BR112012005448B1 - Oligonucleotídeo modificado de fita simples direcionado a um ácido nucleico que codifica huntingtina e capaz de inibir expressão de huntingtina, composição compreendendo o mesmo e seu uso para prevenir, tratar, melhorar, e reduzir a taxa de progressão da doença de huntington - Google Patents

Oligonucleotídeo modificado de fita simples direcionado a um ácido nucleico que codifica huntingtina e capaz de inibir expressão de huntingtina, composição compreendendo o mesmo e seu uso para prevenir, tratar, melhorar, e reduzir a taxa de progressão da doença de huntington Download PDF

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Abstract

composto, composição compreendendo o referido composto e usos do mesmo. providos aqui são métodos, compostos e composições para reduzir expressão de mrna huntingtina e proteína em um animal. tais métodos, compostos e composições são utéis para tratar, prevenir, retardar, ou melhorar doença de huntington, ou um sintoma do mesmo.

Description

Listagem de Sequência
[0001] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de sequência em formato eletrônico. A listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado BIOL0113WOSEQ.txt criado em 8 de setembro de 2010, que tem 456 Kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da listagem de sequência é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Campo da invenção
[0002] São fornecidos métodos, compostos e composições para a redução da expressão de mRNA de huntingtina e proteína em um animal. Tais métodos, compostos e composições são úteis, por exemplo, para tratar, evitar ou melhorar da doença de Huntington.
Fundamentos
[0003] A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa dominante autossômica devastadora causada pela expansão de trinucleotídeo de CAG que codifica um trato de poliglutamina anormalmente longo (PolyQ) na proteína de huntingtina. O gene da doença de Huntington foi primeiro mapeado em 1993 (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. Cell. 1993, 72:971-83), que consiste de um gene, IT15, que continha uma repetição de trinucleotídeo polimórfico que é expandido e instável em cromossomos HD. Embora o CAG repita na faixa de tamanho normal, é usualmente herdado como alelos Mendelian, as repetições de HD expandidas são instáveis através da transmissão meiótica e são observados serem expandidos além da faixa de tamanho normal (6 a 34 unidades de repetição) em pacientes com HD.
[0004] A proteína de huntingtina tanto normal quanto variante está localizada principalmente no citoplasma de neurônios (DiFiglia et al., Neuron 1995, 14:1075-81). Como um resultado de comprimento de poliglutamina excessivo, a proteína de huntingtina forma agregados no citoplasma e no núcleo de neurônios do SNC (Davies et al., Cell 1997, 90:537-548). Tanto animais transgênicos quanto linhas celulares geneticamente modificadas foram usados para investigar os efeitos de repetições de polyQ expandidas na localização e processamento de huntingtina. Entretanto, ainda é incerto se a formação de agregados por si é a etapa citotóxica essencial ou uma consequência da disfunção celular.
[0005] A HD é caracterizada por coréia progressiva, mudanças psiquiátricas e declínio intelectual. Este distúrbio dominante afeta homens e mulheres igualmente e ocorre em todas as raças (Gusella and MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol. 1995 5:656-62). Os sintomas de HD ocorrem devido à morte dos neurônios em muitas regiões cerebrais, mas é mais evidente no estriado, particularmente no núcleo caudado, que sofre um gradiente progressivo de perda celular que ultimamente dizima a estrutura total. Embora o gene que codifica huntingtina seja expressado ubiquamente (Strong, T.V. et al., Nat. Genet. 1995, 5:259-263), a perda celular seletiva e a astrocitose fibrilar são observadas no cérebro, particularmente no caudado e putâmen do estriado e no córtex cerebral de pacientes com HD (Vonsattel, J-P. et al., Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44:559-577) e, em uma extensão menor, no hipocampo (Spargo, E. et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56:487-491) e o subtálamo (Byers, R.K. et al., Neurology 1973, 23:561-569).
[0006] A Huntingtina é crucial para o desenvolvimento anormal e pode estar relacionada com um gene de sobrevivência celular (Nasir et al., Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431-1435). A função normal de huntingtina permanece incompletamente caracterizada, mas com base nas interações proteína-proteína, esta parece estar associada com o citoesqueleto e requerida para a neurogênese (Walling et al., J. Neurosci Res. 1998, 54:301-8). A huntingtina é especificamente clivada durante a apoptose por uma cistepina protease chave, apopaína, conhecida desempenhar um papel pivotal na morte celular apoptótica. A faixa de clivagem é intensificada por tratos de poliglutamina mais longos, sugerindo que a apoptose inapropriada subordina a HD.
[0007] A tecnologia anti-sentido está emergindo como um meio eficaz para reduzir a expressão de produtos genéticos específicos e pode, portanto, mostrar-se ser unicamente útil em diversas aplicações terapêuticas, diagnósticas e de pesquisa para a modulação da expressão de huntingtina. (Ver, Publicação de Patente U. S. N° 2008/0039418 e 2007/0299027)
[0008] Os compostos anti-sentido para a modulação da expressão de huntingtina são divulgados nos pedidos de patente publicados já mencionados. Entretanto, permanece uma necessidade quanto a tais compostos adicionais.
Sumário da Invenção
[0009] São fornecidos métodos, compostos e composições para modular a expressão de huntingtina e tratamento, prevenção, atraso ou melhora da doença de Huntington e/ou um sintoma desta.
Breve Descrição das Figuras Fig. 1:
[00010] A relação de PK/PD de expressão de mRNA de huntingtina no tecido intraestriatal com concentração de ISIS 387898 no cérebro de camundongo. Aos camundongos C57/BL6 foi administrado um bolo simples de 50 μg de ISIS 387898 e expressão de mRNA de huntingtina bm como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidos. O EC50 de ISIS 387898 também foi calculado. Fig. 2:
[00011] Comparação de expressão de mRNA de huntingtina no tecido estriatal e concentrações ISIS 387898 em vários pontos de tempo. Os camundongos C57/BL6 foram administrados em um bolo simples de 50 μg de ISIS 387898 e expressão de mRNA de huntingtina bem como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidos. A duração da ação (como medido por expressão de htt mRNA) de ISIS 387898 (linha tracejada) foi observada ser ainda mais longa após a concentração do oligonucleotídeo (linha sólida) no tecido. Fig. 3:
[00012] A relação PK/PD da expressão de mRNA de huntingtina no tecido do córtex anterior com concentração de ISIS 387898 no cérebro de camundongo. Aos camundongos BACHD foram administrados uma infusão intracerebroventricular de 75 μg de ISIS 387898 por 2 semanas e expressão de mRNA de huntingtina bem como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidos. O EC50 de ISIS 387898 também foi calculado. Fig. 4:
[00013] A comparação da expressão de mRNA de huntingtina no tecido do córtex anterior e concentrações de ISIS 387898 em vários pontos de tempo. Aos camundongos BACHD foi administrada infusão intracerebroventricular de 75 μg de ISIS 387898 por 2 semanas e expressão de mRNA de huntingtina bem como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidas. A duração da ação (como medido por expressão de htt mRNA) de ISIS 387898 (linha tracejada) foi observada ser ainda mais longa após a concentração do oligonucleotídeo (linha sólida) no tecido. Fig. 5:
[00014] Comparação da expressão de mRNA de huntingtina em tecido de córtex posterior e concentrações de ISIS 388241 em vários pontos de tempo. aos camundongos BACHD foi administrada a infusão intracerebroventricular de 50 μg de ISIS 388241 por 2 semanas e expressão de mRNA de huntingtina bem como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidas. A duração da ação (como medido por expressão de htt mRNA) de ISIS 388241 (linha tracejada) foi observada ser ainda mais longa após a concentração do oligonucleotídeo (linha sólida) no tecido. Fig. 6:
[00015] A comparação da expressão de mRNA de huntingtina no tecido de córtex posterior e concentrações ISIS 443139 em vários pontos de tempo. Aos camundongos BACHD foi administrada a infusão intracerebroventricular de 50 μg de ISIS 443139 por 2 semanas e expressão de mRNA de huntingtina bem como a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido no tecido foram medidas. A duração da ação (como medido por expressão de htt mRNA) de ISIS 443139 (linha tracejada) foi observada ser ainda mais longa após a concentração do oligonucleotídeo (linha sólida) no tecido. Fig. 7.
[00016] O efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido no desempenho motor de camundongos BACHD usando-se o ensaio Rotarod. Os camundongos BACHD oram tratados com 50 μg/dia de ICV de ISIS 388241 ou PBS por duas semanas. Os grupos de controle de ninhadas não transgênicas foram similarmente tratados com ISIS 388241 ou PBS. A aceleração do ensaio de Rotarod foi então realizada. Os animais foram colocados no Rotarod em uma velocidade de 2 RPM; o Rotarod acelerado a 40 RPM durante 5 minutos. A duração até cair foi registrada. Os valores de linha de base em 6 meses de idade foram tomados antes do tratamento e os pontos de tempo dados são a idade dos camundongos em que o ensaio foi conduzido. As baras representam a duração até cair em segundos pelos camundongos BACHD tratados com ISIS 388241 (preto) ou camundongos BACHD tratados com PBS (riscado) e por ninhadas não transgênicas tratados com PBS (branco). Camundongos tratados com ISIS 388241apresentaram duração aumentada à queda, portanto, desempenho motor melhorado no Rotarod, em comparação com o controle de PBS. Fig. 8.
[00017] O efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido no peso cerebral de camundongos R6/2. Camundongos R6/2 de seis meses de idade foram tratados com 50 μg/dia de ICV de ISIS 388817 ou ISIS 141923 de oligonucleotídeo de controle ou PBS por 4 semanas. Os grupos de controle de ninhadas não transgênicas foram similarmente tratados com ISIS 388817 ou PBS. Um grupo de controle de camundongos R6/2 pré-sintomáticos de oito semanas de idade foram incluídos no estudo e não receberam qualquer tratamento. As barras representam os pesos cerebrais de camundongos R6/2 não tratados de oito semanas de idade; os camundongos R6/2 tratados com ISIS 141923; os camundongos R6/2 tratados com PBS; camundongos R6/2 tratados com ISIS 388817; ninhadas não transgênicas tratados com PBS e ninhadas não transgênicas tratados com ISIS 388817. Houve um aumento no peso cerebral de camundongos R6/2 tratados com ISIS 388817 em comparação com o controle de PBS. Fig. 9
[00018] A caracterização comportamental de camundongos YAC128 tratados com oligonucleotídeo anti-sentido usando-se o ensaio Open Field. Camundongos YAC128 de cinco meses de idade foram tratados com 50 μg/dia de ICV de ISIS 388241 ou oligonucleotídeo de controle ISIS 141923 ou PBS por 14 dias. Um grupo de controle de FVB/NJ não transgênicos foram incluídos no estudo não dando qualquer tratamento. Os camundongos foram colocados em uma arena de campo aberto que usa photobeam breaks para a medição do movimento horizontal e vertical em uma seção de testes de 30 minutos. Os dados foram analisados usando-se o software de Monitor de Atividade para examinar o movimento ambulatorial completo dentro da arena e movimento dentro do centro da arena como uma medição de ansiedade. As barras representam tempo em segundos gastos no centro do campo por camundongos FVB/NJ, YAC128 tratados com PBS e camundongos YAC128 tratados com ISIS 388241. Os camundongos YAC128 tratados com ISIS 388241 gastam mais tempo no centro e foram, portanto, considerados menos propensos à ansiedade do que o controle de PBS. Fig. 10
[00019] A caracterização comportamental de camundongos YAC128 tratados com oligonucleotídeo anti-sentido usando-se o ensaio Elevated Plus Maze. Camundongos YAC128 de cinco meses de idade foram tratados com 50 μg/dia de ICV de ISIS 388241 ou oligonucleotídeo de controle ISIS 141923 ou com PBS por 14 dias. Um grupo de controle de ninhadas FVB/NJ não transgênicos foram incluídos como controle não tratado. Os camundongos foram colocados no centro de um mecanismo que consistia de dois braços abertos e dois braços fechados, cada um medindo 65 x 6,25 cm e elevado 50 cm acima do solo. A localização dos camundongos no mecanismo e quantidade de tempo gasto nos braços abertos foi registrado em uma sessão de teste de 5 minutos como uma medição de ansiedade. As barras representam a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos por controle de FVB/NJ, YAC128 tratados com PBS e camundongos YAC128 tratados com ISIS 388241. Os camundongos YAC128 tratados com ISIS 388241 gastaram mais tempo nos braços abertos e foram, portanto, considerados menos propenso a ansiedade do que o controle de PBS. Descrição Detalhada da Invenção
[00020] Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a descrição detalhada seguinte são exemplares e explicatórias e não são restritivas da invenção, como reivindicado. Aqui, o uso do singular inclui o plural a não ser que especificamente estabelecido de outra maneira. Como usado aqui, o uso de “ou” significa “e/ou” a não ser que estabelecido de outra maneira. Além disso, o uso do termo “incluindo” bem como outras formas, tais como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Também, os termos, tais como “elemento” ou “componente” abrange tanto elementos quanto componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade, a não ser que especificamente estabelecido de outra maneira.
[00021] A seção títulos usada aqui é para os propósitos organizacionais apenas e não devem ser construídos como limitante da material de assunto descrito. Todos os documentos ou porções dos documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não limitado a, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados aqui por referência às porções do documento debatidas aqui, bem como em sua totalidade. Definições
[00022] A não ser que definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada em conexão com e os procedimentos e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para a síntese química e para a análise química. Quando permitido, todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações, os números de Acessão GENBANK e informação de sequência associada através dos bancos de dados, tais como National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outros dados referidos por toda a divulgação são incorporados por referência às porções do documento debatido aqui, bem como em sua totalidade.
[00023] A não ser que indicado, os seguintes termos têm os seguintes significados:
[00024] “2’-O-metoxietila” (também 2’-MOE e 2’-O(CH2)2-OCH3) refere-se a uma modificação de O-metóxi-etila da posição 2’ de um anel de furosila. Um açúcar modificado por 2’-O-metoxietila é um açúcar modificado.
[00025] O “nucleotídeo de 2’-O-metoxietila” significa um nucleotídeo que compreende uma porção de açúcar modificada por 2’-O- metoxietila.
[00026] “5-metilcitosina” significa uma citosina modificada por um grupo metila ligado à posição 5’. Uma 5-metilcitosina é uma nucleobase modificada.
[00027] “Agente farmacêutico ativo” significa a substância ou substâncias em uma composição farmacêutica que fornece um benefício terapêutico quando administrado a um indivíduo. Por exemplo, em certas formas de realização um oligonucleotídeo anti- sentido alvejado a huntingtina é um agente farmacêutico ativo.
[00028] “Região alvo ativa” ou “região alvo” significa uma região à qual um ou mais compostos anti-sentido ativos são alvejados. Os “compostos anti-sentido ativos” significa compostos anti-sentido que reduzem os níveis de ácido nucleico ou níveis de proteína alvo.
[00029] “Administrado concomitantemente” refere-se à co- administração de dois agentes de qualquer maneira em que os efeitos farmacológicos de ambos são manifestados no paciente ao mesmo tempo. A administração concomitante não requer que ambos os agentes sejam administrados em uma composição farmacêutica simples, na mesma forma de dosagem ou pela mesma via de administração. Os efeitos de ambos os agentes não necessitam se manifestar por si só ao mesmo tempo. Os efeitos necessitam apenas estarem sobrepostos por um período de tempo e não necessita ser coextensivo.
[00030] “Administração” significa fornecer um agente farmacêutico a um indivíduo e inclui, mas não é limitado à administração por um profissional médico e auto-administração.
[00031] “Melhora” refere-se a uma diminuição de pelo menos um indicador, sinal ou sintomas de uma doença, distúrbio ou condição associados. A gravidade de indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[00032] “Animal” refere-se a um ser humano ou animal não humano, que inclui, mas não limita-se a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não humanos, que incluem, mas não limitam-se a, macacos e chimpanzés.
[00033] “Atividade anti-sentido” significa qualquer atividade detectável ou mensurável atribuível à hibridização de um composto anti-sentido a seu ácido nucleico alvo. Em certas formas de realização, a atividade anti-sentido é uma diminuição na quantidade ou expressão de um ácido nucleico alvo ou proteína codificada por tal ácido nucleico alvo.
[00034] “Composto anti-sentido” significa um composto oligomérico que é capaz de passar por hibridização a um ácido nucleico alvo através da ligação de hidrogênio.
[00035] “Inibição anti-sentido” significa a redução de níveis de ácido nucleico alvos ou níveis de proteína alvos na presença de um composto anti-sentido complementar a um ácido nucleico alvo em comparação com os níveis de ácido nucleico alvo ou níveis de proteína alvo na ausência do composto anti-sentido.
[00036] “Oligonucleotídeo anti-sentido” significa um oligonucleotídeo de filamento simples tendo uma sequência de nucleobase que permite a hibridização a uma região correspondente ou segmento de um ácido nucleico alvo.
[00037] “Açúcar bicíclico” significa um anel de furosila modificado pela ligação em ponte de dois átomos de anel não geminais. Um açúcar bicíclico é um açúcar modificado.
[00038] “Ácido nucleico bicíclico” ou “BNA” refere-se a um nucleosídeo ou nucleotídeo em que a porção de furanose do nucleosídeo ou nucleotídeo inclui uma ponte que conecta dois átomos de carbono no anel de furanose, desse modo, formando um sistema de anel bicíclico.
[00039] “Estrutura de cobertura” ou “porção de cobertura terminal” significa modificações químicas, que foram incorporadas em cada terminal de um composto anti-sentido.
[00040] “Região quimicamente distinta” refere-se a uma região de um composto anti-sentido que é, de alguma maneira, diferente daquela uma outra região do mesmo composto anti-sentido. Por exemplo, uma região tendo nucleotídeos de 2’-O-metoxietila é quimicamente diferente de uma região tendo nucleotídeos sem modificações de 2’-O-metoxietila.
[00041] “Composto anti-sentido quimérico” significa um composto anti-sentido que tenha pelo menos duas regiões quimicamente distintas.
[00042] “Co-administração” significa a administração de dois ou mais agentes farmacêuticos a um indivíduo. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem estar em uma composição farmacêutica simples ou pode estar em composições farmacêuticas separadas. Cada um dos dois ou mais agentes farmacêuticos podem ser administrados através da mesma via de administração ou diferente. A co- administração abrange a administração paralela ou sequencial.
[00043] “Complementaridade” significa a capacidade de formar pares entre nucleobases de um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico.
[00044] “Nucleobases contíguas” significa nucleobases imediatamente adjacentes uma à outra.
[00045] “Diluente” significa um ingrediente em uma composição que perde atividade farmacológica, mas que é farmaceuticamente necessária ou desejável. Por exemplo, o diluente em uma composição injetada pode ser uma solução líquida, por exemplo, salina.
[00046] “Dose” significa uma quantidade especificada de um agente farmacêutico fornecido em uma administração simples ou em um período de tempo especificado. Em certas formas e realização, a dose pode ser administrada em um, dois ou mais bolos, tabletes ou injeções. Por exemplo, em certas formas de realização, quando a administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado por uma injeção simples, portanto, duas ou mais injeções podem ser usadas para atingir a dose desejada. Em certas formas de realização, o agente farmacêutico é administrado por infusão em um período estendido de tempo ou de maneira contínua. As doses podem ser estabelecidas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês.
[00047] “Quantidade eficaz” significa a quantidade de agente farmacêutico ativo suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo em necessidade do agente. A quantidade eficaz pode variar entre os indivíduos dependendo da saúde e da condição física o indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, a formulação da composição, estimativa da condição médica dos indivíduos e outros fatores relevantes.
[00048] “Ácido nucleico de huntingtina” significa qualquer ácido nucleico que codifique huntingtina. Por exemplo, em certas formas de realização, um ácido nucleico de huntingtina inclui uma sequência de DNA que codifica huntingtina, uma sequência de RNA transcrita de DNA que codifica huntingtina (incluindo DNA genômico que compreende íntrons e éxons), e uma sequência de mRNA que codifica huntingtina. “mRNA de huntingtina” significa um mRNA que codifica uma proteína de huntingtina.
[00049] “Totalmente complementar” ou “100 % de complementaridade” significa cada nucleobase de uma sequência de nucleobase de um primeiro ácido nucleico tendo uma nucleobase complementar em uma segunda sequência de um segundo ácido nucleico. Em certas formas de realização, um primeiro ácido nucleico é um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo é um segundo ácido nucleico.
[00050] “Gapmero” significa um composto anti-sentido quimérico em que uma região interna tendo uma pluralidade de nucleosídeos que suporta a clivagem de RNase H está posicionada entre as regiões externas tendo um ou mais nucleosídeos, em que os nuclesídeos que compreendem a região interna são quimicamente diferentes do nucleosídeo ou nucleosídeos que compreendem as regiões externas. A região interna pode ser referida como um “segmento de folga” e as regiões externas podem ser referidas como “segmentos de asa”.
[00051] “Ampliado por folga” significa um composto anti-sentido quimérico tendo um segmento de folga de 12 ou mais 2’- desoxirribonucleosídeos contíguos posicionados entre e imediatamente adjacentes aos segmentos de asa 5’ e 3’ tendo de um a seis nucleosídeos.
[00052] “Hibridização” significa o recozimento de moléculas de ácido nucleico complementares. Em certas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico complementares incluem um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo.
[00053] “Imediatamente adjacente” significa não existir elementos de intervenção entre os elementos imediatamente adjacentes.
[00054] “Indivíduo” significa um ser humano ou animal não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[00055] “Ligação internucleosídeo” refere-se à ligação química entre os nucleosídeos.
[00056] “Nucleosídeos ligados” significa nucleosídeos adjacentes que são ligados juntos.
[00057] “Desacordo” ou “nucleobase não complementar” refere-se ao caso quando uma nucleobase de um primeiro ácido nucleico não é capaz de formar pares com o nucleobase correspondente de um segundo ácido nucleico ou alvo.
[00058] “Ligação internucleosídeo modificada” refere-se a uma substituição ou qualquer mudança de um internucleosídeo de ocorrência natural (isto é, uma ligação internucleosídeo de fosfodiéster).
[00059] “Nucleobase modificada” refere-se a qualquer outra nucleobase que não adenina, citosina, guanina, timidina ou uracila. Uma “nucleobase não modificada” significa as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U).
[00060] “Nucleotídeo modificado” significa um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada, ligação internucleosídeo modificada ou nucleobase modificada. Um “nucleosídeo modificado” significa um nucleosídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada ou nucleobase modificada.
[00061] “Oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
[00062] “Açúcar modificado” refere-se a uma substituição ou mudança de um açúcar natural.
[00063] “Motivo” significa um padrão de regiões quimicamente distintas em um composto anti-sentido.
[00064] “Ligação de internucleosídeo de ocorrência natural” significa uma ligação de fosfodiéster 3' a 5'.
[00065] “Porção de açúcar natural” significa um sugar encontrado em DNA (2’-H) ou RNA (2’-OH).
[00066] “Ácido nucleico” refere-se à moléculas compostas de nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui ácidos ribonucléicos (RNA), ácidos desoxirribonucléicos (DNA), ácidos nucléicos de filamento simples, ácidos nucléicos de filamento duplo, ácidos ribonucléicos de interferência pequena (siRNA) e microRNAs (miRNA). Um ácido nucleico também pode compreender uma combinação destes elementos em uma molécula simples.
[00067] “Nucleobase” significa uma porção heterocíclica capaz de formar pares com uma base de um outro ácido nucleico.
[00068] “Sequência de nucleobase” significa a ordem de nucleobases contíguas independentes de qualquer açúcar, ligação ou modificação de nucleobase.
[00069] “Nucleosídeo” significa uma nucleobase ligada a um açúcar.
[00070] “Nucleotídeo” significa um nucleosídeo tendo um grupo fosfato covalentemente ligado à porção açúcar do nucleosídeo.
[00071] “Composto oligomérico” ou “oligômero” significa um polímero de subunidades monoméricas ligadas que são capazes de hibridizar a pelo menos uma região de uma molécula de ácido nucleico.
[00072] “Oligonucleotídeo” significa um polímero de nucleosídeos ligados cada um dos quais pode ser modificado ou não modificado, independente um do outro.
[00073] A “administração parenteral” significa a administração através da injeção ou infusão. A administração parenteral inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intraarterial, administração intraperitoneal ou administração intracranial, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular. A administração pode ser contínua ou crônica ou curta ou intermitente.
[00074] “Peptídeo” significa uma molécula formada pela ligação de pelo menos dois aminoácidos pelas ligações de amida. Peptídeo refere-se a polipeptídeos e proteínas.
[00075] “Composição farmacêutica” significa uma mistura de substâncias adequadas para a administração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais agentes farmacêuticos ativo e uma solução aquosa estéril.
[00076] “Sais farmaceuticamente aceitáveis” significa sais fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis de compostos anti-sentido, isto é, sais que retém a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo precursor e não comunicam efeitos toxicológicos indesejados a estes.
[00077] “Ligação de fosforotioato” significa uma ligação entre nucleosídeos onde a ligação de fosfodiéster é modificada pela substituição de um dos átomos de oxigênio não ligados em ponte com um átomo de enxofre. Uma ligação de fosforotioato é uma ligação internucleosídeo modificada.
[00078] “Porção” significa um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) de um ácido nucleico. Em certas formas de realização, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um ácido nucleico alvo. Em certas formas de realização, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um composto anti-sentido.
[00079] “Evitar” refere-se a atrasar ou prevenção do início ou desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição por um período de tempo de minutos a indefinidamente. Evitar também significa reduzir o risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição.
[00080] “Pró-medicamento” significa um agente terapêutico que esteja preparado em uma forma inativa que é convertida a uma forma ativa dentro do corpo ou células deste pela ação de enzimas endógenas ou ouros produtos químicos ou condições.
[00081] “Efeitos colaterais” significa outras respostas fisiológicas atribuíveis a um tratamento que não os efeitos desejados. Em certas formas de realização, os efeitos colaterais incluem reações no local da injeção, anormalidades no teste de função hepática, anormalidades na função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades no sistema nervoso central, miopatias e mal-estar. Por exemplo, os níveis de aminotransferase aumentadas no soro podem indicar a toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade ou anormalidade da função hepática.
[00082] “Oligonucleotídeo de filamento simples” significa um oligonucleotídeo que não é hibridizado a um filamento complementar.
[00083] “Especificamente hibridizável” refere-se a um composto anti-sentido tendo um grau suficiente de complementaridade entre um oligonucleotídeo anti-sentido e um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado, enquanto inibe-se efeitos mínimos ou nenhum em ácidos nucléicos não alvos sob condições em que a ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo e tratamentos terapêuticos.
[00084] “Alvejamento” ou “alvejado” significa o processo de projeto e seleção de um composto anti-sentido que, especificamente hibridizará a um ácido nucleico alvo e induzirá um efeito desejado.
[00085] “Ácido nucleico alvo”, “RNA alvo” e “transcrição de RNA alvo” todos referem-se a um ácido nucleico capaz de ser alvejado por compostos anti-sentido.
[00086] “Segmento alvo” significa a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo à qual um composto anti-sentido é alvejado. “local alvo de 5’” refere-se ao nucleotídeo mais 5’ de um segmento alvo. “local alvo 3’” refere-se ao nucleotídeo mais 3’ de um segmento alvo.
[00087] “Quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de um agente farmacêutico que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.
[00088] “Tratar” refere-se à administração de uma composição farmacêutica para realizar uma alteração ou melhora de uma doença, distúrbio ou condição.
[00089] “Nucleotídeo não modificado” significa um nucleotídeo composto de nucleobases de ocorrência natural, porções de açúcar e ligações internucleosídeo. Em certas formas de realização, um nucleotídeo não modificado é um nucleotídeo de RNA (isto é, β-D- ribonucleosídeos) ou um nucleotídeo de DNA (isto é β-D- desoxirribonucleosídeo). Certas formas de realização
[00090] Certas formas de realização fornecem métodos, compostos e composições para inibir a expressão de huntingtina.
[00091] Certas formas de realização fornecem compostos anti- sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina. Em certas formas de realização, o ácido nucleico de huntingtina é qualquer uma das sequências apresentadas em GENBANK Accessão N° NM_002111.6 (incorporado aqui como SEQ ID N°: 1), GENBANK Accessão N° NT_006081.17 truncado a partir de nucleotídeos 462000 a 634000 (incorporado aqui como SEQ ID N°: 2), GENBANK Accessão N° NM_010414.1 (incorporado aqui como SEQ ID N°: 3), o complemento de GENBANK Accessão N° NW_001109716.1 truncado em nucleotídeos 698000 a 866000 (incorporado aqui como SEQ ID N°: 4), and GENBANK Accessão N° NM_024357.2 (incorporado aqui como SEQ ID N°: 5).
[00092] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. Em certas formas de realização, as sequências de nucleobase são aquelas relatadas nas SEQ ID N°: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33.
[00093] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14 ou pelo menos 15 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. Em certas formas de realização, as sequências de nucleobase são aquelas relatadas nas SEQ ID N°: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14 ou pelo menos 15 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33.
[00094] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 e 32. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 ou pelo menos 18 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 e 32. Em certas formas de realização, as sequências de nucleobase são aquelas relatadas nas SEQ ID N°: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 ou pelo menos 18 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33.
[00095] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases contínuas que são complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610¬4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931¬4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828, 4928-4947 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização a região é selecionada de 4384¬4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 e 5809-5828 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização a região é selecionada de 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 e 4955-4974. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado tem uma porção de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 porções de nucleobase contíguas que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00096] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases contínuas que são complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925¬ 4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 e 5809-5829 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado tem uma porção de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 15 porções de nucleobase contíguas que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00097] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases contínuas que são complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 e 4955¬4974. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado tem porções de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 15 de nucleobases contíguas que são complementares dentro de uma região descrita aqui.
[00098] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases contínuas que são complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925¬ 4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 e 5809-5829 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado tem porções de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 ou pelo menos 18 porções de nucleobase contíguas que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00099] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos ligados em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases contínuas que são complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 e 4955¬4974. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado tem porções de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 ou pelo menos 18 nucleobases contíguas que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[000100] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado consiste de um oligonucleotídeo modificado de filamento simples.
[000101] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado consiste de 20 nucleosídeos ligados.
[000102] Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é de pelo menos 90 % de complementaridade em seu comprimento total a uma sequência de nucleobase da SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 95 % de complementaridade em seu comprimento total a uma sequência de nucleobase da SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 99 % de complementaridade em seu comprimento total to SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é 100 % de complementaridade em seu comprimento total a uma sequência de nucleobase da SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5.
[000103] Em certas formas de realização, o composto tem pelo menos uma ligação internucleosídeo modificada. Em certas formas de realização, a ligação de internucleosídeo é uma ligação de internucleosídeo de fosforotioato.
[000104] Em certas formas de realização, o composto tem pelo menos um nucleosídeo que compreende um açúcar modificado. Em certas formas de realização, o pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico. Em certas formas de realização, o pelo menos um açúcar bicíclico compreende uma ponte de 4’-CH(CH3)-O-2’. Em certas formas de realização, o pelo menos um açúcar modificado compreende a 2’-O-metoxietila.
[000105] Em certas formas de realização, o composto compreende pelo menos um nucleosídeo modificado por tetraidropirano em que um anel de tetraidropirano substitui o anel de furanose. Em certas formas de realização, o pelo menos um nucleosídeo modificado por tetraidropirano tem a estrutura:
Figure img0001
[000106] em que Bx é uma porção de base heterocíclica opcionalmente protegida. Em certas formas de realização, o composto tem pelo menos um nucleosídeo que compreende uma nucleobase modificada. Em certas formas de realização, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.
[000107] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de folga que consiste de desoxinucleotídeos ligados; (ii) um segmento de asa 5’ que consiste de nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de asa 3’ que consiste de nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga está posicionado entre o segmento de asa 5’ e o segmento de asa 3’ e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[000108] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de folga que consiste de dez desoxinucleotídeos ligados; (ii) um segmento de asa 5’ que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de asa 3’ que consiste de cinco nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga está posicionado imediatamente adjacente a e entre o segmento de asa 5’ e o segmento de asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2’-O-metoxietila e em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação de fosforotioato.
[000109] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de folga que consiste de oito desoxinucleotídeos ligados; (ii) um segmento de asa 5’ que consiste de seis nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de asa 3’ que consiste de seis nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga está posicionado imediatamente adjacente a e entre o segmento de asa 5’ e o segmento de asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2’-O-metoxietila e em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação de fosforotioato.
[000110] Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de folga que consiste de oito desoxinucleotídeos ligados; (ii) um segmento de asa 5’ que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de asa 3’ que consiste de cinco nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga está posicionado imediatamente adjacente a e entre o segmento de asa 5’ e o segmento de asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2’-O-metoxietila e em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação de fosforotioato.
[000111] Certas formas de realização fornecem uma composição que compreende um composto como descrito aqui ou um sal destes e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Em certas formas de realização, a composição compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que compreende pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobase selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 e 32 ou um sal destas e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
[000112] Certas formas de realização fornecem uma composição que compreende um composto como descrito aqui ou um sal destes e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Em certas formas de realização, a composição compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que compreende pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobase selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33 ou um sal destas e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
[000113] Certas formas de realização fornecem métodos de tratar, prevenir ou melhorar da doença de Huntington.
[000114] Certas formas de realização fornecem métodos que compreendem administrar a um animal um composto como descrito aqui a um animal. Em certas formas de realização, o método compreende administrar a um animal um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobase selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 e 32.
[000115] Certas formas de realização fornecem métodos que compreendem administrar a um animal um composto como descrito aqui a um animal. Em certas formas de realização, o método compreende administrar a um animal um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobase selecionada dentre as sequências de nucleobase relatadas nas SEQ ID N°:12, 22, 28, 30, 32 e 33.
[000116] Em certas formas de realização, o animal é um ser humano.
[000117] Em certas formas de realização, a administração previne, trata, melhora ou diminui a progressão da doença de Huntington como descrito aqui.
[000118] Em certas formas de realização, o composto é co- administrado com um segundo agente.
[000119] Em certas formas de realização, o composto e o segundo agente são administrados de maneira concomitante.
[000120] Em certas formas de realização, a administração é a administração parenteral. Em certas formas de realização, a administração parenteral é a administração intracranial. Em certas formas de realização, a administração intracranial é a administração intratecal ou intracerebroventricular.
[000121] Certas formas de realização ainda fornecem um método para reduzir mRNA de huntingtina ou expressão de proteína em um animal que compreende administrar ao animal um composto ou composição como descrito aqui para reduzir mRNA de huntingtina ou expressão de proteína no animal. Em certas formas de realização, o animal é um ser humano. Em certas formas de realização, a redução do mRNA de huntingtina ou expressão de proteína previne, trata, melhora ou diminui a progressão da doença de Huntington.
[000122] Certas formas de realização fornecem um método para tratar um ser humano com doença de Huntington que compreende identificar o ser humano com a doença e administrar ao ser humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição como descrito aqui. Em certas formas de realização, o tratamento reduz um sintoma selecionado do grupo que consiste de agitação, perda de coordenação, movimentos iniciados não intencionais, movimentos incompletos não intencionais, passo inconstante, coréia, rigidez, movimentos de convulsão, postura anormal, instabilidade, expressões faciais anormais, dificuldade de mastigar, dificuldade de engolir, dificuldade de fala, ataque, distúrbios do sono, planejamento prejudicado, flexibilidade prejudicada, pensamento abstrato prejudicado, aquisição de regra prejudicada, início prejudicado de ações apropriadas, inibição prejudicada de ações inapropriadas, memória de curto prazo prejudicada, memória de longo prazo prejudicada, paranóia, desorientação, confusão, alucinação, demência, ansiedade, depressão, afeto enfraquecido, egocentrismos, agressão, comportamento compulsivo, irritabilidade, concepção suicida, massa cerebral reduzida, atrofia muscular, insuficiência cardíaca, tolerância à glicose prejudicada, perda de peso, osteoporose e atrofia testicular.
[000123] Ainda é fornecido um método para reduzir ou prevenir doença de Huntington que compreende administrar ao ser humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto ou composição como descrito aqui, desse modo reduzindo ou evitando a doença de Huntington.
[000124] Ainda é fornecido um método para melhorar um sintoma de doença de Huntington, que compreende administrar, a um ser humano em necessidade deste, um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente à SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5, desse modo, melhorando um sistema de doença de Huntington no ser humano.
[000125] Ainda é fornecido um método para reduzir a via de progressão de um sintoma associado com Doença de Huntington, que compreende administrar, a um ser humano em necessidade deste, um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente à SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5, desse modo reduzindo a taxa de progressão de um sintoma de doença de Huntington no ser humano.
[000126] Ainda é fornecido um método reverter a degeneração indicada por um sintoma associado com doença de Huntington, administrar a um ser humano em necessidade deste, um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente à SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 ou 5, desse modo revertendo a degeneração indicada por um sintoma de doença de Huntington no ser humano.
[000127] Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma físico, cognitivo, psiquiátrico ou periférico. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma físico selecionado do grupo que consiste de agitação, perda de coordenação, movimentos iniciados não intencionais, movimentos incompletos não intencionais, passo inconstante, coréia, rigidez, movimentos de convulsão, postura anormal, instabilidade, expressões faciais anormais, dificuldade de mastigar, dificuldade de engolir, dificuldade de fala, ataque e distúrbios do sono. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma cognitivo selecionado do grupo que consiste de planejamento prejudicado, flexibilidade prejudicada, pensamento abstrato prejudicado, aquisição de regra prejudicada, início prejudicado de ações apropriadas, inibição prejudicada de ações inapropriadas, memória de curto prazo prejudicada, memória de longo prazo prejudicada, paranóia, desorientação, confusão, alucinação e demência. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma psiquiátrico selecionado do grupo que consiste de ansiedade, depressão, afeto enfraquecido, egocentrismos, agressão, comportamento compulsivo, irritabilidade e concepção suicida. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma periférico selecionado do grupo que consiste de massa cerebral reduzida, atrofia muscular, insuficiência cardíaca, tolerância à glicose prejudicada, perda de peso, osteoporose e atrofia testicular.
[000128] Também são fornecidos métodos e compostos para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhora de doença de Huntington.
[000129] Certas formas de realização fornecem o uso de um composto como descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento, melhora ou prevenção de doença de Huntington.
[000130] Certas formas de realização fornecem um composto como descrito aqui para o uso no tratamento, prevenção ou melhora da doença de Huntington como descrito aqui pela terapia e combinação com um agente ou terapia adicionais como descrito aqui. Agentes ou terapias podem ser co-administrados ou administrados de maneira concomitante.
[000131] Certas formas de realização fornecem o uso de um composto como descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhora da doença de Huntington como descrito aqui pela terapia e combinação com um agente ou terapia adicionais como descrito aqui. Agentes ou terapias podem ser co- administrados ou administrados de maneira concomitante.
[000132] Certas formas de realização fornecem o uso de um composto como descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhora da doença de Huntington como descrito aqui em um paciente que é subsequentemente administrado um agente ou terapia adicionais como descrito aqui.
[000133] Certas formas de realização fornecem um kit para o tratamento, prevenção ou melhora da doença de Huntington como descrito aqui em que o kit compreende: (i) um composto como descrito aqui e, alternativamente (ii) um agente ou terapia adicionais como descrito aqui.
[000134] Um kit como descrito que ainda pode incluir instruções para o uso de um kit para tratar, evitar ou melhorar doença de Huntington como descrito aqui pela terapia e combinação como descrito aqui.
[000135] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35 ou 36, para o uso no tratamento de um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de modo que a expressão de huntingtina seja inibida. Em certas formas de realização, a doença ou condição é um distúrbio neurológico. Em certas formas de realização, a doença ou condição é Doença de Huntington. Em certas formas de realização, o animal é um ser humano.
[000136] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35 ou 36, para o uso em um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto para prevenir, tratar, melhorar ou diminuir a progressão de doença de Huntington.
[000137] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 ou 33, para o uso em um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de modo que a expressão de huntingtina seja inibida. Em certas formas de realização, a doença ou condição é um distúrbio neurológico. Em certas formas de realização, a doença ou condição é Doença de Huntington.
[000138] Em certas formas de realização, o animal é um ser humano.
[000139] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 ou 33, para o uso em um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto para prevenir, tratar, melhorar ou diminuir a progressão de doença de Huntington.
[000140] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados pelo menos 8, pelo menos a 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos a 20 porções de nucleobase contíguas complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814¬ 4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809¬ 5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608¬4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 e 4928-4947 da SEQ ID N°: 1, para o uso em um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de modo que a expressão de huntingtina seja inibida.
[000141] Certas formas de realização fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos a 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ou pelo menos a 20 porções de nucleobase contíguas complementares com a região selecionada dos nucleotídeos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622¬4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960¬4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066¬ 115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 e 4928-4947 da SEQ ID N°: 1, para o uso em um animal tendo uma doença ou condição associadas com huntingtina pela administração ao animal, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto para prevenir, tratar, melhorar ou diminuir a progressão de doença de Huntington.
Compostos Anti-Sentido
[000142] Os compostos oligoméricos, mas não limitados a, oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonucleotídeo, miméticos de oligonucleotídeo, compostos anti-sentido, oligonucleotídeos anti-sentido e siRNAs. Um composto oligomérico pode ser “antisentido” a um ácido nucleico alvo, significando que é capaz de sofrer hibridização a um ácido nucleico alvo através da ligação de hidrogênio.
[000143] Em certas formas de realização, um composto anti-sentido tem uma sequência de nucleobase que, quando escrita na direção 5’ a 3’, compreende o complemento reverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo ao qual este é alvejado. Em certas tais formas de realização, um oligonucleotídeo anti-sentido tem uma sequência de nucleobase que, quando escrita na direção 5’ a 3’, compreende o complemento reverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo ao qual este é alvejado.
[000144] Em certas formas de realização, um composto anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina é de 12 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em outras palavras, os compostos anti-sentido são de 12 a 30 nucleobases ligadas. Em outras formas de realização, o composto anti-sentido compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 ou 20 nucleobases ligadas. Em certas tais formas de realização, o composto anti-sentido compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleobases ligadas de comprimento ou uma faixa definida por qualquer um dos dois valores acima.
[000145] Em certas formas de realização, o composto anti-sentido compreende um oligonucleotídeo encurtado ou truncado modificado. O oligonucleotídeo encurtado ou truncado modificado pode ter um nucleosídeo simples anulado da extremidade 5’ (truncação 5’) ou alternativamente da extremidade 3’ (truncação 3’). Um oligonucleotídeo encurtado ou truncado pode ter dois nucleosídeos anulados da extremidade 5’ ou alternativamente pode ter duas subunidades selecionadas da extremidade 3’. Alternativamente, os nucleosídeos anulados podem ser dispersados por todo o oligonucleotídeo modificado, por exemplo, em um composto anti- sentido tendo um nucleosídeo anulado da extremidade 5’ e um nucleosídeo anulado da extremidade 3’.
[000146] Quando um nucleosídeo adicional simples está presente em um oligonucleotídeo alongado, o nucleosídeo adicional pode estar localizado na extremidade 5’ ou 3’ do oligonucleotídeo. Quando dois ou mais nucleosídeos adicionais estão presentes, os nucleosídeos adicionados podem ser adjacentes um ao outro, por exemplo, em um oligonucleotídeo tendo dois nucleosídeos adicionados à extremidade 5’ (adição de 5’) ou alternativamente à extremidade 3’ (adição 3’), do oligonucleotídeo. alternativamente, o nucleosídeo adicionado pode ser dispersado por todo o composto anti-sentido, por exemplo, em um oligonucleotídeo tendo um nucleosídeo adicionado à extremidade 5’ e uma subunidade adicionada à extremidade 3’.
[000147] É possível aumentar ou diminuir o comprimento de um composto anti-sentido, tal como um oligonucleotídeo anti-sentido e/ou introduz base mal combinadas sem eliminação da atividade. Por exemplo, em Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), uma série de oligonucleotídeos anti-sentido 13 a 25 nucleobases de comprimento foram testados quanto à sua capacidade de induzir a clivagem de um alvo RNA em um modelo de injeção de oócito. Os oligonucleotídeos anti-sentido de 25 nucleobases de comprimento com 8 ou 11 bases mal combinadas próximo das extremidades dos oligonucleotídeos anti-sentido foram capazes de direcionar a clivagem específica do mRNA alvo, ainda que uma extensão menor do que os oligonucleotídeos anti-sentido que não continham más combinações. Similarmente, a clivagem específica alvo foi atingida usando-se 13 oligonucleotídeos de nucleobase anti- sentido, incluindo aqueles com 1 ou 3 más combinações.
[000148] Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) demonstraram a capacidade de um oligonucleotídeo tendo 100 % de complementaridade ao bcl-2 mRNA e tendo 3 más combinações ao bcl-xL mRNA para reduzir a expressão tanto de bcl-2 quanto bcl-xL in vitro e in vivo. Além disso, este oligonucleotídeo demonstrou atividade anti-tumor potente in vivo.
[000149] Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) testaram uma série de 14 oligonucleotídeos de nucleobase anti- sentido tandem e oligonucleotídeos de nucleobase anti-sentido 28 e 42 compreendidos da sequência de dois ou três dos oligonucleotídeos anti-sentido tandem, respectivamente, para sua capacidade de impedir a tradução de DHFR humano em um ensaio de reticulócito de coelho. Cada um dos três oligonucleotídeos de nucleobase anti-sentido 14 sozinhos foram capazes de inibir, ainda que em um nível mais modesto do que os oligonucleotídeos de nucleobase anti-sentido 28 ou 42.
Motivos de Composto Anti-Sentido
[000150] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina têm subunidades quimicamente modificadas dispostas em padrões ou motivos, para conferir ao composto, propriedades anti-sentido, tais como a atividade inibidora intensificada, afinidade de ligação aumentada para um ácido nucleico alvo ou resistência à degradação pelas nucleases in vivo.
[000151] Os compostos anti-sentido quiméricos contém tipicamente pelo menos uma região modificada a fim de conferir resistência aumentada à degradação de nuclease, absorção celular aumentada, afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo e/ou atividade inibidora aumentada. Uma segunda região de um composto anti-sentido quimérico pode servir opcionalmente como um substrato para a endonuclease RNase H celular, que cliva o filamento de RNA de um duplex de RNA:DNA.
[000152] Os compostos anti-sentido tendo um motivo de gapmero são considerados compostos anti-sentido quiméricos. Em um gapmero uma região interna tendo uma pluralidade de nucleotídeos que suportam clivagem de RNaseH está posicionada entre as regiões externas tendo uma pluralidade de nucleotídeos que são quimicamente distintos dos nucleosídeos da região interna. No caso de um oligonucleotídeo anti-sentido tendo um motivo gapmero, o segmento de folga em geral, serve como o substrato para a clivagem de endonuclease, enquanto os segmentos de asa compreendem nucleosídeos modificados. Em certas formas de realização, as regiões de um gapmero são diferenciadas pelos tipos de porção de açúcar que compreendem cada região distinta. Os tipos de porção de açúcar que são usados para diferenciar as regiões de um gapmero podem, em algumas formas de realização incluir β-D-ribonucleosideos, β-D- desoxiribonucleosídeos, 2'-nucleosídeo modificados (tais 2’- nucleosídeo modificados podem incluir 2’-MOE e 2’-O-CH3, entre outros) e nucleosídeos de açúcar bicíclicos modificados (Tais nucleosídeos de açúcar bicíclicos podem incluir aqueles tendo uma ponte de 4’-(CH2)n-O-2’, onde n = 1 ou n = 2). Preferivelmente, cada região distinta compreende porções de açúcar uniformes. O motivo asa-folga-asa é frequentemente descrito como “X-Y-Z”, onde “X” representa o comprimento da região de asa 5’, “Y” representa o comprimento da região de folga e “Z” representa o comprimento da região de asa 3’. Como usado aqui, um gapmero descrito como “X-Y- Z” tem uma configuração tal que o segmento de folga esteja posicionado imediatamente adjacente cada um do segmento de asa 5’ e do segmento de asa 3’. Desta maneira, nenhum nucleotídeo de intervenção existe entre o segmento de asa 5’ e o segmento de folga ou o segmento de folga e o segmento de asa 3’. Qualquer um dos compostos anti-sentido descritos aqui pode ter um motivo de gapmero. Em algumas formas de realização, X e Z são os mesmos, em outras formas de realização estes são diferentes. Em uma forma de realização, Y está entre 8 e 15 nucleotídeos. X, Y ou Z podem ser qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Desta maneira, os gapmeros incluem, mas não limitam-se a, por exemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12 a 3, 4¬12 a 4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6¬8-6 ou 5-8-5.
[000153] Em certas formas de realização, o composto anti-sentido como um motivo “wingmer”, tendo uma configuração de asa-folga ou folga-asa, isto é, uma configuração X-Y ou Y-Z como descrito acima para a configuração de gapmero. Desta maneira, as configurações de wingmer incluem, mas não limitam-se a, por exemplo, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 ou 5-13.
[000154] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina possui um motivo de gapmero 5-10-5.
[000155] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina possui um motivo de gapmero 6-8-6.
[000156] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina possui um motivo de gapmero 5-8-5.
[000157] Em certas formas de realização, um composto anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina tem um motivo ampliado de folga.
[000158] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo ampliado de folga anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina tem um segmento de folga de dez 2’- desoxirribonucleotídeos posicionados imediatamente adjacentes a e entre os segmentos de asa de cinco nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas formas de realização, a modificação química compreende uma modificação de 2’-açúcar. Em uma outra forma de realização, a modificação química compreende uma modificação de açúcar 2’-MOE.
[000159] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo ampliado de folga anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina tem um segmento de folga de oito 2’- desoxirribonucleotídeos posicionados imediatamente adjacentes a e entre os segmentos de asa de cinco nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas formas de realização, a modificação química compreende uma modificação de 2’-açúcar. Em uma outra forma de realização, a modificação química compreende uma modificação de açúcar 2’-MOE.
[000160] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo ampliado de folga anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina tem um segmento de folga de oito 2’- desoxirribonucleotídeos posicionados imediatamente adjacentes a e entre os segmentos de asa de seis nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas formas de realização, a modificação química compreende uma modificação de 2’-açúcar. Em uma outra forma de realização, a modificação química compreende a modificação de açúcar 2’-MOE.
[000161] Ácidos nucléicos alvos, Regiões alvo e sequências de nucleotídeo
[000162] As sequências de nucleotídeo que codificam huntingtina incluem, sem limitação, o seguinte: GENBANK Accessão N° NM_002111.6, primeiro depositado com GENBANK® em 31 de maio de 2006 incorporado aqui como SEQ ID N°: 1; GENBANK Accessão N° NT_006081.17 truncado a partir de nucleotídeos 462000 a 634000, primeiro depositado com GENBANK® em 19 de agosto de 2004 e incorporado aqui como SEQ ID N°: 2; GENBANK Accessão N° NM_010414.1, primeiro depositado com GENBANK® em 23 de março de 2004, incorporado aqui como SEQ ID N°: 3; o complemento de GENBANK Accessão N° NW_001109716.1 truncado em nucleotídeos 698000 a 866000, primeiro depositado com GENBANK® em 14 de junho de 2006, incorporado aqui como SEQ ID N°: 4 e GENBANK Accessão N° NM_024357.2, primeiro depositado com GENBANK® em 5 de junho de 2008, incorporado aqui como SEQ ID N°: 5.
[000163] É entendido que a sequência apresentada em cada SEQ ID N°: nos exemplos contidos aqui é independente de qualquer modificação a uma porção de açúcar, uma ligação de internucleosídeo ou uma nucleobase. Como tal, os compostos anti-sentido definidos por uma SEQ ID N°: podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações a uma porção de açúcar, uma ligação de internucleosídeo ou uma nucleobase. Os compostos anti-sentido descritos por Isis Number (Isis N°) indica uma combinação de sequência de nucleobase e motivo.
[000164] Em certas formas de realização, a região alvo é uma região estruturalmente definida do ácido nucleico alvo. Por exemplo, a região alvo pode abranger a 3’ UTR, a 5’ UTR, um éxon, um íntron, uma junção de éxon/íntron, uma região codificadora, uma região de início de tradução, uma região de término de tradução ou outra região de ácido nucleico definida. As regiões estruturalmente definidas para huntingtina podem ser obtidas pelo número de acessão dos bancos de dados de sequência, tais como NCBI e tal informação é incorporada aqui por referência. Em certas formas de realização, a região alvo pode abranger a sequência de um local alvo 5’ de um segmento de alvo dentro da região alvo a um local alvo 3’ de um outro segmento alvo dentro da região alvo.
[000165] O alvejamento inclui a determinação de pelo menos um segmento alvo ao qual um composto anti-sentido hibridiza-se, tal que um efeito desejado ocorre. Em certas formas de realização, o efeito desejado é uma redução nos níveis de ácido nucleico alvo de mRNA. Em certas formas de realização, o efeito desejado é a redução dos níveis de proteína codificados pelo ácido nucleico alvo ou uma mudança fenotípica associada com o ácido nucleico alvo.
[000166] A região alvo pode conter um ou mais segmentos alvo. Os segmentos alvo múltiplos dentro de uma região alvo podem ser de sobreposição. Alternativamente, estes podem ser de não sobreposição. Em certas formas de realização, os segmentos alvo dentro de uma região alvo são separados por não mais do que cerca de 300 nucleotídeos. Em certas formas de realização, os segmentos alvo dentro da região alvo são separados por diversos nucleotídeos isto é, é de cerca de, é não mais do que, é não mais do que cerca de, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nucleotídeos no ácido nucleico alvo ou está em uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes. Em certas formas de realização, os segmentos alvo dentro da região alvo são separados por não mais do que ou não mais do que cerca de, 5 nucleotídeos no ácido nucleico alvo. Em certas formas de realização, os segmentos alvo são contíguos. São consideradas regiões alvo definidas por uma faixa tendo um ácido nucleico de partida que é qualquer um dos locais alvo 5’ ou locais alvo 3’ listados aqui.
[000167] Os segmentos alvo adequados podem ser encontrados dentro de um 5’ UTR, uma região codificadora, um 3’ UTR, um íntron, um éxon ou uma junção de éxon/íntron. Os segmentos alvo contendo um códon de partida ou um códon de interrupção também são segmentos alvo adequados. Um segmento alvo adequado pode excluir especificamente uma certa região estruturalmente definida, tal como o códon de partida ou códon de interrupção.
[000168] A determinação de segmentos alvo adequados podem incluir uma comparação da sequência de um ácido nucleico alvo a outras sequências por todo o genoma. Por exemplo, o algoritmo BLAST pode ser usado para identificar regiões de similaridade entre os ácidos nucléicos diferentes. Esta comparação pode evitar a seleção de sequências de composto anti-sentido que podem se hibridizar de uma maneira não específica a outras sequências que não um ácido nucleico selecionado (isto é, sequências não alvo ou fora do alvo).
[000169] Pode haver variação na atividade (por exemplo, como definido pela redução percentual de níveis de ácido nucleico alvo) dos compostos anti-sentido dentro de uma região alvo ativa. Em certas formas de realização, as reduções em níveis de mRNA de huntingtina são indicativos de inibição da expressão de huntingtina. As reduções nos níveis de proteína de huntingtina também são indicativo de inibição da expressão de mRNA alvo. Além disso, as mudanças fenotípicas são indicativo de inibição da expressão de expressão de huntingtina. Por exemplo, um aumento no tamanho cerebral para normal, melhora na coordenação motora, diminuição nos espasmos musculares contínuos (distonia), diminuição na irritabilidade e/ou ansiedade, melhora da memória ou um aumento na energia, entre outras mudanças fenotípicas que podem ser submetidas a ensaio. Outras indicações fenotípicas, por exemplo, sintomas associados com a doença de Huntington, também podem ser estimados como descrito abaixo.
Hibridização
[000170] Em algumas formas de realização, a hibridização ocorre entre um composto anti-sentido divulgado aqui e um ácido nucleico de huntingtina. O mecanismo mais comum de hibridização envolve a ligação de hidrogênio (por exemplo, Watson-Crick, Hoogsteen ou ligação de hidrogênio de Hoogsteen reversa) entre as nucleobases complementares das moléculas de ácido nucleico.
[000171] A hibridização pode ocorrer sob condições variantes. As condições estringentes são dependentes de sequência e são determinadas por natureza e composição das moléculas de ácido nucleico a serem hibridizadas.
[000172] Os métodos de determinar se uma sequência é especificamente hibridizável a um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na técnica. Em certas formas de realização, os compostos anti-sentidos fornecidos aqui são especificamente hibridizáveis com um ácido nucleico de huntingtina.
Complementaridade
[000173] Um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo são complementaridade um ao outro quando um número suficiente de nucleobases do composto anti-sentido podem ligar o hidrogênio com as nucleobases correspondentes do ácido nucleico alvo, tal que um efeito desejado ocorrerá (por exemplo, inibição anti-sentido de um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de huntingtina).
[000174] Um composto anti-sentido pode hibridizar-se em um ou mais segmentos de um ácido nucleico de huntingtina tal que os segmentos de intervenção ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de arco, estrutura em desacordo ou grampo de cabelo).
[000175] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido fornecidos ou uma porção especificada destes, são ou são pelo menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de complementaridade a um ácido nucleico de huntingtina, um região alvo, segmento alvo ou sua porção especificada. A complementaridade percentual de um composto anti-sentido com um ácido nucleico alvo pode ser determinada usando-se métodos de rotina.
[000176] Por exemplo, um composto anti-sentido em que 18 de 20 nucleobases do composto anti-sentido são complementaridade a uma região alvo e deve, portanto, hibridizar especificamente, deve representar 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, as nucleobases de não complementaridade remanescentes podem ser agrupadas ou intercaladas com nucleobases complementares e não necessitam ser contíguas uma à outra ou a nucleobases complementares. Como tal, um composto anti-sentido que é de 18 nucleobases de comprimento tendo 4 (quatro) nucleobases não complementares que são flanqueadas por duas de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo deve ter 77,8 % de complementaridade total com o ácido nucleico alvo e, desta maneira, deve estar dentro do escopo da presente invenção. A complementaridade percentual de um composto anti-sentido com uma região de ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente usando-se programas BLAST (ferramentas de pesquisa d alinhamento local) e programas PowerBLAST conhecido na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). A homologia percentual, identidade de sequência ou complementaridade, podem ser determinadas, por exemplo, pelo programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando-se ajustes default, que usa o algoritmo de Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[000177] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido fornecidos aqui ou suas porções especificadas, são totalmente complementares (isto é, 100 % de complementaridade) a um ácido nucleico alvo ou sua porção especificada. Por exemplo, o composto anti-sentido pode ser totalmente complementar a um ácido nucleico de huntingtina ou uma região alvo ou um segmento alvo ou sequência alvo destes. Como usado aqui, “totalmente complementar” significa que cada nucleobase de um composto anti-sentido é capaz de precisar a formação de pares de base com as nucleobases correspondentes de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, 20 compostos anti-sentido de nucleobase é totalmente complementar a uma sequência alvo que é de 400 nucleobases de comprimento, tão longa quanto é uma porção de 20 nucleobases correspondentes do ácido nucleico alvo que é totalmente complementar ao composto anti- sentido. Totalmente complementar também pode ser usado em referência a uma porção especificada do primeiro e/ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma porção de 20 nucleobases de um composto anti-sentido de 30 nucleobases pode ser “totalmente complementar” a uma sequência alvo que é de 400 nucleobases de comprimento. A porção de 20 nucleobases do oligonucleotídeo 30 nucleobases é totalmente complementar à sequência alvo se a sequência alvo tiver uma porção de 20 nucleobases correspondentes em que cada nucleobase é complementar à porção de 20 nucleobases do composto anti-sentido. Ao mesmo tempo, o composto anti-sentido de 30 nucleobases inteiro pode ou pode não ser totalmente complementar à sequência alvo, dependendo de como as 10 nucleobases remanescentes do composto anti-sentido também são complementares à sequência alvo.
[000178] O local de uma nucleobase não complementar pode estar na extremidade 5’ ou extremidade 3’ do composto anti-sentido. Alternativamente, a nucleobase ou nucleobases não complementares podem estar em uma posição interna do composto anti-sentido. Quando duas ou mais nucleobases não complementares estão presentes, estes podem ser contíguos (isto é, ligados) ou não contíguos. Em uma forma de realização, uma nucleobase não complementar está localizada no segmento de asa de oligonucleotídeo de gapmero anti-sentido.
[000179] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido que são de ou que não e até 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 nucleobase(s) não complementar(es) com relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de huntingtina ou porção especificada destes.
[000180] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido que são de ou que são de até 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 nucleobase(s) não complementar(es) com relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de huntingtina ou sua porção especificada.
[000181] Os compostos anti-sentido fornecidos aqui também incluem aqueles que são complementares a uma porção de um ácido nucleico alvo. Como usado aqui, “porção” refere-se a um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) nucleobases dentro de uma região ou segmento de um ácido nucleico alvo. Uma “porção” também pode referir-se a um número definido de nucleobases contíguas de um composto anti-sentido. Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido, são complementares a pelo menos uma porção de 8 nucleobases de um segmento alvo. Em certas formas de realização, o composto anti-sentidos são complementares a pelo menos 12 porções de nucleobase de um segmento alvo. Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido são complementares a pelo menos 15 porções de nucleobase de um segmento alvo. Também são considerados compostos anti-sentido que são complementares a pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais porções de nucleobase de um segmento alvo ou uma faixa definida por quaisquer dois destes valores.
Identidade
[000182] Os compostos anti-sentido fornecidos aqui também pode ter uma identidade percentual definida a uma sequência de nucleotídeo particular, SEQ ID N°: ou composto representado por um número Isis específico ou porção deste. Como usado aqui, um composto anti-sentido é idêntica à sequência divulgada neste se este tiver a mesma capacidade de formação de pares de nucleobase. Por exemplo, um RNA que contenha uracila no lugar de timidina em uma sequência de DNA divulgada deve ser considerado idêntico à sequência de DNA visto que tanto uracila quanto timidina forma par com a adenina. Versões encurtadas ou alongadas dos compostos anti- sentido descritas aqui, bem como compostos tendo bases não idênticas relativas aos compostos anti-sentido fornecidos aqui são considerados. As bases não idênticas podem ser adjacentes umas às outras ou dispersadas por todo o composto anti-sentido. A identidade percentual de um composto anti-sentido é calculada de acordo com um número de bases que têm formação de par de base idêntica com relação à sequência à qual esta está sendo comparada.
[000183] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido ou suas porções, são pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênticas a um ou mais do composto anti-sentidos ou SEQ ID N° ou uma porção destes, divulgado aqui.
Modificações
[000184] Um nucleosídeo é uma combinação de açúcar de base. A porção de nucleobase (também conhecida como base) do nucleotídeo é normalmente uma porção de base heterocíclica. Os nucleotídeos são nucleosídeos que ainda incluem um grupo de fosfato covalentemente ligado à porção açúcar do nucleosídeo. Para aqueles nucleosídeos que incluem um açúcar de pentofuranosila, o grupo fosfato pode estar ligado à porção hidroxila 2', 3' ou 5' do açúcar. Os oligonucleotídeos são formados através da ligação covalente de nucleosídeos adjacentes um ao outro, para formar um oligonucleotídeo polimérico linear. Dentro da estrutura de oligonucleotídeo, os grupos fosfato são comumente referidos como formação de uma ligação de internucleosídeos do oligonucleotídeo.
[000185] As modificações aos compostos anti-sentido abrangem substituições ou mudanças às ligações de internucleosídeo, porções de açúcar ou nucleobases. Os compostos anti-sentido modificados são frequentemente preferidos nas formas naturais por causa das propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, absorção celular intensificada, afinidade intensificada para ácido nucleico alvo, estabilidade aumentada na presença de nucleases ou atividade inibidora aumentada.
[000186] Os nucleosídeos quimicamente modificados também podem ser utilizados para aumentar a afinidade de ligação de um oligonucleotídeo encurtado ou truncado anti-sentido para seu ácido nucleico alvo. Consequentemente, os resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com compostos anti-sentido mais curtos que têm tais nucleosídeos quimicamente modificados.
Ligações de internucleosídeo modificadas
[000187] A ligação de internucleosídeo de ocorrência natural de RNA e DNA é uma ligação de fosfodiéster de 3' a 5'. Os compostos anti- sentido tendo uma ou mais ligações de internucleosídeo de ocorrência modificada, isto é, não natural são frequentemente selecionadas em compostos anti-sentido tendo ligações de internucleosídeo de ocorrência natural por causa das propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, absorção celular intensificada, afinidade intensificada para ácidos nucléicos alvos e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[000188] Os oligonucleotídeos tendo ligações internucleosídeo modificadas incluem ligações internucleosídeo que retém um átomo de fósforo, bem como as ligações de internucleosídeo que não têm um átomo de fósforo. O fósforo representativo contendo ligações de internucleosídeo incluem, mas não limitam-se a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato e fosforotioatos. Os métodos de preparação de ligações contendo fósforo e não contendo fósforo também são conhecidos.
[000189] Em certas formas de realização, os compostos anti-sentido alvejados a um ácido nucleico de huntingtina compreendem uma ou mais ligações internucleosídeo modificadas. Em certas formas de realização, as ligações de internucleosídeo modificadas são ligações de fosforotioato. Em certas formas de realização, cada ligação internucleosídeo de um composto anti-sentido é uma ligação de internucleosídeo de fosforotioato.
Porções de açúcar modificado
[000190] Os compostos anti-sentido podem opcionalmente conter um ou mais nucleosídeos em que o grupo de açúcar foi modificado. Tal nucleosídeo de açúcar modificado pode conceder estabilidade de nuclease intensificada, afinidade de ligação aumentada ou alguma outra propriedade biológica benéfica aos compostos anti-sentido. Em certas formas de realização, nucleosídeos compreendem porções de anéis de ribofuranose quimicamente modificadas. Exemplos de anéis de ribofuranose quimicamente modificados incluem sem limitação, adição de grupos substituintes (incluindo grupos substituintes de 5' e 2', formando pontes de átomos de anéis não-geminal para formar os ácidos nucléicos bicíclicos (BNA), substituição do átomo de oxigênio do anel de ribosila com S, N(R) ou C(R1)(R)2 (R = H, alquila C1-C12 ou um grupo de proteção) e combinações destes. Exemplos de açúcares quimicamente modificados incluem nucleosídeo substituído por 2'-F-5'-metil (ver Pedido Internacional PCT WO 2008/101157 publicado em 8/21/08 por outros nucleosídeos substituídos por 5',2'-bis divulgado) ou substituição do átomo de oxigênio de anel de ribosila com S com a substituição adicional na posição 2' (ver Pedido de Patente U.S. publicada US2005-0130923, publicado em 16 de Junho de 2005) ou alternativamente 5'-substituição de um BNA (ver Pedido Internacional PCT WO 2007/134181 Publicado em 11/22/07 em que LNA é substituído com por exemplo um grupo de 5'-metila ou um grupo 5'-vinila).
[000191] Exemplos de nucleosídeos tendo porções de açúcar modificado incluem sem limitações nucleosídeos que compreende grupos substituintes 5'-vinila, 5'-metila (R ou S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 e 2'-O(CH2)2OCH3. O substituinte na posição 2’ também pode ser selecionado de alila, amino, azido, tio, O-alila, alquila O-C1-C10, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) e O-CH2-C(=O)- N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H alquila C1¬C10 substituída ou não substituída.
[000192] Exemplos dos ácidos nucléicos bicíclicos (BNAs) incluem sem limitações nucleosídeos que compreendem uma ponte entre o átomos de anel de ribosila 4' e o 2'. Em certas formas de realização, compostos anti-sentido fornecidos neste incluem um ou mais nucleosídeos BNA em que a ponte compreende uma das fórmulas: 4'- (CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-C(CH3)2-O-2’ (ver PCT/US2008/068922); 4’-CH(CH3)--O-2’ e 4’-C-H(CH2OCH3)--O-2‘ (ver Patente U.S. 7.399.845, depositado em 15 de Julho de 2008); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (ver PCT/US2008/ 064591); 4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (ver Pedido de Patente U.S. publicado US2004-0171570, 2 de Setembro de 2004 publicado); 4’-CH2-N(R)-O- 2’ (ver Patente U.S. 7.427.672, depositado em 23 de Setembro de 2008); 4’-CH2-C(CH3)-2’ e 4’-CH2-C-(=CH2)-2’ (ver PCT/US2008/ 066154) e em que R é, independentemente, H, alquila C1-C12 ou um grupo de proteção. Cada um dos BNAs precedentes incluem várias configurações de açúcar estereoquímico incluindo, por exemplo, α-L- ribofuranose e β-D-ribofuranose (ver Pedido Internacional PCT PCT/DK98/00393, publicado em 25 de Março de 1999 como WO 99/14226).
[000193] Em certas formas de realização, os nucleosídeos são modificados pela substituição do anel de ribosila com um substituto de açúcar. Tal modificação inclui sem limitação, substituição do anel de ribosila com um sistema de anel substituto (algumas vezes referido como análogos de DNA) tal como um anel de morfolino, um anel de cicloexenila, um anel de cicloexila ou um anel de tetraidropiranila tal como um tendo um da fórmula:
Figure img0002
[000194] Muitos outros substitutos do sistema de anel de açúcar biciclo e triciclo também são conhecidos na técnica que podem ser usados para modificar os nucleosídeos para a incorporação nos compostos anti-sentido (ver, por exemplo, artigo de resumo: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Tais sistemas de anéis podem sofrer várias substituições adicionais para intensificar a atividade.
[000195] Métodos para as preparações dos açúcares modificados são bem conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica.
[000196] Nos nucleotídeos tendo porções de açúcar modificado, as porções de nucleobase (natural, modificado ou uma combinação deste) são mantidos para a hibridização com um alvo de ácido nucleico apropriado.
[000197] Em certas formas de realização, compostos anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina compreende um ou mais nucleotídeos tendo as porções de açúcar modificado. Em certas formas de realização, a porção de açúcar modificado é 2’-MOE. Em certas formas de realização, os nucleotídeos modificados 2’-MOE estão dispostos em um motivo gapmero.
Nucleobase modificada
[000198] As modificações ou substituições de nucleobase (ou base) são estruturalmente distinguíveis de, já funcionalmente permutável com, nucleobase sintética modificada ou de ocorrência natural. O nucleobase tanto natural quanto modificado são capazes de participar na ligação de hidrogênio. Tais modificações de nucleobase pode conceder a estabilidade de nuclease, afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica aos compostos anti-sentido. O nucleobase modificado inclui nucleobases sintéticos ou naturais tal como, por exemplo, 5-metilcitocina (5-me-C). Certas substituições de nucleobase, incluindo substituições de 5-metilcitocina, são particularmente úteis para o aumento da afinidade de ligação de um composto anti-sentido por um ácido nucleico alvo. Por exemplo, substituições de 5-metilcitocina foram mostradas para aumentar a estabilidade do duplexo do ácido nucleico por 0,6 a 1,2° C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[000199] O nucleobase não modificado adicional inclui 5-hidroximetil citocina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitocina, 5-halouracil e citocina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracil e citocina e outros derivados de alquinila das bases de pirimidina, 6-azo uracil, citocina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquil, 8-hidroxil e outras 8-adeninas substituídas e guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras 5-uracilas substituídas e citocinas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7- deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina.
[000200] As porções de base heterocíclica também podem incluir em que a base de purina ou pirimidina é substituída com outros heterociclos, por exemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2- aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases que são particularmente úteis para o aumento da afinidade de ligação dos compostos anti-sentido incluem 5-pirimidinas substituídas, 6-azapirimidinas e purinas substituídas N-2, N-6 e O-6, incluindo 2 aminopropiladenina, 5- propiniluracila e 5-propinilcitocina.
[000201] Em certas formas de realização, compostos anti-sentido alvejado ao ácido nucleico de huntingtina compreende uma ou mais nucleobase modificada. Em certas formas de realização, oligonucleotídeos anti-sentido ampliado na folga alvejado ao ácido nucleico de huntingtina compreende uma ou mais nucleobase modificada. Em certas formas de realização, a nucleobase modificada é 5-metilcitocina. Em certas formas de realização, cada citocina é uma 5-metilcitosina.
[000202] Composições e métodos para a formulação das composições farmacêuticas
[000203] Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser misturados com substância inerte ou ativo farmaceuticamente aceitável para a preparação das composições farmacêuticas ou formulações. As composições e métodos para a formulação das composições farmacêuticas são dependentes em diversos critérios, incluindo, mas não limitado a, via de administração, extensão da doença ou dosagem a ser administrada.
[000204] O composto anti-sentido alvejado ao ácido nucleico de huntingtina pode ser utilizado nas composições farmacêuticas pela combinação do composto anti-sentido com um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui a solução salina tamponada por fosfato (PBS). PBS é um diluente adequado para o uso nas composições a ser parenteralmente liberados. Consequentemente, em uma forma de realização, utilizados nos métodos descritos neste é uma composição farmacêutica que compreende um composto anti-sentido alvejado ao ácido nucleico de huntingtina e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, o diluente farmaceuticamente aceitável é PBS. Em certas formas de realização, o composto anti-sentido é um oligonucleotídeo anti-sentido.
[000205] As composições farmacêuticas que compreendem os compostos anti-sentido abrangem qualquer sais, ésteres ou sais farmaceuticamente aceitáveis de tais ésteres ou qualquer outro oligonucleotídeo que, na administração em um animal, incluindo um humano, é capaz de fornecer (diretamente ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou resíduo deste. Consequentemente, por exemplo, a divulgação também é tirada aos sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos anti-sentido, pró- medicamentos, sais farmaceuticamente aceitáveis de tais pró- medicamentos e outros bioequivalentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não são limitados a, sais de sódio e potássio.
[000206] Um pró-medicamento pode incluir a incorporação dos nucleosídeos adicionais em uma ou ambas as extremidades de um composto anti-sentido que são clivados pelas nucleases endógenas dentro do corpo, para formar o composto anti-sentido ativo.
Compostos anti-sentido conjugado
[000207] Os compostos anti-sentido podem ser covalentemente ligados a uma ou mais porções ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular ou absorção celular dos oligonucleotídeos anti-sentido resultantes. Os grupos de conjugado típico incluem porções de colesterol e porções de lipídeos. Os grupos conjugados adicionais incluem carboidratos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, folatol, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, coumarinas e pigmentos.
[000208] Os compostos anti-sentido também podem ser modificados para ter um ou mais grupos de estabilização que são geralmente ligados em um ou ambos terminais dos compostos anti-sentido para intensificar as propriedades tal como, por exemplo, estabilidade de nuclease. Incluído nos grupos de estabilização são estruturas de cobertura. Estas modificações terminais protegem o composto anti- sentido tendo ácido nucleico terminal a partir da degradação exonuclease e pode ajudar uma liberação e/ou localização dentro da célula. A cobertura pode estar presente no terminal 5' (cobertura de 5') ou no terminal 3' (cobertura de 3') ou pode estar presente em ambos terminais. As estruturas de cobertura são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, coberturas básicas desóxi invertidas. Ainda os grupos de estabilização 3' e 5' que podem ser usados para cobrir uma ou ambas extremidades de um composto anti-sentido para conceder a estabilidade de nuclease incluem aquele divulgado no WO 03/004602 publicado em 16 de Janeiro de 2003. Cultura celular e o tratamento dos compostos anti-sentido
[000209] Os efeitos dos compostos anti-sentido no nível, atividade ou expressão do ácido nucleico de huntingtina podem ser testados in vitro em uma variedade dos tipos celulares. Os tipos celulares para tais análises são disponíveis a partir dos vendedores comerciais (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) e as células são cultivadas de acordo com as instruções dos vendedores usando os reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Os tipos celulares ilustrativos incluem, mas não são limitados a, células HepG2, células Hep3B, hepatócitos primários, células A549, fibroblastos GM04281 e as células LLC-MK2. O teste in vitro dos oligonucleotídeos anti-sentido
[000210] Descritos neste são os métodos para o tratamento das células com oligonucleotídeos anti-sentido, que podem ser modificados apropriadamente para o tratamento com outros compostos anti-sentido.
[000211] Em geral, as células são tratadas com oligonucleotídeos anti-sentidos quando as células atingiram aproximadamente 60 a 80 % de confluência na cultura.
[000212] Um reagente comumente usado para introduzir o oligonucleotídeos anti-sentido nas células cultivadas incluem o reagente de transfecção de lipídeo catiônico LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os oligonucleotídeos anti-sentido são misturados com LIPOFECTIN® em OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração final desejada de oligonucleotídeo anti-sentido e uma concentração LIPOFECTIN® que tipicamente varia 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleotídeo anti- sentido.
[000213] Outro reagente usado para introduzir os oligonucleotídeos anti-sentido nas células cultivadas incluem LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O oligonucleotídeo anti-sentido é misturado com LIPOFECTAMINE 2000® em meio de soro reduzido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada de oligonucleotídeo anti-sentido e uma concentração LIPOFECTAMINE® que tipicamente varia de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleotídeo anti-sentido.
[000214] Outro reagente usado para introduzir os oligonucleotídeos anti-sentido nas células cultivadas incluem Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O oligonucleotídeo anti-sentido é misturado com Cytofectin® no meio de soro reduzido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada do oligonucleotídeo anti-sentido e uma concentração Cytofectin® que tipicamente varia de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleotídeo anti- sentido.
[000215] Outra técnica usada para introduzir os oligonucleotídeos anti-sentido nas células cultivadas incluem a eletroporação.
[000216] As células são tratadas com oligonucleotídeos anti-sentido pelos métodos de rotina. As células são tipicamente coletadas 16 a 24 horas após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido, em que o RNA de tempo ou níveis de proteína do ácidos nucléicos alvos são medidos pelos métodos conhecidos na técnica e descritos neste. Em geral, quando os tratamentos são realizados nos replicados múltiplos, os dados são apresentados como a média dos tratamentos de replicado.
[000217] A concentração do oligonucleotídeo anti-sentido usado varia a partir da linha celular a linha celular. Os métodos para determinar a ótima concentração anti-sentido de oligonucleotídeo por uma linha celular particular são bem conhecidos na técnica. Os oligonucleotídeos anti-sentidos são tipicamente usados nas concentrações que variam de 1 nM a 300 nM quando transfectado com LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectina ou Citofectina. Os oligonucleotídeos anti-sentido são usados nas concentrações maiores que variam de 625 a 20.000 nM quando transfectados usando a eletroporação.
Isolamento de RNA
[000218] A análise de RNA pode ser realizado no RNA celular total ou poli(A)+ mRNA. Os métodos do isolamento RNA são bem conhecidos na técnica. O RNA é preparado usando os métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando o reagente TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com os protocolos recomendados do fabricante.
Análise da inibição dos níveis alvos ou expressão
[000219] A inibição dos níveis ou expressão de um ácido nucleico de huntingtina pode ser submetida ao ensaio em uma variedade de maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, níveis alvos do ácido nucleico podem ser quantificados por, por exemplo, análise Northern blot, reação de cadeia de polimerase competitiva (PCR) ou PCR de tempo real quantitativo. A análise de RNA pode ser realizada em um RNA celular toral ou poli(A)+ mRNA. Os métodos do isolamento RNA são bem conhecidos na técnica. A análise Northern blot também é rotina na técnica. O PCR de tempo real quantitativo pode ser convenientemente acompanhado usando o sistema de detecção da sequência ABI PRISM® 7600, 7700 ou 7900 comercialmente disponível, disponível de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA e usado de acordo com as instruções do fabricante. Análise de PCR de tempo real quantitativo dos níveis de RNA alvos
[000220] A quantificação dos níveis de RNA alvos podem ser acompanhados pelo PCR de tempo real quantitativo usando o sistema de detecção da sequência ABI PRISM® 7600, 7700 ou 7900 (PE- Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
[000221] Os métodos do PCR tempo real quantitativo são bem conhecidos na técnica.
[000222] Antes do PCR de tempo real, o RNA isolado é submetido a uma reação de transcriptase reversa (RT), que produz o DNA complementar (cDNA) que é então usado como o substrato para a amplificação de PCR de tempo real. As reações de RT e PCR de tempo real são sequencialmente realizados no mesmo reservatórios de amostra. O RT e reagentes de PCR de tempo real são obtidos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). O RT, reações de PCR de tempo real são realizados pelos métodos bem conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica.
[000223] As quantidades alvo do gene (ou RNA) obtidas pelo PCR de tempo real são normalizados usando o nível de expressão de um gene cuja expressão é constante, tal como ciclofilina A ou pela quantificação de RNA total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). A expressão de ciclofilina A é quantificada pelo PCR de tempo real, por ser realizado simultaneamente com o alvo, multiplexação ou separadamente. O RNA total é quantificado usando o reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Os métodos da quantificação de RNA por RIBOGREEN® são ensinados em Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Um instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) é usado para medir a fluorescência RIBOGREEN®.
[000224] As sondas e iniciadores são projetados para hibridizar o ácido nucleico de huntingtina. Os métodos para projetar as sondas de PCR de tempo real e iniciadores são bem conhecidos na técnica e podem incluir o uso de software tal como software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Análise dos níveis de proteína
[000225] A inibição anti-sentido do ácido nucleico de huntingtina pode ser avaliada pela medição dos níveis de proteína. Os níveis de proteína de huntingtina podem ser avaliados ou quantificados em uma variedade de maneiras bem conhecidas na técnica, tal como imunoprecipitação, análise Western blot (imunoblotting), ensaio imunosorbente ligado por enzima (ELISA), ensaios de proteína quantitativa, ensaios de atividade de proteína (por exemplo, ensaios de atividade caspase), imunoistoquímica, imunocitoquímica ou classificação da célula ativada por fluorescência (FACS). Os anticorpos direcionados ao alvo podem ser identificados e obtidos a partir de uma variedade das fontes, tal como o catálogo MSRS de anticorpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI) ou pode ser preparado por intermédio dos métodos de geração de anticorpo monoclonal ou policlonal convencional bem conhecidos na técnica. Os anticorpos úteis para a detecção da huntingtina humana e rato são comercialmente disponível. Teste in vivo dos compostos anti-sentido
[000226] Os compostos anti-sentido, por exemplo, oligonucleotídeos anti-sentido, são testados nos animais para avaliar sua capacidade para inibir sua expressão de huntingtina e produzir mudanças fenotípicas. O teste pode ser realizado nos animais normais ou nos modelos da doença experimental. Para administração aos animais, oligonucleotídeos anti-sentido são formulados em um diluente farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada por fosfato. A administração inclui as vias parenterais de administração. Seguindo um período de tratamento com oligonucleotídeos anti- sentido, RNA é isolado a partir do tecido e mudanças no ácido nucleico da expressão de huntingtina são medidos. As mudanças nos níveis de proteína de huntingtina também são medidos. Certos compostos
[000227] Cerca de mil e setecentos compostos anti-sentido recentemente projetados de vários comprimentos, motivos e composição da cadeia secundária foram testadas por seu efeito no mRNA de huntingtina humano in vitro em diversos tipos celulares. Os novos compostos foram comparados com cerca de duzentos e cinquenta compostos previamente projetados incluindo ISIS 387916 que tem previamente determinado a ser um dos compostos anti- sentido mais potentes in vitro (ver por exemplo, Publicação de Patente U. S. N°. 2008/0039418 e 2007/0299027. Cerca de mil e setecentos compostos anti-sentido recentemente projetados, cerca de sessenta compostos foram selecionados para o estudo adicional com base na potência in vitro comparada a ISIS 387916. Os compostos selecionados foram testados para a tolerabilidade sistêmica (ver Exemplo 3) e atividade e tolerabilidade no cérebro de camundongos BACHD (ver Exemplo 4) comparado ao ISIS 388241 e ISIS 387916 previamente projetado. A partir destes estudos, os compostos tendo uma sequência de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 ou 32 foram selecionados como tendo tolerabilidade alta e potência alta in vivo. Em virtude da sua sequência complementar, os compostos são complementares às regiões 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823- 4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809- 5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609- 4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 ou 4928-4947 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização, os compostos que alvejam as regiões listadas, ainda como descritos neste, compreende um oligonucleotídeo modificado tendo alguma porção de nucleobase da sequência relatada na SEQ ID N°, ainda como descrito neste. Em certas formas de realização, os compostos que alvejam as regiões listadas ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada pode ser de vários comprimentos, ainda como descrito neste e um pode ter de vários motivos, ainda como descritos neste. Em certas formas de realização, um composto que alveja uma região ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada tem o comprimento e motivo específico como indicado por ISIS N°: ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 451541, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 ou ISIS 444663.
[000228] Os compostos descritos acima como tendo potência in vivo alta e tolerabilidade foram então testados pela injeção de bolo SNC em rato para avaliar a neurotoxicidade adicional (ver Exemplo 5) junto com diversos compostos adicionais tendo uma sequência de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 7, 8, 11, 16, 17. Destes, dez compostos tendo uma sequência de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32 ou 13 foram selecionados como tendo a tolerabilidade alta. Em virtude de sua sequência complementar, os compostos são complementares as regiões 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974 ou 5809-5829 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização, o compostos que alveja as regiões listadas, ainda como descrito neste, compreende um oligonucleotídeo modificado tendo alguma porção de nucleobase da sequência relatada na SEQ ID N°, ainda como descrito neste. Em certas formas de realização, os compostos que alvejam as regiões listadas ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada pode ser de vários comprimentos, ainda como descrito neste e pode ter um de vários motivos, ainda como descritos neste. Em certas formas de realização, um composto que alveja uma região ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada tem o comprimento específico ou motivo como indicado pelo ISIS N°: ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591 e ISIS 444661. os compostos selecionados foram comparados com o compostos previamente projetado ISIS 388241 pela administração ICV nos camundongos BACHD.
[000229] Os estudos adicionais foram então realizados nos compostos descritos acima como tendo potência in vivo alta e tolerabilidade. Os estudos adicionais foram projetados para avaliar a neurotoxicidade adicional. Os estudos incluem a administração ICV no camundongo de tipo selvagem (ver Exemplo 16) e administração de bolo em rato (ver Exemplo 17). SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33 foram selecionadas como tendo a neurotolerabilidade alta. Em virtude de sua sequência complementar, os compostos são complementares as regiões 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820 e 4955-4974 da SEQ ID N°: 1. Em certas formas de realização, os compostos que alvejam as regiões listadas, ainda como descrito neste, compreende um oligonucleotídeo modificado tendo a mesma porção de nucleobase da sequência relatada nas SEQ ID N°, ainda como descrito neste. Em certas formas de realização, os compostos que alveja as regiões listadas ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada pode ser de vários comprimentos, ainda como descrito neste e pode ter um de vários motivos, ainda como descrito neste. Em certas formas de realização, um composto que alveja uma região ou tendo uma porção de nucleobase de uma sequência relatada na SEQ ID N° listada tem o comprimento específico ou motivo como indicado por ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444652 e ISIS 436689.
[000230] Consequentemente, fornecidos neste são os compostos anti-sentido com características melhoradas. Em certas formas de realização, fornecidos neste são os compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado ainda como descrito neste alvejado ou especificamente hibridizável com a região dos nucleotídeos da SEQ ID N°: 1.
[000231] Em certas formas de realização, os compostos como descrito aqui são eficazes pela virtude de ter pelo menos um IC50 in vitro de menos do que 7 uM, menos do que 6 uM, menos do que 5, uM, menos do que 4 uM, menos do que 3 uM, menos do que 2 uM, menos do que 1 uM quando liberado a uma linha celular de fibroblasto humano como descrito aqui ou um ED50 de menos do que 10 μg, menos do que 9 μg, menos do que 8 μg, menos do que 7,5 μg, menos do que 7,4 μg, menos do que 7,0 μg, menos do que 6 μg, menos do que 5 μg, menos do que 4 μg, menos do que 3 μg ou menos do que 2 μg pela injeção de bolo. Como descrito aqui, a infusão ICV pode resultar em 3 a 4 vezes de valores ED50 maiores para os compostos descritos neste. Em certas formas de realização, os compostos como descrito aqui são altamente toleráveis como demonstrados por ter pelo menos um aumento no valor ALT ou AST de não mais do que 4 vezes, 3 vezes ou 2 vezes nos animais tratados por solução salina; um aumento no fígado, baço ou peso do rim de não mais do que 30 %, 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 5 % ou 2 %; ou um aumento os níveis AIF1 não mais do que 350 %, 300 %, 275 %, 250 % 200 %, 150 % ou 100 % no controle. Certas indicações
[000232] Em certas formas de realização, são fornecidos métodos de tratar um indivíduo que compreende administrar uma ou mais composições farmacêuticas como descrito aqui. Em certas formas de realização, o indivíduo tem doença de Huntington.
[000233] Como mostrado nos exemplos abaixo, os compostos alvejados a huntingtina como descrito aqui mostraram reduzir a gravidade dos sintomas fisiológicos de doença de Huntington. Em certos experimentos, a taxa reduzida de degeneração dos compostos, por exemplo, os animais continuaram a experimentar sintomas, mas os sintomas foram menos graves em comparação com os animais não tratados. Em outros dos experimentos, entretanto, os compostos pareceram resultar na regeneração da função por tempo; por exemplo, os animais tratados por um período mais longo de tempo experimentaram sintomas menos graves do que aqueles administrados com os compostos por um período mais curto de tempo. Como debatido acima, a doença de Huntington é uma doença degenerativa com uma progressão tipificada pela gravidade aumentada de sintomas durante o tempo. A capacidade dos compostos exemplificados abaixo para restaurar a função, portanto, demonstra que os sintomas da doença podem ser revertidos pelo tratamento com um composto como descrito aqui.
[000234] Consequentemente, são fornecidos aqui, métodos para a melhora de um sintoma associado com a doença de Huntington em um paciente em necessidade destes. Em certas formas de realização, é fornecido um método para reduzir a taxa de início de um sintoma associado com a doença de Huntington. Em certas formas de realização, é fornecido um método para reduzir a gravidade de um sintoma associado com doença de Huntington. Em certas formas de realização, é fornecido um método para regenerar a função neurológica como mostrado por uma melhora de um sintoma associado com doença de Huntington. Em tais formas de realização, o método compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto alvejado a um ácido nucleico de huntingtina.
[000235] A doença de Huntington é caracterizada por numerosos sintomas físicos, neurológicos psiquiátricos e/ou periféricos. Qualquer sintoma conhecido por aqueles habilitados na técnica que estarão associados com a doença de Huntington podem ser melhorados ou de outra maneira modulados como apresentado acima nos métodos descritos acima. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma físico selecionado do grupo que consiste de agitação, perda de coordenação, movimentos iniciados não intencionais, movimentos incompletos não intencionais, passo inconstante, coréia, rigidez, movimentos de convulsão, postura anormal, instabilidade, expressões faciais anormais, dificuldade de mastigar, dificuldade de engolir, dificuldade de fala, ataque e distúrbios do sono. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma cognitivo selecionado do grupo que consiste de planejamento prejudicado, flexibilidade prejudicada, pensamento abstrato prejudicado, aquisição de regra prejudicada, início prejudicado de ações apropriadas, inibição prejudicada de ações inapropriadas, memória de curto prazo prejudicada, memória de longo prazo prejudicada, paranóia, desorientação, confusão, alucinação e demência. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma psiquiátrico selecionado do grupo que consiste de ansiedade, depressão, afeto enfraquecido, egocentrismos, agressão, comportamento compulsivo, irritabilidade e concepção suicida. Em certas formas de realização, o sintoma é um sintoma periférico selecionado do grupo que consiste de massa cerebral reduzida, atrofia muscular, insuficiência cardíaca, tolerância à glicose prejudicada, perda de peso, osteoporose e atrofia testicular.
[000236] Em certas formas de realização, o sintoma é inquietação. Em certas formas de realização, o sintoma é perda de coordenação. Em certas formas de realização, o sintoma é movimentos iniciados não intencionais. Em certas formas de realização, o sintoma é movimentos incompletos não intencionais. Em certas formas de realização, o sintoma é passo inconstante. Em certas formas de realização, o sintoma é coréia. Em certas formas de realização, o sintoma é rigidez. Em certas formas de realização, o sintoma é movimentos de convulsão. Em certas formas de realização, o sintoma é postura anormal. Em certas formas de realização, o sintoma é instabilidade. Em certas formas de realização, o sintoma é expressões faciais anormais. Em certas formas de realização, o sintoma é dificuldade de mastigar. Em certas formas de realização, o sintoma é dificuldade de engolir. Em certas formas de realização, o sintoma é dificuldade de fala. Em certas formas de realização, o sintoma é ataques. Em certas formas de realização, o sintoma é distúrbios do sono.
[000237] Em certas formas de realização, o sintoma é planejamento prejudicado. Em certas formas de realização, o sintoma é flexibilidade prejudicada. Em certas formas de realização, o sintoma é pensamento abstrato prejudicado. Em certas formas de realização, o sintoma é aquisição de regra prejudicada. Em certas formas de realização, o sintoma é início prejudicado de ações apropriadas. Em certas formas de realização, o sintoma é inibição prejudicada de ações inapropriadas. Em certas formas de realização, o sintoma é memória de curto prazo prejudicada. Em certas formas de realização, o sintoma é memória de longo prazo prejudicada. Em certas formas de realização, o sintoma é paranóia. Em certas formas de realização, o sintoma é desorientação. Em certas formas de realização, o sintoma é confusão. Em certas formas de realização, o sintoma é alucinação. Em certas formas de realização, o sintoma é demência.
[000238] Em certas formas de realização, o sintoma é ansiedade. Em certas formas de realização, o sintoma é depressão. Em certas formas de realização, o sintoma é afeto enfraquecido. Em certas formas de realização, o sintoma é egocentrismo. Em certas formas de realização, o sintoma é agressão. Em certas formas de realização, o sintoma é comportamento compulsivo. Em certas formas de realização, o sintoma é irritabilidade. Em certas formas de realização, o sintoma é concepção suicida.
[000239] Em certas formas de realização, o sintoma é massa cerebral reduzida. Em certas formas de realização, o sintoma é atrofia muscular. Em certas formas de realização, o sintoma é insuficiência cardíaca. Em certas formas de realização, o sintoma é tolerância à glicose prejudicada. Em certas formas de realização, o sintoma é perda de peso. Em certas formas de realização, o sintoma é osteoporose. Em certas formas de realização, o sintoma é atrofia testicular.
[000240] Em certas formas de realização, os sintomas da doença de Huntington podem ser quantificáveis. Por exemplo, a osteoporose pode ser medida e quantificada por, por exemplo, varreduras de densidade óssea. Para tais sintomas, em certas formas de realização, o sintoma pode ser reduzido por cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 % ou uma faixa definida por quaisquer dois destes valores.
[000241] Em certas formas de realização, são fornecidos métodos de tratar um individual que compreende administrar uma ou mais composições farmacêuticas como descrito aqui. Em certas formas de realização, o indivíduo tem doença de Huntington.
[000242] Em certas formas de realização, a administração de um composto anti-sentido alvejado a um ácido nucleico de huntingtina resulta na redução da expressão de huntingtina por pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 % ou uma faixa definida por quaisquer dois destes valores.
[000243] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas que compreendem um composto anti-sentido alvejado a huntingtina são usados para a preparação de um medicamento para o tratamento de um paciente que sofre de ou é suscetível à doença de Huntington.
[000244] Em certas formas de realização, os métodos descritos aqui incluem administrar um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma porção de nucleobases contíguas como descrito aqui de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 ou 32. Em certas formas de realização, os métodos descritos aqui incluem administrar um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma porção de nucleobases contíguas como descrito aqui de uma sequência relatada na SEQ ID N°: 12, 22, 28, 30, 32 e 33. Administração
[000245] Em certas formas de realização, os compostos e composições como descrito aqui são administrados de maneira parenteral.
[000246] Em certas formas de realização, a administração parenteral ocorre por infusão. A infusão pode ser crônica ou contínua ou curta ou intermitente. Em certas formas de realização, os agentes farmacêuticos submetidos à infusão são liberados com uma bomba. Em certas formas de realização, a administração parenteral ocorre por injeção.
[000247] Em certas formas de realização, os compostos e composições são liberados ao SNC. Em certas formas de realização, os compostos e composições são liberados ao fluido cerebroespinhal. Em certas formas de realização, os compostos e composições são administrados à parênquima cerebral. Em certas formas de realização, os compostos e composições são liberados a um animal pela administração intratecal ou administração intracerebroventricular. A distribuição ampla dos compostos e composições, descritos aqui, dentro do sistema nervoso central pode ser atingida por administração intraparenquimal, administração intratecal ou administração intracerebroventricular.
[000248] Em certas formas de realização, a administração parenteral ocorre por injeção. A injeção pode ser liberada por uma seringa ou por uma bomba. Em certas formas de realização, a injeção é uma injeção de bolo. Em certas formas de realização, a injeção é administrada diretamente a um tecido, tal como estriado, caudado, córtex, hipocampo e cerebelo.
[000249] A concentração eficaz média (EC50) de um composto anti- sentido para inibir a expressão de mRNA de huntingtina foi calculada após a infusão de ICV ou injeção de bolo (ver Exemplos 9 e 10). O EC50 para o composto após a injeção intrastriatal foi determinada ser de 0,45 μg/g. O EC50 após a administração de ICV foi determinada ser de 26,4 μg/g.
[000250] Portanto, em certas formas de realização, a liberação de um composto ou composição descritos neste podem afetar o perfil farmacocinético do composto ou composição. Em certas formas de realização, a injeção de um composto ou composição descrito aqui, a um tecido alvejado melhora o perfil farmacocinético do composto ou composição em comparação com a infusão do composto ou composição. Em uma certa forma de realização, a injeção de um composto ou composição melhora a potência em comparação com a difusão ampla, requerendo menos do composto ou composição para atingir a farmacologia similar. Em certas formas de realização, a farmacologia similar refere-se à quantidade de tempo que um mRNA alvo e/ou proteína alvo são sub-regulados (por exemplo, duração de ação). Em certas formas de realização, os métodos de localizar especificamente um agente farmacêutico, tal como por injeção de bolo, diminui a concentração eficaz média (EC50) por um fator de cerca de 50 (por exemplo, 50 vezes menos concentração no tecido é requerido para atingir o mesmo efeito farmacodinâmico ou similar). Em certas formas de realização, os métodos de localizar especificamente um agente farmacêutico, tal como por injeção e bolo, diminui a concentração eficaz média (EC50) por um fator de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50. Em certas formas de realização, o agente farmacêutico em um composto anti-sentido como ainda descrito neste. Em certas formas de realização, o tecido alvejado é tecido cerebral. Em certas formas de realização, o tecido alvejado é tecido estriatal. Em certas formas de realização, a diminuição do EC50 é desejável porque este reduz a dose requerida para atingir um resultado farmacológico em um paciente em necessidade destes.
[000251] A vida média dos oligonucleotídeos e gapmero MOE no tecido cerebral é de 20 dias (ver Exemplos 9 a 11). A duração da ação como medido pela inibição de mRNA de huntingtina é prolongada no cérebro (ver Exemplos 9 e 10). A infusão intracerebroventricular de oligonucleotídeos anti-sentidos por 2 semanas resulta na inibição de mRNA de huntingtina por pelo menos 50 % no tecido estriatal de camundongos BACHD por pelo menos 91 sias após o término da dosagem. A administração pela injeção de bolo resultou em uma duração similar de ação.
[000252] Em certas formas de realização, a liberação de um composto ou composição, como descrito aqui, no SNC resulta em 47 % de sub-regulação de um mRNA alvo e/ou proteína alvo por pelo menos 91 dias. Em certas formas de realização, a liberação de um composto ou composição resulta em pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 % ou pelo menos 75 % de sub-regulação de um mRNA alvo e/ou proteína alvo por pelo menos 20 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 85 dias, pelo menos 90 dias, pelo menos 95 dias, pelo menos 100 dias, pelo menos 110 dias, pelo menos 120 dias. Em certas formas de realização, a liberação ao SNC ocorre pela administração intraparenquimal, administração intratecal ou administração intracerebroventricular.
[000253] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo anti- sentido é liberado por injeção ou infusão uma vez por mês, a cada dois meses, a cada 90 dias, a cada 3 meses, a cada 6 meses, duas vezes ao ano ou uma vez ao ano. Certas Terapias de Combinação
[000254] Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas são coadministradas com um ou mais outros agentes farmacêuticos. Em certas formas de realização, um tal ou mais outros agentes farmacêuticos são projetados para o tratamento da mesma doença, distúrbio ou condição como a uma ou mais composições farmacêuticas escritas aqui. Em certas formas de realização, tal um ou mais outros agentes farmacêuticos são projetados para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição diferentes como a uma ou mais composições farmacêuticas descritas aqui. Em certas formas de realização, tal um ou mais outros agentes farmacêuticos são projetados para o tratamento de um efeito colateral indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas como descrito aqui. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas são co-administradas com um outro agente farmacêutico para o tratamento de um efeito indesejado daquele outro agente farmacêutico. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas são co-administradas com um outro agente farmacêutico para a produção de um efeito combinatório. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas são co-adminitradas comum outro agente farmacêutico para a produção de um efeito sinergístico.
[000255] Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em tempos diferentes. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma formulação simples. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes são preparados de maneira separada.
[000256] Em certas formas de realização, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica que inclui agentes anti-psicóticos, tais como, por exemplo, haloperidol, clorpromazina, clozapina, quetapina e olanzapina; agentes anti- sdepressivos, tais como, por exemplo, fluoxetina, cloridreto de sertralina, venlafaxina e nortriptilina; agentes tranquilizantes, tais como, por exemplo, benzodiazepinas, clonazepam, paroxetina, venlafaxina e beta-bloqueadores; agentes estabilizadores de humor, tais como, por exemplo, lítio, valproato, lamotrigina e carbamazepina; agentes paralíticos, tais como, por exemplo, toxina Botulínica e/ou outros agentes experimentais incluindo, mas não limitado a, tetrabenazina (Xenazina), creatina, conezyme Q10, trealose, ácidos docosaexanóicos, ACR16, etil-EPA, atomoxetina, citalopram, dimebon, memantina, fenilbutirato sódico, ramelteon, ursodiol, zyprexa, xenasina, tiaprida, riluzol, amantadina, [123I]MNI-420, atomoxetina, tetrabenazina, digoxina, detrometorfan, warfarina, alprozam, cetoconazol, omeprazol e minociclina.
EXEMPLOS Divulgação não limitante e incorporação por referência
[000257] Enquanto certos compostos, composições e métodos descritos neste foram descritos com especificidade de acordo com certas formas de realização, os seguintes exemplos servem apenas para ilustrar os compostos descritos neste e não são pretendidos limitar o mesmo. Cada uma das referências relatadas na presente aplicação é incorporada neste por referência em sua totalidade.
Exemplo 1: Oligonucleotídeos anti-sentido alvejados as sequências do gene de huntingtina humano
[000258] Cerca de mil e setecentos compostos anti-sentido recentemente projetados de vários comprimentos, motivos e composição secundária alvejando as sequências do gene de huntingtina humano que foram testadas por seu efeito no mRNA de huntingtina humano in vitro em diversos tipos celulares. Estes gapmeros ainda foram projetados com ligações de internucleosídeo que são apenas as ligações de fosforotioato (descritos na Tabela 1) ou que são as ligações de fosforotioato e fosfodiéster (descritos na Tabela 5). Um número de oligos recentemente projetados e dois oligonucleotídeos de marca de referência (previamente projetados e divulgados) são fornecidos nas Tabelas 1 e 5. Gapmeros com ligações de internucleosídeo totalmente fosforotioato
[000259] Certos dos compostos apresentados na Tabela 1 tem um motivo de 5-10-5 MOE, 6-8-6 MOE, ou 5-8-5 MOE. Os gapmeros 5-10¬5 tem vinte nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga central tem dez 2’-desoxinucleosídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas tendo cinco nucleosídeos cada. O gapmero 6-8-6 tem vinte nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga central tem oito 2’-desoxinucleosídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas tendo seis nucleosídeos cada. Os gapmeros 5-8-5 tem dezoito nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga central tem oito 2’-desoxinucleosídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas tendo cinco nucleosídeos cada. Para todos os gapmeros listados na Tabela 1, cada nucleosídeo no segmento de asas 5’ e cada nucleosídeo no segmento de asas 3’ tem uma modificação 2’-MOE. As ligações de internucleosídeo totalmente cada gapmero são ligações de internucleosídeo fosforotioato (P=S). Todas as citocinas totalmente cada gapmero são 5-metilcitocinas. Cada gapmero na Tabela 1 é alvejado a SEQ ID N°: 1 (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6) ou SEQ ID N°: 2 (Acessão GENBANK N°. NT_006081.17 truncado a partir dos nucleotídeos 462000 a 634000). O ‘local de partida’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘local de interrupção’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. Tabela 1 Oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos com ligações de internucleosídeo de fosforotioato alvejando as sequências do gene de huntingtina humano (SEQ ID N°: 1 e 2)
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[000260] A complementaridade dos gapmeros na Tabela 1 com camundongo, macaco reso e sequências do gene de huntingtina de rato ainda é descrito nas Tabelas 2, 3 e 4.
[000261] Os gapmeros da Tabela 2 são complementares com mRNA de huntingtina de camundongo (Acessão GENBANK N°. NM_010414.1, projetado neste como SEQ ID N°: 3). O ‘local de partida alvo de camundongo’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de camundongo. O ‘local de interrupção alvo de camundongo’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de camundongo. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência de mRNA de camundongo. Tabela 2 Complementaridade dos oligonucleotídeos anti-sentido tendo ligações de fosforotioato com mRNA de murino (SEQ ID N°: 3)
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[000262] O gapmeros da Tabela 3 são complementares com a sequência genômica de huntingtina de macaco reso (o complemento de Acessão GENBANK N°. NW_001109716.1 truncado nos nucleotídeos 698000 a 866000, projetado neste como SEQ ID N°: 4). O ‘Local de partida alvo de macaco reso’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene de macaco reso. O ‘local de interrupção alvo de macaco reso’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene de macaco reso. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência do gene de macaco reso. Tabela 3 Complementaridade dos oligonucleotídeos anti-sentido tendo ligações de fosforotioato com sequência do gene de macaco reso (SEQ ID N°: 4)
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[000263] Os gapmeros da Tabela 4 são complementares com mRNA de huntingtina de rato (Acessão GENBANK N°. NM_024357.2, projetado neste como SEQ ID N°: 5). O ‘local de partida alvo de rato’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de rato. O ‘local de interrupção alvo de rato’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de rato. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene humaN°. O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência de mRNA de rato. Tabela 4 Complementaridade dos oligonucleotídeos anti-sentido tendo ligações de fosforotioato com mRNA de rato (SEQ ID N°: 5)
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Gapmeros com fosforotioato misturado e ligações de internucleosídeo de fosfodiéster
[000264] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na Tabela 5 foram projetados como gapmeros 5-10-5 MOE. Os gapmeros 5-10-5 tem vinte nucleosídeos ligados, em que o segmento de folga central tem dez 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas tendo cinco nucleosídeos cada. Cada nucleosídeo no segmento de asas 5’ e cada nucleosídeo no segmento de asas 3’ tem uma modificação 2’-MOE. As ligações de internucleosídeo dentro do segmento de folga central, as ligações conectadas ao segmento de folga à 5’ ou segmento de asas 3’ e as ligações pelos nucleosídeos mais 5’ e mais 3’ de cada segmentos de asa são todos ligações de fosforotioato (P=S); as ligações de internucleosídeo conectando o restante dos nucleosídeos tanto dos segmentos de asa 5’ quanto 3’ são ligações de fosfodiésteres; isto é o gapmero tem uma cadeia principal misturada. Todas as citocinas totalmente cada gapmero são 5-metilcitocinas. Cada gapmero na Tabela 5 é alvejado a sequência de mRNA humana (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6, projetado neste como SEQ ID N°: 1). O ‘local de partida’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humaN°. O ‘local de interrupção’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humaN°. Tabela 5 Oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos com fosforotioato e ligações de fosfato de internucleosídeo alvejando mRNA de huntingtina humano (SEQ ID N°: 1)
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[000265] A complementaridade dos gapmeros na Tabela 5 com camundongo, macaco reso e sequências do gene de huntingtina de rato ainda são descritos nas Tabelas 6, 7 e 8.
[000266] Os gapmeros da Tabela 6 são complementares com mRNA de huntingtina de camundongo (Acessão GENBANK N°. NM_010414.1; SEQ ID N°: 3). O ‘local de partida alvo de camundongo’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de camundongo. O ‘local de interrupção alvo de camundongo’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de camundongo. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência de mRNA de camundongo. Tabela 6 Complementaridade dos oligonucleotídeos anti-sentido tendo fosforotioato misturado e ligações de fosfato com mRNA de murino (SEQ ID N°: 3)
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[000267] Os gapmeros d a Tabe a 7 são complementares com a sequência genômica de huntingtina de macaco reso (o complemento de Acessão GENBANK N°. NW_001109716.1 truncado nos nucleotídeos 698000 a 866000; SEQ ID N°: 4). O ‘local de partida alvo de macaco reso’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene de macaco reso. O ‘local de interrupção alvo de macaco reso’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado na sequência do gene de macaco reso. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência do gene de macaco reso. Tabela 7 Complementaridade dos oligonucleotídeos anti-sentido tendo fosforotioato misturado e ligações de fosfato com sequência do gene de macaco reso (SEQ ID N°: 4)
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[000268] Os gapmeros da Tabela 8 são complementares com mRNA de huntingtina de rato (Acessão GENBANK N°. NM_024357.2; SEQ ID N°: 5). O ‘local de partida alvo de rato’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de rato. O ‘local de interrupção alvo de rato’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA de rato. O ‘local de partida alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 5’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘local de interrupção alvo humano’ indica o nucleotídeo mais 3’ em que o gapmero é alvejado no mRNA humano (Acessão GENBANK N°. NM_002111.6). O ‘número de erros’ indica o número de erros entre o oligonucleotídeo humano e a sequência de mRNA de rato. Tabela 8
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Exemplo 2: Inibição anti-sen tido dependente da dosagem de mR NA de huntingtina humano in vitro
[000269] Cerca de mil e setecentos compostos anti-sentido recentemente projetados de vários comprimentos, motivos e composição secundária foram testados por seu efeito no mRNA de huntingtina humano in vitro em diversos tipos celulares. Estes compostos foram comparados a cerca de duzentos e cinquenta compostos previamente projetados incluindo o composto ISIS 387916 que foi previamente determinado a ser um composto de potência considerável in vivo. Como mostrado neste exemplo, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ISIS 444661, ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 e previamente projetados ISIS 388241 foram observados ter potência melhor ou similar do que o composto de marca de referência ISIS 387916 in vitro.
Fibroblastos GM04281
[000270] Os fibroblastos GM04281 cultivados em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM, ou 8000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 (sequência avançada CTCCGTCCGGTAGACATGCT, projetado neste como SEQ ID N°: 37; sequência reversa GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG, projetado neste como SEQ ID N°: 38; sequência de sonda TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, projetado neste como SEQ ID N°: 39) foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 9 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti- sentido dos níveis de mRNA de huntingtina.
[000271] A metade da concentração inibidora máxima (IC50) de cada oligonucleotídeo também é apresentado na Tabela 9 e foi calculado pela plotagem das concentrações dos oligonucleotídeos usados versus o percentual de inibição da expressão de mRNA de huntingtina atingida em cada concentração e observando-se a concentração dos oligonucleotídeos em que 50 % de inibição de expressão de mRNA de huntingtina foi atingida comparada ao controle. O IC50 é expressado em μM. Tabela 9 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000272] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados foram testados em um procedimento similar, como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 10 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 10 expressado em μM. Tabela 10 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000273] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 11 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 11 expressado em μM. Tabela 11 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000274] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641 e ISIS 436754 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 12 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 12 expressado em μM. Tabela 12 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000275] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM ou 8000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 13 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 13 expressado em μM. Tabela 13 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000276] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 443139, ISIS 444584, ISIS 444615, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660 e ISIS 444661 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1250 nM, ou 2500 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 14 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O dado apresentado é a média de dois experimentos. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 14 expressado em μM. Tabela 14 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000277] ISIS 387916, ISIS 436671, ISIS 444661, SIS 41964 n e ISIS 436665 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 13.6719 nM, 27.3438 nM, 54.6875 nM, 109.375 nM, 218.75 nM, 437.5 nM, 875 nM, 1750 nM, 3500 nM, ou 7000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 15 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 15 expressado em μM. Tabela 15 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000278] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437168 e ISIS 437175 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM e 8000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 15.1 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 15.1 expressado em μM. Tabela 15.1 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000279] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437441 e ISIS 437442 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 15.2 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 15.2 expressado em μM. Tabela 15.2 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000280] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437175 e ISIS 437527 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os fibroblastos GM04281 cultivados foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 15.3 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 15.3 expressado em μM. Tabela 15.3 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em Fibroblastos GM04281
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[000281] Alguns dos oligonucleotídeos anti-sentido descritos no Exemplo 1 foram testados por seu efeito no mRNA de huntingtina humano in vitro. As células A549 cultivadas em uma densidade de 4.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de lipofectina com 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, ou 200 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 16 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 16 expressado em nM. Tabela 16 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina nas células A549
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[000282] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. As células A549 cultivadas em uma densidade de 20.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM ou 8000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 17 expressados como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti- sentido também é apresentado na Tabela 17 expressado em μM. Tabela 17
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Células LLC-MK2
[000283] Alguns dos oligonucleotídeos anti-sentido descritos no Exemplo 1 e alvejados ao ácido nucleico de huntingtina humano foram testados por seu efeito no macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC-MK2 cultivadas em uma densidade de 25.000 células por reservatórios foram transfectadas usando a eletroporação com 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM, 10.000 nM, ou 20.000 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2686 (sequência avançada GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA, projetado neste como SEQ ID N°: 40; sequência reversa AAGGGATGCTGGGCTCTGT, projetado neste como SEQ ID N°: 41; sequência de sonda AGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX, projetado neste como SEQ ID N°: 42) foi usado para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 18 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 18 expressado em μM. Tabela 18
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[000284] ISIS 3 87916, ISIS 388241, ISIS 436684, SIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591 e ISIS 444607 ainda foram testados por seu efeito em macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC- MK2 cultivadas foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 19 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 19 expressado em μM. Tabela 19
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n.d.= IC50 não deve ser medido por aquele composto
[000285] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660 e ISIS 444661 ainda foram testados por seu efeito em macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC-MK2 cultivadas foram testados em um procedimento similar como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 20 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 20 expressado em μM. Tabela 20 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina nas células LLC-MK2
Figure img0027
[000286] ISIS 387916, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 ainda foram testados por seu efeito em macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC-MK2 cultivadas em uma densidade de 3.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de lipofectina com 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, ou 200 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2686 foi usado para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 21 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 21 expressado em nM. Tabela 21
Figure img0028
[000287] ISIS 387916, ISIS 419641 e ISIS 436689 ainda foram testados por seu efeito em macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC-MK2 cultivadas em uma densidade de 3.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de LipofectAMINE2000 com 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, ou 200 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2686 foi usado para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 22 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 22 expressado em nM. Tabela 22
Figure img0029
[000288] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436665, ISIS 436671 e ISIS 436689 ainda foram testados por seu efeito em macaco reso mRNA de huntingtina in vitro. As células LLC-MK2 cultivadas em uma densidade de 3.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de lipofectina com 4.6875 nM, 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 75 nM, ou 150 nM do oligonucleotídeo anti- sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2686 foi usado para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 23 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 23 expressado em nM. Tabela 23 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina nas células LLC-MK2
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Hepatócitos de camundongo transgênico BACHD
[000289] Alguns dos oligonucleotídeos anti-sentido descritos no Exemplo 1 e alvejados ao ácido nucleico de huntingtina humano foram testados por seu efeito no mRNA de huntingtina humano in vitro. Os hepatócitos de camundongo BACHD cultivados em uma densidade de 10.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de citofectina 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, ou 200 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 24 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O dado apresentado é a média de dois experimentos. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 24 expressado em nM. Tabela 24 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em hepatócitos de murino transgênico BACHD
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[000290] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 419641 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os hepatócitos de camundongo BACHD cultivados em uma densidade de 10.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de citofectina 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM ou 200 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora humana RTS2617 foi usada para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 25 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 25 expressado em nM. Tabela 25 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em hepatócitos de murino transgênico BACHD
Figure img0032
[000291] ISIS 38791 6, ISIS 388241, ISIS 41964 H, ISIS 436665, ISIS 436671 e ISIS 436689 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina humano in vitro. Os hepatócitos de camundongo BACHD cultivados foram testados em uma maneira idêntica como descrito acima. Os resultados são apresentados na Tabela 26 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 26 expressado em nM. Tabela 26 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em hepatócitos de murino transgênico BACHD
Figure img0033
[000292] ISIS 387916, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 ainda foram testados por seu efeito em mRNA de huntingtina de camundongo in vitro. Os hepatócitos de camundongo BACHD cultivados em uma densidade de 20.000 células por reservatórios foram transfectadas usando reagente de transfecção de citofectina 6.667 nM, 20 nM, 60 nM, ou 180 nM do oligonucleotídeo anti-sentido. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo. A série de sonda iniciadora de murino RTS2633 (sequência avançada CAGAGCTGGTCAACCGTATCC, projetado neste como SEQ ID N°: 43; sequência reversa GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA, projetado neste como SEQ ID N°: 44; sequência de sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, projetado neste como SEQ ID N°: 45) foi usado para medir níveis de mRNA. Os níveis de mRNA de huntingtina foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 27 como inibição de porcentagem de mRNA de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas e demonstram a redução dependente da dosagem mediada por oligonucleotídeo anti-sentido dos níveis de mRNA de huntingtina. O IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado na Tabela 27 expressado em nM. Tabela 27 Redução dependente da dosagem de mRNA de huntingtina em hepatócitos de murino transgênico BACHD
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Exemplo 3: Administração sistêmica dos oligonucleotídeos anti-sentido contra mRNA de huntingtina em camundongos BACHD
[000293] Cerca de mil e setecentos compostos anti-sentido recentemente projetados, sessenta e seis compostos foram selecionados com base na potência in vitro comparada a ISIS 387916 para o teste nas avaliações de tolerabilidade sistêmicas.
[000294] Os camundongos BACHD foram tratados com oligonucleotídeos ISIS e avaliados pela mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos bem como inibição de mRNA de huntingtina no fígado. Os oligonucleotídeos anti-sentido que causam mudanças adversas no peso corporal, peso do órgão ou nos níveis de marcadores metabólicos foram considerados inadequados pela utilização nos estudos adicionais.
Estudo 1.T ratamento
[000295] Dezenove grupos de quatro camundongos BACHD cada foram injetados intraperitonealmente com 12,5 mg/kg de ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, ou ISIS 444663 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de controle de quatro camundongos foi injetado intraperitonealmente com PBS duas vezes na semana por 2 semanas. Dois dias após a última dosagem, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e dessangrados pela coleta de plasma, após o qual a deslocação cervical foi realizada e os órgãos coletados. Análise de RNA
[000296] RNA foi extraído a partir do tecido do fígado para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis de huntingtina normal de camundongo foram medidos usando a série de sonda iniciadora de camundongo RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 28 e 29 e foram calculadas como inibição de porcentagem humana e níveis de expressão de huntingtina de murino respectivamente, relativo ao controle PBS. Todos os oligonucleotídeos anti-sentido efetuam a inibição significante dos níveis de mRNA de huntingtina humano. ISIS 388241 tem mais do que três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 28 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina humano em camundongos BACHD
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Tabela 29 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD
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Medições do peso dos órgãos
[000297] Os pesos dos rins, baço, fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 30 como um percentual do controle de solução salina normalizado ao peso corporal. Tabela 30 Percentual de mudança no peso do órgão dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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Avaliação da função do fígado
[000298] Para avaliar o impacto dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática dos camundongos descritos acima, concentrações de plasma de transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressados em IU/L e os resultados são apresentados na Tabela 31. Tabela 31 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido nos marcadores de função hepática
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Estudo 2 Tratamento
[000299] Quatorze grupos de quatro camundongos BACHD cada foram injetados intraperitonealmente com 12,5 mg/kg ou 50 mg/kg de ISIS 419581, ISIS 419602, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419640, ISIS 419641, ou ISIS 419642 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de quatro camundongos BACHD foi injetado intraperitonealmente com 12,5 mg/kg de ISIS 387916 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de controle de quatro camundongos foi injetado intraperitonealmente com PBS duas vezes na semana por 2 semanas. Dois dias após a última dosagem, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e dessangrados pela coleta de plasma, após o qual a deslocação cervical foi realizada e os órgãos coletados. Análise de RNA
[000300] O RNA foi extraído a partir do tecido do fígado para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis de huntingtina normal de camundongo foram medidos usando a série de sonda iniciadora de camundongo RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 32 e 33 e foram calculadas como inibição de porcentagem humana e níveis de expressão de huntingtina de murino respectivamente, relativo ao controle PBS. Tabela 32 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina humano em camundongos BACHD
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Tabela 33 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD
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[000301] Os pesos dos rins, baço, fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 34 como um percentual do controle de solução salina normalizado ao peso corporal. Tabela 34 Percentual de mudança no peso do órgão dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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Figure img0043
[000302] Para avaliar o impacto dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática dos camundongos descritos acima, concentrações de plasma de transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de ALT e AST são expressadas em IU/L e os resultados são apresentados na Tabela 35. Tabela 35
Figure img0044
Estudo 3 Tratamento
[000303] Dezoito grupos de quatro camundongos BACHD cada foram injetados intraperitonealmente com 12,5 mg/kg ou 50 mg/kg de ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, ISIS 419641, ISIS 436645, ISIS 436649, ISIS 436668, ou ISIS 436689 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de quatro camundongos BACHD foi injetado intraperitonealmente com 12,5 mg/kg de ISIS 388241 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de controle de quatro camundongos foi injetado intraperitonealmente com PBS duas vezes na semana por 2 semanas. Dois dias após a última dosagem, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e dessangrados pela coleta de plasma, após o qual a deslocação cervical foi realizada e os órgãos coletados. Análise de RNA
[000304] O RNA foi extraído a partir do tecido do fígado para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis de huntingtina normal de camundongo foram medidos usando a série de sonda iniciadora de camundongo RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 36 e 37 e foram calculadas como inibição de porcentagem humana e níveis de expressão de huntingtina de murino respectivamente, relativo ao controle PBS. Todos os oligonucleotídeos anti-sentido efetuam a inibição significante dos níveis de mRNA de huntingtina humano. ISIS 388241, ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264 e ISIS 436645 tem mais do que três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 436649 e ISIS 436689 tem três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 36 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina humano em camundongos BACHD
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Tabela 37 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD
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[000305] Os pesos dos rins, baço, fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 38 como um percentual do controle de solução salina normalizado ao peso corporal. Os camundongos tratados com ISIS 388263 e ISIS 436645 sofreram o aumento no peso do fígado na dosagem 50 mg/kg comparada ao controle PBS. Tabela 38 Percentual de mudança no peso do órgão dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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Avaliação da função do fígado
[000306] Para avaliar o impacto dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática dos camundongos descritos acima, concentrações de plasma de transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressados em IU/L e os resultados são apresentados na Tabela 39. Tabela 39 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido nos marcadores de função hepática
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Estudo 4 T ratamento
[000307] Dezoito grupos de quatro camundongos BACHD cada foram injetados intraperitonealmente com 12,5 mg/kg ou 50 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 437123, ISIS 437132, ISIS 437140, ISIS 437442, ISIS 437446, ISIS 437477, ISIS 437478, ou ISIS 437490 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de quatro camundongos BACHD foi injetado intraperitonealmente com 12,5 mg/kg de ISIS 387916 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de controle de quatro camundongos foi injetado intraperitonealmente com PBS duas vezes na semana por 2 semanas. Dois dias após a última dosagem, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e dessangrados pela coleta de plasma, após o qual a deslocação cervical foi realizada e os órgãos coletados. Análise de RNA
[000308] O RNA foi extraído a partir do tecido do fígado para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis de huntingtina normal de camundongo foram medidos usando a série de sonda iniciadora de camundongo RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 40 e 41 e foram calculadas como inibição de porcentagem humana e níveis de expressão de huntingtina de murino respectivamente, relativo ao controle PBS. ISIS 388241 e ISIS 437490 tem mais do que três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 437132 tem três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 437123 e ISIS 437140 tem dois erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 40
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Tabela 41 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD
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Medições do peso dos órgãos
[000309] Os pesos dos rins, baço, fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 42 como um percentual do controle de solução salina normalizado ao peso corporal. Tabela 42 Percentual de mudança no peso do órgão dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
Figure img0053
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Avaliação da função do fígado
[000310] Para avaliar o impacto dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática dos camundongos descritos acima, concentrações de plasma de transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressados em IU/L e os resultados são apresentados na Tabela 43. Tabela 43 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido nos marcadores de função hepática
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Estudo 5 T ratamento
[000311] Onze grupos de quatro camundongos BACHD cada foram injetados intraperitonealmente com 12,5 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ou ISIS 444661 duas vezes na semana por 2 semanas. Um grupo de controle de quatro camundongos foi injetado intraperitonealmente com solução salina tamponada por fosfato (PBS) duas vezes na semana por 2 semanas. Dois dias após a última dosagem, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e dessangrados pela coleta de plasma, após o qual a deslocação cervical foi realizada e os órgãos coletados. Análise de RNA
[000312] RNA foi extraído a partir do tecido do fígado para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Níveis de huntingtina normal de camundongo foram medidos usando a série de sonda iniciadora de camundongo RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 44 e 45 e foram calculadas como inibição de porcentagem humana e níveis de expressão de huntingtina de murino respectivamente, relativo ao controle PBS. Todos os oligonucleotídeos anti-sentido efetuam a inibição significante dos níveis de mRNA de huntingtina humano. ISIS 388241, ISIS 437507 e ISIS 443139 tem mais do que três erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 436689 tem 3 erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram a inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 44 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina humano em camundongos BACHD
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Tabela 45 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD
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[000313] Peso corporal e medições do peso dos órgãos
[000314] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos no início do estudo e subsequentemente duas vezes por semana. Os pesos corporais dos camundongos são apresentados na Tabela 46 e são expressados como um percentual de mudança nos pesos tomados no início do estudo. Os resultados indicam que o tratamento com estes oligonucleotídeos não causam qualquer reação adversa no peso corporal dos camundongos em toda parte do estudo. Tabela 46 Percentual de mudança no peso corporal dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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[000315] Os pesos dos rins, baço, fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela 47 como um percentual do controle de solução salina normalizado ao peso corporal. Tabela 47 Percentual de mudança no peso do órgão dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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Avaliação da função do fígado
[000316] Para avaliar o impacto dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática dos camundongos descritos acima, concentrações de plasma de transaminases foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de ALT e AST são expressadas em IU/L. Os níveis de plasma de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico e expressado em g/dL. Os resultados são apresentados na Tabela 48. Tabela 48 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido nos marcadores de função hepática
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Medição da função hepática
[000317] Para avaliar o impacto de Oligonucleotídeos ISIS na função hepática de camundongos descritos acima, concentrações de plasma de nitrogênio da uréia sanguínea (BUN) e creatinina foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 49 expressado em mg/dL. Tabela 49 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores de função hepática BUN Creatinina
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Medição de outros parâmetros metabólicos
[000318] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS em outras funções metabólicas em camundongos descritos acima, concentrações de plasma de glicose, colesterol e triglicerídeos foram medidos usando um analisador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 50 expressado em mg/dL e demonstram que o tratamento com estes oligonucleotídeos não causam qualquer reação adversas no nível destes marcadores metabólicos entre o controle e os grupos de tratamento. Tabela 50 Efeito do tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido nos marcadores metabólicos
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Exemplo 4: Administração de bolo de oligonucleotídeos anti-sentido contra mRNA de huntingtina ao estriado dos camundongos BACHD
[000319] Os camundongos BACHD foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de bolo a uma área cerebral de camundongo definida, o estriado, para o propósito da avaliação da atividade dos oligonucleotídeos no tecido cerebral contra mRNA humano e camundongo de expressão de huntingtina. Tratamento e cirurgia
[000320] Grupos de quatro camundongos BACHD cada foram administrados com ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 ou ISIS 444663 liberado como uma injeção de bolo a 3 μg, 10 μg ou 25 μg concentrações no estriado.
[000321] Um grupo de controle de 4 camundongos BACHD foram similarmente tratados com PBS. ISIS 388241 foi administrado em sete grupos de 4 camundongos cada e os resultados apresentados são a média dos dados derivados a partir de 28 camundongos. ISIS 419628 foi administrado em 2 grupos de 4 camundongos BACHD cada e os resultados apresentados são a média dos dados derivados a partir de 8 camundongos. Sete dias após a administração de bolo, os camundongos foram submetidos a eutanásia usando isoflurano e os órgãos foram removidos. Os animais foram decapitados e o cérebro foi removido para dissecação do tecido estriatal. Análise de RNA
[000322] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis normais de camundongo de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633. Os resultados para os níveis de mRNA de huntingtina humano são apresentados na Tabela 51 e são expressados como percentual de inibição comparada ao grupo PBS de controle. Todos os oligonucleotídeos anti-sentido efetuam a inibição dependente da dosagem dos níveis de mRNA de huntingtina humano. Os resultados para os níveis de mRNA de huntingtina de murino são apresentados na Tabela 52 e são expressados como percentual de inibição comparada ao grupo PBS de controle.
[000323] As dosagens efetivas (ED50) de cada oligonucleotídeo para mRNA de huntingtina humano e mRNA de huntingtina de camundongo foram calculadas pela plotagem das concentrações de ‘’oligonucleotídeos usados versus o percentual de inibição da expressão dos níveis de mRNA de huntingtina de espécies e observando-se as concentrações em que 50 % de inibição de expressão de mRNA de huntingtina foi atingida para cada espécie comparada aos controles correspondentes. O ED50 (μg) para cada oligonucleotídeo anti-sentido também é apresentado nas Tabelas 51 e 52 para mRNA de huntingtina de murino e humano respectivamente.
[000324] ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139 e ISIS 444584 são cada um mal combinados pelos 8 pares de bases ou mais com mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 437168 e ISIS 437441 tem 2 erros cada com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 436689 tem 3 erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram a inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 51 Percentual de inibição dos níveis de mRNA de huntingtina humano in vivo e ED50 dos oligonucleotídeos anti-sentido
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Tabela 52 Percentual de inibição dos níveis de mRNA de huntingtina de murino em vivo e ED50 dos oligonucleotídeos anti-sentido
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[000325] Os dez compostos marcados com um asterisco tem um ED50 melhorado em ISIS 388241.
[000326] Exemplo 5: Ensaio para efeitos neurotóxicos de administração de bolo de oligonucleotídeos anti-sentido no tecido estriatal de ratos
[000327] Cerca de 30 compostos foram selecionados como tendo tolerabilidade alta e potência alta. Os compostos foram então testados pela injeção de bolo SNC no rato ainda para avaliar a neurotoxicidade.
[000328] Os ratos Sprague-Dawley cada foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de bolo a uma área cerebral definida, o estriado, para o propósito da avaliação para a introdução do marcador microglial AIF1 como uma medição da toxicidade SNC.
Tratamento e cirurgia
[000329] Os grupos de quatro ratos Sprague-Dawley foram administrados com ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 4196671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 443168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, ou ISIS 444663 liberado como uma injeção de bolo na concentração de 50 μg no estriado.
[000330] Um grupo de controle de 4 ratos foram similarmente tratados com PBS. Um grupo de 4 ratos foram similarmente tratados com ISIS 104838, um oligonucleotídeo anti-sentido contra TNF- , como um grupo de controle negativo. ISIS 387916 foi administrado em quatro grupos de 4 ratos cada e os resultados apresentados são uma média dos dados derivados a partir de 16 rato. ISIS 419628 foi administrado em dois grupos de 4 ratos cada e os resultados apresentados são a média dos dados a partir de 8 ratos. ISIS 419629, ISIS 444584 e ISIS 444618, que tem indicadores tóxicos no estudo de administração sistêmico (Exemplo 3) também foram testados neste estudo. Sete dias após administração de bolo, os ratos foram submetidos a eutanásia usando isoflurano e os órgãos foram removidos. Os animais foram decapitados e o cérebro foi removido para dissecação do tecido estriatal. Análise de RNA dos níveis de expressão AIF1
[000331] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA AIF1. Os níveis AIF1 de rato foram medidos usando a série de sonda iniciadora de rato rAif1_LTS00219 (sequência avançada AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, projetado neste como SEQ ID N°: 46; sequência reversa CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, projetado neste como SEQ ID N°: 47; sequência de sonda CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX, projetado neste como SEQ ID N°: 48). Os resultados foram calculados como a porcentagem de expressão AIF1 naquele do controle PBS e são apresentados na Tabela 53. ISIS 419629, ISIS 444584 e ISIS 444618, que tem indicadores tóxicos no estudo de administração sistêmico (no Exemplo 3), também tem indicadores tóxicos neste estudo (maior do que 300 % de controle de solução salina acima). Estudos tardios mostram que ISIS 444584 é neurotolerável e exibem indicadores tóxicos negligíveis (ver Exemplo 16 e 17). Tabela 53 Percentual da expressão dos níveis de mRNA AIF1 in vivo como uma medição da neurotoxicidade
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Análise de RNA de níveis de expressão de huntingtina
[000332] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os níveis de mRNA de huntingtina de rato foram medidos usando a série de sonda iniciadora de rato rHtt_LTS00343 (sequência avançada CAGAGCTGGTGAACCGTATCC, projetado neste como SEQ ID N°: 49; sequência reversa GGCTTAAGCAGGGAGCCAAAA, projetado neste como SEQ ID N°: 50; sequência de sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, projetado neste como SEQ ID N°: 51). Os resultados foram calculados como a porcentagem de redução da expressão de huntingtina naquele do controle PBS e são apresentados na Tabela 54. ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507 e ISIS 443139 são cada um mal combinados por 6 pares de base ou mais com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 437442, ISIS 444615 e ISIS 444627 tem 1 erro cada um com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e não mostram inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. ISIS 437168 e ISIS 437441 tem 2 erros cada com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e não mostram inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. ISIS 436689 e ISIS 444584 tem 3 erros cada com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e não mostram inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. Tabela 54 Percentual de redução dos níveis de mRNA de huntingtina de rato em ratos
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Exemplo 6: Administração intracerebroventricular dos oligonucleotídeos anti-sentido contra mRNA de huntingtina - estudo de tolerabilidade em camundongos BACHD
[000333] Os compostos selecionados foram comparados com compostos previamente projetados ISIS 388241 pela administração ICV em camundongos BACHD.
[000334] Os compostos selecionados mais a marca de referência 388241 foram selecionados com base na potência sistêmica e in vitro e tolerabilidade sistêmica bem como Potência SNC e tolerabilidade.
[000335] Os camundongos BACHD foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) a uma área cerebral de camundongo definida, no ventrículo lateral direito, para o propósito da avaliação da tolerabilidade da dosagem ICV em camundongos. Tratamento e cirurgia
[000336] Os grupos de cinco camundongos BACHD cada foram administrados ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 444591, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 444661, ou ISIS 436689 a 150 μg/dia liberado ICV com bombas Alzet 2002 na taxa de 12 μL/dia por 2 semanas. Um grupo de controle de 4 camundongos BACHD foram similarmente tratados com PBS. Os camundongos foram cirurgicamente implantados com as bombas na seguinte maneira: Os camundongos foram individualmente anestesiados com 3 % de isoflurano para a implantação de bomba. Após duas semanas, os camundongos foram anestesiados novamente e a bomba foi cirurgicamente removida. Os animais foram então deixados recuperar por mais de duas semanas antes de ser submetido a eutanásia.
[000337] Os pesos corporais dos camundongos foram tomados semanalmente durante o tratamento e períodos de recuperação. Após 4 semanas, os camundongos foram submetidos a eutanásia usando isoflurano e decapitado. O cérebro foi removido para aquisição do tecido a partir das seções posteriores e anteriores. Análise de RNA
[000338] O RNA foi extraído a partir do hemisférico direito do córtex anterior e a seção cerebelar posterior do local de canulação para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis normais de camundongo de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633. Os resultados foram calculados como inibição de porcentagem de humano e expressão de mRNA de huntingtina de murino comparados ao controle e são apresentados nas Tabelas 56 e 57 respectivamente. Todos os oligonucleotídeos anti-sentido efetuam a inibição significante dos níveis de mRNA de huntingtina humano. ISIS 388241, ISIS 437507 e ISIS 443139 são cada um mal combinados pelos 8 pares de bases ou mais com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 444591 tem 1 erro com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram a inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. ISIS 436689 tem 3 erros com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e não mostram a inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 56 Percentual de redução dos níveis de mRNA de huntingtina humano em camundongos BACHD por intermédio da administração ICV dos oligonucleotídeos anti-sentido
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Tabela 57 Percentual de redução dos níveis de mRNA de huntingtina de murino em camundongos BACHD por intermédio da administração ICV dos oligonucleotídeos anti-sentido
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Medição de peso corporal
[000339] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos no início do estudo e subsequentemente uma vez por semana. Os pesos corporais dos camundongos são apresentados na Tabela 58 e são expressados como um percentual de mudança nos pesos tomados no início do estudo. Os pesos corporais foram considerados uma medição da tolerabilidade dos camundongos à administração ICV do oligonucleotídeo anti-sentido. ‘n.d.’ significa que não existe dados disponíveis por aquele do período de tempo. Tabela 58 Percentual de mudança no peso corporal dos camundongos BACHD durante tratamento oligonucleotídeo anti-sentido
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Sobrevivência dos camundongos
[000340] A sobrevivência dos camundongos foi avaliada em toda parte do período de estudo total. Tabela 59 abaixo mostra o modelo de sobrevivência nos grupos dos camundongos tratados com oligonucleotídeos ISIS bem como o controle. Tabela 59 Número de sobrevivências durante tratamento oligonucleotídeo anti- sentido
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Exemplo 7: Administração inl racerebroventricular dos oligonucleotídeos anti-sentido contra huntingtina em camundongos C57/BL6
[000341] Os camundongos C57/BL6 de tipo selvagem foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) a uma área cerebral de camundongo definida, no ventrículo lateral direito, para o propósito da avaliação da potência dos oligonucleotídeos contra huntingtina de camundongo nestes camundongos. Tratamento e cirurgia
[000342] Os grupos de dez camundongos C57/BL6 cada foram administrados ISIS 408737 (5’ TCCTAGTGTTACATTACCGC 3’ (SEQ ID N°: 52), local de partida 5263 da SEQ ID N°: 3) a 50 μg/dia liberado ICV com bombas Alzet 2002 na taxa de 0,5 μL/dia por 7 dias ou 14 dias. Um grupo de controle de seis camundongos C57/BL6 foram similarmente tratados com PBS. Os camundongos foram cirurgicamente implantados com as bombas na seguinte maneira: Brevemente, bombas osmóticas Alzet (Model 2002) foram reunidas de acordo com as instruções do fabricante. As bombas foram enchidas com uma solução contendo o oligonucleotídeo anti-sentido e incubado durante a noite a 37° C, 24 horas antes da implantação. Os animais foram anestesiados com 3 % de isofluorano e colocado em uma estrutura estereotática. Após esterilizar o local da cirurgia, uma incisão de linha média foi feita na cabeça e a bolsa subcutânea foi criada no dorso, em que uma bomba osmótica pré-enchida foi implantada. Um orifício de broca pequena foi feito através na cabeça acima no ventrículo lateral direito. Uma cânula, conectada a bomba osmótica por intermédio de um catéter plástico, foi então colocado no ventrículo e colado no lugar usando o adesivo Loctite. A incisão foi fechada com suturas. O oligonucleotídeo anti-sentido ou PBS foi submetido por infusão por 7 ou 14 dias, após o qual os animais foram submetidos a eutanásia de acordo com o protocolo humano aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee. O cérebro e o tecido da medula espinhal e foram coletados e congelado rapidamente no nitrogênio líquido. Antes do congelamento, tecido cerebral foi cortado transversalmente em cinco seções (S1, S2, S3, S4 e S5) usando uma matriz cerebral de camundongo. Seções 1 a 5 foram aproximadamente 2 mm a parte de cada um outro com S1 sendo mais rostral e mais S5 caudal. RNA e análise de proteína
[000343] O RNA total foi extraído a partir do cérebro do camundongo e medula espinhal com kit RNeasy Protect Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina usando um kit RNeasy Mini prep (Qiagen). As reações Q-PCR foram conduzidas e analisadas em um detector da sequência ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os níveis de mRNA de camundongo de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino ABI # Mm01213820_m1 (Applied Biosystems) e normalizados a níveis de mRNA de isomerase A de peptidilpropil. Os lisados de proteína foram preparados a partir das placas cerebrais do camundongo como previamente descrito (Li S.H. and Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217:1940-6029). Os lisados foram realizados em 3 a 8% de gel de tris-acetato e transferido usando o sistema de blotting seco iBlot (Invitrogen). Blots foram sondados com anti-beta tubulina (Chemicon) e anticorpo MAB2166 monoclonal (Millipore) que reage especificamente com proteína de huntingtina de murino. Immunoblots foram quantificados usando software Odyssey V3.0.
[000344] Os resultados são apresentados na Tabela 60 como percentual da redução comparada ao controle PBS e demonstram inibição significante de mRNA de huntingtina e os níveis de proteína do oligonucleotídeo anti-sentido tanto no dia 7 quanto no dia 14. Tabela 60
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Exemplo 8: Adminisl ração intracerebroventricular dos oligonucleotídeos anti-sentido contra mRNA de huntingtina nos macacos cinomólgos
[000345] Os macacos cinomólgos foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) a uma área cerebral definida, os ventrículos laterais, para o propósito da avaliação da atividade dos oligonucleotídeos no tecido cerebral contra expressão de mRNA de huntingtina. Tratamento e cirurgia
[000346] Dois grupos de 3 macacos cinomólgos cada foram administrados 0,635 mg/ml (1,5 mg/dia) ou 1,67 mg/ml (4 mg/dia) de ISIS 436689 liberado ICV com bombas ambulatoriais individuais (Pegasus Vario) na taxa de 0,05 ml/hora por 4 semanas. Um grupo de controle de 2 macacos cinomólgos foram administrados com PBS em uma maneira similar. Os grupos foram administrados ISIS 436689 bilateralmente. Um animal foi administrado ISIS 436689 na dosagem 4 mg/dia unilateral ao ventrículo direito.
[000347] Os animais foram deixados 10 dias para recuperar a partir da cirurgia antes da infusão sendo realizada. Durante o período de recuperação pós-cirurgia, os animais foram mantidos na infusão PBS ICV em uma taxa de fluxo de 0,05 mL/h usando uma bomba de infusão ambulatória por ventrículo. No final do período de recuperação, cada cânula foi conectada a uma bomba ambulatorial individual (Pegasus Vario) colocada dentro da bolsa primata (Lomir, PJ-02NB). As bombas permanecem conectadas até a finalização do período de infusão. Após 4 semanas de administração, os animais foram submetidos a eutanásia e o cérebro, fígado e rins foram coletados. Análise de RNA de htt mRNA
[000348] O RNA foi extraído a partir do caudado anterior, caudado posterior, córtex temporal, córtex parietal, hipotálamo, cérebro médio, hipocampos e medulas espinhais, bem como o fígado e rim para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617 e normalizados aos níveis de ciclofilina A de macaco. Os resultados foram calculados como inibição de porcentagem da expressão de mRNA de huntingtina comparada ao controle PBS e são apresentados na Tabela 61. ISIS 436689 efetuado a inibição significante dos níveis de mRNA de huntingtina humano no SNC. Tabela 61
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Exemplo 9: Medição da vida média de ISIS 387898 no estriado dos camundongos C57/BL6 por intermédio da administração de bolo simples
[000349] Os camundongos C57/BL6 foram administrados ISIS 387898 como um bolo simples ao estriado para o propósito da medição da vida-média e duração da ação do oligonucleotídeo anti- sentido contra expressão de mRNA de huntingtina naquele tecido. Tratamento
[000350] Quarenta camundongos C57/BL6 foram tratados com ISIS 387898 (5’ CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3’ (SEQ ID N°: 53); posição de partida 4042 da SEQ ID N°: 1 e posição de partida 4001 da SEQ ID N°: 3) liberado como um bolo simples de 50 μg em um procedimento similar aqueles descritos no Exemplo 5. Oito camundongos de controle C57/BL6 foram tratados com PBS em um procedimento similar. Os grupos de 4 camundongos cada foram submetidos a eutanásia em vários pontos de tempo e tecido estriatal extraído em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 5. Análise de RNA
[000351] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os níveis normais de camundongo de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633. Os resultados são apresentados na Tabela 62 e são expressados como percentual de inibição comparada ao grupo PBS de controle no dia 7. O efeito inibidor de ISIS 387898 foi observado a ser prolongado por pelo menos 91 dias. Tabela 62 Efeito de ISIS 387898 como a administração de bolo simples na expressão de mRNA de huntingtina de murino em vários pontos de tempo no estriado C57/BL6
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Análise da concentração de oligonucleotídeo anti-sentido no cérebro:
[000352] Os tecidos cerebrais foram cortados em pedaços, pesados, homogeneizados e extraídos usando um método de extração líquido - clorofórmio líquido/fenol. Este foi seguido pela extração de fase sólida do sobrenadante em uma coluna ligada por fenila antes da injeção eletrocinética de eletroforese em gel capilar. Um instrumento de eletroforese capilar P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) foi usado para a análise eletroforética capilar enchida com gel. Os picos de oligonucleotídeos foram detectados pela absorbância UV a 260 nm.
[000353] A concentração de ISIS 387898 no cérebro (μg/g) foi plotado contra a expressão da huntingtina humana como uma porcentagem do controle PBS (Tabela 63 e figura 1). A concentração de ISIS 387898 que atingiu 50 % de inibição de expressão de mRNA de huntingtina (EC50) foi calculado. O EC50 foi determinado a ser 0,45 μg/g. A concentração dependente do tempo de ISIS 387898 no cérebro tecido e porcentagem correspondente de expressão de mRNA de huntingtina também foi plotado (Tabela 64 e figura 2) e a vida média de oligonucleotídeo foi calculado como 21 dias. Tabela 63
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Tabela 64 Concentração dependente do tempo de ISIS 387898 no tecido cerebral e seu efeito na expressão htt mRNA como uma porcentagem do controle
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Exemplo 10: Medição da vida média de ISIS 387898 nos ventrículos laterais dos camundongos BACHD pela administração de ICV
[000354] Os camundongos BACHD foram administrados ISIS 387898 para ICV aos ventrículos laterais do cérebro para o propósito da medição da vida-média e duração da ação do oligonucleotídeo anti- sentido contra expressão de mRNA de huntingtina naquele tecido. Tratamento
[000355] Vinte e oito camundongos BACHD foram tratados com ISIS 387898 liberados pela administração ICV a 75 μg/dia por 2 semanas em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Vinte e oito camundongos de controle BACHD foram tratados com PBS em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Os grupos de 4 camundongos cada um de tanto o tratamento quanto os grupos de controle foram submetidos a eutanásia nos pontos de tempo bisemanalmente e tecido cortical anterior extraído em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Análise de RNA
[000356] O RNA foi extraído a partir do hemisfério direito, tanto anterior quanto posterior ao local de canulação para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os níveis normais de camundongo de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633. Os níveis de expressão de mRNA de huntingtina mutantes humanos são apresentados na Tabela 65 e são expressados como percentual de inibição comparada a média daquele medido nos grupos de controle PBS. Os níveis de expressão de mRNA de huntingtina normais de murino são apresentados na Tabela 66 e são expressados como percentual de inibição comparada a média daquele medido nos grupos de controle PBS. O efeito inibidor de ISIS 387898 foi observado a ser prolongado por 91 dias. Tabela 65
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Tabela 66 Efeito de ISIS 387898 administrado ICV na expressão de mRNA de huntingtina de murino em vários pontos de tempo
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Análise da concen tração de oligonucleotídeo anti-sentido no cérebro:
[000357] O tecido cerebral foi processado em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. A concentração de ISIS 387898 no córtex do cérebro anterior (μg/g) foi plotado contra a inibição de huntingtina humana como uma porcentagem do controle PBS (Tabela 67 e figura 3) e o EC50 foi calculado a ser 26,4 μg/g. A concentração dependente do tempo de ISIS 387898 no cérebro tecido também foi plotado (Tabela 68 e figura 4) e a vida média de oligonucleotídeo foi calculado como 21 dias. Tabela 67
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Tabela 68 Concentração dependente do tempo de ISIS 387898 no tecido cerebral e seu efeito na expressão htt mRNA como uma porcentagem do controle
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Exemplo 11: Medição da vida média de ISIS 388241 e ISIS 443139 nos ventrículos laterais dos camundongos BACHD pela administração de ICV
[000358] Os camundongos BACHD foram administrados ISIS 388241 ou ISIS 443139 por ICV aos ventrículos laterais do cérebro para o propósito da medição da vida-média e duração da ação do oligonucleotídeo anti-sentido contra expressão de mRNA de huntingtina naquele tecido. Tratamento
[000359] Vinte camundongos BACHD foram tratados com ISIS 38241 liberados pela administração ICV a 50 μg/dia por 2 semanas em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Vinte camundongos BACHD foram tratados com ISIS 443139 liberados pela administração ICV a 50 μg/dia por 2 semanas em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Vinte camundongos de controle BACHD foram tratados com PBS em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. Os grupos de 4 camundongos cada de tanto os grupos de tratamento quanto grupo de controle foram submetidos a eutanásia nos pontos de tempo bisemanalmente e tecido extraído em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9.
Análise de RNA
[000360] O RNA foi extraído a partir do hemisfério direito, tanto anterior quanto posterior ao local de canulação para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2617. Os resultados são apresentados na Tabela 69 e são expressados como percentual de inibição comparada a média daquele medido nos grupo de controle PBS. Os efeitos inibidores tanto do ISIS 388241 quanto ISIS 443139 foram observados a serem prolongados por pelo menos 16 semanas.
[000361] Tanto ISIS 388241 quanto seu equivalente de cadeia principal misturado, ISIS 443139, tem mais do que 3 erros com mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 5) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle. Tabela 69 Efeito de ISIS 388241 e ISIS 443139 administrado ICV na expressão mRNA de huntingtina humano em vários pontos de tempo
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Análise da concentração de oligonucleotídeo anti-sentido no cérebro:
[000362] O tecido cerebral foi processado em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 9. A concentração dependente do tempo de ISIS 388241 no tecido cerebral posterior foi plotado (Tabela 70 e figura 5) e a vida média de oligonucleotídeo foi calculada como 20 dias. A concentração dependente do tempo de ISIS 443139 no tecido cerebral posterior foi plotado (Tabela 71 e figura 6) e a vida média de oligonucleotídeo foi calculado como 20 dias. Tabela 70 Concentração de ISIS 384241 no tecido cerebral e seu efeito na expressão htt mRNA como uma porcentagem do controle
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Tabela 71 Concentração de ISIS 443139 no tecido cerebral e seu efeito na expressão htt mRNA como uma porcentagem do controle
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Exemplo 12: Efeito da inibição anti-sentido de huntingtina mutante humana no desempenho motor dos camundongos BACHD
[000363] Os camundongos BACHD foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) para o propósito da avaliação do efeito de oligonucleotídeos contra expressão de mRNA de huntingtina em seu desempenho motor por intermédio do ensaio rotarod. T ratamento
[000364] A aceleração do ensaio rotarod foi realizado no Ugo Basile rotarod. Os animais foram colocados no rotarod em uma velocidade de 2 RPM, o rotarod acelerado a 40 RPM em 5 minutos. A duração até a queda ser registrada. A duração até a queda é definida pelo animal que cai a partir do rotarod, ou que para de andar, inclinando-se no rotarod e rotacionando-o. Os camundongos de 6 meses de idade BACHD e suas ninhadas não transgênicas foram treinados a correr no rotarod por uma semana antes do tratamento. Este consiste de três ensaios consecutivos de 5 minutos cada, com um período restante de 20 minutos entre os ensaios. Um grupo de 15 camundongos BACHD foram então tratados com ISIS 388241 a 50 μg/dia liberado ICV com bombas Alzet 2002 na taxa de 12 μL/dia por 2 semanas. Os camundongos foram cirurgicamente implantados com as bombas em um procedimento similar como aquele descrito no Exemplo 6. Um grupo de controle de 14 camundongos BACHD foram tratados com PBS em uma maneira similar. Um grupo de controle de 9 ninhadas não transgênicas foram tratados com PBS em uma maneira similar.
Ensaio de desempenho no Rotarod
[000365] No final do período de tratamento, as bombas foram removidas e duas semanas posteriores, o primeiro rotarod de pós- tratamento foi conduzido. Comportamento Rotarod foi analisado mensalmente até os camundongos terem 11 meses de idade. Cada mês, os animais foram colocados no rotarod por três ensaios realizados no dia por 2 dias. Os resultados são apresentados na Fig. 7, bem como na Tabela 72 expressados como uma duração até a queda em segundos. Os valores de linha de base a 6 meses de idade foram tomados antes do tratamento e os pontos de tempo dados são a idade dos camundongos em que o ensaio foi conduzido. Os dados indicam que o tratamento dos camundongos BACHD com ISIS 388241 aumenta a duração até a queda comparada aquele observado nos camundongos BACHD não tratados. Tabela 72 Efeito da inibição anti-sentido de mRNA de huntingtina mutante em uma duração até a queda (sec)
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Exemplo 13: Efeito da inibição anti-sentido de huntingtina mutante humana e mRNA de huntingtina de murino de tipo selvagem no desempenho motor dos camundongos BACHD
[000366] Os camundongos BACHD foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) para o propósito da avaliação do efeito de oligonucleotídeos contra expressão de mRNA de huntingtina em seu desempenho motor por intermédio do ensaio rotarod. T ratamento
[000367] A aceleração do ensaio rotarod foi realizado no Ugo Basile rotarod. Os animais foram colocados no rotarod em uma velocidade de 2 RPM, o rotarod acelerado a 40 RPM em 5 minutos. A duração até a queda foi registrada. A duração até a queda é definida pelo animal que caia partir do rotarod ou que para de correr no rotarod, que inclina-se no rotarod e o rotaciona. Os camundongos BACHD de dois meses de idade e seus ninhadas não transgênicas foram treinados a correr no rotarod por uma semana antes do tratamento. Este consiste de três ensaios consecutivos de 5 minutos cada, com um período de repouso de 20 minutos entre os ensaios. Os grupos de 17-21 de camundongos BACHD cada foram então tratados com ISIS 388241 a 50 μg/dia, ISIS 408737 a 75 μg/dia, ou ISIS 387898 a 75 μg/dia, liberado ICV com bombas Alzet 2002 na taxa de 0,5 μL/hora por 2 semanas. Os camundongos foram cirurgicamente implantados com as bombas em um procedimento similar aqueles descritos no Exemplo 6. Um grupo de controle de 20 camundongos BACHD foram tratados com PBS em uma maneira similar. Os camundongos de controle de grupos não transgênicos também foram similarmente tratados com oligonucleotídeos ISIS ou PBS em uma maneira similar. Ensaio de desempenho Rotarod
[000368] No final do período de tratamento, as bombas foram removidas e duas semanas posteriores, o primeiro rotarod de pós- tratamento foi conduzido. Comportamento Rotarod foi analisado mensalmente até os camundongos terem 10 meses de idade. Cada mês, os animais foram colocados no rotarod por 3-5 ensaios realizados no dia por 3 dias consecutivos. Os resultados são apresentados na Tabela 73 expressados como uma duração até a queda em segundos. Os valores de linha de base a 2 meses de idade foram tomados antes do tratamento e os pontos de tempo dados são a idade dos camundongos em que o ensaio foi conduzido. ISIS 387898 (projetado na tabela como ASO camundongo-humano) é cruzado reativo tanto para o camundongo quanto mRNA de huntingtina humano e a refore deve inibir tanto o mRNA de huntingtina mutante humano quanto mRNA de huntingtina de murino de tipo selvagem nos camundongos. ISIS 388241 (projetado na tabela como ASO humano) especificamente alveja mRNA de huntingtina humano e é mal combinado pelos 8 pares de bases com mRNA de huntingtina de murino. Portanto, ISIS 388241 inibirá especificamente apenas mRNA de huntingtina mutante humano e não mRNA de huntingtina de murino de tipo selvagem nos camundongos. ISIS 408737 (projetado na tabela como ASO de camundongo) especificamente alveja mRNA de huntingtina de murino e é mal combinado por 7 pares de base com mRNA de huntingtina humana. Portanto, ISIS 408737 inibirá especificamente apenas mRNA de huntingtina de murino de tipo selvagem e não mRNA de huntingtina mutante humano nos camundongos. ‘Tg’ indica os camundongos BACHD e ‘não Tg’ indicam os camundongos de controle não transgênicos.
[000369] Os resultados do estudo indicam que a inibição de mRNA de huntingtina mutante humano por ISIS 388241 (Tg-ASO humano) significantemente melhora o desempenho dos camundongos no ensaio rotarod comparados ao controle (Tg-PBS). Os resultados também indicam aquele tratamento de camundongos com ISIS 387898 (Tg-humano-camundongo ASO), que alveja tanto o mRNA de huntingtina nos camundongos mutante quanto de tipo selvagem, não causam quaisquer efeitos nocivos no desempenho motor dos camundongos e, de fato, também significantemente desempenho rotarod melhorado comparados ao controle (Tg-PBS). Os camundongos tratados com ISIS 408737 (Tg-camundongo ASO) não mostram desempenho rotarod melhorado comparado ao controle PBS, como esperado, visto que o oligonucleotídeo não alveja o mRNA de huntingtina mutante. Os controles não transgênicos foram utilizados como controles positivos neste ensaio. Tabela 73 Efeito da inibição anti-sentido de mRNA de huntingtina em uma duração até a queda (sec)
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Exemplo 14: Efeito da inibição anti-sentido de mRNA de huntingtina na massa cerebral dos camundongos R6/2
[000370] Camundongos R6/2 foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) para o propósito da avaliação do efeito de oligonucleotídeos contra expressão de mRNA de huntingtina no peso cerebral e volume. T ratamento
[000371] Os camundongos R6/2 foram alojados em grupos de até 5 por gaiola (genotipos misturados, sexo simples). Todos os camundongos foram alojados em gaiolas caixa de sapato com forragem de madeira estéril revestindo o desenvolvimento daquele e foram mudados tão frequentemente quanto necessário para fornecer aos animais forragem seca. Este ambiente básico foi enriquecido com a adição de tunéis de divertimento, ninho de retalhos e ossos plásticos para todos os camundongos; isto é, uma gaiola ambientalmente enriquecida contendo um tunel de camundongo, (cor de âmbar, certificado, transparente, produto BioServ # K3323), um Petite Green Gumabone (produto BioServ # K3214) e um ninho (Hockley et al., Ann Neurol. 2002, 51: 235-242). O alimento e água foram disponíveis ad libitum aos camundongos em suas gaiolas de origem.
[000372] Um grupo de dez camundongos R6/2 de seis meses de idade foi administrado 50 μg/dia de ISIS 388817 liberado ICV com bombas Alzet 1004 na taxa de 0,12 μl/hora por 4 semanas. Um grupo de dois ninhadas não transgênicas foi administrado 50 μg/dia de ISIS 388817 liberado em uma maneira similar. Um grupo de controle de cinco camundongos R6/2 foi administrado 50 μg/dia de ISIS 141923 liberado em uma maneira similar. Um grupo de controle de nove camundongos R6/2 foi administrado PBS liberado em uma maneira similar. Um grupo de oito ninhadas não transgênicas foi administrado PBS liberado em uma maneira similar. Um grupo de quatro R6/2 pré- sintomáticos de oito semanas de idade não tratado também foram incluídos no estudo. Medição do peso cerebral
[000373] Os animais foram anestesiados com isofluorano e então submetido a perfusão transcardial com tampão de fosfato Sorenson gelado (SPB) e fixado com 4 % de paraformaldeído em SPB. Os cérebros foram removidos e preparados com cortes coronais imediatamente rostral ao prosencéfalo (removendo os bulbos olfativos) e imediatamente caudal ao cerebelo (removendo a medula espinhal). O cérebro remanescente foi pesado em mg. Os resultados são apresentados na Fig. 8 e Tabela 74 e demonstram o aumento no peso cerebral nos camundongos R6/2 tratados com ISIS 388817 comparados ao PBS de controle Tabela 74 Efeito da inibição anti-sentido de mRNA de huntingtina mutante no peso cerebral (mg)
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Exemplo 15: Efeito da inibição anti-sentido de mRNA de huntingtina no desempenho de ansiedade de camundongos YAC128
[000374] Os camundongos YAC128 foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) para o propósito da avaliação do efeito de oligonucleotídeos contra expressão de mRNA de huntingtina na ansiedade nestes camundongos como medido por seu desempenho no campo de abertura e elevado mais ensaios de labirinto. T ratamento
[000375] Um grupo de sete camundongos YAC128 de cinco meses de idade foi administrado 50 μg/dia de ISIS 388241 liberado ICV com bombas Alzet 1004 na taxa de 0,5 μl/hora por 14 dias. Um grupo de controle de quatro camundongos YAC128 foram similarmente tratados com PBS. Um grupo de controle de oito ninhadas FVB/NJ não transgênicas foram incluídos no estudo e não recebem qualquer tratamento. Os camundongos foram cirurgicamente implantados com as bombas na seguinte maneira: Brevemente, bombas osmóticas Alzet (Model 2002) foram reunidas de acordo com as instruções do fabricante. As bombas foram enchidas com uma solução contendo o oligonucleotídeo anti-sentido e incubado durante a noite a 37° C, 24 horas antes da implantação. Os animais foram anestesiados com 3 % de isofluorano e colocado em uma estrutura estereotática. Após esterilizar o local da cirurgia, uma incisão de linha média foi feita na cabeça e a bolsa subcutânea foi criada no dorso, em que uma bomba osmótica pré-enchida foi implantada. Um orifício de broca pequena foi feito através da cabeça acima no ventrículo lateral direito. Uma cânula, conectada a bomba osmótica por intermédio de um catéter plástico, foi então colocado no ventrículo e colado no lugar usando o adesivo Loctite. A incisão foi fechada com suturas. O oligonucleotídeo anti- sentido ou PBS foi submetido por infusão por 14 dias, após o qual as bombas foram removidas. Os animais foram deixados para recuperar por 2 semanas após análise de comportamento foi feito e os camundongos foram finalmente submetidos a eutanásia de acordo com o protocolo humano aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee. O cérebro e o tecido da medula espinhal e foram coletados e congelado rapidamente no nitrogênio líquido. Antes do congelamento, o tecido cerebral foi cortado transversalmente em cinco seções (S1, S2, S3, S4 e S5) usando uma matriz cerebral de camundongo. As seções 1 a 5 foram aproximadamente 2 mm a parte de cada um outro com S1 sendo mais rostral e mais S5 caudal. Ensaio de campo de abertura
[000376] Os camundongos foram colocados em uma arena de campo de abertura (Med Associates) que usam photobeam breaks para medir o movimento horizontal e vertical em um sessão teste de 30 minutos. O dado foi analisado usando atividade de software Monitor para examinar o movimento ambulatorial total dentro da arena e movimento dentro do centro da arena como uma medição da ansiedade. Os camundongos de controle YAC128 foram esperados para gastar menos tempo no centro da arena comparada com a sua ninhada FVB/NJ propenso menos a ansiedade, não transgênica. Os resultados são apresentados na Fig. 9 e Tabela 75 e indicam que tratamento dos camundongos YAC128 com ansiedade diminuída de oligonucleotídeo anti-sentido nestes camundongos, de acordo com os parâmetros do ensaio de campo de abertura. Tabela 75 Efeito da inibição anti-sentido de htt mRNA mutante no desempenho do campo de abertura de camundongos YAC128
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[000377] O mecanismo que consiste de dois braços abertos e dois braços fechados cada um medindo 65 x 6,25 cm e 50 cm elevado acima do solo. Os camundongos foram colocados no centro do mecanismo e sua localização foi registrada em uma sessão de teste de 5 minutos. Os camundongos de controle YAC128 foram esperados para gastar menos tempo nos braços abertos do mecanismo comparado a suas ninhadas FVB/NJ menos propensas à ansiedade, não transgênico. Os resultados são apresentados na Fig. 10 e Tabela 76 e indicam que o tratamento dos camundongos YAC128 com ansiedade diminuída pelo oligonucleotídeo anti-sentido nestes camundongos, de acordo com os parâmetros do elevado mais ensaio de labirinto. Tabela 76
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[000378] O RNA total foi extraído a partir do cérebro do camundongo e medula espinhal com kit RNeasy Protect Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina usando um kit RNeasy Mini prep (Qiagen). As reações Q-PCR foram conduzidas e analisadas em um detector da sequência ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os níveis de mRNA de huntingtina humano foram medidos usando uma série de sonda iniciadora humana RTS2686 e normalizados a níveis de mRNA de isomerase A de peptidilpropil.
[000379] Os lisados de proteína foram preparados a partir das placas cerebrais do camundongo como previamente descrito (Li S.H. and Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217:1940-6029). Os lisados foram realizados em 3 a 8% de gel de tris-acetato e transferido usando o sistema de blotting seco iBlot (Invitrogen). Blots foram sondados com anti-beta tubulina (Chemicon) e anticorpo EM48 monoclonal de camundongo que reage especificamente com proteína de huntingtina humana (Millipore). Immunoblots foram quantificados usando Software Odyssey V3.0.
[000380] Os resultados são apresentados na Tabela 77 como percentual da redução comparada ao controle PBS e demonstram inibição significante de mRNA de huntingtina e os níveis de proteína do oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 77
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Exemplo 16: Administração intracerebroventricular dos oligonucleotídeos anti-sentido contra huntingtina em camundongos C57/BL6
[000381] Os camundongos C57/BL6 foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de intracerebroventricular (ICV) no ventrículo lateral direito, para o propósito da avaliação da tolerabilidade dos oligonucleotídeos nestes camundongos. Tratamento e cirurgia
[000382] Os grupos de cinco camundongos C57/BL6 cada foram administrados ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444659, ISIS 444660, ou ISIS 444661 a 150 μg/dia liberado ICV com bombas Alzet 2002 na taxa de 0,5 μL/dia por 2 semanas. Um grupo de controle de seis camundongos C57/BL6 foram similarmente tratados com PBS. O procedimento para implantação das bombas e administração de oligonucleotídeo é descritos no Exemplo 6.
[000383] Os animais foram deixados recuperar por duas semanas antes de ser submetido a eutanásia usando isoflurano. O cérebro e o tecido da medula espinhal e foram coletados e congelados rapidamente no nitrogênio líquido. Antes do congelamento, tecido cerebral foi cortado transversalmente em cinco seções (S1, S2, S3, S4 e S5) usando uma matriz cerebral de camundongo. Seções 1 a 5 foram aproximadamente 2 mm a parte de cada um outro com S1 sendo mais rostral e S5 mais caudal. Análise de RNA
[000384] O RNA total foi extraído a partir do córtices anteriores e posteriores do cérebro para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina usando um kit RNeasy Mini prep (Qiagen). As reações RT-PCR foram conduzidas em um detector da sequência ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os níveis de mRNA de camundongo de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633 e normalizados aos níveis de mRNA de ciclofilina. Os resultados são apresentados na Tabela 78 como percentual da redução comparada ao controle PBS. ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444627 e ISIS 444652 todos tem um erro com o mRNA de huntingtina de murino (SEQ ID N°: 3) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de murino comparados ao controle.
[000385] O marcador microglial, AIF1 também foi medido pela análise RT-PCR usando uma série de sonda iniciadora de murino mAIF1_LTS00328 (sequência avançada TGGTCCCCCAGCCAAGA, projetado neste como SEQ ID N°: 54; sequência reversa CCCACCGTGTGACATCCA, projetado neste como SEQ ID N°: 55; sequência de sonda AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTGG, projetado neste como SEQ ID N°: 56). Os resultados são apresentados na Tabela 79 e indicam que os oligonucleotídeos ISIS testados não induzem uma resposta inflamatória. Tabela 78 Percentual de inibição de mRNA de huntingtina de murino comparado ao controle em camundongos C57/BL6
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Tabela 79 Aumento do percentual na expressão AIF1 mRNA comparado ao controle em camundongos C57/BL6
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Medição de pesos corporais
[000386] Os pesos corporais foram medidos nos intervalos reguladores em toda parte do período de estudo e são apresentados na Tabela 80. Estes pesos foram utilizados como um indicador da tolerabilidade. Os camundongos tratados com ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 tem peso corporal consistente em toda parte do período do estudo e foram considerados o mais tolerável de todos os oligonucleotídeos ISIS incluídos no estudo. ‘n/a’ não indica o dado pelo qual o grupo de camundongos. Tabela 80 Pesos corpóreos dos camundongos C57/BL6 após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
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Exemplo 17: Ensaio para efeitos neurotóxicos de administração de bolo de oligonucleotídeos anti-sentido no tecido estriatal de ratos.
[000387] Os ratos Sprague-Dawley foram tratados com oligonucleotídeos ISIS por intermédio da administração de bolo ao estriado, para o propósito da avaliação para a introdução do marcador microglial AIF1 como uma medição da toxicidade SNC. Tratamento e cirurgia
[000388] Os grupos de quatro Ratos Sprague-Dawley foram administrados ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444591, ou ISIS 444652 liberado como um bolo simples em uma concentração de 25 μg, 50 μg, 75 μg, ou 100 μg.
[000389] Um grupo de 4 ratos foram similarmente tratados com ISIS 387916, liberado como um bolo simples a 10 μg, 25 μg, 50 μg, ou 75 μg concentrações. Um grupo de controle de 4 ratos foram similarmente tratados com PBS. Sete dias após administração de bolo, os ratos foram submetidos a eutanásia usando isoflurano e os órgãos foram removidos. Os animais foram decapitados e o cérebro foi removido para dissecação do tecido estriatal. Um par de fórceps curvados finos foram colocados direto no cérebro anterior ao hipocampo para fazer uma incisão transversa no córtex e tecidos subjacentes pela dissecação direta. As extremidades de outro par de fórceps curvados finos foram colocados direto no ao longo do meio do caminho do sino sagital médio entre o hipocampo e o bulbo olfativo para fazer uma incisão longitudinal, corte de corpo do calo pela dissecação direta. O primeiro par de fórceps foi então usado para refletir novamente o canto resultante do córtex que expõe o estriado e a cápsula interna e então dissecar a cápsula interna sempre a partir do estriado. A segunda série de fórceps foi colocado tal que as extremidades curvadas foram no local do estriato e comprimido para isolar o tecido. A primeira série de fórceps foi usado deter a extremidade posterior do estriado e para remover o estriado a partir do cérebro. Análise de RNA dos níveis de expressão AIF1
[000390] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA AIF1. Os níveis AIF1 de rato foram medidos usando a série de sonda iniciadora de rato rAif1_LTS00219. Os resultados foram calculados como a porcentagem de expressão AIF1 naquele do controle PBS e são apresentados na Tabela 81. Os resultados indicam que ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 foram bem tolerados no cérebro do rato. Tabela 81 Percentual da expressão dos níveis de mRNA AIF1 in vivo como uma medição da neurotoxicidade
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Análise de RNA de níveis de expressão de huntingtina
[000391] O RNA foi extraído a partir do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os níveis de mRNA de huntingtina de rato foram medidos usando a série de sonda iniciadora de rato rHtt_LTS00343. Os resultados foram calculados como a porcentagem de redução da expressão de huntingtina naquele do controle PBS e são apresentados na Tabela 82. ISIS 388241 e ISIS 443139 são cada um mal combinados por 6 pares de base ou mais com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e portanto não mostram inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. ISIS 444584 tem 3 erros com a sequência do gene de rato (SEQ ID N°: 5) e portanto não mostram a inibição significante de níveis de mRNA de rato comparados ao controle. Tabela 82 Percentual de redução dos níveis de mRNA de huntingtina de rato em ratos
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Exemplo 18: Inibição anti-sentido dependente da dosagem de mRNA de huntingtina nos hepatócitos primários cinomólgos
[000392] ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 foram testados em hepatócitos primários cinomólgos em várias dosagens. Os oligonucleotídeos de marca de referência, ISIS 387916 e ISIS 388241 também foram incluídos para comparação. As células foram colocadas em uma densidade de 35.000 células por reservatórios e transfectadas usando eletroporação com 39.0625 nM, 78.125 nM, 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM e 20.000 nM concentrações de cada oligonucleotídeo anti-sentido. Após aproximadamente 16 horas, RNA foi isolado a partir das células e níveis transcritos de mRNA de huntingtina foram medidos pelo PCR em tempo real quantitativo usando a série de sonda iniciadora RTS2686. Os níveis de transcritos mRNA de huntingtina foram normalizados um teor de RNA total, como medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 83 como inibição de porcentagem de huntingtina, relativa as células de controle não tratadas. O oligonucleotídeo de controle, ISIS 141923 foi incluído neste ensaio e não demonstram a inibição de mRNA de huntingtina, como esperado.
[000393] ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 tem valores IC50 inferiores do que o oligonucleotídeo de marca de referência, ISIS 388241. ISIS 437527 e ISIS 444652 teve valores de IC 50 mais baixos do que o oligonucleotídeo da marca de referência, ISIS 387916. Tabela 83 Inibição anti-sentido dependente da dosagem de mRNA de huntingtina nos hepatócitos primários cinomólgos
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Exemplo 19: Medição da vida média de oligonucleotídeos ISIS em camundongos BACHD por intermédio da administração de bolo intraestriatal simples
[000394] Os camundongos BACHD foram administrados oligonucleotídeos ISIS como um bolo simples ao estriado para o propósito da medição da duração de ação dos oligonucleotídeos anti- sentido contra expressão de mRNA de huntingtina, ou sua vida-média, naquele tecido. Tratamento e cirurgia
[000395] Os grupos de 25 camundongos BACD cada foram tratados com ISIS 388241, ISIS 436689, ISIS 436671, ou ISIS 444591, liberado como um bolo simples de 40 μg em um procedimento similar aquele descrito no Exemplo 4. Um grupo de controle de 25 camundongos BACHD foram tratados com PBS em um procedimento similar. Em vários pontos de tempo, 5 camundongos de cada grupo foram submetidos a eutanásia e tecido estriatal foi extraído. Um par de fórceps curvado fino foi colocado no cérebro logo antes do hipocampos para fazer uma incisão transversa no córtex e tecidos subjacentes pela dissecação direta. As extremidades de outro par de fórceps curvado fino foram colocado ao longo do meio do caminho do sino sagital médio entre o hipocampos e o bulbo olfativo para fazer uma incisão longitudinal, corte de calo corporal pela dissecação direta. O primeiro para de fórceps foi então usado para refletir novamente o canto do córtex que expõe o estriado e a cápsula interna e então para dissecar a cápsula interna sempre a partir do estriado. A segunda série dos fórceps foi colocado tal que as extremidades curvadas no lado do estriado e comprimido para isolar o tecido. A primeira série dos fórceps foi usado para deter a extremidade posterior do estriado e para remover o estriado a partir do cérebro. Análise de RNA
[000396] O RNA foi extraído a partir das seções anteriores e posteriores do tecido estriatal para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os mutantes humanos níveis de mRNA de huntingtina foram medidos usando RTS2617. Os níveis normais de camundongo de mRNA de huntingtina foram medidos usando uma série de sonda iniciadora de murino RTS2633. Os resultados são apresentados nas Tabelas 84 e 85 e são expressados como percentual de inibição comparada a média do grupo de controle PBS na semana 1, semana 10 e semana 20. A vida média dos oligonucleotídeos ISIS na seção anterior do cérebro foi calculado a partir dos dados de inibição e é apresentado na Tabela 86. Tabela 84
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Tabela 85
Figure img0102
Figure img0103
Tabela 86 Vida média de oligonucleotídeos ISIS na seção anterior do cérebro em camundongos BACHD após injeção de bolo intraestriatal
Figure img0104
Medição de pesos corporais
[000397] Os pesos corporais foram medidos em intervalos regulares e são apresentados na Tabela 87 como uma porcentagem do peso dos camundongos no início do estudo. Estes pesos foram utilizados como um indicador da tolerabilidade. Não existe mudança adversa no peso corporal em qualquer um dos camundongos tratados com oligonucleotídeos ISIS. Tabela 87 Percentual de mudança no peso corporal dos camundongos BACHD após o tratamento de oligonucleotídeo anti-sentido
Figure img0105
Exemplo 20: Efeito de administração intratecal de ISIS 437527 em ratos Sprague Dawley
[000398] Os ratos Sprague Dawley foram dosados com ISIS 437527 pela administração intratecal (IT) como uma dosagem simples, dosagens repetidas ou infusão contínua. Tratamento e cirurgia
[000399] Os ratos foram anestesiados com isoflurano e um catéter de poliuretano de calibre 28 foi colocado no espaço lombar IT de cada rato. A extremidade proximal do catéter foi ligada a uma dosagem pedestal que foi estendida através da pele por animais nos grupos que recebem as injeções do bolo. O catéter para animais no grupo que recebe a infusão contínua foi ligada a uma bomba ALZET (Model 2ML1) que foi colocada em uma bolsa subcutânea no aspecto dorsal de cada animal. Pós-cirurgicamente os animais recebem uma dosagem intramuscular simples do sódio ceftiofur (5 mg/kg) e tartarato de butorfanol (0,05 mg/kg). Os ratos que recebem a infusão contínua começando receber a dosagem de oligonucleotídeo imediatamente. Os animais que receberam as injeções de bolo foram deixados um período de recuperação cirúrgico de pelo menos cinco dias após o qual a potência do catéter foi avaliado.
[000400] Um grupo de ratos 5 Sprague Dawley foi administrado a injeção de bolo simples de 350 μg de ISIS 437527 intratecalmente liberado. Outro grupo de 5 ratos Sprague Dawley foi administrado pelas injeções de bolo de 120 μg de ISIS 437527 intratecalmente liberado três vezes durante o curso de 1 semana. Outro grupo de 5 ratos Sprague Dawley foi administrado pelas injeções de bolo de 350 μg de ISIS 437527 intratecalmente liberado três vezes no curso de 1 semana. Outro grupo de 5 ratos Sprague Dawley foi administrado 50 μg/dia de ISIS 437527 liberado pela infusão contínua em uma taxa de 0,01 mL/hora por 7 dias. Um grupo de controle de 5 ratos Sprague Dawley foi administrado pelas injeções de bolo de PBS intratecalmente liberado três vezes durante o curso de 1 semana. Cada grupo foi dado em um período de recuperação de 7 dias, após o qual os ratos foram submetidos a eutanásia. O cérebro e medula espinhal a partir de todos os grupos e foram coletados e analisados. Análise de RNA de níveis de expressão de huntingtina
[000401] O RNA foi extraído a partir do córtex frontal, córtex temporal e a medula cervical para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina. Os níveis de mRNA de huntingtina de rato foram medidos usando a série da sonda iniciadora rHtt_LTS00343 normalizados os níveis de Ciclofilina. Os resultados são apresentados na Tabela 88 e são expressados como percentual de inibição comparada a média dos grupos de controle PBS. Tabela 88 Percentual de inibição de expressão de mRNA de huntingtina em ratos Sprague Dawley
Figure img0106
Análise de RNA dos níveis de expressão AIF1
[000402] O RNA foi extraído a partir do cótex frontal, córtex temporal e a medula cervical para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA AIF1. Os níveis AIF1 de rato foram medidos usando a série de sonda iniciadora de rato rAif1_LTS00219. Os resultados foram calculados como a porcentagem de expressão AIF1 naquele do controle PBS e são apresentados na Tabela 89. Os resultados indicam que a administração de bolos IT repetida leva a inflamação aos tecidos de medula cervical. A administração IT contínua e administração de bolos IT simples foram bem toleradas nos ratos. Tabela 89 Percentual da expressão dos níveis de mRNA AIF1 em ratos Sprague Dawley como uma medição da neurotoxicidade
Figure img0107
Exemplo 21: Medição da vida média de ISIS 436689 nos tecidos SNC dos macacos cinomólgos por intermédio da administração intratecal
[000403] Os macacos cinómolgos foram administrados ISIS 436689 intratecalmente (IT) para o propósito da medição da vida-média e duração de ação do oligonucleotídeo anti-sentido contra expressão de mRNA de huntingtina em vários tecidos SNC. T ratamento
[000404] O estudo foi conduzido em Northern Biomedical Research, MI. Antes do início do tratamento, os macacos foram mantidos em quarantina por um período de tempo de 4 semanas, durante o qual os painéis padrões de química de soro e hematologia, exame de amostras fecais para ovo e parasitas e um teste de tuberculose, foram conduzidas para avaliar os macacos anormais ou doentes. Os macacos foram implantados com catéteres lombares intratecais usando catéteres de poliuretano conectados a uma porta de acesso de titânio subcutâneo (portal titânio/plástico P.A.S. PORT® Elite com conector Ultra lock). Para a infusão contínua usando uma bomba externa, os animais foram anestesiados para ligar o mecanismo de dosagem a porta. Os animais foram pré-tratados com o sulfato de atropina pela injeção subcutânea em uma dosagem de 0,04 mg/kg. Aproximadamente 15 minutos depois, uma dosagem intramuscular de 8 mg/kg de quetamina HCl foi administrado para induzir a sedação. Os animais foram mascarados em um plano cirúrgico de anestesia, intubado e mantido em aproximadamente 1 L/min de oxigênio e 2 % de halotano ou isoflurano. Os animais receberam uma dosagem intramuscular simples de 5 mg/kg de antibiótico de ceftiofur sódico. Uma incisão foi feita próxima a porta de colocação do suporte de agulha modificado. A agulha modificada foi colocada na porta e garantida com suturas. Na recuperação a partir da cirurgia, uma bolsa foi colocada no animal.
[000405] Quinze macacos cinomólogos machos foram administrados 4 mg/dia de ISIS 436689 em uma concentração de 1,67 mg/mL e em uma taxa de fluxo de 2,4 mL/dia por 21 dias. Um grupo de controle de 3 macacos cinomólgos foi administrado com PBS em uma maneira similar pelo mesmo período de tempo. Os grupos de 3 macacos cada foram deixados no período de recuperação de 1 dia, 2 semanas, 4 semanas, ou 8 semanas, após o qual estes foram submetidos a eutanásia. Durante o período do estudo, os macacos foram observados diariamente por sinais de doença ou aflição.
[000406] Todos os animais foram sedados com uma injeção intramuscular de 8,0 mg/kg de quetamina HCl, mantidos em um halotano ou mistura de isoflurano/oxigênio e fornecidos com um bolo intravenoso de heparina Na a 200 IU/kg. Os animais foram submetidos à perfusão por intermédio do ventrículo cardíaco esquerdo com 0,001 % de nitrito de sódio na solução salina.
[000407] No tempo de sacrifício, o cérebro foi cortado em uma matriz cerebral a 3 mm de espessura de fatia coronal. Diversas estruturas do cérebro foram submetidos a amostragem usando uma biopsia de 4 mm. Uma amostra de diâmetro de 4 mm de cada estrutura foi colocada em 2 mL de tubos com tampa de rosca contendo 1,0 mL de solução de estabilização de RNA RNAlater (Qiagen, CA), incubado por 1 hora em temperatura ambiente e então congelado. As amostras de diâmetro de 6 mm adjacentes foram colocadas em tubos de tampa de rosca de 2 mL e congelados para a análise farmacocinética.
[000408] A medula espinhal foi dissecada nas seções cervicais, torácicas e lombares e aproximadamente seções de espessura de 3 mm de cada área da medula espinhal foi tomada por RNA e análise farmacocinética. Estas amostras foram processadas em uma maneira similar aquela das amostras cerebrais.
[000409] As amostras do fígado foram coletadas pela análise farmacocinética e RNA. As amostras foram processadas em uma maneira similar aquelas do cérebro e medula espinhal como descritos acima. Análise de RNA
[000410] O RNA foi extraído a partir da medula espinhal lombar, medula espinhal torácica, medula espinhal cervical, córtex frontal, córtex ocipital, córtex cerebelar, tecido caudado, hipocampos, cérebro médio e pons para a análise de PCR em tempo real dos níveis de mRNA de huntingtina com série de sonda iniciadora RTS2617. Os resultados medidos nas várias seções da medula espinhal são apresentados na Tabela 90 e são expressados como percentual de inibição comparada aquela medida no grupo de controle PBS em 8 semanas. Os resultados medidos em várias seções do cérebro são apresentados na Tabela 91 e são expressados como percentual de inibição comparada aquele medido no grupo de controle PBS em 8 semanas. Tabela 90 Efeito de ISIS 436689 administrado IT na expressão de mRNA de huntingtina na medula espinhal em vários pontos de tempo
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Tabela 91 Efeito de ISIS 436689 administrado IT na expressão de mRNA de huntingtina em vários tecidos cerebrais em vários pontos de tempo
Figure img0109
Medição da concentração de oligonucleotídeo por ELISA
[000411] Os tecidos (20 mg) foram cortados em pedaços, pesados e homogeneizados antes da extração líquido/ líquido usando fenol/clorofórmio. O sobrenadante foi removido, liofilizado e reconstituído no plasma EDTA humano (1 mL) antes de ser analisado usando um procedimento de hibridização ELISA.
[000412] ISIS 436689 foi detectado nos tecidos pela hibridização a uma sonda de corte complementar rotulada (digoxigenina na extremidade final de 5’ e um espaçador C18 e BioTEG na extremidade final de 3’). O complexo foi então capturado em uma placa revestida com neutravidina e nuclease S1 foi adicionada para digerir as sondas de corte não hibridizadas. Visto que ISIS 436689 protegido pela sonda de corte a partir da digestão, a sonda de corte não digerida foi usada como uma medição da concentração de oligonucleotídeo. A sonda de corte não digerido foi digerida usando um anticorpo anti-digoxigenina conjugado a fosfatase alcalina pela leitura de substrato fluorogênico. As concentrações de oliogonucleotídeos foram medidas nas seções cervicais, torácicas e lombares da medula espinhal e no fígado nos dias 7, 20, 34 e 62 do período de recuperação e são apresentados na Tabela 92. A vida média de ISIS 436689 nestes tecidos foi calculado a partir destes dados e é apresentada na Tabela 93. Os dados indicam que o oligonucleotídeo foi principalmente concentrado no SNC com concentrações negligíveis nos tecidos sistêmicos. Tabela 92
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Tabela 93 Vida média de ISIS 436689 administrado IT na expressão de mRNA de huntingtina em vários tecidos
Figure img0111

Claims (10)

1. Oligonucleotídeo modificado de fita simples direcionado a um ácido nucleico que codifica huntingtina e capaz de inibir expressão de huntingtina, caracterizado pelo fato de que compreende: um segmento de folga que consiste em desoxinucleotídeos ligados; um segmento de asa 5’ que consiste de nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3’ que consiste de nucleosídeos ligados; em que o segmento de folga está posicionado entre o segmento de asa 5’ e o segmento de asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2’-O-metoxietila; em que as ligações de nucleosídeos dentro do segmento de folga, as ligações conectando o segmento de folga ao segmento de asa 5' ou 3', e as ligações para os nucleosídeos de maioria 5' e maioria 3' de cada segmento de asa são todas ligações de fosforotioato, as ligações de nucleosídeos conectando o resto dos nucleosídeos de ambos os segmentos de asa 5 'e 3' e ligações de fosfodiéster; e em que todas as citosinas são 5-metilcitosinas; e em que a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo consiste em uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 22 ou 32.
2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo consiste na sequência de acordo com a SEQ ID NO: 22 (ISIS 443139).
3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo consiste na sequência de acordo com a SEQ ID NO: 32 (ISIS 444652).
4. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é conjugado.
5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou sal deste e pelo menos um de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia.
7. Uso de um oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, ou sal deste, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para prevenir, tratar, melhorar, e reduzir a taxa de progressão da doença de Huntington em um animal.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o animal é um humano.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a composição é coadministrada com um segundo agente.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição e o segundo agente são administrados concomitantemente.
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