ES2962633T3 - Células quiméricas para tratar la distrofia muscular y método para tratar distrofias musculares - Google Patents

Abstract

Se describe una célula quimérica de distrofia muscular generada por fusión ex vivo de un mioblasto con un segundo mioblasto, célula madre mesenquimatosa o célula estromal, así como el uso de la misma en el tratamiento de una distrofia muscular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células quiméricas para tratar la distrofia muscular y método para tratar distrofias musculares

Introducción

Con esta Solicitud se reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de EE. UU. n.° de serie 62/174,122 presentada el 11 de junio de 2015.

Antecedentes

Las distrofias musculares (DM) son un grupo de más de 30 enfermedades genéticas caracterizadas por debilidad progresiva y degeneración de los músculos esqueléticos que controlan el movimiento. Algunas formas de DM se observan en la lactancia o la infancia, mientras que otras pueden no aparecer hasta la mediana edad o más tarde. Los trastornos difieren en términos de la distribución y la extensión de la debilidad muscular (algunas formas de distrofia muscular también afectan el músculo cardíaco), la edad de inicio, la velocidad de progresión y el patrón de herencia.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD), el trastorno de pérdida progresiva de músculo ligada al cromosoma X letal más común, está causada por mutaciones del gen de la distrofina que dan como resultado la ausencia de distrofina, una proteína implicada en el mantenimiento de la integridad del músculo. La DMD afecta a uno de cada 3500 nacimientos masculinos. El inicio se produce entre los 3 y los 5 años y el trastorno progresa rápidamente. La mayoría de los niños son incapaces de caminar a los 12 años y más tarde necesitan un respirador para respirar. Las niñas de estas familias tienen un 50 % de probabilidades de heredar y transmitir el gen defectuoso a sus hijos. Los pacientes debilitados no pueden participar en actividades de rutina; la mayoría depende de la silla de ruedas a los 12 años. La expectativa de vida de los pacientes con DMD es de 25 años. Los niños con DM de Becker (muy similar, pero menos grave que la DM de Duchenne) tienen distrofina defectuosa o no suficiente.

La DM facioescapulohumeral generalmente comienza en la adolescencia. Causa debilidad progresiva en los músculos de la cara, los brazos, las piernas y alrededor de los hombros y el tórax. Progresa lentamente y puede variar en cuanto a los síntomas, desde leves hasta incapacitantes.

La DM miotónica es la forma más común del trastorno en adultos y se caracteriza por espasmos musculares prolongados, cataratas, anomalías cardíacas y alteraciones endocrinas. Los individuos con DM miotónica tienen caras largas y delgadas, párpados caídos y un cuello en forma de cisne.

Las distrofias musculares son causadas por la degeneración progresiva de las fibras del músculo esquelético. La falta de una de varias proteínas localizadas en la membrana plasmática o, con menor frecuencia, en las membranas internas, aumenta la probabilidad de daño durante la contracción, y finalmente conduce a la degeneración de las fibras, acompañada por una inflamación local grave con infiltración de células inmunocompetentes. En las formas más graves, como la distrofia muscular de Duchenne, la regeneración se agota y el músculo esquelético se reemplaza progresivamente por grasa y tejido fibroso. Esta afección conduce al paciente a debilidad progresiva y finalmente a la muerte por insuficiencia respiratoria y/o cardíaca.

En la actualidad, no se ha encontrado todavía una terapia eficaz para la DM, y se da importancia a la rehabilitación para retardar la progresión de los síntomas o el tratamiento respiratorio usando ventiladores mecánicos o similares. La terapia farmacológica incluye corticoesteroides (esteroides), pero tienen efectos secundarios fuertes y no han producido un efecto terapéutico suficiente. Se han sugerido terapias experimentales tales como terapia regenerativa (trasplante de células madre y mioblastos) (Meregalli, et al. (2010) BioDrugs 24:237-247; US 7,341,719; US 7,887,793; y US 7,452,529), terapia génica (transferencia génica de distrofina funcional, omisión mediada por morfolino antisentido de exones mutados), terapia farmacológica alternativa (lectura de mutaciones sin sentido) y similares. Sin embargo, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias más eficaces para tratar a los pacientes con DM.

En el documento WO 96/18303 se divulga el uso de mioblastos normales para suministrar el genoma normal completo para efectuar la reparación genética, o para aumentar el tamaño, o la función de tejidos u órganos.

En el documento US2006251632A1 se divulgan métodos y materiales para mejorar la masa muscular o para el tratamiento de enfermedades musculares en un sujeto, que comprende introducir una célula que tiene un nivel de señalización de miostatina inferior al normal, en el sujeto.

Partridge T. A. et al., Nature 25 MAY 1978, (19780525), vol. 273, n.° 5660, ISSN 0028-0836, páginas 306-308, XP002778941 divulgan «Evidence of fusion between host and donor myoblasts in skeletal muscle grafts.»

Sébastien Goudenege at al, Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, US, (20121101), vol. 20, n. ° 11, doi: 10.1038/mt.2012.188, ISSN 1525-0016, páginas 2153-2167, XP055457899 divulgan «Myoblasts Derived From Normal hESCs and Dystrophic hiPSCs Efficiently Fuse With Existing Muscle Fibers Following Transplantation».

En el documento WO2014210448 se divulga la actividad fusogénica de la proteína Myomaker. Este polipéptido, cuando se expresa en células no musculares, impulsa la fusión de la célula con una célula muscular, pero no con otras células no musculares. También se describe el uso de esta proteína y la célula que la expresa en el suministro de material genético exógeno a células musculares.

En el documento US2008299091A1 se divulga un método para generar estirpes de células madre humanas partenogenéticas homocigóticas de HLA (hpSC-Hhom) a partir de donantes homocigóticos de HLA y heterocigóticos de HLA.

Dedieu et al.; Biology of the cell; mayo de 2002, vol. 94 divulgan «Calpain and myogenesis: development of a convenient cell culture model».

En el documento US2014199377A1 se divulgan composiciones con portadores de liberación sostenida asociados con al menos dos tipos diferentes de factores de crecimiento y métodos de fabricación y tratamientos de estos. En algunas realizaciones, puede preferirse la liberación simultánea de los factores de crecimiento, mientras que, en otras realizaciones, puede preferirse la liberación secuencial de los factores de crecimiento.

Shi et al., Blood, (20040701), vol. 104, n. ° 1, páginas 290-296, XP003011973 divulgan «Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells».

Compendio de la invención

Con la invención se proporciona un método para preparar una célula quimérica para tratar una distrofia muscular, comprendiendo el método incubar ex vivo (a) un primer mioblasto; y (b) un segundo mioblasto, o célula madre mesenquimatosa; con un agente fusogénico para generar la célula quimérica, en donde el segundo mioblasto, o la célula madre mesenquimatosa es de un donante sano y el primer mioblasto es de un sujeto que padece de distrofia muscular. En realizaciones particulares, el donante sano es el padre del sujeto. En realizaciones adicionales, las células madre mesenquimatosas se derivan de la médula ósea o de tejido adiposo y la MDCC secreta una o más citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento similar a insulina tipo 1, factor de crecimiento de hepatocitos y miostatina. También se proporciona una composición que contiene MDCC, un equipo, y un método para administrar MDCC por inyección intravenosa, inyección intraósea o inyección intramuscular en el tratamiento de una distrofia muscular tal como distrofia muscular de Duchenne.

Breve descripción de los dibujos

En la Figura 1 se muestra el procedimiento de fusiónex vivopara crear MDCC humana. En una realización, los mioblastos humanos se obtienen a partir del músculo de un paciente con DMD y se fusionan con mioblastos o células madre mesenquimatosas (CMM) de un donante sano. Antes de la fusión, las células se marcan fluorescentemente con PKH26 o PKH67, respectivamente. La fusión celular de células marcadas fluorescentemente se realiza usando polietilenglicol (PEG). Las células teñidas doblemente (PKH26 y PKH67) que experimentan fusión se seleccionan mediante clasificación de células activadas fluorescentemente (FACS; Bd Asterios). Estas células se administran mediante inyección intramuscular en los músculos deteriorantes del paciente con DMD.

En la Figura 2 se muestra un análisis de citometría de flujo de células quiméricas para tratar la DM humanas creadasex vivo(por fusión) (hMDCC, por sus siglas en inglés). Se muestran gráficos de puntos de mioblastos no teñidos, mioblastos teñidos con PKH26, células madre mesenquimatosas teñidas con PKH67 (MSC, por sus siglas en inglés) y células teñidas con PKH26/PKH67 fusionadas, que confirman la creación de hMDCC.

En las Figuras 3A y 3B se muestran los resultados de un ensayo de contractilidad muscularin vivo. Las mediciones de fuerza muscular (Figura 3A) y porcentaje de fatiga (Figura 3B) se normalizaron con los pesos musculares. Los animales tratados con hMDCC mostraron mejor fuerza muscular (p = 0,04) y tolerancia a la fatiga 90 días después de las inyecciones locales de MDCC.

En las Figuras 4A y 4B se muestran los resultados de un ensayo de contractilidad muscularex vivo.Los músculos gastrocnemios tratados con mMDCC mostraron un aumento de la fuerza contráctil expresada después de la onda sinusoidal máxima (p = 0,039; Figura 4A) y el porcentaje máximo de tensión (Figura 4B), en comparación con el músculo de control no tratado.

En las Figuras 5A y 5B se muestran los resultados de un ensayo de contractilidad muscularin vivo. Las mediciones de fuerza muscular (Figura 5A) y porcentaje de fatiga (Figura 5B) se normalizaron con los pesos musculares. Los animales tratados con mMDCC mostraron mejor fuerza muscular (p = 0,05) y tolerancia a la fatiga 30 días después de las inyecciones locales de MDCC.

Descripción detallada de la invención

Se han desarrollado ahora composiciones de MDCC y métodos para tratar distrofias musculares en pacientes. Con la invención se proporciona un método para preparar una célula quimérica para tratar una distrofia muscular, comprendiendo el método incubar ex vivo (a) un primer mioblasto; y (b) un segundo mioblasto, o célula madre mesenquimatosa; con un agente fusogénico para generar la célula quimérica, en donde el segundo mioblasto, o la célula madre mesenquimatosa es de un donante sano y el primer mioblasto es de un sujeto que padece distrofia muscular. La administración de MDCC permite el suministro simultáneo de células de origen miogénico y mesenquimatosas a los pacientes. Por consiguiente, esta invención proporciona MDCC preparadas por fusión de mioblastos de un sujeto que padece de una distrofia muscular y mioblastos de un donante sano o mioblastos de un sujeto que padece de una distrofia muscular y células madre mesenquimatosas de un donante sano. En modalidades particulares, las MDCC de esta invención encuentran uso en un método para tratar distrofias musculares.

Esta invención difiere de otras terapias basadas en células ya que la terapia combinada introduce mioblastos que se diferencian en miocitos, mientras que las MSC son conocidas por una menor alorreactividad, plasticidad y potencial de desdiferenciación en mioblastos en tejido dañado. La combinación de características de mioblastos/MSC, incluyendo la secreción de citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento, apoya el injerto de MDCC, la tolerancia y la regeneración del músculo en condiciones microambientales favorables. Por otro lado, las características de mioblasto / MDCC de mioblasto y la capacidad para fusionarse espontáneamente ofrecen la capacidad de injertar y reabastecer el nicho de células madre musculares o fusionarse con el mioblasto receptor después del tratamiento, proporcionando mejores resultados en comparación con MDCC de mioblastos/MSC. Las células recogidas de un paciente con DMD pueden fusionarse con células madre positivas para distrofina sanas de un pariente masculino haploidéntico, es decir, padre o de un donante compatible con halo en bancos de células. De esta manera, las MDCC comparten antígenos de superficie de origen propio y haploidéntico, reduciendo el riesgo de rechazo de las MDCC trasplantadas. Además, dado que las MDC<c>no se modifican genéticamente (es decir, mediante métodos recombinantes) y no requieren inmunodepresión, el uso de las células de esta invención proporciona una alternativa segura a las terapias convencionales.

Para los fines de esta invención, una «célula quimérica» o «célula híbrida» es una célula que se construye a partir de una hibridación de células somáticas (o una hibridación de células completas) de, por ejemplo, dos o más células biológicas (células progenitoras). Las células progenitoras o donadoras pueden obtenerse del mismo donante o linaje celular o de diferentes donantes o linaje celular. Aunque las MDCC de esta invención se denominan como «una célula quimérica», dicha célula quimérica significa una célula única o una población de células.

Como se usa en el presente documento, un donante es un sujeto que proporciona una célula usada en la preparación de una célula quimérica de esta invención. El donante puede ser un sujeto con una distrofia muscular o un donante sano, es decir, un individuo que no padece el mismo trastorno genético. El donante puede ser el padre genético (padre) de un sujeto (hijo) con distrofia muscular o un donante de banco celular. En realizaciones particulares, al menos uno de los donantes es un sujeto sano. En ciertas realizaciones, el donante sano es el padre del sujeto. Además, el donante puede ser cualquier mamífero incluyendo un ser humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo y similares. En realizaciones particulares, el donante es un ser humano.

Como es convencional en la técnica, un mioblasto se refiere a una célula muscular primitiva que tiene el potencial de desarrollarse en una fibra muscular. Los mioblastos se caracterizan por la expresión de desmina y CD56, y se pueden obtener a partir de tejido fetal o adulto usando un método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/03768, en que se describe el aislamiento de mioblastos a partir de una población de células brutas por citometría de flujo (por ejemplo, FAC). Alternativamente, se puede obtener un mioblasto mediante el crecimiento y la propagación de mioblastos derivados de biopsia muscular en cultivo. Véase, por ejemplo, Springer, et al. (1997) en: Current Human Genetics. Unidad 13.4, Boyle Ed. John Wiley & Sons, NY. De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, un mioblasto de un donante sano se fusiona con un mioblasto de un sujeto con distrofia muscular. En realizaciones particulares, un primer mioblasto y un mioblasto son de diferentes donantes.

Las «células madre mesenquimatosas» (también denominadas «MSC») pueden dar lugar a tejido conectivo, hueso, cartílago y células en los sistemas circulatorio y linfático. Las células madre mesenquimatosas se encuentran en el mesenquima, la parte del mesodermo embrionario que consiste en células no especializadas fusiformes o estrelladas, empaquetadas en forma holgada. Las células madre mesenquimatosas se pueden obtener por métodos convencionales y se pueden identificar con uno o más de los siguientes marcadores: CD29, CD31-, CD34-, CD44, CD45-, CD51, CD73, CD90/Thy-1, CD105, CD166, Integrina a l, PDGF Ra, Nestin, Sca-1+, SCF R/c-equipo, STRO-1 y VCAM-1. En algunas realizaciones, las células madre mesenquimatosas se derivan u obtienen de la médula ósea (MO) o de tejido adiposo (ASC). En realizaciones particulares, las células madre mesenquimatosas se derivan u obtienen de médula ósea humana.

El término «célula estromal» o «célula estromal adherente» significa una célula definida por su capacidad para adherirse y proliferar en placas de Petri tratadas con cultivo tisular con o sin otras células y/o elementos encontrados en tejido conectivo suelto, incluyendo, entre otros, células endoteliales, pericitos, macrófagos, monocitos, células plasmáticas, mastocitos y adipocitos. Puede usarse cualquier método adecuado para obtener células estromales. Véase, por ejemplo, Tondreau, et al. (2005) Stem Cells 23:1105-1112.

Las células usadas en la preparación de las MDCC de esta invención pueden aislarse y purificarse opcionalmente. Como se usa en el presente documento, el término «aislado» describe una célula de interés que está en un entorno diferente de aquel en el que el elemento se produce de forma natural. «Purificada» como se usa en el presente documento se refiere a una célula retirada de un entorno en el que se produjo y está al menos un 60 % exenta, preferiblemente un 75 % exenta, y lo más preferiblemente un 90 % exenta de otros componentes con los que está asociada de forma natural o con los que de otro modo se asoció durante la producción.

La purificación y/o identificación de células de interés se puede lograr a través de cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, inmunológicamente. Se puede usar tinción histoquímica, citometría de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia (FAC<s>, por sus siglas en inglés), análisis de transferencia western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), etc. La inmunocitoquímica de flujo se puede usar para detectar marcadores de superficie celular, la inmunohistoquímica (por ejemplo, de células fijas) se puede usar para marcadores intracelulares o de superficie celular. El análisis por transferencia Western se puede llevar a cabo en extractos celulares. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima puede usarse para extractos o productos celulares secretados en el medio. Los anticuerpos para la identificación de marcadores de células madre se pueden obtener de fuentes comerciales, por ejemplo, de Chemicon International, (Temecula, CA).

En ciertas realizaciones, las células donadoras son HLA (antígeno leucocitario humano) emparejadas. Las fuentes representativas de células donadoras usadas para la preparación de las MDCC de la invención se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1

Las MDCC se producen mediante fusión:

a) un mioblasto humano de un sujeto que padece distrofia muscular y un mioblasto humano de un donante sano; o

b) un mioblasto humano de un sujeto que padece distrofia muscular y una célula madre mesenquimatosa humana de un donante sano.

Las MDCC de esta invención se preparan por fusiónex vivode dos células donadoras diferentes. Por «exvivo»se entiende que las células se manipulan fuera del cuerpo. La fusión celular es un proceso en el que dos o más células se fusionan en una al fusionar sus membranas plasmáticas. Las MDCC se preparan incubando con un agente fusogénico, incluyendo, entre otros, la exposición de células a compuestos químicos promotores de fusión, tales como polietilenglicol (PEG); el uso de virus inactivados, tales como virus Sendai; y el uso de estimulación eléctrica. Véase, por ejemplo, Kennett (1979) Methods Enzymol. 58:345-359 para una revisión de los métodos usados comúnmente basados en la fusión celular inducida por el virus Sendai, o la fusión celular inducida por el polietilenglicol (PEG). En resumen, las células que hay que fusionar se incuban con un agente fusogénico, tal como virus Sendai o PEG. La centrifugación o agitación se puede usar para estimular la aglomeración y la aposición cerrada de las membranas celulares. Variables tales como tiempo, temperatura, concentración celular y concentración de agente fusogénico pueden optimizarse para cada combinación celular. Con respecto a la electrofusión, no reivindicada, se hacen pasar impulsos eléctricos cortos a través de mezclas de células para estimular la fusión. Véase, por ejemplo, Neil & Zimmermann (1993) Methods Enzymol.

220:174-196.

En ciertas realizaciones, las MDCC se preparan por fusión de células de polietilenglicol. Después de la fusión, las estirpes celulares que representan el origen miogénico/miogénico o miogénico/MSC se separan, se cultivan y se caracterizan para confirmar los marcadores específicos de mioblasto y MSC y los tipos de HLA de clase I de origen de donante celular.

Antes de la fusión, las células donadoras pueden o no cultivarse para aumentar su número. Además, las células donadoras pueden o no estar marcadas (p. ej., con un tinte de membrana) para monitorizar la fusión de las células donadoras. A modo de ilustración, los mioblastos de un sujeto que padece distrofia muscular se marcan con rojo PKH26 y los mioblastos de un donante sano se marcan con verde PKH67.

En algunas realizaciones, las MDCC de esta invención secretan una o más citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento. En ciertas realizaciones, las citocinas inmunomoduladoras y los factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y miostatina. En realizaciones adicionales, las MDCC de esta invención producen distrofina.

Las MDCC de esta invención son de uso particular en el tratamiento de distrofias musculares. Por consiguiente, con esta invención también se proporcionan MDCC de la invención para su uso en el tratamiento de distrofias musculares en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto las MDCC de la invención o una composición que contenga las MDCC en una cantidad eficaz para tratar las distrofias. «Tratar» a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad de la enfermedad; (b) detener el desarrollo de la enfermedad o trastorno; (e) inhibir el empeoramiento de la enfermedad o trastorno; (d) limitar o prevenir la recaída de la enfermedad o trastorno en pacientes que han tenido previamente la enfermedad o trastorno; (e) causar la regresión de la enfermedad o trastorno; (f) mejorar o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno; y (g) mejorar la supervivencia.

Como se indica en este documento, las distrofias musculares son un grupo de enfermedades genéticas caracterizadas por debilidad progresiva y degeneración de los músculos esqueléticos que controlan el movimiento. Ejemplos de distrofias musculares incluyen distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de la cintura de las extremidades, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular congénita de tipo Fukuyama, miopatía de Miyoshi, distrofia muscular congénita de Ullrich, distrofia muscular de Steinert. En ciertas realizaciones, la distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne (DMD).

De acuerdo con la invención, una MDCC o composición que la contiene para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular se administra a un sujeto que tiene una distrofia muscular. En algunas realizaciones, se puede administrar una combinación de MDCC de esta invención. La MDCC o combinación de células puede administrarse mediante injerto, en donde las células se inyectan en el sujeto, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intraarterial, intraósea y similares. En ciertas realizaciones, la administración implica injertar aproximadamente 102, 104, 106, 107, 108, 109, 1010, 1012, o más células. El número de células injertadas puede elegirse basándose en la vía de administración y/o la gravedad de la afección para la que se están injertando las células. Ventajosamente, la MDCC de esta invención se injertará y complementará con éxito la función de los músculos defectuosos de los pacientes con distrofia muscular.

Las composiciones que contienen MDCC o combinaciones de MDCC pueden prepararse combinando la célula o combinación de células con un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. La expresión «Farmacéutica o farmacológicamente aceptable» incluye entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción inapropiada, cuando se administra a un animal o ser humano. Tal como se usa en este documento, «portador farmacéuticamente aceptable» incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las células de la presente divulgación, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. Las composiciones farmacéuticas óptimas las determinará un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración, el formato de suministro y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.a edición, (A. R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Las composiciones de la invención se pueden incorporar en una formulación inyectable. La formulación también puede incluir el material portador fisiológicamente aceptable necesario, excipiente, lubricante, tampón, tensioactivo, antibacteriano, agente de carga (tal como manitol), antioxidantes (ácido ascórbico o bisulfito de sodio) y similares.

Los materiales de formulación aceptables preferiblemente no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o la liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, entre otros, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito sódico); soluciones amortiguadoras (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes espesantes (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); rellenos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones que forman sales (tal como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes mejoradores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes mejoradores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o de potasio, manitol o sorbitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,Id.

El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, complementados posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. Otros ejemplos de vehículos son una solución salina neutra tamponada o una solución salina mezclada con albúmina de suero. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5; o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0 5,5; que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado de este. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada con el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Id.)en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa.

La célula o composición puede proporcionarse mediante sistemas de liberación sostenida, mediante encapsulación o mediante dispositivos de implantación. Las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o continuamente mediante perfusión, o mediante un dispositivo de implantación. La composicion también puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la célula o células se han absorbido o encapsulado. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado. Las inyecciones se pueden administrar como un tratamiento único, repetido (diario, semanal, mensual, anual, etc.) con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado.

La metodología de encapsulación celular se ha descrito previamente, permite el trasplante de células encapsuladas en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (Tresco, et al. (1992) ASAIO J. 38:17-23) o esclerosis lateral amiotrófica (Aebischer, et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:851-860). De acuerdo con esta realización, las células se encapsulan mediante compuestos que forman una membrana microporosa. Las cápsulas, por ejemplo, de aproximadamente 1 cm de longitud, que contienen las células de interés se pueden preparar empleando una membrana microporosa hueca fabricada de poli-éter-sulfona (PES) (Akzo Nobel Faser AG, Wuppertal, Alemania; Déglon, et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:2135-2146).

Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa exenta de pirógenos, parenteralmente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril. La preparación puede implicar la formulación con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida de la célula o células, que luego se pueden suministrar mediante una inyección de liberación retardada. La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Los dispositivos de suministro de fármacos implantables pueden usarse para introducir la composición deseada.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares.

También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones. Las composiciones activas de la presente divulgación pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente divulgación puede ser mediante cualquier vía común, siempre que el tejido objetivo esté disponible por medio de esa vía. Tales vías incluyen la vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. De manera alternativa, la administración puede ser por medio de inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Se preferirá la inyección intramuscular.

Tales composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en el presente documento, el término «cantidad eficaz», «eficaz cantidad» o una «cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a una cantidad de la célula o composición de la invención suficiente para lograr el resultado deseado. La cantidad de la célula o composición que constituye una «cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» puede variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad, el estado, el peso o la edad del paciente que se va a tratar, la frecuencia de administración o la vía de administración, pero puede determinarla rutinariamente un experto en la técnica. Un profesional clínico puede valorar la dosis o la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Se describe un equipo para el tratamiento de una distrofia muscular. El equipo es útil para practicar el método de la invención para tratar una distrofia muscular. El equipo es un ensamble de materiales o componentes que incluyen al menos una de las composiciones inventivas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el equipo incluye un agente fusogénico para llevar a cabo fusiones de células exvivo, y una o más células donadoras (por ejemplo, células donadoras de un banco de células), y opcionalmente materiales para obtener células donadoras, como se ha descrito anteriormente.

La naturaleza exacta de los componentes configurados en el equipo depende del propósito. Por ejemplo, algunos equipos están configurados con el propósito de tratar una distrofia muscular. El equipo puede configurarse particularmente con el propósito de tratar sujetos humanos. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente con el propósito de tratar sujetos humanos adultos. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente para el propósito de tratar niños. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente para el propósito de tratar DMD. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente para el propósito de tratar BMD. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente con el propósito de proporcionar dosis de uso diario continuo. Alternativamente, el equipo puede configurarse particularmente con el propósito de proporcionar dosis de uso necesario. Alternativamente, el equipo puede configurarse para aplicaciones veterinarias, tratando sujetos tales como, entre otros, animales de granja, animales domésticos y animales de laboratorio.

Las instrucciones de uso se pueden incluir en el equipo. «Instrucciones de uso» incluye típicamente una expresión tangible que describe la técnica que va a emplearse al usar los componentes del equipo para obtener un resultado deseado, tal como tratar la distrofia muscular, tratar la BMD o tratar la DMD. Opcionalmente, el equipo contiene también otros componentes útiles como diluyentes, amortiguadores, portadores farmacéuticamente aceptables, jeringas, catéteres, aplicadores herramientas de medición o pipeteo, materiales de vendaje u otros artículos útiles fácilmente reconocibles para los expertos en la técnica.

Los materiales o componentes ensamblados en el equipo se pueden proporcionar al especialista almacenados de cualquier manera conveniente y adecuada que preserve su operabilidad y utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden estar en forma disuelta, deshidratada o liofilizada; se pueden proporcionar a temperatura ambiente, refrigerados o congelados. Los componentes están típicamente contenidos en el material o materiales de envasado adecuados. Tal como se emplea en este documento, la expresión «material de envasado» hace referencia a una o más estructuras físicas usadas para albergar el contenido del equipo. El material de empaque se fabrica mediante métodos conocidos, preferentemente para proporcionar un entorno estéril, libre de contaminantes. Los materiales de envasado empleados en el equipo son los habitualmente utilizados en el tratamiento terapéutico. Tal como se usa en este documento, el término «envasado» hace referencia a un material o matriz sólida tal como vidrio, plástico, papel, papel metalizado y similares que tienen la capacidad de contener los componentes individuales del equipo. El material de envasado generalmente tiene una etiqueta externa en la que se indica el contenido y/o el propósito del equipo y/o sus componentes.

Se proporcionan los siguientes ejemplos no taxativos para ilustrar aun más la presente invención. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Preparaciónex vivode células quiméricas para tratar la distrofia muscular humana (hMDCC)

Se realizaron fusionesex vivode mioblastos humanos alogénicos y MSC o mioblastos de dos donantes no relacionados, usando la técnica del polietilenglicol (Figura 1). En resumen, los mioblastos humanos y MSC disponibles comercialmente (Lonza, Inc.) se cultivaron por separado durante 6 a 10 días. A continuación, las células se marcaron fluorescentemente usando tinte de rastreo PKH-26 (rojo) o PKH-67 (verde), como se muestra en la Figura 1. La fusión se realizó usando PEG. Las células que presentaban tinción doble (PKH26 y PKH67) se seleccionaron mediante clasificación celular activada fluorescentemente (FACS; BD ASTERIOS). Para confirmar la fusión, se evaluó la MDCC marcada doblemente (PKH26 y PKH67) usando microscopía confocal y citometría de flujo (Figura 2). La morfología de la MDCC se evaluó usando microscopía electrónica de transmisión. Las MDCC se confirmaron por la presencia de dos núcleos, membrana celular fusionada y citoplasma fusionado.

Se usó citometría de flujo para evaluar los cambios de fenotipo de MDCC a los 7, 14, 21 y 30 días después de la fusión. Se ensayaron MDCC para la expresión de marcadores específicos del músculo (Anti-Myogen in, AntihMyosin de cadena pesada, Anti-mMYF-5) y marcadores MSC (CD105, CD73, CD90). Los resultados se muestran en la Tabla 2. En particular, la MDCC no expresaba marcadores CD45 o CD8, que son característicos de las células hematopoyéticas.

TABLA 2

Adicionalmente, se analizaron MDCC por FISH para detectar cromosomas sexuales y tinción de viabilidad (azul de tripano). Además, se cultivaron MDCC durante 30 días para ensayar las propiedades de proliferación y secreción mediante ensayo ELISA. Asimismo, usando tinción por inmunofluorescencia, se demostró la expresión de distrofina en MDCC humana. Es más, los resultadosin vitroconfirmaron el potencial de diferenciación miogénica de hMDCC. Después de la fusión, se colocaron hMDCC en medio de diferenciación miogénico específico (medio de suero bajo suplementado con insulina, PROMOCELL) durante 7 días. Se observó expresión de la cadena pesada de miosina esquelética, un marcador de diferenciación de miocitos esqueléticos, en todas las estirpes de hMDCC.

Para evaluar el genotipo y confirmar la fusión celular, se realizó la reacción de polimerización en cadena, sonda específica de secuencia inversa (PCR-rSSOP) y la repetición en tándem corto, PCR (STR - PCR) en MDCC, detectando HLA de clase I y II y combinación de genes específicos de ambos donantes (Tablas 3 y 4, respectivamente). Este análisis indicó que la MDCC presentaba alelos HLA derivados de ambas células donadoras y mostró la presencia de marcadores genéticos específicos para ambas células donadoras de fusión.

TABLA 3

TABLA 4

Los resultados del cultivoin vitromostraron potencial proliferativo, viabilidad a largo plazo y diferenciación de DMDCC para el linaje de miocitos. La expresión de distrofina se mantuvo mediante DMDCC hasta 30 días después de la fusión. La secreción de citocinas por DMDCC se confirmó mediante ensayo ELISA.

En estudiosin vivo, se evaluó el injerto de hMDCC administrado localmente en el modelo de ratón mdx/scid. Se ensayaron cinco grupos de ratones (Tabla 5). Los dos primeros grupos incluyeron MDCC de origen mioblasto/mioblasto o MSC/mioblasto (dosis 0,5 x 106) suministrada a través de múltiples inyecciones intramusculares siguiendo un molde estandarizado, al músculo gastrocnemio izquierdo de ratones mdx/scid. Los grupos de control incluyeron tratamiento con vehículo, tratamiento con mioblastos no fusionados (dosis 0,5 x 106), o tratamiento con MSC y mioblastos mixtos (dosis 0,5 x 106) mediante inyección intramuscular. Los resultados medidos incluyeron la función muscularin vivo, la expresión de distrofina en los músculos tratados, así como el injerto de MDCC en puntos temporales de 1 semana y 12 semanas.

La expresión de distrofina se usó como un marcador específico para hMDCC ya que se había confirmado que ambas estirpes de hMDCC expresaban distrofina. Después de 7 días tras la administración intramuscular local de hMDCC, se mostró el injerto exitoso de hMDCC. Es más, se observó un aumento local de la expresión de distrofina (12 %) tan pronto como 7 días después del trasplante en comparación con la falta de expresión de distrofina en controles mdx/scid. Así mismo, a los 90 días se observó un 17 % de expresión de distrofina.

TABLA 5

Otro conjunto de grupos experimentales (ratones mdx/scid tratados con vehículo y hMDCC y snj natural, n = 3) se ensayaron en ensayos de función motora, incluyendo mediciones de resistencia al agarre y un ensayo de colgado de alambre. Noventa días después del suministro de la terapia con hMDCC, los ratones que recibieron hMDCC mostraron una mejora (p = 0,037) de la fuerza de agarre y la tolerancia a la fatiga en el alambre (ratones mdx/scid, 50 gF; terapia con hMDCC, 85 gF a 90 gF). Se observó una mejora funcional en los grupos tratados con ambas estirpes de MDCC en comparación con los grupos tratados con vehículo hasta el día 42. Después de este punto temporal, solo la hMDCC de mioblastos/mioblastos mantuvo una fuerza muscular aumentada durante todo el periodo de seguimiento de 90 días. En comparación, los valores de fuerza de agarre volvieron a los niveles iniciales después de 42 días en ratones tratados con MSC / hMDCC de mioblastos. Los grupos de control de tratamiento celular no fusionado mostraron una mejora temporal de la función motora solo en los primeros 21 días.

Los músculos gastrocnemios recogidos 90 días después del suministro de hMDCC se analizaron en un ensayo de contractilidadex vivopara evaluar la fuerza muscular evocada por estimulación eléctrica. Los resultados mostraron que el músculo tratado con hMDCC de mioblastos/mioblastos (Figura 3A) tenía una contracción significativamente más fuerte (p = 0,04) incluso bajo tensión inducida (Figura 3B). Las mismas muestras de músculo se analizaron por microscopía confocal para detectar y cuantificar la expresión de distrofina a los 90 días después del tratamiento con hMDCC. En promedio, el 17 % de las células fueron positivas para la expresión de distrofina.

Actualmente, no existe una terapia eficaz para tratar la DMD, un trastorno neuromuscular, genético letal que afecta a 1 de cada 3500 niños recién nacidos. Se han intentado modalidades de tratamiento, tales como agentes moduladores del crecimiento, agentes moduladores de señales antiinflamatorios o de segundo mensajero, y dispositivos moleculares diseñados para omitir mutaciones en el gen de distrofina, sin embargo, estos enfoques no logran detener o revertir la progresión de la enfermedad. En comparación, la presente terapia de MDCC representa un enfoque de medicina regenerativa universal para aplicación local o sistémica en pacientes que padecen DMD. Además, en comparación con otras terapias basadas en células, las características únicas de las MDCC, creadas a través de la fusión exvivo, son la combinación y los efectos sinérgicos de las características complementarias de las células de origen miogénico y mesenquimatosas, tales como alta tasa de proliferación, capacidad de conversión miogénica, y secreción de citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento que facilitan la regeneración muscular. Asimismo, la preparación de MDCC no requiere manipulaciones genéticas o introducción de vectores virales en las células, por lo que es una terapia más segura. Es más, dado que la terapia con MDCC no es específica de gen/mutación, puede adaptarse y aplicarse a pacientes que padecen otros tipos de distrofias musculares que incluyen, p .ej.,distrofia de Becker.

Ejemplo 2: Preparaciónex vivode células quiméricas de distrofia muscular de Duchene de ratón (mDMDCC)

Se establecieron y se expandieron in vitro cultivos de mioblastos primarios snj y mdx (deficientes en distrofina) sanos, así como cultivos MSC de mdx. Se realizaron tres fusiones de mioblastos/MSC y mioblastos/mioblastos murinos con la técnica del polietilenglicol. La expresión de distrofina, así como la capacidad de diferenciación miogénica, se confirmaron antes y después de la fusión.

En estudiosin vivo(Tabla 6), la eficacia del injerto de DMDCC murina, la supervivencia y el restablecimiento de la expresión de distrofina y las funciones motoras se ensayaron 30 días después del suministro local de mDMDCC al músculo gastrocnemio. De los cinco grupos ensayados, se administró mDMDCC compuesto por origen de mioblasto/mioblasto y MSC/mioblasto (dosis 0,5 x 106) a través de múltiples inyecciones intramusculares siguiendo un molde estandarizado, al músculo gastrocnemio izquierdo de ratones mdx. Los grupos de control incluyeron tratamiento con vehículo, tratamiento con mioblastos no condensados y tratamiento con MSC y mioblastos mixtos. Las mediciones de los resultados incluyeron la función muscularin vivo,la expresión de distrofina en los músculos tratados, así como el injerto de mDMDCC, que se evaluaron después de 4 semanas. Después del suministro de mDMDCC de mioblastos/mioblastos, las células que expresan distrofina constituyeron el 37 % de las células nucleadas totales en el análisis de inmunofluorescencia por microscopio confocal. El músculo tratado con mDMDCC de mioblastos/mioblastos mostró áreas positivas y negativas para distrofina. Las células positivas para distrofina se caracterizaron por la expresión de distrofina en la membrana (patrón normal) así como la expresión citoplásmica.

TABLA 6

Curiosamente, los músculos tratados con mDMDCC mostraron un peso muscular disminuido en comparación con los músculos contralaterales no tratados. El peso inferior del músculo tratado puede explicarse por la disminución de la hipertrofia y la fibrosis relacionadas con DMD. A pesar del peso muscular reducido, las mediciones de fuerza muscular, evocadas con estimulación eléctricain situ,dieron como resultado valores aumentados de fuerza muscularin vivo(Figuras 4A y 4B) así comoex vivo(Figuras 5A y 5B).

La función motorain vivoevaluada mediante ensayos de resistencia al agarre y colgamiento de alambre también confirmó la eficacia de mDMDCC con resistencia al agarre incrementada y tiempo prolongado para resistir la fatiga. Los músculos tratados con mDMDCC de mioblastos/mioblastos mantuvieron valores de fuerza más altos que los músculos tratados con MDCC de mioblastos/MSC, que no difirieron de los valores de los músculos de control 30 días después del suministro de la terapia. El tratamiento con mDMDCC derivado de mioblastos dio como resultado una mayor tolerancia a la fatiga, mostrada por un mayor tiempo de suspensión en el alambre en comparación con los animales de control.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una célula quimérica para tratar una distrofia muscular, comprendiendo el método incubaciónex vivo.

(a) un primer mioblasto; y

(b) un segundo mioblasto, o célula madre mesenquimatosa;

con un agente fusogénico para generar la célula quimérica,

en donde el segundo mioblasto, o la célula madre mesenquimatosa es de un donante sano y el primer mioblasto es de un sujeto que padece distrofia muscular.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula quimérica se caracteriza por la expresión de distrofina y/o potencial de diferenciación miogénica.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente fusogénico es polietilenglicol.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el donante sano es el padre del sujeto.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células madre mesenquimatosas derivan de médula ósea o tejido adiposo.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha célula quimérica secreta una o más citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento.

7. El método de la reivindicación 6, en donde una o más citocinas inmunomoduladoras y factores de crecimiento comprenden factor de crecimiento similar a insulina 1, factor de crecimiento de hepatocitos y miostatina.

8. La composición que comprende una célula quimérica preparada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Una célula quimérica preparada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un método de tratamiento de una distrofia muscular, comprendiendo el uso administrar al sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad eficaz de la célula quimérica, tratando así la distrofia muscular del sujeto.

10. La célula quimérica para su uso de la reivindicación 9, en donde la distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne.

11. La célula quimérica para su uso de la reivindicación 9, en donde dicha célula quimérica se administra mediante inyección intravenosa, inyección intraósea o inyección intramuscular.