KR20230143141A - 캡슐화된 rna 폴리뉴클레오타이드 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20230143141A
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로레나 레르너
에드워드 엠. 케네디
크리스토프 쿠에바
제시카 데터링
제프리 데이비드 브라이언트
치-잉 후
투바 에이. 치마
션 에섹스
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온코루스, 인크.
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Abstract

본 개시는 종양 용해성 바이러스 게놈을 코딩하는 재조합 RNA 분자에 관한 것이다. 본 개시는 또한 암의 치료 및 예방을 위한 재조합 RNA 분자의 캡슐화 및 재조합 RNA 분자 및/또는 입자의 사용에 관한 것이다.

Description

캡슐화된 RNA 폴리뉴클레오타이드 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 6일자로 출원된 미국 가출원 제63/134,376호, 2021년 2월 10일자로 출원된 미국 가출원 제63/147,959호, 2021년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제63/181,899호, 2021년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제63/181,917호, 및 2021년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제63/181,663호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 통합
본 출원에 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본원에서 참고로 포함된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 사본(파일명: ONCR_023_03WO_SeqList_ST25.txt, 생성일: 2022년 1월 6일, 파일 크기: 약 524 킬로바이트).
기술분야
본 개시는 일반적으로 면역학, 염증 치료 및 암 치료의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 종양 용해성 바이러스 균주, 바이러스 게놈 발현을 위한 재조합 DNA 분자의 설계, 및 입자-캡슐화된 바이러스 게놈에 관한 것이다. 본 개시는 또한 암과 같은 증식성 장애의 치료 및 예방에 관한 것이다.
종양 용해성 바이러스는 종양 세포를 감염시키고 용해시킬 수 있는 용해 수명 주기를 갖는 복제 가능 바이러스(replication-competent virus)이다. 직접적인 종양 세포 용해는 세포 사멸뿐만 아니라 국소 항원 제시 세포에 의해 흡수되고 제시된 종양 항원에 대한 선천적 적응 면역 반응의 생성을 초래한다. 따라서, 종양 용해성 바이러스는 직접적인 세포 용해 및 바이러스 제거 후 항종양 반응을 유지할 수 있는 항원 특이적 적응 반응을 촉진함으로써 종양 세포 성장에 대항한다.
그러나, 복제 가능 바이러스의 임상적 사용에는 몇 가지 문제가 있다. 일반적으로, 바이러스 노출은 선천적 면역 경로를 활성화하여 광범위하고 비특이적인 염증 반응을 일으킨다. 환자가 이전에 바이러스에 노출된 적이 없는 경우, 이러한 초기 선천적 면역 반응은 적응형 항바이러스 반응의 발달 및 중화 항체의 생성을 유발할 수 있다. 환자가 이전에 바이러스에 노출된 적이 있는 경우, 기존의 중화 항바이러스 항체는 원하는 용해 효과를 방해할 수 있다. 두 경우 모두, 중화 항체의 존재는 표적 세포의 바이러스 용해를 방해할 뿐만 아니라 바이러스 치료제의 재투여를 비효율적으로 만든다. 이러한 요인은 전이성 암의 치료 시에 바이러스 치료제의 사용을 제한하는데, 이는 이러한 암의 치료에 필요한 반복적인 전신 투여의 효능이 자연적으로 발생하는 항바이러스 반응에 의해 방해를 받기 때문이다. 이러한 장애물이 없는 경우에 조차도, 질병이 없는 세포에서의 후속 바이러스 복제는 주변 세포와 조직에 대해 상당한 질병 외 부수적 손상을 초래할 수 있다. 또한, 종양 용해성 바이러스의 다양한 균주는 전형적으로는 암 세포를 죽이는 방향성 및 효능이 상당히 다르다.
복제 가능 바이러스의 치료적 사용, 바이러스 및 상응하는 발현 템플레이트의 조작, 및 상이한 치료 적응증(therapeutic indication)을 위한 적절한 바이러스 균주의 선택과 관련된 조성물 및 방법에 대한 당업계에서 오랫동안 느껴온 미충족 요구가 남아 있다. 본 개시는 이러한 조성물 및 방법 등을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 종양 용해성 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 콕사키바이러스는 EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인 지질 나노입자(LNP: lipid nanoparticle)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이며, 이러한 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 이러한 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
일 양태에서, 본 개시는 종양 용해성 콕사키바이러스 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 콕사키바이러스는 CVA21 Kuykendall 균주인 지질 나노입자(LNP)를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 종양 용해성 세네카 밸리 바이러스(SVV: Seneca Valley Virus)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 S177A 돌연변이를 포함하는 SVV VP2 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, LNP가 세포로 전달되면 세포에 의해 바이러스 입자가 생성되며, 이러한 바이러스 입자는 감염성 및 용균성이다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 두 번째 재조합 RNA 분자를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 니트로환원효소는 NfsB 또는 NfsA이다. 일부 실시형태에서, 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드이다. 일부 실시형태에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 수용체는 PD-1이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인 바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM이다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 재조합 RNA 분자는 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 이러한 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다.일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142, 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 이하를 포함한다:
a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (I)
상기 식에서,
A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
일부 실시형태에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 (I-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (I-a)
상기 식에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
일부 실시형태에서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 상기 헬퍼 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (A")
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다.
일부 실시형태에서, LP1"은 결합이다. 일부 실시형태에서, RP2"는 수소이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (B)
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K) 으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하며, PEG-지질은 DPG-PEG2000을 포함한다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하며, PEG-지질은 하기 화학식 (A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
,
화학식 (A")
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1"은 결합이고;
RP1"은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2"는 수소이고,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 BRIJTM S100, BRIJTM S20, BRIJTM O20 및 BRIJTM C20로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 BRIJTM S100이다.
일부 실시형태에서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
e. A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0.01%-3%;
f. A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30%, 및 D = 0.01%-1%; 또는
g. A = 약 49%, B = 약 22%, C = 약 28%, 및 D = 약 0.5%이다.
일부 실시형태에서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
h. A = 40% - 60%, B = 10% - 30%, C = 20% - 45%, 및 D = 0% - 3%;
i. A = 40% - 60%, B = 10% - 30%, C = 25% - 45%, 및 D = 0.01% - 3%;
j. A = 45% - 55%, B = 10% - 20%, C = 30% - 40%, 및 D = 1% - 2%;
k. A = 45% - 50%, B = 10% - 15%, C = 35% - 40%, 및 D = 1% - 2%; 또는
l. A = 약 49%, B = 약 11%, C = 약 38%, 및 D = 약 1.5%이다.
일부 실시형태에서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
m. A = 45% - 65%, B = 5% - 20%, C = 20% - 45%, 및 D = 0% - 3%;
n. A = 50% - 60%, B = 5% - 15%, C = 30% - 45%, 및 D = 0.01% - 3%;
o. A = 55% - 60%, B = 5% - 15%, C = 30% - 40%, 및 D = 1% - 2%;
p. A = 55% - 60%, B = 5% - 10%, C = 30% - 35%, 및 D = 1% - 2%; 또는
q. A = 약 58%, B = 약 7%, C = 약 33%, 및 D = 약 1.5%이다.
일 양태에서, 본 개시는:
a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 PEG-지질은 하기 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다:
,
화학식 (A")
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일 양태에서, 본 개시는:
a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 PEG-지질은 하기 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다:
,
화학식 (A")
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, R1은 C16-C18 알킬 또는 C16-C18 알케닐이다.일부 실시형태에서, LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다. 일부 실시형태에서, LP1"은 결합이다. 일부 실시형태에서, RP2"는 수소이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A"-f1), 화학식 (A"-f2) 또는 화학식 (A"-f3)의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염이다:
일 양태에서, 본 개시는:
a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 PEG-지질은 하기 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다:
,
화학식 (B)
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일 양태에서, 본 개시는:
a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 PEG-지질은 하기 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다:
,
화학식 (B)
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며,
여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다. 일부 실시형태에서, R1은 C15-C17 알킬 또는 C15-C17 알케닐이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (B-a) 또는 화학식 (B-b)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
일부 실시형태에서, n은 평균 약 20, 약 40, 약 50, 또는 약 100이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 100이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 약 200 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 500 달톤 내지 약 7,000 달톤, 또는 약 800 달톤 내지 약 6,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 가능 지질이 결여된 대조군 LNP와 비교하여 감소된 생체내 면역 반응을 유도하고, 임의 선택적으로, 상기 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2K-DPG 또는 PEG2K-DMG이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 LNP의 가속 혈액 통과(ABC: accelerated blood clearance) 및/또는 항-PEG IgM 반응이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (I)
상기 식에서,
A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
일부 실시형태에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 (I-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (I-a)
상기 식에서,
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
일부 실시형태에서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 (II-1a)의 화합물:
또는 하기 화학식(II-2a)의 화합물이다:
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 구조 지질은 콜레스테롤이고, 헬퍼 지질은 DSPC이고, PEG-지질은 BRIJTM S100이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 구조 지질은 콜레스테롤이고, 헬퍼 지질은 DSPC이고, PEG-지질은 MYRJ™ S100, MYRJ™ S50 또는 MYRJ™ S40이다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 0.1% 내지 약 2% PEG-지질, 예를 들어 약 0.2% 내지 약 0.8 몰%, 약 0.4% 내지 약 0.6 몰%, 약 0.7% 내지 약 1.3%, 또는 약 1.2% 내지 약 1.8% PEG-지질의 몰비를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0.2% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.5% PEG-지질의 몰비를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 1.2% 내지 약 1.8%, 또는 약 1.5% PEG-지질의 몰비를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 44% 내지 약 54% 양이온성 지질, 약 19% 내지 약 25% 헬퍼 지질, 약 24% 내지 약 33% 구조 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질의 몰비는 49:28.5:22:0.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질의 몰비는 49:27.5:22:1.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질의 몰비는 49:38.5:11:1.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 1 내지 약 25의 지질-질소 대 인산염(N:P) 비율을 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 14의 N:P 비율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 히알루로난은 LNP의 표면에 접합된다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 복수의 지질 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 또는 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 5mV 미만, 약 0mV 미만, 약 -5mV 미만, 약 -10mV 미만, 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하면 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 대상체의 표적 세포에 전달하며, 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드는 대상체의 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 종양 용해성 바이러스를 생산한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암세포이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 화학식(A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 가능 지질이 결여된 조성물보다도 긴 생체내 치료 효과의 지속 기간을 갖는다.일부 실시형태에서, 조성물은 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 3시간 이상, 약 4시간 이상, 약 5시간 이상, 약 6시간 이상, 약 7시간 이상, 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 12시간 이상, 약 14시간 이상, 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 20시간 이상, 약 25시간 이상, 약 30시간 이상, 약 35시간 이상, 약 40시간 이상, 약 45시간 이상 또는 약 50시간 이상의 생체내 치료 효과의 지속 기간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 소정의 역치 값(threshold value) 이상의 반감기 및/또는 생체내 AUC를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP에 의한 합성 RNA 바이러스 게놈의 캡슐화 효율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM 또는 약 50mM의 총 지질 농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6의 pH에서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 복수회 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 후속 투여는 최초 투여로부터 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 14일, 또는 적어도 21일 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 종양 용해성 콕사키바이러스 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 콕사키바이러스는 EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인 재조합 RNA 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이고, 상기 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 이러한 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 야생형 콕사키바이러스 바이러스와 100% 서열 동일성을 갖는 RNA 바이러스 게놈을 포함하지 않는다.
일 양태에서, 본 개시는 종양 용해성 콕사키바이러스 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 콕사키바이러스는 CVA21 Kuykendall 균주인 재조합 RNA 분자를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 SVV는 키메라 SVV를 포함하고, 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 삽입된 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포내에서 코딩된 바이러스의 복제를 저해한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142, 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 이하를 포함한다:
a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 비바이러스 전달 매체에 의해 세포에 도입되면 복제 가능 종양 용해성 바이러스를 생성할 수 있다.일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다.일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 대상체 내에 존재하는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF), 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장된다. 일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 핵산 벡터에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 핵산 벡터는 레플리콘이다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 니트로환원효소는 NfsB 또는 NfsA이다. 일부 실시형태에서, 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드이다. 일부 실시형태에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다.일부 실시형태에서, 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 수용체는 PD-1이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인 바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM이다.
일 양태에서, 본 개시는 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는 재조합 DNA 템플레이트를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 본 개시의 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 프로모터 서열과 상기 5' 접합 절단 서열 사이에 리더 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 리더 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 100 bp 미만의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 약 50-90 bp 길이 또는 약 65-75 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 약 70 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 약 10-50 bp, 또는 25-35 bp 길이이다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 3' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열이고, 3' 리보자임 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 서열이다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 RNAseH 프라이머 결합 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열, 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 3' 접합 절단 서열은 IIS형 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, RNA 분자는 콕사키바이러스(CVA)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21 균주이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 14 또는 15에 따른 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTT"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 17에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, RNA 분자는 세네카 밸리 바이러스(SVV)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 53-63 중 어느 하나에 따른 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 58에 따른 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 리보자임 서열은 서열번호: 64 또는 65에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열이고, 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TCAA" 또는 "TTAA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 리더 서열은 서열번호: 53에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70 bp이고, 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 리더 서열은 서열번호: 58에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70 bp이고, 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 프로모터 서열과 3' 접합 절단 서열에 걸쳐 있는 영역 내에 추가의 핵산을 포함하지 않는다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 DNA 분자의 시험관내 전사, 및 얻어진 재조합 RNA 분자의 정제를 포함하는 재조합 RNA 분자의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 종양 용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 말단을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 유효량의 개시내용의 재조합 RNA 분자, 및 포유동물 대상체에게 투여하기에 적합한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 입자는 생분해성이다. 일부 실시형태에서, 입자는 나노입자, 엑소좀, 리포좀 및 리포플렉스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 무손상 엑소좀 또는 빈 엑소좀으로부터 유래된 변형 엑소좀이다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 복수의 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 또는 약 120 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 100 nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 5mV 미만, 약 0mV 미만, 약 -5mV 미만, 약 -10mV 미만, 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 실시형태에서, 조성물을 대상체에게 전달하면 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포에 전달하며, 캡슐화된 재조합 RNA 분자는 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 바이러스를 생성한다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 재조합 RNA 분자를 포함하는 무기 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 무기 입자는 금 나노입자(GNP), 금 나노로드(GNR), 자성 나노입자(MNP), 자성 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소 풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 메조다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT) 또는 별 모양의 중공 실리카 나노입자(SHNP)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 입자의 평균 직경은 약 500 nm 미만, 약 50 nm 내지 500 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm이다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 LNP, 개시내용의 입자, 또는 개시내용의 무기 입자는 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 재조합 RNA 분자는 레플리콘이다.
일 양태에서, 본 개시는 개시내용의 LNP, 개시내용의 입자, 또는 개시내용의 무기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암세포이다.
일 양태에서, 본 개시는 암세포의 사멸 방법으로서, 상기 암성 세포에 입자의 세포내 전달에 충분한 조건 하에서, 상기 암성 세포를 개시내용의 입자, 개시내용의 재조합 RNA 분자, 또는 이의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 캡슐화된 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 복제 가능 바이러스는 암성 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 복제 가능 바이러스는 비-암성 세포에서는 생성되지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
일 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체에게, 유효량의 개시내용의 입자, 개시내용의 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입자 또는 이의 조성물은 정맥내, 비강내, 종양내, 복강내로 또는 흡입제로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 입자 또는 이의 조성물은 종양내 및/또는 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 입자 또는 이의 조성물은 대상체에게 반복적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류 또는 인간이다.
일부 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 결장암 또는 췌장암이며, 여기서 합성 RNA 바이러스 게놈은 KY 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 또는 간암이며, 여기서 합성 RNA 바이러스 게놈은 EF 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 정소암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 신세포암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경아교종, 교모세포종, 흑색종, B세포 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 의미 불명의 단클론성 감마병증(MGUS), 메르켈 세포 암종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암, 및 변연부 림프종(MZL)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신세포암, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 신세포암, 폐암 또는 간암이다. 일부 실시형태에서, 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종)이다. 일부 실시형태에서, 간암은 간세포 암(HCC)(예를 들어, B형 간염 바이러스 관련 HCC)이다. 일부 실시형태에서, 전립선암은 치료중 유발된 신경내분비 전립선암이다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암, 간암, 전립선암(예를 들어, CRPC-NE), 방광암, 췌장암, 대장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신세포암, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포암 또는 흑색종이다. 일부 실시형태에서, 암은 소세포 폐암(SCLC) 또는 신경모세포종이다.
일 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-EF 바이러스를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-KY 바이러스를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-Kuykendall 바이러스를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 바이러스는 종양내 및/또는 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 방법은 조작된 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 종양 용해성 콕사키바이러스 (여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주임), 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 암은 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 기준으로 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 이하의 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 콕사키바이러스 21(CVA21) 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 경우 치료적 유효량의 CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계.
일 양태에서, 본 개시는 이하의 단계를 포함하는, 콕사키바이러스 21(CVA21) 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치료하기 위해 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 방법을 제공한다:
(a) ICAM-1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류하는 단계;
(c) (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 경우 CVA21 또는 상기 CVA21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 치료할 대상을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 대상체에게 CVA21 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계.
일부 실시형태에서, CVA21 균주는 CVA21-KY이다.
도 1은 리포펙타민으로 제형화된 PBS 또는 CVA21-RNA 분자의 종양내 투여 또는 CVA21-Kuykendall 균주 RNA 분자(제형 ID: 70032-6C)를 포함하는 LNP의 정맥내 투여 후 SK-MEL-28 종양 보유 마우스의 종양 부피를 보여준다.
도 2a는 3' 유형 IIS 제한 효소 인식 부위를 사용하여 피코나바이러스에 대한 정통 3' 말단(authentic 3' terminus)을 생성하기 위한 시험관 내 전사 접근법의 개요를 보여준다. 도 2b는 BsmBI 또는 BsaI 제한 효소에 의한 DNA 분해의 전기영동을 보여준다.
도 3은 5' DNA 프라이머 및 RNaseH 효소를 사용하여 피코나바이러스에 대한 정통 5' 말단을 생성하기 위한 RNaseH 접근법을 보여준다.
도 4는 피코나바이러스에 대한 정통 5' 말단을 생성하기 위한 리보자임 접근법을 보여준다.
도 5a - 도 5b는 별개의 5' 말단을 생성하기 위한 해머헤드 리보자임을 보여준다. 도 5a는 화살표의 5' 말단에서 어닐링 및 절단되는 최소 해머헤드 리보자임(HHR)의 구조 모델을 보여준다(서열 번호: 75). 도 5b는 화살표의 5' 말단의 절단을 위한 안정화된 줄기 I(STBL)을 갖는 리보자임의 구조 모델을 보여준다(서열 번호: 76).
도 6a - 도 6c는 별개의 5' 말단을 생성하기 위한 피스톨 리보자임을 보여준다. 도 6a는 야생형 피스톨 리보자임 특성의 개략도를 보여준다(서열 번호: 77). 도 6b는 mFOLD로 모델링한 P3 가닥을 융합하기 위해 테트라루프가 추가된 P. 폴리믹사(P. Polymyxa)의 피스톨 리보자임을 보여준다. 점선 상자는 바이러스 서열의 맥락에서 리보자임의 접힘을 유지하기 위해 돌연변이가 발생한 영역이다. 점선 상자에 표시된 "GUC" 서열은 "UCA"로 돌연변이되어 피스톨 1을 생성하였으며, "GUC" 서열은 "TTA"로 돌연변이되어 피스톨 2를 생성하였다(서열 번호: 78). 도 6c는 다중 피스톨 리보자임 변이체의 서열 정렬 및 P2 모티프의 위치를 보여준다.
도 7a - 도 7b는 RNA 폴리뉴클레오티드로부터 감염성 CVA21 바이러스의 생성을 보여준다. 도 7a는 RNA 폴리뉴클레오티드로부터 감염성 CVA21의 생성에 대한 5' UTR 서열의 효과를 보여준다. 도 7b는 서열번호 2의 5' UTR을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드로부터 감염성 CVA21의 생성을 보여준다.
도 8a - 도 8b는 CVA-LNP의 생체내 효과를 예시한다. 도 8a는 종양 측정치를 보여준다. 도 8b는 시간에 따른 체중 변화를 보여준다. 도 8c는 CVA21 감염으로 인한 H1299 세포 용해의 결과(왼쪽) 및 표시된 세포주에서 ICAM1 및 DAF의 Western 기반 발현 분석의 결과(오른쪽)를 보여준다. 도 8d는 CVA21-KY 감염에 대한 그들의 민감도/내성을 기준으로 130개의 인간 세포주에서의 평균 ICAM-1 mRNA 및 단백질 발현을 보여주는 차트이다. 도 8e는 ICAM-1 발현 및 CVA21-KY 감염에 대한 민감도 사이의 상관관계를 보여주는 다이어그램이다.
도 9는 LNP/피코나바이러스 RNA 조성 및 작용 방식의 도식적 표현을 보여준다. LNP/피코나바이러스 RNA는 전신 투여되고, 피코나바이러스 RNA 게놈은 허용 종양 세포로 전달되어 피코나바이러스 비리온을 복제하고 생성한다. 이어서, 피코나바이러스 감염은 종양 용해 및 항바이러스 면역 반응을 유도하는 이웃 종양 세포로 확산된다.
도 10은 CVA21-RNA 및 Neg-RNA에 대한 시험관 내 전사 과정을 보여준다. 5' 및 3' 리보자임(Rib)에 의한 CVA21-RNA의 자가촉매 절단으로 복제에 필요한 별개의 5' 및 3' 말단을 갖는 CVA21-RNA가 생성되었다. 대조적으로, Neg-RNA 구조는 리보자임 서열이 결핍되고 복제 및 비리온 생성이 불가능하였다.
도 11a는 바이러스의 고유 5' 및 3' 이산 말단을 유지하기 위해 접합 절단 서열을 사용하여 게놈 전사체로부터 비-바이러스성 RNA 폴리뉴클레오티드를 제거하는 일반적인 개략도를 보여준다. 도 11b는 바이러스의 고유 5' 및 3' 이산 말단을 유지하기 위해 접합 절단 서열을 사용하여 게놈 전사체로부터 비-바이러스성 RNA 폴리뉴클레오티드를 제거하는 일반적인 개략도를 보여주는 것으로, 여기서 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
도 12a - 도 12b는 3개의 CVA21 균주에 대한 세포독성 검사로부터 얻은 AUC(도 12a) 및 각각의 개별 세포 15주에 대한 그들의 상대적인 IC50 값(도 12b)의 요약 다이어그램을 보여준다.
도 13은 다양한 암 유형에서 각각의 개별 세포주에 대한 3개의 CVA21 균주의 IC50 값을 보여준다.
도 14는 폐암 및 NSCLC 암 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다.
도 15a - 도 15c는 유방(도 15a), 결장/GI(도 15b) 및 췌장암(도 15c) 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다.
도 16a는 면역조직화학을 통한 인간 폐암 마이크로어레이에서의 ICAM-1 발현을 보여준다. 이는 ICAM-1 양성 및 H-점수인 종양 세포의 백분율을 포함한다(공식에는 +1, +2, +3 ICAM-1 강도 수준을 나타내는 세포의 백분율을 포함함). 도 16b는 다양한 폐 선암종 암 세포주에 대한 EF 및 KY 균주의 종양 용해 효율을 보여준다. 도 16c는 다양한 대세포 폐암 세포주에 대한 EF 및 KY 균주의 종양 용해 효율을 보여준다.
도 17a - 도 17e는 방광(도 17a), 신장(도 17b), 간(도 17c), 난소(도 17d), 및 GBM(도 17e) 암 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다.
도 18a는 유방암 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다. 도 18b는 신장 세포 암종 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다. 도 18c는 간세포 암종 세포주를 사용하여 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로서 플롯팅한 결과를 보여준다.
도 19는 TCID50 값을 기준으로 KY 및 EF 균주에 대한 세포주 민감도를 요약한 표이다.
도 20a 및 도 20b는 감염 후 24시간 및 72시간 시점에 3명의 공여자로부터의 인간 해리된 종양 세포에서 KY 및 EF 균주의 카피수를 플롯팅한 다이어그램을 보여준다.
도 21은 NCI-H1299 이종이식 모델 및 계산된 TGI 백분율에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 22는 NCI-H2122 이종이식 모델 및 계산된 TGI 백분율에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 23은 PC3 이종이식 모델 및 계산된 TGI 백분율에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 24는 지시된 치료를 받은 동물의 시간 경과에 따른 체중 변화(상부 패널) 및 간 화학 변화(하부 패널)를 보여준다.
도 25a - 도 25c는 지시된 바이러스 게놈을 포함하는 LNP로 처리된 동물의 다양한 조직에서 RT-qPCR에 기초한 CVA21 가닥 RNA의 카피수를 보여준다. 도 25a는 처리 후 48시간 후의 CVA21 (-) 가닥 RNA의 카피수를 보여준다. 도 25b는 처리 후 7일 후의 CVA21 (-) 가닥 RNA의 카피수를 보여준다. 도 25c는 감염 후 48시간 또는 7일 후의 지시된 바이러스 게놈을 포함하는 LNP로 처리된 동물의 다양한 조직에서 RT-qPCR에 기초한 CVA21(+) 가닥 RNA의 카피수를 플롯팅한 다이어그램을 보여준다.
도 26은 지시된 조직에서 추출한 샘플의 바이러스 플라크 분석의 결과를 보여준다.
도 27a - 도 27c는 지시된 바이러스 균주로 감염되기 전에 증가하는 양의 IFN으로 전처리된 지시된 세포주의 세포 생존률을 보여준다. 생존 세포의 상대적인 백분율을 계산하기 위해, 모의 감염 그룹에 따라 100% 값을 설정하고, IFN 전처리를 하지 않은 CVA21 바이러스 감염 군에 따라 0% 값을 설정한다. 도 27a는 H1299 세포주에 대한 결과를 보여준다. 도 27b는 H2122 세포주에 대한 결과를 보여준다. 도 27c는 HFF 세포주에 대한 결과를 보여준다.
도 28a는 지시된 바이러스 균주의 상대적인 리바비린 내성 빈도 비율(relative Ribavirin resistance frequency ratio)을 보여준다. 도 28b는 지시된 분석 그룹으로부터 회수된 재조합된 생존 바이러스의 양을 보여준다.
도 29a는 리더 서열 및 5' 리보자임 서열 분석을 위한 템플레이트 구조의 디자인을 보여준다. 도 29b는 상이한 리더 서열 디자인에 기초한 지시된 시험관내 전사 생성물의 겔 전기영동 결과를 보여준다.
도 30은 상이한 5' 리보자임 디자인에 기초한 지시된 시험관내 전사 생성물의 겔 전기영동 결과를 보여준다.
도 31a는 NCI-H1299 이종 이식 모델을 사용하여 상이한 디자인(예를 들어, 다양한 폴리-A 꼬리 길이 및 5' 리보자임 서열)을 갖는 DNA 템플레이트의 시험관내 전사로부터 얻은 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 플롯팅한 다이어그램이다. 도 31b는 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 플롯팅한 다이어그램을 보여준다.
도 32는 3개의 CVA21 균주(EF, KY 및 Kuykendall)의 RNA 바이러스 게놈의 도메인 구성 도식과 선택 영역의 핵산 시작/종료 위치를 보여준다.
도 33은 5' 및 3'에 정밀 말단을 갖는 합성 RNA 바이러스 게놈을 생성하기 위한 CVA21 발현 구조 디자인 및 상응하는 시험관내 전사 과정의 비제한적인 예의 개략도를 보여준다.
도 34는 SVV 바이러스 게놈의 도메인 조직 및 키메라 바이러스의 구성을 보여주는 개략도이다.
도 35는 GFP 리포터 유전자를 보유하는 SVV-001 또는 SVV-IRES 키메라 바이러스로 감염된 NCI-H69AR 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 36은 IFNα 전처리 유무에 관계없이 지시된 SVV 비리온으로 감염된 NCI-H69AR 및 NCI-H69 세포의 형광 강도를 플로팅한 다이어그램(왼쪽) 및 감염 후 12시간 후의 대표적인 형광 이미지(오른쪽)를 보여준다.
도 37은 GFP 리포터 유전자를 보유하는 SVV-001 또는 SVV-P1 키메라 바이러스로 감염된 NCI-H69AR 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 38a 및 도 38b는 GFP 리포터 유전자를 보유하는 SVV-001 또는 SVV-P3 키메라 바이러스로 감염된 NCI-H69AR 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 39a는 SVV 템플레이트에 대한 리더 서열 및 5' 리보자임 서열 분석을 위한 템플레이트 구성 디자인을 예시한다. 도 39b는 SVV 템플레이트에 대한 상이한 리더 서열 디자인에 기초한 지시된 시험관내 전사 생성물의 겔 전기영동 결과를 보여준다. 도 39c는 H1299 세포를 사용한 바이러스 플라크 분석 결과를 보여준다. 도 39d는 상이한 SVV 리더 서열을 사용한 바이러스 게놈의 시험관내 전사 생성물의 RP-HPLC 분석을 보여준다.
도 40a - 도 40c는 H446 종양을 보유하는 흉선 없는 누드 마우스(athymic-nude mice)를 지시된 LNP로 치료된 생체내 용량 적정 효능 연구 결과를 보여준다. 도 40a는 시간 경과에 따른 종양 크기를 보여준다. 도 40b는 0.1 mg/kg의 96062-1 LNP로 치료된 마우스의 종양 조직에서 SVV 복제에 대한 RT-qPCR 측정치를 보여준다. 도 40c는 SVV 복제에 대한 FISH 검정을 보여준다.
도 41은 LNP로 치료된 H446 종양을 보유하는 마우스의 시간 경과에 따른 종양 크기를 보여준다.
도 42는 H446 SCLC 종양 모델에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 43은 H446 SCLC 종양 모델에 기초하여 항-SVV 중화 항체의 존재 또는 부재 하에 지시된 LNP 또는 SVV 비리온으로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 44는 H82 SCLC 종양 모델에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 45는 H82 SCLC 동소 종양 모델(orthotopic tumor model)에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간 경과에 따른 생존 확률을 보여준다.
도 46a는 hDLL3 IHC에 기초한 종양 부담의 정량적 분석을 보여주는 차트이다. 도 46b는 hDLL3 IHC 이미지를 보여준다.
도 47a 및 도 47b는 SCLC PDX 종양 모델의 SVV 치료 결과를 보여준다. 도 47a는 SCLC PDX 종양 모델에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다. 도 47b는 RT-qPCR 측정 결과를 보여준다.
도 48은 상이한 길이의 폴리-A 꼬리를 갖는 SVV RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 49a - 도 49g는 N1E-115 동계 신경모세포종(syngeneic neuroblastoma) 모델에서 SVV/LNP 및 항-PD1 병용 치료의 면역 세포 침윤 및 효과를 보여준다. 도 49a는 종양 mg당 NK, NKT, CD4, CD8 및 Treg 세포의 수를 보여준다. 도 49b는 CD8/Treg 비율을 보여준다. 도 49c는 CTLA-4 또는 PD-1을 발현하는 종양 mg당 CD8 T 세포의 수를 보여준다. 도 49d는 SLEC(CD127-KLRG1+) 또는 MPEC(CD127+-KLRG1-)인 종양 mg당 CD8 T 세포의 수를 보여준다. 도 49e는 M1/M2 대식세포의 비율을 보여준다. 도 49f는 M1 및 M2 대식세포의 수를 보여준다. 도 49g는 종양 mg당 CD45-PD-L1+ 세포의 수를 보여준다.
도 50은 N1E-115 동계 신경모세포종 모델에 기초하여 지시된 LNP로 치료된 동물에서 시간에 따른 종양 크기의 변화를 보여준다.
도 51은 N1E-115 동계 신경모세포종 모델을 보유하는 동물에서 SVV-LNP 및 항-PD1 요법의 병용 효과를 보여준다.
도 52a는 본 개시의 LNP 조성물의 반복 투여 시 종양의 성장을 보여주는 H446 마우스 종양 모델의 결과를 도시하는 차트이다. 도 52b는 LNP 조성물의 투여 시 H446 마우스 종양 모델의 체중 변화를 도시하는 차트이다.
도 53a 및 도 53b는 PEG-지질로서 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 또는 BRIJTM S100을 포함하는 LNP 조성물의 마우스에서의 PK 연구 결과를 도시하는 차트이다.
도 54a는 Oligo-dT 크로마토그래피를 사용한 다양한 폴리-A 꼬리 길이를 갖는 CVA21 바이러스 게놈의 UV A280 흡수 프로파일을 보여준다. 도 54b는 Oligo-dT 크로마토그래피를 사용한 다양한 폴리-A 꼬리 길이를 갖는 SVV 바이러스 게놈의 UV A280 흡수 프로파일을 보여준다.
도 55a - 도 55c는 CAT4 및 CAT5 LNP 조성물의 입자 특성을 예시한다. 도 55a는 입자 크기를 도시하며, 도 55b는 다양한 RNA 산성화 완충액으로 제조된 CAT4 및 CAT5 LNP 조성물의 동적 광 산란 실험에서 측정된 다분산도 지수를 도시한다. 도 55c는 RiboGreen에 의해 측정된 이러한 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 56a - 도 56c는 지시된 CAT 지질을 포함하는 LNP 조성물의 입자 특성을 도시한다. 도 56a는 입자 크기를 도시하며, 도 56b는 LNP 조성물의 동적 광 산란 실험에서 측정된 다분산도 지수를 도시한다. 도 56c는 RiboGreen에 의해 측정된 이러한 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 57은 LNP 제형에 대한 제형화 공정의 도식적 표현을 보여준다.
도 58a - 도 58f는 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다. 도 58a, 도 58b 및 도 58c는 각각의 LNP 제형의 투여 후 96시간 후에 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다. 도 58d, 도 58e 및 도 58f는 각각의 LNP 제형의 투여 후 72시간 후에 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다.
도 59a - 도 59e는 각각의 LNP 제형으로 치료된 마우스의 치료 일수에 따른 종양 부피(왼쪽) 및 체중 변화(오른쪽)를 도시한다. 도 59a는 CAT1, 2, 3, 4, 및 5 LNP 제형에 대한 결과를 보여준다. 도 59b는 CAT6, 7, 8, 9, 및 10 LNP 제형에 대한 결과를 보여준다. 도 59c는 CAT11, 12, 13, 14, 15, 16에 대한 결과를 보여준다. 도 59d는 CAT17, 19, 20, 25, 31, 및 7 LNP 제형에 대한 결과를 보여준다. 도 59e는 CAT18, 21, 22, 23, 26, 28, 29, 32, 34 LNP 제형에 대한 결과를 보여준다.
도 60a - 도 60b는 지시된 LNP 제형에 대한 생체내 RNA 수준 및 종양 부피 및 체중에 대한 효과를 보여준다. 도 60a는 각각의 LNP 제형의 투여 후 72시간 후에 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 생성된 발광에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다. 도 60b는 각각의 LNP 제형으로 치료된 마우스의 치료 일수에 따른 종양 부피(오른쪽) 및 체중 변화(왼쪽)를 도시한다.
도 61a-도 61d는 LC-MS에 의해 측정된 치료된 마우스의 혈장 내 LNP(SS-OC)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다. 도 61a는 Q1W2 투여 일정에 따른 OC/Brij에 대한 결과를 보여준다. 도 61b는 Q2W2 투여 일정에 따른 OC/Brij에 대한 결과를 보여준다. 도 61c는 Q2W2 투여 일정에 따른 OC/DMG에 대한 결과를 보여준다. 도 61d는 Q2W2 투여 일정에 따른 OC/DPG에 대한 결과를 보여준다.
도 62a - 도 61f는 LC-MS에 의해 측정된 치료된 마우스의 혈장 내 LNP(SS-OC 또는 CAT7)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다. 도 62a는 Q2W2 투여 일정에 따른 OC/Brij에 대한 결과를 보여준다. 도 62b는 Q2W2 투여 일정에 따른 CAT7/DMG_6에 대한 결과를 보여준다. 도 62c는 Q2W2 투여 일정에 따른 CAT7/DMG_3에 대한 결과를 보여준다. 도 62d는 Q2W2 투여 일정에 따른 CAT7/DMG_5에 대한 결과를 보여준다. 도 62e는 Q2W2 투여 일정에 따른 CAT7/DMG1_1에 대한 결과를 보여준다. 도 62f는 Q2W2 투여 일정에 따른 CAT7/CHM6_4에 대한 결과를 보여준다.
도 63a - 도 63e는 LC-MS에 의해 측정된 치료된 마우스의 혈장 내 LNP(SS-OC, CAT7, 또는 CAT11)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다. 도 63a는 CAT7/Brij에 대한 결과를 보여준다. 도 63b는 OC/DMG에 대한 결과를 보여준다. 도 63c는 CAT7/CHM6_4에 대한 결과를 보여준다. 도 63d는 CAT11/DMG에 대한 결과를 보여준다. 도 63e는 CAT11/Birj에 대한 결과를 보여준다.
도 64a 및 도 64b는 ELISA 검정에 의해 측정된 각각의 LNP 제형으로 치료된 마우스의 지시된 시점에서의 IgM 수준을 도시한다.
도 65a 및 도 65b는 ELISA 검정에 의해 측정된 각각의 LNP 제형으로 치료된 마우스의 지시된 시점에서의 IgG 수준을 도시한다.
도 66a 및 도 66b는 ECL 검정에 의해 측정된 mRNA BiTE(도 66a) 또는 hEPO(도 66b)의 혈장 수준을 도시한다.
도 67은 CAT7을 포함하는 LNP에 대한 스크리닝 실험의 A-최적 디자인을 도시한다.
도 68은 CAT7을 포함하는 LNP에 대한 실험 실시의 디자인에 기초하고 자가 검증된 앙상블 모델링 방법을 사용하여 모델링된 예측 프로파일러(profiler)를 보여준다.
당업계에서는 특정 암 유형에서 적절한 친화성 및 높은 효능을 갖는 특이적 종양 용해성 바이러스 균주를 선택하는 것이 필요하다. 같은 종에 속하는 바이러스라 하더라도, 바이러스 균주에 따라 암세포를 죽이는 효능과 독성의 양태에서 큰 차이가 있다. 키메라 바이러스는 하나의 바이러스 균주의 바이러스 게놈의 일부를 상이한 균주의 해당 부분으로 대체하여 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키메라 바이러스는 암세포를 죽이는 데 더 효과적일 수 있고/있거나 다른 유리한 특성을 가질 수 있다. 또한, 이러한 바이러스 또는 상응하는 바이러스 게놈을 포함하는 조성물을 제조하는 것은 벡터 템플레이트 디자인뿐만 아니라 제조 공정(예를 들어, 발현, 정제, 캡슐화 및 저장)의 최적화를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 시험관 내에서의 바이러스 발현을 위한 바이러스 게놈 및 템플레이트 벡터의 디자인을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 복제 능력이 있다. 본 개시는 또한 대상체에게 반복적으로 투여될 수 있는 지질 나노입자, 중합체 나노입자 또는 엑소좀과 같은 비면역원성 입자에 캡슐화될 수 있는 바이러스 게놈을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입자는 페이로드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 캡슐화한다. 따라서, 본 개시는 안전하고 효과적인 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터의 전신 전달을 가능하게 하고, 광범위한 증식성 장애(예를 들어, 암)를 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 구성 목적으로만 사용되는 것으로, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 전문 서적을 포함하되 이에 국한되지 않고 본원에서 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 어떤 목적으로든 그 전체가 명시적으로 본원에서 참고로 포함된다. 하나 이상의 통합된 문서 또는 문서의 일부가 출원서의 해당 용어의 정의와 모순되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원서에 나타나는 정의가 우선한다. 그러나, 본원에 인용된 참고 문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원에 대한 언급은 어떤 형태로든 전 세계 모든 국가에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 암시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
정의
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그의 분수(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "a" 및 "an"은, 달리 명시되지 않는 한, 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 모두, 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "복수"는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 하나 이상의 miRNA 표적 서열)를 지칭할 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 동등한 의미로 사용된다. 본 출원에서 약/대략과 함께 또는 없이 사용되는 임의의 숫자는 관련 기술 분야에서 당업자가 이해하는 임의의 정상적인 변동을 포괄하는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되거나 문맥상 명백하지 않은 한 명시된 기준 값의 어느 방향(보다 크거나 작은)으로든 10% 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(해당 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외). 일부 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되거나 문맥상 명백하지 않은 한 명시된 기준 값의 어느 방향(보다 크거나 작은)으로든 10% 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(해당 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
"감소하다(decrease)" 또는 "감소하다(reduce)"는 기준 값과 비교하였을 때 특정 값이 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 감소하는 것을 지칭한다. 특정 값의 감소(decrease 또는 reduction)는 또한 기준 값과 비교하였을 때의 값의 배수 변화로, 예를 들어, 기준 값과 비교하였을 때 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 이상 감소로 표시할 수도 있다.
"증가하다(Increase)"는 기준 값과 비교하였을 때 특정 값이 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 200, 300, 400, 500% 이상 증가하는 것을 지칭한다. 특정 값의 증가는 또한 기준 값과 비교하였을 때의 값의 배수 변화로, 예를 들어, 기준 값의 수준과 비교하였을 때 적어도 1배, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 이상 증가로 표시할 수도 있다.
용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 동일하고 동일한 상대적 위치에 있는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 이와 같이, 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는다. 서열 비교의 경우, 전형적으로는 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 용어 "참조 서열(reference sequence)"은 테스트 서열이 비교되는 분자를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 청구범위의 용어 "서열 동일성"은 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하여 Clustal Omega® 버전 1.2.4에 의해 계산된 서열 동일성을 지칭한다.
용어 "~로부터 유래된(derived from)"은 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 SVV 또는 CVA 게놈을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드는 참조 SVV 또는 CVA 게놈(예를 들어, 자연 발생 또는 변형된 SVV 또는 CVA 게놈)의 전부 또는 일부로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열"로부터 유래된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 또는 핵산 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 및/또는 삽입)를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"상보적"은 자연적으로 또는 비자연적으로 발생하는(예를 들어, 전술한 바와 같이 변형된) 염기(뉴클레오티드) 또는 이의 유사체를 포함하는 두 개의 서열 사이에서 염기 스태킹 및 특정 수소 결합을 통해 쌍을 이루는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 하나의 위치에 있는 염기가 표적의 상응하는 위치에 있는 염기와 수소 결합을 할 수 있는 경우, 해당 염기는 해당 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. 핵산은 수소 결합에 긍정적이거나 부정적인 기여를 제공하지 않는 보편적인 염기 또는 불활성 무염기 스페이서(abasic spacer)를 포함할 수 있다. 염기쌍은 표준적인 Watson-Crick 염기쌍과 비-Watson-Crick 염기쌍(예를 들어, Wobble 염기쌍 및 Hoogsteen 염기쌍)을 모두 포함할 수 있다. 상보적인 염기쌍의 경우, 아데노신형 염기(A)는 티미딘형 염기(T) 또는 우라실형 염기(U)에 상보적이고, 사이토신형 염기(C)는 구아노신형 염기(G)에 상보적이며, 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌과 같은 보편적인 염기는 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고 그에 상보적인 것으로 간주되는 것으로 이해된다(문헌[Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493 and Loakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043] 참조). 이노신(I)은 또한 당업계에서 보편적인 염기로 간주되어 왔으며, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적인 것으로 간주된다. 문헌[Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267]을 참조한다.
"발현 카세트" 또는 "발현 구조물"은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기술된 구성요소가 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "대상체(subject)"는, 예를 들어, 포유 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 영장류이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 소, 양, 염소, 소, 돼지 등과 같은 가축; 또는 개 또는 고양이와 같은 가축이다. 일부 실시형태(예를 들어, 특히 연구 맥락에서)에서, 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 쥐, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 근친교배 돼지와 같은 돼지 등이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"투여"는 본원에서 제제 또는 조성물을 대상체에게 도입하거나 조성물을 세포 및/또는 조직과 접촉시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료"는 대상체에게 제제 또는 조성물을 전달하여 생리학적 결과에 영향을 미치는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 (a) 질병을 억제하는 것, 즉, 질병 발병을 정지시키거나 질병 진행을 예방하는 것; (b) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병 상태의 퇴행을 일으키는 것; 및 (c) 질병을 치료하는 것을 포함하여 포유 동물, 예를 들어 인간에게서 질병을 치료하는 것을 지칭한다.
용어 "유효량"은 특정 생리학적 효과를 초래하는 데 필요한 제제 또는 조성물의 양(예를 들어, 특정 생리학적 효과를 증가, 활성화 및/또는 강화하는 데 필요한 양)을 지칭한다. 특정 제제의 유효량은 질량/부피, 세포 #/부피, 입자/부피, (제제의 질량)/(대상체의 질량), 세포 수/(대상체의 질량), 또는 입자/(대상체의 질량)과 같은 제제의 특성에 따라 다양한 방식으로 표시될 수 있다. 특정 제제의 유효량은 또한 최대 절반 유효 농도(half-maximal effective concentration)(EC50)으로 표현될 수도 있으며, 이는 기준 수준과 최대 반응 수준의 중간인 특정 생리학적 반응의 크기를 초래하는 제제의 농도를 지칭한다.
세포의 "집단"은 1보다 큰 임의의 수의 세포를 지칭하지만, 바람직하게는 적어도 1x103 세포, 적어도 1x104 세포, 적어도 1x105 세포, 적어도 1x106 세포, 적어도 1x107 세포, 적어도 1x108 세포, 적어도 1x109 세포, 적어도 1x1010 세포, 또는 그 이상의 세포를 지칭한다. 세포 집단은 시험관 내 집단(예를 들어, 배양 중인 세포 집단) 또는 생체 내 집단(예를 들어, 특정 조직에 상주하는 세포 집단)을 지칭할 수 있다.
"이펙터 기능(effector function)"은 표적 세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성, 유지, 및/또는 강화와 관련된 면역 세포의 기능을 지칭한다.
용어 "마이크로RNA", "miRNA" 및 "miR"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 표적 메신저 RNA(mRNA)에 분해 또는 번역 억제를 지시하여 유전자 발현을 조절하는 약 21-25개의 뉴클레오티드 길이의 작은 비-코딩 내인성 RNA를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조성물"은 대상체 또는 세포에 투여되거나 전달될 수 있는 본원에서 기술되는 재조합 RNA 분자 또는 입자-캡슐화된 재조합 RNA 분자의 제형을 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 문구는 본원에서는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 합리적인 이익/위험성 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 및/또는 가축에 사용하도록 허용되는 것으로 미국 식품의약국(FDA: Food and Drug Administration)에 의해 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 유동화제, 감미제, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미 강화제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제 및/또는 유화제를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
용어 "복제 가능 바이러스 게놈(replication-competent viral genome)"은 바이러스 복제 및 감염성 바이러스 입자의 생성에 필요한 모든 바이러스 유전자를 코딩하는 바이러스 게놈을 지칭한다.
용어 "종양 용해성 바이러스(oncolytic virus)"는 암세포를 우선적으로 감염시키거나 자연적으로 감염시키도록 변형된 바이러스를 지칭한다.
용어 "벡터"는 본원에서는 다른 핵산 분자를 전달, 코딩 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다.
아미노산 또는 핵산 위치(들)와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "상응하는(corresponding to)" 또는 "상응하다(correspond to)"는 제1 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 서열과 참조 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 서열이 정렬될 때 참조 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 서열에서 주어진 아미노산/핵산과 정렬되는 제1 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 서열의 위치(들)를 지칭한다. 정렬은 당업자가 이러한 목적을 위해 설계된 소프트웨어, 예를 들어, 해당 버전에 대한 디폴트 파라미터를 가진 Clustal Omega 버전 1.2.4를 사용하여 수행한다.
용어 "캡슐화 효율(encapsulation efficiency)" 또는 "EE%"는 LNP에 성공적으로 포획된 표적 분자(예를 들어, 합성 RNA 바이러스 게놈)의 백분율을 지칭한다. 캡슐화 효율은 아래 공식을 사용하여 계산할 수 있다:
(EE %) = (Wt/Wi) × 100 %
여기서, Wt는 LNP 현탁액에 포함된 약물의 총량이며, Wi는 제조 도중 초기에 첨가된 약물의 총량이다. 예시적인 예로서, 초기에 조성물에 제공되는 총 100 mg의 표적분자 중 97 mg의 표적분자가 LNP에 포집되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 나타낼 수 있다.
용어 "지질 질소 대 포스페이트 비율(lipid-nitrogen-to-phosphate ratio)" 또는 "(N:P)"는 지질 나노입자 내의 양하전 가능한 지질 아민기 대 핵산 포스페이트기의 비율을 지칭한다.
용어 "반감기"는 분자(예를 들어, 지질 나노입자에 캡슐화된 분자)의 약동학적 특성을 지칭한다. 반감기는 투여 후 대상체의 신체(예를 들어, 인간 환자 또는 기타 포유 동물) 또는 그의 특정 구획, 예를 들어, 혈청, 즉 순환 반감기 또는 기타 조직에서 측정되는 알려진 양의 생체 내 분자의 50 퍼센트(50%)를 생물학적 과정(예를 들어, 대사, 배설, 가속 혈액 통과(accelerated blood clearance) 등)을 통해 제거하는 데 필요한 시간으로 나타낼 수 있다. 일반적으로, 반감기가 증가하면 투여된 분자의 순환 시 평균 체류 시간(MRT: mean residence time)의 증가를 초래한다.
용어 "가속 혈액 통과(accelerated blood clearance)" 또는 "ABC"는 특정 약제학적 제제(예를 들어, PEG 함유 LNP)가 두 번째 투여 및 후속 투여 시 혈액에서 빠르게 제거되는 현상을 지칭한다. ABC는 리포솜 및 LNP를 포함한 많은 지질 전달 비히클에서 관찰되었다.
본원에서 사용되는 용어 "비율"은 지질 조성(예를 들어, 총 지질 함량의 백분율)과 관련하여 사용되는 경우, 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 몰비를 지칭한다. 총 지질 함량의 백분율로서의 몰비는 또한 "몰%"로 나타낼 수 있다. 예를 들어, "49:22:28.5:0.5 몰%"는 49:22:28.5:0.5의 몰비를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "지방족" 또는 "지방족 기"는 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄(즉, 분지되지 않은) 또는 분지된 치환 또는 비치환된 탄화수소 사슬, 또는 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만 방향족이 아니며(또한 본원에서는 "카보사이클", "지환족" 또는 "사이클로알킬"이라고도 함), 분자의 나머지 부분에 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 탄화수소 또는 비사이클릭 탄화수소를 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 지방족 기는 1-6개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 지방족 기는 1-5개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 실시형태에서, 지방족 기는 1-4개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 지방족 기는 1-3개의 지방족 탄소 원자를 함유하고, 또 다른 실시형태에서 지방족 기는 1-2개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, "지환족"(또는 "카보사이클" 또는 "사이클로알킬")은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만 방향족이 아니며, 분자의 나머지 부분에 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 C3-C6 탄화수소를 지칭한다. 적합한 지방족 기는 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐기 및 이들의 하이브리드, 예를 들어 (사이클로알킬)알킬, (사이클로알케닐)알킬 또는 (사이클로알킬)알케닐을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 특정 수의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 기이다. 일부 실시형태에서, 알킬은 3개의 탄소 원자(C3)를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 알킬은 6개의 탄소 원자(C6)를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸 및 헥실을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 2가 알킬기를 지칭한다. "알킬렌 사슬"은 폴리메틸렌기, 즉 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 2 내지 3이다. 치환된 알킬렌 사슬은 하나 이상의 메틸렌 수소 원자가 치환기로 대체된 폴리메틸렌기이다. 적합한 치환기는 치환된 지방족 기에 대해 아래에 기술된 것들을 포함한다.
단독으로 사용되거나 또는 "아르알킬", "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이 더 큰 모이어티의 일부로 사용되는 용어 "아릴"은 총 5 내지 14개의 고리 구성원을 갖는 모노사이클릭 및 비사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 시스템 중 적어도 하나의 고리는 방향족이고 시스템의 각각의 고리는 3 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시의 특정 실시형태에서, "아릴"은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있는 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라실 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 방향족 고리 시스템을 지칭한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "아릴"의 범위에는 방향족 고리가 하나 이상의 비방향족 고리에 융합된 기, 예를 들어 인다닐, 프탈이미딜, 나프티미딜, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로나프틸 등이 포함된다.
단독으로 사용되거나 더 큰 모이어티, 예를 들어 "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시"의 일부로 사용되는 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 5 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 5, 6 또는 9개의 고리 원자를 갖고; 사이클릭 배열에서 공유되는 6, 10 또는 14 π 전자를 가지며; 탄소 원자 외에, 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다. 용어 "헤테로원자"는 질소, 산소 또는 황을 지칭하며, 임의의 산화된 형태의 질소 또는 황, 및 임의의 4차화된 형태의 염기성 질소를 포함한다. 헤테로아릴기는 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 및 프테리디닐을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 지환족 또는 헤테로사이클릴 고리에 융합된 기를 포함하며, 여기서 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로방향족 고리 상에 있다. 비제한적인 예로는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐 및 피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-3(4H)-온을 포함한다. 헤테로아릴기는 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴기" 또는 "헤테로방향족"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이들 용어 중 임의의 것은 임의로 치환된 고리를 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴에 의해 치환된 알킬기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
용어 "할로지방족"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 지방족 기를 지칭한다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 선형 또는 분지형 알킬기를 지칭한다.
용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릭 라디칼" 및 "헤테로사이클릭 고리"는 상호교환적으로 사용되며, 포화되거나 부분적으로 불포화되고, 탄소 원자 외에 상기에서 정의된 바와 같은 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 안정한 5~7원 모노사이클릭 또는 7~10원 비사이클릭 헤테로사이클릭 모이어티를 지칭한다. 헤테로사이클의 고리 원자와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 예로서, 산소, 황 또는 질소로부터 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 고리에서, 질소는 N(3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서와 같이), NH(피롤리디닐에서와 같이), 또는 +NR(TV-치환 피롤리디닐에서와 같이)일 수 있다. 헤테로사이클릭 고리는 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자의 펜던트 기에 부착될 수 있으며, 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예로는 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴누클리디닐을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 고리", "헤테로사이클릭 기", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 또한 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 지환족 고리, 예를 들어 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로퀴놀리닐에 융합된 기를 포함하며, 여기서 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로사이클릴 고리 상에 있다. 헤테로사이클릴기는 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
헤테로사이클릭 고리는 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자의 펜던트 기에 부착될 수 있으며, 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예로는 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴누클리디닐을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 고리", "헤테로사이클릭 기", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 또한 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 지환족 고리, 예를 들어 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로퀴놀리닐에 융합된 기를 포함하며, 여기서 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로사이클릴 고리 상에 있다. 헤테로사이클릴기는 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 본 개시의 화합물은 "임의로 치환된" 모이어티를 함유할 수 있다. 일반적으로, 용어 "치환된"은, 용어 "임의로"가 앞에 나오는지의 여부에 관계 없이, 지정된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "임의로 치환된" 기는 그룹의 각각의 치환 가능한 위치에 적합한 치환기를 가질 수 있으며, 임의의 주어진 구조에서 하나 이상의 위치가 특정 기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시에 의해 구상되는 치환기의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 실현가능한 화합물의 형성을 초래하는 것들이다. 본원에서 사용되는 용어 "안정한"은 화합물의 생성, 검출 및, 특정 실시양태에서는, 그들의 회수, 정제 및 본원에서 개시되는 목적 중 하나 이상을 위해 사용할 수 있는 조건으로 처리될 경우에 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4Ro; -(CH2)0-4ORo; -O(CH2)0-4Ro*, -(CH2)0-4C(O)ORo; -(CH2)0-4CH(ORo)2; -(CH2)0-4SRo; -(CH2)0-4Ph(R°로 치환될 수 있음); -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph(R°로 치환될 수 있음); -CH=CHPh(R°로 치환될 수 있음); -(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜(R°로 치환될 수 있음); -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(Ro)2; -(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro; -N(Ro*)C(S)Ro; -(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2; -N(Ro)C(S)NRo 2; -(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo; -N(Ro)N(Ro)C(O)Ro; -N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2; -N(Ro)N(Ro)C(O)ORo; -(CH2)0-4C(O)Ro; -C(S)Ro; -(CH2)0-4C(O)ORo; -(CH2)0-4C(O)SRo; -(CH2)0-4C(O)OSiRo 3; -(CH2)0-4OC(O)Ro; -OC(O)(CH2)0-4SRo, SC(S)SRo; -(CH2)0-4SC(O)Ro; -(CH2)0-4C(O)NRo 2; -C(S)NRo 2; -C(S)SRo; -SC(S)SRo, -(CH2)0-4OC(O)NRo 2; -C(O)N(ORo)Ro; -C(O)C(O)Ro; -C(O)CH2C(O)R0; -C(NORo)Ro; -(CH2)0-4SSRo; -(CH2)0-4S(O)2Ro; -(CH2)0-4S(O)2ORo; -(CH2)0-4OS(O)2Ro; -S(O)2NRo 2; -(CH2)0-4S(O)Ro; -N(Ro)S(O)2NRo 2; -N(Ro)S(O)2Ro; -N(ORo)Ro; -C(NH)NRo 2; -P(O)2Ro; -P(O)Ro 2; -OP(O)Ro 2; -OP(O)(ORo)2; SiRo 3; -(C1-4 선형 또는 분지형 알킬렌)O-N(Ro)2; 또는 -(C1-4 선형 또는 분지형 알킬렌)C(O)O-N(*o)2이며, 여기서 각각의 R°는 아래에서 정의되는 바와 같이 치환될 수 있으며, 독립적으로 수소, C1-6지방족, -CH2Ph, ―O(CH2)0-1Ph, ―CH2-(5-6원 헤테로아릴 고리), 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리이거나, 또는, 위의 정의에도 불구하고, 독립적으로 발생하는 2개의 R°는 개재 원자(들)과 함께 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖고 아래에서 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 3-12원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 모노사이클릭 또는 비사이클릭 고리를 형성한다.
R° 상의 적합한 1가 치환기(또는 2개의 독립적으로 발생하는 R°와 개재 원자를 함께 취하여 형성된 고리)는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0-2CH(OR●)2; -O(할로R●), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR●, -(CH2)0-2SR●, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR●, -(C1-4 선형 또는 분지형 알킬렌)C(O)OR●, 또는 -SSR●이며, 여기서 각각의 R●은 비치환되거나 또는 "할로"가 선행하는 경우 하나 이상의 할로겐으로 치환되며, C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된다. R°의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환체는 =O 및 =S를 포함한다.
"임의로 치환된" 기의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 이하: =O, =S, =NNR*2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R*2))2-3O-, 또는 -S(C(R*2))2-3S-를 포함하며, 여기서 각각 독립적으로 발생하는 R*는 수소, 아래에서 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "임의로 치환된" 기의 인접한 치환 가능한 탄소에 결합된 적합한 2가 치환기는 -(CR*2)2-3O-를 포함하며, 여기서 각각 독립적으로 발생하는 R*는 수소, 아래에서 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 선택된다.
R*의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2를 포함하며, 여기서 각각의 R●은 비치환되거나 또는 "할로"가 선행하는 경우 하나 이상의 할로겐으로 치환되며, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리이다.
"임의로 치환된" 기의 치환 가능한 질소 상의 적합한 치환기는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R†를 포함하며; 여기서 각각의 R†는 독립적으로 수소, 아래에서 정의되는 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 비치환된 ―OPh, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리이거나, 또는, 위의 정의에도 불구하고, 독립적으로 발생하는 2개의 R†는 개재 원자(들)과 함께 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 3-12원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 모노사이클릭 또는 비사이클릭 고리를 형성한다.
R†의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2이며, 여기서 각각의 R●은 비치환되거나 또는 "할로"가 선행하는 경우 하나 이상의 할로겐으로 치환되며, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리이다.
본원에서 사용되는 용어 "부분 불포화"는 적어도 하나의 이중 결합 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 지칭한다. 용어 "부분 불포화"는 다중 불포화 부위를 갖는 고리를 포함하도록 의도되지만, 본원에서 정의된 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하려는 의도는 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 염을 지칭하며, 합리적인 이익/위험성 비율에 비례한다. 약제학적으로 허용되는 염은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 본원에 참고로 포함된 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 약제학적으로 허용되는 염을 상세히 기술하고 있다. 본 개시의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 무독성 산부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산을 사용하거나 이온 교환과 같은 해당 분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 기타 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우르레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3- 페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
적절한 염기로부터 유도되는 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은 적절한 경우 할로겐화물, 수산화물, 카복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 저급 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트와 같은 반대 이온을 사용하여 형성된 무독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 유도체"는 수용자에게 투여 시 직접 또는 간접적으로 본 개시의 화합물 또는 이의 활성 대사산물 또는 잔사를 제공할 수 있는 본 개시의 화합물의 임의의 무독성 염, 에스테르, 에스테르의 염 또는 기타 유도체를 의미한다.
용어 "3차 아민"은 3개의 탄소 함유 기에 부착된 아민(질소 원자)을 설명하는 데 사용되며, 각각의 기는 기 내의 탄소 원자를 통해 아민기에 공유 결합된다. 3차 아민은 양자화되거나 루이스산과 착물을 형성할 수 있다.
본원의 변수 정의에서 화학 기의 인용 목록은 해당 변수의 정의를 임의의 단일 기 또는 나열된 기의 조합을 포함한다. 본원의 변수에 대한 실시형태의 언급은 실시형태를 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 다른 실시형태 또는 그의 일부와의 조합을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 또한 구조의 모든 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기하학적(또는 형태적) 형태를 포함하는 것을 의미하며; 예를 들어 각각의 비대칭 중심에 대한 R 및 S 구성, Z 및 E 이중 결합 이성질체, Z 및 E 형태 이성질체 등이 있다. 따라서, 본 발명 화합물의 단일 입체화학적 이성질체뿐만 아니라 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기하학적(또는 형태적) 혼합물도 본 개시의 범위에 속한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시의 화합물의 모든 호변이성질체 형태는 본 개시의 범위에 속한다.
분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 표준 교과서, 예를 들어 그의 개시내용이 본원에서 참고로 포함된 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)]; 문헌[Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)]; 문헌[Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)]; 문헌[Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995)]; 문헌[Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997)]; 및 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]에서 확인할 수 있다.
합성 RNA 바이러스 게놈
일부 실시형태에서, 본 개시는 종양 용해성 바이러스(예를 들어, RNA 게놈)를 코딩하는 재조합 RNA 분자를 제공한다. 이러한 재조합 RNA 분자는 본원에서 "합성 바이러스 게놈" 또는 "합성 RNA 바이러스 게놈"으로 지칭된다. 이러한 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입될 때 감염성의 용해성 바이러스를 생성할 수 있으며, 감염성 바이러스를 복제 및 생성하기 위해 세포 내에 존재하는 추가적인 외인성 유전자 또는 단백질을 필요로 하지 않는다. 오히려, 숙주 세포의 내인성 번역 메커니즘은 합성 RNA 바이러스 게놈으로부터 바이러스 단백질의 발현을 매개한다. 발현된 바이러스 단백질은 이어서 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스 입자(캡시드 단백질, 외피 단백질 및/또는 막 단백질을 포함할 수 있음)로의 바이러스 복제 및 조립을 매개한다. 이와 같이, 본원에서 기술되는 RNA 폴리뉴클레오티드(즉, 합성 RNA 바이러스 게놈)는 숙주 세포에 도입될 때 다른 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 생성한다. 일부 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 피코르나바이러스이다(도 9의 개략도 참조). 일부 실시형태에서, 피코르나바이러스는 CVA21이다. 일부 실시형태에서, 피코르나바이러스는 SVV이다.
일부 실시형태에서, 합성 바이러스 게놈은 재조합 리보핵산(RNA)(즉, 합성 RNA 바이러스 게놈)으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체의 예로는 2'-O-메틸 치환된 RNA, 2'-O-메톡시-에틸 염기, 2' 플루오로 염기, 잠긴 핵산(LNA: locked nucleic acid), 잠금 해제된 핵산(UNA: unlocked nucleic acid), 가교 핵산(BNA: bridged nucleic acid), 모르폴리노 및 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 레플리콘, 이식유전자를 코딩하는 RNA 바이러스 게놈, mRNA 분자, 또는 원형 RNA 분자(circRNA)이다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 게놈은 포지티브 센스 또는 네거티브 센스 게놈(positive sense or negative sense genome)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자는 원형 RNA 분자(circRNA)이다. CircRNA 분자는 엑소뉴클레아제 매개 분해에 필요한 자유 말단이 부족하여 RNA 분자의 반감기가 연장되고 시간이 지남에 따라 보다 안정적인 단백질 생성이 가능해진다(예를 들어, 문헌[Wesselhoeft et al., Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nature Communications. (2018) 9:2629)] 참조). circRNA 분자로부터 기능성 RNA 바이러스를 생성하기 위해, 적절한 3' 및 5' 고유 말단을 가진 선형 RNA 게놈이 생성될 수 있도록 일단 세포 내부에서 원형 구조를 "파괴하여 개방(break open)"하여야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 재조합 RNA 분자는 circRNA 분자로 제공되고, 세포 내부에서 circRNA 분자의 선형화를 촉진하는 하나 이상의 추가 RNA 서열을 추가로 포함한다. 이러한 추가 RNA 서열의 예로는 siRNA 표적 부위, miRNA 표적 부위 및 가이드 RNA 표적 부위를 포함한다. 상응하는 siRNA, miRNA 또는 gRNA는 circRNA 분자와 함께 제형화될 수 있다. 대안적으로, miRNA 표적 부위는 표적 세포에서의 동족 miRNA의 발현에 기초하여 선택될 수 있으며, 따라서 circRNA 분자의 절단 및 코딩된 종양 용해성 바이러스의 초기 발현은 특정 miRNA를 발현하는 표적 세포로 제한된다.
본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 종양 용해성 바이러스를 코딩한다. 종양 용해성 바이러스의 예는 피코르나바이러스(예를 들어, 콕사키바이러스), 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 오르토믹소바이러스 및 마라바 바이러스를 포함하여 당업계에 알려져 있지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 코딩된 종양 용해성 바이러스는 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스(PVS-RIPO 및 기타 키메라 피코르나바이러스와 같은 키메라 소아마비 바이러스 포함) 또는 세네카 밸리 바이러스와 같은 피코르나바이러스과의 바이러스, 또는 다수의 피코르나바이러스로부터의 키메라 기원의 바이러스, 라사 바이러스와 같은 아레나바이러스과의 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스와 같은 레트로바이러스과의 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스와 같은 오르토믹소바이러스과의 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 또는 홍역 바이러스와 같은 파라믹소바이러스과의 바이러스, 포유류 오르토레오바이러스와 같은 레오바이러스과의 바이러스, 신드비스 바이러스와 같은 토가바이러스과의 바이러스, 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바 바이러스와 같은 라브도바이러스과의 바이러스이다.
포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스\
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 게놈을 코딩한다. 일부 실시형태에서, ssRNA 바이러스는 포지티브 센스, ssRNA(+ 센스 ssRNA) 바이러스이다. 예시적인 + 센스 ssRNA 바이러스는 피코르나바이러스과(예를 들어, 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스, 및 세네카 밸리 바이러스(SVV), 예를 들어 SVV-A), 코로나바이러스과(예를 들어, HCoV-229E, 및 HCoV-NL63과 같은 알파코로나바이러스, HCoV-HKU1, HCoV-OC3, 및 MERS-CoV와 같은 베타코로나바이러스), 레트로바이러스과(예를 들어, 쥐 백혈병 바이러스), 및 토가바이러스과(예를 들어, 셈리키 숲 바이러스, 신드비스 바이러스, 로스 리버 바이러스 또는 치쿤구니야 바이러스와 같은 알파 바이러스)의 구성원을 포함한다. 포지티브 센스 ssRNA 바이러스의 추가의 예시적인 속 및 종은 아래 표 1에 나타나 있다.
표 1: 포지티브 센스 ssRNA 바이러스
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스, 폴리오바이러스 및 세네카 밸리 바이러스(SVV)로부터 선택된 피코르나바이러스를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 코딩한다. 이러한 실시형태의 일부 양태에서, 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 코딩하고 서열번호: 2의 5' UTR 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[Brown et al., Complete Genomic Sequencing Shows that Polioviruses and Members of Human Enterovirus Species C Are Closely Related in the Noncapsid Coding Region. Journal of Virology, (2003)77:16, p. 8973-8984]을 참조한다. GenBank 수탁번호 AF546702). 이러한 실시형태에서, 서열 번호: 2의 5' UTR 서열은 예기치 않게도 이전에 기술된 다른 5' UTR 서열과 비교하여 기능성 콕사키바이러스의 생성을 증가시킨다(예를 들어, 문헌[Newcombe et al., Cellular receptor interactions of C-cluster human group A coxsackieviruses Journal of General Virology (2003), 84, 3041-3050]을 참조한다. GenBank 수탁번호 AF465515 참조). 이러한 실시형태의 일부 양태에서, 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 코딩하고 서열번호: 1의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 콕사키바이러스를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21 및 CVA9로부터 선택된다. 예시적인 콕사키바이러스의 핵산 서열은 GenBank 참조 번호 M33854.1(CVB3), GenBank 참조 번호 KT161266.1(CVA21) 및 GenBank 참조 번호 D00627.1(CVA9)로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 Kuykendall(Kuyk) 균주인 서열 번호: 1을 포함하는 변형된 CVA21 바이러스를 코딩한다. 일부 실시형태에서, Kuykendall 균주의 바이러스 게놈의 서열은 GenBank 수탁번호 AF465515.1 또는 AF546702.1에 따른다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 콕사키바이러스를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주 및 CVA21-KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩한다. EF 균주의 바이러스 게놈의 예시적인 서열은 GenBank 수탁번호 EF015029.1에 따른다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩한다. KY 균주의 바이러스 게놈의 예시적인 서열은 GenBank 수탁번호 KY284011.1에 따른다. 도 11 내지 도 26에 도시된 바와 같이, EF 및 KY 균주는 Kuykendall 실험실 균주 및 이전에 기술된 합성 피코르나바이러스 조성물에 비해 치료 이점을 제공한다.
3개의 CVA21 균주(EF, KY 및 Kuykendall)의 도메인 구성은 도 32에서 제공되며, 이들 3개의 균주의 다양한 영역 사이의 서열 동일성은 아래 표 2에서 제공된다.
표 2: 상이한 CVA21 균주의 상응하는 영역 사이의 서열 동일성
CVA21 EF 또는 KY 균주의 바이러스 게놈 중 하나 이상의 특정 영역은 Kuykendall 실험실 균주에 비해 EF 및 KY 균주에 대해 관찰되는 유익한 치료 효과에 기여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 특정 영역은 5' UTR(IRES) 영역, P1 영역 및 3D 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서 기술되는 바이러스 균주에 대한 이러한 각각의 특정 영역의 핵산 위치는 다음과 같다:
(a) CVA21-Kuykendall의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 1의 핵산 1-713을 포함한다. CVA21-KY의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 5의 핵산 1-713을 포함한다. CVA21-EF의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 9의 핵산 1-748을 포함한다.
(b) CVA21-Kuykendall의 P1 영역은 서열번호: 1의 핵산 714-3350을 포함한다. CVA21-KY의 P1 영역은 서열번호: 5의 핵산 714-3350을 포함한다. CVA21-EF의 P1 영역은 서열번호: 9의 핵산 749-3385를 포함한다.
(c) CVA21-Kuykendall의 3D 영역은 서열번호: 1의 핵산 5952-7340을 포함한다. CVA21-KY의 3D 영역은 서열번호: 5의 핵산 5952-7340을 포함한다. CVA21-EF의 3D 영역은 서열번호: 9의 핵산 5987-7375를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 5에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1과 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 6에 따른 5' UTR(IRES) 서열(서열번호: 5의 핵산 1-713에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 2와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 5’ UTR (IRES) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 7에 따른 P1 서열(서열번호: 5의 핵산 714-3350에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 3과 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 P1 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 8에 따른 3D 서열(서열번호: 5의 핵산 5952-7340에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-KY 균주를 코딩하며, 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 4와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 3D 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 9에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1과 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 10에 따른 5' UTR(IRES) 서열(서열번호: 9의 핵산 1-748에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 2와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 5’ UTR (IRES) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 11에 따른 P1 서열(서열번호: 9의 핵산 749-3385에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 3과 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 P1 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 12에 따른 3D 서열(서열번호: 9의 핵산 5987-7375에 해당)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 CVA21-EF 균주를 코딩하며, 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 4와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만 또는 80% 미만(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함)으로 동일한 3D 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 CVA21 RNA 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 서열 CGUCUC(서열번호: 83) 또는 GAGACG(서열번호: 84)를 포함하지 않는다. 상응하는 상보적 DNA 서열인 CGTCTC(서열번호: 85) 및 GAGACG(서열번호: 86)는 BsmBI 제한 효소 인식 부위이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 CVA21 RNA 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 서열 GGUCUC(서열번호: 87) 또는 GAGACC(서열번호: 88)를 포함하지 않는다. 상응하는 상보적 DNA 서열인 GGTCTC(서열번호: 89) 및 GAGACC(서열번호: 90)는 BsaI 제한 효소 인식 부위이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV는 야생형 SVV(예를 들어, SVV-001, 서열번호: 25) 또는 돌연변이 SVV 또는 키메라 SVV(예를 들어, 서열번호: 26으로 코딩된 SVV-001-S177A; 또는 서열번호: 68 또는 서열번호: 73으로 코딩된 SVV-IRES-2-S177A)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177A 돌연변이체이다. SVV 바이러스 게놈과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "S177 돌연변이체"는 야생형 단백질의 아미노산 S177(서열번호: 25에 의해 코딩되는 VP2 단백질에 따른 아미노산 넘버링)에서의 돌연변이를 포함하는 VP2 단백질을 코딩하는 SVV 바이러스 게놈을 지칭한다. 따라서, 용어 "S177A 돌연변이체"는 VP2 단백질의 S177A의 아미노산 치환을 갖는 SVV 돌연변이체를 지칭한다. 서열번호: 25에서, VP2 S177 잔기는 핵산 위치 1645-1647에서 코돈 "UCU"에 의해 코딩된다. 따라서, SVV-S177 돌연변이체는 서열번호: 25의 핵산 위치 1645-1647에 상응하는 영역 내에 핵산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV-S177A 돌연변이체는 서열번호: 25의 핵산 위치 1645-1647에 상응하는 영역에서 코돈 서열 "GCU", "GCC", "GCA" 또는 "GCG"를 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV-S177A 돌연변이체는 서열번호: 25의 핵산 위치 1645-1647에 상응하는 영역에서 코돈 서열 "GCG"를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 SVV RNA 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 서열 GCUCUUC(서열번호: 79) 또는 GAAGAGC(서열번호: 80)를 포함하지 않는다. 상응하는 상보적 DNA 서열인 GCTCTTC(서열번호: 81) 및 GAAGAGC(서열번호: 82)는 SapI 제한 효소 인식 부위이다. 일부 실시형태에서, 야생형 SVV RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 25의 핵산 1504-1510 및/또는 핵산 5293-5299에 상응하는 위치에서 서열번호: 79를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 SVV RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 25의 핵산 1504-1510 및/또는 핵산 5293-5299에 상응하는 영역 내에서 서열번호: 79와 비교하여 적어도 1개의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1개의 뉴클레오티드 치환은 DNA의 상응하는 영역에 의해 코딩되는 아미노산을 변화시키지 않는 침묵 돌연변이(silent mutation)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 SVV RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 25의 핵산 1509 및/또는 5298에 상응하는 위치에서 시티딘("C")을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 SVV RNA 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 서열 GGUCUC(서열번호: 87) 또는 GAGACC(서열번호: 88)를 포함하지 않는다. 상응하는 상보적 DNA 서열인 GGTCTC(서열번호: 89) 및 GAGACC(서열번호: 90)는 BsaI 제한 효소 인식 부위이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 피코르나바이러스를 코딩한다(예를 들어, 제1 피코르나바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 또는 IRES와 같은 한 부분 및 제2 피코르나바이러스로부터 유래된 프로테아제 또는 폴리머라제와 같은 비-구조 유전자와 같은 또 다른 부분을 포함하는 바이러스를 코딩한다). 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 키메라 SVV를 코딩한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVV-001(서열번호: 25 또는 서열번호: 72(Genbank 수탁번호: DQ641257.1)), SVA/BRA/MG2/2015(서열번호: 69; GenBank 수탁번호: KR063108.1), SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015(서열번호: 70; GenBank 수탁번호: KY486156.1), 및 SVV-MN15-308(서열번호: 71; GenBank 수탁번호: KU359214.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 SVV 균주로부터 유래된 하나 이상의 특정 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 특정 영역은 5' UTR(IRES) 영역, P1 영역 및 P3 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서 기술되는 바이러스 균주에 대한 이러한 각각의 특정 영역의 핵산 위치는 다음과 같다:
(a) SVV-001의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 25의 핵산 1-668을 포함한다. SVA/BRA/MG2/2015의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 69의 핵산 1-656을 포함한다. SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 70의 핵산 1-612를 포함한다. SVV-MN15-308의 5' UTR(IRES) 영역은 서열번호: 71의 핵산 1-610을 포함한다.
(b) SVV-001의 P1 영역은 서열번호: 25의 핵산 669-3477을 포함한다. SVA/BRA/MG2/2015의 P1 영역은 서열번호: 69의 핵산 657-3465를 포함한다. SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015의 P1 영역은 서열번호: 70의 핵산 613-3421을 포함한다. SVV-MN15-308의 P1 영역은 서열번호: 71의 핵산 611-3419를 포함한다.
(c) SVV-001의 P3 영역은 서열번호: 25의 핵산 4855-7212를 포함한다. SVA/BRA/MG2/2015의 P3 영역은 서열번호: 69의 핵산 4843-7200을 포함한다. SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015의 P3 영역은 서열번호: 70의 핵산 4799-7156을 포함한다. SVV-MN15-308의 P3 영역은 서열번호: 71의 핵산 4797-7154를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/BRA/MG2/2015(서열번호: 69의 핵산 1-656)로부터 유래된 5' UTR(IRES) 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 69의 핵산 1-656과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/BRA/MG2/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015(서열번호: 70의 핵산 1-612)로부터 유래된 5' UTR(IRES) 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 70의 핵산 1-612와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVV-MN15-308(서열번호: 71의 핵산 1-610)로부터 유래된 5' UTR(IRES) 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 71의 핵산 1-610과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV-MN15-308로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/BRA/MG2/2015(서열번호: 69의 핵산 657-3465)로부터 유래된 P1 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 69의 핵산 657-3465와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/BRA/MG2/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015(서열번호: 70의 핵산 613-3421)로부터 유래된 P1 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 70의 핵산 613-3421과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVV-MN15-308(서열번호: 71의 핵산 611-3419)로부터 유래된 P1 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 71의 핵산 611-3419와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV-MN15-308로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/BRA/MG2/2015(서열번호: 69의 핵산 4843-7200)로부터 유래된 P3 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 69의 핵산 4843-7200과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/BRA/MG2/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015(서열번호: 70의 핵산 4799-7156)로부터 유래된 P3 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 70의 핵산 4799-7156과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVV-MN15-308(서열번호: 71의 핵산 4797-7154)로부터 유래된 P3 영역을 포함하는 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 71의 핵산 4797-7154와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV-MN15-308로부터 유래된 하나 이상의 영역 외에, SVV 바이러스 게놈의 나머지 부분은 SVV-001로부터 유래되며, 서열번호: 25의 상응하는 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 SVA/Canada/MB/NCFAD-104/2015(서열번호: 70) 및 SVV-001(서열번호: 25)로부터 유래된 바이러스 게놈의 나머지 부분으로부터 유래된 5' UTR(IRES) 영역을 포함하는 키메라 SVV를 코딩한다. 일부 실시형태에서, SVV는 SVV-S177 돌연변이체(예를 들어, S177A 돌연변이체)이다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 조작되었으며, 야생형 바이러스(예를 들어, 야생형 CVA21 또는 야생형 SVV)의 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 상응하는 야생형 바이러스의 서열과 99.9% 미만, 99.8% 미만, 99.7% 미만, 99.6% 미만, 99.5% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 94% 미만, 93% 미만, 92% 미만, 91% 미만, 또는 90% 미만의 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포내에서 코딩된 종양 용해성 바이러스의 복제를 저해한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142, 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 비필수 유전자의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3'에 내장된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 페이로드 분자를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 감염성 종양 용해성 바이러스의 생성뿐만 아니라 페이로드 분자의 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자의 발현은 종양 용해성 바이러스의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-12, GM-CSF, CXCL10, IL-36γ, CCL21, IL-18, IL-2, CCL4, CCL5, 항-CD3-항-FAP BiTE, DLL3에 결합하는 항원 결합 분자, 또는 EpCAM에 결합하는 항원 결합 분자로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 MLKL 4HB 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더민 D N-말단 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더민 E N-말단 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 HMGB1 Box B 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 SMAC/디아블로를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 멜리틴을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 L-아미노산 옥시다제(LAAO)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 디스인테그린을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 TRAIL(TNFSF10)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 니트로리덕타제(예를 들어, E. coli NfsB 또는 NfsA)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 레오바이러스 FAST 단백질(예를 들어, ARV p14, BRV p15, 또는 p14-p15 하이브리드)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 렙틴/FOSL2를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-IL-36γ, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL2 또는 IFNγ로부터 선택된 사이토카인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 이러한 실시형태에 사용하기에 적합한 페이로드 분자의 유형에 대한 추가적인 설명이 아래에서 제공된다.
재조합 RNA 바이러스 게놈의 제조 방법
일부 실시형태에서, 본 개시는 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 이러한 재조합 DNA 분자는 본원에서 "DNA 템플레이트" 또는 "재조합 DNA 템플레이트"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 코딩된 합성 RNA 바이러스 게놈의 시험관내 전사를 위한 템플레이트로 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 5'에서 3'으로 하기 요소 중 하나 이상을 포함한다: (i) 프로모터; (ii) 5' 리더 서열; (iii) 5' 접합 절단 서열; (iv) 합성 RNA 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열; (v) polyA 꼬리; 및/또는 (vi) 3' 접합 절단 서열. 일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자를 코딩하는 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 하기 요소를 각각 포함한다: (i) 프로모터; (ii) 5' 리더 서열; (iii) 5' 접합 절단 서열; (iv) 합성 RNA 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열; (v) polyA 꼬리; 및 (vi) 3' 접합 절단 서열. 이러한 각각의 요소는 아래에서 상세히 기술된다. 각각의 개별 요소에 대해 제공된 설명은 각각의 요소의 특정 실시형태가 최종 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)로 조합될 수 있도록 되어 있다. 예를 들어, 특정 리더 서열의 개시는 특정 5' 접합 절단 서열의 개시내용 등과 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 두 개의 인접한 요소 사이에 추가의 핵산을 포함하지 않지만, 프로모터 서열의 상류 또는 3' 접합 절단 서열의 하류에 추가의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이다. 일부 실시형태에서, T7 프로모터 서열은 서열번호: 91을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 DNA 템플레이트를 사용하여 시험관 내에서 생성된다. 다시 말해, 재조합 DNA 템플레이트는 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 용어 "벡터"는 본원에서는 다른 핵산 분자를 전달, 코딩 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다. 전사된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 삽입된다. 벡터는 세포 내에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있고/있거나 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 재조합 RNA 분자는 하나 이상의 DNA 벡터를 사용하여 생성된다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 재조합 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)를 (예를 들어, 형질 감염, 형질 도입, 전기 천공 등에 의해) 시험관 내에서 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 생성된다. 적합한 숙주 세포는 곤충 및 포유동물 세포주를 포함한다. 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드의 발현 및 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성을 가능하게 하기에 적절한 시간 동안 배양한다. 이어서, 합성 RNA 바이러스 게놈을 숙주 세포로부터 단리한 다음, 치료용(예를 들어, 입자에 캡슐화)으로 제형화한다. 3' 및 5' 리보자임을 갖는 CVA21 RNA 바이러스 게놈의 개략적인 시험관내 합성 도식이 도 10에 나타나 있다. 동일한 도식을 접합 절단 서열의 다른 조합을 사용하여 RNA 바이러스 게놈(예를 들어, CVA21 또는 SVV 바이러스 게놈)의 합성에도 적용한다(예를 들어, 도 11a 참조). 3' 접합 절단 서열이 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어지는 경우, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 도 11b에 도시된 바와 같이 시험관내 전사 과정 전에 상응하는 제한 효소로 분해될 수 있다.
T7 프로모터
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 T7 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, T7 프로모터는 서열번호: 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, T7 프로모터는 최대 1, 2, 3 또는 4개의 돌연변이를 갖는 서열번호: 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, T7 프로모터는 그들 사이에 추가의 뉴클레오티드 없이 리더 서열 바로 앞에 위치한다. 일부 실시형태에서, T7 프로모터는 그들 사이에 추가의 뉴클레오티드 없이 5' 접합 절단 서열 바로 앞에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 CVA21 또는 SVV를 코딩한다.
접합 절단 서열
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자는 바이러스에 고유한 별개의 5' 및 3' 말단을 필요로 한다. 시험관 내에서 T7 RNA 폴리머라제에 의해 또는 포유동물 RNA Pol II에 의해 생성된 RNA 전사체는 포유동물의 5' 및 3' UTR을 함유하며, 감염성 RNA 바이러스의 생성에 필요한 분리된 고유 말단은 함유하지 않는다. 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제는 전사를 시작하기 위해 템플레이트 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 구아노신 잔기가 필요하다. 그러나, SVV는 5' 말단에 우리딘 잔기로 시작한다. 따라서, SVV 전사체의 시험관내 전사에 필요한 T7 리더 서열을 제거하여 기능성 감염성 SVV 생성에 필요한 고유 5' SVV 말단을 생성시켜야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 바이러스에 고유한 별개의 5' 및 3' 말단의 생성할 수 있는 추가의 비바이러스성 5' 및 3' 서열을 필요로 한다. 이러한 서열은 본원에서 접합 절단 서열(JCS: junctional cleavage sequence)로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 바이러스의 내인성 5' 및 3' 개별 말단을 유지하기 위해 비바이러스성 RNA 폴리뉴클레오티드가 전사체로부터 제거되도록 바이러스 RNA와 포유류 mRNA 서열의 접합부에서 T7 RNA 폴리머라제 또는 Pol II 코딩된 RNA 전사체를 절단하는 역할을 한다(도 11a에 도시된 개략도 참조). 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 합성 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 플라스미드의 선형화 동안 적절한 말단을 생성하는 역할을 한다(예를 들어, 플라스미드 템플레이트의 선형화 시 및 합성 RNA 게놈의 시험관내 전사 전에 적절한 3' 말단을 생성하기 위해 3' 제한 효소 인식 서열을 사용함).
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 적어도 하나의 5' 접합 절단 서열 및 적어도 하나의 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 하나 이상의 5' 접합 절단 서열 및 적어도 하나의 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 적어도 하나의 5' 접합 절단 서열 및 하나 이상의 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 하나 이상의 5' 접합 절단 서열 및 하나 이상의 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 2개의 5' 접합 절단 서열 및 적어도 하나의 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈의 생성에 사용하기에 적합한 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 적어도 하나의 5' 접합 절단 서열 및 2개의 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
접합 절단 서열의 특성과 바이러스 게놈 전사체로부터 비바이러스성 RNA를 제거하는 것은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 RNA 간섭(RNAi) 분자에 대한 표적이다. 본원에서 사용되는 "RNA 간섭 분자"는 내인성 유전자 침묵 경로(예를 들어, 다이서 및 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC))를 통해 표적 mRNA 서열의 분해를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭 제제는 마이크로 RNA(miRNA), 인공 miRNA(amiRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 또한, 현재 당업계에 알려져 있거나 앞으로 정의될 특정 부위에서 RNA 전사체를 절단하기 위한 임의의 시스템을 사용하여 바이러스 고유의 개별 말단을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, RNAi 분자는 miRNA이다. miRNA는 표적 mRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 약 18-25개 뉴클레오티드 길이의 자연 발생성의 작은 비-코딩 RNA 분자를 지칭한다. 동물에서, miRNA 유전자는 이중 가닥이고 줄기 루프 구조를 형성하는 1차 miRNA(pri-miRNA)로 전사된다. 이어서, Pri-miRNA는 클래스 2 RNase III인 드로샤(Drosha) 및 마이크로프로세서 서브유닛인 DCGR8을 포함하는 마이크로프로세서 복합체에 의해 핵에서 절단되어 70~100개의 뉴클레오티드 전구체 miRNA(pre-miRNA)를 형성한다. pre-miRNA는 헤어핀 구조를 형성하고 세포질로 운반되어 RNase III 효소인 다이서에 의해 약 18-25개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA 이중체로 처리된다. 이중 가닥의 어느 한 가닥이 잠재적으로 기능성 miRNA로 작용할 수 있지만, 전형적으로 miRNA의 하나의 가닥이 분해되고 단지 하나의 가닥만 아르고뉴트(AGO) 뉴클레아제에 로드되어 miRNA 및 그의 mRNA 표적이 상호 작용하는 이펙터 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)를 생성한다(문헌[Wahid et al., 1803:11, 2010, 1231-1243] 참조). 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 miRNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, RNAi 분자는 Pol II 전사체에 내장된 합성 miRNA로부터 유래된 인공 miRNA(amiRNA)이다. (예를 들어, 문헌[Liu et al., Nucleic Acids Res (2008) 36:9; 2811-2834]; 문헌[Zeng et al., Molecular Cell (2002), 9; 1327-1333]; 문헌[Fellman et al., Cell Reports (2013) 5; 1704-1713] 참조). 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 amiRNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, RNAi 분자는 siRNA 분자이다. siRNA는 전형적으로 길이가 약 21-23개의 뉴클레오티드인 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 이중 가닥 siRNA 분자는 세포질에서 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)라고 하는 다중 단백질 복합체와 결합하여 처리되며, 이 과정에서 "승객" 감지 가닥이 이중 가닥으로부터 효소적으로 절단된다. 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥은 서열 상보성으로 인하여 RISC를 상응하는 mRNA로 안내하고 AGO 뉴클레아제는 표적 mRNA를 절단하여 특이 유전자 침묵을 초래한다. 일부 실시형태에서, siRNA 분자는 shRNA 분자로부터 유래된다. shRNA는 줄기 루프 구조를 형성하는 50-70개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 인공 RNA 분자이다. 세포에서 shRNA의 발현은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 shRNA를 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 달성된다. 그런 다음, shRNA는 pre-miRNA의 줄기 루프 구조를 모방하는 생성물로 전사되고, 핵 전파 후 헤어핀은 다이서에 의해 처리되어 이중 siRNA 분자를 형성한 다음, RISC에 의해 추가로 처리되어 표적 유전자 침묵을 매개한다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 siRNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 가이드 RNA(gRNA) 표적 서열이다. 이러한 실시형태에서, 정확한 접합 부위에서 바이러스 게놈 전사체의 절단을 매개하도록 RNase 활성을 갖는 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas13)를 사용하여 gRNA를 설계하고 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 gRNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 pri-miRNA 코딩 서열이다. 바이러스 게놈(예를 들어, 재조합 RNA 분자)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사 시, 이러한 서열은 pri-miRNA 줄기 루프 구조를 형성하고, 이어서 이러한 구조는 드로샤에 의해 핵에서 절단되어 정확한 접합 부위에서 전사체를 절단한다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 pri-mRNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 엔도리보뉴클레아제인 RNAseH에 의한 절단을 촉진하는 프라이머 결합 서열이다. 이러한 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열에 어닐링되는 프라이머는 RNAseH 효소와 함께 시험관내 반응에 첨가된다. RNAseH는 DNA에 혼성화된 RNA의 포스포디에스테르 결합을 특이적으로 가수분해하여 정확한 접합 절단 서열에서 합성 RNA 게놈 중간체의 절단을 가능하게 하여 필요한 5' 및 3' 고유 말단을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어지며, T7 RNA 중합효소로 플라스미드 템플레이트 유출 RNA 합성을 선형화하는 동안 바이러스 전사체의 개별 말단의 생성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 IIS형 제한 효소 인식 부위이다. IIS형 제한 효소는 비대칭 DNA 서열을 인식하고, 그들의 인식 서열 외부의 정의된 거리, 일반적으로는 1~20개의 뉴클레오티드 이내에서 절단하는 특이한 효소군을 포함한다. 예시적인 IIS형 제한 효소는 AcuI, AlwI, BaeI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaXI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBi, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BstI, CaspCI, EarI, EciI, Esp3I, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MbolI, MlyI, MmeI, MnlL, NmeAIII, PleI, SapI, 및 SfaNI를 포함한다. 이러한 IIS형 제한 효소에 대한 인식 서열은 당업계에 알려져 있다. neb.com/tools-and-resources/selection-charts/type-iis-restriction-enzymes에서 New England Biolabs 웹사이트를 참조한다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 SapI 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 BsmBI 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 당업자는 IIS형 제한 효소의 절단 부위가 전형적으로는 효소 인식 부위 외측에 있기 때문에(예를 들어, 1-5개의 뉴클레오티드에 의해 상쇄되기 때문에), 상응하는 접합 절단 서열은 또한 바이러스 전사체의 개별 말단(예를 들어, 3' 말단의 poly-A 꼬리)을 생성하기 위해 상응하는 제한 효소에 의해 필요한 추가의 뉴클레오타이드(들)를 포함할 수도 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 "앱타자임(aptazyme)"으로 지칭되는 리간드-유도성 자가 절단 리보자임을 코딩하는 서열이다. 앱타자임은 리간드에 특이적인 통합된 앱타머 도메인을 함유하는 리보자임 서열이다. 앱타머 도메인에 대한 리간드 결합은 리보자임의 효소 활성의 활성화를 유발하여 RNA 전사체의 절단을 초래한다. 예시적인 앱타자임은 테오필린 의존성 앱타자임(예를 들어, 테오필린 의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, 문헌[Auslander et al., Mol BioSyst. (2010) 6, 807-814]에 기술됨), 테트라사이클린 의존성 앱타자임(예를 들어, Tet-의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, 문헌[Zhong et al., eLife 2016;5:e18858DOI:10.7554/eLife.18858]; 문헌[Win and Smolke, PNAS (2007) 104; 14283-14288]; 문헌[Whittmann and Suess, Mol Biosyt (2011) 7; 2419-2427]; 문헌[Xiao et al., Chem & Biol (2008) 15; 125-1137]; 및 문헌[Beilstein et al., ACS Syn Biol (2015) 4; 526-534]에 기술됨), 구아닌 의존성 앱타자임(예를 들어, 구아닌 의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, 문헌[Nomura et al., Chem Commun., (2012) 48(57); 7215-7217]에 기술됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 앱타자임-코딩 서열이다.
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 RNAi 분자(예를 들어, siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자 또는 amiRNA 분자), gRNA 분자, 또는 RNAseH 프라이머에 대한 표적 서열이다. 이러한 실시형태에서, 접합 절단 서열은 RNAi 분자, gRNA 분자, 또는 프라이머 분자의 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다. 퍼센트 서열 동일성 및 퍼센트 상보성의 비교 및 측정을 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 각각, 예를 들어, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터 구현(문헌[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조), 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하여 당업계에 알려진 알고리즘의 사용; 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 따라 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 동일한 군에 속한다(예를 들어, 둘 모두 RNAi 표적 서열이고, 둘 모두 리보자임 코딩 서열이다, 등). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, shRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열)이며, 바이러스 게놈(예를 들어, 재조합 RNA 분자)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 포함된다. 이러한 실시형태에서, 5' 및 3' RNAi 표적 서열은 동일(즉, 동일한 siRNA, amiRNA 또는 miRNA에 대한 표적임)하거나 상이(즉, 5' 서열은 하나의 siRNA, shmiRNA 또는 miRNA에 대한 표적이며, 3' 서열은 또 다른 siRNA, amiRNA 또는 miRNA에 대한 표적임)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 가이드 RNA 표적 서열이며, 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 말단에 포함된다. 이러한 실시형태에서, 5' 및 3' gRNA 표적 서열은 동일(즉, 동일한 gRNA에 대한 표적임)하거나 상이(즉, 5' 서열은 하나의 gRNA에 대한 표적이며, 3' 서열은 또 다른 gRNA에 대한 표적임)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 pri-mRNA 코딩 표적 서열이며, 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 말단에 포함된다. 일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 리보자임 코딩 표적 서열이며, 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 재조합 RNA 분자)의 5' 및 3' 말단에 즉시 포함된다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 동일한 군에 속하지만, 상이한 변이체 또는 유형이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 5' 및 3' 접합 절단 서열은 RNAi 분자에 대한 표적 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합 절단 서열은 siRNA 표적 서열이고 3' 접합 절단 서열은 miRNA 표적 서열(또는 그 반대)이다. 일부 실시형태에서, 5' 및 3' 접합 절단 서열은 리보자임 코딩 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합 절단 서열은 해머헤드 리보자임 코딩 서열이고 3' 접합 절단 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 코딩 서열이다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 상이한 유형이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열)이며, 3' 접합 절단 서열은 리보자임 서열, 앱타자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열이며, 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 앱타자임 서열, pri-miRNA 코딩 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 앱타자임 서열이며, 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 pri-miRNA 서열이며, 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, 앱타자임 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 gRNA 서열이며, 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, amiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 앱타자임 서열이다.
합성 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관련된 접합 절단 서열의 예시적인 배열은 아래 표 3 및 4에 나타나 있다.
표 3: 대칭 접합 절단 서열(JSC) 배열
표 4: 비대칭 JCS 배열
*"Restr Enz RS"는 제한 효소 인식 부위를 지칭한다
일부 실시형태에서, 접합 절단 서열은 리보자임 코딩 서열이며, 합성 RNA 게놈 중간체의 자가 절단을 매개하여 최종 합성 바이러스 RNA 게놈 및 전염성 RNA 바이러스의 후속 생산에 필요한 고유의 개별 5' 및/또는 3' 말단을 생성한다. 예시적인 리보자임은 해머헤드 리보자임(예를 들어, 도 5a에 도시된 해머헤드 리보자임), 바르쿠드 위성(VS: Varkud satellite) 리보자임, 헤어핀 리보자임, GIR1 분지형 리보자임, glmS 리보자임, 트위스터 리보자임, 트위스터 자매 리보자임(예를 들어, 트위스터 자매 1 또는 트위스터 자매 2), 피스톨 리보자임(예를 들어, 도 6a-6c에 도시된 피스톨 리보자임, Env25 피스톨 리보자임, 또는 알리스티페스 푸트레디니스 피스톨 리보자임), 해쳇 리보자임, 및 델타 간염 바이러스 리보자임을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 리보자임 코딩 서열이다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열, 또는 트위스터 자매 리보자임 서열로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 P. 폴리믹사로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 16-19 및 23-24 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 도 6a 및 6c에 표시된 바와 같은 P2 모티프를 포함하며, 이는 4개의 뉴클레오티드 길이이고 서열번호: 16-19 및 23-24의 핵산 위치 27-30에 상응하는 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 17과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 P2 모티프의 폴리뉴클레오티드 서열은 "TTTA"이다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 18과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 P2 모티프의 폴리뉴클레오티드 서열은 "TTTT"이다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 19와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 P2 모티프의 폴리뉴클레오티드 서열은 "TTGT"이다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 콕사키바이러스(예를 들어, CVA21) RNA 바이러스 게놈의 시험관내 전사를 위해 재조합 DNA 분자에 통합된다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 P. 폴리믹사로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 64 또는 65와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 P2 모티프를 포함하며, 이는 4개의 뉴클레오티드 길이이고 서열번호: 64 또는 65의 핵산 위치 27-30에 상응하는 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 64와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 P2 모티프의 폴리뉴클레오티드 서열은 "TCAA"이다. 일부 실시형태에서, P. 폴리믹사로부터 유래된 5' 피스톨 리보자임 서열은 서열번호: 65와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 P2 모티프의 폴리뉴클레오티드 서열은 "TTAA"이다. 일부 실시형태에서, 5' 피스톨 리보자임 서열은 SVV(예를 들어, SVV-IRES-2) RNA 바이러스 게놈의 시험관내 전사를 위해 재조합 DNA 분자에 통합된다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 Env25 피스톨 리보자임을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Env25 피스톨 리보자임을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 96과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Env25 피스톨 리보자임 RNA 서열은 서열번호: 100과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 알리스티페스 푸트레디니스 피스톨 리보자임을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 알리스티페스 푸트레디니스 피스톨 리보자임을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 97과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 알리스티페스 푸트레디니스 피스톨 리보자임 RNA 서열은 서열번호: 101과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 트위스터 자매 1 리보자임을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 트위스터 자매 1 리보자임을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 98과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 트위스터 자매 1 리보자임 RNA 서열은 서열번호: 102와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 5' 접합 절단 서열은 트위스터 자매 2 리보자임을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 트위스터 자매 2 리보자임을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 99와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 트위스터 자매 2 리보자임 RNA 서열은 서열번호: 103과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
리더 서열
일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 프로모터 서열과 5' 접합 절단 서열 사이에 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리더 서열의 존재는 하류 5' 접합 절단 서열(예를 들어, 5' 리보자임 서열)의 적절한 폴딩을 촉진하거나 보장한다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 약 5 bp, 약 10 bp, 약 15 bp, 약 20 bp, 약 25 bp, 약 30 bp, 약 35 bp, 약 40 bp, 약 45 bp, 약 50 bp, 약 55 bp, 약 60 bp, 약 65 bp, 약 70 bp, 약 75 bp, 약 80 bp, 약 85 bp, 약 90 bp, 약 95 bp, 또는 약 100 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 적어도 5 bp, 적어도 10 bp, 적어도 15 bp, 적어도 20 bp, 적어도 25 bp, 적어도 30 bp, 적어도 35 bp, 적어도 40 bp, 적어도 45 bp, 적어도 50 bp, 적어도 55 bp, 적어도 60 bp, 적어도 65 bp, 적어도 70 bp, 적어도 75 bp, 적어도 80 bp, 적어도 85 bp, 적어도 90 bp, 적어도 95 bp, 또는 적어도 100 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 5 bp 미만, 10 bp 미만, 15 bp 미만, 20 bp 미만, 25 bp 미만, 30 bp 미만, 35 bp 미만, 40 bp 미만, 45 bp 미만, 50 bp 미만, 55 bp 미만, 60 bp 미만, 65 bp 미만, 70 bp 미만, 75 bp 미만, 80 bp 미만, 85 bp 미만, 90 bp 미만, 95 bp 미만, 또는 100 bp 미만 길이이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 약 50-70 bp, 약 40-60 bp, 약 60-80 bp, 약 40-80 bp, 약 30-70 bp, 약 50-90 bp, 약 30-90 bp, 약 20-60 bp, 또는 약 60-100 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 약 57 bp 또는 약 55-60 bp 길이이다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 13-15 중 어느 하나에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 13-15 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 15에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열 다음에 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, P. 폴리믹사로부터의 피스톨 리보자임 또는 그의 변이체)이 뒤따르거나 바로 뒤따른다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 CVA21 RNA 바이러스 게놈의 시험관내 전사를 위해 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)에 통합된다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 53-63 중 어느 하나에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 53에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 53에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 58에 따른 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호: 58에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 리더 서열 다음에 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 서열번호: 64 또는 65에 따른 피스톨 리보자임 또는 그의 변이체)이 뒤따르거나 바로 뒤따른다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 SVV RNA 바이러스 게놈의 시험관내 전사를 위해 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)에 통합된다.
폴리-A 꼬리
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 폴리A 꼬리를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 합성 RNA 바이러스 게놈의 3' 말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 2-500 bp 길이(즉, 2-500 pA)이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 2-100, 2-150, 2-200, 2-250, 2-300, 2-400, 또는 2-500 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 약 10-30, 20-40, 30-50, 40-60, 50-70, 60-80, 70-90, 80-100, 90-110, 100-120, 110-130, 120-140, 130-150, 140-160, 150-170, 160-180, 170-190, 또는 180-200 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 그 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하여 약 65-75, 60-80, 55-85, 50-90, 45-95, 또는 40-100 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 약 70 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 더 긴 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp 길이)는 더 짧은 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 30 bp 길이)를 갖는 상응하는 합성 RNA 바이러스 게놈과 비교하여 Oligo-dT 크로마토그래피에서 합성 RNA 바이러스 게놈의 로딩 용량을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 로딩 용량은, 약 30 bp 길이의 폴리-A 꼬리를 갖는 합성 RNA 바이러스 게놈과 비교하였을 때, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 또는 적어도 10배 향상된다.
재조합 DNA 분자 디자인의 비제한적인 예
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 시험관내 RNA 전사에 의해 시험관내에서 생성된다(예를 들어, 도 10, 도 11a, 도 11b 및 도 33의 개략도 참조). 이어서, 합성 RNA 바이러스 게놈을 정제한 다음, 치료용(예를 들어, 지질 나노입자에 캡슐화)으로 제형화한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 도 5a 및 도 5b에 제공된 것과 같은 변형 HHR); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 3' 델타 간염 바이러스 리보자임 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 제한 효소 인식 부위를 포함하는 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 도 5a 및 도 5b에 제공된 것과 같은 변형 HHR); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 템플레이트는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 해머헤드 리보자임 서열(예를 들어, 야생형 HHR 또는 도 5a 및 도 5b에 제공된 것과 같은 변형 HHR); (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 도 6b에 도시된 피스톨 1 또는 피스톨 2 리보자임 서열)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 도 6b에 도시된 피스톨 1 또는 피스톨 2 리보자임 서열)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5’ RNAseH 프라이머 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 제한 효소 인식 부위를 포함하는 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5’ RNAseH 프라이머 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5’ RNAseH 프라이머 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) 제한 효소 인식 부위를 포함하는 3' 접합 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 5’ RNAseH 프라이머 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iii) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (iv) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 콕사키바이러스(CVA) 게놈이다. 일부 실시형태에서, 콕사키바이러스는 CVA21 균주이다. 일부 실시형태에서, CVA21 균주는 EF 균주이다. 일부 실시형태에서, CVA21 균주는 KY 균주이다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 임의의 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, P. 폴리믹사로부터의 피스톨 리보자임 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) (예를 들어, BsmBI 또는 BsaI 제한 효소에 대한) 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리더 서열(예를 들어, 서열번호: 14 또는 15); (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, P. 폴리믹사로부터의 피스톨 리보자임 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) BsmBI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리더 서열(예를 들어, 서열번호: 14 또는 15); (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, P. 폴리믹사로부터의 피스톨 리보자임 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 15에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsmBI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5A에 제공된 실시형태 E1-E68 중 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 15에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5A에 제공된 실시형태 E1-E68 중 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 14에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsmBI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5A에 제공된 실시형태 E1-E68 중 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 14에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5A에 제공된 실시형태 E1-E68 중 하나로부터 선택된다.
표 5A: CVA21 바이러스 게놈을 발현하기 위한 DNA 템플레이트의 리더 서열, 5' 리보자임 서열, 및 폴리-A 꼬리의 비제한적인 실시형태
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 15에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 18에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) BsmBI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 15에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 18에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) CVA21 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-KY 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 20에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 20에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-KY 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 93에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-KY 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 93에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-EF 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 21에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 21에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-EF 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 95에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-EF 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 95에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-Kuykendall 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 22에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-Kuykendall 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 22에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 CVA21-Kuykendall 균주 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 94에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21-Kuykendall 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 94에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 세네카 밸리 바이러스(SVV) 게놈이다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 임의의 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, P. 폴리믹사로부터의 피스톨 리보자임 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) (예를 들어, SapI 또는 BsaI 제한 효소에 대한) 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리더 서열(예를 들어, 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나); (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 서열번호: 64 또는 65에 따른 서열 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 리더 서열(예를 들어, 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나); (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열(예를 들어, 서열번호: 64 또는 65에 따른 서열 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 20-80 bp 길이, 또는 약 30-70 bp길이), 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 폴리-A 꼬리 뒤에 3' SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하고, SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 폴리-A 꼬리 뒤에 3' BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하고, SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 리더 서열, 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5B에 제공된 실시형태 S1-S340 중 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 서열(예를 들어, a T7 중합효소 프로모터); (ii) 서열번호: 53-60 및 62-63 중 어느 하나에 따른 리더 서열; (iii) 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함하며, 여기서 리더 서열, 5' 피스톨 리보자임 서열 및 폴리-A 꼬리의 조합은 아래 표 5B에 제공된 실시형태 S1-S340 중 하나로부터 선택된다.
표 5B: SVV 바이러스 게놈을 발현하기 위한 DNA 템플레이트의 리더 서열, 5' 리보자임 서열, 및 폴리-A 꼬리의 비제한적인 실시형태
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 53에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 53에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 58에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 58에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 폴리-A 꼬리(예를 들어, 약 70 bp, 약 60-80 bp, 또는 약 50-90 bp 길이의 폴리-A 꼬리), 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 58에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 약 70 bp 길이의 폴리-A 꼬리, 및 (vi) SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는, 5'에서 3'으로: (i) T7 중합효소 프로모터 서열; (ii) 서열번호: 58에 따른 리더 서열; (iii) 서열번호: 64에 따른 5' 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 접합 절단 서열; (iv) SVV 합성 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 약 70 bp 길이의 폴리-A 꼬리, 및 (vi) BsaI 제한 효소 인식 부위를 포함하거나 이로 이루어진 3' 접합 절단 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 SVV 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 52에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 52에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 DNA 분자(예를 들어, DNA 템플레이트)는 SVV 바이러스 게놈을 코딩하고 서열번호: 92에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, SVV 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%(그 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함)의 서열번호: 92에 따른 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
SVV 또는 CVA 게놈을 코딩하는 DNA 템플레이트의 예시적인 실시형태가 아래 표 18에서 제공된다.
표 18: 예시적인 DNA 템플레이트 구조
합성 RNA 게놈을 포함하는 입자
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 "입자"에 캡슐화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 입자는 리포좀, 리포플렉스, 나노입자, 나노캡슐, 미세입자, 미세구, 지질 입자, 엑소좀, 소포 등과 같은 물질의 비조직 유래 조성물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 입자는 비단백질성이며 비면역원성이다. 이러한 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈의 캡슐화는 전신성 항바이러스 면역 반응의 유도 없이 바이러스 게놈을 전달하고 항바이러스 항체의 중화 효과를 완화시킬 수 있다. 또한, 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈의 캡슐화는 게놈이 분해되는 것을 방지하고 표적 숙주 세포로의 도입을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈을 포함하는 나노입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 페이로드 분자를 코딩하는 제2 RNA 분자를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 입자는 대상체 내에서 생분해성이다. 이러한 실시형태에서, 다중 투여량의 입자는 대상체에서 입자의 축적 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 입자의 예는 폴리스티렌 입자, 폴리(락트산-코-글리콜산) PLGA 입자, 폴리펩티드 기반 양이온성 중합체 입자, 사이클로덱스트린 입자, 키토산, N,N,N-트리메틸 키토산 입자, 지질 기반 입자, 폴리(β-아미노 에스테르) 입자, 저분자량 폴리에틸렌이민 입자, 폴리포스포에스테르 입자, 디설파이드 가교결합 중합체 입자, 폴리아미도아민 입자, 폴리에틸렌이민(PEI) 입자 및 PLURIONICS 안정화 폴리프로필렌 설파이드 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드는 무기 입자에 캡슐화된다. 일부 실시형태에서, 무기 입자는 금 나노입자(GNP), 금 나노로드(GNR), 자성 나노입자(MNP), 자성 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소 풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 메조다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT) 또는 별 모양의 중공 실리카 나노입자(SHNP)이다.
바람직하게는, 본원에서 기술되는 입자는 용해도를 향상시키고, 식세포에 의한 제거 및 생체내 응집으로 인해 야기되는 가능한 합병증을 방지하고, 음세포작용(pinocytosis)을 촉진하기 위해 나노 수준의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 1000 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 500 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 30 내지 약 100 nm, 약 50 내지 약 100 nm, 또는 약 75 내지 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 30 내지 약 75 nm 또는 약 30 내지 약 50 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 100 내지 약 500 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 200 내지 400 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 350 nm의 평균 크기를 갖는다.
엑소좀
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 엑소좀에 캡슐화된다. 엑소좀은 다소포체가 모 세포(예를 들어, 엑소좀이 방출되는 세포, 본원에서는 공여자 세포라고도 지칭됨)의 원형질막과 융합한 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내 유입 기원의 작은 막 소포이다. 엑소좀의 표면은 모 세포의 세포막으로부터 유래된 지질 이중층을 포함하며, 모 세포 표면 상에서 발현되는 막 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 또한 모 세포로부터의 시토졸(cytosol)을 함유할 수도 있다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포(MC), 및 수지상 세포(DC)를 비롯한 많은 상이한 세포 유형에서 생성되며, 혈장, 뇨, 기관지폐포 세척액, 장 상피 세포, 및 종양 조직에서 확인되었다. 엑소좀의 조성은 엑소좀이 유래된 모 세포 유형에 따라 달라지기 때문에, "엑소좀 특이적" 단백질은 없다. 그러나, 많은 엑소좀은 엑소좀이 모 세포에서 유래한 세포내 소포와 연관된 단백질(예를 들어, 엔도좀 및 리소좀과 연관되고/되거나 이에 의해 발현되는 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 엑소좀은 주요 조직적합성 복합체 I 및 II(MHC-I 및 MHC-II), 테트라스파닌(예를 들어, CD63), 여러 열 충격 단백질, 액틴 및 튜불린과 같은 세포 골격 성분, 세포 내 막 융합에 관여하는 단백질, 세포-세포 상호작용(예를 들어, CD54), 신호 전달 단백질, 및 세포질 효소와 같은 항원 제시 분자(antigen presentation molecule)가 풍부할 수 있다.
엑소좀은 엑소좀 막과 표적 세포의 원형질막의 융합을 통해 하나의 세포(예를 들어, 모 세포)에서 표적 세포 또는 수용체 세포로 세포 단백질의 전달을 매개할 수 있다. 따라서, 엑소좀에 의해 캡슐화되는 물질을 변형시키면 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드와 같은 외인성 제제를 표적 세포에 도입할 수 있는 메커니즘이 제공된다. 하나 이상의 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)를 포함하도록 변형된 엑소좀을 본원에서는 "변형 엑소좀"으로 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 엑소좀은 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)가 모 세포에 도입됨으로써 생성된다. 이러한 실시형태에서, 외인성 핵산은 외인성 핵산 자체 또는 외인성 핵산의 전사체가 모 세포로부터 생성된 변형된 엑소좀에 통합되도록 모 세포인 엑소좀 생성 세포에 도입된다. 외인성 핵산은 예를 들어 외인성 핵산의 형질전환, 형질주입, 전기천공 및/또는 미세주입과 같은 당업자에게 알려진 수단에 의해 모 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 엑소좀은 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈을 엑소좀에 직접 도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈은 온전한 엑소좀에 도입된다. "온전한 엑소좀"은 엑소좀이 생성되는 모 세포로부터 유래된 단백질 및/또는 유전자 물질을 포함하는 엑소좀을 지칭한다. 온전한 엑소좀을 얻는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Alvarez-Erviti L. et al., Nat Biotechnol. 2011 Apr; 29(4):34-5]; 문헌[Ohno S, et al., Mol Ther 2013 Jan; 21(l):185-91]; 및 문헌[EP Patent Publication No. 2010663] 참조).
특정 실시형태에서, 합성 RNA 게놈은 빈 엑소좀에 도입된다. "빈 엑소좀"은 모 세포로부터 유래된 단백질 및/또는 유전자 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)이 결여된 엑소좀을 지칭한다. 빈 엑소좀(예를 들어, 모 세포 유래 유전자 물질이 결여됨)을 생성하는 방법은 UV-노출, 엑소좀 내 핵산의 로딩을 매개하는 내인성 단백질의 돌연변이/결실, 내인성 유전자 물질이 열린 기공을 통해 엑소좀 밖으로 통과하도록 엑소좀 막의 기공을 개방하는 전기 천공 및 화학 처리를 포함하여 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 빈 엑소좀은 엑소좀 막을 얻기 위해 약 9 내지 약 14의 pH를 갖는 수용액으로 처리하여 엑소좀을 개방하고, 소포 내 성분(예를 들어, 소포 내 단백질 및/또는 핵산)을 제거하고, 엑소좀 막을 재조립하여 빈 엑소좀을 형성함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 소포체 내 성분(예를 들어, 소포체 내 단백질 및/또는 핵산)은 초원심분리 또는 밀도 구배 초원심분리에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 막은 초음파, 기계적 진동, 다공성 막을 통한 압출, 전류, 또는 이러한 기술 중 하나 이상의 조합에 의해 재조립된다. 특정 실시형태에서, 막은 공진에 의해 재조립된다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 게놈으로 온전한 또는 빈 엑소좀을 로딩하여 변형된 엑소좀을 생성하는 것은 시험관내 형질 전환, 트랜스펙션 및/또는 미세 주입과 같은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)는 전기 천공에 의해 온전한 또는 비어 있는 엑소좀에 직접 도입된다. 일부 실시형태에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)는 리포펙션(예를 들어, 트랜스펙션)에 의해 온전한 또는 비어 있는 엑소좀에 직접 도입된다. 본 개시에 따른 엑소좀 생성에 사용하기에 적합한 리포펙션 키트는 당업계에 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능(예를 들어, Roche의 FuGENE® HD 트랜스펙션 시약, 및 Invitrogen의 LIPOFECTAMINETM 2000)하다. 일부 실시형태에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)는 열 충격을 이용한 형질 전환에 의해 온전한 또는 비어 있는 엑소좀에 직접 도입된다. 이러한 실시형태에서, 모 세포로부터 단리된 엑소좀은 엑소좀 막을 투과시키기 위해 Ca2+(CaCl2)와 같은 2가 양이온의 존재 하에서 냉각시킨다. 그런 다음, 엑소좀을 외인성 핵산과 함께 배양하고, 잠시 열 충격을 가할 수 있다(예를 들어, 42℃에서 30-120초 동안 배양). 특정 실시형태에서, 외인성 제제(예를 들어, 본원에서 기술되는 폴리뉴클레오티드)로 빈 엑소좀을 로딩하는 것은 소포내 성분을 제거한 후 제제를 엑소좀 막과 혼합하거나 함께 배양함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 엑소좀 막으로부터 재조립된 변형된 엑소좀은 외인성 제제를 소포 내 공간으로 혼입할 것이다. 엑소좀 캡슐화된 핵산을 제조하는 추가적인 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,889,210호; 제9,629,929호; 및 제9,085,778호; 국제 PCT 공개 WO 2017/161010호 및 WO 2018/039119호 참조).
엑소좀은 세포주, 골수 유래 세포, 및 일차 환자 샘플에서 추출한 세포를 포함하여 다양한 모 세포로부터 얻을 수 있다. 모 세포에서 방출된 엑소좀은 당업계에 알려진 방법으로 모 세포 배양의 상청액으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 전하(예를 들어, 전기영동 분리), 크기(예를 들어, 여과, 분자 체질 등), 밀도(예를 들어, 일반 또는 경사 원심분리) 및 Svedberg 상수(예를 들어, 외력을 가하거나 가하지 않는 침전 등)에 기초한 분리를 포함하여 엑소좀의 물리적 특성을 사용하여 엑소좀을 매질 또는 기타 소스 물질로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 하나 이상의 생물학적 특성에 기초하여 단리할 수 있으며, 표면 마커를 사용할 수 있는 방법(예를 들어, 침전, 고상에 대한 가역적 결합, FACS 분리, 특이적 리간드 결합, 비특이적 리간드 결합 등)을 포함할 수 있다. 엑소좀 표면 단백질의 분석은 CD63과 같은 엑소좀 관련 단백질에 형광 표지된 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 측정할 수 있다. 엑소좀을 특성화하기 위한 추가 마커는 국제 PCT 공개 WO 2017/161010호에 기술되어 있다. 추가로 고려되는 방법에서, 엑소좀은 또한 PEG 유도 융합 및/또는 초음파 융합을 포함한 화학적 및/또는 물리적 방법을 사용하여 융합할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 엑소좀을 단리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, (하나 이상의 크로마토그래피 분획의) 원심분리 기술에 의한 크로마토그래피 분리 후에 추가로 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀의 단리는 전술한 바와 같은 차등 원심분리(문헌[Raposo, G. et al., J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996)] 참조), 초원심분리, 크기 기반 막 여과, 농도 및/또는 속도 구역 원심분리를 포함하는 방법들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 엑소좀 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세리드, 스테롤, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 막은 하나 이상의 폴리펩티드 및 하나 이상의 다당류, 예를 들어 글리칸을 포함할 수 있다. 하나 이상의 막 성분의 상대적인 양을 변경하는 예시적인 엑소좀 막 조성물 및 방법이 국제 PCT 공개 WO 2018/039119호에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 입자는 엑소좀이며, 약 30 내지 약 100 nm, 약 30 내지 약 200 nm, 또는 약 30 내지 약 500 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 엑소좀이며, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 150 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 250 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자는 엑소좀이며, 약 20 nm 내지 300 nm, 약 40 nm 내지 200 nm, 약 20 nm 내지 250 nm, 약 30 nm 내지 150 nm, 또는 약 30 nm 내지 100 nm의 직경을 갖는다.
화합물
화학식 (I)의 화합물
다양한 실시형태에서, 본원에서 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다:
화학식 (I)
상기 식에서,
A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이다.
일부 실시형태에서, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-a)
상기 식에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-b)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-b)
상기 식에서, n은 0, 1, 2 또는 3이고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-bi)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-bi)
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-bii)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-bii)
상기 식에서, m은 0, 1, 2, 또는 3이고; p 및 q는 각각 0, 1, 2, 또는 3이며, q + p는 3 이하이다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-biii)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-biii)
일부 실시형태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I-c)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 (I-c)
일부 실시형태에서, A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다.
일부 실시형태에서, A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2)이다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C3 알킬렌, C2-C4 알케닐, 또는 C3-C4 사이클로알킬로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, -CH2CH=CH2, -CH2CH2OH, , 또는 로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 동일하다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 각각 수소이다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 각각 C2-C4 알케닐, 예를 들어, -CH2CH=CH2이다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 각각 하이드록시-C1-C3 알킬렌, 예를 들어, -CH2CH2OH이다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2는 상이하다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 C3-C4 사이클로알킬이다. 일부 실시형태에서, RN1 및 RN2 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 이다.
일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다.일부 실시형태에서, A는 정확히 하나의 N을 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다. 일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 비치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다.일부 실시형태에서, A는 정확히 하나의 N을 포함하는 비치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다. 일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리이다.일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 비치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리이다.
일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이며, A의 N 원자는 3차 아민이다.
일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하고, 하나 이상의 S를 추가로 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다. 일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하고, 정확히 하나의 S를 추가로 포함하는 임의로 치환된 4~7원 헤테로사이클릴 고리이다.
일부 실시형태에서, A는 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판 및 티오모르폴린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, A는 피롤리딘 및 피페리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C1-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C1-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬이다.
일부 실시형태에서, L1 및 L2는 동일하다. 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 상이하다.
일부 실시형태에서, L1은 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L2는 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L1은 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L2는 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 사슬이다.
일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2CH2CH2-이다. 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2CH2-이다. 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2-이다.
일부 실시형태에서, L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C6 사이클로알킬렌이다. 일부 실시형태에서, L3은 결합이다. 일부 실시형태에서, L3은 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L3은 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L3은 비치환된 C1-C3 알킬렌 사슬이다. 일부 실시형태에서, L3은 -CH2-이다. 일부 실시형태에서, L3은 -CH2CH2-이다. 일부 실시형태에서, L3은 -CH2CH2CH2-이다. 일부 실시형태에서, L3은 2가의 C3-C6 사이클로알킬렌이다. 일부 실시형태에서, L3은 이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~10이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~5이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 2이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 3이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자의 수는 4이다.
일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 임의로 치환된 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 임의로 치환된 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C1-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C1-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C5-C25 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C5-C25 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 비치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 비치환된 C10-C20 알킬이다.
일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 비치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 비치환된 C14-C16 알킬이다.
일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, R2는 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 동일하다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 상이하다. 일부 실시형태에서, R1은 임의로 치환된 C6-C20 알케닐이며, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1은 C6-C20 알케닐이며, R2는 분지형 C10-C20 알킬이다.
일부 실시형태에서, A는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이며, 0~6개의 R3으로 임의로 치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 지방족이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 알킬이다. 일부 실시형태에서, R3은 비치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 실시형태에서, R3은 비치환된 C1-C3 알킬이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 알케닐이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 알케닐이다. 일부 실시형태에서, R3은 비치환된 C1-C6 알케닐이다. 일부 실시형태에서, R3은 비치환된 C1-C3 알케닐이다.
일부 실시형태에서, R3은 1~3개의 C3-C6 사이클로알킬로 치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 1개의 C3-C6 사이클로알킬로 치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 사이클로프로판일로 치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 1~3개의 -OH로 치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 1개의 -OH로 치환된다.
일부 실시형태에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시형태에서, m은 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, m은 0이다. 일부 실시형태에서, m은 1이다. 일부 실시형태에서, m은 2이다. 일부 실시형태에서, m은 3이다. 일부 실시형태에서, m은 4이다. 일부 실시형태에서, m은 5이다. 일부 실시형태에서, m은 6이다.
일부 실시형태에서, n은 0, 1, 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, n은 0이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다. 일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 표 21로부터 선택되는 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
표 21
화학식 (A)의 화합물
다양한 실시형태에서, 본원에서 하기 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
,
화학식 (A)
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1은 -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며;
RP2는 수소 또는 -CH3이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)는 HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3이 아니다.
일부 실시형태에서, LP1은 -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A-a), 화학식 (A-b), 화학식 (A-c), 화학식 (A-d), 또는 화학식 (A-e)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (A-a) 화학식 (A-b)
화학식 (A-c) 화학식 (A-d)
화학식 (A-e)
일부 실시형태에서, RP1은 C6-C24, C10-C20, C10-C18, C10-C16, C10-C14, C10-C12, C12-C20, C12-C18, C12-C16, C12-C14, C14-C20, C14-C18, C14-C16, C16-C20, C16-C18, 또는 C18-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C14-C18 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C14-C16 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C15-C17 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C16-C18 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, 또는 C24 알킬이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C6-C24, C10-C20, C10-C18, C10-C16, C10-C14, C10-C12, C12-C20, C12-C18, C12-C16, C12-C14, C14-C20, C14-C18, C14-C16, C16-C20, C16-C18, 또는 C18-C20 알케닐이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C14-C18 알케닐이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C14-C16 알케닐이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C15-C17 알케닐이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C16-C18 알케닐이다. 일부 실시형태에서, RP1은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, 또는 C24 알케닐이다.
일부 실시형태에서, RP2는 수소이다. 일부 실시형태에서, RP2는 -CH3이다.
일부 실시형태에서, n은 평균 10 내지 200, 10 내지 180, 10 내지 160, 10 내지 140, 10 내지 120, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 20 내지 200, 20 내지 180, 20 내지 160, 20 내지 140, 20 내지 120, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 60, 20 내지 40, 40 내지 200, 40 내지 180, 40 내지 160, 40 내지 140, 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 80, 40 내지 60, 60 내지 200, 60 내지 180, 60 내지 160, 60 내지 140, 60 내지 120, 60 내지 100, 60 내지 80, 80 내지 200, 80 내지 180, 80 내지 160, 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 180, 100 내지 160, 100 내지 140, 100 내지 120, 120 내지 200, 120 내지 180, 120 내지 160, 120 내지 140, 140 내지 200, 140 내지 180, 140 내지 160, 160 내지 200, 160 내지 180, 또는 180 내지 200이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 20이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 40이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 45이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 50이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 68이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 75이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 100이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (A)의 화합물은 이하로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임;
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45임;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45임; 및
HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
대안적인 실시형태
대안적인 실시형태에서, 본원에서 기술되는 화합물은 또한 하나 이상의 동위원소 치환기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 수소는 2H(D 또는 중수소) 또는 3H(T 또는 삼중수소)일 수 있고; 탄소는 예를 들어 13C 또는 14C일 수 있고; 산소는 예를 들어 18O일 수 있으며; 질소는 예를 들어 15N 등일 수 있다. 다른 실시형태에서, 특정 동위원소(예를 들어, 3H, 13C, 14C, 18O, 또는 15N)는 화합물의 특정 부위를 차지하는 원소의 총 동위원소 존재비(isotopic abundance)의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%를 나타낼 수 있다.
지질 나노입자
특정 실시형태에서, 본원에서 기술되는 합성 RNA 바이러스 게놈은 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된다. 특정 실시형태에서, LNP는 하나 이상의 지질, 예를 들어 트리글리세리드(예를 들어, 트리스테아린), 디글리세리드(예를 들어, 글리세롤 바헤네이트), 모노글리세리드(예를 들어, 글리세롤 모노스테아레이트), 지방산(예를 들어, 스테아르산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 및 왁스(예를 들어, 세틸 팔미테이트)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 구조 지질, 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 중성 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 화합물은 나노입자를 형성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 실시형태에서, LNP는 PEG-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 및 구조 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 LNP는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료제를 전달하기 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기술되는 LNP는 이를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 전달하기 위해 제형화된다.
LNP에서 지질의 제형은 특정 LNP의 치료 용도 및 효능에 상당한 영향을 미친다. 예를 들어, SS-OC/콜레스테롤/DSPC/PEG2k-DPG와 같은 LNP 제형은 일반적으로는, 예를 들어, 마우스, 비인간 영장류(NHP) 및/또는 인간에서 정맥내(IV) 투여를 반복할 때 증가된 제거율을 나타내며, 첫 번째 투여 후보다는 두 번째 투여 후에 생체내 순환 시간이 훨씬 더 짧다. 순환 시간이 단축되면 LNP가 표적에 덜 노출되기 때문에 LNP 전달 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이러한 제형은 다중 투여를 필요로 하지 않는 제제를 전달하는 데는 유용할 수 있지만, 후속 투여를 필요로 하는 제제의 전달을 위한 이의 사용은 이러한 단축된 순환 시간으로 인해 제한될 수 있다.
반복 투여 시 생체 내에서 표적 세포에 대한 조정 가능한 순환 및 노출, 예를 들어 지속적인 순환 및 일관된 노출을 입증하는 LNP 제형이 여전히 필요하다. 본 개시는 개시내용의 이온화 가능한 지질 및/또는 PEG-지질을 LNP의 지질 제형에 혼입시킴으로써 이러한 LNP 제형을 제공한다. 반복 투여 시 본 개시의 LNP의 지속적인 순환은 결과적으로 그 안에 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈의 지속적인 치료 효과를 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 이온화 가능한 지질 및/또는 PEG-지질이 없는 경우, 반복 투여 시 LNP 및 그의 성분의 신속한 제거는 신체가 합성 RNA 바이러스 게놈의 방출 전에 LNP를 제거할 수 있기 때문에 후속 투여에서 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈의 전달 효율을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 이온화가능한 지질 및/또는 PEG-지질은 LNP에 혼입될 때 반복 투여 시 LNP의 제거를 지연시켜 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈의 지속적인 방출 및 치료 효과를 가능하게 한다.
폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질
일부 실시형태에서, 개시내용의 PEG-지질은 친수성 헤드 기 및 소수성 지질 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 헤드 기는 PEG 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 PEG-지질은 단일 지질 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 PEG-지질은 모노 알킬 지질 꼬리, 모노 알케닐 지질 꼬리, 모노 알키닐 지질 꼬리, 또는 모노 아실 지질 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모노 지질 꼬리는 에테르기, 카보닐기, 또는 에스테르기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알케닐 에테르, 또는 폴리옥시에틸렌 알키닐 에테르(이러한 분자는 또한 BRIJTM 또는 Brij 분자로도 알려져 있음)를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 알킬 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알케닐 에스테르, 또는 폴리옥시에틸렌 알키닐 에스테르(이러한 분자는 또한 MYRJTM 분자로도 알려져 있음)를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 디아실 지질 꼬리를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (A)
상기 식에서, 변수들은 본원에 정의되어 있다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A')의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (A')
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1'은 결합, -C(O)-, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1'은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며;
RP2'는 수소 또는 -CH3이다.
일부 실시형태에서, LP1'은 결합, -C(O)-, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다. 일부 실시형태에서, RP1'는 RP1이다. 일부 실시형태에서, RP2'는 RP2이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (A")
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고;
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이며;
RP2"는 수소 또는 -CH3이다.
일부 실시형태에서, LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 화학식 (A''-a), 화학식 (A''-b), 화학식 (A''-c), 화학식 (A''-cd), 화학식(A''-e), 또는 화학식(A''-f)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (A"-a) 화학식 (A"-b)
화학식 (A"-c) 화학식 (A"-d)
화학식 (A"-e) 화학식 (A"-f)
일부 실시형태에서, RP1"는 RP1이다. 일부 실시형태에서, RP2"는 RP2이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A"-f1)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (A"-f1)
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A"-f2)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (A"-f2)
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (A"-f3)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (A"-f3)
일부 실시형태에서, 본 개시의 PEG-지질은 하기 화학식 (B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
,
화학식 (B)
상기 식에서,
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이며;
RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이다.
일부 실시형태에서, RB1은 RP1이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (B-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (B-a)
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화학식 (B-b)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (B-b)
일부 실시형태에서, n은 평균 10 내지 200, 10 내지 180, 10 내지 160, 10 내지 140, 10 내지 120, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 20 내지 200, 20 내지 180, 20 내지 160, 20 내지 140, 20 내지 120, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 60, 20 내지 40, 40 내지 200, 40 내지 180, 40 내지 160, 40 내지 140, 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 80, 40 내지 60, 60 내지 200, 60 내지 180, 60 내지 160, 60 내지 140, 60 내지 120, 60 내지 100, 60 내지 80, 80 내지 200, 80 내지 180, 80 내지 160, 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 180, 100 내지 160, 100 내지 140, 100 내지 120, 120 내지 200, 120 내지 180, 120 내지 160, 120 내지 140, 140 내지 200, 140 내지 180, 140 내지 160, 160 내지 200, 160 내지 180, 또는 180 내지 200이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 20이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 40이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 45이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 50이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 68이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 75이다. 일부 실시형태에서, n은 평균 약 100이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 약 500 내지 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 약 500 내지 약 5,000 달톤, 약 500 내지 약 4,000 달톤, 약 500 내지 약 3,000 달톤, 약 500 내지 약 2,000 달톤, 약 500 내지 약 1,000 달톤, 약 500 내지 약 800 달톤, 약 500 내지 약 600 달톤, 약 600 내지 약 5,000 달톤, 약 600 내지 약 4,000 달톤, 약 600 내지 약 3,000 달톤, 약 600 내지 약 2,000 달톤, 약 600 내지 약 1,000 달톤, 약 600 내지 약 800 달톤, 약 800 내지 약 5,000 달톤, 약 800 내지 약 4,000 달톤, 약 800 내지 약 3,000 달톤, 약 800 내지 약 2,000 달톤, 약 800 내지 약 1,000 달톤, 약 1,000 내지 약 5,000 달톤, 약 1,000 내지 약 4,000 달톤, 약 1,000 내지 약 3,000 달톤, 약 1,000 내지 약 2,000 달톤, 약 2,000 내지 약 5,000 달톤, 약 2,000 내지 약 4,000 달톤, 약 2,000 내지 약 3,000 달톤, 약 3,000 내지 약 5,000 달톤, 약 3,000 내지 약 4,000 달톤, 약 5,000 내지 약 10,000 달톤, 약 5,000 내지 약 7,500 달톤, 또는 약 7,500 내지 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 PEG 모이어티는 약 1.500 내지 약 2,500 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 PEG 모이어티는 약 1.000 내지 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 약 500, 약 600, 약 800, 약 1,000, 약 1,500, 약 2,000, 약 ,2500, 약 3,000, 약 3,500, 약 4,000, 약 4,500, 약 5,000, 약 6,000, 약 7,000, 약 8,000, 약 9,000, 또는 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 7,000, 적어도 8,000, 적어도 9,000, 또는 적어도 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 500 이하, 1,000 이하, 1,500 이하, 2,000 이하, 2,500 이하, 3,000 이하, 3,500 이하, 4,000 이하, 4,500 이하, 5,000 이하, 6,000 이하, 7,000 이하, 8,000 이하, 9,000 이하, 또는 10,000 달톤 이하의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 모든 값은 모든 종말점을 포함한다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 (100) 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르, 또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 (100) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (50) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (40) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 팔미테이트, 또는 이들의 혼합물이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9005-00의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C18H37(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 100이다)을 갖는
(BRIJTM S100)이다. BRIJTM S100은 또한, 일반적으로는, 폴리옥시에틸렌 (100) 스테아릴 에테르로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9004-95-9의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C16H33(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 20이다)을 갖는 (BRIJTM C20)이다. BRIJTM C20은 또한 BRIJTM 58, 및, 일반적으로는, 폴리에틸렌 글리콜 헥사데실 에테르, 즉 폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9004-98-2의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C18H35(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 20이다)을 갖는
(BRIJTM O20)이다. BRIJTM O20은 또한, 일반적으로는, 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG20-C18H35이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9005-00-9의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C18H37(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 20이다)을 갖는 (BRIJTM S20)이다. BRIJTM S20은 또한, 일반적으로는, 폴리에틸렌 글리콜 옥타데실 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 100이다)을 갖는 (MYRJTM S100)이다. MYRJTM S100은 또한, 일반적으로는, 폴리옥시에틸렌 (100) 스테아레이트로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)15CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 50이다)을 갖는
(MYRJTM S50)이다. MYRJTM S50은 또한, 일반적으로는, 폴리옥시에틸렌 (50) 스테아레이트로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG50-CH2(CH2)15CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖고 선형 화학식 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH(여기서, n은 40이다)을 갖는 (MYRJTM S40)이다. MYRJTM S40은 또한, 일반적으로는, 폴리옥시에틸렌 (40) 스테아레이트로도 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG-지질은 HO-PEG40-CH2(CH2)15CH3이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화합물이다:
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 하기 화합물이다:
.
본 개시의 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌) 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데코실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 또는 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 단일 지질 꼬리를 갖는 PEG-지질(예를 들어, 화학식 (A), (A'), (A") 또는 (B)의 PEG-지질)은 본 개시의 LNP 조성물의 투여 시에 및/또는 반복 투여 시에 가속 혈액 통과(ABC: accelerated blood clearance)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 단일 지질 꼬리를 갖는 PEG-지질은 본 개시의 LNP 조성물의 투여 시에 및/또는 반복 투여 시에 대상체의 면역계에 의해 생성되는 PEG-특이 항체(예를 들어, 항-PEG IgM)를 감소시키거나 고갈시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 하나 이상의 C6-C20 알킬을 포함하는 지질에 공유 결합된 최대 5 kDa 길이를 갖는 폴리(에틸렌)글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌 글리콜)(DSPE-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)](DSPE-PEG-아민)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DSPE-PEG5K이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DPG-PEG2K이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DSG-PEG2K이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DMG-PEG2K이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DSG-PEG5K이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DMG-PEG5K이다.
일부 실시형태에서, PEG 지질은 절단 가능한 PEG 지질이다. 절단 가능한 결합을 갖는 PEG 유도체의 예로는 펩티드 결합(문헌[Kulkarnietal. (2014).Mmp-9 responsive PEG cleavable nanovesicles for efficient delivery of chemotherapeutics to pancreatic cancer. Mol Pharmaceutics 11:2390-9]; 문헌[Linetal. (2015).Drug/dye-loaded, multifunctional peg-chitosan-iron oxide nanocomposites for methotraxate synergistically self-targeted cancer therapy and dual model imaging. ACS Appl Mater Interfaces 7:11908-20]), 디설파이드 열쇠(disulfide key)(문헌[Yanet al(2014).A method to accelerate the gelation of disulfide-crosslinked hydrogels. Chin J Polym Sci 33:118-27]; 문헌[Wu& Yan(2015).Copper nanopowder catalyzed cross-coupling of diaryl disulfides with aryl iodides in PEG-400. Synlett 26:537-42]), 비닐 에테르 결합, 하이드라존 결합(문헌[Kellyetal. (2016).Polymeric prodrug combination to exploit the therapeutic potential of antimicrobial peptides against cancer cells. Org Biomol Chem 14:9278-86]), 및 에스테르 결합(문헌[Xuetal. (2008).Esterase-catalyzed dePEGylation of pH-sensitive vesicles modified with cleavable PEG-lipid derivatives. J Control Release 130:238-45])으로 변형된 것들을 포함한다. 또한, 문헌[Fang et al., (2017)Cleaveable PEGylation: a strategy for overcoming the "PEG dilemma" in efficient drug delivery. Drug Delivery 24:2, 22-32]을 참조한다.
일부 실시형태에서, PEG 지질은 활성화된 PEG 지질이다. 예시적인 활성화된 PEG 지질은 PEG-NH2, PEG-MAL, PEG-NHS, 및 PEG-ALD를 포함한다. 이러한 기능화된 PEG 지질은 (예를 들어, 항원 결합 분자, 펩티드, 글리칸 등의 부착에 의해) 입자를 특정 표적 세포 또는 조직으로 유도하기 위해 표적화 모이어티를 지질 나노입자에 접합하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 기능화된 모이어티(예를 들어, -NH2, _MAL, -NHS, -ALD)는 본 개시의 PEG-지질(예를 들어, BRIJTM 또는 MYRJTM 계열 PEG 지질)의 PEG 모이어티의 자유 말단에 추가된다.
양이온성 지질
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. "양이온성 지질" 및 "이온화 가능한 지질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
양이온성 지질은 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띠는 많은 지질 종 중 하나를 지칭한다. 이러한 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 디옥타데실디메틸암모늄(DODMA), 디스테아릴디메틸암모늄(DSDMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 생리학적 pH 미만에서 양전하를 갖는 양이온성 지질은 DODAP, DODMA 및 DMDMA를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 C18 알킬 사슬, 헤드 기와 알킬 사슬 사이의 에테르 결합, 및 0 내지 3개의 이중 결합을 포함한다. 이러한 지질은, 예를 들어, DSDMA, DLinDMA, DLenDMA 및 DODMA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 양자화 가능한 3차 아민 헤드 기를 포함한다. 이러한 지질은 본원에서 이온화 가능한 지질로 지칭된다. 이온화 가능한 지질은 이온화 가능한 아민 헤드 기를 포함하며 전형적으로는 약 7 미만의 pKa를 포함하는 지질 종을 지칭한다. 따라서, 산성 pH를 갖는 환경에서, 이온화 가능한 아민 헤드 기는 이온화 가능한 지질이 음으로 하전된 분자(예를 들어, 본원에 기술된 재조합 폴리뉴클레오티드와 같은 핵산)와 우선적으로 상호작용하여 나노입자 조립 및 캡슐화를 용이하게 하도록 양자화된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자로의 핵산의 로딩을 증가시킬 수 있다. pH가 약 7을 초과하는 환경(예를 들어, 약 7.4의 생리학적 pH)에서, 이온화 가능한 지질은 중성 전하를 포함한다. 이온화 가능한 지질을 포함하는 입자가 엔도솜의 낮은 pH 환경(예를 들어, pH <7)으로 흡수되는 경우, 이온화 가능한 지질은 다시 양자화되어 음이온성 엔도솜 막과 결합하여 입자에 의해 캡슐화된 내용물의 방출을 촉진한다. 일부 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 예를 들어 7.SS-절단 가능하고 pH 반응성인 지질 유사 물질(예를 들어, COATSOME® SS-계열)을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이들의 혼합물이다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
,
화학식 (I)
상기 식에서, 변수들은 본원에 정의되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 양이온성 지질은 표 21로부터 선택되는 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 하기 화학식 (II-1)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식(II-1),
상기 식에서,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 C1-C8 지방족 또는 -O(C1-C8 지방족)-이며, 여기서 O 원자는, 존재하는 경우, 피페리딘 고리에 결합되고;
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, 또는 -O-이며, 여기서 -*는 각각 R2a 또는 R2b에 대한 부착 지점을 나타내고, Rx 1의 각각의 발생은 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기, 또는 C13-C23 지방족이다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 하기 화학식 (II-2)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식(II-2),
상기 식에서,
R1a' 및 R1b'는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 -O(C1-C8 알킬렌)이며, 여기서 O 원자는, 존재하는 경우, 피페리딘 고리에 결합되고;
Ya’ 및 Yb’는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, -N(Rx 1)C(O)N(Rx 1)-, 또는 -O-이며, 여기서 -*는 R2a 또는 R2b에 대한 부착 지점을 나타내고, Rx 1의 각각의 발생은 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
Za’ 및 Zb’는 각각 독립적으로 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 알킬렌 또는 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 헤테로알킬렌이고, 여기서 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기는 각각 Ya' 및 Yb'에 결합되며;
R2a' 및 R2b'는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기, 또는 C12-C22 지방족이다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 하기 화학식 (II-1a) (COATSOME® SS-OC) 또는 화학식 (II-2a) (COATSOME® SS-OP)의 화합물이다:
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 (II-1a) (COATSOME® SS-OC)의 화합물이다. COATSOME® SS-OC는 또한 SS-18/4PE-16으로도 알려져 있다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 (II-2a) (COATSOME® SS-OP)의 화합물이다.
일부 실시형태에서, LNP의 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
헬퍼 지질
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 LNP는 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함한다. 용어 "헬퍼 지질"은 LNP의 표적, 예를 들어 세포 내로의 전달을 증가시킬 수 있는 지질을 지칭한다. 임의의 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 헬퍼 지질은 지질 나노입자의 안정성 및/또는 막 융합성을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 인지질이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 인지질 대체물 또는 대체물이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 알킬 레조르시놀이다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 포스파티딜 콜린(PC)이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 포스파티딜 콜린(PC)이 아니다. 일부 실시형태에서 헬퍼 지질은 인지질 또는 인지질 대체물이다. 일부 실시형태에서, 인지질 또는 인지질 대체물은, 예를 들어, 하나 이상의 포화 또는 (폴리)불포화 인지질, 또는 인지질 대체물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일반적으로, 인지질은 인산염 헤드 기와 하나 이상의 지방산 꼬리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 하나 이상의 다중(예를 들어, 이중 또는 삼중) 결합(즉, 하나 이상의 불포화기)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 비양이온성이다.
포스페이트 헤드 기는, 예를 들어, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
지방산 꼬리는, 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피타노산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산 및 도코사헥사에노산으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜 글리세롤 및 포스파티드산과 같은 글리세로인지질을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 인지질은 또한 스핑고미엘린과 같은 포스포스핑고지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비양이온성 헬퍼 지질은 DSPC 유사체, DSPC 대체물, 올레산 또는 올레산 유사체이다.
일부 실시형태에서, 비양이온성 헬퍼 지질은 비-포스파티딜 콜린(PC) 양쪽이온성 지질, DSPC 유사체, 올레산, 올레산 유사체, 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 대체물이다.
일부 실시형태에서, 인지질은 막으로의 융합을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 인지질은 막(예를 들어, 세포막 또는 세포내 막)의 하나 이상의 음으로 하전된 인지질과 상호작용할 수 있다. 막에 대한 인지질의 융합은 지질 함유 조성물의 하나 이상의 요소가 막을 통과하여, 예를 들어, 하나 이상의 요소가 세포로 전달되도록 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포스페이트 헤드 기는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 지방산 꼬리는, 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피타노산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산 및 도코사헥사에노산으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인지질은 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
상기 식에서, Rp는 포스페이트 헤드 기를 나타내며, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있는 불포화가 있거나 없는 지방산 꼬리를 나타낸다. 포스페이트 헤드 기는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 지방산 꼬리는 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산 및 도코사헥사에노산으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 분지화, 산화, 고리화 및 알킨을 포함하는 변형 및 치환기를 갖는 천연 종을 포함하는 비천연 종도 또한 고려된다. 예를 들어, 인지질은 하나 이상의 알킨(예를 들어, 하나 이상의 이중 결합이 삼중 결합으로 대체된 알케닐기)으로 작능화되거나 교차 결합될 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, 알킨기는 아지드에 노출되면 구리 촉매에 의한 고리 첨가 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 반응은 LNP의 지질 이중 층을 작용화하여 막 투과 또는 세포 인식을 촉진하거나 LNP를 표적화 또는 이미지화 모이어티(예를 들어, 염료)와 같은 유용한 성분에 접합시키는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP는 하나 이상의 비양이온성 헬퍼 지질(예를 들어, 중성 지질)을 포함한다. 예시적인 중성 헬퍼 지질은 (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)(DLPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DiPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 세라미드, 및 스핑고미엘린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, LNP의 헬퍼 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DLPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOPE를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:3 (시스) PC), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(22:6 (시스) PC), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(4ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PE(18:2/18:2), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PE 18:3(9Z,12Z, 15Z), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DAPE 18:3(9Z,12Z, 15Z), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(22:6 (시스) PE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨 염(DOPG), 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 헬퍼 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸포스파티딜에탄올아민, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레올포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티딘산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 헬퍼 지질은 DSPC이다.
일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DMPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DSPC 및 DOPE를 모두 포함한다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DSPC, DMPE 및 DOPC 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 하기 화합물이다:
일부 실시형태에서, 본 개시의 인지질은 변형된 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인지질은 변형된 꼬리를 갖는 DSPC(1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 또는 이의 유사체이다. 본원에 기술된 바와 같이, "변형된 꼬리"는 더 짧거나 더 긴 지방족 사슬, 분지가 도입된 지방족 사슬, 치환기가 도입된 지방족 사슬, 하나 이상의 메틸렌이 고리 또는 헤테로원자 기로 치환된 지방족 사슬, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 꼬리일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 헬퍼 지질은 인지질이 아닌 대안적인 지질이다.
일부 실시형태에서, 본 개시에서 유용한 인지질은 변형된 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시에서 유용한 인지질은 변형된 꼬리를 갖는 DSPC 또는 이의 유사체이다. 본원에 기술된 바와 같이, "변형된 꼬리"는 더 짧거나 더 긴 지방족 사슬, 분지가 도입된 지방족 사슬, 치환기가 도입된 지방족 사슬, 하나 이상의 메틸렌이 고리 또는 헤테로원자 기로 치환된 지방족 사슬, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 꼬리일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시에서 유용한 인지질은 변형된 포스포콜린 모이어티를 포함하며, 여기서 4차 아민을 포스포릴기에 연결하는 알킬 사슬은 에틸렌이 아니다(예를 들어, n은 2가 아니다).
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 헬퍼 지질로서 올레산 또는 올레산 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올레산 유사체는 변형된 올레산 꼬리, 변형된 카복실산 모이어티, 또는 이들 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올레산 유사체는 올레산의 카복실산 모이어티가 다른 기로 치환된 화합물이다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 인지질 대신에 헬퍼 지질로서 상이한 양쪽이온성 기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 헬퍼 지질은 자연 발생성 막 지질이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 헬퍼 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-O-4'-(N,N,N-트리메틸)-호모세린(DGTS), 모노갈락토실디아실글리세롤(MGDG), 디갈락토실디아실글리세롤(DGDG), 설포퀴노보실디아실글리세롤(SQDG), 1-팔미토일-2-시스-9,10-메틸렌헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(Cyclo PC), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 헬퍼 지질의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질의 조합은 DSPC를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질의 조합은 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자연 발생성 막 지질(예를 들어, DGTS)을 포함하는 LNP는 유일한 헬퍼 지질로서 DSPC를 포함하는 LNP와 비교하였을 때 LNP에 캡슐화된 표적 분자의 개선된 간 형질감염/전달을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 헬퍼 지질은 5-헵타데실레조르시놀 또는 이의 유도체이다.
구조 지질
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 하나 이상의 구조 지질을 포함한다. 지질 나노입자에 구조 지질을 포함시키면 입자 내의 다른 지질의 응집을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 구조 지질은 스테롤 또는 스테롤 부분을 함유하는 지질일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, LNP의 구조 지질은 스테롤(예를 들어, 피토스테롤 또는 동물성 스테롤)이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤, 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤, β-시토스테롤, 페코스테롤, 에르고스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 알파-토코페롤(이의 유사체, 염 또는 에스테르 포함)을 단독으로 또는 조합하여 포함한다 .
일부 실시형태에서, LNP의 구조 지질은 콜레스테롤, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 덱사메타손, 프레드니손 및 하이드로코르티손) 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태예에서, LNP의 구조 지질은 피토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 피토스테롤은 시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 시토스타놀, 캄페스타놀, 브라시카스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스타놀, 베타-시토스타놀, 에르고스테롤, 루페올, 사이클로아르테놀, A5-아베나세롤, A7-아베나세롤 또는 A7-스티그마스테롤(이의 유사체, 염 또는 에스테르 포함), 단독 또는 조합이다.
일부 실시형태에서, LNP는 하나 이상의 피토스테롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP의 피토스테롤 성분은 단일 피토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP의 피토스테롤 성분은 다양한 피토스테롤(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 서로 다른 피토스테롤)의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP의 피토스테롤 성분은 하나 이상의 피토스테롤과 하나 이상의 동물성 스테롤의 혼합물, 예를 들어 피토스테롤(예를 들어 베타-시토스테롤과 같은 시토스테롤)과 콜레스테롤의 혼합물이다.
본 개시의 일부 실시형태에서, LNP의 구조 지질은 콜레스테롤이다:
C27H46O의 선형구조식인, CAS 번호 57-88-5을 갖는 콜레스테롤.
일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 DLin-MC3-DMA(MC3)이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-EC이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-LC이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 *?*하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OP이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 L-319이다. 일부 실시형태에서, LNP는 구조지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다.
일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DLPE를 포함한다. 일부 실시 형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DOPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 하나 이상의 헬퍼 지질은 DOPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 구조 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다.
일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 구조 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTAP이고, 헬퍼 지질은 DLPE이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 MC3이고, 보조 지질은 DSPC이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DOPE이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질, 구조 지질, 및 적어도 2개의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이고, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 DLPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질, 구조 지질, 및 적어도 2개의 헬퍼 지질을 포함하며, 여기서 양이온성 지질은 MC3이고, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 DOPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 헬퍼 지질은 DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 실시예에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤 및 DLPE를 포함한다. 일부 실시 형태에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤 및 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤 및 DOPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DLPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤, DSPC 및 DMG를 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DLPE 및 DSPE-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤, DSPC 및 DMG-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DOPE 및 DSPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤, DOPE 및 DSPE-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 및 DPG-PEG(예를 들어, DPG-PEG2K)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 I의 PEG-지질(예를 들어, BRIJ™ S100)을 포함한다.
LNP 조성물중의 지질 몰비
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 모든 종말점을 포함하여, 40 몰% 내지 70 몰%의 양이온성 지질, 최대 50 몰%의 헬퍼 지질, 10 몰% 내지 50 몰%의 구조 지질, 및 0.001 몰% 내지 5 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질의 총 몰%는 100%이다.
일부 실시형태에서, LNP 중 양이온성 지질의 몰%는 40 내지 70몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 45몰%, 44 내지 54몰%, 45 내지 60몰%, 45 내지 55몰%, 45 내지 50몰%, 50 내지 60몰%, 49 내지 64몰%, 50 내지 55몰%, 또는 55 내지 60몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중 양이온성 지질의 몰%는 44 내지 54 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중 양이온성 지질의 몰%는 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중 양이온성 지질의 몰%는 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56 , 약 57, 약 58, 약 59, 또는 약 60 몰%이다. 모든 값에는 모든 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 10 내지 60몰%, 10 내지 30몰%, 15 내지 35몰%, 20 내지 40몰%, 20 내지 45몰%, 25 내지 33몰%, 24 내지 32몰%, 25 내지 45몰%, 30 내지 50몰%, 35 내지 43몰%, 35 내지 55몰%, 또는 40 내지 60몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 20 내지 45 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 24 내지 32 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 25 내지 33 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 22 내지 28 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 35 내지 45 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 35 내지 43 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 10 내지 60 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 구조 지질의 몰%는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 또는 약 60 몰%이다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 모든 값에는 모든 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 1 내지 50 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 최대 29 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 1 내지 10 몰%, 5 내지 9 몰%, 5 내지 15 몰%, 8 내지 14 몰%, 18 내지 22%, 19 내지 25몰%, 10 내지 20몰%, 10 내지 25몰%, 15 내지 25몰%, 20 내지 30몰%, 25 내지 35몰%, 30 내지 40몰%, 또는 35 내지 50몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 10 내지 25 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 5 내지 9 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 8 내지 14 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 18 내지 22 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 19 내지 25 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP 중의 헬퍼 지질의 몰%는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 또는 약 40 몰%이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다. 모든 값에는 모든 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP 중의 PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 전체 지질의 0 몰% 초과 및 최대 5 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 0.1몰%, 0.2몰%, 0.25몰%, 0.3몰%, 0.4몰%, 0.5몰%, 0.6몰%, 0.7몰%, 0.8몰%, 0.9몰%, 1.0몰%, 1.1몰%, 1.2몰%, 1.3몰%, 1.4몰%, 1.5몰%, 1.6몰%, 1.7몰%, 1.8몰%, 1.9몰%, 2.0몰%, 2.1몰%, 2.2몰%, 2.3몰%, 2.4몰%, 2.5몰%, 2.6몰%, 2.7몰%, 2.8몰%, 2.9몰%, 3.0몰%, 3.1몰%, 3.2몰%, 3.3몰%, 3.4몰%, 3.5몰%, 4.0몰%, 4.5몰%, 또는 5몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰%, 약 0.2 몰%, 약 0.25 몰%, 약 0.3 몰%, 약 0.4 몰%, 약 0.5 몰%, 약 0.6 몰%, 약 0.7 몰%, 약 0.8 몰%, 약 0.9 몰%, 약 1.0몰%, 약 1.1몰%, 약 1.2몰%, 약 1.3몰%, 약 1.4몰%, 약 1.5몰%, 약 1.6몰%, 약 1.7몰%, 약 1.8몰%, 약 1.9몰%, 약 2.0몰%, 약 2.1몰%, 약 2.2 몰%, 약 2.3 몰%, 약 2.4 몰%, 약 2.5 몰%, 약 2.6 몰%, 약 2.7 몰%, 약 2.8 몰%, 약 2.9 몰%, 약 3.0 몰%, 약 3.1몰%, 약 3.2몰%, 약 3.3몰%, 약 3.4몰%, 약 3.5몰%, 약 4.0몰%, 약 4.5몰%, 또는 약 5몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 적어도 0.1 몰%, 적어도 0.2 몰%, 적어도 0.25 몰%, 적어도 0.3 몰%, 적어도 0.4 몰%, 적어도 0.5 몰%, 적어도 0.6 몰%, 적어도 0.7 몰%, 적어도 0.8 몰%, 적어도 0.9 몰%, 적어도 1.0 몰%, 적어도 1.1 몰%, 적어도 1.2 몰%, 적어도 1.3 몰%, 적어도 1.4 몰%, 적어도 1.5 몰%, 적어도 1.6 몰%, 적어도 1.7 몰%, 적어도 1.8 몰%, 적어도 1.9 몰%, 적어도 2.0 몰%, 적어도 2.1 몰%, 적어도 2.2 몰%, 적어도 2.3 몰%, 적어도 2.4 몰%, 적어도 2.5 몰%, 적어도 2.6 몰%, 적어도 2.7 몰%, 적어도 2.8 몰%, 적어도 2.9 몰%, 적어도 3.0 몰%, 적어도 3.1 몰%, 적어도 3.2 몰%, 적어도 3.3 몰%, 적어도 3.4 몰%, 적어도 3.5 몰%, 적어도 4.0 몰%, 적어도 4.5 몰%, 또는 적어도 5 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 최대 0.1 몰%, 최대 0.2 몰%, 최대 0.25 몰%, 최대 0.3 몰%, 최대 0.4 몰%, 최대 0.5 몰%, 최대 0.6 몰%, 최대 0.7 몰%, 최대 0.8 몰%, 최대 0.9 몰%, 최대 1.0 몰%, 최대 1.1 몰%, 최대 1.2 몰%, 최대 1.3 몰%, 최대 1.4 몰%, 최대 1.5 몰%, 최대 1.6 몰%, 최대 1.7 몰%, 최대 1.8 몰%, 최대 1.9 몰%, 최대 2.0 몰%, 최대 2.1 몰%, 최대 2.2 몰%, 최대 2.3 몰%, 최대 2.4 몰%, 최대 2.5 몰%, 최대 2.6 몰%, 최대 2.7 몰%, 최대 2.8 몰%, 최대 2.9 몰%, 최대 3.0 몰%, 최대 3.1 몰%, 최대 3.2 몰%, 최대 3.3 몰%, 최대 3.4 몰%, 최대 3.5 몰%, 최대 4.0 몰%, 최대 4.5 몰%, 또는 최대 5 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 0.1 내지 4 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총지질의 0.1 내지 2 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총 지질의 0.2 내지 0.8 몰%, 0.4 내지 0.6 몰%, 0.7 내지 1.3 몰%, 1.2 내지 1.8 몰%, 또는 1 내지 3.5 몰%이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질의 몰%는 LNP중에 존재하는 총지질의 0.1 내지 0.7 몰%, 0.2 내지 0.8 몰%, 0.3 내지 0.9 몰%, 0.4 내지 0.8 몰%, 0.4 내지 0.6 몰%, 0.4 내지 1 몰%, 0.5 내지 1.1 몰%, 0.6 내지 1.2 몰%, 0.7 내지 1.3 몰%, 0.8 내지 1.4 몰%, 0.9 내지 1.5 몰%, 1 내지 3.5 몰% 1 내지 1.6 몰%, 1.1 내지 1.7 몰%, 1.2 내지 1.8 몰%, 1.3 내지 1.9 몰%, 1.4 내지 2 몰%, 1.5 내지 2.1 몰%, 1.6 내지 2.2 몰%, 1.7 내지 2.3 몰%, 1.8 내지 2.4 몰%, 1.9 내지 2.5 몰%, 2 내지 2.6 몰%, 2.4 내지 3.8 몰%, 또는 2.6 내지 3.4 몰%이다. 모든 값에는 모든 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 60 몰%의 양이온성 지질, 19 내지 25 몰%의 헬퍼 지질, 25 내지 33 몰%의 구조 지질, 및 0.2 내지 0.8 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 양이온성 지질, 19 내지 25 몰%의 헬퍼 지질, 24 내지 32 몰%의 구조 지질, 및 1.2 내지 1.8 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 양이온성 지질, 8 내지 14 몰%의 헬퍼 지질, 35 내지 43 몰%의 구조 지질, 및 1.2 내지 1.8 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 45 내지 55 몰%의 양이온성 지질, 5 내지 9 몰%의 헬퍼 지질, 36 내지 44 몰%의 구조 지질, 및 2.5 내지 3.5 몰%의 PEG-지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 본 개시의 하나 이상의 양이온성 지질, 본 개시의 하나 이상의 헬퍼 지질, 본 개시의 하나 이상의 구조 지질, 및 본 개시의 하나 이상의 PEG-지질을 하기 표 6에 따라 LNP 중의 총 지질의 몰% (또는 총 지질의 몰% 범위)로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 4가지 지질 성분의 총 몰%는 100%와 동일하다. 일부 실시형태에서, 이들 4가지 지질 성분의 총 몰%는 100% 미만이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물 또는 표 21로부터 선택된 화합물이다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 화학식 A, 화학식 A', 또는 화학식 A′′를 갖는다.
표 6: LNP 중의 지질 성분의 몰%
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 양이온성 지질, 19 내지 25 몰%의 헬퍼 지질, 25 내지 33 몰%의 구조 지질, 및 0.2 내지 0.8 몰몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰% 화학식(II-1a)의 화합물, 19 내지 25 몰%의 DSPC, 25 내지 33 몰%의 콜레스테롤, 및 0.2 내지 0.8 몰%의 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 양이온성 지질, 19 내지 25 몰%의 헬퍼 지질, 24 내지 32 몰%의 구조 지질, 및 1.2 내지 1.8 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 화학식(II-1a)의 화합물, 19 내지 25 몰%의 DSPC, 24 내지 32 몰%의 콜레스테롤, 및 1.2 내지 1.8 몰의 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 양이온성 지질, 8 내지 14 몰%의 헬퍼 지질, 35 내지 43 몰%의 구조 지질, 및 1.2 내지 1.8 몰%의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 종말점을 포함하여, 44 내지 54 몰%의 화학식(II-1a)의 화합물, 8 내지 14 몰%의 DSPC, 35 내지 43 몰%의 콜레스테롤, 및 1.2 내지 1.8 몰%의 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3,로부터 선택된 PEG 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고,여기서 A = 40몰% 내지 60몰%, B = 10몰% 내지 25몰%, C = 20몰% 내지 30몰%, 그리고 D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 PEG-지질을 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 45몰% 내지 50몰%, B = 20몰% 내지 25몰%, C = 25몰% 내지 30몰%이고, D = 0몰% 내지 1몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다.
일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 PEG-지질을 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 49:22:28.5:0.5이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 화학식(A), 화학식(A'), 또는 화학식(A'')의 화합물이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 BRIJ?? S100, BRIJ?? S20, BRIJTM O20 및 BRIJTM C20으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 BRIJTM S100이다.
일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol) 및 DLPE를 포함하며, 여기서 DOTAP:Chol:DLPE의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 50:35:15이다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol) 및 DLPE를 포함하며, 여기서 DOTAP:Chol:DOPE의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 50:35:15이다. 일부 실시형태에서, LNP는 DOTAP, 콜레스테롤(Chol), DLPE, DSPE-PEG를 포함하고, DOTP:Chol:DLPE의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 50:35:15이고, 여기서 입자는 약 0.2 몰% DSPE-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 MC3, 콜레스테롤(Chol), DSPC 및 DMG-PEG를 포함한다. MC3:Chol:DSPC:DMG-PEG의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 49:38.5:11:1.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 40몰% 내지 60몰%, B = 10몰% 내지 25몰%, C = 20몰% 내지 30몰%이고, D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 45몰% 내지 50몰%, B = 20몰% 내지 25몰%, C = 25몰% 내지 30몰%, 그리고 D = 0몰% 내지 1몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 49:22:28.5:0.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 40몰% 내지 60몰%, B = 10몰% 내지 30몰%, C = 20몰% 내지 45몰%이고, D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 40몰% 내지 60몰%, B = 10몰% 내지 30몰%, C = 25몰% 내지 45몰%이고, D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 45몰% 내지 55몰%, B = 10몰% 내지 20몰%, C = 30몰% 내지 40몰%이고, D = 1몰% 내지 2몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 45몰% 내지 50몰%, B = 10몰% 내지 15몰%, C = 35몰% 내지 40몰%이고, D = 1몰% 내지 2몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 49:11:38.5:1.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 45몰% 내지 65몰%, B = 5몰% 내지 20몰%, C = 20몰% 내지 45몰%이고, D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 50몰% 내지 60몰%이고, B = 5몰% 내지 15몰%, C = 30몰% 내지 45몰%, 그리고 D = 0몰% 내지 3몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, 여기서 SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 55몰% 내지 60몰%, B = 5몰% 내지 15몰%이고, C = 30몰% 내지 40몰%이고, D = 1몰% 내지 2몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시양태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 약 A:B:C:D이고, A = 55 몰% 내지 60 몰%, B = 5 몰% 내지 10 몰%, C = 30 몰% 내지 35 몰%이고, D = 1 몰% 내지 2 몰%이고, A+B+C+D = 100몰%이다. 일부 실시형태에서, LNP는 SS-OC, DSPC, 콜레스테롤(Chol) 및 DPG-PEG2K를 포함하며, SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 58:7:33.5:1.5이다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 표적 세포에 의한 나노입자의 흡수를 조절 또는 촉진하기 위해 글리코사미노글리칸(GAG)으로 코팅된다. GAG는 헤파린/헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트/데르마탄 설페이트, 케라틴 설페이트, 또는 히알루론산(HA)일 수 있다. 특정의 실시형태에서, 나노입자의 표면은 HA로 코팅되고 종양 세포에 의한 흡수를 위해 입자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 아르기닌-글리신-아스파테이트 삼중펩티드(RGD 펩티드)로 코팅된다. (Ruoslahti, Advanced Materials, 24, 2012, 3747-3756; 및 Bellis et al., Biomaterials, 32(18), 2011, 4205-4210 참조).
LNP 조성물의 특성
본 개시는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 LNP를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. 또한 본 명세서서는 본 명세서에 기술된 LNP 및 캡슐화된 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 대조군 LNP와 비교하여 생체내 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP는 화학식(A), 화학식(A'), 또는 화학식(A'')가 아닌 PEG-지질을 포함하는 LNP이다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DPG이다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP는 본 개시의 LNP와 동일한 몰비의 PEG-지질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP는 대조군 LNP가 화학식(A), 화학식(A') 또는 화학식(A'')가 아닌 PEG-지질을 포함하는 (예를 들어, 대조군 LNP는 PEG-지질로서 PEG2k-DPG 또는 PEG2k-DMG를 포함할 수 있음) 것을 제외하고는 본 개시의 LNP와 동일하다.
일부 실시형태에서, 대조군 LNP는 화학식(I)이 아닌 양이온성 지질을 포함하는 LNP이다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP의 양이온성 지질은 SS-OC이다. 일부 실시형태에서, 대조군 LNP는 본 개시의 LNP와 동일한 몰비의 양이온성 지질을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 대조군 LNP는 대조 LNP가 화학식(I)이 아닌 양이온성 지질을 포함하는(예를 들어, 대조 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC를 포함할 수 있음) 것을 제외하고는 본 개시의 LNP와 동일하다.
일부 실시형태에서, 면역 반응의 감소는 가속 혈액 제거(ABC)의 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, ABC는 천연 IgM 및/또는 항-PEG IgM의 분비와 관련되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 IgM"은 공지된 면역 노출(예를 들어, 본 개시의 LNP에 대한 노출)과 무관하게 존재하는 혈청 중의 순환 IgM을 지칭한다. "ABC 감소"라는 용어는 대조군 LNP와 비교하여 ABC의 감소를 의미한다. 일부 실시형태에서, ABC의 감소는 대조군 LNP에 비해 두 번째 또는 후속 투여 시 LNP의 제거의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소는 약 10% 내지 약 100%, 약 10 내지 약 50%, 약 20 내지 약 100%, 약 20 내지 약 50%, 약 30 내지 약 100%, 약 30 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40 내지 약 80%, 약 50 내지 약 90%, 또는 약 50 내지 약 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, ABC의 감소는 두 번째 또는 후속 투여 후 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈의 증가 또는 지속적인 검출 가능 수준에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, ABC의 감소는 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 수준의 증가(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상의 배 증가)를 초래할 수 있다. 대조군 LNP 투여 후 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈 수준과 비교한 게놈이다. 일부 실시형태에서, ABC의 감소는 항-PEG IgM의 더 낮은 혈청 수준과 연관되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 LNP는 캡슐화된 분자의 방출 전에 제거될 수 있는 대조군 LNP와 비교하여 반복 투여 시 LNP 및 이의 성분의 제거를 지연시킬 수 있다. 따라서, 본 개시의 LNP는 후속 투여량으로 캡슐화된 분자(예를 들어, 합성 RNA 바이러스 게놈)의 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기(즉, 평균 외경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 150 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 200 nm 내지 약 250 nm, 약 250 nm 내지 약 300 nm, 약 300 nm 내지 약 400 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 약 120, 또는 약 125 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 100 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시 형태에서, LNP는 50 nm 내지 150 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 50 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 125 nm, 50 nm 내지 100 nm, 50 nm 내지 75 nm, 75 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 75nm 내지 100nm, 100nm 내지 150nm, 100nm 내지 125nm 또는 125nm 내지 150nm의 평균 크기(평균 외경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 70 nm 내지 90 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 100 nm 내지 120 nm, 110 nm 내지 130 nm, 120 nm 내지 140 nm, 또는 130 nm 내지 150nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 90 nm 내지 110 nm의 평균 크기를 갖는다. 모든 값에는 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 50 nm 내지 약 150 nm의 평균 크기(즉, 평균 외경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 60 nm 내지 약 130 nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물으로서, 여기서 복수의 LNP는 약 70 nm 내지 약 120 nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 70nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 80nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 90 nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 100nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료 조성물로서, 여기서 복수의 LNP는 약 110 nm의 평균 크기를 갖는, 조성물을 제공한다. 모든 값에는 종말점이 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP에 의한 합성 RNA 바이러스 게놈의 캡슐화 효율은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%는 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP에 의한 합성 RNA 바이러스 게놈의 캡슐화 효율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP 중 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP 중 약 70% 내지 100%, 약 75% 내지 100%, 약 80% 내지 100%, 약 85% 내지 100%, 약 90% 내지 100%, 약 91% 내지 100%, 약 92% 내지 100%, 약 93% 내지 100%, 약 94% 내지 100%, 약 95% 내지 100%, 약 96% 내지 100%, 약 97% 내지 100%, 약 98% 내지 100%, 약 99% 내지 100%는 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 중성 전하(예를 들어, 약 0mV 내지 1mV의 평균 제타 전위)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 40mV 내지 약 0mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 35 mV 내지 약 0 mV, 약 30 mV 내지 약 0 mV, 약 25 mV 내지 약 0 mV, 약 20mV 내지 약 0mV, 약 15mV 내지 약 0mV, 약 10mV 내지 약 0mV, 또는 약 5mV 내지 약 0mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 20mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 10mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 10mV 내지 약 -10mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 10mV, 약 9mV, 약 8mV, 약 7mV, 약 6mV, 약 5mV, 약 4mV, 약 3mV, 약 2mV, 약 1mV, 약 0mV, 약 -1mV, 약 -2mV, 약 -3mV, 약 -4mV, 약 -5mV, 약 -6mV, 약 -7mV, 약 -8mV, 약 -9mV, 약 -9mV 또는 약 -10mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 0mV 내지 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 -20mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, LNP는 약 -30 mV 미만, 약 35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 또는 약 -30mV 내지 약 -20mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0mV, 약 -1mV, 약 -2mV, 약 -3mV, 약 -4mV, 약 -5mV, 약 -6mV, 약 -7mV, 약 -8mV, 약 -9mV, 약 -10mV, 약 -11mV, 약 -12mV, 약 -13mV, 약 -14mV, 약 -15mV, 약 -16mV, 약 -17mV, 약 -18mV, 약 -19mV, 약 -20mV, 약 -21mV, 약 -22mV, 약 -23mV, 약 -24mV, 약 -25mV, 약 -26mV, 약 -27mV, 약 -28mV, 약 -29mV, 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 -20 mV 미만, 약 -30 mV 미만, 약 35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, 약 10:1 내지 약 60:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하고, 약 20:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 30:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 40:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, L:N 질량비는 약 15:1, 약 16:1, 약 17:1, 약 18:1, 약 19:1, 약 20:1, 약 21:1, 약 22:1, 약 23:1, 약 24:1, 약 25:1, 약 26:1, 약 27:1, 약 28:1, 약 29:1, 약 30:1, 약 31:1, 약 32:1, 약 33:1, 약 34:1, 약 35:1, 약 36:1, 약 237:1, 약 28:1, 약 39:1, 약 40:1, 약 41:1, 약 42:1, 약 43:1, 약 44:1, 또는 약 45:1이다.
일부 실시형태에서, LNP는 모든 종말점을 포함하여, 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 30:1 내지 60:1, 40:1 내지 60:1, 50:1 내지 60:1, 10:1 내지 50:1, 20:1 내지 50:1, 30:1 내지 50:1, 40:1 내지 50:1, 10:1 내지 40:1, 20:1 내지 40:1, 30:1 내지 40:1, 10:1 내지 30:1, 20:1 내지 30:1, 또는 10:1 내지 20:1의 지질(L) 대 핵산 분자(N) 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 30:1 내지 40:1의 지질:핵산 분자 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 30:1 내지 36:1의 지질:핵산 분자 질량비를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, 약 10:1 내지 약 60:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, 약 20:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, 약 30:1(L:N)의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, 약 40:1(L:N)의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량비를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 분자를 포함하며, L:N 질량비가 약 15:1, 약 16:1, 약 17:1, 약 18:1, 약 19:1, 약 20:1, 약 21:1, 약 22:1, 약 23:1, 약 24:1, 약 25:1, 약 26:1, 약 27:1, 약 28:1, 약 29:1, 약 30:1, 약 31:1, 약 32:1, 약 33:1, 약 34:1, 약 35:1, 약 36:1, 약 237:1, 약 28:1, 약 39:1, 약 40:1, 약 41:1, 약 42:1, 약 43:1, 약 44:1, 또는 약 45:1이다.
일부 실시형태에서, LNP는 핵산 분자를 포함하며,1 내지 25의 지질-질소-인산염 비율(N:P)을 갖는다. 일부 실시형태에서, N:P는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다. 일부 실시형태에서, N:P는 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 또는 20 내지 25이다. 일부 실시형태에서, LNP는 핵산 분자를 포함하고 14의 지질-질소-인산염 비(N:P)을 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP는 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 코딩된 종양 용해성 바이러스는 대상체에 대한 LNP 투여 부위로부터 멀리 떨어진 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 LNP의 정맥내 투여는 종양 조직에서 바이러스 복제 및 종양 크기의 감소를 초래한다. 이들 데이터는 본 개시의 LNP가 LNP 투여 부위로부터 멀리 떨어진 종양 또는 암성 조직에 국재화할 수 있음을 나타낸다. 이러한 효과는 쉽게 접근할 수 없고, 따라서 종양내 치료 전달에 적합하지 않은 종양의 치료에서 본 명세서에 기술된 LNP-캡슐화된 종양 용해성 바이러스의 사용을 가능하게 한다.
LNP의 제조 방법
일부 실시형태에서, 본 개시는 핵산 분자를 함유하는 지질 나노입자(LNP)의 조성물을 제조하는 방법으로서, 이하의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 핵산 분자를 수용액 중에 원하는 농도로 희석하는 단계;
(b) LNP의 모든 지질 성분을 포함하는 유기 지질상을 미세 유체 흐름을 사용하여 핵산 분자를 함유하는 수성상과 혼합하여 LNP를 형성하는 단계;
(c) LNP를 완충액에 대해 투석하여 유기 용매를 제거하는 단계;
(d) LNP를 목표 부피로 농축하는 단계; 및
(e) 선택적으로, 멸균 필터를 통해 여과하는 단계.
일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:1(v:v) 내지 1:10(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:1 (v:v), 1:2 (v:v), 1:3 (v:v), 1:4 (v:v), 1:5 (v:v), 1:6 (v:v), 1:7 (v:v), 1:8 (v:v), 1:9 (v:v), 또는 1:10 (v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:1(v:v) 내지 1:3(v:v), 1:2(v:v) 내지 1:4(v:v), 1:3(v:v) 내지 1:5(v:v), 1:4(v:v) 내지 1: 6 (v:v), 1:5(v:v) 내지 1:7(v:v), 1:6(v:v) 내지 1:8(v:v), 1:7(v:v) 내지 1: 9(v:v) 또는 1:8(v:v) 내지 1:10(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:3(v:v) 내지 1:5(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:3(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유기 지질상과 수성상은 1:5(v:v)의 비율로 혼합된다.
일부 실시형태에서, 미세 유체 흐름의 총 유속은 5 내지 20mL/분이다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 흐름의 총 유속은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 mL/분이다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 흐름의 총 유속은 9 내지 20mL/분이다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 흐름의 총 유속은 11 내지 13 mL/분이다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)의 유기 지질상의 용매는 에탄올이다. 일부 실시형태에서, 단계(b)에서 유기 지질상에 열이 가해진다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)에서 유기 지질상에 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80℃가 가해진다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)에서 유기 지질상에 60℃ 열이 가해진다. 일부 실시형태에서, 단계(b)에서 유기 지질상에 열이 가해지지 않는다.
일부 실시양태에서, 단계(a)의 수용액은 1 내지 7의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계(a)의 수용액은 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 또는 5 내지 7의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계(a)의 수용액은 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 또는 7의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)의 수용액은 3의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)의 수용액은 5의 pH를 갖는다.
일부 실시형태에서, 총 지질 농도는 5 mM 내지 80 mM이다. 일부 실시형태에서, 총 지질 농도는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80 mM이다. 일부 실시형태에서, 총 지질 농도는 약 20 mM이다. 일부 실시형태에서, 총 지질 농도는 약 40 mM이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법에 의해 생성된 LNP는 1 내지 25의 지질-질소-인산염 비율(N:P)을 갖는다. 일부 실시형태에서, N:P는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다. 일부 실시형태에서, N:P는 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 또는 20 내지 25이다. 일부 실시형태에서, LNP는 핵산 분자를 포함하며, 14의 지질-질소-인산염 비(N:P)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 단계(c)의 완충액은 중성 pH(예를 들어, 1x PBS, pH 7.2)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계(d)는 농축을 위해 원심분리 여과를 이용한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법의 캡슐화 효율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법의 캡슐화 효율은 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법의 캡슐화 효율은 적어도 95%이다. 일부 실시형태에서, 캡슐화 효율은 RiboGreen에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법에 의해 생성된 LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기(즉, 평균 외경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 평균 크기가 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 150 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 200 nm 내지 약 250 nm, 약 250 nm 내지 약 300 nm, 약 300 nm 내지 약 400 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 평균 크기가 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 약 120, 또는 약 125 nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 평균크기가 약 100 nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 평균크기가 50 nm 내지 150 nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 평균 크기(평균 외경)가 50 nm 내지 150 nm, 50nm 내지 125nm, 50nm 내지 100nm, 50nm 내지 75nm, 75nm 내지 150nm, 75nm 내지 125nm, 75nm 내지 100nm, 100nm 내지 150nm, 100nm 내지 125nm 또는 125nm 내지 150nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 평균크기가 70 nm 내지 90 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 100 nm 내지 120 nm, 110 nm 내지 130 nm, 120 nm 내지 140 nm 또는 130 nm 내지 150 nm이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 90 nm 내지 110 nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 다수의 LNP의 다분산 지수는 0.01 내지 0.3이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 0.1 내지 0.15이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 약 0.01, 약 0.02, 약 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 약 0.15, 약 016, 약 0.17, 약 0.18, 약 0.19, 약 0.20, 약 0.21, 약 0.22, 약 0.23, 약 0.24, 약 0.25, 약 0.26, 약 0.27, 약 0.28, 약 0.29, 또는 약 0.30이다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 또는 약 0.15이다. 일부 실시형태에서, 평균 직경 및/또는 다분산도는 동적 광산란을 통해 결정된다.
페이로드 분자
일부 실시형태에서, 입자는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하며, 페이로드 분자를 코딩하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자는 지질 나노입자이고, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 페이로드 분자를 코딩하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자(예를 들어, LNP) 내의 합성 RNA 바이러스 게놈은 페이로드 분자를 코딩하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자(예를 들어, LNP)는 1) 합성 RNA 바이러스 게놈(페이로드 분자를 코딩할 수도 있고 코딩하지 않을 수도 있음) 및 2) 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈과 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드는 입자(예를 들어, LNP)에서 연결되지 않는다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈과 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드는 비공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 합성 RNA 바이러스 게놈 및 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드는 일반적인 3',5' 포스포디에스테르 연결 이외의 공유 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 페이로드 분자를 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' UTR에 조입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 페이로드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 삽입된다. 이러한 실시형태에서, 상응하는 miRNA가 발현되는 세포에서는 페이로드의 번역 및 후속 발현이 발생하지 않거나 실질적으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자를 코딩하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드는 레플리콘이다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 세포독성 펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는 "세포독성 펩타이드"는 숙주 세포에서 발현될 때 세포 사멸 및/또는 숙주 세포에 의해 분비될 때 이웃 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는 단백질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 세포독성 펩타이드는 카스파제, p53, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 외독소 A(PEA), 유형 I 리보자임 비활성화 단백질(RIP)(예를 들어, 사포린 및 젤로닌), 유형 II RIP(예를 들어, 리신)이다 , 시가 유사 독소 1(Slt1), 감광성 활성 산소종(예: 킬러-레드)이다. 특정의 실시형태에서, 세포독성 펩티드는 세포사멸을 통해 세포 사멸을 초래하는 자살 유전자, 예를 들어 카스파제 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 면역 조절 펩티드이다. 본 명세서에서 사용된 "면역 조절 펩티드"는 특정의 면역 수용체 및/또는 경로를 조절(예를 들어, 활성화 또는 억제)할 수 있는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절 펩티드는 면역 세포, 조직 세포 및 기질 세포를 포함하는 임의의 포유동물 세포에 작용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 면역 조절 펩티드는 T 세포, NK 세포, NKT T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 호염기구, 비만 세포 또는 호산구와 같은 면역 세포에 작용한다. 예시적인 면역 조절 펩티드에는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 사이토카인, 케모카인, 가용성 수용체, 세포 표면 수용체 리간드, 이분 펩티드 및 효소와 같은 항원 결합 분자가 포함된다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 IL-1, IL-12, IL-15, IL-18, IL-36γ, TNFα, IFNα, IFNβ, IFNγ 또는 TNFSF14와 같은 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 CXCL10, CXCL9, CCL21, CCL4 또는 CCL5와 같은 케모카인이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 NKG2D 리간드, 뉴로필린 리간드, Flt3 리간드, CD47 리간드(예를 들어, SIRP1α)와 같은 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서 페이로드는 가용성 사이토카인 수용체(예를 들면, IL-13R, TGFβR1, TGFβR2, IL-35R, IL-15R, IL-2R, IL-12R 및 인터페론 수용체) 또는 가용성 선천적 면역 수용체(예를 들면, 톨 유사 수용체, 보체 수용체 등) 등의 가용성 수용체이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 RNA 및/또는 DNA 센싱에 관여하는 단백질의 우성 작용제 돌연변이체(예를 들어 STING, RIG-1 또는 MDA-5의 우성 작용제 돌연변이체)이다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv), F(ab) 등)과 같은 항원 결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 세포 표면 수용체, 예를 들어 면역 체크포인트 수용체(예: PD-1, PD-L1 및 CTLA4) 또는 세포 증식 및 활성화에 관여하는 추가 세포 표면 수용체(예: OX40, CD200R, CD47, CSF1R, TREM2, 4-1BB, CD40, 및 NKG2D)에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 클로로톡신, BmKn-2, 네오플라딘 1, 네오플라딘 2 및 마우리포린과 같은 전갈 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 콘토르트로스타틴, 아폭신-I, 보스롭스톡신-I, BJcuL, OHAP-1, 로도스토민, drCT-I, CTX-III, B1L 및 ACTX-6과 같은 뱀 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 라타르신 및 히알루로니다제와 같은 거미 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 멜리틴 및 아파민과 같은 꿀벌 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 PsT-1, PdT-1 및 PdT-2와 같은 개구리 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 효소이다. 일부 실시형태에서, 효소는 세포외 기질을 변경함으로써 종양 미세환경을 조절할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 효소는 매트릭스 메탈로프로테아제(예를 들어, MMP9), 콜라게나제, 히알루로니다제, 젤라티나제 또는 엘라스타제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 효소는 유전자 지향 효소 전구약물 요법(GDEPT) 시스템, 예를 들어 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 카르복시펩티다제 G2, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 또는 시토크롬 P450의 일부이다. 일부 실시형태에서, 효소는 표적 세포(예를 들어, 카스파제)에서 세포 사멸 경로를 유도하거나 활성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소는 세포외 대사물질 또는 메시지(예를 들어 아데노신 데아미나제 또는 아르기나제 또는 15-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소)를 분해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 MLKL이다. 일부 실시형태에서, MLKL 폴리펩티드는 서열번호: 104에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 MLKL 4HB 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, MLKL 4HB 도메인은 서열번호: 104의 아미노산 1-120에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더민 D(GSDMD)이다. 일부 실시형태에서, 가스더민 D(GSDMD)는 서열번호: 105에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더민 DN N-말단 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 가스더민 D N-말단 단편은 서열번호: 105의 아미노산 1-233에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 서열번호: 105의 L192A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더민 E(GSDME)이다. 일부 실시형태에서, 가스더민 E(GSDME)는 서열번호: 106에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 가스더먼 E N-말단 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 가스더민 E N-말단 단편은 서열번호: 106의 아미노산 1-237에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 HMGB1이다. 일부 실시형태에서, HMGB1 폴리펩타이드는 서열번호: 107에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 HMGB1 박스 B 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, HMGB1 박스 B 도메인은 서열 번호: 107의 아미노산 96-162에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 SMAC/디아블로이다. 일부 실시형태에서, SMAC/디아블로는 서열번호: 108에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 서열 번호: 108의 아미노산 56-239에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 멜리틴이다. 일부 실시형태에서, 멜리틴은 서열번호: 109에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 L-아미노산 산화효소(LAAO)이다. 일부 실시형태에서, L-아미노산 옥시다제(LAAO)는 서열번호: 110에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 디스인테그린이다. 일부 실시형태에서, 디스인테그린은 서열번호: 111에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 TRAIL(TNFSF-10)이다. 일부 실시형태에서, TRAIL(TNFSF-10)은 서열번호: 112에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 니트로리덕타제이다. 일부 실시 형태에서, 니트로리덕타제는 NfsB(예를 들어, 대장균 유래)이다. 일부 실시형태에서, NfsB는 서열번호: 113에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 니트로리덕타제는 NfsA(예를 들어, 대장균 유래)이다. 일부 실시형태에서, NfsA는 서열 번호: 114에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 레오바이러스 FAST 단백질이다. 일부 실시형태에서, 레오바이러스 FAST 단백질은 ARV p14, BRV p15, 또는 p14-p15 하이브리드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 ARV p14이다. 일부 실시형태에서, ARV p14는 서열번호 115에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 BRV p15이다. 일부 실시형태에서, BRV p15는 서열번호 116에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 p14-p15 하이브리드이다. 일부 실시형태에서, p14-p15 하이브리드는 서열번호: 117에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 렙틴/FOSL2이다. 일부 실시형태에서, 렙틴/FOSL2는 서열번호: 118에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)이다. 일부 실시형태에서, 아데노신 디아미나제(ADA2)는 서열 번호: 119에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제이다. 일부 실시형태에서, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 서열번호: 120에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2는 서열번호 121에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-7이다. 일부 실시형태에서, IL-7은 서열번호 122에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL12이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 서열번호 123에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 IL-12 베타 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 서열번호: 124에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 IL-12 알파 서브유닛을 포함한다.
일부 실시형태에서 페이로드 분자는 IL18이다. 일부 실시형태에서, IL18은 서열번호: 125에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-21이다. 일부 실시형태에서, IL-21은 서열번호: 126에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IL-36γ이다. 일부 실시형태에서, IL-36γ는 서열번호: 127에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 IFNγ이다. 일부 실시형태에서, IFNγ는 서열번호 128에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서 페이로드 분자는 CCL21이다. 일부 실시형태에서, CCL21은 서열번호: 129에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 하기 표 20에 나타낸 실시형태 중 하나에 따른 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩된다.
표 20: 페이로드 구성의 비제한적인 실시형태
*각 'x'는 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태예에서, 페이로드 분자는 이분 펩티드이다. 본 명세서에서 사용된 "이분 펩티드"는 비암성 효과기 세포 상에 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제1 도메인 및 표적 세포 (예를 들어, 암 세포, 종양 세포, 또는 다른 유형의 효과기 세포)에 의해 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 도메인으로 구성된 다량체 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이분 폴리펩티드의 개별 폴리펩티드 도메인은 항체 또는 이의 결합 단편 (예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 F(ab)), 나노바디, 디아바디, 플렉시바디, DOCK-AND-LOCK?? 항체 또는 단일클론 항-특이형 항체(mAb2)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이분 폴리펩티드의 구조는 이중 가변 도메인 항체(DVD-IgTM), 탄답®, 이중특이적 T 세포 참여자(BiTETM), 듀오바디® 또는 이중 친화성 재표적화(DART)폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이분 폴리펩티드는 BiTE이고 표 8 및/또는 9에 나타낸 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 예시적인 BiTE는 하기 표 7에 나타낸다.
표 7: 전임상 및 임상 연구에 사용되는 검증된 BiTE
일부 실시형태에서, 효과기 세포에 발현된 세포 표면 항원은 아래 표 8에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 종양 세포 또는 효과기 세포 상에 발현된 세포 표면 항원은 아래 표 9로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 종양 세포 상에 발현된 세포 표면 항원은 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 CD19, EpCAM, CEA, PSMA, CD33, EGFR, Her2, EphA2, MCSP, ADAM17, PSCA, 17-A1, NKGD2 리간드, CSF1R, FAP, GD2, DLL3, TROP2, 넥틴 4 또는 뉴로필린로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항원은 암 발생과 관련된 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 암 발병과 관련된 바이러스 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원, 또는 엡스타인 바 바이러스 항원이다 EBNA2 또는 BZLF1이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 표 9에 나열된 것 중에서 선택된다.
표 8: 예시적인 효과기 세포 표적 항원
표 9: 예시적인 표적 세포 항원
약제학적 조성물 및 사용 방법
본 개시의 한 양태은 본 명세서에 기술된 재조합 RNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본 명세서에 기술된 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자, 및 암 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-EF, CVA21-KY, 또는 SVV 바이러스 또는 상응하는 RNA 바이러스 게놈을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 조성물은 원하는 전달 경로에 적합한 임의의 방식으로 제제화될 수 있다. 전형적으로, 제제에는 임의의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 그의 유도체 또는 전구약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체 또는 호변이성질체를 포함하는 모든 생리학적으로 허용되는 조성물이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받아 인간이나 가축에 사용이 허용되는 모든 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정제, 등장화제, 용매, 계면활성제, 유화제를 비제한적으로 포함한다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체에는 유당, 포도당, 자당 등의 당류; 옥수수 전분, 감자 전분 등의 전분; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트 등의 셀룰로오스 및 그 유도체; 트라가칸스; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물성 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 대두유 등의 오일; 프로필렌 글리콜 등의 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리올; 에틸올레이트, 에틸라우레이트 등의 에스테르; 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄 등의 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약제학적 제제에 사용되는 기타 호환 가능한 물질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"약제학적으로 허용되는 염"에는 산 및 염기 부가염이 모두 포함된다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨)과 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 및 유기산, 이에 한정되지 않지만, 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르빈산, 아스파라긴산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 장뇌산, 장뇌-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 구연산, 시클라민산, 도데실황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 젖산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 1-히드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, 프톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 등으로 형성되는 염을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등과 같은 무기 염기로부터 유도될 수 있다. 유기 염기로부터 유래된 염은, 이에 제한되지 않지만, 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 자연 발생 치환 아민을 포함한 치환 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 특히 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본 개시는 암세포 또는 표적 세포의 사멸 방법으로서, 상기 암성 세포에 상기 조성물의 세포내 전달에 충분한 조건 하에서, 상기 세포를 본 명세서에 기재된 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 입자에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 "암성 세포" 또는 "표적 세포"는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 입자, 또는 본 명세서에 기재된 그의 조성물을 이용한 치료 또는 투여를 위해 선택된 포유동물 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "암성 세포를 사멸하는"은 구체적으로 세포사멸 또는 괴사에 의한 암성 세포의 사멸을 의미한다. 암성 세포의 사멸은 종양 크기 측정, 세포 수, 아넥신 V와 같은 세포 사멸 마커의 검출을 위한 유세포 분석법 및 프로피듐 요오다이드의 혼입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는, 방법을 추가로 제공한다. 투여 경로는 당연히 치료되는 질병의 위치와 성격에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 피내, 경피, 피하, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피, 기관내, 복강내, 종양내, 관류, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 조성물은 전이성 암의 치료에 특히 유용하며, 여기서 조성물을 다수의 기관 및/또는 세포 유형에 전달하기 위해 전신 투여가 필요할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 전신 투여된다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 질병 또는 병태의 증상의 개선 또는 치료를 초래하는 본 명세서에 기술된 조성물의 양 및/또는 용량을 의미한다. 개선은 질병이나 상태, 또는 질병이나 상태의 증상의 개선 또는 치료이다. 개선은 관찰 가능하거나 측정 가능한 개선이거나 또는 대상체의 전반적인 행복감의 개선일 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질병 상태를 개선할 수 있지만 질병의 완전한 치료가 될 수는 없다는 것을 인식하고 있다. 대상체의 개선에는 종양 부담 감소, 종양 세포 증식 감소, 종양 세포 사멸 증가, 면역 경로 활성화, 종양 진행 시간 증가, 암 통증 감소, 생존율 증가 또는 생활의 질 향상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 유효 용량의 투여는 본 명세서에 기술된 조성물의 단회 용량의 투여에 의해 달성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "용량"은 한 번에 전달되는 조성물의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 재조합 RNA 분자의 용량은 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50)으로 측정된다. 일부 실시형태에서, TCID50은 적어도 약 103-109 TCID50/mL, 예를 들어, 적어도 약 103 TCID50/mL, 약 104 TCID50/mL, 약 105 TCID50/mL, 약 106 TCID50/mL, 약 107 TCID50/mL, 약 108 TCID50/mL, 또는 약 109 TCID50/mL이다. 일부 실시형태에서, 용량은 주어진 부피 내의 입자 수(예: 입자/mL)로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량은 각 입자(예를 들어, 입자 #/mL, 여기서 각 입자는 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 게놈 사본을 포함함)에 존재하는 본 명세서에 기술된 RNA 폴리뉴클레오타이드의 게놈 카피 수에 의해 추가로 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유효 용량의 전달은 본 명세서에 기술된 조성물의 다중 용량 투여를 요구할 수 있다. 따라서, 유효 용량의 투여는 본 명세서에 기술된 조성물의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50회 이상의 용량의 투여를 필요로 할 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 다중 용량이 투여되는 실시형태에서, 각 용량은 동일한 행위자 및/또는 동일한 지리적 장소에서 투여될 필요는 없다. 또한, 투여는 미리 결정된 일정에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 투여 일정은 본 명세서에 기술된 조성물의 용량을 매일, 격일, 매주, 격주, 매월, 격월, 매년, 반년마다 등을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 미리 결정된 투여 일정은 주어진 환자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있다 (예를 들어, 투여되는 조성물의 양은 증가 또는 감소될 수 있고 및/또는 투여 빈도는 증가 또는 감소될 수 있으며, 및/또는 투여되는 총 투여량 횟수는 증가 또는 감소될 수 있다).
본 명세서에 사용되는 "예방" 또는 "예방법"은 질병 증상의 완전한 예방, 질병 증상의 발병 지연, 또는 후속적으로 발병되는 질병 증상의 중증도 감소를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 본 명세서에 기재된 조성물이 투여되는 임의의 포유동물 대상체를 의미하는 것으로 해석된다. 특정의 실시형에서, 본 개시의 방법은 인간 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 본 개시의 방법은 또한 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코 원숭이 및 침팬지), 마우스, 래트, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰 족제비, 저빌, 기니피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리), 물고기, 파충류를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 종양 용해성 콕사키바이러스 (여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주임), 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 암은 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 기준으로 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는, 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, CVA21 균주는 CVA21-KY이다.
세포내 접착 분자 1(ICAM-1, BB2, CD54, P3.58로도 알려짐)은 ICAM1 유전자(NCBI 유전자 ID: 3383)에 의해 코딩된 단백질(UniProt Ref: P03562)이며, 세포 간 상호 작용을 안정화하고 백혈구 내피 이동을 촉진하는데 중요하다. 일부 실시형태에서, 특정 암에 대한 치료 결정은 ICAM-1 발현에 기초하여 이루어진다. ICAM-1의 발현은 암에서 결정된다. 암은 ICAM-1 발현 수준을 기준으로 CVA21 발현에 민수성 또는 내성인 것으로 특정된다. 일반적으로 ICAM-1의 더 높은 발현(양성 종양 세포의 % 또는 강도 또는 둘 다)은 CVA21 감염에 대한 더 큰 민감성을 나타낸다(실시예 8 참조). ICAM-1 발현은 mRNA 및/또는 단백질 발현에 대해 당업계에 공지된 수단에 의해 결정될 수 있다. mRNA 발현은 노던 블롯, 리보뉴클레아제 보호 분석, PCR 기반 방법, 서열 분석 방법 등에 의해 결정될 수 있다. 단백질 발현은 면역블로팅(예: 웨스턴 블롯), 면역조직화학, 면역형광법, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 유세포분석, 세포계측 비드 어레이, 질량 분광학, 단백질체학 기반 방법 등에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 이하의 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법을 제공한다: (a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계; (b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 콕사키바이러스 21(CVA21) 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 경우 치료적 유효량의 CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계. 일부 실시형태에서, CVA21 균주는 CVA21-KY이다.
일부 실시형태에서, 본발명은 콕사키바이러스 21(CVA21) 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치료하기 위하여 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) ICAM-1의 발현 수준 및/또는 암 내 ICAM-1 양성 암 세포의 백분율을 결정하는 단계; (b) (a) 단계에서 결정된 ICAM-1의 발현 수준 및/또는 ICAM-1 양성 암 세포의 백분율에 기반하여, CVA21 감염에 민감한 암을 분류하는 단계; (c) (b)단계에서 CVA21 감염에 민감한 암을 분류한 경우, CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치료하기 위한 대상체를 선택하는 단계; 및 (d) CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, CVA21 균주는 CVA21-KY이다.
지질 나노입자 조성물 및 사용 방법
일부 실시형태에서, 본발명은 치료 유효량의 본발명의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 암을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 본발명의 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 PEG-지질을 포함하는 본발명의 LNP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 PEG-지질 및 본발명의 캡슐화된 분자(예를 들어, 합성 RNA 바이러스 게놈)를 포함하는 본발명의 LNP를 포함한다.
본 방법은 특히 캡슐화된 분자가 치료제인 경우, 캡슐화된 분자로부터 이익을 얻는 질환을 갖거나 또는 질환을 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법일 수 있다. 택일적으로, 본 방법은 대상체를 진단하는 방법일 수 있으며, 이 경우 캡슐화된 분자는 진단제일 수 있다.
예방적 용도에 있어서, 본발명의 LNP를 포함하는 약제학적 조성물은 특정 장애에 걸리기 쉽거나 그렇지 않으면 걸릴 위험이 있는 대상체에게 장애의 위험을 제거 또는 감소시키거나 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도에 있어서, 본발명의 LNP를 포함하는 조성물은 이러한 장애의 증상 및 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 장애가 의심되거나 장애로 이미 고통받고 있는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하는데 적절한 양을 치료 유효 용량 또는 양이라고 한다. 예방적 및 치료적 요법 둘 다에 있어서, 약제학적 조성물은 충분한 반응이 이루어질 때까지 몇 몇 용량으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 반응을 모니터링하고, 목적하는 반응이 사라지기 시작하면 반복 용량으로 투여한다.
투여를 위하여, 본발명의 LNP는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 캡슐화된 분자를 포함한다. 약제학적 조성물은 (i) 본발명의 LNP; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 이에 의해 치료 분자는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물 내에서 조합된다. 담체는 받는 대상체가 그의 투여를 허용할 수 있는 경우 "약제학적으로 허용되는 담체"라고 한다. 멸균 인산염-완충 식염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 일 예이다. 다른 적합한 담체, 희석제 또는 부형제는 당업자에게 널리 알려져 있다. (예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)를 참조하기 바란다.) 제형은 바이알 표면의 단백질 손실을 방지하기 위한 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다.
본발명의 LNP를 포함하는 약제학적 조성물은 경구 단위 투여 형태, 정맥내 단위 투여 형태, 비강내 단위 투여 형태, 좌제 단위 투여 형태, 피부내 단위 투여 형태, 근육내 단위 투여 형태, 복강내 단위 투여 형태, 피하 단위 투여 형태, 경막외 단위 투여 형태, 설하 단위 투여 형태, 및 뇌내 단위 투여 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 용량 형태로 제형화될 수 있다. 경구 단위 투여 형태는 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말, 로젠지, 과립, 용액, 현탁액, 유화액, 시럽, 엘릭서, 서방성 제형, 에어로졸 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 조성물은 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본발명의 방법에 따라서, 조성물은, 예를 들어 근육내, 피하, 정맥내, 심방내, 관절내, 비경구, 비강내, 폐내, 경피, 흉막내, 척수강내, 종양내 및 경구 투여 경로를 비롯하여 다양한 투여 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예방 및 치료 목적을 위하여, 조성물은 단일 볼루스(bolus) 전달, 장기간에 걸친 연속 전달(예를 들어, 연속 경피 전달)을 통해, 또는 반복 투여 프로토콜(예를 들어, 매시간, 매일, 매주 또는 매월 기준)로 대상체에게 투여될 수 있다.
투여는 주사, 관주, 흡입, 섭취, 전기삼투, 혈액투석, 이온삼투 및 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 투여 경로는 당연히 치료되는 질병의 위치 및 특성에 따라 달라질 것이며, 예를 들어, 귀의, 구강, 결막, 피부, 치과, 자궁경부, 굴내, 기관내, 장, 경막외, 간질, 관절내, 동맥내, 복부내, 귀 내, 담도내, 기관지내, 활액낭내, 해면내, 뇌내, 수조내, 각막내, 두론내, 관상동맥내, 두개내, 피부내, 추간판내, 관내, 십이지장내, 십이지장내, 경막내, 심외막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 간내, 회장내, 병변내, 설내, 관광내, 림프내, 유방내, 골수내, 뇌막내, 근육내, 비강내, 결절내, 안구내, 장막내, 난소내, 복강내, 심낭내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 관내, 정강내, 척수내, 윤활막내, 힘줄내, 고환내, 기관내, 척수강내, 흉부내, 관내, 종양내, 고막내, 자궁내, 복강내, 혈관내, 뇌실내, 방광내, 전정내, 정맥내, 유리체내, 후두, 비강, 비위, 경구, 안과, 구인두, 비경구, 경피, 관절주위, 경막외, 신경주위, 치주, 호흡기, 후관, 직장, 척추, 지주막하, 결막하, 피하, 치은연하, 설하, 점막하, 망막하, 국소, 경피, 경심내막, 경점막, 태반경유, 기관지, 고막경유, 요관, 요도 및/또는 질 관류, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 전신 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피부내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 경구 투여 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 종양내 투여용으로 제형화된다.
본발명의 조성물의 유효 투여량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태, 대상체가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 치료가 예방적인지 또는 치료요법인지 여부뿐만 아니라 조성물 자체의 특정 활성 및 개인에 대한 목적하는 반응을 이끌어내는 능력을 비롯하여 많은 다양한 요인에 따라 변화한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이 아닌 포유동물일 수 있다. 전형적으로, 투여량 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록, 즉 안전성과 효능을 최적화하도록 조절된다.
이러한 맥락에 있어서. 유효 투여량의 결정은 전형적으로 동물 모델 연구에 이어 인간 임상 시험을 기초로 하며, 모델 대상체에서 대상체 장애의 발생 또는 중증도를 유의하게 감소시키는 유효 투여량 및 투여 프로토콜을 결정함으로써 안내된다. 본발명의 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여될 수 있고, 진단 후 언제든지 대상체에게 투여될 수 있다. 본발명의 조성물은 문제의 질환을 치료하는데 유용한 단독 치료법으로서, 단일 치료법으로서, 또는 다른 약제 또는 다른 치료와 결합으로, 또는 조합 치료법으로서 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본발명의 조성물의 치료 유효량은 약 1 ng/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 본발명의 조성물의 범위는 약 1 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 1 ng/kg 체중 내지 약 100 ng/kg 체중, 약 1 ng/kg 체중 내지 약 10 ng/kg 체중, 약 10 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 10 ng/kg 체중 내지 약 100 ng/kg 체중, 약 100 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 100 ng/kg 체중 내지 약 10 pg/kg 체중, 약 1 μg/kg 체중 kg 내지 약 10 pg/kg 체중, 약 1 μg/kg 체중 내지 약 100 pg/kg 체중, 약 10 pg/kg 체중 내지 약 100 pg/kg 체중, 약 10 pg/kg 체중 체중 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 이러한 범위 내의 투여량은, 예를 들어 1일 다중 투여 또는 매일, 매주, 격주 또는 매월 투여를 포함하는 단일 또는 다중 투여에 의해 달성될 수 있다. 본발명의 조성물은 적절하거나 지시된 대로 볼루스 또는 연속 주입에 의한 단일 용량으로, 또는 볼루스 또는 연속 주입에 의한 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량은, 예를 들어 하루에 여러 번, 하루에 한 번, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 마다, 매주 마다, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 마다, 또는 매월 마다 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본발명의 조성물은 매주 투여된다. 일부 실시형태에서, 본발명의 조성물은 격주로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본발명의 조성물은 3주 마다 투여된다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수도 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기법을 통해 용이하게 모니터링된다.
인간 성인 대상체에게 투여하기 위하여, 치료 유효량은 용량 당 0.0006mg, 용량 당 0.001mg, 용량 당 0.003mg, 용량 당 0.006mg, 용량 당 0.01mg, 용량 당 0.03mg, 용량 당 0.06mg, 용량 당 0.1mg, 용량 당 0.3mg, 용량 당 0.6mg, 용량 당 1mg, 용량 당 3mg, 용량 당 6mg, 용량 당 10mg, 용량 당 30mg, 용량 당 60mg, 용량 당 100mg, 용량 당 300mg, 용량 당 600mg 및 용량 당 1000mg을 포함하는, 용량 당 0.0006mg ~ 1000mg 범위의 용량으로 투여될 수 있지만, 이에 제한되어 있지 않으며, 치료 과정 중에 여러 번, 일반적으로 연속적인 일일 용량을 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본발명의 조성물은 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.003 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/용량 kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/용량 kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 3 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 3 mg/용량 kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 또는 약 6 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량의 용량 수준으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본발명의 조성물은 약 0.001 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량, 약 3 mg/ kg/용량, 약 6 mg/kg/용량, 또는 약 10 mg/kg/용량의 용량 수준으로 투여된다. 본발명의 조성물은 하루 중 다양한 시간에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 최적의 치료 용량은 저녁에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 최적의 치료 용량은 아침에 투여될 수 있다. 예상대로 복용량은 대상체의 질환, 크기, 연령 및 상태에 따라 달라진다.
약제학적 조성물의 투여량은 표적 부위에서 목적하는 농도를 유지하기 위하여 담당 임상의에 의해 달라질 수 있다. 전달 방식에 따라 더 높거나 더 낮은 농도를 선택할 수 있다. 투여량은 또한 투여되는 제형의 방출 속도에 따라 조절되어야 한다.
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 대상체에게 여러 번 (예를 들어, 다수의 용량) 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 반복될 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 목적에 따라 만성적으로 또는 급성적으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 4주 미만, 3주 미만, 2주 미만, 또는 1주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여량 사이의 간격은 3주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여량 사이의 간격은 2주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여량 사이의 간격은 1주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여량 사이의 간격은 28일, 27일, 26일, 25일, 24일, 23일, 22일, 21일, 20일, 19일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 4주 이상, 3주 이상, 2주 이상 또는 1주 이상이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 적어도 3주이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 적어도 2주이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 적어도 1주이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여량 사이의 간격은 적어도 28일, 적어도 27일, 적어도 26일, 적어도 25일, 적어도 24일, 적어도 23일, 적어도 22일, 적어도 21일, 적어도 20일, 적어도 19일, 적어도 18일, 적어도 17일, 적어도 16일, 적어도 15일, 적어도 14일, 적어도 13일, 적어도 12일, 적어도 11일, 적어도 10일, 적어도 9일, 적어도 8일, 적어도 7일, 적어도 6일, 적어도 5일, 적어도 4일, 적어도 3일, 적어도 2일 또는 적어도 1일이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 용량은 대상체에게 1일 1회, 2일 마다 1회, 3일 마다 1회, 4일 마다 1회, 5일 마다 1회, 6일 마다 1회, 7일 마다 1회, 8일 마다 1회, 9일 마다 1회, 10일 마다 1회, 11일 마다 1회, 12일 마다 1회, 13일 마다 1회, 14일 마다 1회, 15일 마다 1회, 16일 마다 1회, 17일 마다 1회, 18일 마다 1회, 19일 마다 1회, 20일 마다 1회, 21일 마다 1회, 22일 마다 1회, 23일 마다 1회, 24일 마다 1회, 25일 마다 1회, 26일 마다 1회, 27일 마다 1회 또는 28일 마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 용량은 대상체에게 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 용량은 대상체에게 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 수 회 투여되며, 여기서 두 번째 및/또는 후속 투여 후 대상체에서 LNP의 혈청 반감기는 첫 번째 투여 후 LNP 혈청 반감기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 분자를 포함하는(예를 들어, LNP에 캡슐화된) 약제학적 조성물의 두 번째 및 후속 용량은, 두 번째 투여 또는 후속 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 캡슐화된 분자의 활성을, 첫 번째 용량 활성의 50% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 60% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 70% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 75% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 80% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 85% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 90% 이상, 또는 첫 번째 용량 활성의 95% 이상 유지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 3시간 이상, 약 4시간 이상, 약 5시간 이상, 약 6시간 이상, 약 7시간 이상, 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 12시간 이상, 약 14시간 이상, 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 20시간 이상, 약 25시간 이상, 약 30시간 이상, 약 35시간 이상, 약 40시간 이상, 약 45시간 이상 또는 약 50시간 이상의 생체내 치료 효과 지속시간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 1.5일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일의 생체내 치료 효과 지속시간을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 예정된 역치 값에 필적하는 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 예정된 역치 값보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 예정된 역치 값보다 짧은 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 예정된 역치 값은, LNP가 (i) 일반식 (A), (A') 또는 (A'')가 아닌 PEG-지질(예를 들어, 대조 조성물 내의 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DPG일 수 있음); 또는 (ii) 일반식 (I)이 아닌 양이온성 지질을 포함하는 것을 제외하곤, 동일한 페이로드 분자 및 LNP를 포함하는 대조 조성물의 반감기이다,
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 이전 투여 후 AUC의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%인 반복 투여 후 AUC(혈액 농도-시간 곡선 밑의 면적)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 이전 투여 후 AUC의 적어도 60%인 AUC를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반복 투여 후, 약제학적 조성물의 AUC는 이전 투여 후 AUC에 비하여 70% 미만, 60% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만 감소한다. 일부 실시형태에서, 반복 투여 후, 약제학적 조성물의 AUC는 이전 투여 후 AUC에 비해 40% 미만 감소한다.
일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물은 종양 용해성 바이러스의 바이러스 게놈을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 종양을 앓고 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하면 핵산 분자가 종양 세포 내로 전달된다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 복제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하면 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스가 선택적으로 복제된다.
일부 실시형태에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 본발명의 약제학적 조성물을 투여하면 종양의 성장이 억제된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양의 성장을 억제한다. 일부 실시형태에서, 종양의 성장이 억제된다는 것은 특정 기간 동안 약제학적 조성물을 투여하기 직전의 종양 크기의 100% 이내로 종양의 크기를 조절한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 종양의 성장이 억제된다는 것은 약제학적 조성물 투여 직전 종양 크기의 110% 이내, 120% 이내, 130% 이내, 140% 이내 또는 150% 이내로 종양의 크기를 조절하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하면 종양이 수축되거나 제거된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 6개월 이내, 9개월 이내, 12개월 이내, 또는 2년 이내에 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 실시형태에서, 종양 수축이란 약제학적 조성물의 투여 직전의 종양 크기에 비하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 종양 크기를 감소시키는 것을 말한다. 일부 실시형태에서, 종양 수축이란 약제학적 조성물의 투여 직전의 종양 크기에 비하여 30% 이상 종양 크기가 감소하는 것을 의미한다.
약제학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 함유한 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어 단일 또는 다중 용량을 위한 주사 가능한 용액의 형태로, 또는 주사 전에 재구성되는 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 택일적으로, 이러한 키트는 약제학적 조성물의 투여를 위한 건조 분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 약제학적 조성물의 표시 및 사용법에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.
본발명은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 치료 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본발명은 캡슐화된 분자를 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포를 LNP 또는 그의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 LNP는 캡슐화된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 분자는 바이러스를 코딩하는 핵산 분자이며, 여기서 세포를 LNP와 접촉시키면 세포에 의해 바이러스 입자가 생성된다. 바이러스 입자는 감염성 및 용해성이다.
일부 실시형태에서, 본발명은 대상체에게 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 다중 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 4주 미만, 3주 미만, 2주 미만 또는 1주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회의 연속 투여 사이의 간격은 2주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여 사이의 간격은 1주 미만이다. 일부 실시형태에서, 2회 연속 투여 사이의 간격은 28일, 27일, 26일, 25일, 24일, 23일, 22일, 21일, 20일, 19일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 4주 이상, 3주 이상, 2주 이상 또는 1주 이상이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 2주이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 1주이다. 일부 실시형태에서, 본발명의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 28일, 27일, 26일, 25일, 24일, 23일, 22일, 21일, 20일, 19일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일이다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일 또는 28일 마다 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 마다 1회 대상체에게 본발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 마다 1회 대상체에게 본발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 본 방법은 다중 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법의 두 번째 및/또는 후속 투여 후 대상체에서 LNP의 혈청 반감기는 첫 번째 투여 후 LNP의 혈청 반감기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
일부 실시형태에서, LNP는 이전 투여 후 AUC의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상의 반복 투여 후 AUC를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 이전 투여 후 AUC의 60% 이상인 AUC를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반복 투여 후, LNP의 AUC는 이전 투여 후 AUC에 비하여 70% 미만, 60% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이다. 일부 실시형태에서, 반복 투여 후, LNP의 AUC는 이전 투여 후 AUC에 비해 40% 미만 감소한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 LNP는 종양 용해성 바이러스의 바이러스 게놈을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 대상체는 종양을 갖고 있으며, LNP를 투여하면 핵산 분자가 종양 세포 내로 전달된다. 일부 실시형태에서, LNP의 투여는 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 복제를 초래한다. 일부 실시형태에서, LNP의 투여는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 선택적 복제를 초래한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 LNP를 종양이 있는 대상체에게 투여하면 종양의 성장이 억제된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양의 성장을 억제한다. 일부 실시형태에서, 종양의 성장이 억제된다는 것은 특정 기간 동안 약제학적 조성물을 투여하기 직전의 종양 크기의 100% 이내로 종양의 크기를 조절한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 종양의 성장이 억제된다는 것은 약제학적 조성물 투여 직전 종양 크기의 110% 이내, 120% 이내, 130% 이내, 140% 이내 또는 150% 이내로 종양의 크기를 조절하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 LNP를 종양이 있는 대상체에게 투여하면 종양이 수축되거나 제거된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 6개월 이내, 9개월 이내, 12개월 이내 또는 2년 이내에 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 실시형태에서, 종양 수축이란 약제학적 조성물의 투여 직전의 종양 크기에 비하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 종양 크기를 감소시키는 것을 말한다. 일부 실시형태에서, 종양 수축이란 약제학적 조성물의 투여 직전의 종양 크기에 비하여 종양 크기가 30% 이상 감소하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 본발명의 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 LNP를 종양이 있는 대상체에게 투여하면 암의 전이를 억제한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있으며, 여기서 본 방법은 암의 성장 및/또는 전이를 억제하거나 지연시킨다.
일부 실시형태에서, 본발명은 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 전신 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피부내, 피하, 비강내, 경구 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 본발명은 LNP 또는 그의 약제학적 조성물을 국소 투여하는 것을 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 투여는 종양내 투여이다.
암
일부 실시형태에서, 본발명은 암성 세포를 본발명의 지질 나노입자, 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 암성 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 암성 세포는 입자/재조합 RNA 분자/조성물을 상기 암성 세포에 세포내 전달하기에 충분한 조건 하에 노출되며, 여기서 캡슐화된 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 복제-가능한 바이러스가 암성 세포의 사멸을 유도한다.
일부 실시형태에서, 본발명은 암을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 본발명의 입자, 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "암"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 질환을 의미하거나 또는 기술하고 있다. 암의 실례로는, 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골형성 육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척색종, 림프관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종 및 연골육종을 포함함), 신경내분비종양, 중피종, 윤활막종, 신경초종, 수막종, 선암종, 흑색종, 백혈병 또는 림프성 악성종양을 들 수 있지만, 이에 제한되어 있지 않다. 이러한 암의 보다 구체적인 실례로는, 편평 세포암(예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암을 포함한 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종 및 폐 편평 암종, 소세포폐암종, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암종, 침샘암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 고환암, 식도암, 담도종양, 유잉종양, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 폐암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 골수이형성질환, 중쇄질환, 신경내분비 종양, 신경초종, 기타 암종, 및 두경부암을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 신경내분비암이다. 더욱이, 양성 전립선 비대증(BPH), 수막종, 신경초종, 신경섬유종증, 켈로이드(keloid), 근종 및 자궁 근종 등을 포함하는 양성(즉, 비암성) 과다증식성 질환, 장애 및 증상도 본 명세서에 개시된 내용을 사용하여 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 소세포 폐암(SCLC), 소세포 방광암, 대세포 신경내분비 암종(LCNEC), 거세-저항성 소세포 신경내분비 전립선암(CRPC-NE), 카르시노이드(예를 들어, 폐 카르시노이드) 및 다형성 교모세포종-IDH 돌연변이(GBM-IDH 돌연변이)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 암은 전이성 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전이되어 있다. 일부 실시형태에서, 암은 비-전이성 암이다.
일부 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 신장 세포 암종, 폐암 또는 간암이다. 일부 실시형태에서, 폐암은 NSCLC(비-소세포 폐암)이다. 일부 실시형태에서, 간암은 HCC(간세포 암종)이다. 일부 실시형태에서, 간암은 전이성이다. 일부 실시형태에서, 유방암은 TNBC(삼중-음성 유방암)이다. 일부 실시형태에서, 방광암은 요로상피암종이다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 식도암, 위암, 폐암, 신장암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 암은 간으로 전이되어 있다. 일부 실시형태에서, 암은 간에 전이된 암이며, 여기서 암은 유방암, 식도암, 위암, 폐암, 신장암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 혈액암은 다발성 골수종이다(예를 들어, Bradley, et al., Oncolytic Virotherapy, 2014:3 47-55를 참조하기 바라며, 그 내용은 전문이 참고로 포함되어 있다). 일부 실시형태에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다.
일부 실시형태에서, 입자, 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물은 암을 치료하거나 또는 폐암(예를 들어, NSCLC), 유방암, 유방암, 대장암 또는 췌장암의 암 세포를 사멸시키기 위하여 CVA21-KY 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암(예를 들어, NSCLC)이다.
일부 실시형태에서, 입자, 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물은 암을 치료하거나 또는 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 또는 간암(예: HCC)의 암세포를 사멸시키기 위하여 CVA21-EF 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 신장 세포 암종이다. 일부 실시형태에서, 암은 간암(예를 들어, HCC)이다. 일부 실시형태에서, 간암은 전이성이다.
일부 실시형태에서, 입자, 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물은 암을 치료하거나 또는 폐암, 간암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 대장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신장 세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종(MCC) 또는 흑색종의 암 세포를 사멸시키기 위하여 SVV(예를 들어, SVV-IRES-2 키메라 바이러스)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 소세포 폐암(SCLC)이다. 일부 실시형태에서, 암은 신경모세포종이다. 일부 실시형태에서, 암은 신경내분비암이다. 일부 실시형태에서, 암은 횡문근육종이다. 일부 실시형태에서, 암은 신경내분비 표현형을 갖는 거세-저항성 전립선암(CRPC-NE)이다. 일부 실시형태에서, 암은 메르켈 세포 암종(MCC)이다.
일부 실시형태에서, 본발명은 (i) 유효량의 본발명의 입자(예를 들어, LNP), 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물, 및 (ii) 유효량의 면역 체크포인트 억제제를, 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 실시예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1에 결합한다(예를 들어, 억제제는 항PD-1 항체이다). 항-PD1 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Nivolumab, Pembrolizumab, Lambrolizumab, Pidilzumab, Cemiplimab 및 AMP-224(AstraZeneca/MedImmune 및 GlaxoSmithKline), Jounce Therapeutics의 JTX-4014, Spartalizumab(PDR001, Novartis), Camrelizumab(SHR1210, Jiangsu HengRui Medicine Co., Ltd), Sintilimab(IBI308, Innovent 및 Eli Lilly), Tislelizumab(BGB-A317), Toripalimab(JS 001), Dostarlimab(TSR-042, WBP-285, GlaxoSmithKline), INCMGA00012(MGA012, Incyte 및 MacroGenics), 및 AMP-514(MEDI0680, AstraZeneca)를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-L1에 결합한다(예를 들어, 억제제는 항-PD-L1 항체이다). 항-PDL1 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 MEDI-4736, MPDL3280A, Atezolizumab(Tecentriq, Roche Genentech), Avelumab(Bavencio, Merck Serono 및 Pfizer) 및 Durvalumab(Imfinzi, AstraZeneca)를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA4에 결합한다(예를 들어, 억제제는 항-CTLA4 항체이다). 항-CTLA4 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 ipilimumab, tremelimumab 또는 WO2014/207063에 개시된 임의의 항체를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-TIGIT 항체 또는 그의 단편이다. 항-TIGIT 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 tiragolumab(Roche), EOS-448(iTeos Therapeutics), Vibostolimab(Merck), Domvanalimab(Arcus, Gilead), BMS-986207(BMS), Etigilimab(Mereo), COM902(Compugen), ASP8374(Astellas), SEA-TGT(Seattle Genetics), BGB-A1217(BeiGene), IBI-939(Innovent) 및 M6223(EMD Serono)를 들 수 있다.
일부 실시형태에서, 1) 입자, 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물 및 2) 면역 체크포인트 억제제는 둘 다 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 이들 2개의 치료 성분은 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료 성분 중 하나 또는 둘 다는 여러 번 투여된다. 일부 실시형태에서, 입자, 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물은 SVV(예를 들어, SVV-IRES-2 키메라 바이러스)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본발명은, (i) 유효량의 본발명의 입자(예를 들어, LNP), 재조합 RNA 분자 또는 이의 조성물, 및 (ii) "조작된 항원 수용체"를 포함하는 유효량의 조작된 면역 세포를, 암으로 고통받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 조작된 항원 수용체란 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 비-자연-발생 항원 특이적 수용체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 힌지(hinge) 및 막횡단 도메인을 통해 신호전달 도메인을 포함한 세포질 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포외 도메인은 MHC-독립적 방식으로 표적 세포에 의해 발현된 항원에 결합하여 조작된 면역 세포의 활성화 및 증식을 유도한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 융합된 꼬리(tag)를 인식한다. 이러한 실시형태에서, CAR의 항원-특이성은 표지된 항체의 항원-특이성에 의존하므로, 단일 CAR 구조물은 하나의 항체를 다른 항체로 대체함으로써 다수의 상이한 항원을 표적화하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,233,125호 및 제9,624,279호, 미국 특허 출원 공개 제20150238631호 및 제20180104354호를 참조한다). 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 본발명에 유용한 항원 결합 도메인으로는, 예를 들어 scFv; 항체; 항체의 항원 결합 영역; 중쇄/경쇄의 가변 영역; 및 단일쇄 항체를 들 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 (CD3ξ 신호전달 도메인과 같은) TCR 복합체 제타 사슬, FcγRIII, FcεRI 또는 T-림프구 활성화 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인 중 임의의 2개를 포함한다. 예시적인 CAR 구조물 및 세포내 신호전달 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에서 참고로 포함되는 WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; 및 WO 2015/090229를 참조하기 바란다).
다양한 종양 항원에 특이적인 CAR은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 CD171-특이적 CAR(Park et al., Mol Ther (2007) 15(4):825-833), EGFRvIII-특이적 CAR(Morgan et al., Hum Gene Ther (2012) 23(10):1043-1053), EGF-R-특이적 CAR(Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014) 107(1):364), 탄산탈수효소 K-특이적 CAR(Lamers et al., Biochem Soc Trans (2016) 44(3):951-959), FR-α 특이적 CAR(Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12 (20):6106-6015), HER2-특이적 CAR(Ahmed et al., J Clin Oncol (2015) 33(15)1688-1696; Nakazawa et al., Mol Ther (2011) 19(12):2133-2143; Ahmed et al., Mol Ther (2009) 17(10):1779-1787; Luo et al., Cell Res (2016) 26(7):850-853; Morgan et al., Mol Ther(2010) 18(4):843-851; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9(2):32), CEA-특이적 CAR(Katz et al., Clin Cancer Res (2015) 21(14):3149-3159), IL13Rα2-특이적 CAR (Brown et al., Clin Cacner Res (2015) 21(18):4062-4072), GD2-특이적 CAR (Louis et al., Blood (2011) 118(23):6050-6056; Caruana et al., Nat Med (2015) 21(5):524-529), ErbB2-특이적 CAR (Wilkie et al., J Clin Immunol (2012) 32(5):1059-1070), VEGF-R-특이적 CAR (Chinnasamy et al. al., Cancer Res (2016) 22(2):436-447), FAP-특이적 CAR(Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(2):154-166), MSLN-특이적 CAR(Moon et al, Clin Cancer Res (2011) 17(14):4719-30), NKG2D-특이적 CAR(VanSeggelen et al., Mol Ther (2015) 23(10):1600-1610), CD19-특이적 CAR(Axicabtagene ciloleucel(Yescarta®) 및 Tisagenlecleucel(Kymriah®)을 들 수 있다. 또한, 종양-특이적 CAR의 임상 시험 검토에 관한 Li et al., J Hematol and Oncol (2018) 11(22)를 참조하기 바란다.
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 조작된 TCR이다. 조작된 TCR은 특정 표적 항원을 인식하는 T 세포 집단으로부터 단리 및 클로닝된 TCRα 및/또는 TCRβ 쇄를 포함한다. 예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ 유전자(즉, TRAC 및 TRBC)는 특정 악성 종양이 있는 개인으로부터 단리된 T 세포 집단 또는 특이적 종양 항원 또는 종양 세포로 면역화된 인간화 마우스에서 단리된 T 세포 집단으로부터 클로닝될 수 있다. 조작된 TCR은 (예를 들어, 표적 세포 표면에 발현된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질의 맥락으로 제시된 동족 항원을 인식함으로써) 내인성 TCR과 동일한 메커니즘을 통해 항원을 인식한다. 이러한 항원 결합은 내인성 신호 전달 경로를 자극하여 TCR-조작 세포의 활성화 및 증식을 유도한다.
종양 항원에 특이적인 조작된 TCR은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WT1-특이적 TCR(JTCR016, Juno Therapeutics; 미국 특허출원공개 번호 20160083449에 기술된 WT1-TCRc4), MART-1 특이적 TCR(Morgan et al., Science 314 (2006) 126-129에 기술된 DMF4T 클론; Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546에 기술된 DMF5T 클론; 및 van den Berg et al., Mol. Ther. 23 (2015) 1541-1550에 기술된 ID3T 클론을 포함함), gp100-특이적 TCR(Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546), CEA-특이적 TCR(Parkhurst et al., Mol Ther. 19 (2011) 620-626), NY-ESO 및 LAGE-1 특이적 TCR(Robbins et al., J Clin Oncol 26 (2011) 917-924; Robbins et al., Clin Cancer Res 21 (2015) 1019-1027; 및 Rapoport et al., Nature Medicine 21 (2015) 914-921에 기술된 1G4T 클론), 및 MAGE-A3-특이적 TCR(Morgan et al., J Immunother 36 (2013) 133-151) 및 Linette et al., Blood 122 (2013) 227 -242)을 들 수 있다. (또한, Debets et al., Seminars in Immunology 23(2016) 10-21을 참조하기 바란다).
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 분화 분자의 클러스터로부터 선택된 표적 항원에 대해 지시되며, 표적 항원 으로는, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD16, CD24, CD25, CD33, CD34, CD45, CD64, CD71, CD78, CD80(B7-1로도 알려져 있음), CD86(B7-2로도 알려져 있음), CD96, CD116, CD117, CD123, CD133, CD138, 및 CD371(CLL1로도 알려짐); 5T4, BCMA(CD269 및 TNFRSF17로도 알려져 있음), UniProt# Q02223, 암배아 항원(CEA), 탄산탈수효소 9(CAIX 또는 MN/CAIX), CD19, CD20, CD22, CD30, CD40과 같은 종양-관련 표면 항원, 디시알로강글리오사이드(disialoganglioside), 예를 들어 GD2, ELF2M, 관상피 점액, 에프린 B2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM), ErbB2(HER2/neu), FCRL5(UniProt# Q68SN8), FKBP11(UniProt# Q9NYL4), 신경교종 관련 항원, 글리코스핑고지질(glycosphingolipid), gp36, GPRC5D(UniProt# Q9NZD1), mut hsp70-2, 장 카르복실 에스테라제, IGF-I 수용체, ITGA8(UniProt# P53708), KAMP3, LAGE-1a, MAGE, 메조텔린(mesothelin), 호중구 엘라스타제, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, PAP, 프로스타제(prostase), 전립선암 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 특이적 항원(PSA), PSMA, 프로스테인(prostein), RAGE-1, ROR1, RU1 (SFMBT1), RU2(DCDC2), SLAMF7(UniProt# Q9NQ25), 수르바이빈(survivin), TAG-72 및 텔로머라제(telomerase); 종양-특이적 펩티드 에피토프를 나타내는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자; 피브로넥틴(fibronectin)의 여분 도메인 A(EDA) 및 여분 도메인 B(EDB)와 같은 종양 간질 항원; 테나신-C(TnC A1) 및 섬유아세포 관련 단백질(FAP)의 A1 도메인; 사이토카인 수용체, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변종 III(EGFRvIII), TFGβ-R, 또는 엔도글린(endoglin)과 같은 이들의 성분; 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자; HIV-특이적 항원(예를 들어, HIV gp120)과 같은 바이러스-특이적 표면 항원; EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라사 바이러스(Lassa virus)-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원; 및 이들 표면 항원의 유도체 또는 변종을 들 수 있다.
추가의 번호별 실시형태
본 발명의 실시형태를 추가로 번호를 매겨서 다음과 설명한다:
실시형태 1. 종양 용해성 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 콕사키바이러스는 EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인, 지질 나노입자(LNP).
실시형태 1.1. 종양 용해성 콕사키바이러스 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 콕사키바이러스가 CVA21 Kuykendall 균주인 지질 나노입자(LNP).
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이고, 상기 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 3, 실시형태 1에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 상기 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 4. 실시형태 1에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 5. 실시형태 1에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 6. 실시형태 1에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, LNP.
실시형태 8. 종양 용해성 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 지질 나노입자(LNP).
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 10. 실시형태 8 또는 9에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 S177A 돌연변이를 포함하는 SVV VP2 단백질을 코딩하는, LNP.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 세포로 전달하면 세포에 의해 바이러스 입자가 생성되고, 상기 바이러스 입자는 감염성 및 용균성인, LNP.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, LNP.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 두 번째 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는, LNP.
실시형태 14. 실시형태 12 또는 13에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, LNP.
실시형태 15, 실시형태 14에 있어서, 상기 니트로환원효소가 NfsB 또는 NfsA인, LNP.
실시형태 16. 실시형태 14에 있어서, 상기 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드인, LNP.
실시형태 17. 실시형태 12 또는 13에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인, LNP.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서,
a) 상기 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택되며;
b) 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이거나; 또는
c) 상기 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는, LNP.
실시형태 19. 실시형태 17에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있는, LNP.
실시형태 20. 실시형태 19에 있어서, 상기 면역 체크포인트 수용체는 PD-1인, LNP.
실시형태 21. 실시형태 17에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있는, LNP.
실시형태 22, 실시형태 21에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)인, LNP.
실시형태 23. 실시형태 21 또는 22에 있어서, 상기 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인-바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원인, LNP.
실시형태 24. 실시형태 21 또는 22에 있어서, 상기 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM인, LNP.
실시형태 25, 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 상기 재조합 RNA 분자는 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는, LNP.
실시형태 26. 실시형태 25에 있어서,상기 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142, 및 miR-126로부터 선택되는, LNP.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 상기 miR-TS 카세트는 이하를 포함하는, LNP:
a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
실시형태 28. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하는, LNP.
실시형태 29. 실시형태 28에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP.
화학식 (I)
A는 ―N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 히드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 시클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
실시형태 30, 실시형태 29에 있어서, 상기 티올레이트의 S와 상기 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4인, LNP.
실시형태 31. 실시형태 29 또는 30에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식 (I-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
화학식 (I-a)
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
실시형태 32. 실시형태 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리인, LNP.
실시형태 33. 실시형태 29에 있어서, 상기 양이온성 지질이 하기 구조식 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
실시형태 34. 실시형태 28에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는, LNP.
실시형태 35. 실시형태 28 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)로부터 선택되는, LNP.
실시형태 36. 실시형태 28에 있어서, 상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 상기 헬퍼 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, LNP.
실시형태 37. 실시형태 28 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 구조 지질은 콜레스테롤인, LNP.
실시형태 38. 실시형태 28 내지 제37 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
화학식 (A")
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 39. 실시형태 38에 있어서, 상기 LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, LNP.
실시형태 40. 실시형태 38에 있어서, LP1"은 결합인, LNP.
실시형태 41. 실시형태 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, RP2"은 수소인, LNP.
실시형태 42. 실시형태 28 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
화학식 (B)
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 43, 실시형태 28 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는, LNP.
실시형태 44. 실시형태 28 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K) 으로부터 선택되는, LNP.
실시형태 45. 실시형태 28에 있어서, 상기 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하고, 상기 PEG-지질은 DPG-PEG2000을 포함하는, LNP.
실시형태 46, 실시형태 28에 있어서, 상기 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하고, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, LNP:
화학식 (A")
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
LP1"은 결합이고;
RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
RP2"는 수소이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 47. 실시형태 28 내지 37 및 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100, BRIJTM S20, BRIJTM O20 및 BRIJTM C20로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP.
실시형태 48. 실시형태 28 내지 37 및 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100인, LNP.
실시형태 49. 실시형태 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
a. A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0.01%-3%;
b. A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30%, 및 D = 0.01%-1%; 또는
c. A = 약 49%, B = 약 22%, C = 약 28%, 및 D = 약 0.5%인, LNP.
실시형태 50. 실시형태 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
a. A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%;
b. A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45%, 및 D = 0.01%-3%;
c. A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40%, 및 D = 1%-2%;
d. A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40%, 및 D = 1%-2%; 또는
e. A = 약 49%, B = 약 11%, C = 약 38%, 및 D = 약 1.5%인, LNP.
실시형태 51. 실시형태 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
a. A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%;
b. A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45%, 및 D = 0.01%-3%;
c. A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40%,및 D = 1%-2%;
d. A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35%, D = 1%-2%; 또는
e. A = 약 58%, B = 약 7%, C = 약 33%, 및 D = 약 1.5%인, LNP.
실시형태 52. 지질 나노입자(LNP)로서:
a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
화학식 (A")
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 53. 지질 나노입자(LNP)로서:
a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
화학식 (A")
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 54. 실시형태 52 또는 53에 있어서, R1은 C16-C18 알킬 또는 C16-C18 알케닐인, LNP.
실시형태 55. 실시형태 52 내지 54 중 어느 하나에 있어서, LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, LNP.
실시형태 56. 실시형태 52 내지 54 중 어느 하나에 있어서,LP1"은 결합인, LNP.
실시형태 57, 실시형태 52 내지 56 중 어느 하나에 있어서, RP2"은 수소인, LNP.
실시형태 58. 실시형태 52 또는 53에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식 (A"-f1), 화학식 (A"-f2) 또는 화학식 (A"-f3)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
화학식 (A"-f1)
화학식 (A"-f2)
화학식 (A"-f3)
실시형태 59. 지질 나노입자(LNP)로서:
a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
화학식 (B)
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 60. 지질 나노입자(LNP)로서:
a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
화학식 (B)
n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
실시형태 61. 실시형태 59 또는 60에 있어서, R1은 C15-C17 알킬 또는 C15-C17 알케닐인, LNP.
실시형태 62. 실시형태 59 또는 60에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(B-a) 또는 화학식(B-b)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP.
화학식(B-a)
화학식(B-b)
실시형태 63. 실시형태 52 내지 62 중 어느 하나에 있어서, n은 평균 약 20, 약 40, 약 50 또는 약 100인, LNP.
실시형태 64. 실시형태 52 내지 62 중 어느 하나에 있어서, n은 평균 약 100인, LNP.
실시형태 65. 실시형태 52 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 약 200달톤 내지 약 10,000달톤, 약 500달톤 내지 약 7,000달톤, 또는 약 800달톤 내지 약 6,000달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함하는, LNP.
실시형태 66. 실시형태 52 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP.
실시형태 67. 실시형태 52 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 화학식 (A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 지질이 결여된 대조군 LNP와 비교하여 감소된 생체내 면역 반응을 유도하고, 임의 선택적으로, 상기 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2K-DPG 또는 PEG2K-DMG인, LNP.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 상기 면역 반응은 LNP의 가속 혈액 클리어런스(ABC) 및/또는 항-PEG IgM 반응인, LNP.
실시형태 69, 실시형태 52 내지 68 중 어느 하나 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
화학식 (I)
A는 ―N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 히드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 시클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 상기 티올레이트의 S와 상기 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4인, LNP.
실시형태 71. 실시형태 69 또는 70에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식 (I-a)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
화학식 (I-a)
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
실시형태 72. 실시형태 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리인, LNP.
실시형태 73. 실시형태 69에 있어서, 상기 양이온성 지질이 하기 구조식, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
실시형태 74. 실시형태 52 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이의 혼합물로부터 선택되는, LNP.
실시형태 75. 실시형태 52 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물 또는 화학식(II-2a)의 화합물인, LNP:
:
화학식(II-1a),
화학식(II-2a).
실시형태 76. 실시형태 52 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤이고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC이고, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100, LNP.
실시형태 77. 실시형태 52 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤이고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC이고, 상기 PEG-지질은 MYRJ?? S100, MYRJ?? S50 또는 MYRJ?? S40, LNP.
실시형태 78. 실시형태 52 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 약 0.1% 내지 약 2% PEG-지질, 예를 들어 약 0.2% 내지 약 0.8 몰%, 약 0.4% 내지 약 0.6 몰%, 약 0.7% 내지 약 1.3%, 또는 약 1.2% 내지 약 1.8% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
실시형태 79. 실시형태 52 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 약 0.2% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.5% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
실시형태 80. 실시형태 52 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 약 1.2% 내지 약 1.8%, 또는 약 1.5% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
실시형태 81. 실시형태 52 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 약 44% 내지 약 54% 양이온성 지질, 약 19% 내지 약 25% 헬퍼 지질, 약 24% 내지 약 33% 구조 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8% PEG-지질의 몰비를 갖는, LNP.
실시형태 82. 실시형태 52 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:28.5:22:0.5인, LNP.
실시형태 83. 실시형태 52 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:27.5:22:1.5인, LNP.
실시형태 84. 실시형태 52 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:38.5:11:1.5인, LNP.
실시형태 85. 실시형태 52 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 약 1 내지 약 25의 지질-질소 대 인산염(N:P) 비율을 갖는, LNP.
실시형태 86. 실시형태 52 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP의 N:P 비율은 약 14인, LNP.
실시형태 87. 실시형태 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 히알루론난은 LNP의 표면에 접합되는, LNP.
실시형태 88. 실시형태 1 내지 87 중 어느 하나에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
실시형태 89. 실시형태 88에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 90. 실시형태 88에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 91. 실시형태 88에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 또는 약 120 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 92. 실시형태 88에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 93. 실시형태 88 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 94. 실시형태 88 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 5mV 미만, 약 0mV 미만, 약 -5mV 미만, 약 -10mV 미만, 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 95. 실시형태 88 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 96. 실시형태 94 또는 95에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 97. 실시형태 88 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하면 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 대상체의 표적 세포에 전달하며, 상기 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 대상체의 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 종양 용해성 바이러스를 생산하는, 약제학적 조성물.
실시형태 98. 실시형태 97에 있어서, 상기 표적 세포는 암세포인, 약제학적 조성물.
실시형태 99. 실시형태 88 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
실시형태 100. 실시형태 88 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 화학식(A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 가능 지질이 결여된 조성물보다도 긴 생체내 치료 효과의 지속 기간을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 101. 실시형태 99 또는 100에 있어서, 상기 조성물은 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 3시간 이상, 약 4시간 이상, 약 5시간 이상, 약 6시간 이상, 약 7시간 이상, 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 12시간 이상, 약 14시간 이상, 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 20시간 이상, 약 25시간 이상, 약 30시간 이상, 약 35시간 이상, 약 40시간 이상, 약 45시간 이상 또는 약 50시간 이상의 생체내 치료 효과 지속 기간을 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 102. 실시형태 99 또는 100에 있어서, 상기 조성물은 소정의 역치 값 이상의 반감기 및/또는 생체내 AUC를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 103. 실시형태 88 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP에 의한 합성 RNA 바이러스 게놈의 캡슐화 효율이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%인, 약제학적 조성물.
실시형태 104. 실시형태 88 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM 또는 약 50mM의 총 지질 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 105. 실시형태 88 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6의 pH에서 제형화되는, 약제학적 조성물.
실시형태 106. 실시형태 88 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 복수회 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
실시형태 107. 실시형태 106에 있어서, 후속의 투여는 최초 투여로부터 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 14일 또는 적어도 21일 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
실시형태 108. 실시형태 88 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
실시형태 109. 종양 용해성 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자로서, 상기 콕사키바이러스는 Kuykendall 균주, EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 109.1. 종양 용해성 콕사키바이러스 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자로서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21 Kuykendall 균주인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 110. 실시형태 109에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이고, 상기 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 111. 실시형태 109에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 상기 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 112. 실시형태 109에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 113. 실시형태 109에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 114. 실시형태 109에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 115. 실시형태 109 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 116. 실시형태 109 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 야생형 콕사키바이러스 바이러스와 100% 서열 동일성을 갖는 RNA 바이러스 게놈을 포함하지 않는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 117. 종양 용해성 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자로서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 118. 실시형태 109 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 삽입된 마이크로RNA(miRNA) 표적서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포내에서 코딩된 바이러스의 복제를 저해하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 119. 실시형태 118에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142 및 miR-126로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 120. 실시형태 119에 있어서, 상기 miR-TS 카세트는 이하를 포함하는, 재조합 RNA 분자:
a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
실시형태 121. 실시형태 109 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 비바이러스 전달 매체에 의해 세포에 도입되면 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스를 생산할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 122. 실시형태 121에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 123. 실시형태 122에 있어서, 상기 세포는 포유동물 대상체 내에 존재하는 포유동물 세포인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 124. 실시형태 118 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 125. 실시형태 118 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF), 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 126. 실시형태 109 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 핵산 벡터에 삽입되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 127. 실시형태 126에 있어서, 상기 핵산 벡터는 레플리콘인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 128. 실시형태 109 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 129. 실시형태 128에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 130. 실시형태 129에 있어서, 상기 니트로환원효소가 NfsB 또는 NfsA인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 131. 실시형태 129에 있어서, 상기 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 132. 실시형태 128에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 133. 실시형태 132에 있어서,
a) 상기 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택되며;
b) 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이거나; 또는
c) 상기 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 134. 실시형태 132에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 135. 실시형태 134에 있어서, 상기 면역 체크포인트 수용체는 PD-1인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 136. 실시형태 132에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 137. 제136항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 138. 실시형태 136 또는 137에 있어서, 상기 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인-바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 139. 실시형태 136 또는 137에 있어서, 상기 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM인, 재조합 RNA 분자.
실시형태 140. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는, 재조합 DNA 템플레이트.
실시형태 141. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하며,상기 RNA 분자는 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
실시형태 142. 실시형태 140 또는 141에 있어서, 상기 프로모터 서열과 상기 5' 접합 절단 서열 사이의 리더 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 143. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 리더 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 144. 실시형태 142 또는 143에 있어서, 상기 리더 서열은 길이가 100bp 미만인, 재조합 DNA 분자.
실시형태 145. 실시형태 140 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열인, 재조합 DNA 분자.
실시형태 146. 실시형태 140 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 약 50-90bp의 길이 또는 약 65-75bp의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 147. 실시형태 145에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp인, 재조합 DNA 분자.
실시형태 148. 실시형태 140 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 약 10-50 bp의 길이, 또는 25-35 bp의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 149. 실시형태 140 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 3' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 150. 실시형태 149에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열이고, 상기 3' 리보자임 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 서열인, 재조합 DNA 분자.
실시형태 151. 실시형태 140 내지 14항 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 RNAseH 프라이머 결합 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 152. 실시형태 140 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 153. 실시형태 152에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열, 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 154. 실시형태 140 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 IIS형 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 155. 실시형태 140 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA 분자는 콕사키바이러스(CVA)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 156. 실시형태 155에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주인, 재조합 DNA 분자.
실시형태 157. 실시형태 155 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 14 또는 15에 따는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 158. 실시형태 155 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTT"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 159. 실시형태 155 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 17에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 160. 실시형태 155 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 161. 실시형태 155 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 162. 실시형태 156에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨ol 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 163. 실시형태 156에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 164. 실시형태 140 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA 분자는 세네카 밸리 바이러스(SVV)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 165. 실시형태 164에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 53-63 중 어느 하나에 따른 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 166. 실시형태 164에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 58에 따를 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 167. 실시형태 164 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 서열번호: 64 또는 65에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열이고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TCAA" 또는 "TTAA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 168. 실시형태 164 내지 167 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 169. 실시형태 164 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 170. 실시형태 164에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 53에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 171. 실시형태 164에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 58에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 172. 실시형태 140 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자는 상기 프로모터 서열과 상기 3' 접합 절단 서열에 걸쳐 있는 영역 내에 추가의 핵산을 포함하지 않는, 재조합 DNA 분자.
실시형태 173. 실시형태 140 내지 172 중 어느 하나의 DNA 분자의 시험관내 전사, 및 얻어진 재조합 RNA 분자의 정제를 포함하는 재조합 RNA 분자의 제조 방법.
실시형태 174. 실시형태 173항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 종양 용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 말단을 포함하는, 방법.
실시형태 175. 유효량의 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 및 포유동물 대상체에게 투여하기에 적합한 담체를 포함하는 조성물.
실시형태 176. 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자.
실시형태 177. 실시형태 176에 있어서, 상기 입자는 생분해성인 입자.
실시형태 178. 실시형태 177에 있어서, 상기 입자는 나노입자, 엑소좀, 리포좀 및 리포플렉스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 입자.
실시형태 179. 실시형태 178에 있어서, 상기 엑소좀은 무손상의 엑소좀 또는 빈 엑소좀으로부터 유래된 변형 엑소좀인, 입자.
실시형태 180. 실시형태 176 내지 179 중 어느 하나에 따른 복수의 입자를 포함하는 약제학적 조성물.
실시형태 181. 실시형태 180에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 182. 실시형태 180에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 183. 실시형태 180에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm 또는 약 120 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 184. 실시형태 180에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 100nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 185. 실시형태 180 내지 184 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 186. 실시형태 180 내지 184 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 5mV 미만, 약 0 mV 미만, 약 -5 mV 미만, 약 -10 mV 미만, 약 -20 mV 미만, 약 -30 mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 187. 실시형태 180 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 188. 실시형태 180 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
실시형태 189. 실시형태 180 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 상기 조성물을 전달하면 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포에 전달하고, 상기 캡 슐화된 재조합 RNA 분자는 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 바이러스를 생성하는, 약제학적 조성물.
실시형태 190. 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는, 무기 입자.
실시형태 191. 실시형태 190에 있어서, 상기 무기 입자는 금 나노입자(GNP), 금 나노로드(GNR), 자성 나노입자(MNP), 자성 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 메조다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT) 또는 별 모양의 중공 실리카 나노입자(SHNP)로부터 선택되는, 무기 입자.
실시형태 192. 실시형태 190 내지 191 중 어느 하나의 무기 입자를 포함하는 조성물로서, 상기 입자의 평균 직경은 약 500 nm 미만, 약 50 nm 내지 500 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm인, 조성물.
실시형태 193. 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는, 제 1 항 내지 제87항 중 어느 한 항의 LNP, 실시형태 176 내지 제179 중 어느 하나의 입자, 또는 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 무기 입자.
실시형태 194. 실시형태 193에 있어서, 상기 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 LNP, 입자 또는 무기 입자.
실시형태 195. 실시형태 1 내지 87 중 어느 하나의 LNP, 실시형태 176 내지 179 중 어느 하나의 입자, 또는 실시형태 190 내지 191 중 어느 하나의 무기 입자를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
실시형태 196. 실시형태 195에 있어서, 상기 LNP, 상기 입자 또는 상기 무기 입자의 표적 세포는 암 세포인, 약제학적 조성물.
실시형태 197. 암세포의 사멸 방법으로서, 상기 암성 세포에 입자의 세포내 전달에 충분한 조건 하에서, 상기 암성 세포를 실시형태 1 내지 87, 176 내지 179 또는 190 내지 191 중 어느 하나의 입자, 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 또는 그의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 캡슐화된 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 복제 가능 바이러스는 암성 세포를 사멸시키는, 방법.
실시형태 198. 실시형태 197에 있어서, 상기 복제 가능 바이러스는 비-암성 세포에서는 생성되지 않는, 방법.
실시형태 199. 실시형태 197 또는 198에 있어서, 상기 방법은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는, 방법.
실시형태 200. 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체에게, 유효량의 실시형태 1 내지 87, 176 내지 179 또는 190 내지 191 중 어느 하나의 입자, 실시형태 109 내지 139 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 201. 실시형태 200에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 정맥내, 비강내, 종양내, 복강내로 또는 흡입제로서 투여되는, 방법.
실시형태 202. 실시형태 200에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 종양내 및/또는 정맥내로 투여되는, 방법.
실시형태 203. 실시형태 200 내지 202 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 대상체에게 반복적으로 투여되는, 방법.
실시형태 204. 실시형태 200 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류 또는 인간인, 방법.
실시형태 205. 실시형태 200 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 결장암 또는 췌장암이고, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 KY 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 206. 실시형태 200 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 또는 간암이고, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 EF 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 207. 실시형태 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 정소암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 신세포암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경아교종, 교모세포종, 흑색종, B세포 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 의미 불명의 단클론성 감마병증(MGUS), 메르켈 세포 암종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암, 및 변연부 림프종(MZL)로부터 선택되는, 방법.
실시형태 208. 실시형태 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신세포암, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 209. 실시형태 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 신세포 암, 폐암 또는 간암인, 방법.
실시형태 210. 실시형태 205, 207 또는 208에 있어서, 상기 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종)인, 방법.
실시형태 211. 실시형태 206, 207 또는 208에 있어서, 상기 간암은 간세포 암(HCC)(예를 들어, B형 간염 바이러스 관련 HCC)인, 방법.
실시형태 212. 실시형태 207에 있어서, 상기 전립선암은 치료중 유발된 신경내분비 전립선암인, 방법.
실시형태 213. 실시형태 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 전립선암(예: CRPC-NE), 방광암, 췌장암, 대장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신세포암, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포암 또는 흑색종인, 방법.
실시형태 214. 실시형태 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 소세포 폐암(SCLC) 또는 신경모세포종인, 방법.
실시형태 215. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-EF 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 216. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-KY 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 217. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-Kuykendall 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 218. 실시형태 215 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스는 종양내 및/또는 정맥내로 투여되는, 방법.
실시형태 219. 실시형태 197 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 220. 실시형태 219에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1의 저해제인, 방법.
실시형태 221. 실시형태 197 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 조작된 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 222. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 종양 용해성 콕사키바이러스 (여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주임), 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 암은 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 기준으로 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는, 방법.
실시형태 223. 이하의 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법:
(a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 콕사키바이러스 21(CVA21) 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 경우 치료적 유효량의 CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계.
실시형태 224. 이하의 단계를 포함하는, 콕사키바이러스 21(CVA21) 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치료하기 위해 암을 앓는 대상체를 선택하는 방법:
(a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류 단계;
(c) (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 잇는 것으로 분류되는 경우 CVA21 또는 상기 CVA21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 치료대상을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 대상체에게 CVA21 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계.
실시형태 225. 실시형태 222 내지 224 중 어느 하나에 있어서, 상기 CVA21 균주가 CVA21-KY인 방법.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 설명하기 위한 목적으로 제공되는 것이지, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본 실시예들은 본 명세서에 기술된 방법과 함께 현재 바람직한 실시형태들을 대표하고; 예시하기 위함이며; 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 내에 포함되는 변경 및 다른 용도에 있어서는 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 RNA 분자로부터 감염성 피코르나바이러스(Picornavirus) 바이러스의 생성
재조합 RNA 분자로부터 감염성 CVA21 바이러스를 생성하는 능력을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간략하게, CVA21 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 체외에서 T7 전사에 의해 생성하고, 293T 세포를 4시간 동안 리포펙타민(리포펙타민) RNAiMax에서 1㎍의 CVA21-RNA 구조물로 형질감염시키고, 세포를 세척하고, 완전한 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 형질감염된 293T의 상청액을 72시간 후에 수집하고, 0.45μM 필터로 주사기 여과하고, NCI-H1299 세포에 연속적으로 희석하였다. 48시간 후, NCI-H1299 배양액으로부터 상청액을 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성을 평가하였다. CVA21 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자는 활성 용해성 바이러스를 생성하였다(데이터는 나타내지 않음).
또한, 1㎍의 CVA21-RNA 지질, CVA21 플라스미드 DNA 또는 CVA21-음성 pDNA 대조군으로 처리된 NCI-H1299 세포의 상청액을 72시간 후에 수집하고, 감염되지 않은 NCI-H1299 세포에 연속적으로 희석하였다. 세포 생존능 분석은 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. CVA21-RNA/LNP는 체외에서 종양 세포 용해를 일으키는 감염성 바이러스를 생성할 수 있다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 2: CVA21-코딩 RNA의 정맥내 전달을 위한 지질 나노입자의 제형
CVA21 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자를 RNA의 생체내 전달을 위해 지질 나노입자로 제형화하였다.
지질 나노입자 생성:
다음과 같은 지질이 지질 나노입자의 제형화에 사용되었다:
(a) D-Lin-MC3-DMA(MC3);
(b) N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)
(c) COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13);
(d) COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15);
(e) COATSOME® SS-OC;
(f) COATSOME® SS-OP;
(g) 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319)
(h) 콜레스테롤;
(i) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(j) 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE);
(k) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC);
(l) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE);
(m) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K);
(n) 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DPG-PEG2K);
(o) 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K);
(p) 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K);
(q) 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르(BRIJ™ S100; CAS 번호: 9005-00-9);
(r) 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르(BRIJ™ S20; CAS 번호: 9005-00-9);
(s) 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르(BRIJ™ O20; CAS 번호: 9004-98-2);
(t) 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(BRIJ™ C20, CAS 번호: 9004-95-9);
(u) 폴리옥시에틸렌(40) 스테아레이트(MYRJ™ S40, CAS 번호: 9004-99-3).
다양한 비율로 에탄올 내에서 지질을 제조하였다. 그 다음, RNA 지질 나노입자를 2mL/분(에탄올, 지질 혼합물의 경우 0.5mL/분 및 수성 완충액, RNA의 경우 1.5mL/분)의 결합 유속으로 미세유동 미세혼합물(Precision NanoSystems, Vancouver, BC)을 사용하여 생성하였다. 생성된 입자를 Ca 및 Mg를 함유하는 PBS로 접선 유동 여과에 의해 세척하였다.
지질 나노입자의 물리적 특성 분석:
지질 나노입자의 물리적 특성은 접선 유동 여과 전과 후에 평가하였다. 입자 크기 분포 및 제타 전위 측정은 Malvern Nano-ZS Zetasizer(Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)를 사용하여 광 산란에 의해 결정하였다. 크기 측정은 pH 7.4의 HBS 내에서 수행하였고 제타 전위 측정은 pH 7.4의 0.01M HBS 내에서 수행하였다. RNA 포착의 백분율은 Ribogreen 분석으로 측정하였다. 80% 이상의 RNA 포착을 나타낸 지질 나노입자를 생체 내에서 시험하였다.
실시예 3: 흑색종에서 CVA21-코딩 RNA 지질 나노입자의 생체내 효능
CVA21-코딩 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자가 감염성 바이러스를 생성하고 생체내 흑색종 종양 성장을 억제하는 능력을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. CVA21 RNA 지질 나노입자 생성, 제형 및 분석은 실시예 2에 기재되어 있다.
종양 성장을 억제하는 CVA21 RNA 지질 나노입자의 능력을 SK-MEL28 이종이식 모델을 사용하여 평가하였다. 간략하게, SK-MEL28 세포(무혈청 PBS 및 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 1x106 세포/0.1 mL)를 8주령 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)에 도달했을 때, 마우스에게 PBS, 또는 리포펙타민 RNAiMAx(1 μg)로 제형화된 CVA21-코딩 RNA를 종양내로 투여하거나 또는 CVA21-코딩 RNA 지질 나노입자(제형 ID: 70032-6C, 5 μg)를 정맥내로 투여하였다. 마우스는 1일과 5일차에 종양내 치료를 받았거나 또는 1, 6, 11 및 16일차에 정맥 치료를 받았다. 종양 부피는 전자 캘리퍼스를 사용하여 주 당 3회 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, CVA21 Kuykendall 균주 RNA 분자(제형 ID: 70032-6C; MC3:Chol:DSPC:DPG-PEG5K는 약 49:39.8:11:0.2 몰%임)를 포함하는 LNP로 정맥내 치료 또는 리포펙타민으로 제형화된 CVA21-Kuykendall 균주 RNA 분자의 종양내 치료는 PBS로 처리된 마우스에 비하여 종양 보유 마우스에서 종양 성장을 예방하였다(2요인 분산분석, p<0.0.001). 총체적으로, 이들 결과는 CVA21 RNA 분자를 포함하는 지질 나노입자가 흑색종을 치료하는데 효과적인 치료 전략임을 시사한다.
실시예 4: CVA21의 불연속 3' 말단 생성을 위한 전략
전술한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 합성 게놈은 합성 게놈으로부터 복제 가능하고 감염성인 바이러스를 생산하기 위하여 바이러스 고유의 불연속 3' 및 5' 말단을 필요로 한다. 체외 포유류 5' 및 3' UTR에서 T7 RNA 폴리머라제에 의해 생성된 RNA 전사체는 감염성 ssRNA 바이러스 생성에 필요한 고유의 불연속 말단을 함유하지 않는다.
3' 제한 효소 인식 서열을 사용하는 전략을 이용하여 감염성 CVA21에 필요한 불연속 3' 말단을 생성하였다. Type IIS 제한 인식 서열(예: BsmBI, BsaI 또는 SapI 인식 서열)은 DNA 템플릿의 3' 말단에 삽입되었다. 상응하는 제한 효소(예: BsmBI, BsaI 또는 SapI)는 인식 부위의 5'를 절단하여 적절한 길이의 폴리티미딘 런(polythymidine run)을 생성하여 바이러스 고유의 불연속 바이러스 폴리아데닐화 부위를 생성한다. 이러한 공정은 도 2A에 설명되어 있다.
BsaI-HF®v2 및 BsmBI-v2(New England Biolabs) 둘 다를 DNA 템플릿의 불연속 3' 말단을 생성하는 효율성에 대해 시험하였다. BsmBI 인식 서열 또는 BsaI 인식 서열을 포함하는 DNA 템플릿을 구성하고 생성물 매뉴얼에 제공된 적절한 조건에서 상응하는 효소에 의해 소화시켰다. 도 2B(상부 겔 이미지)에 나타난 바와 같이, BsmBI는 1 효소 단위/μg DNA 농도에서 상응하는 DNA 구조물의 완전한 소화를 달성했지만, BsmBI의 낮은 농도에서는 불완전한 소화로 이어졌다. 한편, 도 2B(하부 겔 이미지)에 도시된 바와 같이, BsaI는 0.015 효소 단위/μg DNA의 낮은 농도에서 상응하는 DNA 구조물의 완전한 분해를 달성하였으며, 이는, 폴리-A 꼬리 영역 뒤에 BsaI 인식 서열을 통합하고 상응하는 BsaI 제한 효소를 사용하면, RNA 바이러스 게놈에 대한 체외 DNA 템플릿의 불연속 3' 말단을 효율적으로 생성할 수 있음을 시사한다.
실시예 5: CVA21의 불연속 5' 말단의 생성을 위한 RNaseH 전략
CVA21 고유의 불연속 5' 말단을 생성하기 위하여 RNAseH 전략을 사용하였다. 바이러스에 대한 실제 말단을 생성하려면 T7 리더를 제거해야 한다. 도 3은 체외 전사(IVT) 및 5' 리더 처리 방법의 다이어그램 나타내고 있다. IVT 템플릿은 상부에 표시되고 그 결과의 RNA 전사체는 중간에 표시되어 있다. 이러한 CVA21 +ssRNA 전사체는 상보적인 dsDNA 올리고(점선 상자)에 어닐링되고 상응하는 부분은 RNaseH로 가수분해된다. 올바른 5' 말단을 갖는 최종 바이러스 ssRNA 생성물은 하단에 표시되어 있다.
이러한 전략은 3' 제한 효소 전략과 함께 감염성 CVA21 생성에 필요한 불연속 5' 및 3' 말단을 가진 최종 합성 CVA21 게놈을 생성한다.
실시예 6: CVA21의 불연속 5' 말단 생성을 위한 리보자임 전략
CVA21 고유의 불연속 5' 말단을 생성하기 위하여 리보자임 전략을 사용하였다. 이러한 방법의 도식은 피코르나바이러스의 5' 말단에서 절단하는 리보자임의 설계를 나타내는 도 4에 예시되어 있다. 나타난 2개의 리보자임은 귀상어 및 피스톨 리보자임이지만, 다수의 다른 리보자임도 본 문맥에 있어서 특정적으로 절단하도록 조정될 수 있다.
이러한 전략을 구현하기 위한 귀상어 및 피스톨 리보자임의 변성은 각각 도 5 및 도 6에 도시되어 있다. CVA21의 5' 말단을 어닐링하고 절단하는 최소 귀상어 리보자임(HHR)의 구조적 모델은 도 5A에 도시되어 있다(이러한 리보자임은 화살표로 표시된 부위에서 5' 말단을 절단함). CVA21 5' 말단(STBL)의 절단을 위하여 안정화된 스템 I을 갖는 귀상어의 구조적 모델은 도 5B에 도시되어 있다(이러한 리보자임은 화살표로 표시된 부위에서 5' 말단을 절단함). 도 6A는 야생(피스톨 WT)에서 발견되는 피스톨 리보자임 특성의 개략도를 보여준다. 도 6B는 P3 가닥을 융합하기 위해 첨가된 테트라루프(tetraloop)를 갖는 mFOLD에 의해 모델링된 P. Polymyxa의 피스톨 리보자임을 나타내고 있다. 점선 상자의 핵산은 바이러스 서열과 관련하여 리보자임의 폴딩된 부분을 유지하기 위하여 돌연변이되었다. 점선 상자로 표시된 WT "GUC" 서열은 "UCA"로 돌연변이되어 피스톨 1을 생성하고, "GUC" 서열은 "TTA"로 돌연변이되어 피스톨 2를 생성하였다.
실시예 7: 콕사키바이러스(Coxsackievirus)-코딩 RNA 분자의 최적화
재조합 RNA 분자로부터 감염성 콕사키바이러스 A21(CVA21)을 생성하는 능력을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간략하게, CVA21 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드는 이전에 기술된 CVA21 게놈 서열에 기반한 체외 T7 전사에 의해 생성되었다(Newcombe et al., Cellular receptor interaction of C-cluster human group A coxsackieviruses Journal of General Virology (2003), 84, 3041-3050. GenBank Accession No. AF465515 참조). SK-MEL-28 세포를 4시간 동안 리포펙타민 RNAiMax 내에서 CVA21 Kuykendall 균주 RNA 구조물 1㎍으로 형질감염시키고, 이때 웰을 세척하고 완전한 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 48시간 후, SK-MEL-28 배양액으로부터 상청액을 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성을 평가하였다. 도 7A(좌측 패널)에 도시된 바와 같이, 뉴콤(Newcombe) CVA21 서열(GenBank Accession No. AF465515에 따른 바이러스 게놈 서열을 갖는 CVA21 Kuykendall 균주)을 포함하는 RNA 분자는 활성 용해성 바이러스를 생성하지 않았다(용해되지 않은 SK-MEL-28 세포의 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 표시됨).
놀랍게도, 재조합 RNA 분자로부터 감염성 CVA21을 생성하기 위해서는 5' UTR에 대한 다른 방법이 필요하였다. 도 7A(우측 패널)에 도시된 바와 같이, Brown et al. (Journal of Virology, (2003)77:16, p. 8973-8984. GenBank Accession No. AF546702)이 기술한 5' UTR 서열을, 뉴콤(GenBank Accession No. AF546702에 따른 바이러스 게놈 서열을 갖는 CVA21 Kuykendall 균주; 이후에는 CVA21-Brown이라고 함)이 기술한 CVA21 게놈 서열에 배합한 바, 감염성 CVA21 바이러스의 생성 및 바이러스 세포 용해를 초래했으며, 이는 다수의 독립적인 클론 전반야에 걸쳐 크리스탈 바이올렛 염색의 결여에 의해 나타난다. 2개의 상이한 CVA21-Brown 클론으로 형질감염된 SK-MEL-28 세포로부터의 상청액을 72시간 후에 수집하고, 0.45μM 필터로 주사기 여과하고, 신선한 SK-MEL-28 세포에 연속적으로 희석하였다. 48시간 후, SK-MEL-28 배양액으로부터 상청액을 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 감염성을 평가하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, Brown 5' UTR 서열(UTR 서열 - 서열번호: 2, 변성된 CVA21 Kuykendall 균주 서열 - 서열번호: 1)을 포함하는 CVA21 코딩 RNA 분자는 형질감염된 세포의 상청액으로의 감염성 CVA21의 생성 및 방출을 초래하였으며, 이는 세포 용해를 매개하는 상청액 단독의 능력에 의해 나타났다.
실시예 8: CVA21-RNA의 생체내 효능
LNP-캡슐화된 CVA21 Kuykendall 게놈의 생체내 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 흑색종의 SK-MEL-28 모델을 사용하였다. 8-12주령의 NU/NU 누드 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 100μL의 Matrigel 내에서 5x106 - 1x107의 생존 가능한 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 150 ± 30 mm3의 예정 부피에 도달했을 때 치료를 시작하였다. 합성 CVA21-LNP를 1일 및 8일차에 0.2 mg/kg 또는 0.05 mg/kg으로 정맥내 투여하였다. 0.05 mg/kg 정도로 낮은 용량 수준에서는 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다(도 8A). 안정적인 체중(도 8B)과 불리한 임상 징후가 없는 것으로 나타난 바와 같이 2개의 투여량 모두 내약성이 양호하였다.
CVA21 바이러스 진입 및 ICAM-1 발현:
CVA21 바이러스 진입을 위한 세포 상의 ICAM-1 및 붕괴 촉진 인자(DAF) 발현에 대한 요건을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간략하게, H1299 세포는 ICAM-1 및/또는 DAF 발현을 녹-아웃(knock-out)하도록 변성되었다. 변성된 세포를 CVA21-KY로 72시간 동안 감염시켰다. 도 8C에 나타낸 바와 같이, ICAM-1 발현은 CVA21-매개 세포 용해에 필요하였다(ICAM-1+ 조건에서 세포 단층의 부재에 의해 입증됨).
이어서, 130개의 인간 세포주를 mRNA 및 단백질 발현에 의한 ICAM-1 발현에 대해 분석하였다. 이 때, ICAM-1 발현 수준은 CVA 감염에 대한 세포주의 민감성과 상관 관계가 있다. TCID50이 <0.5인 경우 세포주는 CVA21-KY 감염에 민감한 것으로 분류되었다. TCID50이 >0.5인 경우 세포주는 CVA21-KY 감염에 대한 내성이 있는 것으로 분류되었다. 도 8D에 나타낸 바와 같이, 민감한 세포주는 내성 세포주에 비해 ICAM-1 발현이 상당히 증가하였음을 나타냈으며, ICAM-1 발현은 CVA21-KY 감염과 상관관계가 있었다(도 8E). NSCLC, RCC, HCC, 흑색종, HNSCC, TNBC 및 방광암을 포함하는 7개의 상이한 질병 상태로부터의 인간 종양 마이크로어레이 조직을, 잠재적인 질병 상태 선택을 위한 면역조직화학을 통해 인간 ICAM-1 발현에 대하여 추가로 평가하였다(하기 표 19). 그 결과는 이들 종양 조직의 대부분이 CVA21 감염을 허용할 것이라는 것을 나타냈다.
표 19: 7개의 질병 상태에 대해 종양 마이크로어레이 및 IHC를 사용한 인간 ICAM-1 발현의 분석
*H-점수는 발현 강도의 척도(+1,+2, +3)이며, 종양 면적 % =[1Х(% 세포 1+)+2Х(% cells 2+)+3Х(% cells 3+)]
실시예 9: CVA21 균주 선택
3개의 CVA21 균주, 즉 Kuykendall 균주, EF 균주 및 KY 균주 중 하나로부터 유래된 합성 종양 용해성 RNA의 세포 친화성 및 치료 효능의 차이를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 도 32는 3개의 CVA21 균주(EF, KY 및 Kuykendall)의 RNA 바이러스 게놈의 도메인 조직 개략도 및 선택 영역의 핵산 시작/종료 위치를 나타낸다.
평가 기준에는 다음과 같은 것이 포함된다:
(a) 체외 및 생체 내에서 암세포 사멸 능력의 친화성 폭 및 효능;
(b) 세포 항바이러스 반응에 대한 바이러스 민감성(예: 인터페론 민감성);
(c) 균주 안정성(예: 복제 충실도, 재조합 빈도);
(d) 생체내 안전성 및 효능.
전반적으로, 그 결과는 KY 및 EF 균주 둘 다가 실험실 균주인 Kuykendall(KuyK)보다 명백히 능가함을 보여준다. 이들 실험 결과는 도 12A-28B에 제공되어 있으며, 다음과 같이 요약된다:
체외 친화성 및 효능:
3개의 CVA21 균주의 친화성과 효능을 비교하기 위하여 세포독성 스크리닝 및 정량적 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하였다. 도 12A 및 도 12B에 도시된 바와 같이, EF 및 KY는 KX(도시되지 않음) 및 Kuykendall 균주를 능가하고, 관심 세포주 내의 개별 균주를 비교할 때 사멸된 세포주의 폭이 더 컸다(즉, 더 넓은 친화성). AUC 값 <200을 민감성에 대한 컷오프로 사용하여, 시험된 131개 세포주 중 82개는 KuyKendall 실험실 균주에 대한 내성이 있었지만, 131개 세포주 중 59개만이 KY 균주에 대한 내성이 있었고, 131개 세포주 중 65개만이 EF 균주에 대한 내성이 있었다(도 12A).
도 13에 도시된 바와 같이, KY 및 EF 균주는 Kuykendall 실험실 균주에 비하여 다수의 징후에 걸쳐 더 넓은 친화성 및/또는 증가된 효능을 나타낸다.
도 14에 나타낸 바와 같이, KY 균주는 NSCLC 세포주를 포함하는 폐암 세포주에서 보다 호의적인 친화성을 나타내었다. 체외 세포독성 스크린의 결과는 EF 및 KY 균주에 대한 AUC 값의 비율로 표시하였다. 값이 >1인 세포주는 EF(어두운 회색 막대)를 선호하는 반면에, 값이 <1인 세포주는 KY(밝은 회색 막대)를 선호한다. KY가 호의적인 친화성을 나타내는 부가적인 징후가 도 15에 도시되어 있다(유방 세포주 도 15A, 결장/GI 세포주 도 15B 및 췌장 세포주 도 15C). 도 15에 있어서, 어두운 회색은 EF 선호 친화성을 나타내고 밝은 회색은 KY 선호 친화성을 나타낸다.
도 16에 도시된 바와 같이, KY 균주는 체외 NSCLC/선암종 모델에서 더욱 종양 용해성이다. 인간 NSCLC 종양 마이크로어레이(n=97)를 면역조직화학을 통한 ICAM-1 발현에 대해 시험하였다(도 16A 참조). EF 및 KY 균주의 종양 용해 효능도 이들 세포주 모델 전반야에 걸쳐 비교하였다. 도 16B에 나타낸 바와 같이, KY 균주는 EF 균주에 비하여 다수의 NSCLC/선암종 세포주 전반야에 걸쳐 더욱 낮은 IC50에서 종양 세포 용해를 입증하였다(도 16B 참조, 여기서 KY 균주에 대한 IC50은 11/15 NSCLC/선암종 세포주에서 더욱 낮음) ). 도 16C는 또한 KY 균주가 대세포 암종 세포주에서 더욱 낮은 IC50을 나타낸다는 것을 보여준다(좌측 패널).
EF 균주는 방광(도 17A), 신장(도 17B), 간(도 17C), 난소(도 17D) 및 GBM(도 17E) 세포주에서 보다 호의적인 친화성을 나타냈다.
KY 및 EF 균주는 유방암 체외 모델에서 유사한 종양 용해 효능을 입증하였다(도 18A). 신장 세포 암종(RCC) 및 간세포 암종(HCC) 체외 모델에서 EF 균주는 KY 균주보다 낮은 평균 IC50 값을 가지며, 이는 EF 균주가 HCC 및 RCC에서 더욱 우수한 종양 용해 효능을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 17B, 도 17C, 도 18B 및 도 18C를 참조할 것.
EF 균주는 hICAM-1 동계 종양 모델에서 더욱 강력하다: hICAM-1의 발현을 위해 세포주를 형질도입하고 선택하였다. TCID50에 의해 CVA21의 KY 및 EF 균주에 의한 감염에 대한 민감성에 대해 세포주를 분석하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, EF 균주는 M109인 유일한 KY 허용 BALB/c 계통으로 시험된 모든 마우스 계통에서 KY 균주를 능가하였다.
더욱이, EF 및 KY 균주는 상대적으로 인간 해리 종양 세포에서 복제된다. NSCLC 냉동 해리 종양 세포(DTC)를 0.1 MOI에서 KY 및 EF로 감염시켰다. 감염된 세포로부터 RNA를 단리하고, 마이너스 가닥 CVA21 qPCR에 사용하여 24시간 및 72시간에서 바이러스 복제를 비교하였다. 3명의 공여자로부터의 결과를 도 20A 및 도 20B에 나타냈다.
생체내 효능:
이들 CVA21 균주(EF, KY 및 Kuykendall(Ku))의 항종양 효능은 마우스 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 평가하였다. 이들 실험을 위해, 각 균주의 RNA 바이러스 게놈을, 49:22:28.5:0.5 몰%의 SS-OC:DSPC:Chol:BRIJ™ S100의 몰비를 포함하는 LNP에 캡슐화하였다. 대조군의 경우, SVV-neg 바이러스 게놈을 캡슐화하는 LNP뿐만 아니라 PBS 완충액을 사용하였다. 종양 성장 억제(TGI) 백분율은 대조군에 대한 치료군의 종양 부피 변화의 %를 비교함으로써 계산되었다. % TGI는 (1 - (치료된 종양의 평균 부피)/(대조군 종양의 평균 부피)) x 100%로서 정의된다.
NSCLC의 NCI-H1299 이종이식 모델에서 EF 및 KY 균주 효능은 도 21에 예시되어 있다. 2개의 균주는 모두 Kuykendall 균주 및 SVV-neg 합성 RNA 지질 나노입자에 비하여 종양 크기의 현저한 감소를 나타냈다. EF 균주는 NCI-H1299 이종이식 모델에서 KY 균주보다 더욱 좋게 작동하는 것으로 나타났다. EF 균주는 KY 균주가 8마리 동물 중 1마리에서 완전한 반응을 나타낸 것에 비해 8마리 동물 중 3마리에서 완전한 반응을 나타냈다. NSCLC의 NCI-H2122 이종이식 모델에서 EF 및 KY 균주 효능은 도 22에 예시되어 있다. KY 균주는 Kuykendall 균주, EF 균주 및 SVV-neg 합성 RNA 지질 나노입자에 비해 종양 크기의 상당한 감소를 가져왔다.
전립선암의 PC3 이종이식 모델에서 EF 및 KY 균주 효능은 도 23에 예시되어 있다. EF 균주는 Kuykendall 균주, KY 균주 및 SVV 합성 RNA 지질 나노입자에 비해 종양 크기의 상당한 감소를 가져왔다.
균주 내약성:
이들 CVA21 균주(EF, KY 및 Kuykendall(Ku))의 내약성은 또한 hICAM-1 트랜스제닉 마우스 모델(transgenic mouse model)을 사용하여 생체 내에서 평가되었다. 내약성 연구는, 도 24에 나타낸 바와 같이, RNA 바이러스 게놈을 포함하는 LNP를 1 mg/kg의 단일 정맥내 투여량으로 마우스에 투여함으로써 수행되었다. 투여 후 48시간 및 7일차에 부검을 검사하였다. 일시적인 체중 손실 외에는 시험된 제제에 걸쳐 평생 임상 독성 징후가 관찰되지 않았다(도 24, 상단 패널). 실시간 화학 변화는 미미하였다(도 24, 하단 패널).
Kuy, KY 및 EF CVA21 균주에 의한, 뇌, 척수, 간, 신장, 폐, 심장 및 근육에서 CVA21 치료-관련 거시적인 또는 미시적인 병리학적 소견은 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 쿱퍼(Kupffer) 세포의 유사분열 증가와 같은 온화하고 산발적인 미시적 소견은 간에서 주로 관찰되었으며, 이는 LNP vRNA 음성 대조군(SVV-neg/LNP)에서도 동일한 소견이 관찰되었기 때문에 LNP로 인해 기인한 것이다(데이터는 나타내지 않음). 다른 경미한 산발적 소견은 모두 사전 또는 사후 분석 절차에 이차적인 것으로 간주되거나 또는 LNP-RNA 바이러스 게놈의 투여와 관련되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 전반적으로, 이러한 결과는 합성 EF, KY 및 Kuykendall CVA21이 민감한 hICAM-1 트랜스제닉 마우스에서 동등하게 내약성이 우수하다는 것을 나타낸다.
바이러스 제거:
바이러스 복제는 48시간 및 7일 시점에서 바이러스 게놈의 마이너스 및 양성 가닥의 RT-qPCR 뿐만 아니라 바이러스 플라크 분석에 의해 연구되었다(도 25A-도 26). 감염 후 48시간에, Kuykendall 균주는 비장, 간, 심장 및 신장에서 가장 높은 마이너스 가닥 RNA 역가로 복제되었고, CVA21 바이러스는 모든 균주에서 검출되었다(도 25A). 대조적으로, 이들 모든 바이러스는 도 25B에 도시된 바와 같이 감염 후 7일까지 조직에서 대부분 제거되며, 여기서 마이너스 가닥 검출의 결여는 바이러스 복제의 결여를 나타낸다. 바이러스 플라크 분석의 결과는 이러한 결론을 뒷받침한다 - EF 균주만이 4마리 동물 중 2마리의 심장에서 7일 시점에서 플라크 역가에 의해 검출가능하게 남아있었다(도 26). 다른 한편으로, 7일 시점에서 혈장에서 검출된 (+)가닥 바이러스 RNA의 존재(도 25C)는 7일 후에 혈액에서 LNP 순환을 시사한다.
인터페론(IFN) 내성:
NSCLC 세포주 NCI-H1299(도 27A) 및 NCI-H2122(도 27B) 및 HFF(인간 포피 섬유모세포, 도 27C)를 CVA21 EF, KY 또는 Kuykendall 균주로 감염시키기 전에 IFNβ 또는 IFNγ로 전처리하고, 세포 생존을 IFN 전처리의 농도에 대해 플롯팅하였다. 그 결과는 도 27A - 도 27C에 요약되어 있으며, EF 및 KY 균주가 유사한 인터페론(IFN) 내성을 나타낸다는 것을 보여준다.
충실도 및 재조합 비율:
KYI, EF, Kuykendall 및 Kuykendall G64S(고충실도 Kuyk 변이체)를 포함하는 CVA21 균주의 0.1 MOI 감염 전에 NCI-H1299 세포를 리바비린(ribavirin)으로 4시간 동안 전처리함으로써 균주의 충실도를 시험하였다. 처리 24시간 후 세포를 수확하고 적정하였다. 그 결과를 도 28A에 나타내었으며, KY 균주는 고충실도 Kuykendall G64S 균주와 같이 200 μM의 리바비린에 대해 유사한 내성을 나타내었다. 재조합 비율을 시험하기 위하여, CVA21 균주 KuyK를, 완전한 바이러스(WT)로서 EF 균주 또는 KY 균주의 3D pol, 캡시드 단백질(Δcap)의 결여 및 사멸 폴리머라제(ΔGDD)로 제조하였다. KY 또는 EF 균주의 3D pol을 포함하는 KuyK 키메라 바이러스의 2개의 비활성 형태(Δcap 및 ΔGDD)를 함께 KuyK 비-허용 293TME로 형질감염시켰다. 72시간 후에 회수된 재조합 생존 바이러스를 적정하였다. 그 결과는 도 28B에 요약되어 있다. KY 균주의 3D pol은 EF 균주의 상응하는 3D pol보다 훨씬 더 낮은 재조합 비율을 나타냈는데, 이는 KY-3D 조건이 재조합 분석에서 약 80배 더 적은 회수된 바이러스를 가졌기 때문이다. 전반적으로, KY 균주는 EF 균주보다 더욱 높은 기준 충실도와 더욱 낮은 재조합 비율을 나타낸다.
실시예 10: CVA21에 대한 리더 서열 선택
CVA21에 대한 체외 전사 템플릿의 5' 접합 절단 서열 영역에서 리보자임 서열의 정확 및 완전한 절단을 촉진하는 리더 서열을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. Viennafold 프로그램은 리보자임 폴딩과 경쟁할 수 있는 2차 구조를 형성하지 않을 것으로 예상되는 리더 서열의 라이브러리를 생성하는데 사용하였다. 도 29A에 도시된 바와 같이 템플릿 구조물에 삽입된 리더 서열을 포함하는 DNA 라이브러리를 생성하였다. 이어서, DNA 라이브러리를 체외 전사에 적용하고, 각 구조물의 RNA 생성물을 정제하고, 2.5% TBE 아가로스 겔에 로딩하여 리보자임 절단 결과를 조사하였다. 도 29B는 CVA21-L4(서열번호: 13), CVA21-L5(서열번호: 14) 및 CVA21-L6(서열번호: 15)를 포함하는 3개의 새로운 리더 서열의 결과를 음성 대조군(ApwL)과 함께 나타내고 있다. CVA21-L5 및 CVA21-L6 리더 서열은 모두 절단 생성물의 밴드(리더+리보자임 단편 및 바이러스 시작 단편)만이 상응하는 레인에서 볼 수 있기 때문에, 리보자임 서열의 정확 및 완전한 절단을 나타낸다.
실시예 11: CVA21에 대한 5' 리보자임 서열의 최적화
CVA21에 대한 체외 전사 템플릿의 5' 접합 절단 서열 영역에서 리보자임 서열을 최적화하기 위한 실험을 수행하였다. P. polymyxa의 피스톨 리보자임을 기반으로 하는 리보자임 변이체 서열의 라이브러리는 스크리닝되었으며; 이들 변이체 서열은 서열번호: 17의 핵산 위치 27-30에 상응하는 핵산 위치에서 상이하였다. P2 스템에서 바이러스 서열의 개시에 상보적인 무작위 서열로 체외 전사(IVT) 템플릿을 생성하였다. IVT를 수행하고 절단된 세그먼트를 단리하고 small RNA-seq을 수행하여 높은 빈도로 절단된 요소의 서열 조성을 결정하였다.
초기 스크리닝 결과는 서열번호: 17의 위치 27-30에서 뉴클레오티드 "TTTA"를 포함하는 서열번호: 17에 비해 2개의 변이체 리보자임 서열이 더욱 높은 빈도로 나타났다는 것을 보여주었다. 하나는 상응하는 위치에서 "TTTT"를 포함하는 서열번호: 18이고; 다른 하나는 상응하는 위치에서 "TTGT"를 포함하는 서열번호: 19이다.
이들 서열의 접합 절단 효율은 상기 실시예 10에서와 유사한 템플릿 구조물 설계 및 체외 전사 실험 설정을 이용하여 시험하였다. 도 30은 다음과 같은 4개의 설계의 결과를 보여준다: (1) 서열번호: 17에 따른 리보자임 서열 및 대체 리더 서열을 포함하는 PPwL; (2) 리더 서열 L6 및 서열번호: 17에 따른 리보자임 서열을 포함하는 PPwL6; (3) 리더 서열 L6 및 서열번호: 18에 따른 리보자임 서열을 포함하는 PP-TwL6; 및 (4) 리더 서열 L6 및 서열번호: 19에 따른 리보자임 서열을 포함하는 PP-GwL6. 그 결과는 PP-TwL6 설계가 100%에 가까운 절단 효율을 갖고 있음을 입증하였으며, 이는 PPwL6 설계와 유사하거나 더욱 우수하고 PP-GwL6 설계보다 훨씬 높으므로, 서열번호: 18은 이러한 실험 설정에서 서열번호: 19보다 우수하다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 전체 CVA21-KY 균주 바이러스 게놈을 코딩하는 재조합 DNA 템플릿과 관련하여 동일한 설계를 시험했을 때 반복되었다.
5' 및 3'에서 정확한 말단을 갖는 합성 RNA 바이러스 게놈을 생성하기 위한 CVA21 발현 구조물 디자인 및 상응하는 체외 전사 공정의 비제한적 실시예의 일반적인 개략도는 도 33에 제공되어 있다.
실시예 12: 폴리-A 꼬리 서열의 최적화
CVA21 바이러스 게놈 또는 SVV 바이러스 게놈에 부착된 폴리-A 꼬리의 길이를 최적화하기 위한 실험을 수행하였다.
4개의 상이한 길이의 폴리-A 꼬리(30pA, 50pA, 70pA 및 90pA)를, CVA21 또는 SVV 바이러스 게놈을 코딩하는 재조합 DNA 분자의 상응하는 영역으로 클로닝함으로써 평가하였다. 다음과 같은 조건에서 모놀리스 올리고-dT(monolith Oligo-dT) 크로마토그래피에서 생성된 RNA 바이러스 게놈의 정제 효율 및 회수율을 평가하기 위하여 정제 분석을 수행하였다: 유속: 1 mL/min; 로딩 농도: 0.1 mg/mL; 결합 조건: 500mM NaCl.
하기 표 15A에 나타낸 바와 같이, 폴리-A 꼬리가 길면 길수록(>30pA) 용출 후 CVA21 RNA 바이러스 게놈 분자의 결합 용량 및 회수율은 더욱 높아지지만, 70pA 를 초과한 폴리-A 꼬리의 길이의 확장은 정제 효율의 최소한도의 추가 향상을 제공하였다. 대표적인 크로마토그래피 프로파일은 도 54A에 나타나 있다.
표 15A: 다양한 폴리-A 꼬리 길이를 갖는 CVA21-RNA의 올리고-dT 크로마토그래피
다음과 같은 조건에서 다양한 폴리-A 꼬리 길이를 갖는 SVV RNA 바이러스 게놈 분자의 정제 효율 및 회수율을 평가하기 위한 유사한 실험을 수행하였다: 유속: 1 mL/분; 로딩 농도: 0.1 mg/mL; 결합 조건: 500mM NaCl. 30pA의 꼬리를 갖는 SVV-RNA 분자의 음성 가닥 대조군도 추가 대조군으로서 포함되었다.
하기 표 15B에 나타낸 바와 같이, 폴리-A 꼬리가 길면 길수록 용출 후 SVV RNA 바이러스 게놈 분자의 결합 용량 및 회수율은 더욱 높아지지만, 70pA 를 초과한 폴리-A 꼬리의 길이의 확장은 정제 효율의 최소한도의 추가 향상을 제공하였다. 대표적인 크로마토그래피 프로파일은 도 54B에 나타나 있다.
표 15B: 다양한 폴리-A 꼬리 길이를 갖는 SVV-RNA의 올리고-dT 크로마토그래피
70pA 길이의 폴리-A 꼬리를 갖는 합성 RNA 바이러스 게놈은 올리고-dT 크로마토그래피 컬럼에서 증가된 결합 용량 및 회수율을 나타냈다.
이어서, 70pA 폴리-A 꼬리 대 30pA 폴리-A 꼬리, 및 리보자임 서열 서열번호: 18 대 서열번호: 17로 생성된 합성 CVA21-EF 균주 바이러스 게놈의 항종양 효능을 비교하였다. NCI-H1299 세포를 기반으로 한 마우스 폐암 모델을 사용하였다. 도 31A 및 도 31B에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 18에 따른 70pA 폴리-A 꼬리 및 5' 리보자임 서열로 생성된 CVA21-EF 균주 바이러스 게놈은 다른 바이러스 게놈 설계에 비하여 유사하거나 또는 심지어 더 나은 항종양 효능을 나타냈다.
실시예 13: 키메라 SVV의 구축 및 이들의 종양 용해 효능 시험
재조합 SVV RNA 바이러스 게놈을 포함하는 SVV 바이러스를 CVA21에 대해 상기 실시예 1에 기술된 것과 유사한 절차에 따라서 생성하였다. 상기 실시예 6에 기술된 것과 유사한 절차에 따라서 5' 귀상어 리보자임 서열 또는 5' 피스톨 리보자임 서열을 사용하여 SVV RNA 바이러스 게놈의 불연속 5' 말단을 생성하였다. SVV RNA 바이러스 게놈의 불연속 3' 말단은 상기 실시예 4에 기술된 것과 유사한 절차를 따라서 3' 간염 델타 바이러스 리보자임 서열(동시 전사 절단을 통해) 또는 3' 제한 효소 인식 서열(예: SapI, 체외 전사 전에 템플릿 절단을 통해)을 사용하여 생성하였다.
SVV 키메라 바이러스의 생성:
SVV-001 바이러스(모체, 서열번호: 25)는, IRES, P1 또는 P3 영역을 도 34에 기술된 바와 같이 다음과 같은 바이러스를 포함하는 상이한 SVV 균주의 상응하는 영역으로 교체함으로써 키메라 바이러스를 제조하는데 이용되었다:
(a) SVV 바이러스 #1. SVA/BRA/MG2/2015(GenBank: KR063108.1)
(b) SVV 바이러스 #2. SVA/캐나다/MB/NCFAD-104/2015(GenBank: KY486156.1)
(c) SVV 바이러스 #3. SVV-MN15-308(GenBank: KU359214.1)
새로운 SVV-GFP-pDNA 구조물(서열번호: 41-50)을 H1299 세포에 개별적으로 형질감염시켜 GFP 발현에 기반하여 종양 용해 활성을 평가하였다. 비리온을 상청액으로부터 수집하여 추가적인 특성화에 사용하였다. 키메라 바이러스는 "교체된 영역 - 대체된 서열의 바이러스 #"에 기초하여 명명되었다. 예를 들어, "IRES-2"는 IRES 영역이 SVV 바이러스 #2(SVA/캐나다/MB/NCFAD-104/2015)의 상응하는 IRES 영역으로 대체된 SVV-001 모체 바이러스를 나타내며, "P1-1" P1 영역이 SVV 바이러스 #1(SVA/BRA/MG2/2015)의 상응하는 P1 영역으로 대체된 SVV-001 모체 바이러스를 나타낸다.
SVV－IRES 키메라 바이러스의 종양 용해 효능:
정화된 비리온을 사용하여 NCI-H69AR 세포를 감염시켰다. GFP의 강도는 감염 12시간 후 MOI 0.1에서 측정하였다. 도 35에 도시된 바와 같이, SVV-IRES-1 키메라 바이러스(서열번호: 28)는 종양 용해성이지만 GFP를 발현하지 않는다. SVV-IRES-2 키메라 바이러스(서열번호: 29, SVV-001 모체 게놈의 IRES 영역으로 교체된 SVA/캐나다/MB/NCFAD-104로부터의 IRES 서열을 함유함)는 보다 강력한 종양 용해성 및 보다 강력한 GFP 발현을 나타낸다. SVV-IRES-3 키메라 바이러스(서열번호: 30)는 SVV-001 모체(서열번호: 27)보다 적은 GFP 발현을 보였다. 요약하면, 결과적으로, SVV-IRES-2는 SVV-001 모체 바이러스보다 더욱 강력한 종양 용해 활성을 갖는 개선된 종양 용해 바이러스인 것으로 나타났다.
SVV-IRES-2 키메라 바이러스는 인터페론 알파(IFNα)에 대한 민감성에 대해 추가로 시험되었다. 바이러스 복제 및 IFNα에 대한 내성은 민감성(NCI-H69AR) 및 부분 내성(NCI-H69) SCLC 세포주 모두에서 시험되었다. 세포는 MOI 0.1에서 SVV 감염 전에 2시간 동안 100 U/mL에서 INFα로 전처리되었다. SVV 바이러스를 세포에 첨가하고 GFP 강도를 계산하였다. 도 36에 나타낸 바와 같이, SVV-IRES-2 키메라 바이러스는 2 개의 세포주 모두에서 바이러스 복제 및 IFNα에 대한 내성의 증가를 입증하였다. 따라서, 이러한 키메라 바이러스는 SVV-001 모체 바이러스보다 더욱 강력하고 IFNα에 대한 내성을 갖고 있다.
SVV-P1 키메라 바이러스의 종양 용해 효능:
정화된 비리온을 사용하여 NCI-H69AR 세포를 감염시켰다. GFP 강도는 감염 12시간 후 MOI 0.1에서 측정되었다. 시험된 키메라 바이러스는 SVV-P1-1(서열번호: 31), SVV-P1-2(서열번호: 32) 및 SVV-P1-3(서열번호: 33)이었다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 새로운 SVV-P1 키메라 바이러스 중 어느 것도 SVV-001 모체에 비해 증가된 종양 용해 효능을 나타내지 않았다.
SVV-P3 키메라 바이러스의 종양 용해 효능:
도 38A에 있어서, 정화된 비리온은 NCI-H69AR 세포를 감염시키는데 사용되었다. GFP 강도는 감염 48시간 후 MOI 0.1에서 측정되었다. P3-1 키메라 바이러스(서열번호: 34)는 보다 낮은 GFP 발현을 보였고, P3-3 키메라 바이러스(서열번호: 36)는 SVV-001 모체 바이러스와 유사한 GFP 발현을 보였다. 도 38b에 있어서, 정화된 비리온은 NCI-H69AR 세포를 감염시키는데 사용되었다. GFP 강도는 감염 12시간 후 MOI 0.1에서 측정되었다. SVV-P3-2 키메라 바이러스(서열번호: 35)는 SVV-001 모체 바이러스에 비해 감소된 종양 용해 효능을 나타냈다. 따라서, 이들 SVV-P3 키메라 바이러스 중 어느 것도 SVV-001 모체 바이러스에 비해 증가된 종양 용해 효능을 나타내지 않았다.
실시예 14: SVV에 대한 리더 서열 선택
SVV에 대한 체외 전사 템플릿의 5' 접합 절단 서열 영역에서 피스톨 1 리보자임 서열(서열번호: 64)의 정확하고 완전한 절단을 촉진하는 리더 서열을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. Viennafold 프로그램은 리보자임 폴딩과 경쟁할 수 있는 2차 구조물을 형성하지 않을 것으로 예상되는 리더 서열의 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 도 39A에 도시된 바와 같이 템플릿 구조물에 삽입된 리더 서열을 포함하는 다수의 구조물이 생성되었다. 이어서, 구조물을 체외 전사시키고, 각 구조물의 RNA 생성물을 정제하고, 2.5% TBE 아가로스 겔에 로딩하여 리보자임 절단 결과를 조사하였다. 도 39B는 SVV-L0(서열번호: 53), SVV-L1(서열번호: 54), SVV-L2(서열번호: 55), SVV-L3( 서열번호: 56), SVV-L4(서열번호: 57), SVV-L5(서열번호: 58), SVV-L6(서열번호: 59), SVV-L7(서열번호: 60) , SVV-L8(서열번호: 61), SVV-L9(서열번호: 62) 및 SVV-L10(서열번호: 63)을 포함하는 시험된 11개의 리더 서열의 결과를 보여준다. SVV-L8을 제외하곤, 시험된 다른 모든 리더 서열은 절단 생성물의 밴드(리더+리보자임 단편 및 바이러스 시작 단편)만이 상응하는 레인에서 볼 수 있으므로 5' 리보자임 서열의 정확하고 완전한 절단을 촉진한다.
SVV-L0, SVV-L1, SVV-L2, SVV-L5, SVV-L9 또는 SVV-L10의 리더 서열을 포함하는 SVV DNA 템플릿을 체외 전사에 사용하고, 각각의 DNA 템플릿으로부터 생성된 SVV RNA 바이러스 분자를 체외 바이러스 킥-오프 분석에서 감염성 바이러스 입자를 생성하는 능력에 대해 시험하였다. H1299 세포를 각각 1㎍의 전사된 바이러스 RNA로 형질감염시키고, 형질감염 후 12시간 및 48시간차에 플라크 역가를 분석하였다. 도 39C 및 표 17에 나타낸 바와 같이, 바이러스 역가는 상이한 리더 서열을 포함하는 각각의 DNA 템플릿으로부터 생성된 SVV RNA 전사체에 대해 유사하였다.
상기 DNA 템플릿 각각을 체외 전사 효율에 대해 시험하였다.
이들 각각의 DNA 템플릿에 대해, 37℃에서 2.5시간 동안 3 mL 부피로 체외 전사 반응을 수행한 후, 30분 동안 DNaseI 처리를 수행하였다. 체외 전사 생성물을 도 39D에 나타낸 바와 같이 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다. 그 결과, SVV-L1, SVV-L2 및 SVV-L5 리더 서열은 원래의 SVV-L0 리더 서열과 유사한 체외 전사 수율을 제공하는 것으로 나타난 반면에, SVV-L9 및 SVV-L10 리더 서열은 상기 수율의 절반 정도만 제공하는 것으로 나타났다.
사전에, 1000개가 넘는 후보 리더 서열이 생성하고, 상응하는 DNA 템플릿의 전사 효율을 예측하고, Conrad, T. et al. Commun Biol 3, 439 (2020)에 따라서 순위를 매겼다(하기 표 16 참조). 특히, 리더 서열 SVV-L5는 예측시 낮은 순위를 보였지만, 실제 체외 전사 실험에서는 예상치 못한 강력한 수율을 보였다.
표 16 - 리더 서열을 갖는 SVV DNA 템플릿의 예측된 전사 효율
5' 리보자임 절단 후, 리더 서열-리보자임 단편은 전사된 SVV RNA 바이러스 게놈과 비특이적으로 상호작용하여 올리고-dT 컬럼에서 RNA 바이러스 게놈의 정제 효율을 낮출 수도 있다. 최적화된 리더 서열은 정제 중에 이러한 비특이적 상호 작용을 이상적으로 최소화해야 한다. 특이적 리더 서열을 포함하는 이들 각각의 DNA 템플릿에 대하여, 전사 생성물을 80℃의 변성 온도에서 올리고-dT 크로마토그래피로 정제하고, 올리고-dT 크로마토그래피로부터 용출된 RNA 생성물을 리보자임 단편의 존재 및 RNA 바이러스 게놈의 순도에 대해 분석하였다. 하기 표 17에 나타낸 바와 같이, SVV-L5, SVV-L9 또는 SVV-L10 리더 서열을 포함하는 절단된 5' 리보자임 단편은 SVV-L0, SVV-L1 또는 SVV-L2 리더 서열을 포함하는 절단된 5' 리보자임 단편보다 올리고-dT 크로마토그래피에 의해 훨씬 더 효과적으로 제거되었다. .
표 17 - 올리고-dT 크로마토그래피의 변성 후 SVV RNA 바이러스 게놈의 순도
이에 따라, 시험된 다른 리더 서열에 비하여, SVV-L5 리더 서열은 DNA 템플릿에 통합될 때 보다 우수한 체외 전사 수율을 나타낸다. 또한, SVV-L5 리더 서열은 상응하는 5' 리보자임 절단 생성물과 RNA 바이러스 게놈 간의 비특이적 상호작용을 최소화하여 크로마토그래피 정제 중에 5' 리보자임 절단 생성물을 효과적으로 제거한다.
실시예 15: Brij 및 SVV 바이러스 RNA를 포함하는 LNP는 동물 모델에서 높은 항종양 효능을 입증한다
Brij 분자(PEG 지질로서) 및 SVV RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 항종양 효능을 다양한 동물 모델을 사용하여 시험하였다. 이러한 SVV/LNP는 상기 실시예 2에 기술된 것과 유사한 절차에 따라서 생성하였다.
본 실시예에서 사용된 LNP 제형은 표 10에 제공되어 있다.
표 10 - SVV-RNA LNP 제형
SVV/LNP의 항종양 효능을 NCI-H466 SCLC 이종이식 모델에서 시험하였다. 무흉선 암컷 누드 마우스에 NCI-H446 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1 mL)를 주입하고, 오른쪽 옆구리 피하 이식하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 처리 아암(arm) 당 7 마리의 그룹으로 코호트하였다. 마우스를 1일 및 8일차에 2회 SVV RNA를 함유하는 LNP로 처리하였다. 도 40A는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% BRIJ™ S100(제형 #96062-1)을 포함하는 SVV/LNP의 투여량 적정을 나타낸다. 시험된 투여량은 0.025 mg/kg에서 0.2 mg/kg의 범위이다. 시험된 모든 투여량은 PBS 음성 대조군에 비하여 유의미한 종양 성장 억제를 나타냈다(Two-way ANOVA, Tukey Test, p<0.0001; "mpd"는 도면에서 "mg/kg"으로 표시되어 있다.). NCI-H446 종양-보유 마우스에서 SVV-RNA의 단일 IV 투여 후 바이러스 복제의 동역학을 특성화하기 위하여 0.1 mg/kg 투여량을 사용하였다. 종양을 다수의 시점에서 수확하고, RT-qPCR 및 FISH로 분석하였다. 바이러스 마이너스-가닥은 처리 후 1일만에 조기에 RT-qPCR에 의해 검출되었고, 처리 후 7일만에 대다수 종양의 안정기에 도달하였다. 지속적인 SVV 복제는 단일 저 용량의 SVV-RNA를 투여한 후 21일까지 검출되었다(도 40B). 이러한 발견은 주로 SVV 마이너스-가닥 및 양성 가닥의 FISH 검출에 의해 재현되었으며, FISH 신호는 10일까지 최대로 증가하여 이 시점에서 종양 베드(bed) 전체에 걸쳐 바이러스가 퍼져 있음을 나타내고 있다(도 40C).
도 41은 상이한 양이온성 지질 및 다양한 양의 BRIJ™ S100 분자를 포함하는 SVV/LNP의 항종양 이펙터(effector)를 보여준다. LNP 제형에서 양이온성 지질 및 BRIJ™ S100 양의 3가지 상이한 조합을 표 10에 기재된 바와 같이 시험하였다.
시험된 모든 투여량은 PBS 음성 대조군에 비하여 유의미한 종양 성장 억제를 나타내었다(Two-way ANOVA, Tukey Test, p<0.0001; "mpd"는 도면에서 "mg/kg"을 나타냄). 종합적으로, 상기 결과는 SS-OC 또는 SS-OP가 캡슐화된 합성 RNA 바이러스 게놈을 표적 세포에 효과적으로 전달하고 다양한 투여량에 걸쳐 종양 성장 억제를 달성하는 LNP를 제형화하는데 있어서 양이온성 지질로서 사용될 수 있음을 시사한다.
도 42는 NCI-H466을 사용한 SCLC 모델에서 Brij를 포함하는 SVV/LNP 제형의 연장된 항종양 효능을 보여준다. 본 명세서에서 사용된 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% BRIJ™ S100(제형 96062-1)을 포함한다. 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 NCI-H446 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1mL)를 피하 이식하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 처리 아암 당 7 마리의 그룹으로 코호트하였다. 마우스에 0.2 mg/kg의 SVV/LNP를 1일 및 8일차에 2회 투여하였다. 음성 대조군(PBS)에 비하여, SVV/LNP 조성물은 50일 이상의 기간 동안 유의미한 종양 억제 효과를 나타내었다(Two-way ANOVA, Tukey Test p<0.0001).
도 43은 항-SVV 중화 항체의 존재가 SCLC 종양 모델(NCI-H446)에서 SVV/LNP 효능을 억제하지 않는다는 것을 보여준다. 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 NCI-H446 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1 mL)를 피하 이식하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 처리 아암 당 10 마리 마우스 그룹으로 코호트하였다. 마우스에, 0일과 7일차에 항-SVV 중화 항체(μSVV-ab)를 함유한 토끼 혈청 또는 토끼 대조군 혈청(혈청 단독)을 복강내 투여(수동적으로 면역화)하고, 1일 및 8일차에 SVV/LNP 또는 SVV 비리온으로 처리하였다. 본 명세서에서 사용된 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% BRIJ™ S100(제형 96062-1)을 포함한다. PBS, SVV 비리온 또는 SVV/LNP의 정맥내 투여 후 H446 종양-보유 마우스의 종양 부피를 모니터링하였다. SVV/LNP 조성물의 종양 억제 효과는 항-SVV 중화 항체의 존재에 의해 영향을 받지 않는 반면에, SVV 비리온의 종양 억제 효과는 항-SVV 중화 항체의 존재에 의해 완전히 없어졌다. ****TGI는 PBS에 대해 유의미하다(Two-way ANOVA, Tukey Test p<0.0001).
도 44는 NCI-H82 세포를 사용한 SCLC 모델에서 SVV/LNP의 항종양 효능을 보여준다. 본 명세서에서 사용된 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% PEG2k-DPG(80097-2)를 포함한다. 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 NCI-H82 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1 mL)를 피하 이식하였다. 종양 크기 중간값이 약 160 mm3(130-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 치료군 당 7 마리의 그룹으로 코호트하였다. 마우스에 0.2 mg/kg의 SVV/LNP를 1일 및 6일차에 2회 투여하였다. 음성 대조군(SVV-Neg/LNP 또는 PBS)에 비하여, SVV/LNP 조성물은 유의미한 종양 성장 억제를 나타내었다(Two-way ANOVA, Tukey Test p<0.0001).
도 45는 SCLC 동소 종양 모델(NCI-H82)의 연장된 생존에서 SVV/LNP의 전신 투여의 효과를 나타낸다. 종양 발달을 위하여 무혈청 DPBS와 Matrigel의 혼합물(1:1 v/v) 내의 90% 이상 생존 가능한 H82 종양 세포(오른쪽 폐에 주입된 5 x 106개 세포)의 단일 세포 현탁액 0.05ml를 무흉선 누드 마우스의 폐에 접종하였다. PBS, 또는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5 몰% BRIJ™ S100(제형 96076-2(96062-1과 동일한 지질 조성))을 포함하는 1mpk SVV-vRNA/LNP를 종양 이식 후 15일 및 22일차에 마우스에 정맥내(IV) 투여하였다. 음성 대조군(SVV-Neg/LNP 또는 PBS)에 비하여, SVV/LNP 조성물은 이 SCLC 동소 종양 모델에서 마우스의 생존을 유의미하게 연장시켰다. 종양 이식 후 15일과 22일차에 투여된 SVV-RNA는 마우스가 중간값 100일 동안 생존한 대조군 아암에 비해 유의미한 치료 이점, 즉 본 모델에서는 거의 두 배로 생존을 늘린 이점을 제공하였다. 마우스 코호트를 상기 기술한 바와 같이 치료처리하고, SVV-RNA 치료된 마우스의 폐를 IHC에 대한 두 번째 치료 후 10일차에 수확하였다. hDLL3 IHC는 종양 부하에 대한 마커로 사용되었으며, IHC 정량화는 SVV-Neg 또는 PBS 대조군에 비해 종양 부하의 유의미한 감소를 입증하였다(도 46A 및 도 46B). SVV-RNA 처리된 마우스는 광범위한 중앙 종양 괴사를 입증하였다(도 46B).
도 47A는 SCLC PDX 모델에서 SVV/LNP의 항종양 효능을 보여준다. 본 명세서에서 사용된 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% BRIJ™ S100(제형 96062-1)을 포함한다. NOD-SCID 암컷 마우스의 우측 옆구리에 SCLC PDX 세포(무혈청 배지 100ul 내의 12x2 단편)를 피하 이식되게 주입하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 치료 아암 당 8 마리의 그룹으로 코호트하였다. 마우스에 SVV/LNP 또는 음성 대조군 SVV-Neg/LNP 또는 PBS를 1 mg/kg으로 1일 및 8일차에 2회 투여하였다. SVV/LNP는 음성 대조군에 비하여 유의미한 종양 성장 억제를 입증하였다(Two-way ANOVA, Tukey Test p<0.0001). 또한, SVV 복제는 RT-qPCR에 의해 측정되었으며, SVV-RNA 투여된 IV가 SVV 비리온 IT와 유사한 수준의 바이러스 복제를 달성하였음을 보여주었다(도 47B).
다양한 길이의 폴리-A 꼬리를 갖는 SVV RNA 바이러스 게놈의 항종양 효과:
다른 길이의 폴리-A 꼬리를 갖는 SVV RNA 바이러스 게놈을 포함하는 SVV/LNP의 항-종양 효능도 SCLC 모델을 사용하여 시험하였다. 2개의 다른 길이의 폴리-A 꼬리를 시험하였으며, 하나는 길이가 30뉴클레오티드(pA30)이고 다른 하나는 길이가 70뉴클레오티드(pA70)이다. 폴리-A 꼬리를 갖는 상응하는 합성 RNA 바이러스 게놈은, SVV-IRES-2 키메라 바이러스로부터 유래되고 VP2 단백질 S177A 돌연변이를 포함하는 서열번호: 37 및 38에 제시되어 있다. RNA 분자를 모두 각각 서열번호: 51 및 52를 포함하는 DNA 템플릿 구조물을 기반으로 하여 체외 전사하였다. 이들 각각의 DNA 템플릿 구조물은 T7 프로모터 서열, 이어서 서열번호: 53에 따른 리더 서열, 이어서 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열, 이어서 표시된 길이의 poly-A 꼬리를 갖는 SVV-IRES-2 키메라 바이러스 게놈, 이어서 SapI 제한 효소 인식 부위를 포함하며, 인접한 성분들 사이에는 부가적인 뉴클레오티드가 삽입되어 있지 않다.
SVV RNA는 둘 다 양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5몰% BRIJ™ S100을 포함하는 LNP로 제형화되었다. 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 NCI-H446 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1 mL)를 피하 이식되게 주입하였다. 종양 크기 중간값이 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)일 때, 마우스를 처리 아암 당 8 마리의 그룹으로 코호트하였다. 마우스에, SVV-RNA-pA30/LNP 또는 SVV-RNA-pA70/LNP 0.1 mg/kg을 1일과 8일차에 2 회 투여하였다. 도 48에 도시된 바와 같이, SVV-RNA-pA30 및 SVV-RNA-pA70 는 둘 다 종양 성장 억제에서 유사한 효능을 나타냈으며, 이는 PBS 대조군보다 상당히 우수한 것이다(Two-way ANOVA, Tukey Test p<0.0001).
실시예 16: SVV-LNP 및 항-PD-1의 조합 요법
양이온성 지질로서 SS-OC 및 PEG-지질로서 0.5 몰% BRIJ™ S100을 포함하는 SVV/LNP를 동계 신경모세포종 모델 N1E-115에서 시험하였다. A/J 암컷 마우스의오른쪽 옆구리에 N1E-115 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x105 세포/0.1 mL)를 피하 이식되게 주입하였다. 종양 크기 중간값이 약 100 mm3가 되었을 때, 마우스를 치료 아암 당 10 마리의 마우스 그룹으로 코호트하였다. 마우스에 SVV/LNP 또는 음성 대조군 SVV-Neg/LNP 1 mg/kg을 1일 및 8일차에 2회 투여하였다. 이러한 종양 모델에서, 합성 SVV의 투여는 종양에서 CD8 T 세포의 모집 및 CD4 T 세포와 NK 세포에 대한 경향을 유의미하게 증가시켰다(도 49A). 조절 T 세포(Treg) 수는 종양에서 증가하지 않았으며, 이로 인해 항-PD-1에 대한 개선된 임상적 이점과 연관되어 있는 전반적으로 상승된 CD8/Treg 비율이 초래되었다(도 49B). CD8 T 세포는 CTLA4 및 PD-1의 상향조절과 함께 활성화된 표현형을 보였다(도 49C). 단명 이펙터 세포(SLEC) 및 기억 전구체 이펙터 세포(MPEC)는 둘 다 대조군에 비하여 합성 SVV 치료 그룹에서 증가하였다(도 49D). 종양-관련 대식세포도 프로파일링되었으며, M1(식세포성)/M2(전 염증성) 비율의 증가가 관찰되었다(도 49E). M1 대식세포(도 49F)의 수 및 PD-1 리간드인 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 수 또한 상당히 증가하였다(도 49G). 이러한 데이터는 합성 SVV가 TME 내에서 항종양 면역에 도움이 되는 변화를 촉진한다는 것을 나타낸다. N1E-155 종양이 있는 마우스를 SVV/LNP 또는 SVV-Neg-LNP로 처리한 결과 이러한 동계 모델의 유의미한 성장 억제가 입증되었다(도 50). 특히, PD-1 및 PD-L1 발현의 증가로 인해, N1E-115 모델에서 합성 SVV와 항-PD-1 항체 병용의 효능이 평가되었다. 단일 요법으로 투여된 제제는 둘 다 각각의 단일 제제 아암과 비교하여 항-PD-1 항체와 함께 병용 요법으로 투여되었을 때 유의미하게 향상된 적당한 항종양 활성을 가져왔다(도 51).
실시예 17: 상이한 Brij 분자를 사용한 SVV/LNP 제형의 시험
SVV RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자를 제조하고, 표 11 및 표 12에 따라서 특성화하였다. 모든 LNP를 SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질로 제형화하였으며, 여기서 PEG-지질은 각각 PEG2k-DPG, BRIJ™ S100, BRIJ™ C20 또는 BRIJ™ S20이다.
표 11 - SVV-RNA LNP에 대한 제형 매개변수
표 12- SVV-RNA LNP 특성
Z-평균 = 평균 직경, 군PDI - 다분산 지수; %EE = 캡슐화 효율; ZP= 제타 전위
SVV/LNP 조성물을 H446 종양 동물 모델에서 반복 용량 IV 마우스 효능 스크리닝에 사용하였다. 종양 부피(도 52A) 및 체중(도 52B)을 각각의 시점에서 측정하였다. 그 결과, 모든 제형은 높은 항종양 효능을 나타냈으며, 양호한 내약성을 보여주었다. PEG-지질로서 Brij 분자를 포함하는 LNP는 PEG-지질로서 PEG2k-DPG를 포함하는 LNP에 비하여 효능 및 내약성 면에서 유사하였다.
실시예 18: Brij를 포함하는 LNP는 반복 투여 시 생체 내에서 변경된 약동학적 특성을 나타냈다
SVV 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자를 제조하고, 표 13에 따라서 특성화하였다. LNP 내의 PEG-지질은 각각 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 또는 BRIJ™S100이었다. 다른 지질 성분으로는 SS-OC, 콜레스테롤, DSPC 및 선택적으로 b-시토스테롤(960166)을 들 수 있다. 부가적인 특성화 매개변수는 표 14에 제공되어 있다.
표 13 - SVV-RNA LNP에 대한 제형 매개변수
표 14 - SVV-RNA LNP 특성
PDI - 다분산 지수; %EE = 캡슐화 효율; ZP= 제타 전위
SVV/LNP 조성물을 BALB/c 암컷 마우스에서 반복 용량(2주 동안 매주 용량 일정, Q7x2) 정맥내(IV) PK 연구에 사용하였다. 각각의 제형에 대해, 투여량은 0.5 mg/kg이며, 투여 부피는 5 mL/kg이었다. 투여 후 혈청 내 RNA의 카피 수를 첫 번째 투여(1일) 후 및 두 번째 투여(8일) 후 다수의 시점(1시간, 4시간 및 24시간)에서 측정하였다. 그 결과를 도 53A 및 도 53B에 나타낸다. 실선은 첫 번째 투여량의 약동학적 프로파일을 보여준다. 파선은 두 번째 투여량의 약동학적 프로파일을 보여준다.
제형 # 960161 및 # JD-200311-1은 둘 다 SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질(49:28.5:22:0.5 몰%)의 지질 조성을 가지며, PEG-지질은 각각 DPG-PEG2k 및 BRIJ™S100이다.
그 결과는 PEG-지질로서 PEG2k-DPG를 포함하는 LNP가 1차 투여 후 연장된 순환을 보였지만, 2차 투여 시에는 4시간 이내에 신속하게 제거되었음을 나타냈다. 대조적으로, PEG-지질로서 BRIJ™S100을 포함하는 LNP는 1차 투여 후 노출의 중간 변화를 나타냈지만, 2차 투여 시에는 유사한 순환 특성 및 제거의 기울기를 유지하였다.
실시예 19: RNA 산성화 완충액의 변성은 LNP 생물물리학적 특성을 향상시킨다
본 실시예는 구연산염 농도 및 pH를 변화시키는 효과가 LNP 생물물리학적 특성에 미칠 영향을 결정하기 위하여 RNA 산성화 완충액을 변화시키면서 LNP 제형에서 비-복제 세네카 밸리 바이러스(SVV) RNA(SVV-Neg)의 캡슐화를 예시한다. 본 실시예에서 LNP는 이온화성 지질(CAT):DSPC:콜레스테롤:PEG2k-DMG의 지질 조성을 50:7:40:3 몰%로 포함한다. 에탄올 내의 지질 혼합물을, 미세유체 장치(Precision NanoSystems Inc.)를 사용하여 9의 지질-질소 대 인산염 비율(N:P)로 RNA 산성화 완충액(예: 50mM 구연산염, pH 4) 내에서 SVV-Neg와 혼합하였다. 총 지질 농도는 20 mM로 설정되었다.
LNP를 50mM 인산염(pH 6.0)에 대하여 12-16시간 동안 투석하고, 2차 투석을 50mM HEPES, 50mM NaCl, 263mM 수크로스(pH 7.3)에 대하여 4-24시간 동안 실온에서 수행하였다. 투석 후 LNP를 100kDa AMICON® ULTRA CENTRIFUGAL 필터(MilliporeSigma)를 사용하여 농축하고, 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. 그 다음, 샘플을 특성화하고, 필요에 따라 희석하였다. 희석 시, 샘플을 -20℃에서 보관한 경우 5 w/v% 글리세롤 스파이크를 첨가하였다.
동적 광산란(DLS 및 다분산 지수(PDI))에 의해 LNP를 입자 크기에 대해 특성화하였다. CAT4 및 CAT5 제형을 RNA 산성화 완충액으로 시험하였다: (1) 50 nM 구연산염 pH4; (2) 5 mM 구연산염 pH 3.5; (3) 15mM 구연산염 pH 3.5; (4) 30mM 구연산염 pH 3.5; 및 (5) 50mM 구연산염 pH 3.5. 도 55A, 도 55B 및 도 55C는 LNP의 입자 크기, PDI 및 캡슐화 효율을 도시하고 있다. 또한, CAT1 내지 CAT3, CAT6 내지 CAT10 및 CAT35 LNP 제형은 5mM 구연산염 pH 3.5 완충액으로 제조하였다(도 56A, 도 56B 및 도 56C).
그 결과는 보다 작은 입자 크기 및 PDI를 초래하는 RNA 산성화 완충액을 변경하는 것(예를 들어, 염 농도를 낮추는 것)을 시사하였다.
실시예 20: 상이한 이온화성 지질을 포함하는 LNP의 생체내 연구
LNP에 캡슐화된 세네카 밸리 바이러스(SVV)-RNA의 생체내 약동학 및 항종양 효능을 소세포 폐암(SCLC)에 걸린 마우스 모델에서 평가하였다.
본 실시예에 있어서, SVV 바이러스 게놈 및 NanoLuc 루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 RNA 분자를 하기 표 22에 따라서 제조된 LNP에 캡슐화하였다. NLuc는 기질 푸리마진(furimazine)과 함께 제공될 때 발광 신호를 발생하는 루시퍼라제 효소이다. LNP를 5℃에서 100mM 트리스 300mM 수크로스 113mM NaCl(pH 7.4) 내에서 밤새도록 투석하였다. 대안적으로, LNP를 50mM 인산염(pH 6.0)에 대하여 12-16시간 동안 투석하고, 2차 투석을 50mM HEPES, 50mM NaCl, 263mM 수크로스(pH 7.3)에 대하여 실온에서 4-24시간 동안 수행하였다. 투석 후 LNP 제형을 농축하고, 여과하고, 특성화하고, 임의로 희석하였다.
표 22. 생체내 연구를 위한 LNP 제형
NCI-H446 인간 SCLC 세포(무혈청 PBS와 Matrigel®의 1:1 혼합물 내의 5x106 세포/0.1 mL)를 8주령의 무흉선 암컷 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 중간값 종양 크기가 약 150 mm3(120-180 mm3의 범위)에 도달했을 때, 마우스에게 PBS, 또는 SVV-RNA를 포함하는 LNP 0.2 mg/kg을 1일차 또는 1일과 8일차에 정맥내 투여하였다. 광학 이미지 IVIS Lumina(PerkinElmer)를 사용하여 투여 후 96시간에서 생물발광(BLI)을 평가하고, Molecular Imaging 소프트웨어를 사용하여 신호를 정량화하였다(도 58A-58F). 종양 부피 및 체중을 주 당 3회 평가하였다(도 59A-59E).
0.2 mg/kg의 용량으로 2번 투여 후의 종양 퇴행을 CAT1 내지 CAT5 제형에 대해 관찰(도 59A, 좌측)한 바, 모든 제형는 내약성이 양호하였다(도 59A, 우측). 0.2 mg/kg 용량으로 단일 투여 후의 종양 퇴행을 CAT6-CAT9, CAT11, CAT16-CAT17, CAT19-CAT24, CAT26, CAT29, CAT32 및 CAT34 제형에 대해 관찰(도 59B-59E, 좌측)한 바, 모든 제형는 내약성이 양호하였다(도 59B-59E, 오른쪽). 종양 성장 억제는 CAT12-CAT13, CAT15, CAT18 및 CAT28 제형으로 관찰(도 59B-59E, 왼쪽)한 바, 모든 제형는 내약성이 양호하였다(도 59B-59E, 오른쪽).
실시예 21: CAT7 및 상이한 PEG-지질을 포함하는 LNP의 생체내 연구
본 실시예 및 하기 실시예에 사용된 대체 PEG-지질은 하기 표 28에 목록되어 있다:
표 28: PEG-지질
다양한 지질 조성을 갖는 LNP에 캡슐화된 SVV-RNA의 생체내 약동학 및 항종양 효능을 소세포 폐암(SCLC)에 걸린 마우스 모델에서 평가하였다. SVV 바이러스 게놈 및 NLuc를 코딩하는 RNA 분자를, 실시예 19에 기술된 절차와 유사한 절차로 하기 표 23에 따라서 제조된 LNP 내에 캡슐화하였다. 총 지질 농도는 20 mM로 설정되었으며, 지질-질소 대 인산염의 비율(N:P)은 9이었다.
표 23. 생체내 연구를 위한 LNP 제형
SVV-NanoLuc-캡슐화된 LNP의 약동학(생물발광 분석을 통해 평가함) 및 종양 성장 억제 능력을 실시예 20에 기술된 바와 같이 평가하였다.
나노푸시퍼라제(Nanoluciferase)는 연속적인 SVV를 나타내는, 주사 후 72시간에서 검출 가능하다(도 60A). 0.2 mg/kg의 단일 투여량에서 완전한 종양 퇴행이 모든 시험 제형에 대해 관찰되었으며, 모든 제형은 내약성이 양호하였다(도 60B).
실시예 22: LNP 제형의 약동학 평가
콕사키바이러스 A21(CVA21)-RNA-캡슐화 LNP 제형의 약동학(PK)을 쥐에서 평가하였다.
본 실시예에 있어서, CVA-21 바이러스 게놈을 코딩하는 RNA 분자를 실시예 19에 기재된 절차와 유사한 절차로 하기 표 24에 따라서 제조된 LNP에 캡슐화하였다.
표 24. 약동학 연구를 위한 LNP 제형
순수한 암컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley), JVC 쥐(연령: 12주)에게 1일 및 15일(Q2W2)차에 또는 1일 및 8일(Q1W2)차에 LNP에 포함된 바이러스 게놈 1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg을 정맥내 투여하였다. 혈장 샘플을 예정 시간에 수집하였다. 혈장 내 LNP(SS-OC, CAT7 또는 CAT11)에 포함된 이온화성 지질의 농도를 LC-MS로 측정하고(도 61A-61D, 62A-62F 및 63A-63E), 약동학적 매개변수를 계산하여 표 25-1 및 표 25-2에 요약하였다. IgM 및 IgG 수준을 효소-결합 면역분석법(ELISA)에 의해 분석하였다(도 64A-64B 및 도 65A-65B).
표 25-1. 약동학적 매개변수
표 25-2. 약동학 매개변수
상이한 비율 및/또는 유형의 PEG-지질을 갖는 LNP 제형은 다중 투여 후 다양한 T1/2, 노출 및 제거율을 나타낸다. 이들 데이터는 LNP 조성물이 장기 노출 내지 단기 노출에 대한 다양한 치료 페이로드의 요구와 부합하게 개조될 수 있음을 나타낸다.
LNP 제형의 투여 후 항-PEG IgM 수준은 낮아졌으며, 7일부터 21일까지 감소하였다(도 64A 및 도 64B). 항-PEG IgG도 낮아졌고, 다중 투여량으로도 유의미하게 증가하지 않았으며, 이는 낮은 면역원성 가능성을 나타낸다(도 65A 및 도 65B). 시험된 제형 중에서, 이온화가능한 지질로서 CAT7 및 PEG-지질로서 CHM-006을 포함하는 LNP는 IgM 및 IgG 수준이 가장 낮은 것으로 관찰되었다.
실시예 23: mRNA를 캡슐화한 LNP의 제형화
약 8:1 내지 20:1의 N:P 비율로 mRNA를 캡슐화하는 SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질 LNP를 제조한다. PEG-지질은 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 또는 BRIJ™S100이다. 총 지질 농도는 약 10 내지 약 60 mM이다. 제형을 혼합하고 투석하고 농축한다. 크기는 동적 광산란으로 측정하고, 캡슐화 효율은 RiboGreen으로 측정한다. 그 결과, BRIJ™S100은 mRNA LNP 제형용으로 PEG2k-DPG 또는 PEG2k-DMG를 대체하여 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
본 실시예에서는 mRNA LNP 제형을 마우스에서 정맥내 투여를 통해 반복 투여할 때의 약동학적 특성에 대해 시험한다. 투여 후 혈청 내 RNA의 카피 수는 예정된 시점에서 측정된다. 그 결과는 BRIJ™S100을 사용하여 제형화된 LNP가 PEG-2k DPG 또는 PEG2k-DMG를 사용하여 제형화된 LNP에 비하여 두 번째 투여량에서 감소된 제거율을 나타낸다는 것을 보여주었다.
실시예 24: mRNA를 캡슐화한 LNP의 제형화
본 실시예는 지질 나노입자(LNP) 제형 내에서 mRNA의 캡슐화를 예시한다. 본 실시예에서 LNP는 CAT7:DPC:콜레스테롤:CHM-006의 지질 조성을 54.5:20:25:0.5 몰%로 포함한다. 에탄올 내의 지질 혼합물을 RNA 산성화 완충액(5mM 구연산염, pH 3.5) 내에서 인간 에리스로포이에틴(human erythropoeitin; hEPO) mRNA 또는 이중특이적 T 세포 인게이저(bi-specific T cell Engager; BiTE)-코딩 mRNA와 혼합하였다. 총 지질 농도를 20 mM으로 설정하였으며, 지질-질소 대 인산염 비율(N:P)은 9이었다.
LNP를 50mM 인산염(pH 6.0)에 대해 12-16시간 동안 투석하고, 2차 투석을 실온에서 4-24시간 동안 50mM HEPES, 50mM NaCl, 263mM 수크로스(pH 7.3)에 대해 수행하였다. 투석 후 LNP를 100kDa AMICON® ULTRA CENTRIFUGAL 필터(MilliporeSigma)를 사용하여 농축한 다음, 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 멸균 농축하였다. 그 다음, 샘플을 특성화하고, 필요에 따라 희석하였다. 희석 시 샘플을 -20℃에서 보관한 경우에는 5 w/v% 글리세롤 스파이크를 첨가하였다.
LNP 크기를 DLS로 측정하고, 캡슐화 효능을 형광-기반 RiboGreen 분석을 사용하여 측정하였다(표 26).
표 26. LNP-제형화된 mRNA
실시예 25: LNP-제형화된 mRNA의 약동학
mRNA-캡슐화 LNP 제형의 PK(표 26)를 마우스에서 평가하였다.
순수한 암컷 Balb/c 마우스에 1 mg/kg의 LNP를 투여하였다. 3 마리의 마우스를 각각의 예정된 시점에서 채혈하고, 추후 분석을 위하여 혈장을 -80℃에서 동결하였다. hEPO 및 BiTE의 혈장 수준을 Meso Scale Discovery(MSA) 전기화학발광(ECL) 분석에 의해 측정하였다(도 66A 및 도 66B). 높은 수준의 단백질 발현과 장기간 노출이 관찰되었다.
실시예 26: 다양한 길이를 갖는 LNP-제형화된 RNA
다양한 길이를 갖는 RNA를 캡슐화하는 LNP 제형을 실시예 24에 기술된 절차와 유사한 절차로 하기 표 27에 따라서 제조하였다.
표 27. LNP 제형
상기 데이터는 LNP가 다양한 길이의 캡슐화된 RNA에도 불구하고 양호한 생물물리학적 특성(예를 들어, 작은 크기 및 PDI, 높은 %EE)을 유지하였음을 보여준다.
실시예 27: CAT7을 포함하는 LNP의 제형화 연구 및 모델링
A-최적 기준(Jones et al. 2021)을 사용하여 CAT7을 포함하는 LNP의 제형 연구를 설계하고(도 67), 20개의 실험 설계(DOE) 실행을 산출하였다(표 29). 총 지질 농도를 20mM로 설정하고, N:P 비율을 9로 설정하였다. 설계 공간은 40-60 몰% 이온화성 지질의 CAT7, 5-20 몰% 헬퍼 지질의 DSPC, 25-50 몰% 구조적 지질의 콜레스테롤 및 0.25-3 % PEG-지질의 DMG-PEG2000 또는 CHM-001을 포함하는 LNP를 시험하였다. .
표 29. CAT7 LNP에 대한 실험 설계
신뢰할 수 있는 설계 공간의 매개변수 내에서, DOE 최적 조성은 54.5:20:25:0.5의 몰% 비율을 갖는 CAT7:DPC:콜레스테롤:PEG-지질인 것으로 결정되었다.
자체-검증 앙상블 모델링(Self-Validated Ensemble Modeling; SVEM) 방법(Lemkus et al. 2021)을 사용하여, 다양한 조성을 갖는 LNP의 생물물리학적 특성을 예측하고 다른 목적의 결과에 대한 LNP 시스템을 식별하여 미세 조정하기 위한 모델을 제형화하였다. 모델을 개발할 때 목표는 PDI(가중치 1) 및 크기(가중치 0.1)를 최소화하는 것이었다.
결과의 예측 프로파일러는 도 68에 나타낸다. CAT7, DSPC 및 콜레스테롤에 대해서는 2차(곡률 또는 비-선형) 관계가 나타난다. CAT7 조성물은 초기에 40 몰%에서 시작하여 증가 추세를 보이고 이후 약 55 몰%에서 안정화되는 하향 추세를 나타내므로 PDI에 유의미한 영향을 미치는 것으로 보인다. 보다 높은 DSPC는 PDI 및 크기 둘 다의 감소를 선호하는 것으로 보인다. 콜레스테롤은 PDI 및 크기 둘 다에 대해 CAT7과 매우 유사한 패턴을 따르지만, 그 모델은 보다 낮은 몰 조성을 선택하고 있다. PEG-지질 조성의 증가는 관찰된 PDI의 급격한 증가와 관련이 있다.
참고문헌의 도입
본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허공보 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 포함되어 있다. 그러나, 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허공보 및 특허출원에 대한 기재는 그들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 또는 세계 어느 나라에서든 일반적인 공통 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 시사하는 형태가 아니며, 그렇게 받아들여서도 안된다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에서 도시되고 기술되었지만; 이러한 실시형태는 단지 일례로서 제공된다는 것을 당업자라면 자명할 것이다. 이제 당업자라면 본 발명을 벗어나지 않고 수 많은 변형, 변경 및 대체를 가능하게 할 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안은 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다음과 같은 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에 있는 방법 및 구조를 포함하도록 의도된 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Oncorus, Inc. LERNER, Lorena KENNEDY, Edward M. QUEVA, Christophe DETERLING, Jessica BRYANT, Jeffrey David HU, Qi-Ying CHEEMA, Tooba A. ESSEX, Sean <120> ENCAPSULATED RNA POLYNUCLEOTIDES AND METHODS OF USE <130> ONCR-023/03WO 324865-2293 <150> US 63/181,917 <151> 2021-04-29 <150> US 63/181,899 <151> 2021-04-29 <150> US 63/181,663 <151> 2021-04-29 <150> US 63/147,959 <151> 2021-02-10 <150> US 63/134,376 <151> 2021-01-06 <160> 129 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7405 <212> RNA <213> Enterovirus coxsackievirus A21 <400> 1 uuaaaacagc ucugggguug uucccacccc agaggcccac guggcggcua guacucuggu 60 auuacgguac cuuuguacgc cuguuuugua ucccuucccc cguaacuuua gaagcuuauc 120 aaaaguucaa uagcaggggu acaaaccagu accucuacga acaagcacuu cuguuucccc 180 ggugauauca cauagacugu acccacgguc aaaagugauu gauccguuau ccgcuugagu 240 acuucgagaa gccuaguauc accuuggaau cuucgaugcg uugcgcucaa cacucugccc 300 cgaguguagc uuaggcugau gagucugggc acuccccacc ggcgacggug gcccaggcug 360 cguuggcggc cuacccaugg cugaugccgu gggacgcuag uugugaacaa ggugugaaga 420 gccuauugag cuacucaaga guccuccggc cccugaaugc ggcuaauccu aaccacggag 480 caaccgcuca caacccagug aguagguugu cguaaugcgu 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gcaauaaaga augcuuugag agugucccaa ccguccacgg 2520 cucaaucgac ugaagcaacc aguggagcaa acagucagga aguaccagca cuaacugcug 2580 uagaaacagg agcaucaggu caagcaauuc ccagugacgu gauggaaacc agacacguga 2640 uaaacuacaa aacuaggucu gagucauguc uugaaucauu cuuugggaga gcugcgugug 2700 ucacaauccu aucucugacc aacucuucaa aaaguggaga ggaaaagaaa cauuucaaca 2760 uuuggaacau cacguauacc gacacugugc agcuacguag aaaauuagag uucuucacau 2820 auuccagauu ugaccuugaa augacuuuug uguucacaga gaacuacccc aguacagcua 2880 guggagaagu gcgcaaccag guauaccaga uuauguauau uccaccaggg gcaccccgac 2940 caucauccug ggaugauuau acauggcaau ccuccuccaa cccuucuauc uuuuacaugu 3000 acgggaacgc accgccacgg augucaaucc ccuauguagg gauugcuaau gccuacucac 3060 acuuuuauga cgguuuugca cgagugccac uugaggguga gaacacugau gcuggugaca 3120 cguuuuaugg auugguaucc auaaaugauu uuggagucuu ggcagucaga gcagugaacc 3180 gcagcaaucc acacacaaua cacacauccg ugagagugua caugaaacca aaacacauuc 3240 ggugcuggug ccccagaccc ccucgcgcag uauuauacag aggagaagga guggacauga 3300 uauccagugc aauuuuaccc cugaccaaag uagauucuau uacuaccuuc ggauuuggac 3360 accaaaguaa ggcaguguau guugccgguu auaagaucug caacuaccac cuagcaaccc 3420 cuagugauca ucuaaaugca auuagugugu ugugggauag ggauuuaaug guaguagagu 3480 cuagagccca aggaacugac accauagcca gauguaguug uagguguggg gucuauuacu 3540 gugaaucaag aaggaaguac uacccuguca cuuucaccgg uccaacguuc cgauucaugg 3600 aagcgaauga cuacuaccca gcaagauacc agucucacau gcugauagga uguggauuug 3660 cagagccugg agauugcggu ggaauacuaa ggugcaccca uggggugauu gguauuauua 3720 cugcaggggg ugagggagua guagccuuug cugacaucag ggaucuuugg guguaugaag 3780 aggaggccau ggaacaggga auaacaagcu acauugaguc ucuuggcaca gccuuuggug 3840 caggguuuac ucacacaauu agugaaaaag ugacugaguu aacuacaaug auuaccagua 3900 ccauuacaga aaaacuacua aaaaauuugg ugaaaauagu aucagcuuua guaauuguug 3960 ugagaaauua ugaagacacu acuacaguuc uugcaacacu agcauuacuu gggugugaca 4020 uaucuccuug gcagugguug aagaaaaagg caugugaccu acuagaaauu ccucauguac 4080 ugcgccaagg ugaugggugg augaagaaau ucacagaggc uugcaaugca gccaagggcu 4140 uagaauggau uagcaacaaa 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gaaaucacca cauugauuau gaaugagaaa aauaggaggg 5040 ccaauauugg uaacugcaug gaagccuugu uccaaggacc gcugagguac agggaucuga 5100 aaauugaugu gaagacaguc ccccccccug aaugcaucag ugaccuacua caagcagugg 5160 auucucaaga aguuagagau uacugugaaa agaagggcug gauagucaau guuacuagcc 5220 aaauacaguu agaaagaaau aucaacaggg ccaugacuau acuccaagcu gugacuacgu 5280 uugcagcagu ugcaggagua guguauguga uguauaaacu cuuugcuggu caacagggug 5340 cauacacugg uuugccaagc aaaaagccca augucccaac aaucagaguu gccaaaguac 5400 agggaccagg guuugauuau gcaguggcaa uggcuaaaag aaacauacuu acugcaacca 5460 cuacuaaggg ugaauucacu auguuaggag ugcaugauaa uguagcgaua cugccaaccc 5520 augccgcccc aggagaaacu aucauuauug gugggaaaga aguggagauc uuggacgcca 5580 gagcccuaga agaucaagcg ggaaccaauc uugagaucac uauaaucacu cuaaaaagaa 5640 augagaaguu uagagauauc agaccacaua uucccaccca aaucaccgaa accagugaug 5700 gaguauugau cgugaacacu aguaaguacc ccaauaugua ugucccuguu ggugcuguga 5760 ccgaacaggg guaucuuaau cucaguggac gccaaacugc ucguacucug auguacaacu 5820 uuccaacacg agcaggccag 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auggaacuag cugaaauuga 1920 cacacugauu ccaaugaaug caguggaugg gaaaguaaau accauggaaa uguaccagau 1980 cccauuaaac gacaaccuua gcacugaacc caucuuuugc cuaucacuau caccagcguc 2040 ugauaggcga uugagucaca ccaugcuggg agagauucug aacuacuaca cacacuggac 2100 gggcuccauc agauuuacuu uucuauuuug ugguaguaug auggccacag ggaaguugcu 2160 ccuuagcuau ucacccccag gggcgaagcc acccaaaaac cggaaagacg ccaugcuggg 2220 uacgcacaua auaugggacc uggguuuaca gucuaguugu uccauggugg cgcccuggau 2280 uuccaauacg guguacaggc gauguguucg cgacgauuuu accgaaggug gcuacaucac 2340 cuguuucuau cagacuagaa uagugguacc agccucgacc ccaaccagca uguuuaugcu 2400 aggcuuuguc agugcuuguc ccgacuuuag ugugagacug cucagggaca cgacgcacau 2460 cagucaaucg aaauuggucg ccaguaggca gggcauagag gaguuuauag acacagcaau 2520 uaaaaaugca uugaaagugu cacaacccag cacugcacaa ucaacagaag caaccagcgg 2580 agucaacagc caagaggugc cugcacuaac agcaguagag acuggcgcau cgggccaagc 2640 aaucccaagu gaugugguag aaacucgcca cguggugaac uauaagacaa gaucagaguc 2700 cugccuugaa ucauucuuug guagggccgc uugugugaca auucucuccc uuacaaacuc 2760 uucagguagc ggagacgcaa agaagcacua cacaacaugg aacaucacau auacagauac 2820 ggugcaacug cgaaggaaac uggaauuuuu uacguauucc agguuugacu uggaaaugac 2880 cuuuguauuc acugagaacu acccuagcac agcuagugga gagguucgaa aucagguuua 2940 ccaaaucaug uacauuccuc caggggcgcc uagaccuagu ucuugggaug auuacaccug 3000 gcagucauca ucaaacccuu ccauauucua cauguauggu aaugcaccac cacggauguc 3060 gauucccuau gucgggauug cuaacgccua cucgcacuuc uacgauggcu ucgcgcgagu 3120 gccgcuugaa ggugagaaca cagaugccgg ggacaccuuc uacgggcuag uauccaucaa 3180 ugauuuuggu guacuggcag uuagggcagu gaaccgcagc agcccucacg ccauccacac 3240 uucagugagg guguauauga aaccuaaaca cauucgcugc uggugcccca ggccaccacg 3300 agcaguacuu uaccguggug agggagugga caugaucuca agugcaaucc aaccacuaac 3360 caaggucgau ucuauaacaa cauucggcuu uggucaccag aacaaggcag uuuauguugc 3420 uggguauaaa auuuguaacu accacuuagc aacacccagu gaccaccuga acgccauuag 3480 ugugaugugg gacagagauu ugauaguagu ggagucaaga gcacagggaa uugacaccau 3540 agcccggugc aacugcaagu guggcguaua cuacugugaa ucaaggaaaa aguauuaucc 3600 cauuucguuc acugggccca cauuuagaua cauggaggcc aacgaauacu uuccagcuag 3660 auaucagucc cauuuauuaa uugggugcgg guuugcagag ccuggagacu gugguggcau 3720 acucagaugc acacacggug ugaucggcau aauuacagca gguggaccug gagugguggc 3780 cuuugccgac aucagggacc ucugggugua ugaggaggaa gcgauggaac aaggcauuac 3840 aagcuacauc gagacuuuag gggcagcauu uggaacuggg uucacucaac aaauuggaga 3900 caaaauuaca gaguugacua auauggugac aagcacuuuu acggacaaau uguuuaaaaa 3960 cuugauuaaa auagugucuu cguugguuau aauaacucga aacuacgaag acaccaccac 4020 aguauuggcc acucuagcau uguuggguug ugauugcucu ccguggcaau gguugaaaca 4080 caaaguaugu gacauccugc aacugccauu cgcccucaaa cagagugaca guuggcuaaa 4140 gaaguucacu gaggcgugua augccgcaaa agggcucgaa uggauuagca acaagcucuc 4200 caaauuugug gaauggguga agaacaagau aauuccugaa gccagagaca aaguggaauu 4260 ucugcaaaaa uugaaacagu uagaaaugcu ugagaaccag auugcuacac uacaccaauc 4320 cuguccaagu caagaacagc aagagacacu cuuuaacaau guccgcuggu uggcacugca 4380 gucaagacgc uuugcgccgu uguacgcugu ugaagcgcgc 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caauuagagc gcaacaucaa 5280 uagagcuaug acuauccucc aggcaguaac cacguucgcc gcaguggcgg gagugguuua 5340 ugucauguac aagcucuuug cagggcauca aggcgcuuau acugggcucc cgagcaagaa 5400 acccaacgug cccaccauua gaauagcuaa agugcaaggu ccaggguuug acuaugcagu 5460 ugccauggca aagagaaaua ucguuacugc aaccaccaau aagggggagu ucacuaugcu 5520 uggagugcau gauaacguug ccguacuacc aacccaugca ucaccaggug agaccauagu 5580 uauugauggu aaggaaguug aagugcugga cgccaaggcc cuggaggacc aagcuggaac 5640 uaaccuagag aucaccauug ucacucugag aaggaaugag aaguucaggg acaucagacc 5700 ucacaucccc acucaaauca cugagacaaa ugauggagug uugaucguga acacuaguaa 5760 guaccccaac auguaugugc ccguuggugc agugaccgaa caaggguacu ugaaccuggg 5820 ugggcgucaa acugcucgca cucuaaugua caauuuccca acccgagccg gacaaugugg 5880 uggaaucauc acaugcacug gcaaggucau ugggaugcau guugguggga acgguucaca 5940 uggguucgcu gcagcccuaa aacggucaua cuucacucag agccaaggug agauucagug 6000 gaugagacca ucaaaagagg ucgguuaccc aauaauuaau gcaccaagca agacaaaacu 6060 agaacccagu gcuuuccacu auguuuuuga agggguaaag gaaccugcag uacugacuaa 6120 aaacgauccc agauugaaaa cggauuuuga ggaggccaua uucucaaagu auguagggaa 6180 caagaucacu gaaguggaug aauauaugaa agaggcagua gaccauuaug cugggcaacu 6240 caugucuuua gacaucaaua cagagcaaau gugcuuggaa gaugcuaugu auggcacuga 6300 uggucuggaa gcuuuggauc ucucuacuag cgcaggauac ccuuaugugg cucuugggaa 6360 aaagaagaga gauauacuua auaaacaaac aagagacacc aaagaaaugc aaagacuacu 6420 agauaccuau ggaauaaauu ugccucuagu uacuuacgua aaagaugagc ugagaagcaa 6480 gagcaaggug gagcagggua aauccagauu aauugaggcc ucaagcuuga augauucagu 6540 agcaaugaga auggcauuug guaaccugua ugcagcuuuc cacaagaauc caggagucau 6600 cacugguucu gcuguaggau gugacccaga cuuguuuugg agcaagaucc caguauugau 6660 ggaagaaaag cucuuugcau uugauuacac cgguuacgau gccucucuca gucccgcuug 6720 guuugaggca cucaaaaugg uuuuggagaa aauuggauuc ggagauaggg uagauuacau 6780 ugauuaucuc aaccauucac accaucuuua caaaaacaag accuauugug ucaagggcgg 6840 uaugccaucu ggcugcucag gcacuucaau auuuaauuca augauuaaca auuuaauaau 6900 caggacacuc uuacugaaga ccuacaaggg cauagauuug 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uugggccugc acuuucucuc ucgggggcuc aauuacacug acuuuuacuc uuuacugaua 3780 gagaaaugcu cuaguuucuu uaccguagaa ccaccuccuc caccagcuga aaaccugaug 3840 accaagcccu cagugaaguc gaaauuccga aaacuguuua agaugcaagg acccauggac 3900 aaagucaaag acuggaacca aauagcugcc ggcuugaaga auuuucaauu uguucgugac 3960 cuagucaaag agguggucga uuggcugcag gccuggauca acaaagagaa agccagcccu 4020 guccuccagu accaguugga gaugaagaag cucgggccug uggccuuggc ucaugacgcu 4080 uucauggcug guuccgggcc cccucuuagc gacgaccaga uugaauaccu ccagaaccuc 4140 aaaucucuug cccuaacacu ggggaagacu aauuuggccc aaagucucac cacuaugauc 4200 aaugccaaac aaaguucagc ccaacgaguu gaacccguug uggugguccu uagaggcaag 4260 ccgggaugcg gcaagagcuu ggccucuacg uugauugccc aggcuguguc caagcgccuc 4320 uauggcuccc aaaguguaua uucucuuccc ccagauccag auuucuucga uggauacaaa 4380 ggacaguucg ugaccuugau ggaugauuug ggacaaaacc cggauggaca agauuucucc 4440 accuuuuguc agaugguguc gaccgcccaa uuucucccca acauggcgga ccuugcagag 4500 aaagggcguc ccuuuaccuc caaucucauc auugcaacua caaaucuccc ccacuucagu 4560 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caaucuguuu cuauguuggc ucaacauucu ggaaaagaag aauaugauag auugaugcac 7140 cccuucgcug acuacggugc cguaccgagu cacgaguacc ugcaggcaag auggagggcc 7200 uuguucgacu gacccagaua gcccaaggcg cuucggugcu gccggcgauu cugggagaac 7260 ucagucggaa cagaaaaggg 7280 <210> 26 <211> 7280 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVV-001-S177A <400> 26 uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60 ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120 ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180 uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240 ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300 aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360 aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420 gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540 gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu 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acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840 aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900 caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960 augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020 ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080 uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140 aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200 ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260 agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320 aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380 uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440 uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500 ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560 gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620 accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680 ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740 gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800 uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860 aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920 uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980 acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040 gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100 uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160 gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220 aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280 aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340 augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400 acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460 uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520 aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580 ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640 acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700 gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760 ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820 aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880 cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940 gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000 cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060 acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120 gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180 cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240 ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300 cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360 gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420 gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480 ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug agcaagggcg aggagcuguu caccggggug 3540 gugcccaucc uggucgagcu ggacggcgac guaaacggcc acaaguucag cguguccggc 3600 gagggcgagg gcgaugccac cuacggcaag cugacccuga aguucaucug caccaccggc 3660 aagcugcccg ugcccuggcc cacccucgug accacccuga ccuacggcgu gcagugcuuc 3720 agccgcuacc ccgaccacau gaagcagcac gacuucuuca aguccgccau gcccgaaggc 3780 uacguccagg agcgcaccau cuucuucaag gacgacggca acuacaagac ccgcgccgag 3840 gugaaguucg agggcgacac ccuggugaac cgcaucgagc ugaagggcau cgacuucaag 3900 gaggacggca acauccuggg gcacaagcug gaguacaacu acaacagcca caacgucuau 3960 aucauggccg acaagcagaa gaacggcauc aaggugaacu ucaagauccg ccacaacauc 4020 gaggacggca gcgugcagcu cgccgaccac uaccagcaga acacccccau cggcgacggc 4080 cccgugcugc ugcccgacaa ccacuaccug agcacccagu ccgcccugag caaagacccc 4140 aacgagaagc gcgaucacau 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acccguugug gugguccuua gaggcaagcc gggaugcggc 5040 aagagcuugg ccucuacguu gauugcccag gcugugucca agcgccucua uggcucccaa 5100 aguguauauu cucuuccccc agauccagau uucuucgaug gauacaaagg acaguucgug 5160 accuugaugg augauuuggg acaaaacccg gauggacaag auuucuccac cuuuugucag 5220 auggugucga ccgcccaauu ucuccccaac auggcggacc uugcagagaa agggcguccc 5280 uuuaccucca aucucaucau ugcaacuaca aaucuccccc acuucagucc ugucaccauu 5340 gcugauccuu cugcagucuc ucgccguauc aacuacgauc ugacucuaga aguaucugag 5400 gccuacaaga aacacacacg gcugaauuuu gacuuggcuu ucaggcgcac agacgccccc 5460 cccauuuauc cuuuugcugc ccaugugccc uuuguggacg uagcugugcg cuucaaaaau 5520 ggucaccaga auuuuaaucu ccuagaguug gucgauucca uuuguacaga cauucgagcc 5580 aagcaacaag gugcccgaaa caugcagacu cugguucuac agagccccaa cgagaaugau 5640 gacacccccg ucgacgaggc guuggguaga guucucuccc ccgcugcggu cgaugaggcg 5700 cuugucgacc ucacuccaga ggccgacccg guuggccguu uggcuauucu ugccaagcua 5760 ggucuugccc uagcugcggu caccccuggu cugauaaucu uggcaguggg acucuacagg 5820 uacuucucug gcucugaugc 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accggaguuu gagccugcug uguugucaaa auuugauccc 6720 agacugaaca aggauguuga cuuggaugaa guaauuuggu cuaaacacac ugccaauguc 6780 ccuuaccaac cuccuuuguu cuacacauac augucagagu acgcucaucg agucuucucc 6840 uucuugggga aagacaauga cauucugacc gucaaagaag caauucuggg cauccccgga 6900 cuagacccca uggaucccca cacagcuccg ggucugccuu acgccaucaa cggccuucga 6960 cguacugauc ucgucgauuu ugugaacggu acaguagaug cggcgcuggc uguacaaauc 7020 cagaaauucu uagacgguga cuacucugac caugucuucc aaacuuuucu gaaagaugag 7080 aucagacccu cagagaaagu ccgagcggga aaaacccgca uuguugaugu gcccucccug 7140 gcgcauugca uugugggcag aauguugcuu gggcgcuuug cugccaaguu ucaaucccau 7200 ccuggcuuuc uccucggcuc ugcuaucggg ucugacccug auguuuucug gaccgucaua 7260 ggggcucaac ucgaggggag aaagaacacg uaugacgugg acuacagugc cuuugacucu 7320 ucacacggca cuggcuccuu cgaggcucuc aucucucacu uuuucaccgu ggacaauggu 7380 uuuagcccug cgcugggacc guaucucaga ucccuggcug ucucggugca cgcuuacggc 7440 gagcgucgca ucaagauuac cgguggccuc cccuccgguu gugccgcgac cagccugcug 7500 aacacagugc ucaacaaugu 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cuucacaauc cgcggugagg uacacacucg ugaugagccc uuccaaacgg 6180 uucauuucac ucaccacggu auucccacag aucugaugau gguacgucuc ggaccgggca 6240 auucuuuccc uaacaaucua gacaaguuug gacuugacca gaugccggca cgcaacuccc 6300 gugugguugg cguuucgucc aguuacggaa acuucuucuu cucuggaaau uuccucggau 6360 uuguugauuc caucaccucu gaacaaggaa cuuacgcaag acucuuuagg uacaggguga 6420 cgaccuacaa aggauggugc ggcucggccc uggucuguga ggccgguggc guccgacgca 6480 ucauuggccu gcauucugcu ggcgccgccg guaucggcgc cgggaccuau aucucaaaau 6540 uaggacuaau caaagcccug aaacaccucg gugaaccuuu ggccacaaug caaggacuga 6600 ugacugaauu agagccugga aucaccguac auguaccccg gaaauccaaa uugagaaaga 6660 cgaccgcaca cgcgguguac aaaccggagu uugagccugc uguguuguca aaauuugauc 6720 ccagacugaa caaggauguu gacuuggaug aaguaauuug gucuaaacac acugccaaug 6780 ucccuuacca accuccuuug uucuacacau acaugucaga guacgcucau cgagucuucu 6840 ccuucuuggg gaaagacaau gacauucuga ccgucaaaga agcaauucug ggcauccccg 6900 gacuagaccc cauggauccc cacacagcuc cgggucugcc uuacgccauc aacggccuuc 6960 gacguacuga ucucgucgau uuugugaacg guacaguaga ugcggcgcug gcuguacaaa 7020 uccagaaauu cuuagacggu gacuacucug accaugucuu ccaaacuuuu cugaaagaug 7080 agaucagacc cucagagaaa guccgagcgg gaaaaacccg cauuguugau gugcccuccc 7140 uggcgcauug cauugugggc agaauguugc uugggcgcuu ugcugccaag uuucaauccc 7200 auccuggcuu ucuccucggc ucugcuaucg ggucugaccc ugauguuuuc uggaccguca 7260 uaggggcuca acucgagggg agaaagaaca cguaugacgu ggacuacagu gccuuugacu 7320 cuucacacgg cacuggcucc uucgaggcuc ucaucucuca cuuuuucacc guggacaaug 7380 guuuuagccc ugcgcuggga ccguaucuca gaucccuggc ugucucggug cacgcuuacg 7440 gcgagcgucg caucaagauu accgguggcc uccccuccgg uugugccgcg accagccugc 7500 ugaacacagu gcucaacaau gugaucauca ggacugcucu ggcauugacu uacaaggaau 7560 uugaauauga caugguugau aucaucgccu acggugacga ccuucugguu ggcacggauu 7620 acgaucugga cuucaaugag guggcacgac gcgcugccaa guugggguau aagaugacuc 7680 cugccaacaa ggguucuguc uucccuccga cuuccucucu uuccgaugcu guuuuucuaa 7740 agcgcaaauu cguccaaaac aacgacggcu uauacaaacc aguuauggau uuaaagaauu 7800 uggaagccau 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ccucuacguu gauugcccag gcugugucca agcgccucua uggcucccaa 5100 aguguauauu cucuuccccc agauccagau uucuucgaug gauacaaagg acaguucgug 5160 accuugaugg augauuuggg acaaaacccg gauggacaag auuucuccac cuuuugucag 5220 auggugucga ccgcccaauu ucuccccaac auggcggacc uugcagagaa agggcguccc 5280 uuuaccucca aucucaucau ugcaacuaca aaucuccccc acuucagucc ugucaccauu 5340 gcugauccuu cugcagucuc ucgccguauc aacuacgauc ugacucuaga aguaucugag 5400 gccuacaaga aacacacacg gcugaauuuu gacuuggcuu ucaggcgcac agacgccccc 5460 cccauuuauc cuuuugcugc ccaugugccc uuuguggacg uagcugugcg cuucaaaaau 5520 ggucaccaga auuuuaaucu ccuagaguug gucgauucca uuuguacaga cauucgagcc 5580 aagcaacaag gugcccgaaa caugcagacu cugguucuac agagccccaa cgagaaugau 5640 gacacccccg ucgacgaggc guuggguaga guucucuccc ccgcugcggu cgaugaggcg 5700 cuugucgacc ucacuccaga ggccgacccg guuggccguu uggcuauucu ugccaagcua 5760 ggucuugccc uagcugcggu caccccuggu cugauaaucu uggcaguggg acucuacagg 5820 uacuucucug gcucugaugc agaccaagaa gaaacagaaa gugagggauc ugucaaggca 5880 cccaggagcg 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cgugaugagc 5400 ccuuccaaac gguucauuuc acucaccacg guauucccac agaucugaug augguacguc 5460 ucggaccggg caauucuuuc ccuaacaauc uagacaaguu uggacuugac cagaugccgg 5520 cacgcaacuc ccgugugguu ggcguuucgu ccaguuacgg aaacuucuuc uucucuggaa 5580 auuuccucgg auuuguugau uccaucaccu cugaacaagg aacuuacgca agacucuuua 5640 gguacagggu gacgaccuac aaaggauggu gcggcucggc ccuggucugu gaggccggug 5700 gcguccgacg caucauuggc cugcauucug cuggcgccgc cgguaucggc gccgggaccu 5760 auaucucaaa auuaggacua aucaaagccc ugaaacaccu cggugaaccu uuggccacaa 5820 ugcaaggacu gaugacugaa uuagagccug gaaucaccgu acauguaccc cggaaaucca 5880 aauugagaaa gacgaccgca cacgcggugu acaaaccgga guuugagccu gcuguguugu 5940 caaaauuuga ucccagacug aacaaggaug uugacuugga ugaaguaauu uggucuaaac 6000 acacugccaa ugucccuuac caaccuccuu uguucuacac auacauguca gaguacgcuc 6060 aucgagucuu cuccuucuug gggaaagaca augacauucu gaccgucaaa gaagcaauuc 6120 ugggcauccc cggacuagac cccauggauc cccacacagc uccgggucug ccuuacgcca 6180 ucaacggccu ucgacguacu gaucucgucg auuuugugaa cgguacagua 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1380 ccuuucuguc uaggcaggga ggccucaacg gaggggccuu cacagcuacc cuacauagac 1440 acuuuuugau gaagugcggg uggcaggugc agguccaaug uaauuugaca caauuccacc 1500 aaggcgcucu ccuuguugcc augguuccug aaaccacccu ugaugucaag cccgacggua 1560 aggcaaagag cuuacaggag cugaaugaag aacagugggu ggaaaugucu gacgauuacc 1620 ggaccgggaa aaacaugccu uuucaggcgc uuggcacaua cuaucggccc ccuaacugga 1680 cuuggggucc caauuucauc aaccccuauc aaguaacggu uuucccacac caaauucuga 1740 acgcgagaac cucuaccucg guagacauaa acgucccaua caucggggag acccccacgc 1800 aauccucaga gacacagaac uccuggaccc uccucguuau ggugcucguu ccccuagacu 1860 auaaggaagg agccacaacu gacccagaaa uuacauuuuc uguaaggccu acaagucccu 1920 acuucaaugg gcuucgcaac cgcuacacgg ccgggacgga cgaagaacag gggcccauuc 1980 cuacggcacc cagagaaaau ucgcuuaugu uucucucaac ccucccugac gacacugucc 2040 cugcuuacgg gaaugugcgu accccuccug ucaauuaccu cccuggugaa auaaccgacc 2100 uuuugcaacu ggcccgcaua cccacucuca uggcauuuga gcgggugccu gaacccgugc 2160 cugccucaga cacauaugug cccuacguug ccguucccac ccaguucgau gacaggccuc 2220 ucaucuccuu cccgaucacc cuuucagauc ccgucuauca gaacacccug guuggcgcca 2280 ucaguucaaa uuucgccaau uaccgugggu guauccaaau cacucugaca uuuuguggac 2340 ccaugauggc gagagggaaa uuccugcucu cguauucucc cccaaaugga acgcaaccac 2400 agacucuuuc cgaagcuaug cagugcacau acucuauuug ggacauaggc uugaacucua 2460 guuggaccuu cgucgucccc uacaucucgc ccagugacua ccgugaaacu cgagccauua 2520 ccaacucggu uuacuccgcu gaugguuggu uuagccugca caaguugacc aaaauuacuc 2580 uaccaccuga cuguccgcaa agucccugca uucucuuuuu cgcuucugcu ggugaggauu 2640 acacucuccg ucuccccguu gauuguaauc cuuccuaugu guuccacucc accgacaacg 2700 ccgagaccgg gguuauugag gcggguaaca cugacaccga uuucucuggu gaacuggcgg 2760 cuccuggcuc uaaccacacu aaugucaagu uccuguuuga ucgaucucga uuauugaaug 2820 uaaucaaggu acuggagaag gacgccguuu ucccccgccc uuucccuaca caagaaggug 2880 cgcagcagga ugaugguuac uuuugucuuc ugaccccccg cccaacaguc gcuucccgac 2940 ccgccacucg uuucggccug uacgccaauc cguccggcag ugguguucuu gcuaacacuu 3000 cacuggacuu caauuuuuau agcuuggccu guuucacuua cuuuagaucg gaccuugagg 3060 uuacgguggu cucacuagag ccggaucugg aauuugcugu agggugguuu ccuucuggca 3120 gugaauacca ggcuuccagc uuugucuacg accagcugca ugugcccuuc cacuuuacug 3180 ggcgcacucc ccgcgcuuuc gcuagcaagg gugggaaggu aucuuucgug cucccuugga 3240 acucugucuc gucugugcuc cccgugcgcu gggggggggc uuccaagcuc ucuucugcua 3300 cgcggggucu accggcgcau gcugauuggg ggacuauuua cgccuuuguc ccccguccua 3360 augagaagaa aagcaccgcu guaaaacacg uggccgugua cauucgguac aagaacgcac 3420 gugccuggug ccccagcaug cuucccuuuc gcagcuacaa gcagaagaug cugaugcaau 3480 cuggcgauau cgagaccaau cccgggccug cuucugacaa cccaauuuug gaguuucuug 3540 aagcagaaaa ugaucuaguc acucuggccu cucucuggaa gauggugcac ucuguucaac 3600 agaccuggag aaaguaugug aagaacgaug auuuuuggcc caauuuacuc agcgagcuag 3660 ugggggaagg cucugucgcc uuggccgcca cgcuauccaa ccaagcuuca guaaaggcuc 3720 uuuugggccu gcacuuucuc ucucgggggc ucaauuacac ugacuuuuac ucuuuacuga 3780 uagagaaaug cucuaguuuc uuuaccguag aaccaccucc uccaccagcu gaaaaccuga 3840 ugaccaagcc cucagugaag ucgaaauucc gaaaacuguu uaagaugcaa ggacccaugg 3900 acaaagucaa agacuggaac caaauagcug ccggcuugaa gaauuuucaa uuuguucgug 3960 accuagucaa agaggugguc gauuggcugc aggccuggau caacaaagag aaagccagcc 4020 cuguccucca guaccaguug gagaugaaga agcucgggcc uguggccuug gcucaugacg 4080 cuuucauggc ugguuccggg cccccucuua gcgacgacca gauugaauac cuccagaacc 4140 ucaaaucucu ugcccuaaca cuggggaaga cuaauuuggc ccaaagucuc accacuauga 4200 ucaaugccaa acaaaguuca gcccaacgag uugaacccgu uguggugguc cuuagaggca 4260 agccgggaug cggcaagagc uuggccucua cguugauugc ccaggcugug uccaagcgcc 4320 ucuauggcuc ccaaagugua uauucucuuc ccccagaucc agauuucuuc gauggauaca 4380 aaggacaguu cgugaccuug auggaugauu ugggacaaaa cccggaugga caagauuucu 4440 ccaccuuuug ucagauggug ucgaccgccc aauuucuccc caacauggcg gaccuugcag 4500 agaaagggcg ucccuuuacc uccaaucuca ucauugcaac uacaaaucuc ccccacuuca 4560 guccugucac cauugcugau ccuucugcag ucucucgccg uaucaacuac gaucugacuc 4620 uagaaguauc ugaggccuac aagaaacaca cacggcugaa uuuugacuug gcuuucaggc 4680 gcacagacgc cccccccauu uauccuuuug cugcccaugu gcccuuugug gacguagcug 4740 ugcgcuucaa aaauggucac cagaauuuua aucuccuaga guuggucgau uccauuugua 4800 cagacauucg agccaagcaa caaggugccc gaaacaugca gacucugguu cuacagagcc 4860 ccaacgagaa ugaugacacc cccgucgacg aggcguuggg uagaguucuc ucccccgcug 4920 cggucgauga ggcgcuuguc gaccucacuc cagaggccga cccgguuggc cguuuggcua 4980 uucuugccaa gcuaggucuu gcccuagcug cggucacccc uggucugaua aucuuggcag 5040 ugggacucua cagguacuuc ucuggcucug augcagacca agaagaaaca gaaagugagg 5100 gaucugucaa ggcacccagg agcgaaaaug cuuaugacgg cccgaagaaa aacucuaagc 5160 ccccuggagc acucucucuc auggaaaugc aacagcccaa cguggacaug ggcuuugagg 5220 cugcggucgc uaagaaagug gucgucccca uuaccuucau gguucccaac agaccuucug 5280 ggcuuacaca guccgcucuc cuggugaccg gccggaccuu ccuaaucaau gaacauacau 5340 gguccaaucc cuccuggacc agcuucacaa uccgcgguga gguacacacu cgugaugagc 5400 ccuuccaaac gguucauuuc acucaccacg guauucccac agaucugaug augguacguc 5460 ucggaccggg caauucuuuc ccuaacaauc uagacaaguu uggacuugac cagaugccgg 5520 cacgcaacuc ccgugugguu ggcguuucgu ccaguuacgg aaacuucuuc uucucuggaa 5580 auuuccucgg auuuguugau uccaucaccu cugaacaagg aacuuacgca agacucuuua 5640 gguacagggu gacgaccuac aaaggauggu gcggcucggc ccuggucugu gaggccggug 5700 gcguccgacg caucauuggc cugcauucug cuggcgccgc cgguaucggc gccgggaccu 5760 auaucucaaa auuaggacua aucaaagccc ugaaacaccu cggugaaccu uuggccacaa 5820 ugcaaggacu gaugacugaa uuagagccug gaaucaccgu acauguaccc cggaaaucca 5880 aauugagaaa gacgaccgca cacgcggugu acaaaccgga guuugagccu gcuguguugu 5940 caaaauuuga ucccagacug aacaaggaug uugacuugga ugaaguaauu uggucuaaac 6000 acacugccaa ugucccuuac caaccuccuu uguucuacac auacauguca gaguacgcuc 6060 aucgagucuu cuccuucuug gggaaagaca augacauucu gaccgucaaa gaagcaauuc 6120 ugggcauccc cggacuagac cccauggauc cccacacagc uccgggucug ccuuacgcca 6180 ucaacggccu ucgacguacu gaucucgucg auuuugugaa cgguacagua gaugcggcgc 6240 uggcuguaca aauccagaaa uucuuagacg gugacuacuc ugaccauguc uuccaaacuu 6300 uucugaaaga ugagaucaga cccucagaga aaguccgagc gggaaaaacc cgcauuguug 6360 augugcccuc ccuggcgcau ugcauugugg gcagaauguu gcuugggcgc uuugcugcca 6420 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tttccttctg gcagtgaata ccaggcttcc 3240 agctttgtct acgaccagct gcatgtgccc ttccacttta ctgggcgcac tccccgcgct 3300 ttcgctagca agggtgggaa ggtatctttc gtgctccctt ggaactctgt ctcgtctgtg 3360 ctccccgtgc gctggggggg ggcttccaag ctctcttctg ctacgcgggg tctaccggcg 3420 catgctgatt gggggactat ttacgccttt gtcccccgtc ctaatgagaa gaaaagcacc 3480 gctgtaaaac acgtggccgt gtacattcgg tacaagaacg cacgtgcctg gtgccccagc 3540 atgcttccct ttcgcagcta caagcagaag atgctgatgc aatctggcga tatcgagacc 3600 aatcccgggc ctgcttctga caacccaatt ttggagtttc ttgaagcaga aaatgatcta 3660 gtcactctgg cctctctctg gaagatggtg cactctgttc aacagacctg gagaaagtat 3720 gtgaagaacg atgatttttg gcccaattta ctcagcgagc tagtggggga aggctctgtc 3780 gccttggccg ccacgctatc caaccaagct tcagtaaagg ctcttttggg cctgcacttt 3840 ctctctcggg ggctcaatta cactgacttt tactctttac tgatagagaa atgctctagt 3900 ttctttaccg tagaaccacc tcctccacca gctgaaaacc tgatgaccaa gccctcagtg 3960 aagtcgaaat tccgaaaact gtttaagatg caaggaccca tggacaaagt caaagactgg 4020 aaccaaatag ctgccggctt gaagaatttt caatttgttc gtgacctagt caaagaggtg 4080 gtcgattggc tgcaggcctg gatcaacaaa gagaaagcca gccctgtcct ccagtaccag 4140 ttggagatga agaagctcgg gcctgtggcc ttggctcatg acgctttcat ggctggttcc 4200 gggccccctc ttagcgacga ccagattgaa tacctccaga acctcaaatc tcttgcccta 4260 acactgggga agactaattt ggcccaaagt ctcaccacta tgatcaatgc caaacaaagt 4320 tcagcccaac gagttgaacc cgttgtggtg gtccttagag gcaagccggg atgcggcaag 4380 agcttggcct ctacgttgat tgcccaggct gtgtccaagc gcctctatgg ctcccaaagt 4440 gtatattctc ttcccccaga tccagatttc ttcgatggat acaaaggaca gttcgtgacc 4500 ttgatggatg atttgggaca aaacccggat ggacaagatt tctccacctt ttgtcagatg 4560 gtgtcgaccg cccaatttct ccccaacatg gcggaccttg cagagaaagg gcgtcccttt 4620 acctccaatc tcatcattgc aactacaaat ctcccccact tcagtcctgt caccattgct 4680 gatccttctg cagtctctcg ccgtatcaac tacgatctga ctctagaagt atctgaggcc 4740 tacaagaaac acacacggct gaattttgac ttggctttca ggcgcacaga cgcccccccc 4800 atttatcctt ttgctgccca tgtgcccttt gtggacgtag ctgtgcgctt caaaaatggt 4860 caccagaatt ttaatctcct agagttggtc 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gcaagactct ttaggtacag ggtgacgacc 5760 tacaaaggat ggtgcggctc ggccctggtc tgtgaggccg gtggcgtccg acgcatcatt 5820 ggcctgcatt ctgctggcgc cgccggtatc ggcgccggga cctatatctc aaaattagga 5880 ctaatcaaag ccctgaaaca cctcggtgaa cctttggcca caatgcaagg actgatgact 5940 gaattagagc ctggaatcac cgtacatgta ccccggaaat ccaaattgag aaagacgacc 6000 gcacacgcgg tgtacaaacc ggagtttgag cctgctgtgt tgtcaaaatt tgatcccaga 6060 ctgaacaagg atgttgactt ggatgaagta atttggtcta aacacactgc caatgtccct 6120 taccaacctc ctttgttcta cacatacatg tcagagtacg ctcatcgagt cttctccttc 6180 ttggggaaag acaatgacat tctgaccgtc aaagaagcaa ttctgggcat ccccggacta 6240 gaccccatgg atccccacac agctccgggt ctgccttacg ccatcaacgg ccttcgacgt 6300 actgatctcg tcgattttgt gaacggtaca gtagatgcgg cgctggctgt acaaatccag 6360 aaattcttag acggtgacta ctctgaccat gtcttccaaa cttttctgaa agatgagatc 6420 agaccctcag agaaagtccg agcgggaaaa acccgcattg ttgatgtgcc ctccctggcg 6480 cattgcattg tgggcagaat gttgcttggg cgctttgctg ccaagtttca atcccatcct 6540 ggctttctcc tcggctctgc tatcgggtct 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gaccgucaaa gaagcaauuc 6120 ugggcauccc cggacuagac cccauggauc cccacacagc uccgggucug ccuuacgcca 6180 ucaacggccu ucgacguacu gaucucgucg auuuugugaa cgguacagua gaugcggcgc 6240 uggcuguaca aauccagaaa uucuuagacg gugacuacuc ugaccauguc uuccaaacuu 6300 uucugaaaga ugagaucaga cccucagaga aaguccgagc gggaaaaacc cgcauuguug 6360 augugcccuc ccuggcgcau ugcauugugg gcagaauguu gcuugggcgc uuugcugcca 6420 aguuucaauc ccauccuggc uuucuccucg gcucugcuau cgggucugac ccugauguuu 6480 ucuggaccgu cauaggggcu caacucgagg ggagaaagaa cacguaugac guggacuaca 6540 gugccuuuga cucuucacac ggcacuggcu ccuucgaggc ucucaucucu cacuuuuuca 6600 ccguggacaa ugguuuuagc ccugcgcugg gaccguaucu cagaucccug gcugucucgg 6660 ugcacgcuua cggcgagcgu cgcaucaaga uuaccggugg ccuccccucc gguugugccg 6720 cgaccagccu gcugaacaca gugcucaaca augugaucau caggacugcu cuggcauuga 6780 cuuacaagga auuugaauau gacaugguug auaucaucgc cuacggugac gaccuucugg 6840 uuggcacgga uuacgaucug gacuucaaug agguggcacg acgcgcugcc aaguuggggu 6900 auaagaugac uccugccaac aaggguucug ucuucccucc 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caucgacagg ugguacacug gacgccucaa uucuuggaca 1320 aaagcuguaa aaaccuucuc uuuucaggcc gucccgcucc cuggagccuu ccugucuaga 1380 cagggaggcc ucaacggagg ggccuucacg gcuacccuac auagacauuu cuuaaugaag 1440 ugcggguggc aggugcaggu ccaaugcaau uugacgcaau uccaccaagg ugcucuucuu 1500 guugccaugg uccccgaaac cacccuugau gucaaaccug acggcaaggc aaagagcuua 1560 caggagcuga augaagaaca guggguggaa augucugacg auuaccggac cgggaaaaac 1620 augccuuucc agucucuugg cacauacuau cggcccccua acuggacuug gggccccaau 1680 uucaucaacc ccuaucaagu aacaguuuuc ccacaccaaa uucugaacgc gagaaccucu 1740 accucgguag acauaagugu cccauacauc ggggagacuc cuacacaauc cucagagaca 1800 cagaacuccu ggacccuccu cguuauggug cuuguccccc uggacuacaa ggagggagcc 1860 acaacugacc cagaaauuac auuuucugua aggccuacaa guccuuacuu caaugggcua 1920 cguaaccguu ucacgaccgg gacggacgag gaacaggggc ccauucccac agcacccaga 1980 gaaaauucgc uuauguuucu cucaaccauc ccugacgaca cugucccugc uuacgggaau 2040 gugcguaccc cucccgucaa uuaccucccu ggugaaauaa ccgaccucuu acaacuggcc 2100 cguauaccca cucucauggc guucgggcgg gugucugaac ccgagccugc cucagacaca 2160 uaugugcccu acguugccgu uccugcccag uucgacgaca agccucucau cuccuucccg 2220 aucacccuuu cagauccugu cuaccagaac acccugguag gcgccaucag uucgaauuuc 2280 gccaacuacc ggggguguau ccaaaucacu cugacauuuu guggacccau gauggcaaga 2340 gggaaauucc uacucucgua uucuccucca aauggagcac aaccacagac ccuuucugaa 2400 gcuaugcagu gcacguacuc uauuugggau auaggcuuga acucuaguug gaccuuuguc 2460 auccccuaca ucucgcccag ugauuaccgu gaaacucggg cuauuaccaa cucaguuuau 2520 ucugcugaug guugguuuag ccugcacaag cugacuaaaa uuacucuacc accugacugc 2580 ccacagaguc ccuguauucu cuuuuucgcc ucugcuggug aggauuacac ccuccgucuc 2640 ccuguugauu guaauccuuc cuacguguuc cacuccaccg acaacgccga gacugggguu 2700 auugaggcgg guaacacuga caccgacuuc ucuggugagc uggcggcucc uggcucuaac 2760 cacacuaaug ucaaguuccu guuugaucga ucucgauuac ugaauguaau uaagguacug 2820 gagaaggacg ccgucuuccc ccguccuuuc cccacagcaa caggugcaca gcaggacgau 2880 gguuacuuuu gccuucuaac accccgccca acagucgcuu cccgacccgc cacucguuuc 2940 ggccuguacg ucaauccguc 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gccuccucca ccagcugaaa aucugaugac caagcccucc 3840 gugaggucga aauuccgaaa gcuguuuaag augcaaggac ccauggacac agucaaagac 3900 uggaaccaaa uagccgccgg ccugaagaau uuccaauuug uucgugaccu ggucaaagag 3960 guggucgauu ggcuccaggc cuggauuaau aaagagaaag ccagcccugu ccuccaguac 4020 cagcuggaga ugaagaaacu cggacccgug gcuuuggcuc augaugccuu cauggccggu 4080 uccgggcccc cucuuaguga cgaccagauu gaauaucucc agaaccucaa aucucuugcc 4140 cuaacacugg ggaagacuaa uuuggcccaa agucucacca cuaugaucaa ugccaagcaa 4200 agcuccgcuc aacgagucga acccguugug gugguccuua gaggcaagcc gggauguggc 4260 aagagcuugg ccuccacguu gauugcccag gcugugucca agcgucucua cggcucacaa 4320 aguguguauu cucuuccucc ggauccagac uucuucgacg gauacaaagg acaguuugua 4380 accuugaugg acgaucuggg acaaaacccg gaugggcaag auuucuccac cuuuugucag 4440 auggugucga ccgcccaauu ucuucccaac auggcggacc uuacagagaa ggggcguccc 4500 uucaccucca aucuuaucau ugcaacuaca aaccucccuc acuucagccc ugucaccauu 4560 gcugauccuu cugcagucuc ucgucguauc aacuacgacc ugacucuaga aguaucugag 4620 gccuauaaga agcacacacg 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cgaguaccug caggcaagau ggagggccuu guucgacuga 7200 ccuagauagc ccaacgcgcu ccggugcugc cggcgauucu gggagaacuc agucggaaca 7260 gaaaagggaa 7270 <210> 70 <211> 7212 <212> RNA <213> Senecavirus Seneca Valley virus A <400> 70 aaccggcugu guuugcuaga ggcacagagg agcaacaucc aaccugcuuu uguggggaac 60 ggugcggcuc caauuccugc gucgccaaag guguuagcgc acccaaacgg cgcaucuacc 120 aaugcuauug guguggucug cgaguucuag ccuacucguu ucuccccuau ucauucacuc 180 acgcacaaaa aguguguugu aacuacaaga uuuagcccuc acacgggaug ugugauaacc 240 gcaagacuga cucaagcgcg gaaagcgcug uaaccgcaug cuguuagucc cuuuauggcu 300 gcgagauggc uauccaccuc ggaucacuga acuggagcuc gacccuccuu aguaagggaa 360 ccgagaggcc uucuugcaac aagcuccgac acagagucca cgugauugcu accaccauga 420 guacaugguu cuccccucuc gacccaggac uucuuuuuga auauccacgg cucgauccag 480 aggguggggc augauccccc uagcauagcg agcuacagcg ggaacuguag cuaggccuua 540 gcgugccuug gauacugccu gauagggcga cggccuaguc gugucgguuc uauagguagc 600 acauacaaau augcagaacu cucauuuuuc uuucgauaca gccucuggca ccuuugaaga 660 cguaaccgga 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ugaucaaagc ccuuaaacac cucggugaac cucuggcuac 5760 aaugcaagga cugaugacug agcuagagcc uggagucacc guacauguac cccggaaauc 5820 uaaauugaga aagacgaccg cacacgcggu guacaaaccg gaguuugaac cugcuguguu 5880 gucaaaauuu gaucccagac ugaacaagga uguugacuua gaugagguga uuuggucuaa 5940 acacacugcc aacgucccuu aucaaccucc uuuguucuac acauauaugu cagaguacgc 6000 ucaccggguu uucuccuuuu ugggaaaaga caaugacauu cugaccguca aagaagcaau 6060 cuugggcauc ccuggacuag acccuaugga uccccacaca gcuccggguc ugcccuacgc 6120 cauuagcggc cuucgacgua cugaucucgu cgauuuugcg aacggcacgg uagacgcggc 6180 acuggccaug caaauucaga aauucuuaga uggugacuac ucugaucaug ucuuccaaac 6240 uuuucugaaa gaugaaauca gacccucaga gaagguccga gcgggaaaaa cccgcauugu 6300 cgaugugccu ucccuggcgc acugcauugu uggcagaaug cugcuugggc guuuugccgc 6360 caaguuucaa ucccauccug gcuuucuccu uggcucugcu aucgggucug acccugaugu 6420 cuucuggacc gucauagggg cucagcucga gggaagaaag aacacguaug acguggacua 6480 cagugccuuu gacucuucac acggcacugg cuccuucgag gcucucaucu cucacuuuuu 6540 caccguugac aaugguuuua gcccugcgcu gggaccguau cucagauccc uggcugucuc 6600 ggugcacgcu uacggcgagc gucgcaucaa gauuaccgga ggccuccccu cugguugugc 6660 cgcgaccagc cugcugaaca cagugcucaa caaugugauc aucaggacug cucuagcauu 6720 gacuuacaag gaauuugagu augacauggu ugauaucauc gccuacggug acgaccuucu 6780 gguugguacg gauuaugauc uggacuucaa ugagguggcg cggcgcgcug ccaaacuggg 6840 guauaagaug acuccugcca acaaggguuc ugucuucccu ccgacuuccu cucucuccga 6900 ugcuguuuuu cuaaaacgca aauucgucca aaacaaugac ggcuuauaua aaccaguuau 6960 ggauuuaaag aauuuggaag ccaugcucuc cuacuucaaa ccaggaacac uacucgagaa 7020 gcugcaaucu guuucuaugu uggcucaaca uucuggaaaa gaagaauaug auagauugau 7080 gcaccccuuc gcugacuacg gugccguacc gagucacgag uaccugcagg caagauggag 7140 ggccuuguuc gacugaccua gauagcccaa cgcgccucgg ugcugccggc gauucuggga 7200 gaacucaguc gg 7212 <210> 71 <211> 7174 <212> RNA <213> Senecavirus Seneca Valley virus A <400> 71 ccggcugugu uugcuagagg cacaguggag caacauccaa ccugcuuuug uggggaacgg 60 ugcggcucca auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg cgucuaccaa 120 ugcuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc uccccuacuc acucauucac 180 gcacaaaaac uguguuguaa cuacaagguu uagcccucgc acgggaugug cgauaaccgc 240 aagaucgacu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 300 gagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 360 gagaggccuu cuugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugauugcuac caccaugagu 420 acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 480 gguggggcau gaucccccua gcauagcgag cuacagcggg aacuguagcu aggccuuagc 540 gugccuugga uacugccuga uagggcgacg gccuagucgu gucgguucua uagguagcac 600 auacaaauau gcagaacucu cauuuuucuu ucgauacagc cucuggcacc uuugaaaacg 660 uaaccggaac aaaagucaag aucguugaau accccagauc ggugaacaau gguguuuacg 720 auucguccac ucauuuagag auacugaacc uacaggguga aauugaaauu uuaaagucuu 780 ucaacgaaua ccaaauucgc gccgccaaac aacaacuugg acuggacauc guauacgaac 840 uacaggguaa uguucagaca accucaaaga augauuuuga uucccgcggc aauaauggua 900 acaugaccuu caauuacuac gcaaacacuu accagaauuc aguagacuuc ucgaccuccu 960 cgucggcguc 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caaatggaac gcaaccacag actctttccg aagctatgca gtgcacatac tctatttggg 2580 acataggctt gaactctagt tggaccttcg tcgtccccta catctcgccc agtgactacc 2640 gtgaaactcg agccattacc aactcggttt actccgctga tggttggttt agcctgcaca 2700 agttgaccaa aattactcta ccacctgact gtccgcaaag tccctgcatt ctctttttcg 2760 cttctgctgg tgaggattac actctccgtc tccccgttga ttgtaatcct tcctatgtgt 2820 tccactccac cgacaacgcc gagaccgggg ttattgaggc gggtaacact gacaccgatt 2880 tctctggtga actggcggct cctggctcta accacactaa tgtcaagttc ctgtttgatc 2940 gatctcgatt attgaatgta atcaaggtac tggagaagga cgccgttttc ccccgccctt 3000 tccctacaca agaaggtgcg cagcaggatg atggttactt ttgtcttctg accccccgcc 3060 caacagtcgc ttcccgaccc gccactcgtt tcggcctgta cgccaatccg tccggcagtg 3120 gtgttcttgc taacacttca ctggacttca atttttatag cttggcctgt ttcacttact 3180 ttagatcgga ccttgaggtt acggtggtct cactagagcc ggatctggaa tttgctgtag 3240 ggtggtttcc ttctggcagt gaataccagg cttccagctt tgtctacgac cagctgcatg 3300 tgcccttcca ctttactggg cgcactcccc gcgctttcgc tagcaagggt gggaaggtat 3360 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Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155 <210> 126 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg 1 5 10 15 Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu 20 25 30 Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu 35 40 45 Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn 50 55 60 Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80 Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu 85 90 95 Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe 100 105 110 Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu 115 120 125 Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 130 135 <210> 127 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Ser Met Cys Lys Pro Ile Thr Gly Thr Ile Asn Asp Leu Asn Gln Gln 1 5 10 15 Val Trp Thr Leu Gln Gly Gln Asn Leu Val Ala Val Pro Arg Ser Asp 20 25 30 Ser Val Thr Pro Val Thr Val Ala Val Ile Thr Cys Lys Tyr Pro Glu 35 40 45 Ala Leu Glu Gln Gly Arg Gly Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ile Gln Asn 50 55 60 Pro Glu Met Cys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Gly Glu Gln Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Lys Glu Gln Lys Ile Met Asp Leu Tyr Gly Gln Pro Glu Pro 85 90 95 Val Lys Pro Phe Leu Phe Tyr Arg Ala Lys Thr Gly Arg Thr Ser Thr 100 105 110 Leu Glu Ser Val Ala Phe Pro Asp Trp Phe Ile Ala Ser Ser Lys Arg 115 120 125 Asp Gln Pro Ile Ile Leu Thr Ser Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Asn Thr 130 135 140 Ala Phe Glu Leu Asn Ile Asn Asp 145 150 <210> 128 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <210> 129 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys 1 5 10 15 Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu 20 25 30 Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln 35 40 45 Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met 50 55 60 Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys 65 70 75 80 Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser 85 90 95 Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro 100 105 110

Claims (225)

  1. 종양 용해성 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 콕사키바이러스는 Kuykendall 균주, EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인, 지질 나노입자(LNP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이고, 상기 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, LNP.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 상기 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, LNP.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함하는, LNP.
  5. 제1항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함하는, LNP.
  6. 제1항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함하는, LNP.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, LNP.
  8. 종양 용해성 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 지질 나노입자(LNP).
  9. 제8항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 포함하는, LNP.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 S177A 돌연변이를 포함하는 SVV VP2 단백질을 코딩하는, LNP.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 세포로 전달하면 세포에 의해 바이러스 입자가 생성되고, 상기 바이러스 입자는 감염성 및 용균성인, LNP.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, LNP.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 두 번째 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는, LNP.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, LNP.
  15. 제14항에 있어서, 상기 니트로환원효소가 NfsB 또는 NfsA인, LNP.
  16. 제14항에 있어서, 상기 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드인, LNP.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인, LNP.
  18. 제17항에 있어서,
    a) 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택되며;
    b) 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이거나; 또는
    c) 상기 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는, LNP.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 억제할 수 있는, LNP.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 수용체는 PD-1인, LNP.
  21. 제17항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있는, LNP.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)인, LNP.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인-바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원인, LNP.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM인, LNP.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈 및/또는 상기 재조합 RNA 분자는 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는, LNP.
  26. 제25항에 있어서,상기 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142, 및 miR-126로부터 선택되는, LNP.
  27. 제26항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트는 이하를 포함하는, LNP:
    a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
    b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
    c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
    d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하는, LNP.
  29. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP.

    화학식 (I)
    A는 ―N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
    X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
    R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
    RN1및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 히드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 시클로알킬이고;
    L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
    단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
  30. 제29항에 있어서, 상기 티올레이트의 S와 상기 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4인, LNP.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식 (I-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:

    화학식 (I-a)
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리인, LNP.
  33. 제29항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 하기 구조식 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
  34. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), 또는 N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)로부터 선택되는, LNP.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)로부터 선택되는, LNP.
  36. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이고, 상기 헬퍼 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, LNP.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조 지질은 콜레스테롤인, LNP.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:

    화학식 (A")
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
    RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  39. 제38항에 있어서, 상기 LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, LNP.
  40. 제38항에 있어서, LP1"은 결합인, LNP.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RP2"은 수소인, LNP.
  42. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:

    화학식 (B)
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  43. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DPG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DSG-PEG); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌(DMG-PEG), 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)](DSPE-PEG-아민)으로부터 선택되는, LNP.
  44. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K); 1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DPG-PEG2K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DSG-PEG5K); 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K); 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-5000(DMG-PEG5K); 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K) 으로부터 선택되는, LNP.
  45. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하고, 상기 PEG-지질은 DPG-PEG2000을 포함하는, LNP.
  46. 제28항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 COATSOME® SS-OC를 포함하고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC를 포함하고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤(Chol)을 포함하고, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, LNP:

    화학식 (A")
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    LP1"은 결합이고;
    RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
    RP2"는 수소이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  47. 제28항 내지 제37항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100, BRIJTM S20, BRIJTM O20 및 BRIJTM C20로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP.
  48. 제28항 내지 제37항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100인, LNP.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
    a. A = 40%-60%, B = 10%-25%, C = 20%-30%, 및 D = 0.01%-3%;
    b. A = 45%-50%, B = 20%-25%, C = 25%-30%, 및 D = 0.01%-1%; 또는
    c. A = 약 49%, B = 약 22%, C = 약 28%, 및 D = 약 0.5%인, LNP.
  50. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
    a. A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%;
    b. A = 40%-60%, B = 10%-30%, C = 25%-45%, 및 D = 0.01%-3%;
    c. A = 45%-55%, B = 10%-20%, C = 30%-40%, 및 D = 1%-2%;
    d. A = 45%-50%, B = 10%-15%, C = 35%-40%, 및 D = 1%-2%; 또는
    e. A = 약 49%, B = 약 11%, C = 약 38%, 및 D = 약 1.5%인, LNP.
  51. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, SS-OC:DSPC:Chol:PEG-지질의 비율(총 지질 함량의 백분율)은 A:B:C:D이며, 여기서 A+B+C+D = 100%, 그리고
    a. A = 45%-65%, B = 5%-20%, C = 20%-45%, 및 D = 0%-3%;
    b. A = 50%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-45%, 및 D = 0.01%-3%;
    c. A = 55%-60%, B = 5%-15%, C = 30%-40%,및 D = 1%-2%;
    d. A = 55%-60%, B = 5%-10%, C = 30%-35%, D = 1%-2%; 또는
    e. A = 약 58%, B = 약 7%, C = 약 33%, 및 D = 약 1.5%인, LNP.
  52. 지질 나노입자(LNP)로서:
    a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
    b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):

    화학식 (A")
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
    RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  53. 지질 나노입자(LNP)로서:
    a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
    b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(A")의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):

    화학식 (A")
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    LP1"은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1"은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고;
    RP2"는 수소 또는 -CH3이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, R1은 C16-C18 알킬 또는 C16-C18 알케닐인, LNP.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LP1"은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, LNP.
  56. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,LP1"은 결합인, LNP.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, RP2"은 수소인, LNP.
  58. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식 (A"-f1), 화학식 (A"-f2) 또는 화학식 (A"-f3)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    화학식 (A"-f1)
    화학식 (A"-f2)
    화학식 (A"-f3)
  59. 지질 나노입자(LNP)로서:
    a. 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
    b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):

    화학식 (B)
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  60. 지질 나노입자(LNP)로서:
    a. 콕사키바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈; 및
    b. 양이온 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질 및 PEG-지질을 포함하며, 상기 PEG-지질은 화학식(B)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):

    화학식 (B)
    n은 모든 종말점을 포함하여 10 내지 200의 정수이고,
    RB1은 C5-C25알킬 또는 C5-C25알케닐이고,
    여기서 상기 LNP는 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖는다.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, R1은 C15-C17 알킬 또는 C15-C17 알케닐인, LNP.
  62. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 PEG-지질은 화학식(B-a) 또는 화학식(B-b)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP.
    화학식(B-a)
    화학식(B-b)
  63. 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, n은 평균 약 20, 약 40, 약 50 또는 약 100인, LNP.
  64. 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, n은 평균 약 100인, LNP.
  65. 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 약 200달톤 내지 약 10,000달톤, 약 500달톤 내지 약 7,000달톤, 또는 약 800달톤 내지 약 6,000달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함하는, LNP.
  66. 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP.
  67. 제52항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 화학식 (A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 지질이 결여된 대조군 LNP와 비교하여 감소된 생체내 면역 반응을 유도하고, 임의 선택적으로, 상기 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2K-DPG 또는 PEG2K-DMG인, LNP.
  68. 제67항에 있어서, 상기 면역 반응은 LNP의 가속 혈액 클리어런스(ABC) 및/또는 항-PEG IgM 반응인, LNP.
  69. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:

    화학식 (I)
    A는 ―N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 포함하는 4~7원 헤테로사이클릴 고리이고, 여기서 상기 4~7원 헤테로사이클릴 고리는 0~6개의 R3으로 임의로 치환되고;
    X는 각각 독립적으로 -O-, -N(R1)- 또는 -N(R2)-이고;
    R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 임의로 치환된 C1-C31지방족 및 스테로이드일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
    RN1및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 히드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 또는 C3-C7 시클로알킬이고;
    L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 사슬 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 사슬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 사슬, 또는 임의로 치환된 2가의 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
    단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O일 때, L3은 C1-C6 알킬렌 사슬이 아니다.
  70. 제69항에 있어서, 상기 티올레이트의 S와 상기 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2~4인, LNP.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식 (I-a)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:

    화학식 (I-a)
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, A는 임의로 치환된 5~6원 헤테로사이클릴 고리인, LNP.
  73. 제69항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 하기 구조식, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
  74. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA (MC3), COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이의 혼합물로부터 선택되는, LNP.
  75. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물 또는 화학식(II-2a)의 화합물인 LNP:
    :
    화학식(II-1a),
    화학식(II-2a).
  76. 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤이고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC이고, 상기 PEG-지질은 BRIJTM S100, LNP.
  77. 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식(II-1a)의 화합물이고, 상기 구조 지질은 콜레스테롤이고, 상기 헬퍼 지질은 DSPC이고, 상기 PEG-지질은 MYRJTM S100, MYRJTM S50 또는 MYRJTM S40, LNP.
  78. 제52항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 약 0.1% 내지 약 2% PEG-지질, 예를 들어 약 0.2% 내지 약 0.8 몰%, 약 0.4% 내지 약 0.6 몰%, 약 0.7% 내지 약 1.3%, 또는 약 1.2% 내지 약 1.8% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  79. 제52항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 약 0.2% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.5% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  80. 제52항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 약 1.2% 내지 약 1.8%, 또는 약 1.5% PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  81. 제52항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 약 44% 내지 약 54% 양이온성 지질, 약 19% 내지 약 25% 헬퍼 지질, 약 24% 내지 약 33% 구조 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8% PEG-지질의 몰비를 갖는, LNP.
  82. 제52항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:28.5:22:0.5인, LNP.
  83. 제52항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:27.5:22:1.5인, LNP.
  84. 제52항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 화학식(II-1a)의 화합물, 콜레스테롤, DSPC, 및 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3, HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3, HO-PEG20-C18H35, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)13CH3, HO-PEG100-C(O)-CH2(CH2)15CH3, HO-PEG40-C(O)-CH2(CH2)15CH3, 및 HO-PEG50-C(O)-CH2(CH2)15CH3로부터 선택된 PEG-지질을 포함하고, 화학식(II-1a)의 화합물:콜레스테롤:DPC:PEG-지질의 몰비는 49:38.5:11:1.5인, LNP.
  85. 제52항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 약 1 내지 약 25의 지질-질소 대 인산염(N:P) 비율을 갖는, LNP.
  86. 제52항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP의 N:P 비율은 약 14인, LNP.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론난은 LNP의 표면에 접합되는, LNP.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 따른 복수의 지질 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475nm 내지 약 500nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  90. 제88항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  91. 제88항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 또는 약 120 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  92. 제88항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  94. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 5mV 미만, 약 0mV 미만, 약 -5mV 미만, 약 -10mV 미만, 약 -20mV 미만, 약 -30mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  95. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 복수의 LNP는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하면 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 대상체의 표적 세포에 전달하며, 상기 재조합 RNA 폴리뉴클레오타이드는 대상체의 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 종양 용해성 바이러스를 생산하는, 약제학적 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 표적 세포는 암세포인, 약제학적 조성물.
  99. 제88항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 화학식(A")의 PEG-지질 및/또는 화학식(I)의 이온화 가능 지질이 결여된 조성물보다도 긴 생체내 치료 효과의 지속 시간을 갖는, 약제학적 조성물.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 상기 조성물은 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 3시간 이상, 약 4시간 이상, 약 5시간 이상, 약 6시간 이상, 약 7시간 이상, 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 12시간 이상, 약 14시간 이상, 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 20시간 이상, 약 25시간 이상, 약 30시간 이상, 약 35시간 이상, 약 40시간 이상, 약 45시간 이상 또는 약 50시간 이상의 생체내 치료 효과 지속 기간을 갖는, 약제학적 조성물.
  102. 제99항 또는 제100항에 있어서, 상기 조성물은 소정의 역치 값 이상의 반감기 및/또는 생체내 AUC를 갖는, 약제학적 조성물.
  103. 제88항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP에 의한 합성 RNA 바이러스 게놈의 캡슐화 효율이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%인, 약제학적 조성물.
  104. 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM 또는 약 50mM의 총 지질 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
  105. 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6의 pH에서 제형화되는, 약제학적 조성물.
  106. 제88항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 복수회 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 후속의 투여는 최초 투여로부터 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 14일 또는 적어도 21일 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  108. 제88항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  109. 종양 용해성 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 바이러스를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자로서, 상기 콕사키바이러스는 Kuykendall 균주, EF 균주 및 KY 균주로부터 선택되는 CVA21 균주인, 재조합 RNA 분자.
  110. 제109항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-KY 균주이고, 상기 CVA21-KY 균주는 서열번호: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  111. 제109항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21-EF 균주이며, 상기 CVA21-EF 균주는 서열번호: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  112. 제109항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 6 또는 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5'UTR(IRES) 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  113. 제109항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 7 또는 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 P1 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  114. 제109항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 서열번호: 8 또는 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 3D 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 1에 대해 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과 또는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, 재조합 RNA 분자.
  116. 제109항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 야생형 콕사키바이러스 바이러스와 100% 서열 동일성을 갖는 RNA 바이러스 게놈을 포함하지 않는, 재조합 RNA 분자.
  117. 종양 용해성 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 코딩하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자로서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  118. 제109항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 삽입된 마이크로RNA(miRNA) 표적서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 상기 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포에서 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포내에서 코딩된 바이러스의 복제를 저해하는, 재조합 RNA 분자.
  119. 제118항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, miR-142 및 miR-126로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
  120. 제119항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트는 이하를 포함하는, 재조합 RNA 분자:
    a. miR-124 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 카피;
    b. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 카피;
    c. miR-128 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 카피; 또는
    d. miR-217 표적 서열의 하나 이상의 카피, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 카피.
  121. 제109항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 비바이러스 전달 매체에 의해 세포에 도입되면 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스를 생산할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
  122. 제121항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 재조합 RNA 분자.
  123. 제122항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 대상체 내에 존재하는 포유동물 세포인, 재조합 RNA 분자.
  124. 제118항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장되는, 재조합 RNA 분자.
  125. 제118항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR-TS 카세트는 하나 이상의 바이러스 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF), 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 내장되는, 재조합 RNA 분자.
  126. 제109항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 핵산 벡터에 삽입되는, 재조합 RNA 분자.
  127. 제126항에 있어서, 상기 핵산 벡터는 레플리콘인, 재조합 RNA 분자.
  128. 제109항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 외인성 페이로드 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  129. 제128항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 MLKL 4HB 도메인, 개스더민 D N-말단 단편, 개스더민 E N-말단 단편, HMGB1 박스 B 도메인, SMAC/디아블로, 멜리틴, L-아미노산 산화효소(LAAO), 디스인테그린, TRAIL (TNFSF10), 니트로환원효소, 레오바이러스 FAST 단백질, 렙틴/FOSL2, α-1,3-갈락토실전이효소, 또는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, 재조합 RNA 분자.
  130. 제129항에 있어서, 상기 니트로환원효소가 NfsB 또는 NfsA인, 재조합 RNA 분자.
  131. 제129항에 있어서, 상기 레오바이러스 FAST 단백질이 ARV p14, BRV p15 또는 p14-p15 하이브리드인, 재조합 RNA 분자.
  132. 제128항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드인, 재조합 RNA 분자.
  133. 제132항에 있어서,
    a) 상기 사이토카인은 GM-CSF, IFNγ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, 및 IL-36γ로부터 선택되며;
    b) 세포 표면 수용체에 대한 리간드는 Flt3 리간드 또는 TNFSF14이거나; 또는
    c) 상기 케모카인은 CXCL10, CCL4, CCL21 및 CCL5로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
  134. 제132항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 저해할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
  135. 제134항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 수용체는 PD-1인, 재조합 RNA 분자.
  136. 제132항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 종양 항원에 결합할 수 있는, 재조합 RNA 분자.
  137. 제136항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 이중특이성 T 세포 엔게이저 분자(BiTE) 또는 이중특이성 가벼운 T 세포 엔게이저 분자(LiTE)인, 재조합 RNA 분자.
  138. 제136항 또는 제137항에 있어서, 상기 종양 항원은 HBV-코어(B형 간염 코어 항원), HBV-pol, HbS-Ag, HPV E6, HPV E7, 메르켈 세포 폴리오마 대형 T 항원 및 엡스타인-바 바이러스 항원 EBNA2 또는 BZLF1으로부터 선택되는 바이러스 항원인, 재조합 RNA 분자.
  139. 제136항 또는 제137항에 있어서, 상기 종양 항원은 DLL3 또는 EpCAM인, 재조합 RNA 분자.
  140. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는, 재조합 DNA 템플레이트.
  141. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하며,상기 RNA 분자는 청구항 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항으로부터 선택되는, 재조합 RNA 분자.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 상기 프로모터 서열과 상기 5' 접합 절단 서열 사이의 리더 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  143. 5'에서 3'으로, 프로모터 서열, 리더 서열, 5' 접합 절단 서열, 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리-A 꼬리, 및 3' 접합 절단 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  144. 제142항 또는 제143항에 있어서, 상기 리더 서열은 100bp 미만의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
  145. 제140항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열인, 재조합 DNA 분자.
  146. 제140항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 약 50-90bp의 길이 또는 약 65-75bp의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
  147. 제145항에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 약 70bp의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
  148. 제140항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 약 10-50 bp의 길이, 또는 25-35 bp의 길이를 갖는, 재조합 DNA 분자.
  149. 제140항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 3' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  150. 제149항에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열이고, 상기 3' 리보자임 서열은 델타 간염 바이러스 리보자임 서열인, 재조합 DNA 분자.
  151. 제140항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 RNAseH 프라이머 결합 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  152. 제140항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 3' 접합 절단 서열은 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  153. 제152항에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 해머헤드 리보자임 서열, 피스톨 리보자임 서열, 또는 변형된 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  154. 제140항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 IIS형 제한 효소 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  155. 제140항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자는 콕사키바이러스(CVA)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는, 재조합 DNA 분자.
  156. 제155항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주인, 재조합 DNA 분자.
  157. 제155항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 14 또는 15에 따는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  158. 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTT"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
  159. 제155항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 17에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TTTA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
  160. 제155항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  161. 제155항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  162. 제156항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨ol 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsmBI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  163. 제156항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 18에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 BsaI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  164. 제140항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자는 세네카 밸리 바이러스(SVV)의 RNA 바이러스 게놈을 코딩하는, 재조합 DNA 분자.
  165. 제164항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 53-63 중 어느 하나에 따른 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  166. 제164항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호: 58에 따를 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  167. 제164항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 리보자임 서열은 서열번호: 64 또는 65에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 피스톨 리보자임 서열이고, 상기 5' 리보자임 서열의 P2 모티프는 "TCAA" 또는 "TTAA"의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
  168. 제164항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 바이러스 게놈은 서열번호: 68의 핵산 1-670에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 5' UTR(IRES) 서열을 갖는, 재조합 DNA 분자.
  169. 제164항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  170. 제164항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 53에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  171. 제164항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7 프로모터 서열이고, 상기 리더 서열은 서열번호: 58에 따른 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 5' 접합 절단 서열은 서열번호: 64에 따른 피스톨 리보자임 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 상기 폴리-A 꼬리는 길이가 약 70bp이고, 상기 3' 접합 절단 서열은 SapI 인식 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 재조합 DNA 분자.
  172. 제140항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자는 상기 프로모터 서열과 상기 3' 접합 절단 서열에 걸쳐 있는 영역 내에 추가의 핵산을 포함하지 않는, 재조합 DNA 분자.
  173. 제140항 내지 제172항 중 어느 한 항의 DNA 분자의 시험관내 전사, 및 얻어진 재조합 RNA 분자의 정제를 포함하는 재조합 RNA 분자의 제조 방법.
  174. 제173항에 있어서, 상기 재조합 RNA 분자는 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 종양 용해성 바이러스에 고유한 5' 및 3' 말단을 포함하는, 방법.
  175. 유효량의 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 및 포유동물 대상체에게 투여하기에 적합한 담체를 포함하는 조성물.
  176. 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 포함하는 입자.
  177. 제176항에 있어서, 상기 입자는 생분해성인 입자.
  178. 제177항에 있어서, 상기 입자는 나노입자, 엑소좀, 리포좀 및 리포플렉스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 입자.
  179. 제178항에 있어서, 상기 엑소좀은 무손상의 엑소좀 또는 빈 엑소좀으로부터 유래된 변형 엑소좀인, 입자.
  180. 제176항 내지 제179항 중 어느 한 항에 따른 복수의 입자를 포함하는 약제학적 조성물.
  181. 제180항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
  182. 제180항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
  183. 제180항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm 또는 약 120 nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
  184. 제180항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 100nm의 평균 크기를 갖는, 약제학적 조성물.
  185. 제180항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 40mV 내지 약 -40mV, 약 20mV 내지 약 -20mV, 약 10mV 내지 약 -10mV, 약 5mV 내지 약 -5mV, 또는 약 20mV 내지 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  186. 제180항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 5mV 미만, 약 0 mV 미만, 약 -5 mV 미만, 약 -10 mV 미만, 약 -20 mV 미만, 약 -30 mV 미만, 약 -35mV 미만, 또는 약 -40mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  187. 제180항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 -50mV 내지 약 -20mV, 약 -40mV 내지 약 -20mV, 약 -30mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -15mV 내지 약 5mV, 또는 약 -10mV 내지 약 10mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  188. 제180항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 입자는 약 -30mV, 약 -31mV, 약 -32mV, 약 -33mV, 약 -34mV, 약 -35mV, 약 -36mV, 약 -37mV, 약 -38mV, 약 -39mV, 또는 약 -40mV의 평균 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  189. 제180항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 상기 조성물을 전달하면 캡슐화된 재조합 RNA 분자를 표적 세포에 전달하고, 상기 캡 슐화된 재조합 RNA 분자는 표적 세포를 용해할 수 있는 감염성 바이러스를 생성하는, 약제학적 조성물.
  190. 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 포함하는, 무기 입자.
  191. 제190항에 있어서, 상기 무기 입자는 금 나노입자(GNP), 금 나노로드(GNR), 자성 나노입자(MNP), 자성 나노튜브(MNT), 탄소 나노혼(CNH), 탄소풀러렌, 탄소 나노튜브(CNT), 인산칼슘 나노입자(CPNP), 메조다공성 실리카 나노입자(MSN), 실리카 나노튜브(SNT) 또는 별 모양의 중공 실리카 나노입자(SHNP)로부터 선택되는, 무기 입자.
  192. 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 무기 입자를 포함하는 조성물로서, 상기 입자의 평균 직경은 약 500 nm 미만, 약 50 nm 내지 500 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm인, 조성물.
  193. 페이로드 분자를 코딩하는 제2 재조합 RNA 분자를 추가로 포함하는, 제 1 항 내지 제87항 중 어느 한 항의 LNP, 제176항 내지 제179항 중 어느 한 항의 입자, 또는 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 무기 입자.
  194. 제193항에 있어서, 상기 제2 재조합 RNA 분자가 레플리콘인 LNP, 입자 또는 무기 입자.
  195. 제 1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 LNP, 제176항 내지 제179항 중 어느 한 항의 입자, 또는 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 무기 입자를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이 정맥내 및/또는 종양내 전달용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  196. 제195항에 있어서, 상기 LNP, 상기 입자 또는 상기 무기 입자의 표적 세포는 암 세포인, 약제학적 조성물.
  197. 암세포의 사멸 방법으로서, 상기 암성 세포에 입자의 세포내 전달에 충분한 조건 하에서, 상기 암성 세포를 제1항 내지 제87항, 제176항 내지 제179항 또는 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 입자, 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 또는 그의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 캡슐화된 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 복제 가능 바이러스는 암성 세포를 사멸시키는, 방법.
  198. 제197항에 있어서, 상기 복제 가능 바이러스는 비-암성 세포에서는 생성되지 않는, 방법.
  199. 제197항 또는 제198항에 있어서, 상기 방법은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는, 방법.
  200. 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체에게, 유효량의 제1항 내지 제87항, 제176항 내지 제179항 또는 제190항 내지 제191항 중 어느 한 항의 입자, 제109항 내지 제139항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자 또는 그의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  201. 제200항에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 정맥내, 비강내, 종양내, 복강내로 또는 흡입제로서 투여되는, 방법.
  202. 제200항에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 종양내 및/또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  203. 제 200항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자 또는 이의 조성물은 대상체에게 반복적으로 투여되는, 방법.
  204. 제 200항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류 또는 인간인, 방법.
  205. 제 200항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 결장암 또는 췌장암이고, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 KY 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  206. 제200항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 또는 간암이고, 상기 합성 RNA 바이러스 게놈은 EF 균주로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  207. 제 197항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 정소암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 신세포암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경아교종, 교모세포종, 흑색종, B세포 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 의미 불명의 단클론성 감마병증(MGUS), 메르켈 세포 암종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암, 및 변연부 림프종(MZL)로부터 선택되는, 방법.
  208. 제 197항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신세포암, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  209. 제 197항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 신세포 암, 폐암 또는 간암인, 방법.
  210. 제205항, 제207항 또는 208항에 있어서, 상기 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종)인, 방법.
  211. 제206항, 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 간암은 간세포 암(HCC)(예를 들어, B형 간염 바이러스 관련 HCC)인, 방법.
  212. 제207항에 있어서, 상기 전립선암은 치료중 유발된 신경내분비 전립선암인, 방법.
  213. 제 197항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 전립선암(예: CRPC-NE), 방광암, 췌장암, 대장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신세포암, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포암 또는 흑색종인, 방법.
  214. 제 197항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 소세포 폐암(SCLC) 또는 신경모세포종인, 방법.
  215. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-EF 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  216. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-KY 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  217. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 CVA21-Kuykendall 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  218. 제 215항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 종양내 및/또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  219. 제 197항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  220. 제 219항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1의 저해제인, 방법.
  221. 제197항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  222. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 종양 용해성 콕사키바이러스 (여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA21 균주임), 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 암은 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 기준으로 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는, 방법.
  223. 이하의 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법:
    (a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
    (b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 콕사키바이러스 21(CVA21) 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류되는 경우 치료적 유효량의 CVA21 또는 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계.
  224. 이하의 단계를 포함하는, 콕사키바이러스 21(CVA21) 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치료하기 위해 암을 앓는 대상체를 선택하는 방법:
    (a) ICAM1의 발현 수준 및/또는 상기 암에서의 ICAM-1 양성 암세포의 백분율을 결정하는 단계;
    (b) (a)에서 결정된 ICAM-1의 발현 및/또는 ICAM-1 양성 암세포의 백분율에 기초하여 암을 CVA21 감염에 대하여 민감성이 있는 것으로 분류 단계;
    (c) (b)에서 상기 암이 CVA21 감염에 대하여 민감성이 잇는 것으로 분류되는 경우 CVA21 또는 상기 CVA21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 치료대상을 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 선택된 대상체에게 CVA21 또는 상기 CVA21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계.
  225. 제222항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CVA21 균주가 CVA21-KY인 방법.















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* Cited by examiner, † Cited by third party
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