ES2772825T3 - Modulación de la expresión de huntingtina - Google Patents

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Holly Kordasiewicz
Lisa Stanek
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Abstract

Un oligonucleotido modificado monocatenario que consiste en de 12 a 30 nucleosidos unidos, dirigido a un acido nucleico que codifica huntingtina y puede inhibir la expresion de huntingtina, en el que el oligonucleotido modificado comprende: un segmento de separacion que consiste en desoxinucleosidos unidos; un segmento de ala 5' que consiste en nucleosidos unidos; y un segmento de ala 3' que consiste en nucleosidos unidos; en el que el segmento de separacion se situa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleosido de cada segmento de ala comprende un azucar modificado, y en el que los nucleosidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 28.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de la expresión de huntingtina
Campo de la invención
En el presente documento se proporcionan compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARNm de huntingtina y proteína huntingtina en un animal. Dichos compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington.
Antecedentes
La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica dominante devastadora causada por una expansión de trinucleótidos CAG repetidos que codifica un tramo de poliglutamina (PolyQ) anormalmente largo en la proteína huntingtina. El gen de la enfermedad de Huntington se mapeó por primera vez en 1993 (The Huntington's Disease Collaborative Research Group. Cell. 1993, 72:971-83), y consiste en un gen, IT15, que contenía una repetición polimórfica de trinucleótidos que es más larga e inestable en los cromosomas de la EH. Aunque las repeticiones de CAG del intervalo de tamaño normal normalmente se heredan como alelos mendelianos, las repeticiones de la EH expandidas son inestables en la transmisión meiótica y se encuentran expandidas más allá del intervalo de tamaño normal (6-34 unidades de repetición) en pacientes con Eh .
Tanto la proteína huntingtina normal como las variantes se localizan principalmente en el citoplasma de las neuronas (DiFiglia y col., Neuron 1995, 14:1075-81). Como resultado de la longitud excesiva de poliglutamina, la proteína huntingtina forma agregados en el citoplasma y el núcleo de las neuronas del SNC (Davies y col., Cell 1997, 90:537-548). Para investigar los efectos de las repeticiones polyQ expandidas en la localización y el procesamiento de huntingtina se han utilizado tanto animales transgénicos como líneas celulares genéticamente modificadas. Sin embargo, todavía no está claro si la formación de agregados per se es la etapa citotóxica esencial o una consecuencia de la disfunción celular.
La EH se caracteriza por corea progresiva, cambios psiquiátricos y deterioro intelectual. Este trastorno dominante afecta a hombres y mujeres por igual, y se produce en todas las razas (Gusella y MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol.
19955:656-62). Los síntomas de la e H se deben a la muerte de las neuronas en muchas regiones del cerebro, pero es más evidente en el cuerpo estriado, en particular en el núcleo caudado, que sufre un gradiente progresivo de pérdida celular que finalmente diezma toda la estructura. Aunque el gen que codifica huntingtina se expresa de manera ubicua (Strong, T.V. y col., Nat. Genet. 1995, 5:259-263), se observa pérdida selectiva de células y astrocitosis fibrilar en el cerebro, en particular en el núcleo caudado y el putamen del cuerpo estriado y en la corteza cerebral de pacientes con EH (Vonsattel, J-P. y col., Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44:559-577), y, en menor medida, en el hipocampo (Spargo, E. y col., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56:487-491) y el subtálamo (Byers, R.K. y col., Neurology 1973, 23:561-569).
Huntingtina es crucial para el desarrollo normal y se puede considerar como un gen de supervivencia celular (Nasir y col., Human Molecular Genetics, Vol. 5, 1431-1435). La función normal de huntingtina aún no se ha caracterizado por completo, pero basándose en las interacciones entre proteínas, parece estar asociada con el citoesqueleto y ser necesaria para la neurogénesis (Walling y col., J. Neurosci Res. 1998, 54:301-8). Huntingtina es escindida específicamente durante la apoptosis por una cisteína proteasa clave, la apopaína, que se sabe que desempeña un papel fundamental en la muerte celular apoptótica. Los tramos de poliglutamina más largos potencian la tasa de escisión, lo sugiere que la apoptosis inapropiada subyace la EH.
La tecnología antisentido está emergiendo como medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y, por lo tanto, puede ser especialmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación para la modulación de la expresión de huntingtina. (Véanse las publicaciones de patentes de EE. UU. n.° 2008/0039418 y 2007/0299027)
En las solicitudes de patente publicadas mencionadas anteriormente se divulgan compuestos antisentido para modular la expresión de huntingtina. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de otros compuestos de ese tipo.
Sumario de la invención
La invención proporciona un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, dirigido a un ácido nucleico que codifica huntingtina y puede inhibir la expresión de huntingtina, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos;
en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3',
en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado, y
en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 28.
La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un compuesto o una composición de la invención para su uso en la prevención, tratamiento, mejora o ralentización de la progresión de la enfermedad de Huntington en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina mediante administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del oligonucleótido o composición.
Otros aspectos de la invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.
Sumario de la divulgación
En el presente documento se divulgan procedimientos, compuestos y composiciones para modular la expresión de huntingtina y tratar, prevenir, ralentizar o mejorar la enfermedad de Huntington y/o un síntoma de la misma.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1:
Relación PK/PD de la expresión de ARNm de huntingtina en tejido intraestriatal en función de la concentración de ISIS 387898 en cerebro de ratón. A ratones C57/BL6 se les administró un bolo único de 50 |jg de ISIS 387898 y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. También se calculó la CE50 de ISIS 387898.
Fig. 2:
Comparación de la expresión de ARNm de huntingtina en tejido intraestriatal y las concentraciones de ISIS 387898 en diversos puntos de tiempo. A ratones C57/BL6 se les administró un bolo único de 50 jg de ISIS 387898 y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó que la duración de la acción (medida por la expresión de ARNm de htt) de ISIS 387898 (línea discontinua) era mayor incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido.
Fig. 3:
Relación PK/PD de la expresión de ARNm de huntingtina en el tejido de la corteza anterior en función de la concentración de ISIS 387898 en cerebro del ratón. A ratones BACHD se les administró una perfusión intracerebroventricular de 75 jg de ISIS 387898 durante 2 semanas y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. También se calculó la CE50 de ISIS 387898.
Fig. 4:
Comparación de la expresión de ARNm de huntingtina en el tejido de la corteza anterior y las concentraciones de ISIS 387898 en diversos puntos de tiempo. A ratones BACHD se les administró una perfusión intracerebroventricular de 75 jg de ISIS 387898 durante 2 semanas y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó que la duración de la acción (medida por la expresión de ARNm de htt) de ISIS 387898 (línea discontinua) era mayor incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido.
Fig. 5:
Comparación de la expresión de ARNm de huntingtina en el tejido de la corteza posterior y las concentraciones de ISIS 388241 en diversos puntos de tiempo. A ratones BACHD se les administró una perfusión intracerebroventricular de 50 jg de ISIS 388241 durante 2 semanas y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó que la duración de la acción (medida por la expresión de ARNm de htt) de ISIS 388241 (línea discontinua) era mayor incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido.
Fig. 6:
Comparación de la expresión de ARNm de huntingtina en el tejido de la corteza posterior y las concentraciones de ISIS 443139 en diversos puntos de tiempo. A ratones BACHD se les administró una perfusión intracerebroventricular de 50 |jg de ISIS 443139 durante 2 semanas y se midió la expresión de ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó que la duración de la acción (medida por la expresión de ARNm de htt) de ISIS 443139 (línea discontinua) era mayor incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido.
Fig. 7.
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en el desempeño motor de ratones BACHD usando la prueba de rotarod. Se trató a ratones BACHD por vía ICV con 50 jg/día de ISIS 388241 o PBS durante dos semanas. Se trató de forma similar a grupos de control de ratones de las mismas camadas no transgénicos con ISIS 388241 o PBS. A continuación se realizó la prueba de rotarod con aceleración. Los animales se colocaron en el rotarod a una velocidad de 2 RPM; el rotarod aceleró hasta 40 RPM en el lapso de 5 minutos. Se registró la duración hasta la caída. Los valores de referencia a los 6 meses de edad se tomaron antes del tratamiento y los puntos de tiempo dados son la edad de los ratones a la que se realizó la prueba. Las barras representan la duración hasta la caída en segundos de ratones BACHD tratados con ISIS 388241 (negras); ratones BACHD tratados con PBS (rayadas); y ratones de las mismas camadas no transgénicos tratados con PBS (blancas). Los ratones tratados con ISIS 388241 mostraron una duración hasta la caída incrementada y, por lo tanto, mejor desempeño motor en el rotarod, en comparación con el control de PBS.
Fig. 8.
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el peso del cerebro de ratones R6/2. Se trataron ratones R6/2 de seis meses de edad por vía ICV con 50 jg/día de ISIS 388817 u oligonucleótido de control ISIS 141923 o PBS durante 4 semanas. Se trató de forma similar a grupos de control de ratones de las mismas camadas no transgénicos con ISIS 388817 o PBS. Se incluyó en el estudio un grupo de control de ratones R6/2 pre­ sintomáticos de ocho semanas de edad que no recibieron ningún tratamiento. Las barras representan los pesos de los cerebros de: ratones R6/2 no tratados; ratones R6/2 tratados con ISIS 141923; ratones R6/2 tratados con PBS; ratones R6/2 tratados con ISIS 388817; ratones de las mismas camadas no transgénicos tratados con PBS; y ratones de las mismas camadas no transgénicos tratados con ISIS 388817, todos ellos de ocho semanas de edad. Hubo un incremento en el peso del cerebro de los ratones R6/2 tratados con ISIS 388817 en comparación con el control de PBS.
Fig. 9
Caracterización del comportamiento de ratones YAC128 tratados con oligonucleótidos antisentido usando la prueba de campo abierto. Se trataron ratones YAC128 de cinco meses de edad por vía ICV con 50 jg/día de ISIS 388241 u oligonucleótido de control ISIS 141923 o PBS durante 14 días. Se incluyó en el estudio un grupo de control de ratones de las mismas camadas no transgénicos FVB/NJ que no recibieron ningún tratamiento. Los ratones se colocaron en un aparato de campo abierto que usa la interrupción de haces de luz para medir el movimiento horizontal y vertical durante una sesión de prueba de 30 minutos. Los datos se analizaron usando el programa informático Activity Monitor para examinar el movimiento ambulatorio total dentro del aparato y el movimiento dentro del centro del aparato como medida de la ansiedad. Las barras representan el tiempo en segundos que pasaron en el centro del campo ratones FVB/NJ, ratones YAC128 tratados con PBS y ratones YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241 pasaron más tiempo en el centro y, por lo tanto, se consideraron menos propensos a la ansiedad que con el control de PBS.
Fig. 10
Caracterización del comportamiento de ratones YAC128 tratados con oligonucleótidos antisentido usando la prueba de laberinto en cruz elevado. Se trataron ratones YAC128 de cinco meses de edad por vía ICV con 50 jg/día de ISIS 388241 u oligonucleótido de control ISIS 141923 o PBS durante 14 días. Se incluyó un grupo de control de ratones FVB/NJ de las mismas camadas no transgénicos como control sin tratamiento. Los ratones se colocaron en el centro de un aparato que constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados, cada uno con unas medidas de 65 x 6,25 cm, y elevado a 50 cm del suelo. La localización de los ratones en el aparato y la cantidad de tiempo que pasaron en los brazos abiertos se registraron durante una sesión de prueba de 5 minutos como medida de la ansiedad. Las barras representan el porcentaje de tiempo que pasaron en los brazos abiertos los ratones FVB/NJ de control, los ratones YAC128 tratados con PbS y los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241 pasaron más tiempo en los brazos abiertos y, por lo tanto, se consideraron menos propensos a la ansiedad que con el control de PBS.
Descripción detallada
Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En el presente documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente de otro modo. Como se usa en el presente documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique de otro modo. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" engloban tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente de otro modo. Los encabezados de sección utilizados en el presente documento son solo para propósitos organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia objeto descrita.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2 '-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"2-O-metoxietil-nucleótido" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en determinados casos, un oligonucleótido antisentido dirigido a huntingtina es un agente farmacéutico activo.
"Región diana activa" o "región diana" significa una región a la que está dirigido uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" significa los compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma farmacéutica o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes se manifiesten al mismo tiempo. Solo es necesario que los efectos coincidan durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Mejoría" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, que incluyen, pero no se limitan a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En determinados casos, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que puede experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
"Inhibición antisentido" significa reducción de los niveles de ácido nucleico diana o de los niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado por el enlace de dos átomos del anillo no geminales. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un enlace que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" significa modificaciones químicas que se han incorporado en cualquiera de los dos extremos de un compuesto antisentido.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 2'-O-metoxietil-nucleótidos es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos se puede administrar a través de la misma o diferentes vías de administración. La coadministración engloba la administración paralela o secuencial. "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una sola administración, o en un período de tiempo especificado. Se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En determinados casos, el agente farmacéutico se administra por perfusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden indicar en términos de cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar de un individuo a otro dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico de los individuos que se van a tratar, la formulación de la composición, la valoración de la afección médica del individuo y otros factores pertinentes.
"Ácido nucleico de huntingtina" significa cualquier ácido nucleico que codifica huntingtina. Por ejemplo, en determinados modos de realización, un ácido nucleico de huntingtina incluye una secuencia de ADN que codifica huntingtina, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica huntingtina (incluyendo el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica huntingtina. "ARNm de huntingtina" significa un ARNm que codifica una proteína huntingtina.
"Totalmente complementario" o "100 % complementario" significa que cada nucleobase de una secuencia de nucleobases de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobases de un segundo ácido nucleico. En determinados modos de realización, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión por RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "segmento de separación ("gap")" y las regiones externas se pueden denominar "segmentos de ala ("wing")".
"De segmento de separación ampliado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de separación de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos situados entre e inmediatamente contiguos a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinados modos de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
"Inmediatamente contiguo" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente contiguos.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para someterse a tratamiento o terapia.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos contiguos que están unidos entre sí.
"Emparejamiento erróneo" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un primer ácido nucleico no se puede emparejar con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio respecto a un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado.
"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio respecto de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas de un compuesto antisentido.
"Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster 3' - 5'.
"Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico que se puede emparejar con una base de otro ácido nucleico.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier modificación de azúcar, enlace o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que puede hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos unidos, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente unos de los otros.
"Administración parenteral" significa administración por inyección o perfusión. Administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, o crónica, o corta o intermitente.
"Péptido" significa una molécula formada por la unión de al menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuada para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos en el que el enlace fosfodiéster está modificado reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forma enlace por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En determinados modos de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o evitar el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del organismo o de las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas o condiciones.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En determinados modos de realización, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, alteraciones del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el incremento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el incremento de los niveles de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria. "Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, exhibiendo al mismo tiempo efectos mínimos o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Dirigido" o "que se dirige" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de ARN diana" se refieren todos a un ácido nucleico al que pueden dirigirse compuestos antisentido.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que está dirigido un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido situado en posición más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido situado en posición más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a la administración de una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos naturales. Un nucleótido no modificado puede ser un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Determinados modos de realización
En el presente documento se divulgan procedimientos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de huntingtina.
En el presente documento se divulgan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina. En determinados modos de realización, el ácido nucleico de huntingtina es cualquiera de las secuencias detalladas con n.° de acceso GENBANK NM_002111.6 (incorporada al presente documento como SEQ ID NO: 1), n.° de acceso GENBANK NT_006081.17 truncada de los nucleótidos 462000 a 634000 (incorporada al presente documento como SEQ ID NO: 2), n.° de acceso GENBANK NM_010414.1 (incorporada al presente documento como SEQ ID NO: 3), el complemento del n.° de acceso GENBANK NW_0011097l6.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000 (incorporada al presente documento como SEQ ID NO: 4), y n.° de acceso GENBANK NM_024357.2 (incorporada al presente documento como SEQ ID NO: 5).
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos en los que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En determinados casos, las secuencias de nucleobases son las que se refieren en SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 15 a 25 nucleósidos unidos en los que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En determinados casos, las secuencias de nucleobases son las que se refieren en SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 21 nucleósidos unidos en los que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. En determinados casos, las secuencias de nucleobases son las que se refieren en SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En determinados casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12-30 nucleósidos unidos en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos de 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607­ 4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809­ 5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828, 4928-4947 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, la región se selecciona de 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 y 5809-5828 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, la región se selecciona de 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 y 4955-4974. En determinados casos, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 nucleobases contiguas de la cual es complementario dentro de una región descrita en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 15-25 nucleósidos unidos en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610­ 4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 y 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 15 nucleobases contiguas de la cual es complementario dentro de una región descrita en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 15-25 nucleósidos unidos en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809­ 5828, 5809-5826, 5801-5820 y 4955-4974. En determinados casos, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 15 nucleobases contiguas de la cual es complementario dentro de una región descrita en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 18-21 nucleósidos unidos en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610­ 4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 y 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobases contiguas de la cual es complementario dentro de una región descrita en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 18-21 nucleósidos unidos en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809­ 5828, 5809-5826, 5801-5820 y 4955-4974. En determinados casos, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobases contiguas de la cual es complementario dentro de una región descrita en el presente documento.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado consiste en un oligonucleótido modificado monocatenario.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos unidos.
En determinados modos de realización, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 90 % complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5. En determinados modos de realización, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 95 % complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5. En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado es al menos un 99 % complementario en toda su longitud a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5. En determinados modos de realización, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es un 100 % complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.
En determinados modos de realización, el compuesto tiene al menos un enlace internucleosídico modificado. En determinados modos de realización, el enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.
En determinados modos de realización, el compuesto tiene al menos un nucleósido que comprende un azúcar modificado. En determinados modos de realización, el al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En determinados modos de realización, el al menos un azúcar bicíclico comprende un puente de 4'-CH(CH3)-O-2 '. En determinados modos de realización, el al menos un azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo.
En determinados modos de realización, el compuesto comprende al menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano en el que un anillo de tetrahidropirano reemplaza al anillo de furanosa. En determinados modos de
realización, el al menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura:
Figure imgf000010_0001
en la que Bx es un resto de base heterocíclica opcionalmente protegido.
En determinados modos de realización, el compuesto tiene al menos un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En determinados modos de realización, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos unidos;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación se sitúa inmediatamente contiguo a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de separación que consiste en ocho desoxinucleósidos unidos;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste en seis nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste en seis nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación se sitúa inmediatamente contiguo a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de separación que consiste en ocho desoxinucleósidos unidos;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación se sitúa inmediatamente contiguo a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un compuesto como se describe en el presente documento, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinados casos, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un compuesto como se describe en el presente documento, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinados casos, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionada de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulgan procedimientos para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington. En el presente documento se divulgan procedimientos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en el presente documento para un animal. En determinados casos, el procedimiento comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases que se selecciona de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32.
En el presente documento se divulgan procedimientos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en el presente documento para un animal. En determinados casos, el procedimiento comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases que se selecciona de entre las secuencias de nucleobases que se refieren en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33.
En determinados casos, el animal es un humano.
En determinados casos, la administración previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento.
En determinados casos, el compuesto se coadministra con un segundo agente.
En determinados casos, el compuesto y el segundo agente se administran concomitantemente.
En determinados casos, la administración es administración parenteral. En determinados casos, la administración parenteral es administración intracraneal. En determinados casos, la administración intracraneal es administración intratecal o intracerebroventricular.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para reducir la expresión de ARNm de huntingtina o proteína huntingtina en un animal que comprende administrar al animal un compuesto o composición como se describe en el presente documento para reducir la expresión de ARNm de huntingtina o proteína huntingtina en el animal. En determinados casos, el animal es un humano. En determinados casos, la reducción de la expresión de ARNm de huntingtina o proteína huntingtina previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de la enfermedad de Huntington.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar a un humano con enfermedad de Huntington que comprende identificar al humano con la enfermedad y administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En determinados casos, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en inquietud, falta de coordinación, movimientos de inicio involuntario, movimientos incompletos involuntarios, marcha inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anómala, inestabilidad, expresiones faciales anómalas, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones, trastornos del sueño, alteraciones de planificación, alteraciones de flexibilidad, alteraciones de pensamiento abstracto, alteraciones en adquisición de normas, alteraciones en el inicio de acciones apropiadas, alteraciones de inhibición de acciones inapropiadas, alteraciones de memoria a corto plazo, alteraciones de memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones, demencia, ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad, ideación suicida, masa cerebral reducida, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular.
También se divulga un procedimiento para reducir o prevenir la enfermedad de Huntington que comprende administrar a un humano una cantidad de un compuesto o composición terapéuticamente eficaz como se describe en el presente documento, reduciendo o previniendo de este modo la enfermedad de Huntington.
También se divulga un procedimiento para mejorar un síntoma de la enfermedad de Huntington, que comprende administrar a un humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, mejorando de este modo un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
También se divulga un procedimiento para reducir la tasa de progresión de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, que comprende administrar a un humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, reduciendo de este modo la tasa de progresión de un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
También se divulga un procedimiento para revertir la degeneración indicada por un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, administrando a un humano que lo necesita un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, revirtiendo de este modo la degeneración indicada por un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
En determinados casos, el síntoma es un síntoma físico, cognitivo, psiquiátrico o periférico. En determinados casos, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste en inquietud, falta de coordinación, movimientos de inicio involuntario, movimientos incompletos involuntarios, marcha inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anómala, inestabilidad, expresiones faciales anómalas, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones y trastornos del sueño. En determinados casos, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en alteraciones de planificación, alteraciones de flexibilidad, alteraciones de pensamiento abstracto, alteraciones en la adquisición de normas, alteraciones en el inicio de acciones apropiadas, alteraciones de inhibición de acciones inapropiadas, alteraciones de memoria a corto plazo, alteraciones de memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones y demencia. En determinados casos, el síntoma es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideación suicida. En determinados casos, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste en reducción de la masa cerebral, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular.
También se divulgan procedimientos y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejoría de la enfermedad de Huntington.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad de Huntington.
También se divulga en el presente documento un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención o mejoría de la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento mediante politerapia con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o las terapias se pueden coadministrar o administrar concomitantemente.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento mediante politerapia con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o las terapias se pueden coadministrar o administrar concomitantemente.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento en un paciente al que posteriormente se administra un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
También se divulga en el presente documento un kit para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento, en el que el kit comprende:
(i) un compuesto como se describe en el presente documento; y de forma alternativa
(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Un kit como se describe en el presente documento puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento mediante politerapia como se describe en el presente documento.
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35 o 36, para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para inhibir la expresión de huntingtina. En determinados casos, la enfermedad o afección es un trastorno neurológico. En determinados casos, la enfermedad o afección es la enfermedad de Huntington. En determinados casos, el animal es un humano.
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 , al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35 o 36, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar o ralentizar la progresión de la enfermedad de Huntington.
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 o 33, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para inhibir la expresión de huntingtina. En determinados casos, la enfermedad o afección es un trastorno neurológico. En determinados casos, la enfermedad o afección es la enfermedad de Huntington. En determinados casos, el animal es un humano.
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 , al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 o 33, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar o ralentizar la progresión de la enfermedad de Huntington.
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12-30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931­ 4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEQ ID NO: 1, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para inhibir la expresión de huntingtina
También se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12-30 nucleósidos unidos, en el que los nucleósidos unidos comprenden una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 , al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931­ 4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEQ ID NO: 1, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar o ralentizar la progresión de la enfermedad de Huntington.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" a un ácido nucleico diana, lo que significa que puede hibridar con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En determinados de dichos modos de realización, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
En determinados modos de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene una longitud de 12 a 30 nucleótidos. En otras palabras, los compuestos antisentido tienen de 12 a 30 nucleobases unidas. En otros casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleobases unidas. En determinados de dichos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleobases unidas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
En determinados casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un único nucleósido eliminado del extremo 5' (truncamiento en 5') o, de forma alternativa, del extremo 3' (truncamiento en 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos nucleósidos eliminados del extremo 5' o, de forma alternativa, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3'. De forma alternativa, los nucleósidos eliminados pueden estar dispersos por todo el oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando un único nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional se puede localizar en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden estar contiguos entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5' (adición en 5') o, de forma alternativa, al extremo 3' (adición en 3') del oligonucleótido. De forma alternativa, el nucleósido añadido puede estar disperso por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido añadido al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible incrementar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se sometió a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De forma similar, se logró una escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo los que tenían 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi y col. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100 % de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL de reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) sometieron a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad de detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más moderado que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora potenciada, afinidad de unión por un ácido nucleico diana incrementada o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir una resistencia a la degradación por nucleasas incrementada, una captación celular incrementada, una afinidad de unión por el ácido nucleico diana incrementada y/o una actividad inhibidora incrementada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión por RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de separación en general sirve como sustrato para la escisión por las endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinados modos de realización, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir, en algunos modos de realización, p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (dichos nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2 '-O-CH3, entre otros) y nucleósidos modificados en el azúcar bicíclico (dichos nucleósidos modificados en el azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2). Preferentemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo ala-separación-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región del ala 5', "Y" representa la longitud de la región de la separación y "Z" representa la longitud de la región del ala 3'. Como se usa en el presente documento, un gápmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de separación se sitúa inmediatamente contiguo a cada uno del segmento del ala 5' y el segmento del ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de separación, o entre el segmento de separación y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo gápmero. En algunos modos de realización, X y Z son iguales, en otros modos de realización son diferentes. En un modo de realización preferente, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por tanto, los gápmeros incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10­ 2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6 o 5-8-5.
En determinados casos, el compuesto antisentido tiene un motivo "wingmero", que tiene una configuración de alaseparación o separación-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describe anteriormente para la configuración del gápmero. Por tanto, las configuraciones de wingmero incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5­ 10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 o 5-13.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo gápmero 5-10-5.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo gápmero 6-8-6.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo gápmero 5-8-5.
En determinados modos de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un motivo ampliado por separación.
En determinados modos de realización, un oligonucleótido antisentido ampliado por separación dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un segmento de separación de diez 2 '-desoxirribonucleótidos situados inmediatamente contiguos a y entre segmentos de ala de cinco nucleósidos modificados químicamente. En determinados modos de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-azúcar. En otro modo de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-MOE-azúcar.
En determinados modos de realización, un oligonucleótido antisentido ampliado por separación dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un segmento de separación de ocho 2 '-desoxirribonucleótidos situados inmediatamente contiguos a y entre segmentos de ala de cinco nucleósidos modificados químicamente. En determinados modos de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-azúcar. En otro modo de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-MOE-azúcar.
En determinados modos de realización, un oligonucleótido antisentido ampliado por separación dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un segmento de separación de ocho 2 '-desoxirribonucleótidos situados inmediatamente contiguos a y entre segmentos de ala de seis nucleósidos modificados químicamente. En determinados modos de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-azúcar. En otro modo de realización, la modificación química comprende una modificación 2'-MOE-azúcar.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican huntingtina incluyen, sin limitación, las siguientes: n.° de acceso GenBank NM_002111.6, depositada por primera vez en GENBANK® el 31 de mayo de 2006 que se incorpora al presente documento como SEQ ID NO: 1; n.° de acceso GenBank NT_006081.17 truncada de los nucleótidos 462000 a 634000, depositada por primera vez en GENBANK® el 19 de agosto de 2004, y que se incorpora al presente documento como SEQ ID NO: 2; n.° de acceso GenBank NM_010414.1, depositada por primera vez en GENBANK® el 23 de marzo de 2004, que se incorpora al presente documento como SEQ ID NO: 3; el complemento del n.° de acceso GENBANK NW_001109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000, depositada por primera vez en GENBANK® el 14 de junio de 2006, que se incorpora al presente documento como SEQ ID NO: 4, y el n.° de acceso GenBank NM_024357.2, depositada por primera vez en GENBANK® el 5 de junio de 2008, que se incorpora al presente documento como SEQ Id NO: 5.
Se entiende que la secuencia detallada en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en el presente documento es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Por tanto, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones en un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número Isis (n.° Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo. En determinados modos de realización, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede englobar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, un punto de unión exón/intrón, una región de codificación, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para huntingtina se pueden obtener mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias tales como NCBI. En determinados modos de realización, una región diana puede englobar la secuencia desde un sitio diana en 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana en 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
Dirigir incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se híbrida un compuesto antisentido, de modo que se produce un efecto deseado. En determinados modos de realización, el efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En determinados modos de realización, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana se pueden superponer. De forma alternativa, pueden no superponerse. En determinados casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En determinados casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es de aproximadamente, es de no más de, es de no más de aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes. En determinados casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En determinados casos, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en el presente documento.
Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5', una región de codificación, una UTR 3', un intrón, un exón o un punto de unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de terminación también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, tal como el codón de inicio o el codón de terminación.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, se puede usar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o no deseadas).
Puede existir variación en la actividad (por ejemplo, como se define por la reducción porcentual de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En determinados modos de realización, las reducciones en los niveles de ARNm de huntingtina son indicativas de inhibición de la expresión de huntingtina. Las reducciones en los niveles de una proteína huntingtina también son indicativas de inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de inhibición de la expresión de huntingtina. Por ejemplo, incremento del tamaño del cerebro con respecto al normal, mejora en la coordinación motora, disminución de los espasmos musculares continuos (distonía), disminución de la irritabilidad y/o ansiedad, mejora de la memoria o un incremento de la energía, entre otros cambios fenotípicos que se pueden analizar. Otras indicaciones fenotípicas, por ejemplo, síntomas asociados con la enfermedad de Huntington, también se pueden evaluar como se describe a continuación.
Hibridación
En algunos modos de realización, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en el presente documento y un ácido nucleico de huntingtina. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno tipo Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
Se puede producir hibridación en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y se determinan por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico de huntingtina.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina).
Un compuesto antisentido puede hibridar a uno o más segmentos de un ácido nucleico de huntingtina de modo que los segmentos intermedios o contiguos no participen en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, emparejamiento erróneo o estructura de horquilla).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o una porción especificada de los mismos, son, o son al menos, un 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios a un ácido nucleico de huntingtina, una región diana, un segmento diana o una porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando procedimientos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Por tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad total con el ácido nucleico diana y, por tanto, entraría dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). El porcentaje de homología, la identidad o la complementariedad de secuencias se pueden determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o porciones especificadas de los mismos, son totalmente complementarios (es decir, 100 % complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de huntingtina, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido puede formar emparejamientos precisos de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también se puede usar en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. De forma alternativa, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar unidas) o no contiguas. En un modo de realización, una nucleobase no complementaria se localiza en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o una porción especificada del mismo.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o una porción especificada del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también se puede referir a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a una porción de al menos de 8 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a una porción de al menos de 12 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a una porción de al menos de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a una porción de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido respecto a una secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO, o compuesto particular representado por un número Isis específico, o una porción de los mismos. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y extendidas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden ser contiguas entre sí o estar dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en el presente documento.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los "nucleótidos" son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosílico, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2 ', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos contiguos entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, los grupos fosfato se consideran comúnmente como parte integrante de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones en los compuestos antisentido engloban sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo son preferentes a las formas naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad por el ácido nucleico diana potenciada, estabilidad incrementada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora incrementada.
También se pueden emplear nucleósidos modificados químicamente para incrementar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con los de compuestos antisentido más cortos que tienen dichos nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, a menudo se seleccionan preferentemente respecto a los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad por los ácidos nucleicos diana potenciada y estabilidad incrementada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que conservan un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces que contienen y no contienen fósforo son bien conocidos.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinados modos de realización, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico del compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos con azúcar modificado pueden conferir estabilidad potenciada frente a nucleasas, afinidad de unión incrementada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinados modos de realización, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos grupos sustituyentes en 5' y 2', formación de puentes de átomos de anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S, N(R), o C(R1)(R)2 (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, de forma alternativa, la sustitución en 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que LNA está sustituido, por ejemplo, por un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 '-OCH3 y 2 '-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos de BNA en los que el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2 ' (LNA); 4'-(CH2)-S-2 '; 4'-(CH2)-O-2 ' (LNA); 4'-(CH2)2-O-2 ' (ENA); 4'-C(CH3)2-O-2 ' (véase PCT/US2008/068922); 4'-CH(CH3)-O-2 ' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2 ' (véase la patente de EE. UU. 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-CH2-N(OCH3)-2 ' (véase PCT/US2008/064591); 4'-CH2-O-N(CH3)-2 ' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2' (véase la patente de EE. UU. 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(CH3)-2 ' y 4'-Ch2-C(=CH2)-2 ' (véase PCT/US2008/066154); y en los que R es, independientemente, H, alquilo C1-C12 o un grupo protector. Cada uno de los BNA anteriores incluye diversas configuraciones estereoquímicas del azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como el documento WO 99/14226).
En determinados modos de realización, los nucleósidos se modifican mediante reemplazo del anillo de ribosilo por un sustituto de azúcar. Dicha modificación incluye, sin limitación, reemplazo del anillo de ribosilo por un sistema de anillo sustituto (a veces denominados "análogos de ADN") tal como un anillo de morfolino, un anillo de ciclohexenilo, un anillo de ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo tal como uno que tiene una de las fórmulas:
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También se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar bicíclicos y tricíclicos en la técnica que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación a compuestos antisentido (véase, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillo se pueden someter a diversas sustituciones adicionales para potenciar la actividad.
Los procedimientos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En determinados modos de realización, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En determinados modos de realización, los nucleótidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gápmero.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases naturales o sintéticas no modificadas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas pueden participar en enlaces de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobases pueden conferir estabilidad frente a nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas sustituciones de nucleobases, incluidas las sustituciones por 5-metilcitosina, son útiles en particular para incrementar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones por 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex del ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Otras nucleobases no modificadas incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil adenina y guanina y otros derivados alquílicos de las mismas, 2-propil adenina y guanina y otros derivados alquílicos de las mismas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil adeninas y guaninas y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular, 5-bromo, 5-trifluorometil uracilos y citosinas y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Los restos de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellos en los que la base purínica o pirimidínica se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo 7-desazaadenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son útiles en particular para incrementar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilocitosina.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos antisentido ampliados por separación dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinados modos de realización, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En determinados modos de realización, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y procedimientos para formular composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con una sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis que se va a administrar.
El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina se puede usar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se van a administrar por vía parenteral. En consecuencia, en los procedimientos descritos en el presente documento se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En determinados modos de realización, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido engloban cualquier sal, éster o sal de dicho éster farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, pueda proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del organismo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden estar unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos lipídicos. Grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenacina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores que en general están unidos a uno o ambos extremos de los compuestos oligoméricos para potenciar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad frente a nucleasas. Se incluyen en los grupos estabilizadores las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación por exonucleasas, y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5' (caperuza 5'), o en el extremo 3' (caperuza 3'), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas desoxi abásicas invertidas. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar como caperuza de uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para conferir estabilidad frente a nucleasas incluyen los divulgados en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de huntingtina se pueden someter a prueba in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para dichos análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2. Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En el presente documento se describen procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80 % de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que típicamente varía de 2 a 12 |jg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo que se usa para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que típicamente varía de 2 a 12 jg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo que se usa para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que típicamente varía de 2 a 12 jg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica que se usa para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación. Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por procedimientos de rutina. Las células se extraen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden por procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan en términos de promedio de los tratamientos repetidos.
La concentración de oligonucleótido antisentido que se usa varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectin o Cytofectin. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones mayores que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar sobre ARNm celular total o ARN poli(A)+. Los procedimientos para el aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles de expresión diana
La inhibición de los niveles de expresión de un ácido nucleico de huntingtina se puede analizar de una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis por Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar sobre ARNm celular total o ARN poli(A)+. Los procedimientos para el aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis por Northern blot también es habitual en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar cómodamente usando el sistema de detección de secuencias disponible comercialmente ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARNm diana se puede realizar mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción con transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que a continuación se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones con RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos RT y de PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones con RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cantidades de gen (o ARN) diana obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando o bien el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como ciclofilina A, o bien cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, realizándose simultáneamente con la diana, de forma multiplexada o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los procedimientos de cuantificación de ARN mediante RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L.J. y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia con RIBOGREEN®.
Las sondas y los cebadores se diseñan para hibridarse con un ácido nucleico de huntingtina. Los procedimientos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de programas informáticos tales como PRIMER EXPRESS® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de niveles de proteínas
La inhibición antisentido de ácidos nucleicos de huntingtina se puede evaluar midiendo los niveles de la proteína huntingtina. Los niveles de la proteína huntingtina se pueden evaluar o cuantificar de una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis por Western blot (inmunoelectrotransferencia), ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), análisis cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o separación celular activada por fluorescencia (FACS). Se pueden identificar anticuerpos dirigidos a una diana y obtenerse de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar por medio de procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Anticuerpos útiles para la detección de huntingtina humana y de rata están disponibles comercialmente.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se someten a prueba en animales para evaluar su capacidad de inhibir la expresión de huntingtina y producir cambios fenotípicos. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías parenterales de administración. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico de huntingtina. También se miden los cambios en los niveles de proteína huntingtina.
Determinados compuestos
Se sometieron a prueba aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y composición de la cadena principal para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro en diversos tipos de células. Los nuevos compuestos se compararon con aproximadamente doscientos cincuenta compuestos previamente diseñados, incluyendo ISIS 387916, que previamente se había determinado que era uno de los compuestos antisentido más potentes in vitro (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes de EE. UU. n.° 2008/0039418 y 2007/0299027. De los aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño, se seleccionaron aproximadamente sesenta compuestos para estudios adicionales en base a la potencia in vitro en comparación con ISIS 387916. Los compuestos seleccionados se sometieron a prueba para determinar la tolerabilidad sistémica (véase Ejemplo 3) y la actividad y tolerabilidad en el cerebro de ratones BACHD (véase Ejemplo 4) comparando con ISIS 388241 e ISIS 387916 previamente diseñados. A partir de estos estudios, se seleccionaron los compuestos que tenían una secuencia de nucleobases de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 o 32 porque tenían una alta tolerabilidad y alta potencia in vivo. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868­ 4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 o 4928-4947 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas, como se describen adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene alguna porción de nucleobases de la secuencia que se refiere en las SEQ ID NO, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tienen una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas pueden ser de diversa longitud, como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden tener uno de diversos motivos, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, un compuesto dirigido a una región o que tiene una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas tiene la longitud y el motivo específicos según indican los n.° ISIS: ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 451541, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663.
Los compuestos descritos anteriormente por tener una alta potencia y tolerabilidad in vivo se sometieron a prueba a continuación mediante inyección en bolo en el SNC en ratas para evaluar adicionalmente la neurotoxicidad (véase Ejemplo 5) junto con diversos compuestos adicionales que tienen una secuencia de nucleobases de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 7, 8, 11, 16, 17. De estos, se seleccionaron diez compuestos que tenían una secuencia de nucleobases de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32 o 13 por tener alta tolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 o 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas, como se describen adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene alguna porción de nucleobases de la secuencia que se refiere en las SEQ ID NO, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tienen una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas pueden ser de diversa longitud, como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden tener uno de diversos motivos, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, un compuesto dirigido a una región o que tiene una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas tiene la longitud y el motivo específicos según lo indicado por los n.° ISIS: ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591 e ISIS 444661. Los compuestos seleccionados se compararon con el compuesto ISIS 388241 previamente diseñado mediante administración ICV a ratones BACHD.
A continuación se realizaron estudios adicionales en compuestos descritos anteriormente por tener una alta potencia y tolerabilidad in vivo. Los estudios adicionales fueron diseñados para evaluar adicionalmente la neurotoxicidad. Los estudios incluyeron la administración ICV a ratones naturales (véase Ejemplo 16) y la administración en bolo a ratas (véase Ejemplo 17). Se seleccionaron las SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33 por tener alta neurotolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 y 4955-4974 de SEQ ID NO: 1. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas, como se describen adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene alguna porción de nucleobases de la secuencia que se refiere en las SEQ ID NO, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tienen una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas pueden ser de diversa longitud, como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden tener uno de diversos motivos, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados casos, un compuesto dirigido a una región o que tiene una porción de nucleobases de una secuencia que se refiere en las SEQ ID NO enumeradas tiene la longitud y el motivo específicos según lo indicado por ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444652 e ISIS 436689.
En consecuencia, se divulgan en el presente documento compuestos antisentido con características mejoradas. Se divulgan en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado como se describe adicionalmente en el presente documento dirigido a o específicamente hibridable con la región de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
En determinados modos de realización, los compuestos como se describen en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos uno de una CI50 in vitro de menos de 7 |jM, menos de 6 |jM, menos de 5 |jM, menos de 4 jiM, menos de 3 jiM, menos de 2 jiM, menos de 1 jiM cuando se administra a una línea celular de fibroblastos humanos como se describe en el presente documento o una DE50 de menos de 10 jig, menos de 9 jig, menos de 8 jig, menos de 7,5 jig, menos de 7,4 jig, menos de 7,0 jig, menos de 6 jig, menos de 5 jig, menos de 4 jig, menos de 3 jig o menos de 2 jig por inyección en bolo. Como se describe en el presente documento, la perfusión ICV puede dar como resultado valores de DE50 de 3 a 4 veces mayores para los compuestos descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, los compuestos como se describen en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra porque tienen al menos uno de un incremento de un valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces o 2 veces frente a los animales tratados con solución salina; un incremento en el peso del hígado, bazo o riñón de no más de un 30 %, 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 5 % o 2 %; o un incremento de los niveles de AIF1 de no más de un 350 %, 300 %, 275 %, 250 %, 200 %, 150 % o 100 % frente al control.
Determinadas indicaciones
En el presente documento se divulgan procedimientos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento. En determinados casos, el individuo tiene la enfermedad de Huntington.
Como se muestra en los ejemplos a continuación, se ha demostrado que los compuestos dirigidos a huntingtina como se describen en el presente documento reducen la gravedad de los síntomas fisiológicos de la enfermedad de Huntington. En determinados de los experimentos, los compuestos redujeron la tasa de degeneración, por ejemplo, los animales continuaron experimentando síntomas, pero los síntomas fueron menos graves que en los animales no tratados. En otro de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen dar como resultado la regeneración de la función con el tiempo; por ejemplo, los animales tratados durante un periodo de tiempo más largo experimentaron síntomas menos graves que aquellos a los que los compuestos se les administraron durante un periodo de tiempo más corto. Como se analiza anteriormente, la enfermedad de Huntington es una enfermedad degenerativa con una progresión caracterizada por gravedad incrementada de los síntomas con el tiempo. La capacidad de los compuestos ejemplificados a continuación de restablecer la función, por lo tanto, demuestra que los síntomas de la enfermedad se pueden revertir mediante tratamiento con un compuesto como se describe en el presente documento.
En consecuencia, en el presente documento se divulgan procedimientos para mejorar un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington en un sujeto que lo necesite. Se divulga un procedimiento para reducir la tasa de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. También se divulga un procedimiento para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. Además se divulga un procedimiento para regenerar la función neurológica como se muestra por una mejora de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. En dichos casos, los procedimientos comprenden administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de huntingtina.
La enfermedad de Huntington se caracteriza por numerosos síntomas físicos, neurológicos, psiquiátricos y/o periféricos. Cualquier síntoma conocido por un experto en la técnica como asociado con la enfermedad de Huntington puede mejorarse o modularse de otro modo como se detalla anteriormente en los procedimientos descritos anteriormente. En determinados modos de realización, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste en inquietud, falta de coordinación, movimientos de inicio involuntario, movimientos incompletos involuntarios, marcha inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anómala, inestabilidad, expresiones faciales anómalas, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones y trastornos del sueño. En determinados modos de realización, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en alteraciones de planificación, alteraciones de flexibilidad, alteraciones de pensamiento abstracto, alteraciones en la adquisición de normas, alteraciones en el inicio de acciones apropiadas, alteraciones de inhibición de acciones inapropiadas, alteraciones de memoria a corto plazo, alteraciones de memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones y demencia. En determinados modos de realización, el síntoma es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideación suicida. En determinados modos de realización, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste en reducción de la masa cerebral, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular.
En determinados modos de realización, el síntoma es inquietud. En determinados modos de realización, el síntoma es falta de coordinación. En determinados modos de realización, el síntoma es movimientos de inicio involuntario. En determinados modos de realización, el síntoma es movimientos incompletos involuntarios. En determinados modos de realización, el síntoma es marcha inestable. En determinados modos de realización, el síntoma es corea. En determinados modos de realización, el síntoma es rigidez. En determinados modos de realización, el síntoma es movimientos de contorsión. En determinados modos de realización, el síntoma es postura anómala. En determinados modos de realización, el síntoma es inestabilidad. En determinados modos de realización, el síntoma es expresiones faciales anómalas. En determinados modos de realización, el síntoma es dificultad para masticar. En determinados modos de realización, el síntoma es dificultad para tragar. En determinados modos de realización, el síntoma es dificultad para hablar. En determinados modos de realización, el síntoma es convulsiones. En determinados modos de realización, el síntoma es trastornos del sueño.
En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de planificación. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de flexibilidad. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de pensamiento abstracto. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones en la adquisición de normas. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones en el inicio de acciones apropiadas. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de inhibición de acciones inapropiadas. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de memoria a corto plazo. En determinados modos de realización, el síntoma es alteraciones de memoria a largo plazo. En determinados modos de realización, el síntoma es paranoia. En determinados modos de realización, el síntoma es desorientación. En determinados modos de realización, el síntoma es confusión. En determinados modos de realización, el síntoma es alucinaciones. En determinados modos de realización, el síntoma es demencia.
En determinados modos de realización, el síntoma es ansiedad. En determinados modos de realización, el síntoma es depresión. En determinados modos de realización, el síntoma es embotamiento afectivo. En determinados modos de realización, el síntoma es egocentrismo. En determinados modos de realización, el síntoma es agresión. En determinados modos de realización, el síntoma es comportamiento compulsivo. En determinados modos de realización, el síntoma es irritabilidad. En determinados modos de realización, el síntoma es ideación suicida.
En determinados modos de realización, el síntoma es reducción de la masa cerebral. En determinados modos de realización, el síntoma es atrofia muscular. En determinados modos de realización, el síntoma es insuficiencia cardíaca. En determinados modos de realización, el síntoma es intolerancia a la glucosa. En determinados modos de realización, el síntoma es pérdida de peso. En determinados modos de realización, el síntoma es osteoporosis. En determinados modos de realización, el síntoma es atrofia testicular.
En determinados modos de realización, los síntomas de la enfermedad de Huntington pueden ser cuantificables. Por ejemplo, la osteoporosis se puede medir y cuantificar mediante, por ejemplo, densitometría ósea. Para dichos síntomas, en determinados modos de realización, el síntoma se puede reducir en aproximadamente un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
En el presente documento se divulgan procedimientos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento. En determinados casos, el individuo tiene la enfermedad de Huntington.
En determinados modos de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina da como resultado la reducción de la expresión de huntingtina en al menos aproximadamente un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
En determinados modos de realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a huntingtina se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a la enfermedad de Huntington.
Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobases contiguas como se describe en el presente documento de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 o 32. En determinados casos, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobases contiguas como se describe en el presente documento de una secuencia que se refiere en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33.
Administración
En determinados casos, los compuestos y composiciones como se describen en el presente documento se administran por vía parenteral.
En determinados casos, la administración parenteral es por perfusión. La perfusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En determinados casos, los agentes farmacéuticos perfundidos se administran con una bomba. En determinados casos, la administración parenteral es por inyección.
En determinados casos, los compuestos y composiciones se administran en el SNC. En determinados casos, los compuestos y composiciones se administran en el líquido cefalorraquídeo. En determinados casos, los compuestos y composiciones se administran en el parénquima cerebral. En determinados casos, los compuestos y composiciones se administran a un animal mediante administración intratecal o administración intracerebroventricular. La amplia distribución de compuestos y composiciones, descrita en el presente documento, dentro del sistema nervioso central se puede lograr con administración intraparenquimatosa, administración intratecal o administración intracerebroventricular.
En determinados casos, la administración parenteral es por inyección. La inyección se puede administrar con una jeringa o una bomba. En determinados casos, la inyección es una inyección en bolo. En determinados casos, la inyección se administra directamente a un tejido, como el cuerpo estriado, el núcleo caudado, la corteza, el hipocampo y el cerebelo.
Se calculó la mediana de la concentración eficaz (CE50) de un compuesto antisentido para inhibir la expresión de ARNm de huntingtina después de la perfusión ICV o la inyección en bolo (véanse Ejemplos 9 y 10). La CE50 para el compuesto después de la inyección intraestriatal se determinó que era de 0,45 |jg/g. Se determinó que la CE50 después de la administración ICV era de 26,4 jg/g.
Por lo tanto, en determinados casos, la administración de un compuesto o composición descrito en el presente documento puede afectar el perfil farmacocinético del compuesto o composición. En determinados casos, la inyección de un compuesto o composición descrito en el presente documento en un tejido diana mejora el perfil farmacocinético del compuesto o composición en comparación con la perfusión del compuesto o composición. En un caso determinado, la inyección de un compuesto o composición mejora la potencia en comparación con la difusión amplia, requiriendo menos cantidad del compuesto o composición para lograr una farmacología similar. En determinados casos, una farmacología similar se refiere a la cantidad de tiempo que un ARNm diana y/o proteína diana está regulado por disminución (por ejemplo, la duración de la acción). En determinados casos, los procedimientos para localizar específicamente un agente farmacéutico, tal como la inyección en bolo, disminuyen la mediana de la concentración eficaz (CE50) en un factor de aproximadamente 50 (por ejemplo, se requiere una concentración 50 veces menor en el tejido para lograr el mismo efecto farmacodinámico o similar). En determinados casos, los procedimientos para localizar específicamente un agente farmacéutico, tal como la inyección en bolo, disminuyen la mediana de la concentración eficaz (CE50) en un factor de 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. En determinados casos, el agente farmacéutico en un compuesto antisentido como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados modos de realización, el tejido diana es tejido cerebral. En determinados modos de realización, el tejido diana es tejido del cuerpo estriado. En determinados casos, es deseable disminuir la CE50 porque se reduce la dosis requerida para lograr un resultado farmacológico en un paciente que lo necesita.
La semivida de los oligonucleótidos gápmeros con MOE en el tejido cerebral es de aproximadamente 20 días (véanse Ejemplos 9-11). La duración de la acción medida por la inhibición de ARNm de huntingtina se prolonga en el cerebro (véanse Ejemplos 9 y 10). La perfusión intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido durante 2 semanas da como resultado la inhibición de ARNm de huntingtina en al menos un 50 % en el tejido estriado de ratones BACHD durante al menos 91 días después de finalizar la administración. La administración por inyección en bolo dio como resultado una duración de acción similar.
En determinados casos, la administración de un compuesto o composición, como se describe en el presente documento, en el SNC da como resultado una regulación por disminución de un 47 % de un ARNm diana y/o proteína diana durante al menos 91 días. En determinados casos, la administración de un compuesto o composición da como resultado una regulación por disminución de al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 % o al menos un 75 % de un ARNm diana y/o proteína diana durante al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días, al menos 100 días, al menos 110 días, al menos 120 días. En determinados casos, la administración en el SNC es por administración intraparenquimatosa, administración intratecal o administración intracerebroventricular.
En determinados casos, un oligonucleótido antisentido se administra mediante inyección o perfusión una vez al mes, cada dos meses, cada 90 días, cada 3 meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Determinadas politerapias
En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas se coadministran con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En determinados casos, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que la una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En determinados casos, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente de la una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En determinados casos, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas se coadministran con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinatorio. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran en diferentes momentos. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una única formulación. En determinados casos, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan por separado.
En determinados casos, los agentes farmacéuticos que se pueden coadministrar con una composición farmacéutica incluyen agentes antipsicóticos, tales como, por ejemplo, haloperidol, clorpromazina, clozapina, quetapina y olanzapina; agentes antidepresivos, tales como, por ejemplo, fluoxetina, clorhidrato de sertralina, venlafaxina y nortriptilina; agentes tranquilizantes tales como, por ejemplo, benzodiacepinas, clonazepam, paroxetina, venlafaxina y betabloqueantes; agentes estabilizadores del estado de ánimo tales como, por ejemplo, litio, valproato, lamotrigina y carbamazepina; agentes paralizantes tales como, por ejemplo, toxina botulínica; y/u otros agentes experimentales que incluyen, pero sin limitarse a, tetrabenazina (Xenazina), creatina, conezima Q10, trehalosa, ácidos docosahexanoicos, ACR16, etil-EPA, atomoxetina, citalopram, dimebon, memantina, fenilbutirato de sodio, ramelteon, ursodiol, zyprexa, xenasina, tiaprida, riluzol, amantadina, [123I]MNI-420, atomoxetina, tetrabenazina, digoxina, detrometorfano, warfarina, alprozam, ketoconazol, omeprazol y minociclina.
EJEMPLOS
Divulgación no limitante
Si bien determinados compuestos, composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con determinados modos de realización, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: oligonucleótidos antisentido dirigidos a secuencias de genes de huntingtina humana
Se sometieron a prueba aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y composición de la cadena principal dirigidos a la secuencia del gen de huntingtina humana para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro en diversos tipos de células. Estos gápmeros se diseñaron además con enlaces internucleosídicos que son o bien solo enlaces fosforotioato (descritos en la Tabla 1) o bien son enlaces fosforotioato y fosfodiéster (descritos en la Tabla 5). En las Tablas 1 y 5 se proporcionan diversos oligonucleótidos de nuevo diseño y dos oligonucleótidos de referencia (previamente diseñados y divulgados).
Gápmeros con todos los enlaces internucleosídicos fosforotioato
Determinados compuestos presentados en la Tabla 1 tienen un motivo de 5-10-5 MOE, 6-8-6 MOE o 5-8-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 tienen veinte nucleósidos unidos, en los que el segmento de separación central tiene diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada una. El gápmero 6-8-6 tiene veinte nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación central tiene ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen seis nucleósidos cada una. Los gápmeros 5-8-5 tienen dieciocho nucleósidos unidos, en el que el segmento de separación central tiene ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada una. Para todos los gápmeros enumerados en la Tabla 1, cada nucleósido del segmento de ala 5' y cada nucleósido del segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Todos los enlaces internucleosídicos de cada gápmero son enlaces internucleosídicos fosforotioato (P=S). Todas las citosinas de cada gápmero son 5-metilcitosinas. Cada gápmero en la Tabla 1 está dirigido a SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6) o SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_006081.17 truncada de los nucleótidos 462000 a 634000). "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de terminación" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano.
Tabla 1
Oligonucleótidos antisentido quiméricos con enlaces internucleosídicos fosforotioato dirigidos a secuencias de enes de huntin tina humana SEQ ID NO: 1 2
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La complementariedad de los gápmeros en la Tabla 1 con las secuencias de genes de huntingtina de ratón, macaco de la India y rata se describe más detalladamente en las Tablas 2, 3 y 4.
Los gápmeros de la Tabla 2 son complementarios del ARNm de huntingtina de ratón (n.° de acceso GENBANK NM_010414.1, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 3). "Sitio de inicio diana murino" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm murino. "Sitio de terminación diana murino" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm murino. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de ratón.
Tabla 2
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato con ARNm murino SEQ ID NO: 3
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Los gápmeros de la Tabla 3 son complementarios de la secuencia genómica de huntingtina de macaco de la India (el complemento del n.° de acceso GENBANK NW_001109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 4). "Sitio de inicio diana de macaco de la India" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen de macaco de la India. "Sitio de terminación diana de macaco de la India" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen de macaco de la India. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de gen de macaco de la India.
Tabla 3
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato con la
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Los gápmeros de la Tabla 4 son complementarios del ARNm de huntingtina de rata (n.° de acceso GENBANK NM_024357.2, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 5). "Sitio de inicio diana de rata" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm de rata. "Sitio de terminación diana de rata" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm de rata. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de rata.
Tabla 4
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato con ARNm de rata SEQ ID NO: 5
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Gápmeros con enlaces intemucleosídicos fosforotioato y fosfodiéster mezclados
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 5 se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 tienen veinte nucleósidos unidos, en los que el segmento de separación central tiene diez 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido del segmento de ala 5' y cada nucleósido del segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces intemucleosídicos dentro del segmento de separación central, los enlaces que conectan el segmento de separación con el segmento de ala 5' o 3', y los enlaces para los nucleósidos más 5' y más 3' de cada segmento de ala son todos enlaces fosforotioato (P=S); los enlaces intemucleosídicos que conectan el resto de los nucleósidos de los segmentos de ala 5' y 3' son enlaces fosfodiéster; es decir, el gápmero tiene una cadena principal mixta. Todas las citosinas de cada gápmero son 5-metilcitosinas. Cada gápmero en la Tabla 5 está dirigido a la secuencia de ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 1). "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano. "Sitio de terminación" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano.
Tabla 5
Oligonucleótidos antisentido quiméricos con enlaces intemucleosídicos fosforotioato y fosfato diri idos^ a ARNm de huntin tina humana SEQ ID NO: 1
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La complementariedad de los gápmeros en la Tabla 5 con las secuencias de genes de huntingtina de ratón, macaco de la India y rata se describe más detalladamente en las Tablas 6, 7 y 8.
Los gápmeros de la Tabla 6 son complementarios del ARNm de huntingtina de ratón (n.° de acceso GENBANK NM_010414.1, SEQ ID NO: 3). "Sitio de inicio diana murino" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm murino. "Sitio de terminación diana murino" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm murino. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de ratón.
Tabla 6
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato y fosfato mezclados con ARNm murino SEQ ID NO: 3
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Los gápmeros de la Tabla 7 son complementarios de la secuencia genómica de huntingtina de macaco de la India (el complemento del n.° de acceso Ge NBANK NW_001109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000, SEQ ID NO: 4). "Sitio de inicio diana de macaco de la India" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen de macaco de la India. "Sitio de terminación diana de macaco de la India" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen de macaco de la India. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de gen de macaco de la India.
Tabla 7
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato y fosfato mezclados con la secuencia de en de macaco de la India SEQ ID NO: 4
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Los gápmeros de la Tabla 8 son complementarios del ARNm de huntingtina de rata (n.° de acceso GENBANK NM_024357.2, SEQ ID NO: 5). "Sitio de inicio diana de rata" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm de rata. "Sitio de terminación diana de rata" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm de rata. "Sitio de inicio diana humano" indica el nucleótido más 5' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Sitio de terminación diana humano" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero en el ARNm humano (n.° de acceso GENBANK NM_002111.6). "Número de emparejamientos erróneos" indica el número de emparejamientos erróneos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de rata.
Tabla 8
Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato y fosfato mezclados con ARNm de rata SEQ ID NO: 5
Figure imgf000034_0001
Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina humana in v itro
Se sometieron a prueba aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y composición de la cadena principal para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro en diversos tipos de células. Estos compuestos se compararon con aproximadamente doscientos cincuenta compuestos diseñados previamente, incluyendo el compuesto ISIS 387916, que previamente se había determinado que era un compuesto de potencia considerable in vivo. Como se muestra en este ejemplo, se encontró que ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ISIS 444661, ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 previamente diseñado tenían una potencia similar o mejor que el compuesto de referencia ISIS 387916 in vitro.
A. Fibroblastos GM04281
Se transfectaron fibroblastos GM04281 cultivados a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM u 8000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 (secuencia del cebador directo CTCCGTCCGGTAGACATGCT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 37; secuencia del cebador inverso GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 38; secuencia de la sonda TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 39) se usó para medir el nivel de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 9 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina.
La concentración inhibidora del 50 % (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 9 y se calculó representando las concentraciones de oligonucleótidos usados en función de la inhibición porcentual de la expresión de ARNm de huntingtina lograda en cada concentración, y anotando la concentración de oligonucleótido a la que se logró el 50 % de inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina en comparación con el control. La CI50 se expresa en |jM.
Tabla 9
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000034_0002
ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 10 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 10 expresada en |jM.
Tabla 10
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000035_0001
ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 11 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 11 expresada en j M.
Tabla 11
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000035_0002
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641 e ISIS 436754 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 12 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 12 expresada en j M.
Tabla 12
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000035_0003
ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron fibroblastos GM04281 cultivados a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM u 8000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 13 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 13 expresada en j M.
Tabla 13
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000035_0004
437507
Figure imgf000036_0001
1,30
Figure imgf000036_0002
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 443139, ISIS 444584, ISIS 444615, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660 e ISIS 444661 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron fibroblastos GM04281 cultivados a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1250 nM u 2500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 14 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 14 expresada en |jM.
Tabla 14
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000036_0003
ISIS 387916, ISIS 436671, ISIS 444661, ISIS 419641 e ISIS 436665 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron fibroblastos GM04281 cultivados a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 13,6719 nM, 27,3438 nM, 54,6875 nM, 109,375 nM, 218,75 nM, 437,5 nM, 875 nM, 1750 nM, 3500 nM o 7000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 15 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15 expresada en j M.
Tabla 15
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000037_0001
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437168 e ISIS 437175 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron fibroblastos GM04281 cultivados a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM y 8000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 15.1 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.1 expresada en |jM.
Tabla 15.1
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000037_0002
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437441 e ISIS 437442 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 15.2 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.2 expresada en j M.
Tabla 15.2
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000037_0003
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437175 e ISIS 437527 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 15.3 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.3 expresada en j M.
Tabla 15.3
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281
Figure imgf000038_0001
B. Células A549
Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 se sometieron a prueba para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron células A549 cultivadas a una densidad de 4.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Lipofectin con oligonucleótido antisentido 7,4074 nM, 22,222 nM, 66,667 nM o 200 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 16 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 16 expresada en nM.
Tabla 16
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células A549
Figure imgf000038_0002
ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron células A549 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM u 8000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 17 expresados como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 17 expresada en |jM.
Tabla 17
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células A549
Figure imgf000038_0003
C. Células LLC-MK2
Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humana se sometieron a prueba para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina de macaco de la India in vitro. Se transfectaron células LLC-MK2 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM, 10.000 nM u 20.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2686 (secuencia del cebador directo GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 40; secuencia del cebador inverso AAGGGATGCTGGGCTCTGT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 41; secuencia de la sonda AGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 42) se usó para medir el nivel de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 18 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 18 expresada en |jM.
Tabla 18
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000039_0002
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591 e ISIS 444607 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Células LLC-MK2 cultivadas se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 19 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 19 expresada en j M.
Tabla 19
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000039_0001
n.d. = no se pudo medir la CI50 para ese compuesto
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660 e ISIS 444661 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Células LLC-MK2 cultivadas se sometieron a prueba en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 20 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 20 expresada en j M.
Tabla 20
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000040_0001
ISIS 387916, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron células LLC-MK2 cultivadas a una densidad de 3.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Lipofectin con oligonucleótido antisentido 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2686 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 21 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 21 expresada en nM.
Tabla 21
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000040_0002
ISIS 387916, ISIS 419641 e ISIS 436689 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina de macaco de la India in vitro. Se transfectaron células LLC-MK2 cultivadas a una densidad de 3.000 células por pocillo usando reactivo de transfección LipofectAMINE2000 con oligonucleótido antisentido 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2686 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 22 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 22 expresada en nM.
Tabla 22
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000041_0001
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436665, ISIS 436671 e ISIS 436689 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina de macaco de la India in vitro. Se transfectaron células LLC-MK2 cultivadas a una densidad de 3.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Lipofectin con oligonucleótido antisentido 4,6875 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM o 150 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2686 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 23 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 23 expresada en nM.
Tabla 23
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en células LLC-MK2
Figure imgf000041_0002
D. Hepatocitos de ratón transgénico BACHD
Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humana se sometieron a prueba para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados a una densidad de 10.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Cytofectin con oligonucleótido antisentido 7,4074 nM, 22,222 nM, 66,667 nM o 200 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 24 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 24 expresada en nM.
Tabla 24
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos de ratón trans énico BACHD
Figure imgf000041_0003
ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 419641 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados a una densidad de 10.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Cytofectin con oligonucleótido antisentido 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 25 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 25 expresada en nM.
Tabla 25
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos de ratón trans énico BACHD
Figure imgf000042_0001
ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, ISIS 436665, ISIS 436671 e ISIS 436689 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Hepatocitos de ratón BACHD cultivados se sometieron a prueba de manera idéntica a la descrita anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 26 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 26 expresada en nM.
Tabla 26
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos de ratón trans énico BACHD
Figure imgf000042_0002
ISIS 387916, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 se sometieron a pruebas adicionales para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina de ratón in vitro. Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados a una densidad de 20.000 células por pocillo usando reactivo de transfección Cytofectin con oligonucleótido antisentido 6,667 nM, 20 nM, 60 nM o 180 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebadores y sonda murinos RTS2633 (secuencia del cebador directo CAGAGCTGGTCAACCGTATCC, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 43; secuencia del cebador inverso GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 44; secuencia de la sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 45) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 27 como inhibición porcentual de ARNm de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 27 expresada en nM.
Tabla 27
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos de ratón trans énico BACHD
Figure imgf000042_0003
Ejemplo 3: Administración sistémica de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de huntingtina en ratones BACHD
De los aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño, se seleccionaron sesenta y seis compuestos en base a la potencia in vitro en comparación con ISIS 387916 para someterlos a pruebas de cribado de tolerabilidad sistémica.
Se trataron ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS y se evaluaron para determinar los cambios en los niveles de diversos marcadores metabólicos, así como la inhibición de ARNm de huntingtina en el hígado. Los oligonucleótidos antisentido que causaron cambios adversos en el peso corporal, el peso de los órganos o en los niveles de marcadores metabólicos se consideraron inadecuados para su utilización en otros estudios.
Estudio 1.
Tratamiento
A diecinueve grupos de cuatro ratones BACHD cada uno se les inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de control de cuatro ratones se le inyectó intraperitonealmente PBS dos veces por semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para la extracción de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se extrajeron los órganos.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 28 y 29 y se calcularon como inhibición porcentual de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control de PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido logran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina humana. ISIS 388241 tiene más de tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostró inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 28
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina humana en ratones BACHD
Figure imgf000043_0001
Tabla 29
Inhibición porcentual de urina en ratones BACHD
Figure imgf000044_0002
Mediciones de peso de órganos
Al final del estudio se midieron los pesos de hígado, bazo y riñón, y se presentan en la Tabla 30 como porcentaje del control de solución salina normalizado respecto al peso corporal.
Tabla 30
Cambio porcentual en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000044_0001
Evaluación de la función hepática
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 31.
Tabla 31
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de la función hepática
Figure imgf000045_0002
Estudio 2
Tratamiento
A catorce grupos de cuatro ratones BACHD se les inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 419581, ISIS 419602, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419640, ISIS 419641 o ISIS 419642 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de cuatro ratones BACHD se le inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ISIS 387916 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de control de cuatro ratones se le inyectó intraperitonealmente PBS dos veces por semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para la extracción de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se extrajeron los órganos.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 32 y 33 y se calcularon como inhibición porcentual de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control de PBS.
Tabla 32
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina humana en ratones BACHD
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0002
Tabla 33
Inhibición porcentua a en ratones BACHD
Figure imgf000046_0003
Mediciones de peso de órganos
Al final del estudio se midieron los pesos de hígado, bazo y riñón, y se presentan en la Tabla 34 como porcentaje del control de solución salina normalizado respecto al peso corporal.
Tabla 34
Cambio porcentual en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000046_0001
Evaluación de la función hepática
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de ALT y AST se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 35.
Tabla 35
Efecto del tratamiento con oli onu cleótidos antisentido sobre los marcadores de la función hepática
Figure imgf000047_0001
Estudio 3
Tratamiento
A dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD se les inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, ISIS 419641, ISIS 436645, ISIS 436649, ISIS 436668 o ISIS 436689 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de cuatro ratones BACHD se le inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ISIS 388241 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de control de cuatro ratones se le inyectó intraperitonealmente PBS dos veces por semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para la extracción de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se extrajeron los órganos.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 36 y 37 y se calcularon como inhibición porcentual de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control de PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido logran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264 e ISIS 436645 tienen más de tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 436649 e ISIS 436689 tienen tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 36
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina humana en ratones BACHD
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000048_0002
Tabla 37
Inhibición porcentua a en ratones BACHD
Figure imgf000048_0003
Mediciones de peso de órganos
Al final del estudio se midieron los pesos de hígado, bazo y riñón, y se presentan en la Tabla 38 como porcentaje del control de solución salina normalizado respecto al peso corporal. Los ratones tratados con ISIS 388263 e ISIS 436645 experimentaron incrementos de peso del hígado a la dosis de 50 mg/kg en comparación con el control de PBS.
Tabla 38
Cambio porcentual en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Evaluación de la función hepática
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 39.
Tabla 39
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de la función hepática
Figure imgf000049_0002
Estudio 4
Tratamiento
A dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD se les inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 437123, ISIS 437132, ISIS 437140, ISIS 437442, ISIS 437446, ISIS 437477, ISIS 437478 o ISIS 437490 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de cuatro ratones BACHD se le inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ISIS 387916 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de control de cuatro ratones se le inyectó intraperitonealmente PBS dos veces por semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para la extracción de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se extrajeron los órganos.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 40 y 41 y se calcularon como inhibición porcentual de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control de PBS. ISIS 388241 e ISIS 437490 tienen más de tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 437132 tiene tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostró inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 437123 e ISIS 437140 tienen dos emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 40
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina humana en ratones BACHD
Figure imgf000050_0002
Tabla 41
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina murina en ratones BACHD
Figure imgf000050_0003
Mediciones de peso de órganos
Al final del estudio se midieron los pesos de hígado, bazo y riñón, y se presentan en la Tabla 42 como porcentaje del control de solución salina normalizado respecto al peso corporal.
Tabla 42
Cambio porcentual en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Evaluación de la función hepática
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 43.
Tabla 43
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de la función hepática
Figure imgf000051_0002
Estudio 5
Tratamiento
A once grupos de cuatro ratones BACHD se les inyectó intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 4445911 o ISIS 444661 dos veces por semana durante 2 semanas. A un grupo de control de cuatro ratones se le inyectó intraperitonealmente solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces por semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para la extracción de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se extrajeron los órganos.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 44 y 45 y se calcularon como inhibición porcentual de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control de PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido logran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507 e ISIS 443139 tienen más de tres emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 44
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina humana en ratones BACHD
Figure imgf000052_0002
Tabla 45
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina murina en ratones BACHD
Figure imgf000052_0003
Mediciones de peso corporal y peso de órganos
Los pesos corporales de los ratones se midieron al inicio del estudio y posteriormente dos veces por semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la Tabla 46 y se expresan como cambio porcentual respecto a los pesos registrados al inicio del estudio. Los resultados indican que el tratamiento con estos oligonucleótidos no causó ningún cambio adverso en el peso corporal de los ratones durante todo el estudio.
Tabla 46
Cambio porcentual en el peso corporal de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0002
Al final del estudio se midieron los pesos de hígado, bazo y riñón, y se presentan en la Tabla 47 como porcentaje del control de solución salina normalizado respecto al peso corporal.
Tabla 47
Cambio porcentual en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000053_0003
Evaluación de la función hepática
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de ALT y AST se expresan en UI/l. Los niveles plasmáticos de bilirrubina y albúmina también se midieron utilizando el mismo analizador de bioquímica clínica y se expresan en g/dl. Los resultados se presentan en la Tabla 48.
Tabla 48
Efecto del tratamiento con ol i onucleótidos antisentido sobre los marcadores de la función hepática
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0002
Medición de la función renal
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función renal de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina utilizando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 49 expresados en mg/dl.
Tabla 49
Efecto del tratamiento con oli onuc leótidos^antisentido sobre los marcadores de la función renal
Figure imgf000054_0003
Medición de otros parámetros metabólicos
Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en otras funciones metabólicas en los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones plasmáticas de glucosa, colesterol y triglicéridos utilizando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 50 expresados en mg/dl y demuestran que el tratamiento con estos oligonucleótidos no causó ningún cambio adverso en los niveles de estos marcadores metabólicos entre los grupos de control y de tratamiento.
Tabla 50
Efecto del tratamiento con oli onucleótidos antisentido en marcadores metabólicos
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 4: Administración en bolo de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de huntingtina al cuerpo estriado de ratones BACHD
Se trató a ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración en bolo a un área definida del cerebro del ratón, el cuerpo estriado, con el propósito de cribar la actividad de los oligonucleótidos en el tejido cerebral contra la expresión de ARNm de huntingtina humana y de ratón.
Tratamiento y cirugía
A grupos de cuatro ratones BACHD cada uno se les administró ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663 en forma de inyección en bolo único a concentraciones de 3 |jg, 10 |jg o 25 |jg en el cuerpo estriado.
Un grupo de control de 4 ratones BACHD se trató de forma similar con PBS. Se administró ISIS 388241 a siete grupos de 4 ratones cada uno y los resultados presentados son el promedio de los datos derivados de los 28 ratones. Se administró ISIS 419628 a 2 grupos de 4 ratones BACHD cada uno y los resultados presentados son el promedio de los datos derivados de los 8 ratones. Siete días después de la administración del bolo, los ratones se sacrificaron usando isoflurano y se extrajeron los órganos. Se decapitó a los animales y se extrajo el cerebro para diseccionar el tejido del cuerpo estriado.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de ARNm de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murino RTS2633. Los resultados para los niveles de ARNm de huntingtina humana se presentan en la Tabla 51 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el grupo de control de PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido logran una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana. Los resultados para los niveles de ARNm de huntingtina murina se presentan en la Tabla 52 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el grupo de control de PBS.
Las dosis eficaces (DE50) de cada oligonucleótido para ARNm de huntingtina humana y ARNm de huntingtina de ratón se calcularon representando gráficamente las concentraciones de los oligonucleótidos usados en función de la inhibición porcentual del nivel de expresión de ARNm de huntingtina de cualquiera de las dos especies y registrando las concentraciones a las cuales se conseguía un 50 % de inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina para cada especie en comparación con los controles correspondientes. La DE50 (jig) para cada oligonucleótido antisentido también se presenta en las Tablas 51 y 52 para ARNm de huntingtina humana y murina, respectivamente.
ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139 e ISIS 444584 presentan cada uno emparejamientos erróneos de 8 pares de bases o más con ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 437168 e ISIS 437441 tienen cada uno 2 emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 51
Inhibición porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina humana in v iv o y DE50 de los oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0002
Tabla 52
Inhibición porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina murina in v iv o y DE50 de los oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000056_0001
Los diez compuestos marcados con un asterisco tenían una DE50 mejorada respecto a ISIS 388241.
Ejemplo 5: Ensayo para determinar efectos neurotóxicos de la administración en bolo de oligonucleótidos antisentido en el tejido del cuerpo estriado de ratas
Se seleccionaron aproximadamente 30 compuestos por su alta tolerabilidad y alta potencia. A continuación, los compuestos se sometieron a prueba por inyección en bolo en el SNC en ratas para evaluar adicionalmente la neurotoxicidad.
Se trató a cada una de las ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración en bolo en un área definida del cerebro, el cuerpo estriado, con el propósito de cribar la inducción del marcador microglial
AIF1 como medida de toxicidad en el SNC.
Tratamiento y cirugía
A grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se les administró ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, 4196671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 443168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663 en forma de inyección en bolo único a una concentración de 50 |jg en el cuerpo estriado. Un grupo de control de 4 ratas se trató de forma similar con PBS. Un grupo de 4 ratas se trató de forma similar con ISIS 104838, un oligonucleótido antisentido contra TNF-a, como grupo de control negativo. ISIS 387916 se administró a cuatro grupos de 4 ratas cada uno y los resultados presentados son un promedio de los datos derivados de las 16 ratas.
ISIS 419628 se administró a dos grupos de 4 ratas cada uno y los resultados presentados son el promedio de los datos de las 8 ratas. ISIS 419629, ISIS 444584 e ISIS 444618, que tenían indicadores de toxicidad en el estudio de administración sistémica (Ejemplo 3) también se sometieron a prueba en este estudio. Siete días después de la administración del bolo, las ratas se sacrificaron usando isoflurano y se extrajeron los órganos. Se decapitó a los animales y se extrajo el cerebro para diseccionar el tejido del cuerpo estriado.
Análisis de ARN de los niveles de expresión de AIF1
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de AIF1. Los niveles de AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de rata rAif1_LTS00219 (secuencia del cebador directo AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, designada en el presente documento como
SEQ ID NO: 46; secuencia del cebador inverso CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 47; secuencia de la sonda CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 48). Los resultados se calcularon como porcentaje de expresión de AIF1 respecto a la del control de PBS y se presentan en la Tabla 53. ISIS 419629, ISIS 444584 e ISIS 444618, que tenían indicadores de toxicidad en el estudio de administración sistémica (en el Ejemplo 3), también tenían indicadores de toxicidad en este estudio (más del 300 % mayor que el control de solución salina). Estudios posteriores demostraron que ISIS 444584 es neurotolerable y presenta indicadores de toxicidad despreciables (véanse Ejemplos 16 y 17).
Tabla 53
Porcentaje de expresión de los niveles de ARNm de AIF1 in _ v iv o como medida de neurotoxicidad
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Análisis de ARN de los niveles de expresión de huntingtina
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de rata rHtt_LTS00343 (secuencia del cebador directo CAGAGCTGGTGAACCGTAt Cc , designada en el presente documento como SEQ ID NO: 49; secuencia del cebador inverso GGCTTAAGCAGGGAGCCAAAA, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 50; secuencia de la sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 51). Los resultados se calcularon como reducción porcentual de la expresión de huntingtina respecto a la del control de PBS y se presentan en la Tabla 54. ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507 e ISIS 443139 presentan cada uno emparejamientos erróneos de 6 pares de bases o más con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y, por lo tanto, no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 437442, ISIS 444615 e ISIS 444627 tienen 1 emparejamiento erróneo cada uno con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 437168 e ISIS 437441 tienen 2 emparejamientos erróneos cada uno con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 436689 e ISIS 444584 tienen 3 emparejamientos erróneos cada uno con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control.
Tabla 54
Reducción porcentual de los niveles de ARNm de _ huntingtina de rata en ratas
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Figure imgf000059_0002
Ejemplo 6: Estudio de tolerabilidad de la administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra de ARNm de huntingtina en ratones BACHD
Los compuestos seleccionados se compararon con el compuesto ISIS 388241 previamente diseñado mediante administración ICV a ratones BACHD.
Los compuestos seleccionados más el compuesto de referencia 388241 se seleccionaron en base a la potencia in vitro y sistémica y la tolerabilidad sistémica, así como la potencia y tolerabilidad en el SNC.
Los ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración intracerebroventricular (ICV) en un área definida del cerebro del ratón, el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la tolerabilidad de la administración ICV en ratones.
Tratamiento y cirugía
A grupos de cinco ratones BACHD cada uno se les administró ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 444591, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 444661 o ISIS 436689 a 150 |jg/día por vía ICV con bombas Alzet 2002 a un caudal de 12 jl/día durante 2 semanas. Un grupo de control de 4 ratones BACHD se trató de forma similar con PBS. Las bombas se implantaron quirúrgicamente a los ratones de la siguiente manera: Se anestesió individualmente a los ratones con isoflurano al 3 % para el implante de la bomba. Después de dos semanas, se volvió a anestesiar a los ratones y se extirpó la bomba quirúrgicamente. A continuación, se permitió recuperarse a los animales durante dos semanas más antes de ser sacrificados.
Los pesos corporales de los ratones se registraron semanalmente durante los períodos de tratamiento y recuperación. Después de 4 semanas, los ratones se sacrificaron usando isoflurano y se decapitaron. Se extrajo el cerebro para obtener tejido de las secciones anterior y posterior.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN del hemisferio derecho de la corteza anterior y la sección posterior del cerebelo del sitio de canulación para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de ARNm de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murino RTS2633. Los resultados se calcularon como inhibición porcentual de la expresión de ARNm de huntingtina humana y murina en comparación con el control y se presentan en las Tablas 56 y 57, respectivamente. Todos los oligonucleótidos antisentido logran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507 e ISIS 443139 presentan cada uno emparejamientos erróneos de 8 pares de bases o más con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 444591 tiene 1 emparejamiento erróneo con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no demuestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 56
Reducción porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina humana en ratones BACHD por medio de la administración ICV de oli onucleótidos antisentido
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Tabla 57
Reducción porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina murina en ratones BACHD por medio de la administración ICV de oli onucleótidos antisentido
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Medición de peso corporal
Los pesos corporales de los ratones se midieron al inicio del estudio y posteriormente una vez por semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la Tabla 58 y se expresan como cambio porcentual respecto a los pesos registrados al inicio del estudio. Los pesos corporales se consideraron una medida de la tolerancia de los ratones a la administración ICV de oligonucleótidos antisentido. "n.d." significa que no había datos disponibles para ese período de tiempo.
Tabla 58
Cambio porcentual en el peso corporal de ratones BACHD durante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido
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Supervivencia de los ratones
La supervivencia de los ratones se evaluó durante todo el período del estudio. La Tabla 59 a continuación muestra el patrón de supervivencia en los grupos de ratones tratados con oligonucleótidos ISIS, así como con el control.
Tabla 59
Número d rviv n i r n l r mi n n li n l i antisentido
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Ejemplo 7: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra huntingtina en ratones C57/BL6
Se trataron ratones C57/BL6 naturales con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración intracerebroventricular (ICV) en un área definida del cerebro del ratón, el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la potencia de los oligonucleótidos contra huntingtina murina en estos ratones.
Tratamiento y cirugía
A grupos de diez ratones C57/BL6 cada uno se les administró ISIS 408737 (5' TCCTAGTGTTACATTACCGC 3' (SEQ ID NO: 52), sitio de inicio 5263 de SEQ ID NO: 3) a 50 |jg/día administrado por vía ICV con bombas Alzet 2002 a un caudal de 0,5 jl/día durante 7 días o 14 días. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6 se trató de forma similar con PBS. Las bombas se implantaron quirúrgicamente a los ratones de la siguiente manera: En resumen, las bombas osmóticas Alzet (Modelo 2002) se montaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bombas se llenaron con una solución que contenía el oligonucleótido antisentido y se incubaron durante la noche a 37 °C, 24 horas antes del implante. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3 % y se colocaron en un marco de esterotaxia. Después de esterilizar el lecho quirúrgico, se realizó una incisión en la línea media sobre el cráneo y se creó un receptáculo subcutáneo en la espalda, en el que se implantó una bomba osmótica precargada. Se taladró un pequeño orificio en el cráneo sobre el ventrículo lateral derecho. A continuación, se colocó una cánula en el ventrículo, conectada a la bomba osmótica por medio de un catéter de plástico, y se pegó usando adhesivo Loctite. La incisión se cerró con puntos de sutura. El oligonucleótido antisentido o PBS se perfundió durante 7 o 14 días, después de lo cual se sacrificó a los animales de acuerdo con un protocolo compasivo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Se extrajo tejido del cerebro y de la médula espinal y se ultracongeló en nitrógeno líquido. Antes de congelar, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 estaban separadas aproximadamente 2 mm entre sí, siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal.
Análisis de ARN y proteínas
Se extrajo ARN total de cerebro y médula espinal de ratones con el kit RNeasy Protect Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina utilizando un kit de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Las reacciones de Q-PCR se realizaron y analizaron en un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm de huntingtina de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murinos ABI # Mm01213820_m1 (Applied Biosystems) y se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de peptidilprolil isomerasa A. Se prepararon lisados de proteínas a partir de cortes de cerebro de ratón como se ha descrito previamente (Li S.H. y Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217:1940-6029). Los lisados se procesaron en gel de tris-acetato al 3-8 % y se transfirieron usando el sistema de transferencia en seco iBlot (Invitrogen). Las transferencias se sondearon con anticuerpo contra tubulina beta (Chemicon) y anticuerpo monoclonal MAB2166 (Millipore) que reacciona específicamente con proteína huntingtina murina. Las inmunotransferencias se cuantificaron utilizando el programa informático Odyssey V3.0. Los resultados se presentan en la Tabla 60 como reducción porcentual en comparación con el control de PBS y demuestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina y de proteína huntingtina con el oligonucleótido antisentido tanto el día 7 como el día 14.
Tabla 60
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina murjna en ratones C57/BL6
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Ejemplo 8: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de huntingtina en macacos cangrejeros
Se trató a macacos cangrejeros con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración intracerebroventricular (ICV) a un área cerebral definida, los ventrículos laterales, con el propósito de cribar la actividad de los oligonucleótidos en el tejido cerebral contra la expresión de ARNm de huntingtina.
Tratamiento y cirugía
A dos grupos de 3 macacos cangrejeros cada uno se les administró 0,635 mg/ml (1,5 mg/día) o 1,67 mg/ml (4 mg/día) de ISIS 436689 administrado por vía ICV con bombas portátiles individuales (Pegasus Vario) a un caudal de 0,05 ml/hora durante 4 semanas. A un grupo de control de 2 macacos cangrejeros se le administró PBS de forma similar. Los grupos recibieron ISIS 436689 bilateralmente. A un animal se le administró ISIS 436689 a la dosis de 4 mg/día unilateralmente al ventrículo derecho.
Se permitió a los animales recuperarse de la cirugía durante 10 días antes de realizar la perfusión. Durante el período de recuperación posquirúrgico, los animales se mantuvieron con perfusión ICV de PBS a un caudal de 0,05 ml/h utilizando una bomba de perfusión portátil por ventrículo. Al final del período de recuperación, cada cánula se conectó a una bomba portátil individual (Pegasus Vario) que se colocó dentro de una chaqueta para primates (Lomir, PJ-02NB). Las bombas permanecieron conectadas hasta la finalización del período de perfusión. Después de 4 semanas de administración, se sacrificó a los animales y se extirpó cerebro, hígado y riñón.
Análisis de ARN de ARNm de htt
Se extrajo ARN del núcleo caudado anterior, el núcleo caudado posterior, la corteza temporal, la corteza parietal, el hipotálamo, el mesencéfalo, el hipocampo y la médula espinal, así como del hígado y el riñón para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617 y se normalizaron respecto a los niveles de ciclofilina A de mono. Los resultados se calcularon como inhibición porcentual de la expresión de ARNm de huntingtina en comparación con el control de PBS y se presentan en la Tabla 61. ISIS 436689 logró una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina humana en el SNC.
Tabla 61
Reducción porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina en macacos cangrejeros
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n.d. = sin datos
Ejemplo 9: Medición de la semivida de ISIS 387898 en el cuerpo estriado de ratones C57/BL6 por medio de la administración en bolo único
A ratones C57/BL6 se les administró ISIS 387898 como un bolo único en el cuerpo estriado con el propósito de medir la semivida y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de ARNm de huntingtina en ese tejido.
Tratamiento
Se trató a cuarenta ratones C57/BL6 con ISIS 387898 (5' CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3' (SEQ ID NO: 53); posición de inicio 4042 de SEQ ID NO: 1 y posición de inicio 4001 de SEQ ID NO: 3) administrado en un bolo único de 50 |jg en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5. Se trató a ocho ratones C57/BL6 de control con PBS en un procedimiento similar. Se sacrificaron grupos de 4 ratones cada uno en diversos puntos de tiempo y se extrajo tejido del cuerpo estriado en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murino RTS2633. Los resultados se presentan en la Tabla 62 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el grupo de control de PBS el día 7. Se observó que el efecto inhibidor de ISIS 387898 se prolongaba durante al menos 91 días.
Tabla 62
Efecto de ISIS 387898 administrado en bolo único en la expresión de ARNm de huntingtina murina en diversos puntos de tiem o en el cuer o estriado de ratones C57/BL6
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Análisis de la concentración de oligonucleótidos antisentido en el cerebro:
Los tejidos cerebrales se picaron, pesaron, homogeneizaron y extrajeron usando un procedimiento de extracción líquido-líquido con fenol/cloroformo. A esto le siguió la extracción en fase sólida del sobrenadante en una columna con fenilo antes de la inyección electrocinética con electroforesis capilar en gel. Para el análisis electroforético capilar en gel se usó el instrumento de electroforesis capilar AP/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Los picos de los oligonucleótidos se detectaron por absorbancia UV a 260 nm.
La concentración de ISIS 387898 en el cerebro (|jg/g) se representó en función de la expresión de huntingtina humana como porcentaje del control de PBS (Tabla 63 y Figura 1). Se calculó la concentración de ISIS 387898 que logra una inhibición del 50 % de la expresión de ARNm de huntingtina (CE50). Se determinó que la CE50 era de 0,45 jg/g. También se representó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral y el porcentaje correspondiente de expresión de ARNm de huntingtina (Tabla 64 y Figura 2) y la semivida del oligonucleótido se calculó en 21 días.
Tabla 63
Concentración de ISIS 387898 en tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de ARNm de htt como orcentae del control
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Tabla 64
Concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de A ^ ol
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Ejemplo 10: Medición de la semivida de ISIS 387898 en los ventrículos laterales de ratones BACHD por medio de la administración ICV
A ratones BACHD se les administró ISIS 387898 por vía ICV en los ventrículos laterales del cerebro con el propósito de medir la semivida y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de ARNm de huntingtina en ese tejido.
Tratamiento
Se trató a veintiocho ratones BACHD con ISIS 387898 administrado por vía ICV a 75 |jg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trató a veintiocho ratones BACHD de control con PBS en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se sacrificaron grupos de 4 ratones de los grupos de tratamiento y control cada dos semanas y se extrajo tejido de la corteza anterior en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación, para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los niveles de ARNm de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murino RTS2633. Los niveles de expresión de ARNm de huntingtina mutante humana se presentan en la Tabla 65 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el promedio de los valores medidos en los grupos de control de PBS. Los niveles de expresión de ARNm de huntingtina normal murina se presentan en la Tabla 66 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el promedio de los valores medidos en los grupos de control de PBS. Se observó que el efecto inhibidor de ISIS 387898 se prolongaba durante 91 días.
Tabla 65
Efecto de ISIS 387898 administrado por vía ICV en la expresión de ARNm de huntingtina humana en diversos untos de tiem o
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Tabla 66
Efecto de ISIS 387898 administrado por vía ICV en la expresión de ARNm de huntingtina murina en diversos untos de tiem o
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Análisis de la concentración de oligonucleótidos antisentido en el cerebro:
El tejido cerebral se procesó con un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. La concentración de ISIS 387898 en la corteza anterior del cerebro (|jg/g) se representó en función de la inhibición de huntingtina humana como porcentaje del control de PBS (Tabla 67 y Figura 3), y la CE50 se calculó que era de 26,4 jg/g. También se representó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral (Tabla 68 y Figura 4) y la semivida del oligonucleótido se calculó en 21 días.
Tabla 67
Concentración de ISIS 387898 en tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de ARNm de htt como
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Tabla 68
Concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de ARNm h m r n l ntrol
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Ejemplo 11: Medición de la semivida de ISIS 388241 e ISIS 443139 en los ventrículos laterales de ratones BACHD por medio de la administración ICV
A ratones BACHD se les administró ISIS 388241 o ISIS 443139 por vía ICV en los ventrículos laterales del cerebro con el propósito de medir la semivida y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de ARNm de huntingtina en ese tejido.
Tratamiento
Se trató a veinte ratones BACHD con ISIS 388241 administrado por vía ICV a 50 |jg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trató a veinte ratones BACHD con ISIS 443139 administrado por vía ICV a 50 jg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trató a veinte ratones BACHD de control con PBS en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se sacrificaron grupos de 4 ratones de los grupos de tratamiento y del grupo de control cada dos semanas y se extrajo tejido en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación, para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2617. Los resultados se presentan en la Tabla 69 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el promedio de los valores medidos en los grupos de control de PBS. Se observó que los efectos inhibidores de ISIS 388241 e ISIS 443139 se prolongaron durante al menos 16 semanas.
Tanto ISIS 388241 como su equivalente de cadena principal mixta, ISIS 443139, tienen más de 3 emparejamientos erróneos con ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 5) y, por lo tanto, no demostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
Tabla 69
Efecto de ISIS 388241 e ISIS 443139 administrado por vía ICV en la expresión de ARNm de huntingtina h m n n iv r n i m
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Análisis de la concentración de oligonucleótidos antisentido en el cerebro:
El tejido cerebral se procesó con un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se representó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 388241 en el tejido cerebral posterior (Tabla 70 y Figura 5) y la semivida del oligonucleótido se calculó en 20 días. Se representó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 443139 en el tejido cerebral posterior (Tabla 71 y Figura 6) y la semivida del oligonucleótido se calculó en 20 días.
Tabla 70
Concentración de ISIS 384241 en tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de ARNm de htt como orcentae del control
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Tabla 71
Concentración de ISIS 443139 en tejido cerebral y su efecto sobre la expresión de ARNm de htt como
^
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Ejemplo 12: Efecto de la inhibición antisentido de huntingtina humana mutante sobre el desempeño motor de ratones BACHD
Se trató a ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS por medio de administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión de ARNm de huntingtina sobre su desempeño motor por medio de la prueba de rotarod.
Tratamiento
La prueba de rotarod con aceleración se realizó en el rotarod Ugo Basile. Los animales se colocaron en el rotarod a una velocidad de 2 RPM; el rotarod aceleró a 40 RPM en el lapso de 5 minutos. Se registró la duración hasta la caída. La duración hasta la caída se define por la caída del animal del rotarod o porque este detiene la carrera, se cuelga del rotarod y rota en él. Se entrenó a ratones BACHD de seis meses de edad y ratones de las mismas camadas no transgénicos para correr en el rotarod durante una semana antes del tratamiento. Esto consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una, con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. A continuación, se trató a un grupo de 15 ratones BACHD con ISIS 388241 por vía ICV a 50 |jg/día administrado con bombas Alzet 2002 a un caudal de 12 jl/día durante 2 semanas. Las bombas se implantaron quirúrgicamente a los ratones en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Un grupo de control de 14 ratones BACHD se trató con PBS de forma similar. Se trató a un grupo de control de 9 ratones de las mismas camadas no transgénicos con PBS de forma similar.
Prueba de desempeño en rotarod
Al final del período de tratamiento, se extirparon las bombas y dos semanas después se realizó la primera prueba de rotarod postratamiento. El comportamiento en el rotarod se analizó mensualmente hasta que los ratones tuvieron 11 meses de edad. Cada mes se colocó a los animales en el rotarod para hacer tres pruebas al día durante 2 días. Los resultados se presentan en la Fig. 7, así como en la Tabla 72, expresados como duración hasta la caída en segundos. Los valores de referencia a los 6 meses de edad se tomaron antes del tratamiento y los puntos de tiempo dados son la edad de los ratones a la que se realizó la prueba. Los datos indican que el tratamiento de ratones BACHD con ISIS 388241 incrementó la duración hasta la caída en comparación con la observada en ratones BACHD no tratados.
Tabla 72
Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntin tina mutante sobre la duración hasta la caída s)
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Ejemplo 13: Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntingtina humana mutante y huntingtina murina natural sobre el desempeño motor de ratones BACHD
Se trató a ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS por medio de administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión de ARNm de huntingtina sobre su desempeño motor por medio de la prueba de rotarod.
Tratamiento
La prueba de rotarod con aceleración se realizó en el rotarod Ugo Basile. Los animales se colocaron en el rotarod a una velocidad de 2 RPM; el rotarod aceleró a 40 RPM en el lapso de 5 minutos. Se registró la duración hasta la caída. La duración hasta la caída se define por la caída del animal del rotarod o porque este detiene la carrera, se cuelga del rotarod y rota en él. Se entrenó a ratones BACHD de dos meses de edad y ratones de las mismas camadas no transgénicos para correr en el rotarod durante una semana antes del tratamiento. Esto consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una, con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. Se trató a grupos de 17-21 ratones BACHD con ISIS 388241 a 50 |jg/día, ISIS 408737 a 75 |jg/día, o ISIS 387898 a 75 jg/día, administrados por vía ICV con bombas Alzet 2002 a un caudal de 0,5 jl/hora durante 2 semanas. Las bombas se implantaron quirúrgicamente a los ratones en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Un grupo de control de 20 ratones BACHD se trató con PBS de forma similar. Los grupos de ratones de control no transgénicos también se trataron de forma similar con oligonucleótidos ISIS o PBS de forma similar.
Prueba de desempeño en rotarod
Al final del período de tratamiento, se extirparon las bombas y dos semanas después se realizó la primera prueba de rotarod postratamiento. El comportamiento en el rotarod se analizó mensualmente hasta que los ratones tuvieron 10 meses de edad. Cada mes se colocó a los animales en el rotarod para hacer 3-5 pruebas al día durante 3 días consecutivos. Los resultados se presentan en la Tabla 73, expresados como la duración hasta la caída en segundos. Los valores de referencia a los 2 meses de edad se tomaron antes del tratamiento y los puntos de tiempo dados son la edad de los ratones a la que se realizó la prueba. ISIS 387898 (designado en la tabla como ASO humano-murino) presenta reactividad cruzada tanto con ARNm de huntingtina humana como de ratón y, por lo tanto, inhibiría tanto ARNm de huntingtina mutante humana como ARNm de huntingtina murina natural en los ratones. ISIS 388241 (designado en la tabla como ASO humano) está dirigido específicamente a ARNm de huntingtina humana y presenta emparejamientos erróneos de 8 pares de bases con ARNm de huntingtina murina. Por lo tanto, ISIS 388241 inhibiría específicamente solo ARNm de huntingtina mutante humana y no ARNm de huntingtina murina natural en los ratones. ISIS 408737 (designado en la tabla como ASO murino) está dirigido específicamente a ARNm de huntingtina murina y presenta emparejamientos erróneos de 7 pares de bases con ARNm de huntingtina humana. Por lo tanto, ISIS 408737 inhibiría específicamente solo ARNm de huntingtina murina natural y no ARNm de huntingtina mutante humana en los ratones. "Tg" indica los ratones BACHD y "No Tg" indica los ratones de control no transgénicos.
Los resultados del estudio indican que la inhibición de ARNm de huntingtina mutante humana por ISIS 388241 (ASO Tg-humano) mejoró significativamente el desempeño de los ratones en la prueba de rotarod en comparación con el control (Tg-PBS). Los resultados también indican que el tratamiento de ratones con ISIS 387898 (ASO Tg-humanomurino), dirigido tanto a ARNm de huntingtina mutante como natural en los ratones, no causó ningún efecto perjudicial en el desempeño motor de los ratones y, de hecho, también mejoró significativamente el desempeño en la prueba de rotarod en comparación con el control (Tg-PBS). Los ratones tratados con ISIS 408737 (ASO Tgmurino) no mostraron un desempeño mejorado en la prueba de rotarod en comparación con el control de PBS, como se esperaba, ya que el oligonucleótido no está dirigido al ARNm de huntingtina mutante. En este ensayo se usaron controles no transgénicos como controles positivos.
Tabla 73
Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntingtina sobre la duración hasta la caída (s)
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Ejemplo 14: Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntingtina sobre la masa cerebral de ratones R6/2
Se trató a ratones R6/2 con oligonucleótidos ISIS por medio de administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión de ARNm de huntingtina sobre el peso y el volumen del cerebro.
Tratamiento
Los ratones R6/2 se alojaron en grupos de hasta 5 por jaula (genotipos mixtos, un solo sexo). Todos los ratones se alojaron en jaulas de tipo caja de zapatos con lecho de madera estéril cubriendo el suelo que se cambiaba con la frecuencia necesaria para proporcionar a los animales un lecho seco. Este entorno básico se enriqueció con la adición de túneles de juego, materiales de nidificación triturados y huesos de plástico para todos los ratones; es decir, una jaula de ambiente enriquecido que contenía un túnel de ratón (color ámbar, certificado, transparente, producto BioServ # K3323), un hueso de goma Petite Green Gumabone (producto BioServ # K3214) y material de nidificación (Hockley y col., Ann Neurol. 2002, 51 : 235-242). Los ratones disponían de comida y agua a demanda en las jaulas.
A un grupo de diez ratones R6/2 de seis meses se le administró 50 |jg/día de ISIS 388817 por vía ICV con bombas Alzet 1004 a un caudal de 0,12 jl/h durante 4 semanas. A un grupo de dos ratones de las mismas camadas no transgénicos se le administró 50 jg/día de ISIS 388817 de forma similar. A un grupo de control de cinco ratones R6/2 se le administró 50 jg/día de ISIS 141923 de forma similar. A un grupo de control de nueve ratones R6/2 se le administró PBS de forma similar. A un grupo de ocho ratones de las mismas camadas no transgénicos se le administró PBS de forma similar. También se incluyó en el estudio un grupo de cuatro R6/2 presintomáticos no tratados de ocho semanas de edad.
Medición del peso del cerebro
Los animales se anestesiaron con isofluorano y a continuación se sometieron a perfusión transcardíaca con tampón fosfato de Sorenson (SPB) helado, y se fijaron con paraformaldehído al 4 % en SPB. Se extrajeron los cerebros y se cortaron con cortes frontales inmediatamente rostrales al prosencéfalo (eliminando los bulbos olfativos) e inmediatamente caudales al cerebelo (eliminando la médula espinal). El cerebro restante se pesó en mg. Los resultados se presentan en la Fig. 8 y la Tabla 74 y demuestran el incremento del peso del cerebro en ratones R6/2 tratados con ISIS 388817 en comparación con el control de PBS.
Tabla 74
Efecto de la inhibició peso del cerebro (mg)
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Ejemplo 15: Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntingtina sobre el desempeño de ansiedad de ratones YAC128
Se trató a ratones YAC128 con oligonucleótidos ISIS por medio de administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión de ARNm de huntingtina sobre la ansiedad en estos ratones, medido por su desempeño en pruebas de campo abierto y de laberinto en cruz elevado. Tratamiento
A un grupo de siete ratones YAC128 de cinco meses de edad se les administró 50 |jg/día de ISIS 388241 por vía ICV con bombas Alzet 1004 a un caudal de 0,5 jl/h durante 14 días. Un grupo de control de cuatro ratones YAC128 se trató de forma similar con PBS. Se incluyó en el estudio un grupo de control de ocho ratones FVB/NJ de las mismas camadas no transgénicos que no recibieron ningún tratamiento. Las bombas se implantaron quirúrgicamente a los ratones de la siguiente manera: En resumen, las bombas osmóticas Alzet (Modelo 2002) se montaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bombas se llenaron con una solución que contenía el oligonucleótido antisentido y se incubaron durante la noche a 37 °C, 24 horas antes del implante. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3 % y se colocaron en un marco de esterotaxia. Después de esterilizar el lecho quirúrgico, se realizó una incisión en la línea media sobre el cráneo y se creó un receptáculo subcutáneo en la espalda, en el que se implantó una bomba osmótica precargada. Se taladró un pequeño orificio en el cráneo sobre el ventrículo lateral derecho. A continuación, se colocó una cánula en el ventrículo, conectada a la bomba osmótica por medio de un catéter de plástico, y se pegó usando adhesivo Loctite. La incisión se cerró con puntos de sutura. Se perfundió oligonucleótido antisentido o PBS durante 14 días, después de lo cual se extirparon las bombas. Se permitió a los animales recuperarse durante 2 semanas, después de lo cual se realizó un análisis de comportamiento y finalmente se sacrificó a los ratones de acuerdo con un protocolo compasivo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Se extrajo tejido del cerebro y de la médula espinal y se ultracongeló en nitrógeno líquido. Antes de congelar, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 estaban separadas aproximadamente 2 mm entre sí, siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal.
Prueba de campo abierto
Los ratones se colocaron en un aparato de campo abierto (Med Associates) que utiliza la interrupción de haces de luz para medir el movimiento horizontal y vertical durante una sesión de prueba de 30 minutos. Los datos se analizaron usando el programa informático Activity Monitor para examinar el movimiento ambulatorio total dentro del aparato y el movimiento dentro del centro del aparato como medida de la ansiedad. Se esperaba que los ratones de control YAC128 pasaran menos tiempo en el centro del aparato que los ratones FVB/NJ de las mismas camadas no transgénicos y menos propensos a la ansiedad. Los resultados se presentan en la Fig. 9 y la Tabla 75 e indican que el tratamiento de ratones YAC128 con oligonucleótidos antisentido disminuyó la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros de la prueba de campo abierto.
Tabla 75
Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de htt mutante sobre el desempeño en campo abierto de ratones YAC128
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Prueba de laberinto en cruz elevado
El aparato constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados, cada uno con unas medidas de 65 x 6,25 cm, y elevado a 50 cm del suelo. Se colocaron los ratones en el centro del aparato y se registró su localización durante una sesión de prueba de 5 minutos. Se esperaba que los ratones de control YAC128 pasaran menos tiempo en los brazos abiertos del aparato que los ratones FVB/NJ de las mismas camadas no transgénicos y menos propensos a la ansiedad. Los resultados se presentan en la Fig. 10 y la Tabla 76 e indican que el tratamiento de ratones YAC128 con oligonucleótidos antisentido disminuyó la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros de la prueba de laberinto en cruz elevado.
Tabla 76
Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de htt mutante sobre el desempeño de ratones YAC128 en el laberinto en cruz elevado
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Análisis de ARN y proteínas
Se extrajo ARN total de cerebro y médula espinal de ratones con el kit RNeasy Protect Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina utilizando un kit de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Las reacciones de Q-PCR se realizaron y analizaron en un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm de huntingtina humana se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda humanos RTS2686 y se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de peptidilprolil isomerasa A.
Se prepararon lisados de proteínas a partir de cortes de cerebro de ratón como se ha descrito previamente (Li S.H. y Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217:1940-6029). Los lisados se procesaron en gel de tris-acetato al 3­ 8 % y se transfirieron usando el sistema de transferencia en seco iBlot (Invitrogen). Las transferencias se sondearon con anticuerpo contra tubulina beta (Chemicon) y anticuerpo monoclonal EM48 de ratón que reacciona específicamente con la proteína huntingtina humana (Millipore). Las inmunotransferencias se cuantificaron utilizando el programa informático Odyssey V3.0.
Los resultados se presentan en la Tabla 77 como reducción porcentual en comparación con el control de PBS y demuestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de huntingtina y de proteína con el oligonucleótido antisentido.
Tabla 77
Inhibición porcentu l ARNm h nin in en ratones YAC128
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Ejemplo 16: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra huntingtina en ratones C57/BL6
Se trató a ratones C57/BL6 con oligonucleótidos ISIS por medio de administración intracerebroventricular (ICV) en el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la tolerabilidad de los oligonucleótidos en estos ratones. Tratamiento y cirugía
A grupos de cinco ratones C57/BL6 cada uno se administró ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444659, ISIS 444660 o ISIS 444661 a 150 |jg/día por vía ICV con bombas Alzet 2002 a un caudal de 0,5 jl/día durante 2 semanas. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6 se trató de forma similar con PBS. El procedimiento para implantar las bombas y administrar los oligonucleótidos se describe en el Ejemplo 6.
Se permitió a los animales recuperarse durante dos semanas antes de sacrificarlos usando isoflurano. Se extrajo tejido del cerebro y de la médula espinal y se ultracongeló en nitrógeno líquido. Antes de congelar, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 estaban separadas aproximadamente 2 mm entre sí, siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal. Análisis de ARN
Se extrajo ARN total de las cortezas anterior y posterior del cerebro para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina utilizando un kit de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Las reacciones de RT-PCR se realizaron en un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm de huntingtina de ratón se midieron usando un conjunto de cebadores y sonda murinos RTS2633 y se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de ciclofilina. Los resultados se presentan en la Tabla 78 como reducción porcentual en comparación con el control de PBS. ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444627 e ISIS 444652 tienen un emparejamiento erróneo con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y, por lo tanto, no demostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control.
También se midió el marcador microglial, AIF1, mediante análisis por RT-PCR usando el conjunto de cebadores y sonda murinos mAIF1_LTS00328 (secuencia del cebador directo TGGTCCCCCAGCCAa Ga , designada en el presente documento como SEQ ID NO: 54; secuencia del cebador inverso CCCACCGTGTGACATCCA, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 55; secuencia de la sonda AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTG, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 56). Los resultados se presentan en la Tabla 79 e indican que los oligonucleótidos ISIS sometidos a prueba no indujeron una respuesta inflamatoria.
Tabla 78
Inhibición porcentual de ARNm de huntin tina murina en com aración con el control en ratones C57/BL6
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Tabla 79
Incremento porcentual de la expresión de ARNm de AIF1 en com aración con el control en ratones C57/BL6
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Medición de peso corporal
Los pesos corporales se midieron a intervalos regulares durante todo el período del estudio y se presentan en la Tabla 80. Estos pesos se utilizaron como indicador de la tolerabilidad. Los ratones tratados con ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 tuvieron un peso corporal constante durante todo el período del estudio y se consideraron los oligonucleótidos ISIS más tolerables de todos los incluidos en el estudio. "n. d." indica que no hay datos para ese grupo de ratones.
Tabla 80
Pesos corporales de ratones C57/BL6 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
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Ejemplo 17: Ensayo para determinar efectos neurotóxicos de la administración en bolo de oligonucleótidos antisentido en el tejido del cuerpo estriado de ratas
Se trató a ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos ISIS por medio de la administración en bolo en el cuerpo estriado con el propósito de cribar la inducción del marcador microglial AIF1 como medida de toxicidad para el SNC. Tratamiento y cirugía
A grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se administró ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444591 o ISIS 444652 en forma de un bolo único a una concentración de 25 |jg, 50 |jg, 75 |jg o 100 |jg. Un grupo de 4 ratas se trató de forma similar con ISIS 387916, administrado en forma de un bolo único a concentraciones de 10 jig, 25 jig, 50 jig o 75 jig. Un grupo de control de 4 ratas se trató de forma similar con PBS. Siete días después de la administración del bolo, las ratas se sacrificaron usando isoflurano y se extrajeron los órganos. Se decapitó a los animales y se extrajo el cerebro para diseccionar el tejido del cuerpo estriado. Se colocó un par de pinzas curvas finas directamente en el cerebro, justo anterior al hipocampo, para hacer una incisión transversal en la corteza y los tejidos subyacentes mediante disección roma. Las puntas de otro par de pinzas curvas finas se colocaron directamente hacia abajo a lo largo del seno medio sagital a medio camino entre el hipocampo y el bulbo olfativo para hacer una incisión longitudinal, cortando el cuerpo calloso por disección roma. A continuación, se usó el primer par de pinzas para replegar la esquina resultante de la corteza exponiendo el cuerpo estriado y la cápsula interna y, a continuación, para diseccionar y extraer la cápsula interna del cuerpo estriado. El segundo juego de pinzas se colocó de modo que los extremos curvos estuvieran a ambos lados del cuerpo estriado y se presionaron hacia abajo para aislar el tejido. El primer juego de pinzas se usó para pinzar el extremo posterior del cuerpo estriado y extirpar el cuerpo estriado del cerebro.
Análisis de ARN de los niveles de expresión de AIF1
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de AIF1. Los niveles de AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de rata rAif1_LTS00219. Los resultados se calcularon como porcentaje de expresión de AIF1 respecto a la del control de PBS y se presentan en la Tabla 81. Los resultados indican que ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 fueron bien tolerados en el cerebro de rata.
Tabla 81
Porcentaje de expresión de los niveles de ARNm de AIF1 in v iv como medida de neurotoxicidad
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Análisis de ARN de los niveles de expresión de huntingtina
Se extrajo ARN de tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de rata rHtt_LTS00343. Los resultados se calcularon como reducción porcentual de la expresión de huntingtina respecto a la del control de PBS y se presentan en la Tabla 82. ISIS 388421 e ISIS 443139 presentan cada uno emparejamientos erróneos de 6 pares de bases o más con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y, por lo tanto, no demuestran inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 444584 tiene 3 emparejamientos erróneos con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y, por lo tanto, no muestra una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control.
Tabla 82
Reducción porcentual de los niveles de ARNm de huntingtina de rata en ratas
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Ejemplo 18: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos primarios de mono cangrejero
ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 se sometieron a prueba en hepatocitos primarios de mono cangrejero a diversas dosis. También se incluyeron oligonudeótidos de referencia, ISIS 387916 e ISIS 388241, como comparación. Las células se cultivaron a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 39,0625 nM, 78,125 nM, 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM o 20.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de transcrito de ARNm de huntingtina mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores y sonda RTS2686. Los niveles de transcrito de ARNm de huntingtina se normalizaron respecto al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 83 como inhibición porcentual de huntingtina, en relación con las células de control no tratadas. En este ensayo se incluyó el oligonucleótido de control ISIS 141923 y no demostró inhibición de ARNm de huntingtina, como se esperaba.
ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 tenían valores de CI50 menores que el oligonucleótido de referencia, ISIS 388241. ISIS 437527 e ISIS 444652 tenían valores de CI 50 tan bajos como o menores que el oligonucleótido de referencia, ISIS 387916.
Tabla 83
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos
rimarios^ de mono can reero
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Ejemplo 19: Medición de la semivida de los oligonucleótidos ISIS en ratones BACHD por medio de la administración de un bolo único intraestriatal
A ratones BACHD se les administraron oligonucleótidos ISIS como un bolo único en el cuerpo estriado con el propósito de medir la duración de la acción de los oligonucleótidos antisentido contra la expresión de ARNm de huntingtina, o su semivida, en ese tejido.
Tratamiento y cirugía
Grupos de 25 ratones BACD se trataron cada uno con ISIS 388241, ISIS 436689, ISIS 436671 o ISIS 444591, administrados como un bolo único de 40 |jg en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 4. Un grupo de control de 25 ratones BACHD se trató con PBS en un procedimiento similar. En diversos puntos de tiempo se sacrificaron 5 ratones de cada grupo y se extrajo tejido del cuerpo estriado. Se colocó un par de pinzas curvas finas directamente en el cerebro, justo anterior al hipocampo, para hacer una incisión transversal en la corteza y los tejidos subyacentes mediante disección roma. Las puntas de otro par de pinzas curvas finas se colocaron directamente hacia abajo a lo largo del seno medio sagital a medio camino entre el hipocampo y el bulbo olfativo para hacer una incisión longitudinal, cortando el cuerpo calloso por disección roma. A continuación, se usó el primer par de pinzas para replegar la esquina resultante de la corteza exponiendo el cuerpo estriado y la cápsula interna y, a continuación, para diseccionar y extraer la cápsula interna del cuerpo estriado. El segundo juego de pinzas se colocó de modo que los extremos curvos estuvieran a ambos lados del cuerpo estriado y se presionaron hacia abajo para aislar el tejido. El primer juego de pinzas se usó para pinzar el extremo posterior del cuerpo estriado y extirpar el cuerpo estriado del cerebro.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de las secciones anterior y posterior del tejido del cuerpo estriado para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron usando RTS2617. Los niveles de ARNm de huntingtina normal de ratón se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda murino RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 84 y 85 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el promedio del grupo de control de PBS en la semana 1, la semana 10 y la semana 20. Se calculó la semivida de los oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro a partir de los datos de inhibición y se presenta en la Tabla 86.
Tabla 84
Inhibición porcentual de la e diversos puntos de tiempo
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Figure imgf000077_0003
Tabla 85
Inhibición porcentual d ersos puntos de tiempo
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Tabla 86
Semivida de oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro en ratones BACHD después de la in i n in r ri l n l
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Medición de peso corporal
Los pesos corporales se midieron a intervalos regulares, y se presentan en la Tabla 87 como porcentaje del peso de los ratones al comienzo del estudio. Estos pesos se utilizaron como indicador de la tolerabilidad. No hubo cambios adversos en el peso corporal en ninguno de los ratones tratados con oligonucleótidos ISIS.
Tabla 87
Cambio porcentual en el peso corporal de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
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Ejemplo 20: Efecto de la administración intratecal de ISIS 437527 en ratas Sprague Dawley
A ratas Sprague Dawley se les administró ISIS 437527 mediante administración intratecal (IT) como dosis única, como dosis repetidas o como perfusión continua.
Tratamiento y cirugía
Las ratas se anestesiaron con isoflurano y se colocó un catéter de poliuretano de calibre 28 en el espacio lumbar IT de cada rata. El extremo proximal del catéter se unió a un anclaje de administración que se extendía a través de la piel de los animales de los grupos que recibieron inyecciones en bolo. El catéter de los animales del grupo que recibió perfusión continua se conectó a una bomba ALZET (Modelo 2ML1) que se colocó en un receptáculo subcutáneo en la cara dorsal de cada animal. Después de la cirugía, los animales recibieron una dosis intramuscular única de ceftiofur sódico (5 mg/kg) y tartrato de butorfanol (0,05 mg/kg). Las ratas que recibieron perfusión continua comenzaron a recibir la dosis de oligonucleótidos de inmediato. A los animales que iban a recibir inyecciones en bolo se les dejó un período de recuperación quirúrgica de al menos cinco días, después del cual se evaluó la permeabilidad del catéter.
A un grupo de 5 ratas Sprague Dawley se les administró una única inyección en bolo de 350 |jg de ISIS 437527 por vía intratecal. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley recibió inyecciones en bolo de 120 jg de ISIS 437527 administradas por vía intratecal tres veces en el transcurso de 1 semana. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley recibió inyecciones en bolo de 350 jg de ISIS 437527 administradas por vía intratecal tres veces en el transcurso de 1 semana. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley recibió 50 jg/día de ISIS 437527 administrados por perfusión continua a un caudal de 0,01 ml/h durante 7 días. A un grupo de control de 5 ratas Sprague Dawley se le administraron inyecciones en bolo de PBS por vía intratecal tres veces en el transcurso de 1 semana. A cada grupo se le dio un período de recuperación de 7 días, después del cual las ratas fueron sacrificadas. Se extrajo y se analizó el cerebro y la médula espinal de todos los grupos.
Análisis de ARN de los niveles de expresión de huntingtina
Se extrajo ARN de la corteza frontal, la corteza temporal y la médula cervical para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda rHtt_LTS00343 normalizado respecto a los niveles de ciclofilina. Los resultados se presentan en la Tabla 88 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con el promedio de los valores de los grupos de control de PBS.
Tabla 88
Inhibición p r n l l x r i n ARNm ^ h nin in n r r gue Dawley
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Análisis de ARN de los niveles de expresión de AIF1
Se extrajo ARN de la corteza frontal, la corteza temporal y la médula cervical para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de AIF1. Los niveles de AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de cebadores y sonda de rata rAif1_LTS00219. Los resultados se calcularon como porcentaje de expresión de AIF1 respecto a la del control de PBS y se presentan en la Tabla 89. Los resultados indican que las administraciones repetidas de bolo IT dan lugar a inflamación en los tejidos de la médula cervical. La administración IT continua y las administraciones de bolo IT único fueron bien toleradas en las ratas.
Tabla 89
Porcentaje de expresión de los niveles de ARNm de AIF1 en ratas Sprague Dawley como medida de neurotoxicidad
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Ejemplo 21: Medición de la semivida de ISIS 436689 en los tejidos del SNC de monos cangrejeros por medio de administración intratecal
A monos cangrejeros se les administró ISIS 436689 por vía intratecal (IT) con el propósito de medir la semivida y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de ARNm de huntingtina en diversos tejidos del SNC.
Tratamiento
El estudio se realizó en Northern Biomedical Research, MI. Antes del inicio del tratamiento, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de 4 semanas, durante el cual se realizaron series estándar de pruebas de bioquímica y hematología sérica, análisis de muestras fecales para detectar huevos y parásitos y una prueba de tuberculosis, para cribar monos con anomalías o enfermos. A los monos se les implantaron catéteres lumbares intratecales utilizando catéteres de poliuretano conectados a una vía de titanio subcutánea (P.A.S. PORT® Elite de plástico/titanio con conector Ultra lock). Para la perfusión continua usando una bomba externa, se anestesió a los animales para fijar el aparato de administración a la vía. Los animales se pretrataron con sulfato de atropina mediante inyección subcutánea a una dosis de 0,04 mg/kg. Aproximadamente 15 minutos después, se administró una dosis intramuscular de 8 mg/kg de ketamina HCl para inducir la sedación. A los animales se les aplicó una mascarilla a un plano quirúrgico de anestesia, se les intubó y se les mantuvo con aproximadamente 1 l/min de oxígeno y 2 % de halotano o isoflurano. Se administró a los animales una dosis intramuscular única de 5 mg/kg de antibiótico ceftiofur sódico. Se hizo una incisión cerca de la vía para colocar el soporte para la aguja modificada. La aguja modificada se colocó en la vía y se fijó con puntos de sutura. Al recuperarse de la cirugía, al animal se le colocó una chaqueta.
A quince monos cangrejeros machos se les administró 4 mg/día de ISIS 436689 a una concentración de 1,67 mg/ml y un caudal de 2,4 ml/día durante 21 días. A un grupo de control de 3 monos cangrejeros se le administró PBS de forma similar durante el mismo período de tiempo. A los grupos de 3 monos cada uno se les dejó un período de recuperación de 1 día, 2 semanas, 4 semanas u 8 semanas, después de lo cual fueron sacrificados. Durante el período de estudio, se observó a los monos a diario para determinar signos de enfermedad o sufrimiento.
Todos los animales se sedaron con una inyección intramuscular de 8,0 mg/kg de ketamina HCl, se mantuvieron con una mezcla de halotano o isoflurano/oxígeno, y se les administró un bolo intravenoso de heparina sódica a 200 UI/kg. Se perfundió a los animales por medio del ventrículo cardíaco izquierdo con 0,001 % de nitrito de sodio en solución salina.
En el momento de sacrificarlos, el cerebro se cortó en una matriz cerebral con un grosor de corte frontal de 3 mm. Se tomaron muestras de varias estructuras cerebrales usando un punzón de biopsia de 4 mm. Se colocó una muestra de 4 mm de diámetro de cada estructura en tubos con cierre de rosca de 2 ml que contenían 1,0 ml de solución de estabilización de ARN RNAlater (Qiagen, CA), se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se congelaron. Se colocaron muestras contiguas de 6 mm de diámetro en tubos con cierre de rosca de 2 ml y se congelaron para el análisis farmacocinético.
La médula espinal se seccionó en secciones cervical, torácica y lumbar, y se tomaron secciones de aproximadamente 3 mm de grosor de cada área de la médula espinal para análisis de ARN y farmacocinética. Estas muestras se procesaron de forma similar a las muestras de cerebro.
Se extrajeron muestras de hígado para análisis de ARN y farmacocinética. Estas muestras se procesaron de forma similar a las de cerebro y médula espinal descritas anteriormente.
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de la médula espinal lumbar, la médula espinal torácica, la médula espinal cervical, la corteza frontal, la corteza occipital, la corteza cerebelosa, el tejido del núcleo caudado, el hipocampo, el mesencéfalo y la protuberancia para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina con el conjunto de cebadores y sonda RTS2617. Los resultados medidos en las diversas secciones de la médula espinal se presentan en la Tabla 90 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con lo medido en el grupo de control de PBS a las 8 semanas. Los resultados medidos en las diversas secciones del cerebro se presentan en la Tabla 91 y se expresan como inhibición porcentual en comparación con lo medido en el grupo de control de PBS a las 8 semanas.
Tabla 90
Efecto de ISIS 436689 administrado por vía IT sobre la expresión de ARNm de huntingtina en la médula
^
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Tabla 91
Efecto de ISIS 436689 administrado por vía IT sobre la expresión de ARNm de huntingtina en
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M e d ic ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e o lig o n u c le ó tid o s p o r E L IS A
Los tejidos (20 mg) se picaron, pesaron y homogeneizaron antes de la extracción líquido/líquido usando fenol/cloroformo. Se extrajo el sobrenadante, se liofilizó y se reconstituyó en plasma humano con EDTA (1 ml) antes de analizarlo usando un procedimiento de hibridación y ELISA.
ISIS 436689 se detectó en los tejidos mediante hibridación con una sonda de corte complementaria marcada (digoxigenina en el extremo 5' y un separador C18 y BioTEG en el extremo 3'). A continuación, se capturó el complejo en una placa recubierta con neutravidina y se añadió nucleasa S1 para digerir las sondas de corte no hibridadas. Como ISIS 436689 protegía la sonda de corte de la digestión, la sonda de corte no digerida se utilizó como medida de la concentración del oligonucleótido. La sonda de corte no digerida se detectó usando un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina, seguido de lectura del sustrato fluorogénico. Las concentraciones del oligonucleótido se midieron en las secciones cervical, torácica y lumbar de la médula espinal y en el hígado los días 7, 20, 34 y 62 del período de recuperación, y se presentan en la Tabla 92. Se calculó la semivida de ISIS 436689 en estos tejidos a partir de estos datos, y se presenta en la Tabla 93. Los datos indican que el oligonucleótido se concentró principalmente en el SNC con concentraciones insignificantes en los tejidos sistémicos.
Tabla 92
Concentraciones (^g/g de tejido) de ISIS 436689 administrado por vía IT sobre la expresión de ARNm de h nin in n iv r i n iv r n i m
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Tabla 93
Semivida de ISIS 436689 administrado por vía IT en la expresión de ARNm de huntingtina en diversos tejidos Órgano Semivid
édula cervi 4,0
dula toráci 15,1
édula lumb 18,7
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Hígado
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7,6
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos, dirigido a un ácido nucleico que codifica huntingtina y puede inhibir la expresión de huntingtina, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos;
en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3',
en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado, y
en el que los nucleósidos unidos comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 28.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido:
(a) comprende al menos 15 o al menos 18 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 28;
(b) comprende la SEQ ID NO: 28; o
(c) consiste en la SEQ ID NO: 28.
3. El oligonucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido consiste en:
(a) de 15 a 25 nucleósidos unidos;
(b) de 18 a 21 nucleósidos unidos; o
(c) 20 nucleótidos.
4. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido es al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % complementaria a la SEQ ID NO: 1.
5. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados, y opcionalmente en el que los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato.
6. El oligonucleótido de la reivindicación 5, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
7. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que:
(a) el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, por ejemplo, un azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH2-N(R)-O-2’, en el que R es, independientemente, H, alquilo C1-C12 o un grupo protector; o
(b) el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo; o
(c) el oligonucleótido comprende al menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano en el que un anillo de tetrahidropirano sustituye al anillo de furanosa, por ejemplo, el nucleósido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura:
Figure imgf000191_0001
en la que Bx es un resto de base heterocíclica opcionalmente protegido.
8. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada, opcionalmente en el que la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
9. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que el oligonucleótido comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar.
10. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el oligonucleótido comprende: un segmento de separación que consiste en ocho desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar.
11. El oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el oligonucleótido comprende: un segmento de separación que consiste en ocho desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5 'que consiste en seis nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3 'que consiste en seis nucleósidos unidos;
y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar.
12. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que el oligonucleótido está conjugado.
13. Una composición que comprende el oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
14. Un oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una composición de la reivindicación 13 para su uso en la prevención, tratamiento, mejora o ralentización de la progresión de la enfermedad de Huntington en un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del oligonucleótido o composición.
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