丢失。也可以转录反向重复序列的着丝粒拷贝内的重复基因(SMN2)，但是SMN2基因不完全补偿SMN1功能的丧失。
共济失调-毛细血管扩张(A-T)或路易斯-巴尔综合征是罕见的神经退行性遗传性疾病。术语“共济失调”是指协调不良，并且术语“毛细血管扩张”是指小的扩张血管。这两个术语描述了这种疾病的特征。AT可损害小脑和可能造成运动和协调受损的大脑的另外区域。AT还可削弱免疫系统，从而增加感染，并可损害DNA修复，从而增加癌症的风险。A-T可以与基因ATM中的缺陷相关联，基因ATM负责管理对多种形式的应激的细胞反应。
X连锁无丙种球蛋白血症，也称为X连锁低丙种球蛋白血症、XLA、布鲁顿型无丙种球蛋白血症、布鲁顿综合征或性连锁无丙种球蛋白血症，是可以影响身体抵抗感染的能力的X连锁遗传障碍。XLA患者缺乏成熟B细胞，且因此缺乏抗击感染的必要抗体。布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)可以与介导B细胞发育和成熟相关，并且BTK基因可以与XLA相关。
糖尿病(DM)(通常称为糖尿病)是特征为长时间的高血糖水平的一组代谢疾病。糖尿病的症状包括体重减轻、多尿或排尿增加、多饮或口渴增加及多食或饥饿增加。糖尿病可以分为四类：1型、2型、妊娠糖尿病和其他特定类型的糖尿病。1型糖尿病可以通过胰腺中胰岛的胰岛素产生β细胞的损失表征，其导致胰岛素缺乏。2型糖尿病可以通过胰岛素抵抗表征，其也可以与胰岛素分泌减少结合。妊娠糖尿病可能类似于2型糖尿病，并且可以涉及不充足的胰岛素分泌与反应性的组合。其他特定类型的糖尿病可包括糖尿病前期、成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)和先天性糖尿病。
癌症可以是实体瘤或血液恶性肿瘤。实体瘤可以是肉瘤或癌瘤。肉瘤可以是骨、软骨、脂肪肌肉、血管或造血组织的癌症。示例性肉瘤可包括腺泡状横纹肌肉瘤，腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞瘤、血管肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、软组织透明细胞肉瘤、去分化脂肪肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、上皮样纤维肉瘤、上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤、肾外横纹肌样瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤、婴儿纤维肉瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、卡波西肉瘤、骨平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨脂肪肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤(MFH)、骨的恶性纤维性组织细胞瘤(MFH)、恶性间质瘤、恶性外周神经鞘瘤、间叶性软骨肉瘤、粘液纤维肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、粘液炎性成纤维细胞肉瘤、具有血管周围上皮样细胞分化的瘤、骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、具有血管周围上皮样细胞分化的瘤、骨膜骨肉瘤、多形性脂肪肉瘤、多形性横纹肌肉瘤、PNET/骨外尤因肿瘤、横纹肌肉瘤、圆细胞脂肪肉瘤、小细胞骨肉瘤、孤立性纤维性肿瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性骨肉瘤。
癌瘤可以是自上皮细胞发生的癌症。示例性癌瘤可包括腺癌，鳞状细胞癌，腺鳞癌，间变性癌，大细胞癌，小细胞癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌症(即胆管癌)，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，子宫颈癌，结肠癌，未知原发癌(CUP)，食管癌，眼癌，输卵管癌，胃肠道癌，肾癌，肝癌，肺癌，成神经管细胞瘤，黑色素瘤，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，甲状旁腺疾病，阴道癌，垂体瘤，前列腺癌，直肠癌，皮肤癌，胃癌，睾丸癌，喉癌，甲状腺癌，子宫癌，阴道癌或外阴癌。
血液恶性肿瘤是血液系统的恶性肿瘤，并且可包括基于T细胞和基于B细胞的恶性肿瘤。示例性血液恶性肿瘤可包括骨髓性白血病，骨髓增生性肿瘤，非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)，间变性大细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)，母细胞性NK细胞淋巴瘤，肠病型T细胞淋巴瘤，血肿性(hematosplenic)γ-δT细胞淋巴瘤，成淋巴细胞淋巴瘤，鼻NK/T-细胞淋巴瘤，治疗相关T细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，高风险CLL，非CLL/SLL淋巴瘤，前淋巴细胞性白血病(PLL)，滤泡性淋巴瘤(FL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，多发性骨髓瘤，结外边缘区B细胞淋巴瘤，淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，非伯基特高级B细胞淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)，免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞性白血病，淋巴浆细胞性淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤，血管内大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤或淋巴样肉芽肿病。
在一些情况下，本文所述的组合物和方法用于治疗肌营养不良，脊髓性肌萎缩(SMA)，共济失调-毛细血管扩张，X连锁无丙种球蛋白血症，糖尿病或癌症。本文所述的组合物和方法可用于治疗肌营养不良，脊髓性肌萎缩(SMA)，共济失调-毛细血管扩张，X连锁无丙种球蛋白血症，糖尿病或癌症，其中疾病或障碍与蛋白质产生受损相关。本文所述的组合物和方法可用于治疗肌营养不良，脊髓性肌萎缩(SMA)，共济失调-毛细血管扩张，X连锁无丙种球蛋白血症，糖尿病或癌症，其中疾病或障碍特征为缺陷性剪接。
疾病可以是由导致整个内含子在成熟转录物中保留的突变所引起的任何遗传病症。疾病可以是糖尿病。疾病可以是I型糖尿病。疾病可以是II型糖尿病。在另一个实施方式中，疾病可以是癌症。癌症可以是髓性白血病或骨髓增生性肿瘤。癌症可以维持促进识别3’剪接位点的任何剪接体成分中的突变。多核酸聚合物可以用于增加具有残留β-细胞活性的受试者中的内源性表达。多核酸聚合物可用于增加胰岛素原在其他糖尿病患者中的表达，包括接受移植的β细胞的那些患者。多核酸聚合物可以用作含有编码U2成分的基因中的突变的恶性肿瘤(例如，>20％的髓性白血病)的反义疗法。
在疾病是糖尿病的实施方式中，降低内含子保留的发生率可以是在受试者的胎儿发育期间。例如，可以对怀孕母亲施用多核酸聚合物，以减少胎儿中的内含子保留。
受试者可以是真核生物。受试者可以是哺乳动物。受试者可以是人类。受试者可以是非人灵长类。受试者可以是非灵长类哺乳动物，例如大鼠，小鼠，雪貂，狗，猫或猪。受试者可以是胎儿，例如人类胎儿。
该方法可包括在治疗前确定疾病病理是否由基因转录物中的内含子保留所引起的步骤。该确定可以使用本领域技术人员可获得的任何适合的试验或遗传分析。
在一些情况下，使用基于核酸的技术例如原位杂交和RT-PCR在核酸水平进行检测。测序技术可包括下一代测序技术，例如Helicos True单分子测序(tSMS)(Harris T.D.等人，(2008)Science 320：106-109)；454测序(Roche)(Margulies，M.等人，2005，Nature，437,376-380)；SOLiD技术(Applied Biosystems)；SOLEXA测序(Illumina)；PacificBiosciences的单分子实时(SMRTTM)技术；纳米孔测序(Soni GV和Meller A.(2007)ClinChem 53：1996-2001)；半导体测序(Ion Torrent；Personal Genome Machine)；DNA纳米球测序；使用来自Dover Systems(Polonator)的技术的测序，以及在测序之前不需要扩增或另外转化天然DNA的技术(例如，Pacific Biosciences和Helicos)，例如基于纳米孔的策略(例如Oxford Nanopore，Genia Technologies和Nabsys)。测序技术还可包括Sanger测序，Maxam-Gilbert测序，鸟枪法测序，桥式PCR，基于质谱的测序，基于微流体的Sanger测序，基于显微术的测序，RNAP测序或基于杂交的测序。
感兴趣的基因转录物的测序还可包括扩增步骤。示例性扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，自维持的序列复制(3SR)，环介导的等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，全基因组扩增，多重置换扩增，链置换扩增，解旋酶依赖性扩增，切口酶扩增反应，重组聚合酶扩增，逆转录PCR，连接介导的PCR或甲基化特异性PCR。
可用于获得核酸序列的另外的方法包括例如全基因组RNA表达阵列，酶联免疫吸附测定(ELISA)，基因组测序，从头测序，Pacific Biosciences SMRT测序，免疫组织化学(IHC)，免疫细胞化学(ICC)，质谱，串联质谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，原位杂交，荧光原位杂交(FISH)，显色原位杂交(CISH)，银原位杂交(SISH)，数字PCR(dPCR)，逆转录PCR，定量PCR(Q-PCR)，单标记qPCR，实时PCR，nCounter分析(Nanostringtechnology)，蛋白质印迹法，DNA印迹法，SDS-PAGE，凝胶电泳和RNA印迹法。
在一些情况下，可以使用例如基于免疫沉淀的测定如蛋白质印迹法或ELISA在蛋白质水平进行检测。另外，方法例如电泳和质谱分析也可用于检测感兴趣的蛋白质。
根据本发明的另一个方面，提供了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:46或任选的与SEQ IDNO:46具有至少95％同一性的区域或由其组成。该区域可以与SEQ ID NO:46具有至少98％或99％同一性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:3或任选的与SEQ IDNO:3具有至少95％同一性的区域或由其组成。该区域可以与SEQ ID NO:3具有至少98％或99％同一性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一互补的序列或由其组成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成。该区域可包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少98％同一性的序列互补的序列或由其组成。该区域可包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一具有至少99％同一性的序列互补的序列或由其组成。
细胞可以在体外。细胞可以是离体的。细胞可以是真核细胞或原核细胞。细胞可以是真核细胞。细胞可以是来自人；非人灵长类；或非灵长类哺乳动物如猫，大鼠，小鼠，狗，雪貂或猪的哺乳动物细胞。细胞可以是人细胞，例如来自上皮细胞，结缔组织细胞，激素分泌细胞，神经细胞，骨骼肌细胞，血细胞或免疫系统细胞。细胞可以是肿瘤细胞，例如实体瘤细胞或血液恶性肿瘤细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的多核酸聚合物的区域，或者任选地，包含与SEQ ID NO:46具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。该区域可以与SEQ ID NO:46具有至少98％或99％同一性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的多核酸聚合物的区域，或者任选地，包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。该区域可以与SEQ IDNO:3具有至少98％或99％同一性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多核酸聚合物，其对于多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一互补的序列或由其组成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多核酸聚合物，其对于多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一互补的序列或由其组成；或者任选地，包含与SEQ ID NO:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域。该区域可以与SEQ ID NO:47至434具有至少98％或99％同一性。
提及对于多核酸聚合物的区域的至少一部分反义的，本领域技术人员可以理解为是指至少5个连续核苷酸的区域。提及对于多核酸聚合物的区域的至少一部分反义的，本领域技术人员可以理解为是指至少10个连续核苷酸的区域。
根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含选自包括以下的组中任一的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ IDNO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ IDNO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。
根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一种的序列具有至少99％同一性的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一种的序列具有至少98％同一性的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一种的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合。
根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一种的核酸序列或由组成。应理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。
根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少99％同一性的核酸序列或由其组成。根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少98％同一性的核酸序列或由其组成。根据本发明的另一个方面，提供了多核酸聚合物，其包含与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其组成。应理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置换(例如，具有这样的序列的RNA的DNA形式)。
多核酸聚合物可以是分离的多核酸聚合物。多核酸聚合物可以与适合于将多核酸聚合物递送至细胞的递送载体缀合或结合。递送载体可以能够进行位点特异性、组织特异性或细胞特异性的递送。例如，递送载体可以是细胞特异性的病毒颗粒或其成分，或者，递送载体可以是细胞特异性的抗体颗粒或其成分。多核酸聚合物可以靶向于递送到胰腺中的β细胞。多核酸聚合物可以靶向于递送到胸腺细胞。多核酸聚合物可以靶向于递送到恶性细胞。多核酸聚合物可以被修饰以增加其稳定性。在多核酸聚合物是RNA的实施方式中，多核酸聚合物可以被修饰以增加其稳定性。多核酸聚合物可以通过2’-O-甲基和2’-O-甲氧基乙基核糖修饰。对于RNA的增加递送稳定性的适合修饰对于本领域技术人员是明显的。
多核酸聚合物可以是质粒载体的部分。多核酸聚合物可以是病毒载体的部分。多核酸聚合物可以在病毒载体上编码。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明的多核酸聚合物的载体。载体可包括病毒载体。病毒载体可包括腺相关病毒载体。载体可包括将多核酸聚合物靶向于恶性细胞或特定细胞类型的任何病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了包含或结合于本发明的多核酸聚合物的递送载体。递送载体可包括基于脂质的纳米颗粒；阳离子细胞穿透肽(CPP)；或直链或支链阳离子聚合物；或生物缀合物，例如胆固醇，胆汁酸，脂质，肽，聚合物，蛋白质或适体，其与多核酸聚合物缀合用于细胞内递送和/或改善的稳定性。递送载体可以细胞或组织特异性的或者发育阶段特异性的。递送载体可包含抗体或其部分。抗体可以对感兴趣的细胞上的细胞表面标志物是特异性的，以将多核酸聚合物递送到特定细胞。例如，根据Ji Hoon Jeong等人(Journal of Controlled Release 107(2005)562-570)，其通过引用并入本文，抗体可包含用于将非病毒多核酸聚合物靶向递送到胰岛β细胞的抗GAD抗体。例如，抗GAD抗体通过PEG接头将抗GAD Fab’片段与PEI缀合(PEI-PEG-Fab’)。其他特异性抗体可以用于这样的缀合以将多核酸聚合物递送到靶向组织。
药物组合物/制剂、给药和治疗方案
根据本发明的一个方面，提供了一种治疗特征为蛋白质功能形式的产生受损的疾病或病症的治疗剂，其包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含诱导提高部分加工的mRNA转录物中内含子剪除的治疗剂；其中所述受试者具有部分加工的mRNA转录物的池，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式的拷贝并且所述部分加工的mRNA转录物各自包含抑制所述部分加工的mRNA转录物的翻译的至少一个保留内含子；和使所述受试者的靶细胞与所述治疗剂接触，以诱导所述部分加工的mRNA转录物的池的一部分经历剪接而从所述部分中的每个所述部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子，从而产生完全加工的mRNA转录物，其中所述完全加工的mRNA转录物翻译以表达所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，这治疗所述疾病或病症。
治疗剂可以引起细胞中一种或多种剪接蛋白复合物的激活，以从部分加工的mRNA转录物的池的一部分中的每个部分加工的mRNA转录物去除至少一个保留内含子。治疗剂可以抑制调节内含子剪接活性的蛋白质。治疗剂可以激活调节内含子剪接活性的蛋白质。治疗剂可以与调节内含子剪接活性的蛋白质相互作用或结合。治疗剂可以与部分加工的mRNA转录物的靶多核苷酸序列相互作用或结合。在一些实施方式中，治疗剂可以是多核酸聚合物，例如本文所述的多核酸聚合物。在一些实施方式中，治疗剂可以是小分子。
小分子可以是小于900道尔顿的分子，并且可以在细胞中启动一个或多个剪接蛋白复合物以从部分加工的mRNA转录物的池的一部分中的每个部分加工的mRNA转录物去除至少一个保留内含子。小分子可以抑制调节内含子剪接活性的蛋白质。小分子可以激活调节内含子剪接活性的蛋白质。小分子可以与调节内含子剪接活性的蛋白质相互作用或结合，或者可以与部分加工的mRNA转录物的靶多核苷酸序列相互作用或结合。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明的多核酸聚合物的组合物。组合物可以是药学上可接受的组合物。组合物可包含药学上可接受的载体。组合物可包含另外的活性剂，例如药物或前药。组合物可包含不同多核酸聚合物(例如SSO)的组合用于治疗。
除了多核酸聚合物之外，组合物还可包含至少一种另外的生物活性分子。生物活性分子可以是药物或前药。生物活性分子可包含核酸或氨基酸。生物活性分子可包含小分子(例如<900道尔顿的分子)。
本文所述的药物组合物可包含多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述靶序列在两个G四链体之间，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。本文所述的药物组合物也可包含多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。此外，本文所述的药物组合物可包含多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
本文所述的药物组合物还可包含多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，并且其中所述结合基序形成发夹结构，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
本文所述的药物制剂可以通过多种施用途径(包括但不限于胃肠外(例如静脉内，皮下，肌内)，口服，鼻内，含服，局部，直肠或经皮施用途径)施用于受试者。在一些情况下，本文所述的药物组合物配制用于胃肠外(例如静脉内，皮下，肌内)施用。在另外的情况下，本文所述的药物组合物配制用于口服施用。在又另外的情况下，本文所述的药物组合物配制用于鼻内施用。
本文所述的药物制剂可包括但不限于水性液体分散体，自乳化分散体，固溶体，脂质体分散体，气溶胶，固体剂型，粉末，速释制剂，控释制剂，快速熔融制剂，片剂，胶囊剂，丸剂，延释制剂，延长释放制剂，脉冲释放制剂，多颗粒制剂以及混合的速释和控释制剂。
药物制剂可包含载体或载体材料，其可包括药剂学中任何常用的赋形剂，并且应当基于与本文公开的组合物的相容性和期望剂型的释放曲线性质来选择。示例性载体材料包括例如粘合剂，悬浮剂，崩解剂，填充剂，表面活性剂，增溶剂，稳定剂，润滑剂，润湿剂，稀释剂等。药学上相容的载体材料可包括但不限于阿拉伯胶，明胶，胶体二氧化硅，甘油磷酸钙，乳酸钙，麦芽糊精，甘油，硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，胆固醇，胆固醇酯，酪蛋白酸钠，大豆卵磷脂，牛磺胆酸，磷脂酰胆碱，氯化钠，磷酸三钙，磷酸氢二钾，纤维素和纤维素偶联物，糖硬脂酰乳酸钠，卡拉胶，单甘油酯，甘油二酯，预胶化淀粉等。参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton，Pa.：Mack PublishingCompany，1995)；Hoover，John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.,Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.,1980；和PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
药物制剂可包含分散剂和/或粘度调节剂，其可包括控制药物在液体介质中的扩散和均一性的材料或者造粒方法或共混方法。在一些实施方式中，这些试剂还促进涂层或侵蚀基质的效率。示例性扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物，电解质，60或80，PEG，聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为)和基于碳水化合物的分散剂，例如羟丙基纤维素(例如HPC，HPC-SL和HPC-L)，羟丙基甲基纤维素(例如HPMC K100，HPMC K4M，HPMC K15M和HPMC K100M)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)，非晶纤维素，硅酸镁铝，三乙醇胺，聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，具有环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)，泊洛沙姆(例如Pluronics 和其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙胺(例如Tetronic也称为Poloxamine其是从环氧丙烷和环氧乙烷顺序添加到乙二胺获得的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation，Parsippany，N.J.))，聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可具有约300至约6000、或约3350至约4000或约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚山梨酯-80，海藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和阿拉伯胶，瓜尔胶，黄原胶类，包括黄原胶，糖，纤维素材料，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚山梨酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮，卡波姆，聚乙烯醇(PVA)，海藻酸盐，壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。特别适用于脂质体分散体和自乳化分散体的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，来自蛋的天然磷脂酰胆碱，来自蛋的天然磷脂酰甘油，胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
药物制剂可包含pH调节剂或缓冲剂，其可包括酸，例如乙酸，硼酸，柠檬酸，乳酸，磷酸和盐酸；碱，例如氢氧化钠，磷酸钠，硼酸钠，柠檬酸钠，乙酸钠，乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲剂，例如柠檬酸盐/葡萄糖，碳酸氢钠和氯化铵。这样的酸、碱和缓冲剂以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量被包含。
药物制剂还可包含使组合物的渗透压达到可接受范围所需的量的一种或多种盐。这样的盐可包括具有钠，钾或铵阳离子和氯离子，柠檬酸根，抗坏血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氢根，硫酸根，硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐；适合的盐包括氯化钠，氯化钾，硫代硫酸钠，亚硫酸氢钠和硫酸铵。
药物制剂还可包含稀释剂，因其可提供更稳定的环境而也可用于使化合物稳定。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供pH控制或维持)可以用作本领域中的稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物体积以帮助压缩或为均匀掺合物产生足够体积而用于胶囊填充。这样的化合物可包括例如乳糖，淀粉，甘露醇，山梨醇，葡萄糖，微晶纤维素，如磷酸氢钙，二水合磷酸氢二钙；磷酸三钙，磷酸钙；无水乳糖，喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉，可压缩糖，如Di-(Amstar)；甘露醇，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素，蔗糖基稀释剂，糖粉(confectioner’s sugar)；一水合硫酸二氢钙，二水合硫酸钙；三水合乳酸钙，葡萄糖结合剂(dextrates)；水解谷物固体，直链淀粉；粉末纤维素，碳酸钙；甘氨酸，高岭土；甘露醇，氯化钠；肌醇，膨润土等。
药物制剂可包含促进物质分解或崩解的崩解试剂或崩解剂。术语“崩解”可包括当与胃肠液接触时剂型的溶解和分散。崩解剂的实例可包括淀粉，例如天然淀粉(如玉米淀粉或马铃薯淀粉)，预胶化淀粉(如National 1551或)，或淀粉羟乙酸钠(如或)，纤维素(如木材产品)，甲基结晶纤维素(例如 PH101，PH102，PH105，P100，Ming和Solka-)，甲基纤维素，交联羧甲基纤维素或交联纤维素(如交联羧甲基纤维素钠(Ac-Di-)，交联羧甲基纤维素，或交联的交联羧甲纤维素)，交联淀粉(如淀粉羟乙酸钠)，交联聚合物(如交联聚维酮，交联聚乙烯吡咯烷酮)，海藻酸盐(如海藻酸或海藻酸的盐，如海藻酸钠)，粘土(如HV(硅酸镁铝))，树胶(如琼脂，瓜尔胶，刺槐豆胶，卡拉亚胶，果胶或黄蓍胶)，淀粉羟乙酸钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂(如阳离子交换树脂)，柑橘渣，月桂基硫酸钠，与淀粉组合，等。
药物制剂可包含填充剂，例如乳糖，碳酸钙，磷酸钙，磷酸氢钙，硫酸钙，微晶纤维素，纤维素粉末，葡萄糖，葡萄糖结合剂，葡聚糖，淀粉，预胶化淀粉，蔗糖，木糖醇，乳糖醇，甘露醇，山梨醇，氯化钠，聚乙二醇等。
药物制剂可包含调味剂和/或甜味剂，例如阿拉伯胶糖浆，安赛蜜K，阿力甜，茴香，苹果，阿斯巴甜，香蕉，巴伐利亚奶油，浆果，黑醋栗，黄油硬糖味的棕色糖浆(butterscotch)，柠檬酸钙，樟脑，焦糖，樱桃，樱桃乳脂，巧克力，肉桂，泡泡糖，柑橘，柑橘榨汁(citrus punch)，柑橘乳脂，棉花糖，可可，可乐，冷樱桃，冷柑橘，环璜酸盐，cylamate，葡萄糖，桉树，丁香油酚，果糖，水果榨汁，生姜，甘草亭酸酯，甘草(甘草)糖浆，葡萄，葡萄柚，蜂蜜，异麦芽酮糖醇，柠檬，酸橙，柠檬乳脂，甘草酸单铵(monoammoniumglyrrhizinate)麦芽酚，甘露醇，枫树，棉花糖，薄荷醇，薄荷乳脂，混合浆果，新橙皮苷DC，纽甜，橙，梨，桃，胡椒薄荷，胡椒薄荷乳脂，粉，树莓，根汁，朗姆酒，糖精，黄樟素，山梨醇，绿薄荷，绿薄荷乳脂，草莓，草莓乳脂，甜叶菊，三氯蔗糖，蔗糖，糖精钠，糖精，阿斯巴甜，安赛蜜钾，甘露醇，踝蛋白，木糖醇(sylitol)，三氯蔗糖，山梨醇，瑞士奶油，塔格糖，柑桔，索马甜，百果糖，香草，核桃，西瓜，野樱桃，冬青，木糖醇或这些调味成分的任何组合，例如茴芹-薄荷醇，樱桃-茴芹，肉桂-橙，樱桃-肉桂，巧克力-薄荷，蜂蜜-柠檬，柠檬-酸橙，柠檬-薄荷，薄荷醇-桉树，橙-奶油，香草-薄荷及其混合物。
润滑剂和助流剂也可包含在本文所述的药物制剂中，其可以防止、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性的润滑剂可包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂基富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐如铝，钙，镁，锌，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山嵛酸甘油酯，聚乙二醇，月桂基硫酸镁或钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，Cab-O-淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂等。
增塑剂可以是用于使微包封材料或薄膜包衣软化以使它们较不易碎的化合物。适合的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300，PEG 400，PEG 600，PEG 1450，PEG 3350和PEG800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纤维素和三醋酸甘油酯。增塑剂还可以用作分散剂或润湿剂。
增溶剂可包括化合物，如三醋酸甘油酯，柠檬酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，月桂基硫酸钠，多库酯钠(sodium doccusate)，维生素E TPGS，二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，N-羟乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，羟丙基环糊精，乙醇，正丁醇，异丙醇，胆固醇，胆汁盐，聚乙二醇200-600，三缩四乙二醇，二乙二醇单乙醚，丙二醇和二甲基异山梨醇等。
稳定剂可包括化合物，如任何抗氧化剂，缓冲剂，酸，防腐剂等。
悬浮剂可包括化合物，如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300至约6000、或约3350至约4000或约7000至约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟甲基纤维素，聚山梨酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶，如黄蓍胶和阿拉伯胶，瓜尔胶，黄原胶类，包括黄原胶，糖，纤维素材料，如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮等。
表面活性剂可包括化合物，如月桂基硫酸钠，多库酯钠，Tween60或80，三醋酸甘油酯，维生素E TPGS，脱水山梨醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，聚山梨醇酯，泊洛沙姆，胆汁盐，单硬脂酸甘油酯，环氧乙烷和丙烯的共聚物氧化物，例如(BASF)等。另外的表面活性剂可包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯聚醇(octoxynol)10，辛苯聚醇40。有时，可包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。
粘度增强剂可包括例如甲基纤维素，黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，卡波姆，聚乙烯醇，海藻酸盐，阿拉伯胶，壳聚糖及其组合。
润湿剂可包括化合物，如油酸，单硬脂酸甘油酯，脱水山梨醇单油酸酯，脱水山梨醇单月桂酸酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯，多库酯钠，油酸钠，月桂基硫酸钠，多库酯钠，三醋酸甘油酯，吐温80，维生素E TPGS，铵盐等。
可注射制剂
适合于肌内、皮下或静脉内注射的制剂可包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液，分散体，悬浮液或乳液，以及用于重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。适合的水性和非水性载体(carrier)，稀释剂，溶剂或媒介(vehicle)的实例包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油，克列莫佛等)，其适合的混合物，植物油(如橄榄油)和可注射有机酯，如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。适合于皮下注射的制剂还可以含有添加剂，如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等确保防止微生物生长。包含等渗剂，例如糖、氯化钠等，也可以是期望的。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
对于静脉内注射，本文所述的化合物可以配制在水溶液中，优选配制在生理学相容的缓冲液如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。对于其他胃肠外注射，适合的制剂可包括水性或非水性溶液，优选用生理相容的缓冲剂或赋形剂。这样的赋形剂通常是本领域已知的。
肠胃外注射可包括浓注(bolus injection)或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，具有加入的防腐剂。本文所述的药物组合物可以是适合于作为在油性或水性媒介中的无菌悬浮液、溶液或乳液胃肠外注射的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水性溶液。此外，活性化合物的悬浮体可以制备为适宜的油性注射悬浮体。适合的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮体可以含有增加悬浮体粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮体还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。或者，活性成分可以是用于在使用前用适合的媒介(例如无菌无热原水)重构的粉末形式。
口服制剂
用于口服使用的药物制备物可以通过将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文所述的化合物混合，任选地研磨所得混合物，并且在需要时在加入适合的助剂后加工颗粒混合物以获得片剂或糖丸核而获得。适合的赋形剂可包括例如填充剂，如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉，小麦淀粉，稻米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠；或其它，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的交联羧甲纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或者海藻酸或其盐，如藻酸钠。
糖丸核可以具有适合的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以添加到片剂或糖丸包衣中用于识别或表征不同的活性化合物剂量的组合。
固体剂型可以是片剂形式(包括悬浮片剂，快熔片剂，咬-崩解片剂，快速崩解片剂，泡腾片剂或囊片)，丸剂，粉末剂(包括无菌包装粉末、可分配粉末或泡腾粉末)，胶囊(包括软或硬胶囊，例如由动物来源的明胶或植物来源的HPMC制成的胶囊或“淋洒胶囊(sprinkle capsule)”)，固体分散体，固溶体，可生物侵蚀剂型，控释制剂，脉冲释放剂型，多颗粒剂型，粒剂，颗粒剂或气雾剂。在另外的情况下，药物制剂是粉末形式。在又一些情况下，药物制剂是片剂形式，包括但不限于快熔片剂。另外，本文所述的药物制剂可以作为单胶囊或多胶囊的剂型施用。在一些情况下，药物制剂以两个、三个或四个胶囊或片剂施用。
药物固体剂型可包含本文所述的组合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，例如相容的载体，粘合剂，填充剂，悬浮剂，调味剂，甜味剂，崩解剂，分散剂，表面活性剂，润滑剂，着色剂，稀释剂，增溶剂，湿润剂，增塑剂，稳定剂，渗透促进剂，润湿剂，消泡剂，抗氧化剂，防腐剂或其一种或多种组合。在又一些方面，使用标准包衣程序，例如在Remington’sPharmaceutical Sciences，第20版(2000)中描述的那些。
用于固体剂型的适合的载体可包括但不限于阿拉伯胶，明胶，胶体二氧化硅，甘油磷酸钙，乳酸钙，麦芽糊精，甘油，硅酸镁，酪蛋白酸钠，大豆卵磷脂，氯化钠，磷酸三钙，磷酸氢二钾，硬脂酰乳酸钠，卡拉胶，甘油单酯，甘油二酯，预胶化淀粉，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素，蔗糖，微晶纤维素，乳糖，甘露醇等。
用于固体剂型的适合的填充剂可包括但不限于乳糖，碳酸钙，磷酸钙，磷酸氢钙，硫酸钙，微晶纤维素，纤维素粉末，葡萄糖，葡萄糖结合剂，葡聚糖，淀粉，预胶化淀粉，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)，蔗糖，木糖醇，乳糖醇，甘露醇，山梨醇，氯化钠，聚乙二醇等。
粘合剂赋予固体口服剂型制剂以粘结性：对于粉末填充的胶囊制剂，它们有助于栓塞形成，其可以填充到软壳或硬壳胶囊中，并且对于片剂制剂，它们确保片剂在压缩后保持完整，并且帮助确保在压缩或填充步骤之前的混合均匀性。适合用作本文所述的固体剂型中的粘合剂的材料包括但不限于羧甲基纤维素，甲基纤维素(例如)，羟丙基甲基纤维素(例如Hypromellose USP Pharmacoat-603)，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(Aqoate HS-LF和HS)，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素(例如)，乙基纤维素(例如)和微晶纤维素(例如)，微晶葡萄糖，直链淀粉，硅酸镁铝，多糖酸，膨润土，明胶，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物，交联聚维酮，聚维酮，淀粉，预胶化淀粉，黄蓍胶，糊精，糖，如蔗糖(例如)，葡萄糖，葡萄糖，糖蜜，甘露醇，山梨醇，木糖醇(例如)，乳糖，天然或合成树胶，如阿拉伯胶，黄蓍胶，印度胶(ghatti gum)，isapol壳的粘胶，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮(例如CL，CL，XL-10，和K-12)，落叶松阿拉伯半乳聚糖，聚乙二醇，蜡，海藻酸钠等。
用于固体剂型中的适合的润滑剂或助流剂可包括但不限于硬脂酸，氢氧化钙，滑石，玉米淀粉，硬脂基富马酸钠，碱金属和碱土金属盐，如铝，钙，镁，锌，硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸锌，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇，如CarbowaxTM，PEG 4000，PEG 5000，PEG 6000，丙二醇，油酸钠，山嵛酸甘油酯，棕榈酰硬脂酸甘油酯，苯甲酸甘油酯，月桂基硫酸镁或月桂基硫酸钠等。
用于固体剂型的适合的稀释剂可包括但不限于糖(包括乳糖，蔗糖和葡萄糖)，多糖(包括葡萄糖结合剂和麦芽糊精)，多元醇(包括甘露醇，木糖醇和山梨醇)，环糊精等。
用于固体剂型的适合的润湿剂可包括例如油酸，单硬脂酸甘油酯，脱水山梨醇单油酸酯，脱水山梨醇单月桂酸酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯，季铵化合物(例如Polyquat)，油酸钠，月桂基硫酸钠，硬脂酸镁，多库酯钠，三醋酸甘油酯，维生素E TPGS等。
用于固体剂型的适合的表面活性剂可包括例如十二烷基硫酸钠，脱水山梨醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，聚山梨酯，泊洛沙姆，胆汁盐，单硬脂酸甘油酯，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如(BASF)等。
用于固体剂型的适合的悬浮剂可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300至约6000、或约3350至约4000或约7000至约5400的分子量，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚山梨酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和阿拉伯胶，瓜尔胶，黄原胶类，包括黄原胶，糖，纤维素材料，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮等。
用于固体剂型的适合的抗氧化剂包括例如丁基化羟基甲苯(BHT)，抗坏血酸钠和生育酚。
用于口服施用的液体制剂剂型可以是选自包括但不限于药学上可接受的水性口服分散体，乳液，溶液，酏剂，凝胶剂和糖浆剂的组的水性悬浮体。参见，例如Singh等人，Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，第2版，第754-757页(2002)。另外，液体剂型可包含添加剂，例如：(a)崩解剂；(b)分散剂；(c)润湿剂；(d)至少一种防腐剂，(e)粘度增强剂，(f)至少一种甜味剂和(g)至少一种调味剂。在一些实施方式中，水性分散体可以进一步包含结晶抑制剂。
本文所述的水性悬浮体和分散体可以在如USP药师药典(2005版，第905章)中定义的均匀状态保持至少4小时。均质性应通过与确定整个组合物的均质性一致的取样方法来确定。在一个实施方式中，可以通过持续小于1分钟的物理搅拌将水性悬浮体再悬浮成均匀的悬浮体。在另一个方面，可以通过持续小于45秒的物理搅拌将水性悬浮体再悬浮成均匀的悬浮体。在又一个方面，可以通过持续小于30秒的物理搅拌将水性悬浮体再悬浮成均匀的悬浮体。在又一个实施方式中，不需要搅拌来维持均匀的水性分散体。
在另一个方面，剂型可包括微包封制剂。在一些实施方式中，一种或多种另外的相容性材料存在于微包封材料中。示例性材料包括但不限于pH调节剂，侵蚀促进剂，消泡剂，抗氧化剂，调味剂和载体材料，如粘合剂，悬浮剂，崩解剂，填充剂，表面活性剂，增溶剂，稳定剂，润滑剂，润湿剂和稀释剂。
可用于延迟包含本文所述化合物的制剂的释放的示例性微包封材料包括但不限于羟丙基纤维素醚(HPC)，例如或Nisso HPC，低取代羟丙基纤维素醚(L-HPC)，羟丙基甲基纤维素醚(HPMC)，如Seppifilm-LC，Metolose SR， -E，Opadry YS，PrimaFlo，Benecel MP824和Benecel MP843，甲基纤维素聚合物，如-A，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素Aqoat(HF-LS，HF-LG，HF-MS)和乙基纤维素(EC)及其混合物，如E461，-EC，聚乙烯醇(PVA)，如Opadry AMB，羟乙基纤维素，如羧甲基纤维素和羧甲基纤维素(CMC)的盐，如-CMC，聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物，如Kollicoat单甘油酯(Myverol)，甘油三酯(KLX)，聚乙二醇，改性食品淀粉，丙烯酸聚合物和丙烯酸聚合物与纤维素醚的混合物，如EPO，L30D-55，FS 30DL100-55，L100，S100，RD100，E100，L12.5，S12.5，NE30D和NE 40D，乙酸纤维素邻苯二甲酸酯，sepifilms，如HPMC和硬脂酸的混合物，环糊精，以及这些材料的混合物。
增塑剂可包括聚乙二醇，例如PEG 300，PEG 400，PEG 600，PEG 1450，PEG 3350和PEG 800，硬脂酸，丙二醇，油酸和三醋酸甘油酯，其掺入到微包封材料中。在另外的实施方式中，用于延迟药物组合物释放的微包封材料来自USP或国家处方集(NF)。在又一些实施方式中，微包封材料是Klucel。在再一些实施方式中，微包封材料是甲基纤维素。
微包封组合物可以通过本领域普通技术人员已知的方法配制。这样的已知方法包括例如喷雾干燥法，旋转圆盘-溶剂法，热熔融法，喷雾冷却法，流化床，静电沉积，离心挤出，旋转悬浮分离，液-气或固气界面处聚合，压力挤出，或喷雾溶剂萃取浴。除了这些之外，还可以使用几种化学技术，例如复合凝聚，溶剂蒸发，聚合物-聚合物不相容性，液体介质中的界面聚合，原位聚合，液体中干燥和液体介质中的去溶剂化。此外，也可以使用其它方法，例如辊压，挤出/滚圆，凝聚或纳米颗粒涂布。
鼻内制剂
鼻内制剂是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号4,476,116和6,391,452中。使用本领域中已知的苯甲醇或其它适合的防腐剂、碳氟化合物和/或其它增溶剂或分散剂，根据上述和本领域公知的其它技术制备的包含本文所述组合物的制剂制备为在盐水中的溶液。参见，例如Ansel，H.C.等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，第六版(1995)。优选地，用适合的无毒的药学上可接受的成分制备这些组合物和制剂。这些成分是制备鼻用剂型的技术人员已知的，并且这些成分中的一些可以在本领域的标准参考书，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005中找到。适合载体的选择高度取决于期望的鼻用剂型(例如溶液，悬浮体，软膏剂或凝胶剂)的确切性质。除活性成分外，鼻用剂型通常还含有大量的水。也可以存在少量的其它成分，例如pH调节剂，乳化剂或分散剂，防腐剂，表面活性剂，胶凝剂或缓冲剂和其它稳定和增溶剂。鼻用剂型应与鼻分泌物等渗。
对于吸入施用，本文所述的可以是气溶胶、轻雾或粉末的形式。本文所述的药物组合物使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它适合的气体，以来自加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀以递送计量的量来确定剂量单元。可以配制例如(仅举例而言)用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊和药筒，含有本文所述化合物与适合的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
治疗方案
可以施用组合物用于治疗应用或作为维持治疗，例如对于缓解期的患者。组合物可以每天一次，每天两次，每天三次或更多次施用。组合物可以每日，每天，每隔一天，一周5天，每周一次，每隔一周，每月两周，每月三周，每月一次，每月两次，每月三次或者更多次施用。组合物可以施用至少1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月，18个月，2年，3年或更多。
在其中患者状态确实改善的情况下，根据医生的判断，化合物的施用可以连续给予；或者，所施用的药物的剂量可以暂时减少或暂时中止一段时间(即“药物假期”)。药物假期的长度可以在2天和1年之间变化，包括(仅举例而言)2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或365天。药物假期期间的剂量减少可以是10％-100％，包括(仅举例而言)10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。
一旦已经发生患者病症改善，如果需要，施用维持剂量。随后，可以随症状将施用的剂量或频率或两者减少至保持改善的疾病、障碍或病症的水平。然而，患者可能在任何症状复发后需要长期间歇性治疗。
将对应于这样的量的给定试剂的量将根据以下因素而变化，例如具体化合物、疾病的严重性、需要治疗的受试者或宿主的特性(例如，体重)，但是仍然可以以本领域已知的方式根据病例周围的具体情况常规确定，包括例如所施用的具体药剂、给药途径和所治疗的受试者或宿主。期望的剂量可以以单一剂量或作为同时(或在短时间内)或以适当的间隔施用的分开的剂量方便地存在，例如每天两个、三个、四个或更多个亚剂量。
本文所述的药物组合物可以是适合于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有离散量的制剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊剂，以及小瓶或安瓿中的粉剂。水性悬浮体组合物可包装在单剂量、不可再封闭的容器中。或者，可以使用多剂量、可再封闭容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。仅举例而言，用于胃肠外注射的制剂可以存在于单位剂型(其包括但不限于安瓿)或多剂量容器中，含有加入的防腐剂。
上述范围仅仅是提示性的，因为关于个体治疗方案的变量的数量很大，并且这些推荐值的显著偏离并不罕见。这样的剂量可以根据大量变量而改变，不限于所用的化合物的活性、待治疗的疾病或病症、施用模式、个体受试者的需要、所治疗的疾病或病症的严重性以及医生的判断。
这样的治疗方案的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序测定，包括但不限于测定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50和ED50之间的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在具有最小毒性的循环浓度范围(包括ED50)内。剂量可以在该范围内变化，取决于所采用的剂型和所使用的施用途径。
根据本发明的另一个方面，提供了一种选择进行治疗的受试者的方法，其包括确定所述受试者是否患有由基因转录物中的内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导的疾病，其中在阳性确认后，选择所述受试者待进行治疗；和任选地治疗所述受试者。
治疗可包括改正基因转录物中的内含子保留。治疗可包括将根据本发明的多核酸聚合物与基因转录物杂交，以诱导从基因转录物去除内含子。
根据本发明的另一个方面，提供了使用反义多核酸聚合物通过癌细胞中内含子保留的改正而使基因表达正常化的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗或预防疾病的根据本发明的多核酸聚合物、根据本发明的组合物、根据本发明的载体或根据本发明的递送载体。
根据本发明的另一个方面，提供了用于生产治疗或预防疾病的药物的根据本发明的多核酸聚合物、根据本发明的组合物、根据本发明的载体或根据本发明的递送载体。
疾病可以是糖尿病或癌症。
在提及多核酸聚合物序列时，技术人员应理解序列中可以容许一个或多个置换，任选地，序列中可以容许两个置换，使得其维持与靶序列杂交的能力，或者在置换是在靶序列中的情况下，维持被识别为靶序列的能力。提及序列同一性，可以使用标准/默认参数通过BLAST序列比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)测定。例如，序列可以具有99％同一性并且仍然发挥根据本发明的作用。在另外的实施方式中，序列可以具有98％同一性并且仍然发挥根据本发明的作用。在另一个实施方式中，序列可以具有95％同一性并且仍然发挥根据本发明的作用。
当提及减少或改正内含子保留时，减少可以是完全的，例如100％，或者可以是部分的。减少可以是临床上显著的。减少/改正可以是相对于未治疗的受试者中的内含子保留水平，或者是相对于类似受试者的群体中的内含子保留的量。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少10％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少20％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少40％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少50％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少60％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少80％的内含子保留。相对于平均受试者或治疗前的受试者，减少/改正可以是少至少90％的内含子保留。
试剂盒/制品
本文提供了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。试剂盒可含有本文所述的多核酸聚合物中的一种或多种，例如识别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ IDNO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ IDNO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的多核酸聚合物。试剂盒还可含有一种或多种对于本文所述的多核酸聚合物反义的多核酸聚合物，例如，SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:39，SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47-434。试剂盒可以进一步含有构成和递送多核酸聚合物所必需的试剂和缓冲剂。
试剂盒还可包括被分隔以接收一个或多个容器(例如小瓶、管等)的载体、包装或容器，每个容器包含待用于本文所述的方法中的单独部件之一，例如多核酸聚合物和试剂。适合的容器包括例如瓶，小瓶，注射器和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。
本文提供的制品含有包装材料。药用包装材料的实例包括但不限于瓶，管，袋，容器，瓶以及适合于所选择的制剂和预期的施用和治疗模式的任何包装材料。
试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明，以及具有使用说明的包装插页。通常也将包括一组说明。
技术人员应理解，在适当的情况下，本发明的一个实施方式或方面的任选的特征可适用于本发明的其它实施方式或方面。
现将参照附图，仅举例而言，更详细地描述本发明的实施方式。
实施例
这些实施例仅提供用于说明目的，而非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1
大多数真核基因含有必须准确地从初级转录物中去除以产生能够编码蛋白质的功能性mRNA的间插序列或内含子(1)。该过程以高度动态的方式改变mRNA组成，其利用五种小核RNA和大量蛋白质与前mRNA中保守但简并的序列的相互依赖的相互作用(2)。内含子剪接通常促进跨种类的mRNA累积和蛋白质表达(3-5)。这个过程可以通过内含子突变或变体而改变，这也可以削弱偶联的基因表达途径，包括转录、mRNA输出和翻译。这通过5’非翻译区(5’UTR)中的内含子而最好地示例，其中改变内含子保留的天然变体或突变改变具有上游开放阅读框(uORF)或其他调节基序的转录物的相对丰度并显著影响翻译(6，7)。然而，尚未开发出在这类情况下使基因表达正常化的成功的序列特异性策略。
剪接转换寡核苷酸(SSO)是通过结合剪接位点识别或调节序列并与顺式和反式作用因子竞争其靶标来调节内含子剪接的反义试剂(8)。它们已经显示为恢复异常剪接、改变现有mRNA的相对表达或产生不正常表达的新型剪接变体(8)。通过大量SSO修饰(例如2’-O-甲基和2’-O-甲氧基乙基核糖)提高靶向SSO-RNA双链体的稳定性促进了探索其对于越来越多的人类疾病基因的治疗潜力的研究，包括肌肉营养不良中的DMD(9，10)、脊髓性肌萎缩中的SMN2(11)、共济失调-毛细血管扩张症中的ATM(12)和X连锁无丙种球蛋白血症中的BTK(13)。虽然这些方法接近于实现其对有限数量的疾病的临床潜力(8)，但由突变诱导的异常剪接(14)所导致的>300种孟德尔病症和越来越多的复杂性状可能适合于SSO介导的基因表达的改正。
1型糖尿病的病因学具有由人白细胞抗原(HLA)和多种修饰性非HLA基因座赋予的强遗传成分(15)。在染色体11上的胰岛素原基因(INS)区域(称为IDDM2)中鉴别到最强的修饰子(15)。这一区域的进一步作图表明INS是最可能的IDDM2靶标(16)，与这种自身抗原在发病机制中的关键作用一致(17)。在IDDM2处对于这种疾病的遗传风险已归因于与易感性和保护性INS单倍型的差异稳态RNA水平，可能涉及该基因上游的小卫星DNA序列(18，19)。然而，对天然存在的INS多态性的系统性检验揭示了没有小卫星序列的报告基因构建体中单倍型特异性胰岛素原表达水平，其由内含子1(7)中称为IVS1+5ins4(也称为rs3842740或INS-69)和IVS1-6A/T(rs689，INS-27或HphI+/-)的两个变体所导致(16，20)。前一个变体激活内含子1的隐蔽5’剪接位点，而位于3’剪接位点(3’ss)上游6个核苷酸的后一个变体的腺嘌呤(A)促进内含子保留，从而增加具有延伸的5’UTR的转录物的相对丰度(21)。与胸腺嘧啶(T)相比，IVS1-6A/T的A等位基因在体外降低了对嘧啶结合蛋白的亲和力，并使3’ss更依赖于U2小核核糖核蛋白的辅助因子(U2AF)(7)(U2结合、剪接体组装和3’ss选择所需的异源二聚体(22))。含内含子1的转录物在从产生胰岛素的组织制备的IVS1-6A衍生cDNA文库中过度表现(21)，从核排出(23)，并含有与高等灵长类中内含子1的3’ss的弛缓共同进化的短的人亚科特异性uORF(7)。由A等位基因赋予的更低的胰岛素原表达可能导致胰岛素原肽在胎儿胸腺中的次优表现和自身反应性T细胞的不充分负向选择，最终导致胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏(7)。然而，尚未尝试改正从含有IVS1-6A的前mRNA中去除INS内含子1的低效率，并将内含子保留降低至针对疾病保护性T等位基因所观察到的水平。
本研究开始寻找在前mRNA中增加INS内含子1剪接效率并抑制剪接沉默子或诱饵剪接位点以增强胰岛素原表达的SSO。鉴别了降低内含子1保留的转录物的相对丰度的SSO，证明以单核苷酸分辨率描述优化的反义靶标，并且显示了邻近反义靶序列的平行G-四链体的形成以及结合该区域的蛋白质的鉴别的证据。
材料和方法
反义寡核苷酸
SSO购自MWG Biotech(德国)。所有SSO和乱序对照具有在第二核糖位置带有2’-O-甲基核糖核苷酸的全长硫代磷酸酯骨架。除了INS SSO及其乱序版本之外，我们使用靶向其它人类基因的SSO作为另外的对照控制，如(13)所述。每个SSO的位置如图1A所示，且其序列见表2。
剪接报告基因构建体
此前报道了称为IC的携带1型糖尿病相关单倍型的野生型剪接报道体(7,21)。每个构建体都含有所有INS外显子和完整的内含子，但最后的外显子的长度不同。使用引物D-C、D-F和D-B克隆IC报道体；IC D-B缺乏内含子2的隐蔽3’ss。与IC D-C相比，剪接至该位点的异构体的相对丰度对于IC DF较低(7,21)。为了测试靶向内含子1的隐蔽5’剪接位点的SSO，通过在rs3842740处的4-nt插入修饰IC构建体，以产生称为ICIVS1+5ins4的报道体。此前报道了TSC2和F9构建体(24)。质粒在大肠杆菌菌株DH5α中扩增，并使用Wizard Plus SVMiniprep试剂盒(Promega，USA)提取质粒DNA。它们的插入片段进行完全地测序以确认14个基因内天然变体中每一个的身份，并排除不期望的突变。
细胞培养和转染
在Dulbecco氏改良Eagle培养基、10％胎牛血清和青霉素/链霉素(Lifetechnologies，USA)中培养人胚肾293(HEK293)、人肝细胞肝癌HepG2和非洲绿猴COS7细胞。如(13)所述，根据制造商的建议使用jetPRIME(Polyplus，USA)进行瞬时转染。如此前报道的(7，25)，用两次小干扰RNA(siRNA)U2AF35ab攻击来通过RNA干扰(RNAi)下调U2AF35以诱导内含子1的隐蔽3’ss；靶向DHX36的siRNA双链体如所述的(26)。在添加SSO和/或报道体之前24小时应用第二次攻击。在加入报告基因构建体之后24小时收获细胞培养物。
剪接产物分析
用TRI试剂提取总RNA，并用DNA酶(Life technologies，USA)处理。使用寡(dT)15引物和莫洛尼鼠病毒逆转录酶(Promega，USA)逆转录第一链cDNA。如此前报道的(7)，用载体特异性引物PL3和靶向3’UTR的引物E的组合进行聚合酶链反应(PCR)。在聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，并如所述的(27)测量其信号强度。通过Sanger核苷酸测序证实每种mRNA异构体的身份。
圆二色性和核磁共振谱
用于圆二色性(CD)和核磁共振(NMR)的寡核糖核苷酸购自Thermo Scientific，根据制造商的说明去保护，冻干并储存在-20℃下。通过在milliQ水或KCl缓冲液(100mM KCl，10mM K2HPO4/KH2PO4，pH 7.0，milliQ水)中重悬浮至2-4μM的终浓度，从脱盐的冻干样品制备储备溶液。使用配备有LTD6G循环水浴(Grant Instruments，UK)和热电温度控制器(Melcor，USA)的PiStar-180分光光度计(Applied Photophysics Ltd，Surrey，UK)获得CD谱。将样品在小室中加热至95℃总共15分钟，然后通过使样品冷却至室温最少4小时时间来将样品退火。使用1cm路径长度的无应变石英比色杯在215-340nm波长范围内并在指示温度下记录CD谱。以1nm间隔记录数据点。使用3nm的带宽，并且在使得能够自适应采样的情况下在每个点获取5000计数。每条迹线显示为三次扫描的平均值(±SD)。在对应于折叠的四倍体物质的带最大值的265nm处获得CD温升。使用5至99℃的范围，以0.5℃的间隔获得点，在0.5℃的增量之间时间步长为120-180s。点以10,000计数获得，并使得能够自适应采样。比较加热和冷却研究以检查滞后和总体可逆性。使用具有三重共振冷冻探针的BrukerAvance III谱仪在800MHz下收集NMR谱(1H)。使用标准Bruker采集参数。使用Topspin(3.0版)收集数据并在CCPN分析(2.1版)中处理。
拉下实验和蛋白质印迹法
使用MEGAshortscript TM T7(Life Technologies，USA)以及用引物5’-ATTAATACGACTCACTATAGGGCTCAGGGTTCCAGG和5’-TGCAGCAGGGAGGACG和作为模板的所示质粒的DNA扩增的T7标记的PCR产物进行体外转录。所示的合成RNA购自Eurofins UK。500pmol的每种RNA用5mM m-高碘酸钠处理，并结合于己二酸二酰肼琼脂糖珠(adipic aciddehydrazide)(Sigma，USA)。具有结合的RNA的珠在2ml的2M NaCl中洗涤3次，并在缓冲液D(20mM HEPES-KOH，pH 7，6.5％体积/体积甘油，100mM KCl，0.2mM EDTA，0.5mM二硫苏糖醇)中洗涤3次，与HeLa核提取物和具有终浓度为0.5mg/ml的肝素的缓冲液D一起温育。用缓冲液D洗涤未结合的蛋白质5次。在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离结合的蛋白质，通过考马斯蓝染色和/或对于硝酸纤维素膜进行印迹分析。
如所述的(7)进行蛋白质印迹分析。抗体购自Sigma(hnRNP E1/E2，产品号R4155，U2AF65，产品号U4758，和SFRS2，产品号S2320)，Abcam(DHX36，产品号ab70269)和Millipore(SC35，克隆1SC-4F11)。由教授Douglas Black，UCLA提供针对hnRNP F和hnRNP H的抗血清。
质谱分析
在胰蛋白酶消化后，将样品冷冻干燥，并用25μl 5％ACN/0.1％甲酸重悬浮用于质谱(MS)。通过LC/MS/MS使用Surveyor LC系统和LCQ Deca XP Plus(ThermoScientific)对肽进行分析。使用MassMatrix文件转换工具(2.0版；http://www.massmatrix.net)将原始数据文件转换成mascot通用文件，以输入到Mascot搜索算法(Matrix Science)中。
酶学结构探测
使用有限的V1RNA酶(Ambion)、T1RNA酶(Ambion)和S1核酸酶(Fermentas)消化进行的RNA二级结构测定已在其他地方详细描述(28)。简而言之，将来自插入(ins)和缺失(del)前mRNA的RNA的1μg试样在30℃下在100μl中用0.002U RNA酶V1、0.05U RNA酶T1和19US1核酸酶消化10分钟。使用无酶试样作为对照(C)。使用在5’端用[32P]-ATP标记的反义引物，根据标准方案将切割的RNA逆转录。
结果
促进5’UTR中弱内含子的前mRNA剪接的反义寡核苷酸
为了鉴别能够减少INS内含子1的保留并增加剪接介导的翻译增强的SSO，我们设计了一系列2’-O-甲基修饰的硫代磷酸酯SSO，在HEK293细胞中单独地共表达每个SSO与携带单倍型IC的剪接报告基因构建体，并检查外源mRNA产物的相对丰度(图1A和B)。报道体中的IC单倍型没有小卫星序列，并且包含总共14个多态性位点(7，20)，包括rs689的A等位基因。该等位基因抑制内含子1剪接，并且与更常见的T等位基因相比产生较低的胰岛素原水平(21)。在这些序列此前的系统性缺失分析(7)中显示出外显子包含或内含子保留的最明显改变的区域中选择靶向内含子1和外显子2的SSO。外显子3中的SSO位于内含子2的真实3’ss和下游126nt的强竞争性隐蔽3’ss之间，以鉴别改变其使用的前mRNA基序(图1A)。在HEK293细胞中测试的15个INS SSO的初始集合中，11个显示mRNA异构体的相对丰度的可再现的改变(表2)。内含子1保留通过单寡核糖核苷酸SSO21显著减少(P<0.01，Mann-Whitney秩和检验；图2A)。SSO21靶向内含子1的位置59-74，包括此前发现在缺失后赋予内含子保留的最大减少的基序(称为del5)(7)。由SSO21诱导的内含子保留水平的降低是剂量依赖性的(图2A)，并且也在HepG2细胞和黑脸绿猴(Chlorocebus aethiops)COS7细胞中观察到，与使用辅助剪接序列的剪接体成分的普遍存在的表达和高度进化保守性相一致(1，2)。除了减少内含子1保留，SSO21促进内含子2的隐蔽3’ss(图2A)。然而，对于其它INS SSO和乱序对照(图3和表2)也观察到这种效应，表明非特异性的相互作用。为了证实SSO21诱导的内含子1剪接的增强不被内含子2的隐蔽3’ss促进，我们与缺少该位点并且仅保留外显子3的前89个核苷酸的较短报道体共转染该SSO。图2B显示SSO21能够以与具有较长外显子3的报道体相同的程度促进内含子1剪接。相反，对于缺少del5区段的报道体，没有观察到SSO21诱导的内含子保留的减少。除了内含子保留，对于5个SSO(包括在内含子1的隐蔽3’ss下游结合的SSO8)观察到外显子2跳读的增加(cr3’ss+81；图1和3C，表2)。这种隐蔽3’ss通过RNAi介导的U2AF的小亚基(U2AF35)的耗尽而诱导，并且在缺少U2AF35的细胞中不通过桥接寡核糖核苷酸(SSO4)逆转；而是观察到外显子2跳读(图3C)。U2AF35的耗尽也抑制内含子2的隐蔽3’ss。总的来说，鉴别了在几种灵长类细胞系中减少INS内含子1保留的单个SSO。
在单核苷酸水平上内含子保留靶标的优化
有趣的是，设计为靶向del5区段的其他SSO不减少内含子1保留，除了SSO20的小的作用(图1A和2A)。为了测试在SSO21侧翼的核苷酸的重要性并且为了以单碱基分辨率对最佳靶标作图，在该区域进行详细的反义微行走。INS报道体单独地与SSO21的5’和3’的另外18个16聚体结合的1-9个核苷酸将共转染到HEK293细胞中，并检查其RNA产物。内含子1保留最受SSO21和在每个方向上移位1-2个核苷酸的SSO抑制(图4)。与初始筛选一致，在四个C的上游运行中靶向多于一个胞嘧啶的SSO(C4，参见SSO1和SSO2，图1A)不是有效的(SSO21-3r至SSO21-10r，图4)。在相反的方向，靶向通常在内含子剪接增强子中发现(29-31)的连续G的SSO增加内含子保留。因此，用于减少INS内含子1的保留的最佳反义靶标以单核苷酸分辨率映射到此前通过整个内含子的系统性缺失分析鉴别为最抑制的区域(7)。
内含子保留的反义靶标与平行RNA四链体相邻
注意到靶标夹在预测形成稳定的RNA鸟嘌呤(G)四链体的两个内含子区段之间(内含子1核苷酸36-61和78-93；图4A中突出显示)。这些结构通过堆叠由以循环的Hoogsteen氢键排布方式组织的四个G组成的G-四分体(G-quartet)来产生(32)，并且已经涉及重要的细胞过程，包括复制、重组、转录、翻译(33，34)和RNA加工(35-39)。为了测试它们是否在体外形成，将源自该区域的合成核糖核苷酸用于已经广泛用于体外表征DNA和RNA四链体结构的CD谱分析中(40-43)。在25℃下在215和330nm之间记录的下游19聚体的CD谱(称为CD1)在265nm处显示强正椭圆率，且在约240nm处具有负强度，指示平行四链体(图5A)。为了确认四链体而非其他稳定的二级结构基序的存在，在5℃和95℃下记录UV吸收谱。在两个温度处(低于和高于熔化转变点)的UV吸收差异光谱显示在～295nm处的特征性增色位移及在240nm和280nm处的双重最大值，提供体外形成稳定的平行链RNA四链体的证据。这通过CD1的1H NMR研究证实(图5B)，其显示在10和12ppm之间的信号的特征性包络，对应于G-四联体结构内的Hoogsteen H键合的G。通过CD进行的热稳定性测量产生高度可逆的S形合作性解开转变，Tm＝56.8±0.2℃(图5C)。图5D(上图)显示19聚体到通过1-4个核苷酸的相对短的环序列连接的两个堆叠的G-四联体的可能排列。
INS内含子1中剪接抑制序列的构象转变模型
源自反义靶标上游的区域的合成20聚体的CD(称为CD2)也显示出稳定结构形成的证据，给出以270nm为中心的更宽的吸收包络和S形热解开转变(Tm＝69.0±0.45℃；图5A)。与下游寡聚CD1不同，在热示差谱中没有发现UV中的增色位移。然而，不同于CD1的在12和14ppm之间的1H NMR谱中的一组明确的尖锐信号显示双链RNA特征性的沃森-克里克H-键合碱基对的形成(图5B)。使用Mfold的重叠内含子区段的二级结构预测表明前mRNA形成稳定的局部茎-环；其中一个通过增加内含子1保留的G→C突变(称为G2；图5D，下图)而进一步稳定(7)。位于更下游且使四链体结构失稳定的另一个G→C置换(称为G3)(图5D，上图)也抑制内含子剪接(7)。最后，在单核苷酸多态性处含有A或G的CD2寡核苷酸(图4A和(20))显示非常相似的CD谱，具有明确的解链转变和Tm值，表明G和A等位基因形成相同的结构。
为了进一步测试内含子剪接中标准和非标准结构之间的暂时平衡的重要性，使用了CD、NMR和诱变实验的组合(图6)。合成包含内含子保留靶标的5’端的寡核糖核苷酸CD3，并预测茎-环/四链体(图4A和6A)。还合成了突变形式的CD4，其携带两个C→U转变，这使发夹失稳定，但保持四链体的稳定性。在转染到HEK293细胞中的IC报告基因构建体中也引入相同的突变。CD3的NMR谱揭示了平衡的G-四联体和标准碱基配对发夹结构(称为H1和H2)两者的信号共存(图6B和C)。通过向含有100mM KCl的缓冲溶液中加入2mM和然后6mM MgCl2来研究Mg2+对四链体和发夹之间的构象平衡的影响。如Bugaut等人(57)所报道的，构象平衡没有被在KCl的存在下加入Mg2+而显著地扰乱。因此，我们观察到RNA发夹和四链体结构在模拟其中K+和Mg2+离子以高浓度存在的细胞环境的环境中的形成。CD熔解曲线显示宽的转变(Tm＝79.9℃)，与具有不同稳定性的多个构象状态一致。CD4中的CC→UU突变导致H1的NMR信号丢失(图6B)，并且Tm降低13℃，这与更稳定的发夹H1的选择性去稳定化一致，导致与四链体平衡的H2群体的增加。瞬时转染显示CC→UU突变改善内含子1剪接，而预测使四链体和发夹两者失稳定的称为M1的突变仅具有小的影响(图6D，表1A)。
为了研究这些结构的平衡如何更系统地影响内含子剪接，制备了一系列突变的构建体以使预测的四链体、H1/H2结构和两个胞嘧啶运行失稳定/保持(表1A)。它们的转录物显示内含子保留水平的显著性差异(图7；P＝0.0001，基于秩的Kruskal-Wallis单因素ANOVA)。首先，G-四链体的消除增加内含子1保留，其通过除去每个胞嘧啶运行而被进一步增强(比较突变4-6与野生型，P＝0.0004)。这些突变似乎对内含子保留具有累加效应(比较野生型与突变1或9；3相对于2和4相对于5)。其次，在不存在G-四链体的情况下增加的内含子保留不通过去除H1和H2而改变，但它们的消除增强了外显子跳读(比较突变4对于6的异构体2)。第三，当仅存在两个C4运行中的一个时，H1的去除稍微改善内含子1剪接(比较8与9)，这和内含子保留与所测试的RNA的预测稳定性之间统计学显著的相关性一致(图7B)。内含子剪接的效率因此由平衡的标准和非标准结构之间的构象转变控制。
表1A.在质粒构建体中改变预测的RNA G四链体、茎环和两个胞嘧啶运行的INS内含子1突变
在获胜SSO靶向的区域中的蛋白质-RNA相互作用
为了鉴别与包含反义靶标和/或相关的标准和非标准结构的RNA相互作用的蛋白质，使用野生型和从T7标记的PCR产物转录的del5RNA、代表靶序列的合成RNA(CD5)和称为AV3的含有3’ss CAG的对照寡聚物进行拉下实验。蛋白质印迹显示野生型和del5转录物两者都结合hnRNP F/H，但是对于CD5不存在该结合(图7C)。与仅有珠的对照相比，这些蛋白质也通过来自野生型和del5RNA的下拉凝胶的差异染色片段的MS/MS分析检测。针对SRSF2的两种抗体，其在几种SR蛋白中显示出对于推定的结合活性的最高评分，未能检测任何特异性相互作用(图7C)。尽管对于del5，来自构成哺乳动物细胞中主要的聚(C)结合活性(44)的hnRNP E1/E2的信号高于背景(图7C)，但在缺乏hnRNP E1/E2的细胞中没有观察到内含子保留的变化。
在DHX36耗尽时富G和贫G报道体的剪接模式
RNA G-四链体结合解旋酶DHX36，其能够将四链体RNA转化为稳定的双链体，并且是HeLa细胞中四链体分解活性的主要来源(26，45)。DHX36与ATM前mRNA中的内含子剪接增强子交联(46)，并且可以解开TERC的5’区域内的四链体结构(26)。为了测试DHX36耗尽是否可以影响INS剪接，将贫和富G-四链体的报道体瞬时转染(图8A，表1)到耗尽的细胞中。选择对照构建体以给出剪接产物的近似相等的表现，其通过使分支位点弱化而实现(24)，从而提供灵敏的离体剪接试验。然而，尽管存在有效的DHX36耗尽(图8B)，但在短或长的构建体中均没有看到INS内含子1保留的统计学显著的改变，我们也没有在贫G和富G对照中观察到大的变化(图8C-E)。这些结果与此前在DHX36耗尽细胞中下调的转录物中四链体序列的显著富集的缺乏(47)及不存在对敲低的ATM反应相一致(46)。
INS内含子1的群体特异性隐蔽5’剪接位点的SSO诱导抑制
除rs689外，INS内含子1剪接受到位于天然5’ss附近的rs3842740处的多态性TTGC插入的影响(21)。这种插入存在于所有非洲人染色体的四分之一中，但在白种人的IC单倍型上不存在(20)。该插入激活下游的隐蔽5’(图1A)，将所得mRNA的5’UTR进一步延伸26个核苷酸并抑制胰岛素原表达(7，21)。为了测试新的5’ss是否可以被SSO有效抑制，将相同的插入引入到IC构建体中以及与称为SSO10的桥连寡核糖核苷酸共表达的野生型和突变报道体中。尽管隐蔽剪接受到抑制，但内含子1的标准剪接即使在高SSO10浓度下也不完全恢复，最可能是通过该插入而弱化的真实5’ss的次优识别的结果。
为了在存在和不存在该插入的情况下获得对5’UTR序列的折叠的初步了解，使用用单链和双链特异性RNA酶进行的部分RNA消化进行酶学结构探测。对于野生型RNA检测的总体切割位置和强度与mfold预测总体上一致，其中两个主要茎环区域(SL1和SL2)被几个内部凸起中断。结构探测和mfold预测都表明在rs3842740处的插入延伸了在SL1中的中央凸起，因为与SL1的其余部分和SL2相比，该区域中T1和S1切割的数量增加。最后，转录物不在显示四链体体外形成的区域中被RNA酶V1消化。
讨论
INS内含子1的剪接沉默子中的反义内含子保留靶标
在此，显示了首次使用反义技术减少成熟转录物中整个内含子的保留并且使用SSO改变单倍型依赖性INS表达。通过内含子1的系统性诱变(7)和通过宏观(图1)和微行走(图4)策略，促进补偿rs689处的A等位基因对有效RNA加工的不利影响的获胜SSO的鉴别。有趣的是，靶序列含有串联CAG(G/C)基序，其类似于3’ss共有序列(consensus)(图4)。这样的“假受体”此前实验性地涉及剪接位点抑制(27)，并且在剪接沉默子中过度表现。例如，这两个四聚体在高可信的102个内含子剪接沉默子中更常见(49)，并且在通过随机10聚体的荧光激活筛选鉴别的109个增强子中耗尽(50)。在QUEPASA剪接沉默子中，YAG基序也比预期的更加频繁(51)，表明它们是保留靶标的重要功能成分。中间胞嘧啶序列也可以发挥重要作用，因为QUEPASA沉默子中的C4运行的频率比预期的高～2倍。这些基序也在通过在相对于所测试的3’ss的-62/-51位置处插入的序列的系统性筛选所鉴别的内含子剪接调节元件的4％中发现(52)。这项研究鉴别了称为ISS22的元件(AAATAGAGGCCCCAG)，其与最佳内含子保留靶SFI共同具有3’九聚体(下划线)。然而，不同于AV3的最佳3’ss识别序列，我们进行的与蛋白质印迹法偶联的拉下实验仅显示对于U2AF65非常弱(如果有)的结合(图7C)。
RNA加工控制中四链体与发夹之间的构象转变
反义靶标正好在潜在G-四链体形成RNA的上游鉴别，其结构随后通过CD和NMR分析证实(图1A和5)。RNA四链体比其DNA对应物更稳定，已经越来越多地涉及RNA代谢的调节(33，34，41，42)，并为药物开发提供了独特的途径(53)。2-四分体四链体在热力学上比其3-或4-四分体对应物更不稳定，并且可能在动力学上更易变化，但它们仍然表现出显著的稳定性，并且可以用于响应于细胞环境在四链体和非四链体结构之间更加顺应和动态的切换(54-56)。获胜SSO可以阻断与反式作用因子的相互作用，改变更高级的结构，RNA-蛋白复合物形成的速率，或者损害2-四分体四链体与H1/H2之间的构象转变(图5)。最近已经对于自始未预测的四链体描述了类似的转变(57)，提高了富G的内含子1中另外的序列可能参与反义靶标附近的平衡的可能性，可能涉及多个四链体基序和竞争性茎-环。
显示在hnRNP F/H耗尽后增加的内含子1保留和对hnRNP F/H过表达的相反作用的结合(图7C)和功能实验(7)表明这些蛋白质与该内含子中的关键剪接辅助序列相互作用。与此前结论是hnRNP F直接结合RNA四链体的报道(58)相反，已经显示hnRNP F通过排他地结合单链G序列阻止RNA四链体形成(59)。基于灵长类基因组的预测表明大多数推定的四链体可能折叠成标准结构(60)。这些蛋白质降低前mRNA占据，推测促进四链体形成(59)，并潜在地降低剪接效率。
偶联的剪接和翻译基因表达控制中的RNA四链体
RNA四链体在～8.0％的5’UTR中被预测，并且被提出其充当通用的翻译抑制剂(60，61)。INS内含子1被弱剪接并且是U2AF35依赖性的(7)，并且显著部分的含内含子1的转录物被从细胞核输出(23)。这表明由CD1形成的RNA G-四链体可以影响这些mRNA的翻译，其含有对人亚科具有特异性的三氨基酸uORF(7)。该uORF明显抑制胰岛素原表达，并且正好位于几个碱基对的下游，提示G-四链体可通过隔离uORF来促进翻译的概念。内部核糖体进入位点的活性需要功能性2-四分四链体(54)。
表1.报告基因构建体中预测的RNA G-四链体的密度
a如所述的(78)计算非重叠四链体序列的长度及其G评分。
剪接位点选择中的依赖性的反义策略
除了标准mRNA异构体4之外，已经在从来自产生胰岛素的组织的cDNA文库中得到的表达序列标签数据库中发现了异构体2、3和6(图1B)(21)。这表明由报告基因构建体产生的隐蔽剪接位点在体内被识别，并且我们的单倍型依赖性报道体系统在培养的细胞中精确地重现这些事件，不管细胞是否表达内源性胰岛素。除了抑制保留内含子1的转录物之外，最佳SSO增加了外显子3的隐蔽3’ss的利用(图2)。这种不期望的作用可以通过相邻外显子和内含子的剪接的协同来解释，其此前针对个体基因和在全局上观察到(63-67)。此外，G丰富的下游转录起始位点已经与RNA聚合酶II暂停位点相关联(68)。虽然内含子2的两个强竞争的3’ss可能响应于影响RNA折叠的非特异性信号(图3，表2)，但其可能缓解观察到的依赖性并在连接的剪接位点处使用SSO组合减少隐蔽3’ss激活并检查其协同作用或拮抗作用，从而受益于使用与小基因相反的全基因构建体。
多功能反义寡核苷酸以减少INS内含子1的保留
自从首次使用2’-O-甲基-硫代磷酸酯SSO(69)，这种类型的化学修饰已经成功地用于许多体外和体内应用(9，10，70)。为了进一步微调mRNA异构体的表达，可以设计优化的SSO以将适合的反式作用剪接因子束缚到它们的靶序列上(11，71)。该体系的明显候选物是U2AF35，因为内含子1由于高等灵长类中3’ss的驰缓而是弱的，并且由rs689处的A等位基因进一步削弱，这使得该内含子是高度U2AF35依赖性的(图3)(7)。除了U2AF35之外，未来的双功能或多功能反义策略可以采用此前显示影响INS内含子1和外显子2剪接的剪接因子(例如Tra2β或SRSF3)的结合平台(7)。Tra2β可能结合SSO6靶标，其与末端环中有效的GAA剪接增强子形成预测的稳定的发夹结构(图3B)。SRSF3是内含子2的隐蔽3’ss的抑制所需要的(7)，并且结合具有共有序列(A/U)C(A/U)(A/U)C的富嘧啶序列(72)。与SRSF3的RNA识别基序相互作用的CAUC基序(73)正好存在于隐蔽3’ss的上游。
使人类遗传疾病中的内含子保留水平正常化
这些结果提供了使用非遗传方式补偿来自易感1型糖尿病的单倍型的较低效的剪接和较低INS表达的机会。
常见变体例如rs689在很大程度上造成了复杂性状(包括自身免疫性疾病)的遗传性(74)，但它们的功能和结构后果在很大程度上是未知的。如果优化的INS SSO可以被安全和有效地引入到发育的胸腺中，这种途径可以提供新型预防方法以促进对1型糖尿病中的主要自身抗原的耐受性。对于这样的干预，最明显的候选者是在HLA和INS基因座两者处疾病易感性等位基因纯合的受影响儿童的母亲。这样的基因型与兄弟姐妹的极高疾病风险相关(75)。除了1型糖尿病的初步预防之外，未来基于SSO的治疗可能应用于在诊断时具有显著的残留β-细胞活性的患者以及适合接受β-细胞移植的患者，并且可以受益于增加的来自移植细胞的胰岛素原表达的内含子介导的增强。还可以设想通过利用多功能SSO靶向多个剪接调节基序，通过内含子剪接和胰岛素原表达更显著的增强对其它糖尿病患者使用这种治疗模式。SSO可以在胸腺上皮细胞和13-细胞中具有效用，其可以提供用于测试它们对外源和内源胰岛素原表达的影响的更自然的系统。最后，类似的反义策略可以帮助减少由剪接因子基因的体细胞突变导致的癌细胞中的普遍内含子保留，如骨髓增生性疾病中U2AF35的锌指结构域中的特定置换所说明的(76)。
在恶性细胞中减少内含子保留
使用来自复制的、polyA选择的样品的RNAseq数据选择优先保留在U2AF缺陷型HEK293细胞中的一组146个内含子序列，然后在基因组浏览器中检查每个内含子保留事件。这些序列使用RepeatMasker的灵敏版本(可从http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker获得)进行重复掩蔽。因为用于减少INS内含子1保留的最佳反义靶标[Kralovicova J等人，(2014).Nucleic Acids Res doi：10.1093/nar/gku507，公布于2014年6月17日]与在哺乳动物中保守的内含子剪接调节元件重叠[Yeo GW等人，(2007).PLoSGenet 3：e85]，包括CCCAG、AGGCC(Kralovicova等人，2014中的图4)，含有这些短的五聚体至七聚体基序的内含子区段中的反义靶标和独立来源的内含子剪接调节基序组[VoelkerRB，&Berglund JA(2007).Genome Res 17：1023-1033]被选择，从而增加了寡核苷酸与这些靶标相互作用以影响RNA加工的机会。靶序列经历常规反义寡核苷酸设计，包括去除含有C运行的序列以避免G-四链体形成。5’和3’剪接位点两者、多聚嘧啶序列、分支位点和超分支区域的附近也被避免。该选择产生388个化合物的集合(表3)，覆盖U2AF敏感性内含子总长度的～15％并且代表所有人内含子序列的～0.001％。因此，使这组寡核苷酸靶区域对于U2依赖性内含子的剪接抑制性序列富集，其没有从维持U2途径中的突变或缺失的恶性细胞中的辅助因子获得足够的帮助。
胰岛素相关序列
候选SSO序列
注：用“*”标记的候选者是在图4中讨论的获胜寡聚物
CD5
RNA形式-CUGCAGAGCUGGGGCCUG(SEQ ID NO:1)
DNA形式-CTGCAGAGCTGGGGCCTG(SEQ ID NO:2)
结合caggccccagcucugcag(SEQ ID NO:3)
SSO21*
RNA形式-UGCAGAGCUGGGGCCU(SEQ ID NO:4)
DNA形式-TGCAGAGCTGGGGCCT(SEQ ID NO:5)
结合aggccccagcucugca(SEQ ID NO:6)
SSO21-2r*
RNA形式-GCAGAGCUGGGGCCUG(SEQ ID NO:7)
DNA形式-GCAGAGCTGGGGCCTG(SEQ ID NO:8)
结合caggccccagcucugc(SEQ ID NO:9)
SSO21-3r
RNA形式-CAGAGCUGGGGCCUGG(SEQ ID NO:10)
DNA形式-CAGAGCTGGGGCCTGG(SEQ ID NO:11)
结合ccaggccccagcucug(SEQ ID NO:12)
SSO21-4r
RNA形式-AGAGCUGGGGCCUGGG(SEQ ID NO:13)
DNA形式-AGAGCTGGGGCCTGGG(SEQ ID NO:14)
结合cccaggccccagcucu(SEQ ID NO:15)
SSO21-5r
RNA形式-GAGCUGGGGCCUGGGG(SEQ ID NO:16)
DNA形式-GAGCTGGGGCCTGGGG(SEQ ID NO:17)
结合ccccaggccccagcuc(SEQ ID NO:18)
SSO21-6r
RNA形式-AGCUGGGGCCUGGGGU(SEQ ID NO:19)
DNA形式-AGCTGGGGCCTGGGGT(SEQ ID NO:20)
结合accccaggccccagcu(SEQ ID NO:21)
SSO21-7r
RNA形式-GCUGGGGCCUGGGGUC(SEQ ID NO:22)
DNA形式-GCTGGGGCCTGGGGTC(SEQ ID NO:23)
结合gaccccaggccccagc(SEQ ID NO:24)
SSO21-8r
RNA形式-CUGGGGCCUGGGGUCC(SEQ ID NO:25)
DNA形式-CTGGGGCCTGGGGTCC(SEQ ID NO:26)
结合ggaccccaggccccag(SEQ ID NO:27)
SSO21-9r
RNA形式-UGGGGCCUGGGGUCCA(SEQ ID NO:28)
DNA形式-TGGGGCCTGGGGTCCA(SEQ ID NO:29)
结合uggaccccaggcccca(SEQ ID NO:30)
SSO21-10r
RNA形式-GGGGCCUGGGGUCCAG(SEQ ID NO:31)
DNA形式-GGGGCCTGGGGTCCAG(SEQ ID NO:32)
结合cuggaccccaggcccc(SEQ ID NO:33)
SSO21-14f*
RNA形式-CUGCAGAGCUGGGGCC(SEQ ID NO:34)
DNA形式-CTGCAGAGCTGGGGCC(SEQ ID NO:35)
结合ggccccagcucugcag(SEQ ID NO:36)
SSO21-15f
RNA形式-GCUGCAGAGCUGGGGC(SEQ ID NO:37)
DNA形式-GCTGCAGAGCTGGGGC(SEQ ID NO:38)
结合gccccagcucugcagc(SEQ ID NO:39)
SSO21-16f
RNA形式-UGCUGCAGAGCUGGGG(SEQ ID NO:40)
DNA形式-TGCTGCAGAGCTGGGG(SEQ ID NO:41)
结合ccccagcucugcagca(SEQ ID NO:42)
SSO21-17f
RNA形式-CUGCUGCAGAGCUGGG(SEQ ID NO:43)
DNA形式-CTGCTGCAGAGCTGGG(SEQ ID NO:44)
结合cccagcucugcagcag(SEQ ID NO:45)
前mRNA转录物的靶区域的序列(例如，用于结合SSO)
cuggaccccaggccccagcucugcagcag(SEQ ID NO:46)
表2
1，删除的区段(del)的序列在图2中示出
癌症相关序列
下表(表3)的序列也可以具有替代尿嘧啶残基的胸腺嘧啶残基(例如，DNA形式)。下表的每个序列都可以是本发明的多核酸聚合物的实施方式。下表(表3)中“化合物名称”下提到的每个基因或ORF都可包含用于改正内含子保留的基因靶标。
表3
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，这样的实施方式仅以示例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案。旨在以下权利要求限定本发明的范围，并且旨在由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
所述的具体方法、组合物和试剂盒可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是出于描述特定实施方式的目的，而非旨在作出限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
当提供值时，可以理解，每个值可以表示为“约”特定值或范围。“约”还可包括准确的量。例如，“约5μL”可以表示“约5μL”或“5μL”。通常，术语“约”可包括预期在所记载的值的10％内的量。
本文使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题内容。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语可以具有与所要求保护的主题内容所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文的描述仅仅是示例性和说明性的，并且不限制所要求保护的任何主题内容。在本申请中，除非另有特别说明，单数的使用可包括复数。除非上下文另有明确规定，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”可包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用可以表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式(例如“包括”、“包含”和“包括的”)的使用不是限制性的。
通过引用并入
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种预防或治疗受试者的疾病的方法，其包括成熟基因转录物中内含子保留的改正，其中所述疾病是由所述基因转录物中的所述内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其中内含子保留的改正包括施用配置为与所述基因转录物杂交的多核酸聚合物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中内含子保留的改正包括施用多核酸聚合物，所述多核酸聚合物配置为与所述基因转录物杂交并且配置为干扰以下的一个或多个：经典RNA结构(茎环)、非经典RNA结构(G四链体)的构象转变，与反式作用因子的相互作用，和RNA-蛋白复合物形成速率。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含内含子剪接调节元件或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含SEQ IDNO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的序列或者由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的序列或者由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一序列具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ IDNO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQID NO:44或其组合；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
10.根据权利要求1至4或8中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约30个核苷酸。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物被修饰以增加其稳定性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物被束缚于蛋白质或适体，其中所述蛋白质是增强、抑制或调节剪接和内含子去除的剪接因子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物与适合于将所述多核酸聚合物递送到细胞或组织和/或递送到细胞或组织中的递送载体缀合或结合。
15.根据权利要求1至7、9或11至14中任一项所述的方法，其中所述基因转录物编码胰岛素原。
16.根据权利要求1至4、8或10至14中任一项所述的方法，其中所述基因转录物转录自基因或ORF，所述基因或ORF选自包括以下的基因或ORF中的任一：ABCD4、ABCF3；ACADVL；ALKBH6；AP1G2；APEX1；ARFRP1；ATHL1；ATP1A3；ATP5D；ATP13A1；BAX；BDH2；BRD2；C1orf63；C1orf630；C1orf631；C1orf124；C2orf49；C8orf82；C16orf59；CAPRIN2；CASKIN2；CDCA7；CEP164；CEP170；CLCN7；CPNE1；CPSF3L；DCXR；DENND4B；DFFA；DIS3L2；DNAJB12；DPF1；DRG2；DSN1；EML3；EWSR1；EWSR10；FGFR4；FTSJ1；GBAP1GMPPA；GMPR2；GNPTG；GORASP1；GPATCH4；HGS；HMG20B；IFFO1ISYNA1；KRI1；LOC148413；LZTR1；MAN2C1；MAP4K2；MCOLN1；MDP1；MIB2；MITD1；MOK；MOV10；MRPL35；MTMR11；MUS81；NAPEPLD；NBEAL2；NDRG4NDUFB10；NFATC4；NFKBIB；NIT1；NKTR；NPRL2；NSUN5P1；NUDT22；PAN2；PDDC1；PDLIM4；PHF1；PIK3CD；PITPNM1；PPIL2；PPP1R35；PPP4C；PQLC2；PRPF39；PSME2；PTPMT1；QARS；RAD52；RHOT2；RMND5B；RNF123；RPL10A；RPP21；RPS6KB2RUSC1；SCRN2；SCYL1；SFR1；SGSM3；SIRT7；SLC25A3；SLC30A7；SLC37A4；STK19；STX10；TCF25；TOMM40；TP53I3；TRIM41；TRPT1；TSTA3；TTC14；TTC140；TUBGCP6；U2AF1L4UCK1；UNC45A；VAMP1；VAMP10；VARS；VPS28；WDR24；WDR90；WRAP53；YDJC；YIPF3；ZCCHC8；ZCCHC18；ZFAND1；ZNF131；ZNF300ZNF317；ZNF692；ZNF711；ZNRD1；ZWINT或其组合。
17.根据权利要求1至7、9或10至15中任一项所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
18.根据权利要求1至4、8或10至14或16中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在治疗前确定疾病病理是否由基因转录物中的内含子保留所引起的步骤。
20.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的区域或由其组成。
21.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的区域或由其组成。
22.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中的任一具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成。
23.一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的多核酸聚合物的区域或者包含与SEQ ID NO:46具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
24.一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的多核酸聚合物的区域或者包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
25.一种多核酸聚合物，其对于多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中的任一互补的序列或由其组成；或者任选地，对于包含与SEQ ID NO:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
26.一种多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性的多核酸聚合物序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ IDNO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ IDNO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ IDNO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
27.一种多核酸聚合物，其包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物与适合于将所述多核酸聚合物递送至细胞的递送载体缀合或结合。
29.一种载体，其包含权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物。
30.一种递送载体，其包含或结合于权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物。
31.一种组合物，其包含权利要求23至28中任一项所述的多核酸聚合物、或根据权利要求29所述的载体、或根据权利要求30所述的递送载体。
32.根据权利要求31所述的组合物，其还包含另外的生物活性分子。
33.一种选择进行治疗的受试者的方法，其包括确定所述受试者是否患有由基因转录物中的内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导的疾病，其中在阳性确认后，选择所述受试者待用根据权利要求23至28中任一项所述的多核酸聚合物、或根据权利要求29所述的载体、或根据权利要求30所述的递送载体、或根据权利要求31或32所述的组合物进行治疗；和任选地治疗所述受试者。
34.反义多核酸聚合物通过癌细胞中内含子保留的改正而使基因表达正常化的用途。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因转录物是内含子剪接调节元件。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件在两个G四链体之间。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序。
38.权利要求37的方法，其中所述内含子剪接调节元件还包含第二CCC基序。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件还包含CCCAG或AGGCC基序。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件不形成G四链体。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物与所述基因转录物特异性杂交。
42.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述靶序列在两个G四链体之间，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
43.权利要求42所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的所述保留内含子杂交。
44.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
45.权利要求44所述的药物组合物，其中所述内含子剪接调节元件还包含第二CCC基序。
46.权利要求45所述的药物组合物，其中所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。
47.权利要求42-46中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与包含CCCAG或AGGCC基序的内含子剪接调节元件杂交。
48.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
49.权利要求42-48中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。
50.权利要求42-49中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含两个连续的吡啶残基。
51.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，并且其中所述结合基序形成发夹结构，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
52.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
53.权利要求51所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物还能够使所述发夹结构失稳定。
54.根据权利要求42-53中任一项所述的药物组合物，其中所述递送载体包含细胞穿透肽或基于肽的纳米颗粒。
55.权利要求42-54中任一项所述的药物组合物，其中所述递送载体通过离子键合与所述多核酸聚合物复合。
56.权利要求42-55中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。
57.权利要求42-56中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％互补或100％互补。
58.权利要求42-57中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或者1个或更少的错配。
59.权利要求42-58中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在核苷部分或在磷酸酯部分被修饰。
60.权利要求42-59中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物包含一个或多个人工核苷酸碱基。
61.权利要求59或60所述的药物组合物，其中所述一个或多个人工核苷酸碱基包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在所述多核酸聚合物的核苷部分的核糖部分的2’羟基处被修饰。
63.权利要求62所述的药物组合物，其中在所述2’羟基处的修饰是通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)部分。
64.权利要求63所述的药物组合物，其中将甲基添加到所述核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲基核糖部分。
65.权利要求63所述的药物组合物，其中将甲氧基乙基添加到所述核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲氧基乙基核糖部分。
66.权利要求63所述的药物组合物，其中在所述2’羟基处的修饰通过亚甲基与4’碳连接。
67.权利要求59-61中任一项所述的药物组合物，其中所述核糖环被六元吗啉环替代以产生吗啉人工核苷酸类似物。
68.权利要求59-61中任一项所述的药物组合物，其中磷酸酯骨架被寡聚甘氨酸样部分替代以产生肽核酸(PNA)。
69.权利要求59-61中任一项所述的药物组合物，其中磷酸酯骨架通过巯基或甲基修饰。
70.权利要求59-69中任一项所述的药物组合物，其中5’端、3’端或其组合被修饰。
71.权利要求59-70中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰保护所述多核酸聚合物免受受试者中的内源性核酸酶影响。
72.权利要求59-71中任一项所述的药物组合物，其中修饰的多核酸聚合物不诱导RNA酶H切割RNA或者诱导RNA酶H切割RNA的能力降低。
73.权利要求59-72中任一项所述的组合物，其中所述多核酸聚合物被修饰以提高其稳定性。
74.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ ID NO:46的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％或者具有100％序列同一性。
75.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与包含SEQ IDNO:46的至少10个连续碱基的mRNA转录物杂交。
76.权利要求42-73中所述任一项的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:45或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。
77.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ ID NO:3具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。
78.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与选自SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ IDNO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ IDNO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，和SEQ ID NO:44或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％或者100％的序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
79.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或其组合的序列具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％或者具有100％序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
80.权利要求42-73中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ ID NO:47-434或其组合的序列的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％序列同一性。
81.权利要求42-80中任一项所述的药物组合物，其中所述杂交是特异性杂交。
82.权利要求42-81中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物是合成的多核酸聚合物。
83.权利要求42-82中任一项所述的药物组合物，其中包含所述多核酸聚合物的所述药物组合物静脉内或皮下施用。
84.一种用于治疗有需要的患者的疾病或病症的组合物，其包括向所述患者施用权利要求42-83所述的药物组合物。
85.如权利要求84所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症与蛋白质产生受损相关或者特征为缺陷性剪接。
86.如权利要求84或85所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是遗传性疾病。
87.如权利要求86所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
88.如权利要求86所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
89.如权利要求86所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。
90.如权利要求84-89中任一项所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是糖尿病。
91.如权利要求84-89中任一项所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是癌症。
92.如权利要求84-91中任一项所述的用途的组合物，其还包括选择用于治疗与蛋白质产生受损相关的疾病或病症的受试者，其包括：
a)确定所述受试者是否患有与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症；和
b)如果所述受试者患有所述与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求42-83所述的药物组合物。
93.如权利要求84-91中任一项所述的用途的组合物，其还包括选择用于治疗特征为缺陷性剪接的疾病或病症的治疗的受试者，其包括：
a)确定所述受试者是否患有特征为所述缺陷性剪接的疾病或病症；和
b)如果所述受试者患有所述特征为所述缺陷性剪接的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求42-83所述的药物组合物。
94.一种治疗有需要的受试者中特征为蛋白质的全长功能形式的产生受损的疾病或病症的方法，其包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：
诱导提高部分加工的mRNA转录物中内含子剪除的治疗剂；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中所述受试者具有部分加工的mRNA转录物的池，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，并且所述部分加工的mRNA转录物各自包含抑制所述部分加工的mRNA转录物的翻译的至少一个保留内含子；和
b)使所述受试者的靶细胞与所述治疗剂接触，以诱导所述部分加工的mRNA转录物的池的一部分经历剪接以从所述部分中的每个部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子，从而产生完全加工的mRNA转录物，其中所述完全加工的mRNA转录物翻译为表达所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，这治疗所述疾病或病症。
95.权利要求94所述的方法，其中所述治疗剂引起所述细胞中一种或多种剪接蛋白复合物的激活，以从所述部分加工的mRNA转录物的池的所述部分中的每个所述部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子。
96.权利要求94或95所述的方法，其中所述治疗剂抑制调节内含子剪接活性的蛋白质。
97.权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述治疗剂激活调节内含子剪接活性的蛋白质。
98.权利要求94-97中任一项所述的方法，其中所述治疗剂结合调节内含子剪接活性的蛋白质。
99.权利要求94-98中任一项所述的方法，其中所述治疗剂结合所述部分加工的mRNA转录物的靶多核苷酸序列。
100.权利要求94-99中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是多核酸聚合物。
101.权利要求94-100中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子。
102.权利要求94-101中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是权利要求42-83所述的药物组合物。
103.权利要求94-102中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括所述蛋白质的全长功能形式的亚常态生产。
104.权利要求94-103中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损是由于不存在所述蛋白质全长功能形式的表达，或者所述蛋白质全长功能形式的表达水平足够低以引起所述疾病或病症。
105.权利要求94-104中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括不存在所述蛋白质的生产，或者产生所述蛋白质的缺陷形式。
106.权利要求105所述的方法，其中所述蛋白质的缺陷形式是所述蛋白质的截短形式、所述蛋白质的错误折叠形式或具有异常靶结合的所述蛋白质的形式。
107.权利要求94-106中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致所述蛋白质的全长功能形式的表达增加。
108.一种诱导部分加工的mRNA转录物的加工以去除保留内含子而产生编码蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物的方法，其包括：
a)将分离的多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物杂交，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式且包含至少一个保留内含子；
b)从所述部分加工的mRNA转录物中去除所述至少一个保留内含子以产生编码所述蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物；和
c)从所述完全加工的mRNA转录物翻译所述蛋白质的全长功能形式。
109.权利要求108所述的方法，其还包括将包含所述分离的多核酸聚合物的药物组合物施用于有需要的受试者。
110.权利要求108或109所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损与疾病或病症相关。
111.权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病。
112.权利要求108-111中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
113.权利要求108-111中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
114.权利要求108-111中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。
115.权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病。
116.权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
117.权利要求108-116中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物是反义序列。
118.权利要求108-117中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的保留内含子杂交。
119.权利要求108-118中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。
120.权利要求119所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件包含CCC基序。
121.权利要求108-120中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体。
122.权利要求108-121中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序在两个G四链体之间。
123.权利要求108-122中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序具有第一CCC基序和第二CCC基序。
124.权利要求123所述的方法，其中所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。
125.权利要求101-124中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互补。
126.权利要求108-125中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或者1个或更少的错配。
127.权利要求108-126中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。
128.权利要求108-127中任一项所述的方法，其中所述受试者是真核生物或原核生物。
129.权利要求94-127中任一项所述的方法，其中所述受试者是选自人、小鼠、大鼠、非人灵长类动物或非灵长类哺乳动物的真核生物。

Claims (129)

1.一种预防或治疗受试者的疾病的方法，其包括成熟基因转录物中内含子保留的改正，其中所述疾病是由所述基因转录物中的所述内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其中内含子保留的改正包括施用配置为与所述基因转录物杂交的多核酸聚合物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中内含子保留的改正包括施用多核酸聚合物，所述多核酸聚合物配置为与所述基因转录物杂交并且配置为干扰以下的一个或多个：经典RNA结构(茎环)、非经典RNA结构(G四链体)的构象转变，与反式作用因子的相互作用，和RNA-蛋白复合物形成速率。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含内含子剪接调节元件或由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含SEQ IDNO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的序列或者由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的序列或者由其组成的转录物的靶区域的至少一部分是反义的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的转录物的靶区域是反义的：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:15；SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:33；SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:45或其组合。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物对于包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中任一序列具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成的转录物的区域是反义的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ IDNO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；和SEQID NO:44或其组合；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
10.根据权利要求1至4或8中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约30个核苷酸。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物被修饰以增加其稳定性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物被束缚于蛋白质或适体，其中所述蛋白质是增强、抑制或调节剪接和内含子去除的剪接因子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物与适合于将所述多核酸聚合物递送到细胞或组织和/或递送到细胞或组织中的递送载体缀合或结合。
15.根据权利要求1至7、9或11至14中任一项所述的方法，其中所述基因转录物编码胰岛素原。
16.根据权利要求1至4、8或10至14中任一项所述的方法，其中所述基因转录物转录自基因或ORF，所述基因或ORF选自包括以下的基因或ORF中的任一：ABCD4、ABCF3；ACADVL；ALKBH6；AP1G2；APEX1；ARFRP1；ATHL1；ATP1A3；ATP5D；ATP13A1；BAX；BDH2；BRD2；C1orf63；C1orf630；C1orf631；C1orf124；C2orf49；C8orf82；C16orf59；CAPRIN2；CASKIN2；CDCA7；CEP164；CEP170；CLCN7；CPNE1；CPSF3L；DCXR；DENND4B；DFFA；DIS3L2；DNAJB12；DPF1；DRG2；DSN1；EML3；EWSR1；EWSR10；FGFR4；FTSJ1；GBAP1GMPPA；GMPR2；GNPTG；GORASP1；GPATCH4；HGS；HMG20B；IFFO1ISYNA1；KRI1；LOC148413；LZTR1；MAN2C1；MAP4K2；MCOLN1；MDP1；MIB2；MITD1；MOK；MOV10；MRPL35；MTMR11；MUS81；NAPEPLD；NBEAL2；NDRG4NDUFB10；NFATC4；NFKBIB；NIT1；NKTR；NPRL2；NSUN5P1；NUDT22；PAN2；PDDC1；PDLIM4；PHF1；PIK3CD；PITPNM1；PPIL2；PPP1R35；PPP4C；PQLC2；PRPF39；PSME2；PTPMT1；QARS；RAD52；RHOT2；RMND5B；RNF123；RPL10A；RPP21；RPS6KB2RUSC1；SCRN2；SCYL1；SFR1；SGSM3；SIRT7；SLC25A3；SLC30A7；SLC37A4；STK19；STX10；TCF25；TOMM40；TP53I3；TRIM41；TRPT1；TSTA3；TTC14；TTC140；TUBGCP6；U2AF1L4UCK1；UNC45A；VAMP1；VAMP10；VARS；VPS28；WDR24；WDR90；WRAP53；YDJC；YIPF3；ZCCHC8；ZCCHC18；ZFAND1；ZNF131；ZNF300ZNF317；ZNF692；ZNF711；ZNRD1；ZWINT或其组合。
17.根据权利要求1至7、9或10至15中任一项所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
18.根据权利要求1至4、8或10至14或16中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在治疗前确定疾病病理是否由基因转录物中的内含子保留所引起的步骤。
20.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:46或与SEQ ID NO:46具有至少95％同一性的区域或由其组成。
21.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括将多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的区域或由其组成。
22.一种调节细胞中的内含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物与前mRNA的区域杂交，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中的任一具有至少95％同一性的序列互补的序列或由其组成。
23.一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:46或由其组成的多核酸聚合物的区域或者包含与SEQ ID NO:46具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
24.一种多核酸聚合物，其对于包含SEQ ID NO:3或由其组成的多核酸聚合物的区域或者包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
25.一种多核酸聚合物，其对于多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的，其中所述区域包含与包括SEQ ID NO:47至434或其组合的序列组中的任一互补的序列或由其组成；或者任选地，对于包含与SEQ ID NO:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其组成的多核酸聚合物的区域的至少一部分是反义的。
26.一种多核酸聚合物，其包含与选自包括以下的组中任一的序列具有至少95％同一性的多核酸聚合物序列或由其组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ IDNO:23；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:31；SEQ IDNO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ IDNO:41；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:44或其组合；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
27.一种多核酸聚合物，其包含多核酸聚合物序列或由其组成，所述多核酸聚合物序列与选自包括SEQ ID NO:47至434或其组合的组中任一的序列具有至少95％同一性；和任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物与适合于将所述多核酸聚合物递送至细胞的递送载体缀合或结合。
29.一种载体，其包含权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物。
30.一种递送载体，其包含或结合于权利要求23至27中任一项所述的多核酸聚合物。
31.一种组合物，其包含权利要求23至28中任一项所述的多核酸聚合物、或根据权利要求29所述的载体、或根据权利要求30所述的递送载体。
32.根据权利要求31所述的组合物，其还包含另外的生物活性分子。
33.一种选择进行治疗的受试者的方法，其包括确定所述受试者是否患有由基因转录物中的内含子保留所引起的缺陷性蛋白质表达所诱导的疾病，其中在阳性确认后，选择所述受试者待用根据权利要求23至28中任一项所述的多核酸聚合物、或根据权利要求29所述的载体、或根据权利要求30所述的递送载体、或根据权利要求31或32所述的组合物进行治疗；和任选地治疗所述受试者。
34.反义多核酸聚合物通过癌细胞中内含子保留的改正而使基因表达正常化的用途。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因转录物是内含子剪接调节元件。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件在两个G四链体之间。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序。
38.权利要求37的方法，其中所述内含子剪接调节元件还包含第二CCC基序。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件还包含CCCAG或AGGCC基序。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件不形成G四链体。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物与所述基因转录物特异性杂交。
42.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述靶序列在两个G四链体之间，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
43.权利要求[0014]所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的所述保留内含子杂交。
44.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交，其中所述内含子剪接调节元件包含第一CCC基序，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
45.权利要求[0014]所述的药物组合物，其中所述内含子剪接调节元件还包含第二CCC基序。
46.权利要求[0015]所述的药物组合物，其中所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。
47.权利要求[0014]-[0016]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与包含CCCAG或AGGCC基序的内含子剪接调节元件杂交。
48.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体，并且其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
49.权利要求[0014]-[0016]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。
50.权利要求[0014]-[0017]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含两个连续的吡啶残基。
51.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，并且其中所述结合基序形成发夹结构，其中所述多核酸聚合物能够诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
52.一种药物组合物，其包含：
多核酸聚合物，其与编码蛋白质且包含保留内含子的部分加工的mRNA转录物的靶序列杂交，其中所述多核酸聚合物诱导所述保留内含子从所述部分加工的mRNA转录物中剪切掉；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
53.权利要求[0018]所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物还能够使所述发夹结构失稳定。
54.根据权利要求[0014]-53中任一项所述的药物组合物，其中所述递送载体包含细胞穿透肽或基于肽的纳米颗粒。
55.权利要求[0014]-[0020]中任一项所述的药物组合物，其中所述递送载体通过离子键合与所述多核酸聚合物复合。
56.权利要求[0014]-[0020]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。
57.权利要求[0014]-[0020]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％互补或100％互补。
58.权利要求[0014]-[0021]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或者1个或更少的错配。
59.权利要求[0014]-[0021]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在核苷部分或在磷酸酯部分被修饰。
60.权利要求[0014]-[0021]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物包含一个或多个人工核苷酸碱基。
61.权利要求[0021]或[0022]所述的药物组合物，其中所述一个或多个人工核苷酸碱基包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巯基膦酸酯核苷酸或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
62.权利要求[0022]所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物在所述多核酸聚合物的核苷部分的核糖部分的2’羟基处被修饰。
63.权利要求[0022]所述的药物组合物，其中在所述2’羟基处的修饰是通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)部分。
64.权利要求[0022]所述的药物组合物，其中将甲基添加到所述核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲基核糖部分。
65.权利要求[0022]所述的药物组合物，其中将甲氧基乙基添加到所述核糖部分的2’羟基以产生2’-O-甲氧基乙基核糖部分。
66.权利要求[0022]所述的药物组合物，其中在所述2’羟基处的修饰通过亚甲基与4’碳连接。
67.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述核糖环被六元吗啉环替代以产生吗啉人工核苷酸类似物。
68.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中磷酸酯骨架被寡聚甘氨酸样部分替代以产生肽核酸(PNA)。
69.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中磷酸酯骨架通过巯基或甲基修饰。
70.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中5’端、3’端或其组合被修饰。
71.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰保护所述多核酸聚合物免受受试者中的内源性核酸酶影响。
72.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中修饰的多核酸聚合物不诱导RNA酶H切割RNA或者诱导RNA酶H切割RNA的能力降低。
73.权利要求[0021]-[0022]中任一项所述的组合物，其中所述多核酸聚合物被修饰以提高其稳定性。
74.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ ID NO:46的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％或者具有100％序列同一性。
75.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与包含SEQ ID NO:46的至少10个连续碱基的mRNA转录物杂交。
76.权利要求[0014]-[0022]中所述任一项的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:12，SEQID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:30，SEQID NO:33，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:45或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。
77.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与SEQ ID NO:3具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。
78.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与选自SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，和SEQ ID NO:44或其组合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％或者100％的序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
79.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其组合的序列具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％或者具有100％序列同一性，并且任选地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置换。
80.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与mRNA转录物杂交，所述mRNA转录物与选自SEQ ID NO:47-434或其组合的序列的至少13个连续碱基具有至少80％，85％，90％或95％序列同一性。
81.权利要求[0014]-[0023]中任一项所述的药物组合物，其中所述杂交是特异性杂交。
82.权利要求[0014]-[0022]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物是合成的多核酸聚合物。
83.权利要求[0014]-[0023]中任一项所述的药物组合物，其中包含所述多核酸聚合物的所述药物组合物静脉内或皮下施用。
84.一种用于治疗有需要的患者的疾病或病症的组合物，其包括向所述患者施用权利要求[0014]-[0024]所述的药物组合物。
85.如权利要求[0025]所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症与蛋白质产生受损相关或者特征为缺陷性剪接。
86.如权利要求[0025]或[0026]所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是遗传性疾病。
87.如权利要求[0026]所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
88.如权利要求[0026]所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
89.如权利要求[0026]所述的用途的组合物，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。
90.如权利要求[0025]-[0026]中任一项所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是糖尿病。
91.如权利要求[0025]-[0026]中任一项所述的用途的组合物，其中所述疾病或病症是癌症。
92.如权利要求[0025]-[0026]中任一项所述的用途的组合物，其还包括选择用于治疗与蛋白质产生受损相关的疾病或病症的受试者，其包括：
a)确定所述受试者是否患有与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症；和
b)如果所述受试者患有所述与所述蛋白质产生受损相关的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求[0014]-[0024]所述的药物组合物。
93.如权利要求[0025]-[0026]中任一项所述的用途的组合物，其还包括选择用于治疗特征为缺陷性剪接的疾病或病症的治疗的受试者，其包括：
a)确定所述受试者是否患有特征为所述缺陷性剪接的疾病或病症；和
b)如果所述受试者患有所述特征为所述缺陷性剪接的疾病或病症，则向所述受试者施用权利要求[0014]-[0024]所述的药物组合物。
94.一种治疗有需要的受试者中特征为蛋白质的全长功能形式的产生受损的疾病或病症的方法，其包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：
诱导提高部分加工的mRNA转录物中内含子剪除的治疗剂；和
药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中所述受试者具有部分加工的mRNA转录物的池，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，并且所述部分加工的mRNA转录物各自包含抑制所述部分加工的mRNA转录物的翻译的至少一个保留内含子；和
b)使所述受试者的靶细胞与所述治疗剂接触，以诱导所述部分加工的mRNA转录物的池的一部分经历剪接以从所述部分中的每个部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子，从而产生完全加工的mRNA转录物，其中所述完全加工的mRNA转录物翻译为表达所述蛋白质的全长功能形式的拷贝，这治疗所述疾病或病症。
95.权利要求[0026]所述的方法，其中所述治疗剂引起所述细胞中一种或多种剪接蛋白复合物的激活，以从所述部分加工的mRNA转录物的池的所述部分中的每个所述部分加工的mRNA转录物去除所述至少一个保留内含子。
96.权利要求[0026]或[0027]所述的方法，其中所述治疗剂抑制调节内含子剪接活性的蛋白质。
97.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述治疗剂激活调节内含子剪接活性的蛋白质。
98.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述治疗剂结合调节内含子剪接活性的蛋白质。
99.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述治疗剂结合所述部分加工的mRNA转录物的靶多核苷酸序列。
100.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是多核酸聚合物。
101.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子。
102.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是权利要求[0014]-[0024]所述的药物组合物。
103.权利要求[0026]-[0028]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括所述蛋白质的全长功能形式的亚常态生产。
104.权利要求[0026]-[0029]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损是由于不存在所述蛋白质全长功能形式的表达，或者所述蛋白质全长功能形式的表达水平足够低以引起所述疾病或病症。
105.权利要求[0026]-[0030]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损包括不存在所述蛋白质的生产，或者产生所述蛋白质的缺陷形式。
106.权利要求[0030]所述的方法，其中所述蛋白质的缺陷形式是所述蛋白质的截短形式、所述蛋白质的错误折叠形式或具有异常靶结合的所述蛋白质的形式。
107.权利要求[0026]-[0030]中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致所述蛋白质的全长功能形式的表达增加。
108.一种诱导部分加工的mRNA转录物的加工以去除保留内含子而产生编码蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物的方法，其包括：
a)将分离的多核酸聚合物与所述部分加工的mRNA转录物杂交，所述部分加工的mRNA转录物能够编码所述蛋白质的全长功能形式且包含至少一个保留内含子；
b)从所述部分加工的mRNA转录物中去除所述至少一个保留内含子以产生编码所述蛋白质的全长功能形式的完全加工的mRNA转录物；和
c)从所述完全加工的mRNA转录物翻译所述蛋白质的全长功能形式。
109.权利要求[0030]所述的方法，其还包括将包含所述分离的多核酸聚合物的药物组合物施用于有需要的受试者。
110.权利要求[0030]或[0031]所述的方法，其中所述蛋白质全长功能形式的产生受损与疾病或病症相关。
111.权利要求[0030]-[0031]中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病。
112.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子的基因拷贝的基因组，所述外显子在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
113.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含含有外显子组的基因拷贝的基因组，所述外显子组在适当地转录为完全加工的mRNA时编码所述蛋白质的全长功能形式。
114.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中患有所述遗传性疾病的受试者具有包含所述基因的缺陷拷贝的基因组，其不能产生所述蛋白质的全长功能形式。
115.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病。
116.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
117.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物是反义序列。
118.权利要求[0030]-[0032]中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的保留内含子杂交。
119.权利要求[0030]-[0070]中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的内含子剪接调节元件杂交。
120.权利要求[0070]所述的方法，其中所述内含子剪接调节元件包含CCC基序。
121.权利要求[0030]-[0070]中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序不形成G四链体。
122.权利要求[0030]-[0074]中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序在两个G四链体之间。
123.权利要求[0030]-[0074]中任一项所述的方法，其中所述反义序列与所述部分加工的mRNA转录物的结合基序杂交，其中所述结合基序具有第一CCC基序和第二CCC基序。
124.权利要求[0074]所述的方法，其中所述第一CCC基序距所述第二CCC基序约3个或更多个核苷酸碱基。
125.权利要求101-[0074]中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互补。
126.权利要求[0030]-[0033]中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列与所述部分加工的mRNA转录物的靶序列有4个或更少，3个或更少，2个或更少或者1个或更少的错配。
127.权利要求[0030]-[0033]中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物长度为约10至约50，约10至约45，约10至约40，约10至约30，约10至约25或约10至约20个核苷酸。
128.权利要求[0030]-[0033]中任一项所述的方法，其中所述受试者是真核生物或原核生物。
129.权利要求[0026]-[0033]中任一项所述的方法，其中所述受试者是选自人、小鼠、大鼠、非人灵长类动物或非灵长类哺乳动物的真核生物。
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