KR20170119730A - Ｔｎｆ 수퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질환 치료에 있어서의 그의 용도 - Google Patents

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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

TNF 수용체 (TNFR1 및 TNFR2) 및 TNFR 수퍼패밀리에 속하는 다른 수용체를 암호화하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 화합물을 이용하여 이들 수용체의 발현을 제어하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 특히 이러한 화합물들은 상기 수용체의 막횡단 도메인의 제거를 유발하고, TNF-α 활성 또는 관련 리간드의 활성을 감소시키는 길항제로 작용하는 수용체의 가용성 형태를 생산한다. TNF-α 활성을 감소시킴은 TNF-α 활성과 연계된 염증성 질환 또는 증상을 치료 및 개선하는 방법을 제공한다. 마찬가지로, 다른 리간드들과 연계된 질환들도 유사한 방식으로 치료될 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 스플라이스-스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO)로서, 생체내에서 안정한 작은 분자이며, 서열 특이적 방식으로 RNA에 혼성화되고, 그의 표적과 결합하여 알엔아제 H에 의해 분해되지 않는다.

Description

ＴＮＦ 수퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질환 치료에 있어서의 그의 용도 {SPLICE SWITCHING OLIGOMERS FOR TNF SUPERFAMILY RECEPTORS AND THEIR USE IN TREATMENT OF DISEASE}
본 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 2006년 10월 20일자 출원 미국 가출원 제60/862,350호 및 2005년 11월 10일자 출원 미국 가출원 제60/735,429호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 스플라이스 스위칭 (splice switching) 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO)를 이용한 pre-mRNA 분자의 스플라이싱 (splicing)의 제어 (controlling) 및 단백질 발현의 조절 (regulating)을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. SSO는 뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 서열 특이성을 가지고 표적 RNA에 혼성화 (hybridize)할 수 있으며 알엔아제 H (RNase H)를 활성화시키거나 다른 방법으로 표적 RNA를 분해시키지 않는 임의의 중합체 또는 분자를 포함한다. 특히 기술된 구체예들은 종양괴사인자 (Tumor necrosis factor) (TNF) 수퍼패밀리 (superfamily)의 수용체에 관련된다.
진핵세포에 의한 mRNA의 생산은 2-단계 과정이다. 1 단계에서, 길고 연속적인 전사체 (transcript), 메신저 RNA 전구체 (pre-mRNA)가 형성된다. pre-mRNA는 단백질을 암호화하지 않는 서열 (인트론)들이 산재되어 있는 단백질 암호화 서열 (엑손)을 포함한다. 2 단계에서, 스플라이싱이라고 지칭하는 과정에 의해 전사체의 인트론들이 제거되고 엑손들이 연결된다. 이 과정이 완성된 기능성 mRNA를 생성시키는 중심 단계이다. 각 인트론의 5' 말단은 스플라이스-공여자 부위 (splice-donor site) 또는 5' 스플라이스 부위를 포함하고, 각 인트론의 3' 말단은 스플라이스 수용자 (splice-acceptor) 또는 3' 스플라이스 부위를 포함한다. pre-mRNA의 처리에는, 스플라이싱 및 핵으로부터의 mRNA 수송을 수행하며, 총괄하여 스플라이시오좀 (spliceosome)이라 지칭되는, 단백질 및 RNA 분자들을 포함하는 복합체 (complex)가 참여한다.
대안적 (alternative) 스플라이스 부위가 존재할 경우, 스플라이싱 단계는 단일 유전자로부터 2 개 이상의 (관련된) 단백질의 합성을 허용한다 (예를 들어 참조: Gist, A., 2005, Scientific American, April, p.60). 생리적 메커니즘으로서 대안적 스플라이싱을 이용하는 유전자 중에는 염증 및 면역 시스템에 영향을 주는 단백질 사이토카인 (cytokine)의 세포-표면 수용체가 있다. 이러한 단백질은 막 내재 형태 (integral membrane form)로 발현되고 사이토카인 리간드 결합에 반응하여 신호를 전달한다. 이러한 사이토카인 수용체는 사이토카인에 결합하여 신호 전달 (signal transduction)을 방지할 수 있는 분비성 형태 (secreted form)로도 존재한다. 상기 2 가지 수용체 형태는 대안적 스플라이싱에 의해 생산되며, 분자의 막-횡단 도메인 (membrane-spanning domain)을 암호화하기 위해 필요한 하나 이상의 엑손의 결실에 있어서 서로 상이하다. 일부 수용체에 있어서는, 분비성 스플라이스 변형체 (variant)와는 구별되는 수용체의 가용성 단편이, 내재형 막 부착 수용체 (integral membrane bound receptor)로부터 세포외 도메인 (extracellular domain)의 단백질 가수분해성 절단 (proteolytic cleavage)에 의해 생산된다.
이러한 수용체 패밀리의 하나는 TNF 수용체 (TNFR) 수퍼패밀리이다. 일반적으로 TNFR 수퍼패밀리는 TNF 수퍼패밀리 내에서 일반적으로 동정된 19 리간드 중의 하나 이상과의 결합에 기인하는 세포 신호를 매개하는 29 수용체로 구성된다. TNFR 수퍼패밀리는, 공통의 시스테인 풍부 도메인 (CRD)을 특징으로 하는 카복시-말단 세포내 도메인 및 아미노-말단 세포외 도메인을 가진 타입 I 막횡단 단백질 (transmembrane protein) 그룹이다. TNFR 수퍼패밀리는 2 개의 서브그룹으로 나누어진다: 세포내 사멸 도메인 (intracellular death domain) (DD)을 포함하는 수용체 및 포함하지 않는 수용체. DD는 수용체 활성화에 따라 아포토시스 (apoptosis)를 유도하는 80 아미노산 모티프 (motif)이다. 추가로, TNF-α 수용체 타입 I (인간 mRNA에 대한 GenBank 수납번호 X55313으로 예시되는 TNFSFR1A, 이하 "TNFR1"이라 칭함) 및 TNF-α 수용체 타입 II (인간 mRNA에 대한 GenBank 수납번호 NM_001066으로 예시되는 TNFSF1B, 이하 "TNFR2"라 칭함)는 다중 수용체 서브유닛 (multiple receptor subunit)의 조립 (assembly) 및 후속의 TNF-α 결합에 필요한 리간드-결합 어셈블리 전구체 도메인 (pre-ligand-binding assembly domain) (PLAD)이라고 지칭되는 고유 도메인을 공통적으로 가지고 있다. TNFR 수퍼패밀리의 대부분의 구성원들은 TNFR-관련 인자 (TRAF)와 결합함으로써 신호 전달을 활성화시킨다. 이러한 결합은 TNFR 수퍼패밀리 구성원들의 세포내 도메인의 특이적 모티프에 의해 매개된다 (Palladino, M.A., et al., 2003, Nat. Rev. Drug Discov. 2:736-46). TNFR 수퍼패밀리의 다른 구성원들은 RANK (TNFRSF11A), CD40 (TNFRSF5), CD30 (TNFRSF8), 및 LT-βR (TNFRSF3)을 포함한다.
TNF-α는 막-결합 동종삼량체 (membrane-bound homotrimer)로 존재하며 단백질 분해효소 TNF-α 전환효소 (TACE)에 의해 순환계 내로 방출되는 친염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)이다. TNF-α는 상해 (injury) 및 감염에 대한 염증 반응의 매개자로서 순환계 내로 도입된다. TNF-α 활성은 류머티즘성 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 건선 (psoriasis) 및 건선성 관절염 (psoriatic arthritis)과 같은 염증성 질환의 진행에 관련된다 (Palladino, M.A., et al., 2003, Nat. Rev. Drug Discov. 2:736-46). 중증의 감염 중에 경험하는 바와 같이, 높은 수준의 TNF-α에 대한 급성 노출 (acute exposure)은 패혈증 (sepsis)을 유발한다; 그 증상은 쇼크 (shock), 저산소증 (hypoxia), 다발성 장기부전 (multiple organ failure), 및 사망을 포함한다. 만성적 저용량 (low dose)의 TNF-α는 체중 감소, 탈수 (dehydration) 및 지방 손실 (fat loss)을 특징으로 하는 악액질 (cachexia)을 유발할 수 있으며, 악성종양 (malignancy)과 연계되어 있다.
TNF-α 활성은 2 개의 상이한 유전자에 의해 암호화되는 2 개의 수용체, TNFR1 및 TNFR2에 의해 주로 매개된다. TNFR1은 약 55 킬로달톤 (kDal)의 분자량을 가진 막-결합 단백질인 반면, TNFR2는 분자량 75 kDal의 막-결합 단백질이다. 두 가지 수용체의 가용성 세포외 도메인은 모두 메탈로프로테아제 (metalloprotease)에 의하여 세포막으로부터 어느 정도 탈락된다. 더우기 TNFR2의 pre-mRNA는 대안적 스플라이싱을 받아 완전한 길이의 활성 막-결합 수용체 (mTNFR2) 또는 막횡단을 위한 암호화 서열을 포함하는 엑손 7 및 8이 결여된 분비성 디코이 수용체 (decoy receptor) (sTNFR2)가 된다 (Lainez et al., 2004, Int. Immunol., 16:169). sTNFR2는 TNF-α와 결합하지만 생리적 반응을 이끌어내지는 못하므로 TNF-α 활성을 감소시킨다. TNFR1의 내생적인 (endogenous) 분비성 스플라이스 변형체는 아직 동정되지 않았으나, 두 가지 수용체의 유사한 유전자 구조는 이러한 TNFR1 동종형 (isoform)을 생산할 잠재성을 강력히 시사한다
TNFR1 및 TNFR2가 모두 결여된 유전자 적중 마우스 (knockout mouse)에 TNF 신호 경로를 표적화하는 약물을 처리한 결과, 이러한 약물이 뇌졸중 (stroke) 또는 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury)의 치료에 유익할 수 있는 것으로 나타났다 (Bruce, et al., 1996, Nat. Med. 2:788). TNFR2 유전자 적중 마우스는 또한 각각 인간 대뇌 말라리아 (cerebral malaria) 및 다발성 경화증 (multiple sclerosis)의 모델인 실험적-유도된 대뇌 말라리아 (Lucas, R., et al., 1997, Eur. J. Immunol. 27:1719) 및 자가면역성 뇌척수염 (autoimmune encephalomyelitis) (Suvannavejh, G.C., et al., 2000, Cell. Immunol., 205:24)에서 TNFR2의 역할을 정립하기 위해서도 이용되었다.
TNFR2는 T 세포 상에 고밀도로 존재하며, 간질성 폐질환 (interstitial lung disease)의 폐 미소환경 (pulmonary microenvironment)에서 폐포염 (alveolitis)을 일으키는 면역 반응에 있어서 역할을 담당하는 것으로 보인다 (Agostini, C., et al., 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153:1359). TNFR2는 또한 인간 지질 대사의 대사 장애와도 관계가 있으며 비만 및 인슐린 저항 (insulin resistance) (Fernandez-Real, et al., 2000, Diabetes Care, 23:831), 가족성 결합성 고지혈증 (familial combined hyperlipidemia) (Geurts, et al., 2000, Hum. Mol. Genet. 9:2067; van Greevenbroek, et al., 2000, Atherosclerosis, 153:1), 고혈압 (hypertension) 및 콜레스테롤 과잉혈증 (hypercholesterolemia) (Glenn, et al., 2000, Hum. Mol. Genet., 9:1943)과 관련지어져 왔다. 최근에 TNFR2는 인간 기면발작 (narcolepsy)와 관련지어졌다 (Komata, T., et al., 1999, Tissue Antigens, 53:527). 또한, TNFR2 다형성 (polymorphism)은 전신 홍반성 루프스 (systemic lupus erythematosus)에 대한 감수성을 유발하는 것으로 보인다 (Hohjoh, H., et al., 2000, Tissue Antigens, 56:446).
CD40의 스플라이스 변형체 (Tone, M., et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:1751) ("Tone"), 및 CD95 (FAS) (Shen, L., et al., 2002, Am. J. Path. 161:2123)은 악성 종양에서 발견되었다. 이들 스플라이스 변형체 중의 몇 가지는 결실에 의하거나 엑손 7의 해독틀 (reading frame)을 손상시키는 돌연변이에 의하여 막횡단 영역의 손실을 야기한다. 이들이 악성 전환 (malignant transformation)에 의해 유발되는 비정상적 변형체를 의미하는지 생리적 대체물 (physiological alternative)인지는 아직 알려지지 않았다.
TNF 수퍼패밀리 구성원들의 과도한 활성이 담당하는 역할로 인하여, 분비성 형태의 양이 증가하고 막 내재 형태의 양이 감소하도록 TNFR 수용체들의 대안적 스플라이싱을 제어함이 유용할 수 있다. 본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위한 스플라이스 스위칭 (splice switching) 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO)를 제공한다. SSO는 안티센스 (antisence) 올리고뉴클레오티드 (ASON)와 유사하다. 그러나, ASON과는 대조적으로, SSO는 알엔아제 H에 의한 표적의 분해를 유발하지 않으면서 표적 RNA에 혼성화될 수 있다.
SSO는 어떤 지중해 빈혈 (thalassemia)에서 발견된 비정상적인 스플라이싱을 조절하기 위해 이용되어왔다 (Kole에게 설정된 미국특허 제5,976,879; Lacerra, G., et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:9591). IL-5 수용체 α-쇄 (IL-5Rα)에 관한 연구는 막-횡단 엑손을 저지하는 SSO가 분비성 형태의 합성을 증가시키고 막 내재 형태의 합성을 저해함을 입증하였다 (Bennet에게 설정된 미국특허 제6,210,892호; Karras, J.G., et al., 2000, Mol. Pharm, 58:380).
IL-5 수용체는 이종이량체 (heterodimer)로 나타나는 수용체 타입의 구성원이다. 인터류킨 5 수용체 (IL-5R)는 IL-3R 수용체 패밀리의 구성원으로서, 이는 또한 인터류킨 3 수용체 (IL-3R) 및 GM-CSF도 포함한다. IL-3R 패밀리 구성원은 공유된 공통의 β 쇄 및 사이토카인 리간드 특이성을 지닌 고유의 α 쇄로 이루어진 다중 서브유닛 (multisubunit) 수용체이다. IL-3R 패밀리 구성원은 조혈계 (hematopoietic system) 내에 발현된다. 특히 IL-5는 호산구 (eosinophil), 호염기구 (basophil) 및 B 세포에서만 독점적으로 발현된다 (Adachiand, T. & Alam, R., 1998, Am. J. Physiol. 275:C623-33). 본 발명의 TNFR 수퍼패밀리 및 상기 수용체는 서열 동질성 (homology)을 가지고 있지 않으며 별개의 신호 경로에 작용한다.
SSO는 Tone에서 검출되는 주요 CD40 스플라이스 변형체를 생산하기 위해 이용되어 왔으며, 여기에서 막횡단 영역의 업스트림 (upstream)인 엑손 6의 결실은 단백질의 해독틀 변경을 야기한다. SSO가 예상되는 mRNA 스플라이스 변형체를 유발하였으나, 분비된 수용체가 검출되지 않았으므로 변형체 mRNA의 단백질 합성 (translation) 산물은 불안정한 것으로 보인다 (Siwkowski, A.M., et al., 2004, Nucleic Acids Res. 32; 2695).
발명의 요약
본 발명은 TNF 수용체 (TNFR1 및 TNFR2) 및 TNFR 수퍼패밀리의 다른 사이토카인 수용체를 암호화하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 제어함으로써 상기 수용체들의 발현을 제어하는 조성물 및 방법을 제공한다. 더욱 특이적으로, 본 발명은 분비성 형태의 발현 증가 및 막 내재 형태의 발현 감소를 유발한다. 추가로, 본 발명은 과도한 사이토카인 활성과 관련된 질환의 치료에 이용될 수 있다.
막 내재 형태 mRNA 내에 존재하지만 1차 전사체 ("pre-mRNA")로부터 제거되어 분비성 형태 mRNA가 되게 하는 엑손 또는 엑손들을 "막횡단 엑손 (transmembrane exon)"이라 지칭한다. 본 발명은 수용체 pre-mRNA의 막횡단 엑손 및/또는 인접한 인트론에 상보적인 핵산 및 핵산 유사체를 포함한다. 상보성은 스플라이스 부위를 횡단하는 pre-mRNA 서열 내의 서열들에 기초할 수 있고, 이는 엑손-인트론 접합부 (junction)를 횡단하는 서열에 기초한 상보성을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 또는 상보성이 인트론 서열에 단독으로 기초할 수 있거나, 상보성이 엑손 서열에 단독으로 기초할 수도 있다.
당업자에게 공지되고 이용 가능한 몇 가지 대안적 화학들 (alternative chemistries)이 있다. 한 가지 중요한 특징은 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드 ("안티센스 올리고뉴클레오티드", 이하 "ASON"이라 지칭함)와 같이 알엔아제 H에 의한 표적의 분해를 유발하지 않으면서 표적 RNA에 혼성화되는 능력이다. 명확성을 기하기 위하여, 상기 화합물들을 스플라이스-스위칭 올리고머 (SSO)라고 지칭한다. SSO가 2' O-개질된 올리고뉴클레오티드 및 리보뉴클레오시드포스포로티오에이트와 함께 펩티드 핵산 및 리보퓨라노실-기초의 결합이 없는 다른 중합체를 포함하나 이에 한정되지 않음을, 당업자는 인식할 것이다.
본 발명의 한 구체예는 환자 또는 생물 대상에게 SSO를 투여함으로써 염증성 질환 (disease) 또는 증상 (condition)을 치료하는 방법이다. 투여되는 SSO는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경시켜 TNFR 수퍼패밀리 수용체의 안정하고 분비성이며 리간드-결합성인 형태를 암호화하는 스플라이스 변형체를 생산함으로써, 상기 수용체에 대한 리간드의 활성을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포에 SSO를 투여함으로써 TNFR 수퍼패밀리 수용체의 안정하고 분비성이며 리간드-결합성인 형태를 세포 내에서 생산하는 방법이다.
본 발명의 상기 및 다른 목적 및 태양들이 본 명세서의 도면 및 이하 기술하는 명세서에서 상세히 논의된다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서, 용어 "종양괴사인자 수용체 수퍼패밀리" 또는 "TNFR 수퍼패밀리" 또는 "TNFRSF"는, 공통의 시스테인 풍부 도메인 (CRD)을 특징으로 하는 카복시-말단 세포내 도메인 및 아미노-말단 세포외 도메인을 가진 타입 I 막횡단 단백질 그룹을 지칭한다. TNFR 수퍼패밀리는 수용체들로 구성되며, TNF 수퍼패밀리 내의 하나 이상의 리간드에 결합함으로써 세포 신호를 매개한다. TNFR 수퍼패밀리는 2 개의 서브그룹으로 나누어진다: 세포내 사멸 도메인 (DD)을 포함하는 수용체 및 포함하지 않는 수용체. DD는 수용체 활성화에 따라 아포토시스를 유도하는 80 아미노산 모티프이다. TNFR 수퍼패밀리의 구성원들은 TNFR1 (TNFRSF1A), TNFR2 (TNFRSF1B), RANK (TNFRSF11A), CD40 (TNFRSF5), CD30 (TNFRSF8), 및 LT-βR (TNFRSF3)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "종양괴사인자 수퍼패밀리" 또는 "TNF 수퍼패밀리"는 TNFR 수퍼패밀리 내의 하나 이상의 수용체에 결합하는 리간드의 그룹을 지칭한다. TNF 패밀리 리간드와 그의 상응하는 수용체 또는 수용체들의 결합은 세포 신호전달을 매개한다. TNF 수퍼패밀리의 구성원들은 TNF-α, RANKL, CD40L, LT-α, 또는 LT-β를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "염증성 질환 또는 증상"은, TNF 수퍼패밀리에 속하는 리간드와 그의 상응하는 수용체 또는 수용체들의 결합에 의해 적어도 부분적으로 유발되거나 악화되는 질환, 장애 (disorder), 또는 다른 의학적 증상을 지칭한다. 이러한 질환 또는 증상은, TNF 수퍼패밀리 리간드 수준의 증가, TNFR 수퍼패밀리 수용체 수준의 증가, 또는 상응하는 신호 경로의 감도 증가에 연계된 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 염증성 질환 또는 증상의 예는 류머티즘성 관절염, 소아 류머티즘성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease) (크론병 또는 궤양성 대장염을 포함함), 간염, 패혈증, 알콜성 간질환, 및 비-알콜성 지방간 (non-alcoholic steatosis)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "간염"은 간의 염증을 적어도 부분적인 특징으로 하는 소화기병학적 (gastroenterological) 질환, 증상, 또는 장애를 지칭한다. 간염의 예는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스와 연계된 간염, 또는 허혈/재관류 (ischemia/reperfusion)와 연계된 간 염증을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "막 결합 형태" 또는 "막 내재 형태"는 세포막을 횡단하는 아미노산 서열과 함께 막의 양쪽 면에 아미노산 서열을 가진 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "안정하고, 분비성이며, 리간드-결합성인 형태" 또는 "안정하고, 가용성이며, 리간드-결합성인 형태" (본 명세서에서 용어 "분비성" 및 "가용성"은 동의어이며 호환할 수 있음)는, 그들이 분비성이고 안정하면서도 상응하는 리간드에 대한 결합능을 보유하는 방식으로 천연의 막 결합 형태 수용체와 관련되어 있는 단백질을 지칭한다. 이러한 분비성 형태가 생리적인지 여부에 의해 상기 형태들이 정의되는 것이 아니라, 단지 이러한 스플라이스 변형체의 산물이 분비성이며, 안정하고, 생산되었을 때 리간드-결합능을 보유한다는 점에 유념해야 한다.
용어 "분비성"은 형태가 가용성, 즉 그가 세포막에 결합되어 있지 않음을 의미한다. 이러한 맥락에서, 당업자에게 공지된 종래의 활성조사를 이용하여 막과 관계 없는 분획, 예를 들어 세포 상등액 또는 혈청에서 형태의 대부분을 검출할 수 있다면, 그 형태를 가용성이라 할 것이다.
용어 "안정한"은 분비된 형태가 당업자에 의해 종래의 활성조사를 이용하여 검출 가능함을 의미한다. 예를 들어, 수득한 세포, 세포 상등액, 또는 환자의 혈청으로부터 형태를 검출하기 위하여 웨스턴 블로팅, ELISA 활성조사를 이용할 수 있다.
용어 "리간드-결합성"은, 형태가 상응하는 막 내재 형태의 특이적 리간드-결합 활성을, 반드시 전부는 아니더라도 적어도 어느 정도 유의적 수준으로 보유함을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "리간드의 활성을 감소시키는"은 수용체와 리간드의 결합 또는 상호작용으로부터 유발되는 세포내 신호전달을 감소시키는 임의의 작용을 지칭한다. 예를 들어, 리간드가 그의 수용체의 가용성 형태에 결합함에 의해서, 또는 리간드와의 결합에 이용 가능한 그의 수용체의 막 형태의 양을 감소시킴에 의해서, 활성이 감소할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "pre-mRNA의 스플라이싱 변경"은 스플라이스 산물의 비율 변경을 유발하는 세포 pre-mRNA 표적의 스플라이싱 변경을 지칭한다. 이러한 스플라이싱의 변경은 당업자에게 주지된 다양한 기술들에 의해서 검출될 수 있다. 예를 들어, 전체 세포 RNA에 대한 RT-PCR을 이용하여 SSO 존재 또는 부재 하에 스플라이스 산물의 비율을 검출할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상보적인"은 표적 서열을 함유하는 DNA 또는 RNA와 SSO 사이에 안정하고 특이적인 결합이 일어나기에 충분한 정도의 상보성 또는 정밀한 대합 (pairing)을 지칭하기 위해 사용된다. SSO의 서열이 그의 표적 서열에 100% 상보적일 필요는 없다는 점이 당업계에 이해되어 있다. 스플라이싱이 허용되는 조건 하에서, 표적에의 결합이 일어나고 비-특이적 결합이 배제된다면, 충분한 정도의 상보성이 있다.
가용성이고 안정하며 분비성인 리간드-결합 형태의 양을 증가시키고 막 내재 형태의 양을 감소시키도록 TNFR 수퍼패밀리에 속하는 수용체의 대안적 스플라이싱을 제어하기 위하여, 본 발명은 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO)를 채용한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 과도한 TNF 수퍼패밀리 활성과 연계된 질환의 치료에 이용될 수 있다.
따라서 본 발명의 한 구체예는 환자에게 SSO를 투여함으로써 염증성 질환 또는 증상을 치료하는 방법이다. 투여되는 SSO는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경하여 TNFR 수퍼패밀리 수용체의 안정하고 분비성인 리간드-결합 형태를 생산함으로써 그 수용체에 대한 리간드의 활성을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포에 SSO를 투여함으로써 TNFR 수퍼패밀리 수용체의 안정하고 분비성인 리간드-결합 형태를 세포 내에서 생산하는 방법이다.
이하 논의되는 본 발명의 하기 태양들은 상기 구체예들에 적용된다.
SSO의 길이는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASON)와 유사하며, 통상 10 내지 24 뉴클레오티드 범위이다. 본 발명은, RNA에 혼성화 되면서도 종래의 안티센스 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드와 같이 알엔아제 H에 의한 RNA의 파괴를 활성화시키지 않는 몇 가지 화학의 SSO들로 실시될 수 있다. 본 발명은 2'O-메틸 또는 2'O-메틸옥시에틸 포스포로티오에이트와 같은 2'O 개질된 핵산 올리고머를 이용하여 실시될 수 있다. 핵염기 (nucleobase)가 당에 연결될 필요는 없다; 소위 펩티드 핵산 올리고머 또는 몰폴린-기초의 올리고머가 사용될 수 있다. 이들 상이한 연결 화학의 비교는 문헌 (Sazani, P. et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:3695)에서 찾을 수 있다. 용어 스플라이스-스위칭 올리고뉴클레오티드는 상기 형태를 포함하도록 의도된다. 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오티드 갭머 (gapmer)와 SSO 사이의 관계를 인식할 것이다. 갭머는 알엔아제 H 활성화 영역 (통상 2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트)를 함유하고 그 측면에 비-활성화 뉴클레아제 저항성 올리고머가 인접한 ASON이다. 일반적으로, 갭머 ASON 내의 측면 인접 서열 (flanking sequence)에 적합한 임의의 화학은 SSO에 이용될 수 있다.
본 발명의 SSO는 널리 공지된 고체상 합성 (solid phase synthesis) 기술을 통해 만들 수 있다. 당업계에 공지된 상기 합성을 위한 임의의 다른 수단들도 부가적으로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용함은 주지되어 있다.
특히 바람직한 화학은 잠금 핵산 (locked nucleic acid) (LNA)에 의해 제공된다 (Koshkin, A.A., et al., 1998, Tetrahedron 54:3607; Obika, S., et al., 1998, Tetrahedron Lett. 39:5401). 2'O 및 4'C 사이의 가교 (bridge)에 의해서 리보퓨라노실 부위가 2 환 (bicyclic)으로 된다는 점을 제외하고는, LNA는 종래의 포스포디에스테르-연결된 리보뉴클레오티드이다. 이러한 가교는 리보퓨라노즈 환의 입체구조 (conformation)를 속박하여 3'-엔도 입체구조가 되게하며, 이는 올리고뉴클레오티드가 상보적 RNA에 혼성화될 때 취하는 입체구조이다. LNA 합성에 있어서의 최근의 진보는 WO 03/095467에 기술되어 있다. 가장 대표적인 가교는 메틸렌 또는 에틸렌이다. 2'O,4'C-에틸렌-가교된 핵산 (ENA)은 다른 LNA와 함께 문헌 (Morita, et al., 2003, Bioorg. & Med. Chem. 11:2211)에 기술되어 있다. 그러나, 대안적 화학이 사용될 수도 있으며 2'O는 2'N으로 대체될 수 있다. LNA 및 종래의 뉴클레오티드는 혼합되어 키메릭 (chimeric) SSO를 형성할 수 있다. 예를 들어, LNA 및 2'데옥시뉴클레오티드가 교번하는 키메릭 SSO 또는 LNA 및 2'O-Me 또는 2'O-MOE가 교번하는 키메릭 SSO가 채용될 수 있다. 이러한 화학의 대안에서는, 단순히 2'-데옥시뉴클레오티드가 아니라, 포스포로티오에이트디에스테르 결합이 포스포디에스테르를 대체한다. 생체내 사용에 있어서, 포스포로티오에이트 연결이 바람직하다.
LNA 뉴클레오티드가 SSO에 채용될 경우 비-LNA 뉴클레오티드도 함께 존재함이 바람직하다. LNA 뉴클레오티드는 혼성화에 대한 매우 높은 친화성을 가지므로 심각한 비-특이적 결합이 있을 수 있으며, 이는 유리-SSO의 유효농도 (effective concentration)을 감소시킬 수 있다. LNA 뉴클레오티드를 사용할 경우에는 이들을 2'-데옥시뉴클레오티드와 편리하게 교번시킬 수 있다. 교번의 양식은 결정적이지 않다. 교번하는 뉴클레오티드, 교번하는 디뉴클레오티드 또는 혼합 양식, 예를 들어 LDLDLD 또는 LLDLLD 또는 LDDLDD가 사용될 수 있다. 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-데옥시뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 LNA 뉴클레오티드와 혼합될 경우, 알엔아제 H의 활성화를 방지하는 것이 중요하다. SSO의 약 1/3 내지 2/3의 LNA 뉴클레오티드가 적합할 것으로 예상된다. 예를 들어 SSO가 12량체라면, 적어도 4 개의 LNA 뉴클레오티드 및 4 개의 종래 뉴클레오티드가 존재할 것이다.
SSO의 기반은 종래의 사이토신, 구아닌, 아데닌 및 우라실 또는 티미딘일 수 있다. 대안으로서 개질된 염기도 사용될 수 있다. 결합 친화도를 증가시키는 개질된 염기는 특별한 관심의 대상이 된다. 바람직한 개질 염기의 한정되지 않는 한 가지 예는 소위 G-클램프 (G-clamp) 또는 9-(아미노에톡시)페녹사진 뉴클레오티드, 구아노신과 4 수소결합을 형성하는 사이토신 유사체이다 (Flanagan, W.M., et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3513; Holmes, S.C., 2003, Nucleic Acids Res. 31:2759).
알엔아제 H를 활성화시키지 않는 다수의 대안적 화학이 이용 가능하다. 예를 들어 적합한 SSO는 적어도 하나 또는 전부의 뉴클레오티드간 가교 (internucleotide bridging) 포스페이트 잔기들이 개질된 포스페이트, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포로몰폴리데이트, 포스포로피페라지데이트, 및 포스포로아미데이트인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어 뉴클레오티드간 가교 포스페이트 잔기는 하나 걸러 상기와 같이 개질될 수 있다. 또 다른 한정되지 않는 예에서, 상기 SSO는 적어도 하나 또는 전부의 뉴클레오티드가 2' 저급알킬 부위 (예를 들어 C1-C4, 직쇄 또는 측쇄의, 포화 또는 불포화 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어 뉴클레오티드가 하나 걸러 상기와 같이 개질될 수 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 4]
SSO의 길이 (즉 올리고머 내의 모노머 갯수)는 약 10 내지 약 30 염기의 길이가 될 것이다. 한 구체예에서, 20 염기의 2'O-Me-리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 효과적이다. 친화도-증가 화학적 개질을 이용하면 SSO가 특이성을 유지하면서도 더 짧아질 수 있음을, 당업자는 인식한다. 표적 서열에 대한 특이적 인지력을 유지하고, SSO의 자가 혼성화를 형성하는 2 차 구조를 방지할 필요성 및 세포 진입성 (cell entry) 획득을 위한 제한에 의해서 SSO 크기에 상한선이 부과됨을, 당업자는 추가로 인식할 것이다. 이러한 제한은 SSO의 길이가 길어지면 (SSO의 친화도에 의존하는 일정한 길이를 초과) 특이성 저하, 불활성화 또는 활성 저하가 나타날 가능성이 높음을 의미한다.
본 발명의 SSO는, SSO의 활성, 세포내 분포 (cellular distribution) 또는 세포내 유입 (cellular uptake)을 증진하는 하나 이상의 부위 (moeity) 또는 접합체 (conjugate)를 SSO에 화학적으로 연결함을 수반하는 SSO의 개질을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 부위는 지질 부위, 예를 들어 콜레스테롤 부위, 콜린산, 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부위, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부위를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주어진 SSO 내의 모든 위치가 균일하게 개질될 필요는 없으며, 사실상 상기 개질 중의 하나 이상이 단일 화합물 내에 또는 SSO 내의 단일 뉴클레오시드에도 혼입될 수 있다.
유입, 분포, 및/또는 흡수 (absorption)를 보조하기 위한 다른 분자, 분자 구조, 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형에 SSO를 혼합, 캡슐화, 접합시키거나, 다른 방법으로 연계시킬 수 있다.
세포 분화 (cellular differentiation)는 스플라이시오좀의 분화를 포함하나 이에 한정되지 않음을 당업자는 인식한다. 따라서 본 발명의 모든 특정 SSO의 활성은 그들이 도입되는 세포 타입에 의존할 수 있다. 예를 들어 어떤 세포 타입에서 효과적인 SSO가 또 다른 세포 타입에서는 효과적이지 않을 수 있다.
본 발명의 방법, 올리고뉴클레오티드, 및 제형은 인간 또는 동물 유전자에서 스플라이싱을 시험하기 위한 시험관내 또는 생체내 수단으로서도 또한 유용하다. 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 절차 또는 당업자에게 자명할 그의 개질에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 의료 전문가가 TNF 수퍼패밀리 리간드의 효과 또는 이러한 리간드에 의해 활성화되는 신호 경로를 제한하고자 의도하는 임의의 증상을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 본 발명은 염증성 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 증상은 염증성 전신 질환, 예를 들어 류머티즘성 관절염 또는 건선성 관절염이다. 또 다른 구체예에서, 질환은 염증성 간질환이다. 염증성 간질환의 예는 A 형, B 형, 또는 C 형 간염 바이러스와 연계된 간염, 알콜성 간질환, 및 비-알콜성 지방간을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 염증성 질환은 건선과 같은 피부병이다.
본 발명의 이용은 공지의 TNF 길항제가 유용함이 입증된 질환의 치료를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 3 개의 특이적 TNF 길항제가 현재 FDA 승인을 득하였다. 그 약물들은 에타네르셉트 (Enbrel®), 인플릭시마브 (Remicade®) 및 아달리무마브 (Humira®)이다. 이들 약물 중의 하나 이상이 류머티즘성 관절염, 소아 류머티즘성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 염증성 장질환 (크론병 또는 궤양성 대장염)의 치료에 대하여 승인되었다.
바람직한 구체예에서, 수용체는 TNFR1 또는 TNFR2 수용체이다. 다른 구체예에서, 수용체는 TNFR1 및 TNFR2에 대해 충분한 동질성을 가진 TNFR 수퍼패밀리의 구성원, 예를 들어 TNFRSF3, TNFRSF5, 또는 TNFRSF11A로서, 엑손 7 및 8에 대해 동질성을 가진 엑손들 중의 하나 또는 양자가 결실되면 분비성 형태가 유발된다. 본 발명의 실시 가능성은 상기 분비성 형태가 생리적인지 여부에 의해 결정되지 않으며, 단지 상기 스플라이스 변형체의 산물이 분비성이고, 안정하며, 리간드-결합능을 가진다는 점에 있음을, 당업자는 인식한다.
대상에 대한 SSO의 투여는 ASON에 대해 개발된 절차를 이용하여 달성될 수 있다. ASON은 실험동물 및 인간 환자에게 정맥투여에 의해 식염수 중의 6 mg/kg 까지의 용량으로 주당 3 회 성공적으로 투여되었다 (Yacysyhn, B.R., et al., 2002, Gut 51:30 (크론병의 치료를 위한 항-ICAM-1 ASON); Stevenson, J., et al., 1999, J. Clinical Oncology 17:2227 (PBMC에 표적화된 항-RAF-1 ASON)). TNF-α에 지향된 2'O-MOE 포스포로티오에이트 ASON의 약물 동력학이 보고되었다 (Geary, R.S., et al., 2003, Drug Metabolism and Disposition 31:1419). 혼합된 LNA/DNA 분자의 전신적 효능 또한 보고되었다 (Fluiter, K., et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:953).
마우스 모델 시스템에서 2'O-MOE 포스포로티오에이트 및 PNA 화학을 이용하여 SSO의 전신적 활성을 조사하였다. 뇌, 위장 및 진피 (dermis)를 제외한 모든 조사 조직에서 유의적 활성이 관찰되었다 (Sazani, P., et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 1228).
일반적으로 종래의 안티센스 치료에 있어서 유용한 임의의 투여 방법이 본 발명의 SSO를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 배양 세포에서 SSO를 시험하기 위해서는, ASON 또는 SSO를 시험하기 위해 개발된 임의의 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 제형은 수성 담체와 같이 생리적 또는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 SSO를 포함한다. 따라서 본 발명에 사용하기 위한 제형은 복막내, 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 근육내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구 투여에 적합한 것들과 함께, 국소적 (눈 및 질 전달을 포함하는 점막을 포함), 경구, 직장 또는 폐 (산제 또는 에어로졸의 흡입 (inhalation) 또는 통기 (insufflation)를 포함하여, 흡입기 (nebulizer)에 의하거나, 기관내 (intratracheal), 비내 (intranasal) 전달을 포함) 투여에 적합한 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 제형은 단위 투여형 (dosage form)으로 편리하게 제공될 수 있으며 당업계에 주지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 임의의 주어진 사례에 가장 적합한 투여 경로는 대상, 치료할 증상의 성질 및 중증도, 및 사용할 특정 활성 화합물에 의존한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 생리적 및 약제학적으로 허용되는 그의 염: 즉 모체 화합물 (parent compound)의 목적하는 생물학적 활성을 유지하며 바람직하지 않은 독성 효과를 부가하지 않는 염을 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 이러한 염의 예는 (a) 양이온, 예를 들어 소듐, 포타슘, NH4 +, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들어 스퍼민 및 스퍼미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염; (d) 원소 음이온 (elemental anion), 예를 들어 염소, 브롬, 및 요오드로부터 형성된 염이다.
본 발명은, 앞서 논의한 바와 같이 TNF-α와 같은 사이토카인의 과도한 활성을 수반하는 염증성 장애를 앓고 있는 환자에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원의 가용성 형태의 그에 상응하는 막 결합 형태에 대한 비율을 증가시키기 위한 의약품의 제조에 있어서 상기 설명한 특징들을 지닌 SSO의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 의약품의 제조에 있어서 SSO는 특히 허용 가능한 담체와 통상적으로 혼합된다. 담체는 당연히 제형 내의 다른 성분들과의 친화성 면에서 허용 가능해야 하며 환자에게 유해하지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 하나 이상의 보조적인 치료적 성분을 임의로 포함하는 컴포넌트 (component)들의 혼합으로 본질적으로 구성되는 임의의 약학적 공지 기술에 의해 제조될 수 있는 본 발명의 제형 내에 SSO가 혼입된다.
본 발명의 제형은 활성 화합물의 멸균된 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있으며, 이 조제품은 바람직하게는 목적하는 수용자 (recipient)의 혈액과 등장성이고 필수적으로 발열 물질 (pyrogen)이 없어야 한다. 상기 조제품은 항-산화제, 완충제, 세균발육저지제 (bacteriostat), 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액 (suspension)은 현탁제 (suspending agent) 및 농축제 (thickening agent)를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 제형은 단위 투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액상 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용수의 첨가 만을 필요로 하는 동결-건조된 (lyophilized) 조건에서 보관할 수 있다.
제형에서 SSO는 지질 입자 또는 베시클 (vesicle), 예를 들어 리포좀 (liposome) 또는 미세결정 (microcrystal) 내에 함유될 수 있으며, 이는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 입자는 그 내부에 SSO를 함유하는 한, 유니라멜라 (unilamellar) 또는 플루리라멜라 (plurilamellar)와 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 이러한 입자 및 베시클에는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양전하를 띈 지질이 특히 바람직하다. 상기 지질 입자의 제조는 주지되어 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 6]
SSO는 스플라이싱을 조절하는 임의의 요소 또는 요소들의 조합, 예를 들어 3' 스플라이스 부위, 5' 스플라이스 부위, 분기점 (branch point), 폴리피리미딘 트랙트 (polypyrimidine tract), 엑손 스플라이싱 촉진자 (exonic splicing enhancer), 엑손 스플라이싱 억제자 (exon splicing silencer), 인트론 스플라이싱 촉진자 (intronic splicing enhancer), 및 인트론 스플라이싱 억제자 (intronic splicing silencer)를 표적화할 수 있다. 도 4, 도 5, 및 도 8에 도시된 바와 같이 서열 및 위치가 확인된 SSO들의 활성을 나타내는 하기 표들을 지표로 SSO 서열을 결정할 수 있다. 당업자는 하기 사항들에 주목할 것이다: 1) 엑손에 대해 상보적인 SSO는 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자 부위에 대해 상보적일 필요가 없다, 표 1의 SSO A7-10, B7-7 및 B7-9에 유의; 2) 인트론의 서열 및 엑손의 단 1 개에 불과한 뉴클레오티드에 상보적인 SSO도 유효할 수 있다, 표 1의 A8-5 및 B7-6에 유의; 3) 엑손 바로 옆에 인접한 인트론에 상보적인 SSO도 효과적일 수 있다, 표 2의 3312에 유의; 4) 올리고뉴클레오티드 단독의 효능으로부터 다른 SSO들과의 조합으로서의 SSO의 효능을 통상적으로 예측할 수 있다.
인간 TNF-α수용체를 지향하는 본 발명은 엑손 7 또는 8 및 그들의 인접 인트론을 포함하는 TNFR1 또는 TNFR2 유전자의 부분의 적어도 10 개, 바람직하게는 15 내지 20 개 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 지닌 SSO를 이용하여 실시될 수 있음을, 당업자는 인식한다. 더욱 바람직하게는 엑손 자체의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 상보적 서열 내에 포함된다. SEQ ID Nos: 1-4는 TNFR1(SEQ ID Nos: 1 및 2) 및 TNFR2 (SEQ ID Nos: 3 및 4)의 엑손 7 및 8의 서열 및 측면에 인접한 인트론의 50 개 인접 뉴클레오티드를 포함한다. LNA 또는 G-클램프 뉴클레오티드를 포함하며 이에 한정되지 않는 친화도-증진 개질을 이용할 경우, SSO의 길이를 상응하여 감소시킬 수 있음을 당업자는 인식한다. LNA 및 종래의 뉴클레오티드를 교번하여 사용할 경우 길이 16이 효과적이다. LNA 및 종래의 뉴클레오티드를 교번시키는 양식은 중요하지 않다.
부분적인 "헤어핀" 복나선 ("hairpin" duplex) 구조의 형성을 야기할 수 있는 자가-상보적 (self-complementary) SSO가 되지 않도록 SSO 서열을 신중하게 선택해야 함을 당업자는 인식할 것이다. 또한, 비-특이적 염기 대합의 가능성을 최소화하기 위하여 높은 GC 함량을 피해야 한다. 추가로, 예를 들어 BLAST에 의해 밝혀지는 바와 같이, 표적외 유전자 (off-target gene)에 부합하는 SSO 또한 피해야 한다.
어떤 상황에서는, 인간 및 적어도 하나의 다른 종을 표적화할 수 있는 SSO 서열을 선택함이 바람직할 수 있다. 인간에게 사용하기 전에 본 발명을 상기 다른 종에서 시험 및 최적화하기 위해 이러한 SSO를 사용할 수 있으며, 이는 규제 승인 및 약물 개발 목적에 있어서 유용하다. 예를 들어, 인간 TNFR2를 표적화하는 SEQ ID Nos: 74, 75, 77, 78, 80, 및 89는 상응하는 마카카 물라타 (Macaca Mullata) 서열에도 100% 상보적이다. 결과적으로 상기 서열은 인간에게 사용하기 전에 원숭이에서의 시험 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서 다양한 생략, 부가 및 개질이 상기 본 발명에 대하여 이루어질 수 있음을 당업자는 인식할 것이며, 첨부하는 청구의 범위에 의해 규정되는 바와 같이 이러한 개질 및 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 포함될 것을 의도한다. 모든 참조문헌, 특허, 특허출원 또는 다른 인용 문헌들은 원용으로서 본 명세서에 포함된다.
도 1은 종양괴사인자 수용체 pre-mRNA의 부분 및 TNFR1 및 TNFR2를 위한 스플라이스 산물의 구조를 도시한다. 이러한 전사체는 수용체의 막횡단 도메인을 암호화하는 엑손 7 및 엑손 8을 정상적으로 포함한다. 상기 엑손들 모두 또는 그 중의 하나에 지향된 SSO (막대)는 대안적 스플라이싱 결과를 유도하여 완전한 막횡단 도메인이 결여된 전사체를 야기한다.
도 2는 세포 배양에서 쥐과 (murine) TNFR1에 대한 SSO의 스플라이싱 산물을 나타낸다. NIH-3T3 세포에 가상 트랜스펙션 (mock transfection) [리포펙타민®2000 (LFA2000 단독)]하거나, 엑손 7 누락 (skipping) TNFR1 SSO인 A7-5 또는 A7-10을 단독으로, 또는 엑손 7 누락 SSO 및 엑손 8 누락 SSO인 A8-3의 배합물을, 표시된 농도로 트랜스펙션하였다. 24 시간 후에 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. "전체 길이" TNFR1이 475 bp 밴드로 나타나도록, 엑손 5에서 엑손 9까지를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하였다. 엑손 7이 결여된 전사체 (△ 엑손 7) 및, 엑손 7 및 엑손 8이 모두 결여된 전사체 (△ 엑손 7/8)은 각각 361 bp 및 332 bp 밴드로 나타난다.
도 3은 세포 배양에서 쥐과 TNFR2에 대한 SSO의 스플라이싱 산물을 나타낸다. NIH-3T3 세포에 가상 트랜스펙션 (LFA2000 단독)하거나, 엑손 7 누락 TNFR2 SSO인 B7-6 또는 B7-1을 단독으로, 또는 엑손 7 누락 올리고뉴클레오티드 및 엑손 8 누락 올리고뉴클레오티드인 B8-4의 배합물을, 표시된 농도로 트랜스펙션하였다. 24 시간 후에 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. "전체 길이" TNFR2가 486 bp 밴드로 나타나도록, 엑손 5에서 엑손 9까지를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하였다. 엑손 7이 결여된 전사체 (△ 엑손 7) 및, 엑손 7 및 엑손 8이 모두 결여된 전사체 (△ 엑손 7/8)은 각각 408 bp 및 373 bp 밴드로 나타난다.
도 4a 및 도 4b는 쥐과 TNFR1의 엑손 7 (4a) 및 8 (4b)의 서열 및 그 측면에 인접한 인트론들의 서열을 나타낸다. 또한 스플라이스 스위칭 활성을 조사한 2'O-Me-올리고리보뉴클레오시드-포스포로티오에이트 SSO의 서열도 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 쥐과 TNFR2의 엑손 7 (5a) 및 8 (5b)의 서열 및 그 측면에 인접한 인트론들의 서열을 나타낸다. 또한 스플라이스 스위칭 활성을 조사한 2'O-Me-올리고리보뉴클레오시드-포스포로티오에이트 SSO의 서열도 보여준다.
도 6은 막횡단 엑손을 암호화하는 영역에서 인간 및 쥐과의 TNF 수용체 유전자의 배열을 제공한다. 쥐과 서열인 SEQ ID Nos: 107, 108, 109, 및 110은 인간 서열인 SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 및 4와 각각 동질성을 보인다.
도 7은 마우스 간세포 초대 배양 (primary mouse hepatocyte culture)에서, 도 2 및 도 3에 기술된 바와 같이 활성조사를 수행한, SSO의 스플라이싱 산물을 나타낸다.
도 8a - 도 8d는 표 2 및 표 3으로부터의 마우스 및 인간 TNFR2 (TNFRSF1B) (8a 및 8b) 및 TNFR1 (TNFRSF1A) (8c 및 8d) LNA SSO 서열을 제공한다. 도 8a 및 도 8c는 표적 엑손에 대한 각 SSO의 상대적 위치를 도식적으로 설명한다. 도 8b 및 도 8d는 pre-mRNA 서열 (5'에서 3'으로) 및 그에 혼성화된 SSO (3'에서 5'으로)를 나타낸다.
도 9는 LAN SSO로 처리한 L929 쥐과 세포에서의 스플라이싱 산물을 나타낸다. 세포를 표시된 LNA SSO로 최종 농도 50 nM에서 트랜스펙션하였다. 24 시간 후에, 세포를 용해시키고 RT-PCR로 스플라이스 스위칭을 분석하였다. 상단 패널, 엑손 7을 표적화하는 SSO; 하단 패널, 엑손 8을 표적화하는 SSO. FL, 전체 길이 TNFR2 앰플리콘; △7, △8, △7/8, 각 TNFR2 스플라이스 변형체의 앰플리콘.
도 10은 TNFR2를 표적화하는 LNA SSO 배합물을 이용한 L929 쥐과 세포에서의 스플라이싱 산물을 나타낸다. L929 세포에 표시된 단독 또는 다중 LNA SSO를 각각 50 nM로 처리하고 도 9에 기술한 바와 같이 24 시간 후에 분석하였다.
도 11은 TNFR1을 표적화하는 LNA SSO 배합물을 이용한 L929 쥐과 세포에서의 스플라이싱 산물을 나타낸다. L929 세포에 표시된 단독 또는 다중 LNA SSO를 각각 50 nM로 처리하고 24 시간 후에 도 9에 기술한 바와 같이 분석하였다.
도 12는 LNA SSO로 처리한 초대 마우스 간세포에서의 스플라이싱 산물을 나타낸다. 초대 마우스 간세포를 각각 최종 농도 33 nM의 표시된 단독 또는 다중 LNA SSO로 트랜스펙션하고 도 9에 기술된 바와 같이 분석하였다.
도 13은 L929 세포 (좌) 및 초대 마우스 간세포 (우)에서의 분비성 TNFR2 스플라이스 변형체의 검출을 도식적으로 설명한다. 세포를 표시된 LNA SSO로 트랜스펙션하였다. 72 시간 후에, 세포외 배지를 수거하고 R&D 시스템즈 (Minneapolis, MN)의 Quantikine® 마우스 sTNF RII ELISA 키트로부터의 항체를 사용하여 효소결합 면역분석법 (ELISA)으로 분석하였다. 데이터를 mL 당 pg 가용성 TNFR2로 표시하였다.
도 14는 TNFR2를 표적화하는 LNA SSO로 처리한 초대 인간 간세포에서의 스플라이싱 산물을 나타낸다. 초대 인간 간세포를 표시된 LNA SSO로 트랜스펙션하고 도 9에 기술된 바와 같이 24 시간 후에 RT-PCR로 스플라이스 스위칭을 분석하였다. "전체 길이" (FL) TNFR2가 463 bp 밴드로 나타나도록, 엑손 5에서 엑손 9까지를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하였다. 엑손 7이 결여된 전사체 (△ 엑손 7), 엑손 8이 결여된 전사체 (△ 엑손 8) 및, 엑손 7 및 엑손 8이 모두 결여된 전사체 (△ 엑손 7/8)은 각각 385 bp, 428 bp, 및 350 bp 밴드로 나타난다.
도 15는 마우스에서 LNA 3274 (상단) 및 3305 (하단)의 복막내 (i.p.) 주사에 대한 스플라이싱 산물을 나타낸다. LNA 3274는 25 mg/kg/day로 4 일간 (4/1 및 4/10) 또는 10 일간 (10/1) 복막내 주사하였다. 최종 주사로부터 1 일 (4/1 및 10/1) 또는 10 일 (4/10) 후에 마우스들을 희생시키고 간으로부터의 전체 RNA를 TNFR2의 스플라이스 스위칭에 대해 RT-PCR로 분석하였다. LNA 3305는 표시된 일일 용량으로 4 일간 주사하였다. 익일에 마우스들을 희생시키고 3274 처리 동물들에서와 같이 간을 분석하였다.
도 16 (상단 패널)은 SSO 처리로부터 10 일 후의 마우스 혈청 중의 가용성 TNFR2 양을 도식적으로 설명한다. 표시된 SSO 또는 식염수를 25 mg/kg/일로 10 일간 마우스에게 복막내 주사하였다 (그룹당 n=5). 주사 개시 4 일전 및 최종 주사 후 표시된 일수에 혈청을 수집하였다. 도 13에 기술한 바와 같이 혈청을 ELISA로 분석하였다. 제 10 일에, 마우스들을 희생시키고 도 9에 기술한 바와 같이 RT-PCR로 TNFR2 스플라이스 스위칭에 대하여 간을 분석하였다 (하단 패널)
도 17은 TNFR2 SSO 처리 후 혈청 중의 가용성 TNFR1의 양을 도식적으로 설명한다. 가용성 TNFR1에 대해 R&D 시스템즈 (Minneapolis, MN)의 Quantikine® 마우스 sTNF RI ELISA 키트로부터의 항체를 사용하여 도 16으로부터의 마우스 혈청을 ELISA로 분석하였다.
도 18 (상단 패널)은 SSO 처리로부터 27 일 후의 마우스 혈청 중의 가용성 TNFR2의 양을 도식적으로 설명한다. 최종 주사 후 27 일까지 혈청 샘플을 수집한 점을 제외하고는, 도 16에서와 같이 마우스들을 처리하였다. LNA 3083 및 3272는 TNFR2 스플라이스 스위칭 기능이 없는 대조군 SSO이다. 제 27 일에 마우스들을 희생시키고 도 9에 기술한 바와 같이 RT-PCR로 TNFR2 스플라이스 스위칭에 대해 간을 분석하였다.
도 19는 LNA 올리고뉴클레오티드-처리 마우스 혈청 중의 항-TNF-α 활성을 도시한다. L929 세포를 0.1 ng/mL의 TNF-α (TNF) 또는 표시된 올리고뉴클레오티드로 처리한 마우스로부터의 10% 혈청을 부가한 TNF-α (도 18 참조)로 처리하였다. 24 시간 후에 세포 생존력을 측정하여 처리하지 않은 세포들 (비처리)에 표준화 (normalize) 하였다.
도 20은 도 19에 기술된 생존력 활성조사를 이용하여 LNA 올리고뉴클레오티드-처리 마우스 혈청의 항-TNF-α 활성을 재조합 가용성 TNFR2 (rsTNFR2) 및 Enbrel®의 활성과 도식적으로 비교한다.
실시예 1
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드. 전체가 균일하게 개질된 2'-O-메틸-리보뉴클레오시드-포스포로티오에이트 (2'-OMe) 20량체는 Trilink Biotechnologies, SanDiego, CA에 의해 합성되었다. 그 서열은 표 1에 열거되어 있다. 표 2 및 표 3은 교번하는 2'데옥시- 및 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 가진 키메릭 LNA SSO들의 서열을 나타낸다. 이들은 Santaris Pharma, Denmark에 의해 합성되었다. 각각의 LNA 올리고뉴클레오티드에 있어서, 5'-말단 뉴클레오시드는 2'O-4'-메틸렌-리보뉴클레오시드이고 3'-말단 리보뉴클레오시드는 2'데옥시-리보뉴클레오시드이다.
세포 배양 및 트랜스펙션. NIH-3T3 세포는 10% 콜로라도 송아지 태아 혈청 (fetal calf serum) 및 항생제로 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media)에서 유지하였다 (37 ℃, 5% CO2). L929 세포는 10% 우태혈청 (fetal bovine serum) 및 항생제로 보충된 최소필수배지 (minimal essential media)에서 유지하였다 (37 ℃, 5% CO2). 트랜스펙션을 위하여 NIH-3T3 또는 L929 세포를 웰당 105 세포로 24-웰 플레이트에 접종하고, 24 시간 후에 트랜스펙션하였다. 표시된 농도에서 제조자 지침에 따라 올리고뉴클레오티드를 2 μL의 리포펙타민™ 2000 트랜스펙션 시약 (Invitrogen)과 복합체화 (complexed)시켰다. 뉴클레오티드/지질 복합체를 세포에 적용하고 수 시간 동안 배양하였다. 배지를 흡인 제거하고 TRI-시약™ (MRC, Cincinnati, OH)으로 세포를 수거하였다.
RT- PCR. TRI-시약 (MRC, Cincinnati, OH)으로 전체 RNA를 분리하고 공급자 지침에 따라 rTth 폴리머라제 (Applied Biosystems)를 이용하여 RT-PCR에 의해 TNFR1 또는 TNFR2 mRNA를 증폭하였다. 쥐과 TNFR1 mRNA는 순방향 (forward) 프라이머 PS009 (SEQ ID No: 111) (5'-GAA AGT GAG TGC GTC CCT TGC-3') 및 역방향 (reverse) 프라이머 PS010 (SEQ ID No: 112) (5'-GCA CGG AGC AGA GTG ATT CG-3')을 사용하여 증폭하였다. 쥐과 TNFR2 mRNA는 순방향 프라이머 PS003 (SEQ ID No: 113) (5'-GAG CCC CAA ATG GAA ATG TGC-3') 및 역방향 프라이머 PS004 (SEQ ID No: 114) (5'-GCT CAA GGC CTA CTG CC-3')을 사용하여 증폭하였다. 인간 TNFR2 mRNA는 순방향 프라이머 (SEQ ID No: 115) (5'-ACT GAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC-3') 및 역방향 프라이머 (SEQ ID No: 116) (5'-CCT TAT CGG CAG GCA AGT GAG-3')을 사용하여 증폭하였다. 가시화 (visualization)를 위하여, PCR 단계에 Cy5-표지된 dCTP (GE Healthcare)를 포함시켰다 (50 μL PCR 반응당 0.1 μL). PCR 사이클을: 95 ℃, 60 sec; 56 ℃, 30 sec; 72 ℃, 60 sec로 총 22 사이클 진행하였다. PCR 산물을 10% 비-변성 (non-denaturing) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, Cy5-표지된 밴드들을 Typhoon™9400 스캐너 (GE Healthcare)로 가시화하였다. 스캔을 ImageQuant™ (GE Healthcare) 소프트웨어로 정량화하였다.
마우스 간세포 배양. 간세포 수집을 위하여 마우스들의 간을 0.53 mg/ml의 콜라게나제 (Worthington Type 1, code CLS)를 함유하는 RPMI 배지로 관류 (perfused)시켰다. 관류 후에, 세포 현탁액을 수집하여 10% (부피비) FBS, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 1 nM 인슐린 및 13 nM 덱사메타존을 함유하는 RPMI의 정지 용액 (stop solution)에 접종하였다. 약 3 × 105 세포가 6-웰 콜라겐-코팅 플레이트에 접종되었다. 1 시간 후에 접종 배지를 10% (부피비) FBS가 없는 접종배지로 구성된 유지 배지로 교체하였다. 24 시간 후에 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 양을 변화시키면서 적용하였다. 트랜스펙션 후 24 시간에 TRI-시약™으로 세포를 용해시켰다.
인간 간세포 배양. 인간 간세포는 ADMET technologies 또는 UNC-Chapel Hill의 The UNC Cellular Metabolism and Transport Core로부터 현탁액으로 입수하였다. 세포를 세척하여 10% FBS, 1 ㎍/mL 인간 인슐린, 및 13 nM 덱사메타존으로 보충한 RPMI 1640에 현탁하였다. 간세포를 3 mL 배지 중에 플레이트 당 0.5 × 106 세포로 6-웰 플레이트에 평판배양하였다. 1-1.5 시간 후에 비점착 (non-adherent) 세포를 제거하고, 1 ㎍/mL 인간 인슐린 및 130 nM 덱사메타존으로 보충한, FBS가 없는 RPMI 1640으로 배지를 교체하였다.
6-웰 플레이트에서 LNA SSO들을 간세포에 전달하기 위해 10 μL의 5 μM LNA 스톡을 100 μL의 OPTI-MEM™에 희석시키고, 4 μL의 리포펙타민™2000을 100 μL의 OPTI-MEM™에 희석시켰다. 2800 μL의 배지가 들어있는 6-웰 플레이트에서 200 μL의 복합체 용액을 세포에 적용하여, 총 3000 μL가 되도록 하였다. LNA의 최종 농도는 17 nM이었다. 24 시간 후에 세포를 TRI-시약™ 내에 수거하였다. 전체 RNA를 제조자 지침에 따라 분리하였다. 약 200 ng의 전체 RNA를 역전사-PCR (RT-PCR)에 제공하였다.
ELISA. 세포 배양 배지 또는 마우스 혈청에서 가용성 TNFR2의 수준을 결정하기 위하여, R&D Systems (Minneapolis, MN)의 Quantikine® 마우스 sTNF RII ELISA 키트를 사용하였다. 세포 배양 배지 또는 마우스 혈청에서 가용성 TNFR1의 수준을 결정하기 위하여, R&D Systems (Minneapolis, MN)의 Quantikine® 마우스 sTNF RI ELISA 키트를 사용하였다. 검출을 위해 사용되는 항체는 수용체의 프로테아제 절단 형태도 검출함에 유의한다.
세포 배양 연구를 위하여, 트랜스펙션 후 72 시간에 세포외 배지를 수집하였다. 제조자 지침에 따라 50 μL의 희석하지 않은 배지를 사용하여 활성조사를 수행하였다. 활성조사 판독은 570 nm에서 파장을 보정하여 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 수행하였다.
마우스 생체내 연구를 위하여, 동물로부터의 혈액을 37 ℃에서 1 시간 동안 응고시키고 14,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다 (Jouan BRA4i 원심분리기). 혈청을 수집하여 제조자 지침에 따라 1:10으로 희석한 50 μL의 마우스 혈청을 사용하여 활성을 조사하였다. 활성조사 판독은 570 nm에서 파장을 보정하여 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 수행하였다.
L929 세포독성 활성조사. 96-웰 플레이트에 플레이트 당 104 세포로 평판배양한 L929 세포를, 표시된 올리고뉴클레오티드로 처리한 마우스로부터의 10% 혈청 존재 하에, 총 100 μL의 세포 배양 배지 내에서 0.1 ng/mL TNF-α (TNF) 및 악티노마이신 D (ActD)로 처리하였다. 대조군 레인은 처리하지 않은 마우스로부터의 10% 혈청 내에서 평판배양하였다. 24 시간 후에 20 μL CellTiter 96® 수용액 (Promega)를 가하고 마이크로플레이트 판독기로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존력을 측정하였다. 세포 생존력을 TNF/ActD로 처리하지 않은 세포에 대해 표준화하였다.
실시예 2
SSO의 스플라이스 스위칭 활성 시험
SSO를 합성하여 NIH-3T3 또는 L929 세포에 트랜스펙션하였다. 세포로부터의 전체 RNA를 RT-PCR로 분석하여 SSO의 스플라이스 스위칭 능력을 평가하였다. 표 1은 20 뉴클레오티드 2'O-Me-리보뉴클레오시드-포스포로티오에이트 쥐과 SSO들의 서열 및 스플라이스 스위칭 활성을 수록한다. 표 2는 16 뉴클레오티드 키메릭 LNA 쥐과 SSO들의 서열 및 스플라이스 스위칭 활성을 수록한다. 표 3은 16 뉴클레오티드 키메릭 LNA 인간 SSO들의 서열 및 스플라이스 스위칭 활성을 수록한다. 각각의 표는 상보적 영역에 의한 각 SSO의 표적 부위 및 뉴클레오티드의 숫자도 열거한다; 예를 들어 I6:E7(8:8)은 인트론 6의 가장 3' 쪽 8 뉴클레오티드 및 엑손 7의 가장 5' 쪽 8 뉴클레오티드에 대해 상보적임을 의미한다; E7(16)은 엑손 7 내의 16 뉴클레오티드에 상보적임을 의미하고; E8:I8(7:9)는 엑손 8의 가장 3' 쪽 7 뉴클레오티드 및 인트론 8의 가장 5' 쪽 9 뉴클레오티드에 대해 상보적임을 의미한다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
실시예 3
L929 마우스 세포에 대한 SSO의 효과
단일 LNA SSO를 L929 쥐과 세포에 트랜스펙션하고 TNFR2의 스플라이스 스위칭을 분석하였다. 도 9 (상단)는 마우스 엑손 7을 표적화하는 LNA들의 스플라이스 스위칭 결과를 나타낸다. 시험한 LNA들 중에서 적어도 9 개가 활성을 나타냈다. 특히 LNA 3312, 3274 및 3305는 엑손 7의 누락을 50% 이상까지 유도하였다; LNA 3305 처리는 거의 완전한 누락을 유발하였다. 도 9 (하단)는 마우스 엑손 8을 표적화하는 SSO들의 활성을 나타낸다. 데이터는 LNA 3315 및 3316이 엑손 8의 약 20% 누락을 유도함에 있어서 동일한 효능을 지녔음을 보여준다. 엑손 8이 작으므로 (35 nts), 엑손 8-포함 및 엑손 8-결실 PCR 단편들의 차이 또한 작음에 유의한다.
실시예 4
L929 마우스 세포에 대한 다중 SSO의 효과
엑손 7 및 8을 표적화하는 LNA SSO들을 배합하여 L929 세포에 트랜스펙션하고, 이러한 처리가 TNFR2 △7/8 mRNA의 생성을 유발하는지 여부를 결정하였다. 도 10의 데이터는 엑손 8 표적화 3315 또는 3316을 엑손 7 표적화 LNA 3305, 3309, 3312, 또는 3274 중의 하나와 배합하였을 때 2 개 엑손 모두의 누락을 동시에 유도함을 보여준다. 특히, LNA 3305 및 3315의 배합은 60%를 초과하는 △7/8 mRNA로의 이행 (shift)을 유발하였으며, 나머지는 거의 전부 △7 mRNA였다. 다른 배합들도 효과적이었다; 3274 및 3315의 배합은 △7/8 mRNA로의 50% 이행을 유발하였다. 이러한 데이터는 대안적으로 스플라이싱된 TNFR2 mRNA를 유도함에 있어서 LNA SSO들이 매우 효과적임을 의미한다. 마찬가지로 TNFR1 엑손 7 및 8을 표적화하는 LNA SSO들의 배합도 L929 세포에서 그들 각각의 엑손들의 이행을 유도하였다 (도 11).
실시예 5
초대 마우스 간세포에 대한 LNA SSO들의 효과
TNFR2 LNA SSO들을 초대 마우스 간세포에 트랜스펙션한 결과, 이러한 세포에서의 스플라이스 스위칭에 동일하게 효과적임을 발견하였다. 특히, LNA 3315와 배합한 LNA 3274 또는 3305의 처리는 L929 세포에서 발견한 것과 매우 유사한 스플라이스 이행 프로파일을 나타내었다 (도 12). 상기 데이터로부터 스플라이스 이행이 의도된 생체내 세포 표적에서도 일어남이 확인된다.
실시예 6
쥐과 세포로부터의 TNFR2 스플라이스 변형체의 분비
가용성 TNFR2 단백질의 생산 및 세포외 배지로의 분비를 유도하는 LNA SSO들의 능력을 시험하였다. L929 세포를 상기와 같이 LNA SSO들로 처리하고, 트랜스펙션 후 48 시간에 세포외 배지 시료를 수집하였다. 시료들을 가용성 TNFR2에 특이적인 ELISA로 정량분석하였다 (△7 및 △7/8 단백질 동종형에 대하여). 도 13 좌측 패널은 RNA 스플라이싱의 이행을 최상으로 유도한 LNA들이 또한 세포외 배지로 가장 많은 단백질을 분비하였음을 나타낸다. 특히, LNA 3305, 3312 및 3274가 가용성 TNFR2를 백그라운드 대비 적어도 3.5-배 증가시키고 250 pg/mL 가용성 스플라이스 변형체를 산출하면서 최상의 성과를 보였다. 유사하게 처리한 초대 마우스 간세포에서도 증가가 관찰되었다 (도 13, 우측 패널). 이러한 초대 세포에서, LNA 3274 또는 3305의 단독 처리는 세포외 배지 중의 가용성 TNFR2를 약 2.5-배 증가시켜 ~200 pg/mL의 가용성 스플라이스 변형체를 산출하였고, 3274 또는 3305를 3315와 배합하였을 때에도 단백질 생산이 증가하였다. 따라서, 스플라이스 변형체 mRNA의 유도는 가용성 TNFR2의 생산 및 분비와 관련되어 있다.
실시예 7
초대 인간 간세포에 대한 LNA SSO들의 효과
인간 TNFR2 pre-mRNA에 대한 LNA SSO들을 초대 배양 인간 간세포에 트랜스펙션 시켰다. 도 14는 엑손 7에 표적화된 10 개 SSO 중 7 개가 스플라이스 스위칭 활성을 보였음을 나타낸다. 특히, LNA 3378, 3384 및 3479는 엑손 7의 적어도 75% 누락을 나타내었다. 유사하게, 5 개의 엑손 8 표적화 SSO 중의 4 개가 활성을 보였다. 흥미롭게도, LNA 3464, 3465, 또는 3466은 단독으로 △7/8 스플라이스 제거를 충분히 유도하였으며, 이는 마우스 세포에서는 관찰되지 않은 사실이다. 그러므로 엑손 7 및 엑손 8 모두의 누락을 유도하기 위하여 단지 하나의 SSO가 요구될 수 있다. 상기 데이터로부터, 의도하는 인간 치료적 표적에서 스플라이스 이행이 일어남이 확인된다.
실시예 8
마우스에서 LNA SSO의 생체내 주사
식염수만으로 희석하여 3 mg/kg 내지 25 mg/kg의 투여량으로 LNA 3305를 마우스에게 1 일 1 회 4 일 동안 복막내 (i.p.) 주사하였다. 제 5 일에 마우스를 희생시켜 간으로부터의 전체 RNA를 RT-PCR로 분석하였다. 데이터는 세포 배양에서 발견된 것과 유사한 스플라이스 스위칭 효능을 나타냈다. 25 mg/kg의 최대 투여량에서, LNA 3305는 △7 mRNA로의 거의 완전한 전환을 유도하였다 (도 15, 하단 패널).
LNA 3274를 사용한 유사한 절차에 의해 △7 mRNA로의 약 20% 전환이 유도되었다. LNA 3274에 의한 △7 mRNA의 유도를 최적화하기 위하여, 투여량 처방 계획 및 최종 주사로부터 동물을 희생시키기까지의 시간 간격을 변화시켰다. 식염수만으로 희석하여 25 mg/kg으로 LNA 3274를 마우스에게 1 일 1 회 4 일 동안 주사하였다 (i.p.). 제 15 일에 분석한 마우스에서, 반면에 제 5 일에 분석한 마우스들은 20%에 불과한 △7 mRNA로의 이행을 나타냈다 (도 15, 상단 패널). 또한, 10 일 동안 주사를 투여 받고 제 11 일에 희생된 마우스들은 △7 mRNA의 50% 유도를 보였다 (도 15 상단). 이러한 생체내 데이터는 TNFR2 LNA SSO가 간에 잔존하여 투여 후 적어도 10 일간 스플라이스 스위칭을 유도함을 시사한다.
실시예 9
순환상의 (circulatory) TNFR 스플라이스 변형체
간에서의 △7 mRNA의 유도는, 분비되어 순환 내에 축적되는 가용성 TNFR을 생산할 것이다. 그러므로 마우스들을 LNA 3274, 3305, 또는 대조군 3083 단독으로 10 일간 25 mg/kg/일로 i.p. 처리하였다. 주사 전에 마우스들로부터 채혈하고 최종 주사로부터 1, 5 및 10 일 후에 다시 채혈하였다. 혈청 중의 가용성 TNFR2의 농도를 정량분석하였다. 도 16은 LNA 처리가 6000-8000 pg/mL의 가용성 TNFR2 (△7)를 유도하며, 이는 적어도 10일간 백그라운드에 비해 유의적으로 높았음을 보여준다. 동일한 시료를 가용성 TNFR1 생산에 대해 활성 조사하였다. 가용성 TNFR1의 증가는 관찰되지 않았다 (도 17).
더욱 긴 시간 지점에서 효과를 시험하기 위하여, 동일한 실험을 수행하면서 최종 주사로부터 27 일까지 혈청내 가용성 TNFR2에 대해 마우스들을 분석하였다. 그 결과는, 최종 LNA SSO 주사로부터 27일 후에 가용성 TNFR2 수준에는 단지 경미한 감소가 있을 뿐임을 보여준다 (도 18). 상기 데이터는 LNA의 효과가 적어도 27 일간 잔존함을 시사한다.
실시예 10
LNA SSO로 처리한 마우스의 항-TNF-α 활성의 측정
LNA 3274 처리 마우스로부터의 혈청의 항-TNF-α 활성을 L929 세포독성 활성조사에서 시험하였다. 이 활성조사에서는 배양된 L929 세포를 고정된 농도의 TNF-α의 세포독성 효과로부터 보호하는 능력에 대하여 혈청을 시험하였다. L929 세포를 100 μL의 완비된 MEM 배지 (10% 정규 FBS 함유) 중에 웰당 2 × 104 세포로 96-웰 플레이트에 접종하고 37 ℃에서 24 시간 동안 성장시켰다. 도 19에 나타낸 바와 같이, LNA 3274로 처리한 마우스들로부터의 혈청은 0.1 ng/mL TNF-α에 노출된 L929 세포의 생존력을 증가시켰으나, 대조군 LNA (3083 또는 3272)는 그렇지 않았다. 그러므로, LNA 3274 혈청은 △7 TNFR2 TNF-α 길항제를 함유하며, 이는 TNF-α에 결합하고 비활성화함으로써 세포를 TNF-α의 세포독성 효과로부터 보호하기에 충분하다. 이러한 항-TNF-α 활성은 3274 LNA의 최종 주사로부터 5 일 및 27 일 후의 동물들의 혈청에 존재하였다.
실시예 11
다른 항-TNF-α 약제에 대한 LNA SSO의 비교
실시예 10에서와 같이 L929 세포를 접종하였다. (i) rsTNFR2 (재조합 가용성) (0.01-3 ㎍/ml), (ii) LNA3274 처리 마우스로부터의 혈청 (1.25-10%, 처리하지 않은 마우스로부터의 혈청에 희석) 또는 (iii) Enbrel® (0.45-150 pg/ml)과 함께 90 μL의 무혈청 MEM, 0.1 ng/ml TNF-α (TNF) 및 1 ㎍/ml의 악티노마이신 D (ActD)를 함유하고, 마우스 혈청의 최종 농도가 10%, 최종 부피 100 μL가 되도록 시료를 제조하였다. 시료들을 실온에서 30 분간 배양하였다. 이어서 시료들을 평판배양 세포에 적용하고 5% CO2 습윤 대기중에 37℃에서 ~24 시간 동안 배양하였다. 20 μL CellTiter 96® 수용액 (Promega)을 가하여 마이크로플레이트 판독기로 490 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 세포 생존력은 TNF/ActD로 처리하지 않은 세포에 대하여 표준화하였다.
<110> SAZANI, PETER L. KOLE, RYSZARD ORUM, HENRIK <120> SPLICE SWITCHING OLIGOMERS FOR TNF SUPERFAMILY RECEPTORS AND THEIR USE IN TREATMENT OF DISEASE <130> 7353-4 <140> US/11/595,485 <141> 2006-11-10 <150> 60/862,350 <151> 2006-10-20 <150> 60/735,429 <151> 2005-11-10 <160> 116 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 214 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgcggccccc ctctgcccgc tcctctgacc aacacctgct ttgtctgcag gcaccacagt 60 gctgttgccc ctggtcattt tctttggtct ttgcctttta tccctcctct tcattggttt 120 aatgtatcgc taccaacggt ggaagtccaa gctctactcc attggtgagt gggggctttg 180 ggagggagag ggagctggtg ggggtgaggg agga 214 <210> 2 <211> 129 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggctgagag aggaagtgaa atttatgatg ctttctttct ttttcctcag tttgtgggaa 60 atcgacacct gaaaaagagg tgagatgaaa tgagagagtt actcccaaat gtccctgacc 120 attccttat 129 <210> 3 <211> 178 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 acatttgagt ttgttttctg tagctgtctg agcttctctt ttctttctag gactgattgt 60 gggtgtgaca gccttgggtc tactaataat aggagtggtg aactgtgtca tcatgaccca 120 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 56 cagagggata ctcacc 16 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 57 cgcagaggga tactca 16 <210> 58 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 58 gaacaagtca gaggca 16 <210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 59 gaggcaggac ttcttc 16 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 60 cgcagtacct gcagac 16 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 61 agtacctgca gaccag 16 <210> 62 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 62 ggcaacagca ccgcag 16 <210> 63 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Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 76 agtagaccca aggctg 16 <210> 77 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 77 ccactcctat tattag 16 <210> 78 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 78 caccactcct attatt 16 <210> 79 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 79 ctgggtcatg atgaca 16 <210> 80 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 80 acttttcacc tgggtc 16 <210> 81 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 81 tcttactttt cacctg 16 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 82 tggactctta cttttc 16 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 83 aggatggact cttact 16 <210> 84 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 84 aaggatggac tcttac 16 <210> 85 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 85 cttctctata aagagg 16 <210> 86 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 86 ccttggcttc tctctg 16 <210> 87 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 87 tcaccacctt ggcttc 16 <210> 88 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 88 actcaccacc ttggct 16 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Synthetic oligonucleotide <400> 89 gacactcacc accttg 16 <210> 90 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Claims (72)

  1. 종양괴사인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor) (TNFR) 수퍼패밀리 (superfamily)에 대한 리간드의 활성을 감소시키기 위한 시간 및 양으로 하나 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머 (splice switching oligomer) (SSO)를 대상에게 투여하며, 여기에서 하나 이상의 SSO는 상기 수용체의 안정하고, 분비성이며, 리간드-결합성인 형태의 생산을 증가시키기 위하여 상기 수용체를 암호화하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경하는 능력을 지님을 특징으로 하는, 염증성 질환 (disease) 또는 증상 (condition)의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용체의 막 결합 형태 (membrane bound form)의 생산이 감소되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8, 및 TNFRSF11A로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 포유류 수용체인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 포유류 수용체가 인간 수용체, 영장류 수용체, 또는 쥐과 (murine) 수용체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 수용체가 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 수용체가 인간 TNFRSF1B인 방법.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 리간드가 TNF-α, RANKL, CD40L, LT-α 또는 LT-β인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 리간드가 TNF-α인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 질환 또는 증상이 류머티즘성 관절염, 소아 류머티즘성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease; 크론병 (Crohn's disease) 또는 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)), 간염 (hepatitis), 패혈증 (sepsis), 알콜성 간질환 (alcoholic liver disease) 및 비-알콜성 지방간 (non-alcoholic steatosis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 간염이 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스와 연계된 간염, 또는 허혈/재관류 (ischemia/reperfusion)를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 2 개 이상의 SSO가 투여되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, pre-mRNA의 스플라이싱 변경이 수용체의 막 횡단 도메인 (membrane spanning domain)의 적어도 일부를 암호화하는 하나 이상의 엑손 (exon)의 삭제를 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5 또는 TNFRSF11A이고 pre-mRNA의 스플라이싱 변경이 pre-mRNA로부터의 엑손 7, 엑손 8, 또는 양자 모두의 삭제를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, pre-mRNA의 스플라이싱 변경이 엑손 7의 삭제를 포함하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 수용체가 TNFRSF8이고 pre-mRNA의 스플라이싱 변경이 pre-mRNA로부터의 엑손 11의 삭제를 포함하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, SSO가 SEQ ID Nos: 1, 2, 3 또는 4로부터의 연속적인 서열 (contiguous sequence)에 상보적인 적어도 10 내지 적어도 20 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 51-164, SEQ ID No: 2의 51-79, SEQ ID No: 3의 51-127, 또는 SEQ ID No: 4의 51-85에 의해 암호화되는 엑손으로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드에 상보적인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 뉴클레오티드가 상기 엑손들 중의 하나의 적어도 2, 5, 8 또는 10 뉴클레오티드에 상보적인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 뉴클레오티드가 상기 엑손들로부터 선택된 서열들에만 상보적인 방법.
  22. 제18항에 있어서, SSO가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 1-50, SEQ ID No: 1의 165-215, SEQ ID No: 2의 1-50, SEQ ID No: 2의 80-130, SEQ ID No: 3의 1-50, SEQ ID No: 3의 128-178, SEQ ID No: 4의 뉴클레오티드 1-50, 또는 SEQ ID No: 4의 86-136에 의해 암호화되는 인트론 (intron)에만 상보적인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드만를 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 각각 2'O-4'C-(메틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 각각 2'O-4'C-(에틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드인 방법.
  26. 제23항에 있어서, SSO가 2'O-Me 리보뉴클레오티드 및 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, SSO가 적어도 4 개의 LNA 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  28. 제18항에 있어서, SSO의 서열이 SEQ ID Nos: 74, 75, 77, 78, 80, 82, 84, 및 86-89로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 비경구, 국소, 경구, 직장, 또는 폐 투여인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 비경구 투여가 복막내, 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 근육내 주사 또는 주입인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 투여가 경구 또는 피하인 방법.
  32. 세포에 하나 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO)를 투여하며, 여기에서 하나 이상의 SSO는 수용체의 안정하고, 분비성이며, 리간드-결합성인 형태의 생산을 증가시키기 위하여 수용체를 암호화하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경하는 능력을 지님을 특징으로 하여, TNFR 수퍼패밀리에 속하는 수용체의 안정하고, 분비성이며, 리간드-결합성인 형태의 생산을 세포내에서 증가시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 수용체의 막 결합 형태의 생산이 감소되는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 방법이 생체내에서 수행되는 방법.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 방법이 시험관내에서 수행되는 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8 및 TNFRSF11A로 구성되는 그룹으로부터 선택된 포유류 수용체인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 포유류 수용체가 인간, 영장류, 또는 쥐과 수용체인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 수용체가 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 수용체가 인간 TNFRSF1B인 방법.
  41. 제37항에 있어서, SSO가 SEQ ID Nos: 1, 2, 3 또는 4로부터의 연속적인 서열에 상보적인 적어도 10 내지 적어도 20 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 51-164, SEQ ID No: 2의 51-79, SEQ ID No: 3의 51-127, 또는 SEQ ID No: 4의 51-85에 의해 암호화되는 엑손으로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드에 상보적인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상보적 서열이 상기 엑손들 중의 하나의 적어도 2, 5, 8 또는 10 뉴클레오티드에 상보적인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 뉴클레오티드가 상기 엑손들로부터 선택된 서열들에만 상보적인 방법.
  45. 제41항에 있어서, SSO가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 1-50, SEQ ID No: 1의 165-215, SEQ ID No: 2의 1-50, SEQ ID No: 2의 80-130, SEQ ID No: 3의 1-50, SEQ ID No: 3의 128-178, SEQ ID No: 4의 뉴클레오티드 1-50, 또는 SEQ ID No: 4의 86-136에 의해 암호화되는 인트론에만 상보적인 방법.
  46. 제32항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드만를 포함하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 각각 2'O-4'C-(메틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 각각 2'O-4'C-(에틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드인 방법.
  49. 제46항에 있어서, SSO가 2'O-Me 리보뉴클레오티드 및 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  50. 제46항에 있어서, SSO가 적어도 4 개의 LNA 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 방법.
  51. 적어도 10 개 내지 적어도 20 개의 뉴클레오티드를 포함하며, SSO가 수용체의 안정하고, 분비성이며, 리간드-결합성인 형태를 생산하기 위하여 TNFR 수퍼패밀리에 속하는 수용체를 암호화하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경하는 능력을 지닌 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO).
  52. 제51항에 있어서, pre-mRNA의 스플라이싱 변경이 수용체의 막 횡단 도메인의 적어도 일부를 암호화하는 하나 이상의 엑손의 삭제를 포함하는 SSO.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 수용체가 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8, 및 TNFRSF11A로 구성되는 그룹으로부터 선택된 포유류 수용체인 SSO.
  54. 제53항에 있어서, 포유류 수용체가 인간, 영장류, 또는 쥐과 수용체인 SSO.
  55. 제54항에 있어서, 수용체가 TNFSF1A 또는 TNFRSF1B인 SSO.
  56. 제55항에 있어서, 수용체가 인간 TNFSF1A 또는 인간 TNFRSF1B인 SSO.
  57. 제56항에 있어서, 수용체가 인간 TNFSF1B인 SSO.
  58. 제56항에 있어서, SEQ ID Nos: 1, 2, 3 또는 4로부터의 연속적인 서열에 상보적인 적어도 10 개 내지 적어도 20 개의 뉴클레오티드를 포함하는 SSO.
  59. 제58항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 51-164, SEQ ID No: 2의 51-79, SEQ ID No: 3의 51-127 또는 SEQ ID No: 4의 51-85에 의해 암호화되는 엑손으로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드에 상보적인 SSO.
  60. 제59항에 있어서, 뉴클레오티드가 상기 엑손들 중의 하나의 적어도 2, 5, 8 또는 10 개 뉴클레오티드에 상보적인 SSO.
  61. 제59항에 있어서, 뉴클레오티드가 상기 엑손들로부터 선택된 서열들에만 상보적인 SSO.
  62. 제58항에 있어서, SSO가 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 1-50, SEQ ID No: 1의 165-215, SEQ ID No: 2의 1-50, SEQ ID No: 2의 80-130, SEQ ID No: 3의 1-50, SEQ ID No: 3의 128-178, SEQ ID No: 4의 뉴클레오티드 1-50 또는 SEQ ID No: 4의 86-136에 의해 암호화되는 인트론에만 상보적인 SSO.
  63. 제51항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 SSO.
  64. 제63항에 있어서, SSO가 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨 (HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 상기 중 어느 하나의 포스포로티오에이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 (PNA) 유사체; 상기 중 어느 하나의 메틸포스포네이트 유사체, 상기 중 어느 하나의 펩티드 핵산 유사체, 상기 중 어느 하나의 N3'→P5' 포스포르아미데이트 유사체, 및 상기 중 어느 하나의 포스포로디아미데이트 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체, 및 그의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드만를 포함하는 SSO.
  65. 제63항에 있어서, 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 각각 2'O-4'C-(메틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 각각 2'O-4'C-(에틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드인 SSO.
  66. 제63항에 있어서, SSO가 2'O-Me 리보뉴클레오티드 및 2'O-4'C-연결된 바이사이클릭 리보퓨라노실 (LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 SSO.
  67. 제63항에 있어서, 적어도 4 개의 2'O-4'-(메틸렌)-리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트 또는 2'O-4'-(메틸렌)-리보뉴클레오티드를 포함하는 SSO.
  68. SEQ ID Nos: 8, 9, 14, 17-21, 24-29, 32, 33, 38-42, 44-46, 50-52, 55-57, 60, 68-71, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 84 및 86-89로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 SSO.
  69. 제68항에 있어서, 서열이 인간 TNFR2 서열에 상보적이고 SEQ ID Nos: 74, 75, 77, 78, 80, 82 및 84로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 SSO.
  70. 제68항에 있어서, 서열이 인간 TNFR2 서열에 상보적이고 SEQ ID Nos: 86-89로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 SSO.
  71. 제69항에 있어서, 서열이 SEQ ID Nos: 74 및 80으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 SSO.
  72. 제51항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 따른 SSO 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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