TW201904590A - 包含胞外囊泡之製劑、用以製備該製劑之方法及其用途 - Google Patents

包含胞外囊泡之製劑、用以製備該製劑之方法及其用途

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Abstract

本揭示內容為一種包含胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及治療活性劑之製劑，其中該治療活性劑係包覆或包埋於該EV中。依據本揭示內容較佳的實施方式，由臍帶之間葉幹細胞來分離該EV，且該活性劑可以是一生長因子、免疫調節劑、小分子、siRNA、cDNA或植物成分，舉例來說，薑黃素。本揭示內容亦關於用以製備本發明製劑之方法，以及本發明製劑於治療不同疾病的醫藥用途。

Description

包含胞外囊泡之製劑、用以製備該製劑之方法及其用途
本揭示內容是關於生物傳遞系統之領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種包含一或多活性劑之胞外囊泡製劑，以及其用途。
胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是一種源自細胞的膜狀囊泡，代表細胞間訊息傳遞的內源機制。一般來說，一細胞(即一供體細胞)可釋放不同形式之EV，包含胞外體(exosome，直徑介於50到150奈米之間)及微囊泡(microvesicle，直徑介於50到500奈米之間)。一受體細胞會藉由胞飲作用(endocytosis)、膜融合(membrane fusion)或特定的配體-受器內化反應(ligand-receptor internalization)來吸收釋出的EV，據以將EV之內含物(例如，供體細胞的核酸、脂多醣、蛋白及/或脂質)傳遞至受體細胞。
可由不同來源的生物液體(例如，血液、尿液、腦脊液、惡性腹水、母乳、支氣管肺泡灌洗液及唾液)來分離EV。基於EV的內含物反應了供體細胞的狀態，EV可作為一種生物標記，應用於診斷、預斷疾病及流行病學等不同領域。舉例來說，源自癌細胞或由其周邊基質細胞或白血球釋放的EV，會進入循環系統，引導癌細胞侵襲及轉移；反之亦然，間葉幹細胞及/或免疫細胞會因應癌細胞釋出EV，以拮抗癌細胞的侵襲及轉移。據此，由腹水分離的EV可用以診斷卵巢癌，並決定疾病的分期；而由血液分離的EV則可用以診斷卵巢癌及乳癌。
基於雙層脂質的特性，EV亦可作為一種胞器治療的候選療法。EV可造成細胞融合、攜帶細胞間連結溝通的蛋白或miRNA，並透過主要生物膜到達諸如腎臟、肝臟及中樞神經系流等遠端器官。
基於高生物相容性、低免疫性、奈米級大小及可穿透主要生物屏障(包含血腦障壁)，EV亦可作為一種傳遞藥物的候選療法。然而，其治療功效往往隨著諸如疾病、疾病的嚴重程度及EV特性(例如，EV的細胞來源、大小及內含物)等因素而有所差異。利用前條件培養刺激(pre-conditional culture stimulation)或分離後併入(post-isolation incorporation)方法，將小分子、胜肽、核酸、適體(aptamer)或骨架(scaffold)包覆或包埋於EV結構中，或許可改善及增加其治療應用性。
有鑑於此，相關領域亟需一種經修飾的EV，其可廣泛治療不同疾病，例如發炎性疾病、退化性疾病、感染性疾病、代謝性疾病、發育不良性疾病、糖尿病及癌症。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的一態樣是關於一種製劑，其包含EV及一或多包覆於該EV中的活性劑。依據本揭示內容實施方式，該EV是源自一間葉幹細胞。較佳地，是由臍帶的華通氏膠來分離該間葉幹細胞。
該活性劑是選自生長因子、免疫調節劑、抗癌劑、抗發炎劑、抗感染劑、抗老化劑、抗氧化劑、抗放射劑、核酸及其組合所組成之群組。依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是阿司匹靈(aspirin)、苔蘚蟲素(bryostatin)或薑黃素(curcumin)。依據其他實施方式，該活性劑是核酸，其係選自小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acid, siRNA)、小髮夾核糖核酸(small hairpin ribonucleic acid, shRNA)及微核糖核酸(micro-ribonucleic acid miRNA)所組成的群組。依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是一可調控T細胞分化的多肽。或是該活性劑可以是一抗氧化劑、一生物試劑或一抗老化劑，例如二甲雙胍(metformin)及β-拉帕醌(β-lapachone)等。
依據某些實施方式，可利用一方法來製備本揭示內容之製劑，該方法包含： (a-1) 由該間葉幹細胞分離該EV；以及 (b-1) 將步驟(a-1)之分離EV與該活性劑混合，以使該分離EV包覆該活性劑。
或者是，可利用一方法來製備本揭示內容之製劑，該方法包含： (a-2) 對該間葉幹細胞投予該活性劑；以及 (b-2) 由步驟(a-2)之經投予該活性劑之該間葉幹細胞分離該EV。
亦或是，可利用一方法來製備本揭示內容之製劑，該方法包含： (a-3) 以直線加速器、X射線或加馬射線照射該間葉幹細胞；以及 (b-3) 由步驟(a-3)之該經照射之間葉幹細胞分離該EV。
依據本揭示內容某些實施方式，在步驟(a-3)中，是以1-10 戈雷(Gray, Gy) 的X射線照射該間葉幹細胞。較佳地，是以1-5 Gy的X射線照射該間葉幹細胞。依據一操作實施例，是以3 Gy的X射線照射該間葉幹細胞。
本揭示內容的另一態樣是關一種用以治療一個體之發炎性疾病、乾眼症、退化性疾病、癌症、感染性疾病及/或老化的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容之製劑。
例示性之發炎性疾病包含乾癬、腸炎、燒傷、急性腎臟損傷、創傷性腦部損傷、皮膚損傷、關節炎及自體免疫等疾病。
可利用本發明方法治療的退化性疾病包含，但不限於，帕金森氏症、阿茲海默症、失智症、中風、慢性腎臟損傷、慢性肺臟損傷及聽力損失。
可利用本發明方法治療的癌症包含胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟、腎臟癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤，以及頭頸部鱗狀細胞癌。
至於感染性疾病，其可由細菌、病毒或真菌所引發。
一般來說，可以適當路徑對該個體投予本揭示內容之製劑。例示性之適當路徑包含，局部皮膚、黏膜(例如，結膜內、鼻腔內或氣管內)、口服、脊髓內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、關節內、心室內、腦室內、腹腔注射，以及中耳內投予。
該個體為一哺乳動物；較佳地，為一人類。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I. 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為代表性的參考數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「製劑」(formulation)一詞在本揭示內容是指一種組合物，其包含一或多磷脂質，以及一或多包覆(encapsulated)或包埋(embedded)於該一或多磷脂質中的活性劑。本揭示內容之製劑包含一具有脂質體結構(即包覆於雙層脂質之親水性核)的EV，以及至少一種包覆於該EV之脂質體結構中的活性劑。
「包覆」(encapsulate)一詞是指包含(encompass)、包封(encase)或以其他方式連接二或多種材料的過程，據以將被包覆的材料固定於包覆材料之結構中或結構上。「包覆」(encapsulate)一詞在本揭示內容是指將一或多分子(例如本發明活性劑)包含於一個囊胞顆粒(舉例來說，EV的親油/親水性膜)中。一般來說，可以EV的雙層脂質包圍內或覆蓋其表面的活性劑。
在本揭示內容中，「華通氏膠」(Wharton’s jelly)一詞亦可稱為層間膠(inter-laminar jelly)，為一種臍帶基質的子集合，可指臍帶的黏膜-結締組織物質。華通氏膠的成分包含一黏膜結締組織，其包含肌纖維母細胞、纖維母細胞、巨噬細胞及間葉幹細胞；以及一種由透明質酸及其他未確認之細胞族群所形成的無定形基質。華通氏膠為臍帶的一種成分。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥物的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本揭示內容之製劑) 的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。具體來說，「治療有效量」(therapeutically effective amount)一詞若與本揭示內容之製劑共同使用時，是指足以減少或減緩個體體內與發炎性疾病、退化性疾病、感染性疾病、代謝性疾病、發育不良、糖尿病或癌症相關之病徵的製劑劑量。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之麩醯胺酸)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。
II. 本發明實施方式
本揭示內容旨在提供一種包含一EV及一或多活性劑之製劑、用以製備該製劑的方法，以及製劑之用途。
(I) 本發明製劑
本揭示內容的第一態樣是關於一種製劑，其包含一源自間葉幹細胞(MSC)的EV，以及一或多包覆於該EV中的活性劑，其中該MSC係源自華通氏膠。
EV為一具有脂質體結構(即由雙層脂質包覆的親水/脂性膜)之球形囊泡，可作為藥物傳遞的載具，其中可將活性劑包覆於該脂質體結構中。依據使用需求的不同，適合包覆於EV脂質體結構之活性劑可以是一生長因子、一免疫調節劑、一抗癌劑、一抗發炎劑、一抗感染劑、一抗老化劑、一抗氧化劑、一抗放射劑、一維生素、一熱休克蛋白(heat-shock protein, HSP)、一核酸、一植物成分，或其組合。
相較於源自其他組合/細胞的EV，源自臍帶之間葉幹細胞(ucMSC)的EV至少具有以下6種優勢： (1)與臍帶血相似，不同源自幹細胞或血清之因子可回復動物的老化狀態。源自ucMSC的EV包含較高量的生長因子，包含胎盤生長因子(placental growth factor, PLGF) 顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)等。 (2)依據蛋白質體分析，ucMSC中增生分子的表現量會高於成人類型之MSC中增生分子的表現量。 (3)相較於成人類型之MSC，ucMSC具有較長的端粒(telomere)。增生功能可使ucMSC大規模性製備EV。 (4)可對源自ucMSC之EV投予放射線照射或調節劑處理，據以製備可用以治療再生性、抗感染或抗發疾病之製劑，或是具有放射線保護功效的製劑。 (5)EV具有雙層脂質的特性，可裝載胜肽或核酸(例如DNA適體、RNA適體、miRNA及siRNA等)。 (6)可藉由將特定化合物(例如疏水性或親水性化合物)併入EV之脂質體結構中，將EV配製為一抗鹼、抗酸或抗凍製劑。
依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是一由植物組成萃取之植物成分，其中該植物組成係選自由葉、莖、根、花、塊莖、花粉、果實及種子所組成的群組。或者是，該活性劑可以是一萃取自真菌或細菌的萃取物。依據某些實施例，該活性劑是阿司匹靈、脂多醣、槲皮素(quercetin)、薑黃素、黃耆(astragalus)、白藜蘆醇(resveratrol)、蝦青素(astaxathin)或多酚(polyphenol)。在本揭示內容一操作實施例中，該活性劑是薑黃素。
依據本揭示內容某些實施方式，該活性劑是生長因子。例示性之生長因子包含，但不限於，血管生長素(angiopoietin)、巨噬細胞群落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)、顆粒性白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、胎盤生長因子(placental growth factor, PLGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、內皮因子(endoglin)、內皮素(endothelin)、瘦素(leptin)、濾泡抑素(follistatin)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、神經生長因子(nerve growth factor, NGF)、轉形生長因子-α (transforming growth factor-α, TGF-α)、轉形生長因子-β (TGF-β)、軟骨生長因子(cartilage growth factor, CGF)、幹細胞因子(stem cell factor, SCF)、腦神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、介白素(interleukin, IL)及肝配(ephrin)。在本揭示內容一操作實施例中，該活性劑是血管生長素、內皮因子、FGF-2、HGF、IL-8及VEGF-C。
例示性之抗癌藥物包含，但不限於，薑黃素、干擾素(interferon, IFN)、細胞激素、抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab, HERCEPTIN® )、T-DM1、貝伐單抗(bevacizumab, AVASTIN® )、西妥昔單抗(cetuximab, ERBITUX® )、帕尼單抗(panitumumab, VECTIBIX® )、利妥昔(rituximab, RITUXAN® )及百克沙(tositumomab, BEXXAR® ))、抗雌性素(anti-estrogen，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黃體釋素促效劑(LHRH agonist，例如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，例如氟他胺(flutamide)及比卡魯胺(bicalutamide))、光動力治療(photodynamic therapies，例如維替泊芬(vertoporfin, BPD-MA)、酞菁(phthalocyanine)、光敏劑Pc4 (photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹紅菌素(demethoxy-hypocrellin A, 2BA-2-DMHA))、氮芥(nitrogen mustard，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法崙(melphalan))、亞硝基尿素(nitrosoureas，例如卡莫司汀(carmustine, BCNU)及洛莫司汀(lomustine, CCNU))、烷基磺酸(alkylsulphonate，例如白消安(busulfan)及蘇消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，例如達卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含鉑化合物(platinum containing compound，例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、長春花生物鹼(vinca alkaloid，例如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、類紫杉醇(taxoid，例如紫杉醇(paclitaxel)或與奈米粒子白蛋白結合之紫杉醇(Abraxane)、與十二碳六烯酸結合之紫杉醇(DHA-paclitaxel, Taxoprexin)、與聚谷氨酸結合之紫杉醇(PG-paclitaxel, paclitaxel poliglumex, CT-2103, XYOTAX)、腫瘤活化前趨藥物ANG1005(Angiopep-2 bound to three molecules of paclitaxel)、紫杉醇-EC-1 (paclitaxel bound to the erbB2-recognizing peptide EC-1)及與葡萄糖結合之紫杉醇(例如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜樹鹹(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及絲裂黴素C (mytomycin C))等紫杉醇等效物)、抗代謝藥物(anti-metabolite)、二氫葉酸還原酶抑制劑(DHFR inhibitor，例如氨甲喋呤(methotrexate)、二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依達曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-單磷酸去氫酶抑制劑(IMP dehydrogenase inhibitor，例如黴酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸還原酶抑制劑(ribonuclotide reductase inhibitor，例如羥基尿素(hydroxyurea)及去鐵胺(deferoxamine))、尿嘧啶相似物(uracil analog，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶相似物(cytosine analog，例如阿糖胞苷(cytarabine, ara C或cytosine arabinoside)及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤相似物(purine analog，例如巰基嘌呤(mercaptopurine)及硫鳥嘌呤(Thioguanine))、維生素D3相似物(Vitamin D3 analog，例如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊二烯抑制劑(isoprenylation inhibitor，例如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(dopaminergic neurotoxin，例如1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、細胞週期抑制劑(例如星形孢菌素(staurosporine))、放線菌素(actinomycin，例如放線菌素D)、博萊黴素(bleomycin，例如博萊黴素A2、博萊黴素B2及培洛黴素(peplomycin))、蒽環類藥物(anthracycline，例如柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂質體多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗藥性抑制劑(MDR inhibitor，例如維拉帕米(verapamil))、鈣離子三磷酸腺苷酶抑制劑(Ca2+ ATPase inhibitor，例如毒胡蘿蔔素(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，例如阿西替尼(axitinib, AG013736)、波舒(bosutinib, SKI-606)、尼布(cediranib, RECENTINTM, AZD2171)、達沙替尼(dasatinib, SPRYCEL® , BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib, TARCEVA® )、吉非替尼(gefitinib, IRESSA® )、伊馬替尼(imatinib, Gleevec® , CGP57148B, STI-571)、拉帕替尼(lapatinib, TYKERB® , TYVERB® )、來他替尼(lestaurtinib, CEP-701)、那替尼(neratinib, HKI-272)、尼洛(nilotinib, TASIGNA® )、馬沙尼(semaxanib, semaxinib, SU5416)、舒尼替尼(sunitinib, SUTENT® , SU11248)、托西尼布(toceranib, PALLADIA® )、凡德他尼(vandetanib, ZACTIMA® , ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib, PTK787, PTK/ZK)、曲妥珠單抗(trastuzumab, HERCEPTIN® )、貝伐單抗(bevacizumab, AVASTIN® )、利妥昔單抗(rituximab, RITUXAN® )、西妥昔單抗(cetuximab, ERBITUX® )、帕尼單抗(panitumumab, VECTIBIX® )、蘭尼單抗(ranibizumab, Lucentis® )、尼洛(nilotinib, TASIGNA® )、索拉非尼(sorafenib, NEXAVAR® )、依維莫司(everolimus, AFINITOR® )、阿崙單抗(alemtuzumab, CAMPATH® )、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin, MYLOTARG® )、西羅莫司(temsirolimus, TORISEL® )、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韋替尼乳酸鹽(dovitinib lactate, TKI258, CHIR-258)、BIBW 2992 (TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120 (VARGATEF® )、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替洛尼(tivozanib, AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、及/或XL228)、蛋白酶抑制劑(proteasome inhibitor，例如硼替佐米(bortezomib, Velcade))、哺乳類斥消靈標的蛋白抑制劑(mTOR inhibitor，例如雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus, CCI-779)、依維莫司(everolimus, RAD-001)、雷帕黴素衍生物(ridaforolimus, AP23573, Ariad)、AZD8055 (AstraZeneca)、BEZ235 (Novartis)、BGT226 (Norvartis)、XL765 (Sanofi Aventis)、PF-4691502 (Pfizer)、GDC0980 (Genetech)、SF1126 (Semafoe)及OSI-027 (OSI))、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱(gemcitabine)、洋紅黴素(carminomycin)、亞葉酸鈣(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine或procarbazine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜樹鹼(campathecin)、普卡黴素(plicamycin)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methopterin)、紫菜黴素(porfiromycin)、美法崙(melphalan)、異長春鹼(leurosidine)、環氧長春鹼(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲貝替定(trabectedin)、海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素(carminomycin)及六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。
例示性的抗發炎藥劑包含，但不限於，非類固醇類的抗發炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drug, NASID)，例如阿司匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)及那普洛辛(naproxen)。其他的例示性抗發炎藥劑包含阿氯芬酸(alclofenac)、阿氯米松雙丙酸酯(alclometasone dipropionate)、阿孕奈德(algestone acetonide)、α澱粉酶(alpha amylase)、安西法爾(amcinafal)、安西非特(amcinafide)、氨芬酸鈉(amfenac sodium)、鹽酸氨普立糖(amiprilose hydrochloride)、阿那白滯素(anakinra)、阿尼祿酸(anirolac)、阿尼 紮芬(anitrazafen)、阿紮丙宗(apazone)、巴柳氮二鈉 (balsalazide disodium)、節達 酸(bendazac)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、鹽酸節達明(benzydamine hydrochloride)、 鳳梨蛋白酶(bromelains)、溴呱莫(broperamole)、布地奈德(budesonide)、卡布洛芬 (carprofen)、環洛芬(cicloprofen)、辛噴他宗(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、 丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)、丁氯倍他松(clobetasone butyrate)、 氯p比酸(clopirac)、氯硫卡松丙酸鹽(cloticasone propionate)、醋酸三氟米松 (cormethasone acetate)、可托多松(cortodoxone)、癸酸鹽(decanoate)、地夫可特(deflazacort)、 庚酸睾酮(delatestryl)、能普-睾酮(depo-testosterone)、地奈德(desonide)、 去輕米松(desoximetasone)、二丙酸地塞米松(dexamethasone dipropionate)、 雙氯芬酸鉀(diclofenac potassium)、雙氯芬酸鈉 (diclofenac sodium)、雙醋二氟拉松(diflorasonediacetate)、二氟米酮鈉 (diflumidone sodium)、二氟尼柳 (diflunisal)、二氟潑尼醋(difluprednate)、雙酞嘆酮(diftalone)、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide)、輕西奈德(drocinonide)、甲地松(endrysone)、恩莫單抗(enlimomab)、依諾利康鈉 (enolicam sodium)、依匹挫(epirizole)、依託度酸(etodolac)、依託芬那醋(etofenamate)、聯苯乙酸(felbinac)、非那莫(fenamole)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛 酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、苯吡噁二酮(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、 夫拉紮酮(flazalone)、氟紮可特(fluazacort)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟咪挫 (flumizole)、醋酸氟尼縮松(flunisolide acetate)、氟尼辛(flunixin)、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、氟考丁醋(fluocortin butyl)、氟米龍醋酸醋(fluorometholone acetate)、苯氟喹酮(fluquazone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟瑞托芬(fluretofen)、丙 酸氟替卡松(fluticasone propionate)、咲喃洛芬(furaprofen)、咲羅布芬(furobufen)、 哈西奈德(halcinonide)、丙酸齒倍他索(halobetasol propionate)、醋酸齒潑尼 松(halopredone acetate)、異 丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬錯 (ibuprofen aluminum)、皮考布洛芬(ibuprofen piconol)、伊洛達普(ilonidap)、吲噪美 辛(indomethacin)、吲噪美辛鈉 (indomethacin sodium)、吲噪布洛芬(indoprofen)、吲四挫(intrazole)、醋異氟龍(isoflupredone acetate)、氧卓乙酸 (isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮基布洛芬(ketoprofen)、鹽酸洛非咪挫(lofemizole hydrochloride)、氯諾昔康(lomoxicam)、氯替潑諾碳酸乙醋(loteprednol etabonate)、 甲氯滅酸鈉 (meclofenamate sodium)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲氯松二丁 醋(meclorisone dibutyrate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美沙拉嗪(mesalamine)、美西拉宗(meseclazone)、甲二氛睾酬(mesterolone)、美雄酬(methandrostenolone)、 美替諾龍(methenolone)、美替諾龍醋酸醋(methenolone acetate)、磺庚甲潑尼龍 (methylprednisolone suleptanate)、嗎尼氟醋(momiflumate)、萘丁美酮(nabumetone)、諾龍(nandrolone)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉 (naproxen sodium)、甲氧萘丙醇 (naproxol)、尼馬宗(nimazone)、奧沙拉嗪鈉(olsalazinesodium)、肝蛋白(orgotein)、奧帕諾辛(orpanoxin)、氧甲氫龍(oxandrolane)、奧沙普秦(oxaprozin)、羥基保 泰松(oxyphenbutazone)、輕甲稀龍(oxymetholone)、鹽酸瑞尼托林(paranyline hydrochloride)、戊聚糖多硫酸鈉 (pentosan polysulfate sodium)、甘油保泰松鈉 (phenbutazone sodium glycerate)、吡非尼酮(pirfenidone)、吡羅昔康(piroxicam)、 肉桂酸吡羅昔康(piroxicam cinnamate)、吡羅昔康乙醇胺(piroxicam olamine)、比諾布洛芬(pirprofen)、潑那紮特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、普羅度酸 (prodolic acid)、普羅喹宗(proquazone)、普羅沙挫(proxazole)、枸橡酸普羅沙挫 (proxazolecitrate)、利美索龍(rimexolone)、氯馬紮利(romazarit)、水楊酸膽鹼硫酸 儀(salcolex)、沙那西定(salnacedin)、雙水楊醋(salsalate)、血根氯鞍(sanguinarium chloride)、司克拉宗(seclazone)、絲美辛(sermetacin)、康力龍(stanozolol)、舒多昔 康(sudoxicam)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、他美辛(talmetacin)、氟煙酞醋 (talniflumate)、他洛柳醋(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼達普(tenidap)、替尼達普鈉 (tenidap sodium)、替諾昔康(tenoxicam)、氧喹苯胺(tesicam)、辛叉異喹 酮(tesimide)、睾酮、睾酮混合物(testosterone blends)、四氫甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、替可的松匹伐醋(tixocortol pivalate)、托美丁(tolmetin)、托美 丁鈉 (tolmetin sodium)、三氯氟松(triclonide)、三氟氨醋(triflumidate)、齊多美辛(zidometacin)及苯醯吡酸鈉 (zomepirac sodium)。此外，亦可利用細胞激素拮抗劑來產生抗發炎功效，例如IL-10、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-5、IL-13、TGF-β或VEGF之適體。
例示性之抗氧化劑包含胺(例如，N,N-二乙基羥胺(N,N-diethylhydroxylamine)及胺基胍(amino-guanidine))、精胺酸吡酮(arginine pilolate)、抗壞血酸(ascorbic acid)及其鹽類、脂肪酸之抗壞血酸酯(ascorbyl ester of fatty acid)、生物類黃酮(bioflavonoid)、丁基化羥基苯甲酸(butylated hydroxy benzoic acid)及其鹽類、二羥基反丁烯二酸(dihydroxy fumaric acid)及其鹽類、沒食子酸(gallic acid)及其烷基酯(例如，沒食子酸丙酯(propyl gallate)及尿酸)、 甘胺酸吡酮酸鹽(glycine pidolate)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基二氫苯并哌喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、硫辛酸(lipoic acid)、離胺酸(lysine)、黑色素(melanin)、甲硫胺酸(methionine)、降二氫癒創木酸 (nordihydroguaiaretic acid)、脯胺酸(proline)、水飛薊素(silymarin)、山梨酸(sorbic acid)及其鹽類、巰基化合物(例如麩胺基硫(glutathione))、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、過氧化氫酶(catalase)、茶萃取物、葡萄皮/種子萃取物、迷迭香萃取物、生育酚醋酸鹽(tocopherol acetate)、生育酚、生育酚山梨酸鹽(tocopherol sorbate)及其組合。該些成分可裝載至一骨架上，以增加其組織局部性分布。
例示性之抗老化劑包含，但不限於，薑黃素、輔酶Q10、葉黃素(xanthophyll，例如蝦青素、岩藻黃素(fucoxanthin)及玉米黃質(zeaxanthin))、L-麩胺基硫、類視色素(retinoid)、α-羥酸、β-羥酸及黃體素(lutein)。或者是，抗老化劑可以是一蛋白醣、一醣蛋白或一醣脂質，其非必要性地可裝載至一骨架上，以增加其組織局部性分布。
例示性之抗感染劑包含，但不限於，LL37、IFN-α、親水性及疏水性抗生素及適體。
維生素可以是維生素A、維生素D、維生素K或維生素E。
例示性之HSP包含，但不限於，HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP70、HSP72、HSP90、HSP100及HSP104。
核酸可以是DNA或RNA。依據本揭示內容某些實施方式，核酸是一RNA，舉例來說，一siRNA、一shRNA或一miRNA。或者是，核酸可以是一DNA適體或一RNA適體。例示性之miRNA包含miRNA前體(agomir；例如miRNA125a、miRNA21、miRNA214、miRNA410、miRNA495及548L-5p等)，以及miRNA拮抗核酸(antagomir；例如miRNA10a、miRNA182-5p及miRNA155a等)。在本揭示內容一實施例中，核酸為包含序列編號：2之核苷酸序列的miRNA10a。
或者是，本發明製劑之活性劑可以是一蝦青素-類胡蘿蔔素(asta-carotenoid)，其係選自由蝦青素、胡蘿蔔素(carotene)、海膽酮(echinenone)、斑螯黃質(又名角黃素，canthaxanthin)、金盏花红素(adonirubin)、皮黃質(doradexanthin)、玉米黃質(zeaxanthin)、環氧玉米黃質(antheraxanthin)、菫菜黃質(violaxanthin)、新黄素(neoxanthin)及其組合所組成的群組。
例示性之免疫調節劑包含介白素(例如IL-2、IL-7、IL-12)、細胞激素(例如 G-CSF及干擾素 (IFN))、趨化介素(chemokine；例如CXCL13、CCL26及CXCL7)、免疫檢查點之拮抗劑(例如抗-CTLA-4、抗-PD1或抗-PD-L1 (PD-1之配體)、抗-LAG3、抗-B7-H3、合成胞嘧啶磷酸-鳥苷(cytosine phosphate-guanosine, CpG)去氧寡核苷酸，及葡聚醣)，以及Treg調控劑(例如環磷醯胺(cyclophosphamide))。在本揭示內容一特定實施例中，免疫調節劑為一包含序列編號：1之胺基酸序列的多肽。
在某些實施方式中，活性劑是阿司匹靈、脂多醣、二甲雙胍、胜肽或苔蘚蟲素.
本揭示內容所述之製劑可穩定存在於冷凍環境中(例如以液體或冷凍乾燥形式穩定存在至少3個月)，以及酸處理(例如包含蝦青素的製劑)或鹼處理(例如包含薑黃素的製劑)。此外，本發明製劑亦可穩定存在於諸如甘油及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等多元醇中。
(II) 製備本發明製劑
可藉由前條件處理(例如將活性劑與MSC共同培養，或對MSC投予放射線照射或諸如阿司匹靈、二甲雙胍、脂多醣及白藜蘆醇(resveratrol))等小分子處理)，或是分離後處理(例如將蝦青素或薑黃素等活性劑併入源自經放射線照射或未經放射線照射之MSC的EV中)，將活性劑併入EV的脂質體結構中。本揭示內容提供三種例示性之用以製備本發明EV製劑的方法。
第一種方法包含以下步驟： (a-1) 由間葉幹細胞分離EV；以及 (b-1) 將步驟(a-1)之分離EV與活性劑混合，以使該分離EV包覆該活性劑。
一般來說，可依據本發明所屬技術領域具有通常知識者所知之方法，由適當來源分離EV；較佳是由MSC來分離EV。例示性之用以分離EV的方法包含，但不限於，差速離心法(differential centrifugation)、蔗糖梯度離心法(sucrose gradient centrifugation)、微過濾法(microfiltration)、抗體塗佈磁珠法(antibody-coated magnetic bead)、生物反應器(bioreactor)及微流體裝置(microfluidic device)。或者是，可利用商業化套組(例如EXOQUICK)由組織/生物液體中分離EV。
依據本揭示內容之實施方式，是由MSC的培養上清液來製備EV。一般來說，先將MSC培養於包含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的低葡萄糖DMEM中，之後以無血清培養液處理，以誘發MSC釋放EV至上清液中；可藉由任何適當的方式來收集釋出的EV。在一較佳實施例中，是利用微過濾法來分離釋出的EV，其中該微過濾法可保留大小介於0.02到0.20微米的顆粒。
或者是，可利用中空纖維生物反應器(一種三維細胞培養系統)來改善EV的製備效率。生物反應器是一種微型化系統，包含泵(用以使細胞培養液通過包含細胞(例如MSC)的卡匣)及一微型中空纖維(用以媒介營養物質與廢棄物質之交換)。細胞(例如MSC)會將EV釋放至中空纖維中，之後可利用任何適當的方法來收集包含EV的培養液。
為製備本揭示內容之製劑，在步驟(b-1)中，是將由步驟(a-1)所分離的EV與活性劑混合充足的時間，或是直到活性劑包覆於各EV的脂質體結構中。之後以濾網(截切大小約為20奈米)進行離心，以製備本揭示內容之EV製劑。
或者是，可依據活性劑的特性(即活性劑的疏水性或親水性)，利用超音波振盪、電穿孔法、離心、共溶劑、界面活性劑或脂質等方式來增加/改善EV包覆活性劑的劑量。
亦或是，可利用另一種方法來製備本揭示內容之製劑，該方法包含以下步驟： (a-2) 對該間葉幹細胞投予活性劑或用以編碼該活性劑的多核苷酸；以及 (b-2) 由步驟(a-2)之經投予該活性劑或該用以編碼該活性劑之多核苷酸的間葉幹細胞來分離EV。
在一實施方式中，是將MSC培養於包含活性劑(例如二甲雙胍、脂多醣、苔蘚蟲素或阿司匹靈)或用以編碼該活性劑之多肽的培養液中一段時間，以使EV釋放至上清液中；接者，再由上清液收集EV。依據本揭示內容實施方式，收集的EV具有活性表面蛋白多醣、四穿膜蛋白(tetraspanin)、胜肽、生長因子及/或miRNA包覆於其中。
依據某些實施方式，是將MSC培養於具有活性劑之前條件處理的培養液中，之後投予低氧(例如1% O2 )及無血清培養液處理24-48小時，以促使細胞釋放EV；在此情況下，釋出之EV包含活性劑(例如蛋白多醣、蛋白、生長因子及/或miRNA)於其雙層脂質囊泡上及/或雙層脂質囊泡中。
當活性劑是胜肽(蛋白)、RNA (miRNA或siRNA)或脂質時，可將該胜肽/蛋白、核酸(例如DNA適體或RNA適體)或脂質併入由MSC收集之EV中。或者是，可利用轉染技術，將用以編碼活性劑的多核苷酸轉入MSC中，藉以使MSC表現該活性劑。可利用習知技藝人士所熟知之任一種方法來進行轉染；舉例來說，磷酸鈣共沉澱(calcium phosphate co-precipitation)、電穿孔(electroporation)、核轉染(nucleofection)、細胞擠壓(cell squeezing，輕壓細胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，利用高強度超音波於細胞膜形成孔洞)、光轉染(optical transfection，利用高聚焦雷射於細胞膜製造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，將DNA連接至一奈米纖維表面並注入細胞中)、基因槍(gene gun，將DNA連接至一惰性固體之奈米粒子後，注入標的細胞核內)、磁轉染(magnetofection，利用磁力將DNA送至標的細胞內)、病毒轉染(viral transduction，利用病毒作為載體，將DNA送至標的細胞內)或以樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質體(liposome)及陽離子聚合物(cationic polymer)。在將經轉染之MSC培養於無血清培養液且低氧狀態一段時間(例如24-48小時)後，可利用與上述相似之方法收集釋放至上清液中的EV。
依據欲裝載至EV脂質結構之活性劑的不同，本揭示內容的包覆率約為10-90%，較佳約為30-70%，更佳約為40-50%。依據一特定實施方式，是將0.08到80 mM的薑黃素與每毫升0.15毫克的EV (分離自1.6 x 107 細胞/80毫升的上清液)混合，其包覆率約為46%-100% (0.01 mM: 46.2%, 0.2 mM: 100%, 1.0 mM: 100%)。
或者是或此外，可利用第三種方法來製備本揭示內容之製劑。該方法包含： (a-3) 以直線加速器、X射線或加馬射線照射間葉幹細胞；以及 (b-3) 由步驟(a-3)之經照射之間葉幹細胞來分離EV。
在該種實施方式中，是以直線加速器、X射線或加馬射線來照射MSC，藉以誘發MSC產生抗發炎分子、抗老化分子、抗氧化分子及/或抗放射分子。據此，由該經放射線照射之MSC釋出的EV包含任一種上述分子於其脂質體結構中。依據一特定實施例，是以1-10 Gy (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 Gy)之X射線來照射MSC，之後將該經照射之MSC培養於低氧環境24-48小時；接著再收集釋出的EV。較佳是，以1-5 Gy之X射線來照射MSC。依據本揭示內容之一操作實施例，是以3 Gy之X射線來照射MSC。
由上述任一種方法製得之製劑皆可作為生物傳遞系統，其中各EV的脂質體結構除了可作為一儲存空間，據以攜帶活性劑(例如植物成分、生長因子、抗癌藥物、抗發炎分子、抗老化分子、抗氧化分子、抗放射分子、維生素及/或蝦青素-類胡蘿蔔素)至標的細胞之外，亦可作為一保護層，保護包覆於其結構中的活性劑避免於血流中快速降解。一旦本揭示內容之製劑與標的細胞接觸後，各EV的脂質體結構會與標的細胞之細胞膜融合，進而將包覆的活性劑釋放至標的細胞中。
依據本揭示內容某些實施方式，本揭示內容之製劑的直徑約為20-200奈米。
依據本揭示內容非必要性的實施方式，本揭示內容之製劑更可包含一輔助分子，其係與活性劑共同包覆或共同包埋於各分離EV的脂質體結構中，據以增加活性劑的治療功效。可利用共溶劑(例如PEG 400)、界面活性劑(例如TWEEN-20)或脂質(例如LABRAFIL)將輔助分子及活性劑共同包覆或共同包埋於EV脂質體中。較佳地，該輔助分子為一細胞激素或一防禦素(defensin)。
細胞激素可選自由以下物質所組成的群組： G-CSF、GM-CSF、介白素(例如IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-19、IL-20、IL-25及IL-27)、干擾素(例如IFN-α、IFN-β及IFN-γ)及腫瘤壞死因子(例如TNFα及TNFβ)。防禦素可以是α-防禦素、β-防禦素或θ-防禦素。
依據本揭示內容實施方式，輔助分子及活性劑可同時或依序與MSC接觸；因此，由MSC釋放的EV會同時包含該輔助分子及活性劑於其結構中。依據輔助分子特性的不同，可利用適當方法使輔助分子與MSC接觸。舉例來說，當輔助分子為生長因子、細胞激素、防禦素或伴護蛋白(chaperone)時，可將MSC培養於包含該輔助分子的細胞培養液，藉以將該輔助分子轉入MSC細胞中；另一方面，若輔助分子為小分子(例如阿司匹靈或苔蘚蟲素)時，則可利用結合受體或共受體，及媒介免疫調控功效，使輔助分子與MSC接觸。
或者是，可依據輔助分子及活性劑的特性(例如疏水性或親水性)，藉由直接混合、超音波振盪、電穿孔法、離心法、梯度離心法、擠壓法或其組合，同時或依序將輔助分子及活性劑裝載至分離的EV中。
當可想見，亦可先以上述適當的方法使第一分子與MSC接觸，之後利用混合、超音波振盪、電穿孔法、離心法、梯度離心法、擠壓法或其組合，使由該MSC釋放的EV與第二分子混合，據以製備本揭示內容之製劑。依據一實施方式，第一分子是輔助分子，而第二分子則為活性劑。依據另一實施方式，第一分子為活性劑，而第二分子則為輔助分子。
(III) 本揭示內容之製劑的用途
本揭示內容的第三態樣為上述任一種實施方式所述之製劑於治療不同疾病的用途，該些疾病包含發炎性疾病、乾眼症、退化性疾病、癌症、感染性疾病及老化。
依據本揭示內容實施方式，該用以治療一有治療需要之個體的方法包含對該個體投予一有效量之本發明製劑。可利用適當路徑對該個體投予本發明製劑，例示性之適當路徑包含，局部、黏膜(例如，結膜內、鼻腔內或氣管內)、口服、脊髓內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、關節內、心室內、腦室內、腹腔注射，以及中耳內投予。
為治療疾病，將本發明製劑之約108 到1015 EV (較佳為109 到1014 EV)投予至該個體體內，其中該EV可產生約0.1微克到1公克之活性劑。依據本揭示內容某些實施方式，該個體為一小鼠，其中約1010 到1013 EV　(其可產生約10微克到1毫克之活性劑)即可產生治療功效。
本發明所屬技術領域具有通常知識者可依據由動物模式所決定的劑量來計算本發明製劑的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。當可想見，臨床醫護人員可依據個體的身體及生理因素來決定本發明EV製劑的實際投予劑量，該些因素包含，但不限於，年齡、性別、體重、體表面積、欲治療之疾病、疾病的嚴重程度、先前病史、其他藥物服用與否及投予路徑等。
依據某些實施方式，本揭示內容之製劑可用以治療一罹患發炎性疾病的個體。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容之製劑，以調控其免疫細胞、生長因子、趨化介素及/或細胞激素的功能或表現。例示性之可以本發明方法治療之發炎性疾病包含，但不限於，乾癬、腸炎、燒傷、急性腎臟損傷、創傷性腦部損傷、皮膚損傷、關節炎及自體免疫疾病。
依據某些實施方式， 本揭示內容之製劑可用以治療一罹患退化性疾病的個體。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容之製劑，以減少該個體的氧化壓力。在一實施方式中，是藉由抑制呼吸爆發(respiratory burst)來減少氧化壓力。在另一實施方式中，是藉由增加生長因子的表現來減少氧化壓力。在另一實施方式中，是藉由調控AMP激酶的活化來減少氧化壓力。例示性之可以本發明方法治療之退化性疾病包含帕金森氏症、阿茲海默症、失智症、中風、慢性腎臟損傷、慢性肺臟損傷及聽力損失。
依據某些實施方式，本揭示內容之製劑可用以治療一個體之癌症。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容之製劑，以抑制癌細胞生長及/或抑制癌細胞移動。可利用本發明方法治療之癌症包含，但不限於，胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟、腎臟癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤，以及頭頸部鱗狀細胞癌。
在本揭示內容某些實施方式中，本揭示內容之製劑於個體體內具有抗老化之功效。依據一實施例，本揭示內容之製劑可改善個體的認知能力。
依據某些實施方式，本發明製劑對脊髓損傷具有治療功效，其中本發明製劑之EV可專一地標的至脊髓的損傷區域。
或者是，本揭示內容之製劑可藉由增加個體的抗菌或免疫反應(例如細胞及體液免疫)來治療該個體的感染性疾病，其中該感染性疾病可由細菌、病毒或真菌所引起。
依據本揭示內容某些操作實施例，活性劑可相加地(additively)或加乘地(synergistically)增加EV的治療功效。在某些實施例中，相較於源自癌細胞的EV，源自ucMSC的EV具有更佳的治病功效。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
材料及方法
細胞培養
由全球生物資源中心(Global Bioresource Center, ATCC)購買C2C12肌原細胞，並將其培養於包含10%FBS之DMEM (Dulbecco modified eagle medium)細胞培養液中。由ATCC購買U937 骨髓細胞及DLD-1癌細胞，並將其培養於包含10% FBS之RPMI-1640細胞培養液中。細胞皆係培養於37°C之5% CO2 潮溼培養箱中。
分離及確認臍帶間葉幹細胞 (ucMSC)
由正常自然生產的臍帶取下一段5公分長的臍帶。將該段5公分長的臍帶置於包含生理食鹽水之容器中，去除臍帶血管後，收集臍帶基質。將臍帶基質剪切為直徑約1公分的片段，之後於低氧環境，以低葡萄糖之DMEM培養該些基質片段。以流式細胞儀及特定抗體來確認由臍帶基因游離出之ucMSC (CD29+ 、CD34- 、CD44+ 及CD73+ )。第1圖闡述該分析結果。
分離及確認 ucMSC 之胞外囊泡 ( 以下稱為 ucMSC- 純 -EV)
將ucMSC培養於包含10% FBS之低葡萄糖DMEM培養液中。為分離ucMSC-純-EV，將細胞培養液置換為無血清之DMEM；於常氧或低氧環境培養48小時後，收集上清液，並以保留性離心(以一0.02微米濾網進行離心)及一0.20微米濾網過濾。分離直徑介於0.02至0.20微米之ucMSC-純-EV，並進行濃縮(200倍濃縮)。以抗-CD81及抗-CD63抗體分別利用流式細胞儀及西方墨點分析來確認經濃縮之ucMSC-純-EV。
此外，亦利用多抗體塗佈磁珠(multiplex antibody-coated bead)試驗來分析包覆於ucMSC-純-EV之生長因子。結果總結於表1。
源自分離後併入之 EV
可於pH 6.0-10.0之環境中，以室溫培養藉以有效將疏水性薑黃素(具有陽離子特性)包覆於EV之脂質體結構中。本研究是將0、0.02、0.20或1.25 mM 薑黃素加至20毫升之置於無血清培養液(pH=10)中的ucMSC-純-EV (每毫升約1 x 1011 囊泡)，之後於室溫反應15分鐘。以0.02微米濾網過濾混合物，以得到具有薑黃素包覆於其結構中的ucMSC-純-EV (以下稱為EV-薑黃素；最終濃度約為每毫升1.2毫克)。薑黃素的併入效率約為100%到46.2%。以OD420奈米進行測量，並利用已知濃度之連續稀釋製作標準曲線，據以得到薑黃素的濃度。
分離源自前處理 ucMSC 的 EV
將30盤(每盤細胞密度為每毫升4 x 104 細胞，共10毫升)之ucMSC培養於包含10% FBS之低葡萄糖DMEM培養液中，並投予阿司匹靈(每毫升250微克)或苔蘚蟲素1 (10 nM)等小分子之前處理。1天後，將培養液置換為無血清之低葡萄糖DMEM培養液；培養24小時後，收集上清液(300毫升)，並以0.45微米濾網移除細胞碎屑，之後再以0.2微米濾網去除細胞凋亡體，最後利用0.02微米之濾網組將EV濃縮至每毫升1.2毫克，以分別得到阿司匹靈-EV (每毫升7.1 x 1012 囊泡)及苔蘚蟲素-EV (每毫升2.7 x 1012 囊泡)。
由經直線加速照射處理之 ucMSC 分離 EV ( 以下稱為 ucMSC- 照射 -EV)
將ucMSCs (每毫升4 x 104 細胞，共300毫升)培養於包含10% FBS之低葡萄糖DMEM培養液中1天。之後，將培養液置換為無血清之低葡萄糖DMEM培養液，再以直接加速器(Clinac 1800, Varian Associates, Inc., CA, USA)投予細胞3 Gy (次致死劑量)之照射。之後，培養細胞2天。收集上清液(300毫升)，並依上述方法進行系列過濾收集。
為評估得到之ucMSC-照射-EV的生物功效，將ucMSC (每孔洞3 x 104 細胞)或C2C12肌原細胞(每毫升5 x 104 細胞)培養於48孔洞細胞培養盤。加入包含不同ucMSC-照射-EV之無血清培養液後，利用直線加速器以單一分次對細胞投予或不投予6 Gy之照射。1天後，以1　μM之二氯螢光素酸鹽(dichlorofluorecein hydrochloride, DCFH)及流式細胞儀來分析活性含氧物(reactive oxygen species, ROS)的含量。
培養 EV 及小分子
將多肽SIYRRGARRWRKL (亦稱為ZIP多肽，序列編號：1，m.w. 1982.4，0.5 uM)與每毫升0.12毫克之ucMSC-純-EV (約每毫升2.2 x 1011 囊泡)混合於RPMI培養液中，之後於室溫培養60分鐘。相較於ucMSC-純-EV，包含多肽之ucMSC-純-EV (以下稱為EV-ZIP)具有較高的分子量，因此可利用過濾(分子量之截切值約為100千道耳頓)來進行分離。
為製備包覆RNA(例如miRNA或siRNA)之EV，將100微升之ucMSC-純-EV (約109 囊泡，100微克)與2微克之miRNA-10a拮抗系列 (antagomir:CACAAAUUCGGAUCUACAGGGUA，由5’端至3’端；序列編號：2)於包含10微升轉染劑及40微升之磷酸鹽緩衝生理食鹽水之轉染溶液中反應。將混合物置於37°C培養10分鐘。加入30微升停止溶液(Exoquick)中止反應，並於4°C放置30分鐘。以10,000 g超高速離心5分鐘，以分離包含miRNA10a拮抗核酸系列之ucMSC-純-EV (以下稱為EV-miRNA10a)。
處理 C2C12 肌肉細胞生長
在培養好的C2C12細胞置於無血清的環境中，對C2C12肌原細胞(每孔洞1 x 103 細胞)投予特定處理24小時。以台酚藍排除試驗及CCK-8細胞增生試驗來分析細胞存活率及增生情況。
處理 U937 骨髓細胞
將U937骨髓細胞種植於24孔洞盤中，細胞密度為每孔洞8 x 104 細胞(於0.4毫升培養液中)，之後投予100 nM佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯 (phorbol myristate acetate, PMA)刺激，於37°C之5% CO2 細胞培養箱中培養48小時。以PBS洗滌細胞2次後，加入包含或不包含ucMSC-純-EV (每毫升0.15毫克)、薑黃素 (Cur，0.8 mM)或EV-薑黃素 (Cur/EVs，0.8 mM)之培養液反應30分鐘。加入1 uM之DCFH作用20分鐘，之後以流式細胞儀來分析由H2 O2 媒介之於480奈米發散的螢光值。
分析 EV 中 miRNA 表現資料
分別萃取由DLD-1細胞收集之EV (即DEV，1.0毫升，每毫升2.2 x 1012 囊泡)、由 ucMSC收集之EV (即MEV，1.0毫升，每毫升2.2 x 1012 囊泡)，以及包含薑黃素之EV (即EV-薑黃素)的RNA，以進行miRNA定序分析。簡單來說，加入700微升之QIAzol水解試劑(Qiagen)至EV沉澱物均質化處理；將混合物置於室溫反應5分鐘後，加入140微升之氯仿，劇烈搖晃15秒。依據使用操作說明，以12,000g於4°C離心15分鐘，以收集RNA檢體。以次世代定序(next generation sequencing, NGS)進行包含microRNA (miRNA)之小RNA定序(RNA-Seq)。利用TRUSEQ®小RNA (Illumina)檢體製備流程可以把小RNA定序來分析數以千計的miRNA序列。以人類短非編碼RNA序列(人類miRNA，Hsa miR)比對，並利用miRBase資料庫來分析得到的數據。
分析 EV 之蛋白表現資料
將蛋白質水解緩衝液分別加入由DLD-1細胞收集之EV (即DEV，1.0毫升，每毫升2.2 x 1012 囊泡)、由 ucMSC收集之EV (即MEV，1.0毫升，每毫升2.2 x 1012 囊泡)，以及包含薑黃素之EV (即EV-薑黃素)中。以蛋白試驗套組來檢測各EV之蛋白濃度，以ITRAQ™ (同量異位標誌以進行相對及絕對定量分析)處理3批檢體之混合蛋白質。ITRAQ™試驗是基於以化合物(其可產生同量異位片段)標誌之胜肽來定量分析蛋白含量的方法。Applied Biosystems ITRAQ™試劑 (Applied Biosystems Inc., USA)包含四種同質性(不同質量)異位試劑：ITRAQ™試劑114、ITRAQ™試劑115、ITRAQ™試劑116，以及ITRAQ™試劑117，以標記EV的蛋白，之後以LC/MS-MS進行分析。ITRAQ™共確認1160種蛋白。將比對率超過高或低2及4定義為截切值，以顯示表現差異。
EV 對 T 細胞分化之功效
利用投予刺激後，T細胞會由靜止狀況(Tho)分化為具有不同功能之T細胞。當T細胞分化為輔助性T細胞1型 (T helper 1, Th1)、輔助性T細胞2 型(T helper 2, Th2)、調節性T細胞(T regulatory， Treg)或Th17型，其細胞表面受體會表現不同的特性。CXCR3表現代表Th1；CCR4表現代表Th2；CD25表現代表Treg，而CCR6表現則代表Th17分化。利用流式細胞儀及抗-CXCR3、抗-CCR4、抗-CD25與抗-CCR6抗體(eBiosources Inc. USA)來檢測投予不同EV處理後之T細胞的分化狀況。簡單來說，將周邊血液單核球細胞以每孔洞2 x 105 細胞的密度培養於300微升之細胞培養液中，並加入或不加入抗-CD3 (每孔洞10微克)及抗-CD28 (每孔洞2微克)抗體反應4天；於第2天及第3天將不同EV (包含ucMSC-純-EV、苔蘚蟲素-EV、阿司匹靈-EV及EV-miRNA10a)加入包含抗-CD3及抗-CD28抗體之孔洞中。
皮膚投予 EV 以治療乾癬
在小鼠乾癬模式中，是以62.5毫克之混合於眼霜(187.5毫克)的咪喹莫特(5%)製劑來誘發小鼠(BALB/c)之耳廓產生乾癬。將該製劑塗抹至BALB/c小鼠之耳廓，連續塗抹3天。之後，將小鼠分為4組：(A)對照組，於第4到7天時，將製劑塗抹至小鼠耳廓；(B) EV-治療組，於第4到7天時，將包含每毫克2 x 1011 囊泡之ucMSC-純-EV的製劑塗抹至小鼠耳廓；(C) EV-薑黃素組，於第4到7天時，將包含每毫克2 x 1011 囊泡(約為每毫克120微克蛋白)之EV-薑黃素的製劑塗抹至小鼠耳廓；以及(D) 薑黃素組，於第4到7天時，將包含1 uM薑黃素的製劑塗抹至小鼠耳廓。於第14天分析耳廓厚度及血管發炎(腫脹)反應。
黏膜投予 EV 以治療乾眼症
在小鼠乾眼症模式中，是將BALB/c小鼠飼育於10%之低溼度的23°C環境中，藉以誘發其產生乾眼症狀。同時以皮下注射方式每天投予小鼠2劑0.15毫升之胃使可胖(escopan；每毫升2.5毫克)，共投予3天。於小鼠(100%)產生乾眼症之3天後，將10微升之包含或不包含ucMSC-純-EV，或阿司匹靈-EV (約為12微克蛋白之EV，2.2 x 1010 到7.1 x 1010 囊泡)的局部滴液投予至小鼠眼部，連續投予4天。於麻醉狀態下，投予5微升之10%螢光素反應30秒，之後以1毫升PBS洗滌，藉以觀察結膜的發炎狀況。
非口服投予 EV 以治療聽力損失
在小鼠聽力損失的模式中，是對C57BL/6小鼠每日投予每公斤4毫克之二氯二胺鉑，連續投予5天，藉以造成其內耳細胞損傷，其中於第1到5天分別以腹腔注射方式對小鼠投予0.1毫升PBS (作為負對照組)、0.1毫升ucMSC-純-EV或0.1毫升EV-薑黃素(約120微克蛋白之EV，2.2 x 1011 到2.8 x 1011 囊泡)。藉由分析內耳細胞之細胞數量及功能來評估ucMSC-純-EV及EV-薑黃素的保護功效。於治療10天後，利用閾值設定為12 kHz 的聽覺大腦反應(auditory brain response, ABR)及柯蒂氏器培植體(organ of Corti explant)的免疫螢光照片來分析本發明EV製劑對聽力損失及內耳細胞死亡的保護功效。為製備足以進行動物實驗(每日腹腔注射大量EV)之包含或不包含薑黃素的ucMSC-EV，同時製備包含或不包含薑黃素的 ucMSC-EV，並將其儲存於-80°C至少3個月。為確保對各小鼠投予均質之ucMSC-EV，於進行動物實驗前，解凍並均勻混合不同批之EV。利用單向ANOVA及鄧氏檢定法(Duncan post hoc test)來分析對照組及二氯二胺鉑組之差異。
非口服投予 EV 以治療小鼠老化
在小鼠抗老化模式中，是以皮下注射方式對BALB/c小鼠每天投予每公斤100毫克之D-半乳糖，連續投予6週。於誘發老化6週後及評估認知能力前，以腹腔注射方式對小鼠投予0.1毫升PBS (作為負對照組)、0.1毫升薑黃素 (1 uM)、0.1毫升ucMSC-純-EV、0.1毫升EV-薑黃素 (約120微克蛋白之EV，2.2 x 1011 囊泡)或每公斤5毫克之b-拉帕醌，每週投予3次，共投予3週。以莫氏水迷宮模式(Morris water maze model)來評估ucMSC-純-EV及EV-薑黃素的抗老化功效。
EV 於脊髓內的分布
為了解EV於脊髓內的分布，將每毫升1.2毫克(2.2 x 1012 囊泡)之ucMSC-純-EV脊髓內注射至Sprague-Dawley大鼠(n = 3)體內。簡單來說，於麻醉狀態下，將一導管置於大鼠的脊髓內，藉以以每小時1微升的速度連續72小時輸入ucMSC-純-EV。其中EV的製備，是以20微升Exo-綠蛋白標記套組(羧基螢光素乙醯乙酸，Carboxyfluorescein Succinimidyl diacetate ester-CFSE，EXOG200A-1)與ucMSC-純-EV (400微升)於37°C反應10分鐘後，加入ExoQuick(胞囊速澱)30微升，並置於4°C中止反應30分鐘，之後以10,000 g的轉速離心5分鐘，藉以標記ucMSC-純-EV。將標記之ucMSC-純-EV懸浮於400微升PBS中，以待後續實驗使用。
犠牲於L5背根(dorsal root)具有單側損傷的大鼠，收集其背根(包含未損傷之L4及受損傷之L5 背根)進行組織切片，之後以DAPI (4',6-二脒基-2-苯基，4',6-diamidino-2-phenylindole)對照染色組織細胞。以螢光顯微鏡來檢測ucMSC-純-EV於脊髓中的分布。
實施例1　確認ucMSC-純-EV特性
本實施例將檢測ucMSC-純-EV的生物標記及生物活性。實驗結果分別闡述於表1及第2圖。
流式細胞儀及西方墨點分析分別證明本發明ucMSC-純-EV會表現四穿膜蛋白 CD81及EV標記CD63 (第2圖之圖A及B)。進一步以TEM確認ucMSC-純-EV的大小約為50-150奈米(第2圖之圖C)。以多抗體塗佈磁珠試驗來評估ucMSC-純-EV中各生長因子的表現量，結果總結於表1。 表1 ucMSC-純-EV中的生長因子
表1的數據指出，ucMSC-純-EV包覆不同的生長因子，包含血管生長素(一種血管生長因子，可調控血管新生路徑)、內皮因子(一種TGF-β受體複合體的次單位，可調控血管新生TGF-β訊息傳遞路徑)、纖維母細胞生長因子-2 (FGF-2，亦稱為鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)；一種具有促細胞分裂及細胞存活活性的生長因子)、濾泡抑素(亦稱為活化素結合蛋白(activin-binding protein)一種與細胞增生、發炎反應、濾泡生成及發育相關的生長因子)、肝細胞生長因子(亦稱為分散因子(scatter factor)；一種可調控細胞生長、移動、形態、血管新生、腫瘤生成、組織再生及免疫反應的生長因子)、介白素-8 (IL-8；一種可誘使免疫細胞趨化性(chemotaxis)及調控免疫反應的趨化介素(chemokine))、血管內皮生長因子-C (VEGF-C；血小板衍生生長因子/血管內皮生長因子(PDGF/VEGF)家族中的一員，與淋巴管新生、細胞存活、增生、移動、神經發育及血壓調控相關的因子)。
為探討EV的生物活性，以不同劑量之分離自ucMSC或DLD-1癌細胞的EV處理C2C12肌原細胞。結果指出，投予EV會以劑量相關的方式促進細胞生長(第2圖之圖D)。此外，相較於分離自DLD-1的EV (簡稱DEV)，分離自ucMSC的EV (簡稱MEV)可更顯著地促進細胞生長(P＜ 0.01，n=6；第2圖之圖D)。
該些結果指出，相較於對照組或分離自其他細胞的EV，本發明ucMSC-純-EV對促進細胞生長具有更顯著的功效。
實施例2 確認包含不同活性劑之EV
2.1 生物活性
除了ucMSC-純-EV，本實施例將檢測包含薑黃素之EV (即，EV-薑黃素)、包含miRNA10a拮抗核酸(antagomir) 之EV (即，EV-miRNA10a)，或是分離自以苔蘚蟲素前處理之EV (即，苔蘚蟲素-EV)或以阿司匹靈前處理之EV (即，阿司匹靈-EV)的生物活性。結果分別闡述於第3-4及7-8圖，以及表2。
以多抗體塗佈磁珠試驗來分析ucMSC-純-EV及EV-薑黃素中生長因子的表現量，結果總結於表2。 表2 ucMSC-純-EV及EV-薑黃素中的生長因子 由4組實驗計算數值，並以Mann Whitney U檢測進行分析。
表2之數據指出，相較於ucMSC-純-EV，EV-薑黃素具有顯著(p=0.029, n=4)較高量之濾泡抑素及IL-8，而血管生長素、內皮因子、FGF-2、HGF及VEGF-C於EV-薑黃素中的表現量則與ucMSC-純-EV相似。
第3圖的數據指出，不同EV對於促C2C12細胞生長具有不同的功效，其中相較於EV-薑黃素 (EV-Cur)，阿司匹靈-EV (Asp-EV)可誘發顯著較高的生長率(P＜0.05, n=3)。
為探討於發炎反應的功效，分別以培養液(作為負對照組)、ucMSC-純-EV (EVs)、薑黃素(Cur)及EV-薑黃素(Cur/EVs)處理U937 骨髓細胞。相較於對照組，投予ucMSC-純-EV、薑黃素或EV-薑黃素可顯著減少ROS的含量，其中併入薑黃素可加乘性地增加ucMSC-純-EV的抗氧化功效(第4圖)。
此外，亦以流式細胞儀及對CXCR3 (Th1細胞之標記)、CCR4 (Th2細胞之標記)、CD25 (Treg細胞之標記)或CCR6 (Th17細胞之標記)具有專一性之抗體來檢測ucMSC-純-EV、苔蘚蟲素-EV、阿司匹靈-EV及EV-miRNA10a對T細胞分化的作用。靜止狀態之T細胞僅會表現低量之細胞標記，以抗-CD3 (每毫升10微克)及抗-CD28 (每毫升2微克)之抗體 (對照組)處理4天後，會顯著誘發CXCR3、CCR4及CD25的表現量(P ＜ 0.01, n=6)，而不會影響CCR6的表現量(第8圖)。於第2及3天投予不同的EV則會影響Th細胞分化。投予ucMSC-純-EV (EV)會顯著增加CD25及CCR4的表現(*表示P ＜ 0.05, n=6)；再者指出，ucMSC-純-EV (EV)會誘發Treg及Th2分化(第8圖之圖B及C)。另一方面，相較於苔蘚蟲素-EV，投予EV-miRNA10a則會顯著刺激T (CD4)細胞表現CCR4 (#表示P ＜ 0.05, n=6)及CCR6 (*表示P ＜ 0.05, n=6)(第8圖之圖B及D)。相較於對照組，所有EV處理皆不會明顯刺激CXCR3的表現(第8圖之圖A)。
該些結果指出，活性劑可相加性或加乘性地增強ucMSC-純-EV於不同形式之免疫細胞及/或疾病的調節作用。
2.2 不同EV的濃度及大小
以NanoSight NS300奈米顆粒追蹤分析來評估包含不同活性劑之ucMSC-EV的大小及濃度。表3及第7圖之數據指出，EV大小介於30至300奈米的囊泡濃度約為每毫升2.2 x 1012 及7.1 x 1012 囊泡。囊泡的平均大小約為151到175奈米，而眾數(mode)則介於107到174奈米(表3及第7圖)。 表3 不同EV之數量及大小
實施例3 EV中miRNA及蛋白表現
3.1 miRNA表現
利用超過2000筆之miRBase資料庫來比對及確認36種Hsa miR表現於MEV，其中2種miRNA (hsa miR10a-5p及miR182-5p)會過量表現於源自DLD-1的EV (DEV)；相較於源自DLD-1的EV，其他34種miRNA則會於包含或不包含薑黃素之ucMSC-純-EV (MEV)中具有較高的表現量(第5圖)。如第5圖的結果所示，ucMSC-純-EV的miRNA表現資料明顯與源自DLD-1之EV的miRNA不同，其中併入薑黃素會增加EV中5種miRNA (包含191-5p、125b-5p、Let-7f-5p、125a-5p及127-3p)的表現，而會降低2種miRNA (包含10a-5p及21-3p)的表現。
3.2 EV內蛋白質表現
源自ucMSC之EV (即MEV)的蛋白表現資料明顯與源自DLD-1結腸癌細胞之EV (即DEV)不同，其中併入薑黃素僅會些微地改變蛋白表現資料(第6圖)。iTRAQ (同量異位標誌以進行相對及絕對定量分析) LC/MS-MS光譜測定法共確認1160種蛋白，其中僅定義改變差異＞ 2倍或＜ 1/2倍，以及差異＞ 4倍或＜ 1/4倍。表4總結特定EV的蛋白表現資料。 表4 特定EV之蛋白表現資料
表4之數據指出，當定義改變差異 ＞ 2倍或＜ 1/2倍時，ucMSC-純-EV (MEV)及源自DLD-1癌細胞之EV (DEV)之間會有317 (135+182)種蛋白表現不同，而MEV及包含薑黃素之ucMSC-純-EV (EV-薑黃素)之間則會有51 (17+34)種蛋白表現不同。當定義改變差異 ＞ 4倍或＜ 1/4倍時，ucMSC-純-EV (MEV)及源自DLD-1癌細胞之EV (DEV)之間會有54 (25+29)種蛋白表現不同，而MEV及包含薑黃素之ucMSC-純-EV (EV-薑黃素)之間則會有4種蛋白(有3種增加：Ras相關蛋白Rab-1A、受器型酪胺酸蛋白磷酸酶F (Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F)、細胞黏附分子1 (cell adhesion molecule 1)；有1種減少：源自肝腫瘤之生長因子(Hepatoma-derived growth factor)(表3)。該些改變可應用於抗腫瘤或抗發炎之治療。
實施例4 ucMSC-照射-EV減少ucMSC之ROS產生
高劑量之放射線照射(6 Gy)會顯著增加ucMSC中的ROS含量(第9圖)。第9圖之結果亦指出，在四重複實現中，由3 Gy放射線照射之前處理的ucMSC-照射-EV (Rad-EV)會顯著減少經較高放射線照射(6 Gy)之ucMSC中ROS的含量；相較之下，由未經放射線照射之前處理收集的ucMSC-純-EV (EV)則不具此保護功效。
實施例5 EV-ZIP調控T細胞分化
靜止T細胞(CD4+ 及CD8+ T細胞)僅會表現低量CCR4(Neg組)，以抗-CD3 (每毫升10微克)及抗-CD28 (每毫升2微克)刺激4天作為正對照組(對照組)會顯著誘發CD8及CD4細胞表現CCR4 (P ＜ 0.05，n = 4)(第10圖)。於第2及3天加入包含或不包含多肽之EV會對Th2細胞分化產生不同功效，其中投予ucMSC-EV (EV)會顯著增加CCR4表現(*表示P＜ 0.05，n=4)，而投予EV-ZIP (EV-ZIP)則會顯著抑制CD8細胞表現CCR4，卻不會影響CD4細胞表現CCR4 (#表示P ＜ 0.05,n = 4)(第10圖)。
實施例6 EV-miRNA10a調控癌細胞移動
ucMSC-純-EV具有其自身的特定miRNA表現資料(第5圖)，而不具有全人類細胞的miRNA。對該些於EV中低量表現或過量的miRNA而言，可將用以拮抗過量表現之miRNA的miRNA拮抗劑(antagomir)，或是用以增加低量表現之miRNA的miRNA前體(agomir)併入EV中，據以增加EV的生物功能。在本實施例中，將miRNA拮抗劑miRNA10a併入EV中，進而評估其抗腫瘤功效。第11圖之數據證明源自DLD-1癌細胞的EV (DEV)會促進DLD-1細胞移動，而投予ucMSC-純-EV (MEV)治療則會顯著抑制DLD-1細胞移動。相較於DEV，併入miRNA10a拮抗核酸(antagomir)會顯著抑制DLD-1細胞移動(第11圖)。
實施例7 於動物實驗之治療功效
7.1 皮膚投予EV以治療皮膚乾癬
為評估本發明EV 製劑對皮膚乾癬的治療功效，以咪喹莫特誘發小鼠產生乾癬，接著依據材料及方法所述之流程，對各小鼠投予特定EV。第12圖闡述該些結果。
如第12圖(圖A)所示，數組實驗之代表性照片顯示誘發產生皮膚類乾癬的區域及有效治療反應。定量結果指出，投予咪喹莫特(載體組)明顯增加小鼠耳廓的厚度，而投予EV-薑黃素治療則可顯著降低乾癬分數(耳廓厚度)(第12圖之圖B)。
7.2 黏膜投予EV以治療乾眼症
本實施例將分析本發明EV製劑於治療乾眼症之功效。依據材料及方法所述之流程對BALB/c小鼠投予特定處理。以螢光顯微鏡分析螢光素沉澱分數的改變來評估乾眼症的改善程度，結果闡述於第13圖。
照片顯示代表性治療的反應(第13圖之圖A)。定量結果指出，相較於僅投予培養液之組別(SFM，作為負對照組)，投予ucMSC-純-EV (EV)或阿司匹靈-EV (Asp-EV)可顯著降低乾眼症的分數(第13圖之圖B及C)。
7.3 非口服投予EV以治療聽力損失
本實施例將檢測本發明EV 製劑對聽力損失的治療功效。依據材料及方法所述之流程對C57BL/6小鼠投予特定處理，第14圖闡述該些結果。為得到足以進行動物實驗(每日腹腔投予之大量EV)之包含或不包含薑黃素的ucMSC-EV，同時製備包含或不包含薑黃素的 ucMSC-EV，並將其儲存於-80°C至少3個月。為確保對各小鼠投予均質之ucMSC-EV，於進行動物實驗前，解凍並均勻混合不同批之EV。其於聽力損失之治療功效指出EV製劑可穩定冷凍保存，而無需抗凍劑。
投予二氯二胺鉑(載體組)會造成小鼠的聽力損失，投予ucMSC-純-EV (EV)及EV-薑黃素會顯著回復二氯二胺鉑(cisplatin)所造成的聽力損失；相較之下，僅投予薑黃素則不具有意義的功效(第14圖之圖A及B)。以毒蠅虎蕈鹼(phalloidin，綠色)、肌凝蛋白7a (myosin7a， MYO7A，紅色)及細胞核(DAPI，藍色)染色內耳細胞。結果證明相較於對照組(二氯二胺鉑)，投予ucMSC-純-EV (EV)或EV-薑黃素治療會明顯降低由二氯二胺鉑造成的細胞死亡量(第14圖之圖C)。
7.4 腹腔投予EV以產生抗老化功效
本實施例將探討本發明EV製劑是否可於動物體內產生抗老化功效。依據材料及方法所述之流程對小鼠投予特定處理，結果闡述於第15圖。
莫氏水迷宮證明投予D-半乳糖會導致老化認知缺損。具體來說，相較於未處理之小鼠，投予D-半乳糖6週後，小鼠於水池中會花顯著較長的時間來到達安全島(第15圖之圖A)。投予ucMSC-純-EV (DG+EV)、薑黃素(DG+薑黃素)、EV-薑黃素(DG+EV-薑黃素)或β-拉帕醌(DG+β-拉帕醌)治療會明顯減少小鼠到達安全島的時間(第15圖之圖B)。
7.5 EV於脊髓內的分布
為評估本發明EV製劑於治療脊髓損傷的應用性，依據材料及方法所述步驟，利用CFSE 標記ucMSC-純-EV後，脊髓內注射至小鼠體內。
如第16圖結果所示，以CFSE標記之EV會位於L5之受損傷的背根神經節，而不會進入未受傷之L4背根神經節。該結果是由三重覆實驗所得到的代表性照片。結果顯示，ucMSC-純-EV可專一性地進入損傷(發炎)組織，而不會進入正常組織。
整體來看，該些結果證實本發明EV製劑可用以治療不同疾病及/或病狀，包含癌症、乾癬、乾眼症、聽力損失、老化及脊髓損傷。
總結上述，本揭示內容提供一種用以治療疾病之EV製劑。本發明EV製劑包含一源自ucMSC的EV，以及一或多活性劑(例如生長因子、siRNA、多肽、小分子、植物成分或其組合)，其中該一或多活性劑是藉由前條件處理或分離後併入而包覆於該源自ucMSC之EV的脂質體結構中。依據本揭示內容實施例，可於pH=6-10的環境製備本發明EV製劑，製得的EV製劑可穩定儲存於-80°C，而不需外加抗凍劑。該活性劑可相加性或加乘性地增強源自ucMSC之EV的治療功效，據以提供更有效之治療疾病的方法。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之流式細胞儀分析數據，其闡述臍帶之間葉幹細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, ucMSC)上細胞標記的表現。 第2圖為依據本揭示內容實施例1所繪示之數據，其係關於分離及確認ucMSC-純-EV (即，源自未經前處理之ucMSC的EV)。圖A：流式細胞儀分析結果闡述ucMSC-純-EV之CD81標記的表現量。圖B：西方墨點分析結果闡述ucMSC-純-EV之CD63標記的表現量。圖C：穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy (TEM))之數據闡述ucMSC-純-EV的形態，其中ucMSC-純-EV的直徑約為50-150奈米。比例尺表示0.1微米(100奈米)。圖D：EV可以劑量相關的方式促進C2C12肌原細胞的生長，其中相較於源自DLD-1癌細胞的EV (標示為DEV)，ucMSC-純-EV (標示為MEV)對增強細胞生長具有更顯著的功效。 第3圖為依據本揭示內容實施例2所繪述之柱狀圖，其闡述特定EV對肌肉細胞生長的功效。EV：投予ucMSC-純-EV之C2C12肌原細胞；EV-Cur：投予EV-薑黃素(即，具有薑黃素包覆或包埋於其結構中之EV)之C2C12肌原細胞；Bryo-EV：投予苔蘚蟲素-EV (即，由ucMSC培養上清液所分離的EV，其中該ucMSC是經苔蘚蟲素前處理24小時)之C2C12肌原細胞；Asp-EV：投予阿司匹靈-EV (即，由ucMSC培養上清液所分離的EV，其中該ucMSC是經阿司匹靈前處理24小時)之C2C12肌原細胞 。*代表P ＜ 0.05，以Mann Whitney U檢測進行分析。 第4圖為依據本揭示內容實施例2所繪述之柱狀圖，其闡述特定處理對抗發炎反應的加乘性功效，其中包含薑黃素的EV (Cur/EVs)可顯著降低細胞中的活性含氧物(reactive oxygen species, ROS)產生。由三重覆實驗計算數據，並以Mann Whitney U檢測進行統計分析。 第5圖為依據本揭示內容實施例3所繪述之結果，其闡述源自DLD-1之EV (DEV)、ucMSC-純-EV (MEV)，或EV-薑黃素的miRNA表現資料，其中在2,000筆人類miRNA (hsa miR)中，有36種miRNA於該些EV中具有不同表現量。相較於ucMSC-EV，併入薑黃素會增加5種miRNA的表現量，並減少2種miRNA的表現量。 第6圖為依據本揭示內容實施例3所繪述之結果，其闡述源自DLD-1之EV (DEV)、ucMSC-純-EV (MEV)，或EV-薑黃素的蛋白表現資料，其中當定義增加超過4倍及減少到低於1/4倍時，併入薑黃素會增加6種蛋白的表現量，並減少4種蛋白的表現量。 第7圖為依據本揭示內容實施例2所繪述之追蹤分析結果，其闡述特定EV的濃度及體積大小。純EV的眾數大小(size of mode)為144奈米，分離後併入薑黃素之EV (EV-薑黃素)具有較小的眾數體積，源自以苔蘚蟲素前培養處理之EV (苔蘚蟲素-EV)具有較大的體積，而源自以阿司匹靈前培養處理之EV (阿司匹靈-EV)則具有較大的體積及較高的濃度。 第8圖為依據本揭示內容實施例2所繪述之數據，其闡述特定EV對調控T細胞分化的功效。圖A：CXCR3 (Th1細胞的細胞標記)的表現量；*代表neg組及刺激對照組之間P ＜ 0.05。圖B：CCR4 (Th2細胞的細胞標記)的表現量；*代表對照組及EV組之間P ＜ 0.05；#代表byro-EV組及EV-10a組之間P ＜ 0.05。圖C：CD25 (調節性T細胞(T regulatory， Treg) 的細胞標記)；*代表對照組及EV組之間P ＜ 0.05；#代表byro-EV組及EV-10a組之間P ＜ 0.05。圖D：CCR6 (Th17細胞的細胞標記)的表現量；*代表byro-EV組及EV-10a組之間P ＜ 0.05。neg：僅投予PBS處理；刺激對照組：投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理；EV組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入ucMSC-純-EV 的情況；byro-EV組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入包含苔蘚蟲素-EV的情況；Asp-EV組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入阿司匹靈-EV的情況；EV-10a組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入包含EV-miRNA10a拮抗核酸(antagomir)包埋於其中的EV的情況下。 第9圖為依據本揭示內容實施例4所繪述之柱狀圖，其闡述EV對放射線照射誘發之ROS生成的保護功效，其中該EV為ucMSC-照射-EV (即，利用直線加速器以單一分次對ucMSC投予或不投予3 Gy (次致死劑量)照射後，由該ucMSC分離的EV)。對照組：以PBS處理且以0或6 Gy之X射線照射之ucMSC；EV：以ucMSC-純-EV處理，且以0或6 Gy之X射線照射之ucMSC；Rad-EV：以ucMSC-照射-EV處理，且以0或6 Gy之X射線照射之ucMSC。 以Mann Whitney U檢測分析P值。*代表對照組0 Gy照射及6 Gy照射之間P ＜ 0.05。#代表EV組及Rad-EV組之6 Gy照射之間P ＜ 0.05。 第10圖為依據本揭示內容實施例5所繪述之數據，其闡述特定處理對T細胞分化的功效。圖A：CCR4於CD4+ T細胞的表現量；*代表Neg組及刺激對照組之間P ＜ 0.05。圖B：CCR4於CD8+ T細胞的表現量；*代表對照組及EV組之間P ＜ 0.05；#代表EV組及EV-ZIP組之間P ＜ 0.05。Neg：僅投予PBS處理；刺激對照組：投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理；EV組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入包含ucMSC-純-EV的情況；ZIP組：投予序列編號：1之多肽處理；EV-ZIP組：在投予抗-CD3及抗-CD28抗體處理後加入包含EV-ZIP的情況。 第11圖為依據本揭示內容實施例6所繪述之柱狀圖，其闡述特定EV對癌細胞的拮抗移動功效。對照/DLD-1：投予PBS處理的DLD-1細胞；DEV/DLD-1：投予源自DLD-1之EV處理的DLD-1細胞；MEV/DLD-1：投予ucMSC-純-EV處理的DLD-1細胞；DEV-miR-10a/DLD-1：投予EV處理的DLD-1細胞，其中該EV是源自DLD-1細胞且包含miRNA10a拮抗核酸(antagomir)；MEV-miR-10a/DLD-1：投予EV-miRNA10a處理的DLD-1細胞。*代表DEV/DLD-1組及MEV/DLD-1組之間P ＜ 0.05。#代表DEV/DLD-1組及DEV-miR-10a/DLD-1組之間P ＜ 0.05。 第12圖為依據本揭示內容實施例7所繪述之數據，其闡述特定治療於小鼠模式中對乾癬的治療功效。圖A及B分別為耳廓厚度的照片及定量分析結果。對照組：僅投予PBS的小鼠；載體組：投予咪喹莫特(imiquimod)後，以PBS進行治療的小鼠；EV：投予咪喹莫特後，以ucMSC-純-EV進行治療的小鼠；EV-薑黃素：投予咪喹莫特後，以EV-薑黃素進行治療的小鼠。*代表P ＜ 0.05，以Mann Whitney U檢測進行分析；與對照組相比較。 第13圖為依據本揭示內容實施例7所繪述之數據，其闡述特定治療於小鼠模式中對乾眼症的治療功效。圖A：接受載體或特定治療之小鼠結膜照片。圖B：經無血清培養液(SFM)或ucMSC-純-EV (EV)治療之小鼠的乾眼症分數。圖C：經無血清培養液(SFM)或阿司匹靈-EV治療之小鼠的乾眼症分數。O.D.：右眼；O.S.：左眼。*代表P ＜ 0.05，以Mann Whitney U檢測進行分析；與SFM組相比較。 第14圖為依據本揭示內容實施例7所繪述之數據，其闡述特定治療於小鼠模式中對聽力損失的保護功效。圖A及B：接受特定治療之小鼠的聽覺大腦反應(auditory brain response, ABR)分析數據。圖C：柯蒂氏器培植體(organ of Corti explant)的免疫螢光照片，其中箭號所指為治療後損失的毛細胞。比例尺為50微米。載體組：投予二氯二胺鉑(cisplatin)後，以PBS治療的小鼠；EV：投予二氯二胺鉑後，以ucMSC-純-EV治療的小鼠；EV-薑黃素：投予二氯二胺鉑後，以EV-薑黃素治療的小鼠；薑黃素：投予二氯二胺鉑後，以薑黃素治療的小鼠。 第15圖為依據本揭示內容實施例7所繪述之數據，其闡述特定治療於小鼠模式中的抗老化功效。圖A：投予或不投予D-半乳糖後，小鼠的逃避潛伏期(escape latency)。圖B：接受特定治療後，小鼠的逃避潛伏期。 第16圖為依據本揭示內容實施例7所繪述之數據，其闡述ucMSC-純-EV於脊髓內的分布狀態。

Claims (10)

  1. 一種包含一胞外囊泡及一活性劑之製劑，其中該胞外囊泡是源自一間葉幹細胞，且該活性劑是包覆於該EV中，其中是由臍帶的華通氏膠來分離該間葉幹細胞。
  2. 如請求項1所述之製劑，其中該活性劑是選自由生長因子、免疫調節劑、抗癌劑、抗發炎劑、抗感染劑、抗老化劑、抗氧化劑、抗放射劑、核酸及其組合所組成之群組。
  3. 如請求項2所述之製劑，其中該活性劑是阿司匹靈、苔蘚蟲素、二甲雙胍、脂多醣或薑黃素。
  4. 如請求項2所述之製劑，其中該核酸是小干擾核糖核酸(siRNA)、小髮夾核糖核酸(shRNA)或微核糖核酸(miRNA)。
  5. 如請求項1所述之製劑，其中是利用一方法來製備該製劑，該方法包含： (a)由該間葉幹細胞分離該EV；以及 (b)將步驟(a)之分離EV與該活性劑混合，以使該分離EV包覆該活性劑。
  6. 如請求項1所述之製劑，其中是利用一方法來製備該製劑，該方法包含： (a)對該間葉幹細胞投予該活性劑；以及 (b)由步驟(a)之經投予該活性劑之該間葉幹細胞分離該EV。
  7. 如請求項1所述之製劑，其中是利用一方法來製備該製劑，該方法包含： (a)以直線加速器、X射線或加馬射線照射該間葉幹細胞；以及 (b)由步驟(a)之該經照射之間葉幹細胞分離該EV。
  8. 如請求項7所述之製劑，其中在步驟(a)中，是以1-10戈雷的X射線照射該間葉幹細胞。
  9. 一種如請求項1所述之製劑於製備一藥物的用途，其中該藥物可用以治療一個體之一發炎性疾病、乾眼症、退化性疾病、癌症或老化。
  10. 如請求項9所述之用途，其中係以局部、結膜內、鼻腔內、氣管內、口服、脊髓內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、關節內、心室內、腦室內、腹腔及中耳內投予的路徑將該藥物投予至該個體。
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