KR20180026798A - 트랜스티레틴 발현의 조절 - Google Patents

트랜스티레틴 발현의 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR20180026798A
KR20180026798A KR1020187005906A KR20187005906A KR20180026798A KR 20180026798 A KR20180026798 A KR 20180026798A KR 1020187005906 A KR1020187005906 A KR 1020187005906A KR 20187005906 A KR20187005906 A KR 20187005906A KR 20180026798 A KR20180026798 A KR 20180026798A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
certain embodiments
seq
transthyretin
compound
antisense
Prior art date
Application number
KR1020187005906A
Other languages
English (en)
Inventor
브렛 피. 모니아
수잔 엠. 프레이어
앤드류 엠. 시우코우스키
Original Assignee
아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 filed Critical 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드
Publication of KR20180026798A publication Critical patent/KR20180026798A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/52—Physical structure branched
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

본원은 동물에서 트랜스티레틴 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물, 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법, 화합물, 및 조성물은 트랜스티레틴 아밀로이드증 또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는데 유용하다.

Description

트랜스티레틴 발현의 조절{MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION}
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 55 Kb 크기의 2011년 4월 28일에 생성된 BIOL0123WOSEQ.txt의 제목의 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
동물에서 트랜스티레틴 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물, 및 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 방법, 화합물, 및 조성물은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는데 유용하다.
발명의 배경
트랜스티레틴(TTR)(전알부민으로도 공지됨, 고티록신혈증(hyperthytoxinemia), 이상전알부민혈증(dysprealbuminemic), 티록신; 노인성 전신성 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드증 Ⅰ, PALB; 이상트랜스트레틴혈증(dystransthyretinemic), HST2651; TBPA; 이상전알부민혈증 정상갑상선 고티록신혈증)은 티록신 및 레티놀의 운송을 책임지는 혈청/혈장 및 뇌척수액 단백질이다(Sakaki et al, Mol Biol Med. 1989, 6:161-8). 구조적으로, TTR은 동종사합체이며; 단백질의 점 돌연변이 및 미스폴딩(misfolding)은 아밀로이드 원섬유의 침착을 발생시키고, 이는 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA), 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP), 및 가족성 아밀로이드 심장병증(FAC)과 같은 장애와 관련된다.
TTR은 간 및 뇌의 맥락얼기에 의해 주로 합성되고, 보다 덜한 정도로 인간의 망막에 의해 합성된다(Palha, Clin Chem Lab Med, 2002, 40, 1292-1300). 간에서 합성되는 트랜스티레틴은 혈액으로 분비되는 반면, 맥락얼기에서 유래되는 트랜스티레틴은 CSF에 대해 예정된다. 맥락얼기에서, 트랜스티레틴 합성은 전체 국소 단백질 합성의 약 20%이며, 전체 CSF 단백질의 25%만큼 많다(Dickson et al., J Biol Chem, 1986, 261, 3475-3478).
유전적 및 면역조직화학 진단 시험을 이용하여, TTR 아밀로이드증을 갖는 환자가 전세계 많은 국가에서 발견되었다. 최근의 연구는 TTR 아밀로이드증이 이전에 생각한 것 만큼 희귀한 풍토 질병이 아니며, 노인 집단의 25% 만큼 많이 걸릴 수 있다는 것을 나타낸다(Tanskanen et al, Ann Med. 2008;40(3):232-9).
생화학 수준에서, TTR은 FAP 환자의 아밀로이드 침착물에서 주요 단백질 성분으로 확인되었고(Costa et al, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 1978, 75:4499-4503), 이후에 상기 단백질의 위치 30에서의 발린에 대한 메티오닌의 치환이 상기 질병을 야기시키는 가장 흔한 분자적 결함인 것으로 밝혀졌다(Saraiva et al, J. Clin. Invest. 1984, 74: 104-119). TTR 응집 및 아밀로이드 원섬유의 광범위한 전신적 세포외 침착인 FAP는 결합조직 전체에 걸쳐, 특히 말초신경계에서 발생한다(Sousa and Saraiva, Prog . Neurobiol. 2003, 71: 385-400). TTR 침착 후, 작은 직경의 민말이집 및 말이집 섬유에서 시작하는 축삭 변성이 발생하고, 이는 궁극적으로는 신경절 부위에서 신경 손실을 발생시킨다.
본원에 기재된 화합물 및 치료 방법은 TTR 관련 장애에 현재 이용가능한 치료 선택에 비해 유의한 장점을 제공한다. TTR 아밀로이드증은 전형적으로 10년 이내에 사망을 야기시키며, 최근까지는 불치인 것으로 간주되었다. 간 이식이 가족성 경우에 질병-관련 대립유전자를 야생형(WT) 대립유전자로 대체시키는 효과적인 수단인데, 이는 간이 전형적으로 아밀로이드 TTR의 공급원이기 때문이다. 간 이식이 유전자 요법의 형태로서 효과적이나, 문제가 없는 것은 아니다. 이식은 수용자 및 공여자에 대한 침습성 수술 필요, 장기간의 이식후 면역억제 요법, 공여자 부족, 높은 비용, 및 질병 진행으로 인한 많은 수의 양호한 후보자가 아닌 TTR 아밀로이드증 환자로 인해 복잡하다. 불행히도, 일부 가족성 환자에서는 간 이식 후에도 심장 아밀로이드증이 진행되는데, 이는 WT TTR이 종종 지속적으로 침착되기 때문이다. TTR의 중추신경계(CNS) 침착은 또한 맥락얼기에 의한 이의 합성으로 인해 이식에 의해 경감되지 않는다. 이식은 WT TTR의 침착으로 인해 80세 이상의 사람들의 약 25%가 걸리는 가장 우세한 TTR 질병인 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA)에 대해 실행가능한 선택이 아니다.
안티센스 기술이 특정 유전자 생성물의 발현을 감소시키기 위한 효과적인 수단으로 나오고 있으며, 따라서 이는 TTR 발현의 조절을 위한 다수의 치료, 진단, 및 연구 적용에서 유일무이하게 유용한 것으로 입증될 수 있다(미국 특허 출원 번호 2008/0039418호 및 2007/0299027호 참조).
본 발명은 트랜스티레틴 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 트랜스티레틴의 발현을 조절하기 위한 안티센스 화합물은 상기 언급된 공개된 특허 출원에 개시되어 있다. 그러나, 추가적인 상기 화합물이 여전히 필요하다.
발명의 개요
트랜스티레틴(TTR) mRNA 및 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법, 화합물, 및 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, TTR mRNA 및 단백질의 발현을 조절하는데 유용한 화합물은 안티센스 화합물이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
특정 구체예에서, 조절은 세포 또는 조직에서 발생할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 또는 조직은 동물 내의 세포 또는 조직이다. 특정 구체예에서, 동물은 인간이다. 특정 구체예에서, TTR mRNA 수준이 감소된다. 특정 구체예에서, TTR 단백질 수준이 감소된다. 이러한 감소는 시간-의존적 방식 또는 용량-의존적 방식으로 발생할 수 있다.
트랜스티레틴의 발현을 조절하고, 트랜스티레틴 아밀로이드증 및/또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키기 위한 방법, 화합물, 및 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴의 발현을 조절하고, 트랜스티레틴 아밀로이드 질병 또는 트랜스티레틴 아밀로이드증 또는 트랜스티레틴 관련 아밀로이드증(예를 들어, 유전성 TTR 아밀로이드증, 연수막 아밀로이드증, 트랜스티레틴 아밀로이드 다발신경병증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 가족성 아밀로이드 심근병증, 또는 노년 전신 아밀로이드증)을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키기 위한 방법, 화합물, 및 조성물이 제공된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있는 동물은 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 또는 124에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 25, 80, 86, 또는 87에 열거된 핵염기 서열 중 어느 하나로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 위험이 있거나 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 트랜스티레틴 핵산에 100% 상보적인 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물; 또는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료된다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료되며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 트랜스티레틴 핵산에 100% 상보적이고, 상기 화합물은 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열을 갖는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 동물은 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에 투여함으로써 치료되며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 트랜스티레틴 핵산에 100% 상보적이고, 상기 화합물은 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열을 갖는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5개의 연결된 변형된 뉴클레오사이드를 독립적으로 갖는 2개의 윙 세그먼트 사이에 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드의 갭 세그먼트를 갖는다. 특정 구체예에서, 윙 세그먼트 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 당을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드이다. 특정 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다.
특정 구체예에서, 조절은 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 발생할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포, 조직 또는 기관은 동물에 존재한다. 특정 구체예에서, 동물은 인간이다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 mRNA 수준이 감소된다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 단백질 수준이 감소된다. 이러한 감소는 시간-의존적 방식 또는 용량-의존적 방식으로 발생할 수 있다.
또한, 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 질병, 장애, 및 질환을 예방하고, 치료하고, 개선시키는데 유용한 방법, 화합물, 및 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 이러한 질병, 장애, 및 질환은 트랜스티레틴 아밀로이드증 관련 질병, 장애 또는 질환이다.
특정 구체예에서, 치료 방법은 TTR 안티센스 화합물을 필요로 하는 개체에 TTR 안티센스 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료 방법은 TTR 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 필요로 하는 개체에 TTR 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 치료 방법은 트랜스티레틴 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 추가 요법제를 필요로 하는 개체에 트랜스티레틴 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 추가 요법제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
상술된 일반적 기재 및 하기의 상세한 설명 둘 모두는 단지 예시 및 설명을 위한 것으로, 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본원에서, 단수형의 사용은 달리 특별히 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다. 본원에서 사용되는 "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 이로 제한하는 것이 아니다. 또한, "구성요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 달리 특별히 언급하지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 구성요소 및 성분 및 하나 이상의 하위단위(subunit)를 포함하는 구성요소 및 성분 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 섹션 제목은 단지 구성적 목적을 위한 것으로, 기재되는 주제를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다. 특허, 특허 출원, 기사, 책, 및 논문을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 본 출원에 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부는 본원에 논의된 상기 문헌의 부분뿐만 아니라 이의 전체내용이 참조로서 본원에 명백히 포함된다.
정의
특정한 정의가 제공되지 않는 경우, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약화학과 관련하여 이용되는 명명법, 및 이의 절차 및 기술은 당 분야에 널리 공지되고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 및 화학 분석을 위해 표준 기술이 이용될 수 있다. 허용시, 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물, 미국 국립생물정보센터(NCBI)와 같은 데이터베이스를 통해 수득가능한 GENBANK 등록 번호 및 관련 서열 정보 및 본원의 개시 전체에 걸쳐 언급되는 다른 데이터는 본원에 논의된 상기 문헌의 부분뿐만 아니라 전체내용이 참조로서 포함된다.
달리 표시하지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는다:
"2'-0-메톡시에틸"(또한, 2'-MOE 및 2'-0(CH2)2-OCH3)은 푸로실 고리의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 의미한다. 2'-0-메톡시에틸 변형된 당은 변형된 당이다.
"2'-0-메톡시에틸 뉴클레오타이드"는 2'-0-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"5-메틸사이토신"은 5' 위치에 부착된 메틸기로 변형된 사이토신을 의미한다. 5-메틸사이토신은 변형된 핵염기이다.
"활성 약학적 작용제"는 개체에 투여되는 경우 치료적 이익을 제공하는 약학적 조성물 중의 물질 또는 물질들을 의미한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 활성 약학적 작용제이다.
"활성 표적 영역" 또는 "표적 영역"은 하나 이상의 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 영역을 의미한다. "활성 안티센스 화합물"은 표적 핵산 수준 또는 단백질 수준을 감소시키는 안티센스 화합물을 의미한다.
"동시 투여된"은 2개의 작용제 둘 모두의 약리학적 효과가 동시에 환자에서 나타나는 임의의 방식의 2개의 작용제의 공동투여를 의미한다. 동시 투여는 둘 모두의 작용제가 단일한 약학적 조성물로 투여되거나, 동일 투여 형태로 투여되거나, 동일 투여 경로로 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 둘 모두의 작용제의 효과는 동시에 자신들로 나타날 필요는 없다. 상기 효과는 단지 일정 기간 동안 중첩되는 것을 필요로 하며, 같은 시간에 걸쳐 존재할 필요는 없다.
"투여하는"은 개체에 약학적 작용제를 제공하는 것을 의미하며, 의학 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"개선"은 관련 질병, 장애, 또는 질환의 적어도 하나의 지표, 증후, 또는 증상의 감소를 의미한다. 지표의 중증도는 당업자에게 공지된 주관적 또는 객관적 수단에 의해 결정될 수 있다.
"아밀로이드증"은 다양한 신체 조직에서의 비정상적 단백질(아밀로이드 또는 아밀로이드 원섬유) 침착으로부터 발생하는 질병 또는 장애의 군이다. 아밀로이드 단백질은 신체의 한 특정 부위에 침착(국소화 아밀로이드증)되거나, 이들은 신체 전체에 걸쳐 침착(전신 아밀로이드증)될 수 있다. 원발성(AL), 속발성(AA), 및 가족성(ATTR)의 3개 유형의 전신 아밀로이드증이 존재한다. 원발성 아밀로이드증은 임의의 다른 질병과 관련되지 않으며, 고유한 질병 존재로 간주된다. 속발성 아밀로이드증은 또 다른 질병의 결과로서 발생한다. 가족성 지중해열(Familial Mediterranean Fever)은 가족성(유전) 아밀로이드증의 한 형태이다.
"동물"은 인간 또는 비인간 동물, 비제한적인 예로, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 비인간 영장류, 비제한적인 예로, 원숭이 및 침팬지를 의미한다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물의 이의 표적 핵산으로의 하이브리드화에 기인하는 임의의 검출가능하거나 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 구체예에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 상기 표적 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질의 양 또는 발현에서의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소결합을 통해 표적 핵산에 대한 하이브리드화를 겪을 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다.
"안티센스 억제"는 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 부재하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준에 비한 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적 핵산의 상응하는 영역 또는 세그먼트에 대한 하이브리드화를 가능케 하는 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"이환식 당"은 2개의 비-제미널(non-geminal) 고리 원자의 브릿징에 의해 변형된 푸로실 고리를 의미한다. 이환식 당은 변형된 당이다.
"이환식 핵산" 또는 "BNA"는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 푸라노스 부분이 푸라노스 고리 상의 2개의 탄소 원자를 연결함으로써 이환식 고리 시스템을 형성시키는 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"캡 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 어느 한 말단에 통합된 화학적 변형을 의미한다.
"중추신경계(CNS)"는 수막 내에 둘러싸인 척추동물 신경계를 의미한다. 이는 대부분의 신경계를 함유하며, 뇌(뇌를 갖는 척추동물에서), 및 척수로 구성된다. CNS는 배측 체강 내에 함유되고, 뇌는 두개강 내에 함유되고, 척수는 척수강 내에 함유된다. 뇌는 또한 두개골에 의해 보호되고, 척수는 척추동물에서 또한 척추뼈에 의해 보호된다.
"화학적으로 다른 영역"은 동일 안티센스 화합물의 또 다른 영역과 어떠한 방식으로든 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 의미한다. 예를 들어, 2'-0-메톡시에틸 뉴클레오타이드를 갖는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖지 않는 뉴클레오타이드를 갖는 영역과 화학적으로 다르다.
"키메라 안티센스 화합물"은 적어도 2개의 화학적으로 다른 영역을 갖는 안티센스 화합물을 의미한다.
"맥락얼기"는 뇌척수액(CSF)이 생성되는 뇌의 실 상의 영역이다.
"공동투여"는 개체로의 2개 이상의 약학적 작용제의 투여를 의미한다. 2개 이상의 약학적 작용제는 단일 약학적 조성물에 존재할 수 있거나, 독립된 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 2개 이상의 약학적 작용제 각각은 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 공동 투여는 병행 또는 순차적 투여를 포함한다.
"상보성"은 제1 핵산 및 제2 핵산의 핵염기 사이에 쌍을 형성하는 능력을 의미한다.
"연속적 핵염기"는 서로 매우 인접한 핵염기를 의미한다.
"희석제"는 약리학적 활성이 결핍되어 있으나, 약학적으로 필요하거나 요망되는 조성물 내의 성분을 의미한다. 예를 들어, 주사된 조성물 내의 희석제는 액체, 예를 들어, 염수 용액일 수 있다.
"용량"은 단일 투여, 또는 특정된 기간에 제공되는 약학적 작용제의 특정량을 의미한다. 특정 구체예에서, 용량은 1, 2, 또는 이 초과의 볼루스, 정제, 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여가 요망되는 특정 구체예에서, 요망되는 용량은 단일 주사에 의해 용이하게 수용되지 않는 부피를 필요로 하며, 따라서 요망되는 용량을 달성하기 위해 2회 이상의 주사가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 약학적 작용제는 연장된 기간에 걸치거나 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주, 또는 월 당 약학적 작용제의 양으로 언급될 수 있다.
"유효량"은 활성 약학적 작용제를 필요로 하는 개체에서 요망되는 생리학적 결과를 달성하기에 충분한 활성 약학적 작용제의 양을 의미한다. 유효량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개체의 분류학적 군, 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 개체마다 다양할 수 있다.
"가족성 아미로이드증" 또는 "유전성 아밀로이드증"은 유전 아밀로이드증의 한 형태이다.
"가족성 아밀로이드 다발신경병증" 또는 "FAP"는 진행성 감각 및 운동 다발신경병증을 야기시키는 트랜스티레틴 단백질의 아밀로이드 변이체의 전신 침착을 특징으로 하는 유전적으로 전달되는 신경변성 장애이다.
"완전히 상보적" 또는 "100% 상보적"은 제1 핵산의 핵염기 서열의 각각의 핵염기가 제2 핵산의 제2 핵염기 서열 내에 상보적 핵염기를 갖는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 제2 핵산이다.
"갭머(Gapmer)"는 RNase H 분해를 뒷받침하는 다수의 뉴클레오사이드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오사이드를 갖는 외부 영역 사이에 위치되는 키메라 안티센스 화합물을 의미하고, 여기서 내부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드는 외부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들과 화학적으로 다르다. 내부 영역은 "갭 세그먼트"로 언급될 수 있고, 외부 영역은 "윙 세그먼트"로 언급될 수 있다.
"갭이 넓은(gap-widened)"은 1 내지 6개의 뉴클레오사이드를 갖는 5' 및 3' 윙 세그먼트에 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되는 12개 이상의 연속적 2'-데옥시리보뉴클레오사이드의 갭 세그먼트를 갖는 키메라 안티센스 화합물을 의미한다.
"유전성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증"은 티록신 및 비타민 A에 대한 혈장 수송 단백질인 트랜스티레틴에서의 돌연변이에 의해 야기되는 전신 질병이다. 이는 말초 신경병증 및 제한심근병증과 가장 빈번히 관련되나, 신체 전체에 걸친 혈관벽 및 결합조직 구조에서의 아밀로이드 침착은 다른 기관계의 기능이상을 야기시킨다. 위장 운동 이상은 변비, 설사 및 지연위배출로부터의 조기 포만을 갖는 상기 질병에서 흔하다. 손목에서의 아밀로이드의 결합조직 침착은 손목굴증후군을 야기시킬 수 있다. 척수 혈관 및 주위 구조에서의 아밀로이드 침착은 파행의 증상을 갖는 척추관협착을 야기시킨다.
"하이브리드화"는 상보적 핵산 분자의 어닐링(annealing)을 의미한다. 특정 구체예에서, 상보적 핵산 분자는 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함한다.
"매우 인접한"은 매우 인접한 구성요소 사이에 개재 구성요소가 존재하지 않는 것을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"대뇌실내(intracerebroventricular) 투여" 또는 "대뇌 실내 투여" 또는 "대뇌 실 투여"는 뇌의 뇌실계로의 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다.
"복막내 투여"는 복막강으로의 투여를 의미한다.
"수막강내 투여"는 척수 및 뇌에 존재하는 뇌척수액으로의 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다.
"정맥내 투여"는 정맥으로의 투여를 의미한다.
"실내 투여"는 뇌 또는 심장의 실로의 투여를 의미한다.
"뉴클레오사이드간 연결"은 뉴클레오사이드 사이의 화학적 결합을 의미한다.
"연수막성"은 뇌 및 척수를 덮는 조직의 2개의 가장 안쪽의 층인 연수막을 갖는 것을 의미한다. "연수막성 아밀로이드증"은 연수막 내의 트랜스티레틴 아밀로이드 침착으로부터 발생하는 연수막의 아밀로이드증을 의미한다.
"연결된 뉴클레오사이드"는 함께 결합되는 인접한 뉴클레오사이드를 의미한다.
"미스매치" 또는 "비-상보성 핵염기"는 제1 핵산의 핵염기가 제2 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 쌍을 형성할 수 없는 경우를 의미한다.
"변형된 뉴클레오사이드간 연결"은 치환 또는 자연 발생 뉴클레오사이드간 결합(즉, 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 결합)으로부터의 임의의 변화를 의미한다.
"변형된 핵염기"는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 타이미딘, 또는 우라실이 아닌 임의의 핵염기를 의미한다. "변형되지 않은 핵염기"는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 타이민(T), 사이토신(C), 및 우라실(U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오타이드"는 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오사이드간 연결, 또는 변형된 핵염기를 독립적으로 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. "변형된 뉴클레오사이드"는 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기를 독립적으로 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오타이드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"변형된 당"은 자연 당으로부터의 치환 또는 변화를 의미한다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내의 화학적으로 다른 영역의 패턴을 의미한다.
"자연 발생 뉴클레오사이드간 연결"은 3' 대 5' 포스포다이에스터 연결을 의미한다.
"자연 당 모이어티"는 DNA(2'-H) 또는 RNA(2'-OH)에서 발견되는 당을 의미한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오타이드로 구성되는 분자를 의미한다. 핵산은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 및 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다. 핵산은 또한 단일 분자 내에 상기 구성요소의 조합을 포함할 수 있다.
"핵염기"는 또 다른 핵산의 염기와 쌍을 이룰 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 연결, 또는 핵염기 변형과 독립적인 연속적 핵염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오사이드"는 당에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"올리고머 화합물" 또는 "올리고머"는 핵산 분자의 적어도 일부 영역에 하이브리드화될 수 있는 연결된 단량체 서브유닛의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 각각이 서로 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 연결된 뉴클레오사이드의 중합체를 의미한다.
"비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들어, 뇌내 투여, 수막강내 투여, 실내 투여, 실 투여, 대뇌실내(intracerebroventricular) 투여, 대뇌 실내 투여 또는 대뇌 실 투여를 포함한다. 투여는 연속, 또는 만성, 또는 단기 또는 간헐적 투여일 수 있다.
"펩타이드"는 아미드 결합에 의해 적어도 2개의 아미노산을 연결시킴으로써 형성된 분자를 의미한다. 펩타이드는 폴리펩타이드 및 단백질을 의미한다.
"약학적 조성물"은 개체에 투여하기에 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 하나 이상의 활성 약학적 작용제 및 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"은 안티센스 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용되는 염, 즉, 모(parent) 올리고뉴클레오타이드의 요망되는 생물학적 활성을 보유하고, 요망되지 않는 독물학적 효과를 제공하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 연결"은, 포스포다이에스터 결합이 비-브릿징 산소 원자 중 하나를 황 원자로 대체시킴으로써 변형된 뉴클레오사이드 사이의 연결을 의미한다. 포스포로티오에이트 연결은 변형된 뉴클레오사이드간 연결이다.
"부분"은 핵산의 연속적(즉, 연결된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. 특정 구체예에서, 부분은 표적 핵산의 연속적 핵염기의 규정된 수이다. 특정 구체예에서, 부분은 안티센스 화합물의 연속적 핵염기의 규정된 수이다.
"예방하다"는 수분으로부터 무기한까지의 기간 동안 질병, 장애, 또는 질환의 발병 또는 발달을 지연시키거나 미리 억제하는 것을 의미한다. 예방은 또한 질병, 장애, 또는 질환이 발달할 위험이 감소된 것을 의미한다.
"프로드러그"는 내인성 효소 또는 다른 화합물 또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 이의 세포 내에서 활성 형태로 전환되는 비활성 형태로 제조되는 치료 작용제를 의미한다.
"부작용"은 요망되는 효과가 아닌 치료에 기인한 생리학적 반응을 의미한다. 특정 구체예에서, 부작용은 주사 부위 반응, 간 기능 시험 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상, 근육병증, 및 권태를 포함한다. 예를 들어, 혈청에서의 증가된 아미노트랜스퍼라제 수준은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 빌리루빈은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다
"단일-가닥 올리고뉴클레오타이드"는 상보적 가닥에 하이브리드화되지 않는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"특이적으로 하이브리드화가능한"은 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이에서 요망되는 효과를 유도하기에 충분한 정도의 상보성을 가지면서, 특정 결합이 요망되는 조건, 즉, 생체내 검정 및 치료적 치료의 경우에 생리학적 조건하에서 비-표적 핵산에 대해 효과가 없거나 최소한의 효과를 나타내는 안티센스 화합물을 의미한다.
"피하 투여"는 피부 바로 밑의 투여를 의미한다.
"표적화시키는" 또는 "표적화된"은 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화되어, 요망되는 효과를 유도하는 안티센스 화합물의 설계 및 선택 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA" 및 "표적 RNA 전사체" 모두는 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 핵산을 의미한다.
"표적 세그먼트"는 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 핵산의 뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 가장 5'의 뉴클레오타이드를 의미한다. "3' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 가장 3'의 뉴클레오타이드를 의미한다.
"치료적 유효량"은 개체에게 치료적 이익을 제공하는 약학적 작용제의 양을 의미한다.
"트랜스티레틴-특이적 억제제" 또는 "트랜스티레틴 억제제"는 트랜스티레틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시킬 수 있는 임의의 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 예는 핵산, 펩타이드, 항체, 또는 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함한다.
"트랜스티레틴 특이적 조정자" 또는 "트랜스티레틴 조정자"는 트랜스티레틴 mRNA 또는 단백질 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 임의의 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 "트랜스티레틴-관련 아밀로이드증" 또는 "트랜스티레틴 아밀로이드증" 또는 "트랜스티레틴 아밀로이드 질병"은 트랜스티레틴-함유 아밀로이드 원섬유의 형성을 발생시키는 트랜스티레틴의 기능이상 또는 조절이상과 관련된 임의의 병상 또는 질병이다. 트랜스티레틴 아밀로이드증은 유전성 TTR 아밀로이드증, 연수막 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증, 가족성 안구연수막(oculoleptomeningeal) 아밀로이드증, 노인성 심장 아밀로이드증, 또는 노인성 전신성 아밀로이드증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"치료하다"는 질병, 장애, 또는 질환의 변화 또는 개선을 달성하기 위해 약학적 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
"변형되지 않은 뉴클레오타이드"는 자연 발생 핵염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오사이드간 연결로 구성되는 뉴클레오타이드를 의미한다. 특정 구체예에서, 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 RNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-리보뉴클레오사이드) 또는 DNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드)이다.
특정 구체예
특정 구체예는 트랜스티레틴 발현을 억제하기 위한 방법, 화합물, 및 조성물을 제공한다.
특정 구체예는 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산은 GENBANK 등록 번호 NM_000371.2(본원에 서열번호 1로 포함됨), 뉴클레오타이드 2009236으로부터 2017289까지 트렁케이션된 GENBANK 등록 번호 NT_010966.10(본원에 서열번호 2로 포함됨); 인간 엑손에 대한 유사성을 기초로 하여 레수스 원숭이 유전체 서열 GENBANK 등록 번호 NW_001105671.1로부터 추출된 엑손 1-4; 및 뉴클레오타이드 628000으로부터 638000까지 트렁케이션된 GENBANK 등록 번호 NW_001105671.1(본원에 서열번호 4로 포함됨)에 기재된 서열 중 임의의 것이다.
특정 구체예는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 25, 80, 86, 및 87에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 8 내지 80개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 50개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예는 20 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 또는 적어도 19개의 연속적 핵염기를 포함한다.
특정 구체예에서, 화합물은 서열번호 80에 열거된 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 SEQ ED NO:1의 누클레오디드 120-139, 212-236, 226-245, 293-468, 293-326, 347-381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 500-519, 501-535, 502-531, 505-524, 507-526, 508-527, 514-540, 514-539, 515-534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 580-608, 580-599, 584-606, 585-604, 587-606, 또는 597-617로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 영역은 서열번호 1의 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 영역은 서열번호 1의 501-535 또는 580-608로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 501-535 또는 580-608로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 영역 내에서 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 인간 트랜스티레틴(TTR)을 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, 서열번호 1의 핵산과 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상보적이다.
특정 구체예는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 핵염기 부분과 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ED NO:1의 뉴클레오타이드 508-527로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 부분과 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속적 핵염기 부분을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 인간 트랜스티레틴(TTR)을 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, 서열번호 1의 핵산과 90%, 95%, 99%, 또는 100% 상보적이다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 60% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 70% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 80% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 90% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 95% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 99% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 및 589-608로부터 선택된 영역 내에서 100% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 60% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 70% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 80% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 90% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 95% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 99% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527 내에서 100% 상보적인 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1: 120-139, 212-236, 226-245, 293-468, 293-326, 347-381, 425-468, 425-467, 452-478, 452-474, 459-478, 461-519, 462-500, 500-519, 502-531, 507-526, 505-524, 508-527, 514-540, 514-539, 515-534, 516-535, 523-542, 544-606, 544-564, 564-583, 578-601, 580-599, 584-606, 585-604, 587-606, 또는 597-617의 뉴클레오타이드 영역을 표적으로 한다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 트랜스티레틴 핵산의 영역을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산의 영역을 표적으로 하는 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 상기 영역의 동등한 길이의 핵염기 부분에 상보적인 연속적 핵염기 부분을 갖는다. 예를 들어, 부분은 본원에 열거된 영역의 동등한 길이의 부분에 상보적인 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적 핵염기 부분일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ED NO:1: 120-139, 212-236, 226-245, 293-381, 293-366, 353-381, 293-468, 425-468, 425-467, 452-476, 461-481, 461-500, 500-519, 461-519, 502-531, 502-539, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-540, 523-542, 544-606, 544-564, 544-583, 또는 597-617의 뉴클레오타이드 영역을 표적으로 한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산의 영역을 표적으로 하는 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1의 영역 501-535 또는 580-608의 동등한 길이의 핵염기 부분에 상보적인 연속적 핵염기 부분을 갖는다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 60%의 억제를 나타낸다: 226-245, 293-366, 357-467, 452-474, 457-476, 459-478, 462-500, 500-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-564, 564-583, 578-601, 584-606, 또는 597-617.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 65%의 억제를 나타낸다: 293-366, 357-376, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 500-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 544-563, 564-583, 578-601, 585-606, 또는 597-617.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 70%의 억제를 나타낸다: 293-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 500-519, 502-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 564-583, 578-598, 581-600, 또는 597-617.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 75%의 억제를 나타낸다: 293-322, 347-366, 425-449, 432-467, 452-474, 459-478, 462-500, 500-519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-539, 578-598, 581-600, 또는 597-616.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 80%의 억제를 나타낸다: 303-322, 425-449, 432-460, 443-467, 452-473, 481-500, 500-519, 503-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539, 579-598, 581-600, 또는 597-616.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 85%의 억제를 나타낸다: 427-449, 432-458, 441-460, 443-467, 452-473, 504-531, 504-536, 505-525, 506-530, 507-527, 508-527, 508-536, 514-536, 519-539, 또는 581-600.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 90%의 억제를 나타낸다: 428-449, 432-456, 439-458, 441-460, 445-466, 452-473, 504-525, 508-527, 또는 515-536.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화되는 경우 서열번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역은 적어도 95%의 억제를 나타낸다: 434-453, 436-456, 441-460, 445-465, 505-524, 또는 516-535.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 60% 억제를 나타낸다: ISIS NO:420954, 420904, 304286, 420874, 420948, 420883, 420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 65% 억제를 나타낸다: ISIS NO:420955, 420952, 420956, 420957, 420882, 420947, 420950, 304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 70% 억제를 나타낸다: ISIS NO:304312, 304307, 420879, 420910, 420902, 420908, 420924, 420877, 420880, 304309, 304289, 420906, 304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 75% 억제를 나타낸다: ISIS NO:420877, 420878, 420880, 304284, 304285, 420884, 420885, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 420899, 420900, 420901, 420902, 420906, 420908, 304296, 420909, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926, 304309, 420949, 420951, 또는 304311.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 80% 억제를 나타낸다: ISIS NO:304311, 420878, 420911, 304284, 304288, 420909, 304296, 420949, 304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 85% 억제를 나타낸다: ISIS NO:304290, 304299, 420898, 420920, 420925, 420951, 304287, 420894, 420916, 420918, 420926, 304285, 420919, 420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887, 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 90% 억제를 나타낸다: ISIS NO:420923, 420886, 420900, 420912, 420915, 420917, 420921, 420884, 420885, 420887. 420889, 420892, 420901, 420914, 420897, 420899, 420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893. 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 하기 안티센스 화합물은 인간 트랜스티레틴을 엔코딩하는 핵산인 서열번호 1의 영역을 표적으로 하며, 트랜스티레틴 mRNA의 적어도 95% 억제를 나타낸다: ISIS NO:420888, 420895, 420896, 420913, 420922, 420893, 420890, 또는 420891.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120-139이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120-139를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 37로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120-139를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420872로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 212-236이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 212-236을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 8 및 38로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 이러한 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 212-236을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420873 또는 304267로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 226-245이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 226-245를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 39로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 이러한 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 226-245를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420874로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-381이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-381을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 10, 42-48로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 이러한 구체예에서, SEQ ED NO:1의 뉴클레오타이드 293-381을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, 또는 420883로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-366이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-366을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 42-45로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 이러한 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-366을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420877, 420878, 420879, 또는 420880으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 353-381이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 353-381을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 10, 46-48로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 353-381을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:304280, 420881, 420882, 또는 420883로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-468이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-468을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 10-18, 42-63으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 293-468을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420877, 420878, 420879, 420880, 304280, 420881, 420882, 420883, 304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 또는 304291로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-468이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-468을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 11-18, 49-63으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-468을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 또는 304291로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-467이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-468을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 11-17, 49-63으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 425-468을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:304284, 304285, 420884, 420885, 304286, 420886, 420887, 420888, 420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 또는 420898로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 452-476이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 452-476을 표적으로 한다. 특정한 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 64-69로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 452-476을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420889, 420890, 420891, 304287, 420892, 304288, 420893, 304289, 304290, 420894, 420895, 420896, 420897, 420898, 304291, 304292, 304293, 420899, 420900, 420901, 420902, 420903, 또는 420904로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-481이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-481을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 72-73으로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-481을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420907 또는 420908로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-500이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-500을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 22, 72 및 73으로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-500을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420907, 420908 또는 304296으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 500-519이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 500-519를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 74로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 500-519를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420909로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-519이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-519를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 22, 23, 72-74로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 461-519를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420907, 420908, 304296, 또는 420909로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-531이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-531을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25, 75-84로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-531을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 또는 420919로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-539이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-539를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25, 26, 75-91로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 502-539를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420910, 420911, 420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 또는 420926으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 504-536이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 504-536을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25, 26, 77-88로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 504-536을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420912, 420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 420922, 또는 420923으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505-535이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505-535를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25, 26, 78-87로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505-535를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 420919, 304300, 420920, 420921, 또는 420922로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 506-530이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 506-530을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25, 79-83으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 506-530을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420913, 420914, 304299, 420915, 420916, 420917, 420918, 또는 420919로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-527이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-527을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 25 또는 80으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 507-527을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:304299 또는 420915로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 80로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420915로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 514-540이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 514-540을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 85-92로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 514-540을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420920, 420921, 420922, 420923, 420924, 420925, 420926, 또는 420927로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 523-542이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 523-542를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 94로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 523-542를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420929로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-606이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-606을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 30-33, 112-122로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-606을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420947, 420948, 304304, 304307, 304308, 304309, 420949, 420950, 420951, 420952, 420953, 420954, 420955, 420956, 또는 420957로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-564이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-564를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 112-113으로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-564를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420947 또는 420948로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-583이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-583을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 30, 31, 112, 및 113으로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 544-583을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:420947, 420948, 304304, 또는 304307로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 597-617이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 597-617을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서열번호 34-35로부터 선택되는 핵염기 서열을 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 597-617을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 ISIS NO:304311 또는 304312로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드로 구성된다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1, 2, 또는 4의 핵염기 서열에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 90% 상보적이다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1, 2, 또는 4의 핵염기 서열에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 상보적이다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 또는 4에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 99% 상보적이다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1, 2, 또는 4의 핵염기 서열에 대해 전체 길이에 걸쳐 100% 상보적이다.
특정 구체예에서, 화합물은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 갖는다. 특정 구체예에서, 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결이다.
특정 구체예에서, 화합물은 변형된 당을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 갖는다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 이환식 당이다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 이환식 당은 4'-CH(CH3)-0-2' 브릿지를 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-0-메톡시에틸을 포함한다.
특정 구체예에서, 화합물은 적어도 하나의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오사이드를 포함하며, 여기서 테트라하이드로피란 고리는 푸라노스 고리를 대체시킨다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오사이드는 하기 구조를 가진다:
Figure pat00001
상기 식에서, Bx는 임의로 보호된 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
특정 구체예에서, 화합물은 변형된 핵염기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신이다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-0-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 6개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 6개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-0-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-0-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-0-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 핵염기 서열은 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속된 핵염기를 포함한다.
특정 구체예에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 (i) 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; (ii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 (iii) 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-0-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 핵염기 서열은 서열번호 80에 열거되어 있다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 조성물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속된 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 조성물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속된 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 점성도 수준은 40 cP 미만이다. 특정 구체예에서, 조성물은 15 cP 미만의 점성도 수준을 갖는다. 특정 구체예에서, 조성물은 12 cP 미만의 점성도 수준을 갖는다. 특정 구체예에서, 조성물은 10 cP 미만의 점성도 수준을 갖는다
특정 구체예는 트랜스트레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예는 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 동물에게 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예는 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 동물에게 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 화합물 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함하며, 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 501-535 또는 580-608로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 부분에 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다.
특정 구체예는 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 동물에게 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예는 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 동물에게 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 화합물 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함하며, 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 508-527로부터 선택된 영역 내의 동등한 길이의 부분에 상보적인 적어도 8개의 연속적 핵염기 부분을 포함한다.
특정 구체예에서, 동물은 인간이다.
특정 구체예에서, 투여는 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증의 진행을 예방하거나, 치료하거나, 개선시키거나, 둔화시킨다.
특정 구체예에서, 화합물은 제2 작용제와 공동 투여된다.
특정 구체예에서, 화합물 및 제2 작용제는 동시 투여된다.
특정 구체예에서, 투여는 비경구 투여이다. 특정 구체예에서, 비경구 투여는 피하 투여이다. 특정 구체예에서, 투여용 제형은 염수 중 화합물이다. 특정 구체예에서, 화합물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122, 및 124에 열거된 핵염기 서열로부터 선택된 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 및 염수를 포함한다. 특정 구체예에서, 제형은 임의의 안정화제 또는 지질 작용제를 포함하는 추가 안정화제를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 투여는 비경구 투여이다. 특정 구체예에서, 비경구 투여는 두개내 투여이다. 특정 구체예에서, 두개내 투여는 뇌내, 수막강내, 실내, 실, 대뇌실내, 대뇌 실내 또는 대뇌 실 투여이다.
특정 구체예는 동물에서 트랜스티레틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 트랜스티레틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구체예에서, 동물은 인간이다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것은 트랜스티레틴 아밀로이드증의 진행을 예방하거나, 치료하거나, 개선시키거나, 둔화시킨다.
특정 구체예는 트랜스티레틴 관련 질병을 갖는 인간을 확인하고, 상기 인간에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 관련 질병을 갖는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 치료는 안절부절증, 조정력 부족, 눈떨림, 강직성 반신마비, 근협조 결핍(lack of musclecoordination), 약화된 시력, 불면증, 비정상적 감각, 근간대경련, 시각상실, 어음 손실(loss of speech), 손목굴증후군, 발작, 거미막밑출혈, 뇌졸중 및 뇌에서의 출혈, 수두증, 실조, 및 강직마비, 혼수, 감각신경병증, 지적이상증(parathesia), 감각저하, 운동신경병증, 자율신경병증, 기립저혈압, 주기적 변비, 주기적 설사, 구역, 구토, 감소된 발한, 발기부전, 지연위배출, 요폐, 요실금, 진행성 심장병증, 피로, 숨참, 체중감소, 식욕부진, 무감각, 저림, 쇠약, 혀가 커짐(enlarged tongue), 콩팥증후군, 울혈심부전, 운동시 호흡곤란, 말초 부종, 부정맥, 두근거림, 현기증(lightheadedness), 실신, 체위저혈압, 말초 신경 문제(peripheral nerve problem), 감각 운동 장애(sensory motor impairment), 하지 신경병증, 상지 신경병증, 통각과민, 변경된 온도 감각, 하지 쇠약(lower extremity weakness), 악액질, 말초 부종, 간비대, 자색반증, 확장기 기능장애, 조기심실수축, 뇌신경병증, 감소된 심건반사(diminished deep tendon reflexes), 유리체 내의 아밀로이드 침착, 유리체혼탁, 건성안, 녹내장, 동공 내의 부채꼴 모양(scalloped appearance), 및 수저류로 인한 발의 종창으로 구성되는 군으로부터 선택된 증상을 감소시킨다. 특정 구체예에서, 증상은 기억 장애, 판단, 및 사고 장애, 계획 장애(impaired planning), 융통성 장애, 추상적 사고 장애, 규칙 습득 장애, 적절한 행동 개시 장애, 부적절한 행동 억제 장애, 단기 기억 장애, 장기 기억 장애, 편집증, 지남력장애, 착란, 환각 및 치매로 구성되는 군으로부터 선택된 인지적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심, 공격, 강박행동, 과민성, 인격 변조, 예를 들어, 기억, 판단 및 사고 장애, 및 자살관념으로 구성되는 군으로부터 선택되는 정신의학적 증상이다.
추가 구체예는 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 심장 아밀로이드증을 발생시키는 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병을 갖는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 치료는 울혈심부전, 심장비대, 운동시 호흡곤란, 말초 부종, 부정맥, 두근거림, 현기증, 실신, 중증 체위저혈압을 발생시킬 수 있는 말초 혈관구조의 내피밑층에서의 침착, 확장기 기능장애, 심장차단, 조기심실수축, 및 다양한 빠른부정맥으로 구성되는 군으로부터 선택된 증상을 감소시킨다.
추가 구체예는 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 말초 신경병증 장애를 발생시키는 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병을 갖는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 치료는 말초 신경 문제, 감각 운동 장애, 하지 신경병증, 상지 신경병증, 통각과민, 변경된 온도 감각, 하지 쇠약, 동통, 종종 성적 또는 소변 기능장애로 종종 나타나는 자율신경 기능장애, 대칭 감각 장애 및 쇠약, 기립저혈압, 설사, 및/또는 발기부전으로 구성되는 군으로부터 선택된 증상을 감소시킨다.
추가 구체예는 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 조성물을 위장 장애를 발생시키는 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병을 갖는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 치료는 설사, 변비, 구역, 구토, 및 관련 신장 및 간 장애로 구성되는 군으로부터 선택된 증상을 감소시킨다.
치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 인간에게 투여함으로써 트랜스티레틴 아밀로이드증을 감소시키거나 예방하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 감소시키거나 예방하는 방법이 추가로 제공된다.
치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 인간에게 투여함으로써 심장 질병을 감소시키거나 예방하는 것을 포함하는, 심장 질병을 감소시키거나 예방하는 방법이 추가로 제공된다. 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 인간에게 투여함으로써 신경병증 질병을 감소시키거나 예방하는 것을 포함하는, 신경병증 질병을 감소시키거나 예방하는 방법이 추가로 제공된다. 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 인간에게 투여함으로써 위장 질병을 감소시키거나 예방하는 것을 포함하는, 위장 질병을 감소시키거나 예방하는 방법이 추가로 제공된다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시키는 것을 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시키는 방법이 추가로 제공되며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 또는 4에 특이적으로 하이브리드화됨으로써, 상기 인간에서 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시킨다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 증상의 진행 속도를 감소시키는 것을 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 증상의 진행 속도를 감소시키는 방법이 추가로 제공되며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 또는 4에 특이적으로 하이브리드화됨으로써, 상기 인간에서 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상의 진행 속도를 감소시킨다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 증상에 의해 나타나는 변성을 역전시키는 것을 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 증상에 의해 나타나는 변성을 역전시키는 방법이 추가로 제공되며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 또는 4에 특이적으로 하이브리드화됨으로써, 상기 인간에서 트랜스티레틴 아밀로이드 질병의 증상에 의해 나타나는 변성을 역전시킨다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시키는 것을 필요로 하는 인간에게 투여함으로써, 상기 인간에서 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시키는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 증상을 개선시키는 방법이 추가로 제공된다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 80에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하는 것을 필요로 하는 인간에게 투여함으로써, 상기 인간에서 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하는 것을 포함하는, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 갖는 인간을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.
특정 구체예에서, 증상은 신체적, 인지적, 정신의학적, 또는 말초적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 안절부절증, 조정력 부족, 눈떨림, 강직성 반신마비, 근협조 결핍, 약화된 시력, 불면증, 비정상적 감각, 근간대경련, 시각상실, 어음 손실, 손목굴증후군, 발작, 거미막밑출혈, 뇌졸중 및 뇌에서의 출혈, 수두증, 실조, 및 강직마비, 혼수, 감각신경병증, 지적이상증, 감각저하, 운동신경병증, 자율신경병증, 기립저혈압, 주기적 변비, 주기적 설사, 구역, 구토, 감소된 발한, 발기부전, 지연위배출, 요폐, 요실금, 진행성 심장병증, 피로, 숨참, 체중감소, 식욕부진, 무감각, 저림, 쇠약, 혀가 커짐, 콩팥증후군, 울혈심부전, 운동시 호흡곤란, 말초 부종, 부정맥, 두근거림, 현기증, 실신, 체위저혈압, 말초 신경 문제, 감각 운동 장애, 하지 신경병증, 상지 신경병증, 통각과민, 변경된 온도 감각, 하지 쇠약, 악액질, 말초 부종, 간비대, 자색반증, 확장기 기능장애, 조기심실수축, 뇌신경병증, 감소된 심건반사, 유리체 내의 아밀로이드 침착, 유리체혼탁, 건성안, 녹내장, 동공 내의 부채꼴 모양, 및 수저류로 인한 발의 종창으로 구성되는 군으로부터 선택된 신체적 증상이다.
특정 구체예에서, 증상은 기억 장애, 판단, 및 사고 장애, 계획 장애, 융통성 장애, 추상적 사고 장애, 규칙 습득 장애, 적절한 행동 개시 장애, 부적절한 행동 억제 장애, 단기 기억 장애, 장기 기억 장애, 편집증, 지남력장애, 착란, 환각 및 치매로 구성되는 군으로부터 선택된 인지적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심, 공격, 강박행동, 과민성, 인격 변조, 예를 들어, 기억, 판단 및 사고 장애, 및 자살관념으로 구성되는 군으로부터 선택되는 정신의학적 증상이다.
특정 구체예에서, 증상은 적어도 하나의 신체적 증상, 적어도 하나의 인지적 증상, 적어도 하나의 정신의학적 증상, 및 적어도 하나의 말초적 증상 중 적어도 하나이다.
특정 구체예에서, 신체적 증상은 안절부절증, 조정력 부족, 의도치 않게 개시되는 운동(unintentionally initiated motions), 의도치 않게 완료되지 않는 운동(unintentionally uncompleted motions), 불완전 보행, 무도병, 경축, 꼬임 운동(writhing motion), 비정상적 자세, 불안정, 비정상적 안면 표정, 씹기 어려움(difficulty chewing), 삼키기 어려움(difficulty swallowing), 대화의 어려움(difficulty speaking), 발작, 및 수면 장애로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 인지적 증상은 기억 장애, 판단, 및 사고 장애, 계획 장애, 융통성 장애, 추상적 사고 장애, 규칙 습득 장애, 적절한 행동 개시 장애, 부적절한 행동 억제 장애, 단기 기억 장애, 장기 기억 장애, 편집증, 지남력장애, 착란, 환각 및 치매로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 정신의학적 증상은 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심, 공격, 강박행동, 과민성, 인격 변조, 예를 들어, 기억, 판단 및 사고 장애, 및 자살관념으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 말초적 증상은 감소된 뇌 질량, 근위축, 심부전, 내당력장애(impaired glucose tolerance), 체중 감소, 골다공증, 및 고환위축으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
중추신경계 관련 질병의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 약제의 제조를 위한 방법 및 화합물이 또한 제공된다.
특정 구체예는 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 추가 작용제 또는 요법제와의 조합 요법에 의해 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 제공한다. 작용제 또는 요법제는 공동 투여되거나 동시 투여될 수 있다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 추가 작용제 또는 요법제와의 조합 요법에 의해 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 작용제 또는 요법제는 공동 투여되거나 동시 투여될 수 있다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 추가 작용제 또는 요법제가 이후에 투여되는 환자에서 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 키트를 제공하며, 이러한 키트는 하기를 포함한다:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 화합물; 및 대안적으로,
(ii) 본원에 기재된 바와 같은 추가 작용제 또는 요법제.
본원에 기재된 바와 같은 키트는 본원에 기재된 바와 같은 조합 요법에 의해 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴 아밀로이드증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 키트를 이용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
안티센스 화합물
올리고머 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 모방체(mimetics), 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 siRNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대해 "안티센스"일 수 있으며, 이는 수소결합을 통해 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은, 5'에서 3' 방향으로 기재하는 경우 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정한 상기 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3' 방향으로 기재하는 경우 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 12 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 즉, 안티센스 화합물은 12 내지 30개의 연결된 핵염기이다. 다른 구체예에서, 안티센스 화합물은 8 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30, 15 내지 30, 18 내지 24, 18 내지 21, 19 내지 22, 또는 20개의 연결된 핵염기로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 상기 구체예에서, 안티센스 화합물은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개의 연결된 핵염기 길이, 또는 상기 값 중 임의의 2개 값에 의해 규정되는 범위로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 길이가 감소되거나 트렁케이션된 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 길이가 감소되거나 트렁케이션된 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단(5' 트렁케이션), 또는 대안적으로 3' 말단(3' 트렁케이션)으로부터 결실된 단일 뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 길이가 감소되거나 트렁케이션된 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 결실된 2개의 뉴클레오사이드를 가질 수 있거나, 대안적으로, 3' 말단으로부터 결실된 2개의 서브유닛을 가질 수 있다. 대안적으로, 결실된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 5' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오사이드 및 3' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오사이드를 갖는 안티센스 화합물에서 변형된 올리고뉴클레오타이드 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다.
단일한 추가 뉴클레오사이드가 길이가 증가된 올리고뉴클레오타이드에 존재하는 경우, 추가 뉴클레오사이드는 올리고뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단에 위치될 수 있다. 2개 이상의 추가 뉴클레오사이드가 존재하는 경우, 추가된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단(5' 첨가) 또는 대안적으로 3' 말단(3' 첨가)에 첨가된 2개의 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드에서 서로 인접하여 있을 수 있다. 대안적으로, 추가된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 5' 말단에 추가된 하나의 뉴클레오사이드 및 3' 말단에 추가된 하나의 서브유닛을 갖는 올리고뉴클레오타이드에서 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다.
안티센스 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이를 증가시키거나 감소시키고/시키거나, 활성을 제거함이 없이 미스매치 염기를 도입시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌[Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)]에서, 일련의 13-25개의 핵염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 난모세포 주사 모델에서 표적 RNA의 분해를 유도하는 능력에 대해 시험되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 말단 근처에 8 또는 11개의 미스매치 염기를 갖는 25개 핵염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 미스매치를 함유하지 않은 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 덜한 정도이긴 하지만 표적 mRNA의 특이적 분해를 유도할 수 있었다. 유사하게, 1 또는 3개의 미스매치를 갖는 것을 포함하는 13개 핵염기의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표적 특이적 분해가 달성되었다.
문헌[Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)]에서 시험관내 및 생체내에서 bcl-2 및 bcl-xL 둘 모두의 발현을 감소시키는, bcl-2 mRNA에 대해 100% 상보성을 갖고, bcl-xL mRNA에 대해 3개의 미스매치를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 능력이 입증되었다. 더욱이, 상기 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 효능있는 항종양 활성을 나타내었다.
문헌[Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988)]에서는 토끼 그물적혈구 검정에서 인간 DHFR의 번역을 억제시키는 능력에 대해 일련의 탠덤 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 탠덤 안티센스 올리고뉴클레오타이드 2 또는 3개의 서열로 구성되는 28 및 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 각각 시험하였다. 상기 3개의 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 각각은 단독으로, 28 또는 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 비해 보다 약한 수준이긴 하지만 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 패턴으로 배열된 화학적으로 변형된 서브유닛, 또는 안티센스 화합물 특성, 예를 들어, 향상된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성, 또는 생체내 누클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 부여하는 모티프를 갖는다.
키메라 안티센스 화합물은 전형적으로 누클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 키메라 안티센스 화합물의 두번째 영역은 임의로 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 분해하는 세포 엔도누클레아제 RNase H에 대한 기질로 작용할 수 있다.
갭머 모티프를 갖는 안티센스 화합물은 키메라 안티센스 화합물로 간주된다. 갭머에서, RNaseH 분해를 뒷받침하는 다수의 뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드를 갖는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드와 화학적으로 다른 다수의 뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드를 갖는 외부 영역 사이에 위치된다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 갭 세그먼트는 일반적으로 엔도누클레아제 분해에 대한 기질로 작용하는 반면, 윙 세그먼트는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 갭머의 영역은 각각의 별개의 영역을 포함하는 당 모이어티의 유형에 의해 구별된다. 갭머의 영역을 구별하는데 사용되는 당 모이어티의 유형은 일부 구체예에서 β-D-리보뉴클레오사이드, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드, 2'-변형된 뉴클레오사이드(이러한 2'-변형된 뉴클레오사이드는 특히 2'-MOE, 및 2'-0-CH3를 포함할 수 있음), 및 이환식 당 변형 뉴클레오사이드(이러한 이환식 당 변형 뉴클레오사이드는 4'-(CH2)n-0-2' 브릿지를 갖는 것을 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 또는 2임)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 별개의 영역은 균일한 당 모이어티를 포함한다. 윙-갭-윙 모티프는 종종 "X-Y-Z"로 기재되며, 여기서 "X"는 5' 윙 영역의 길이이고, "Y"는 갭 영역의 길이이고, "Z"는 3' 윙 영역의 길이이다. 본원에서 사용되는 "X-Y-Z"로 기재된 갭머는 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트 및 3' 윙 세그먼트 각각에 매우 인접하여 위치되는 형태를 갖는다. 따라서, 5' 윙 세그먼트와 갭 세그먼트 사이 또는 갭 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에는 개재 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다. 본원에 기재된 안티센스 화합물 중 어느 것도 갭머 모티프를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, X 및 Z는 동일하고, 다른 구체예에서, 이들은 상이하다. 한 바람직한 구체예에서, Y는 8 내지 15개의 뉴클레오타이드이다. X, Y 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 또는 이 초과의 뉴클레오타이드 중 임의의 것일 수 있다. 따라서, 갭머는, 예를 들어, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6 또는 5-8-5를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, "윙머(wingmer)" 모티프로서의 안티센스 화합물은 갭머 형태에 대해 상기 기재된 바와 같이 윙-갭 또는 갭-윙 형태, 즉, X-Y 또는 Y-Z 형태를 갖는다. 따라서, 윙머 형태는, 예를 들어, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 또는 5-13을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 5-10-5 갭머 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 6-8-6 갭머 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 5-8-5 갭머 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 갭이 넓은(gap-widened) 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 갭이 넓은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5개의 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드의 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되는 10개의 2'-데옥시리보뉴클레오타이드의 갭 세그먼트를 갖는다. 특정 구체예에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 갭이 넓은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5개의 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드의 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되는 8개의 2'-데옥시리보뉴클레오타이드의 갭 세그먼트를 갖는다. 특정 구체예에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 갭이 넓은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 6개의 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드의 윙 세그먼트 사이에서 이에 매우 인접하여 위치되는 8개의 2'-데옥시리보뉴클레오타이드의 갭 세그먼트를 갖는다. 특정 구체예에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오타이드 서열
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산은 2008년 2월 13일에 GENBANK(등록상표)에 처음 수탁된 GENBANK 등록 번호 NM_000371.2(본원에서 서열번호 1로 포함됨), 2002년 8월 1일에 GENBANK(등록상표)에 처음 수탁된, 뉴클레오타이드 2009236으로부터 2017289까지 트렁케이션된 GENBANK 등록 번호 NT_010966.10(본원에서 서열번호 2로 포함됨); 인간 엑손에 대한 유사성을 기초로 한, 레수스 원숭이 유전체 서열 GENBANK 등록 번호 NW_001105671.1로부터 추출된 엑손 1-4; 및 2006년 3월 28일에 GENBANK(등록상표)에 처음 수탁된 뉴클레오타이드 628000으로부터 638000까지 트렁케이션된 GENBANK 등록 번호 NW_001105671.1(본원에 서열번호 4로 포함됨)에 기재된 서열 중 임의의 것이다.
본원에 포함된 실시예에서의 각각의 서열번호에 기재된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오사이드간 연결, 또는 핵염기에 대한 임의의 변형에 대해 독립적임이 이해된다. 이와 같이, 서열번호에 의해 규정된 안티센스 화합물은 당 모이어티, 뉴클레오사이드간 연결, 또는 핵염기에 대한 하나 이상의 변형을 독립적으로 포함할 수 있다. ISIS 번호(Isis No) 또는 ISIS NO에 의해 기재된 안티센스 화합물은 핵염기 서열과 모티프의 조합물을 나타낸다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 규정된 영역이다. 예를 들어, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손 인트론 접합부, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종료 영역, 또는 다른 규정된 핵산 영역을 포함할 수 있다. 트랜스티레틴의 구조적으로 규정된 영역은 NCBI와 같은 서열 데이터베이스로부터의 등록 번호에 의해 수득될 수 있고, 이러한 정보는 본원에 참조로서 포함된다. 특정 구체예에서, 표적 영역은 표적 영역 내의 하나의 표적 세그먼트의 5' 표적 부위로부터 표적 영역 내의 또 다른 표적 세그먼트의 3' 표적 부위까지의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 안티센스 화합물이 하이브리드화되어 요망되는 효과가 발생하는 적어도 하나의 표적 세그먼트의 결정을 포함한다. 특정 구체예에서, 요망되는 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소이다. 특정 구체예에서, 요망되는 효과는 표적 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질 수준의 감소 또는 표적 핵산과 관련된 표현형 변화이다.
표적 영역은 하나 이상의 표적 세그먼트를 함유할 수 있다. 표적 영역 내의 다수의 표적 세그먼트는 중첩될 수 있다. 대안적으로, 이들은 중첩되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 약 300개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 표적 핵산 상의 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개, 약 250, 약 200, 약 150, 약 100, 약 90, 약 80, 약 70, 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 또는 약 10개, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개 이하, 약 250, 약 200, 약 150, 약 100, 약 90, 약 80, 약 70, 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 또는 약 10개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 상기 값 중 임의의 2개 값에 의해 규정되는 범위의 다수의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 표적 핵산 상의 5개, 5개 이하 또는 약 5개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 세그먼트는 연속적이다. 본원에 나열된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위 중 임의의 것인 시작 핵산을 갖는 범위에 의해 규정되는 표적 영역이 고려된다.
5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손, 또는 엑손/인트론 접합부 내에 적합한 표적 세그먼트가 발견될 수 있다. 시작 코돈 또는 정지 코돈을 함유하는 표적 세그먼트가 또한 적합한 표적 세그먼트이다. 적합한 표적 세그먼트는 특히 시작 코돈 또는 정지 코돈과 같은 특정한 구조적으로 규정된 영역을 배제한다.
적합한 표적 세그먼트의 결정은 유전체 전체에 걸친 다른 서열에 대한 표적 핵산 서열의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들어, BLAST 알고리즘은 다양한 핵산 사이에서 유사성 영역을 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산이 아닌 서열(즉, 비-표적 또는 탈-표적(off-target) 서열)에 대해 비특이적 방식으로 하이브리드화될 수 있는 안티센스 화합물 서열의 선택을 방지할 수 있다.
활성 표적 영역 내에서 안티센스 화합물의 활성의 변화(예를 들어, 표적 핵산 수준의 감소 퍼센트로 규정됨)가 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 mRNA 수준의 감소는 트랜스티레틴 발현의 억제를 나타낸다. 트랜스티레틴 단백질 수준의 감소는 또한 표적 mRNA 발현의 억제를 나타낸다. 추가로, 표현형 변화는 트랜스티레틴 발현의 억제를 나타낸다. 예를 들어, 다른 표현형 변화 중에서도 뇌 크기의 정상으로의 증가, 운동 협조(motor coordination)에서의 개선, 지속적인 근연축(근육긴장이상증)의 감소, 과민성 및/또는 불안의 감소, 기억 개선, 또는 에너지 증가가 검정될 수 있다. 다른 표현형 표시, 예를 들어, 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 증상이 하기 기재되는 바와 같이 평가될 수 있다.
하이브리드화
일부 구체예에서, 본원에 개시된 안티센스 화합물과 트랜스티레틴 핵산 사이에 하이브리드화가 발생한다. 가장 일반적인 하이브리드화 메커니즘은 핵산 분자의 상보적 핵염기 사이의 수소결합(예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴(reversed Hoogsteen) 수소결합)을 포함한다.
하이브리드화는 다양한 조건하에서 발생할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 하이브리드화되는 핵산 분자의 특성 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화될 수 있는지의 여부를 결정하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 안티센스 화합물은 트랜스티레틴 핵산과 특이적으로 하이브리드화 가능하다.
상보성
안티센스 화합물 및 표적 핵산은, 안티센스 화합물의 핵염기의 충분한 수가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소결합되는 경우에 서로 상보적이며, 요망되는 효과(예를 들어, 표적 핵산, 예를 들어, 트랜스티레틴 핵산의 안티센스 억제)가 발생할 것이다.
안티센스 화합물은 개재 또는 인접 세그먼트가 하이브리드화 사건에 관여하지 않도록 트랜스티레틴 핵산의 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐 하이브리드화될 수 있다(예를 들어, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조).
특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물, 또는 이의 특정 부분은 트랜스티레틴 핵산, 표적 영역, 표적 세그먼트, 또는 이의 특정 부분에 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적이다. 안티센스 화합물과 표적 핵산의 상보성 퍼센트는 통상적인 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 안티센스 화합물의 20개의 핵염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이고, 따라서 특이적으로 하이브리드화되는 안티센스 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낸다. 이러한 예에서, 나머지 비상보적 핵염기는 밀집되어 있거나, 상보성 핵염기에 산재되어 있을 수 있고, 서로 또는 상보성 핵염기에 대해 연속적일 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전한 상보성의 2개의 영역에 플랭킹되어 있는 4개의 비상보성 핵염기를 갖는 18개 핵염기 길이의 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8%의 전체 상보성을 가질 것이고, 이에 따라 본 발명의 범위에 포함될 것이다. 안티센스 화합물과 표적 핵산 영역의 상보성 퍼센트는 당 분야에 공지된 BLAST 프로그램(기본적 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656)을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 상동성, 서열 동일성 또는 상보성 퍼센트는 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman)의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)을 이용하는 디폴트 설정을 이용하여, 예를 들어, 갭 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물 또는 이의 특정 부분은 표적 핵산 또는 이의 특정된 부분에 완전히 상보적(즉, 100% 상보적)이다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 트랜스티레틴 핵산, 또는 표적 영역, 또는 표적 세그먼트 또는 이의 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "완전히 상보적"은 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확힌 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 20개 핵염기의 안티센스 화합물은 안티센스 화합물과 완전히 상보적인 표적 핵산의 상응하는 20개의 핵염기 부분이 존재하는 한 400개 핵염기 길이인 표적 서열에 완전히 상보적이다. 완전한 상보성은 또한 첫번째 및/또는 두번째 핵산의 특정 부분에 관하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 30개의 핵염기의 안티센스 화합물의 20개 핵염기 부분은 400개 핵염기 길이인 표적 서열에 "완전히 상보적"일 수 있다. 30개 핵염기 올리고뉴클레오타이드의 20개 핵염기 부분은, 표적 서열이 상응하는 20개 핵염기 부분을 가지고, 여기서 각각의 핵염기가 안티센스 화합물의 20개 핵염기 부분에 상보적인 경우에 표적 서열에 완전히 상보적이다. 동시에, 전체 30개 핵염기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 나머지 10개 핵염기가 또한 표적 서열에 상보적인지의 여부에 따라 표적 서열에 완전히 상보적이거나, 완전히 상보적이지 않을 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단일 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 존재할 수 있다. 2개 이상의 비-상보적 핵염기가 존재하는 경우, 이들은 연속적(즉, 연결됨)이거나 비-연속적일 수 있다. 일 구체예에서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 윙 세그먼트에 위치된다.
특정 구체예에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개, 또는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이하의 핵염기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예를 들어, 트랜스티레틴 핵산, 또는 이의 특정 부분에 비해 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
특정 구체예에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개, 또는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 이하의 핵염기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예를 들어, 트랜스티레틴 핵산, 또는 이의 특정 부분에 비해 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한 표적 핵산의 부분에 상보적인 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 "부분"은 표적 핵산의 영역 또는 세그먼트 내의 연속적(즉, 연결된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. "부분"은 또한 안티센스 화합물의 연속적 핵염기의 규정된 수를 의미할 수 있다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 8개의 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 12개의 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 15개의 핵염기 부분에 상보적이다. 표적 세그먼트의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 이 초과의 핵염기 부분, 또는 상기 값 중 임의의 2개 값에 의해 규정되는 범위에 상보적인 안티센스 화합물이 또한 고려된다.
동일성
본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한 특정 ISIS 번호로 표시되는 특정 뉴클레오타이드 서열, 서열번호, 또는 화합물, 또는 이의 일부에 대해 규정된 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 안티센스 화합물은, 동일한 핵염기 쌍형성 능력을 갖는 경우 본원에 개시된 서열에 대해 동일하다. 예를 들어, 개시된 DNA 서열에서 타이민 대신에 우라실을 함유하는 RNA는 DNA 서열과 동일한 것으로 간주될 것인데, 이는 우라실 및 타이민 둘 모두가 아데닌과 쌍을 형성하기 때문이다. 본원에 기재된 안티센스 화합물의 길이가 감소되거나 증가된 형태뿐만 아니라 본원에 제공된 안티센스 화합물에 비해 동일하지 않은 염기를 갖는 화합물이 또한 고려된다. 동일하지 않은 염기는 서로 인접하여 있을 수 있거나, 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 산재되어 있을 수 있다. 안티센스 화합물의 동일성 퍼센트는 비교되는 서열에 비한 동일한 염기쌍 형성을 갖는 염기의 수에 따라 결정된다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 이의 일부는 본원에 개시된 안티센스 화합물 또는 서열번호, 또는 이의 일부 중 하나 이상과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
변형
뉴클레오사이드는 염기-당 조합물이다. 뉴클레오사이드의 핵염기(염기로도 공지됨) 부분은 일반적으로 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오사이드에 대해, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 선형 중합 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 서로 인접한 뉴클레오사이드의 공유 연결을 통해 형성된다. 올리고뉴클레오타이드 구조 내에서, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 연결을 형성시키는 것으로 통상적으로 언급된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오사이드간 연결, 당 모이어티, 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변경을 포함한다. 변형된 안티센스 화합물이 종종 자연 형태에 비해 선호되는데, 이는, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 향상된 핵산 표적에 대한 친화성, 누클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성과 같은 요망되는 특성 때문이다.
표적 핵산에 대한 길이가 감소되거나 트렁케이션된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합 능력을 증가시키기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드가 또한 이용될 수 있다. 결과적으로, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드를 갖는 보다 짧은 안티센스 화합물로 요망되는 결과가 종종 수득될 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드간 연결
RNA 및 DNA의 자연 발생 뉴클레오사이드간 연결은 3' 대 5' 포스포다이에스터 연결이다. 자연 발생 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 안티센스 화합물에 비해 하나 이상의 변형된, 즉, 비-자연 발생 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 안티센스 화합물이 종종 선택되는데, 이는, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 향상된 표적 핵산에 대한 친화성, 및 누클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성과 같은 요망되는 특성 때문이다.
변형된 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 보유한 뉴클레오사이드간 연결뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 대표적인 인 함유 뉴클레오사이드간 연결은 포스포다이에스터, 포스포트라이에스터, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로티오에이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인-함유 및 비-인-함유 연결의 제조 방법은 널리 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티에이트 연결이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티에이트 뉴클레오사이드간 연결이다.
변형된 당 모이어티
본 발명의 안티센스 화합물은 임의로 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오사이드를 임의로 함유할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오사이드는 향상된 누클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성, 또는 안티센스 화합물에 대한 일부 다른 이로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 뉴클레오사이드는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는, 비제한적인 예로, 치환된 기(5' 및 2' 치환된 기를 포함함)의 첨가, 이환식 핵산(BNA)을 형성하는 비-제미널 고리 원자의 브릿징, 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R2)(R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임)로의 대체, 및 이의 조합을 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오사이드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오사이드에 대해 8/21/08에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157호 참조) 또는 2'-위치에 추가 치환을 갖는 리보실 고리 산소 원자의 S로의 대체(2005년 6월 16일에 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923호 참조) 또는 대안적으로 BNA의 5' 치환(11/22/07에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181호 참조, 여기서 LNA가, 예를 들어, 5'-메틸 또는 5'-비닐기로 치환됨)을 포함한다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드의 예는, 비제한적인 예로, 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-0CH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함한다. 2' 위치에서의 치환기는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, 0(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), 및 0-CH2-C(=0)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)으로부터 선택될 수 있고, 상기 식에서, 각각의 R1, Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다.
본원에서 사용되는 "이환식 뉴클레오사이드"는 이환식 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오사이드를 의미한다. 이환식 뉴클레오사이드의 예는, 비제한적인 예로, 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 4' 대 2' 브릿지를 포함하는 하나 이상의 이환식 뉴클레오사이드를 포함한다. 상기 4' 대 2' 브릿징된 이환식 뉴클레오사이드의 예는 하기 화학식 중 하나를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 4'-(CH2)-0-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-0-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-0-2' 및 4'-CH(CH20CH3)-0-2'(및 이의 유사체, 2008년 7월 15일에 발행된 미국 특허 제7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-0-2'(및 이의 유사체, 2009년 1월 8일에 공개된 국제 출원 WO/2009/006478호 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체, 2008년 12월 11일에 공개된 국제 출원 WO/2008/150729호 참조); 4'-CH2-0-N(CH3)-2'(2004년 9월 2일에 공개된 미국 특허 출원 US2004-0171570호 참조); 4'-CH2-N(R)-0-2'(여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임)(2008년 9월 23일에 발행된 미국 특허 7,427,672호 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2'(및 이의 유사체, 2008년 12월 8일에 공개된 국제 출원 WO 2008/154401호 참조).
이환식 뉴클레오사이드와 관련된 추가 레포트는 또한 공개된 문헌에서 발견될 수 있다(예를 들어, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumaret al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr.Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr.Opinion Mol Ther., 2001, 3, 239-243; 미국 특허 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제7,034,133호; 제7,053,207호; 제7,399,845호; 제7,547,684호; 및 제7,696,345호; 미국 특허 출원 공개 공보 제US2008-0039618; US2009-0012281; 미국 특허 출원 제60/989,574호; 제61/026,995호; 제61/026,998호; 제61/056,564호; 제61/086,231호; 제61/097,787; 및 제61/099,844호; 국제 특허 출원 공개 WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; 및 WO 2009/006478 참조). 예를 들어, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학 당 형태를 갖는 전술한 이환식 뉴클레오사이드 각각이 제조될 수 있다(WO 99/14226으로서 1999년 3월 25일에 공개된 PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393 참조).
특정 구체예에서, BNA 뉴클레오사이드의 이환식 당 모이어티는 펜토푸라노실 당 모이어티의 4'와 2' 위치 사이에 적어도 하나의 브릿지를 갖는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 브릿지는 독립적으로 -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=0)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -0-, -Si(Ra)2-, -S(=0)x-, 및 -N(Ra)-로부터 선택된 1 또는 2 내지 4개의 연결된 기를 독립적으로 포함하고;
상기 식에서,
x는 0, 1, 또는 2이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=0)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=0)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고;
각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=0)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
특정 구체예에서, 이환식 당 모이어티의 브릿지는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-0-, -C(RaRb)-N(R)-0- 또는 -C(RaRb)-0-N(R)-이다. 특정 구체예에서, 브릿지는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-0-2', 4'-(CH2)2-0-2', 4'-CH2-0-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-0-2'-이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예에서, 이환식 뉴클레오사이드는 이성질체 형태에 의해 추가로 규정된다. 예를 들어, 4'-2' 메틸렌-옥시 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드는 α-L 형태 또는 β-D 형태로 존재할 수 있다. 전에는, α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-0-2') BNA는 안티센스 활성을 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 통합되었다(Frieden et al., NucleicAcids Research, 2003, 21, 6365-6372).
특정 구체예에서, 이환식 뉴클레오사이드는 하기 도시되는 바와 같은 (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-0-2') BNA , (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-0-2') BNA, (C) 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-0-2') BNA, (D) 아미노옥시(4'-CH2-0-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-0-2') BNA, 및 (F) 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)-0-2') BNA, (G) 메틸렌-티오(4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카보사이클릭(4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, 및 (J) 프로필렌 카보사이클릭 (4'-(CH2)3-2') BNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며;
Figure pat00002
상기 식에서, Bx는 염기 모이어티이고, R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅰ을 갖는 이환식 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00003
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
-Qa-Qb-Qc-는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-0- 또는 -N(Rc)-0-CH2이고;
Rc는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅱ를 갖는 이환식 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00004
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이고;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오이다.
일 구체예에서, 치환된 기 각각은 독립적으로 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, 및 NJeC(=X)NJcJd로부터 독립적으로 선택된 치환기로 일치환되거나 다치환되고, 여기서 각각의 Jc, Jd 및 Je는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJc이다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅲ를 갖는 이환식 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00005
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이고;
Zb는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 치환된 아실 (C(=0)-)이다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅳ를 갖는 이환식 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00006
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이고;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
각각의 qa, qb, qc 및 qd는 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅴ를 갖는 이환식 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00007
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이고;
qa, qb, qe 및 qf는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, S02Jj, NJjJk, N3, CN, C(=0)OJj, C(=0)NJjJk, C(=0)Jj, 0-C(=0)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=0)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
또는 qe 및 qf는 함께 =C(qg)(qh)이고;
qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
올리고머화와 함께 메틸렌옥시(4'-CH2-0-2') BNA 단량체 아데닌, 사이토신, 구아닌, 5-메틸-사이토신, 타이민 및 우라실의 합성 및 제조, 및 핵산 인지 특성이 기재되어 있다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA 및 이의 제조가 또한 WO 98/39352호 및 WO 99/14226호에 기재되어 있다.
메틸렌옥시(4'-CH2-0-2') BNA 및 2'-티오-BNA의 유사체가 또한 제조되었다(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 중합효소에 대한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오사이드 듀플렉스(duplex)를 포함하는 잠김(locked) 뉴클레오사이드 유사체의 제조가 또한 기재되어 있다(Wengel et al., WO 99/14226). 더욱이, 신규한 형태적으로 제한된 고친화성 올리고뉴클레오타이드 유사체인 2'-아미노-BNA의 합성이 당 분야에 기재되어 있다(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥을 갖는 이의 듀플렉스의 열 안정성이 이전에 보고되었다.
특정 구체예에서, 하기 화학식 Ⅵ을 갖는 뉴클레오사이드가 제공되며:
Figure pat00008
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매체에 대한 공유 부착이고;
각각의 qi, qj, qk 및 ql은 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, S02Jj, NJjJk, N3, CN, C(=0)OJj, C(=0)NJjJk, C(=0)Jj, 0-C(=0)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=0)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
qi 및 qj 또는 ql 및 qk는 함께 =C(qg)(qh)이고, 여기서 qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 브릿지 및 알케닐 유사체 브릿지 4-CH=CH-CH2-2'를 갖는 하나의 카보사이클릭 이환식 뉴클레오사이드가 기재되어 있다(Freier et al., NucleicAcids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). 올리고머화와 함께 카보사이클릭 이환식 뉴클레오사이드의 합성 및 제조 및 생화학 연구가 또한 기재되어 있다(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
본원에서 사용되는 "4'-2' 이환식 뉴클레오사이드" 또는 "4' 대 2' 이환식 뉴클레오사이드"는 당 고리의 2' 탄소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 푸라노스 고리의 2개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지를 포함하는 푸라노스 고리를 포함하는 이환식 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 "단환식 뉴클레오사이드"는 이환식 당 모이어티가 아닌 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 특정 구체예에서, 뉴클레오사이드의 당 모이어티, 또는 당 모이어티 유사체는 임의의 위치에서 변형되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "2'-변형된 당"은 2' 위치에서 변형된 푸라노실 당을 의미한다. 특정 구체예에서, 상기 변형은 치환 및 비치환된 알콕시, 치환 및 비치환된 티오알킬, 치환 및 비치환된 아미노 알킬, 치환 및 비치환된 알킬, 치환 및 비치환된 알릴, 및 치환 및 비치환된 알키닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 할라이드로부터 선택된 치환기를 포함한다. 특정 구체예에서, 2' 변형은 0[(CH2)n0]mCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nF, 0(CH2)nONH2, OCH2C(=0)N(H)CH3, 및 0(CH2)nON[(CH2)nCH3]2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 치환기로부터 선택되고, 상기 식에서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 2'-치환기는 또한 C1-C12 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ONO2, N02, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 이탈기, 리포터 기, 인터캘레이터(intercalator), 약동학 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 안티센스 화합물의 약역학 특성을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다(Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). 이러한 2'-MOE 치환은 변형되지 않은 뉴클레오사이드 및 다른 변형된 뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-O-메틸, O-프로필, 및 0-아미노프로필에 비해 개선된 결합 친화성을 갖는 것으로 기재되어 있다. 2'-MOE 치환기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 또한 생체내 사용에 대해 유망한 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 밝혀졌다(Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; 및 Altmann et al., NucleosidesNucleotides, 1997, 16, 917-926).
본원에서 사용되는 "변형된 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오사이드"는 일반적인 뉴클레오사이드 내의 펜토푸라노실 잔기에 대해 치환된 6-원 테트라하이드로피란 "당"(당 대용물(surrogate))을 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다. 변형된 THP 뉴클레오사이드는 헥시톨 핵산(HNA), 알트리톨 핵산(ANA), 만니톨 핵산(MNA)(Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 참조), 플루오로 HNA(F-HNA)로 당 분야에서 언급되는 것 또는 하기 화학식 Ⅶ를 갖는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며:
Figure pat00009
상기 식에서, 상기 화학식 Ⅶ의 적어도 하나의 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체 각각에 대해 독립적으로,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 안티센스 화합물에 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 연결기이거나, Ta 및 Tb 중 하나는 안티센스 화합물에 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 연결기이고, Ta 및 Tb 중 나머지는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 컨쥬게이트 기 또는 5' 또는 3'-말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; R1 및 R2 각각은 수소, 하이드록실, 할로겐, 치환되거나 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 선택되고, 상기 식에서, X는 O, S 또는 NJ1이고, 각각의 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7이 각각 H인 화학식 Ⅶ의 변형된 THP 뉴클레오사이드가 제공된다. 특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 H가 아니다. 특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 메틸이다. 특정 구체예에서, R1 및 R2 중 하나가 플루오로인 화학식 Ⅶ의 THP 뉴클레오사이드가 제공된다. 특정 구체예에서, R1은 플루오로이고, R2는 H이고; R1은 메톡시이고, R2는 H이고, R1은 H이고, R2는 메톡시에톡시이다.
본원에서 사용되는 "2'-변형된" 또는 "2'-치환된"은 H 또는 OH가 아닌 2' 위치에서 치환기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 2'-변형된 뉴클레오사이드는 당 고리의 2개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지는 당 고리의 2' 탄소와 또 다른 탄소를 연결시키는 이환식 뉴클레오사이드; 브릿징되지 않은 2' 치환기를 갖는 뉴클레오사이드, 예를 들어, 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, 0-(CH2)2-0-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, 0-(CH2)2-0-N(Rm)(Rn), 또는 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn)을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다. 2'-변형된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 당의 다른 위치 및/또는 핵염기에서 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "2'-F"는 2' 위치에서 플루오로기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 "2'-OMe" 또는 "2'-OCH3" 또는 "2'-0-메틸"은 각각 당 고리의 2' 위치에서 -OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 "MOE" 또는 "2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3" 또는 "2'-0-메톡시에틸"은 각각 당 고리의 2' 위치에서 -OCH2CH2OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"는 다수의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 화합물을 의미한다. 특정 구체예에서, 다수의 뉴클레오사이드 중 하나 이상은 변형된다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오사이드(RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오사이드(DNA)를 포함한다.
많은 다른 바이사이클로 및 트라이사이클로 당 대용물 고리 시스템은 또한 당 분야에 공지되어 있고, 이는 안티센스 화합물로의 통합을 위해 뉴클레오사이드를 변형시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 이에 대해서는 문헌[Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854]을 참조할 수 있다).
이러한 고리 시스템은 활성을 향상시키기 위해 다양한 추가 치환을 겪을 수 있다.
변형된 당의 제조를 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드에서, 핵염기 모이어티(자연, 변형 또는 이의 조합)가 적절한 핵산 표적과의 하이브리드화에 대해 유지된다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 구체예에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드는 갭머(gapmer) 모티프에 배열된다. 특정 구체예에서, 변형된 당 모이어티는 (4'-CH(CH3)-0-2') 브릿징 기를 갖는 이환식 뉴클레오사이드이다. 특정 구체예에서, (4'-CH(CH3)-0-2') 변형 뉴클레오사이드는 갭머 모티프의 윙 전체에 걸쳐 배열된다.
변형된 핵염기
핵염기(또는 염기) 변형 또는 치환은 자연 발생 또는 합성의 변형되지 않은 핵염기와 구조적으로 구별되나, 아직 기능적으로는 이와 상호교환적이다. 자연 및 변형 핵염기 둘 모두는 수소 결합에 관여할 수 있다. 이러한 핵염기 변형은 안티센스 화합물에 누클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 이로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 변형된 핵염기는 합성 및 자연 핵염기, 예를 들어, 5-메틸사이토신(5-me-C)을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환을 포함하는 특정 핵염기 치환은 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
추가의 변형되지 않은 핵염기는 5-히드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오타이민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 타이민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
헤테로사이클릭 염기 모이어티는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용한 핵염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 갭이 넓은(gap-widened) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신이다. 특정 구체예에서, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
약학적 조성물을 제형화시키기 위한 조성물 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학적 조성물 또는 제형의 제조를 위한 약학적으로 허용되는 활성 또는 비활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학적 조성물의 제형을 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 질병의 정도, 또는 투여되는 용량을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 기준에 따른다.
트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물과 적합한 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 조합시킴으로써 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충 염수(PBS)를 포함한다. PBS는 비경구적으로 전달되는 조성물에서 사용하기에 적합한 희석제이다. 추가로, 일 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 것은 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이다. 특정 구체예에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 PBS이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 투여시 생물학적으로 활성인 대사물 또는 이의 잔여물을 제공(직접 또는 간접적)할 수 있는 임의의 약학적으로 허용되는 염, 에스터, 또는 이러한 에스터의 염, 또는 임의의 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 개시는 또한 안티센스 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 프로드러그, 이러한 프로드러그의 약학적으로 허용되는 염, 및 다른 생물학적 동등물에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
프로드러그는 신체 내의 내인성 누클레아제에 의해 분해되어 활성 안티센스 화합물을 형성하는 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에 추가 뉴클레오사이드의 통합을 포함할 수 있다.
컨쥬게이션된 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 생성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트에 공유적으로 연결될 수 있다. 전형적 컨쥬게이트 기는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티를 포함한다. 추가 컨쥬게이트 기는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다.
안티센스 화합물은 또한, 예를 들어, 누클레아제 안정성과 같은 특성을 향상시키는 안티센스 화합물의 한 말단 또는 둘 모두의 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 기를 갖도록 변형될 수 있다. 안정화 기에 캡 구조가 포함된다. 이러한 말단 변형은 엑소누클레아제 분해로부터 말단 핵산을 갖는 안티센스 화합물을 보호하고, 이는 세포 내에서의 전달 및/또는 국소화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단(5-캡), 또는 3'-말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나, 둘 모두의 말단에 존재할 수 있다. 캡 구조는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 반전된 데옥시 무염기(abasic) 캡을 포함한다. 누클레아제 안정성을 부여하는 안티센스 화합물의 한 말단 또는 둘 모두의 말단을 캡핑(capping)하는데 사용될 수 있는 추가의 3' 및 5'-안정화 기는 2003년 1월 16일에 공개된 WO 03/004602호에 개시된 것을 포함한다.
세포 배양 및 안티센스 화합물 처리
트랜스티레틴 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과는 다양한 세포 유형에서 시험관내에서 시험될 수 있다. 상기 분석에 사용되는 세포 유형은 공급업체(예를 들어, American Type CultureCollection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)에서 시판되고, 세포는 시판되는 시약(예를 들어, Invitrogen Life Technologies, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용하여 공급업체의 설명서에 따라 배양된다. 예시적 세포 유형은 HepG2 세포, Hep3B 세포, 일차 간세포, A549 세포, GM04281 섬유모세포 및 LLC-MK2 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 시험관내 시험
다른 안티센스 화합물을 이용한 처리에 적절하게 변형될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 세포의 처리를 위한 방법이 본원에 기재된다.
일반적으로, 세포가 배양시에 약 60-80% 컨플루언스(confluence)에 도달하는 경우에 상기 세포는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된다.
배양된 세포에 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 통상적으로 사용되는 한 시약은 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 리포펙틴(LIPOFECTIN)(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 2 내지 12 ㎍/mL 범위의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 리포펙틴(등록상표) 농도의 요망되는 최종 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM(등록상표) 1(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재) 중 리포펙틴(등록상표)과 혼합된다.
배양된 세포에 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 사용되는 또 다른 시약은 LIPOFECT AMINE 2000(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 2 내지 12 ug/mL 범위의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 LIPOFECTAMINE(등록상표) 농도의 요망되는 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM(등록상표) 1 감소 혈청 배지(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재) 중의 LIPOFECTAMINE 2000(등록상표)과 혼합된다.
배양된 세포에 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 사용되는 또 다른 시약은 사이토펙틴(Cytofectin)(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 2 내지 12 ug/mL 범위의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 사이토펙틴(등록상표) 농도의 요망되는 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM(등록상표) 1 감소 혈청 배지(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재) 중의 사이토펙틴(등록상표)과 혼합된다.
배양된 세포에 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 사용되는 또 다른 기술은 전기천공을 포함한다.
세포는 통상적 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된다. 세포는 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 16-24시간 후에 수거되고, 이 시점에서 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준이 당 분야에 공지되고 본원에 기재된 방법에 의해 측정된다. 일반적으로, 처리가 다수의 반복으로 수행되는 경우, 데이터는 반복 처리의 평균으로 제공된다.
사용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 세포주마다 다양하다. 특정 세포주에 대한 최적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도를 결정하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 LIPOFECTAMINE2000(등록상표), 리포펙틴 또는 사이토펙틴으로 트랜스펙션되는 경우 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전기천공을 이용하여 트랜스펙션되는 경우 625 내지 20,000 nM 범위의 높은 농도로 사용된다.
RNA 분리
RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행될 수 있다. RNA 분리의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. RNA는 제조업체의 권장된 프로토콜에 따라, 예를 들어, TRIZOL(등록상표) 시약(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용하여 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조된다.
표적 수준 또는 발현의 억제 분석
트랜스티레틴 핵산의 수준 또는 발현의 억제는 당 분야에 공지된 다양한 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 수준은, 예를 들어, 노던 블롯 분석, 경쟁 중합효소 연쇄반응(PCR), 또는 정량적 실시간 PCR에 의해 정량될 수 있다. RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행될 수 있다. RNA 분리의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 노던 블롯 분석이 또한 당 분야에서 통상적이다. 정량적 실시간 PCR은 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 PE-Applied Biosystems에서 구입가능한 시판되는 ABI PRISM(등록상표) 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템(Sequence Detection System)을 이용하여 편리하게 달성될 수 있고, 제조업체의 설명서에 따라 사용될 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량은 제조업체의 설명서에 따라 ABI PRISM(등록상표) 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템(PE-Applied Biosystems, 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재)을 이용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 달성될 수 있다. 정량적 실시간 PCR의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
실시간 PCR 전, 분리된 RNA는 실시간 PCR 증폭에 대해 기질로 이후에 사용되는 상보적 DNA(cDNA)를 생성시키는 역전사효소(RT) 반응에 적용된다. RT 및 실시간 PCR 반응은 동일한 샘플 웰에서 순차적으로 수행된다. RT 및 실시간 PCR 시약은 Invitrogen(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 수득된다. RT, 실시간 PCR 반응은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 수행된다.
실시간 PCR에 의해 수득되는 유전자(또는 RNA) 표적의 양은 발현이 일정한 유전자, 예를 들어, 사이클로필린 A의 발현 수준을 이용하거나, RIBOGREEN(등록상표)(Invitrogen, Inc. 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용한 전체 RNA 정량에 의해 표준화된다. 사이클로필린 A 발현은 실시간 PCR에 의하거나, 표적과의 동시 작업에 의하거나, 다중화에 의하거나, 독립적으로 정량된다. 전체 RNA는 RIBOGREEN(등록상표) RNA 정량화 시약(Invitrogen, Inc. 오리건주의 유진시에 소재)을 이용하여 정량화된다. RIBOGREEN(등록상표)에 의한 RNA 정량화 방법은 문헌[Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)]에 교시되어 있다. CYTOFLUOR(등록상표) 4000 기계(PE Applied Biosystems)가 RIBOGREEN(등록상표) 형광을 측정하는데 사용된다.
프로브 및 프라이머는 트랜스티레틴 핵산에 하이브리드화되도록 설계된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 PRIMER EXPRESS(등록상표) 소프트웨어(Applied Biosystems, 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재)와 같은 소프트웨어의 사용을 포함할 수 있다.
단백질 수준의 분석
트랜스티레틴 핵산의 안티센스 억제는 트랜스티레틴 단백질 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 트랜스티레틴의 단백질 수준은 당 분야에 널리 공지된 다양한 방식, 예를 들어, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석(면역블로팅), 효소면역측정법(ELISA), 정량적 단백질 검정, 단백질 활성 검정(예를 들어, 카스파제(caspase) 활성 검정), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성 세포 분류기(FACS)로 평가되거나 정량될 수 있다. 표적에 특이적인 항체는 항체의 MSRS 카탈로그(Aerie Corporation, 미시건주의 버밍허시에 소재)와 같은 다양한 공급원으로부터 확인되고, 이로부터 수득될 수 있거나, 당 분야에 널리 공지된 통상적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 생성 방법을 통해 제조될 수 있다. 인간 및 래트 트랜스티레틴의 검출에 유용한 항체는 시판된다.
안티센스 화합물의 생체내 시험
안티센스 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 트랜스티레틴의 발현을 억제하고, 표현형 변화를 발생시키는 능력을 평가하기 위해 동물에서 시험된다. 시험은 정상 동물, 또는 실험 질병 모델에서 수행될 수 있다. 동물로의 투여를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수 중에서 제형화된다. 투여는 비경구 투여 경로를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 치료 기간 후, RNA는 조직으로부터 분리되고, 트랜스티레틴 핵산 발현에서의 변화가 측정된다. 트랜스티레틴 단백질 수준에서의 변화가 또한 측정된다.
특정 화합물
다양한 길이, 모티프 및 백본 조성물의 약 246개의 새로이 설계된 안티센스 화합물이 여러 세포 유형에서 시험관내에서 인간 트랜스티레틴 mRNA에 대한 이의 효과에 대해 시험되었다. 신규한 화합물이 시험관내에서 가장 효능있는 안티센스 화합물 중 일부인 것으로 이전에 결정된 ISIS NO: 304267, 304268, 304280, 304284, 304285, 304286, 304287, 304288, 304289, 304290, 304291, 304292, 304293, 304294, 304296, 304297, 304298, 304299, 304300, 304301, 304302, 304303, 304304, 304307, 304308, 304309, 304311, 및 304312를 포함하는 약 79개의 이전에 설계된 화합물과 비교되었다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2005/0244869호 및 제US2009/0082300호 참조). 약 325개의 새로이 설계된 안티센스 화합물 및 이전에 설계된 안티센스 화합물 중, 약 15개의 화합물이 시험관내 효능을 기초로 하여 추가 연구에 대해 선택되었다. 선택된 화합물이 트랜스제닉 마우스 모델에서 생체내 효능 및 내약성에 대해 시험되었다(실시예 10 참조). 시험되는 15개의 화합물 중, 11개가 선택되고, CD1 마우스에서의 전신 내약성(실시예 11 참조) 및 간에서의 반감기 측정(실시예 12 참조), 및 또한 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에서의 전신 내약성(실시예 13 참조) 및 간에서의 올리고뉴클레오타이드 농도의 약동학 연구(실시예 14 참조)에 대해 시험되었다. 이러한 연구로부터, 7개의 화합물이 트랜스제닉 마우스에서 용량 의존적 억제 및 내약성에 대해 시험되었다(실시예 15 참조). 더욱이, 15개의 추가 화합물이 표 1로부터 선택되었고, 다양한 모티프를 갖는 6개의 추가 화합물이 상기 언급된 검정에서 높은 효능 및 내약성을 나타낸 ISIS 420951에 대한 중첩 서열을 갖도록 설계되었다. 이러한 추가 화합물은 트랜스제닉 마우스에서 효능 및 내약성에 대해 ISIS 420951과 비교되었다(실시예 16 참조). 모든 이러한 연구(실시예 10-16)를 기초로 하여, 22개의 화합물이 선택되고, CD1 마우스에서 전신 내약성에 대해 시험되었다(실시예 17 참조). 7개의 화합물이 마우스 모델에서 내약성이 있는 것으로 간주되었고, 스프라그-돌리 래트에서 전신 내약성(실시예 18 참조) 및 간 및 신장에서 올리고뉴클레오타이드 농도의 약동학 연구(실시예 19 참조)에 대해 추가로 시험되었다. 7개의 화합물이 또한 트랜스제닉 마우스에서 용량-의존적 효능에 대해 시험되었다(실시예 20 참조).
상기 연구(실시예 16-20)의 최종 평가는 서열번호 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 및 124에 열거된 서열의 핵염기 서열을 갖는 9개의 화합물의 선택을 발생시켰다. 상보적 서열에 의해, 화합물은 서열번호 1의 영역 505-524, 507-526, 508-527, 513-532, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606, 또는 589-608에 상보적이다. 특정 구체예에서, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 상기 나열된 영역을 표적으로 하는 화합물은 본원에 추가로 기재된 바와 같은 서열번호에 열거된 서열의 일부 핵염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 나열된 영역을 표적으로 하거나, 상기 나열된 서열번호에 열거된 서열의 핵염기 부분을 갖는 화합물은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다양한 길이일 수 있고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다양한 모티프 중 하나를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 영역을 표적으로 하거나, 상기 나열된 서열번호에 열거된 서열의 핵염기 부분을 갖는 화합물은 ISIS NO: ISIS 304299, ISIS 420913, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 또는 ISIS 420959에 의해 표시된 바와 같은 특정 길이 및 모티프를 갖는다.
서열번호 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 및 124에 열거된 서열의 핵염기 서열을 갖는 9개의 화합물이 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이의 일차 간세포에서 용량 의존적 억제에 대해 추가로 시험되었다(실시예 21 참조). 이러한 화합물이 또한 최적 점성도에 대해 시험되었다(실시예 22). 서열번호 78, 86, 87, 115, 120 및 124에 열거된 서열의 핵염기 서열을 갖는 화합물 중 7개의 CD1 마우스의 간에서의 반감기가 또한 평가되었다(실시예 23).
이러한 연구(실시예 1-23)의 최종 평가는 서열번호 25, 80, 86, 87, 115, 120, 122 및 124에 열거된 서열의 핵염기 서열을 갖는 8개의 화합물의 선택을 발생시켰다. 상보적 서열에 의해, 화합물은 SEQ ED NO:1의 영역 504-523, 505-524, 512-531, 513-532, 577-596, 582-601, 584-603, 및 586-605에 상보적이다. 특정 구체예에서, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 상기 나열된 영역을 표적으로 하는 화합물은 본원에 추가로 기재된 바와 같은 서열번호에 열거된 서열의 일부 핵염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 나열된 영역을 표적으로 하고, 상기 나열된 서열번호에 열거된 서열의 핵염기 부분을 갖는 화합물은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다양한 길이일 수 있고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다양한 모티프 중 하나를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 영역을 표적으로 하고, 상기 나열된 서열번호에 열거된 서열의 핵염기 부분을 갖는 화합물은 ISIS NO: ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 또는 ISIS 420959에 의해 표시된 바와 같은 특정 길이 및 모티프를 갖는다.
이러한 8개의 화합물은 시노몰구스 원숭이에서 효능, 약동학 프로파일 및 내약성에 대해 시험되었다(실시예 24). 이러한 원숭이에서의 억제 연구는 상기 화합물 중 일부를 이용한 처리가 간에서 TTR mRNA의 높은 억제를 야기시키는 것을 나타내었다. 특히, ISIS 420950, ISIS 420955 및 ISIS 420915를 이용한 처리는 PBS 대조군에 비해 각각 91%, 79% 및 78% 억제를 야기시켰다. ISIS 420915가 ISIS 304299(59%)에 비해 더 큰 TTR(78%) mRNA를 야기켰으나, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 SEQ ED NO:1 상의 표적 영역의 단일 염기쌍 변화에 의해 서로 상이한 것이 인지되었다. 단백질 분석은 또한 대조군에 비해 TTR 단백질의 76% 억제를 야기시킨 ISIS 420915를 이용한 처리 및 47% 억제를 야기시킨 ISIS 304299를 이용한 처리로 RNA 분석 데이터를 보충하였다. 트랜스티레틴과 관련된 단백질로서의 RBP4 단백질 수준은 또한 안티센스 화합물을 이용한 처리 후에 감소하는 것으로 예상되었다. RBP4 단백질 수준은 ISIS 420915를 이용한 처리 후에 63% 감소되었다. ISIS 304299를 이용한 처리는 RBP4 단백질 수준을 19% 감소시켰다. 또한, ISIS 420915는 원숭이 연구에서 나타난 바와 같이 ISIS 304299보다 내약성이 있었다(실시예 24). ISIS 304299(ALT 81 IU/L 및 AST 101 IU/L)로 처리된 원숭이의 트랜스아미나제 수준은 ISIS 420915(ALT 68 IU/L 및 AST 62 IU/L)로 처리된 원숭이의 트랜스아미나제 수준보다 높았다. ISIS 304299(96 ㎎/dL)로 처리된 원숭이의 보체 C3 수준은 ISIS 420915(104 ㎎/dL)로 처리된 원숭이의 보체 C3 수준보다 낮았다.
따라서, 개선된 특징 중 임의의 하나 이상을 갖는 안티센스 화합물이 본원에 제공된다. 한 특정 구체예에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드의 영역을 표적으로 하거나 이에 특이적으로 하이브리드화가능한 본원에 추가로 기재된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.
따라서, 개선된 특징 중 임의의 하나 이상을 갖는 안티센스 화합물이 본원에 제공된다. 한 특정 구체예에서, 서열번호 2의 뉴클레오타이드의 영역을 표적으로 하거나 이에 특이적으로 하이브리드화가능한 본원에 추가로 기재된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.
따라서, 개선된 특징 중 임의의 하나 이상을 갖는 안티센스 화합물이 본원에 제공된다. 한 특정 구체예에서, 서열번호 4의 뉴클레오타이드의 영역을 표적으로 하거나 이에 특이적으로 하이브리드화가능한 본원에 추가로 기재된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물은 실시예 67에 기재된 바와 같이 전기천공을 이용하여 시노몰구스 원숭이 간세포주에 전달되는 경우에 2.9 μM 미만, 2.2 μM 미만, 2.0 μM 미만, 1.5 μM 미만, 1.4 μM 미만, 1.3 μM 미만, 1.0 μM 미만, 0.7 μM 미만, 0.6 μM 미만의 시험관내 IC50 중 적어도 하나를 가짐에 따라 효능이 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물은 염수 처리된 동물에 비해 4배, 3배 또는 2배 이하의 ALT 또는 AST 값에서의 증가, 또는 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% 또는 2% 이하의 간, 비장 또는 신장 중량에서의 증가 중 적어도 하나를 가짐에 따라 매우 내약성이 있다.
특정 적응증
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 개체느 중추신경계 관련 질병을 갖는다.
하기 실시예에 제시되는 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스티레틴을 표적으로 하는 화합물은 중추신경계 관련 질병의 생리학적 증상의 중증도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 특정 실험에서, 화합물은 아밀로이드 플라크 형성의 속도를 감소시켰으며, 예를 들어, 동물은 증상을 계속 겪었으나, 이러한 증상은 미처리된 동물에 비해 덜 중증이었다. 그러나, 다른 실험에서, 화합물은 시간이 지남에 따라 기능을 재생시키는 것으로 보이며, 예를 들어, 장기간 동안 처리된 동물은 보다 짧은 기간 동안 상기 화합물이 투여된 동물보다 덜 중증의 증상을 겪었다. 따라서, 기능을 회복시키는 하기 예시되는 화합물의 능력은 질병의 증상이 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 이용한 처리에 의해 역전될 수 있는 것을 입증한다.
따라서, 중추신경계 관련, 심장, 신경병리학 또는 위장 질병과 관련된 증상을 개선시킬 필요가 있는 피검체에서 중추신경계 관련 심장, 신경병리학 또는 위장 질병과 관련된 증상을 개선시키는 방법에 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 중추신경계 관련, 심장, 신경병리학 또는 위장 질병과 관련된 증상의 발생 속도를 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 중추신경계 관련, 심장, 신경병리학 또는 위장과 관련된 증상의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 이러한 구체예에서, 상기 방법은 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 치료적 유효량의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
트랜스티레틴 아밀로이드증은 다수의 신체적, 신경학적, 정신의학적, 및/또는 말초적 증상을 특징으로 한다. 트랜스티레틴 아밀로이드증과 관련된 것으로 당업자에게 공지된 임의의 증상은 상기 기재된 방법에서 상기 기재된 바와 같이 개선되거나 달리 조절될 수 있다. 특정 구체예에서, 증상은 신체적, 인지적, 정신의학적, 또는 말초적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 안절부절증, 조정력 부족, 눈떨림, 강직성 반신마비, 근협조 결핍(lack of musclecoordination), 약화된 시력, 불면증, 비정상적 감각, 근간대경련, 시각상실, 어음 손실(loss of speech), 손목굴증후군, 발작, 거미막밑출혈, 뇌졸중 및 뇌에서의 출혈, 수두증, 실조, 및 강직마비, 혼수, 감각신경병증, 지적이상증(parathesia), 감각저하, 운동신경병증, 자율신경병증, 기립저혈압, 주기적 변비, 주기적 설사, 구역, 구토, 감소된 발한, 발기부전, 지연위배출, 요폐, 요실금, 진행성 심장병증, 피로, 숨참, 체중감소, 식욕부진, 무감각, 저림, 쇠약, 혀가 커짐(enlarged tongue), 콩팥증후군, 울혈심부전, 운동시 호흡곤란, 말초 부종, 부정맥, 두근거림, 현기증(lightheadedness), 실신, 체위저혈압, 말초 신경 문제(peripheral nerve problem), 감각 운동 장애(sensory motor impairment), 하지 신경병증, 상지 신경병증, 통각과민, 변경된 온도 감각, 하지 쇠약(lower extremity weakness), 악액질, 말초 부종, 간비대, 자색반증, 확장기 기능장애, 조기심실수축, 뇌신경병증, 감소된 심건반사(diminished deep tendon reflexes), 유리체 내의 아밀로이드 침착, 유리체혼탁, 건성안, 녹내장, 동공 내의 부채꼴 모양(scalloped appearance), 및 수저류로 인한 발의 종창으로 구성되는 군으로부터 선택된 신체적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 기억 장애, 판단, 및 사고 장애, 계획 장애(impaired planning), 융통성 장애, 추상적 사고 장애, 규칙 습득 장애, 적절한 행동 개시 장애, 부적절한 행동 억제 장애, 단기 기억 장애, 장기 기억 장애, 편집증, 지남력장애, 착란, 환각 및 치매로 구성되는 군으로부터 선택된 인지적 증상이다. 특정 구체예에서, 증상은 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심, 공격, 강박행동, 과민성, 인격 변조, 예를 들어, 기억, 판단 및 사고 장애, 및 자살관념으로 구성되는 군으로부터 선택되는 정신의학적 증상이다.
특정 구체예에서, 증상은 안절부절증이다. 특정 구체예에서, 증상은 조정력 부족이다. 특정 구체예에서, 증상은 눈떨림이다. 특정 구체예에서, 증상은 강직성 반신마비이다. 특정 구체예에서, 증상은 근협조 결핍이다. 특정 구체예에서, 증상은 약화된 시력이다. 특정 구체예에서, 증상은 불면증이다. 특정 구체예에서, 증상은 비정상적 감각이다. 특정 구체예에서, 증상은 근간대경련이다. 특정 구체예에서, 증상은 시각상실이다. 특정 구체예에서, 증상은 어음 손실이다. 특정 구체예에서, 증상은 손목굴증후군이다. 특정 구체예에서, 증상은 발작이다. 특정 구체예에서, 증상은 거미막밑출혈이다. 특정 구체예에서, 증상은 뇌졸중이다. 특정 구체예에서, 증상은 뇌에서의 출혈이다. 특정 구체예에서, 증상은 수두증이다. 특정 구체예에서, 증상은 실조이다. 특정 구체예에서, 증상은 강직마비이다. 특정 구체예에서, 증상은 혼수이다. 특정 구체예에서, 증상은 감각신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 지적이상증이다. 특정 구체예에서, 증상은 감각저하이다. 특정 구체예에서, 증상은 운동신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 자율신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 기립저혈압이다. 특정 구체예에서, 증상은 주기적 변비이다. 특정 구체예에서, 증상은 주기적 설사이다. 특정 구체예에서, 증상은 구역이다. 특정 구체예에서, 증상은 구토이다. 특정 구체예에서, 증상은 감소된 발한이다. 특정 구체예에서, 증상은 발기부전이다. 특정 구체예에서, 증상은 지연위배출이다. 특정 구체예에서, 증상은 요폐이다. 특정 구체예에서, 증상은 요실금이다. 특정 구체예에서, 증상은 진행성 심장병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 피로이다. 특정 구체예에서, 증상은 숨참이다. 특정 구체예에서, 증상은 체중감소이다. 특정 구체예에서, 증상은 무감각이다. 특정 구체예에서, 증상은 저림이다. 특정 구체예에서, 증상은 쇠약이다. 특정 구체예에서, 증상은 혀가 커짐이다. 특정 구체예에서, 증상은 콩팥증후군이다. 특정 구체예에서, 증상은 울혈심부전이다. 특정 구체예에서, 증상은 운동시 호흡곤란이다. 특정 구체예에서, 증상은 말초 부종이다. 특정 구체예에서, 증상은 부정맥이다. 특정 구체예에서, 증상은 두근거림이다. 특정 구체예에서, 증상은 현기증이다. 특정 구체예에서, 증상은 실신이다. 특정 구체예에서, 증상은 체위저혈압이다. 특정 구체예에서, 증상은 말초 신경 문제이다. 특정 구체예에서, 증상은 감각 운동 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 하지 신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 상지 신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 통각과민이다. 특정 구체예에서, 증상은 변경된 온도 감각이다. 특정 구체예에서, 증상은 하지 쇠약이다. 특정 구체예에서, 증상은 악액질이다. 특정 구체예에서, 증상은 말초 부종이다. 특정 구체예에서, 증상은 간비대이다. 특정 구체예에서, 증상은 자색반증이다. 특정 구체예에서, 증상은 확장기 기능장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 조기심실수축이다. 특정 구체예에서, 증상은 뇌신경병증이다. 특정 구체예에서, 증상은 감소된 심건반사이다. 특정 구체예에서, 증상은 유리체 내의 아밀로이드 침착이다. 특정 구체예에서, 증상은 유리체혼탁이다. 특정 구체예에서, 증상은 건성안이다. 특정 구체예에서, 증상은 녹내장이다. 특정 구체예에서, 증상은 동공 내의 부채꼴 모양이다. 특정 구체예에서, 증상은 수저류로 인한 발의 종창이다.
특정 구체예에서, 증상은 기억 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 판단, 및 사고 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 계획 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 융통성 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 추상적 사고 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 규칙 습득 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 적절한 행동 개시 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 부적절한 행동 억제 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 단기 기억 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 장기 기억 장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 편집증이다. 특정 구체예에서, 증상은 지남력장애이다. 특정 구체예에서, 증상은 착란이다. 특정 구체예에서, 증상은 환각이다. 특정 구체예에서, 증상은 치매이다.
특정 구체예에서, 증상은 치매이다. 특정 구체예에서, 증상은 불안이다. 특정 구체예에서, 증상은 우울증이다. 특정 구체예에서, 증상은 둔화정동이다. 특정 구체예에서, 증상은 자기중심이다. 특정 구체예에서, 증상은 공격이다. 특정 구체예에서, 증상은 강박행동이다. 특정 구체예에서, 증상은 과민성이다. 특정 구체예에서, 증상은 인격 변조이다. 특정 구체예에서, 증상은 자살관념이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 개체는 중추신경계 관련 질병을 갖는다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여는 트랜스티레틴 발현을 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 상기 값 중 임의의 2개의 값에 의해 규정되는 범위로 감소시킨다.
특정 구체예에서, 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 중추신경계 관련 질병으로 고통받거나 이에 민감한 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 서열번호 25, 78, 80, 86, 87, 115, 120, 122 및 124에 열거된 서열의 본원에 기재된 바와 같은 연속적 핵염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
투여
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여부 및 치료되는 부위에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소, 폐내, 예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐내, 기관내, 비내, 피내 및 경피, 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 조성물은 특정 조직, 예를 들어, 간 또는 뇌를 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 조성물은 비경구 투여된다. "비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들어, 뇌내 투여, 수막강내 투여, 실내 투여, 실 투여, 대뇌실내(intracerebroventricular) 투여, 대뇌 실내 투여 또는 대뇌 실 투여를 포함한다. 투여는 연속적, 또는 만성, 또는 단기 또는 간헐적 투여일 수 있다.
특정 구체예에서, 비경구 투여는 주입에 의해 이루어진다. 주입은 만성 또는 연속 또는 단기 또는 간헐적 주입일 수 있다. 특정 구체예에서, 주입되는 약학적 작용제는 펌프를 이용하여 전달된다. 특정 구체예에서, 비경구 투여는 주사에 의해 이루어진다.
특정 구체예에서, 비경구 투여는 피하 투여이다.
추가 구체예에서, 투여용 제형은 본원에 기재된 화합물 및 염수이다.
특정 구체예에서, 화합물 및 조성물은 CNS로 전달된다. 특정 구체예에서, 화합물 및 조성물은 뇌척수액에 전달된다. 특정 구체예에서, 화합물 및 조성물은 뇌 실질에 전달된다. 특정 구체예에서, 화합물 및 조성물은 수막강내 투여, 또는 대뇌실내 투여에 의해 중추신경계의 다수의 부위(예를 들어, 뇌의 다수의 부위, 및/또는 척수)로 동물에게 전달된다. 중추신경계 내에서의 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 광범위한 분포는 실질내 투여, 수막강내 투여, 또는 대뇌실내 투여를 이용하여 달성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 뇌로의 직접적인 주사에 의해 전달될 수 있는 약학적 조성물을 포함한다. 주사는 뇌의 특정 부위(예를 들어, 흑색질, 맥락얼기, 피질, 해마, 선조체, 맥락얼기 또는 창백핵)로의 정위 주사에 의해 이루어질 수 있다. 화합물은 또한 뇌의 미만성 부위로 전달(예를 들어, 뇌의 피질로의 미만성 전달)될 수 있다.
특정 구체예에서, 비경구 투여는 주사에 의해 이루어진다. 주사는 주사기 또는 펌프를 이용하여 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 주사는 볼루스 주사이다. 특정 구체예에서, 주사는 조직, 예를 들어, 선조체, 꼬리(caudate), 피질, 해마 및 소뇌에 직접 투여된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물의 전달은 화합물 또는 조성물의 약동학 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 특정 구체예에서, 표적화된 조직으로의 본원에 기재된 화합물 또는 조성물의 주사는 화합물 또는 조성물의 주입에 비해 상기 화합물 또는 조성물의 약동학적 프로파일을 개선시킨다. 한 특정 구체예에서, 화합물 또는 조성물의 주사는 광범위한 확산에 비해 효능을 개선시키고, 이는 유사한 약리학을 달성하는데 화합물 또는 조성물을 덜 필요로 한다. 특정 구체예에서, 유사한 약리학은 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질이 하향 조절되는 시간의 양(예를 들어, 작용 기간)을 의미한다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 볼루스 주사에 의해 약학적 작용제를 특이적으로 국소화시키는 방법은 반수 영향 농도(median effective concentration)(EC50)를 약 μM 감소(예를 들어, 동일하거나 유사한 약역학 효과를 달성하는데 조직에서 50배 덜한 농도가 필요함)시킨다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 볼루스 주사에 의한 것과 같은 약학적 작용제를 특이적으로 국소화시키는 방법은 반수 영향 농도(EC50)를 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50배 감소시킨다. 특정 구체예에서, 약학적 작용제는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 안티센스 화합물이다. 특정 구체예에서, 표적화되는 조직은 뇌 조직이다. 특정 구체예에서, 표적화되는 조직은 선조체 조직이다. 특정 구체예에서, EC50을 감소시키는 것이 요망되는데, 이는 이러한 감소가 약리학적 결과를 달성하는 것이 필요한 환자에서 약리학적 결과를 달성하는데 필요한 용량을 감소시키기 때문이다.
CD1 마우스 간 조직에서의 MOE 갭머 올리고뉴클레오타이드의 반감기는 약 21일이다(실시예 12 참조).
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 매월 1회, 2개월에 1회, 90일에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회, 1년에 2회 또는 1년에 1회 주사 또는 주입에 의해 전달된다.
특정 조합 요법
특정 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 약학적 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 본원에 기재된 하나 이상의 약학적 조성물과 동일한 질병, 장애, 또는 질환을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 상기 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 본원에 기재된 하나 이상의 약학적 조성물과 상이한 질병, 장애, 또는 질환을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 상기 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물의 요망되지 않는 부작용을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 다른 약학적 작용제의 요망되지 않는 효과를 치료하기 위해 또 다른 약학적 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 조합 효과를 발생시키기 위해 또 다른 약학적 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 상승작용 효과를 발생시키기 위해 또 다른 약학적 작용제와 공동 투여된다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 상이한 시간에 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 단일 제형으로 함께 제조된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약학적 작용제는 독립적으로 제조된다.
특정 구체예에서, 제2 작용제는 본 발명의 약학적 조성물의 투여 전에 투여된다. 특정 구체예에서, 제2 작용제는 본 발명의 약학적 조성물의 투여 후에 투여된다. 특정 구체예에서, 제2 화합물은 본 발명의 약학적 조성물과 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 공동 투여되는 제2 화합물의 용량은, 상기 제2 화합물이 단독으로 투여되는 경우에 투여되는 용량과 동일하다. 특정 구체예에서, 공동 투여되는 제2 화합물의 용량은, 상기 제2 화합물이 단독으로 투여되는 경우에 투여되는 용량보다 적다. 특정 구체예에서, 공동 투여되는 제2 화합물의 용량은, 상기 제2 화합물이 단독으로 투여되는 경우에 투여되는 용량보다 크다.
특정 구체예에서, 제2 화합물의 공동 투여는 제1 화합물의 효과를 향상시키고, 상기 화합물들의 공동 투여는 제1 화합물이 단독으로 투여되는 효과보다 큰 효과를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 공동 투여는 단독으로 투여되는 경우의 화합물의 효과에 부가적인 효과를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 공동 투여는 단독으로 투여되는 경우의 화합물의 효과에 초부과적(supra-additive)인 효과를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 제1 화합물은 안티센스 화합물이다. 특정 구체예에서, 제2 화합물은 안티센스 화합물이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물과 공동 투여될 수 있는 약학적 작용제는 항정신병제, 예를 들어, 할로페리돌(haloperidol), 클로르프로마진(chlorpromazine), 클로자핀(clozapine), 퀘타핀(quetapine), 및 올란자핀(olanzapine); 항우울제, 예를 들어, 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린 하이드로클로라이드(sertraline hydrochloride), 벤라팍신(venlafaxine) 및 노르트립틸린(nortriptyline); 진정제, 예를 들어, 벤조디아제핀, 클로나제팜, 파록세틴, 벤라팍신, 및 베타-차단제; 기분-안정화제, 예를 들어, 리튬, 발프로에이트, 라모트리진, 및 카바마제핀(carbamazepine); 마비 작용제, 예를 들어, 보툴리눔(Botulinum) 독소; 및/또는 다른 실험 작용제, 비제한적인 예로, 테트라베나진(Xenazine), 크레아틴, 코엔자임 Q10, 트레할로스, 도코사헥사엔산, ACR16, 에틸-EPA, 아토목세틴(atomoxetine), 시탈로프람(citalopram), 디메본(dimebon), 메만틴(memantine), 나트륨 페닐부티레이트, 라멜테온(ramelteon), 우르소디올(ursodiol), 자이프렉사(zyprexa), 제나신(xenasine), 티아프라이드(tiapride), 릴루졸(riluzole), 아만타딘(amantadine), [123I]MNI-420, 아토목세틴, 테트라베나진, 디곡신(digoxin), 데트로메토르판(detromethorphan), 와파린(warfarin), 알프로잠(alprozam), 케토코나졸, 오메프라졸, 및 미노사이클린을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물과 공동 투여될 수 있는 약학적 작용제는 진통제, 예를 들어, 파라세타몰(paracetamol)(아세트아미노펜); 비-스테로이드 항염증 약물(NSAID), 예를 들어, 살리실레이트; 마약성 약물, 예를 들어, 모르핀, 및 마약 특성을 갖는 합성 약물, 예를 들어, 트라마돌을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물과 공동 투여될 수 있는 약학적 작용제는 근이완제, 예를 들어, 벤조디아핀 및 메토카바몰을 포함한다.
제형
본 발명의 화합물은 또한 섭취, 분포 및/또는 흡수를 돕는 다른 분자, 화합물의 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들어, 리포솜, 수용체-표적화된 분자, 또는 다른 제형과 혼합되거나, 이에 컨쥬게이션되거나, 달리 관련될 수 있다. 상기 섭취, 분포 및/또는 흡수를 돕는 제형의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,158호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 안티센스 화합물은 인간을 포함하는 동물에게 투여시 생물학적 활성 대사물 또는 이의 잔여물을 제공(직접 또는 간접적으로 제공)할 수 있는 임의의 약학적으로 허용되는 염, 에스터, 또는 상기 에스터의 염, 또는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용되는 염, 즉, 모(parent) 화합물의 요망되는 생물학적 활성을 보유하고, 요망되지 않는 독물학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드에 대해, 약학적으로 허용되는 염 및 이의 용도의 바람직한 예는 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다. 나트륨염이 올리고뉴클레오타이드 약물의 적합한 형태인 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여부 및 치료되는 부위에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어, 뇌내 투여, 수막강내 투여, 실내 투여, 실 투여, 대뇌실내 투여, 대뇌 실내 투여 또는 대뇌 실 투여를 포함한다.
맥락얼기에서의 트랜스티레틴 발현을 표적으로 하기 위해 실내 투여가 바람직하다. 적어도 하나의 2'-0-메톡시에틸 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 경구 투여에 특히 유용한 것으로 생각된다. 국소 투여용 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적액, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적 약학적 담체, 수성, 분말 또는 오일 베이스, 증점제 등이 필요하거나 요망될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다.
단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있는 본 발명의 약학적 제형은 약학 산업에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)를 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분과 액체 담체 또는 미세하게 나누어진 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 충분히 결합시킨 후, 필요시 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 임의의 많은 가능한 투여 형태, 비제한적인 예로, 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연성 젤, 좌약, 및 관장제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합된 매질 중의 현탁액으로 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 포말 및 리포솜-함유 제형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 약학적 조성물 및 제형은 하나 이상의 침투 향상제, 담체, 부형제 또는 다른 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멀젼은 전형적으로 0.1 ㎛ 직경을 보통 초과하는 비말 형태로 다른 액체에 분산된 한 액체의 이종성 시스템이다. 에멀젼은 분산된 상 외에 추가 성분, 및 수성상, 오일상 중의 용액, 또는 자체가 독립된 상으로 제공될 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 마이크로에멀젼이 본 발명의 구체예로 포함된다. 에멀젼 및 이의 용도는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 제형은 리포솜 제형을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "리포솜"은 구체 이중층 또는 이중층들에 배열된 양쪽성(amphiphilic) 지질로 구성되는 소포를 의미한다. 리포솜은 친지질성 물질로부터 형성된 막 및 전달되는 조성물을 함유하는 수성 내부를 갖는 단일층 또는 다층 소포이다. 양이온성 리포솜은 음성으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정적인 복합체를 형성하는 것으로 생각되는 양성으로 하전된 리포솜이다. pH-민감성 또는 음성으로 하전된 리포솜은 DNA와 복합체화되기 보다는 DNA를 엔트래핑(entrapping)하는 것으로 생각된다. 양이온성 및 비양이온성 리포솜 둘 모두가 세포에 DNA를 전달하는데 사용된다.
리포솜은 또한 본원에서 사용되는 용어인 "입체적으로 안정화된" 리포솜을 포함하며, 이는 리포솜으로 통합되는 경우에 특화된 지질이 결핍된 리포솜에 비해 향상된 순환 존재기간을 발생시키는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포솜을 의미한다. 리포솜 및 이의 용도는 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 제형은 염수 제형을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 제형은 본원에 기재된 화합물 및 염수로 구성된다. 특정 구체예에서, 제형은 본질적으로 본원에 기재된 화합물 및 염수로 구성된다. 특정 구체예에서, 염수는 약학적으로 허용되는 등급의 염수이다. 특정 구체예에서, 염수는 완충 염수이다. 특정 구체예에서, 염수는 포스페이트 완충 염수(PBS)이다.
특정 구체예에서, 제형은 리포솜을 배제시킨다. 특정 구체예에서, 제형은 입체적으로 안정화된 리포솜을 배제시킨다. 특정 구체예에서, 제형은 인지질을 배제시킨다. 특정 구체예에서, 제형은 본질적으로 본원에 기재된 화합물 및 염수로 구성되고, 리포솜을 배제시킨다.
본 발명의 약학적 제형 및 조성물은 또한 표면활성제를 포함할 수 있다. 표면활성제 및 이의 용도는 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오타이드의 효과적인 전달에 영향을 주기 위해 다양한 침투 향상제를 이용한다. 침투 향상제 및 이의 용도는 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
당업자는 제형이 이의 소기의 용도, 즉, 투여 경로에 따라 통상적으로 설계됨을 인지할 것이다.
국소 투여에 바람직한 제형은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 국소 전달 작용제, 예를 들어, 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스터, 스테로이드, 킬레이트제 및 표면활성제와 혼합된 것을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포솜은 중성(예를 들어, 다이올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 다이미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 다이스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예를 들어, 다이미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 다이올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 다이올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA) 지질 및 리포솜을 포함한다.
정맥내, 동맥내, 피하, 복막내, 근내 주사 또는 주입, 또는 두개내 투여용의 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 비제한적인 예로, 침투 향상제, 담체 화합물 및 다른 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 올리고머 화합물 및 비-안티센스 메커니즘에 의해 작용하는 하나 이상의 다른 화학치료제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 화학치료제의 예는 암 화학치료 약물, 예를 들어, 다우노루비신, 다우노마이신), 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 사이토신 아라비노사이드, 비스-클로로에틸니트로소우레아, 부설판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카바진, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린(amsacrine), 클로람부실(chlorambucil), 메틸사이클로헥실니트로소우레아, 질소 머스터드, 멜팔란(melphalan), 사이클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-아자사이티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르마이신(deoxycoformycin), 4-하이드록시퍼옥시사이클로포스포르아미드, 5-플루오로우라실(5-FU), 5-플루오로데옥시유리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드(etoposide)(VP-16), 트라이메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 젬시타빈, 테니포시드(teniposide), 시스플라틴(cisplatin) 및 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol)(DES)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 사용되는 경우, 상기 화학치료제는 개별적(예를 들어, 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드), 순차적(예를 들어, 일정 기간 동안의 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드 후, MTX 및 올리고뉴클레오타이드), 또는 하나 이상의 다른 상기 화학치료제와 조합(예를 들어, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오타이드, 또는 5-FU, 방사선요법 및 올리고뉴클레오타이드)하여 사용될 수 있다. 비스테로이드 항염증 약물 및 코르티코스테로이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항염증 약물, 및 리비비린(ribivirin), 비다라빈(vidarabine), 아시클로버(acyclovir) 및 간시클로버(ganciclovir)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항바이러스 약물이 또한 본 발명의 조성물과 조합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 조합물이 또한 본 발명의 범위 내이다. 2개 이상의 조합된 화합물이 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
또 다른 관련 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제1 핵산을 표적으로 하는 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오타이드, 및 제2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동일 핵산 표적의 상이한 영역을 표적으로 하는 2개 이상의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 안티센스 화합물의 다수의 예가 당 분야에 공지되어 있다. 2개 이상의 조합된 화합물이 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
투여
치료 조성물의 제형 및 이의 이후의 투여(투여)는 당업자의 기술 범위 내인 것으로 생각된다. 투여는 치료되는 질병 상태의 중증도 및 반응, 수일 내지 수개월, 또는 치료가 성취되거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지 지속되는 치료 과정에 좌우된다. 최적 투여 일정은 환자의 신체에서의 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 최적 투여량은 개별적 올리고뉴클레오타이드의 상대 효능에 따라 다양할 수 있고, 이는 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50을 기초로 하여 평가될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 kg 당 0.01㎍ 내지 100g이고, 하루, 매주, 매월 또는 매년, 또는 요망되는 간격으로 1회 이상 제공될 수 있다. 성공적인 치료 후, 질병 상태의 재발을 방지하기 위해 환자가 유지 요법을 겪는 것이 요망될 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 매일 1회 이상으로 체중 kg 당 0.01㎍ 내지 100g 범위의 유지 용량으로 투여된다. 본 발명은 이의 바람직한 특정 구체예에 따라 특이적으로 기재되었으나, 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공하며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 출원에 열거된 참고문헌, GenBank 등록 번호 등의 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본원은 동물에서 트랜스티레틴 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물, 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법, 화합물, 및 조성물은 트랜스티레틴 아밀로이드증 또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는데 유용하다.
실시예
참고문헌에 의한 비제한적 개시 및 포함
본원에 기재된 특정 화합물, 조성물 및 방법은 특정 구체예에 따라 특이적으로 기재되었으나, 하기 실시예는 본원에 기재된 화합물을 단지 예시하기 위해 제공하며, 이를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 출원에 열거된 참고문헌 각각은 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
실시예 1: HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 안티센스 억제
트랜스티레틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였고, 시험관내에서 트랜스티레틴 mRNA에 대한 효과에 대해 시험하였다. 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 배양된 HepG2 세포를 리포펙틴 시약을 이용하여 50 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS1396(정방향 서열 CCCTGCTGAGCCCCTACTC, 본원에서 서열번호 5로 명명됨; 역방향 서열 TCCCTCATTCCTTGGGATTG, 본원에서 서열번호 6으로 명명됨; 프로브 서열 ATTCCACCACGGCTGTCGTCAX, 본원에서 서열번호 7로 명명됨). 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다.
표 1 및 2에서의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 5-10-5 MOE 갭머로 설계하였다. 갭머는 20 뉴클레오타이드 길이이며, 여기서 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오타이드로 구성되며, 이는 각각 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는 윙에 의해 양 측면(5' 방향 및 3' 방향)에 플랭킹(flanking)되어 있다. 5' 윙 세그먼트 내의 각각의 뉴클레오타이드 및 3' 윙 세그먼트 내의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-MOE 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "인간 표적 시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열 내에서 표적화되는 가장 5'의 뉴클레오타이드를 나타낸다. "인간 표적 정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열 내에서 표적화되는 가장 3'의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 표 1에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열번호 1(GENBANK 수탁번호 NM_000371.2)로 명명된 인간 트랜스티레틴 mRNA를 표적으로 한다. 특정 갭머가 또한 본원에서 서열번호 2(GENBANK 수탁번호 NT_010966.10, 뉴클레오타이드 2009236 내지 2017289로부터 트렁케이션됨)로 명명된 인간 트랜스티레틴 유전체 서열의 인트론 서열 또는 인트론-엑손 접합부(junction)를 표적으로 하도록 설계하였고, 이는 표 2에 나열되어 있다.
표 1 및 2의 인간 올리고뉴클레오타이드는 또한 레수스(rhesus) 원숭이 유전자 서열과 교차 반응성이다. '미스매치'는 인간 올리고뉴클레오타이드가 레수스 원숭이 유전자 서열과 미스매치되는 핵염기의 수를 나타낸다. 인간 올리고뉴클레오타이드와 레수스 원숭이 서열 사이의 상보성이 클수록, 인간 올리고뉴클레오타이드는 레수스 원숭이 서열과 교차 반응할 가능성이 높다. 표 1에서의 인간 올리고뉴클레오타이드를 인간 엑손에 대한 유사성을 기초로 하여 레수스 원숭이 유전체 서열 GENBANK 등록 번호 NW 001105671.1로부터 발췌한 엑손 1-4와 비교하였다. 표 2에서의 인간 올리고뉴클레오타이드를 본원에서 서열번호 4(GENBANK 수탁번호 NW_001105671.1, 뉴클레오타이드 628000 내지 638000으로부터 트렁케이션됨)로 명명된 레수스 원숭이 유전체 서열과 비교하였다. "레수스 원숭이 표적 시작 부위"는 갭머가 레수스 원숭이 유전자 서열 내에서 표적화되는 가장 5'의 뉴클레오타이드를 나타낸다. "레수스 원숭이 표적 정지 부위"는 갭머가 레수스 원숭이 유전자 서열 내에서 표적화되는 가장 3'의 뉴클레오타이드를 나타낸다.
표 1
SEQ ED NO:1 및 SEQ ED NO:4를 표적으로 하는 5-10-5 MOE 윙 및 데옥시 갭을 갖는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 인간 트랜스티레틴 mRNA 수준의 억제
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
표 2
서열번호 2 및 서열번호 4를 표적으로 하는 5-10-5 MOE 윙 및 데옥시 갭을 갖는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 인간 트랜스티레틴 mRNA 수준의 억제
Figure pat00016
Figure pat00017
인간 트랜스티레틴 mRNA의 짧은 길이로 인해, 앰플리콘 올리고뉴클레오타이드를 피하기 위해 제1 프라이머 프로브 세트 RTS1396으로부터 멀리 떨어져서 제2 프라이머 프로브 세트를 설계하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 신규한 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3029(정방향 서열 CTTGCTGGACTGGTATTTGTGTCT, 본원에서 서열번호 161로 명명됨, 역방향 서열 AGAACTTTGACCATCAGAGGACACT, 본원에서 서열번호 162로 명명됨; 프로브 서열 CCCTACGGGCACCGGTGAATCCX, 본원에서 서열번호 163으로 명명됨)를 이용하여 시험관내에서 트랜스티레틴 mRNA에 대한 효과에 대해 시험하였다. 웰 당 10,000개 세포의 밀도의 배양된 HepG2 세포를 리포펙틴 시약을 이용하여 50 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 미처리된 대조 세포에 비한 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제시된다. 결과는 PBS 대조 세포 세트의 억제 퍼센트로 표 3에 제시된다.
표 3
프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용한 5-10-5 MOE 윙 및 데옥시 갭을 갖는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 인간 트랜스티레틴 mRNA 수준의 억제
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
신규한 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용한 억제 결과를 기초로 하여, 트랜스티레틴 mRNA의 50% 또는 이 초과의 억제를 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예 2: 마이크로워크(microwalk)에 의해 설계된 올리고뉴클레오타이드에 의한 HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 안티센스 억제
적어도 50%의 억제를 나타낸 표 3에 제시된 갭머를 기초로 하여 추가 갭머를 설계하였다. 표 3으로부터의 본래의 갭머의 약간 업스트림 및 다운스트림으로 이동된(즉, "마이크로워크") 갭머를 생성시킴으로써 상기 갭머를 설계하였다. 다양한 모티프, 예를 들어, 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 2-13-5 MOE, 및 4-11-5 MOE 모티프를 이용하여 갭머를 또한 생성시켰다. 이러한 갭머를 시험관내에서 시험하였다. 웰 당 10,000개 세포 밀도의 배양된 HepG2 세포를 리포펙틴 시약을 이용하여 50 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 트랜스트레틴 mRNA 수준을 측정하기 위해 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 미처리된 대조 세포에 비한 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제시된다. 결과는 표 4에 제시된다.
표 4의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 2-13-5 MOE 또는 4-11-5 MOE 갭머로 설계하였다. 표 4에서 별표(*)로 표시된 갭머는 갭머 ISIS 425650-425763을 마이크로워크를 통해 설계한 본래의 갭머이다. 5-10-5 갭머는 20개의 뉴클레오타이드 길이이며, 여기서 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오타이드로 구성되며, 이는 각각 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는 윙에 의해 양 측면(5' 방향 및 3' 방향)에 플랭킹되어 있다. 3-14-3 갭머는 20개의 뉴클레오타이드 길이이며, 여기서 중심 갭 세그먼트는 14개의 2'-데옥시뉴클레오타이드로 구성되며, 이는 각각 3개의 뉴클레오타이드를 포함하는 윙에 의해 양 측면(5' 방향 및 3' 방향)에 플랭킹되어 있다. 2-13-5 갭머는 20개의 뉴클레오타이드 길이이며, 여기서 중심 갭 세그먼트는 13개의 2'-데옥시뉴클레오타이드로 구성되며, 이는 각각 2개 및 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는 윙을 갖는 5' 및 3' 방향에 플랭킹되어 있다. 4-11-5 갭머는 20개의 뉴클레오타이드 길이이며, 여기서 중심 갭 세그먼트는 11개의 2'-데옥시뉴클레오타이드로 구성되며, 이는 각각 4개 및 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는 윙을 갖는 5' 및 3' 방향에 플랭킹되어 있다. 모티프(5-10-5, 3-14-3, 2-113-5, 및 4-11-5) 각각에 대해, 5' 윙 세그먼트 내의 각각의 뉴클레오타이드 및 3' 윙 세그먼트 내의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-MOE 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 시작 부위"는 갭머가 표적화되는 가장 5'의 뉴클레오타이드를 나타낸다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적화되는 가장 3'의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 표 4에 나열된 각각의 갭머는 서열번호 1(GENBANK 수탁번호 NM_000371.2)의 핵염기 481-619에 걸쳐 있는 표적 영역을 표적으로 한다.
표 4에 제시된 바와 같은, 하기와 같은 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 적어도 50%의 억제를 나타내었다: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425699, 425739, 304299, 425660, 425700, 425740, 420915, 420916, 425662, 425702, 420919, 425703, 420920, 425664, 425704, 425742, 420921, 425665, 425705, 425743, 420922, 425666, 425706, 420923, 420937, 420944, 425669, 425709, 425746, 425710, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425673, 425713, 425749, 425651, 425675, 425715, 425751, 304309, 425676, 425716, 425752, 420949, 425677, 425717, 425753, 420950, 425678, 425718, 425754, 4209 1, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 425756, 420953, 425681, 25721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425759, 425724, 425760, 425762, 304310, 425729, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 425768, 304313, 425734, 및 425769.
하기와 같은 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 적어도 60%의 억제를 나타내었다: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425697, 425737, 420913, 425658, 425698, 425738, 420914, 425659, 425739, 304299, 425740, 420915, 425702, 420919, 420920, 425742, 420921, 425665, 425705, 425706, 420923, 425746, 425711, 425747, 420948, 425712, 425748, 425651, 425715, 425751, 304309, 425716, 425752, 425677, 425717, 425753, 420950, 425718, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 420952, 425680, 425720, 420953, 425681, 425721, 425757, 420954, 425722, 425758, 420955, 425724, 425760, 425764, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425692, 425732, 425767, 425654, 425693, 425733, 304313, 및 425769.
하기와 같은 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 적어도 70%의 억제를 나타내었다: 304296, 425655, 425695, 425735, 425649, 425656, 425696, 425736, 420912, 425657, 425737, 420913, 425738, 420914, 425659, 304299, 420915, 420920, 425742, 425712, 425748, 425716, 425754, 420951, 425679, 425719, 425755, 425680, 425721, 425757, 425760, 425653, 425690, 425730, 425765, 304311, 425691, 425731, 425766, 304312, 425767, 425693, 및 304313.
하기와 같은 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 적어도 80%의 억제를 나타내었다: 304296, 425655, 425695, 425736, 420913, 425659, 304299, 420915, 425716, 425754, 425719, 425757, 425765, 및 425767.
하기와 같은 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 적어도 85%의 억제를 나타내었다: 420913, 425716, 425754, 및 425719.
하나의 갭머 ISIS 425719는 90% 억제를 나타내었다.
표 4
서열번호 1(GENBANK 수탁번호 NM_000371.2)을 표적으로 하는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 인간 트랜스티레틴 mRNA 수준의 억제
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
실시예 3: HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
인간 트랜스티레틴의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 실시예 2로부터의 갭머를 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개 세포 밀도로 플레이팅시키고, 표 5에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM 및 10000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 미처리된 대조 세포에 비한 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제시된다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 억제중간농도(IC50)가 또한 표 5에 제시되며, 이를 각각의 농도에서 달성된 트랜스티레틴 mRNA 발현의 억제 퍼센트에 비해 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 농도를 작도함으로써 계산하였고, 트랜스티레틴 mRNA 발현의 50% 억제가 대조군에 비해 달성된 올리고뉴클레오타이드의 농도를 확인하였다. 표 5에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 유의하게 감소되었다.
표 5
전기천공을 이용한 HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00027
실시예 2로부터의 갭머를 또한 트랜스펙션 시약 리포펙틴을 이용하여 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 처리하였다. 세포를 웰 당 10,000개 세포 밀도로 플레이팅시키고, 표 6에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 6에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 유의하게 감소되었다.
표 6
리포펙틴 시약을 이용한 HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00028
실시예 4: HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
실시예 3으로부터 선택된 갭머를 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 7에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 0.0617 μM, 0.1852 μM, 0.5556 μM, 1.6667 μM 및 5 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 7에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
표 7
전기천공을 이용한 HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00029
실시예 5: Hep3B 세포에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
인간 트랜스티레틴의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 실시예 4로부터의 갭머를 Hep3B 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 8에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 0.0206 μM, 0.062 μM, 0.185 μM, 0.556 μM, 1.667 μM 및 5 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS1396을 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 8에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 IC50이 또한 표 8에 제시된다.
표 8
전기천공을 이용한 Hep3B 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00030
실시예 6: 인간 트랜스티레틴 - 트랜스제닉 마우스 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
인간 트랜스티레틴-트랜스제닉 마우스의 일차 간세포에서 실시예 5로부터의 갭머를 다양한 용량으로 시험하였다. ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312 및 ISIS 420951(실시예 2 참조)을 또한 동일 배양 조건하에서 상기 갭머와 함께 재시험하였다. 세포를 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 9에 특정된 바와 같이 사이토펙틴을 이용하여 18.75 nM, 37.5 nM, 75 nM, 150 nM 및 300 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS1396을 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 9에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
표 9
사이토펙틴을 이용한 마우스 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00031
실시예 7: HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
실시예 6으로부터의 갭머를 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 10에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 0.062 μM, 0.185 μM, 0.556 μM, 1.66 μM 및 5000 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS1396을 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 10에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
표 10
전기천공을 이용한 HepG2 세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00032
실시예 8: 인간 트랜스티레틴 - 트랜스제닉 마우스 일차 간세포에서의 인간 트랜스트레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
인간 트랜스티레틴-트랜스제닉 마우스의 일차 간세포에서 실시예 6으로부터의 갭머를 또한 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 11에 특정된 바와 같이 사이토펙틴을 이용하여 5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM 및 80 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 11에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
표 11
사이토펙틴을 이용한 마우스 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00033
갭머를 또한 트랜스펙션 작용제로서 전기천공을 이용하여 시험하였다. 세포를 웰 당 35,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 12에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 148.148 nM, 444.444 nM, 1,333.333 nM, 4,000 nM 및 12,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다.
표 12
전기천공을 이용한 마우스 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00034
실시예 9: 시노몰구스 원숭이 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
실시예 6으로부터의 갭머를 또한 시노몰구스 원숭이의 일차 간세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 35,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 13에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 1,250 nM, 2,500 nM, 5,000 nM, 10,000 nM 및 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS1396을 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 13에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리된 간세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
NCBI 데이터베이스에서 완전한 시노몰구스 원숭이 유전자 서열의 부재하에서, 올리고뉴클레오타이드를 레수스 원숭이 유전자 서열에 대한 교차-반응성에 대해 시험하였는데, 이는 상기 두 종이 동일 속(genus) '마카카(Macaca)'로부터 유래되기 때문이다. 인간 올리고뉴클레오타이드는 본원에서 서열번호 4(GENBANK 수탁번호 NW_001105671.1로부터 추출된 엑손 1-4)로 명명된 레수스 원숭이 트랜스티레틴 유전자와 교차-반응한다. '미스매치'는 인간 올리고뉴클레오타이드와 레수스 원숭이 트랜스티레틴 유전자 사이의 미스매치의 수를 나타내고, 'n/a'는 인간 올리고뉴클레오타이드가 레수스 원숭이 트랜스티레틴 유전자와 3개 이상의 미스매치를 갖고, 이에 따라 레수스 원숭이 트랜스티레틴 유전자와 교차 반응하지 않는 것을 나타낸다.
표 13
전기천공을 이용한 레수스 원숭이 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00035
실시예 10: 인간 트랜스티레틴 - 트랜스제닉 마우스에서의 인간 트랜스티레틴의 생체내 억제
트랜스티레틴 mRNA의 유의한 억제를 나타내는 실시예 6으로부터의 갭머를 인간 트랜스티레틴 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 시험하였고, 갭머의 효능을 평가하였다.
처리
4마리의 hTTR 트랜스제닉 암컷 마우스의 15개의 군 각각에 4주 동안 1주일에 2회 피하로 25 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 304311, ISIS 304312, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425653, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, ISIS 425755, 또는 ISIS 425757을 투여하였다. 4마리의 암컷 hTTR 트랜스제닉 마우스의 또 다른 군에 4주 동안 1주일에 2회 25 ㎎/㎏의 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, 본원에서 서열번호 165로 명명됨)을 주사하였다. 4마리의 hTTR 트랜스제닉 암컷 마우스의 또 다른 군에 4주 동안 1주일에 2회 PBS를 피하 주사하였다. 마우스에 대조군으로 제공되는 PBS를 주사하였다. 혈장 트랜스티레틴 수준 분석을 위해 0, 1, 2, 3, 및 4주에서 모든 군으로부터 혈액 샘플을 수거하였다. 마지막 투여 2일 후에 마우스를 희생시키고, 표적 mRNA 분석을 위해 간을 수거하였다.
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하여 트랜스티레틴의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과를 PBS 대조군에 비한 인간 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 14에 제시된 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인간 트랜스티레틴 mRNA의 유의한 감소를 발생시켰다. 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923을 이용한 처리는 예상된 바와 같이 트랜스티레틴의 유의한 감소를 발생시키지 않았다.
표 14
PBS 대조군에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 간에서의 인간 트랜스티레틴 mRNA의 억제
Figure pat00036
단백질 분석
인간 트랜스티레틴 단백질 수준을 항-트랜스티레틴 폴리클로날 항체(Abcam Ab37774) 및 양 항-TTR 호스라디쉬 퍼옥시다제 검출 항체(Abcam cat. no. 35217)를 이용하여 ELISA에 의해 트랜스제닉 마우스 혈장에서 측정하였다. ImmunoPure(등록상표) TMB SubstrateKit에 의해 색 반응을 발달시키고, 미세역가 플레이트 분광광도계를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전 및 7, 14 및 28일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 15에 제공되며, 이는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에서의 단백질 수준의 시간 의존적 감소를 나타낸다.
표 15
투여 전 수준에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 혈장에서의 인간 트랜스티레틴 단백질의 억제
Figure pat00037
체중 및 기관 중량
마우스의 체중을 투여 전 및 처리 기간 종료시에 측정하였다. 체중이 표 16에 제공되며, 이는 처리 시작 전에 수득된 PBS 대조 중량에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 퍼센트로 표 16에 제공된다. 표 16에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 결과로서 체중 또는 기관 중량에서 유의한 변화가 없었다.
표 16
안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 트랜스제닉 마우스의 체중 및 기관 중량에서의 변화 퍼센트
Figure pat00038
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 17에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 17에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 17
트랜스제닉 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00039
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN)의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 18에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다. 데이터는 트랜스티레틴의 안티센스 억제가 상기 트랜스제닉 마우스에서 BUN 수준에 대해 효과가 없는 것을 나타낸다.
표 18
트랜스제닉 마우스의 신장에서의 BUN에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00040
실시예 11: CD1 마우스에서 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내약성
CD1(등록상표) 마우스(Charles River, MA)는 안전성 및 효능 시험에 종종 이용되는 다목적 마우스 모델이다. 마우스를 실시예 10에 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 시험하였고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
8마리의 CD1 마우스 군 각각에 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, 및 ISIS 425755를 피하 주사하였다. 각 군으로부터의 4마리의 마우스를 처리 기간 중 2주 및 6주에 평가하였다. 각 시점에서의 마지막 투여 3일 후, 체중을 측정하고, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관 및 혈장을 수거하였다.
체중 및 기관 중량
마우스의 체중을 투여 전 및 각 처리 기간의 종료(2주 및 6주)에서 측정하였다. 체중은 표 19 및 20에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 19 및 20에 제공된다.
표 19
2주에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 CD1 마우스의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00041
표 20
6주에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 CD1 마우스의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00042
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 21 및 22에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 21 및 22에 제공된다.
표 21
2주에서의 CD1 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00043
표 22
6주에서의 CD1 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00044
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 23 및 24에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 23
2주에서의 CD1 마우스의 신장에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00045
표 24
6주에서의 CD1 마우스의 신장에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00046
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적율(HCT), 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구혈색소량(MCH), 및 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 측정 및 분석뿐만 아니라 차동 혈액 세포 수의 측정, 예를 들어, WBC(호중구, 림프구, 및 단핵구), RBC, 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 Antech Diagnostics에 보냈다. 결과가 표 25-28에 제공된다. 표에 제공된 백분율은 PBS 대조군에 비한 전체 혈액 세포 수에서의 변화 퍼센트를 나타낸다. PBS 대조군의 70% 미만의 혈소판 수의 감소 또는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구를 위해 선택하였다.
표 25
2주에서의 CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00047
표 26
6주에서의 CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00048
표 27
2주에서의 CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 차동 혈액 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00049
표 28
6주에서의 CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 차동 혈액 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00050
실시예 12: CD1 마우스 간에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 반감기의 측정
CD1 마우스를 실시예 11에 기재된 연구로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 올리고뉴클레오타이드 반감기뿐만 아니라 간으로부터의 올리고뉴클레오타이드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
12마리의 CD1 마우스 군 각각에 2주 동안 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, 및 ISIS 425755를 피하 주사하였다. 각 군으로부터의 4마리의 마우스를 최종 투여 3일, 28일 및 56일 후에 희생시켰다. 분석을 위해 간을 수거하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오타이드의 농도뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(분해된 형태를 포함함)를 측정하였다. 사용되는 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출 후의 고상 추출로 구성되는 이전에 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변형이다. 추출 전에 내부 표준(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTCTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호 166로 명명됨)을 첨가하였다. 약 1.14 ㎍/g의 최저 정량한계(lower limit of quantitation)(LLOQ)를갖는 교정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다. 이후, WinNonlin 소프트웨어(PHARSIGHT)를 이용하여 반감기를 계산하였다.
결과가 표 29 및 30에 제공되고, 간 조직 g 당 ㎍(㎍/g)으로 표현된다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 반감기가 표 31에 제공된다. 11-34일 이내의 반감기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구를 위해 선택하였다.
표 29
CD1 마우스의 간에서의 전장 올리고뉴클레오타이드 농도(㎍/g)
Figure pat00051
표 30
CD1 마우스의 간에서의 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(㎍/g)
Figure pat00052
표 31
CD1 마우스의 간에서의 올리고뉴클레오타이드의 반감기(일)
Figure pat00053
실시예 13: 스프라그 -돌리 래트에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내약성
스프라그-돌리 래트를 실시예 11 및 12에 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
래트의 체중, 전혈구수 및 차동 혈액 수뿐만 아니라 소변 단백질/크레아티닌 비를 투여 전에 평가하였다. 4마리의 스프라그-돌리 래트 군 각각에 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, 및 ISIS 425755를 피하 주사하였다. 각 시점에서의 마지막 투여 3일 후, 체중을 측정하고, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관 및 혈장을 수거하였다.
체중 및 기관 중량
래트의 체중을 투여 전 및 처리 기간의 종료에서 측정하였다. 체중은 표 32에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 32에 제공된다.
표 32
안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 스프라그-돌리 래트의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00054
표 32에 제시된 바와 같이, 특정 화합물은 비장 중량에서 4배 미만의 증가를 나타내었다.
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 33에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 33에 제공된다.
표 33
스프라그-돌리 래트의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00055
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 34에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다. 전체 소변 단백질 대 크레아티닌의 비를 또한 평가하였고, 표 35에 제시된다.
표 34
스프라그-돌리 래트의 신장에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00056
표 35
스프라그-돌리 래트의 신장에서의 전체 소변 단백질/크레아티닌에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00057
표 34 및 35에 제시된 바와 같이, 특정 화합물은 상기 래트의 신장에서 전체 소변 단백질/크레아티닌에서 7배 미만의 증가를 나타내었다. 더욱이, 특정 화합물은 상기 래트의 신장에서 전체 소변 단백질/크레아티닌에서 6배 미만의 증가를 나타내었다.
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적율(HCT), 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구혈색소량(MCH), 및 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 측정 및 분석뿐만 아니라 차동 혈액 세포 수의 측정, 예를 들어, WBC(호중구, 림프구, 및 단핵구), RBC, 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 Antech Diagnostics에 보냈다. 결과는 표 36 및 37에 제공된다. 표에 제공된 백분율은 PBS 대조군에 비한 전체 혈액 세포 수에서의 변화 퍼센트를 나타낸다.
표 36
스프라그-돌리 래트에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00058
표 37
스프라그-돌리 래트에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00059
실시예 14: 스프라그 -돌리 래트 간 및 신장에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도의 약동학 연구
스프라그 돌리 래트를 실시예 13에 기재된 연구로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 올리고뉴클레오타이드 반감기뿐만 아니라 간 및 신장으로부터의 올리고뉴클레오타이드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
4마리의 스프라그 돌리 래트 군 각각에 2주 동안 1주일에 2회 20 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 304309, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425655, ISIS 425656, ISIS 425679, ISIS 425695, ISIS 425736, ISIS 425737, 및 ISIS 425755를 피하 주사하였다. 마지막 투여 3일 후, 래트를 희생시키고, 분석을 위해 간 및 신장을 수거하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오타이드의 농도뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(분해된 형태를 포함함)를 측정하였다. 사용되는 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출 후의 고상 추출로 구성되는 이전에 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변형이다. 추출 전에 내부 표준(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호 166로 명명됨)을 첨가하였다. 약 1.14 ㎍/g의 최저 정량한계(LLOQ)를 갖는 교정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다. 결과는 표 38 및 39에 제공되고, 간 또는 신장 조직의 g 당 μg(㎍/g)으로 표현된다. 전장 올리고뉴클레오타이드의 신장 대 간 비를 또한 계산하였고, 표 38에 제공된다.
표 38
스프라그-돌리 래트의 간 및 신장에서의 전장 올리고뉴클레오타이드 농도(μg/g) 및 비
Figure pat00060
표 39
스프라그-돌리 래트의 간 및 신장에서의 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(μg/g)
Figure pat00061
실시예 15: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 트랜스티레틴의 생체내 용량 의존적 억제
인간 트랜스티레틴 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 실시예 14에 기재된 연구로부터 선택된 증가하는 용량의 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 투여하여, 상기 마우스에서 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 억제 효과를 평가하였다.
처리
4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리) 군 각각에 4주 동안 1주일에 2회 4 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 또는 25 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420951, ISIS 425679, ISIS 425736, ISIS 425737, 또는 ISIS 425755를 피하 주사하였다. 4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리)의 한 군에 4주 동안 1주일에 2회 25 ㎎/㎏의 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923을 피하 주사하였다. 4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리)의 한 대조군에 4주 동안 1주일에 2회 PBS를 피하 주사하였다. 혈장 샘플을 0, 7, 14, 21 및 28일에 각 군으로부터 수집하였다. 마지막 투여 2일 후, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관을 수거하였다.
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하는 트랜스티레틴의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군에 비한 인간 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제공된다. 표 40에 제시된 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인간 트랜스티레틴 mRNA의 유의한 용량 의존적 감소를 발생시켰다. 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923을 이용한 처리는 예상된 바와 같이 트랜스티레틴의 유의한 감소를 발생시키지 않았다.
표 40
PBS 대조군에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 간에서의 인간 트랜스티레틴 mRNA의 억제
Figure pat00062
단백질 분석
인간 트랜스티레틴 단백질 수준을 항-트랜스티레틴 폴리클로날 항체(Abcam Ab37774) 및 양 항-TTR 호스라디쉬 퍼옥시다제 검출 항체(Abcam cat. no. 35217)를 이용하여 ELISA에 의해 트랜스제닉 마우스 혈장에서 측정하였다. ImmunoPure(등록상표) TMB SubstrateKit에 의해 색 반응을 발달시키고, 미세역가 플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전 및 7, 14, 21 및 28일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 41에 제공되며, 이는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에서의 단백질 수준의 시간 의존적 및 용량 의존적 감소를 나타낸다.
표 41
투여 전 수준에 비한 트랜스제닉 마우스 혈장에서의 인간 트랜스티레틴 단백질의 억제
Figure pat00063
체중 및 기관 중량
마우스의 체중을 투여 전 및 처리 기간의 종료에서 측정하였다. 체중은 표 42에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 42에 제공된다.
표 42
안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 트랜스제닉 마우스의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00064
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 43에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 43에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 43
트랜스제닉 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00065
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN)의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 44에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 44
트랜스제닉 마우스의 신장에서의 BUN에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00066
실시예 16: 인간 트랜스티레틴 - 트랜스제닉 마우스에서의 인간 트랜스티레틴의 생체내 억제
표 4로부터의 5-10-5 MOE 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, 및 ISIS 420959. 트랜스티레틴 mRNA의 65% 또는 이 초과의 억제를 나타낸 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였고, 인간 트랜스티레틴 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 시험하였다. ISIS 420951에 대한 중첩 서열(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG(서열번호 116))을 갖고, 다양한 모티프를 갖는 추가 올리고뉴클레오타이드를 또한 트랜스제닉 마우스에서 시험하기 위해 설계하였다. 이러한 추가 올리고뉴클레오타이드는 ISIS 450518(TTTTATTGTCTCTGCCTG(서열번호 5-8-5 MOE(서열번호 167)), ISIS 450519(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 6-8-6 MOE(서열번호 116)), ISIS 450520(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 3-10-7 MOE(서열번호 116)), ISIS 450521(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 7-10-3 MOE(서열번호 116)), ISIS 450522(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 2-10-8 MOE(서열번호 116)), 및 ISIS 450523(GTTTTATTGTCTCTGCCTGG, 8-10-2 MOE(서열번호 116))였다.
처리
4마리의 hTTR 트랜스제닉 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리) 군 각각에 4주 동안 1주일에 2회 25 ㎎/㎏의 ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522, 또는 ISIS 425523을 피하 투여하였다. 4마리의 hTTR 트랜스제닉 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리)의 대조군에 4주 동안 1주일에 2회 PBS를 피하 주사하였다. 혈장 트랜스티레틴 수준 분석을 위해 0, 14 및 28일에 모든 군으로부터 혈액 샘플을 수거하였다. 마우스를 마지막 투여 2일 후에 희생시키고, 표적 mRNA 분석을 위해 간을 수거하였다.
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하는 트랜스티레틴의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군에 비한 인간 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제공된다. 표 45에 제시된 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인간 트랜스티레틴 mRNA의 유의한 감소를 발생시켰다.
표 45
PBS 대조군에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 간에서의 인간 트랜스티레틴 mRNA의 억제
Figure pat00067
단백질 분석
인간 트랜스티레틴 단백질 수준을 항-트랜스티레틴 폴리클로날 항체(Abcam Ab37774) 및 양 항-TTR 호스라디쉬 퍼옥시다제 검출 항체(Abcam cat. no. 35217)를 이용하여 ELISA에 의해 트랜스제닉 마우스 혈장에서 측정하였다. ImmunoPure(등록상표) TMB SubstrateKit에 의해 색 반응을 발달시키고, 미세역가 플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전 및 7, 14, 및 28일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 46에 제공되며, 이는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에서의 단백질 수준의 시간 의존적 감소를 나타낸다.
표 46
투여 전 수준에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 혈장에서의 인간 트랜스티레틴 단백질의 억제
Figure pat00068
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 47에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 47에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 47
트랜스제닉 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00069
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN)의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 48에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 48
트랜스제닉 마우스의 신장에서의 BUN에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00070
실시예 17: CD1 마우스에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내약성
CD1 마우스를 실시예 16으로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
8마리의 CD1 마우스 군 각각에 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 304313, ISIS 420913, ISIS 420919, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420937, ISIS 420944, ISIS 420947, ISIS 420949, ISIS 420950, ISIS 420951, ISIS 420952, ISIS 420953, ISIS 420955, ISIS 420957, ISIS 420959, ISIS 425518, ISIS 425519, ISIS 425520, ISIS 425521, ISIS 425522, 또는 ISIS 425523를 피하 주사하였다. 각 시점에서의 마지막 투여 3일 후, 체중을 측정하고, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관 및 혈장을 수거하였다.
체중 및 기관 중량
마우스의 체중을 투여 전 및 각 처리 기간의 종료(2주 및 6주)에서 측정하였다. 체중은 표 49에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 49에 제공된다.
표 49
6주에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 CD1 마우스의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00071
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 50에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 50에 제공된다.
표 50
CD1 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00072
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 51에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 51
CD1 마우스의 신장에서의 BUN에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00073
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적율(HCT), 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구혈색소량(MCH), 및 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 측정 및 분석뿐만 아니라 차동 혈액 세포 수의 측정, 예를 들어, WBC(호중구, 림프구, 및 단핵구), RBC, 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 Antech Diagnostics에 보냈다. 결과가 표 52 및 53에 제공된다. 표에 제공된 백분율은 PBS 대조군에 비한 전체 혈액 세포 수에서의 변화 퍼센트를 나타낸다.
표 52
CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00074
표 53
CD1 마우스에서의 PBS 대조군에 비한 차동 혈액 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00075
실시예 18: 스프라그 -돌리 래트에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내약성
실시예 17에 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 스프라그-돌리 래트에서 시험하였고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
래트의 체중, 전혈구 수 및 차동 혈구 수뿐만 아니라 소변 단백질/크레아티닌 비를 투여 전에 평가하였다. 4마리의 스프라그-돌리 래트 군 각각에 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 및 ISIS 420959를 피하 주사하였다. 각 시점에서의 마지막 투여 3일 후, 체중을 측정하고, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관 및 혈장을 수거하였다.
체중 및 기관 중량
래트의 체중을 투여 전 및 처리 기간의 종료에서 측정하였다. 체중은 표 54에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 54에 제공된다.
표 54
안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 스프라그-돌리 래트의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00076
표 54에 제시된 바와 같이, 화합물은 상기 래트의 기관 중량에서 10배 미만의 증가를 나타내었다. 더욱이, 특정 화합물은 상기 래트의 기관 중량에서 7배 미만의 증가를 나타내었다. 특정 화합물은 상기 래트의 기관 중량에서 6배 미만의 증가를 나타내었다. 특정 화합물은 상기 래트의 기관 중량에서 5배 미만의 증가를 나타내었다.
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 55에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 55에 제공된다.
표 55
스프라그-돌리 래트의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00077
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 56에 제시되고, ㎎/dL로 표현된다. 전체 소변 단백질 대 크레아티닌의 비를 또한 평가하였고, 표 56에 제시된다.
표 56
스프라그-돌리 래트의 신장에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00078
표 57
스프라그-돌리 래트의 신장에서의 전체 소변 단백질/크레아티닌에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00079
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적율(HCT), 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구혈색소량(MCH), 및 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 측정 및 분석뿐만 아니라 차동 혈액 세포 수의 측정, 예를 들어, WBC(호중구, 림프구, 및 단핵구), RBC, 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 Antech Diagnostics에 보냈다. 결과가 표 58 및 59에 제공된다. 표에 제공된 백분율은 PBS 대조군에 비한 전체 혈액 세포 수에서의 변화 퍼센트를 나타낸다.
표 58
스프라그-돌리 래트에서의 PBS 대조군에 비한 전혈구 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00080
표 59
스프라그-돌리 래트에서의 PBS 대조군에 비한 차동 혈액 세포 수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(%)
Figure pat00081
실시예 19: 스프라그 -돌리 래트 간 및 신장에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도의 반감기의 약동학 연구
스프라그 돌리 래트를 실시예 18에 기재된 연구로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 올리고뉴클레오타이드 반감기뿐만 아니라 간 및 신장으로부터의 올리고뉴클레오타이드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
4마리의 스프라그 돌리 래트 군 각각에 2주 동안 1주일에 2회 20 ㎎/㎏의 ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 및 ISIS 420959를 피하 주사하였다. 마지막 투여 3일 후, 래트를 희생시키고, 분석을 위해 간 및 신장을 수거하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오타이드의 농도뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(분해된 형태를 포함함)를 측정하였다. 사용되는 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출 후의 고상 추출로 구성되는 이전에 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변형이다. 추출 전에 내부 표준(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호 166로 명명됨)을 첨가하였다. 약 1.14 ㎍/g의 최저 정량한계(LLOQ)를 갖는 교정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다. 결과는 표 60 및 61에 제공되고, 간 또는 신장 조직의 g 당 μg(㎍/g)으로 표현된다. 올리고뉴클레오타이드 농도의 신장 대 간 비를 또한 계산하였고, 표 60 및 61에 제공된다.
표 60
스프라그-돌리 래트의 간 및 신장에서의 전장 올리고뉴클레오타이드 농도(μg/g) 및 비
Figure pat00082
표 61
스프라그-돌리 래트의 간 및 신장에서의 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(μg/g)
Figure pat00083
실시예 20: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 트랜스티레틴의 생체내 용량 의존적 억제
실시예 16-19에서 입증된 바와 같이 우수한 효능 및 내약성을 나타낸 ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420957 및 ISIS 420959를 인간 트랜스티레틴 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서의 용량 의존적 표적 넉다운(knockdown)의 연구를 위해 선택하였다. 90% 또는 그 초과의 표적 넉다운을 나타내었으나, 또한 CD1 마우스에서 독성을 나타낸 ISIS 420950 및 ISIS 420955(실시예 16-19)을 또한 비교를 위해 본 연구에서 선택하였다.
처리
4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리) 군 각각에 4주 동안 1주일에 2회 4 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 또는 25 ㎎/㎏의 ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 또는 ISIS 420959를 피하 주사하였다. 4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리)의 한 군에 4주 동안 1주일에 2회 25 ㎎/㎏의 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923을 피하 주사하였다. 4마리의 마우스(수컷 2마리 및 암컷 2마리)의 한 대조군에 4주 동안 1주일에 2회 PBS를 피하 주사하였다. 혈장 샘플을 0, 14 및 28일에 각 군으로부터 수집하였다. 마지막 투여 2일 후, 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 기관을 수거하였다.
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하는 트랜스티레틴의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군에 비한 인간 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제공된다. 표 62에 제시된 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인간 트랜스티레틴 mRNA의 유의한 용량 의존적 감소를 발생시켰다. 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 141923을 이용한 처리는 예상된 바와 같이 트랜스티레틴의 유의한 감소를 발생시키지 않았다.
표 62
PBS 대조군에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 간에서의 인간 트랜스티레틴 mRNA의 억제
Figure pat00084
단백질 분석
인간 트랜스티레틴 단백질 수준을 항-트랜스티레틴 폴리클로날 항체(Abcam Ab37774) 및 양 항-TTR 호스라디쉬 퍼옥시다제 검출 항체(Abcam cat. no. 35217)를 이용하여 ELISA에 의해 트랜스제닉 마우스 혈장에서 측정하였다. ImmunoPure(등록상표) TMB SubstrateKit에 의해 색 반응을 발달시키고, 미세역가 플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전 및 7, 14, 21 및 28일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 63에 제공되며, 이는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에서의 단백질 수준의 시간 의존적 및 용량 의존적 감소를 나타낸다.
표 63
투여 전 수준에 비한 hTTR 트랜스제닉 마우스 혈장에서의 인간 트랜스티레틴 단백질의 억제
Figure pat00085
체중 및 기관 중량
마우스의 체중을 투여 전 및 처리 기간의 종료에서 측정하였다. 체중은 표 64에 제공되고, 처리 시작 전에 측정된 PBS 대조군 체중에 비한 증가 퍼센트로 표현된다. 간, 비장 및 신장 중량을 연구 종료시에 측정하였고, 이는 또한 PBS 대조군의 각각의 기관 중량에 비한 변화 백분율로 표 64에 제공된다.
표 64
안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후의 트랜스제닉 마우스의 체중 및 기관 중량의 변화(%)
Figure pat00086
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 트랜스아미나제의 혈장 농도를 측정하였다. ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 65에 제공되고, IU/L로 표현된다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 동일 임상 화학 분석기를 이용하여 측정하였고, 결과는 또한 표 65에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 65
트랜스제닉 마우스의 간에서의 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00087
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 우레아 질소(BUN)의 혈장 농도를 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, 뉴욕주의 멜빌시에 소재)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 66에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 66
트랜스제닉 마우스의 신장에서의 BUN에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00088
실시예 21: 시노몰구스 원숭이 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용량 반응 확인
CD1 마우스 및 스프라그 돌리 래트에서 내약성(실시예 17-19에 기재된 연구)뿐만 아니라 트랜스제닉 마우스에서 효능(실시예 16 및 20에 기재된 연구)을 나타내는 갭머를 선택하였고, 시노몰구스 원숭이의 일차 간세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 35,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 표 67에 특정된 바와 같이 전기천공을 이용하여 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1,250 nM 2,500 nM, 5,000 nM, 10,000 nM 및 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 분리시키고, 트랜스티레틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 트랜스티레틴 프라이머 프로브 세트 RTS1396을 mRNA 수준을 측정하는데 사용하였다. 트랜스티레틴 mRNA 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과를 미처리된 대조군 세포에 비한 트랜스티레틴 억제 퍼센트로 제공하였다. 표 67에 예시된 바와 같이, 트랜스티레틴 mRNA 수준은 본원에서 서열번호 4로 명명된 레수스 원숭이 트랜스티레틴 유전자(GENBANK 수탁번호 NW_001105671.1로부터 추출된 엑손 1-4)와 교차-반응하는 ISIS 올리고뉴클레오타이드 모두로 처리된 간세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
표 67
전기천공을 이용한 시노몰구스 원숭이 일차 간세포에서의 인간 트랜스티레틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pat00089
실시예 22: 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점성도의 측정
40 cP를 초과하는 점성도를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 스크리닝하기 위한 목적으로 실시예 21에 기재된 연구로부터의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점성도를 측정하였다. 40 cP를 초과하는 점성도를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 임의의 피검체에게 투여되기에는 너무 점성이다.
ISIS 올리고뉴클레오타이드(32-35 ㎎)를 유리 바이얼로 칭량하고, 120 μL의 물을 첨가하고, 50℃에서 바이얼을 가열함으로써 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 용액 중에 용해시켰다. 사전-가열된 샘플의 일부(75 μL)를 마이크로점도계(Cambridge)로 피펫으로 옮겼다. 마이크로점도계의 온도를 25℃로 설정하였고, 샘플의 점성도를 측정하였다. 사전-가열된 샘플의 또 다른 일부(20 μL)를 85℃에서 260 nM에서의 UV 판독(Cary UV 기계)을 위해 10 mL의 물로 피펫으로 옮겼다. 결과는 표 68에 제공되며, 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드 용액은 상기 언급된 기준하에서 점성도가 최적임을 나타낸다.
표 68
인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점성도 및 농도
Figure pat00090
실시예 23: CD1 마우스 간에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 반감기의 측정
CD1 마우스를 실시예 22에 기재된 연구로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고, 올리고뉴클레오타이드 반감기뿐만 아니라 간으로부터의 올리고뉴클레오타이드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
12마리의 CD1 마우스 군 각각에 2주 동안 1주일에 2회 50 ㎎/㎏의 ISIS 420913, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 및 ISIS 420959를 피하 주사하였다. 각 군으로부터의 4마리의 마우스를 최종 투여 3일, 28일 및 56일 후에 희생시켰다. 분석을 위해 간을 수거하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오타이드의 농도뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(분해된 형태를 포함함)를 측정하였다. 사용되는 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출 후의 고상 추출로 구성되는 이전에 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변형이다. 추출 전에 내부 표준(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호 166로 명명됨)을 첨가하였다. 약 1.14 ㎍/g의 최저 정량한계(LLOQ)를 갖는 교정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다. 이후, WinNonlin 소프트웨어(PHARSIGHT)를 이용하여 반감기를 계산하였다.
결과가 표 69에 제공되고, 간 조직의 g 당 ㎍(㎍/g)으로 표현된다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 반감기는 표 70에 제공된다.
표 69
CD1 마우스의 간에서의 전장 올리고뉴클레오타이드 농도(㎍/g)
Figure pat00091
표 70
CD1 마우스의 간에서의 올리고뉴클레오타이드의 반감기(일)
Figure pat00092
실시예 24: 시노몰구스 원숭이에서의 인간 트랜스티레틴을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과
시노몰구스 원숭이에 실시예 21, 22 및 23에 기재된 연구로부터의 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드효능 및 내약성뿐만 아니라 이의 간 및 신장에서의 약동학 프로파일을 평가하였다.
처리
연구 전, 원숭이를 30일의 기간 동안 격리하여 두었고, 이 기간 동안 비정상 또는 병든 원숭이를 스크리닝하기 위해 혈청 화학 및 혈액학의 표준 패널, 충란 및 충체에 대한 배설물 샘플의 검사, 및 결핵 시험을 수행하였다. 4마리의 무작위적으로 지정된 수컷 시노몰구스 원숭이의 9개 군 각각에 처음 1주 동안 1주일에 3회, 및 이후 다음 11주 동안 1주일에 2회 25 ㎎/㎏의 ISIS 304299, ISIS 420915, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957, 또는 ISIS 420959를 피하 주사하였다. 4마리의 시노몰구스 원숭이의 대조군에 처음 1주 동안 1주일에 3회 및 이후 다음 11주 동안 1주일에 2회 PBS를 피하 주사하였다. 혈액 샘플을 처리 5일 전뿐만 아니라 연구 기간의 다양한 날에 수거하고, 분석하였다. 동물을 혈액 수집 적어도 13시간 전(밤새)에 금식시켰다. 마지막 투여 48시간 후인 86일에 모든 군을 최종적으로 희생시켰다.
연구 기간 동안, 원숭이를 매일 질병 또는 고통의 증후에 대해 관찰하였다. 처리에 대해 유해효과를 나타내는 임의의 동물을 분리시키고, 수의사 및 연구 감독자에게 맡겼다. ISIS 420955로 처리된 모든 동물을 이러한 군에서의 2마리의 원숭이에 의해 나타난 질병의 증상으로 인해 31일에 연구로부터 분리시켰다. 유사하게, ISIS 420957 및 ISIS 420950으로 처리된 군으로부터의 각 1마리의 원숭이를 질병의 증후로 인해 각각 44일 및 76일에 연구로부터 분리시켰다.
억제 연구
RNA 분석
86일에, 프라이머 프로브 세트 RTS3029를 이용하는 트랜스티레틴의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 사이클로필린으로 표준화된 PBS 대조군에 비한 트랜스티레틴의 억제 퍼센트로 제공된다. 유사한 결과가 RIBOGREEN(등록상표)을 이용한 표준화에 대해 수득되었다. 표 71에 제시된 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 PBS 대조군과 비교하여 트랜스티레틴 mRNA의 유의한 감소를 발생시켰다. 특히, ISIS 420915 및 ISIS 304299의 올리고뉴클레오타이드가 단일한 염기쌍 변화에 의해 서로 상이함에도 불구하고, ISIS 420915를 이용한 처리는 ISIS 304299를 이용한 처리보다 큰 TTR mRNA의 억제를 야기시켰다. ISIS 420955로 처리된 동물 데이터는 31일에 수집되었다.
표 71
PBS 대조군에 비한 시노몰구스 원숭이 간에서의 트랜스티레틴 mRNA의 억제
Figure pat00093
(*31일의 데이터)
단백질 분석
원숭이를 혈액 수집 전에 밤새 금식시켰다. 모든 이용가능한 동물로부터 약 1 mL의 혈액을 수집하였고, EDTA의 칼륨 염을 함유하는 튜브에 두었다. 튜브를 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)시켜 혈장을 수득하였다. 임상 분석기를 이용하여 혈장에서 트랜스티레틴 단백질 수준을 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전(-5일) 및 1, 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72, 및 86일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 72에 제공되고, 이는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에서의 단백질 수준의 시간 의존적 감소를 나타낸다. 최종 혈장 TTR 수준이 표 73에 제공되고, 이는 TTR 단백질 수준 감소와 TTR mRNA 억제 사이의 강한 상관관계를 나타낸다(표 71). 특히, ISIS 420915 및 ISIS 304299의 올리고뉴클레오타이드가 단일한 염기쌍 변화에 의해 서로 상이함에도 불구하고, ISIS 420915를 이용한 처리는 ISIS 304299를 이용한 처리보다 큰 TTR 혈장 단백질의 억제(76% 억제 대 47% 억제)를 야기시켰다.
표 72
투여 전 수준에 비한 시노몰구스 원숭이 혈장에서의 트랜스티레틴 단백질 수준 감소의 시간 경과
Figure pat00094
n/a= ISIS 420955로 처리된 동물에 대한 연구는 31일에 종료되었으며, 따라서 이후의 일에 대한 데이터는 이용가능하지 않다.
표 73
투여 전 수준에 비한 시노몰구스 원숭이 혈장에서의 86일의 트랜스티레틴 단백질 수준 감소
Figure pat00095
RBP4 단백질 수준을 또한 ELISA 키트를 이용하여 혈장에서 측정하였다. 혈장 샘플을 투여 전(-5일) 및 9, 16, 23, 30, 44, 58, 72, 및 86일에 수집하였다. 결과는 투여 전 수준에 비한 억제 퍼센트로 표현되어 표 74에 제공된다. ISIS 올리고뉴클레오타이드 중 일부(ISIS 420915, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955 및 ISIS 420959)는 TTR 감소와 동시에 단백질 수준에서의 시간 의존적 감소를 나타낸다. 최종 혈장 RBP4 수준이 표 75에 제공되고, 이는 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리에 대해 RBP4 및 TTR 단백질 수준 감소 사이의 강한 상관관계를 나타낸다(표 73). 특히, ISIS 420915 및 ISIS 304299의 올리고뉴클레오타이드가 단일한 염기쌍 변화에 의해 서로 상이함에도 불구하고, ISIS 420915를 이용한 처리는 ISIS 304299를 이용한 처리보다 큰 RBP4 혈장 단백질의 억제(63% 억제 대 19% 억제)를 야기시켰다.
표 74
투여 전 수준에 비한 시노몰구스 원숭이 혈장에서의 RBP4 단백질 수준 감소의 시간 경과
Figure pat00096
n/a= ISIS 420955로 처리된 동물에 대한 연구는 31일에 종료되었으며, 따라서 이후의 일에 대한 데이터는 이용가능하지 않다.
표 75
투여 전 수준에 비한 시노몰구스 원숭이 혈장에서의 86일의 RBP4 단백질 수준 감소
Figure pat00097
내약성 연구
체중 및 기관 중량 측정
동물의 전반적 건강에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 체중 및 기관 중량을 86일에 측정하였다. ISIS 420955로 처리된 동물에 대한 데이터를 31일에 수집하였다. 체중을 측정하고, 투여 전 수준에서의 체중과 비교하였다. 기관 중량을 측정하고, 처리군 중량을 상응하는 PBS 대조군 중량과 비교하였다. 데이터는 표 76에 제공된다.
표 76
투여 전 수준에 비한 시노몰구스 원숭이에서의 최종 체중 및 기관 중량 변화%
Figure pat00098
(*31일의 데이터)
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 혈액 샘플을 혈청 분리를 위해 임의의 항응고제를 함유하지 않는 튜브에 수집하였다. 튜브를 90분 동안 실온에서 유지시킨 후, 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)하여 혈청을 수득하였다. Toshiba 200FR NEO 화학 분석기(Toshiba Co., Japan)를 이용하여 트랜스아미나제의 농도를 측정하였다. 86일에 ALT(알라닌 트랜스아미나제) 및 AST(아스파테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였으며, 결과는 표 77에 제공되고, IU/L로 표현된다. 손상된 간 세포에 의해 증가된 양으로 합성되는 알칼리성 포스파타제가 또한 간 질병의 마커이며, 이를 유사하게 측정하였다. 간에서 합성되고, 염증의 마커로 작용하는 C-반응성 단백질(CRP)를 또한 86일에 유사하게 측정하였다. 알칼리성 포스파타제 및 CRP 데이터 둘 모두가 또한 표 77에 제공된다. 빌리루빈이 또한 간 대사 마커이며, 이를 유사하게 측정하였고, 이는 표 77에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
표 77
시노몰구스 원숭이 혈장에서의 간 대사 마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00099
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 혈액 샘플을 혈청 분리를 위해 임의의 항응고제를 함유하지 않는 튜브에 수집하였다. 튜브를 90분 동안 실온에서 유지시킨 후, 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)하여 혈청을 수득하였다. 86일에 Toshiba 200FR NEO 화학 분석기(Toshiba Co., Japan)를 이용하여 BUN 및 크레아티닌의 농도를 측정하였다. 결과는 표 78에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
연구 5일전, 및 이후 25 및 84일에 특수한 스테인레스-강철 우리 팬으로부터의 배출에 의해 소변 샘플을 수집하였다. Toshiba 200FR NEO 화학 분석기(Toshiba Co., Japan)를 이용하여 소변 전체 단백질 대 크레아티닌 비를 측정하였고, 결과가 표 79에 제공된다.
표 78
시노몰구스 원숭이에서의 혈장 BUN 및 크레아티닌 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00100
표 79
시노몰구스 원숭이에서의 소변 단백질 대 크레아티닌 비에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00101
n/a= ISIS 420955로 처리된 동물에 대한 연구는 31일에 종료되었으며, 따라서 이후의 일에 대한 데이터는 이용가능하지 않다.
혈액학
시노몰구스 원숭이에서의 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 임의의 염증 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 모든 연구 군으로부터 수집하였다. 약 0.5 mL의 혈액을 EDTA의 칼륨 염을 함유하는 튜브에 이용가능한 연구 동물 각각으로부터 수집하였다. 샘플을 ADVIA120 혈액학 분석기(Bayer, USA)를 이용하여 적혈구 세포(RBC) 수, 백혈구 세포(WBC) 수, 개별적 백혁구 세포 백분율, 예를 들어, 단핵구, 호중구, 림프구의 백분율뿐만 아니라 혈소판 수 및 적혈구용적율(%)에 대해 분석하였다. 데이터는 표 80에 제공된다.
표 80
시노몰구스 원숭이에서의 혈액학 파라미터에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과
Figure pat00102
염증 인자의 분석
염증과 관련된 인자에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 보체 C3 분석뿐만 아니라 사이토카인 수준의 측정을 위해 86일에 모든 이용가능한 동물로부터 혈액을 수집하였다. 보체 C3 분석을 위해, 혈액 샘플을 혈청 분리를 위해 항응고제를 함유하지 않는 튜브에 수집하였다. 튜브를 90분 동안 실온에서 유지시킨 후, 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)하여 혈청을 수득하였다. 자동화 분석기(Toshiba 200 FR NEO chemistry analyzer, Toshiba co., Japan)를 이용하여 보체 C3를 측정하였다. 데이터는 표 81에 제공되고, ㎎/dL로 표현된다.
사이토카인 수준 분석을 위해, 혈액을 혈장 분리를 위해 EDTA를 함유하는 튜브에 수집하였다. 이후, 튜브를 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)하여 혈청을 수득하였다. 케모카인 및 사이토카인 수준의 측정을 위해 혈장 샘플을 AushonBiosystems Inc.(Billerica, MA)에 보냈다. 각각의 영장류 항체를 이용하여 TNF-α의 수준을 측정하였고, 각각의 교차 반응 인간 항체를 이용하여 MIP-1α, MCP-1, 및 MIP-1β의 수준을 측정하였다. 측정을 처리 시작 5일 전, 및 3 및 86일에 수행하였다. 결과는 표 82-85에 제공된다.
표 81
시노몰구스 원숭이에서의 보체 C3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00103
표 82
시노몰구스 원숭이에서의 MCP-1에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00104
표 83
시노몰구스 원숭이에서의 TNF-α에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00105
표 84
시노몰구스 원숭이에서의 MIP-1α에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00106
표 85
시노몰구스 원숭이에서의 MIP-1β에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00107
응고 시험
응고 경로와 관련된 인자에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 응고에 대한 표준 시험을 이용하였다. 48시간의 기간에 걸쳐 원숭이로부터의 혈소판 결핍 혈장(platelet poor plasma)(PPP)을 이용하여 PT 및 aPTT를 측정하였다. PT 및 aPTT 값은 표 86 및 87에 제공되고, 초로 표현된다. 혈장에 대한 피브리노겐 수준을 또한 48시간의 기간에 걸쳐 정량하였고, 데이터는 표 88에 제공된다. 표 86-88에 제시된 바와 같이, PT, aPTT 및 피브리노겐은 PBS 대조군에 비해 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리된 원숭이에서 현저하게 변경되지 않았다.
표 86
PT에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(초)
Figure pat00108
표 87
aPTT에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(초)
Figure pat00109
표 88
피브리노겐에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(㎎/dL)
Figure pat00110
갑상선 패널 분석
갑상선 호르몬에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 원숭이를 밤새 금식시키고, 처리 시작 5일 전, 및 51 및 86일에 이용가능한 연구 동물 각각으로부터 3.5 mL의 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액 샘플을 혈청 분리를 위해 임의의 항응고제를 함유하지 않는 튜브에 유지시켰다. 튜브를 90분 동안 실온에서 유지시킨 후, 원심분리(실온에서 10분 동안 3000 rpm)하여 혈청을 수득하였다. 혈청 샘플을 갑상선 패널 분석을 위해 Emory University의 Biomarkers Core Laboratory(조지아주 애틀랜타시에 소재)에 보냈다. 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 결과가 표 89에 제공되고, μL/mL로 표현된다. 전체 및 유리 T3 호르몬에 대한 결과가 표 90 및 91에 제공된다. 전체 및 유리 T4 호르몬에 대한 결과가 표 92 및 93에 제공된다. 종합적으로, 갑상선 패널 분석은 모든 동물이 트랜스티레틴 발현 수준이 감소되는 경우에도 허용되는 호르몬 수준 내에서 유지된 것을 나타내었고, 이는 트랜스티레틴 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 호르몬 수준에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다.
표 89
TSH에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(μL/mL)
Figure pat00111
표 90
전체 T3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(ng/dL)
Figure pat00112
표 91
유리 T3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00113
표 92
전체 T4에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(ng/dL)
Figure pat00114
표 93
유리 T4에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리의 효과(pg/mL)
Figure pat00115
약동학 연구
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오타이드의 농도뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(분해된 형태를 포함함)를 측정하였다. 사용되는 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출 후의 고상 추출로 구성되는 이전에 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변형이다. 추출 전에 내부 표준(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호 166로 명명됨)을 첨가하였다. 약 1.14 ㎍/g의 최저 정량한계(LLOQ)를 갖는 교정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다. 신장 대 간에서의 농도의 비를 계산하였다. 결과는 표 94 및 95에 제공되고, 조직 g 당 ㎍(㎍/g)로 표현된다.
표 94
시노몰구스 원숭이의 간에서의 전장 올리고뉴클레오타이드 농도(㎍/g)
Figure pat00116
표 95
시노몰구스 원숭이의 간에서의 전체 올리고뉴클레오타이드 농도(㎍/g)
Figure pat00117
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Brett P. Monia Susan M. Freier Andrew M. Siwkowski <120> MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION <130> BIOL0123WO <150> 61/329,538 <151> 2010-04-29 <150> 61/405,163 <151> 2010-10-20 <160> 177 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 650 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg 60 ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc 120 tgatggtcaa agttctagat gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg 180 tgttcagaaa ggctgctgat gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt 240 ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg 300 aaatagacac caaatcttac tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag 360 aggtggtatt cacagccaac gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga 420 gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc 480 ctccagtgga cctgaaggac gagggatggg atttcatgta accaagagta ttccattttt 540 actaaagcag tgttttcacc tcatatgcta tgttagaagt ccaggcagag acaataaaac 600 attcctgtga aaggcacttt tcattccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 650 <210> 2 <211> 8054 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 2 ttgttgaccc atggatccat caagtgcaaa cattttctaa tgcactatat ttaagcctgt 60 gcagctagat gtcattcaac atgaaataca ttattacaac ttgcatctgt ctaaaatctt 120 gcatctaaaa tgagagacaa aaaatctata aaaatggaaa acatgcatag aaatatgtga 180 gggaggaaaa aattaccccc aagaatgtta gtgcacgcag tcacacaggg agaagactat 240 ttttgttttg ttttgattgt tttgttttgt tttggttgtt ttgttttggt gacctaactg 300 gtcaaatgac ctattaagaa tatttcatag aacgaatgtt ccgatgctct aatctctcta 360 gacaaggttc atatttgtat gggttactta ttctctcttt gttgactaag tcaataatca 420 gaatcagcag gtttgcagtc agattggcag ggataagcag cctagctcag gagaagtgag 480 tataaaagcc ccaggctggg agcagccatc acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg 540 cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc 600 ctacggtgag tgtttctgtg acatcccatt cctacattta agattcacgc taaatgaagt 660 agaagtgact ccttccagct ttgccaacca gcttttatta ctagggcaag ggtacccagc 720 atctattttt aatataatta attcaaactt caaaaagaat gaagttccac tgagcttact 780 gagctgggac ttgaactctg agcattctac ctcattgctt tggtgcatta ggtttgtaat 840 atctggtacc tctgtttcct cagatagatg atagaaataa agatatgata ttaaggaagc 900 tgttaatact gaattttcag aaaagtatcc ctccataaaa tgtatttggg ggacaaactg 960 caggagatta tattctggcc ctatagttat tcaaaacgta tttattgatt aatctttaaa 1020 aggcttagtg aacaatattc tagtcagata tctaattctt aaatcctcta gaagaattaa 1080 ctaatactat aaaatgggtc tggatgtagt tctgacatta ttttataaca actggtaaga 1140 gggagtgact atagcaacaa ctaaaatgat ctcaggaaaa cctgtttggc cctatgtatg 1200 gtacattaca tcttttcagt aattccactc aaatggagac ttttaacaaa gcaactgttc 1260 tcaggggacc tattttctcc cttaaaattc attatacaca tccctggttg atagcagtgt 1320 gtctggaggc agaaaccatt cttgctttgg aaacaattac gtctgtgtta tactgagtag 1380 ggaagctcat taattgtcga cacttacgtt cctgataatg ggatcagtgt gtaattcttg 1440 tttcgctcca gatttctaat accacaaaga ataaatcctt tcactctgat caattttgtt 1500 aacttctcac gtgtcttctc tacacccagg gcaccggtga atccaagtgt cctctgatgg 1560 tcaaagttct agatgctgtc cgaggcagtc ctgccatcaa tgtggccgtg catgtgttca 1620 gaaaggctgc tgatgacacc tgggagccat ttgcctctgg gtaagttgcc aaagaaccct 1680 cccacaggac ttggttttat cttcccgttt gcccctcact tggtagagag aggctcacat 1740 catctgctaa agaatttaca agtagattga aaaacgtagg cagaggtcaa gtatgccctc 1800 tgaaggatgc cctctttttg ttttgcttag ctaggaagtg accaggaacc tgagcatcat 1860 ttaggggcag acagtagaga aaagaaggaa tcagaactcc tctcctctag ctgtggtttg 1920 caaccctttt gggtcacaga acactttatg taggtgatga aaagtaaaca ttctatgccc 1980 agaaaaaatg cacagataca cacacataca aaatcatata tgtgatttta ggagtttcac 2040 agattccctg gtgtccctgg gtaacaccaa agctaagtgt ccttgtctta gaattttagg 2100 aaaaggtata atgtgtatta acccattaac aaaaggaaag gaattcagaa atattattaa 2160 ccaggcatct gtctgtagtt aatatggatc acccaaaacc caaggctttt gcctaatgaa 2220 cactttgggg cacctactgt gtgcaaggct gggggctgtc aagctcagtt aaaaaaaaaa 2280 agatagaaga gatggatcca tgaggcaaag tacagcccca ggctaatccc acgatcaccc 2340 gacttcatgt ccaagagtgg cttctcacct tcattagcca gttcacaatt ttcatggagt 2400 ttttctacct gcactagcaa aaacttcaag gaaaatacat attaataaat ctaagcaaag 2460 tgaccagaag acagagcaat caggagaccc tttgcatcca gcagaagagg aactgctaag 2520 tatttacatc tccacagaga agaatttctg ttgggtttta attgaacccc aagaaccaca 2580 tgattcttca accattattg ggaagatcat tttcttaggt ctggttttaa ctggcttttt 2640 atttgggaat tcatttatgt ttatataaaa tgccaagcat aacatgaaaa gtggttacag 2700 gactattcta agggagagac agaatggaca ccaaaaatat tccaatgttc ttgtgaatct 2760 tttccttgca ccaggacaaa aaaaaaaaga agtgaaaaga agaaaggagg aggggcataa 2820 tcagagtcag taaagacaac tgctattttt atctatcgta gctgttgcag tcaaatggga 2880 agcaatttcc aacattcaac tatggagctg gtacttacat ggaaatagaa gttgcctagt 2940 gtttgttgct ggcaaagagt tatcagagag gttaaatata taaaagggaa aagagtcaga 3000 tacaggttct tcttcctact ttaggttttc cactgtgtgt gcaaatgata ctccctggtg 3060 gtgtgcagat gcctcaaagc tatcctcaca ccacaaggga gaggagcgag atcctgctgt 3120 cctggagaag tgcagagtta gaacagctgt ggccacttgc atccaatcat caatcttgaa 3180 tcacagggac tctttcttaa gtaaacatta tacctggccg ggcacggtgg ctcacgcctg 3240 taatcccagc actttgggat gccaaagtgg gcatatcatc tgaggtcagg agttcaagac 3300 cagcctggcc aacatggcaa aactccgtct ttatgaaaaa tacaaaaatt agccaggcat 3360 ggtggcaggc gcctgtaatc ccagctaatt gggaggctga ggctggagaa tcccttgaat 3420 ctaggaggca gaggttgcag tgagctgaga tcgtgccatt gcactccagc ctgggtgaca 3480 agagtaaaac tctgtctcaa aaaaaaaaaa ttatacctac attctcttct tatcagagaa 3540 aaaaatctac agtgagcttt tcaaaaagtt tttacaaact ttttgccatt taatttcagt 3600 taggagtttt ccctacttct gacttagttg aggggaaatg ttcataacat gtttataaca 3660 tgtttatgtg tgttagttgg tgggggtgta ttactttgcc atgccatttg tttcctccat 3720 gcgtaactta atccagactt tcacacctta taggaaaacc agtgagtctg gagagctgca 3780 tgggctcaca actgaggagg aatttgtaga agggatatac aaagtggaaa tagacaccaa 3840 atcttactgg aaggcacttg gcatctcccc attccatgag catgcagagg tgagtataca 3900 gaccttcgag ggttgttttg gttttggttt ttgcttttgg cattccagga aatgcacagt 3960 tttactcagt gtaccacaga aatgtcctaa ggaaggtgat gaatgaccaa aggttccctt 4020 tcctattata caagaaaaaa ttcacaacac tctgagaagc aaatttcttt ttgactttga 4080 tgaaaatcca cttagtaaca tgacttgaac ttacatgaaa ctactcatag tctattcatt 4140 ccactttata tgaatattga tgtatctgct gttgaaataa tagtttatga ggcagccctc 4200 cagaccccac gtagagtgta tgtaacaaga gatgcaccat tttatttctc gaaaacccgt 4260 aacattcttc attccaaaac acatctggct tctcggaggt ctggacaagt gattcttggc 4320 aacacatacc tatagagaca ataaaatcaa agtaataatg gcaacacaat agataacatt 4380 taccaagcat acaccatgtg gcagacacaa ttataagtgt tttccatatt taacctactt 4440 aatcctcagg aataagccac tgaggtcagt cctattatta tccccatctt atagatgaag 4500 aaaatgaggc accaggaagt caaataactt gtcaaaggtc acaagactag gaaatacaca 4560 agtagaaatg tttacaatta aggcccaggc tgggtttgcc ctcagttctg ctatgcctcg 4620 cattatgccc caggaaactt tttcccttgt gaaagccaag cttaaaaaaa gaaaagccac 4680 atttgtaacg tgctctgttc ccctgcctat ggtgaggatc ttcaaacagt tatacatgga 4740 cccagtcccc ctgccttctc cttaatttct taagtcattt gaaacagatg gctgtcatgg 4800 aaatagaatc cagacatgtt ggtcagagtt aaagatcaac taattccatc aaaaatagct 4860 cggcatgaaa gggaactatt ctctggctta gtcatggatg agactttcaa ttgctataaa 4920 gtggttcctt tattagacaa tgttaccagg gaaacaacag gggtttgttt gacttctggg 4980 gcccacaagt caacaagaga gccccatcta ccaaggagca tgtccctgac tacccctcag 5040 ccagcagcaa gacatggacc ccagtcaggg caggagcagg gtttcggcgg cgcccagcac 5100 aagacattgc ccctagagtc tcagccccta ccctcgagta atagatctgc ctacctgaga 5160 ctgttgtttg cccaagagct gggtctcagc ctgatgggaa ccatataaaa aggttcactg 5220 acatactgcc cacatgttgt tctctttcat tagatcttag cttccttgtc tgctcttcat 5280 tcttgcagta ttcattcaac aaacattaaa aaaaaaaaaa agcattctat gtgtggaaca 5340 ctctgctaga tgctgtggat ttagaaatga aaatacatcc cgacccttgg aatggaaggg 5400 aaaggactga agtaagacag attaagcagg accgtcagcc cagcttgaag cccagataaa 5460 tacggagaac aagagagagc gagtagtgag agatgagtcc caatgcctca ctttggtgac 5520 gggtgcgtgg tgggcttcat gcagcttctt ctgataaatg cctccttcag aactggtcaa 5580 ctctaccttg gccagtgacc caggtggtca tagtagattt accaagggaa aatggaaact 5640 tttattagga gctcttaggc ctcttcactt catggatttt tttttccttt ttttttgaga 5700 tggagttttg ccctgtcacc caggctggaa tgcagtggtg caatctcagc tcactgcaac 5760 ctccgcctcc caggttcaag caattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggactaca 5820 ggtgtgcgcc accacaccag gctaattttt gtattttttg taaagacagg ttttcaccac 5880 gttggccagg ctggtctgaa ctccagacct caggtgattc acctgtctca gcctcccaaa 5940 gtgctgggat tacaggtgtg agccaccgtg cccggctact tcatggattt ttgattacag 6000 attatgcctc ttacaatttt taagaagaat caagtgggct gaaggtcaat gtcaccataa 6060 gacaaaagac atttttatta gttgattcta gggaattggc cttaagggga gccctttctt 6120 cctaagagat tcttaggtga ttctcacttc ctcttgcccc agtattattt ttgtttttgg 6180 tatggctcac tcagatcctt ttttcctcct atccctaagt aatccgggtt tctttttccc 6240 atatttagaa caaaatgtat ttatgcagag tgtgtccaaa cctcaaccca aggcctgtat 6300 acaaaataaa tcaaattaaa cacatcttta ctgtcttcta cctctttcct gacctcaata 6360 tatcccaact tgcctcactc tgagaaccaa ggctgtccca gcacctgagt cgcagatatt 6420 ctactgattt gacagaactg tgtgactatc tggaacagca ttttgatcca caatttgccc 6480 agttacaaag cttaaatgag ctctagtgca tgcatatata tttcaaaatt ccaccatgat 6540 cttccacact ctgtattgta aatagagccc tgtaatgctt ttacttcgta tttcattgct 6600 tgttatacat aaaaatatac ttttcttctt catgttagaa aatgcaaaga ataggagggt 6660 gggggaatct ctgggcttgg agacaggaga cttgccttcc tactatggtt ccatcagaat 6720 gtagactggg acaatacaat aattcaagtc tggtttgctc atctgtaaat tgggaagaat 6780 gtttccagct ccagaatgct aaatctctaa gtctgtggtt ggcagccact attgcagcag 6840 ctcttcaatg actcaatgca gttttgcatt ctccctacct tttttttcta aaaccaataa 6900 aatagataca gcctttaggc tttctgggat ttcccttagt caagctaggg tcatcctgac 6960 tttcggcgtg aatttgcaaa acaagacctg actctgtact cctgctctaa ggactgtgca 7020 tggttccaaa ggcttagctt gccagcatat ttgagctttt tccttctgtt caaactgttc 7080 caaaatataa aagaataaaa ttaattaagt tggcactgga cttccggtgg tcagtcatgt 7140 gtgtcatctg tcacgttttt cgggctctgg tggaaatgga tctgtctgtc ttctctcata 7200 ggtggtattc acagccaacg actccggccc ccgccgctac accattgccg ccctgctgag 7260 cccctactcc tattccacca cggctgtcgt caccaatccc aaggaatgag ggacttctcc 7320 tccagtggac ctgaaggacg agggatggga tttcatgtaa ccaagagtat tccattttta 7380 ctaaagcagt gttttcacct catatgctat gttagaagtc caggcagaga caataaaaca 7440 ttcctgtgaa aggcactttt cattccactt taacttgatt ttttaaattc ccttattgtc 7500 ccttccaaaa aaaagagaat caaaatttta caaagaatca aaggaattct agaaagtatc 7560 tgggcagaac gctaggagag atccaaattt ccattgtctt gcaagcaaag cacgtattaa 7620 atatgatctg cagccattaa aaagacacat tctgtaaatg agagagcctt attttcctgt 7680 aaccttcagc aaatagcaaa agacacattc caagggccca cttctttact gtgggcattt 7740 cttttttttt ctttttttct tttttccttt tttgagacaa agtctcactc tgttgcccag 7800 gctagaatgc agtggtgtaa tctcagctca ctgcaacctc tgcttcctgg gttcaagcga 7860 ttctcctgcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc gcatgccacc acgcctagct 7920 catttttgta tttttagtag agatgggatt ttgccatgtt ggctaggctg gtctacgaac 7980 tcctgacctc aggtgatcca cctgcctcag cctcccaaag tgctgggatt acaggcatga 8040 gccactacac ccgg 8054 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <211> 10001 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 4 gactctattc ctagttatgg tctcaactac atttgctcat tgctgtgagg ggtgagccca 60 cctcccggag tcctctcctg cacattccta tgttcctgaa aggactttcc atcccttcca 120 ctactccctg aaaactcctg tgcttcatga tttcttgttg aattttttct aatctgactc 180 tatcagttat gggaatgttc cctcaactct tagtgctcca gactggactc gctcttggca 240 tgtatttgtc caaaatattt gtctgctcta tgtcttctac atatttgtct tataaggaac 300 aaacacctga tttgtttatc catgaacaaa gccacacatg ctagtgcaca cgcacataca 360 cacacacaca tacacacaga ggattctgta cgtgattaat gaatcatcaa atcatcataa 420 tttctggact tgtattaata cgtcggccag gaggaaaaga atccgttgtc aatcatggct 480 tctggttctc acggtcatct ctactttctt ccagcaagtt tgattctgtc aaacaccagc 540 tggcagcttt gttccggcat gcccagtgca ggagagtcag taaagaagat ttcattctct 600 gtatttcagc gtcgtcaatg ccaggttgaa atacgctatt ctggcccagc tcagtggctc 660 acacgtgtaa tcccagcact ttggaaggcc aaggcaggca gatcgcttga gcccaggaat 720 tcgagaccag cctgggcaag aggctgaggt gggaggatga cctgagcccg ggaggtcaag 780 gctgcagcca gctgtgatca tgtcactgca ctcaagccag ggcgtcggag tgagaccgtg 840 tcaaaaaaaa aggaaggaaa gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag 900 gaaggaagga aggaagggag ggagggaggg agggagggag gaaggaagga aggaagtatg 960 taaggaagga aggaaggaag gaagggaggg acggagggcg ggagggaagg aagatgccat 1020 tcttagattg aagtggacct tatgtgggca gaacacacac acacacacac acattgtgga 1080 gaaattgctg actaagcaaa gcttccaaat gactgagttt ggctaaaacg taggctttta 1140 aaaatgtgag cactgccaag ggtttttcct tgttgaccca tggatccatc aagtgcaaac 1200 attttctaat gcactatatt taagcctgtg cagccaaatg tcattcaaca tgaaatgcat 1260 tattacaact tgcatctgtc taaaatcttg catcaaaaat gaaagacaaa aatgtataaa 1320 aatggaaaac atgcatagaa atatgtgagg gaggaaaaaa atatccccag gaatgttagt 1380 gcacggagtc acacagggag aagactattt ttgttttgtt ttgattgttt tgttctggtg 1440 acctcactgg tcaaatgacc tattaagaat attttgtaga gctaatgttc cgatgctcta 1500 atctctctag acaaggttca tatttgtatg ggttacttat tctctctttg ttgactaagt 1560 caataatcag aatcagcagg tttggagtca gattggcagg gataagcagc ctagctcagg 1620 agaagtgggt ataaaagccc caggctggga gcagccatca cagaagtcca ctcgttcttg 1680 gcaggatggc ttctcatcgt ctgctcctcc tctgcctcgc tggactggta tttgtgtctg 1740 aggctggtcc tacggtgagt gtttctgtga catctcgctc ctacatttaa aatgcacgct 1800 aaatgaggta ggagtgactc cttccagctt tgccaagcag cttttgttac tagggcaagg 1860 gtacccagca tctattttta atatcattta ttcaaacttc aaaaagaatg aagttccact 1920 gagcttactg agctgggact tgaactctgg ggattctgcc tcattgcttt ggtgcattgg 1980 gtttgtaatg tctggtatct ccacttcctc agatcgatga tagagataaa gatatgatat 2040 taaggaagct gttaatcctg aattttcaga aaagtatccc tttataaaat gtatttgggg 2100 ggcaaactgc atgagattat attctggccc tatagctaat caaaatgtat ttaccgatta 2160 atctttaaaa ggcttagtga acaatatttt agtcagatat ctaattctta aatactctag 2220 aaggattaac taatctataa aatgggtctg gatatagtct gacataattt tataacaacc 2280 ggtaagaggg agtgactaga gcaacaacta aaatcatctc aggaaaaact gttttggtcc 2340 tatgtatggt acgttacatc ttttcagtaa ttccattcaa atggagaagt ttaacaaggc 2400 aactgttctc agggggccta ttctctccct taaaattcat tatacacatc cctggttgat 2460 agcagtgtgt ctggaggcag aaaccattct tgctttggaa acaattatgt ctgtgttata 2520 ctgagtaggg aagctcatta actgtcaaca cttatgttct tcataatgga atcagtgtgt 2580 aattcttgtt ttgttccaga tttctaacac cataaagaat aaatcctttc actctgatca 2640 atgttgttaa cttctcactt gtcttctcta tacccagggc gttgatgaat ccaagtgtcc 2700 tctgatggtc aaagttctag atgccgtccg aggcagtcct gccgtcaatg tggctgtgaa 2760 cgtgttcaaa aaggctgctg atgagacctg ggcgccattt gcctctgggt aagaaccctc 2820 ccacgggact tggttttatc ttcccattgg cccctcagtt ggtagacaga ggctcacatc 2880 atctgctaaa gaatttacaa gtagattgaa aaacgtgagc agaggtcaag tatgccctct 2940 gaagatgccc tctttttgtt ttgcttagct aggaagggac caggaacctg agcatcattt 3000 aggggcagac agtagagaaa agaaggaatc agaactcttc ccctctagct gtggtgtgca 3060 acccttttgg gtcacagacc actttatgta ggtgataaaa actaaagatt ctatgcccag 3120 aaaaaatgta cagatacaca cacacaaaac catatatgtg attttaggag tttcacagat 3180 tccctggtgt ccctgggtaa caccaaaggt gagagtcctc gtcttagaat tttaggaaag 3240 aggtgcaatg tgtattaacc cactaacgaa aggaaaggga ttcagaaata ttattgacta 3300 ggcatctgtc tgtagttcat ttggatcacc ccaaacccag ggcttttgcc taatgaacac 3360 tttggggcac ctactgtgtg cagggctgga ggctgtcaag ctcagttaaa acaaatgtaa 3420 aaaaagacag aagaaatgga tccatgaggc aaagtacagc cccagactaa tcccatgatc 3480 acccaacttc atgtgcaaga gtgacttcta accttcatga gccagtttac aattttcatg 3540 gagtttttct acctacacta caaaaactcc aaggaaaata tatattaata aacctaagcg 3600 aattgaccga aagacagagc aataaggaga cccttcgcac ccagcagaag aggaactgtt 3660 aagtacttac ttctcctcag agaagaattt ctgttgtatt ttaattgaac cccaagaacc 3720 acacgattct tcaaccatta ttggtaagat cattttctta ggtctggttt taactgactt 3780 tttatttggt aattcattta tgtttatata aaatgccaag cataacatga aaagtggtta 3840 caggactatt ctaagggaga gagaaaatgg ataccaaaaa tattccaatg ttcttatgaa 3900 tcttttccct tgcgtcagga caaaaaaaaa aaaaatgtaa agaagaaagg aggagatgca 3960 caatcagagt cagtaaagac aactgctatt tttatctgtc atagctgttg cagtctaatg 4020 ggaagcaatt tccaacattc aactatggag ctggtactta catggaaata gaagttgcct 4080 agtgtttgtt gctggcaaag agttatcaga gaggttaaat atataaaagg gaagagtcag 4140 atacaggttc ttcttcctac tttaggtttt ccactgtgtg tgcaaatgac cctccctggt 4200 ggtgtgcaga tgctctgaaa ggtatcctca caccacaagg cagaggagcg agaccctgct 4260 gtcctggaga agtgcagagt tagaacagct gtggccactt ccagggatgg tcacaacatc 4320 ccatctaatc atcaatcttg aacaacaagg actctttctt aagaaaacat tatacccagc 4380 cgggcgcggt ggctcacacc tgtaaatctc agcgctttgg gaggctgaaa tgggcatatc 4440 atctgaggtc gagagctcaa gaccaacctg gccaacatgg caaaactccg tctctatgaa 4500 aaatacaaaa attagccagg catggtggca ggcacctgta atcccggcta ctcgggaggc 4560 tgagactgga gaatcccttg aacctggagg cagaggttgc agtgagctga gatcacgcca 4620 ctgcactcca gcctgggtga ctagagtaaa actctgtctc aaaaataaaa aaaaatttaa 4680 aaaattatac ctacattctc ttcttatcag agaaaaatat ctacagtgag cttttcaaaa 4740 gtttttacaa actttttgcc atttaatttc agacagttat gagttttccc tacttctgac 4800 ttagttgagg ggaaatgtat ataacacatt tatgtgtgtt gtgtatataa cacatataac 4860 acgtttatgt gtgttggtgg gggtattact ttgccatgcc atttgtttcc tccatgccta 4920 acttaaccca gactttcaca ccttatagga aaaccagtga gtctggagag ctgcatgggc 4980 tcacaactga ggaggaattt gtagaaggga tatacaaagt ggaaatagac accaaatctt 5040 actggaagtc acttggcatc tccccattcc atgagcatgc agaggtgagt atataaacct 5100 tcgagggttg ttttggtttt ggtttttgct tttggcatcc caggaaatgc acagttttac 5160 ttagcatacc acagaaatgt cctaaagaag gtgatgaatg accaaaggtt ccctctcctc 5220 ttatacaaga acaaattcac aacactctga gaagcacatt tctttttgac tttgaggaaa 5280 acccatttag taacatgact tgaacttaca tgacactatt catagtctac tcattccatt 5340 ttatatgaat attgatgtat ttgccgttga aataacatgt ttatgaggca gacctccaga 5400 ccccacgtag agtgtatgaa acaagagatg caccatttta tttctctaaa acctgtaaca 5460 ttcttcattc caaaacacat ctggctcctc ggaggtttgg acaagtgatt cttggcaaca 5520 catacataga gagacaataa aatcaaagta ataatggcaa cacaacagat aacatttact 5580 aagcatacac catgtggcag acacaattat aagtgttttc tatatttaac ctacttcatc 5640 ctcagggaca agccactgag gtcagtccta ttattatccc catctcatag atgaagcaag 5700 tgaggcacca ggaagtcaaa taacttgtca aaggtcacaa ggctaggaaa cacacaagta 5760 gagatgttta caaacaaggc ccaggctggg tttgccctca attctgctct gcctcgcatt 5820 gcgacccagg aaatttgttc ccctgtgaaa agccaagctt aaaaaaagaa aagccacatt 5880 tgtaacgtgc tctgttcccc tgcctatggt gaggatcttc gaacagttat acagctccct 5940 gtcttcccct tgtcttaatt tcttcagtca tttgaaacag atggctgtca tggaaataga 6000 atccagacat gttggtcaga gttaaagatc aactaattcc atcaaaaata gctcagcatg 6060 aaagggaact attctctggc ttagtcatgg atgagacttt caattgctat aaagtggttc 6120 ctttattagg caatgttacc agggaaacaa taggggcttg tttgacttct ggggcccaca 6180 agtcaccaag ggagccccat ctaccaagaa gcatgtccct gactaccccg cagccaggca 6240 gcaagacacg gacgccggtc agggcagcag cagggtttca gtggtgccca gcacaagaca 6300 ttgctcctag agtctcagcc cctacccttg agtagtagaa ctgcctacct gagaccgttg 6360 tttgcctaag acctgggtct cagcctgatg ggaaccatct aaaaagttca tcgccatact 6420 gcccacgtgt tgttctcttt cattagatct cagcttcctt gactgctctt cactcttgtt 6480 tattcattca acaaacattt aaaaaataaa agcattctat gtgtggaaca ctctgataga 6540 ggctggagat tcagaaatga aaatacatcc ctacccttgg aatggagggg aaaggactga 6600 agtaagacag actaggcagg cccgtcagcc cagcttgaag cccagataaa tatggagaac 6660 aagagtgagt gagtagtgag agatgagtcc cagtgcctca ctttggtgac tggtgcatgg 6720 tgggcttcat gcagcttctt ctgataaatg cctccttcag aaccggtcac ctctaccttg 6780 gccagtgacc caagtggtca tattagattt accaagggaa attggaaact tttattagga 6840 gctcttaggc ctcttcactt catggaattt tttctttttt cttttttttt tgagatggag 6900 ttttgctctg tcacccaggc tggaatgcag tggtgcaatc ttggctcact gcaaccttta 6960 cttcccaggt tcaagcaatt cttctgcctc agcctcccga gtagctggga ctacaggtgc 7020 acgccaccat acccagctaa gttttgtatt tttcatagag acagggtttc gccatgttgg 7080 ccaggctggt ctcgaactcc agacctcagg tgattcaccc acctcagcct cccaaagtgc 7140 tggcattaca ggtgtgagcc agtacaccca gctacttcat ggatttttga tcacagatta 7200 tgcctcttat aatttttaag aagaatcaag tgggctgaag gtcaatgtca ccataagata 7260 aaagatattt ttattagttg attctaggga gttggcctta aggggagccc tttcttctta 7320 agagattctt ggccgggcgc ggtggctcaa gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga 7380 gacgggtgga tcatgaggtc aggagatcga gaccatcctg gtaacacggt gaaaccccgt 7440 ctctactaaa aaatacaaaa aaactagccg ggtgagttgg cgggcgcctg tagtcccagc 7500 tactcgggag gctgaggcag gagaatggcg taaacccggg aggcggagct tgcagtgagc 7560 tgagatctgg ccactgcact ccagcccggg tgacagagcg agactccgtc tcaaaaaaaa 7620 aaaaaaaaaa aaagagattc ttaggtgatt ctcacttcct cttgccccaa tattattttt 7680 gtttttggta tggctcactc agctcctttt tccctcctat ccctaagtaa tccgggtttc 7740 ttttccccat atttggaaca aaatgtattt atgcagagtg tgtccaaaac tcaacccaag 7800 gcccgtatac aaaataaatc aaattaaaca catctttact gtcttctacc tctttcctga 7860 cctcaattta tcccaacttg cctcactctg agaatcaagc ctgtcccagc acatgagttg 7920 cagatactct actgaatttg acagaactgt gtgactatct ggaacagcat tttgatccac 7980 aatttgccca gttacaaagc ttaaatgaag tctagtgcat gcatgtatat ttcaaaattc 8040 caccatgctc ttccacactc tgtattgtaa atagagccct gaaatgcttt tggttcatat 8100 ttcattgctt gctatacata aaaatatact ttttcttctt catgttagaa aatgcaaaga 8160 atagtggggt gggggaatct ctgggcttgg agacaggaga cttaccttcc tactgtggtt 8220 ccatcagtat gtagactggg gcaatacaat aattcaagtc tggtttgctc atctgtaaaa 8280 tgggaagaat gtttccagct ccagaatgct aagtctctaa gtctgtggtt ggcagccact 8340 attgcagcag cttttcaatg actcagtgca tttttccatt ctccccacct tttttttttc 8400 taaaaccaac aaaatagata cagcctttag gctctctggg atttccctta gtcaagctag 8460 ggccatcctg acttttgatg tgaatttgca aaacaagacc tggttctgta ctcctgctct 8520 aagggctgtg catggttcca aaggcttggc ttgccagtgt atttgagctt tttccttctg 8580 ttcaaacttc aaaatataaa agaataaaat taattaagtt ggcactggac ttccggtggt 8640 cagtcatgtg tgtcatctgt acggttttcg ggctctggtg gaaatggata ctgtctgtct 8700 tctctcatag gtggtattca cagccaacga ttccggcccc cgccactaca ccatcgccgc 8760 cctgctgagc ccctactcct attccaccac ggctgtcgtc accaatccca aggaatgagg 8820 gacttctcca gaggatctga aggacgaggg atgggatttc atgtaaccaa gagtattcca 8880 tttttactaa agcagtgttt tcacctcata agctatgtta ggagtccagg cagagacaat 8940 aaaacattcc tgtgaaaggc acttttcatt ccattttaac ttgatttttt aaattccctt 9000 attgtccctt ccaaaaaaac aagaatcaaa attctacaaa gaagcaaagg aattctagaa 9060 cgtatctggg cagaacgcta ggagagatcc aaatttccaa tttattgcaa gcaaagcaca 9120 tattaaatat gatctgcagt catcaaaaag acacattctg taaatgagaa agccttattt 9180 tcctgtaacc ttcagtgaat agcaaaagac acattctaag ggcccacttc tttactgtgg 9240 gcatttcttt tcttttcttt tttttttttt cttttctttt ccttttttga gacaaagtct 9300 cactctgtcg cccaggctag aatgcagtgg tgtgatctca gctcactgca acctctgctt 9360 ccgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccaagcag ctgggattac aggcgcccgc 9420 caccacacct ggctaatttt tctacttgta gtagagatgg ggtttcgcca tgttggctag 9480 gctggcctcg aactcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cagcctccca aagtgctggg 9540 attacaggca tgagccacta cacccggccc ctactctggg catttctttg atttaagaga 9600 agggcagctc caacaagaca cacctgcaga gactcaggcc atccgatcag ttcaggctag 9660 atccacgctg caatcagcca ggtcagggac aaaccaaaga accccacaca cccaatttac 9720 ttaggctgat ccaaaatcca tgtatggaga actcacatgc agcaggcact attttaggtg 9780 atctgaacat aaagaatagg acccagtacc tgcatttatt taaagaactc acaatctttt 9840 gaaaagataa ctgtttcatc atggtttggc aggaggctat ggtacaaggc acagcaaagg 9900 taagaaggag aaaaaaccaa caccctagag aaatcagaaa atgactctga ataggtgtca 9960 cttaatctga gtgttggtaa tttgtcagat agacaaggga a 10001 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccctgctgag cccctactc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tccctcattc cttgggattg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 7 attccaccac ggctgtcgtc a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 actggttttc ccagaggcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gactcactgg ttttcccaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 tgaataccac ctctgcatgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 ccgtggtgga ataggagtag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 agccgtggtg gaataggagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 cgacagccgt ggtggaatag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 ttggtgacga cagccgtggt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 gattggtgac gacagccgtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 gggattggtg acgacagccg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 tgggattggt gacgacagcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 attccttggg attggtgacg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 cattccttgg gattggtgac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 tcattccttg ggattggtga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 agaagtccct cattccttgg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 gtccttcagg tccactggag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 catccctcgt ccttcaggtc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 tacatgaaat cccatccctc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 cttggttaca tgaaatccca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 aatactcttg gttacatgaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 ttagtaaaaa tggaatactc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 actgctttag taaaaatgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 tgaaaacact gctttagtaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 tatgaggtga aaacactgct 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 tggacttcta acatagcata 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 tctctgcctg gacttctaac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 ttattgtctc tgcctggact 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 tgcctttcac aggaatgttt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 gtgcctttca caggaatgtt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 cagaggagga gcagacgatg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 tctagaactt tgaccatcag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 ttttcccaga ggcaaatggc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 tccagactca ctggttttcc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 tatcccttct acaaattcct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 atttccactt tgtatatccc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 tggtgtctat ttccactttg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 cagtaagatt tggtgtctat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 cttccagtaa gatttggtgt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 ccacctctgc atgctcatgg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 tgtgaatacc acctctgcat 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 gctgtgaata ccacctctgc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 cgttggctgt gaataccacc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 cagccgtggt ggaataggag 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 gacagccgtg gtggaatagg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 acgacagccg tggtggaata 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 52 gacgacagcc gtggtggaat 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 53 tgacgacagc cgtggtggaa 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 gtgacgacag ccgtggtgga 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 ggtgacgaca gccgtggtgg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 tggtgacgac agccgtggtg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 attggtgacg acagccgtgg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 ggattggtga cgacagccgt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 ttgggattgg tgacgacagc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 cttgggattg gtgacgacag 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 ccttgggatt ggtgacgaca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 tccttgggat tggtgacgac 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 ttccttggga ttggtgacga 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 64 ctcattcctt gggattggtg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 cctcattcct tgggattggt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 ccctcattcc ttgggattgg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 67 tccctcattc cttgggattg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 68 gtccctcatt ccttgggatt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 69 agtccctcat tccttgggat 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 70 aagtccctca ttccttggga 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 71 gaagtccctc attccttggg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 72 gagaagtccc tcattccttg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 73 ggagaagtcc ctcattcctt 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 74 acatgaaatc ccatccctcg 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 75 ttacatgaaa tcccatccct 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 76 gttacatgaa atcccatccc 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 77 ggttacatga aatcccatcc 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 78 tggttacatg aaatcccatc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 79 ttggttacat gaaatcccat 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 80 tcttggttac atgaaatccc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 81 ctcttggtta catgaaatcc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 82 actcttggtt acatgaaatc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 83 tactcttggt tacatgaaat 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 84 atactcttgg ttacatgaaa 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 85 gaatactctt ggttacatga 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 86 ggaatactct tggttacatg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 87 tggaatactc ttggttacat 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 88 atggaatact cttggttaca 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 89 aatggaatac tcttggttac 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 90 aaatggaata ctcttggtta 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 91 aaaatggaat actcttggtt 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 92 aaaaatggaa tactcttggt 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 93 taaaaatgga atactcttgg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 94 gtaaaaatgg aatactcttg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 95 agtaaaaatg gaatactctt 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 96 tagtaaaaat ggaatactct 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 97 tttagtaaaa atggaatact 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 98 ctttagtaaa aatggaatac 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 99 gctttagtaa aaatggaata 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 100 tgctttagta aaaatggaat 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 101 ctgctttagt aaaaatggaa 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 102 cactgcttta gtaaaaatgg 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 103 acactgcttt agtaaaaatg 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 104 aacactgctt tagtaaaaat 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 105 aaacactgct ttagtaaaaa 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 106 aaaacactgc tttagtaaaa 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 107 gaaaacactg ctttagtaaa 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 108 gtgaaaacac tgctttagta 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 109 ggtgaaaaca ctgctttagt 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 110 aggtgaaaac actgctttag 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 111 gaggtgaaaa cactgcttta 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 tgaggtgaaa acactgcttt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 atgaggtgaa aacactgctt 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 114 tttattgtct ctgcctggac 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 115 ttttattgtc tctgcctgga 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 gttttattgt ctctgcctgg 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 117 tgttttattg tctctgcctg 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 118 atgttttatt gtctctgcct 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 119 aatgttttat tgtctctgcc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 120 gaatgtttta ttgtctctgc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 121 ggaatgtttt attgtctctg 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 122 aggaatgttt tattgtctct 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 123 caggaatgtt ttattgtctc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 124 acaggaatgt tttattgtct 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 125 gatgtcacag aaacactcac 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcaaagctgg aaggagtcac 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 127 gaacttcatt ctttttgaag 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 128 agcttcctta atatcatatc 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 129 tatagggcca gaatataatc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 130 actaagcctt ttaaagatta 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 131 tggaattact gaaaagatgt 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 132 accagggatg tgtataatga 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 133 tccctactca gtataacaca 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 134 gatcagagtg aaaggattta 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 135 gggaagataa aaccaagtcc 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 136 taaattcttt agcagatgat 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 137 aatgatgctc aggttcctgg 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 138 ttggtgttac ccagggacac 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 139 aaagtgttca ttaggcaaaa 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 140 ggcattttat ataaacataa 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 141 aagaacattg gaatattttt 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 142 gttggaaatt gcttcccatt 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 143 agtggaaaac ctaaagtagg 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 144 ttcccctcaa ctaagtcaga 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 145 cctataaggt gtgaaagtct 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 146 tgtaagttca agtcatgtta 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 147 gtgttgccaa gaatcacttg 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 148 aaaacactta taattgtgtc 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 149 ctttgacaag ttatttgact 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 150 atccatgact aagccagaga 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 151 atggttccca tcaggctgag 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 152 gcatttatca gaagaagctg 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 153 ttgaccttca gcccacttga 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 154 aggaagtgag aatcacctaa 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 155 agaagacagt aaagatgtgt 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 156 aaattgtgga tcaaaatgct 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 157 aaccagactt gaattattgt 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 158 agtggctgcc aaccacagac 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 159 ggaagtccag tgccaactta 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 160 atccatttcc accagagccc 20 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 161 cttgctggac tggtatttgt gtct 24 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 162 agaactttga ccatcagagg acact 25 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 163 ccctacgggc accggtgaat cc 22 <210> 164 <211> 612 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 164 acagaagtcc actcgttctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctt ctctgcctcg 60 ctggactggt atttgtgtct gaagctggtc ctacgggcgt tgatgaatcc aagtgtcctc 120 tgatggtcaa agttctagat gccgtccgag gcagtcctgc cgtcaatgtg gctgtgaacg 180 tgttcaaaaa ggctgctgat gagacctggg cgccatttgc ctctgggaaa accagtgagt 240 ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg 300 aaatagacac caaatcttac tggaagtcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag 360 aggtggtatt cacagccaac gattccggcc cccgccacta caccatcgcc cgcctgctga 420 gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc 480 cagaggatct gaaggacgag ggatgggatt tcatgtaacc aagagtattc catttttact 540 aaagcagtgt tttcacctca taagctatgt taggagtcca ggcagagaca ataaaacatt 600 cctgtgaaag gc 612 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 165 ccttccctga aggttcctcc 20 <210> 166 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 166 gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27 <210> 167 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 167 ttttattgtc tctgcctg 18 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 168 tacaaatggg atgctactgc 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 169 ggaatcccaa gcctcaaacg 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 170 cgtccttcag gtccactgga 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 171 atatgaggtg aaaacactgc 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 172 tattgtctct gcctggactt 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 173 cacaggaatg ttttattgtc 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 174 cctttcacag gaatgtttta 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 175 gcctttcaca ggaatgtttt 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 176 agtgcctttc acaggaatgt 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 177 aagtgccttt cacaggaatg 20

Claims (1)

  1. 트랜스티레틴 아밀로이드증을 가진 인간을 확인하고, 트랜스티레틴 아밀로이드증에 대해 상기 인간을 치료하기 위해 치료적 유효량의 화합물을 상기 인간에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 화합물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 연결된 뉴클레오사이드는 서열번호 25, 86, 87, 115, 120, 122 또는 124에 열거된 서열의 적어도 8개의 연속된 핵염기를 포함하는 것인, 트랜스티레틴 아밀로이드증을 가진 인간을 치료하는 방법.
KR1020187005906A 2010-04-29 2011-04-29 트랜스티레틴 발현의 조절 KR20180026798A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32953810P 2010-04-29 2010-04-29
US61/329,538 2010-04-29
US40516310P 2010-10-20 2010-10-20
US61/405,163 2010-10-20
PCT/US2011/034661 WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-04-29 Modulation of transthyretin expression

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127031119A Division KR101835386B1 (ko) 2010-04-29 2011-04-29 트랜스티레틴 발현의 조절

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180026798A true KR20180026798A (ko) 2018-03-13

Family

ID=44903998

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127031119A KR101835386B1 (ko) 2010-04-29 2011-04-29 트랜스티레틴 발현의 조절
KR1020187005906A KR20180026798A (ko) 2010-04-29 2011-04-29 트랜스티레틴 발현의 조절

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127031119A KR101835386B1 (ko) 2010-04-29 2011-04-29 트랜스티레틴 발현의 조절

Country Status (25)

Country Link
US (8) US20110294868A1 (ko)
EP (1) EP2563920B1 (ko)
JP (1) JP5896175B2 (ko)
KR (2) KR101835386B1 (ko)
CN (1) CN103038345B (ko)
BR (1) BR112012027547B1 (ko)
CA (2) CA2994063A1 (ko)
CY (2) CY1119070T1 (ko)
DK (1) DK2563920T3 (ko)
ES (1) ES2625689T3 (ko)
HR (1) HRP20170737T1 (ko)
HU (2) HUE031909T2 (ko)
IL (1) IL222697A (ko)
LT (2) LT2563920T (ko)
LU (1) LUC00096I2 (ko)
MX (1) MX343559B (ko)
NL (1) NL300963I2 (ko)
NO (1) NO2019001I1 (ko)
NZ (1) NZ603339A (ko)
PL (1) PL2563920T3 (ko)
PT (1) PT2563920T (ko)
RS (1) RS56011B1 (ko)
RU (1) RU2592669C2 (ko)
SI (1) SI2563920T1 (ko)
WO (1) WO2011139917A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200058446A (ko) * 2017-09-29 2020-05-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ttr 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
SI2937418T1 (en) 2008-10-20 2018-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compounds and procedures for inhibiting the expression of transthyretin
US9101643B2 (en) 2009-11-03 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin (TTR)
BR112012027547B1 (pt) 2010-04-29 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina
US9580708B2 (en) 2011-09-14 2017-02-28 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotides compounds
EP3301177B1 (en) * 2011-11-18 2020-03-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
WO2013173608A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
US9574193B2 (en) 2012-05-17 2017-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein (a) expression
US20160002624A1 (en) 2012-05-17 2016-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
AU2013315225B2 (en) 2012-09-14 2018-11-08 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
DK2951305T3 (en) 2013-01-30 2018-10-29 Hoffmann La Roche LNA oligonucleotide KULHYDRATKONJUGATER
NZ631512A (en) * 2013-05-01 2016-10-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
EP3608406B1 (en) 2014-05-01 2023-02-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating complement factor b expression
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
DK3185957T3 (da) 2014-08-29 2022-08-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Patisiran til anvendelse ved behandlingen af transthyretin-medieret amyloidosis
AU2016219052B2 (en) * 2015-02-13 2022-06-02 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US10758558B2 (en) 2015-02-13 2020-09-01 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
US10851371B2 (en) 2015-04-10 2020-12-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of SMN expression
DK3329002T3 (da) 2015-07-31 2021-01-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transthyretin (ttr)-irna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling eller forebyggelse af ttr-forbundne sygdomme
US10982215B2 (en) * 2015-12-09 2021-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) and methods of use thereof
WO2017218884A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Combinations for the modulation of smn expression
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
JP2021508333A (ja) 2017-09-19 2021-03-04 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）媒介アミロイドーシスの治療用組成物及び方法
CN111417728A (zh) 2017-09-29 2020-07-14 因特利亚治疗公司 用于ttr基因编辑及治疗attr淀粉样变性的组合物及方法
WO2020128816A2 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Pfizer Inc. Pharmaceutical compositions and methods comprising a combination of a benzoxazole transthyretin stabilizer and an additional therapeutic agent
WO2021041884A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
US20220064638A1 (en) 2020-02-28 2022-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating smn2
JP2023516748A (ja) 2020-03-06 2023-04-20 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ｔｔｒ）の発現を阻害するための組成物および方法
EP4200412A1 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Precision BioSciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the transthyretin gene
CA3094859A1 (en) * 2020-10-01 2022-04-01 Entos Pharmaceuticals Inc. Proteolipid vesicles formulated with fusion associated small transmembrane proteins
WO2022112919A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Pfizer Inc. (aza)benzothiazolyl substituted pyrazole compounds
EP4334448A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
EP4351541A2 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
AU2022323090A1 (en) 2021-08-03 2024-02-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
CN114058636A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法

Family Cites Families (263)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
DE3855864T2 (de) 1987-11-30 1997-09-25 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DK0497875T3 (da) 1989-10-24 2000-07-03 Gilead Sciences Inc 2'-modificerede oligonukleotider
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
DK0541722T3 (da) 1990-08-03 1996-04-22 Sterling Winthrop Inc Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
DE69233046T2 (de) 1991-10-24 2004-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsfeld Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
RU95104940A (ru) 1992-07-27 1997-01-10 Хайбрайдон Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения
US6410324B1 (en) 2001-04-27 2002-06-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of tumor necrosis factor receptor 2 expression
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994014226A1 (en) 1992-12-14 1994-06-23 Honeywell Inc. Motor system with individually controlled redundant windings
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
KR960701077A (ko) 1993-01-25 1996-02-24 다알렌 반스톤 올리고누클레오티드 알킬포스포네이트 및 알킬포스포노티오에이트(oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates)
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
ES2107205T3 (es) 1993-03-30 1997-11-16 Sanofi Sa Analogos de nucleosidos aciclicos y secuencias oligonucleotidas que los contienen.
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
ES2149962T3 (es) 1993-12-09 2000-11-16 Univ Jefferson Compuestos y metodos para mutaciones dirigidas al sitio en celulas eucarioticas.
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US6248720B1 (en) * 1996-07-03 2001-06-19 Brown University Research Foundation Method for gene therapy using nucleic acid loaded polymeric microparticles
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
US6143037A (en) * 1996-06-12 2000-11-07 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for coating medical devices
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6809193B2 (en) 1997-08-13 2004-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
EP2341057A3 (en) 1997-09-12 2011-11-23 Exiqon A/S Oligonucleotide Analogues
US20030203862A1 (en) 1998-03-26 2003-10-30 Miraglia Loren J. Antisense modulation of MDM2 expression
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US5951455A (en) 1998-12-04 1999-09-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of G-alpha-11 expression
US20040226056A1 (en) 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6040179A (en) 1999-06-25 2000-03-21 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of G-alpha-i2 expression
US20040002153A1 (en) 1999-07-21 2004-01-01 Monia Brett P. Modulation of PTEN expression via oligomeric compounds
US6284538B1 (en) 1999-07-21 2001-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of PTEN expression
US6165728A (en) 1999-11-19 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of NCK-2 expression
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
US20040048249A1 (en) 2000-01-21 2004-03-11 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and secreted polypeptides
AU2001259370A1 (en) 2000-05-09 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of obtaining active antisense compounds
US6974667B2 (en) 2000-06-14 2005-12-13 Gene Logic, Inc. Gene expression profiles in liver cancer
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
US6383809B1 (en) 2000-10-30 2002-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of cytohesin-1 expression
DK2813582T3 (en) 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
US20020160394A1 (en) 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US6468796B1 (en) 2001-04-27 2002-10-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bifunctional apoptosis regulator expression
CA2452458A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20040138163A1 (en) 2002-05-29 2004-07-15 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005517452A (ja) 2002-02-20 2005-06-16 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＢＣＬ２遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
WO2004016735A2 (en) 2002-05-23 2004-02-26 Ceptyr, Inc. Modulation of biological signal transduction by rna interference
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
ES2322145T3 (es) 2002-07-26 2009-06-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Moleculas pequeñas modificadas de adn inerferente y procedimiento de uso.
CA2495298C (en) 2002-08-16 2010-10-19 Rexahn Corporation Use of antisense oligonucleotides to inhibit the expression of akt-1
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
EP2305812A3 (en) 2002-11-14 2012-06-06 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US7655785B1 (en) 2002-11-14 2010-02-02 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
US7696334B1 (en) 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
US20130130231A1 (en) 2002-11-26 2013-05-23 Isaac Bentwich Bioinformatically detectable group of novel viral regulatory genes and uses thereof
CA2513398C (en) 2003-01-31 2013-09-10 Rexahn Corporation Antisense oligonucleotides that inhibit expression of hif-1
WO2005049806A2 (en) 2003-03-14 2005-06-02 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20040198640A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Dharmacon, Inc. Stabilized polynucleotides for use in RNA interference
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
US7244764B2 (en) 2003-06-23 2007-07-17 Neurochem (International) Limited Methods and compositions for treating amyloid-related diseases
US7888497B2 (en) 2003-08-13 2011-02-15 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JP2007538103A (ja) * 2004-05-20 2007-12-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート トランスサイレチン安定化
US7919472B2 (en) 2004-09-17 2011-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
WO2006045202A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Topigen Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotides for treating allergy and neoplastic cell proliferation
JP2008518610A (ja) 2004-11-03 2008-06-05 アルマック ダイアグノスティックス リミテッド トランスクリプトームマイクロアレイ技法およびそれを使用する方法
JP5425474B2 (ja) 2006-01-26 2014-02-26 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ハンチンチン対する、組成物及びその使用
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2008150729A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
US8278283B2 (en) 2007-07-05 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted or unsaturated bicyclic nucleic acid analogs
KR101654007B1 (ko) * 2007-08-15 2016-09-05 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 테트라하이드로피란 핵산 유사체
NZ586875A (en) * 2007-12-28 2012-10-26 Elan Pharm Inc Treatment and prophylaxis of amyloidosis with an antibody that binds a specific epitope of human amyloid A peptide
WO2009143390A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating expression of rbp4
HUE043090T2 (hu) * 2008-06-09 2019-08-28 Univ Muenchen Ludwig Maximilians Gyógyszerek fehérjék aggregálódásának gátlására olyan betegségeknél, amelyek fehérje-aggregálódással és/vagy neurodegeneratív megbetegedésekkel függnek össze
WO2010017509A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
SI2937418T1 (en) 2008-10-20 2018-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compounds and procedures for inhibiting the expression of transthyretin
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
BR112012027547B1 (pt) * 2010-04-29 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina
EP3301177B1 (en) 2011-11-18 2020-03-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
DK3329002T3 (da) 2015-07-31 2021-01-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transthyretin (ttr)-irna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling eller forebyggelse af ttr-forbundne sygdomme
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200058446A (ko) * 2017-09-29 2020-05-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ttr 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법

Also Published As

Publication number Publication date
NL300963I2 (nl) 2021-03-08
US20160369275A1 (en) 2016-12-22
WO2011139917A1 (en) 2011-11-10
EP2563920A1 (en) 2013-03-06
HUE031909T2 (en) 2017-08-28
NO2019001I1 (no) 2019-01-04
PT2563920T (pt) 2017-05-26
JP5896175B2 (ja) 2016-03-30
DK2563920T3 (en) 2017-05-22
BR112012027547B1 (pt) 2022-06-14
EP2563920A4 (en) 2014-11-12
LTC2563920I2 (lt) 2020-10-12
CN103038345A (zh) 2013-04-10
US20140256797A1 (en) 2014-09-11
CY2019001I1 (el) 2019-11-27
US9061044B2 (en) 2015-06-23
EP2563920B1 (en) 2017-03-15
LT2563920T (lt) 2017-05-25
CA2994063A1 (en) 2011-11-10
CA2797792A1 (en) 2011-11-10
US20110294868A1 (en) 2011-12-01
BR112012027547A2 (pt) 2020-10-13
US20150252367A1 (en) 2015-09-10
MX343559B (es) 2016-11-10
HRP20170737T1 (hr) 2017-07-28
US20190169613A1 (en) 2019-06-06
CA2797792C (en) 2018-02-27
NZ603339A (en) 2015-01-30
MX2012012624A (es) 2013-05-06
SI2563920T1 (sl) 2017-05-31
CY2019001I2 (el) 2019-11-27
CY1119070T1 (el) 2018-01-10
NL300963I9 (nl) 2019-01-16
LTPA2019001I1 (lt) 2019-01-25
KR20130098162A (ko) 2013-09-04
RS56011B1 (sr) 2017-09-29
RU2592669C2 (ru) 2016-07-27
US8697860B1 (en) 2014-04-15
US11535849B2 (en) 2022-12-27
HUS1900001I1 (hu) 2019-01-28
US20180273946A1 (en) 2018-09-27
ES2625689T3 (es) 2017-07-20
LUC00096I2 (ko) 2021-04-14
NL300963I1 (ko) 2019-01-08
RU2012150394A (ru) 2014-06-10
US9816092B2 (en) 2017-11-14
US9399774B2 (en) 2016-07-26
JP2013526860A (ja) 2013-06-27
IL222697A0 (en) 2012-12-31
PL2563920T3 (pl) 2017-08-31
LUC00096I1 (ko) 2019-01-07
CN103038345B (zh) 2017-07-21
KR101835386B1 (ko) 2018-03-08
IL222697A (en) 2017-05-29
US20210095281A1 (en) 2021-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11535849B2 (en) Modulation of transthyretin expression
JP6704439B2 (ja) ハンチンチン発現の修飾
AU2017235886B2 (en) Antisense modulation of gcgr expression
US20110237646A1 (en) Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
KR20220077933A (ko) Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물
KR20160054595A (ko) 보체 인자 b의 조절자
AU2011237426A1 (en) Modulation of CETP expression
AU2016203300B2 (en) Modulation of transthyretin expression
US20240132885A1 (en) Modulation of transthyretin expression
AU2011248467A1 (en) Modulation of transthyretin expression

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid