JP6672270B2 - トランスサイレチン（ｔｔｒ）媒介アミロイドーシスの治療方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１４年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４４，１００号明細書、及び２０１５年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１５０，５９６号明細書の利益及びそれらに対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願は両方ともにあらゆる目的から全体として参照により援用される。

トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、主に肝臓で作られる四量体タンパク質である。ＴＴＲ遺伝子の突然変異によってこのタンパク質四量体が不安定になると、単量体のミスフォールディングが起こり、凝集してＴＴＲアミロイド線維（ＡＴＴＲ）となる。組織沈着の結果、全身性ＡＴＴＲアミロイドーシスが引き起こされる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。既報告のＴＴＲ突然変異は１００を超え、様々な疾患症状を呈する。

ＴＴＲアミロイドーシスは種々の形で現れる。末梢神経系がより顕著に冒される場合、この疾患は家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）と称される。病変が主に心臓にあり、神経系にない場合、この疾患は家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）と呼ばれる。主要なＴＴＲアミロイドーシスの第３のタイプは、軟膜／ＣＮＳ（中枢神経系）アミロイドーシスと呼ばれる。

家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及びＡＴＴＲ関連心筋症に関連する最も一般的な突然変異は、それぞれＶａｌ３０Ｍｅｔ（非特許文献４）及びＶａｌ１２２Ｉｌｅ（非特許文献５）である。

現在のＦＡＰ治療の選択肢は、循環アミロイド形成性タンパク質を安定化させ、又はその量を減少させることに重点が置かれている。同所性肝移植は突然変異体ＴＴＲレベルを低減し（非特許文献６）、早期ＦＡＰ患者で生存の改善が報告されているが、野生型ＴＴＲは沈着し続け得る（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２、近刊のＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）。

タファミジス及びジフルニサルは循環ＴＴＲ四量体を安定化させて、疾患の進行を減速させることができる（非特許文献１３；非特許文献４；非特許文献１４；非特許文献１５）。しかしながら、患者の大多数で治療中に症状が悪化し続けることから、ＦＡＰに対する新規の疾患修飾性の治療選択肢の必要性が浮かび上がる。

ＴＴＲを標的化するｄｓＲＮＡの説明については、例えば、（特許文献１）及び（特許文献２）を参照することができる。

ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１３８１号明細書（国際公開第２０１０／０４８２２８号パンフレット） ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５３１１号明細書（国際公開第２０１１／０５６８８３号パンフレット）

Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｆｏｒｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ Ｉ ａｍｙｌｏｉｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ４８３ ｃａｓｅｓ」．Ｉｎ：Ｇｌｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉａ，１９８０ ｐｇ．８８−９３ Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ａｎｄ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」．ＦＥＢＳ Ｊ ２００７，２７４：１６３７−１６５０ Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｆｉｂｒｉｌ ｉｎ ｓｅｎｉｌｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９０，８７：２８４３−２８４５ Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｔａｆａｍｉｄｉｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ」．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１２，７９：７８５−７９２ Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｒｄｉａｃ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ｖ１２２Ｉ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ」．Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ ２００９，１５８：６０７−６１４ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｗｏ Ｓｗｅｄｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ（ＦＡＰ−ｍｅｔ３０）」．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ １９９１，４０：２４２−２４６ Ｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎｔｏ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｉｎ ＦＡＰ ｐａｔｉｅｎｔｓ」．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００７，７：２３５−２４２ Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ」Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５ Ａｕｇ ２５；８５（８）６７５−８２ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｆｔｅｒ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ」．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１２，７８：６３７−６４３ Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｉｍｐａｃｔ ｏｎ Ｓｗｅｄｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ’ｓｕｒｖｉｖａｌ」．Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ ２００９，１５：１２２９−１２３５ Ｓｔａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ」．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９８，６６：２２９−２３３ Ｆｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｏｒｄｉｃ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ−Ａｎ ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｔｒｅａｔ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｎｏｒｄｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ １９８２−２０１３」．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ；５０（６）：７９７−８０８ Ｂｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｄｉｆｌｕｎｉｓａｌ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ」．ＪＡＭＡ ２０１３，３１０：２６５８−２６６７ Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔａｆａｍｉｄｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ」．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１３，２６０：２８０２−２８１４ Ｌｏｚｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｔａｆａｍｉｄｉｓ ｉｎ ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ Ｍｅｔ３０ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ」．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１３，２０：１５３９−１５４５

本明細書には、有効量のトランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物を投与することにより、ヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させる又はその増加を抑制する方法が記載され、ここで有効量は、ヒト対象の血清中ＴＴＲタンパク質濃度を５０μｇ／ｍｌ未満に低下させるか、又は少なくとも８０％低下させる。本明細書にはまた、ＮＩＳの増加又はＦＡＰを有する対象にＴＴＲ阻害組成物を投与すること、及びＮＩＳの増加又はＦＡＰを有する対象のＴＴＲタンパク質レベルを決定することにより、ＮＩＳの増加又は家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）の治療に応じてＴＴＲ阻害組成物の投薬量を調整する方法も記載される。一部の実施形態では、ＴＴＲタンパク質レベルが５０μｇ／ｍｌより高い場合、次に対象に投与するＴＴＲ阻害組成物が増量され、ＴＴＲタンパク質レベルが５０μｇ／ｍｌ未満である場合、次に対象に投与するＴＴＲ阻害組成物が減量される。本明細書にはまた、製剤化されたバージョンのＴＴＲ阻害ｓｉＲＮＡも記載される。

ΔＮＩＳ又はΔｍＮＩＳ＋７の進行とＴＴＲ濃度との関係を示すグラフである。 ΔＮＩＳ又はΔｍＮＩＳ＋７の進行とＴＴＲ濃度との係を示すグラフである。

以下に更に詳細に記載するとおり、本明細書には、有効量のトランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物を投与することにより、この有効量によって血清中ＴＴＲタンパク質濃度が５０μｇ／ｍｌ未満に低下するか、又は少なくとも８０％低下するように、ヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させる又はその増加を抑制する方法が開示される。一実施形態において、ＴＴＲ阻害組成物はパチシランである。パチシランは、静脈内（ＩＶ）投与用の肝指向性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された、ＴＴＲに特異的な低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である。

ＴＴＲ阻害組成物
本明細書に記載される方法は、ＴＴＲ阻害組成物の投与を含む。ＴＴＲ阻害組成物は、ヒト対象の血清中のＴＴＲタンパク質濃度を低下させる任意の化合物であってもよい。例としては、限定はされないが、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡが挙げられる。ｓｉＲＮＡの例としては、ＴＴＲ遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ、例えば、以下のパチシリン（ｐａｔｉｓｉｒｉｎ）（更に詳細に記載する）及びレブシラン（ｒｅｖｕｓｉｒａｎ）が挙げられる。例としてはまた、アンチセンスＲＮＡも挙げられる。ＴＴＲ遺伝子を標的化するアンチセンスＲＮＡの例については、米国特許第８，６９７，８６０号明細書を参照することができる。

ＴＴＲ阻害組成物はＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する。本明細書で使用されるとき、「トランスサイレチン」（「ＴＴＲ」）は細胞の遺伝子を指す。ＴＴＲは、ＡＴＴＲ、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、プレアルブミン、ＴＢＰＡ、及びトランスサイレチン（プレアルブミン、アミロイドーシスＩ型）としても知られる。ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡ転写物の配列はＮＭ＿０００３７１を参照することができる。マウスＴＴＲ ｍＲＮＡの配列はＮＭ＿０１３６９７．２を参照することができ、及びラットＴＴＲ ｍＲＮＡの配列はＮＭ＿０１２６８１．１を参照することができる。

用語「サイレンス」「発現を阻害する」「の発現を下方調節する」「の発現を抑制する」などは、本明細書でそれらがＴＴＲ遺伝子を指す限り、ＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指し、この抑制は、第一の細胞又は細胞の群と実質的に同一であるが処理されていない第二の細胞又は細胞の群（対照細胞）と比較した、ＴＴＲ遺伝子が転写され、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第一の細胞又は細胞の群から単離され得るｍＲＮＡの量の低下により明らかになる。阻害度は、通常、

の点から表される。

代替的に、阻害度は、ＴＴＲ遺伝子発現に機能的に関連付けられるパラメータの低下、例えば、細胞により分泌される、ＴＴＲ遺伝子によりコードされるタンパク質の量、又は所定の表現型、例えばアポトーシスを呈する細胞の数の低下で与えられ得る。原則として、ＴＴＲ遺伝子サイレンシングは、構成的に又は遺伝子操作によって標的を発現している任意の細胞内で、任意の適切なアッセイによって決定され得る。しかしながら、所定のｄｓＲＮＡが、ＴＴＲ遺伝子の発現を所定の程度阻害し、従って本発明に包含されるか否かを決定するために参照が必要である場合、下記の実施例に提供するアッセイは、そのような参照の役割を果たすであろう。

ＲＮＡｉ
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するため、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡであるＴＴＲ阻害組成物を使用する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、この相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、概して１９〜２４ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを更に含み得る。ＴＴＲ阻害ｓｉＲＮＡは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１３８１号明細書（国際公開第２０１０／０４８２２８号パンフレット）及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５３１１号明細書（国際公開第２０１１／０５６８８３号パンフレット）（双方とも全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

一実施形態において、ＴＴＲ阻害組成物は、以下に更に詳細に記載するパチシランである。別の実施形態において、ＴＴＲ阻害組成物は、三価ＧａｌＮＡｃ糖質クラスター共役ＴＴＲに特異的なｓｉＲＮＡであるレブシランである。レブシランについての包括的な説明は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書及び米国特許出願公開第２０１４０３１５８３５号明細書（これらの内容は全体として参照により援用される）を参照することができる。

ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＴＴＲ遺伝子の発現中に形成されたｍＲＮＡの配列に由来する、標的配列に実質的に相補的な、概して完全に相補的な相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含むため、好適な条件下で組み合わせると、これらの２本の鎖はハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。用語「アンチセンス鎖」は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用されるとき、用語「相補性領域」は、ある配列、例えば本明細書に定義するとおりの標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域で最も許容され、存在する場合には概して１つ又は複数の末端領域、例えば５’及び／又は３’末端から６、５、４、３、又は２ヌクレオチドの範囲内にある。用語「センス鎖」は、本明細書で使用されるとき、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。概して、二重鎖構造は、１５〜８０、又は１５〜６０若しくは１５〜３０又は２５〜３０、又は１８〜２５、又は１９〜２４、又は１９〜２１、又は１９、２０、又は２１塩基対長である。一実施形態において、二重鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、二重鎖は２１塩基対長である。

ｄｓＲＮＡの各鎖は、一般に、１５〜８０、又は１８〜６０、又は１５〜３０、又は１８〜２５、又は１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、鎖の各々は、２５〜３０ヌクレオチド長である。二本鎖の各鎖は、同一の長さ又は異なる長さを有してもよい。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせで使用される場合、各ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一でも又は異なっていてもよい。

ｄｓＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドからなる１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを含んでもよい。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４、一般に、１又は２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖を超える３’末端及び５’末端において各々１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。更なる実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖を超える３’末端及び５’末端において各々１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。

本明細書で使用されるとき、特に指示されない限り、用語「相補的」は、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列と比べて記載するために使用するとき、当業者は理解するであろうとおり、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが特定の条件下で第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指す。かかる条件は、例えばストリンジェントな条件であってもよく、ここでストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、続く洗浄を含み得る。生物体内で直面し得るような生理学的に関連性のある条件など、他の条件を適用してもよい。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従い２つの配列の相補性を調べるのに最適な一連の条件を決定することができるであろう。

これには、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとの第一及び第二のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合が含まれる。かかる配列は、本明細書において互いに「完全に相補的」と称され得る。しかしながら、本明細書において第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、これらの２つの配列は完全に相補的であることができ、又はそれらは、その最終的な適用に最も関連性のある条件下でハイブリダイズする能力は保持しつつ、ハイブリダイズしたときに１つ以上の、但し概して４、３、又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたときに１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、相補性の決定に関してかかるオーバーハングはミスマッチと見なさないものとする。例えば、あるオリゴヌクレオチド２１ヌクレオチド長と別のオリゴヌクレオチド２３ヌクレオチド長とを含むｄｓＲＮＡ（ここでは長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む）は、本明細書の記載の目的上、なおも「完全に相補的」と称され得る。

本明細書で使用されるとおりの「相補的」配列はまた、ハイブリダイズ能力に関する上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対及び／又は非天然修飾ヌクレオチドで形成される塩基対も含み、又は全てがそれらによって形成され得る。かかる非ワトソン・クリック塩基対は、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティン塩基対合を含む。

用語「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」は、本明細書において、それらが用いられる文脈から理解されるであろうとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で一致する塩基に関して用いられ得る。

本明細書で使用されるとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡ）の連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡの分断されていない部分に対してその配列が実質的に相補的である場合、ＴＴＲ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。

ｄｓＲＮＡは、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような自動ＤＮＡ合成機を例えば使用することにより、以下で更に考察するとおりの当該技術分野において公知の標準方法によって合成することができる。

修飾ｄｓＲＮＡ
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法に用いられるｄｓＲＮＡは、安定性を増強するため化学修飾される。本発明を特徴付ける核酸は、参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，」Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような、当技術分野にてよく確立された方法により合成及び／又は修飾することができる。本発明に有用なｄｓＲＮＡ化合物の特定の例は、修飾バックボーンを含む又は天然ヌクレオシド間結合を有さないＲＮＡを含む。本明細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するｄｓＲＮＡは、バックボーン内にリン原子を保持するものと、バックボーン内にリン原子を有さないものとを含む。本明細書の目的において、及び、当技術分野にて時折言及されるように、それらのヌクレオシド間バックボーン内にリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なされてもよい。

修飾ｄｓＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び、隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’に結合する、反転極性を有するもの）が挙げられる。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；及び米国特許第５，６２５，０５０号明細書が挙げられ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

内部にリン原子を含まない修飾ｄｓＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部分を有するその他、が挙げられる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許第には、非限定的に米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５号明細書；米国特許第５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；及び米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

他の好適なｄｓＲＮＡ模倣物において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、即ちバックボーンの両方は、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。卓越したハイブリダイゼーション特性を有することが示されている１つのそのようなオリゴマー化合物、ｄｓＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ｄｓＲＮＡの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンで置換されている。酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許第には、非限定的に米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。

本発明の別の実施形態は、ホスホロチオエートバックボーンを有するｄｓＲＮＡ、並びに上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号明細書のヘテロ原子バックボーン、特に−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとして既知］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−及び−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［ここで天然のホスホジエステルバックボーンは、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表される］及び上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミドバックボーンを有するオリゴヌクレオシドである。上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノバックボーン構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。

修飾ｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含み得る。好ましいｄｓＲＮＡは、以下のうちの１つを２’位に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２、（ｎ及びｍは、１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいｄｓＲＮＡは、以下のうちの１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても既知）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基が挙げられる。更なる好ましい修飾には、本明細書の下記の実施例に記載するような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、２’−ＤＭＡＯＥとしても既知のＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び、本明細書の下記の実施例に記載するような２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても既知）、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２が挙げられる。

他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。またｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ内及び５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の変更を行うことができる。またＤｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；及び米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの所定のものは、所有者が本願と共通であり、またこれらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野にて多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａｇｕａｎｉｎ）、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，ＹＳ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを含む。これらの核酸塩基の所定のものは、本発明を特徴付けるオリゴマー化合物の結合親和性の増大に特に有用である。それらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃、増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、更に特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた際に、例示的な塩基置換である。

上記した修飾核酸塩基及び他の修飾核酸塩基の所定の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１号明細書，米国特許第５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；及び米国特許第５，６８１，９４１号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれ、また同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号明細書が挙げられる。

パチシラン
一実施形態において、ＴＴＲ阻害組成物はパチシランである。パチシランは、静脈内（ＩＶ）投与用の肝指向性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された、ＴＴＲに特異的な低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である（Ａｋｉｎｃ Ａ，Ｚｕｍｂｕｅｈｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．「ＲＮＡｉ療法薬の送達用の脂質様物質コンビナトリアルライブラリ（Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；２６（５）：５６１−５６９）。このＴＴＲ ｓｉＲＮＡは、ＷＴ ＴＴＲ並びに既報告のあらゆるＴＴＲ突然変異との相同性を確保して裏付けるため、ＴＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域内に標的領域を有する。ＬＮＰの媒介によって肝臓に送達された後、パチシランはＴＴＲ ｍＲＮＡを分解の標的とし、それによりＲＮＡｉ機構を介して突然変異体及びＷＴ ＴＴＲタンパク質の強力且つ持続的な減少が生じる。

ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−１８３２８としても知られる）は、以下の配列を含むセンス鎖とアンチセンス鎖とからなる；小文字は２’−Ｏ−メチル型のヌクレオチドを示す。

製造工程は、二重鎖の２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって合成することからなる。精製後、２つのオリゴヌクレオチドをアニールして二重鎖にする。

パチシラン薬物製剤は、等張性リン酸緩衝生理食塩水中のＴＴＲ ｓｉＲＮＡ ＡＬＮ−１８３２８と脂質賦形剤（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ_２０００−Ｃ−ＤＭＧ）との無菌配合物である。

パチシランの配合を以下の表１に示す。

一部の実施形態において、パチシラン薬物製剤は、容器、例えばガラスバイアルに、１バイアルにつき以下の量で提供される。

注射用のパチシラン溶液は、２ｍｇ／ｍＬのＴＴＲ ｓｉＲＮＡ薬物物質を含有する。パチシラン薬物製剤は、１０ｍＬガラスバイアルに５．５ｍＬの充填容積で包装される。この容器密閉システムは、米国薬局方／欧州薬局方（ＵＳＰ／ＥＰ）タイプＩホウケイ酸ガラスバイアルと、Ｔｅｆｌｏｎ被覆ブチルゴム栓と、アルミニウムフリップオフキャップとからなる。

四量体安定化剤
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、四量体安定化剤を別のＴＴＲ阻害組成物と共投与することを含む。

四量体安定化剤は、ＴＴＲタンパク質に結合してＴＴＲ四量体を安定化させる働きをする化合物である。ＴＴＲ四量体を不安定化させる突然変異は、ＴＴＲのミスファイル及び凝集を引き起こす。

四量体安定化剤の例としては、タファミジス及びジフルニサルが挙げられる。タファミジス及びジフルニサルは両方ともに、疾患の進行を減速させることができる（Ｂｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，「家族性アミロイドポリニューロパチーに対するジフルニサルの再目的化：無作為化臨床試験（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｄｉｆｌｕｎｉｓａｌ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）」．ＪＡＭＡ ２０１３，３１０：２６５８−２６６７；Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，「トランスサイレチン家族性アミロイドポリニューロパチーの治療に対するタファミジスの長期効果（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔａｆａｍｉｄｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）」．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１３，２６０：２８０２−２８１４；Ｌｏｚｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｅｔ３０トランスサイレチン家族性アミロイドポリニューロパチーの遅発におけるタファミジスの能力低下及び安全性に対する効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｔａｆａｍｉｄｉｓ ｉｎ ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ Ｍｅｔ３０ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）」．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１３，２０：１５３９−１５４５）。

対象及び診断
本明細書には、ヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させる又はその増加を抑制する方法が開示され、ここでヒト対象はＴＴＲ関連障害を有する。一部の実施形態において、ＴＴＲ関連障害は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患の一つである。ある実施形態では、この疾患はＴＴＲアミロイドーシスであり、これは、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、及び症候性ポリニューロパチーなど、種々の形で現れる。末梢神経系がより顕著に冒される場合、この疾患はＦＡＰと称される。病変が主に心臓にあり、神経系にない場合、この疾患は家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）と呼ばれる。主要なＴＴＲアミロイドーシスの第３のタイプは、軟膜／ＣＮＳ（中枢神経系）アミロイドーシスと呼ばれる。ＡＴＴＲは自律神経系に発症する。

一部の実施形態において、ＴＴＲ関連障害を有するヒト対象は、突然変異体ＴＴＲ遺伝子を有する。既報告のＴＴＲ突然変異は１００を超え、様々な疾患症状を呈する。ＦＡＰ及びＡＴＴＲ関連心筋症に関連する最も一般的な突然変異は、それぞれＶａｌ３０Ｍｅｔ及びＶａｌ１２２Ｉｌｅである。ＴＴＲ突然変異はタンパク質のミスフォールディングを引き起こしてＴＴＲアミロイド形成の過程を加速させ、臨床的に有意なＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ（アミロイドーシス−トランスサイレチン型）とも称される）の発生の最も重要なリスク要因である。８５を超えるアミロイド形成性ＴＴＲ変異体が、全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られている。

一部の実施形態において、ヒト対象は、生検によるＡＴＴＲアミロイドーシスの確定診断が得られ且つ軽度から中等度のニューロパチーを有する成人（１８歳以上）である場合、任意の形態のＴＴＲアミロイドーシスに対する治療を受けるように選択される。更なる実施形態において、ヒト対象はまた、以下の１つ以上も有する：カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）≧６０％；ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）１７〜３３ｋｇ／ｍ^２；十分な肝腎機能（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）≦２．５×正常範囲上限（ＵＬＮ）、正常範囲内の総ビリルビン、アルブミン＞３ｇ／ｄＬ、及び国際標準化比（ＩＮＲ）≦１．２；血清クレアチニン≦１．５ＵＬＮ）；及びＢ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルス血清反応陰性。

別の実施形態において、ヒト対象は、肝移植を受けた；治療中に計画された手術を受けた；ＨＩＶ陽性である；３０日以内にタファミジス又はジフルニサル以外の治験薬の投与を受けていた；ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の心不全分類＞２を有した；妊娠中又は授乳中である；全身性細菌、ウイルス、寄生虫、又は真菌感染が判明していたか又はそれが疑われた；不安定狭心症、制御されない臨床的に有意な心不整脈を有した；又は過去にリポソーム製剤に対して重度の反応を起こしたことがあったか、又はオリゴヌクレオチドに対する過敏症が判明していた場合、治療から除外される。

ニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）
本明細書に開示される方法は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物の投与によってヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）を低下させ又はその増加を抑制する。ＮＩＳは、特に末梢性ニューロパチーに関して、筋力低下、感覚、及び反射を計測するスコア化法を指す。ＮＩＳスコアは、筋力低下について標準筋肉群（１は２５％の低下、２は５０％の低下、３は７５％の低下、３．２５は重力に抗して動かすことができる、３．５は重力を除くと動かすことができる、３．７５は筋攣縮はあるが動かない、及び４は麻痺状態である）、標準筋伸展反射群（０は正常、１は低い、２は無しである）、及び触圧、振動、関節位置及び運動、及びピン痛覚（全て示指及び母趾について採点する：０は正常、１は低い、２は無しである）を評価する。評価は、年齢、性別、及び体力で補正する。

一実施形態において、ＮＩＳスコアを低下させる本方法は、少なくとも１０％のＮＩＳの低下をもたらす。他の実施形態において、本方法スコアは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０％、又は少なくとも５０％のＮＩＳの低下をもたらす。他の実施形態において、本方法はＮＩＳスコアの増加を抑制し、例えば、本方法はＮＩＳスコアの０％の増加をもたらす。

ヒト対象のＮＩＳを決定する方法は当業者に周知であり、以下を参照することができる。

Ｄｙｃｋ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．，「ロチェスター糖尿病性ニューロパチー研究コホートにおける複合スコアを用いた糖尿病性ポリニューロパチーの経時的評価（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｔｕｄｙ ｃｏｈｏｒｔ）」，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９７． ４９（１）：ｐｇｓ．２２９−２３９）。

Ｄｙｃｋ ＰＪ．「ポリニューロパチーの検出、特徴付け、及びステージ判定：糖尿病患者における評価（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａｓｓｅｓｓｅｄ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃｓ）」．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．１９８８ Ｊａｎ；１１（１）：２１−３２。

改定ニューロパチー障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物の投与によってヒト対象の改定ニューロパチー障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）を低下させ又はその増加を抑制する。当業者に周知のとおり、ｍＮＩＳ＋７は、大小神経線維機能の電気生理学的計測（ＮＣＳ及びＱＳＴ）及び自律神経機能の計測（体位血圧）と組み合わせた臨床検査に基づく神経学的障害（ＮＩＳ）の評価を指す。

ｍＮＩＳ＋７スコアは、ＮＩＳ＋７スコア（ＮＩＳ＋７つの検査に相当する）の改定版である。ＮＩＳ＋７は筋力低下及び筋伸展反射を分析する。７つの検査のうち５つは神経伝導の属性を含む。これらの属性は、腓骨神経複合筋活動電位振幅、運動神経伝導速度及び運動神経遠位潜時（ＭＮＤＬ）、脛骨ＭＮＤＬ、及び腓腹感覚神経活動電位振幅である。これらの値は、年齢、性別、身長、及び体重の変数について補正される。７つの検査のうち残りの２つは、振動検出閾値及び深呼吸に伴う心拍数低下を含む。

ｍＮＩＳ＋７スコアは、スマート定量的体性感覚検査（Ｓｍａｒｔ Ｓｏｍａｔｏｔｏｐｉｃ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｅｎｓａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の使用、新規の自律神経評価、並びに尺骨、腓骨、及び脛骨神経の振幅の複合筋活動電位、及び尺骨及び腓腹神経の感覚神経活動電位の使用を考慮に入れるようにＮＩＳ＋７を改定するものである（Ｓｕａｎｐｒａｓｅｒｔ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，「治験に向けてＮＩＳ＋７を改定するためのＴＴＲ ＦＡＰコホートの後ろ向き研究（Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ＴＴＲ ＦＡＰ ｃｏｈｏｒｔ ｔｏ ｍｏｄｉｆｙ ＮＩＳ＋７ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｉａｌｓ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，２０１４．３４４（１−２）：ｐｇｓ．１２１−１２８）。

ある実施形態では、ｍＮＩＳ＋７スコアを低下させる本方法は、少なくとも１０％のｍＮＩＳ＋７の低下をもたらす。他の実施形態において、本方法スコアは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０％、又は少なくとも５０％のｍＮＩＳ＋７スコアの低下をもたらす。他の実施形態において、本方法はｍＮＩＳ＋７の増加を抑制し、例えば、本方法はｍＮＩＳ＋７の０％の増加をもたらす。

血清ＴＴＲタンパク質濃度
本明細書に記載される方法は、ヒト対象に有効量のトランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物を投与するステップを含み、ここで有効量は、ヒト対象の血清中ＴＴＲタンパク質濃度を５０μｇ／ｍｌ未満に低下させるか、又は少なくとも８０％低下させる。血清ＴＴＲタンパク質濃度は、当業者に公知の任意の方法、例えば、抗体ベースのアッセイ、例えばＥＬＩＳＡを用いて直接決定することができる。或いは、血清ＴＴＲタンパク質濃度は、ＴＴＲ ｍＲＮＡの量を計測することにより決定してもよい。更なる実施形態において、血清ＴＴＲタンパク質濃度は、代用物質、例えばビタミンＡ又はレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）の濃度を計測することによって決定される。一実施形態において、血清ＴＴＲタンパク質濃度は、以下の実施例に記載するとおりＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定される。

一部の実施形態において、血清ＴＴＲタンパク質の濃度は５０μｇ／ｍｌ未満、又は４０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌ未満に低下する。一部の実施形態において、血清ＴＴＲタンパク質の濃度は８０％、又は８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、又は９５％低下する。

ＡＵＣ
ＡＵＣは、ある用量の薬物、例えばＴＴＲ阻害組成物を患者に投与した後の時間の経過に伴う血流の血漿中における組成物、例えばＴＴＲの濃度の曲線下面積を指す。ＡＵＣは、患者の血漿への組成物の吸収速度及び血漿からのその除去速度の影響を受ける。当業者に公知のとおり、ＡＵＣは、薬物投与後の血漿組成物濃度の積分を計算することによって決定し得る。別の態様において、ＡＵＣは、以下の式を用いて予測することができる：

予測ＡＵＣ＝（Ｄ×Ｆ）／ＣＬ

（式中、Ｄは投薬濃度であり、Ｆはバイオアベイラビリティの計測値であり、及びＣＬは予測クリアランス速度である）。当業者は、予測ＡＵＣの値が±３倍〜４倍の範囲の誤差を含むことを理解する。

一部の実施形態において、ＡＵＣを決定するためのデータは、薬物の投与後に様々な時間間隔で患者から血液試料を採取することによって得られる。一態様において、ＴＴＲ阻害組成物を投与した後の患者の血漿中の平均ＡＵＣは、約９０００〜約１８０００の範囲である。

代謝及び／又は可能性のある他の治療剤との相互作用に関してばらつきがあるため、血漿ＴＴＲ濃度は対象毎に大きく異なり得ることが理解される。本発明の一態様において、血漿ＴＴＲ濃度は対象によって異なり得る。同様に、最高血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）又は最高血漿濃度到達時間（Ｔ_ｍａｘ）又は時点０から最終計測可能濃度時点までの曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）又は血漿濃度時間曲線下総面積（ＡＵＣ）などの値も、対象によって異なり得る。このばらつきにより、ＴＴＲ阻害組成物などの化合物の「治療有効量」を成すために必要な量は、対象によって異なり得る。

医薬組成物
本明細書に記載される方法は、ＴＴＲ阻害組成物、例えば、ＴＴＲ遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ、例えばパチシランの投与を含む。一部の実施形態において、ＴＴＲ阻害組成物は医薬組成物である。

本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」は、ＴＴＲ阻害組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む。用語「薬学的に許容可能な担体」は、治療剤の投与用の担体を指す。かかる担体としては、限定はされないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。この用語は細胞培養培地を具体的に除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が挙げられる。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム、及びラクトースが挙げられ、一方、コーンスターチ及びアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンを挙げることができ、一方、潤滑剤は、存在する場合、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。必要であれば、錠剤は、胃腸管での吸収を遅延させるため、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングされてもよい。

本発明の医薬組成物は、局部又は全身処置のどちらが所望されるか、及び、処置されるべき範囲に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所、経肺、例えば噴霧器を含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送により；気管内、鼻腔内、上皮及び経皮、経口又は非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋内注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えば実質内、くも膜下腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。

本組成物は、肝臓（例えば肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的化する方法で送達され得る。医薬組成物は、注射によって脳に直接送達することができる。注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、又は淡蒼球）への定位的注射によることができ、又はｄｓＲＮＡを中枢神経系の複数の領域に（例えば、脳の複数の領域に、及び／又は脊髄に）送達することができる。ｄｓＲＮＡはまた、脳の拡散領域に送達することもできる（例えば、脳の皮質への拡散送達）。

一実施形態において、ＴＴＲを標的化するｄｓＲＮＡは、一端が組織、例えば脳、例えば脳の黒質、皮質、海馬、線条体、脳梁又は淡蒼球に植え込まれたカニューレ又は他の送達装置を用いて送達することができる。カニューレはｄｓＲＮＡ組成物のリザーバに接続され得る。流れ又は送達は、ポンプ、例えばＡｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）などの浸透圧ポンプ又はミニポンプによって媒介され得る。一実施形態において、ポンプ及びリザーバは組織から離れた範囲、例えば腹部に植え込まれ、送達は、ポンプ又はリザーバから放出部位に通じる導管によって達成される。脳へのｄｓＲＮＡ組成物の注入は、数時間又は数日間、例えば、１、２、３、５、又は７日間又はそれ以上にわたり得る。脳への送達装置については、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号明細書、及び同第５，８１４，０１４号明細書に記載されている。

投薬量及びタイミング
当業者は、対象の有効な治療に必要な投薬量及びタイミングに、限定はされないが、疾患又は障害の重症度、前治療、対象の全般的な健康及び／又は年齢、及び他の既存疾患を含めた特定の要因が影響を及ぼし得ることを理解するであろう。更に、治療有効量の組成物による対象の治療には、単回治療又は連続治療が含まれ得る。本発明に包含されるＴＴＲ阻害組成物の有効な投薬量及び生体内半減期の推定は、本明細書の他の部分に記載されるとおり、従来の方法を用いるか、又は適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づき行うことができる。

一般に、ＴＴＲ阻害組成物の医薬組成物の好適な用量は、レシピエントの体重１キログラム当たり１日０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、概して体重１キログラム当たり１日１〜５０ｍｇの範囲となり得る。

例えば、ＴＴＲ阻害組成物はｓｉＲＮＡであってもよく、一用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６２８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。別の実施形態において、投薬量は０．１５ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇである。例えば、ＴＴＲ阻害組成物は、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、又は０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。ある実施形態では、ＴＴＲ阻害組成物は０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

医薬組成物（例えばパチシラン）は、１日１回、又は５、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日に１回若しくは２回投与され得る。単位投薬量は、例えば数日間にわたるＴＴＲ阻害組成物の徐放を提供する従来の徐放製剤を用いて、数日間にわたる送達用に化合物化することができる。徐放製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤で用い得るような、特定の部位における薬剤の送達に特に有用である。

ある実施形態では、ＴＴＲ阻害組成物はパチシランであり、投薬量は０．３ｍｇ／ｋｇであり、ここで用量は２１日に１回投与される。別の実施形態において、有効量は０．３ｍｇ／ｋｇであり、この有効量は２１日に１回、１ｍＬ／分で１５分間、続いて３ｍＬ／分で５５分間の７０分間の注入によって投与される。別の実施形態において、有効量は０．３ｍｇ／ｋｇであり、この有効量は２１〜２８日おきに２用量で、３．３ｍＬ／分の６０分間の注入によるか、又は１．１ｍＬ／分で１５分間、続いて３．３ｍＬ／分で５５分間の７０分間の注入によって投与される。

ＴＴＲ阻害組成物の投薬量は、ＴＴＲ阻害組成物を投与して対象のＴＴＲタンパク質レベル決定することにより、ＮＩＳの増加又はＦＡＰの治療に応じて調整することができる。ＴＴＲタンパク質レベルが５０μｇ／ｍｌより高い場合、次に対象に投与するＴＴＲ阻害組成物を増量し、ＴＴＲタンパク質レベルが５０μｇ／ｍｌ未満である場合、次に対象に投与するＴＴＲ阻害組成物を減量する。

ＴＴＲ阻害組成物は、標的遺伝子の発現によって媒介される病的過程の治療において有効な他の公知の薬剤と併用して投与することができる。ある実施形態では、パチシランがタファミジス又はジフルニサルなどの四量体安定化剤と共に投与される。いずれにしても、投与担当医師は、当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される標準的な有効性測定を用いて観察された結果に基づき、パチシラン及び／又は四量体安定化剤投与の量及びタイミングを調整することができる。

以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は、あくまでも例示を目的として提供され、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することは意図されない。使用する数（例えば、量、温度等）に関しては正確性を確保するように努めているが、当然ながら、幾らかの実験誤差及び偏差は許容されるべきである。

本発明の実施は、特に指示されない限り、当該分野の技術の範囲内にあるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来方法を用いることになる。かかる技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

実施例１：ＴＴＲアミロイドーシスに対するパチシランの安全性及び有効性
臨床第Ｉ相試験では、パチシランが２８日間にわたって患者のＴＴＲレベルを低下させることが分かった。この試験の結果は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９）に発表した。この発表はあらゆる目的から参照によって援用される。研究デザイン及び結果の概要について、以下のとおり再掲する。

この試験は、ＴＴＲアミロイドーシス患者又は健常成人におけるパチシランの単回投与の安全性及び有効性を判定するための多施設、無作為化、単純盲検、プラセボ対照、及び用量範囲探索試験であった。１８〜４５歳の男性及び女性について、健康であり（病歴、理学的検査、及び１２誘導心電図検査に基づき決定したとき）、ＢＭＩが１８．０〜３１．５であり、十分な肝機能及び血球数を有し、且つ妊娠の可能性がない場合に本試験に適格とした。

参加者系列（各系列４人）を、３：１の比で０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量のパチシラン又はプラセボ（通常生理食塩水）の投与を受けるように無作為に割り付けた。パチシランはそれぞれ１５分間及び６０分間で静脈内投与した。本試験では、注入関連反応のリスクを低減するため、患者は注入前夜及び注入当日に同様の前投薬を受けた。これらの投薬には、デキサメタゾン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが含まれた。

全ＴＴＲについてバリデートされた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、血清ＴＴＲレベルに反映されるとおりのパチシランの薬力学的活性を計測した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）。各患者のＴＴＲ、レチノール結合タンパク質、及びビタミンＡのベースラインレベルは、パチシラン投与前の４回の計測の平均値と定義した。薬物投与開始時から２８日目まで有害事象をモニタした。安全性のモニタリングには、血液学的評価、血液化学分析、及び甲状腺機能検査も含まれた。

パチシランに含まれるＴＴＲ ｓｉＲＮＡの血漿薬物動態を、バリデートされたＥＬＩＳＡベースのハイブリダイゼーションアッセイを用いて判定した。ｓｉＲＮＡの検出及び定量化には、ＡＴＴＯ−Ｐｒｏｂｅ−ＨＰＬＣアッセイ（定量下限、１ミリリットル当たり１．０ｎｇ）（Ｔａｎｄｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ ＵＴ）を使用した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＮＪ）を使用して薬物動態推定値を決定した。

ベースラインレベルと比較したときのＴＴＲ、ビタミンＡ、及びレチノール結合タンパク質のノックダウンを計測した（データは示さず）。

結果
最も低い２つのパチシラン用量では、ＴＴＲレベルの有意な変化は（プラセボと比較したとき）観察されなかった。しかしながら、０．１５〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量を投与された全ての参加者で実質的なＴＴＲのノックダウンが観察された（データは示さず）。ＴＴＲノックダウンは、３つの用量レベル全てにおいて急速、強力且つ持続的であり、２８日目までプラセボと比較したとき極めて有意に変化した（Ｐ＜０．００１）。０．１５及び０．３ｍｇ／ｋｇで見られたロバストな反応及び０．５ｍｇ／ｋｇでの中程度の漸進的な反応改善を踏まえ、１人の参加者のみが０．５ｍｇ／ｋｇの用量を受けた。

反応動態は、特に少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇの用量であれば、参加者間にばらつきがほとんどなく（データは示さず）、３日目までに５０％超低下し、ほぼ１０日目までに最下点レベルとなり、２８日目にも５０％を超える抑制が続き、７０日目までに完全な回復が起こった。０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び０．５ｍｇ／ｋｇの投与を受けた参加者のＴＴＲノックダウンの最高値は、それぞれ８５．７％、８７．６％、及び９３．８％であった。０．１５ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量での平均最下点は、それぞれ８２．３％（９５％信頼区間（ＣＩ）、６７．７〜９０．３）及び８６．８％（９５％ＣＩ、８３．８〜８９．３）であった；これらの最下点は、絶対ＴＴＲレベル又はパーセントＴＴＲノックダウンのいずれで分析したときも、参加者間でほとんどばらつきを示さず、プラセボと比較したとき極めて有意であった（Ｐ＜０．００１）（データは示さず）。

ノックダウンの程度によって抑制期間が決まるように見え、２８日目の低下の平均は、０．１５ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの投与を受けた参加者についてそれぞれ５６．６％（９５％ＣＩ、１１．６〜７８．７）及び６７．１％（９５％ＣＩ、４５．５〜８０．１）であり、０．５ｍｇ／ｋｇの投与を受けた１人の患者について２８日目に７６．８％の低下であった。０．３ｍｇ／ｋｇの用量でヒトにおいて観察されたＴＴＲノックダウンは、同じ用量レベルで非ヒト霊長類において見られるものと事実上同じであった（データは示さず）。パチシランによるこれらのＴＴＲの低下はレチノール結合タンパク質及びビタミンＡレベルの変化と相関した（データは示さず）。

パチシランの使用は、血液学、肝臓、若しくは腎臓計測値又は甲状腺機能にいかなる有意な変化ももたらさず、薬物関連重篤有害事象又は有害事象に起因する治験薬中止はなかった（データは示さず）。

パチシランの血漿薬物動態プロファイルから、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡのピーク血漿濃度及び最終日までの曲線下面積の値が、試験した用量範囲でほぼ用量比例的に増加したことが示された（データは示さず）。

パチシランの特異性
パチシランの効果の特異性を更に実証するため、ＡＬＮ−ＰＣＳ（これは、パチシランに使用されるのと同種の脂質ナノ粒子に製剤化された、ＰＣＳＫ９（コレステロール降下の標的）を標的化するｓｉＲＮＡを含む）の第１相試験における健常ボランティア群のＴＴＲも計測した。０．４ｍｇ／ｋｇ ＡＬＮ−ＰＣＳ（いわゆる対照ｓｉＲＮＡ）の単回投与はＴＴＲに何ら効果を及ぼさなかったことから（データは示さず）、ＴＴＲに対するパチシランの効果はｓｉＲＮＡによる特異的な標的化に起因したもので、脂質ナノ粒子の製剤の非特異的な効果ではなかったことが示された。

０．３ｍｇ／ｋｇの用量を投与された参加者から得た血液試料に対する５’ＲＡＣＥ（相補ＤＮＡ末端迅速増幅）アッセイを用いて循環細胞外ＲＮＡにおける予測ＴＴＲ ｍＲＮＡ切断産物を検出することにより、パチシランの薬力学的効果の特異性及び作用機序を裏付ける更なるエビデンスが得られた。血液試料を採取するため、凝固血液試料（対象からの投与前及び投与後２４時間）を１２００×ｇで２０分間遠心した後に血清を採取した。血清を更にもう一回１２００×ｇで１０分間遠心して浮遊細胞材料を除去し、次に凍結した。解凍した血清を塩化リチウム（終濃度１Ｍ）と混合し、４℃で１時間インキュベートした。試料を４℃、１２０，０００×ｇで２時間スピンしてＲＮＡをペレット化し、ペレットからＴｒｉｚｏｌ抽出（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）及びイソプロパノール沈殿によって全ＲＮＡを単離した。

ＴＴＲ ｓｉＲＮＡの媒介による切断産物を検出するため、単離したＲＮＡを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したライゲーション媒介ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用した。ＲＮＡをＧｅｎｅＲａｃｅｒアダプターにライゲートし、ＴＴＲ特異的リバースプライマー（５’−ａａｔｃａａｇｔｔａａａｇｔｇｇａａｔｇａａａａｇｔｇｃｃｔｔｔｃａｃａｇ−３’）（配列番号３）を使用して逆転写し、続いてアダプターに相補的なＧｅｎｅ Ｒａｃｅｒ ＧＲ５’フォワードプライマー及びＴＴＲ特異的リバースプライマー（５’−ｇｃｃｔｔｔｃａｃａｇｇａａｔｇｔｔｔｔａｔｔｇｔｃｔｃｔｇ−３’））（配列番号４）を使用して２ラウンドのＰＣＲを行った。ＧＲ５’ネステッドプライマー及びＴＴＲ特異的リバースネステッドプライマー（５’−ｃｔｃｔｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｔａａｃａｔａｇｃａｔａｔｇａｇｇｔｇ−３’））（配列番号５）でネステッドＰＣＲを実施した。ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＣＲ産物をクローニングした。クローニングしたインサートを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって増幅した。Ｍａｃｒｏｇｅｎシーケンシング施設においてこれらのアンプリコンをＴ７プロモータープライマーでシーケンシングした。ＣＬＣ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈを使用して９６クローンからの配列をヒトＴＴＲとアラインメントした。

投与前試料及び薬物投与２４時間後に得た試料の両方でＴＴＲ ｍＲＮＡが検出された。ＲＮＡｉ機構と一致して、３人の参加者全てにおいて投与前試料に予測ｍＲＮＡ切断産物はなく、投与後試料には存在した（データは示さず）。

ヒト血清中の野生型及び突然変異体ＴＴＲを定量化するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイの適格性評価及び実施がＴａｎｄｅｍ Ｌａｂｓによって行われた。キモトリプシンを使用して血清試料を消化し、次にタンパク質沈殿抽出によって処理した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。そのユニークな特異的質量電荷比遷移に従い、野生型ＴＴＲに相当するキモトリプシンペプチドＴＴＲＷ−１及び突然変異体Ｖ３０Ｍに相当するＶ３０Ｍ−１をモニタした。安定同位体標識ペプチド（ＴＴＲＷ−１−Ｄ８及びＶ３０Ｍ−１−Ｄ８）を使用して得られた標準検量線データを用いてヒト血清試料中の内因性ペプチド断片（ＴＴＲＷ−１及びＶ３０Ｍ−１）を計算した。標準のピーク面積比（即ち内部標準ＴＴＲＷ−Ｌ１−Ｄ１６に対するＴＴＲＷ−１−Ｄ８及びＶ３０Ｍ−Ｌ１−Ｄ１６に対するＶ３０Ｍ−１−Ｄ８）を使用して、１／ｘ２加重最小二乗回帰分析を用いて線形検量線を作成した。適格性が確認されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により、５〜２５００ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線で５ｎｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ）が達成された。

実施例２：家族性アミロイドポリニューロパチーに対するパチシラン療法の安全性及び有効性に関する複数用量試験
この臨床第ＩＩ相試験では、ＴＴＲ媒介性ＦＡＰ患者に複数用量のパチシランを投与して、これらの患者における複数漸増静脈内用量のパチシランの安全性、忍容性、薬物動態、及び薬力学を判定した。このデータは、２０１３年１１月に行われた家族性アミロイドポリニューロパチー国際シンポジウム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ Ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ＩＳＦＡＰ）において発表した。

適格患者は、生検によるＡＴＴＲアミロイドーシスの確定診断が得られ且つ軽度から中等度のニューロパチーを有する成人（≧１８歳）であって；カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）≧６０％；ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）１７〜３３ｋｇ／ｍ^２；十分な肝腎機能（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）≦２．５×正常範囲上限（ＵＬＮ）、正常範囲内の総ビリルビン、アルブミン＞３ｇ／ｄＬ、及び国際標準化比（ＩＮＲ）≦１．２；血清クレアチニン≦１．５ＵＬＮ）；及びＢ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルス血清反応陰性の者とした。患者は、肝移植を受けた；本試験中に計画された手術を受けた；ＨＩＶ陽性であった；３０日以内にタファミジス又はジフルニサル以外の治験薬の投与を受けていた；ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の心不全分類＞２を有した；妊娠中又は授乳中であった；全身性細菌、ウイルス、寄生虫、又は真菌感染が判明していたか又はそれが疑われた；不安定狭心症、制御されない臨床的に有意な心不整脈を有した；又は過去にリポソーム製剤に対して重度の反応を起こしたことがあったか、又はオリゴヌクレオチドに対する過敏症が判明していた場合、除外した。

これは、ＦＡＰ患者におけるパチシランの多施設、国際的、非盲検、複数用量漸増第ＩＩ相研究であった。３人の患者のコホートが２用量のパチシランの投与を受け、各用量は静脈内（ＩＶ）注入として投与した。コホート１〜３には、それぞれパチシラン０．０１、０．０５及び０．１５ｍｇ／ｋｇの２用量を４週に１回（Ｑ４Ｗ）投与し；コホート４及び５には、両方ともに、パチシラン０．３ｍｇ／ｋｇの２用量をＱ４Ｗで投与した。コホート６〜９の患者は全て、パチシラン０．３ｍｇ／ｋｇの２用量の投与を３週に１回（Ｑ３Ｗ）受けた。全ての患者がパチシラン注入前に毎回、注入関連反応のリスクを低減するため、デキサメタゾン、パラセタモール（アセトアミノフェン）、Ｈ２ブロッカー（例えば、ラニチジン又はファモチジン）、及びＨ１ブロッカー（例えば、セチリジン、ヒドロキシジン又はフェキソフェナジン）からなる前投薬を受けた。パチシランは、３．３ｍＬ／分で６０分間、又はマイクロドージングレジメン（１．１ｍＬ／分で１５分間、続いて残りの用量について３．３ｍＬ／分）を用いて７０分間かけてＩＶ投与した。

全ての患者について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて血清中の全ＴＴＲタンパク質レベルを評価した。加えて、専売の質量分析法（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ突然変異を有する患者の血清中の野生型及び突然変異体ＴＴＲタンパク質を個別且つ特別に計測した。血清試料は、スクリーニング時、及び０、１、２、７、１０、１４、２１、２２、２３日目（Ｑ３Ｗのみ）；２８、２９日目（Ｑ４Ｗのみ）；３０日目（Ｑ４Ｗのみ）；３１日目（Ｑ３Ｗのみ）；３５、３８日目（Ｑ４Ｗのみ）並びにフォローアップの４２、４９、５６、１１２及び２０８日目に採取した。

０日目及び以下の時点、即ち、投与前（計画された投与開始の１時間以内）、注入終了時（ＥＯＩ）、注入後５、１０及び３０分並びに１、２、４、６、２４、４８、１６８、３３６、５０４時間（２１日目、Ｑ３Ｗレジメンのみ）及び６７２時間（２８日目、Ｑ４Ｗレジメンのみ）で採取した血液試料に基づき、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡの血漿濃度−時間プロファイルを作成した。Ｑ４Ｗレジメンについては８４及び１８０日目、及びＱ３Ｗレジメンについては３５、９１及び１８７日目に更なる試料を採取した。コホート３〜９は、０日目、ＥＯＩ、及び注入後２時間の血液試料について、遊離及び封入ＴＴＲ ｓｉＲＮＡの両方も分析した。血清ＴＴＲ ｓｉＲＮＡは、バリデートされたＡＴＴＯ−Ｐｒｏｂｅ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイ（Ｔａｎｄｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）を使用して分析した。ＰＫ分析は、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ血漿濃度−時間データのノンコンパートメント及び／又はコンパートメント評価を用いて実施して、バリデートされたソフトウェアプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を使用してＰＫパラメータ推定値を決定した。投与後に排泄ＴＴＲ ｓｉＲＮＡレベルについて尿試料を分析し、腎クリアランス（ＣＬ_Ｒ）を計測した。

血清中ビタミンＡ及びレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）レベルを、全ＴＴＲに関して指定したのと同じ時点で、それぞれＨＰＬＣ及び比濁法によって計測した（Ｂｉｏｍｉｎｓ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）。

ＰＰ集団のベースラインからのＴＴＲノックダウンの平均値及び分散を計算した（ベースラインは全投与前値の平均として定義した）。分散分析（ＡＮＯＶＡ）及び共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を用いて、個別のペアワイズ比較（用量レベル間）のチューキーの事後検定によりＰＤデータ（自然対数変換した対ベースラインＴＴＲ）を分析した。最下点ＴＴＲレベルは、各用量投与後の２８日期間（Ｑ３Ｗ群については２１日期間）（初回用量期間、２回目用量期間：Ｑ４Ｗ群及びＱ３Ｗ群についてそれぞれ１〜２８、２９〜５６日目及び１〜２１、２２〜４２日目）における患者毎の最低レベルとして定義した。ベースラインと比べたＴＴＲとＲＢＰ又はビタミンＡとの関係、及び野生型レベルとＶ３０ＭＴＴＲレベルとの関係を線形回帰によって調べた。パワーモデル解析を用いてＰＫパラメータにおけるパチシラン成分の用量比例性を判定した。ＡＥは、国際医薬用語集（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ：ＭｅｄＤＲＡ）のコード体系、第１５．０版、並びにＡＥ、検査データ、バイタルサインデータ、及びＥＣＧ間隔データに関して提供される記述統計学を使用してコード化した。全ての統計分析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．３又はそれ以上を使用して実施した。有効性及び薬力学：平均値（ＳＤ）ベースライン血清ＴＴＲタンパク質レベルは用量コホート間で同程度であった：０．０１、０．０５、０．１５、０．３ Ｑ４Ｗ及び０．３ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ投薬群について、それぞれ、２７２．９（９８．８６）、２２６．５（１２．６７）、２７６．１（７．６５）、２４２．６（３８．３０）及び２３５．５（４４．４５）μｇ／ｍＬ。

０．０１ｍｇ／ｋｇ用量コホートと比較して、０．３ｍｇ／ｋｇ Ｑ４Ｗ及びＱ３Ｗコホートにおいて１回目及び２回目のパチシラン投与後にＴＴＲの有意な低下（ｐ＜０．００１ ＡＮＣＯＶＡ後の事後検定による）が観察された（データは示さず）。Ｖａｌ３０Ｍｅｔ突然変異を有する患者では、野生型及び突然変異体ＴＴＲについてほぼ同程度のノックダウンが観察された（データは示さず）。血清ＴＴＲノックダウンレベルはＲＢＰ（ｒ^２＝０．８９、ｐ＜１０^−１５）及びビタミンＡ（ｒ^２＝０．９０、ｐ＜１０^−１５）の循環レベルの低下と高度に相関した（データは示さず）。

タファミジス又はジフルニサルを服用した患者は、安定化剤療法薬を服用しなかった患者と比較して血清ＴＴＲのベースラインレベルが有意に増加したが（ｐ＜０．００１ ＡＮＯＶＡによる）（データは示さず）、パチシラン投与はこれらの２つの患者群に同程度のＴＴＲノックダウンをもたらした（データは示さず）。

薬物動態：パチシランＴＴＲ ｓｉＲＮＡ成分の平均濃度はＥＯＩ後に低下し（データは示さず）、２１／２８日目の２回目の投与後にｓｉＲＮＡの蓄積はなかった。各投与後の封入対非封入ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ濃度の計測から、循環ＬＮＰ製剤の安定性が示された。１回目及び２回目の両方の投与について、最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）及び０から最終計測可能時点までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｌａｓｔ）の平均値は、試験した用量範囲で用量比例的に増加した。投与１及び投与２後のＣｍａｘ及びＡＵＣ０−ｌａｓｔは同等であり、蓄積はなかった。０日目及び２１／２８日目のパチシランの終末半減期中央値は用量＞０．０１ｍｇ／ｋｇで３９〜５９時間であり、各用量コホートについて投与１及び投与２を比べたとき比較的変化が少なかった。

これらの第ＩＩ相データは、パチシランによるＦＡＰ患者の治療が血清ＴＴＲタンパク質レベルのロバストな用量依存的且つ統計的に有意なノックダウンをもたらしたことを実証している。３〜４週間おきに投与したパチシラン０．３ｍｇ／ｋｇの２連続用量で８０％超の持続的な平均ＴＴＲ低下が実現し、Ｑ３Ｗ群では９６％の最大ノックダウンが実現した。これらのノックダウン率は、パチシランの単回漸増投与プラセボ対照第１相試験（Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１３ａ）で観察された率と一致している。他の全身性アミロイド疾患からのエビデンスは、疾患原因のタンパク質が僅か５０％程減少することにより、臨床上の疾患改善又は安定化が得られ得ることを示している（Ｌａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｌａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００７）。パチシランによるＴＴＲノックダウンの程度は、患者がタファミジス又はジフルニサルを服用することによる影響を受けなかったことから、これらのＴＴＲ安定化剤薬物がパチシランの薬理活性を妨げないことが示唆される。Ｖａｌ３０Ｍｅｔ突然変異を有する患者では、パチシランは突然変異型及び野生型の両方のＴＴＲの産生を抑制した；後者は肝移植後の遅発性ＦＡＰ患者においてアミロイド形成性のままである（Ｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，２００３；Ｌｉｅｐｎｉｅｋｓ ｅｔ ａｌ，２０１０）。

実施例３：パチシランの投与によるＮＩＳ及びｍＮＩＳ＋７によって計測するときの神経学的障害の低減
実施例２に記載するプロトコルを用いてＦＡＰ患者で非盲検拡大研究を実施した、及び実施する。パチシランの投与により、ＮＩＳ及びｍＮＩＳ＋７の両方が低下した。

先に第２相試験で投与されたＦＡＰ患者を適格として、第２相ＯＬＥ研究に繰り越し登録した。６ヵ月毎に臨床エンドポイントを評価して、０．３０ｍｇ／ｋｇで３週に１回、最長２年の投与を実施した、及び実施する。この研究目的には、神経学的障害に対する効果（ｍＮＩＳ＋７及びＮＩＳ）、クオリティ・オブ・ライフ、ｍＢＭＩ、能力低下、運動能力、握力、自律神経症状、皮膚生検の神経線維密度、心臓病変（心臓サブ群において）、及び血清ＴＴＲレベルが含まれた。

患者の人口統計学的特性を以下に示す。

ベースライン特性には、以下が含まれた。

以下の表に示すとおり、パチシランの投与は血清ＴＴＲレベルの降下をもたらした。パチシランは約８０％の持続的な血清ＴＴＲ降下を実現し、投与間に最大８８％の更なる最下点があった。

以下の表に示すとおり、パチシランの投与は、６及び１２ヵ月時に計測したときｍＮＩＳ＋７の変化をもたらした。

以下の表に示すとおり、パチシランの投与は６及び１２ヵ月時にＮＩＳの変化をもたらした。

図１及び図２に示すとおり、ΔＮＩＳ又はΔｍＮＩＳ＋７の進行とＴＴＲ濃度との間の関係を線形回帰によって調べた。ＴＴＲ及び平均投与前トラフ値［ＴＴＲ］は６ヵ月時のｍＮＩＳ＋７の変化と相関した。

ＮＩＳ及びｍＮＩＳ＋７は０、６、及び１２ヵ月時に計測した。０〜６ヵ月及び０〜１２ヵ月のΔＮＩＳ又はΔｍＮＩＳ＋７を応答変数として使用した。予測変数には、２つの異なるＴＴＲ濃度計測値：ＴＴＲタンパク質濃度曲線下面積（「ＡＵＣ」）、及び８４及び１６８日目（０〜６ヵ月の比較について）及び８４、１６８、２７３、及び３５７日目（０〜１２ヵ月の比較について）におけるベースラインと比べた平均パーセントノックダウンを含めた。

いずれのＴＴＲ計測値も、「ベースライン」は全投与前値の平均として定義した。ＴＴＲ ＡＵＣは、未加工のＴＴＲ濃度（μｇ／ｍＬ）及びベースライン値を始端として（０日目に挿入）１８２日目（０〜６ヵ月の比較について）又は３５７日目（０〜１２ヵ月の比較について）までにわたり台形法を使用して計算した。ベースラインに対するパーセントノックダウンは、予定した各時点で計算した。線形回帰を実施して、予測変数と応答変数との間に関連性はないとする帰無仮説の検定に関連するＰ値を報告した。

１２ヵ月時にｍＮＩＳ＋７及びＮＩＳ変化の平均はそれぞれ−２．５及び０．４ポイントであったが、これは同様のベースラインＮＩＳを有した患者集団における先行のＦＡＰ研究からの１２ヵ月時推定ｍＮＩＳ＋７及びＮＩＳの急激な増加（例えば、１０〜１８ポイントの増加）と比べても遜色がない。ニューロパチー障害スコアの進行に対するパチシランの好ましい影響は、ＴＴＲ低下の程度と相関した。これは、パチシランによる血清ＴＴＲ負荷量の低下がＦＡＰ患者の臨床的有益性につながることを実証している。

本発明は好ましい実施形態及び様々な代替的実施形態を参照して具体的に例示及び説明されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくそれらに形態及び詳細の様々な変更を加え得ることを理解するであろう。

本明細書の本文中で引用される全ての参考文献、付与済みの特許及び特許出願は、あらゆる目的から本明細書によって全体として参照により援用される。

Claims (22)

1. ＴＴＲ関連障害を有するヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させるための医薬組成物であって、０．３ｍｇ／ｋｇの以下に記載されるとおりのパチシランを含み、：
   前記パチシランが静脈内投与され、且つ有効量により、前記ヒト対象の血清中ＴＴＲタンパク質濃度が５０μｇ／ｍｌ未満に低下するか、又は少なくとも８０％低下し、前記ＴＴＲ濃度が酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される、医薬組成物。
2. ＴＴＲ関連障害を有するヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させる又はその増加を抑制するための医薬組成物であって、以下に記載されるとおりのパチシランを含み、
   ここで、０．３ｍｇ／ｋｇの医薬組成物が前記ヒト対象に２１日に１回静脈内投与され、血清ＴＴＲタンパク質濃度を５０μｇ／ｍｌ未満に低下させるか、又は少なくとも８０％低下させる、医薬組成物。
3. ＴＴＲ関連障害を有するヒト対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）又は改定ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を低下させる又はその増加を抑制するための医薬組成物であって、有効量のトランスサイレチン（ＴＴＲ）阻害組成物を含み、前記有効量が治療６ヵ月後に９０００〜１８０００の平均血清ＴＴＲ ＡＵＣをもたらす、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 以下
   に記載されるとおりのパチシランを含む、ヒト対象のトランスサイレチン（ＴＴＲ）発現を阻害するための医薬組成物。
5. 以下
   に記載されるとおりのパチシランからなる医薬組成物であって、ここで前記医薬組成物がバイアルに含まれる、ヒト対象のトランスサイレチン（ＴＴＲ）発現を阻害するための医薬組成物。
6. 前記組成物が０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
7. 前記組成物が０．１５〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
8. 前記組成物が０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
9. 前記組成物が０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２１日に１回投与される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
10. 前記組成物が、１ｍＬ／分で１５分間、続いて３ｍＬ／分で５５分間の７０分間の注入によって０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２１日に１回投与される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
11. 治療が、血清トランスサイレチンに関するＥＬＩＳＡによって決定するとき８２．３〜８６．８％の範囲の平均トランスサイレチンレベル低下をもたらす、請求項４または５に記載の医薬組成物。
12. 前記ヒト対象が、軽度から中等度のニューロパチーを伴うトランスサイレチンアミロイドーシスの生検による確定診断を有する、請求項４または５に記載の医薬組成物。
13. ヒト対象におけるトランスサイレチン媒介アミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のための、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
14. 前記組成物が０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 前記組成物が０．１５〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
16. 前記組成物が０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
17. 前記組成物が０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２１日に１回投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
18. 前記組成物が、１ｍＬ／分で１５分間、続いて３ｍＬ／分で５５分間の７０分間の注入によって０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２１日に１回投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
19. 治療が前記対象のニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）の低下をもたらす、請求項１３に記載の医薬組成物。
20. 前記ヒト対象が症候性ポリニューロパチーを有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
21. 前記ヒト対象が、確認されているＴＴＲ突然変異を有するＦＡＰの診断を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
22. 請求項４又は５に記載の組成物と使用説明書とを含むキット。