KR102175230B1 - 헌팅틴 발현의 조절 - Google Patents

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Abstract

동물에서 헌팅틴 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키는 방법, 화합물, 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법, 화합물, 및 조성물은 헌팅톤병, 또는 그의 증상을 치료하고, 지연시키고, 또는 개선하는 데에 유용하다.

Description

헌팅틴 발현의 조절{MODULATION OF HUNTINGTIN EXPRESSION}
[서열 목록]
본 출원은 전자적 형태의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 456 Kb 크기로, 2010년 9월 8일자로 생성된 BIOL0113WOSEQ.txt 제목의 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자적 형태 내 정보는 온전히 그대로 참조로서 본 명세서에 포함된다.
동물에서 헌팅틴 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키는 방법, 화합물, 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법, 화합물, 및 조성물은 예를 들어 헌팅톤병, 또는 그의 증상을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하는 데에 유용하다.
헌팅톤병 (HD)은 헌팅틴 단백질 내에 비정상적으로 긴 폴리글루타민 (PolyQ) 관을 암호화하는 CAG 삼뉴클레오티드 반복 확장에 의해 야기되는 치명적인 상염색체 우성, 신경변성 질환이다. HD 염색체상에서 확장되고 불안정한 다형성 삼뉴클레오티드 반복을 포함하는 유전자, IT15로 이루어진 헌팅톤 질환 유전자는 1993년에 최초로 지도화되었다 (The Huntington Collaborative Research Group. Cell. 1993, 72:971-83). 정상적 크기 범위 내 CAG 반복이 통상적으로 멘델 유전자좌로서 유전된다고 하더라도, 확장된 HD 반복은 감수분열 전파를 통해 불안정하고 HD 환자에서 정상적 크기 범위 (6-34 반복 단위)를 벗어나 확장되는 것으로 규명되었다.
정상 및 변형 헌팅틴 단백질 모두는 주로 뉴런의 세포질 내에 위치한다 (DiFiglia 등, Neuron 1995, 14: 1075-81). 과도한 폴리글루타민 길이의 결과, 헌팅틴 단백질은 CNS 뉴런의 세포질 및 핵 내에 응집체를 형성한다 (Davies et al., Cell 1997, 90: 537-548). 형질전환 동물 및 유전적으로 변형된 세포주 모두가 헌팅틴의 국소화 및 프로세싱에 미치는 확장된 폴리Q 반복의 효과를 조사하는데 사용되어 왔다. 그러나, 원래 응집체의 형성이 세포 기능장애의 필수적인 세포독성 단계인지 또는 그의 결과인지 여부는 여전히 불투명하다.
HD는 진행성 무도병, 정신적 변화 및 지능 저하를 특징으로 한다. 이러한 우성 장애는 남성 및 여성에게 똑같이 영향을 미치고, 모든 인종에서 야기된다 (Gusella and MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol. 1995 5:656-62). HD의 증상은 다수의 뇌 영역 내에서 뉴런의 사멸에 기인하지만, 선조체 내, 특히 꼬리핵 내에 가장 명백하고, 이는 전체 구조를 궁극적으로 파괴하는 진행성 구배의 세포 소실을 야기한다. 헌팅틴을 암호화하는 유전자가 보편적으로 발현된다고 하더라도 (Strong, T.V. 등, Nat. Genet. 1995, 5: 259-263), 선택적 세포 소실 및 세동성 별아교세포종이 HD 환자의 뇌, 특히 선조체의 꼬리핵 및 조가비핵 내 및 대뇌피질 내에서 관찰되고 (Vonsattel, J-P. 등, Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44: 559-577), 더 낮은 수준으로는, 해마 (Spargo, E. 등, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56: 487-491) 및 시상하부 (Byers, R.K. et al., Neurology 1973, 23: 561-569) 내에서 관찰된다.
헌팅틴은 정상적 발생에 결정적이며 세포 생존 유전자로서 간주될 수 있다 (Nasir 등, Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431-1435). 헌팅틴의 정상적 기능에 대해 그의 특징이 완전히 규명되지는 않았지만, 단백질-단백질 상호작용에 근거하면, 골격근과 관련이 있고 신경발생에 요구되는 것으로 보인다 (Walling 등, J. Neurosci Res. 1998, 54: 301-8). 헌팅틴은 아폽토시스 세포 사멸에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려진, 주요 시스테인 프로테아제인 아포파인에 의해 아폽토시스 동안 특이적으로 절단된다. 절단 속도는 더 긴 폴리글루타민 관에 의해 증가되는데, 이는 부적절한 아폽토시스가 HD의 원인임을 제안하는 것이다.
안티센스 기술이 특정 유전자 산물의 발현을 감소시키기 위한 효과적인 수단으로 부상하고 있고, 이에 헌팅틴 발현의 조절을 위한 수많은 치료학적, 진단학적 및 연구적 응용에 매우 유용한 것으로 입증될 수 있다 (미국특허공개 제2008/0039418호 및 제2007/0299027호 참조).
헌팅틴의 발현을 조절하기 위한 안티센스 화합물이 앞서 언급한 공개 특허 출원에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 화합물에 대한 부가적인 요구가 남아있다.
헌팅틴의 발현을 조절하고 헌팅톤병 및/또는 이의 증상을 치료하고, 예방하고, 지연시키고, 또는 개선하기 위한 방법, 화합물, 및 조성물이 본 명세서에 제공된다.
전술한 일반적인 서술 및 하기의 상세한 설명 모두는 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 바와 같은, 발명을 제한하지 않는 것으로 이해된다. 본 명세서에서, 단수의 사용은 달리 특별히 지시되지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "또는"의 사용은 달리 지시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 ＂포함하는＂ 및 다른 형태, 예컨대 ＂포함하다＂ 및 ＂포함된＂의 사용은 비제한적이다. 또한, ＂요소＂ 또는 ＂성분＂과 같은 용어는 달리 특별히 지시되지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 요소들 및 성분들과 하나 이상의 소단위를 포함하는 요소들 및 성분들 모두를 포함한다..
본 명세서에 사용된 항목의 제목은 단지 체계적인 목적을 위한 것으로, 기술된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 이들로 제한되는 것은 아니지만, 특허, 특허출원, 기사, 서적 및 논문을 비롯한, 본 출원에 인용된 모든 문헌들, 또는 문헌들의 일부는 온전히 그대로뿐만 아니라, 본 명세서에 논의된 문헌의 일부에 대해 참조로서 명백히 본 명세서에 포함된다.
정의
특별한 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 분석화학, 합성유기화학, 및 의약화학 및 약품화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 과정 및 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학합성 및 화학분석에 표준 기술이 사용될 수 있다. 허용되는 경우, 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물, GENBANK 등재번호 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 및 다른 데이터베이스로부터 입수 가능한 관련된 서열 정보는 전체로서 뿐만 아니라 본 명세서에 논의된 문헌의 일부분에 대해 참조로서 본 명세서에 포함된다.
달리 지시되지 않는 한, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다:
"2'-O-메톡시에틸" (또한, 2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3)은 퓨로실 고리의 2' 위치에서의 O-메톡시-에틸 변형을 지칭한다. 2'-O-메톡시에틸 변형된 당은 변형된 당이다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드"는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다.
"5-메틸시토신"은 5' 위치에 부착된 메틸기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 뉴클레오염기이다.
"활성 약제"는 개체에 투여되었을 때 치료적 이익을 제공하는 약학적 조성물 내 성분 또는 성분들을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 헌팅틴을 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 활성 약제이다.
"활성 표적 부위" 또는 "표적 부위"는 하나 이상의 활성 안티센스 화합물이 표적되는 부위를 의미한다. "활성 안티센스 화합물"은 표적 핵산 수준 또는 단백질 수준을 감소시키는 안티센스 화합물을 의미한다.
"동시에 투여되는"은 두 제제의 약리학적 효과가 환자에게서 동시에 나타나게 하는 임의의 방식으로 두 제제의 병용-투여를 지칭한다. 동시 투여는 두 제제 모두가 단일 약학적 조성물 내에, 단일 투약 형태로, 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되는 것을 요구하지 않는다. 두 제제의 효과가 동시에 그 자체로 명백할 필요는 없다. 효과는 일정 기간 동안 중복될 필요는 있지만 동시에 존재할 필요는 없다.
"투여하는"은 개체에게 약제를 제공하는 것을 의미하고, 이로 제한되는 것은 아니지만, 의학 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 포함한다.
"개선"은 질환, 장애 또는 상태와 관련된 지표, 징후 또는 증상의 적어도 하나가 감소하는 것을 지칭한다. 지표의 중증도는 당업자에게 알려진 주관적 또는 객관적 측정에 의해 결정될 수 있다.
"동물"은 이로 제한되는 것은 아니지만, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 이로 제한되는 것은 아니지만, 원숭이 및 침팬지를 비롯한 비-인간 영장류를 포함하는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다.
"안티센스 활성"은 그의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화에 기여하는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 발현에 있어서의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화를 수행할 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다.
"안티센스 억제"는 안티센스 화합물의 부재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준과 비교하여 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 대응하는 부위 또는 분절에 혼성화를 가능케 하는 뉴클레오염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"바이사이클릭 당"은 2개의 비-동일탄소상 고리 원자의 연결에 의해 변형된 퓨로실 고리를 의미한다. 바이사이클릭 당은 변형된 당이다.
"바이사이클릭 핵산" 또는 "BNA"는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 퓨라노스 부분이 퓨라노스 고리 상에서 2개의 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하여 바이사이클릭 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 지칭한다.
"캡 구조" 및 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 어느 한 말단에 도입된 화학적 변형을 의미한다.
"화학적으로 별개의 영역"은 일부 안티센스 화합물의 다른 영역과 어느 방식으로든 화학적으로 다른 안티센스 화합물의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드를 갖는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형이 없는 뉴클레오티드를 갖는 영역과 화학적으로 구분된다.
"키메릭 안티센스 화합물"은 적어도 2개의 화학적으로 별개의 영역을 갖는 안티센스 화합물을 의미한다.
"병용-투여"는 개체에 2개 이상의 약제의 투여를 의미한다. 2개 이상의 약제는 단일 약학적 조성물일 수 있고, 별개의 약학적 조성물일 수 있다. 2개 이상의 약제 각각은 같거나 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 병용-투여는 동시 또는 연속 투여를 포함한다.
"상보성"은 제1 핵산과 제2 핵산의 뉴클레오염기 사이의 짝짓기 효능을 의미한다.
"연속된 뉴클레오염기"는 서로에 바로 인접한 뉴클레오염기를 의미한다.
"희석제"는 약리학적 활성은 결여되지만 약학적으로 필요하거나 바람직한 조성물 내 성분을 의미한다. 예를 들어, 주사된 조성물 내 희석제는 액체, 예컨대 식염수일 수 있다.
"용량"은 단일 투여 시에 또는 특정된 기간 동안에 제공되는 약제의 특정된 양을 의미한다. 특정 실시양태에서, 용량은 1회, 2회 또는 그 이상의 볼루스, 정제, 또는 주사제로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여가 바람직한 특정 실시양태에서, 바람직한 용량은 단일 주사에 의해 용이하게 수용되지 않는 부피를 요구하고, 따라서 2회 이상의 주사가 바람직한 용량을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약제는 연장된 기간에 걸쳐서 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 1시간, 1일, 1주일, 또는 1개월당 약제의 양으로 제시될 수 있다.
"유효량"은 활성 약제를 필요로 하는 개체에서 바람직한 생리학적 결과를 달성하기에 충분한 양의 활성 약제의 양을 의미한다. 유효량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개체들의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 요인들에 따라 개체들 중에서 달라질 수 있다.
"헌팅틴 핵산"은 헌팅틴을 암호화하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에는 헌팅틴을 암호화하는 DNA 서열, 헌팅틴을 암호화하는 DNA로부터 전사되는 RNA 서열 (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA를 포함함), 및 헌팅틴을 암호화하는 mRNA 서열이 포함된다. "헌팅틴 mRNA"는 헌팅틴 단백질을 암호화하는 mRNA를 의미한다.
"완전히 상보적" 또는 "100% 상보적"은 제1 핵산의 뉴클레오염기 서열의 각각의 뉴클레오염기가 제2 핵산의 제2 뉴클레오염기 서열 내에 상보적인 뉴클레오염기를 갖는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고 표적 핵산이 제2 핵산이다.
"갭머"는 RNase H 절단을 지지하는 복수 개의 뉴클레오시드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오시드를 갖는 외부 영역들 사이에 위치하고, 내부 영역을 포함하는 상기 뉴클레오시드가 외부 영역들을 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드와 화학적으로 구분되는, 키메릭 안티센스 화합물을 의미한다. 내부 영역은 "갭 분절"로 언급될 수 있고, 외부 영역은 "날개 분절"로 언급될 수 있다.
"갭-확장된"은 1 내지 6개의 뉴클레오시드를 갖는 5' 및 3' 날개 분절 사이 및 그에 바로 인접하여 위치하는 12개 이상의 연속된 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 갭 분절을 갖는 키메릭 안티센스 화합물을 의미한다.
"혼성화"는 상보적인 핵산 분자에의 어닐링을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상보적인 핵산 분자에는 안티센스 화합물 및 표적 핵산이 포함된다.
"바로 인접한"은 바로 인접한 요소들 사이에 개재된 요소가 없는 것을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"뉴클레오시드간 연결"은 뉴클레오시드들 사이의 화학적 결합을 지칭한다.
"연결된 뉴클레오시드"는 함께 결합된 인접한 뉴클레오시드를 의미한다.
"불일치" 또는 "비-상보적 뉴클레오염기"는 제1 핵산의 뉴클레오염기가 제2 또는 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오염기와 짝짓기를 할 수 없는 경우를 지칭한다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 자연 발생적인 뉴클레오시드간 결합으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 지칭한다 (즉, 포스포로다이에스테르 뉴클레오시드간 결합).
"변형된 뉴클레오염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실이 아닌 임의의 뉴클레오염기를 의미한다. "변형된 뉴클레오염기"는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)과, 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 또는 변형된 뉴클레오염기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. "변형된 뉴클레오시드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티 또는 변형된 뉴클레오염기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 지칭한다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내 화학적으로 별개 영역의 패턴을 의미한다.
"자연 발생적인 뉴클레오시드간 연결"은 3' 내지 5' 포스포로다이에스테르 연결을 의미한다.
"천연 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH) 내에서 발견되는 당을 의미한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오티드로 이루어진 분자를 지칭한다. 핵산에는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 소분자 간섭 리보핵산 (siRNA), 및 마이크로RNAs (miRNA)가 포함된다. 핵산은 또한 단일 분자 내에 이들 요소들의 조합을 포함할 수 있다.
"뉴클레오염기"는 다른 핵산의 염기와 짝짓기를 할 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"뉴클레오염기 서열"은 임의의 당, 연결, 또는 뉴클레오염기 변형과 무관한 연속된 뉴클레오염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 뉴클레오염기를 의미한다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"올리고머 화합물" 또는 "올리고머"는 적어도 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 단량체 소단위의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 이들 각각이, 서로 독립적으로, 변형되거나 비변형될 수 있는, 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
"경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 경구 투여에는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여, 예컨대, 수막강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다. 투여는 연속적, 또는 만성적, 또는 단기적 또는 간헐적일 수 있다.
"펩티드"는 아미드 결합에 의해 적어도 2개의 아미노산들이 연결되어 형성된 분자를 의미한다. 펩티드는 폴리펩티드 및 단백질을 지칭한다.
"약학적 조성물"은 개체에 투여되기에 적합한 성분들의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 하나 이상의 활성 약제 및 멸균된 수성 용액을 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 안티센스 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 올리고뉴클레오티드의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만 그에 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 연결"은 포스포로다이에스테르 결합이 비-가교 산소 원자들 중 하나를 황 원자로 대체함으로써 변형되는 뉴클레오시드들 사이의 연결을 의미한다. 포스포로티오에이트 연결은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
"부분"은 핵산의 연속된 (즉, 연결된) 뉴클레오염기의 한정된 개수를 의미한다. 특정 실시양태에서, 부분은 표적 핵상의 연속된 뉴클레오염기의 한정된 개수이다. 특정 실시양태에서, 부분은 안티센스 화합물의 연속된 뉴클레오염기의 한정된 개수이다.
"예방"은 수분 내지 무기한의 기간 동안 질환, 장애, 또는 상태의 개시를 지연시키거나 미리 방지하는 것을 지칭한다. 예방은 또한 질환, 장애, 또는 상태가 발병할 위험을 감소시키는 것을 의미한다.
"전구약물"은 내인성 효소 또는 다른 화합물 또는 조건의 작용에 의해 체내 또는 세포 내에서 그의 활성 형태로 전환되는 불활성 형태로 제조된 치료제를 의미한다.
"부작용"은 바람직한 효과 이외에 처리에 기인한 생리학적 반응을 의미한다. 특정 실시양태에서, 부작용에는 주사 부위 반응, 간기능 검사 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상, 근질환, 및 불안이 포함된다. 예를 들어, 혈청 내 증가된 아미노전이효소 수준은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 빌리루빈은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다.
"단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적 가닥에 혼성화되지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"특이적으로 혼성화 가능한"은 바람직한 효과를 유도하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산에 충분한 정도의 상보성을 가지면서, 특이적 결합이 바람직한 조건, 즉, 생체 내 분석 및 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건 하에서 비-표적 핵산에 최소한의 효과를 미치거나 아무런 효과도 미치지 않는 안티센스 화합물을 지칭한다.
"표적화", "표적하는" 또는 "표적된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 바람직한 효과를 유도하게 될 안티센스 화합물의 고안 및 선발 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA" 및 "표적 RNA 전사체"는 모두 안티센스 화합물에 의해 표적될 수 있는 핵산을 지칭한다.
"표적 분절"은 안티센스 화합물이 표적되는 표적 핵산의 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 분절의 5'-대부분의 뉴클레오티드를 지칭한다. "3' 표적 부위"는 표적 분절의 3'-대부분의 뉴클레오티드를 지칭한다.
"치료학적 유효량"은 개체에 치료적 이익을 제공하는 약제의 양을 의미한다.
"처리"는 질환, 장애, 또는 상태의 변경 또는 개선을 초래하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
"비변형된 뉴클레오티드"는 자연 발생적인 뉴클레오염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 뉴클레오티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 비변형된 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-리보뉴클레오시드) 또는 DNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-데옥시리보뉴클레오시드)이다.
특정 실시양태
특정 실시양태는 헌팅틴 발현을 억제하기 위한 방법, 화합물, 및 조성물을 제공한다.
특정 실시양태는 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산은 GENBANK 등재번호 NM_002111.6 (서열번호: 1로 본 명세서에 포함됨), 뉴클레오티드 462000 내지 634000이 절단된 GENBANK 등재번호 NT_006081.17 (서열번호: 2로 본 명세서에 포함됨), GENBANK 등재번호 NM_010414.1 (서열번호: 3으로 본 명세서에 포함됨), 뉴클레오티드 698000 내지 866000에서 절단된 GENBANK 등재번호 NW_001109716.1의 보체 (서열번호: 4로 본 명세서에 포함됨), 및 GENBANK 등재번호 NM_024357.2 (서열번호: 5로 본 명세서에 포함됨)에 개시된 임의의 서열이다.
특정 실시양태는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13으로 기재된 것들이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다.
특정 실시양태는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13으로 기재된 것들이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다.
특정 실시양태는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 및 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 및 32로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13으로 기재된 것들이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 뉴클레오염기 서열들로부터 선택된 서열의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다.
특정 실시양태는 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828, 4928-4947로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 영역은 서열번호: 1의 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, 및 5809-5828로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 영역은 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, 및 4955-4974로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 영역 내에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는다.
특정 실시양태는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, 및 5809-5829로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 영역 내에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는다.
특정 실시양태는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 뉴클레오티드 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, 및 4955-4974로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 영역 내에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 또는 적어도 15개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는다.
특정 실시양태는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, 및 5809-5829로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 영역 내에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는다.
특정 실시양태는 18 내지 21개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 상기 연결된 뉴클레오시드는 뉴클레오티드 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, 및 4955-4974로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 영역 내에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 변형된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오염기 서열에 대해 그의 전장에 걸쳐 적어도 90% 상보적이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오염기 서열에 대해 그의 전장에 걸쳐 적어도 95% 상보적이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오염기 서열에 대해 그의 전장에 걸쳐 적어도 99% 상보적이다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오염기 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오염기 서열에 대해 그의 전장에 걸쳐 100% 상보적이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 변형된 당을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 당은 바이사이클릭 당이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 테트라하이드로피란 고리가 퓨라노스 고리를 대체하는 적어도 하나의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오시드는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112018130209615-pat00001
상기 식에서, Bx는 선택적으로 보호된 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 변형된 뉴클레오염기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오염기는 5-메틸시토신이다.
실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
(i) 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
(ii) 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절;
(iii) 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절,
갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하고 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함함.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
(i) 10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
(ii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절;
(iii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절,
갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하고 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결임.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
(i) 8개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
(ii) 6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절;
(iii) 6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절,
갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하고 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결임.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
(i) 8개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
(ii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절;
(iii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절,
갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하고 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결임.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 그의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 및 32로 기재된 뉴클레오염기 서열로부터 선택된 뉴클레오염기 서열의 적어도 12개의 연속된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 그의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 뉴클레오염기 서열로부터 선택된 뉴클레오염기 서열의 적어도 12개의 연속된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 실시양태는 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 및 32로 기재된 뉴클레오염기 서열로부터 선택된 뉴클레오염기 서열의 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 실시양태는 동물에게 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 뉴클레오염기 서열로부터 선택된 뉴클레오염기 서열의 적어도 8개의 연속된 뉴클레오염기를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 동물은 인간이다.
특정 실시양태에서, 투여는 본 명세서에 기술된 바와 같은 헌팅톤병의 진행을 예방하고, 치료하고, 개선하고, 또는 지연시킨다.
특정 실시양태에서, 화합물은 제2 제제와 함께 병용-투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물 및 제2 제제는 동시에 투여된다.
특정 실시양태에서, 투여는 경구 투여이다. 특정 실시양태에서, 경구 투여는 두개내 투여이다. 특정 실시양태에서, 두개내 투여는 수막강내 또는 뇌실내 투여이다.
특정 실시양태는 나아가 동물에서 헌팅틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물에서 헌팅틴 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다. 특정 실시양태에서, 헌팅틴 mRNA 또는 단백질 발현의 감소는 헌팅톤병의 진행을 예방하고, 치료하고, 개선하고, 또는 지연시킨다.
특정 실시양태는 헌팅톤병을 갖는 인간을 식별하고 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는 헌팅톤병을 갖는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료는 불안증, 부조정 절름발이, 비의도적으로 개시된 운동, 비의도적으로 미완된 운동, 불규칙적 걸음걸이, 무도병, 경축, 몸부림 운동, 비정상적 자세, 불안정, 비정상적 얼굴 표정, 씹기 장애, 삼키기 장애, 말하기 장애, 발작, 수면 장애, 계획 부전, 유연성 부전, 추상사고 부전, 규칙 습득 부전, 적절한 활동의 개시 부전, 부적절한 활동의 억제 부전, 단기 기억 부전, 장기 기억 부전, 편집증, 방향감장애, 혼동, 환각, 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심주의, 공격성, 강박행동, 과민성, 자살관념, 감소된 뇌 질량, 근위축, 심부전, 글루코스 내성 부전, 체중 감소, 골다공증, 및 고환위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 증상을 감소시킨다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하여 헌팅톤병을 감소 또는 예방하는 것을 포함하는 헌팅톤병을 감소 또는 예방하는 방법이 또한 제공된다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 특이적으로 혼성화하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하여 인간에서 헌팅톤병의 증상을 개선하는 것을 포함하는, 헌팅톤병의 증상을 개선하는 방법이 또한 제공된다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 특이적으로 혼성화하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하여 인간에서 헌팅톤병의 증상의 진행 속도를 감소시키는 것을 포함하는, 헌팅톤병과 관련된 증상의 진행 속도를 감소시키는 방법이 또한 제공된다.
12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 서열번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 특이적으로 혼성화하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하여 인간에서 헌팅톤병의 증상에 의해 나타나는 퇴행을 역전시키는 것을 포함하는, 헌팅톤병과 관련된 증상에 의해 나타나는 퇴행을 역전시키는 방법이 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 증상은 물리적, 인지적, 정신적, 또는 말초적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 불안증, 부조정 절름발이, 비의도적으로 개시된 운동, 비의도적으로 미완된 운동, 불규칙적 걸음걸이, 무도병, 경축, 몸부림 운동, 비정상적 자세, 불안정, 비정상적 얼굴 표정, 씹기 장애, 삼키기 장애, 말하기 장애, 발작, 및 수면 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 물리적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 계획 부전, 유연성 부전, 추상사고 부전, 규칙 습득 부전, 적절한 활동의 개시 부전, 부적절한 활동의 억제 부전, 단기 기억 부전, 장기 기억 부전, 편집증, 방향감장애, 혼동, 환각 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 인지적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심주의, 공격성, 강박행동, 과민성 및 자살관념으로 이루어진 군으로부터 선택된 정신적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 감소된 뇌 질량, 근위축, 심부전, 글루코스 내성 부전, 체중 감소, 골다공증, 및 고환위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 말초적 증상이다.
헌팅톤병의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 약물의 제조를 위한 방법 및 화합물이 또한 제공된다.
실시양태는 헌팅톤병을 치료하고, 개선하고, 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 부가적인 제제 또는 요법을 이용한 병용 요법에 의해 본 명세서에 기술된 바와 같이 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하는데 사용하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물을 제공한다. 제제 또는 요법은 병용-투여 또는 동시에 투여될 수 있다.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 부가적인 제제 또는 요법을 이용한 병용 요법에 의해 본 명세서에 기술된 바와 같이 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하기 위한 약물의 제조에 있어 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 제제 또는 요법은 병용-투여 또는 동시에 투여될 수 있다.
특정 실시양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 부가적인 제제 또는 요법이 연속적으로 투여된 환자에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하기 위한 약물의 제조에 있어 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
특정 실시양태는 하기를 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하기 위한 키트를 제공한다:
(i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물; 및 대안적으로
(ii) 본 명세서에 기술된 바와 같은 부가적인 제제 또는 요법.
본 명세서에 기술된 바와 같은 키트는 나아가 본 명세서에 기술된 바와 같은 병용 요법에 의해 본 명세서에 기술된 바와 같이 헌팅톤병을 치료하고, 예방하고, 또는 개선하도록 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함한다.
특정 실시양태는 헌팅틴의 발현이 억제되도록 화합물의 치료학적 유효량을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물을 치료하는데 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 또는 36으로 기재된 서열의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 신경계장애이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 헌팅톤병이다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다.
특정 실시양태는 헌팅톤병의 진행을 예방하고, 치료하고, 개선하고, 또는 지연시키기 위해 치료학적 유효량의 화합물을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물에게 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 또는 36으로 기재된 서열의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다.
특정 실시양태는 헌팅틴의 발현이 억제되도록 치료학적 유효량의 화합물을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물에게 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 또는 33으로 기재된 서열의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 신경계장애이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 헌팅톤병이다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다.
특정 실시양태는 헌팅톤병의 진행을 예방하고, 치료하고, 개선하고, 또는 지연시키기 위해 치료학적 유효량의 화합물을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물에게 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 또는 36으로 기재된 서열의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기를 포함한다.
특정 실시양태는 헌팅틴의 발현이 억제되도록 치료학적 유효량의 화합물을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물에게 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 및 4928-4947로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다.
특정 실시양태는 헌팅톤병의 진행을 예방하고, 치료하고, 개선하고, 또는 지연시키기 위해 치료학적 유효량의 화합물을 동물에게 투여함으로써 헌팅틴과 관련된 질환 또는 상태를 갖는 동물에게 사용하기 위한, 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공하는데, 연결된 뉴클레오시드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 및 4928-4947로부터 선택된 영역 내에 상보적인 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속된 뉴클레오염기 부분을 포함한다.
안티센스 화합물
올리고머 화합물에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA가 포함된다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대해 "안티센스"일 수 있는데, 이는 수소 결합을 통해 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 것을 의미한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은, 5'에서 3' 방향으로 기재될 때, 표적되는 표적 핵산의 표적 분절의 역 상보를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는다. 이러한 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로 기재될 때, 표적되는 표적 핵산의 표적 분절의 역 상보를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 12 내지 30개 길이의 뉴클레오티드이다. 다시 말해, 안티센스 화합물은 12 내지 30개의 연결된 뉴클레오염기이다. 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 8 내지 80개, 12 내지 50개, 15 내지 30개, 18 내지 24개, 19 내지 22개, 또는 20개의 연결된 뉴클레오염기로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 길이로 연결된 뉴클레오염기, 또는 상기 수치의 임의의 2개로 한정된 범위로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단축되거나 절단된 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 단축되거나 절단된 변형 올리고뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 (5' 절단), 또는 대안적으로 3' 말단으로부터 (3' 절단) 단일 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 단축되거나 절단된 올리고뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 결실된 2개의 뉴클레오시드를 가질 수 있고, 또는 대안적으로 3' 말단으로부터 결실된 2개의 소단위를 가질 수 있다. 대안적으로, 결실된 뉴클레오시드는 변형된 올리고뉴클레오티드 전체에 분산될 수 있는데, 예를 들어, 5' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드 및 3' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오시드를 갖는 안티센스 화합물일 수 있다.
부가적인 단일의 부가적인 뉴클레오시드가 연장된 올리고뉴클레오티드 내에 존재하는 경우, 부가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 위치할 수 있다. 2개 이상의 부가적인 뉴클레오시드가 존재하는 경우, 부가된 뉴클레오시드는 서로 인접하여 존재할 수 있는데, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부가되거나 (5' 부가) 대안적으로 3' 말단에 부가된 (3' 부가) 2개의 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 대안적으로, 부가된 뉴클레오시드는 안티센스 화합물의 전체에 분산될 수 있는데, 예를 들어, 5' 말단에 부가된 하나의 뉴클레오시드 및 3' 말단에 부가된 하나의 소단위를 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
안티센스 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이를 늘이거나 줄일 수 있고/있거나, 활성의 제거 없이 불일치 염기를 도입할 수 있다. 예를 난모세포 주입 모델에서 표적 RNA의 절단을 유도하는 들어, 문헌 [Woolf 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992]에는, 13 내지 25개 길이의 뉴클레오염기를 갖는 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능에 대해 조사하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단 근처에 8개 또는 11개의 불일치 염기를 갖는 25개 길이의 뉴클레오염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 불일치를 포함하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 비해 비록 더 낮은 수준이기는 하지만, 표적 mRNA의 특이적 절단을 유도할 수 있었다. 유사하게, 표적 특이적 절단이 1개 또는 3개의 불일치를 갖는 13개 뉴클레오염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 달성되었다.
문헌 [Gautschi 등, J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001]에는 bcl-2 mRNA에 대해 100% 상보성을 갖고 bcl-xL mRNA에 대해 3개 불일치를 갖는 올리고뉴클레오티드가 bcl-2 및 bcl-xL 모두의 발현을 시험관 내 및 생체 내에서 감소시키는 효능이 입증되어 있다. 나아가, 이 올리고뉴클레오티드는 강력한 생체 내 항-종양 활성을 증명하였다.
문헌 [Maher and Dolnick, Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988]에서는 일련의 탠덤 14개 뉴클레오염기 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 탠덤 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2개 또는 3개의 서열로 각각 이루어진 28개 및 42개 뉴클레오염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 토끼 망상적혈구 분석에서 인간 DHFR의 번역을 정지시키는 이들의 효능에 대해 검사하였다. 14개 뉴클레오염기 안티센스 올리고뉴클레오티드 3개 각각은 단독으로, 28개 또는 42개 뉴클레오염기 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 높은 수준은 아니지만, 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물에 예컨대 억제 활성을 증강시키고, 표적 핵산에 대한 결합 친화도를 증가시키고, 또는 생체 내 뉴클리아제 의한 분해에 대한 내성을 증가시키는 특성을 부여하기 위해 일정한 양식으로 배열된 화학적으로 변형된 소단위들, 또는 모티프들을 포함한다.
키메릭 안티센스 화합물은 전형적으로 뉴클리아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하도록 변형된 적어도 하나의 영역을 포함한다. 키메릭 안티센스 화합물의 제2 영역은 선택적으로, RNA:DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 절단하는, 세포성 엔도뉴클리아제 RNase H의 기질로 제공될 수 있다.
갭머 모티프를 갖는 안티센스 화합물은 키메릭 안티센스 화합물로 고려된다. 갭머에서 RNaseH 절단을 지지하는 복수 개의 뉴클레오티드를 갖는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오시드와는 화학적으로 구분되는 복수 개의 뉴클레오티드를 갖는 외부 영역들 사이에 위치한다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에, 갭 분절은 일반적으로 엔도뉴클리아제 절단용 기질로 제공되고, 날개 분절은 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 갭머의 영역은 각 별개의 영역을 포함하는 당 모이어티의 유형에 의해 구별된다. 갭머의 영역을 구별하는데 사용되는 당 모이어티의 유형은 β-D-리보뉴클레오시드, β-D-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (예컨대, 2'-변형된 뉴클레오시드는 그 중에서 특히 2＇-MOE, 및 2＇-O-CH3을 포함할 수 있음), 및 바이사이클릭 당 변형된 뉴클레오시드(예컨대, 바이사이클릭 당 변형된 뉴클레오시드는 4＇-(CH2)n-O-2가교 (여기서, n=1 또는 n=2)를 갖는 것들을 포함할 수 있음)를 포함하는 일부 실시양태일 수 있다. 바람직하게는, 각 별개의 영역은 균일한 당 모이어티를 포함한다. 날개-갭-날개 모티프는 종종 "X-Y-Z"로 기술되는데, "X"는 5' 날개 영역의 길이를 나타내고, "Y"는 갭 영역의 길이를 나타내며, "Z"는 3' 날개 영역의 길이를 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "X-Y-Z"로 기술된 갭머는 갭 분절이 5' 날개 분절 및 3' 날개 분절의 각각에 바로 인접하여 위치하도록 형상을 갖는다. 따라서, 5' 날개 분절과 갭 분절 사이, 또는 갭 분절과 3' 날개 분절 사이에는 개재 뉴클레오티드가 존재하지 않는다. 본 명세서에 기술된 임의의 안티센스 화합물은 갭머 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X 및 Z는 동일하고, 다른 실시양태에서 이들은 다르다. 바람직한 실시양태에서, Y는 8개와 15개 사이의 뉴클레오티드이다. X, Y 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 어느 하나일 수 있다. 따라서, 갭머에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6 또는 5-8-5이 포함된다.
특정 실시양태에서, "윙머" 모티프로서 안티센스 화합물은 갭머 형상에 대해 상기에 기술된 바와 같은 날개-갭 또는 갭-날개 형상, 즉, X-Y 또는 Y-Z 형상을 갖는다. 따라서, 윙머 형상에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 또는 5-13이 포함된다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 5-10-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 6-8-6 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 5-8-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 갭-날개 모티프를 갖는다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 갭-날개 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5개의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 날개 분절에 바로 인접하고 이들 사이에 위치하는 10개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 갭 분절을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 갭-날개 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5개의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 날개 분절에 바로 인접하고 이들 사이에 위치하는 8개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 갭 분절을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 갭-날개 안티센스 올리고뉴클레오티드는 6개의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 날개 분절에 바로 인접하고 이들 사이에 위치하는 8개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 갭 분절을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오티드 서열
헌팅틴을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 제한 없이, 하기를 포함한다: 서열번호: 1로 본 명세서에 포함된, 2006년 3월 31일자로 GENBANK®에 최초로 등재된 GENBANK 등재번호 NM_002111.6; 서열번호: 2로 본 명세서에 포함된, 2004년 8월 19일자로 GENBANK®에 최초로 등재되고, 뉴클레오티드 462000 내지 634000이 절단된 GENBANK 등재번호 NT_006081.17; 서열번호: 3으로 본 명세서에 포함된, 2004년 3월 23일자로 GENBANK®에 최초로 등재된, GENBANK 등재번호 NM_010414.1; 서열번호: 4로 본 명세서에 포함된, 2006년 6월 14일자로 GENBANK®에 최초로 등재되고, 뉴클레오티드 698000 내지 866000에서 절단된 GENBANK 등재번호 NW_001109716.1의 보체; 및 서열번호: 5로 본 명세서에 포함된, 2008년 6월 5일자로 GENBANK®에 최초로 등재된 GENBANK 등재번호 NM_024357.2.
본 명세서에 포함된 실시예에서 각각의 서열번호로 개시된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 뉴클레오염기에 대한 임의의 변형과 무관한 것으로 이해된다. 따라서, 서열번호로 한정된 안티센스 화합물은, 독립적으로, 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 뉴클레오염기에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. Isis 번호 (Isis No)로 기재된 안티센스 화합물은 뉴클레오염기 서열과 모티프의 조합을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 한정된 영역이다. 예를 들어, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 연접, 암호화 영역, 번역 개시 영역, 번역 종결 영역, 또는 다른 한정된 핵산 영역을 포함할 수 있다. 헌팅틴에 대해 구조적으로 한정된 영역들은 참조로서 본 명세서에 포함되는 NCBI 및 정보와 같은 서열 데이터베이스로부터 등재번호로 입수될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 표적 영역 내 하나의 분절 영역의 5' 표적 부위부터 표적 영역 내 다른 하나의 표적 분절의 3' 표적 부위까지의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 바람직한 효과가 일어나도록 안티센스 화합물이 혼성화하는 적어도 하나의 표적 분절의 결정을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바람직한 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소이다. 특정 실시양태에서, 바람직한 효과는 표적 핵산에 의해 암호회되는 단백질 수준 또는 표적 핵산과 관련된 표현형 변화의 감소이다.
표적 영역은 하나 이상의 표적 분절을 포함할 수 있다. 표적 영역 내 다중 표적 분절들이 중복될 수 있다. 대안적으로, 이들은 비-중복될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내 표적 분절들은 약 300개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내 표적 분절들은 표적 핵산 상에서 약 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개, 그 이하, 약 그 이하이고, 또는 전술한 수치들의 임의의 2개로 정의되는 범위인 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내 표적 분절들은 표적 핵산 상에서 5개 이하, 약 그 이하의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 분절은 연속된다. 본 명세서에 개시된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위의 어느 하나인 개시 핵산을 갖는 범위로 한정된 표적 영역들이 고려된다.
적합한 표적 분절은 5' UTR, 암호화 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손, 또는 엑손/인트론 연접 내에서 발견될 수 있다. 개시 코돈 또는 종결 코돈을 포함하는 표적 분절이 또한 적합한 표적 분절이다. 적합한 표적 분절은 개시 코돈 또는 종결 코돈과 같이 구조적으로 한정된 특정 영역을 특이적으로 배제할 수 있다.
적합한 표적 분절의 결정은 게놈 전체에서 다른 서열에 대한 표적 핵산의 서열의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들어, BLAST 알고리즘이 다른 핵산들 사이에서 유사성을 갖는 영역을 식별하는데 사용될 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산 이외의 다른 서열 (즉, 비-표적 또는 이탈-표적 서열)에 비-특이적인 방식으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물 서열의 선택을 방지할 수 있다.
활성 표적 영역 내에서 안티센스 화합물의 활성에 변화 (예컨대, 표적 핵산 수준의 감소율로 정의되는 바와 같음)가 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 헌팅틴 mRNA 수준의 감소는 헌팅틴 발현 억제의 표시이다. 헌팅틴 단백질 수준의 감소는 또한 표적 mRNA 발현 억제의 표시이다. 나아가, 표현형 변화가 헌팅틴 발현 억제의 표시이다. 예를 들어, 다른 표현형 변화들 중에서, 정상 대비 뇌 크기의 증가, 운동 협응의 개선, 지속적인 근연축의 감소 (근육긴장이상), 과민성 및/또는 불안의 감소, 기억력 개선, 또는 활력 증가가 분석될 수 있다. 다른 표현형 표시, 예컨대, 헌팅톤병과 관련된 증상이 또한 하기에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
혼성화
일부 실시양태에서, 혼성화는 본 명세서에 기술된 안티센스 화합물과 헌팅틴 핵산 사이에서 일어난다. 혼성화의 가장 일반적인 기작은 핵산 분자의 상보성 뉴클레오염기들 사이의 수소 결합 (예컨대, 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역 후그스틴 수소 결합)을 포함한다.
혼성화는 다양한 조건 하에서 일어날 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 혼성화되는 핵산 분자의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는지 여부를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 안티센스 화합물은 헌팅틴 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있다.
상보성
안티센스 화합물 및 표적 핵산은 바람직한 효과 (예컨대, 헌팅틴 핵산과 같은 표적 핵산의 안티센스 억제)가 일어나도록 안티센스 화합물의 충분한 개수의 뉴클레오염기가 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오염기와 수소 결합을 형성할 수 있을 때 서로 상보적이다.
안티센스 화합물은 개재하는 또는 인접한 분절들이 혼성화 과정 (예컨대, 루프 구조, 불일치 또는 머리핀 구조)에 관여하지 않도록 헌팅틴 핵산의 하나 이상의 분절에 걸쳐서 혼성화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 안티센스 화합물, 또는 그의 특정 부분은 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적이거나, 또는 적어도 상보적이다. 표적 핵산과 안티센스 화합물의 상보성 비율은 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이어서 특이적으로 혼성화하게 되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이 예시에서, 잔존하는 비상보성 뉴클레오염기는 무리를 이루거나 상보성 뉴클레오염기 사이에 산재할 수 있으며, 서로에게 또는 상보성 뉴클레오염기에 연속될 필요는 없다. 따라서, 표적 핵산에 완벽한 상보성인 2개 영역이 측면에 위치하는 네 개 (4)의 비상보성 뉴클레오염기를 갖는 18개 길이의 뉴클레오염기인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체 77.8%의 상보성을 가질 수 있고 따라서 본 발명의 범위에 속할 수 있다. 표적 핵산의 영역과 안티센스 화합물의 상동성 비율은 당해 기술분야에 공지된 BLAST 프로그램 (basic local alignment search tools) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다 (Altschul 등, J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7: 649-656). 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은, 예를 들어, 스미스 및 워터맨 (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482-489)의 알고리즘을 사용하는, 디폴트 설정을 이용한, 갭 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 안티센스 화합물, 또는 그의 특정된 부분은 표적 핵산 또는 그의 특정 부분에 완전히 상보적이다 (즉, 100% 상보적). 예를 들어, 안티센스 화합물은 헌팅틴 핵산, 또는 표적 영역, 또는 이들의 표적 분절 또는 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "완전히 상보적"은 안티센스 화합물의 각 뉴클레오염기가 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오염기와 정확한 염기 짝짓기를 할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 20개 뉴클레오염기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물에 완전히 상보적인 표적 핵산의 대응하는 20개 뉴클레오염기 부분이 존재하는 한, 400개 뉴클레오염기 길이인 표적 서열에 완전히 상보적이다. 완전히 상보적은 또한 제1 및/또는 제2 핵산의 특정 부분에 대한 인용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 30개 뉴클레오염기 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오염기 부분은 400개 뉴클레오염기 길이인 표적 서열에 "완전히 상보적"일 수 있다. 30개 뉴클레오염기 올리고뉴클레오티드의 20개 뉴클레오염기 부분은, 만약 표적 서열이 각 뉴클레오염기가 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오염기에 상보적인 대응하는 20개 뉴클레오염기 부분을 갖는다면, 표적 서열에 완전히 상보적이다. 동시에, 전체 30개 뉴클레오염기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 잔존하는 10개 뉴클레오염기가 또한 표적 서열에 상보적인지 여부에 따라서, 표적 서열에 완전히 상보적이거나 아닐 수 있다.
비-상보적 뉴클레오염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단일 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 뉴클레오염기 또는 뉴클레오염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 존재할 수 있다. 2개 이상의 비-상보적 뉴클레오염기가 존재하는 경우, 이들은 연속적이거나 (즉, 연결되거나) 비-연속적일 수 있다. 일 실시양태에서, 비-상보적 뉴클레오염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드의 날개 분절 내에 위치할 수 있다.
특정 실시양태에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오염기 길이이거나 최대 이 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예컨대 헌팅틴 핵산, 또는 그의 특정 부분 대비, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 뉴클레오염기(들)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오염기 길이이거나 최대 이 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예컨대 헌팅틴 핵산, 또는 그의 특정 부분에 대해, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 뉴클레오염기(들)을 포함한다.
본 명세서에 제공된 안티센스 화합물에는 또한 표적 핵산의 부분에 상보적인 것들이 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "부분"은 표적 핵산의 영역 또는 분절 내 연속된 (즉, 연결된) 뉴클레오염기의 한정된 개수를 지칭한다. "부분"은 또한 안티센스 화합물의 연속된 뉴클레오염기의 한정된 개수를 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 8개 뉴클레오염기 부분에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 12개 뉴클레오염기 부분에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 분절의 적어도 15개 뉴클레오염기 부분에 상보적이다. 표적 분절의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 뉴클레오염기 부분, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 한정된 범위에 상보적인 안티센스 화합물이 또한 고려된다.
동일성
본 명세서에 제공된 안티센스 화합물은 또한 특정 뉴클레오티드 서열, 서열번호, 또는 특정 Isis 번호로 표시되는 화합물, 또는 그의 일부분에 대해 한정된 동일성 비율을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 동일한 뉴클레오염기 짝짓기 효능을 갖는다면 안티센스 화합물은 본 명세서에 기술된 서열과 동일하다. 예를 들어, 기술된 DNA 서열 내에 티미딘 대신에 우라실을 포함하는 RNA는, 우라실 및 티미딘 모두 아데닌과 짝을 형성하기 때문에 DNA 서열과 동일한 것으로 간주될 것이다. 본 명세서에 제공된 안티센스 화합물에 대해 동일하지 않은 염기를 갖는 화합물뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 단축되고 연장된 형태의 안티센스 화합물이 또한 고려된다. 동일하지 않은 염기는 서로에 인접할 수도 있고 안티센스 화합물 전체에 분산될 수도 있다. 안티센스 화합물의 동일성 비율은 그것이 비교되는 서열에 비해 동일한 염기 짝짓기를 갖는 염기의 개수에 따라 계산된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물, 또는 그의 일부분은, 본 명세서에 기술된, 하나 이상의 안티센스 화합물 또는 서열번호, 또는 그의 일부분에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
변형
뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 뉴클레오염기 (염기로도 알려짐) 부분은 일반적으로 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토퓨라노실 당을 포함하는 그러한 뉴클레오시드의 경우, 인산기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 서로에게 인접한 뉴클레오시드들의 공유 결합을 통해 형성되어 선형 올리고머 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 인산기는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결을 형성하는 것으로 통상 언급된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오시드간 연결, 당 모이어티, 또는 뉴클레오염기에 대한 치환 또는 변화를 포함한다. 변형된 안티센스 화합물은 종종, 예를 들어, 증강된 세포 유입, 핵산 표적에 대한 증강된 친화도, 뉴클리아제 존재 시의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성과 같은 바람직한 특성으로 인해 천연형에 비해 선호된다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드가 또한 그의 표적 핵산에 대한 단축 또는 절단된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 동등한 결과가 종종 이러한 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 갖는 더 짧은 안티센스 화합물을 이용해 달성될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
RNA 및 DNA의 자연 발생적인 뉴클레오시드간 연결은 3' 내지 5' 포스포로다이에스테르 연결이다. 하나 이상의 변형된, 즉 비-자연 발생적인, 뉴클레오시드간 연결을 갖는 안티센스 화합물이, 증강된 세포 유입, 핵산 표적에 대한 증강된 친화도, 뉴클리아제 존재 시의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성과 같은 바람직한 특성으로 인해, 주로 자연 발생적인 뉴클레오시드간 연결을 갖는 안티센스 화합물보다 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 연결뿐만 아니라 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 대표적인 인에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 포스포로다이에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로티오에이트가 포함된다. 인-함유 및 비-인-함유 연결의 제조방법은 잘 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
변형된 당 모이어티
안티센스 화합물은 당기가 변형되어 있는 하나 이상의 뉴클레오시드를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드는 증강된 뉴클리아제 안정성, 증가된 결합 친화도 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보퓨라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보퓨라노스 고리의 예시에는, 제한 없이, 치환기의 부가 (5＇ 및 2＇ 치환기 포함), 바이사이클릭 핵산 (BNA)을 형성하기 위한 비-동일탄소 고리 원자의 가교, 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R)2 (R = H, C1-C12 알킬 또는 보호기)로의 대체 및 이들의 조합이 포함된다. 화학적으로 변형된 당의 예시에는 2＇-F-5＇-메틸 치환된 뉴클레오시드 (다른 기술된 5＇,2＇-비스 치환된 뉴클레오시드에 관해 2008년 8월 21일자로 공개된 PCT 국제특허 제WO 2008/101157호 참조) 또는 2＇-위치에서 추가의 치환을 갖는 리보실 고리 산소 원자의 S로의 대체 (2005년 6월 16일자로 공개된 미국특허출원 공개 제US2005-0130923호 참조) 또는 대안적으로 BNA의 5＇-치환 (LNA가 예를 들어 5＇-메틸 또는 5＇-비닐기로 치환되는, 2007년 11월 22일자로 공개된 PCT 국제특허 제2007/134181호 참조)이 포함된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드의 예시에는, 제한 없이, 5＇-비닐, 5＇-메틸 (R 또는 S), 4＇-S, 2＇-F, 2＇-OCH3 및 2＇-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오시드가 포함된다. 2＇위치에서의 치환은 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) (여기서, 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬임)로부터 선택될 수 있다.
바이사이클릭 핵산 (BNAs)의 예시에는, 제한 없이, 4＇과 2＇ 리보실 고리 원자들 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오시드가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 안티센스 화합물에는, 가교가: 4＇-(CH2)-O-2＇(LNA); 4＇-(CH2)-S-2＇; 4＇-(CH2)-O-2＇(LNA); 4＇-(CH2)2-O-2＇ (ENA);4＇-C(CH3)2-O-2＇ (PCT/US2008/068922 참조); 4＇-CH(CH3)-O-2＇ 및 4＇-C-H(CH2OCH3)-O-2＇(2008년 7월 15일자로 허여된, 미국특허 제7,399,845호 참조); 4＇-CH2-N(OCH3)-2＇ (PCT/US2008/064591 참조); 4＇-CH2-O-N(CH3)-2＇ (2004년 9월 2일자로 공개된, 미국특허출원 공개 제2004-0171570호 참조); 4＇-CH2-N(R)-O-2＇(2008년 9월 23일자로 허여된, 미국특허 제7,427,672호 참조); 4＇-CH2-C(CH3)-2＇ 및 4＇-CH2-C-(=CH2)-2＇(PCT/US2008/066154 참조) (상기에서, R은, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임)의 화학식 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 BNA 뉴클레오시드가 포함된다. 전술한 BNAs의 각각은, 예를 들어 α-L-리보퓨라노스 및 β-D-리보퓨라노스 (제WO99/14226호로서 1999년 3월 25일자로 공개된, PCT 국제출원 제PCT/DK98/00393호 참조)를 비롯한 다양한 입체화학적 당 형상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드는 리보실 고리의 당 대용품으로의 치환에 의해 변형된다. 이러한 변형에는, 제한 없이, 리보실 고리의 대용품 고리 시스템 (때로 DNA 유사체로 언급됨)으로의 치환, 예컨대 하기 화학식 중 하나를 갖는 것과 같은 모르폴리노 고리, 사이클로헥세닐 고리, 사이클로헥실 고리 또는 테트라하이드로피라닐 고리로의 치환이 포함된다:
Figure 112018130209615-pat00002
안티센스 화합물 내로의 도입용 뉴클레오시드를 변형하기 위해 사용될 수 있는 다수의 다른 바이사이클로 및 트리사이클로 당 대용품 고리 시스템이 또한 당해 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, 문헌 [review article: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10: 841-854] 참조). 이러한 고리 시스템은 활성을 증강시키기 위해 다양한 부가적인 치환이 이루어질 수 있다.
변형된 당의 제조방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드에서, 뉴클레오염기 모이어티 (천연, 변형된 또는 이들의 조합)는 적합한 핵산 표적과의 혼성화가 유지된다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 실시양태에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오티드는 갭머 모티프 내에 배열된다.
변형된 뉴클레오염기
뉴클레오염기 (또는 염기) 변형 또는 치환은 자연 발생적 또는 합성 비변형된 뉴클레오염기와, 기능적으로는 호환가능하지만, 구조적으로 구별된다. 천연형 및 변형된 뉴클레오염기 모두 수소 결합에 참여할 수 있다. 이러한 뉴클레오염기 변형은 뉴클리아제 안정성, 결합 친화도 또는 일부 다른 이로운 생물학적 특성을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 변형된 뉴클레오염기에는, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C)과 같은 합성 및 천연형 뉴클레오염기가 포함된다. 5-메틸시토신 치환을 비롯한 특정 뉴클레오염기 치환은 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중가닥 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 나타났다 (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
부가적인 비변형된 뉴클레오염기에는 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다.
헤테로사이클릭 염기 모이어티에는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 것들이 포함된다. 안티센스 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용한 뉴클레오염기에는 2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린이 포함된다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 갭-확장된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오염기는 5-메틸시토신이다. 특정 실시양태에서, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
약학적 조성물을 제조하기 위한 조성 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오티드는 약학적 조성물 또는 제형의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 활성 또는 불활성 성분과 혼합될 수 있다. 약학적 조성물의 제형화를 위한 조성 및 방법은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 투여 경로, 질환 정도, 또는 투여되는 용량을 비롯한 다수의 기준에 좌우된다.
헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 조합함으로써 약학적 조성물 내에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제에는 인산염 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. PBS는 경구로 전달되는 조성물에 사용하기에 적합한 희석제이다. 따라서, 일 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에 기술된 방법에 사용된다. 특정 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 PBS이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에 투여 시, 생물학적 활성 대사산물 또는 그의 잔사를 (직접적 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서는 또한 안티센스 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 이러한 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 기타 생물학적 등가물에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 염에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 나트륨염 및 칼륨염이 포함된다.
전구약물은 활성 안티센스 화합물을 형성하기 위해 체내에서 내인성 뉴클리아제에 의해 절단되는 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부가적인 뉴클레오시드의 도입을 포함할 수 있다.
결합 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 하나 이상의 모이어티에 공유적으로 연결되거나 수득되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포내 분포 또는 세포내 유입을 증강시키는 결합체일 수 있다. 전형적인 결합기에는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티가 포함된다. 부가적인 결합기에는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플로오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료가 포함된다.
안티센스 화합물은 또한, 예를 들어, 뉴클리아제 안정성와 같은 특성을 증강시키기 위해 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단 모두에 통상적으로 부착되는 하나 이상의 안정화기를 갖도록 변형될 수 있다. 안정화기 내에는 캡 구조가 포함된다. 이러한 말단 변형은 엑소뉴클리아제 분해로부터 말단 핵산을 갖는 안티센스 화합물을 보호하고, 세포 내 전달 및/또는 국소화에 도움이 될 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡)에, 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있고, 또는 양 말단 모두에 존재할 수 있다. 캡 구조는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 역위 데옥시 어베이직 (abasic) 캡이 포함된다. 또한, 뉴클리아제 안정성을 부여하기 위해 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단을 캡핑하는데 사용될 수 있는 3' 및 5'-안정화기에는 2003년 1월 16일자로 공개된 제WO03/004602호에 기술된 것들이 포함된다.
세포 배양 및 안티센스 화합물 처리
헌팅틴 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과를 다양한 세포 유형에 대해 시험관 내로 검사할 수 있다. 이러한 분석에 사용되는 세포 유형은 상업적인 판매자로부터 입수가능하고 (예컨대, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) 상업적으로 이용가능한 시약 (예컨대, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 판매자의 지시에 따라서 세포를 배양한다. 예시적인 세포 유형에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, HepG2 세포, Hep3B 세포, 원발성 간세포, A549 세포, GM04281 섬유아세포 및 LLC-MK2 세포가 포함된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관 내 검사
다른 안티센스 화합물로의 처리에 적합하게 변형될 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 세포를 처리하는 방법이 본 명세서에 기술된다.
일반적으로, 세포가 배양 시 대략 60-80% 융합성에 도달하였을 때 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포 내로 도입하는데 일반적으로 사용되는 하나의 시약에 양이온성 지질 형질감염 시약 리포펙틴® (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 리포펙틴과 혼합하여 안티센스 올리고뉴클레오티드의 바람직한 최종 농도와 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드당 2 내지 12 ug/mL 범위인 리포펙틴® 농도를 달성한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포에 도입하는데 사용되는 다른 시약에 리포펙타민 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM® 1 감소된 혈청 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 리포펙타민 2000®과 혼합하여 바람직한 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드당 2 내지 12 ug/mL 범위인 리포펙타민® 농도를 달성한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포에 도입하는데 사용되는 다른 시약에 사이토펙틴® (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM® 1 감소된 혈청 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 사이토펙틴®과 혼합하여 바람직한 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드당 2 내지 12 ug/mL 범위인 리포펙타민® 농도를 달성한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포에 도입하는데 사용되는 다른 기술에 전기천공이 포함된다.
세포를 통상적인 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한다. 전형적으로 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리하고 16-24시간 후 수확하며, 그때 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준을 당해 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기술된 방법에 의해 측정한다. 일반적으로, 처리가 다중 반복으로 수행될 때, 결과를 반복 처리의 평균으로 표시한다.
사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주마다 달라진다. 특정 세포주에 최적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도를 결정하기 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 리포펙타민 2000®, 리포펙틴 또는 사이토펙틴으로 형질감염될 때 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전기천공을 이용하여 형질감염될 때 625 내지 20,000 nM 범위의 더 높은 농도로 사용된다.
RNA 분리
RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA를 대상으로 수행될 수 있다. RNA 분리방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여, 예를 들어 제조사의 권고된 프로토콜에 따라서 트리졸® 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 RNA를 제조한다.
표적 수준 또는 발현의 억제 분석
헌팅틴 핵산의 수준 또는 발현의 억제는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방식으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 수준은, 예컨대, 노던 블롯 분석, 경쟁적 중합효소 연쇄반응 (PCR), 또는 정량적 실시간 PCR에 의해 정량될 수 있다. RNA 분석은 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA를 대상으로 수행될 수 있다. RNA 분리방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 노던 블롯 분석이 또한 당해 기술분야에서 통상적이다. 정량적 실시간 PCR이 PE-어플라이드 바이오시스템즈 (Foster City, CA)로부터 입수가능하고 제조사의 지침에 따라 사용되는, 상업적으로 이용가능한 ABI PRISM® 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량은 제조사의 지침에 따라 ABI PRISM® 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용한 정량적 실시간 PCR에 의해 수행될 수 있다. 정량적 실시간 PCR 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
실시간 PCR 전에, 분리된 RNA를 역전사 (RT) 반응에 적용하여, 이후에 실시간 PCR 증폭의 기질로 사용되는 상보적 DNA (cDNA)를 생성한다. RT 및 실시간 PCR 반응을 동일 시료원에서 연속적으로 수행한다. RT 및 실시간 PCR 시약은 인비트로젠 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 입수한다. RT, 실시간-PCR 반응을 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행한다.
실시간 PCR에 의해 수득된 유전자 (또는 RNA) 표적 양을 사이클로필린 A와 같이 그의 발현이 일정한 유전자의 발현 수준을 사용하거나, 리보그린® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)을 사용해 총 RNA를 정량함으로써 표준화한다. 사이클로필린 A 발현을 표적과 동시에, 다중으로, 또는 개별적으로 반응시킴으로써 실시간 PCR에 의해 정량하였다. 총 RNA를 리보그린® RNA 정량 시약 (Invitrogen, Inc. Eugene, OR)을 사용해 정량한다. 리보그린®에 의한 RNA 정량 방법은 문헌 [Jones, L.J., 등, Analytical Biochemistry, 1998, 265: 368-374]에 교시되어 있다. 리보그린® 형광을 측정하기 위해 사이토플루오르® 4000 기계 (PE Applied Biosystems)를 사용한다.
헌팅틴 핵산에 혼성화하는 프로브 및 프라이머를 고안한다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 고안하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 프라이머 익스프레스® 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA)와 같은 소프트웨어의 사용이 포함될 수 있다.
단백질 수준의 분석
헌팅틴 단백질 수준을 측정하여 헌팅틴 핵산의 안티센스 억제를 평가할 수 있다. 헌팅틴의 단백질 수준은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방식, 예컨대 면역침강, 분석 웨스턴 블롯 분석 (면역블롯팅), 효소-연계 면역흡착 분석 (ELISA), 정량적 단백질 분석, 단백질 활성 분석 (예를 들어, 캐스파제 활성 분석), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 이용해 평가 또는 정량할 수 있다. 표적에 지향되는 항체는 항체의 MSRS 카달로그 (Aerie Corporation, Birmingham, MI)와 같은 다양한 공급원으로부터 동정되고 입수될 수 있으며, 또는 당해 기술분야에 잘 알려진 단일클론 또는 다중클론 항체 제조방법을 통해 제조될 수 있다. 인간 및 래트 헌팅틴의 검출에 유용한 항체는 상업적으로 이용가능하다.
안티센스 화합물의 생체 내 검사
안티센스 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 헌팅틴의 발현을 억제하고 표현형적 변화를 야기하는 이들의 효능에 대해 동물에서 검사한다. 검사는 정상 동물, 또는 실험 질환 모델을 대상으로 수행될 수 있다. 동물에의 투여를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인산염-완충 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 희석제에 제형화된다. 투여에는 투여의 경구 경로가 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로 일정 기간 처리 후, RNA를 조직으로부터 분리하고 헌팅틴 핵산 발현의 변화를 측정한다. 헌팅틴 단백질 수준의 변화를 또한 측정한다.
특정 화합물
다양한 길이, 모티프 및 골격 조성의 약 1700개의 새롭게 고안된 안티센스 화합물들을 여러 세포주에서 인간 헌팅틴 mRNA에 대한 이들의 시험관 내 효과를 검사하였다. 새로운 화합물을 시험관 내에서 가장 강력한 안티센스 화합물 중 하나인 것으로 이미 알려져 있는 ISIS 387916을 비롯한 약 250개의 이전에 고안된 화합물과 비교하였다 (예컨대, 미국특허공개 제2008/0039418호 및 제2007/0299027호 참조). 약 1700개의 새롭게 고안된 안티센스 화합물들 중에서, 약 60개의 화합물들이 ISIS 387916 대비 시험관 내 효능을 근거로 이후의 연구에 선택되었다. 선택된 화합물들을 이전에 고안된 ISIS 388241 및 ISIS 387916과 비교하여 전신 순응성 (실시예 3 참조) 및 BACHD 마우스의 뇌에서 활성 및 순응성 (실시예 4 참조)에 대해 검사하였다. 이들 연구로부터, 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 또는 32로 기재된 서열의 뉴클레오염기 서열을 갖는 화합물이 높은 순응성 및 높은 생체 내 효능을 갖는 것으로 선택되었다. 이들의 상보적 서열에 비추어, 화합물은 서열번호: 1의 영역 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 또는 4928-4947에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 열거된 영역을 표적하는 화합물은 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같은 서열의 일부 뉴클레오염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 길이일 수 있고, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 모티프들의 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기 부분을 포함하는 화합물은 다음의 ISIS 번호로 지시되는 바와 같이 특정 길이 및 모티프를 갖는다: ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 451541, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, 또는 ISIS 444663.
높은 생체 내 효능 및 순응성을 갖는 것으로 상기에 기술된 화합물은 이후에 서열번호: 7, 8, 11, 16, 17로 기재된 서열의 뉴클레오염기 서열을 갖는 수개의 부가적인 화합물과 함께 신경독성 (실시예 5 참조)을 추가로 평가하기 위해 래트에서 CNS 볼루스 주사로 검사하였다. 이들 중, 서열번호: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32 또는 13으로 기재된 서열의 뉴클레오염기 서열을 갖는 10개의 화합물들이 높은 순응성을 갖는 것으로 선택되었다. 이들의 상보적 서열에 비추어, 화합물은 서열번호: 1의 영역 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, 또는 5809-5829에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 열거된 영역을 표적하는 화합물은 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 서열번호로 기재된 서열의 일부 뉴클레오염기 부분를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 길이일 수 있고, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 모티프들의 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은 다음의 ISIS 번호로 표시되는 바와 같은 특정 길이 및 모티프를 갖는다: ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, 및 ISIS 444661. 선택된 화합물들을 BACHD 마우스에서 ICV 투여에 의해 이전에 고안된 화합물 ISIS 388241과 비교하였다.
이어서 높은 생체 내 효능 및 순응성을 갖는 것으로 상기에 기술된 화합물에 대해 부가적인 연구를 수행하였다. 신경독성을 추가로 평가하기 위해 부가적인 연구를 고안하였다. 연구는 야생형 마우스에서 ICV 투여 (실시예 16 참조) 및 래트에서 볼루스 투여를 포함하였다 (실시예 17 참조). 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33을 높은 신경순응성을 갖는 것으로 선택하였다. 이들의 상보적 서열에 비추어, 화합물들은 서열번호: 1의 영역 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, 및 4955-4974에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 길이일 수 있고, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 모티프들의 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 길이일 수 있고, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 다양한 모티프들의 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 열거된 영역을 표적하거나 열거된 서열번호로 기재된 서열의 뉴클레오염기를 포함하는 화합물은 ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444652, 및 ISIS 436689로 표시되는 바와 같은 특정 길이 및 모티프를 갖는다.
따라서, 개선된 특성을 갖는 안티센스 화합물이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 영역을 표적하거나 그에 특이적으로 혼성화할 수 있는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물이 본 명세서에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 인간 섬유아세포 세포주에 전달될 때 7 uM 미만, 6 uM 미만, 5 uM 미만, 4 uM 미만, 3 uM 미만, 2 uM 미만, 1 uM 미만의 시험관 내 IC50 또는 볼루스 주사에 의해 10 ug 미만, 9 ug 미만, 8 ug 미만, 7.5 ug 미만, 7.4 ug 미만, 7.0 ug 미만, 6 ug 미만, 5 ug 미만, 4 ug 미만, 3 ug 미만, 또는 2 ug 미만의 ED50의 적어도 하나를 갖는 것으로 미루어 효과적이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, ICV 주입은 본 명세서에 기술된 화합물에 대해 3 내지 4배 더 높은 ED50 값을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물은 식염수 처리된 동물에 비해 4배, 3배, 또는 2배 이상의 ALT 또는 AST 값의 증가; 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% 또는 2% 이상의 간, 비장 또는 신장 무게의 증가; 또는 대조군에 비해 350%, 300%, 275%, 250%, 200%, 150% 또는 100% 이상의 AIF1 수준의 증가 중 적어도 하나를 갖는 것으로 입증되는 바와 같이 매우 순응적이다.
특정 징후
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시양태에서, 개체는 헌팅톤병을 갖는다.
하기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 명세서에 기술된 바와 같이 헌팅틴에 표적되는 화합물은 헌팅톤병의 생리학적 증상의 중증도를 경감하는 것으로 나타났다. 특정 실험에서, 화합물은 분해 속도를 감소시켰는데, 예컨대, 동물은 계속 증상을 경험하지만 증상은 비처리 동물에 비해 덜 심각하였다. 그러나, 다른 실험에서, 화합물은 시간의 경과에 따라 기능의 재생을 유발하는 것으로 보이는데; 예컨대, 더 긴 기간 동안 처리된 동물은 더 짧은 기간 동안 화합물이 투여된 동물보다 덜 심각한 증상을 경험하였다. 상기에 논의된 바와 같이, 헌팅톤병은 시간의 경과에 따라 증상이 증가하는 중증도를 특징으로 하는 진행을 갖는 퇴행성 질환이다. 따라서 기능을 회복시키는 것으로 하기에 예시된 화합물의 효능은 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물을 이용한 처리에 의해 질환의 증상이 역전될 수 있음을 증명한다.
따라서, 이를 필요로 하는 대상에게서 헌팅톤병과 관련된 증상을 개선하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시양태에서, 헌팅톤병과 관련된 증상의 개시율을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 헌팅톤병과 관련된 증상의 중증도를 경감하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 헌팅톤병과 관련된 증상의 개선에 의해 나타나는 바와 같은 신경계 기능을 재생하는 방법이 제공된다. 이러한 실시양태에서, 방법은 헌팅틴 핵산에 표적되는 화합물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
헌팅톤병은 다수의 물리적, 신경학적, 정신적, 및/또는 말초적 증상을 특징으로 한다. 헌팅톤병과 관련된 것으로 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 임의의 증상은 상기에 기술된 방법에서 상기에 개시된 바와 같이 개선되거나 다르게는 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 증상은 불안증, 부조정 절름발이, 비의도적으로 개시된 운동, 비의도적으로 미완된 운동, 불규칙적 걸음걸이, 무도병, 경축, 몸부림 운동, 비정상적 자세, 불안정, 비정상적 얼굴 표정, 씹기 장애, 삼키기 장애, 말하기 장애, 발작, 및 수면 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 물리적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 계획 부전, 유연성 부전, 추상사고 부전, 규칙 습득 부전, 적절한 활동의 개시 부전, 부적절한 활동의 억제 부전, 단기 기억 부전, 장기 기억 부전, 편집증, 방향감장애, 혼동, 환각 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심주의, 공격성, 강박행동, 과민성 및 자살관념으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신적 증상이다. 특정 실시양태에서, 증상은 감소된 뇌 질량, 근위축, 심부전, 글루코스 내성 부전, 체중 감소, 골다공증, 및 고환위축으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말초적 증상이다.
특정 실시양태에서, 증상은 불안증이다. 특정 실시양태에서, 증상은 부조정 절름발이이다. 특정 실시양태에서, 증상은 비의도적으로 개시된 운동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 비의도적으로 미완된 운동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 불규칙적 걸음걸이. 특정 실시양태에서, 증상은 무도병이다. 특정 실시양태에서, 증상은 경축이다. 특정 실시양태에서, 증상은 몸부림 운동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 비정상적 자세이다. 특정 실시양태에서, 증상은 불안정이다. 특정 실시양태에서, 증상은 비정상적 얼굴 표정이다. 특정 실시양태에서, 증상은 씹기 장애이다. 특정 실시양태에서, 증상은 삼키기 장애이다. 특정 실시양태에서, 증상은 말하기 장애이다. 특정 실시양태에서, 증상은 발작이다. 특정 실시양태에서, 증상은 수면 장애이다.
특정 실시양태에서, 증상은 계획 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 유연성 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 추상사고 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 규칙 습득 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 적절한 활동의 개시 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 부적절한 활동의 억제 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 단기 기억 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 장기 기억 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 편집증이다. 특정 실시양태에서, 증상은 방향감장애이다. 특정 실시양태에서, 증상은 혼동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 환각이다. 특정 실시양태에서, 증상은 치매이다.
특정 실시양태에서, 증상은 불안이다. 특정 실시양태에서, 증상은 우울증이다. 특정 실시양태에서, 증상은 둔화정동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 자기중심주의이다. 특정 실시양태에서, 증상은 공격성이다. 특정 실시양태에서, 증상은 강박행동이다. 특정 실시양태에서, 증상은 과민성이다. 특정 실시양태에서, 증상은 자살관념이다.
특정 실시양태에서, 증상은 감소된 뇌 질량이다. 특정 실시양태에서, 증상은 근위축이다. 특정 실시양태에서, 증상은 심부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 글루코스 내성 부전이다. 특정 실시양태에서, 증상은 체중 감소이다. 특정 실시양태에서, 증상은 골다공증이다. 특정 실시양태에서, 증상은 고환위축이다.
특정 실시양태에서, 헌팅톤병의 증상은 정량될 수 있다. 예를 들어, 골다공증은 예컨대 골 밀도 스캔에 의해 측정되고 정량될 수 있다. 이러한 증상의 경우, 특정 실시양태에서, 증상은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위로 감소될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 개체는 헌팅톤병을 갖는다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴 핵산에 표적되는 안티센스 화합물의 투여는 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위로 헌팅틴 발현의 감소를 초래한다.
특정 실시양태에서, 헌팅틴에 표적되는 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 헌팅톤병을 앓거나 이에 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 약물의 제조에 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 방법은, 본 명세서에 기술된 바와 같이 서열번호: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 또는 32로 기재된 서열의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 방법은, 본 명세서에 기술된 바와 같이 서열번호: 12, 22, 28, 30, 32, 및 33으로 기재된 서열의 연속된 뉴클레오염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
투여
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 및 조성물은 경구로 투여된다.
특정 실시양태에서, 경구 투여는 주입에 의한 것이다. 주입은 만성적 또는 연속적 또는 단기적 또는 간헐적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 주입된 약제는 펌프를 이용해 전달된다. 특정 실시양태에서, 경구 투여는 주사에 의한 것이다.
특정 실시양태에서, 화합물 및 조성물은 CNS로 전달된다. 특정 실시양태에서, 화합물 및 조성물은 뇌척수액에 전달된다. 특정 실시양태에서, 화합물 및 조성물은 뇌 실질에 전달된다. 특정 실시양태에서, 화합물 및 조성물은 수막강내 투여, 또는 뇌실내 투여에 의해 동물에 전달된다. 중추신경계 내, 본 명세서에 기술된 화합물 및 조성물의 광범위한 분포는 실질내 투여, 수막강내 투여, 또는 뇌실내 투여에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 경구 투여는 주사에 의한 것이다. 주사는 주사기 또는 펌프를 이용해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 주사는 볼루스 주사이다. 특정 실시양태에서, 주사는 선조체, 꼬리엽, 피질, 해마 및 소뇌와 같은 조직에 직접적으로 투여된다.
헌팅틴 mRNA 발현을 억제하는 안티센스 화합물의 정중 유효 농도 (EC50)를 ICV 주입 또는 볼루스 주사 (실시예 9 및 10 참조) 후에 계산하였다. 선조체내 주사 후 화합물의 EC50을 0.45 mg/g으로 결정하였다. ICV 투여 후 EC50을 26.4 mg/g로 결정하였다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물의 전달은 화합물 또는 조성물의 약동학적 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 조직에 대한 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물의 주사는 화합물 또는 조성물의 주입에 비해 화합물 또는 조성물의 약동학적 프로파일을 개선하다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 조성물의 주사는 유사한 약리학을 달성하기 위해 더 적은 화합물 또는 조성물을 요구하는, 광범위한 확산에 비해 효능을 개선한다. 특정 실시양태에서, 유사한 약리학은 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질이 하향-조절되는 시간의 양을 지칭한다 (예컨대, 작용 기간). 특정 실시양태에서, 예컨대 볼루스 주사에 의해 약제를 특이적으로 국소화하는 방법은 약 50배로 정중 유효 농도 (EC50)(예컨대, 동일하거나 유사한 약력학적 효과를 달성하는데 요구되는 50배 더 적은 농도)를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 예컨대 볼루스 주사에 의해 약제를 특이적으로 국소화하는 방법은 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50배로 정중 유효 농도 (EC50)를 감소시킨다. 특정 실시양태에서 안티센스 화합물 내 약제가 본 명세서에 추가로 기술된다. 특정 실시양태에서, 표적되는 조직은 뇌 조직이다. 특정 실시양태에서 표적되는 조직은 선조체 조직이다. 특정 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자에게서 약학적 결과를 달성하는데 요구되는 용량을 감소시키기 때문에 EC50의 감소가 바람직하다.
뇌 조직에서 MOE 갭머 올리고뉴클레오티드의 반감기는 약 20일이다 (실시예 9-11 참조). 헌팅틴 mRNA의 억제에 의해 측정되는 바와 같은 작용 지속기간은 뇌에서 연장된다 (실시예 9 및 10 참조). 2주간의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뇌실내 주입은 투여를 중단한 후 적어도 91일간 BACHD 마우스의 선조체 조직에서 적어도 50% 헌팅틴 mRNA의 억제를 초래한다. 볼루스 주사에 의한 투여는 유사한 작용 지속기간을 초래한다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물의 CNS로의 전달은 적어도 91일간 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질의 47% 하향-조절을 유발한다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 조성물의 전달은 적어도 20일간, 적어도 30일간, 적어도 40일간, 적어도 50일간, 적어도 60일간, 적어도 70일간, 적어도 80일간, 적어도 85일간, 적어도 90일간, 적어도 95일간, 적어도 100일간, 적어도 110일간, 적어도 120일간 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 하향-조절을 유발한다. 특정 실시양태에서, CNS에의 전달은 실질내 투여, 수막강내 투여, 또는 뇌실내 투여에 의한 것이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 매월 1회, 매월 2회, 90일마다, 3개월마다, 6개월마다, 1년에 2회 또는 1년에 1회 주사 또는 주입에 의해 전달된다.
특정 병용 요법
특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물이 하나 이상의 다른 약제와 병용-투여된다. 특정 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 다른 약제는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 약학적 조성물과 동일한 질환, 장애, 또는 상태를 치료하도록 고안된다. 특정 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 다른 약제는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 약학적 조성물과 다른 질환, 장애, 또는 상태를 치료하도록 고안된다. 특정 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 다른 약제는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 약학적 조성물의 바람직하지 않은 부작용을 치료하도록 고안된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 다른 약제의 바람직하지 않은 부작용을 치료하기 위해 또 다른 약제와 병용-투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 병용 효과를 얻기 위해 다른 약제와 병용-투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물은 상승 효과를 얻기 위해 다른 약제와 병용-투여된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약제는 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약제는 다른 시점에 투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약제는 단일 제형으로 함께 제조된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 약학적 조성물 및 하나 이상의 다른 약제는 개별적으로 제조된다.
특정 실시양태에서, 약학적 조성물과 병용-투여될 수 있는 약제에는 예컨대, 할로페리돌, 클로르프로마진, 클로자핀, 퀘타핀, 및 올란자핀과 같은 항정신병제; 예컨대, 플루옥세틴, 염산세트랄린, 벤라팍신 및 노르트리프틸린과 같은 항우울제; 예컨대, 벤조다이아제핀, 클로나제팜, 파록세틴, 벤라팍신, 및 베타-차단제와 같은 정신안정제; 예컨대, 리튬, 발프로에이트, 라모트리진, 및 카르바제핀과 같은 기분-안정화제; 예컨대, 보툴리늄 독소와 같은 마비제; 및/또는 이로 제한되는 것은 아니지만, 테트라베나진 (세나진), 크레아틴, 코엔자임 Q10, 트레할로세, 도코사헥사노산, ACR16, 에틸-EPA, 아톰옥세틴, 시탈로프람, 디메본, 메만틴, 소듐 페닐부티레이트, 라멜테온, 우르소디올, 지프렉사, 세나신, 티아프라디, 릴루졸, 아만타딘, [123I]MNI-420, 아톰옥세틴, 테트라벤나진, 딕옥신, 데트로메쏘르판, 와르파린, 알프로잠, 케토코나졸, 오메프라졸, 및 미노사이클린을 비롯한 기타 시험제가 포함된다.
도 1: 마우스 뇌에서 선조체 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 387898 농도의 PK/PD 상관관계. C57/BL6 마우스에 50 μg의 ISIS 387898의 단일 볼루스를 투여하고 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 387898의 EC50 또한 계산하였다.
도 2: 다양한 시점에서 선조체 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 387898 농도의 비교. C57/BL6에 50 μg의 ISIS 387898의 단일 볼루스를 투여하고 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 387898 (파선)의 작용 지속기간 (htt mRNA 발현으로 측정됨)은 조직 내 올리고뉴클레오티드 (실선)의 농도 이후에도 더 긴 것으로 관찰되었다.
도 3: 마우스 뇌에서 전방 피질 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 387898 농도의 상관관계 PK/PD. BACHD 마우스에 75 μg의 ISIS 387898을 2주간 뇌실내 주입으로 투여하고 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 387898의 EC50 또한 계산하였다.
도 4: 다양한 시점에서 전방 피질 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 387898 농도의 비교. BACHD 마우스에 75 μg의 ISIS 387898을 2주간 뇌실내 주입으로 투여하고 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 387898 (파선)의 작용 지속기간 (htt mRNA 발현으로 측정됨)은 조직 내 올리고뉴클레오티드 (실선)의 농도 이후에도 더 긴 것으로 관찰되었다.
도 5: 다양한 시점에서 후방 피질 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 388241 농도의 비교. BACHD 마우스에 50 μg의 ISIS 388241을 2주간 뇌실내 주입으로 투여하고, 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 388241 (실선)의 작용 지속기간 (htt mRNA 발현으로 측정됨)은 조직 내 올리고뉴클레오티드 (실선)의 농도 이후에도 더 긴 것으로 관찰되었다.
도 6: 다양한 시점에서 후방 피질 조직 내 헌팅틴 mRNA 발현과 ISIS 443139 농도의 비교. BACHD 마우스에 50 μg의 ISIS 443139를 2주간 뇌실내 주입으로 투여하고, 조직 내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도뿐만 아니라 헌팅틴 mRNA 발현을 측정하였다. ISIS 443139(실선)의 작용 지속기간 (htt mRNA 발현으로 측정됨)은 조직 내 올리고뉴클레오티드 (실선)의 농도 이후에도 더 긴 것으로 관찰되었다.
도 7: 로타로드 (Rotarod) 분석을 이용한 BACHD 마우스에서 운동 수행효능에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리의 효과. BACHD 마우스를 50 μg/일 ICV의 ISIS 388241 또는 PBS로 2주간 처리하였다. 비-형질전환 한배 새끼들의 대조군을 ISIS 388241 또는 PBS로 유사하게 처리하였다. 그 후에 가속 로타로드 분석을 수행하였다. 동물을 2 RPM 속도의 로타로드 위에 놓고; 로타로드를 5분에 걸쳐 40 RPM으로 가속하였다. 떨어지는데 걸리는 시간을 기록하였다. 처리 전에 6개월령에서 기저선을 취하였고 주어진 시점은 분석이 수행된 마우스의 연령이다. 막대는 ISIS 388241 (흑색)로 처리된 BACHD 마우스; PBS로 처리된 BACHD 마우스 (사선); 및 PBS로 처리된 비-형질전환 한배 새끼들 (백색)에서 떨어지는데 걸리는 시간을 초로 나타낸 것이다. ISIS 388241-처리된 마우스는 떨어지기까지 증가된 기간을 나타내었고, 따라서, PBS 대조군에 비해 로타로드에서 개선된 운동 수행효능을 나타내었다.
도 8: R6/2 마우스의 뇌 중량에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리의 효과. 6개월령의 R6/2 마우스를 50 μg/일 ICV의 ISIS 388817 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ISIS 141923 또는 PBS로 4주간 처리하였다. 비-형질전환 한배 새끼들의 대조군을 ISIS 388817 또는 PBS로 유사하게 처리하였다. 본 연구는 8주령의 전-증상 R6/2 마우스의 대조군을 포함하지만 어떠한 처리도 제공하지 않았다. 막대는 8주령의 비처리 R6/2 마우스; ISIS 141923로 처리된 R6/2 마우스; PBS로 처리된 R6/2 마우스; ISIS 388817로 처리된 R6/2 마우스; PBS로 처리된 비-형질전환 한배 새끼들; 및 ISIS 388817로 처리된 비-형질전환 한배 새끼들의 뇌 중량을 나타낸다. PBS 대조군에 비해 ISIS 388817로 처리된 R6/2 마우스의 뇌 중량에서 증가가 나타났다.
도 9: 오픈 필드 분석 (Open Field assay)을 이용한 안티센스 올리고뉴클레오티드-처리된 YAC128 마우스의 행동 특성. 5개월령의 YAC128 마우스를 50 μg/일 ICV의 ISIS 388241 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ISIS 141923 또는 PBS로 14일간 처리하였다. 본 연구는 비-형질전환 FVB/NJ 한배 새끼들의 대조군을 포함하지만 어떠한 처리도 제공하지 않았다. 마우스를 30분의 검사 시기에 걸쳐서 수평 및 수직 운동을 측정하기 위해 광선 단락 (photobeam breaks)을 사용하는 오픈 필드 아레나에 놓았다. 불안의 척도로서 아레나 내에서 총 배회 운동과 아레나의 중심 내에서의 운동을 조사하기 위해 활성 모니터 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다. 막대는 FVB/NJ 마우스, PBS로 처리된 YAC128, 및 ISIS 388241로 처리된 YAC128 마우스가 필드의 중심에서 보낸 시간을 초로 나타낸 것이다. ISIS 388241로 처리된 YAC128 마우스는 중심에서 더 긴 시간을 보냈고, 따라서 PBS 대조군에 비해 불안-경향이 덜한 것으로 간주하였다.
도 10: 고가식 십자미로 (Elevated Plus Maze) 분석을 이용한 안티센스 올리고뉴클레오티드-처리된 YAC128 마우스의 행동 특성. 5개월령의 YAC128 마우스를 50 μg/일 ICV의 ISIS 388241 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ISIS 141923 또는 PBS로 14일간 처리하였다. 비처리군으로 비-형질전환 FVB/NJ 한배 새끼들의 대조군을 포함시켰다. 마우스를 2개의 개방형 팔 및 2개의 폐쇄형 팔로 구성되고 이들 각각 65×6.25 cm의 크기이며 지면으로부터 50 cm 이상 들어 올려져 있는 장치의 중심에 위치시켰다. 불안의 척도로서 장치 위의 마우스 위치 및 개방형 암에서 보내는 시간의 길이를 5분의 검사 시기에 걸쳐 기록하였다. 막대는 FVB/NJ 대조군, PBS로 처리된 YAC128, 및 ISIS 388241로 처리된 YAC128 마우스가 개방형 암에서 보낸 시간의 비율을 나타낸다. ISIS 388241로 처리된 YAC128 마우스는 개방형 암에서 더 긴 시간을 보냈고, 따라서 PBS 대조군에 비해 불안-경향이 덜한 것으로 간주하였다.
실시예
비-제한적 기재 및 참조로서의 도입
본 명세서에 기술된 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 실시양태에 따라 특이적으로 기술된다고 하더라도, 하기 실시예는 본 명세서에 기술된 화합물을 단지 예시하기 위해 제공되며 이를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원에 인용된 참조 각각은 온전히 그대로 참조로서 본 명세서에 포함된다.
인간 헌팅틴 유전자 서열 내에 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드
인간 헌팅틴 유전자 서열을 표적하는 다양한 길이, 포티프 및 골격 조성의 약 1700개의 새롭게 고안된 안티센스 화합물들을 인간 헌팅틴 mRNA에 대한 이들의 시험관 내 효능에 대해 여러 세포 유형에서 검사하였다. 이들 갭머들은 포스포로티오에이트 연결만 (표 1에 기술됨)을 갖거나 포스포로티오에이트 및 포스포로다이에스테르 연결 (표 5에 기술됨)을 갖는 뉴클레오시드간 연결을 갖도록 추가로 고안되었다. 다수의 새롭게 고안된 올리고들 2개의 표준 올리고뉴클레오티드 (이전에 고안되고 기술됨)가 표 1 및 5에 제공된다.
완전한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 갭머
표 1에 제시된 화합물의 일부는 5-10-5 MOE, 6-8-6 MOE, 또는 5-8-5 MOE의 모티프를 갖는다. 5-10-5 갭머는 20개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는데, 중심 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고 양 측면에 (5' 및 3' 방향으로) 각각 5개의 뉴클레오시드를 갖는 날개가 위치한다. 6-8-6 갭머는 20개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는데, 중심 갭 분절은 8개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고 양 측면에 (5' 및 3' 방향으로) 각각 6개의 뉴클레오시드를 갖는 날개가 위치한다. 5-8-5 갭머는 18개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는데, 중심 갭 분절은 8개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하고 양 측면에 (5＇ 및 3＇ 방향으로) 각각 5개의 뉴클레오시드를 갖는 날개가 위치한다. 표 1에 열거된 모든 갭머들의 경우, 5' 날개 분절에서 각각의 뉴클레오시드 및 3＇ 날개 분절에서 각각의 뉴클레오시드는 2＇-MOE 변형을 갖는다. 각 갭머 전체의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드간 연결이다. 각 갭머 전체의 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 표 1에서 각 갭머는 서열번호: 1 (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 또는 서열번호: 2 (뉴클레오티드 462000 내지 634000이 절단된 GENBANK 등재번호 NT_006081.17)에 표적된다. ＇개시 부위＇는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적되는 5＇-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. ＇종결 부위＇는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적되는 3＇-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다.
Chimeric antisense oligonucleotides with phosphorothioate internucleoside linkages targeting human huntingtin gene sequences ( SEQ ID NOs : 1 and 2)
Start Site Stop Site Target
SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Sequence (5' to 3') Motif SEQ
ID
NO.
4384 4403 1 436665 TAGCATTCTTATCTGCACGG 5-10-5 6
4511 4530 1 436668 ACCCGTAACTGAACCAGCTG 5-10-5 7
4599 4618 1 419627 TTCCCTGAACTGGCCCACTT 5-10-5 8
4605 4624 1 419628 CTCTGATTCCCTGAACTGGC 5-10-5 9
4607 4626 1 444607 GCCTCTGATTCCCTGAACTG 5-10-5 10
4608 4627 1 419629 TGCCTCTGATTCCCTGAACT 5-10-5 11
4608 4627 1 444578 TGCCTCTGATTCCCTGAACT 6-8-6 11
4609 4628 1 436671 TTGCCTCTGATTCCCTGAAC 5-10-5 12
4610 4629 1 444608 ATTGCCTCTGATTCCCTGAA 5-10-5 13
4617 4636 1 444615 TGGAATGATTGCCTCTGATT 5-10-5 14
4622 4639 1 437168 GTTTGGAATGATTGCCTC 5-8-5 15
4679 4698 1 419630 CCAATGATCTGTTTTGAATG 5-10-5 16
4733 4752 1 419636 GCCTTCCTTCCACTGGCCAT 5-10-5 17
4813 4832 1 444618 CTGCATCAGCTTTATTTGTT 5-10-5 18
4814 4833 1 419637 CCTGCATCAGCTTTATTTGT 5-10-5 19
4823 4842 1 444627 AGCTCTTTTCCTGCATCAGC 5-10-5 20
4860 4877 1 437507 GTAACATTGACACCACCA 5-8-5 21
4862 4881 1 388241 CTCAGTAACATTGACACCAC 5-10-5 22
4868 4887 1 436684 ATGAGTCTCAGTAACATTGA 5-10-5 23
4925 4944 1 419640 TCCTTGTGGCACTGCTGCAG 5-10-5 24
4928 4947 1 419641 TTCTCCTTGTGGCACTGCTG 5-10-5 25
4931 4950 1 419642 TCATTCTCCTTGTGGCACTG 5-10-5 26
4931 4948 1 437442 ATTCTCCTTGTGGCACTG 5-8-5 27
4955 4974 1 436689 CGAGACAGTCGCTTCCACTT 5-8-5 28
4960 4977 1 437175 TGTCGAGACAGTCGCTTC 5-8-5 29
5801 5820 1 444584 TTGCACATTCCAAGTTTGGC 5-10-5 30
5807 5826 1 387916 TCTCTATTGCACATTCCAAG 5-10-5 31
5809 5828 1 444591 TTTCTCTATTGCACATTCCA 5-10-5 32
5809 5826 1 437527 TCTCTATTGCACATTCCA 5-8-5 33
1446 1465 2 388817 GCAGGGTTACCGCCATCCCC 5-10-5 34
101088 101105 2 437441 ACCTTATCTGCACGGTTC 5-8-5 35
115066 115085 2 436754 CTCTCTGTGTATCACCTTCC 5-10-5 36
표 1의 갭머와 마우스, 붉은털 원숭이 및 래트 헌팅틴 유전자 서열의 상보성을 표 2, 3 및 4에 추가로 기재하였다.
표 2의 갭머는 마우스 헌팅틴 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_010414.1, 본 명세서에서 서열번호: 3으로 지정됨)와 상보적이다. '마우스 표적 개시 부위는 갭머가 마우스 mRNA에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '마우스 표적 종결 부위'는 갭머가 마우스 mRNA에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 마우스 mRNA 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having phosphorothioate linkages with murine mRNA ( SEQ ID NO: 3)
Human Start Site Human Stop Site Human Target SEQ ID NO. ISIS
No. 		Mouse
Start
Site 		Mouse
Stop
Site 		No. of mismatches SEQ
ID
NO.
4384 4403 1 436665 4343 4362 0 6
4511 4530 1 436668 4470 4489 1 7
4599 4618 1 419627 4558 4577 0 8
4605 4624 1 419628 4564 4583 0 9
4607 4626 1 444607 4566 4585 0 10
4608 4627 1 419629 4567 4586 0 11
4608 4627 1 444578 4567 4586 0 11
4609 4628 1 436671 4568 4587 0 12
4610 4629 1 444608 4569 4588 0 13
4617 4636 1 444615 4576 4595 1 14
4622 4639 1 437168 4581 4598 2 15
4679 4698 1 419630 4638 4657 0 16
4733 4752 1 419636 4692 4711 0 17
4813 4832 1 444618 4772 4791 0 18
4814 4833 1 419637 4773 4792 0 19
4823 4842 1 444627 4782 4801 1 20
4925 4944 1 419640 4884 4903 0 24
4928 4947 1 419641 4887 4906 0 25
4931 4950 1 419642 4890 4909 0 26
4931 4948 1 437442 4890 4907 0 27
4955 4974 1 436689 4914 4933 3 28
5807 5826 1 387916 5763 5782 1 31
5809 5826 1 437527 5765 5782 1 33
5809 5828 1 444591 5765 5784 1 32
101088 101105 2 437441 4340 4357 2 35
표 3의 갭머는 붉은털 원숭이 헌팅틴 게놈 서열 (뉴클레오티드 698000 내지 866000가 절단된 GENBANK 등재번호 NW_001109716.1의 보체, 본 명세서에서 서열번호: 4로 지정됨)과 상보적이다. '붉은털 원숭이 표적 개시 부위'는 갭머가 붉은털 원숭이 유전자 서열 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '붉은털 원숭이 표적 종결 부위'는 갭머가 붉은털 원숭이 유전자 서열 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 붉은털 원숭이 유전자 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having phosphorothioate linkages with rhesus monkey gene sequence ( SEQ ID NO: 4)
Human Start Site Human Stop Site Human Target SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Rhesus
monkey
Start
Site 		Rhesus monkey Stop
Site 		No. of
mismatches 		SEQ
ID
NO.
4511 4530 1 436665 98182 98201 0 6
4599 4618 1 419627 101353 101372 1 8
4609 4628 1 436671 102256 102275 3 12
4610 4629 1 444608 102257 102276 2 13
4617 4636 1 444615 102264 102283 0 14
4622 4639 1 437168 102269 102286 0 15
4679 4698 1 419630 102326 102345 0 16
4733 4752 1 419636 102380 102399 0 17
4813 4832 1 444618 105030 105049 0 18
4814 4833 1 419637 105031 105050 0 19
4823 4842 1 444627 105040 105059 0 20
4860 4877 1 437507 105077 105094 1 21
4862 4881 1 388241 105079 105098 1 22
4868 4887 1 436684 105085 105104 0 23
4925 4944 1 419640 106844 106863 0 24
4928 4947 1 419641 106847 106866 0 25
4931 4950 1 419642 106850 106869 0 26
4931 4948 1 437442 106850 106867 0 27
4955 4974 1 436689 106874 106893 0 28
4960 4977 1 437175 106879 106896 0 29
5801 5820 1 444584 125331 125350 0 30
5807 5826 1 387916 125337 125356 0 31
5809 5826 1 437527 125339 125356 0 33
5809 5828 1 444591 125339 125358 0 32
101088 101105 2 437441 97904 97921 0 35
115066 115085 2 436754 110518 110537 0 36
표 4의 갭머는 래트 헌팅틴 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_024357.2, 본 명세서에서 서열번호: 5로 지정됨)에 상보적이다. '래트 표적 개시 부위'는 갭머가 래트 mRNA 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '래트 표적 종결 부위'는 갭머가 래트 mRNA 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 유전자 서열 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 래트 mRNA 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having phosphorothioate linkages with rat mRNA ( SEQ ID NO: 5)
Human Start Site Human Stop Site Human Target SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Rat
Start
Site 		Rat
Stop
Site 		No. of mismatches SEQ
ID
NO.
4384 4403 1 436665 4343 4362 1 6
4511 4530 1 436668 4470 4489 1 7
4599 4618 1 419627 4558 4577 0 8
4605 4624 1 419628 4564 4583 0 9
4607 4626 1 444607 4566 4585 0 10
4608 4627 1 419629 4567 4586 0 11
4608 4627 1 444578 4567 4586 0 11
4609 4628 1 436671 4568 4587 0 12
4610 4629 1 444608 4569 4588 0 13
4617 4636 1 444615 4576 4595 1 14
4622 4639 1 437168 4581 4598 2 15
4679 4698 1 419630 4638 4657 0 16
4733 4752 1 419636 4692 4711 0 17
4813 4832 1 444618 4772 4791 0 18
4814 4833 1 419637 4773 4792 0 19
4823 4842 1 444627 4782 4801 1 20
4925 4944 1 419640 4884 4903 1 24
4928 4947 1 419641 4887 4906 1 25
4931 4950 1 419642 4890 4909 1 26
4931 4948 1 437442 4890 4907 1 27
4955 4974 1 436689 4914 4933 3 28
5801 5820 1 444584 5757 5776 3 30
5807 5826 1 387916 5763 5782 0 31
5809 5826 1 437527 5765 5782 0 33
5809 5828 1 444591 5765 5784 0 32
101088 101105 2 437441 4340 4357 2 35
혼합된 포스포로티오에이트 및 포스포로다이에스테르 뉴클레오시드간 연결을 갖는 갭머
표 5의 키메릭 안티센스 올리고뉴클레오티드를 5-10-5 MOE 갭머로 고안하였다. 5-10-5 갭머는 20개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는데, 중심 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함하고 양 측면에 (5' 및 3' 방향으로) 각각 5개의 뉴클레오시드를 갖는 날개가 위치한다. 5' 날개 분절 내 각 뉴클레오시드 및 3' 날개 분절 내 각 뉴클레오시드는 2'-MOE 변형을 포함한다. 중심 갭 분절 내 뉴클레오시드간 연결, 갭 분절을 5' 또는 3' 날개 분절에 연결하는 연결, 및 각 날개 분절의 5'- 및 3'-최말단 뉴클레오시드에 대한 연결은 모두 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이고; 5' 및 3' 날개 분절 모두에서 나머지 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오시드간 연결은 포스포로다이에스테르 연결로; 즉 갭머는 혼합 골격을 갖는다. 각 갭머 전체에서 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 표 5의 각 갭머는 인간 mRNA 서열 (GENBANK 등재번호 NM_002111.6, 본 명세서에서 서열번호: 1로 지정됨)에 표적된다. '개시 부위'는 갭머가 인간 mRNA 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '종결 부위'는 갭머가 인간 mRNA 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다.
Chimeric antisense oligonucleotides with phosphorothioate and phosphate internucleoside linkages targeting human huntingtin mRNA ( SEQ ID NO: 1)
Start Site Stop Site Target
SEQ
ID NO. 		ISIS No. Sequence (5' to 3') Motif SEQ
ID
NO.
4607 4626 1 444658 GCCTCTGATTCCCTGAACTG 5-10-5 10
4608 4627 1 444659 TGCCTCTGATTCCCTGAACT 5-10-5 11
4609 4628 1 444660 TTGCCTCTGATTCCCTGAAC 5-10-5 12
4610 4629 1 444661 ATTGCCTCTGATTCCCTGAA 5-10-5 13
4813 4832 1 444663 CTGCATCAGCTTTATTTGTT 5-10-5 18
4862 4881 1 443139 CTCAGTAACATTGACACCAC 5-10-5 22
5809 5828 1 444652 TTTCTCTATTGCACATTCCA 5-10-5 32
4928 4947 1 451541 TTCTCCTTGTGGCACTGCTG 5-10-5 25
마우스, 붉은털 원숭이 및 래트 헌팅틴 유전자 서열과 표 5의 갭머의 상보성을 표 6, 7, 및 8에 추가로 기재하였다.
표 6의 갭머는 마우스 헌팅틴 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_010414.1; 서열번호: 3)에 상보적이다. '마우스 표적 개시 부위는 갭머가 마우스 mRNA에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '마우스 표적 종결 부위'는 갭머가 마우스 mRNA에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 마우스 mRNA 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having mixed phosphorothioate and phosphate linkages with murine mRNA ( SEQ ID NO: 3)
Human Start Site Human Stop Site Human Target SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Mouse
Start
Site 		Mouse
Stop
Site 		No. of mismatches SEQ
ID
NO.
4607 4626 1 444658 4566 4585 0 10
4608 4627 1 444659 4567 4586 0 11
4609 4628 1 444660 4568 4587 0 12
4610 4629 1 444661 4569 4588 0 13
4813 4832 1 444663 4772 4791 0 18
5809 5828 1 444652 5765 5784 1 32
표 7의 갭머는 붉은털 원숭이 헌팅틴 게놈 서열 (뉴클레오티드 698000 내지 866000에서 절단된 GENBANK 등재번호 NW_001109716.1의 보체; 서열번호: 4)에 상보적이다. '붉은털 원숭이 표적 개시 부위'는 갭머가 붉은털 원숭이 유전자 서열 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '붉은털 원숭이 표적 종결 부위'는 갭머가 붉은털 원숭이 유전자 서열 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 붉은털 원숭이 유전자 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having mixed phosphorothioate and phosphate linkages with rhesus monkey gene sequence ( SEQ ID NO: 4)
Human
Start
Site 		Human
Stop
Site 		Human Target
SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Rhesus
monkey
Start
Site 		Rhesus
monkey
Stop
Site 		No. of
mismatches 		SEQ
ID
NO.
4609 4628 1 444660 102256 102275 3 12
4610 4629 1 444661 102257 102276 2 13
4813 4832 1 444663 105030 105049 0 18
4862 4881 1 443139 105079 105098 1 22
5809 5828 1 444652 125339 125358 0 32
표 8의 갭머는 래트 헌팅틴 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_024357.2; 서열번호: 5)에 상보적이다. '래트 표적 개시 부위'는 갭머가 래트 mRNA 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '래트 표적 종결 부위'는 갭머가 래트 mRNA 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 개시 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 5'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '인간 표적 종결 부위'는 갭머가 인간 mRNA (GENBANK 등재번호 NM_002111.6) 내에 표적되는 3'-최말단 뉴클레오티드를 나타낸다. '불일치 개수'는 인간 올리고뉴클레오티드와 래트 mRNA 서열 사이의 불일치 개수를 나타낸다.
Complementarity of antisense oligonucleotides having mixed phosphorothioate and phosphate linkages with rat mRNA ( SEQ ID NO: 5)
Human Start Site Human Stop Site Human Target SEQ
ID
NO. 		ISIS No. Rat
Start
Site 		Rat
Stop
Site 		No. of mismatches SEQ
ID
NO.
4607 4626 1 444658 4566 4585 0 10
4608 4627 1 444659 4567 4586 0 11
4609 4628 1 444660 4568 4587 0 12
4610 4629 1 444661 4569 4588 0 13
4813 4832 1 444663 4772 4791 0 18
5809 5828 1 444652 5765 5784 0 32
인간 헌팅틴 mRNA의 시험관 내 용량-의존적 안티센스 억제
인간 헌팅틴 유전자 서열을 표적하는 다양한 길이, 포티프 및 골격 조성의 약 1700개의 새롭게 고안된 안티센스 화합물들을 인간 헌팅틴 mRNA에 대한 이들의 시험관 내 효과에 대해 여러 세포 유형에서 검사하였다. 이들 화합물을 생체 내에서 상당한 효능을 갖는 것으로 이전에 확인된 화합물인 화합물 ISIS 387916을 비롯해 약 250여 개의 이전에 고안된 화합물과 비교하였다. 이 실시예에 나타난 바와 같이, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ISIS 444661, ISIS 437527, ISIS 444584, 및 ISIS 444652 및 이전에 고안된 ISIS 388241이 표준 화합물 ISIS 387916와 유사하거나 그보다 우수한 시험관 내 효능을 갖는 것으로 확인되었다.
A. GM04281 섬유모세포
웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 GM04281 섬유모세포를 전기천공을 이용하여 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM, 또는 8000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617 (정방향 서열 CTCCGTCCGGTAGACATGCT, 본 명세서에서 서열번호: 37로 지정됨; 역방향 서열 GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG, 본 명세서에서 서열번호: 38로 지정됨; 프로브 서열 TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, 본 명세서에서 서열번호: 39로 지정됨)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 9에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다.
각 올리고뉴클레오티드의 억제 중간 농도 (IC50)를 또한 표 9에 나타내고, 사용된 올리고뉴클레오티드의 농도를 각 농도에서 수득된 헌팅틴 mRNA 발현의 억제율에 대해 플롯팅하고 대조군과 비교하여 헌팅틴 mRNA 발현의 50% 억제가 달성되는 올리고뉴클레오티드의 농도를 기록하여 계산하였다. IC50은 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS No. 500
nM 		1000 nM 2000 nM 4000 nM 8000 nM IC 50 (μM)
387916 33 73 90 96 97 1.00
388241 44 70 82 95 97 0.61
419641 26 32 71 90 93 1.06
436665 56 67 87 95 96 0.32
436671 12 35 68 82 91 1.55
436689 10 34 61 80 91 1.89
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, 및 ISIS 437507의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 GM04281 섬유모세포를 상기에 기술된 바와 같이, 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 10에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 안티센스 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 μM로서 표 10에 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS No. 500
nM 		1000
nM 		2000
nM 		4000
nM 		8000
nM 		IC 50
( μM )
387916 56 84 94 98 99 0.34
388241 58 75 94 98 99 0.23
437507 61 74 85 93 93 0.22
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, 및 ISIS 437507의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 GM04281 섬유모세포를 상기에 기술된 바와 같이, 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 11에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 안티센스 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 μM로서 표 11에 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS
No. 		500
nM 		1000
nM 		2000
nM 		4000
nM 		8000 nM IC 50 (μM)
387916 40 61 85 94 97 0.70
388241 51 72 86 94 98 0.41
437507 30 55 71 79 82 1.07
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, 및 ISIS 436754의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 GM04281 섬유모세포를 상기에 기술된 바와 같이, 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 12에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 안티센스 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 μM로서 표 12에 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS No. 500
nM 		1000 nM 2000 nM 4000 nM 8000 nM IC 50
( μM )
387916 58 75 93 98 98 0.22
388241 40 68 85 95 98 0.73
419641 37 58 86 92 95 0.80
436754 44 62 63 84 93 0.59
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, 및 ISIS 437507의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 GM04281 섬유모세포를 전기천공에 의해 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM 또는 8000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 13에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 13에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS No. 250 nM 500 nM 1000
Nm 		2000
nM 		4000
nM 		8000
nM 		IC 50 (μM)
387916 10 9 61 85 97 99 0.79
388241 0 18 42 90 98 99 1.08
437507 1 0 32 71 92 98 1.30
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 443139, ISIS 444584, ISIS 444615, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, 및 ISIS 444661의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 GM04281 섬유모세포를 전기천공에 의해 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1250 nM, 또는 2500 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 14에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 14에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS
No 		156.25 nM 312.5 Nm 625
nM 		1250
nM 		2500 nM IC 50
( μM )
387916 19 22 44 62 85 0.73
388241 3 13 24 42 71 1.42
419628 56 45 59 71 83 0.20
419629 42 38 67 70 89 0.33
419637 24 17 32 61 77 0.91
436684 15 28 55 73 85 0.59
443139 13 45 50 64 81 0.61
444584 0 0 25 50 74 1.28
444615 36 35 37 38 70 0.12
444627 40 38 48 73 87 0.43
444652 15 28 55 73 85 0.59
444658 50 54 75 84 96 0.18
444659 47 61 69 79 93 0.18
444660 41 61 65 84 95 0.22
444661 47 59 72 84 96 0.19
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 436671, ISIS 444661, ISIS 419641, 및 ISIS 436665의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 GM04281 섬유모세포를 전기천공에 의해 13.6719 nM, 27.3438 nM, 54.6875 nM, 109.375 nM, 218.75 nM, 437.5 nM, 875 nM, 1750 nM, 3500 nM, 또는 7000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 15에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 15에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in GM04281 fibroblasts
ISIS No. 13.6719 nM 27.3438 nM 54.6875 nM 109.375 nM 218.75
nM 		437.5
nM 		875
nM 		1750 nM 3500 nM 7000 nM IC 50 ( μM )
387916 0 31 14 43 44 68 86 89 97 97 0.31
436671 0 0 21 31 54 73 77 83 88 97 0.31
444661 0 10 25 53 66 73 87 96 99 99 0.16
419641 5 23 33 48 44 75 79 90 94 98 0.17
436665 26 37 47 44 65 83 89 94 98 98 0.07
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437168, 및 ISIS 437175의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 GM04281 섬유모세포를 전기천공에 의해 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM, 및 8000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 15.1에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 15.1에 μM로 나타내었다.
Figure 112018130209615-pat00003
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437441, 및 ISIS 437442의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 GM04281 섬유모세포를 상기에 기술된 바와 같이 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 15.2에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 15.2에 μM로 나타내었다.
Figure 112018130209615-pat00004
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437175, 및 ISIS 437527의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 GM04281 섬유모세포를 상기에 기술된 바와 같이 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 15.3에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 15.3에 μM로 나타내었다.
Figure 112018130209615-pat00005
B. A549 세포
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 실시예 1에 기술된 일부 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 4,000 세포의 밀도로 배양된 A549 세포를 전기천공에 의해 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 16에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 16에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in A549 cells
ISIS No. 7.4074 nM 22.222 nM 66.667 nM 200.00
nM 		IC 50 (nM)
387916 12 37 76 92 33
419640 21 45 73 93 27
419641 34 60 83 96 15
419642 30 58 85 95 16
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, 및 ISIS 437507의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 20,000 세포의 밀도로 배양된 A549 섬유모세포를 전기천공에 의해 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM 또는 8000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 17에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 17에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in A549 cells
ISIS No. 250 nM 500 nM 1000 nM 2000 nM 4000 nM 8000 nM IC 50 (μM)
387916 15 17 25 36 52 75 3.09
388241 12 22 38 58 77 91 1.43
437507 25 28 38 57 58 76 1.84
C. LLC-MK2 세포
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 실시예 1에 기술된 일부 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 배양된 LLC-MK2 세포를 전기천공에 의해 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM, 10,000 nM, 또는 20,000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2686 (정방향 서열 GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA, 본 명세서에서 서열번호: 40으로 지정됨; 역방향 서열 AAGGGATGCTGGGCTCTGT, 본 명세서에서 서열번호: 41로 지정됨; 프로브 서열 AGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX, 본 명세서에서 서열번호: 42로 지정됨)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 18에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 18에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS No. 625
nM 		1250 nM 2500 nM 5000 nM 10000 nM 20000 nM IC 50 (μM)
388241 21 12 35 46 46 94 4.1
444591 37 46 51 52 82 96 1.9
419641 32 52 69 87 94 97 1.2
444661 45 59 66 85 91 95 0.8
419642 6 3 56 81 91 98 2.9
436665 40 43 70 73 84 89 1.2
436671 31 51 68 82 90 97 1.2
436689 24 37 59 74 89 98 1.9
437507 21 15 11 33 55 92 6.4
443139 31 36 37 56 76 97 2.6
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, 및 ISIS 444607의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 LLC-MK2 세포를 상기에 기술된 바와 같이 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 19에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 19에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS No. 625.0 nM 1250.0 nM 2500.0 nM 5000.0 nM 10000.0 nM 20000.0 nM IC 50
387916 23 42 57 81 88 96 1.95
388241 6 12 37 43 62 84 5.32
437168 72 47 60 78 83 92 1.43
437175 27 48 36 56 68 78 3.58
437441 29 34 50 67 56 85 2.43
437507 18 29 18 33 45 66 6.12
437527 36 36 48 57 81 90 2.71
436684 0 12 24 29 36 49 n.d.
444578 34 40 65 74 82 87 1.70
444584 28 38 68 75 90 94 1.69
444591 25 45 55 74 85 94 1.84
444607 41 54 76 87 92 94 0.96
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, 및 ISIS 444661의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 LLC-MK2 세포를 상기에 기술된 바와 같이 유사한 과정으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 20에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 20에 μM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS No 625.0 nM 1250.0 nM 2500.0 nM 5000.0 nM 10000.0 nM 20000.0 nM IC50
387916 35 44 68 74 90 96 1.35
388241 23 37 54 56 68 89 2.64
444608 43 50 64 83 90 95 1.07
444615 29 45 55 76 90 97 1.67
444618 30 34 57 73 89 95 1.66
444627 35 56 76 90 97 98 1.00
444652 32 55 66 55 92 98 1.23
444658 50 62 80 90 95 97 0.55
444659 31 56 68 86 95 97 1.17
444660 38 49 62 86 89 96 1.26
444661 41 50 75 68 95 97 0.95
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, 및 ISIS 419642의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 3,000 세포의 밀도로 배양된 LLC-MK2 세포를 리포펙타민 형질감염 시약을 이용해 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2686을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 21에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 21에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS No. 6.25 nM 12.5 nM 25.0 nM 50.0 nM 100.0 nM 200.0 nM IC 50
387916 1 37 37 53 84 90 35
419627 0 9 18 45 58 72 75
419628 9 30 49 63 73 77 31
419629 9 16 40 56 80 85 36
419630 17 8 43 58 71 81 40
419636 23 25 38 55 72 78 37
419637 10 35 31 62 78 76 33
419640 3 28 39 59 74 87 36
419641 11 34 51 65 85 87 26
419642 25 30 49 65 85 88 24
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 419641, 및 ISIS 436689의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 3,000 세포의 밀도로 배양된 LLC-MK2 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 시약을 이용해 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2686을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 22에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 22에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS
No 		6.25 nM 12.5 nM 25
nM 		50
nM 		100
nM 		200
nM 		IC 50 (nM)
387916 0 50 31 68 83 90 47
419641 28 23 28 51 65 81 74
436689 16 30 29 48 67 83 69
붉은털 원숭이 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436665, ISIS 436671, 및 ISIS 436689의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 3,000 세포의 밀도로 배양된 LLC-MK2 세포를 리포펙타민 형질감염 시약을 이용해 4.6875 nM, 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 75 nM, 또는 150 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2686을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 23에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 23에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in LLC -MK2 cells
ISIS No. 4.6875 nM 9.375 nM 18.75 nM 37.5 nM 75.0 nM 150.0 nM IC 50 (nM)
387916 7 6 38 59 82 91 32
388241 0 0 5 35 62 81 60
436665 7 0 36 59 64 69 37
436671 21 7 35 59 80 86 31
436689 38 45 45 59 76 86 15
D. BACHD 형질전환 마우스 간세포
인간 헌팅틴 mRNA에 대한, 실시예 1에 기술된 인간 헌팅틴 핵산에 표적되는 일부 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 10,000 세포의 밀도로 배양된 BACHD 마우스 간세포를 사이토펙틴 형질감염 시약을 이용해 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 24에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 제시된 결과는 2회 실험의 평균이다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 24에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in BACHD transgenic murine hepatocytes
ISIS No. 7.4074 nM 22.222 nM 66.667 nM 200.00 nM IC 50 (nM)
387916 8 19 58 89 40
419640 15 30 64 93 33
419641 20 35 73 97 31
419642 3 29 70 96 43
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, 및 ISIS 419641의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 10,000 세포의 밀도로 배양된 BACHD 마우스 간세포를 사이토펙틴 형질감염 시약을 이용해 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 25에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 25에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in BACHD transgenic murine hepatocytes
ISIS No. 12.5 nM 25 nM 50 Nm 100 nM 200 nM IC 50 (nM)
387916 0 37 51 78 91 51
388241 0 10 45 70 92 68
419641 17 38 70 88 96 34
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, ISIS 436665, ISIS 436671, 및 ISIS 436689의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 배양된 BACHD 마우스 간세포를 상기에 기술된 바와 동일한 방식으로 검사하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 26에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 26에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in BACHD transgenic murine hepatocytes
ISIS No. 12.5 nM 25 nM 50 nM 100 nM 200 nM IC 50 (nM)
387916 19 48 64 86 93 32
388241 20 34 54 81 93 38
419641 38 54 70 85 95 21
436665 32 40 67 84 93 29
436671 32 42 58 78 91 32
436689 35 44 70 88 96 25
인간 헌팅틴 mRNA에 대한 ISIS 387916, ISIS 419640, ISIS 419641, 및 ISIS 419642의 시험관 내 효과를 추가로 검사하였다. 웰당 20,000 세포의 밀도로 배양된 BACHD 마우스 간세포를 사이토펙틴 형질감염 시약을 이용해 6.667 nM, 20 nM, 60 nM, 또는 180 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 경과 후, 세포로부터 RNA를 분리하고 헌팅틴 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR을 이용해 측정하였다. 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633 (정방향 서열 CAGAGCTGGTCAACCGTATCC, 본 명세서에서 서열번호: 43으로 지정됨; 역방향 서열 GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA, 본 명세서에서 서열번호: 44로 지정됨; 프로브 서열 ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, 본 명세서에서 서열번호: 45로 지정됨)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 함량에 맞추어 조절하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 mRNA의 억제율로서 표 27에 나타내고, 이는 헌팅틴 mRNA 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 용량-의존적 감소를 입증한다. 각 올리고뉴클레오티드의 IC50을 또한 표 27에 nM로 나타내었다.
Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in BACHD transgenic murine hepatocytes
ISIS
No. 		6.667 nM 20
nM 		60 nM 180 nM IC 50 (nM)
387916 15 15 68 94 37
419640 4 39 73 94 32
419641 16 45 81 96 24
419642 23 39 75 93 25
BACHD 마우스에서 헌팅틴 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전신 투여
전신 순응성 스크린에서의 검사에서 ISIS 387916에 상응하는 시험관 내 효능을 기준으로 약 1700여 개의 새롭게 고압된 안티센스 화합물들 중에서 66개의 화합물을 선발하였다.
BACHD 마우스를 ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리하고 간에서 헌팅틴 mRNA의 억제와 다양한 대사 마커들의 수준에 있어서의 변화를 평가하였다. 체중, 장기 무게 또는 대사 마커들의 수준에 유해한 변화를 초래하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이후의 연구에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 간주하였다.
연구 1
처리
각 4마리 BACHD 마우스의 19개 그룹에 12.5 mg/kg의 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, 또는 ISIS 444663을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 PBS를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 마지막 투여하고 2일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 혈장 채취를 위해 피를 뽑았고, 그 후에 경추 탈구를 수행하고 장기를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 마우스 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 28 및 29에 나타내었고 PBS 대조군에 대하여 인간 및 생쥐 헌팅틴 발현 수준의 억제율을 각각 계산하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내었다. ISIS 388241은 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)에 3개 이상의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. % inhibition
387916 82
388241 52
419629 80
419637 83
436684 55
444578 70
444584 62
444591 54
444607 76
444608 61
444615 89
444618 91
444627 92
444652 79
444658 62
444659 74
444660 66
444661 72
444663 77
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. % inhibition
387916 77
419629 75
419637 87
436684 32
444578 64
444584 20
444591 32
444607 76
444608 66
444615 60
444618 88
444627 58
444652 66
444658 53
444659 62
444660 47
444661 67
444663 60
장기 무게 측정
간, 비장 및 신장의 무게를 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화된 식염수 대조군의 비율로서 표 30에 나타내었다.
Percent change in organ weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
ISIS No. Liver Spleen Kidney
387916 -5 -13 +6
388241 -1 +14 -5
419629 +5 +13 -12
419637 -6 -17 -25
436684 -2 -3 +6
444578 +11 +18 +1
444584 +8 +54 +1
444591 +4 -4 -3
444607 +3 +22 -8
444608 +6 +18 -3
444615 +6 +1 +3
444618 +11 +0 -2
444627 +3 -14 +14
444652 -11 -4 -18
444658 -1 0 -16
444659 +1 +15 -2
444660 -5 +4 -6
444661 -1 +7 -1
444663 +7 +10 +8
간 기능의 평가
상기에 기술된 마우스의 간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 아미노전이효소의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (automated clinical chemistry analyzer, Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노전이효소 (AST)의 측정을 IU/L로 표시하였고 그 결과를 표 31에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of liver function
ALT AST
PBS 40 69
387916 69 84
388241 42 76
419629 51 71
419637 59 86
436684 60 87
444578 62 93
444584 48 76
444591 39 53
444607 51 111
444608 48 75
444615 74 95
444618 687 908
444627 105 127
444652 54 64
444658 46 59
444659 90 138
444660 34 64
444661 49 99
444663 90 164
연구 2
처리
각 4마리 BACHD 마우스의 14개 그룹에 12.5 mg/kg 또는 50 mg/kg의 ISIS 419581, ISIS 419602, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419640, ISIS 419641, 또는 ISIS 419642를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 12.5 mg/kg의 ISIS 387916을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 PBS를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 마지막 투여하고 2일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 혈장 채취를 위해 피를 뽑았고, 그 후에 경추 탈구를 수행하고 장기를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 마우스 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 32 및 33에 나타내었고 PBS 대조군에 대하여 인간 및 생쥐 헌팅틴 발현 수준의 억제율을 각각 계산하였다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
387916 12.5 71
419581 12.5 54
50 68
419602 12.5 72
50 77
419628 12.5 65
50 76
419629 12.5 87
50 93
419640 12.5 69
50 79
419641 12.5 61
50 80
419642 12.5 76
50 83
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
387916 12.5 70
419581 12.5 42
50 86
419602 12.5 77
50 85
419628 12.5 67
50 86
419629 12.5 90
50 93
419640 12.5 63
50 84
419641 12.5 52
50 81
419642 12.5 56
50 83
장기 무게 측정
간, 비장 및 신장의 무게를 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화된 식염수 대조군의 비율로서 표 34에 나타내었다.
Percent change in organ weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
ISIS No. Dose (mg/kg) Liver Spleen Kidney
387916 12.5 -9 3 -4
419581 12.5 -2 -6 -1
50 14 -1 -11
419602 12.5 10 1 -2
50 28 9 -3
419628 12.5 -2 -7 -2
50 -3 7 -9
419629 12.5 -7 -5 -10
50 16 0 -8
419640 12.5 -5 -2 -8
50 1 -20 -4
419641 12.5 -7 -10 -11
50 -2 -13 -9
419642 12.5 -11 -21 -19
50 -1 -8 -9
간 기능의 평가
상기에 기술된 마우스의 간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 아미노전이효소의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (automated clinical chemistry analyzer, Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. ALT 및 AST의 측정을 IU/L로 표시하였고 그 결과를 표 35에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of liver function
Dose (mg/kg) ALT AST
PBS 44 80
387916 12.5 44 75
419581 12.5 56 101
50 390 281
419602 12.5 86 108
50 240 229
419628 12.5 52 110
50 51 73
419629 12.5 104 118
50 1262 1150
419640 12.5 36 65
50 38 55
419641 12.5 56 103
50 57 172
419642 12.5 40 64
50 47 101
연구 3
처리
각 4마리 BACHD 마우스의 18개 그룹에 12.5 mg/kg 또는 50 mg/kg의 ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, ISIS 419641, ISIS 436645, ISIS 436649, ISIS 436668, 또는 ISIS 436689를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 12.5 mg/kg의 ISIS 388241을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 PBS를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 마지막 투여하고 2일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 혈장 채취를 위해 피를 뽑았고, 그 후에 경추 탈구를 수행하고 장기를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 마우스 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 36 및 37에 나타내었고 PBS 대조군에 대하여 인간 및 생쥐 헌팅틴 발현 수준의 억제율을 각각 계산하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내었다. ISIS 388241, ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, 및 ISIS 436645는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개 이상의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 436649 및 ISIS 436689는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
388241 12.5 32
388250 12.5 21
50 45
388251 12.5 30
50 34
388263 12.5 29
50 35
388264 12.5 35
50 42
419641 12.5 71
50 73
436645 12.5 43
50 48
436649 12.5 40
50 38
436668 12.5 45
50 69
436689 12.5 62
50 78
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
419641 12.5 68
50 77
436668 12.5 41
50 62
장기 무게 측정
간, 비장 및 신장의 무게를 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화된 식염수 대조군의 비율로서 표 38에 나타내었다. ISIS 388263 및 ISIS 436645로 처리된 마우스는 PBS 대조군에 비해 50 mg/kg 용량에서 간 무게의 증가를 경험하였다.
Percent change in organ weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
ISIS No. Dose (mg/kg) Liver Spleen Kidney
388241 12.5 1 6 9
388250 12.5 2 1 -2
50 1 30 3
388251 12.5 4 -8 1
50 19 19 2
388263 12.5 4 8 9
50 23 52 1
388264 12.5 2 -2 3
50 12 9 6
419641 12.5 -1 -9 3
50 2 -4 3
436645 12.5 8 6 5
50 26 25 9
436649 12.5 1 0 6
50 0 1 3
436668 12.5 1 5 10
50 -2 3 11
436689 12.5 -3 -5 4
50 6 11 5
간 기능의 평가
상기에 기술된 마우스의 간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 아미노전이효소의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (automated clinical chemistry analyzer, Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노전이효소 (AST)의 측정을 IU/L로 표시하였고 그 결과를 표 39에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of liver function
Dose (mg/kg) ALT AST
PBS 43 76
388241 12.5 43 88
388250 12.5 37 55
50 44 89
388251 12.5 42 98
50 67 91
388263 12.5 51 90
50 55 93
388264 12.5 31 59
50 65 90
419641 12.5 39 70
50 42 83
436645 12.5 43 82
50 179 143
436649 12.5 35 47
50 38 76
436668 12.5 36 73
50 28 57
436689 12.5 31 52
50 49 164
연구 4
처리
각 4마리 BACHD 마우스의 18개 그룹에 12.5 mg/kg 또는 50 mg/kg의 ISIS 388241, ISIS 437123, ISIS 437132, ISIS 437140, ISIS 437442, ISIS 437446, ISIS 437477, ISIS 437478, 또는 ISIS 437490을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 12.5 mg/kg의 ISIS 387916을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 PBS를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 마지막 투여하고 2일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 혈장 채취를 위해 피를 뽑았고, 그 후에 경추 탈구를 수행하고 장기를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 마우스 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 40 및 41에 나타내었고 PBS 대조군에 대하여 인간 및 생쥐 헌팅틴 발현 수준의 억제율을 각각 계산하였다. ISIS 388241 및 ISIS 437490은 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개 이상의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 437132는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 437123 및 ISIS 437140은 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 2개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
387916 12.5 51
388241 12.5 47
50 67
437123 12.5 0
50 21
437132 12.5 31
50 33
437140 12.5 7
50 32
437442 12.5 42
50 85
437446 12.5 39
50 70
437477 12.5 52
50 75
437478 12.5 54
50 78
437490 12.5 42
50 44
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. Dose (mg/kg) % inhibition
387916 12.5 48
437442 12.5 27
50 76
437446 12.5 38
50 71
437477 12.5 63
50 87
437478 12.5 60
50
장기 무게 측정
간, 비장 및 신장의 무게를 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화된 식염수 대조군의 비율로서 표 42에 나타내었다.
Percent change in organ weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
ISIS No. Dose (mg/kg) Liver Spleen Kidney
387916 12.5 1 6 12
388241 12.5 -3 16 -2
50 -6 10 0
437123 12.5 -4 0 4
50 4 0 -4
437132 12.5 -2 -3 -5
50 2 -6 -2
437140 12.5 -4 11 -3
50 4 5 -5
437442 12.5 -10 9 3
50 -3 -20 -10
437446 12.5 -6 7 2
50 -4 1 -1
437477 12.5 1 -2 0
50 25 -9 -6
437478 12.5 -7 -4 -9
50 22 4 3
437490 12.5 -5 0 -5
50 -7 3 -9
간 기능의 평가
상기에 기술된 마우스의 간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 아미노전이효소의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (automated clinical chemistry analyzer, Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노전이효소 (AST)의 측정을 IU/L로 표시하였고 그 결과를 표 43에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of liver function
Dose (mg/kg) ALT AST
PBS 32 58
387916 12.5 40 122
388241 12.5 39 93
50 28 62
437123 12.5 38 88
50 34 66
437132 12.5 34 52
50 30 52
437140 12.5 30 62
50 40 63
437442 12.5 40 106
50 63 119
437446 12.5 35 119
50 35 89
437477 12.5 39 68
50 52 162
437478 12.5 37 53
50 55 71
437490 12.5 48 71
50 34 59
연구 5
처리
각 4마리 BACHD 마우스의 11개 그룹에 12.5 mg/kg의 ISIS 388241, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, 또는 ISIS 444661을 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 4마리 마우스의 대조군에 인산염 완충 식염수 (PBS)를 2주간 주 2회 복강 내로 주사하였다. 마지막 투여하고 2일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 혈장 채취를 위해 피를 뽑았고, 그 후에 경추 탈구를 수행하고 장기를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 마우스 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 44 및 45에 나타내었고 PBS 대조군에 대하여 인간 및 생쥐 헌팅틴 발현 수준의 억제율을 각각 계산하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내었다. ISIS 388241, ISIS 437507, 및 ISIS 443139는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개 이상의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 436689는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. % inhibition
388241 53
419640 34
419641 63
419642 55
436665 63
436671 66
436689 57
437507 54
443139 39
444591 48
444661 50
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in BACHD mice
ISIS No. % inhibition
419640 24
419641 51
419642 34
436665 49
436671 63
444591 41
444661 46
체중 및 장기 무게 측정
마우스의 체중을 연구 개시 시점과 이어서 주 2회 측정하였다. 마우스의 체중을 표 46에 나타내었고 이는 시점에 측정된 체중 대비 변화율로 표현되었다. 결과는 이들 올리고뉴클레오티드로의 처리가 연구 전반에 걸쳐 마우스의 체중에 아무런 유해한 변화도 야기하지 않음을 나타낸다.
Percent change in body weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
day 4 day 7 day 10 day 12
PBS -3 0 +2 +1
ISIS 388241 -2 -1 -1 +1
ISIS 419640 +1 0 +3 +4
ISIS 419641 +1 +1 +2 0
ISIS 419642 -3 -2 +1 -5
ISIS 436665 +1 +4 +5 +1
ISIS 436671 +1 +2 +5 +4
ISIS 436689 +1 +3 0 -1
ISIS 437507 -1 -2 +2 -2
ISIS 443139 -2 +6 +4 +1
ISIS 444591 -1 +1 +2 0
ISIS 444661 +1 +3 +2 0
간, 비장 및 신장의 무게를 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화된 식염수 대조군의 비율로서 표 47에 나타내었다.
Percent change in organ weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
ISIS No. Liver Spleen Kidney
388241 +2 +13 -7
419640 -2 +12 -12
419641 +4 +3 -13
419642 +5 +19 -8
436665 -3 +3 -13
436671 0 +1 -18
436689 -6 -10 -12
437507 -5 -5 -14
443139 -2 -9 -13
444591 -2 -10 -12
444661 0 -16 -12
간 기능 평가
상기에 기술된 마우스의 간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 아미노전이효소의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (automated clinical chemistry analyzer, Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. ALT 및 AST의 측정을 IU/L로 표시하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 자동화 임상화학 분석기로 측정하여 g/dL로 표시하였다. 결과를 표 48에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of liver function
ALT AST Bilirubin Albumin
PBS 42.5 86.5 0.2 3.1
ISIS 388241 39.3 54.5 0.3 3.0
ISIS 419640 36.8 85.8 0.2 2.9
ISIS 419641 50.0 71.8 0.2 3.0
ISIS 419642 42.8 77.0 0.1 3.0
ISIS 436665 51.5 123.0 0.2 3.0
ISIS 436671 52.0 71.0 0.1 3.0
ISIS 436689 38.3 75.3 0.2 3.1
ISIS 437507 37.0 77.5 0.1 3.0
ISIS 443139 41.3 124.8 0.2 3.0
ISIS 444591 46.5 61.3 0.2 3.0
ISIS 444661 67.5 109.8 0.2 3.1
신장 기능 측정
상기에 기술된 마우스의 신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 혈중 우레아 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 결과를 mg/dL로 표시하여 표 49에 나타내었다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on markers of kidney function
BUN Creatinine
PBS 24.0 0.17
ISIS 388241 22.6 0.17
ISIS 419640 21.4 0.16
ISIS 419641 19.9 0.16
ISIS 419642 23.6 0.18
ISIS 436665 20.2 0.17
ISIS 436671 22.6 0.17
ISIS 436689 19.2 0.18
ISIS 437507 19.9 0.16
ISIS 443139 23.3 0.16
ISIS 444591 23.5 0.18
ISIS 444661 25.4 0.18
다른 대사 매개변수의 측정
상기에 기술된 마우스의 다른 대사 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, 글루코스, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 혈장 농도를 자동화 임상화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 결과를 mg/dL로 표시하여 표 50에 나타내었고 이는 이들 올리고뉴클레오티드로의 처리가 대조군과 처리군 사이에서러한 대사 마커들의 수준에 아무런 유해한 변화도 야기하지 않음을 증명한다.
Effect of antisense oligonucleotide treatment on metabolic markers
Glucose Cholesterol Triglycerides
PBS 198 142 225
ISIS 388241 197 133 185
ISIS 419640 198 132 189
ISIS 419641 188 140 219
ISIS 419642 184 128 192
ISIS 436665 199 134 152
ISIS 436671 196 148 174
ISIS 436689 194 132 174
ISIS 437507 198 139 155
ISIS 443139 178 122 239
ISIS 444591 202 145 263
ISIS 444661 180 140 247
BACHD 마우스의 선조체에 헌팅틴 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 볼루스 투여
인간 및 마우스 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 뇌 조직 내 올리고뉴클레오티드의 활성을 조사하기 위하여 BACHD 마우스의 한정된 마우스 뇌 영역에 볼루스 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
처리 및 수술
각 4마리 BACHD 마우스의 그룹에 3 μg, 10 μg 또는 25 μg 농도의 단일 볼루스 주사로서 전달되는 ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 또는 ISIS 444663을 선조체 내로 투여하였다.
각 4마리 BACHD 마우스의 대조군을 PBS로 유사하게 처리하였다. ISIS 388241을 각 4마리 마우스의 7개 그룹에 투여하였고 제시된 결과는 28마리 마우스로부터 유도된 데이터의 평균이다. ISIS 419628을 각 4마리 BACHD 마우스의 2개 그룹에 투여하였고 제시된 결과는 8마리 마우스로부터 유도된 데이터의 평균이다. 볼루스 투여하고 7일 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 장기를 제거하였다. 동물의 목을 베고 선조체 조직의 절개를 위해 뇌를 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 인간 헌팅틴 mRNA 수준에 대한 결과를 표 51에 나타내었고 PBS 대조군에 대한 억제율로 표시되었다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 용량-의존적 억제를 나타내었다. 생쥐 헌팅틴 mRNA 수준에 대한 결과를 표 52에 나타내었고 PBS 대조군에 대한 억제율로 표시되었다.
인간 헌팅틴 mRNA 및 마우스 헌팅틴 mRNA에 대한 각 올리고뉴클레오티드의 유효량 (ED50)을, 사용된 올리고뉴클레오티드의 농도 대 각 종류의 헌팅틴 mRNA 발현의 억제율을 플롯팅하고 대응하는 대조군에 비해 각 종류에 대해 헌팅틴 mRNA 발현의 50% 억제가 달성되는 농도를 기록하여 계산하였다. 각각의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 ED50 (mg) 또한 인간 및 생쥐 헌팅틴 mRNA에 대해 각각 표 51 및 52에 나타내었다.
ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139, 및 ISIS 444584는 각각 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 8개 이상의 염기쌍에서 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 437168 및 ISIS 437441은 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 2개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다. ISIS 436689는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)와 3개의 불일치를 갖고, 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA levels in vivo and ED 50 of the antisense oligonucleotides
ISIS No. 3 mg 10 mg 25 mg ED 50
388241 33 55 68 7.4
419628 49 58 83 5.1
419637 40 62 79 6.1
419640 52 64 77 4.8
419641 71 77 89 2.2
419642 67 70 83 3.0
436665 52 71 60 5.8
436671 68 80 84 2.4
436684 2 18 37 36.9
436689 27 63 81 7.0
436754 31 54 61 10.5
437168 2 49 60 15.2
437175 0 53 64 12.9
437441 3 32 38 35.3
437442 38 50 56 11.9
437507 38 59 79 6.6
437527 37 47 59 11.9
443139 39 61 70 6.7
444578 51 66 75 4.6
444584 30 63 71 7.8
444591 60 54 70 5.6
444607 57 69 75 3.2
444608 67 68 82 3.1
444615 47 55 91 5.2
444618 57 64 83 4.0
444627 47 70 61 5.0
444652 36 62 66 7.8
444658 60 66 79 3.6
444659 61 67 84 3.4
444660 55 62 66 4.2
444661 48 57 70 6.4
444663 42 60 80 5.5
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA levels in vivo and ED 50 of the antisense oligonucleotides
ISIS No. 3 mg 10 mg 25 mg ED 50
419628 50 55 83 5.1
419637 63 79 86 2.6
419640 51 60 86 4.9
419641 65 80 87 2.7
419642 69 73 88 2.5
436665 68 82 66 2.7
436671 75 87 90 2
437442 30 53 82 9
437527 67 73 90 2.7
444578 50 65 74 4.9
444591 69 69 81 2.8
444607 57 70 75 3.8
444608 70 72 90 2.5
444615 30 37 88 9.5
444618 66 71 90 2.8
444627 41 60 57 8.8
444652 47 62 66 4.7
444658 60 62 85 3.9
444659 54 62 85 4.2
444660 42 48 64 9.5
444661 49 57 74 5.9
444663 42 65 84 5.1
별표로 표시된 10개의 화합물은 ISIS 388241보다 개선된 ED50을 나타내었다.
래트의 선조체 조직 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 볼루스 투여의 신경독성 효과 분석
약 30개의 화합물을 높은 순응성 및 높은 효능을 갖는 것으로 선택하였다. 신경독성을 추가로 평가하기 위하여 화합물들을 래트에 CNS 볼루스 주사로 검사하였다.
CNS 독성의 척도로서 미세아교세포 마커인 AIF1의 유도에 대해 조사하기 위하여 스프라그-다우리 래트 각각을 지정된 뇌 영역인, 선조체에 볼루스 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
처리 및 수술
4마리의 스프라그-다우리 래트의 그룹에 50 μg 농도의 단일 볼루스 주사로서 전달되는 ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 4196671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 443168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, 또는 ISIS 444663을 선조체 내로 투여하였다.
4마리 래트의 대조군에 PBS를 유사하게 처리하였다. 4마리 래트의 그룹에는 음성 대조군으로서 TNF-a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 ISIS 104838을 유사하게 처리하였다. ISIS 387916을 4마리 래트의 4개 그룹에 투여하였고 제시된 결과는 16마리 래트로부터 유도된 데이터의 평균이다. ISIS 419628을 각각 4마리 래트의 2개 그룹에 투여하였고 제시된 결과는 8마리 래트로부터 유도된 데이터의 평균이다. 전신 투여 연구 (실시예 3)에서 독성 지표를 갖는, ISIS 419629, ISIS 444584 및 ISIS 444618을 또한 본 연구에서 검사하였다. 볼루스 투여하고 7일 후, 래트를 이소플루란으로 마취시키고 장기를 제거하였다. 동물의 목을 베고 선조체 조직의 절개를 위해 뇌를 적출하였다.
AIF1 발현 수준의 RNA 분석
AIF1 mRNA 수준의 정량적 실시간 PCR을 위해 RNA를 선조체 조직으로부터 분리하였다. 래트 프라이머 프로브 세트 rAif1_LTS00219 (정방향 서열 AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, 본 명세서에서 서열번호: 46으로 지정됨; 역방향 서열 CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, 본 명세서에서 서열번호: 47로 지정됨; 프로브 서열 CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX, 본 명세서에서 서열번호: 48로 지정됨)을 사용하여 래트 AIF1 수준을 측정하였다. 결과를 PBS 대조군 세포에 대한 AIF1 발현의 비율로서 계산하여 표 53에 나타내었다. 전신 투여 연구 (실시예 3)에서 독성 지표를 갖는, ISIS 419629, ISIS 444584, 및 ISIS 444618은 또한 본 연구에서도 독성 지표를 나타내었다 (식염수 대조군에 비해 300% 초과). 이후의 연구에서는 ISIS 444584가 신경내성 (neurotolerable)이고 미미한 수준의 독성 지표를 나타냄이 확인되었다 (실시예 16 및 17 참조).
Percent expression of AIF1 mRNA levels in vivo as a measure of neurotoxicity
ISIS No. % expression
104838 111
387916 870
388241 236
419627 168
419628 497
419629 247
419630 227
419636 464
419637 275
419640 305
419641 206
419642 173
436665 217
436668 447
436671 239
436684 700
436689 149
436754 125
437168 130
437175 131
437441 158
437442 157
437507 133
437527 184
443139 143
444578 352
444584 317
444591 194
444607 362
444608 476
444615 645
444618 547
444627 377
444652 336
444658 364
444659 319
444660 411
444661 249
444663 448
헌팅틴 발현 수준의 RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 정량적 실시간 PCR을 위해 RNA를 선조체 조직으로부터 분리하였다. 래트 프라이머 프로브 세트 rHtt_LTS00343 (정방향 서열 CAGAGCTGGTGAACCGTATCC, 본 명세서에서 서열번호: 49로 지정됨; 역방향 서열 GGCTTAAGCAGGGAGCCAAAA, 본 명세서에서 서열번호: 50으로 지정됨; 프로브 서열 ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, 본 명세서에서 서열번호: 51로 지정됨)을 사용하여 래트 헌팅틴 mRNA 수준을 측정하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 발현의 감소율로서 계산하여 표 54에 나타내었다. ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, 및 ISIS 443139는 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 대해 6개 이상의 염기쌍에서 불일치이고, 따라서 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 437442, ISIS 444615, 및 ISIS 444627은 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 대해 1개의 불일치를 갖고, 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 437168 및 ISIS 437441은 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 2개의 불일치를 갖고 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 436689 및 ISIS 444584는 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 3개의 불일치를 갖고 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다.
Percent reduction of rat huntingtin mRNA levels in rats
ISIS No. % reduction
387916 70
419627 67
419628 57
419629 85
419630 11
419636 53
419637 84
436671 77
437527 86
444578 72
444591 35
444607 57
444608 68
444618 56
444652 75
444658 61
444659 55
444660 63
444661 52
444663 59
BACHD 마우스에서 헌팅틴 mRNA - 순응성 연구에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뇌실내 투여
선택된 화합물들을 BACHD 마우스에서 ICV 투여에 의해 이전에 고안된 화합물 ISIS 388241과 비교하였다.
선택된 화합물들과 표준 388241은 CNS 효능 및 순응성 뿐만 아니라 시험관 내 및 전신 효능 및 전신 순응성을 근거로 선발되었다.
마우스에서 ICV 투약의 순응성을 평가하기 위하여 BACHD 마우스를 한정된 마우스 뇌 영역인, 우측 가쪽뇌실에 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
처리 및 수술
각각 5마리 BACHD 마우스의 그룹에 2주간 12 μL/일의 속도로 알제트 (Alzet) 2002 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 150 μg/일 농도로 ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 444591, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 444661, 또는 ISIS 436689를 투여하였다. 4마리 BACHD 마우스의 대조군에 PBS를 유사하게 처리하였다. 하기 방식으로 마우스에 펌프를 외과적으로 이식하였다: 펌프 이식을 위해 마우스를 개별적으로 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 2주 후, 마우스를 다시 마취시키고 펌프를 외과적으로 제거하였다. 그 후에 동물을 안락사시키기 전에 2주 이상 회복되게 하였다.
처리 및 회복 기간 동안 매주 마우스의 체중을 측정하였다. 4주 후, 마우스를 이소플루란을 사용해 안락사시키고 목을 베었다. 전방 및 후방 절개로부터 조직 적출을 위해 뇌를 제거하였다.
RNA 분석
RNA를 헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 관삽입 부위의 전방 피질 및 후방 소뇌 절편의 우측 반구로부터 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 대조군에 비해 인간 및 생쥐 헌팅틴 mRNA 발현의 억제율로서 계산하고 각각 표 56 및 57에 나타내었다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내었다. ISIS 388241, ISIS 437507, 및 ISIS 443139은 각각 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)에 대해 8개 이상의 염기쌍이 불일치이고 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 444591은 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)에 대해 1개의 불일치를 갖고 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 436689는 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)에 대해 3개의 불일치를 갖고 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내지 않는다.
Percent reduction of human huntingtin mRNA levels in BACHD mice via ICV administration of antisense oligonucleotides

ISIS No.
Number
of mice 		Anterior
cortex 		Posterior
cortex
388241 3 82 70
419640 1 60 46
419641 2 75 66
419642 3 29 42
436665 5 62 38
436671 3 69 77
436689 3 49 40
437507 3 77 66
443139 5 93 90
444591 5 79 78
Percent reduction of murine huntingtin mRNA levels in BACHD mice via ICV administration of antisense oligonucleotides

ISIS No.
Number
of mice 		Anterior
cortex 		Posterior
cortex
419640 1 22 34
419641 2 40 26
419642 3 63 71
436665 5 72 56
436671 3 80 71
체중 측정
마우스의 체중을 연구 개시 시점에 측정하고 이어서 주 1회 측정하였다. 마우스의 체중을 표 58에 나타내고 연구의 개시 시점에서 측정된 중량에 대한 변화율로 표시하였다. 체중을 안티센스 올리고뉴클레오티드의 ICV 투여에 대한 마우스의 순응성의 척도로 간주하였다. 'n.d.'는 정해진 기간 동안에 입수가능한 데이터가 없음을 의미한다.
Percent change in body weight of BACHD mice during antisense oligonucleotide treatment
week 1 week 2 week 3 week 4
PBS -1 +2 +6 +6
ISIS 388241 +3 +11 +15 +7
ISIS 437507 +21 +10 +13 -4
ISIS 443139 +10 +10 +16 +12
ISIS 419640 +21 +11 -10 +9
ISIS 419641 +24 +3 -5 -12
ISIS 419642 +45 +39 +12 +1
ISIS 444591 +18 +38 +27 +17
ISIS 436665 +34 +43 +23 +9
ISIS 436671 +19 +17 +11 0
ISIS 444661 +19 -10 -21 n.d.
ISIS 436689 +49 +40 +2 -17
마우스의 생존율
전체 연구 기간에 걸쳐서 마우스의 생존율을 평가하였다. 하기 표 59는 대조군 뿐만 아니라 ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리된 마우스 그룹에서의 생존 양상을 나타낸다.
Number of survivals during antisense oligonucleotide treatment
week 1 week 2 week 3 week 4
PBS 5 5 5 5
ISIS 388241 4 3 3 3
ISIS 437507 5 5 4 4
ISIS 443139 5 5 5 5
ISIS 419640 5 5 4 1
ISIS 419641 5 5 4 2
ISIS 419642 5 5 4 2
ISIS 444591 5 5 5 5
ISIS 436665 5 5 5 5
ISIS 436671 4 4 3 3
ISIS 444661 5 5 1 0
ISIS 436689 4 4 4 3
C57/BL6 마우스에서 헌팅틴에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뇌실내 투여
마우스에서 마우스 헌팅틴에 대한 올리고뉴클레오티드의 효능을 평가하기 위해 야생형 C57/BL6 마우스의 한정된 마우스 뇌 영역인, 우측 가쪽뇌실에 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
처리 및 수술
각각 10마리 C57/BL6 마우스의 그룹을 7일 또는 14일간 0.5 μL/일의 속도로 알제트 2002 펌프를 이용해 ICV로 전달된 50 μg/일로 ISIS 408737 (5' TCCTAGTGTTACATTACCGC 3'(서열번호: 52), 서열번호: 3의 개시 부위 5263)을 투여하였다. 6마리 C57/BL6 마우스의 대조군에 PBS를 유사하게 처리하였다. 하기 방식으로 펌프를 마우스에 외과적으로 이식하였다: 간략히, 알제트 삼투압 펌프 (Model 2002)를 제조사의 지침에 따라 조립하였다. 펌프를 안티센스 올리고뉴클레오티드 함유 용액으로 채우고 이식 24시간 전에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 동물을 3% 이소플루란으로 마취시키고 입체틀 내에 위치시켰다. 수술 부위를 멸균한 후, 두개골 위에 중간 절개를 만들고 등 위에 피하 주머니를 형성하였고, 그 안에 미리-충전된 삼투압 펌프를 이식하였다. 작은 천두공을 두개골을 통하여 우측 가쪽뇌실 위에 만들었다. 이어서 플라스틱 카데터를 통해 삼투압 펌프에 연결된, 캐뉼러를 심실 내에 위치시키고 록타이트 접착제를 사용하여 제 위치에 접착시켰다. 절개를 봉합사를 이용해 봉합하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 7일 또는 14일간 주입하고, 그 후 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 허가된 고전적인 프로토콜에 따라 안락사시켰다. 뇌 및 척수 조직을 적출하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 냉동 전에, 뇌 조직을 마우스 뇌 기질을 사용해 5개의 절편으로 횡단으로 절단하였다. S1은 가장 입쪽이고 S5는 가장 꼬리쪽으로 하여 절편 1 내지 5는 대략 서로에서 2 mm 떨어져 있다.
RNA 및 단백질 분석
RNeasy 미니 프렙 키트 (Qiagen)를 이용한 헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNeasy 보호 미니 키트 (Qiagen, Mississauga, ON, Canada)를 사용해 마우스의 뇌 및 척수로부터 총 RNA를 추출하였다. Q-PCR 반응을 ABI 프리즘 7700 서열 검출기 (Applied Biosystems) 상에서 수행하고 분석하였다. 마우스 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 ABI # Mm01213820_m1 (Applied Biosystems)을 사용해 측정하고 펩티딜프로필 아이소머라제 A mRNA 수준에 표준화하였다. 단백질 용해물을 이전에 보고된 바와 같이 마우스 뇌 평판으로부터 준비하였다 (Li S.H. and Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217: 1940-6029). 용해물을 3-8% 트리스-아세테이트 겔 상에 로우딩하고 iBlot 건조 블롯팅 시스템 (Invitrogen)을 이용해 전달하였다. 블롯을 항-베타 튜불린 (Chemicon) 및 생쥐 헌팅틴 단백질과 특이적으로 반응하는 단일클론 MAB2166 항체 (Millipore)로 탐침하였다. 면역블롯을 오디세이 V3.0 소프트웨어를 이용해 정량하였다.
결과를 PBS 대조군과 비교하여 감소율로서 표 60에 나타내었고 이는 7일 및 17일째 모두에서 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 헌팅틴 mRNA 및 단백질 수준의 현저한 억제를 입증한다.
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA in C57/BL6 mice
day 7 day 14
mRNA 66 68
protein 21 49
사이노몰로거스 원숭이에서 헌팅틴 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뇌실내 투여
뇌 조직에서 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 활성을 조사하기 위해 사이노몰로거스 원숭이의 한정된 뇌 영역인, 가쪽뇌실에 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드츨 처리하였다.
처리 및 수술
각 3마리 사이노몰로거스 원숭이의 2개 그룹에 4주간 0.05 ml/시간의 속도로 개별적인 이동 펌프 (Pegasus Vario)를 이용해 ICV로 전달되는 0.635 mg/ml (1.5 mg/일) 또는 1.67 mg/ml (4 mg/일)의 ISIS 436689를 투여하였다. 2마리 사이노몰로거스 원숭이의 대조군에 유사한 방식으로 PBS를 투여하였다. ISIS 436689를 양쪽으로 그룹에 투여하였다. 동물 1마리에 4 mg/일 용량의 ISIS 436689를 우측 심실에 한쪽으로 투여하였다.
주입 전에 동물들을 10일간 수술로부터 회복되게 하였다. 수술 후 회복 기간 동안, 동물들을 심실당 하나의 이동식 주입 펌프를 사용하여 0.05 mL/시간의 유속으로 PBS ICV 주입 상태를 유지하였다. 회복 기간의 말미에, 각각의 캐뉼러를 프라이메이트 자켓 (primate jacket)(Lomir, PJ-02NB) 내에 위치한 개별적인 이동식 펌프 (Pegasus Vario)에 연결하였다. 펌프는 주입 기간이 종결될 때까지 연결된 채로 유지하였다. 4주간의 투여 후, 동물들을 안락사시키고 뇌, 간 및 신장을 적출하였다.
htt mRNA의 RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 간 및 신장뿐만 아니라 전방 꼬리엽, 후방 꼬리엽, 측두 피질, 두정 피질, 시상하부, 중뇌, 해마, 및 척수로부터 추출하였다 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 사용하여 측정하고 원숭이 사이클로필린 A 수준에 대해 표준화하였다. 결과를 PBS 대조군과 비교하여 헌팅틴 mRNA 발현의 억제율로서 계산하고 이를 표 61에 나타내었다. ISIS 436689는 CNS에서 인간 헌팅틴 mRNA 수준의 상당한 억제를 나타내었다.
Percent reduction of huntingtin mRNA levels in cynomologous monkeys via ICV administration of antisense oligonucleotides
Tissue Dose (mg/day)
1.5 (bilateral) 4 (bilateral) 4 (right unilateral) 4 (left unilateral)
Anterior caudate 59 49 85 12
Posterior caudate 52 81 63 0
Temporal cortex 10 34 41 31
Parietal cortex 22 38 46 24
Hypothalamus 59 71 35 100
Mid-brain 32 38 2 0
Hippocampus 18 18 28 10
Cervical cord 58 65 n.d. n.d.
Thoracic cord 50 67 n.d. n.d.
Lumbar cord 49 62 n.d. n.d.
Liver 0 13 n.d. n.d.
Kidney 0 13 n.d. n.d.
(n.d.= no data)
단일 볼루스 투여를 통한 C57/BL6 마우스의 선조체에서 ISIS 387898의 반감기 측정
선조체 조직 내에서 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기 및 작용 지속기간을 측정하기 위해 C57/BL6 마우스의 선조체에 ISIS 387898을 단일 볼루스로서 투여하였다.
처리
40마리 C57/BL6 마우스를 실시예 5에 기술된 것과 유사한 과정으로 50 μg의 단일 볼루스로 전달된 ISIS 387898 (5' CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3'(서열번호: 53); 서열번호: 1의 개시 위치 4042 및 서열번호: 3의 개시 위치 4001)로 처리하였다. 대조군 8마리 C57/BL6 마우스를 유사한 과정으로 PBS로 처리하였다. 각각 4마리 마우스의 그룹들을 다양한 시점에서 안락사시키고 실시예 5에 기술된 것과 유사한 과정으로 선조체 조직을 적출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 선조체 조직으로부터 추출하였다. 마우스 정상 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 이용해 측정하였다. 결과를 표 62에 나타내고 이는 7일째에 PBS 대조군에 대한 억제율로 표시되었다. ISIS 387898의 억제 효과가 적어도 91일간 연장된 것으로 관찰되었다.
Effect of ISIS 387898 as a single bolus administration on murine huntingtin mRNA expression at various time points in C57/BL6 striatum
Treatment Days after dosing % inhibition
ISIS 387898 1 66
7 74
14 68
21 77
28 75
50 63
73 55
91 48
PBS 50 5
뇌에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도 분석
뇌 조직을 다지고, 무게를 측정한 후 균질화하고 페놀/클로로포름 액-액 추출 방법을 사용해 추출하였다. 이어서 모세관 겔 전기영동 동전기적 주사 전에 페닐-결합 칼럼 상에서 상층액의 고상 추출을 수행하였다. P/ACE MDQ 모세관 전기영동 기기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 겔-충진 모세관 전기영동 분석에 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 피크를 260 nm의 UV 흡광도에서 검출하였다.
뇌에서 ISIS 387898의 농도 (μg/g)를 PBS 대조군의 비율로서 인간 헌팅틴의 발현에 대해 플롯팅하였다 (표 63 및 도 1). 헌팅틴 mRNA 발현의 50% 억제를 달성하는 ISIS 387898의 농도 (EC50)를 계산하였다. EC50을 0.45 μg/g인 것으로 결정하였다. 뇌 조직에서 ISIS 387898의 시간-의존적 농도 및 대응하는 헌팅틴 mRNA 발현율을 또한 플롯팅하고 (표 64 및 도 2) 올리고뉴클레오티드의 반감기를 21일로 계산하였다.
Concentration of ISIS 387898 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
concentration (㎍/g) % mRNA expression
0 105.0
25 28.8
50 28.2
75 27.9
100 27.8
125 27.8
Time-dependent concentration of ISIS 387898 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
Time (day) Conc (㎍/g) mRNA % expression
1 116 35
7 65.7 27
14 30 32
23 34.9 24
30 12.2 26
51 2.1 38
73 1.4 47
92 1.1 53
ICV 투여를 통한 BACHD 마우스의 가쪽뇌실에서 ISIS 387898의 반감기 측정
뇌의 가쪽뇌실 조직 내에서 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기 및 작용 지속기간을 측정하기 위해 BACHD 마우스의 가쪽뇌실에 ISIS 387898을 ICV로 투여하였다.
처리
28마리 BACHD 마우스를 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 2주간 75 μg/일의 농도로 ICV 투여에 의해 전달되는 ISIS 387898로 처리하였다. 대조군 28마리 BACHD 마우스를 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 PBS로 처리하였다. 처리군 및 대조군 모두로부터 각각 4마리 마우스의 그룹을 격주 시점에서 안락사시키고 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 전방 피질 조직을 추출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 우측 반구, 관삽입 부위의 전방 및 후방 모두로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 이용해 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 이용해 측정하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 발현 수준을 표 65에 나타내고 이는 PBS 대조군에서 측정된 평균에 대한 억제율로서 표시되었다. 생쥐 정상 헌팅틴 mRNA 발현 수준을 표 66에 나타내고 이는 PBS 대조군에서 측정된 평균에 대한 억제율로서 표시되었다. ISIS 387898의 억제 효과가 적어도 91일간 연장된 것으로 관찰되었다.
Effect of ISIS 387898 administered ICV on human huntingtin mRNA expression at various time points
Treatment Days after dosage anterior posterior
ISIS 387898 14 74 65
28 67 61
42 70 61
56 57 52
70 57 43
91 41 61
127 28 16
PBS 14 0 0
28 0 0
42 1 0
56 9 10
70 13 10
91 13 25
127 11 0
Effect of ISIS 387898 administered ICV on murine huntingtin mRNA expression at various time points
Treatment Days after dosage anterior posterior
ISIS 387898 14 85 81
28 81 69
42 86 79
56 74 69
70 73 58
91 39 63
127 39 0
PBS 14 0 0
28 0 0
42 0 0
56 17 14
70 5 24
91 9 17
127 32 0
뇌에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도 분석
뇌 조직을 실시예 9에 기재된 것과 유사한 과정으로 처리하였다. 뇌의 전방 피질 내 ISIS 387898의 농도 (μg/g)를 PBS 대조군의 비율로서 인간 헌팅틴의 억제에 대해 플롯팅하고 (표 67 및 도 3), EC50을 26.4 μg/g인 것으로 계산하였다. 뇌 조직에서 ISIS 387898의 시간-의존적 농도를 또한 플롯팅하고 (표 68 및 도 4) 올리고뉴클레오티드의 반감기를 21일로 계산하였다.
Concentration of ISIS 387898 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
Concentration (㎍/g) % mRNA expression
0 105
10 90.7
100 19.3
200 14.3
300 13.2
400 12.7
500 12.5
600 12.4
Time-dependent concentration of ISIS 387898 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
Days after last dose Conc (mg/g) % mRNA expression
14 554.3 12
28 219.8 15
42 154 13
56 146.9 32
70 48.3 28
91 46.1 66
127 11.8 90
ICV 투여를 통한 BACHD 마우스의 가쪽뇌실에서 ISIS 388241 및 ISIS 443139의 반감기 측정
뇌의 가쪽뇌실 조직에서 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기 및 작용 지속기간을 측정하기 위하여 BACHD 마우스의 가쪽뇌실에 ICV에 의해 ISIS 388241 또는 ISIS 443139를 투여하였다.
처리
20마리 BACHD 마우스를 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 2주간 50 μg/일의 농도로 ICV 투여에 의해 전달되는 ISIS 38241로 처리하였다. 대조군 20마리 BACHD 마우스를 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 2주간 50 μg/일의 농도로 ICV 투여에 의해 전달되는 ISIS 443139로 처리하였다. 20마리의 대조군 BACHD 마우스를 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 PBS로 처리하였다. 처리군 및 대조군 모두로부터 각각 4마리 마우스의 그룹을 격주 시점에서 안락사시키고 실시예 9에 기술된 것과 유사한 과정으로 조직을 추출하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 우측 반구, 관삽입 부위의 전방 및 후방 모두로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS2617을 이용해 측정하였다. 결과를 표 69에 나타내고 이는 PBS 대조군에서 측정된 평균에 대한 억제율로서 표시되었다. ISIS 388241 및 ISIS 443139 모두의 억제 효과가 적어도 16주간 연장된 것으로 관찰되었다.
ISIS 388241 및 이의 혼합 골격 등가물인 ISIS 443139는 모두 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 5)에 대해 3개 이상의 불일치를 갖고 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
Effect of ISIS 388241 and ISIS 443139 administered ICV on human huntingtin mRNA expression at various time points
Treatment Weeks after dosage anterior posterior
ISIS 388241 0 63 64
4 79 56
8 67 51
12 76 68
16 35 34
ISIS 443139 0 35 55
4 20 62
8 61 59
12 67 53
16 46 37
PBS 0 15 10
4 0 2
8 5 0
12 32 4
16 6 2
뇌에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도 분석
뇌 조직을 실시예 9에 기술된 것과 유사한 방식으로 처리하였다. 후방 뇌 조직에서 ISIS 388241의 시간-의존적 농도를 플롯팅하고 (표 70 및 도 5) 올리고뉴클레오티드의 반감기가 20일인 것으로 계산하였다. 후방 뇌 조직에서 ISIS 443139의 시간-의존적 농도를 플롯팅하고 (표 71 및 도 6) 올리고뉴클레오티드의 반감기가 20일인 것으로 계산하였다.
Concentration of ISIS 384241 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
Days after last dose Conc (ug/g) % mRNA expression
0 170.3 36
28 65.2 43
56 13 49
84 8.2 32
112 6.9 66
Concentration of ISIS 443139 in brain tissue and its effect on htt mRNA expression as a percentage of the control
Days after last dose Conc (ug/g) % mRNA expression
0 71.3 45
28 47.4 38
56 11.3 41
84 11.1 46
112 5.6 63
BACHD 마우스의 운동 수행효능에 대한 돌연변이 인간 헌팅틴의 안티센스 억제 효과
로타로드 분석을 통해 마우스의 운동 수행효능에 대한 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 측정하기 위해 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 BACHD 마우스에 처리하였다.
처리
가속 로타로드 분석을 유고 바실레 (Ugo Basile) 로타로드 상에서 수행하였다. 동물을 2 RPM 속도의 로타로드 위에 놓고, 로타로드를 5분에 걸쳐 40 RPM으로 가속하였다. 떨어지는데 걸리는 시간을 기록하였다. 떨어지는데 걸리는 시간은 동물이 로타로드로부터 떨어지거나, 또는 이들의 작동을 멈추고, 로타로드에 매달리게 하고 이를 회전시킴으로써 정의된다. 처리 전에 1주일간 6개월령의 BACHD 마우스 및 이들의 비-형질전환 한배 새끼들을 로타로드 상에서 달리도록 훈련시켰다. 시험 사이에 20분간의 휴식 기간을 갖는, 각 5분간의 3회 연속 시험으로 이루어졌다. 이어서 15마리 BACHD 마우스의 그룹을 2주간 12 μL/일의 속도로 알제트 2002 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 50 μg/일의 농도로 ISIS 388241을 처리하였다. 실시예 6에 기술된 것과 유사한 과정으로 마우스에 펌프를 외과적으로 이식하였다. 14마리 BACHD 마우스의 대조군을 유사한 방식으로 PBS로 처리하였다. 9마리 비-형질전환 한배 새끼들의 대조군을 유사한 방식으로 PBS로 처리하였다.
로타로드 수행효능 분석
처리기간의 말미에, 펌프를 제거하고 2주 후, 제1 후-처리 로타로드 분석을 수행하였다. 마우스가 11개월이 될 때까지 로타로드 행동을 매월 분석하였다. 매월, 동물을 2일간 하루에 3회 시험 달리기를 위해 로타로드 상에 위치시켰다. 떨어지는데 걸리는 시간을 초로 표시한 결과를 도 7 및 표 72에 나타내었다. 처리 전에 6개월령에서 기저선 값을 취하였고 취해진 시점은 분석이 수행된 마우스의 월령이다. 데이터는 ISIS 388241로의 BACHD 마우스 처리가 비처리 BACHD 마우스에서 관찰된 것에 비해 떨어지기까지 기간을 증가시켰음을 나타낸다.
Effect of antisense inhibition of mutant huntingtin mRNA on duration to fall (sec)
6 months 7 month 8 months 9 months 10 months 11 months
ISIS 388241 97 108 154 148 144 159
PBS control 94 117 115 104 99 92
Non-transgenic control 197 198 215 207 198 199
BACHD 마우스의 운동 수행효능에 대한 돌연변이 인간 헌팅틴 및 야생형 생쥐 헌팅틴 mRNA의 안티센스 억제 효과
로타로드 분석을 통해 마우스의 운동 수행효능에 대한 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 측정하기 위해 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 BACHD 마우스에 처리하였다.
처리
가속 로타로드 분석을 유고 바실레 로타로드 상에서 수행하였다. 동물을 2 RPM 속도의 로타로드 위에 놓고, 로타로드를 5분에 걸쳐 40 RPM으로 가속하였다. 떨어지는데 걸리는 시간을 기록하였다. 떨어지는데 걸리는 시간은 동물이 로타로드로부터 떨어지거나, 또는 이들의 작동을 멈추고, 로타로드에 매달리게 하고 이를 회전시킴으로써 정의된다. 처리 전에 1주일간 2개월령의 BACHD 마우스 및 이들의 비-형질전환 한배 새끼들을 로타로드 상에서 달리도록 훈련시켰다. 시험 사이에 20분간의 휴식 기간을 갖는, 각 5분간의 3회 연속 시험으로 이루어졌다. 이어서 17-21마리 BACHD 마우스의 그룹을 2주간 0.5 μL/시간의 속도로 알제트 2002 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 5 μg/일의 농도로 ISIS 388241, 75 μg/일의 농도로 ISIS 408737, 또는 75 μg/일의 농도로 ISIS 387898를 처리하였다. 실시예 6에 기술된 것과 유사한 과정으로 마우스에 펌프를 외과적으로 이식하였다. 20마리 BACHD 마우스의 대조군을 유사한 방식으로 PBS로 처리하였다. 비-형질전환 대조군 마우스를 또한 유사한 방식으로 ISIS 올리고뉴클레오티드 또는 PBS로 처리하였다.
로타로드 수행효능 분석
처리기간의 말미에, 펌프를 제거하고 2주 후, 제1 후-처리 로타로드 분석을 수행하였다. 마우스가 10개월이 될 때까지 로타로드 행동을 매월 분석하였다. 매월, 동물을 연속 3일간 하루에 3-5회 시험 달리기를 위해 로타로드 상에 위치시켰다. 떨어지는데 걸리는 시간을 초로 표시한 결과를 표 73에 나타내었다. 처리 전에 2개월령에서 기저선 값을 취하였고 취해진 시점은 분석이 수행된 마우스의 월령이다. ISIS 387898 (표에서 인간-마우스 ASO로 지정됨)은 마우스 및 인간 헌팅틴 mRNA에 모두 교차-반응성이고 따라서 마우스에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 및 야생형 생쥐 헌팅틴 mRNA 모두를 억제할 것이다. ISIS 388241 (표에서 인간 ASO로 지정됨)은 특이적으로 인간 헌팅틴 mRNA를 표적하고 생쥐 헌팅틴 mRNA와 8개 염기쌍이 불일치한다. 따라서, ISIS 388241은 마우스에서 야생형 생쥐 헌팅틴 mRNA가 아닌 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA만을 특이적으로 억제할 것이다. ISIS 408737 (표에서 마우스 ASO로 지정됨)은 특이적으로 생쥐 헌팅틴 mRNA를 표적하고 인간 헌팅틴 mRNA에 7개 염기쌍이 불일치한다. 따라서, ISIS 408737은 마우스에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA가 아닌 야생형 생쥐 헌팅틴 mRNA만을 특이적으로 억제할 것이다. 'Tg'는 BACHD 마우스를 나타내고 '비-Tg'는 비-형질전환 대조군 마우스를 나타낸다.
연구 결과는 ISIS 388241 (Tg-인간 ASO)에 의한 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA의 억제가 대조군 (Tg-PBS)에 비해 로타로드 분석에서 마우스의 수행효능을 현저히 개선하였음을 나타낸다. 결과는 또한 마우스에서 돌연변이 및 야생형 헌팅틴 mRNA 모두를 표적하는, ISIS 387898 (Tg-인간-마우스 ASO)의 마우스 처리가 마우스의 운동 수행효능에 어떠한 유해한 효과도 야기하지 않으며, 실제로, 대조군 (Tg-PBS)에 비해 로타로드 수행효능을 현저히 개선하였음을 나타낸다. ISIS 408737로 처리된 마우스 (Tg-마우스 ASO)는, 예상대로, 올리고뉴클레오티드가 돌연변이 헌팅틴 mRNA를 표적하지 않기 때문에, PBS 대조군에 비해 개선된 수행효능을 나타내지 않았다. 이 분석에서 비-형질전환 대조군을 양성 대조군으로 사용하였다.
Effect of antisense inhibition of huntingtin mRNA on duration to fall (sec)
2 months 3 months 4 months 5 months 6 months 7 months 8 months 9 months 10 months
Tg-Human ASO 146 167 190 192 190 188 181 191 191
Tg-mouse ASO 151 142 152 143 139 144 139 123 130
Tg-Human-mouse ASO 149 187 203 199 196 194 189 194 171
Tg-PBS 152 164 169 160 159 155 148 135 136
Non-Tg-Human ASO 212 223 234 236 247 248 245 247 235
Non-Tg-Mouse ASO 201 212 215 213 231 243 244 250 247
Non-Tg-Human-mouse ASO 220 240 239 224 243 244 246 229 235
Non-Tg-PBS 193 220 228 227 228 216 220 208 208
R6/2 마우스의 뇌 질량에 대한 헌팅틴 mRNA의 안티센스 억제 효과
헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 뇌 중량 및 부피에 대한 효과를 평가하기 위해 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 R6/2 마우스에 처리하였다.
처리
R6/2 마우스를 케이지당 최대 5마리까지 한 그룹 내에 수용하였다 (혼합 유전형, 단일 성별). 동물에게 건조한 깔개 (bedding)의 제공이 요구되는 만큼 빈번히 교환되는, 바닥을 덮는 멸균 나무 깔개를 갖춘 구두-상자 케이지 내에 모든 마우스를 수용하였다. 이러한 기본적 환경은 모든 마우스에 대해 놀이 터널, 잘게 조각난 둥지, 및 플라스틱 뼈를 부가하여 강화하였다; 즉, 마우스 터널 (호박색의, 공인된, 투명, BioServ Product# K3323), 펫타이트 그린 고무뼈 (BioServ Product # K3214) 및 둥지 (Hockley et al., Ann Neurol. 2002, 51: 235-242)를 포함하는 환경적으로-강화된 케이지. 식품 및 식수는 이들의 홈 케이지 내에서 마우스에 임의로 이용가능하였다.
6개월령의 R6/2 마우스의 그룹에 4주간 0.12 μl/시간의 속도로 알제트 1004 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 50 μg/일의 ISIS 388817을 투여하였다. 2마리 비-형질전환 한배 새끼들의 그룹에 유사한 방식으로 전달되는 50 μg/일의 ISIS 388817을 투여하였다. 5마리 R6/2 마우스의 대조군에 유사한 방식으로 전달되는 50 μg/일의 ISIS 141923을 투여하였다. 9마리 R6/2 마우스의 대조군에 유사한 방식으로 전달되는 PBS를 투여하였다. 8마리 비-형질전환 한배 새끼들의 그룹에 유사한 방식으로 PBS를 투여하였다. 4마리의 비처리 8주령의 증상-전 R6/2의 그룹을 또한 본 연구에 포함하였다.
뇌 질량 측정
동물을 이소플루란으로 마취시킨 후 빙냉 소렌슨 인산염 완충액 (SPB)을 이용한 심장관통 (transcardial) 관류에 적용하고, SPB 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 뇌를 제거하고, 전뇌의 바로 입쪽 (후각망울 제거) 및 소뇌의 바로 꼬리쪽 (척수 제거)을 관상 절단을 이용해 다듬었다. 나머지 뇌의 무게를 mg으로 측정하였다. 결과를 도 8 및 표 74에 나타내었고 이는 PBS 대조군에 비해 ISIS 388817로 처리된 R6/2 마우스에서 뇌 질량이 증가하였음을 입증한다.
Effect of antisense inhibition of mutant huntingtin mRNA on brain weight (mg)
Mouse model Treatment Brain weight
R6/2 PBS 367
ISIS 141923 375
ISIS 388817 394
R6/2 (8 weeks old) None 402
Non-transgenic ISIS 141923 452
ISIS 388817 436
YAC128 마우스의 수행 불안에 대한 헌팅틴 mRNA의 안티센스 억제 효과
오픈 필드 및 고가식 십자 미로 분석에서 마우스의 수행효능에 의해 측정되는 바와 같이 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드가 불안증에 미치는 효과를 평가하기 위하여 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 YAC128 마우스를 ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
처리
7마리의 5개월령 YAC128 마우스의 그룹에 14일간 0.5 μl/시간의 속도로 알제트 1004 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 50 μg/일의 ISIS 388241을 투여하였다. 4마리 YAC128 마우스의 대조군을 PBS로 유사하게 처리하였다. 8마리 비-형질전환 FVB/NJ 한배 새끼들의 대조군을 본 연구에 포함시키고 어떠한 처리도 하지 않았다. 하기 방식으로 마우스에 펌프를 외과적으로 이식하였다: 간략히, 알제트 삼투압 펌프 (Model 2002)를 제조사의 지침에 따라 조립하였다. 펌프를 안티센스 올리고뉴클레오티드 함유 용액으로 채우고 이식 24시간 전에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 동물을 3% 이소플루란으로 마취시키고 입체틀 내에 위치시켰다. 수술 부위를 멸균한 후, 두개골 위에 중간 절개를 만들고 등 위에 피하 주머니를 형성하고, 그 안에 미리-충전된 삼투압 펌프를 이식하였다. 작은 천두공을 두개골을 통하여 우측 가쪽뇌실 위에 만들었다. 이어서 플라스틱 카데터를 통해 삼투압 펌프에 연결된, 캐뉼러를 심실 내에 위치시키고 록타이트 접착제를 사용하여 제 위치에 접착시켰다. 절개를 봉합사를 이용해 봉합하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PBS를 14일간 주입하고, 그 후 펌프를 제거하였다. 동물을 2주간 회복되게 한 후 행동 분석을 수행하고 마우스를 최종적으로 동물실험윤리위원회에 의해 허가된 고전적인 프로토콜에 따라 안락사시켰다. 뇌 및 척수 조직을 적출하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 냉동 전에, 뇌 조직을 마우스 뇌 기질을 사용해 5개의 절편 (S1, S2, S3, S4, 및 S5)으로 횡단으로 절단하였다. S1은 가장 입쪽이고 S5는 가장 꼬리쪽으로 하여 절편 1 내지 5는 대략 서로에서 2 mm 떨어져 있다.
오픈 필드 분석
마우스를 30분의 검사 시기에 걸쳐서 수평 및 수직 운동을 측정하기 위해 광선 단락을 사용하는 오픈 필드 아레나 (Med Associates)에 놓았다. 아레나 내에서 총 배회 운동과 불안의 척도로서 아레나의 중심 내에서의 운동을 조사하기 위해 활성 모니터 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다. YAC128 대조군 마우스는 이들의 비-형질전환, 불안-경향이 덜한 FVB/NJ 한배 새끼들에 비해 아레나의 중심에서 시간을 덜 보낼 것으로 예상되었다. 결과를 도 9 및 표 75에 나타내었고 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 YAC128 마우스 처리가 오픈 필드 분석의 매개변수에 따라 이들 마우스의 불안을 감소시켰음을 나타낸다.
Effect of antisense inhibition of mutant htt mRNA on open field performance of YAC128 mice
Mice model Time in center (sec)
FVB control 1326
YAC128 control 964
ISIS 388241 treated YAC128 1433
고가식 십자미로 분석
장치는 2개의 개방형 팔 및 2개의 폐쇄형 팔로 구성되고 이들 각각은 65×6.25 cm 크기로 지면으로부터 50 cm 이상 들어 올려져 있다. 마우스를 이 장치의 중심에 위치시키고 이들의 위치를 5분의 검사 시기에 걸쳐서 기록하였다. YAC128 대조군 마우스는 이들의 비-형질전환, 불안-경향이 덜한 FVB/NJ 한배 새끼들에 비해 장치의 개방형 암에서 덜 시간을 보낼 것으로 예상되었다. 결과를 도 10 및 표 76에 나타내었고, 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 YAC128 마우스 처리가 고가식 십자미로 분석의 매개변수에 따라서, 이들 마우스의 불안을 감소시켰음을 나타낸다.
Effect of antisense inhibition of mutant htt mRNA on elevated plus maze performance of YAC128 mice
Mice model % time in open arms
FVB control 32
YAC128 control 18
ISIS 388241 treated YAC128 27
RNA 및 단백질 분석
RNeasy 미니 프렙 키트 (Qiagen)를 이용한 헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNeasy 보호 미니 키트 (Qiagen, Mississauga, ON, Canada)를 사용해 마우스의 뇌 및 척수로부터 총 RNA를 추출하였다. Q-PCR 반응을 ABI 프리즘 7700 서열 검출기 (Applied Biosystems) 상에서 수행하고 분석하였다. 인간 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2686을 사용해 측정하고 펩티딜프로필 아이소머라제 A mRNA 수준에 표준화하였다.
단백질 용해물을 이전에 보고된 바와 같이 마우스 뇌 평판 (slab)으로부터 준비하였다 (Li S.H. and Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217: 1940-6029). 용해물을 3-8% 트리스-아세테이트 겔 상에 로우딩하고 iBlot 건조 블롯팅 시스템 (Invitrogen)을 이용해 전달하였다. 블롯을 항-베타 튜불린 (Chemicon) 및 인간 헌팅틴 단백질과 특이적으로 반응하는 마우스 단일클론 EM48 항체 (Millipore)로 탐침하였다. 면역블롯을 오디세이 V3.0 소프트웨어를 이용해 정량하였다.
결과를 PBS 대조군과 비교하여 감소율로서 표 77에 나타내었고 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 헌팅틴 mRNA 및 단백질 수준의 현저한 억제를 입증한다.
Percent inhibition of huntingtin mRNA in YAC128 mice
%inhibition
mRNA 85
protein 86
C57/BL6 마우스에서 헌팅틴에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뇌실내 투여
마우스에서 올리고뉴클레오티드의 순응성을 평가하기 위하여 C57/BL6 마우스의 우측 가쪽뇌실에 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
처리 및 수술
각각 5마리 C57/BL6 마우스의 그룹에 2주간 0.5 μL/일의 속도로 알제트 2002 펌프를 이용해 ICV로 전달되는 150 μg/일 농도로 ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444659, ISIS 444660, 또는 ISIS 444661를 투여하였다. 6마리 C57/BL6 마우스의 대조군에 PBS를 유사하게 처리하였다. 펌프를 이식하고 올리고뉴클레오티드를 투여하는 과정은 실시예 6에 기재된 바와 같다.
동물을 2주간 회복되게 한 후 행동 분석을 수행하고 이소플루란을 사용해 안락사시켰다. 뇌 및 척수 조직을 적출하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 냉동 전에, 뇌 조직을 마우스 뇌 기질을 사용해 5개의 절편 (S1, S2, S3, S4, 및 S5)으로 횡단으로 절단하였다. S1은 가장 입쪽이고 S5는 가장 꼬리쪽으로 하여 절편 1 내지 5는 대략 서로에서 2 mm 떨어져 있다.
RNA 분석
RNeasy 미니 프렙 키트 (Qiagen)를 이용한 헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNeasy 보호 미니 키트 (Qiagen, Mississauga, ON, Canada)를 사용해 뇌의 전방 및 후방 피질로부터 총 RNA를 추출하였다. RT-PCR 반응을 ABI 프리즘 7700 서열 검출기 (Applied Biosystems) 상에서 수행하고 분석하였다. 마우스 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용해 측정하고 사이클로필린 mRNA 수준에 표준화하였다. 결과를 PBS 대조군과 비교하여 감소율로서 표 78에 나타내었다. ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444627, 및 ISIS 444652는 모두 생쥐 헌팅틴 mRNA (서열번호: 3)에 1개의 불일치를 갖고 따라서 대조군에 비해 생쥐 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않았다.
미세아교세포 마커, AIF1을 또한 생쥐 프라이머 프로브 세트 mAIF1_LTS00328 (정방향 서열 TGGTCCCCCAGCCAAGA, 본 명세서에서 서열번호: 54로 지정됨; 역방향 서열 CCCACCGTGTGACATCCA, 본 명세서에서 서열번호: 55로 지정됨; 프로브 서열 AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTGG, 본 명세서에서 서열번호: 56으로 지정됨)을 사용하여 RT-PCR 분석에 의해 측정하였다. 결과를 표 79에 나타내었고 이는 검사된 ISIS 올리고뉴클레오티드가 염증 반응을 유도하지 않았음을 나타낸다.
Percent inhibition of murine huntingtin mRNA compared to the control in C57/BL6 mice
ISIS No anterior posterior
387916 72 74
437527 59 62
444578 69 69
444584 0 9
444607 59 79
444608 41 66
444627 41 45
444652 61 64
444660 35 33
444661 72 69
Percent increase in AIF1 mRNA expression compared to the control in C57/BL6 mice
ISIS No anterior posterior
387916 159 67
437527 102 77
444578 22 7
444584 33 37
444607 34 58
444608 29 1
444627 46 22
444652 59 50
444660 -3 11
444661 67 62
체중 측정
연구 기간 전체에서 일정한 간격으로 체중을 측정하고, 이를 표 80에 나타내었다. 체중을 순응성의 표지로서 사용하였다. ISIS 437527, ISIS 444584, 및 ISIS 444652로 처리된 마우스는 연구 기간 전체에서 일정한 체중을 나타내었고 연구에 포함된 모든 ISIS 올리고뉴클레오티드 중에서 가장 순응성인 것으로 간주되었다. 'n/a'는 마우스의 그룹에 대해 아무런 데이터가 없음을 나타낸다.
Body weights of C57/BL6 mice after antisense oligonucleotide treatment
Day 0 Day 4 Day 8 Day 12 Day 16 Day 19 Day 23 Day 26 Day 28
PBS 105 108 111 114 111 111 113 114 112
ISIS 387916 107 108 106 111 106 104 101 101 97
ISIS 437527 105 116 116 120 111 112 112 108 108
ISIS 444578 105 116 112 115 103 98 83 81 87
ISIS 444584 105 117 115 111 105 105 103 104 102
ISIS 444607 105 115 112 110 101 98 106 109 106
ISIS 444608 102 111 112 112 97 91 78 75 87
ISIS 444627 105 116 124 126 105 104 93 94 91
ISIS 444652 106 122 124 126 119 113 111 111 108
ISIS 444659 105 118 123 116 92 89 68 n/a n/a
ISIS 444660 104 115 120 118 103 93 89 84 90
ISIS 444661 107 125 120 106 76 86 89 86 91
래트의 선조체 조직에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 볼루스 투여의 신경독성 효과 분석
CNS 독성의 척도로서 미세아교세포 마커 AIF1의 유도를 조사하기 위해, 스프라그-다우리 래트의 선조체에 볼루스 투여를 통해 ISIS 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
처리 및 수술
4마리 스프라그-다우리 래트의 그룹에 25 μg, 50 μg, 75 μg, 또는 100 μg의 농도로 단일 볼루스로서 전달되는 ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444591, 또는 ISIS 444652를 투여하였다.
4마리 래트의 그룹을 10 μg, 25 μg, 50 μg, 또는 75 μg 농도로 단일 볼루스로서 전달되는, ISIS 387916으로 유사하게 처리하였다. 4마리 래트의 대조군을 PBS로 유사하게 처리하였다. 볼루스 투여하고 7일 후, 래트를 이소플루란을 이용해 안락사시키고 장기를 제거하였다. 동물의 목을 베고 선조체 조직의 해부를 위해 뇌를 제거하였다. 한 쌍의 가는 만곡의 집게를 해마의 바로 앞쪽 뇌 속에 아래로 곧장 위치시켜 비절개 박리에 의해 피질 및 하부 조직 내에 횡단 절개를 형성하였다. 다른 한 쌍의 가는 만곡의 집게의 끝을 해마와 후각망울 사이의 정중시상 부비강 중간을 따라 아래로 곧장 위치시켜 비절개 박리에 의해 뇌량을 절단하는 종단 절개를 형성하였다. 이어서 첫 번째 쌍의 집게를 사용하여 선조체 및 내포를 노출하는 피질의 한쪽 구석을 들어올리고, 이어서 선조체로부터 내포를 절개하였다. 두 번째 세트의 집게는 만곡 말단이 선조체의 한쪽 부분에 닿고 조직을 분리하도록 내리누르게 위치시켰다. 첫 번째 세트의 집게는 선조체의 후방 말단을 끄집어내고 뇌로부터 선조체를 제거하는데 사용하였다.
AIF1 발현 수준의 RNA 분석
AIF1 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 선조체 조직으로부터 추출하였다. 래트 AIF1 수준을 래트 프라이머 프로브 세트 rAif1_LTS00219를 사용하여 측정하였다. 결과를 대조군에 대한 AIF1 발현율로 계산하여 이를 표 81에 나타내었다. 결과는 ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, 및 ISIS 444652가 래트 뇌에서 충분히 순응성이었음을 나타낸다.
Percent expression of AIF1 mRNA levels in vivo as a measure of neurotoxicity
ISIS No Dose (㎍) % increase
387916 10 145
25 157
50 247
75 316
388241 25 29
50 12
75 30
100 41
436671 25 37
50 2
75 13
100 50
443139 25 0
50 7
75 167
100 26
444591 25 18
50 80
75 50
100 207
437527 25 98
50 45
75 23
100 126
444584 25 -1
50 10
75 35
100 31
444652 25 17
50 46
75 39
100 48
헌팅틴 발현 수준의 RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 정량적 실시간 PCR을 위해 RNA를 선조체 조직으로부터 분리하였다. 래트 프라이머 프로브 세트 rHtt_LTS00343을 사용하여 래트 헌팅틴 mRNA 수준을 측정하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴 발현의 감소율로서 계산하여 표 82에 나타내었다. ISIS 388241 및 ISIS 443139는 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 대해 6개 이상의 염기쌍에서 불일치이고, 따라서 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다. ISIS 444584는 각각 래트 유전자 서열 (서열번호: 5)에 대해 3개의 불일치를 갖고, 대조군에 비해 래트 mRNA 수준의 현저한 억제를 나타내지 않는다.
Percent reduction of rat huntingtin mRNA levels in rats
ISIS No Dose (㎍) % inhibition
387916 10 6
25 39
50 55
75 60
388241 25 8
50 23
75 27
100 19
436671 25 52
50 57
75 57
100 70
443139 25 35
50 29
75 28
100 27
444591 25 26
50 57
75 68
100 69
437527 25 40
50 55
75 60
100 74
444584 25 43
50 38
75 38
100 41
444652 25 49
50 70
75 55
100 59
사이노몰거스 일차 간세포에서 헌팅틴 mRNA의 용량-의존적 안티센스 억제
ISIS 437527, ISIS 444584, 및 ISIS 444652를 다양한 용량으로 사이노몰거스 일차 간세포에서 검사하였다. 표준 올리고뉴클레오티드인 ISIS 387916 및 ISIS 388241을 또한 비교를 위해 포함하였다. 세포를 웰당 35,000 세포의 밀도로 도말하고 39.0625 nM, 78.125 nM, 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1,250 nM, 2,500 nM, 5,000 nM, 10,000 nM, 및 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드 각각을 전기천공을 이용해 형질감염시켰다. 대략 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리하고 헌팅틴 mRNA 전사체 수준을 프라이머 프로브 세트 RTS2686을 사용해 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 헌팅틴 mRNA 전사체 수준을 리보그린®에 의해 측정된 바와 같이, 총 RNA 함량에 대해 표준화하였다. 결과를 비처리 대조군 세포에 대한 헌팅틴의 억제율로서 표 83에 나타내었다. 대조군 올리고뉴클레오티드인 ISIS 141923가 본 분석에 포함되었고, 예상대로, 헌팅틴 mRNA의 억제를 증명하지 못하였다.
ISIS 437527, ISIS 444584, 및 ISIS 444652는 표준 올리고뉴클레오티드인 ISIS 388241보다 낮은 IC50 값을 나타내었다. ISIS 437527 및 ISIS 444652는 표준 올리고뉴클레오티드인 ISIS 387916보다 낮거나 더 낮은 IC50 값을 나타내었다.
Dose-dependent antisense inhibition of huntingtin mRNA in cynomolgous primary hepatocytes
ISIS 387916 ISIS 388241 ISIS 437527 ISIS 444584 ISIS 444652 ISIS 141923
39.0625 nM 0 6 0 0 0 0
78.125 nM 17 4 19 0 16 0
156.25 nM 6 0 27 11 12 3
312.5 nM 19 0 23 16 35 0
625.0 nM 31 0 37 30 50 0
1250.0 nM 45 0 28 23 52 0
2500.0 nM 62 4 33 47 74 0
5000.0 nM 78 54 55 42 86 0
10000.0 nM 82 80 68 77 91 0
20000.0 nM 84 75 70 69 92 0
IC50 (μM) 1.4 5.4 2.0 4.0 0.8 >20
단일 선조체내 볼루스 투여를 통한 BACHD 마우스에서 ISIS 올리고뉴클레오티드의 반감기 측정
선조체 조직 내에서 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 작용 지속기간, 또는 이의 반감기를 측정하기 위해 BACHD 마우스의 선조체에 단일 볼루스로서 ISIS 올리고뉴클레오티드를 투여하였다.
처리 및 수술
각각 25마리 BACD 마우스의 그룹을 실시예 4에 기재된 것과 유사한 방식으로 40 μg의 단일 볼루스로서 전달되는, ISIS 388241, ISIS 436689, ISIS 436671, 또는 ISIS 444591로 처리하였다. 25마리 BACHD 마우스의 대조군을 유사한 방식으로 PBS로 처리하였다. 다양한 시점에서, 각 그룹의 5마리 마우스를 안락사시키고 선조체 조직을 추출하였다. 한 쌍의 가는 만곡의 집게를 해마의 바로 앞쪽 뇌 속에 아래로 곧장 위치시켜 비절개 박리에 의해 피질 및 하부 조직 내에 횡단 절개를 형성하였다. 다른 한 쌍의 가는 만곡의 집게의 끝을 해마와 후각망울 사이의 정중시상 부비강 중간을 따라 아래로 곧장 위치시켜 비절개 박리에 의해 뇌량을 절단하는 종단 절개를 형성하였다. 이어서 첫 번째 쌍의 집게를 사용하여 선조체 및 내포를 노출하는 피질의 한쪽 구석을 들어올리고, 이어서 선조체로부터 내포를 절개하였다. 두 번째 세트의 집게는 만곡 말단이 선조체의 한쪽 부분에 닿고 조직을 분리하도록 내리누르게 위치시켰다. 첫 번째 세트의 집게는 선조체의 후방 말단을 끄집어내고 뇌로부터 선조체를 제거하는데 사용하였다.
RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 선조체 조직의 전방 및 후방 절편으로부터 RNA를 추출하였다. 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA 수준을 RTS2617을 사용하여 측정하였다. 마우스 정상 헌팅틴 mRNA 수준을 생쥐 프라이머 프로브 세트 RTS2633을 사용하여 측정하였다. 결과를 표 84 및 85에 나타내었고, 이는 1주, 10주 및 20주째에 PBS 대조군의 평균에 대한 억제율로서 표시되었다. 뇌의 전방 절편에서 ISIS 올리고뉴클레오티드의 반감기를 억제 데이터로부터 계산하였고 표 86에 나타내었다.
Percent inhibition of human huntingtin mRNA expression at various time points
ISIS No Time (weeks) Posterior Anterior
388241 1 72 91
5 65 86
10 52 73
15 26 56
20 14 53
436671 1 82 92
5 78 89
10 68 82
15 61 77
20 30 77
444591 1 60 85
5 58 76
10 48 60
15 27 43
20 27 36
436689 1 72 83
5 72 87
10 60 74
15 50 74
20 44 59
Percent inhibition of mouse huntingtin mRNA expression at various time points
ISIS No Time (weeks) Posterior Anterior
388241 1 1 12
5 22 36
10 17 14
15 7 18
20 9 38
436671 1 84 96
5 77 80
10 64 86
15 51 78
20 19 75
444591 1 74 95
5 70 90
10 57 67
15 34 47
20 33 38
436689 1 40 32
5 47 40
10 35 18
15 34 22
20 36 5
Half-life of ISIS oligonucleotides in the anterior section of the brain in BACHD mice after intrastriatal bolus injection
ISIS No Half-life (days)
436671 46.6
436689 39.4
444591 24.3
388241 25.8
체중 측정
일정한 간격으로 체중을 측정하고, 이를 연구 개시 시점에서 마우스의 체중의 비율로서 표 87에 나타내었다. 체중을 순응성의 표지로서 사용하였다. ISIS 올리고뉴클레오티드로 처리된 어떠한 마우스에서도 체중의 유해한 변화가 관찰되지 않았다.
Percent change in body weight of BACHD mice after antisense oligonucleotide treatment
Week 5 Week 10 Week 15 Week 20
PBS 8 19 26 28
ISIS 388241 9 22 29 26
ISIS 436671 5 19 35 38
ISIS 444591 7 21 30 43
ISIS 436689 3 18 31 38
스프라그 다우리 래트에서 ISIS 437527의 수막강내 투여 효과
스프라그 다우리 래트에 단일 용량, 반복 용량, 또는 연속 주입으로서 수막강내 (IT) 투여에 의해 ISIS 437527을 투여하였다.
처리 및 수술
래트를 이소플루란을 이용해 마취시키고 28-게이지 폴리우레탄 카데터를 각 래트의 IT 요추 공간 내에 위치시켰다. 볼루스 주사를 받는 그룹 내 동물의 경우에는 카데터의 근위단을 피부를 통해 연장되는 투약 받침대에 부착하였다. 연속 주입을 받는 그룹 내 동물의 경우에는 카데터를 각 동물의 등쪽면 위에 피하 공간 내에 위치하는 ZET 펌프 (Model 2ML1)에 부착하였다. 수술-후에 세프티오푸르 소디움 (5 mg/kg) 및 부토르파놀 타르트레이트 (0.05 mg/kg)의 단일 근육내 용량을 동물에게 투여하였다. 연속 주입을 받는 래트는 올리고뉴클레오티드 용량을 즉시 투여받기 시작하였다. 볼루스 주사를 받게 되는 동물은 카데터의 효능을 평가한 후 적어도 5일의 수술 회복 기간을 갖게 하였다.
5마리 스프라그 다우리 래트의 그룹에 수막강내로 전달되는 350 μg의 ISIS 437527의 단일 볼루스 주사를 투여하였다. 5마리 스프라그 다우리 래트의 다른 그룹에 1주일의 기간에 걸쳐 3회 수막강내로 전달되는 120 μg의 ISIS 437527의 볼루스 주사를 투여하였다. 5마리 스프라그 다우리 래트의 또 다른 그룹에 1주일에 걸쳐 3회 수막강내로 전달되는 350 μg의 ISIS 437527의 볼루스 주사를 투여하였다. 5마리 스프라그 다우리 래트의 또 다른 그룹에 7일간 0.01 mL/시간의 속도로 연속 주입에 의해 전달되는 50 μg/일의 ISIS 437527을 투여하였다. 5마리 스프라그 다우리 래트의 대조군에 1주일에 걸쳐서 3회 수막강내로 전달되는 PBS의 볼루스 주사를 투여하였다. 각 그룹에 7일간의 회복 기간이 주어졌고, 그 후에 래트를 안락사시켰다. 모든 그룹으로부터 뇌 및 척수를 적출하고 분석하였다.
헌팅틴 발현 수준의 RNA 분석
헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 전두 피질, 측두 피질, 및 경부 척수로부터 RNA를 추출하였다. 래트 헌팅틴 mRNA 수준을 프라이머 프로브 세트 rHtt_LTS00343을 사용하여 측정하고 사이클로필린 수준에 대해 표준화하였다. 결과를 표 88에 나타내었고 이는 대조군의 평균에 대한 억제율로서 표시되었다.
Percent inhibition of huntingtin mRNA expression in Sprague Dawley rats
Tissue Dose schedule Dose % inhibition
Frontal Cortex IT Infusion 50 ㎍/day 11
Single IT Bolus 350 ㎍ 28
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 21
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 0
Temporal Cortex IT Infusion 50 ㎍/day 0
Single IT Bolus 350 ㎍ 34
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 44
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 48
Cervical Cord IT Infusion 50 ㎍/day 22
Single IT Bolus 350 ㎍ 45
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 58
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 46
AIF1 발현 수준의 RNA 분석
AIF1 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 전두 피질, 측두 피질, 및 경부 척수로부터 RNA를 추출하였다. 래트 AIF1 수준을 래트 프라이머 프로브 세트 rAif1_LTS00219를 사용해 측정하였다. 결과를 PBS 대조군에 대한 AIF1 발현율로 계산하고 이를 표 89에 나타내었다. 결과는 반복된 IT 볼루스 투여가 경부 척수 조직에서 염증을 유발함을 나타낸다. 연속 IT 투여 및 단일 IT 볼루스 투여는 래트에서 매우 순응성이었다.
Percent expression of AIF1 mRNA levels in Sprague Dawley rats as a measure of neurotoxicity
Tissue Dose schedule Dose % inhibition
Frontal Cortex IT Infusion 50 ㎍/day -36
Single IT Bolus 350 ㎍ -4
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 41
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 -7
Temporal Cortex IT Infusion 50 ㎍/day 15
Single IT Bolus 350 ㎍ 22
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 25
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 76
Cervical Cord IT Infusion 50 ㎍/day 108
Single IT Bolus 350 ㎍ 72
Repeated IT Bolus 120 ㎍ X 3 473
Repeated IT Bolus 350 ㎍ X 3 268
수막강내 투여를 통한 사이노몰거스 원숭이의 CNS 조직 내 ISIS 436689의 반감기 측정
다양한 CNS 조직에서 안티센스 헌팅틴 mRNA 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 반감기 및 작용 지속기간을 측정하기 위해 사이노몰거스 원숭이에 수막강내로 (IT) ISIS 436689를 투여하였다.
처리
노던 바이오케미칼 연구소 (Northern Biomedical Research, MI)에서 연구를 수행하였다. 처리 개시 전에, 원숭이를 4주간 격리 상태로 유지하였고, 그 기간 동안에 비정상 또는 병든 원숭이를 선별하기 위해 혈청 화학 및 혈액학, 난자 및 기생충에 대한 대변 시료의 조사, 및 결핵 검사의 표준 패널을 수행하였다. 원숭이에 피하 티타늄 접속 포트에 연결된 폴리우레탄 카데터 (P.A.S. PORT®Elite Plastic/Titanium portal with Ultra lock connector)를 사용하여 수막강내 요추 카데터를 이식하였다. 외부 펌프를 이용한 연속 주입을 위해, 동물을 마취시켜 투약 장치를 포트에 부착시켰다. 동물을 0.04 mg/kg의 용량으로 피하 주사에 의해 아트로핀 설페이트로 전처리하였다. 대략 15분 후, 케타민 HCl의 8 mg/kg의 근육내 용량을 투여하여 진정을 유도하였다. 마취된 동물의 수술 면을 가리고, 관을 삽입한 후 대략 1 L/분의 산소 및 2% 할로세인 또는 이소플루란 상에서 유지하였다. 5 mg/kg 세프티오푸르 소디움 항생제의 단일 근육내 용량을 동물에 투여하였다. 변형된 바늘 지지체의 배치를 위해 포트 근처에 절개를 만들었다. 변형된 바늘을 포트 내에 위치시키고 봉합사로 봉합하였다. 수술로부터 회복 시에, 재킷을 동물 위에 놓아두었다.
15마리의 웅성 사이노몰거스 원숭이를 21일간 1.67 mg/mL의 농도 및 2.4 mL/일의 유속으로 4 mg/일의 ISIS 436689를 투여하였다. 3마리 사이노몰거스 원숭이의 대조군에 동일한 기간 동안 유사한 방식으로 PBS를 투여하였다. 각 3마리 원숭이의 그룹들을 1일, 2주, 4주, 또는 8주의 회복 기간을 갖게 하였고, 그 후에 이들을 안락사시켰다. 연구 기간 동안에, 질병 또는 고통의 징후에 대해 원숭이들을 매일 관찰하였다.
8.0 mg/kg의 케타민 HCl의 근육내 주사로 모든 동물을 진정시키고, 할로세인 또는 이소플루란/산소 혼합물 상에서 유지시킨 후, 200 IU/kg의 헤파린 Na의 정맥내 볼루스를 제공하였다. 동물을 식염수 중의 0.001% 질산나트륨으로 좌심실을 통해 관류시켰다.
희생시킬 때, 3 mm 관상 절편 두께로 뇌 기질 내에서 뇌를 절단하였다. 여러 개의 뇌 구조물을 4 mm 생검 펀치를 사용하여 채취하였다. 각 구조물로부터 얻은 4 mm 직경의 시료 하나를 1.0 mL의 RNAlater RNA 안정화 용액 (Qiagen, CA)을 함유하는 2 mL 스크류 캡 튜브에 넣고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 냉동시켰다. 인접한 6 mm 직경의 시료를 2 mL 스크류 캡 튜브에 넣고 약동학적 분석을 위해 냉동시켰다.
척수를 경부, 흉부 및 요추 절편으로 절편을 나누고, 척수 각 부위의 대략 3 mm 두께의 절편을 RNA 및 약동학적 분석을 위해 취하였다. 이들 시료를 뇌 시료와 유사한 방식으로 처리하였다.
간 시료를 RNA 및 약동학적 분석을 위해 수집하였다. 이들 시료를 상기에 기술된 뇌 및 척수 시료와 유사한 방식으로 처리하였다.
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS2617를 이용한 헌팅틴 mRNA 수준의 실시간 PCR 분석을 위해 요추 척수, 흉부 척수, 경부 척수, 전두 피질, 후두 피질, 소뇌 피질, 꼬리엽 조직, 해마, 중뇌, 및 교뇌로부터 RNA를 추출하였다. 척수의 다양한 절편에서 측정된 결과를 표 90에 나타내었고 이는 8주째에 PBS 대조군에서 측정된 결과에 대한 억제율로서 표시되었다. 뇌의 다양한 절편에서 측정된 결과를 표 91에 나타내었고 이는 8주째에 PBS 대조군에서 측정된 결과에 대한 억제율로서 표시되었다.
Effect of ISIS 436689 administered IT on huntingtin mRNA expression in the spinal cord at various time points
Recovery period Lumbar spinal cord Thoracic spinal cord Cervical spinal cord
1 Day 36 66 65
2 Weeks 56 55 54
4 Weeks 0 63 65
8 Weeks 48 48 44
Effect of ISIS 436689 administered IT on huntingtin mRNA expression in various brain tissues at various time points
Recovery period Frontal cortex Occipital cortex Cerebellar cortex Caudate Hippocampus Middle brain Pons
1 Day 53 37 8 21 19 24 22
2 Weeks 42 28 16 3 28 0 32
4 Weeks 47 32 25 7 22 2 43
8 Weeks 33 34 11 17 27 5 22
ELISA에 의한 올리고뉴클레오티드 농도 측정
조직 (20 mg)을 잘게 다지고, 무게를 재고, 페놀/클로로포름을 이용한 액/액 추출 전에 균질화하였다. 상층액을 제거하고, 동결건조하여, 혼성화 ELISA 과정을 이용하여 분석하기 전에 인간 EDTA 혈장 (1 mL) 내에 재구성하였다.
표지된 상보적 절단 프로브 (5' 말단에 딕옥시제닌 및 3' 말단에 C18 스페이서 및 BioTEG)에 대한 혼성화에 의해 조직 내에서 ISIS 436689를 검출하였다. 그 후에 복합체를 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획하고 S1 뉴클리아제를 첨가하여 혼성화되지 않은 절단 프로브를 분해하였다. ISIS 436689는 절단 프로브가 분해되는 것을 보호하기 때문에, 분해되지 않은 절단 프로브를 올리고뉴클레오티드 농도의 척도로 사용하였다. 분해되지 않은 절단 프로브를 알칼라인 포스파타아제에 결합된 항-딕옥시제닌 항체를 사용하여 검출한 후 형광성 기질을 판독하였다. 올리고뉴클레오티드 농도를 회복 기간의 7일, 20일, 34일, 및 62일째에 척수의 경부, 흉부 및 요추와 간에서 측정하고, 표 92에 나타내었다. 이들 조직 내에서 ISIS 436689의 반감기를 상기 데이터로부터 계산하였고, 이를 표 93에 나타내었다. 데이터는 올리고뉴클레오티드가 전신 조직에서 무시할만한 농도로 CNS에 주로 농축되어 있음을 나타낸다.
Concentrations (㎍/g tissue) of ISIS 436689 administered IT on huntingtin mRNA expression in various tissues at various time points
Organ Day 7 Day 20 Day 34 Day 62
Cervical cord 118.9 78.7 79.8 42.8
Thoracic cord 503.5 215.8 101.6 61.4
Lumbar cord 557.1 409.5 143.3 49.5
Liver 33.6 10.3 2.0 0.2
Half-life of ISIS 436689 administered IT on huntingtin mRNA expression in various tissues
Organ Half-life
Cervical cord 4.0
Thoracic cord 15.1
Lumbar cord 18.7
Liver 7.6
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Hung, Gene Bennett, C. Frank Freier, Susan M. Kordasiewicz, Holly Stanek, Lisa Cleveland, Don W. <120> MODULATION OF HUNTINGTIN EXPRESSION <130> BIOL0113WO <150> US 61/241,853 <151> 2009-09-11 <160> 58 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 13481 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 gctgccggga cgggtccaag atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag 60 agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga 120 ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga 180 gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 240 gcagcagcag cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca 300 gcttcctcag ccgccgccgc aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc 360 gccgcccccg ccgccacccg gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccaaagaa 420 agaactttca gctaccaaga aagaccgtgt gaatcattgt ctgacaatat gtgaaaacat 480 agtggcacag tctgtcagaa attctccaga atttcagaaa cttctgggca tcgctatgga 540 actttttctg ctgtgcagtg atgacgcaga gtcagatgtc aggatggtgg ctgacgaatg 600 cctcaacaaa gttatcaaag ctttgatgga ttctaatctt ccaaggttac 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 145140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaaata aggcagcaga ctggtgtttc tttctttttt 145200 ttttttctcc taccttattt tgagagagta gccagatggt gtcttgactg atattccaga 145260 gcagggacaa agcccactga ggtttggggg ctgcaattac caatggctgg aatgcatttg 145320 attacggtgc gttccatgtt aaggatcaat aagattgtgc tctttctgga aagtatcttt 145380 tagttttatt tattggtatt cagaggagtg taggttgaat taaaatgaaa aggcatttta 145440 taaaggccgt gagtagtaca tggtttcatt tttctaatgt cttgcagaga ttttattagg 145500 cttctcgaag tgttcacgta cattacgtta atgtgatact aagagtaact gtactctggc 145560 acagcgaagc cagcagaatg ggaagttgtg gaatgcaggc ccttgattct gatagaaggt 145620 gtggtatgaa ctcgcagaaa tgacagtttg gagggtagac atatgtcaca agtcatcaag 145680 attgtcttta aattcatcca tagaagctaa caggttgtca taagcaaagc ctctaaaatg 145740 tatgagggaa ttcaaggata atttatcaaa aagtaattca tgtttggagt tttgtgccca 145800 aaggagtcct tgatttgaaa aatgggtgtt tgcccatcag attgtttcag ggtccgtatg 145860 tgcagaggcc gtgcctcgtg ccccgtgagc tcagcctgac agaagtccct tggtagcact 145920 tagggacttg gttagcactt 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 20 agctcttttc ctgcatcagc 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 21 gtaacattga caccacca 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 22 ctcagtaaca ttgacaccac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 23 atgagtctca gtaacattga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 24 tccttgtggc actgctgcag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 25 ttctccttgt ggcactgctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 26 tcattctcct tgtggcactg 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 27 attctccttg tggcactg 18 <210> 28 <211> 20 <212> 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 36 ctctctgtgt atcaccttcc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ctccgtccgg tagacatgct 20 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ggaaatcaga accctcaaaa tgg 23 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 39 tgagcactgt tcaactgtgg atatcggga 29 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 gtctgagcct ctctcggtca a 21 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 aagggatgct gggctctgt 19 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 42 agcaaagctt ggtgtcttgg cactgttagt 30 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 cagagctggt caaccgtatc c 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 ggcttaaaca gggagccaaa a 21 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 45 acttcatgat gagctcggag ttcaac 26 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 aggagaaaaa caaagaacac cagaa 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 caattagggc aactcagaaa tagct 25 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 48 ccaactggtc ccccagccaa ga 22 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 cagagctggt gaaccgtatc c 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ggcttaagca gggagccaaa a 21 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 51 acttcatgat gagctcggag ttcaac 26 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 52 tcctagtgtt acattaccgc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 53 ctcgactaaa gcaggatttc 20 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 tggtccccca gccaaga 17 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 cccaccgtgt gacatcca 18 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 56 agctatctcc gagctgccct gattgg 26 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 gctgattaga gagaggtccc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 tcccatttca ggagacctgg 20

Claims (76)

  1. 서열번호: 28의 서열로 이루어진, 헌팅틴을 암호화하는 핵산을 표적으로 하고 헌팅틴 발현을 억제할 수 있는 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드로서,
    (a) 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오시드가 바이사이클릭 당인 변형된 당을 포함하는 것;
    (b) 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는 변형된 당을 포함하는 것;
    (c) 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 테트라하이드로피란 고리가 퓨라노스 고리를 대체하는 하나 이상의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 것;
    (d) 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오시드가 5-메틸시토신인 변형된 뉴클레오염기를 포함하는 것; 및
    (e) 상기 변형된 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것
    으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 갖는, 올리고뉴클레오티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 바이사이클릭 당의 각각이 4'-CH2-N(R)-O-2' 가교를 포함하고, 여기서 R은 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기인 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    하나 이상의 바이사이클릭 당의 각각이 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오시드의 각각이 하기 구조를 갖되,
    Figure 112020033388191-pat00018

    상기 식에서, Bx는 선택적으로 보호된 헤테로사이클릭 염기 모이어티인, 올리고뉴클레오티드.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서,
    모든 시토신이 5-메틸시토신인 올리고뉴클레오티드.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 1 항에 있어서,
    변형된 올리고뉴클레오티드가,
    연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
    연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절; 및
    연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절
    을 포함하고, 여기서 갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하며, 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    변형된 올리고뉴클레오티드가,
    10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
    5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절; 및
    5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절
    을 포함하고, 여기서 갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하며, 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 14 항에 있어서,
    변형된 올리고뉴클레오티드가,
    8개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 분절;
    6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 날개 분절; 및
    6개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 날개 분절
    을 포함하고, 여기서 갭 분절은 5' 날개 분절과 3' 날개 분절 사이에 위치하며, 각 날개 분절의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 결합체화된(conjugated) 것인 올리고뉴클레오티드.
  18. 헌팅톤병을 예방하거나, 치료하거나, 개선하거나, 또는 진행을 지연시키기 위한, 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  19. 헌팅톤병을 예방하거나, 치료하거나, 개선하거나, 또는 진행을 지연시키는 방법에 사용하기 위한, 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물.
  20. 동물에서 헌팅틴 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한, 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    동물이 인간인 약학적 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서,
    헌팅틴 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 것이 헌팅톤병을 예방하거나, 치료하거나, 개선하거나, 또는 진행을 지연시키는 것인 약학적 조성물.
  23. 헌팅톤병을 지닌 인간을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 치료가 인간에서 불안증, 부조정 절름발이, 비의도적으로 개시된 운동, 비의도적으로 미완된 운동, 불규칙적 걸음걸이, 무도병, 경축, 몸부림 운동(writhing motions), 비정상적 자세, 불안정, 비정상적 얼굴 표정, 씹기 장애, 삼키기 장애, 말하기 장애, 발작, 수면 장애, 계획 부전(impaired planning), 유연성 부전, 추상적 사고 부전, 규칙 습득 부전, 적절한 활동의 개시 부전, 부적절한 활동의 억제 부전, 단기 기억 부전, 장기 기억 부전, 편집증, 방향감 장애, 혼동, 환각, 치매, 불안, 우울증, 둔화정동, 자기중심주의, 공격성, 강박행동, 과민성, 자살관념(suicidal ideation), 감소된 뇌질량, 근위축, 심부전, 글루코스 내성 부전, 체중 감소, 골다공증, 및 고환 위축의 적어도 하나를 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  25. 헌팅톤병의 감소 또는 예방을 위해 치료학적 유효량의 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 인간에게 투여하는 것을 포함하는 헌팅톤병의 감소 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제11항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 제 19 항에 있어서,
    상기 방법이 올리고뉴클레오티드와 제2 약제를 병용-투여하는 것을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 방법이 올리고뉴클레오티드와 제2 약제를 동시에 투여하는 것을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  28. 제 19 항에 있어서,
    약학적 조성물이 중추신경계(CNS)로 투여하기 위한 것인 약학적 조성물.
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