BR112012027547B1 - Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina - Google Patents

Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina Download PDF

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Abstract

COMPOSTO COMPREENDENDO OLIGONUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO, E SEUS USOS PARA PREVENIR TRATAR , MELHORAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DA AMILOIDOSE TRANSTIRRETINA OU PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE mRNA OU DE PROTEÍNA DE TRANSTIRRETINA". A presente invenção refere-se a métodos, a composto s e a composições para reduzir a expressão do mRNA de transtirretina e proteína em um animal. Esses métodos, compostos e composições são úteis, para tratar, prevenir, retardar ou melhorar a amiloidose transtirretina, ou um sintoma da mesma.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[001] O presente pedido está sendo depositado, juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado BIOL0123WOSEQ.txt criado em 28 de abril de 2011, que tem um tamanho de 55 Kb. A informação no formato eletrônico da listagem da sequência é incorporada neste documento para referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] São fornecidos neste documento métodos, compostos, e composições para reduzir a expressão do mRNA de transtirretina e proteína em um animal. Tais métodos, compostos, e composições são úteis, por exemplo, para tratar, prevenir, ou melhorar a amiloidose transtirretina.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[003] A transtirretina (TTR), (também conhecida como pré- albumina, hipertireoxinemia, disprealbuminêmica, tiroxina; amiloidose sistêmica senila, polineuropatia amiloide, amiloidose I, PALB; distranstirretineimica, HST2651; TBPA; hipertireoxinemia eutiroidal disprealbuminêmica) é uma proteína do soro/plasma e do fluido cerebrospinhal responsável pelo transporte da tiroxina e do retinol (Sakaki et. al, Mol do Biol Med. 1989, 6:161-8). Estruturalmente, a TTR é um homotetrâmero; mutações pontuais e desenovelamento da proteína levam à deposição de fibrilas amiloides e está associada com distúrbios, como a amiloidose sistêmica senil (SSA), o polineuropatia amiloide familiar (FAP), e cardiopatia amiloide familiar (FAC).
[004] A TTR é sintetizada principalmente pelo fígado e pelo plexo coroide do cérebro e, em menor grau, pela retina em seres humanos (Palha, Clin Chem Lab Med, 2002, 40, 1292-1300). A transtirretina que é sintetizada no fígado é secretada no sangue, enquanto que a transtirretina originada no plexo coroide é destinada para o CSF. No plexo coroide, a síntese da transtirretina representa aproximadamente 20% da síntese total de proteína local e tanto quanto 25% da proteína total do CSF (Dickson et. al., Biol Chem de J, 1986, 261, 3475-3478).
[005] Com a disponibilidade dos testes de diagnóstico genéticos e imunohistoquímicos, pacientes com amiloidose TTR foram encontrados em muitas nações do mundo. Estudos recentes indicam que a amiloidose TTR não é uma doença endêmica rara como se pensava anteriormente e que pode afetar tanto quanto 25% da população idosa (Tanskanen et al, Ann Med. 2008; 40 (3): 232-9).
[006] Em nível bioquímico, a TTR foi identificada como o principal componente proteico em depósitos de amiloide de pacientes FAP (Costa et al., proc.Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 1978, 75:4499 - 4503) e mais tarde, uma substituição da metionina por valina na posição 30 da proteína foi considerado o defeito molecular mais comum que causa a doença (Saraiva et. al, J. Clin. Invest. 1984, 74: 104-119). Em FAP, a deposição extracelular sistêmica espalhada de agregados de TTR e de fibrilas amiloides ocorre em todo o tecido conjuntivo, particularmente no sistema nervoso periférico (Sousa e Saraiva, Prog. Neurobiol. 2003, 71: 385-400). Depois da deposição de TTR, a degeneração axônica ocorre, começando nas fibras mielinizadas e desmielinizadas de diâmetro menor, e finalmente conduzindo à perda neuronal nos sítios ganglionares.
[007] Os compostos e os métodos de tratamento descritos neste documento fornecem vantagens significativas sobre as opções de tratamentos disponíveis atualmente para distúrbios relacionados com a TTR. A amiloidose TTR normalmente leva à morte dentro dos dez anos, e até recentemente, foi considerada incurável. O transplante de fígado é um meio eficaz de substituir o alelo associado à doença por um alelo do tipo selvagem (WT) em casos familiares devido a que o fígado é normalmente a fonte de TTR amiloidogênicos. Embora o transplante de fígado seja eficaz como uma forma de terapia genética, não é sem problemas. O transplante é complicado pela necessidade de cirurgia invasiva para o destinatário e o doador, de terapia de imunosupressão por longo prazo pós-transplante, escassez de doadores, alto custo, e grande número de pacientes de amiloidose TTR que não são bons candidatos devido à progressão da doença. Infelizmente, a amiloidose cardíaca progride em alguns pacientes familiares mesmo após o transplante de fígado porque a TTR WT muitas vezes continua se depositando. A deposição no sistema nervoso central (SNC) de TTR também não é aliviada por transplante devido a sua síntese pelo plexo coroide. O transplante não é uma opção viável para a doença mais prevalente de TTR, amiloidose sistêmica senil (SSA), que afeta aproximadamente 25% daqueles com mais de 80, devido à deposição de TTR WT.
[008] A tecnologia antissenso está surgindo como um meio eficaz para reduzir a expressão de produtos de genes específicos e, portanto, prova ser excepcionalmente útil num número de aplicações terapêuticas, diagnóstico e de investigação para a modulação da expressão de TTR (ver Publicações de Patente US 2008/0039418 e 2007/0299027).
[009] A presente invenção fornece composições e métodos para a modulação da expressão da transtirretina. Os compostos antissenso para a modulação da expressão da transtirretina são divulgados nos pedidos de patente publicados acima mencionados. No entanto, ainda há uma necessidade de mais ditos compostos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] São fornecidos neste documento métodos, compostos, e composições para modular a expressão do mRNA e da proteína de transtirretina. Em certas modalidades, compostos úteis para modular a expressão do mRNA e da proteína de TTR são compostos antissenso. Em certas modalidades, os compostos antissenso são oligonucleotídeos antissenso.
[0011] Em certas modalidades, a modulação pode ocorrer em uma célula ou tecido. Em certas modalidades, a célula ou tecido está em um animal. Em certas modalidades, o animal é um ser humano. Em certas modalidades, os níveis do mRNA de TTR estão reduzidos. Em certas modalidades, os níveis da proteína de TTR estão reduzidos. Dita redução pode ocorrer de forma dependente do tempo ou dependente da dose.
[0012] São fornecidos neste documento métodos, compostos, e composições para modular a expressão da transtirretina e tratar, prevenir, retardar ou melhorar a amiloidose transrretina e/ou um sintoma da mesma. Em certas modalidades estão os métodos, compostos, e composições para modular a expressão de transtirretina e tratar, prevenir, retardar ou melhorar a doença amiloide transtirretina ou amiloidose transtirretina ou amiloidose relacionada com a transtirretina (por exemplo, amiloidose TTR hereditária, amiloidose leptomeníngeo, polineuropatia amiloide transtirretina, polineuropatia amiloide familiar, cardiopatia amiloide familiar, ou amiloidose sistêmica senil).
[0013] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 80 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 80 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0014] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 50 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 50 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0015] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0016] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 15 a 25 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 15 a 25 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0017] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 18 a 21 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 18 a 21 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0018] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 20 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0019] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 80 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 8 a 80 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0020] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 50 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 50 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0021] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0022] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 15 a 25 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 15 a 25 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0023] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 18 a 21 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 18 a 21 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, ou 124.
[0024] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 80 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 8 a 80 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, contagem de células do sangue 87.
[0025] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 50 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 50 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, ou 87.
[0026] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, ou 87.
[0027] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 15 a 25 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 15 a 25 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, ou 87.
[0028] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 18 a 21 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 18 a 21 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, ou 87.
[0029] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 20 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de qualquer uma das sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, ou 87.
[0030] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 80 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 8 a 80 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0031] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 50 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 50 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0032] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0033] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 15 a 25 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 15 a 25 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0034] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 18 a 21 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 18 a 21 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0035] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 a 30 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 20 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0036] Em certas modalidades, um animal em risco de amiloidose transtirretina ou com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 20 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0037] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é 100% complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado constituído de 20 nucleosídeos ligados e tendo a sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[0038] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é 100% complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1; e onde o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste em 20 nucleosídeos ligados que têm a seqüência do nucleobase relatada na SEQ ID NO: 80.
[0039] Em certas modalidades, um animal com amiloidose transtirretina é tratado mediante administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto constituído por um oligonucleotídeo modificado consistindo em 20 nucleosídeos ligados, onde o oligonucleotídeo modificado é 100% complementar a um ácido nucleico da transtirretina conforme mostrado na SEQ ID NO: 1; onde o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste em 20 nucleosídeos ligados que têm a sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80; e onde os oligonucleotídeos modificados têm um segmento de intervalo de 10 deoxinucleosídeos ligados entre dois segmentos flanqueantes que independentemente têm 5 nucleosídeos modificados ligados. Em certas modalidades, um ou mais nucleosídeos modificados no segmento de flanqueamento têm um açúcar modificado. Em determinadas modificações, o nucleosídeo modificado é um nucleosídeo 2'- substituído. Em certas modalidades, o nucleosídeo modificado é um nucleosídeo 2'-MOE.
[0040] Em certas modalidades, a modulação pode ocorrer em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Em certas modalidades, a célula, tecido ou órgão está em um animal. Em certas modalidades, o animal é um ser humano. Em certas modalidades, os níveis do mRNA de transtirretina estão reduzidos. Em certas modalidades, os níveis da proteína de transtirretina estão reduzidos. Dita redução pode ocorrer de forma dependente do tempo ou dependente da dose.
[0041] São também fornecidos métodos, compostos, e composições úteis para prevenir, tratar, e melhorar doenças, distúrbios, e circunstâncias relacionadas com a amiloidose transtirretina. Em certas modalidades, ditas doenças, distúrbios, e circunstâncias são doenças, distúrbios ou circunstâncias relacionadas com a amiloidose transtirretina.
[0042] Em certas modalidades, métodos de tratamento incluem a administração de um composto antissenso de TTR a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento incluem a administração de um oligonucleotídeo antissenso de TTR a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0043] Em certas modalidades, os métodos de tratamento incluem a administração de um oligonucleotídeo antissenso de transtirretina e de uma terapia adicional a um indivíduo em necessidade do mesmo. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0044] Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente como a seguinte descrição detalhada são apenas exemplares e explicativas e não restritivas da invenção, conforme reivindicado. Aqui, a utilização do singular inclui o plural, salvo se indicado especificamente de outra maneira. Conforme usado neste documento, o uso de "ou" significa "e/ou" salvo se indicado de outra maneira. Além disso, o uso do termo "incluindo" bem como outras formas, como "inclui" e "incluído", não é limitante. Também, termos como "elemento" ou "componente" incluem elementos e componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes compreendendo mais de uma subunidade, salvo se indicado especificamente de outra maneira.
[0045] Os títulos da seção usados neste documento são apenas para fins de organização e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito. Todos os documentos ou partes de documentos, citados neste pedido, incluindo, entre outros, patentes, pedidos de patentes, artigos, livros e tratados, estão expressamente incorporados neste documento, por referência para as partes do documento discutido aqui, bem como em sua totalidade.
DEFINIÇÕES
[0046] Salvo se fornecidas definições específicas, a nomenclatura utilizada em relação a, e os procedimentos e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica descritas neste documento são aquelas conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrões podem ser usadas para síntese química, e análise química. Onde permitido, todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações, números de acesso no GENBANK e informação de sequência associadas obtidas através de bases de dados como o centro nacional para a informação de biotecnologia (NCBI) entre outros dados referenciados ao longo desta revelação, são incorporados como referência para as partes do documento discutidas aqui, bem como em sua totalidade.
[0047] Salvo se indicado de outra maneira, os seguintes termos têm os seguintes significados:
[0048] "2'-O-metoxietila" (também 2'-MOE e 2'-O(CH2)2-OCH3) refere-se a uma modificação O-metoxietila na posição 2' de um anel furosila. Um açúcar modificado do 2'-O-metoxietila é um açúcar modificado.
[0049] "Nucleotídeo de 2'-O-metoxietila" significa um nucleotídeo constituído por uma porção de açúcar modificado de 2'-O-metoxietila.
[0050] "5-metilcitosina" significa uma citosina modificada com um grupo metil ligado à posição 5. Uma 5-metilcitosina é uma nucleobase modificada.
[0051] "Agente farmacêutico ativo" significa a substância ou as substâncias em uma composição farmacêutica que fornecem um benefício terapêutico quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, em certas modalidades um oligonucleotídeo antissenso direcionado à transtirretina é um agente farmacêutico ativo.
[0052] "Região alvo ativa" ou "região alvo" significa uma região a que um ou mais compostos antissensos ativos são alvos. "Compostos antissensos ativos" significam os compostos antissensos que reduzem níveis de ácidos nucleicos ou níveis de proteína alvos.
[0053] "Administrado concomitantemente" refere-se à coadministração de dois agentes de qualquer forma em que os efeitos farmacológicos de ambos são manifestos no paciente ao mesmo tempo. A administração concomitante não requer que ambos os agentes sejam administrados em uma única composição farmacêutica, sob a mesma forma de dosagem, ou através da mesma rota de administração. Os efeitos de ambos os agentes não precisam se manifestar ao mesmo tempo. Os efeitos só precisam estar sobrepostos por um período de tempo e não precisam ser coextensivos.
[0054] "Administrar" significa fornecer um agente farmacêutico a um indivíduo, e inclui, entre outros, à administração por um profissional médico e à autoadministração.
[0055] "Amenização" refere-se a uma diminuição de pelo menos um indicador, sinal, ou sintoma de uma doença, de um distúrbio, ou de uma condição associada. A gravidade dos indicadores pode ser determinada pelas medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas por especialistas na técnica.
[0056] "Amiloidose" é um grupo de doenças ou distúrbios resultantes de depósitos anormais de proteína (amiloide ou fibrilosa amiloide) em vários tecidos do corpo. As proteínas amiloides podem se depositar em uma determinada área do corpo (Amiloidose localizada) ou podem se depositar por todo o corpo (Amiloidose sistêmica). Existem três tipos de amiloidose sistêmica: primária (AL), secundária (AA), e familiar (ATTR). A amiloidose primária não está associada com nenhuma outra doença e é considerada uma entidade de doença por si só. A amiloidose secundária ocorre como resultado de outra doença. A febre Mediterrânea Familiar é uma forma de amiloidose familiar (herdada).
[0057] "Animal" refere-se a um ser humano ou um animal não humano, incluindo, entre outros, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos, e primatas não humanos, incluindo, entre outros, macacos e chimpanzés.
[0058] "Atividade antissenso" significa qualquer atividade detectável ou mensurável atribuível à hibridização de um composto antissenso a seu ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a atividade antissenso é uma diminuição na quantidade ou na expressão de um ácido nucleico ou proteína alvo codificada por dito ácido nucleico alvo.
[0059] "Composto antissenso" significa um composto oligômero que é capaz de se submeter à hibridização com um ácido nucleico alvo através de ligação de hidrogênio.
[0060] "Inibição antissenso" significa a redução dos níveis de ácido nucleico alvo ou níveis da proteína alvo na presença de um composto antissenso complementar a um ácido nucleico alvo em comparação aos níveis de ácido nucleico alvo ou níveis da proteína alvo na ausência do composto antissenso.
[0061] "Oligonucleotídeo antissenso" significa o oligonucleotídeo de fita simples contendo uma sequência de nucleobases que permite a hibridização à correspondente região ou segmento de um ácido nucleico alvo.
[0062] "Açúcar bicíclico" significa um anel furosil modificado por ponte de dois átomos de anel não geminais. Um açúcar bicíclico é um açúcar modificado.
[0063] "Ácido nucleico bicíclico" ou "BNA" refere-se a um nucleosídeo ou nucleotídeo em que a parte furanose do nucleosídeo ou nucleotídeo inclui uma ponte que liga dois átomos de carbono no anel furanose, formando um sistema de anéis bicíclicos.
[0064] "Estrutura Cap" ou "porção terminal capa" significa modificações químicas, que foram incorporadas em qualquer terminal de um composto antissenso.
[0065] "Sistema Nervoso Central (SNC)" refere-se ao sistema nervoso do vertebrado que está entre as meninges. Ele contém a maior parte do sistema nervoso e consiste no cérebro (nos vertebrados que têm cérebros) e a medula espinhal. O SNC está contido dentro da cavidade dorsal, com o cérebro dentro da cavidade craniana e a coluna vertebral no canal medular. O cérebro também está protegido pelo crânio e a medula espinhal, nos vertebrados, também está protegida pelas vértebras.
[0066] "Região quimicamente distinta" refere-se a uma região de um composto antissenso que é de algum modo quimicamente diferente de outra região de mesmo composto antissenso. Por exemplo, uma região tendo nucleotídeos 2'-O-metoxietila é quimicamente distinta de uma região tendo nucleotídeos sem modificações 2'-O-metoxietila .
[0067] "Composto quimérico antissenso" significa um composto antissenso que tem pelo menos duas regiões quimicamente distintas.
[0068] "Plexo coroide" é a área sobre os ventrículos do cérebro onde é produzido o fluido cerebrospinal (CSF).
[0069] "Coadministração" significa a administração de dois ou mais agentes farmacêuticos a um indivíduo. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem estar em uma única composição farmacêutica, ou podem estar em composições farmacêuticas separadas. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem estar em uma única composição farmacêutica, ou podem estar em composições farmacêuticas separadas. A coadministração engloba a administração paralela ou sequencial.
[0070] "Complementaridade" significa a capacidade de emparelhamento entre nucleobases de um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico.
[0071] "Nucleobases contíguas" significam nucleobases imediatamente adjacentes umas às outras.
[0072] "Diluente" significa um ingrediente em uma composição que não possui atividade farmacológica, mas é farmaceuticamente necessária ou desejável. Por exemplo, o diluente em uma composição injetada pode ser uma solução líquida, por exemplo, soro fisiológico.
[0073] "Dose" significa que uma determinada quantidade de um agente farmacêutico fornecido em uma única administração, ou em um período de tempo especificado. Em certas modalidades, uma dose pode ser administrada em um, dois, ou mais bolus, comprimidos ou injeções. Por exemplo, em certas modalidades onde a administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado para uma única injeção, consequentemente, duas ou mais injeções podem ser usadas para conseguir a dose desejada. Em certas modalidades, o agente farmacêutico é administrado pela infusão sobre um período de tempo prolongado ou continuamente. Doses podem ser enunciadas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês.
[0074] "Quantidade efetiva" significa a quantidade de agente farmacêutico ativo suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo na necessidade do agente. A quantidade efetiva pode variar entre os indivíduos dependendo da condição de saúde e física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, da formulação da composição, da avaliação do estado de saúde do indivíduo e dentre outros fatores relevantes.
[0075] "Amiloidose familiar" ou "amiloidose hereditária" é uma forma de amiloidose hereditária.
[0076] "Polineuropatia amiloide familiar" ou "FAP" é um distúrbio neurodegenerativo transmitido geneticamente, caracterizado por deposições sistêmicas de variantes amiloide de proteínas transtirretina, causando polineuropatia sensorial e motora progressiva.
[0077] "Totalmente complementar" ou "100% complementar" significa que cada nucleobase de uma sequência de nucleobases de um primeiro ácido nucleico tem uma nucleobase complementar em uma segunda sequência de nucleobases de um segundo ácido nucleico. Em certas modalidades, um primeiro ácido nucleico é um composto antissenso e um ácido nucleico alvo é um segundo ácido nucleico.
[0078] "Gapmer" significa um composto quimérico antissenso em que uma região interna contendo uma pluralidade de nucleosídeos que permite a clivagem de ARNse H está posicionada entre as regiões externas contendo um ou mais nucleosídeos, onde os nucleosídeos que constituem a região interna são quimicamente distintos do nucleosídeo ou nucleosídeos que compreendem as regiões externas. A região interna pode ser referida como um "segmento de intervalo" e as regiões externas podem ser referidas como "segmentos flanqueantes."
[0079] "Gap-estendido" significa um composto quimérico antissenso contendo um segmento de intervalo de 12 ou mais 2'- deoxiribonucleosídeos contíguos posicionados entre e imediatamente adjacentes aos segmentos flanqueantes 5' e 3' tendo de um a seis nucleosídeos.
[0080] "Amiloidose transtirretina hereditária (TTR)" é uma doença sistêmica causada por mutações na transtirretina, uma proteína plasmática de transporte de tiroxina e vitamina A. É mais frequentemente associada com a neuropatia periférica e a cardiomiopatia restritiva, mas depósitos de amiloide nas paredes dos vasos sanguíneos e nas estruturas tecido conjuntivo por todo o corpo muitas vezes causam disfunção dentre outros sistemas de órgãos. Anormalidades da motilidade gastrointestinal são comuns nesta doença com constipação, diarreia e saciedade precoce por esvaziamento gástrico retardado. Depósitos de amiloide no tecido conjuntivo no pulso podem causar síndrome do túnel do carpo. Depósitos de amiloide nos vasos sanguíneos da coluna vertebral e estruturas circundantes causam estenose espinal com sintomas de claudicação.
[0081] "Hibridização" significa o emparelhamento de moléculas de ácido nucleico complementar. Em certas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos complementar incluem um composto antissenso e um ácido nucleico alvo.
[0082] "Imediatamente adjacentes" significa que não há nenhum elemento interveniente entre os elementos imediatamente adjacentes.
[0083] "Indivíduo" significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0084] "Administração intracerebroventricular" ou "administração cerebral intraventricular " ou "Administração cerebral ventricular" significa administração por injeção ou infusão no sistema ventricular do cérebro.
[0085] "Administração intraperitoneal" significa administração pela cavidade peritoneal.
[0086] "Administração intratecal" significa administração por injeção ou infusão pelo líquido cerebrospinhal bHNAando a medula espinal e cérebro.
[0087] "Administração intravenosa" significa administração em uma veia.
[0088] "Administração intraventricular" significa administração nos ventrículos do cérebro ou do coração.
[0089] "Ligação internucleosídica" refere-se à ligação química entre nucleosídeos.
[0090] "Leptomeníngeo" significa ter a ver com as leptomeninges, as duas camadas mais internas dos tecidos que cobrem o cérebro e a medula espinal. "Amiloidose leptomeníngea" refere-se a amiloidose das leptomeninges resultantes da deposição amiloide transtirretina dentro das leptomeninges.
[0091] "Nucleosídeos ligados" significa nucleosídeos adjacentes que estão ligados entre si.
[0092] "Desemparelhamento" ou "nucleobase não complementar" refere-se ao caso quando a nucleobase de um primeiro ácido nucleico não é capaz de se parear com a correspondente nucleobase de um segundo ácido nucleico alvo.
[0093] "Ligação internucleosídeos modificada" refere-se a uma substituição ou qualquer alteração na ligação internucleosídeos que ocorre naturalmente (ou seja, uma ligação internucleosídeos fosfodiéster).
[0094] "Nucleobase modificada" refere-se a qualquer nucleobase exceto adenina, citosina, guanina, timidina ou uracila. Uma "nucleobase não modificada" significa s bases purinas adenina (A) e guanina (G), e as bases pirimidinas timina (T), citosina (C), e uracila (U).
[0095] "Nucleotídeo modificado" significa um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada, ligação internucleosídeos modificada, ou nucleobase modificada. Um "nucleosídeo modificado" significa um nucleosídeo contendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada ou nucleobase modificada.
[0096] "Oligonucleotídeo modificado" significa um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
[0097] "Açúcar modificado" refere-se a uma substituição ou alteração de um açúcar natural.
[0098] "Motivo" significa o padrão das regiões quimicamente distintas em um composto antissenso.
[0099] "Ligação internucleosídeos que ocorre naturalmente" significa uma ligação fosfodiéster 3' a 5'.
[00100] "Porção de açúcar natural" significa um açúcar encontrado no (2'-H) do DNA ou no (2'-OH) do RNA.
[00101] "Ácido nucleico" refere-se às moléculas compostas de nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui ácidos ribonucleico (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de fita simples, ácidos nucleicos de fita dupla, pequenos ácidos nucleicos de interferência (siRNA) e microRNAs (miRNA). Um ácido nucleico também pode incluir uma combinação desses elementos em uma única molécula.
[00102] "Nucleobase" significa um grupo heterocíclico capaz de parear-se com uma base de outro ácido nucleico.
[00103] "Sequência de nucleobases" significa a ordem de nucleobases contíguas independente de qualquer açúcar, ligação ou modificação de nucleobase.
[00104] "Nucleosídeo" significa uma nucleobase ligada a um açúcar.
[00105] "Nucleotídeo" significa um nucleosídeo contendo um grupo fosfato covalentemente ligado à parte açúcar do nucleosídeo.
[00106] "Composto oligomérico" ou "oligômero" significa um polímero de subunidades monoméricas ligadas que é capaz de se hibridizar a, pelo menos, uma região de uma molécula de ácido nucleico.
[00107] "Oligonucleotídeo" significa um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais podem ser modificado ou não modificado, independente um do outro.
[00108] "Administração parenteral" significa administração por injeção ou infusão. A administração parenteral inclui a administração subcutânea, a administração intravenosa, a administração intramuscular, a administração intra-arterial, a administração intraperitoneal ou a administração intracraniana, por exemplo, a administração intracerebral, a administração intratecal, a administração ventricular, a administração ventricular, a administração intracerebroventricular, a administração ventricular cerebral ou a administração ventricular cerebral. A administração pode ser contínua, ou crônica, ou curta ou intermitente.
[00109] "Peptídeo" significa uma molécula formada pela ligação de, pelo menos, dois aminoácidos por ligações amidas. Peptídeo refere-se aos polipeptídeos e proteínas.
[00110] "Composição farmacêutica" significa uma mistura de substâncias adequadas para a administração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode incluir um ou mais agentes farmacêuticos e uma solução aquosa estéril.
[00111] "Sais farmaceuticamente aceitáveis" significam sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis de compostos antissensos, ou seja, sais que retêm a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo parente e não lhes conferem os respectivos efeitos toxicológicos indesejáveis.
[00112] "Ligação fosforotioato" significa uma ligação entre os nucleosídeos onde a ligação fosfodiéster é modificada substituindo um dos átomos de oxigênio não ligante com um átomo do enxofre. Uma ligação tiofosfato é uma ligação internucleosídica modificada.
[00113] "Parte" significa um número definido de nucleobases contíguas (ou seja, vinculadas) de ácidos nucleicos. Em certas modalidades, uma parte é um número definido de nucleobases contíguas de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma parte é um número definido de nucleobases contígua de um composto antissenso.
[00114] "Prevenir" refere-se a atrasar ou prevenir o aparecimento ou o desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição por um período de tempo de minutos a indefinidamente. Prevenir também significa reduzir o risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição.
[00115] "Profármaco" significa um agente terapêutico que é preparado em uma forma inativa que é convertido em uma forma ativa dentro do corpo ou das células por ação de enzimas endógenas ou outros produtos químicos ou condições.
[00116] "Efeitos colaterais" significam respostas fisiológicas atribuídas a um tratamento diferente dos efeitos desejados. Em certas modalidades, os efeitos colaterais incluem reações no local de injeção, anormalidades no teste da função hepática, anormalidades na função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades no sistema nervoso central, miopatias e mal estar. Por exemplo, níveis de aminotransferase aumentados no soro podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, a bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.
[00117] "Oligonucleotídeo de fita simples" significa um oligonucleotídeo que não está hibridizado a uma fita complementar.
[00118] "Especificamente hibridizável" refere-se a um composto "antissenso" com suficiente grau de complementaridade entre um oligonucleotídeo antissenso e um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado, enquanto exibindo mínimo ou nenhum efeito sobre ácidos nucleicos não alvos sob condições em que a ligação específica é desejada, ou seja, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo e tratamentos terapêuticos.
[00119] "Administração subcutânea" significa administração logo abaixo da pele.
[00120] "Marcação" ou "marcado" significa que o processo de desenho e seleção de um composto antissenso que especificamente será hibridizado a um ácido nucleico alvo e induz um efeito desejado.
[00121] "Ácidos nucleicos alvo," "RNA alvo" e "RNA alvo transcrito" todos se referem a um ácido nucleico capaz de ser alvo de compostos antissenso.
[00122] "Segmento alvo" significa a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo para o qual um composto antissenso é marcado. "Sítio alvo 5'" refere-se ao nucleotídeo que está na extremidade 5' de um segmento alvo. "Sítio alvo 3'" refere-se ao nucleotídeo que está na extremidade 3' de um segmento alvo.
[00123] "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um agente farmacêutico que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.
[00124] "Inibidor específico de transtirretina" ou "inibidor de transtirretina", significa um composto capaz de diminuir a expressão de mRNA ou da proteína transtirretina. Exemplos de ditos compostos incluem um ácido nucleico, um peptídeo, um anticorpo ou um inibidor da deacetilase de histona.
[00125] "Modulador específico de transtirretina" ou "modulador de transtirretina", significa um composto capaz de diminuir a expressão de mRNA ou da proteína transtirretina.
[00126] "Amiloidose relacionada com a transtirretina" ou "Amiloidose transtirretina" ou "doença amiloide transtirretina", como utilizada aqui, é qualquer patologia ou doença associada à disfunção ou desregulação da transtirretina que resulta na formação de fibrilas amiloides contendo transtirretina. Amiloidose transtirretina inclui, entre outros, a, amiloidose TTR hereditária, amiloidose melanocitose, Polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), cardiomiopatia amiloide familiar, amiloidoseoculoleptomeningeal familiar, amiloidose cardíaca senil ou amiloidose sistêmica senil.
[00127] "Tratar" refere-se à administração uma composição farmacêutica para efetuar uma alteração ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição.
[00128] "Nucleotídeo não modificado" significa que um nucleotídeo composto de nucleobases que ocorre naturalmente, porções de açúcares e ligações internucleosídicas. Em certas modalidades, um nucleotídeo não modificado é um nucleotídeo de RNA (isto é, β-D- ribonucleosídeos) ou um nucleotídeo de DNA (isto é, β-D- desoxirribonucleosídeo).
Certas modalidades
[00129] Certas modalidades fornecem métodos, compostos, e composições para a inibição da expressão da transtirretina.
[00130] Certas modalidades fornecem compostos antissensos direcionados a um ácido nucleico de transtirretina. Em certas modalidades, o ácido nucleico de transtirretina é qualquer uma das sequências do número de acesso no GENBANK NM_000371.2 (incorporadas aqui como SEQ ID NO: 1), N.° de acesso no GENBANK NT_010966.10 truncado a partir dos nucleotídeos 2009236 até 2017289 (incorporada aqui como SEQ ID NO: 2); éxons 1-4 extraído da sequência genômica do macaco rhesus número de acesso no GENBANK NW_001105671.1, com base na similaridade a éxons humanos; e número de acesso no GENBANK. NW_001105671.1 truncado a partir dos nucleotídeos 628000 até 638000 (incorporados aqui como SEQ ID NO: 4).
[00131] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8 a 80 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, e 124. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00132] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 50 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00133] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00134] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00135] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00136] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8 a 80 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87.
[00137] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 50 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87.
[00138] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87.
[00139] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87.
[00140] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, e 87.
[00141] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8 a 80 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[00142] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 50 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NO: 80.
[00143] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NO: 80.
[00144] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID Ns: 80.
[00145] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas na SEQ ID NO: 80.
[00146] Certas modalidades fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 a 30 nucleosídeos onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[00147] Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados relatados na SEQ ID NO: 80.
[00148] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 120-139, 212-236, 226245, 293-468, 293-326, 347-381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 500-519, 535-501, 502-531, 505-524, 507526508-527, 514-540, 514-539, 515-534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 580-608, 580-599, 606 584, 585-604, 587606 ou 597-617 SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades a região é selecionada de 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades a região é selecionada de 501-535 ou 580-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00149] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 501-535 ou 580-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00150] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 508-527 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00151] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 15 a 25 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00152] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 18 a 21 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui.
[00153] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar dentro de uma região descrita aqui. Em determinadas incorporações, o oligonucleotídeo modificado é 90%, 95%, 99%, ou 100% complementar a um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana (TTR), por exemplo. SEQ ID No: 1.
[00154] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 508-527 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma parte de pelo menos umas 9, pelo menos umas 10, pelo menos umas 11, pelo menos umas 12, pelo menos umas 13, pelo menos umas 14, pelo menos umas 15, pelo menos umas 16, pelo menos umas 17, pelo menos umas 18, pelo menos umas 19 ou pelo menos umas 20 nucleobases contíguas de que é complementar a uma parte de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 508-527 da SEQ ID NO: 1. Em determinadas incorporações, o oligonucleotídeo modificado é 90%, 95%, 99%, ou 100% complementar a um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana (TTR), por exemplo. SEQ ID No: 1.
[00155] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 60% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00156] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 70% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585- 604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00157] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 80% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00158] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 90% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00159] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 95% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00160] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 99% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00161] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 100% complementar dentro da região selecionada de nucleotídeos 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 e 589-608 da SEQ ID NO: 1.
[00162] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 60% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00163] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 70% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00164] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 80% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00165] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 90% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00166] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 95% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00167] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 99% complementar dentro dos nucleotídeos 508527 da SEQ ID NO: 1.
[00168] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado que consiste de 20 nucleosídeos ligados 100% complementar dentro dos nucleotídeos 508-527 da SEQ ID NO: 1.
[00169] Em certas modalidades, um composto antissenso ou um oligonucleotídeo modificado direcionado a um ácido nucleico de transtirretina é direcionado às seguintes regiões de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. 120-139, 212-236, 226-245, 293-468, 293-326, 347381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 500-519, 502-531, 507-526, 505-524, 508-527, 514-540, 514-539, 515- 534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 580-599, 584-606, 585-604, 587-606, ou 597-617.
[00170] Em certas modalidades, um composto antissenso ou oligonucleotídeos modificados é direcionado a uma região de um ácido nucleico de transtirretina. Em certas modalidades, ditos compostos ou oligonucleotídeos marcados para uma região de um ácido nucleico de transtirretina têm uma parte de nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento à região. Por exemplo, a parte pode ser uma parte de pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas complementar a uma parte de comprimento igual a uma região relatada aqui. Em certas modalidades, ditos compostos ou oligonucleotídeos são marcados às seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. 120-139, 212-236, 226-245, 293-381, 293-366, 353381, 293-468, 425-468, 425-467, 452-476, 461-481, 461-500, 500-519, 461-519, 502-531, 502-539, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508527, 508-536, 514-540, 523-542, 544-606, 544-564, 544-583, ou 597617.
[00171] Em certas modalidades, ditos compostos ou oligonucleotídeos marcados para uma região de um ácido nucleico de transtirretina têm uma parte de nucleobases contíguas que é complementar a uma parte de nucleobases de igual comprimento à região 501-535 ou 580-608 da SEQ ID NO: 1.
[00172] Em certas modalidades, às seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 60% de inibição: 226-245, 293-366, 357-467, 452-474, 457-476, 459-478, 462500, 500-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-564, 564-583, 578-601, 584-606, ou 597-617.
[00173] Em certas modalidades, às seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são alvos de compostos antissenso ou de olignucleotídeos, apresenta pelo menos 65% de inibição: 293-366, 357-376, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462500, 500-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-563, 564-583, 578-601.585-606, ou 597-617.
[00174] Em certas modalidades, às seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 70% de inibição: 293-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 500519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 564-583, 578-598, 581-600, ou 597-617.
[00175] Em certas modalidades, as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 75% de inibição: 293-322, 347-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462500, 500-519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 578-598, 581-600, ou 597-616.
[00176] Em certas modalidades, as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 80% de inibição: 303-322, 425-449, 432-460, 443-467, 452-473, 481-500, 500519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539, 579-598, 581-600, ou 597-616.
[00177] Em certas modalidades, as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 85% de inibição: 427-449, 432-458, 441-460, 443-467, 452-473, 504-531, 504536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539, ou 581-600.
[00178] Em certas modalidades, as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 90% de inibição: 428-449, 432-456, 439-458, 441-460, 445-466, 452-473, 504525, 508-527, ou 515-536.
[00179] Em certas modalidades, as seguintes regiões de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, quando são marcados por compostos antissenso ou de oligonucleotídeos, apresenta pelo menos 95% de inibição: 434-453, 436-456, 441-460, 445-465, 505-524, ou 516-535.
[00180] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 60% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs:.420954, 420904, 304286, 420874, 420948, 420883, 420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00181] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 65% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00182] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 70% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00183] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 75% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 420877, 420878, 420880, 304284, 304285, 420884, 420885, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 420899, 420900, 420901, 420902, 420906, 420908, 304296, 420909, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926, 304309, 420949, 420951, ou 304311.
[00184] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 80% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 42089.
[00185] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 85% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00186] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 90% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00187] Em certas modalidades, os seguintes compostos antissenso são marcados para uma região de uma SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a transtirretina humana, e apresenta pelo menos 95% de inibição de um mRNA de transtirretina: ISIS NOs: 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, ou 420891.
[00188] Em certas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 120-139 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 120-139 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NO: 37. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 120-139 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 420872.
[00189] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 212-236 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 212-236 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 8 e 38. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 212-236 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420873 ou 304267.
[00190] Em certas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 226-245 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 226-245 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico transtirretina compreende uma sequência de nucleobase selecionada de SEQ ID NO: 39. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 226-245 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 420874.
[00191] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 293-381 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-381de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 10, 42 - 48. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-381 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, ou 420883.
[00192] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 293-366 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-366 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 42-45. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-366 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420877, 420878, 420879, ou 420880.
[00193] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 353-381 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 353-381 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 10, 46-48. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 353-381 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 304280, 420881, 420882, ou 420883.
[00194] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 293-468 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-468 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 10-18, 42-63. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 293-468 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, 420883, 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, ou 304291.
[00195] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 425-468 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 425-468 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 11-18, 49-63. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 425-468 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, 420883, 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, ou 304291.
[00196] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 425-467 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 425-468 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 11-17, 49-63. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 425-468 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897 ou 420898.
[00197] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 452-476 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 452-476 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 64-69. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 452-476 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 304291, 304292, 304293, 420899, 420900, 420901, 420902, 420903, ou 420904.
[00198] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 461-481 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-481 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 72-73. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-481 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420907 ou 420908.
[00199] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 461-500 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-500 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 22, 72 e 73. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-500 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420907, 420908 ou 304296.
[00200] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 500-519 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 500-519 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NO: 74. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 500-519 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 420909.
[00201] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 461-519 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-519 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 22, 23, 72-74. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 461-519 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420907, 420908, 304296, ou 420909.
[00202] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 502-531 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 502-531 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25, 75-84. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 502-531 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, ou 420919.
[00203] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 502-539 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 502-539 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25, 26, 75-91. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 502-539 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, ou 420926.
[00204] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 504-536 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 504-536 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25, 26, 77-88. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 504-536 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922, ou 420923.
[00205] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 505-535 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 505-535 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25, 26, 78-87. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 505-535 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, ou 420922.
[00206] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 506-530 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 506-530 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25, 79-83. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 506-530 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, ou 420919.
[00207] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 507-527 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 507-527 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 25 ou 80. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 507-527 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 304299 ou 420915.
[00208] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 508-527 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 508-527 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NO: 80. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 508-527 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 420915.
[00209] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 514-540 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 514-540 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 85-92. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 514-540 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926, ou 420927.
[00210] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 523-542 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 523-542 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NO: 94. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 523-542 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NO: 420929.
[00211] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 544-606 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-606 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 30-33, 112122. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-606 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420947, 420948, 304304, 304307, 304308, 304309, 420949, 420950, 420951, 420952, 420953, 420954, 420955, 420956, ou 420957.
[00212] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 544-564 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-564 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 112-113. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-564 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420947 ou 420948.
[00213] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 544-583 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-583 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 30, 31, 112, e 113. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 544-583 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 420947, 420948, 304304, ou 304307.
[00214] Em certas modalidades, uma região alvo são os nucleotídeos 597-617 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 597-617 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina compreende uma sequência de nucleobases selecionada da SEQ ID NOs: 34-35. Em certas modalidades, um composto antissenso é marcado para os nucleotídeos 597-617 de SEQ ID NO: 1 é selecionada do ISIS NOs: 304311 ou 304312.
[00215] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste de um oligonucleotídeo modificado de fita simples.
[00216] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste de 20 nucleosídeos ligados.
[00217] Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 90% complementar sobre seu comprimento completo a uma sequência de nucleobases da SEQ ID NO: 1, 2, ou 4. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 95% complementar sobre seu comprimento completo a uma sequência de nucleobases da SEQ ID NO: 1, 2, ou 4. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 99% complementar sobre seu comprimento completo à SEQ ID NO: 1, 2, ou 4. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado é 100% complementar sobre seu comprimento completo a uma sequência de nucleobases da SEQ ID NO: 1, 2, ou 4.
[00218] Em certas modalidades, o composto tem pelo menos uma ligação internucleosídica modificada. Em certas modalidades, a ligação internucleosídeos é uma ligação internucleosídica tiofosfato.
[00219] Em certas modalidades, o composto tem pelo menos um nucleosídeo contendo um açúcar modificado. Em certas modalidades, pelo menos o açúcar modificado é um açúcar bicíclico. Em certas modalidades, pelo menos o açúcar bicíclico compreende uma ponte 4'- CH(CH3)-O-2'. Em determinadas incorporações, pelo menos o um açúcar modificado compreende um 2'-O-metoxietila.
[00220] Em certas modalidades, o composto compreende pelo menos um nucleosídeo tetra-hidropirano modificado onde um anel tetra-hidropirano substitui o anel furanose. Em certas modalidades, pelo menos o nucleosídeo tetra-hidropirano modificado tem a estrutura:
Figure img0001
[00221] onde Bx é uma porção de base heterocíclica opcionalmente protegida.
[00222] Em certas modalidades, o composto tem pelo menos um nucleosídeo que compreende uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.
[00223] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3' e onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar modificado.
[00224] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de dez desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de cinco nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente a, e entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e onde cada ligação internucleosídeos é uma ligação tiofosfato.
[00225] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de oito desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de seis nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de seis nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente a, e entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e onde cada ligação internucleosídeos é uma ligação tiofosfato.
[00226] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de oito desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de cinco nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacentes a, e entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', e onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e onde cada ligação internucleosídeos é uma ligação tiofosfato.
[00227] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de dez desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de cinco nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente a, e entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e onde cada ligação internucleosídeos é uma ligação tiofosfato; e onde a sequência de nucleobases compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas à sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[00228] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste de dez desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento de flanqueamento 5' que consiste de cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento de flanqueamento 3' que consiste de cinco nucleosídeos ligados, onde o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente a, e entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', onde cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e onde cada ligação internucleosídeos é uma ligação tiofosfato; e onde a sequência de nucleobases está relatada na SEQ ID NO: 80.
[00229] Certas modalidades fornecem uma composição que compreende um composto conforme descrito aqui, ou um sal do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou um diluente. Em certas modalidades, a composição compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e contendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, e 124 ou um sal dos mesmos e um veículo farmaceuticamente aceitável ou um diluente.
[00230] Certas modalidades fornecem uma composição que compreendem um composto conforme descrito aqui, ou um sal disso, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou um diluente. Em certas modalidades, a composição compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos e tem uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 12 nucleobases contíguas da sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80 ou um sal dele e um veículo farmaceuticamente aceitável ou um diluente.
[00231] Certas modalidades fornecem uma composição que compreende um composto conforme descrito aqui, onde o nível da viscosidade é menor a 40 cP. Em certas modalidades, a composição tem um nível de viscosidade menor a 15 cP. Em certas modalidades, a composição tem um nível de viscosidade menor a 12 cP. Em certas modalidades, a composição tem um nível de viscosidade menor a 10 cP.
[00232] Certas modalidades fornecem métodos de tratamento, prevenção, ou melhoram a amiloidose de transtirretina.
[00233] Certas modalidades fornecem métodos que compreendem a administração a um animal de um composto conforme descrito aqui a um animal. Em certas modalidades, o método compreende a administração a um animal de um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e contendo uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
[00234] Certas modalidades fornecem métodos que compreendem a administração a um animal de um composto conforme descrito aqui a um animal. Em certas modalidades, o método compreende a administração a um animal de um composto ou um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de umas 8 nucleobases contíguas complementar a uma parte de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 501-535 ou 580-608 de SEQ ID NO: 1.
[00235] Certas modalidades fornecem métodos que compreendem a administração a um animal de um composto conforme descrito aqui a um animal. Em certas modalidades, o método compreende a administração a um animal de um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80.
[00236] Certas modalidades fornecem métodos que compreendem a administração a um animal de um composto conforme descrito aqui a um animal. Em certas modalidades, o método compreende a administração a um animal de um composto ou um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde os nucleosídeos ligados compreendem pelo menos uma parte de umas 8 nucleobases contíguas complementar a uma parte de igual comprimento dentro da região selecionada de nucleotídeos 508-527 de SEQ ID NO: 1.
[00237] Em certas modalidades, o animal é um ser humano.
[00238] Em certas modalidades, a administração previne, trata, melhora, ou retarda a progressão da amiloidose de transtirretina conforme descrito aqui.
[00239] Em certas modalidades, o composto é coadministrado com um segundo agente.
[00240] Em certas modalidades, o composto e o segundo agente são administrados concomitantemente.
[00241] Em certas modalidades, a administração é administração parenteral. Em certas modalidades, a administração parenteral é administração subcutânea. Em certas modalidades, a formulação para administração é o composto em solução salina. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobases que compreende pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionada de entre as sequências de nucleobases relatadas nas SEQ ID NOs: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, e 124 ou um sal disso e solução salina. Em certas modalidades, a formulação não inclui nenhum agente estabilizador ou agente estabilizador adicional incluindo agentes lipídicos.
[00242] Em certas modalidades, a administração é administração parenteral. Em certas modalidades, a administração parenteral é administração intracranial. Em certas modalidades, a administração intracranial é administração intracerebral, intratecal, intraventricular, ventricular, intracerebroventricular, intraventicular cerebral ou ventricular cerebral.
[00243] Certas modalidades ainda fornecem um método para reduzir mRNA de transtirretina ou expressão de proteína em um animal que inclui a administração ao animal de um composto ou composição conforme descrito aqui para reduzir mRNA de transtirretina ou expressão de proteína no animal. Em certas modalidades, o animal é um ser humano. Em certas modalidades, reduzindo mRNA de transtirretina ou expressão de proteína impede, trata, melhora ou retarda a progressão da amiloidose transtirretina.
[00244] Certas modalidades fornecem um método para tratar um ser humano com uma doença relacionada com a transtirretina compreendendo a identificação do homem com a doença e a administração ao ser humano de uma quantidade de um composto ou composição terapeuticamente eficaz conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o tratamento reduz um sintoma selecionado do grupo constituído por agitação, falta de coordenação, nistagmo, paraparesia espástica, falta de coordenação muscular, deficiência visual, insônia, sensações incomuns, mioclonia, cegueira, perda da fala, síndrome do túnel do carpo, ataques, hemorragias subaracnoides, acidente vascular cerebral e hemorragia no cérebro, hidrocefalia, ataxia e paralisia espástica, coma, neuropatia sensorial, parestesia, hipestesia, neuropatia motora, neuropatia autonómica, hipotensão ortostática, constipação cíclica, diarreia cíclica, náuseas, vômitos, sudorese reduzida, impotência, retardo no esvaziamento gástrico, retenção urinária, incontinência urinária, cardiopatia progressiva, fadiga, dificuldade respiratória, perda de peso, falta de apetite, dormência, formigamento, fraqueza, macroglossia, síndrome nefrótica, insuficiência cardíaca congestiva, dispneia de esforço, edema periférico, arritmias, palpitações, tonturas, síncope, hipotensão postural, problemas de nervo periférico, deficiência sensorial motora, neuropatia de membros inferiores, neuropatia de membros superiores, hiperalgesia, sensação de temperatura alterada, fraqueza da extremidade inferior, caquexia, edema periférico, hepatomegalia, púrpura, disfunção diastólica, contrações ventricular prematuras, neuropatia craniana, redução nos reflexos do tendão profundo, depósitos de amiloide no corpo vítreo, opacidade vítrea, olhos secos, glaucoma, aparência curvada nas pupilas, inchaço dos pés devido à retenção de água. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma cognitivo selecionado do grupo constituído por memória debilitada, deficiência de julgamento e pensamento, planeamento comprometido, flexibilidade comprometida, pensamento abstrato comprometido, aquisição de regra comprometida, iniciação de ações apropriadas comprometida, inibição de ações impróprias comprometida, memória em curto prazo danificada, memória em longo prazo danificada, paranoia, desorientação, confusão, alucinação e demência. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma psiquiátrico selecionado do grupo constituído por demência, ansiedade, depressão, afeto embotado, egocentrismo, agressividade, comportamento compulsivo, irritabilidade, mudanças de personalidades, inclusive, memória danificada, julgamento e pensamento e idealização suicida.
[00245] Outras modalidades fornecem um método de tratar um ser humano com amiloidose transtirretina levando à amiloidose cardíaca e de administração para o ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o tratamento reduz um sintoma selecionado do grupo constituído por insuficiência cardíaca congestiva congestiva, cardiomegalia, dispneia de esforço, edema periférico, arritmias, palpitações, tontura, síncope, deposição no subendotélio da vascularização periférica podem levar à severa hipotensão postural, disfunção diastólica, bloqueio cardíaco, contrações ventriculares prematuras e várias taquiarritmias.
[00246] Outras modalidades fornecem um método de tratar um ser humano com amiloidose transtirretina levando a distúrbios neuropáticos periféricos e de administração para o ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o tratamento reduz um sintoma selecionado do grupo constituído por problemas de nervos periféricos, comprometimento sensório-motor, neuropatia do membro inferior, neuropatia do membro superior, hiperalgesia, sensação de temperatura alterada, fraqueza na extremidade inferior, dor, disfunção autonômica, que muitas vezes se manifesta como disfunção sexual ou urinária, deficiência e fraqueza sensorial simétrica, hipotensão ortostática, diarreia e/ou impotência.
[00247] Outras modalidades fornecem um método de tratar um ser humano com amiloidose transtirretina levando a distúrbios gastrointestinais e de administrar para o ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o tratamento reduz um sintoma selecionado do grupo constituído por diarreia, constipação, náuseas, vômitos e distúrbios relacionados com o rim e com o fígado.
[00248] Ainda é fornecido um método para reduzir ou prevenir à amiloidose transtirretina, compreendendo a administração a um ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui, desse modo reduzindo ou prevenindo a amiloidose transtirretina.
[00249] Ainda é fornecido um método para reduzir ou prevenir uma doença cardíaca, incluindo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz composta a um ser humano ou composição conforme descrito aqui, desse modo reduzindo ou prevenindo uma doença cardíaca. Ainda é fornecido um método para reduzir ou prevenir à doença neuropática, compreendendo a administração a um ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui, desse modo reduzindo ou prevenindo uma doença neuropática. Ainda é fornecido um método para reduzir ou prevenir à doença gastrointestinal, compreendendo a administração a um ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição conforme descrito aqui, desse modo reduzindo ou prevenindo uma doença gastrointestinal.
[00250] Ainda é fornecido um método para melhorar um sintoma de amiloidose transtirretina, compreendendo a administração a um ser humano com necessidade do mesmo, um composto contendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou 4, melhorando desse modo um sintoma de amiloidose transtirretina no ser humano.
[00251] Ainda é fornecido um método para reduzir a taxa de progressão de um sintoma associado com a amiloidose transtirretina, compreendendo a administração a um ser humano com necessidade do mesmo, um composto contendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente a SEQ ID NO: 1, 2, ou 4, reduzindo desse modo a taxa de progressão de um sintoma de amiloidose trasntirretina no ser humano.
[00252] Ainda é fornecido um método para reverter a degeneração indicada por um sintoma associado com a amiloidose transtirretina, compreendendo a administração a um ser humano com necessidade do mesmo, um composto contendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, onde o dito oligonucleotídeo modificado hibridiza-se especificamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou 4, invertendo desse modo a degeneração indicada por um sintoma da doença amiloidose transtirretina no ser humano.
[00253] Ainda é fornecido um método para melhorar um sintoma de amiloidose transtirretina, compreendendo a administração a um ser humano com necessidade do mesmo, um composto contendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80, melhorando desse modo um sintoma de amiloidose transtirretina no ser humano.
[00254] Outras modalidades fornecem um método para tratar um humano com amiloidose transtirretina, administrando a um ser humano com necessidade do mesmo, um composto contendo um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases relatada na SEQ ID NO: 80, tratando desse modo a amiloidose transtirretina no ser humano.
[00255] Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma físico, cognitivo, psiquiátrico, ou periférico. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma físico selecionado do grupo constituído por agitação, falta de coordenação, nistagmo, paraparesia espástica, falta de coordenação muscular, deficiência visual, insônia, sensações incomuns, mioclonia, cegueira, perda da fala, síndrome do túnel do carpo, ataques, hemorragias subaracnoideo, acidente vascular cerebral e hemorragia no cérebro, hidrocefalia, ataxia e paralisia espástica, coma, neuropatia sensorial, parestesia, hipestesia, neuropatia motora, neuropatia autonôma, hipotensão ortostática, constipação cíclica, diarreia cíclica, náuseas, vômitos, sudorese reduzida, impotência, retardo no esvaziamento gástrico, retenção urinária, incontinência urinária, cardiopatia progressiva, fadiga, dificuldade respiratória, perda de peso, falta de apetite, dormência, formigamento, fraqueza, macroglossia, síndrome nefrótica, insuficiência cardíaca congestiva, dispneia de esforço, edema periférico, arritmias, palpitações, tonturas, síncope, hipotensão postural, problemas de nervo periférico, deficiência sensorial motora, neuropatia de membros inferiores, neuropatia de membros superiores, hiperalgesia, sensação de temperatura alterada, fraqueza da extremidade inferior, caquexia, edema periférico, hepatomegalia, púrpura, disfunção diastólica, contrações ventricular prematuras, neuropatia craniana, redução nos reflexos do tendão profundo, depósitos de amiloide no corpo vítreo, opacidade vítrea, olhos secos, glaucoma, aparência curvada nas pupilas, inchaço dos pés devido à retenção hídrica.
[00256] Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma cognitivo selecionado do grupo constituído por memória comprometida, deficiência de julgamento e pensamento, planeamento comprometido, flexibilidade comprometida, pensamento abstrato comprometido, aquisição de regra comprometida, iniciação de ações apropriadas comprometida, inibição de ações impróprias comprometida, memória em curto prazo danificada, memória em longo prazo danificada, paranoia, desorientação, confusão, alucinação e demência. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma psiquiátrico selecionado do grupo constituído por demência, ansiedade, depressão, afeto embotado, egocentrismo, agressividade, comportamento compulsivo, irritabilidade, mudanças de personalidades, inclusive, memória danificada, julgamento e pensamento e idealização suicida.
[00257] Em certas modalidades, o sintoma é pelo menos um de pelo menos um sintoma físico, pelo menos um sintoma cognitivo e, pelo menos um sintoma psiquiátrico, e pelo menos um sintoma periférico.
[00258] Em certas modalidades, o sintoma físico é selecionado do grupo constituído por agitação, falta de coordenação, movimentos involuntariamente iniciados, movimentos involuntariamente não concluídos, marcha instável, coreia, rigidez, movimentos contorcidos, postura anormal, instabilidade, expressões faciais anormais, dificuldade de mastigação, dificuldade de engolir, dificuldade de fala, ataque e perturbações do sono.
[00259] Em certas modalidades, o sintoma cognitivo é selecionado do grupo constituído por memória comprometida, deficiência de julgamento e pensamento, planeamento comprometido, flexibilidade comprometida, pensamento abstrato comprometido, aquisição de regra comprometida, iniciação de ações apropriadas comprometida, inibição de ações impróprias comprometida, memória em curto prazo danificada, memória em longo prazo danificada, paranoia, desorientação, confusão, alucinação e demência.
[00260] Em certas modalidades, o sintoma psiquiátrico é selecionado do grupo constituído por demência, ansiedade, depressão, afeto embotado, egocentrismo, agressividade, comportamento compulsivo, irritabilidade, mudanças de personalidades, inclusive, memória danificada, julgamento e pensamento e idealização suicida.
[00261] Em certas modalidades, o sintoma periférico é selecionado do grupo constituído por massa cerebral reduzida, atrofia muscular, insuficência cardíaca, tolerância à glicose danificada, perda de peso, osteoporose, e atrofia testicular.
[00262] São fornecidos também métodos e compostos para a preparação de um medicamento para o tratamento, a prevenção, ou a melhora de uma doença relacionada com o sistema nervoso central.
[00263] Certas modalidades fornecem o uso de um composto conforme descrito aqui na manufatura de um medicamento para tratar, melhorar, ou prevenir a amiloidose transtirretina.
[00264] Certas modalidades fornecem um composto conforme descrito aqui para o uso no tratamento, prevenção, ou melhoramento da amiloidose transtirretina conforme descrito aqui por combinação de terapia com um agente ou terapia adicional conforme descrito aqui. Os agentes ou as terapias podem ser coadministrados ou administrados concomitantemente.
[00265] Certas modalidades fornecem o uso de um composto conforme descrito aqui na manufatura de um medicamento para tratar, prevenir, ou melhorar a amiloidose transtirretina conforme descrito aqui por combinação de terapia com um agente ou terapia adicional conforme descrito aqui. Os agentes ou as terapias podem ser coadministrados ou administrados concomitantemente.
[00266] Certas modalidades fornecem o uso de um composto conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para tratar, prevenir, ou melhorar a amiloidose transtirretina conforme descrito aqui em um paciente a quem é administrado subsequentemente um agente ou terapia adicional conforme descrito aqui.
[00267] Certas modalidades fornecem um kit para tratar, prevenir, ou melhorar a amiloidose transtirretina conforme descrito aqui onde o kit compreende: (i) um composto conforme descrito aqui; e como alternativa (ii) um agente ou terapia adicional conforme descrito aqui.
[00268] Um kit conforme descrito aqui poderá igualmente incluir instruções para usar o kit para tratar, prevenir ou melhorar a amiloidose transtirretina conforme descrito aqui por combinação de terapia, conforme descrito aqui.
Compostos antissenso
[00269] Os compostos oligoméricos incluem, entre outros, oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos do oligonucleotídeos, miméticos de oligonucleotídeos, compostos antissenso, oligonucleotídeos antissenso, e siRNAs. Um composto oligomérico pode ser "antissenso" a um ácido nucleico alvo, significando que é capaz de se submeter à hibridização com um ácido nucleico alvo através de ligação de hidrogênio.
[00270] Em certas modalidades, um composto antissenso tem uma sequência de nucleobases que, quando escrita nos sentido 5' a 3', compreende o complemento inverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo para o qual ele é direcionado. Em algumas dessas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso tem uma sequência de nucleobases que, quando escrita em sentido 5' para 3', compreende o complemento inverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo para o qual ele é marcado.
[00271] Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina tiene de 12 a 30 nucleotídeos de comprimento. Ou seja, os compostos antissenso são de 12 a 30 nucleobases ligadas. Em outras modalidades, o composto antissenso compreende um oligonucleotídeo modificado contendo de 8 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 18 a 21, 19 a 22 ou 20 nucleobases ligadas. Em algumas dessas modalidades, o composto antissenso compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleobases ligadas de comprimento, ou de um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima.
[00272] Em certas modalidades, o composto antissenso compreende um oligonucleotídeo modificado reduzido ou truncado. O oligonucleotídeo modificado reduzido ou truncado pode ter um único nucleosídeo suprimido na extremidade 5' (truncamento 5'), ou alternativamente na extremidade 3' (truncamento 3'). Um oligonucleotídeo reduzido ou truncado pode ter dois nucleosídeos suprimidos na extremidade 5' ou como alternativa pode ter duas subunidades suprimidas na extremidade 3'. Alternativamente, os nucleosídeos suprimidos podem estar dispersos ao longo de todo o oligonucleotídeo modificado, por exemplo, em um composto antissenso que tem um nucleosídeo suprimido na extremidade 5' e um nucleosídeo suprimido na extremidade 3.
[00273] Quando um único nucleosídeo adicional está presente em um oligonucleotídeo alongado, o nucleosídeo adicional pode estar situado na extremidade 5' ou 3' do oligonucleotídeo. Quando dois ou mais nucleosídeos adicionais estão presentes, os nucleosídeos adicionados podem ser adjacentes entre si, por exemplo, em um oligonucleotídeo que tem dois nucleosídeos adicionados na extremidade 5' (adição 5'), ou alternativamente à extremidade 3' (adição 3'), do oligonucleotídeo. Alternativamente, os nucleosídeos adicionados podem estar dispersos ao longo de todo o oligonucleotídeo modificado, por exemplo, em um oligonucleotídeo tendo um nucleosídeo adicionado ao extremo 5' e uma subunidade adicionada ao extremo 3'.
[00274] É possível aumentar ou diminuir o comprimento de um composto antissenso, como um oligonucleotídeo antissenso, e/ou introduzir bases não pareadas sem eliminar a atividade. Por exemplo, em Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305 - 7309, 1992), uma série de oligonucleotídeos antissenso de 13-25 nucleobases de comprimento foram testados quanto a sua capacidade de induzir a clivagem de um RNA alvo em um modelo da injeção do oócito. Oligonucleotídeos antissenso de 25 nucleobases de comprimento com 8 ou 11 bases não pareadas perto das extremidades dos oligonucleotídeos antissenso foram capazes de direcionar a clivagem específica do mRNA alvo, embora em menor grau do que os olignucleotídeos antissenso que não continham nenhum falta de pareamento. Da mesma forma, a clivagem alvo específica foi conseguida usando oligonucleotídeos antissenso de 13 nucleobases, incluindo aqueles com 1 ou 3 não pareados.
[00275] Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, março 2001) demonstrado a capacidade de um oligonucleotídeo tendo 100% de complementariedade ao mRNA da bcl-2 e tendo 3 desemparelhamentos ao mRNA da bcl-xL, de reduzir a expressão de bcl-2 e de bcl-xL in vitro e in vivo. Além disso, este oligonucleotídeo demonstrou potente atividade anti-tumoral in vivo.
[00276] Maher e Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341 - 3358,1988) testados uma série de oligonucleotídeos antissenso de 14 nucleobases em tandem, e uns oligonucleotídeos antissenso de 28 e 42 nucleobases compostos da sequência de dois ou três oligonucleotídeos antissenso em tandem, respectivamente, quanto a sua capacidade de deter a tradução da DHFR humana em um ensaio de reticulócito de coelho. Cada um dos três oligonucleotídeos antissenso de 14 nucleobases por si só podia inibir a tradução, embora a um nível mais modesto do que os oligonucleotídeos antissenso de 28 ou 42 nucleobases. Motivos de composto antissenso
[00277] Em certas modalidades, os compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina têm subunidades modificadas quimicamente arranjadas em padrões, ou motivos, para conferir aos compostos antissenso propriedades como melhorar a atividade inibitória, incrementar a afinidade de ligação a um ácido nucleico alvo, ou a resistência à degradação por nucleases in vivo.
[00278] Os compostos quiméricos antissenso normalmente contêm pelo menos uma região modificada de forma a conferir uma maior resistência à degradação por nuclease, um aumento da absorção celular, um aumento da afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo, e/ou um aumento da atividade inibitória. Uma segunda região de um composto quimérico antissenso pode opcionalmente servir como substrato para a endonuclease celular RNAse H, que cliva a fita de RNA de uma dupla RNA:DNA.
[00279] Compostos antissenso que têm um motivo gapmer são considerados compostos quiméricos antissenso. Em um gapmer uma região interna que tem uma pluralidade de nucleotídeos ou nucleosídeos ligados que suporte a clivagem de RNAseH está posicionada entre as regiões externas que têm uma pluralidade de nucleotídeos ou nucleosídeos ligados que são quimicamente distintos dos nucleotídeos ou nucleosídeos ligados da região interna. No caso de um oligonucleotídeo antissenso que tem um motivo gapmer, o segmento de intervalo geralmente serve como substrato para a clivagem de endonucleases, enquanto os segmentos flanqueantes compreendem nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, as regiões de um gapmer são diferenciadas pelos tipos de porções de açúcar que integram cada região distinta. Os tipos de porções de açúcar que são usados para diferenciar as regiões de um gapmer podem em algumas modalidades incluir β-D-ribonucleosideos, β-D- desoxiribonucleosídeos, nucleosídeos 2'-modificados (ditos nucleosídeos 2'-modificados podem incluir 2'-MOE e 2'-O-CH3, entre outros), e nucleosídeos modificados de açúcar bicíclico (ditos nucleosídeos modificados de açúcar bicíclico podem incluir aqueles que têm uma ponte 4'-(CH2)n-O-2', onde n = 1 ou n = 2). De preferência, cada região distinta inclui porções de açúcares uniformes. O motivo flanqueante-gap-flanqueante é frequentemente descrito como "X-Y-Z", onde "X" representa o comprimento da região flanqueante 5', "Y" representa o comprimento da região intervaloe "Z" representa o comprimento da região flanqueante 3'. Conforme usado aqui, um gapmer descrito como "X-Y-Z" tem uma configuração tal que o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente a cada segmento de flanqueamento 5' e segmento de flanqueamento 3'. Assim, nenhum nucleotídeo intermediário existe entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de intervalo, ou o segmento de intervalo e o segmento de flanqueamento 3'. Qualquer um dos compostos antissenso aqui descritos pode ter um motivo gapmer. Em algumas modalidades, X e Z são iguais, em outras modalidades são diferentes. Em uma modalidade preferencial, Y está entre 8 e 15 nucleotídeos. X, Y ou z pode ser qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Assim, os gapmers incluem, entre outros, por exemplo, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6 ou 5-8-5.
[00280] Em certas modalidades, o composto antissenso como um motivo " wingmer", tendo uma configuração flanqueante -gap ou gap- flanqueante, isto é uma configuração X-Y ou Y-Z conforme descrito acima para a configuração do gapmer. Assim, as configurações gapmers incluem, entre outras, por exemplo, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 314,16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 ou 5-13.
[00281] Em certas modalidades, os compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina possuem um motivo gapmer 5-10-5.
[00282] Em certas modalidades, os compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina possuem um motivo gapmer 6-8-6.
[00283] Em certas modalidades, os compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina possuem um motivo gapmer 5-8-5.
[00284] Em certas modalidades, um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina possui um motivo intervalo ampliado.
[00285] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso intervaloampliado marcado para um ácido nucleico de transtirretina tem um segmento de intervalo de dez 2'- desoxiribonucleotídeos posicionados imediatamente junto a, e entre segmento de flanqueamento de cinco nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas modalidades, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'. Em outra modalidade, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'-MOE.
[00286] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso intervaloampliado direcionado a um ácido nucleico de transtirretina tem um segmento de intervalo de oito 2'- desoxiribonucleotídeos posicionados imediatamente junto a, e entre segmento de flanqueamento de cinco nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas modalidades, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'. Em outra modalidade, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'-MOE.
[00287] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso intervaloampliado direcionado a um ácido nucleico de transtirretina tem um segmento de intervalo de oito 2'- desoxiribonucleotídeos posicionados imediatamente junto a, e entre segmento de flanqueamento de seis nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas modalidades, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'. Em outra modalidade, a modificação química compreende uma modificação do açúcar 2'-MOE. Ácidos nucleicos alvo, regiões alvo e sequências de nucleotídeos
[00288] Em certas modalidades, o ácido nucleico de transtirretina é qualquer uma das sequências apresentadas no número de acesso no GENBANK NM_000371.2, primeiramente depositado no GENBANK® em 13 de fevereiro de 2008 (incorporada aqui como SEQ ID NO: 1), no. de acesso no GENBANK NT_010966.10 truncado a partir dos nucleotídeos 2009236 até 2017289, primeiramente depositado no GENBANK® no 1 de agosto de 2002,(incorporado aqui como SEQ ID NO: 2); éxons 1-4 extraído da sequência genômica do macaco rhesus do no. de acesso no GENBANK NW_001105671.1, com base na similaridade a éxons humanos; e no. de acesso no GENBANK NW_001105671.1 truncado a partir dos nucleotídeos 628000 até 638000 (incorporados aqui como SEQ ID NO: 4), depositado primeiramente no GENBANK® no 28 de março de 2006.
[00289] Entende-se que a sequência apresentada em cada SEQ ID NO nos exemplos aqui contidos é independente de qualquer modificação a uma porção de açúcar, a uma ligação internucleosídeos, ou a uma nucleobase. Como tal, compostos antissenso definidos por um SEQ ID NO podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações a uma porção de açúcar, a uma ligação internucleosídeos ou a uma nucleobase. Os compostos antissenso descritos pelo número ISIS (ISIS No) ou ISIS NO indicam uma combinação de sequência de nucleobases e motivo.
[00290] Em certas modalidades, uma região alvo é uma região definida estruturalmente de ácido nucleico alvo. Por exemplo, uma região alvo pode abranger um 3' UTR, um 5' UTR, um éxon, um íntron, uma junção de éxon/íntron, uma região codificante, uma região de início de tradução, região de terminação de tradução ou outra região definida do ácido nucleico. As regiões estruturalmente definidas para transtirretina podem ser obtidas pelo número de acesso de bancos de dados de sequências como NCBI e tal informação está incorporada aqui para referência. Em certas modalidades, uma região alvo pode abranger a sequência de um sítio alvo 5' de um segmento alvo dentro da região alvo para um sítio alvo 3' de um outro segmento alvo dentro da região alvo.
[00291] A marcação inclui a determinação de pelo menos um segmento alvo para o qual um composto antissenso se hibridiza de forma tal que o efeito desejado ocorra. Em certas modalidades, o efeito desejado é uma redução nos níveis de ácidos nucleicos do mRNA alvo. Em certas modalidades, o efeito desejado é a redução dos níveis da proteína codificada pelo ácido nucleico alvo ou uma mudança fenotípica associada com o ácido nucleico alvo.
[00292] Uma região alvo pode conter um ou mais segmentos alvo. Vários segmentos alvo dentro de uma região alvo podem estar sobrepostos. Alternativamente, podem não estar sobrepostos. Em certas modalidades, os segmentos alvo dentro de uma região alvo estão separados por não mais do que aproximadamente 300 nucleotídeos. Em certas modalidades, os segmentos alvo dentro de uma região alvo estão separados por um número de nucleotídeos que é, cerca de, não mais do que, não mais do que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nucleotídeos no ácido nucleico alvo, ou está em uma faixa definida por dois dos valores anteriores. Em certas modalidades, os segmentos alvo dentro de uma região alvo estão separados por não mais do que, ou não mais de que aproximadamente, 5 nucleotídeos no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, os segmentos alvo são contíguos. São contempladas as regiões alvo definidas por uma faixa que tem um ácido nucleico inicial que está em qualquer um dos sítios alvo 5' ou sítios alvo 3' alistados aqui.
[00293] Segmentos alvo apropriados podem ser encontrados dentro de uma 5' UTR, uma região codificante, uma 3' UTR, um íntron, um éxon ou uma junção éxon/íntron. Segmentos alvos contendo um códon de início ou um códon de finalização também são segmentos alvo apropriados. Um segmento alvo apropriado pode excluir especificamente uma determinada região estruturalmente definida como o códon de início ou códon de finalização.
[00294] A determinação dos segmentos alvo apropriados pode incluir uma comparação da sequência de ácidos nucleicos alvo com outras sequências em todo o genoma. Por exemplo, o algoritmo BLAST pode ser usado para identificar regiões de similaridade entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparação pode prevenir a seleção de sequências de compostos antissenso que podem hibridizar de forma não específica a outras sequências que não são as do ácido nucleico alvo selecionado (isto é, sequência não alvo ou fora do alvo).
[00295] Pode haver variação na atividade (por exemplo, conforme definido pela redução percentual dos níveis de ácido nucleico alvo) dos compostos antissenso dentro de uma região alvo ativa. Em certas modalidades, as reduções nos níveis de mRNA de transtirretina são indicativas da inibição da expressão da transtirretina. As reduções nos níveis de uma proteína de transtirretina também são indicativas da inibição da expressão de mRNA alvo. Ainda mais, alterações fenotípicas são indicativas da inibição da expressão da transtirretina. Por exemplo, aumento do tamanho do cérebro ao normal, melhora na coordenação motora, diminuição de espasmos musculares contínuos (distonia), diminuição da irritabilidade e/ou ansiedade, melhoria da memória, ou um aumento na energia, entre outras alterações fenotípicas que podem ser analisadas. Outras indicações fenotípicas, por exemplo, sintomas associados com a amiloidose transtirretina, também podem ser avaliadas conforme descrito abaixo. Hibridização
[00296] Em algumas modalidades, hibridização ocorre entre um composto antissenso divulgado aqui e um ácido nucleico de transtirretina. O mecanismo mais comum de hibridização envolve ligações de hidrogênio (por exemplo, Watson-Crick, ligações de hidrogênio Hoogsteen ou reverso de Hoogsteen) entre nucleobases complementar de moléculas de ácido nucleico.
[00297] A hibridização pode ocorrer sob condições variadas. Condições rigorosas são dependentes de sequência e estão determinadas pela natureza e composição das moléculas de ácido nucleico a ser hibridizadas.
[00298] Métodos para determinar se uma sequência é especificamente hibridizável a um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na técnica. Em certas modalidades, os compostos antissenso fornecidos aqui são especificamente hibridizáveis com um ácido nucleico de transtirretina.
Complementaridade
[00299] Um composto antissenso e um ácido nucleico alvo são complementar um ao outro quando um número suficiente de nucleobases do composto antissenso pode se ligar por ligação de hidrogênio com as correspondentes nucleobases do ácido nucleico alvo, de modo que irá ocorrer um efeito desejado (por exemplo, inibição antissenso de um ácido nucleico alvo, como um ácido nucleico de transtirretina).
[00300] Um composto antissenso pode se hibridizar em um ou mais segmentos de um ácido nucleico de transtirretina de modo que segmentos adjacentes ou intermediários não estão envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de alça, estrutura de não pareamento ou de gancho).
[00301] Em certas modalidades, os compostos antissenso aqui fornecidos, ou uma parte especificada dos mesmos, são, ou pelo menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar a um ácido nucleico de transtirretina, uma região alvo, o um segmento especifico dele. O percentual de complementariedade de um composto antissenso com um ácido nucleico alvo pode ser determinado usando métodos de rotina.
[00302] Por exemplo, um composto antissenso no qual 18 de 20 nucleobases do composto antissenso são complementar a uma região alvo e, por conseguinte, hibridizam especificamente, representaria uma complementaridade de 90 por cento. Neste exemplo, as restantes nucleobases não complementar podem se agrupar ou intercalar com nucleobases complementar e não precisam ser contíguas umas às outras ou a nucleobases complementar. Como tal, um composto antissenso que tem 18 nucleobases de comprimento com 4 (quatro) nucleobases não complementar as quais estão flanqueadas por duas regiões completamente complementar com o ácido nucleico alvo teria 77,8% de complementaridade total com o ácido nucleico alvo e seria, portanto, abrangido no âmbito da presente invenção. O percentual de complementaridade de um composto antissenso com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente usando programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamentos locais básicos) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang e Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Os percentuais de homologia, de identidade de sequência ou de complementaridade, podem ser determinados mediante, por exemplo, o programa Gap (pacote de análise de sequência Wisconsin, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando as configurações padrões, que usam o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[00303] Em certas modalidades, os compostos antissenso fornecidos aqui, ou porções especificas dos mesmos, são inteiramente complementar (isto é. 100% complementar) a um ácido nucleico alvo, ou porção específica do mesmo. Por exemplo, o composto antissenso pode ser totalmente complementar a um ácido nucleico de transtirretina, ou a uma região alvo, ou a um segmento alvo ou a uma sequência alvo deles. Conforme usado aqui, "completamente complementar" significa que cada nucleobase de um composto antissenso é capaz do emparelhamento preciso de bases com as correspondentes nucleobases de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, um composto antissenso de 20 nucleobases é inteiramente complementar a uma sequência alvo que tem 400 nucleobases de comprimento, desde que haja uma correspondente parte de 20 nucleobases do ácido nucleico alvo que é inteiramente complementar ao composto antissenso. Completamente complementar também pode ser usada em referência a uma parte específica do primeiro e/ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma parte de 20 nucleobases de um composto de um composto antissenso de 30 nucleobases pode ser "completamente complementar" para uma sequência alvo que tem 400 nucleobases de comprimento. A parte de 20 nucleobases do oligonucleotídeo de 30 nucleobases é completamente complementar a uma sequência alvo se a sequência alvo tem a correspondente parte de 20 nucleobases onde cada nucleobase é complementar à parte de 20 nucleobases do composto antissenso. Ao mesmo tempo, o composto antissenso inteiro de 30 nucleobases pode ou não ser completamente complementar à sequência alvo, dependendo se as restantes 10 nucleobases do composto antissenso também são complementar à sequência alvo.
[00304] A posição de uma nucleobase não complementar pode estar na extremidade 5' ou na extremidade 3' do composto antissenso. Alternativamente, a nucleobase ou as nucleobases não complementar podem estar em uma posição interna do composto antissenso. Quando dois ou mais nucleobases não complementar estão presentes, podem ser contíguas (isto é. ligadas) ou não contíguas. Em uma modalidade, uma base não complementar situa-se no segmento flanquante de um oligonucleotídeo antissenso de gapmer.
[00305] Em certas modalidades, os compostos antissenso que têm, ou têm até 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais de 4, não mais de 3, não mais de 2, ou não mais de 1 nucleobase(s) não complementar referente a um ácido nucleico alvo, como um ácido nucleico de transtirretina, ou uma parte especifica dele.
[00306] Em certas modalidades, os compostos antissenso que têm, ou têm até 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais de 6, não mais de 5, não mais de 4, não mais de 3, não mais de 2, ou não mais de 1 nucleobase(s) não complementar referente a um ácido nucleico alvo, como um ácido nucleico de transtirretina, ou uma parte especifica dele.
[00307] Os compostos antissenso fornecidos aqui também incluem aqueles que são complementares a uma parte de um ácido nucleico alvo. Conforme usado aqui, "parte" refere-se a um número definido de nucleobases contíguas (ou seja, ligadas) dentro de uma região ou segmento de um ácido nucleico alvo. Uma "parte" pode referir-se a um número definido de nucleobases contíguas de um composto antissenso. Em certas modalidades, os compostos antissenso, são complementar pelo menos a uma parte de 8 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso são complementares pelo menos a uma parte de 12 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos antissenso, são complementares pelo menos a uma parte de 15 nucleobases de um segmento alvo. Também são contemplados os compostos antissenso que são complementares pelo menos a uma parte de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleobases de um segmento alvo, ou uma faixa definida por dois desses valores.
Identidade
[00308] Os compostos antissenso fornecidos aqui podem também ter um percentual de identidade definida para uma sequência de nucleotídeos particular, SEQ ID NO, ou composto, representado por um número Isis específico, ou uma parte do mesmo. Conforme usado aqui, um composto antissenso é idêntico à sequência divulgada aqui se tiver a mesma capacidade de emparelhamento de nucleobases. Por exemplo, um RNA que contivesse a uracila no lugar da timidina em uma sequência de DNA divulgada seria considerado idêntico à sequência do DNA desde que a uracila e a timidina se emparelhem com a adenina. Versões encurtadas e alongadas dos compostos antissenso aqui descritos, bem como os compostos contendo bases não idênticas em relação aos compostos antissenso fornecidos aqui também são contempladas. As bases não idênticas podem estar adjacentes umas com outras ou dispersadas por todo o composto antissenso. A percentual de identidade de um composto antissenso é calculada de acordo com o número das bases que têm idêntica base emparelhando em relação com a sequência que está sendo comparada.
[00309] Em certas modalidades, os compostos antissenso, ou partes deles, são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos a um ou mais dos compostos antissenso ou SEQ ID NOs, ou uma parte deles, divulgados aqui. Modificações
[00310] Um nucleosídeo é uma combinação de base-açúcar. A parte nucleobase (também conhecida como base) do nucleosídeo é normalmente uma porção de base heterocíclica. Os nucleotídeos são nucleosídeos que incluem ainda um grupo fosfato covalentemente ligado à parte do açúcar do nucleosídeo. Para os nucleosídeos que incluem um açúcar pentofuranosila, o grupo fosfato pode estar ligado ao grupo hidroxila 2', 3' ou 5' do açúcar. Os nucleotídeos são formados através da ligação covalente de nucleosídeos adjacentes entre si, para formar um oligonucleotídeo polimérico linear. Dentro da estrutura do oligonucleotídeo, os grupos fosfatos são comumente referidos como formando as ligações internucleosídeas do oligonucleotídeo.
[00311] As modificações aos compostos antissenso englobam substituições ou alterações de ligações internucleosídicas, de partes de açúcares ou de nucleobases. Os compostos antissenso modificados muitas vezes são preferidos sobre formas nativas por causa das propriedades desejáveis, como, por exemplo, maior absorção celular, maior afinidade para o ácido nucleico alvo, maior estabilidade na presença de nucleases, ou maior atividade inibitória.
[00312] Os nucleosídeos quimicamente modificados podem também ser empregados para aumentar a afinidade de ligação de um oligonucleotídeo antissenso encurtado ou truncado para seu ácido nucleico alvo. Consequentemente, resultados comparáveis, muitas vezes podem ser obtidos com compostos antissenso encurtados que têm ditos nucleosídeos quimicamente modificados. Ligações internucleosídicas modificadas
[00313] A ligação de internucleosídeos que naturalmente ocorre entre RNA e DNA é uma ligação fosfodiéster 3' para 5'. Os compostos antissenso contendo uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas, ou seja, ligações internucleosídicas que não ocorrem naturalmente, frequentemente são selecionadas sobre os compostos antissenso contendo ligações internucleosídicas que ocorrem naturalmente devido às propriedades desejáveis, como, por exemplo, maior absorção celular, maior afinidade para o ácido nucleico alvo e maior estabilidade na presença de nucleases.
[00314] Os oligonucleotídeos contendo ligações internucleosídicas modificadas incluem ligações internucleosídicas que mantêm um átomo de fósforo, bem como as ligações internucleosídicas que não têm um átomo de fósforo. As ligações internucleosídicas contendo o fósforo representante incluem, entre outras, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos e fosforotioatos. Os métodos da preparação de ligações contendo fósforo e não contendo fósforo são bem conhecidos.
[00315] Em certas modalidades, compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina compreendem um ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em certas modalidades, as ligações internucleosídicas modificadas são ligações fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação internucleosídeo de um composto antissenso é uma ligação internucleosídeos fosforotioato. Porções de açúcares modificadas
[00316] Os compostos antissenso da invenção opcionalmente podem conter um ou mais nucleosídeos onde o grupo açúcar foi modificado. Ditos nucleosídeos de açúcar modificados podem conferir maior estabilidade de nuclease, maior afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica para os compostos antissenso. Em certas modalidades, os nucleosídeos compreendem porções do anel ribofuranose quimicamente modificadas. Os exemplos de anéis ribofuranoses quimicamente modificados incluem entre outros, adição de grupos substituintes (incluindo grupos substituintes 5' e 2') em ponte de átomos do anel não germinais para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), substituição do átomo de oxigênio do anel ribosil com S, N (R), ou C (R1) (R2) (R, R1 e R2 são cada um independentemente H, C1-C12alquil ou um grupo de proteção) e combinações dos mesmos. Os exemplos de açúcares quimicamente modificados incluem nucleosídeos com 2'-F-5'-metil substituído (vide Pedido Internacional PCT WO 2008/101157 publicado em 8/21/08 para outros nucleosídeos 5',2,-bis substituídos revelados) ou substituição do átomo de oxigênio do anel ribosil com S com ainda outra substituição na posição 2'- (vide Pedido de Patente US2005-0130923, publicado em 16 de junho de 2005) ou alternativamente uma substituição 5' de um BNA (vide pedido internacional de PCT WO 2007/134181 publicado em 11/22/07 em que ANL é substituído com por exemplo um grupo 5'-metila ou 5'-vinila).
[00317] Os exemplos de nucleosídeos contendo porções de açúcares modificadas incluem, entre outros, nucleosídeos que compreendem grupos substituintes 5'-vinila, 5'-metil ((R ou S), 4'-S, 2'- F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F e 2'-O(CH2)2OCH3. O substituinte na posição 2' também pode ser selecionado de alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), e O- CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), onde cada Rl, Rm e Rn é, de forma independente, H ou C1-C10 alquil substituído ou não substituído.
[00318] Conforme usado aqui, "nucleosídeos bicíclicos" refere-se a nucleosídeos modificados que compreende uma porção de açúcar bicíclica. Os exemplos de nucleosídeos bicíclicos incluem entre outros nucleosídeos que compreendem uma ponte entre os átomos do anel ribosil 4' e 2'. Em certas modalidades, os compostos antissenso fornecidos aqui incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos que compreende uma ponte 4' a 2'. Os exemplos de ditos nucleosídeos bicíclicos com ponte 4' a 2', incluem entre outros, a uma da fórmula: 4'- (CH2)-O-2' (ANL); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ANE); 4'-CH(CH3)-O-2' e 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (e análogos dos mesmos, vide patente U.S. 7.399.845, emitida em 15 de julho de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (e análogos dos mesmos vide a publicação de pedido internacional WO/2009/006478, publicado em 8 de Janeiro de 2009); 4'-CH2- N(OCH3)-2' (e análogos dos mesmos vide publicaçãp de pedido internacional WO/2008/150729, publicado em 11 de Dezembro de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (vide pedido da patente US2004-0171570, publicado em 2 de Setembro de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', onde R é H, C1-C12 alquil ou um grupo de proteção (vide Patente U.S. 7.427.672, emitida em 23 de Setembro de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (vide Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4'-CH2- C(=CH2)-2' (e análogos dos mesmos vide publicação de pedido internacional WO 2008/154401, publicada em 8 de Dezembro de 2008).
[00319] Ainda outros relatórios relacionados a nucleosídeos bicíclicos também podem ser encontrados na literatura publicada (vide, por exemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. Patent Nos. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; e 7.696.345; Publicação de Patente US US2008-0039618; US2009-0012281; patentes US 60/989.574; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; e 61/099.844; Pedidos internacionais PCT WO publicados 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; e WO 2009/006478. Cada um dos nucleosídeos bicíclicos acima mencionados pode ser preparado contendo uma ou mais configurações estereoquímicas dos açúcares incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (vide pedido internacional do PCT PCT/DK98/00393, publicado em 25 de Março de 1999 como WO 99/14226).
[00320] Em certas modalidades, as partes de açúcares bicíclicos de nucleosídeos BNA incluem, entre outros, compostos com pelo menos uma ponte entre a posição 4' e 2' da porção de açúcar pentofuranosil onde tais pontes independente compreende 1 ou de 2 a 4 grupos ligados independentemente selecionados de -[C(Ra)(Rb)]n-, - C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, - S(=O)x-, e N(Ra)-;
[00321] onde:
[00322] x é 0, 1, ou 2;
[00323] n é 1, 2, 3 ou 4;
[00324] cada Ra e Rb é, independentemente, H, um grupo protetor, hidroxila, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, radical heterociclo, radical heterociclo substituído, heteroarila, heteroarila substituída, radical C5-C7 alicíclico , radical C5-C7 alicíclico substituído, halogênio, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(=O)-H), acila substituída, CN, sulfonila (S(=O)2-J1), ou sulfonila (S(=O)-J1); e
[00325] cada J1 eJ2 é, independentemente, H, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, acila (C(=O)-H), acila substituída, um radical heterocíclico, um radical heterocíclico substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-C12 aminoalquila substituída ou um grupo protetor.
[00326] Em certas modalidades, a ponte de uma porção de açúcar bicíclica é -[C(^)(Rb)]nr, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ou -C(RaRb)- O-N(R)-. Em certas modalidades, a ponte é 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'- (CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' e 4'-CH2-N(R)- O-2'- onde cada R é, independentemente, H, um grupo protetor ou C1C12 alquila.
[00327] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos ainda são definidos pela configuração isomérica. Por exemplo, um nucleosídeo que compreende uma ponte 4'-2' metileno-óxi, pode estar na configuração α-L ou na configuração β-D. Previamente, o α-L- metileno-óxi (4'-CH2-O-2') dos BNAs foram incorporados em oligonucleotídeos antissenso que mostraram atividade antissenso (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[00328] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos incluem, entre outros, o (A) BNA a-L-metileno-óxi (4'-CH2-O-2‘), o (B) o BNA β- D-metileno-óxi (4'-CH2-O-2'), o (C) BNA etileno-óxi (4'-(CH2)2-O-2'), o (D) BNA amino-óxi (4'-CH2-O-N(R)-2'), o (E) BNA oxiamino (4'-CH2- N(R)-O-2'), e o (F) BNA metil(metileno-óxi) (4'-CH(CH3)-O-2'), o (G) BNA metileno-tio (4'-CH2-S-2'), o (H) BNA metileno-amino (4'-CH2- N(R)-2'), o (I) BNA metil carboxílico (4'-CH2-CH(CH3)-2'), e o (J) BNA propileno carboxílico (4'-(CH2)3-2') conforme descrito abaixo.
Figure img0002
[00329] onde Bx é a porção de base e R é independentemente H, um grupo protetor ou C1-C12 alquila.
[00330] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula I:
Figure img0003
[00331] em que:
[00332] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00333] -Qa-Qb-Qc- é -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O- N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- ou -N(Rc)-O-CH2-;
[00334] Rc é C1-C12 alquila ou um grupo amino protetor; e
[00335] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxil protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00336] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula II:
Figure img0004
[00337] em que:
[00338] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00339] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxil protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00340] Za é C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alquila substituída, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinil substituído, acila, acila substituída, amido substituído, tiol ou tio substituído.
[00341] Em uma modalidade, cada um dos grupos substituídos é, independentemente, mono ou poli substituído com grupos substituintes independentemente selecionados de halogênio, oxo, hidroxila,OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, e NJeC(=X)NJcJd, onde cada Jc, Jd eJe é, independentemente, H, C1-C6 alquila, ou C1-C6 alquila substituída e X é O ou NJc.
[00342] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula III:
Figure img0005
[00343] em que:
[00344] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00345] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxil protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00346] Zb é C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alquil substituído, C2-C6 alquenil substituído, C2-C6 alquinil substituído ou acil (C(=O)-) substituído.
[00347] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula IV:
Figure img0006
[00348] em que:
[00349] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00350] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxil protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00351] Rd é C1-C6 alquila, C1-C6 alquila substituída, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinila, ou C2-C6 alquinila substituída;
[00352] cada qa, qb, qc e qd é, independentemente, H, halogênio, C1C6 alquila, C1-C6 alquila substituída, C2-C6 alquenila,C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinila ou C2-C6 alquinila substituída, C1-C6 alcoxila, C1-C6 alcoxila substituída, acila, acila substituída, C1-C6 aminoalquila ou C1-C6 aminoalquila substituída;
[00353] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula V:
Figure img0007
[00354] em que:
[00355] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00356] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxila protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00357] qa, qb, qe e qf são cada um, independentemente, hidrogênio, halogênio, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C1-C12 alcóxi, C1-C12 alcóxi substituído, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O) OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O) NJjJk ouN(H)C(=S)NJjJk;
[00358] ou qe e qf juntos são =C(qg)(qh);
[00359] qg e qh são cada um, independentemente, H, halogênio, C1 C12 alquila ou C1-C12 alquila substituída.
[00360] A síntese e a preparação dos monômeros de BNA metileno-óxi (4'-CH2-O-2') adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina e uracila, junto com as suas oligomerizações, e as propriedades de reconhecimento de ácido nucleico foram descritas (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Os ANBs e a preparação deles também estão descritos em WO 98/39352 e em WO 99/14226.
[00361] Análogos de BNA metileno-óxi (4'-CH2-O-2') e ANBs-2'-tio, também foram preparados (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). A preparação de análogos de nucleosídeos bloqueados compreendendo duplex de oligodesoxirribonucleotídeo como substratos para polimerases de ácidos nucleicos também tem sido descrita (Wengel et al., WO 99/14226). Além disso, a síntese de BNA-2'-amino, um novo análogo de oligonucleotídeo de alta afinidade de conformação restrita foi descrito na técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Além disso, BNA-2'-amino e BNA-2'-metilamino foram preparados e a estabilidade térmica de seus duplex com fitas de RNA e DNA complementar foi relatada previamente.
[00362] Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos são fornecidos contendo a Fórmula VI:
Figure img0008
[00363] em que:
[00364] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00365] Ta e Tb são cada um, independentemente H, um grupo hidroxil protetor, um grupo conjugado, um grupo fósforo reativo, uma porção de fósforo ou uma ligação covalente a um meio de suporte.
[00366] cada qi, qj qk e ql são, independentemente, H, halogênio, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C1C12 alcoxila, C1-C12 alcoxila substituída, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkouN(H)C(=S) NJjJk; e
[00367] qi e qj ou ql e qk são junto o =C(qg)(qh), onde qg e qh são cada um, independentemente, H, halogênio, C1-C12 alquil ou C1-C12 alquil substituído.
[00368] Um nucleosídeo carboxílicos bicíclicos contendo uma ponte 4'-(CH2)3-2' e a ponte análoga de alquenil 4'-CH=CH-CH2-2' foram descritos (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 44294443 e Albaek et al., J. Org. Chem. , 2006, 71, 7731-7740). A síntese e a preparação de nucleosídeos carboxílicos bicíclicos, junto com as suas oligomerizações e os estudos bioquímicos também foram descritos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26), 83628379).
[00369] Conforme usado aqui, "nucleosídeo bicíclico 4'-2'" ou "nucleosídeo bicíclico 4' a 2'" refere-se a um nucleosídeo bicíclico que compreende um anel furanose que compreende uma ponte que conecta dois átomos de carbono do anel furanose que conecta o átomo de carbono 2' e o átomo de carbono 4' do anel de açúcar.
[00370] Conforme usado aqui, "nucleosídeos monocíclico" refere-se aos nucleosídeos que compreendem porções de açúcares modificadas que não são porções de açúcares bicíclicas. Em certas modalidades, a porção de açúcar, ou o análogo da porção de açúcar, de um nucleosídeo podem estar modificados ou substituídos em qualquer posição.
[00371] Conforme usado aqui, "o açúcar 2'- modificado" significa um açúcar furanosil modificado na posição 2'. Em certas modalidades, tais modificações incluem os substituintes selecionados de: um haleto, incluindo, entre outros ao alcóxi substituído e não substituído e à tioaquila substituída e não substituída, à amino alquila substituída e não substituída, à alquila substituída e não substituída, à alila substituída e não substituída, e à alquinila substituída e não substituída. Em certas modalidades, as modificações 2' são selecionadas dos substituintes incluindo, entre outras: O [(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, onde n e m são desde 1 a aproximadamente 10. Outros grupos substituintes 2' também podem ser selecionados de: C1-C12 alquila, alquila substituída, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, hetrocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um composto antissenso, et al substituintes contendo similares propriedades. Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados compreendem uma cadeia lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Ditas substituições 2'-MOE foram descritas como contendo melhoras na afinidade de ligação quando comparadas com os nucleosídeos não modificados e os outros nucleosídeos modificados, como 2'-O-metila, O-propila, e O-aminopropila. Os oligonucleotídeos contendo o substituinte 2'-MOE também demonstraram ser inibidores antissenso da expressão do genes com características promissoras para o uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; e Altmann et al., Nucleosídeos Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[00372] Conforme usado aqui, um "nucleosídeo tetra-hidropirano modificado" ou "nucleosídeo THP modificado" significa um nucleosídeo contendo um "açúcar" tetra-hidropirano de seis membros substituído no resíduo pentofuranosila em nucleosídeos normais (um substituto do açúcar). Os nucleosídeos THP modificados incluem, entre outros, o que é referenciado na técnica como o ácido nucleico hexitol (HNA), o ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MNA) (vide Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), flúorflúor HNA (F- HNA) ou aqueles compostos que têm a fórmula VII:
Figure img0009
[00373] em que independentemente para cada um dos ditos pelo menos um análogo de nucleosídeo tetra-hidropirano da Fórmula VII:
[00374] Bx é uma porção de base heterocíclica;
[00375] Ta e Tb são cada um, independentemente, um grupo de ligação de internucleosídeos que liga o análogo de nucleosídeo tetra- hidropirano ao composto antissenso ou um dos Ta e Tb é um grupo de ligação de internucleosídeos que liga o análogo de nucleosídeo tetra- hidropirano ao composto antissenso e o outro dos Ta e Tb é H, um grupo protetor hidroxila, um grupo conjugado ligado ou um grupo terminal 5' ou 3';
[00376] q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um independentemente, H, C1-C6 alquila, C1-C6 alquil substituído, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquenil substituído, C2-C6 alquinil ou C2-C6 alquinil substituído; e cada um dos R1 e R2 é selecionado a partir de hidrogênio, hidroxila, halogênio, alcoxi substituído ou não substituído, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X) J1, OC(=X) NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 e CN, onde X é O, S ou NJ1 e cada J1, J2 e J3 são, independentemente, H ou C1-C6 alquil.
[00377] Em certas modalidades, os nucleosídeos THP modificados da Fórmula VII são fornecidos onde q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um H. Em certas modalidades, pelo menos um dos q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é outro além do H. Em certas modalidades, pelo menos um dos q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é metil. Em certas modalidades, os nucleosídeos de THP da Fórmula VII são fornecidos onde um dos R1 e R2é flúor. Em certas modalidades, R1 é flúor e R2 é H; R1 é metóxi e R2 é H, e R1 é H e R2 é metoxietóxi.
[00378] Conforme usado aqui, "2'-modificado" ou "2'-substituído" refere-se a um nucleosídeo que compreende um açúcar que compreende um substituinte na posição 2' que seja outro além de H ou OH. Os nucleosídeos 2'-modificados incluem, entre outros, os nucleosídeos onde a ponte conectando dois átomos de carbono do anel do açúcar conecta o carbono 2' e outro carbono do anel do açúcar; e nucleosídeos com 2' substituintes não ligantes, como alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ou O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-C10 alquil substituído ou não substituído. Nucleosídeos 2'-modificados podem ainda compreender outras modificações, por exemplo, em outras posições do açúcar e/ou na nucleobase.
[00379] Conforme usado aqui, "2'-F" refere-se a um nucleosídeo que compreende um açúcar que compreende um grupo flúor na posição 2'.
[00380] Conforme usado aqui, "2'-OMe" ou "2"-OCH3" ou "2'-O- metila" cada um se refere a um nucleosídeo que compreende um açúcar constituído por um grupo -OCH3 na posição 2' do anel de açúcar.
[00381] Conforme usado aqui, "MOE" ou "2'-MOE" ou "2'-OCH2CH2 OCH3" ou "2'-O-metoxietila" cada um se refere a um nucleosídeo que compreende um açúcar constituído por um grupo -OCH2CH2OCH3 na posição 2' do anel do açúcar.
[00382] Conforme usado aqui, "oligonucleotídeo" refere-se a um composto que compreende uma pluralidade de nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, uma ou mais da pluralidade de nucleosídeos estão modificados. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um ou mais ribonucleosídeos (RNA) e/ou desoxirribonucleosídeos (DNA).
[00383] Muitos outros sistemas de anel biciclo e triciclo substituto de açúcar são também conhecidos na técnica que podem ser usados para modificar nucleosídeos para a incorporação nos compostos antissenso (ver, por exemplo, artigo de revisão: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
[00384] Ditos sistemas de anel podem submeter-se a várias substituições adicionais para melhorar a atividade.
[00385] Métodos para as preparações de açúcares modificados são bem conhecidos por especialistas na técnica.
[00386] Nos nucleotídeos contendo porções de açúcar modificadas, as porções da nucleobase (natural, modificada ou uma combinação delas) são mantidas para a hibridização com um ácido nucleico alvo apropriado.
[00387] Em certas modalidades, os compostos antissenso compreendem um ou mais nucleosídeos contendo porções de açúcar modificadas. Em certas modalidades, a porção do açúcar modificada é 2'-MOE. Em certas modalidades, os nucleosídeos 2'-MOE modificados são arranjados em um motivo gapmer. Em certas modalidades, a porção de açúcar modificada é um nucleosídeo bicíclico que tem um grupo ponte (4'-CH(CH3)-O-2'). Em certas modalidades, os nucleosídeos (4'-CH(CH3)-O-2') modificados são arranjados através dos flanqueantes de um motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
[00388] As modificações ou substituições de nucleobases (ou bases) são estruturalmente intercambiáveis de, ainda funcionalmente permutáveis com, nucleobases de ocorrência natural ou sintéticas não modificadas. Ambas as nucleobases naturais e modificadas são capazes de participar das ligações de hidrogênio. Tais modificações de nucleobases podem conferir estabilidade de nuclease, afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica para os compostos antissenso. As nucleobases modificadas incluem as nucleobases sintéticas e naturais como, por exemplo, a 5-metilcitosina (5-me-C). Algumas substituições de nucleobases, incluindo as substituições da 5-metilcitosina, são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação de um composto antissenso para um ácido nucleico alvo. Por exemplo, substituições 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade dos ácidos nucleicos duplos em 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. e Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton,1993, pp. 276-278).
[00389] As nucleobases não modificadas adicionais incluem 5- hidróximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila entre outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracila e citosina entre outros derivados alquinil de bases pirimidinas, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracila, 8-halo, 8- amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxil e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluormetil e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2- F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7- deazaguanina e 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina.
[00390] Partes de bases heterocíclicas podem incluir também aquelas nas quais a base purina ou pirimidina está substituída por outros heterocíclicos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7- deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases que são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos antissenso incluem pirimidinas 5-substituídas, 6- azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina.
[00391] Em certas modalidades, compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina compreendem um ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso de intervalo ampliado marcados para um ácido nucleico de transtirretina compreendem uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma 5-metilcitosina. Composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas
[00392] Os oligonucleotídeos antissenso podem ser misturados com substância farmaceuticamente aceitável ativa ou inerte para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de compostos farmacêuticos são dependentes de um número de critérios, incluindo, entre outros, via de administração, a extensão da doença, ou a dose a ser administrada.
[00393] Os compostos antissenso marcados para um ácido nucleico de transtirretina podem ser utilizados em composições farmacêuticas combinando o composto antissenso com um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável apropriado. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui tampão fosfato salino (PBS). PBS é um diluente apropriado para uso em composições para ser administrado via parenteral. Por conseguinte, em uma modalidade, nos métodos descritos aqui se emprega uma composição farmacêutica que compreende um composto antissenso marcado para um ácido nucleio de transtirretina e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é PBS. Em certas modalidades, o composto antissenso é um oligonucleotídeo antissenso.
[00394] As composições farmacêuticas que compreendem compostos antissenso abrangem qualquer sal farmaceuticamente aceitável, ésteres ou sais de ditos ésteres, ou qualquer outro oligonucleotídeo que, após a administração a um animal, incluindo um ser humano, é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou resíduo do mesmo. Por conseguinte, por exemplo, a revelação também é desenhada para sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos antissenso, de profármaco, sais farmaceuticamente aceitáveis dos ditos profármacos, entre outros bioequivalentes. Sais farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, entre outros, sais de sódio e potássio.
[00395] Um profármaco pode incluir a incorporação de nucleosídeos adicionais em uma ou ambas as extremidades de um composto antissenso que são clivadas por nucleases endógenas dentro do corpo, para formar o composto antissenso ativo. Compostos antissenso conjugados
[00396] Os compostos antissenso podem estar covalentemente ligados a uma ou mais porções ou conjugados que melhoram a atividade, a distribuição celular ou a absorção celular dos oligonucleotídeos antissenso resultantes. Os típicos grupos conjugados incluem porções de colesterol e porções lipídicas. Os grupos conjugados adicionais incluem carboidratos, fosfolipídios, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas e corantes.
[00397] Os compostos antissenso também podem ser modificados para ter um ou mais grupos estabilizadores que geralmente estão ligados a um ou ambos os terminais dos compostos antissenso para melhorar as propriedades como, por exemplo, a estabilidade para nucleases. Incluído nos grupos estabilizadores estão as estruturas capa. Essas modificações terminais protegem o composto antissenso contendo ácido nucleico terminal da degradação de exonucleases, e podem ajudar na administração e/ou localização dentro de uma célula. O capa pode estar presente no teminal 5' (5'-capa), ou no terminal 3' (3'-capa), ou pode estar presente em ambos terminais. As estruturas capa são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, capas básicas desoxi invertidas. Outros grupos estabilizadores 3' e 5' que podem ser usados para terminar uma ou ambas as extremidades de um composto antissenso para conferir estabilidade de nuclease incluem aqueles divulgados no WO 03/004602 publicado em 16 de Janeiro de 2003. Cultura celular e tratamento de compostos antissenso
[00398] Os efeitos dos compostos antissenso no nível, atividade ou expressão de ácidos nucleicos de transtirretina podem ser testados in vitro em uma variedade de tipos de células. Os tipos de células usadas para ditas análises estão disponíveis em fornecedores comerciais (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) e as células são cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor usando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo. Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Os tipos de células ilustrativas incluem, entre outras, as células HepG2, as células Hep3B, os hepatócitos primários, as células A549, os fibroblastos GM04281 e as células LLC-MK2. Análise in vitro de oligonucleotídeos antissenso
[00399] São descritos aqui os métodos para o tratamento das células com oligonucleotídeos antissenso, que podem ser modificadas apropriadamente para o tratamento com outros compostos antissenso.
[00400] Em geral, as células são tratadas com oligonucleotídeos antissenso quando as células atingem cerca de 60-80% de confluência na cultura.
[00401] Um reagente comumente usado para introduzir oligonucleotídeos antissenso na cultura de células inclui o reagente de transfecção lipídico catiônico LIPOFECTIN ® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os oligonucleotídeos antissenso são misturados com LIPOFECTIN ® em OPTI-MEM ® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração final desejada do oligonucleotídeo antissenso e uma concentração de LIPOFECTIN ® que geralmente varia de 2 a 12 μg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo antissenso.
[00402] Outro reagente comumente usado para introduzir oligonucleotídeos antissenso na cultura de células inclui o LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os oligonucleotídeos antissenso são misturados com LIPOFECTAMINE 2000® em OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração final desejada do oligonucleotídeo antissenso e uma concentração de LIPOFECTAMINE® que geralmente varia de 2 a 12 μg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo antissenso.
[00403] Outro reagente usado para introduzir oligonucleotídeos antissenso na cultura de células inclui o Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O oligonucleotídeo antissenso é misturado com Cytofectin® em OPTI-MEM ® 1 com meio reduzido de soro (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada do oligonucleotídeo antissenso e uma concentração de Cytofectin® que geralmente varia de 2 a 12 μg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo antissenso.
[00404] Outra técnica usada para introduzir oligonucleotídeos antissenso na cultura de células inclui a eletroporação.
[00405] As células são tratadas com oligonucleotídeos antissenso por métodos de rotina. As células são normalmente colhidas 16-24 horas após o tratamento com oligonucleotídeo antissenso, tempo no qual os níveis de RNA ou proteína de ácidos nucleicos alvo são medidos por métodos conhecidos na técnica e descritos aqui. Em geral, quando os tratamentos são realizados em várias repetições, os dados são apresentados como a média dos tratamentos em réplicas.
[00406] As concentrações de oligonucleotídeos antissenso usados variam de linhagem celular para linhagem celular. Os métodos para determinar a concentração ótima do oligonucleotídeo antissenso para uma linhagem celular em particular são bem conhecidos na técnica. Os oligonucleotídeos antissenso são normalmente usados em concentrações que variam de 1 nM a 300 nM quando são transfectados com LIPOFECTAMINE2000 ®, Lipofectin ou Cytofectin. Os oligonucleotídeos antissenso são usados em concentrações mais altas, variando de 625 a 20.000 nM quando são transfectados usando eletroporação.
Isolamento de RNA
[00407] A análise de RNA pode ser realizada no total do RNA celular ou da poli(A) + mRNA. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. O RNA é preparado usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando o reagente TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Análise de inibição de níveis ou expressãoalvo
[00408] A inibição dos níveis ou expressão de um ácido nucleico de transtirretina pode ser avaliada em uma variedade de formas conhecidas na técnica. Por exemplo, os níveis do ácido nucleico alvo podem ser quantificados, por exemplo, por análise de Northern blot, por reação em cadeia da polimerase competitiva (PCR), ou por PCR em tempo real quantitativa. A análise de RNA pode ser realizada no total do RNA celular ou da poli(A) + mRNA. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. A análise do Northern blot também é de rotina na técnica. A PCR em tempo real quantitativa pode ser convenientemente realizada usando o sistema de detecção de sequência comercialmente disponível ABI PRISM® 7600, 7700, ou 7900, disponível de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA e utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Análise de PCR em tempo real quantitativo dos níveis de RNA alvo
[00409] A quantificação dos níveis de RNA alvo pode ser realizada por PCR em tempo real quantitativo usando o sistema de detecção de sequência ABI PRISM® 7600, 7700, ou 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os métodos de PCR em tempo real quantitativo são bem conhecidos na técnica.
[00410] Antes do PCR em tempo real, o RNA isolado é submetido a uma reação da transcriptase reversa (RT), que produz DNA complementar (DNAc) que é usado como substrato para a amplificação por PCR em tempo real. As reações RT e PCR em tempo real são realizadas sequencialmente no mesmo poço da amostra. Os reagentes do RT e do PCR em tempo real são obtidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). As reações de RT e de PCR em tempo real são realizadas por métodos conhecidos por especialistas na técnica.
[00411] As quantidades obtidas de gene (ou RNA) alvo por PCR são normalizados usando o nível de expressão de um gene cuja expressão é constante, como a Ciclofilina A, ou através da quantificação do RNA total usando RIBOGREEN ® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). A expressão de Ciclofilina A é quantificada por PCR em tempo real, sendo simultaneamente executada com o alvo, multiplexação, ou separada. O RNA total é quantificado usando o reagente de quantificação de RNA do RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OU). Os métodos de quantificação de RNA por RIBOGREEN® são ensinados em Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). O instrumento CYTOFLUOR ® 4000 (PE Applied Biosystems) é usado para medir a fluorescência de RIBOGREEN®.
[00412] As sondas e os iniciadores são desenhados para hibridizar a um ácido nucleico de transtirretina. Os métodos para desenhar as sondas e os iniciadores de PCR em tempo real são bem conhecidos na técnica e podem incluir o uso de software como PRIMER EXPRESS ® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Análise dos níveis de proteína
[00413] A inibição antissenso de ácidos nucleicos de transtirretina pode ser avaliada através da medição de níveis de proteína transtirretina. Os Níveis de proteína de transtirretina podem ser avaliados ou quantificados em uma variedade de formas bem conhecidas na técnica, como imunoprecipitação, análise de Western blot (immunoblotting), ensaio imunoenzimático (ELISA), ensaios quantitativos de proteína, ensaios da atividade de proteína (por exemplo, ensaios de atividade da caspase), imunohistoquímica, imunocitoquímica ou análise de fluorescência de células marcadas (FACS). Os anticorpos dirigidos a um alvo podem ser identificados e obtidos a partir de uma variedade de fontes, como o catálogo de anticorpos do MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), ou podem ser preparados através de métodos de geração convencional de anticorpo monoclonal ou policlonal conhecidos na técnica. Os anticorpos úteis para a detecção da transtirretina humana e de rato estão comercialmente disponíveis. Testes in vivo de compostos antissenso
[00414] Os compostos antissenso, por exemplo, os oligonucleotídeos antissenso, são testados em animais para avaliar sua capacidade de inibir a expressão da transtirretina e produzir alterações fenotípicas. Os ensaios podem ser realizados em animais normais ou em modelos experimentais de doença. Para a administração em animais, os oligonucleotídeos antissenso são formulados em um diluente farmaceuticamente aceitável, como tampão salino de fosfato. A administração inclui vias de administração parenteral. Após um período de tratamento com oligonucleotídeos antissenso, o RNA é isolado a partir de tecido e alterações na expressão de ácido nucleico de transtirretina são medidas. As alterações nos níveis de proteína transtirretina também são medidas. Certos compostos
[00415] Cerca de duzentos e quarenta e seis compostos antissenso recém-projetados de vários comprimentos, motivos e composições foram testados para o seu efeito no mRNA de transtirretina humano in vitro em vários tipos de células. Os novos compostos foram comparados com cerca de setenta e nove compostos previamente desenhados, incluindo ISIS NOs. 304267, 304268, 304280, 304284, 304285, 304286, 304287, 304288, 304289, 304290, 304291, 304292, 304293, 304294, 304296, 304297, 304298, 304299, 304300, 304301, 304302, 304303, 304304, 304307, 304308, 304309, 304311 e 304312 que anteriormente demonstraram ser uns dos mais potentes compostos antissenso in vitro (vide por exemplo, a publicação de patente US 2005/0244869 e US2009/0082300). Dos aproximadamente trezentos e vinte cinco compostos antissenso recentemente desenhados e anteriormente desenhados, aproximadamente quinze compostos foram selecionados para um estudo mais detalhado baseado na potência in vitro. Os compostos selecionados foram testados para potência e tolerabilidade in vivo em um modelo de camundongo transgênico (vide exemplo 10). Dos quinze compostos testados, onze foram selecionados e testados para tolerabilidade sistêmica (vide exemplo 11) e medição da meia-vida no fígado (vide exemplo 12) em camundongos CD1 e também para tolerabilidade sistêmica (vide exemplo 13) e estudos farmacocinéticos da concentração do oligonucleotídeo no fígado (vide exemplo 14) em ratos Sprague-Dawley. Destes estudos, sete compostos foram testados para inibição e a tolerabilidade dependente da dose, em camundongos transgênicos (vide o exemplo 15). Além disso, quinze compostos adicionais foram selecionados da Tabela 1 e seis compostos adicionais com vários motivos foram desenhados com sequências sobrepostas à ISIS 420951, o que indicou elevada potência e tolerabilidade nos ensaios acima mencionados. Estes compostos adicionais foram comparados com a ISIS 420951 para potência e tolerabilidade em camundongos transgênicos (vide o exemplo 16). Baseados em todos estes estudos (exemplos 10-16) vinte e dois compostos foram selecionados e testados para tolerabilidade sistêmica em camundongos CD1 (vide o exemplo 17). Sete compostos foram considerados toleráveis no modelo murino e posteriormente testados para tolerabilidade sistêmica em ratos Sprague Dawley (vide exemplo 18) e em estudos farmacocinéticos da concentração de oligonucleotídeo no fígado e no rim (vide o exemplo 19). Os sete compostos também foram testados para a potência dependente da dose, em ratos transgênicos (vide o exemplo 20).
[00416] A avaliação final destes estudos (exemplos 16-20) conduziu à seleção de nove compostos que têm uma sequência de nucleobases de uma sequência relatada na SEQ ID NO: 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124. Em virtude de sua sequência complementar, os compostos são complementares às regiões 505-524, 507-526, 508527, 513-532, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 ou 589608 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, os compostos direcionados às regiões listadas, como descrito aqui, são constituídos por um oligonucleotídeo modificado que tem alguma parte de nucleobase da sequência relatada na SEQ ID NO, conforme descrito aqui. Em certas modalidades, os compostos direcionados às regiões listadas ou contendo uma parte de nucleobase de uma sequência relatada nas SEQ ID NOs listadas podem ser de vários comprimentos, como descrito aqui e podem ter um dos vários motivos, como descritos aqui. Em certas modalidades, um composto marcado para uma região ou contendo uma parte de nucleobase de uma sequência relatada nas SEQ ID NOs listadas tem o comprimento e motivo específico conforme indicado pelo ISIS NOs: ISIS 304299, ISIS 420913, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, ou ISIS 420959.
[00417] Os nove compostos contendo uma sequência de nucleobases de uma sequência relatada na SEQ ID NO: 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124, foram posteriormente testados para inibição dependente da dose, em hepatócitos primários do macaco do cynomolgus (vide o exemplo 21). Estes compostos foram também testados para viscosidade ótima (exemplo 22). A meia-vida no fígado dos camundongos CD1 de sete dos compostos que têm uma sequência de nucleobases de uma sequência relatada nas SEQ ID NOs: 78, 86, 87, 115, 120 e 124 foram também avaliados (exemplo 23).
[00418] A avaliação final destes estudos (exemplos 1-23) conduziu à seleção de oito compostos que têm uma sequência de nucleobases de uma sequência relatada na SEQ ID NO: 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124. Em virtude de sua sequência complementar, os compostos são complementares às regiões 504-523, 505-524, 512-531, 513-532, 577-596, 582-601, 584-603 e 605-586 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, os compostos marcados para as regiões listadas, como descrito aqui, são constituídos por um oligonucleotídeo modificado que tem alguma parte de nucleobase da sequência relatada na SEQ ID NO, conforme descrito aqui. Em certas modalidades, os compostos direcionados às regiões listadas ou contendo uma parte de nucleobase de uma sequência relatada nas SEQ ID NOs listadas podem ser de vários comprimentos, como descrito aqui e podem ter um dos vários motivos, como descritos aqui. Em certas modalidades, um composto marcado para uma região ou contendo uma parte de nucleobase de uma sequência relatada nas SEQ ID NOs listadas tem o comprimento e motivo específico conforme indicado pelo ISIS NOs: ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, ou ISIS 420959.
[00419] Estes oito compostos foram testados para eficácia, o perfil farmacocinético e a tolerabilidade em macacos cynomolgus (exemplo 24). Os estudos de inibição nesses macacos indicaram que o tratamento com alguns destes compostos causaram alta inibição de mRNA de TTR no fígado. Especificamente, o tratamento com IS-IS 420950, ISIS 420955 e ISIS 420915 causou a inibição de 91%, 79% e 78%, comparados respectivamente com o controle de PBS. Verificou- se que ISIS420915 causou maior inibição do mRNA de TTR (78%) comparado com a ISIS 304299 (59%), mesmo que os dois oligonucleotídeos diferem entre si por uma única mudança de pares de base da sua região alvo na SEQ ID NO: 1. A análise da proteína complementou também os dados da análise do RNA com o tratamento com ISIS 420915 causando 76% de inibição e com o tratamento ISIS 304299 causando 47% de inibição da proteína de TTR comparada com o controle. Os níveis da proteína RBP4, como uma proteína associada com a transtirretina, esperaram-se também diminuir depois do tratamento com os compostos antissenso. Os níveis da proteína RBP4 diminuíram 63% após o tratamento com ISIS 420915. O tratamento com ISIS 304299 diminuiu 19% os níveis da proteína RBP4. Além disso, ISIS 420915 foi mais tolerável do que ISIS 304299, conforme indicado no estudo em macacos (exemplo 24). Os níveis de transaminase de macacos tratados com ISIS 304299 (ALT 81 IU/L e AST 101 IU/L) foram mais elevados do que aqueles tratados com ISIS 420915 (ALT 68 IU/L e AST 62 IU/L). Os níveis de complemento C3 de macacos tratados com ISIS 304299 (96 mg/dL) foram inferiores aos dos macacos tratados com ISIS 420915 (104 mg/dL).
[00420] Assim, são fornecidos aqui compostos antissenso com uma ou mais das características melhoradas. Em certas modalidades, são fornecidos aqui compostos que compreende um oligonucleotídeo modificado conforme descrito aqui como alvo para, ou especialmente como hibridizável com a região de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
[00421] Assim, são fornecidos aqui compostos antissenso com uma ou mais das características melhoradas. Em certas modalidades, são fornecidos aqui compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado conforme descrito aqui como alvo para, ou especialmente como hibridizável com a região de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.
[00422] Assim, são fornecidos aqui compostos antissenso com uma ou mais das características melhoradas. Em certas modalidades, são fornecidos aqui compostos que compreende um oligonucleotídeo modificado conforme descrito aqui como alvo para, ou especialmente como hibridizável com a região de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4).
[00423] Em certas modalidades, os compostos conforme descritos aqui são eficazes em virtude de terem pelo menos um de um IC50 in vitro de menos de 2,9 μM, menos de 2,2 μM, menos de 2,0 μM, menos de 1,5 μM, menos de 1,4 μM, menos de 1,3 μM, menos de 1,0 μM, menos de 0,7 μM, menos de 0,6 μM, quando são administrados a uma linhagem celular de hepatócito de macaco cynomolgous usando a eletroporação conforme descrito no Exemplo 67. Em certas modalidades, os compostos conforme descritos aqui são altamente toleráveis conforme demonstrado contendo pelo menos um valor dos ALT ou AST aumentado de não mais de 4 vezes, 3 vezes, ou 2 vezes em relação aos animais tratados com salina; ou um aumento no peso do fígado, do baço ou do rim de não mais de 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% ou 2%. Certas indicações
[00424] Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos de tratar um indivíduo compreendendo a administração de uma ou mais composições farmacêuticas conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o indivíduo tem uma doença relacionada com o sistema nervoso central.
[00425] Conforme mostrado nos exemplos abaixo, os compostos marcados para transtirretina conforme descrito aqui demonstraram que reduzem a gravidade dos sintomas fisiológicos de doenças relacionadas com o sistema nervoso central. Em alguns dos experimentos, os compostos reduziram a taxa de formação de placas amiloides, por exemplo, os animais continuaram experimentando sintomas, mas os sintomas eram menos graves em comparação com animais não tratados. Em outras experiências, no entanto, os compostos parecem resultar na regeneração da função ao longo do tempo; por exemplo, os animais tratados por um longo período de tempo experimentaram sintomas menos graves do que aqueles que receberam os compostos por um curto período de tempo. A capacidade dos compostos, exemplificados abaixo, de restaurar a função, portanto, demonstra que os sintomas da doença podem ser revertidos por tratamento com um composto conforme descrito aqui.
[00426] Assim, são fornecidos aqui métodos para melhorar um sintoma associados com uma doença relacionada com o sistema nervoso central, cardíaco, neuropatológica ou gastrointestinal em um paciente com necessidade dele. Em certas modalidades, é fornecido um método para reduzir a taxa de aparecimento de um sintoma associado com uma doença relacionada com o sistema nervoso central, cardíaco, neuropatológico ou gastrointestinal. Em certas modalidades, é fornecido um método para reduzir a severidade de um sintoma associado com o sistema nervoso central, cardíaco, neuropatológico ou gastrointestinal. Em ditas modalidades, os métodos compreendem a administração a um indivíduo com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto direcionado a um ácido nucleico de transtirretina.
[00427] A amiloidose transtirretina é caracterizada por vários sintomas físicos, neurológicos, psiquiátricos e/ou periféricos. Qualquer sintoma conhecida por um especialista na técnica a ser associado à amiloidose transtirretina pode ser amenizado ou caso contrário modulado conforme definido acima nos métodos descritos acima. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma físico, cognitivo, psiquiátrico, ou periférico. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma físico selecionado do grupo constituído por agitação, falta de coordenação, nistagmo, paraparesia espástica, falta de coordenação muscular, deficiência visual, insônia, sensações incomuns, mioclonia, cegueira, perda da fala, síndrome do túnel do carpo, ataques, hemorragias subaracnoideo, acidente vascular cerebral e hemorragia no cérebro, hidrocefalia, ataxia e paralisia espástica, coma, neuropatia sensorial, parestesia, hipestesia, neuropatia motora, neuropatia autonôma, hipotensão ortostática, constipação cíclica, diarreia cíclica, náuseas, vômitos, sudorese reduzida, impotência, retardo no esvaziamento gástrico, retenção urinária, incontinência urinária, cardiopatia progressiva, fadiga, dificuldade respiratória, perda de peso, falta de apetite, dormência, formigamento, fraqueza, macroglossia, síndrome nefrótica, insuficiência cardíaca congestiva, dispneia de esforço, edema periférico, arritmias, palpitações, tonturas, síncope, hipotensão postural, problemas de nervo periférico, deficiência sensorial motora, neuropatia de membros inferiores, neuropatia de membros superiores, hiperalgesia, sensação de temperatura alterada, fraqueza da extremidade inferior, caquexia, edema periférico, hepatomegalia, púrpura, disfunção diastólica, contrações ventricular prematuras, neuropatia craniana, redução nos reflexos do tendão profundo, depósitos de amiloide no corpo vítreo, opacidade vítrea, olhos secos, glaucoma, aparência curvada nas pupilas, inchaço dos pés devido à retenção de água. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma cognitivo selecionado do grupo constituído por memória comprometida, deficiência de julgamento e pensamento, planejamento comprometido, flexibilidade comprometida, pensamento abstrato comprometido, aquisição de regra comprometida, iniciação de ações apropriadas comprometida, inibição de ações impróprias comprometida, memória em curto prazo danificada, memória em longo prazo danificada, paranoia, desorientação, confusão, alucinação e demência. Em certas modalidades, o sintoma é um sintoma psiquiátrico selecionado do grupo constituído por demência, ansiedade, depressão, afeto embotado, egocentrismo, agressividade, comportamento compulsivo, irritabilidade, mudanças de personalidades, inclusive, memória danificada, julgamento e pensamento e idealização suicida.
[00428] Em certas modalidades, o sintoma é agitação. Em certas modalidades, o sintoma é falta de coordenação. Em certas modalidades, o sintoma é nistagmo. Em certas modalidades, o sintoma é paraparesia espástica. Em certas modalidades, o sintoma é falta de coordenação muscular. Em certas modalidades, o sintoma é visão danificada. Em certas modalidades, o sintoma é insônia. Em certas modalidades, o sintoma é sensações incomuns. Em certas modalidades, o sintoma é mioclonus. Em certas modalidades, o sintoma é cegueira. Em certas modalidades, o sintoma é perda da fala. Em certas modalidades, o sintoma é síndrome do túnel carpal. Em certas modalidades, o sintoma é convulsão. Em certas modalidades, o sintoma é hemorragia subaracnoidea. Em certas modalidades, o sintoma é derrame. Em certas modalidades, o sintoma é sangrando no cérebro. Em certas modalidades, o sintoma é hidrocefalia. Em certas modalidades, o sintoma é ataxia. Em certas modalidades, o sintoma é paralisia espástica. Em certas modalidades, o sintoma é coma. Em certas modalidades, o sintoma é neuropatia sensorial. Em certas modalidades, o sintoma é parestesia. Em certas modalidades, o sintoma é hipoestesia. Em certas modalidades, o sintoma é neuropatia motora. Em certas modalidades, o sintoma é neuropatia autonôma. Em certas modalidades, o sintoma é hipotensão ortostática. Em certas modalidades, o sintoma é constipação cíclica. Em certas modalidades, o sintoma é diarreia cíclica. Em certas modalidades, o sintoma é náusea. Em certas modalidades, o sintoma é vômito. Em certas modalidades, o sintoma é sudação reduzida. Em certas modalidades, o sintoma é impotência. Em certas modalidades, o sintoma é esvaziamento gástrico lento. Em certas modalidades, o sintoma é retenção urinária. Em certas modalidades, o sintoma é incontinência urinária. Em certas modalidades, o sintoma é cardiopatia progressiva. Em certas modalidades, o sintoma é fadiga. Em certas modalidades, o sintoma é falta de ar. Em certas modalidades, o sintoma é perda do peso. Em certas modalidades, o sintoma é dormência. Em certas modalidades, o sintoma é formigamento. Em certas modalidades, o sintoma é fraqueza. Em certas modalidades, o sintoma é macroglossia. Em certas modalidades, o sintoma é síndrome nefrótica. Em certas modalidades, o sintoma é Insuficiência cardíaca congestiva. Em certas modalidades, o sintoma é dispneia de esforço. Em certas modalidades, o sintoma é edema periférico. Em certas modalidades, o sintoma é arritmia. Em certas modalidades, o sintoma é palpitação. Em determinadas incorporações, o sintoma é tonturas. Em certas modalidades, o sintoma é síncope. Em certas modalidades, o sintoma é hipotensão postural. Em certas modalidades, o sintoma é problema dos nervos periféricos. Em certas modalidades, o sintoma é deficiência motora sensorial. Em certas modalidades, o sintoma é neuropatia dos membros inferiores. Em certas modalidades, o sintoma é a neuropatia dos membros superiores. Em certas modalidades, o sintoma é hiperalgesia. Em certas modalidades, o sintoma é sensação de temperatura alterada. Em certas modalidades, o sintoma é debilidade das extremidades inferiores. Em certas modalidades, o sintoma é caquexia. Em certas modalidades, o sintoma é edema. Em certas modalidades, o sintoma é hepatomegalia. Em certas modalidades, o sintoma é púrpura. Em determinadas incorporações, o sintoma é disfunção diastólica. Em certas modalidades, o sintoma é contrações ventriculares prematuras. Em certas modalidades, o sintoma é neuropatia cranial. Em certas modalidades, o sintoma é diminuição dos reflexos do tendão profundo. Em certas modalidades, o sintoma é depósitos amiloides no corpo vítreo. Em certas modalidades, o sintoma é opacidade vítrea. Em certas modalidades, o sintoma é olhos secos. Em certas modalidades, o sintoma é glaucoma. Em determinadas incorporações, o sintoma é aparência curvada nas pupilas. Em certas modalidades, o sintoma é inchamento dos pés devido à retenção hídrica.
[00429] Em certas modalidades, o sintoma é memória comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é julgamento e pensamento comprometido. Em certas modalidades, o sintoma é deficiência de planejamento. Em certas modalidades, o sintoma é flexibilidade comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é pensamento abstrato comprometido. Em certas modalidades, o sintoma é aquisição de regras comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é iniciação de ações apropriadas comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é inibição de ações impróprias comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é memória de curto prazo comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é memória de longo prazo comprometida. Em certas modalidades, o sintoma é paranoia. Em certas modalidades, o sintoma é desorientação. Em certas modalidades, o sintoma é confusão. Em certas modalidades, o sintoma é alucinação. Em certas modalidades, o sintoma é demência.
[00430] Em certas modalidades, o sintoma é demência. Em certas modalidades, o sintoma é ansiedade. Em certas modalidades, o sintoma é depressão. Em certas modalidades, o sintoma embotamento afetivo. Em certas modalidades, o sintoma é egocentrismo. Em certas modalidades, o sintoma é agressão. Em certas modalidades, o sintoma é comportamento compulsivo. Em certas modalidades, o sintoma é irritabilidade. Em certas modalidades, o sintoma é mudança de personalidade. Em certas modalidades, o sintoma é idealização suicida.
[00431] Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos de tratamento de um indivíduo compreendendo a administração de uma ou mais composições farmacêuticas conforme descritas aqui. Em certas modalidades, o indivíduo tem uma doença relacionada com o sistema nervoso central.
[00432] Em certas modalidades, a administração de um composto antissenso marcado para um ácido nucleico de transtirretina resulta na redução da expressão da transtirretina em pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99% ou em um intervalo definido por dois desses valores.
[00433] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um composto antissenso marcado para transtirretina são usadas para a preparação de um medicamento para o tratamento de um paciente que sofre ou que é susceptível a uma doença relacionada com o sistema nervoso central.
[00434] Em certas modalidades, os métodos descritos aqui incluem a administração de um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado contendo uma parte de nucleobases contíguas, conforme descrito aqui de uma sequência relatada na SEQ ID NO: 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 e 124.
Administração
[00435] Em certas modalidades, os compostos e composições conforme descritos aqui podem ser administrados em um número de maneiras dependendo de se o tratamento desejado é local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica, pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, inclusive por nebulização; intratraqueal, intranasal, epidérmico e transdermal, oral ou parenteral. Os compostos e as composições conforme descrito aqui podem ser administrados de forma de atingir um tecido específico, como o fígado ou o cérebro.
[00436] Em certas modalidades, os compostos e as composições conforme descritos aqui são administrados por via parenteral. A "administração parenteral" significa a administração por injeção ou infusão. A administração parenteral inclui a administração subcutânea, a administração intravenosa, a administração intramuscular, a administração intra-arterial, a administração intraperitoneal ou a administração intracraniana, por exemplo, a administração intracerebral, a administração intratecal, a administração ventricular, a administração ventricular, a administração intracerebroventricular, a administração ventricular cerebral ou a administração ventricular cerebral. A administração pode ser contínua, ou crônica, ou curta ou intermitente.
[00437] Em certas modalidades, a administração parenteral é por infusão. A infusão pode ser crônica ou contínua, ou curta ou intermitente. Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos infundidos são administrados com uma bomba. Em certas modalidades, a administração parenteral é por injeção.
[00438] Em certas modalidades, a administração parenteral é subcutânea.
[00439] Em outras modalidades, a formulação para administração consiste dos compostos descritos aqui e solução salina.
[00440] Em certas modalidades, os compostos e composições são administrados ao SNC. Em certas modalidades, os compostos e composições são administrados ao líquido cerebrospinhal. Em certas modalidades, os compostos e composições conforme descritos aqui são administrados no parênquima cerebral. Em certas modalidades, os compostos e composições são administrados a um animal em regiões múltiplas do sistema nervoso central (por exemplo, em regiões múltiplas do cérebro, e/ou na medula espinal) por administração intratecal, ou administração intracerebroventricular. A ampla distribuição dos compostos e composições, descritos aqui, dentro do sistema nervoso central pode se conseguir com a administração intraparenquimal, a administração intratecal, ou a administração intracerebroventricular.
[00441] Em certas modalidades, a presente invenção inclui composições farmacêuticas que podem ser administradas por injeção diretamente no cérebro. A injeção pode ser mediante injeção estereotáxica em uma região particular do cérebro (por exemplo, a substância nigra, plexo coroide, córtex, hipocampo, striatum, plexo coroide ou globus pallidus). O composto também pode ser administrado em regiões difusas do cérebro (por exemplo, uma administração difusa no córtex do cérebro).
[00442] Em certas modalidades, a administração parenteral é por injeção. A injeção pode ser administrada com uma seringa ou uma bomba. Em certas modalidades, a injeção é uma injeção em bolus. Em certas modalidades, a injeção é administrada diretamente em um tecido, como o estriato, caudado, córtex, hipocampo e cerebelo.
[00443] Em certas modalidades, a administração de um composto ou composição aqui descritos pode afetar o perfil farmacocinético do composto ou da composição. Em certas modalidades, a injeção de um composto ou composição aqui descritos, em um tecido alvo melhora o perfil farmacocinético do composto ou da composição, em comparação com a infusão do composto ou da composição. Em uma determinada modalidade, a injeção de um composto ou composição melhora a potência comparado com ampla difusão, exigindo menos do composto ou composição para alcançar semelhante farmacologia. Em certas modalidades, semelhante farmacologia refere-se à quantidade de tempo que um mRNA alvo e/ou uma proteína alvo é infrarregulado (por exemplo, a duração da ação). Em certas modalidades, os métodos de localização específica de um agente farmacêutico, como por injeção em bolus, diminuem a concentração média efetiva (EC50) por um fator de cerca de 50 (por exemplo, 50 vezes menos de concentração no tecido é requerido para conseguir o mesmo ou similar efeito farmacodinâmico). Em certas modalidades, os métodos de localização específica de um agente farmacêutico, como por injeção em bolus, diminuem a concentração média efetiva (EC50) por um fator de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50. Em certas modalidades o agente farmacêutico é um composto antissenso conforme descrito aqui. Em certas modalidades, o tecido alvo é o tecido cerebral. Em certas modalidades, o tecido alvo é tecido estriatal. Em certas modalidades, a diminuição da EC50 é desejável porque reduz a dose necessária para alcançar um resultado farmacológico em paciente em necessidade do mesmo.
[00444] A meia-vida dos oligonucleotídeos gapmer MOE no tecido do fígado dos camundongos CD1 é aproximadamente 21 dias (veja os exemplos 12).
[00445] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso é administrado por injeção ou infusão uma vez a cada mês, a cada dois meses, a cada 90 dias, a cada 3 meses, a cada 6 meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano. Certas terapias de combinação
[00446] Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são coadministradas com um ou mais outros agentes farmacêuticos. Em certas modalidades, tais um ou mais outros agentes farmacêuticos são desenhados para tratar a mesma doença, distúrbio ou condição que uma ou mais composições farmacêuticas descritas aqui. Em certas modalidades, ditos um ou mais outros agentes farmacêuticos são desenhados para tratar uma doença, distúrbio ou condição diferente da uma ou mais composições farmacêuticas descritas aqui. Em certas modalidades, ditos um ou mais outros agentes farmacêuticos são desenhados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas conforme descritas aqui. Em certas modalidades, uma ou mais composições são coadministradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado daquele outro agente farmacêutico. Em certas modalidades, uma ou mais composição farmacêutica são coadministradas com outro agente farmacêutico para produzir um efeito combinatório. Em certas modalidades, um ou mais composições farmacêuticas são coadministradas com outro agente farmacêutico para produzir um efeito sinérgico.
[00447] Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em diferentes tempos. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparadas junto em uma única formulação. Em certas modalidades, um ou mais composições farmacêuticas e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparadas separadamente.
[00448] Em certas modalidades, o segundo composto é administrado antes da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades, o segundo composto é administrado depois da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades, o segundo composto é administrado ao mesmo tempo em que uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades, a dose do segundo composto coadministrado é a mesma que a dose que deveria ser administrada se o segundo composto fosse administrado sozinho. Em certas modalidades, a dose de um segundo composto coadministrado é menor do que a dose que deveria ser administrada se o segundo composto fosse administrado sozinho. Em certas modalidades, a dose de um segundo composto coadministrado é maior do que a dose que deveria ser administrada se o segundo composto fosse administrado sozinho.
[00449] Em certas modalidades, a coadministração de um segundo composto realça o efeito de um primeiro composto, de modo que a coadministração dos compostos resulta em um efeito que é maior do que o efeito do primeiro composto administrado sozinho. Em certas modalidades, a coadministração resulta em efeitos que são aditivos aos efeitos dos compostos quando administrados sozinhos. Em certas modalidades, a coadministração resulta em efeitos que são supra- aditivos dos efeitos dos compostos quando administrados sozinhos. Em certas modalidades, o primeiro composto é um composto antissenso. Em certas modalidades, o segundo composto é um composto antissenso.
[00450] Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser coadministrado com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem agentes antipsicóticos, como, por exemplo, haloperidol, clorpromazina, clozapina, quetiapina, e olanzapina; agentes antidepressivos, como, por exemplo, fluoxetina, cloridrato de sertralina, venlafaxina e nortriptilina; agentes tranquilizantes como, por exemplo, benzodiazepínicos, clonazepam, paroxetina, venlafaxina e beta-bloqueadores; agentes estabilizadores do humor como, por exemplo, lítio, valproato, lamotrigina e carbamazepina; agentes paralisantes como, por exemplo, a toxina botulínica; e/ou outros agentes experimentais, incluindo entre outros, tetrabenazina (Xenazine), creatina, coenzima Q10, trealose, ácidos docosa- hexanóico, ACR16, etil-EPA, atomoxetina, citalopram, dimebon, memantina, fenilbutirato de sódio, ramelteon, ursodiol, zyprexa, xenasine, tiaprida, riluzol, amantadina, [123I] MNI-420, atomoxetina, tetrabenazina, digoxina, dextrometorfano, warfarina, alprazolam, cetoconazol, omeprazol e minociclina.
[00451] Em certas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser coadministrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem analgésicos, como paracetamol (acetaminofeno); anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), como, salicilatos; drogas narcóticas, como, morfina e drogas sintéticas com propriedades narcóticas, como o tramadol.
[00452] Em certas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser coadministrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem relaxantes musculares, como, benzodiazepinas e metocarbamol.
Formulações
[00453] Os compostos da invenção podem também ser misturados, conjugados ou de outra maneira associados com outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como por exemplo, lipossomas, moléculas alvos de receptores, ou outras formulações, para ajudar na captação, distribuição e/ou absorção. As patentes de Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de ditas formulações que ajudam na captação, distribuição e/ou absorção incluem, entre outras, as patentes US: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; e 5.595.756, cada qual é incorporada aqui por referência.
[00454] Os compostos antissenso da invenção compreendem qualquer sal, ésteres ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administrado em um animal, incluindo um ser humano, é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou resíduo do mesmo.
[00455] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis de compostos da invenção, ou seja, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto parente e não lhes conferem os respectivos efeitos toxicológicos indesejáveis. Para oligonucleotídeos, os exemplos preferenciais de sais farmaceuticamente aceitáveis e seus usos são descritos na patente US 6.287.860, que está incorporada aqui em sua totalidade. Os sais de sódio têm demonstrado serem formas adequadas de fármacos do oligonucleotídeo.
[00456] A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos antissenso da invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em um número de maneiras, dependendo se é desejado o tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser parenteral. A administração parenteral inclui a injeção ou a infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracranial, por exemplo, a administração intracerebral, a administração intratecal, a administração intraventricular, a administração ventricular, a administração intracerebroventricular, a administração intraventricular cerebral ou a administração ventricular cerebral.
[00457] A administração intraventricular é preferencial para a expressão da transtirretina alvo no plexo coroide. Acredita-se que os oligonucleotídeos com pelo menos uma modificação 2'-O-metoxietila são particularmente úteis para a administração oral. As composições e formulações farmacêuticas para a administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Os veículos farmacêuticos convencionais, aquosos, pó ou de bases oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e semelhantes também podem ser úteis.
[00458] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem estar convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de associação dos ingredientes ativos com os veículos ou excipientes farmacêuticos. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e intimamente colocando em associação os ingredientes ativos com os veículos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida, se for necessário, moldar o produto.
[00459] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis, como, entre outras, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, líquidos, xaropes, géis moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meio aquoso, não aquosos ou mistos. Suspensões aquosas ainda podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizadores.
[00460] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, entre outras, soluções, emulsões, espumas e formulações contendo lipossomas. As composições e formulações farmacêuticas da presente invenção podem incluir um ou mais intensificadores de penetração, veículos, excipientes ou outros ingredientes ativos ou inativos.
[00461] As emulsões são sistemas tipicamente heterogêneos de um líquido disperso em outro sob a forma de gotículas, geralmente superior a 0,1 μm de diâmetro. As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou ele mesmo como uma fase separada. As microemulsões estão incluídas como uma modalidade da presente invenção. As emulsões e seus usos são bem conhecidos na técnica e ainda são descritos na patente US 6.287.860, que está incorporada aqui em sua totalidade.
[00462] As formulações da presente invenção incluem formulações lipossomais. Conforme usado na presente invenção, o termo "lipossoma" significa uma vesícula composta por lipídios anfifílicos, organizados em uma bicamada esférica ou em bicamadas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares, que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso que contém a composição a ser administrada. Lipossomas catiônicos são lipossomas carregados positivamente que acreditamos que interagem com as moléculas de DNA carregadas negativamente para formar um complexo estável. Lipossomas que são sensíveis ao pH ou carregados negativamente acreditamos que prendem o DNA em vez de formar complexo com ele. Lipossomas catiônicos e não catiônicos têm sido utilizados para administrar o DNA às células.
[00463] Os lipossomas também incluem lipossomas "estericamente estáveis", um termo que, conforme usado aqui, refere-se aos lipossomas compostos por um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados nos lipossomas, resulta em um aumento do tempo de vida de circulação em relação aos lipossomas deficientes de ditos lipídeos especializados. Os lipossomas e seus usos são descritos na patente US 6.287.860, que está incorporada aqui em sua totalidade.
[00464] Em outra modalidade da invenção, formulações da presente invenção incluem formulações salinas. Em certas modalidades da invenção, uma formulação consiste nos compostos descritos aqui e solução salina. Em certas modalidades, uma formulação consiste essencialmente dos compostos descritos aqui e solução salina. Em certas modalidades, a solução salina é solução salina de grau farmaceuticamente aceitável. Em determinadas incorporações, a solução salina é uma solução salina tamponada. Em certas modalidades, a solução salina é o tampão fosfato salino (PBS).
[00465] Em certas modalidades, uma formulação exclui os lipossomas. Em certas modalidades, a formulação exclui os lipossomas estericamente estabilizados. Em certas modalidades, uma formulação exclui os fosfolipídeos. Em certas modalidades, a formulação consiste essencialmente dos compostos descritos aqui e solução salina e exclui os lipossomas.
[00466] As formulações e composições farmacêuticas da presente invenção também podem incluir surfactantes. Os surfactantes e seus usos são descritos na patente US 6.287.860, que está incorporada aqui em sua totalidade.
[00467] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários intensificadores de penetração para afetar a administração eficiente de ácidos nucleicos, particularmente de oligonucleotídeos. Os intensificadores de penetração e seus usos são descritos na patente US 6.287.860, que está incorporada aqui em sua totalidade.
[00468] Um especialista na técnica reconhecerá que as formulação são projetadas rotineiramente de acordo com seu uso pretendido, isto é via de administração.
[00469] Formulações preferenciais para a administração tópica incluem aqueles em que os oligonucleotídeos da invenção estão em mistura com um agente de administração tópica como lipídeos, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e surfactantes. Lipídeos e lipossomas preferenciais incluem os neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil-etanolamina DOPE, dimiristoilfosfatilcolina DMPC, distearol fosfatidil colina), os negativos (por exemplo, dimiristoil fosfatidil glicerol DMPG) e os catiônicos (por exemplo, dioleoil tetrametil aminopropil DOTAP e dioleoil fosfatidil etanolamina DOTMA).
[00470] Composições e formulações para a administração parenteral, incluindo a injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, ou intracraniana pode incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes entre outros aditivos apropriados como, entre outros, intensificadores de penetração, compostos veículos e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00471] Certas modalidades da invenção fornecem composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos oligoméricos e um ou mais outros agentes quimioterápicos que funcionam através de um mecanismo de não antissenso. Exemplos de ditos agentes quimioterápicos incluem entre outros às drogas quimioterápicas do câncer como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosidea, bis-cloroetil nitrosureia, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucila, metilciclohexilnitrosureia, mostardas de nitrogênio, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, deoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluoruracila (5-FU) 5-fluordeoxi- uridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vimblastina, etoposideo (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, teniposideo, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Quando usado com os compostos da invenção, ditos agentes quimioterápicos podem ser usados individualmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleotídeo), sequencialmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleotídeo por um período de tempo seguido de MTX e oligonucleotídeo), ou em combinação com um ou mais de ditos agentes quimioterápicos (por exemplo, 5-FU, MTX e oligonucleotídeo ou 5-FU, radioterapia e oligonucleotídeo). As drogas anti-inflamatórias, incluindo entre outras drogas e corticosteroides anti-inflamatórios não esteroides, e drogas antivirais, incluindo entre outros a ribavirina, vidarabina, aciclovir, e ganciclovir, também podem ser combinados em composições da invenção. Combinações de compostos antissenso e outras drogas não antissenso também estão dentro do escopo desta invenção. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados juntos ou sequencialmente.
[00472] Em outra modalidade relacionada, as composições da invenção podem conter um ou mais compostos antissenso, particularmente oligonucleotídeos, direcionados a um primeiro ácido nucleico e um ou mais compostos antissenso adicionais direcionados a um segundo ácido nucleico alvo. Alternativamente, as composições da invenção podem conter dois ou mais compostos antissenso marcados para diferentes regiões do mesmo ácido nucleico alvo. Inúmeros exemplos de compostos antissenso são conhecidos na técnica. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados juntos ou sequencialmente. Dosagem
[00473] A formulação de composições terapêuticas e sua subsequente administração (dosagem) acreditam-se esteja dentro da habilidade dos especialistas na técnica. A dosagem é dependente da gravidade e capacidade de resposta do estado de doença a ser tratada, com o decorrer do tratamento com uma duração de vários dias até vários meses, ou até que a cura seja efetuada ou uma diminuição do estado de doença seja alcançada. Os esquemas de dosagens ótimos podem ser calculados a partir de medições do acúmulo do fármaco no corpo do paciente. A dosagem ótima pode variar dependendo da potência relativa dos oligonucleotídeos individuais, e geralmente pode ser estimada com base na EC50s que demonstrou ser eficaz in vitro e in vivo em modelos animais. Em geral, a dose é de 0,01 μg a 100 g por kg de peso corporal, e pode ser dado uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou em intervalos desejados. Depois do tratamento bem sucedido, pode ser desejável manter o paciente submetido à terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado da doença, onde o oligonucleotídeo é administrado em doses de manutenção, variando de 0,01 μg a 100 g por kg de peso de corpo, uma ou mais vezes diariamente.
[00474] Embora a presente invenção tenha sido descrita com especificidade de acordo com algumas das suas modalidades preferenciais, os seguintes exemplos servem apenas para ilustrar a invenção e não como tentativa de limitar os mesmos. Cada uma das referências, números de acesso no GENBANK e semelhantes relatados no presente pedido é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
EXEMPLOS Divulgação e incorporação não limitante por referência
[00475] Enquanto certos compostos, composições e métodos aqui descritos têm sido descritos com especificidade em conformidade com certas modalidades, os exemplos a seguir servem apenas para ilustrar os compostos descritos aqui e não se limitam ao mesmo. Cada uma das referências relatadas no presente pedido é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Exemplo 1: Inibição antissenso da transtirretina humana em células HepG2
[00476] Os oligonucleotídeos antissenso foram projetados marcados para ácido nucleico de transtirretina e foram testados quanto a seus efeitos no RNA, de transtirretina in vitro. As células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10.000 células por poço foram transfectadas usando reagente lipofectin com 50 nM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de cerca de 24 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humano RTS1396 (sequência direta CCCTGCTGAGCCCCTACTC, designada aqui como SEQ ID NO: 5; sequência reversa TCCCTCATTCCTTGGGATTG, designada aqui como SEQ ID NO: 6; sequência sonda ATTCCACCACGGCTGTCGTCAX, designada aqui como o SEQ ID NO: 7). Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas.
[00477] Os oligonucleotídeos antissenso quiméricos nas Tabelas 1 e 2 foram projetados como gapmers MOE 5-10-5. Os gapmers têm 20 nucleotídeos de comprimento, onde o segmento central de abertura é composto de dez 2'-deoxinucleotídeos e está flanqueado em ambos os lados (nos sentidos 5' e 3') pelas flanqueantes que compreendem cinco nucleotídeos cada uma. Cada nucleotídeo no segmento de flanqueamento 5' e cada nucleotídeo no segmento de flanqueamento 3' tem uma modificação de MOE 2'. As ligações internucleosídicas ao longo de cada gapmer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina ao longo de cada gapmer são 5-metilcitidinas. O "sítio de início do alvo humano" indica o nucleotídeo 5' mais externo no qual o gapmer é marcado para a sequência de genes humanos. O "sítio final do alvo humano" indica o nucleotídeo 3' mais externo no qual o gapmer é marcado para a sequência de genes humanos. Cada gapmer listado na Tabela 1 é direcionado ao mRNA humano de transtirretina, designado aqui como SEQ ID NO: 1 (N° de acesso no GENBANK NM_000371.2). Determinados gapmers também foram projetados cujas sequências intrônicas alvo ou junções íntron-éxon da sequência genômica humana de transtirretina, designado aqui como SEQ ID NO: 2 (N° de acesso no GENBANK. NT_010966.10 truncado desde o nucleotídeo 2009236 até 2017289) e são alistados na Tabela 2.
[00478] Os oligonucleotídeos humanos das Tabelas 1 e 2 também geram reação cruzada com sequências de genes de macaco rhesus. Os 'desemparelhamentos' indicam o número de nucleobases, pelo qual o oligonucleotídeo humano não é pareado corretamente com uma sequência de genes de macaco rhesus. Quanto maior é a complementariedade entre o oligonucleotídeo humano e a sequência do macaco rhesus, maior será a possibilidade do oligonucleotídeo humano de gerar reação cruzada com a sequência do macaco rhesus. Os oligonucleotídeos humanos na Tabela 1 foram comparados com os éxons 1-4 extraídos da sequência genômica do macaco rhesus do N.° acesso no GENBANK NW_001105671.1, baseado na similaridade com os éxons humanos. Os oligonucleotídeos humanos na Tabela 2 foram comparados com a sequência genômica do macaco rhesus, designada aqui como SEQ ID NO: 4 (N° de acesso no GENBANK NW_001105671.1 truncado desde o nucleotídeo 628000 até 638000). O "sítio de início do alvo do macaco rhesus" indica o nucleotídeo 5' mais externo no qual o gapmer é marcado para a sequência de genes do macaco rhesus. O "sítio de interrupção alvo do macaco rhesus" indica o nucleotídeo 3' mais externo no qual o gapmer é marcado para a sequência de genes do macaco rhesus. Tabela 1
[00479] Inibição dos níveis de mRNA de transtirretina humana por oligonucleotídeos antissenso quiméricos contendo os flancos MOE 5-10-5 e o intervalo desóxi direcionado a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 4).
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Tabela 2
[00480] Inibição dos níveis de mRNA de transtirretina humana por oligonucleotídeos antissenso quiméricos contendo os flancos MOE 5-10-5 e o intervalo desóxi marcado para SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.
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[00481] Devido ao curto comprimento do mRNA da transtirretina humana, um segundo conjunto de iniciadores foi projetado diferente do primeiro conjunto de iniciadores, RTS1396, para evitar os oligonucleotídeos amplicon. Os oligonucleotídeos antissenso também foram testados por seus efeitos no mRNA de transtirretina in vitro usando o novo conjunto de iniciadores humanos RTS3029 (sequência direta CTTGCTGGACTGGTATTTGTGTCT, designada aqui como SEQ ID NO: 161, sequência reversa AGAACTTTGACCATCAGAGGACACT, designada aqui como SEQ ID NO: 162; sequência sonda CCCTACGGGCACCGGTGAATCCX, designada aqui como SEQ ID NO: 163). Células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10.000 células por poço foram transfectadas usando o reagente lipofectin com 50 nM de oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de cerca de 24 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Os resultados são apresentados na Tabela 3 como percentual de inibição do conjunto de células de controle em PBS. Tabela 3
[00482] Inibição dos níveis de mRNA de transtirretina humana por oligonucleotídeos antissenso quiméricos contendo os flancos MOE 5-10-5 e o intervalo desóxi com o conjunto de iniciadores RTS3029
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[00483] Baseado nos resultados da inibição usando o novo conjunto de iniciadores RTS3029, os oligonucleotídeos antissenso que apresentam 50% ou mais de inibição do mRNA de transtirretina foram selecionados para estudos posteriores.
Exemplo 2: Inibição antissenso da transtirretina humana em células HepG2 por oligonucleotídeos projetados por microwalk
[00484] Gapmers adicionais foram projetados com base nos gapmers apresentado na Tabela 3 que demonstraram uma inibição de pelo menos 50%. Esses gapmers foram projetados mediante criação de gapmers deslocados ligeiramente a jusante e a montante (ou seja, "microwalk") dos gapmers originais da Tabela 3. Gapmers foram ainda criados com vários motivos, por exemplo, 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 213-5 MOE, and 4-11-5 MOE motivos. Esses gapmers foram testados in vitro. As células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10.000 células por poço foram transfectadas usando reagente lipofectin com 50 nM do oligonucleotídeo antissenso. Após um período de tratamento de cerca de 24 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Os resultados são apresentados na Tabela 4.
[00485] Os oligonucleotídeos antissenso quiméricos na Tabela 4 foram projetados como gapmers MOE 5-10-5, 3-14-3 MOE, 2-13-5 MOE ou 4-11-5 MOE. Os gapmers designados com um asterisco (*) na Tabela 4 são os gapmers originais a partir do qual os gapmers, ISIS 425650-425763, foram projetados através do microwalk. Os gapmers 5-10-5 têm 20 nucleotídeos de comprimento, onde o segmento central de abertura está composto de dez 2'-deoxinucleotídeos e está flanqueado em ambos os lados (nos sentidos 5' e 3') pelos flancos que compreendem cinco nucleotídeos cada uma. Os gapmers 3-14-3 têm 20 nucleotídeos de comprimento, onde o segmento central de abertura está composto de quatorze 2'-deoxinucleotídeos e está flanqueado em ambos os lados (nos sentidos 5' e 3') pelos flancos que compreendem três nucleotídeos cada uma. Os gapmers 2-13-5 têm 20 nucleotídeos de comprimento, onde o segmento central de abertura está composto de treze 2'-deoxinucleotídeos e está flanqueado nos sentidos 5' e 3' por assas que compreendem dois e cinco nucleotídeos respectivamente. Os gapmers 4-11-5 têm 20 nucleotídeos de comprimento, onde o segmento central de abertura está composto de onze 2'-deoxinucleotídeos e está flanqueado nos sentidos 5' e 3' por flancos que compreendem quatro e cinco nucleotídeos respectivamente. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3, 2-13-5 e 4-11-5), cada nucleotídeo no segmento de flanco 5' e cada nucleotídeo no segmento de flanco 3' tem uma modificação de MOE 2'. As ligações internucleosídicas ao longo de cada gapmer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina ao longo de cada gapmer são 5- metilcitidinas. O "sítio de início do alvo" indica o nucleotídeo 5' mais externo no qual o gapmer é direcionado. O "sítio final do alvo" indica o nucleotídeo 3' mais externo no qual o gapmer é direcionado. Cada gapmer listado na tabela 4 é direcionado para a região alvo abrangendo as nucleobases 481-619 da SEQ ID NO: 1 (N.° de acesso no GENBANK NM_000371.2).
[00486] Conforme mostrado na Tabela 4, vários dos gapmers apresentaram pelo menos 50% de inibição, incluindo os números ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425699, 425739, 304299, 425660, 425700, 425740, 420915, 420916, 425662, 425702, 420919, 425703, 420920, 425664, 425704, 425742, 420921, 425665, 425705, 425743, 420922, 425666, 425706, 420923, 420937, 420944, 425669, 425709, 425746, 425710, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425673, 425713, 425749, 425651, 425675, 425715, 425751, 304309, 425676, 425716, 425752, 420949, 425677, 425717, 425753, 420950, 425678, 425718, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 425756, 420953, 425681, 425721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425759, 425724, 425760, 425762, 304310, 425729, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 425768, 304313, 425734, e 425769.
[00487] Vários dos gapmers apresentaram pelo menos 60% de inibição, incluindo os números ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425739, 304299, 425740, 420915, 425702, 420919, 420920, 425742, 420921, 425665, 425705, 425706, 420923, 425746, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425651, 425715, 425751, 304309, 425716, 425752, 425677, 425717, 425753, 420950, 425718, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 420953, 425681, 425721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425724, 425760, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 304313, e 425769.
[00488] Vários dos gapmers apresentaram pelo menos 70% de inibição, incluindo os números ISIS: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425737, 420913, 425738, 420914, 425659, 304299, 420915, 420920, 425742, 425712, 425748, 425716, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 425680, 425721, 425757, 425760, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425767, 425693, e 304313.
[00489] Vários dos gapmers apresentaram pelo menos 80% de inibição, incluindo os números ISIS: 304296, 425655, 425695, 425736, 420913, 425659, 304299, 420915, 425716, 425754, 425719, 425757, 425765, e 425767.
[00490] Vários dos gapmers apresentaram pelo menos 85% de inibição, incluindo os números ISIS: 420913, 425716, 425754, e 425719.
[00491] Um gapmer, ISIS 425719, apresentou 90% de inibição. Tabela 4
[00492] Inibição dos níveis de mRNA de transtirretina humana por oligonucleotídeos antissenso quiméricos direcionados a SEQ ID NO: 1 (N.° de acesso no GENBANK NM_000371.2).
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Exemplo 3: Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2
[00493] Gapmers do Exemplo 2 exibindo inibição in vitro significativa da transtirretina humana foram testados em várias doses nas células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM e 10000 nM, conforme especificado na Tabela 5. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas.
[00494] A metade da concentração inibitória máxima (IC50) de cada do oligonucleotídeo também é apresentada na Tabela 5 e foi calculada traçando-se as concentrações de oligonucleotídeos utilizadas versus o percentual de inibição da expressão de mRNA de transtirretina alcançado para cada concentração, e observando a concentração do oligonucleotídeo no qual 50% de inibição da expressão de mRNA de transtirretina foi alcançada em relação ao controle. Conforme ilustrado na Tabela 5, os níveis de mRNA da transtirretina foram significativamente reduzidos de forma dose- dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 5
[00495] Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2 usando eletroporação
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[00496] Gapmers do Exemplo 2 foram testados também em várias doses nas células HepG2 usando o reagente de transfecção lipofectina. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM e 100 nM, conforme especificado na Tabela 6. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 6, os níveis de mRNA da transtirretina foram significativamente reduzidos de forma dose-dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 6
[00497] Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2 usando reagente lipofectina
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Exemplo 4: Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2
[00498] Gapmers selecionado do Exemplo 3 foram testados em várias doses nas células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo antissenso 0,0617 μM, 0,1852 μM, 0,5556 μM, 1,6667 μM e 5 μM do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado na Tabela 7. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 7, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose-dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 7
[00499] Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2 usando eletroporação
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Exemplo 5: Confirmação da resposta de dose de oligonucleotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em células de Hep3B
[00500] Gapmers do Exemplo 4 exibindo inibição in vitro significativa da transtirretina humana foram testados em várias doses nas células Hep3B. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo antissenso 0,0206 M, 0,062 M, 0,185 M, 0,556 M, 1,6667 M e 5 M do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado na Tabela 8. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS1396 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 8, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose-dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. A IC50 de cada oligonucleotídeo é apresentada também na Tabela 8. Tabela 8
[00501] Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células Hep3B usando eletroporação
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Exemplo 6: Confirmação de resposta de dose de oligonuc eotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em hepatócitos primários de camundongo transgênico com a transtirretina humana
[00502] Gapmers do Exemplo 5 foram testados também em várias doses em hepatócitos primários de camundongos transgênicos com a transtirretina humana ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312 e ISIS 420951 (vide o exemplo 2) foram também re-examinados junto com estes gapmers sob as mesmas condições de cultivo. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando Cytofectin com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM, 150 nM e 300 nM, conforme especificado na Tabela 9. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS1396 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 9, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose- dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 9
[00503] Inibição dose-dependente do antissenso da transtirretina humana em hepatócitos primários de camundongo usando citofectin
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Exemplo 7: Confirmação da resposta de dose de oligonucleotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em células de HepG2
[00504] Gapmers selecionados do Exemplo 6 foram testados em várias doses nas células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo antissenso 0,062 μM, 0,185 μM, 0,556 μM, 1,66 μM e 5,000 μM do oligonucleotídeo antissenso, conforme especificado na Tabela 10. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS1396 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 10, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose-dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 10
[00505] Inibição antissenso dose-dependente da transtirretina humana em células HepG2 usando eletroporação
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Exemplo 8: Confirmação de resposta de dose de oligonuc eotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em hepatócitos primários de camundongo transgênico com a transtirretina humana
[00506] Gapmers do Exemplo 6 foram testados também em várias doses em hepatócitos primários de camundongos transgênicos com a transtirretina humana As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando Cytofectin com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 10 nM, 20 nM, 40 nM, e 80 nM, conforme especificado na Tabela 11. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 11, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose-dependente em células tratadas com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 11
[00507] Inibição dose-dependente do antissenso da transtirretina humana em hepatócitos primários de camundongo usando citofectin.
Figure img0052
[00508] Gapmers também foram testados usando eletroporação como o agente do transfecção. As células foram plaqueadas em uma densidade de 35.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 148,148 nM, 444,444 nM, 1.333,333 nM, 4.000 nM e 12.000 nM, conforme especificado na Tabela 12. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS3029 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Tabela 12
[00509] Inibição dose-dependente do antissenso da transtirretina humana em hepatócitos primários de camundongo usando eletroporação
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Exemplo 9: Confirmação de resposta de dose de oligonucleotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em hepatócitos primários de macaco cynomolgus
[00510] Gapmers do Exemplo 6 também foram testados em várias doses em hepatócitos primários de macacos cynomolgus. As células foram plaqueadas em uma densidade de 35.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM e 20.000 nM, conforme especificado na Tabela 13. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS1396 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Conforme ilustrado na Tabela 13, os níveis de mRNA da transtirretina foram reduzidos de forma dose-dependente em hepatócitos tratados com oligonucleotídeos ISIS.
[00511] Na ausência de uma sequência genética completa de macaco cynomolgus no banco de dados do NCBI, os oligonucleotídeos foram testados na reatividade cruzada contra a sequência genética de macaco rhesus, devido a que as duas espécies são do mesmo gênero, 'Macaca'. Os oligonucleotídeos humanos apresentam reatividade cruzada com o gene de transtirretina do macaco rhesus, designado aqui como SEQ ID NO: 4 (éxons 1-4 extraído do N.° de acesso no GENBANK NW_001105671.1). Os "desemparelhamentos" indicam o número de desemparelhamentos entre o oligonucleotídeo humano e o gene de transtirretina do macaco rhesus. "n/a" indica que o oligonucleotídeo humano tem mais de 3 desemparelhamentos com o gene de transtirretina do macaco rhesus e consequentemente não apresenta reação cruzada com ele. Tabela 13
[00512] Inibição dose-dependente do antissenso da transtirretina humana em hepatócitos primários de macaco Rhesus usando eletroporação
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Exemplo 10: Inibição in vivo da transtirretina humana nos camundongos transgênicos com transtirretina humana
[00513] Gapmers do Exemplo 6, demonstrando inibição significativa do mRNA da transtirretina, foram testados em camundongos transgênicos contendo o gene de transtirretina humano e a eficácia dos gapmers foi avaliada. Tratamento
[00514] Quinze grupos de quatro camundongos fêmeas transgênicos com hTTR cada um, foram administrados por via subcutânea duas vezes por semana durante quatro semanas com 25 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425653, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, ISIS 425755, ou 425757 de ISIS. Outro grupo de quatro camundongos fêmeas transgênicos com hTTR foi injetado com 25 mg/kg do oligonucleotídeo controle ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, designado aqui como SEQ ID NO: 165) duas vezes uma semana por quatro semanas. Outro grupo de quatro camundongos fêmeas transgênicos com hTTR foram injetados por via subcutânea com PBS duas vezes por semana durante quatro semanas. Os ratos injetados com PBS serviram como um grupo de controle. Amostras de sangue foram coletadas de todos os grupos nas semanas 0, 1, 2, 3 e 4 para análise do nível de transtirretina plasmática. Os ratos foram sacrificados dois dias após a última dose e os fígados foram colhidos para análise do mRNA alvo. Análise do RNA
[00515] O RNA foi extraído do tecido do fígado para análise da transtirretina por PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores RTS3029. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina humana, em relação o controle de PBS. Conforme mostrado na Tabela 14, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso ISIS resultou em redução significativa do mRNA da transtirretina humana em comparação com o controle de PBS. O tratamento com o oligonucleotídeo controle, ISIS 141923 não resultou em redução significativa da transtirretina, como esperado. Tabela 14
[00516] Inibição do mRNA da transtirretina humana no fígado de camundongos transgênicos com hTTR em relação ao controle de PBS
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Análise de proteína
[00517] Os níveis da proteína de transtirretina foram medidos no plasma dos camundongos transgênicos por ELISA usando um anticorpo policlonal anti-transtirretina (Abcam Ab37774) e um anticorpo de detecção de ovelha anti-TTR com peroxidase de rábano picante (Abcam no. cat. 35217). A reação de cor foi desenvolvida pelo kit de substrato TMB ImmunoPure® e medida a 450 nm usando um espectrofotômetro de microplacas. As amostras do plasma foram colhidas pré-dose e nos dias 7, 14 e 28. Os resultados são apresentados na Tabela 15 expressados como percentual de inibição comparados com os níveis da pré-dose e demonstram uma redução dependente do tempo dos níveis da proteína com tratamento com oligonucleotídeos ISIS. Tabela 15
[00518] Inibição da proteína transtirretina humana no plasma de camundongos transgênicos com hTTR em relação aos níveis de pré- dose.
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Peso corporal e peso do órgão
[00519] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos pré- dose e no fim do período do tratamento. Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 16 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 16 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Conforme mostrado na Tabela 16, não houve nenhuma alteração significativa nos pesos corporais ou órgãos como resultados do tratamento com oligonucleotídeo antissenso. Tabela 16
[00520] Mudança percentual nos pesos corporais e órgãos dos camundongos transgênicos depois do tratamento com oligonucleotídeo.
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[00521] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 17, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica; resultados também são apresentados na Tabela 17 e expressos em mg/dL. Tabela 17
[00522] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos transgênicos
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[00523] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 18, expressados em mg/dL. Os dados indicam que a inibição antissenso da transtirretina não tem nenhum efeito nos níveis do BUN nestes camundongos transgênicos. Tabela 18
[00524] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso no BUN (mg/dL) no rim de camundongos transgênicos
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Exemplo 11: Tolerabilidade de oligonucleotídeos antissenso marcados para transtirretina humana em camundongos CD1
[00525] Camundongos CD1® (Charles River, MA) são um modelo multiuso de camundongos, frequentemente utilizados para testes de segurança e eficácia. Os ratos foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS selecionados dos estudos descritos no Exemplo 10 e avaliados para mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00526] Grupos de oito camundongos CD1 foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana com 50 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, e ISIS 425755. Quatro camundongos de cada grupo foram avaliados na semana 2 e na semana 6 do período do tratamento. Três dias após a última dose em cada ponto de tempo, os pesos corporais foram tomados, os camundongos foram sacrificados e os órgãos e o plasma foram colhidos para uma análise posterior. Pesos corporais e dos órgãos
[00527] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos pré- dose e no final de cada período de tratamento (duas e seis semanas). Os pesos corporais estão apresentados nas Tabelas 19 e 20, e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também nas Tabelas 19 e 20 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 19
[00528] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos camundongos CDI depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%) na semana 2
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Tabela 20
[00529] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos camundongos CDI depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%) na semana 6
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Função do fígado
[00530] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados nas Tabelas 21 e 22, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica e os resultados também são apresentados nas Tabelas 21 e 22. Tabela 21
[00531] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1 na semana
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Tabela 22
[00532] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1 na semana 6
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Função do rim
[00533] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) e creatinina foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados nas Tabelas 23 e 24, expressados em mg/dL. Tabela 23
[00534] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no rim de camundongos CD1 na semana 2
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Tabela 24
[00535] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no rim de camundongos CD1 na semana 6.
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Ensaios de hematologia
[00536] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foi enviado para Antech Diagnostics para as medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), como também as medições das contagens de células sanguíneas diferenciais, como aquelas dos WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC, e plaquetas, e conteúdo de Hemoglobinaa total. Os resultados são apresentados nas Tabelas 2528. As percentuais dadas nas tabelas indicam a mudança percentual na contagem de células sanguíneas totais comparadas com o controle de PBS. Aqueles oligonucleotídeos antissenso que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas inferior a 70% do controle PBS ou um aumento na contagem de monócitos de mais de duas vezes foram selecionados para estudos posteriores. Tabela 25
[00537] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas completa (%), em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1 na semana 2
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Tabela 26
[00538] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas completa (%), em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1 na semana 6
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Tabela 27
[00539] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas diferencial (%), em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1 na semana 2
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Tabela 28
[00540] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas diferencial (%), em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1 na semana 6
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Exemplo 12: Medição da meia-vida de oligonucleotídeo antissenso no fígado de camundongo CD1
[00541] Os camundongos CD1 foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS dos estudos descritos no Exemplo 11 e a meia-vida do oligonucleotídeo como também o tempo transcorrido para o oligonucleotídeo ser degradado e eliminado do fígado foi avaliado. Tratamento
[00542] Grupos de doze camundongos CD1 foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana durante 2 semanas com 50 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, e ISIS 425755. Quatro camundongos de cada grupo foram sacrificados 3 dias, 28 dias e 56 dias seguido da dose final. Os fígados foram colhidos para a análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00543] A concentração do oligonucleotídeo completo, bem como a concentração total do oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foi medida. O método usado é uma modificação de métodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) o qual consiste de uma extração fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado 27-mer 2'-O-metoxietila, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aqui como SEQ ID NO: 166) foi adicionado antes da extração. As concentrações da amostra do tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite de quantificação inferior (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. As meia-vidas foram calculadas utilizando o software WinNonlin (PHARSIGHT).
[00544] Os resultados são apresentados nas Tabelas 29 e 30, expressos μg/g de tecido do fígado. A meia-vida de cada do oligonucleotídeo é apresentada na Tabela 31. Oligonucleotídeos antissenso com meia-vidas dentro dos 11-34 dias foram escolhidos para estudos posteriores. Tabela 29
[00545] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento completo (μg/g), no fígado de camundongos CD1
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Tabela 30
[00546] Concentração total do oligonucleotídeo (μg/g) no fígado dos camundongos CD1
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Tabela 31
[00547] Meia-vida de oligonucleotídeo (dias) no fígado dos camundongos CD1
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Exemplo 13: Tolerabilidade de oligonucleotídeos antissenso marcados para transtirretina humana em ratos Sprague-Dawley
[00548] Os ratos Sprague-Dawley foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS selecionados dos estudos descritos nos Exemplos 11 e 12 e avaliados para mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00549] Os pesos corporais, a contagem completa de sangue e a contagem diferencial de sangue, assim como a relação proteína/creatinina urinária dos ratos foram avaliados pré-dose. Grupos de quatro ratos Sprague-Dawley foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana com 50 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 e ISIS 425755. Três dias após a última dose em cada ponto de tempo, os pesos corporais foram tomados, os camundongos foram sacrificados e os órgãos e o plasma foram colhidos para uma análise posterior. Pesos corporais e dos órgãos
[00550] Os pesos corporais dos ratos foram medidos pré-dose e no fim do período do tratamento. Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 32 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 32 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 32
[00551] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos ratos Sprague-Dawley depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%) Peso Corporal Fígado Baço Rim
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[00552] Conforme mostrado nas tabelas 32, determinados compostos mostraram um aumento menor de 4 vezes no peso do Baço. Função do fígado
[00553] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 33, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica e os resultados também são apresentados na Tabela 33. Tabela 33
[00554] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos marcadores metabólicos no fígado de ratos Sprague-Dawley
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Função do rim
[00555] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) e creatinina foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 34, expressados em mg/dL. A relação no total de proteína e creatinina urinária também foi avaliada e apresentada na tabela 35. Tabela 34
[00556] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos marcadores metabólicos (mg/dL) no rim de ratos Sprague-Dawley
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Tabela 35
[00557] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no total de proteína/creatinina urinária no rim de ratos Sprague Dawley
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[00558] Conforme mostrado nas tabelas 34 e 35, certos compostos demonstraram um aumento menor de 7-vezes de proteína/creatinina total urinária no rim desses ratos. Além disso, determinados compostos demonstraram um aumento menor de 6-vezes no total de proteína/creatinina urinária no rim desses ratos.
Ensaios de hematologia
[00559] O sangue obtido de todos os grupos de ratos foi enviado para Antech Diagnostics para as medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), como também as medições das contagens de células sanguíneas diferenciais, como aquelas dos WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC, e plaquetas, e conteúdo de hemoglobina total. Os resultados são apresentados nas Tabelas 36 e 37. As percentuais indicadas nas tabelas indicam a variação percentual na contagem de células de sangue total em comparação comparada o controle de PBS. Tabela 36
[00560] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem completa de células do sangue (%), em comparação com o controle de PBS em ratos Sprague-Dawley
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Tabela 37
[00561] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem completa de células do sangue (%), em comparação com o controle de PBS em ratos Sprague-Dawley
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Exemplo 14: Estudos farmacocinéticos da concentração de oligonucleotídeo antissenso em fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
[00562] Os ratos Sprague-Dawley foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS dos estudos descritos no Exemplo 13 e a meia-vida do oligonucleotídeo como também o tempo transcorrido para o oligonucleotídeo ser degradado e eliminado do fígado e do rim foi avaliado. Tratamento
[00563] Grupos de quatro ratos Sprague-Dawley foram injetados por via subcutânea duas vezes por 2 semanas com 20 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737 e ISIS 425755. Três dias após a última dose, os ratos foram sacrificados e os fígados e rins foram coletados para análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00564] A concentração do oligonucleotídeo completo, bem como a concentração total do oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foi medida. O método usado é uma modificação de métodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) o qual consiste de uma extração fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado 27-mer 2'-O-metoxietila, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aqui como SEQ ID NO: 166) foi adicionado antes da extração. As concentrações da amostra do tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite de quantificação inferior (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Os resultados são apresentados nas Tabelas 38 e 39, expressos como g/g de tecido do fígado ou rim. A relação rim/fígado do oligonucleotídeo de comprimento total foi também calculada e apresentada na Tabela 38. Tabela 38
[00565] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento completo (μg/g) e relação no fígado e no rim dos ratos Sprague-Dawley
Figure img0083
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Tabela 39
[00566] Concentração total do oligonucleotídeo (μg/g) no fígado e no rim dos ratos Sprague-Dawley
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Exemplo 15: Inibição dose-dependente in vivo da transtirretina humana em camundongos transgênicos
[00567] Camundongos transgênicos contendo o gene humano da transtirretina foram dosados em doses crescentes de oligonucleotídeos ISIS selecionados a partir de estudos descritos no Exemplo 14 para avaliar o efeito da inibição dose-dependente da transtirretina humana nesses camundongos. Tratamento
[00568] Grupos de quatro camundongos, dois machos e dois fêmeas, foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com 4 mg/kg, 10 mg/kg ou 25 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425679, ISIS 425736, ISIS 425737, ou ISIS 425755. Um grupo de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foi injetado por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com 25 mg/kg do oligonucleotídeo controle, ISIS 141923. Um grupo de controle de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foi injetado por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com PBS. Amostras de plasma de cada grupo foram retiradas nos dias 0, 7, 14, 21 e 28. Dois dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados e os órgãos foram colhidos para uma análise posterior. Análise do RNA
[00569] O RNA foi extraído do tecido do fígado para análise da transtirretina por PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores RTS3029. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina humana, em relação o controle de PBS. Conforme mostrado na Tabela 40, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso ISIS resultou na redução significativa dose-dependente do mRNA da transtirretina humana em comparação com o controle de PBS. O tratamento com o oligonucleotídeo controle, ISIS 141923 não resultou em redução significativa da transtirretina, como esperado. Tabela 40
[00570] Inibição do mRNA da transtirretina humana no fígado de camundongos transgênicos com hTTR em relação ao controle de PBS
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Figure img0087
Análise de proteína
[00571] Os níveis da proteína de transtirretina foram medidos no plasma dos camundongos transgênicos por ELISA usando um anticorpo policlonal anti-transtirretina (Abcam Ab37774) e um anticorpo de detecção de ovelha anti-TTR com peroxidase de rábano silvestre (Abcam n.° cat. 35217). A reação de cor foi desenvolvida pelo kit de substrato TMB ImmunoPure® e medida a 450 nm usando um espectrofotômetro de microplacas. As amostras do plasma foram extraidas pré-dose e nos dias 7, 14, 21 e 28. Os resultados são apresentados na Tabela 41 expressados como percentual de inibição comparados com os níveis da pré-dose e demonstram uma redução dependente do tempo e dose-dependente dos níveis da proteína com tratamento com oligonucleotídeos ISIS. Tabela 41
[00572] Inibição da proteína transtirretina humana no plasma de camundongos transgênicos em relação aos níveis de pré-dose
Figure img0088
Peso corporal e peso do órgão
[00573] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos pré- dose e no fim do período do tratamento. Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 42 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 42 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 42
[00574] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos camundongos transgênicos depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%)
Figure img0089
Função do fígado
[00575] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 43, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica; resultados também são apresentados na Tabela 43 e expressos em mg/dL. Tabela 43
[00576] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos transgênicos
Figure img0090
Função do rim
[00577] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 44, expressados em mg/dL. Tabela 44
[00578] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso no BUN (mg/dL) no rim de camundongos transgênicos
Figure img0091
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Exemplo 16: Inibição in vivo da transtirretina humana nos camundongos transgênicos com transtirretina humana
[00579] Oligonucleotídeos antissenso com motivos MOE 5-10-5, ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, e ISIS 420959 da Tabela 4. Estes oligonucleotídeos antissenso que apresentaram 65% de inibição ou mais do mRNA de transtirretina foram selecionadas e testadas em camundongos transgênicos contendo o gene da transtirretina humana. Oligonucleotídeos adicionais com sequências solapando a ISIS 420951 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG (SEQ ID NO: 116)) e com vários motivos também foram projetados para testar nos camundongos transgênicos. Estes oligonucleotídeos adicionais foram ISIS 450518 (TTTTATTGTCTCTGCCTG (SEQ ID NO: 5-8-5 MOE (SEQ ID NO: 167)), ISIS 450519 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, MOE 6-8-6 (SEQ ID NO: 116)), ISIS 450520 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, MOE 3-10-7 (SEQ ID NO: 116)), IS-IS 450521 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, MOE 7-10-3 (SEQ ID NO: 116)), ISIS 450522 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, MOE 2-10-8 (SEQ ID NO: 116)), e ISIS 450523 (GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, MOE 8-10-2 (SEQ ID NO: 116)). Tratamento
[00580] Grupos de quatro camundongos transgênicos com hTTR, dois machos e duas fêmeas, foram administrados por via subcutânea duas vezes por semana durante quatro semanas com 25 mg/kg de ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522, ou ISIS 425523. Um grupo de controle de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foi injetado por via subcutânea com PBS duas vezes por semana por 4 semanas. Amostras de sangue foram coletadas de todos os grupos nos dias 0, 14, e 28 para análise do nível de transtirretina plasmático. Os ratos foram sacrificados dois dias após a última dose e os fígados foram colhidos para análise do mRNA alvo. Análise do RNA
[00581] O RNA foi extraído do tecido do fígado para análise da transtirretina por PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores RTS3029. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina humana, em relação ao controle de PBS. Conforme mostrado na Tabela 45, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso ISIS resultou na redução significativa do mRNA da transtirretina humana em comparação com o controle de PBS. Tabela 45
[00582] Inibição do mRNA da transtirretina humana no fígado de camundongos transgênicos com hTTR em relação ao controle de PBS
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Análise de proteína
[00583] Os níveis da proteína de transtirretina foram medidos no plasma nos camundongos transgênicos por ELISA usando um anticorpo policlonal anti-transtirretina (Abcam Ab37774) e um anticorpo de detecção de ovelha anti-TTR com peroxidase de rábano silvestre (Abcam no. cat. 35217). A reação de cor foi desenvolvida pelo kit de substrato TMB ImmunoPure® e medida a 450 nm usando um espectrofotômetro de microplacas. As amostras do plasma foram colhidas pré-dose e nos dias 7, 14 e 28. Os resultados são apresentados na Tabela 46 expressados como percentual de inibição comparados com os níveis da pré-dose e demonstram uma redução dependente do tempo e dose-dependente dos níveis da proteína com tratamento com oligonucleotídeos ISIS. Tabela 46
[00584] Inibição da proteína transtirretina humana no plasma de camundongos transgênicos com hTTR em relação aos níveis de pré- dose
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Função do fígado
[00585] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 47, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica; resultados também são apresentados na Tabela 47 e expressos em mg/dL. Tabela 47
[00586] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos transgênicos
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Função do rim
[00587] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 48, expressados em mg/dL. Tabela 48
[00588] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso no BUN (mg/dL) no rim de camundongos transgênicos
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Exemplo 17: Tolerabilidade d e oligonucleotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em camundongos CD1
[00589] Os camundongos CD1 foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS do Exemplo 16 e avaliados para mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00590] Grupos de oito camundongos CD1 foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana com 50 mg/kg de ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522, ou ISIS 425523. Três dias após a última dose em cada ponto de tempo, os pesos corporais foram tomados, os camundongos foram sacrificados e os órgãos e o plasma foram colhidos para uma análise posterior. Pesos corporais e dos órgãos
[00591] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos pré- dose e no final de cada período de tratamento (duas e seis semanas). Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 49 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 49 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 49
[00592] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos camundongos CDI depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%) na semana 6
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Figure img0100
Função do fígado
[00593] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 50, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica e os resultados também são apresentados na Tabela 50. Tabela 50
[00594] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1
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Função do rim
[00595] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) e creatinina foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 51, expressados em mg/dL. Tabela 51
[00596] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso no
Figure img0102
Ensaios de hematologia
[00597] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foi enviado para Antech Diagnostics para as medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), como também as medições das contagens de células sanguíneas diferenciais, como aquelas dos WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC, e plaquetas, e conteúdo de hemoglobina total. Os resultados são apresentados nas Tabelas 52 e 53. As percentuais indicadas nas tabelas indicam a variação percentual na contagem de células de sangue total em comparação comparada o controle de PBS. Tabela 52
[00598] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem completa de células do sangue (%), em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1
Figure img0103
Tabela 53
[00599] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas diferenciais (%) em comparação com o controle de PBS nos camundongos CD1
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Figure img0105
Exemplo 18: Tolerabilidade de oligonucleotídeos antissenso direcionados para transtirretina humana em ratos Sprague-Dawley
[00600] Os oligonucleotídeos ISIS selecionados dos estudos descritos no Exemplo 17 também foram avaliados em ratos Sprague- Dawles e avaliados para mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00601] Os pesos corporais, a contagem completa de sangue e a contagem diferencial de sangue, assim como a relação proteína/creatinina urinária dos ratos foram avaliados pré-dose. Grupos de quatro ratos Sprague-Dawley foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana com 50 mg/kg de ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, e ISIS 420959. Três dias após a última dose em cada ponto de tempo, os pesos corporais foram tomados, os camundongos foram sacrificados e os órgãos e o plasma foram colhidos para uma análise posterior. Pesos corporais e dos órgãos
[00602] Os pesos corporais dos ratos foram medidos pré-dose e no fim do período do tratamento. Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 54 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 54 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 54
[00603] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos ratos Sprague-Dawley depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%)
Figure img0106
[00604] Conforme mostrado na ta bela 54, os compostos demonstraram um aumento menor a 10-vezes no peso do órgão destes ratos. Além disso, determinados compostos demonstraram um aumento menor a 7-vezes no peso do órgão destes ratos. Enquanto que certos compostos demonstraram um aumento menor a 6-vezes no peso do órgão destes ratos. Determinados compostos demonstraram um aumento menor a 5-vezes no peso do órgão destes ratos. Função do fígado
[00605] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 55, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica e os resultados também são apresentados na Tabela 55. Tabela 55
[00606] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos marcadores metabólicos no fígado de ratos Sprague-Dawley
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Função do rim
[00607] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) e creatinina foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 56, expressados em mg/dL. A relação proteína/creatinina urinária total também foi avaliada e apresentada na tabela 56. Tabela 56
[00608] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos marcadores metabólicos (mg/dL) no rim de ratos Sprague-Dawley
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Tabela 57
[00609] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no total de proteína/creatinina urinária no rim de ratos Sprague Dawley
Figure img0109
Ensaios de hematologia
[00610] O sangue obtido de todos os grupos de ratos foi enviado para Antech Diagnostics para as medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), como também as medições das contagens de células sanguíneas diferenciais, como aquelas dos WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC, e plaquetas, e conteúdo de hemoglobina total. Os resultados são apresentados nas Tabelas 58 e 59. As percentuais dadas nas tabelas indicam a mudança percentual na contagem de células sanguíneas totais comparadas com o controle de PBS. Tabela 58
[00611] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem completa de células do sangue (%), em comparação com o controle de PBS em ratos Sprague-Dawley
Figure img0110
Tabela 59
[00612] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso na contagem de células sanguíneas diferenciais (%), em comparação com o controle de PBS em ratos Sprague-Dawley
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Exemplo 19: Estudos farmacocinéticos de meia-vida da concentração de oligonucleotídeo antissenso em fígado e rim de ratos Sprague- Dawley
[00613] Os ratos Sprague-Dawley foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS dos estudos descritos no Exemplo 18 e a meia-vida do oligonucleotídeo como também o tempo transcorrido para o oligonucleotídeo ser degradado e eliminado do fígado e do rim foi avaliado. Tratamento
[00614] Grupos de quatro ratos Sprague-Dawley foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana durante 2 semanas com 20 mg/kg de ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, e ISIS 420959. Três dias após a última dose, os ratos foram sacrificados e os fígados e rins foram coletados para análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00615] A concentração do oligonucleotídeo completo, bem como a concentração total do oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foi medida. O método usado é uma modificação de métodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) o qual consiste de uma extração fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado 27-mer 2'-O-metoxietila, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aqui como SEQ ID NO: 166) foi adicionado antes da extração. As concentrações da amostra do tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite de quantificação inferior (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Os resultados são apresentados nas Tabelas 60 e 61, expressos como g/g de tecido do fígado ou rim. A relação rim/fígado da concentração do oligonucleotídeo também foi calculada e apresentada nas Tabelas 60 e 61. Tabela 60
[00616] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento completo (μg/g) e relação no fígado e no rim dos ratos Sprague-Dawley
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Tabela 61
[00617] Concentração total do oligonucleotídeo (μg/g) no fígado e no rim dos ratos Sprague-Dawley
Figure img0113
Exemplo 20: Inibição dose-dependente in vivo da transtirretina humana em camundongos transgênicos
[00618] ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420957 e ISIS 420959, que apresentaram boa eficácia e tolerabilidade, conforme demonstrado nos Exemplos 16-19, foram escolhidos para o estudo dose-dependente de knockdown alvo nos camundongos transgênicos que contêm o gene de transtirretina humano. ISIS 420950 e ISIS 420955, que demonstraram 90% ou mais de knockdown alvo, mas que também demonstraram toxicidade nos camundongos CD1 (Exemplos 16-19) também foram escolhidos para este estudo para comparação. Tratamento
[00619] Grupos de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com 4 mg/kg, 10 mg/kg ou 25 mg/kg de ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, ou ISIS 420959. Um grupo de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foi injetado por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com 25 mg/kg do oligonucleotídeo controle, ISIS 141923. Um grupo de controle de quatro camundongos, dois machos e duas fêmeas, foi injetado por via subcutânea duas vezes por semana por 4 semanas com PBS. Amostras de plasma de cada grupo foram retiradas nos dias 0, 14 e 28. Dois dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados e os órgãos foram colhidos para uma análise posterior. Análise do RNA
[00620] O RNA foi extraído do tecido do fígado para análise da transtirretina por PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores RTS3029. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina humana, em relação ao controle de PBS. Conforme mostrado na Tabela 62, o tratamento com o oligonucleotídeo antissenso ISIS resultou em uma redução significativa, dose-dependente, do mRNA de transtirretina humana em comparação com o controle PBS O tratamento com o oligonucleotídeo controle, ISIS 141923 não resultou em redução significativa da transtirretina, como esperado. Tabela 62
[00621] Inibição do mRNA da transtirretina humana no fígado de camundongos transgênicos com hTTR em relação ao controle de PBS
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Análise de proteína
[00622] Os níveis da proteína de transtirretina foram medidos no plasma nos camundongos transgênicos por ELISA usando um anticorpo policlonal anti-transtirretina (Abcam Ab37774) e um anticorpo de detecção de ovelha anti-TTR com peroxidase de rábano silvestre (Abcam no. cat. 35217). A reação de cor foi desenvolvida pelo kit de substrato TMB ImmunoPure® e medida a 450 nm usando um espectrofotômetro de microplacas. As amostras do plasma foram extraídas pré-dose e nos dias 7, 14, 21 e 28. Os resultados são apresentados na Tabela 63 expressados como percentual de inibição comparados com os níveis da pré-dose e demonstram uma redução dependente do tempo e dose-dependente dos níveis da proteína com tratamento com oligonucleotídeos ISIS. Tabela 63
[00623] Inibição da proteína transtirretina humana no plasma de camundongos transgênicos com hTTR em relação aos níveis de pré- dose
Figure img0116
Peso corporal e peso do órgão
[00624] Os pesos corporais dos camundongos foram medidos pré- dose e no fim do período do tratamento. Os pesos corporais estão apresentados na Tabela 64 e expressados como percentual de incremento sobre o peso controle de PBS feito antes do começo do tratamento. Os pesos do fígado, do baço e do rim foram medidos no fim do estudo, e são apresentados também na Tabela 64 como uma mudança percentual sobre os respectivos pesos dos órgãos controles de PBS. Tabela 64
[00625] Mudança nos pesos corporais e dos órgãos dos camundongos transgênicos depois do tratamento com oligonucleotídeo antissenso (%)
Figure img0117
Função do fígado
[00626] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas das transaminases foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na Tabela 65, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos usando o mesmo analisador de química clínica; resultados também são apresentados na Tabela 65 e expressos em mg/dL. Tabela 65
[00627] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos no fígado de camundongos transgênicos
Figure img0118
Figure img0119
Função do rim
[00628] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função do rim, as concentrações plasmáticas do nitrogênio ureico sanguíneo (BUN) foram medidas utilizando um analisador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na Tabela 66, expressados em mg/dL. Tabela 66
[00629] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo antissenso no BUN (mg/dL) no rim de camundongos transgênicos
Figure img0120
Figure img0121
Exemplo 21: Confirmação de resposta de dose de oligonucleotídeos antissenso direcionados à transtirretina humana em hepatócitos primários de macaco cynomolgus
[00630] Gapmers apresentando tolerabilidade em camundongos CD1 e ratos Sprague Dawley (estudos descritos nos Exemplos 17-19), bem como a potência em camundongos transgênicos (estudos descritos nos Exemplos de 16 e 20) foram selecionados e testados em várias doses em hepatócitos primários de macacos cynomolgus. As células foram plaqueadas em uma densidade de 35.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações do oligonucleotídeo antissenso de 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1.250 nM, 2,500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM e 20.000 nM, conforme especificado na Tabela 67. Após um período de tratamento de cerca de 16 horas, o RNA foi isolado a partir das células e os níveis de mRNA da transtirretina foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. O conjunto de iniciadores humanos RTS1396 foi usado para medir os níveis de mRNA da transtirretina. Os níveis de mRNA da transtirretina foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, medida pelo RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina, em relação às células controle não tratadas. Como ilustrado na tabela 67, os níveis de mRNA de transtirretina foram reduzidos em uma maneira dose-dependente nos hepatócitos tratados com todos os oligonucleotídeos ISIS, que apresentam reação cruzada com o gene de transtirretina de macaco rhesus, designados aqui como SEQ ID NO: 4 (exons 1-4 extraído do N.° de acesso no GENBANK NW_001105671.1). Tabela 67
[00631] Inibição dose-dependente do antissenso da transtirretina humana em hepatócitos primários de macaco cynomolgus usando eletroporação
Figure img0122
Exemplo 22: Medição da viscosidade de oligonucleotídeos antissenso ISIS direcionados à transtirretina humana
[00632] A viscosidade dos oligonucleotídeos antissenso dos estudos descritos no Exemplo 21 foi medida com o objetivo de fazer a triagem de oligonucleotídeos antissenso que tem uma viscosidade maior a 40 cP. Os oligonucleotídeos com viscosidade maior a 40 cP seriam demasiados viscosos para serem administrados a qualquer sujeito.
[00633] Oligonucleotídeos ISIS (32-35 mg) foram pesados em um frasco de vidro, 120 μL de água foi adicionada e o oligonucleotídeo antissenso foi dissolvido na solução por aquecimento do frasco a 50°C. Parte (75 μL) da amostra pré-aquecida foi pipetada para um micro-viscosímetro (Cambridge). A temperatura do micro-viscosímetro foi definida a 25°C e a viscosidade da amostra foi medida. Outra parte (20 μL) da amostra pré-aquecida foi pipetada em 10 mL de água para a leitura UV a 260 nm a 85°C (instrumento Cary UV). Os resultados são apresentados na Tabela 68 e indicam que todas as soluções dos oligonucleotídeos antissenso apresentaram viscosidade ótima sob os critérios indicados acima. Tabela 68
[00634] Viscosidade e concentração dos oligonucleotídeos antissenso ISIS direcionados à transtirretina humana
Figure img0123
Exemplo 23: Medição da meia-vida de oligonucleotídeo antissenso no fígado de camundongo CD1
[00635] Os camundongos CD1 foram tratados com os oligonucleotídeos antissenso ISIS dos estudos descritos no Exemplo 22 e a meia-vida do oligonucleotídeo como também o tempo transcorrido para o oligonucleotídeo ser degradado e eliminado do fígado foi avaliado. Tratamento
[00636] Grupos de doze camundongos CD1 foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana durante 2 semanas com 50 mg/kg de ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, e ISIS 420959. Quatro camundongos de cada grupo foram sacrificados 3 dias, 28 dias e 56 dias seguido da dose final. Os fígados foram colhidos para a análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00637] A concentração do oligonucleotídeo completo, bem como a concentração total do oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foi medida. O método usado é uma modificação de métodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) o qual consiste de uma extração fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado 27-mer 2'-O-metoxietila, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aqui como SEQ ID NO: 166) foi adicionado antes da extração. As concentrações da amostra do tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite de quantificação inferior (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. As meia-vidas foram calculadas utilizando o software WinNonlin (PHARSIGHT).
[00638] Os resultados são apresentados na Tabela 69, expressos como μg/g de tecido do fígado. A meia-vida de cada do oligonucleotídeo é apresentada na Tabela 70. Tabela 69
[00639] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento completo (μg/g), no fígado de camundongos CD1
Figure img0124
Tabela 70
[00640] Meia-vida de oligonucleotídeo (dias) no fígado dos camundongos CD1
Figure img0125
Exemplo 24: Efeito de oligonucleotídeos antissenso ISIS direcionados à transtirretina humana em macacos cynomolgus
[00641] Os macacos cynomolgus foram tratados com oligonucleotídeos antissenso ISIS dos estudos descritos nos Exemplos 21, 22 e 23. A tolerabilidade e eficácia do oligonucleotídeo antissenso, bem como seu perfil farmacocinético no fígado e nos rins, foram avaliados. Tratamento
[00642] Antes do estudo, os macacos foram mantidos em quarentena durante um período de tempo de 30 dias, durante os qual os painéis padrões da química do soro e hematologia, o exame das amostras fecais para ovos e parasitas, e um teste de tuberculose, foram conduzidos para filtrar macacos anormais ou doentes. Nove grupos de quatro macacos cynomolgus machos aleatória designados foram injetados por via subcutânea três vezes por semana durante a primeira semana, e subsequentemente duas vezes por semana durante as 11 semanas seguintes, com 25 mg/kg de ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, ou ISIS 420959. Um grupo de controle de 4 macacos cynomolgus foi injetado com PBS por via subcutânea três vezes por semana durante a primeira semana, e subsequentemente duas vezes por semana durante as 11 semanas seguintes. Amostras de sangue foram coletadas 5 dias antes do tratamento, bem como em vários dias do período de estudo e analisadas. Os animais estiveram em jejum em um mínimo de 13 horas (uma noite) antes da coleta de sangue. Sacrifícios terminais de todos os grupos foram realizados no dia 86, que foi 48 horas após a última dose.
[00643] Durante o período do estudo, os macacos foram observados diariamente por sinais de doença ou de aflição. Qualquer animal mostrando efeitos adversos ao tratamento foi removido e encaminhado ao veterinário e Diretor de Estudo. Todos os animais tratados com ISIS 420955 foram removidos do estudo no dia 31 devido aos sintomas de doença indicados por 2 macacos do grupo. Da mesma forma, um macaco de cada um dos grupos tratados com ISIS 420957 e ISIS 420950 foi removido do estudo nos dias 44 e 76, respectivamente, devido a sinais de doença.
Estudos de inibição Análise do RNA
[00644] No dia 86, o RNA foi extraído do tecido do fígado para análise da transtirretina por PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores RTS3029. Os resultados são apresentados como percentual de inibição da transtirretina humana, em relação ao controle de PBS, normalizados para a ciclofilina. Resultados semelhantes foram obtidos em normalização com RIBOGREEN®. Conforme mostrado na Tabela 71, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso ISIS resultou na redução significativa do mRNA da transtirretina humana em comparação com o controle de PBS. Especificamente, o tratamento com ISIS 420915 causou maior inibição de mRNA de TTR do que o tratamento com ISIS 304299, mesmo que os dois oligonucleotídeos diferissem de se por um único deslocamento de par de bases. Os dados para os animais tratados com ISIS 420955 foram tomados no dia 31. Tabela 71
[00645] Inibição do mRNA da transtirretina no fígado de macaco cynomolgus em relação ao controle de PBS
Figure img0126
Análise de proteína
[00646] Os macacos foram mantidos em jejum durante a noite antes da coleta do sangue. Aproximadamente 1 mL de sangue foi coletado de todos os animais disponíveis e colocados em tubos contendo o sal de potássio do EDTA. Os tubos foram centrifugados (3000 rpm por 10 min à temperatura ambiente) para obter o plasma. Os níveis de proteína transtirretina foram medidos no plasma usando um analisador clínico. As amostras do plasma foram extraídas pré-dose (no dia -5) e nos dias 1, 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72 e 86. Os resultados são apresentados na Tabela 72 expressados como percentual de inibição comparados com os níveis da pré-dose e demonstram uma redução dependente do tempo dos níveis da proteína com tratamento com oligonucleotídeos ISIS. Os níveis finais da TTR plasmática são apresentados na tabela 73 e demonstram a correlação forte entre a redução do nível da proteína TTR e a inibição do mRNA de TTR (Tabela 71). Especificamente, o tratamento com ISIS 420915 causou maior inibição da proteína TTR plasmática do que o tratamento com ISIS 304299 (76% de inibição em relação aos 47% de inibição), mesmo que os dois oligonucleotídeos diferissem de se por um único deslocamento de par de bases. Tabela 72
[00647] Transcurso de tempo da redução do nível da proteína transtirretina no plasma do macaco cynomolgus em relação aos níveis pré-dose
Figure img0127
n/a = estudo foi encerrado no dia 31 de animais tratados com ISIS 420955; portanto os dados para os dias subsequentes não estão disponíveis. Tabela 73
[00648] Redução do nível da proteína transtirretina do dia 86 no plasma do macaco cynomolgus em relação aos níveis pré-dose
Figure img0128
[00649] Os níveis da proteína RBP4 também foram medidos no plasma usando um jogo de ELISA. As amostras do plasma foram extraídas pré-dose (no dia -5) e nos dias 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72 e 86. Os resultados são apresentados na Tabela 74 expressados como a percentual de inibição comparado com os níveis pré-dose. Alguns dos oligonucleotídeos ISIS (ISIS 420915, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955 e ISIS 420959) demonstram uma redução tempo-dependente nos níveis da proteína, concomitante com a redução da TTR. Os níveis finais de RBP4 plasmática são apresentados na Tabela 75 e também demonstram a forte correlação entre a redução dos níveis das proteínas RBP4 e TTR (tabela 73) no tratamento com os oligonucleotídeos acima mencionados. Especificamente, o tratamento com ISIS 420915 causou maior inibição da proteína RBP4 plasmática do que o tratamento com ISIS 304299 (63% de inibição em relação aos 19% de inibição), mesmo que os dois oligonucleotídeos diferissem de se por um único deslocamento de par de bases. Tabela 74
[00650] Transcurso de tempo da redução do nível da proteína RBP4 no plasma do macaco cynomolgus em relação aos níveis pré- dose
Figure img0129
n/a = esl tudo foi encerrado no dia 31 de animais trai tados com ISIS 420955; portanto os dados para os dias subsequentes não estão disponíveis. Tabela 75
[00651] Redução do nível da proteína RBP4 do dia 86 no plasma do macaco cynomolgus em relação aos níveis pré-dose
Figure img0130
Estudos de tolerabilidade Medições de peso corporal e de órgão
[00652] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS sobre a saúde geral dos animais, os pesos do corpo e do órgão foram medidos no dia 86. Os dados para os animais tratados com ISIS 420955 foram tomados no dia 31. Os pesos corporais foram medidos e comparados com aqueles nos níveis pré-dose. Os pesos dos órgãos foram medidos e os pesos do grupo do tratamento foram comparados com os pesos correspondentes do controle de PBS. Os dados são apresentados na Tabela 76. Tabela 76
[00653] Alterações em % do peso final do corpo e do órgão no macaco cynomolgus em relação aos níveis pré-dose
Figure img0131
Função do fígado
[00654] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, amostras do sangue foram coletadas de todos os grupos de estudo. As amostras do sangue foram coletadas em tubos sem nenhum anticoagulante para a separação do soro. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente por 90 minutos e em seguida centrifugados (3000 RPM por 10 minutos à temperatura ambiente) para obter o soro. As concentrações das transaminases foram medidas usando um analisador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão). As concentrações plasmáticas de ALT (Alanina transaminase) e AST (Aspartato transaminase) foram medidas no dia 86 e os resultados são apresentados na Tabela 77, expressas em IU/L. A fosfatase alcalina, a qual é sintetizada em maiores quantidades pelas células comprometidas do fígado, também é um marcador da doença hepática e foi medida da mesma forma. A proteína C-reativa (CRP), que é sintetizada no fígado e que serve como um marcador de inflamação, também foi medida de maneira similar no dia 86. Os dados da fosfatase alcalina e da CRP também são apresentados na Tabela 77. A bilirrubina é também um marcador metabólico do fígado e foi também medida e é apresentada na Tabela 77, expressa em mg/dL. Tabela 77
[00655] Efeito do tratamento de olignucleotídeo antissenso em marcadores metabólicos do fígado em plasma de macaco cynomolgus
Figure img0132
Função do rim
[00656] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS na função hepática, amostras do sangue foram coletadas de todos os grupos de estudo. As amostras do sangue foram coletadas em tubos sem nenhum anticoagulante para a separação do soro. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente por 90 minutos e em seguida centrifugados (3000 RPM por 10 minutos à temperatura ambiente) para obter o soro. Concentrações de BUN e creatinina foram medidas no dia 86 usando um analisador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão). Os resultados são apresentados na Tabela 78, expressados em mg/dL.
[00657] Amostras de urina foram coletadas por drenagem de bandejas especiais de aço inoxidável da gaiola no dia 5 antes do estudo e posteriormente nos dias 25 e 84. A relação proteína total e creatinina urinária foi medida usando um analisador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japão) e os resultados são apresentados na Tabela 79. Tabela 78
[00658] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos níveis plasmáticos de BUN e creatinina (mg/dL) em macacos cynomolgus
Figure img0133
Tabela 79
[00659] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso na relação proteína e creatinina urinária em macacos cynomolgus
Figure img0134
n/a = estudo foi encerrado no dia 31 para animais tratados com ISIS 420955; portanto os dados para os dias subsequentes não estão disponíveis. Hematologia
[00660] Para avaliar qualquer efeito inflamatório de oligonucleotídeos ISIS em macacos cynomolgus, amostras de aproximadamente 0,5 mL de sangue foram coletadas de cada um dos animais do estudo disponível em tubos contendo o sal de potássio do EDTA. As amostras foram analisadas para a contagem de células vermelhas do sangue (RBC), células brancas do sangue (WBC), percentuais das células brancas do sangue, como aquelas dos monócitos, neutrófilos, linfócitos, como também para a contagem de plaquetas e hematócritos (%), usando um analisador hematológico ADVIA120 (Bayer, EUA). Os dados são apresentados na Tabela 80. Tabela 80
[00661] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso nos parâmetros hematológicos em macacos cynomolgus
Figure img0135
Análise dos fatores de inflamação
[00662] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS nos fatores envolvidos na inflamação, sangue foi coletado no dia 86 de todos os animais disponíveis para a análise do C3 do complemento, bem como para a medição dos níveis de citocinas. Para a análise do C3 do complemento, as amostras do sangue foram coletadas em tubos sem nenhum anticoagulante para a separação do soro. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente por 90 minutos e em seguida centrifugados (3000 RPM por 10 minutos à temperatura ambiente) para obter o soro. O C3 do complemento foi medido usando um analisador automático (analisador de química Toshiba 200 FR NEO, Toshiba co., Japão). Os dados são apresentados na Tabela 81, expressa em mg/dL.
[00663] Para análise de nível de citocinas, sangue foi coletado em tubos contendo EDTA para separação do plasma. Os tubos foram em seguida centrifugados (3000 rpm por 10 min à temperatura ambiente) para obter o plasma. Amostras de plasma foram enviadas para Aushon Biosystems Inc. (Billerica, MA) para medição dos níveis de quimiocinas e citocinas. Os níveis de TNF-α foram medidos usando os respectivos anticorpos de primata e os níveis de MIP-1α, MCP-1, e MIP-1β foram medidos usando os respectivos anticorpos humanos de reação cruzada. Medidas foram feitas 5 dias antes do início do tratamento e nos dias 3 e 86. Os resultados são apresentados nas Tabelas 82-85. Tabela 81
[00664] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no C3 do complemento (mg/dL) em macacos cynomolgus
Figure img0136
Figure img0137
Tabela 82
[00665] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no
Figure img0138
Tabela 83
[00666] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no
Figure img0139
Tabela 84
[00667] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no
Figure img0140
Tabela 85
[00668] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no
Figure img0141
Testes de coagulação
[00669] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos ISIS nos fatores envolvidos na via da coagulação, os testes padrão de coagulação foram empregados. PT e aPTT foram medidos usando plasma pobre de plaquetas (PPP) de macacos durante um período de 48 horas. Valores de PT e aPTT são fornecidos nas Tabelas de 86 e 87 e expresso em segundos. Níveis de fibrinogênio no plasma também foram quantificados por um período de 48 horas e os dados são apresentados na Tabela 88. Conforme mostrado nas Tabelas 86-88, PT, aPTT e fibrinogênio não foram alterados significativamente em macacos tratados com oligonucleotídeos ISIS, comparados com o controle de PBS. Tabela 86
[00670] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no PT (s)
Figure img0142
Tabela 87
[00671] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no aPTT (s)
Figure img0143
Tabela 88
[00672] Efeito do tratamento de oligonucleotídeo antissenso no fibrinogênio (mg/dL)
Figure img0144
Figure img0145
Análise de painel de tireoide
[00673] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS nos hormônios da tireoide, macacos foram mantidos em jejum durante a noite e 3,5 mL de sangue foram extraídos de cada um dos animais disponíveis do estudo 5 dias antes do começo do tratamento e nos dias 51 e 86. As amostras do sangue foram mantidas em tubos sem nenhum anticoagulante para a separação do soro. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente por 90 minutos, e em seguida foram centrifugados (3000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente) para obter o soro. Amostras de soro foram enviadas para o Laboratório Núcleo de Biomarcadores da Emory University (Atlanta, GA) para análise de painel de tireoide. Os resultados para o hormônio estimulante da tireoide (TSH) são fornecidos na Tabela 89 e expressos em μL/mL. Os resultados para o hormônio T3 total e livre são fornecidos nas Tabelas 90 e 91. Os resultados para o hormônio T4 total e livre são fornecidos nas Tabelas 92 e 93. Em geral, a análise de painel de tireoide mostrou que todos os animais permaneceram dentro de níveis aceitáveis de hormônio mesmo que reduziram-se os níveis de expressão da transtirretina, demonstrando que os oligonucleotídeos antissenso de transtirretina não afetou os níveis hormonais. Tabela 89
[00674] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no TSH (μL/mL)
Figure img0146
Figure img0147
Tabela 90
[00675] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no T3 total (ng/dL)
Figure img0148
Tabela 91
[00676] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no T3 livre (pg/mL)
Figure img0149
Tabela 92
[00677] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no T4 total (ng/dL)
Figure img0150
Tabela 93
[00678] Efeito do tratamento do oligonucleotídeo antissenso no T4 livre (pg/mL)
Figure img0151
Estudos farmacocinéticos Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00679] A concentração do oligonucleotídeo completo, bem como a concentração total do oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foi medida. O método usado é uma modificação de métodos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) o qual consiste de uma extração fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado 27-mer 2'-O-metoxietila, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aqui como SEQ ID NO: 166) foi adicionado antes da extração. As concentrações da amostra do tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite de quantificação inferior (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Calculou-se a relação entre as concentrações no rim e fígado. Os resultados são apresentados nas Tabelas 94 e 95, expressos como g/g de tecido. Tabela 94
[00680] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento completo (μg/g), no fígado de macaco cynomolgus
Figure img0152
Tabela 95
[00681] Concentração total do oligonucleotídeo (μg/g), no fígado de macaco cynomolgus
Figure img0153

Claims (7)

1. Oligonucleotídeo modificado de fita simples, caracterizado pelo fato de que consiste em 20 nucleosídeos ligados apresentando uma sequência de nucleobases consistindo na sequência decrita na SEQ ID NO: 80, em que o oligonucleotídeo modificado apresenta: um segmento de intervalo que consiste em dez deoxinucleosídeos ligados; um segmento de flanqueamento 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; e um segmento de flanqueamento 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo está posicionado entre o segmento de flanqueamento 5' e o segmento de flanqueamento 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de flanqueamento compreende um açúcar 2'-O-metoxietila; e em que cada ligação internucleosídeo do oligonucleotídeo modificado é uma ligação fosforotioato, e em que cada citosina do oligonucleotídeo modificado é 5-metilcitosina.
2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo modificado de fita simples como definido na reivindicação 1, ou sal do mesmo e pelo menos um de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sal do mesmo é um sal de sódio ou um sal de potássio.
4. Uso de um oligonucleotídeo modificado de fita simples ou composição, como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar amiloidose transtirretina.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amiloidose transtirretina é polineuropatia amiloidótica familiar (FAP).
6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amiloidose transtirretina é cardiopatia amiloide familiar (FAC).
7. Uso do oligonucleotídeo modificado de fita simples ou composição, como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para reduzir a expressão de mRNA ou de proteína de transtirretina em um tecido ou célula humana.
BR112012027547-0A 2010-04-29 2011-04-29 Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina BR112012027547B1 (pt)

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