JP2013503646A - 自閉症スペクトラム障害を診断するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般に自閉症スペクトラム障害を診断するための組成物および方法に関する。ある実施形態では、本発明は、被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を含む。その方法は、被験体からの生物学的試料（例えば組織試料または体液試料）から核酸を得て、被験体の核酸中に変異型配列が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施する工程を含み得る。
Description
関連出願
この発明は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２００９年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４０，４６９号への優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／２４０，４６９号の開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
この発明は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２００９年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４０，４６９号への優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／２４０，４６９号の開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、一般に自閉症スペクトラム障害（autism spectrum disorder）を診断するための組成物および方法に関する。
本発明は、一般に自閉症スペクトラム障害（autism spectrum disorder）を診断するための組成物および方法に関する。
自閉症は、社会的相互作用およびコミュニケーションスキルの領域において脳の正常な発達を妨げる複雑な発達障害である。典型的には、自閉症の小児および成人は、言語および非言語コミュニケーション、社会的相互作用、ならびに娯楽または遊びの活動が困難である。
自閉症は一般に、社会的相互作用およびコミュニケーションスキルを含む、発達のいくつかの領域における重篤で広汎性の障害を特徴とする神経学的障害のカテゴリーである、広汎性発達障害（ＰＤＤ）の傘の下に入る５つの障害の１つとして特徴づけられる。ＰＤＤに属する５つの障害は、自閉症障害、アスペルガー障害、小児期崩壊性障害（ＣＤＤ）、レット障害、および特定不能のＰＤＤ（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む。これらの障害の各々についての特定の診断基準は、米国精神医学会によって配布された、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｅｘｔ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２０００に見出すことができる。
自閉症の生物学的症状発現に関する確定診断試験はなく、従って、自閉症は依然として、ほとんど全面的に行動症状を通して診断しなければならない唯一の神経学的障害の１つである。ＤＳＭ−ＩＶは、自閉症を１２の診断基準によって特徴づけられる広汎性発達障害（ＰＤＤ）と分類する。これらの基準は３つのカテゴリーに属する：社会的相互作用の障害；コミュニケーションの障害；および限られた範囲の活動と興味。自閉症の診断は、小児が１２の症状の少なくとも６つを示すことを必要とする。
小児が上記に挙げた自閉症の定義に適合しない場合は、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）と呼ばれる状態を有すると診断され得る。特定不能の形態の広汎性発達障害（ＰＤＤ）のそのような診断は、例えば遅い年齢での発症、または閾値下もしくは非定型症状のために上記カテゴリーに属さない非定型自閉症を包含し得る。ＤＳＭ−ＩＶによれば、自閉症様行動が存在する場合、特に社会的および言語的コミュニケーションスキルの発達の重篤な障害が存在するが、小児が古典的自閉症またはいかなる他の特定の広汎性発達障害、統合失調症、統合失調型人格障害もしくは回避性人格障害についての基準にも合致しない場合にこの診断が使用されるべきである。
農薬および／または出生時欠損を引き起こすことがある作用物質への暴露を含むがこれらに限定されない、様々な作用物質が自閉症の発症に関連すると主張されてきた。少なく一部の症例では、自閉症は遺伝学的基礎を有し得ると思われる。自閉症の遺伝学は複雑であると思われる。例えば、コピー数の変異および染色体の構造異常（大型および小型の両方）が、特に、自閉症または自閉症行動が一般的である症候群を有する患者の特定のゲノム領域に存在することが示されている（非特許文献１）。ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は、自閉症集団における構造異常を示した。多くの異なる遺伝子の遺伝的変異についての因果的役割が、関連研究分析または連鎖研究分析からの証拠に基づいて示唆されている。まだ、ゲノムワイド関連研究分析は、単独でまたは組合せとして作用する、特定の共通変異型を関連づけることはできていないが、そのような研究は、他の原因となる遺伝子または経路を指摘し得る関連ピークを同定した。遺伝的変異が少なくとも非症候性自閉症の原因であり得るというある程度の証拠が存在する。
ＡｂｒａｈａｍｓおよびＧｅｓｃｈｗｉｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００８）９：３４１〜３５５
小児を診断するための評価は、典型的には医師と小児の両親を含むチームによって行われる。自閉症スペクトラム障害の診断は主観的であるので、小児の誤診が高い頻度で起こることがある。従って、被験体が自閉症スペクトラム障害に罹患しているかどうかの客観的決定を提供することができる診断試験に対する満たされていない必要性が存在する。
本発明は、一般に自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物は、その被験体または他の被験体について自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを客観的に診断するために、被験体から遺伝情報を得るまたは遺伝情報を提供するために使用し得る。
１つの実施形態では、本発明は、被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を含む。その方法は、被験体からの生物学的試料（例えば組織試料または体液試料）から核酸を得て、被験体の核酸中に変異型配列が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施する工程を含み得る。ある実施形態では、前記方法は、その変異型を自閉症スペクトラム障害に関連する公知の変異型と比較して、その変異型が自閉症に関連するとこれまでに同定されている変異型であるかどうかを決定することを含み得る。または、前記方法は、変異型を、新しい、これまでに特徴づけられていないまたはこれまでに記述されていない変異型として同定することを含み得る。変異型が新しい変異型である場合、本発明の方法は、その突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予想されるか否かを決定する分析を実施することをさらに含み得る。本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するために変異型プロフィール（すなわち被験体において同定された突然変異の集積）を利用することをさらに含み得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの遺伝子についてのサンプル核酸配列を得るために、被験体からの組織試料または体液試料から核酸を得て、核酸の少なくとも一部を配列決定することを含み得る。
本発明のさらなる他の実施形態は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクと相関する突然変異（すなわち変異型）を同定するための方法を含み得る。その方法は、突然変異した場合、自閉症の発症に関連し得る配列を有すると評価される核酸を同定する工程を含み得る。また、前記方法は、自閉症スペクトラム障害を有する被験体からの生物学的試料（例えば組織試料または体液試料）から核酸試料を得て、自閉症スペクトラム障害を有さない個体における核酸配列と比較して、自閉症を有する被験体において核酸配列の突然変異が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施し、自閉症スペクトラム障害を有する被験体における突然変異の存在が、前記突然変異が自閉症スペクトラム障害の発症に関連し得ることを指示することを含み得る。変異型が新しい変異型である場合、本発明の方法は、その突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予想されるか否かを決定する分析を実施することをさらに含み得る。本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するために使用できる種々の突然変異のパネルを集積することをさらに含み得る。
さらなる他の実施形態では、本発明は、以下の遺伝子またはゲノム領域：ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢまたはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つの核酸を含む単離された核酸を含み、前記配列は、自閉症スペクトラム障害の指標となるまたは自閉症スペクトラム障害に関連する変異型を含む。
本発明のさらなる特徴を以下で述べる。本発明は、その適用を以下の特許請求の範囲、説明および図面で示される詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実行または実施することができる。
本発明の様々な特徴、態様および利点は、以下の図面を参照してより明らかになる。
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の実施例で示す数値は可能な限り正確に報告されている。いかなる数値も、しかし、それぞれの試験測定において認められる標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を本質的に含む。さらに、本明細書で開示されるすべての範囲は、その中に組み込まれるありとあらゆる部分範囲を包含することが理解されるべきである。例えば、「１〜１０」と明記された範囲は、最小値の１から最大値の１０までの間（両端を含む）のありとあらゆる部分範囲；すなわち、最小値の１またはそれ以上、例えば１〜６．１で始まり、最大値の１０またはそれ以下、例えば５．５〜１０で終わるすべての部分範囲を包含するとみなされるべきである。加えて、「本明細書に組み込まれる」と言及されるいかなる参考文献も、その全体が組み込まれると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、単数形態の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明確かつ明白に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を包含することにさらに留意されたい。「および／または」という用語は一般に、少なくともどちらか一方を指すために使用される。一部の場合には、「および／または」という用語は、「または」という用語と交換可能に使用される。
また「部分」および「フラグメント」という用語は、ポリペプチド、核酸または他の分子構築物の部分を指すために交換可能に使用される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、部分的または完全長タンパク質のいずれかを含み得るタンパク質分子を表すために本明細書では交換可能に使用される。「ペプチド」という用語は、文脈が特に指示しない限り、完全長未満のタンパク質または非常に短いタンパク質を意味するために使用される。
当技術分野で公知のように、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、そのα炭素が、１つのアミノ酸のα炭素のカルボキシル基ともう１つ別のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応によって形成されるペプチド結合を介して連結されているアミノ酸（典型的にはＬ−アミノ酸）の鎖である。典型的には、タンパク質を構成するアミノ酸は、タンパク質のアミノ末端残基から出発し、カルボキシ末端残基へと向かう方向で増加して、順に番号づけられる。
当技術分野で公知のように、核酸配列を互いにハイブリダイズするための条件は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでにわたると表すことができる。一般に、抗ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、高温にて低塩緩衝液中でハイブリッドを洗浄することを指す。ハイブリダイゼーションは、結合したＤＮＡを、６５℃にて、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの当技術分野で標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用してろ過し、プローブの長さに依存して室温から６８℃までの範囲の温度にて、０．２５Ｍ ＮａＨＰＯ４、３．５％ＳＤＳ中で洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することであり得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ参照）。例えば、高ストリンジェンシー洗浄は、１４塩基のオリゴヌクレオチドプローブについては３７℃、または１７塩基オリゴヌクレオチドプローブについては４８℃、または２０塩基オリゴヌクレオチドプローブについては５５℃、または２５塩基オリゴヌクレオチドプローブについては６０℃、または約２５０ヌクレオチド長のヌクレオチドプローブについては６５℃にて、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを含む。核酸プローブは、例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでの末端標識によって、またはランダムプライマー標識による［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰなどの放射性標識ヌクレオチドの組込みによって放射性ヌクレオチドで標識し得る。あるいは、ビオチニル化またはフルオレセイン標識ヌクレオチドの組込みによってプローブを標識し、ストレプトアビジンまたは抗フルオレセイン抗体を用いてプローブを検出し得る。
本明細書で使用される場合、「上流」という用語は、分子がタンパク質である場合は２番目の残基に対してＮ末端側である、または分子が核酸である場合は２番目の残基に対して５’側である残基を指す。同じく本明細書で使用される場合、「下流」という用語は、分子がタンパク質である場合は２番目の残基に対してＣ末端側である、または分子が核酸である場合は２番目の残基に対して３’側である残基を指す。本明細書で開示されるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は、すべてＮ末端アミノ酸からＣ末端アミノ酸へと列挙され、本明細書で開示される核酸配列は、すべて分子の５’末端から分子の３’末端へと列挙される。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。実行者は、当技術分野の定義および用語に関して特にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい。アミノ酸残基についての略語は、２０の一般的なＬ−アミノ酸の１つを指すために当技術分野で使用される標準的な３文字および／または１文字表記である。
「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドである。この用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ならびにヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体から作製されるＲＮＡおよびＤＮＡを包含するために使用される。
「同一性」または「パーセント同一」という用語は、２つのアミノ酸配列の間または２つの核酸配列の間の配列同一性を指す。パーセント同一性は、２つの配列を整列することによって決定でき、比較される配列によって共有される位置の同一残基（すなわちアミノ酸またはヌクレオチド）の数を指す。配列アラインメントおよび比較は、当技術分野において標準的なアルゴリズムを用いて（例えばＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：２４４４）、またはＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡとして公的に利用可能なこれらのアルゴリズムのコンピュータ化されたバージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって実施し得る。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤを通して利用可能なＥＮＴＲＥＺも配列比較のために使用し得る。別の場合には、パーセント同一性を決定するためにＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔなどの市販のソフトウエアを使用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えばＢＬＡＳＴＮ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎについてのインターネットサイトで入手可能な）を使用し得る。１つの実施形態では、２つの配列のパーセント同一性は、各々のアミノ酸ギャップが、それが２つの配列間の１個のアミノ酸のミスマッチであるかのごとくに加重されるように、ギャップ加重１のＧＣＧを用いて決定し得る。または、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し得る。
本明細書で使用される場合、「保存された残基」という用語は、同じ構造および／または機能を有する複数のタンパク質の間で同じであるアミノ酸を指す。保存された残基の領域はタンパク質の構造または機能にとって重要であり得る。従って、三次元タンパク質において同定される隣接する保存された残基は、タンパク質の構造または機能にとって重要であり得る。保存された残基または３Ｄ構造の保存された領域を見つけるために、異なる種からの、または同じ種の個体の同じかまたは類似のタンパク質についての配列の比較を行い得る。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列に言及する場合の「類似」または「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列とある程度の相同性または同一性を有するポリペプチドを意味する。相同性比較は、目視によって、またはより一般には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これら市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間のパーセント相同性を計算できる（例えばＷｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：７２６−７３０）。例えば、相同な配列は、別の実施形態では互いに少なくとも７０％同一、７５％同一、８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９７％同一または９８％同一であるアミノ酸配列を包含すると解釈され得る。
本明細書で使用される場合、それに少なくとも９０％同一という用語は、指示される配列に９０〜１００％にわたる同一性の配列を包含し、その間のすべての範囲を包含する。従って、それに少なくとも９０％同一という用語は、指示される配列に９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５．９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、９９．５パーセント同一である配列を包含する。同様に「少なくとも７０％同一」という用語は、７０〜１００％にわたって同一である配列を包含し、その間のすべての範囲を包含する。パーセント同一性の決定は、本明細書で述べるアルゴリズムを用いて決定される。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質「ドメイン」は、独立した単位を含むポリペプチドまたはタンパク質に沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列および／または生物学的活性の見地から定義され得る。１つの実施形態では、ポリペプチドドメインは、タンパク質の残りの部分から実質的に独立して折りたたまれたタンパク質の領域を含み得る。ドメインは、ＰＦＡＭ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＳＢＡＳＥ、ＩＳＲＥＣ ＰＲＯＦＩＬＥＳ、ＳＡＭＲＴおよびＰＲＯＣＬＡＳＳなどの、しかしこれらに限定されないドメインデータベースを用いて同定し得る。
本明細書で使用される場合、遺伝子は、遺伝の単位である。一般に、遺伝子は、タンパク質または機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡの一部である。遺伝子の現代の実用的定義は、遺伝的形質の単位に対応するゲノム配列の位置特定可能な領域である。遺伝子は、調節領域、転写領域、および／または他の機能性配列領域に関連し得る。
本明細書で使用される場合、遺伝子調節エレメントまたは調節配列は、転写因子などの調節タンパク質が、遺伝子発現を調節するために結合するＤＮＡのセグメントである。そのような調節領域は、しばしば調節される遺伝子の上流にある。
本明細書で使用される場合、エクソンは、ＲＮＡの他の部分（例えば、イントロンとして知られる介在領域）がＲＮＡスプライシングによって除去された後、成熟またはプロセシングされたＲＮＡにおいて認められる核酸配列である。それ自体、エクソン配列は、一般にタンパク質またはタンパク質の部分をコードする。イントロンは、ＲＮＡスプライシングによって周囲のエクソン配列から取り除かれるＲＮＡの部分である。
本明細書で使用される場合、発現されたＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡ（「コードＲＮＡ」）、および転写されるが翻訳されない任意の他のＲＮＡ（「非コードＲＮＡ」）である。
本明細書で使用される場合、マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写後調節に関与する短い（２０〜２４ヌクレオチド）非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の両方に影響を及ぼすことができる。例えば、マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の相補的配列に結合して、遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。ｍｉＲＮＡは、タンパク質をコードするかまたは非コードのいずれかであり得るキャップされたポリアデニル化一次転写産物（プリｍｉＲＮＡ）の一部としてＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。一次転写産物は、ドローシャリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、約７０ヌクレオチドのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）を生成することができ、前記前駆体ｍｉＲＮＡは、細胞質ダイサーリボヌクレアーゼによってさらに切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ＊）産物を生成することができる。成熟ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対合を介して標的ｍＲＮＡを認識することができ、最も一般的には標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化を生じさせる、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれることができる。
本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡは、基本的には約２０個の相補的ヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡはより大きな二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子の分解によって作製される。ｓｉＲＮＡは、本質的に、ｍＲＮＡの分解を導くｍＲＮＡとｓｉＲＮＡの相互作用によってその対応するｍＲＮＡを２つに分割することによって遺伝子発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡはまた、ＤＮＡと相互作用して、クロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｇ）サイレンシングおよびヘテロクロマチンの増加を促進することができる。
本明細書で使用される場合、後成的エレメントは、基礎となるＤＮＡ配列の変化以外の機構によって遺伝子発現を変化させることができる。そのようなエレメントは、擬似突然変異、刷込み、遺伝子サイレンシング、Ｘ染色体の不活性化、位置効果、再プログラム化、トランスベクション、母性効果、ヒストン修飾、およびヘテロクロマチンを調節するエレメントを包含し得る。
本明細書で使用される場合、突然変異および変異型という用語は、核酸またはタンパク質配列の変化を表すために交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「自閉症スペクトラム障害に関連する」は、変異型が、非自閉症対照におけるよりも自閉症を有する患者において多く認められることを意味する。一般に、そのような関連の統計的有意性は、複数の患者を検定することによって決定できる。
本明細書で使用される場合、対象領域は、ＤＮＡ配列中の変異型を検定するために標的される染色体の部分である。
自閉症スペクトラム障害を診断するための方法および組成物
本発明の実施形態は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための組成物および方法を含む。本発明の方法および組成物は、その被験体または他の被験体について自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを客観的に診断するために、被験体から遺伝情報を得るまたは遺伝情報を提供するために使用し得る。
本発明の実施形態は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための組成物および方法を含む。本発明の方法および組成物は、その被験体または他の被験体について自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを客観的に診断するために、被験体から遺伝情報を得るまたは遺伝情報を提供するために使用し得る。
１つの実施形態では、本発明は、被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を含む。その方法は、被験体からの組織試料または体液試料から核酸を得て、被験体の核酸中に変異型配列（すなわち突然変異）が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施する工程を含み得る。ある実施形態では、前記方法は、その変異型を自閉症スペクトラム障害に関連する公知の変異型と比較して、その変異型が自閉症に関連するとこれまでに同定されている変異型であるかどうかを決定することを含み得る。または、前記方法は、変異型を、新しい、これまでに特徴づけられていない変異型として同定することを含み得る。変異型が新しい変異型である場合、本発明の方法は、その突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予想されるか否かを決定する分析を実施することをさらに含み得る。本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するために変異型プロフィール（すなわち被験体において同定された突然変異の集積）を利用することをさらに含み得る。
ある実施形態では、本発明は、被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を含み、前記方法は、被験体からの組織試料または体液試料から核酸を得ること；被験体の核酸中に１つの変異型配列または複数の変異型配列が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施すること；検出された各々の変異型について、その変異型が自閉症スペクトラム障害に関連する公知の変異型であるかまたはこれまでに記述されていない変異型であるかを決定すること；前記変異型がこれまでに記述されていない変異型である場合は、変異型が遺伝子発現および／またはタンパク質機能の少なくとも１つに有害な作用を及ぼすと予想されるか否かを決定すること；ならびに検出された変異型配列または複数の変異型配列に基づき、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断することを含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの遺伝子についてのサンプル核酸配列を得るために、被験体からの組織試料または体液試料から核酸を得て、核酸の少なくとも一部を配列決定することを含み得る。ある実施形態では、前記方法は、変異型を、自閉症スペクトラム障害に関連する公知の変異型と比較して、その変異型が、自閉症に関連するとこれまでに同定されている変異型であるかどうかを決定することを含み得る。または、前記方法は、変異型を、新しい、これまでに特徴づけられていない変異型として同定することを含み得る。変異型が新しい変異型である場合、またはこれまでに特徴づけられている（すなわち同定されている）変異型に関して一部の場合には、本発明の方法は、その突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予想されるか否かを決定する分析を実施することをさらに含み得る。本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するために変異型プロフィール（すなわち被験体において同定された変異型の集積）を利用することをさらに含み得る。
本発明の方法の各々の実施形態において、本発明の方法は、関連の統計的有意性を決定するために複数の個体においてアッセイ（例えば配列決定）を実施することを含み得る。
本発明の方法の様々な実施形態においておよび本明細書でより詳細に述べるように、アッセイは、核酸配列決定、ハイブリッドキャプチャー法（hybrid capture）および／または後成的分析の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態では、次世代（大量並列シーケンシング）を使用し得る。または、サンガーシーケンシングを使用し得る。または、次世代（大量並列シーケンシング）とサンガーシーケンシングの組合せを使用し得る。加えておよび／または選択的に、配列決定は、合成による１分子シーケンシング（single-molecule sequencing-by-synthesis）の少なくとも１つを含む。従って、ある実施形態では、変異を示す試料を同定するために複数のＤＮＡ試料をプール中で分析する。加えてまたは選択的に、ある実施形態では、少なくとも２つのプールにおいて同じ変異を示す個々の試料を同定するために複数のＤＮＡ試料を複数のプール中で分析する。
また、様々な実施形態において、実施する工程中の核酸は、遺伝子、ＲＮＡ、エクソン、イントロン、遺伝子調節エレメント、発現されたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは後成的エレメントを含む。また、スプライス部位、転写因子結合、Ａ−Ｉエディティング部位、マイクロＲＮＡ結合部位、および機能性ＲＮＡ構造部位を含む調節エレメントを突然変異（すなわち変異型）に関して評価し得る。
ある実施形態では、変異型を分析するために選択される核酸は、１つ以上の自閉症スペクトラム障害に関連することが公知の配列または関連することが疑われる配列から選択される配列を含む。例えば、核酸は、表１中の遺伝子の１つの少なくとも一部を含む。または、核酸は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の発症において重要であり得る生化学的経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。例えば、ある実施形態では、核酸は、代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路中のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。例えば、ある実施形態では、変異型は、表２中の変異型の少なくとも１つを含む。従って、本発明の方法のある実施形態では、核酸は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢまたはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＳＨＡＮＫ３またはＨＯＭＥＲ１の少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む。ある実施形態では、変異型は、以下の突然変異：ＨＯＭＥＲ １ ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ；ＧＲＭ５ ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ；ＭＡＰＫ２ ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ；ＨＲＡＳ ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ；ａ ＭＥＣＰ２ ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘの少なくとも１つを含む。
本発明の方法の様々な実施形態において、自閉症スペクトラム障害は、非症候性自閉症（non-syndromic autism）、古典的自閉症(classical autism）、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害、または特定不能の広汎性発達障害（pervasive developmental disorder not otherwise specified）（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の少なくとも１つであり得る。ある実施形態では、自閉症スペクトラム障害は非症候性自閉症（すなわち、自閉症の症状を呈するが、自閉症でしばしば認められる身体的症状発現を示さない患者）を含む。
本発明の方法は、顕在表現型を含む、自閉症に関係する遺伝的症候群の存在または遺伝的症候群を発症する増大したリスクを診断することをさらに含み得る。例えば、ある実施形態では、遺伝的症候群は、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、１５ｑ１１−ｑ１３重複、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ前突然変異（fragile X premutation）、染色体２ｑの欠失、ＸＹＹ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、アペール症候群、ＡＲＸ遺伝子の突然変異、ド・ランゲ症候群、スミス・メイジェニス症候群（Smith-Magenis syndrome）、ウィリアムズ症候群、ヌーナン症候群、ダウン症候群、口蓋心顔面症候群、筋緊張性ジストロフィー、シュタイネルト病、結節硬化症、デュシェーヌ病、ティモシー症候群（Timothy syndrome）、１０ｐ染色体末端欠失、カウデン症候群、４５，Ｘ／４６，ＸＹモザイク、ミーレ症候群（Myhre syndrome）、ソトス症候群、コーエン症候群、ゴルドナール症候群、ジュベール症候群、Ｌｕｊａｎ−Ｆｒｙｎｓ症候群、メビウス症候群（Moebius syndrome）、伊藤のメラニン減少症、神経線維腫症１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、および／またはＨＥＡＤＤ症候群の少なくとも１つを含む。
本発明の方法は、まだＡＳＤの症状を示していない、または診断があいまいである個体の診断を助けるために使用し得る。例えば、被験体は小児または胎児であり得る。
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を配列決定するための技術は高感度であり、それ故、被験体から採取されたほとんどいかなる生物学的試料（すなわち組織または体液）も使用できる。例えば、選択的実施形態では、体液は、脳脊髄液、血液、羊水、母体血または尿の少なくとも１つを含む。
上述したように、ある実施形態では、突然変異を評価する遺伝子は、自閉症の発症に関連する生化学的経路中のタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、ある実施形態では、遺伝子は代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路に関与する。１つの実施形態では、経路は、ｍＧｌｕＲ５シグナル伝達経路であるおよび／またはｍＧｌｕＲ５受容体の活性にとって重要な遺伝子を含む。または、特定の型の自閉症症候群に関連する他の生化学的経路を評価し得る。例えば、ある実施形態では、表１中の遺伝子および／またはゲノム領域の少なくとも１つを評価し得る。
経路がｍＧｌｕＲ５シグナル伝達経路であるおよび／またはｍＧｌｕＲ５受容体の活性にとって重要な遺伝子を含む場合、ＤＮＡ配列は、表２に示す遺伝子または表２に示す遺伝子を含むゲノム領域に由来し得る。本発明の方法のある実施形態では、ＡＳＤの存在または増大したリスクを指示し得る突然変異に関して評価される遺伝子および／またはゲノム領域は、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＦＭＲ１、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＣＰ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＨＥＢ、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２および／またはＵＢＥ３Ａである。ある実施形態では、アッセイにおいて使用される天然または非変異型配列は、以下の遺伝子：ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＦＭＲ１、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＣＰ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＨＥＢ、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２および／またはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つからのエクソン配列を含む。例えば、ある実施形態では、変異型に関して評価される遺伝子配列はエクソン配列を含む。または、イントロン配列または他の非コード領域を潜在的に有害な突然変異に関して評価し得る。ある実施形態では、エクソン配列および付加的な隣接配列（例えば、ＵＴＲおよび／またはイントロン配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５以上のヌクレオチド）をアッセイにおいて分析する。または、これらの配列の部分を使用し得る。ある実施形態では、評価される遺伝子配列は、以下の遺伝子：ＨＯＭＥＲ１、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１および／またはＴＳＣ２の少なくとも１つからのエクソン配列および／または隣接するイントロンもしくはＵＴＲ配列を含む。ある実施形態では、評価される遺伝子配列は、ＨＯＭＥＲ１遺伝子からのエクソン配列を含む。そのような変異型遺伝子配列は、表２に示す突然変異の少なくとも１つを有する配列を含み得る。
本発明のさらなる他の実施形態は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクと相関する突然変異を同定するための方法を含み得る。その方法は、突然変異した場合、自閉症の発症に関連し得る、遺伝子またはゲノム領域などの核酸配列を同定する工程を含み得る。また、前記方法は、自閉症スペクトラム障害を有する被験体からの組織試料または体液試料から核酸試料を得ること；および自閉症スペクトラム障害を有さない個体における核酸配列と比較して、自閉症を有する被験体において核酸配列の突然変異が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施し、自閉症スペクトラム障害を有する被験体における突然変異の存在が、前記突然変異が自閉症スペクトラム障害の発症に関連し得ることを指示することを含み得る。または、前記方法は、選択した遺伝子またはゲノム領域の配列を新しい変異型（すなわち、これまでに発見されていない突然変異）に関して分析することを含み得る。変異型が新しい変異型である場合、またはこれまでに同定されている変異型に関して一部の場合には、前記方法は、その突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予想されるか否かを決定する分析を実施することをさらに含み得る。前記方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するために使用できる種々の突然変異のパネルを集積することをさらに含み得る。
従って、本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクと相関する突然変異を同定するための方法であって、突然変異した場合、自閉症の発症に関連し得るまたは関連する配列を有すると評価される核酸を同定すること；自閉症スペクトラム障害を有する被験体からの組織試料または体液試料から核酸試料を得ること；および自閉症スペクトラム障害を有さない個体における核酸配列と比較して、自閉症を有する被験体において核酸配列の突然変異が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施し、自閉症スペクトラム障害を有する被験体における突然変異の存在が、前記突然変異が自閉症スペクトラム障害の発症に関連し得ることを指示することを含む方法を含み得る。
新しい突然変異を同定するための本発明の方法の実施形態では、本発明の方法は、関連の統計的有意性を決定するために複数の個体においてアッセイ（例えば配列決定）を実施することを含み得る。
ある実施形態では、突然変異は、これまでに自閉症スペクトラム障害の発症に関連づけられていた変異型である。または、突然変異は、これまでに記述されていない変異型であり得る。本発明の方法は、突然変異が遺伝子発現および／またはタンパク質機能の少なくとも１つに有害な作用を及ぼすと予想されるか否かを決定することを付加的に含み得る。
ある実施形態では、変異型に関して分析するために選択される核酸は、１つ以上の自閉症スペクトラム障害に関連することが公知の配列または関連することが疑われる配列から選択される配列を含む。例えば、核酸は、表１中の遺伝子の１つの少なくとも一部を含む。または、核酸は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の発症において重要であり得る生化学的経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。例えば、ある実施形態では、核酸は、代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路中のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。例えば、ある実施形態では、変異型は、表２中の変異型の少なくとも１つを含む。従って、本発明の方法のある実施形態では、核酸は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢまたはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＳＨＡＮＫ３またはＨＯＭＥＲ１の少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む。
本発明の方法の様々な実施形態では、自閉症スペクトラム障害は、非症候性自閉症、古典的自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害、または特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の少なくとも１つであり得る。ある実施形態では、自閉症スペクトラム障害は非症候性自閉症を含む。
または、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、１５ｑ１１−ｑ１３重複、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ前突然変異、染色体２ｑの欠失、ＸＹＹ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、アペール症候群、ＡＲＸ遺伝子の突然変異、ド・ランゲ症候群、スミス・メイジェニス症候群、ウィリアムズ症候群、ヌーナン症候群、ダウン症候群、口蓋心顔面症候群、筋緊張性ジストロフィー、シュタイネルト病、結節硬化症、デュシェーヌ病、ティモシー症候群、１０ｐ染色体末端欠失、カウデン症候群、４５，Ｘ／４６，ＸＹモザイク、ミーレ症候群、ソトス症候群、コーエン症候群、ゴルドナール症候群、ジュベール症候群、Ｌｕｊａｎ−Ｆｒｙｎｓ症候群、メビウス症候群、伊藤のメラニン減少症、神経線維腫症１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、および／またはＨＥＡＤＤ症候群の少なくとも１つのような、自閉症に関連する（例えば遺伝的に関係する）他の症候群と変異型の関連性。
本発明の方法の様々な実施形態においておよび本明細書でより詳細に述べるように、アッセイは、核酸配列決定、ハイブリッドキャプチャー法および後成的分析の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態では、次世代（大量並列シーケンシング）を使用し得る。または、サンガーシーケンシングを使用し得る。または、次世代（大量並列シーケンシング）とサンガーシーケンシングの組合せを使用し得る。加えておよび／または選択的に、配列決定は、合成による１分子シーケンシングの少なくとも１つを含む。従って、ある実施形態では、変異を示す試料を同定するために複数のＤＮＡ試料をプール中で分析する。加えてまたは選択的に、ある実施形態では、少なくとも２つのプールにおいて同じ変異を示す個々の試料を同定するために複数のＤＮＡ試料を複数のプール中で分析する。
また、様々な実施形態において、実施する工程中の核酸は、遺伝子、ＲＮＡ、エクソン、イントロン、遺伝子調節エレメント、発現されたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは後成的エレメントを含む。また、スプライス部位、転写因子結合、Ａ−Ｉエディティング部位、マイクロＲＮＡ結合部位、および機能性ＲＮＡ構造部位を含む調節エレメントを突然変異（すなわち変異型）に関して評価し得る。
本発明の方法は、まだＡＳＤの症状を示していない、または診断があいまいである個体の診断を助けるために使用し得る。例えば、被験体は小児または胎児であり得る。
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を配列決定するための技術は高感度であり、それ故、被験体から採取されたほとんどいかなる生物学的試料（すなわち組織または体液）も使用できる。例えば、選択的実施形態では、体液は、脳脊髄液、血液、羊水、母体血または尿の少なくとも１つを含む。
再び、ある実施形態では、新しい突然変異を評価する遺伝子は、自閉症の発症に関連する生化学的経路中のタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、ある実施形態では、遺伝子は代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路に関与する。１つの実施形態では、経路はｍＧｌｕＲ５シグナル伝達経路であり、および／またはｍＧｌｕＲ５受容体の活性にとって重要な遺伝子を含む。または、特定の型の自閉症症候群に関連する他の生化学的経路を評価し得る。例えば、ある実施形態では、表１中の遺伝子および／またはゲノム領域の少なくとも１つを評価し得る。
経路がｍＧｌｕＲ５シグナル伝達経路であるおよび／またはｍＧｌｕＲ５受容体の活性にとって重要な遺伝子を含む場合、ＤＮＡ配列は、表２に示す遺伝子または表２に示す遺伝子を含むゲノム領域に由来し得る。本発明の方法のある実施形態では、ＡＳＤの存在または増大したリスクを指示し得る新しい突然変異に関して評価される遺伝子および／またはゲノム領域は、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＦＭＲ１、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＣＰ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＨＥＢ、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２および／またはＵＢＥ３Ａである。ある実施形態では、天然または非変異型配列は、以下の遺伝子：ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＦＭＲ１、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＣＰ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＨＥＢ、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２および／またはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つからのエクソン配列を含む。例えば、ある実施形態では、変異型に関して評価される遺伝子配列はエクソン配列を含む。ある実施形態では、エクソン配列および付加的な隣接配列（例えば、ＵＴＲおよび／またはイントロン配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５以上のヌクレオチド）をアッセイにおいて分析する。または、イントロン配列または他の非コード領域を潜在的に有害な突然変異に関して評価し得る。または、これらの配列の部分を使用し得る。そのような変異型遺伝子配列は、表２に示す突然変異の少なくとも１つを有する配列を含み得る。
本発明の他の実施形態は、自閉症スペクトラム障害に関連する突然変異を含む単離された遺伝子配列を提供する。そのような遺伝子配列は、被験体についての自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを客観的に診断するために使用し得る。ある実施形態では、単離された核酸は、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＦＭＲ１、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＣＰ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＨＥＢ、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２および／またはＵＢＥ３Ａのいずれか１つまたはそれらの組合せの非変異型配列または変異型配列を含み得る。例えば、ある実施形態では、遺伝子配列はエクソン配列を含む。ある実施形態では、エクソン配列および付加的な隣接配列（例えば、ＵＴＲおよび／またはイントロン配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５以上のヌクレオチド）をアッセイにおいて分析する。または、イントロン配列もしくは他の非コード領域を使用し得る。または、これらの配列の部分を使用し得る。ある実施形態では、遺伝子配列は、以下の遺伝子：ＨＯＭＥＲ１、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１および／またはＴＳＣ２の少なくとも１つからのエクソン配列を含む。ある実施形態では、遺伝子配列は、ＨＯＭＥＲ１遺伝子からのエクソン配列を含む。そのような変異型遺伝子配列は、表２に示す突然変異の少なくとも１つを有する配列を包含する。１つの実施形態では、単離された核酸は、以下の変異型：ＨＯＭＥＲ １ ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ；ＧＲＭ５ ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ；ＭＡＰＫ２ ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ；ＨＲＡＳ ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ；ａ ＭＥＣＰ２ ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘの少なくとも１つを含み得る。
自閉症スペクトラム障害は、一般に広汎性発達障害（ＰＤＤ）の傘の下に入る５つの障害の１つとして特徴づけられる。ＰＤＤに属する５つの障害は、自閉症（古典的自閉症）、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害、および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を包含する。本発明によれば、５つの障害の１つおよび／または自閉症スペクトラム障害に関連することが公知のまたは関連することが疑われる遺伝子のパネルを分析し得る。ある実施形態では、自閉症は非症候性自閉症である。または、他の型の自閉症スペクトラム障害の存在もしくは発症の増大したリスクを特徴づけてもよい。
本発明の方法および組成物は、さらに、自閉症に関係する遺伝的症候群を発症する増大したリスクを診断するまたは予測するために使用してもよく、それにより被験体が症候性自閉症または非症候性自閉症または別の自閉症スペクトラム障害に罹患している、また発症する危険度が高いかどうかを決定し得る。自閉症に一般に関係する遺伝性障害は、例えば、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、１５ｑ１１−ｑ１３重複、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ前突然変異、染色体２ｑの欠失、ＸＹＹ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、アペール症候群、ＡＲＸ遺伝子の突然変異、ド・ランゲ症候群、スミス・メイジェニス症候群、ウィリアムズ症候群、ヌーナン症候群、ダウン症候群、口蓋心顔面症候群、筋緊張性ジストロフィー、シュタイネルト病、結節硬化症、デュシェーヌ病、ティモシー症候群、１０ｐ染色体末端欠失、カウデン症候群、４５，Ｘ／４６，ＸＹモザイク、ミーレ症候群、ソトス症候群、コーエン症候群、ゴルドナール症候群、ジュベール症候群、Ｌｕｊａｎ−Ｆｒｙｎｓ症候群、メビウス症候群、伊藤のメラニン減少症、神経線維腫症１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、およびＨＥＡＤＤ症候群を包含する。
本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害に関連する変異型を同定するために、核酸配列決定、ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲまたは当技術分野で公知の他の技術を利用し得る。そのような技術の説明は、当業者によって使用されるテキストにおいて見出され得る。または、本明細書でより詳細に述べるようなより新しいシーケンシング技術を使用し得る（例えば、Ｂｏｗｅｒｓら、２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：５９３−５９５；Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１：８１４−８１８参照）。客観的診断試験を利用することにより、本発明の方法は、自閉症スペクトラム障害を診断する主観的方法に関連する誤診を大きく低減するおよび／または排除する。
例えば、ある実施形態では、本発明は、被験体（例えば小児または胎児）から核酸試料を得て、自閉症スペクトラム障害の指標となる配列変異型、再構成、コピー数変異型等を同定することにより、被験体における自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を提供する。配列変異型は、ＡＳＤを有する被験体においてこれまでに同定されているものであり得る。または、配列変異型は新しい（すなわちこれまでに記述されていない）ものであり得る。変異型の同定は、経験的であり得るか、または本明細書で教示する１つ以上の自閉症スペクトラム障害に関連する公知の配列変化との比較によって行い得る。
核酸供給源材料は、脳脊髄液、血液、羊水、母体血、口腔スワブ、痰または尿などの体液または組織から入手し得る。診断は、遺伝子、エクソン、イントロン、遺伝子調節エレメント、イントロン、発現されたＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび後成的エレメントなどの、しかしこれらに限定されない任意の遺伝要素の分析によって行い得る。単一コピーの遺伝子を検出するのに十分な感度の配列決定法を使用し得る。
ゲノム中のさらなる他のエレメントも遺伝子発現にとって重要であり得、それら自体、ＡＳＤの診断において使用し得る変異型として企図される。例えば、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢおよびＵＢＥ３Ａ遺伝子について、スプライス部位、転写因子結合、Ａ−Ｉエディティング部位、マイクロＲＮＡ結合部位、機能性ＲＮＡ構造部位を包含する調節エレメントがマッピングされており、本明細書で述べる突然変異（変異型）に関して評価することができる。
従って、本発明の方法および組成物の各々に関して、変異型は、以下の少なくとも１つを含有する核酸配列を含み得る：（１）Ａ−Ｉエディティング部位−アデノシンからイノシンへの（Ａ−Ｉ）ＲＮＡエディティングは脳において明確な局所特異性を示し、正常な行動のために必須であり、特定のエディティング部位における変化は、てんかんおよび統合失調症を包含する様々な神経病変に関連づけられてきた；（２）スプライス部位−原因となる突然変異のほぼ半数がプレｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼし、筋緊張性ジストロフィーおよび第１７番染色体に連鎖するパーキンソン症候群を包含する、多くの神経疾患がスプライシング欠損によって引き起こされると推定される；（３）保存された機能性ＲＮＡ構造−一本鎖ＲＮＡを介した調節は構造依存性であり、ヘアピンおよびステムループなどのいくつかのコア二次構造が繰り返し使用され、これらの構造の変化は、ＳＥＰＮ１関連ミオパシーの古典的な例におけるように、それらの機能に影響を及ぼして疾患を引き起こし得る；（４）実証された転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）−「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＤＮＡエレメントの百科事典）」（ＥＮＣＯＤＥ）プロジェクトは、ＣＨｉＰ−ｓｅｑを使用して予測される転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）へのいくつかの転写因子の結合を実証しており、ＴＦＢＳにおける突然変異は、統合失調症および双極性障害を包含するいくつかの精神障害に関連する；（５）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位−ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることによって遺伝子発現プログラムの全体的なシフトを誘導する、脳発達の鍵となる調節因子としてますます認識されており、マイクロＲＮＡ結合部位の突然変異はツレット症候群およびＴＤＰ４３陽性の前頭側頭型認知症に関係づけられている；（６）ポリアデニル化部位−ｍＲＮＡの安定化のためには３ポリアデニル化が必要であり、ポリアデニル化欠損は、それらのｍＲＮＡの変化した発現を間接的に導き得るか、またはまれに、眼咽頭筋ジストロフィーにおけるような機能作用を直接獲得し得る；（７）公知の調節エレメント−Ｏｐｅｎ ＲＥＧｕｌａｔｏｒｙ ＡＮＮＯｔａｔｉｏｎデータベース（ＯＲｅｇＡｎｎｏ）は、学術文献からの公知の調節エレメントのキュレーションのためのデータベースである；（８）いくつかのｍｉＲＮＡ遺伝子はタンパク質コード遺伝子内に埋め込まれており、ｍｉＲＮＡ遺伝子の多型はアルツハイマー病および統合失調症に関連するので、関心領域（ＲＯＩ）内にコードされるｍｉＲＮＡ遺伝子；（９）ＲＯＩ内にコードされる核小体低分子ＲＮＡ遺伝子−いくつかのｓｎｏＲＮＡ遺伝子はタンパク質コード遺伝子中に保持され、脳特異的ｓｎｏＲＮＡの変化は特定の疾患、例えばプラダー・ウィリー症候群に関連づけられている；（１０）有胎盤哺乳動物全体にわたる超保存されたエレメント−超保存されたエレメントは百万年にもわたっていかなる配列変化も防ぐ極めて強大な進化圧下にあり、それ自体重要な機能的役割を担持すると思われる。
例えば、本発明の実施形態は、被験体、例えば小児または胎児において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法を提供する。そのような方法は、被験体からの、または胎児の場合はその母親からの、組織試料または体液試料から核酸を得ることを含み得る。前記方法は、核酸配列またはゲノムの配列もしくはコピー数に変異型が存在するか否かを検出するために核酸を配列決定するまたは核酸のゲノム配列もしくはコピー数を測定する工程をさらに含み得る。前記方法は、自閉症スペクトラム障害についての核酸配列またはゲノム配列もしくはコピー数の変異型の臨床的重要性を評価する工程をさらに含み得る。そのような分析は、罹患集団（すなわち疾患を有する被験体）における変異型配列の関連の程度の評価を含み得る。そのような分析はまた、突然変異が遺伝子発現および／またはタンパク質機能に及ぼし得る影響の程度の分析を含み得る。前記方法はまた、この評価の結果に基づき自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断することを含み得る。
本明細書で教示される評価を行うために多くの異なるゲノム分析技術が使用できる。例えば、標的リシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、コピー数、後成的比較、再構成、欠失、および他の変異型の同定／分析を使用して本明細書で教示される比較および同定を行うことができる。以下の例示は説明を目的とするものであり、当業者は、本明細書で特定される結果を達成するために任意の利用可能なゲノム分析技術を使用できることを理解する。
本発明による分析のための核酸は、任意の臨床的に許容される方法でヒト試料から、例えばヒト組織または体液から入手し得る。核酸は、成人または小児から入手できるかまたは胎児性材料（例えば母体血清または羊水からの胎児染色体材料）であり得る。粘液、血液、血漿、血清、血清誘導体、胆汁、血液、母体血、粘液質、唾液、汗、羊水、乳房液、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）などの組織または体液からの細胞材料を包含する、任意の組織または体液源が許容される。試料はまた、スワブまたは細針吸引液または生検組織であり得る。試料はまた、細胞または生物学的材料を含む培地であり得る。被験体が胎児である実施形態では、羊水または母体血のいずれかから液体試料を得ることができる。
試料採取の時点で自閉症スペクトラム障害に罹患していないことが既知の１人以上の個体に由来する参照配列と比較して核酸中の変異型（すなわち突然変異）を検出するために、核酸を配列決定し得るならびに／またはそのゲノム配列および／もしくはコピー数を測定する。上述したように、配列変異型はまた、経験的に入手し得る。核酸は、複数の遺伝要素に由来する複数の核酸を含み得る。配列変異型またはゲノム配列もしくはコピー数を検出する方法は当技術分野において公知であり、配列変異型またはゲノム配列もしくはコピー数は、当技術分野で公知の任意のシーケンシング法、例えば全体的シーケンシングまたは１分子シーケンシングによって、および当技術分野で公知のゲノム配列またはコピー数を検出するための任意の方法、例えばアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによって検出できる。
シーケンシングを実施する従来の方法の１つは、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７４：５４６３−６７によって述べられている、チェーンターミネーションおよびゲル分離による。別の従来のシーケンシング法は、核酸フラグメントの化学的分解を含む。Ｍａｘａｍら、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５６０−５６４参照。最後に、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングに基づく方法が開発されている。例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許出願公開第２００９０１５６４１２号参照。これらの参考文献の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、シーケンシングはサンガーシーケンシング技術によって実施される。古典的サンガーシーケンシングは、一本鎖ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、放射性または蛍光標識ヌクレオチド、およびＤＮＡ鎖の伸長を終結させる改変ヌクレオチドを含む。標識がジデオキシヌクレオチドターミネーター（例えば標識プライマー）に結合していないか、または単色標識（例えば放射性同位体）である場合は、ＤＮＡ試料を、４つの標準的なデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）ならびにＤＮＡポリメラーゼを含む、４つの別々のシーケンシング反応に分ける。各々の反応に４つのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＴＴＰ）の１つだけを添加する。これらのジデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖の伸長の間に２つのヌクレオチド間でホスホジエステル結合を形成するために必要な３’−ＯＨ基を欠く、鎖終結ヌクレオチドである。しかし、ジデオキシヌクレオチドの各々が異なる標識（例えば４つの異なる蛍光染料）を担持する場合は、別々の反応を必要とせずにすべてのシーケンシング反応を一緒に実施することができる。
発生期の、すなわち伸長中のＤＮＡ鎖へのジデオキシヌクレオチドの組込みは、ＤＮＡ鎖の延長を終結させ、様々な長さの入れ子セットのＤＮＡフラグメントを生じさせる。次に、新たに合成して標識したＤＮＡフラグメントを変性し、鎖の長さの１塩基の相違を分離することができる変性ポリアクリルアミド−尿素ゲル上でのゲル電気泳動を用いてサイズによって分離する。４つのＤＮＡ合成反応の各々を同じ単色標識（例えば放射性同位体）で標識した場合は、それらをゲルの４つの個別の隣接するレーンの１つにおいて分離し、ゲル中の各レーンを、それぞれの反応において使用されたジデオキシヌクレオチドに従って、すなわちゲルレーンＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃと指定する。４つの異なる標識を使用した場合は、反応をゲル上の１つのレーンで組み合わせることができる。次にＤＮＡバンドをオートラジオグラフィーまたは蛍光によって視覚化し、反応生成物がゲル中の特定の点を通り過ぎるときにＸ線フィルムまたはゲル画像または蛍光の継続的観測からＤＮＡ配列を直接読み取ることができる。
末端ヌクレオチド塩基を、そのバンドを生じさせた反応に添加されたジデオキシヌクレオチドまたはその対応する直接標識によって同定する。次に、ゲル中の種々のバンドの相対的位置を使用して、指示されるＤＮＡ配列を読み取る（最短から最長まで）。サンガーシーケンシング法は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているものなどのＤＮＡシーケンサーを用いて自動化することができる。
他の実施形態では、核酸の配列決定は、単一分子またはＰＣＲなどの方法を介した増幅によって単一分子から誘導される概ね同一の分子の群の大量並列シーケンシング（「次世代シーケンシング」としても知られる）によって達成される。大量並列シーケンシングは、例えば、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｐｉｄｕｓら、米国特許第７，１６９，５６０号、Ｑｕａｋｅら、米国特許第６，８１８，３９５号、Ｈａｒｒｉｓ、米国特許第７，２８２，３３７号およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），１００：３９６０−３９６４（２００３）に示されている。
次世代シーケンシングでは、分析用の十分な量の核酸を得るために核酸に関してＰＣＲまたは全ゲノム増幅を実施することができる。次世代シーケンシングの一部の形態では、その方法は増幅されていないＤＮＡからＤＮＡ配列を評価することができるので、増幅を必要としない。ひとたび測定されれば、試験試料からの核酸の配列および／またはゲノム配列および／またはゲノムコピー数を、試料を採取した時点で自閉症スペクトラム障害に罹患していないことが既知の１人以上の個体に由来する参照標準と比較する。試験試料からの核酸の配列および／またはゲノム配列および／またはゲノム配列および／またはコピー数と参照標準との間のすべての相違を変異型とみなす。
次世代（大量並列シーケンシング）では、すべての関心領域を一緒に配列決定し、参照配列との比較（アラインメント）によって読み取った各配列の起点を決定する。関心領域を１つの反応において一緒に富化することができるか、または別々に富化して、その後シーケンシングの前に組み合わせることができる。ある実施形態では、および本明細書の実施例でより詳細に述べるように、アッセイに含まれる遺伝子のコードエクソンに由来するＤＮＡ配列を、無作為に断片化したゲノムＤＮＡの特異的ＲＮＡプローブへのバルクハイブリダイゼーションによって富化する。同じアダプター配列をすべてのフラグメントの末端に結合し、１つの反応において１つのプライマー対を用いたＰＣＲによってすべてのハイブリダイゼーション捕捉フラグメントを富化させる。ハイブリダイゼーションによってあまり効率的に捕捉されない領域は、特異的プライマーでのＰＣＲによって増幅する。加えて、特異的プライマーを用いたＰＣＲは、ゲノム内の別の場所に類似の配列（「偽エクソン」）が存在するエクソンを増幅するために使用し得る。
大量並列シーケンシングを使用するある実施形態では、ＰＣＲ産物を連結して長い一続きのＤＮＡを形成し、それを短いフラグメントに切断する（例えば音響エネルギーによって）。この工程は、フラグメントの末端が関心領域全体に分布されることを確実にする。その後、一続きのｄＡヌクレオチドを各フラグメントの３’末端に付加し、フラグメントをオリゴ（ｄＴ）プライマーで被覆した平面に結合させる（「フローセル」）。次に、オリゴ（ｄＴ）プライマーを蛍光標識ヌクレオチドで伸長することによって各々のフラグメントを配列決定し得る。各シーケンシングサイクルの間に、１つの型のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）だけを付加し、鎖終結ヌクレオチドの使用を介して１つのヌクレオチドだけを組み込ませる。例えば、１回目のシーケンシングサイクルの間に、蛍光標識したｄＣＴＰを付加することができる。このヌクレオチドだけが、次のヌクレオチドとしてＣを必要とする成長中の相補的ＤＮＡ鎖に組み込まれる。各シーケンシングサイクル後に、フローセルの画像を撮影し、どのフラグメントが伸長したかを決定する。Ｃを組み込んだＤＮＡ鎖は発光するが、Ｃを組み込まなかったＤＮＡ鎖は暗く見える。鎖終結を逆転させて、成長中のＤＮＡ鎖を再び伸長可能にし、このプロセスを合計１２０サイクル反復する。
画像を、各フラグメントの３’末端の２５〜６０塩基を反復する、一般に「リード」と称される一続きの塩基に変換する。次にリードを、分析されたＤＮＡについての参照配列と比較する。任意の所与の一続きの２５塩基は、典型的にはヒトゲノムにおいて１回だけ生じるので、大部分のリードをヒトゲノム内の１つの特定の位置に「整列」することができる。最後に、利用可能なリードから各ゲノム領域のコンセンサス配列を構築し、その位置の正確な参照配列と比較し得る。コンセンサス配列と参照配列の間の相違が配列変異型と呼ばれる。
自閉症マーカーを同定する方法
ある実施形態では、本発明は、自閉症マーカー（すなわち、自閉症と統計的に有意に関連する核酸配列中の変異型）を同定する方法を含む。新しいマーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、自閉症との関連および／または因果関係を示す生化学的経路におけるそれらの重要性に基づいて選択され得る。または、マーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、家族における自閉症の継承に遺伝的に関係するＤＮＡ領域との遺伝的関連性に基づいて選択され得る（例えば、ＡｂｒａｈａｍｓとＧｅｓｃｈｗｉｎｄ，２００８）。または、マーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、まだ評価されていない染色体の特定の領域をカバーするように体系的に評価され得る。
ある実施形態では、本発明は、自閉症マーカー（すなわち、自閉症と統計的に有意に関連する核酸配列中の変異型）を同定する方法を含む。新しいマーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、自閉症との関連および／または因果関係を示す生化学的経路におけるそれらの重要性に基づいて選択され得る。または、マーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、家族における自閉症の継承に遺伝的に関係するＤＮＡ領域との遺伝的関連性に基づいて選択され得る（例えば、ＡｂｒａｈａｍｓとＧｅｓｃｈｗｉｎｄ，２００８）。または、マーカーに関して検定される遺伝子および／またはゲノム領域は、まだ評価されていない染色体の特定の領域をカバーするように体系的に評価され得る。
本明細書で論じる場合、自閉症スペクトラム障害は、一般に広汎性発達障害（ＰＤＤ）の傘の下に入る５つの障害の１つとして特徴づけられる。ＰＤＤに属する５つの障害は、自閉症障害、アスペルガー障害、小児期崩壊性障害（ＣＤＤ）、レット障害、および特定不能のＰＤＤ（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む。ある場合には、自閉症は非症候性であり得る。以下の表１は、本発明の方法に従って自閉症スペクトラム障害を診断するために新しいマーカーに関して評価し得る遺伝子またはゲノム領域のパネルを提供する。
例えば、図１は、ｍＧｌｕＲ５シグナル伝達経路に関与し、そのような遺伝子における突然変異が自閉症の発症に関係するか否かを決定するために本発明に従って評価し得る遺伝子の描写を提供する。そのような配列変異が自閉症の発症に関係し得ることが証拠で指示される場合は、被験体における自閉症の存在および／または自閉症を発症する増大したリスクの指示を提供する、患者試料のＤＮＡシーケンシングにおいて使用するための単離された配列が提供され得る。例えば、および本明細書でより詳細に述べるように、表２は、評価し得る遺伝子および／またはゲノム領域、ならびに自閉症被験体（すなわち非症候性自閉症を有すると診断された患者）において認められる突然変異のサブセットを提供する。
図２に描写されるように、変異型および／または変異型の組合せを、以下の方法の１つ以上に基づき自閉症スペクトラム障害に関するそれらの臨床的重要性について評価し得る。変異型または変異型の組合せが、自閉症スペクトラム障害を有する被験体からの核酸において自閉症スペクトラム障害を有さない被験体におけるよりも頻繁に起こることが報告されるかまたは認知される場合は、少なくとも潜在的に自閉症スペクトラム障害に対する素因があるとみなされる。変異型または変異型の組合せが、自閉症スペクトラム障害を有する個体に排他的にまたは選択的に伝播されることが報告されるかまたは認知される場合は、少なくとも潜在的に自閉症スペクトラム障害に対する素因があるとみなされる。逆に、変異型が両方の集団において同様の頻度で認められる場合は、自閉症症候群障害（ＡＳＤ）の発症に関連する可能性は低い（図２、右側参照）。
タンパク質または生物学的系の機能を測定するのに適切な実験モデル系において、変異型または変異型の組合せがこのタンパク質またはこの生物学的系の機能に対して全体的に有害な作用を及ぼすことが報告されるかまたは認知される場合、およびこの変異型または変異型の組合せが、自閉症スペクトラム障害に関連することが公知の遺伝子に影響を及ぼす場合は、少なくとも潜在的に自閉症スペクトラム障害に対する素因があるとみなされる。例えば、変異型または変異型の組合せが、タンパク質または核酸の配列および／または構造への予測される作用に基づき、タンパク質または遺伝子発現に対して全体的に有害な作用を及ぼす（すなわち、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異またはスプライス部位突然変異、さらにはミスセンス突然変異を生じさせる）ことが予測される場合、ならびにこの変異型または変異型の組合せが、自閉症スペクトラム障害に関連することが公知の遺伝子に影響を及ぼす場合は、少なくとも潜在的に自閉症スペクトラム障害に対する素因があるとみなされる（図２、左側参照）。
また、ある実施形態では、変異型の全体的な数が重要であり得る。試験試料において、個別にまたは組合せとして、少なくとも高い確実性で自閉症スペクトラム障害に関連すると評価される１つの変異型またはいくつかの変異型が検出される場合、その遺伝物質中でこの変異型またはこれらの変異型が検出された個体は、自閉症スペクトラム障害に罹患しているまたは自閉症スペクトラム障害を発症する危険度が高いと診断され得る。
自閉症スペクトラム障害を診断するための方法および組成物
ある実施形態では、自閉症スペクトラム障害の診断は、核酸または核酸のパネルの配列、ゲノム上の位置もしくはゲノム配列、および／またはゲノムコピー数の変異を検出することによって実施される。例えば、一部の実施形態では、変異型に関して評価される遺伝子またはゲノム領域は、表１中の遺伝子から選択される。パネルは、表１中の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０個の遺伝子を含むことができる。他の実施形態では、診断は、表１からの５個未満の遺伝子で行われ、ある実施形態では、表１からの１個だけの遺伝子で行われる。
ある実施形態では、自閉症スペクトラム障害の診断は、核酸または核酸のパネルの配列、ゲノム上の位置もしくはゲノム配列、および／またはゲノムコピー数の変異を検出することによって実施される。例えば、一部の実施形態では、変異型に関して評価される遺伝子またはゲノム領域は、表１中の遺伝子から選択される。パネルは、表１中の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０個の遺伝子を含むことができる。他の実施形態では、診断は、表１からの５個未満の遺伝子で行われ、ある実施形態では、表１からの１個だけの遺伝子で行われる。
例えば、以下の表２は、少なくともその一部がｍＧｌｕＲ５受容体シグナル伝達に関与する、表１からの遺伝子のサブセットを提供する。表２はまた、自閉症を有する被験体において検出され得るこれらの遺伝子についての変異型も提供する。これらの変異型は、本発明の方法および組成物のある実施形態では、被験体における自閉症スペクトラム障害を指示し得る。
突然変異は、１つのヌクレオチドの置換でさえも、非常に異なる結果を生じることがある。スプライス部位突然変異は、既存のスプライス部位を破壊するかまたは新しいスプライス部位を創造する。両方の種類の変異が変化したｍＲＮＡプロセシングを導き、従って、劇的に異なる成熟ｍＲＮＡ及び異なるタンパク質を導くことがある。
ナンセンス突然変異は、コード領域の中央に終結コドンを導入し、これはタンパク質のトランケーションを導く。ミスセンス突然変異は、タンパク質内の１つのアミノ酸を別のアミノ酸に変化させる。同義突然変異は、アミノ酸配列を変化させない突然変異である。
フレームシフト突然変異は、突然変異の下流のアミノ酸配列（すなわちフレームシフト部位）の完全な変化を導くリーディングフレームのシフトを生じさせる。フレームシフト突然変異は、３で割り切れない数のヌクレオチドの正味の欠失または挿入によって引き起こされる。インフレーム欠失および／または挿入は、タンパク質内の１つ以上のアミノ酸の欠失または挿入を導くが、リーディングフレームを変化させず、そのため欠失または挿入部位の下流のアミノ酸配列を変化させない。
表２の変異型は、本明細書で述べる方法を用いて非症候性自閉症を有する被験体において検出された。ある実施形態では、自閉症スペクトラム障害の診断は、変異型を含む試料核酸を表２中の遺伝子から選択される核酸変異型を包含する核酸のパネルと比較することによって実施できる。または、新規変異型をパネルに含めてもよい。パネルは、表２中の遺伝子の少なくとも１、２、３、５、１０、１５、１６個または全部を含み得る。他の実施形態では、診断は、表２からの３個未満の遺伝子で行われ、ある実施形態では、表２からの１個だけの遺伝子で行われる。
従って、ＡＲＣ（活性調節性細胞骨格関連）は、シナプス可塑性の統合ならびに長期記憶の形成のために重要なタンパク質をコードする。ＡＲＣはまた、シナプス活動に応答してＡＭＰＡ受容体のエンドサイトーシスを調節し、ＡＭＰＡ受容体の恒常的シナプススケーリングに関与する。ＡＲＣ遺伝子は、第８番染色体の８ｑ２４．３に位置し、ｐ末端より１４３，６８９，４１２ｂｐから始まって、ｐ末端より１４３，６９２，８３５ｂｐで終了する（３，４２４塩基；方向：マイナス鎖）。ＡＲＣのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００８に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０１５１９３）を図３Ａに配列番号：１として示す（２０２〜１３９２のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｂに配列番号：２として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＥＩＦ４Ｅ（真核生物翻訳開始因子４Ｅ）は、真核生物翻訳開始因子４Ｅをコードする。ＥＩＦ４Ｅは、リボソームをｍＲＮＡの７−メチル−グアノシンキャップ構造へと向かわせることに関与する真核生物翻訳開始因子である。ＥＩ４ＦＥは、ＥＩＦ４Ｅプレ開始複合体の一部である。ＥＩＦ４Ｅのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００４に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００１９６８）を図３Ｃに配列番号：３として示す（１５２４〜２１７７のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｄに配列番号：４として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードする。このタンパク質は、通常多くの組織で作られ、脳内の神経細胞間のシナプス結合の発生において役割を果たし得る。ＦＭＲＰは、記憶および学習において重要であり得る、シナプス可塑性の調節に関与し得る。ＦＭＲ１遺伝子はＸ染色体の長腕の２７．３に位置し、塩基対１４６，６９９，０５４から塩基対１４６，７３６，１５６までにわたる。ＦＭＲ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００２３に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００２０２４）を図３Ｅに配列番号：５として示す（２３０〜２１２８のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｆに配列番号：６として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＧＲＭ１（グルタミン酸受容体、代謝型１）は、代謝型グルタミン酸受容体１（ｍＧｌｕＲ１）タンパク質をコードする。ＧＲＭ５（グルタミン酸受容体、代謝型５）は、代謝型グルタミン酸受容体５（ｍＧｌｕＲ５）タンパク質をコードする。Ｌ−グルタミン酸は中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、イオンチャネル型グルタミン酸受容体および代謝型グルタミン酸受容体の両方を活性化する。グルタミン酸神経伝達は、正常な脳機能の大部分の局面に関与し、多くの神経病理学的状態において障害され得る。代謝型グルタミン酸受容体は、配列相同性、推定上のシグナル伝達機構および薬理学的特性に基づいて３つの群に分けられてきた、Ｇタンパク質共役受容体のファミリーである。第Ｉ群はＧＲＭ１およびＧＲＭ５を含み、これらの受容体はホスホリパーゼＣを活性化することが示されている。第ＩＩ群はＧＲＭ２およびＧＲＭ３を含み、第ＩＩＩ群はＧＲＭ４、ＧＲＭ６、ＧＲＭ７およびＧＲＭ８を含む。第ＩＩ群と第ＩＩＩ群の受容体はサイクリックＡＭＰカスケードの阻害に関係するが、それらのアゴニスト選択性が異なる。
ＧＲＭ１遺伝子は、第６番染色体の６ｑ２４に位置し、ｐ末端より１４６，３９０，６１１ｂｐから始まって、ｐ末端より１４６，８００，４２７ｂｐで終了する（４０９，８１７塩基；方向：プラス鎖）。ＧＲＭ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００６に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０００８３８）を図３Ｇに配列番号：７として示す（４７１〜４０５５のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｈに配列番号：８として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＧＲＭ５遺伝子は、第１１番染色体の１１ｑ１４．２−ｑ１４．３に位置し、ｐ末端より８７，８８０，６２６ｂｐから始まって、ｐ末端より８８，４３８，７６１ｂｐで終了する（５５８，１３６塩基；方向：マイナス鎖）。ＧＲＭ５のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１１に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０００８４２）を図３Ｉに配列番号：９として示す（３６９〜３９１１のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｊに配列番号：１０として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＨＯＭＥＲ１は、樹状突起タンパク質のｈｏｍｅｒファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、第１群代謝型グルタミン酸受容体機能を調節する。ＨＯＭＥＲ１遺伝子は、第５番染色体の５ｑ１４．２に位置し、ｐ末端より７８，７０４，２１５ｂｐから始まって、ｐ末端より７８，８４５，７９６ｂｐで終了する（１４１，５８２塩基；方向：マイナス鎖）。ＨＯＭＥＲ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００５に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００４２７２）を図３Ｋに配列番号：１１として示す（１１０４〜２１６８のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｌに配列番号：１２として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＨＲＡＳはＲａｓ癌遺伝子ファミリーに属し、そのメンバーは哺乳動物肉腫レトロウイルスのトランスフォーミング遺伝子に関連する。これらの遺伝子によってコードされる産物はシグナル伝達経路において機能する。これらのタンパク質はＧＴＰおよびＧＤＰに結合することができ、固有のＧＴＰアーゼ活性を有する。ＨＲＡＳ遺伝子は、第１１番染色体の１１ｐ１５．５に位置し、ｐ末端より５２２，２４２ｂｐから始まって、ｐ末端より５２５，５９１ｂｐで終了する（３，３５０塩基；方向：マイナス鎖）。ＨＲＡＳのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１１に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿１７６７９５）を図３Ｍに配列番号：１３として示す（１８９〜７０１のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｎに配列番号：１４として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＭＡＰ２Ｋ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１）は、ＭＥＫ１プロテインキナーゼとして知られるタンパク質をコードする。ＭＡＰ２Ｋ２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２）は、ＭＥＫ２プロテインキナーゼとして知られるタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、細胞の外側からの化学的シグナルを細胞の核に伝達する、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路と呼ばれるシグナル伝達経路の一部である。ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達は、細胞の成長と分裂（増殖）、細胞が特定の機能を果たすように成熟するプロセス（分化）、細胞運動、および細胞の自己破壊（アポトーシス）を制御するのを助ける。
ＭＡＰ２Ｋ１遺伝子は、第１５番染色体の１５ｑ２２．１−ｑ２２．３３に位置し、ｐ末端より６４，４６６，６７４ｂｐから始まって、ｐ末端より６４，５７０，９３６ｂｐで終了する（１０４，２６３塩基；方向：プラス鎖）。ＭＡＰ２Ｋ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１５に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００２７５５）を図３Ｏに配列番号：１５として示す（４７６〜１６５７のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｐに配列番号：１７として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＭＡＰ２Ｋ２遺伝子は、第１９番染色体の１９ｐ１３．３に位置し、ｐ末端より４，０４１，３１９ｂｐから始まって、ｐ末端より４，０７５，１２６ｂｐで終了する（３３，８０８塩基；方向：マイナス鎖）。ＭＡＰ２Ｋ２のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１９に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０３０６６２）を図３Ｑに配列番号：１７として示す（２５５〜１４５７のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｒに配列番号：１８として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＭＥＣＰ２遺伝子（メチルＣｐＧ結合タンパク質２）は、正常な脳発達のために必須のタンパク質（ＭｅＣＰ２）をコードする。このタンパク質は、脳内の神経細胞の機能のために重要であると思われ、成熟神経細胞中に高レベルで存在する。研究は、ＭｅＣＰ２タンパク質が、細胞間コミュニケーションが起こる、神経細胞間のシナプスを形成するうえで役割を果たすことを示唆する。このタンパク質はいくつかの他の遺伝子を沈黙化させ、それらがタンパク質を生成するのを妨げる。ＭＥＣＰ２遺伝子はＸ染色体のＸｑ２８に位置し、ｐ末端より１５２，９４０，２１８ｂｐから始まって、ｐ末端より１５３，０１６，４０６ｂｐで終了する（７６，１８９塩基；方向：マイナス鎖）。ＭＥＣＰ２のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００２３に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００４９９２）を図３Ｓに配列番号：１９として示す（２２７〜１６８７のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｒに配列番号：２０として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＰＩＫ３ＣＡは、ＡＴＰを利用してＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２をリン酸化する、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒サブユニットであるタンパク質をコードする。この遺伝子は第３番染色体の３ｑ２６．３に位置し、ｐ末端より１８０，３４９，００５ｂｐから始まって、ｐ末端より１８０，４３５，１９４ｂｐで終了する（８６，１９０塩基；方向：プラス鎖）。ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００６２１８）を図３Ｕに配列番号：２１として示す（１５８〜３３６４のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｖに配列番号：２２として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＰＩＫ３Ｒ１は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの８５ｋＤの調節ユニットであるタンパク質をコードする。この遺伝子は第５番染色体の５ｑ１３．１に位置し、ｐ末端より６７，５５８，２１８ｂｐから始まって、ｐ末端より６７，６３３，４０５ｂｐで終了する（７５，１８８塩基；方向：プラス鎖）。ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００５に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿１８１５２３）を図３Ｗに配列番号：２３として示す（４３〜２２１７のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｘに配列番号：２４として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＰＴＥＮは、テンシン様ドメインならびに二重特異性タンパク質チロシンホスファターゼのものに類似する触媒ドメインを含む３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼである、ホスファターゼおよびテンシンホモロジータンパク質をコードする。ＰＴＥＮタンパク質は、ホスホイノシチド基質を選択的に脱リン酸化し、細胞においてホスファチジルイノシト−３，４，５−三リン酸の細胞内レベルを負に調節する。ＰＴＥＮタンパク質は細胞周期の調節に関与し、細胞が急速に増殖し過ぎるのを防ぐ。ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００７４６６に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０００３１４）を図３Ｙに配列番号：２５として示す（１０３２〜２２４３のコード配列）；タンパク質配列を図３Ｚに配列番号：２６として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＲＡＦ１は、それが直接結合しているＲａｓファミリーの膜結合ＧＴＰアーゼの下流で機能するＭＡＰキナーゼをコードする。ひとたび活性化されると、細胞ＲＡＦ１タンパク質は、二重特異性プロテインキナーゼＭＥＫ１およびＭＥＫ２をリン酸化して活性化することができ、それらが次にセリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２をリン酸化して活性化する。活性化されたＥＲＫは、細胞生理現象の多面的エフェクターであり、細胞分裂周期、アポトーシス、細胞分化および細胞移動に関与する遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。ＲＡＦ１遺伝子は第３番染色体の３ｐ２５に位置し、ｐ末端より１２，６００，１０８ｂｐから始まって、ｐ末端より１２，６８０，６７８ｂｐで終了する（８０，５７１塩基；方向：マイナス鎖）。ＲＡＦ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に見出される。遺伝子配列 （ＮＭ＿００２８８０）を図３ＡＡに配列番号：２７として示す（４１６〜２３６２のコード配列）；タンパク質配列を図３ＢＢに配列番号：２８として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＲＨＥＢは、脳で豊富なＲａｓホモログ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）として知られるＧＴＰ結合タンパク質をコードする。ＲｈｅｂはＲａｓスーパーファミリーのメンバーであり、神経可塑性に関与し得る。このタンパク質は低分子ＧＴＰアーゼスーパーファミリーのメンバーであり、Ｒａｓ関連ＧＴＰ結合領域の５回の反復を有する脂質固定細胞膜タンパク質をコードする。ＲＨＥＢのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００７に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００５６１４）を図３ＣＣに配列番号：２９として示す（４１４〜９６８のコード配列）；タンパク質配列を図３ＤＤに配列番号：３０として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＳＨＡＮＫ３は、脳内でシナプスを構築するために必要なタンパク質をコードする。Ｓｈａｎｋタンパク質は、神経伝達物質受容体、イオンチャネルおよび他の膜タンパク質をアクチン細胞骨格およびＧタンパク質共役シグナル伝達経路に連結するシナプス後肥厚部のマルチドメイン足場タンパク質である。Ｓｈａｎｋタンパク質はまた、シナプス形成および樹状突起棘成熟においても役割を果たす。この遺伝子は、第２２番染色体の２２ｑ１３．３に位置し、ｐ末端より４９，４５９，９３６ｂｐから始まって、ｐ末端より４９，５１８，５０７ｂｐで終了する（５８，５７２塩基；方向：プラス鎖）。ＳＨＡＮＫ３のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００２２に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿００１０８０４２０）を図３ＥＥに配列番号：３１として示す（１〜５２４４のコード配列）；タンパク質配列を図３ＦＦに配列番号：３２として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＴＳＣ１（結節硬化症１）は、腫瘍サプレッサーとして関係づけられてきた末梢膜タンパク質をコードする。ＴＳＣ１はまた、ＴＳＣ２と複合して、小胞輸送およびドッキングに関与する。ＴＳＣ１遺伝子は第９番染色体の９ｑ３４に位置し、ｐ末端より１３４，７５６，５５７ｂｐから始まって、ｐ末端より１３４，８０９，８４１ｂｐで終了する（５３，２８５塩基；方向：マイナス鎖）。ＴＳＣ１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００９に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０００３６８）を図３ＧＧに配列番号：３３として示す（２３５〜３７２９のコード配列）；タンパク質配列を図３ＨＨに配列番号：３４として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＴＳＣ２遺伝子（結節硬化症２）は、ツベリンと呼ばれる、腫瘍サプレッサーとして関係づけられてきたタンパク質をコードする。その遺伝子産物は、サイトゾル複合体においてハマルチンと結合し、ハマルチンについてのシャペロンとして働く。ＴＳＣ２は小胞輸送において機能を有し、ＴＳＣ１とＴＳＣ２の間の相互作用は小胞のドッキングを促進する。ＴＳＣ１およびＴＳＣ２の遺伝子産物は、細胞の増殖および大きさを制御するのを助けるように協力して働く。ＴＳＣ２遺伝子は第１６番染色体の１６ｐ１３．３に位置し、ｐ末端より２，０３７，９９１ｂｐから始まって、ｐ末端より２，０７８，７１４ｂｐで終了する（４０，７２４塩基；方向：プラス鎖）。ＴＳＣ２のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１６に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿０００５４８）を図３ＩＩに配列番号：３５として示す（１０７〜５５３０のコード配列）；タンパク質配列を図３ＪＪに配列番号：３６として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
ＵＢＥ３Ａ（ユビキチンプロテインリガーゼＥ３Ａ）は、ユビキチンプロテインリガーゼＥ３Ａと呼ばれる酵素をコードする。この酵素は、細胞内でタンパク質を標的して破壊する（分解する）ことに関与する。この遺伝子は第１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３に位置し、ｐ末端より２３，１３３，４８９ｂｐから始まって、ｐ末端より２３，２３５，２２１ｂｐで終了する（１０１，７３３塩基；方向：マイナス鎖）。ゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１５に見出される。遺伝子配列（ＮＭ＿１３０８３９）を図３ＫＫに配列番号：３７として示す（６５８〜３２７６のコード配列）；タンパク質配列を図３ＬＬに配列番号：３８として示す。本明細書で注記される場合を除き、この配列中の変異型は、少なくとも一部の自閉症スペクトラム障害（例えば非症候性自閉症）に関連することがこれまでに示されていないと考えられ、表２中の変異型は、非症候性自閉症または症候性自閉症に関連することがこれまでに示されていない。
例えば、表２中の最初のＡＲＣ変異型については、配列番号：１のＤＮＡ配列を使用して、変異型：ｃ６５Ｔ＞Ｇをコードする遺伝子のコード配列を決定することができ、変異型ｐ．Ｖａｌ２２Ｇｌｙを有するタンパク質のタンパク質配列を使用して、この変異型がミスセンス突然変異を含むことを決定し得る。突然変異の性質は、タンパク質配列（配列番号：２）および機能に関してさらに評価し得る。例えば、ＶａｌからＧｌｙへのアミノ酸置換は保存的置換であるとみなされ得るので、この突然変異は中等度から軽度の影響を及ぼすと予想され得る。または、タンパク質についての三次元立体配座データのより詳細な分析は、突然変異がタンパク質機能に有害であり得ることを指示し得る。同様の分析を、図４、パネル（ｐａｎｅｓ）Ａ〜ＬＬに示す配列を使用して、表２に記載されている変異型の各々について実施し得る。
従って、ある実施形態では、ＡＳＤ（例えば非症候性自閉症）を有する患者および対照（すなわち非自閉症個体）からの試料中の、ｍＧｌｕＲ５経路に関与する多くのキータンパク質をコードする１９個の遺伝子におけるコード領域および隣接するＲＮＡ調節領域内のＤＮＡ配列変異型の数および性質を検討し得る。標的領域を試料のプール中で富化し、まれな変異型の検出を可能にする次世代技術によって配列決定し得る。そのような方法の１つの実施形態を本明細書の実施例においてより詳細に論じる。そのような配列決定は、一般に、本明細書で述べる方法を用いて許容されるコストで高感度および低い偽発見率の条件下にて実施される。変異型検出の感度は、一般にこの位置をカバーするリードの数（「深度」または「カバー率」として知られる）、すなわちその特定の位置に関して利用可能な配列情報の量に依存し得る。富化方法およびシーケンシング工程の両方が配列の背景によって影響されるので、カバー率は領域によって異なり得る。加えて、変異型検出の感度も変異型の種類（置換対欠失および／または挿入）によって異なる。高いカバー率（すなわち≧３０ｘ領域のシーケンシング）で、感度は、ある実施形態では、置換変異型の検出については約９９％、≦５塩基にわたる欠失および／または挿入の検出については９０％、ならびに６〜約４０塩基にわたる欠失および／または挿入の検出については約３０％である。またある実施形態では、≦５塩基または≧６塩基にわたる挿入および／または欠失は、すべての変異型発生のそれぞれ約１０％および１％、すべての病原性変異型発生のそれぞれ約１６％および２．６％を占める。配列決定される領域内の各々の塩基位置におけるカバー率、配列決定される領域の長さおよび変異型の種類に特異的な感度を考慮に入れて、アッセイに含まれる各遺伝子についての変異型検出の全体的感度が提供され得る。例えば、遺伝子中の分析される塩基の８０％が９７％の感度に対応するカバー率を有し、１５％が９２％の感度に対応するカバー率を有し、そして５％が８０％の感度に対応するカバー率を有する場合、その遺伝子についての全体的な感度は９５％と計算される。一般に、５０％未満の感度を有するエクソンは、各遺伝子ごとの全体的感度評価には含まれないが、配列決定されないセグメントとして別途に報告される。
ある実施形態では、病原性であることが公知のまたは病原性であると予測される、次世代シーケンシングによって検出されるすべての配列変異型ならびに新規である（すなわちこれまでに文献またはデータベースに記載されていない）すべての配列変異型を、一方向サンガーシーケンシングによって確認する。それ故、報告される変異型の偽陽性率は一般に非常に低い。この方法を使用して、いくつかの異なる遺伝子における対照と比較した場合、全体としてのまれな変異型の数ならびにまれな、潜在的に破壊性の変異型の数の統計的に有意の増加を検出し得る。
例えば、１つの実施形態では、罹患していない個体では見られない、表２に示す変異型は、あるタイプの自閉症症候群（すなわち非症候性自閉症）を有する個体からの試料中で認められた。
例えば、表３〜５は、自閉症の症状を示さなかった（すなわち対照）または非症候性自閉症を有すると診断された個体において認められる、ｍＧｌｕＲ５シグナル伝達に関連する変異型の分析を提供する。本明細書の実施例でより詳細に述べるように、表２の変異型は、自閉症スペクトラム障害（非症候性自閉症）を有する２９０名の個体からの試料において認められた。
表３〜５に示すように、これらの遺伝子の少なくとも４つ（ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２およびＨＯＭＥＲ１）は、自閉症患者における高い検出に基づく突然変異を有していた。また、これらの遺伝子および検定したその他の遺伝子の少なくとも一部に関して、遺伝子発現またはタンパク質機能に関する突然変異の重要度は、変異型が非症候性自閉症の発症に関連し得ることを指示した。これらの突然変異はまた、他の種類の自閉症症候群にも関与し得る。これらの遺伝子の少なくとも１つ（ＨＯＭＥＲ１）は、これまでに機能的または遺伝的に自閉症に関連づけられていなかった。
表３は、対照（すなわち自閉症またはＡＳＤを有さない個体）と比べた場合の、ＡＧＲＥ試料データベースによって提供される、非症候性自閉症を有する患者からの試料中の一般的変異型およびまれな変異型の数の比較を示す。遺伝子の一部に関して、患者プールからの個体ではまれな変異型の数の明確な増加が存在し、一方より一般的な変異型は両方の群において同様の頻度を示すことがわかる。
１つの実施形態では、変異型（突然変異）は、表２に列挙する変異型の１つであり得る。または、変異型は、ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉ；ｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ突然変異；またはｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ突然変異などの、しかしこれらに限定されないＨＯＭＥＲ１の少なくとも１つであり得る。加えてまたは選択的に、突然変異は、ＧＲＭ５ ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ突然変異を含み得る。加えてまたは選択的に、突然変異は、ＭＡＰＫ２ ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ突然変異および／またはＨＲＡＳ ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ突然変異を含み得る。加えてまたは選択的に、突然変異は、ＭＥＣＰ２ ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘ突然変異を含み得る。
例えば、ＨＯＭＥＲ１変異型の２つ（ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉおよびｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ）は、ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５中のＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフと相互作用する、Ｈｏｍｅｒ１のＥＶＨ１ドメイン内に位置する。ＨＯＭＥＲ１における３番目の潜在的に損傷性の変異型（ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ）は、ＥＶＨ１ドメインについての内部結合部位として働く、ＣＲＨ１ドメインのＰモチーフ内の保存されたプロリンの１つに影響を及ぼす。ｍＧｌｕＲへのＥＶＨ１結合はＨｏｍｅｒ１のホモ多量体化を誘導し、一方Ｈｏｍｅｒ１の内部ＰモチーフへのＥＶＨ１結合はこのホモ多量体化を停止させると提案されている。興味深いことに、ＡＧＲＥ試料中で検出されたＧＲＭ５変異型の１つ（ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ）は、ｍＧｌｕＲ５中の保存されたＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ Ｈｏｍｅｒ１結合モチーフに比較的近接して位置する。
他の実施形態では、検出される突然変異はＴＳＣ１またはＴＳＣ２遺伝子中のいずれかである（表２参照）。さらなる他の実施形態では、検出される突然変異はＳＨＡＮＫ ３遺伝子中である（表２参照）。
他の実施形態では、ＡＧＲＥ試料は、保存されたスプライス部位に影響を及ぼし、従って損傷性である可能性が高いＭＡＰ２Ｋ２中の変異型（ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ）を有し得る。さらなる他の実施形態では、潜在的に損傷性である変異型はまた、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路におけるもう１つの遺伝子である、ＨＲＡＳにおいても検出された。このＨＲＡＳ変異型（ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ）は、ＧＴＰ結合Ｈ−ｒａｓの膜結合および機能において重要な役割を果たす１２８位のアルギニンを破壊する。
さらなる他の実施形態では、本発明の方法は、１つのＡＧＲＥ試料において、ＡＳＤのもう１つの症候性形態であるレット症候群に関連することが公知の遺伝子、ＭＥＣＰ２中のナンセンス突然変異（ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘ）をさらに検出し得る。
本発明の方法を以下の非限定的実施例によって例示する。
実施例１
自閉症候補遺伝子における変異型の発見
ＡＧＲＥコレクションからの２９０試料およびＣｏｒｉｅｌｌコレクションからの民族的に適合する２９０の試料中の、自閉症スペクトラム障害に関連すると仮定された１９の候補遺伝子および肥大型心筋症に関連することが公知の４つの対照遺伝子のすべてのコードエクソンを増幅した。増幅の前に、ＮＡＮＯＤＲＯＰ分光光度計での測定によって各試料中のＤＮＡ濃度を測定し、次に等しい量のＤＮＡを使用して、各々２０のＡＧＲＥ試料の１５プールおよび各々２０のＣｏｒｉｅｌｌ試料の１５プールを作製した。
自閉症候補遺伝子における変異型の発見
ＡＧＲＥコレクションからの２９０試料およびＣｏｒｉｅｌｌコレクションからの民族的に適合する２９０の試料中の、自閉症スペクトラム障害に関連すると仮定された１９の候補遺伝子および肥大型心筋症に関連することが公知の４つの対照遺伝子のすべてのコードエクソンを増幅した。増幅の前に、ＮＡＮＯＤＲＯＰ分光光度計での測定によって各試料中のＤＮＡ濃度を測定し、次に等しい量のＤＮＡを使用して、各々２０のＡＧＲＥ試料の１５プールおよび各々２０のＣｏｒｉｅｌｌ試料の１５プールを作製した。
各コレクションの１０試料を２つのプール中に存在させ、それらの試料中の変異型検出の独立した複製を可能にした。各プールについて、合計約１１６，０００塩基を含む、合計２９３のＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物は、すべてのｍＲＮＡアイソフォームのすべてのコード領域ならびに隣接イントロン領域をカバーした。ＰＣＲの間に誤差が導入されるのを最小限に抑えるため、高品質のポリメラーゼをＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲプライマーにＮｏｔＩ制限部位を含む配列の尾部を付した。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物をプールし、ＮｏｔＩ制限酵素での消化に供した。ＮｏｔＩ消化したＰＣＲ産物を連結して、数ｋｂの長さのコンカテマーを作製した。次にコンカテマーを２００〜２５０ｂｐ長のフラグメントに無作為にせん断した。ＩＬＬＵＭＩＮＡのプロトコールに従って、フラグメントを末端修復し、Ａ尾部を付加して、フォーク型アダプター分子に連結した。アダプター連結したフラグメントをＰＣＲによって選択的に富化した。富化工程の間に、６ｂｐのインデックスをフラグメントに付加した。フラグメントにインデックスを付けることにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ２装置の同じレーン上で異なる試料プールからのフラグメントを配列決定することが可能になった。
ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２で配列決定を５０サイクル実施した。レーン当たりの最小収率は５００万リードであった。２つの異なる試料プールからのフラグメントライブラリーを、塩基および試料プール当たり８００倍または個体当たり４０倍（個体の染色体当たり２０倍）の平均標的カバー率について、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２レーンごとに配列決定した。この平均カバー率は、２０試料のプールにおいて１つのヘテロ接合変異型の発生を検出するのに十分であった。カバー率、従って検出感度は、増幅領域内でおよび増幅領域間で、ならびにフラグメントライブラリー間で異なることが認められた。
各々のＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２レーンから導きだされた配列データをベースコーリングのためにＢＵＳＴＡＲＤを介して処理し、次に出力データをインデックスに基づき種々のファイルに分けた。実際のインデックス配列と１つ以下の塩基が異なるインデックスリードだけを使用した。インデックス分割後、アライナー（ＭＯＳＡＩＫ）とバリアントコーラー（ＧＩＧＡＢＡＹＥＳ）からなる、Ｂｏｓｔｏｎ ＣｏｌｌｅｇｅにおいてＤｒ．Ｇａｂｏｒ Ｍａｒｔｈによって開発されたパイプラインを用いて配列データを分析した。最初のＰＣＲ産物ライブラリープラス隣接する非コード配列の約３０ヌクレオチドに存在するすべてのコードエクソンについて、配列リードを、ｈｇ１８由来配列から構築された参照配列に整列した。リードが整列されたとみなされるためには、塩基の少なくとも６０％が最大限１つのミスマッチで整列されねばならなかった。プールデータにおけるバリアントコーリングは、３種類のフィルターの連続的な適用、次いでＧＩＧＡＢＡＹＥＳによって用いられるＢａｙｅｓｉａｎベースのバリアントコーリングアルゴリズムの使用に基づいた。フィルターは、以下の実験条件を順守することにより、２０試料のプールにおいて１つのヘテロ接合変異型の発生を検出するために８０〜９０％の感度を維持しつつ、偽陽性率を低減するように設計された：（１）ベースコールのＱＶ値は少なくとも２０でなければならない；（２）マイナーアレルコールの最小数を各々のＤＮＡ鎖（コードおよび非コード）から導かなければならない；および（３）マイナーアレル頻度が一定の値に達しなければならない。
フィルターを以下のように適用した。少なくとも２０のＱＶで各ＤＮＡ鎖上に少なくとも４回生じたマイナーアレルを潜在的な変異型として考慮した。総カバー率（すなわち任意のＱＶ値のベースコールの総数）が１２００以下であった位置では、少なくとも２０のＱＶで各ＤＮＡ鎖上に少なくとも３回生じたマイナーアレルを潜在的な変異型として考慮した。総カバー率が９００以下であった位置では、少なくとも２０のＱＶで各ＤＮＡ鎖上に少なくとも２回生じたマイナーアレルを潜在的な変異型として考慮した。上述した基準に基づき潜在的な変異型がコールされたすべての位置で、次に、何らかの他の試料プールでの何らかのフィルターによるすべての変異型コールを潜在的な変異型として考慮した。その後、すべての潜在的変異型コールを、プール試料におけるバリアントコーリングのための適切な設定でＧＩＧＡＢＡＹＥＳバリアントコーリングアルゴリズムに供した。生じた変異型コールのうちで、１．５％以上のマイナーアレル頻度を有するものだけを許容した。
実施例２
ＡＧＲＥおよび対照試料において認められた変異型の数
合計５３６の変異型が、ＧＡ２およびＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォームの両方でＡＧＲＥおよび／または対照試料において検出された（表３）。これらの変異型を、≧１％のアレル頻度で認められた場合は「一般的」、および＜１％のアレル頻度で認められた場合はまれなと称した。ＡＧＲＥ試料および対照においてそれぞれ検出された３３６および３１０の変異型はまれな変異型であった。一般的およびまれな変異型の両方の数が個々の遺伝子間で異なった。表２は、検出された変異型の少なくとも一部を示す。
ＡＧＲＥおよび対照試料において認められた変異型の数
合計５３６の変異型が、ＧＡ２およびＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォームの両方でＡＧＲＥおよび／または対照試料において検出された（表３）。これらの変異型を、≧１％のアレル頻度で認められた場合は「一般的」、および＜１％のアレル頻度で認められた場合はまれなと称した。ＡＧＲＥ試料および対照においてそれぞれ検出された３３６および３１０の変異型はまれな変異型であった。一般的およびまれな変異型の両方の数が個々の遺伝子間で異なった。表２は、検出された変異型の少なくとも一部を示す。
前記方法は、潜在的に破壊性の作用を有するまれな変異型を選択することを含み得る。この群には、タンパク質レベルでミスセンスまたはナンセンス変化を引き起こす、保存されたスプライス部位に影響を及ぼす、または３’ＵＴＲもしくは５’ＵＴＲ内に位置し、従ってｍＲＮＡ転写もしくはプロセシングに影響し得る変異型が含まれた。合計２１６のまれな、潜在的に破壊性の変異型のうちで、１４７はＡＧＲＥにおいておよび１２２は対照において認められた（表４）。それらのうちで、５８はＡＧＲＥ試料においてのみ認められ、３１は対照試料でのみ認められ（表５）、ＡＧＲＥ試料におけるまれな、潜在的に破壊性の変異型の統計的に有意の富化を指示した。個々の遺伝子のレベルでは、ＨＯＭＥＲ１、ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２遺伝子に関して富化が統計的有意性に達した（表５）。
これらの遺伝子の３つ（ＳＨＡＮＫ３、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２）は、自閉症における因果的役割がこれまでに明らかにされている。特に、しかしながら、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２中の変異型による自閉症は、典型的には結節硬化症の背景で認められるが、今回の研究では、症候性形態のＡＳＤを有する個体からの試料は除外された。４番目の遺伝子（ＨＯＭＥＲ１）は、これまで自閉症に因果的に関連づけられていなかった。ＨＯＭＥＲ１変異型の２つ（ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉおよびｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ）は、ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５中のＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフと相互作用することが示されている、Ｈｏｍｅｒ１のＥＶＨ１ドメイン内に位置する。ＨＯＭＥＲ１における３番目の潜在的に損傷性の変異型（ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ）は、ＥＶＨ１ドメインについての内部結合部位として働く、ＣＲＨ１ドメインのＰモチーフ内の保存されたプロリンの１つに影響を及ぼす。ｍＧｌｕＲへのＥＶＨ１結合はＨｏｍｅｒ１のホモ多量体化を誘導し、一方Ｈｏｍｅｒ１の内部ＰモチーフへのＥＶＨ１結合はこのホモ多量体化を停止させると提案されている。興味深いことに、ＡＧＲＥ試料中で検出されたＧＲＭ５変異型の１つ（ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ）は、ｍＧｌｕＲ５中の保存されたＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ Ｈｏｍｅｒ１結合モチーフに比較的近接して位置する。
ＡＧＲＥ試料においてのみ観察されたまれな、潜在的に破壊性のＴＳＣ１およびＴＳＣ２変異型のいくつかは、それらが明らかな疾患変異型と共に認められることおよび／または結節硬化症表現型と明瞭に分離されないことから、他所ではまれな多型として分類されてきた。これらの変異型は、従って、結節硬化症に関してはハイポモルフ変異型であり得、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２中で他の変異型と共に生じる場合は調節因子として働く。単一遺伝子障害の多形態性およびより軽度の形態の単一遺伝子疾患におけるハイポモルフ変異型の役割がますます広く認識されている。
ＡＧＲＥ試料におけるまれな、潜在的に破壊性の変異型の富化は、この初期サンプリングで遺伝子の４つについて統計的有意性に達したが、特定の単一変異型は付加的な遺伝子のＡＳＤへの因果関係を示唆する。具体的には、１つのＡＧＲＥ試料が、保存されたスプライス部位に影響を及ぼし、従って損傷性である可能性が高いＭＡＰ２Ｋ２中の変異型（ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ）を保持していた。潜在的に損傷性の変異型はまた、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路におけるもう１つの遺伝子である、ＨＲＡＳにおいても検出された。このＨＲＡＳ変異型（ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ）は、ＧＴＰ結合Ｈ−ｒａｓの膜結合および機能において重要な役割を果たすことが示されている１２８位のアルギニンを破壊する。ＭＡＰ２Ｋ２およびＨＲＡＳは、それぞれ、どちらも精神発達遅延および遅滞に関連する単一遺伝子障害である、心臓顔皮膚症候群およびコステロ症候群に関連することが公知である。しかし、ＭＡＰ２Ｋ２はこれまで自閉症に関係づけられていなかったが、初期関連研究はＨＲＡＳとＡＳＤの間の関連性を示唆した。
本発明の方法はさらに、１つのＡＧＲＥ試料において、ＡＳＤのもう１つの症候性形態であるレット症候群に関連することが公知の遺伝子、ＭＥＣＰ２中の１つのナンセンス突然変異（ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘ）を検出した。興味深いことに、このナンセンス突然変異はＭＥＣＰ２の３つのＣ末端アミノ酸の欠失だけを引き起こし、従ってハイポモルフ変異型でもあり得る。
いずれかのプールで変異型が検出されたすべての位置における各プール中の各遺伝子についての平均カバー率を決定した。１つまたは少数のプールにおける低いカバー率は、一般的な変異型の検出にはほとんど影響を及ぼさず、というのは、変異型が多くの異なるプールで認められるからである。しかし、まれな変異型は、それらがより低いカバー率のプールでのみ生じた場合は見逃される可能性がある。これらの影響を正しく認識するため、２つの測定を評価した：（１）一定のカットオフ値（例えば２０標本のプールについては１６０および１５標本のプールについては１２０）より低いカバー率を有するプールの数；ならびに（２）一般的変異型とまれな変異型の相対的頻度。いくつかのプールにおける低いカバー率の存在および集団の間での一般的変異型とまれな変異型の不均衡な比率の両方が、所与の遺伝子におけるまれな変異型についての検出信頼度を低下させる。
本発明の方法は、候補遺伝子におけるまれな変異型の発見を提供するので、試料プールの大きさが変異型検出の感度を制限しなかったかどうかを決定するためのアッセイを実施した。
より大きな（２０試料）プールにおける変異型検出の感度を検証するため、これまでにＭＹＢＰＣ３、ＭＨＹ７、ＴＮＮＴ２およびＴＮＮＩ３遺伝子のすべてのコードエクソンについてサンガーシーケンシングが実施されている２０試料からの検証プールを構築し、ＰＣＲを用いてこれらの標的を富化した。ＰＣＲ産物を鎖状に連結し、せん断して、高いカバー率の条件下にＧＡ２シーケンサーで配列決定した。配列決定は、２０試料の１つにおいてのみヘテロ接合的に存在する（シングルトン）２０変異型を含む、これまでにサンガーシーケンシングによって検出された４６の１ヌクレオチド変異型のすべてを検出し、そのようなプール（例えば高いカバー率の条件下にＧＡ２での２０試料プール）における変異型検出の高い感度を明らかにした。シングルトンの一部については、プールで検出されたアレル頻度が０．０２５の理論値から逸脱していたが、すべてのシングルトンが≧０．０１２のアレル頻度、または理論値の半分で検出された。このアレル頻度カットオフで、しかしながら、サンガーシーケンシングによって検出されていなかった、従って、６４％の偽発見率（ＦＤＲ）で偽陽性の可能性がある付加的な８２の変異型が検出された。
実施例３：方法
試料の選択
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する個体からのＤＮＡ試料（ｎ＝２９０）を、以下の選択基準に基づき、ｔｈｅ Ａｕｔｉｓｍ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＡＧＲＥ）コレクションから入手した：自閉症診断面接改訂版（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ，Ｒｅｖｉｓｅｄ）（ＡＤＩ−Ｒ）および自閉症診断観察スケジュール（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ）（ＡＤＯＳ）による自閉症の診断；特発性（すなわち非症候性）自閉症；少なくとも１名の罹患家族；ならびにＲＡＶＥＮ、ＰｅｏｂｏｄｙおよびＳＲＳについての完全なデータの利用可能性。試料の民族性は、２２１名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系ではない白色の、１以下の人種；１１名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系ではない白色の、２以上の人種；５３名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系；および５名の個体についてはアジア系として与えられた。３００の対照ＤＮＡ試料をＣｏｒｉｅｌｌコレクションから入手し、それらはコーカサスまたはヨーロッパ民族性の２４８試料およびヒスパニック系またはラテン系民族性の５２からなった。
試料の選択
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する個体からのＤＮＡ試料（ｎ＝２９０）を、以下の選択基準に基づき、ｔｈｅ Ａｕｔｉｓｍ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＡＧＲＥ）コレクションから入手した：自閉症診断面接改訂版（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ，Ｒｅｖｉｓｅｄ）（ＡＤＩ−Ｒ）および自閉症診断観察スケジュール（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ）（ＡＤＯＳ）による自閉症の診断；特発性（すなわち非症候性）自閉症；少なくとも１名の罹患家族；ならびにＲＡＶＥＮ、ＰｅｏｂｏｄｙおよびＳＲＳについての完全なデータの利用可能性。試料の民族性は、２２１名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系ではない白色の、１以下の人種；１１名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系ではない白色の、２以上の人種；５３名の個体についてはヒスパニック系またはラテン系；および５名の個体についてはアジア系として与えられた。３００の対照ＤＮＡ試料をＣｏｒｉｅｌｌコレクションから入手し、それらはコーカサスまたはヨーロッパ民族性の２４８試料およびヒスパニック系またはラテン系民族性の５２からなった。
次世代シーケンシング
ＮＡＮＯＤＲＯＰ分析システムを用いてすべての試料についてＤＮＡ濃度を測定し、等しい量の対照試料ＤＮＡを、各々２０試料および１５試料の直交プールに混合した。次に各々のプールを、５’末端にＮｏｔＩ制限部位を含む１４ｂｐ配列の尾部を付した特異的ＰＣＲプライマーを使用して、１９の候補遺伝子の各々の最長アイソフォームのすべてのコードエクソンをＰＣＲ増幅するための１つのＤＮＡ鋳型として使用した。同じ鋳型（すなわち試料プール）に由来するすべてのＰＣＲ産物をプールし、ＮｏｔＩで消化して、連結してコンカテマーを形成し、その後ＣＯＶＡＲＩＳ Ｓ２装置を用いて１５０〜３００ｂｐの平均サイズを有するフラグメントに無作為にせん断した。これらのフラグメントは、製造者の指示に従ったＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２（２０試料プール）またはＨＥＬＩＣＯＳ ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（１５試料プール）のいずれかでのシーケンシングのために調製した。ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングを５０サイクル実施し、５０塩基近くまでのリード長を生じさせ、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥシーケンシングを１２０サイクルまたは３０クワッド実施して、約３２塩基の平均リード長を生じさせた。
ＮＡＮＯＤＲＯＰ分析システムを用いてすべての試料についてＤＮＡ濃度を測定し、等しい量の対照試料ＤＮＡを、各々２０試料および１５試料の直交プールに混合した。次に各々のプールを、５’末端にＮｏｔＩ制限部位を含む１４ｂｐ配列の尾部を付した特異的ＰＣＲプライマーを使用して、１９の候補遺伝子の各々の最長アイソフォームのすべてのコードエクソンをＰＣＲ増幅するための１つのＤＮＡ鋳型として使用した。同じ鋳型（すなわち試料プール）に由来するすべてのＰＣＲ産物をプールし、ＮｏｔＩで消化して、連結してコンカテマーを形成し、その後ＣＯＶＡＲＩＳ Ｓ２装置を用いて１５０〜３００ｂｐの平均サイズを有するフラグメントに無作為にせん断した。これらのフラグメントは、製造者の指示に従ったＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２（２０試料プール）またはＨＥＬＩＣＯＳ ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（１５試料プール）のいずれかでのシーケンシングのために調製した。ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングを５０サイクル実施し、５０塩基近くまでのリード長を生じさせ、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥシーケンシングを１２０サイクルまたは３０クワッド実施して、約３２塩基の平均リード長を生じさせた。
次世代シーケンシングデータの分析
リードを、３０の隣接する非コード塩基で各々の側に「パッドを付加した（ｐａｄｄｅｄ）」各増幅エクソンンのｈｇ１８由来配列を含む参照配列に整列した。ＧＡ２リードについてはアライナーＭＯＳＡＩＫを使用し、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥリードについてはアライナーＩＮＤＥＸＤＰを使用した。バリアントコーリングは、ＧＡ２についてはＧＩＧＡＢＡＹＥＳで実施したが、Ｂａｙｅｓｉａｎベースのアルゴリズムは使用せず、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥリードについてはＳＮＰＳＮＩＦＦＥＲで実施した。ＳＮＰＳＮＩＦＦＥＲは、１％の最小マイナーアレル頻度閾値を必要とした。ＧＩＧＡＢＡＹＥＳでは最小マイナーアレル頻度閾値は設定しなかった。両方の場合に、バリアントコールは、それらが各ＤＮＡ鎖上で少なくとも１回生じた場合にのみ受け入れた。初期バリアントコーリングの間は他のフィルターを使用しなかった。
リードを、３０の隣接する非コード塩基で各々の側に「パッドを付加した（ｐａｄｄｅｄ）」各増幅エクソンンのｈｇ１８由来配列を含む参照配列に整列した。ＧＡ２リードについてはアライナーＭＯＳＡＩＫを使用し、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥリードについてはアライナーＩＮＤＥＸＤＰを使用した。バリアントコーリングは、ＧＡ２についてはＧＩＧＡＢＡＹＥＳで実施したが、Ｂａｙｅｓｉａｎベースのアルゴリズムは使用せず、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥリードについてはＳＮＰＳＮＩＦＦＥＲで実施した。ＳＮＰＳＮＩＦＦＥＲは、１％の最小マイナーアレル頻度閾値を必要とした。ＧＩＧＡＢＡＹＥＳでは最小マイナーアレル頻度閾値は設定しなかった。両方の場合に、バリアントコールは、それらが各ＤＮＡ鎖上で少なくとも１回生じた場合にのみ受け入れた。初期バリアントコーリングの間は他のフィルターを使用しなかった。
サンガーシーケンシング
次世代シーケンシングンの間に検出された変異型を確認するため、選択遺伝子領域および選択試料についてサンガーシーケンシングを実施した。ＰＣＲプライマーおよび条件は、試料プールの代わりに個々の試料を鋳型として使用したことを除き、前回と同じであった。次に、ＡＢＩ ＢＩＧＤＹＥ試薬を使用して、シーケンシングプライマーとしての役割を果たす特異的ＰＣＲプライマーで各々のＰＣＲ産物をサイクルシーケンシングし、シーケンシング産物をＡＢＩ３７３０ｅｘｌで分離した。ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＣＡＮＮＥＲ（ＡＢＩ）を用いてシーケンシングトレースを視覚化し、所与の突然変異の存在または不在を参照配列との手動比較によって決定した。
次世代シーケンシングンの間に検出された変異型を確認するため、選択遺伝子領域および選択試料についてサンガーシーケンシングを実施した。ＰＣＲプライマーおよび条件は、試料プールの代わりに個々の試料を鋳型として使用したことを除き、前回と同じであった。次に、ＡＢＩ ＢＩＧＤＹＥ試薬を使用して、シーケンシングプライマーとしての役割を果たす特異的ＰＣＲプライマーで各々のＰＣＲ産物をサイクルシーケンシングし、シーケンシング産物をＡＢＩ３７３０ｅｘｌで分離した。ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＣＡＮＮＥＲ（ＡＢＩ）を用いてシーケンシングトレースを視覚化し、所与の突然変異の存在または不在を参照配列との手動比較によって決定した。
特許、特許出願、特許公開、定期刊行物、書籍、論文、ウエブコンテンツなどの他の資料の参照および引用を本開示全体を通して行っている。すべてのそのような資料は、すべての目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (29)
- 被験体において自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断するための方法であって、前記方法は：
被験体からの組織試料または体液試料から核酸を得る工程；
前記被験体の核酸中に１つの変異型配列または複数の変異型配列が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施する工程；
検出された各々の変異型について、前記変異型が自閉症スペクトラム障害に関連する公知の変異型であるかまたはこれまでに記述されていない変異型であるかを決定する工程；
前記変異型がこれまでに記述されていない変異型である場合は、前記変異型が遺伝子発現および／またはタンパク質機能の少なくとも１つに有害な作用を及ぼすと予想されるか否かを決定する工程；ならびに
検出された前記変異型配列または前記複数の変異型配列に基づき、前記自閉症スペクトラム障害の存在または前記自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクを診断する工程
を含む、方法。 - 前記アッセイが、核酸配列決定、ハイブリッドキャプチャー法および後成的分析の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記実施する工程における前記核酸が、遺伝子、エクソン、イントロン、遺伝子調節エレメント、発現されたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは後成的エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が、１つ以上の自閉症スペクトラム障害に関連することが公知の配列または関連することが疑われる配列から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が、表１中の遺伝子の１つの少なくとも一部を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記核酸が、代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路中のタンパク質をコードする遺伝子に由来する、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢまたはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＳＨＡＮＫ３またはＨＯＭＥＲ１の少なくとも１つについての遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記配列決定が、合成による１分子シーケンシングまたは大量並列シーケンシングの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。
- 変異を示す試料を同定するために複数のＤＮＡ試料をプール中で分析する、請求項２に記載の方法。
- 少なくとも２つのプールにおいて同じ変異を示す個々の試料を同定するために複数のＤＮＡ試料を複数のプール中で分析する、請求項１０に記載の方法。
- 前記自閉症スペクトラム障害が、非症候性自閉症、古典的自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害、または特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記自閉症スペクトラム障害が非症候性自閉症を含む、請求項１に記載の方法。
- 顕在表現型を含む、自閉症に関係する遺伝的症候群の存在または遺伝的症候群を発症する増大したリスクを診断する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記遺伝的症候群が、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、１５ｑ１１−ｑ１３重複、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ前突然変異、染色体２ｑの欠失、ＸＹＹ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、アペール症候群、ＡＲＸ遺伝子の突然変異、ド・ランゲ症候群、スミス・メイジェニス症候群、ウィリアムズ症候群、ヌーナン症候群、ダウン症候群、口蓋心顔面症候群、筋緊張性ジストロフィー、シュタイネルト病、結節硬化症、デュシェーヌ病、ティモシー症候群、１０ｐ染色体末端欠失、カウデン症候群、４５，Ｘ／４６，ＸＹモザイク、ミーレ症候群、ソトス症候群、コーエン症候群、ゴルドナール症候群、ジュベール症候群、Ｌｕｊａｎ−Ｆｒｙｎｓ症候群、メビウス症候群、伊藤のメラニン減少症、神経線維腫症１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、またはＨＥＡＤＤ症候群の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記被験体が小児である、請求項１に記載の方法。
- 前記被験体が胎児である、請求項１に記載の方法。
- 前記体液が、脳脊髄液、血液、羊水、母体血および尿の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記変異型が、表２中の変異型の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記変異型が、以下の突然変異：ＨＯＭＥＲ １ ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉ；ＨＭＥＲ １ ｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ；ＧＲＭ５ ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ；ＭＡＰＫ２ ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ；ＨＲＡＳ ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ；ａ ＭＥＣＰ２ ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 自閉症スペクトラム障害の存在または自閉症スペクトラム障害を発症する増大したリスクと相関する突然変異を同定するための方法であって、
突然変異した場合、自閉症の発症に関連し得るまたは関連する配列を有すると評価される核酸を同定する工程；
自閉症スペクトラム障害を有する被験体からの組織試料または体液試料から核酸試料を得る工程；および
自閉症スペクトラム障害を有さない個体における核酸配列と比較して、自閉症を有する前記被験体において前記核酸配列において突然変異が存在するか否かを同定するためのアッセイを実施する工程であって、自閉症スペクトラム障害を有する被験体における前記突然変異の存在が、前記突然変異が前記自閉症スペクトラム障害の発症に関連し得ることを示す、工程
を含む、方法。 - 前記突然変異が、これまでに自閉症スペクトラム障害の発症に関連づけられていた変異型である、請求項２１に記載の方法。
- 前記突然変異がこれまでに記述されていない変異型である、請求項２１に記載の方法。
- 前記突然変異が遺伝子発現および／またはタンパク質機能の少なくとも１つに有害な作用を及ぼすと予想されるか否かを決定する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 突然変異の存在または不在を評価する前記核酸配列が、代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路中のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部である、請求項２１に記載の方法。
- 前記自閉症スペクトラム障害が非症候性自閉症である、請求項２１に記載の方法。
- 以下の遺伝子：ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＭＥＣＰ２、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＭ１、ＧＲＭ５、ＡＲＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＯＭＥＲ１、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＲＡＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＦＭＲ１、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢまたはＵＢＥ３Ａの少なくとも１つからの変異型配列を含む単離された核酸であって、前記配列が自閉症スペクトラム障害の指標となる変異型を含む、単離された核酸。
- 表２に記載される変異型配列を含む、請求項２７に記載の単離された核酸。
- 以下の変異型：ＨＯＭＥＲ １ ｃ．１９５Ｇ＞Ｔ、Ｍ６５Ｉ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．２９０Ｃ＞Ｔ、Ｓ９７Ｌ；ＨＯＭＥＲ １ ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、Ｐ１４２Ｌ；ＧＲＭ５ ｃ．３５０３Ｔ＞Ｃ、Ｌ１１６８Ｐ；ＭＡＰＫ２ ｃ．５８１−１Ｇ＞Ｔ；ＨＲＡＳ ｃ．３８３Ｇ＞Ａ、Ｒ１２８Ｑ；ａ ＭＥＣＰ２ ｃ．１４７７Ｇ＞Ｔ、Ｅ４８３Ｘの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載の単離された核酸。
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