CN102171342A - 杜兴肌营养不良中有效的外显子(44)跳跃方法及相关手段 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与具有5′-GUGGCUAACAGAAGCU (SEQ ID NO 1)序列的核苷酸分子结合和/或互补的核酸分子，以及该分子在诱导DMD患者的DMD基因外显子44跳跃的方法中的用途。

Description

杜兴肌营养不良中有效的外显子(44)跳跃方法及相关手段

发明领域

本发明涉及遗传学领域，更具体而言，涉及人类遗传学。本发明特别涉及人类杜兴肌营养不良基因剪接的调节。

背景技术

肌病是导致肌肉功能障碍的病症。肌营养不良是指以骨骼肌逐渐衰弱和退化为特征的遗传疾病。杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)是最常见的童年形式的肌营养不良。它们为隐性遗传疾病，因为负责DMD和BMD的基因位于X染色体上，突变主要影响男性，并且发病率为每3500个男孩中约一例。

DMD和BMD是由编码肌养蛋白的DMD基因中的基因缺陷引起的，肌养蛋白是细胞主链与细胞外基质之间相互作用必需的肌肉蛋白质，从而在收缩期间维持肌纤维的稳定性。DMD是一种严重的、致死的神经肌肉病症，其导致12岁以前依赖轮椅支持，并且DMD患者常常在30岁以前死于呼吸或心力衰竭。相比之下，BMD患者通常保持能行走，直至生命晚期，并且具有几乎正常的预期寿命。肌养蛋白基因DMD突变的特征为移码插入、缺失或无义点突变，这导致功能性肌养蛋白的缺乏。BMD突变通常保持可读框完整，从而允许合成具有部分功能性肌养蛋白。

在过去20年中已经研究了一些可能的疗法，包括成肌细胞移植、DNA靶向的基因疗法和反义介导的外显子跳跃(van Deutekom and van Ommen，(2003)，Nat.Rev.Genet.，4(10)：774-83)。反义介导的外显子跳跃目旨在将存在于DMD患者中的框外(out-of-frame)突变转变成合成至少部分功能性肌养蛋白的框内(in-frame)BMD样突变，从而延长肌肉的活力(Aartsma-Rus and van Ommen，(2007)，RNA，13(10)：1609-24)。

外显子跳跃能够被反义寡核苷酸(AON)诱导，该反义寡核苷酸针对涉及外显子连接酶促过程的剪接点的剪接供体或剪接受体位点，或针对外显子内部序列。通常，剪接供体和剪接受体位点包含保守序列，靶向这些序列有不可避免的风险，即会同时靶向来自DMD或其他基因转录本的另外的外显子的剪接位点。

DMD基因的外显子44由148个碱基对组成。外显子44的治疗性跳跃会恢复DMD患者的正确可读框，所述DMD患者具有缺失或者具有外显子44的重复，所述缺失包括但不限于外显子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，对于某些DMD患者而言，突变是这样的，从而除了外显子44跳跃以外，一个或多个外显子的同时跳跃是恢复可读框必需的。这种突变的非限制性实例为侧翼外显子43或45中的无义点突变，分别要求外显子43+44跳跃或外显子44+45跳跃。上述突变总共发生于约6-8％的全部DMD患者中。大部分所得的肌养蛋白在该蛋白中心杆结构域被截短，这使得重要的N-末端肌动蛋白结合结构域、与小肌养蛋白(dystrobrevin)和肌养蛋白结合蛋白(syntrophin)结合的C-末端结构域以及β-营养不良聚糖结合C-末端富含半胱氨酸的结构域完整。

发明描述

本发明鉴定了外显子44中四个不同区域，其特别适合诱导外显子44的跳跃。因此，本发明提供了调节细胞中DMD基因的外显子44剪接的方法，该方法包括为所述细胞提供与包含以下序列的核苷酸序列结合的分子：SEQ ID NO.1：5’-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQ ID NO.2：5’-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQ ID NO.3：5’-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQ ID NO.4：5’-CUGUUGAGAAA。当DMD前mRNA(pre-mRNA)的外显子44中存在SEQ ID NO：1、2、3或4时，该分子优选地与SEQ ID NO：1、2、3或4的任意一个结合或互补。

在本申请书中，短语“诱导跳跃”与“调节剪接”是同义的。

据发现，与包含SEQ ID NO.1：5’-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQ ID NO.2：5’-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQ ID NO.3：5’-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQ ID NO.4：5’-CUGUUGAGAAA的核苷酸序列结合的分子在提供了该分子的细胞中导致外显子44的高效跳跃。而且，所示序列没有一个源自剪接点的保守部分。因此，所述分子不大可能介导DMD前mRNA的其他外显子或其他基因的外显子的差异剪接。另外，通过避免与上文所定义的核苷酸序列结合的分子中的CpG对，会优选地避免其他(免疫)毒性。

外显子跳跃指在细胞中诱导成熟的mRNA，该mRNA不含有通常存在于其中的特定外显子。外显子跳跃通过为表达所述mRNA的前mRNA的细胞提供这样的分子而实现，该分子能够干扰诸如允许剪接的酶促过程所需的剪接供体或剪接受体序列的序列，或者能够干扰识别作为外显子而并入mRNA的一段核苷酸所需的外显子包含信号。术语前mRNA指通过转录从细胞核中的DNA模板合成的未加工或部分加工的前体mRNA。

本发明的某些方法会缓和具有缺失或具有外显子44的重复的DMD患者的生肌细胞或肌细胞的一种或多种特征，该缺失包括但不限于外显子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，移除诸如外显子43或外显子45的侧翼外显子会由于该侧翼外显子中的无义点突变而引起框外转录。外显子44的其他跳跃联合侧翼外显子的跳跃会恢复DMD患者的生肌细胞或肌细胞中DMD基因的可读框。这些突变的非限制性实例为侧翼外显子43或45中的无义点突变，它们分别要求外显子43+44跳跃或外显子44+45跳跃。

在实施方案中，本发明的方法还可以将强BMD患者的生肌细胞或肌细胞的一种或多种特征缓和为轻微BMD患者的特征。DMD或DMD患者的细胞的特征包括肌细胞吸收的钙增加、胶原蛋白合成增加、形态学改变、脂类生物合成改变、氧化应激和/或破坏的肌膜增加。本发明方法的优选实施方案将在后文中进行定义。

在一实施方案中，本文所定义的分子可以为与特定的序列结合和/或互补的化合物分子，或者诸如经修饰能够与RNA分子上指定的核苷酸序列结合的RNA结合蛋白或非天然锌指蛋白的蛋白。筛查与特定核苷酸序列结合的化合物分子的方法公开于，例如PCT/NL01/00697和美国专利6,875,736中，它们通过引用并入本文。设计与特定核苷酸序列结合的RNA结合锌指蛋白的方法公开于Friesen and Darby，Nature Structural Biology 5：543-546(1998)中，其通过引用并入本文。与特定SEQ ID NO：1、2、3或4序列之一结合，优选在DMD的外显子44的情况下，可以通过本领域技术人员已知的技术来评价。优选的技术为EP 1619249所述的凝胶迁移率变动分析。在优选的实施方案中，一旦在凝胶迁移率变动分析中检测到所述分子与标记的序列SEQ ID NO：1、2、3或4的结合，则认为所述分子与特定序列之一结合。可选择地，或者与前述实施方案结合，如后文所定义的，分子为与SEQ ID NO：1、2、3或4或其部分互补或者基本上互补的寡核苷酸。该语境中所用的术语“基本上”互补表示，可以允许1个或2个或者更多个错配，只要具有功能性，即外显子44的诱导跳跃仍然是可接受的。

本发明提供了设计能够诱导DMD基因的外显子44跳跃的分子的方法，该分子优选为寡核苷酸。首先，如前文所定义的，选择与SEQ ID NO：1、2、3或4之一或其部分结合的所述寡核苷酸。随后，在优选的方法中，设计必须考虑至少以下方面之一以进一步改进所述分子：

-所述分子不含有CpG，

-所述分子不含有G-四联体基序，

-所述分子具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学属性。

寡核苷酸中CpG的存在通常与所述寡核苷酸免疫原性增加有关(Dorn and Kippenberger，Curr Opin Mol Ther 2008 10(1)10-20)。这种增加的免疫原性是不期望的，因为其可能诱导肌纤维的破坏。动物模型中的免疫原性可以通过评价所述动物的肌肉活检中的CD4⁺和/或CD8⁺细胞的存在和/或炎症单核细胞侵润来评价。免疫原性还可以利用本领域技术人员已知的标准免疫测定，在用本发明的寡核苷酸进行处理的动物或人的血液中，通过检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在来评价。免疫原性的增加可以通过利用标准免疫测定，检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在或增加量来评价。

包含G-四联体基序的寡核苷酸具有形成四联体(quadruplex)的趋势，该四联体是通过4条单链寡核苷酸的Hoogsteen碱基配对形成的多聚体或集合物(aggregate)(Cheng and Van Dyke，Gene.1997 Sep 15；197(1-2)：253-60)，这当然是不期望的：因为预期寡核苷酸的效率会降低。多聚化或聚集优选地通过本领域技术人员已知的标准聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳技术来评价。在优选的实施方案中，小于总量的20％或15％、10％、7％、5％或更低的本发明的寡核苷酸具有利用上文所述的测定评价的多聚化或聚集能力。

本发明允许设计具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学属性的寡核苷酸。RNA结合动力学和/或热力学性质至少部分地通过寡核苷酸的解链温度来测定(Tm；用寡核苷酸属性计算器来计算(www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html)，对于单链RNA，利用基本Tm和最近的邻近模型来计算)，和/或通过AON-靶外显子复合体的自由能来测定(利用RNA结构4.5)。如果Tm过高，则预期寡核苷酸具有较低的特异性。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，对于这些参数中的每一个，难以给出优选的范围。可接受的Tm的变动范围可以为35℃至65℃，而可接受的自由能的变动范围可以为15kcal/mol至45kcal/mol。

因此，技术人员可以首先选择寡核苷酸作为潜在治疗化合物，如本文所定义的，所述寡核苷酸与外显子44的SEQ ID NO：1、2、3或4或其部分结合和/或互补。技术人员可以检查所述寡核苷酸如前文所定义地与所述序列结合。任选地，在第二步中，技术人员可以利用本发明，通过检查CpG的不存在、G-四联体基序的不存在，和/或通过优化其Tm和/或AON-靶复合物的自由能来进一步优化所述寡核苷酸。技术人员可以试图设计这样的寡核苷酸，其中不存在CpG和/或不在G-四联体基序，和/或通过选择与所述寡核苷酸互补的外显子44(例如SEQ ID NO：1、2、3或4)的不同序列来获得更可接受的Tm和/或自由能。或者，如果与外显子44的SEQ ID NO：1、2、3或4中给定的一段序列互补的寡核苷酸包含CpG、G-四联体基序和/或不具有可接受的Tm和/或自由能，则本领域技术人员可以通过降低该寡核苷酸的长度和/或通过选择与该寡核苷酸互补的任何SEQ ID NO：1、2、3或4中不同的一段序列和/或通过改变该寡核苷酸的化学来改进任何这些参数。

作为实例，如果选择SEQ ID NO：1，则设计据发现与该序列结合的几种寡核苷酸：SEQ ID NO：5、49和54。据发现包含SEQ ID NO：5的寡核苷酸具有最优的RNA结合动力学和/或热力学性质，例如最优的Tm。当我们测试这些寡核苷酸诱导外显子44跳跃的功能性时，证实包含SEQ ID NO：5的寡核苷酸在这四种寡核苷酸中是最有效的。这些寡核苷酸的每一个在本发明中都是有功能的。然而，包含SE QID NO：5的寡核苷酸是最优选的鉴定为与SEQ ID NO：1结合和/或互补的寡核苷酸。

在该方法的任何步骤中，本发明的寡核苷酸优选为仍然能够表现出可接受水平的功能活性的寡核苷酸。所述寡核苷酸的功能活性优选为将DMD基因的外显子44的跳跃诱导至某种程度，以为个体提供功能性肌养蛋白和/或mRNA，和/或至少部分地降低异常肌养蛋白和/或mRNA的产生。每种这些特征在后文中定义。这些功能活性可以在个体的肌肉组织或肌细胞中，或者在体外的细胞中进行测量。可以在mRNA水平，优选利用RT-PCR来评价功能性。可以在蛋白水平，优选利用蛋白印迹分析或横切片的免疫荧光分析来评价功能性。在优选的实施方案中，当在DMD患者的肌细胞中通过RT-PCR进行测试时，寡核苷酸被认为诱导DMD基因的外显子44的跳跃，外显子44跳跃百分比为至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％。

在优选的实施方案中，这样的寡核苷酸优选为药物。更优选地，所述药物用于预防或治疗个体或患者的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良。如本文所定义的，DMD前mRNA优选地表示DMD或BMD患者的DMD基因的前mRNA。优选地，患者旨在表示患有DMD或BMD的患者，或者由于他或她的遗传背景而容易发展DMD或BMD的患者。

对于DMD患者，所用的寡核苷酸优选地修正至少一个存在于所述患者的DMD基因中的DMD突变，因此会优选地产生看起来像BMD肌养蛋白的肌养蛋白：所述肌养蛋白优选地为如后文所定义的功能性肌养蛋白。

对于BMD患者，所用的寡核苷酸优选地修正至少一个存在于所述患者的DMD基因中的BMD突变，因此会优先产生或产生更多的比原始存在于所述BMD患者中的肌养蛋白更具功能性的肌养蛋白。甚至更优选地，所述药物增加个体的功能性或更具功能性的肌养蛋白和/或mRNA的产生，和/或至少部分地降低个体的异常或功能性较低的肌养蛋白和/或mRNA的产生。

优选地，本发明的方法通过诱导和/或促进患者的一种或多种细胞中，优选肌细胞中如本文所定义的至少DMD前mRNA的外显子44的跳跃来增加该患者的更具功能性的肌养蛋白和/或mRNA的产生，和/或降低该个体的异常或功能性较低的肌养蛋白和/或mRNA的产生。通常在DMD患者中增加患者的更具功能性的肌养蛋白和/或mRNA的产生，和/或降低患者的异常肌养蛋白和/或mRNA的产生。通常在BMD患者中增加更具功能性的或功能性肌养蛋白和/或mRNA的产生。

因此，优选方法是这样的方法，其中在患者中，或者在所述患者的一种或多种细胞中，增加更具功能性的或功能性肌养蛋白和/或mRNA的产生，和/或降低所述患者的异常肌养蛋白和/或mRNA的产生，其中所述异常肌养蛋白和/或mRNA或者所述更具功能性的肌养蛋白和/或mRNA的水平通过与所述方法起作用时所述患者的所述肌养蛋白和/或mRNA的水平进行比较来评价。

如本文所定义的，功能性肌养蛋白优选地为对应于具有SEQ ID NO：55所定义的氨基酸序列的蛋白的野生型肌养蛋白。功能性肌养蛋白优选地为这样的肌养蛋白，其在其N末端部分具有肌动蛋白结合结构域(N末端的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)以及C末端结构与(C末端的后325个氨基酸)，并且这些结构域的每一个都存在于本领域技术人员已知的野生型肌养蛋白中。本文所示的氨基酸对应于SEQ ID NO：55所示的野生型肌养蛋白的氨基酸。在另一实施方案中，功能性肌养蛋白为表现出至少某种程度的野生型肌养蛋白活性。优选地，“至少某种程度”表示野生型功能性肌养蛋白相应活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在该语境中，优选地，野生型肌养蛋白的活性为与肌动蛋白结合以及与肌养蛋白相关的糖蛋白复合物(DGC)结合(Aartsma-Rus A et al，(2006)，Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database：an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule(进入leiden杜兴肌营养不良突变数据库：确定读框规则的突变类型和矛盾事例的综述)，Muscle Nerve，34：135-144.)。如技术人员已知的，肌养蛋白与肌动蛋白的结合以及与DGC复合物的结合可以通过利用总蛋白提取物的共免疫沉淀或疑似为营养不良的肌肉活检横切片的免疫荧光分析，进行观察。

患有杜兴肌营养不良的个体通常在编码肌养蛋白的基因中具有突变，该突变防止合成完整的蛋白，即过早终止防止合成该蛋白的C末端。在贝克肌营养不良中，肌养蛋白基因与野生型相比也包含突变，但是该突变通常不包含过早终止并且通常合成该蛋白的C末端。因此，合成了具有与野生型蛋白在活性类型至少相同的功能性肌养蛋白，尽管不一定是相同量的活性。在优选的实施方案中，功能性肌养蛋白表示框内肌养蛋白基因。BMD个体的基因组通常编码包含N末端部分(N末端的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的后325个氨基酸)的肌养蛋白，但是其中心杆状结构域可以短于野生型肌养蛋白的中心杆状结构域(Aartsma-Rus A et al，(2006)，Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database：an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule(进入leiden杜兴肌营养不良突变数据库：确定读框规则的突变类型和矛盾事例的综述)，Muscle Nerve，34：135-144.)。本文所示的氨基酸对应于SEQ ID NO：55所示的野生型肌养蛋白的氨基酸。用于治疗DMD的外显子跳跃优选地，但非专门地涉及通过使杆状结构域中的外显子跳跃来克服前mRNA的过早终止以修正可读框并允许合成包含C末端在内的肌养蛋白的剩余部分，尽管该蛋白由于较小的杆状结构域而稍微变小。在优选的实施方案中，可以为患有DMD并用本文所定义的寡核苷酸治疗的个体提供表现出至少某种程度的野生型肌养蛋白活性的肌养蛋白。更优选地，如果所述个体为杜兴肌营养不良患者或者疑似为杜兴肌营养不良患者，则功能性肌养蛋白为在功能性上与患有BMD的个体的肌养蛋白相当的肌养蛋白：优选地，所述肌养蛋白能够与肌动蛋白和DGC相互作用，但是其中心杆状结构域可以短于野生型肌养蛋白的中心杆状结构域(Aartsma-Rus A et al，(2006)，Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database：an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule(进入leiden杜兴肌营养不良突变数据库：确定读框规则的突变类型和矛盾事例的综述)，Muscle Nerve，34：135-144.)。野生型肌养蛋白的中心杆状结构域包含24个血影蛋白样重复(Aartsma-Rus A et al，(2006)，Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database：an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule (进入leiden杜兴肌营养不良突变数据库：确定读框规则的突变类型和矛盾事例的综述)，Muscle Nerve，34：135-144.)。例如，本文所提供的肌养蛋白的中心杆状结构域可以包含5-23、10-22或12-18个血影蛋白样重复，只要其能够与肌动蛋白和与DGC结合。

降低所述患者或所述患者细胞中的异常肌养蛋白的产生可以在mRNA水平评价，并且优选地表示99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更低的原始量的异常肌养蛋白mRNA仍然可以通过RT PCR检测。异常肌养蛋白mRNA或蛋白在本文中也称为非功能性或功能性较低至非功能性或半功能性的肌养蛋白mRNA或蛋白。非功能性前mRNA肌养蛋白优选地导致框外肌养蛋白，这表示没有产生和/或检测到肌养蛋白。非功能性肌养蛋白优选地为不能与肌动蛋白和/或DGC蛋白复合物的成员结合的肌养蛋白。非功能性肌养蛋白或肌养蛋白mRNA通常不具有或不编码具有完整的蛋白C末端的肌养蛋白。

增加患者或所述患者细胞中功能性肌养蛋白的产生可以在mRNA水平评价(通过RT-PCR分析)，并且优选地表示可检测量的功能性或框内肌养蛋白可以通过RT PCR检测。在另一实施方案中，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的可检测肌养蛋白mRNA是功能性或框内肌养蛋白mRNA。

增加患者或所述患者细胞中功能性肌养蛋白的产生可以在蛋白水平评价(通过免疫荧光和蛋白印迹分析)，并且优选地表示可检测量的功能性肌养蛋白可以通过免疫荧光或蛋白印迹分析检测。在另一实施方案中，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的可检测肌养蛋白是功能性肌养蛋白。

增加或降低优选地在个体或患者的肌肉组织或肌细胞中通过与在用本发明的所述分子或组合物进行治疗之前存在于所述个体或患者中的量进行比较来评价。或者，比较可以用所述个体或患者的肌肉组织或细胞来进行，如果治疗是局部的，所述个体或患者尚未用所述寡核苷酸或组合物进行治疗。

在另一方面，提供了用于缓和个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多种症状，或者缓和所述个体的生肌细胞或肌细胞的一种或多种特征的方法，所述方法包括给予所述个体如本文所定义的寡核苷酸或组合物。

还提供了用于增强、诱导或促进患有杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良个体的表达肌养蛋白前mRNA的细胞中所述肌养蛋白前mRNA的外显子跳跃的方法，所述方法包括给予所述个体如本文所定义的寡核苷酸或组合物。

还提供了用于增加细胞中功能性肌养蛋白的产生和/或降低细胞中异常肌养蛋白的产生的方法，所述细胞包含编码异常肌养蛋白的肌养蛋白基因的前mRNA，所述方法包括为所述细胞提供本发明的寡核苷酸或组合物并允许由所述前mRNA剪接产生的mRNA翻译。在一实施方案中，所述方法在体内进行，例如利用细胞培养。优选地，所述方法为所述个体体内的。

在本上下文中，已经了定义了增加功能性肌养蛋白的产生。

利用本发明的分子或组合物缓和个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多种症状可以通过任何以下测定来评价：至丧失行走的时间延长、肌肉强度改善、举起重物的能力改善、从地板起来的时间改善、9米行走时间改善、4阶爬行所耗时间改善、腿功能等级改善、肺功能改善、心脏功能改善、生活质量改善。这些测定中的每个测定对技术人员是已知的。作为实例，出版物Manzur et al(Manzur AY et al，(2008)，Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy(用于杜兴肌营养不良的糖皮质激素皮质类固醇)(综述)，Wiley publishers，The Cochrane collaboration.)给出了这些测定中的每个测定的大量解释。对于这些测定中的每个测定，只要在测定中发现所测量参数的可检测的改善或延长，这优选地表示利用本发明的分子或组合物缓和了个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多种症状。可检测的改善或延长优选地为如Hodgetts et al(Hodgetts S.，et al，(2006)，Neuromuscular Disorders，16：591-602)所述的统计上显著的改善或延长。

或者，杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多种症状的缓和可以通过测量与肌纤维的功能、完整性和/或存活相关的肌纤维特征的改善来评价，所述特征在患者自身进行评价。这样的特征可以在给定患者的细胞、组织水平进行评价。一种或多种特征的缓和可以通过患者的生肌细胞或肌细胞的任何以下测定进行评价：肌细胞钙吸收减少、胶原蛋白合成降低、形态学改变、脂类生物合成改变、氧化应激降低和/或肌纤维功能、完整性和/或存活改善。这些参数通常利用肌肉活检横切片的免疫荧光和/或组织化学分析来评价。

本文所用的寡核苷酸优选地包括反义寡核苷酸或反义寡核糖核苷酸。在优选的实施方案中，应用了外显子跳跃技术。外显子跳跃干扰发生于真核细胞中的天然剪接过程。在高等真核生物中，细胞DNA中的蛋白质遗传信息编码于外显子中，该外显子被内含子序列互相隔离。这些内含子在某些情况下非常长。真核生物的转录系统(transcription machinery)产生含有外显子和内含子的前mRNA，而已经在产生前mRNA期间的剪接系统通过存在于前mRNA中的外显子剪接在一起产生蛋白的实际编码区。

外显子跳跃导致缺乏至少一个跳跃的外显子的成熟mRNA。因此，当所述外显子编码氨基酸时，外显子跳跃导致表达改变的产物。外显子跳跃技术目前涉及使用反义寡核苷酸(AON)。许多这项工作在杜兴肌营养不良的mdx小鼠模型中完成。Mdx小鼠携带外显子23中的无义突变。除了妨碍合成功能性肌养蛋白的mdx突变以外，已经在mdx肌肉组织中观察到稀有的天然存在的肌养蛋白阳性纤维。这些肌养蛋白阳性纤维被认为来自由于体细胞突变或通过替代剪接而导致的明显天然存在的外显子跳跃机制。分别涉及肌养蛋白前mRNA中的内含子22和23的3’和/或5’剪接位点的AON被证实干扰通常参与除去内含子23的因子，从而外显子23也从mRNA中被除去(Alter J，et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improv

通过特定外显子的靶向跳跃，将DMD表型转变为较轻微的BMD表型。外显子跳跃优选地由靶向外显子内部序列的AON的结合诱导。针对外显子内部序列的寡核苷酸通常不表现出与非外显子序列的重叠。其优选地不与剪接位点重叠，至少在剪接位点存在于内含子中的情况下不重叠。针对外显子内部序列的寡核苷酸优选地不含有与邻近的内含子互补的序列。因此，还提供了本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能性等同物用于抑制肌养蛋白前mRNA的外显子包含入所述前mRNA的剪接所产生的mRNA中。优选应用外显子跳跃技术，从而肌养蛋白前mRNA所产生的mRNA的外显子缺乏产生了虽然较短但更具功能性的肌养蛋白的编码区。在本语境中，如前文所定义的，抑制外显子的包含优选地表示检测到原始的异常肌养蛋白mRNA和/或蛋白降低。

在本发明的语境中，寡核苷酸的功能性等同物优选地表示如本文本文所定义的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸已经被取代，并且其中至少在某种程度上保留了所述功能性等同物的活性。优选地，所述功能性等同物的活性提供了功能性肌养蛋白。因此，所述功能性等同物的所述活性优选地通过定量功能性肌养蛋白的量或通过定量功能性肌养蛋白mRNA的量来评价。优选地，功能性肌养蛋白(或功能性肌养蛋白mRNA)在本文中被定义为能够与肌动蛋白及DGC蛋白的成员结合的肌养蛋白(或由所述mRNA编码的肌养蛋白)。寡核苷酸的所述活性的评价，优选地通过RT-PCR(m-RNA)进行，或通过免疫荧光或蛋白印迹分析(蛋白)进行。当其表示至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或者更高的功能性等同物所来源的所述寡核苷酸的相应活性时，所述活性优选地保留至某种程度。这类活性可以在个体的肌肉组织或肌细胞中或者在体外于细胞中，通过与功能性等同物所来源的所述寡核苷酸的相应寡核苷酸的活性进行比较来测量。在本申请中，当使用词语寡核苷酸时，其可以由本文所定义的该寡核苷酸的功能性等同物替代。

在优选的实施方案中，包含前文所定义的与肌养蛋白前mRNA的外显子44结合和/或互补的序列的本发明的寡核苷酸是这样的：互补部分是本发明寡核苷酸长度的至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％或者甚至更优选至少95％，或者甚至更优选至少98％，或者甚至更优选至少99％，或者甚至更优选100％。在最优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸由如本文所定义的与肌养蛋白前mRNA的部分互补的序列组成。作为实例，寡核苷酸可以包含与本文所定义的肌养蛋白前mRNA的部分互补的序列和另外的侧翼序列。在更优选的实施方案中，所述寡核苷酸的所述互补部分的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸。优选地，用另外的侧翼序列改良蛋白与寡核苷酸的结合，或改良寡核苷酸的热力学性质，更优选地改良靶RNA结合亲和力。

因此，并不绝对要求互补区中的所有碱基能够与相反链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，可以例如并入不与互补链上的碱基配对的残基。可以允许某种程度的错配，如果在细胞环境中，核苷酸的长度足够与互补部分杂交。在该语境中，“足够”优选地表示利用EP 1 619 249的实施例1所述的凝胶迁移率变动分析，寡核苷酸的结合是可检测的。任选地，所述寡核苷酸还可以通过转染入患者的肌细胞来进行测试。靶向外显子的跳跃可以通过RT-PCR评价(如EP 1 619 249所述)。互补区优选地如此设计，即当组合时，他们对前mRNA中的外显子是特异性的。可以用各种长度的互补区来产生这样的特异性，因为这取决于系统中其他(前)mRNA的实际序列。一种或多种其他前mRNA也会能够与寡核苷酸杂交的风险随着寡核苷酸大小的增加而降低。明显的是，在互补区中包含错配但保留与前mRNA中靶向区域杂交和/或结合的能力的寡核苷酸可以用于本发明中。然而，优选地，至少互补部分不包含这样的错配，因为这些部分通常比在一个或多个互补区中具有这样的错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。据认为较高的杂交强度(即，增加与相反链的相互作用的数目)有利于增加干扰系统的剪接机构的过程的效率。优选地，互补为90％至100％。通常，在20个核苷酸的寡核苷酸中，这允许1或2个错配，或者在40个核苷酸的寡核苷酸中，允许1、2、3或4个错配，或者在60个核苷酸的寡核苷酸中，允许1、2、3、4、5或6个错配。

本发明的优选分子包含基于核苷酸的序列或由基于核苷酸的序列组成，该基于核苷酸的序列与选自DMD前mRNA的外显子44的序列反义。DMD前mRNA的序列优选地选自SEQ ID NO 1：5’-GUGGCUAACAGAAGCU；SEQ ID NO 2：5’-GGGAACAUGCUAAAUAC；SEQ ID NO 3：5’-AGACACAAAUUCCUGAGA和SEQ ID NO 4：5’-CUGUUGAGAAA。

本发明的分子优选为分离的分子。

本发明的分子优选为核酸分子或基于核苷酸的分子或寡核苷酸或反义寡核苷酸，其与选自SEQ ID NO：1、2、3或4的外显子44的序列结合和/或互补。

本发明的优选分子包含约8至约60个核苷酸或由约8至约60个核苷酸组成，更优选包含约10至约50个核苷酸或由约10至约50个核苷酸组成，更优选包含约17至约40个核苷酸或由约17至约40个核苷酸组成，更优选包含约18至约30个核苷酸或由约18至约30个核苷酸组成，更优选包含约18至约24个核苷酸或由约18至约24个核苷酸组成，最优选包含约20个核苷酸或由约20个核苷酸组成，例如18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸或23个核苷酸。

本发明的优选分子包含8至60个核苷酸或由8至60个核苷酸组成，更优选包含10至50个核苷酸或由10至50个核苷酸组成，更优选包含17至40个核苷酸或由17至40个核苷酸组成，更优选包含18至30个核苷酸或由18至30个核苷酸组成，更优选包含21至60个核苷酸或由21至60个核苷酸组成，更优选包含22至55个核苷酸或由22至55个核苷酸组成，更优选包含23至53个核苷酸或由23至53个核苷酸组成，更优选包含24至50个核苷酸或由24至50个核苷酸组成，更优选包含25至45个核苷酸或由25至45个核苷酸组成，更优选包含26至43个核苷酸或由26至43个核苷酸组成，更优选包含27至41个核苷酸或由27至41个核苷酸组成，更优选包含28至40个核苷酸或由28至40个核苷酸组成，更优选包含29至40个核苷酸或由29至40个核苷酸组成，更优选包含18至24个核苷酸或由18至24个核苷酸组成，或者优选地包含11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸或由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

在某些实施方案中，本发明提供了包含选自表1A所示的反义核苷酸序列的反义核苷酸序列的分子，或由选自表1A所示的反义核苷酸序列的反义核苷酸序列组成的分子。

与具有核苷酸序列SEQ ID NO 1：5’-GUGGCUAACAGAAGCU的核苷酸结合和/或互补和/或反义的本发明的分子或核酸分子，优选地包含以下反义核苷酸序列或由以下反义核苷酸序列组成：SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：54。靶向DMD前mRNA的该区域的优选分子包含以下反义核苷酸序列或由以下反义核苷酸序列组成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO 49或SEQ ID NO 54。最优选的寡核苷酸包含SEQ ID NO：5的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO：5的反义核苷酸序列组成。

在更优选的实施方案中，本发明提供了包含反义核苷酸序列SEQ ID NO 5：5’-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG或由反义核苷酸序列SEQ ID NO 5：5’-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG组成的分子。据发现，该分子非常有效地调节肌细胞中DMD基因的外显子44的剪接。包含SEQ ID NO：5的本发明的这种优选分子包含21至60个核苷酸，更优选包含22至55个核苷酸，更优选包含23至53个核苷酸，更优选包含24至50个核苷酸，更优选包含25至45个核苷酸，更优选包含26至43个核苷酸，更优选包含27至41个核苷酸，更优选包含28至40个核苷酸，更优选包含29至40个核苷酸，或者优选地包含20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸或者由20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

在另一优选的实施方案中，本发明提供了包含反义核苷酸序列SEQ ID NO 49或54或者由反义核苷酸序列SEQ ID NO 49或54组成的分子。包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：54的本发明的这些优选分子还包含18至60个核苷酸，更优选包含18至55个核苷酸，更优选包含20至53个核苷酸，更优选包含24至50个核苷酸，更优选包含25至45个核苷酸，更优选包含26至43个核苷酸，更优选包含27至41个核苷酸，更优选包含28至40个核苷酸，更优选包含29至40个核苷酸，或者优选地包含18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸，或者由18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

在另一实施方案中，与SEQ ID NO 2：5’-GGGAACAUGCUAAAUAC反义的本发明的分子优选地包含SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 44的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 44的反义核苷酸序列组成。包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的本发明的优选分子还包含17至60个核苷酸，更优选包含18至30个核苷酸，更优选包含21至60个核苷酸，更优选包含22至55个核苷酸，更优选包含23至53个核苷酸，更优选包含24至50个核苷酸，更优选包含25至45个核苷酸，更优选包含26至43个核苷酸，更优选包含27至41个核苷酸，更优选包含28至40个核苷酸，更优选包含29至40个核苷酸，更优选包含18至24个核苷酸，或者优选地包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

仍然在另一实施方案中，与SEQ ID NO 3：5’-AGACACAAAUUCCUGAGA反义的本发明的分子，优选地包含SEQ ID NO 47或SEQ ID NO 48的反义核苷酸序列或者由SEQ ID NO 47或SEQ ID NO 48的反义核苷酸序列组成。包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48的本发明的这些优选分子还包含17至60个核苷酸，更优选包含18至30个核苷酸，更优选包含17至60个核苷酸，更优选包含22至55个核苷酸，更优选包含23至53个核苷酸，更优选包含24至50个核苷酸，更优选包含25至45个核苷酸，更优选包含26至43个核苷酸，更优选包含27至41个核苷酸，更优选包含28至40个核苷酸，更优选包含29至40个核苷酸，更优选包含18至24个核苷酸，或者优选地包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

仍然在另一实施方案中，与SEQ ID NO 4：5’-CUGUUGAGAAA反义的本发明的分子优选地包含SEQ ID NO 45或SEQ ID NO 46的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 45或SEQ ID NO 46的反义核苷酸序列组成。包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46的本发明的这些优选分子还包含11至60个核苷酸，更优选包含11至30个核苷酸，更优选包含11至60个核苷酸，或者优选地包含11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸，或者由11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸组成。

本发明的分子的核苷酸序列可以含有RNA残基，或者一个或多个DNA残基，和/或一个或多个核苷酸类似物或等同物，如将在下文进一步所详细地描述的。

优选本发明的分子包含一个或多个残基，该残基经修饰增加核酸酶抗性和/或增加反义核苷酸对靶序列的亲和力。因此，在优选的实施方案中，反义核苷酸序列包含至少一种核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物被定义为具有修饰的碱基和/或修饰的主链和/或非天然核苷间连接或这些修饰的组合的残基。

在优选的实施方案中，核苷酸类似物或等同物包含修饰的主链。此类主链的实例为吗啉代主链；氨基甲酸酯主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基(methyleneformacetyl)主链；核糖乙酰基(riboacetyl)主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主链、亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；以及酰胺主链。二氨基磷酸酯(Phosphorodiamidate)吗啉代低聚物为已经作为反义试剂而研究的修饰的主链寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的主链，其中DNA的脱氧核糖由6元环代替并且磷酸二酯键由二氨基磷酸酯键代替。吗啉代寡核苷酸对酶促降解具有抗性，并且看起通过阻止翻译干扰前mRNA剪接而不是通过激活RNase H(核糖核酸酶H)来充当反义试剂发挥作用。已经通过物理破坏细胞膜的方法将吗啉代寡核苷酸成功地送递至组织培养细胞，并且比较这些方法中的几个方法的研究发现划痕负载(scrape loading)是最有效的送递方法；然而，由于吗啉代主链是不带电的，所以阳离子脂类不是细胞中吗啉代寡核苷酸吸收的有效介质。最近的报告证明，吗啉代寡核苷酸形成三链体，并且由于非离子主链，这些研究表明，吗啉代寡核苷酸在没有镁的情况下能够形成三链体。

还优选的是，主链的残基之间的连接不包含磷原子，例如由短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合或者一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键合形成的连接。

优选的核苷酸类似物或等同物包含具有修饰的聚酰胺主链的肽核酸(PNA)(Nielsen，et al.(1991)Science 254，1497-1500)。对于碱基对的识别，基于PNA的分子是DNA分子的真实模拟。PNA主链由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接至主链。替代性主链包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju and Kumar(2005)Chem.Commun，495-497)。由于PNA分子的主链含有不带电的磷酸基团，所以PNA-RNA杂化物通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂化物更稳定(Egholm et al(1993)Nature 365，566-568)。

另一优选的主链包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6元吗啉代环代替。最优选的核苷酸类似物或等同物包含二氨基磷酸酯吗啉代低聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由6元吗啉代换代替，并且邻近的吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子二氨基磷酸酯键代替。

仍然在另一实施方案中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中一个非桥接氧的取代。这种修饰稍微使碱基配对不稳定，但是明显地增加了对核酸酶降解的抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；H-膦酸酯；包括3’-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯在内的甲基及其他烷基膦酸酯；次膦酸酯；包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在内的氨基磷酸酯；硫羰基氨基磷酸酯；硫羰基烷基膦酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸盐(selenophosphate)或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。

本发明的另一优选核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，其是2’、3’和/或5’位置处的单或二取代的，如-OH；-F；取代或未取代、直链或支链低级(C1-C10)的烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可以被一个或多个杂原子中断；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨基氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)；以及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物或者脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物或者脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化的糖部分包含锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)，其中2’-碳原子连接至糖环的3’或4’碳原子，从而形成双环糖部分。优选的LNA包括2’-O，4’-C-乙烯桥接的核酸(Morita et al.2001.Nucleic Acid Res Supplement No.1：241-242)。这些取代赋予核苷酸类似物或等同物RNase H和核酸酶抗性并增加对靶RNA的亲和力。

在另一实施方案中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成和天然碱基，如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤以及本领域已知或会知道的嘧啶和嘌呤的其他氮杂、脱氮(deaza)、-羟基、-卤代、-硫代、巯基、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。

技术人员应当理解，并不需要统一地修饰反义寡核苷酸的所有位置。另外，多于一个的前述类似物或等同物可以被并入单个反义寡核苷酸或者甚至反义寡核苷酸的一个位置处。在某些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类似物或等同物。

本发明优选的反义寡核苷酸包括2’-O烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2’-O-乙基修饰的核糖、2’-O-丙基修饰的核糖和/或诸如卤代衍生物的这些修饰的取代衍生物。

本发明的最优选反义寡核苷酸包2’-O-甲基硫代磷酸酯核糖。

技术人员应当理解，可以将不同的反义寡核苷酸组合，用于外显子44有效跳跃。在优选的实施方案中，将至少两种反义寡核苷酸的组合用于本发明的方法中，例如，两种不同的反义寡核苷酸、三种不同的反义寡核苷酸、四种不同的反义寡核苷酸或五种不同的反义寡核苷酸。

可以将反义寡核苷酸连接至增强细胞的反义寡核苷酸吸收的部分，优选生肌细胞或肌细胞。这些部分的实例为胆固醇；碳水化合物；维生素；生物素；脂类；磷脂；穿透细胞的肽，其包括但不限于触角蛋白(antennapedia)、TAT、运送子(transportan)和带正电的氨基酸，如寡精氨酸、聚精氨酸、寡赖氨酸或聚赖氨酸；抗原结合结构域，如抗体提供的抗原结合结构域、抗体的Fab片段或单链抗原结合结构域，如卵形单结构域抗原结合结构域(cameloid single domain antigen-binding domain)。

优选的反义寡核苷酸包含肽连接的PMO。

可以利用本领域已知的合适方法间接地给予寡核苷酸。例如，可以向个体或所述个体的细胞、组织或器官提供表达载体形式的寡核苷酸，其中该表达载体编码包含所述寡核苷酸的转录本。优选地通过基因送递媒介物将表达载体导入细胞、组织、器官或个体。在优选的实施方案中，提供了基于病毒的表达载体，该基于病毒的表达载体包含驱动本文所鉴定的分子表达或转录的表达盒或转录盒。可以通过质粒来源的反义寡核苷酸表达或者由基于腺病毒的载体或基于腺伴随病毒的载体所提供的病毒表达来为细胞提供能够干扰基本序列的分子，该分子导致高效的外显子44跳跃。表达优选地由聚合酶III启动子驱动，例如U1、U6或U7 RNA启动子。优选的送递媒介物是病毒载体，如腺伴随病毒载体(AAV)、诸如慢病毒载体的逆转录病毒(Goyenvalle A，et al.Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping.Science 2004；306(5702)：1796-9，De Angelis FG，et al.Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells(带有针对肌养蛋白前mRNA的外显子51的剪接点的反义序列的嵌合snRNA分子在Delta 48-50 DMD中诱导外显子跳跃并恢复肌养蛋白合成).Proc Natl Acad Sci USA 2002；99(14)：9456-61或Denti MA，et al.Chimeric adeno-associated virus/antisense U1 small nuclear RNA effectively rescues dystrophin synthesis and muscle function by local treatment of mdx mice(嵌合腺伴随病毒/反义U1小核RNA通过mdx小鼠的局部治疗有效地解救肌养蛋白合成和肌肉功能).Hum Gene Ther 2006；17(5)：565-74)等。此外，可以将质粒、人工染色体、可用于人基因组细胞中的靶向同源重组和整合的质粒合适地用于送递本文所定义的寡核苷酸。本发明优选的是那些载体，其中转录由PolIII启动子驱动，和/或其中转录本为与U1或U7转录本融合物的形式，这获得送递小转录本的良好结果。技术人员可以设计合适的转录本。优选的是PolIII驱动的转录本。优选地，为与U1或U7转录本融合转录本的形式(参见，相同的Goyenvalle A et al，De Angelis FG et al或Denti MA et al)。这样的融合物可以如所述产生(Gorman L，et al，Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs(通过改良的U7小核RNA稳定地改变前mRNA剪接模式).Proc Natl Acad Sci USA 1998；95(9)：4929-34或Suter D，et al，Double-target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations(双靶向反义U7 snRNA促进三种人β地中海贫血突变中的异常外显子的有效跳跃).Hum Mol Genet 1999；8(13)：2415-23)。

可以送递寡核苷酸自身。然而，寡核苷酸也可以由病毒载体编码。通常，寡核苷酸为RNA转录本的形式，该RNA转录本包含所述转录本的一部分中的寡核苷酸的序列。

一种优选的反义寡核苷酸表达系统是基于腺病毒伴随病毒(AAV)的载体。已经开发了单链和双链基于AAV的载体，该载体可以延长小反义核苷酸序列的表达，用于使DMD的外显子44高效跳跃。

优选的基于AAV的载体包含由聚合酶III启动子(Pol III)驱动的表达盒。优选的Pol III启动子为，例如U1、U6或U7 RNA启动子。

因此，本发明还提供了基于病毒的载体，其包含Pol III启动子驱动的表达盒，用于表达本发明的诱导DMD基因的外显子44跳跃的反义寡核苷酸。

考虑到已经目前已经实现的进步，所以期望改善为个体或所述个体的细胞、组织、器官提供寡核苷酸和/或其等同物的方式。当然，可以并入这样的未来改进，来利用本发明的方法实现对重建mRNA的所述效果。可以将寡核苷酸和/或其等同物自身送递至个体、所述个体的细胞、组织或器官。当给予寡核苷酸和/或其等同物时，优选将寡核苷酸和/或其等同物溶于与送递方法相容的溶液中。可以通过提供水溶液中的质粒，为肌细胞或生肌细胞提供用于反义寡核苷酸的质粒。或者，可以利用已知的转染试剂，通过转染来提供质粒。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内和/或心室内给药，优选溶液为生理盐水溶液。特别优选的是，在本发明中使用赋形剂或转染试剂，其有助于将本文所定义的每种组分送递至细胞和/或送递入细胞，优选肌细胞。能够形成复合物、纳米颗粒、微团、小泡和/或脂质体的赋形剂或转染试剂是优选的，其将复合或捕捉在小泡或脂质体中的本文所定义的每种组分送递通过细胞膜。许多这些赋形剂在本领域是已知的。合适的赋形剂或转染试剂包括聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBI Fermentas))；LipofectAMINE^TM 2000或其衍生物；或者类似的阳离子聚合物，其包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)和衍生物；合成亲水脂分子(SAINT-18)；lipofectinTM；DOTAP；和/或病毒衣壳蛋白，其能够自我组装成可以将本文所定义的每种组分送递至优选肌细胞的细胞的颗粒。已经证实这样的赋形剂有效地将诸如反义核酸的寡核苷酸送递至包括肌细胞在内的各种培养细胞。对于整体细胞存活率，将它们的高转染潜力与期望的低至中等的毒性组合。结构修饰的便利可以用于允许进一步的修饰以及它们的其他(体内)核酸转移特征和毒性的分析。

Lipofectin代表脂质体转染试剂的实例。其由两种脂质组分组成：阳离子脂质N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(cp.DOTAP，其是甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组送递系统是聚合纳米颗粒。

可以将诸如已知为DNA转染试剂的二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的聚阳离子与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合以配制阳离子纳米颗粒，其可以将优选寡核苷酸的本文所定义的每种组分跨越细胞膜送递入细胞。

除了这些常见的纳米颗粒材料以外，阳离子肽鱼精蛋白提供了配制寡核苷酸与胶体的替代方法。这种胶态纳米颗粒系统可以形成所谓的proticle，其可以通过简单的自我组装过程来包装并介导寡核苷酸的细胞内释放而制备。技术人员可以选择并采用任何上述或其他可商购的替代赋形剂和送递系统来包装和送递用于本发明的寡核苷酸从而将其送递，用于治疗人的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良。

此外，可以将寡核苷酸共价或非共价连接至靶向配体，该靶向配体经特别的设计促进吸收入细胞、细胞质和/或其细胞核。这样的配体可以包含(i)化合物(包括但不限于肽(样)结构)，其识别促进细胞吸收的细胞、组织或器官特异性元件，和/或(ii)化学化合物，其能够促进吸收入细胞和/或寡核苷酸从诸如核内体或溶酶体的小泡的细胞内释放。

因此，在优选的实施方案中，将寡核苷酸配制于组合物或药物或组合物中，并为其提供至少赋形剂和/或用于送递的靶向配体和/或将其送递细胞和/或增强其细胞内送递的送递装置。因此，本发明还包含药物可接受的组合物，该药物可接受的组合物包含寡核苷酸并且还包含至少一种赋形剂和/或用于送递的靶向配体和/或将所述寡核苷酸送递至细胞和/或增强其细胞内送递的送递装置。

应当理解，如果组合物包含诸如后文所定义的辅助化合物的其他组分，则该组合物的每种组分可以不配制于一种单一的组合或组合物或制剂中。取决于它们的特性，技术人员会知道哪种类型的制剂最适合本文所定义的每种组分。在优选的实施方案中，本发明提供了包含寡核苷酸和如后文所定义的其他辅助化合物的组件试剂盒(kit of parts)形式的组合物或制剂。

优选的寡核苷酸用于预防或治疗个体的杜兴肌营养不良(DMD)或贝克肌营养不良(BMD)。可以用本发明的寡核苷酸治疗的个体可能已经诊断为患有DMD或BMD。或者，可以用本发明的寡核苷酸治疗的个体可能尚未诊断为患有DMD或BMD，但是该个体可以是考虑到其遗传背景而具有增加的发展DMD或BMD风险的个体。优选的个体是人。

若需要，可以通过添加药物可接受的载体将表达本发明反义寡核苷酸的分子或载体并入药理活性混合物中。

因此，本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含：包含本发明的反义寡核苷酸的分子，或者表达本发明的反义寡核苷酸的基于病毒的载体。

在另一方面，提供了包含本文所定义的寡核苷酸的组合物。优选地，所述组合物包含至少两种不同的本文所定义的寡核苷酸。更优选地，这两种不同的寡核苷酸经设计使一个或两个或更多个外显子跳跃。本发明包括多重跳跃，其中诱导外显子44跳跃的本发明的寡核苷酸与诱导另一外显子跳跃的另一寡核苷酸联合使用。在该语境中，另一外显子可以为外显子43、45或52。多外显子跳跃已经公开于EP 1 619 249中。DMD基因为具有许多不同外显子的大基因。考虑到该基因位于X染色体上，受到影响的，主要是男孩，尽管女孩也可以受该疾病的影响，因为它们可以从父母接受该基因的坏拷贝或者由于他们的肌细胞中特定偏向的X染色体失活而遭受功能性等位基因的特定偏向失活。蛋白由至少2.4Mb的多个外显子(79)编码。缺陷可以发生在DMD基因的任何部分。特定外显子或特定的多个外显子的跳跃可以常见地导致重建的mRNA，其编码比正常肌养蛋白短但是至少具有部分功能的肌养蛋白。开发基于外显子跳跃技术的药物的实践问题是，可能导致细胞中功能性肌养蛋白缺乏的众多突变。尽管可以通过单一外显子的跳跃来修正多个不同的突变这一事实，但是这样的众多突变要求对不同突变需要跳跃不同的外显子产生一系列不同的药物。能够诱导两个或更多个外显子跳跃的寡核苷酸或包含如后文所定义的至少两种不同寡核苷酸的组合物的优势在于，可以用单一的药物使多于一个外显子跳跃。这种属性不仅是实用的，而且对于治疗许多不同DMD或特定的严重BMD突变而仅需要产生有限数目的药物是非常有用的。本领域技术人员已知的另一选择是选择特定功能性重建的肌养蛋白，并制备能够产生这些优选的肌养蛋白的化合物。这样的优选的最终结果还称为轻微表型肌养蛋白。

在优选的实施方案中，所述组合物优选为药物组合物，所述药物组合物包含药物可接受的载体、佐剂、稀释剂和/或赋形剂。

还提供了这样的药物组合物，其可以包含任何药物可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂。这样的药物可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂可以例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition(制药科学和实践，第20版).Baltimore，MD：Lippincott Williams & Wilkins，2000中发现。所述组合物的每一特征都在前文中进行了定义。

如果使用几种寡核苷酸，则本文中已经定义的浓度或剂量可以指所用的全部寡核苷酸的总浓度或剂量或者所用或所添加的每种寡核苷酸的浓度或剂量。因此，在一实施方案中，提供了组合物，其中所用的每种寡核苷酸的量或寡核苷酸的总量按0.5mg/kg至10mg/kg的量剂量给药。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸或表达本发明的反义寡核苷酸的基于病毒的载体在调节DMD mRNA剪接中的用途。剪接优选地于体外在人生肌细胞或肌细胞中进行调节。更优选的是，剪接于体内在人生肌细胞或肌细胞中进行调节。

包含本发明的一种或多种核苷酸类似物或等同物的优选反义寡核苷酸在全身送递时调节包括心肌细胞在内的一种或多种肌细胞中的剪接。在这一方面，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的全身送递可能导致靶向肌细胞的亚群，而包含不同核苷酸类似物或等同的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不同亚群。因此，在一实施方案中，优选地使用包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的组合，用于调节DMD mRNA的外显子44跳跃。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸或表达本发明的反义寡核苷酸的基于病毒的载体在制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。

因此，在另一方面，提供了本文所定义的寡核苷酸或组合物在制备用于预防或治疗个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的药物中的用途。所述用途的每种特征在前文进行了定义。

本发明的用途或方法中的治疗为至少1周，至少1个月，至少几个月，至少1年，至少2、3、4、5、6年或更长。用于本发明的本文所定义的每种分子或寡核苷酸或其等同物可以适合于直接体内给予受DMD或BMD影响或面临发展DMD或BMD风险的个体的细胞、组织和/或器官，并且可以直接体内、离体或体外给药。本发明的寡核苷酸、组合物、化合物或辅助化合物的给药频率可以取决于几种参数，如患者的年龄、患者的突变、分子的数量(即，剂量)、所述分子的制剂。频率可以为两周或4周或5周或者更长的时间内至少1次。

本发明的寡核苷酸的剂量范围优选地基于临床试验中的剂量渐增而设计(体内使用)，其中存在严格的方案要求。本文所定义的分子或寡核苷酸可用的剂量为0.1mg/kg至20mg/kg，优选为0.5mg/kg至10mg/kg。

在优选的实施方案中，可以使用的本文所定义的寡核苷酸的浓度范围为0.1nM至1μM。优选地，该范围用于诸如肌细胞或肌肉组织的细胞模型的体外用途。更优选地，所用浓度的范围为0.3nM至400nM，甚至更优选为1nM至200nM。如果使用几种寡核苷酸，则该浓度或剂量可以指寡核苷酸的总浓度或剂量或者所添加的每种寡核苷酸的浓度或剂量。

上文给出的寡核苷酸的浓度或剂量范围为体外或离体使用的优选浓度或剂量。技术人员应当理解，取决于所用的寡核苷酸、要治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所用的培养基及转染和孵育条件，所用的寡核苷酸的浓度或剂量还可以变化并且需要进一步优化。

本发明所用的本文所定义的寡核苷酸可以适合于体内给予受DMD或BMD影响或面临发展DMD或BMD风险的个体的细胞、组织和/或器官，并且可以体内、离体或体外给药。所述寡核苷酸可以直接或间接给予受DMD或BMD影响或面临发展DMD或BMD风险的个体的细胞、组织和/或器官，并且可以直接或间接体内、离体或体外给药。由于杜兴肌营养不良和贝克肌营养在不良肌细胞中具有明显表型，所以优选地所述细胞是肌细胞，还优选地所述组织是肌肉组织和/或还优选地所述器官包含肌肉组织或由肌肉组织组成。优选的器官为心脏。优选地，所述细胞包含编码突变体肌养蛋白的基因。优选地，所述细胞为患有DMD或BMD个体的细胞。

除非另外指明，可以将本文所述的每个实施方案与本文所述的另一实施方案组合。

在本文及其权利要求中，动词“包含”及其变形以其非限制性意义使用，以表示包括该词语之后的项，但是并不排除未特别指出的项。此外，动词“由…组成”可以由“基本上由…组成”代替以表示本文所定义的化合物或辅助化合物除了特别指定的组分外可以包含其他组分，所述其他组分并不改变本发明的独特特征。

此外，通过不定冠词“a(一个)”或“an(一个)”对要素的引用不排除存在多于一项要素存在的可能性，除非上下文明确地要求有且仅有一项要素。因此，不定冠词“a(一个)”或“an(一个)”通常表示“至少一个”。

当词语“大约”或“约”当与数值联合使用时(大约10，约10)优选地表示值可以为大于该值的10％或小于该值的1％的给定值。

本文所用的表述“体内”可以表示，在可以分离自细胞所来源的有机体的细胞体系中。优选的细胞为肌细胞。体内还可以表示在组织中或在多细胞有机体中，该多细胞有机体优选为本文所定义的患者。在本发明中，体内与通常与无细胞体系相关的体外相反。

本说明书所引用的全部专利和文献通过引用特此整体并入本文。除非另外指明，可以将本文所指的每个实施方案组合在一起。

在下文的实施例中将进一步解释本发明。这些实施例并不限制本发明的范围，而是仅仅用于阐明本发明。

附图图例

图1.在来自健康对照或具有外显子45缺失的DMD患者的转染的肌细胞中，经设计诱导来自DMD基因的外显子44跳跃的AON的评价。

(A)在来自具有外显子45缺失的患者分化的肌细胞(肌管)中，所有测试(转染)的AON以150nM的浓度诱导了外显子44跳跃，并且PS188(SEQ ID NO：5)、PS190(以前公开为h44AON2；Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)、PS191(SEQ ID NO：47)、PS193(SEQ ID NO：48)、PS194(SEQ ID NO：46)和PS196(SEQ ID NO：51)证明了最高的效率(84％-94％)。

(B)还通过以150nM和400nM转染至健康人对照细胞来测试大部分AON。结果总结于该柱状图中。PS188(SEQ ID NO：5)、PS190、PS191(SEQ ID NO：47)、PS193(SEQ ID NO：48)、PS194(SEQ ID NO：46)和PS196(SEQ ID NO：51)被证实在诱导外显子44跳跃中最有效。注意，患者细胞中外显子44跳跃水平通常高于对照细胞，因为以下事实：与健康细胞相比，在患者细胞中，外显子44跳跃是读框恢复的并且更具功能性且稳定。在所有实验中，在未转染的肌细胞中没有观察到外显子44跳跃(数据未显示)。

(C)在对照肌细胞中，以150nM和400nM的转染浓度类似地测试了PS197(SEQ ID NO 52)以及3个另外的AON即PS199(SEQ ID NO 44)、PS200(SEQ ID NO 49)和PS201(SEQ ID NO 50)的实施例。外显子44跳跃百分比为1％(PS199)至44％(PS200)。M：DNA大小标记(100bp梯)。

图2.通过转染人对照肌细胞或外周血单核细胞(PB-MNC)进行的PS188(SEQ ID NO：5)其他评价。

(A)剂量应答实验。在人对照肌细胞中，在从50nM增加至400nM的转染剂量，PS188表现出水平渐增的外显子44跳跃(一式3份)，在400nM时高达45％。

(B)用200nM PS188转染健康个体的PB-MNC。尽管肌养蛋白在该类型的细胞中仅以低水平表达这一事实，但是仍然明显地观察到了外显子44跳跃。这些结果证实了PS188诱导来自DMD基因的外显子44跳跃的效率。M：DNA大小标记。

图3.通过向表达全长人DMD基因的转基因hDMD小鼠和广泛的毒性研究中所包括的猕猴(cynomolgus monkey)给药而进行的PS188(SEQ ID NO：5)的其他评价。

(A)向hDMD小鼠的腓肠肌(G1和G2)肌肉内注射2x40g PS188后，观察到外显子44跳跃，尽管是低水平的。这证实PS188在肌肉组织中体内诱导人外显子44跳跃的能力。鉴于这样的事实，即与营养不良肌纤维相比，该小鼠模型已经具有通常表现出较低水平的AON吸收的健康肌纤维，所以低水平是预期的。NT：在未处理的hDMD肌肉中，未观察到外显子44跳跃。M：DNA大小标记。

(B)在PS188的毒性试验所包括的猴中，以6mg/kg PS188的剂量水平进行每4天1小时、持续29天的静脉内输注后，在外周血单核细胞(PB-MNC)中观察到外显子44跳跃。在未处理的猴中(NT)，未观察到外显子44跳跃。M：DNA大小标记。

实施例

实施例1

材料与方法

AON设计(部分地)基于靶外显子RNA的重叠开放二级结构，这是通过m-倍程序(m-fold program，Mathewset al.，J Mol Biol 1999；288(5)：911-40)预测的；(部分)地基于重叠推定SR-蛋白结合位点，这是通过ESE-发现软件(ESE-Finder software，rulai.cshl.edu/tools/ESE/)(Cartegni et al.，Nucleic Acids Res 2003；31(13)：3568-71)预测的；以及基于避免3个或更多个核苷酸或CpG对的G段(G-stretch)。AON(参见表1)由Eurogentec(Belgium)和Prosensa Therapeutics BV(Leiden，Netherlands)合成，并且含有2’-O-甲基RNA和全长硫代磷酸酯主链。

组织培养、转染和RT-PCR分析

如以前所述(Aartsma-Rus et al.Hum Mol Genet 2003；12(8)：907-14；Havenga et al.J Virol 2002；76(9)：4612-20)，处理来自健康个体(“人对照”)或具有外显子45缺失的DMD患者的肌管培养物。为了筛查AON，用150nM和/或400nM的每种AON转染肌管培养物。使用转染试剂聚乙烯亚胺(PEI，ExGen500 MBI Fermentas)或衍生物(UNIFectylin，Prosensa Therapeutics BV，Netherlands)，并且每克AON 2μl ExGen500或UNIFectylin。将具有荧光标记的对照AON用于证实最优的转染效率(通常获得超过90％的荧光核)。如所述(Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)，转染后24至48小时分离RNA。利用位于外显子44侧翼的外显子中的引物，通过巢式RT-PCR分析来测定外显子跳跃效率(Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)。利用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，从琼脂糖凝胶分离PCR片段，利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied Biosystems)和ABI 3700测序仪(PE Applied Biosystems)，进行序列验证(由Leiden基因组技术中心(LGTC))。对于定量，利用DNA 1000LabChips试剂盒在Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)上分析PCR产物。

结果

设计了一系列靶向外显子44中的序列的AON，并通过转染和随后的分离的RNA的RT-PCR及序列分析在健康对照和患者来源的肌管培养物中进行测试。在源自具有外显子45缺失的DMD患者的肌管中，对于每个AON(PS187至PS201)，以150nM诱导特异性外显子44跳跃，并且PS188(SEQ ID NO：5)、PS190(以前公开为h44AON2，Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)、PS191(SEQ ID NO：47)、PS193(SEQ ID NO：48)、PS194(SEQ ID NO：46)和PS196(SEQ ID NO：51)证明了最高水平的跳跃(在150nM时，84％至94％)(图1A)。

在来自健康个体的对照细胞中进行类似的转染。评价了外显子44跳跃的百分比，并与患者细胞培养物进行比较(图1B)。对照百分比通常低于患者细胞的百分比，这是外显子44跳跃后对照转录本无义介导的RNA衰变(decay)所固有的(参见，例如图1A(患者细胞)比图1C(对照细胞)的PS197结果)。

在对照肌细胞中，以150nM和400nM的浓度，测试了三个其他的AON(PS199(SEQ ID NO 44)、PS200(SEQ ID NO 49)和PS201(SEQ ID NO 50)。外显子44跳跃百分比的范围为1％(PS199)至44％(PS200)(图1C)。基于所有的转染实验，AON PS187、PS188、PS190、PS191、PS192、PS193、PS194、PS196和PS200被认为是最有效的，并且AONPS189、PS197、PS198、PS199和PS201是效率最低的。

在剂量应答实验中，通过应用一式三份从50nM至400nM的渐增剂量，还在健康人对照肌细胞中测试了PS188(SEQ ID NO 5)。因此，观察到水平渐增的外显子44跳跃，在400nMPS188时高达45％(图2A)。

实施例2

材料与方法

将收集于EDTA管中的新鲜健康人对照血液样品在HistoPaque梯度介质(HistoPaque gradient)顶部分层。一旦离心，则收集含有单核细胞的第二层(从顶部到底部，4层)，将其洗涤并再次离心。将细胞团重悬浮于增殖培养基中，并进行计数。在6孔板中，每孔接种8x10⁶个细胞，并在37℃、5％CO₂的条件下孵育3hr(小时)。然后将细胞用0或200nM PS188(SEQ ID NO：5；2’OMePS RNA；Prosensa Therapeutics BV)转染，每盘两份。转染后72hr分离RNA，并利用位于外显子44侧翼的DMD-基因特异性引物(Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)，通过RT-PCR分析进行分析。序列分析(由Leiden基因组技术中心(LGTC))，利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied Biosystems)和ABI 3700测序仪(PE Applied Biosystems)针对分离的PCR产物(利用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN))进行，以确认RNA水平的特异性外显子44跳跃。

结果

在来自健康对照个体的转染的外周血单核细胞(PB-MNC)中，当以200nM应用时，PS188诱导新的较短的转录本片段产生(图2B)。将该片段分离并测序，并且由于外显子44的特异性跳跃而得以证实。在非转染的PB-MNC中，未观察到外显子44跳跃。这些结果表明，PS188是有效的体外诱导人外显子44跳跃的化合物。

实施例3

材料与方法

反义寡核糖核苷酸(AON)

将正常和mdx小鼠(Sicinski et al.(1989).Science 244：1578-1580)注射小鼠特异性m46AON4(van Deutekom et al.(2001)Hum Mol Genet 10：1547-1554)，而将hDMD小鼠注射人特异性PS196(SEQ ID NO 51)或PS188(SEQ ID NO 5)。两种AON都含有全长硫代磷酸酯主链和2’-O-甲基修饰的核糖分子(PS196：Eurogentec，Belgium；PS188：Prosensa Therapeutics BV)。

正常、mdx和转基因hDMD小鼠

正常小鼠(C57Bl/6NCrL)和mdx小鼠(C57Bl/10ScSn-mdx/J)获得自Charles River Laboratories(The Netherlands)。转基因hDMD小鼠在我们自己的LUMC实验室进行改造。简言之，通过与带有含有全长(2.4Mb)人DMD基因的2.7Mb的YAC的酵母原生质球融合，对胚胎干细胞(ES)进行遗传修饰。该YAC以前通过酵母中较小的重叠YAC的同源重组来构建(Den Dunnen et al.(1992).Hum Mol Genet 1：19-28)。如通过PFGE定位、全基因的外显子-PCR分析和中期FISH分析所评价的，ES细胞表现出整合了一个拷贝的全尺寸YAC，将该ES细胞用于产生纯合hDMD小鼠(’t Hoen et al.，J.Biol.Chem.2008)。转基因hDMD小鼠看起来身体上未受遗传修饰影响。可以在肌肉中，在RNA和蛋白水平上，证实人DMD基因的合适表达。这些小鼠的改造获得Dutch Ministry of Agriculture(LNV)；project nr.VVA/BD01.284(E21)的许可。

AON的给药

小鼠的肌肉内AON注射实验由Leiden大学医学系(Medical Faculty of Leiden University)的动物实验委员会(UDEC)许可(项目号00095，03027)。根据生产商的说明书，注射AON，该AON为纯AON，或与阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI；ExGen 500(20x)，MBI Fermentas)以1ml PEI每nmol AON的比率，在5％w/v葡萄糖溶液中复合，或者与15nmol SAINT-18TM(Synvolux Therapeutics B.V.，The Netherlands)复合。SAINT-18TM送递系统基于阳离子吡啶鎓头基团，并且允许反义寡核苷酸的无毒送递。通过腹膜内注射1∶1(v/v)的Hypnorm/Dormicum溶液(Janssen Pharmaceutica，Belgium/Roche，The Netherlands)，将小鼠麻醉。以40μl的最终注射体积，利用带有22号针的Hamilton注射器，将纯AON(PS188)给予至小鼠的两块腓肠肌中。小鼠以24h的间隔接受两次40μl注射。在注射后不同的时间点将它们处死，对于注射PS188的hDMD小鼠，为最后注射后10天。将肌肉分离并冷冻于液氮冷却的2-甲基丁烷中。

RT-PCR分析

将肌肉样品在RNA-Bee溶液(Campro Scientific，The Netherlands)中匀质化。根据生产商的说明书，分离并纯化总RNA。对于使用逆转录酶C.therm聚合酶(therm polymerase)或Transcriptor(Roche Diagnostics，The Netherlands)的cDNA合成，将300ng的RNA用于20μl的反应中，并且在60℃保持30min，该反应使用小鼠或人特异性引物逆转录。第一PCR使用外部引物对(对于注射PS188的小鼠，侧翼外显子43-45)，反应条件为94℃(40sec(秒))、60℃(40sec)和72℃(60sec)，20个循环。然后，利用在直接位于靶外显子(对于注射PS188的小鼠，外显子44)侧翼的外显子中的巢式引物组合，再次扩增1μl该反应物(1∶10稀释)，反应条件为94℃(40sec)、60℃(40sec)和72℃(60sec)，30个循环。在2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。利用DNA 1000LabChip

试剂盒和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，The Netherlands)，通过定量PCR产物来测定跳跃效率。引物对和序列以前已有描述(Aartsma-Rus et al.(2002)Neuromuscul Disord 12 Suppl：S71.8，17；van Deutekom et al.(2001)Hum Mol Genet 10：1547-1554)。

序列分析

利用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，从2％琼脂糖凝胶分离RT-PCR产物。由Leiden基因组技术中心(LGTC)，利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied Biosystems)，直接进行DNA测序，并在ABI 3700测序仪(PE Applied Biosystems)上进行分析。

MALDI-TOF质谱

按照生产商的说明书，利用核酸纯化试剂盒(SequazymeTM Pinpoint SNP试剂盒的核酸纯化试剂盒，Applied Biosystems)，用96孔离心板(spin plate)(Applied Biosystems)，纯化RNA-Bee肌肉匀浆。将1ml等份的基质溶液(50％乙腈中的50mg/ml 3-羟基吡啶甲酸和25mM柠檬酸二铵)应用于AnchorChipTM样品靶标(Bruker Daltonics，Germany)，并空气干燥。以0.5ml等份将样品点至基质晶体上，并空气干燥。在Reflex III MALDI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics，Germany)进行质量测定。以反射模式获得光谱并积累约900激光发射。分析标记和未标记的m46AON4样品，用于比较。

结果

野生型肌肉中的外显子跳跃

我们首先建立小鼠肌肉中的体内靶向的外显子跳跃，并优化不同的给药参数。初始实验在野生型小鼠中进行，而无义介导的RNA衰变会导致低估外显子跳跃效率，AON的效果仅在mRNA水平进行监测。我们注射了0.9nmol至5.4nmol的剂量渐增的每种反义寡核苷酸。总肌肉RNA的RT-PCR分析证明，在所有注射的样品中出现了新的较短的转录本片段。序列分析证实了该产物中精确的外显子44跳跃(数据未显示)。

分析了对侧注射的肌肉的横切片的荧光标记的对照AON的分散和持续性。注射纯AON后，我们在某些纤维内观察到高达一周的荧光信号。在较晚的时间点，只观察到弱信号，并且主要在胞间隙中。甚至在3周后，PEI的使用明显地增强了荧光信号的分散和持续性。然而，其还诱导吸收大部分荧光的纤维降解和单核细胞渗入。利用SAINT，在胞间隙(interstitial space)中检测到高达1周的大部分信号，这表明该试剂不有效地将AON送递入肌纤维中。由于荧光信号可以不对应于完整且功能性AON的存在，所以我们进行了注射的肌肉样品的MALDI-TOF质谱。分析表明，在24小时内从AON除去了荧光标记。当使用PEI时，标记的AON仅在2周内是可检测的。间质AON可能比细胞内AON对降解更敏感。在全部3个系列中，在注射后3至4周观察到未标记的AON，但是当存在于细胞内时，即在PEI系列中，该AON可以只是功能性的。

hDMD肌肉中人特异性外显子跳跃

由于外显子跳跃策略是序列特异性的治疗方法，所以理想的临床前验证应当为小鼠实验背景中的靶人DMD基因。我们改造了这样的转基因“人化”DMD(hDMD)小鼠，其带有整合和功能性的全长人DMD基因的拷贝。hDMD小鼠肌肉中人肌养蛋白的表达通过横切片的免疫组织化学分析，利用人特异性抗体(MANDYS106)来特异性地检测。在肌肉RNA水平，利用小鼠或人特异性引物的RT-PCR证明了人DMD基因的正确转录。而且，一旦与mdx小鼠杂交，则hDMD构建体表现为补偿应营养不良缺陷，这如通过组织学和cDNA微阵列分析所评价的(’t Hoen et al.，J.Biol.Chem.2008)。hDMD小鼠具有健康的肌纤维，该肌纤维通常表现出有限的裸AON的吸收。将与PEI复合的人特异性AON PS196(SEQ ID NO 51)，或无PEI的PS188(SEQ ID NO 5)注射到hDMD小鼠的腓肠肌中(24hr内注射2x40μg)。在注射后7至10天，我们清楚地观察到来自人DMD转录本的靶向的外显子44的跳跃(图3A)。尽管人特异性AON与相应的小鼠序列是高度同源的，各自的20-mer中只有2或3个错配，但是小鼠内源转录本的所受的影响并没有达到任何可检测的水平。序列分析证实PS188诱导了外显子44跳跃。在未处理的hDMD肌肉中，没有观察到外显子44跳跃。这些结果表明，PS188是诱导肌肉组织中人外显子跳跃的有效化合物。

实施例4

材料与方法

作为PS188的广泛毒性项目的一部分，每4天通过1小时静脉内输注(5mL/kg/h)处理非禁食的猕猴，持续29天，剂量水平为6mg/kgPS188(SEQ ID NO 5；2’OMePS RNA；Agilent Life Sciences，USA)。在每个处理天(第1、5、9、13、17、21、25和29测试天)，且在开始给药前不久(尽可能的在给药前，最多在给药开始前1小时内)，新鲜地制备PS188制剂。制剂通过将PS188溶于磷酸盐缓冲液来制备；如药品的分析证书所提供的，考虑纯度和水含量。按照每只动物目前的体重，调整PS188的量。最后给药(第33天)后96小时，将动物处死。将全血样品收集于EDTA管中，并(室温下过夜运输后)在HistoPaque梯度介质的顶部分层。一旦离心，收集含有单核细胞的第二层(从顶部到底部，4层)，将其洗涤并再次离心。从所得的细胞团分离RNA，并利用位于外显子44侧翼的DMD基因特异性引物(Aartsma-Rus et al.Neuromuscul Disord 2002；12 Suppl：S71)，通过RT-PCR分析进行分析。序列分析(由Leiden基因组技术中心(LGTC))，利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied Biosystems)和ABI 3700测序仪(PE Applied Biosystems)，针对分离的PCR产物(利用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN))进行，以确认RNA水平上的特异性外显子44跳跃。

结果

在每4天以6mg/kg PS188的剂量水平通过1小时静脉内输注处理29天的猴中，于外周血单核细胞(图3B)中，观察到外显子44跳跃，尽管事实是，这些细胞仅表达低水平的肌养蛋白。实际上，PS188所靶向的人和猴DMD序列是100％相同的。在未处理的猴中没有观察到外显子44跳跃。这些结果表明，PS188是体内诱导外显子44跳跃的有效化合物。

表1 反义寡核苷酸序列

表1A

1(PS188)	UCAGCUUCUGUUAGCCACUG	SEQ ID NO 5
			2	UUCAGCUUCUGUUAGCCACU	SEQ ID NO 6
3	UUCAGCUUCUGUUAGCCACUG	SEQ ID NO 7
			4	UCAGCUUCUGUUAGCCACUGA	SEQ ID NO 8
5	UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGA	SEQ ID NO 9

表1B

47(PS196)	GCCGCCAUUUCUCAACAG	SEQ ID NO 51
			48(PS197)	GUAUUUAGCAUGUUCCCA	SEQ ID NO 52
49(PS198)	CAGGAAUUUGUGUCUUUC	SEQ ID NO 53
			50(PS189)	UCUGUUAGCCACUGAUUAAAU	SEQ ID NO 54

SEQ ID NO：55智人(Homo sapiens)DMD氨基酸序列

MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFVLWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPDVEEILSKGQHLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTVDAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM

Claims (11)

1.核酸分子，其与具有核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQ ID NO：1)的核苷酸结合和/或互补。

2.如权利要求1所述的分子，其中所述分子包含反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含8至60个核苷酸或由8至60个核苷酸组成。

3.如权利要求2所述的分子，其中所述反义寡核苷酸包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：54。

4.如权利要求3所述的分子，其中所述分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：5或由核苷酸序列SEQ ID NO：5组成。

5.如权利要求1-4中任一项权利要求所述的分子，包含2’-O烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸。

6.如权利要求5所述的分子，其中所述分子包含2’-O甲基硫代磷酸酯核糖。

7.基于病毒的载体，包含Pol III启动子驱动的表达盒，用于表达权利要求1-6中任一项权利要求所定义的分子，优选地，所述分子与所述核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQ ID NO：1)结合和/或互补。

8.药物组合物，包含权利要求1-6中任一项权利要求所定义的分子或权利要求7所述的载体和药物可接受的载体。

9.权利要求1-6中任一项权利要求所定义的分子或权利要求7所述的载体在调节DMD前mRNA剪接中的用途。

10.权利要求1-6中任一项权利要求所定义的分子或权利要求7所述的载体在制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。

11.用于诱导细胞中DMD基因的外显子44跳跃的方法，所述方法包括为所述细胞提供权利要求1-6中任一项权利要求所定义的分子或权利要求7所述的载体。

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