CN107920503A - 肌营养不良症嵌合细胞和治疗肌营养不良症的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了通过成肌细胞与第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞的离体融合产生的肌营养不良症嵌合细胞，以及其在治疗肌营养不良症中的用途。

Description

肌营养不良症嵌合细胞和治疗肌营养不良症的方法
本申请要求2015年6月11日提交的美国临时专利申请序列号62/174,122的优先权的利益，其内容通过引用以整体并入本文。
背景技术
肌营养不良症(MD)是以控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化为特征的一组超过30种的遗传疾病。有些形式的MD在婴儿期或童年时期出现，而另一些则可能在中年以后才出现。这些障碍在肌肉无力的分布和程度(一些形式的MD还影响心肌)、发病年龄、进展速率和遗传模式方面不相同。
杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)(DMD)是最常见的致死性X染色体相关的进行性肌肉萎缩性疾病，由肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变引起，导致肌营养不良蛋白的缺乏，肌营养不良蛋白是一种参与维持肌肉完整性的蛋白。DMD影响每3500例男性出生中的一例。发病在3到5年之间，且疾病进展迅速。大多数男孩在12岁时无法行走，后来需要呼吸器进行呼吸。这些家庭的女孩有50％的机会继承和传递有缺陷的基因给他们的孩子。衰弱的患者不能参加日常活动；大部分在12岁之前就依赖轮椅。DMD患者的预期寿命为25。罹患贝克(Becker)MD(与杜氏MD非常相似但不太严重)的男孩具有错误的或不足的肌营养不良蛋白。
面肩肱型MD通常始于青少年时期。它会导致面部、手臂、腿部以及肩部和胸部周围的肌肉的进行性萎缩。它进展缓慢，症状可以从轻度到失能而不尽相同。
强直性MD是该障碍最常见的成人形式，并以延长的肌肉痉挛，白内障，心脏异常和内分泌紊乱为特点。强制性MD患者有长而瘦的脸，下垂的眼睑和天鹅般的脖子。
肌营养不良症由骨骼肌纤维的进行性退化引起。缺乏位于质膜或不常见的内膜上的几种蛋白中的一种增加了收缩期间损伤的概率，并最终导致纤维退化，伴随有免疫活性细胞浸润的严重局部炎症。在最严重的形式中，例如杜氏肌营养不良症，再生被耗尽且骨骼肌逐渐被脂肪和纤维组织所取代。这种情况导致患者进行性衰弱并最终因呼吸和/或心力衰竭而死。
现在还没有发现用于MD的有效疗法，重点被放在减缓症状进展的康复或利用机械呼吸机等来进行呼吸管理。药物疗法包括皮质类固醇(类固醇)，但是它们具有强烈的副作用并且没有产生足够的治疗效果。实验疗法如再生疗法(干细胞和成肌细胞的移植)(Meregalli等，(2010)BioDrugs 24：237-247；US 7,341,719；US 7,887,793和US 7,452,529)、基因治疗(功能性肌营养不良蛋白基因转移，反义吗啉代介导的突变外显子跳跃)、替代药物疗法(通读无义突变)等已被提出。然而，对发展新的更有效的策略来治疗MD患者存在着迫切的需要。
发明内容
本发明提供了通过融合(a)第一成肌细胞；和(b)第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞而制备的肌营养不良症嵌合细胞(MDCC)，其中所述第一成肌细胞、第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞中的至少之一来自于健康的供体。在一些实施方式中，所述第一成肌细胞和第二成肌细胞来自于不同的供体。在一些实施方式中，所述第一成肌细胞、第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞是自体的或同种异体的。在特定的实施方式中，所述健康的供体为对象的父亲。在另外的实施方式中，所述间充质干细胞来源于骨髓或脂肪组织，且所述MDCC分泌一种或多种免疫调节细胞因子和生长因子，例如胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子和肌肉生长抑制素。还提供了含有所述MDCC的组合物，一种试剂盒，以及在肌营养不良症例如杜氏肌营养不良症的治疗中通过静脉内注射、骨内注射或肌内注射施用所述MDCC的方法。
附图说明
图1示出创建人MDCC的离体融合过程。在一种实施方式中，从DMD患者的肌肉中获得人成肌细胞，并与来自健康供体的成肌细胞或间充质干细胞(MSC)融合。在融合之前，分别用PKH26或PKH67对细胞进行荧光标记。使用聚乙二醇(PEG)进行荧光标记细胞的细胞融合。通过荧光活化细胞分选(FACS；BD Asterios)选择发生融合的双重(PKH26和PKH67)染色的细胞。将这些细胞通过肌内注射递送到DMD患者恶化的肌肉中。
图2示出离体创建的(通过融合)人MD嵌合细胞(hMDCC)的流式细胞分析。示出的是未染色的成肌细胞、PKH26-染色的成肌细胞、PKH67-染色的间充质干细胞(MSC)和融合的PKH26/PKH67-染色的细胞的点阵图，确认hMDCC的创建。
图3A和3B示出体内肌肉收缩性测试的结果。用肌肉重量对肌肉力量(图3A)和疲劳百分比(图3B)测量进行归一化。在MDCC局部注射后90天，经hMDCC处理的动物显示改善的肌肉力(p＝0.04)和疲劳耐受性。
图4A和4B示出离体肌肉收缩性测试的结果。与对照、未处理的肌肉相比，经mMDCC处理的腓肠肌显示出在最大正弦波(p＝0.039；图4A)和最大百分比张力(图4B)之后表达的增加的收缩强度。
图5A和5B示出体内肌肉收缩性测试的结果。用肌肉重量对肌肉力量(图5A)和疲劳百分比(图5B)测量进行归一化。在MDCC局部注射后30天，经mMDCC处理的动物显示改善的肌肉力和疲劳耐受性(p＝0.05)。
具体实施方式
现在已经开发出用于治疗患者的肌营养不良症的MDCC组合物和方法。MDCC系通过第一群成肌细胞(自体或同种异体)与第二群成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞的离体融合创建。MDCC的施用使得能够将肌源性细胞和间充质源细胞同时递送给患者。因此，本发明提供了通过将来自罹患肌营养不良症的对象的成肌细胞与来自健康供体的成肌细胞；来自罹患肌营养不良症的对象的成肌细胞和间充质干细胞；来自健康供体的成肌细胞和间充质干细胞；来自罹患肌营养不良症的对象的成肌细胞和基质细胞；或来自健康供体的成肌细胞和基质细胞进行融合而制备的MDCC。在特定的实施方式中，本发明的MDCC可用于治疗肌营养不良症的方法中。
本发明区别于其他细胞类疗法，因为组合疗法引入分化为肌细胞的成肌细胞，而MSC已知具有降低的同种异体反应性、可塑性和在受损组织中去分化为成肌细胞的潜能。成肌细胞/MSC特性的组合，包括分泌免疫调节细胞因子和生长因子，在有利的微环境条件下支持MDCC植入、耐受和肌肉再生。另一方面，成肌细胞/成肌细胞MDCC的特性和自发融合的能力提供了植入和再补充肌肉干细胞生态位或在处理后与受体成肌细胞融合的能力，与成肌细胞/MSC MDCC相比提供了更好的结果。从DMD患者收获的细胞可以与来自单倍体相合雄性亲本，即父亲或来自细胞库中的单倍体匹配的供体的健康的、肌营养不良蛋白阳性的干细胞进行融合。以这种方式，MDCC共享自身和单倍体相合来源的表面抗原，降低移植MDCC的排斥风险。此外，假定所述MDCC没有经过遗传学修饰(即，通过重组方法)且不需要免疫抑制，本发明的细胞的使用提供了常规疗法的安全替代疗法。
对于本发明的目的，“嵌合细胞”或“杂交细胞”是由例如两种或更多种生物细胞(母细胞)的体细胞杂交(或全细胞杂交)构建的细胞。母细胞或供体细胞可以从相同的供体或细胞谱系或者不同的供体或细胞谱系获得。虽然本发明的MDCC被称为“嵌合细胞”，但是所述嵌合细胞旨在表示单一细胞或细胞群。
如本文所用，供体是提供在制备本发明的嵌合细胞中所用的细胞的对象。所述供体可以是肌营养不良症患者或健康供体，即不罹患相同遗传疾病的个体。所述供体可以是罹患肌营养不良症的对象(儿子)的遗传学父亲(父本)或细胞库供体。在具体的实施方式中，至少一个供体是健康的对象。在某些实施方式中，健康的供体是对象的父亲。在其他实施方式中，第一成肌细胞，第二成肌细胞，间充质干细胞或基质细胞是自体的或同种异体的。此外，供体可以是包括人类、小鼠、大鼠、狗、猫、马等的任何哺乳动物。在特定的实施方式中，所述供体是人类。
作为本领域的惯例，成肌细胞指具有发展成肌纤维的潜能的原始肌细胞。成肌细胞以表达肌纤维蛋白和CD56为特征，并且可以使用本领域已知的方法从胎儿或成人的组织中获得。参见例如WO93/03768，其公开了通过流式细胞术(例如FAC)从粗细胞群中分离出成肌细胞。或者，可以通过在培养物中生长和繁殖来自肌肉活组织检查的成肌细胞来获得成肌细胞。参见例如Springer等(1997)于Current Human Genetics(当前人类遗传学)，Unit13.4,Boyle Ed.John Wiley&Sons,NY。根据本发明的一些实施方式，来自健康供体的成肌细胞与来自罹患肌营养不良症的对象的成肌细胞发生融合。在特定的实施方式中，第一成肌细胞和成肌细胞来自于不同的供体。
“间充质干细胞”(也称为“MSC”)可在循环系统和淋巴系统中产生结缔组织、骨、软骨和细胞。间充质干细胞存在于间质中，即由松散堆积，梭形或星状非特化细胞组成的胚胎中胚层的部分。间充质干细胞可以通过常规方法获得并且可以鉴定为下列标志物中的一种或多种：CD29、CD31–、CD34–、CD44，CD45–、CD51、CD73、CD90/Thy-1、CD105、CD166、整合素α1、PDGF Rα、巢蛋白、Sca-1+、SCF R/c-Kit、STRO-1和VCAM-1。在一些实施方式中，所述间充质干细胞来源于或获得于骨髓(BM)和脂肪组织(ASC)。在特定实施方式中，所述间充质干细胞来自于或获得于人骨髓。
术语“基质细胞”或“粘附基质细胞”旨在表示通过其在组织培养处理的皮氏培养皿(petri dishes)中的粘附和增殖能力定义的细胞，所述皮氏培养皿具有或不具有在疏松结缔组织中发现的其他细胞和/或成分，所述细胞包括但不限于内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞和脂肪细胞。可以使用任何合适的方法来获得基质细胞。参见例如Tondreau等，(2005)Stem Cells(干细胞)23：1105-1112。在特定的实施方式中，所述基质细胞来源于或获自骨髓(BM)或脐带血(CB)。在其他实施方式中，所述基质细胞是CD133+基质细胞。
在本发明的MDCC的制备中使用的细胞可以被分离和任选地被纯化。本文使用的术语“被分离”旨在描述所处环境不同于各元素自然发生的环境中的感兴趣的细胞。本文使用的“被纯化”指从产生它的环境中被除去的细胞，并且是60％游离，优选70％游离，且最优选90％游离于与它自然相关的或在产生期间以别的方式与它相关的其他组分。
可以通过本领域已知的任何方法，如免疫学方法，来实现感兴趣的细胞的纯化和/或鉴定。可以使用组织化学染色，流式细胞术，荧光活化细胞分选(FACS)，蛋白质印迹分析，酶联免疫吸附测定(ELISA)等。流式免疫细胞化学可用于检测细胞表面标志物，免疫组织化学(例如固定化细胞)可用于细胞内或细胞表面标志物。蛋白质印迹分析可以在细胞提取物上进行。酶联免疫吸附测定可用于细胞提取物或分泌到培养基中的产物。用于鉴定干细胞标志物的抗体可以从商业来源获得，例如从Chemicon International(蒂梅丘拉(Temecula)，加州)。
在一些实施方式中，在本发明的MDCC的制备中所用的供体细胞对于被处理的对象是自体的或异体的。在其他实施方式中，在本发明的MDCC的制备中所用的供体细胞对于所述对象是同种异体的。在特定的实施方式中，所述供体细胞是HLA(人类白细胞抗原)匹配的。用于本发明的MDCC的制备的供体细胞的代表性来源列于表1。
表1
在特定的实施方式中，通过融合
a)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人成肌细胞；
b)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人间充质干细胞；
c)来自健康供体的人成肌细胞和来自健康供体的人间充质干细胞；
d)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人基质细胞；或者
e)来自健康供体的人成肌细胞和来自健康供体的人基质细胞，
产生所述MDCC。
通过两种不同供体细胞的离体融合制备本发明的MDCC。“离体”的意思是在体外操纵细胞。细胞融合是两个或更多个细胞通过融合它们的质膜而合并为一个细胞的过程。MDCC的制备可以采用本领域已知的细胞融合方法，包括但不限于，将细胞暴露于促进融合的化学品如聚乙二醇(PEG)；使用灭活病毒如仙台病毒；以及使用电刺激。例如参见Kennett(1979)Methods Enzymol.58:345-359，其中综述了基于仙台病毒诱导的细胞融合或由聚乙二醇(PEG)诱导的细胞融合的常用方法。简而言之，将要融合的细胞与促融合剂如仙台病毒或PEG一起温育。可以使用离心或搅拌来促进细胞膜的结块和紧密并列。诸如时间、温度、细胞浓度和融合剂浓度等变量可针对每种细胞组合进行优化。就电融合而言，短电脉冲通过细胞混合物以刺激融合。参见例如Neil&Zimmermann(1993)Methods Enzymol.220：174-196。
在某些实施方式中，所述MDCC通过聚乙二醇细胞融合来制备。融合后，代表肌源性/肌源性或肌源性/MSC源的细胞系被分离、培养和表征，以确认成肌细胞和MSC特异性标志物以及HLA I类型的细胞供体来源。
在融合前，可以培养或不培养供体细胞以增加它们的数量。另外，可以标记或不标记所述供体细胞(例如用膜染料)以监测供体细胞的融合。举例来说，用PKH26-红标记来自罹患肌营养不良症的对象的成肌细胞，用PKH67-绿标记来自健康供体的成肌细胞。
在一些实施方式中，本发明的MDCC分泌一种或多种免疫调节细胞因子和生长因子，在某些实施方式中，免疫调节细胞因子和生长因子包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)和肌肉生长抑制素。在另外的实施方式中，本发明的MDCC产生肌营养不良蛋白。
本发明的MDCC特别用于治疗肌营养不良症。因此，本发明还提供了治疗有需要的对象的肌营养不良症的方法，通过向对象施用本发明的MDCC或含有有效治疗营养不良症的量的MDCC的组合物。“治疗”罹患疾病或病症的对象意味着完成下列的一项或多项：(a)降低所述疾病的严重程度；(b)阻止所述疾病或病症的发展；(e)抑制所述疾病或病症的恶化；(d)限制或防止先前罹患所述疾病或病症的患者中的所述疾病或病症的复发；(e)使所述疾病或病症消退；(f)改善或消除所述疾病或病症的症状；和(g)改善生存。
如本文所述，肌营养不良症是以控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化为特征的一组遗传性疾病。肌营养不良症的实例包括杜氏肌营养不良症，贝克型肌营养不良症，肢带型肌营养不良症，强直性肌营养不良症，面肩肱型肌营养不良症，眼咽肌营养不良症，埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌营养不良症，福山型先天性肌营养不良症，三好氏(Miyoshi)肌肉病变，乌尔里希(Ullrich)先天性肌营养不良症，施泰纳特(Steinert)肌营养不良症。在某些实施方式中，肌营养不良症是杜氏肌营养不良症(DMD)。
根据治疗方法，将MDCC或包含其的组合物施用于罹患肌营养不良症的对象。在一些实施方式中，可以施用本发明的MDCC的组合。所述MDCC或细胞的组合可以通过植入来施用，其中通过例如静脉内、肌内、动脉内、骨内等将所述细胞注射到受试者体内。在某些实施方式中，施用包括移植约102，104，106，107，108，109，1010，1012或更多的细胞。可以基于给药途径和/或细胞正在移植的病症的严重程度来选择移植细胞的数量。有利地，本发明的MDCC将成功植入并补充肌营养不良症患者的缺陷肌肉的功能。
可以通过将细胞或细胞组合与药学上可接受的载体或水性介质混合来制备含有所述MDCC或MDCC的组合的组合物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利反应、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂等。这样的介质和药剂在药物活性物质中的使用在本领域是公知的。除了任何常规介质或药剂与本公开的细胞不相容的范围，考虑它在治疗组合物中的使用。药物组合物可以由本领域技术人员根据例如预期的给药途径、递送形式和期望的剂量来确定。例如，参见，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明登氏药学全书)，第18版，(A.R.Gennaro编辑)，1990，Mack Publishing Company。
本发明的组合物可以并入到可注射制剂中。所述制剂还可以包括必要的生理上可接受的载体物质，赋形剂，润滑剂，缓冲剂，表面活性剂，抗菌剂，填充剂(如甘露醇)，抗氧化剂(抗坏血酸或亚硫酸氢钠)等。
可接受的制剂材料优选在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。所述药物组合物可以含有制剂材料用于修饰、维持或保存组合物的例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。合适的制剂材料可以包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(例如普兰尼克(PLURONICS)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨酯20和聚山梨酸酯80、TRITON、三甲胺、卵磷脂、胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇或山梨醇)；递送载体(delivery vehicle)；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明登氏药学全书)，同上。
药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是含水的或非水的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水，生理盐水溶液或人造脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外给药的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性载体。药物组合物可包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其因此还可包含山梨醇或其合适的替代物。可通过将具有所需纯度的所选组合物与可选的配制剂(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备本发明的药物组合物以用于储存。
可以通过缓释系统、通过包封或通过植入装置来提供所述细胞或组合物。可以通过快速浓注或连续输注或通过植入装置来施用所述组合物。也可以通过植入已在其上吸收或包封有所述细胞的膜、海绵或其它合适的材料来局部施用所述组合物。在使用植入装置的情况下，该装置可以被植入到任何合适的组织或器官中。所述注射可以作为一次性治疗给予，重复(每天，每周，每月，每年等)以达到所需的治疗效果。
先前已经描述了细胞包封方法，其允许在帕金森病(Tresco，等(1992)ASAIOJ.38:17-23)或肌萎缩性侧索硬化症(Aebischer等(1996)Hum.Gene Ther.7:851-860)的治疗中移植被包封的细胞。根据该实施方式，细胞被形成微孔膜的化合物包封。可以使用由聚醚砜(PES)制造的中空微孔膜制备含有感兴趣的细胞的长度例如约1cm的胶囊(Akzo NobelFaser AG，伍珀塔尔，德国；Déglon等，(1996)Hum.Gene Ther.7:2135-2146)。
本发明的组合物可以肠胃外递送。当考虑胃肠外给药时，用于本发明的治疗组合物可以是无热原、胃肠外可接受的水溶液的形式。一种用于肠胃外注射的特别合适的载体是无菌蒸馏水。制剂可以涉及具有试剂的配方，所述试剂可提供一种或多种细胞的受控或持续释放，如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、高分子化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体，然后可以通过储库注射进行递送。具有透明质酸的制剂具有促进循环持续时间的作用。可以使用可植入的药物递送装置引入所需的组合物。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。可能也期望包括等渗剂如糖、氯化钠等。
还可以将补充性活性成分并入组合物中。本公开的活性组合物可以包含经典的药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用将通过任何常用途径进行，只要目标组织通过该途径是可获得的即可。这种途径包括口、鼻、颊、直肠、阴道或局部途径。或者，可以通过正位、皮内、皮下、腹膜内或静脉内注射给药。肌内注射将是优选的。这种组合物通常作为药学上可接受的组合物进行给药。
如本文所用，术语“有效量”，“有效的量”或“治疗有效量”是指足以实现所需结果的本发明的细胞或组合物的量。构成“有效量”或“治疗有效量”的细胞或组合物的量可根据疾病的严重程度，待治疗的患者的状况、体重或年龄，给药频率或给药途径进行变化，但是可以由本领域普通技术人员常规地确定。临床医生可以定制(titer)剂量或给药途径以获得最佳治疗效果。
本发明还涉及用于治疗肌营养不良症的试剂盒。该试剂盒可用于实施本发明的治疗肌营养不良症的方法。该试剂盒是材料或组分的集合，包括至少一种本发明的组合物。因此，在一些实施方式中，所述试剂盒是用于进行离体细胞融合的促融合剂，和一种或多种供体细胞(例如来自细胞库的供体细胞)，以及任选地用于获得供体细胞的材料，如上所述。
本发明试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期的目的。例如，为了治疗肌营养不良症的目的对一些实施方式进行配置。在一种实施方式中，为了治疗人类对象的目的对所述试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了治疗成年人类对象对所述试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了治疗儿童的目的对所述试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了治疗DMD的目的对该试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了治疗BMD的目的对该试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了提供持续的每日使用剂量的目的而对所述试剂盒进行特别配置。在另一种实施方式中，为了提供需使用剂量的目的而对所述试剂盒进行特别配置。在进一步的实施方式中，所述试剂盒被配置用于兽医应用，治疗对象例如但不限于农场动物、家养动物和实验室动物。
所述试剂盒中可以包含使用说明。“使用说明”典型地包括描述在使用所述试剂盒的组件以达到预期后果的过程中要应用的技术的切实表达，所述预期后果例如治疗肌营养不良症、治疗BMD或治疗DMD。可选地，所述试剂盒还包括其他有用组件，如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、包扎材料或本领域技术人员容易识别的其他有用的用具。
组装在所述试剂盒中的材料或组件可以以保存其可操作性和实用性的任何便利且合适的方式提供给从业人员。例如，所述组件可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供它们。所述组件通常包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。所述包装材料通过众所周知的方法构建，优选提供无菌、无污染的环境。所述试剂盒中使用的包装材料是通常用于治疗的那些包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，例如玻璃，塑料，纸，箔等。包装材料通常具有指示试剂盒和/或其组分的内容和/或目的的外部标签。
提供以下非限制性实例以进一步阐述本发明。
实例1：人肌营养不良症嵌合细胞的离体制备
使用聚乙二醇技术进行来自两位不相关供体的同种异源的人成肌细胞和MSC或成肌细胞的离体融合(图1)。简要地，将市售(Lonza，Inc.)人成肌细胞和MSC分开培养6至10天。然后，如图1所示，使用PKH-26(红)或PKH-67(绿)追踪染料将细胞进行荧光标记。使用PEG进行融合。通过荧光活化细胞分选(FACS；BD ASTERIOS)选择显示两种(PKH26和PKH67)着色的细胞。为了确认融合，使用共聚焦显微镜和流式细胞术(图2)评估双(PKH26和PKH67)标记MDCC。使用透射电子显微镜评估MDCC的形态。两个细胞核、融合细胞膜和融合细胞质的存在证实所述MDCC。
使用流式细胞术测定MDCC在融合后7、14、21、30天的表现型变化。测试MDCC的关于肌肉特异性标志物(抗成肌素、抗h肌球蛋白重链、抗mMYF-5)和MSC标志物(CD105、CD73、CD90)的表达。结果示于表2。值得注意的是，所述MDCC没有表达作为造血细胞特征的CD45或CD8标志物。
表2
另外，通过FISH分析MDCC以检测性染色体和活力染色(台盼蓝)。此外，将MDCC培养30天以通过ELISA测定测试增殖和分泌性质。并且，使用免疫荧光染色，在所述人MDCC中显示出肌营养不良蛋白的表达。另外，体外结果确认了hMDCC的肌源性分化潜能。在融合后，将hMDCC置于特定肌源性分化培养基(补充有胰岛素的低血清培养基，PROMOCELL)中7天。在所有hMDCC系中观察到作为骨骼肌细胞分化标志物的骨骼肌球蛋白重链表达。
为了测试基因型和确认细胞融合，在MDCC上进行聚合酶链式反应-反向序列特异性探针(PCR-rSSOP)和短串联重复PCR(STR-PCR)，从两个供体中检测HLA I类和II类以及特异性基因组合(分别见表3和表4)。该分析表明MDCC呈现源自两种供体细胞的HLA等位基因，并显示存在对两种融合供体细胞均具有特异性的遗传标记。
表3
表4
体外培养结果显示DMDCC对肌细胞谱系的增殖潜力、长期生存力和分化。DMDCC在融合后直至30天维持肌营养不良蛋白的表达。通过ELISA测定证实DMDCC分泌细胞因子。
在体内研究中，评估局部施用的hMDCC在mdx/scid小鼠模型中的植入。测试了五组小鼠(表5)。前两组包括成肌细胞/成肌细胞或MSC/成肌细胞源的MDCC(剂量0.5×106)，按照标准化模板经多次肌内注射，给药至mdx/scid小鼠的左腓肠肌。对照组包括通过肌内注射的用载体进行处理，用未融合的成肌细胞进行处理(剂量0.5×106)，或用混合的MSC和成肌细胞(剂量0.5×106)进行处理。测量的结果包括体内肌肉功能、被处理肌肉中的肌营养不良蛋白表达、以及在1周和12周时间点的MDCC植入。
使用肌营养不良蛋白表达作为hMDCC的特异性标志物，是因为已经证实hMDCC系皆表达肌营养不良蛋白。在hMDCC的局部肌内给药7天后，显示出hMDCC的成功植入。另外，与在mdx/scid对照中缺乏肌营养不良蛋白表达相比，早至移植后7天观察到局部增加的肌营养不良蛋白表达(12％)。而且，在90天时观察到17％的肌营养不良蛋白表达。
表5
在运动功能测试中测试另一组实验组(用载体和hMDCC处理的mdx/scid和野生型snj小鼠，n＝3)，包括握力测量和线悬挂测试。在接受hMDCC治疗递送后90天，接受hMDCC的小鼠显示出握力和线上疲劳耐受性的改善(p＝0.037)(mdx/scid小鼠，50gF；hMDCC疗法，85-90gF)。与载体处理组相比，在用两种MDCC系处理的组中观察到功能改善直至第42天。在该时间点之后，在整个90天随访期中仅成肌细胞/成肌细胞hMDCC维持增加的肌肉强度。相比之下，在用MSC/成肌细胞hMDCC处理的小鼠中，握力强度值在42天后回到基线水平。未融合细胞处理对照组仅在前21天显示暂时的运动功能改善。
在离体收缩性测试中分析在给药hMDCC后第90天收获的腓肠肌，以评估由电刺激引起的肌肉强度。结果显示，即使在诱导张力下(图3B)，成肌细胞/成肌细胞hMDCC处理的(图3A)肌肉也具有明显更强的收缩(p＝0.04)。通过共聚焦显微镜分析同一肌肉样品以检测和定量在hMDCC处理后90天的肌营养不良蛋白表达。平均而言，17％的细胞对肌营养不良蛋白表达呈阳性。
目前，没有有效的疗法来治疗DMD，一种影响每3500新生男孩中的一个新生儿的致死的遗传性神经肌肉障碍。已经尝试了治疗方式，如生长调节剂、抗炎剂或第二信使信号调节剂，以及被设计用于跳过肌营养不良蛋白基因中的突变的分子装置，然而这些方法不能阻止或逆转疾病进展。相比之下，本发明的MDCC疗法代表了用于DMD患者的局部或全身应用的通用再生医学方法。此外，与其他基于细胞的疗法相比，通过离体融合产生的MDCC的独特特征是肌源性细胞和间充质源细胞的补充特性的组合和协同效应，例如高增殖率、肌源性转化能力以及免疫调节细胞因子和促进肌肉再生的生长因子的分泌。此外，MDCC的制备不需要基因操纵或向细胞中导入病毒质粒，因此使其成为一种安全的疗法。另外，因为MDCC疗法不是基因/突变特异性的，所以能够将它定制和应用于罹患其他类型的肌营养不良症包括例如贝克肌营养不良的患者。
实例2：小鼠杜氏肌营养不良症嵌合细胞(mDMDCC)的离体制备
在体外建立并扩增健康的snj和mdx(肌营养不良蛋白缺陷型)原代成肌细胞培养物以及mdx MSC培养物。使用聚乙二醇技术进行三种小鼠成肌细胞/MSC和成肌细胞/成肌细胞融合。在融合前后确认肌营养不良蛋白表达以及肌源性分化能力。
在体内研究中(表6)，在将mDMDCC局部递送至腓肠肌后30天测试小鼠DMDCC植入的功效、肌营养不良蛋白表达的存活和恢复以及运动功能。在所测试的五组中，由成肌细胞/成肌细胞和MSC/成肌细胞源(剂量0.5×106)组成的mDMDCC按照标准化模板经多次肌内注射给药到mdx小鼠的左腓肠肌。对照组包括用载体处理、用未融合的成肌细胞处理以及用混合的MSC和成肌细胞处理。结果测量包括体内肌肉功能、被处理肌肉中的肌营养不良蛋白表达、以及在4周后测定的mDMDCC植入。在给药成肌细胞/成肌细胞mDMDCC后，在通过共聚焦显微镜的免疫荧光分析中肌营养不良蛋白表达细胞占总成核细胞的37％。成肌细胞/成肌细胞mDMDCC处理的肌肉显示肌营养不良蛋白阳性区和肌营养不良蛋白阴性区。肌营养不良蛋白阳性细胞的特征在于膜上的肌营养不良蛋白表达(正常模式)以及细胞质表达。
表6
有趣的是，与对侧未处理的肌肉相比，mDMDCC处理的肌肉显示下降的肌肉重量。被处理肌肉的较低重量可以通过下降的DMD相关肥大和纤维化来解释。不管下降的肌肉重量，使用原位电刺激引发的肌肉力量测量结果造成体内(图4A和图4B)以及离体(图5A和图5B)的肌肉强度值增加。
通过握力和金属丝悬挂测试评估的体内运动功能也证实了mDMDCC具有增加的握力和延长的抗疲劳时间的功效。成肌细胞/成肌细胞mDMDCC处理的肌肉保持的强度值比用成肌细胞/MSC MDCC处理的肌肉更高，后者在治疗给药后30天与对照组肌肉值无差异。成肌细胞衍生的mDMDCC处理导致对疲劳的耐受性增加，表现为与对照动物相比更长的线上悬挂时间。

Claims (13)

1.一种肌营养不良症嵌合细胞(MDCC)，其包含
(a)第一成肌细胞；和
(b)第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞
之间的融合，其中所述第一成肌细胞、第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞中的至少之一来自于健康的供体。
2.权利要求1的MDCC，其中所述第一成肌细胞和第二成肌细胞来自于不同的供体。
3.权利要求1的MDCC，其中所述第一成肌细胞、第二成肌细胞、间充质干细胞或基质细胞是自体的或同种异体的。
4.权利要求1的MDCC，其中所述健康的供体为对象的父亲。
5.权利要求1的MDCC，其中所述间充质干细胞来源于骨髓或脂肪组织。
6.权利要求1的MDCC，其中所述MDCC分泌一种或多种免疫调节细胞因子和生长因子。
7.权利要求6的MDCC，其中所述一种或多种免疫调节细胞因子和生长因子包含胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子和肌肉生长抑制素。
8.权利要求1的MDCC，其包含
a)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人成肌细胞；
b)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人间充质干细胞；
c)来自健康供体的人成肌细胞和来自健康供体的人间充质干细胞；
d)来自罹患肌营养不良症的对象的人成肌细胞和来自健康供体的人基质细胞；或者
e)来自健康供体的人成肌细胞和来自健康供体的人基质细胞
之间的融合。
9.包含权利要求1的MDCC和药学上可接受的载体的组合物。
10.一种治疗肌营养不良症的方法，所述方法包括向需要治疗的对象施用有效量的权利要求1的MDCC，从而治疗对象的肌营养不良症。
11.权利要求10的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症。
12.权利要求10的方法，其中所述MDCC通过静脉内注射、骨内注射或肌内注射被施用。
13.用于治疗肌营养不良症的试剂盒，其包含
(a)融合剂，和
(b)选自成肌细胞、间充质干细胞和基质细胞的一种或多种供体细胞。
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