CN114306368A

CN114306368A - CircHOMER1的应用和结直肠癌治疗制剂

Info

Publication number: CN114306368A
Application number: CN202210017455.9A
Authority: CN
Inventors: 黄河; 徐容; 林良武; 熊力
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了circHOMER1的应用和结直肠癌治疗制剂。通过研究证实了circHOMER1在结直肠癌组织中低表达，过表达circHOMER1可以提高光动力对结直肠癌肿瘤细胞治疗的敏感性。因此将circHOMER1用于提高光动力治疗的试剂，具有深远的临床意义以及提高结直肠癌光动力治疗应用前景。

Description

CircHOMER1的应用和结直肠癌治疗制剂

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种环状RNA circHOMER1在制备提高结直肠癌光动力治疗试剂中的应用和相应的结直肠癌治疗制剂。

背景技术

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在中国，结直肠癌在所有恶性肿瘤发病率和死亡率分别排第4和第5位，且在我国结直肠癌新发病例和结直肠癌有关的死亡病例占据世界首位。这种疾病对健康构成了严重的威胁，给社会和个人带来了沉重的经济负担。常见的肿瘤治疗手段有手术治疗、放疗、化疗等。常规治疗手段副作用大，且对于放化疗耐受或者中晚期转移的患者往往达不到好的效果。因此需要一种替代或者补充的治疗方法对常规治疗达不到较好效果的患者进行治疗。

光动力治疗是一类微创治疗手段，它主要是利用一定波长的光源激发可以特异性聚集在肿瘤部位的光敏剂，产生具有细胞毒性的ROS，在细胞中发生氧化反应，杀伤肿瘤细胞。光动力可以利用介入手段，如光纤或者内窥镜对肿瘤进行治疗。或者联合其他治疗方式，如手术治疗后进行光动力治疗，清楚残余肿瘤细胞，减少复发。或者作为主要的治疗手段，避免了常规治疗带来的副作用。由此可见，光动力作为新型治疗手段以及提高治疗疗效对于放化疗耐受的中晚期以及转移的患者有着重大的作用。

已有研究表明了非编码RNA(lncRNA和miRNA)可以在光动力治疗肿瘤过程中发挥作用，circRNA在光动力治疗肿瘤过程中的功能至今没有研究报道。

因此，筛选出新型circRNA作为提高肿瘤光动力治疗疗效的有效分子，并能尽早在专利领域得到很好的保护，能显著提高我国在该技术领域的国际竞争力。

发明内容

本发明从RNA-Seq数据中筛选出了光动力处理后高表达的环状RNA，在结直肠癌组织中验证出其表达情况，进一步验证了其是能够提高光动力治疗结直肠癌的有效分子。

本发明的首要目的是提供环状RNAcircHOMER1在制备促进结直肠癌光动力治疗作用制剂中的应用。

进一步地，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用制剂包括过表达circHOMER1的试剂；所述环状RNAcircHOMER1的序列如SEQ No.1所示。

进一步地，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指提高光动力对结直肠癌肿瘤细胞治疗的敏感性。

进一步地，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指对结直肠癌细胞增殖水平的抑制和凋亡水平的促进作用。

更进一步地，过表达circHOMER1的试剂包括：环状RNAcircHOMER1过表达载体。

本发明的次要目的是提供一种辅助光动力治疗结直肠癌的试剂。光动力作为一种微创的治疗手段，操作方便，精准定位于肿瘤部位，对周围正常组织无毒副作用，是一类较理想的治疗手段。在细胞水平，本发明通过上调环状RNAcircHOMER1后发现其可以明显升高结直肠癌细胞对光动力治疗的敏感性，提高了光动力的治疗效果。

一种促进结直肠癌光动力治疗作用的制剂，包括过表达circHOMER1的试剂；所述环状RNAcircHOMER1的序列如SEQ No.1所示。

所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指提高光动力对结直肠癌肿瘤细胞治疗的敏感性。

所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指对结直肠癌细胞增殖水平的抑制和凋亡水平的促进作用。

过表达circHOMER1的试剂包括：环状RNAcircHOMER1过表达载体。

构建环状RNAcircHOMER1的过表达载体时，所选过表达载体为Plo-ciR。通过设计两段侧翼序列将环状RNAcircHOMER1的序列插入Plo-ciR中，经测序以及酶切鉴定后转染进入细胞。侧翼序列：

如SEQ No.2和3所示

原引物序列：

上游引物：GGAACAACCTATCTTCAGCA，如SEQ No.4所示；

下游引物：CTATGTGAAAATGGCAATGCA，如SEQ No.5所示。

上述促进结直肠癌光动力治疗作用的制剂，还可以包括实时荧光定量检测试剂和细胞增殖和凋亡检测试剂。

本发明验证了环状RNAcircHOMER1在光动力治疗结直肠癌细胞中表达上调，具有统计学意义，且测序数据匹配实验验证，试验过程严谨，结果真实可靠。

本发明提供用于提高光动力治疗结直肠癌的试剂，为提高结直肠癌的治疗疗效提供可靠的辅助产品。

本发明在验证过程中，首先在对光动力处理后的细胞中筛选出了高表达的环状RNAcircHOMER1，并在其他细胞系中也验证了光动力可以提高环状RNAcircHOMER1的表达水平。动物水平实验也显示了环状RNAcircHOMER1在光动力处理后的肿瘤组织中也表达上调。在人源的结直肠癌组织标本中环状RNAcircHOMER1表达下调。过表达环状RNAcircHOMER1后可以提高光动力对结直肠癌细胞增殖水平的抑制和凋亡水平的促进作用。

本发明通过RNA-Seq数据发现光动力处理结直肠癌细胞后环状RNAcircHOMER1高表达，通过试验进行证实了在两株结直肠癌细胞中，光动力处理后环状RNAcircHOMER1高表达，且在临床组织样本(n＝40)中环状RNAcircHOMER1在结直肠癌组织中低表达。过表达环状RNAcircHOMER1后可以提高结直肠癌光动力治疗效果。首次发现了环状RNAcircHOMER1可以提高结直肠癌光动力治疗疗效。从而提示环状RNAcircHOMER1可作为提高光动力治疗的靶标。本发明为肿瘤治疗提供了强有力的分子生物学工具。具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为对差异表达的circRNA进行聚类热图分析。

图2为对差异表达的circRNA进行聚类火山图分析。

图3为qPCR检测结直肠癌组织中环状RNAcircHOMER1的表达；GAPDH作为内参(CRC和癌旁组之间采用配对t检验分析统计差异，*代表p<0.05)。

图4为qPCR检测光动力处理后环状RNAcircHOMER1表达情况；GAPDH作为内参(两组之间采用独立样本的t检验进行统计分析，***代表p<0.001)。

图5裸鼠皮下瘤光动力模型构建；

(A)裸鼠皮下瘤光动力模型构建思路模式图；(B)裸鼠肿瘤组织获得。

图6为裸鼠皮下瘤-PDT模型构建后肿瘤组织中环状RNAcircHOMER1表达检测情况，GAPDH作为内参(两组之间采用独立样本的t检验进行统计分析，***代表p<0.001)。

图7为过表达环状RNAcircHOMER1质粒pLO-ciR图谱以及circHOMER1插入pLO-ciR位点模式图。

图8为circHOMER1过表达效率检测；

图9为circHOMER1促进DVDMs-PDT对细胞增殖能力的抑制作用；

(A-B)RKO和CX-1细胞中分别转染circHOMER1过表达质粒以及空白质粒后用0.1μMDVDMs孵育后用5J/cm²处理，随后CCK8孵育2小时后检测各组OD值，评估细胞增殖水平；(C-D)细胞中转染circHOMER1过表达质粒以及空白质粒12小时后用0.1μM DVDMs孵育后用5J/cm²处理，随后消化细胞，采用凋亡流式试剂盒检测两组细胞的凋亡情况。(两组之间采用独立样本的t检验进行统计分析，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001)。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非形成对本发明的限制。

本发明中采用的结直肠癌细胞来自ATCC细胞库(RKO和CX-1)，光动力所需的光敏剂DVDMs购自江西庆隆公司，630nm激光仪购自桂林兴达。过表达环状RNAcircHOMER1的空白载体Plo-ciR购自广州吉赛生物,过表达环状RNAcircHOMER1载体构建由长沙擎科生物完成。

本发明采用的癌旁组织以及结直肠癌组织样本来自于中南大学湘雅二医院。所选择临床样本排除了手术以及放化疗患者和其他严重免疫性疾病以及其他重大疾病。临床标本收集时间区间：2018-2019年。收集临床样本逐步完整临床资料，包括患者姓名、性别、年龄、住院编号、病理类型、病理分期、接受治疗情况等。所有临床样本均征得被采集者的同意。

Realtime PCR引物

本发明所用的引物和探针均通过专用的引物设计网站Primer 3.0进行设计。引物合成工作委托擎科生物工程公司合成。为了确保引物的特异性和qPCR的精确性，严格遵循以下引物设计原则：

本发明所用引物序列如下：

扩增环状RNAcircHOMER1引物

上游引物：AGTCTCCTTTAACACCGGAAAGTAT，如SEQ No.6所示；

下游引物：AGACACAGTAACTGCATGCTTG，如SEQ No.7所示。

内参(GAPDH)引物序列

上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGTG，如SEQ No.8所示；

下游引物：GAGTCCTTCCACGATACCAAAG，如SEQ No.9所示。

实施例1：RNA-seq实验

对PDT处理前和处理后的细胞进行RNA-Seq测序，筛选PDT处理后差异表达的circRNA。这部分实验内容由广州锐博生物技术有限公司完成，具体步骤如下：RNA进行提取以及质检后，经探针去除rRNA，RNaseR去线性RNA后构建Illumina测序文库。随后进行测序，测序模式为PE150，测序数据量12G/15G。对于测序数据首先进行Raw Data过滤、去接头序列及低质量reads，获得高质量数据(Clean Data)。然后通过与核糖体数据库进行比对，去除核糖体RNA序列，获得有效的reads。将有效的reads与参考基因组进行比对(mapping)，比对结果用于下一步环状RNA的鉴定，锐博生物采用2个软件综合鉴定环状RNA，得到高度可信环状RNA。并进一步对鉴定得到的环状RNA进行序列预测、表达值计算和表达差异分析。显著差异表达的环状RNA用于后续功能挖掘。

RNA-seq结果分析

采用DESeq2方法计算差异环状RNA，并使用p-value小于0.05|log2 Fold Change|大于1作为差异circRNA的界定标准。聚类分析判断在PDT处理前和后差异环状RNA的表达模式。在本次测序结果中p-value小于0.05及|log2 Fold Change|大于1的差异circRNAs一共有839个，在RKO-PDT组中上调的差异circRNAs有652个，下调的有187个(表1)。采用DESeq2计算差异表达的circRNA，p-value<0.05且|log2 Fold Change|>1作为聚类分析界定，绘制热图分析Control组和PDT组中上调以及下调的circRNAs(图1)；采用DESeq2计算差异表达的circRNA，p-value<0.05且|log2 Fold Change|>1作为聚类分析界定，绘制火山图分析Control组和PDT组中上调以及下调的circRNAs(图2)，统计差异环状RNA的整体分布情况。

表1差异表达circRNAs的统计结果

实施例2：qPCR检测结直肠癌组织中环状RNAcircHOMER1的表达

收集了40对新鲜的组织进行qPCR检测环状RNAcircHOMER1在结直肠癌及癌旁组织中的表达情况，结果如图3所示。环状RNAcircHOMER1在癌旁中高表达，在结直肠癌组织中低表达。

实施例3：qPCR检测光动力处理后环状RNAcircHOMER1表达情况

结直肠癌细胞RKO和CX-1加入完全培养基(含0.1μM光敏剂)孵育4小时后，10cm²/J的激光处理。继续培养6小时，收集细胞加入Trizol裂解细胞并检测环状RNAcircHOMER1表达。

采用qPCR检测RKO、RKO-PDT和CX-1、CX-1-PDT组细胞中环状RNAcircHOMER1的表达水平。如图4所示，光动力处理后的RKO和CX-1细胞中环状RNAcircHOMER1表达水平明显上调。

实施例4：裸鼠皮下瘤-PDT模型构建以及环状RNAcircHOMER1表达检测

构建裸鼠移植瘤模型：将生长状态佳的CX-1细胞消化成单个细胞后，以5×10⁷个细胞每只注射到6周龄裸鼠皮下。待瘤子长到90-110cm³时，随机选择10只裸鼠，分成2组：实验组(PDT处理组)和对照组(Control组)。对照组不予处理，实验组裸鼠尾静脉以1mg/kg的量注射光敏剂DVDMs，24小时后实验组裸鼠予以630nm激光照射，光照时长5分钟，能量为100J/cm²。光照12小时后处死裸鼠，进行拍照后剥离瘤子，放入PBS中清洗后用液氮速冻。对于要进行qPCR检测环状RNAcircHOMER1表达情况的组织用液氮冻存后，研钵研磨加入Trizol裂解，放入-20℃备用。

构建的裸鼠皮下移植瘤模型，通过DVDMs-PDT处理后，检测DVDMs-PDT对肿瘤的影响。裸鼠皮下瘤-光动力治疗模型模式图如图5A所示；裸鼠皮下移植瘤-DVDMs-PDT处理模型构建完成后剥离瘤子，发现光动力处理组中裸鼠皮下组织颜色变成深红色，剥离下来的组织外表发生了明显的改变，组织整体呈现血红色(图5B)

构建了裸鼠皮下移植瘤模型，通过DVDMs-PDT处理后，肿瘤组织中环状RNAcircHOMER1的表达水平进行了检测，如图6所示光动力处理肿瘤组织后环状RNAcircHOMER1的表达水平上调。

实施例5：过表达环状RNAcircHOMER1

本发明过表达环状RNAcircHOMER1质粒pLO-ciR图谱以及circHOMER1插入pLO-ciR位点模式图见图7。

将2ug对照质粒和过表达环状RNAcircHOMER1质粒分别转染至结直肠癌细胞中。6-8小时换液。连续培养48小时后，收集细胞，加入Trizol裂解细胞，冻存至-20℃，用于RNA抽提检测环状RNAcircHOMER1表达情况。

环状RNAcircHOMER1表达检测

RNA抽提流程：

(1)在冰上把裂解好的细胞及组织，于室温下放置5分钟，使得完全裂解之后。每一管组织或者细胞裂解液中加入200μL三氯甲烷，剧烈地振荡15秒，低温下放置5分钟，待其分层。

(2)2-8℃，12000rpm离心15分钟。样品分为三层，有机相在底层是红色的，蛋白层在中间层是白色的，水相层在上层是无色的，上层核酸是我们所需要的。

(3)吸取450μL的上层液体加到新的无酶tube管中，异丙醇加入450μL，轻轻的上下颠倒混匀，放在低温下静置15分钟。

(4)2-8℃，12000rpm离心15分钟，白色沉淀在离心后出现在管底，轻轻倒掉上清液，小心保留底下沉淀。

(5)每管加入1mL 75％的乙醇至沉淀飘离管壁(75％的乙醇用DEPC水配制)。2-8℃，7500rpm离心5分钟，弃去上清，重复2次这一步操作，离心一次，弃去上清。

(6)无核酸酶水溶解白色的沉淀得到RNA，促溶：50-60℃或者4℃冰箱过夜。

CDNA制备流程：

(1)按照逆转录试剂盒说明书进行操作：

充分混匀后加入以下成分：

(2)反应程序：

25℃ 5分钟

42℃ 60分钟

70℃ 5分钟

(3)反应在PCR仪上完成。待反应完毕后每管冷却到12℃时，将样品取出用作后续实验或者放入-20℃长久保存。

QPCR实验步骤以及反应程序

(1)反应体系

(2)反应程序如下：

(3)导出反应结果，计算目的基因和参照基因Ct、ΔCt和2^-ΔΔCt计算方法：Ct值由ABI 7500Manager软件计算给出；ΔCt₁＝实验组待检测的基因Ct-实验组参照基因Ct；ΔCt₂＝Control组待检测的基因Ct-Control组参照基因Ct；ΔΔCt＝ΔCt₁-ΔCt₂；2^-ΔΔCt通过公式计算得出。结果分析利用Graph RAD prism7作出柱状图，分析circRNA在细胞中的2^-ΔΔCt。采用独立样本t检验检验分析circRNA在细胞中的2^-ΔΔCt值。

过表达环状RNAcircHOMER1的表达效率见图8。

实施例6：CircHOMER1增敏效果评估

为更好地检测过表达circHOMER1对光动力处理结直肠癌细胞的效果，降低了光动力的光照剂量，由10J/cm²降低为5J/cm²。通过CCK8和凋亡实验评估过表达circHOMER1后是否可以提高光动力治疗对结直肠癌细胞的治疗疗效。

(1)光动力毒性实验：细胞以2×10⁵个细胞加入6孔板中，待细胞贴壁后转染2μg过表达环状RNAcircHOMER1质粒和对照质粒。连续培养12小时后消化细胞以每孔细胞以5×10³每孔的细胞数接种到96孔板，细胞于37℃细胞培养。细胞加0.1μM浓度的DVDMs，并接受5cm²/J的激光处理。细胞继续培养12小时和24小时，然后每孔加入10μL CCK8,最后放到酶标仪上，450nm吸收光下检测每个孔的吸光值(OD值)。分析细胞的吸光度值，同时用excel作图，SPSS进行统计分析。

(2)细胞凋亡实验：细胞以2×10⁵每孔的细胞数接种到6孔板，并转染2ug过表达环状RNAcircHOMER1质粒和对照质粒。连续培养12小时。随后细胞添加0.1μM华卟啉钠DVDMs孵育4小时，随后用630nm激光激发2分钟(5J/cm²)。随后用无EDTA的胰酶消化细胞后，800g离心收集细胞后用PBS重悬，调整细胞数为5×10⁶个/mL。随后离心5分钟，取沉淀，用冰上冷却的PBS洗涤一次，1000rpm离心5分钟，5μL的Annexin V-FITC加入到100μL细胞悬液，无光孵育10分钟。加入PI孵育10分钟后，上机检测。

CircHOMER1过表达抑制细胞增殖促进细胞凋亡

CCK8实验发现，过表达circHOMER1可以明显促进光动力对细胞增殖的抑制作用(图9A-B)；且过表达circHOMER1可以促进细胞凋亡水平(图9C-D)。结果提示circHOMER1对CRC有增敏的作用。

序列表

<110> 中南大学

<120> CircHOMER1的应用和结直肠癌治疗制剂

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

ggaacaacct atcttcagca ctcgagctca tgtcttccaa attgacccaa acacaaagaa 60

gaactgggta cccaccagca agcatgcagt tactgtgtct tatttctatg acagcacaag 120

aaatgtgtat aggataatca gtttagatgg ctcaaaggca ataataaata gtaccatcac 180

cccaaacatg acatttacta aaacatctca gaagtttggc cagtgggctg atagccgggc 240

aaacaccgtt tatggattgg gattctcctc tgagcatcat ctttcgaaat ttgcagaaaa 300

gtttcaggaa tttaaagaag ctgctcgact agcaaaggaa aaatcacaag agaagatgga 360

acttaccagt acaccttcac aggaatccgc aggcggggat cttcagtctc ctttaacacc 420

ggaaagtatc aacgggacag atgatgaaag aacacctgat gtgacacaga actcagagcc 480

aagggctgaa ccaactcaga atgcattgcc attttcacat ag 522

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggaattctg aaatatgcta tcttacag 28

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattccat atgtcaagaa aaaatatatt cac 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaacaacct atcttcagca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctatgtgaaa atggcaatgc a 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtctccttt aacaccggaa agtat 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agacacagta actgcatgct tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagatccctc caaaatcaag tg 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagtccttcc acgataccaa ag 22

Claims

1.环状RNAcircHOMER1在制备促进结直肠癌光动力治疗作用制剂中的应用，其特征在于，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用制剂包括过表达circHOMER1的试剂；所述环状RNAcircHOMER1的序列如SEQ No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指提高光动力对结直肠癌肿瘤细胞治疗的敏感性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指对结直肠癌细胞增殖水平的抑制和凋亡水平的促进作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达circHOMER1的试剂包括：环状RNAcircHOMER1过表达载体。

5.一种促进结直肠癌光动力治疗作用的制剂，其特征在于，包括过表达circHOMER1的试剂；所述环状RNAcircHOMER1的序列如SEQ No.1所示。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指提高光动力对结直肠癌肿瘤细胞治疗的敏感性。

7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述的促进结直肠癌光动力治疗作用是指对结直肠癌细胞增殖水平的抑制和凋亡水平的促进作用。

8.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，过表达circHOMER1的试剂包括：环状RNAcircHOMER1过表达载体。